JP2024508546A - プライマー－プローブ組成物、キット、および検出方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、プライマー－プローブ組成物、キットおよび検出方法に関する。前記プライマー－プローブ組成物は群（ｉ）～（ｉｘ）の１つの群から選択され、前記キットは前記プライマー－プローブ組成物を含む。本発明によれば、患者のｅｘ ｖｉｖｏ試料中のＡＫＲ１Ｃ３ ＲＮＡ含有量を検出することができる。

Description

本発明は分子生物学的検出技術の分野に関し、特に、プライマー－プローブ組成物、キット、および検出方法に関する。

アルデヒド－ケトン還元酵素ファミリー１メンバーＣ３（ＡＫＲ１Ｃ３）は、ヒトにおいて、ＡＫＲ１Ｃ３遺伝子によってコードされる酵素である。様々な種類のがんにおいて、ＡＫＲ１Ｃ３は、タンパク質量で過剰発現される。腫瘍においてＡＫＲ１Ｃ３が高発現をすることから、化合物ＯＢＩ－３４２４（ＡＳＴ－３４２４およびＴＨ－３４２４ともいう）、ＯＢＩ－３４２３およびＯＢＩ－２８７０は腫瘍において特異的に活性化されるように設計されるが、ＡＫＲ１Ｃ３の発現が低い正常細胞においては活性化できず腫瘍特異的標的化を達成できない。化合物ＯＢＩ－３４２４は固形腫瘍および血液腫瘍を含む１４種類を超えるヒトがんを治療するために、現在、米国（ＮＣＴ０４３１５３２４およびＮＣＴ０３５９２２６４）および中国（ＣＸＨＬ１９００１３７およびＣＸＨＬ２０００２６３）において複数の第Ｉ相臨床試験で研究されている。

化合物ＯＢＩ－３４２４は、ＡＫＲ１Ｃ３によって活性化される新規プロドラッグジアルキル化剤である。研究により、化合物ＯＢＩ－３４２４の活性化はＡＫＲ１Ｃ３依存的であり、その細胞毒性および抗腫瘍効果はＡＫＲ１Ｃ３酵素の発現量と高い相関関係にあることが確認されている。化合物ＯＢＩ－３４２４は様々な種類のヒトがんにおいてｅｘ ｖｉｖｏでのＡＫＲ１Ｃ３依存的細胞毒性およびｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍活性を示しており、このことは、様々な種類のがんの治療に使用可能な抗がん剤としての化合物ＯＢＩ－３４２４のさらなる開発を支持する。ＡＫＲ１Ｃ３は、がん患者の状態を分析するためのバイオマーカーとして使用され、さらに患者が治療のために化合物ＯＢＩ－３４２４を選択するよう導く。したがって、実際の適用において、患者のｅｘ ｖｉｖｏ試料中のＡＫＲ１Ｃ３酵素含有量を検出することができ、その検出結果に従って、化合物ＯＢＩ－３４２４を治療のために患者に投与するかどうかが決定される。

従来技術では、通常、ウェスタンブロッティングまたは免疫化学染色（ＩＨＣ）を使用して患者のｅｘ ｖｉｖｏ試料中のＡＫＲ１Ｃ３酵素含有量を検出している。参考文献（Ｈａｒｖｅｙ Ｄ Ｊ，Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ Ｒ Ｓ，Ｄａｃｈｓ Ｇ Ｕ，ｅｔ ａｌ．、「生体還元性プロドラッグＰＲ－１０４Ａは好気条件下でヒトアルド－ケトレダクターゼ１Ｃ３によって活性化される」［Ｊ］Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１０，７０（４）：１５７３）には、２７００個の腫瘍組織試料を計数し、ＩＨＣ法によって分析したところ、ＡＫＲ１Ｃ３酵素は肝臓がん、胃がん、食道がん、膀胱がんにおいては発現量が高かったのに対し、小細胞肺がん、乳がん、白血病、前立腺がんにおいては発現量が低かったことが記載されている。したがって、ＩＨＣ法を使用して、固形腫瘍組織試料中のＡＫＲ１Ｃ３酵素の発現量を検出することは理論的に実現可能である。

しかしながら、がんまたは腫瘍には多くの種類があるが、固形腫瘍以外の血液がん（白血病）の患者は組織試料を提供することができないため、ウェスタンブロッティングまたは免疫化学染色を直接使用して血液がん（白血病）試料中のＡＫＲ１Ｃ３酵素の発現量を検出することは不可能である。

本出願人の研究開発チームは、異なる固形がん細胞のＡＫＲ１Ｃ３酵素の発現量およびＡＫＲ１Ｃ３ ＲＮＡ含有量ががん細胞増殖に対するＡＳＴ－３４２４阻害のＩＣ_５０値と有意に相関し、異なる血液がん細胞株のＡＫＲ１Ｃ３酵素の発現量およびＡＫＲ１Ｃ３ ＲＮＡ含有量ががん細胞増殖に対するＡＳＴ－３４２４阻害のＩＣ_５０値と有意に相関することを見出した。したがって、ＡＲＫＲ１Ｃ３ＲＮＡ含有量を検出することによって酵素含有量も予測または特徴付けることができるため、薬剤投与の指針とすることができる。

しかしながら、従来技術には、ＡＫＲ１Ｃ３ ＲＮＡ含有量を検出するための対応する検出方法はない。対応する検出方法を用いてＡＫＲ１Ｃ３ ＲＮＡ含有量を評価することができると仮定すると、ＡＫＲ１Ｃ３ ＲＮＡ含有量がより高く、プロドラッグに最も反応する可能性が高い患者に、より良好ながん治療効果を達成するために化合物ＯＢＩ－３４２４を投与するように選択することができる。

そこで、本発明はプライマー－プローブ組成物、キットおよび検出方法を提供し、前記プライマー－プローブ組成物、前記キットおよび前記検出方法を用いて、患者のｅｘ ｖｉｖｏ試料中のＡＫＲ１Ｃ３ ＲＮＡ含有量を高確度で、高分析特異的に、精密に、かつ検出限界低く検出することを目的とする。

