JP2024510415A - ｉＲｈｏｍ２に対するヒト化抗体 - Google Patents
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Abstract
本発明は、ヒトｉＲｈｏｍ２に結合する、ヒト化抗体もしくは標的結合断片または標的結合能を保持するその誘導体に関する（図１）。
Description
本出願は、ｉＲｈｏｍ２に対するヒト化抗体に関する。
ＡＤＡＭメタロペプチダーゼドメイン１７（ＡＤＡＭ１７）（ヒトＡＤＡＭ１７のＮＣＢＩ参照： ＮＰ＿００３１７４）は、ＴＡＣＥ（腫瘍壊死因子‐α変換酵素）とも呼ばれ、ジスインテグリンおよびメタロプロテアーゼのＡＤＡＭタンパク質ファミリーに属する酵素である。８２４アミノ酸からなるポリペプチドである。
ＡＤＡＭ１７は、細胞表面の腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ‐α）のプロセシング、およびトランスゴルジ網の細胞内膜内からのプロセシングに関与すると理解されている。このプロセスは「切断（ｓｈｅｄｄｉｎｇ）」としても知られており、膜結合型したプロタンパク質（プロＴＮＦ－αなど）からの可溶性エクトドメインの切断と放出が関与しており、生理学的に重要であることが知られている。ＡＤＡＭ１７は、同定された最初の「シェダーゼ」であり、また、膜アンカー型サイトカイン、細胞接着分子、受容体、リガンド、および酵素の放出において役割を果たすと理解されている。
ＴＮＦ－α遺伝子のクローニングにより、小胞体内での移行時に細胞膜に挿入されるようになる２６ｋＤａのＩＩ型膜貫通プロポリペプチドをコードすることが明らかになった。細胞表面では、プロＴＮＦ－αは生物学的に活性であり、接触分泌細胞間シグナル伝達を介して免疫応答を誘導することができる。しかし、プロＴＮＦ－αはそのＡｌａ７６－Ｖａｌ７７アミド結合でタンパク質分解的切断を受けることができ、これによりプロＴＮＦ－α分子から可溶性の１７ｋＤａの細胞外ドメイン（エクトドメイン）が放出される。この可溶性エクトドメインは一般にＴＮＦ－αとして知られるサイトカインであり、この分子のパラ分泌シグナル伝達において極めて重要である。この可溶性ＴＮＦ－αのタンパク質分解による遊離はＡＤＡＭ１７によって触媒される。
ＡＤＡＭ１７はまた、乳腺におけるＥＧＦＲリガンドアンフィレグリンの切断を調節することによって、ＭＡＰキナーゼシグナル伝達経路を調節する。ＡＤＡＭ１７は、ＥＧＦＲ、ＴＧＦα、ＡＲＥＧ、ＥＲＥＧ、ＨＢ－ＥＧＦ、Ｅｐｉｇｅｎのいくつかのリガンドを活性化するために重要である。さらに、ＡＤＡＭ１７は、細胞接着分子であるＬ－セレクチンの切断に関与する。
最近、ＡＤＡＭ１７が放射線療法に対する抵抗性形成の決定的メディエーターとして発見された。また、非小細胞肺癌では放射線療法によりＡＤＡＭ１７が活性化され、複数の生存因子の切断、増殖因子経路活性化、放射線療法による治療抵抗性が生じることが示された。
ＡＤＡＭ１７は、ＴＮＦαを含む異なる病原性および非病原性因子の放出にとって極めて重要な因子であると思われることから、治療標的分子として注目されるようになった。そのため、ＡＤＡＭ１７の阻害剤の開発には様々な試みがなされている。
しかし、これまでのところ、臨床的に成功していることが証明されたこのような阻害剤はない。
従って、ＡＤＡＭ１７活性の制御、調節、減少または抑制を可能にする新たな手法を提供することが本発明の１つの目的である。
炎症性疾患の治療を可能にする新たな手法を提供することは、本発明の別の目的である。
これらおよび他の目的は、独立したクレームの特徴によって解決される。従属クレームは、特定の状況において好ましいことがある本発明の実施形態を開示する。同様に、明細書は、特定の状況において好ましいことがある本発明のさらなる実施形態を開示する。
本発明は、特にヒトｉＲｈｏｍ２に結合するヒト化抗体を提供する。一実施形態では、これらの抗体は、ヒトｉＲｈｏｍ２に結合すると、ＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７活性を阻害および／または低下させる。
（詳細な説明）
本発明の一態様によれば、
ａ）
配列番号１および５；
配列番号９および１３；
配列番号１７および２１；
配列番号２５および２９；
配列番号３３および３７；または
配列番号４１および４５
の重鎖／軽鎖可変ドメイン配列ペアのうちの１つを含む３つの重鎖および３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）のセットを含むか、
ｂ）
配列番号２、３、４、６、７および８、
配列番号１０、１１、１２、１４、１５および１６、
配列番号１８、１９、２０、２２、２３および２４、
配列番号２６、２７、２８、３０、３１および３２、
配列番号３４、３５、３６、３８、３９および４０、または
配列番号４２、４３、４４、４６、４７および４８、
から選択される３つの重鎖および３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）のセットを含むか、
ｃ） ｂ）の重鎖／軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）のセットを含み、ただし、ＣＤＲの少なくとも１つは、それぞれの配列番号に対して最大３個のアミノ酸置換を有するか、；および／または
ｄ） ｂ）またはｃ）の重鎖／軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）のセットを含み、ただし、ＣＤＲの少なくとも１つは、それぞれの配列番号に対して６６％以上の配列同一性を有し、
ＣＤＲは、ヒトｉＲｈｏｍ２と結合できるように、適切なタンパク質フレームワーク、好ましくは可変ドメインフレームワークに埋め込まれている、
ｉＲｈｏｍ２に結合するヒト化抗体、または標的結合断片もしくは標的結合能を保持するその誘導体を提供する。
本発明の一態様によれば、
ａ）
配列番号１および５；
配列番号９および１３；
配列番号１７および２１；
配列番号２５および２９；
配列番号３３および３７；または
配列番号４１および４５
の重鎖／軽鎖可変ドメイン配列ペアのうちの１つを含む３つの重鎖および３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）のセットを含むか、
ｂ）
配列番号２、３、４、６、７および８、
配列番号１０、１１、１２、１４、１５および１６、
配列番号１８、１９、２０、２２、２３および２４、
配列番号２６、２７、２８、３０、３１および３２、
配列番号３４、３５、３６、３８、３９および４０、または
配列番号４２、４３、４４、４６、４７および４８、
から選択される３つの重鎖および３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）のセットを含むか、
ｃ） ｂ）の重鎖／軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）のセットを含み、ただし、ＣＤＲの少なくとも１つは、それぞれの配列番号に対して最大３個のアミノ酸置換を有するか、；および／または
ｄ） ｂ）またはｃ）の重鎖／軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）のセットを含み、ただし、ＣＤＲの少なくとも１つは、それぞれの配列番号に対して６６％以上の配列同一性を有し、
ＣＤＲは、ヒトｉＲｈｏｍ２と結合できるように、適切なタンパク質フレームワーク、好ましくは可変ドメインフレームワークに埋め込まれている、
ｉＲｈｏｍ２に結合するヒト化抗体、または標的結合断片もしくは標的結合能を保持するその誘導体を提供する。
一実施形態では、ＣＤＲはＫａｂａｔ、ＣｈｏｔｈｉａまたはＭａｃＣａｌｌｕｍの定義に従って決定され、好ましくは、ＣＤＲは表１に示す番号付けに従って決定される。
ヒト化ｍＡｂの製造および／または選択のための方法は、当技術分野で公知である。例えば、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社によるＵＳ６３３１４１５はキメラ抗体の産生を記載し、一方、Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＣｏｕｎｃｉｌによるＵＳ６５４８６４０はＣＤＲ移植技術を記載し、Ｃｅｌｌｔｅｃｈ社によるＵＳ５８５９２０５はヒト化抗体の産生を記載している。
ヒト化抗体とは、相補性決定領域がヒト以外の種から採取された親抗体に由来し、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４のようなヒト抗体のフレームワーク（少なくとも可変ドメイン）に移植された抗体である。ヒト化抗体は、親抗体と同じ標的に結合するが、ヒトフレームワークに移植されるため、免疫原性（ＨＡＭＡ反応など）が低下する。このため、ヒト化抗体は親（例えばマウス）抗体とは構造的に異なる。
ヒト化においては、ＣＤＲをヒトフレームワークに移植するステップの後に、移植プロセスで失われた親和性を再び獲得するための親和性成熟のステップが続くことが多い。このプロセスにより、ＣＤＲを含むヒト抗体の配列がさらに改変される。
一実施形態では、ＣＤＲは、ＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７活性を阻害または低下させることができるように、適切なタンパク質フレームワークに埋め込まれている。
不活性型ロンボイドファミリーメンバー２（ｉＲｈｏｍ２）は、ヒトではＲＨＢＤＦ２遺伝子によりコードされるタンパク質である。約８５０個のアミノ酸からなる膜貫通タンパク質で、７個の膜貫通ドメインをもつ。
ｉＲｈｏｍ２には異なるアイソフォームがある。ここでなされた実験は、ＮＣＢＩ参照ＮＰ＿０７８８７５．４として定義されるアイソフォームを用いて確立されている。しかしながら、限定されるわけではないが、以下の表に示すように、教示は、ｉＲｈｏｍ２の他のアイソフォームに伝達可能である：
ｉＲｈｏｍ２には異なるアイソフォームがある。ここでなされた実験は、ＮＣＢＩ参照ＮＰ＿０７８８７５．４として定義されるアイソフォームを用いて確立されている。しかしながら、限定されるわけではないが、以下の表に示すように、教示は、ｉＲｈｏｍ２の他のアイソフォームに伝達可能である：
本明細書中で使用される、用語「ＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７活性を阻害および／または低下させる」は、例えば、それぞれの切断アッセイにおいて測定されるようなＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７の活性を阻害または低下させる抗体またはその断片によって引き起こされる作用を記述することを意味する（例えば、図８および実施例６参照）。
ＡＤＡＭメタロペプチダーゼドメイン１７（ＡＤＡＭ１７）は、ＴＡＣＥ（腫瘍壊死因子‐α変換酵素）とも呼ばれ、ジスインテグリンおよびメタロプロテアーゼのＡＤＡＭタンパク質ファミリーに属する酵素である。ＡＤＡＭ１７は、細胞表面の腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ‐α）のプロセシング、およびトランスゴルジ網の細胞内膜内からのプロセシングに関与すると理解されている。このプロセスは「切断（ｓｈｅｄｄｉｎｇ）」としても知られており、膜結合型したプロタンパク質（プロＴＮＦ－αなど）からの可溶性エクトドメインの切断と放出が関与しており、生理学的に重要であることが知られている。ＡＤＡＭ１７は、同定された最初の「シェダーゼ」であり、また、多様な膜アンカー型サイトカイン、細胞接着分子、受容体、リガンド、および酵素の放出において役割を果たすと理解されている。
ＴＮＦ－α遺伝子のクローニングにより、ＴＮＦ－αは２６ｋＤａのＩＩ型膜貫通型プロポリペプチドをコードしており、成熟する過程で細胞膜に挿入されることが明らかになった。細胞表面では、プロＴＮＦ－αは生物学的に活性であり、接触分泌細胞間シグナル伝達を介して免疫応答を誘導することができる。しかし、プロＴＮＦ－αはそのＡｌａ７６－Ｖａｌ７７アミド結合でタンパク質分解的切断を受けることができ、これによりプロＴＮＦ－α分子から可溶性の１７ｋＤａの細胞外ドメイン（エクトドメイン）が放出される。この可溶性エクトドメインは一般にＴＮＦ－αとして知られるサイトカインであり、パラ分泌シグナル伝達において極めて重要である。この可溶性ＴＮＦ－αのタンパク質分解による遊離はＡＤＡＭ１７によって触媒される。
最近、ＡＤＡＭ１７が放射線療法に対する抵抗性の決定的メディエーターとして発見された。また、非小細胞肺癌では放射線療法によりＡＤＡＭ１７が活性化され、複数の生存因子の切断、増殖因子経路活性化、放射線療法による治療抵抗性が生じることが示された。
ＡＤＡＭ１７はまた、乳腺におけるＥＧＦＲリガンドであるアンフィレグリンの切断を制御することによって、ＭＡＰキナーゼシグナル伝達経路を制御している。さらに、ＡＤＡＭ１７は、細胞接着分子であるＬ－セレクチンの切断に関与している。
本明細書中で使用される、用語「ＣＤＲ」または「相補性決定領域」は、両方の重鎖および軽鎖ポリペプチドの可変領域内に見出される非隣接抗原結合部位を意味することを意図している。これらの特定の領域は、Ｋａｂａｔら（１９７７）、Ｋａｂａｔら（１９９１）、Ｃｈｏｔｈｉａら（１９８７）およびＭａｃＣａｌｌｕｍら（１９９６）によって記載されており、ここで定義は、互いに比較した場合に、アミノ酸残基の重複またはサブセットを含む。それにもかかわらず、抗体または移植された抗体のＣＤＲまたはそのバリアントを参照するいずれかの定義の適用は、本明細書中で定義され使用される用語の範囲内であることが意図されている。上記参照の各々によって定義されるＣＤＲを包含するアミノ酸残基は、比較として以下の表１に示す。
本明細書中で使用する場合、抗体可変ドメインに関連して使用する場合の用語「フレームワーク」は、抗体の可変ドメイン内のＣＤＲ領域外の全てのアミノ酸残基を意味するように入力する。したがって、可変ドメインのフレームワークは約１００～１２０アミノ酸の長さであるが、ＣＤＲ以外のアミノ酸のみを参照することを意図している。
本明細書中で使用されるように、用語「標的Ｘに結合することができる」は、それぞれの結合ドメインが１０-4以下のＫDで標的に結合することを意味するものとして理解されなければならない。ＫDは平衡解離定数で、抗体または断片とその抗原の間のｋoff／ｋonの比率である。ＫDと親和性は逆に関連している。ＫD値は抗体または断片の濃度（特定の実験に必要な抗体または断片の量）に関連しているため、ＫD値が低いほど（濃度が低いほど）、結合ドメインの高い親和性になる。次の表は、モノクローナル抗体の典型的なＫD範囲を示している。
好ましくは、抗体または断片は、２個までのアミノ酸置換を有し、より好ましくは１個までのアミノ酸置換を有する
好ましくは、抗体または断片のＣＤＲの少なくとも１つは、それぞれの配列番号に対して６７％以上、６８％以上、６９％以上、７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％、７７％以上、７８％以上、７９％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上最も好ましくは１００％の配列同一性を有する。
本明細書中「配列同一性のパーセンテージ」は、比較窓上で２つの最適に並べられた生物配列（アミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列）を比較することによって決定され、ここで、比較窓における対応する配列の部分は、２つの配列の最適なアラインメントのために、付加または欠失を含まない参照配列と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。パーセンテージは、両配列において同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が生じる位置の数を決定して一致位置の数を得、一致位置の数を比較窓における位置の総数で除し、結果に１００を乗じて配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算される。
用語「同一」又はパーセント「同一性」は、２つ以上の核酸又はポリペプチド配列に関して、同じ配列である２つ以上の配列若しくはサブ配列を指す。２つの配列が、下記の配列比較アルゴリズムの１つを用いて、または手動アラインメントと目視検査によって測定された比較ウィンドウ、または指定領域にわたって最大対応となるように比較およびアラインメントしたときに、同じアミノ酸残基またはヌクレオチドが指定された割合（すなわち、指定領域にわたって少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性、または指定しない場合は、参照配列全体）であれば「実質同一」であるとする。本開示は、本明細書に例示されるポリペプチドと実質的に同一であるポリペプチドを提供する。アミノ酸配列に関して、同一性または実質的同一性は、長さが少なくとも５、１０、１５または２０アミノ酸、場合によっては長さが少なくとも約２５、３０、３５、４０、５０、７５または１００アミノ酸、場合によっては長さが少なくとも約１５０、２００または２５０アミノ酸、または参照配列の全長にわたる領域にわたって存在することができる。より短いアミノ酸配列、例えば２０以下のアミノ酸配列に関しては、本明細書で定義される保存的置換に従って、１または２個のアミノ酸残基が保存的に置換された場合、実質的な同一性が存在する。
好ましくは、ＣＤＲの少なくとも１つは、以下を含むＣＤＲ配列修飾に対象であった
親和性成熟
免疫原性の低下
親和性成熟により所定の抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏで抗体の親和性を高めるプロセス天然の対応物と同様に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ親和性の成熟も変異と選択の原理に基づいている。これは、抗体、抗体断片または抗体ミメティックのような他のペプチド分子を最適化するために首尾よく使用されている。ＣＤＲ内部のランダム変異は、放射線、化学的変異原またはエラープローンＰＣＲを用いて導入される。さらに、チェーンシャフリングによって遺伝的多様性を増加させることができる。ファージディスプレイ法のようなディスプレイ法を用いて２、３ラウンドの変異と選択を行うと、通常、低ナノモル域で親和性をもつ抗体断片が生じる。原理については、Ｅｙｌｅｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ． （２０１６）またはＵＳ２００５０１６９９２５Ａ１を参照のこと。その内容は、参照により実施可能性の目的で本明細書に援用される。
親和性成熟
免疫原性の低下
親和性成熟により所定の抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏで抗体の親和性を高めるプロセス天然の対応物と同様に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ親和性の成熟も変異と選択の原理に基づいている。これは、抗体、抗体断片または抗体ミメティックのような他のペプチド分子を最適化するために首尾よく使用されている。ＣＤＲ内部のランダム変異は、放射線、化学的変異原またはエラープローンＰＣＲを用いて導入される。さらに、チェーンシャフリングによって遺伝的多様性を増加させることができる。ファージディスプレイ法のようなディスプレイ法を用いて２、３ラウンドの変異と選択を行うと、通常、低ナノモル域で親和性をもつ抗体断片が生じる。原理については、Ｅｙｌｅｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ． （２０１６）またはＵＳ２００５０１６９９２５Ａ１を参照のこと。その内容は、参照により実施可能性の目的で本明細書に援用される。
作成された抗体は、マウス配列由来のＣＤＲ領域を、必要なフレームワーク復帰変異とともに、配列由来のＶ領域に含む。したがって、ヒト化抗体を患者に投与すると、ＣＤＲ自体が免疫原性の反応を引き起こすことができる。ＣＤＲによって引き起こされる免疫原性を減少させる方法は、Ｈａｒｄｉｎｇら（２０１０）またはＵＳ２０１４２２７２５１Ａ１に開示されており、その内容は、実施可能性の目的で参照により本明細書に援用される。
本発明の一実施形態によれば、抗体または断片は、
ａ） 以下の配列番号のペアで示される重鎖／軽鎖可変ドメイン（ＨＣＶＤ／ＬＣＶＤ）のペア
１および５；
９および１３；
１７および２１；
２５および２９；
３３および３７ならびに／または
４１および４５
ｂ） ａ）の重鎖／軽鎖可変ドメイン（ＨＣＶＤ／ＬＣＶＤ）のペアであって、但し
ＨＣＶＤは、それぞれの配列番号に対して８０％以上の配列同一性を有し、および／または
ＬＣＤＶＤは、それぞれの配列番号に対して８０％以上の配列同一性を有する、ペア、
ｃ） ａ）またはｂ）の重鎖／軽鎖可変ドメイン（ＶＤ）ペアであって、但しＨＣＶＤまたはＬＣＶＤの少なくとも１つが、それぞれの配列番号に対して最大１０個のアミノ酸置換を有する、ペアを含み、
前記抗体または断片は、ヒトｉＲｈｏｍ２に結合し、および／またはＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７活性を阻害もしくは低下させることができる。
ａ） 以下の配列番号のペアで示される重鎖／軽鎖可変ドメイン（ＨＣＶＤ／ＬＣＶＤ）のペア
１および５；
９および１３；
１７および２１；
２５および２９；
３３および３７ならびに／または
４１および４５
ｂ） ａ）の重鎖／軽鎖可変ドメイン（ＨＣＶＤ／ＬＣＶＤ）のペアであって、但し
ＨＣＶＤは、それぞれの配列番号に対して８０％以上の配列同一性を有し、および／または
ＬＣＤＶＤは、それぞれの配列番号に対して８０％以上の配列同一性を有する、ペア、
ｃ） ａ）またはｂ）の重鎖／軽鎖可変ドメイン（ＶＤ）ペアであって、但しＨＣＶＤまたはＬＣＶＤの少なくとも１つが、それぞれの配列番号に対して最大１０個のアミノ酸置換を有する、ペアを含み、
前記抗体または断片は、ヒトｉＲｈｏｍ２に結合し、および／またはＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７活性を阻害もしくは低下させることができる。
抗体またはその重鎖または軽鎖に関連して使用される「可変ドメイン」は、分子上に抗原結合を付与し、かつ定常領域ではない抗体の一部を意味することを意図している。この用語は、可変領域全体の結合機能の一部を維持するその機能性断片を含むことを意図している。可変領域結合断片には、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）2、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃｆｖ）などの機能性断片が含まれる。このような機能性断片は当業者には周知である。したがって、ヘテロマー可変領域の機能性断片を記述する際のこれらの用語の使用は、当業者に周知の定義に対応することを意図している。そのような用語は、例えば、Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．、（１９９３）またはＰｌｕｃｋｔｈｕｎ ａｎｄ Ｓｋｅｒｒａ （１９９０）に記載されている。
好ましくは、ＨＣＶＤおよび／またはＬＣＶＤは、それぞれの配列番号に対して≧８１％；≧８２％；≧８３％；≧８４％；≧８５％；≧８６％；≧８７％；≧８８％；≧８９％；≧９０％；≧９１％；≧９２％；≧９３％；≧９４％；≧９５％；≧９６％；≧９７％；≧９８％；≧９９％；または最も好ましくは１００％の配列同一性を有する。
本発明の一実施形態によれば、少なくとも１つのアミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換である。
本明細書中で使用される「保存的アミノ酸置換」は、非保存的置換よりも抗体機能に及ぼす効果が小さい。アミノ酸の分類にはいろいろな方法があるが、それらの構造とＲ基の全般的な化学的性質に基づいて、しばしば６つの主要な群に分類される。
いくつかの実施形態において、「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されたものである。例えば、類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが当技術分野で定義されている。これらのファミリーには、
塩基性側鎖（リジン、アルギニン、ヒスチジンなど）、
酸性側鎖（アスパラギン酸、グルタミン酸など）、
非荷電極性側鎖（グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システインなど）、
非極性側鎖（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンなど）、
β分岐側鎖（スレオニン、バリン、イソロイシンなど）
芳香族側鎖（チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジンなど）。
塩基性側鎖（リジン、アルギニン、ヒスチジンなど）、
酸性側鎖（アスパラギン酸、グルタミン酸など）、
非荷電極性側鎖（グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システインなど）、
非極性側鎖（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンなど）、
β分岐側鎖（スレオニン、バリン、イソロイシンなど）
芳香族側鎖（チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジンなど）。
他の保存されたアミノ酸置換は、ペプチドの電荷を修飾するためにアスパラギンをアスパラギン酸に置換する場合のように、アミノ酸側鎖ファミリーを横切って起こることもできる。保存的変化には、さらに、化学的に相同な非天然アミノ酸（すなわち、ロイシンの代わりに合成非天然疎水性アミノ酸、トリプトファンの代わりに合成非天然芳香族アミノ酸）の置換を含むことができる。
本発明の一実施形態によれば、抗体または断片は、以下の少なくとも１つを有する。
前述の請求項のいずれか１項に記載の抗体または断片と比較して、ヒトｉＲｈｏｍ２に対する標的結合親和性が５０％以上であるか、および／または
前述の請求項のいずれか１項に記載の抗体または断片のＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７活性に対する阻害または低下効果の５０％以上である。
前述の請求項のいずれか１項に記載の抗体または断片と比較して、ヒトｉＲｈｏｍ２に対する標的結合親和性が５０％以上であるか、および／または
前述の請求項のいずれか１項に記載の抗体または断片のＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７活性に対する阻害または低下効果の５０％以上である。
本明細書中で使用される場合、用語「結合親和性」は、結合相互作用の強度を意味することが意図され、したがって、実際の結合親和性ならびに見かけの結合親和性の両方を含む。実際の結合親和性は、解離速度に対する会合速度の比である。したがって、結合親和性を付与または最適化するには、結合親和性の所望のレベルを達成するためにこれらの成分のいずれかまたは両方を変更することが含まれる。見かけの親和性には、例えば、相互作用のアビディティを含むことができる。例えば、二価のヘテロマー可変領域結合断片は、その価数のために改変された、または最適化された結合親和性を示すことができる。
結合剤の親和性を測定するのに適した方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を通してである。この方法は、表面プラズモン波が金属／液体界面で励起されたときに生じる現象に基づいている。光は試料に接していない表面の側表面に照射され、反射され、ＳＰＲは角度と波長の特定の組合せで反射光強度の低下を引き起こす。生体分子結合事象は表層での屈折率の変化を引き起こし、これはＳＰＲシグナルの変化として検出される。結合事象は、受容体－リガンドのペア間の結合会合または解離のいずれかであり得る。屈折率の変化は、基本的に瞬時に測定することができ、したがって、親和性定数の個々の構成要素の決定を可能にする。具体的には、会合速度（ｋon）と解離速度（ｋoff）の正確な計測を可能にする。
ｋonおよびｋoffを測定すると、変更された可変領域または最適化された可変領域を特定できるため、効果的である。例えば、改変された可変領域、またはそのヘテロマー結合断片は、例えば、類似の結合親和性を示す可変領域およびヘテロマー結合断片と比較して、より高いｋonを有するため、より有効であり得る。ｋonが高い分子ほど、より速い速度でその標的に特異的に結合して阻害することができるので、効果の増大がもたらされる。同様に、本発明の分子は、類似の結合親和性を有する分子と比較して、より低いｋoff 値を示すため、より効果的であり得る。ｋoff速度が低い分子ほど効力が高くなるのは、いったん結合すると、分子の標的からの解離が遅くなるからである。そのヘテロマー可変領域結合断片を含む本発明の改変された可変領域および最適化された可変領域に言及されているが、会合および解離速度を測定するための上述の方法は、治療または診断のためのより効果的な結合剤を同定するために、本質的に任意の抗体またはその断片に適用可能である。
表面を通して結合剤の親和性を測定するもう一つの適切な方法は、ＦＡＣＳ／スキャッチャード分析である。それぞれの説明については、特に実施例１を参照のこと。
表面プラズモン共鳴を用いた会合および解離速度を含む親和性を測定する方法は、当業者においてよく知られており、例えば、ＪｏｎｓｓｏｎおよびＭａｌｍｑｕｉｓｔ、（１９９２）およびＷｕら（１９９８）に記載することができる。さらに、結合相互作用を測定するための当技術分野でよく知られている１つの装置は、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ（スウェーデン、ウプサラ）を通じて市販されているＢＩＡｃｏｒｅ ２０００機器である。
好ましくは、前記標的結合親和性は、参照結合剤のそれと比較して、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％以上、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％以上、６９％以上、７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％、７７％以上、７８％以上、７９％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、最も好ましくは９９％以上である。
本明細書で使用されるように、ベンチマーク結合剤と比較したＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７活性に対する阻害または低下効果の定量は、例えば、図８および実施例６に記載されているように、ＴＮＦα切断効果を測定する適切なアッセイを用いて決定される。
本発明の別の態様によれば、ヒトｉＲｈｏｍ２に結合し、ヒトｉＲｈｏｍ２への結合を
ａ） 上記の説明による抗体、および／または
ｂ） クローン１６－Ｂ－０３；１６－Ｂ－０５；１６－Ｂ－０７；２３－Ｂ－０４；４２－Ｂ－０２；および／または４２－Ｂ－０４からなる群から選択される抗体
と競合するヒト化抗体が提供される。
ａ） 上記の説明による抗体、および／または
ｂ） クローン１６－Ｂ－０３；１６－Ｂ－０５；１６－Ｂ－０７；２３－Ｂ－０４；４２－Ｂ－０２；および／または４２－Ｂ－０４からなる群から選択される抗体
と競合するヒト化抗体が提供される。
本発明の別の態様によれば、
ａ） 上記の説明による抗体、および／または
ｂ）クローン１６－Ｂ－０３；１６－Ｂ－０５；１６－Ｂ－０７；２３－Ｂ－０４；４２－Ｂ－０２；および／または４２－Ｂ－０４からなる群から選択される抗体
と本質的に同じヒトｉＲｈｏｍ２上の領域、または同じ領域に結合するヒト化抗体が提供される。
ａ） 上記の説明による抗体、および／または
ｂ）クローン１６－Ｂ－０３；１６－Ｂ－０５；１６－Ｂ－０７；２３－Ｂ－０４；４２－Ｂ－０２；および／または４２－Ｂ－０４からなる群から選択される抗体
と本質的に同じヒトｉＲｈｏｍ２上の領域、または同じ領域に結合するヒト化抗体が提供される。
クローン１６－Ｂ－０３；１６－Ｂ－０５；１６－Ｂ－０７；２３－Ｂ－０４；４２－Ｂ－０２；および４２－Ｂ－０４は、本明細書の配列の表に特定されている。
本明細書で使用される場合、「領域」という用語は、細胞外領域、ドメイン、サブドメイン、または二次構造（例えばループ）、好ましくはエピトープを意味すると理解される。
このような抗体または断片のフォーマットまたは構造に関しては、上記と同じ好ましい実施形態が適用される。一実施形態において、前記抗体または断片は、モノクローナル抗体、または標的結合断片もしくは標的結合能を保持するその誘導体、または抗体ミメティックである。
本明細書で使用する場合、「結合について競合する」という用語は、上記のような配列で定義される抗体の１つに関して使用され、これは、実際の抗体または断片が、前記配列で定義される抗体または断片と同じ標的、または標的エピトープ、またはドメインまたはサブドメインに結合する活性を有し、後者のバリアントであることを意味する。結合の効率（例えば、動力学または熱力学）は、後者の効率と同じか、またはそれより大きいか、またはそれより小さいことができる。例えば、基質への結合のための平衡結合定数は、２つの抗体について異なり得る。
結合に対するこのような競合は、競合結合アッセイで適切に測定することができる。そのようなアッセイはＦｉｎｃｏ ｅｔ ａｌ．２０１１に開示されており、その内容は参照により本明細書に援用され、特許請求の解釈に対するそれらの意味はＤｅｎｇ ｅｔ ａｌ ２０１８に開示されており、その内容は、参照により本明細書に援用される。
この特性を試験するために、適当なエピトープ地図作成技術が利用可能であり、とりわけ、以下を含む：
Ｘ線共結晶解析と低温電子顕微鏡（ｃｒｙｏ－ＥＭ）
アレイ－ベースのオリゴ－ペプチドスキャニング
部位特異的変異誘発マッピング
ハイスループットショットガン変異誘発エピトープマッピング
水素－重水素交換
架橋結合質量分析法
Ｘ線共結晶解析と低温電子顕微鏡（ｃｒｙｏ－ＥＭ）
アレイ－ベースのオリゴ－ペプチドスキャニング
部位特異的変異誘発マッピング
ハイスループットショットガン変異誘発エピトープマッピング
水素－重水素交換
架橋結合質量分析法
これらの方法は、特に、Ｂａｎｉｋら（２０１０）、およびＤｅＬｉｓｓｅｒ（１９９９）において開示され、議論されており、その内容は、実施可能の目的で参照により本明細書に援用される。
一実施形態によれば、抗体または断片は、ヒトｉＲｈｏｍ２に結合すると、少なくともそのループ１の領域内に結合する。Ｒｈｏｍ２のループ１は、配列番号４９のアミノ酸残基４７４－６６０を含む。別の実施形態では、抗体または断片は、ループ１のＮ末端側に位置する膜近傍ドメイン（ＪＭＤ）には結合しない。本発明の一実施形態によれば、ＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７活性の阻害または低下は、ｉＲｈｏｍ２媒介性のＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７活性化またはＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７と基質分子を含む他のタンパク質との相互作用に対する抗体または断片の干渉によって引き起こされる。
本発明の一実施形態によれば、抗体または断片は、ヒトｉＲｈｏｍ２に結合すると、誘導されたＴＮＦαの切断を阻害または低下させる。
本発明の一実施形態によれば、抗体または断片は、ヒトｉＲｈｏｍ２に結合すると、誘導されたＩＬ－６Ｒの切断を阻害または低下させる。
本発明の一実施形態によれば、抗体または断片は、ヒトｉＲｈｏｍ２に結合すると、誘導されたＨＢ－ＥＧＦ切断を阻害または低下させる。
本明細書中で使用される「ＴＮＦα切断」とは、膜アンカー型腫瘍壊死因子α（ｍＴＮＦα／プロＴＮＦα）が環境中に放出されて可溶性ＴＮＦα（ｓＴＮＦαまたは単にＴＮＦα）になるプロセスを意味する。このプロセスは、特にＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７によって誘発される。
インターロイキン６レセプター（ＩＬ－６Ｒ）の放出または切断とは、可溶性ＩＬ－６Ｒが、ＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７による細胞表面の膜結合ＩＬ－６Ｒの膜貫通ドメイン近傍のタンパク質分解部位でのタンパク質分解切断によって産生される過程を指す。
ヘパリン結合性ＥＧＦ様増殖因子（ＨＢ－ＥＧＦ）の放出または切断とは、ＨＢ－ＥＧＦの可溶型が生成され、細胞表面から遊離する切断過程を指す。ヘパリン結合ＥＧＦ様増殖因子は、ヘパリンに親和性のある上皮増殖因子であり、膜アンカー型の分裂促進および走化性糖タンパク質として合成される。ヒトマクロファージ様細胞の条件培地で最初に同定されたＨＢ－ＥＧＦは、高度に遺伝子発現が制御された８７アミノ酸の糖タンパク質である。
ＴＮＦα切断効果を測定するのに適したアッセイは、例えば図８と実施例６に記載されている。ＩＬ－６Ｒおよび／またはＨＢ－ＥＧＦの放出または切断を決定する適切なアッセイは、例えば、それぞれ図１０および実施例８または図１２および実施例１０に記載されている。
本発明の一実施形態によれば、抗体または断片が結合するヒトｉＲｈｏｍ２は、
ａ） 配列番号４９に記載のアミノ酸配列、または
ｂ） 配列番号４９と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、但しｉＲｈｏｍ２活性を維持するアミノ酸配列
を含む。
ａ） 配列番号４９に記載のアミノ酸配列、または
ｂ） 配列番号４９と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、但しｉＲｈｏｍ２活性を維持するアミノ酸配列
を含む。
いくつかの実施形態において、ヒトｉＲｈｏｍ２は、配列番号４９と≧８１％、好ましくは≧８２％、より好ましくは≧８３％、≧８４％、≧８５％、≧８６％、≧８７％、≧８８％、≧８９％、≧９０％、≧９１％、≧９２％、≧９３％、≧９４％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８または最も好ましくは≧９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
配列番号４９は、ＮＣＢＩ参照ＮＰ＿０７８８７５．４のもとでアクセス可能な不活性ロンボイドタンパク質２（ｉＲｈｏｍ２）アイソフォーム１［Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ］のアミノ酸配列を表す。一般に、ｉＲｈｏｍ２には異なったバリアントとアイソフォームが存在する。同様に、完全なまたは少なくとも実質的なｉＲｈｏｍ２活性を維持する、保存的またはサイレントアミノ酸置換を含む変異体が存在するか、または存在し得る。これらのアイソフォーム、バリアントおよび変異体は、上記に規定された同一性範囲に包含されるが、機能不全の非活性バリアントおよび変異体は除外される。
本発明の一実施形態において、抗体または断片はモノクローナル抗体、または標的結合断片もしくは標的結合能を保持するその誘導体、または抗体ミメティックである。
本発明の一実施形態によれば、抗体または断片は、以下からなる群から選択される少なくとも１つのフォーマットである：ＩｇＧ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、または（Ｆａｂ）２。
本明細書中で用いる「モノクローナル抗体（ｍＡｂ）」という用語は、均一な抗体集団、すなわち、全免疫グロブリンまたは標的結合能を保持するその断片もしくは誘導体からなる均質な集団を有する抗体組成物を指す。
特に好ましくは、このような抗体は、ＩｇＧ抗体、または標的結合能を保持するその断片もしくは誘導体である。免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）は、抗体の一種である。ヒトの血清抗体の約７５％を占めるＩｇＧは、血液中に存在する最も一般的なタイプの抗体である。ＩｇＧ分子は、プラズマＢ細胞によって作られ、放出される。各ＩｇＧは２つの抗原結合部位を持つ。
ＩｇＧ抗体は、４本のペプチド鎖からなる分子量約１５０ｋＤａの大きな分子である。約５０ｋＤａの同一のクラスγ重鎖２本と約２５ｋＤａの同一の軽鎖２本を含み、したがって４量体の４元構造である。２本の重鎖は、ジスルフィド結合によって互いに、そしてそれぞれ軽鎖に連結されている。その結果、４量体は２つの同じ半分を持ち、それらが一緒になってＹ字型の形状を形成する。フォークの両端には、同一の抗原結合部位を含む。ＩｇＧのＦｃ領域は、高度に保存されたＮ－グリコシル化部位を有している。この部位に結合するＮ－グリカンは、主に複合型のコアフコシル化ジアンテナリー構造（ｃｏｒｅ－ｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ ｄｉａｎｔｅｎｎａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ）である。さらに、これらのＮ－グリカンの少量は、二等分したＧｌｃＮＡｃとα－２，６結合したシアル酸残基を有していることも確認されている。
ヒトには４つのＩｇＧサブクラス（ＩｇＧ１、２、３、４）があり、血清中に多く含まれる順に名前が付けられている（ＩｇＧ１が最も多く含まれる）。
本明細書中で使用される場合、用語「断片」は、標的結合能を保持するそのような抗体の断片を指す。例えば、
ＣＤＲ（相補性決定領域）
超可変領域、
可変ドメイン（Ｆｖ）
ＩｇＧまたはＩｇＭ重鎖（ＶＨ、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域からなる）
ＩｇＧまたはＩｇＭ軽鎖（ＶＬおよびＣＬ領域からなる）、および／または
Ｆａｂおよび／またはＦ（ａｂ）2。
本明細書中で使用される場合、用語「断片」は、標的結合能を保持するそのような抗体の断片を指す。例えば、
ＣＤＲ（相補性決定領域）
超可変領域、
可変ドメイン（Ｆｖ）
ＩｇＧまたはＩｇＭ重鎖（ＶＨ、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域からなる）
ＩｇＧまたはＩｇＭ軽鎖（ＶＬおよびＣＬ領域からなる）、および／または
Ｆａｂおよび／またはＦ（ａｂ）2。
本明細書中で使用される用語「誘導体」は、構造的には異なるが、依然としていくつかの構造的関連性を有するタンパク質構築物、例えばｓｃＦｖ、Ｆａｂおよび／またはＦ（ａｂ）2、ならびに二重、三重またはより高い特異性抗体構築物、およびさらに標的結合能を保持する共通抗体概念を指す。これらの項目はすべて以下に説明する。
当業者に知られている他の抗体誘導体は、ダイアボディ、ラクダ抗体、ナノボディ、ドメイン抗体、ｓｃＦｖｓからなる２つの鎖を有する二価ホモ二量体、ＩｇＡｓ（Ｊ鎖と分泌成分によって連結された２つのＩｇＧ構造）、サメ抗体、新世界霊長類フレームワークと非新世界霊長類ＣＤＲからなる抗体、ＣＨ３＋ＶＬ＋ＶＨを含む二量体化構築物、および抗体コンジュゲート（例えば、毒素、サイトカイン、放射性同位体または標識に連結された抗体または断片または誘導体）である。これらのタイプは文献によく記載されており、さらなる発明活動を加えることなく、本開示に基づいて当業者が使用することができる。
ハイブリドーマ細胞の製造方法は、ケーラー＆ミルシュタイン（１９７５）に開示されている。
完全ヒトｍＡｂの製造および／または選択のための方法は、当技術分野で公知である。これらは、それぞれのタンパク質またはペプチドで免疫化されたトランスジェニック動物の使用、または、酵母ディスプレイ、ファージディスプレイ、Ｂ細胞ディスプレイまたはリボソームディスプレイのような適切なディスプレイ技術の使用を含み、ここで、ライブラリーからの抗体が定常期においてヒトｉＲｈｏｍ２に対してスクリーニングされる。
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ抗体ライブラリーは、とりわけ、ＭｏｒｐｈｏＳｙｓによりＵＳ６３０００６４およびＭＲＣ／Ｓｃｒｉｐｐｓ／ＳｔｒａｔａｇｅｎｅによりＵＳ６２４８５１６で開示される。ファージディスプレイ技術は、例えば、ＤｙａｘによりＵＳ５２２３４０９に開示されている。トランスジェニック型の哺乳動物プラットフォームは、例えばＴａｃｏｎｉｃＡｒｔｅｍｉｓ社によるＥＰ１４８０５１５Ａ２に説明されている。
ＩｇＧ、ＩｇＭ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂおよび／またはＦ（ａｂ）2は、当業者によく知られた抗体フォーマットである。関連する有効化技術は、それぞれの教科書から入手することができる。
本明細書中で使用される場合、用語「Ｆａｂ」は、抗原結合領域を含むＩｇＧ／ＩｇＭ断片に関するものであり、前記断片は、抗体の各々の重鎖および軽鎖からの１つの定常および１つの可変ドメインから構成される
本明細書中で使用される場合、用語「Ｆａｂ」は、抗原結合領域を含むＩｇＧ／ＩｇＭ断片に関するものであり、前記断片は、抗体の各々の重鎖および軽鎖からの１つの定常および１つの可変ドメインから構成される
本明細書中で使用される、用語「Ｆ（ａｂ）2」は、ジスルフィド結合によって互いに結合した２つのＦａｂ断片からなるＩｇＧ／ＩｇＭ断片に関する。
本明細書中で使用される、用語「ｓｃＦｖ」は、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の可変領域の融合物である単鎖可変領域断片であり、短いリンカー、通常セリン（Ｓ）またはグリシン（Ｇ）により結合される。このキメラ分子は、定常領域を除去し、リンカーペプチドを導入するにもかかわらず、元の免疫グロブリンの特異性を保持している。
改変された抗体フォーマットは、例えば、二重または三重特異性抗体構築物、抗体ベースの融合タンパク質、免疫コンジュゲートなどである。これらのタイプは文献によく記載されており、本開示に基づいて当業者が使用することができ、さらに発明の活性を加える。
本明細書中で使用される、用語「抗体ミメティック」は、抗体と同様に、標的タンパク質に特異的に結合するが、抗体とは構造的に関係しない、有機分子、最もしばしばタンパク質に関する。抗体ミメティックは通常、約３～２０ｋＤａのモル質量を有する人工ペプチドまたはタンパク質である。定義は、とりわけ、アフィボディ分子 、アフィリン、アフィマ、アフィチン、アルファボディ、アンチカリン、アビマー、ＤＡＲＰｉｎｓ、フィノマー、クニッツドメインペプチド、モノボディ、およびナノＣＬＡＭＰを包含する。
１以上の実施形態において、抗体またはその断片は、単離された抗体、または標的結合能を保持する標的結合断片もしくはその誘導体、または単離された抗体ミメティックである
１以上の実施形態において、抗体またはその断片は、単離された抗体、または標的結合能を保持する標的結合断片もしくはその誘導体、または単離された抗体ミメティックである
１つ以上の実施形態において、抗体は、改変されたもしくは組換え抗体、または標的結合能を保持する標的結合断片もしくはその誘導体、または改変されたもしくは組換え抗体ミメティックである。
本発明の一実施形態によれば、抗体または断片は、以下からなる群から選択される少なくとも１つのフォーマットの抗体である：ＩｇＧ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、または（Ｆａｂ）２。
本発明の一実施形態によれば、抗体または断片はヒトｉＲｈｏｍ１と交差反応性を示さない。ヒトｉＲｈｏｍ １の塩基配列は本明細書で 配列番号５０として開示されている。
本発明の別の態様によれば、前述の請求項のいずれか１つに記載の結合剤をコードする核酸が提供される。
一実施形態では、結合剤が少なくとも１つの軽鎖と１つの重鎖のヘテロマー構造を有するモノクローナル抗体である場合、結合剤の重鎖と軽鎖をそれぞれコードする核酸または一ペアの核酸が提供される。
このような核酸は薬学的目的にも使用できる。核酸は、ＲＮＡ分子、または、例えば、安定性を提供し、免疫原性を低下させるために、シュードウリジン（Ψ）またはＮ－１メチルシュードウリジン（ｍ１Ψ）のような修飾ヌクレオチドを含むＲＮＡ誘導体であり得る（例えば、ＵＳ８２７８０３６およびＵＳ９４２８５３５を参照のこと、これらの内容は、実施可能性の目的で本明細書に援用される）。別の実施形態では、最もＧＣリッチなコドンを含むＲＮＡは、安定性を提供し、免疫原性を低下させるために選択される（例えばＥＰ１３９２３４１を参照。）ｍＲＮＡは、例えば、適当なリポソーム中で送達され得、免疫応答を回避し、および／または折りたたみおよび翻訳効率を改善するための特異的配列または修飾ウリジンヌクレオシド類のいずれかを含み、時には、それらを特定の細胞型に標的化するための５´および／または３´末端でのキャップ修飾を含む。いくつかの実施形態において、それぞれのＲＮＡ配列は、配列番号１００～配列番号１４７から選択される。どのＲＮＡがどの抗体配列をコードしているかは、以下の表を参照のこと。
核酸も同様にＤＮＡ分子であり得る。その場合、分子はｃＤＮＡとすることができ、任意で適切なベクター、例えば弱毒化された非病原性ウイルスに組み込まれるか、あるいは１つ以上のプラスミドとして提供される。このようなプラスミドは、例えば、特許ＥＰ３３９７３３７Ｂ１（その内容は、実施可能性の目的で本明細書に援用される）に開示されているようなエレクトロポレーション装置を用いて患者に投与することができる。いくつかの実施形態では、それぞれのＤＮＡ配列は、配列番号５２～ 配列番号９９から選択される。どのｃＤＮＡがどの抗体配列をコードしているかは、以下の表を参照のこと。
一般に、遺伝子コードは縮退しているため、このような鎖をコードする能力を持つ核酸は数多く存在する。当業者であれば、与えられた核酸が上記の基準を満たすかどうかを判断することは十分に可能である。一方、当業者であれば、コドン使用表に基づいて、与えられたアミノ酸配列から、それをコードする適切な核酸をリバースエンジニアリングすることが完全に可能である。この目的のために、オンラインツール”ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｓｕｉｔｅ”（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｏｒｇ／ｓｍｓ２／ｒｅｖ＿ｔｒａｎｓ．ｈｔｍｌ）が提供する”ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｌａｔｅ”のようなソフトウェアツールを使用することができる。したがって、請求項に記載のようなタンパク質配列をコードするＤＮＡやＲＮＡの代替配列はいくらでも存在する。これらの代替配列は、本発明の範囲に含まれるものとみなす。
本発明の別の態様によれば、炎症状態と診断されているか、発症しているか、または発症するリスクがあると診断されているヒトまたは動物対象の治療、またはそのような状態の予防のための、（医薬の製造のための）上記記載の抗体または断片または核酸の使用が提供される。
炎症状態を診断するために、患者は身体検査を受け、病歴を聞かれることもある。医師は、関節の炎症、関節のこわばり、関節の機能低下を調べることがある。さらに、医療従事者はＸ線検査および／または血液検査を命じ、健康な対照群と比較して、例えば血清ｈｓ－ＣＲＰ、ＩＬ－６、ＴＮＦ－α、およびＩＬ－１０、赤血球沈降速度、血漿粘度、フィブリノゲン、および／またはフェリチンのような炎症マーカーを検出することができる。
本発明の別の態様によれば、上記記載の抗体または断片または核酸、および任意に１つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物が提供される。
本発明の別の態様によれば、（ｉ）抗体または断片または核酸または上記の医薬組成物、および（ｉｉ）１つ以上の治療的活性化合物を含む組合せ物が提供される。
本発明の別の態様によると、炎症状態を治療または予防するための方法が提供され、それは、（ｉ）上記記載の抗体または断片、（ｉｉ）上記記載の核酸、（ｉｉｉ）上記記載の医薬組成物、または（ｉｖ）上記記載の組合せ物の、ヒトまたは動物対象への投与を、治療上十分な量で含む方法を含む。
本発明の別の態様によれば、
ａ） 上記記載の抗体または断片、上記記載の核酸、上記記載の医薬組成物、または上記記載の組合せ物
ｂ） 組成物、組成物または組合せ物を投与するための装置、および
ｃ） キットの使用のための説明書
を含む、部品の治療用キットが提供される。
ａ） 上記記載の抗体または断片、上記記載の核酸、上記記載の医薬組成物、または上記記載の組合せ物
ｂ） 組成物、組成物または組合せ物を投与するための装置、および
ｃ） キットの使用のための説明書
を含む、部品の治療用キットが提供される。
本発明は図面および前記の説明において詳細に図示および説明されてきたが、そのような図示および説明は例示または例示的であり、限定的ではないと考えられるべきであり、本発明は開示された実施形態に限定されない。開示される実施形態に対する他の変形形態は、図面、開示、及び添付の特許請求の範囲の研究から、請求される発明を実施する際に当業者によって理解され、実施され得る。特許請求の範囲において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語は、他の要素又はステップを排除するものではなく、不定冠詞「ａ（１つの）」又は「ａｎ（１つの）」は複数形を除外するものではない。特定の手段が相互に異なる従属請求項に列挙されているという単なる事実は、これらの手段の組合せを使用して利益を得ることができないことを示すものではない。特許請求の範囲のどの引用符号も、範囲を限定すると解釈するべきではない。
本明細書に開示される全てのアミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端まで示される；本明細書に開示される全ての核酸配列は、５′－＞３′で示される。
抗体のヒト化の一般的方法
ＣＤＲ移植によるヒト化は、マウスやその他の異種起源種、ハイブリドーマに由来する抗体を用いて、潜在的な免疫原性を低減させながら、親抗体の結合活性や機能活性を保持する、実績のある成功した技術である。一般的にはキメラ抗体から出発し、免疫反応を引き起こす可能性のある可変ドメイン内の外来フレームワーク領域（ＦＲ）を除去することが目的である。この問題の解決策は、マウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒトのアクセプターフレームワークに「移植」することである。
ＣＤＲ移植によるヒト化は、マウスやその他の異種起源種、ハイブリドーマに由来する抗体を用いて、潜在的な免疫原性を低減させながら、親抗体の結合活性や機能活性を保持する、実績のある成功した技術である。一般的にはキメラ抗体から出発し、免疫反応を引き起こす可能性のある可変ドメイン内の外来フレームワーク領域（ＦＲ）を除去することが目的である。この問題の解決策は、マウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒトのアクセプターフレームワークに「移植」することである。
しかし、ＣＤＲのコンフォメーションを維持するためには、Ｖｅｒｎｉｅｒゾーンにある一連の支持フレームワーク残基が重要であるため、ＣＤＲのグラフト化だけでは結合親和性が著しく低下したり、完全に失われたりする可能性がある。この問題は、ヒトの骨格にマウスの残基をヒトフレームワークに再導入することで解決できる。このような置換は一般にバックミューテーションと呼ばれる。
治療用抗体の最も重要な特性は活性であるため、ヒト化の際に提案された置換が抗体の親和性や安定性に影響を与えないことが重要である。抗体の生物物理学的特性、ＣＤＲループのコンフォメーション、そしてタンパク質のモデリングの進歩とともに、結合親和性と安定性を維持したまま抗体を正確にヒト化することを可能にするフレームワークに関する情報が、過去２０年間に大量に収集された。
ヒト化の手順は以下のように行った：
１）親抗体のドメインと領域が同定された
２）重要な位置と潜在的な翻訳後修飾（ＰＴＭ）が同定された
抗体Ｆｖには、ＶＨ／ＶＬ鎖間界面を構成する、あるいはＣＤＲの５つについて定義されている標準的な構造の個別セットを担う重要な位置がいくつかある：これらの位置は、置換を提案する前に詳細に検討されるべきである。
翻訳後修飾（ＰＴＭ）は、治療用タンパク質の開発中に、不均一性の増加、生物活性の低下、安定性の低下、免疫原性、断片化、凝集などの問題を引き起こす可能性がある。ＰＴＭの潜在的な影響は、その場所によって、また場合によっては溶媒への暴露によっても異なる。配列は以下の潜在的なＰＴＭについて分析された：アスパラギンの脱アミド化、アスパラギン酸の異性化、遊離システインチオール基、Ｎ－グリコシル化、メチオニンとトリプトファンの酸化。
１）親抗体のドメインと領域が同定された
２）重要な位置と潜在的な翻訳後修飾（ＰＴＭ）が同定された
抗体Ｆｖには、ＶＨ／ＶＬ鎖間界面を構成する、あるいはＣＤＲの５つについて定義されている標準的な構造の個別セットを担う重要な位置がいくつかある：これらの位置は、置換を提案する前に詳細に検討されるべきである。
翻訳後修飾（ＰＴＭ）は、治療用タンパク質の開発中に、不均一性の増加、生物活性の低下、安定性の低下、免疫原性、断片化、凝集などの問題を引き起こす可能性がある。ＰＴＭの潜在的な影響は、その場所によって、また場合によっては溶媒への暴露によっても異なる。配列は以下の潜在的なＰＴＭについて分析された：アスパラギンの脱アミド化、アスパラギン酸の異性化、遊離システインチオール基、Ｎ－グリコシル化、メチオニンとトリプトファンの酸化。
３） 配列分析と重要な位置に基づいて、各鎖に最適なアクセプターヒト生殖細胞系列配列が選択された。
ヒト生殖細胞系列に対する親抗体配列のアラインメントに基づき、最も一致するエントリーを同定した。アクセプターとして最適なヒト生殖細胞系列の同定は、以下に示す順序付けられた基準に基づいて行われた：
Ｖ遺伝子全体（フレームワーク＋ＣＤＲ）の配列同一性
同一または互換性のある鎖間インターフェース残基
親ＣＤＲの標準的コンフォメーションによるサポートループ
４） 親マウスＦｖ領域の３Ｄ構造モデルが構築された
５） 分子モデルの綿密な検査に続いて、各位置の置換が可能かどうかの初期評価が行われた。位置は「中立貢献」または「重要」に分類された。また、潜在的なＰＴＭを破壊するための単一変異も同定された。
６） ＣＤＲ移植は、親配列とアクセプター配列の間で異なる位置を分析することによって行われた。中立位置の置換はすべて行った。
ヒト生殖細胞系列に対する親抗体配列のアラインメントに基づき、最も一致するエントリーを同定した。アクセプターとして最適なヒト生殖細胞系列の同定は、以下に示す順序付けられた基準に基づいて行われた：
Ｖ遺伝子全体（フレームワーク＋ＣＤＲ）の配列同一性
同一または互換性のある鎖間インターフェース残基
親ＣＤＲの標準的コンフォメーションによるサポートループ
４） 親マウスＦｖ領域の３Ｄ構造モデルが構築された
５） 分子モデルの綿密な検査に続いて、各位置の置換が可能かどうかの初期評価が行われた。位置は「中立貢献」または「重要」に分類された。また、潜在的なＰＴＭを破壊するための単一変異も同定された。
６） ＣＤＲ移植は、親配列とアクセプター配列の間で異なる位置を分析することによって行われた。中立位置の置換はすべて行った。
ヒト化抗体の設計段階では、この手順は、より正確には生殖細胞系列化と定義され、選択したアクセプターと異なる親フレームワークのアミノ酸を、対応するヒトのアミノ酸に置き換える。
７） 異なるヒト化ＶＨおよびＶＬバージョンの組み合わせが製造され、精製され、結合および生物学的活性について試験された。
８） 異なるバージョン間で最適なヒト化重鎖と軽鎖の組み合わせの選択は、以下の基準を評価することによって行った：
ａ） 哺乳動物細胞（ＨＥＫ ２９３または好ましくはＣＨＯ）で産生されたヒト化バージョンのヒトＩｇＧ１／Ｋａｐｐａとしての一過性発現レベル（キメラバージョンと比較して）。ＥＬＩＳＡによる精製、またはＯｃｔｅｔラベルフリー検出システムを用いたプロテインＡによる測定のために、収穫前のトランスフェクト細胞からの組織培養上清を使用する。
ｂ） キメラヒトＩｇＧ１／Ｋａｐｐａバージョン（キメラとは、ヒト定数領域に融合した親マウスのＶＨとＶＬの組み合わせを意味する）と比較した結合能（ＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳによるＥＣ５０；または好ましくはＢｉａｃｏｒｅまたはＯｃｔｅｔによるＫｄ）。
ｃ） 関連するｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞アッセイにおけるヒト化抗体の生物学的活性を、参照キメラ抗体のそれと比較した。
ｄ） 関連するオルソログ種との交差反応性（ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合活性）。
