CN117098994A - 用于car t细胞的抗原特异性激活和扩增的人工靶标 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于激活样品中具有至少一种嵌合抗原结合受体的CAR细胞的方法，该方法通过将样品与至少一种底物一起孵育，所述底物在其表面上被提供有至少一种抗CAR独特型抗体和/或选自由CD19、CD20、CD22、BCMA、CD33、MSLN、CD123、HER2、GD2、EGFR、PSMA、MUC1、CD318、TSPAN8、CD66c、CEA、CLA、CD276、FolR1、CLEC12A、CLL‑1和CD371组成的组的至少一种抗原，以及具有选自由CD28、CD2、CD6、CD26、CD53和LFA‑1组成的组的至少一种共刺激分子，其特征在于，所述样品在悬浮液中与至少一种底物一起孵育，从而激活CAR T细胞以表达选自由mRNA、效应分子或细胞表面激活标记物组成的组的标记物。
Description
技术领域
过继细胞疗法，如嵌合抗原受体(CAR)T细胞(其中T细胞效应子功能，如细胞毒性被重新定向针对癌症细胞)，是迅速发展的免疫治疗领域中有前途的新治疗选择。CAR T细胞的功能能力评估是在该疗法的研发和商业化期间进行的，例如用于选择CAR结合物或CAR构建体，用于CAR T细胞产品的质量控制，以及用于对被治疗的患者中持续存在的CAR T细胞的离体分析。进行这种评估的一种方法是将CAR T细胞与表达CAR靶标的靶细胞共培养，并在这些细胞存在的情况下测量CAR-T细胞的激活。
背景技术
使用活的靶细胞进行体外功能测定存在几个主要的缺点。它们包括由所使用的靶细胞源引入的高变异性、逐批遗传漂变，以及在储存和细胞培养期间的处理变化。这些代表了用于CAR T细胞功能表征的生物测定标准化的主要障碍。因此，用能够诱导CAR T细胞激活的合成人工试剂代替活的靶细胞将对标准化和一致性具有重大好处。
Wu等人(Cellular&Molecular Immunology 2020，17:600-612)以及Lindner等人(Sci.Adv.2020；6:eaaz3223)在其综述中描述了CAR T细胞与靶细胞相互作用时CAR信号传导中的重要因素：从受体与抗原的接触和近端信号传导到免疫突触的形成以及晚期信号传导结果。这些论文中需要并提到了几个信号。对于本发明，论文中所列的信号被减少为所需的两个信号：足够数量的受体和抗原之间的接触以及与共刺激信号(如CD28)的信号传导。此外，这两篇论文还描述了为了有效激活CAR T细胞，需要聚集大量的CAR。
还已知颗粒(例如，二氧化硅、聚苯乙烯、水凝胶、PMMA等)可以与抗体偶联，并用于各种生物应用(例如，Nano Res(2008)1:99 115)。为此，以二氧化硅颗粒为例，抗体偶联颗粒(https://www.cd-bioparticles.com/product/silica-particles-list-168.html)已经可商购获得。例如，作为用于抗体偶联表面的微孔板和载玻片也是如此，其可从Schott和PolyAn获得，作为用于固定各种生物分子的官能化微孔板和载玻片(例如，https://www.schott.com/nexterion/english/products/functional-coatings/3d-polymer-coating.html和https://www.poly-an.de/microplates-cell-culture-consumables/ microplate-surfaces)。但是，这些材料均从未被用于选择性靶向和激活CAR T细胞或其他CAR细胞(例如，CAR NK细胞、CAR巨噬细胞)。
