CN103153085B - 硫酯酶及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了编码硫酯酶的核苷酸序列、用于产生它们的方法、它们在形成硫酯的方法中的用途和它们在用于能够产生所述硫酯酶的其他野生型细菌的方法中的用途。另外，公开了包含由本发明所公开方法产生的硫酯的组合物。

Description

硫酯酶及其用途
技术领域
公开了编码硫酯酶的核苷酸序列、产生它们的方法、它们在形成硫酯的方法中的用途。
背景
对于干酪、蔬菜、肉和咖啡产品等而言，硫酯是重要调味化合物。特别有用的硫酯包括但不限于硫代丁酸甲酯(下文称作“MTB”)、硫代乙酸甲酯(下文称作“MTA”)和硫代丙酸甲酯(下文称作“MTP”)。
可以合成地产生硫酯。然而，因为食品趋势和健康顾虑及福祉顾虑，对于从天然产物直接获得或通过生物学过程产的调味化合物(如硫酯)存在特殊需要。这类化合物的一个特殊优点是，可以将它们称作“天然”的并且可能在消费产品上这样标注。
已知多种细菌在发酵期间产生硫酯。然而，这些现有过程的产量和产物比率难以影响。
因此，将有益的是，开发更可预测和可能在经济上更有可行性的产生硫酯的方法，所述硫酯可能用于消费产品中并且标注为“天然的”。
详述
申请人现在已经鉴定编码硫酯酶的核苷酸序列。
这项研究结果使这些核苷酸序列能够用于以下方法中，其中所述方法能够高效地产生可以添加至消费产品并标记为“天然”的硫酯。另外，这些核苷酸序列可以用于鉴定能够形成硫酯的其他野生型细菌的筛选方法中。
根据第一个说明性实施方案，提供了编码具有硫酯酶活性的酶的核苷酸序列，所述核苷酸序列包含SEQ.ID.No.1、3、5和7中所公开的核苷酸序列或其功能等同物。
不限于并且仅以说明的方式，这些核酸可以从属于短杆菌属(Brevibacterium)家族的细菌分离。根据某些实施方案，这些核酸可以从属于扩展短杆菌(Brevibacterium linens)物种的细菌分离，一个非限制性实例是美国典型培养物保藏中心(下文称作ATCC)菌株9174(BL2)。
核苷酸序列的功能等同物包括这些核苷酸序列，其因遗传密码的简并性而拥有与本文中公开的那些核苷酸序列不同的核苷酸序列，但是编码具有相同活性的相同氨基酸序列。
功能等同物包括本文所述序列的天然存在变体以及合成核苷酸序列，例如，通过化学合成或天然存在的DNA重组所获得的那些核苷酸序列。功能等同物可以是天然或合成性置换、添加、缺失、替换或插入一个或多个核苷酸的结果。
功能等同物的实例包括这些核酸序列，它们包含因不导致多肽活性的改变并因此可以在功能上视为中性的至少一个保守氨基酸置换而产生的有义突变。
提供功能相似氨基酸的保守性置换表是本领域熟知的。例如，选择保守性置换的一个示例性指导包括(原始残基跟随示例性置换)：ala/gly或ser；arg/lys；asn/gln或his；asp/glu；cys/ser；gln/asn；gly/asp；gly/ala或pro；his/asn或gln；ile/leu或val；leu/ile或val；lys/arg或gln或glu；met/leu或tyr或ile；phe/met或leu或tyr；ser/thr；thr/ser；trp/tyr；tyr/trp或phe；val/ile或leu。替代的示例性指导使用以下6个组，每个组含有彼此互为保守性置换的氨基酸：1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(1)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；和6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。另一个的示例性指导是允许全部带电荷的氨基酸彼此作为保守性置换，无论它们是否带正电荷或带负电荷。
在编码序列中改变、添加或缺失单个氨基酸或小百分比(例如至多到26%、至多到20%、至多到10%或至多到5%)的氨基酸的单个置换、缺失或添加还视为功能等同物。
功能等同物的其他非限制性的实例包括片段、直向同源物、剪接变体、单核苷酸多态性和等位变体。
这类功能等同物将与本文中公开的核苷酸序列具有60%、75%、80%、90%、95%或更大的同源性。
核苷酸序列同源性可以通过序列同一性或通过杂交确定。
序列同一性可以使用基本局部比对搜索工具技术(下文称作BLAST)确定。BLAST技术是由可在http://www.ncbi.nlm.nih.gov获得的程序blastn使用的启发式检索算法。
如果通过杂交确定同源性，则应当将这些核苷酸序列视为基本上同源的，前提是它们能够选择性地杂交至本文中公开的核苷酸序列。
杂交应当在严格杂交条件下在42°C的温度在由50%甲酰胺、5x标准柠檬酸钠(下文称作SSC)和1%十二烷基硫酸钠(下文称作SDS)组成的溶液中实施。洗涤可以在65°C在0.2xSSC和0.1%SDS的溶液中实施。
背景杂交可能因为其他核苷酸序列存在于例如cDNA中而发生。小于随靶DNA所观察到的特异性相互作用的强度10倍的任何信号应当视为背景。可以测量相互作用的强度，例如，通过将探针例如用32P进行放射标记。
核苷酸序列也可以包含以下项中的一个或多个：合适的5'非翻译区、能够实现在适宜的宿主细胞中表达的启动子、合适的3'非翻译区、终止密码子和标签。
标签的非限制性实例包括但不限于膜输出标签和用于硫酯酶检测的标签，包括但不限于His标签、谷胱甘肽-S-转移酶标签(GST)。
5'非翻译区可以包含影响转录或翻译效率的其他操纵基因或基序。3'非翻译区可以包含其他信号如用于转录性终止的信号。
影响转录或翻译的操纵基因或基序的非限制性实例包括但不限于使转录物高效多聚腺苷酸化所需的信号、核糖体结合位点、识别位点例如EcoR1。
根据所讨论的宿主细胞和所需的结果，选择合适的5'和3'非翻译区、标签、终止密码子和影响转录或翻译的操纵基因或基序完全在本领域技术人员的能力范围内。在本文所包括的实施例中给出非限制性实例。
在SEQ.ID.No.1、3、5和7中所公开的核苷酸序列或其功能等同物可以用来产生包含SEQ.ID.No.2、4、6和8中所公开的氨基酸序列或其功能等同物的硫酯酶。
可以通过充分建立的克隆技术实现具有硫酯酶活性的酶的表达，其中所述酶包含SEQ.ID.No.2、4、6和8中所公开的氨基酸序列或其功能等同物中的一个或多个。
根据另一个说明性实施方案，提供了用SEQ.ID.No.1、3、5和7中所公开的核苷酸序列或其功能等同物中的一个或多个转染的宿主细胞。这类宿主细胞能够表达具有硫酯酶活性的酶，其中所述酶包含SEQ.ID.No.2、4、6和8中所公开的氨基酸序列或其功能等同物中的一个或多个。
合适的宿主细胞包括细菌、真菌、植物或动物源的原核生物和真核细胞。
