JP2024514933A

JP2024514933A - Ｍｈｃクラスｉ及びｉｉ発現の下方調節のための人工マイクロｒｎａ埋込ｓｈｒｎａを発現するｃａｒｎｋｔ

Info

Publication number: JP2024514933A
Application number: JP2023564406A
Authority: JP
Inventors: ヘッツェイ，アンドラス; リウ，ビン; エス．メテリッサ，レオニド
Original assignee: Baylor College of Medicine
Current assignee: Baylor College of Medicine
Priority date: 2021-04-23
Filing date: 2022-04-22
Publication date: 2024-04-03
Also published as: KR20240000529A; CA3217652A1; US20220348930A1; WO2022226353A1; AU2022262648A1; EP4326315A1; AU2022262648A9; CN117355327A

Abstract

本開示は、１つ以上の内因性主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）遺伝子の発現をノックダウンするように操作されたナチュラルキラーＴ細胞に関連する方法及び組成物を提供する。本開示はまた、インビトロ及びインビボの両方で同種異系免疫細胞による拒絶反応に抵抗する操作されたＣＡＲＮＫＴ細胞を提供する。【選択図】図１

Description

連邦政府支援の研究又は開発に関する声明
本発明は、米国国立衛生研究所（ｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ）により授与された助成金番号５Ｐ５０ＣＡ１２６７５２に基づく政府支援を受けて行われた。政府は、本発明において、特定の権利を有する。

関連出願に対する相互参照及び配列表の組み込み
本出願は、２０２１年４月２３日に出願された米国仮出願第６３／１７９，１０４号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）の利益を主張する。（ＭＳ－Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）で測定して）７，２５５バイトであり、２０２２年４月２２日に作成された「Ｐ３５０６２ＵＳ００＿ＳＬ．ＴＸＴ」という名称のファイルに含まれる配列表は、本明細書とともに電子的に提出され、参照によりその全体が組み込まれる。

本開示は、少なくとも細胞生物学、分子生物学、免疫学、及び医学の分野に関する。

Ｉ型ＮＫＴ細胞（ＮＫＴ）は、不変ＴＣＲα鎖Ｖα２４－Ｊαｌ８を発現し、単型ＨＬＡクラス－Ｉ様分子ＣＤ１ｄ（遺伝子ＩＤ９１２）によって提示される自己又は微生物由来の糖脂質に反応する先天性リンパ球の進化的に保存されたサブセットである（Ｐｏｒｃｅｌｌｉｅｔａｌ．ＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＴｃｅｌｌａｎｔｉｇｅｎｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＴＣＲ）ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｂｙｈｕｍａｎｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｂｌｏｏｄＣＤ４－８－ａｌｐｈａ／ｂｅｔａＴｃｅｌｌｓｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｓｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｕｓｅｏｆｓｅｖｅｒａｌＶｂｅｔａｇｅｎｅｓａｎｄａｎｉｎｖａｒｉａｎｔＴＣＲａｌｐｈａｃｈａｉｎ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９３；１７８（１）：１－１６）；ＬａｎｔｚａｎｄＢｅｎｄｅｌａｃ，“ＡｎｉｎｖａｒｉａｎｔＴｃｅｌｌｒｅｃｅｐｔｏｒａｌｐｈａｃｈａｉｎｉｓｕｓｅｄｂｙａｕｎｉｑｕｅｓｕｂｓｅｔｏｆｍａｊｏｒｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙｃｏｍｐｌｅｘｃｌａｓｓＩ－ｓｐｅｃｉｆｉｃＣＤ４＋ａｎｄＣＤ４－８－Ｔｃｅｌｌｓｉｎｍｉｃｅａｎｄｈｕｍａｎｓ，”Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９４；１８０（３）：１０９７－１１０６；ＢｅｎｄｅｌａｃＡ，ＬａｎｔｚＯ，ＱｕｉｍｂｙＭＥ，ＹｅｗｄｅｌｌＪＷ，ＢｅｎｎｉｎｋＪＲ，ＢｒｕｔｋｉｅｗｉｃｚＲＲ．ＣＤ１ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｂｙｍｏｕｓｅＮＫ１＋Ｔｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ１９９５；２６８（５２１２）：８６３－８６５．；ＫｉｍＥＹ，ＬｙｎｃｈＬ，ＢｒｅｎｎａｎＰＪ，ＣｏｈｅｎＮＲ，ＢｒｅｎｎｅｒＭＢ．ＴｈｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｐｒｏｇｒａｍｓｏｆｉＮＫＴｃｅｌｌｓ．Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１５；２７（ｌ）：２６－３２）。

グローバル転写プロファイリング研究は、ＮＫＴが、Ｔ細胞及びＮＫ細胞と特性を共有するが、リンパ球の別個の集団であることを実証する（Ｃｏｈｅｎｅｔａｌ．，２０１３）。マウス及びヒトの両方において、ＮＫＴは、ＣＤ４＋ＣＤ８＋（二重陽性、ＤＰ）胸腺細胞（ＣＤ８、遺伝子ＩＤ９２５）の段階で従来のＴ細胞から分岐する。胸腺上皮細胞によって陽性選択される従来のＴ細胞とは異なり、ＮＫＴは、ＣＤ１ｄ発現ＤＰ胸腺細胞によって選択される（ＧａｐｉｎＬ，ＭａｔｓｕｄａＪＬ，ＳｕｒｈＣＤ，ＫｒｏｎｅｎｂｅｒｇＭ．ＮＫＴｃｅｌｌｓｄｅｒｉｖｅｆｒｏｍｄｏｕｂｌｅ－ｐｏｓｉｔｉｖｅｔｈｙｍｏｃｙｔｅｓｔｈａｔａｒｅｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙｓｅｌｅｃｔｅｄｂｙＣＤｌｄ．Ｎａｔ．ｌｍｍｕｎｏｌ．２００１；２（１０）：９７１－９７８）。陽性選択直後の前骨髄球性白血病ジンクフィンガー転写因子（ＰＬＺＦ）の発現は、ＮＫＴの胸腺内拡張及びエフェクター／メモリー様分化を可能にする（ＳａｖａｇｅＡＫ，ｅｔａｌ．ＴｈｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒＰＬＺＦｄｉｒｅｃｔｓｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｒｐｒｏｇｒａｍｏｆｔｈｅＮＫＴｃｅｌｌｌｉｎｅａｇｅ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．２００８；２９（３）：３９１－４０３）。

ＮＫＴ細胞は、多数の抗腫瘍特性を有し、その数は、いくつかの種類のがんにおける良好な転帰と相関することが報告されている。ＨｅｃｚｅｙＡ．ｅｔａｌ．及びＴｉａｎＧ．ｅｔａｌ．は、ＮＫＴ細胞が末梢血から単離され、ＣＡＲを形質導入され、養子細胞療法用途のために臨床規模に拡張され得ることを実証した。いくつかの研究により、ドナー由来のＮＫＴがＧｖＨＤを媒介せず、ＧｖＨＤを抑制する可能性さえあることが示された。したがって、同種異系の健常ドナー由来ＣＡＲ－ＮＫＴ細胞を使用して、Ｔ細胞とは異なり、追加の遺伝子操作を必要としないＧｖＨＤのリスクなしにがん患者を治療することができる。

しかしながら、全ての正常な有核細胞は、ＨＬＡクラスＩを発現し、したがって、ＨＬＡ不一致のドナーからの養子移入された治療細胞は、宿主免疫系によって除去される。Ｔ及びＮＫＴ細胞はまた、活性化されたときにＨＬＡクラスＩＩを一過的に発現することができ、ＨＬＡクラスＩＩミスマッチは、宿主ＣＤ４Ｔ細胞によるドナー細胞除去を誘発する。そのような拒絶反応を遅らせる一般的なアプローチは、宿主免疫系の回復前に、エフェクター細胞が抗腫瘍活性を媒介するための治療窓を可能にするために、免疫抑制性宿主コンディショニングを使用することである。しかしながら、そのようなアプローチは患者にとって有毒であり、治療用エフェクター細胞の持続性が不十分であるために完全な腫瘍制御が不可能となる場合がある。

したがって、臨床規模に急速に拡張することができ、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を誘発せず、患者によって忍容される市販のＣＡＲベースの細胞免疫療法が必要とされている。単型ＣＤ１ｄによる制限により、ＮＫＴ細胞は、ＧｖＨＤを産生しない。

同種異系宿主の免疫系によるＣＡＲ－ＮＫＴ細胞の拒絶反応を制限するために、本開示は、ＮＫＴ細胞におけるＨＬＡクラスＩ及びクラスＩＩのノックダウンをそれぞれ達成するために、β２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）及び不変鎖（Ｉｉ）（別名ＣＤ７４）又はクラスＩＩトランスアクチベーター（ＣＩＩＴＡ）に対するｓｈＲＮＡ配列を組み込む構築物を提供する。特に、本開示は、ＣＡＲ構築物に組み込まれた人工マイクロＲＮＡ（ａｍｉＲ）足場内に埋め込まれたｓｈＲＮＡ配列を含む構築物を提供する。

ここでは、最適化されたＣＡＲ－ａｍｉＲ構築物が、形質導入されたＮＫＴ細胞におけるＨＬＡクラスＩ及びＩＩの有効なノックダウンを媒介することが示されている。これらの構築物を発現するＮＫＴ細胞は、リンパ腫ＮＳＧマウスモデルにおいて強力なインビボ抗腫瘍活性を実証し、インビトロ及びインビボの両方で同種異系免疫細胞による拒絶反応に抵抗する。

本開示は、腫瘍抗原を認識するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするＤＮＡ配列と、ＭＨＣクラスＩ又はＭＨＣクラスＩＩ遺伝子を標的とする小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）配列をコードするＤＮＡ配列と、を含む、内因性主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）遺伝子の発現を抑制するための組換え構築物であって、ｓｈＲＮＡ配列が、人工マイクロＲＮＡ（ａｍｉＲ）足場に埋め込まれている、組換え構築物を提供し、含む。

一態様において、本明細書に開示される組換え構築物は、サイトカインをコードするＤＮＡ配列を更に含む。いくつかの態様において、サイトカインは、インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２７、ＩＬ－３３、又はそれらの組み合わせである。一態様において、サイトカインは、ＩＬ－１５である。一態様において、ＩＬ－１５は、ヒトＩＬ－１５である。一態様において、ＩＬ－１５をコードするＤＮＡ配列は、コドン最適化されている。別の態様において、ＩＬ１５は、ＩＬ－２シグナルペプチドを含む。

いくつかの態様において、ａｍｉＲは、ａｍｉＲ１５５である。他の態様において、ａｍｉＲは、ａｍｉＲ３０である。

いくつかの態様において、ＭＨＣクラスＩ遺伝子は、β２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）である。

いくつかの態様において、ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子は、不変鎖（Ｉｉ）又はクラスＩＩトランスアクチベーター（ＣＩＩＴＡ）をコードする。

いくつかの態様において、本明細書に開示される組換え構築物は、第１のａｍｉＲ足場に埋め込まれた第１のｓｈＲＮＡ配列と、第２のａｍｉＲ足場に埋め込まれた第２のｓｈＲＮＡ配列と、を含む。いくつかの態様において、第１のｓｈＲＮＡ配列は、ＭＨＣクラスＩ遺伝子を標的とし、第２のｓｈＲＮＡ配列は、ＭＨＣクラスＩ遺伝子を標的とする。一態様において、第１のａｍｉＲ足場及び第２のａｍｉＲ足場は、同じａｍｉＲ配列に由来する。他の態様において、第１のａｍｉＲ足場及び第２のａｍｉＲ足場は、異なるａｍｉＲ配列に由来する。

本開示はまた、同種異系宿主の免疫系による操作されたナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞の拒絶反応を制限するための方法であって、ＮＫＴ細胞に、本明細書に開示される組換え構築物を形質導入することを含み、ＮＫＴ細胞における内因性ＭＨＣ遺伝子の発現が、ｓｈＲＮＡによって抑制される、方法を提供し、含む。

いくつかの態様において、内因性ＭＨＣ遺伝子の発現レベルは、形質導入後２日で少なくとも１０％減少する。

いくつかの態様において、内因性ＭＨＣ遺伝子の発現レベルは、形質導入後７日で少なくとも１０％減少する。

いくつかの態様において、内因性ＭＨＣ遺伝子の発現レベルは、形質導入後１４日で少なくとも１０％減少する。

いくつかの態様において、ＮＫＴ細胞は、ＣＤ１ｄ制限性ＮＫＴ細胞である。

本開示は更に、本明細書に開示される組換え構築物を形質導入されたか、又は本明細書に開示される方法によって産生された、操作されたＮＫＴ細胞であって、ＮＫＴ細胞における内因性ＭＨＣ遺伝子の発現が、組換え構築物を形質導入されていない対照ＮＫＴ細胞と比較して著しく抑制される、操作されたＮＫＴ細胞を提供し、含む。