Dirar等人(PLOS ONE 15(9):e0238819)证明了CAR T细胞可以通过用其抗独特型抗体官能化的微米结构化的表面来激活。然而，尽管可以通过显微镜观察到早期激活事件和脱粒，但所达到的激活水平从未被证明达到了生物学相关的水平。此外，他们没有使用抗CD28作为共刺激信号。他们使用微接触印刷法来生成具有微米大小的抗独特型抗体岛的表面。
发明内容
因此，本发明的目的是提供一种用于激活CAR T细胞的更可靠的、生物学相关的方法。该目的可以通过以下方法来实现，该方法用于激活样品中具有至少一种嵌合抗原结合受体的CAR细胞，通过将样品与至少一种底物一起孵育，所述底物在其表面上被提供有至少一种抗CAR独特型抗体和/或选自由CD19、CD20、CD22、BCMA、CD33、MSLN、CD123、HER2、GD2、EGFR、PSMA、MUC1、CD318、TSPAN8、CD66c、CEA、CLA、CD276、FolR1、CLEC12A、CLL-1和CD371组成的组的至少一种抗原以及选自由CD28、CD2、CD6、CD26、CD53和LFA-1组成的组的至少一种共刺激分子，其特征在于，所述样品在悬浮液中与所述至少一种底物一起孵育，从而激活CAR T细胞以表达选自由mRNA、效应分子或细胞表面激活标记物组成的组的标记物。
进一步地，本发明涉及通过组合以下特征能够以抗原依赖性方式激活并优选扩增CAR细胞的人工材料(底物)：
(1)用于结合空间可用的抗原(例如抗独特型抗体或CAR抗原)，所述抗原以高密度共价结合在颗粒表面或表面上。该抗原可以直接或以间接的方式(例如，通过抗生物素和生物素化的抗原，或通过抗硫胺素和硫胺化剂)与表面结合。
(2)共刺激分子结合实体(例如抗CD28抗体)，与抗原一起结合在颗粒或表面上，或者以可溶性形式添加。
本发明的另一个目的是提供一种用于激活CAR细胞的底物，其特征在于，至少一种所述底物在其表面被提供有至少一种抗CAR独特型抗体和/或选自由CD19、CD20、CD22、BCMA、CD33、MSLN、CD123、HER2、GD2、EGFR、PSMA、MUC1、CD318、TSPAN8、CD66c、CEA、CLA、CD276、FolR1、CLEC12A、CLL-1和CD371组成的组的至少一种抗原以及选自由CD28、CD2、CD6、CD26、CD53和LFA-1组成的组的至少一种共刺激分子。
这些材料的应用可以用作靶标，以定性或定量地评估由CAR的激活触发的任何生物学事件，例如在制造的CAR T细胞批次的质量控制中、效力测定、激活用相关标记物的研究、分选被激活的细胞或用于分析或治疗应用的CAR T细胞的抗原特异性扩增。
CAR抗原优选地选自由液体肿瘤抗原和实体肿瘤抗原组成的组。本发明的方法和本发明的底物适用于所有种类的CAR细胞，但特别适用于CAR T细胞、CAR NK细胞和/或CAR巨噬细胞。
附图说明
图1至图6示出了提供具有抗CAR独特型抗体、抗原和共刺激分子的底物的几个实施方案。
图7至图20示出了根据本发明的实验结果。
具体实施方式
优选地，本发明的方法是通过提供底物作为平均直径至少为0.4μm、优选平均直径在1-5μm之间的颗粒来进行的。所述底物可以包含二氧化硅、聚苯乙烯、聚烯烃、多糖、聚酯、聚丙烯酸酯、聚乳酸和/或氧化铁。还可以使用这些材料作为由其他材料制成的颗粒的包衣。最优选地，表面额外地被提供有化学反应性基团，如羧基或胺基。
优选地，所述颗粒以悬浮液的形式被提供给样品，例如悬浮于细胞培养基中。
在第一实施方案中，所述底物通过将所述至少一种抗CAR独特型抗体或至少一种抗原和至少一种共刺激分子经由引物分子与所述底物(即为表面)结合来制备。作为引物分子，SMCC(反式-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯)是优选的。进一步地，可以使用n＝2、4、6、8、12、24的SM(PEG)n作为引物分子。