根据一个说明性实施方案，细胞是细菌细胞或真菌细胞。
在另一个说明性实施方案中，细胞选自以下一种或多种：大肠杆菌(Escherichia coli)、短杆菌属(Brevibacterium)、棒状杆菌属(Cornynebacterium)、节杆菌属(Arthrobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)、诺卡菌属(Nocardia)、甲基杆菌属(Methylobacteri)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、链球菌属(Streptococcus)、片球菌属(Pediococcus)、酒球菌属(Oenococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、魏斯氏菌属(Weisella)、肉食杆菌属(Carnobacterium)和四体球菌属(Tetragenococcus)。丙酸杆菌属物种(Proprionibacterium sp.)、双歧杆菌属某些物种(Bifidobacteriumspp.)、肠球菌属某些物种(Enterococcus spp.)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、节杆菌属物种(Arthrobacter sp.)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)和马胃葡萄球菌(Staphylococcusequorum)。白地霉(Geotrichum candidum)、解脂耶罗维亚酵母(Yarrowia lipolytica)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。
如本领域熟知，宿主细胞可以用核苷酸序列或其功能等同物瞬时或稳定转染。
可以使用将核苷酸序列导入宿主细胞的任何已知方法。仅需要所用的具体基因工程方法能够成功地将所需的核苷酸序列或其功能等同物导入能够表达所需的氨基酸序列或其功能等同物的宿主细胞中。这些方法可以包括将克隆的基因组DNA、cDNA、合成性DNA或其他外来遗传物质导入宿主细胞中，并且包括使用磷酸钙转染法、polybrene(溴化己二甲胺)、原生质体融合、电穿孔、脂质体、微量注射、表达载体等。
包含SEQ.ID.No.1、3、5和7中所公开的至少一个核酸序列或其功能等同物的表达载体，作为独立表达载体或作为表达载体文库表达载体，均可以通过多种常规技术导入细胞的基因组、细胞的细胞质或细胞的胞核中并且在其中表达。
选择合适的技术完全在本领域技术人员的能力范围内。
根据一个说明性实施方案，表达载体可以用来用SEQ.ID.No.1、3、5和7中所公开的核苷酸序列或其功能等同物转染宿主细胞。
在本发明的另一个方面，提供了包含SEQ.ID.No.1、3、5和7中所公开的核苷酸序列或其功能等同物的载体。
可以使用任何适合的表达载体。载体类型的非限制性实例包括噬菌体、质粒或粘粒DNA表达载体；病毒表达载体或细菌表达载体。
根据所讨论的宿主细胞和所需的结果，选择合适的表达载体完全在本领域技术人员的能力范围内。
在一个说明性实施方案中，载体选自pBL、pET-22b(+)、Pgem-5z、pGIV1。
在转染后，可以使用本领域熟知的标准培养条件培养转染的细胞。
技术人员将显而易见，不同的细胞需要不同的培养条件，包括适宜的温度和细胞培养基。根据所讨论的宿主细胞和所需的最终结果，决定培养条件完全在本领域技术人员的能力范围内。
在另一个方面，提供了产生具有硫酯酶活性的酶的方法，所述酶包含SEQ.ID.No.2、4、6和8中所公开的氨基酸序列或其功能等同物中的一个或多个，所述方法包括将包含SEQ.ID.No.1、3、5和7中所公开的核苷酸序列或其功能等同物的核苷酸序列插入载体中；用所述载体转化宿主细胞并在合适的培养基中培育转化的宿主细胞。
如上文所述，技术人员将显而易见，不同的细胞需要不同的培养条件，包括适宜的温度和细胞培养基。根据所讨论的宿主细胞和所需的最终结果，决定培养条件完全在本领域技术人员的能力范围内。
关于某些细胞的适宜培养基和条件的信息，可以在美国典型培养物保藏中心(ATCC)网站：
http://www.lgcstandards-atcc.org/Home/tabid/477/Default.aspx上找到。
在一个具体的说明性实施方案中，所用的细胞是短杆菌细胞、棒状杆菌细胞或大肠杆菌细胞并且培养基是基于乳制品或乳清的。
在另一个具体的说明性实施方案中，所用的细胞是短杆菌细胞、棒状杆菌细胞或大肠杆菌细胞并且培养基选自胰酪胨-大豆、deMan-Rogosa-Sharpe(MRS)、Elliker's、M17、营养培养液或LB培养基。细胞在37°C孵育过夜。
为了增加硫酯酶的产量，SEQ.ID.No.1、3、5和7中所公开的核苷酸序列或其功能等同物可以通过将它们置于强组成型启动子控制下进行过量表达。
根据所讨论的宿主细胞和所讨论的载体，选择合适的组成型启动子完全在本领域技术人员的能力范围内。
如果需要包含SEQ.ID.No.2、4、6和8中所公开的氨基酸序列或其功能等同物的硫酯酶，则可以使用本领域熟知的方法从培养基分离。
包含SEQ.ID.No.2、4、6和8中所公开的氨基酸序列或其功能等同物中至少之一的分离的硫酯酶或包含SEQ.ID.No.1、3、5和7中所公开的核苷酸序列或其功能等同物中至少之一的转染的宿主细胞可以用来产生硫酯。
在另一个方面，提供包括一种产生硫酯的方法，包括使包含SEQ.ID.No.2、4、6和8中所公开的至少一个氨基酸序列或其功能等同物的至少一种硫酯酶和/或包含SEQ.ID.No.1、3、5和7中所公开的至少一个核苷酸序列或其功能等同物的至少一种宿主细胞与至少一种合适的底物接触，孵育所述混合物，分离含有硫酯的粗产物并且纯化所述粗产物以便仅获得硫酯。
孵育可以在20℃至40℃的温度，以4至9的pH实施范围从1至100小时的时间。
在一个说明性实施方案中，孵育可以在25℃至38℃的温度，以6至8的pH实施范围从1至72小时的时间。
短链脂肪酸辅酶A衍生物已经由申请人发现是包含SEQ.ID.No.2、4、6和8中所公开的至少一个氨基酸序列或其功能等同物的硫酯酶的合适底物。
在一个说明性实施方案中，合适的底物包含短链脂肪酸辅酶A(SCFA-CoA)。
在另一个说明性实施方案中，合适的底物包括C1-C8SCFA-CoA。
本发明的转染的宿主细胞和/或酶可以在运动或固定的形式下使用。
在一个说明性实施方案中，这种酶和/或宿主细胞以固定的形式使用。
任何纯化技术可以用来纯化粗产物并且决定采用这样的技术完全在本领域技术人员的能力范围。纯化技术的非限制性实例包括：亲和纯化、离心、层析。