ｅ） キメラと比較したヒト化バージョンの生物物理学的特性の測定：
高分子凝集体のレベルを測定するためのＳＥＣ－ＨＰＬＣプロファイル、
非還元および還元条件下でのＳＤＳ－ＰＡＧＥ、
ＭｉｃｒｏｃａｌTM ＶＰ－キャピラリーＤＳＣシステムを用いた示差走査熱量測定（ＤＳＣ）による分析で、Ｆａｂ、ＣＨ２、ＣＨ３のＴｍを測定。
一般的な抗体作製法
８） 異なるバージョン間で最適なヒト化重鎖と軽鎖の組み合わせの選択は、以下の基準を評価することによって行った：
ａ） 哺乳動物細胞（ＨＥＫ ２９３または好ましくはＣＨＯ）で産生されたヒト化バージョンのヒトＩｇＧ１／Ｋａｐｐａとしての一過性発現レベル（キメラバージョンと比較して）。ＥＬＩＳＡによる精製、またはＯｃｔｅｔラベルフリー検出システムを用いたプロテインＡによる測定のために、収穫前のトランスフェクト細胞からの組織培養上清を使用する。
ｂ） キメラヒトＩｇＧ１／Ｋａｐｐａバージョン（キメラとは、ヒト定数領域に融合した親マウスのＶＨとＶＬの組み合わせを意味する）と比較した結合能（ＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳによるＥＣ５０；または好ましくはＢｉａｃｏｒｅまたはＯｃｔｅｔによるＫｄ）。
ｃ） 関連するｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞アッセイにおけるヒト化抗体の生物学的活性を、参照キメラ抗体のそれと比較した。
ｄ） 関連するオルソログ種との交差反応性（ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合活性）。
ｅ） キメラと比較したヒト化バージョンの生物物理学的特性の測定：
高分子凝集体のレベルを測定するためのＳＥＣ－ＨＰＬＣプロファイル、
非還元および還元条件下でのＳＤＳ－ＰＡＧＥ、
ＭｉｃｒｏｃａｌTM ＶＰ－キャピラリーＤＳＣシステムを用いた示差走査熱量測定（ＤＳＣ）による分析で、Ｆａｂ、ＣＨ２、ＣＨ３のＴｍを測定。
一般的な抗体作製法
組換え抗体作製のために、標的ＤＮＡ配列を設計し、最適化し、合成した。完全な配列を発現ベクターにサブクローニングし、ＣＨＯ細胞発現用にトランスフェクショングレードのプラスミドを最大調製した。ＣＨＯ細胞をＣＨＯ ＴＦ発現培地（Ｘｅｌｌ ＡＧ、ドイツ）で培養し、標的タンパク質をコードする組換えプラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクション後１１日目に採取した細胞培養上清を精製に使用した。細胞培養ブロスを遠心分離し、ろ過した。ろ過した細胞培養上清をＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＰｒｉｓｍＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、ＵＳＡ）アフィニティー精製カラムに適切な流速でロードした。適切な緩衝液で洗浄・溶出後、溶出画分をプールし、最終製剤用緩衝液に緩衝液交換した。精製したタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析し、分子量と純度を測定した。
実施例１：本発明のヒト化抗体の親和性決定
この研究では、本発明のヒト化抗体１６－Ｂ－０３、１６－Ｂ－０５、１６－Ｂ－０７、２３－Ｂ－０４、４２－Ｂ－０２および４２－Ｂ－０４の親和性測定を、ヒトｉＲｈｏｍ２を発現するマウス細胞株であるＬ９２０－２０４１－ｈｉＲ２－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７細胞を用いた間接ＦＡＣＳスキャッチャード分析により行った。
この研究では、本発明のヒト化抗体１６－Ｂ－０３、１６－Ｂ－０５、１６－Ｂ－０７、２３－Ｂ－０４、４２－Ｂ－０２および４２－Ｂ－０４の親和性測定を、ヒトｉＲｈｏｍ２を発現するマウス細胞株であるＬ９２０－２０４１－ｈｉＲ２－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７細胞を用いた間接ＦＡＣＳスキャッチャード分析により行った。
Ｌ９２９－２０４１－ｈｉＲ２－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７の作製
抗体の比較可能で信頼性の高い結合解析に適した細胞系を作製するため、Ｌ９２９（ＮＣＴＣクローン９２９）マウス線維芽細胞（ＡＴＣＣ、ＵＳＡ）を遺伝子改変し、マウスｉＲｈｏｍ２遺伝子をノックアウトした。得られたＬ９２９マウスｉＲｈｏｍ２ノックアウト細胞株は、その後、異なるヒトｉＲｈｏｍ２構築物に感染させ、異なるヒトｉＲｈｏｍ２タンパク質を安定に発現する細胞株誘導体を得て、同じ遺伝的背景で異なるｉＲｈｏｍ２バリアントとの結合解析を可能にした。
抗体の比較可能で信頼性の高い結合解析に適した細胞系を作製するため、Ｌ９２９（ＮＣＴＣクローン９２９）マウス線維芽細胞（ＡＴＣＣ、ＵＳＡ）を遺伝子改変し、マウスｉＲｈｏｍ２遺伝子をノックアウトした。得られたＬ９２９マウスｉＲｈｏｍ２ノックアウト細胞株は、その後、異なるヒトｉＲｈｏｍ２構築物に感染させ、異なるヒトｉＲｈｏｍ２タンパク質を安定に発現する細胞株誘導体を得て、同じ遺伝的背景で異なるｉＲｈｏｍ２バリアントとの結合解析を可能にした。
簡単に説明すると、ｍＲｈｂｄｆ２．３ ＩＶＴ ｇＲＮＡ （ＡＡＧＣＡＴＧＣＴＡＴＣＣＴＧＣＴＣＧＣ）はＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＧｅｎｅＡｒｔ ＧｍｂＨ、Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙで合成された。２４ウェルプレートでの播種の１日後、Ｌ９２９親細胞を、ＧｅｎｅＡｒｔ ＣＲＩＳＰＲ Ｎｕｃｌｅａｓｅ ｍＲＮＡユーザーガイド（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）に従い、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）を用いて、ｇＲＮＡ／ＧｅｎｅＡｒｔ Ｐｌａｔｉｎｉｕｍ Ｃａｓ９ Ｎｕｃｅｌａｓｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）ミックスでトランスフェクトした。トランスフェクションの３日後、細胞を溶解し、ｍＲｈｂｄｆ２．３ ｆｗｄ （ＴＣＡＡＴＧＡＧＣＴＣＴＴＴＡＴＧＧＧＧＣＡ） ／ ｍＲｈｂｄｆ２．３ ｒｅｖ （ＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＴＣＣＣＣＴＣＡＧＧＴＣ） ５ｐｒｉｍｅｒ ｐａｉｒ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）を用いた特異的ＰＣＲ産物の増幅のためにＤＮＡを抽出した。陽性ウェルの選択には、ＧｅｎｅＡｒｔ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ２％ Ｅ－Ｇｅｌ Ｓｉｚｅ Ｓｅｌｅｃｔ ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）において、適切なサイズの顕著な単一バンドを有するサンプルに適用した。切断アッセイＰＣＲ産物は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社の２％ Ｅ－Ｇｅｌ Ｓｉｚｅ Ｓｅｌｅｃｔアガロースゲルでも分析した。陽性サブクローンの同定には切断検出キットを用い、限定希釈法を用いて同定されたポリクローナルＬ９２９集団のサブクローニングを２回行った。こうして、第１ラウンドで同定された最も有望な陽性サブクローン（１０２９と命名）を第２ラウンドでさらにサブクローン化し、最終クローン（２０４１と命名）を得た。このサブクローン由来のモノクローナル細胞集団はＬ９２９－２０４１と名付けられ、細胞株Ｌ９２９－２０４１－ｈｉＲ２－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７を作製するために、ヒトｉＲｈｏｍ２構築物ｈｉＲ２－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７でのその後の感染（実施例３に記載の手順に従って）に使用された。
Ｌ９２９－２０４１－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ７のＦＡＣＳスキャッチャード分析
簡単に説明すると、Ｌ９２９－２０４１－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ７をＰＢＳ中１０ｍＭ ＥＤＴＡで回収し、洗浄してＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、３％ ＦＢＳ、０．０５％ アジ化ナトリウム）に再懸濁し、Ｎｕｎｃ Ｕ底９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）にウェル当たり約３ｘ１０5細胞で 播種した。細胞をペレット化し、上清を除去するために、プレートを１５００ｒｐｍ、４℃で３分間遠心分離した。一次染色では、細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液のみ（対照）、または本発明のヒト化抗体１６－Ｂ－０３、１６－Ｂ－０５、１６－Ｂ－０７、２３－Ｂ－０４、４２－Ｂ－０２および４２－Ｂ－０４のＦＡＣＳ緩衝液中での１６０μｇ／ｍｌから始まる連続２倍希釈液（合計２２濃度）のいずれかを、１ウェルあたり１００μｌに懸濁し、氷上で１時間インキュベートした。その後、プレートを１５００ｒｐｍ、４℃で３分間遠心し、１ウェルあたり２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。二次染色では、細胞をスピンダウンし、ＦＡＣＳ緩衝液で１：１００に希釈したＰＥ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ´）２検出断片（Ｄｉａｎｏｖａ、ドイツ）を１ウェルあたり１００μｌ懸濁した。光から保護し、細胞懸濁液を氷上で１時間インキュベートした。その後、プレートを１５００ｒｐｍ、４℃で３分間遠心し、１ウェルあたり２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄した。最後に、細胞を１ウェルあたり１５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、ＢＤ ＡｃｃｕｒｉＴＭ Ｃ６ Ｐｌｕｓフローサイトメーター（ドイツ、ベクトン・ディッキンソン社製）を用いて分析した。Ｐｒｉｓｍ８ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｗｔｗａｒｅ、ＵＳＡ）を適用し、本発明の各抗体のそれぞれのＫＤ値を算出した。
簡単に説明すると、Ｌ９２９－２０４１－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ７をＰＢＳ中１０ｍＭ ＥＤＴＡで回収し、洗浄してＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、３％ ＦＢＳ、０．０５％ アジ化ナトリウム）に再懸濁し、Ｎｕｎｃ Ｕ底９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）にウェル当たり約３ｘ１０5細胞で 播種した。細胞をペレット化し、上清を除去するために、プレートを１５００ｒｐｍ、４℃で３分間遠心分離した。一次染色では、細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液のみ（対照）、または本発明のヒト化抗体１６－Ｂ－０３、１６－Ｂ－０５、１６－Ｂ－０７、２３－Ｂ－０４、４２－Ｂ－０２および４２－Ｂ－０４のＦＡＣＳ緩衝液中での１６０μｇ／ｍｌから始まる連続２倍希釈液（合計２２濃度）のいずれかを、１ウェルあたり１００μｌに懸濁し、氷上で１時間インキュベートした。その後、プレートを１５００ｒｐｍ、４℃で３分間遠心し、１ウェルあたり２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。二次染色では、細胞をスピンダウンし、ＦＡＣＳ緩衝液で１：１００に希釈したＰＥ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ´）２検出断片（Ｄｉａｎｏｖａ、ドイツ）を１ウェルあたり１００μｌ懸濁した。光から保護し、細胞懸濁液を氷上で１時間インキュベートした。その後、プレートを１５００ｒｐｍ、４℃で３分間遠心し、１ウェルあたり２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄した。最後に、細胞を１ウェルあたり１５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、ＢＤ ＡｃｃｕｒｉＴＭ Ｃ６ Ｐｌｕｓフローサイトメーター（ドイツ、ベクトン・ディッキンソン社製）を用いて分析した。Ｐｒｉｓｍ８ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｗｔｗａｒｅ、ＵＳＡ）を適用し、本発明の各抗体のそれぞれのＫＤ値を算出した。
図１は、この研究の代表的な結果を示しており、本発明のヒト化抗体１６－Ｂ－０３、１６－Ｂ－０５、１６－Ｂ－０７、２３－Ｂ－０４、４２－Ｂ－０２および４２－Ｂ－０４のＬ９２９－２０４１－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ７細胞への結合のＫＤ値は、サブナノモルから低ナノモルの範囲にあることを示している。
実施例２：ｉＲｈｏｍ１／２－／－ダブルノックアウトマウス胚線維芽細胞の作製
様々な目的、特に以下の実施例のいくつかで述べる結合研究のためには、内因性のｉＲｈｏｍ１またはｉＲｈｏｍ２タンパク質を欠くバックグラウンドに対して、目的の特定のｉＲｈｏｍバリアントを規定レベルで発現する細胞系が必要であった。この目的のために、マウスｉＲｈｏｍ１とマウスｉＲｈｏｍ２の両方がホモ接合的に陰性なダブルノックアウトマウス（ＤＫＯ）からマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）を樹立した（ｉＲｈｏｍ１／２－／－）。本実施例では、ｉＲｈｏｍ１／２－／－ＤＫＯ ＭＥＦの樹立および不死化ｉＲｈｏｍ１／２－／－ＤＫＯ ＭＥＦ細胞株の作製に用いたマウス系統について説明する。
様々な目的、特に以下の実施例のいくつかで述べる結合研究のためには、内因性のｉＲｈｏｍ１またはｉＲｈｏｍ２タンパク質を欠くバックグラウンドに対して、目的の特定のｉＲｈｏｍバリアントを規定レベルで発現する細胞系が必要であった。この目的のために、マウスｉＲｈｏｍ１とマウスｉＲｈｏｍ２の両方がホモ接合的に陰性なダブルノックアウトマウス（ＤＫＯ）からマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）を樹立した（ｉＲｈｏｍ１／２－／－）。本実施例では、ｉＲｈｏｍ１／２－／－ＤＫＯ ＭＥＦの樹立および不死化ｉＲｈｏｍ１／２－／－ＤＫＯ ＭＥＦ細胞株の作製に用いたマウス系統について説明する。
ｉＲｈｏｍ１／２－／－ＤＫＯ ＭＥＦの樹立に用いたマウス系統
簡単に説明すると、Ｃ５７ＢＬ／６ＮバックグラウンドのＲｈｂｄｆ２ｔｍ１ｂ（ＫＯＭＰ）Ｗｔｓｉマウス系統（Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ－Ｒｈｂｄｆ２ｔｍ１ｂ（ＫＯＭＰ）Ｗｔｓｉ）は、米国カリフォルニア大学デービス校のノックアウトマウスプロジェクト（ＫＯＭＰ）リポジトリから入手した（Ｒｈｂｄｆ２はｉＲｈｏｍ２の別名）。ヘテロ接合体雄性Ｒｈｂｄｆ２ｔｍ１ｂマウスを１２９Ｓｖ／Ｊ遺伝的背景を持つ野生型雌性マウスと交配させ、混合遺伝的背景を持つヘテロ接合体子孫（１２９Ｓｖ／Ｊ－Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ）を作製した。これらのヘテロ接合体マウス同士を交配させ、Ｒｈｂｄｆ２遺伝子の欠失がホモ接合体である雌雄の子孫を作製した（Ｒｈｂｄｆ２－／－マウス、１２９Ｓｖ／Ｊ－Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ）。得られたホモ接合体Ｒｈｂｄｆ２ノックアウトマウスのコロニーは、Ｒｈｂｄｆ－／－雄マウスと雌マウスの交配によってさらに拡大し、十分な数のマウスを作製した。ホモ接合体Ｒｈｂｄｆ２－／－マウスは生存可能で生殖能力があり、明らかな自然発生的病理学的表現型は見られない。
簡単に説明すると、Ｃ５７ＢＬ／６ＮバックグラウンドのＲｈｂｄｆ２ｔｍ１ｂ（ＫＯＭＰ）Ｗｔｓｉマウス系統（Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ－Ｒｈｂｄｆ２ｔｍ１ｂ（ＫＯＭＰ）Ｗｔｓｉ）は、米国カリフォルニア大学デービス校のノックアウトマウスプロジェクト（ＫＯＭＰ）リポジトリから入手した（Ｒｈｂｄｆ２はｉＲｈｏｍ２の別名）。ヘテロ接合体雄性Ｒｈｂｄｆ２ｔｍ１ｂマウスを１２９Ｓｖ／Ｊ遺伝的背景を持つ野生型雌性マウスと交配させ、混合遺伝的背景を持つヘテロ接合体子孫（１２９Ｓｖ／Ｊ－Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ）を作製した。これらのヘテロ接合体マウス同士を交配させ、Ｒｈｂｄｆ２遺伝子の欠失がホモ接合体である雌雄の子孫を作製した（Ｒｈｂｄｆ２－／－マウス、１２９Ｓｖ／Ｊ－Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ）。得られたホモ接合体Ｒｈｂｄｆ２ノックアウトマウスのコロニーは、Ｒｈｂｄｆ－／－雄マウスと雌マウスの交配によってさらに拡大し、十分な数のマウスを作製した。ホモ接合体Ｒｈｂｄｆ２－／－マウスは生存可能で生殖能力があり、明らかな自然発生的病理学的表現型は見られない。
Ｒｈｂｄｆ１ノックアウトマウスは、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｍｏｕｓｅ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（ＩＫＭＣ）のＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ Ｍｏｕｓｅ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｐｒｏｇｒａｍ（ＥＵＣＯＭＭ）から入手した。これらの動物の作製については、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ， ２０１５， ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１５０５６４９１１２に記載されている。ホモ接合体Ｒｈｂｄｆ１－／－マウスは生存可能で生殖能力があり、明らかな自然発生的病理学的表現型は見られない。
Ｒｈｂｄｆ１とＲｈｂｄｆ２のＤＫＯマウス（Ｒｈｂｄｆ１／２－／－マウス）を作製するために、Ｒｈｂｄｆ１－／－マウスとＲｈｂｄｆ２－／－マウスを交配し、Ｒｈｂｄｆ１＋／－Ｒｈｂｄｆ２＋／－のダブルヘテロ接合体マウスを作製した。これをＲｈｂｄｆ２－／－マウスと交配してＲｈｂｄｆ１＋／－Ｒｈｂｄｆ２－／－動物を作製し、これを互いに交配して、以下に記載のとおり、Ｅ１３．５ Ｒｈｂｄｆ１／２－／－ＤＫＯ ＭＥＦを作製するために予想されるメンデル比（全胚の１／４）で両方のＲｈｂｄｆ遺伝子を欠くＥ１４．５胚（Ｒｈｂｄｆ１／２－／－ＤＫＯ胚）を作製した。
不死化ｉＲｈｏｍ１／２－／－ＤＫＯ ＭＥＦ細胞株の作製
簡単に説明すると、妊娠したＲｈｂｄｆ１＋／－Ｒｈｂｄｆ２－／－メスをＥ１３．５で犠牲にした。子宮角を氷冷ＰＢＳの入った皿に取り出した。先端の細い鉗子を用いて胚を母体組織から離し、各胚を胎盤から取り出した。その後、それぞれの胚を鋭利なメスで切断し、肝臓、心臓、肺、腸などの内臓をすべて取り除いた。尾の０．５ｍｍの切片を取り除き、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移し、ゲノムＤＮＡの単離と、その後のＰＣＲによる遺伝子型判定を行い、胚の正しい遺伝子型を確認した。その後、残った胚組織をＰＢＳで１回洗浄し、０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡを２ｍＬ入れた組織培養皿に移した。組織を滅菌メス２本で広範囲にミンチし、トリプシン／細胞混合液を３７℃で１５分間インキュベートした。トリプシン化は、ＦＣＳ含有増殖培地の添加によって停止された。単一細胞懸濁液を作るため、混合液を上下にピペッティングし、まず１０ｍＬの血清ピペットで５回、次に５ｍＬの血清ピペットで５回、最後に火で磨いたパスツールピペットで数回ピペッティングし、残っている細胞クラスターをさらに解離させた。その後、１個の胚から得た細胞を１０ｃｍの組織培養プレート２枚にプレーティングした。翌日、培地を新しい培地に交換し、細胞が９０％のコンフルエントに達するまで増殖させた。最終的に、細胞は拡大され、将来の使用のためにストックされた。
簡単に説明すると、妊娠したＲｈｂｄｆ１＋／－Ｒｈｂｄｆ２－／－メスをＥ１３．５で犠牲にした。子宮角を氷冷ＰＢＳの入った皿に取り出した。先端の細い鉗子を用いて胚を母体組織から離し、各胚を胎盤から取り出した。その後、それぞれの胚を鋭利なメスで切断し、肝臓、心臓、肺、腸などの内臓をすべて取り除いた。尾の０．５ｍｍの切片を取り除き、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移し、ゲノムＤＮＡの単離と、その後のＰＣＲによる遺伝子型判定を行い、胚の正しい遺伝子型を確認した。その後、残った胚組織をＰＢＳで１回洗浄し、０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡを２ｍＬ入れた組織培養皿に移した。組織を滅菌メス２本で広範囲にミンチし、トリプシン／細胞混合液を３７℃で１５分間インキュベートした。トリプシン化は、ＦＣＳ含有増殖培地の添加によって停止された。単一細胞懸濁液を作るため、混合液を上下にピペッティングし、まず１０ｍＬの血清ピペットで５回、次に５ｍＬの血清ピペットで５回、最後に火で磨いたパスツールピペットで数回ピペッティングし、残っている細胞クラスターをさらに解離させた。その後、１個の胚から得た細胞を１０ｃｍの組織培養プレート２枚にプレーティングした。翌日、培地を新しい培地に交換し、細胞が９０％のコンフルエントに達するまで増殖させた。最終的に、細胞は拡大され、将来の使用のためにストックされた。
初代Ｒｈｂｄｆ１／２－／－ＤＫＯ ＭＥＦの不死化のために、細胞をｐＭＳＣＶ発現系（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ＵＳＡ）を用いたレトロウイルス系で形質導入した。簡単に説明すると、ｐＭＳＣＶ－Ｚｅｏ－ＳＶ４０は以下のようにして作製した： プラスミドｐＭＳＣＶ－ｐｕｒｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， ＵＳＡ）からピューロマイシン耐性をコードする配列を除去し、ｐｃＤＮＡ３．１（＋） Ｚｅｏベクター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ＵＳＡ）からゼオシン耐性を付与する配列に置換した。レトロウイルスパッケージング細胞株ＧＰ２－２９３（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ＵＳＡ）をエンベロープベクターｐＶＳＶ－Ｇ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ＵＳＡ）およびｐＭＳＣＶ－Ｚｅｏ－ＳＶ４０プラスミドと組み合わせて使用し、ＳＶ４０ラージＴ抗原をコードするレトロウイルスを作製した。ウイルスを濾過し、５０％コンフルエントでプレーティングした初代Ｒｈｂｄｆ１／２－／－ＤＫＯ ＭＥＦに２４時間添加した。その後、形質導入したＲｈｂｄｆ１／２－／－ＤＫＯ ＭＥＦを選択圧なしの増殖培地で２４時間増殖させた後、１００μｇ／ｍｌのゼオシンを含む増殖培地に移した。細胞はコンフルエントになった時点で継代し、１０回継代した後、将来の使用のためにストックした。
実施例３：本発明のヒト化抗体のマウス交差反応性の評価
次に、不死化ｉＲｈｏｍ１／２－／－ＤＫＯ ＭＥＦをタグ化ヒトｉＲｈｏｍ２で再構成し、本発明のヒト化抗体の標的認識を試験した。さらに、本発明のヒト化抗体１６－Ｂ－０３、１６－Ｂ－０５、１６－Ｂ－０７、２３－Ｂ－０４、４２－Ｂ－０２および４２－Ｂ－０４と、ｉＲｈｏｍ２のマウスオルソログとの交差反応性を測定するために、マウスｉＲｈｏｍ２のタグ化形態を安定に発現するｉＲｈｏｍ１／２－／－ＤＫＯ ＭＥＦを作製した。
次に、不死化ｉＲｈｏｍ１／２－／－ＤＫＯ ＭＥＦをタグ化ヒトｉＲｈｏｍ２で再構成し、本発明のヒト化抗体の標的認識を試験した。さらに、本発明のヒト化抗体１６－Ｂ－０３、１６－Ｂ－０５、１６－Ｂ－０７、２３－Ｂ－０４、４２－Ｂ－０２および４２－Ｂ－０４と、ｉＲｈｏｍ２のマウスオルソログとの交差反応性を測定するために、マウスｉＲｈｏｍ２のタグ化形態を安定に発現するｉＲｈｏｍ１／２－／－ＤＫＯ ＭＥＦを作製した。
Ｔ７タグ付きヒトまたはマウスｉＲｈｏｍ２を安定に発現するｉＲｈｏｍ１／２－／－ＤＫＯ ＭＥＦの作製
簡単に説明すると、１日目に、Ｐｈｏｅｎｉｘ－ＥＣＯ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、米国）を、標準増殖培地中の６ウェル組織培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、ドイツ）に、１ウェル当たり８ｘ１０5細胞で播種し、３７℃、５％ＣＯ2で一晩静置した。２日目に、クロロキン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）を最終濃度２５μＭで添加した新鮮な培地に交換した。リン酸カルシウム法を適用し、細胞を２μｇ／ｍｌのｐＭＳＣＶ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ＵＳＡ）空ベクター、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７をコードするヒトｉＲｈｏｍ２全長野生型Ｃ末端にＴ７エピトープ（ＭＡＳＭＴＧＧＱＱＭＧ）を３コピー連続付加したもの、またはｐＭＳＣＶ－ｍｉＲ２－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７をコードするマウスｉＲｈｏｍ２全長野生型Ｃ末端にＴ７エピトープを３コピー連続付加したものでトランスフェクトし、３７℃、５％ＣＯ2に保った。７時間後、細胞上清をクロロキン欠乏の標準増殖培地と交換してトランスフェクションを停止し、３７℃、５％ＣＯ2で一晩培養してウイルス産生を行った。並行して、レトロウイルス感染の標的細胞として不死化したｉＲｈｏｍ１／２－／－ＤＫＯ ＭＥＦを、標準増殖培地中の６ウェル組織培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、ドイツ）に１ウェルあたり１ｘ１０5細胞で播種し、３７℃、５％ＣＯ2で一晩静置した。３日目に、ｐＭＳＣＶ、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７またはｐＭＳＣＶ－ｍｉＲ２－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７エコトロピックウイルスを放出したＰｈｏｅｎｉｘ－ＥＣＯ細胞の上清を回収し、０．４５μｍのＣＡフィルターで濾過し、４μｇ／ｍｌのポリブレン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）を添加した。不死化したｉＲｈｏｍ１／２－／－ＤＫＯ ＭＥＦから培地を除去した後、ウイルスを含む上清を標的細胞に加え、３７℃、５％ＣＯ2で４時間、初感染を行った。同時に、Ｐｈｏｅｎｉｘ－ＥＣＯ細胞を新鮮な培地で再インキュベートし、さらに４時間後に濾過し、再び４μｇ／ｍｌのポリブレン存在下で、それぞれの標的細胞集団の２回目の感染に使用した。同様に、３回目の、しかし一晩の感染サイクルを行った。４日目に、ウイルスを含む細胞上清を新鮮な標準増殖培地と交換した。５日目以降、ｐＭＳＣＶ空ベクターに安定に感染させた不死化ＭＥＦ－ＤＫＯ－ＥＶ対照細胞、ヒトｉＲｈｏｍ２全長野生型Ｃ末端をＴ７エピトープの連続する３つのコピーでタグ化したものを安定に発現するＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７細胞、およびマウスｉＲｈｏｍ２全長野生型Ｃ末端をＴ７エピトープの連続する３つのコピーでタグ化したものを安定に発現するＭＥＦ－ＤＫＯ－ｍｉＲ２－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７細胞を選択するために、２ｍｇ／ｍｌのジェネティシン（Ｇ４１８、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）の存在下で細胞を増殖させた、増殖後、細胞は将来の使用のためにストックされた。
簡単に説明すると、１日目に、Ｐｈｏｅｎｉｘ－ＥＣＯ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、米国）を、標準増殖培地中の６ウェル組織培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、ドイツ）に、１ウェル当たり８ｘ１０5細胞で播種し、３７℃、５％ＣＯ2で一晩静置した。２日目に、クロロキン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）を最終濃度２５μＭで添加した新鮮な培地に交換した。リン酸カルシウム法を適用し、細胞を２μｇ／ｍｌのｐＭＳＣＶ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ＵＳＡ）空ベクター、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７をコードするヒトｉＲｈｏｍ２全長野生型Ｃ末端にＴ７エピトープ（ＭＡＳＭＴＧＧＱＱＭＧ）を３コピー連続付加したもの、またはｐＭＳＣＶ－ｍｉＲ２－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７をコードするマウスｉＲｈｏｍ２全長野生型Ｃ末端にＴ７エピトープを３コピー連続付加したものでトランスフェクトし、３７℃、５％ＣＯ2に保った。７時間後、細胞上清をクロロキン欠乏の標準増殖培地と交換してトランスフェクションを停止し、３７℃、５％ＣＯ2で一晩培養してウイルス産生を行った。並行して、レトロウイルス感染の標的細胞として不死化したｉＲｈｏｍ１／２－／－ＤＫＯ ＭＥＦを、標準増殖培地中の６ウェル組織培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、ドイツ）に１ウェルあたり１ｘ１０5細胞で播種し、３７℃、５％ＣＯ2で一晩静置した。３日目に、ｐＭＳＣＶ、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７またはｐＭＳＣＶ－ｍｉＲ２－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７エコトロピックウイルスを放出したＰｈｏｅｎｉｘ－ＥＣＯ細胞の上清を回収し、０．４５μｍのＣＡフィルターで濾過し、４μｇ／ｍｌのポリブレン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）を添加した。不死化したｉＲｈｏｍ１／２－／－ＤＫＯ ＭＥＦから培地を除去した後、ウイルスを含む上清を標的細胞に加え、３７℃、５％ＣＯ2で４時間、初感染を行った。同時に、Ｐｈｏｅｎｉｘ－ＥＣＯ細胞を新鮮な培地で再インキュベートし、さらに４時間後に濾過し、再び４μｇ／ｍｌのポリブレン存在下で、それぞれの標的細胞集団の２回目の感染に使用した。同様に、３回目の、しかし一晩の感染サイクルを行った。４日目に、ウイルスを含む細胞上清を新鮮な標準増殖培地と交換した。５日目以降、ｐＭＳＣＶ空ベクターに安定に感染させた不死化ＭＥＦ－ＤＫＯ－ＥＶ対照細胞、ヒトｉＲｈｏｍ２全長野生型Ｃ末端をＴ７エピトープの連続する３つのコピーでタグ化したものを安定に発現するＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７細胞、およびマウスｉＲｈｏｍ２全長野生型Ｃ末端をＴ７エピトープの連続する３つのコピーでタグ化したものを安定に発現するＭＥＦ－ＤＫＯ－ｍｉＲ２－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７細胞を選択するために、２ｍｇ／ｍｌのジェネティシン（Ｇ４１８、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）の存在下で細胞を増殖させた、増殖後、細胞は将来の使用のためにストックされた。
テストシステム評価と抗体の特性解析のためのＦＡＣＳ分析
簡単に説明すると、不死化ＭＥＦ－ＤＫＯ－ＥＶ対照細胞、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７細胞、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｍｉＲ２－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７細胞をＰＢＳ中１０ｍＭ ＥＤＴＡで回収し、洗浄後、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、３％ ＦＢＳ、０．０５％ アジ化ナトリウム）に再懸濁し、Ｎｕｎｃ Ｕ底９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）にウェル当たり約３ｘ１０5細胞で播種した。細胞をペレット化し、上清を除去するために、プレートを１５００ｒｐｍ、４℃で３分間遠心分離した。一次染色では、細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液のみ（対照）、３μｇ／ｍｌ ＦＡＣＳ緩衝液のマウスモノクローナル抗Ｔ７ ＩｇＧ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国）、または同じく３μｇ／ｍｌ ＦＡＣＳ緩衝液の本発明のヒト化抗体１６－Ｂ－０３、１６－Ｂ－０５、１６－Ｂ－０７、２３－Ｂ－０４、４２－Ｂ－０２および４２－Ｂ－０４のいずれかを１ウェルあたり１００μｌに再懸濁し、氷上で１時間インキュベートした。その後、プレートを１５００ｒｐｍ、４℃で３分間遠心し、１ウェルあたり２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。前の抗Ｔ７染色の二次染色のために、細胞をスピンダウンし、ＦＡＣＳ緩衝液で１：１００に希釈したＰＥ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆ（ａｂ´）２検出フラグメント（Ｄｉａｎｏｖａ、ドイツ）にウェルあたり１００μｌ再懸濁した。本発明のヒト化抗体による前の二次染色では、細胞をスピンダウンし、ＦＡＣＳ緩衝液で１：１００に希釈したＰＥ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ´）２検出フラグメント（Ｄｉａｎｏｖａ， Ｇｅｒｍａｎｙ）１ウェルあたり１００μｌに再懸濁した。光から保護し、細胞懸濁液を氷上で１時間インキュベートした。その後、プレートを１５００ｒｐｍ、４℃で３分間遠心し、１ウェルあたり２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄した。最後に、細胞を１ウェルあたり１５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、ＢＤ ＡｃｃｕｒｉＴＭ Ｃ６ Ｐｌｕｓフローサイトメーター（ドイツ、ベクトン・ディッキンソン社製）を用いて分析した。
簡単に説明すると、不死化ＭＥＦ－ＤＫＯ－ＥＶ対照細胞、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７細胞、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｍｉＲ２－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７細胞をＰＢＳ中１０ｍＭ ＥＤＴＡで回収し、洗浄後、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、３％ ＦＢＳ、０．０５％ アジ化ナトリウム）に再懸濁し、Ｎｕｎｃ Ｕ底９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）にウェル当たり約３ｘ１０5細胞で播種した。細胞をペレット化し、上清を除去するために、プレートを１５００ｒｐｍ、４℃で３分間遠心分離した。一次染色では、細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液のみ（対照）、３μｇ／ｍｌ ＦＡＣＳ緩衝液のマウスモノクローナル抗Ｔ７ ＩｇＧ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国）、または同じく３μｇ／ｍｌ ＦＡＣＳ緩衝液の本発明のヒト化抗体１６－Ｂ－０３、１６－Ｂ－０５、１６－Ｂ－０７、２３－Ｂ－０４、４２－Ｂ－０２および４２－Ｂ－０４のいずれかを１ウェルあたり１００μｌに再懸濁し、氷上で１時間インキュベートした。その後、プレートを１５００ｒｐｍ、４℃で３分間遠心し、１ウェルあたり２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。前の抗Ｔ７染色の二次染色のために、細胞をスピンダウンし、ＦＡＣＳ緩衝液で１：１００に希釈したＰＥ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆ（ａｂ´）２検出フラグメント（Ｄｉａｎｏｖａ、ドイツ）にウェルあたり１００μｌ再懸濁した。本発明のヒト化抗体による前の二次染色では、細胞をスピンダウンし、ＦＡＣＳ緩衝液で１：１００に希釈したＰＥ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ´）２検出フラグメント（Ｄｉａｎｏｖａ， Ｇｅｒｍａｎｙ）１ウェルあたり１００μｌに再懸濁した。光から保護し、細胞懸濁液を氷上で１時間インキュベートした。その後、プレートを１５００ｒｐｍ、４℃で３分間遠心し、１ウェルあたり２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄した。最後に、細胞を１ウェルあたり１５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、ＢＤ ＡｃｃｕｒｉＴＭ Ｃ６ Ｐｌｕｓフローサイトメーター（ドイツ、ベクトン・ディッキンソン社製）を用いて分析した。
図２ａおよび２ｂは、この実験の代表的な結果を示す。抗マウスＩｇＧまたは抗ヒトＩｇＧ二次抗体のみでインキュベートした対照試料（２ａおよび２ｂ、灰色）と比較して、抗Ｔ７タグ抗体（図２ａ、黒）との共インキュベーションでは、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ＥＶ対照細胞（図２ａ、左）のバックグラウンド染色はほとんど見られなかった。対照的に、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７（図２ａ中）細胞およびＭＥＦ－ＤＫＯ－ｍｉＲ２－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７（図２ａ右）細胞の両方における抗Ｔ７タグ抗体の結合解析では、相対蛍光強度の強い増加が認められ、異所的に発現されたヒトおよびマウスｉＲｈｏｍ２バリアントの両方が、これらの遺伝子操作された細胞集団の表面に局在していることが示され、したがって、本発明の抗体を特性評価するための適切なテストシステムとして有効であることを示す。これらの細胞集団を、本発明のヒト化抗体の代表例であるヒト化抗体１６－Ｂ－０３と共インキュベートすると（図２ｂ、黒）、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ＥＶ対照細胞のバックグラウンド染色は全く見られなくなる（図２ｂ、左）、一方、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７細胞において、抗Ｔ７タグ抗体で観察されたものと同様の相対蛍光強度の強いシフトは、本発明のヒト化抗体１６－Ｂ－０３とヒトｉＲｈｏｍ２バリアントとの強い結合を示す（図２ｂ、中）。対照的に、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｍｉＲ２－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７細胞に対する本発明のヒト化抗体１６－Ｂ－０３の有意な結合は検出されず（図２ｂ、右）、抗Ｔ７タグ抗体（図２ａ、右）で細胞表面上の存在が確認されたマウスｉＲｈｏｍ２バリアントが、本発明のヒト化抗体１６－Ｂ－０３によって認識されない証拠を提供する。同様の結果が本発明のヒト化抗体１６－Ｂ－０５、１６－Ｂ－０７、２３－Ｂ－０４、４２－Ｂ－０２、４２－Ｂ－０４でも得られ、本発明のこれらのヒト化抗体はいずれもマウスｉＲｈｏｍ２と交差反応しないことが示された。
実施例４：本発明のヒト化抗体の結合特異性の評価
ヒトｉＲｈｏｍ２タンパク質と、その近縁ファミリーメンバーであるヒトｉＲｈｏｍ１タンパク質との配列相同性により （ヒトｉＲｈｏｍ２についてはＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０７８８７５．４．を、ヒトｉＲｈｏｍ１についてはＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０７１８９５．３を参照し、ヒトｉＲｈｏｍ２対ヒトｉＲｈｏｍ１の細胞外ループ１、２、３およびＣ末端尾部のアミノ酸配列同一性は、それぞれ６７．４％、１００．００％、８０．００％および６３．６４％と計算される）、次の段階として、本発明のヒト化抗体１６－Ｂ－０３、１６－Ｂ－０５、１６－Ｂ－０７、２３－Ｂ－０４、４２－Ｂ－０２、４２－Ｂ－０４のヒトｉＲｈｏｍ２対ヒトｉＲｈｏｍ１に対する結合特異性を評価した。この目的のために、ヒトｉＲｈｏｍ１のタグを安定に発現するｉＲｈｏｍ１／２－／－ＤＫＯ ＭＥＦを作製した。
ヒトｉＲｈｏｍ２タンパク質と、その近縁ファミリーメンバーであるヒトｉＲｈｏｍ１タンパク質との配列相同性により （ヒトｉＲｈｏｍ２についてはＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０７８８７５．４．を、ヒトｉＲｈｏｍ１についてはＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０７１８９５．３を参照し、ヒトｉＲｈｏｍ２対ヒトｉＲｈｏｍ１の細胞外ループ１、２、３およびＣ末端尾部のアミノ酸配列同一性は、それぞれ６７．４％、１００．００％、８０．００％および６３．６４％と計算される）、次の段階として、本発明のヒト化抗体１６－Ｂ－０３、１６－Ｂ－０５、１６－Ｂ－０７、２３－Ｂ－０４、４２－Ｂ－０２、４２－Ｂ－０４のヒトｉＲｈｏｍ２対ヒトｉＲｈｏｍ１に対する結合特異性を評価した。この目的のために、ヒトｉＲｈｏｍ１のタグを安定に発現するｉＲｈｏｍ１／２－／－ＤＫＯ ＭＥＦを作製した。
Ｔ７タグ付きヒトｉＲｈｏｍ１を安定に発現するｉＲｈｏｍ１／２－／－ＤＫＯ ＭＥＦの作製
簡単に説明すると、１日目に、Ｐｈｏｅｎｉｘ－ＥＣＯ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、米国）を、標準増殖培地中の６ウェル組織培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、ドイツ）に、１ウェル当たり８ｘ１０5細胞で播種し、３７℃、５％ＣＯ2で一晩静置した。２日目に、クロロキン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）を最終濃度２５μＭで添加した新鮮な培地に交換した。リン酸カルシウム法を適用し、ヒトｉＲｈｏｍ１全長野生型Ｃ末端にＴ７エピトープを連続３コピー付加したものをコードするｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ１－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７（配列番号５０）を２μｇ／ｍｌトランスフェクトし、３７℃、５％ ＣＯ２に保った。７時間後、細胞上清をクロロキン欠乏の標準増殖培地と交換してトランスフェクションを停止し、３７℃、５％ＣＯ2で一晩培養してウイルス産生を行った。並行して、レトロウイルス感染の標的細胞として不死化したｉＲｈｏｍ１／２－／－ＤＫＯ ＭＥＦを、標準増殖培地中の６ウェル組織培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、ドイツ）に１ウェルあたり１ｘ１０5細胞で播種し、３７℃、５％ＣＯ2で一晩静置した。３日目に、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ１－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７エコトロピックウイルスを放出したＰｈｏｅｎｉｘ－ＥＣＯ細胞の上清を回収し、０．４５μｍのＣＡフィルターで濾過し、４μｇ／ｍｌのポリブレン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）を添加した。不死化したｉＲｈｏｍ１／２－／－ＤＫＯ ＭＥＦから培地を除去した後、これらの上清を標的細胞に加え、３７℃、５％ＣＯ2で４時間、初感染を行った。同時に、Ｐｈｏｅｎｉｘ－ＥＣＯ細胞を新鮮な培地で再インキュベートし、さらに４時間後に濾過し、再び４μｇ／ｍｌのポリブレン存在下で、それぞれの標的細胞集団の２回目の感染に使用した。同様に、３回目の、しかし一晩の感染サイクルを行った。４日目に、ウイルスを含む細胞上清を新鮮な標準増殖培地と交換した。５日目以降、ヒトｉＲｈｏｍ１全長野生型Ｃ末端をＴ７エピトープの連続する３コピーでタグ化したものを安定的に発現する不死化ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ１－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７細胞を、２ｍｇ／ｍｌのジェネティシン（Ｇ４１８、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）の存在下で細胞を増殖させた。増殖後、細胞は将来の使用のためにストックされた。
簡単に説明すると、１日目に、Ｐｈｏｅｎｉｘ－ＥＣＯ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、米国）を、標準増殖培地中の６ウェル組織培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、ドイツ）に、１ウェル当たり８ｘ１０5細胞で播種し、３７℃、５％ＣＯ2で一晩静置した。２日目に、クロロキン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）を最終濃度２５μＭで添加した新鮮な培地に交換した。リン酸カルシウム法を適用し、ヒトｉＲｈｏｍ１全長野生型Ｃ末端にＴ７エピトープを連続３コピー付加したものをコードするｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ１－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７（配列番号５０）を２μｇ／ｍｌトランスフェクトし、３７℃、５％ ＣＯ２に保った。７時間後、細胞上清をクロロキン欠乏の標準増殖培地と交換してトランスフェクションを停止し、３７℃、５％ＣＯ2で一晩培養してウイルス産生を行った。並行して、レトロウイルス感染の標的細胞として不死化したｉＲｈｏｍ１／２－／－ＤＫＯ ＭＥＦを、標準増殖培地中の６ウェル組織培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、ドイツ）に１ウェルあたり１ｘ１０5細胞で播種し、３７℃、５％ＣＯ2で一晩静置した。３日目に、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ１－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７エコトロピックウイルスを放出したＰｈｏｅｎｉｘ－ＥＣＯ細胞の上清を回収し、０．４５μｍのＣＡフィルターで濾過し、４μｇ／ｍｌのポリブレン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）を添加した。不死化したｉＲｈｏｍ１／２－／－ＤＫＯ ＭＥＦから培地を除去した後、これらの上清を標的細胞に加え、３７℃、５％ＣＯ2で４時間、初感染を行った。同時に、Ｐｈｏｅｎｉｘ－ＥＣＯ細胞を新鮮な培地で再インキュベートし、さらに４時間後に濾過し、再び４μｇ／ｍｌのポリブレン存在下で、それぞれの標的細胞集団の２回目の感染に使用した。同様に、３回目の、しかし一晩の感染サイクルを行った。４日目に、ウイルスを含む細胞上清を新鮮な標準増殖培地と交換した。５日目以降、ヒトｉＲｈｏｍ１全長野生型Ｃ末端をＴ７エピトープの連続する３コピーでタグ化したものを安定的に発現する不死化ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ１－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７細胞を、２ｍｇ／ｍｌのジェネティシン（Ｇ４１８、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）の存在下で細胞を増殖させた。増殖後、細胞は将来の使用のためにストックされた。
テストシステム評価と抗体の特性解析のためのＦＡＣＳ分析
簡単に説明すると、不死化ＭＥＦ－ＤＫＯ－ＥＶ対照細胞およびＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７細胞（実施例３に既に記載）に加えて、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ１－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７細胞を、ＰＢＳ中１０ｍＭ ＥＤＴＡで回収し、洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、３％ ＦＢＳ、０．０５％アジ化ナトリウム）で再懸濁し、Ｎｕｎｃ Ｕ底９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ＵＳＡ）にウェル当たり約３ｘ１０5細胞ずつ播種した。細胞をペレット化し、上清を除去するために、プレートを１５００ｒｐｍ、４℃で３分間遠心分離した。一次染色では、細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液のみ（対照）、３μｇ／ｍｌ ＦＡＣＳ緩衝液のマウスモノクローナル抗Ｔ７ ＩｇＧ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国）、または同じく３μｇ／ｍｌ ＦＡＣＳ緩衝液の本発明のヒト化抗体１６－Ｂ－０３、１６－Ｂ－０５、１６－Ｂ－０７、２３－Ｂ－０４、４２－Ｂ－０２、４２－Ｂ－０４のいずれか１ウェルあたり１００μｌに再懸濁し、氷上で１時間インキュベートした。その後、プレートを１５００ｒｐｍ、４℃で３分間遠心し、１ウェルあたり２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。前の抗Ｔ７染色の二次染色のために、細胞をスピンダウンし、ＦＡＣＳ緩衝液で１：１００に希釈したＰＥ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆ（ａｂ´）２検出フラグメント（Ｄｉａｎｏｖａ、ドイツ）にウェルあたり１００μｌ再懸濁した。本発明のヒト化抗体による前の二次染色では、細胞をスピンダウンし、ＦＡＣＳ緩衝液で１：１００に希釈したＰＥ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ´）２検出フラグメント（Ｄｉａｎｏｖａ， Ｇｅｒｍａｎｙ）１ウェルあたり１００μｌに再懸濁した。光から保護し、細胞懸濁液を氷上で１時間インキュベートした。その後、プレートを１５００ｒｐｍ、４℃で３分間遠心し、１ウェルあたり２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄した。最後に、細胞を１ウェルあたり１５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、ＢＤ ＡｃｃｕｒｉＴＭ Ｃ６ Ｐｌｕｓフローサイトメーター（ドイツ、ベクトン・ディッキンソン社製）を用いて分析した。
簡単に説明すると、不死化ＭＥＦ－ＤＫＯ－ＥＶ対照細胞およびＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７細胞（実施例３に既に記載）に加えて、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ１－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７細胞を、ＰＢＳ中１０ｍＭ ＥＤＴＡで回収し、洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、３％ ＦＢＳ、０．０５％アジ化ナトリウム）で再懸濁し、Ｎｕｎｃ Ｕ底９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ＵＳＡ）にウェル当たり約３ｘ１０5細胞ずつ播種した。細胞をペレット化し、上清を除去するために、プレートを１５００ｒｐｍ、４℃で３分間遠心分離した。一次染色では、細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液のみ（対照）、３μｇ／ｍｌ ＦＡＣＳ緩衝液のマウスモノクローナル抗Ｔ７ ＩｇＧ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国）、または同じく３μｇ／ｍｌ ＦＡＣＳ緩衝液の本発明のヒト化抗体１６－Ｂ－０３、１６－Ｂ－０５、１６－Ｂ－０７、２３－Ｂ－０４、４２－Ｂ－０２、４２－Ｂ－０４のいずれか１ウェルあたり１００μｌに再懸濁し、氷上で１時間インキュベートした。その後、プレートを１５００ｒｐｍ、４℃で３分間遠心し、１ウェルあたり２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。前の抗Ｔ７染色の二次染色のために、細胞をスピンダウンし、ＦＡＣＳ緩衝液で１：１００に希釈したＰＥ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆ（ａｂ´）２検出フラグメント（Ｄｉａｎｏｖａ、ドイツ）にウェルあたり１００μｌ再懸濁した。本発明のヒト化抗体による前の二次染色では、細胞をスピンダウンし、ＦＡＣＳ緩衝液で１：１００に希釈したＰＥ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ´）２検出フラグメント（Ｄｉａｎｏｖａ， Ｇｅｒｍａｎｙ）１ウェルあたり１００μｌに再懸濁した。光から保護し、細胞懸濁液を氷上で１時間インキュベートした。その後、プレートを１５００ｒｐｍ、４℃で３分間遠心し、１ウェルあたり２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄した。最後に、細胞を１ウェルあたり１５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、ＢＤ ＡｃｃｕｒｉＴＭ Ｃ６ Ｐｌｕｓフローサイトメーター（ドイツ、ベクトン・ディッキンソン社製）を用いて分析した。
図３ａおよび３ｂは、これらの分析結果の代表的なものである。ＭＥＦ－ＤＫＯ－ＥＶ対照細胞（図３ａ、左；図２ａ、左と同じ）およびＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７（図３ａ、右；図２ａ中）と同じ）の染色と比較すると、抗Ｔ７タグ抗体を用いてＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ１－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７で得られた相対蛍光強度の強い増加（図３ａ中）は、ヒトｉＲｈｏｍ２バリアントと同様に、ヒトｉＲｈｏｍ１バリアントもこの遺伝子操作された細胞集団の表面に位置し、したがって、本発明の抗体を特性評価するための適切なテストシステムとして有効であることを示す。この文脈において、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７細胞上に発現したヒトｉＲｈｏｍ２バリアントに対する本発明のヒト化抗体の代表例としての抗体１６－Ｂ－０３の結合（図３ｂ、右；図２ｂの中と同一である）は、実施例３で既に示されたが、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ１－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７細胞に対する本発明のヒト化抗体１６－Ｂ－０３の有意な結合は検出されず（図３ｂ、中）、抗Ｔ７タグ抗体（図３ａ、中）で細胞表面上の存在が確認されたヒトｉＲｈｏｍ１バリアントは、本発明のヒト化抗体１６－Ｂ－０３によって認識されないという証拠を提供する。同様の結果が、本発明のヒト化抗体１６－Ｂ－０５、１６－Ｂ－０７、２３－Ｂ－０４、４２－Ｂ－０２、４２－Ｂ－０４でも得られ、本発明のこれらのヒト化抗体はいずれもヒトｉＲｈｏｍ１を認識しないことが示された。
実施例５：異なる生物種に対する本発明の抗体の交差反応性の評価
次に、本発明の抗体とｉＲｈｏｍ２のそれぞれのオルソログとの交差反応性を測定するために、アカゲザル、カニクイザル、イヌまたはウサギのｉＲｈｏｍ２のタグ化形態を安定に発現するｉＲｈｏｍ１／２－／－ＤＫＯ ＭＥＦを作製した。アカゲザル、カニクイザル、イヌまたはウサギのｉＲｈｏｍ１のタグを安定的に発現させたｉＲｈｏｍ１／２－／－ＤＫＯ ＭＥＦを作製し、これらの種のｉＲｈｏｍ１に対するｉＲｈｏｍ２の特異性を確認した。
次に、本発明の抗体とｉＲｈｏｍ２のそれぞれのオルソログとの交差反応性を測定するために、アカゲザル、カニクイザル、イヌまたはウサギのｉＲｈｏｍ２のタグ化形態を安定に発現するｉＲｈｏｍ１／２－／－ＤＫＯ ＭＥＦを作製した。アカゲザル、カニクイザル、イヌまたはウサギのｉＲｈｏｍ１のタグを安定的に発現させたｉＲｈｏｍ１／２－／－ＤＫＯ ＭＥＦを作製し、これらの種のｉＲｈｏｍ１に対するｉＲｈｏｍ２の特異性を確認した。
Ｔ７タグ付きアカゲザル、カニクイザル、イヌまたはウサギｉＲｈｏｍ２を安定に発現するｉＲｈｏｍ１／２－／－ＤＫＯ ＭＥＦの作製
