JP6573944B2 - チオエステラーゼおよびそれらの使用 - Google Patents
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Description
チオエステルは合成によって作ることができる。しかしながら、食べ物のトレンド、および健康およびウェルネスの関心のため、天然物から直接得られるかまたは生物学的プロセスを通して産生される、チオエステルなどのフレーバー化合物についての特段の需要がある。かかる化合物の特段の利点は、「天然」と称され得、および消費者製品(consumable products)に対して潜在的にそのように表示し得ることである。
したがって、消費者製品に使用することができ、および「天然」と表示することができる、チオエステルを産生する、より予測可能および潜在的により経済的に実行可能な方法を開発することは有益であろう。
この知見は、該ヌクレオチド配列の、消費者製品に加えることができ、および「天然」と表示することができるチオエステルの効果的な産生を可能にする方法における使用を可能にする。さらには、これらのヌクレオチド配列はチオエステルを形成する能力を有する他の野生型の細菌を同定するためのスクリーニング方法において使用し得る。
ヌクレオチド配列の機能的同等物には、遺伝子コードの縮退により、本明細書に開示されたものと異なるヌクレオチド配列を有するが、同じ活性を有する同じアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
機能的同等物の例は、ポリペプチドの活性における変化につながらす、したがって機能的に中立と考えることができる、少なくとも一つの保存されたアミノ酸の置換に起因するセンス変異を含む核酸配列を含む。
機能的同等物の別の非限定の例には、フラグメント、オルソログ、スプライス変異体、一塩基多型および対立遺伝子変異体を含む。
かかる機能的に同等なものは本明細書に開示されたヌクレオチド配列に対して60%、75%、80%、90%、95%またはそれ以上の相同性を有する。
配列同一性はbasic local alignment search tool(以下BLAST)技術を使用して決定されてよい。BLAST技術はhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov.で利用できるプログラムblastnに採用されるヒューリスティックな検索アルゴリズムである。
相同性がハイブリダイゼーションによって決定される場合、ヌクレオチド配列が本明細書に開示されているヌクレオチド配列に選択的にハイブリダイズする能力があるという条件で、それらは実質的に相同性があると考えられるべきである。
例えばcDNA中の、別のヌクレオチド配列の存在のため、バックグラウンドハイブリダイゼーションが起こり得る。標的DNAとの間で観察される特異的な相互作用の10倍(10 fold)より小さい強さであるどんなシグナルもバックグラウンドであると考えられるべきである。相互作用の強さは、例えばプローブを、例として32Pで放射性標識することで計測されてもよい。
タグの非限定な例は、これに限定するものではないが、膜外輸送タグ(membrane export tag)および、これに限定するものではないが、Hisタグ、グルタチオン−S−トランスフェラーゼタグ(GST)を含む、チオエステラーゼの検出のために使用されるタグを含む。
転写または翻訳に影響するオペレーターまたはモチーフの非限定な例は、これに限定するものではないが、転写産物の効率的なポリアデニル化に必要とされるシグナル、リボソーム結合部位、例としてEcoR1などの認識部位を含む。
配列番号1、3、5および7に開示されたヌクレオチド配列またはそれらの機能的同等物は、配列番号2、4、6および8に開示されたアミノ酸配列またはそれらの機能的同等物を含むチオエステラーゼ酵素を産生するために使用されてよい。
別の実例的態様によると、配列番号1、3、5および7に開示された1または2以上のヌクレオチド配列、またはそれらの機能的同等物でトランスフェクトされた宿主細胞が提供される。かかる宿主細胞は配列番号2、4、6および8で開示されている1または2以上のアミノ酸配列、またはそれらの機能的同等物を含む、チオエステラーゼ活性をもつ酵素を発現できる。
実例的態様によると、細胞は細菌または菌の細胞である。
