JP2024510244A - 抗原特異的活性化及びｃａｒ ｔ細胞の増殖のための人工標的 - Google Patents
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Abstract
本発明は、試料を懸濁液中の少なくとも基材とともにインキュベートし、それによってＣＡＲ Ｔ細胞を活性化して、ｍＲＮＡ、エフェクター分子又は細胞表面活性化マーカーからなる群から選択されるマーカーを発現させることを特徴とする、試料と、その表面上で少なくとも１つの抗ＣＡＲイディオタイプ抗体、及び／又はＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＢＣＭＡ、ＣＤ３３、ＭＳＬＮ、ＣＤ１２３、ＨＥＲ２、ＧＤ２、ＥＧＦＲ、ＰＳＭＡ、ＭＵＣ１、ＣＤ３１８、ＴＳＰＡＮ８、ＣＤ６６ｃ、ＣＥＡ、ＣＬＡ、ＣＤ２７６、ＦｏｌＲ１、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＬＬ－１及びＣＤ３７１からなる群から選択される少なくとも１つの抗原を有する少なくとも１つの基材と、ＣＤ２８、ＣＤ２、ＣＤ６、ＣＤ２６、ＣＤ５３及びＬＦＡ－１からなる群から選択される少なくとも１つの同時刺激分子とをインキュベートすることにより、試料中の少なくとも１つのキメラ抗原結合受容体を有するＣＡＲ細胞を活性化する方法に関する。
Description
Ｔ細胞エフェクター機能、例えば細胞毒性が、癌細胞に対して向けられている、養子細胞療法、例えばキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞は、急速に進化する免疫療法分野における有望な新たな治療選択肢の１つである。ＣＡＲ Ｔ細胞の機能的能力の評価は、例えば、ＣＡＲバインダー又はＣＡＲ構築物の選択のため、ＣＡＲ Ｔ細胞生成物の品質管理のため及び治療した患者に残存するＣＡＲ Ｔ細胞のｅｘ ｖｉｖｏ分析のために、治療法の研究開発及び商品化の際に実施される。これを行うための１つの方法は、ＣＡＲ標的を発現する標的細胞とＣＡＲ－Ｔ細胞とを同時培養し、そしてこれらの細胞の存在下でＣＡＲ－Ｔ細胞の活性化を測定することである。
背景技術
ｉｎ ｖｉｔｒｏ機能アッセイでのための生きた標的細胞の使用にはいくつかの大きな欠点がある。それらは、使用した標的細胞源によってもたらされる高い変動性、バッチ間の遺伝的浮動、保管及び細胞培養中の取り扱いの変動を含む。これらは、ＣＡＲ Ｔ細胞の機能的特徴のためのバイオアッセイの標準化に大きな障害を示す。したがって、生きた標的細胞をＣＡＲ Ｔ細胞の活性化を誘導できる合成人工試薬に置き換えることは、標準化及び一貫性にとって大きな利点を含む。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ機能アッセイでのための生きた標的細胞の使用にはいくつかの大きな欠点がある。それらは、使用した標的細胞源によってもたらされる高い変動性、バッチ間の遺伝的浮動、保管及び細胞培養中の取り扱いの変動を含む。これらは、ＣＡＲ Ｔ細胞の機能的特徴のためのバイオアッセイの標準化に大きな障害を示す。したがって、生きた標的細胞をＣＡＲ Ｔ細胞の活性化を誘導できる合成人工試薬に置き換えることは、標準化及び一貫性にとって大きな利点を含む。
Ｗｕら（Ｃｅｌｌｕｌａｒ＆Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０２０，１７：６００－６１２）及びＬｉｎｄｎｅｒら（Ｓｃｉ．Ａｄｖ．２０２０；６：ｅａａｚ３２２３）は、ＣＡＲ Ｔ細胞が標的細胞と相互作用する際のＣＡＲシグナル伝達における重要な要素（受容体と抗原の接触及び近位シグナル伝達から免疫学的シナプス形成及び後期シグナル伝達の結果まで）を概要欄に記載している。いくつかのシグナルが必要であり、これらの学術論文において説明されている。本発明について、学術論文において挙げられたシグナルは必要な２つのシグナル、すなわち十分な数の受容体と抗原との接触、及び同時刺激シグナル、例えばＣＤ２８でのシグナル伝達に絞り込まれた。さらに、双方の学術論文は、効率的なＣＡＲ Ｔ細胞の活性化のために、より多くのＣＡＲがクラスター化される必要があるとも記載されている。
