JP2024509538A - ジヒドロカルコン類の生体触媒生産 - Google Patents
ジヒドロカルコン類の生体触媒生産 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2024509538A JP2024509538A JP2023553366A JP2023553366A JP2024509538A JP 2024509538 A JP2024509538 A JP 2024509538A JP 2023553366 A JP2023553366 A JP 2023553366A JP 2023553366 A JP2023553366 A JP 2023553366A JP 2024509538 A JP2024509538 A JP 2024509538A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- chalcone
- dihydrochalcone
- seq
- coli
- group
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 230000002210 biocatalytic effect Effects 0.000 title claims 2
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 40
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 33
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 33
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 21
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 11
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims abstract description 10
- DQFBYFPFKXHELB-UHFFFAOYSA-N Chalcone Natural products C=1C=CC=CC=1C(=O)C=CC1=CC=CC=C1 DQFBYFPFKXHELB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 35
- 235000005513 chalcones Nutrition 0.000 claims description 35
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 31
- DQFBYFPFKXHELB-VAWYXSNFSA-N trans-chalcone Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(=O)\C=C\C1=CC=CC=C1 DQFBYFPFKXHELB-VAWYXSNFSA-N 0.000 claims description 31
- PXLWOFBAEVGBOA-UHFFFAOYSA-N dihydrochalcone Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1C1=C(O)C=CC(C(=O)CC(O)C=2C=CC(O)=CC=2)=C1O PXLWOFBAEVGBOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- QGGZBXOADPVUPN-UHFFFAOYSA-N dihydrochalcone Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(=O)CCC1=CC=CC=C1 QGGZBXOADPVUPN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 229930003949 flavanone Natural products 0.000 claims description 23
- 150000002208 flavanones Chemical class 0.000 claims description 23
- 235000011981 flavanones Nutrition 0.000 claims description 23
- 108010004539 Chalcone isomerase Proteins 0.000 claims description 19
- RWKSTZADJBEXSQ-UHFFFAOYSA-N 3-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)-1-(2,4,6-trihydroxyphenyl)propan-1-one Chemical compound C1=C(O)C(OC)=CC=C1CCC(=O)C1=C(O)C=C(O)C=C1O RWKSTZADJBEXSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 claims description 13
- 150000002338 glycosides Chemical class 0.000 claims description 13
- AYMYWHCQALZEGT-ORCRQEGFSA-N Butein Natural products OC1=CC(O)=CC=C1C(=O)\C=C\C1=CC=C(O)C(O)=C1 AYMYWHCQALZEGT-ORCRQEGFSA-N 0.000 claims description 10
- ZONYXWQDUYMKFB-UHFFFAOYSA-N SJ000286395 Natural products O1C2=CC=CC=C2C(=O)CC1C1=CC=CC=C1 ZONYXWQDUYMKFB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- FTODBIPDTXRIGS-UHFFFAOYSA-N homoeriodictyol Natural products C1=C(O)C(OC)=CC(C2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C2)=C1 FTODBIPDTXRIGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 10
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 10
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 8
- FTVWIRXFELQLPI-ZDUSSCGKSA-N (S)-naringenin Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1[C@H]1OC2=CC(O)=CC(O)=C2C(=O)C1 FTVWIRXFELQLPI-ZDUSSCGKSA-N 0.000 claims description 7
- FTODBIPDTXRIGS-ZDUSSCGKSA-N homoeriodictyol Chemical compound C1=C(O)C(OC)=CC([C@H]2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C2)=C1 FTODBIPDTXRIGS-ZDUSSCGKSA-N 0.000 claims description 7
- WGEYAGZBLYNDFV-UHFFFAOYSA-N naringenin Natural products C1(=O)C2=C(O)C=C(O)C=C2OC(C1)C1=CC=C(CC1)O WGEYAGZBLYNDFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 235000007625 naringenin Nutrition 0.000 claims description 7
- 229940117954 naringenin Drugs 0.000 claims description 7
- CNABJBYLQABXJR-UHFFFAOYSA-N 3-Hydroxyphloretin Chemical compound OC1=CC(O)=CC(O)=C1C(=O)CCC1=CC=C(O)C(O)=C1 CNABJBYLQABXJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 claims description 6
- 239000001100 (2S)-5,7-dihydroxy-2-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)chroman-4-one Substances 0.000 claims description 5
- SWAJPHCXKPCPQZ-UHFFFAOYSA-N 7-hydroxyflavanone Chemical compound O1C2=CC(O)=CC=C2C(=O)CC1C1=CC=CC=C1 SWAJPHCXKPCPQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims description 4
- 241000660147 Escherichia coli str. K-12 substr. MG1655 Species 0.000 claims description 4
- ARGKVCXINMKCAZ-UHFFFAOYSA-N neohesperidine Natural products C1=C(O)C(OC)=CC=C1C1OC2=CC(OC3C(C(O)C(O)C(CO)O3)OC3C(C(O)C(O)C(C)O3)O)=CC(O)=C2C(=O)C1 ARGKVCXINMKCAZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- ORJDDOBAOGKRJV-CQSZACIVSA-N (2S)-Pinocembrin Natural products C1([C@H]2CC(=O)C3=C(O)C=C(C=C3O2)OC)=CC=CC=C1 ORJDDOBAOGKRJV-CQSZACIVSA-N 0.000 claims description 2
- SAJHRQBGZMZGMA-AWEZNQCLSA-N (2s)-2-(2,6-dihydroxyphenyl)-5-hydroxy-7-methoxy-2,3-dihydrochromen-4-one Chemical compound C1([C@@H]2CC(=O)C3=C(O)C=C(C=C3O2)OC)=C(O)C=CC=C1O SAJHRQBGZMZGMA-AWEZNQCLSA-N 0.000 claims description 2
- KFGFEKHSEPSVNO-AWEZNQCLSA-N (2s)-7-hydroxy-5-methoxy-2-(4-methoxyphenyl)-2,3-dihydrochromen-4-one Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1[C@H]1OC2=CC(O)=CC(OC)=C2C(=O)C1 KFGFEKHSEPSVNO-AWEZNQCLSA-N 0.000 claims description 2
- JVSPTYZZNUXJHN-UHFFFAOYSA-N 3'-hydroxyflavanone Chemical compound OC1=CC=CC(C2OC3=CC=CC=C3C(=O)C2)=C1 JVSPTYZZNUXJHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- ZLHVIYHWWQYJID-UHFFFAOYSA-N 4'-hydroxyflavanone Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1OC2=CC=CC=C2C(=O)C1 ZLHVIYHWWQYJID-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- CTVDHGQUNVCNAO-UHFFFAOYSA-N 4,7-dihydroxy-2-phenyl-4H-chromen-3-one Chemical compound OC1=CC=C2C(C(C(OC2=C1)C1=CC=CC=C1)=O)O CTVDHGQUNVCNAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- SWAJPHCXKPCPQZ-AWEZNQCLSA-N 7-Hydroxyflavanone Natural products C1([C@@H]2CC(=O)C3=CC=C(C=C3O2)O)=CC=CC=C1 SWAJPHCXKPCPQZ-AWEZNQCLSA-N 0.000 claims description 2
- 239000001606 7-[(2S,3R,4S,5S,6R)-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-3-[(2S,3R,4R,5R,6S)-3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxyoxan-2-yl]oxy-5-hydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)chroman-4-one Substances 0.000 claims description 2
- 241000193744 Bacillus amyloliquefaciens Species 0.000 claims description 2
- 241000194108 Bacillus licheniformis Species 0.000 claims description 2
- RWLCJUJOUDVNQX-UHFFFAOYSA-N Dihydroechioidinin Natural products O1C2=CC(OC)=CC(O)=C2C(=O)CC1C1=CC=CC=C1O RWLCJUJOUDVNQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- ORJDDOBAOGKRJV-UHFFFAOYSA-N Dihydrotectochrysin Natural products O1C2=CC(OC)=CC(O)=C2C(=O)CC1C1=CC=CC=C1 ORJDDOBAOGKRJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 claims description 2
- 241001302584 Escherichia coli str. K-12 substr. W3110 Species 0.000 claims description 2
- QUQPHWDTPGMPEX-UHFFFAOYSA-N Hesperidine Natural products C1=C(O)C(OC)=CC=C1C1OC2=CC(OC3C(C(O)C(O)C(COC4C(C(O)C(O)C(C)O4)O)O3)O)=CC(O)=C2C(=O)C1 QUQPHWDTPGMPEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 241001099157 Komagataella Species 0.000 claims description 2
- 241001099156 Komagataella phaffii Species 0.000 claims description 2
- 241000299943 Kordiimonas lipolytica Species 0.000 claims description 2
- FURUXTVZLHCCNA-UHFFFAOYSA-N Liquiritigenin Natural products C1=CC(O)=CC=C1C1OC2=CC(O)=CC=C2C(=O)C1 FURUXTVZLHCCNA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 241000235648 Pichia Species 0.000 claims description 2
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 claims description 2
- SAJHRQBGZMZGMA-UHFFFAOYSA-N Scuteamoenin Natural products O1C2=CC(OC)=CC(O)=C2C(=O)CC1C1=C(O)C=CC=C1O SAJHRQBGZMZGMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 241000235013 Yarrowia Species 0.000 claims description 2
- QUQPHWDTPGMPEX-UTWYECKDSA-N aurantiamarin Natural products COc1ccc(cc1O)[C@H]1CC(=O)c2c(O)cc(O[C@@H]3O[C@H](CO[C@@H]4O[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]4O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]3O)cc2O1 QUQPHWDTPGMPEX-UTWYECKDSA-N 0.000 claims description 2
- APSNPMVGBGZYAJ-GLOOOPAXSA-N clematine Natural products COc1cc(ccc1O)[C@@H]2CC(=O)c3c(O)cc(O[C@@H]4O[C@H](CO[C@H]5O[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]5O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]4O)cc3O2 APSNPMVGBGZYAJ-GLOOOPAXSA-N 0.000 claims description 2