もう一つの実例的態様によると、細胞はEscherichia coli、Brevibacterium、Corynebacterium、Arthrobacter、Pseudomonas、Nocardia, Methylobacteri、Lactobacillus、Lactococcus、Streptococcus、Pediococcus,Oenococcus、Leuconostoc、Weisella、Carnobacterium、および Tetragenococcus、Proprionibacterium sp.、Bifidobacterium spp.、Enterococcus spp、Corynebacteriumglutamicum、Arthrobacter sp.、Micrococcus luteus および Staphylococcus equorum、Geotrichum candidum、Yarrowia lipolytica、Kluyveromyces lactis、Debaryomyces hansenii、Saccharomyces cerevisiaeから選択される一または二以上である。
宿主細胞の中にヌクレオチド配列を導入するための任意の既知の方法が使用されてよい。使用される特定の遺伝子工学手順は、所望のアミノ酸配列またはそれらの機能的同等物を発現できる宿主細胞の中に所望のヌクレオチド配列またはそれらの機能的同等物を成功裏に導入できるということだけが必要である。それらの方法は、クローン化されたゲノムDNA、cDNA、合成DNAまたは他の外来の遺伝物質を宿主細胞に導入することを伴ってよく、およびリン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、細胞質融合、エレクトロポレーション、リポソーム、マイクロインジェクション、発現ベクター等の使用を含んでよい。
適した技術を選択することは、十分に当業者のなす範囲内である。
本発明の別の側面では、配列番号1、3、5、および7に開示される少なくとも一つのヌクレオチド配列またはそれらの機能的同等物かならなるベクターが提供される。
問題となっている宿主細胞および所望の効果に応じて、適した発現ベクターを選択することは十分に当業者のなす範囲内である。
トランスフェクション後、トランスフェクトされた細胞は当該技術分野でよく知られた標準培養条件を使用して培養されてよい。
異なる細胞が、適切な温度および細胞培養培地を含む異なる培養条件を要求することは、当業者に明らかである。問題となっている細胞および所望の最終結果に応じて培養条件を決定することは、十分に当業者のなす範囲内である。
ある細胞に関する適切な培養培地および条件についての情報は、アメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)のウェッブサイト:http://www.lgcstandards-atcc.org/Home/tabid/477/Default.aspxで見出し得る。
別の特定の実例的態様において、細胞はBrevibacterium、CorynebacteriumまたはE. Coli細胞であり、培養培地はトリプチケースソイ(tripticase‐soy)、de Man-Rogosa-Sharpe(MRS)、エリカ(Elliker's)、M17、ニュートリエントブロスまたはLB培地から選択された。細胞は37℃で一昼夜インキュベートされた。
問題となっている宿主細胞およびベクターに応じて、適した構成的プロモーターを選択することは、十分に当業者のなす範囲内である。
配列番号2、4、6および8に開示される少なくとも一つのヌクレオチド配列またはそれらの機能的同等物を含む単離されたチオエステラーゼ酵素、または配列番号1、3、5および7に開示される少なくとも一つのヌクレオチド配列またはそれらの機能的同等物を含むトランスフェクトされた宿主細胞は、チオエステルを産生するために使用されてよい。
実例的態様において、インキュベーションは25℃から38℃の温度、6から8のpH、1から72時間の範囲の期間で実行される。短鎖脂肪酸補酵素A誘導体が配列番号2、4、6および8に開示される少なくとも一つのアミノ酸配列またはそれらの機能的同等物を含むチオエステラーゼ酵素の適した基質であることが、出願人らにより見出された。
別の実例的態様において、適した基質はC1−C8のSCFA−CoAを含む。
本発明のトランスフェクトされた宿主細胞、および/または酵素は可動のまたは固定化された形式で使用されてよい。
実例的態様において、酵素および/または宿主細胞は固定化された形式で使用される。