いくつかの態様において、操作されたＮＫＴ細胞は、同種異系Ｔ細胞又はＰＢＭＣによる拒絶反応に対する耐性が改善されている。

いくつかの態様において、操作されたＮＫＴ細胞は、同種異系ナチュラルキラー細胞による破壊に対する耐性が改善されている。

本開示は、以下の添付の図面を参照して開示されている。

β２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）及び不変鎖（Ｉｉ）（別名、ＣＤ７４）又はクラスＩＩトランスアクチベーター（ＣＩＩＴＡ）に対する、人工マイクロＲＮＡ（ａｍｉＲ）（ＣＡＲ１９－ａｍｉＲ）又は短ヘアピンＲＮＡ若しくは小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）のｐｏｌＩＩＩプロモーターをベースとする発現（ＣＡＲ１９－ｓｈＲＮＡ）の配列を有するＣＡＲ１９発現構築物の図を提示する。ＬＴＲ＝長末端反復、ｓｃＦｖ＝一本鎖可変断片、Ｈ＝ヒンジ、ＴＭ＝膜貫通。いくつかの実施形態において、Ｕ６プロモーターはＨ１又は７ＳＫプロモーターで置き換えられる。Ｕ６、Ｈ１、又は７ＳＫプロモーターによって駆動されたか、又はｍｉＲ１５５足場に埋め込まれたスクランブル（ｓｃｒ．）又はＢ２Ｍ特異的ｓｈＲＮＡを含むＣＡＲ１９構築物を形質導入されたＮＫＴにおけるＣＡＲ１９発現の代表的な結果を提示する。ＣＡＲ発現を、形質導入の２日後に評価する。Ｈ１、７ＳＫ、又はＵ６プロモーターによって駆動されたか、又はａｍｉＲ１５５に埋め込まれたスクランブル（ｓｃｒ．）又はＢ２Ｍ特異的ｓｈＲＮＡを含むＣＡＲ１９構築物を形質導入されたＮＫＴのＣＡＲ１９及びＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃに細胞をゲートするドナーの細胞内フローサイトメトリーの代表的なドットプロットを提示する。形質導入試料及び非形質導入試料についてのＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ発現の代表的なヒストグラムをそれぞれについて示す。ＣＡＲ１９内からａｍｉＲ１５５によって支持されるＢ２ＭｓｈＲＮＡ発現は、ＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃの最大レベルのノックダウンをもたらすことが示されている（右下）。ＣＡＲ及びＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃの発現を、形質導入の２日後に評価する。同上。Ｕ６プロモーターによって駆動されたか、又はａｍｉＲ１５５に埋め込まれたスクランブル（ｓｃｒ．）又はＢ２Ｍ特異的ｓｈＲＮＡを含むＣＡＲ１９構築物を形質導入されたＮＫＴのＣＡＲ１９及びＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃに細胞をゲートするドナーの細胞内フローサイトメトリーの別の代表的なドットプロットを提示する。ＣＡＲ及びＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃの発現を、形質導入の１４日後に評価する。示されるように、ａｍｉＲ３０に埋め込まれたスクランブル（ｓｃｒ．）又はＢ２Ｍ特異的ｓｈＲＮＡを含むＣＡＲ１９構築物を形質導入されたＮＫＴのＣＡＲ１９及びＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃに細胞をゲートするドナーの細胞内フローサイトメトリーの代表的なドットプロットを提示する。ＣＡＲ及びＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃの発現を、形質導入の７日後に評価する。ａｍｉＲ１５５に埋め込まれた５つの異なるＢ２Ｍ特異的ｓｈＲＮＡ配列（配列番号１～５）及びＡＮＣＨＯＲ生成物に使用される以前に評価されたｓｈＲＮＡ配列（配列番号６）を含むＣＡＲ１９構築物を形質導入されたＮＫＴのＣＡＲ１９及びＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃに細胞をゲートするドナーの細胞内フローサイトメトリーの代表的なドットプロットを提示する。ＣＡＲ及びＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃの発現を、形質導入の１２日後に評価する。結果を定量し、表４に提示する。ａｍｉＲ１５５に埋め込まれたＣＩＩＴＡ特異的ｓｈＲＮＡ（それぞれグラフ１～１０に対応する配列番号７～１６）を含む１０個のＣＡＲ１９構築物を形質導入されたＮＫＴのＣＡＲ１９及びＨＬＡ－ＤＲ、ＤＰ、ＤＱに細胞をゲートするドナーの代表的な細胞内フローサイトメトリーのドットプロットを提示する。ＣＡＲ及びＨＬＡ－ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの発現を、形質導入の１２日後に評価する。結果を定量し、表４に提示する。ａｍｉＲ１５５に埋め込まれたＣＩＩＴＡ特異的ｓｈＲＮＡ（それぞれグラフ１～１０に対応する配列番号７～１６）を含む１０個のＣＡＲ１９構築物を形質導入されたＮＫＴのＣＡＲ１９及びＨＬＡ－ＤＲ、ＤＰ、ＤＱに細胞をゲートするドナーの代表的な細胞内フローサイトメトリーのドットプロットを提示する。ＣＡＲ及びＨＬＡ－ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの発現を、形質導入の１２日後に評価する。結果を定量し、表４に提示する。ａｍｉＲ１５５に埋め込まれたＣＩＩＴＡ特異的ｓｈＲＮＡ（それぞれグラフ１～１０に対応する配列番号７～１６）を含む１０個のＣＡＲ１９構築物を形質導入されたＮＫＴのＣＡＲ１９及びＨＬＡ－ＤＲ、ＤＰ、ＤＱに細胞をゲートするドナーの代表的な細胞内フローサイトメトリーのドットプロットを提示する。ＣＡＲ及びＨＬＡ－ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの発現を、形質導入の１２日後に評価する。結果を定量し、表４に提示する。ａｍｉＲ１５５に埋め込まれたＣＤ７４特異的ｓｈＲＮＡ（それぞれグラフ１～１０に対応する配列番号１７～２６）を含む１０個のＣＡＲ１９構築物を形質導入されたＮＫＴのＣＡＲ１９及びＨＬＡ－ＤＲ、ＤＰ、ＤＱに細胞をゲートするドナーの代表的な細胞内フローサイトメトリーのドットプロットを提示する。ＣＡＲ及びＨＬＡ－ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの発現を、形質導入の１２日後に評価する。結果を定量し、表４に提示する。ａｍｉＲ１５５に埋め込まれたＣＤ７４特異的ｓｈＲＮＡ（それぞれグラフ１～１０に対応する配列番号１７～２６）を含む１０個のＣＡＲ１９構築物を形質導入されたＮＫＴのＣＡＲ１９及びＨＬＡ－ＤＲ、ＤＰ、ＤＱに細胞をゲートするドナーの代表的な細胞内フローサイトメトリーのドットプロットを提示する。ＣＡＲ及びＨＬＡ－ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの発現を、形質導入の１２日後に評価する。結果を定量し、表４に提示する。ａｍｉＲ１５５に埋め込まれたＣＤ７４特異的ｓｈＲＮＡ（それぞれグラフ１～１０に対応する配列番号１７～２６）を含む１０個のＣＡＲ１９構築物を形質導入されたＮＫＴのＣＡＲ１９及びＨＬＡ－ＤＲ、ＤＰ、ＤＱに細胞をゲートするドナーの代表的な細胞内フローサイトメトリーのドットプロットを提示する。ＣＡＲ及びＨＬＡ－ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの発現を、形質導入の１２日後に評価する。結果を定量し、表４に提示する。Ｂ２Ｍを標的とする単一のａｍｉＲ埋込ｓｈＲＮＡ（配列番号Ｘ又はＣＩＩＴＡ（配列番号１２）を含むＣＡＲ１９．１５構築物を形質導入されたＮＫＴのパーセントノックダウンの代表的なプロットを提示する。ノックダウン効率を、形質導入の４日後に評価した。Ｎ＝４のドナー。ＢｉｏＬｅｇｅｎｄＥＬＩＳＡＭＡＸ（商標）ＤｅｌｕｘｅＳｅｔＨｕｍａｎＩＬ－１５キット（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ＃４３５１０４）を使用して示される構築物を形質導入された代表的なドナーＮＫＴ細胞からのＩＬ－１５分泌、及びＣＡＲ１９の発現のグラフを示す。図１０のパネルＡは、ＣＡＲ１９．１５、ＣＡＲ１９．１５．ｕ６－ｂ２ｍ、ＣＡＲ１９．１５．ｍｉＲ１５５－ｂ２ｍ、又は非形質導入（ＮＴ）を形質導入され、かつ単独で培養されたか、又はＣＤ１９陽性Ｒａｊｉリンパ腫細胞と４８時間共培養されたＮＫＴ細胞を提示する。図１０のパネルＢは、Ｕ６プロモーターによって駆動されるか、又はｍｉＲ１５５足場に埋め込まれたＢ２Ｍ特異的ｓｈＲＮＡを含むＣＡＲ１９構築物を形質導入されたＮＫＴ細胞を提示する。ＣＡＲ発現を、形質導入の２日後に評価する。Ｎ＝１のドナー、３回の技術的反復。コドン最適化されたＩＬ１５配列、ＩＬ１５受容体α（ＩＬ１５Ｒａ）、及びＩＬ１５ＲａＳｕｓｈｉドメイン（ＩＬ１５Ｒａの細胞外Ｎ末端部分、ＩＬ１５の結合に不可欠）を組み込むことによって、ノックダウン構築物からＩＬ１５発現を促進するように設計された構築物の図を提示する。パネルＡ及びパネルＢは、示される構築物を形質導入されたか、又は形質導入されておらず、かつ単独で培養されたか、又はＣＤ１９陽性Ｒａｊｉリンパ腫細胞と７２時間共培養されたかのいずれかのＮＫＴのＩＬ－１５発現のグラフを提示する。培養上清は、ＩＬ１５分泌を検出するために、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄＥＬＩＳＡＭＡＸ（商標）ＤｅｌｕｘｅＳｅｔＨｕｍａｎＩＬ－１５キット（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ＃４３５１０４）を使用して処理する。Ａ）Ｎ＝１のドナー、３回の技術的反復。Ｂ）Ｎ＝３のドナー。ＣＡＲ１９．１５－１５Ｒａ－ａｍｉＲ－Ｂ２Ｍ構築物を形質導入されたＮＫＴのＣＡＲ１９及びＩＬ－１５に細胞をゲートするドナーの細胞内フローサイトメトリーの代表的なドットプロット（図１１）を提示し、ＩＬ１５発現を４日後に評価する。３人のドナーから示されるデータ。ＣＡＲ１９及びコドン最適化されたＩＬ１５発現の二重ノックダウン構築物が、それぞれ、ＨＬＡクラスＩ及びＩＩノックダウンを媒介するために、ａｍｉＲ３０－Ｂ２ＭｓｈＲＮＡ及びａｍｉＲ１５５－ＣＩＩＴＡｓｈＲＮＡと対合した図を示す。図１４に示されるＣＡＲ１９構築物を形質導入されたＮＫＴのＣＡＲ１９及びＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ又はＨＬＡ－ＤＲ、ＤＰ、ＤＱに細胞をゲートするドナーの細胞内フローサイトメトリーの代表的なドットプロット（Ａ）を提示する。３人のドナー（ＢＬ＃８１、８２、８３）のノックダウンパーセンテージ（Ｂ）のグラフを提示する。図１４に示されるＣＡＲ１９構築物を形質導入されたＮＫＴのＣＡＲ１９及びＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ又はＨＬＡ－ＤＲ、ＤＰ、ＤＱに細胞をゲートするドナーの細胞内フローサイトメトリーの、４人のドナーからの代表的なドットプロットを提示する。ＣＡＲ、ＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＨＬＡ－ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの発現を、拡張の１９日目に評価する。ラベルは、各集団についてのＭＦＩ、及び矢印で結ばれた細胞集団間のノックダウンパーセンテージを示す。図１４に示されるＣＡＲ１９構築物を形質導入されたＮＫＴのＣＡＲ１９及びＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ又はＨＬＡ－ＤＲ、ＤＰ、ＤＱに細胞をゲートするドナーの細胞内フローサイトメトリーの、４人のドナーからの代表的なドットプロットを提示する。ＣＡＲ、ＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＨＬＡ－ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの発現を、拡張の１９日目に評価する。ラベルは、各集団についてのＭＦＩ、及び矢印で結ばれた細胞集団間のノックダウンパーセンテージを示す。示される構築物を形質導入されたか、又は形質導入されておらず、かつ単独で培養されたか、又はＣＤ１９陽性Ｒａｊｉリンパ腫細胞と４８時間共培養された、ＮＫＴ細胞におけるＩＬ１５分泌の代表的なグラフを提示する。培養上清は、ＩＬ１５分泌を検出するために、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄＥＬＩＳＡＭＡＸ（商標）ＤｅｌｕｘｅＳｅｔＨｕｍａｎＩＬ－１５キット（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ＃４３５１０４）を使用して処理する。Ｎ＝３のドナー（ＢＬ＃８１、８２、８３）。ＣＡＲ１９及びＣＡＲ１９．ＩＬ１５ＮＫＴ細胞と比較した、ＣＤ１９陽性標的細胞に対するインビトロ細胞傷害性の代表的なグラフを提示する。示された構築物をＮＫＴ細胞に形質導入し、指定されたエフェクター対標的比で高レベルのホタルルシフェラーゼを発現するように操作されたＣＤ１９陽性Ｒａｊｉリンパ腫細胞とＮＫＴ細胞を６時間共培養する。生物発光の検出のためのアッセイの終了時に、ルシフェリンを添加した。インビボでＣＤ１９陽性腫瘍を制御し、かつＣＡＲ１９．１５ＮＫＴ細胞と比較してＮＳＧマウスの生存を促進するために、ＣＡＲ１９．ｏｐｔｉ－ＩＬ１５二重ノックダウン構築物を形質導入されたＮＫＴ細胞の結果を提示する。０日目に２×１０^５個のホタルルシフェラーゼ陽性のＤａｕｄｉリンパ腫細胞を静脈注射し、続いて３日目に示される構築物を形質導入されたか、又は構築物を形質導入されていない（非形質導入、ＮＴ）５×１０^６個のＮＫＴ細胞を静脈注射したＮＳＧマウスのイメージングを提示する。イメージングの直前に、各マウスは、腹腔内注射により３０ｍｇ／ｍＬで１００μＬのルシフェリンを受け取り、生物発光チャネル下でイメージングされる。（生物発光カウントスケール６００～３０，０００）。インビボでＣＤ１９陽性腫瘍を制御し、かつＣＡＲ１９．１５ＮＫＴ細胞と比較してＮＳＧマウスの生存を促進するために、ＣＡＲ１９．ｏｐｔｉ－ＩＬ１５二重ノックダウン構築物を形質導入されたＮＫＴ細胞の結果を提示する。図１９Ａに示されるマウスのカプラン－マイヤー生存曲線を示す。ＩＬ１５分泌を促進するための融合ＩＬ２シグナルペプチド（ＩＬ２ＳＰ）を含むＣＡＲ１９及びコドン最適化されたＩＬ１５の二重ノックダウン構築物の図を提示する。ＳＤ／ＳＡ＝スプライスドナー／スプライスアクセプター図２０の二重ノックダウン構築物を発現するＮＫＴ細胞によるＩＬ１５分泌の代表的なグラフを提示する。ＮＫＴ細胞は、示される構築物を形質導入されているか、又は形質導入されておらず、かつ単独で培養されるか、又はＣＤ１９陽性Ｒａｊｉリンパ腫細胞と４８時間共培養される。培養上清は、ＩＬ１５分泌を検出するために、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄＥＬＩＳＡＭＡＸ（商標）ＤｅｌｕｘｅＳｅｔＨｕｍａｎＩＬ－１５キット（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ＃４３５１０４）を使用して処理する。ＣＤ１９陽性腫瘍をインビボで制御し、かつＣＡＲ１９．１５ＮＫＴ細胞と比較してＮＳＧマウスの生存を促進するために、図２０の二重ａｍｉＲノックダウンを有するＩＬ２ＳＰ－ｏｐｔｉＩＬ１５ＣＡＲ１９構築物を形質導入されたＮＫＴ細胞の結果を提示する。ＮＳＧマウスに、０日目に２×１０^５個のホタルルシフェラーゼ陽性のＤａｕｄｉリンパ腫細胞を静脈注射し、続いて４日目に示される構築物を形質導入されたか、又は構築物を形質導入されていない（非形質導入、ＮＴ）１×１０^６個又は５×１０^６個のＮＫＴを静脈注射する。イメージングの直前に、各マウスは、腹腔内注射により３０ｍｇ／ｍＬで１００μＬのルシフェリンを受け取り、生物発光チャネル下でイメージングされる。生物発光カウントは、６００～３０，０００である。二重ノックダウン構築物を発現するＣＡＲＮＫＴ細胞で処置したＮＳＧマウスにおける腫瘍進行の結果、及びカプラン－マイヤー生存曲線をそれぞれ提示する。ＮＳＧマウスに、０日目に２×１０^５個のホタルルシフェラーゼ陽性のＤａｕｄｉリンパ腫細胞を静脈注射し、続いて３日目に示される構築物を形質導入されたか、又は構築物を形質導入されていない（非形質導入、ＮＴ）５×１０^６個のＮＫＴを静脈注射する。イメージングの直前に、各マウスは、腹腔内注射により３０ｍｇ／ｍＬで１００μＬのルシフェリンを受け取り、生物発光チャネル下でイメージングされる。生物発光カウントは、２０００～３０，０００である。Ｂ）Ａ）に示すマウスのカプラン－マイヤー生存曲線。腫瘍進行は遅延し、生存率は変化しない。１）Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡの代わりに２つのスクランブルｓｈＲＮＡ配列を含むＣＡＲ１９．１５（ＣＡＲ１９．ＩＬ２ＳＰ－ｏｐｔｉ１５．ａｍｉＲ－ＳＣＲ－ａｍｉＲ－ＳＣＲ、スクランブル）、２）ａｍｉＲ埋込Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡｓｈＲＮＡ配列を含むＣＡＲ１９．１５（ＣＡＲ１９．ＩＬ２ＳＰ－ｏｐｔｉ１５．ａｍｉＲ－Ｂ２Ｍ－ａｍｉＲ－ＣＩＩＴＡ、ノックダウン）、並びにＨＬＡＩ細胞上でゲートされた、フローサイトメトリーによって毎日ＣＡＲ及びＨＬＡ発現について評価されるＢ２Ｍ／ＣＩＩＴＡ二重ノックダウン構築物（ノックアウト）を発現するＮＫＴ細胞の代表的なグラフを提示する。受容体ＮＫ細胞（ＨＬＡ－Ａ２＋）を、ＮＫ細胞単離キット（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃｈ）を使用して単離し、ドナーＮＫＴ細胞（ＨＬＡ－Ａ２－）と１：１の比で３日間共培養する。Ｂ２Ｍ／ＣＩＩＴＡ二重ノックダウン構築物を発現するＮＫＴ細胞は、同種異系ＮＫ細胞の存在下で持続するが、二重ノックアウトは、ＮＫＴ細胞をＮＫ細胞死滅に対して脆弱なままとする。同上。図２４のスクランブル、ノックダウン、及びノックアウト構築物を２～３日ごとに形質導入されたＮＫＴ細胞のフローサイトメトリーの代表的なグラフを提示する。ナイーブ汎Ｔ細胞（ｐａｎＴｃｅｌｌ）単離キットを使用して、汎Ｔ細胞をレシピエントＰＢＭＣから単離し、ヒト（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃｈのレシピエントＴ細胞（ＨＬＡ－Ａ２＋）をドナーＮＫＴ細胞（ＨＬＡ－Ａ２－）と２：１（Ｔ：ＮＫＴ）の比で７日間共培養する。Ｂ２Ｍ／ＣＩＩＴＡ二重ノックダウン構築物を発現するＮＫＴ細胞は、スクランブルｓｈＲＮＡ対照構築物を担持するＮＫＴ細胞と比較して、同種異系Ｔ細胞による拒絶反応に抵抗する。同上。同種異系ＰＢＭＣとの共培養において２～３日ごとに評価した形質導入ＮＫＴ細胞のフローサイトメトリー結果の代表的なグラフを提示する。レシピエントＰＢＭＣ（ＨＬＡ－Ａ２＋）をドナーＮＫＴ細胞（ＨＬＡ－Ａ２－）と１０：１（ＰＢＭＣ：ＮＫＴ）の比で７日間共培養する。ＮＫＴ細胞に、１）スクランブルｓｈＲＮＡ対照を有するＣＡＲ１９．１５、又は２）二重ノックダウンを有するＣＡＲ１９．１５を形質導入する。同上。１）Ｂ２Ｍ対照（Ｓｃｒ）の代わりにスクランブルｓｈＲＮＡ配列を有するＣＡＲ１９．ＩＬ２ＳＰ－ｏｐｔｉ１５、２）二重ノックダウン（ＫＤ）を有するＣＡＲ１９．ＩＬ２ＳＰ－ｏｐｔｉ１５、３）二重ノックアウト（ＫＯ）を有するＣＡＲ１９．ＩＬ２ＳＰ－ｏｐｔｉ１５を形質導入され、かつＮＫ細胞単離キット（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃｈ）を使用して単離されたレシピエントＮＫ細胞（ＨＬＡ－Ａ２＋）と、２：１（ＮＫ：ＮＫＴ）の比で２日間共培養されたＮＫＴ細胞のフローサイトメトリーの代表的なグラフを提示する。図２７ＡのパネルＡは、共培養の０日目及び２日目のドナーＮＫＴ細胞の総頻度を示す代表的なフロープロットを提示する（図２７Ｂの上）。図２７ＡのパネルＢは、ドナーＮＫＴ細胞の絶対細胞カウントを提示する。全てのデータは平均値±標準偏差を示し、３つの独自のドナー－レシピエントペアを使用する。Ｐ値は、多重比較のためのＳｉｄａｋ補正を伴う双方向ＡＮＯＶＡを使用して決定し、有意ではない（Ｐ＞０．０５）値は示さない。Ｐ値は、両側対合スチューデントｔ検定を使用して決定する。１）Ｂ２Ｍ対照（Ｓｃｒ）の代わりにスクランブルｓｈＲＮＡ配列を有するＣＡＲ１９．ＩＬ２ＳＰ－ｏｐｔｉ１５、２）二重ノックダウン（ＫＤ）を有するＣＡＲ１９．ＩＬ２ＳＰ－ｏｐｔｉ１５、３）二重ノックアウト（ＫＯ）を有するＣＡＲ１９．ＩＬ２ＳＰ－ｏｐｔｉ１５を形質導入され、かつＮＫ細胞単離キット（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃｈ）を使用して単離されたレシピエントＮＫ細胞（ＨＬＡ－Ａ２＋）と、２：１（ＮＫ：ＮＫＴ）の比で２日間共培養されたＮＫＴ細胞のフローサイトメトリーの代表的なグラフを提示する。図２７ＢのパネルＣは、共培養の０日目及び２日目のレシピエントＮＫ細胞を提示する。全てのデータは平均値±標準偏差を示し、３つの独自のドナー－レシピエントペアを使用する。Ｐ値は、多重比較のためのＳｉｄａｋ補正を伴う双方向ＡＮＯＶＡを使用して決定し、有意ではない（Ｐ＞０．０５）値は示さない。Ｐ値は、両側対合スチューデントｔ検定を使用して決定する。別の態様において、形質導入ＮＫＴ細胞のフローサイトメトリーの代表的なグラフと、ドナーＮＫＴ細胞及びレシピエントＴ細胞の絶対細胞カウントを提示する。ナイーブ汎Ｔ細胞単離キット、ヒト（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃｈ）を使用して、汎Ｔ細胞をレシピエントＰＢＭＣ（ＨＬＡ－Ａ２＋）から単離する。次いで、精製したＴ細胞をＯＫＴ３／αＣＤ２８で２４時間刺激し、インビトロで５～１０日間増殖させ、２日間ドナーＮＫＴ細胞（ＨＬＡ－Ａ２－）と２：１（Ｔ：ＮＫＴ）の比で共培養する。ＮＫＴに、１）スクランブルｓｈＲＮＡ配列（Ｓｃｒ）を有するＣＡＲ１９．ＩＬ２ＳＰ－ｏｐｔｉ１５、２）二重ノックダウン（ＫＤ）を有するＣＡＲ１９．ＩＬ２ＳＰ－ｏｐｔｉ１５、３）二重ノックアウト（ＫＯ）を有するＣＡＲ１９．ＩＬ２ＳＰ－ｏｐｔｉ１５を形質導入する。図２８ＡのパネルＡは、共培養の０日目及び２日目のドナーＮＫＴ細胞の総頻度を示す代表的なフロープロットを提示する（図２８Ｂの上）。ドナーＮＫＴ細胞の絶対細胞カウントを図２８ＡのパネルＢに示す。全てのデータは平均値±標準偏差を示し、５つの独自のドナー－レシピエントペアを使用する。Ｐ値は、多重比較のためのＳｉｄａｋ補正を伴う双方向ＡＮＯＶＡを使用して決定し、有意ではない（Ｐ＞０．０５）値は示さない。別の態様において、形質導入ＮＫＴ細胞のフローサイトメトリーの代表的なグラフと、ドナーＮＫＴ細胞及びレシピエントＴ細胞の絶対細胞カウントを提示する。ナイーブ汎Ｔ細胞単離キット、ヒト（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃｈ）を使用して、汎Ｔ細胞をレシピエントＰＢＭＣ（ＨＬＡ－Ａ２＋）から単離する。次いで、精製したＴ細胞をＯＫＴ３／αＣＤ２８で２４時間刺激し、インビトロで５～１０日間増殖させ、２日間ドナーＮＫＴ細胞（ＨＬＡ－Ａ２－）と２：１（Ｔ：ＮＫＴ）の比で共培養する。ＮＫＴに、１）スクランブルｓｈＲＮＡ配列（Ｓｃｒ）を有するＣＡＲ１９．ＩＬ２ＳＰ－ｏｐｔｉ１５、２）二重ノックダウン（ＫＤ）を有するＣＡＲ１９．ＩＬ２ＳＰ－ｏｐｔｉ１５、３）二重ノックアウト（ＫＯ）を有するＣＡＲ１９．ＩＬ２ＳＰ－ｏｐｔｉ１５を形質導入する。図２８ＢのパネルＣは、共培養２日目のレシピエントＴ細胞の絶対細胞カウントを提示する。全てのデータは平均値±標準偏差を示し、５つの独自のドナー－レシピエントペアを使用する。Ｐ値は、多重比較のためのＳｉｄａｋ補正を伴う双方向ＡＮＯＶＡを使用して決定し、有意ではない（Ｐ＞０．０５）値は示さない。別の態様において、形質導入ＮＫＴ細胞のフローサイトメトリーの代表的なグラフと、ドナーＮＫＴ細胞及びレシピエントＴ細胞の絶対細胞カウントを提示する。レシピエントの全ＰＢＭＣ（ＨＬＡ－Ａ２＋）をドナーＮＫＴ（ＨＬＡ－Ａ２－）と１０：１（ＰＢＭＣ：ＮＫＴ）の比で９日間共培養する。ＮＫＴに、１）Ｂ２Ｍ対照（Ｓｃｒ）の代わりにスクランブルｓｈＲＮＡ配列を有するＣＡＲ１９．ＩＬ２ＳＰ－ｏｐｔｉ１５、２）二重ノックダウン（ＫＤ）を有するＣＡＲ１９．ＩＬ２ＳＰ－ｏｐｔｉ１５、３）二重ノックアウト（ＫＯ）を有するＣＡＲ１９．ＩＬ２ＳＰ－ｏｐｔｉ１５を形質導入する。図２９ＡのパネルＡは、共培養の０日目及び９日目のドナーＮＫＴ細胞の総頻度を示す代表的なフロープロットを提示する（図２９Ｂの上）。図２９ＡのパネルＢは、ドナーＮＫＴ細胞の絶対細胞カウントを示す。全てのデータは平均値±標準偏差を示し、３つの独自のドナー－レシピエントペアを使用する。Ｐ値は、多重比較のためのＳｉｄａｋ補正を伴う双方向ＡＮＯＶＡを使用して決定し、有意ではない（Ｐ＞０．０５）値は示さない。Ｐ値は、両側対合スチューデントｔ検定を使用して決定する。別の態様において、形質導入ＮＫＴ細胞のフローサイトメトリーの代表的なグラフと、ドナーＮＫＴ細胞及びレシピエントＴ細胞の絶対細胞カウントを提示する。レシピエントの全ＰＢＭＣ（ＨＬＡ－Ａ２＋）をドナーＮＫＴ（ＨＬＡ－Ａ２－）と１０：１（ＰＢＭＣ：ＮＫＴ）の比で９日間共培養する。ＮＫＴに、１）Ｂ２Ｍ対照（Ｓｃｒ）の代わりにスクランブルｓｈＲＮＡ配列を有するＣＡＲ１９．ＩＬ２ＳＰ－ｏｐｔｉ１５、２）二重ノックダウン（ＫＤ）を有するＣＡＲ１９．ＩＬ２ＳＰ－ｏｐｔｉ１５、３）二重ノックアウト（ＫＯ）を有するＣＡＲ１９．ＩＬ２ＳＰ－ｏｐｔｉ１５を形質導入する。図２９ＢのパネルＣは、共培養の０、３、６、及び９日目のレシピエントＴ細胞の絶対細胞カウントを示す。全てのデータは平均値±標準偏差を示し、３つの独自のドナー－レシピエントペアを使用する。Ｐ値は、多重比較のためのＳｉｄａｋ補正を伴う双方向ＡＮＯＶＡを使用して決定し、有意ではない（Ｐ＞０．０５）値は示さない。Ｐ値は、両側対合スチューデントｔ検定を使用して決定する。Ｂ２Ｍ／ＣＩＩＴＡ二重ノックダウン構築物を発現するＮＫＴ細胞のインビボでのインビボＴ細胞媒介性拒絶反応モデルにおけるインビボ持続性の代表的な結果を提示する。パネルＡは、実験手順を提示する。ＮＳＧマウスは、－１日目に１．２Ｇｙで照射され、翌日にＨＬＡ－Ａ２^－レシピエントから７×１０^６個のインビトロ拡張ヒトＴ細胞（初回ＯＫＴ３／αＣＤ２８刺激後５～１０日目）を受け取る。４日後、マウスは、２×１０^６個の対照構築物（ＣＡＲ１９．ＩＬ２ＳＰ－ｏｐｔｉ１５．ａｍｉＲ－ＳＣＲ－ａｍｉＲ－ＳＣＲ）又はノックダウン構築物（ＣＡＲ１９．ＩＬ２ＳＰ－ｏｐｔｉ１５．ａｍｉＲ－ｂ２ｍ－ａｍｉＲ－ｃｉｉｔａ）を形質導入されたＮＫＴ細胞をＨＬＡ－Ａ２^＋ドナーから静脈内に受け取る。ＲＴＣ＝レシピエントＴ細胞。パネルＢは、６日目及び２８日目の末梢血中のドナーＨＬＡ－Ａ２＋Ｓｃｒ対照又は二重ＫＤＮＫＴ細胞の頻度を示す代表的なフロープロットを提示する。パネルＣは、指定された時点でのドナーＨＬ－Ａ２＋ＮＫＴ細胞及びレシピエントＨＬＡ－Ａ２－Ｔ細胞（パネルＤ）の頻度を提示する。データは、群当たり７～８匹のマウスの平均±ＳＤを示す。同上。スクランブル対照ＮＫＴと比較して、同種異系ＰＢＭＣの存在下でＢ２Ｍ／ＣＩＩＴＡ二重ノックダウン構築物を発現するＮＫＴ細胞のインビボでのＰＢＭＣ細胞媒介性拒絶反応モデルにおけるインビボ持続性の代表的な結果を提示する。パネルＡは、実験手順を提示する。ＮＳＧ（ＭＨＣ^ＫＯ）マウスには、－１日目に１．２Ｇｙで再照射し、次いで、０日目にＨＬＡ－Ａ２^－レシピエントから静脈内に５×１０^６個の新たに単離されたＰＢＭＣを受け取る。４日後、ＨＬＡ－Ａ２^＋ドナーからの５×１０^６個のスクランブル対照又は二重ノックダウン形質導入ＮＫＴを静脈内投与する。パネルＢは、６日目及び２０日目の末梢血中のドナーＨＬＡ－Ａ２＋Ｓｃｒ対照又は二重ＫＤＮＫＴ細胞の頻度を示す代表的なフロープロットを提示する。パネルＣは、ドナーＨＬ－Ａ２＋ＮＫＴ細胞頻度を提示し、パネルＤは、指定された時点でのレシピエントＨＬＡ－Ａ２－Ｔ細胞の頻度を提示する。データは、群当たり７～８匹のマウスの平均±ＳＤを示す。同上。Ｂ２Ｍ／ＣＩＩＴＡ二重ノックダウン構築物を発現するＮＫＴ細胞のＢ細胞リンパ腫異種移植片を含むインビボＴ細胞媒介性拒絶反応モデルにおける、同種異系Ｔ細胞の存在下でのインビボでの抗腫瘍活性の代表的な結果を、スクランブル対照ＮＫＴ細胞と比較して提示する。パネルＡは、実験手順を提示する。ＮＳＧマウスは、１．２Ｇｙで照射し、翌日にＨＬＡ－Ａ２レシピエントから静脈内に７×１０^６個のインビトロ拡張ヒトＴ細胞（初回ＯＫＴ３／αＣＤ２８刺激後８～１０日目）を受け取る。１日後、２×１０^５個のホタルルシフェラーゼ陽性のＤａｕｄｉ細胞を静脈注射し、次いで、３日後に、５×１０^６個のスクランブル対照又はノックダウン形質導入ＮＫＴ細胞をＨＬＡ－Ａ２＋ドナーから生成する。ＲＴＣ＝レシピエントＴ細胞。パネルＢは、６日目及び２８日目の末梢血中のドナーＨＬＡ－Ａ２＋スクランブル対照又は二重ＫＤＮＫＴ細胞の頻度を示す代表的なフロープロットを提示する。腫瘍注射後の末梢血中のＨＬＡ－Ａ２＋ドナーＣＡＲＮＫＴ細胞（パネルＣ）及びＨＬＡ－Ａ２－ＲＴＣ（パネルＤ）の頻度。Ｐ値は、両側ログランク検定を使用して決定される。同上。Ｂ２Ｍ／ＣＩＩＴＡ二重ノックダウン構築物を発現するＮＫＴ細胞のＢ細胞リンパ腫異種移植片を含むインビボＴ細胞媒介性拒絶反応モデルにおける、同種異系Ｔ細胞の存在下でのインビボでの抗腫瘍活性の代表的な結果を、スクランブル対照ＮＫＴ細胞と比較して提示する。パネルＥは、指定された時点でＩＶＩＳイメージングを使用して測定されたリンパ腫の進行を提示する。パネルＦは、各実験群におけるマウスの生存を示すカプラン－マイヤー曲線を提示する。Ｐ値は、両側ログランク検定を使用して決定される。ＣＡＲ．ＧＰＣ３．ｏｐｔｉ－ＩＬ１５二重ノックダウン構築物の例を提示する。構築物は、ＧＣ３３由来のＧＰＣ３特異的ｓｃＦｖ又はヒト化ＹＰ７由来のｓｃＦｖのいずれかをコードする配列を含む。ヒト化ＧＰＣ３ｓｃＦｖ（ＹＰ７）又はマウスＧＰＣ３ｓｃＦｖ（ＧＣ３３）のいずれかを発現するＣＡＲ－ＧＰＣ３ＮＫＴ細胞において、ＨＬＡクラスＩ又はクラスＩＩ遺伝子ノックダウンのレベルが観察されることを提示する。ヒト化ＧＰＣ３ｓｃＦｖ（ＹＰ７）を発現するＮＫＴ細胞及びマウスＧＰＣ３ｓｃＦｖを発現するＮＫＴ細胞におけるＩＬ１５の発現レベルを提示する。ｘＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅアッセイによって測定した、ヒト化ＧＰＣ３ｓｃＦｖ（ＹＰ７）を発現する細胞及びマウスＧＰＣ３ｓｃＦｖを発現するＮＫＴ細胞における細胞傷害性レベルを提示する。ＨＣＣ異種移植片モデルにおけるＣＡＲ．ＧＰＣ３ＮＫＴ細胞の実験設計及び予想される抗腫瘍活性を提示する。Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡを標的とするａｍｉＲ構築物を発現するＣＡＲ．ＧＰＣ３ＮＫＴ細胞及びＩＬ１５構築物を含むＣＡＲ．ＧＰＣ３ＮＫＴ細胞におけるＢ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、又は天然ＩＬ－１５の発現レベルを提示する。ＣＡＲ．ＧＰＣ３の上流又は下流のＩＬ－１５コード配列を有する構築物を発現するＮＫＴ細胞におけるＩＬ－１５発現レベルの比較を提示する。１５Ｇ２８ＢＢｚ発現ＮＫＴ細胞と比較して、Ｇ．２８ＢＢｚ．１５．ｍｉＲ発現ＮＫＴ細胞において下方調節されるＨＬＡ特異的遺伝子を示すヒートマップを提示する。調整されたＰ値は０．０５未満であり、倍率変化は２を超える。１５Ｇ２８ＢＢｚ発現ＮＫＴ細胞と比較して、ＹＰ７．２８ＢＢｚ．１５．ｍｉＲ発現ＮＫＴ細胞において下方調節されるＨＬＡ特異的及び免疫エフェクター遺伝子を示すヒートマップを提示する。調整されたＰ値は０．０５未満であり、倍率変化は２を超える。同上。同上。同上。同上。同上。同上。同上。マウスＧ．２８ＢＢｚ．１５．ｍｉＲ発現ＮＫＴ細胞と比較して、ヒト化ＹＰ７．２８ＢＢｚ．１５．ｍｉＲ発現ＮＫＴ細胞において重要な経路が濃縮されていないことを示すヒートマップを提示する。調整されたＰ値は０．０５未満であり、倍率変化は２を超える。

対応する参照符号は、いくつかの図全体にわたって対応する部分を示す。本明細書に示される実施例は、本開示の［１つ又はいくつかの］実施形態を例示するが、いかなる様式でも本開示の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。

本出願は、遺伝子改変ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）に関する方法及び組成物を対象とする。ＮＫＴ細胞は、Ｔ細胞及びＮＫ細胞の両方のいくつかの特徴を共有するが、従来のＴ細胞及びＮＫ細胞のいずれとも異なる別個の細胞型である。ＮＫＴ細胞は、従来のＴ細胞及びＮＫ細胞とは相違した発達を有し、独自の転写調節因子セットによって駆動される異なる機能を有する。ＫｒｏｎｅｎｂｅｒｇＭ，ＧａｐｉｎＬ．ＴｈｅｕｎｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌｌｉｆｅｓｔｙｌｅｏｆＮＫＴｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００２；２（８）：５５７－５６８；Ｇｏｄｆｒｅｙ，ＪＣＩ，２００４，ＣｏｈｅｎＮＲ，ｅｔａｌ．ＳｈａｒｅｄａｎｄｄｉｓｔｉｎｃｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｐｒｏｇｒａｍｓｕｎｄｅｒｌｉｅｔｈｅｈｙｂｒｉｄｎａｔｕｒｅｏｆｉＮＫＴｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｄｍｍｕｎｏｌ．２０１３；１４（ｌ）：９０－９９）を参照されたい。Ｇｏｄｆｒｅｙｅｔａｌ．は、ＮＫＴ細胞系統に関連する独自のプログラミングを反映して、転写因子、シグナル伝達因子、細胞表面分子、サイトカイン、及び選択的にＮＫＴ細胞発達に影響を与える他の因子を同定している。（Ｇｏｄｆｒｅｙｅｔａｌ．，“ＲａｉｓｉｎｇｔｈｅＮＫＴｃｅｌｌｆａｍｉｌｙ，”Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１（３）：１９７－２０６（２０１０）（“Ｇｏｄｆｒｅｙｅｔａｌ．”）は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＥｎｇｅｌａｎｄＫｒｏｎｅｎｂｅｒｇ，“ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｃｏｎｔｒｏｌｏｆｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆＶα４ｉＮＫＴｃｅｌｌｓ，”ＣｕｒｒｅｎｔＴｏｐｉｃｓｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ３８１，２０１４も参照されたい）。胸腺におけるＮＫＴ細胞分化に影響を及ぼす多くの転写因子及びシグナル伝達分子は、そこで発達する他の従来のＴ細胞集団には影響を及ぼさない。本開示を通して使用される場合、「Ｔ細胞」という用語は、ＮＫＴ細胞と区別可能な従来のＴ細胞に限定される。これらの違いにより、非ＮＫＴ細胞を予測不可能にする遺伝子発現の操作された利得及び損失等の刺激及び遺伝子変化に対する応答が異なる。

