JP2024512039A - 黄色ブドウ球菌ワクチンの工業的製造方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、生物医学の分野に属し、詳しくは、黄色ブドウ球菌ワクチンの工業的製造方法に関するものである。本発明によって提供される方法は、黄色ブドウ球菌全菌体等の様々な免疫原性成分を含む、品質が安定して管理可能なワクチンを工業的に製造することを保証する。本発明によって製造されるワクチンは、免疫原性が良好であるので、実際の接種量が少ないだけでなく、薬物耐性黄色ブドウ球菌によって引き起こされる様々な感染症を予防することができる。【選択図】 図１
Description
［１］．本発明は、生物医学の分野に属し、詳しくは、黄色ブドウ球菌ワクチンの工業的製造方法に関するものである。
［２］．黄色ブドウ球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）は重要な日和見病原体である。成人群の約２０％が持続的に、さらにその３０％が間欠的に黄色ブドウ球菌を保有している。黄色ブドウ球菌は皮膚や軟部組織の感染症を引き起こすほか、生命を脅かす肺炎、菌血症、及び心内膜炎、化膿性関節炎、骨髄炎等の重大な合併症を引き起こす可能性もある。また、黄色ブドウ球菌の外毒素は、食中毒、表皮水疱症、及び毒素性ショック症候群を引き起こす可能性もある。
［３］．黄色ブドウ球菌感染症の治療には、通常、エリスロマイシン、ペニシリン、ゲンタマイシン、バンコマイシン、又はセファロスポリンＶＩが選択的に用いられる。しかし、抗生物質の乱用による、様々な新しい抗生物質耐性菌株の出現、特にメチシリン耐性黄色ブドウ球菌株（Ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｓ． ａｕｒｅｕｓ， ＭＲＳＡ）の急速な蔓延により、抗生物質のみを利用する黄色ブドウ球菌によって引き起こされる関連疾患の治療はますます信頼できなくなりつつある。ＭＲＳＡによって引き起こされる感染症は、抗生物質を利用する治療が難しく、致死率も高い。そのため、黄色ブドウ球菌ワクチンや免疫治療に対する研究が現在広く行われている。
［４］．黄色ブドウ球菌ワクチンには、全菌体不活化ワクチン、遺伝子組み換えワクチン、サブユニットワクチン、ＤＮＡワクチン等が含まれる。従来の黄色ブドウ球菌ワクチンの製造方法としては、１）抗原として黄色ブドウ球菌の１種又は複数種の成分を抽出して製造する方法であって、主に黄色ブドウ球菌の１種又は複数種の抗原の、原核生物による発現とアジュバントによる吸着とを利用してワクチンを製造する方法、２）黄色ブドウ球菌の莢膜多糖を抽出して精製し、発現された１種又は複数種の黄色ブドウ球菌抗原タンパク質又は他の外因性担体タンパク質を添加してその免疫原性を向上させる方法、３）抗原として黄色ブドウ球菌から分泌された１種又は複数種の外毒素を発現して精製し、担体タンパク質と結合させてその免疫原性を向上させる方法、４）黄色ブドウ球菌の１種又は複数種のタンパク質の抗原決定基のコード配列をプラスミドに挿入し、黄色ブドウ球菌ＤＮＡワクチンを構築する方法、等がある。上記の方法によって製造されたワクチンは、いずれも全菌体ワクチンよりその免疫原性が劣り、毒性タンパク質、保存抗原、防御抗原、莢膜多糖等のほとんどが網羅されていないため、網羅性が不十分で適用範囲が狭いという問題がある。全菌体不活化ワクチンはこれらの問題を克服し、生体における大量の免疫グロブリンの産生を刺激することができる。そのため、従来の技術の欠点を補完し補うことのできるように、免疫性と網羅性が向上し、適用範囲がより広い黄色ブドウ球菌ワクチンを研究することが急務である。
［５］．本発明は、上記事情に鑑み、黄色ブドウ球菌ワクチンの工業的製造方法及び該ワクチンの応用を提供することを目的とする。
［６］．黄色ブドウ球菌ワクチンの工業的製造方法であって、
［７］．Ｓ１ 黄色ブドウ球菌株を適切な培地で培養し、シード液を製造する工程と、
［８］．Ｓ２ 前記シード液を発酵槽に接種して発酵させる工程と、
［９］．Ｓ３ 前記発酵槽内の菌体の密度を監視し、前記発酵槽内の前記菌体が対数増殖期まで達した場合、前記発酵槽内の菌液を採取して遠心力２，０００～４，０００×ｇで直接遠心分離し、１０～３０ｍｉｎ後に前記菌体を収集する工程と、
［１０］．Ｓ４ 前記菌体を等張注射液で再懸濁し、濃度を調整した後、放射線照射を行って前記菌体の増殖活性を失わせる工程であって、前記放射線照射に用いる放射線はＸ線を含む、工程と、
［１１］．Ｓ５ 前記等張注射液で、前記放射線照射が行われた前記菌液の濃度を０．５～１×１０８個／ｍｌに調整し、前記黄色ブドウ球菌ワクチンを得る工程と、を含む、ことを特徴とする工業的製造方法。
［７］．Ｓ１ 黄色ブドウ球菌株を適切な培地で培養し、シード液を製造する工程と、
［８］．Ｓ２ 前記シード液を発酵槽に接種して発酵させる工程と、
［９］．Ｓ３ 前記発酵槽内の菌体の密度を監視し、前記発酵槽内の前記菌体が対数増殖期まで達した場合、前記発酵槽内の菌液を採取して遠心力２，０００～４，０００×ｇで直接遠心分離し、１０～３０ｍｉｎ後に前記菌体を収集する工程と、
［１０］．Ｓ４ 前記菌体を等張注射液で再懸濁し、濃度を調整した後、放射線照射を行って前記菌体の増殖活性を失わせる工程であって、前記放射線照射に用いる放射線はＸ線を含む、工程と、
［１１］．Ｓ５ 前記等張注射液で、前記放射線照射が行われた前記菌液の濃度を０．５～１×１０８個／ｍｌに調整し、前記黄色ブドウ球菌ワクチンを得る工程と、を含む、ことを特徴とする工業的製造方法。
［１２］．さらに、前記Ｓ１は、
［１３］．ａ．前記黄色ブドウ球菌株をトリプティックソイ寒天（Ｔｒｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ Ａｇａｒ， ＴＳＡ）平板に接種して培養し、一次シードを得る工程と、