簡単に説明すると、１日目に、Ｐｈｏｅｎｉｘ－ＥＣＯ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、米国）を、標準増殖培地中の６ウェル組織培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、ドイツ）に、１ウェル当たり８ｘ１０5細胞で播種し、３７℃、５％ＣＯ2で一晩静置した。２日目に、クロロキン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）を最終濃度２５μＭで添加した新鮮な培地に交換した。リン酸カルシウム法を適用し、細胞を２μｇ／ｍｌのｐＭＳＣＶ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， ＵＳＡ）空ベクター、アカゲザルｉＲｈｏｍ２全長野生型 Ｃ末端をＴ７エピトープの連続する３つのコピーでタグ化したものをコードするｐＭＳＣＶ－ｒｈｅｓｕｓ－ｉＲ２－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７細胞、カニクイザルｉＲｈｏｍ２全長野生型 Ｃ末端をＴ７エピトープの連続する３つのコピーでタグ化したものをコードするｐＭＳＣＶ－ｃｙｎｏ－ｉＲ２－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７細胞、イヌｉＲｈｏｍ２ 全長野生型 Ｃ末端をＴ７エピトープの連続する３つのコピーでタグ化したものをコードするｐＭＳＣＶ－ｄｏｇ－ｉＲ２－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７細胞、ウサギｉＲｈｏｍ２全長野生型 Ｃ末端をＴ７エピトープの連続する３つのコピーでタグ化したものをコードするｐＭＳＣＶ－ｒａｂｂｉｔ－ｉＲ２－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７細胞でトランスフェクトし、３７oＣ，５％ ＣＯ2に保存した。７時間後、細胞上清をクロロキン欠乏の標準増殖培地と交換してトランスフェクションを停止し、３７℃、５％ＣＯ2で一晩培養してウイルス産生を行った。並行して、レトロウイルス感染の標的細胞として不死化したｉＲｈｏｍ１／２－／－ＤＫＯ ＭＥＦを、標準増殖培地中の６ウェル組織培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、ドイツ）に１ウェルあたり１ｘ１０5細胞で播種し、３７℃、５％ＣＯ2で一晩静置した。３日目に、ｐＭＳＣＶ、ｐＭＳＣＶ－ｒｈｅｓｕｓ－ｉＲ２－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｃｙｎｏ－ｉＲ２－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｄｏｇ－ｉＲ２－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７、またはｐＭＳＣＶ－ｒａｂｂｉｔ－ｉＲ２－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７エコトロピックウイルスをそれぞれ放出したＰｈｏｅｎｉｘ－ＥＣＯ細胞の上清を回収し、０．４５μｍ ＣＡフィルターで濾過し、４μｇ／ｍｌのポリブレン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）を添加した。不死化したｉＲｈｏｍ１／２－／－ＤＫＯ ＭＥＦから培地を除去した後、ウイルスを含む上清を標的細胞に加え、３７℃、５％ＣＯ2で４時間、初感染を行った。同時に、Ｐｈｏｅｎｉｘ－ＥＣＯ細胞を新鮮な培地で再インキュベートし、さらに４時間後に濾過し、再び４μｇ／ｍｌのポリブレン存在下で、それぞれの標的細胞集団の２回目の感染に使用した。同様に、３回目の、しかし一晩の感染サイクルを行った。４日目に、ウイルスを含む細胞上清を新鮮な標準増殖培地と交換した。５日目以降は、ｐＭＳＣＶ空ベクターに安定的に感染させた不死化ＭＥＦ－ＤＫＯ－ＥＶ対照細胞、アカゲザルｉＲｈｏｍ２全長野生型 Ｃ末端をＴ７エピトープの連続する３つのコピーでタグ化したものを安定に発現するｐＭＳＣＶ－ｒｈｅｓｕｓ－ｉＲ２－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７細胞、カニクイザルｉＲｈｏｍ２全長野生型 Ｃ末端をＴ７エピトープの連続する３つのコピーでタグ化したものを安定に発現するｐＭＳＣＶ－ｃｙｎｏ－ｉＲ２－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７細胞、イヌｉＲｈｏｍ２全長野生型 Ｃ末端をＴ７エピトープの連続する３つのコピーでタグ化したものを安定に発現するｐＭＳＣＶ－ｄｏｇ－ｉＲ２－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７細胞、ウサギｉＲｈｏｍ２全長野生型 Ｃ末端をＴ７エピトープの連続する３つのコピーでタグ化したものを安定に発現するｐＭＳＣＶ－ｒａｂｂｉｔ－ｉＲ２－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７細胞を選択するために、または２ｍｇ／ｍｌのジェネティシン（Ｇ４１８、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）の存在下で細胞を増殖させた。増殖後、細胞は将来の使用のためにストックされた。これと並行して、アカゲザル、カニクイザル、イヌ、ウサギのｉＲｈｏｍ１をタグ化したものを安定的に発現するｉＲｈｏｍ１／２－／－ＤＫＯ ＭＥＦを同様の方法で作製した。
簡単に説明すると、１日目に、Ｐｈｏｅｎｉｘ－ＥＣＯ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、米国）を、標準増殖培地中の６ウェル組織培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、ドイツ）に、１ウェル当たり８ｘ１０5細胞で播種し、３７℃、５％ＣＯ2で一晩静置した。２日目に、クロロキン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）を最終濃度２５μＭで添加した新鮮な培地に交換した。リン酸カルシウム法を適用し、細胞を２μｇ／ｍｌのｐＭＳＣＶ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， ＵＳＡ）空ベクター、アカゲザルｉＲｈｏｍ２全長野生型 Ｃ末端をＴ７エピトープの連続する３つのコピーでタグ化したものをコードするｐＭＳＣＶ－ｒｈｅｓｕｓ－ｉＲ２－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７細胞、カニクイザルｉＲｈｏｍ２全長野生型 Ｃ末端をＴ７エピトープの連続する３つのコピーでタグ化したものをコードするｐＭＳＣＶ－ｃｙｎｏ－ｉＲ２－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７細胞、イヌｉＲｈｏｍ２ 全長野生型 Ｃ末端をＴ７エピトープの連続する３つのコピーでタグ化したものをコードするｐＭＳＣＶ－ｄｏｇ－ｉＲ２－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７細胞、ウサギｉＲｈｏｍ２全長野生型 Ｃ末端をＴ７エピトープの連続する３つのコピーでタグ化したものをコードするｐＭＳＣＶ－ｒａｂｂｉｔ－ｉＲ２－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７細胞でトランスフェクトし、３７oＣ，５％ ＣＯ2に保存した。７時間後、細胞上清をクロロキン欠乏の標準増殖培地と交換してトランスフェクションを停止し、３７℃、５％ＣＯ2で一晩培養してウイルス産生を行った。並行して、レトロウイルス感染の標的細胞として不死化したｉＲｈｏｍ１／２－／－ＤＫＯ ＭＥＦを、標準増殖培地中の６ウェル組織培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、ドイツ）に１ウェルあたり１ｘ１０5細胞で播種し、３７℃、５％ＣＯ2で一晩静置した。３日目に、ｐＭＳＣＶ、ｐＭＳＣＶ－ｒｈｅｓｕｓ－ｉＲ２－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｃｙｎｏ－ｉＲ２－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｄｏｇ－ｉＲ２－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７、またはｐＭＳＣＶ－ｒａｂｂｉｔ－ｉＲ２－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７エコトロピックウイルスをそれぞれ放出したＰｈｏｅｎｉｘ－ＥＣＯ細胞の上清を回収し、０．４５μｍ ＣＡフィルターで濾過し、４μｇ／ｍｌのポリブレン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）を添加した。不死化したｉＲｈｏｍ１／２－／－ＤＫＯ ＭＥＦから培地を除去した後、ウイルスを含む上清を標的細胞に加え、３７℃、５％ＣＯ2で４時間、初感染を行った。同時に、Ｐｈｏｅｎｉｘ－ＥＣＯ細胞を新鮮な培地で再インキュベートし、さらに４時間後に濾過し、再び４μｇ／ｍｌのポリブレン存在下で、それぞれの標的細胞集団の２回目の感染に使用した。同様に、３回目の、しかし一晩の感染サイクルを行った。４日目に、ウイルスを含む細胞上清を新鮮な標準増殖培地と交換した。５日目以降は、ｐＭＳＣＶ空ベクターに安定的に感染させた不死化ＭＥＦ－ＤＫＯ－ＥＶ対照細胞、アカゲザルｉＲｈｏｍ２全長野生型 Ｃ末端をＴ７エピトープの連続する３つのコピーでタグ化したものを安定に発現するｐＭＳＣＶ－ｒｈｅｓｕｓ－ｉＲ２－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７細胞、カニクイザルｉＲｈｏｍ２全長野生型 Ｃ末端をＴ７エピトープの連続する３つのコピーでタグ化したものを安定に発現するｐＭＳＣＶ－ｃｙｎｏ－ｉＲ２－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７細胞、イヌｉＲｈｏｍ２全長野生型 Ｃ末端をＴ７エピトープの連続する３つのコピーでタグ化したものを安定に発現するｐＭＳＣＶ－ｄｏｇ－ｉＲ２－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７細胞、ウサギｉＲｈｏｍ２全長野生型 Ｃ末端をＴ７エピトープの連続する３つのコピーでタグ化したものを安定に発現するｐＭＳＣＶ－ｒａｂｂｉｔ－ｉＲ２－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７細胞を選択するために、または２ｍｇ／ｍｌのジェネティシン（Ｇ４１８、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）の存在下で細胞を増殖させた。増殖後、細胞は将来の使用のためにストックされた。これと並行して、アカゲザル、カニクイザル、イヌ、ウサギのｉＲｈｏｍ１をタグ化したものを安定的に発現するｉＲｈｏｍ１／２－／－ＤＫＯ ＭＥＦを同様の方法で作製した。
テストシステム評価と抗体の特性解析のためのＦＡＣＳ分析
簡単に説明すると、不死化ＭＥＦ－ＤＫＯ－ＥＶ対照細胞、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｒｈｅｓｕｓ－ｉＲ２－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７細胞、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｃｙｎｏ－ｉＲ２－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７細胞、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｄｏｇ－ｉＲ２－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７細胞およびＭＥＦ－ＤＫＯ－ｒａｂｂｉｔ－ｉＲ２－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７細胞およびそれぞれのｉＲｈｏｍ１カウンターパートを、ＰＢＳ中１０ ｍＭ ＥＤＴＡで回収し、洗浄後、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、３％ ＦＢＳ、０．０５％アジ化ナトリウム）に再懸濁し、Ｎｕｎｃ Ｕ底９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ＵＳＡ）にウェル当たり約３ｘ１０5細胞ずつ播種した。細胞をペレット化し、上清を除去するために、プレートを１５００ｒｐｍ、４℃で３分間遠心分離した。一次染色では、細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液単独（対照）、３μｇ／ｍｌ ＦＡＣＳ緩衝液でのマウスモノクローナル抗Ｔ７ ＩｇＧ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国）、または同じく３μｇ／ｍｌ ＦＡＣＳ緩衝液での本発明の抗体のいずれか１ウェルあたり１００μｌに再懸濁し、氷上で１時間インキュベートした。その後、プレートを１５００ｒｐｍ、４℃で３分間遠心し、１ウェルあたり２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。前の抗Ｔ７染色の二次染色のために、細胞をスピンダウンし、ＦＡＣＳ緩衝液で１：１００に希釈したＰＥ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆ（ａｂ´）２検出フラグメント（Ｄｉａｎｏｖａ、ドイツ）にウェルあたり１００μｌ再懸濁した。本発明のヒト化抗体による前の二次染色では、細胞をスピンダウンし、ＦＡＣＳ緩衝液で１：１００に希釈したＰＥ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ´）２検出フラグメント（Ｄｉａｎｏｖａ， Ｇｅｒｍａｎｙ）１ウェルあたり１００μｌに再懸濁した。光から保護し、細胞懸濁液を氷上で１時間インキュベートした。その後、プレートを１５００ｒｐｍ、４℃で３分間遠心し、１ウェルあたり２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄した。最後に、細胞を１ウェルあたり１５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、ＢＤ ＡｃｃｕｒｉＴＭ Ｃ６ Ｐｌｕｓフローサイトメーター（ドイツ、ベクトン・ディッキンソン社製）を用いて分析した。
簡単に説明すると、不死化ＭＥＦ－ＤＫＯ－ＥＶ対照細胞、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｒｈｅｓｕｓ－ｉＲ２－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７細胞、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｃｙｎｏ－ｉＲ２－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７細胞、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｄｏｇ－ｉＲ２－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７細胞およびＭＥＦ－ＤＫＯ－ｒａｂｂｉｔ－ｉＲ２－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７細胞およびそれぞれのｉＲｈｏｍ１カウンターパートを、ＰＢＳ中１０ ｍＭ ＥＤＴＡで回収し、洗浄後、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、３％ ＦＢＳ、０．０５％アジ化ナトリウム）に再懸濁し、Ｎｕｎｃ Ｕ底９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ＵＳＡ）にウェル当たり約３ｘ１０5細胞ずつ播種した。細胞をペレット化し、上清を除去するために、プレートを１５００ｒｐｍ、４℃で３分間遠心分離した。一次染色では、細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液単独（対照）、３μｇ／ｍｌ ＦＡＣＳ緩衝液でのマウスモノクローナル抗Ｔ７ ＩｇＧ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国）、または同じく３μｇ／ｍｌ ＦＡＣＳ緩衝液での本発明の抗体のいずれか１ウェルあたり１００μｌに再懸濁し、氷上で１時間インキュベートした。その後、プレートを１５００ｒｐｍ、４℃で３分間遠心し、１ウェルあたり２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。前の抗Ｔ７染色の二次染色のために、細胞をスピンダウンし、ＦＡＣＳ緩衝液で１：１００に希釈したＰＥ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆ（ａｂ´）２検出フラグメント（Ｄｉａｎｏｖａ、ドイツ）にウェルあたり１００μｌ再懸濁した。本発明のヒト化抗体による前の二次染色では、細胞をスピンダウンし、ＦＡＣＳ緩衝液で１：１００に希釈したＰＥ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ´）２検出フラグメント（Ｄｉａｎｏｖａ， Ｇｅｒｍａｎｙ）１ウェルあたり１００μｌに再懸濁した。光から保護し、細胞懸濁液を氷上で１時間インキュベートした。その後、プレートを１５００ｒｐｍ、４℃で３分間遠心し、１ウェルあたり２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄した。最後に、細胞を１ウェルあたり１５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、ＢＤ ＡｃｃｕｒｉＴＭ Ｃ６ Ｐｌｕｓフローサイトメーター（ドイツ、ベクトン・ディッキンソン社製）を用いて分析した。
図４ａおよび４ｂは、アカゲザルに対する交差反応性分析の代表的な結果を示す。ＭＥＦ－ＤＫＯ－ＥＶ対照細胞（図４ａ左；図２ａ左と同じ）、ＭＥＦ－ＤＫＯ－Ｒｈｅｓｕｓ－ｉＲ１－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７（図４ａ中）およびＭＥＦ－ＤＫＯ－Ｒｈｅｓｕｓ－ｉＲ２－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７（図４ａ右）の染色と比較すると、抗Ｔ７タグ抗体を用いてＭＥＦ－ＤＫＯ－Ｒｈｅｓｕｓ－ｉＲ１－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７およびＭＥＦ－ＤＫＯ－Ｒｈｅｓｕｓ－ｉＲ２－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７で得られた相対蛍光強度の強い増加は、ヒトｉＲｈｏｍ１および２バリアントと同様に、アカゲザルｉＲｈｏｍ１および２バリアントもまた、この遺伝子操作された細胞集団の表面に位置し、したがって、本発明の抗体を特性評価するための適切なテストシステムとして有効であることを示す。本発明のヒト化抗体の代表例としての抗体１６－Ｂ－０３は、ＭＥＦ－ＤＫＯ－Ｒｈｅｓｕｓ－ｉＲ２－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７細胞上で発現したアカゲザルｉＲｈｏｍ２バリアントと強い結合を示した（図４ｂ右）のに対し、ＭＥＦ－ＤＫＯ－Ｒｈｅｓｕｓ－ｉＲ１－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７細胞には有意な結合が検出されなかった（図４ｂ中）。このことは、アカゲザルのｉＲｈｏｍ２バリアントが本発明のヒト化抗体１６－Ｂ－０３によって特異的に認識されるという証拠を示している、一方、アカゲザルのｉＲｈｏｍ１は認識されず、その細胞表面上の存在は抗Ｔ７タグ抗体で確認された（図４ａ中）。同様の結果が本発明のヒト化抗体１６－Ｂ－０５、１６－Ｂ－０７、２３－Ｂ－０４、４２－Ｂ－０２、４２－Ｂ－０４でも得られ、本発明のこれらのヒト化抗体はすべてアカゲザルｉＲｈｏｍ２を認識するが、アカゲザルｉＲｈｏｍ１を認識しないことが示された。
図５ａおよび５ｂは、カニクイザルに対する交差反応性分析の代表的な結果を示す。ＭＥＦ－ＤＫＯ－ＥＶ対照細胞（図５ａ左；図２ａ左と同じ）、ＭＥＦ－ＤＫＯ－Ｃｙｎｏ－ｉＲ１－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７（図５ａ中）およびＭＥＦ－ＤＫＯ－Ｃｙｎｏ－ｉＲ２－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７（図５ａ右）との染色と比較すると、抗Ｔ７タグ抗体を用いてＭＥＦ－ＤＫＯ－Ｃｙｎｏ－ｉＲ１－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７およびＭＥＦ－ＤＫＯ－Ｃｙｎｏ－ｉＲ２－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７で得られた相対蛍光強度の強い増加は、ヒトｉＲｈｏｍ１および２バリアントと同様に、カニクイザルｉＲｈｏｍ１および２バリアントもまた、この遺伝子操作された細胞集団の表面に位置しており、したがって、本発明の抗体を特性評価するための適切なテストシステムとして有効であることを示す。本発明のヒト化抗体の代表例としての抗体１６－Ｂ－０３は、ＭＥＦ－ＤＫＯ－Ｃｙｎｏ－ｉＲ２－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７細胞上に発現させたカニクイザルｉＲｈｏｍ２バリアントと強い結合を示した（図５ｂ、右）のに対し、ＭＥＦ－ＤＫＯ－Ｃｙｎｏ－ｉＲ１－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７細胞には有意な結合が検出されなかった（図５ｂ、中）。このことは、カニクイザルのｉＲｈｏｍ２バリアントが本発明のヒト化抗体１６－Ｂ－０３によって特異的に認識されるという証拠を示している、一方、カニクイザルのｉＲｈｏｍ１は認識されず、その細胞表面上の存在は抗Ｔ７タグ抗体で確認された（図５ａ中）。同様の結果が、本発明のヒト化抗体１６－Ｂ－０５、１６－Ｂ－０７、２３－Ｂ－０４、４２－Ｂ－０２、４２－Ｂ－０４でも得られ、本発明のこれらのヒト化抗体はすべて、カニクイザルｉＲｈｏｍ２を認識するが、カニクイザルｉＲｈｏｍ１を認識しないことが示された。
図６ａおよび６ｂは、イヌに対する交差反応性分析の代表的な結果を示している。ＭＥＦ－ＤＫＯ－ＥＶ対照細胞、ＭＥＦ－ＤＫＯ－Ｄｏｇ－ｉＲ１－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７（図６ａ中）およびＭＥＦ－ＤＫＯ－Ｄｏｇ－ｉＲ２－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７（図６ａ右）の染色と比較すると（図６ａ左；図２ａ左と同じ）、抗Ｔ７タグ抗体を用いてＭＥＦ－ＤＫＯ－Ｄｏｇ－ｉＲ１－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７およびＭＥＦ－ＤＫＯ－Ｄｏｇ－ｉＲ２－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７で得られた相対蛍光強度の強い増加は、ヒトｉＲｈｏｍ１および２バリアントと同様に、イヌｉＲｈｏｍ１および２バリアントもまた、この遺伝子操作された細胞集団の表面に位置し、したがって、本発明の抗体を特性評価するための適切なテストシステムとして有効であることを示す。本発明のヒト化抗体の代表例としての抗体１６－Ｂ－０３は、ＭＥＦ－ＤＫＯ－Ｄｏｇ－ｉＲ２－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７細胞上で発現したイヌｉＲｈｏｍ２バリアントと強い結合を示した（図６ｂ右）のに対し、ＭＥＦ－ＤＫＯ－Ｄｏｇ－ｉＲ１－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７細胞には有意な結合が検出されなかった（図６ｂ中）。このことは、イヌｉＲｈｏｍ２バリアントが本発明のヒト化抗体１６－Ｂ－０３によって特異的に認識されることの証拠となる 一方、イヌｉＲｈｏｍ１は認識されず、その細胞表面上の存在は抗Ｔ７タグ抗体で確認された（図６ａ中）。同様の結果が、本発明のヒト化抗体１６－Ｂ－０５、１６－Ｂ－０７、２３－Ｂ－０４、４２－Ｂ－０２、４２－Ｂ－０４でも得られ、本発明のこれらのヒト化抗体はすべてイヌｉＲｈｏｍ２を認識するが、イヌｉＲｈｏｍ１を認識しないことが示された。
図７ａおよび７ｂは、ウサギに対する交差反応性分析の代表的な結果を示す。ＭＥＦ－ＤＫＯ－ＥＶ対照細胞（図７ａ左；図２ａ左と同じ）、ＭＥＦ－ＤＫＯ－Ｒａｂｂｉｔ－ｉＲ１－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７（図７ａ中）およびＭＥＦ－ＤＫＯ－Ｒａｂｂｉｔ－ｉＲ２－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７（図７ａ右）の染色と比較すると、抗Ｔ７タグ抗体を用いてＭＥＦ－ＤＫＯ－Ｒａｂｂｉｔ－ｉＲ１－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７およびＭＥＦ－ＤＫＯ－Ｒａｂｂｉｔ－ｉＲ２－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７で得られた相対蛍光強度の強い増加は、ヒトｉＲｈｏｍ１および２バリアントと同様に、ウサギｉＲｈｏｍ１および２バリアントもまた、この遺伝子操作された細胞集団の表面に位置し、たがって、本発明の抗体を特性評価するための適切なテストシステムとして有効であることを示す。本発明のヒト化抗体の代表例としての抗体１６－Ｂ－０３は、ＭＥＦ－ＤＫＯ－Ｒａｂｂｉｔ－ｉＲ２－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７細胞上で発現したウサギｉＲｈｏｍ２バリアントと強い結合を示した（図７ｂ右）のに対し、ＭＥＦ－ＤＫＯ－Ｒａｂｂｉｔ－ｉＲ１－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７細胞には有意な結合が検出されなかった（図７ｂ中）。このことは、ウサギｉＲｈｏｍ２バリアントが本発明のヒト化抗体１６－Ｂ－０３によって特異的に認識されることの証拠となる 一方、ウサギｉＲｈｏｍ１は認識されず、その細胞表面上の存在は抗Ｔ７タグ抗体で確認された（図７ａ中）。同様の結果が、本発明のヒト化抗体１６－Ｂ－０５、１６－Ｂ－０７、２３－Ｂ－０４、４２－Ｂ－０２、４２－Ｂ－０４でも得られ、本発明のこれらのヒト化抗体はすべてウサギｉＲｈｏｍ２を認識するが、ウサギｉＲｈｏｍ１を認識しないことが示された。
実施例６：ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＬＰＳ誘導ＴＮＦα切断に対する本発明の抗体の阻害効果の解析
以下の研究では、ヒトＴＨＰ－１単球細胞からの内因性ＴＮＦαのＬＰＳ誘導放出に対する本発明のヒト化抗体の阻害効果を確認するために、ＥＬＩＳＡベースのＴＮＦα放出アッセイを行った。
以下の研究では、ヒトＴＨＰ－１単球細胞からの内因性ＴＮＦαのＬＰＳ誘導放出に対する本発明のヒト化抗体の阻害効果を確認するために、ＥＬＩＳＡベースのＴＮＦα放出アッセイを行った。
本実施例で用いたＥＬＩＳＡベースのＴＮＦα放出アッセイを以下に記述する。
簡単に説明すると、１日目にＮｕｎｃ ｂｌａｃｋ ＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）９６－ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）に、マウス抗ヒトＴＮＦα捕捉抗体（ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡキットの一部として提供）を４μｇ／ｍｌ ＴＢＳで１ウェルあたり１００μｌ、４℃で一晩コートした。２日目、捕捉抗体溶液を除去し、ＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）プレートを１ウェルあたり３００μｌのＴＢＳ、１％ ＢＳＡで１－２時間室温でブロッキングした。一方、８０μｌの通常増殖培地中の２０、０００個のＴＨＰ－１（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、米国）細胞を、Ｇｒｅｉｎｅｒ ＣＥＬＬＳＴＡＲ Ｖ底９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ、ドイツ）の各ウェルに播種し、陽性対照として５０μＭのＢａｔｉｍａｓｔａｔ（ＢＢ９４、Ａｂｃａｍ、英国）（得られた１００μｌサンプル容量中の最終濃度は１０μＭ）、アイソタイプコントロールとして１５μｇ／ｍｌのヒトＩｇＧ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、ＵＳＡ）（最終濃度３μｇ／ｍｌ、サンプル量１００μｌ）、または本発明のヒト化抗体を１５μｇ／ｍｌ（最終濃度３μｇ／ｍｌ、サンプル量１００μｌ）を添加した標準増殖培地（ウェルあたり２０μｌ）で、３７℃、５％ＣＯ2で３０分間プレインキュベートした。刺激対象の場合は、試験品を含まない標準増殖培地２０μｌを加えた。その後、細胞（非刺激対照を除く）を、ＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ， ＵＳＡ）を３００ｎｇ／ｍｌの増殖培地で最終濃度５０ｎｇ／ｍｌになるように１ウェルあたり２０μｌで３７℃、５％ ＣＯ2で２時間刺激した。その後、９６－ウェルプレートを細胞を沈殿させるために遠心分離した。並行して、ブロッキング緩衝液をＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）プレートから除去し、９６ヘッドプレート洗浄機（スイス、テカングループ）上で１ウェルあたり３５０μｌのＴＢＳ－Ｔ （ドイツ、カール・ロス）でプレートを４回洗浄した。乾燥を避けるため、直ちにＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）プレートの各ウェルにＴＢＳ ３０μｌを添加した後、試料あたり無細胞上清７０μｌを移した。さらに、ＴＢＳで規定濃度に希釈した組換えヒトＴＮＦαタンパク質（ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡキットの一部として提供）１００μｌを標準参照としてプレートに添加した。その後、５０ｎｇ／ｍｌのＴＢＳでビオチン化ヤギ抗ヒトＴＮＦα検出抗体（ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡキットの一部として提供）を１ウェルあたり１００μｌ添加し、直接光から保護し、プレートを室温で２時間インキュベートした。９６－ヘッドプレート洗浄機 （Ｔｅｃａｎ Ｇｒｏｕｐ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ、Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ）上でＴＢＳ－Ｔ （Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ、ドイツ）１ウェルあたり３５０μｌで４回洗浄し、４サイクル目以降は緩衝液の痕跡をすべて注意深く除去した後、ＴＢＳ中で１：１０，０００に希釈したストレプトアビジン－ＡＰ （Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）１００μｌを各ウェルに添加し、再び直接光から保護し、プレートを室温で３０分間インキュベートした。９６－ヘッドプレート洗浄機 （Ｔｅｃａｎ Ｇｒｏｕｐ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）上でＴＢＳ－Ｔ （Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ、ドイツ）１ウェルあたり３５０μｌで４回再洗浄し、４サイクル目以降は緩衝液の痕跡をすべて注意深く除去した後、室温暗所で１時間インキュベートするため、ＡｔｔｏＰｈｏｓ基質溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国）を１ウェルあたり１００μｌを添加した。ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ１０００ （Ｔｅｃａｎ Ｇｒｏｕｐ、スイス）マイクロプレートリーダーを用いて、各ウェルの蛍光を励起波長４３５ｎｍ、発光波長５５５ｎｍで収集した。
図８は、絶対数（図８ａ）および阻害率（図８ｂ）でのＴＨＰ－１細胞からのＬＰＳ誘導性ＴＮＦα放出に対する試験品の効果を示すこの実験の代表的な結果を示す。メタロプロテアーゼの低分子阻害剤であるＢａｔｉｍａｓｔａｔ（ＢＢ９４）は陽性対照として機能し、ＬＰＳ誘導のＴＮＦα放出を強力に阻害したが、ＩｇＧアイソタイプコントロールの存在はＴＮＦα切断に有意な影響を及ぼさなかった。対照的に、等濃度の本発明のヒト化抗体１６－Ｂ－０３、１６－Ｂ－０５、１６－Ｂ－０７、２３－Ｂ－０４、４２－Ｂ－０２および４２－Ｂ－０４は、ＴＨＰ－１細胞からのＬＰＳ誘導ＴＮＦα放出をそれぞれ７５．１％、７８．７％、７７．２％、７７．６％、７５．２％および７６．１％阻害する。
実施例７：ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＰＭＡ誘導ＴＮＦα 切断に対する本発明の抗体の阻害効果の解析
ヒトＴＨＰ－１細胞からのＬＰＳ誘導の内因性ＴＮＦα放出に対する本発明の抗体の阻害効果を試験した実施例６とは対照的に、この分析は、ヒト単球Ｕ－９３７細胞からの内因性ＴＮＦαのＰＭＡ誘導放出に対する本発明の抗体の阻害効果を確認するために行われた。
ヒトＴＨＰ－１細胞からのＬＰＳ誘導の内因性ＴＮＦα放出に対する本発明の抗体の阻害効果を試験した実施例６とは対照的に、この分析は、ヒト単球Ｕ－９３７細胞からの内因性ＴＮＦαのＰＭＡ誘導放出に対する本発明の抗体の阻害効果を確認するために行われた。
本実施例で用いたＥＬＩＳＡベースのＴＮＦα放出アッセイを以下に記述する。
簡単に説明すると、１日目にＮｕｎｃ ｂｌａｃｋ ＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）９６－ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）に、マウス抗ヒトＴＮＦα捕捉抗体（ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡキットの一部として提供）を４μｇ／ｍｌ ＴＢＳで１ウェルあたり１００μｌ、４℃で一晩コートした。２日目、捕捉抗体溶液を除去し、ＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）プレートを１ウェルあたり３００μｌのＴＢＳ、１％ ＢＳＡで１－２時間室温でブロッキングした。一方、８０μｌの通常増殖培地中の７５、０００個のＵ－９３７ （Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｕｔｈｅｎｔｉｃａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ， ＵＫ） 細胞を、Ｇｒｅｉｎｅｒ ＣＥＬＬＳＴＡＲ Ｖ底９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ、ドイツ）の各ウェルに播種し、陽性対照として５０μＭのＢａｔｉｍａｓｔａｔ（ＢＢ９４、Ａｂｃａｍ、英国）（得られた１００μｌサンプル容量中の最終濃度は１０μＭ）、アイソタイプコントロールとして５０μｇ／ｍｌのヒトＩｇＧ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、ＵＳＡ）（最終濃度１０μｇ／ｍｌ、サンプル量１００μｌ）、または本発明の抗体を１６．６６μｇ／ｍｌ（最終濃度３．３３μｇ／ｍｌ、サンプル量１００μｌ）を添加した標準増殖培地（ウェルあたり２０μｌ）で、３７℃、５％ＣＯ2で３０分間プレインキュベートした。刺激対象の場合は、試験品を含まない標準増殖培地２０μｌを加えた。その後、細胞（非刺激対照を除く）を、ＰＭＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ， ＵＳＡ）を１５０ｎｇ／ｍｌの増殖培地で最終濃度２５ｎｇ／ｍｌになるように１ウェルあたり２０μｌで３７℃、５％ ＣＯ2で１時間刺激した。その後、９６－ウェルプレートを細胞を沈殿させるために遠心分離した。並行して、ブロッキング緩衝液をＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）プレートから除去し、９６ヘッドプレート洗浄機（スイス、テカングループ）上で１ウェルあたり３５０μｌのＴＢＳ－Ｔ （ドイツ、カール・ロス）でプレートを４回洗浄した。乾燥を避けるため、直ちにＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）プレートの各ウェルにＴＢＳ ３０μｌを添加した後、試料あたり無細胞上清７０μｌを移した。さらに、ＴＢＳで規定濃度に希釈した組換えヒトＴＮＦαタンパク質（ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡキットの一部として提供）１００μｌを標準参照としてプレートに添加した。その後、５０ｎｇ／ｍｌのＴＢＳでビオチン化ヤギ抗ヒトＴＮＦα検出抗体（ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡキットの一部として提供）を１ウェルあたり１００μｌ添加し、直接光から保護し、プレートを室温で２時間インキュベートした。９６－ヘッドプレート洗浄機 （Ｔｅｃａｎ Ｇｒｏｕｐ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ、Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ）上でＴＢＳ－Ｔ （Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ、ドイツ）１ウェルあたり３５０μｌで４回洗浄し、４サイクル目以降は緩衝液の痕跡をすべて注意深く除去した後、ＴＢＳ中で１：１０，０００に希釈したストレプトアビジン－ＡＰ （Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）１００μｌを各ウェルに添加し、再び直接光から保護し、プレートを室温で３０分間インキュベートした。９６－ヘッドプレート洗浄機 （Ｔｅｃａｎ Ｇｒｏｕｐ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）上でＴＢＳ－Ｔ （Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ、ドイツ）１ウェルあたり３５０μｌで４回再洗浄し、４サイクル目以降は緩衝液の痕跡をすべて注意深く除去した後、室温暗所で１時間インキュベートするため、ＡｔｔｏＰｈｏｓ基質溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国）を１ウェルあたり１００μｌを添加した。ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ１０００ （Ｔｅｃａｎ Ｇｒｏｕｐ、スイス）マイクロプレートリーダーを用いて、各ウェルの蛍光を励起波長４３５ｎｍ、発光波長５５５ｎｍで収集した。
図９は、Ｕ－９３７細胞からのＴＮＦαのＰＭＡ誘導放出に対する試験品の効果を、絶対数（図９ａ）および阻害率（図９ｂ）で示した、この実験の代表的な結果である。メタロプロテアーゼの低分子阻害剤であるＢａｔｉｍａｓｔａｔ（ＢＢ９４）は陽性対照として機能し、ＬＰＳ誘導のＴＮＦα放出を強力に阻害したが、ＩｇＧアイソタイプコントロールの存在はＴＮＦα切断に有意な影響を及ぼさなかった。対照的に、本発明のヒト化抗体１６－Ｂ－０３、１６－Ｂ－０５、１６－Ｂ－０７、２３－Ｂ－０４、４２－Ｂ－０２および４２－Ｂ－０４は、Ｕ－９３７細胞からのＰＭＡ誘導ＴＮＦα放出をそれぞれ８９．８％、８９．０％、９０．３％、７７．２％、８５．０％および８７．９％阻害する。
実施例８：ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＰＭＡ誘導性インターロイキン６レセプター（ＩＬ－６Ｒ）切断に対する本発明の抗体の阻害効果の解析
以下の研究では、ＥＬＩＳＡベースのＩＬ－６Ｒ放出アッセイを行い、ヒトＴＨＰ－１単球細胞からの内因性ＩＬ－６ＲのＰＭＡ誘導放出に対する本発明の抗体の阻害効果を分析した。
以下の研究では、ＥＬＩＳＡベースのＩＬ－６Ｒ放出アッセイを行い、ヒトＴＨＰ－１単球細胞からの内因性ＩＬ－６ＲのＰＭＡ誘導放出に対する本発明の抗体の阻害効果を分析した。
この実施例で用いたＥＬＩＳＡベースのＩＬ－６Ｒ放出アッセイを以下に記述する。
簡単に説明すると、１日目にＮｕｎｃ ｂｌａｃｋ ＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）９６－ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）に、マウス抗ヒトＩＬ－６Ｒ捕捉抗体（ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡキットの一部として提供）を２μｇ／ｍｌ ＴＢＳで１ウェルあたり１００μｌ、４℃で一晩コートした。２日目、捕捉抗体溶液を除去し、ＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）プレートを１ウェルあたり３００μｌのＴＢＳ、１％ ＢＳＡで１－２時間室温でブロッキングした。一方、８０μｌの通常増殖培地中の４０、０００個のＴＨＰ－１（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、米国）細胞を、Ｇｒｅｉｎｅｒ ＣＥＬＬＳＴＡＲ Ｖ底９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ、ドイツ）の各ウェルに播種し、陽性対照として５０μＭのＢａｔｉｍａｓｔａｔ（ＢＢ９４、Ａｂｃａｍ、英国）（得られた１００μｌサンプル容量中の最終濃度は１０μＭ）、アイソタイプコントロールとして１５μｇ／ｍｌのヒトＩｇＧ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、ＵＳＡ）（最終濃度３μｇ／ｍｌ、サンプル量１００μｌ）、または本発明の抗体を１５μｇ／ｍｌ（最終濃度３μｇ／ｍｌ、サンプル量１００μｌ）を添加した標準増殖培地（ウェルあたり２０μｌ）で、３７℃、５％ＣＯ2で３０分間プレインキュベートした。刺激対象の場合は、試験品を含まない標準増殖培地２０μｌを加えた。その後、細胞（非刺激対照を除く）を、ＰＭＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ， ＵＳＡ）を１５０ｎｇ／ｍｌの増殖培地で最終濃度２５ｎｇ／ｍｌになるように１ウェルあたり２０μｌで３７℃、５％ ＣＯ2で１時間刺激した。その後、９６－ウェルプレートを細胞を沈殿させるために遠心分離した。並行して、ブロッキング緩衝液をＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）プレートから除去し、９６ヘッドプレート洗浄機（スイス、テカングループ）上で１ウェルあたり３５０μｌのＴＢＳ－Ｔ （ドイツ、カール・ロス）でプレートを４回洗浄した。乾燥を避けるため、直ちにＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）プレートの各ウェルにＴＢＳ ３０μｌを添加した後、試料あたり無細胞上清７０μｌを移した。さらに、ＴＢＳで規定濃度に希釈した組換えヒトＩＬ－６Ｒタンパク質（ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡキットの一部として提供）１００μｌを標準参照としてプレートに添加した。その後、１００ｎｇ／ｍｌのＴＢＳでビオチン化ヤギ抗ヒトＩＬ－６Ｒ検出抗体（ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡキットの一部として提供）を１ウェルあたり１００μｌ添加し、直接光から保護し、プレートを室温で２時間インキュベートした。９６－ヘッドプレート洗浄機 （Ｔｅｃａｎ Ｇｒｏｕｐ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ、Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ）上でＴＢＳ－Ｔ （Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ、ドイツ）１ウェルあたり３５０μｌで４回洗浄し、４サイクル目以降は緩衝液の痕跡をすべて注意深く除去した後、ＴＢＳ中で１：１０，０００に希釈したストレプトアビジン－ＡＰ （Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）１００μｌを各ウェルに添加し、再び直接光から保護し、プレートを室温で３０分間インキュベートした。９６－ヘッドプレート洗浄機 （Ｔｅｃａｎ Ｇｒｏｕｐ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）上でＴＢＳ－Ｔ （Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ、ドイツ）１ウェルあたり３５０μｌで４回再洗浄し、４サイクル目以降は緩衝液の痕跡をすべて注意深く除去した後、室温暗所で１時間インキュベートするため、ＡｔｔｏＰｈｏｓ基質溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国）を１ウェルあたり１００μｌを添加した。ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ１０００ （Ｔｅｃａｎ Ｇｒｏｕｐ、スイス）マイクロプレートリーダーを用いて、各ウェルの蛍光を励起波長４３５ｎｍ、発光波長５５５ｎｍで収集した。
図１０ａおよび１０ｂは、絶対数（図１０ａ）および阻害率（図１０ｂ）において、ＴＨＰ－１細胞からのＩＬ－６ＲのＰＭＡ誘導放出に対する試験品の効果を示す、この実験の代表的な結果を示す。メタロプロテアーゼの低分子阻害剤であるＢａｔｉｍａｓｔａｔ（ＢＢ９４）は陽性対照として機能し、ＰＭＡ誘導のＩＬ－６Ｒ放出を強力に阻害したが、ＩｇＧアイソタイプコントロールの存在はＩＬ－６Ｒ切断に有意な影響を及ぼさなかった。対照的に、等濃度の本発明のヒト化抗体１６－Ｂ－０３、１６－Ｂ－０５、１６－Ｂ－０７、２３－Ｂ－０４、４２－Ｂ－０２および４２－Ｂ－０４は、それぞれ７５．６％、７４．０％、７５．６％、７０．１％、６８．５％および７１．６％、ＴＨＰ－１細胞からのＰＭＡ誘導性ＩＬ－６Ｒ放出を阻害する。
実施例９：ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＰＭＡ誘導性インターロイキン６レセプター（ＩＬ－６Ｒ）切断に対する本発明の抗体の阻害効果の解析
上述の実施例８を補足して、ヒトＵ－９３７細胞からの内因性ＩＬ－６ＲのＰＭＡ誘導放出に対する本発明の抗体の阻害効果を確認するために、ＥＬＩＳＡベースのＩＬ－６Ｒ放出アッセイを行った。
上述の実施例８を補足して、ヒトＵ－９３７細胞からの内因性ＩＬ－６ＲのＰＭＡ誘導放出に対する本発明の抗体の阻害効果を確認するために、ＥＬＩＳＡベースのＩＬ－６Ｒ放出アッセイを行った。
この実施例で用いたＥＬＩＳＡベースのＩＬ－６Ｒ放出アッセイを以下に記述する。
簡単に説明すると、１日目にＮｕｎｃ ｂｌａｃｋ ＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）９６－ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）に、マウス抗ヒトＩＬ－６Ｒ捕捉抗体（ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡキットの一部として提供）を２μｇ／ｍｌ ＴＢＳで１ウェルあたり１００μｌ、４℃で一晩コートした。２日目、捕捉抗体溶液を除去し、ＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）プレートを１ウェルあたり３００μｌのＴＢＳ、１％ ＢＳＡで１－２時間室温でブロッキングした。一方、８０μｌの通常増殖培地中の７５、０００個のＵ－９３７ （Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｕｔｈｅｎｔｉｃａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ， ＵＫ） 細胞を、Ｇｒｅｉｎｅｒ ＣＥＬＬＳＴＡＲ Ｖ底９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ、ドイツ）の各ウェルに播種し、陽性対照として５０μＭのＢａｔｉｍａｓｔａｔ（ＢＢ９４、Ａｂｃａｍ、英国）（得られた１００μｌサンプル容量中の最終濃度は１０μＭ）、アイソタイプコントロールとして５０μｇ／ｍｌのヒトＩｇＧ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、ＵＳＡ）（最終濃度１０μｇ／ｍｌ、サンプル量１００μｌ）、または本発明の抗体を１６．６６μｇ／ｍｌ（最終濃度３．３３μｇ／ｍｌ、サンプル量１００μｌ）を添加した標準増殖培地（ウェルあたり２０μｌ）で、３７℃、５％ＣＯ2で３０分間プレインキュベートした。刺激対象の場合は、試験品を含まない標準増殖培地２０μｌを加えた。その後、細胞（非刺激対照を除く）を、ＰＭＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ， ＵＳＡ）を１５０ｎｇ／ｍｌの増殖培地で最終濃度２５ｎｇ／ｍｌになるように１ウェルあたり２０μｌで３７℃、５％ ＣＯ2で１時間刺激した。その後、９６－ウェルプレートを細胞を沈殿させるために遠心分離した。並行して、ブロッキング緩衝液をＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）プレートから除去し、９６ヘッドプレート洗浄機（スイス、テカングループ）上で１ウェルあたり３５０μｌのＴＢＳ－Ｔ （ドイツ、カール・ロス）でプレートを４回洗浄した。乾燥を避けるため、直ちにＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）プレートの各ウェルにＴＢＳ ３０μｌを添加した後、試料あたり無細胞上清７０μｌを移した。さらに、ＴＢＳで規定濃度に希釈した組換えヒトＩＬ－６Ｒタンパク質（ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡキットの一部として提供）１００μｌを標準参照としてプレートに添加した。その後、１００ｎｇ／ｍｌのＴＢＳでビオチン化ヤギ抗ヒトＩＬ－６Ｒ検出抗体（ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡキットの一部として提供）を１ウェルあたり１００μｌ添加し、直接光から保護し、プレートを室温で２時間インキュベートした。９６－ヘッドプレート洗浄機 （Ｔｅｃａｎ Ｇｒｏｕｐ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ、Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ）上でＴＢＳ－Ｔ （Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ、ドイツ）１ウェルあたり３５０μｌで４回洗浄し、４サイクル目以降は緩衝液の痕跡をすべて注意深く除去した後、ＴＢＳ中で１：１０，０００に希釈したストレプトアビジン－ＡＰ （Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）１００μｌを各ウェルに添加し、再び直接光から保護し、プレートを室温で３０分間インキュベートした。９６－ヘッドプレート洗浄機 （Ｔｅｃａｎ Ｇｒｏｕｐ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）上でＴＢＳ－Ｔ （Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ、ドイツ）１ウェルあたり３５０μｌで４回再洗浄し、４サイクル目以降は緩衝液の痕跡をすべて注意深く除去した後、室温暗所で１時間インキュベートするため、ＡｔｔｏＰｈｏｓ基質溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国）を１ウェルあたり１００μｌを添加した。ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ１０００ （Ｔｅｃａｎ Ｇｒｏｕｐ、スイス）マイクロプレートリーダーを用いて、各ウェルの蛍光を励起波長４３５ｎｍ、発光波長５５５ｎｍで収集した。
図１１は、絶対数（図１１ａ）および阻害率（図１１ｂ）において、Ｕ－９３７細胞からのＩＬ－６ＲのＰＭＡ誘導放出に対する試験品の効果を示す、この実験の代表的な結果を示す。メタロプロテアーゼの低分子阻害剤であるＢａｔｉｍａｓｔａｔ（ＢＢ９４）は陽性対照として機能し、ＰＭＡ誘導のＩＬ－６Ｒ放出を強力に阻害したが、ＩｇＧアイソタイプコントロールの存在はＩＬ－６Ｒ切断に有意な影響を及ぼさなかった。対照的に、本発明のヒト化抗体１６－Ｂ－０３、１６－Ｂ－０５、１６－Ｂ－０７、２３－Ｂ－０４、４２－Ｂ－０２および４２－Ｂ－０４は、Ｕ－９３７細胞からのＰＭＡ誘導ＩＬ－６Ｒ放出をそれぞれ７９．６％、８１．７％、７７．５％、７７．８％、７８．３％および８２．４％阻害する。
実施例１０：ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＰＭＡ誘導ヘパリン結合性ＥＧＦ様増殖因子（ＨＢ－ＥＧＦ）の切断に対する本発明の抗体の阻害効果の解析
以下の研究では、ＥＬＩＳＡベースのＨＢ－ＥＧＦ放出アッセイを行い、ヒトＴＨＰ－１単球細胞からの内因性ＨＢ－ＥＧＦのＰＭＡ誘導放出に対する本発明の抗体の阻害効果を分析した。
以下の研究では、ＥＬＩＳＡベースのＨＢ－ＥＧＦ放出アッセイを行い、ヒトＴＨＰ－１単球細胞からの内因性ＨＢ－ＥＧＦのＰＭＡ誘導放出に対する本発明の抗体の阻害効果を分析した。
本実施例で用いたＥＬＩＳＡベースのＨＢ－ＥＧＦ放出アッセイを以下に記述する。
簡単に説明すると、１日目にＮｕｎｃ ｂｌａｃｋ ＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）９６－ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）に、ラット抗ヒトＨＢ－ＥＧＦ捕捉抗体（ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡキットの一部として提供）を２μｇ／ｍｌ ＴＢＳで１ウェルあたり１００μｌ、４℃で一晩コートした。８０μｌの通常増殖培地中の４０、０００個のＴＨＰ－１（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、米国）細胞を、Ｇｒｅｉｎｅｒ ＣＥＬＬＳＴＡＲ Ｖ底９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ、ドイツ）の各ウェルに播種し、陽性対照として５０μＭのＢａｔｉｍａｓｔａｔ（ＢＢ９４、Ａｂｃａｍ、英国）（得られた１００μｌサンプル容量中の最終濃度は１０μＭ）、アイソタイプコントロールとして１５μｇ／ｍｌのヒトＩｇＧ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、ＵＳＡ）（最終濃度３μｇ／ｍｌ、サンプル量１００μｌ）、または本発明の抗体を１５μｇ／ｍｌ（最終濃度３μｇ／ｍｌ、サンプル量１００μｌ）を添加した標準増殖培地（ウェルあたり２０μｌ）で、３７℃、５％ＣＯ2で３０分間プレインキュベートした。刺激対象の場合は、試験品を含まない標準増殖培地２０μｌを加えた。その後、細胞（非刺激対照を除く）を、ＰＭＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ， ＵＳＡ）を１５０ｎｇ／ｍｌの増殖培地で最終濃度２５ｎｇ／ｍｌになるように１ウェルあたり２０μｌで３７℃、５％ ＣＯ2で２４時間刺激した。２日目、捕捉抗体溶液を除去し、ＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）プレートを１ウェルあたり３００μｌのＴＢＳ、１％ ＢＳＡで１－２時間室温でブロッキングした。その後、９６－ウェルプレートを細胞を沈殿させるために遠心分離した。並行して、ブロッキング緩衝液をＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）プレートから除去し、９６ヘッドプレート洗浄機（スイス、テカングループ）上で１ウェルあたり３５０μｌのＴＢＳ－Ｔ （ドイツ、カール・ロス）でプレートを４回洗浄した。乾燥を避けるため、直ちにＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）プレートの各ウェルにＴＢＳ ３０μｌを添加した後、試料あたり無細胞上清７０μｌを移した。さらに、ＴＢＳで規定濃度に希釈した組換えヒトＨＢ－ＥＧＦタンパク質（ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡキットの一部として提供）１００μｌを標準参照としてプレートに添加した。その後、プレートを室温で２時間インキュベートした。９６ヘッドプレート洗浄機（Ｔｅｃａｎ Ｇｒｏｕｐ、スイス）で、１ウェルあたり３５０μｌのＴＢＳ－Ｔ（Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ、ドイツ）で４回洗浄し、４回目のサイクルの後にすべての緩衝液の痕跡を注意深く除去した後、１ウェルあたり１００μｌのビオチン化ヤギ抗ヒトＨＢ－ＥＧＦ検出抗体（ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡキットの一部として提供）を５０ｎｇ／ｍｌ ＴＢＳで添加し、直射日光を避けて、プレートを室温で２時間インキュベートした。９６－ヘッドプレート洗浄機 （Ｔｅｃａｎ Ｇｒｏｕｐ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ、Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ）上でＴＢＳ－Ｔ （Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ、ドイツ）１ウェルあたり３５０μｌで４回洗浄し、４サイクル目以降は緩衝液の痕跡をすべて注意深く除去した後、ＴＢＳ中で１：１０，０００に希釈したストレプトアビジン－ＡＰ （Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）１００μｌを各ウェルに添加し、再び直接光から保護し、プレートを室温で３０分間インキュベートした。９６－ヘッドプレート洗浄機 （Ｔｅｃａｎ Ｇｒｏｕｐ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）上でＴＢＳ－Ｔ （Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ、ドイツ）１ウェルあたり３５０μｌで４回再洗浄し、４サイクル目以降は緩衝液の痕跡をすべて注意深く除去した後、室温暗所で１時間インキュベートするため、ＡｔｔｏＰｈｏｓ基質溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国）を１ウェルあたり１００μｌを添加した。ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ１０００ （Ｔｅｃａｎ Ｇｒｏｕｐ、スイス）マイクロプレートリーダーを用いて、各ウェルの蛍光を励起波長４３５ｎｍ、発光波長５５５ｎｍで収集した。
図１２は、絶対数（図１２ａ）および阻害率（図１２ｂ）で、ＴＨＰ－１細胞からのＨＢ－ＥＧＦのＰＭＡ誘導放出に対する試験品の効果を示す、この実験の代表的な結果を示す。メタロプロテアーゼの低分子阻害剤であるＢａｔｉｍａｓｔａｔ（ＢＢ９４）は陽性対照として機能し、ＰＭＡ誘導のＨＢ－ＥＧＦ放出を強力に阻害したが、ヒトＩｇＧアイソタイプコントロールの存在はＨＢ－ＥＧＦ切断に有意な影響を及ぼさなかった。対照的に、等濃度の本発明のヒト化抗体１６－Ｂ－０３、１６－Ｂ－０５、１６－Ｂ－０７、２３－Ｂ－０４、４２－Ｂ－０２および４２－Ｂ－０４は、それぞれ８０．２％、８３．０％、８０．５％、８４．４％、８１．２％および８６．２％、ＴＨＰ－１細胞からのＰＭＡ誘導ＨＢ－ＥＧＦ放出を阻害する。
実施例１１：ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＰＭＡ誘導ＨＢ－ＥＧＦ切断に対する本発明の抗体の阻害効果の解析
上述の実施例１０を補足して、ヒトＵ－９３７細胞からの内因性ＨＢ－ＥＧＦのＰＭＡ誘導放出に対する本発明の抗体の阻害効果を確認するために、ＥＬＩＳＡベースのＨＢ－ＥＧＦ放出アッセイを行った。