上記目的のために、本発明の第１の態様は、
（ｉ）それらのヌクレオチド配列がそれぞれ配列番号１、配列番号２および配列番号３で示される上流プライマーＡＫＲ１Ｃ３－Ｆ１、下流プライマーＡＫＲ１Ｃ３－Ｒ１およびプローブＡＫＲ１Ｃ３－Ｐ１と、
（ｉｉ）それらのヌクレオチド配列がそれぞれ配列番号４、配列番号５および配列番号３で示される上流プライマーＡＫＲ１Ｃ３－Ｆ２、下流プライマーＡＫＲ１Ｃ３－Ｒ２およびプローブＡＫＲ１Ｃ３－Ｐ１と、
（ｉｉｉ）それらのヌクレオチド配列がそれぞれ配列番号４、配列番号６および配列番号３で示される上流プライマーＡＫＲ１Ｃ３－Ｆ２、下流プライマーＡＫＲ１Ｃ３－Ｒ６およびプローブＡＫＲ１Ｃ３－Ｐ１と、
（ｉｖ）それらのヌクレオチド配列がそれぞれ配列番号７、配列番号５および配列番号３で示される上流プライマーＡＫＲ１Ｃ３－Ｆ６、下流プライマーＡＫＲ１Ｃ３－Ｒ２およびプローブＡＫＲ１Ｃ３－Ｐ１と、
（ｖ）それらのヌクレオチド配列がそれぞれ配列番号７、配列番号６および配列番号３で示される上流プライマーＡＫＲ１Ｃ３－Ｆ６、下流プライマーＡＫＲ１Ｃ３－Ｒ６およびプローブＡＫＲ１Ｃ３－Ｐ１と、
（ｖｉ）それらのヌクレオチド配列がそれぞれ配列番号８、配列番号９および配列番号１０で示される上流プライマーＡＫＲ１Ｃ３－Ｆ５、下流プライマーＡＫＲ１Ｃ３－Ｒ５およびプローブＡＫＲ１Ｃ３－Ｐ２と、
（ｖｉｉ）それらのヌクレオチド配列がそれぞれ配列番号１１、配列番号１２および配列番号３で示される上流プライマーＡＫＲ１Ｃ３－Ｆ３、下流プライマーＡＫＲ１Ｃ３－Ｒ３およびプローブＡＫＲ１Ｃ３－Ｐ１と、
（ｖｉｉｉ）それらのヌクレオチド配列がそれぞれ配列番号１３、配列番号１２および配列番号１０で示される上流プライマーＡＫＲ１Ｃ３－Ｆ４、下流プライマーＡＫＲ１Ｃ３－Ｒ３およびプローブＡＫＲ１Ｃ３－Ｐ２と、
（ｉｘ）それらのヌクレオチド配列がそれぞれ配列番号１４、配列番号１５、および配列番号１６で示される上流プライマーＡＫＲ１Ｃ３－Ｆ７、下流プライマーＡＫＲ１Ｃ３－Ｒ７、およびプローブＡＫＲ１Ｃ３－Ｐ３
の群のいずれか１つから選択されるプライマー－プローブ組成物を提供する。

本発明の好ましい実施形態では、前記プライマー－プローブ組成物は前記群（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖ）のいずれか１つから選択され、
より好ましくは、前記プライマー－プローブ組成物は群（ｉｖ）から選択される。

本発明の好ましい実施形態では、前記プローブＡＫＲ１Ｃ３－Ｐ１、ＡＫＲ１Ｃ３－Ｐ２およびＡＫＲ１Ｃ３－Ｐ３の５’末端レポーターはＦＡＭであり、前記プローブＡＫＲ１Ｃ３－Ｐ１、ＡＫＲ１Ｃ３－Ｐ２およびＡＫＲ１Ｃ３－Ｐ３の３’末端クエンチャーはＭＧＢである。

同様の発明概念に基づいて、本発明の第２の態様は、前記プライマー－プローブ組成物を含むキットを提供する。

本発明の好ましい実施形態では、前記キットは、さらに、参照遺伝子のプライマー－プローブ組成物を含み、
好ましくは、前記参照遺伝子はＡＣＴＢである。

本発明の好ましい実施形態では、前記参照遺伝子のプライマー－プローブ組成物が、それらのヌクレオチド配列がそれぞれ配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９で示される上流プライマーＡＣＴＢ－Ｆ１、下流プライマーＡＣＴＢ－Ｒ１およびプローブＡＣＴＢ－Ｐ１を含む。

本発明の好ましい実施形態では、前記プローブＡＣＴＢ－Ｐ１の５’末端レポーターがＶＩＣであり、前記プローブＡＣＴＢ－Ｐ１の３’末端クエンチャーがＢＨＱ１である。

本発明の好ましい実施形態では、前記キットは、さらに、ポリメラーゼ混合物を含み、前記ポリメラーゼ混合物が、ＤＮＡポリメラーゼ、ＭｇＣｌ_２、緩衝液およびｄＮＴＰを主に含み、
好ましくは、前記ポリメラーゼ混合物がＫＡＰＡ ＰＲＯＢＥ ＦＡＳＴ ＲＴ－ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（２×）である。

本発明の好ましい実施形態では、前記キットは、さらに、逆転写酵素混合物を含み、
好ましくは、前記逆転写酵素混合物がＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＶＩＬＯ ＭＡＲＳＴＥＲ ＭＩＸである。

本発明の好ましい実施形態では、前記のキットは、さらに、陰性対照および陽性対照を含み、
好ましくは、前記陰性対照がヌクレアーゼを含まない水であり、および／または、
好ましくは、前記陽性対照が既知のコピー数の参照である。