本発明の別の側面において、本明細書に記載されているような方法により得られるまたは産生されるチオエステルが提供される。
キットは、チオエステルを産生するための、本明細書に開示された方法を実行するために使用されてよい。
実例的態様において、適した基質は短鎖脂肪酸補酵素A(SCFA‐CoA)を含む。
チーズに存在するチオエステルの量および比率はそのフレーバーに影響することが知られている。チオエステルはその製造及び熟成の間に、チーズに存在する微生物によって産生される。これらの微生物はしばしば種培養としてチーズに加えられる。
別の実例的態様において、チオエステラーゼ酵素、および/または宿主細胞は種培養の一部として加えられる。
別の側面において、上記で定義された方法により得られるまたは、それにしたがって産生されるチーズ製品が提供される。
配列番号1、3、5および7に開示されるヌクレオチド配列、またはそれらの機能的同等物は、配列番号2、4、6および8に開示されるアミノ酸配列によってコードされるチオエステラーゼ酵素をコードする遺伝子またはそれらの機能的同等物を含む野生型の生物をスクリーニングおよび同定するために使用されてよい。
別の側面において、配列番号1、3、5、および7に開示されるヌクレオチド配列またはそれらの機能的同等物を、スクリーニング方法におけるマーカーとして使用することを含む、配列番号2、4、6および8に開示されるアミノ酸配列によってコードされたチオエステラーゼ酵素またはそれらの機能的同等物を産生することができる生物を同定する方法が提供される。
実例的態様において、生物は野生型の生物である。
任意の知られたスクリーニング方法が使用されてよい。よく知られたスクリーニング方法の例は、これに限定されないが、コンピューター作動の公共の配列データベースのヌクレオチドまたはタンパク質相同性検索、ハイスループットシークエンシングを介したヌクレオチドスクリーニング、および、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)スクリーニングを含む。
別の側面において、本明細書に記載されている方法によって得られるまたは産生される少なくとも一つのチオエステルを含む組成物が提供される。
別の側面において、組成物のフレーバーを創り出すまたは改変する方法であって、本明細書に開示されるように形成される少なくとも一つのチオエステルを該組成物に加えることを含む、前記方法が提供される。
組成物は、加えて、フレーバー組成物で通常使用される別の風味物質成分および賦形剤、例えば運搬物質、を含んでよい。
別の風味物質成分のさらなる例は、the National Academy of Sciencesによる“Chemicals Used in Food Processing”、1274巻、63〜258頁、で見出すことができる。
本明細書に開示されるように形成されたチオエステルは、100%までの濃度で組成物に使用されてよい。ある態様によると、チオエステルは、約0.01%から約99%の範囲の濃度で組成物に含まれてよい。他の態様によると、チオエステルは、約1%から約99%の範囲の濃度で組成物に含まれてよい。
本明細書で開示されるように形成されたチオエステル、または本明細書で開示される少なくとも一つのチオエステルを含む組成物を、消費者製品に該チオエステルまたは組成物を直接混ぜるための通常の技術を使用することで消費者製品に加えることができる。
別の側面において、本明細書に記載される方法により得られるまたは産生される少なくとも一つのチオエステル含む消費者製品が提供される。
例示的な甘い製品は、これに限定されないが、朝食用シリアル、レディー・トゥー・イート(“rte”)シリアル、家族向け朝食用シリアル、フレーク、ミューズリー、他のrteシリアル、子供向け朝食用シリアル、ホットシリアルを含む。
チオエステルは、乳製品、特にチーズのフレーバーが付与された製品ににとって、特に重要なフレーバー付与成分である。特に、好ましくはMTAおよび/またはMTPと組み合わせで使用される、チオエステルMTBは、よいフレーバーのインパクトを持つ本物のチーズフレーバーを提供するために望まれる。
別の実例的態様では、消費者製品は、本明細書で開示されるように形成されたMTA、および/またはMTB、および/またはMTPを含む、チーズのフレーバーが付与された製品である。
この発明は、下記の配列番号を参照して説明されている。
配列番号1はチオエステラーゼ酵素425をコードするヌクレオチド配列を表現している。