- ADSYMQORONDIDD-ZJHVPRRPSA-N hesperetin 7-O-beta-D-glucoside Chemical compound C1=C(O)C(OC)=CC=C1[C@H]1OC2=CC(O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)=CC(O)=C2C(=O)C1 ADSYMQORONDIDD-ZJHVPRRPSA-N 0.000 claims description 2
- QUQPHWDTPGMPEX-QJBIFVCTSA-N hesperidin Chemical compound C1=C(O)C(OC)=CC=C1[C@H]1OC2=CC(O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@H]4[C@@H]([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O4)O)O3)O)=CC(O)=C2C(=O)C1 QUQPHWDTPGMPEX-QJBIFVCTSA-N 0.000 claims description 2
- VUYDGVRIQRPHFX-UHFFFAOYSA-N hesperidin Natural products COc1cc(ccc1O)C2CC(=O)c3c(O)cc(OC4OC(COC5OC(O)C(O)C(O)C5O)C(O)C(O)C4O)cc3O2 VUYDGVRIQRPHFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229940025878 hesperidin Drugs 0.000 claims description 2
- JBQATDIMBVLPRB-UHFFFAOYSA-N isoliquiritigenin Natural products OC1=CC(O)=CC=C1C1OC2=CC(O)=CC=C2C(=O)C1 JBQATDIMBVLPRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- FURUXTVZLHCCNA-AWEZNQCLSA-N liquiritigenin Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1[C@H]1OC2=CC(O)=CC=C2C(=O)C1 FURUXTVZLHCCNA-AWEZNQCLSA-N 0.000 claims description 2
- 229930019673 naringin Natural products 0.000 claims description 2
- DFPMSGMNTNDNHN-ZPHOTFPESA-N naringin Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](OC=2C=C3O[C@@H](CC(=O)C3=C(O)C=2)C=2C=CC(O)=CC=2)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O DFPMSGMNTNDNHN-ZPHOTFPESA-N 0.000 claims description 2
- 229940052490 naringin Drugs 0.000 claims description 2
- HXTFHSYLYXVTHC-AJHDJQPGSA-N narirutin Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O[C@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](OC=2C=C3O[C@@H](CC(=O)C3=C(O)C=2)C=2C=CC(O)=CC=2)O1 HXTFHSYLYXVTHC-AJHDJQPGSA-N 0.000 claims description 2
- HXTFHSYLYXVTHC-ZPHOTFPESA-N narirutin Natural products C[C@@H]1O[C@H](OC[C@H]2O[C@@H](Oc3cc(O)c4C(=O)C[C@H](Oc4c3)c5ccc(O)cc5)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]2O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O HXTFHSYLYXVTHC-ZPHOTFPESA-N 0.000 claims description 2
- ARGKVCXINMKCAZ-UZRWAPQLSA-N neohesperidin Chemical compound C1=C(O)C(OC)=CC=C1[C@H]1OC2=CC(O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O[C@H]3[C@@H]([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O3)O)=CC(O)=C2C(=O)C1 ARGKVCXINMKCAZ-UZRWAPQLSA-N 0.000 claims description 2
- ORJDDOBAOGKRJV-AWEZNQCLSA-N pinostrobin Chemical compound C1([C@@H]2CC(=O)C3=C(O)C=C(C=C3O2)OC)=CC=CC=C1 ORJDDOBAOGKRJV-AWEZNQCLSA-N 0.000 claims description 2
- GSZUGBAEBARHAW-UHFFFAOYSA-N sophoraflavone B Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1=CC=C(C=2OC3=CC(O)=CC=C3C(=O)C=2)C=C1 GSZUGBAEBARHAW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- KFGFEKHSEPSVNO-CQSZACIVSA-N tsugafolin Natural products O(C)c1c2C(=O)C[C@H](c3ccc(OC)cc3)Oc2cc(O)c1 KFGFEKHSEPSVNO-CQSZACIVSA-N 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 4
- -1 Stepogenin Chemical compound 0.000 claims 3
- MFMUGDKVPYHIAU-UHFFFAOYSA-N 2-methoxy-2-phenyl-3h-chromen-4-one Chemical compound C1C(=O)C2=CC=CC=C2OC1(OC)C1=CC=CC=C1 MFMUGDKVPYHIAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- RTIXKCRFFJGDFG-UHFFFAOYSA-N Chrysin Natural products C=1C(O)=CC(O)=C(C(C=2)=O)C=1OC=2C1=CC=CC=C1 RTIXKCRFFJGDFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 241000235649 Kluyveromyces Species 0.000 claims 1
- CBSBTSXXVIJKLP-UHFFFAOYSA-N OC1C(C(OC2=CC(=CC=C12)O)C1=CC(=CC=C1)OC)=O Chemical compound OC1C(C(OC2=CC(=CC=C12)O)C1=CC(=CC=C1)OC)=O CBSBTSXXVIJKLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- FGUBFGWYEYFGRK-HNNXBMFYSA-N Pinocembrin Natural products Cc1cc(C)c2C(=O)C[C@H](Oc2c1)c3ccccc3 FGUBFGWYEYFGRK-HNNXBMFYSA-N 0.000 claims 1
- 241000165031 Pseudomonas lactis Species 0.000 claims 1
- KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N dihydrochrysin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C2)=C1 KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- URFCJEUYXNAHFI-ZDUSSCGKSA-N pinocembrin Chemical compound C1([C@@H]2CC(=O)C3=C(O)C=C(C=C3O2)O)=CC=CC=C1 URFCJEUYXNAHFI-ZDUSSCGKSA-N 0.000 claims 1
- DJOJDHGQRNZXQQ-AWEZNQCLSA-N sakuranetin Chemical compound C1([C@@H]2CC(=O)C3=C(O)C=C(C=C3O2)OC)=CC=C(O)C=C1 DJOJDHGQRNZXQQ-AWEZNQCLSA-N 0.000 claims 1
- RNAPFFYGJWALAQ-UHFFFAOYSA-N sakuranetin Natural products O1C2=CC(C)=CC(O)=C2C(=O)CC1C1=CC=C(O)C=C1 RNAPFFYGJWALAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 9
- 239000000284 extract Substances 0.000 abstract description 8
- 235000012041 food component Nutrition 0.000 abstract description 2
- 239000005417 food ingredient Substances 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 42
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 25
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 25
- 239000000047 product Substances 0.000 description 25
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 25
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 24
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- CMFGBLHCLKLQIG-DUXPYHPUSA-N (e)-3-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)-1-(2,4,6-trihydroxyphenyl)prop-2-en-1-one Chemical compound C1=C(O)C(OC)=CC=C1\C=C\C(=O)C1=C(O)C=C(O)C=C1O CMFGBLHCLKLQIG-DUXPYHPUSA-N 0.000 description 19
- 101001041037 Arabidopsis thaliana Lariat debranching enzyme Proteins 0.000 description 19
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 19
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 16
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 14
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 description 12
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 11
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 7
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 7
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 7
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 7
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 7
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 7
- YQHMWTPYORBCMF-UHFFFAOYSA-N Naringenin chalcone Natural products C1=CC(O)=CC=C1C=CC(=O)C1=C(O)C=C(O)C=C1O YQHMWTPYORBCMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 6
- 150000001789 chalcones Chemical class 0.000 description 6
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 6
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- YQHMWTPYORBCMF-ZZXKWVIFSA-N 2',4,4',6'-tetrahydroxychalcone Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1\C=C\C(=O)C1=C(O)C=C(O)C=C1O YQHMWTPYORBCMF-ZZXKWVIFSA-N 0.000 description 5
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 5
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 5
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- CRBYNQCDRNZCNX-DUXPYHPUSA-N trans-2',3,4,4',6'-pentahydroxychalcone Chemical compound OC1=CC(O)=CC(O)=C1C(=O)\C=C\C1=CC=C(O)C(O)=C1 CRBYNQCDRNZCNX-DUXPYHPUSA-N 0.000 description 5
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 5
- WGVFVBIJKULVHA-QHHAFSJGSA-N 3,2',4'-Trihydroxy-4-methoxychalcone Chemical compound C1=C(O)C(OC)=CC=C1\C=C\C(=O)C1=CC=C(O)C=C1O WGVFVBIJKULVHA-QHHAFSJGSA-N 0.000 description 4
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- XJLXINKUBYWONI-NNYOXOHSSA-N NADP zwitterion Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 4
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 4
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 4
- KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N Palladium Chemical compound [Pd] KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 244000269722 Thea sinensis Species 0.000 description 4
- 244000299461 Theobroma cacao Species 0.000 description 4
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 description 4
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 4
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 4
- WQWVIIRCVOZVPN-HWKANZROSA-N homoeriodictyol chalcone Chemical compound C1=C(O)C(OC)=CC(\C=C\C(=O)C=2C(=CC(O)=CC=2O)O)=C1 WQWVIIRCVOZVPN-HWKANZROSA-N 0.000 description 4
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 4
- 235000014393 valine Nutrition 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 3
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 3
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- BWFSBUVPIAIXKJ-QHHAFSJGSA-N Homobutein Chemical compound C1=C(O)C(OC)=CC(\C=C\C(=O)C=2C(=CC(O)=CC=2)O)=C1 BWFSBUVPIAIXKJ-QHHAFSJGSA-N 0.000 description 3