［１４］．ｂ．前記一次シードをトリプティックソイブロス（Ｔｒｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ Ｂｒｏｔｈ， ＴＳＢ）培地に接種して複数回拡大培養する工程であって、拡大回数は２回以上、毎回の拡大培養における接種の細菌濃度は０．０１～０．１ＯＤ／ｍｌ、接種体積は培養体積の１０％以下、毎回拡大培養したシード液の最終濃度は０．８±０．２ＯＤ／ｍｌである、工程と、を含む。
［１３］．ａ．前記黄色ブドウ球菌株をトリプティックソイ寒天（Ｔｒｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ Ａｇａｒ， ＴＳＡ）平板に接種して培養し、一次シードを得る工程と、
［１４］．ｂ．前記一次シードをトリプティックソイブロス（Ｔｒｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ Ｂｒｏｔｈ， ＴＳＢ）培地に接種して複数回拡大培養する工程であって、拡大回数は２回以上、毎回の拡大培養における接種の細菌濃度は０．０１～０．１ＯＤ／ｍｌ、接種体積は培養体積の１０％以下、毎回拡大培養したシード液の最終濃度は０．８±０．２ＯＤ／ｍｌである、工程と、を含む。
［１５］．さらに、前記Ｓ１は具体的に、ａ．前記黄色ブドウ球菌株をトリプティックソイ寒天（Ｔｒｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ Ａｇａｒ， ＴＳＡ）平板に接種して培養し、一次シードを得る工程と、ｂ．前記一次シードをトリプティックソイブロス（Ｔｒｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ Ｂｒｏｔｈ， ＴＳＢ）培地に接種し、細菌濃度を０．０１～０．１ＯＤ／ｍｌに調整した後、対数増殖期まで拡大培養を行って二次シード液を得る工程と、ｃ．次いで前記二次シード液を新鮮なＴＳＢ培地に接種し、細菌濃度を０．０１～０．１ＯＤ／ｍｌに調整し、引き続き対数増殖期まで拡大培養を行って三次シード液を得る工程と、を含む。実際には、各工程において拡大された体積は、最終工程における拡大要求に応じて調整することができる（例えば、理論的には１００ｍｌから１，０００ｍｌまで、１，０００ｍｌから１０Ｌまで）。菌種（ワーキングシード）の蘇生（前記一次シード）から発酵槽への接種の前に、２回の拡大（即ち、前記二次シード液、前記三次シード液）を行うことも必要である。その理由は、２回の拡大を通じて、細菌が完全に活性化され、より速く増殖するとともに、培養時間を短縮することができるからである。拡大回数が多すぎると、汚染リスクが増加するが、拡大回数が１回だけだと、必要な培養時間が長くなるか、又は菌体の製造量が不十分（規模化が不十分）になる。
［１６］．さらに、前記黄色ブドウ球菌株は、ＡＴＣＣ２５９２３、ＡＴＣＣ３３５９１、ＳＣＰＨ－１８及びＳＣＰＨ－２５から選ばれる１種又は２種以上を含む。
［１７］．前記Ｓ２で接種された前記シード液の細菌濃度は０．０１～０．１ＯＤ／ｍｌである。前記発酵槽は、１Ｌ～２０Ｌの発酵液を含む発酵槽であってもよく、実際の発酵体積は、一般に発酵槽の体積の１／３～１／２である。好ましくは、１０Ｌの発酵槽を選択して発酵を行う。
［１８］．さらに、発酵パラメーターとしては、通気量は３～５Ｌ／ｍｉｎ、回転速度は２００～３００ｒｐｍ、温度は３５～３９℃であり、ｐＨ値と溶存酸素値はオンラインで監視され、菌体の培養は対数増殖期（１．５±０．３ＯＤ／ｍｌ）まで行われる。
［１９］．さらに、Ｓ３では、遠心分離終了後に上清液を捨てて前記菌体を収集する。
［２０］．さらに、Ｓ４では、前記菌体を等張注射液で再懸濁し、０．５～１×１０１０ＣＦＵ／ｍｌの濃度に調整し、前記等張注射液は生理食塩水等の溶液を含む。
［２１］．さらに、前記放射線照射は、線量率が約５～２０Ｇｙ／ｍｉｎ、総線量が約２，０００～３，０００Ｇｙである。
［２２］．さらに、前記放射線照射が行われた前記菌液は、全菌体、核酸、菌体断片及び膜小胞を含む。
［２３］．本発明は、前記のいずれか１項に記載の工業的製造方法によって製造された黄色ブドウ球菌ワクチンを提供する。
［２４］．さらに、前記ワクチンは、黄色ブドウ球菌全菌体ワクチンである。
［２５］．さらに、前記ワクチンは、アジュバントをさらに含む。
［２６］．さらに、前記アジュバントは、アルミニウムアジュバント、ＭＦ５９、ＡＳ０１、ＡＳ０４、ＣｐＧ及びＩＳＡ５１から選ばれる１種又は２種以上を含む。本発明における黄色ブドウ球菌ワクチンは、アジュバント無添加型として製造されてもよく、又は必要に応じてアジュバント添加型として製造されてもよい。
［２７］．さらに、前記ワクチンの剤形は、皮下注射製剤、筋肉注射製剤、経口製剤及び鼻腔吸入製剤から選ばれる１種又は２種以上である。
［２８］．さらに、本発明によって製造された黄色ブドウ球菌ワクチンは、前記放射線照射が行われなかった黄色ブドウ球菌から製造された黄色ブドウ球菌ワクチンと比較して、その細胞外核酸が約２０％増加し、また、本発明によって製造された黄色ブドウ球菌ワクチンは、２～８℃で４週間保存された場合、前記放射線照射の終了時と比較して、その細胞外核酸が５～１５倍増加し得る。
［２９］．前記のいずれか１項に記載の黄色ブドウ球菌ワクチンの、黄色ブドウ球菌によって引き起こされる菌血症を予防又は治療するための薬物の製造への応用。
［３０］．さらに、前記黄色ブドウ球菌ワクチンの免疫手順は、２週間の間隔で３回の皮下接種を行うことを含む。
［３１］．さらに、前記黄色ブドウ球菌ワクチンは、１×１０７個／回～２×１０７個／回の黄色ブドウ球菌全菌体を含む。
［３２］．前記のいずれか１項に記載の黄色ブドウ球菌ワクチンの、黄色ブドウ球菌によって引き起こされる肺炎を予防又は治療するための薬物の製造への応用。
［３３］．さらに、前記黄色ブドウ球菌ワクチンの免疫手順は、２週間の間隔で３回の皮下接種を行うことを含む。