ＮＫＴ細胞は、全ゲノム転写解析に基づいて区別可能であり、従来の細胞系統及びＮＫ細胞系統から等しく離れている。Ｃｏｈｅｎｅｔａｌ．（前掲）を参照されたい。Ｔリンパ球としても知られる従来のＴ細胞は、病原体と戦い、かつ免疫応答を調節する機能を有する重要な細胞型である。これらの細胞の２つのホールマークは、細胞分化中に再配列して多種多様な受容体を形成するＤＮＡのセグメントによってコードされる抗原受容体の発現である。いくつかの細胞は、例えば、この一般的なＴ細胞の定義に該当する：サブタイプＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ３、ＴＨ１７、ＴＦＨを含むＴヘルパー細胞（ＣＤ４＋細胞）、細胞傷害性Ｔ細胞（主にＣＤ８＋細胞、ＣＴＬとも呼ばれる）、メモリーＴ細胞（セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、及びレジデントメモリーＴ細胞を含む）、調節Ｔ細胞、及び粘膜関連不変Ｔ細胞。Ｔ細胞の細胞表面マーカーとしては、Ｔ細胞受容体及びＣＤ３が挙げられる。一般に、Ｔ細胞はＣＤ５６を発現しない（すなわち、ＣＤ５６陰性である）。

ＮＫ細胞及びＮＫＴ細胞は、ＣＤ５６＋である。ヒトでは、ＮＫ細胞は、通常、細胞表面マーカーＣＤ５６、ＣＤ１６１、ＣＤ１１ｂ、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ４４、ＣＤ１５８、及びＩＬ－１２Ｒを発現する。ＮＫ細胞は、完全に異なる構造を有する受容体の限られたレパートリーを発現し、そのうちのいくつかはＮＫＴ細胞上にも見出される。ほとんどのＮＫ受容体は、ヒトとげっ歯類を比較すると、高度に保存されていない。ＮＫ細胞は、活性化又は阻害され得るキラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）のファミリーのメンバー、並びにＮＫＧ２Ｄ及びＣＤ９４ＮＫＧ２Ａ／Ｃ等のタンパク質のレクチン（炭水化物結合）ファミリーのメンバーである受容体を発現する。ＫＩＲは、ＮＫＴ細胞上では発現されない。ＮＫ細胞は、ヒトのＫＩＲ又はマウスのＬｙ４９、天然の細胞傷害性受容体（ＮＣＲ）、ＮＫＧ２Ｄ及びＣＤ９４：ＮＫＧ２ヘテロ二量体等の多数の細胞表面受容体によって活性化される。加えて、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２及びＣＣＬＳ等のサイトカイン及びケモカインは、ＮＫ細胞活性化において重要な役割を果たす。

ＮＫＴ細胞は、概して、ＣＤ３＋ＣＤ５６＋細胞として識別され、Ｔ細胞受容体を発現することができる。ＮＫＴ細胞は、Ｔ細胞受容体及びＴ細胞のようなＣＤ３鎖を発現するが、ＮＫ細胞のようなＣＤ５６及びＣＤ１６１のようなマーカーも有する。とは言え、ＮＫＴ細胞が異なる細胞系統であることは、専門家によって一般的に受け入れられている。すなわち、ＮＫＴ細胞は他のＴ細胞とは非常に異なり、それらの挙動及び特性は、他のＴ細胞の分析から予測することができず、それらはＮＫ細胞でもない。ＮＫＴ細胞は、従来のＴ細胞及びＮＫ細胞とは完全に異なる細胞である。ＮＫＴ細胞系統の独自の特性のため、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、及びＢ細胞等のリンパ球の他の集団で行われた観察は、ＮＫＴ細胞活性化の機能的結果を予測しない場合がある。

ＮＫＴ細胞は、細胞表面マーカーの発現に基づいて、ＣＤ４Ｔ細胞、ＣＤ８Ｔ細胞、調節Ｔ細胞、γδＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単球及び樹状細胞を含む他の細胞型から同定することができる。Ｐａｒｋｅｔａｌ．，“ＯＭＩＰ－０６９：Ｆｏｒｔｙ－ＣｏｌｏｒＦｕｌｌＳｐｅｃｔｒｕｍＦｌｏｗＣｙｔｏｍｅｔｒｙＰａｎｅｌｆｏｒＤｅｅｐＩｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇｏｆＭａｊｏｒＣｅｌｌＳｕｂｓｅｔｓｉｎＨｕｍａｎＰｅｒｉｐｈｅｒａｌＢｌｏｏｄ，”ＣｙｔｏｍｅｔｒｙＰａｒｔＡ９７Ａ：１０４４－１０５１（２０２０）、Ｈｅｒｔｏｇｈｓｅｔａｌ．，ＯＭＩＰ－０６４：Ａ２７－ＣｏｌｏｒＦｌｏｗＣｙｔｏｍｅｔｒｙＰａｎｅｌｔｏＤｅｔｅｃｔａｎｄＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅＨｕｍａｎＮＫＣｅｌｌｓａｎｄＯｔｈｅｒＩｎｎａｔｅＬｙｍｐｈｏｉｄＣｅｌｌＳｕｂｓｅｔｓ，ＭＡＩＴＣｅｌｌｓ，ａｎｄ γδ ＴＣｅｌｌｓ，ＣｙｔｏｍｅｔｒｙＰａｒｔＡ９７Ａ：１０１９－１０２３（２０２０）、Ｓａｈｉｒｅｔａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆａ４３ｃｏｌｏｒｐａｎｅｌｆｏｒｔｈｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌａｎｄｕｎｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌＴ－ｃｅｌｌｓｕｂｓｅｔｓ，Ｂｃｅｌｌｓ，ＮＫｃｅｌｌｓ，ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ，ｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌｓ，ａｎｄｉｎｎａｔｅｌｙｍｐｈｏｉｄｃｅｌｌｓｕｓｉｎｇｓｐｅｃｔｒａｌｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ２０２０：１－７を参照されたい。

ＮＫＴ細胞は、Ｉ型及びＩＩ型の２つの主な種類に分かれている。Ｉ型ＮＫＴ細胞又は不変ＮＫＴ細胞（「ｉＮＫＴ」）として知られるＮＫＴ細胞の最も顕著な形態は、不変Ｔ細胞受容体α鎖（Ｖα４ｉマウス又はＶα２４ｉヒト）を有する。Ｉ型ＮＫＴ（ｉＮＫＴ）細胞は、αＧａｌＣｅｒ類似体を充填したＣＤ１ｄベースの四量体の結合によって容易に検出することができる。抗原受容体の形態は、比較的少数のベータ鎖のうちの１つと対合した不変のアルファ鎖による限定的なレパートリーである。阻害又は治療的使用。この不変受容体によって認識される抗原は、例えば、細菌細胞内に見出される糖脂質である。不変受容体は、海洋スポンジに由来する糖脂質であるアルファ－ガラトシルセラミド（ａ－ＧａｌＣｅｒ）を認識する。この化合物は、微生物糖脂質に類似しており、現在、一般に、スポンジに関連する微生物共生体に由来すると想定されている。ＮＫＴ細胞は、分子ＣＤ１ｄに提示される抗原を必要とする。

ＩＩ型ＮＫＴ細胞もまた、ＣＤ１ｄからの抗原提示を必要とするが、より多様であるが依然として限定されたＴＣＲレパートリーを有する。ＩＩ型ＮＫＴ細胞は、低レベルの転写因子ＰＬＺＦを発現する。Ｉ型ＮＫＴ細胞は、α－ＧａｌＣｅｒのみを認識するが、ＩＩ型ＮＫＴ細胞は、スルファチド、リソ－スルファチド、リソ－ＰＣ及びリソ－ＧＬ１を認識する。ＩＩ型ＮＫＴ細胞は、ヒトにおいてより一般的であるが、マウスにおいてそれほど一般的ではない。ＤｈｏｄｐｋａｒａｎｄＫｕｍａｒ，“ＴｙｐｅＩＩＮＫＴＣｅｌｌｓａｎｄＴｈｅｉｒＥｍｅｒｇｉｎｇＲｏｌｅｉｎＨｅａｌｔｈａｎｄＤｉｓｅａｓｅ，”ＪＩｍｍｕｎｏｌ．１９８（３）：１０１５－１０２１（２０１７）を参照されたい。

２つの経路は、ＮＫＴ細胞活性化について知られている。ＮＫＴ細胞は、ＣＤ１ｄ分子上に提示される抗原を介して、Ｔ細胞受容体を介して刺激に応答する。これは、ＴＣＲシグナルを生成するためのＣＤ４又はＣＤ８共受容体の関与に依存せず、これらの細胞の応答は、共刺激シグナルへの依存性がいくらか低くなる。更に、ＮＫＴ細胞の活性化のメカニズムは、ＩＬ－１２及びＩＬ－１８等の先天性炎症刺激を介して、Ｔ細胞受容体と会合する抗原の不在下に存在する。一度活性化されたＴ細胞が、末梢血中に見出される。同様に、ＮＫ細胞も、末梢血中に見出される。対照的に、ＮＫＴ細胞の大部分は組織中に見出され、例えば、ＣＣＲ２及びＣＣＲ６を含む２段階プロセスを介して媒介されるように、末梢血から腫瘍部位に遊走する。この遊走に関与するメカニズムは、ＮＫＴ細胞に特異的であり、他のリンパ球に適用される一般的なメカニズムではない。

ｉＮＫＴ細胞は、他のＴ細胞型と容易に区別可能である。表１を参照されたい。拡張されたＴ細胞（ＣＤ４Ｔ細胞のサブセット）のごく一部のみが、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を介してのいずれかの活性化時に腫瘍保護性Ｔｈ２サイトカイン（ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－１３、ＩＬ－１０）を産生することができる。Ｔ細胞の大部分（全てのＣＤ８＋Ｔ細胞を含む）及び全てのＮＫ細胞は、抗腫瘍Ｔｈ１サイトカイン（すなわち、ＩＦＮ－ガンマ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＴＮＦ－アルファ）のみを産生する。対照的に、ＮＫＴ細胞は、Ｔｈ１とＴｈ２サイトカインを同時に産生する」。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）活性化後に産生されるＴｈ１及びＴｈ２サイトカインのバランスに応じて、ＮＫＴ細胞は、免疫応答を活性化又は抑制することができる。したがって、ＮＫＴ細胞は、免疫活性化及び免疫抑制の興味深い逆説的な二重機能を有する。対照的に、他の免疫細胞は、通常、１つの一次機能、例えば、病原体と戦う機能を有し、一方、細胞の他のサブセットは、免疫応答の調節に専念する。

ＮＫＴ細胞も胸腺で発達するが、Ｉ型ＮＫＴ細胞の陽性選択はＣＤ１ｄ陽性胸腺細胞によって媒介される。ＮＫＴ細胞はまた、樹状細胞による陰性選択にもさらされる。胸腺におけるＴ細胞及びＮＫＴ細胞の発達及び成熟をまとめた、図２のＧｏｄｆｒｅｙｅｔａｌ．を参照されたい。

別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。以下の参考文献は、本発明で使用される用語の多くの一般的な定義を当業者に提供する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎｅｔａｌ．，ＤｉｃｔｉｏｎａｒｙｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（２ｎｄｅｄ．１９９４）、ＴｈｅＣａｍｂｒｉｄｇｅＤｉｃｔｉｏｎａｒｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗａｌｋｅｒｅｄ．，１９８８）、ＴｈｅＧｌｏｓｓａｒｙｏｆＧｅｎｅｔｉｃｓ，５ｔｈＥｄ．，Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒｅｔａｌ．（編集），ＳｐｒｉｎｇｅｒＶｅｒｌａｇ（１９９１）、及びＨａｌｅ＆Ｍａｒｈａｍ，ＴｈｅＨａｒｐｅｒＣｏｌｌｉｎｓＤｉｃｔｉｏｎａｒｙｏｆＢｉｏｌｏｇｙ（１９９１）。本明細書で使用される場合、以下の用語は、特に明記しない限り、以下にそれらに帰属する意味を有する。

本明細書で使用される場合、「約」という用語は、＋／－１０％を指す。

「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、及びそれらの同根語は、「含むが、これらに限定されない」を意味する。

「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｏｆ）」という用語は、「を含み、これに限定する」ことを意味する。

「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙｏｆ）」という用語は、組成物、方法、又は構造が、追加の成分、工程、及び／又は部品が、特許請求される組成物、方法、又は構造の基本的かつ新規な特徴を実質的に変化させない場合にのみ、追加の成分、工程、及び／又は部品を含み得ることを意味する。

本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈から別途明確に示されない限り、複数の参照を含む。例えば、「１つの細胞」又は「少なくとも１つの細胞」という用語は、それらの混合物を含む、複数の細胞を含み得る。

「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、米国特許法においてそれらに起因する広範な意味を有することが意図され、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味し得る。

「増加」は、少なくとも５％正に変化することを意味する。変化は、５％、１０％、２５％、３０％、５０％、７５％、又は１００％であってもよい。

「減少する」又は「減少する」は、少なくとも５％負に変化することを意味する。変化は、５％、１０％、２５％、３０％、５０％、７５％、又は１００％であってもよい。

「変調する」は、正又は負の変化を意味する。例示的な変調には、１％、２％、５％、１０％、２５％、５０％、７５％、又は１００％の変化が含まれる。

本出願を通じて、本開示の様々な実施形態は、範囲フォーマットで提示され得る。範囲形式での説明は、単に便宜及び簡潔のためであり、本開示の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈されるべきでないことを理解されたい。したがって、範囲の記載は、全ての可能な部分範囲並びにその範囲内の個々の値を具体的に開示しているとみなされるべきである。例えば、１～６などの範囲の記載は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６などの部分範囲、並びにその範囲内の個々の数字、例えば、１、２、３、４、５、及び６などを具体的に開示しているとみなされるべきである。これは、範囲の幅に関係なく適用される。

本明細書で数値範囲が示される場合は常に、表示範囲内の任意の引用数字（分数又は整数）を含むことを意味している。第１の表示数及び第２の表示数の「間の範囲にある／範囲」及び第１の表示数「～」第２の表示数の「範囲にある／範囲」という語句は、本明細書では互換的に使用され、第１及び第２の表示数並びにそれらの間の全ての分数及び整数の数字を含むことを意味する。

本明細書で使用される場合、「遺伝子操作されたナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞」又は「操作されたＮＫＴ細胞」は、非天然プロモーターの下流に外因性タンパク質又は内因性タンパク質をコードする少なくとも１つの組換え核酸を含むＮＫＴ細胞である。態様において、遺伝子操作されたＮＫＴ細胞は、キメラ抗原受容体をコードする組換え核酸を含む。

「内因性」とは、細胞又は組織において通常発現される核酸分子又はポリペプチドを意味する。

「外因性」とは、細胞内に内因的に存在しないか、又は過剰発現したときに得られる機能的効果を達成するのに十分なレベルでは存在しない核酸分子又はポリペプチドを意味する。したがって、「外因性」という用語は、外来性、異種性、並びに過剰発現核酸分子及びポリペプチド等の細胞内で発現される任意の組換え核酸分子又はポリペプチドを包含するであろう。

本明細書で使用される場合、「人工マイクロＲＮＡ（ａｍｉＲＮＡ）」という用語は、天然に存在するｍｉＲＮＡと同様に遺伝子サイレンシングを促進するために開発された分子である。ａｍｉＲＮＡは、一般に、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡステムループ内の成熟ｍｉＲＮＡ配列を、目的の遺伝子を標的とする配列に置き換えることによって構築される。これらの分子は、これらの選択肢と同じ効率を示し、細胞傷害性が低いため、ｓｈＲＮＡ及びｓｉＲＮＡに基づくサイレンシングアプローチに代わる優れた選択肢を提供する。本明細書で使用される場合、人工マイクロＲＮＡ足場」に「埋め込まれた」という用語は、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡステムループ内の成熟ｍｉＲＮＡ配列を、目的の遺伝子を標的とする配列に置き換えるプロセスを指す。いくつかの態様において、本開示で使用されるａｍｉＲは、ａｍｉＲ１５５である。Ｌａｇｏｓ－Ｑｕｉｎｔａｎａｅｔａｌ．，“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｉｓｓｕｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃｍｉｃｒｏＲＮＡｓｆｒｏｍｍｏｕｓｅ．”ＣｕｒｒＢｉｏｌ．２００２Ａｐｒ３０；１２（９）：７３５－９。別の態様において、本開示で使用されるａｍｉＲは、ａｍｉＲ３０である。Ｆｅｌｌｍａｎｎｅｔａｌ．，“ＡｎｏｐｔｉｍｉｚｅｄｍｉｃｒｏＲＮＡｂａｃｋｂｏｎｅｆｏｒｅｆｆｅｃｔｉｖｅｓｉｎｇｌｅ－ｃｏｐｙＲＮＡｉ．”ＣｅｌｌＲｅｐ．２０１３Ｄｅｃ２６；５（６）：１７０４－１３。更なる態様において、本開示で使用されるａｍｉＲは、当該技術分野で既知の人工マイクロＲＮＡ足場である。

「短ヘアピンＲＮＡ」、「小ヘアピンＲＮＡ」、又は「ｓｈＲＮＡ」は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を介して標的遺伝子発現をサイレンシングするために使用することができるタイトなヘアピンターンを有する人工ＲＮＡ分子である。それらは、典型的には、１９～２９塩基対（ｂｐ）のステム、少なくとも４個のヌクレオチド（ｎｔ）のループ、及び３’末端のジヌクレオチドオーバーハングからなる。いくつかの態様において、本開示における「ｓｈＲＮＡ」という用語は、小ヘアピンＲＮＡの「ステム」部分のセンス鎖又はアンチセンス鎖を指し得る。他の態様において、「ｓｈＲＮＡ」という用語は、センス鎖、アンチセンス鎖、及びその間のループを含み得る。

本明細書で使用される場合、目的の遺伝子を「標的にする」小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は、目的の遺伝子と本質的に同一であるか、又は本質的に相補的である少なくとも１９個の連続したヌクレオチドの配列を含むｓｈＲＮＡを指す。本開示で機能するｓｈＲＮＡの態様は、１００％である必要はないが、遺伝子サイレンシング機構による切断を可能にするために細胞内の生理学的条件下で、標的遺伝子から転写されたＲＮＡにハイブリダイゼーションして二本鎖を形成することを可能にするのに少なくとも十分である配列相補性を有する。したがって、態様において、セグメントは、標的遺伝子又は標的遺伝子から転写されたメッセンジャーＲＮＡのいずれかにおける１９個以上の連続したヌクレオチドの配列と本質的に同一であるか、又は本質的に相補的であるように設計される。「本質的に同一」とは、標的遺伝子又は標的遺伝子から転写されたＲＮＡのいずれかにおける１９個以上の連続したヌクレオチドの配列と比較して、１００％の配列同一性、又は少なくとも約８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％の配列同一性を有することを意味し、「本質的に相補的」とは、標的遺伝子又は標的遺伝子から転写されたＲＮＡのいずれかにおける１９個以上の連続したヌクレオチドの配列と比較して、１００％の配列相補性、又は少なくとも約８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％の配列相補性を有することを意味する。本開示のいくつかの態様において、ｓｈＲＮＡは、所与の標的遺伝子の１つの対立遺伝子に対して１００％の配列同一性又は相補性を有する配列を含むように設計され、他の態様において、ｓｈＲＮＡは、所与の標的遺伝子の複数の対立遺伝子に対して１００％の配列同一性又は相補性を有する配列を含むように設計される。

配列同一性は、典型的には、当該技術分野で広く利用可能な配列分析ソフトウェアを使用して測定される。そのようなソフトウェアは、様々な置換、欠失、及び／又は他の修飾に対して相同性の程度を割り当てることによって、同一又は類似の配列を一致させる。保存的置換としては、典型的には、以下の群内の置換が含まれる：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リジン、アルギニン；及びフェニルアラニン、チロシン。同一性の程度を決定するための例示的なアプローチでは、ＢＬＡＳＴプログラムが使用されてもよく、ｅ－３～ｅ－１００の確率スコアは、密接に関連する配列を示している。

主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ及びクラスＩＩタンパク質は、免疫系の適応性分岐において重要な役割を果たす。タンパク質の両方のクラスは、Ｔ細胞による認識のために細胞表面上にペプチドを提示するタスクを共有する。免疫原性ペプチド－ＭＨＣクラスＩ（ｐＭＨＣＩ）複合体は、有核細胞上に提示され、細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞によって認識される。一方、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞（ＤＣ）、マクロファージ、又はＢ細胞）によるｐＭＨＣＩＩの提示は、ＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化し、エフェクター細胞の協調及び調節につながることができる。全ての場合において、それは、所与のｐＭＨＣ複合体と相互作用するクロノタイプＴ細胞受容体であり、潜在的に、持続した細胞：細胞接触形成及びＴ細胞活性化につながる。Ｗｉｅｃｚｏｒｅｋｅｔａｌ．，“ＭａｊｏｒＨｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙＣｏｍｐｌｅｘ（ＭＨＣ）ＣｌａｓｓＩａｎｄＣｌａｓｓＩＩＰｒｏｔｅｉｎｓ：ＣｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌＰｌａｓｔｉｃｉｔｙｉｎＡｎｔｉｇｅｎＰｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ．”ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１７，Ｍａｒ１７；８：２９２。

主要組織適合性複合体クラスＩ及びクラスＩＩは、全体的に類似した倍数を共有する。結合プラットフォームは、ＭＨＣクラスＩの場合には単一の重いα鎖（ＨＣ）に由来し、ＭＨＣクラスＩＩの場合には２本の鎖（α鎖及びβ鎖）に由来する２つのドメインで構成される。２つのドメインは、塩基としてわずかに湾曲したβシートと、その間にペプチド鎖を収容するのに十分な距離にある２つのαヘリックスを上部に形成するように進化した。２つの膜近位免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインは、ペプチド結合単位を支持する。１つのＩｇドメインは、ＭＨＣクラスＩＩの各鎖に存在し、一方、ＭＨＣクラスＩの第２のＩｇ型ドメインは、不変軽鎖ベータ－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）とＨＣとの非共有結合的会合によって提供される。膜貫通ヘリックスは、ＭＨＣクラスＩのＨＣ及びＭＨＣクラスＩＩの両方の鎖を膜内に固定する。Ｉｄ．クラスＩＩトランスアクチベーター（ＣＩＩＴＡ）は、ＭＨＣクラスＩ及びＩＩ遺伝子のγ－インターフェロン活性化転写を調節する転写コアクチベーターである。

ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）系又は複合体は、ヒトにおけるＭＨＣ遺伝子複合体によってコードされる関連タンパク質群である。これらの細胞表面タンパク質は、免疫系の調節に関与する。

本明細書で使用される場合、「方法」という用語は、化学、薬理学、生物学、生化学、及び医学分野の実践者によって既知の様式、手段、技術、及び手順から既知であるか、又はそれらから容易に開発される様式、手段、技術、及び手順を含むが、これらに限定されない、所与のタスクを達成するための様式、手段、技術、及び手順を指す。

本明細書で使用される場合、「治療」という用語は、治療される個体又は細胞の疾患経過を変更しようとする試みにおける臨床介入を指し、予防のために、又は臨床病理学の経過中のいずれかで実施することができる。治療の治療効果としては、限定されないが、疾患の発生若しくは再発を予防すること、症状の緩和、疾患の任意の直接的若しくは間接的な病理学的結果の軽減、転移を予防すること、疾患進行の速度を低減すること、疾患状態の改善若しくは緩和、並びに寛解又は改善された予後が挙げられる。疾患又は障害の進行を予防することによって、治療は、罹患したか、若しくは診断した対象、又は障害を有する疑いがある対象において、障害に起因する悪化を予防することができるだけではなく、治療は、障害のリスクがある対象、若しくは障害を有する疑いがある対象において、障害の発症又は障害の症状を予防することができる。

本明細書で使用される場合、「細胞」、「細胞株」、及び「細胞培養物」という用語は、交換可能に使用され得る。これらの用語の全てはまた、任意の及び全ての後の世代であるそれらの子孫を含む。全ての子孫は、故意又は不注意の突然変異のために同一ではない場合があることを理解されたい。本明細書に開示される細胞は、自己細胞、同系細胞、同種異系細胞、及び場合によっては異種異系細胞であってもよい。

「単離された細胞」という用語は、細胞に天然に伴う分子及び／又は細胞成分から分離される細胞を意味する。

本明細書で使用される「キメラ抗原受容体」又は「ＣＡＲ」という用語は、免疫エフェクター細胞上で発現され、抗原を特異的に結合するように操作される人工Ｔ細胞受容体を指す。態様において、ＣＡＲは、及びエクトドメイン、膜貫通ドメイン、及びエンドドメインを含む。特定の態様において、ＣＡＲは、エクトドメイン及び膜貫通ドメインをエンドドメインなしで含むことができるが、本出願のより多くのＣＡＲは、エンドドメインを含み、細胞内シグナル伝達を提供する。

