JP2024510663A - マイクロｒｎａ－１３４阻害剤 - Google Patents
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Abstract
【課題】てんかんおよび他の神経傷害が脳損傷の発生を引き起こす可能性が高いプロセスを特異的に標的とする、治療または防止手段として有用な新規の効果的かつ安全な治療法の意義のあるまだ対処されていない必要性が存在する。【解決手段】本発明は、新規の非常に強力なアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。そのような化合物は、てんかんなどの神経疾患を含めた、ｍｉＲ－１３４活性のモジュレーションが有益である種々の疾患を治療するための医薬組成物を作出するために有用である。【選択図】なし
Description
本発明は、マイクロＲＮＡ－１３４（ｍｉＲ－１３４）の活性を阻害することが可能な新規の化合物および組成物に関する。具体的には、本発明は、てんかんを含めたＣＮＳ障害の治療に有用な、ヒトにおいてｉｎ ｖｉｖｏでｍｉＲ－１３４の活性をモジュレートすることが可能なアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物を提供する。
てんかんは、反復性の自発性発作を特徴とする重篤な慢性神経性障害であり、世界的に約５０００万人が影響を受けている。
現在利用可能な抗てんかん薬では、一般には患者の３分の２で発作がコントロールされるが、基礎をなす病態生理にはおそらく効果がない。てんかん患者の残りの３分の１は、薬剤抵抗性であるか、または現在利用可能な薬物による重篤な副作用が生じている。
薬物治療を受ける選択肢がない患者において発作を回避するための代替法は、ケトン食療法、脳外科手術、迷走神経および頭蓋内刺激である。
症候性（後天性）てんかんの発達には、とりわけ、イオンチャネルおよび神経伝達物質受容体の発現の変更、シナプス再構築、炎症、グリオーシスならびにニューロン死が伴うと考えられている。しかし、細胞および分子機構に関する我々の理解は未だ不完全なままである。現在のところ、てんかんが引き起こされる可能性が高い脳損傷後の予防的治療（「抗てんかん」）は存在しない。同様に、てんかん重積状態（ＳＥ）に対する、または、脳損傷もしくはてんかんを引き起こす可能性が高い急性神経性傷害、例えば脳卒中、もしくは外傷を治療するための特定の神経保護治療は存在しない。
最近のデータから、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）がてんかんを含めたいくつかの神経性障害の病態形成に極めて重要であることが示唆されている。ｍｉＲＮＡには、遺伝子発現の転写後調節を媒介する短い（約２２ｎｔ）内在性非コードＲＮＡのクラスが含まれる（Ambros, 2004 Nature, (2004) Sep 16; 431 (7006): 350-5；Bartel, 2009 Cell, (2009) Jan 23; 136 (2): 215-33）。成熟ｍｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）に主に位置する部分的に相補的な標的部位にｍｉＲＩＳＣ複合体を方向づけることにより、ｍｉＲＩＳＣ複合体のガイド分子としての役割を果たし、ｍｉＲＩＳＣ複合体が標的部位に方向づけられた結果、標的の翻訳抑制および／またはｍＲＮＡ分解がもたらされる（van Rooij & Kauppinen EMBO Mol Med (2014), Jul; 6 (7): 851-64）。ｍｉＲＮＡ標的認識をガイドする重要な決定因子は、ｍｉＲＮＡシード領域（成熟ｍｉＲＮＡのヌクレオチド２～７）と、標的ｍＲＮＡ ３’ＵＴＲ内の完全に相補的なシードマッチ部位との塩基対合である（Bartel, 2009 Cell, (2009) Jan 23; 136 (2): 215-33）。マイクロＲＮＡ－１３４（ｍｉＲ－１３４）は、脳に特異的な、活動調節型ｍｉＲＮＡであり、ニューロン微細構造の制御に関係づけられている。錘体細胞は新皮質および海馬体における最も一般的なニューロンである。錘体細胞は、内因性の興奮性皮質シナプスの主要な供給源であり、それらの樹状突起スパインは興奮性シナプスの主要なシナプス後標的であり、スパインのサイズはシナプス強度の指標である。成体の脳では、スパインは極めて安定しているが、学習および記憶形成の間、また精神神経疾患および病的脳活動の状況では、再構築が起こる。スパインの崩壊は、一部において、コフィリンによるアクチンのＮ－メチル－Ｄ－アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体／カルシウム依存性脱重合に媒介される。コフィリンはＬＩＭキナーゼ－１（Ｌｉｍｋ１）によりリン酸化され、不活化する。Ｌｉｍｋ１が喪失するとスパインの形態異常が生じる。海馬ニューロンでは、ｍｉＲ－１３４がＬｉｍｋ１ ｍＲＮＡを標的とし、それにより、Ｌｉｍｋ１タンパク質翻訳を妨げる。ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてｍｉＲ－１３４を過剰発現させることによりスパイン体積が低減することが報告されており、一方、ウイルスベクターを使用してｉｎ ｖｉｖｏにおいてｍｉＲ－１３４を過剰発現させると、樹状突起の全長が短縮し、長期増強（ＬＴＰ）が抑制される。ｍｉＲＮＡ生合成の構成成分であるＤｇｒｃ８を欠くマウスは、ｍｉＲ－１３４を含めたいくつかの成熟ｍｉＲＮＡを産生することができず、海馬のスパイン密度の低下を示す。スパイン減少の機能的帰結は状況に応じて異なり得、興奮性が促進されるか、またはニューロンにおけるＮＭＤＡ受容体により駆動される電流が切り離され、興奮毒性が防止される。抗ｍｉＲを使用してｉｎ ｖｉｖｏにおけるｍｉＲ－１３４の発現をサイレンシングすることにより、海馬ＣＡ３錘体ニューロン樹状突起スパイン密度が２１％低下し、マウスがてんかん重積状態によって引き起こされる発作および海馬傷害に不応性（ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ）になった。マウスにおいて、てんかん重積状態後にｍｉＲ－１３４を枯渇させることにより、後の自発性発作の発生が９０％超低減し、付随する側頭葉てんかんの病理学的特色が軽減した。したがって、ｍｉＲ－１３４活性の阻害により、発作の持続的な抑止および神経保護の増大が導かれる。
要約すると、てんかんおよび他の神経傷害が脳損傷の発生を引き起こす可能性が高いプロセスを特異的に標的とし、上記の問題のいくつかを克服する、治療または防止手段として有用な新規の効果的かつ安全な治療法の意義のあるまだ対処されていない必要性が依然として存在する。
本発明は、マイクロＲＮＡ１３４（ｍｉＲ－１３４）の強力な阻害剤である新規の化合物を提供する。そのような化合物は、医学的使用のため、例えば、ｍｉＲ－１３４のモジュレーションが有益である疾患を治療する、緩和させる、好転させる、先制治療するまたは予防するための組成物に有用である。そのような疾患は、てんかんおよび記憶障害を含めた神経疾患を含む。
本発明の化合物は、１８～１９ヌクレオチド長の配列を含むｍｉＲ－１３４（配列番号１）と相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、ＬＮＡ／ＤＮＡミックスマーであり、３つを超える連続したＤＮＡヌクレオチドのひと続きを含有せず、かつ、１～１８のホスホロチオエートヌクレオシド間連結を有する、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ－１３４配列５’ＵＧＵＧＡＣＵＧＧＵＵＧＡＣＣＡＧＡＧＧＧＧ３’（配列番号１）と相補的である。
一部の実施形態では、本発明は、５’ＧＵＧＡＣＵＧＧＵＵＧＡＣＣＡＧＡＧＧ３’（配列番号２）の一部または全体を標的とするように設計されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
一部の実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも５’ＧＵＧＡＣＵＧＧＵＵＧＡＣＣＡＧＡＧ３’（配列番号３）を標的とするように設計されたものである。
一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列５’ＣＴＣＴＧＧＴＣＡＡＣＣＡＧＴＣＡＣ３’（配列番号４）を含む。
一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１８または１９ヌクレオチド長であり、配列５’ＣＴＣＴＧＧＴＣＡＡＣＣＡＧＴＣＡＣ３’（配列番号４）を含む。
一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１８または１９ヌクレオチド長であり、配列５’ＣＴＣＴＧＧＴＣＡＡＣＣＡＧＴＣＡＣ３’（配列番号４）を含み、ミックスマーである。
一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１８または１９ヌクレオチド長であり、配列５’ＣＴＣＴＧＧＴＣＡＡＣＣＡＧＴＣＡＣ３’（配列番号４）を含み、ＬＮＡ／ＤＮＡミックスマーである。
一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１８または１９ヌクレオチド長であり、配列５’ＣＴＣＴＧＧＴＣＡＡＣＣＡＧＴＣＡＣ３’（配列番号４）を含み、５０～７０％のＬＮＡ、例えば５５～６５％のＬＮＡ、例えば５５～６１％のＬＮＡ、例えば少なくとも５０％のＬＮＡ、例えば少なくとも５５％のＬＮＡを有するＬＮＡ／ＤＮＡミックスマーである。
一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１８または１９ヌクレオチド長であり、配列５’ＣＴＣＴＧＧＴＣＡＡＣＣＡＧＴＣＡＣ３’（配列番号４）を含み、５０～７０％のＬＮＡ、例えば５５～６５％のＬＮＡ、例えば５５～６１％のＬＮＡ、例えば少なくとも５０％のＬＮＡ、例えば少なくとも５５％のＬＮＡを有するＬＮＡ／ＤＮＡミックスマーであり、各末端の２つのヌクレオチドがＬＮＡである。
一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号５～２１または２３～６０のいずれか１つである。
一部の実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、上記の実施形態のものなど、または配列番号５～２１もしくは２３～６０など）は、医薬としての使用のためのものである。
一部の実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号５～２１または２３～６０のいずれかからなり、任意選択により、送達ビヒクルを含む。
好ましい実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号７を含む。
別の好ましい実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号８を含む。
別の好ましい実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１０を含む。
別の好ましい実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１２を含む。
別の好ましい実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１９を含む。
別の好ましい実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号２４を含む。
別の好ましい実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号２６を含む。
別の好ましい実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号２７を含む。
別の好ましい実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号２８を含む。
別の好ましい実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号２９を含む。
別の好ましい実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号３０を含む。
別の好ましい実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号３１を含む。
別の好ましい実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号３２を含む。
別の好ましい実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号３３を含む。
別の好ましい実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号３４を含む。
別の好ましい実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号３５を含む。
別の好ましい実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号３６を含む。
別の好ましい実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号３７を含む。
別の好ましい実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号４５を含む。