配列番号2はチオエステラーゼ酵素425のアミノ酸配列を表現している。
配列番号5はチオエステラーゼのひとつ3320をコードするヌクレオチド配列を表現している。
配列番号6はチオエステラーゼ酵素3320のアミノ酸配列を表現している。
配列番号3はチオエステラーゼ酵素1875をコードするヌクレオチド配列を表現している。
配列番号4はチオエステラーゼ酵素1875のアミノ酸配列を表現している。
配列番号7はチオエステラーゼ酵素1874をコードするヌクレオチド配列を表現している。
配列番号8はチオエステラーゼ酵素1874のアミノ酸配列を表現している。
例1−タンパク質発現のためのチオエステラーゼ遺伝子クローニング
チオエステラーゼ酵素(以下TE)、TE0425、TE1875、TE3320およびTE1874のDNA配列は、遺伝子特異的なプライマー(表1)を用いたポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用した増幅により、B.linens株ATCC9174から得た。
プライマーは、クローニングされるべき遺伝子内として生じる部位を避けつつ、pET−22b(+)ベクター(Novagen)中に遺伝子を方向性(directional)クローニングさせるための制限部位を含む。5’プライマーは、強力なE.coliリボソーム結合部位およびATG開始コドンを提供する配列AGGAGGATTAACATAが後に続く、XbaI部位を含む。ATGコドンの後に、それぞれの5’プライマーは特定のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームの二番目のコドンの最初の塩基で始まる14−20塩基のインフレーム遺伝子特異的な配列を含む。
pET−22b(+)ベクターは、Novagenによって設計され、E.coliでの誘導発現および、発現タンパク質中に組み込まれたポリヒスチジンドメインのニッケルカラムへの結合によるタンパク質精製の両方を提供する。このベクターにクローニングされた遺伝子の転写には、誘導物質IPTGの添加が要求されるように設計されおり、この発明で概説された目的のためのpET−22b(+)ベクターシステムの使用は、製造者の推奨に完全に従って実行された。
pET−22b(+)ベクターへの、得られた遺伝子特異的なXbaIからSalIまたはXhoIフラグメントのクローニングは、ベクター骨格からのC末のHisタグドメインをコードするインフレーム配列および終止コドンを有するオープンリーディングフレームを作成した。
ベクターDNAにライゲーションし、エレクトロポレーションした後、推定の遺伝子挿入物をもつE.coli DH5α形質転換体クローンは、50μg/mLのアンピシリンを含むLB寒天プレート上で選択された。pGEM‐5Zクローニングは、青/白βガラクトシダーゼ遺伝子不活性スクリーニングを使用した、挿入物のクローンの初期スクリーニングが可能であった。形質転換体はそこで、アンピシリン耐性コロニーから回収されたプラスミドDNAの0.8%アガロースゲル電気泳動により、適切なサイズのプラスミドについてスクリーニングされた。
選択されたコロニーからのプラスミドDNAは、その後制限酵素で消化され、消化産物のアガロースゲル電気泳動を使用し、挿入物に隣接する予想される制限部位をもつ挿入DNAの存在および大きさを確認した。これらのスクリーニングを通過した挿入物は、挿入物に隣接するベクター部位に結合するプライマーを使用し、シークエンシングされた。それらは、pGEM‐5ZクローンのためのSP6およびT7プロモータープライマーおよび、pET‐22b(+)のためのT7プロモーターおよびT7ターミネータープライマーであった。
最初にpGEM‐5Zベクターにクローニングされた配列について、挿入物を、調製用のアガロースゲルからの抽出により適切な制限消化物から回収し、そこでpET‐22b(+)の中に移され、上述のとおりスクリーニングされた。E.coliのDH5α細胞中で期待されるpET‐22b(+)コンストラクトを得た後、プラスミドを回収し、タンパク質発現のためにE.coli BL21(DE3)細胞へとエレクトロポレーションによって形質転換した。
タンパク質発現を、例1で調製されたE.coli BL21(DE3)細胞中で、前記E.coli細胞を含むバッチ培養物(100から250mL)への0.5mMのIPTGの添加を通じて誘導した。