上述の実施例１０を補足して、ヒトＵ－９３７細胞からの内因性ＨＢ－ＥＧＦのＰＭＡ誘導放出に対する本発明の抗体の阻害効果を確認するために、ＥＬＩＳＡベースのＨＢ－ＥＧＦ放出アッセイを行った。
この実施例で用いたＥＬＩＳＡベースのＨＢ－ＥＧＦ放出アッセイは、実施例１０に記載したものと同じであるが、唯一の違いは、ＴＨＰ－１（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＵＳＡ）細胞の代わりにＵ－９３７（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｕｔｈｅｎｔｉｃａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、ＵＫ）細胞（８０，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を用いたことである。
図１３は、Ｕ－９３７細胞からのＨＢ－ＥＧＦのＰＭＡ誘導放出に対する試験品の効果を、絶対数（図１３ａ）および阻害率（図１３ｂ）で示した、この実験の代表的な結果である。メタロプロテアーゼの低分子阻害剤であるＢａｔｉｍａｓｔａｔ（ＢＢ９４）は陽性対照として機能し、ＰＭＡ誘導のＨＢ－ＥＧＦ放出を強力に阻害したが、ヒトＩｇＧアイソタイプコントロールの存在はＨＢ－ＥＧＦ切断にほとんど影響を及ぼさなかった。対照的に、等濃度の本発明のヒト化抗体１６－Ｂ－０３、１６－Ｂ－０５、１６－Ｂ－０７、２３－Ｂ－０４、４２－Ｂ－０２および４２－Ｂ－０４は、それぞれ９９．２％、９９．７％、９９．２％、９９．５％、９８．８％および９９．４％で、Ｕ－９３７細胞からのＰＭＡ誘導ＨＢ－ＥＧＦ放出を阻害する。
実施例１２：ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＰＭＡ誘導トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦα）切断に対する本発明の抗体の阻害効果の解析
以下の研究では、ヒトＰＣ３前立腺癌細胞からの内因性ＴＧＦαのＰＭＡ誘導放出に対する本発明の抗体の阻害効果を分析するために、ＥＬＩＳＡベースのＴＧＦα放出アッセイを行った。
以下の研究では、ヒトＰＣ３前立腺癌細胞からの内因性ＴＧＦαのＰＭＡ誘導放出に対する本発明の抗体の阻害効果を分析するために、ＥＬＩＳＡベースのＴＧＦα放出アッセイを行った。
本実施例で用いたＥＬＩＳＡベースのＴＧＦα放出アッセイを以下に記す。
簡単に説明すると、１日目にＮｕｎｃ ｂｌａｃｋ ＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）９６－ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）に、ヤギ抗ヒトＴＧＦα捕捉抗体（ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡキットの一部として提供）を０．４μｇ／ｍｌ ＴＢＳで１ウェルあたり１００μｌ、４℃で一晩コートした。８０，０００個のＰＣ３（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｕｔｈｅｎｔｉｃａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、ＵＫ）細胞を１００μｌの標準増殖培地に入れ、Ｆ底９６ウェル細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＵＳＡ）の各ウェルに播種し、３７℃、５％ＣＯ2で一晩培養した。２日目、捕捉抗体溶液を除去し、ＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）プレートを１ウェルあたり３００μｌのＴＢＳ、１％ ＢＳＡで１－２時間室温でブロッキングした。一方、細胞はＰＢＳで一度洗浄し、陽性対照として５０μＭのＢａｔｉｍａｓｔａｔ（ＢＢ９４、Ａｂｃａｍ、英国）（得られた１００μｌサンプル容量中の最終濃度は１０μＭ）、アイソタイプコントロールとして５０μｇ／ｍｌのヒトＩｇＧ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、ＵＳＡ）（最終濃度１０μｇ／ｍｌ、サンプル量１００μｌ）、または本発明の抗体を５０μｇ／ｍｌ（最終濃度１０μｇ／ｍｌ、サンプル量１００μｌ）を添加した８０μＬのＯｐｔｉＭＥＭ培地（ウェルあたり２０μｌ）で、３７℃、５％ＣＯ2で３０分間プレインキュベートした。刺激対象の場合は、試験品を含まないＯｐｔｉＭＥＭ培地２０μｌを加えた。その後、細胞（非刺激対照を除く）を、ＰＭＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ， ＵＳＡ）を１５０ｎｇ／ｍｌのＯｐｔｉＭＥＭで最終濃度２５ｎｇ／ｍｌになるように１ウェルあたり２０μｌで３７℃、５％ ＣＯ2で２時間刺激した。並行して、ブロッキング緩衝液をＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）プレートから除去し、９６ヘッドプレート洗浄機（スイス、テカングループ）上で１ウェルあたり３５０μｌのＴＢＳ－Ｔ （ドイツ、カール・ロス）でプレートを４回洗浄した。乾燥を避けるため、直ちにＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）プレートの各ウェルにＴＢＳ ２０μｌを添加した後、試料あたり無細胞上清８０μｌを移した。さらに、ＴＢＳで規定濃度に希釈した組換えヒトＴＧＦαタンパク質（ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡキットの一部として提供）１００μｌを標準参照としてプレートに添加した。その後、３７．５ｎｇ／ｍｌのＴＢＳでビオチン化ヤギ抗ヒトＴＧＦα検出抗体（ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡキットの一部として提供）を１ウェルあたり１００μｌ添加し、直接光から保護し、プレートを室温で２時間インキュベートした。９６－ヘッドプレート洗浄機 （Ｔｅｃａｎ Ｇｒｏｕｐ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ、Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ）上でＴＢＳ－Ｔ （Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ、ドイツ）１ウェルあたり３５０μｌで４回洗浄し、４サイクル目以降は緩衝液の痕跡をすべて注意深く除去した後、ＴＢＳ中で１：１０，０００に希釈したストレプトアビジン－ＡＰ （Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）１００μｌを各ウェルに添加し、再び直接光から保護し、プレートを室温で３０分間インキュベートした。９６－ヘッドプレート洗浄機 （Ｔｅｃａｎ Ｇｒｏｕｐ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）上でＴＢＳ－Ｔ （Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ、ドイツ）１ウェルあたり３５０μｌで４回再洗浄し、４サイクル目以降は緩衝液の痕跡をすべて注意深く除去した後、室温暗所で１時間インキュベートするため、ＡｔｔｏＰｈｏｓ基質溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国）を１ウェルあたり１００μｌを添加した。ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ１０００ （Ｔｅｃａｎ Ｇｒｏｕｐ、スイス）マイクロプレートリーダーを用いて、各ウェルの蛍光を励起波長４３５ｎｍ、発光波長５５５ｎｍで収集した。
図１４は、ＰＣ３細胞からのＴＧＦαのＰＭＡ誘導放出に対する試験品の効果を、絶対数（図１４ａ）と阻害率（図１４ｂ）で示した、この実験の代表的な結果である。メタロプロテアーゼの低分子阻害剤であるＢａｔｉｍａｓｔａｔ（ＢＢ９４）は陽性対照として機能し、ＰＭＡ誘導のＴＧＦα放出を９０．７％阻害したが、ＩｇＧアイソタイプコントロールの存在はＴＧＦα切断を阻害する効果はなかった。。等濃度の本発明のヒト化抗体１６－Ｂ－０３、１６－Ｂ－０５、１６－Ｂ－０７、２３－Ｂ－０４、４２－Ｂ－０２および４２－Ｂ－０４の存在下では、ＰＣ３細胞からのＴＧＦαのＰＭＡ誘導放出がそれぞれ１５．９％、２３．８％、３．３％、２１．３％、６．４％および１９．５％阻害され、ＴＧＦα切断に対する非常に中程度の効果しか検出されなかった。
実施例１３：ｉＲｈｏｍ２を内因的に発現する細胞株における本発明の抗体の結合特異性の評価
本研究では、本発明の抗体の代表例としてヒト化抗体４２－Ｂ－０２を用い、ｉＲｈｏｍ２を内在性発現している細胞株における結合特異性解析を行った。研究は、ｉＲｈｏｍ２を内因性に発現するがｉＲｈｏｍ１は内因性に陰性であるヒトＢリンパ球系細胞株であるＲＰＭＩ－８２２６細胞、ｉＲｈｏｍ２とｉＲｈｏｍ１の両方を内因性に発現するヒト単球系細胞株であるＴＨＰ－１細胞、およびｉＲｈｏｍ２は陰性であるがｉＲｈｏｍ１を内因性に発現するヒト線維芽細胞株であるＲＨ－３０細胞を用いて行われた。
本研究では、本発明の抗体の代表例としてヒト化抗体４２－Ｂ－０２を用い、ｉＲｈｏｍ２を内在性発現している細胞株における結合特異性解析を行った。研究は、ｉＲｈｏｍ２を内因性に発現するがｉＲｈｏｍ１は内因性に陰性であるヒトＢリンパ球系細胞株であるＲＰＭＩ－８２２６細胞、ｉＲｈｏｍ２とｉＲｈｏｍ１の両方を内因性に発現するヒト単球系細胞株であるＴＨＰ－１細胞、およびｉＲｈｏｍ２は陰性であるがｉＲｈｏｍ１を内因性に発現するヒト線維芽細胞株であるＲＨ－３０細胞を用いて行われた。
簡単に説明すると、ヒトＲＰＭＩ－８２２６細胞（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ、ドイツ）、ＴＨＰ－１細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、米国）、およびＲＨ－３０細胞（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ、ドイツ）をＰＢＳ中１０ｍＭ ＥＤＴＡで回収し、洗浄後、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、３％ ＦＢＳ、０．０５％ アジ化ナトリウム）に再懸濁し、Ｎｕｎｃ Ｕ底９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）にウェル当たり約２ｘ１０5細胞で 播種した。細胞をペレット化し、上清を除去するために、プレートを１５００ｒｐｍ、４℃で３分間遠心分離した。一次染色では、細胞をＦＡＣＳ緩衝液単独（対照）またはＦＡＣＳ緩衝液中の本発明の抗体３μｇ／ｍｌのいずれかに１ウェルあたり１００μｌ懸濁し、氷上で１時間インキュベートした。その後、プレートを１５００ｒｐｍ、４℃で３分間遠心し、１ウェルあたり２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。二次染色では、細胞をスピンダウンし、ＦＡＣＳ緩衝液で１：１００に希釈したＰＥ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ´）２検出断片（Ｄｉａｎｏｖａ、ドイツ）を１ウェルあたり１００μｌ懸濁した。光から保護し、細胞懸濁液を氷上で１時間インキュベートした。その後、プレートを１５００ｒｐｍ、４℃で３分間遠心し、１ウェルあたり２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄した。最後に、細胞を１ウェルあたり１５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、ＢＤ ＡｃｃｕｒｉＴＭ Ｃ６ Ｐｌｕｓフローサイトメーター（ドイツ、ベクトン・ディッキンソン社製）を用いて分析した。
図１５にこの研究の代表的な結果を示す。二次抗体のみでインキュベートした対照試料（灰色）と比較すると、ｉＲｈｏｍ２ を内因性に発現している ＲＰＭＩ－８２２６ 細胞と ＴＨＰ－１ 細胞の両方を、本発明の抗体の代表例であるヒト化抗体 ４２－Ｂ－０２ と共インキュベートした場合（左 ＆ 中、黒）、両細胞株で相対蛍光強度の強いシフトが見られ、ｉＲｈｏｍ２ が内因性に陽性である２つのヒト細胞株に対する本発明のヒト化抗体 ４２－Ｂ－０２ の強い結合が証明された。一方、ｉＲｈｏｍ２を発現していないＲＨ－３０細胞には、本発明の抗体の代表例であるヒト化抗体４２－Ｂ－０２（右、黒色）の結合は検出されず、内因性に発現しているｉＲｈｏｍ２が本発明のヒト化抗体４２－Ｂ－０２に特異的に認識されている証拠となる。
実施例１４：大きな細胞外ループの単一アミノ酸置換または欠失に基づく本発明の抗体のエピトープマッピング
現在、抗体によって認識されるエピトープをマッピングする方法は、Ｘ線結晶構造解析、アレイベースのオリゴペプチドスキャニング、水素重水素交換、架橋結合質量分析など、いくつかある。部位特異的突然変異誘発やハイスループットショットガン突然変異誘発などの遺伝学的アプローチにより、単一アミノ酸分解能でのエピトープマッピングが可能となる。しかし、タンパク質のランダムな位置でのアミノ酸置換や、非関連アミノ酸による置換は、タンパク質のコンフォメーション変化や機能喪失を引き起こす危険性があり、その結果、置換されたアミノ酸が抗体エピトープに寄与しているかどうかについて誤解を招く可能性がある。このようなリスクを回避するエレガントで一般的に受け入れられている方法は、あるタンパク質の個々のアミノ酸を、構造的に関連するタンパク質、すなわちオルソログまたは近縁のファミリーメンバーの相同アミノ酸で置き換えることである。前述したように、本発明のヒト化抗ヒトｉＲｈｏｍ２抗体は、マウスのオルソログ（実施例３）とも、近縁のファミリーメンバーであるヒトｉＲｈｏｍ１（実施例４）とも交差反応しないことが証明されているので、この両者はすべて当てはまる。さらに、あるタンパク質の個々のアミノ酸をアミノ酸のアラニンで置換することは、エピトープをマッピングするために広く用いられているアプローチである。
現在、抗体によって認識されるエピトープをマッピングする方法は、Ｘ線結晶構造解析、アレイベースのオリゴペプチドスキャニング、水素重水素交換、架橋結合質量分析など、いくつかある。部位特異的突然変異誘発やハイスループットショットガン突然変異誘発などの遺伝学的アプローチにより、単一アミノ酸分解能でのエピトープマッピングが可能となる。しかし、タンパク質のランダムな位置でのアミノ酸置換や、非関連アミノ酸による置換は、タンパク質のコンフォメーション変化や機能喪失を引き起こす危険性があり、その結果、置換されたアミノ酸が抗体エピトープに寄与しているかどうかについて誤解を招く可能性がある。このようなリスクを回避するエレガントで一般的に受け入れられている方法は、あるタンパク質の個々のアミノ酸を、構造的に関連するタンパク質、すなわちオルソログまたは近縁のファミリーメンバーの相同アミノ酸で置き換えることである。前述したように、本発明のヒト化抗ヒトｉＲｈｏｍ２抗体は、マウスのオルソログ（実施例３）とも、近縁のファミリーメンバーであるヒトｉＲｈｏｍ１（実施例４）とも交差反応しないことが証明されているので、この両者はすべて当てはまる。さらに、あるタンパク質の個々のアミノ酸をアミノ酸のアラニンで置換することは、エピトープをマッピングするために広く用いられているアプローチである。
そこで、本発明の抗体の結合に寄与する単一アミノ酸を同定するアプローチとして、マウスｉＲｈｏｍ２関連単一アミノ酸置換、ヒトｉＲｈｏｍ１関連単一アミノ酸置換、またはアラニンへの単一アミノ酸置換のいずれかを有する１３７個のヒトｉＲｈｏｍ２バリアントセットのプラスミドを設計した。これらの１３７の置換は、大きな細胞外ループ１（ヒトｉＲｈｏｍ２のＡＡ５０２からＡＡ５９４）のアミノ酸を反映しており、ヒトｉＲｈｏｍ２対マウスｉＲｈｏｍ２で非同一、ヒトｉＲｈｏｍ２対ヒトｉＲｈｏｍ１で非同一、またはヒトｉＲｈｏｍ２のそれぞれのアミノ酸がアラニンに置換されている。ヒトｉＲｈｏｍ２のアミノ酸の代わりに、マウスｉＲｈｏｍ２またはヒトｉＲｈｏｍ１の対応する位置のアミノ酸を導入するか、ヒトｉＲｈｏｍ２のアミノ酸をアラニンに置換した。マウス ｉＲｈｏｍ２またはヒト ｉＲｈｏｍ１ に対応するアミノ酸が存在しない場合、ヒト ｉＲｈｏｍ２のそれぞれのアミノ酸を欠失させて、以下のバリアントを作成した： ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５０２Ｒ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｎ５０３Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５０４Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｈ５０５Ｒ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｈ５０５Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５０６Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５０７Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｃ５０８Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｉ５０９Ｖ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｉ５０９Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５１０Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５１１Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５１２Ｌ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５１２Ｓ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５１２Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５１３Ｋ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５１３Ｅ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５１３Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５１４Ｅ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５１４Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５１５Ｅ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５１５Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｃ５１６Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５１７Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５１８Ｓ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５１８Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５１９Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｌ５２０Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５２１Ｓ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５２２Ｖ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５２２Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｆ５２３Ｗ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｆ５２３Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｖ５２４Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５２５Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｗ５２６Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５２７Ｐ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５２７Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５２８Ｎ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５２８Ｉ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５２８Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５２９Ｈ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５２９Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５３０Ｐ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５３０Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５３１Ｓ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５３１Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５３２Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５３３－－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５３３Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｍ５３４Ｓ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｍ５３４－－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｍ５３４Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５３５－－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５３５Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５３６－－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５３６Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５３７Ｅ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５３７Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５３８Ｌ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５３８Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｌ５３９Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５４０Ｓ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５４０Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５４１Ｈ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５４１Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５４２Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５４３Ｑ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５４３Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５４４Ｐ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５４４Ｑ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５４４Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５４５Ｆ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５４５Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５４６Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５４７Ｖ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５４７Ｓ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｖ５４８Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｃ５４９Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｈ５５０Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５５１Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５５２Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５５３Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５５４Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５５５Ｖ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５５５Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｃ５５６Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５５７Ｄ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５５７Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５５８Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５５９Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５６０Ｓ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５６１Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５６２Ｅ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５６２Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５６３Ｄ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５６３Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５６４Ｐ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５６４Ｓ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｈ５６５Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｉ５６６Ｅ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｉ５６６Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｗ５６７Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５６８Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５６９Ｅ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５６９Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５７０Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｉ５７１Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５７２Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５７３Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｗ５７４Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５７５Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｉ５７６Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｃ５７７Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５７８Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５７９Ｋ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５７９Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５８０Ｎ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５８０Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５８１Ｓ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５８２Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５８３Ｇ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５８３Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｎ５８４Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｈ５８５Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５８６Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５８７Ｎ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５８７Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｆ５８８Ｈ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｆ５８８Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｌ５８９Ｐ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｌ５８９Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｈ５９０Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｍ５９１Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５９２Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｃ５９３Ａ－Ｔ７およびｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５９４Ｖ－Ｔ７。
この実施例では、１３７の単一アミノ酸置換または欠失バリアントを発現するｉＲｈｏｍ１／２－／－ＤＫＯ ＭＥＦ集団の作製、ならびに適切なタンパク質コンフォメーションの指標としての細胞表面局在および機能活性の観点からのそれらの特徴付けについて説明する。続いて、本発明のヒト化抗体１６－Ｂ－０３、１６－Ｂ－０５、１６－Ｂ－０７、２３－Ｂ－０４、４２－Ｂ－０２および４２－Ｂ－０４の、単一アミノ酸置換または欠失を有するヒトｉＲｈｏｍ２バリアントを発現する１３７の人工ＭＥＦ集団のパネル全体に対する結合解析について記載する。
単一アミノ酸置換または欠失を有する１３７個のＴ７タグ付きヒトｉＲｈｏｍ２バリアントを安定に発現するｉＲｈｏｍ１／２－／－ＤＫＯ ＭＥＦの作製
簡単に説明すると、１日目に、Ｐｈｏｅｎｉｘ－ＥＣＯ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、米国）を、標準増殖培地中の６ウェル組織培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、ドイツ）に、１ウェル当たり８ｘ１０5細胞で播種し、３７℃、５％ＣＯ2で一晩静置した。２日目に、クロロキン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）を最終濃度２５μＭで添加した新鮮な培地に交換した。リン酸カルシウム法を適用して、細胞を、Ｔ７エピトープ（ＭＡＳＭＴＧＧＱＱＭＧ）の連続する３コピーでＣ末端にタグ付けされたヒトｉＲｈｏｍ２全長単一アミノ酸置換体をコードする、２μｇ／ｍｌのｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５０２Ｒ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｎ５０３Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５０４Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｈ５０５Ｒ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｈ５０５Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５０６Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５０７Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｃ５０８Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｉ５０９Ｖ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｉ５０９Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５１０Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５１１Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５１２Ｌ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５１２Ｓ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５１２Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５１３Ｋ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５１３Ｅ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５１３Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５１４Ｅ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５１４Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５１５Ｅ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５１５Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｃ５１６Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５１７Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５１８Ｓ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５１８Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５１９Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｌ５２０Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５２１Ｓ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５２２Ｖ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５２２Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｆ５２３Ｗ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｆ５２３Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｖ５２４Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５２５Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｗ５２６Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５２７Ｐ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５２７Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５２８Ｎ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５２８Ｉ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５２８Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５２９Ｈ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５２９Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５３０Ｐ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５３０Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５３１Ｓ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５３１Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５３２Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５３３－－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５３３Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｍ５３４Ｓ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｍ５３４－－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｍ５３４Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５３５－－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５３５Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５３６－－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５３６Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５３７Ｅ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５３７Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５３８Ｌ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５３８Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｌ５３９Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５４０Ｓ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５４０Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５４１Ｈ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５４１Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５４２Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５４３Ｑ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５４３Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５４４Ｐ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５４４Ｑ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５４４Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５４５Ｆ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５４５Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５４６Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５４７Ｖ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５４７Ｓ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｖ５４８Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｃ５４９Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｈ５５０Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５５１Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５５２Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５５３Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５５４Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５５５Ｖ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５５５Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｃ５５６Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５５７Ｄ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５５７Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５５８Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５５９Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５６０Ｓ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５６１Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５６２Ｅ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５６２Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５６３Ｄ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５６３Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５６４Ｐ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５６４Ｓ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｈ５６５Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｉ５６６Ｅ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｉ５６６Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｗ５６７Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５６８Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５６９Ｅ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５６９Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５７０Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｉ５７１Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５７２Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５７３Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｗ５７４Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５７５Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｉ５７６Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｃ５７７Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５７８Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５７９Ｋ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５７９Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５８０Ｎ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５８０Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５８１Ｓ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５８２Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５８３Ｇ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５８３Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｎ５８４Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｈ５８５Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５８６Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５８７Ｎ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５８７Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｆ５８８Ｈ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｆ５８８Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｌ５８９Ｐ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｌ５８９Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｈ５９０Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｍ５９１Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５９２Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｃ５９３Ａ－Ｔ７およびｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５９４Ｖ－Ｔ７でトランス
