JP2024509538A

JP2024509538A - ジヒドロカルコン類の生体触媒生産

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Publication number: JP2024509538A
Application number: JP2023553366A
Authority: JP
Inventors: トルステン・ガイスラー; ヤコブ・ペーター・ライ; バスティアン・ジルペル; ドン・イー; ウーヴェ・ボルンショイアー
Original assignee: シムライズ・アーゲー
Priority date: 2021-03-03
Filing date: 2021-03-03
Publication date: 2024-03-04
Also published as: EP4301865A1; WO2022184248A1; CN117242185A; US20240150797A1

Abstract

本発明は、食品成分の分野に属し、ジヒドロカルコン類の生産のために使用される様々な抽出物ならびに対応する酵素からのジヒドロカルコン類の生産のための方法に関する。さらに、本発明は、本発明による酵素を発現するためのトランスジェニック微生物およびベクターに関する。

Description

食品技術の領域では、香味物質が常に必要とされている。特にジヒドロカルコン類のクラスは、これらの物質またはこれらの物質の混合物が他の香味物質と比較して優れた特性を示すため、注目される。ジヒドロカルコン類の天然源は植物であり、リンゴの葉に特に高い含量が見られる（非特許文献１）。植物からのジヒドロカルコン類の回収および抽出は、収率およびプロセス費用の点で好ましくないため、ジヒドロカルコン類のいくつかの生産方法が文献に記載されている。

望ましい産物はヘスペレチンジヒドロカルコン（３）である。

香味物質としてのヘスペレチンジヒドロカルコン（３）の芳香効果は、特許文献１に記載されている。この特性は、非特許文献２および非特許文献３からも知られる。ヘスペレチンジヒドロカルコン（３）と、果糖および他の甘味料の含量を増加させたコーンシロップとの混合物が、特許文献２に記載される。

１，８‐ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ‐７‐エン、ｔｅｒｔ‐ブチルジメチルシリルクロリドおよび塩酸を反応させることにより、ワンポット反応においてヘスペレチン（２）からのヘスペレチンカルコン（１）の生産が達成できることが記載されている（非特許文献４）。

ヘスペレチンカルコン（１）を生成するさらなる方法は、水酸化カリウムの添加によるトリヒドロキシアセトンのイソバニリンとのアルドール縮合を含む（非特許文献５）。

さらなるステップでは、ヘスペレチンカルコン（１）が水素またはギ酸およびパラジウム触媒を用いた水素化を介してさらに還元されて、ヘスペレチンジヒドロカルコン（３）が形成され得る（非特許文献６、特許文献３）。

鉄または白金などの無機触媒によってヘスペレチンカルコン（２）からヘスペレチンジヒドロカルコン（３）の生産を直接達成できることも記載されている（特許文献４）。

ヘスペレチンジヒドロカルコン（３）は、ネオヘスペリジンジヒドロカルコンの酸加水分解によっても調製され得る（特許文献２）。さらに、特許文献５または特許文献４に記載されるように、ヘスペレチンカルコン（２）を１０％ＫＯＨ水溶液に溶解し、続いて水素（Ｐｄ／Ｃ触媒）で還元することによって、ヘスペレチンカルコン（２）からヘスペレチンジヒドロカルコン（３）を得ることができる。保護基、他の塩基または還元剤の使用、および酸触媒アルドール反応の可能性は、当業者に知られている。

しかし、最新技術で記載された全ての方法をＥＣ１３３４／２００８に従って天然の生産方法であると表明することはできず、特定のジヒドロカルコンの生産に限定される。

天然物としてのラベル付けは、多くの消費者にとって購入決定に非常に重要であるため、このラベル表示が許される適切なジヒドロカルコン類が特に必要であることは明らかである。植物原料からジヒドロカルコン類を得ることは、時間および費用がかかるプロセスであり、本明細書に挙げられた一部のジヒドロカルコン類では、自然には見られないため不可能である。

酵素法または発酵法に関しては、ナリンゲニン、エリオジクチオールおよびホモエリオジクチオールの変換のみが最新技術で報告されている（特許文献６、非特許文献７）。単一酵素のフラバノノール開裂レダクターゼがナリンゲニンおよびホモエリオジクチオールをそれぞれのジヒドロカルコン類に変換できることにもさらに言及されている（非特許文献８）。４‐Ｏ‐メチル化誘導体はいずれも酵素によって変換されなかった。

腸内細菌Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍｒａｍｕｌｕｓが、ジヒドロキシカルコンフロレチンの生産を伴う経路を介してナリンゲニン‐７‐Ｏ‐グルコシドを変換できることがさらに知られている。残念なことに、これはフロログルシノールおよびジヒドロケイ皮酸にさらに分解される（非特許文献９）。

いくつかの生物について、カルコンのそれぞれのジヒドロカルコン類への還元活性が文献に、例えば非特許文献１０および非特許文献１１に記載されている。

報告された方法およびプロセスはいずれも、高価であるか、手間がかかるか、または商業生産用に利用できないかのいずれかである。

国際公開第２０１７１８６２９９Ａ１号国際公開第２０１９０８０９９０Ａ１号米国特許出願公開第２０１８０１７７７５８Ａ１号中国特許第１１１０１８６８４号独国特許第２１４８３３２Ａ１号欧州特許第２９６３１０９Ａ１号

アダム（Ａｄａｍｕ）ら著、リンゴ（Ｍａｌｕｓｓｐ．）葉におけるジヒドロカルコン類の形成についての研究（Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓｏｎｔｈｅｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｄｉｈｙｄｒｏｃｈａｌｃｏｎｅｓｉｎａｐｐｌｅ（Ｍａｌｕｓｓｐ．）ｌｅａｖｅｓ）．アクタホルティクルツラエ（ＡｃｔａＨｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｅ）２０１９年，１２４２，４１５‐４２０ジャーナルオブアグリカルチュラルアンドフードケミストリー（Ｊ．Ａｇｒｉｃ．ＦｏｏｄＣｈｅｍ．）、２５（４）、７６３‐７７２Ｊ．Ｍｅｄ．、１９８１年、２４（４）、４０８‐４２８マイルズ・クリストファー（Ｍｉｌｅｓ，Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ）Ｏ．ら著、オーストラリアンジャーナルオブケミストリー（ＡｕｓｔｒａｌｉａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｅｍｉｓｔｒｙ）（１９８９年）、４２（７）、１１０３‐１３ワダー（Ｗａｄｈｅｒ），Ｓ．Ｊ．ら著、インターナショナルジャーナルオブケミカルサイエンシズ（ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｅｍｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ）（２００６年），４（４），７６１‐７６６ガン・リシェ（Ｇａｎ，Ｌｉ‐Ｓｈｅ）ら著、バイオオーガニック＆メディシナルケミストリーレターズ（Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆ＭｅｄｉｃｉｎａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙＬｅｔｔｅｒｓ）（２０１７年），２７（６）、１４４１‐１４４５ガル（Ｇａｌｌ）ら著、アンゲヴァンテケミーインターナショナルエディション（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．）２０１３年、５２、１‐５ブラウネ（Ｂｒａｕｎｅ）ら著、２０１９年アプライドアンドエンヴァイロンメンタルマイクロバイオロジー（ＡｐｐｌＥｎｖｉｒｏｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ）８５：ｅ０１２３３‐１９Ｈ．シュナイダー（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）、Ｍ．ブラウト（Ｂｌａｕｔ）著、アーカイブズオブマイクロバイオロジー（Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）２０００年、１７３、７１‐７５ジシュカ・ハーベレヒト（Ｚｙｓｚｋａ‐Ｈａｂｅｒｅｃｈｔ）ら著、２０１８年ストンパー（Ｓｔｏｍｐｏｒ）ら著、２０１６年