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 3
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 3
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 3
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 3
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 3
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 3
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 3
- 229930003935 flavonoid Natural products 0.000 description 3
- 235000017173 flavonoids Nutrition 0.000 description 3
- 150000002215 flavonoids Chemical class 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- AIONOLUJZLIMTK-AWEZNQCLSA-N hesperetin Chemical compound C1=C(O)C(OC)=CC=C1[C@H]1OC2=CC(O)=CC(O)=C2C(=O)C1 AIONOLUJZLIMTK-AWEZNQCLSA-N 0.000 description 3
- AIONOLUJZLIMTK-UHFFFAOYSA-N hesperetin Natural products C1=C(O)C(OC)=CC=C1C1OC2=CC(O)=CC(O)=C2C(=O)C1 AIONOLUJZLIMTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000010209 hesperetin Nutrition 0.000 description 3
- 229960001587 hesperetin Drugs 0.000 description 3
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 3
- 235000005772 leucine Nutrition 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 3
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 3
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 3
- JVGNTXGHBHMJDO-UHFFFAOYSA-N sappanchalcone Natural products COC1=CC(O)=CC=C1C(=O)C=CC1=CC=C(O)C(O)=C1 JVGNTXGHBHMJDO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 235000014347 soups Nutrition 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- GQHTUMJGOHRCHB-UHFFFAOYSA-N 2,3,4,6,7,8,9,10-octahydropyrimido[1,2-a]azepine Chemical compound C1CCCCN2CCCN=C21 GQHTUMJGOHRCHB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001531190 Eubacterium ramulus Species 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical group NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 2
- 241000220225 Malus Species 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010073771 Soybean Proteins Proteins 0.000 description 2
- 235000009470 Theobroma cacao Nutrition 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 235000019219 chocolate Nutrition 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 239000008298 dragée Substances 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical group O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000015243 ice cream Nutrition 0.000 description 2
- JVTZFYYHCGSXJV-UHFFFAOYSA-N isovanillin Chemical compound COC1=CC=C(C=O)C=C1O JVTZFYYHCGSXJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 238000002888 pairwise sequence alignment Methods 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VGEREEWJJVICBM-UHFFFAOYSA-N phloretin Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1CCC(=O)C1=C(O)C=C(O)C=C1O VGEREEWJJVICBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 235000013930 proline Nutrition 0.000 description 2
- 230000001603 reducing effect Effects 0.000 description 2
- 235000015067 sauces Nutrition 0.000 description 2
- 235000011888 snacks Nutrition 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 235000014214 soft drink Nutrition 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 229940001941 soy protein Drugs 0.000 description 2
- 235000013599 spices Nutrition 0.000 description 2
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 2
- 235000013616 tea Nutrition 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ZWTDXYUDJYDHJR-UHFFFAOYSA-N (E)-1-(2,4-dihydroxyphenyl)-3-(2,4-dihydroxyphenyl)-2-propen-1-one Natural products OC1=CC(O)=CC=C1C=CC(=O)C1=CC=C(O)C=C1O ZWTDXYUDJYDHJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QOWYOXPGLAOHHB-UHFFFAOYSA-N 1,1,1-trihydroxypropan-2-one Chemical compound CC(=O)C(O)(O)O QOWYOXPGLAOHHB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PZNPLUBHRSSFHT-RRHRGVEJSA-N 1-hexadecanoyl-2-octadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)O[C@@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)COC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC PZNPLUBHRSSFHT-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 1
- YEDFEBOUHSBQBT-UHFFFAOYSA-N 2,3-dihydroflavon-3-ol Chemical compound O1C2=CC=CC=C2C(=O)C(O)C1C1=CC=CC=C1 YEDFEBOUHSBQBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VFGLRVWAOAFUGZ-UHFFFAOYSA-N 2,3-dihydroxy-1,3-diphenylprop-2-en-1-one Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(=O)C(O)=C(O)C1=CC=CC=C1 VFGLRVWAOAFUGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NTGCJQVVGPZETF-UHFFFAOYSA-N 2-(3-methoxyphenyl)-2,3-dihydrochromen-4-one Chemical compound COC1=CC=CC(C2OC3=CC=CC=C3C(=O)C2)=C1 NTGCJQVVGPZETF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KKWPTRUHVUCXOB-UHFFFAOYSA-N 3,7-dihydroxy-2-(4-methoxyphenyl)-2,3-dihydrochromen-4-one Chemical compound OC1C(OC2=CC(=CC=C2C1=O)O)C1=CC=C(C=C1)OC KKWPTRUHVUCXOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XMIIGOLPHOKFCH-UHFFFAOYSA-N 3-phenylpropionic acid Chemical compound OC(=O)CCC1=CC=CC=C1 XMIIGOLPHOKFCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical class CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000144725 Amygdalus communis Species 0.000 description 1
- 235000003276 Apios tuberosa Nutrition 0.000 description 1
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 1
- 244000105624 Arachis hypogaea Species 0.000 description 1
- 235000010777 Arachis hypogaea Nutrition 0.000 description 1
- 235000010744 Arachis villosulicarpa Nutrition 0.000 description 1
- 240000006914 Aspalathus linearis Species 0.000 description 1
- 235000012984 Aspalathus linearis Nutrition 0.000 description 1
- 235000007319 Avena orientalis Nutrition 0.000 description 1
- 244000075850 Avena orientalis Species 0.000 description 1
- 235000014698 Brassica juncea var multisecta Nutrition 0.000 description 1
- 235000006008 Brassica napus var napus Nutrition 0.000 description 1
- 240000000385 Brassica napus var. napus Species 0.000 description 1
- 235000006618 Brassica rapa subsp oleifera Nutrition 0.000 description 1
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 1
- 244000045195 Cicer arietinum Species 0.000 description 1
- 235000010523 Cicer arietinum Nutrition 0.000 description 1
- 240000007154 Coffea arabica Species 0.000 description 1
- 240000006766 Cornus mas Species 0.000 description 1
- 235000003363 Cornus mas Nutrition 0.000 description 1
- 235000019542 Cured Meats Nutrition 0.000 description 1
- 108010082495 Dietary Plant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000004278 EU approved seasoning Substances 0.000 description 1
- 239000001329 FEMA 3811 Substances 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010050375 Glucose 1-Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 241001138401 Kluyveromyces lactis Species 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 235000014647 Lens culinaris subsp culinaris Nutrition 0.000 description 1
- 244000043158 Lens esculenta Species 0.000 description 1
- 241000219745 Lupinus Species 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241000220296 Malus sp. Species 0.000 description 1
- MZSGWZGPESCJAN-MOBFUUNNSA-N Melitric acid A Natural products O([C@@H](C(=O)O)Cc1cc(O)c(O)cc1)C(=O)/C=C/c1cc(O)c(O/C(/C(=O)O)=C/c2cc(O)c(O)cc2)cc1 MZSGWZGPESCJAN-MOBFUUNNSA-N 0.000 description 1
- 102000014171 Milk Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010011756 Milk Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N NAD zwitterion Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 1
- 240000004713 Pisum sativum Species 0.000 description 1
- 235000010582 Pisum sativum Nutrition 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091007187 Reductases Proteins 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010034546 Serratia marcescens nuclease Proteins 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 235000006468 Thea sinensis Nutrition 0.000 description 1
- 240000006677 Vicia faba Species 0.000 description 1
- 235000010749 Vicia faba Nutrition 0.000 description 1
- 235000002098 Vicia faba var. major Nutrition 0.000 description 1
- 239000005862 Whey Substances 0.000 description 1
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000005882 aldol condensation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005575 aldol reaction Methods 0.000 description 1