在另一个实施方案中，所述底物通过将所述至少一种抗CAR独特型抗体或至少一种抗原和至少一种共刺激分子经由生物素化的抗体与所述底物(即为表面)结合来制备。所述生物素化的抗体可再次通过引物分子与所述表面结合。
进一步地，所述至少一种抗CAR独特型抗体和/或选自由CD19、CD20、CD22、BCMA、CD33、MSLN、CD123、HER2、GD2、EGFR、PSMA、MUC1、CD318、TSPAN8、CD66c、CEA、CLA、CD276、FolR1、CLEC12A、CLL-1和CD371组成的组的至少一种抗原以及选自由CD28、CD2、CD6、CD26、CD53和LFA-1组成的组的至少一种共刺激分子被提供在至少两种不同底物的表面上，例如被提供至两种或更多种不同颗粒。
在本发明的方法中，可进一步直接或间接地例如通过分泌信使分子来检测所激活的CAR T细胞。可通过成像、流式细胞术或RT-PCR/RNAseq进行CAR细胞的激活的检测。
可替换地，可间接地检测所激活的CAR T细胞。例如，所述方法可以通过将样品与悬浮液中的所述底物(尤其是颗粒)一起孵育从而激活CAR T细胞以分泌蛋白质并检测所分泌的蛋白质来进行。在该变体中，还可以激活CAR T细胞以表达选自由mRNA、效应分子或细胞表面激活标记物组成的组的标记物，并检测所述标记物。检测这样的标记物或分泌的蛋白质属于本领域技术人员的公知常识。
与生物系统、如表达抗原的靶细胞相比，可以生产具有更明确和可再生的化学组成的人工系统，其能够获得比靶细胞潜在地更可再生的材料。与细胞相比，它们也可以以更少的精力被大规模生产。另一个潜在的好处是与靶细胞相比具有更好的储存稳定性。
在至少微米大小的表面上的抗独特型抗体例如与抗CD28的组合(以溶液形式或与抗独特型抗体结合在一起)导致了CAR T细胞足够强烈的激活以便用于在效力测定中取代靶细胞，或用于CAR T细胞的CAR特异性扩增。
本发明的方法可以在以下工作流程中执行：
变体1：在与CAR结合颗粒体外培养后测定由CAR细胞分泌的IFN-γ的水平。测定IFN-γ水平的读出方法使用Miltenyi开发的MACSPlex IFN-γ免疫测定法，该方法是一种基于珠粒的流式细胞因子检测法。将培养后收集的上清液样品与抗IFN-γ抗体包被的MACSPlex捕获珠粒一起孵育，并且IFN-γ与特异性抗体结合。添加由对IFN-γ有特异性的荧光偶联的抗体组成的检测试剂。因此，在MACSPlex捕获珠粒、IFN-γ和检测试剂之间形成了夹心复合物。这些复合物可以基于MACSPlex捕获珠粒和检测试剂二者的荧光特征通过流式细胞术进行分析。使用已知量的IFN-γ的标准物来定量上清液中的细胞因子。
变体2：在蛋白质转运抑制剂如布雷菲德菌素A(Brefeldin A)的存在下，在与CAR结合颗粒体外培养后测定表达IFN-γ的CAR细胞的频率。这导致在CAR细胞激活后细胞质中IFN-γ的积聚。培养后，例如用多聚甲醛固定细胞，并且例如用皂苷渗透细胞膜，以使检测试剂穿过细胞质。添加对IFN-γ具有特异性的荧光偶联抗体，从而导致在培养期间被激活以表达IFN-γ的细胞的荧光标记。可以添加另外的荧光偶联抗体以检测另外的细胞因子的表达，或表面激活诱导的蛋白质如CD137的表达。可以基于被标记的细胞的光学和荧光特征通过流式细胞术来分析细胞。
实施例
制备人工靶标，通过将抗生物素抗体与二氧化硅珠粒的表面共价结合，随后将生物素化的抗独特型抗体(抗CD19 CAR，命名为C01；或抗CD20 CAR，命名为37B4)和生物素化的抗CD28的混合物固定化在抗生物素包被的二氧化硅颗粒的表面上。
制备方案如图1或图2所示。