別の好ましい実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号４６を含む。
別の好ましい実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号４７を含む。
別の好ましい実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号４８を含む。
別の好ましい実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号４９を含む。
別の好ましい実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号５０を含む。
別の好ましい実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号５１を含む。
別の好ましい実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号５２を含む。
別の好ましい実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号５３を含む。
別の好ましい実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号５４を含む。
別の好ましい実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号５５を含む。
別の好ましい実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号５６を含む。
別の好ましい実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号５９を含む。
別の好ましい実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号６０を含む。
一部の実施形態では、本発明は、有効投薬量の本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物を提供する。
一部の実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、脳に送達するためのものである。
一部の実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ－１３４活性のモジュレーションが有益である疾患を治療するためのものである。
一部の実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ－１３４のモジュレーションが有益である神経疾患を治療するためのものである。
一部の実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、てんかんを治療するためのものである。
本発明は、マイクロＲＮＡ－１３４（ｍｉＲ－１３４）と相補的な非常に強力なアンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびそのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む組成物を、神経疾患を含めた、ｍｉＲ－１３４活性のモジュレーションが有益である疾患を治療するために使用する方法を提供する。
本発明は、非常に強力なアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物、およびそのような化合物を含む組成物、ならびに、種々のｍｉＲ－１３４のモジュレーションが有益である疾患を治療するためのそれらの医学的使用を提供する。
上述の疾患の多くは十分には治療することができず、かつ／または、現在利用可能な治療は、重篤な副作用を引き起こすものであるので、本発明の化合物の必要性がある。
本発明の実施形態の記載では、明瞭にするために特定の用語法に依拠する。しかし、本発明は、そのように選択された特定の用語に限定されるものではなく、特定の用語それぞれが、同様の目的を実現するために同様に機能する全ての技術的等価物を包含することが理解される。
「治療有効量」または「有効量」または「有効用量」という用語は、治療剤を必要とする個体に対して所望の治療効果をもたらす治療剤の量を指す。有効量は、治療を受ける個体の健康および身体の状況、治療を受ける個体の分類群、組成物の製剤、投与方法、個体の医学的状態の評定、および他の関連性のある因子に応じて個体の間で変動し得る。
「治療」という用語は、所与の疾患を部分的にまたは完全に治癒させる、またはその疾患の１つもしくは複数の症状もしくは特徴を低減させる、本明細書ではアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む治療用医薬のあらゆる投与を指す。
「化合物」という用語は、本明細書で使用される場合、本発明によるオリゴヌクレオチドを含む化合物を指す。一部の実施形態では、化合物は、本発明のオリゴヌクレオチドとは別に他のエレメントを含み得る。そのような他のエレメントは、非限定的な例では、オリゴヌクレオチドとコンジュゲートしたまたは他のやり方で結合させた送達ビヒクルであり得る。
「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、標的核酸の対応する領域またはセグメントとのハイブリダイゼーションを可能にする核酸塩基配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを意味する。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、「ミックスマー」であることが好ましい。
「ｍｉＲ－１３４と相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド」という用語は、「抗ｍｉＲ－１３４」または「抗ｍｉＲ－１３４オリゴヌクレオチド」または「抗ｍｉＲ－１３４アンチセンスオリゴヌクレオチド」という用語と互換的に使用される。
「ミックスマー」は、ＬＮＡおよびＤＮＡヌクレオシドなどのヌクレオシド類似体が混在するアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、ここで、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡｓｅＨなどのＲＮＡｓｅを動員し得る複数のヌクレオシドを有する内部領域（例えば、少なくとも６または７つのＤＮＡヌクレオチドの領域など）を含まず、内部領域を構成するヌクレオシドは、外部ウイングを構成するヌクレオシドまたはヌクレオシドとは化学的に別個のものである。
「ヌクレオシド類似体」は、例えば、Freier & Altmann; Nucl. Acid. Res., 1997, 25, 4429-4443およびUhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213に記載されており、適切かつ好ましいヌクレオシド類似体の例は、これによって参照により組み込まれるＷＯ２００７０３１０９１に提示されている。
「５－メチルシトシン」は、５’位に付着したメチル基で修飾されたシトシンを意味する。５－メチルシトシンは修飾核酸塩基である。
「２’－Ｏ－メトキシエチル」（２’－ＭＯＥおよび２’－Ｏ（ＣＨ２）２－ＯＣＨ３とも称される）は、フラノース環の２’位におけるＯ－メトキシ－エチル修飾を指す。
「２’－ＭＯＥヌクレオシド」（２’－Ｏ－メトキシエチルヌクレオシドとも称される）は、２’－ＭＯＥ修飾された糖部分を含むヌクレオシドを意味する。
「ロックド核酸」または「ＬＮＡ」は、接近不可能なＲＮＡと称されることも多い、修飾ＲＮＡ核酸塩基である。ＬＮＡ核酸塩基のリボース部分が、２’酸素と４’炭素を接続する追加の架橋で修飾されている。ＬＮＡオリゴヌクレオチドでは、従来のＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドと比較して、その相補鎖に対する親和性の実質的な増大がもたらされる。一部の態様では、二環式ヌクレオシド類似体はＬＮＡヌクレオチドであり、したがって、これらの用語を互換的に使用することができ、そのような実施形態では、どちらも、リボース糖環のＣ２’とＣ４’の間にリンカー基（例えば、架橋など）が存在することを特徴とする。この状況で使用される場合、「ＬＮＡ単位」、「ＬＮＡ単量体」、「ＬＮＡ残基」、「ロックド核酸単位」、「ロックド核酸単量体」または「ロックド核酸残基」という用語は、二環式ヌクレオシド類似体を指す。ＬＮＡ単位は、とりわけ、ＷＯ９９／１４２２６、ＷＯ００／５６７４６、ＷＯ００／５６７４８、ＷＯ０１／２５２４８、ＷＯ０２／２８８７５、ＷＯ０３／００６４７５、ＷＯ２０１５０７１３８８、およびＷＯ０３／０９５４６７に記載されている。
「ベータ－Ｄ－オキシＬＮＡ」は好ましいＬＮＡバリアントである。
「二環式核酸」または「ＢＮＡ」または「ＢＮＡヌクレオシド」は、ヌクレオシド糖単位の４’位と２’位の間に２つの炭素原子を接続する架橋を有し、それにより、二環式糖を形成した核酸単量体を意味する。そのような二環式糖の例としては、これだけに限定されないが、Ａ）ｐｔ－Ｌ－メチレンオキシ（４’－ＣＨ２－Ｏ－２’）ＬＮＡ，（Ｂ）Ｐ－Ｄ－メチレンオキシ（４’－ＣＨ２－Ｏ－２’）ＬＮＡ，（Ｃ）エチレンオキシ（４’－（ＣＨ２）２－Ｏ－２’）ＬＮＡ，（Ｄ）アミノオキシ（４’－ＣＨ２－Ｏ－Ｎ（Ｒ）－２’）ＬＮＡおよび（Ｅ）オキシアミノ（４’－ＣＨ２－Ｎ（Ｒ）－Ｏ－２’）ＬＮＡが挙げられる。
本明細書で使用される場合、ＬＮＡ化合物として、これだけに限定されないが、糖の４’位と２’位の間に少なくとも１つの架橋を有する化合物であって、架橋のそれぞれが独立に、２’酸素原子と４’炭素原子を接続する－［Ｃ（Ｒ～）（Ｒ２）］，，－、－Ｃ（Ｒ～）＝Ｃ（Ｒ２）－、－Ｃ（Ｒ～）＝Ｎ、－Ｃ（＝ＮＲＥＭ）－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｓ）－、－Ｏ－、－Ｓｉ（Ｒｉ）ｑ－、－Ｓ（＝Ｏ）－および－Ｎ（Ｒ＆）－（式中、ｘは０、１、または２であり、ｎは１、２、３、または４であり、各Ｒ＆およびＲ２は独立に、Ｈ、保護基、ヒドロキシル、Ｃ＞＞Ｃ＞＞アルキル、置換Ｃ＞＞（－ＣＨ２－）基である）から独立に選択される連結基を１つまたは２～４つ含み、メチレンオキシ（４’－ＣＨ２－Ｏ－２’）ＬＮＡという用語が使用される、化合物が挙げられる。
さらに、この位置にエチレン架橋基を有する二環性糖部分の場合では、エチレンオキシ（４’－ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ－２’）ＬＮＡが使用される。メチレンオキシ（４’－ＣＨ２－Ｏ－２’）ＬＮＡの異性体であるｎ－Ｌ－メチレンオキシ（４’－ＣＨ２－Ｏ－２’）も本明細書で使用されるＬＮＡの定義の範囲内に包含される。
一部の実施形態では、ヌクレオシド単位は、ベータ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡ、アルファ－Ｌｏｘｙ－ＬＮＡ、ベータ－Ｄ－アミノ－ＬＮＡ、アルファ－Ｌ－アミノ－ＬＮＡ、ベータ－Ｄ－チオ－ＬＮＡ、アルファ－Ｌ－チオ－ＬＮＡ、５’－メチル－ＬＮＡ、ベータ－Ｄ－ＥＮＡおよびアルファ－Ｌ－ＥＮＡの一覧から選択されるＬＮＡ単位である。
「ｃＥｔ」または「拘束エチル」は、４’炭素と２’炭素を接続する架橋を含む二環性糖部分を意味し、ここで、架橋は、式：４’－ＣＨ（ＣＨ３）－Ｏ－２’を有する。
「拘束エチルヌクレオシド」（ｃＥｔヌクレオシドとも称される）は、４’－ＣＨ（ＣＨ３）－Ｏ－２’架橋を含む二環性糖部分を含むヌクレオシドを意味する。ｃＥｔおよびその特性のいくつかがPallan et al. Chem Commun (Camb). 2012, August 25; 48 (66): 8195-8197に記載されている。
「トリシクロ（ｔｃ）－ＤＮＡ」は、ＤＮＡおよびＲＮＡに対する結合特性の増強を示す、立体配置が拘束されたＤＮＡ類似体のクラスに属する。構造および作製方法はRenneberg et al. Nucleic Acids Res. 2002 Jul 1; 30 (13): 2751-2757に見ることができる。
本明細書で言及される「２’－フルオロ」は、糖環の２’位にフルオロ基を含むヌクレオシドである。２’－フッ素化ヌクレオチドは、Peng et al. J Fluor Chem. 2008 September; 129 (9): 743-766に記載されている。
本明細書で言及される場合「２’－Ｏ－メチル」は、糖環の２’位に－ＯＣＨ３基を含む糖を含むヌクレオシドである。
本明細書で言及される「立体配置が制限されたヌクレオシド（ＣＲＮ）」およびそれらを合成するための方法は、これにより参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１３０３６８６８に記載されている。ＣＲＮは、糖修飾されたヌクレオシドであり、ＬＮＡと同様に、リボースのＣ２’炭素とＣ４’炭素が化学架橋によって接続している。しかし、ＣＲＮでは、Ｃ２’－Ｃ４’架橋は、ＬＮＡ分子よりも炭素１つ長い。ＣＲＮではリボースの化学架橋によってリボースが固定位置にロックされ、それにより核酸塩基およびリン酸基の柔軟性が制限される。ＲＮＡに基づくまたはＤＮＡに基づくオリゴヌクレオチド内のＣＲＮ置換には、ハイブリダイゼーション親和性の増大およびヌクレアーゼ分解に対する抵抗性の増強という利点がある。