粒子（例えば、いくつか例を挙げると、シリカ、ポリスチレン、ヒドロゲル、ＰＭＭＡ）を抗体と接合させて、種々の生物学的用途のために使用できることも公知である（例えば、Ｎａｎｏ Ｒｅｓ（２００８）１：９９１１５）。この目的のために、シリカ粒子の例を挙げると、抗体結合粒子（https://www.cd-bioparticles.com/product/silica-particles-list-168.html）が既に市販されている。同様のことは、例えば、種々の生体分子の固定化のための機能化マイクロプレート及びガラススライドとしてＳｃｈｏｔｔ及びＰｏｌｙＡｎから入手可能である、抗体結合のための表面としてのマイクロプレート及びガラススライドにも当てはまる（例えば、https://www.schott.com/nexterion/english/products/functional-coatings/3d-polymer-coating.html及びhttps://www.poly-an.de/microplates-cell-culture-consumables/microplate-surfaces）。しかし、これらの材料はいずれも、ＣＡＲ Ｔ細胞又は他のＣＡＲ細胞（例えばＣＡＲ ＮＫ細胞、ＣＡＲマクロファージ）を選択的に標的にして活性化するために使用されていない。
Ｄｉｒａｒら（ＰＬＯＳ ＯＮＥ １５（９）：ｅ０２３８８１９）は、抗イディオタイプ抗体で機能化したミクロン構造化表面によってＣＡＲ Ｔ細胞を活性化できることを実証した。しかしながら、初期の活性化イベント及び脱顆粒は顕微鏡で観察できたとしても、達せられた活性化レベルが生物学的に関連するレベルに達していることは証明されていない。さらに、彼らは抗ＣＤ２８を同時刺激シグナルとして使用しなかった。それらは、マイクロコンタクトプリンティングを使用して、抗イディオタイプ抗体のミクロンサイズの島を有する表面を生じた。
発明の目的
したがって、本発明の目的は、ＣＡＲ Ｔ細胞を活性化するためのより信頼性があり、かつ生物学的に適切な方法を提供することであった。これは、試料と、その表面上で少なくとも１つの抗ＣＡＲイディオタイプ抗体、及び／又はＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＢＣＭＡ、ＣＤ３３、ＭＳＬＮ、ＣＤ１２３、ＨＥＲ２、ＧＤ２、ＥＧＦＲ、ＰＳＭＡ、ＭＵＣ１、ＣＤ３１８、ＴＳＰＡＮ８、ＣＤ６６ｃ、ＣＥＡ、ＣＬＡ、ＣＤ２７６、ＦｏｌＲ１、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＬＬ－１及びＣＤ３７１からなる群から選択される少なくとも１つの抗原を有する少なくとも１つの基材と、及びＣＤ２８、ＣＤ２、ＣＤ６、ＣＤ２６、ＣＤ５３及びＬＦＡ－１からなる群から選択される少なくとも１つの同時刺激分子とをインキュベートすることにより、試料中の少なくとも１つのキメラ抗原結合受容体を有するＣＡＲ細胞を活性化する方法であって、試料を懸濁液中の少なくとも基材とともにインキュベートし、それによってＣＡＲ Ｔ細胞を活性化して、ｍＲＮＡ、エフェクター分子又は細胞表面活性化マーカーからなる群から選択されるマーカーを発現させることを特徴とする前記方法によって達成される。
したがって、本発明の目的は、ＣＡＲ Ｔ細胞を活性化するためのより信頼性があり、かつ生物学的に適切な方法を提供することであった。これは、試料と、その表面上で少なくとも１つの抗ＣＡＲイディオタイプ抗体、及び／又はＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＢＣＭＡ、ＣＤ３３、ＭＳＬＮ、ＣＤ１２３、ＨＥＲ２、ＧＤ２、ＥＧＦＲ、ＰＳＭＡ、ＭＵＣ１、ＣＤ３１８、ＴＳＰＡＮ８、ＣＤ６６ｃ、ＣＥＡ、ＣＬＡ、ＣＤ２７６、ＦｏｌＲ１、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＬＬ－１及びＣＤ３７１からなる群から選択される少なくとも１つの抗原を有する少なくとも１つの基材と、及びＣＤ２８、ＣＤ２、ＣＤ６、ＣＤ２６、ＣＤ５３及びＬＦＡ－１からなる群から選択される少なくとも１つの同時刺激分子とをインキュベートすることにより、試料中の少なくとも１つのキメラ抗原結合受容体を有するＣＡＲ細胞を活性化する方法であって、試料を懸濁液中の少なくとも基材とともにインキュベートし、それによってＣＡＲ Ｔ細胞を活性化して、ｍＲＮＡ、エフェクター分子又は細胞表面活性化マーカーからなる群から選択されるマーカーを発現させることを特徴とする前記方法によって達成される。
さらに、本発明は、以下の特徴を組み合わせることにより、抗原依存的方法でＣＡＲ細胞を活性化し、好ましくは増殖させることができる人工材料（基材）を対象とする：