「受容体」とは、１つ以上のリガンドを選択的に結合する細胞膜上に存在するポリペプチド又はその部分を意味する。

本明細書で使用される場合、「抗原認識ドメイン」は、一般に、特定のがん抗原に特異的な一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む。いくつかの態様において、同じ細胞内に２つ以上のＣＡＲが存在する場合、第２のＣＡＲは、別の特定の抗原に特異的なｓｃＦｖを含んでもよい。

本明細書で使用される場合、「一本鎖可変断片」又は「ｓｃＦｖ」という用語は、ＶＨ：ＶＬヘテロ二量体を形成するように共有結合される免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質である。重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）は、直接的に接続されるか、又はペプチドをコードするリンカー（例えば、１０、１５、２０、２５個のアミノ酸）によって接続されるかのいずれかであり、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端に接続するか、又はＶＨのＣ末端をＶＬのＮ末端に接続する。リンカーは通常、可撓性のためにグリシンが豊富であり、溶解性のためにセリン又はトレオニンが豊富である。定常領域の除去及びリンカーの導入にもかかわらず、ｓｃＦｖタンパク質は、元の免疫グロブリンの特異性を保持する。一本鎖Ｆｖポリペプチド抗体は、Ｈｕｓｔｏｎ，ｅｔａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：５８７９－５８８３，１９８８）によって記載されるように、ＶＨ及びＶＬをコードする配列を含む核酸から発現することができる。また、米国特許第５，０９１，５１３号、同第５，１３２，４０５号、及び同第４，９５６，７７８号、並びに米国特許公開第２００５／０１９６７５４号及び同第２００５／０１９６７５４号を参照されたい。

本明細書で使用される場合、「膜貫通ドメイン」は、タンパク質が発現されるときに、少なくとも１回、二重層を横断する、主に非極性アミノ酸残基の領域である。一般に、膜貫通ドメインは、１８～２１個のアミノ酸残基によってコードされ、アルファヘリカル配置を採用する。本明細書で使用される場合、膜貫通ドメインは、当該技術分野で既知の任意の種類のものであってもよい。態様において、膜貫通ドメインは、場合によってはＣＤ２８であるが、である。他の供給源としては、ＣＤ３－Ｃ、ＣＤ４、又はＣＤ８が挙げられる。エクトドメインの例示的な組み合わせを、ＰＣＴ／ＵＳ２０２２／０１５５２５の図２７ｂに示す。他の好適な膜貫通領域は、ＣＤ１６、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、及びＮＫＧ２ｄから得ることができる。

本明細書で使用される場合、「エンドドメイン」という用語は、細胞内でのシグナル伝達を提供するＣＡＲの細胞内ドメインを指す。一般に、エンドドメインは、刺激ドメイン及び任意に共刺激ドメインの２つの部分に更に分割することができる。共刺激ドメインは、ＰＣＴ／ＵＳ２０２２／０１５５２５の図２７ａにおいて刺激ドメインのアミノ末端に配置されることが示されているが、本明細書はまた、アミノ末端刺激ドメインを提供し、続いて、共刺激ドメイン（存在する場合）を提供する。最も一般的に使用されるエンドドメインコンポーネントは、３つのＩＴＡＭを含有し、抗原が結合した後に活性化シグナルをＮＫＴ細胞に伝達するＣＤ３－ゼータである。他の好適な刺激ドメインは、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー９（遺伝子ＩＤ３６０４、例えば、４－１ＢＢ又はＣＤ１３７）、インターロイキン２１（ＩＬ－２１、遺伝子ＩＤ５９０６７）、造血細胞シグナルトランスデューサー（ＨＣＳＴ、遺伝子ＩＤ１０８７０、例えば、ＤＡＰ１０）、及び膜貫通免疫シグナル伝達アダプター（ＴＹＲＯＢＰ、遺伝子ＩＤ７３０５、ＤＡＰ１２）から得ることができる。

本明細書で使用される場合、「エクトドメイン」という用語は、ＣＡＲの細胞外部分を指し、シグナルペプチド、抗原認識ドメイン、及び抗原認識ドメインを膜貫通ドメインに連結するスペーサー又はヒンジ領域を包含する。発現すると、シグナルペプチドは除去され得る。

本明細書で使用される「腫瘍抗原」という用語は、正常又は非腫瘍性細胞と比較して、腫瘍細胞上に独自に又は差異的に発現する抗原（例えば、ポリペプチド、糖タンパク質、又は糖脂質）を指す。本発明に関して、腫瘍抗原は、抗原認識受容体（例えば、ＣＤ１９、Ｍｕｃ－１）によって認識されることができるか、又は受容体リガンド結合（例えば、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１／Ｌ２、８７．１１２）を介して免疫応答を抑制することができる腫瘍によって発現される任意のポリペプチドを含む。

「組織抗原」とは、腫瘍細胞と比較して、正常又は非腫瘍性細胞又は組織上で独自に又は差異的に発現される抗原（例えば、ポリペプチド又は糖タンパク質又は糖脂質）を意味する。

「対象」、「個体」、及び「患者」という用語は、本明細書において互換的に使用され、限定されないが、マウス、ラット、及びモルモット等のげっ歯類を含む実験動物等の非ヒト霊長類を含む哺乳動物、好ましくはヒト及び他の霊長類を含む任意の脊椎動物対象を指す。この用語は、特定の年齢を示すものではない。したがって、成人及び新生児の両方を対象とすることが意図されている。

「有効量」とは、治療効果を有するのに十分な量を意味する。一実施形態において、「有効量」は、新生物の継続的な増殖、成長、又は転移（例えば、浸潤又は遊走）を阻止、改善、又は阻害するのに十分な量である。

「異種核酸分子又はポリペプチド」という用語は、細胞、又は細胞から得られた試料中に通常は存在しない、核酸分子（例えば、ａｃＤＮＡ、ＤＮＡ、若しくはＲＮＡ分子）、又はポリペプチドを意味する。この核酸は、別の生物由来であってもよく、又は例えば、細胞若しくは試料において通常は発現しないｍＲＮＡ分子であってもよい。

「免疫応答性細胞」とは、免疫応答又は前駆体、又はその子孫で機能する細胞を意味する。

「単離された」、「精製された」、又は「生物学的に純粋な」という用語は、その天然状態で見られるように通常それに伴う成分から様々な程度に遊離している材料を指す。「分離する」は、元の供給源又は周囲からの分離の程度を示す。「精製する」は、単離よりも高い分離の程度を示す。「精製された」又は「生物学的に純粋な」タンパク質は、任意の不純物がタンパク質の生物学的特性に実質的に影響を及ぼさないか、又は他の有害な結果を引き起こさない程十分に他の材料を含まない。すなわち、本発明の核酸又はペプチドは、組換えＤＮＡ技法によって産生されたときに細胞物質、ウイルス物質、若しくは培養培地を実質的に含まないか、又は化学合成されたときに化学前駆体若しくは他の化学物質を実質的に含まない場合に精製されている。純度及び均一性は、典型的には、分析化学技術、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又は高速液体クロマトグラフィーを使用して判定される。「精製された」という用語は、核酸又はタンパク質が電気泳動ゲルにおいて本質的に１つのバンドを生じることを示すことができる。修飾、例えば、リン酸化又はグリコシル化に供され得るタンパク質について、異なる修飾は、別々に精製され得る異なる単離されたタンパク質を生じ得る。

「薬剤を得る（ｏｂｔａｉｎｉｎｇｔｈｅａｇｅｎｔ）」におけるような用語「得る（ｏｂｔａｉｎｉｎｇ）」は、薬剤（又は指示された物質又は材料）を購入する、合成する、又はそれ以外の方法で取得することを含むことが意図されている。

「新生物」という用語は、細胞若しくは組織の病的な増殖、及びその後の他の組織若しくは器官への遊走又は浸潤を特徴とする疾患を意味する。新生物の成長は、典型的には、制御不能であり、かつ進行性であり、正常細胞の増殖を誘発しないか、又はその休止を引き起こす条件下で起こる。新生物は、限定されないが、膀胱、骨、脳、乳房、軟骨、グリア、食道、卵管、胆嚢、心臓、腸、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、神経組織、卵巣、膵臓、前立腺、骨格筋、皮膚、脊髄、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、気管、尿路、尿管、尿道、子宮、及び膣、又はそれらの組織若しくは細胞型からなる群から選択される器官を含む、様々な細胞型、組織、又は器官に罹患し得る。新生物としては、がん、例えば、肉腫、がん腫、又は形質細胞腫（形質細胞の悪性腫瘍）などが挙げられる。本発明を使用することができる例示的な新生物としては、これらに限定されないが、白血病（例えば、急性白血病、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄芽球性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性単球性白血病、急性赤血球白血病、慢性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病）、真性多血症、リンパ腫（ホジキン病、非ホジキン病）、ワルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖疾患、並びに肉腫及びがん腫等の固形腫瘍（例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸がん、膵臓がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、扁平上皮がん、基底細胞がん、腺がん、汗腺がん、皮脂腺がん、乳頭がん、乳頭腺がん、嚢胞腺がん、髄様がん、気管支原性がん、腎細胞がん、肝臓腫、ナイル管がん（ｎｉｌｅｄｕｃｔｃａｒｃｉｎｏｍａ）、絨毛がん、セミノーマ、胚細胞がん、ウィルム腫瘍、子宮頚がん、子宮がん、精巣がん、肺がん、小細胞肺がん、膀胱がん、上皮がん、神経膠腫、星細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、神経鞘腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、及び網膜芽細胞腫）が挙げられる。

「作動可能に連結された」とは、本明細書で使用される場合、生体分子に関連する生物学的機能、活性、及び／又は構造が少なくとも保持されるように、２つ以上の生体分子の連結を意味する。ポリペプチドに関して、この用語は、２つ以上のポリペプチドの連結が、各ポリペプチド成分のそれぞれの個々の活性の少なくとも一部を保持する融合ポリペプチドをもたらすことを意味する。２つ以上のポリペプチドは、直接又はリンカーを介して連結され得る。核酸に関して、この用語は、適切な分子（例えば、転写アクチベータータンパク質）が第２のポリヌクレオチドに結合するときに、第１のポリヌクレオチドが、第１のポリヌクレオチドの転写を指示する第２のポリヌクレオチドに隣接して配置されることを意味する。

「プロモーター」とは、転写の開始及び速度が制御される核酸配列の領域である制御配列を意味する。それは、ＲＮＡポリメラーゼ及び他の転写因子等の調節タンパク質及び分子が結合して核酸配列の特異的転写を開始し得る遺伝子エレメントを含み得る。

「参照」又は「対照」は、比較の標準を意味する。例えば、ＣＡＲ及び追加のタンパク質を発現する細胞の免疫応答は、ＣＡＲ単独を発現する対応する非操作細胞の免疫応答と比較され得る。

「類似体」という用語は、参照ポリペプチド又は核酸分子の機能を有する構造的に関連するポリペプチド又は核酸分子を意味する。

「疾患」は、細胞、組織、又は器官の正常な機能を損傷又は妨害する任意の状態又は障害を意味する。疾患の例としては、細胞の新生物又は病原体感染が挙げられる。

本明細書で使用される場合、「操作する（ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）」という用語は、１つ以上の外因性核酸配列を導入するための細胞の遺伝子組換えを指す。好ましくは、操作することにより、タンパク質を発現するように転写及び翻訳される外因性核酸配列が導入された。外因性核酸配列を導入することは、形質転換、トランスフェクション、及び形質導入を含む当該技術分野で既知の方法を使用して実行することができる。

一態様において、本明細書に開示される組換え構築物は、サイトカインをコードするＤＮＡ配列を更に含む。いくつかの態様において、サイトカインは、インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２７、ＩＬ－３３、又はそれらの組み合わせである。一態様において、サイトカインは、ＩＬ－１５である。一態様において、ＩＬ－１５は、ヒトＩＬ－１５である。一態様において、ＩＬ－１５をコードするＤＮＡ配列は、コドン最適化されている。別の態様において、ＩＬ１５は、ＩＬ－２シグナルペプチドを含む。一態様において、ＩＬ１５Ｒａと併せてＩＬ１５をコードするＤＮＡ配列。別の態様において、ＩＬ１５ＲａＳｕｓｈｉドメインと併せてＩＬ１５をコードするＤＮＡ配列。いくつかの態様において、ＩＬ－１５をコードするＤＮＡ配列は、ＣＡＲをコードするＤＮＡ配列の上流にある。他の態様において、ＩＬ－１５をコードするＤＮＡ配列は、ＣＡＲをコードするＤＮＡ配列の下流にある。

いくつかの態様において、本開示で使用されるａｍｉＲは、ａｍｉＲ１５５である。別の態様において、本開示で使用されるａｍｉＲは、ａｍｉＲ３０である。更なる態様において、本開示で使用されるａｍｉＲは、当該技術分野で既知の人工マイクロＲＮＡ足場である。

いくつかの態様において、ＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩ遺伝子は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩ及びクラスＩＩ遺伝子である。

いくつかの態様において、本明細書に開示される組換え構築物は、異なる種類の免疫細胞における発現に好適である。特定の他の実施形態において、本明細書に記載の腫瘍抗原特異的ＣＡＲは、異なる種類の免疫細胞において発現される。免疫細胞の例としては、限定されないが、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、ＮＫＴ細胞、ΜΑΓΓ細胞、γδ－Τ細胞、又はそれらの混合物が挙げられる。Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、若しくはＴｒｅｇ細胞、Ｔｈ１Ｔ細胞、Ｔｈ２Ｔ細胞、Ｔｈ１７Ｔ細胞、非特異的Ｔ細胞、又は前述のもののうちのいずれかの組み合わせを含むＴ細胞の集団であってもよい。免疫細胞は、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを保有し得、ポリヌクレオチドは、自殺遺伝子を更に含み得る。

いくつかの態様において、本開示はまた、同種異系宿主の免疫系による操作された免疫細胞の拒絶反応を制限するための方法であって、免疫細胞に、本明細書に開示される組換え構築物を形質導入することを含み、免疫細胞における内因性ＭＨＣ遺伝子の発現が、ｓｈＲＮＡによって抑制される、方法を提供し、含む。

いくつかの態様において、同種異系宿主の免疫系は、限定されないが、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、ＮＫＴ細胞、ΜΑΓΓ細胞、γδ－Τ細胞、又はそれらの混合物を含む免疫細胞を含む。Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、若しくはＴｒｅｇ細胞、Ｔｈ１Ｔ細胞、Ｔｈ２Ｔ細胞、Ｔｈ１７Ｔ細胞、非特異的Ｔ細胞、又は前述の細胞のうちのいずれかの組み合わせを含むＴ細胞の集団であってもよい。

いくつかの態様において、操作された免疫細胞における内因性ＭＨＣ遺伝子の発現レベルは、形質導入後２日で、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％減少する。いくつかの態様において、操作された免疫細胞における内因性ＭＨＣ遺伝子の発現レベルは、形質導入後２日で、１０％～１５％、１０％～２０％、１０％～２５％、１０％～３０％、１０％～３５％、１０％～４０％、１０～４５％、１０％～５０％、１０％～５５％、１０％～６０％、１０％～６５％、１０％～７０％、１０％～７５％、１０％～８０％、１０％～８５％、１０％～９０％、１０％～９５％、１５％～２０％、１５％～２５％、１５％～３０％、１５％～３５％、１５％～４０％、１５％～４５％、１５％～５０％、１５％～５５％、１５％～６０％、１５％～６５％、１５％～７０％、１５％～７５％、１５％～８０％、１５％～８５％、１５％～９０％、１５％～９５％、２０％～２５％、２０％～３０％、２０％～３５％、２０％～４０％、２０％～４５％、２０％～５０％、２０％～５５％、２０％～６０％、２０％～６５％、２０％～７０％、２０％～７５％、２０％～８０％、２０％～８５％、２０％～９０％、２０％～９５％、２５％～３０％、２５％～３５％、２５％～４０％、２５％～４５％、２５％～５０％、２５％～５５％、２５％～６０％、２５％～６５％、２５％～７０％、２５％～７５％、２５％～８０％、２５％～８５％、２５％～９０％、２５％～９５％、３０％～３５％、３０％～４０％、３０％～４５％、３０％～５０％、３０％～５５％、３０％～６０％、３０％～６５％、３０％～７０％、３０％～７５％、３０％～８０％、３０％～８５％、３０％～９０％、３０％～９５％、３５％～４０％、３５％～４５％、３５％～５０％、３５％～５５％、３５％～６０％、３５％～６５％、３５％～７０％、３５％～７５％、３５％～８０％、３５％～８５％、３５％～９０％、３５％～９５％、４０％～４５％、４０％～５０％、４０％～５５％、４０％～６０％、４０％～６５％、４０％～７０％、４０％～７５％、４０％～８０％、４０％～８５％、４０％～９０％、４０％～９５％、４５％～５０％、４５％～５５％、４５％～６０％、４５％～６５％、４５％～７０％、４５％～７５％、４５％～８０％、４５％～８５％、４５％～９０％、４５％～９５％、５０％～５５％、５０％～６０％、５０％～６５％、５０％～７０％、５０％～７５％、５０％～８０％、５０％～８５％、５０％～９０％、５０％～９５％、５５％～６０％、５５％～６５％、５５％～７０％、５５％～７５％、５５％～８０％、５５％～８５％、５５％～９０％、５５％～９５％、６０％～６５％、６０％～７０％、６０％～７５％、６０％～８０％、６０％～８５％、６０％～９０％、６０％～９５％、６５％～７０％、６５％～７５％、６５％～８０％、６５％～８５％、６５％～９０％、６５％～９５％、７０％～７５％、７０％～８０％、７０％～８５％、７０％～９０％、７０％～９５％、７５％～８０％、７５％～８５％、７５％～９０％、７５％～９５％、８０％～８５％、８０％～９０％、８０％～９５％、８５％～９０％、８５％～９５％、又は９０％～９５％減少する。

いくつかの態様において、操作された免疫細胞における内因性ＭＨＣ遺伝子の発現レベルは、形質導入後７日で、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％減少する。いくつかの態様において、操作された免疫細胞における内因性ＭＨＣ遺伝子の発現レベルは、形質導入後７日で、１０％～１５％、１０％～２０％、１０％～２５％、１０％～３０％、１０％～３５％、１０％～４０％、１０～４５％、１０％～５０％、１０％～５５％、１０％～６０％、１０％～６５％、１０％～７０％、１０％～７５％、１０％～８０％、１０％～８５％、１０％～９０％、１０％～９５％、１５％～２０％、１５％～２５％、１５％～３０％、１５％～３５％、１５％～４０％、１５％～４５％、１５％～５０％、１５％～５５％、１５％～６０％、１５％～６５％、１５％～７０％、１５％～７５％、１５％～８０％、１５％～８５％、１５％～９０％、１５％～９５％、２０％～２５％、２０％～３０％、２０％～３５％、２０％～４０％、２０％～４５％、２０％～５０％、２０％～５５％、２０％～６０％、２０％～６５％、２０％～７０％、２０％～７５％、２０％～８０％、２０％～８５％、２０％～９０％、２０％～９５％、２５％～３０％、２５％～３５％、２５％～４０％、２５％～４５％、２５％～５０％、２５％～５５％、２５％～６０％、２５％～６５％、２５％～７０％、２５％～７５％、２５％～８０％、２５％～８５％、２５％～９０％、２５％～９５％、３０％～３５％、３０％～４０％、３０％～４５％、３０％～５０％、３０％～５５％、３０％～６０％、３０％～６５％、３０％～７０％、３０％～７５％、３０％～８０％、３０％～８５％、３０％～９０％、３０％～９５％、３５％～４０％、３５％～４５％、３５％～５０％、３５％～５５％、３５％～６０％、３５％～６５％、３５％～７０％、３５％～７５％、３５％～８０％、３５％～８５％、３５％～９０％、３５％～９５％、４０％～４５％、４０％～５０％、４０％～５５％、４０％～６０％、４０％～６５％、４０％～７０％、４０％～７５％、４０％～８０％、４０％～８５％、４０％～９０％、４０％～９５％、４５％～５０％、４５％～５５％、４５％～６０％、４５％～６５％、４５％～７０％、４５％～７５％、４５％～８０％、４５％～８５％、４５％～９０％、４５％～９５％、５０％～５５％、５０％～６０％、５０％～６５％、５０％～７０％、５０％～７５％、５０％～８０％、５０％～８５％、５０％～９０％、５０％～９５％、５５％～６０％、５５％～６５％、５５％～７０％、５５％～７５％、５５％～８０％、５５％～８５％、５５％～９０％、５５％～９５％、６０％～６５％、６０％～７０％、６０％～７５％、６０％～８０％、６０％～８５％、６０％～９０％、６０％～９５％、６５％～７０％、６５％～７５％、６５％～８０％、６５％～８５％、６５％～９０％、６５％～９５％、７０％～７５％、７０％～８０％、７０％～８５％、７０％～９０％、７０％～９５％、７５％～８０％、７５％～８５％、７５％～９０％、７５％～９５％、８０％～８５％、８０％～９０％、８０％～９５％、８５％～９０％、８５％～９５％、又は９０％～９５％減少する。

いくつかの態様において、内因性ＭＨＣ遺伝子の発現レベルは、形質導入後１４日で、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％減少する。いくつかの態様において、操作された免疫細胞における内因性ＭＨＣ遺伝子の発現レベルは、形質導入後１４日で１０％～１５％、１０％～２０％、１０％～２５％、１０％～３０％、１０％～３５％、１０％～４０％、１０～４５％、１０％～５０％、１０％～５５％、１０％～６０％、１０％～６５％、１０％～７０％、１０％～７５％、１０％～８０％、１０％～８５％、１０％～９０％、１０％～９５％、１５％～２０％、１５％～２５％、１５％～３０％、１５％～３５％、１５％～４０％、１５％～４５％、１５％～５０％、１５％～５５％、１５％～６０％、１５％～６５％、１５％～７０％、１５％～７５％、１５％～８０％、１５％～８５％、１５％～９０％、１５％～９５％、２０％～２５％、２０％～３０％、２０％～３５％、２０％～４０％、２０％～４５％、２０％～５０％、２０％～５５％、２０％～６０％、２０％～６５％、２０％～７０％、２０％～７５％、２０％～８０％、２０％～８５％、２０％～９０％、２０％～９５％、２５％～３０％、２５％～３５％、２５％～４０％、２５％～４５％、２５％～５０％、２５％～５５％、２５％～６０％、２５％～６５％、２５％～７０％、２５％～７５％、２５％～８０％、２５％～８５％、２５％～９０％、２５％～９５％、３０％～３５％、３０％～４０％、３０％～４５％、３０％～５０％、３０％～５５％、３０％～６０％、３０％～６５％、３０％～７０％、３０％～７５％、３０％～８０％、３０％～８５％、３０％～９０％、３０％～９５％、３５％～４０％、３５％～４５％、３５％～５０％、３５％～５５％、３５％～６０％、３５％～６５％、３５％～７０％、３５％～７５％、３５％～８０％、３５％～８５％、３５％～９０％、３５％～９５％、４０％～４５％、４０％～５０％、４０％～５５％、４０％～６０％、４０％～６５％、４０％～７０％、４０％～７５％、４０％～８０％、４０％～８５％、４０％～９０％、４０％～９５％、４５％～５０％、４５％～５５％、４５％～６０％、４５％～６５％、４５％～７０％、４５％～７５％、４５％～８０％、４５％～８５％、４５％～９０％、４５％～９５％、５０％～５５％、５０％～６０％、５０％～６５％、５０％～７０％、５０％～７５％、５０％～８０％、５０％～８５％、５０％～９０％、５０％～９５％、５５％～６０％、５５％～６５％、５５％～７０％、５５％～７５％、５５％～８０％、５５％～８５％、５５％～９０％、５５％～９５％、６０％～６５％、６０％～７０％、６０％～７５％、６０％～８０％、６０％～８５％、６０％～９０％、６０％～９５％、６５％～７０％、６５％～７５％、６５％～８０％、６５％～８５％、６５％～９０％、６５％～９５％、７０％～７５％、７０％～８０％、７０％～８５％、７０％～９０％、７０％～９５％、７５％～８０％、７５％～８５％、７５％～９０％、７５％～９５％、８０％～８５％、８０％～９０％、８０％～９５％、８５％～９０％、８５％～９５％、又は９０％～９５％減少する。

本開示はまた、本明細書に開示される組換え構築物を形質導入されたか、又は本明細書に開示される方法によって産生された、操作された免疫細胞であって、免疫細胞における内因性ＭＨＣ遺伝子の発現が、組換え構築物を形質導入されていない対照免疫細胞と比較して著しく抑制される、操作された免疫細胞を提供し、含む。免疫細胞の例としては、限定されないが、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、ＮＫＴ細胞、ΜΑΓΓ細胞、γδ－Τ細胞、又はそれらの混合物が挙げられる。Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、若しくはＴｒｅｇ細胞、Ｔｈ１Ｔ細胞、Ｔｈ２Ｔ細胞、Ｔｈ１７Ｔ細胞、非特異的Ｔ細胞、又は前述のもののうちのいずれかの組み合わせを含むＴ細胞の集団であってもよい。

本明細書に提供されるように、態様において、遺伝子操作されたＮＫＴ細胞は、Ｉ型ＮＫＴ細胞である。ある態様において、Ｉ型ＮＫＴ細胞は、ＣＤ６２Ｌ陽性（ＣＤ６２Ｌ＋）ＮＫＴ細胞である。一般に、本開示のＮＫＴ細胞は、ヒト末梢血から単離され、遺伝子操作されたＮＫＴ細胞を産生する遺伝子構築物を導入する前に、２０日未満の培養を受けている。

態様において、本開示の遺伝子操作されたＮＫＴ細胞は、細胞マーカーＣＤ４、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＣＤ４５ＲＯ（遺伝子ＩＤ５７８８）、ＯＸ４０、ＣＣＲ７、及びそれらの組み合わせの発現を更に特徴とする。これらのマーカーの発現は、抗腫瘍応答を媒介することができる腫瘍部位へのＮＫＴ細胞の輸送（ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）と密接に関連している。更なる態様において、遺伝子操作されたＮＫＴ細胞は、限定されないが、Ｓ１ＰＲ１、ＩＬ－７Ｒａ、ＩＬ２１Ｒ等のＮＫＴ細胞の生存及び記憶のマーカーを発現する。態様において、本開示の遺伝子操作されたＮＫＴ細胞は、低レベルの消耗マーカーＴＩＭ－３、ＬＡＧ３、及びＰＤ－１を発現する。