したがって、本発明の主な課題は、好ましくは費用効率が高くスケーラブルであり、得られた産物を「天然物」としてラベル付けできる、様々な望ましいジヒドロカルコン類の生産のための方法および適切な生体触媒を提供することであった。

本発明の主な課題は、
ｉ）配列番号２４～４６および１６９～１７６からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる少なくとも１つのエンレダクターゼを提供するステップ、
ｉｉ）配列番号１４５～１５８からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる少なくとも１つの遺伝子操作されたカルコンイソメラーゼを任意に提供するステップ、
ｉｉｉ）少なくとも１つのフラバノンおよび／または少なくとも１つのカルコンおよび／または対応するグリコシド類の少なくとも１つを提供するステップ、
ｉｖ）ステップｉ）で提供された少なくとも１つのエンレダクターゼ、および任意にステップｉｉ）で提供された少なくとも１つのカルコンイソメラーゼを、ステップｉｉｉ）で提供された少なくとも１つのフラバノンおよび／または少なくとも１つのカルコンおよび／または少なくとも１つの対応するグリコシドと一緒にインキュベートするステップ、
ｖ）少なくとも１つのジヒドロカルコンを得るステップ、
ｖｉ）得られたジヒドロカルコンを任意に精製するステップ
を含むかまたはそれらからなる、ジヒドロカルコン類の生体触媒製造のための方法を提供することによって解決される。

ジヒドロカルコン類は、系統的にプロパノン誘導体と名付けられ、構造的に１，３‐ジフェニルプロペノン（カルコン）に関係し、植物において生合成され、広範囲の生物活性を示す、開鎖フラボノイドである。カルコン類からジヒドロカルコン類への変換は、カルコン類の二重結合を還元し、したがってジヒドロカルコン類を形成する酵素によって媒介され得る。

本発明に関しての生体触媒製造は、生体触媒の助けの下での抽出物からの産物の製造として理解されねばならない。このような生体触媒は、部分的に精製されたまたは精製された、生きた生物系（細胞）の一部として存在し得る酵素であると一般に理解される。各生体触媒は、固有の化学反応を触媒する。

本発明による方法に関連して使用される酵素は、配列番号２４～４６および１６９～１７６からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるエンレダクターゼである。エンレダクターゼは、電子的に活性化された炭素‐炭素二重結合の不斉還元を高い化学選択性および上昇した立体選択性で触媒する。

驚くべきことに、本発明による方法で使用されるエンレダクターゼは、カルコン類からジヒドロカルコン類への変換を触媒するために優れた活性および選択性を示すことが分かった。配列番号２４～４６および１６９～１７６のエンレダクターゼは、それらの触媒活性および選択性に基づいて選択され、配列番号２４～４６は、配列の説明に記載されるように異なる生物からの天然に存在する配列であり、配列番号１６９～１７６は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ酵素ＡｔＤＢＲ１に由来する遺伝子操作された配列である。

本開示がパーセンテージに関してアミノ酸配列の配列相同性に言及するときは常に、核酸配列の場合はＥＭＢＯＳＳＷａｔｅｒＰａｉｒｗｉｓｅＳｅｑｕｅｎｃｅＡｌｉｇｎｍｅｎｔｓ（ヌクレオチド）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｗａｔｅｒ／ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ．ｈｔｍｌ）、またはアミノ酸配列の場合はＥＭＢＯＳＳＷａｔｅｒＰａｉｒｗｉｓｅＳｅｑｕｅｎｃｅＡｌｉｇｎｍｅｎｔｓ（タンパク質）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｗａｔｅｒ／）を使用して計算できる値を指す。欧州分子生物学研究所（ＥＭＢＬ：ＥｕｒｏｐｅａｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）欧州バイオインフォマティクス研究所（ＥＢＩ：ＥｕｒｏｐｅａｎＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓＩｎｓｔｉｔｕｔｅ）により提供される局所配列アラインメントツールの場合には、修正されたＳｍｉｔｈ‐Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムが使用される（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／およびスミス（Ｓｍｉｔｈ），ＴＦ＆ウォーターマン（Ｗａｔｅｒｍａｎ），Ｍ．Ｓ．「共通分子部分配列の同定（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃｏｍｍｏｎｍｏｌｅｃｕｌａｒｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）」ジャーナルオブモレキュラーバイオロジー（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ）、１９８１年１４７（１）：１９５‐１９７を参照）。さらに、ここでは、修正されたＳｍｉｔｈ‐Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用して２つの配列のそれぞれのペアワイズアライメントを行う際に、ＥＭＢＬ‐ＥＢＩによって現在与えられるデフォルトパラメータが参照される。これらは、（ｉ）アミノ酸配列の場合：マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２、ギャップオープンペナルティ＝１０、およびギャップ伸長ペナルティ＝０．５、ならびに（ｉｉ）核酸配列の場合：マトリックス＝ＤＮＡｆｕｌｌ、ギャップオープンペナルティ＝１０、およびギャップ伸長ペナルティ＝０．５である。

「配列相同性」という用語は、本発明との関連では「配列同一性」と互換的に使用されることができる。いずれの用語も常に、それに対して配列同一性または配列相同性が決定される酵素の全長と比較した本発明による酵素の全長を指す。

本発明に関しては、本発明による方法のステップｉｉ）において追加のカルコンイソメラーゼを提供することが好ましい。カルコンイソメラーゼは、カルコンからフラバノンへ、またはその逆の反応を触媒する酵素である。カルコンイソメラーゼの別名は、カルコン‐フラバノンイソメラーゼである。