本明細書で言及される「アンロックド核酸」または「ＵＮＡ」は、一般には、リボースのＣ２－Ｃ３のＣ－Ｃ結合が除去され、アンロックド「糖」残基が形成されたアンロックド核酸である（これにより参照により本明細書に組み込まれるFluiter et al., Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039、およびSnead et al. Molecular Therapy-Nucleic Acids (2013) 2, e103；を参照されたい）。
「標的領域」とは、１つまたは複数のアンチセンス化合物がターゲティングされる標的核酸の一部を意味する。
「標的化送達」とは、本明細書で使用される場合、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、特定の組織もしくは細胞への効率的な送達が容易になるように製剤化されている、または、アンチセンスオリゴヌクレオチドが他のやり方で、例えば、標的化部分を含むように改変されている、もしくは、他のやり方で、特定の標的細胞への取り込みが容易になるように改変されている、送達を意味する。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、マイクロＲＮＡ－１３４（ｍｉＲ－１３４）を標的とするように設計されたものである。
成熟配列５’ＵＧＵＧＡＣＵＧＧＵＵＧＡＣＣＡＧＡＧＧＧＧ３’（配列番号１）（ｍｉＲＢａｓｅ ａｃｃ番号ＭＩＭＡＴ００００４４７）を有するｍｉＲ－１３４の標的領域に対して特定のアンチセンスオリゴヌクレオチドが設計されている。
上記の「ｍｉＲＢａｓｅ」への言及はmiRBase release 22.1に従う。
「ｍｉＲ－１３４関連神経疾患」という用語は、本明細書で使用される場合、疾患病態がｍｉＲ－１３４活性のアップレギュレーションに関連付けられる、または疾患の治療のためにｍｉＲ－１３４活性のダウンレギュレーションが有益になる疾患を意味する。
化合物
本発明の化合物は、１７～１９ヌクレオチド長、例えば、１８～１９ヌクレオチド長の配列を含む、ｍｉＲ－１３４を標的とするＬＮＡ／ＤＮＡミックスマーアンチセンスオリゴヌクレオチド（抗ｍｉＲ－１３４化合物）であり、配列番号１～３のうちの１つまたは複数と相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドである。本発明の抗ｍｉＲ－１３４化合物は、１７、１８または１９ヌクレオチド長であり、３’末端に少なくとも２つの末端ＬＮＡヌクレオチド類似体を有し、４０％～７０％のＬＮＡ、例えば、５０％～７０％のＬＮＡを含み、２つを超えるＤＮＡヌクレオチドの連続的なひと続きを含まない。さらに、本発明の抗ｍｉＲ－１３４化合物は、少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結を有する。ある態様に従って、本発明は、７～１４、例えば１０～１４の親和性増強性ヌクレオチド類似体を含み、３つを超える連続したＤＮＡヌクレオチドのひと続きを含有しないミックスマーである、１８～１９核酸塩基長の配列からなる、ｍｉＲ－１３４と相補的な抗ｍｉＲ－１３４オリゴヌクレオチドであって、１～１８のホスホロチオエートヌクレオシド間連結を含み、配列番号２と相補的である、アンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。
本発明の化合物は、１７～１９ヌクレオチド長、例えば、１８～１９ヌクレオチド長の配列を含む、ｍｉＲ－１３４を標的とするＬＮＡ／ＤＮＡミックスマーアンチセンスオリゴヌクレオチド（抗ｍｉＲ－１３４化合物）であり、配列番号１～３のうちの１つまたは複数と相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドである。本発明の抗ｍｉＲ－１３４化合物は、１７、１８または１９ヌクレオチド長であり、３’末端に少なくとも２つの末端ＬＮＡヌクレオチド類似体を有し、４０％～７０％のＬＮＡ、例えば、５０％～７０％のＬＮＡを含み、２つを超えるＤＮＡヌクレオチドの連続的なひと続きを含まない。さらに、本発明の抗ｍｉＲ－１３４化合物は、少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結を有する。ある態様に従って、本発明は、７～１４、例えば１０～１４の親和性増強性ヌクレオチド類似体を含み、３つを超える連続したＤＮＡヌクレオチドのひと続きを含有しないミックスマーである、１８～１９核酸塩基長の配列からなる、ｍｉＲ－１３４と相補的な抗ｍｉＲ－１３４オリゴヌクレオチドであって、１～１８のホスホロチオエートヌクレオシド間連結を含み、配列番号２と相補的である、アンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。
本発明の特定の化合物を表１に配列番号５～２１または２３～６０として開示する。一部の実施形態では、配列番号５～２１または２３～６０などの本発明の化合物は、ＬＮＡ以外のヌクレオチド類似体を含む。一部の実施形態では、配列番号５～２１または２３～６０におけるＤＮＡヌクレオチドのいくつかを、ＬＮＡ以外の親和性増強ヌクレオチド類似体、例えば、非限定的な例としてトリシクロ－ＤＮＡ、２’－フルオロ、２’－Ｏ－メチル、２’メトキシエチル（２’ＭＯＥ）、２’環状エチル（ｃＥＴ）、ＵＮＡ、２’フルオロおよび立体配置が制限されたヌクレオシド（ＣＲＮ）のいずれか１つで置き換える。一部の実施形態では、化合物配列番号５～２１または２３～６０は、完全なホスホロチオエート骨格を有する、すなわち、全てのヌクレオシド間連結がホスホロチオエート連結である。好ましい実施形態では、表１に示されている配列番号５～２１または２３～６０の化合物では、全てのヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合であり、全てのＬＮＡがベータ－Ｄ－オキシＬＮＡであり、ＬＮＡシトシン（Ｃ）の全てが５－メチルシトシンである。
表１において、大文字はＬＮＡヌクレオチドを示し、小文字はＤＮＡヌクレオチドであり、ＬＮＡシトシンは５－メチルシトシンであり、全てのヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合であり、ＬＮＡはベータ－Ｄ－オキシＬＮＡである。
対照（比較対象）オリゴヌクレオチドである配列番号２２は、ＷＯ１９２１９７２３の配列番号８と同一である。
一態様によると、本発明は、本発明および／または実施形態によるｍｉＲ－１３４と相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むｍｉＲ－１３４阻害組成物に関する。
別の態様によると、本発明は、有効投薬量の本発明および／または実施形態によるｍｉＲ－１３４と相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。
別の態様によると、本発明は、有効投薬量の本発明および／または実施形態によるｍｉＲ－１３４と相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物であって、前記ｍｉＲ－１３４と相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドが唯一の活性医薬成分である、医薬組成物に関する。
別の態様によると、本発明は、本発明および／もしくは実施形態によるアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは本発明および／もしくは実施形態による組成物を使用することによって本発明および／または実施形態による疾患を治療する方法に関する。一部の態様では、本発明は、医薬としての使用のための、本発明の化合物、すなわち、配列番号５～２１または２３～６０のうちのいずれか１つ、例えば、好ましい実施形態では、配列番号７、８、１０、１２、１９、２４、２６～３７、４５～５６、５９または６０のうちのいずれか１つに関する。
別の態様によると、本発明は、本発明および／もしくは実施形態によるｍｉＲ－１３４と相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは本発明および／もしくは実施形態による組成物を使用することによって本発明および／または実施形態による疾患を診断する方法に関する。
組成物および使用
本発明の化合物は、組成物、例えば本発明の医薬組成物としての使用のためのものであり、医薬として、および、本明細書に開示される疾患、例えば、てんかんを含めた神経性障害を治療するため、緩和させるため、好転させるため、先制治療するため、または予防するために使用するためのものである。
本発明の化合物は、組成物、例えば本発明の医薬組成物としての使用のためのものであり、医薬として、および、本明細書に開示される疾患、例えば、てんかんを含めた神経性障害を治療するため、緩和させるため、好転させるため、先制治療するため、または予防するために使用するためのものである。
一部の実施形態では、本発明の化合物は、組成物、例えば、ｍｉＲ－１３４関連疾患を治療するための医薬組成物に含められ、ｍｉＲ－１３４関連疾患は、疾患または疾患パラメータを治療するため、予防するため、緩和させるためまたは好転させるためにｍｉＲ－１３４活性のモジュレーションが有益である疾患である。一部の実施形態では、治療、予防、緩和または好転は治癒的なものである。一部の実施形態では、治療、予防、緩和または好転は疾患修飾性である。一部の実施形態では、治療、予防、緩和または好転は防止的なものである。
化合物および組成物によって治療する、緩和させる、好転させる、先制して治療する、または予防的に治療することができる疾患としては、非限定的な例として、神経障害、例えば、神経変性障害、神経発達障害、遺伝障害、遺伝性神経発達障害、または精神疾患を含めた、中枢神経系（ＣＮＳ）または末梢神経系（ＰＮＳ）の疾患が挙げられる。特に、本発明の化合物および組成物を、てんかん、例えば、薬剤抵抗性てんかん、てんかんの発作、てんかんの自発性発作、治療法抵抗性発作、焦点性てんかん、好ましくは前頭葉、頭頂葉、後頭葉または側頭葉を焦点とする焦点性てんかんを治療するため、緩和させるため、好転させるため、先制治療するためまたは予防するために使用することができる。一部の実施形態では、てんかんは、全般てんかん、好ましくは欠神、ミオクロニー発作、強直間代性発作、強直性発作、脱力発作、間代性発作および攣縮の中から選択される。一部の実施形態では、てんかんは、てんかん重積状態である。一部の実施形態では、本発明の化合物および組成物は、てんかん、例えば、常染色体優性夜間前頭葉てんかん、徐波睡眠期持続性棘徐波を示すてんかん性脳症（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｓｐｉｋｅ－ａｎｄ－ｗａｖｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ｓｌｏｗ ｓｌｅｅｐ）、ドラベ症候群、脳卒中後てんかん、てんかん性脳症、笑いてんかん、欠神、良性新生児発作、ジーボンス症候群、若年ミオクロニーてんかん、ランドウ・クレフナー症候群、レンノックス・ガストー症候群、内側側頭葉てんかん、ミオクロニー脱力発作を伴うてんかん、大田原症候群、パナイトポーラス症候群、ＰＣＤＨ１９症候群、中心側頭棘波をもつ良性小児てんかん、スタージ・ウェーバー症候群、症候性焦点性てんかん、一過性てんかん性健忘およびウエスト症候群の中から選択されるてんかんを治療するため、緩和させるため、好転させるため、先制治療するためまたは予防するためのものである。一部の実施形態では、本発明の化合物および組成物は、てんかんを治療するため、緩和させるため、好転させるため、先制治療するためまたは予防するためのものであり、前記てんかんは、精神障害、認知障害、睡眠障害、心血管障害、呼吸器疾患、炎症性障害、不安、疼痛、認知機能障害、うつ病、認知症、頭痛、片頭痛、心疾患、潰瘍、消化性潰瘍、関節炎および骨粗鬆症の中から選択される共存症と共に存在する。
一部の実施形態では、本発明の化合物および組成物は、海馬損傷などのニューロン損傷を治療するため、緩和させるため、好転させるため、先制治療するためまたは予防するためのものである。一部の実施形態では、本発明の化合物および組成物は、酸化ストレス、炎症およびアポトーシスを治療するため、緩和させるため、好転させるため、先制治療するためまたは予防するために有用である。一部の実施形態では、本発明の化合物および組成物は、脳出血により誘導される脳損傷、虚血性脳卒中、出血性卒中または脳卒中を治療するため、緩和させるため、好転させるため、先制治療するためまたは予防するためのものである。
一部の実施形態では、本発明の化合物および組成物は、自己免疫疾患、記憶障害、海馬硬化症、パーキンソン病、脱髄性疾患、多発性硬化症、脊髄損傷、急性脊髄損傷、筋萎縮性側索硬化症、進行性球麻痺、進行性筋萎縮症、原発性側索硬化症、運動失調、ベル麻痺、遺伝性神経疾患、シャルコー・マリー・トゥース、頭痛、ホートン頭痛、片頭痛、ピック病、進行性核上性麻痺、多系統変性、運動ニューロン疾患、ハンチントン病、プリオン病、クロイツフェルト・ヤコブ病、大脳皮質基底核変性症、失語症、原発性進行性失語症、運動障害またはその症状もしくは影響を治療するため、緩和させるため、好転させるため、先制治療するためまたは予防するためのものである。
一部の実施形態では、本発明の化合物および組成物は、認知症を治療するため、緩和させるため、好転させるため、先制治療するためまたは予防するためのものである。
一部の実施形態では、本発明の化合物および組成物は、アルツハイマー病、血管性認知症、前頭側頭型認知症およびレビー小体認知症の中から選択される認知症を治療するため、緩和させるため、好転させるため、先制治療するためまたは予防するためのものである。
一部の実施形態では、本発明の化合物および組成物は、疼痛を治療するため、緩和させるため、好転させるため、先制治療するためまたは予防するためのものである。