同様の発明概念に基づいて、本発明の第３の態様は、がん治療薬の調製における、前記プライマー－プローブ組成物または前記キットの使用を提供する。

本発明の好ましい実施形態では、患者のｅｘ ｖｉｖｏ試料中のＡＫＲ１Ｃ３ ＲＮＡ含有量を前記プライマー－プローブ組成物または前記キットを用いて求め、ＡＫＲ１Ｃ３ ＲＮＡ含有量が所定の含有量以上の患者に、ＡＫＲ１Ｃ３活性化抗がん剤を投与する。

本発明の好ましい実施形態では、前記ＡＫＲ１Ｃ３ ＲＮＡ含有量をＡＫＲ１Ｃ３コピー数／参照遺伝子コピー数の比に従って求め、
好ましくは、前記所定の含有量が０．０００１～１であり、
より好ましくは、前記所定の含有量が０．０００１１～０．５であり、
さらに好ましくは、前記所定の含有量が０．０００１３～０．０５である。

本発明の好ましい実施形態では、前記ｅｘ ｖｉｖｏ試料は、血液試料、骨髄試料、または組織試料を含む。

本発明の好ましい実施形態では、前記ＡＫＲ１Ｃ３活性化抗がん剤はもちろん、本発明におけるＡＫＲ１Ｃ３活性化抗がんプロドラッグを含む。すなわち、プロドラッグの形態の化合物は、細胞内の生化学的環境におけるＡＫＲ１Ｃ３の触媒作用下で還元されて細胞毒性毒素を得ることにより、がん細胞に対して毒性効果を発揮する。以下の特許出願を参照のこと。
ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０２１５８１号（国際公開第２０１６／１４５０９２号（中国特許出願第２０１６８００１５０７８８号明細書（中国特許出願公開第１０７５３０５５６号明細書）に対応））
ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０２５６６５号（国際公開第２０１６／１６１３４２号（中国特許出願第２０１６８００４４６０８１号明細書（中国特許出願公開第１０８２９０９１１号明細書）対応））
ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６２１１４号（国際公開第２０１７／０８７４２８号（中国特許出願第２０１６８００２００１３２号明細書（中国特許出願公開第１０８１３６２１４号明細書）に対応））
ＰＣＴ／ＮＺ２０１９／０５００３０号（国際公開第２０１９／１９０３３１号（中国特許出願第２０１９８００２３４２３．６号明細書（中国特許出願公開第１１１９１８８６４号明細書）に対応））

上記特許出願に開示された一般式の化合物および特定の化合物は全て、ＡＫＲ１Ｃ３活性化抗がんプロドラッグ（化合物）に属し、上記特許出願の開示の全てを本明細書に組み込む。

概して、ＡＫＲ１Ｃ３活性化抗がん剤は、下記条件を満たすとする。
ＡＫＲ１Ｃ３阻害剤（上記３つの特許に開示されたＴＨ－３０２１など、または化合物３６、すなわち、Ｆｌａｎａｇａｎ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２０１４）、９６２－９７７の
）の存在下でのがん細胞の増殖に対する化合物の検出される阻害効果がＡＫＲ１Ｃ３阻害剤の非存在下でのがん細胞の阻害効果（上記３つの特許に開示されたＴＨ－３０２１など）よりも低い。ＩＣ_５０を使用してがん細胞増殖に対する阻害効果を定量する場合、ＡＫＲ１Ｃ３阻害剤の存在下において特定のがん細胞株に対する化合物の検出されるＩＣ_５０がＡＫＲ１Ｃ３阻害剤の非存在下におけるそれよりも大きい時は、前記化合物はＡＫＲ１Ｃ３活性化抗がん剤であると決定することができる。

好ましくは、前記ＡＫＲ１Ｃ３活性化抗がん剤は、以下の構造
を有する化合物から選択される化合物である。

本発明の好ましい実施形態では、前記がんは、肺がん、非小細胞肺がん、肝臓がん、膵臓がん、乳がん、胃がん、骨がん、食道がん、乳房がん、前立腺がん、精巣がん、大腸がん、卵巣がん、膀胱がん、子宮頸がん、肝細胞がん、メラノーマ、扁平上皮がん、基底細胞がん、腺がん、汗腺がん、皮脂腺がん、乳頭がん、乳頭腺がん、腎細胞がん、嚢胞腺がん、嚢胞がん、髄様がん、気管支がん、骨細胞がん、上皮がん、胆管がん、絨毛がん、胎児性がん、セミノーマ、ウィルムス腫瘍、神経膠芽腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫瘍、血球芽腫、声帯神経腫、髄膜腫、神経芽腫、視神経芽腫、網膜芽細胞腫、神経線維腫、線維肉腫、線維症芽細胞腫、線維腫、線維腺腫、線維軟骨腫、線維嚢腫、線維粘液腫、線維骨肉腫、線維粘液肉腫、線維乳頭腫、粘液肉腫、粘液嚢腫、粘液軟骨腫、粘液軟骨肉腫、粘液線維肉腫、粘液腺腫、粘液芽腫、脂肪肉腫、脂肪腫、脂肪腺腫、脂肪芽腫、脂肪軟骨腫、脂肪線維腫、脂肪血管腫、粘液脂肪腫、軟骨肉腫、軟骨腫、軟骨筋腫、脊索腫、絨毛がん、絨毛上皮腫、絨毛芽腫、骨肉腫、骨芽細胞腫、骨軟骨線維腫、骨軟骨肉腫、骨軟骨腫、骨細胞腫、骨歯腫、骨線維腫、骨の線維肉腫、血管肉腫、血管腫、血管脂肪腫、血管軟骨腫、血管芽腫、血管角腫、血管膠腫、血管内皮腫、血管線維腫、血管筋腫、血管脂肪腫、血管リンパ腫、血管脂肪平滑筋腫、血管筋脂肪腫、血管筋神経腫、血管粘液腫、血管細網腫、リンパ管肉腫、リンパ肉芽腫、リンパ管腫、リンパ腫、リンパ粘液腫、リンパ肉腫、リンパ管線維腫、リンパ球腫、リンパ上皮腫、リンパ芽腫、末梢性Ｔ細胞リンパ腫、結節性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、内皮腫、内芽腫、滑膜腫、滑膜肉腫、中皮腫、結合組織腫瘍、ユーイング腫瘍、平滑筋腫、平滑筋肉腫、平滑筋芽腫、平滑筋線維腫、横紋筋腫、横紋筋肉腫、横紋筋粘液腫、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性疾患細胞、赤血球増加症、リンパ腫、子宮内膜がん、神経膠腫、結腸直腸がん、甲状腺がん、尿路上皮がんまたは多発性骨髄腫を含み、
好ましくは、前記がんは、卵巣がん、子宮頸がん、膵臓がん、乳がん、結腸直腸がん、食道がん、胃がん、幹細胞がん、非小細胞肺がん、前立腺がん、腎細胞がん、末梢Ｔ細胞リンパ腫、結節性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、急性リンパ性白血病または急性骨髄性白血病を含む。