在本发明的另一个方面，提供通过如本文所述的方法可获得或产生的硫酯。
在另一个方面提供一种用于产生硫酯的试剂盒，所述试剂盒包括至少一种硫酯酶和/或至少一种宿主细胞，所述硫酯酶包含SEQ.ID.No.2、4、6和8中所公开的至少一个氨基酸序列或其功能等同物，所述宿主细胞包含SEQ.ID.No.1、3、5和7中所公开的至少一个核苷酸序列或其功能等同物，和至少一种合适的底物。
这种试剂盒可以用来实施如本文所公开的用于产生硫酯的方法。
在一个说明性实施方案中，合适的底物包含短链脂肪酸辅酶A(SCFA-CoA)。
在另一个说明性实施方案中，合适的底物包括C1-C8SCFA-CoA。
C1-C8SCFA-CoA底物可以按0.01μM-500μM、0.01μM-200μM、0.01μM-50μM的浓度提供。
已知干酪中存在的硫酯的量和比率影响其风味。硫酯由干酪中存在的微生物在其制造和成熟期间产生。经常将这些微生物添加至干酪作为起子培养物。
在另一个方面，提供一种对干酪调味的方法，其包括在干酪制造过程期间向其添加至少一种硫酯酶和/或至少一种宿主细胞，所述硫酯酶包含在序列ID编号2、4、6和8中所公开的至少一个氨基酸序列或其功能等同物，所述宿主细胞包含在序列ID编号1、3、5和7中所公开的至少一个核苷酸序列或其功能等同物。
在一个说明性实施方案中，将硫酯酶和/或宿主细胞作为起子培养物的部分添加。
在另一个说明性实施方案中，将硫酯酶和/或宿主细胞作为添加至乳的起子培养物的部分添加。
在另一个方面，提供根据本文以上限定的方法可获得或产生的干酪产品。
在SEQ.ID.No.1、3、5和7中所公开的核苷酸序列或其功能等同物可以用来筛选和鉴定野生型生物，其中所述野生型生物含有编码硫酯酶的基因，所述硫酯酶由SEQ.ID.No.2、4、6和8中所公开的氨基酸序列或其功能等同物编码。
在另一个方面提供在SEQ.ID.No.1、3、5和7中所公开的核苷酸序列或其功能等同物作为筛选方法中标记的用途，其中所述方法筛选能够产生硫酯酶的野生型生物，所述硫酯酶由SEQ.ID.No.2、4、6和8中所公开的氨基酸序列或其功能等同物编码。
在另一个方面提供一种鉴定能够产生硫酯酶的生物的方法，所述硫酯酶由SEQ.ID.No.2、4、6和8中所公开的氨基酸序列或其功能等同物编码，所述方法包括使用SEQ.ID.No.1、3、5和7中所公开的核苷酸序列或其功能等同物作为筛选方法中的标记。
这种方法中鉴定的生物可以是任何原核和真核生物。
在一个说明性实施方案中，生物是野生型生物。
可以使用任何已知的筛选方法。熟知筛选方法的实例包括但不限于，计算机驱动的公共序列数据库的核苷酸或蛋白质同源性检索法、通过高通量测序的核苷酸筛选法和聚合酶链反应(PCR)筛选。
可以分离和纯化通过本文中公开的方法形成的硫酯用作许多组合物和消费产品中的调味化合物。
在另一个方面，提供了包含通过本文中所述的方法所获得或产生的至少一种硫酯的组合物。
在另一个方面提供一种产生或调节组合物的风味的方法，所述方法包括向所述组合物添加如本文中公开那样所形成的至少一种硫酯。
这些硫酯可以在净形式下或在溶剂中存在或添加至组合物中，或它们可以首先例如通过用包埋材料(例如聚合物、胶囊、微胶囊、纳米胶囊、脂质体、前体、成膜物质、吸收剂)，例如通过使用碳沸石、环状寡糖及其混合物包埋加以修饰，或它们可以与适合在施加外源刺激如光、酶等时释放硫酯的基材化学地结合。
一个类型的硫酯可以是组合物的单一调味组分。可选地，可以组合使用多个类型的硫酯。
组合物可以额外地包含其他调味成分和赋形剂，例如香料组合物中常规使用的载体材料。
所述其他调味成分包括但不限于天然香料、人工香料、香辛料、调料等。示例性调味成分包括合成香料油和调味芳香物质和/或油、油树脂(oleoresin)、精油、源自植物、叶、花、果实等的馏出液和提取物和包含前述至少一种的组合。
其他调味成分的其他实施例可以在National Academy ofSciences，"Chemicals Used in Food Processing(食品加工中的化学品)"，1274出版，第63-258页中找到。
香料组合物中常规使用的所述赋形剂包括但不限于溶剂(包括水、醇、乙醇、油、脂肪、植物油和miglyol)、粘合剂、稀释剂、崩解剂、润滑剂、增味剂、着色剂、防腐剂、抗氧化剂、乳化剂、稳定剂、风味增进剂(flavour-enhancer)、抗结块剂等。
香料组合物中常规使用的调味成分和赋形剂的其他实施例可以在“Perfume and Flavour Materials of Natural Origin(天然来源的香料和香料物质)”,S.Arctander编著,Elizabeth,N.J.,1960；引自“Perfumeand Flavour Chemicals(香料和香料化学品)”,S.Arctander编著,第I和第II卷,Allured Publishing Corporation,Carol Stream,USA,1994；引自“Flavourings(香料)”,E.Ziegler和H.Ziegler(编著),Wiley-VCHWeinheim,1998和“CTFA Cosmetic Ingredient Handbook(CTFA化妆品成分手册)”,J.M.Nikitakis(编著),第1版,The Cosmetic,Toiletryand Fragrance Association(美国化妆品与香料协会),Inc.,Washington,1988.中找到。
香料组合物的其他合适且合乎需要的成分在标准文件如“Handbook of Industrial Chemical Additives(工业化学品添加物手册)”,M.和I.Ash,第2版,(Synapse 2000)中描述。
如本文中公开那样形成的硫酯可以在组合物中以至多到100%的浓度使用。根据某些实施方案，硫酯可以以范围约0.01%至约99%的浓度包含在组合物中。根据其他实施方案，硫酯可以以范围约1%至约99%的浓度包含在组合物中。
在另一个方面，提供一种产生、增强或调节消费产品的风味的方法，所述方法包括向所述消费产品添加如本文中公开那样所形成的至少一种硫酯。
如本文中公开那样形成的硫酯或含有如本文中公开那样的至少一种硫酯的组合物可以通过使用将所述硫酯或组合物直接混入消费产品的常规技术，添加至消费产品。
如本文中公开那样形成的硫酯可以向消费产品添加的量可以在宽范围内变动，并且特别取决于消费产品的性质、取决于所需的效果、向消费产品添加如本文中公开那样形成的硫酯的目的，例如增强或产生味觉，并且取决于消费产品中所包含的任何其他组分(例如其他香料成分)的性质和量。根据所需的最终用途和效果，决定并入消费产品中的如本文中公开那样形成的硫酯的合适量完全在本领域技术人员的能力范围内。