本発明の化合物は、ある特定の精神疾患、特に、ｍｉＲ－１３４活性のモジュレーションが有益である精神疾患を治療するためにも使用することができる。
一部の実施形態では、本発明の化合物および組成物は、ｍｉＲ－１３４のモジュレーションが有益である精神疾患を治療するため、緩和させるため、好転させるため、先制治療するためまたは予防するためのものである。
一部の実施形態では、本発明の化合物および組成物は、自閉症、または気分障害、うつ病性障害、統合失調症、双極性障害、注意欠陥多動性障害、不安またはトゥレット症を治療するため、緩和させるため、好転させるため、先制治療するためまたは予防するためのものである。
一部の実施形態では、本発明の化合物および組成物は、大うつ病性障害を治療するため、緩和させるため、好転させるため、先制治療するためまたは予防するためのものである。
一部の実施形態では、本発明の化合物および組成物は、ｍｉＲ－１３４の発現または活性のモジュレーションが有益である記憶障害を治療するため、緩和させるため、好転させるため、先制治療するためまたは予防するためのものである。
ｍｉＲ－１３４は、種々のがんの病態形成に関係づけられ、したがって、本発明の抗ｍｉＲ－１３４化合物はまた、がんを治療または防止する方法における使用のためのものである。
一部の実施形態では、本発明の化合物および組成物は、がんを治療するため、緩和させるため、好転させるため、先制治療するためまたは予防するためのものである。
一部の実施形態では、本発明の化合物および組成物は、神経系のがん、好ましくは神経膠腫を治療するため、緩和させるため、好転させるため、先制治療するためまたは予防するためのものである。
一部の実施形態では、本発明の化合物および組成物は、肺腫瘍、非小細胞肺がん、神経膠腫、頭頸部扁平上皮癌、膵がん、結腸がん、前立腺がん、黒色腫、ぶどう膜黒色腫、口腔扁平上皮癌または舌の扁平上皮癌の群から選択されるがんを治療するため、緩和させるため、好転させるため、先制治療するためまたは予防するためのものである。
一部の実施形態では、本発明の化合物および組成物は、プラダー・ウィリ症候群、アンジェルマン症候群、心血管障害、アテローム性動脈硬化症、および肺疾患のうちのいずれか１つを治療するため、緩和させるため、好転させるため、先制治療するためまたは予防するためのものである。
一部の実施形態では、本発明の化合物および組成物は、感染症を治療するため、緩和させるため、好転させるため、先制治療するためまたは予防するためのものである。
一部の実施形態では、本発明の化合物および組成物は、敗血症、髄膜炎および脳炎の中から選択される感染症を治療するため、緩和させるため、好転させるため、先制治療するためまたは予防するためのものである。
一部の実施形態では、本発明の化合物および組成物は、を治療するため、緩和させるため、好転させるため、先制治療するためまたは予防するためのものである。
一部の実施形態では、本発明の化合物および組成物は、遺伝障害、好ましくは神経線維腫症を治療するため、緩和させるため、好転させるため、先制治療するためまたは予防するためのものである。
一部の実施形態では、抗ｍｉＲ－１３４化合物を抗ｍｉＲ－１３４組成物によって処置されるある特定の疾患に対する他の治療法と共に有利に使用することができる。
したがって、本発明のｍｉＲ－１３４と相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１種または複数種の他の治療法と組み合わせて使用するためのものである。一部の実施形態では、本発明のｍｉＲ－１３４と相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、実施形態に記載の疾患に対する、例えば、神経障害および精神障害を治療するための１種または複数種の他の治療法と組み合わせて使用するためのものである。一部の実施形態では、前記他の治療法は、抗ｍｉＲ－２７ｂアンチセンスオリゴヌクレオチドである。一部の実施形態では、前記他の治療法は、アデノシンキナーゼ阻害剤である。一部の実施形態では、前記他の治療法は、哺乳動物、例えばヒトにおいてＮｒｆ－２／ＡＲＥ経路を誘導するものである。一部の実施形態では、抗ｍｉＲ－１３４組成物は、抗ｍｉＲ２７ｂアンチセンスオリゴヌクレオチド、抗アデノシンキナーゼアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびＮｒｆ－２／ＡＲＥ経路を誘導する治療法のうちの１つまたは複数と組み合わせて使用されるものである。
一部の実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、それらが唯一の活性成分である組成物に使用されるものであり、一部の実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、他の活性医薬成分を含む組成物に使用するためのものである。
本発明は、本発明の抗ｍｉＲ－１３４化合物を含み、薬学的に許容される担体をさらに含む医薬組成物を提供する。
一部の実施形態では、本発明の医薬組成物は、ｍｉＲ－１３４と相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを唯一の活性医薬成分として含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の活性医薬成分が本発明の医薬組成物中に存在する。
投薬量
「有効投薬量」という表現は、所望の効果が実現される薬物の用量を指す。本発明に関しては、所望の効果は、ｍｉＲ－１３４の活性の低下である。ｍｉＲ－１３４の活性の低下は、例えば、ｍｉＲ－１３４もしくはｍｉＲ－１３４前駆体の分解をもたらすオリゴヌクレオチドを使用する場合にはｍｉＲ－１３４のレベルを測定することによって測定することができる、または、マイクロＲＮＡ－１３４標的（例えば、ｍｉＲ－１３４結合性部位を含み、発現がｍｉＲ－１３４によって調節されるｍＲＮＡ（ｍｉＲ－１３４標的ｍＲＮＡ）など）の抑制解除を測定することによって測定することができる。したがって、ｍｉＲ－１３４阻害を直接的に測定することもでき、ｍｉＲ－１３４活性の二次的指標によって間接的に測定することもできる。
「有効投薬量」という表現は、所望の効果が実現される薬物の用量を指す。本発明に関しては、所望の効果は、ｍｉＲ－１３４の活性の低下である。ｍｉＲ－１３４の活性の低下は、例えば、ｍｉＲ－１３４もしくはｍｉＲ－１３４前駆体の分解をもたらすオリゴヌクレオチドを使用する場合にはｍｉＲ－１３４のレベルを測定することによって測定することができる、または、マイクロＲＮＡ－１３４標的（例えば、ｍｉＲ－１３４結合性部位を含み、発現がｍｉＲ－１３４によって調節されるｍＲＮＡ（ｍｉＲ－１３４標的ｍＲＮＡ）など）の抑制解除を測定することによって測定することができる。したがって、ｍｉＲ－１３４阻害を直接的に測定することもでき、ｍｉＲ－１３４活性の二次的指標によって間接的に測定することもできる。
本発明の化合物は、有効投薬量で使用するためのものであり、組成物は、有効投薬量の本発明の化合物を含む。
一部の実施形態では、各投薬時に投与される化合物の投薬量、例えば、単位用量は、０．０００１ｍｇ／ｋｇ～２５ｍｇ／ｋｇの範囲内に入る。
一部の実施形態では、有効用量は、ｍｉＲ－１３４またはその活性を、継続的な投与間の期間にわたって意義のあるレベルまで、例えば、対象に対して治療的利益になるレベルまで、ダウンレギュレートするために十分な用量である。
本発明の医薬組成物は、一部の実施形態では、最初の投薬量増量相をもたらすための投与用に作ることができ、疾患病態に応じて、最初の投薬量増量相の後に、対象における、例えば対象の標的組織における化合物の濃度を維持することを目的として、維持投薬量スキームを続けることができ、それが疾患の治療に有効になる。投薬の効果は、例えば、疾患の状態を示す疾患パラメータを観察することによって測定することもでき、標的組織に応じて、ｍｉＲ－１３４標的ＲＮＡ活性などの種々の組織パラメータ、または、代替例では、血漿中の測定可能な病状依存的パラメータを観察することによっても測定可能であり得る。
薬物送達
種々の送達系が公知であり、本発明の治療薬を投与するために使用することができる。投与方法としては、これだけに限定されないが、皮下投与、静脈内投与、非経口投与、経鼻投与、経肺投与、直腸内投与、膣内投与、子宮内投与、尿道内投与、眼への投与、耳への投与、皮膚投与、皮内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、硬膜外投与、脳室内投与（ｉｎｔｒａｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）、脳内投与、くも膜下腔内投与または経口投与または脳もしくは脳脊髄液中への直接投与が挙げられる。組成物を、任意の都合のよい経路によって、例えば、注入またはボーラス注射によって、上皮もしくは皮膚粘膜組織（例えば、口腔粘膜、直腸および腸粘膜など）を通じた吸収によって投与することができ、また、他の生物活性のある薬剤を伴って、または伴わずに投与することができる。投与は、全身性であっても局所的であってもよい。さらに、本発明の組成物を中枢神経系に脳室内およびくも膜下腔内投与を含めた任意の適切な経路によって投与することが望ましい場合がある。脳室内カテーテル、例えば、オンマイヤーリザーバーなどのリザーバーに取り付けられた脳室内カテーテルにより、脳室内注射を容易にすることができる。例えば、吸入器またはネブライザー、およびエアロゾル化剤を伴う製剤を使用することにより、経肺投与を使用することもできる。治療薬がＣＮＳまたはＰＮＳに送達されることが好ましい。
種々の送達系が公知であり、本発明の治療薬を投与するために使用することができる。投与方法としては、これだけに限定されないが、皮下投与、静脈内投与、非経口投与、経鼻投与、経肺投与、直腸内投与、膣内投与、子宮内投与、尿道内投与、眼への投与、耳への投与、皮膚投与、皮内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、硬膜外投与、脳室内投与（ｉｎｔｒａｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）、脳内投与、くも膜下腔内投与または経口投与または脳もしくは脳脊髄液中への直接投与が挙げられる。組成物を、任意の都合のよい経路によって、例えば、注入またはボーラス注射によって、上皮もしくは皮膚粘膜組織（例えば、口腔粘膜、直腸および腸粘膜など）を通じた吸収によって投与することができ、また、他の生物活性のある薬剤を伴って、または伴わずに投与することができる。投与は、全身性であっても局所的であってもよい。さらに、本発明の組成物を中枢神経系に脳室内およびくも膜下腔内投与を含めた任意の適切な経路によって投与することが望ましい場合がある。脳室内カテーテル、例えば、オンマイヤーリザーバーなどのリザーバーに取り付けられた脳室内カテーテルにより、脳室内注射を容易にすることができる。例えば、吸入器またはネブライザー、およびエアロゾル化剤を伴う製剤を使用することにより、経肺投与を使用することもできる。治療薬がＣＮＳまたはＰＮＳに送達されることが好ましい。
送達手段としては、吸入送達、シリンジまたはミニ浸透圧ポンプによる直接筋肉内への筋肉内送達、シリンジまたはミニ浸透圧ポンプによって腹膜に直接投与する腹腔内投与、シリンジによって皮膚の下に直接投与する皮下投与、注射によってまたは浸透圧ポンプに取り付けられた小さなカテーテルを使用して脳室に直接投与する脳室内投与が挙げられる。さらに、筋肉内または脊髄に直接設置されるインプラントを調製することができる（例えば、小型のシリコンインプラント）。本発明の組成物を治療が必要な領域に局所的に投与することが望ましい場合がある。これは、例えば、限定するものではなく、局部適用によって、注射によって、カテーテルを用いて、坐薬を用いて、またはインプラントを用いて実現することができ、前記インプラントは、シラスティック膜などの膜または線維を含めた、多孔質、非多孔質、またはゼラチン質材料製であってよい。
医薬組成物
本発明は、医薬組成物も提供する。そのような組成物は、治療有効量の治療薬、および薬学的に許容される担体を含み得る。「薬学的に許容される」という用語は、規制当局によって承認される通り定義することができる。規制当局は、例えば、欧州医薬品庁（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ Ａｇｅｎｃｙ）、連邦もしくは州政府であり得る、または動物、特にヒトにおける使用に関して米国薬局方もしくは他の一般に認められている薬局方に収載されているものであり得る。「治療有効量」という用語は、障害または疾患の発達または発生の臨床的に意義のある阻害、好転または逆転をもたらす治療薬の量と定義することができる。「担体」という用語は、治療薬がそれと共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指し得る。そのような医薬担体は、滅菌された液体、例えば、水、および石油、動物、野菜または合成起源のものを含めた油、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などであってよい。医薬組成物を静脈内投与する場合、好ましい担体は水であり得る。生理食塩水溶液ならびにブドウ糖水溶液およびグリセロール水溶液も、特に注射液のための液体担体として使用することができる。適切な医薬賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、モルト、イネ、穀粉、白亜、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなどが挙げられる。組成物は、所望であれば、湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝液も含有してよい。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、ピル、カプセル剤、散剤、徐放性製剤などの形態をとってよい。組成物を、従来の結合剤およびトリグリセリドなどの担体を用いて坐薬として製剤化することができる。経口用製剤には、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準の担体を含めることができる。そのような組成物は、治療有効量の治療薬を、好ましくは精製された形態で、患者に適当に投与するための形態をもたらすために適した量の担体と共に含有してよい。製剤を投与形式に合わせることができる。静脈内投与用の組成物は、滅菌等張性水性緩衝液中の溶液であってよい。必要であれば、組成物に、可溶化剤および注射部位の疼痛を和らげるためのリグノカインなどの局所麻酔薬を含めることもできる。成分は別々に供給することもでき、混合して単位剤形として、例えば、活性薬剤の数量が示されたアンプルまたはサシェなどの密封容器中の凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として供給することもできる。組成物を注入によって投与する場合、滅菌された医薬品グレードの水または生理食塩水を含有する注入用ボトルに分配することができる。組成物を注射によって投与する場合、成分を投与前に混合することができるように、注射用滅菌水、または生理食塩水のアンプルを提供することができる。