（１） 立体的に利用可能な抗原（例えば、抗イディオタイプ抗体又はＣＡＲ抗原）について、粒子又は表面の表面上で高密度で共有結合する。抗原は、表面に直接結合する、又は、間接的に（例えば、抗ビオチン抗原及びビオチン化抗原を介して、もしくは抗チアミン剤及びチアミン化剤を介して）結合することができる。
（２） 同時刺激分子結合実体（例えば、抗ＣＤ２８抗体）、抗原と組み合わせて粒子又は表面上で結合するか、又は可溶性の形で添加される。
（１） 立体的に利用可能な抗原（例えば、抗イディオタイプ抗体又はＣＡＲ抗原）について、粒子又は表面の表面上で高密度で共有結合する。抗原は、表面に直接結合する、又は、間接的に（例えば、抗ビオチン抗原及びビオチン化抗原を介して、もしくは抗チアミン剤及びチアミン化剤を介して）結合することができる。
（２） 同時刺激分子結合実体（例えば、抗ＣＤ２８抗体）、抗原と組み合わせて粒子又は表面上で結合するか、又は可溶性の形で添加される。
本発明の他の目的は、ＣＡＲ細胞を活性化するための基材であって、少なくとも１つの基材が、少なくとも１つの抗ＣＡＲ細胞イディオタイプ抗体及び／又はＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＢＣＭＡ、ＣＤ３３、ＭＳＬＮ、ＣＤ１２３、ＨＥＲ２、ＧＤ２、ＥＧＦＲ、ＰＳＭＡ、ＭＵＣ１、ＣＤ３１８、ＴＳＰＡＮ８、ＣＤ６６ｃ、ＣＥＡ、ＣＬＡ、ＣＤ２７６、ＦｏｌＲ１、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＬＬ－１及びＣＤ３７１からなる群から選択される少なくとも１つの抗原と、及びＣＤ２８、ＣＤ２、ＣＤ６、ＣＤ２６、ＣＤ５３及びＬＦＡ－１からなる群から選択される少なくとも１つの同時刺激分子とをその表面上で提供することを特徴とする、前記基材である。
これら材料の用途は、例えば、製造したＣＡＲ Ｔ細胞バッチの品質管理、効力アッセイ、活性化に関連するマーカーの研究、活性化細胞の選別において、又は分析もしくは治療用途のためのＣＡＲ Ｔ細胞の抗原特異的増殖のために、ＣＡＲの活性化によって引き起こされるあらゆる生物学的事象を定性的又は定量的に評価するための標的として使用されうる。
ＣＡＲ抗原は、液体腫瘍抗原及び固形腫瘍抗原の群から選択されることが好ましい。本発明の方法及び本発明の基材は、あらゆる種類のＣＡＲ細胞に適用可能であるが、特にＣＡＲ Ｔ細胞、ＣＡＲ ＮＫ細胞及び／又はＣＡＲマクロファージに適用可能である。
詳細な説明
好ましくは、本発明の方法は、平均直径少なくとも０．４μｍの、好ましくは平均直径１～５μｍを有する粒子として基材を提供することによって実施される。基材は、シリカ、ポリスチレン、ポリオレフィン、多糖類、ポリエステル、ポリアクリレート、ポリ乳酸及び／又は酸化鉄を含んでよい。さらに、これらの材料を、さらに他の材料から作られた粒子のコーティングとして使用することが可能である。最も好ましくは、表面は、カルボキシ基又はアミン基のような化学反応性基がさらに提供される。
好ましくは、本発明の方法は、平均直径少なくとも０．４μｍの、好ましくは平均直径１～５μｍを有する粒子として基材を提供することによって実施される。基材は、シリカ、ポリスチレン、ポリオレフィン、多糖類、ポリエステル、ポリアクリレート、ポリ乳酸及び／又は酸化鉄を含んでよい。さらに、これらの材料を、さらに他の材料から作られた粒子のコーティングとして使用することが可能である。最も好ましくは、表面は、カルボキシ基又はアミン基のような化学反応性基がさらに提供される。
好ましくは、粒子は、懸濁液で、例えば細胞培地に懸濁させて、試料に提供される。
第１の実施形態において、基材は、少なくとも１つの抗ＣＡＲイディオタイプ抗体又は少なくとも１つの抗原及び少なくとも１つの同時刺激分子をプライマー分子を介して基材（すなわち、表面）に結合させることによって製造される。プライマー分子として、ＳＭＣＣ（スクシンイミジル－トランス－４－（Ｎ－マレイミジルメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート）が好ましい。さらに、プライマー分子として、ＳＭ（ＰＥＧ）ｎ（ｎ＝２、４、６、８、１２、２４）を使用できる。
他の実施形態において、基材は、少なくとも１つの抗ＣＡＲイディオタイプ抗体又は少なくとも１つの抗原及び少なくとも１つの同時刺激分子をビオチン化抗体を介して基材（すなわち、表面）に結合させることによって製造される。ビオチン化抗体は、プライマー分子を介して、表面に再び結合しうる。