对于抗生物素抗体与二氧化硅珠粒表面的共价结合，首先用SMCC激活胺官能化二氧化硅珠粒，通过将DMSO中的SMCC添加至水中的胺官能化的二氧化硅珠粒。在珠粒用Vivaspin过滤单元(MWCO 100kDa，8个洗涤循环，用水进行6个循环，然后用PBS进行2个循环)通过超滤纯化之前，将混合物在室温下孵育1.5小时。纯化后的现有马来酰亚胺官能化的二氧化硅珠粒在PBS中的浓度为约10g/L。为了将抗体与马来酰亚胺官能化的二氧化硅珠粒偶联，通过在50mM MES缓冲液pH6中将4.5g/L抗体溶液与10mM DTT孵育1小时，然后使用PD10柱纯化并将缓冲液交换到PBS中，从而还原抗生物素抗体。然后，将还原的抗生物素抗体添加至马来酰亚胺官能化的二氧化硅珠粒中(每mg二氧化硅珠粒约50μg还原的抗体，每个马来酰亚胺基约11当量抗体)，并将混合物在4℃孵育2天。然后，通过离心(2个离心步骤：1000g进行5分钟，PBS用作洗涤缓冲液)纯化颗粒，并重悬以使PBS中最终颗粒浓度为约12g/L。获得的抗体/mg二氧化硅珠粒的比例取决于所用的二氧化硅珠粒的尺寸(例如，3.9μm二氧化硅珠粒＝0.81μg抗生物素/mg二氧化硅；2μm二氧化硅珠粒＝1.2μg抗生物素/mg二氧化硅)。
为了固定化生物素化的抗独特型和抗CD28抗体的混合物，将TexMACS培养基中生物素化的抗体与抗生物素官能化的二氧化硅珠粒二者的50μL混合物在室温下孵育15分钟。抗独特型抗体与抗CD28抗体的摩尔比为3.3:1。反应混合物中抗体的浓度为4μg/ml抗独特型抗体、1.2μg/ml抗CD28抗体和1.2μg/ml抗生物素抗体(偶联在二氧化硅珠粒上)。该材料在没有进一步纯化的情况下使用。
在二氧化硅珠粒上进行的相同官能化化学也在购自PolyAn的胺官能化的微孔板上进行。
制备方案如图3和图4所示。
使用不同的底物，用DCH/NHS激活羧基官能化的聚苯乙烯珠粒，然后用氨基-葡聚糖分子包被，最后通过用SMCC修饰来进行马来酰亚胺官能化，之后将还原的抗体与珠粒共价偶联。
制备方案如图5和图6所示。
在功能性生物测定中测试不同的官能化的材料。在不同材料(人工靶向材料或Jeko-1对照靶细胞系)存在下，CD2019 CAR T细胞(表达具有CD20和CD19抗原结合结构域的串联CAR的T细胞)于37℃过夜培养。除非另有说明，在用不同材料进行细胞培养期间，抗体浓度为1μg/ml抗独特型抗体和0.3μg/ml抗CD28抗体。然后使用MACSPlex测量上清液中效应分子的分泌。在图中，IFNγ显示为CAR T细胞激活的指标。
通过将具有吸附的抗体的微孔板(与高度共价修饰的板相比，由于可能的脱附，其通常具有较低的官能化程度，并且还具有在下一结合步骤中不利于抗体定向的风险)与具有共价连接的抗体的微孔板(其与尽可能多量的抗体偶联)进行比较，可以表明抗原特异性激活可以用两者实现，但用共价官能化的微孔板可以达到更高的程度。还可以表明，与仅含有抗独特型抗体的样品相比，添加共刺激分子(在这种情况下为抗CD28)大大增强了CAR T细胞的激活。图7示出了结果。
该比较还说明了高密度有利于CAR T细胞的良好激活。
共价修饰的微孔板与官能化的颗粒的比较表明，用抗独特型抗体和抗CD28的混合物官能化的微米大小的二氧化硅或聚苯乙烯颗粒(平均尺寸约为4μm)与具有相同表面包衣的微孔板一样能很好地激活CAR T细胞，从而产生相似水平的IFNγ。在与CAR T细胞共培养后，两种材料均产生了与对照靶细胞相似水平的IFNγ(CD20敲除Jeko-1细胞，命名为CD20KO；CD19敲除Jeko-1细胞，命名为CD19KO；CD20和CD19双敲除Jeko-1细胞，命名为dKO)，证明了它们在测定中可用作人工靶标，并且还可用于CAR T细胞扩增。图8示出了结果。
与单独使用抗独特型抗体相比，添加抗CD28与抗独特型抗体的组合显著增强了激活，这证明了为了在具有人工靶标的靶细胞范围内获得激活，具有共刺激信号的重要性。
图9示出了单独使用抗独特型与使用抗独特型和抗CD28的组合(比例为3.3:1)的激活的比较。