本発明は、医薬組成物も提供する。そのような組成物は、治療有効量の治療薬、および薬学的に許容される担体を含み得る。「薬学的に許容される」という用語は、規制当局によって承認される通り定義することができる。規制当局は、例えば、欧州医薬品庁（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ Ａｇｅｎｃｙ）、連邦もしくは州政府であり得る、または動物、特にヒトにおける使用に関して米国薬局方もしくは他の一般に認められている薬局方に収載されているものであり得る。「治療有効量」という用語は、障害または疾患の発達または発生の臨床的に意義のある阻害、好転または逆転をもたらす治療薬の量と定義することができる。「担体」という用語は、治療薬がそれと共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指し得る。そのような医薬担体は、滅菌された液体、例えば、水、および石油、動物、野菜または合成起源のものを含めた油、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などであってよい。医薬組成物を静脈内投与する場合、好ましい担体は水であり得る。生理食塩水溶液ならびにブドウ糖水溶液およびグリセロール水溶液も、特に注射液のための液体担体として使用することができる。適切な医薬賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、モルト、イネ、穀粉、白亜、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなどが挙げられる。組成物は、所望であれば、湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝液も含有してよい。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、ピル、カプセル剤、散剤、徐放性製剤などの形態をとってよい。組成物を、従来の結合剤およびトリグリセリドなどの担体を用いて坐薬として製剤化することができる。経口用製剤には、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準の担体を含めることができる。そのような組成物は、治療有効量の治療薬を、好ましくは精製された形態で、患者に適当に投与するための形態をもたらすために適した量の担体と共に含有してよい。製剤を投与形式に合わせることができる。静脈内投与用の組成物は、滅菌等張性水性緩衝液中の溶液であってよい。必要であれば、組成物に、可溶化剤および注射部位の疼痛を和らげるためのリグノカインなどの局所麻酔薬を含めることもできる。成分は別々に供給することもでき、混合して単位剤形として、例えば、活性薬剤の数量が示されたアンプルまたはサシェなどの密封容器中の凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として供給することもできる。組成物を注入によって投与する場合、滅菌された医薬品グレードの水または生理食塩水を含有する注入用ボトルに分配することができる。組成物を注射によって投与する場合、成分を投与前に混合することができるように、注射用滅菌水、または生理食塩水のアンプルを提供することができる。
実施例１：細胞培養
接着性ラット褐色細胞腫細胞株ＰＣ－１２ Ａｄｈ（ＥＣＡＣＣ番号８８０２２４０１）をＡＴＣＣから購入し（ＡＴＣＣ ｃａｔ番号ＣＲＬ－１７２１．１（商標））、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）ＣｅｌｌＢＩＮＤ（登録商標）Ｓｕｒｆａｃｅ細胞培養フラスコ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ ｃａｔ番号ＣＬＳ３２９０）中、２．５％熱失活ウシ胎仔血清（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ ｃａｔ番号Ｆ４１３５－５００ｍｌ）、１５％熱失活ウマ血清（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ ｃａｔ番号Ｈ１３８５－５００ｍｌおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ ｃａｔ番号Ｐ４３３３－１００ｍｌ）を補充したＨａｍ’ｓ Ｆ－１２Ｋ（Ｋａｉｇｈｎ’ｓ）培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｃａｔ番号２１１２７０２２）で成長させた。細胞を、加湿５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で保持し、週に２回継代した。
接着性ラット褐色細胞腫細胞株ＰＣ－１２ Ａｄｈ（ＥＣＡＣＣ番号８８０２２４０１）をＡＴＣＣから購入し（ＡＴＣＣ ｃａｔ番号ＣＲＬ－１７２１．１（商標））、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）ＣｅｌｌＢＩＮＤ（登録商標）Ｓｕｒｆａｃｅ細胞培養フラスコ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ ｃａｔ番号ＣＬＳ３２９０）中、２．５％熱失活ウシ胎仔血清（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ ｃａｔ番号Ｆ４１３５－５００ｍｌ）、１５％熱失活ウマ血清（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ ｃａｔ番号Ｈ１３８５－５００ｍｌおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ ｃａｔ番号Ｐ４３３３－１００ｍｌ）を補充したＨａｍ’ｓ Ｆ－１２Ｋ（Ｋａｉｇｈｎ’ｓ）培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｃａｔ番号２１１２７０２２）で成長させた。細胞を、加湿５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で保持し、週に２回継代した。
実施例２：培養物におけるルシフェラーゼレポーターアッセイ
単純かつ非常に高感度の手法は、ルシフェラーゼなどのレポーター遺伝子の３’ＵＴＲ内に単一の完全マッチｍｉＲＮＡ結合性部位を有するｍｉＲＮＡレポータープラスミドの構築を伴うものである。この方法は、培養した細胞において、ｍｉＲＮＡ阻害を検証するため、また異なる抗ｍｉＲ設計の効力を比較するために広範囲にわたって使用されている。
単純かつ非常に高感度の手法は、ルシフェラーゼなどのレポーター遺伝子の３’ＵＴＲ内に単一の完全マッチｍｉＲＮＡ結合性部位を有するｍｉＲＮＡレポータープラスミドの構築を伴うものである。この方法は、培養した細胞において、ｍｉＲＮＡ阻害を検証するため、また異なる抗ｍｉＲ設計の効力を比較するために広範囲にわたって使用されている。
ヒトｍｉＲ－１３４に対する単一の完全マッチ標的部位に対応するアニーリングされたオリゴヌクレオチドを、デュアルルシフェラーゼｐｓｉＣＨＥＣＫ２プラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ）のウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子の３’ＵＴＲ内にクローニングすることにより、ｍｉＲ－１３４レポーターを生成した。
ルシフェラーゼアッセイに関しては、トランスフェクションの前日に、ＰＣ－１２ Ａｄｈ細胞を９６ウェルＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）ＣｅｌｌＢＩＮＤ（登録商標）Ｓｕｒｆａｃｅ細胞培養マイクロウェルプレート（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ ｃａｔ番号ＣＬＳ３３３０）にウェル当たり細胞２５，０００個の密度で播種した。リポフェクタミン２０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｃａｔ番号１１６６８－０１９）をＯｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｃａｔ番号５１９８５０２６）中、０．５μ／ウェルの最終濃度で使用して細胞へのトランスフェクションを行った。ｍｉＲ－１３４は広範囲のがんにおいてダウンレギュレートされるので（Pan et al, Mol Ther Nucleic Acids. 2017 Mar 17; 6: 140-149.）、十分なレベルのｍｉＲ－１３４を発現する細胞株を見いだすのは困難であった。これを克服するために、ｍｉＲ－１３４模倣体を細胞に同時トランスフェクトした。したがって、最終濃度２．５ｎＭのｍｉＲＣＵＲＹ ＬＮＡ ｍｉＲＮＡ模倣体、ｈｓａ－ｍｉＲ－１３４－５ｐ（Ｑｉａｇｅｎ ｃａｔ番号 ３３９１７３）をトランスフェクション反応に添加した。１７種のアンチセンスオリゴヌクレオチドのライブラリーに対するスクリーニングを、ルシフェラーゼレポータープラスミドを伴う各抗ｍｉＲ－１３４およびｍｉＲ－１３４模倣体を最終濃度０．２ｎＭ、１ｎＭ、５ｎＭで同時トランスフェクトすることにより、ルシフェラーゼレポーターアッセイを使用して行った。配列がスクランブルされたオリゴヌクレオチド、ｍｉＲＮＡマッチ部位を含有しないベクター、およびモックトランスフェクションを対照として含めた。さらに、以前公開された抗ｍｉＲ－１３４オリゴヌクレオチド（ＷＯ１９２１９７２３の配列番号８）を比較対象として使用した。全ての試料について技術的２連で実行した。４時間後、細胞をＯｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）培地で洗浄し、新鮮な完全細胞培養培地をウェルに添加した。
トランスフェクションの２４時間後、Ｄｕａｌ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ ｃａｔ番号Ｅ２９２０）を使用し、製造者の指示に従ってルシフェラーゼアッセイを行った。試薬をプレート中で３０分インキュベートした後、発光量をプレートリーダー（ＶａｒｉｏＳｋａｎ Ｌｕｘ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で決定した。
結果を、バックグラウンド発光を差し引き、次いで、ウミシイタケルシフェラーゼ活性をホタルルシフェラーゼ活性によって正規化することにより分析した。次いで、２回の技術的２連の平均を空ベクターに対して正規化し、パーセンテージとして表した。結果をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（バージョン９．０．２、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）で可視化した。
１７種全てのアンチセンスオリゴヌクレオチドについて、ホタルルシフェラーゼ活性に対して正規化したウミシイタケルシフェラーゼ活性の抑制解除のレベルの、空ベクターに対するパーセンテージが図１に示されている。
抗ｍｉＲ－１３４オリゴヌクレオチドの完全なライブラリーから、最も強力な５種の抗ｍｉＲ１３４分子をさらなる分析およびＩＣ５０決定のために選択した。
実施例３：培養した細胞株における抗ｍｉＲ－１３４オリゴヌクレオチドのＩＣ５０の決定
ｍｉＲ－１３４の阻害に関するアンチセンスオリゴヌクレオチドの効力を決定するために、ＩＣ５０決定を行った。ルシフェラーゼアッセイを実施例２に記載の通り実施した。細胞へのトランスフェクションを、８０ｎＭから２倍希釈で０．００４９ｎＭまでにわたる広範囲の抗ｍｉＲ－１３４濃度を使用して行った。ウミシイタケルシフェラーゼをホタルルシフェラーゼ活性に対して正規化し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（バージョン９．０．２、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）でｌｏｇ（Ｍ）に対してプロットした。用量反応曲線を、３パラメータ非線形当てはめを使用して当てはめ、ＩＣ５０値をｎＭ単位で算出した。