同様の発明概念に基づいて、本発明の第４の態様は、
（１）検出対象のｅｘ ｖｉｖｏ試料のＲＮＡを抽出し、前記抽出したＲＮＡを逆転写系に添加し、前記抽出したＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを合成する工程と、
（２）前記プライマー－プローブ組成物または前記キットを用いて、ｃＤＮＡをテンプレートとしてｑＰＣＲまたはデジタルＰＣＲ増幅を行う工程と、
（３）ｑＰＣＲまたはデジタルＰＣＲ増幅結果に従って検出対象のｅｘ ｖｉｖｏ試料のＡＫＲ１Ｃ３ ＲＮＡ含有量を求める工程と、
を含む、ＡＫＲ１Ｃ３ ＲＮＡ含有量を検出する方法を提供する。

本発明の好ましい実施形態では、前記工程（１）において、前記抽出したＲＮＡの濃度を検出し、好ましくは、Ｑｕｂｉｔ ＲＮＡ ＨＳアッセイキットを使用して前記抽出したＲＮＡの濃度を検出し、前記逆転写系が逆転写酵素を含み、好ましくは、前記抽出したＲＮＡおよび逆転写酵素の質量対体積比がμｇ／μＬの単位で（０．５～２）：４であり、より好ましくは、前記抽出したＲＮＡおよび逆転写酵素の質量対体積比が、μｇ／μＬの単位で（１～１．８）：４であり、さらにより好ましくは、前記抽出したＲＮＡおよび逆転写酵素の質量対体積比がμｇ／μＬの単位で２：４である。

本発明の好ましい実施形態において、前記工程（２）では、ｑＰＣＲ反応系において、前記群（ｉ）～（ｉｘ）のいずれか１つから選択されるプライマー－プローブ組成物を、参照遺伝子のプライマー－プローブ組成物と混合し、
好ましくは、前記ｑＰＣＲ反応系において、ＡＫＲ１Ｃ３上流プライマー、ＡＫＲ１Ｃ３下流プライマーおよびＡＫＲ１Ｃ３プローブのモル比が（２～１０）：（２～１０）：３であり；
より好ましくは、前記ｑＰＣＲ反応系において、ＡＫＲ１Ｃ３上流プライマー、ＡＫＲ１Ｃ３下流プライマーおよびＡＫＲ１Ｃ３プローブのモル比が（３～７）：（３～７）：３であり、
さらにより好ましくは、前記ｑＰＣＲ反応系において、ＡＫＲ１Ｃ３上流プライマー、ＡＫＲ１Ｃ３下流プライマーおよびＡＫＲ１Ｃ３プローブのモル比が５：５：３であり、および／または
前記ｑＰＣＲ反応系において、
好ましくは、上流プライマーＡＣＴＢ－Ｆ１、下流プライマーＡＣＴＢ－Ｒ１およびプローブＡＣＴＢ－Ｐ１のモル比が（２～１０）：（２～１０）：３であり、
より好ましくは、上流プライマーＡＣＴＢ－Ｆ１、下流プライマーＡＣＴＢ－Ｒ１およびプローブＡＣＴＢ－Ｐ１のモル比が（３～７）：（３～７）：３であり、
さらにより好ましくは、上流プライマーＡＣＴＢ－Ｆ１、下流プライマーＡＣＴＢ－Ｒ１およびプローブＡＣＴＢ－Ｐ１のモル比が５：５：３であり、および／または
前記ｑＰＣＲ反応系において、
好ましくは、ＡＫＲ１Ｃ３上流プライマー、ＡＫＲ１Ｃ３下流プライマーおよびＡＫＲ１Ｃ３プローブの量がそれぞれ上流プライマーＡＣＴＢ－Ｆ１、下流プライマーＡＣＴＢ－Ｒ１およびプローブＡＣＴＢ－Ｐ１の量と同じである。

本発明の好ましい実施形態において、前記工程（２）では、前記ｑＰＣＲ反応系において、ｄＵＴＰ、ＵＮＧ酵素、ｃＤＮＡテンプレートおよびポリメラーゼ混合物も添加され、
好ましくは、前記ポリメラーゼ混合物の体積が前記ｑＰＣＲ反応系の総体積の（０．３～０．８）であり、
より好ましくは、前記ポリメラーゼ混合物の体積が前記ｑＰＣＲ反応系の総体積の０．５倍である。