フェクトとし３７℃、５％ＣＯ2に保った。７時間後、細胞上清をクロロキン欠乏の標準増殖培地と交換してトランスフェクションを停止し、３７℃、５％ＣＯ2で一晩培養してウイルス産生を行った。並行して、レトロウイルス感染の標的細胞として不死化したｉＲｈｏｍ１／２－／－ＤＫＯ ＭＥＦを、標準増殖培地中の６ウェル組織培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、ドイツ）に１ウェルあたり１ｘ１０5細胞で播種し、３７℃、５％ＣＯ2で一晩静置した。３日目、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５０２Ｒ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｎ５０３Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５０４Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｈ５０５Ｒ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｈ５０５Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５０６Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５０７Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｃ５０８Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｉ５０９Ｖ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｉ５０９Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５１０Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５１１Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５１２Ｌ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５１２Ｓ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５１２Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５１３Ｋ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５１３Ｅ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５１３Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５１４Ｅ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５１４Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５１５Ｅ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５１５Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｃ５１６Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５１７Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５１８Ｓ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５１８Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５１９Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｌ５２０Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５２１Ｓ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５２２Ｖ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５２２Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｆ５２３Ｗ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｆ５２３Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｖ５２４Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５２５Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｗ５２６Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５２７Ｐ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５２７Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５２８Ｎ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５２８Ｉ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５２８Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５２９Ｈ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５２９Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５３０Ｐ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５３０Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５３１Ｓ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５３１Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５３２Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５３３－－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５３３Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｍ５３４Ｓ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｍ５３４－－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｍ５３４Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５３５－－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５３５Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５３６－－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５３６Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５３７Ｅ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５３７Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５３８Ｌ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５３８Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｌ５３９Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５４０Ｓ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５４０Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５４１Ｈ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５４１Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５４２Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５４３Ｑ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５４３Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５４４Ｐ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５４４Ｑ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５４４Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５４５Ｆ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５４５Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５４６Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５４７Ｖ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５４７Ｓ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｖ５４８Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｃ５４９Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｈ５５０Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５５１Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５５２Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５５３Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５５４Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５５５Ｖ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５５５Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｃ５５６Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５５７Ｄ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５５７Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５５８Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５５９Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５６０Ｓ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５６１Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５６２Ｅ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５６２Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５６３Ｄ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５６３Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５６４Ｐ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５６４Ｓ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｈ５６５Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｉ５６６Ｅ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｉ５６６Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｗ５６７Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５６８Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５６９Ｅ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５６９Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５７０Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｉ５７１Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５７２Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５７３Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｗ５７４Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５７５Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｉ５７６Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｃ５７７Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５７８Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５７９Ｋ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５７９Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５８０Ｎ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５８０Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５８１Ｓ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５８２Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５８３Ｇ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５８３Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｎ５８４Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｈ５８５Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５８６Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５８７Ｎ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５８７Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｆ５８８Ｈ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｆ５８８Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｌ５８９Ｐ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｌ５８９Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｈ５９０Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｍ５９１Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５９２Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｃ５９３Ａ－Ｔ７およびｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５９４Ｖ－Ｔ７エコトロピックウイルスをリリースするＰｈｏｅｎｉｘ－ＥＣＯ細胞の上清を回収し、０．４５μｍのＣＡフィルターで濾過し、４μｇ／ｍｌのポリブレン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）を添加した。不死化したｉＲｈｏｍ１／２－／－ＤＫＯ ＭＥＦ
から培地を除去した後、これらの上清を標的細胞に加え、３７℃、５％ＣＯ2で４時間、初感染を行った。同時に、Ｐｈｏｅｎｉｘ－ＥＣＯ細胞を新鮮な培地で再インキュベートし、さらに４時間後に濾過し、再び４μｇ／ｍｌのポリブレン存在下で、それぞれの標的細胞集団の２回目の感染に使用した。同様に、３回目の、しかし一晩の感染サイクルを行った。４日目に、ウイルスを含む細胞上清を新鮮な標準増殖培地と交換した。５日目以降、ヒトｉＲｈｏｍ２全長の単一アミノ酸置換体を安定に発現する、Ｃ末端にＴ７エピトープが３コピー連続してタグ付けされた、不死化ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５０２Ｒ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｎ５０３Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５０４Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｈ５０５Ｒ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｈ５０５Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５０６Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５０７Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｃ５０８Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｉ５０９Ｖ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｉ５０９Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５１０Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５１１Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５１２Ｌ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５１２Ｓ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５１２Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５１３Ｋ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５１３Ｅ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５１３Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５１４Ｅ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５１４Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５１５Ｅ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５１５Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｃ５１６Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５１７Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５１８Ｓ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５１８Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５１９Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｌ５２０Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５２１Ｓ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５２２Ｖ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５２２Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｆ５２３Ｗ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｆ５２３Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｖ５２４Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５２５Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｗ５２６Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５２７Ｐ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５２７Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５２８Ｎ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５２８Ｉ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５２８Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５２９Ｈ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５２９Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５３０Ｐ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５３０Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５３１Ｓ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５３１Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５３２Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５３３－－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５３３Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｍ５３４Ｓ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｍ５３４－－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｍ５３４Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５３５－－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５３５Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５３６－－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５３６Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５３７Ｅ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５３７Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５３８Ｌ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５３８Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｌ５３９Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５４０Ｓ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５４０Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５４１Ｈ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５４１Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５４２Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５４３Ｑ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５４３Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５４４Ｐ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５４４Ｑ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５４４Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５４５Ｆ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５４５Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５４６Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５４７Ｖ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５４７Ｓ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｖ５４８Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｃ５４９Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｈ５５０Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５５１Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５５２Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５５３Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５５４Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５５５Ｖ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５５５Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｃ５５６Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５５７Ｄ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５５７Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５５８Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５５９Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５６０Ｓ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５６１Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５６２Ｅ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５６２Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５６３Ｄ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５６３Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５６４Ｐ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５６４Ｓ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｈ５６５Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｉ５６６Ｅ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｉ５６６Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｗ５６７Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５６８Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５６９Ｅ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５６９Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５７０Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｉ５７１Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５７２Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５７３Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｗ５７４Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５７５Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｉ５７６Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｃ５７７Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５７８Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５７９Ｋ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５７９Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５８０Ｎ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５８０Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５８１Ｓ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５８２Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５８３Ｇ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５８３Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｎ５８４Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｈ５８５Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５８６Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５８７Ｎ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５８７Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｆ５８８Ｈ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｆ５８８Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｌ５８９Ｐ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｌ５８９Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｈ５９０Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｍ５９１Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５９２Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｃ５９３Ａ－Ｔ７およびＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５９４Ｖ－Ｔ７細胞を選択するため、２ｍｇ／ｍｌのジェネティシン（Ｇ４１８、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）存在下で培養した。増殖後、細胞は将来の使用のためにストックされた。
簡単に説明すると、１日目に、Ｐｈｏｅｎｉｘ－ＥＣＯ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、米国）を、標準増殖培地中の６ウェル組織培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、ドイツ）に、１ウェル当たり８ｘ１０5細胞で播種し、３７℃、５％ＣＯ2で一晩静置した。２日目に、クロロキン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）を最終濃度２５μＭで添加した新鮮な培地に交換した。リン酸カルシウム法を適用して、細胞を、Ｔ７エピトープ（ＭＡＳＭＴＧＧＱＱＭＧ）の連続する３コピーでＣ末端にタグ付けされたヒトｉＲｈｏｍ２全長単一アミノ酸置換体をコードする、２μｇ／ｍｌのｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５０２Ｒ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｎ５０３Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５０４Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｈ５０５Ｒ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｈ５０５Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５０６Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５０７Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｃ５０８Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｉ５０９Ｖ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｉ５０９Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５１０Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５１１Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５１２Ｌ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５１２Ｓ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５１２Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５１３Ｋ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５１３Ｅ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５１３Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５１４Ｅ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５１４Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５１５Ｅ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５１５Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｃ５１６Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５１７Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５１８Ｓ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５１８Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５１９Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｌ５２０Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５２１Ｓ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５２２Ｖ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５２２Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｆ５２３Ｗ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｆ５２３Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｖ５２４Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５２５Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｗ５２６Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５２７Ｐ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５２７Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５２８Ｎ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５２８Ｉ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５２８Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５２９Ｈ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５２９Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５３０Ｐ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５３０Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５３１Ｓ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５３１Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５３２Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５３３－－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５３３Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｍ５３４Ｓ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｍ５３４－－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｍ５３４Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５３５－－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５３５Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５３６－－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５３６Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５３７Ｅ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５３７Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５３８Ｌ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５３８Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｌ５３９Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５４０Ｓ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５４０Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５４１Ｈ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５４１Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５４２Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５４３Ｑ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５４３Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５４４Ｐ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５４４Ｑ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５４４Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５４５Ｆ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５４５Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５４６Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５４７Ｖ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５４７Ｓ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｖ５４８Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｃ５４９Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｈ５５０Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５５１Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５５２Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５５３Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５５４Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５５５Ｖ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５５５Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｃ５５６Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５５７Ｄ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５５７Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５５８Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５５９Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５６０Ｓ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５６１Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５６２Ｅ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５６２Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５６３Ｄ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５６３Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５６４Ｐ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５６４Ｓ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｈ５６５Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｉ５６６Ｅ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｉ５６６Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｗ５６７Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５６８Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５６９Ｅ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５６９Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５７０Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｉ５７１Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５７２Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５７３Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｗ５７４Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５７５Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｉ５７６Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｃ５７７Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５７８Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５７９Ｋ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５７９Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５８０Ｎ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５８０Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５８１Ｓ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５８２Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５８３Ｇ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５８３Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｎ５８４Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｈ５８５Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５８６Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５８７Ｎ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５８７Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｆ５８８Ｈ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｆ５８８Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｌ５８９Ｐ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｌ５８９Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｈ５９０Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｍ５９１Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５９２Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｃ５９３Ａ－Ｔ７およびｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５９４Ｖ－Ｔ７でトランス
フェクトとし３７℃、５％ＣＯ2に保った。７時間後、細胞上清をクロロキン欠乏の標準増殖培地と交換してトランスフェクションを停止し、３７℃、５％ＣＯ2で一晩培養してウイルス産生を行った。並行して、レトロウイルス感染の標的細胞として不死化したｉＲｈｏｍ１／２－／－ＤＫＯ ＭＥＦを、標準増殖培地中の６ウェル組織培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、ドイツ）に１ウェルあたり１ｘ１０5細胞で播種し、３７℃、５％ＣＯ2で一晩静置した。３日目、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５０２Ｒ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｎ５０３Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５０４Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｈ５０５Ｒ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｈ５０５Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５０６Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５０７Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｃ５０８Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｉ５０９Ｖ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｉ５０９Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５１０Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５１１Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５１２Ｌ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５１２Ｓ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５１２Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５１３Ｋ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５１３Ｅ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５１３Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５１４Ｅ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５１４Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５１５Ｅ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５１５Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｃ５１６Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５１７Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５１８Ｓ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５１８Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５１９Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｌ５２０Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５２１Ｓ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５２２Ｖ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５２２Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｆ５２３Ｗ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｆ５２３Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｖ５２４Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５２５Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｗ５２６Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５２７Ｐ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５２７Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５２８Ｎ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５２８Ｉ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５２８Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５２９Ｈ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５２９Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５３０Ｐ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５３０Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５３１Ｓ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５３１Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５３２Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５３３－－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５３３Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｍ５３４Ｓ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｍ５３４－－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｍ５３４Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５３５－－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５３５Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５３６－－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５３６Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５３７Ｅ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５３７Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５３８Ｌ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５３８Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｌ５３９Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５４０Ｓ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５４０Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５４１Ｈ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５４１Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５４２Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５４３Ｑ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５４３Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５４４Ｐ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５４４Ｑ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５４４Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５４５Ｆ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５４５Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５４６Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５４７Ｖ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５４７Ｓ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｖ５４８Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｃ５４９Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｈ５５０Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５５１Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５５２Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５５３Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５５４Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５５５Ｖ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５５５Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｃ５５６Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５５７Ｄ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５５７Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５５８Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５５９Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５６０Ｓ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５６１Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５６２Ｅ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５６２Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５６３Ｄ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５６３Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５６４Ｐ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５６４Ｓ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｈ５６５Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｉ５６６Ｅ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｉ５６６Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｗ５６７Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５６８Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５６９Ｅ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５６９Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５７０Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｉ５７１Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５７２Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５７３Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｗ５７４Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５７５Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｉ５７６Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｃ５７７Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５７８Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５７９Ｋ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５７９Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５８０Ｎ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５８０Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５８１Ｓ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５８２Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５８３Ｇ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５８３Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｎ５８４Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｈ５８５Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５８６Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５８７Ｎ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５８７Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｆ５８８Ｈ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｆ５８８Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｌ５８９Ｐ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｌ５８９Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｈ５９０Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｍ５９１Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５９２Ａ－Ｔ７、ｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｃ５９３Ａ－Ｔ７およびｐＭＳＣＶ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５９４Ｖ－Ｔ７エコトロピックウイルスをリリースするＰｈｏｅｎｉｘ－ＥＣＯ細胞の上清を回収し、０．４５μｍのＣＡフィルターで濾過し、４μｇ／ｍｌのポリブレン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）を添加した。不死化したｉＲｈｏｍ１／２－／－ＤＫＯ ＭＥＦ