本開示は、がん抗原を認識する抗体認識ドメインを含むＣＡＲタンパク質を提供し、含む。態様において、ＣＡＲは、がん抗原の抗体認識ドメイン、スペーサー又はヒンジ領域、膜貫通ドメイン、及びエンドドメインを含む。ある態様において、抗体認識ドメインは、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。特定の態様において、抗体認識ドメインは、例えば、目的の抗原を発現するがん細胞の細胞表面上のがん抗原を対象とする。態様において、エンドドメインは、Ｔ細胞受容体ｚ鎖に由来するもの等の刺激ドメインを含む。他の態様において、本明細書の刺激ドメインには、限定されないが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－ＩＢＢ、及びＯＸ４０等の共刺激分子由来のエンドドメイン、又はＩＬ７及びＩＬ１５等のサイトカイン受容体のシグナル伝達成分が含まれる。態様において、共刺激分子は、抗原会合後にＣＡＲによって産生されるＮＫＴ細胞の活性化、増殖、及び細胞傷害性を増強するために使用される。特定の態様において、共刺激分子は、ＣＤ２８、ＯＸ４０、又は４－１ＢＢである。

本開示によって含まれ、提供されるのは、がん抗原、例えば、黒色腫関連抗原（ＭＡＧＥ）、黒色腫優先発現抗原（ＰＲＡＭＥ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、Ｋ－軽鎖、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＲＯＲｌ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３／４、ＥＧＦｒｖＩＩＩ、がん胎児性抗原、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＨＥＲ２、メソセリン、ＴＡＧ７２、ＰＳＭＡ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、Ｂ７－Ｈ６、ＩＬ－１３受容体ａ２、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＣＡ９、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＭＷ－ＭＡＡ、ＣＤ１７１、ＬｅｗｉｓＹ、Ｇ２５０／ＣＡＩＸ、ＨＬＡ－ＡＩＭＡＧＥＡｌ、ＨＬＡ－Ａ２ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＳＣ１、葉酸受容体－ａ、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、８Ｈ９、ＮＣＡＭ、ＶＥＧＦ受容体、５Ｔ４、胎児ＡｃｈＲ、又はＣＤ４４ｖ６である。ある態様において、がん抗原は、ＣＤ１９、ＧＤ２、及びグリピカン－３（ＧＰＣ３）からなる群から選択される。別の態様において、がん抗原は、ＣＤ１９である。ある態様において、がん抗原は、ＧＤ２である。更に別の態様において、がん抗原は、ＧＰＣ３である。

また、本開示によって含まれ、提供されるのは、ＭＡＧＥ、ＰＲＡＭＥ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、Ｋ－軽鎖、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＲＯＲｌ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３／４、ＥＧＦｒｖＩＩＩ、がん胎児性抗原、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＨＥＲ２、メソセリン、ＴＡＧ７２、ＰＳＭＡ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、Ｂ７－Ｈ６、ＩＬ－１３受容体ａ２、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＣＡ９、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＭＷ－ＭＡＡ、ＣＤ１７１、ＬｅｗｉｓＹ、Ｇ２５０／ＣＡＩＸ、ＨＬＡ－ＡＩＭＡＧＥＡｌ、ＨＬＡ－Ａ２ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＳＣ１、葉酸受容体－ａ、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、８Ｈ９、ＮＣＡＭ、ＶＥＧＦ受容体、５Ｔ４、胎児ＡｃｈＲ、又はＣＤ４４ｖ６からなる群から選択されるがん抗原を認識する２つ以上のＣＡＲ分子を含む遺伝子操作されたＮＫＴ細胞である。

特定の態様において、抗原認識ドメインは、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む。特定の態様において、抗原認識ドメインは、キャンセル細胞（ｃａｎｃｅｌｃｅｌｌ）の細胞表面上のがん抗原を認識する。がん抗原の非限定的な例としては、黒色腫関連抗原（ＭＡＧＥ）、黒色腫優先発現抗原（ＰＲＡＭＥ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、Ｋ－軽鎖、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＲＯＲｌ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３／４、ＥＧＦｒｖＩＩＩ、がん胎児性抗原、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＨＥＲ２、メソセリン、ＴＡＧ７２、ＰＳＭＡ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、Ｂ７－Ｈ６、ＩＬ－１３受容体ａ２、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＣＡ９、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＭＷ－ＭＡＡ、ＣＤ１７１、ＬｅｗｉｓＹ、Ｇ２５０／ＣＡＩＸ、ＨＬＡ－ＡＩＭＡＧＥＡｌ、ＨＬＡ－Ａ２ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＳＣ１、葉酸受容体－ａ、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、８Ｈ９、ＮＣＡＭ、ＶＥＧＦ受容体、５Ｔ４、胎児ＡｃｈＲ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、又はＣＤ４４ｖ６のうちのいずれか１つが挙げられる。いくつかの場合には、抗原認識ドメインは、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＧＤ２、ＧＰＣ３、ＣＳＰＧ４、ＨＥＲ２、ＣＥＡ、又はメソセリンを認識する。１つの特定の態様において、抗原認識ドメインは、ＣＤ１９特異的抗体ＦＭＣ－６３由来の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む。別の特定の態様において、抗原認識ドメインは、ＧＤ２特異的抗体１４Ｇ２ａ由来の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む。別の特定の態様において、抗原認識ドメインは、ＧＰＣ３特異的抗体ＧＣ３３又はＹＰ７由来の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む。

一態様において、本開示による発現構築物におけるエンドドメイン配列は、抗原認識ドメインと標的抗原との会合後のＮＫＴ細胞増殖及びエフェクター機能のための刺激シグナルを生成するために、Ｔ細胞受容体ζ鎖に由来するもの等の細胞質シグナル伝達ドメインを含む。エンドドメイン配列の非限定的な例としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－ＩＢＢ、及びＯＸ４０等の共刺激分子由来のエンドドメイン、又はＩＬ７及びＩＬ１５等のサイトカイン受容体のシグナル伝達成分が挙げられる。特定の態様において、共刺激分子は、抗原会合後にＮＫＴ細胞の活性化、増殖、及び細胞傷害性を増強するために使用される。特定の態様において、共刺激分子は、ＣＤ２８、ＯＸ４０、及び４－１ＢＢである。一態様において、本開示によるＣＡＲのエンドドメインは、抗原認識及び受容体のクラスター後の細胞内でのシグナル伝達のために利用される。一態様において、エンドドメインは、３つのＩＴＡＭを含有し、抗原が結合した後に活性化シグナルをＮＫＴ細胞に伝達するＣＤ３－ゼータを含む。特定の態様において、追加の共刺激シグナル伝達、例えば、ＣＤ３－ゼータが、ＣＤ２８、４－ＩＢＢ、及び／又はＯＸ４０と組み合わせて利用される。特定の態様において、エンドドメイン配列は、ＣＤ３－ゼータ鎖にフレーム内で融合した４－１ＢＢのシグナル配列を含む。

膜貫通ドメインは、いかなる種類のものであってもよい。一態様において、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８の膜貫通ドメインを含む。別の態様において、膜貫通ドメインは、ＣＤ８の膜貫通ドメインを含む。

１つの特定の態様において、ＣＡＲ．ＣＤ１９、ＣＡＲ．ＧＤ２、及びＣＡＲ．ＧＰＣ３構築物は、前述のように作製され（Ｈｅｃｚｅｙｅｔａｌ．，２０１４、Ｐｕｌｅｅｔａｌ．，ＡｃｈｉｍｅｒｉｃＴｃｅｌｌａｎｔｉｇｅｎｒｅｃｅｐｔｏｒｔｈａｔａｕｇｍｅｎｔｓｃｙｔｏｋｉｎｅｒｅｌｅａｓｅａｎｄｓｕｐｐｏｒｔｓｃｌｏｎａｌｅｘｐａｎｓｉｏｎｏｆｐｒｉｍａｒｙｈｕｍａｎＴｃｅｌｌｓ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２００５；１２（５）：９３３－９４１）、ＣＤ１９特異的抗体ＦＭＣ－６３若しくはＧＤ２特異的抗体１４Ｇ２ａ若しくはＧＰＣ３特異的抗体ＧＣ３３、又はＹＰ７に由来するｓｃＦｖを含み、ＩｇＧｌヒンジ領域に由来する短いスペーサーを介してＣＤ８ａに由来する膜貫通ドメインに接続され、その後に、ζ鎖と融合した４－１ＢＢのシグナル伝達エンドドメイン配列が続く。

本開示による発現構築物は、１つ以上のＤＮＡ分子又は構築物として細胞に導入することができ、構築物（複数可）を含む宿主細胞の選択を可能にする少なくとも１つのマーカーが存在し得る。構築物は、従来の方法で調製することができ、遺伝子及び調節領域は、適宜単離されてもよく、ライゲーションされてもよく、適切なクローニング宿主でクローニングされてもよく、制限若しくは配列決定、又は他の好都合な手段によって分析されてもよい。一旦完成し、適切な配列を有することが実証された構築物は、次いで、任意の好都合な手段によってＣＴＬに導入されてもよい。構築物は、感染又は細胞への形質導入のために、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、又は単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、又はレトロウイルスベクターを含む他のもののような非複製性の欠陥ウイルスゲノムに組み込まれ、パッケージ化されてもよい。構築物は、所望であれば、トランスフェクションのためのウイルス配列を含み得る。あるいは、構築物は、融合、エレクトロポレーション、微粒子銃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ）、トランスフェクション、リポフェクション等によって導入され得る。宿主細胞は、構築物の導入前に培養物中で成長及び拡張させ、続いて、構築物の導入及び構築物の組み込みのための適切な処置を行ってもよい。次いで、細胞を拡張させ、構築物中に存在するマーカーによってスクリーニングする。成功裏に使用され得る様々なマーカーとしては、ｈｐｒｔ、ネオマイシン耐性、チミジンキナーゼ、ハイグロマイシン耐性等が挙げられる。

特定の態様において、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、又はその両方の下方調節を有する細胞を含む、本開示に包含される細胞を生成する方法が存在する。そのような細胞はまた、１つ以上の種類の操作された受容体を発現し得る。

いくつかの態様において、細胞を産生する方法は、操作される細胞を得る工程を含むが、他の場合において、得る工程は、本方法に含まれない。ドナー細胞は、例えば、がんを有しない対象を含む健常対象から得られ得る。細胞は、Ｂ２Ｍ及び／又はＣＩＩＴＡを下方調節するために組換え操作の前に拡張されても、拡張されなくてもよい。いくつかの方法では、細胞は、例えば、そのような選択が細胞の増強された拡張を可能にする、マーカーを発現するか、又はマーカーの発現を欠くように選択され得る。例えば、細胞を産生する方法の一部は、ＣＤ６２Ｌの発現、ＣＤ４の発現、及び／又はＰＤ１の低減された発現若しくは非存在の発現を選択するための工程を含み得る。

特定の実施形態において、本開示の細胞は、Ｂ２Ｍ及び／又はＣＩＩＴＡを下方調節する薬剤以外の実体を発現するように操作され、実体は、操作された受容体、サイトカイン、又は別の遺伝子産物であり得る。特定の実施形態において、実体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。ある場合には、細胞がＢ２Ｍ及び／又はＣＩＩＴＡを下方調節するようにする工程は、細胞が他の実体を発現することができるようにする同時工程であるが、代替的な場合には、これらは異なる工程である。特定の実施形態において、細胞が同時にＢ２Ｍ及び／又はＣＩＩＴＡを下方調節し、ＣＡＲを発現するように操作される場合、Ｂ２Ｍ及び／又はＣＩＩＴＡを下方調節する薬剤及びＣＡＲが同じベクター上で発現されるからである。しかしながら、他の場合では、Ｂ２Ｍ及び／又はＣＩＩＴＡ並びにＣＡＲを下方調節する薬剤は、異なるベクターから発現される。

本開示の方法は、ドナー細胞又はその拡張された子孫に導入されるベクターを生成する工程を含んでも、含まなくてもよい。組換えベクターの産生は当該技術分野で周知であり、ウイルスベクター又は非ウイルスベクターを含む様々なベクターを利用してもよい。単一のベクターが、Ｂ２Ｍ及び／又はＣＩＩＴＡを下方調節する薬剤と、ＣＡＲ等の操作された受容体の両方を包含する場合、当業者は、ベクターの設計が細胞のサイズ制約（例えば）を考慮に入れることを認識する。

操作される細胞がＴ細胞である場合、当該技術分野での通常の方法を使用するなどして、細胞の内因性Ｔ細胞受容体を下方調節又はノックアウトしてもよい。

本開示の態様は、対象におけるがん又は前がん状態等の医学的状態の治療に使用するために、本開示に包含される１つ以上の細胞を含む。細胞は、神経芽細胞腫、乳がん、子宮頚がん、卵巣がん、子宮内膜がん、黒色腫、膀胱がん、肺がん、膵臓がん、結腸がん、前立腺がん、リンパ系統の造血腫瘍、白血病、急性リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、骨髄性白血病、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病、甲状腺がん、甲状腺濾胞がん、間葉起源腫瘍、線維肉腫、横紋筋肉腫、黒色腫、ぶどう膜黒色腫、奇形がん腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、膠芽腫、皮膚の良性腫瘍、腎がん、未分化大細胞リンパ腫、食道扁平細胞がん、肝細胞がん（ＨＣＣ）、濾胞樹状細胞がん（ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌｃａｒｃｉｎｏｍａ）、腸がん、筋浸潤がん、精嚢腫瘍、表皮がん、脾臓がん、膀胱がん、頭頚部がん、胃がん、肝がん、骨がん、脳がん、網膜がん、胆道がん、小腸がん、唾液腺がん、子宮がん、精巣がん、結合組織がん、前立腺肥大、骨髄異形成、ワルデンストレームマクログロビン血症、鼻咽頭、神経内分泌がん骨髄異形成症候群、中皮腫、血管肉腫、カポジ肉腫、カルチノイド、食道胃、卵管がん、腹膜がん、漿液性乳頭状ミュラー管がん（ｐａｐｉｌｌａｒｙｓｅｒｏｕｓｍｕｌｌｅｒｉａｎｃａｎｃｅｒ）、悪性腹水、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、又はリー・フラウメニ症候群及びフォンヒッペル－リンダウ症候群（ＶＨＬ）から選択される遺伝性がん症候群を含む、あらゆる種類のがんに使用してもよい。特定の実施形態において、前がん状態は、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）である。

本開示の特定の態様において、本開示に包含される細胞により疾患を治療する方法が存在する。疾患は任意の種類のものであってもよいが、特定の実施形態では、疾患はがんである。細胞は、神経芽細胞腫、乳がん、子宮頚がん、卵巣がん、子宮内膜がん、黒色腫、膀胱がん、肺がん、膵臓がん、結腸がん、前立腺がん、リンパ系統の造血腫瘍、白血病、急性リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、骨髄性白血病、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病、甲状腺がん、甲状腺濾胞がん、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、間葉起源腫瘍、線維肉腫、横紋筋肉腫、黒色腫、ぶどう膜黒色腫、奇形がん腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、膠芽腫、皮膚の良性腫瘍、腎がん、未分化大細胞リンパ腫、食道扁平細胞がん、肝細胞がん、濾胞樹状細胞がん、腸がん、筋浸潤がん、精嚢腫瘍、表皮がん、脾臓がん、膀胱がん、頭頚部がん、胃がん、肝がん、骨がん、脳がん、網膜がん、胆道がん、小腸がん、唾液腺がん、子宮がん、精巣がん、結合組織がん、前立腺肥大、骨髄異形成、ワルデンストレームマクログロビン血症、鼻咽頭、神経内分泌がん骨髄異形成症候群、中皮腫、血管肉腫、カポジ肉腫、カルチノイド、食道胃、卵管がん、腹膜がん、漿液性乳頭状ミュラー管がん、悪性腹水、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、又はリー・フラウメニ症候群及びフォンヒッペル－リンダウ症候群（ＶＨＬ）から選択される遺伝性がん症候群を含む、あらゆる種類のがんが治療され得る。特定の実施形態において、疾患は、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）である。

Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、又はその両方の低減された発現を有する、有効量の本開示の細胞を、細胞による療法を必要とする対象に提供する。量は、疾患の少なくとも１つの症状が改善される限り、任意の量であってもよい。特定の実施形態では、細胞は、少なくとも約ｌｘｌＯ６～約ｌｘｌＯ９個の細胞、更により望ましくは、約ｌｘｌＯ７～約ｌｘｌＯ９個の細胞の範囲で提供されるが、それよりも上（例えば、ｌｘｌＯ９個の細胞よりも多い）又はそれよりも下（例えば、ｌｘｌＯ７個よりも少ない）のいずれかの任意の好適な量を利用することができる。特定の実施形態では、１以上の用量の細胞が対象に提供され、後続の用量は、分、時、日、週、月、又は年単位で分けてもよい。ある場合には、細胞の別個の送達は、異なる量の細胞を有する。例えば、細胞の初回用量は、１以上の後続の用量よりも多くても少なくてもよい。

治療される個体は、成人、青年、小児、乳児、又は動物であり得る。個体は、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ等を含む哺乳動物であり得る。
個体は、任意の性別、人種、遺伝的背景等を有し得る。この個体は、がんの既往歴及び／又は家族歴を有していても、有していなくてもよい。Ｂ２Ｍ及び／又はＣＩＩＴＡの発現の下方調節のために操作される細胞は、ファミリーメンバーから得られても、得られなくてもよい。個体ががんを有する場合、がんは任意の段階又はグレードであり得、がんは原発性、転移性、再発性、感受性、難治性などであり得る。

いくつかの態様において、本開示の免疫療法に加えて、手術、放射線療法、ホルモン療法、別の非同一性免疫療法、化学療法、又はそれらの組み合わせ等の１つ以上の療法が対象に提供され得る。

いくつかの態様において、細胞は、例えば、がんの既往歴及び／又は家族歴を有する対象を含む対象におけるがんの予防のために用いられる。

細胞は、例えば、注射を含む任意の好適な方法で対象に送達され得る。特に、細胞は、注入又は注射により対象に投与されることが想定される。好適な組成物の投与は、異なる方法、例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内、局所、非経口、経皮、管腔内、動脈内、髄腔内、又は皮内投与によって行うことができる。細胞は、がんへの直接注射によって提供されてもよい。細胞の投与は、全身的であっても局所的であってもよい。

細胞は、がんに関連する低酸素環境を標的としていても、していなくてもよい。そのような場合、細胞内の発現構築物からの発現をもたらす任意の調節エレメントは、低酸素環境で有効であり得る。

いくつかの態様において、個体におけるがん又は前がん疾患等の医学的状態の治療に使用するための、本明細書に記載の同種異系ＮＫＴを含む組成物が提供される。そのような組成物は、ＨＬＡが一致するか否かにかかわらず、任意の個人に投与することができる既製品である。このような組成物は、即時の利用可能性、安全性、及び治療可能性に関して、患者に大きな利点を有する。本明細書に記載の細胞に加えて、当該組成物は、限定されないが、懸濁剤、抗酸化剤、緩衝液、抑菌剤、及び溶質を含んでもよい。

本明細書に記載される細胞組成物のうちのいずれか及び／又は細胞組成物を生成及び／又は使用するための試薬が、キットに含まれ得る。非限定的な例では、細胞又は細胞を操作するための試薬が、キットに含まれ得る。特定の実施形態では、Ｂ２Ｍ及び／又はＣＩＩＴＡの発現が低減された細胞、又はＢ２Ｍ及び／又はＣＩＩＴＡの発現が低減されたＮＫＴ細胞を含む細胞集団が、キットに含まれ得る。そのようなキットは、細胞を操作するための１つ以上の試薬を有していても、有していなくてもよい。そのような試薬としては、例えば、小分子、タンパク質、核酸、抗体、緩衝液、プライマー、ヌクレオチド、塩、及び／又はそれらの組み合わせが挙げられる。ｓｈＲＮＡ又はＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ等のＢ２Ｍ及び／又はＣＩＩＴＡの発現を直接的又は間接的に低減することが可能な核酸（ＤＮＡ若しくはＲＮＡ）又は他の薬剤が、キットに含まれ得る。１つ以上のサイトカインをコードする核酸、又はサイトカイン自体が、キットに含まれ得る。サイトカイン又はアゴニストモノクローナル抗体を含む抗体等のタンパク質が、キットに含まれ得る。抗体を含む基質、又は裸の基質自体が、キットに含まれ得る。抗原提示細胞活性を含む細胞又はそれらを生成する試薬が、キットに含まれ得る。操作された受容体、例えば、キメラ抗原受容体又はキメラサイトカイン受容体又は操作されたＴ細胞受容体をコードするヌクレオチド（それらを生成するための１つ以上の試薬を含む）が、キットに含まれ得る。

特定の態様において、キットは、本開示の細胞療法と、がん療法等の特定の医学的状態のための別の療法と、を含む。ある場合には、キットは、細胞療法の実施形態に加えて、例えば、化学療法、ホルモン療法、及び／又は免疫療法等の第２のがん療法も含む。キットは、対象の特定のがんに合わせて調整されてもよく、対象のそれぞれの第２のがん療法を含む。

キットは、本開示の好適に等分された組成物を含み得る。キットの成分は、水性媒体又は凍結乾燥形態のいずれかで包装され得る。キットの容器手段は、概して、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジ、又は他の容器手段を含み、その中に成分を配置することができ、好ましくは、好適に等分することができる。キット内に２つ以上の成分がある場合、キットはまた、追加の成分が別々に配置され得る第２、第３、又は他の追加の容器を一般的に含んでもよい。しかしながら、成分の様々な組み合わせが、バイアルに含まれてもよい。本開示のキットはまた、典型的には、商業的販売のために密閉された状態で組成物及び任意の他の試薬容器を収容するための手段を含む。そのような容器には、所望のバイアルが保持される射出成形又はブロー成形されたプラスチック容器が含まれ得る。

実施例１：材料及び方法
ＮＫＴ細胞の単離、拡張、及びインビボ注射。
アフェレーシスによりＰＢＭＣを単離する。ＢｕｆｆｙＣｏａｔｓ（ＧｕｌｆＣｏａｓｔＲｅｇｉｏｎａｌＢｌｏｏｄＣｅｎｔｅｒ）を得た。試料を等体積のＰＢＳで希釈する。１５ｍｌのＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅを５０ｍｌの遠心分離チューブに入れ、界面を妨害することなく、３５ｍｌの末梢血／ＰＢＳをＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ上に慎重に重ねる。チューブをブレーキなしで室温で８００×ｇで３０分間遠心分離する。上部ＰＢＳ層を慎重に吸引し、約１０ｍｌのＰＢＳを残す。ＰＢＭＣを、血清学的ピペットを使用して、ＰＢＳ／Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅで慎重に回収する。回収したＰＢＭＣを、室温で５分間、８００×ｇで遠心分離することによって、５０ｍｌのＰＢＳで３回洗浄する。ＰＢＭＣを５０ｍｌのＭＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、トリパンブルーを使用してカウントする。ｉＮＫＴの単離に進む。

ＭｉｌｔｅｎｙｉマイクロビーズでＮＫＴ細胞を単離する。最初に、細胞番号を前の工程から決定する。細胞懸濁液を３００×ｇで１０分間遠心分離する。上清を完全に吸引する。細胞ペレットを、合計１０個の細胞当たり４００μＬのＭＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させる。抗ｉＮＫＴＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）を合計１０個の細胞当たり１００μＬ添加する。細胞とＭｉｃｒｏＢｅａｄｓをよく混合し、冷蔵庫（２～８℃）で１５分間インキュベートする。細胞を、細胞１０個当たり１～２ｍＬのＭＡＣＳ緩衝液を添加することによって洗浄し、３００×ｇで１０分間遠心分離する。上清を完全に吸引する。最大１０個の細胞を５００μＬのＭＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させる。カラムを、好適なＭＡＣＳセパレータの磁場に配置する。カラムを、適切な量のＭＡＣＳ緩衝液ですすぐことによって調製する。ＬＳ：３ｍＬ。細胞懸濁液をカラム上に塗布する。未標識細胞を含むフロースルーを収集する。カラムを、適切な量のＭＡＣＳ緩衝液で洗浄する。ＬＳ：３×３ｍＬを通過する未標識細胞を収集する。次に、カラムをセパレータから取り出し、好適な収集チューブ上に配置する。適切な量のＭＡＣＳ緩衝液を、カラム上にピペットする。磁気的に標識された細胞を、プランジャーをカラムにしっかりと押し込むことによって直ちに洗い流す。ＬＳ：５ｍＬ。

形質導入を含むＮＫＴ一次刺激。ＮＫＴ細胞を４００ｇで５分間室温で遠心分離し、１ｍｌの完全ＲＰＭＩ培地に再懸濁し、２４ウェルプレートの１つのウェルに配置する。細胞をカウントし、この工程での純度染色のために少量のアリコートを採取する。ＰＢＭＣをカウントする。照射器をレベル５に設定し、適切な量のＰＢＭＣを２．５Ｇｙ照射し、１０分４０秒間照射する。照射後、ＰＢＭＣを洗浄し、５×１０^６個の細胞／ｍＬで再懸濁させる。１ｍｌのＰＢＭＣ（５００万細胞）を２４ウェルプレート中のＮＫＴ細胞に添加する。１００ｎｇ／ｍｌ（２μＬ）のαＧａｌＣｅｒ（ストック：１００μｇ／ｍＬ）、２００ＩＵ／ｍＬ（２μＬ）のＩＬ－２（ストック：２００ＩＵ／μＬ）、及び１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２１を添加する。細胞を３７℃、５％のＣＯ_２で１０日間インキュベートし、２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２及び１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２１を１日おきに供給する。必要に応じて、培地を交換し、かつ／又はウェルを分割する。一次拡張の８日目に、以下のようにＮＫＴ細胞の形質導入を実行する。形質導入後、ＮＫＴ数が１０×１０^６個の細胞を超えたら、細胞を６ウェルＧ－Ｒｅｘプレートに移し、合計１０～１２日間拡張を続ける。一次拡張の最後に、ＮＫＴ細胞を凍結するか、又は二次刺激に進むことができる。