本発明の好ましい実施形態において、前記工程（２）では、ＡＫＲ１Ｃ３および参照遺伝子が、それぞれＡＫＲ１Ｃ３デジタルＰＣＲ検出システムおよび参照遺伝子デジタルＰＣＲ検出システムによって増幅され、
好ましくは、前記ＡＫＲ１Ｃ３デジタルＰＣＲ検出システムにおいて、ＡＫＲ１Ｃ３上流プライマー、ＡＫＲ１Ｃ３下流プライマーおよびＡＫＲ１Ｃ３プローブのモル比が（５～１５）：（５～１５）：３であり、
より好ましくは、ＡＫＲ１Ｃ３上流プライマー、ＡＫＲ１Ｃ３下流プライマーおよびＡＫＲ１Ｃ３プローブのモル比が（８～１４）：（８～１４）：３であり、
さらにより好ましくは、ＡＫＲ１Ｃ３上流プライマー、ＡＫＲ１Ｃ３下流プライマーおよびＡＫＲ１Ｃ３プローブのモル比が１２：１２：３であり、および／または
前記参照遺伝子デジタルＰＣＲ検出システムにおいて、
好ましくは、上流プライマーＡＣＴＢ－Ｆ１、下流プライマーＡＣＴＢ－Ｒ１およびプローブＡＣＴＢ－Ｐ１のモル比が（５～１５）：（５～１５）：３であり、
より好ましくは、上流プライマーＡＣＴＢ－Ｆ１、下流プライマーＡＣＴＢ－Ｒ１およびプローブＡＣＴＢ－Ｐ１のモル比が（８～１４）：（８～１４）：３であり、
さらにより好ましくは、上流プライマーＡＣＴＢ－Ｆ１、下流プライマーＡＣＴＢ－Ｒ１およびプローブＡＣＴＢ－Ｐ１のモル比が１２：１２：３である。

本発明の好ましい実施形態では、前記工程（３）において、ｑＰＣＲまたはデジタルＰＣＲ増幅結果に従って検出対象のｅｘ ｖｉｖｏ試料のＡＫＲ１Ｃ３ ＲＮＡ含有量を求める工程が、
（Ａ）ｑＰＣＲまたはデジタルＰＣＲ増幅結果に従って検出対象のｅｘ ｖｉｖｏ試料のＡＫＲ１Ｃ３および参照遺伝子のコピー数をそれぞれ求める工程と、
（Ｂ）ＡＫＲ１Ｃ３コピー数／参照遺伝子コピー数の比を計算して、検出対象のｅｘ ｖｉｖｏ試料のＡＫＲ１Ｃ３ ＲＮＡ含有量を求める工程と、
を含む。

本発明の好ましい実施形態では、前記ｑＰＣＲ法を用いる場合、前記工程（Ａ）はさらに、
（Ａ_１）ＡＫＲ１Ｃ３のＣｔ値および初期コピー数ｌｇ値の検量線、並びに参照遺伝子のＣｔ値および初期コピー数ｌｇ値の検量線をそれぞれプロットする工程と、
（Ａ_２）前記検量線に従って、検出されたＡＫＲ１Ｃ３および参照遺伝子のＣｔ値によってそれぞれ検出対象のｅｘ ｖｉｖｏ試料のＡＫＲ１Ｃ３および参照遺伝子のコピー数を求める工程と、
を含む。

本発明の好ましい実施形態では、前記方法を使用して、血液試料、骨髄試料または組織試料中のＡＫＲ１Ｃ３ ＲＮＡ含有量を検出する。

同様の発明概念に基づき、本発明の第５の態様は、前記方法用いて、検出対象のｅｘ ｖｉｖｏ試料のＡＫＲ１Ｃ３ ＲＮＡ含有量を検出し、その後、前記検出対象のｅｘ ｖｉｖｏ試料のＡＫＲ１Ｃ３ ＲＮＡ含有量に従って、前記検出対象のｅｘ ｖｉｖｏ試料のＡＫＲ１Ｃ３酵素の発現量を求めるＡＫＲ１Ｃ３酵素の発現量を検出する方法を提供する。

本発明の好ましい実施形態では、前記検出対象のｅｘ ｖｉｖｏ試料中のＡＫＲ１Ｃ３ ＲＮＡ含有量と、前記検出対象のｅｘ ｖｉｖｏ試料中のＡＫＲ１Ｃ３酵素の発現量との間に線形相関がある。