［３４］．さらに、前記黄色ブドウ球菌ワクチンは、１×１０７個／回～２×１０７個／回の黄色ブドウ球菌全菌体を含む。
［３５］．本発明は、従来の技術と比較して、以下の有益な効果を有する。
［３６］．（１）本発明は、Ｘ線を用いて不活化を行うが、Ｘ線は、黄色ブドウ球菌の菌体構造に明らかな破壊を与えず（即ち、Ｘ線は、黄色ブドウ球菌を不活化すると同時に、菌体構造（抗原）の完全性を維持する）、黄色ブドウ球菌全菌体が免疫においてより効果的な抗原になることを保証する。また、Ｘ線は、黄色ブドウ球菌からの核酸放出の増加（即ち、黄色ブドウ球菌からの細胞外核酸のレベル増加）を誘導し、ワクチンの免疫原性を向上させる。さらに、このような黄色ブドウ球菌からの細胞外核酸放出に対するＸ線の誘導作用は、Ｘ線照射を停止しても、照射された黄色ブドウ球菌はまだ時間の経過とともに核酸放出を持続することができる。これに加えて、Ｘ線は黄色ブドウ球菌からの膜小胞放出の増加を誘導することに寄与し、ワクチンの免疫原性をさらに向上させる。
［３７］．（２）本発明に用いる照射方法は、間欠照射、即ち、５～２０Ｇｙ／ｍｉｎの線量率での長時間間欠照射（好ましくは５～１０分間隔）であるので、放射線照射の総線量（≦３，０００Ｇｙ）を減少させ、これによって、大線量の放射線の菌体に対する破壊を回避し、ワクチンの免疫効力及び安全性を向上させる。
［３８］．（３）本発明は、黄色ブドウ球菌全菌体等の様々な免疫原性成分を含む、品質が安定して管理可能なワクチンを工業的に製造するために、黄色ブドウ球菌ワクチンの工業的製造方法を提供する。具体的には、本発明の方法は、工業的製造効率を向上させると同時に、免疫原性物質（例えば、菌体、菌体断片、膜小胞及び核酸）の保持及び有害物質（例えば、外毒素）の除去を確保し、ワクチンの有効性や安全性を向上させる。その中で、菌体断片は遠心分離等の操作により得られる。
［３９］．（４）本発明によって製造されるワクチンは、免疫原性が良好であるので、実際の接種量が少ないだけでなく、薬物耐性黄色ブドウ球菌によって引き起こされる様々な感染症、例えば、黄色ブドウ球菌菌血症、黄色ブドウ球菌肺炎等を予防することができる。さらに、本発明によって製造されるワクチンは、通常、アジュバントを含まなくてもよい（即ち、生体の免疫応答を増強するためのアジュバントを必要としない）が、もちろん、いくつかのシナリオにおいては（例えば、免疫原性が極めて良好な黄色ブドウ球菌ワクチンの製造を必要とする場合）、アジュバントを併用してもよい。上述した良好な免疫原性（ワクチンの防御効力）は、上述したような製造方法のおかげだけでなく、ワクチンに対する実際の免疫手順、即ち、総接種回数を減少させると同時に、免疫間隔を延長させることによっても達成される。本発明は、このような免疫手順がワクチンの実際の効力を向上させることに寄与し、且つ、免疫間隔の延長がワクチンに対する生体の免疫応答規則により合致することを見出した。
［４０］．（５）本発明の技術的解決策においては、Ｘ線を用いた不活化は、従来のホルムアルデヒド不活化や熱不活化と比較して、核酸放出レベルが増加し、且つ、化学残留物がないため、ワクチンの免疫原性を向上させると同時に、化学不活化剤によるアレルギー反応や発癌リスクをある程度回避し、ワクチンの安全性を向上させ、副作用を減少させる。
［４１］．本発明の実施形態又は従来の技術における技術的解決策をより明確に説明するために、以下、実施形態又は従来の技術の説明で使用される添付の図面を簡単に紹介する。明らかに、以下の説明における図面は、本発明のいくつかの実施形態であり、当業者にとって、創造的な努力なしにこれらの図面から他の図面を取得することもできる。
［４７］．本発明の実施形態の目的、技術的解決策及び利点をより明確にするために、以下、本発明の実施形態における技術的解決策を添付図面と共に明確かつ完全に説明する。なお、記載した実施形態は、本発明の実施形態の一部であり、その全てではないことは明らかである。本発明における実施形態に基づき、当業者が創意工夫をすることなく得られる他のすべての実施形態は、本発明の保護範囲に含まれる。
［４８］．注意すべきことは、ここにおいて、「含む」、「包含する」、又はそれらの任意の他の変形語という用語は、非排他的な包含をカバーすることを意図しているということである。したがって、一連の要素を含むプロセス、方法、物品、又は装置は、それらの要素だけでなく、明示的に列挙されていない他の要素、又はそのようなプロセス、方法、物品、又は装置に固有の要素も含む。さらなる限定がない場合は、「一つの……を含む」という語句によって限定される要素は、その要素を含むプロセス、方法、物品、又は装置における追加の同一要素の存在を排除しない。
［４９］．例えば、本明細書で使用される「約」という用語は、典型的には記載された値の＋／－５％、より典型的には該当値の＋／－４％、より典型的には該当値の＋／－３％、より典型的には該当値の＋／－２％、さらに典型的には該当値の＋／－１％、さらに典型的には該当値の＋／－０．５％として表示される。
［５０］．本明細書では、特定の実施形態をある範囲内の形式で開示することができる。この「ある範囲内」の説明は、ただ便宜や簡潔さを図るためのものであり、開示された範囲に対する柔軟性のない制限として解釈されるべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の説明は、その範囲内の個々の数値だけでなく、すべての可能な部分範囲を具体的に開示したと見なされるべきである。例えば、１から６の範囲の説明は、１から３、１から４、１から５、２から４、２から６、３から６、など、及びこの範囲内の１、２、３、４、５、及び６などの個々の番号を具体的に開示したと見なされるべきである。上記のルールは、範囲の幅に関係なく適用される。
［５１］．実施例１
［５２］．黄色ブドウ球菌ワクチンの製造方法
［５３］．１．培地と試薬
［５４］．トリプティックソイブロス（ＴＳＢ）