ＮＫＴ細胞の形質導入。レトロネクチンコーティングプレートを調製する：ｉ）。形質導入に必要なウェルの数を決定する；ｉｉ）。各ウェルについてＰＢＳ中に７ｕｇ／ｍｌのレトロネクチン懸濁液を作製し、非組織培養コーディングプレートの各ウェルに１ｍｌのレトロネクチン懸濁液を添加する；ｉｉｉ）プレートの縁部をパラフィルムで密封し、４℃で一晩インキュベートする。又は、当日使用する場合は、レトロネクチンコーティングプレートを３７℃で４時間インキュベートする。次いで、レトロネクチンコーティングプレートを４℃から取り出し、フード内で約１０分間温める。同時に、レトロウイルス上清を解凍する。レトロネクチン懸濁液を吸引し、廃棄する。１ｍｌのレトロウイルス上清を各ウェルに添加する。プレートを４６００Ｇで１時間、３０℃で遠心分離する。ＮＫＴ細胞を収集し、０．２５×１０^６個の細胞／ｍｌの濃度で調製する。２００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２及び１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－２１をＮＫＴ懸濁液に添加する。レトロウイルス上清を吸引する。ＮＫＴ懸濁液を各ウェルにメッキし、ウェル当たり０．５ｘ１０^６個のＮＫＴの最終濃度を得る。プレートを４００ｇで１０分間回転させる。次いで、プレートを、３７℃、５％のＣＯ_２で４８時間インキュベートする。一次拡張の９日目に、ＮＫＴ細胞を、新鮮な培地を含む２４ウェル組織培養プレートに移す。ウェルは、一般に、約１×１０^６個の細胞／ｍｌの濃度を維持するために一緒にプールされる。

ＮＫＴ二次拡張。一次刺激／形質導入の終了後、又は一次拡張した凍結ＮＫＴ細胞を使用して、ＮＫＴ細胞を２×１０^６個の細胞／ｍｌで再懸濁する。二次刺激のためにＰＢＭＣを使用する場合、凍結したアリコートを解凍し、レベル５で１０分４０秒間照射する。人工ＡＰＣ（Ｂ－８－２）を使用する場合、細胞を１×１０^６個の細胞／ｍｌで再懸濁し、レベル５で２７分間照射する。照射された細胞を洗浄し、２４ウェルプレート中で１：５のＮＫＴ：ＰＢＭＣ又は２：１のＮＫＴ：ａＡＰＣ比でＮＫＴ細胞と共培養する。１００ｎｇ／ｍｌ（２μＬ）のαＧａｌＣｅｒ（ストック：１００μｇ／ｍＬ）、２００ＩＵ／ｍＬ（２μＬ）のＩＬ－２（ストック：２００ＩＵ／μＬ）、及び１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２１を添加する。細胞を３７℃、５％のＣＯ_２で１０日間インキュベートし、２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２及び１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２１を１日おきに供給する。必要に応じて、培地を交換し、かつ／又はウェルを分割する。ＮＫＴ数が１０×１０^６個の細胞を超えたら、細胞をＧ－Ｒｅｘ１０に移し、合計１０～１２日間拡張を続ける。

ＣＡＲ．ＣＤ１９形質導入効率及びＮＫＴ細胞純度を評価する。各個々の抗体について、ＦＡＣＳチューブ当たり０．５～１×１０^６個のＮＫＴ細胞を使用して単色補償対照をセットアップし、最終体積５０ｕｌで染色する。細胞を４℃で２０分間インキュベートし、２ｍｌの１×ＰＢＳで一度洗浄し、４００×ｇで５分間回転させ、３００ｕｌの１×ＰＢＳに再懸濁させる。未染色の対照については、０．５～１×１０^６個のＮＫＴ細胞を追加のＦＡＣＳチューブに取っておく。実験試料について、０．５～１×１０^６個のＮＫＴ細胞を培養物からＦＡＣＳチューブに移す。非形質導入細胞を陰性対照として用いる。細胞を２ｍｌの１×ＰＢＳで洗浄する。５ｕｌのＡｌｅｘａ６４７抗ＣＡＲ．ＣＤ１９抗体を添加し、細胞を４℃オフライトで２０分間インキュベートする。次に、細胞を徹底的に洗浄する。

０日目：ホタルルシフェラーゼ／ＧＦＰ＋ＣＤ１９＋Ｄａｕｄｉ細胞を用いてリンパ腫異種移植片を確立する。ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２γｎｕｌｌ（ＮＳＧ）マウスを、ＳｍａｌｌＡｎｉｍａｌＣｏｒｅＦａｃｉｌｉｔｙｏｆＴｅｘａｓＣｈｉｌｄｒｅｎ’ｓＨｏｓｐｉｔａｌで維持し、動物研究プロトコル番号ＡＮ－５１９４を参照する、ＢａｙｌｏｒＣｏｌｌｅｇｅｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌＢｉｏｓａｆｅｔｙＣｏｍｍｉｔｔｅｅ及びＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌＡｎｉｍａｌＣａｒｅａｎｄＵｓｅＣｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）によって承認されたプロトコルに従って処置する。０日目に、ＮＳＧマウスに、２×１０^５個のホタルルシフェラーゼ／ＧＦＰ＋Ｄａｕｄｉ細胞を尾静脈を介して注射して、疾患を確立する。ＰＢＳで細胞を洗浄する。３００ｕｌのＰＢＳを追加し、試料をＬＳＲＩＩ又はｉＱｕｅにかける。まず、ＦＳＣ対ＳＳＣプロットで生リンパ球をゲートする。ＣＡＲ＋ゲートをセットアップするために非形質導入ＮＫＴ細胞を使用して、ＣＡＲ／ＣＤ１９＋陽性細胞を直接ゲートする。

３日目：ＣＡＲ．ＣＤ１９形質導入ＮＫＴを注射する。Ｄａｕｄｉ異種移植片を注射した３日後、Ｄａｕｄｉ腫瘍を担持するＮＳＧマウスに、尾静脈を介して５×１０^６個のＣＡＲ．ＣＤ１９ＮＫＴ細胞を注射し、続いて２週間にわたって１日おきにＩＬ－２（２０００Ｕ／マウス）を腹腔内注射する。腫瘍のサイズ／分布を、以下のように生物発光イメージングを使用して毎週モニタリングする。イメージングの直前に、各マウスに、腹腔内注射により３０ｍｇ／ｍＬで１００μＬのルシフェリンを注射する。ＴｅｘａｓＣｈｉｌｄｒｅｎ’ｓＨｏｓｐｉｔａｌのＳｍａｌｌＡｎｉｍａｌＩｍａｇｉｎｇＦａｃｉｌｉｔｙにおいて、５分後、マウスを、ＩＶＩＳ（登録商標）ＬｕｍｉｎａＩＩ定量的蛍光及び生物発光イメージングシステムを用いて生物発光チャネル下でイメージングする。次に、ＬｉｖｉｎｇＩｍａｇｅ（登録商標）ソフトウェアを使用して生物発光カウントを解析する。

インビトロ細胞傷害性アッセイ
ルシフェラーゼ陽性のＤａｕｄｉ又はＲａｊｉ細胞の培養物を、ＲＰＭＩ－１６４０／ＧｌｕｔａＭＡＸ／１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ中で確立する。実験を開始する前にルシフェラーゼ発現を確認し、細胞傷害性アッセイで使用するために標的細胞の数を決定する（標準曲線を、最高濃度で２００，０００個の細胞で設定し、次いで１：２の連続希釈を実行し、ルシフェラーゼ発現について評価する。アッセイに使用する標的細胞の数が、標準曲線の線形範囲内にあることを確実にする。）。Ｄａｕｄｉ細胞の懸濁液を、ＲＰＭＩ／２０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ培地中で０．２×１０^６個の細胞／ｍＬ（又は標準曲線に基づいて計算された細胞数）で調製する。黒色透明底部９６ウェルプレートの適切なウェルに、１００μＬ（２０，０００細胞）をプレーティングする。少なくとも３つのウェルは標的細胞のみでセットアップし、３つのウェルは培地のみの対照用にセットアップする。ウェルは、エフェクター細胞が処理されている間、完全に加湿された雰囲気中、空気中５％のＣＯ_２中、３７℃に置かれる。エフェクター細胞を回収し、カウントする。細胞を、１０：１、５：１、２．５：１、及び１．２５：１のエフェクター：標的比について適切な濃度に希釈し、形質導入速度が全てのＣＡＲ形質導入ＮＫＴ細胞にわたって正規化されることを確実にする。エフェクター細胞を各濃度の標的に３回ずつ添加する。細胞を、完全に加湿された雰囲気中、空気中５％のＣＯ_２中、３７℃で６時間培養する。ＴｅｃａｎＳｐａｒｋ１０Ｍプレートリーダーを３７℃に温めるようにセットアップし、生物発光シグナルを読み取り、取得テンプレートをセットアップする。ウェルの基部との接触を避けながら、各プレートの全てのウェルから１００μＬの培地を慎重に取り除く。使用直前に、必要量の１．５ｍｇ／ｍｌルシフェリンワーキングストックを調製する。１００ｕｌのルシフェリンを各プレートの全てのウェルに添加する。プレートを、完全に加湿された雰囲気中、空気中５％のＣＯ_２中、３７℃で５分間インキュベートする。プレートをインキュベーターから取り出し、次に蓋を取り外し、ＴｅｃａｎＳｐａｒｋ１０Ｍプレートリーダーを使用して生物発光を読み取る。データ分析の場合：データを取得し、以下のように死滅／溶解パーセンテージを計算する：
（総ルシフェラーゼ）－（ｘ） ×１００％
（総ルシフェラーゼ）－（自発ルシフェラーゼ）

レトロウイルス構築物及びレトロウイルスの産生。
ＣＡＲ．ＣＤ１９、ＣＡＲ．ＧＤ２、及びＣＡＲ．ＧＰＣ３構築物は、前述のように作製され（Ｈｅｃｚｅｙｅｔａｌ．，２０１４、Ｐｕｌｅｅｔａｌ．，２００５）、ＣＤ８ａに由来する膜貫通ドメインにＩｇＧｌヒンジ領域に由来する短いスペーサーを介して接続されたＣＤ１９特異的抗体ＦＭＣ－６３又はＧＤ２特異的抗体１４Ｇ２ａ由来のｓｃＦｖを含み、その後にｚ鎖と融合した４－１ＢＢのシグナルエンドドメイン配列が続く。

ＣＡＲ１９．ＩＬ２ＳＰ－Ｏｐｔｉ１５．ａｍｉＲ構築物のクローニング及び配列情報
プライマー配列は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ製であり、ＮＣＢＩ製の「ＰｒｉｍｅｒＢＬＡＳＴ」ツールを使用して設計される。テンプレートは、ＣＡＲ１９．１５ベクターである。以下の表２は、合成されたクローニングプライマー及びＤＮＡ断片を示す。表３は、配列決定プライマーである。

増殖及びアポトーシスアッセイ
ＮＫＴをＣｅｌｌＴｒａｃｅＶｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で標識し、αＧａｌＣｅｒパルスＢ－８－２細胞で刺激する。細胞増殖を、フローサイトメトリーを使用してＣＴＶ希釈を測定することによって、６日目に調べる。ＮＫＴ刺激後３日目に、それぞれアネキシン－Ｖ及び７－ＡＡＤ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＦｒａｎｋｌｉｎＬａｋｅｓ，ＮＪ）を染色し、続いてフローサイトメトリーによって、早期及び後期のアポトーシスを測定する。

多重サイトカイン定量アッセイＣＤ１９－ＣＡＲ－ＮＫＴを、Ｄａｕｄｉリンパ腫細胞によって、１：１の比で２４時間刺激する。上清を収集し、製造業者のプロトコルに従ってＬｕｍｉｎｅｘ（登録商標）分析のためにＭＩＬＬＩＰＬＥＸＭＡＰＨｕｍａｎＣｙｔｏｋｉｎｅ／ＣｈｅｍｏｋｉｎｅＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙパネル（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して分析する。

フローサイトメトリー。
以下のｍＡｂを使用して、免疫表現型決定を実行する：ＨＬＡ－ＣＥＭＲ８－５、ＣＤ１ｄＣＤｌｄ４２、ＣＤ８６２３３１、４－１ＢＢＬＣ６５－４８５、ＯＸ４０Ｌｉｋ－１、ＣＤ３ＯＫＴ、Ｖａ２４－Ｊａｌ８６Ｂ１１、ＣＤ４ＳＫ３、ＣＤ６２ＬＤＲＥＧ－５６、ＣＤ１３４ＡＣＴ３５、ＣＤ１３７４Ｂ４－１、ＰＤ－１ＥＨ１２．１、ＧＡＴＡ３Ｌ５０－８２３（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＬＡＧ－３Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ、ＴＥＶＩ－３３４４８２３（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍ）、及びウサギ抗ＬＥＦｌＥＰ２０３０ＹｍＡｂ（ＡＢＣＡＭ）。ＢＤ又はＲ＆Ｄ推奨の蛍光色素及びアイソタイプマッチングＡｂを陰性対照として使用する。抗Ｉｄ（クローン１３６．２０．１）ＣＤ１９－ＣＡＲ特異的ｍＡｂ（ＴｏｒｉｋａｉＨ，ｅｔａｌ．ＴｏｗａｒｄｅｌｉｍｉｎａｔｉｎｇＨＬＡｃｌａｓｓＩｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｔｏｇｅｎｅｒａｔｅｕｎｉｖｅｒｓａｌｃｅｌｌｓｆｒｏｍａｌｌｏｇｅｎｅｉｃｄｏｎｏｒｓ．ｆｉ／ｏｏ＜ｉ．２０１３；１２２（８）：１３４１－１３４９）及びヤギ抗マウスＩｇＧ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、ＮＫＴ上のＣＡＲ．ＣＤ１９の発現を決定する。

ＮＫＴ細胞表現型分析
ＮＫＴ細胞表現型は、ＣＤ３（ＵＣＨＴ１）、Ｖα２４－Ｊα１８（６Ｂ１１）、ＣＤ４（ＲＰＡ－Ｔ４）、グランザイムＢ（ＧＢ１１）、ＣＤ６２Ｌ（ＤＲＥＧ－５６；ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＳａｎＪｏｓｅ，ＣＡ）、Ｖβ１１（Ｃ２１；ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ、Ｂｒｅａ，ＣＡ）、及びＩＬ－２１Ｒ（１７Ａ１２；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ及びＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を用いて評価する。形質導入されたＮＫＴによるＣＤ１９－ＣＡＲ発現は、Ｂ．Ｊｅｎａ博士（ＭＤＡｎｄｅｒｓｏｎＣａｎｃｅｒＣｅｎｔｅｒ、Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）からの贈呈品である抗ＩｄｍＡｂ（クローン１３６．２０．１）（２５）を使用して検出する。細胞内染色は、Ｂｃｌ２（Ｎ４６－４６７；ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びＢＩＭ（Ｙ３６；Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）用のｍＡｂを有する固定／透過化溶液キット（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して実行し、続いて二次ヤギ抗ウサギＩｇＧ－ＡＦ４８８ｍＡｂ（Ａｂｃａｍ）で染色する。Ｐｈｏｓｆｌｏｗ染色は、Ｓｔａｔ３用のｍＡｂ（ｐＹ７０５；Ｃｌｏｎｅ４；ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含むＣｙｔｏｆｉｘ緩衝液（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びＰｅｒｍ緩衝液ＩＩＩ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて実行する。Ｓｔａｔ３リン酸化の検出は、ＩＬ－２１による処置の１５分後に実行する。ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ又はＲ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓによって推奨される蛍光色素及びアイソタイプマッチング抗体を陰性対照として使用する。

ＢＤＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェアバージョン６．０及びＦｌｏｗＪｏ１０．１（ＴｒｅｅＳｔａｒ、Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）を使用して、ＬＳＲ－ＩＩ５－レーザーフローサイトメーター（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で解析を実行する。

遺伝子発現解析
Ｄｉｒｅｃｔ－ｚｏｌ（商標）ＲＮＡＭｉｎｉＰｒｅｐＫｉｔ（ＺｙｍｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を使用して、総ＲＮＡを収集する。遺伝子発現解析は、ＢＣＭゲノム及びＲＮＡＰｒｏｆｉｌｉｎｇＣｏｒｅによるｎＣｏｕｎｔｅｒＡｎａｌｙｓｉｓＳｙｓｔｅｍを用いてＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙＰａｎｅｌバージョン２（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ、Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）を使用して実行する。データを、ｎＳｏｌｖｅｒ３．０ソフトウェア（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ）を使用して解析する。２つの培養条件におけるＣＤ６２Ｌ＋及びＣＤ６２Ｌ－サブセット間の遺伝子発現レベルの差は、ＬｉｎｅａｒＭｏｄｅｌｓｆｏｒＭｉｃｒｏａｒｒａｙＤａｔａ（Ｌｉｍｍａ）分析パッケージ（２６）の対合調整ｔ統計量（ｐａｉｒｅｄｍｏｄｅｒａｔｅｄｔ－ｓｔａｔｉｓｔｉｃ）を使用して評価する。

インビボ実験
ＮＳＧマウスをＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙから入手し、ＢＣＭ動物ケア施設で維持する。マウスに２×１０^５個のルシフェラーゼ形質導入Ｄａｕｄｉリンパ腫細胞を静脈（ＩＶ）注射して、腫瘍成長を開始する。３日目に、マウスに、４×１０×１０^６個のＣＤ１９－ＣＡＲ－ＮＫＴをＩＶ注射し、続いて、ＩＬ－２（１，０００Ｕ／マウス）のみ、又はＩＬ－２（１，０００Ｕ／マウス）とＩＬ－２１（５０ｎｇ／マウス）との組み合わせを２週間、隔日で腹腔内（ＩＰ）注射する。腫瘍成長は、生物発光イメージング（ＴｅｘａｓＣｈｉｌｄｒｅｎ’ｓＨｏｓｐｉｔａｌのＳｍａｌｌＡｎｉｍａｌＩｍａｇｉｎｇｃｏｒｅｆａｃｉｌｉｔｙ）によって週に１回評価する。

統計
Ｓｈａｐｉｒｏ－Ｗｉｌｋ検定を使用して、連続変数の正規性を評価する。Ｐ値が０．０５未満の場合、正規性は否定される。非正規分布データの場合、マン・ホイットニーＵ検定を使用して、２つの群間の連続変数の差異を評価する。連続変数の違いを評価するために、両側対合スチューデントｔ検定を使用して２つの群を比較し、一方向ＡＮＯＶＡと検定後ボンフェローニ補正を使用して３つ以上の群を比較し、双方向ＡＮＯＶＡとＳｉｄａｋの事後検定を使用して２対２の設定で比較する。生存を、ログランク（マンテル－コックス）検定を用いたカプラン－マイヤー法を使用して分析して、２つの群を比較する。統計は、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ７（ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅ、ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して計算される。Ｐ値が０．０５未満であった場合、差は有意であるとみなされる。

実施例２：ＮＫＴにおけるＨＬＡクラスＩ／ＩＩノックダウン及びＣＡＲ１９との共発現のためのＡＭＩＲ対ＰＯＬＩＩＩプロモーター駆動ＳＨＲＮＡ
同種異系宿主の免疫系によるＮＫＴ細胞の拒絶反応を制限するために、β２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）及び不変鎖（Ｉｉ）（別名ＣＤ７４）又はクラスＩＩトランスアクチベーター（ＣＩＩＴＡ）に対するＵ６プロモーター駆動ｓｈＲＮＡ配列を組み込む組換え構築物を、それぞれ、ＮＫＴ細胞において、ＨＬＡクラスＩ及びクラスＩＩのノックダウンを達成するように設計する。Ｕ６プロモーターの代わりに、７ＳＫ及びＨ１ポリメラーゼＩＩＩプロモーターを含む構築物も設計及び評価する。

一方、実験は、ＣＡＲ１９内からのＢ２Ｍ－ｓｈＲＮＡ配列の発現を支持するためにａｍｉＲ足場（例えば、ａｍｉＲ１５５及びａｍｉＲ３０）を使用することの実現可能性を評価するために実施する。ＣＡＲ１９構築物が、図１に示されている。目的は、このアプローチが、ＣＡＲ発現への影響及び形質導入ＮＫＴにおけるＨＬＡクラスＩ及び／又はＩＩの発現を効果的に抑制する能力の点で、ポリメラーゼＩＩＩプロモーター駆動ｓｈＲＮＡの使用とどのように比較するかを評価することである。

図２では、Ｕ６、Ｈ１、又は７ＳＫプロモーターによって駆動されたか、又はｍｉＲ１５５足場に埋め込まれたスクランブル（ｓｃｒ．）又はＢ２Ｍ特異的ｓｈＲＮＡを含むＣＡＲ１９構築物がＮＫＴ細胞に形質導入される。ＣＡＲ発現を形質導入の２日後に評価した。図２は、代表的なドナー由来のＮＫＴ細胞において、ＣＡＲ１９構築物の３’末端にプロモーター駆動ｓｈＲＮＡ又はｍｉＲ駆動ｓｈＲＮＡのいずれかを組み込むと、ｓｈＲＮＡ特異性にかかわらず、同様にＣＡＲ発現レベルが低下したことを示す。

図３では、示されるように、Ｈ１、７ＳＫ、又はＵ６プロモーターによって駆動されたか、又はａｍｉＲ１５５に埋め込まれたスクランブル（ｓｃｒ．）又はＢ２Ｍ特異的ｓｈＲＮＡを含むＣＡＲ１９構築物がＮＫＴ細胞に形質導入される。ＣＡＲ及びＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃの発現を、形質導入の２日後に評価する。図３は、ＣＡＲ１９内からのａｍｉＲ１５５によって支持されるＢ２ＭｓｈＲＮＡ発現が、評価された３つのポリメラーゼＩＩＩ駆動プロモーターと比較して、最大レベルのＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃノックダウンをもたらすことを示す。

図４では、示されるように、Ｕ６プロモーターによって駆動されたか、又はａｍｉＲ１５５に埋め込まれたスクランブル（ｓｃｒ．）又はＢ２Ｍ特異的ｓｈＲＮＡを含むＣＡＲ１９構築物がＮＫＴ細胞に形質導入される。ＣＡＲ及びＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃの発現を、形質導入の１４日後に評価する。図４は、ａｍｉＲ１５５－Ｂ２ＭｓｈＲＮＡ構築物が、ＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ発現の効果的な長期（形質導入後１４日）抑制を媒介し、Ｕ６－Ｂ２ＭｓｈＲＮＡ構築物よりも高い程度のノックダウンを示していることを示す。

図５では、示されるように、ａｍｉＲ３０に埋め込まれたスクランブル（ｓｃｒ．）又はＢ２Ｍ特異的ｓｈＲＮＡを含むＣＡＲ１９構築物がＮＫＴ細胞に形質導入される。ＣＡＲ及びＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃの発現を、形質導入の７日後に評価する。図５は、ａｍｉＲ３０－Ｂ２ＭｓｈＲＮＡ構築物が、形質導入の７日後に評価したＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ発現の効果的な抑制を媒介し、ａｍｉＲ１５５－Ｂ２ＭｓｈＲＮＡ構築物と同程度のノックダウンを実証することを示す。

まとめると、これらの実験により、ＣＡＲ１９構築物の３’末端にプロモーター駆動ｓｈＲＮＡ又はｍｉＲ駆動ｓｈＲＮＡのいずれかを組み込むと、ｓｈＲＮＡ特異性にかかわらず、ＣＡＲ発現のレベルが同様に低下することが実証される。ＣＡＲ１９内からのａｍｉＲ１５５によって支持されるＢ２ＭｓｈＲＮＡ発現は、Ｕ６、Ｈ１、及び７ＳＫポリメラーゼＩＩＩ駆動プロモーターと比較して、最大レベルのＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃノックダウンをもたらす。ａｍｉＲ１５５－Ｂ２ＭｓｈＲＮＡ構築物は、Ｕ６－Ｂ２ＭｓｈＲＮＡ構築物と比較して、ＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃの発現のより効果的かつ安定した抑制を媒介する。ａｍｉＲ３０－Ｂ２ＭｓｈＲＮＡ構築物が、形質導入の７日後に評価したＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ発現の効果的な抑制を媒介し、ａｍｉＲ１５５－Ｂ２ＭｓｈＲＮＡ構築物と同程度のノックダウンを実証する。

実施例３：Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、及びＣＤ７４についてのＡＭＩＲ－ＳＨＲＮＡ標的配列のスクリーニング
この実施例では、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、及びＣＤ７４を標的とする異なるｓｈＲＮＡ候補配列を、以下に詳述するようにスクリーニングする。ｓｈＲＮＡ配列は、Ｓｉｇｍａを通じて入手可能な検証済みｓｈＲＮＡセットから選択されるか（以下のリストの１）、又はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＲＮＡｉツールを使用して設計されるか（以下のリストの２）のいずれかである。このスクリーニングアプローチにより、ＣＡＲ１９内のａｍｉＲ１５５と併せて、形質導入されたＮＫＴ細胞におけるＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ（Ｂ２ＭｓｈＲＮＡについて）及びＨＬＡ－ＤＲ、ＤＰ、ＤＱ（ＣＩＩＴＡ及びＣＤ７４ｓｈＲＮＡについて）の最も効率的なノックダウンを媒介する、それぞれの場合のｓｈＲＮＡ配列の選択が可能になる。

表４は、ｓｈＲＮＡ候補の配列を提供する。

図６では、ＮＫＴ細胞に、ａｍｉＲ１５５に埋め込まれたＢ２Ｍ特異的ｓｈＲＮＡ（５つの異なる候補配列及びＡＮＣＨＯＲ生成物に使用される以前に評価されたｓｈＲＮＡ配列）を含むＣＡＲ１９構築物が形質導入される。ＣＡＲ及びＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃの発現を、形質導入の１２日後に評価する。結果は、Ｂ２Ｍを標的とするために使用される特異的ｓｈＲＮＡ配列に応じて、ＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃノックダウンレベルの変動を示す。

図７では、ａｍｉＲ１５５に埋め込まれたＣＩＩＴＡ特異的ｓｈＲＮＡ（１０個の異なる候補配列）を含むＣＡＲ１９構築物がＮＫＴ細胞に形質導入される。ＣＡＲ及びＨＬＡ－ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの発現は、形質導入の１２日後に評価する。結果は、ＣＩＩＴＡを標的とするために使用される特異的ｓｈＲＮＡ配列に応じて、ＨＬＡ－ＤＲ、ＤＰ、ＤＱノックダウンレベルの変動を示す。