図１は化合物ＯＢＩ－３４２４のｅｘ ｖｉｖｏのＡＫＲ１Ｃ３依存的細胞毒性を示し、左側の図は肝細胞がん細胞におけるＡＫＲ１Ｃ３タンパク質の発現量とＯＢＩ－３４２４のＩＣ_５０との相関性を示し、真ん中の図は肝細胞がん細胞におけるＡＫＲ１Ｃ３ ＲＮＡの発現量とＯＢＩ－３４２４のＩＣ_５０との相関性を示し、右側の図は、非小細胞肺がん細胞におけるＡＫＲ１Ｃ３ ＲＮＡの発現量とＯＢＩ－３４２４のＩＣ_５０との相関性を示す。 図２は白血病細胞株に対する化合物ＯＢＩ－３４２４の細胞毒性を示し、図２ａに６種類のＢ－ＡＬＬ細胞株に対する化合物ＯＢＩ－３４２４の細胞毒性を示し、図２ｂに７種類のＴ－ＡＬＬ細胞株に対する化合物ＯＢＩ－３４２４の細胞毒性を示し、図２ｃにＯＢＩ－３４２４の濃度１０ｎｍｏｌ／Ｌでの１８種類のＡＬＬ ＰＤＸのｅｘ ｖｉｖｏのＡＫＲ１Ｃ３タンパク質の発現量と細胞生存率との相関性を示し、図２ｄにＯＢＩ－３４２４の濃度１００ｎｍｏｌ／Ｌでの１８種類のＡＬＬ ＰＤＸのｅｘ ｖｉｖｏのＡＫＲ１Ｃ３タンパク質の発現量と細胞生存率との相関性を示す。 図３は白血病細胞株におけるＡＫＲ１Ｃ３ｍＲＮＡの発現量とタンパク質の発現量との相関性を示し、図３ａにＲＮＡ－Ｓｅｑ解析により検出した各種ＡＬＬ ＰＤＸのＡＫＲ１Ｃ３ｍＲＮＡの発現量を示し、図３ｂにウェスタンブロット法により検出した各種ＡＬＬ ＰＤＸのＡＫＲ１Ｃ３タンパク質の発現量を示し、図３ｃにＡＫＲ１Ｃ３ ＲＮＡの発現量とタンパク質の発現量との相関性を示し、図３ｄにＡＫＲ１Ｃ３ ＲＮＡの発現量とＯＢＩ－３４２４のＩＣ_５０の相関性を示す。 図４は本願におけるＡＫＲ１Ｃ３プライマー－プローブの位置情報を示す。 図５は９対のＡＫＲ１Ｃ３プライマー－プローブの増幅結果を示し、図５ａにＦ１Ｒ１Ｐ１プライマー－プローブの増幅結果を示し、図５ｂにＦ２Ｒ２Ｐ１プライマー－プローブの増幅結果を示し、図５ｃにＦ２Ｒ６Ｐ１プライマー－プローブの増幅結果を示し、図５ｄにＦ６Ｒ２Ｐ１プライマー－プローブの増幅結果を示し、図５ｅにＦ６Ｒ６Ｐ１プライマー－プローブの増幅結果を示し、図５ｆにＦ５Ｒ５Ｐ２プライマー－プローブの増幅結果を示し、図５ｇにＦ３Ｒ３Ｐ１プライマー－プローブの増幅結果を示し、図５ｈにＦ４Ｒ３Ｐ２プライマー－プローブの増幅結果を示し、図５ｉにＦ７Ｒ７Ｐ３プライマー－プローブの増幅結果を示す。 図６は３対のＡＫＲ１Ｃ３プライマー－プローブの増幅結果および検量線を示し、図６ａにＦ２Ｒ６Ｐ１プライマー－プローブの増幅結果を示し、図６ｂにＦ２Ｒ６Ｐ１プライマー－プローブの検量線を示し（○は標準を示し、Ｅ（増幅率）＝８２．５％、Ｒ^２＝０．９８７、Ｓｌｏｐｅ＝－３．８２６、ｙ－ｉｎｔ（ｙ－切片）＝５１．９６１）、図６ｃにＦ６Ｒ２Ｐ１プライマー－プローブの増幅結果を示し、図６ｄにＦ６Ｒ２Ｐ１プライマー－プローブの検量線を示し（○は標準を示し、Ｅ（増幅率）＝９６．５％、Ｒ^２＝０．９８２、Ｓｌｏｐｅ＝－３．４０８、ｙ－ｉｎｔ（ｙ－切片）＝４９．５９１）、図６ｅにＦ６Ｒ６Ｐ１プライマー－プローブの増幅結果を示し、図６ｆにＦ６Ｒ６Ｐ１プライマー－プローブの検量線を示す（○は標準を示し、Ｅ（増幅率）＝９８．０％、Ｒ^２ ＝０．９９２、Ｓｌｏｐｅ＝－３．３７１、ｙ－ｉｎｔ（ｙ切片）＝４９．３８５）。 図７はＡＫＲ１Ｃ３プラスミドの増幅結果と検量線を示し、図７ａにＡＫＲ１Ｃ３プラスミドの増幅結果を示し、図７ｂにＡＫＲ１Ｃ３プラスミドの検量線を示す（○は標準を示し、Ｅ（増幅率）＝１００．７％、Ｒ^２＝０．９９９、Ｓｌｏｐｅ＝－３．３０５、ｙ－ｉｎｔ（ｙ－切片）＝４２．３３６）。 図８は４種類の参照遺伝子プライマー－プローブの増幅結果を示し、図８ａに参照遺伝子ＧＡＰの増幅結果を示し、図８ｂに参照遺伝子ＧＯＬＧＡ１の増幅結果を示し、図８ｃに参照遺伝子ＡＣＴＢの増幅結果を示し、図８ｄに参照遺伝子ＨＰＲＴ１の増幅結果を示す。 図９は異なる細胞株におけるＡＫＲ１Ｃ３発現のウェスタンブロット結果を示す。 図１０は４種類の参照遺伝子を用いて異なる細胞株におけるＡＫＲ１Ｃ３発現を検出した結果を示し、図１０ａに参照遺伝子ＨＰＲＴ１を用いて異なる細胞株におけるＡＫＲ１Ｃ３発現を検出した結果を示し、図１０ｂに参照遺伝子ＧＡＰを用いて異なる細胞株におけるＡＫＲ１Ｃ３発現を検出した結果を示し、図１０ｃに参照遺伝子ＡＣＴＢを用いて異なる細胞株におけるＡＫＲ１Ｃ３発現を検出した結果を示し、図１０ｄに参照遺伝子ＧＯＬＧＡ１を用いて異なる細胞株におけるＡＫＲ１Ｃ３発現を検出した結果を示す。 図１１はＡＫＲ１Ｃ３－ＡＣＴＢシステムによって検出された異なる細胞株の結果を示す。 図１２はＡＫＲ１Ｃ３－ＡＣＴＢシステムによって検出されたＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞株の結果を示し、図１２ａにＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞株におけるＡＫＲ１Ｃ３の増幅結果を示し、図１２ｂにＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞株におけるＡＫＲ１Ｃ３の検量線を示し（標的：ＡＫＲ１Ｃ３、Ｅｆｆ（増幅率）％＝９４．１９％、Ｒ^２＝０．９９８、Ｓｌｏｐｅ＝－３．４７、ｙ－ｉｎｔｅｒ（ｙ切片）＝３４．５９５）、図１２ｃにＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞株におけるＡＣＴＢの増幅結果を示し、図１２ｄにＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞株におけるＡＣＴＢの検量線を示す（標的：ＡＣＴＢ、Ｅｆｆ（増幅率）％＝９５．３０２％、Ｒ^２＝０．９９１、Ｓｌｏｐｅ＝－３．４４、ｙ－ｉｎｔｅｒ（ｙ切片）＝２８．８５４。 図１３はＡＫＲ１Ｃ３－ＡＣＴＢシステムで検出されたプラスミドの結果を示し、図１３ａにＡＫＲ１Ｃ３プラスミドの増幅結果を示し、図１３ｂにＡＫＲ１Ｃ３プラスミドの検量線を示し（標的：ＡＫＲ１Ｃ３、Ｅｆｆ（増幅率）％＝１０１．８５３％、Ｒ^２＝０．９９８、Ｓｌｏｐｅ＝－３．２７８、ｙ－ｉｎｔｅｒ（ｙ－切片）＝３８．０４８）、図１３ｃにＡＣＴＢプラスミドの増幅結果を示し、図１３ｄにＡＣＴＢプラスミドの検量線を示す（標的：ＡＣＴＢ、Ｅｆｆ（増幅率）％＝９４．１３４％、Ｒ^２＝１、Ｓｌｏｐｅ＝－３．４７１、ｙ－ｉｎｔｅｒ（ｙ－切片）＝４０．８２１）。 図１４はＪｕｒｋａｔ細胞株のｑＰＣＲ検出結果を示す。 図１５は細胞株のデジタルＰＣＲ検出結果を示す（ＦＡＭとＶＩＣは同時に検出された）。 図１６はデジタルＰＣＲにより検出された２種類の細胞株におけるＡＫＲ１Ｃ３発現の結果を示し、図１６ａにデジタルＰＣＲにより検出されたＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞株におけるＡＫＲ１Ｃ３発現の結果を示し、図１６ｂにデジタルＰＣＲにより検出されたＭＯＬＴ－４細胞株におけるＡＫＲ１Ｃ３発現の結果を示す。 図１７はデジタルＰＣＲにより検出された２種類の細胞株におけるＡＣＴＢ発現結果を示し、図１７ａにデジタルＰＣＲにより検出されたＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞株におけるＡＣＴＢ発現結果を示し、図１７ｂに、デジタルＰＣＲにより検出されたＭＯＬＴ－４細胞株におけるＡＣＴＢ発現結果を示す。 図１８はＡＫＲ１Ｃ３－ＡＣＴＢシステムにより検出された実物試料試験におけるプラスミドの結果を示し、図１８ａにＡＫＲ１Ｃ３プラスミドの増幅結果を示し、図１８ｂにＡＫＲ１Ｃ３プラスミドの検量線を示し（標的：ＡＫＲ１Ｃ３、Ｅｆｆ（増幅率）％＝９９．１０８％、Ｒ^２＝０．９９６、Ｓｌｏｐｅ＝－３．３４４、ｙ－ｉｎｔｅｒ（ｙ－切片）＝３８．１２８）、図１８ｃにＡＣＴＢプラスミドの増幅結果を示し、図１８ｄにＡＣＴＢプラスミドの検量線を示す（標的：ＡＣＴＢ、Ｅｆｆ（増幅率）％＝９３．４４５％、Ｒ^２＝０．９９８、Ｓｌｏｐｅ＝－３．４９、ｙ－ｉｎｔｅｒ（ｙ－切片）＝４０．６３６）。 図１９は実物試料におけるＦＡＭコピー数／ＶＩＣコピー数のヒストグラムである。 図２０はデジタルＰＣＲで検出された細胞株のｃＤＮＡの５倍希釈のコピー数の結果を示す。