［５５］．トリプティックソイ寒天（ＴＳＡ）
［５６］．塩化ナトリウム注射液（０．９％）
［５４］．トリプティックソイブロス（ＴＳＢ）
［５５］．トリプティックソイ寒天（ＴＳＡ）
［５６］．塩化ナトリウム注射液（０．９％）
［５７］．２．ワクチン製造過程
［５８］．１）一次シードの製造
［５９］．グリセリンで保存された菌種を－８０℃の超低温冷蔵庫から取り出し、ＴＳＡ平板に画線接種し、３７±１℃で１６±１ｈ培養した。本実施例では、ＡＴＣＣ２５９２３菌種を用いた。
［５９］．グリセリンで保存された菌種を－８０℃の超低温冷蔵庫から取り出し、ＴＳＡ平板に画線接種し、３７±１℃で１６±１ｈ培養した。本実施例では、ＡＴＣＣ２５９２３菌種を用いた。
［６０］．２）二次シード液の製造
［６１］．適量の菌体を掻き取って１０ｍｌのＴＳＢに入れ、分光光度計で菌液濃度を測定し、最終濃度が約０．０５ＯＤ／ｍｌとなるように適切な体積の菌液を１００ｍｌのＴＳＢに接種し、３７±１℃、２２０ｒｐｍで対数増殖期（０．８±０．２ＯＤ／ｍｌ）まで振とう培養を行った。
［６１］．適量の菌体を掻き取って１０ｍｌのＴＳＢに入れ、分光光度計で菌液濃度を測定し、最終濃度が約０．０５ＯＤ／ｍｌとなるように適切な体積の菌液を１００ｍｌのＴＳＢに接種し、３７±１℃、２２０ｒｐｍで対数増殖期（０．８±０．２ＯＤ／ｍｌ）まで振とう培養を行った。
［６２］．３）三次シード液の製造
［６３］．二次シード液を採取し、分光光度計で菌液濃度を測定し、最終濃度が約０．０５ＯＤ／ｍｌとなるように適切な体積の菌液を１，０００ｍｌのＴＳＢに接種し、３７±１℃、２２０ｒｐｍで対数増殖期（０．８±０．２ＯＤ／ｍｌ）まで振とう培養を行った。
［６３］．二次シード液を採取し、分光光度計で菌液濃度を測定し、最終濃度が約０．０５ＯＤ／ｍｌとなるように適切な体積の菌液を１，０００ｍｌのＴＳＢに接種し、３７±１℃、２２０ｒｐｍで対数増殖期（０．８±０．２ＯＤ／ｍｌ）まで振とう培養を行った。
［６４］．４）発酵槽培養
［６５］．三次シード液を採取し、分光光度計で菌液濃度を測定し、最終濃度が約０．０５ＯＤ／ｍｌとなるように適切な体積の菌液を４ＬのＴＳＢに接種した。発酵パラメータとしては、培養における通気量は３～５Ｌ／ｍｉｎ、回転速度は２５０±２０ｒｐｍ、温度は３７±１℃であり、ｐＨ値と溶存酸素値はオンラインで監視され、培養は対数増殖期（１．５±０．３ＯＤ／ｍｌ）まで行われるように設定した。
［６５］．三次シード液を採取し、分光光度計で菌液濃度を測定し、最終濃度が約０．０５ＯＤ／ｍｌとなるように適切な体積の菌液を４ＬのＴＳＢに接種した。発酵パラメータとしては、培養における通気量は３～５Ｌ／ｍｉｎ、回転速度は２５０±２０ｒｐｍ、温度は３７±１℃であり、ｐＨ値と溶存酸素値はオンラインで監視され、培養は対数増殖期（１．５±０．３ＯＤ／ｍｌ）まで行われるように設定した。
［６６］．５）菌体の収穫
［６７］．菌液を遠心分離バケツに入れ、３，０００×ｇ、室温で遠心分離を２０ｍｉｎ行った。２０ｍｌの塩化ナトリウム注射液（０．９％）で菌体を再懸濁し、遠心洗浄を１回行った。２０ｍｌの塩化ナトリウム注射液（０．９％）で菌体を再懸濁した。
［６７］．菌液を遠心分離バケツに入れ、３，０００×ｇ、室温で遠心分離を２０ｍｉｎ行った。２０ｍｌの塩化ナトリウム注射液（０．９％）で菌体を再懸濁し、遠心洗浄を１回行った。２０ｍｌの塩化ナトリウム注射液（０．９％）で菌体を再懸濁した。
［６８］．６）濃度の調整
［６９］．菌液濃度を０．５～１×１０１０ＣＦＵ／ｍｌに調整した。
［６９］．菌液濃度を０．５～１×１０１０ＣＦＵ／ｍｌに調整した。
［７０］．７）Ｘ線不活化
［７１］．菌液を密封可能な容器（５０ｍｌ遠心分離管等）に、液面の高さが１ｃｍを超えないように分注した。放射線の総線量が≧２，０００Ｇｙであれば、菌液を完全に不活化することができる。菌液を完全に不活化する観点と、総線量が大きすぎることを避ける（大きすぎる場合、全菌体が破裂し、菌体毒素が放出される）観点から、総不活化線量を２，０００～３，０００Ｇｙに設定する。線量率を５～２０Ｇｙ／ｍｉｎに設定することが適切である。線量率が低すぎる（即ち、＜５Ｇｙ／ｍｉｎ）場合、総照射時間（＞４００ｍｉｎ）と総製造時間（＞８ｈ）が延長され、製造効率に影響を及ぼすほか、長時間環境温度下と製造環境中にある菌液は分解と汚染への暴露のリスクがある。線量率が高すぎる（即ち＞２０Ｇｙ／ｍｉｎ）場合、総照射時間（＜１００ｍｉｎ）が短すぎ、十分な総照射時間（≧２ｈ）が保証されず、やはり不活化程度に悪影響を及ぼす。不活化の詳細なパラメータは、照射装置や機器の性能、菌液容器の形状、液面の高さ、菌液濃度等の様々な要因によって影響を受けるため、線量率、総線量、照射回数及び各照射の間隔時間は、実際の製造ニーズに応じて調整することができる。各照射の間隔時間は、好ましくは５～１０ｍｉｎである。
［７１］．菌液を密封可能な容器（５０ｍｌ遠心分離管等）に、液面の高さが１ｃｍを超えないように分注した。放射線の総線量が≧２，０００Ｇｙであれば、菌液を完全に不活化することができる。菌液を完全に不活化する観点と、総線量が大きすぎることを避ける（大きすぎる場合、全菌体が破裂し、菌体毒素が放出される）観点から、総不活化線量を２，０００～３，０００Ｇｙに設定する。線量率を５～２０Ｇｙ／ｍｉｎに設定することが適切である。線量率が低すぎる（即ち、＜５Ｇｙ／ｍｉｎ）場合、総照射時間（＞４００ｍｉｎ）と総製造時間（＞８ｈ）が延長され、製造効率に影響を及ぼすほか、長時間環境温度下と製造環境中にある菌液は分解と汚染への暴露のリスクがある。線量率が高すぎる（即ち＞２０Ｇｙ／ｍｉｎ）場合、総照射時間（＜１００ｍｉｎ）が短すぎ、十分な総照射時間（≧２ｈ）が保証されず、やはり不活化程度に悪影響を及ぼす。不活化の詳細なパラメータは、照射装置や機器の性能、菌液容器の形状、液面の高さ、菌液濃度等の様々な要因によって影響を受けるため、線量率、総線量、照射回数及び各照射の間隔時間は、実際の製造ニーズに応じて調整することができる。各照射の間隔時間は、好ましくは５～１０ｍｉｎである。