基于消费产品重量以重量ppm计，如本文中公开那样形成的硫酯的常见非限制性浓度是约500ppm至约0.01ppm，更具体地约250ppm至约0.01ppm，仍更具体地约100ppm至约1ppm。
在另一个方面，提供了包含通过本文中所述的方法所获得或产生的至少一种硫酯的消费产品。
如本文所用的术语“消费产品”意指意在置于口腔中并摄取或已在口中使用并随后抛弃的任何产品。合适的消费产品包括但不限于酱汁、调味品、全部类型的食品原料、糖食产品，焙烘产品、甜品、美味产品，包括调味肉和肉产品和调味蔬菜和蔬菜产品、乳产品、饮料、口腔护理产品和其组合。
示例性食品原料包括但不限于冷藏点心、甜点心和开胃点心、水果点心、薯片/薯条(chips/crisp)、膨化小吃、墨西哥圆饼/玉米片、爆米花、椒盐卷饼、坚果、其他甜点心和开胃点心、点心棒、燕麦棒、早餐棒、能量棒、水果棒、其他点心棒、代餐产品、瘦身产品、康复期饮料、快餐、罐装快餐、冷冻快餐、干燥快餐、冷餐快餐、什锦正餐、冷冻匹萨、冷藏匹萨、汤、罐装汤、脱水汤、速食汤、冷藏汤、UHT汤、冷冻汤、面食、罐装面食、干燥面食、冷藏/新鲜面食、面条、素面条、方便面、杯装/碗装方便面、小袋装方便面、冷藏面条、点心面条、干燥食品、什锦甜点、酱汁、调味汁和调味品、芳草和香辛料、涂抹酱、果酱和蜜饯、蜜、巧克力涂抹酱、基于坚果的涂抹酱和基于酵母的涂抹酱。
示例性糖食产品包括但不限于口香糖(其包括加糖香口胶、无糖香口胶、功能性香口胶和泡泡糖)、夹心糖、巧克力和其他巧克力糖果产品、药制糖果产品、糖锭、片剂、糖果锭剂、薄荷糖、标准薄荷糖、提神薄荷糖(power mint)、奶糖、硬质糖果、硬糖(boiled candy)、呼吸和其他口腔护理膜或条(breath and other oral care film or strip)、柺杖糖、棒棒糖、橡皮糖(gummy)、冻胶糖、乳脂软糖、饴糖、硬芯糖球和软芯糖球(hard and soft panned good)、太妃糖、乳脂糖(taffy)、甘草糖(liquorice)、明胶糖、胶糖(gum drop)、冻胶糖豆(jelly bean)、牛轧糖、翻糖、一种或多种以上糖的组合和并入一种或多种以上糖的可食用组合物。
示例性焙烘产品包括但不限于曲奇饼(alfajore)、面包、包装/工业用面包、无包装/手工面包、馅饼、蛋糕、包装蛋糕、无包装/手工蛋糕、饼干、巧克力挂涂饼干、夹心饼干、注心饼干、美味饼干和薄脆饼、面包代用品。
示例性甜品包括但不限于早餐谷物食品、即食(“rte”)谷物食品、急停早餐谷物食品、薄片、muesli、其他即食谷物食品、儿童早餐谷物食品、热谷物食品。
示例性美味产品包括但不限于咸味点心(马铃薯片、炸薯片、坚果、墨西哥圆饼-烤面包(tortilla-tostada)、椒盐卷饼、干酪点心、玉米点心、马铃薯点心、即食爆米花、可微波加工的爆米花、炸猪皮、坚果、薄脆饼、薄脆饼点心、早餐谷物食品、肉、肉冻、腌肉(火腿、咸肉)、午餐肉/早餐肉(热狗、冷盘冷、香肠)、番茄产品、人造奶油、花生黄油、汤(清汤、灌装汤、奶油汤、速食汤、UHT汤)、罐装蔬菜、意大利面酱。
示例性乳产品包括但不限于、冰淇淋、速食冰淇淋(impulse icecream)、单份装乳类冰淇淋、单份装水冰淇淋、多份装乳类冰淇淋、多份装水冰淇淋、家庭装冰淇淋、家庭装乳类冰淇淋、冰淇淋甜食、大块冰淇淋、家庭装水冰淇淋、冷冻酸奶、手工冰淇淋、乳产品、乳、鲜乳/巴氏消毒乳、全脂鲜乳/巴氏消毒乳、半脱脂鲜乳/巴氏消毒乳、长货架期/UHT乳、全脂长货架期/UHT乳、半脱脂长货架期/UHT乳、无脂长货架期/UHT乳、山羊乳、炼乳/淡乳、原味炼乳/淡乳、调味、功能性和其他炼乳、调味乳饮料、仅含乳的调味乳饮料、用果汁调味的乳饮料、酸乳、酸乳饮料、发酵乳类饮料、咖啡伴侣、乳粉、调味的乳粉饮料、奶油、酸奶、原味/天然酸奶、调味酸奶、果味酸奶、益生酸奶、饮用型酸奶、标准饮料饮用型酸奶、益生性饮用型酸奶、冷藏和货架稳定的甜食、基于乳的甜食、基于大豆的甜食。
示例性饮料包括但不限于调味水、软饮料、水果饮料、基于咖啡的饮料、基于茶的饮料、基于果汁的饮料(包括水果和蔬菜)、乳基饮料、凝胶饮料、碳酸饮料或非碳酸饮料、粉状饮料、酒精饮料或无酒精饮料。
对于乳产品，尤其干酪调味的产品，硫酯是特别重要的调味成分。具体而言，为提供真实干酪风味伴随良好的香影响，需要硫酯MTB，优选地与MTA和/或MTP组合使用。
在一个说明性实施方案中，包含至少一种如本文中公开那样形成的硫酯的消费产品是干酪调味的产品。
在另一个说明性实施方案中，消费产品是干酪调味的产品，其包含如本文中公开那样形成的MTA和/或MTB和/或MTP。
序列鉴定
已经参考以下序列ID编号描述本发明：
SEQ ID NO.1-描述编码硫酯酶425的核苷酸序列。
SEQ ID NO.2-描述硫酯酶425的氨基酸序列。
SEQ ID NO.3-描述编码硫酯酶3320之一的核苷酸序列。
SEQ ID NO.4-描述硫酯酶3320的氨基酸序列。
SEQ ID NO.5-描述编码硫酯酶1875的核苷酸序列。
SEQ ID NO.6-描述硫酯酶1875的氨基酸序列。
SEQ ID NO.7-描述编码硫酯酶1874的核苷酸序列。
SEQ ID NO.8-描述硫酯酶1874的氨基酸序列。
阐述以下实施例以进一步详细描述本发明和显示所公开的方法和产物。然而，这些实施例不应当以任何方式解释为限制性的。
实施例
实施例1–克隆硫酯酶基因用于蛋白质表达
使用聚合酶链反应(PCR)，以基因特异性引物(表1)，通过扩增从扩展短杆菌菌株ATCC9174获得硫酯酶(下文称作TE)TE 0425、TE1875、TE 3320和TE 1874的DNA序列。
引物包括允许基因定向克隆于pET-22b(+)载体(Novagen)中的限制性位点，同时避开在待克隆的基因内部的位点。5'引物包括XbaI位点，后接序列AGGAGGATTAACATATG，此序列提供强力大肠杆菌核糖体结合位点和ATG起始密码子。在ATG密码子后，每条5'引物包括14-20个碱基的符合可读框的基因特异性序列，其始于编码特定蛋白质的可读框的第二密码子的第一碱基。
3'引物包括SalI或XhoI位点和与除天然终止密码子之外的特定可读框的17-23碱基3'序列相对应的基因特异性序列。
pET-22b(+)载体由Novagen设计成在大肠杆菌中提供诱导型表达并通过并入已表达蛋白质中的多组氨酸结构域与镍柱的结合而纯化蛋白质。将克隆至这个载体中的基因转录设计成需要添加诱导物IPTG，并且出于本发明中所概述的目的，完全根据制造商的推荐使用pET-22b(+)载体系统。
为基因表达，使用大肠杆菌BL21(DE3)宿主细胞，其表达所用pET-22b(+)载体需要的T7RNA聚合酶。