E.coli細胞は、そこで2から4hの間インキュベートし、その時間の後、商品名Ni‐NTA Agarose(Invitrogen)として売られているニッケル充填樹脂を使用して、自然の条件下でHisタグタンパク質の精製を行った。
インキュベートされたE.coli細胞は、こで50mMのリン酸ナトリウム(pH8.0)、20mMのイミダゾール、0.5Mの塩化ナトリウムバッファーを含む溶液に加えられ、ガラスビーズとともにボルテックスすることにより破壊された。
クローニングされたチオエステラーゼタンパク質は、50mMイミダゾールを含むバッファーで精製カラムから抽出された。抽出の後、タンパク質はさらに250mMの同じバッファーで溶出された。
抽出されたタンパク質は、そこで50mMのTrisHCl(pH8.0)バッファーで、4℃で透析された。バッファーはプロセスを通して4回変えられた。
個々のチオエステラーゼタンパク質のそれぞれの濃度は、キット供給者(Sigma)により指示されるように採用されるmicro-Lowryキットを使用し、決定された。
精製されたTE425、TE3320、TE1875、およびTE1874の、脂肪酸からチオエステルを産生する能力を決定した。別段の記載のない限り、溶液という言葉は、水をベースとした溶液として解釈されるべきである。
それぞれ10mMの蟻酸(C1)、酢酸(C2)、プロピオン酸(C3)、酪酸およびイソ酪酸(C4)吉草酸およびイソ吉草酸(C5)およびヘキサン酸を含む短鎖脂肪酸(以下SCFA)混合物を調製した。この混合物を、そこで希釈し、最終的な総C1からC6SCFA濃度が80μMの溶液を得た。
100mMのリン酸バッファー(pH7.2)、100μMのウシ血清アルブミン(以下BSA)、25μMのメタンチオール(以下MeSH)、25μMの補酵素A(以下CoASH)、等量のピリドキサールリン酸、ピリドキサミンおよびピリドキサールを含む2.5μMの組成物(以下ピリドキサールカクテル)、上記で調製された80μMの(C1‐C6)SCFA混合物、10μMのフルフリルアルコール、および100μlの4つの0.35μM酵素液のうち1つを含む、4つのサンプル溶液を調製した。
コントロール1は、100mMリン酸バッファー(pH7.2)、100μMのBSA、25μMのMeSH、25μMのCoASH、2.5μMのピリドキサールカクテル、80μMの(C1‐C6)SCFA混合および10μMのフルフリルアルコールを含むが、酵素は含まない溶液であった。
コントロール2から5は、100mMのリン酸バッファー(pH7.2)、100μMのBSA、25μMのMeSH、25μMのCoASH、2.5μMのピリドキサールカクテル、80μMの(C1‐C6)SCFA混合物、10μMのフルフリルアルコール、および0.35μM酵素液の4つのうち1つ100μlを含むが、80μMの(C1−C6)SCFA混合物は入ってない溶液であった。
10μMフルフリルアルコールは、SPME変動性を是正するためにサンプルに加えられた。
SPMEを行うために、カルボキセン/ポリジメチルシロキサンでコートされたファイバーが使用された。
コーティングの厚さは85μmであった。
いずれの酵素も、これらのアッセイ条件下でチオエステル合成活性を実証しなかった;すなわち、基質としてSCFAを使用した、チオ酢酸メチル、チオプロピオン酸メチル、チオ酪酸メチルおよびチオ吉草酸メチルの検出可能な産生は記録されなかった。
単一のSCFAを基質として用いた追加試験もまた、同様の否定的な結果であった。
チオエステル合成がSCFA基質から検出されなかったため、精製されたTE425、TE3320、TE1875およびTE1874の、遊離の酪酸の代わりにブチリル補酵素A(以下、ブチリル‐CoA)からのMTB産生を触媒する能力を試験した。
4つのサンプル溶液を、5μMの4つのチオエステラーゼ酵素のうち1つを、0.22mMのBSA、100mMのリン酸バッファー(pH8.0)、0.03mMのブチリル‐CoAおよび0.03mMのMeSHを含む溶液に加えることにより、調製した。
コントロール7は、0.22mMのBSA、100mMのリン酸バッファー(pH8.0)、0.03mMのブチリル‐CoAおよび0.03mMのMeSHを含むが、酵素は含まない溶液であった。
コントロール8から11は、0.22mMのBSA、100mMのリン酸バッファー(pH8.0)および5μMの4つのチオエステラーゼ酵素を含むが、ブチリル‐CoAは含まない溶液であった。
コントロール12は、40μMのMTBだけを含む溶液であった。これはMTBのSPME検出のためのコントロールとして使用された。