さらに、少なくとも１つの抗ＣＡＲイディオタイプ抗体、及び／又はＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＢＣＭＡ、ＣＤ３３、ＭＳＬＮ、ＣＤ１２３、ＨＥＲ２、ＧＤ２、ＥＧＦＲ、ＰＳＭＡ、ＭＵＣ１、ＣＤ３１８、ＴＳＰＡＮ８、ＣＤ６６ｃ、ＣＥＡ、ＣＬＡ、ＣＤ２７６、ＦｏｌＲ１、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＬＬ－１及びＣＤ３７１からなる群から選択される少なくとも１つの抗原、並びにＣＤ２８、ＣＤ２、ＣＤ６、ＣＤ２６、ＣＤ５３及びＬＦＡ－１からなる群から選択される少なくとも１つの同時刺激分子が、少なくとも２つの異なる基材の、例えば２つ以上の異なる粒子の表面上で提供される。
本発明の方法において、活性化させたＣＡＲ Ｔ細胞は、さらに、直接的又は間接的に、例えばメッセンジャー分子の分泌を介して検出されうる。ＣＡＲ細胞の活性化の検出は、イメージング、フローサイトメトリー又はＲＴ－ＰＣＲ／ＲＮＡｓｅｑによって実施されてよい。
代わりに、活性化させたＣＡＲ Ｔ細胞を間接的に検出してよい。例えば、この方法は、試料を懸濁液中の基材、特に粒子と一緒にインキュベートし、それによりＣＡＲ Ｔ細胞を活性化してタンパク質を分泌させ、そして分泌したタンパク質を検出することによって実施してよい。この変法において、ＣＡＲ Ｔ細胞を活性化して、ｍＲＮＡ、エフェクター分子又は細胞表面活性化マーカーからなる群から選択されるマーカーを発現させ、そしてマーカーを検出することがさらに可能である。かかるマーカー又は／及び分泌タンパク質の検出は、当業者の常識の範囲内である。
抗原を発現する標的細胞のような生物学的システムとは対照的に、人工システムは、より明確で再現性のある化学組成で生成でき、これは標的細胞と比較して潜在的により再現性のある材料を可能にする。細胞と比較して少ない労力で大規模に生産することもできる。他の潜在的な利点は、標的細胞と比較して良好な保存安定性である。
少なくともミクロンサイズの表面上の抗イディオタイプ抗体と、例えば溶液中の抗ＣＤ２８、又は抗イディオタイプ抗体と一緒に結合した抗イディオタイプ抗体の組み合わせは、効力アッセイで標的細胞を置き換えるために有用であるか又はＣＡＲ Ｔ細胞のＣＡＲ特異的増殖のために使用されるための、ＣＡＲ Ｔ細胞の十分に強力な活性化をもたらす。
本発明の方法は、次の流れで実施されうる：
変法１： ＣＡＲ細胞によって分泌されるＩＦＮ－γのレベルを、ＣＡＲ結合粒子とのｉｎ ｖｉｔｒｏ培養後に測定する。ＩＦＮ－γレベルを測定のための読み出し方法は、ビーズベースのフローサイトメトリーサイトカイン検出アッセイである、Ｍｉｌｔｅｎｙｉが開発したＭＡＣＳＰｌｅｘ ＩＦＮ－γイムノアッセイを使用する。培養後に収集した上清試料を、抗ＩＦＮ－γ抗体で被覆したＭＡＣＳＰｌｅｘ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｂｅａｄｓとインキュベートし、そしてＩＦＮ－γが特定の抗体に結合する。ＩＦＮ－γに特異的な蛍光色素結合抗体から構成される検出試薬を追加する。その結果、ＭＡＣＳＰｌｅｘ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｂｅａｄ、ＩＦＮ－γ及び検出試薬の間でサンドイッチ複合体が形成される。これらの複合体は、ＭＡＣＳＰｌｅｘ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｂｅａｄ及び検出試薬の双方の蛍光特性に基づいてフローサイトメトリーによって分析できる。既知量のＩＦＮ－γの標準を、上澄み中のサイトカインの定量のために使用する。
変法２： ＩＦＮ－γ発現ＣＡＲ細胞の頻度を、タンパク質輸送阻害剤、例えばＢｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａの存在下でＣＡＲ結合粒子とのｉｎ ｖｉｔｒｏ培養後に測定する。これは、ＣＡＲ細胞活性化後の細胞質内でのＩＦＮ－γの蓄積をもたらす。培養後に、細胞を、例えばパラホルムアルデヒドで固定し、そして細胞膜を、例えばサポニンで透過化して、検出試薬を細胞質に浸透できるようにする。ＩＦＮ－γに特異的な蛍光色素結合抗体を添加して、培養中に活性化してＩＦＮ－γを発現する細胞の蛍光標識をもたらす。追加の蛍光結合抗体を追加して、追加のサイトカインの発現、又は表面活性化誘導タンパク質、例えばＣＤ１３７の発現を検出できる。細胞を、標識細胞の光学特性及び蛍光特性に基づいて、フローサイトメトリーによって分析できる。