驚くべきことに、配列番号１４５～１５８からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる遺伝子操作されたカルコンイソメラーゼは、フラバノンからカルコンへの反応を触媒する際に優れた性能を示し、したがってジヒドロカルコン類を生産するための抽出物としてフラバノンで開始する方法において使用され得ることが分かった。本発明による方法で使用されるところのカルコンイソメラーゼが、フラバノンをカルコンに変換でき、それがその後カルコンからジヒドロカルコンへの反応に供給されるため、本発明による、本発明による方法のステップｉ）で提供されるところのエンレダクターゼによるカルコンのジヒドロカルコンへの変換を促進することは特に驚くべきことであった。

本発明に関しての「遺伝子操作された」とは、本発明による酵素が、天然に存在する酵素または最新技術から知られている酵素と比較して変更または修飾されていることを意味する。適切な修飾は、アミノ酸配列における変異であり得る。適切な変異誘発法、ならびに必要な条件および試薬は、当業者によく知られている。変異は、例えば塩基の置き換え（もしくは置換）、除去（もしくは欠失）、または付加を通じて遺伝子レベルで生じる。これらの変異は、結果として生じるタンパク質のアミノ酸配列に対して異なる影響を有する。置換の場合には、いわゆる「ナンセンス」変異が生じ、タンパク質生合成を早期に停止させ、結果として生じるタンパク質を機能不全にとどまらせ得る。いわゆる「ミスセンス」変異では、コードされたアミノ酸のみが変化し、これらの変異は結果として生じるタンパク質の機能的変化をもたらし、最善の場合には、結果として生じるタンパク質の安定性または活性の向上を引き起こし得る。一般的な命名法では、アミノ酸置換変異は、その位置および置換されるアミノ酸に基づいて、例えばＡ１４３Ｇと指名される。この表記法は、Ｎ末端からＣ末端のアミノ酸配列の１４３位でアミノ酸のアラニンがグアニンに交換されていることを意味する。

フラバノン類は、フラボノイド生合成経路の最初のフラボノイド産物である。これらは、Ｃ２のキラル中心の存在とＣ２‐Ｃ３結合の不存在とにより特徴付けられる。フラバノン類は柑橘類に高濃度で見られる。これらは、本発明による抽出物として好ましく使用され、以下にさらに明記される。

カルコン類は、異なる置換基を持つα，β‐不飽和カルボニル系によって結合された２つの芳香環（ＡおよびＢ）からなるα，β‐不飽和ケトン類である。本発明による抽出物として好ましく使用されるカルコンは、以下にさらに明記される。

使用されるフラバノン類および／またはカルコン類に関連する「対応するグリコシド類」という用語は、グリコシド結合を介して別の官能基に結合した糖を有する対応するフラバノン類および／またはカルコン類を指す。フラバノン類および／またはカルコン類のグリコシド類は、フラバノン類および／またはカルコン類の天然源中に特に存在する。

本発明による方法から得られるジヒドロカルコン類は、使用されるフラバノンおよび／またはカルコンおよび／またはそれらの対応するグリコシド類、またはそれぞれ使用される出発材料に応じて、異なるジヒドロカルコン類の混合物として、および／または他の化合物と一緒になった混合物において存在し得る。それらは、当業者に知られる適切な方法によってさらに精製され得る。得られたジヒドロカルコン類の混合物または精製されたジヒドロカルコン類は、芳香組成物、栄養または享楽向けの調製物などの調製物に香味剤として組み込まれるのが好ましい。

好ましくは、栄養または享楽向けの調製物は、（カロリーオフ）焼き物（例えばパン、乾燥ビスケット、ケーキ、他の焼き物品）、菓子類（例えばミューズリーバー製品、チョコレート、チョコレートバー、他のバー形態の製品、フルーツガム、ドラジェ、ハードおよびソフトキャラメル、チューインガム）、ノンアルコール飲料（例えばココア、コーヒー、緑茶、紅茶、（緑、紅）茶抽出物を強化した（緑、紅）茶飲料、ルイボスティー、その他のハーブティー、果実入りソフト飲料、アイソトニック飲料、清涼飲料、ネクター、果物および野菜ジュース、果物または野菜ジュース調製物）、インスタント飲料（例えばインスタントココア飲料、インスタントティー飲料、インスタントコーヒー飲料）、肉製品（例えばハム、フレッシュソーセージまたは生ソーセージ調製物、香辛料入りまたはマリネしたフレッシュまたは塩漬け肉製品）、卵または卵製品（乾燥卵、卵白、卵黄）、シリアル製品（例えば朝食用シリアル、ミューズリーバー、調理済みインスタント米製品）、乳製品（例えば高脂肪または低脂肪または無脂肪乳飲料、ライスプディング、ヨーグルト、ケフィア、クリームチーズ、ソフトチーズ、ハードチーズ、乾燥粉乳、ホエー、バター、バターミルク、アイスクリーム、部分または完全加水分解乳タンパク質含有製品）、大豆タンパク質または他の大豆画分から作られた製品（例えば豆乳およびそれから生産された製品、単離または酵素処理大豆タンパク質含有飲料、大豆粉含有飲料、大豆レシチン含有調製物、豆腐もしくはテンペなどの発酵製品またはそれらから生産された製品、ならびに果物調製物および任意に香味料との混合物）、タンパク質豊富な植物材料からの（例えばオート麦、アーモンド、エンドウ、ルピナス、レンティル、ソラマメ、ひよこ豆、米、キャノーラの種子材料からの）乳製品様調製物（乳タイプ、ヨーグルトタイプ、デザートタイプ、アイスクリーム）、植物タンパク質強化乳製品不使用飲料、果物調製物（例えばジャム、シャーベット、フルーツソース、フルーツフィリング）、野菜調製物（例えばケチャップ、ソース、乾燥野菜、冷凍野菜、調理済み野菜、煮詰め野菜）、スナック類（例えばベークドまたはフライドポテトチップまたはポテト生地製品、トウモロコシまたはラッカセイベースの押出物）、脂または油ベースの製品またはそれらのエマルション（例えばマヨネーズ、レムラード、ドレッシング、いずれも高脂肪または減脂肪）、その他の既製料理およびスープ（例えば乾燥スープ、インスタントスープ、調理済みスープ）、香辛料、香辛料混合物、および特に例えばスナック類の分野で使用される調味料、甘味料調製物、錠剤または小袋、飲料を甘くまたは白くするためのその他の調製物からなる群より選択され得る。