10μMフルフリルアルコールは、SPME変動性を是正するためにサンプルに加えられた。
SPMEを行うために、カルボキセン/ポリジメチルシロキサンでコートされたファイバーが使用された。コーティングの厚さは、85μmであった。
コントロール7から12は118でピークを示さず、結果としてそれらのサンプルはいかなるMTBも含まないと推測される(表3)。
それぞれの酵素によって産生されたMTBの量は、サンプル中のMTBの量におおむね比例するはずであるM/Z118に対応するGCピークエリアから評価できる。すべてのピークエリアおよび対応するMTB濃度を表4に列挙した。
精製されたTE425およびTE3320の、SCFA CoA誘導体の混合物からチオエステル産物を触媒する能力を決定する。
この活性を調査するために、CoA−SCFAを2段階反応で合成した。
脂肪酸無水物の調整は、以下の方法を通して為された。
10mモルのN,N’−ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)を、50mLの乾燥四塩化炭素(CCl4)(50mL)に加えた。この溶液は、そこで150mLの乾燥CCl4に混合された20mmoleのSCFAを含有する第二の溶液に加えられた。
SCFA無水物を調製し、分離した後、30μMのC2からC8のSCFA無水物のそれぞれを30mLの氷冷水中の2.5μMピリドキサールカクテルの45μmolの分離溶液に加えた。
C2からC8のSCFA−CoAをトリクロロ酢酸(以下TCA)での沈殿によって精製し、酵素活性アッセイのため水に再懸濁した。
一旦SCFA−CoAを形成した後、異なるチオエステラーゼおよびSCFA−CoAを含むサンプルを、35μMチオエステラーゼ酵素の一つ、TE425またはTE3320のいずれかと120μMのC2からC8のSCFA−CoA混合物を、100μMのBSA、100mMリン酸バッファー(pH7.2)、25μMのMeSHおよび2.5μMのピリドキサールカクテルを含む溶液中に加えることにより調整した。
コントロール13は、120μMのC2からC8のSCFA−CoA混合物、100μMのBSA、100mMのリン酸バッファー(pH7.2)、25μMのメタンチオールおよび2.5μMのピリドキサールカクテルを含むが、酵素は含まない溶液であった。
コントロール14から15は、35μMチオエステラーゼ酵素の一つ、TE425またはTE3320のいずれか、100μMのBSA、100mMのリン酸バッファー(pH7.2)、25μMのメタンチオールおよび2.5μMのピリドキサールカクテルを含むが、C2からC8のSCFA−CoA混合物は含まない溶液であった。
10μMフルフリルアルコールは、SPME変動性を是正するためにサンプルに加えられた。
SPMEファイバーに吸収されたまたはコートされた分析物は、選択された時間間隔でGC−MSによって分析された。
TE3320はMTBおよびMTV形成(C4,C5)の活性ピークを示し;ブチリルおよびバレリル−CoAが好ましい基質であることを示唆する。一方、TE425はMTH形成にわずかなピークを与え、ヘキサノイルCoA(C6)がその主要な基質であり得ることを示す。
試験サンプルを、0.35μMのTE3320を含む溶液100μLを、100mMのリン酸バッファー(pH7.2)、100mMのBSA、25μMのメタンチオール、2.5μM ピリドキサールカクテルおよび4.16μMのアセチル−CoA(C2)、プロピオニル−CoA(C3)、ブチリル−CoA(C4)、バレリル−CoA(C5)ヘキサノイル−CoA(C6)、およびオクタノイル−CoA(C8)をそれぞれ含む溶液に加えることで調整した。
二つのコントロールサンプルも調製した。
コントロール17は、0.35μMのTE3320を含む溶液100μL、100mMのリン酸バッファー(pH7.2)、100mMのBSA、25μMのメタンチオールおよび2.5μMのピリドキサールカクテルを含むが、CoA−SFCA誘導体は含まない溶液であった。。
10μMフルフリルアルコールは、SPME変動性を是正するためにサンプルに加えられた。
SPMEを行うために、カルボキセン/ポリジメチルシロキサンでコートされたファイバーが使用された。コーティングの厚さは85μmであった。
SPMEファイバーに吸収されたまたはコートされた分析物を、GC−MSを用いて分析した。
この結果はチオエステルが形成されたことおよびTE3320が適切な基質から様々なチオエステルを形成する能力を有するチオエステラーゼであることを証明する。