から培地を除去した後、これらの上清を標的細胞に加え、３７℃、５％ＣＯ2で４時間、初感染を行った。同時に、Ｐｈｏｅｎｉｘ－ＥＣＯ細胞を新鮮な培地で再インキュベートし、さらに４時間後に濾過し、再び４μｇ／ｍｌのポリブレン存在下で、それぞれの標的細胞集団の２回目の感染に使用した。同様に、３回目の、しかし一晩の感染サイクルを行った。４日目に、ウイルスを含む細胞上清を新鮮な標準増殖培地と交換した。５日目以降、ヒトｉＲｈｏｍ２全長の単一アミノ酸置換体を安定に発現する、Ｃ末端にＴ７エピトープが３コピー連続してタグ付けされた、不死化ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５０２Ｒ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｎ５０３Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５０４Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｈ５０５Ｒ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｈ５０５Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５０６Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５０７Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｃ５０８Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｉ５０９Ｖ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｉ５０９Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５１０Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５１１Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５１２Ｌ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５１２Ｓ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５１２Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５１３Ｋ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５１３Ｅ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５１３Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５１４Ｅ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５１４Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５１５Ｅ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５１５Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｃ５１６Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５１７Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５１８Ｓ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５１８Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５１９Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｌ５２０Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５２１Ｓ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５２２Ｖ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５２２Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｆ５２３Ｗ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｆ５２３Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｖ５２４Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５２５Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｗ５２６Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５２７Ｐ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５２７Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５２８Ｎ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５２８Ｉ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５２８Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５２９Ｈ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５２９Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５３０Ｐ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５３０Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５３１Ｓ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５３１Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５３２Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５３３－－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５３３Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｍ５３４Ｓ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｍ５３４－－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｍ５３４Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５３５－－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５３５Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５３６－－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５３６Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５３７Ｅ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５３７Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５３８Ｌ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５３８Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｌ５３９Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５４０Ｓ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５４０Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５４１Ｈ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５４１Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５４２Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５４３Ｑ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５４３Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５４４Ｐ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５４４Ｑ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５４４Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５４５Ｆ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５４５Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５４６Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５４７Ｖ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５４７Ｓ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｖ５４８Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｃ５４９Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｈ５５０Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５５１Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５５２Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５５３Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５５４Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５５５Ｖ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５５５Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｃ５５６Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５５７Ｄ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５５７Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５５８Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５５９Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５６０Ｓ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５６１Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５６２Ｅ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５６２Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５６３Ｄ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５６３Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５６４Ｐ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５６４Ｓ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｈ５６５Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｉ５６６Ｅ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｉ５６６Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｗ５６７Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５６８Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５６９Ｅ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５６９Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５７０Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｉ５７１Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５７２Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５７３Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｗ５７４Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５７５Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｉ５７６Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｃ５７７Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５７８Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５７９Ｋ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５７９Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５８０Ｎ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５８０Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５８１Ｓ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５８２Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５８３Ｇ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５８３Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｎ５８４Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｈ５８５Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５８６Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５８７Ｎ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５８７Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｆ５８８Ｈ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｆ５８８Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｌ５８９Ｐ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｌ５８９Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｈ５９０Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｍ５９１Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５９２Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｃ５９３Ａ－Ｔ７およびＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５９４Ｖ－Ｔ７細胞を選択するため、２ｍｇ／ｍｌのジェネティシン（Ｇ４１８、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）存在下で培養した。増殖後、細胞は将来の使用のためにストックされた。
テストシステム検証のためのＦＡＣＳ分析
簡単に説明すると、不死化ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７細胞およびＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５０２Ｒ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｎ５０３Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５０４Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｈ５０５Ｒ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｈ５０５Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５０６Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５０７Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｃ５０８Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｉ５０９Ｖ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｉ５０９Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５１０Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５１１Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５１２Ｌ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５１２Ｓ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５１２Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５１３Ｋ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５１３Ｅ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５１３Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５１４Ｅ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５１４Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５１５Ｅ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５１５Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｃ５１６Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５１７Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５１８Ｓ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５１８Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５１９Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｌ５２０Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５２１Ｓ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５２２Ｖ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５２２Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｆ５２３Ｗ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｆ５２３Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｖ５２４Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５２５Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｗ５２６Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５２７Ｐ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５２７Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５２８Ｎ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５２８Ｉ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５２８Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５２９Ｈ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５２９Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５３０Ｐ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５３０Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５３１Ｓ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５３１Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５３２Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５３３－－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５３３Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｍ５３４Ｓ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｍ５３４－－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｍ５３４Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５３５－－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５３５Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５３６－－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５３６Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５３７Ｅ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５３７Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５３８Ｌ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５３８Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｌ５３９Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５４０Ｓ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５４０Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５４１Ｈ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５４１Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５４２Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５４３Ｑ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５４３Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５４４Ｐ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５４４Ｑ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５４４Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５４５Ｆ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５４５Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５４６Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５４７Ｖ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５４７Ｓ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｖ５４８Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｃ５４９Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｈ５５０Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５５１Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５５２Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５５３Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５５４Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５５５Ｖ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５５５Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｃ５５６Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５５７Ｄ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５５７Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５５８Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５５９Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５６０Ｓ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５６１Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５６２Ｅ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５６２Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５６３Ｄ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５６３Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５６４Ｐ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５６４Ｓ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｈ５６５Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｉ５６６Ｅ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｉ５６６Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｗ５６７Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５６８Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５６９Ｅ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５６９Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５７０Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｉ５７１Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５７２Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５７３Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｗ５７４Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５７５Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｉ５７６Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｃ５７７Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５７８Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５７９Ｋ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５７９Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５８０Ｎ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５８０Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５８１Ｓ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５８２Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５８３Ｇ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５８３Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｎ５８４Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｈ５８５Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５８６Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５８７Ｎ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５８７Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｆ５８８Ｈ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｆ５８８Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｌ５８９Ｐ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｌ５８９Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｈ５９０Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｍ５９１Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５９２Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｃ５９３Ａ－Ｔ７およびＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５９４Ｖ－Ｔ７細胞をＰＢＳ中１０ｍＭ ＥＤＴＡで回収し、洗浄してＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、３％ ＦＢＳ、０．０５％ アジ化ナトリウム）に再懸濁し、Ｎｕｎｃ Ｕ底９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）に１ウェルあたり約１ｘ１０5細胞で播種した。細胞をペレット化し、上清を除去するために、プレートを１５００ｒｐｍ、４℃で３分間遠心分離した。一次染色では、細胞をＦＡＣＳ緩衝液単独（対照）または３μｇ／ｍｌのマウスモノクローナル抗Ｔ７ ＩｇＧ（米国Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、ＦＡＣＳ緩衝液）１ウェルあたり１００μｌに再懸濁し、氷上で１時間インキュベートした。その後、プレートを１５００ｒｐｍ、４℃で３分間遠心し、１ウェルあたり２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。二次染色では、細胞をスピンダウンし、ＦＡＣＳ緩衝液で１：１００に希釈したＰＥ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆ（ａｂ´）２検出断片（Ｄｉａｎｏｖａ、ドイツ）を１ウェルあたり１００μｌ懸濁した。光から保護し、細胞懸濁液を氷上で１時間インキュベートした。その後、プレートを１５００ｒｐｍ、４℃で３分間遠心し、１ウェルあたり２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄した。最後に、細胞を１ウェルあたり１５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、ＢＤ ＡｃｃｕｒｉＴＭ Ｃ６ Ｐｌｕｓフローサイトメーター（ドイツ、ベクトン・ディッキンソン社製）を用いて分析した。
簡単に説明すると、不死化ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７細胞およびＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５０２Ｒ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｎ５０３Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５０４Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｈ５０５Ｒ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｈ５０５Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５０６Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５０７Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｃ５０８Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｉ５０９Ｖ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｉ５０９Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５１０Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５１１Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５１２Ｌ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５１２Ｓ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５１２Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５１３Ｋ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５１３Ｅ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５１３Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５１４Ｅ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５１４Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５１５Ｅ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５１５Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｃ５１６Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５１７Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５１８Ｓ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５１８Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５１９Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｌ５２０Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５２１Ｓ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５２２Ｖ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５２２Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｆ５２３Ｗ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｆ５２３Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｖ５２４Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５２５Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｗ５２６Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５２７Ｐ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５２７Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５２８Ｎ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５２８Ｉ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５２８Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５２９Ｈ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５２９Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５３０Ｐ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５３０Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５３１Ｓ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５３１Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５３２Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５３３－－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５３３Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｍ５３４Ｓ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｍ５３４－－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｍ５３４Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５３５－－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５３５Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５３６－－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５３６Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５３７Ｅ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５３７Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５３８Ｌ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５３８Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｌ５３９Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５４０Ｓ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５４０Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５４１Ｈ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５４１Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５４２Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５４３Ｑ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５４３Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５４４Ｐ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５４４Ｑ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５４４Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５４５Ｆ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５４５Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５４６Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５４７Ｖ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５４７Ｓ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｖ５４８Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｃ５４９Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｈ５５０Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５５１Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５５２Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５５３Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５５４Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５５５Ｖ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５５５Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｃ５５６Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５５７Ｄ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５５７Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５５８Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５５９Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５６０Ｓ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５６１Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５６２Ｅ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５６２Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５６３Ｄ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５６３Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５６４Ｐ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５６４Ｓ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｈ５６５Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｉ５６６Ｅ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｉ５６６Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｗ５６７Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５６８Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５６９Ｅ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５６９Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５７０Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｉ５７１Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５７２Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５７３Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｗ５７４Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５７５Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｉ５７６Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｃ５７７Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５７８Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５７９Ｋ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５７９Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５８０Ｎ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５８０Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５８１Ｓ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５８２Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５８３Ｇ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５８３Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｎ５８４Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｈ５８５Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５８６Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５８７Ｎ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５８７Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｆ５８８Ｈ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｆ５８８Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｌ５８９Ｐ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｌ５８９Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｈ５９０Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｍ５９１Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５９２Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｃ５９３Ａ－Ｔ７およびＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５９４Ｖ－Ｔ７細胞をＰＢＳ中１０ｍＭ ＥＤＴＡで回収し、洗浄してＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、３％ ＦＢＳ、０．０５％ アジ化ナトリウム）に再懸濁し、Ｎｕｎｃ Ｕ底９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）に１ウェルあたり約１ｘ１０5細胞で播種した。細胞をペレット化し、上清を除去するために、プレートを１５００ｒｐｍ、４℃で３分間遠心分離した。一次染色では、細胞をＦＡＣＳ緩衝液単独（対照）または３μｇ／ｍｌのマウスモノクローナル抗Ｔ７ ＩｇＧ（米国Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、ＦＡＣＳ緩衝液）１ウェルあたり１００μｌに再懸濁し、氷上で１時間インキュベートした。その後、プレートを１５００ｒｐｍ、４℃で３分間遠心し、１ウェルあたり２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。二次染色では、細胞をスピンダウンし、ＦＡＣＳ緩衝液で１：１００に希釈したＰＥ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆ（ａｂ´）２検出断片（Ｄｉａｎｏｖａ、ドイツ）を１ウェルあたり１００μｌ懸濁した。光から保護し、細胞懸濁液を氷上で１時間インキュベートした。その後、プレートを１５００ｒｐｍ、４℃で３分間遠心し、１ウェルあたり２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄した。最後に、細胞を１ウェルあたり１５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、ＢＤ ＡｃｃｕｒｉＴＭ Ｃ６ Ｐｌｕｓフローサイトメーター（ドイツ、ベクトン・ディッキンソン社製）を用いて分析した。