［７２］．８）原液
［７３］．照射終了後に、１／１００体積の菌液を採取し、ＴＳＡ平板に塗抹し、３７±１℃で４８ｈ培養し、細菌が成長していなかったことを確認した。同時に、「中国薬局方」（通則１１０１）に従い、１／１００体積の菌液を採取し、無菌試験を行った。
［７３］．照射終了後に、１／１００体積の菌液を採取し、ＴＳＡ平板に塗抹し、３７±１℃で４８ｈ培養し、細菌が成長していなかったことを確認した。同時に、「中国薬局方」（通則１１０１）に従い、１／１００体積の菌液を採取し、無菌試験を行った。
［７４］．９）ワクチン完成品
［７５］．塩化ナトリウム注射液（０．９％）でワクチン菌体濃度を０．５～１×１０８個／ｍｌに調整し、即ち、ワクチン完成品を得た。完成品は２～８℃で保存された。注意すべきことは、生菌菌体濃度は、１ｍｌあたりの細菌コロニー形成単位の「ＣＦＵ／ｍｌ」で表わされ、不活化菌菌体濃度は、１ｍｌあたりの細菌数の「個／ｍｌ」で表わされるということである。本明細書で使用されるように、「１ＣＦＵ／ｍｌ」は、「１個／ｍｌ」で表される菌体濃度と同等と見なされる。
［７５］．塩化ナトリウム注射液（０．９％）でワクチン菌体濃度を０．５～１×１０８個／ｍｌに調整し、即ち、ワクチン完成品を得た。完成品は２～８℃で保存された。注意すべきことは、生菌菌体濃度は、１ｍｌあたりの細菌コロニー形成単位の「ＣＦＵ／ｍｌ」で表わされ、不活化菌菌体濃度は、１ｍｌあたりの細菌数の「個／ｍｌ」で表わされるということである。本明細書で使用されるように、「１ＣＦＵ／ｍｌ」は、「１個／ｍｌ」で表される菌体濃度と同等と見なされる。
［７６］．実施例２
［７７］．不活化線量の検討
［７８］．本実施例では、Ｘ線を用いて黄色ブドウ球菌種を不活化した。
［７９］．方法：照射前に、製造された菌液を希釈して平板に塗抹し、計数を行った。各照射終了後、試料を採取し、希釈して平板に塗抹し、計数を行った。毎回３枚ずつ試料を採取してそれぞれ計数を行い、各照射後の細菌生存率を算出した。
［８１］．結果：Ｘ線は、ＤＮＡ損傷を誘導し細菌を不活化するというユニークな殺菌メカニズムを有する。図１から分かるように、黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ２５９２３に用いるＸ線の不活化線量は≧１，９５０Ｇｙであるが、実際の製造において細菌菌液を絶対的に且つ完全に不活化する必要性を考慮すると、不活化線量を≧２，０００Ｇｙに設定することもできるし、不活化線量を２，１００Ｇｙまでも１線量点増加することもできる。
［８２］．実施例３
［８３］．異なる不活化方法がワクチンからの核酸放出のレベルに及ぼす影響の検討
［８４］．方法：
［８５］．１．同じバッチで１バッチの菌液を製造し、５等分し、以下の操作で処理した。
［８６］．２．生菌対照：何の処理もせず、室温で放置した。
［８７］．３．半不活化線量：Ｘ線不活化手順に従って処理を行い、総線量は１，０５０Ｇｙであった。
［８８］．４．不活化線量：Ｘ線不活化手順に従って処理を行い、総線量は２，１００Ｇｙであった。
［８９］．５．ホルムアルデヒド不活化：最終濃度が１％となるようにホルムアルデヒド溶液を添加し、３７±１℃で２４ｈ不活化処理を行い、不活化終了後に、塩化ナトリウム注射液（０．９％）で液交換洗浄を３～５回行った。
［９０］．６．熱不活化：１２１℃の高圧蒸気を用いて滅菌を１５ｍｉｎ行った。
［９１］．７．核酸放出測定：全ての試料の不活化処理を終了した後、直ちに試料を採取して（０週）遠心分離し、上清を採取し、ＵＶ分光光度計を用いて核酸濃度（Ａ２６０）を測定した。２週間と４週間後に、再度、試料を採取して測定した。
［８５］．１．同じバッチで１バッチの菌液を製造し、５等分し、以下の操作で処理した。
［８６］．２．生菌対照：何の処理もせず、室温で放置した。
［８７］．３．半不活化線量：Ｘ線不活化手順に従って処理を行い、総線量は１，０５０Ｇｙであった。
［８８］．４．不活化線量：Ｘ線不活化手順に従って処理を行い、総線量は２，１００Ｇｙであった。
［８９］．５．ホルムアルデヒド不活化：最終濃度が１％となるようにホルムアルデヒド溶液を添加し、３７±１℃で２４ｈ不活化処理を行い、不活化終了後に、塩化ナトリウム注射液（０．９％）で液交換洗浄を３～５回行った。
［９０］．６．熱不活化：１２１℃の高圧蒸気を用いて滅菌を１５ｍｉｎ行った。
［９１］．７．核酸放出測定：全ての試料の不活化処理を終了した後、直ちに試料を採取して（０週）遠心分離し、上清を採取し、ＵＶ分光光度計を用いて核酸濃度（Ａ２６０）を測定した。２週間と４週間後に、再度、試料を採取して測定した。
［９２］．結果：図２に示すように、Ｘ線不活化後に、黄色ブドウ球菌からの細胞外核酸のレベル増加が誘導され、このような核酸放出の過程はまだ時間の経過とともに継続していた。核酸放出は、Ｘ線不活化をホルムアルデヒド不活化や熱不活化と区別する重要な特徴の一つであり、ワクチンにより多くの免疫原性をもたらし、より多くの免疫シグナル伝達経路、例えばＳＴＩＮＧ、ＴＬＲ９等を活性化させる可能性がある。
［９３］．ＳＴＩＮＧ経路の活性化は、免疫系による細菌感染の認識を促進し、Ｉ型インターフェロンの産生（細胞性免疫の向上）を促進することに寄与するとともに、免疫性段階ではワクチン抗原成分の提示と免疫系による認識に、感染性段階では細菌の排除にも寄与する。ＴＬＲ９経路は、免疫系において細菌のＣｐＧ ＤＮＡを認識する主要な受容体であり、これによって一連の炎症誘発性サイトカインやケモカインの産生を誘導し、最終的にＴｈ１様炎症反応を引き起こす。細菌ワクチンは、主に、体液性免疫を主とし、細胞性免疫は比較的に弱い。細菌核酸によって活性化されるＳＴＩＮＧ及びＴＬＲ９経路は共に、Ｔｈ１細胞性免疫を向上させ、免疫効果の向上を促進することに寄与する。
［９４］．実施例４