変法１： ＣＡＲ細胞によって分泌されるＩＦＮ－γのレベルを、ＣＡＲ結合粒子とのｉｎ ｖｉｔｒｏ培養後に測定する。ＩＦＮ－γレベルを測定のための読み出し方法は、ビーズベースのフローサイトメトリーサイトカイン検出アッセイである、Ｍｉｌｔｅｎｙｉが開発したＭＡＣＳＰｌｅｘ ＩＦＮ－γイムノアッセイを使用する。培養後に収集した上清試料を、抗ＩＦＮ－γ抗体で被覆したＭＡＣＳＰｌｅｘ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｂｅａｄｓとインキュベートし、そしてＩＦＮ－γが特定の抗体に結合する。ＩＦＮ－γに特異的な蛍光色素結合抗体から構成される検出試薬を追加する。その結果、ＭＡＣＳＰｌｅｘ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｂｅａｄ、ＩＦＮ－γ及び検出試薬の間でサンドイッチ複合体が形成される。これらの複合体は、ＭＡＣＳＰｌｅｘ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｂｅａｄ及び検出試薬の双方の蛍光特性に基づいてフローサイトメトリーによって分析できる。既知量のＩＦＮ－γの標準を、上澄み中のサイトカインの定量のために使用する。
変法２： ＩＦＮ－γ発現ＣＡＲ細胞の頻度を、タンパク質輸送阻害剤、例えばＢｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａの存在下でＣＡＲ結合粒子とのｉｎ ｖｉｔｒｏ培養後に測定する。これは、ＣＡＲ細胞活性化後の細胞質内でのＩＦＮ－γの蓄積をもたらす。培養後に、細胞を、例えばパラホルムアルデヒドで固定し、そして細胞膜を、例えばサポニンで透過化して、検出試薬を細胞質に浸透できるようにする。ＩＦＮ－γに特異的な蛍光色素結合抗体を添加して、培養中に活性化してＩＦＮ－γを発現する細胞の蛍光標識をもたらす。追加の蛍光結合抗体を追加して、追加のサイトカインの発現、又は表面活性化誘導タンパク質、例えばＣＤ１３７の発現を検出できる。細胞を、標識細胞の光学特性及び蛍光特性に基づいて、フローサイトメトリーによって分析できる。
実施例
人工標的を、抗ビオチン抗体をシリカビーズの表面に共有結合させることによって調製し、続いて、ビオチン化抗イディオタイプ抗体（Ｃ０１と名付けた抗ＣＤ１９ ＣＡＲ、又は３７Ｂ４と名付けた抗ＣＤ２０ ＣＡＲのいずれか）とビオチン化抗ＣＤ２８との混合物を抗ビオチン被覆シリカ粒子の表面に固定化する。
人工標的を、抗ビオチン抗体をシリカビーズの表面に共有結合させることによって調製し、続いて、ビオチン化抗イディオタイプ抗体（Ｃ０１と名付けた抗ＣＤ１９ ＣＡＲ、又は３７Ｂ４と名付けた抗ＣＤ２０ ＣＡＲのいずれか）とビオチン化抗ＣＤ２８との混合物を抗ビオチン被覆シリカ粒子の表面に固定化する。
調製の略図を図１又は図２に示す。
シリカビーズの表面への抗ビオチン抗体の共有結合のために、ＤＭＳＯ中でＳＭＣＣを水中のアミン官能化シリカビーズに添加することによって、アミン官能化シリカビーズを最初にＳＭＣＣで活性化した。その混合物を室温で１．５時間インキュベートした、そしてＶｉｖａｓｐｉｎ濾過ユニット（ＭＷＣＯ １００ｋＤａ、８つの洗浄サイクル（水で６サイクル、続いてＰＢＳで２サイクル））での限外濾過によってビーズを精製した。精製後のマレイミド官能化シリカビーズの濃度は、ＰＢＳ中で約１０ｇ／Ｌであった。マレイミド官能化シリカビーズへの抗体結合のために、抗ビオチン抗体を、５０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６）中で１０ｍＭ ＤＴＴを有する４．５ｇ／Ｌ抗体溶液を１時間インキュベートし、その後精製し、そしてＰＤ１０ カラムを使用してＰＢＳに緩衝液交換することによって還元した。次に、還元した抗ビオチン抗体をマレイミド官能化シリカビーズに添加し（シリカビーズ１ｍｇあたり還元抗体５０μｇ、マレイミド基あたり約１１当量の抗体）、そして混合物を４℃で２日間インキュベートした。その後、粒子を遠心分離（１０００ｇで５分間の遠心分離ステップを２回、洗浄緩衝液としてＰＢＳを使用した）によって精製し、そしてＰＢＳ中で最終粒子濃度が約１２ｇ／Ｌになるように再懸濁した。シリカビーズ１ｍｇあたりの抗体の得られた比率は、使用したシリカビーズのサイズに依存した（例えば、３．９μｍシリカビーズ＝シリカ１ｍｇあたり抗ビオチン０．８１μｇ、２μｍシリカビーズ＝シリカ１ｍｇあたり抗ビオチン１．２μｇ）。