図８では、ａｍｉＲ１５５に埋め込まれたＣＤ７４特異的ｓｈＲＮＡ（１０個の異なる候補配列）を含むＣＡＲ１９構築物がＮＫＴ細胞に形質導入される。ＣＡＲ及びＨＬＡ－ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの発現は、形質導入の１２日後に評価する。結果は、ＣＤ７４を標的とするために使用される特異的ｓｈＲＮＡ配列に応じて、ＨＬＡ－ＤＲ、ＤＰ、ＤＱノックダウンレベルの変動を示す。

表５は、図６～８において評価したｓｈＲＮＡ候補に関するＨＬＡクラスＩ又はＩＩノックダウン効率の定量をまとめたものである。

図９では、示されるように、Ｂ２Ｍを標的とする単一のａｍｉＲ埋込ｓｈＲＮＡ（ＡＮＣＨＯＲからのｓｈＲＮＡ配列を使用して）又はＣＩＩＴＡ（候補配列＃６を使用して）を含むＣＡＲ１９．１５構築物がＮＫＴ細胞に形質導入される。ノックダウン効率を、形質導入の４日後に評価する。Ｎ＝４のドナー（ＢＬ＃６２、８０、８１、８３）。以下の表６は、図９に対応するデータを提示する。

まとめると、これらの実験は、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、及びＣＤ７４のための最良のｓｈＲＮＡ候補が選択されたことを実証する。ＨＬＡクラスＩＩのノックダウンの場合、ＣＩＩＴＡは、ｓｈＲＮＡ標的化のためにＣＤ７４よりも選択される。

実施例４：ＣＡＲ１９－ａｍｉＲ構築物を発現するＮＫＴによるＩＬ１５産生の改善
ＣＡＲ１９構築物からのＩＬ１５の効率的な共発現は、形質導入されたＮＫＴの生存及び抗腫瘍活性を促進するのに重要である。ＩＬ１５ＥＬＩＳＡを実行し、結果は、Ｕ６駆動Ｂ２ＭｓｈＲＮＡ又はｍｉＲ１５５埋込Ｂ２ＭｓｈＲＮＡのいずれかを含むＣＡＲ１９．１５を発現するＮＫＴが、元のＣＡＲ１９．１５を発現するＮＫＴと比較して、ＩＬ１５レベルを著しく低下させることを示す（図１０のパネルＡ）。ＩＬ１５レベルのこの低下は、これらの構築物を発現するＮＫＴからの低レベルのＣＡＲ発現にも対応する（図１０のパネルＢ）。以下の表７は、図１０のパネルＡに対応するデータを示す。

この問題に対処するために、３つの構築物のセット（図１１）を、ＩＬ１５発現（コドン最適化されたＩＬ１５）又は生物学的効力／活性（ＩＬ１５Ｒａ又はＩＬ１５ＲａＳｕｓｈｉドメインと併せて発現するＩＬ１５）を改善することを目的とした修飾で設計する。ＮＫＴ細胞に新しい構築物を形質導入し、ＩＬ１５産生への影響について評価する。

図１２は、ａｍｉＲ１５５駆動Ｂ２ＭｓｈＲＮＡを含むＣＡＲ１９構築物からのコドン最適化（ｏｐｔｉ）ＩＬ１５の発現が、ＣＤ１９＋腫瘍細胞との共培養後のＩＬ１５の分泌を促進することを示す。以下の表８は、図１２のパネルＡに対応するデータを提示する。以下の表９は、図１２のパネルＢに対応するデータを提示する。

図１３は、ＣＡＲ１９．１５からのＩＬ１５－ＩＬ１５Ｒａの共発現が、ＩＬ１５Ｒａへの結合を介した形質導入ＮＫＴによるＩＬ１５の表面発現を促進することを示す。データは、３人のドナーからのものである。

まとめると、これらの実験により、Ｕ６又はａｍｉＲ１５５駆動Ｂ２ＭｓｈＲＮＡを含むＣＡＲ１９．１５構築物を発現するＮＫＴにおけるＩＬ１５分泌及びＣＡＲ発現が、元のＣＡＲ１９．１５と比較して低いことが実証される。ａｍｉＲ１５５駆動Ｂ２ＭｓｈＲＮＡを含むＣＡＲ１９構築物からのコドン最適化（ｏｐｔｉ）ＩＬ１５の発現は、ＮＫＴにおけるＩＬ１５の分泌を促進する。しかしながら、効果は、試験した３人のドナーにおいて様々であった。ＣＡＲ１９．１５からのＩＬ１５－ＩＬ１５Ｒａの共発現は、ＩＬ１５Ｒａへの結合を介した形質導入ＮＫＴによるＩＬ１５の表面発現を促進する。この結合は、ＩＬ２Ｒ－ベータ及び共通のガンマ鎖を発現する隣接／標的細胞へのＩＬ１５の効果的なトランスプレゼンテーションを促進し得る。

実施例５：二重ノックダウン構築物の評価：ＣＡＲ１９及び最適化されたＩＬ１５と共発現したａｍｉＲ埋込ｓｈＲＮＡ配列
同種異系患者におけるＣＡＲ１９ＮＫＴの拒絶反応を最小限に抑えるために、構築物を、ａｍｉＲ埋込ｓｈＲＮＡ配列を用いてＢ２Ｍ（クラスＩ）及びＣＩＩＴＡ（クラスＩＩ）を標的とするＨＬＡクラスＩ及びＩＩを同時にノックダウンするように設計する。最良の性能のＢ２Ｍ及びＣＩＩＴＡ特異的ｓｈＲＮＡを、二重ノックダウン構築物に含まれるように単一のノックダウンスクリーニングで選択及び評価する。Ｂ２ＭｓｈＲＮＡ標的配列は、ＡＮＣＨＯＲ生成物で使用されるものと同じであり、ａｍｉＲ３０内に埋め込まれ、ＣＩＩＴＡｓｈＲＮＡ候補＃６は、ａｍｉＲ１５５内に埋め込まれている。コドン最適化されたＩＬ１５はまた、以前の実験からの所見に基づいて、この構築物を形質導入されたＮＫＴ細胞によるＩＬ１５分泌を最大化するために組み込まれる。

この二重ノックダウン構築物（図１４）によって媒介されるＨＬＡクラスＩ及びＩＩノックダウンの有効性を形質導入ＮＫＴ細胞で評価する。ＩＬ１５ＥＬＩＳＡもまた、追加のａｍｉＲ－ｓｈＲＮＡの存在がＩＬ１５の発現又は分泌に影響を及ぼすか否かを決定するために実行される。更に、この構築物を発現するＮＫＴ細胞の抗腫瘍活性も、関連するインビトロ及びインビボモデルで評価される。

図１５は、ＣＡＲ１９．ｏｐｔｉ－ＩＬ１５二重ノックダウン構築物が、形質導入１０日後の３人のドナー由来のＮＫＴにおける有効なＨＬＡクラスＩ及びＩＩノックダウンを媒介することを示す。ＮＫＴ細胞に、図１４に示すＣＡＲ１９構築物を形質導入する。ＣＡＲ、ＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＨＬＡ－ＤＲ、ＤＰ、ＤＱの発現を、形質導入の１０日後に評価する。３人のドナー（ＢＬ＃８１、８２、８３）に関するノックダウンパーセンテージ結果を図１５のパネルＢにまとめる。以下の表１０は、図１５Ｂに対応するデータを示す。

図１６は、ＣＡＲ１９．ｏｐｔｉ－ＩＬ１５二重ノックダウン構築物が、形質導入１９日後の４人の健常ドナー由来のＮＫＴにおける有効なＨＬＡクラスＩ及びＩＩノックダウンを媒介することを示す。

図１７は、ＣＡＲ１９．ｏｐｔｉ－ＩＬ１５二重ノックダウン構築物を発現するＮＫＴ細胞において、元のＣＡＲ１９．１５構築物と比較して、Ｌ１５分泌が低いままであることを示す。ＮＫＴ細胞は、示される構築物を形質導入されているか、又は形質導入されておらず、かつ単独で培養されるか、又はＣＤ１９＋Ｒａｊｉリンパ腫細胞と４８時間共培養される。培養上清は、ＩＬ１５分泌を検出するために、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄＥＬＩＳＡＭＡＸ（商標）ＤｅｌｕｘｅＳｅｔＨｕｍａｎＩＬ－１５キット（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ＃４３５１０４）を使用して処理する。Ｎ＝３のドナー（ＢＬ＃８１、８２、８３）。以下の表１１は、図１７に対応するデータを提示する。

図１８は、ＣＡＲ１９．ｏｐｔｉ－ＩＬ１５二重ノックダウン構築物を形質導入されたＮＫＴ細胞が、ＣＡＲ１９及びＣＡＲ１９．ＩＬ１５ＮＫＴ細胞と比較して、同様のレベルのＣＤ１９陽性標的細胞に対するインビトロ細胞傷害性を示すことを示す。示された構築物をＮＫＴ細胞に形質導入し、指定されたエフェクター対標的比で高レベルのホタルルシフェラーゼを発現するように操作されたＣＤ１９＋Ｒａｊｉリンパ腫細胞とＮＫＴ細胞を６時間共培養する。ルシフェリンは、生物発光の検出のためのアッセイの終了時に添加する。以下の表１２は、図１８に対応するデータを提示する。

図１９は、ＣＡＲ１９．ｏｐｔｉ－ＩＬ１５二重ノックダウン構築物を形質導入されたＮＫＴ細胞が、インビボでＣＤ１９＋腫瘍を制御し、ＣＡＲ１９．１５ＮＫＴと比較してＮＳＧマウスの生存を促進することを示す。ＮＳＧマウスに、０日目に２×１０^５個のホタルルシフェラーゼ陽性のＤａｕｄｉリンパ腫細胞を静脈注射し、続いて３日目に示される構築物を形質導入されたか、又は構築物を形質導入されていない（非形質導入、ＮＴ）５×１０^６個のＮＫＴを静脈注射する。イメージングの直前に、各マウスは、腹腔内注射により３０ｍｇ／ｍＬで１００μＬのルシフェリンを受け取り、生物発光チャネル下でイメージングされる。生物発光カウントは、６００～３０，０００である。パネルＢは、パネルＡに示されるマウスのカプラン－マイヤー生存曲線である。以下の表１３は、図１９Ｂに対応するデータを提示する。

まとめると、これらの実験により、ＣＡＲ１９．ｏｐｔｉ－ＩＬ１５二重ノックダウン構築物が、ＮＫＴにおける有効なＨＬＡクラスＩ及びＩＩノックダウンを媒介することが実証される。ＣＡＲ１９．ｏｐｔｉ－ＩＬ１５二重ノックダウン構築物を形質導入されたＮＫＴは、ＣＡＲ１９及びＣＡＲ１９．ＩＬ１５ＮＫＴと比較して、同様のレベルのＣＤ１９陽性標的細胞に対するインビトロ細胞傷害性を示す。ＣＡＲ１９．ｏｐｔｉ－ＩＬ１５二重ノックダウン構築物を形質導入されたＮＫＴは、インビボでＣＤ１９＋腫瘍を制御し、ＣＡＲ１９．１５ＮＫＴと比較してＮＳＧマウスの生存を促進する。ＣＡＲ１９．ｏｐｔｉ－ＩＬ１５二重ノックダウン構築物を発現するＮＫＴにおけるＩＬ１５分泌は、元のＣＡＲ１９．１５と比較して低いままである。

実施例６：二重ノックダウン構築物を発現するＮＫＴからのＩＬ１５分泌を促進するために、ＩＬ１５シグナルペプチドをＩＬ２シグナルペプチドに置き換える
二重ノックダウン構築物を発現するＮＫＴ細胞によるＩＬ１５の分泌を増強するために、ＩＬ１５シグナルペプチドを、融合タンパク質の分泌を媒介するために一般的に使用されるＩＬ２シグナルペプチドと置き換える（図２０）。修飾された構築物を発現するＮＫＴによるＩＬ１５分泌を、元の構築物と比較する。ＮＳＧマウスにおける抗腫瘍活性実験もまた、インビボ機能に対する任意の影響を評価するために実行される。

図２１は、ＩＬ２シグナルペプチドが、二重ノックダウン構築物を発現するＮＫＴ細胞によるＩＬ１５分泌を促進することを示す。ＮＫＴ細胞は、示される構築物を形質導入されているか、又は形質導入されておらず、かつ単独で培養されるか、又はＣＤ１９＋Ｒａｊｉリンパ腫細胞と４８時間共培養される。培養上清は、ＩＬ１５分泌を検出するために、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄＥＬＩＳＡＭＡＸ（商標）ＤｅｌｕｘｅＳｅｔＨｕｍａｎＩＬ－１５キット（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ＃４３５１０４）を使用して処理する。表１４は、図２１に対応するデータを提示する。

図２２は、二重ａｍｉＲノックダウンを伴うＩＬ２ＳＰ－ｏｐｔｉＩＬ１５ＣＡＲ１９構築物を発現するＮＫＴのインビボ評価を示す。ＮＳＧマウスに、０日目に２×１０^５個のホタルルシフェラーゼ陽性のＤａｕｄｉリンパ腫細胞を静脈注射し、続いて４日目に示される構築物を形質導入されたか、又は構築物を形質導入されていない（非形質導入、ＮＴ）１×１０^６個又は５×１０^６個のＮＫＴを静脈注射する。イメージングの直前に、各マウスは、腹腔内注射により３０ｍｇ／ｍＬで１００μＬのルシフェリンを受け取り、生物発光チャネル下でイメージングされる。生物発光カウントは、６００～３０，０００である。

図２３は、ＩＬ２ＳＰが、二重ノックダウン構築物を発現するＣＡＲＮＫＴで処置したマウスの生存期間を延長することなく、ＮＳＧマウスにおける腫瘍進行を遅らせるように見えることを示す。ＮＳＧマウスに、０日目に２×１０^５個のホタルルシフェラーゼ陽性のＤａｕｄｉリンパ腫細胞を静脈注射し、続いて３日目に示される構築物を形質導入されたか、又は構築物を形質導入されていない（非形質導入、ＮＴ）５×１０^６個のＮＫＴを静脈注射する。イメージングの直前に、各マウスは、腹腔内注射により３０ｍｇ／ｍＬで１００μＬのルシフェリンを受け取り、生物発光チャネル下でイメージングされる。生物発光カウントは、２０００～３０，０００である。パネルＢは、パネルＡに示されるマウスのカプラン－マイヤー生存曲線である。以下の表１５は、図２３Ｂに対応するデータを提示する。

まとめると、これらの実験により、ＩＬ２シグナルペプチドが二重ノックダウン構築物を発現するＮＫＴによるＩＬ１５分泌を促進することが示される。ＩＬ２ＳＰは、二重ノックダウン構築物を発現するＣＡＲＮＫＴで処置したマウスにおける腫瘍進行を遅らせ得る。

実施例７：混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を介した二重ノックダウン構築物を発現するＮＫＴの同種異系性の評価
ＨＬＡクラスＩ及びＩＩの発現をノックダウンする究極の目的は、形質導入されたＮＫＴの同種異系性を低減し、それによって、同種異系患者内のこれらの細胞に関する拒絶反応を防止又は遅延させ、治療時間枠を増加させることである。

ａｍｉＲ構築物によって媒介されるＨＬＡノックダウンがＮＫＴ同種異系性にどのように影響するかを決定するために、いくつかの混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を、ＣＡＲ１９．ＩＬ２ＳＰ－ｏｐｔｉ１５二重ノックダウン（ＣＡＲ１９．ＩＬ２ＳＰ－ｏｐｔｉ１５．ａｍｉＲ－Ｂ２Ｍ－ａｍｉＲ－ＣＩＩＴＡ）ＮＫＴをＨＬＡ不一致のＮＫ細胞、Ｔ細胞、又はＰＢＭＣと共培養することによって実行する。共培養中の複数の時点で、ＮＫＴ細胞数、ＣＡＲ発現、及びＨＬＡ発現を評価して、ＮＫＴが同種異系免疫細胞の存在下で持続することができるか否かを決定する。並行して、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡｓｈＲＮＡ配列の代わりにスクランブルｓｈＲＮＡ配列を有するＣＡＲ１９．ＩＬ２ＳＰ－ｏｐｔｉ１５ＮＫＴ（ＣＡＲ１９．ＩＬ２ＳＰ－ｏｐｔｉ１５．ａｍｉＲ－ＳＣＲ－ａｍｉＲ－ＳＣＲ）、並びにＢ２Ｍ及びＣＩＩＴＡがノックアウトされたＮＫＴ（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を介して特異的ガイドＲＮＡによって媒介される）を使用して、同じ共培養を実行する。

加えて、同種異系Ｔ細胞及びＰＢＭＣ拒絶反応を含む、いくつかのインビボＭＬＲ拒絶反応アッセイを実行する。これらの実験では、ＨＬＡ不一致レシピエントＴ細胞又はＰＢＭＣをＮＳＧマウス（ＰＢＭＣの場合はＭＨＣヌル）に注射し、４日後にＢ２Ｍ／ＣＩＩＴＡｓｈＲＮＡ又はスクランブル配列ｓｈＲＮＡを含むａｍｉＲ二重ノックダウン構築物を発現するドナーＮＫＴ細胞を注入する。Ｔ細胞拒絶反応モデルはまた、ＣＤ１９＋Ｄａｕｄｉリンパ腫腫瘍を有するマウスの文脈において評価される。

図２４に示すように、Ｂ２Ｍ／ＣＩＩＴＡ二重ノックダウン構築物を発現するＮＫＴは、同種異系ＮＫ細胞の存在下で持続するが、二重ノックアウトは、インビトロＭＬＲにおいてＮＫＴをＮＫ細胞死滅に対して脆弱なままとする。受容体ＮＫ細胞（ＨＬＡ－Ａ２＋）を、ＮＫ細胞単離キット（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃｈ）を使用して単離し、ドナーＮＫＴ（ＨＬＡ－Ａ２－）と１：１の比で３日間共培養する。ＮＫＴに、１）Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡの代わりに２つのスクランブルｓｈＲＮＡ配列を含むＣＡＲ１９．１５（ＣＡＲ１９．ＩＬ２ＳＰ－ｏｐｔｉ１５．ａｍｉＲ－ＳＣＲ－ａｍｉＲ－ＳＣＲ、スクランブル）、２）ａｍｉＲ埋込Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡｓｈＲＮＡ配列を含むＣＡＲ１９．１５（ＣＡＲ１９．ＩＬ２ＳＰ－ｏｐｔｉ１５．ａｍｉＲ－Ｂ２Ｍ－ａｍｉＲ－ＣＩＩＴＡ、ノックダウン）、３）Ｂ２Ｍ／ＣＩＩＴＡ二重ノックアウトを有するＮＫＴを形質導入する。ＮＫＴは、ＨＬＡＩ－細胞上でゲートされたＣＡＲ及びＨＬＡ発現について、フローサイトメトリーによって毎日評価する。以下の表１６は、図２４に対応するデータを提示する。

図２５に示すように、Ｂ２Ｍ／ＣＩＩＴＡ二重ノックダウン構築物を発現するＮＫＴは、インビトロＭＬＲにおいてスクランブルｓｈＲＮＡ対照構築物を担持するＮＫＴと比較して、同種異系Ｔ細胞による拒絶反応に抵抗する。ナイーブ汎Ｔ細胞（ｐａｎＴｃｅｌｌ）単離キットを使用して、汎Ｔ細胞をレシピエントＰＢＭＣから単離し、ヒト（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃｈのレシピエントＴ細胞（ＨＬＡ－Ａ２＋）をドナーＮＫＴ（ＨＬＡ－Ａ２－）と２：１（Ｔ：ＮＫＴ）の比で７日間共培養する。ＮＫＴに、１）ＣＡＲ１９．１５スクランブルｓｈＲＮＡ対照、２）二重ノックダウンを有するＣＡＲ１９．１５、３）Ｂ２Ｍ／ＣＩＩＴＡ二重ノックアウトを有するＮＫＴを形質導入する。ＮＫＴを、２～３日ごとにフローサイトメトリーによって評価する。以下の表１７及び１８は、図２５に対応するデータを提示する。

図２６に示すように、Ｂ２Ｍ／ＣＩＩＴＡ二重ノックダウン構築物を発現するＮＫＴは、インビトロＭＬＲにおいてスクランブルｓｈＲＮＡ対照構築物を担持するＮＫＴと比較して、同種異系ＰＢＭＣによる拒絶反応に抵抗する。レシピエントのＰＢＭＣ（ＨＬＡ－Ａ２＋）をドナーＮＫＴ（ＨＬＡ－Ａ２－）と１０：１（ＰＢＭＣ：ＮＫＴ）の比で７日間共培養する。ＮＫＴに、１）スクランブルｓｈＲＮＡ対照を有するＣＡＲ１９．１５、又は２）二重ノックダウンを有するＣＡＲ１９．１５を形質導入する。ＮＫＴ細胞を、２～３日ごとにフローサイトメトリーによって評価する。以下の表１９及び２０は、図２６に対応するデータを提示する。

図２７に示すように、Ｂ２Ｍ／ＣＩＩＴＡ二重ノックダウン構築物を発現するＮＫＴは、同種異系ＮＫ細胞による死滅に抵抗するが、二重ノックアウトは、インビトロＭＬＲにおけるＮＫ細胞死滅に対してＮＫＴを脆弱なままとする。レシピエントＮＫ細胞（ＨＬＡ－Ａ２＋）を、ＮＫ細胞単離キット（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃｈ）を使用して単離し、単離後、２：１（ＮＫ：ＮＫＴ）の比で２日間ドナーＮＫＴ（ＨＬＡ－Ａ２－）と共培養する。ＮＫＴに、１）スクランブルｓｈＲＮＡ配列（Ｓｃｒ）を有するＣＡＲ１９．ＩＬ２ＳＰ－ｏｐｔｉ１５、２）二重ノックダウン（ＫＤ）を有するＣＡＲ１９．ＩＬ２ＳＰ－ｏｐｔｉ１５、３）二重ノックアウト（ＫＯ）を有するＣＡＲ１９．ＩＬ２ＳＰ－ｏｐｔｉ１５を形質導入する。Ａ）共培養の０日目及び２日目のドナーＮＫＴ細胞の総頻度を示す代表的なフロープロット。共培養の０日目及び２日目のＢ）ドナーＮＫＴ細胞及びＣ）レシピエントＮＫ細胞の絶対細胞カウント。全てのデータは平均値±標準偏差を示し、３つの独自のドナー－レシピエントペアを使用する。Ｐ値は、多重比較のためのＳｉｄａｋ補正を伴う双方向ＡＮＯＶＡを使用して決定し、有意ではない（Ｐ＞０．０５）値は示さない。Ｐ値は、両側対合スチューデントｔ検定を使用して決定する。以下の表２１は、図２７Ａに対応するデータを提示する。以下の表２２は、図２７Ｂに対応するデータを提示する。

図２８に示すように、Ｂ２Ｍ／ＣＩＩＴＡ二重ノックダウン構築物を発現するＮＫＴは、インビトロＭＬＲにおいてスクランブルｓｈＲＮＡ対照構築物を担持するＮＫＴと比較して、同種異系Ｔ細胞による拒絶反応に抵抗する。ナイーブ汎Ｔ細胞単離キット、ヒト（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃｈ）を使用して、汎Ｔ細胞をレシピエントＰＢＭＣ（ＨＬＡ－Ａ２＋）から単離する。次いで、精製したＴ細胞をＯＫＴ３／αＣＤ２８で２４時間刺激し、インビトロで５～１０日間増殖させ、２日間ドナーＮＫＴ（ＨＬＡ－Ａ２－）と２：１（Ｔ：ＮＫＴ）の比で共培養する。ＮＫＴに、１）スクランブルｓｈＲＮＡ配列（Ｓｃｒ）を有するＣＡＲ１９．ＩＬ２ＳＰ－ｏｐｔｉ１５、２）二重ノックダウン（ＫＤ）を有するＣＡＲ１９．ＩＬ２ＳＰ－ｏｐｔｉ１５、３）二重ノックアウト（ＫＯ）を有するＣＡＲ１９．ＩＬ２ＳＰ－ｏｐｔｉ１５を形質導入する。Ａ）共培養の０日目及び２日目のドナーＮＫＴ細胞の総頻度を示す代表的なフロープロット。共培養の２日目のＢ）ドナーＮＫＴ細胞及びＣ）レシピエントＴ細胞の絶対細胞カウント。全てのデータは平均値±標準偏差を示し、５つの独自のドナー－レシピエントペアを使用する。Ｐ値は、多重比較のためのＳｉｄａｋ補正を伴う双方向ＡＮＯＶＡを使用して決定し、有意ではない（Ｐ＞０．０５）値は示さない。以下の表２３は、図２８Ａに対応するデータを提示する。以下の表２４は、図２８Ｂに対応するデータを提示する。

図２９に示すように、Ｂ２Ｍ／ＣＩＩＴＡ二重ノックダウン構築物を発現するＮＫＴは、インビトロＭＬＲにおいてスクランブルｓｈＲＮＡ対照構築物を担持するＮＫＴと比較して、同種異系ＰＢＭＣによる拒絶反応に抵抗する。レシピエントの全ＰＢＭＣ（ＨＬＡ－Ａ２＋）をドナーＮＫＴ（ＨＬＡ－Ａ２－）と１０：１（ＰＢＭＣ：ＮＫＴ）の比で９日間共培養する。ＮＫＴに、１）スクランブルｓｈＲＮＡ配列（Ｓｃｒ）を有するＣＡＲ１９．ＩＬ２ＳＰ－ｏｐｔｉ１５、２）二重ノックダウン（ＫＤ）を有するＣＡＲ１９．ＩＬ２ＳＰ－ｏｐｔｉ１５、３）二重ノックアウト（ＫＯ）を有するＣＡＲ１９．ＩＬ２ＳＰ－ｏｐｔｉ１５を形質導入する。Ａ）共培養の０日目及び９日目のドナーＮＫＴ細胞の総頻度を示す代表的なフロープロット。共培養の０日目、３日目、６日目、及び９日目のＢ）ドナーＮＫＴ細胞及びＣ）レシピエント細胞の絶対細胞カウント。全てのデータは平均値±標準偏差を示し、３つの独自のドナー－レシピエントペアを使用する。Ｐ値は、多重比較のためのＳｉｄａｋ補正を伴う双方向ＡＮＯＶＡを使用して決定し、有意ではない（Ｐ＞０．０５）値は示さない。Ｐ値は、両側対合スチューデントｔ検定を使用して決定する。以下の表２５は、図２９Ａに対応するデータを提示する。以下の表２６は、図２９Ｂに対応するデータを提示する。