［９５］．Ｘ線不活化された菌体の電子顕微鏡観察
［９６］．走査型電子顕微鏡試料の製造方法：
［９７］．１．試料の製造：黄色ブドウ球菌ワクチンの製造手順に従って、黄色ブドウ球菌を不活化した後、走査型電子顕微鏡試料の製造用に原液を採取した。
［９８］．２．固定：不活化されたワクチン原液２００μｌを採取し、３，０００×ｇで遠心分離を１０ｍｉｎ行って上清を捨て、１ｍｌの２％～３％グルタルアルデヒドを加えて４℃で一晩固定を行った。
［９９］．３．洗浄：０．１Ｍ ＰＢＳで洗浄を３回行った。
［１００］．４．脱水：その後、３０％、５０％、７０％、８０％、９０％のエタノール勾配で順次脱水をそれぞれ１回ずつ行い、１００％無水エタノールで脱水を３回行った。毎回脱水すると、できるだけ菌体を軽く吹き散らした。毎回、処理を１０ｍｉｎ、３，０００×ｇで遠心分離を５ｍｉｎ行った。
［１０１］．５．乾燥：ＣＯ２を用いた臨界点乾燥法によって、３５℃で乾燥を１ｈ行った。
［１０２］．６．試料台への接着とコーティング：特製の両面粘着テープで試料を金属製試料台に接着し、イオンスパッタリング法で試料に金膜をコーティングした。
［１０３］．７．走査と撮像。
［９８］．２．固定：不活化されたワクチン原液２００μｌを採取し、３，０００×ｇで遠心分離を１０ｍｉｎ行って上清を捨て、１ｍｌの２％～３％グルタルアルデヒドを加えて４℃で一晩固定を行った。
［９９］．３．洗浄：０．１Ｍ ＰＢＳで洗浄を３回行った。
［１００］．４．脱水：その後、３０％、５０％、７０％、８０％、９０％のエタノール勾配で順次脱水をそれぞれ１回ずつ行い、１００％無水エタノールで脱水を３回行った。毎回脱水すると、できるだけ菌体を軽く吹き散らした。毎回、処理を１０ｍｉｎ、３，０００×ｇで遠心分離を５ｍｉｎ行った。
［１０１］．５．乾燥：ＣＯ２を用いた臨界点乾燥法によって、３５℃で乾燥を１ｈ行った。
［１０２］．６．試料台への接着とコーティング：特製の両面粘着テープで試料を金属製試料台に接着し、イオンスパッタリング法で試料に金膜をコーティングした。
［１０３］．７．走査と撮像。
［１０４］．結果：図３は、走査型電子顕微鏡の結果を示す。Ｘ線不活化は、黄色ブドウ球菌の菌体構造に明らかな破壊を与えなかった。即ち、Ｘ線は、黄色ブドウ球菌を不活化すると同時に、菌体構造（抗原）の完全性を維持し、それが免疫においてより効果的な抗原になることを可能にした。
［１０５］．透過型電子顕微鏡試料の製造方法：
［１０６］．１．試料の製造：黄色ブドウ球菌ワクチンの製造手順に従って、黄色ブドウ球菌を不活化した後、透過型電子顕微鏡試料の製造用に原液を採取した。
［１０７］．２．前固定：不活化されたワクチン原液２００μｌを採取し、３，０００×ｇで遠心分離を１０ｍｉｎ行って上清を捨て、１ｍｌの２％～３％グルタルアルデヒドを加えて４℃で一晩固定を行った。
［１０８］．３．洗浄：０．１Ｍ ＰＢＳで洗浄を３回行った。
［１０９］．４．後固定：１％オスミウム酸固定液で固定を２ｈ行った。
［１１０］．５．洗浄：０．１Ｍ ＰＢＳで洗浄を３回行った。
［１１１］．６．脱水：その後、３０％、５０％、７０％、８０％、９０％のアセトン勾配で順次脱水をそれぞれ１回ずつ行い、１００％純アセトンで脱水を３回行った。毎回脱水すると、できるだけ菌体を軽く吹き散らした。毎回、処理を３０ｍｉｎ、３，０００×ｇで遠心分離を５ｍｉｎ行った。
［１１２］．７．浸透：純アセトンと包埋液（１：２）の混合液に室温で一晩浸透を行った。
［１１３］．８．包埋：浸透された試料を包埋板にピックアップし、３７℃で一晩、４５℃で１２ｈ、６０℃で４８ｈ包埋を行った。
［１１４］．９．超薄切片。
［１１５］．１０．ネガティブ染色：１％リンタングステン酸を１滴滴下して染色を１～２ｍｉｎ行い、濾紙に染色液を吸収させた。純水を１滴滴下して濾紙に吸収させる操作を２～３回繰り返して余分なリンタングステン酸を洗い流し、静置して乾燥を行った。
［１１６］．１１．透過型電子顕微鏡による撮像。
［１０７］．２．前固定：不活化されたワクチン原液２００μｌを採取し、３，０００×ｇで遠心分離を１０ｍｉｎ行って上清を捨て、１ｍｌの２％～３％グルタルアルデヒドを加えて４℃で一晩固定を行った。
［１０８］．３．洗浄：０．１Ｍ ＰＢＳで洗浄を３回行った。
［１０９］．４．後固定：１％オスミウム酸固定液で固定を２ｈ行った。
［１１０］．５．洗浄：０．１Ｍ ＰＢＳで洗浄を３回行った。
［１１１］．６．脱水：その後、３０％、５０％、７０％、８０％、９０％のアセトン勾配で順次脱水をそれぞれ１回ずつ行い、１００％純アセトンで脱水を３回行った。毎回脱水すると、できるだけ菌体を軽く吹き散らした。毎回、処理を３０ｍｉｎ、３，０００×ｇで遠心分離を５ｍｉｎ行った。
［１１２］．７．浸透：純アセトンと包埋液（１：２）の混合液に室温で一晩浸透を行った。
［１１３］．８．包埋：浸透された試料を包埋板にピックアップし、３７℃で一晩、４５℃で１２ｈ、６０℃で４８ｈ包埋を行った。
［１１４］．９．超薄切片。
［１１５］．１０．ネガティブ染色：１％リンタングステン酸を１滴滴下して染色を１～２ｍｉｎ行い、濾紙に染色液を吸収させた。純水を１滴滴下して濾紙に吸収させる操作を２～３回繰り返して余分なリンタングステン酸を洗い流し、静置して乾燥を行った。
［１１６］．１１．透過型電子顕微鏡による撮像。
［１１７］．結果：図３は、透過型電子顕微鏡の結果を示す。Ｘ線は、黄色ブドウ球菌を不活化すると同時に、菌体構造（抗原）の完全性を維持した。
［１１８］．実施例５
［１１９］．黄色ブドウ球菌菌血症（血流感染）モデルにおける黄色ブドウ球菌ワクチンの防御力の検討
［１２０］．方法：