- 235000020224 almond Nutrition 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 1
- 235000015173 baked goods and baking mixes Nutrition 0.000 description 1
- 230000037429 base substitution Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 235000015895 biscuits Nutrition 0.000 description 1
- 235000020279 black tea Nutrition 0.000 description 1
- 235000008429 bread Nutrition 0.000 description 1
- 235000015496 breakfast cereal Nutrition 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 235000014121 butter Nutrition 0.000 description 1
- 235000015155 buttermilk Nutrition 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 235000013736 caramel Nutrition 0.000 description 1
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 229940112822 chewing gum Drugs 0.000 description 1
- 235000015218 chewing gum Nutrition 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 235000020971 citrus fruits Nutrition 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 235000016213 coffee Nutrition 0.000 description 1
- 235000013353 coffee beverage Nutrition 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 1
- QLACLEPYLWLNTD-UHFFFAOYSA-N dihydrocinnamic acid Natural products COc1ccc(CCC(O)=O)c(O)c1OC QLACLEPYLWLNTD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021186 dishes Nutrition 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 235000014103 egg white Nutrition 0.000 description 1
- 210000000969 egg white Anatomy 0.000 description 1
- 235000013345 egg yolk Nutrition 0.000 description 1
- 210000002969 egg yolk Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- TUJPOVKMHCLXEL-UHFFFAOYSA-N eriodictyol Natural products C1C(=O)C2=CC(O)=CC(O)=C2OC1C1=CC=C(O)C(O)=C1 TUJPOVKMHCLXEL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SBHXYTNGIZCORC-ZDUSSCGKSA-N eriodictyol Chemical compound C1([C@@H]2CC(=O)C3=C(O)C=C(C=C3O2)O)=CC=C(O)C(O)=C1 SBHXYTNGIZCORC-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- 235000011797 eriodictyol Nutrition 0.000 description 1
- SBHXYTNGIZCORC-UHFFFAOYSA-N eriodyctiol Natural products O1C2=CC(O)=CC(O)=C2C(=O)CC1C1=CC=C(O)C(O)=C1 SBHXYTNGIZCORC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 229930003939 flavanonol Natural products 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 235000011194 food seasoning agent Nutrition 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 235000015203 fruit juice Nutrition 0.000 description 1
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 1
- 235000012055 fruits and vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 235000011868 grain product Nutrition 0.000 description 1
- 235000014168 granola/muesli bars Nutrition 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 238000004442 gravimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 235000009569 green tea Nutrition 0.000 description 1
- 235000011617 hard cheese Nutrition 0.000 description 1
- 235000015092 herbal tea Nutrition 0.000 description 1
- 238000005984 hydrogenation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 235000021539 instant coffee Nutrition 0.000 description 1
- 235000014109 instant soup Nutrition 0.000 description 1
- 235000020344 instant tea Nutrition 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000015141 kefir Nutrition 0.000 description 1
- 235000008960 ketchup Nutrition 0.000 description 1
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 238000002865 local sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 235000020121 low-fat milk Nutrition 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 239000008268 mayonnaise Substances 0.000 description 1
- 235000010746 mayonnaise Nutrition 0.000 description 1
- 235000013622 meat product Nutrition 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 235000021239 milk protein Nutrition 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 229950006238 nadide Drugs 0.000 description 1
- DLIKSSGEMUFQOK-SFTVRKLSSA-N naringenin 7-O-beta-D-glucoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CC(O)=C(C(=O)C[C@H](O2)C=3C=CC(O)=CC=3)C2=C1 DLIKSSGEMUFQOK-SFTVRKLSSA-N 0.000 description 1
- 235000008486 nectar Nutrition 0.000 description 1
- ITVGXXMINPYUHD-CUVHLRMHSA-N neohesperidin dihydrochalcone Chemical compound C1=C(O)C(OC)=CC=C1CCC(=O)C(C(=C1)O)=C(O)C=C1O[C@H]1[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O2)O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 ITVGXXMINPYUHD-CUVHLRMHSA-N 0.000 description 1
- 229940089953 neohesperidin dihydrochalcone Drugs 0.000 description 1
- 235000010434 neohesperidine DC Nutrition 0.000 description 1
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 1
- 235000019520 non-alcoholic beverage Nutrition 0.000 description 1
- 238000005580 one pot reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052763 palladium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- QCDYQQDYXPDABM-UHFFFAOYSA-N phloroglucinol Chemical compound OC1=CC(O)=CC(O)=C1 QCDYQQDYXPDABM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001553 phloroglucinol Drugs 0.000 description 1
- IBHWREHFNDMRPR-UHFFFAOYSA-N phloroglucinol carboxylic acid Natural products OC(=O)C1=C(O)C=C(O)C=C1O IBHWREHFNDMRPR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000013606 potato chips Nutrition 0.000 description 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 1
- RXVLWCCRHSJBJV-UHFFFAOYSA-N prunin Natural products OCC1OC(O)C(Oc2cc(O)c3C(=O)CC(Oc3c2)c4ccc(O)cc4)C(O)C1O RXVLWCCRHSJBJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000011962 puddings Nutrition 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 235000020330 rooibos tea Nutrition 0.000 description 1
- 235000013580 sausages Nutrition 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 235000008983 soft cheese Nutrition 0.000 description 1
- 239000008247 solid mixture Substances 0.000 description 1
- 235000013322 soy milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008347 soybean phospholipid Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- BCNZYOJHNLTNEZ-UHFFFAOYSA-N tert-butyldimethylsilyl chloride Chemical compound CC(C)(C)[Si](C)(C)Cl BCNZYOJHNLTNEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 235000015192 vegetable juice Nutrition 0.000 description 1
- 230000002087 whitening effect Effects 0.000 description 1
- 235000013618 yogurt Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/24—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carbonyl group
- C12P7/26—Ketones
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/90—Isomerases (5.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/185—Escherichia
- C12R2001/19—Escherichia coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y505/00—Intramolecular lyases (5.5)
- C12Y505/01—Intramolecular lyases (5.5.1)
- C12Y505/01006—Chalcone isomerase (5.5.1.6)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本発明は、食品成分の分野に属し、ジヒドロカルコン類の生産のために使用される様々な抽出物ならびに対応する酵素からのジヒドロカルコン類の生産のための方法に関する。さらに、本発明は、本発明による酵素を発現するためのトランスジェニック微生物およびベクターに関する。
Description
本発明は、食品成分の分野に属し、ジヒドロカルコン類の生産のために使用される様々な抽出物ならびに対応する酵素からのジヒドロカルコン類の生産のための方法に関する。さらに、本発明は、本発明による酵素を発現するためのトランスジェニック微生物およびベクターに関する。
食品技術の領域では、香味物質が常に必要とされている。特にジヒドロカルコン類のクラスは、これらの物質またはこれらの物質の混合物が他の香味物質と比較して優れた特性を示すため、注目される。ジヒドロカルコン類の天然源は植物であり、リンゴの葉に特に高い含量が見られる（非特許文献１）。植物からのジヒドロカルコン類の回収および抽出は、収率およびプロセス費用の点で好ましくないため、ジヒドロカルコン類のいくつかの生産方法が文献に記載されている。
望ましい産物はヘスペレチンジヒドロカルコン（３）である。
香味物質としてのヘスペレチンジヒドロカルコン（３）の芳香効果は、特許文献１に記載されている。この特性は、非特許文献２および非特許文献３からも知られる。ヘスペレチンジヒドロカルコン（３）と、果糖および他の甘味料の含量を増加させたコーンシロップとの混合物が、特許文献２に記載される。
１，８‐ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ‐７‐エン、ｔｅｒｔ‐ブチルジメチルシリルクロリドおよび塩酸を反応させることにより、ワンポット反応においてヘスペレチン（２）からのヘスペレチンカルコン（１）の生産が達成できることが記載されている（非特許文献４）。
ヘスペレチンカルコン（１）を生成するさらなる方法は、水酸化カリウムの添加によるトリヒドロキシアセトンのイソバニリンとのアルドール縮合を含む（非特許文献５）。
さらなるステップでは、ヘスペレチンカルコン（１）が水素またはギ酸およびパラジウム触媒を用いた水素化を介してさらに還元されて、ヘスペレチンジヒドロカルコン（３）が形成され得る（非特許文献６、特許文献３）。
鉄または白金などの無機触媒によってヘスペレチンカルコン（２）からヘスペレチンジヒドロカルコン（３）の生産を直接達成できることも記載されている（特許文献４）。
ヘスペレチンジヒドロカルコン（３）は、ネオヘスペリジンジヒドロカルコンの酸加水分解によっても調製され得る（特許文献２）。さらに、特許文献５または特許文献４に記載されるように、ヘスペレチンカルコン（２）を１０％ＫＯＨ水溶液に溶解し、続いて水素（Ｐｄ／Ｃ触媒）で還元することによって、ヘスペレチンカルコン（２）からヘスペレチンジヒドロカルコン（３）を得ることができる。保護基、他の塩基または還元剤の使用、および酸触媒アルドール反応の可能性は、当業者に知られている。
しかし、最新技術で記載された全ての方法をＥＣ１３３４／２００８に従って天然の生産方法であると表明することはできず、特定のジヒドロカルコンの生産に限定される。
天然物としてのラベル付けは、多くの消費者にとって購入決定に非常に重要であるため、このラベル表示が許される適切なジヒドロカルコン類が特に必要であることは明らかである。植物原料からジヒドロカルコン類を得ることは、時間および費用がかかるプロセスであり、本明細書に挙げられた一部のジヒドロカルコン類では、自然には見られないため不可能である。