ｍｉＲ－１３４の阻害に関するアンチセンスオリゴヌクレオチドの効力を決定するために、ＩＣ５０決定を行った。ルシフェラーゼアッセイを実施例２に記載の通り実施した。細胞へのトランスフェクションを、８０ｎＭから２倍希釈で０．００４９ｎＭまでにわたる広範囲の抗ｍｉＲ－１３４濃度を使用して行った。ウミシイタケルシフェラーゼをホタルルシフェラーゼ活性に対して正規化し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（バージョン９．０．２、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）でｌｏｇ（Ｍ）に対してプロットした。用量反応曲線を、３パラメータ非線形当てはめを使用して当てはめ、ＩＣ５０値をｎＭ単位で算出した。
図２は、５種の抗ｍｉＲ－１３４オリゴヌクレオチドの用量反応曲線およびＩＣ５０値を示す。
実施例４：培養したＵ－８７ Ｍｇ細胞におけるＩＣ５０決定
Ｕ－８７ Ｍｇ細胞株におけるＩＣ５０曲線を、リポフェクタミン２０００の量をウェル当たり０．４μＬとし、トランスフェクションを９６ウェルＣｏｓｔａｒ黒色プレート（ｃａｔ番号：３６０３、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｗｏｒｌｄ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ、ＵＳＡ）で行ったこと以外はＰＣ－１２ Ａｄｈ細胞の場合と同様に得た。
Ｕ－８７ Ｍｇ細胞株におけるＩＣ５０曲線を、リポフェクタミン２０００の量をウェル当たり０．４μＬとし、トランスフェクションを９６ウェルＣｏｓｔａｒ黒色プレート（ｃａｔ番号：３６０３、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｗｏｒｌｄ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ、ＵＳＡ）で行ったこと以外はＰＣ－１２ Ａｄｈ細胞の場合と同様に得た。
図３は、Ｕ－８７ Ｍｇ細胞における５種のｍｉＲ－１３４抗ｍｉＲオリゴヌクレオチドの用量反応曲線およびＩＣ５０値を示す。
実施例５：培養したＰＣ－１２ Ａｄｈ細胞株におけるｍｉＲ－１３４標的ｍＲＮＡの抑制解除
ｍｉＲＮＡは、それらの標的ｍＲＮＡのレベルを負に調節するので、抗ｍｉＲオリゴヌクレオチドによるｍｉＲ－１３４阻害の機能的影響をその後に続く標的ｍＲＮＡのアップレギュレーションによって測定することができる。ｍｉＲ－１３４の主な標的はＬｉｍｋ１およびＳｅｒｐｉｎｅ１である。これらの２種のマーカーのアップレギュレーションにより、ｍｉＲ－１３４阻害の機能的影響が示される。
ｍｉＲＮＡは、それらの標的ｍＲＮＡのレベルを負に調節するので、抗ｍｉＲオリゴヌクレオチドによるｍｉＲ－１３４阻害の機能的影響をその後に続く標的ｍＲＮＡのアップレギュレーションによって測定することができる。ｍｉＲ－１３４の主な標的はＬｉｍｋ１およびＳｅｒｐｉｎｅ１である。これらの２種のマーカーのアップレギュレーションにより、ｍｉＲ－１３４阻害の機能的影響が示される。
ＰＣ－１２ Ａｄｈ細胞へのトランスフェクションを、上記の実施例に記載されている通りであるが、細胞を１２ウェルＣｅｌｌＢｉｎｄプレート（ｃａｔ番号：ＣＬＳ３３３６、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｗｏｒｌｄ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ、ＵＳＡ）にウェル当たり細胞３×１０５個の密度で播種したこと、ウェル当たり６μＬのリポフェクタミン２０００を使用したこと、ルシフェラーゼレポーターを使用しなかったことを例外として行った。直接顕微鏡によって検査することによってトランスフェクション効率を確認するために、ＦＡＭ標識されたオリゴヌクレオチドを別のウェルにトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、ｍｉＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ｃａｔ番号：２１７００４、Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用し、製造者の指示に従ってＲＮＡ抽出を行った。さらなる分析を行うまでＲＮＡを－８０℃で保管した。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＶ逆転写酵素（ｃａｔ番号：１８０９００１０、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用し、製造者の指示に従って逆転写を行った。これには、ｅｚＤＮａｓｅ（商標）（ｃａｔ番号：１１７６６０５１、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）によるｇＤＮＡの除去、およびランダムな六量体プライマー（ｃａｔ番号：ＳＯ１４２、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）の使用が含まれた。ｑＰＣＲを、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ６ Ｆｌｅｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）で、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｎｅｗａｒｋ、ＮＪ、ＵＳＡ）によって合成されたＴａｑＭａｎアッセイ（表２）およびＴａｑＭａｎ（商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ＩＩ、ＵＮＧなし（ｃａｔ番号：４４４００４０、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用し、製造者の指示に従って行った。全てのｑＰＣＲアッセイを、エクソンにまたがる（ｅｘｏｎ－ｓｐａｎｎｉｎｇ）ように設計し、ｂｌａｓｔによってプライマーの特異性を確認し、プライマーの効率を５倍希釈系列を使用して決定した。Ｈｐｒｔ１をハウスキーピング遺伝子として使用した。全てのｑＰＣＲ結果をΔΔＣｔ法（Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2-ΔΔCT Method. Methods. 2001;25(4):402-408）を使用し、スクランブルされたオリゴヌクレオチドを正規化のために使用して解析した。
図４は、ｍｉＲ－１３４標的ｍＲＮＡの抑制解除のレベルを示す。
実施例６：培養されたＰＣ－１２ Ａｄｈ細胞株におけるｍｉＲ－１３４標的タンパク質の抑制解除
トランスフェクションを、ＰＣ－１２ Ａｄｈ細胞を６ウェルＣｅｌｌＢｉｎｄプレート（ｃａｔ番号：ＣＬＳ３３３５、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｗｏｒｌｄ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ、ＵＳＡ）にウェル当たり細胞６．２５×１０５個で播種し、１５μＬ／ウェルのリポフェクタミン２０００（ｃａｔ番号：１１６６８０１９、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用した以外は実施例５の通り行った。トランスフェクションの４８時間後、細胞タンパク質を、ｃＯｍｐｌｅｔｅ（商標）Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（ｃａｔ番号：１１６９７４９８００１、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充したＲＩＰＡ緩衝液（ｃａｔ番号：８９９００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して抽出し、タンパク質濃度をＢｉｏ－Ｒａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ ＩＩ（ｃａｔ番号：５０００００２、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用し、製造者の指示に従って測定した。電気泳動のために、タンパク質２４μｇを１２％ゲル（Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ ＴＧＸ ｓｔａｉｎ－ｆｒｅｅ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）にローディングし、その後、タンパク質をＰＶＤＦメンブレン（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）にブロッティングした。メンブレンをＬＩＭＫ１に対する一次抗体（ｃａｔ番号：３８４２、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、５％ＢＳＡ中、１：５００）およびＧＡＰＤＨ（ｃａｔ番号：６０００４－１－Ｉｇ、Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ、ＥｖｅｒｙＢｌｏｔ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（ｃａｔ：１２０１００２０、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）中、１：２０，０００）と一緒に４℃で一晩インキュベートした。翌日、ＨＲＰとコンジュゲートした二次抗体（ロバ抗ウサギ、ｃａｔ番号：３１４５８、５％ＢＳＡ中、１：３，０００、およびロバ抗マウス、ｃａｔ番号：ＳＡ１－１００、ＥｖｅｒｙＢｌｏｔ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ中、１：２，０００；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を室温で１時間インキュベートした。その後、メンブレンをＣｌａｒｉｔｙ Ｗｅｓｔｅｒｎ ＥＣＬ基質（ｃａｔ番号：１７０５０６１、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）と一緒に５分間インキュベートし、次いで、ＣｈｅｍｉＤｏｃ Ｍｐ Ｉｍａｇｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で画像処理した。メンブレンをＩｍａｇｅＳｔｕｄｉｏ Ｌｉｔｅ（Ｌｉ－Ｃｏｒ）で分析し、ＬＩＭＫ１発現をＧＡＰＤＨに対して正規化し、次いで、スクランブルされたオリゴヌクレオチド対照に対するパーセンテージとして表した。アッセイ対照として、ｍｉＲ－１３４模倣体で処理していないマウス脳タンパク質試料および細胞由来のタンパク質を使用した。分析されたメンブレンの例を図５に見ることができる。
トランスフェクションを、ＰＣ－１２ Ａｄｈ細胞を６ウェルＣｅｌｌＢｉｎｄプレート（ｃａｔ番号：ＣＬＳ３３３５、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｗｏｒｌｄ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ、ＵＳＡ）にウェル当たり細胞６．２５×１０５個で播種し、１５μＬ／ウェルのリポフェクタミン２０００（ｃａｔ番号：１１６６８０１９、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用した以外は実施例５の通り行った。トランスフェクションの４８時間後、細胞タンパク質を、ｃＯｍｐｌｅｔｅ（商標）Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（ｃａｔ番号：１１６９７４９８００１、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充したＲＩＰＡ緩衝液（ｃａｔ番号：８９９００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して抽出し、タンパク質濃度をＢｉｏ－Ｒａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ ＩＩ（ｃａｔ番号：５０００００２、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用し、製造者の指示に従って測定した。電気泳動のために、タンパク質２４μｇを１２％ゲル（Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ ＴＧＸ ｓｔａｉｎ－ｆｒｅｅ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）にローディングし、その後、タンパク質をＰＶＤＦメンブレン（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）にブロッティングした。メンブレンをＬＩＭＫ１に対する一次抗体（ｃａｔ番号：３８４２、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、５％ＢＳＡ中、１：５００）およびＧＡＰＤＨ（ｃａｔ番号：６０００４－１－Ｉｇ、Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ、ＥｖｅｒｙＢｌｏｔ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（ｃａｔ：１２０１００２０、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）中、１：２０，０００）と一緒に４℃で一晩インキュベートした。翌日、ＨＲＰとコンジュゲートした二次抗体（ロバ抗ウサギ、ｃａｔ番号：３１４５８、５％ＢＳＡ中、１：３，０００、およびロバ抗マウス、ｃａｔ番号：ＳＡ１－１００、ＥｖｅｒｙＢｌｏｔ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ中、１：２，０００；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を室温で１時間インキュベートした。その後、メンブレンをＣｌａｒｉｔｙ Ｗｅｓｔｅｒｎ ＥＣＬ基質（ｃａｔ番号：１７０５０６１、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）と一緒に５分間インキュベートし、次いで、ＣｈｅｍｉＤｏｃ Ｍｐ Ｉｍａｇｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で画像処理した。メンブレンをＩｍａｇｅＳｔｕｄｉｏ Ｌｉｔｅ（Ｌｉ－Ｃｏｒ）で分析し、ＬＩＭＫ１発現をＧＡＰＤＨに対して正規化し、次いで、スクランブルされたオリゴヌクレオチド対照に対するパーセンテージとして表した。アッセイ対照として、ｍｉＲ－１３４模倣体で処理していないマウス脳タンパク質試料および細胞由来のタンパク質を使用した。分析されたメンブレンの例を図５に見ることができる。