［１２１］．１．試験群分け：本試験では、メチシリン感受性黄色ブドウ球菌（Ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ， ＭＳＳＡ）ＡＴＣＣ２５９２３、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ， ＭＲＳＡ）ＡＴＣＣ３３５９１、並びにＳＣＰＨ－１８及びＳＣＰＨ－２５という２株の多剤耐性（Ｍｕｌｔｉ－ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ， ＭＤＲ）黄色ブドウ球菌臨床分離株、を含む４株の黄色ブドウ球菌を選択してワクチン免疫群にそれぞれチャレンジ試験を行った。その中で、対照群（未免疫、Ｕｎｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）と免疫群（免疫済、Ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）はそれぞれ、１０匹ずつを用いた。
［１２２］．２．免疫：ワクチン完成品（０．５～１×１０８個／ｍｌ）を採取し、６～８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスを免疫し、０．２ｍｌ（１～２×１０７個／回）を鼠径にを皮下接種し、２週間の間隔で３回の免疫接種を行った。最終免疫の２週間後にチャレンジ試験を行った。
［１２３］．３．血流感染モデルの確立
［１２４］．３．１ チャレンジ試験菌株（ＡＴＣＣ２５９２３、ＡＴＣＣ３３５９１、ＳＣＰＨ－１８、ＳＣＰＨ－２５）を血液平板に蘇生し、３７±１℃で１６±１ｈ培養した。
［１２５］．３．２ 単クローンを採取して３ｍｌのＴＳＢに接種し、３７±１℃で１６±１ｈ培養した。
［１２６］．３．３ 分光光度計で菌液濃度を測定し、最終濃度が約０．０５ＯＤ／ｍｌとなるように適切な体積の菌液を２０ｍｌのＴＳＢに接種し、３７±１℃、２２０ｒｐｍで対数増殖期（０．８±０．２ＯＤ／ｍｌ）まで振とう培養を行った。
［１２７］．３．４ ３，０００×ｇ、室温で遠心分離を１０ｍｉｎ行った。２ｍｌの塩化ナトリウム注射液（０．９％）で菌体を再懸濁し、菌液濃度を０．５～１×１０９ＣＦＵ／ｍｌに調整した。
［１２８］．３．５ マウス尾静脈に菌液を０．１ｍｌ／匹（０．５～１×１０８ＣＦＵ／匹）で注射した。
［１２９］．３．６ 免疫群と対照群のマウスの１週間以内の生存率を観察して統計した。
［１２２］．２．免疫：ワクチン完成品（０．５～１×１０８個／ｍｌ）を採取し、６～８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスを免疫し、０．２ｍｌ（１～２×１０７個／回）を鼠径にを皮下接種し、２週間の間隔で３回の免疫接種を行った。最終免疫の２週間後にチャレンジ試験を行った。
［１２３］．３．血流感染モデルの確立
［１２４］．３．１ チャレンジ試験菌株（ＡＴＣＣ２５９２３、ＡＴＣＣ３３５９１、ＳＣＰＨ－１８、ＳＣＰＨ－２５）を血液平板に蘇生し、３７±１℃で１６±１ｈ培養した。
［１２５］．３．２ 単クローンを採取して３ｍｌのＴＳＢに接種し、３７±１℃で１６±１ｈ培養した。
［１２６］．３．３ 分光光度計で菌液濃度を測定し、最終濃度が約０．０５ＯＤ／ｍｌとなるように適切な体積の菌液を２０ｍｌのＴＳＢに接種し、３７±１℃、２２０ｒｐｍで対数増殖期（０．８±０．２ＯＤ／ｍｌ）まで振とう培養を行った。
［１２７］．３．４ ３，０００×ｇ、室温で遠心分離を１０ｍｉｎ行った。２ｍｌの塩化ナトリウム注射液（０．９％）で菌体を再懸濁し、菌液濃度を０．５～１×１０９ＣＦＵ／ｍｌに調整した。
［１２８］．３．５ マウス尾静脈に菌液を０．１ｍｌ／匹（０．５～１×１０８ＣＦＵ／匹）で注射した。
［１２９］．３．６ 免疫群と対照群のマウスの１週間以内の生存率を観察して統計した。
［１３０］．結果：図４に示すように、対照群のマウスは各菌株のチャレンジ試験後７２～１２０ｈ以内に全て死亡し、各菌株のチャレンジ試験が行われたマウスに対する免疫群の免疫防御率はそれぞれ１００％（ＡＴＣＣ２５９２３）、６０％（ＡＴＣＣ３３５９１）、７０％（ＳＣＰＨ－１８）、８０％（ＳＣＰＨ－２５）であり、即ち、黄色ブドウ球菌菌血症に対する黄色ブドウ球菌ワクチンの防御率は６０％以上であった。
［１３１］．実施例６
［１３２］．黄色ブドウ球菌肺炎（気道感染）モデルにおける黄色ブドウ球菌ワクチンの防御力の検討
［１３３］．方法：
［１３４］．１．試験群分け：本試験では、メチシリン感受性黄色ブドウ球菌（Ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ， ＭＳＳＡ）ＡＴＣＣ２５９２３、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ， ＭＲＳＡ）ＡＴＣＣ３３５９１、並びにＳＣＰＨ－１８及びＳＣＰＨ－２５という２株の多剤耐性（Ｍｕｌｔｉ－ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ， ＭＤＲ）黄色ブドウ球菌臨床分離株、を含む４株の黄色ブドウ球菌を選択してワクチン免疫群にそれぞれチャレンジ試験を行った。その中で、対照群（未免疫、Ｕｎｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）と免疫群（免疫済、Ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）はそれぞれ、３５匹ずつを用い、各時点で３～５匹ずつを用いた。
［１３５］．２．免疫：ワクチン完成品（０．５～１×１０８個／ｍｌ）を採取し、６～８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスを免疫し、０．２ｍｌ（１～２×１０７個／回）を鼠径にを皮下接種し、２週間の間隔で３回の免疫接種を行った。最終免疫の２週間後にチャレンジ試験を行った。
［１３６］．３．肺炎（気道感染）モデルの確立
［１３７］．３．１ チャレンジ試験菌株（ＡＴＣＣ２５９２３、ＡＴＣＣ３３５９１、ＳＣＰＨ－１８、ＳＣＰＨ－２５）を血液平板に蘇生し、３７±１℃で１６±１ｈ培養した。