酵素法または発酵法に関しては、ナリンゲニン、エリオジクチオールおよびホモエリオジクチオールの変換のみが最新技術で報告されている（特許文献６、非特許文献７）。単一酵素のフラバノノール開裂レダクターゼがナリンゲニンおよびホモエリオジクチオールをそれぞれのジヒドロカルコン類に変換できることにもさらに言及されている（非特許文献８）。４‐Ｏ‐メチル化誘導体はいずれも酵素によって変換されなかった。
腸内細菌Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｍｕｌｕｓが、ジヒドロキシカルコンフロレチンの生産を伴う経路を介してナリンゲニン‐７‐Ｏ‐グルコシドを変換できることがさらに知られている。残念なことに、これはフロログルシノールおよびジヒドロケイ皮酸にさらに分解される（非特許文献９）。
いくつかの生物について、カルコンのそれぞれのジヒドロカルコン類への還元活性が文献に、例えば非特許文献１０および非特許文献１１に記載されている。
報告された方法およびプロセスはいずれも、高価であるか、手間がかかるか、または商業生産用に利用できないかのいずれかである。
アダム（Ａｄａｍｕ）ら著、リンゴ（Ｍａｌｕｓ ｓｐ．）葉におけるジヒドロカルコン類の形成についての研究（Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ ｏｎ ｔｈｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｈｙｄｒｏｃｈａｌｃｏｎｅｓ ｉｎ ａｐｐｌｅ（Ｍａｌｕｓ ｓｐ．）ｌｅａｖｅｓ）．アクタホルティクルツラエ（Ａｃｔａ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｅ）２０１９年，１２４２，４１５‐４２０
ジャーナルオブアグリカルチュラルアンドフードケミストリー（Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．）、２５（４）、７６３‐７７２
Ｊ．Ｍｅｄ．、１９８１年、２４（４）、４０８‐４２８
マイルズ・クリストファー（Ｍｉｌｅｓ，Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ）Ｏ．ら著、オーストラリアンジャーナルオブケミストリー（Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）（１９８９年）、４２（７）、１１０３‐１３
ワダー（Ｗａｄｈｅｒ），Ｓ．Ｊ．ら著、インターナショナルジャーナルオブケミカルサイエンシズ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）（２００６年），４（４），７６１‐７６６
ガン・リシェ（Ｇａｎ，Ｌｉ‐Ｓｈｅ）ら著、バイオオーガニック＆メディシナルケミストリーレターズ（Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ）（２０１７年），２７（６）、１４４１‐１４４５
ガル（Ｇａｌｌ）ら著、アンゲヴァンテケミーインターナショナルエディション（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．）２０１３年、５２、１‐５
ブラウネ（Ｂｒａｕｎｅ）ら著、２０１９年 アプライドアンドエンヴァイロンメンタルマイクロバイオロジー（Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ）８５：ｅ０１２３３‐１９
Ｈ．シュナイダー（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）、Ｍ．ブラウト（Ｂｌａｕｔ）著、アーカイブズオブマイクロバイオロジー（Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）２０００年、１７３、７１‐７５
ジシュカ・ハーベレヒト（Ｚｙｓｚｋａ‐Ｈａｂｅｒｅｃｈｔ）ら著、２０１８年
ストンパー（Ｓｔｏｍｐｏｒ）ら著、２０１６年
したがって、本発明の主な課題は、好ましくは費用効率が高くスケーラブルであり、得られた産物を「天然物」としてラベル付けできる、様々な望ましいジヒドロカルコン類の生産のための方法および適切な生体触媒を提供することであった。
本発明の主な課題は、
ｉ）配列番号２４～４６および１６９～１７６からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる少なくとも１つのエンレダクターゼを提供するステップ、
ｉｉ）配列番号１４５～１５８からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる少なくとも１つの遺伝子操作されたカルコンイソメラーゼを任意に提供するステップ、
ｉｉｉ）少なくとも１つのフラバノンおよび／または少なくとも１つのカルコンおよび／または対応するグリコシド類の少なくとも１つを提供するステップ、
ｉｖ）ステップｉ）で提供された少なくとも１つのエンレダクターゼ、および任意にステップｉｉ）で提供された少なくとも１つのカルコンイソメラーゼを、ステップｉｉｉ）で提供された少なくとも１つのフラバノンおよび／または少なくとも１つのカルコンおよび／または少なくとも１つの対応するグリコシドと一緒にインキュベートするステップ、
ｖ）少なくとも１つのジヒドロカルコンを得るステップ、
ｖｉ）得られたジヒドロカルコンを任意に精製するステップ
を含むかまたはそれらからなる、ジヒドロカルコン類の生体触媒製造のための方法を提供することによって解決される。
ｉ）配列番号２４～４６および１６９～１７６からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる少なくとも１つのエンレダクターゼを提供するステップ、
ｉｉ）配列番号１４５～１５８からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる少なくとも１つの遺伝子操作されたカルコンイソメラーゼを任意に提供するステップ、
ｉｉｉ）少なくとも１つのフラバノンおよび／または少なくとも１つのカルコンおよび／または対応するグリコシド類の少なくとも１つを提供するステップ、
ｉｖ）ステップｉ）で提供された少なくとも１つのエンレダクターゼ、および任意にステップｉｉ）で提供された少なくとも１つのカルコンイソメラーゼを、ステップｉｉｉ）で提供された少なくとも１つのフラバノンおよび／または少なくとも１つのカルコンおよび／または少なくとも１つの対応するグリコシドと一緒にインキュベートするステップ、
ｖ）少なくとも１つのジヒドロカルコンを得るステップ、
ｖｉ）得られたジヒドロカルコンを任意に精製するステップ
を含むかまたはそれらからなる、ジヒドロカルコン類の生体触媒製造のための方法を提供することによって解決される。
ジヒドロカルコン類は、系統的にプロパノン誘導体と名付けられ、構造的に１，３‐ジフェニルプロペノン（カルコン）に関係し、植物において生合成され、広範囲の生物活性を示す、開鎖フラボノイドである。カルコン類からジヒドロカルコン類への変換は、カルコン類の二重結合を還元し、したがってジヒドロカルコン類を形成する酵素によって媒介され得る。
本発明に関しての生体触媒製造は、生体触媒の助けの下での抽出物からの産物の製造として理解されねばならない。このような生体触媒は、部分的に精製されたまたは精製された、生きた生物系（細胞）の一部として存在し得る酵素であると一般に理解される。各生体触媒は、固有の化学反応を触媒する。
本発明による方法に関連して使用される酵素は、配列番号２４～４６および１６９～１７６からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるエンレダクターゼである。エンレダクターゼは、電子的に活性化された炭素‐炭素二重結合の不斉還元を高い化学選択性および上昇した立体選択性で触媒する。
驚くべきことに、本発明による方法で使用されるエンレダクターゼは、カルコン類からジヒドロカルコン類への変換を触媒するために優れた活性および選択性を示すことが分かった。配列番号２４～４６および１６９～１７６のエンレダクターゼは、それらの触媒活性および選択性に基づいて選択され、配列番号２４～４６は、配列の説明に記載されるように異なる生物からの天然に存在する配列であり、配列番号１６９～１７６は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ酵素ＡｔＤＢＲ１に由来する遺伝子操作された配列である。
本開示がパーセンテージに関してアミノ酸配列の配列相同性に言及するときは常に、核酸配列の場合はＥＭＢＯＳＳ Ｗａｔｅｒ Ｐａｉｒｗｉｓｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ（ヌクレオチド）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｗａｔｅｒ／ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ．ｈｔｍｌ）、またはアミノ酸配列の場合はＥＭＢＯＳＳ Ｗａｔｅｒ Ｐａｉｒｗｉｓｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ（タンパク質）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｗａｔｅｒ／）を使用して計算できる値を指す。欧州分子生物学研究所（ＥＭＢＬ：Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）欧州バイオインフォマティクス研究所（ＥＢＩ：Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）により提供される局所配列アラインメントツールの場合には、修正されたＳｍｉｔｈ‐Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムが使用される（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／およびスミス（Ｓｍｉｔｈ），ＴＦ＆ウォーターマン（Ｗａｔｅｒｍａｎ），Ｍ．Ｓ．「共通分子部分配列の同定（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｍｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）」ジャーナルオブモレキュラーバイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、１９８１年１４７（１）：１９５‐１９７を参照）。さらに、ここでは、修正されたＳｍｉｔｈ‐Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用して２つの配列のそれぞれのペアワイズアライメントを行う際に、ＥＭＢＬ‐ＥＢＩによって現在与えられるデフォルトパラメータが参照される。これらは、（ｉ）アミノ酸配列の場合：マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２、ギャップオープンペナルティ＝１０、およびギャップ伸長ペナルティ＝０．５、ならびに（ｉｉ）核酸配列の場合：マトリックス＝ＤＮＡｆｕｌｌ、ギャップオープンペナルティ＝１０、およびギャップ伸長ペナルティ＝０．５である。
「配列相同性」という用語は、本発明との関連では「配列同一性」と互換的に使用されることができる。いずれの用語も常に、それに対して配列同一性または配列相同性が決定される酵素の全長と比較した本発明による酵素の全長を指す。
本発明に関しては、本発明による方法のステップｉｉ）において追加のカルコンイソメラーゼを提供することが好ましい。カルコンイソメラーゼは、カルコンからフラバノンへ、またはその逆の反応を触媒する酵素である。カルコンイソメラーゼの別名は、カルコン‐フラバノンイソメラーゼである。
驚くべきことに、配列番号１４５～１５８からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる遺伝子操作されたカルコンイソメラーゼは、フラバノンからカルコンへの反応を触媒する際に優れた性能を示し、したがってジヒドロカルコン類を生産するための抽出物としてフラバノンで開始する方法において使用され得ることが分かった。本発明による方法で使用されるところのカルコンイソメラーゼが、フラバノンをカルコンに変換でき、それがその後カルコンからジヒドロカルコンへの反応に供給されるため、本発明による、本発明による方法のステップｉ）で提供されるところのエンレダクターゼによるカルコンのジヒドロカルコンへの変換を促進することは特に驚くべきことであった。
本発明に関しての「遺伝子操作された」とは、本発明による酵素が、天然に存在する酵素または最新技術から知られている酵素と比較して変更または修飾されていることを意味する。適切な修飾は、アミノ酸配列における変異であり得る。適切な変異誘発法、ならびに必要な条件および試薬は、当業者によく知られている。変異は、例えば塩基の置き換え（もしくは置換）、除去（もしくは欠失）、または付加を通じて遺伝子レベルで生じる。これらの変異は、結果として生じるタンパク質のアミノ酸配列に対して異なる影響を有する。置換の場合には、いわゆる「ナンセンス」変異が生じ、タンパク質生合成を早期に停止させ、結果として生じるタンパク質を機能不全にとどまらせ得る。いわゆる「ミスセンス」変異では、コードされたアミノ酸のみが変化し、これらの変異は結果として生じるタンパク質の機能的変化をもたらし、最善の場合には、結果として生じるタンパク質の安定性または活性の向上を引き起こし得る。一般的な命名法では、アミノ酸置換変異は、その位置および置換されるアミノ酸に基づいて、例えばＡ１４３Ｇと指名される。この表記法は、Ｎ末端からＣ末端のアミノ酸配列の１４３位でアミノ酸のアラニンがグアニンに交換されていることを意味する。
フラバノン類は、フラボノイド生合成経路の最初のフラボノイド産物である。これらは、Ｃ２のキラル中心の存在とＣ２‐Ｃ３結合の不存在とにより特徴付けられる。フラバノン類は柑橘類に高濃度で見られる。これらは、本発明による抽出物として好ましく使用され、以下にさらに明記される。
カルコン類は、異なる置換基を持つα，β‐不飽和カルボニル系によって結合された２つの芳香環（ＡおよびＢ）からなるα，β‐不飽和ケトン類である。本発明による抽出物として好ましく使用されるカルコンは、以下にさらに明記される。
使用されるフラバノン類および／またはカルコン類に関連する「対応するグリコシド類」という用語は、グリコシド結合を介して別の官能基に結合した糖を有する対応するフラバノン類および／またはカルコン類を指す。フラバノン類および／またはカルコン類のグリコシド類は、フラバノン類および／またはカルコン類の天然源中に特に存在する。
本発明による方法から得られるジヒドロカルコン類は、使用されるフラバノンおよび／またはカルコンおよび／またはそれらの対応するグリコシド類、またはそれぞれ使用される出発材料に応じて、異なるジヒドロカルコン類の混合物として、および／または他の化合物と一緒になった混合物において存在し得る。それらは、当業者に知られる適切な方法によってさらに精製され得る。得られたジヒドロカルコン類の混合物または精製されたジヒドロカルコン類は、芳香組成物、栄養または享楽向けの調製物などの調製物に香味剤として組み込まれるのが好ましい。
好ましくは、栄養または享楽向けの調製物は、（カロリーオフ）焼き物（例えばパン、乾燥ビスケット、ケーキ、他の焼き物品）、菓子類（例えばミューズリーバー製品、チョコレート、チョコレートバー、他のバー形態の製品、フルーツガム、ドラジェ、ハードおよびソフトキャラメル、チューインガム）、ノンアルコール飲料（例えばココア、コーヒー、緑茶、紅茶、（緑、紅）茶抽出物を強化した（緑、紅）茶飲料、ルイボスティー、その他のハーブティー、果実入りソフト飲料、アイソトニック飲料、清涼飲料、ネクター、果物および野菜ジュース、果物または野菜ジュース調製物）、インスタント飲料（例えばインスタントココア飲料、インスタントティー飲料、インスタントコーヒー飲料）、肉製品（例えばハム、フレッシュソーセージまたは生ソーセージ調製物、香辛料入りまたはマリネしたフレッシュまたは塩漬け肉製品）、卵または卵製品（乾燥卵、卵白、卵黄）、シリアル製品（例えば朝食用シリアル、ミューズリーバー、調理済みインスタント米製品）、乳製品（例えば高脂肪または低脂肪または無脂肪乳飲料、ライスプディング、ヨーグルト、ケフィア、クリームチーズ、ソフトチーズ、ハードチーズ、乾燥粉乳、ホエー、バター、バターミルク、アイスクリーム、部分または完全加水分解乳タンパク質含有製品）、大豆タンパク質または他の大豆画分から作られた製品（例えば豆乳およびそれから生産された製品、単離または酵素処理大豆タンパク質含有飲料、大豆粉含有飲料、大豆レシチン含有調製物、豆腐もしくはテンペなどの発酵製品またはそれらから生産された製品、ならびに果物調製物および任意に香味料との混合物）、タンパク質豊富な植物材料からの（例えばオート麦、アーモンド、エンドウ、ルピナス、レンティル、ソラマメ、ひよこ豆、米、キャノーラの種子材料からの）乳製品様調製物（乳タイプ、ヨーグルトタイプ、デザートタイプ、アイスクリーム）、植物タンパク質強化乳製品不使用飲料、果物調製物（例えばジャム、シャーベット、フルーツソース、フルーツフィリング）、野菜調製物（例えばケチャップ、ソース、乾燥野菜、冷凍野菜、調理済み野菜、煮詰め野菜）、スナック類（例えばベークドまたはフライドポテトチップまたはポテト生地製品、トウモロコシまたはラッカセイベースの押出物）、脂または油ベースの製品またはそれらのエマルション（例えばマヨネーズ、レムラード、ドレッシング、いずれも高脂肪または減脂肪）、その他の既製料理およびスープ（例えば乾燥スープ、インスタントスープ、調理済みスープ）、香辛料、香辛料混合物、および特に例えばスナック類の分野で使用される調味料、甘味料調製物、錠剤または小袋、飲料を甘くまたは白くするためのその他の調製物からなる群より選択され得る。
本発明の意味の中での栄養または享楽向けの調製物は、カプセル、錠剤（非被覆および被覆錠剤、例えば胃耐性被覆）、糖衣ピル、顆粒、ペレット、固体混合物、液相中の分散物、エマルションとして、粉末として、溶液として、ペーストとして、または飲み込みもしくは咀嚼できる他の製剤としての形の栄養補助食品としても存在することができる。
本発明の好ましい実施形態は、本発明による方法であって、ｉ）で提供される少なくとも１つのエンレダクターゼは、精製または部分的に精製される、方法に関する。精製されたエンレダクターゼとは、提供時に９０％（ｗ／ｗ）以上の純度を示す酵素をいう。酵素の精製のための適切な方法は、当業者に知られている。部分的に精製された酵素とは、純度が９０％（ｗ／ｗ）未満であり、生体内に存在しない酵素を指す。