本発明の意味の中での栄養または享楽向けの調製物は、カプセル、錠剤（非被覆および被覆錠剤、例えば胃耐性被覆）、糖衣ピル、顆粒、ペレット、固体混合物、液相中の分散物、エマルションとして、粉末として、溶液として、ペーストとして、または飲み込みもしくは咀嚼できる他の製剤としての形の栄養補助食品としても存在することができる。

本発明の好ましい実施形態は、本発明による方法であって、ｉ）で提供される少なくとも１つのエンレダクターゼは、精製または部分的に精製される、方法に関する。精製されたエンレダクターゼとは、提供時に９０％（ｗ／ｗ）以上の純度を示す酵素をいう。酵素の精製のための適切な方法は、当業者に知られている。部分的に精製された酵素とは、純度が９０％（ｗ／ｗ）未満であり、生体内に存在しない酵素を指す。

別の好ましい実施形態は、本発明による方法であって、ステップｉｖ）のインキュベーションは、少なくとも５、１０、１５、２０、２５分間、好ましくは少なくとも３０分間行われる、方法に関する。

さらに別の実施形態は、本発明による方法であって、ステップｉｉｉ）で提供される少なくとも１つのフラバノンおよび／または少なくとも１つのカルコンおよび／または対応するグリコシド類の少なくとも１つは、ホモエリオジクチオール、ヘスペリジン、ヘスペレチン‐７‐グルコシド、ネオヘスペリジン、ナリンゲニン、ナリンギン、ナリルチン、リキリチゲニン、ピノセムブリン、ステッポゲニン、スクテアモエニン、ジヒドロエキオジニン、ポンシレチン、サクラネチン、イソサクラネチン、４，７‐ジヒドロキシ‐フラバノン、４，７‐ジヒドロキシ‐３’‐メトキシフラバノン、３，７‐ジヒドロキシ‐４’‐メトキシフラバノン、３’４，７‐トリヒドロキシフラバノン、アルピネンチン、ピノストロビン、７‐ヒドロキシフラバノン、４’‐ヒドロキシフラバノン、３‐ヒドロキシフラバノン、ツガフォリンからなる群より選択される、方法に関する。

好ましいフラバノン類および／またはカルコン類は、以下に示されるそれらの構造式で表現される。

本発明の一実施形態は、本発明による方法であって、ステップｉｉｉ）で少なくとも１つのフラバノンおよび／または少なくとも１つのカルコンおよび／または対応するグリコシド類の少なくとも１つが提供され、少なくとも１つのフラバノンおよび／または少なくとも１つのカルコンおよび／または対応するグリコシド類の少なくとも１つは、精製または部分的に精製される、方法に関する。

本発明の別の実施形態は、本発明による方法であって、ステップｖ）で得られる少なくとも１つのジヒドロカルコンは、ブテインジヒドロカルコン、ホモブテインジヒドロカルコン、４‐Ｏ‐メチルブテインジヒドロカルコン、ナリンゲニンジヒドロカルコン、ヘスペレチンジヒドロカルコン、ホモエリオジクチオールジヒドロカルコンおよびエリオジクチオールジヒドロカルコンからなる群より選択される、方法に関する。

好ましいジヒドロカルコン類は、以下に示されるそれらの構造式で表現される。

上に好ましいものとして記載された全ての実施形態は、本発明に関して互いに互換可能に組み合わせることができる。

本発明の別の態様は、配列番号１６９～１７６からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる遺伝子操作されたエンレダクターゼに関する。

本発明の好ましい一実施形態は、配列番号１８９によるコンセンサス配列を有する遺伝子操作されたエンレダクターゼに関する。

コンセンサス配列は、本発明による全ての遺伝子操作された酵素を表し、アミノ酸置換が存在し得る可変位置はＸａａによってマークされる。

本発明の別の好ましい実施形態は、遺伝子操作されたエンレダクターゼに関し、遺伝子操作されたエンレダクターゼは、アラニン、グリシン、セリン、アスパラギン、バリン、スレオニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニンおよびフェニルアラニンからなる群より選択される２７６位および／または２９０位のアミノ酸を含む。

本発明のさらに別の好ましい実施形態は、遺伝子操作されたエンレダクターゼに関し、遺伝子操作されたエンレダクターゼは、ロイシン、グルタミン、スレオニン、システイン、フェニルアラニンアスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群より選択される２８５位のアミノ酸を含む。

本発明の別の好ましい実施形態では、遺伝子操作されたエンレダクターゼは、野生型配列と比較して２８５位のバリンからグルタミンへのアミノ酸置換（Ｖ２８５Ｑ）を含む。

配列番号１６９～１７６からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるエンレダクターゼは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａからの天然に存在するエンレダクターゼＡｔＤＢＲ１に由来し、遺伝子操作されて新たなＡｔＤＢＲ１バリアントが生成された。特に、配列番号１６９～１７６からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列相同性を有するバリアントは、カルコン類からジヒドロカルコンへ類の変換において活性および選択性の増加を示すことが分かった。これらのバリアントは、酵素の特異性および活性を変更する機能的アミノ酸置換を示す。

配列番号１４５～１５８からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる遺伝子操作されたカルコンイソメラーゼも本明細書に記載される。

遺伝子操作されたカルコンイソメラーゼは、配列番号１９０によるコンセンサス配列を有するのが好ましい。

遺伝子操作されたカルコンは、明記された位置の以下のアミノ酸の少なくとも１つを含むのが特に好ましい。
‐４０位
‐７９位アラニン、プロリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ロイシン、バリンメチオニンまたはイソロイシン、
‐８７位リシン、アルギニンまたはアスパラギン、
‐１２２位アスパラギン酸、アスパラギンまたはグルタミン酸、
‐１２５位アルギニンまたはグリシン

さらに好ましいのは、アラニン、グリシン、プロリン、イソロイシン、バリン、メチオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、およびアルギニンからなる群より選択される７９位または１２５位のアミノ酸を含む遺伝子操作されたカルコンイソメラーゼである。驚くべきことに、配列番号１４５～１５８からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる遺伝子操作されたカルコンイソメラーゼは、フラバノンからカルコンへの反応を触媒する際に優れた性能を示すことが分かった。本発明によるカルコンイソメラーゼは、カルコンの部分で等価の反応を有し、フラバノンからカルコンへの反応を主に触媒することは特に驚くべきことであった。そのようにして得られたカルコンはその後、本発明による、本発明による方法のステップｉ）で提供されるところのエンレダクターゼによりジヒドロカルコンに触媒され得る。