9.3および10.2分におけるそれぞれm/z値118および132のより大きなピークエリアサイズは、TE3320がC4およびC5基質に選択性を有することを示し得る。
B.linensまたはcorynebacterum属菌の他の種におけるTE425、TE3320、TE1875およびTE1874の過剰発現は、適したプラスミドベクターの中に本発明のヌクレオチド配列を挿入し、該ベクターで宿主細胞を形質転換することにより、増加した遺伝子コピー数を介して達成され得る。
適したベクターには、B.linens株ATCC9174で見出される天然のプラスミドpBLIN1に由来する、pGIV1を含む。pGIV1の特徴には、pBLIN1複製起点および隣接しているrep遺伝子、E.coliにおける複製のためのpUC複製起点、プロモーター−遺伝子構築物を挿入することができるマルチクローニング部位に隣接した置き換え可能なアンピシリン耐性遺伝子、およびB.linens宿主細胞におけるスクリーニングを促進するためのカナマイシン耐性の遺伝子を含む。
適した5’非翻訳(プロモーター)領域の例は、アセト乳酸シンターゼラージサブユニットをコードし、メチオニン付加によって強く上方制御され得る遺伝子REBL2645のすぐ上流の200bp領域、ならびに構成的に発現され得るメチオニルアミノペプチダーゼをコードする遺伝子、RBLE02060上流すぐ近くの200bp領域を含む(Cholet et al., 2007, Appl. Microbiol. Biotechnol., 74:1320-1332)。
両方とも、その5’末端にEco31I部位および、その3’末端にHindIII部位を隣接して有する。
チオエステラーゼ遺伝子フラグメントの3’末端には、HindIII部位のすぐ5’側にTGA終止コドンを含む。
それらのフラグメントは、適切なペアの制限酵素で消化され、そのあと、NotIおよびHindIIIで消化されているpBluescript(Stratagene, Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA)中に、トリプルライゲーションでライゲーションされた。RBLE02060およびREBLE2645プロモーターフラグメントは、TE1875およびTE3320遺伝子挿入物フラグメントと4対のプロモーター−遺伝子の組合せとしてライゲートされ、E.coli DH5アルファ細胞中に形質転換された。
配列確認の後、挿入物フラグメントを、B.linensシャトルベクターのpGIV1中に移転するために、NotI−HindIII制限フラグメントとして回収した。該ベクターは、NotIおよびHindIII酵素で、ポリリンカー領域で消化され、そこで、個々のプロモーター遺伝子挿入物を、ベクターにライゲートし、E.coli DH5アルファ細胞中に形質転換した。
pGIV1:TEプラスミドで形質転換されたB.linens ATCC 19391の代表的な単離物を選択し、TE425、3320、1875または1874の過剰発現は、表1に提供される配列に基づくプライマーを使用し、TE mRNA転写物のリアルタイム定量的PCR(Q−PCR)で確認し得る。かかる配列から適切なQ−PCRプライマーを設計し、関連するmRNA転写物を定量することは、十分に当業者のなす範囲内である。
他の乳酸細菌である、Lactobacillus caseiにおけるTE425、TE3320、TE1875およびTE1874の異種発現は、適したプラスミドベクター中に本発明のヌクレオチド配列を挿入し、該ベクターで宿主細胞を形質転換することにより、増加した遺伝子コピー数を介して達成され得る。
異種発現のためのチオエステラーゼ遺伝子構築物プラスミド(以下TEプラスミド)の構築は、TE遺伝子の異種発現のために適した5’非翻訳領域を含む、適したベクターを用いなければいけないということ以外は、例1に記載される方法にしたがったPCRで行われた。
pHADHにおける異種発現に適した5’非翻訳領域は、P1およびP2(表10)プライマーを使用して、推定上のリボソーム結合部位およびdhicのためのプロモーターのPCR増幅により誘導され得、285塩基対のXbaI/BglIIフラグメントを得る。TE3320またはTE1875のコーディング領域は、B71およびB72またはB73およびB74プライマーをそれぞれ使用して、B.linens ATCC9174のゲノムDNAから増幅された。