別の好ましい実施形態は、本発明による方法であって、ステップｉｖ）のインキュベーションは、少なくとも５、１０、１５、２０、２５分間、好ましくは少なくとも３０分間行われる、方法に関する。
さらに別の実施形態は、本発明による方法であって、ステップｉｉｉ）で提供される少なくとも１つのフラバノンおよび／または少なくとも１つのカルコンおよび／または対応するグリコシド類の少なくとも１つは、ホモエリオジクチオール、ヘスペリジン、ヘスペレチン‐７‐グルコシド、ネオヘスペリジン、ナリンゲニン、ナリンギン、ナリルチン、リキリチゲニン、ピノセムブリン、ステッポゲニン、スクテアモエニン、ジヒドロエキオジニン、ポンシレチン、サクラネチン、イソサクラネチン、４，７‐ジヒドロキシ‐フラバノン、４，７‐ジヒドロキシ‐３’‐メトキシフラバノン、３，７‐ジヒドロキシ‐４’‐メトキシフラバノン、３’４，７‐トリヒドロキシフラバノン、アルピネンチン、ピノストロビン、７‐ヒドロキシフラバノン、４’‐ヒドロキシフラバノン、３‐ヒドロキシフラバノン、ツガフォリンからなる群より選択される、方法に関する。
好ましいフラバノン類および／またはカルコン類は、以下に示されるそれらの構造式で表現される。
本発明の一実施形態は、本発明による方法であって、ステップｉｉｉ）で少なくとも１つのフラバノンおよび／または少なくとも１つのカルコンおよび／または対応するグリコシド類の少なくとも１つが提供され、少なくとも１つのフラバノンおよび／または少なくとも１つのカルコンおよび／または対応するグリコシド類の少なくとも１つは、精製または部分的に精製される、方法に関する。
本発明の別の実施形態は、本発明による方法であって、ステップｖ）で得られる少なくとも１つのジヒドロカルコンは、ブテインジヒドロカルコン、ホモブテインジヒドロカルコン、４‐Ｏ‐メチルブテインジヒドロカルコン、ナリンゲニンジヒドロカルコン、ヘスペレチンジヒドロカルコン、ホモエリオジクチオールジヒドロカルコンおよびエリオジクチオールジヒドロカルコンからなる群より選択される、方法に関する。
好ましいジヒドロカルコン類は、以下に示されるそれらの構造式で表現される。
上に好ましいものとして記載された全ての実施形態は、本発明に関して互いに互換可能に組み合わせることができる。
本発明の別の態様は、配列番号１６９～１７６からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる遺伝子操作されたエンレダクターゼに関する。
本発明の好ましい一実施形態は、配列番号１８９によるコンセンサス配列を有する遺伝子操作されたエンレダクターゼに関する。
コンセンサス配列は、本発明による全ての遺伝子操作された酵素を表し、アミノ酸置換が存在し得る可変位置はＸａａによってマークされる。
本発明の別の好ましい実施形態は、遺伝子操作されたエンレダクターゼに関し、遺伝子操作されたエンレダクターゼは、アラニン、グリシン、セリン、アスパラギン、バリン、スレオニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニンおよびフェニルアラニンからなる群より選択される２７６位および／または２９０位のアミノ酸を含む。
本発明のさらに別の好ましい実施形態は、遺伝子操作されたエンレダクターゼに関し、遺伝子操作されたエンレダクターゼは、ロイシン、グルタミン、スレオニン、システイン、フェニルアラニンアスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群より選択される２８５位のアミノ酸を含む。
本発明の別の好ましい実施形態では、遺伝子操作されたエンレダクターゼは、野生型配列と比較して２８５位のバリンからグルタミンへのアミノ酸置換（Ｖ２８５Ｑ）を含む。
配列番号１６９～１７６からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなるエンレダクターゼは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａからの天然に存在するエンレダクターゼＡｔＤＢＲ１に由来し、遺伝子操作されて新たなＡｔＤＢＲ１バリアントが生成された。特に、配列番号１６９～１７６からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列相同性を有するバリアントは、カルコン類からジヒドロカルコンへ類の変換において活性および選択性の増加を示すことが分かった。これらのバリアントは、酵素の特異性および活性を変更する機能的アミノ酸置換を示す。
配列番号１４５～１５８からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる遺伝子操作されたカルコンイソメラーゼも本明細書に記載される。
遺伝子操作されたカルコンイソメラーゼは、配列番号１９０によるコンセンサス配列を有するのが好ましい。
遺伝子操作されたカルコンは、明記された位置の以下のアミノ酸の少なくとも１つを含むのが特に好ましい。
‐４０位
‐７９位アラニン、プロリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ロイシン、バリンメチオニンまたはイソロイシン、
‐８７位リシン、アルギニンまたはアスパラギン、
‐１２２位アスパラギン酸、アスパラギンまたはグルタミン酸、
‐１２５位アルギニンまたはグリシン
‐４０位
‐７９位アラニン、プロリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ロイシン、バリンメチオニンまたはイソロイシン、
‐８７位リシン、アルギニンまたはアスパラギン、
‐１２２位アスパラギン酸、アスパラギンまたはグルタミン酸、
‐１２５位アルギニンまたはグリシン
さらに好ましいのは、アラニン、グリシン、プロリン、イソロイシン、バリン、メチオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、およびアルギニンからなる群より選択される７９位または１２５位のアミノ酸を含む遺伝子操作されたカルコンイソメラーゼである。驚くべきことに、配列番号１４５～１５８からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる遺伝子操作されたカルコンイソメラーゼは、フラバノンからカルコンへの反応を触媒する際に優れた性能を示すことが分かった。本発明によるカルコンイソメラーゼは、カルコンの部分で等価の反応を有し、フラバノンからカルコンへの反応を主に触媒することは特に驚くべきことであった。そのようにして得られたカルコンはその後、本発明による、本発明による方法のステップｉ）で提供されるところのエンレダクターゼによりジヒドロカルコンに触媒され得る。
好ましくは、遺伝子操作されたカルコンイソメラーゼは、配列番号１５４、１５７、１４５、１５２、１５５、１５３、１４７からなる群より選択される、より好ましくは配列番号１５７、１５４および１４５からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる。
さらなる好ましい実施形態では、遺伝子操作されたカルコンイソメラーゼの配列は、配列番号８５～９８からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列相同性を有するＥｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｍｕｌｕｓに由来する。
全ての上述した酵素の実施形態は、上述した本発明による方法に関して使用することができる。
本発明のさらに別の態様は、本発明による遺伝子操作されたエンレダクターゼをコードする核酸配列を含むトランスジェニック微生物に関する。
本発明の好ましい一実施形態は、本発明によるトランスジェニック微生物であって、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１、Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５、好ましくはＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０などのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ種、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｉｔｉｌｉｓ、またはＢａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓなどのＢａｃｉｌｌｕｓ種、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種、好ましくはＳ．ｃｅｒｅｖｅｓｉａｅ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、またはＫ．ｐｈａｆｆｉｉおよびＨ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａなどのＫｏｍａｇａｔａｅｌｌａ種、好ましくはＫ．ｐｈａｆｆｉｉ、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａなどのＹａｒｒｏｗｉａ種、Ｋ．ｌａｃｔｉｓなどのＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ種からなる群より選択される微生物に関する。
本発明の一態様は、
‐配列番号２４～４６および１６９～１７６からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列相同性を有するエンレダクターゼをコードする少なくとも１つの核酸配列
および任意に
‐配列番号１４５～１５８からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列相同性を有する遺伝子操作されたカルコンイソメラーゼをコードする少なくとも１つの核酸配列
を含むベクター、好ましくはプラスミドベクターに関する。
‐配列番号２４～４６および１６９～１７６からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列相同性を有するエンレダクターゼをコードする少なくとも１つの核酸配列
および任意に
‐配列番号１４５～１５８からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列相同性を有する遺伝子操作されたカルコンイソメラーゼをコードする少なくとも１つの核酸配列
を含むベクター、好ましくはプラスミドベクターに関する。
本発明によるベクターの好ましい一実施形態では、ベクターは、
配列番号２４～４６および１６９～１７６からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列相同性を有するエンレダクターゼをコードする少なくとも１つの核酸配列
および
‐配列番号１４５～１５８からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列相同性を有する遺伝子操作されたカルコンイソメラーゼをコードする少なくとも１つの核酸配列
を含む。
配列番号２４～４６および１６９～１７６からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列相同性を有するエンレダクターゼをコードする少なくとも１つの核酸配列
および
‐配列番号１４５～１５８からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列相同性を有する遺伝子操作されたカルコンイソメラーゼをコードする少なくとも１つの核酸配列
を含む。
本発明の一態様は、２つのベクターを含むベクター系に関し、第１のベクターは、
配列番号２４～４６および１６９～１７６からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列相同性を有するエンレダクターゼをコードする少なくとも１つの核酸配列
を含み、第２のベクターは、
配列番号１４５～１５８からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列相同性を有する遺伝子操作されたカルコンイソメラーゼをコードする少なくとも１つの核酸配列
を含む。
配列番号２４～４６および１６９～１７６からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列相同性を有するエンレダクターゼをコードする少なくとも１つの核酸配列
を含み、第２のベクターは、
配列番号１４５～１５８からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列相同性を有する遺伝子操作されたカルコンイソメラーゼをコードする少なくとも１つの核酸配列
を含む。
上述のトランスジェニック微生物またはベクターのさらなる実施形態は、上述の本発明による方法の好ましい実施形態を検討すれば明らかになり、したがって本発明によるトランスジェニック微生物またはベクターに関連して適宜適用される。
本発明の別の態様は、本発明による少なくとも１つのエンレダクターゼおよび／または本発明による少なくとも１つのトランスジェニック微生物および／または本発明による少なくとも１つのベクターの、好ましくは上に好ましいものとして記載されたような、ジヒドロカルコン類の生体触媒製造における、好ましくは本発明による方法における、使用に関する。
本発明は、例示的な非限定的実施例によってさらに特徴付けられる。
１．プラスミドＤＮＡのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細胞への形質転換
プラスミド増殖のために、プラスミドＤＮＡを化学的にコンピテントなＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α細胞（ニューイングランドバイオラボ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、フランクフルトアムマイン、ドイツ）に形質転換した。発現株の生成のために、プラスミドＤＮＡを化学的にコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に形質転換した。
プラスミド増殖のために、プラスミドＤＮＡを化学的にコンピテントなＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α細胞（ニューイングランドバイオラボ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、フランクフルトアムマイン、ドイツ）に形質転換した。発現株の生成のために、プラスミドＤＮＡを化学的にコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に形質転換した。
５０μＬのそれぞれのＥ．ｃｏｌｉ株を氷上で５分間インキュベートした。１μｌのプラスミドＤＮＡを添加した後、懸濁液を混合し、氷上で３０分間インキュベートした。細胞懸濁液をサーモブロック内で４２℃で４５秒間インキュベートし、続いて氷上で２分間インキュベートすることによって形質転換を行った。３５０μｌのＳＯＣアウトグロース培地（ニューイングランドバイオラボ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、フランクフルトアムマイン、ドイツ）を添加した後、細胞を３７℃および２００ｒｐｍで１時間インキュベートした。続いて、細胞懸濁液を、それぞれの抗生物質を含むＬＢ‐寒天プレート（カーロス社（Ｃａｒ Ｒｏｔｈ ＧｍｂＨ）、カールスルーエ、ドイツ）上に広げ、３７℃で１６時間インキュベートした。
２．発現プラスミドの生成
配列番号４８をコードする配列番号４７をベクターｐＣＤＦＤｕｅｔ‐１にクローニングして、ベクターｐＣＤＦＤｕｅｔ‐１ＣＨＩを得た。ベクターｐＣＤＦＤｕｅｔ‐１と配列番号４９および配列番号５０、ならびに配列番号５６と配列番号５１および配列番号５２を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）によって専門家に知られる一般的な手法に従って増幅し、反応溶液を１：１の比で混合し、実施例１に記載のように３７℃での１時間のインキュベーション後に、１．５μｌの混合物をＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αに形質転換した。ベクターｐＣＤＦＤｕｅｔ‐１ＣＨＩを、実施例１に記載のようにＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換する。
配列番号４８をコードする配列番号４７をベクターｐＣＤＦＤｕｅｔ‐１にクローニングして、ベクターｐＣＤＦＤｕｅｔ‐１ＣＨＩを得た。ベクターｐＣＤＦＤｕｅｔ‐１と配列番号４９および配列番号５０、ならびに配列番号５６と配列番号５１および配列番号５２を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）によって専門家に知られる一般的な手法に従って増幅し、反応溶液を１：１の比で混合し、実施例１に記載のように３７℃での１時間のインキュベーション後に、１．５μｌの混合物をＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αに形質転換した。ベクターｐＣＤＦＤｕｅｔ‐１ＣＨＩを、実施例１に記載のようにＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換する。
配列番号２４～配列番号４６をそれぞれコードする配列番号１～配列番号２３の配列を合成し、ｐＥＴ２８ａベクターのＮｃｏＩ制限部位とＸｈｏＩ制限部位との間にクローニングして（ツイストバイオサイエンス（Ｔｗｉｓｔ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）、サンフランシスコ、米国）、表１に列挙されたプラスミドを得た。これらの発現ベクターを、実施例１に記載のようにＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞またはプラスミドｐＣＤＦＤｕｅｔ‐１ＣＨＩを含むＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に形質転換する。