抗独特型抗体与抗CD28的混合物可以通过在如上所述将生物素化的抗体固定化在抗生物素包被的二氧化硅珠粒上期间混合两种抗体来制备，这导致珠粒在其表面具有所需比例的两种抗体。可替代地，可以用单独的抗体来制备二氧化硅珠粒，然后以抗独特型抗体与抗CD28的所需比例混合在其表面各具有一种抗体类型的二氧化硅珠粒。两种材料导致CAR T细胞激活的水平相似。制备单独的珠粒、而非具有抗体混合物的珠粒可有利于珠粒上的单独抗体的定量。在其表面上仅具有抗CD28的珠粒(与具有抗独特型抗体和抗CD28的混合物的样品中使用的抗CD28的浓度相同)不能激活CAR T细胞，这证明了利用测试条件的激活是CAR特异性的。图10示出了结果。
一系列尺寸的二氧化硅珠粒可以用作人工靶标。测试了直径为约0.4μm至约4.6μm的颗粒。表明了理想的珠粒尺寸在2μm至4μm之间的范围内，但所有测试的颗粒的尺寸均能够激活CAR T细胞。还表明，对于在相当的抗CD28浓度下(在没有独特型抗体的情况下)的所有颗粒尺寸，观察到激活水平十分低，从而证明了观察到的CAR T细胞的激活确实是抗原特异性的，并且不能单独使用抗CD28来实现。图11示出了结果。
用人工靶标激活CAR T细胞是浓度依赖性的。不同的CAR T细胞的理想浓度会有所不同，对于所示实施例中测试的CAR T细胞，抗独特型抗体(与抗CD28一起固定化在二氧化硅珠粒上)在激活期间的理想浓度在5-25μg/mL的范围内。图12示出了结果。
用人工靶标进行的激活不仅可以通过靶向CD2019 CAR T细胞的CD19CAR来实现，还可以通过用抗CD20 CAR独特型抗体(命名为37B4)靶向CD20CAR来实现，从而证明了相同的观念也可以用于其他CAR特异性。图13示出了结果。
使用由抗CD19 CAR独特型抗体(克隆REA1297)或抗CD20 CAR独特型抗体(REA1339或REA1341)珠粒与抗CD28抗体(克隆15E8)珠粒的混合物组成的基于聚苯乙烯的人工靶标(如上文所述和如图5所示)激活对CD20和CD19具有特异性的CAR T细胞。作为阳性对照，CART细胞与表达CD20(“CD19KO”)或CD19(“CD20KO”)的Jeko-1细胞共培养。作为阴性对照，CART细胞单独培养(“CAR”)，与不表达CD20或CD19的Jeko-1细胞(“dKO”)共培养，或CAR T细胞与抗CD28抗体(克隆15E8)珠粒共培养(“只有CD28”)。通过测量分泌至上清液中的INFγ的浓度来评估激活。如图14所示，人工靶标激活导致CAR T细胞激活和IFNγ分泌，其所达到的浓度与通过表达CD20的JeKo-1细胞(“CD19KO”)的激活的浓度相似。这些结果证明，使用人工靶标的激活与通过细胞靶标的激活相当。
CAR T细胞在补充有人AB血清、IL-7、IL15和Pen/Strep的TexMACS培养基中与或不与基于聚苯乙烯的人工靶标共培养，并在5天和7天后计数以评估扩增。如图15所示，7天后，用人工靶标培养的CAR T细胞的数量比不用人工靶标培养的CAR T细胞的数量高出2倍，表明了人工靶标可以成功地用于扩增CAR T细胞。
将聚苯乙烯磁珠(3μm)激活/包被/官能化，并偶联至与人全血(WB)一起孵育的专用抗体(例如，CD4、CD15、CD7，并且包括抗生物素)的集合中，以结合靶细胞。然后，磁性分离并选择性地耗尽这些细胞，如图16至20中的点图所示。这说明聚苯乙烯珠粒和聚苯乙烯磁珠可用于激活CAR细胞，也说明了它们的免疫磁性选择性标记可用于操纵、耗竭和从例如Wb或培养基中分离等。
Claims (12)