将所得到的基因特异性XbaI至SalI或XhoI片段克隆至pET-22b(+)载体，产生以下可读框，其具有编码C端His标签结构域的符合可读框的序列和来自载体主链的终止密码子。
表1．用来克隆TE基因至pET-22b(+)载体中的基因特异性引物
用具有校对功能的Pwo和Taq聚合酶的混合物(Expand 20kbplusPCR系统，Roche Diagnostics GmbH)对硫酯酶基因进行聚合酶链反应(PCR)扩增后，使用pGEMT载体系统I克隆试剂盒(PromegaCorporation)，将PCR产物在不作限制酶切消化的情况下克隆至pGEM-5Z载体中。
与载体DNA连接并电穿孔后，在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板上选择带有推定性基因插入物的大肠杆菌DH5α转化体克隆。pGEM-5Z克隆法允许使用蓝/白β-半乳糖苷酶基因失活筛选法初始筛选克隆的插入物。随后通过在0.8%琼脂凝胶上电泳从氨苄青霉素抗性菌落回收的质粒DNA，对转化体筛选适当大小的质粒。
在以上内容的备选方法中，在PCR引物序列中所包含的5'和3'限制性位点处进行限制酶切消化后，将PCR产物直接克隆至pET-22b(+)中。
随后用限制性酶消化来自所选择菌落的质粒DNA，以便使用消化产物的琼脂糖凝胶电泳证实存在这样的插入物DNA，其具有预测的在插入物旁侧的限制性位点和大小。使用与插入物旁侧的载体位点结合的引物，将通过这些筛选的插入物测序。对于pGEM-5Z克隆，这些引物是SP6和T7启动子引物，并且对于pET-22b(+)克隆，这些引物是T7启动子和T7终止子引物。
使用BigDye Terminator方法进行测序。在每种情况下通过基于计算机的与扩展短杆菌菌株ATCC 9174基因组序列中相应基因的完美同源性匹配，鉴定到具有预期序列的克隆。
对于最初克隆在pGEM-5Z载体中的序列，通过从制备性琼脂糖凝胶中洗脱，从适宜的限制酶切消化物回收插入物，并且随后将所述插入物转移至pET-22b(+)中并且如上文所述那样筛选。在大肠杆菌DH5α细胞中获得预期的pET-22b(+)构建体后，将质粒回收并且通过电穿孔法转化至大肠杆菌BL21(DE3)细胞中用于蛋白质表达。
实施例2–纯化克隆的硫酯酶
在实施例1中制备的大肠杆菌BL21(DE3)细胞内通过添加0.5mM IPTG至包含前述大肠杆菌细胞的分批培养物(100至250mL)，诱导蛋白质表达。
随后将大肠杆菌细胞孵育2-4小时，在此时间后，使用以商标Ni-NTA琼脂糖(Invitrogen)出售的载镍树脂在天然条件下进行加His-标签的蛋白质的纯化。
随后将孵育的大肠杆菌细胞添加至包含50mM磷酸钠(pH8.0)，20mM咪唑，0.5M NaCl缓冲液的溶液并且通过与玻璃珠一起涡旋混合加以破坏。
包含已破坏细胞的溶液随后添加至如制造商所指导那样准备的纯化柱，所述纯化柱包含1.5ml NI-NTA琼脂糖树脂。
用含有50mM咪唑的缓冲液从纯化柱提取克隆的硫酯酶蛋白。在提取后，将蛋白质进一步用250mM相同的缓冲液洗脱。
提取的蛋白质随后在4°C对50mM TrisHCl缓冲液(pH8.0)透析。在整个过程期间更换4次缓冲液。
随后，使用3K Amicon Ultra-4管柱(Millipore,Inc.,Billerica,MA)，如制造商所指导那样使用，浓缩每种硫酯酶蛋白。
使用微量Lowry试剂盒，如试剂盒供应商(Sigma)所指导那样使用，测定每种单独硫酯酶蛋白的浓度。
实施例3–SFCA作为底物
测定纯化的TE 425、TE 3320、TE 1875和TE 1874从脂肪酸中产生硫酯的能力。除非另外声明，术语溶液应当解释为是水基溶液。
制备了含有10mM以下每种酸：甲酸(C1)、乙酸(C2)、丙酸(C3)、丁酸和异丁酸(C4)、戊酸与异戊酸(C5)和己酸(C6)的短链脂肪酸(下文称作SCFA)混合物。随后稀释这种混合物以产生最终总C1至C6 SCFA浓度为80μM的溶液。
分别独立稀释如实施例2中所述那样纯化的TE 425、TE 3320、TE 1875和TE 1874蛋白以产生最终酶浓度为0.35μM的独立溶液。
准备4种样品溶液，所述样品溶液包含100mM磷酸盐缓冲液(pH7.2)、100μM牛血清白蛋白(下文称作BSA)、25μM甲硫醇(下文称作MeSH)、25μM辅酶A(下文称作CoASH)、2.5μM含有等量吡哆醛-磷酸盐、吡哆胺和吡哆醛(下文称作吡哆醛混合物)的组合物、80μM上文制备的(C1-C6)SCFA混合物、10μM糠醇和100μl四种0.35μM酶溶液之一。
也制备对照样品。
对照1是包含100mM磷酸盐缓冲液(pH7.2)、100μM BSA、25μM MeSH、25μM CoASH、2.5μM吡哆醛混合物、80μM(C1-C6)SCFA混合物和10μM糠醇，但不含酶的溶液。
对照2-5是包含100mM磷酸盐缓冲液(pH7.2)，100μM BSA，25μM MeSH，25μM CoASH，2.5μM吡哆醛混合物，80μM(C1-C6)SCFA混合物，10μM糠醇和100μl四种0.35μM酶溶液之一，但不含(C1-C6)SCFA混合物的溶液。
表2中显示样品和对照的内容物。
表2.
在制备后，随后将全部样品在37°C孵育35分钟，同时实施固相微量提取(SPME)。
添加10μM糠醇至样品以校正SPME变异性。
为进行SPME，使用碳分子筛/聚二甲基硅氧烷涂覆的纤维。涂层厚度是85mμm。
随后通过气相色谱和质谱法(GC-MS)以选择的时间区间分析在SPME纤维上吸附或包覆的分析物。
在这些分析条件下没有一种酶展示硫酯合成活性；即使用SCFA混合物作为底物，没有记录到硫代乙酸甲酯，硫代丙酸甲酯，硫代丙酸丁酯和硫代戊酸甲酯的可检测产生。
采用单一SCFA作为底物的后续实验产生相似的阴性结果。
实施例4–辅酶A-SFCA衍生物作为底物
由于从SCFA底物中未检测到硫酯合成，测试纯化的TE 425、TE 3320、TE 1875和TE 1874从替代游离丁酸盐的丁酰-辅酶A(下文称作丁酰-CoA)中催化MTB产生的能力。
通过添加5μM四种硫酯酶之一至包含0.22mM BSA、100mM磷酸盐缓冲液(pH8.0)、0.03mM丁酰-CoA和0.03mM MeSH的溶液中制备4种样品溶液。
也制备6份对照样品。
对照7是包含0.22mM BSA、100mM磷酸盐缓冲液(pH8.0)、0.03mM丁酰-CoA和0.03mM MeSH，但是不含酶的溶液。
对照8至11是包含0.22mM BSA、100mM磷酸盐缓冲液(pH8.0)和5μM四种硫酯酶，但是不含丁酰-CoA的溶液。
对照12是仅包含40μM MTB的溶液。使用这种溶液作为SPME检测MTB的对照。
表3中显示样品和对照的内容物。
表3.