配列番号６９～配列番号８４をそれぞれコードする配列番号５３～配列番号６８の配列を合成し、ｐＥＴ２８ｂベクターのＮｄｅＩ制限部位とＢａｍＨＩ制限部位との間にクローニングして（バイオキャット（ＢｉｏＣａｔ）、ハイデルベルク、ドイツ）、表２に列挙されたプラスミドを得た。これらの発現ベクターを、実施例１に記載のようにＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に形質転換する。
人工設計により、ＣＨＩｅｒａ酵素の活性および／または特異性を最適化するために、ＣＨＩｅｒａのある変異体を作製した。これらのＣＨＩｅｒａ変異体バリアントは、配列番号１４５～配列番号１５８をコードする配列番号８５～配列番号９６に対応し、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅキット（アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）、米国）を使用した部位特異的変異誘発によって生成された。このために、配列番号６８を含むベクターｐＥＴ２８ｂ＿ＣＨＩｅｒａを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって製造者のマニュアルに従って配列番号９９～配列番号１４３の配列からの同じ対番号の１つのプライマー対をそれぞれ用いて増幅した。１μＬのＤｐｎＩで３７℃で１時間消化した後、混合物を、実施例１に記載のようにＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αに形質転換して、表３に列挙したプラスミドを得た。
配列番号１６０をコードする配列番号１５９の配列を合成し、ｐＥＴ２８ａベクターのＮｄｅＩ制限部位とＸｈｏＩ制限部位との間にクローニングして（ツイストバイオサイエンス（Ｔｗｉｓｔ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）、サンフランシスコ、米国）、プラスミドｐＥＴ２８ａ＿ｈｉｓ‐ＡｔＤＢＲ１を得た。
人工設計により、ＡｔＤＢＲ１酵素の活性および／または特異性を最適化するために、ＡｔＤＢＲ１のある変異体を作製した。これらのＡｔＤＢＲ１変異体バリアントは、配列番号１６９～配列番号１７６をコードする配列番号１６１～配列番号１６８に対応し、Ｑ５（登録商標）部位特異的変異誘発キット（ニューイングランドバイオラボ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、ドイツ）を使用した部位特異的変異誘発によって生成された。このために、配列番号１５９を含むベクターｐＥＴ２８ａ＿ｈｉｓ‐ＡｔＤＢＲ１を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって製造者のマニュアルに従って配列番号１７７～配列番号１８８の配列からの同じ対番号の１つのプライマー対をそれぞれ用いて増幅した。製造者のマニュアルにしたがった消化およびライゲーションの後、混合物を、実施例１に記載のようにＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αに形質転換して、表４に列挙したプラスミドを得た。
３．Ｅ．ｃｏｌｉ細胞の培養およびエンレダクターゼによる生体内変換
ｐＣＤＦＤｕｅｔ‐１ＣＨＩと表１からのｐＥＴ２８ａプラスミドの１つとを含むＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞、または表１からのｐＥＴ２８ａプラスミドの１つだけを含むＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を使用して、必要な抗生物質を含む５ｍＬのＬＢ培地（カールロス社（Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ ＧｍｂＨ）、カールスルーエ、ドイツ）にそれぞれ植菌した。１６時間のインキュベーション（３７℃、２００ｒｐｍ）後、細胞を使用して、必要な抗生物質を含む５０ｍＬのＴＢ培地（カールロス社（Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ ＧｍｂＨ）、カールスルーエ、ドイツ）にＯＤ６００＝０．１で植菌した。細胞をＯＤ６００＝０．５～０．８まで増殖させ（３７℃、２００ｒｐｍ）、１ｍＭのイソプロピル‐β‐Ｄ‐チオガラクトピラノシドを培養物に添加した。細胞培養物を１６時間インキュベートし（２２℃、２００ｒｐｍ）、遠心分離し（１０分、１０，０００ｒｐｍ）、上清を廃棄した。細胞ペレットを、Ｂ‐ＰＥＲタンパク質抽出試薬（サーモフィッシャーサイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ボン、ドイツ）を製造者の指示に従って使用して溶解した。その後の遠心分離（１０分、２０．０００ｒｐｍ）後、１．５ｍＭニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、１．５ｍＭニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、１Ｍグルコース、１Ｕグルコースデヒドロゲナーゼおよび１ｍＭ基質の添加により上清を生体内変換のために使用した。ブテイン、ホモブテイン、４‐Ｏ‐メチルブテイン、ナリンゲニンカルコン、ヘスペレチンカルコン、エリオジクチオールカルコンおよびホモエリオジクチオールカルコンをそれぞれ基質として使用した。反応混合物を３０℃で１６時間インキュベートした。メタノール（１体積の反応混合物＋１体積のメタノール）で反応を停止させた後、サンプルを遠心分離し（２０分、２０，０００ｒｐｍ）、上清をＬＣおよびＬＣ‐ＭＳ分析のために使用した。
ｐＣＤＦＤｕｅｔ‐１ＣＨＩと表１からのｐＥＴ２８ａプラスミドの１つとを含むＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞、または表１からのｐＥＴ２８ａプラスミドの１つだけを含むＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を使用して、必要な抗生物質を含む５ｍＬのＬＢ培地（カールロス社（Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ ＧｍｂＨ）、カールスルーエ、ドイツ）にそれぞれ植菌した。１６時間のインキュベーション（３７℃、２００ｒｐｍ）後、細胞を使用して、必要な抗生物質を含む５０ｍＬのＴＢ培地（カールロス社（Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ ＧｍｂＨ）、カールスルーエ、ドイツ）にＯＤ６００＝０．１で植菌した。細胞をＯＤ６００＝０．５～０．８まで増殖させ（３７℃、２００ｒｐｍ）、１ｍＭのイソプロピル‐β‐Ｄ‐チオガラクトピラノシドを培養物に添加した。細胞培養物を１６時間インキュベートし（２２℃、２００ｒｐｍ）、遠心分離し（１０分、１０，０００ｒｐｍ）、上清を廃棄した。細胞ペレットを、Ｂ‐ＰＥＲタンパク質抽出試薬（サーモフィッシャーサイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ボン、ドイツ）を製造者の指示に従って使用して溶解した。その後の遠心分離（１０分、２０．０００ｒｐｍ）後、１．５ｍＭニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、１．５ｍＭニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、１Ｍグルコース、１Ｕグルコースデヒドロゲナーゼおよび１ｍＭ基質の添加により上清を生体内変換のために使用した。ブテイン、ホモブテイン、４‐Ｏ‐メチルブテイン、ナリンゲニンカルコン、ヘスペレチンカルコン、エリオジクチオールカルコンおよびホモエリオジクチオールカルコンをそれぞれ基質として使用した。反応混合物を３０℃で１６時間インキュベートした。メタノール（１体積の反応混合物＋１体積のメタノール）で反応を停止させた後、サンプルを遠心分離し（２０分、２０，０００ｒｐｍ）、上清をＬＣおよびＬＣ‐ＭＳ分析のために使用した。
４．ＣＨＩの精製および生体内変換
表２または表３からのｐＥＴ２８ｂプラスミドの１つを含むＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を使用して、１ＬのＬＢ培地にＯＤ＝０．１で植菌した。細胞をＯＤが０．４～０．６に達するまで３７℃、２５０ｒｐｍでインキュベートし、０．１ｍＭ ＩＰＴＧを補充することにより誘導した。２８℃、２５０ｒｐｍでの１６時間のタンパク質発現後、４，０００×ｇでの１５分間の遠心分離により細胞を採取した。採取した細胞を、０．５ｍｇ／ｍＬリゾチーム（シグマアルドリッチ（Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ））、０．４Ｕ／ｍＬ Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（シグマアルドリッチ（Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ））およびＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（メルク（Ｍｅｒｃｋ））により室温で０．５時間溶解して、粗細胞抽出物を得た。粗抽出物を１０，０００×ｇで３０分間遠心分離して、ペレットを除去した。Ｎｉアフィニティクロマトグラフィ（ＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））によって組換えタンパク質を精製した。粗抽出物の上清を、２０ｍＭイミダゾールとともにカラムにロードした。カラムを、５カラム体積の３０ｍＭイミダゾールと２０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）および５００ｍＭ ＮａＣｌで洗浄した。１５０ｍＭイミダゾールと２０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）および５００ｍＭ ＮａＣｌによって標的タンパク質を溶出した。Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ‐１５（メルク（Ｍｅｒｃｋ））による限外濾過によって５０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．５）とのバッファー交換を達成した。反応混合物（２５℃の５０ｍＭ ＰＢＳ中のＣＨＩと１００μＭのナリンゲニンカルコン、ヘスペレチンカルコン、エリオジクチオールカルコン、ホモエリオジクチオールカルコンまたは４‐Ｏ‐メチルブテインのいずれか）における３８４ｎｍでの吸光度の減少を測定することによって、それぞれの精製された酵素の活性を決定した。結果を表５に示す。
表２または表３からのｐＥＴ２８ｂプラスミドの１つを含むＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を使用して、１ＬのＬＢ培地にＯＤ＝０．１で植菌した。細胞をＯＤが０．４～０．６に達するまで３７℃、２５０ｒｐｍでインキュベートし、０．１ｍＭ ＩＰＴＧを補充することにより誘導した。２８℃、２５０ｒｐｍでの１６時間のタンパク質発現後、４，０００×ｇでの１５分間の遠心分離により細胞を採取した。採取した細胞を、０．５ｍｇ／ｍＬリゾチーム（シグマアルドリッチ（Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ））、０．４Ｕ／ｍＬ Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（シグマアルドリッチ（Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ））およびＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（メルク（Ｍｅｒｃｋ））により室温で０．５時間溶解して、粗細胞抽出物を得た。粗抽出物を１０，０００×ｇで３０分間遠心分離して、ペレットを除去した。Ｎｉアフィニティクロマトグラフィ（ＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））によって組換えタンパク質を精製した。粗抽出物の上清を、２０ｍＭイミダゾールとともにカラムにロードした。カラムを、５カラム体積の３０ｍＭイミダゾールと２０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）および５００ｍＭ ＮａＣｌで洗浄した。１５０ｍＭイミダゾールと２０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）および５００ｍＭ ＮａＣｌによって標的タンパク質を溶出した。Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ‐１５（メルク（Ｍｅｒｃｋ））による限外濾過によって５０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．５）とのバッファー交換を達成した。反応混合物（２５℃の５０ｍＭ ＰＢＳ中のＣＨＩと１００μＭのナリンゲニンカルコン、ヘスペレチンカルコン、エリオジクチオールカルコン、ホモエリオジクチオールカルコンまたは４‐Ｏ‐メチルブテインのいずれか）における３８４ｎｍでの吸光度の減少を測定することによって、それぞれの精製された酵素の活性を決定した。結果を表５に示す。
５．ＡｔＤＢＲ１の精製および基質供給
プラスミドｐＥＴ２８ａ＿ｈｉｓ‐ＡｔＤＢＲ１を含むＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を使用して、必要な抗生物質を含む５ｍＬ ＬＢ培地（カールロス社（Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ ＧｍｂＨ）、カールスルーエ、ドイツ）に植菌した。１６時間のインキュベーション（３７℃、２００ｒｐｍ）後、細胞を使用して、必要な抗生物質を含む５０ｍＬのＴＢ培地（カールロス社（Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ ＧｍｂＨ）、カールスルーエ、ドイツ）にＯＤ６００＝０．１で植菌した。細胞をＯＤ６００＝０．５～０．８まで増殖させ（３７℃、２００ｒｐｍ）、１ｍＭのイソプロピル‐β‐Ｄ‐チオガラクトピラノシドを培養物に添加した。細胞培養物を１６時間インキュベートし（２２℃、２００ｒｐｍ）、遠心分離し（１０分、１０，０００ｒｐｍ）、上清を廃棄した。細胞ペレットを、Ｂ‐ＰＥＲタンパク質抽出試薬（サーモフィッシャーサイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ボン、ドイツ）を製造者の指示に従って使用して溶解した。続く遠心分離（１０分、２０，０００ｒｐｍ）の後、１ｍＬのＨｉｓＴｒａｐ ＦＦカラム（ＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））を製造者のマニュアルに従って使用して上清を精製した。溶出したタンパク質を、ＰＤ‐１０脱塩カラム（ＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））を使用して、製造者のマニュアルの重量分析プロトコルを使用して脱塩した。タンパク質を５０ｍＭ リン酸バッファーｐＨ６．０に溶出させた。精製されたタンパク質を、１．５ｍＭニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸の添加および基質（ナリンゲニンカルコン、ヘスペレチンカルコン、エリオジクチオールカルコンまたはホモエリオジクチオールカルコンをそれぞれ使用した）の供給により生体内変換のために使用した。反応液に、１０ｐｐｍの基質を１０分毎に１５０分間補充した。３０℃でインキュベーションを行った。メタノール（１体積の反応混合物＋１体積のメタノール）で反応を停止させた後、サンプルを遠心分離し（２０分、２０．０００ｒｐｍ）、上清をＬＣおよびＬＣ‐ＭＳ分析のために使用した（図１５を参照）。
プラスミドｐＥＴ２８ａ＿ｈｉｓ‐ＡｔＤＢＲ１を含むＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を使用して、必要な抗生物質を含む５ｍＬ ＬＢ培地（カールロス社（Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ ＧｍｂＨ）、カールスルーエ、ドイツ）に植菌した。１６時間のインキュベーション（３７℃、２００ｒｐｍ）後、細胞を使用して、必要な抗生物質を含む５０ｍＬのＴＢ培地（カールロス社（Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ ＧｍｂＨ）、カールスルーエ、ドイツ）にＯＤ６００＝０．１で植菌した。細胞をＯＤ６００＝０．５～０．８まで増殖させ（３７℃、２００ｒｐｍ）、１ｍＭのイソプロピル‐β‐Ｄ‐チオガラクトピラノシドを培養物に添加した。細胞培養物を１６時間インキュベートし（２２℃、２００ｒｐｍ）、遠心分離し（１０分、１０，０００ｒｐｍ）、上清を廃棄した。細胞ペレットを、Ｂ‐ＰＥＲタンパク質抽出試薬（サーモフィッシャーサイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ボン、ドイツ）を製造者の指示に従って使用して溶解した。続く遠心分離（１０分、２０，０００ｒｐｍ）の後、１ｍＬのＨｉｓＴｒａｐ ＦＦカラム（ＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））を製造者のマニュアルに従って使用して上清を精製した。溶出したタンパク質を、ＰＤ‐１０脱塩カラム（ＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））を使用して、製造者のマニュアルの重量分析プロトコルを使用して脱塩した。タンパク質を５０ｍＭ リン酸バッファーｐＨ６．０に溶出させた。精製されたタンパク質を、１．５ｍＭニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸の添加および基質（ナリンゲニンカルコン、ヘスペレチンカルコン、エリオジクチオールカルコンまたはホモエリオジクチオールカルコンをそれぞれ使用した）の供給により生体内変換のために使用した。反応液に、１０ｐｐｍの基質を１０分毎に１５０分間補充した。３０℃でインキュベーションを行った。メタノール（１体積の反応混合物＋１体積のメタノール）で反応を停止させた後、サンプルを遠心分離し（２０分、２０．０００ｒｐｍ）、上清をＬＣおよびＬＣ‐ＭＳ分析のために使用した（図１５を参照）。