好ましくは、遺伝子操作されたカルコンイソメラーゼは、配列番号１５４、１５７、１４５、１５２、１５５、１５３、１４７からなる群より選択される、より好ましくは配列番号１５７、１５４および１４５からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる。

さらなる好ましい実施形態では、遺伝子操作されたカルコンイソメラーゼの配列は、配列番号８５～９８からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列相同性を有するＥｕｂａｃｔｅｒｉｕｍｒａｍｕｌｕｓに由来する。

全ての上述した酵素の実施形態は、上述した本発明による方法に関して使用することができる。

本発明のさらに別の態様は、本発明による遺伝子操作されたエンレダクターゼをコードする核酸配列を含むトランスジェニック微生物に関する。

本発明の好ましい一実施形態は、本発明によるトランスジェニック微生物であって、Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１、Ｅ．ｃｏｌｉＭＧ１６５５、好ましくはＥ．ｃｏｌｉＷ３１１０などのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ種、Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｉｔｉｌｉｓ、またはＢａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓなどのＢａｃｉｌｌｕｓ種、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種、好ましくはＳ．ｃｅｒｅｖｅｓｉａｅ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、またはＫ．ｐｈａｆｆｉｉおよびＨ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａなどのＫｏｍａｇａｔａｅｌｌａ種、好ましくはＫ．ｐｈａｆｆｉｉ、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａなどのＹａｒｒｏｗｉａ種、Ｋ．ｌａｃｔｉｓなどのＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ種からなる群より選択される微生物に関する。

本発明の一態様は、
‐配列番号２４～４６および１６９～１７６からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列相同性を有するエンレダクターゼをコードする少なくとも１つの核酸配列
および任意に
‐配列番号１４５～１５８からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列相同性を有する遺伝子操作されたカルコンイソメラーゼをコードする少なくとも１つの核酸配列
を含むベクター、好ましくはプラスミドベクターに関する。

本発明によるベクターの好ましい一実施形態では、ベクターは、
配列番号２４～４６および１６９～１７６からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列相同性を有するエンレダクターゼをコードする少なくとも１つの核酸配列
および
‐配列番号１４５～１５８からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列相同性を有する遺伝子操作されたカルコンイソメラーゼをコードする少なくとも１つの核酸配列
を含む。

本発明の一態様は、２つのベクターを含むベクター系に関し、第１のベクターは、
配列番号２４～４６および１６９～１７６からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列相同性を有するエンレダクターゼをコードする少なくとも１つの核酸配列
を含み、第２のベクターは、
配列番号１４５～１５８からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列相同性を有する遺伝子操作されたカルコンイソメラーゼをコードする少なくとも１つの核酸配列
を含む。

上述のトランスジェニック微生物またはベクターのさらなる実施形態は、上述の本発明による方法の好ましい実施形態を検討すれば明らかになり、したがって本発明によるトランスジェニック微生物またはベクターに関連して適宜適用される。

本発明の別の態様は、本発明による少なくとも１つのエンレダクターゼおよび／または本発明による少なくとも１つのトランスジェニック微生物および／または本発明による少なくとも１つのベクターの、好ましくは上に好ましいものとして記載されたような、ジヒドロカルコン類の生体触媒製造における、好ましくは本発明による方法における、使用に関する。

本発明は、例示的な非限定的実施例によってさらに特徴付けられる。

ＣＨＩおよびＡｔＤＢＲ１を発現する（点線）またはＣＨＩのみを発現する（実線）Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）細胞の溶解物上清を使用したブテインの生体内変換のＬＣクロマトグラムを示す。ＣＨＩおよびＡｔＤＢＲ１を発現する（点線）またはＣＨＩのみを発現する（実線）Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）細胞の溶解物上清を使用したホモブテインの生体内変換のＬＣクロマトグラムを示す。ＣＨＩおよびＡｔＤＢＲ１を発現する（点線）またはＣＨＩのみを発現する（実線）Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）細胞の溶解物上清を使用した４‐Ｏ‐メチルブテインの生体内変換のＬＣクロマトグラムを示す。ＡｔＤＢＲ１を発現するＥ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）細胞の溶解物上清を使用したナリンゲニンカルコンの生体内変換のＬＣ‐ＭＳクロマトグラムを示す。ＡｔＤＢＲ１を発現するＥ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）細胞の溶解物上清を使用したヘスペレチンカルコンの生体内変換のＬＣ‐ＭＳクロマトグラムを示す。ＡｔＤＢＲ１を発現するＥ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）細胞の溶解物上清を使用したエリオジクチオールカルコンの生体内変換のＬＣ‐ＭＳクロマトグラムを示す。ブテインとともにインキュベートされた異なるエンレダクターゼを発現するＥ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）細胞の溶解物上清の産物ブテインジヒドロカルコンの形成を示す。ホモブテインとともにインキュベートされた異なるエンレダクターゼを発現するＥ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）細胞の溶解物上清の産物ホモブテインジヒドロカルコンの形成を示す。４‐Ｏ‐メチルブテインとともにインキュベートされた異なるエンレダクターゼを発現するＥ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）細胞の溶解物上清の産物４‐Ｏ‐メチルブテインジヒドロカルコンの形成を示す。ナリンゲニンカルコンとともにインキュベートされた異なるエンレダクターゼを発現するＥ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）細胞の溶解物上清の産物ナリンゲニンジヒドロカルコンの形成を示す。ヘスペレチンカルコンとともにインキュベートされた異なるエンレダクターゼを発現するＥ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）細胞の溶解物上清の産物ヘスペレチンジヒドロカルコンの形成を示す。エリオジクチオールカルコンとともにインキュベートされた異なるエンレダクターゼを発現するＥ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）細胞の溶解物上清の産物エリオジクチオールジヒドロカルコンの形成を示す。ホモエリオジクチオールカルコンとともにインキュベートされた異なるエンレダクターゼを発現するＥ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）細胞の溶解物上清の産物ホモエリオジクチオールジヒドロカルコンの形成を示す。異なるカルコンに対するＣＨＩおよびＣＨＩｅｒａバリアントの特異的活性を示す。異なるカルコンとともにインキュベートされた精製されたＡｔＤＢＲ１のジヒドロカルコン産物の形成を示す。ヘスペレチンカルコンとともにインキュベートされた異なるＡｔＤＢＲ１バリアントを発現するＥ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）細胞の溶解物上清の産物ヘスペレチンジヒドロカルコンの形成を示す。Ａ）酵素を用いず５０ｍＭリン酸バッファーｐＨ６．０中で９０分間、Ｂ）精製されたＡｔＤＢＲ１を用いて０分間、Ｃ）精製されたＡｔＤＢＲ１を用いて９０分間の、ヘスペレチンインキュベーションのＬＣ‐ＭＳクロマトグラムを示す。