図１６ａは、ヒトｉＲｈｏｍ２バリアントｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５３６Ａ－Ｔ７についてのこの実験の代表的な結果を例示的に示する。ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７細胞（左）とＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５３６Ａ－Ｔ７細胞（右）での抗Ｔ７タグ抗体（黒）と抗マウスＩｇＧ二次抗体（灰色）の結合解析から、相対蛍光強度の強い増加が明らかになった。これは、ヒトｉＲｈｏｍ２野生型（左）と同様に、ヒトｉＲｈｏｍ２バリアントｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５３６Ａ－Ｔ７（右）がこれらの細胞の表面によく発現し、局在することを示す。ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５０２Ｒ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｎ５０３Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５０４Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｈ５０５Ｒ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｈ５０５Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５０６Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５０７Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｃ５０８Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｉ５０９Ｖ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｉ５０９Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５１０Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５１１Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５１２Ｌ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５１２Ｓ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５１２Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５１３Ｋ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５１３Ｅ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５１３Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５１４Ｅ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５１４Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５１５Ｅ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５１５Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｃ５１６Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５１７Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５１８Ｓ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５１８Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５１９Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｌ５２０Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５２１Ｓ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５２２Ｖ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５２２Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｆ５２３Ｗ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｆ５２３Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｖ５２４Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５２５Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｗ５２６Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５２７Ｐ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５２７Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５２８Ｎ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５２８Ｉ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５２８Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５２９Ｈ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５２９Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５３０Ｐ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５３０Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５３１Ｓ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５３１Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５３２Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５３３－－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５３３Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｍ５３４Ｓ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｍ５３４－－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｍ５３４Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５３５－－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５３５Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５３６－－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５３６Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５３７Ｅ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５３７Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５３８Ｌ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５３８Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｌ５３９Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５４０Ｓ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５４０Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５４１Ｈ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５４１Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５４２Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５４３Ｑ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５４３Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５４４Ｐ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５４４Ｑ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５４４Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５４５Ｆ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５４５Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５４６Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５４７Ｖ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５４７Ｓ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｖ５４８Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｃ５４９Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｈ５５０Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５５１Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５５２Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５５３Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５５４Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５５５Ｖ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５５５Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｃ５５６Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５５７Ｄ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５５７Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５５８Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５５９Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５６０Ｓ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５６１Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５６２Ｅ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５６２Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５６３Ｄ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５６３Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５６４Ｐ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５６４Ｓ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｈ５６５Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｉ５６６Ｅ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｉ５６６Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｗ５６７Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５６８Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５６９Ｅ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５６９Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５７０Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｉ５７１Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５７２Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５７３Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｗ５７４Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５７５Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｉ５７６Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｃ５７７Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５７８Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５７９Ｋ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５７９Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５８０Ｎ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５８０Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５８１Ｓ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５８２Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５８３Ｇ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５８３Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｎ５８４Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｈ５８５Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５８６Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５８７Ｎ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５８７Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｆ５８８Ｈ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｆ５８８Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｌ５８９Ｐ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｌ５８９Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｈ５９０Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｍ５９１Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５９２Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｃ５９３Ａ－Ｔ７およびＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５９４Ｖ－Ｔ７細胞で発現させたヒトｉＲｈｏｍ２全長単一アミノ酸置換体の発現と局在についても同様の結果が得られた。
テストシステム検証のためのＴＧＦα ＥＬＩＳＡ
単一アミノ酸置換または欠失を有する１３７個のヒトｉＲｈｏｍ２バリアントすべてを試験するために、上記の実施例に記載したように作製したこれらのバリアントを安定に発現するそれぞれのＭＥＦ－ＤＫＯ細胞株を、ＴＧＦα切断ＥＬＩＳＡ分析に供した。これらのバリアントが適切に折り畳まれていることを示す指標として、全てのバリアントの機能性を証明するために、ヌクレオフェクションしたＴＧＦαのＰＭＡ誘導放出を評価した。この分析に使用した細胞は、ｉＲｈｏｍ１／２－／－ダブルノックアウトマウス胚線維芽細胞（実施例２に記載）のレスキューバリアントであり、それぞれのヒトｉＲｈｏｍ２バリアントの単一アミノ酸置換または欠失によってレスキューされているため、安定発現しているｉＲｈｏｍ２バリアントは、これらの細胞で発現している唯一のｉＲｈｏｍタンパク質であり、したがって、これらの細胞におけるＴＧＦαの切断に寄与している唯一のｉＲｈｏｍである。
単一アミノ酸置換または欠失を有する１３７個のヒトｉＲｈｏｍ２バリアントすべてを試験するために、上記の実施例に記載したように作製したこれらのバリアントを安定に発現するそれぞれのＭＥＦ－ＤＫＯ細胞株を、ＴＧＦα切断ＥＬＩＳＡ分析に供した。これらのバリアントが適切に折り畳まれていることを示す指標として、全てのバリアントの機能性を証明するために、ヌクレオフェクションしたＴＧＦαのＰＭＡ誘導放出を評価した。この分析に使用した細胞は、ｉＲｈｏｍ１／２－／－ダブルノックアウトマウス胚線維芽細胞（実施例２に記載）のレスキューバリアントであり、それぞれのヒトｉＲｈｏｍ２バリアントの単一アミノ酸置換または欠失によってレスキューされているため、安定発現しているｉＲｈｏｍ２バリアントは、これらの細胞で発現している唯一のｉＲｈｏｍタンパク質であり、したがって、これらの細胞におけるＴＧＦαの切断に寄与している唯一のｉＲｈｏｍである。
簡単に説明すると、１日目にＮｕｎｃ ｂｌａｃｋ ＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標） ９６－ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ＵＳＡ）にマウス抗ヒトＴＧＦα捕捉抗体（ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡキットの一部として提供）をＴＢＳ中４００ｎｇ／ｍｌで１ウェルあたり１００μｌ、４℃で一晩コートした。４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒシステム（Ｌｏｎｚａ、スイス）を用いて、ｐｃＤＮＡ３．１ベクターバックボーンにｈＴＧＦα－ＦＬ－ＷＴ構築物を、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５０２Ｒ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｎ５０３Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５０４Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｈ５０５Ｒ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｈ５０５Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５０６Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５０７Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｃ５０８Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｉ５０９Ｖ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｉ５０９Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５１０Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５１１Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５１２Ｌ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５１２Ｓ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５１２Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５１３Ｋ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５１３Ｅ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５１３Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５１４Ｅ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５１４Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５１５Ｅ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５１５Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｃ５１６Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５１７Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５１８Ｓ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５１８Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５１９Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｌ５２０Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５２１Ｓ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５２２Ｖ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５２２Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｆ５２３Ｗ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｆ５２３Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｖ５２４Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５２５Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｗ５２６Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５２７Ｐ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５２７Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５２８Ｎ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５２８Ｉ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５２８Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５２９Ｈ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５２９Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５３０Ｐ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５３０Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５３１Ｓ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５３１Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５３２Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５３３－－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５３３Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｍ５３４Ｓ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｍ５３４－－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｍ５３４Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５３５－－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５３５Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５３６－－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５３６Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５３７Ｅ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５３７Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５３８Ｌ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５３８Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｌ５３９Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５４０Ｓ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５４０Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５４１Ｈ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５４１Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５４２Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５４３Ｑ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５４３Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５４４Ｐ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５４４Ｑ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５４４Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５４５Ｆ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５４５Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５４６Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５４７Ｖ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５４７Ｓ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｖ５４８Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｃ５４９Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｈ５５０Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５５１Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５５２Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５５３Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５５４Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５５５Ｖ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５５５Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｃ５５６Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５５７Ｄ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５５７Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５５８Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５５９Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５６０Ｓ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５６１Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５６２Ｅ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５６２Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５６３Ｄ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５６３Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５６４Ｐ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５６４Ｓ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｈ５６５Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｉ５６６Ｅ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｉ５６６Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｗ５６７Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５６８Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５６９Ｅ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５６９Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５７０Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｉ５７１Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５７２Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５７３Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｗ５７４Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５７５Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｉ５７６Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｃ５７７Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５７８Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５７９Ｋ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５７９Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５８０Ｎ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５８０Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５８１Ｓ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５８２Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５８３Ｇ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５８３Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｎ５８４Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｈ５８５Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５８６Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５８７Ｎ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５８７Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｆ５８８Ｈ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｆ５８８Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｌ５８９Ｐ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｌ５８９Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｈ５９０Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｍ５９１Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５９２Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｃ５９３Ａ－Ｔ７およびＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５９４Ｖ－Ｔ７細胞にエレクトロポレーションした後、Ｆ底９６ウェル細胞培養プレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）の各ウェルに１００μｌの標準増殖培地中で、単一アミノ酸置換または欠失を有するヒトｉＲｈｏｍ２バリアントを持つ約３３、０００個のＭＥＦ－ＤＫＯ細胞を播種した。２日目、捕捉抗体溶液を除去し、ＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）プレートを１ウェルあたり３００μｌのＴＢＳ、１％ ＢＳＡで１時間室温でブロッキングした。一方、細胞をＰＢＳで１回洗浄した後、１ウェルあたり８０μｌのＯｐｔｉＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ＵＳＡ）を加えた。
その後、細胞（非刺激対照を除く）を、ＰＭＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ， ＵＳＡ）を最終濃度２５ｎｇ／ｍｌになるように１ウェルあたり２０μｌで３７℃、５％ ＣＯ2で１時間刺激した。２０μｌのＯｐｔｉＭＥＭ培地を刺激していない対照細胞に加えた。その後、９６－ウェルプレートを細胞を沈殿させるために遠心分離した。並行して、ブロッキング緩衝液をＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）プレートから除去し、９６ヘッドプレート洗浄機（スイス、テカングループ）上で１ウェルあたり３５０μｌのＴＢＳ－Ｔ （ドイツ、カール・ロス）でプレートを４回洗浄した。乾燥を避けるため、直ちにＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）プレートの各ウェルにＴＢＳ ３０μｌを添加した後、試料あたり無細胞上清７０μｌを移した。その後、３７．５ｎｇ／ｍｌのＴＢＳでビオチン化ヤギ抗ヒトＴＧＦα検出抗体（ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡキットの一部として提供）を１ウェルあたり１００μｌ添加し、直接光から保護し、プレートを室温で２時間インキュベートした。９６－ヘッドプレート洗浄機 （Ｔｅｃａｎ Ｇｒｏｕｐ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ、Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ）上でＴＢＳ－Ｔ （Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ、ドイツ）１ウェルあたり３５０μｌで４回洗浄し、４サイクル目以降は緩衝液の痕跡をすべて注意深く除去した後、ＴＢＳ中で１：１０，０００に希釈したストレプトアビジン－ＡＰ （Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）１００μｌを各ウェルに添加し、再び直接光から保護し、プレートを室温で３０分間インキュベートした。９６－ヘッドプレート洗浄機 （Ｔｅｃａｎ Ｇｒｏｕｐ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）上でＴＢＳ－Ｔ （Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ、ドイツ）１ウェルあたり３５０μｌで４回再洗浄し、４サイクル目以降は緩衝液の痕跡をすべて注意深く除去した後、室温暗所で１時間インキュベートするため、ＡｔｔｏＰｈｏｓ基質溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国）を１ウェルあたり１００μｌを添加した。ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ１０００ （Ｔｅｃａｎ Ｇｒｏｕｐ、スイス）マイクロプレートリーダーを用いて、各ウェルの蛍光を励起波長４３５ｎｍ、発光波長５５５ｎｍで収集した。
図１６ｂは、これらのＴＧＦα放出アッセイから得られた結果であり、１３７個のヒトｉＲｈｏｍ２バリアントのうち、単一アミノ酸置換または欠失した１２８個のバリアントは、ＴＧＦ αの切断がＰＭＡで誘導されることから機能的に活性であり、これらのバリアントが適切に折り畳まれていることを示す。ヒトｉＲｈｏｍ２バリアントｈｉＲ２－ＦＬ－Ｃ５１６Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｆ５２３Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｃ５４９Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５５２Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｃ５５６Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５５９Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｗ５６７Ａ－Ｔ７、ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｗ５７４Ａ－Ｔ７およびｈｉＲ２－ＦＬ－Ｃ５７７Ａ－Ｔ７は機能性を示さなかったか、ほとんど示さなかったので、さらなる解析から除外した。
エピトープマッピングを目的とした本発明の精製抗体の結合を特徴付けるためのＦＡＣＳ分析
簡単に言えば、不死化ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５０２Ｒ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｎ５０３Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５０４Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｈ５０５Ｒ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｈ５０５Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５０６Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５０７Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｃ５０８Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｉ５０９Ｖ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｉ５０９Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５１０Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５１１Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５１２Ｌ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５１２Ｓ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５１２Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５１３Ｋ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５１３Ｅ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５１３Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５１４Ｅ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５１４Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５１５Ｅ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５１５Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｃ５１６Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５１７Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５１８Ｓ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５１８Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５１９Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｌ５２０Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５２１Ｓ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５２２Ｖ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５２２Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｆ５２３Ｗ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｆ５２３Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｖ５２４Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５２５Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｗ５２６Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５２７Ｐ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５２７Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５２８Ｎ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５２８Ｉ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５２８Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５２９Ｈ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５２９Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５３０Ｐ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５３０Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５３１Ｓ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５３１Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５３２Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５３３－－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５３３Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｍ５３４Ｓ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｍ５３４－－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｍ５３４Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５３５－－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５３５Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５３６－－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５３６Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５３７Ｅ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５３７Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５３８Ｌ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５３８Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｌ５３９Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５４０Ｓ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５４０Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５４１Ｈ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５４１Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５４２Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５４３Ｑ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５４３Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５４４Ｐ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５４４Ｑ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５４４Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５４５Ｆ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５４５Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５４６Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５４７Ｖ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５４７Ｓ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｖ５４８Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｃ５４９Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｈ５５０Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５５１Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５５２Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５５３Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５５４Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５５５Ｖ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５５５Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｃ５５６Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５５７Ｄ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５５７Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５５８Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５５９Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５６０Ｓ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５６１Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５６２Ｅ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５６２Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５６３Ｄ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５６３Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５６４Ｐ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５６４Ｓ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｈ５６５Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｉ５６６Ｅ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｉ５６６Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｗ５６７Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５６８Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５６９Ｅ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５６９Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５７０Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｉ５７１Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５７２Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５７３Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｗ５７４Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５７５Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｉ５７６Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｃ５７７Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５７８Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５７９Ｋ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５７９Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５８０Ｎ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５８０Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５８１Ｓ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５８２Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５８３Ｇ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５８３Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｎ５８４Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｈ５８５Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５８６Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５８７Ｎ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５８７Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｆ５８８Ｈ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｆ５８８Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｌ５８９Ｐ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｌ５８９Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｈ５９０Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｍ５９１Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５９２Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｃ５９３Ａ－Ｔ７およびＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５９４Ｖ－Ｔ７細胞を、ＰＢＳ中１０ｍＭ ＥＤＴＡで回収し、洗浄してＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、３％ ＦＢＳ、０．０５％ アジ化ナトリウム）に再懸濁し、Ｎｕｎｃ Ｕ底９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）に１ウェル当たり約１ｘ１０5細胞で 播種した。細胞をペレット化し、上清を除去するために、プレートを１５００ｒｐｍ、４℃で３分間遠心分離した。一次染色では、細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液のみ（対照）、またはＦＡＣＳ緩衝液中３μｇ／ｍｌの本発明のヒト化抗体１６－Ｂ－０３、１６－Ｂ－０５、１６－Ｂ－０７、２３－Ｂ－０４、４２－Ｂ－０２および４２－Ｂ－０４のいずれか１ウェルあたり１００μｌに再懸濁し、氷上で１時間インキュベートした。その後、プレートを１５００ｒｐｍ、４℃で３分間遠心し、１ウェルあたり２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。二次染色では、細胞をスピンダウンし、ＦＡＣＳ緩衝液で１：１００に希釈したＰＥ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ´）２検出断片（Ｄｉａｎｏｖａ、ドイツ）を１ウェルあたり１００μｌ懸濁した。光から保護し、細胞懸濁液を氷上で１時間インキュベートした。その後、プレートを１５００ｒｐｍ、４℃で３分間遠心し、１ウェルあたり２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄した。最後に、細胞を１ウェルあたり１５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、ＢＤ ＡｃｃｕｒｉＴＭ Ｃ６ Ｐｌｕｓフローサイトメーター（ドイツ、ベクトン・ディッキンソン社製）を用いて分析した。