在制备后，全部样品在32°C孵育。在2小时孵育后，将SPME实施30分钟，在整个过程期间温度保持在32°C。这导致总孵育时间2.5小时。
添加10μM糠醇至样品以校正SPME变异性。
为进行SPME，使用碳分子筛/聚二甲基硅氧烷涂覆的纤维。涂层厚度是85μM。
使用GC-MS以选择的时间区间分析在SPME纤维上吸附或包覆的分析物。表4中显示来自这个分析的结果。
表4.通过TE酶从丁酰-CoA和MeSH中产生MTB
m/z 118峰面积 MTB浓度(μM)
对照7 0 0
对照8-11 0 0
对照12 62.02 40
样品1 TE425 2.96 1.908
样品2 TE 1874 1.56 1.006
样品3 TE 3320 11.73 7.57
样品4 TE 1875 615 3966
对照12仅含有MTB。这个对照显示MTB的预期m/z比是118。
对照7至12没有在118处显示峰并且因此可以假定这些样品不含有任何MTB(表3)。
样品1、2、3和4在118处均显示峰。这证明，在每种情况下MTB已经形成，并且因此证明TE 425、TE 3320、TE 1875和TE 1874是能够从CoA-SCFA衍生物中产生硫酯的硫酯酶。
可以从M/Z 118相应的GC峰面积估计由每种酶产生的MTB的量，所述GC峰面积应当大致与样品中MTB的量成正比。表4中列出全部峰面积和相应的MTB浓度。
实施例5–TE酶底物偏好型和产物谱
确定纯化的TE 425和TE 3320催化从SCFA CoA-衍生物的混合物中产生硫酯的能力。
为研究这种活性，CoA-SFCA在一个两步骤反应中合成。
通过以下方法进行脂肪酸酐的制备：
将10毫摩尔N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)添加至50mL无水四氯化碳(CCl4)(50mL)。随后将这种溶液添加至含有150mL无水CCl4中20毫摩尔SCFA混合物的第二溶液。
反应混合物在室温保持5小时，在此时间后，通过过滤移除二环己基脲(DCU)沉淀物。通过在降低的压力下蒸发除去沉淀物中的任何CCl4。固体残余物从丙酮中重结晶。晶体用CCl4洗涤以除去痕量的化学品。产物随后由色谱分离以产生纯的C2至C8 SCFA酐。
在已经制备和分离SCFA酐后，将30μM的C2至C8 SCFA酐的每种添加至30mL冰冷水中45μMol的2.5μM吡哆醛混合物的单独溶液。
添加碳酸氢钠至全部样品以确保在每种情况下pH是7-7.5。全部混合物均维持在冰浴中并且频繁振摇60分钟。
将C2至C8 SCFA-CoA通过用三氯乙酸(下文称作TCA)沉淀进行纯化并且重悬于水酶活性测定法中。
一旦已经形成SCFA CoA，通过添加35μM所述硫酯酶之一(TE425或TE3320)外加120μM C2至C8 SCFA-CoA混合物至含有100μMBSA、100mM磷酸盐缓冲液(pH7.2)、25μM MeSH和2.5μM吡哆醛混合物的溶液，制备包含不同硫酯酶和SFCA-CoA的样品。
也制备对照样品。
对照13是包含120μM C2至C8 SCFA-CoA混合物、100μM BSA、100mM磷酸盐缓冲液(pH7.2)、25μM甲硫醇和2.5μM吡哆醛混合物，但不含酶的溶液。
对照14至15是包含35μM所述硫酯酶之一(TE425或TE3320)、100μM BSA，100mM磷酸盐缓冲液(pH7.2)、25μM甲硫醇和2.5μM吡哆醛混合物，但不含C2至C8SCFA-CoA混合物的溶液。
表5中显示样品和对照的内容物。
表5.
全部样品在37°C孵育35分钟，随后将SPME用碳分子筛/聚二甲基硅氧烷涂覆(厚度=85um)的纤维实施是30分钟。这导致总孵育时间45分钟。
添加10μM糠醇至样品以校正SPME变异性。
通过GC-MS以选择的时间区间分析在SPME纤维上吸附或包覆的分析物。
表6中所显示的与等摩尔SCFA-CoA衍生物混合物的孵育后的结果证实TE 425和3320具有不同的底物选择性。
TE 3320显示形成MTB和MTV(C4，C5)的活性峰；提示丁酰-和戊酰-CoA是优选的底物。相反，TE 425在MTH形成产生弱峰，提示己酰-CoA(C6)可以是主要底物。
表6.TE 3320和TE 425以C 2 至C 8 SCFA-CoA混合物作为底物时的酶 活性
＊MTA，硫代乙酸甲酯；MTP，硫代丙酸甲酯；MTB，硫代丁酸甲酯；MTV，硫代戊酸甲酯；MTH，硫代己酸甲酯；MTO，硫代辛酸甲酯
实施例6-通过TE3320产生多种硫酯
通过添加包含0.35μMTE 3320的100μl溶液至包含100mM磷酸盐缓冲液(pH7.2)、100μM BSA、25μM甲硫醇、2.5μM吡哆醛混合物和4.16μM以下每种：乙酰-CoA(C2)、丙酰-CoA(C3)、丁酰-CoA(C4)、戊酰-CoA(C5)、己酰-CoA(C6)和辛酰-CoA(C8)的溶液，制备测试样品。
也制备两份对照样品。
对照16是包含100mM磷酸盐缓冲液(pH7.2)、100μM BSA、25μM甲硫醇、2.5uM吡哆醛混合物和4.16uM以下每种：乙酰-CoA C2、丙酰-CoA C3、丁酰-CoA C4、戊酰-CoA C5、己酰-CoA C6和辛酰-CoAC8；但不含酶的溶液。
对照17是包含100μl包含0.35μM TE3320的溶液、100mM磷酸盐缓冲液(pH7.2)、100μM BSA，25μM甲硫醇和2.5μM吡哆醛混合物；但不含CoA-SFCA衍生物的溶液。
表7中显示样品和对照的内容物。
表7.