図３０に示すように、Ｂ２Ｍ／ＣＩＩＴＡ二重ノックダウン構築物を発現するＮＫＴは、インビボＴ細胞媒介性拒絶反応モデルにおけるスクランブル対照ＮＫＴと比較して、同種異系Ｔ細胞の存在下でインビボで持続する。Ａ）ＮＳＧマウスは、－１日目に１．２Ｇｙで照射され、翌日にＨＬＡ－Ａ２－レシピエントから７×１０６個のインビトロ拡張ヒトＴ細胞（初回ＯＫＴ３／αＣＤ２８刺激後５～１０日目）を受け取った。４日後、マウスは、２×１０^６個の対照構築物（ＣＡＲ１９．ＩＬ２ＳＰ－ｏｐｔｉ１５．ａｍｉＲ－ＳＣＲ－ａｍｉＲ－ＳＣＲ）又はノックダウン構築物（ＣＡＲ１９．ＩＬ２ＳＰ－ｏｐｔｉ１５．ａｍｉＲ－ｂ２ｍ－ａｍｉＲ－ｃｉｉｔａ）を形質導入されたＮＫＴをＨＬＡ－Ａ２＋ドナーから静脈内に受け取った。ＲＴＣ＝レシピエントＴ細胞。Ｂ）６日目及び２８日目の末梢血中のドナーＨＬＡ－Ａ２＋Ｓｃｒ対照又は二重ＫＤＮＫＴ細胞の頻度を示す代表的なフロープロット。指定された時点でのＣ）ドナーＨＬ－Ａ２＋ＮＫＴ細胞及びＤ）レシピエントＨＬＡ－Ａ２－Ｔ細胞の頻度。データは、群当たり７～８匹のマウスの平均±ＳＤを示す。以下の表２７は、図３０のパネルＣに対応するデータを提示する。以下の表２８は、図３０のパネルＤに対応するデータを提示する。

図３１に示すように、Ｂ２Ｍ／ＣＩＩＴＡ二重ノックダウン構築物を発現するＮＫＴは、インビボＰＢＭＣ媒介性拒絶反応モデルにおけるスクランブル対照ＮＫＴと比較して、同種異系ＰＢＭＣの存在下でインビボで持続する。Ａ）ＮＳＧ（ＭＨＣ^ＫＯ）マウスには、－１日目に１．２Ｇｙで再照射し、次いで、０日目にＨＬＡ－Ａ２－レシピエントから静脈内に５×１０^６個の新たに単離されたＰＢＭＣを受け取った。４日後、ＨＬＡ－Ａ２＋ドナーからの５×１０^６個のスクランブル対照又は二重ノックダウン形質導入ＮＫＴを静脈内投与する。Ｂ）６日目及び２０日目の末梢血中のドナーＨＬＡ－Ａ２＋Ｓｃｒ対照又は二重ＫＤＮＫＴ細胞の頻度を示す代表的なフロープロット。指定された時点でのＣ）ドナーＨＬ－Ａ２＋ＮＫＴ細胞及びＤ）レシピエントＨＬＡ－Ａ２－Ｔ細胞の頻度。データは、群当たり７～８匹のマウスの平均±ＳＤを示す。以下の表２９は、図３１のパネルＣに対応するデータを提示する。以下の表３０は、図３１のパネルＤに対応するデータを提示する。

図３２に示すように、Ｂ２Ｍ／ＣＩＩＴＡ二重ノックダウン構築物を発現するＮＫＴは、Ｂ細胞リンパ腫異種移植片を有するインビボＴ細胞媒介性拒絶反応モデルにおけるスクランブル対照ＮＫＴと比較して、同種異系Ｔ細胞の存在下でインビボで持続し、かつ強力な抗腫瘍活性を媒介する。ＮＳＧマウスは、１．２Ｇｙで照射し、翌日にＨＬＡ－Ａ２レシピエントから静脈内に７×１０６個のインビトロ拡張ヒトＴ細胞（初回ＯＫＴ３／αＣＤ２８刺激後８～１０日目）を受け取った。１日後、２×１０５個のホタルルシフェラーゼ陽性のＤａｕｄｉ細胞を静脈注射し、次いで、３日後に、５×１０６個のスクランブル対照又はノックダウン形質導入ＮＫＴをＨＬＡ－Ａ２＋ドナーから生成する。ＲＴＣ＝レシピエントＴ細胞。Ｂ）６日目及び２８日目の末梢血中のドナーＨＬＡ－Ａ２＋スクランブル対照又は二重ＫＤＮＫＴ細胞の頻度を示す代表的なフロープロット。腫瘍注射後の末梢血中のＣ）ＨＬＡ－Ａ２＋ドナーＣＡＲＮＫＴ細胞及びＤ）ＨＬＡ－Ａ２－ＲＴＣの頻度。Ｅ）特定の時点でＩＶＩＳイメージングを用いて測定したリンパ腫の進行。Ｆ）各実験群におけるマウスの生存を示すカプラン－マイヤー曲線。Ｐ値は、両側ログランク検定を使用して決定される。以下の表３１は、図３２ＡのパネルＣに対応するデータを提示する。以下の表３２は、図３２ＡのパネルＤに対応するデータを提示する。表３３は、図３２ＢのパネルＦに対応するデータを提示する。

まとめると、これらの実験により、Ｂ２Ｍ／ＣＩＩＴＡ二重ノックダウン構築物（ＣＡＲ１９．ＩＬ２ＳＰ－ｏｐｔｉ１５．ａｍｉＲ－Ｂ２Ｍ－ａｍｉＲ－ＣＩＩＴＡ）を発現するＮＫＴは同種異系ＮＫ細胞による死滅に抵抗するが、Ｂ２ＭノックアウトはＮＫＴをＮＫ細胞死滅に対して脆弱なままとすることが実証される。Ｂ２Ｍ／ＣＩＩＴＡ二重ノックダウン構築物を発現するＮＫＴは、スクランブルｓｈＲＮＡ対照構築物（ＣＡＲ１９．ＩＬ２ＳＰ－ｏｐｔｉ１５．ａｍｉＲ－ｓｃｒ－ａｍｉＲ－ｓｃｒ）を担持するＮＫＴと比較して、同種異系Ｔ細胞による拒絶反応に抵抗する。二重ノックダウン構築物を発現するＮＫＴは、Ｔ細胞及びＰＢＭＣ媒介性インビボ拒絶反応モデルの両方において、スクランブルｓｈＲＮＡ対照ＮＫＴよりも著しく良好に持続する。二重ノックダウン構築物を発現するＮＫＴは、Ｄａｕｄｉ細胞異種移植片を有するインビボＴ細胞媒介性拒絶反応モデルにおいて強力な抗腫瘍活性を保持する。

実施例８：ＮＫＴにおけるＨＬＡクラスＩ／ＩＩノックダウン及びＣＡＲ．ＧＰＣ３との共発現のためのａｍｉＲ対ＰｏｌＩＩＩプロモーター駆動ｓｈＲＮＡ
実験は、ＣＡＲ．ＧＰＣ３内からのＢ２Ｍ－ｓｈＲＮＡ配列の発現を支持するためにａｍｉＲ足場（例えば、ａｍｉＲ１５５及びａｍｉＲ３０）を使用することの実現可能性を評価するために実施する。いくつかの代表的なＣＡＲ．ＧＰＣ３構築物は、例えば、図３３に記載される。目的は、このアプローチが、ＣＡＲ発現への影響及び形質導入ＮＫＴにおけるＨＬＡクラスＩ及び／又はＩＩの発現を効果的に抑制する能力の点で、ポリメラーゼＩＩＩプロモーター駆動ｓｈＲＮＡの使用とどのように比較するかを評価することである。

これらの実験により、ＣＡＲ．ＧＰＣ３構築物の３’末端にプロモーター駆動ｓｈＲＮＡ又はｍｉＲ駆動ｓｈＲＮＡのいずれかを組み込むと、ｓｈＲＮＡ特異性にかかわらず、ＣＡＲ発現のレベルが同様に低下することが実証されることが予想される。ＣＡＲ．ＧＰＣ３内からのａｍｉＲ１５５によって支持されるＢ２ＭｓｈＲＮＡ発現は、Ｕ６、Ｈ１、及び７ＳＫポリメラーゼＩＩＩ駆動プロモーターと比較して、最大レベルのＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃノックダウンをもたらす。ａｍｉＲ１５５－Ｂ２ＭｓｈＲＮＡ構築物は、Ｕ６－Ｂ２ＭｓｈＲＮＡ構築物と比較して、ＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃの発現のより効果的かつ安定した抑制を媒介する。ａｍｉＲ３０－Ｂ２ＭｓｈＲＮＡ構築物が、形質導入の７日後に評価したＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ発現の効果的な抑制を媒介し、ａｍｉＲ１５５－Ｂ２ＭｓｈＲＮＡ構築物と同程度のノックダウンを実証する。

実施例９：二重ノックダウン構築物の評価：ＣＡＲ．ＧＰＣ３及び最適化されたＩＬ１５と共発現したａｍｉＲ埋込ｓｈＲＮＡ配列
同種異系患者におけるＣＡＲ．ＧＰＣ３ＮＫＴ細胞の拒絶反応を最小限に抑えるために、構築物を、ａｍｉＲ埋込ｓｈＲＮＡ配列を用いてＢ２Ｍ（クラスＩ）及びＣＩＩＴＡ（クラスＩＩ）を標的とするＨＬＡクラスＩ及びＩＩを同時にノックダウンするように設計する。最良の性能のＢ２Ｍ及びＣＩＩＴＡ特異的ｓｈＲＮＡを、二重ノックダウン構築物に含まれるように単一のノックダウンスクリーニングで選択及び評価する。Ｂ２ＭｓｈＲＮＡ標的配列は、ＡＮＣＨＯＲ生成物で使用されるものと同じであり、ａｍｉＲ３０内に埋め込まれ、ＣＩＩＴＡｓｈＲＮＡ候補＃６は、ａｍｉＲ１５５内に埋め込まれている。コドン最適化されたＩＬ１５はまた、以前の実験からの所見に基づいて、この構築物を形質導入されたＮＫＴ細胞によるＩＬ１５分泌を最大化するために組み込まれる。

この二重ノックダウン構築物によって媒介されるＨＬＡクラスＩ及びＩＩノックダウンの有効性を形質導入ＮＫＴ細胞で評価する。ＩＬ１５ＥＬＩＳＡもまた、追加のａｍｉＲ－ｓｈＲＮＡの存在がＩＬ１５の発現又は分泌に影響を及ぼすか否かを決定するために実行される。更に、この構築物を発現するＮＫＴ細胞の抗腫瘍活性も、関連するインビトロ及びインビボモデルで評価される。

これらの実験により、ＣＡＲ．ＧＰＣ３．ｏｐｔｉ－ＩＬ１５二重ノックダウン構築物が、ＮＫＴ細胞における有効なＨＬＡクラスＩ及びＩＩノックダウンを媒介することが実証されることが予想される。ＣＡＲ．ＧＰＣ３．ｏｐｔｉ－ＩＬ１５二重ノックダウン構築物を形質導入されたＮＫＴ細胞は、ＣＡＲ．ＧＰＣ３及びＣＡＲ．ＧＰＣ３．ＩＬ１５ＮＫＴと比較して、同様のレベルのＧＰＣ３陽性標的細胞に対するインビトロ細胞傷害性を示す。ＣＡＲ．ＧＰＣ３．ｏｐｔｉ－ＩＬ１５二重ノックダウン構築物を形質導入されたＮＫＴは、インビボでＧＰＣ３＋腫瘍を制御し、ＣＡＲ．ＧＰＣ３．１５ＮＫＴと比較してＮＳＧマウスの生存を促進する。ＣＡＲ．ＧＰＣ３．ｏｐｔｉ－ＩＬ１５二重ノックダウン構築物を発現するＮＫＴにおけるＩＬ１５分泌は、元のＣＡＲ．ＧＰＣ３．１５と比較して低いままである。

実施例１０：混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を介した二重ノックダウン構築物を発現するＣＡＲ．ＧＰＣ３ＮＫＴの同種異系性の評価
ａｍｉＲ構築物によって媒介されるＨＬＡノックダウンがＮＫＴ同種異系性にどのように影響するかを決定するために、いくつかの混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を、ＣＡＲ．ＧＰＣ３．ＩＬ２ＳＰ－ｏｐｔｉ１５二重ノックダウン（ＣＡＲ．ＧＰＣ３．ＩＬ２ＳＰ－ｏｐｔｉ１５．ａｍｉＲ－Ｂ２Ｍ－ａｍｉＲ－ＣＩＩＴＡ）ＮＫＴをＨＬＡ不一致のＮＫ細胞、Ｔ細胞、又はＰＢＭＣと共培養することによって実行する。共培養中の複数の時点で、ＮＫＴ細胞数、ＣＡＲ発現、及びＨＬＡ発現を評価して、ＮＫＴが同種異系免疫細胞の存在下で持続することができるか否かを決定する。並行して、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡｓｈＲＮＡ配列の代わりにスクランブルｓｈＲＮＡ配列を有するＣＡＲ．ＧＰＣ３．ＩＬ２ＳＰ－ｏｐｔｉ１５ＮＫＴ（ＣＡＲ．ＧＰＣ３．ＩＬ２ＳＰ－ｏｐｔｉ１５．ａｍｉＲ－ＳＣＲ－ａｍｉＲ－ＳＣＲ）、並びにＢ２Ｍ及びＣＩＩＴＡがノックアウトされたＮＫＴ（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を介して特異的ガイドＲＮＡによって媒介される）を使用して、同じ共培養を実行する。

加えて、同種異系Ｔ細胞及びＰＢＭＣ拒絶反応を含む、いくつかのインビボＭＬＲ拒絶反応アッセイを実行する。これらの実験では、ＨＬＡ不一致レシピエントＴ細胞又はＰＢＭＣをＮＳＧマウス（ＰＢＭＣの場合はＭＨＣヌル）に注射し、４日後にＢ２Ｍ／ＣＩＩＴＡｓｈＲＮＡ又はスクランブル配列ｓｈＲＮＡを含むａｍｉＲ二重ノックダウン構築物を発現するドナーＮＫＴ細胞を注入する。Ｔ細胞拒絶反応モデルはまた、ＧＰＣ３＋Ｄａｕｄｉリンパ腫腫瘍を有するマウスの文脈において評価される。

これらの実験により、Ｂ２Ｍ／ＣＩＩＴＡ二重ノックダウン構築物（ＣＡＲ．ＧＰＣ３．ＩＬ２ＳＰ－ｏｐｔｉ１５．ａｍｉＲ－Ｂ２Ｍ－ａｍｉＲ－ＣＩＩＴＡ）を発現するＮＫＴは同種異系ＮＫ細胞による死滅に抵抗するが、Ｂ２ＭノックアウトはＮＫＴをＮＫ細胞死滅に対して脆弱なままとすることが実証されることが予想される。Ｂ２Ｍ／ＣＩＩＴＡ二重ノックダウン構築物を発現するＮＫＴは、スクランブルｓｈＲＮＡ対照構築物（ＣＡＲ．ＧＰＣ３．ＩＬ２ＳＰ－ｏｐｔｉ１５．ａｍｉＲ－ｓｃｒ－ａｍｉＲ－ｓｃｒ）を担持するＮＫＴと比較して、同種異系Ｔ細胞による拒絶反応に抵抗する。二重ノックダウン構築物を発現するＮＫＴは、Ｔ細胞及びＰＢＭＣ媒介性インビボ拒絶反応モデルの両方において、スクランブルｓｈＲＮＡ対照ＮＫＴよりも著しく良好に持続する。二重ノックダウン構築物を発現するＮＫＴは、Ｄａｕｄｉ細胞異種移植片を有するインビボＴ細胞媒介性拒絶反応モデルにおいて強力な抗腫瘍活性を保持する。

実施例１１：ＣＡＲ．ＧＰＣ３．ｏｐｔｉ－ＩＬ１５二重ノックダウン構築物を発現するＮＫＴ細胞の評価
ＣＡＲ．ＧＰＣ３．ｏｐｔｉ－ＩＬ１５二重ノックダウン構築物の例を図３３に示す。構築物は、ＧＣ３３由来のＧＰＣ３特異的ｓｃＦｖ又はヒト化ＹＰ７由来のｓｃＦｖのいずれかをコードする配列を含む。図３４は、ヒト化ＧＰＣ３ｓｃＦｖ（ＹＰ７）又はマウスＧＰＣ３ｓｃＦｖ（ＧＣ３３）のいずれかを発現するＣＡＲ．ＧＰＣ３ＮＫＴ細胞において、同様のレベルのＨＬＡクラスＩ又はクラスＩＩ遺伝子ノックダウンが観察されることを示す。

ＣＡＲ．ＧＰＣ３ＮＫＴ細胞によるＩＬ－１５産生は、ベースラインで（非刺激）又はＧＰＣ３陽性Ｈｕｈ－７、ＨｅｐＧ２、又はＡ５４９細胞による刺激後に測定される。図３５は、１つの実験において、マウスＧＰＣ３ｓｃＦｖ（ＧＣ３３）二重ノックダウン構築物を発現するＮＫＴ細胞は、ヒト化ＧＰＣ３ｓｃＦｖ（ＹＰ７）二重ノックダウン構築物を発現するＮＫＴ細胞よりも多くＩＬ－１５を分泌することを示す。以下の表３４は、図３５に対応するデータを提示する。図３６は、別の実験において、ＧＣ３３二重ノックダウン構築物を発現するＮＫＴ細胞が、ｘＣｅｌｌｉｇｅｎｃｅアッセイによって測定して、ＹＰ７二重ノックダウン構築物を発現するＮＫＴ細胞よりも高い細胞傷害性レベルを示すことを示す。図３７に示すように、ＨＣＣ異種移植片モデルにおいて、ヒト化ｓｃＦｖＹＰ７二重ノックダウン構築物又はＧＣ３３二重ノックダウン構築物を発現するＮＫＴ細胞を評価するために、実験を実施する。以下の表３５は、図３７に対応するデータを提示する。

実施例１２：ＣＡＲの上流にＩＬ－１５を配置することにより、トランスジェニックＩＬ－１５遺伝子発現が増強される
図３８は、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡを標的とするａｍｉＲ構築物を発現するＣＡＲ．ＧＰＣ３ＮＫＴ細胞が、より低いレベルのこれらの標的遺伝子を発現するが、ＩＬ１５を含むＣＡＲ．ＧＰＣ３ＮＫＴ細胞は、より高いレベルの天然ＩＬ１５を発現することを示す。以下の表３６は、図３８に対応するデータを提示する。

トランスジェニックＩＬ－１５遺伝子発現レベルに対する、ＣＡＲ．ＧＰＣ３の上流にＩＬ－１５を配置する効果を試験するために、代替構築物を調製する。図３９は、ＣＡＲ．ＧＰＣ３の上流にＩＬ－１５コード配列を配置することにより、トランスジェニックＩＬ－１５遺伝子の発現レベルが増強されることを示す。以下の表３７は、図３９に対応するデータを提示する。

実施例１３：ＣＡＲ．ＧＰＣ３ＮＫＴ細胞における全般的遺伝子発現に対するＢ２Ｍ及びＣＩＩＴＡノックダウンの効果の評価
ヒト化ＹＰ７又はマウスＧＰＣ３発現ＣＡＲ．ＧＰＣ３ＮＫＴ細胞に対する、ａｍｉＲによるＨＬＡクラスＩ及びクラスＩＩの二重ノックダウンの効果を調べるために、全般的な差次的遺伝子発現を分析する。以下の表３８は、４人のドナーにおいて分析された上方調節又は下方調節された遺伝子の数をまとめたものである。

図４０は、１５Ｇ２８ＢＢｚ発現ＮＫＴ細胞と比較して、Ｇ．２８ＢＢｚ．１５．ｍｉＲ発現ＮＫＴ細胞において下方調節されるＨＬＡ特異的遺伝子を示すヒートマップを提示する。以下の表３９は、負に調節された遺伝子をまとめたものである。表４０は、図４０に対応するデータを提示する。

図４１は、１５Ｇ２８ＢＢｚ発現ＮＫＴ細胞と比較して、ＹＰ７．２８ＢＢｚ．１５．ｍｉＲ発現ＮＫＴ細胞において下方調節されるＨＬＡ特異的及び免疫エフェクター遺伝子を示すヒートマップを提示する。以下の表４１は、負に調節された遺伝子をまとめたものである。以下の表４２は、正に調節された遺伝子をまとめたものである。表４３は、図４１に対応するデータを示す。

図４２は、マウスＧ．２８ＢＢｚ．１５．ｍｉＲ発現ＮＫＴ細胞と比較して、ヒト化ＹＰ７．２８ＢＢｚ．１５．ｍｉＲ発現ＮＫＴ細胞において重要な経路が濃縮されていないことを示すヒートマップである。表４４は、図４２に対応するデータを提示する。

まとめると、これらのデータは、Ｂ２Ｍ／ＣＩＩＴＡ特異的ａｍｉＲ－ｓｈＲＮＡを含むＣＡＲを発現するＮＫＴ細胞と比較して、１５Ｇ２８ＢＢｚＮＫＴ細胞におけるＨＬＡ特異的遺伝子発現のレベルがより低いことを示す。

Claims

腫瘍抗原を認識するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするＤＮＡ配列と、ＭＨＣクラスＩ又はＭＨＣクラスＩＩ遺伝子を標的とする小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）配列をコードするＤＮＡ配列と、を含む、内因性主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）遺伝子の発現を抑制するための組換え構築物であって、前記ｓｈＲＮＡ配列が、人工マイクロＲＮＡ（ａｍｉＲ）足場に埋め込まれている、組換え構築物。
前記腫瘍抗原が、ＣＤ１９、ＧＤ２、又はＧＰＣ３である、請求項１に記載の組換え構築物。
サイトカインをコードするＤＮＡ配列を更に含む、請求項１又は２に記載の組換え構築物。
前記サイトカインが、インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２７、ＩＬ－３３、又はそれらの組み合わせである、請求項３に記載の組換え構築物。
前記サイトカインが、ＩＬ－１５である、請求項４に記載の組換え構築物。
ＩＬ－１５をコードする前記ＤＮＡ配列が、コドン最適化されている、請求項５に記載の組換え構築物。
前記ＩＬ－１５が、ＩＬ－２シグナルペプチドを含む、請求項５又は６に記載の組換え構築物。
前記ａｍｉＲが、ａｍｉＲ１５５又はａｍｉＲ３０である、請求項１～７のいずれか一項に記載の組換え構築物。
前記ｓｈＲＮＡ配列が、少なくとも２１ヌクレオチド長であり、前記ＭＨＣ遺伝子配列の少なくとも２１個の連続したヌクレオチドと同一又は相補的なヌクレオチド配列を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の組換え構築物。
前記ＭＨＣクラスＩ遺伝子が、β２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）をコードする、請求項１～９のいずれか一項に記載の組換え構築物。
前記ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子が、不変鎖（Ｉｉ）又はクラスＩＩトランスアクチベーター（ＣＩＩＴＡ）をコードする、請求項１～１０のいずれか一項に記載の組換え構築物。
前記構築物が、第１のａｍｉＲ足場に埋め込まれた第１のｓｈＲＮＡ配列と、第２のａｍｉＲ足場に埋め込まれた第２のｓｈＲＮＡ配列と、を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の組換え構築物。
前記第１のｓｈＲＮＡ配列が、ＭＨＣクラスＩ遺伝子を標的とし、前記第２のｓｈＲＮＡ配列が、ＭＨＣクラスＩ遺伝子を標的とする、請求項１２に記載の組換え構築物。
前記第１のａｍｉＲ足場及び前記第２のａｍｉＲ足場が、同じａｍｉＲ配列に由来する、請求項１２に記載の組換え構築物。
前記第１のａｍｉＲ足場及び前記第２のａｍｉＲ足場が、異なるａｍｉＲ配列に由来する、請求項１２に記載の組換え構築物。
同種異系宿主の免疫系による操作されたナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞の拒絶反応を制限するための方法であって、ＮＫＴ細胞に、請求項１～１５のいずれか一項に記載の組換え構築物を形質導入することを含み、前記ＮＫＴ細胞における前記内因性ＭＨＣ遺伝子の前記発現が、前記ｓｈＲＮＡによって抑制される、方法。
前記内因性ＭＨＣ遺伝子の発現レベルが、形質導入後２日で少なくとも１０％減少する、請求項１６に記載の方法。
前記内因性ＭＨＣ遺伝子の発現レベルが、形質導入後７日で少なくとも１０％減少する、請求項１６に記載の方法。
前記内因性ＭＨＣ遺伝子の発現レベルが、形質導入後１４日で少なくとも１０％減少する、請求項１６に記載の方法。
前記ＮＫＴ細胞が、ＣＤ１ｄ制限的ＮＫＴ細胞である、請求項１６～１９のいずれか一項に記載の方法。
請求項１～１５のいずれか一項に記載の組換え構築物を形質導入された、操作されたＮＫＴ細胞であって、前記ＮＫＴ細胞における前記内因性ＭＨＣ遺伝子の前記発現が、前記組換え構築物を形質導入されていない対照ＮＫＴ細胞と比較して著しく抑制される、操作されたＮＫＴ細胞。
前記操作されたＮＫＴ細胞が、同種異系Ｔ細胞又はＰＢＭＣによる拒絶反応に対する改善された耐性を有する、請求項２１に記載の操作されたＮＫＴ細胞。
前記操作されたＮＫＴ細胞が、同種異系ナチュラルキラー細胞による破壊に対する改善された耐性を有する、請求項２１に記載の操作されたＮＫＴ細胞。
前記操作されたＮＫＴ細胞が、インビボで抗腫瘍活性を示す、請求項２１に記載の操作されたＮＫＴ細胞。