１．プラスミドＤＮＡのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ細胞への形質転換
プラスミド増殖のために、プラスミドＤＮＡを化学的にコンピテントなＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α細胞（ニューイングランドバイオラボ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）、フランクフルトアムマイン、ドイツ）に形質転換した。発現株の生成のために、プラスミドＤＮＡを化学的にコンピテントなＥ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に形質転換した。

５０μＬのそれぞれのＥ．ｃｏｌｉ株を氷上で５分間インキュベートした。１μｌのプラスミドＤＮＡを添加した後、懸濁液を混合し、氷上で３０分間インキュベートした。細胞懸濁液をサーモブロック内で４２℃で４５秒間インキュベートし、続いて氷上で２分間インキュベートすることによって形質転換を行った。３５０μｌのＳＯＣアウトグロース培地（ニューイングランドバイオラボ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）、フランクフルトアムマイン、ドイツ）を添加した後、細胞を３７℃および２００ｒｐｍで１時間インキュベートした。続いて、細胞懸濁液を、それぞれの抗生物質を含むＬＢ‐寒天プレート（カーロス社（ＣａｒＲｏｔｈＧｍｂＨ）、カールスルーエ、ドイツ）上に広げ、３７℃で１６時間インキュベートした。

２．発現プラスミドの生成
配列番号４８をコードする配列番号４７をベクターｐＣＤＦＤｕｅｔ‐１にクローニングして、ベクターｐＣＤＦＤｕｅｔ‐１ＣＨＩを得た。ベクターｐＣＤＦＤｕｅｔ‐１と配列番号４９および配列番号５０、ならびに配列番号５６と配列番号５１および配列番号５２を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）によって専門家に知られる一般的な手法に従って増幅し、反応溶液を１：１の比で混合し、実施例１に記載のように３７℃での１時間のインキュベーション後に、１．５μｌの混合物をＥ．ｃｏｌｉＤＨ５αに形質転換した。ベクターｐＣＤＦＤｕｅｔ‐１ＣＨＩを、実施例１に記載のようにＥ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換する。

配列番号２４～配列番号４６をそれぞれコードする配列番号１～配列番号２３の配列を合成し、ｐＥＴ２８ａベクターのＮｃｏＩ制限部位とＸｈｏＩ制限部位との間にクローニングして（ツイストバイオサイエンス（ＴｗｉｓｔＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）、サンフランシスコ、米国）、表１に列挙されたプラスミドを得た。これらの発現ベクターを、実施例１に記載のようにＥ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）細胞またはプラスミドｐＣＤＦＤｕｅｔ‐１ＣＨＩを含むＥ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に形質転換する。

配列番号６９～配列番号８４をそれぞれコードする配列番号５３～配列番号６８の配列を合成し、ｐＥＴ２８ｂベクターのＮｄｅＩ制限部位とＢａｍＨＩ制限部位との間にクローニングして（バイオキャット（ＢｉｏＣａｔ）、ハイデルベルク、ドイツ）、表２に列挙されたプラスミドを得た。これらの発現ベクターを、実施例１に記載のようにＥ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に形質転換する。

人工設計により、ＣＨＩｅｒａ酵素の活性および／または特異性を最適化するために、ＣＨＩｅｒａのある変異体を作製した。これらのＣＨＩｅｒａ変異体バリアントは、配列番号１４５～配列番号１５８をコードする配列番号８５～配列番号９６に対応し、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅキット（アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）、米国）を使用した部位特異的変異誘発によって生成された。このために、配列番号６８を含むベクターｐＥＴ２８ｂ＿ＣＨＩｅｒａを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって製造者のマニュアルに従って配列番号９９～配列番号１４３の配列からの同じ対番号の１つのプライマー対をそれぞれ用いて増幅した。１μＬのＤｐｎＩで３７℃で１時間消化した後、混合物を、実施例１に記載のようにＥ．ｃｏｌｉＤＨ５αに形質転換して、表３に列挙したプラスミドを得た。

配列番号１６０をコードする配列番号１５９の配列を合成し、ｐＥＴ２８ａベクターのＮｄｅＩ制限部位とＸｈｏＩ制限部位との間にクローニングして（ツイストバイオサイエンス（ＴｗｉｓｔＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）、サンフランシスコ、米国）、プラスミドｐＥＴ２８ａ＿ｈｉｓ‐ＡｔＤＢＲ１を得た。

人工設計により、ＡｔＤＢＲ１酵素の活性および／または特異性を最適化するために、ＡｔＤＢＲ１のある変異体を作製した。これらのＡｔＤＢＲ１変異体バリアントは、配列番号１６９～配列番号１７６をコードする配列番号１６１～配列番号１６８に対応し、Ｑ５（登録商標）部位特異的変異誘発キット（ニューイングランドバイオラボ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）、ドイツ）を使用した部位特異的変異誘発によって生成された。このために、配列番号１５９を含むベクターｐＥＴ２８ａ＿ｈｉｓ‐ＡｔＤＢＲ１を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって製造者のマニュアルに従って配列番号１７７～配列番号１８８の配列からの同じ対番号の１つのプライマー対をそれぞれ用いて増幅した。製造者のマニュアルにしたがった消化およびライゲーションの後、混合物を、実施例１に記載のようにＥ．ｃｏｌｉＤＨ５αに形質転換して、表４に列挙したプラスミドを得た。

３．Ｅ．ｃｏｌｉ細胞の培養およびエンレダクターゼによる生体内変換
ｐＣＤＦＤｕｅｔ‐１ＣＨＩと表１からのｐＥＴ２８ａプラスミドの１つとを含むＥ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）細胞、または表１からのｐＥＴ２８ａプラスミドの１つだけを含むＥ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を使用して、必要な抗生物質を含む５ｍＬのＬＢ培地（カールロス社（ＣａｒｌＲｏｔｈＧｍｂＨ）、カールスルーエ、ドイツ）にそれぞれ植菌した。１６時間のインキュベーション（３７℃、２００ｒｐｍ）後、細胞を使用して、必要な抗生物質を含む５０ｍＬのＴＢ培地（カールロス社（ＣａｒｌＲｏｔｈＧｍｂＨ）、カールスルーエ、ドイツ）にＯＤ_６００＝０．１で植菌した。細胞をＯＤ_６００＝０．５～０．８まで増殖させ（３７℃、２００ｒｐｍ）、１ｍＭのイソプロピル‐β‐Ｄ‐チオガラクトピラノシドを培養物に添加した。細胞培養物を１６時間インキュベートし（２２℃、２００ｒｐｍ）、遠心分離し（１０分、１０，０００ｒｐｍ）、上清を廃棄した。細胞ペレットを、Ｂ‐ＰＥＲタンパク質抽出試薬（サーモフィッシャーサイエンティフィック（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ボン、ドイツ）を製造者の指示に従って使用して溶解した。その後の遠心分離（１０分、２０．０００ｒｐｍ）後、１．５ｍＭニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、１．５ｍＭニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、１Ｍグルコース、１Ｕグルコースデヒドロゲナーゼおよび１ｍＭ基質の添加により上清を生体内変換のために使用した。ブテイン、ホモブテイン、４‐Ｏ‐メチルブテイン、ナリンゲニンカルコン、ヘスペレチンカルコン、エリオジクチオールカルコンおよびホモエリオジクチオールカルコンをそれぞれ基質として使用した。反応混合物を３０℃で１６時間インキュベートした。メタノール（１体積の反応混合物＋１体積のメタノール）で反応を停止させた後、サンプルを遠心分離し（２０分、２０，０００ｒｐｍ）、上清をＬＣおよびＬＣ‐ＭＳ分析のために使用した。