样品随后在32°C孵育。在2小时孵育后，实施SPME。SPME耗时30分钟，并且在整个过程期间温度保持在32°C。这导致总孵育时间2.5小时。
添加10μM糠醇至样品以校正SPME变异性。
为进行SPME，使用碳分子筛/聚二甲基硅氧烷涂覆的纤维。涂层厚度是85μM。
随后使用GC-MS分析在SPME纤维上吸附或包覆的分析物。
表8中显示来自GC-MS分析的结果。
表8.停留时间、m/z片段选择和TE3320酶的硫酯形成活性
对照16和17均不显示对应任何硫酯产物的峰(表8)。含有TE3320酶的样品在m/z值分别为90、104、118、132、146和174时在7.9、8.6、9.3、10.2、11.12和13.32分钟处显示峰。
这个结果证明硫酯形成并且TE3320是能够从适宜底物中形成多种硫酯的硫酯酶。
可以从相应的GC峰面积中估计由TE3320产生的每种硫酯的量。每个峰对应于特定的硫酯并且每个峰的面积应当大致与样品中相应的每种硫酯的量成正比。表8中列出全部峰面积。
m/z值分别为118和132时在9.3和10.2分钟的较大峰面积尺度可以表明TE3320对C4和C5底物具有偏好性。
实施例7–过量表达扩展短杆菌硫酯酶
可以通过将本发明的核苷酸序列插入合适的质粒载体中并且用所述载体转化宿主细胞，借助增加的基因拷贝数实现TE 425、TE 3320、TE 1875和TE1874在扩展短杆菌或棒状杆菌的其他物种中的过量表达。
合适的载体包括pGIV1，其源自扩展短杆菌菌株ATCC 9174中存在的天然质粒pBLIN1。pGIV1的特征包括pBLIN1复制起点和相邻的rep基因、用于大肠杆菌中复制的pUC复制起点、侧翼分布有其中可以插入启动子-基因构建体的多克隆位点的可替换性氨苄青霉素抗性基因和促进在扩展短杆菌宿主细胞中选择的卡那霉素抗性基因。
TE 425、3320、1875和1874的启动子-基因构建体由具有影响转录或翻译效率的操纵基因或启动子基序的合适5'非翻译区外加TE编码序列组成。
合适的5'非翻译(“启动子”)区的实例包括紧邻REBL2645(一个可以通过添加Met强烈上调的编码乙酰乳酸合酶大亚基的基因)上游的200bp区域以及紧邻RBLE02060(一个可以组成型表达的编码甲硫氨酰氨基肽酶的基因)上游的200bp区域(Cholet等人,2007,Appl.Microbiol.Biotechnol.74:1320-1332)。
遵循实施例1中描述的一般PCR策略，装配启动子-基因构建体。启动子片段是200碱基对长度并且在它们的5'末端侧翼分布Not I位点并且在3'末端侧翼分布有Eco31I位点。此外，构建3'启动子引物以包括一个ATG起始密码子、一个在起始密码子上游前十个核苷酸的强核糖体结合位点(AGGAGG)和这个核糖体结合位点与起始密码子之间的‘共有’序列CCAC。AGGAGG六聚体与靠近扩展短杆菌16S核糖体RNA序列3'末端的区域互补。
硫酯酶基因片段对于TE 1875是603碱基对，并且对于TE 3320是435碱基对。这两个片段在其5'末端侧翼均分布有Eco31I位点并且在其3'末端侧翼均分布Hind III位点。硫酯酶基因片段的3'末端包含紧邻HindIII位点5'的TGA终止密码子。
这些片段用适宜的成对限制性酶消化并且随后以三重连接方式连接至已经用NotI和HindIII消化的pBluescript(Stratagene,AgilentTechnologies,Inc.,Santa Clara,CA)。RBLE02060和REBL2645启动子片段与TE 1875和TE 3320基因插入物片段以4个成对启动子-基因组合方式连接并且转化至大肠杆菌DH5α细胞中。
通过DNA序列分析证实来自有前景克隆的质粒DNA中存在正确装配的启动子-基因组合(表9)。
在序列证实后，回收插入物片段作为NotI-HindIII限制性片段以便转移至扩展短杆菌穿梭载体pGIV1中。该载体在多接头区内用中NotI和HindIII酶消化，随后将各个启动子-插入物连接至载体中并且转化至大肠杆菌DH5α细胞中。
通过DNA序列分析证实来自有前景的转化体的重组质粒DNA(pGIV1:TE质粒)中存在克隆的启动子-基因组合。随后分离质粒DNA并且使用Leret等人,1998(Microbiol.144:2827-2836)所述的操作方案，将其转化至扩展短杆菌ATCC 19391中，所述文献通过引用的方式并入本文。
选择用pGIV1:TE质粒转化的扩展短杆菌ATCC 19391的代表性分离株，并且可以使用基于表1中所提供序列的引物，通过TE mRNA转录物的实时定量PCR(Q-PCR)证实TE 425、3320、1875或1874的过量表达。从这类序列中设计适宜的Q-PCR引物并且对同族mRNA转录物定量完全在本领域技术人员的能力范围内。
表9.组合的启动子和TE基因构建体的核苷酸序列将修饰的核糖 体结合位点和起始密码子区加下划线并且以粗体字显示。
实施例8–硫酯酶的异源表达
可以通过将本发明的核苷酸序列插入合适的质粒载体中并且用所述载体转化宿主细胞，借助增加的基因拷贝数实现TE 425、TE 3320、TE 1875和TE1874在干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)或其他乳酸细菌中的异源表达。
通过PCR遵循实施例1中描述的方法构建用于异源表达的硫酯酶基因构建体质粒(下文称作TE质粒)，除了必须使用含有用于TE基因异源表达的合适5'非翻译区的合适载体之外。
合适的载体是源自干酪乳杆菌或其他乳酸细菌的那些并且可以包括但不限于pHADH，一种含有来自干酪乳杆菌ATCC 334的克隆dhic基因的质粒(Broadbent等人,2004，Appl.Environ.Microbiol.70:4814-4820)。
可以使用引物P1和P2(表10)，通过PCR扩增推定性核糖体结合位点和dhic启动子区以获得285bp XbaI/BglII片段，衍生用于pHADH中异源表达的合适5'非翻译区。使用引物B71和B72或B73和B74从扩展短杆菌ATCC9174基因组DNA中分别扩增TE 3320或TE 1875的编码区。
这些反应产生在456bp BglII/BamHI片段上的完整TE3320编码区或在609bp BglII/BamHI片段上的完整TE1875编码区。起始密码子是BglII位点下游的1个(TE3320)或2个(TE1875)碱基对。在TE基因中或在dhic启动子区中不存在这3种限制性酶(或SacI，见下文)的识别位点。
表10.用来克隆TE基因至pHADH衍生性载体中的PCR引物
*限制性核酸内切酶靶位点嵌入引物序列中以促进定向克隆。
PCR片段用BglII消化并且启动子分别与每个编码序列连接。回收连接的DNA样品并且通过采用引物组合P1/B72和P1/B74的PCR扩增检查(表10)。
启动子-TE编码区构建体随后用XbaI和BamHI消化并连接至也用XbaI和BamHI消化的pBlueScript中并且转化至大肠杆菌DH5α中。通过使用引物P1xB72(TE3320)和P1xB74(TE1875)的PCR和来自重组质粒的插入区域的DNA序列分析，验证转化体中存在正确装配的启动子-基因组合。
重组质粒用SacI和BamHI消化并且从pBlueScript载体分离启动子-编码区片段。将插入物连接至SacI/BamHI消化的pHADH中，这有效地用启动子-TE编码区替换dhic，并转化至大肠杆菌DH5α中。
通过使用引物P1xB72(TE3320)和P1xB74(TE1875)的PCR和来自重组质粒的插入区域的DNA序列分析，验证转化体中存在正确装配的启动子-基因组合。
将重组质粒pTE 3320和pTE 1875从大肠杆菌克隆中回收并且通过电穿孔转化至干酪乳杆菌ATCC 334或其他乳酸细菌中。
对于干酪乳杆菌，转化细胞的几种方法之一始于将静止期细胞以2%(vol/vol)接种至500mL MRS培养液(Difco,Detroit,Mich.,USA)中并且在37°C孵育直至悬液达到在600nm(A600)的吸光度0.8。