特に定義しない限り、本明細書の一つまたは複数の実施例で使用される技術用語または科学用語は、本開示が属する分野の当業者によって理解される通常の意味を持つものとする。

以下の実施例における実験方法は、特に明記しない限り、全て従来の方法である。以下の実施例で使用される医薬品、試薬等の原料は特に明記しない限り、全て市販品である。

患者への薬剤の「投与」は、直接投与（医療専門家によって患者に投与してもよいし、自己投与でもよい）および／または間接投与（薬剤処方箋の作成でもよい）を指す。例えば、患者に薬剤を自己投与するよう指導したり、患者に薬剤処方箋を提供したりする医師は、患者に薬剤を投与することになる。

「がん」は浸潤によって局所的に広がり、潜在的に制限されない増殖を伴う転移によって全身的に広がり得る、白血病、リンパ腫、がんおよび他の悪性腫瘍（固形腫瘍を含む）を指す。がんとしては、例えば、副腎、骨、脳、乳房、気管支、結腸および／または直腸、胆嚢、頭頸部、腎臓、咽喉、肝臓、肺、神経組織、膵臓、前立腺、副甲状腺、皮膚、胃および甲状腺のがんが挙げられるが、これらに限定されない。その他、特定のがんの例としては、急性および慢性リンパ球性および顆粒球性腫瘍、腺がん、腺腫、基底細胞がん、低分化子宮頸部上皮および上皮内がん、ユーイング肉腫、類表皮がん、巨細胞腫、多形性神経膠芽腫、毛様細胞腫瘍、腸神経節細胞腫瘍、増殖性角膜神経腫瘍、膵島細胞がん、カポジ肉腫、平滑筋腫、白血病、リンパ腫、悪性カルチノイド、悪性メラノーマ、悪性高カルシウム血症、マルファノイド体質腫瘍、骨髄性上皮がん、転移性皮膚がん、粘膜神経腫、骨髄腫、菌状肉芽腫、神経芽腫、骨肉腫、骨原性肉腫およびその他の肉腫、卵巣腫瘍、褐色細胞腫、真性赤血球増加症、原発性脳腫瘍、小細胞肺がん、潰瘍型および乳頭型の扁平上皮がん、過形成、セミノーマ、軟部肉腫、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、腎細胞腫瘍、局所皮膚病変、細網肉腫、およびウィルムス腫瘍が挙げられる。

「患者」および「個体」という用語は本明細書において互換的に使用することができ、がんの治療を必要とする哺乳動物を指す。一般に、患者はヒトである。一般に、患者はがんと診断されたヒトである。特定の例において、「患者」または「個体」は、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、マウスまたはラットなどの薬剤および治療法のスクリーニング、特徴付け、および評価に使用される非ヒト哺乳動物であってもよい。

「プロドラッグ」は投与後に、少なくとも１つの特性に関して、代謝されるか、生物学的に活性化されたまたはより活性化された化合物（または薬剤）に変換される化合物を指す。プロドラッグは、薬剤と比較して、より活性が低くまたは不活性になるように化学的に修飾されるが、前記化学的修飾は、プロドラッグを投与した後に代謝または他の生物学的プロセスによって対応する薬剤を生成するものである。プロドラッグは活性薬剤と比較して、代謝安定性もしくは輸送特性を改変させたり、副作用もしくは毒性をより低くしたり、香味を改善することができる（例えば、参照によりその開示を本明細書に組み込む、参考文献「Ｎｏｇｒａｄｙ，１９８５，Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐａｇｅｓ ３８８－３９２」を参照）。プロドラッグは、対応する薬剤以外の反応物質を用いて合成することができる。