精製されたＡｔＤＢＲ１を、１．５ｍＭニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸および１０μＭヘスペレチンの添加により生体内変換のために使用した。対照反応を、上記のように、但し精製されたＡｔＤＢＲ１の代わりに５０ｍＭリン酸バッファーｐＨ６．０を用いて行った。反応物を３０℃でインキュベートした。インキュベーションの０分後、またはインキュベーションの９０分後に、メタノール（１体積の反応混合物＋１体積のメタノール）で反応を停止させた。サンプルを遠心分離し（２０分、２０，０００ｒｐｍ）、上清をＬＣ‐ＭＳ分析のために使用した。結果を図１７に描写する。
６．Ｅ．ｃｏｌｉ細胞の培養およびＡｔＤＢＲ１バリアントによる生体内変換
表４のｐＥＴ２８ａプラスミドの１つを含むＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を使用して、必要な抗生物質を含む４５０μＬ ＬＢ培地（カールロス社（Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ ＧｍｂＨ）、カールスルーエ、ドイツ）の前培養物をそれぞれ植菌した。６時間のインキュベーション（３７℃、３００ｒｐｍ）後、細胞を使用して、それぞれの前培養物３５μＬを抗生物質を含む６６５μＬ ＴＢ培地（カールロス社（Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ ＧｍｂＨ）、カールスルーエ、ドイツ）に植菌した。細胞を７５分間増殖させ（３７℃、３００ｒｐｍ）、５０μｌの１５ｍＭイソプロピル‐β‐Ｄ‐チオガラクトピラノシドを培養物に添加した。細胞培養物を１６時間インキュベートし（２８℃、３００ｒｐｍ）、遠心分離し（２０分、５，０００ｒｐｍ）、上清を廃棄した。細胞ペレットを、５００μＬ Ｂ‐ＰＥＲタンパク質抽出試薬（サーモフィッシャーサイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ボン、ドイツ）中で製造者の指示に従って溶解した。その後の遠心分離（６０分、５，０００ｒｐｍ）後、１．５ｍＭニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸および２０μＭの基質ヘスペレチンカルコンの添加により上清を生体内変換のために使用した。反応混合物を４０℃で３．５時間インキュベートした。メタノール（１体積の反応混合物＋１体積のメタノール）で反応を停止させた後、サンプルを遠心分離し（６０分、５，０００ｒｐｍ）、上清をＬＣ分析のために使用した。結果を図１６に描写する。
表４のｐＥＴ２８ａプラスミドの１つを含むＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を使用して、必要な抗生物質を含む４５０μＬ ＬＢ培地（カールロス社（Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ ＧｍｂＨ）、カールスルーエ、ドイツ）の前培養物をそれぞれ植菌した。６時間のインキュベーション（３７℃、３００ｒｐｍ）後、細胞を使用して、それぞれの前培養物３５μＬを抗生物質を含む６６５μＬ ＴＢ培地（カールロス社（Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ ＧｍｂＨ）、カールスルーエ、ドイツ）に植菌した。細胞を７５分間増殖させ（３７℃、３００ｒｐｍ）、５０μｌの１５ｍＭイソプロピル‐β‐Ｄ‐チオガラクトピラノシドを培養物に添加した。細胞培養物を１６時間インキュベートし（２８℃、３００ｒｐｍ）、遠心分離し（２０分、５，０００ｒｐｍ）、上清を廃棄した。細胞ペレットを、５００μＬ Ｂ‐ＰＥＲタンパク質抽出試薬（サーモフィッシャーサイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ボン、ドイツ）中で製造者の指示に従って溶解した。その後の遠心分離（６０分、５，０００ｒｐｍ）後、１．５ｍＭニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸および２０μＭの基質ヘスペレチンカルコンの添加により上清を生体内変換のために使用した。反応混合物を４０℃で３．５時間インキュベートした。メタノール（１体積の反応混合物＋１体積のメタノール）で反応を停止させた後、サンプルを遠心分離し（６０分、５，０００ｒｐｍ）、上清をＬＣ分析のために使用した。結果を図１６に描写する。
Claims (11)
- ｉ）配列番号２４～４６および１６９～１７６からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる少なくとも１つのエンレダクターゼを提供するステップ、
ｉｉ）配列番号１４５～１５８からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる少なくとも１つの遺伝子操作されたカルコンイソメラーゼを任意に提供するステップ、
ｉｉｉ）少なくとも１つのフラバノンおよび／または少なくとも１つのカルコンおよび／または対応するグリコシド類の少なくとも１つを提供するステップ、
ｉｖ）ステップｉ）で提供された前記少なくとも１つのエンレダクターゼ、および任意にステップｉｉ）で提供された前記少なくとも１つのカルコンイソメラーゼを、ステップｉｉｉ）で提供された前記少なくとも１つのフラバノンおよび／または前記少なくとも１つのカルコンおよび／または前記少なくとも１つの対応するグリコシドと一緒にインキュベートするステップ、
ｖ）少なくとも１つのジヒドロカルコンを得るステップ、
ｖｉ）前記得られたジヒドロカルコンを任意に精製するステップ
を含むかまたはそれらからなる、ジヒドロカルコン類の生体触媒製造のための方法。 - ステップｉ）で提供される前記少なくとも１つのエンレダクターゼは、精製または部分的に精製される、請求項１に記載の方法。
- ステップｉｖ）の前記インキュベーションは、少なくとも５、１０、１５、２０、２５分間、好ましくは少なくとも３０分間行われる、請求項１または２のいずれか１項に記載の方法。
- ステップｉｉｉ）で提供される前記少なくとも１つのフラバノンおよび／または少なくとも１つのカルコンおよび／または対応するグリコシド類の少なくとも１つは、ホモエリオジクチオール、ヘスペリジン、ヘスペレチン‐７‐グルコシド、ネオヘスペリジン、ナリンゲニン、ナリンギン、ナリルチン、リキリチゲニン、ピノセムブリン、ステッポゲニン、スクテアモエニン、ジヒドロエキオジニン、ポンシレチン、サクラネチン、イソサクラネチン、４，７‐ジヒドロキシ‐フラバノン、４，７‐ジヒドロキシ‐３’‐メトキシフラバノン、３，７‐ジヒドロキシ‐４’‐メトキシフラバノン、３’４，７‐トリヒドロキシフラバノン、アルピネンチン、ピノストロビン、７‐ヒドロキシフラバノン、４’‐ヒドロキシフラバノン、３‐ヒドロキシフラバノン、ツガフォリンからなる群より選択される、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
- ステップｉｉｉ）で少なくとも１つのフラバノンおよび／または少なくとも１つのカルコンおよび／または対応するグリコシド類の少なくとも１つが提供され、前記少なくとも１つのフラバノンおよび／または前記少なくとも１つのカルコンおよび／または対応するグリコシド類の少なくとも１つは、さらに精製または部分的に精製される、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
- ステップｖ）で得られる前記少なくとも１つのジヒドロカルコンは、ブテインジヒドロカルコン、ホモブテインジヒドロカルコン、４‐Ｏ‐メチルブテインジヒドロカルコン、ナリンゲニンジヒドロカルコン、ヘスペレチンジヒドロカルコン、ホモエリオジクチオールジヒドロカルコンおよびエリオジクチオールジヒドロカルコンからなる群より選択される、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
- 配列番号１６９～１７６からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる遺伝子操作されたエンレダクターゼ。
- 請求項７に記載の遺伝子操作されたエンレダクターゼをコードする核酸配列を含むトランスジェニック微生物。
- 前記微生物は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１、Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５、好ましくはＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０などのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ種、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｉｔｉｌｉｓ、またはＢａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓなどのＢａｃｉｌｌｕｓ種、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種、好ましくはＳ．ｃｅｒｅｖｅｓｉａｅ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、またはＫ．ｐｈａｆｆｉｉおよびＨ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａなどのＫｏｍａｇａｔａｅｌｌａ種、好ましくはＫ．ｐｈａｆｆｉｉ、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａなどのＹａｒｒｏｗｉａ種、Ｋ．ｌａｃｔｉｓなどのＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ種からなる群より選択される、請求項７または８に記載のトランスジェニック微生物。
- ‐配列番号２４～４６および１６９～１７６からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列相同性を有するエンレダクターゼをコードする少なくとも１つの核酸配列
および任意に
‐配列番号１４５～１５８からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列相同性を有する遺伝子操作されたカルコンイソメラーゼをコードする少なくとも１つの核酸配列
を含むベクター、好ましくはプラスミドベクター。 - 請求項７に記載の少なくとも１つのエンレダクターゼおよび／または請求項８または９に記載の少なくとも１つのトランスジェニック微生物および／または請求項１０に記載の少なくとも１つのベクターの、ジヒドロカルコン類の生体触媒製造における、好ましくは請求項１～６のいずれか１項に記載の方法における、使用。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/EP2021/055319 WO2022184248A1 (en) | 2021-03-03 | 2021-03-03 | Biocatalytical production of dihydrochalcones |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2024509538A true JP2024509538A (ja) | 2024-03-04 |
Family
ID=74859431
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2023553366A Pending JP2024509538A (ja) | 2021-03-03 | 2021-03-03 | ジヒドロカルコン類の生体触媒生産 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20240150797A1 (ja) |
| EP (1) | EP4301865A1 (ja) |
| JP (1) | JP2024509538A (ja) |
| CN (1) | CN117242185A (ja) |
| WO (1) | WO2022184248A1 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117737018B (zh) * | 2024-02-07 | 2024-05-03 | 广东金骏康生物技术有限公司 | 一种烯醛还原酶突变体、鼠李糖苷酶突变体、三酶表达菌株及其应用 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2148332C2 (de) | 1970-09-30 | 1983-01-27 | The Procter & Gamble Co., 45202 Cincinnati, Ohio | Süßmittel und Verfahren zum Süßen von einnehmbaren Stoffen |
| US10238627B2 (en) | 2013-05-06 | 2019-03-26 | Indiana University Research And Technology Corporation | Compounds for treatment of angiogenesis-mediated diseases |
| EP2963109B1 (de) | 2014-07-01 | 2017-09-06 | Symrise AG | Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von Flavanonglykosid-Dihydrochalkonen |
| WO2016193504A1 (en) * | 2015-06-05 | 2016-12-08 | Evolva Sa | Biosynthesis of phenylpropanoid and dihydrophenylpropanoid derivatives |
| WO2017186299A1 (en) | 2016-04-28 | 2017-11-02 | Symrise Ag | Use of 3-(3-hydroxy-4-methoxy-phenyl)-1-(2,4,6-trihydroxy-phenyl)-propan-1-one |
| MX2020003152A (es) | 2017-10-23 | 2022-05-25 | Symrise Ag | Composición de aroma. |
| CN111018684A (zh) | 2019-11-20 | 2020-04-17 | 陕西嘉禾生物科技股份有限公司 | 一种橙皮素二氢查尔酮的合成方法 |
-
2021
- 2021-03-03 JP JP2023553366A patent/JP2024509538A/ja active Pending
- 2021-03-03 WO PCT/EP2021/055319 patent/WO2022184248A1/en active Application Filing
- 2021-03-03 US US18/278,159 patent/US20240150797A1/en active Pending
- 2021-03-03 CN CN202180095065.7A patent/CN117242185A/zh active Pending
- 2021-03-03 EP EP21710232.6A patent/EP4301865A1/en active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2022184248A1 (en) | 2022-09-09 |
| US20240150797A1 (en) | 2024-05-09 |
| EP4301865A1 (en) | 2024-01-10 |
| CN117242185A (zh) | 2023-12-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR102378988B1 (ko) | 무칼로리 감미제 | |
| EP3283614B1 (en) | Production of non-caloric sweeteners using engineered whole-cell catalysts | |
| US9932610B2 (en) | Methods of making vanillin via the microbial fermentation of ferulic acid from eugenol using a plant dehydrogenase | |
| JP7177048B2 (ja) | ステビオール配糖体の生合成製造およびそのためのプロセス | |
| KR20220034793A (ko) | 우리딘 다이포스페이트-의존성 글라이코실트랜스퍼라제 효소 | |
| Ferreira-Lazarte et al. | Production of α-rhamnosidases from Lactobacillus plantarum WCFS1 and their role in deglycosylation of dietary flavonoids naringin and rutin | |
| EP2957182A1 (en) | Improved natural sweetener compositions | |
| US20220042060A1 (en) | Biosynthesis production of steviol glycosides and processes therefore | |
| JP2024509538A (ja) | ジヒドロカルコン類の生体触媒生産 | |
| WO2020176668A1 (en) | Mogroside biocatalysis methods | |
| US20230279451A1 (en) | Methods for the biocatalytical manufacturing of dihydrochalcones | |
| CN110343681A (zh) | 合成呋喃酮及其衍生物葡萄糖苷的糖基转移酶突变体蛋白 | |
| JP6573944B2 (ja) | チオエステラーゼおよびそれらの使用 | |
| JP2023027835A (ja) | 改変グルタミン酸デカルボキシラーゼ |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20240207 |