４．ＣＨＩの精製および生体内変換
表２または表３からのｐＥＴ２８ｂプラスミドの１つを含むＥ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を使用して、１ＬのＬＢ培地にＯＤ＝０．１で植菌した。細胞をＯＤが０．４～０．６に達するまで３７℃、２５０ｒｐｍでインキュベートし、０．１ｍＭＩＰＴＧを補充することにより誘導した。２８℃、２５０ｒｐｍでの１６時間のタンパク質発現後、４，０００×ｇでの１５分間の遠心分離により細胞を採取した。採取した細胞を、０．５ｍｇ／ｍＬリゾチーム（シグマアルドリッチ（Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ））、０．４Ｕ／ｍＬＢｅｎｚｏｎａｓｅ（シグマアルドリッチ（Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ））およびＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（メルク（Ｍｅｒｃｋ））により室温で０．５時間溶解して、粗細胞抽出物を得た。粗抽出物を１０，０００×ｇで３０分間遠心分離して、ペレットを除去した。Ｎｉアフィニティクロマトグラフィ（ＧＥヘルスケア（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ））によって組換えタンパク質を精製した。粗抽出物の上清を、２０ｍＭイミダゾールとともにカラムにロードした。カラムを、５カラム体積の３０ｍＭイミダゾールと２０ｍＭＰＢＳ（ｐＨ７．４）および５００ｍＭＮａＣｌで洗浄した。１５０ｍＭイミダゾールと２０ｍＭＰＢＳ（ｐＨ７．４）および５００ｍＭＮａＣｌによって標的タンパク質を溶出した。ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ‐１５（メルク（Ｍｅｒｃｋ））による限外濾過によって５０ｍＭＰＢＳ（ｐＨ７．５）とのバッファー交換を達成した。反応混合物（２５℃の５０ｍＭＰＢＳ中のＣＨＩと１００μＭのナリンゲニンカルコン、ヘスペレチンカルコン、エリオジクチオールカルコン、ホモエリオジクチオールカルコンまたは４‐Ｏ‐メチルブテインのいずれか）における３８４ｎｍでの吸光度の減少を測定することによって、それぞれの精製された酵素の活性を決定した。結果を表５に示す。

５．ＡｔＤＢＲ１の精製および基質供給
プラスミドｐＥＴ２８ａ＿ｈｉｓ‐ＡｔＤＢＲ１を含むＥ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を使用して、必要な抗生物質を含む５ｍＬＬＢ培地（カールロス社（ＣａｒｌＲｏｔｈＧｍｂＨ）、カールスルーエ、ドイツ）に植菌した。１６時間のインキュベーション（３７℃、２００ｒｐｍ）後、細胞を使用して、必要な抗生物質を含む５０ｍＬのＴＢ培地（カールロス社（ＣａｒｌＲｏｔｈＧｍｂＨ）、カールスルーエ、ドイツ）にＯＤ_６００＝０．１で植菌した。細胞をＯＤ_６００＝０．５～０．８まで増殖させ（３７℃、２００ｒｐｍ）、１ｍＭのイソプロピル‐β‐Ｄ‐チオガラクトピラノシドを培養物に添加した。細胞培養物を１６時間インキュベートし（２２℃、２００ｒｐｍ）、遠心分離し（１０分、１０，０００ｒｐｍ）、上清を廃棄した。細胞ペレットを、Ｂ‐ＰＥＲタンパク質抽出試薬（サーモフィッシャーサイエンティフィック（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ボン、ドイツ）を製造者の指示に従って使用して溶解した。続く遠心分離（１０分、２０，０００ｒｐｍ）の後、１ｍＬのＨｉｓＴｒａｐＦＦカラム（ＧＥヘルスケア（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ））を製造者のマニュアルに従って使用して上清を精製した。溶出したタンパク質を、ＰＤ‐１０脱塩カラム（ＧＥヘルスケア（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ））を使用して、製造者のマニュアルの重量分析プロトコルを使用して脱塩した。タンパク質を５０ｍＭリン酸バッファーｐＨ６．０に溶出させた。精製されたタンパク質を、１．５ｍＭニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸の添加および基質（ナリンゲニンカルコン、ヘスペレチンカルコン、エリオジクチオールカルコンまたはホモエリオジクチオールカルコンをそれぞれ使用した）の供給により生体内変換のために使用した。反応液に、１０ｐｐｍの基質を１０分毎に１５０分間補充した。３０℃でインキュベーションを行った。メタノール（１体積の反応混合物＋１体積のメタノール）で反応を停止させた後、サンプルを遠心分離し（２０分、２０．０００ｒｐｍ）、上清をＬＣおよびＬＣ‐ＭＳ分析のために使用した（図１５を参照）。

精製されたＡｔＤＢＲ１を、１．５ｍＭニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸および１０μＭヘスペレチンの添加により生体内変換のために使用した。対照反応を、上記のように、但し精製されたＡｔＤＢＲ１の代わりに５０ｍＭリン酸バッファーｐＨ６．０を用いて行った。反応物を３０℃でインキュベートした。インキュベーションの０分後、またはインキュベーションの９０分後に、メタノール（１体積の反応混合物＋１体積のメタノール）で反応を停止させた。サンプルを遠心分離し（２０分、２０，０００ｒｐｍ）、上清をＬＣ‐ＭＳ分析のために使用した。結果を図１７に描写する。