ビオチン化抗イディオタイプ抗体と抗ＣＤ２８抗体との混合物の固定化のために、ＴｅｘＭＡＣＳ培地中でのビオチン化抗体及び抗ビオチン官能化シリカビーズの双方の混合物５０μＬを室温で１５分間インキュベートした。抗イディオタイプ抗体と抗ＣＤ２８抗体のモル比は３．３：１であった。反応混合物中の抗体の濃度は、抗イディオタイプ４μｇ／ｍｌ、抗ＣＤ２８ １．２μｇ／ｍｌ及び抗ビオチン抗体１．２μｇ／ｍｌ（シリカビーズ上で結合）であった。この物質をさらに精製せずに使用した。
シリカビーズに対して行われたのと同様の官能化化学反応を、ＰｏｌｙＡｎから購入したアミン官能化マイクロプレートでも実施した。
調製の略図を図３及び図４に示す。
異なる基材を使用して、カルボキシ官能化ポリスチレンビーズをＤＣＨ／ＮＨＳで活性化させ、そしてアミノデキストラン分子で被覆し、最後にＳＭＣＣでの修飾によってマレイミド官能化し、その後還元抗体をビーズに共有結合させた。
調製の略図を図５及び図６に示す。
異なる官能化材料を機能性バイオアッセイで試験した。ＣＤ２０１９ ＣＡＲ Ｔ細胞（ＣＤ２０及びＣＤ１９の抗原結合ドメインを有するタンデムＣＡＲを発現するＴ細胞）を、異なる材料（人工標的材料又はＪｅｋｏ－１対照標的細胞株）の存在下で３７℃で一晩培養した。特に明記しない限り、異なる材料での細胞培養中の抗体濃度は、抗イディオタイプ１μｇ／ｍｌ及び抗ＣＤ２８抗体０．３μｇ／ｍｌであった。次に、ＭＡＣＳＰｌｅｘを使用して、上澄みへのエフェクター分子の分泌を測定した。図では、ＣＡＲ Ｔ細胞活性化の指標としてＩＦＮγを示す。
抗体を吸着させたマイクロプレート（一般に、脱離の可能性があるため、高度に共有結合により修飾させたプレートに比べて官能化の程度が低く、かつ次の結合ステップで抗体の配向が不利になるリスクも有する）と、抗体を共有結合させたマイクロプレート（可能な限り多量の抗体と結合させた）とを比較すると、抗原特異的活性化は双方で達成できたが、共有結合により官能化させたマイクロプレートの方がより高度に達成できたことが示された。同時刺激分子、この場合は抗ＣＤ２８の添加により、抗イディオタイプ抗体のみを含むサンプルと比較してＣＡＲ Ｔ細胞の活性化が大幅に増強されることも示されている。その結果を図７に示す。
この比較は、ＣＡＲ Ｔ細胞の良好な活性化のために高密度が好ましいことも示す。
共有結合修飾されたマイクロプレートと官能化粒子との比較は、抗イディオタイプ抗体と抗ＣＤ２８との混合物で官能化させ、平均サイズ約４μｍのミクロンサイズのシリカ又はポリスチレン粒子は、同一の表面コーティングを施したマイクロプレートとしてＣＡＲ Ｔ細胞を活性化するために同様にうまく機能し、結果として同様のレベルのＩＦＮγを得たことを示す。ＣＡＲ Ｔ細胞との同時培養後に、双方の材料は対照標的細胞（ＣＤ２０ＫＯと名付けたＣＤ２０ノックアウトＪｅｋｏ－１細胞；ＣＤ１９ＫＯと名付けたＣＤ１９ノックアウトＪｅｋｏ－１細胞；ｄＫＯと名付けたＣＤ２０及びＣＤ１９二重ノックアウトＪｅｋｏ－１細胞）と同レベルのＩＦＮγを生成し、アッセイにおける人工標的として、及び潜在的にＣＡＲ Ｔ細胞の増殖にも有用であることを実証した。その結果を図８に示す。
抗イディオタイプ抗体と組み合わせた抗ＣＤ２８の添加は、抗イディオタイプ抗体単独の使用と比較して活性化が著しく強化され、人工標的による標的細胞の範囲内での活性化を得るために、同時刺激シグナルを有することが重要であることを実証した。
図９は、抗イディオタイプ単独による活性化と、３．３：１の比での抗イディオタイプと抗ＣＤ２８とを組み合わせた活性化の比較を示す。
抗イディオタイプ抗体と抗ＣＤ２８との混合物は、前記した抗ビオチン被覆シリカビーズ上にビオチン化抗体を固定化して双方の抗体を混合することによって調製することができ、これは双方の抗体を所望の比率で表面上に有するビーズをもたらす。代わりに、シリカビーズを個別の抗体で調製し、そしてその表面に１種類の抗体をそれぞれ有するシリカビーズを、抗イディオタイプ抗体と抗ＣＤ２８の所望の比率で混合することもできる。双方の材料は、同様のレベルのＣＡＲ Ｔ細胞活性化をもたらす。抗体の混合物を有するビーズの代わりに個々のビーズを調製することは、ビーズ上の個々の抗体の定量化に有利であってよい。その表面上で（抗イディオタイプ抗体と抗ＣＤ２８との混合物を有する試料で使用したのと同じ抗ＣＤ２８濃度で）抗ＣＤ２８のみを有するビーズは、ＣＡＲ Ｔ細胞を活性化できず、これは試験した条件での活性化がＣＡＲ特異的であることを示す。その結果を図１０に示す。