簡単に言えば、不死化ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５０２Ｒ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｎ５０３Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５０４Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｈ５０５Ｒ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｈ５０５Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５０６Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５０７Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｃ５０８Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｉ５０９Ｖ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｉ５０９Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５１０Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５１１Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５１２Ｌ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５１２Ｓ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５１２Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５１３Ｋ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５１３Ｅ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５１３Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５１４Ｅ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５１４Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５１５Ｅ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５１５Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｃ５１６Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５１７Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５１８Ｓ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５１８Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５１９Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｌ５２０Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５２１Ｓ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５２２Ｖ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５２２Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｆ５２３Ｗ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｆ５２３Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｖ５２４Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５２５Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｗ５２６Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５２７Ｐ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５２７Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５２８Ｎ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５２８Ｉ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５２８Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５２９Ｈ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５２９Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５３０Ｐ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５３０Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５３１Ｓ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５３１Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５３２Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５３３－－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５３３Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｍ５３４Ｓ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｍ５３４－－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｍ５３４Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５３５－－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５３５Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５３６－－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５３６Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５３７Ｅ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５３７Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５３８Ｌ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５３８Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｌ５３９Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５４０Ｓ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５４０Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５４１Ｈ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５４１Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５４２Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５４３Ｑ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５４３Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５４４Ｐ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５４４Ｑ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５４４Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５４５Ｆ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５４５Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５４６Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５４７Ｖ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５４７Ｓ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｖ５４８Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｃ５４９Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｈ５５０Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５５１Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５５２Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５５３Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５５４Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５５５Ｖ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５５５Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｃ５５６Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５５７Ｄ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５５７Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５５８Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５５９Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５６０Ｓ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５６１Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５６２Ｅ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５６２Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５６３Ｄ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５６３Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５６４Ｐ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５６４Ｓ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｈ５６５Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｉ５６６Ｅ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｉ５６６Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｗ５６７Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５６８Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５６９Ｅ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５６９Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５７０Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｉ５７１Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５７２Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５７３Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｗ５７４Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｐ５７５Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｉ５７６Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｃ５７７Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５７８Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５７９Ｋ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５７９Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５８０Ｎ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｑ５８０Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ａ５８１Ｓ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｒ５８２Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５８３Ｇ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｓ５８３Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｎ５８４Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｈ５８５Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｔ５８６Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５８７Ｎ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｇ５８７Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｆ５８８Ｈ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｆ５８８Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｌ５８９Ｐ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｌ５８９Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｈ５９０Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｍ５９１Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｄ５９２Ａ－Ｔ７、ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｃ５９３Ａ－Ｔ７およびＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｅ５９４Ｖ－Ｔ７細胞を、ＰＢＳ中１０ｍＭ ＥＤＴＡで回収し、洗浄してＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、３％ ＦＢＳ、０．０５％ アジ化ナトリウム）に再懸濁し、Ｎｕｎｃ Ｕ底９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）に１ウェル当たり約１ｘ１０5細胞で 播種した。細胞をペレット化し、上清を除去するために、プレートを１５００ｒｐｍ、４℃で３分間遠心分離した。一次染色では、細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液のみ（対照）、またはＦＡＣＳ緩衝液中３μｇ／ｍｌの本発明のヒト化抗体１６－Ｂ－０３、１６－Ｂ－０５、１６－Ｂ－０７、２３－Ｂ－０４、４２－Ｂ－０２および４２－Ｂ－０４のいずれか１ウェルあたり１００μｌに再懸濁し、氷上で１時間インキュベートした。その後、プレートを１５００ｒｐｍ、４℃で３分間遠心し、１ウェルあたり２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。二次染色では、細胞をスピンダウンし、ＦＡＣＳ緩衝液で１：１００に希釈したＰＥ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ´）２検出断片（Ｄｉａｎｏｖａ、ドイツ）を１ウェルあたり１００μｌ懸濁した。光から保護し、細胞懸濁液を氷上で１時間インキュベートした。その後、プレートを１５００ｒｐｍ、４℃で３分間遠心し、１ウェルあたり２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄した。最後に、細胞を１ウェルあたり１５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、ＢＤ ＡｃｃｕｒｉＴＭ Ｃ６ Ｐｌｕｓフローサイトメーター（ドイツ、ベクトン・ディッキンソン社製）を用いて分析した。
図１７ａは、この実験の代表的な結果を示す。例として、単一アミノ酸置換または欠失を有する１２８個の機能的ヒトｉＲｈｏｍ２バリアントのパネル全体について、ヒトｉＲｈｏｍ２バリアントｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５３６Ａ－Ｔ７を発現する細胞の解析データを示す。ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７細胞（左）およびＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－Ｋ５３６Ａ－Ｔ７細胞（右）における、本発明の抗体の代表例としてのヒト化抗体４２－Ｂ－０２（黒）および抗マウスＩｇＧ二次抗体（灰色）の結合解析は、ヒトｉＲｈｏｍ２の単一アミノ酸リジン５３６のアラニンによる置換が、ヒトｉＲｈｏｍ２の結合を強く阻害し、したがって、本発明のヒト化抗体４２－Ｂ－０２の結合に寄与している（右）ことを示す。ＭＥＦ－ＤＫＯ－ｈｉＲ２－ＦＬ－ＷＴ－Ｔ７細胞（左）への結合は、ヒト化抗体４２－Ｂ－０２の陽性対照として使用した。
図１７ｂは、図１７ａの拡張として、単一アミノ酸置換または欠失を有するヒトｉＲｈｏｍ２バリアントを発現する１２８個の操作された機能的ＭＥＦ集団のパネル全体に対する本発明のヒト化抗体１６－Ｂ－０３、１６－Ｂ－０５、１６－Ｂ－０７、２３－Ｂ－０４、４２－Ｂ－０２および４２－Ｂ－０４のＦＡＣＳ分析の結果を要約したものである。各抗体のヒト ｉＲｈｏｍ２ 野生型に対する結合率は １００％とする。任意のバリアントに対する抗体結合が３０～５９％低下したものは薄い灰色で表示され（「１」と表示）、６０～９５％低下したものは灰色で表示され（「２」と表示）、９５％以上低下したものは濃い灰色で表示される（「３」と表示）。これらのデータは、本発明のヒト化抗体１６－Ｂ－０３、１６－Ｂ－０５、１６－Ｂ－０７、２３－Ｂ－０４、４２－Ｂ－０２および４２－Ｂ－０４の結合に関連するアミノ酸位置の関連パターンを明らかにしている。
実施例１５：ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける健常人ドナーの初代ヒト材料におけるＬＰＳ誘導ＴＮＦα 切断に対する本発明の抗体の阻害効果の解析
以下の研究において、ＥＬＩＳＡに基づくＴＮＦα放出アッセイを実施し、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を用いて、健康なドナーから得た一次ヒト材料からの内因性ＴＮＦαのＬＰＳ誘導放出に対する本発明の抗体の阻害効果を分析した。
以下の研究において、ＥＬＩＳＡに基づくＴＮＦα放出アッセイを実施し、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を用いて、健康なドナーから得た一次ヒト材料からの内因性ＴＮＦαのＬＰＳ誘導放出に対する本発明の抗体の阻害効果を分析した。
本実施例で用いたＥＬＩＳＡベースのＴＮＦα放出アッセイを以下に記述する。
簡単に説明すると、１日目にＮｕｎｃ ｂｌａｃｋ ＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）９６－ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）に、マウス抗ヒトＴＮＦα捕捉抗体（ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡキットの一部として提供）を４μｇ／ｍｌ ＴＢＳで１ウェルあたり１００μｌ、４℃で一晩コートした。２日目、捕捉抗体溶液を除去し、ＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）プレートを１ウェルあたり３００μｌのＴＢＳ、１％ ＢＳＡで３時間室温でブロッキングした。一方、８０μｌの通常増殖培地中の、健康なドナーの２０、０００個のＰＢＭＣ細胞（ＲｅａｃｈＢｉｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ， ＵＳＡ）を、Ｇｒｅｉｎｅｒ ＣＥＬＬＳＴＡＲ Ｖ底９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ、ドイツ）の各ウェルに播種し、陽性対照として５０μＭのＢａｔｉｍａｓｔａｔ（ＢＢ９４、Ａｂｃａｍ、英国）（得られた１００μｌサンプル容量中の最終濃度は１０μＭ）、アイソタイプコントロールとして１５μｇ／ｍｌのヒトＩｇＧ１ ｋａｐｐａ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、ＵＳＡ）（最終濃度３μｇ／ｍｌ、サンプル量１００μｌ）、または本発明の抗体を１５μｇ／ｍｌ（最終濃度３μｇ／ｍｌ、サンプル量１００μｌ）を添加した標準増殖培地（ウェルあたり２０μｌ）で、３７℃、５％ＣＯ2で３０分間プレインキュベートした。刺激対象の場合は、試験品を含まない標準増殖培地２０μｌを加えた。その後、細胞（非刺激対照を除く）を、ＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ， ＵＳＡ）を０．０６ｎｇ／ｍｌの増殖培地で最終濃度０．０１ｇ／ｍｌになるように１ウェルあたり２０μｌで３７℃、５％ ＣＯ2で２時間刺激した。その後、９６－ウェルプレートを細胞を沈殿させるために遠心分離した。並行して、ブロッキング緩衝液をＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）プレートから除去し、９６ヘッドプレート洗浄機（スイス、テカングループ）上で１ウェルあたり３５０μｌのＴＢＳ－Ｔ （ドイツ、カール・ロス）でプレートを４回洗浄した。乾燥を避けるため、直ちにＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）プレートの各ウェルにＴＢＳ ３０μｌを添加した後、試料あたり無細胞上清７０μｌを移した。さらに、ＴＢＳで規定濃度に希釈した組換えヒトＴＮＦαタンパク質（ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡキットの一部として提供）１００μｌを標準参照としてプレートに添加した。その後、５０ｎｇ／ｍｌのＴＢＳでビオチン化ヤギ抗ヒトＴＮＦα検出抗体（ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡキットの一部として提供）を１ウェルあたり１００μｌ添加し、直接光から保護し、プレートを室温で２時間インキュベートした。９６－ヘッドプレート洗浄機 （Ｔｅｃａｎ Ｇｒｏｕｐ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ、Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ）上でＴＢＳ－Ｔ （Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ、ドイツ）１ウェルあたり３５０μｌで４回洗浄し、４サイクル目以降は緩衝液の痕跡をすべて注意深く除去した後、ＴＢＳ中で１：１０，０００に希釈したストレプトアビジン－ＡＰ （Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）１００μｌを各ウェルに添加し、再び直接光から保護し、プレートを室温で３０分間インキュベートした。９６－ヘッドプレート洗浄機 （Ｔｅｃａｎ Ｇｒｏｕｐ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）上でＴＢＳ－Ｔ （Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ、ドイツ）１ウェルあたり３５０μｌで４回再洗浄し、４サイクル目以降は緩衝液の痕跡をすべて注意深く除去した後、室温暗所で１時間インキュベートするため、ＡｔｔｏＰｈｏｓ基質溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国）を１ウェルあたり１００μｌを添加した。ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ１０００ （Ｔｅｃａｎ Ｇｒｏｕｐ、スイス）マイクロプレートリーダーを用いて、各ウェルの蛍光を励起波長４３５ｎｍ、発光波長５５５ｎｍで収集した。
図１８は、健康なドナーのＰＢＭＣからのＬＰＳ誘導ＴＮＦα放出に対する試験品の効果を、絶対数（図１８ａ）および阻害率（図１８ｂ）で示した、この実験の代表的な結果である。メタロプロテアーゼの低分子阻害剤であるＢａｔｉｍａｓｔａｔ（ＢＢ９４）は陽性対照として機能し、ＬＰＳ誘導のＴＮＦα放出を９８．９％阻害したが、ＩｇＧアイソタイプコントロールの存在はＴＮＦα切断に有意な影響を及ぼさなかった。対照的に、等濃度の本発明のヒト化抗体１６－Ｂ－０３、１６－Ｂ－０５、１６－Ｂ－０７、２３－Ｂ－０４、４２－Ｂ－０２および４２－Ｂ－０４は、それぞれ７４．２％、７３．５％、７２．８％、５９．４％、６４．３％および６８．５％、健常ドナーのＰＢＭＣからのＬＰＳ誘導ＴＮＦα放出を阻害する。
実施例１６：ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける健常人ドナーの初代ヒト材料におけるＰＭＡ誘導ＩＬ－６Ｒ切断に対する本発明の抗体の阻害効果の解析
以下の研究において、ＥＬＩＳＡに基づくＩＬ－６Ｒ放出アッセイを実施し、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を用いて、健康なドナーから得た一次ヒト材料からの内因性ＩＬ－６ＲのＰＭＡ誘導放出に対する本発明の抗体の阻害効果を分析した。
以下の研究において、ＥＬＩＳＡに基づくＩＬ－６Ｒ放出アッセイを実施し、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を用いて、健康なドナーから得た一次ヒト材料からの内因性ＩＬ－６ＲのＰＭＡ誘導放出に対する本発明の抗体の阻害効果を分析した。
この実施例で用いたＥＬＩＳＡベースのＩＬ－６Ｒ放出アッセイを以下に記述する。
簡単に説明すると、１日目にＮｕｎｃ ｂｌａｃｋ ＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）９６－ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）に、マウス抗ヒトＩＬ－６Ｒ捕捉抗体（ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡキットの一部として提供）を２μｇ／ｍｌ ＴＢＳで１ウェルあたり１００μｌ、４℃で一晩コートした。
８０μｌの通常増殖培地中の、健康なドナーの４００００個のＰＢＭＣ細胞（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｃａｎａｄａ）を、Ｇｒｅｉｎｅｒ ＣＥＬＬＳＴＡＲ Ｖ底９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ、ドイツ）の各ウェルに播種し、陽性対照として５０μＭのＢａｔｉｍａｓｔａｔ（ＢＢ９４、Ａｂｃａｍ、英国）（得られた１００μｌサンプル容量中の最終濃度は１０μＭ）、アイソタイプコントロールとして１５μｇ／ｍｌのヒトＩｇＧ１ ｋａｐｐａ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、ＵＳＡ）（最終濃度３μｇ／ｍｌ、サンプル量１００μｌ）、または本発明の抗体を１５μｇ／ｍｌ（最終濃度３μｇ／ｍｌ、サンプル量１００μｌ）を添加した標準増殖培地（ウェルあたり２０μｌ）で、３７℃、５％ＣＯ2で３０分間プレインキュベートした。刺激対象の場合は、試験品を含まない標準増殖培地２０μｌを加えた。その後、細胞（非刺激対照を除く）を、ＰＭＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ， ＵＳＡ）を１５０ｎｇ／ｍｌの増殖培地で最終濃度２５ｎｇ／ｍｌになるように１ウェルあたり２０μｌで３７℃、５％ ＣＯ2で２４時間刺激した。
２日目、捕捉抗体溶液を除去し、ＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）プレートを１ウェルあたり３００μｌのＴＢＳ、１％ ＢＳＡで２時間室温でブロッキングした。
一方、９６－ウェルプレートを細胞を沈殿させるために遠心分離した。並行して、ブロッキング緩衝液をＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）プレートから除去し、９６ヘッドプレート洗浄機（スイス、テカングループ）上で１ウェルあたり３５０μｌのＴＢＳ－Ｔ （ドイツ、カール・ロス）でプレートを４回洗浄した。乾燥を避けるため、直ちにＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）プレートの各ウェルにＴＢＳ ３０μｌを添加した後、試料あたり無細胞上清７０μｌを移した。さらに、ＴＢＳで規定濃度に希釈した組換えヒトＩＬ－６Ｒタンパク質（ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡキットの一部として提供）１００μｌを標準参照としてプレートに添加した。プレートを室温で２時間インキュベートした。９６ヘッドプレート洗浄機（Ｔｅｃａｎ Ｇｒｏｕｐ、スイス）で、１ウェルあたり３５０μｌのＴＢＳ－Ｔ（Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ、ドイツ）で４回洗浄し、４回目のサイクルの後にすべての緩衝液の痕跡を注意深く除去した後、１ウェルあたり１００μｌのビオチン化ヤギ抗ヒトＩＬ－６Ｒ検出抗体（ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡキットの一部として提供）を１００ｎｇ／ｍｌ ＴＢＳで添加し、直射日光を避けて、プレートを室温で２時間インキュベートした。９６－ヘッドプレート洗浄機 （Ｔｅｃａｎ Ｇｒｏｕｐ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ、Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ）上でＴＢＳ－Ｔ （Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ、ドイツ）１ウェルあたり３５０μｌで４回洗浄し、４サイクル目以降は緩衝液の痕跡をすべて注意深く除去した後、ＴＢＳ中で１：１０，０００に希釈したストレプトアビジン－ＡＰ （Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）１００μｌを各ウェルに添加し、再び直接光から保護し、プレートを室温で３０分間インキュベートした。９６－ヘッドプレート洗浄機 （Ｔｅｃａｎ Ｇｒｏｕｐ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）上でＴＢＳ－Ｔ （Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ、ドイツ）１ウェルあたり３５０μｌで４回再洗浄し、４サイクル目以降は緩衝液の痕跡をすべて注意深く除去した後、室温暗所で１時間インキュベートするため、ＡｔｔｏＰｈｏｓ基質溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国）を１ウェルあたり１００μｌを添加した。ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ１０００ （Ｔｅｃａｎ Ｇｒｏｕｐ、スイス）マイクロプレートリーダーを用いて、各ウェルの蛍光を励起波長４３５ｎｍ、発光波長５５５ｎｍで収集した。
図１９は、健康なドナーのＰＢＭＣからのＩＬ－６ＲのＰＭＡ誘導放出に対する試験品の効果を、絶対数（図１９ａ）および阻害率（図１９ｂ）で示す、この実験の代表的な結果を示す。メタロプロテアーゼの低分子阻害剤であるＢａｔｉｍａｓｔａｔ（ＢＢ９４）は陽性対照として機能し、ＰＭＡ誘導のＩＬ－６Ｒ放出を９６．２％阻害したが、ＩｇＧアイソタイプコントロールの存在はＩＬ－６Ｒ切断に有意な影響を及ぼさなかった。対照的に、等濃度の本発明のヒト化抗体１６－Ｂ－０３、１６－Ｂ－０５、１６－Ｂ－０７、２３－Ｂ－０４、４２－Ｂ－０２および４２－Ｂ－０４は、それぞれ７５．０％、７９．０％、７５．４％、６４．６％、７３．４％および７８．４％、健常ドナーのＰＢＭＣからのＰＭＡ誘導ＩＬ－６Ｒ放出を阻害する。
実施例１７：ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける健常人ドナーの初代ヒト材料におけるＰＭＡ誘導ＨＢ－ＥＧＦ切断に対する本発明の抗体の阻害効果の解析
以下の研究において、ＥＬＩＳＡに基づくＨＢ－ＥＧＦ放出アッセイを実施し、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を用いて、健康なドナーから得た一次ヒト材料からの内因性ＨＢ－ＥＧＦのＰＭＡ誘導放出に対する本発明の抗体の阻害効果を分析した。
以下の研究において、ＥＬＩＳＡに基づくＨＢ－ＥＧＦ放出アッセイを実施し、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を用いて、健康なドナーから得た一次ヒト材料からの内因性ＨＢ－ＥＧＦのＰＭＡ誘導放出に対する本発明の抗体の阻害効果を分析した。
本実施例で用いたＥＬＩＳＡベースのＨＢ－ＥＧＦ放出アッセイを以下に記述する。
簡単に説明すると、１日目にＮｕｎｃ ｂｌａｃｋ ＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）に、マウス抗ヒトＨＢ－ＥＧＦ捕捉抗体（ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡキットの一部として提供）を２μｇ／ｍｌ ＴＢＳで１ウェルあたり１００μｌ、４℃で一晩コートした。
８０μｌの通常増殖培地中の、健康なドナーの８００００個のＰＢＭＣ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｃａｎａｄａ）を、Ｇｒｅｉｎｅｒ ＣＥＬＬＳＴＡＲ Ｖ底９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ、ドイツ）の各ウェルに播種し、陽性対照として５０μＭのＢａｔｉｍａｓｔａｔ（ＢＢ９４、Ａｂｃａｍ、英国）（得られた１００μｌサンプル容量中の最終濃度は１０μＭ）、アイソタイプコントロールとして１５μｇ／ｍｌのヒトＩｇＧ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、ＵＳＡ）（最終濃度３μｇ／ｍｌ、サンプル量１００μｌ）、または本発明の抗体を１５μｇ／ｍｌ（最終濃度３μｇ／ｍｌ、サンプル量１００μｌ）を添加した標準増殖培地（ウェルあたり２０μｌ）で、３７℃、５％ＣＯ2で３０分間プレインキュベートした。刺激対象の場合は、試験品を含まない標準増殖培地２０μｌを加えた。その後、細胞（非刺激対照を除く）を、ＰＭＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ， ＵＳＡ）を１５０ｎｇ／ｍｌの増殖培地で最終濃度２５ｎｇ／ｍｌになるように１ウェルあたり２０μｌで３７℃、５％ ＣＯ2で２４時間刺激した。２日目、捕捉抗体溶液を除去し、ＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）プレートを１ウェルあたり３００μｌのＴＢＳ、１％ ＢＳＡで２時間室温でブロッキングした。
一方、９６－ウェルプレートを細胞を沈殿させるために遠心分離した。並行して、ブロッキング緩衝液をＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）プレートから除去し、９６ヘッドプレート洗浄機（スイス、テカングループ）上で１ウェルあたり３５０μｌのＴＢＳ－Ｔ （ドイツ、カール・ロス）でプレートを４回洗浄した。乾燥を避けるため、直ちにＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標）プレートの各ウェルにＴＢＳ ３０μｌを添加した後、試料あたり無細胞上清７０μｌを移した。さらに、ＴＢＳで規定濃度に希釈した組換えヒトＨＢ－ＥＧＦタンパク質（ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡキットの一部として提供）１００μｌを標準参照としてプレートに添加した。プレートを室温で２時間インキュベートした。９６ヘッドプレート洗浄機（Ｔｅｃａｎ Ｇｒｏｕｐ、スイス）で、１ウェルあたり３５０μｌのＴＢＳ－Ｔ（Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ、ドイツ）で４回洗浄し、４回目のサイクルの後にすべての緩衝液の痕跡を注意深く除去した後、１ウェルあたり１００μｌのビオチン化ヤギ抗ヒトＨＢ－ＥＧＦ検出抗体（ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡキットの一部として提供）を５０ｎｇ／ｍｌ ＴＢＳで添加し、直射日光を避けて、プレートを室温で２時間インキュベートした。
９６－ヘッドプレート洗浄機 （Ｔｅｃａｎ Ｇｒｏｕｐ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ、Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ）上でＴＢＳ－Ｔ （Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ、ドイツ）１ウェルあたり３５０μｌで４回洗浄し、４サイクル目以降は緩衝液の痕跡をすべて注意深く除去した後、ＴＢＳ中で１：１０，０００に希釈したストレプトアビジン－ＡＰ （Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）１００μｌを各ウェルに添加し、再び直接光から保護し、プレートを室温で３０分間インキュベートした。９６－ヘッドプレート洗浄機 （Ｔｅｃａｎ Ｇｒｏｕｐ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）上でＴＢＳ－Ｔ （Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ、ドイツ）１ウェルあたり３５０μｌで４回再洗浄し、４サイクル目以降は緩衝液の痕跡をすべて注意深く除去した後、室温暗所で１時間インキュベートするため、ＡｔｔｏＰｈｏｓ基質溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国）を１ウェルあたり１００μｌを添加した。ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ１０００ （Ｔｅｃａｎ Ｇｒｏｕｐ、スイス）マイクロプレートリーダーを用いて、各ウェルの蛍光を励起波長４３５ｎｍ、発光波長５５５ｎｍで収集した。
図２０は、健康なドナーのＰＢＭＣからのＨＢ－ＥＧＦのＰＭＡ誘導放出に対する試験品の効果を、絶対数（図２０ａ）および阻害率（図２０ｂ）で示す、この実験の代表的な結果を示す。メタロプロテアーゼの低分子阻害剤であるＢａｔｉｍａｓｔａｔ（ＢＢ９４）は陽性対照として機能し、ＰＭＡ誘導のＨＢ－ＥＧＦ放出を１００．０％阻害したが、ＩｇＧアイソタイプコントロールの存在はＨＢ－ＥＧＦ切断に有意な影響を及ぼさなかった。対照的に、等濃度の本発明のヒト化抗体１６－Ｂ－０３、１６－Ｂ－０５、１６－Ｂ－０７、２３－Ｂ－０４、４２－Ｂ－０２および４２－Ｂ－０４は、それぞれ６９．７％、７４．８％、６６．５％、４９．６％、５９．２％および６６．７％、健常ドナーのＰＢＭＣからのＰＭＡ誘導ＨＢ－ＥＧＦ放出を阻害する。
実施例１８：ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＬＰＳ誘導ＴＮＦα切断に対する本発明の抗体の阻害効果の解析
以下の研究では、敗血症性ショックのマウスモデルにおいて、ＬＰＳ誘導内因性ＴＮＦα放出に対する本発明の抗体の阻害効果を確認するために、ＥＬＩＳＡベースのＴＮＦα放出アッセイを行った。実験は、マウスゲノムｉＲｈｏｍ２ ＤＮＡの一部（抗体結合部位をコードするエクソン）を対応するヒトゲノムＤＮＡ配列に置き換えた遺伝子ヒト化マウスを用いて行われた。すべての動物実験は、Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｆｏｒ Ｓｐｅｃｉａｌ ＳｕｒｇｅｒｙおよびＷｅｉｌｌ Ｃｏｒｎｅｌｌ ＭｅｄｉｃｉｎｅのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅの承認を得た。
以下の研究では、敗血症性ショックのマウスモデルにおいて、ＬＰＳ誘導内因性ＴＮＦα放出に対する本発明の抗体の阻害効果を確認するために、ＥＬＩＳＡベースのＴＮＦα放出アッセイを行った。実験は、マウスゲノムｉＲｈｏｍ２ ＤＮＡの一部（抗体結合部位をコードするエクソン）を対応するヒトゲノムＤＮＡ配列に置き換えた遺伝子ヒト化マウスを用いて行われた。すべての動物実験は、Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｆｏｒ Ｓｐｅｃｉａｌ ＳｕｒｇｅｒｙおよびＷｅｉｌｌ Ｃｏｒｎｅｌｌ ＭｅｄｉｃｉｎｅのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅの承認を得た。
１日目に、１群のマウスに本発明の抗体を２００μＬ ＰＢＳ中２５０μｇ／ｋｇの濃度で注射した。もう１つのグループには、同量のＰＢＳのみを注射した（マウス１匹につき２００μｌのＰＢＳ）。１時間後、すべてのマウスにＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）をマウス１匹あたり５０μｇ／２００μＬ（２５０ｎｇ／μＬ）の濃度で注射した。すべてのマウスを注意深く観察し、２時間後にＣＯ2吸入により安楽死させた。胸腔から血液を取り出し、４０００ｇ、室温で１０分間遠心分離し、細胞や残骸を除去した。透明な血清は新しいチューブに移され、その後ＥＬＩＳＡ測定用にＰＢＳで１：１０に希釈された。
ＴＮＦα放出の測定には、Ｍｏｕｓｅ ＴＮＦ－α Ｕｎｃｏａｔｅｄ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を用いた。簡単に説明すると、１日目にＣｏｓｔａｒ（登録商標） ９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＵＳＡ）に抗マウスＴＮＦα捕捉抗体（ＥＬＩＳＡキットの一部として提供）を１ウェル当たり１００μｌ、ＰＢＳ中１：２５０で４℃にて一晩コートした。２日目、捕捉抗体溶液を除去し、Ｃｏｓｔａｒ（登録商標） プレートを Ｎｕｎｃ Ｉｍｍｕｎｏｗａｓｈ ｐｌａｔｅ ｗａｓｈｅｒ （ＶＷＲ、ＵＳＡ）を用いて１ウェルあたり２５０μｌのＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ ０．０５％ （Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏ、ＵＳＡ）で３回洗浄し、プレートを１５０μｌのＥＬＩＳＡ／ＥＬＩＳＰＯＴ Ｄｉｌｕｅｎｔ （１Ｘ）（キットの一部として提供）で１時間ブロッキングした。その後、Ｃｏｓｔａｒ（登録商標） プレートからブロッキング緩衝液を除去し、Ｎｕｎｃ Ｉｍｍｕｎｏｗａｓｈ ｐｌａｔｅ ｗａｓｈｅｒ（ＶＷＲ、米国）を用いて、１ウェルあたり２５０μｌのＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ ０．０５％（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏ、米国）でプレートを３回洗浄した。その直後に、ビオチン化抗マウス ＴＮＦα 検出抗体（ＥＬＩＳＡ キットの一部として提供）２０μｌ を ＥＬＩＳＡ／ＥＬＩＳＰＯＴ 希釈液で最終希釈倍率 １：２５０ ですべてのウェルに添加した。次に、８０μｌの透明な、１：１０に希釈した血清、または８０μｌの組換えマウスＴＮＦαタンパク質（ＥＬＩＳＡキットの一部として提供される）の標準リファレンスをＥＬＩＳＡ／ＥＬＩＳＰＯＴ Ｄｉｌｕｅｎｔで規定濃度に希釈したものをプレートに加えた。サンプル、標準品、検出抗体を室温で２時間インキュベートした。Ｎｕｎｃ Ｉｍｍｕｎｏｗａｓｈ ｐｌａｔｅ ｗａｓｈｅｒ （ＶＷＲ， ＵＳＡ）を用いて、１ウェルあたり２５０μｌのＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ ０．０５％ （Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏ， ＵＳＡ）で３回洗浄し、３回目のサイクルの後にすべての緩衝液の痕跡を注意深く除去した後、ＥＬＩＳＡ／ＥＬＩＳＰＯＴ Ｄｉｌｕｅｎｔで１：１００に希釈した１００μｌのストレプトアビジン－西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート（ＥＬＩＳＡキットの一部として提供）を各ウェルに添加し、プレートを室温で３０分間インキュベートした。Ｎｕｎｃ Ｉｍｍｕｎｏｗａｓｈ ｐｌａｔｅ ｗａｓｈｅｒ （ＶＷＲ、ＵＳＡ）を用いて、１ウェルあたり２５０μｌのＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ ０．０５％ （Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏ、ＵＳＡ）で３回洗浄し、３回目の洗浄後に緩衝液の痕跡を注意深く除去した後、１ウェルあたり１００μｌのＴＭＢ基質溶液（ＢＤ、ＵＳＡ）を加えて１５分間インキュベートした。１００μｌの２Ｎ硫酸（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）を加えて発色反応を止め、Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ Ｔｉｔｅｒｔｅｋ Ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（ＶＷＲ、ＵＳＡ）を用いてＥＬＩＳＡプレートの波長４５０ｎｍを読み取った。
図２１は、遺伝子的にヒト化されたマウスの血清中のＴＮＦαのＬＰＳ誘導放出に対する試験品の効果を、絶対数（図２１ａ）および放出率（図２１ｂ）で示す、この実験の代表的な結果である。遺伝的にヒト化したマウスの血清中のＬＰＳによるＴＮＦαの放出を１００％とすると、本発明の抗体の代表例としてのヒト化抗体４２－Ｂ－０２は、遺伝的にヒト化したマウスの血清中のＬＰＳ誘導ＴＮＦαの放出を１７．３％とする。
参考文献
配列
下記の配列は、本出願の開示の一部を形成する。ＷＩＰＯ ＳＴ ２５互換性のある電子化配列表もまた、この出願と共に提供される。疑義を避けるため、以下の表中の配列と電子化配列表中の配列との間に齟齬が存在する場合、この表中の配列は正しいものとみなされるものとする。
下記の配列は、本出願の開示の一部を形成する。ＷＩＰＯ ＳＴ ２５互換性のある電子化配列表もまた、この出願と共に提供される。疑義を避けるため、以下の表中の配列と電子化配列表中の配列との間に齟齬が存在する場合、この表中の配列は正しいものとみなされるものとする。
Claims (20)
- ｉＲｈｏｍ２に結合するヒト化抗体、または標的結合断片もしくは標的結合能を保持するその誘導体であって、
ａ）以下の重鎖／軽鎖可変ドメイン配列ペアのうちの１つを含む３つの重鎖および３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）のセットを含むか、
配列番号１および５、
配列番号９および１３、
配列番号１７および２１、
配列番号２５および２９、
配列番号３３および３７、または
配列番号４１および４５、
ｂ）以下から選択される３つの重鎖および３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）のセットを含むか、
配列番号２、３、４、６、７および８、
配列番号１０、１１、１２、１４、１５および１６、
配列番号１８、１９、２０、２２、２３および２４、
配列番号２６、２７、２８、３０、３１および３２、
配列番号３４、３５、３６、３８、３９および４０、または
配列番号４２、４３、４４、４６、４７および４８、
ｃ） ｂ）の重鎖／軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）のセットであって、ただし、ＣＤＲの少なくとも１つは、それぞれの配列番号に対して最大３個のアミノ酸置換を有する、セットを含むか、
ｄ） ｂ）またはｃ）の重鎖／軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）のセットであって、ただし、ＣＤＲの少なくとも１つは、それぞれの配列番号に対して６６％以上の配列同一性を有する、セットを含み、
ＣＤＲは、ヒトｉＲｈｏｍ２と結合できるように、適切なタンパク質フレームワーク、好ましくは可変ドメインフレームワークに埋め込まれている、
ヒト化抗体、または標的結合断片もしくは標的結合能を保持するその誘導体。 - ＣＤＲはＫａｂａｔ、ＣｈｏｔｈｉａまたはＭａｃＣａｌｌｕｍの定義に従って決定され、好ましくは、ＣＤＲは表１に示す番号付けに従って決定される、請求項１に記載の抗体または断片。
- ａ） 以下の配列番号のペアで示される重鎖／軽鎖可変ドメイン（ＨＣＶＤ／ＬＣＶＤ）のペア、
１および５、
９および１３、
１７および２１、
２５および２９、
３３および３７、ならびに／または
４１および４５、
ｂ） ａ）の重鎖／軽鎖可変ドメイン（ＨＣＶＤ／ＬＣＶＤ）のペアであって、但し
ＨＣＶＤは、それぞれの配列番号に対して８０％以上の配列同一性を有し、および／または
ＬＣＤＶＤは、それぞれの配列番号に対して８０％以上の配列同一性を有する、ペア、
ｃ） ａ）またはｂ）の重鎖／軽鎖可変ドメイン（ＶＤ）ペアであって、但しＨＣＶＤまたはＬＣＶＤの少なくとも１つが、それぞれの配列番号に対して最大１０個のアミノ酸置換を有する、ペアを含み、
前記抗体または断片は、ヒトｉＲｈｏｍ２に結合し、および／またはＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７活性を阻害もしくは低下させることができる、
請求項１～２のいずれか１項に記載の抗体または断片。 - 少なくとも１つのアミノ酸置換が保存的アミノ酸置換である、請求項１～３のいずれか１項に記載の抗体または断片。
- 以下の少なくとも１つを有する、前述の請求項のいずれか１項に記載の抗体または断片。
前述の請求項のいずれか１項に記載の抗体または断片と比較して、ヒトｉＲｈｏｍ２に対する標的結合親和性が５０％以上であるか、および／または
前述の請求項のいずれか１項に記載の抗体または断片のＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７活性に対する阻害または低下効果の５０％以上である。 - ヒトｉＲｈｏｍ２に結合し、ヒトｉＲｈｏｍ２との結合を
ａ） 請求項１～５のいずれか１項に記載の抗体、または
ｂ） クローン１６－Ｂ－０３、１６－Ｂ－０５、１６－Ｂ－０７、２３－Ｂ－０４、４２－Ｂ－０２、および／または４２－Ｂ－０４からなる群から選択される抗体
と競合するヒト化抗体。 - ａ） 請求項１～５のいずれか１項に記載の抗体、または
ｂ） クローン１６－Ｂ－０３、１６－Ｂ－０５、１６－Ｂ－０７、２３－Ｂ－０４、４２－Ｂ－０２、および／または４２－Ｂ－０４からなる群から選択される抗体
と本質的に同じヒトｉＲｈｏｍ２上の領域、または同じ領域に結合するヒト化抗体。 - ヒトｉＲｈｏｍ２に結合すると、少なくともそのループ１の領域内に結合する、前述の請求項のいずれか１項に記載の抗体または断片。
- ＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７活性の阻害または低下が、ｉＲｈｏｍ２媒介性のＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７活性化の干渉によって引き起こされる、前述の請求項のいずれか１項に記載の抗体または断片。
- ヒトｉＲｈｏｍ２と結合すると、
誘導されたＴＮＦα切断を阻害または低下させるか、
誘導されたＩＬ－６Ｒ切断を阻害または低下させるか、および／または
誘導されたＨＢ－ＥＧＦ切断を阻害または低下させる、
前述の請求項のいずれか１項に記載の抗体または断片。 - 抗体または断片が結合するヒトｉＲｈｏｍ２が、
ａ） 配列番号４９に記載のアミノ酸配列、または
ｂ） 配列番号４９と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、但しｉＲｈｏｍ２活性を維持するアミノ酸配列
を含む、
前述の請求項のいずれか１項に記載の抗体または断片。 - モノクローナル抗体、または標的結合断片もしくは標的結合能を保持するその誘導体である、前述の請求項のいずれか１項に記載の抗体または断片。
- ＩｇＧ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、または（Ｆａｂ）２からなる群より選択されるフォーマットの少なくとも１つにおける抗体である、前述の請求項のいずれか１項に記載の抗体または断片。
- ヒトｉＲｈｏｍ１と交差反応性を示さない、前述の請求項のいずれか１項に記載の抗体または断片。
- 前述の請求項のいずれか１項に記載の抗体または断片の少なくとも１つの鎖をコードする核酸。
- 炎症状態と診断されているか、発症しているか、または発症するリスクがあると診断されているヒトまたは動物対象の治療、またはそのような状態の予防のための、（医薬の製造のための）、請求項１～１４の何れか一項に記載の抗体または断片または請求項１５に記載の核酸の使用。
- 請求項１～１４のいずれか１項に記載の抗体もしくは断片、または請求項１５に記載の核酸、および任意に１つ以上の薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
- （ｉ）請求項１～１４のいずれか１項に記載の抗体または断片、請求項１５に記載の核酸、または請求項１７に記載の医薬組成物、および（ｉｉ）１以上の治療的活性化合物を含む組合せ物。
- 炎症状態を治療または予防する方法であって、請求項１～１４のいずれか一項に記載の抗体または断片、請求項１５に記載の核酸、請求項１７に記載の医薬組成物または請求項１８に記載の組合せ物を治療上十分な量でヒトまたは動物対象に投与することを含む方法。
- 以下を含む部品の治療キット：
ａ） 請求項１～１４のいずれか１項に記載の抗体または断片、請求項１５に記載の核酸、請求項１７に記載の医薬組成物、または請求項１８に記載の組合せ物、
ｂ） 組成物、組成物または組合せ物を投与するための装置、および
ｃ） キットの使用のための説明書。
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