開始コドンは、BglII部位の1つ(TE3320)または2つ(TE1875)の塩基対下流であった。これら3つの制限酵素(またはSacI、下記参照)の認識部位は、TE遺伝子または、dhicプロモーター領域には存在しない。
プロモーター−TEコーディング領域構築物は、そこで、XbaIおよびBamHIで消化され、同様にXbaIおよびBamHIで消化されたpBlueScript中にライゲーションされ、E.coli DH5アルファに形質転換された。形質転換体における正しく組み立てられたプロモーター遺伝子の組合せの存在は、P1×B72(TE3320)およびP1×B74(TE1875)プライマーを用いたPCRおよび、組換えプラスミドからの挿入領域のDNA配列分析により検証された。
形質転換体における正しく組み立てられたプロモーター遺伝子の組合せの存在は、P1×B72(TE3320)およびP1×B74(TE1875)プライマーを用いたPCRおよび、組換えプラスミドからの挿入領域のDNA配列分析により検証された。
L. caseiについて、細胞を形質転換するためのいくつかの方法の一つは、定常期の細胞を2%(vol/vol)で500mLのMRSブロス(Difco, Detroit, Mich., USA)に接種し、懸濁液の600nm(A600)の吸光度が0.8に達するまで、37℃でインキュベートすることにより開始される。
pTE3320およびpTE1875形質転換体におけるプロモーター−遺伝子の組合せの忠実度は、P1×B72(TE3320)およびP1×B74(TE1875)プライマーを用いたPCRおよび、挿入領域のDNA配列分析により検証された。
代わりに、これらの宿主におけるTE活性は、例4に記載の方法を使用して細胞の溶解物についての酵素アッセイにより実証できる。
Claims (5)
- チオエステルを産生する方法であって、
配列番号6のアミノ酸配列、もしくは配列番号6のアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む少なくとも一つのチオエステラーゼ酵素をコードするヌクレオチド、および/または配列番号5のヌクレオチド配列、もしくは配列番号5のヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むヌクレオチド、を含むベクターで少なくとも一つの宿主細胞を形質転換すること、
該宿主細胞とC1‐C8のSCFA‐CoAを含む少なくとも一つの適した基質とを接触させること、
混合物をインキュベートすること、
チオエステルを含む粗生成物を単離すること、および
粗生成物を精製してチオエステルのみを得ること
を含む、前記方法。 - 請求項1に従ってチオエステルを産生するためのキットの使用であって、前記キットが、
配列番号6のアミノ酸配列、もしくは配列番号6のアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む少なくとも一つのチオエステラーゼ酵素をコードするヌクレオチド、および/または配列番号5のヌクレオチド配列、もしくは配列番号5のヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むヌクレオチド、を含むベクターで形質転換された少なくとも一つの宿主細胞、および
C1‐C8のSCFA‐CoAを含む少なくとも一つの適した基質
を含む、前記使用。 - チーズにフレーバー付与する方法であって、前記方法が、
チーズの製造プロセスの間に、配列番号6のアミノ酸配列、もしくは配列番号6のアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む少なくとも一つのチオエステラーゼ酵素をコードするヌクレオチド、および/または配列番号5のヌクレオチド配列、もしくは配列番号5のヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むヌクレオチド、を含むベクターで形質転換された少なくとも一つの宿主細胞をチーズに加えること
を含み、前記宿主細胞が、C1‐C8のSCFA‐CoAを含む少なくとも一つの適した基質と接触させられる、前記方法。 - 宿主細胞が、種培養の一部として加えられる、請求項3に記載の方法。
- 請求項3または4に記載の方法により得られるまたは生産される、フレーバー付与されたチーズ製品、またはチーズのフレーバーが付与された製品の使用。
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