実施例７：培養されたＰＣ－１２ Ａｄｈ細胞における配列番号２３～６０および１９のアンチセンスオリゴヌクレオチドのルシフェラーゼアッセイ。
本実験は、以下を例外として実施例２と同様に行った：
コラーゲン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ ｃａｔ番号Ｃ８９１９）で処理した透明底の白色９６ウェルプレート（ｃａｔ番号３６１０、Ｃｏｒｎｉｎｇ）中、抗ｍｉＲオリゴヌクレオチドを０．５ｎＭおよび５ｎＭの濃度でトランスフェクトした。バックグラウンド除去は行わず、ウミシイタケ強度をホタルルシフェラーゼに対して正規化し、ＡＳＯ濃度に対してプロットした。
本実験は、以下を例外として実施例２と同様に行った：
コラーゲン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ ｃａｔ番号Ｃ８９１９）で処理した透明底の白色９６ウェルプレート（ｃａｔ番号３６１０、Ｃｏｒｎｉｎｇ）中、抗ｍｉＲオリゴヌクレオチドを０．５ｎＭおよび５ｎＭの濃度でトランスフェクトした。バックグラウンド除去は行わず、ウミシイタケ強度をホタルルシフェラーゼに対して正規化し、ＡＳＯ濃度に対してプロットした。
図６は、配列番号１９および比較対象と比較した、新規アンチセンスオリゴヌクレオチドによるウミシイタケシグナルの抑制解除のレベルをホタルルシフェラーゼ発光に対して正規化したものを示す。
実施例８：培養したＰＣ－１２ Ａｄｈ細胞におけるＩＣ５０決定
本実験は、コラーゲン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ ｃａｔ番号Ｃ８９１９）で処理した透明底の白色９６ウェルプレート（ｃａｔ番号３６１０、Ｃｏｒｎｉｎｇ）で行ったこと以外は実施例３と同様に行った。バックグラウンド除去は行わず、ウミシイタケ強度をホタルルシフェラーゼに対して正規化し、ＡＳＯ濃度に対してプロットした。
本実験は、コラーゲン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ ｃａｔ番号Ｃ８９１９）で処理した透明底の白色９６ウェルプレート（ｃａｔ番号３６１０、Ｃｏｒｎｉｎｇ）で行ったこと以外は実施例３と同様に行った。バックグラウンド除去は行わず、ウミシイタケ強度をホタルルシフェラーゼに対して正規化し、ＡＳＯ濃度に対してプロットした。
用量反応曲線およびＩＣ５０値が図７に示されている。
実施形態
１）１７～１９ヌクレオチド長、例えば１８～１９ヌクレオチド長の配列を含む、ｍｉＲ－１３４（配列番号１または２）と相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、７～１４、例えば７～１２、例えば１０～１３、例えば１０～１１の親和性増強性ヌクレオチド類似体を有し、３つを超える連続したＤＮＡヌクレオチドのひと続きを含有しないミックスマーであり、かつ、１～１８のホスホロチオエートヌクレオシド間連結を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
１）１７～１９ヌクレオチド長、例えば１８～１９ヌクレオチド長の配列を含む、ｍｉＲ－１３４（配列番号１または２）と相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、７～１４、例えば７～１２、例えば１０～１３、例えば１０～１１の親和性増強性ヌクレオチド類似体を有し、３つを超える連続したＤＮＡヌクレオチドのひと続きを含有しないミックスマーであり、かつ、１～１８のホスホロチオエートヌクレオシド間連結を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
２）配列番号３と相補的である、実施形態１によるアンチセンスオリゴヌクレオチド。
３）配列番号４の配列を含む、実施形態１または２によるアンチセンスオリゴヌクレオチド。
４）１８または１９ヌクレオチド長であり、配列番号４を含み、ＬＮＡ／ＤＮＡミックスマーである、実施形態１から３までのいずれか１つによるアンチセンスオリゴヌクレオチド。
５）１７、１８または１９ヌクレオチド長であり、配列番号４を含み、４０～７０％のＬＮＡ、例えば５５～６５％のＬＮＡ、例えば５５～６１％のＬＮＡ、例えば少なくとも５０％のＬＮＡ、例えば少なくとも５５％のＬＮＡを有するＬＮＡ／ＤＮＡミックスマーである、実施形態１から４までのいずれか１つによるアンチセンスオリゴヌクレオチド。
６）３’末端の２つの末端ヌクレオチドがＬＮＡである、または各末端の２つの末端ヌクレオチドがＬＮＡである、実施形態１から５までのいずれか１つによるアンチセンスオリゴヌクレオチド。
７）ＬＮＡがベータ－Ｄ－オキシＬＮＡである、実施形態１から６までのいずれか１つによるアンチセンスオリゴヌクレオチド。
８）全てのヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である、実施形態１から７までのいずれか１つによるアンチセンスオリゴヌクレオチド。
９）配列番号５～２１または２３～６０のいずれか１つである、実施形態１から８までのいずれか１つによるアンチセンスオリゴヌクレオチド。
１０）アンチセンスオリゴヌクレオチドが配列番号７、８、１０、１２、１９、２４、２６～３７、４５～５６、５９または６０のいずれか、例えば配列番号１９、３６、５２、５３、および５４のいずれかから選択され、Ｃが５－メチルシトシンであり、ＬＮＡがベータ－Ｄ－オキシＬＮＡであり、全てのヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である、実施形態１から９までのいずれか１つによるアンチセンスオリゴヌクレオチド。
１１）ＬＮＡ／ＤＮＡミックスマーが、トリシクロ－ＤＮＡ、２’－フルオロ、２’－Ｏ－メチル、２’メトキシエチル（２’ＭＯＥ）、２’環状エチル（ｃＥＴ）、ＵＮＡ、２’フルオロおよび立体配置が制限されたヌクレオシド（ＣＲＮ）のいずれか１つであるヌクレオシドを１つまたは複数さらに含む、実施形態１から１０までのいずれか１つによるアンチセンスオリゴヌクレオチド。
１２）医薬としての使用のための、実施形態１から１１までのいずれか１つによるアンチセンスオリゴヌクレオチド。
１３）実施形態１から１２までのいずれか１つによるアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むｍｉＲ－１３４阻害組成物。
１４）アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号５～２１または２３～６０のいずれか１つである、実施形態１２による医薬としての使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド、または実施形態１３による組成物。
１５）使用が、ｍｉＲ－１３４活性の改変が有益であるｍｉＲ－１３４関連疾患を治療する、緩和させる、好転させる、先制治療するまたは予防するためのものである、実施形態１２、１３または１４による使用または組成物。
１６）使用が、ＣＮＳまたはＰＮＳのｍｉＲ－１３４関連疾患を治療する、緩和させる、好転させる、先制治療するまたは予防するためのものである、実施形態１２、１３、１４または１５による使用または組成物。
１７）神経性障害を治療する、緩和させる、好転させる、先制治療するまたは予防するためのものである、実施形態１６による使用。
１８）使用が、神経変性障害を治療する、緩和させる、好転させる、先制治療するまたは予防するためのものである、実施形態１６または１７による使用。
１９）神経発達障害、遺伝障害、および／または遺伝性神経発達障害を治療する、緩和させる、好転させる、先制治療するまたは予防するためのものである、実施形態１６による使用。
２０）てんかんを治療する、緩和させる、好転させる、先制治療するまたは予防するためのものである、実施形態１２から１７までのいずれか１つによる使用。
２１）薬剤抵抗性てんかんを治療する、緩和させる、好転させる、先制治療するまたは予防するためのものである、実施形態２０による使用。
２２）てんかんの発作を治療する、緩和させる、好転させる、先制治療するまたは予防するためのものである、実施形態２０による使用。
２３）てんかんの自発性発作を治療する、緩和させる、好転させる、先制治療するまたは予防するためのものである、実施形態２２による使用。
２４）治療法抵抗性発作を治療する、緩和させる、好転させる、先制治療するまたは予防するためのものである、実施形態２２または２３による使用。
２５）前記てんかんが、焦点性てんかんであり、前記焦点性てんかんが、前頭葉、頭頂葉、後頭葉または側頭葉を焦点とするものであることが好ましい、実施形態２０から２３までによる使用。
２６）前記てんかんが、全般てんかんであり、前記全般てんかんが、欠神、ミオクロニー発作、強直間代性発作、強直性発作、脱力発作、間代性発作および攣縮の中から選択されることが好ましい、実施形態２０から２３までによる使用。
２７）前記てんかんが、てんかん重積状態である、実施形態２０から２６までによる使用。
２８）前記てんかんが、常染色体優性夜間前頭葉てんかん、徐波睡眠期持続性棘徐波を示すてんかん性脳症（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｓｐｉｋｅ－ａｎｄ－ｗａｖｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ｓｌｏｗ ｓｌｅｅｐ）、ドラベ症候群、脳卒中後てんかん、てんかん性脳症、笑いてんかん、欠神、良性新生児発作、ジーボンス症候群、若年ミオクロニーてんかん、ランドウ・クレフナー症候群、レンノックス・ガストー症候群、内側側頭葉てんかん、ミオクロニー脱力発作を伴うてんかん、大田原症候群、パナイトポーラス症候群、ＰＣＤＨ１９症候群、中心側頭棘波をもつ良性小児てんかん、スタージ・ウェーバー症候群、症候性焦点性てんかん、一過性てんかん性健忘およびウエスト症候群の中から選択される、実施形態２０から２７までによる使用。
２９）前記てんかんが、精神障害、認知障害、睡眠障害、心血管障害、呼吸器疾患、炎症性障害、不安、疼痛、認知機能障害、うつ病、認知症、頭痛、片頭痛、心疾患、潰瘍、消化性潰瘍、関節炎および骨粗鬆症の中から選択される共存症と共に存在する、実施形態２０から２８までによる使用。
３０）ニューロン損傷を防止もしくは予防する、好転させる、または緩和させるまたは治療するためのものである、実施形態１６から２９までによる使用。
３１）海馬損傷を治療する、緩和させる、好転させる、先制治療するまたは予防するためのものである、実施形態３０による使用。
３２）酸化ストレス、炎症および／またはアポトーシスを治療する、緩和させる、好転させる、先制治療するまたは予防するためのものである、実施形態１６による使用。
３３）脳出血により誘導される脳損傷、虚血性脳卒中、出血性卒中または脳卒中を治療する、緩和させる、好転させる、先制治療するまたは予防するためのものである、実施形態１６による使用
３４）自己免疫疾患、記憶障害、海馬硬化症、パーキンソン病、脱髄性疾患、多発性硬化症、脊髄損傷、急性脊髄損傷、筋萎縮性側索硬化症、進行性球麻痺、進行性筋萎縮症、原発性側索硬化症、運動失調、ベル麻痺、遺伝性神経疾患、シャルコー・マリー・トゥース、頭痛、ホートン頭痛、片頭痛、ピック病、進行性核上性麻痺、多系統変性、運動ニューロン疾患、ハンチントン病、プリオン病、クロイツフェルト・ヤコブ病、大脳皮質基底核変性症、失語症、原発性進行性失語症、運動障害またはその症状もしくは影響を治療する、緩和させる、好転させる、先制治療するまたは予防するためのものである、実施形態１６から１９までによる使用。
３５）認知症を治療する、緩和させる、好転させる、先制治療するまたは予防するためのものである、実施形態１６から１９までによる使用。
３６）前記認知症が、アルツハイマー病、血管性認知症、前頭側頭型認知症およびレビー小体認知症の中から選択される、実施形態３５による使用。
３７）疼痛を治療する、緩和させる、好転させる、先制治療するまたは予防するためのものである、実施形態１２または１４から１９までのいずれか１つによる使用。