広範囲のシリカビーズのサイズを人工標的として使用できる。約０．４μｍ～約４．６μｍの直径を有する粒子を試験した。理想的なビーズサイズは２～４μｍの範囲であったことが示されたが、試験した全ての粒子サイズでＣＡＲ Ｔ細胞を活性化できた。全ての粒子サイズについて、同等の抗ＣＤ２８濃度で（イディオタイプ抗体の非存在下で）非常に低いレベルの活性化が観察されることも示され、これにより、観察したＣＡＲ Ｔ細胞の活性化が確かに抗原特異的であり、抗ＣＤ２８単独では達成されないことを実証した。結果を図１１に示す。
人工標的でのＣＡＲ Ｔ細胞の活性化は濃度に依存する。理想的な濃度はＣＡＲ Ｔ細胞で異なり、示した例で試験したＣＡＲ Ｔ細胞について、活性化中の抗イディオタイプ抗体（抗ＣＤ２８と一緒にシリカビーズに固定化した）の理想的な濃度は５～２５μｇ／ｍＬの範囲であった。その結果を図１２に示す。
人工標的による活性化は、ＣＤ２０１９ ＣＡＲ Ｔ細胞のＣＤ１９ ＣＡＲを標的とするだけでなく、抗ＣＤ２０ ＣＡＲイディオタイプ抗体（３７Ｂ４と名付けた）でＣＤ２０ ＣＡＲを標的にすることによっても達成でき、これにより、同一の概念が他のＣＡＲ特異性にも同様に使用できることを実証した。その結果を図１３に示す。
抗ＣＤ１９ ＣＡＲイディオタイプ抗体（クローンＲＥＡ１２９７）又は抗ＣＤ２０ＣＡＲイディオタイプ抗体（ＲＥＡ１３３９又はＲＥＡ１３４１）ビーズと抗ＣＤ２８抗体（クローン１５Ｅ８）ビーズとの混合物からなる前記した及び図５に示したポリスチレンベースの人工標的を使用して、ＣＤ２０及びＣＤ１９に特異的なＣＡＲ Ｔ細胞を活性化した。陽性対照として、ＣＡＲ Ｔ細胞を、ＣＤ２０（「ＣＤ１９ＫＯ」）又はＣＤ１９（「ＣＤ２０ＫＯ」）を発現するＪｅｋｏ－１細胞と同時培養した。陰性対照として、ＣＡＲ Ｔ細胞を単独で培養するか（「ＣＡＲ」）、ＣＤ２０又はＣＤ１９を発現しないＪｅｋｏ－１細胞とともに培養するか（「ｄＫＯ」）、又はＣＡＲ Ｔ細胞を抗ＣＤ２８抗体（クローン１５Ｅ８）ビーズと共に培養した（「ＣＤ２８のみ」）。活性化を、上澄みに分泌したＩＮＦγの濃度を測定することによって評価した。図１４が示すように、人工標的の活性化は、ＣＡＲ Ｔ細胞の活性化及びＩＦＮγ分泌がもたらし、ＣＤ２０発現ＪｅＫｏ－１細胞（「ＣＤ１９ＫＯ」）による活性化と同様の濃度に達した。これらの結果は、人工標的を使用した活性化が細胞標的による活性化に匹敵することを示す。
ＣＡＲ Ｔ細胞を、ポリスチレンベースの人工標的の有無にかかわらず、ヒトＡＢ血清、ＩＬ－７、ＩＬ１５及びＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐで補ったＴｅｘＭＡＣＳ培地で同時培養し、５日後及び７日後に計数して増殖を評価した。図１５に示すように、７日後に人工標的を使用して培養したＣＡＲ Ｔ細胞の数は、人工標的を使用せずに培養したＣＡＲ Ｔ細胞の数よりも２倍多く、人工標的を使用してＣＡＲ Ｔ細胞を増殖できることを示した。
磁性ポリスチレンビーズ（３μｍ）を、活性化／被覆／機能化して、標的細胞に結合するためにヒト全血（ＷＢ）とインキュベートした専用の抗体（例：ＣＤ４、ＣＤ１５、ＣＤ７及び抗ビオチンを含む）の収集物に結合させた。これらの細胞を、磁気的に単離させ、図１６～２０におけるドットプロットに見られるように選択的に枯渇させることができる。これは、ＣＡＲ細胞の活性化のためのポリスチレンビーズ及び磁性ポリスチレンビーズの使用だけでなく、いくつか例を挙げると、操作、除去及び例えばＷｂ又は培地からの分離のための免疫磁気選択的標識も示す。
Claims (12)
- 試料と、その表面上で少なくとも１つの抗ＣＡＲイディオタイプ抗体及び／又はＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＢＣＭＡ、ＣＤ３３、ＭＳＬＮ、ＣＤ１２３、ＨＥＲ２、ＧＤ２、ＥＧＦＲ、ＰＳＭＡ、ＭＵＣ１、ＣＤ３１８、ＴＳＰＡＮ８、ＣＤ６６ｃ、ＣＥＡ、ＣＬＡ、ＣＤ２７６、ＦｏｌＲ１、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＬＬ－１及びＣＤ３７１からなる群から選択される少なくとも１つの抗原を備えた少なくとも１つの基材と、ＣＤ２８、ＣＤ２、ＣＤ６、ＣＤ２６、ＣＤ５３及びＬＦＡ－１からなる群から選択される少なくとも１つの同時刺激分子とをインキュベートすることにより、試料中の少なくとも１つのキメラ抗原結合受容体を有するＣＡＲ細胞を活性化する方法であって、試料を懸濁液中の少なくとも基材と共にインキュベートし、それによってＣＡＲ Ｔ細胞を活性化して、ｍＲＮＡ、エフェクター分子又は細胞表面活性化マーカーからなる群から選択されるマーカーを発現させることを特徴とする、前記方法。