1.一种用于激活样品中具有至少一种嵌合抗原结合受体的CAR细胞的方法，所述方法通过将样品与至少一种底物一起孵育，所述底物在其表面上被提供有至少一种抗CAR独特型抗体和/或选自由CD19、CD20、CD22、BCMA、CD33、MSLN、CD123、HER2、GD2、EGFR、PSMA、MUC1、CD318、TSPAN8、CD66c、CEA、CLA、CD276、FolR1、CLEC12A、CLL-1和CD371组成的组的至少一种抗原，以及被提供有选自由CD28、CD2、CD6、CD26、CD53和LFA-1组成的组的至少一种共刺激分子，其特征在于，所述样品在悬浮液中与所述至少一种底物一起孵育，从而激活CAR T细胞以表达选自由mRNA、效应分子或细胞表面激活标记物组成的组的标记物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，提供所述底物作为悬浮液中的颗粒，其中所述颗粒的平均直径为至少0.4μm。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述样品与悬浮液中的颗粒一起孵育，从而激活CAR细胞以分泌蛋白质并检测所分泌的蛋白质。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，通过成像、流式细胞术或RT-PCR/RNAseq来检测CAR细胞的激活。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述至少一种抗CAR独特型抗体和/或选自由CD19、CD20、CD22、BCMA、CD33、MSLN、CD123、HER2、GD2、EGFR、PSMA、MUC1、CD318、TSPAN8、CD66c、CEA、CLA、CD276、FolR1、CLEC12A、CLL-1和CD371组成的组的至少一种抗原以及选自由CD28、CD2、CD6、CD26、CD53和LFA-1组成的组的至少一种共刺激分子被提供在至少两种不同底物的表面上。
6.一种用于激活CAR细胞的底物，其特征在于，至少一种所述底物在其表面被提供有至少一种抗CAR独特型抗体和/或选自由CD19、CD20、CD22、BCMA、CD33、MSLN、CD123、HER2、GD2、EGFR、PSMA、MUC1、CD318、TSPAN8、CD66c、CEA、CLA、CD276、FolR1、CLEC12A、CLL-1和CD371组成的组的至少一种抗原以及被提供有选自由CD28、CD2、CD6、CD26、CD53和LFA-1组成的组的至少一种共刺激分子。
7.根据权利要求6所述的底物，其特征在于，提供所述底物作为平均直径为至少0.4μm的颗粒。
8.根据权利要求6或7所述的底物，其特征在于，所述颗粒包括二氧化硅、聚苯乙烯、聚烯烃、多糖、聚酯、聚丙烯酸酯、聚乳酸和/或氧化铁。
9.根据权利要求6至8中任一项所述的底物，其特征在于，所述至少一种抗CAR独特型抗体和/或所述至少一种抗原和/或所述至少一种共刺激分子通过抗生物素抗体、抗硫胺素抗体或通过链霉亲和素与所述底物结合。
10.根据权利要求6至8中任一项所述的底物，其特征在于，至少一种抗CAR独特型抗体或至少一种抗原和至少一种共刺激分子通过引物分子与所述底物结合。
11.根据权利要求9所述的底物，其特征在于，所述引物分子为SMCC(反式-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯)。
12.根据权利要求6至8中任一项所述的底物，其特征在于，所述至少一种抗CAR独特型抗体和/或选自由CD19、CD20、CD22、BCMA、CD33、MSLN、CD123、HER2、GD2、EGFR、PSMA、MUC1、CD318、TSPAN8、CD66c、CEA、CLA、CD276、FolR1、CLEC12A、CLL-1和CD371组成的组的至少一种抗原以及选自由CD28、CD2、CD6、CD26、CD53和LFA-1组成的组的至少一种共刺激分子被提供在至少两种不同底物的表面上。
Applications Claiming Priority (3)
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