６．Ｅ．ｃｏｌｉ細胞の培養およびＡｔＤＢＲ１バリアントによる生体内変換
表４のｐＥＴ２８ａプラスミドの１つを含むＥ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を使用して、必要な抗生物質を含む４５０μＬＬＢ培地（カールロス社（ＣａｒｌＲｏｔｈＧｍｂＨ）、カールスルーエ、ドイツ）の前培養物をそれぞれ植菌した。６時間のインキュベーション（３７℃、３００ｒｐｍ）後、細胞を使用して、それぞれの前培養物３５μＬを抗生物質を含む６６５μＬＴＢ培地（カールロス社（ＣａｒｌＲｏｔｈＧｍｂＨ）、カールスルーエ、ドイツ）に植菌した。細胞を７５分間増殖させ（３７℃、３００ｒｐｍ）、５０μｌの１５ｍＭイソプロピル‐β‐Ｄ‐チオガラクトピラノシドを培養物に添加した。細胞培養物を１６時間インキュベートし（２８℃、３００ｒｐｍ）、遠心分離し（２０分、５，０００ｒｐｍ）、上清を廃棄した。細胞ペレットを、５００μＬＢ‐ＰＥＲタンパク質抽出試薬（サーモフィッシャーサイエンティフィック（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ボン、ドイツ）中で製造者の指示に従って溶解した。その後の遠心分離（６０分、５，０００ｒｐｍ）後、１．５ｍＭニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸および２０μＭの基質ヘスペレチンカルコンの添加により上清を生体内変換のために使用した。反応混合物を４０℃で３．５時間インキュベートした。メタノール（１体積の反応混合物＋１体積のメタノール）で反応を停止させた後、サンプルを遠心分離し（６０分、５，０００ｒｐｍ）、上清をＬＣ分析のために使用した。結果を図１６に描写する。

Claims

ｉ）配列番号２４～４６および１６９～１７６からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる少なくとも１つのエンレダクターゼを提供するステップ、
ｉｉ）配列番号１４５～１５８からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる少なくとも１つの遺伝子操作されたカルコンイソメラーゼを任意に提供するステップ、
ｉｉｉ）少なくとも１つのフラバノンおよび／または少なくとも１つのカルコンおよび／または対応するグリコシド類の少なくとも１つを提供するステップ、
ｉｖ）ステップｉ）で提供された前記少なくとも１つのエンレダクターゼ、および任意にステップｉｉ）で提供された前記少なくとも１つのカルコンイソメラーゼを、ステップｉｉｉ）で提供された前記少なくとも１つのフラバノンおよび／または前記少なくとも１つのカルコンおよび／または前記少なくとも１つの対応するグリコシドと一緒にインキュベートするステップ、
ｖ）少なくとも１つのジヒドロカルコンを得るステップ、
ｖｉ）前記得られたジヒドロカルコンを任意に精製するステップ
を含むかまたはそれらからなる、ジヒドロカルコン類の生体触媒製造のための方法。
ステップｉ）で提供される前記少なくとも１つのエンレダクターゼは、精製または部分的に精製される、請求項１に記載の方法。
ステップｉｖ）の前記インキュベーションは、少なくとも５、１０、１５、２０、２５分間、好ましくは少なくとも３０分間行われる、請求項１または２のいずれか１項に記載の方法。
ステップｉｉｉ）で提供される前記少なくとも１つのフラバノンおよび／または少なくとも１つのカルコンおよび／または対応するグリコシド類の少なくとも１つは、ホモエリオジクチオール、ヘスペリジン、ヘスペレチン‐７‐グルコシド、ネオヘスペリジン、ナリンゲニン、ナリンギン、ナリルチン、リキリチゲニン、ピノセムブリン、ステッポゲニン、スクテアモエニン、ジヒドロエキオジニン、ポンシレチン、サクラネチン、イソサクラネチン、４，７‐ジヒドロキシ‐フラバノン、４，７‐ジヒドロキシ‐３’‐メトキシフラバノン、３，７‐ジヒドロキシ‐４’‐メトキシフラバノン、３’４，７‐トリヒドロキシフラバノン、アルピネンチン、ピノストロビン、７‐ヒドロキシフラバノン、４’‐ヒドロキシフラバノン、３‐ヒドロキシフラバノン、ツガフォリンからなる群より選択される、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
ステップｉｉｉ）で少なくとも１つのフラバノンおよび／または少なくとも１つのカルコンおよび／または対応するグリコシド類の少なくとも１つが提供され、前記少なくとも１つのフラバノンおよび／または前記少なくとも１つのカルコンおよび／または対応するグリコシド類の少なくとも１つは、さらに精製または部分的に精製される、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
ステップｖ）で得られる前記少なくとも１つのジヒドロカルコンは、ブテインジヒドロカルコン、ホモブテインジヒドロカルコン、４‐Ｏ‐メチルブテインジヒドロカルコン、ナリンゲニンジヒドロカルコン、ヘスペレチンジヒドロカルコン、ホモエリオジクチオールジヒドロカルコンおよびエリオジクチオールジヒドロカルコンからなる群より選択される、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
配列番号１６９～１７６からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる遺伝子操作されたエンレダクターゼ。
請求項７に記載の遺伝子操作されたエンレダクターゼをコードする核酸配列を含むトランスジェニック微生物。
前記微生物は、Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１、Ｅ．ｃｏｌｉＭＧ１６５５、好ましくはＥ．ｃｏｌｉＷ３１１０などのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ種、Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｉｔｉｌｉｓ、またはＢａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓなどのＢａｃｉｌｌｕｓ種、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種、好ましくはＳ．ｃｅｒｅｖｅｓｉａｅ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、またはＫ．ｐｈａｆｆｉｉおよびＨ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａなどのＫｏｍａｇａｔａｅｌｌａ種、好ましくはＫ．ｐｈａｆｆｉｉ、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａなどのＹａｒｒｏｗｉａ種、Ｋ．ｌａｃｔｉｓなどのＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ種からなる群より選択される、請求項７または８に記載のトランスジェニック微生物。
‐配列番号２４～４６および１６９～１７６からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列相同性を有するエンレダクターゼをコードする少なくとも１つの核酸配列
および任意に
‐配列番号１４５～１５８からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列相同性を有する遺伝子操作されたカルコンイソメラーゼをコードする少なくとも１つの核酸配列
を含むベクター、好ましくはプラスミドベクター。
請求項７に記載の少なくとも１つのエンレダクターゼおよび／または請求項８または９に記載の少なくとも１つのトランスジェニック微生物および／または請求項１０に記載の少なくとも１つのベクターの、ジヒドロカルコン類の生体触媒製造における、好ましくは請求項１～６のいずれか１項に記載の方法における、使用。