- 基材を懸濁液中で粒子として提供し、粒子が少なくとも０．４μｍの平均直径を有することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
- 試料を懸濁液中で粒子と共にインキュベートし、それによりＣＡＲ Ｔ細胞を活性化してタンパク質を分泌させ、そして分泌したタンパク質を検出することを特徴とする、請求項２に記載の方法。
- ＣＡＲ細胞の活性化を、画像化、フローサイトメトリー又はＲＴ－ＰＣＲ／ＲＮＡ配列によって検出することを特徴とする、請求項１から３までのいずれか１項に記載の方法。
- 少なくとも１つの抗ＣＡＲイディオタイプ抗体、及び／又はＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＢＣＭＡ、ＣＤ３３、ＭＳＬＮ、ＣＤ１２３、ＨＥＲ２、ＧＤ２、ＥＧＦＲ、ＰＳＭＡ、ＭＵＣ１、ＣＤ３１８、ＴＳＰＡＮ８、ＣＤ６６ｃ、ＣＥＡ、ＣＬＡ、ＣＤ２７６、ＦｏｌＲ１、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＬＬ－１及びＣＤ３７１からなる群から選択される少なくとも１つの抗原、並びにＣＤ２８、ＣＤ２、ＣＤ６、ＣＤ２６、ＣＤ５３及びＬＦＡ－１からなる群から選択される少なくとも１つの同時刺激分子を、少なくとも２つの異なる基材の表面上で提供することを特徴とする、請求項１から４までのいずれか１項に記載の方法。
- ＣＡＲ細胞を活性化するための基材であって、少なくとも１つの基材が、少なくとも１つの抗ＣＡＲ細胞イディオタイプ抗体及び／又はＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＢＣＭＡ、ＣＤ３３、ＭＳＬＮ、ＣＤ１２３、ＨＥＲ２、ＧＤ２、ＥＧＦＲ、ＰＳＭＡ、ＭＵＣ１、ＣＤ３１８、ＴＳＰＡＮ８、ＣＤ６６ｃ、ＣＥＡ、ＣＬＡ、ＣＤ２７６、ＦｏｌＲ１、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＬＬ－１及びＣＤ３７１からなる群から選択される少なくとも１つの抗原と、ＣＤ２８、ＣＤ２、ＣＤ６、ＣＤ２６、ＣＤ５３及びＬＦＡ－１からなる群から選択される少なくとも１つの同時刺激分子とをその表面上で提供することを特徴とする、前記基材。
- 少なくとも０．４μｍの平均直径を有する粒子として提供することを特徴とする、請求項６に記載の基材。
- 粒子が、シリカ、ポリスチレン、ポリオレフィン、多糖類、ポリエステル、ポリアクリレート、ポリ乳酸及び／又は酸化鉄を含むことを特徴とする、請求項６又は７に記載の基材。
- 少なくとも１つの抗ＣＡＲイディオタイプ抗体及び／又は少なくとも１つの抗原及び／又は少なくとも１つの同時刺激分子を、抗ビオチン抗体、抗チアミン抗体又はストレプトアビジンを介して基材に結合することを特徴とする、請求項６から８までのいずれか１項に記載の基材。
- 少なくとも１つの抗ＣＡＲイディオタイプ抗体又は少なくとも１つの抗原及び少なくとも１つの同時刺激分子を、プライマー分子を介して基材に結合することを特徴とする、請求項６から８までのいずれか１項に記載の基材。
- プライマー分子が、ＳＭＣＣ（スクシンイミジル－トランス－４－（Ｎ－マレイミジルメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート）であることを特徴とする、請求項９に記載の基材。
- 少なくとも１つの抗ＣＡＲイディオタイプ抗体、及び／又はＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＢＣＭＡ、ＣＤ３３、ＭＳＬＮ、ＣＤ１２３、ＨＥＲ２、ＧＤ２、ＥＧＦＲ、ＰＳＭＡ、ＭＵＣ１、ＣＤ３１８、ＴＳＰＡＮ８、ＣＤ６６ｃ、ＣＥＡ、ＣＬＡ、ＣＤ２７６、ＦｏｌＲ１、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＬＬ－１及びＣＤ３７１からなる群から選択される少なくとも１つの抗原、並びにＣＤ２８、ＣＤ２、ＣＤ６、ＣＤ２６、ＣＤ５３及びＬＦＡ－１からなる群から選択される少なくとも１つの同時刺激分子を、少なくとも２つの異なる基材の表面上で提供する、請求項６から８までのいずれか１項に記載の基材。
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