将细胞通过以5000xg离心收获，用无菌蒸馏水洗涤两次并悬浮于2.5mL冰冷的无菌30%聚乙二醇1450(Sigma Chemical Co.)中。将上文形成的3μl TE质粒构建体与0.2cm电穿孔小杯中的100μl细胞悬液混合并置于冰上3分钟。在设置成以下参数的Bio-Rad GenePulser(Bio-Rad Laboratories,Richmond,Calif.,USA)中输送电脉冲：2.5kV，25μF和200Ω。在电穿孔后，添加0.9mL加温(37°C)的MRS培养液并且将细胞在37°C孵育2小时。在每mL含有5μg ERY(SigmaChemical Co.,St.Louis,Mo.,USA)的MRS琼脂上收集转化的细胞。
通过在0.6%琼脂糖凝胶中采用Tris乙酸盐缓冲液(40mM Tris，20mM乙酸和2mM Na2EDTA，pH8.1)的电泳分离证实TE载体在来自推定性转化体的裂解物中存在。根据所讨论的宿主细胞，选择用于分离质粒DNA的适宜裂解方法完全在本领域技术人员的能力范围内。
通过使用引物P1xB72(TE3320)和P1xB74(TE1875)的PCR和插入区域的DNA序列分析，验证pTE 3320和pTE 1875转化体中的启动子-基因组合的忠实性。
可以使用基于同族基因序列的引物，通过TE mRNA转录物的实时定量PCR(Q-PCR)证实TE 425、3320、1875或1874的过量表达。
可选地，可以使用实施例4中描述的方法，通过细胞裂解物的酶测定法展示这些宿主中的TE活性。
尽管已经与多种说明性实施方案相关联地描述了编码硫酯酶的核苷酸序列和氨基酸序列和使用它们多种方法和并入它们的产品，但是应当理解可以使用其他相似的实施方案，或可以对所述实施方案进行修改和添加以便执行本文中所公开的相同功能而不脱离公开内容。上文描述的实施方案并不必然地处于可选状态，因为可以组合多种实施方案以提供所需的特征。因此，本公开不应当限于任何单一实施方案，反而应当以符合所附权利要求书的宽度和范围进行解释。

Claims (15)

1.一种编码具有产生硫代丁酸甲酯即MTB的硫酯酶活性的酶的分离的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列公开于SEQ.ID.No.1，或其中所述核苷酸序列编码多肽，所述多肽的氨基酸序列公开于SEQ.ID.No.2。
2.载体，其包含根据权利要求1所述的核苷酸序列。
3.宿主细胞，用根据权利要求2所述的载体转化。
4.根据权利要求3所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是细菌来源或真菌来源的。
5.产生具有产生MTB的硫酯酶活性的酶的方法，其包括：将编码具有产生硫代丁酸甲酯即MTB的硫酯酶活性的酶的分离的核苷酸序列插入表达载体中，所述核苷酸序列由SEQ.ID.No.1中所公开的核苷酸序列组成，或由编码多肽的核苷酸序列组成，所述多肽由SEQ.ID.No.2中所公开的氨基酸序列组成；用所述载体转化宿主细胞并且在合适的培养条件下培育所述转化的宿主细胞。
6.产生MTB硫酯的方法，包括使由SEQ.ID.No.2中所公开的氨基酸序列组成的硫酯酶和/或包含SEQ.ID.No.1中所公开的核苷酸序列的至少一种宿主细胞与至少一种合适的底物接触，孵育所述混合物，分离含有硫酯的粗产物并且纯化所述粗产物以便仅获得硫酯。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述底物包括C1-C8SCFA-CoA。
8.用于产生MTB硫酯的试剂盒，包括至少一种硫酯酶和/或至少一种宿主细胞，所述硫酯酶由SEQ.ID.No.2中所公开的氨基酸序列组成，所述宿主细胞包含SEQ.ID.No.1中所公开的核苷酸序列，和至少一种合适的底物。
9.对干酪调味的方法，其包括在干酪制造过程期间向其添加至少一种产生MTB的硫酯酶和/或至少一种宿主细胞，所述硫酯酶由SEQ.ID.No.2中所公开的氨基酸序列组成，所述宿主细胞包含SEQ.ID.No.1中所公开的核苷酸序列。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述硫酯酶和/或宿主细胞作为起子培养物的部分添加。
11.调味的干酪产品或干酪调味的产品，通过根据权利要求9或10所述的方法可获得或产生。
12.SEQ.ID.No.1中所公开的核苷酸序列的用途，作为筛选生物的方法中的标记物，所述生物能够产生由所述核苷酸序列编码的产生MTB的硫酯酶。
13.组合物，其包含通过根据权利要求6或7所述的方法获得或产生的MTB硫酯。
14.消费产品，其包含通过根据权利要求6或7所述的方法获得或产生的MTB硫酯。
15.根据权利要求14所述的消费产品，其中所述消费产品选自干酪调味的产品或调味的干酪产品。
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1735690A (zh) * 2002-06-21 2006-02-15 孟山都技术有限公司 硫酯酶相关核酸序列及方法

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6057103A (en) * 1995-07-18 2000-05-02 Diversa Corporation Screening for novel bioactivities
ATE336178T1 (de) * 2000-04-06 2006-09-15 Quest Int Aromatisieren von nahrungsmitteln mit verbindungen die ein mit zwei spezifischen atomen oder gruppen verbundenes schwefelatom enthalten
CA2599577A1 (en) * 2005-03-04 2006-09-14 Verenium Corporation Nucleic acids and proteins and methods for making and using them
JP2006262818A (ja) * 2005-03-25 2006-10-05 Meiji Milk Prod Co Ltd 乳酸桿菌由来の酸耐性に関わる遺伝子
JP4766341B2 (ja) * 2007-09-10 2011-09-07 独立行政法人産業技術総合研究所 新規微生物
WO2009150856A1 (ja) * 2008-06-13 2009-12-17 株式会社ヤクルト本社 酸素耐性付与遺伝子及びその利用
EP2310532B1 (en) * 2008-06-30 2014-05-07 The Washington University Methods of promoting weight loss and associated arrays
US9175234B2 (en) * 2008-12-23 2015-11-03 REG Life Sciences, LLC Methods and compositions related to thioesterase enzymes

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1735690A (zh) * 2002-06-21 2006-02-15 孟山都技术有限公司 硫酯酶相关核酸序列及方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Accession No: NZ_AAGP01000017，Brevibacterium linens BL2 BlinB01_17, whole genome shotgun sequence;DOE Joint Genome Institute;《Genbank database》;20050408;ORIGIN和FEATURES *

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