３８）ｍｉＲ－１３４のモジュレーションが有益である精神疾患を治療する、緩和させる、好転させる、先制治療するまたは予防するためのものである、実施形態１２から１６までのいずれかによる使用。
３９）自閉症、または気分障害、うつ病性障害、統合失調症、双極性障害、注意欠陥多動性障害、不安またはトゥレット症を治療する、緩和させる、好転させる、先制治療するまたは予防するためのものである、実施形態３８による使用。
４０）大うつ病性障害を治療する、緩和させる、好転させる、先制治療するまたは予防するためのものである、実施形態３９による使用。
４１）ｍｉＲ－１３４の発現または活性のモジュレーションが有益である記憶障害を治療する、緩和させる、好転させる、先制治療するまたは予防するためのものである、実施形態１２から１７までのいずれか１つによる使用。
４２）がんを治療する、緩和させる、好転させる、先制治療するまたは予防するためのものである、実施形態１２から１５までのいずれか１つによる使用。
４３）前記がんが、神経系のがん、好ましくは神経膠腫である、実施形態４２による使用。
４４）肺腫瘍、非小細胞肺がん、神経膠腫、頭頸部扁平上皮癌、膵がん、結腸がん、前立腺がん、黒色腫、ぶどう膜黒色腫、口腔扁平上皮癌または舌の扁平上皮癌の群から選択されるがんを治療する、緩和させる、好転させる、先制治療するまたは予防するためのものである、実施形態４２による使用。
４５）アンチセンスオリゴヌクレオチドが、プラダー・ウィリ症候群、アンジェルマン症候群、心血管障害、アテローム性動脈硬化症、および肺疾患のうちのいずれか１つの治療における使用のためのものである、実施形態１２から１７までのいずれか１つによる使用。
４６）感染症を治療する、緩和させる、好転させる、先制治療するまたは予防するためのものである、実施形態１２または１４から１９までのいずれか１つによる使用。
４７）前記感染症が、敗血症、髄膜炎および脳炎の中から選択される、実施形態４６による使用。
４８）遺伝障害、好ましくは神経線維腫症を治療する、緩和させる、好転させる、先制治療するまたは予防するためのものである、実施形態１２または１４から１９までのいずれか１つによる使用。
４９）本発明の実施形態１から１１までのいずれか１つによるアンチセンスオリゴヌクレオチドが、１種または複数種の他の治療法と組み合わせて使用するためのものである、実施形態１２から４８までのいずれか１つによる使用。
５０）前記治療法が、ｍｉＲ－２７ｂと相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドである、実施形態４８による使用。
５１）前記治療法が、アデノシンキナーゼｍＲＮＡと相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは別のアデノシンキナーゼ阻害剤である、実施形態４９による使用。
５２）前記治療法が、哺乳動物、例えばヒトにおいてＮｒｆ－２／ＡＲＥ経路を誘導するものである、実施形態４９による使用。
５３）前記治療法が、ｍｉＲ－２７ｂと相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド、アデノシンキナーゼｍＲＮＡと相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびＮｒｆ－２／ＡＲＥ経路を誘導する治療法のうちの１つまたは複数である、実施形態４９による使用。
５４）実施形態１から１２までのいずれか１つによるアンチセンスオリゴヌクレオチドが唯一の活性医薬成分である、実施形態１２から４８までのいずれか１つによる使用。
５５）有効投薬量の実施形態１から１２までのいずれか１つによるアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
５６）有効投薬量の実施形態１から１２までのいずれか１つによるアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物であって、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが唯一の活性医薬成分である、医薬組成物。
５７）実施形態１２から４９までのいずれか１つによる使用のためのものである、実施形態４９による医薬組成物。
５８）皮下投与、静脈内投与、非経口投与、経鼻投与、経肺投与、直腸内投与、膣内投与、子宮内投与、尿道内投与、眼への投与、耳への投与、皮膚投与、皮内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、硬膜外投与、脳室内投与（ｉｎｔｒａｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）、脳内投与、くも膜下腔内投与もしくは経口投与による投与用、もしくは脳もしくは脳脊髄液中への直接投与用である、または、インプラントとして投与される、実施形態５５または５７による医薬組成物。
５９）くも膜下腔内投与用である、実施形態５５または５６による医薬組成物。
６０）脳室内投与（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）用である、実施形態５５または５６による医薬組成物。
６１）ポンプにより投与され、前記ポンプがミニポンプであることが好ましく、前記ミニポンプがミニ浸透圧ポンプであることがより好ましい、実施形態５５から５８までのいずれか１つによる医薬組成物。
６２）脳室内カテーテルによって容易になる脳室内投与用であり、前記カテーテルがリザーバーに取り付けられていることが好ましく、前記リザーバーがオンマイヤーリザーバーであることが好ましい、実施形態５５から６１までのいずれか１つによる医薬組成物。
６３）１日、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、２４日間、２５日間、２６日間、２７日間、２８日間、２９日間、３０日間、３１日間、３２日間、３３日間、３４日間、３５日間、３６日間、３７日間、３８日間、３９日間、４０日間、４１日間、４２日間、４３日間、４４日間、４５日間、４６日間、４７日間、４８日間、４９日間、５０日間、５１日間、５２日間、５３日間、５４日間、５５日間、５６日間、５７日間、５８日間、５９日間、６０日間、６１日間、６２日間、６３日間、６４日間、６５日間、６６日間、６７日間、６８日間、６９日間、７０日間、７１日間、７１日間、７２日間、７３日間、７４日間、７５日間、７６日間、７７日間、７８日間、７９日間、８０日間、８１日間、８２日間、８３日間、８４日間、８５日間、８６日間、８７日間、８８日間、８９日間、９０日間、９１日間、９２日間、９３日間、９４日間、９５日間、９６日間、９７日間、９８日間、９９日間、１００日間、１０１日間、１０２日間、１０３日間、１０４日間、１０５日間、１０６日間、１０７日間、１０８日間、１０９日間、１１０日間、１１１日間、１１２日間、１１３日間、１１４日間、１１５日間、１１６日間、１１７日間、１１８日間、１１９日間または好ましくは１２０日間の間隔で投与される、実施形態５５から６２までのいずれか１つによる医薬組成物。
６４）１～２００日間、１０～１９０日間、２０～１８０日間、３０～１７０日間、４０～１６０日間、５０～１５０日間、６０～１４０日間、７０～１３０日間、８０～１２０日間、９０～１１０日間または好ましくは約１００日間の間隔で投与される、実施形態５５から６３までのいずれか１つによる医薬組成物。
６５）実施形態１２から４９までのいずれか１つによる疾患を治療する方法における使用のための、実施形態１から１２までのいずれか１つによる抗ｍｉＲ－１３４オリゴヌクレオチドまたは実施形態１３による組成物。
６６）実施形態１から１２までのいずれか１つによるアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは実施形態１３による組成物を使用することによって実施形態１２から４９までのいずれか１つによる疾患を治療する方法。
６７）治療が、防止的治療、治癒的治療または疾患修飾治療のいずれか１つである、実施形態１２から４９までのいずれか１つによる使用、または実施形態４８から６５までのいずれか１つによる方法。
６８）実施形態１から１２までのいずれか１つによるアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは実施形態１３による組成物を使用することによって実施形態１２から４９までのいずれか１つによる疾患を診断する方法。
参考文献
１）Jimenez-Mateos et al., Nature Medicine (2012) volume 18, pages 1087-1094.
１）Jimenez-Mateos et al., Nature Medicine (2012) volume 18, pages 1087-1094.
Claims (15)
- ｍｉＲ－１３４と相補的な、１７～１９ヌクレオチド長、例えば１８～１９ヌクレオチド長の配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、７～１４の親和性増強性ヌクレオチド類似体を有し、３つを超える連続したＤＮＡヌクレオチドのひと続きを含有しないミックスマーであり、かつ、１～１８のホスホロチオエートヌクレオシド間連結を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
- 配列番号３と相補的である、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
- 配列番号４の配列を含む、請求項１または２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
- １８または１９ヌクレオチド長であり、配列番号４を含み、ＬＮＡ／ＤＮＡミックスマーである、請求項１から３までのいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
- １８または１９ヌクレオチド長であり、配列番号４を含み、前記ミックスマーのヌクレオシドの４０～７０％がＬＮＡである、例えば５５～６５％がＬＮＡ、例えば５５～６１％がＬＮＡ、例えば少なくとも５０％がＬＮＡ、例えば少なくとも５５％がＬＮＡである、請求項１から４までのいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
- ３’末端の２つの末端ヌクレオチドがＬＮＡである、または各末端の２つの末端ヌクレオチドがＬＮＡである、請求項１から５までのいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
- ＬＮＡが、ベータ－Ｄ－オキシＬＮＡであり、ＬＮＡシトシンが、５－メチルシトシンである、請求項１から６までのいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
- 全てのヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である、請求項１から７までのいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
- 配列番号１９、５～１８、２０、２１または２３～６０のうちのいずれか１つである、請求項１から８までのいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
- 配列番号：
（配列番号１９）５’ＣＣＴｃｔＧｇＴｃＡＡｃｃＡＧｔｃＡＣ３’または
（配列番号３６）５’ＣｃｔｃｔＧｇＴｃＡＡｃｃＡｇＴｃＡＣ３’
（配列番号５２）５’ＣＣＴｃｔＧｇＴｃＡＡｃｃＡｇＴｃＡＣ３’
（配列番号５３）５’ＣＣＴｃｔＧｇＴｃＡＡｃｃａＧＴｃＡＣ３’
（配列番号５４）５’ＣＴＣｔｇＧＴｃａＡｃｃＡｇＴｃＡＣ３’
のうちのいずれか１つであり、大文字がＬＮＡであり、小文字がＤＮＡであり、大文字のＣが５－メチルシトシンであり、ＬＮＡがベータ－Ｄ－オキシＬＮＡであり、全てのヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である、請求項９に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。 - ＬＮＡ／ＤＮＡミックスマーが、トリシクロ－ＤＮＡ、２’－フルオロ、２’－Ｏ－メチル、２’メトキシエチル（２’ＭＯＥ）、２’環状エチル（ｃＥＴ）、ＵＮＡ、２’フルオロおよび立体配置が制限されたヌクレオシド（ＣＲＮ）のいずれか１つであるヌクレオシドを１つまたは複数をさらに含む、請求項１から１０までのいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
- 医薬としての使用のための、請求項１から１１までのいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
- 使用が、ＣＮＳまたはＰＮＳのｍｉＲ－１３４関連疾患を治療するためのものである、請求項１から１２に記載の使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは組成物。
- ＣＮＳまたはＰＮＳの疾患が、神経性障害である、請求項１から１３までのいずれか一項に記載の使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは組成物。
- 神経性障害が、てんかんである、請求項１から１４までのいずれか一項に記載の使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは組成物。
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2022
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