［１３８］．３．２ 単クローンを採取して３ｍｌのＴＳＢに接種し、３７±１℃で１６±１ｈ培養した。
［１３９］．３．３ 分光光度計で菌液濃度を測定し、最終濃度が約０．０５ＯＤ／ｍｌとなるように適切な体積の菌液を２０ｍｌのＴＳＢに接種し、３７±１℃、２２０ｒｐｍで対数増殖期（０．８±０．２ＯＤ／ｍｌ）まで振とう培養を行った。
［１４０］．３．４ ３，０００×ｇ、室温で遠心分離を１０ｍｉｎ行った。２ｍｌの塩化ナトリウム注射液（０．９％）で菌体を再懸濁し、菌液濃度を２～４×１０８ＣＦＵ／ｍｌに調整した。
［１４１］．３．５ マウス気道に菌液を０．０５ｍｌ／匹（１～２×１０７ＣＦＵ／匹）で注射した。
［１４２］．３．６ 免疫群と対照群のマウス肺部の１週間以内の毎日の細菌負荷量を観察して統計した。
［１３５］．２．免疫：ワクチン完成品（０．５～１×１０８個／ｍｌ）を採取し、６～８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスを免疫し、０．２ｍｌ（１～２×１０７個／回）を鼠径にを皮下接種し、２週間の間隔で３回の免疫接種を行った。最終免疫の２週間後にチャレンジ試験を行った。
［１３６］．３．肺炎（気道感染）モデルの確立
［１３７］．３．１ チャレンジ試験菌株（ＡＴＣＣ２５９２３、ＡＴＣＣ３３５９１、ＳＣＰＨ－１８、ＳＣＰＨ－２５）を血液平板に蘇生し、３７±１℃で１６±１ｈ培養した。
［１３８］．３．２ 単クローンを採取して３ｍｌのＴＳＢに接種し、３７±１℃で１６±１ｈ培養した。
［１３９］．３．３ 分光光度計で菌液濃度を測定し、最終濃度が約０．０５ＯＤ／ｍｌとなるように適切な体積の菌液を２０ｍｌのＴＳＢに接種し、３７±１℃、２２０ｒｐｍで対数増殖期（０．８±０．２ＯＤ／ｍｌ）まで振とう培養を行った。
［１４０］．３．４ ３，０００×ｇ、室温で遠心分離を１０ｍｉｎ行った。２ｍｌの塩化ナトリウム注射液（０．９％）で菌体を再懸濁し、菌液濃度を２～４×１０８ＣＦＵ／ｍｌに調整した。
［１４１］．３．５ マウス気道に菌液を０．０５ｍｌ／匹（１～２×１０７ＣＦＵ／匹）で注射した。
［１４２］．３．６ 免疫群と対照群のマウス肺部の１週間以内の毎日の細菌負荷量を観察して統計した。
［１４３］．結果：図５に示すように、各菌株のチャレンジ試験後、対照群のマウス肺部の細菌負荷量は明らかな増加傾向を示し、且つ、対照群のマウスは７２～１２０ｈ以内に全て死亡したが、免疫群は、チャレンジ試験菌株に対して明らかな排除傾向を示し、或いはチャレンジ試験菌株を完全に排除するようになった。
［１４４］．以上、本発明の実施形態を添付図面と共に説明したが、本発明は、単に模式的なものであって限定するものではなく、本発明の目的及び請求項によって保護される範囲から逸脱することなく、当業者が本発明に触発されて作り得る多くの形態があり、それらは全て本発明の保護範囲に入るものである。
Claims (10)
- 黄色ブドウ球菌ワクチンの工業的製造方法であって、
Ｓ１ 黄色ブドウ球菌株を適切な培地で培養し、シード液を製造する工程と、
Ｓ２ 前記シード液を発酵槽に接種して発酵させる工程と、
Ｓ３ 前記発酵槽内の菌体の密度を監視し、前記発酵槽内の前記菌体が対数増殖期まで達した場合、前記発酵槽内の菌液を採取して遠心力２，０００～４，０００×ｇで直接遠心分離し、１０～３０ｍｉｎ後に前記菌体を収集する工程と、
Ｓ４ 前記菌体を等張注射液で再懸濁し、濃度を調整した後、放射線照射を行って前記菌体の増殖活性を失わせる工程であって、前記放射線照射に用いる放射線はＸ線を含む、工程と、
Ｓ５ 前記等張注射液で、前記放射線照射が行われた前記菌液の濃度を０．５～１×１０８個／ｍｌに調整し、前記黄色ブドウ球菌ワクチンを得る工程と、
を含む、ことを特徴とする工業的製造方法。 - 前記Ｓ１は、
ａ． 前記黄色ブドウ球菌株をトリプティックソイ寒天（Ｔｒｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ Ａｇａｒ， ＴＳＡ）平板に接種して培養し、一次シードを得る工程と、
ｂ． 前記一次シードをトリプティックソイブロス（Ｔｒｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ Ｂｒｏｔｈ， ＴＳＢ）培地に接種して複数回拡大培養する工程であって、拡大回数は２回以上、毎回の拡大培養における接種の細菌濃度は０．０１～０．１ＯＤ／ｍｌ、接種体積は培養体積の１０％以下、毎回拡大培養したシード液の最終濃度は０．８±０．２ＯＤ／ｍｌである、工程と、
を含む、ことを特徴とする請求項１に記載の工業的製造方法。 - 前記黄色ブドウ球菌株は、ＡＴＣＣ２５９２３、ＡＴＣＣ３３５９１、ＳＣＰＨ－１８及びＳＣＰＨ－２５から選ばれる１種又は２種以上を含む、ことを特徴とする請求項１に記載の工業的製造方法。
- 前記Ｓ２で接種された前記シード液の細菌濃度は０．０１～０．１ＯＤ／ｍｌである、ことを特徴とする請求項１に記載の工業的製造方法。
- 前記放射線照射が行われた前記菌液は、全菌体、核酸、菌体断片及び膜小胞を含む、ことを特徴とする請求項１に記載の工業的製造方法。
- 前記放射線照射は、線量率が５～２０Ｇｙ／ｍｉｎ、総線量が≧２，０００Ｇｙである、ことを特徴とする請求項１に記載の工業的製造方法。
- 請求項１～６のいずれか１項に記載の工業的製造方法によって製造された黄色ブドウ球菌ワクチン。
- 請求項７に記載の黄色ブドウ球菌ワクチンの、黄色ブドウ球菌によって引き起こされる菌血症を予防又は治療するための薬物の製造への応用。
- 請求項７に記載の黄色ブドウ球菌ワクチンの、黄色ブドウ球菌によって引き起こされる肺炎を予防又は治療するための薬物の製造への応用。
- 前記黄色ブドウ球菌ワクチンの免疫手順は、２週間の間隔で３回の皮下接種を行うことを含む、ことを特徴とする請求項９に記載の応用。
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