「固形腫瘍」は骨、脳、肝臓、肺、リンパ節、膵臓、前立腺、皮膚および軟部組織（肉腫）における転移性腫瘍を含むが、これらに限定されない固形腫瘍を指す。

状態または患者の「治療」は、臨床結果を含む有益なまたは所望の結果を得るための工程をとることを指す。本発明の目的のために、有益なまたは所望の臨床結果には、がんの１つ以上の症状の緩和または改善、疾患の程度の軽減、疾患進行の遅延または鈍化；病状の緩和、寛解、または安定化；または他の有益な結果が含まれるが、これらに限定されない。がんの治療は、部分的反応や病状の安定である場合もある。

「腫瘍細胞」は任意の適切な種、例えば、マウス、イヌ、ネコ、ウマまたはヒトなどの哺乳動物の腫瘍細胞を指す。

薬剤の「治療有効量」はがん患者に投与した場合に、患者におけるがんの１つまたは複数の症状の、例えば、緩和、回復、寛解または排除といった意図される治療効果を発揮する薬剤の量を指す。治療効果は、必ずしも１回の用量の投与によって生じるわけではなく、一連の用量の投与後にのみ生じ得る。したがって、治療有効量は、１回以上の投与回数で投与してもよい。

光学活性化合物の記載において、接頭辞ＲおよびＳは、そのキラル中心の周りの分子の絶対配置を表すために使用される。（＋）および（－）は化合物の光学活性、すなわち、偏光面が光学活性化合物を通して回転する方向を表すために使用される。接頭辞（－）は化合物が左旋性であること、すなわち、化合物が偏光面の方向を左または反時計回りに回転させることを表す。接頭辞（＋）は化合物が右旋性であること、すなわち、化合物が偏光面の方向を右または時計回りに回転させることを表す。ただし、光学的符号（＋）および（－）は、分子のＲおよびＳの絶対配置とは無関係である。

化合物ＯＢＩ－３４２４（ＡＳＴ－３４２４およびＴＨ－３４２４ともいう）、ＯＢＩ－３４２３およびＯＢＩ－２８７０の構造を、以下に示す。
式中、ＯＢＩ－３４２４はＳ－光学異性体であり、ＯＢＩ－３４２３はＲ－光学異性体であり、ＯＢＩ－２８７０はＯＢＩ－３４２４とＯＢＩ－３４２３との１：１の比のラセミ混合物である。

以前の研究は化合物ＯＢＩ－３４２４、ＯＢＩ－３４２３およびＯＢＩ－２８７０が様々なヒトがん、特に、固形腫瘍および血液悪性腫瘍に対して良好な治療効果を有することを示している。固形腫瘍（肝臓がん、肝細胞がん（ＨＣＣ）、非小細胞肺がん、メラノーマ、前立腺がん、乳がん、食道がん、腎臓がん、胃がん、大腸がん、脳腫瘍、膀胱がん、子宮頸がん、卵巣がん、頭頸部がん、子宮内膜がん、膵臓がん、肉腫様がんおよび直腸がんなどを含む）に対する化合物ＯＢＩ－３４２４の治療効果は中国特許出願公開第１０８２９０９１１号明細書に記載されている。血液悪性腫瘍（Ｂ系急性リンパ芽球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）およびＴ系急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）を含む）に対する化合物ＯＢＩ－３４２４の治療効果は、国際公開第２０１９／０６２９１９号に記載されている。

ＡＫＲ１Ｃ３は、多くの種類のがん、特に肝臓がん、胃がん、腎臓がん、ＣＲＰＣおよび非小細胞肺がんにおいてタンパク質量で過剰発現される。腫瘍においてＡＫＲ１Ｃ３が高発現をすることから、化合物ＯＢＩ－３４２４は腫瘍において特異的に活性化するように設計されるが、ＡＫＲ１Ｃ３の発現が低い正常細胞において活性化できず腫瘍特異的標的化を達成できない。ＯＢＩ－３４２４は、ＡＫＲ１Ｃ３によって選択的に活性化される非常に強力なＤＮＡアルキル化プロドラッグとして開発されている。ＮＡＤＰＨの存在下で、ＯＢＩ－３４２４は、ＡＫＲ１Ｃ３からＯＢＩ－２６６０に自発的に加水分解される中間体に還元される。ＯＢＩ－２６６０はチオＴＥＰＡ（Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’－トリエチレンチオホスホラミド）に類似したＤＮＡジアルキル化剤であり、これはグアニンのＮ７（またはＯ６）位でＤＮＡ架橋をもたらし、その後、以下に示すように細胞死をもたらす。

本出願人が行ったさらなる研究により、化合物ＯＢＩ－３４２４の活性化がＡＫＲ１Ｃ３依存的であり、その細胞毒性および抗腫瘍効果がＡＫＲ１Ｃ３タンパク質の発現量と高い相関関係にあることが確認されている。化合物ＯＢＩ－３４２４は様々な種類のヒトがんにおいてｅｘ ｖｉｖｏでのＡＫＲ１Ｃ３依存的細胞毒性およびｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍活性を示しており、このことは、異なる種類のがんの治療に使用可能な抗がん剤としての化合物ＯＢＩ－３４２４のさらなる開発を支持する。ＡＫＲ１Ｃ３をバイオマーカーとして使用してがん患者の状態を分析し、さらに患者が治療のために化合物ＯＢＩ－３４２４を選択するよう導く。

本出願の実施例１では、固形腫瘍中のＡＫＲ１Ｃ３酵素およびＡＫＲ１Ｃ３ ＲＮＡ含有量ががん細胞上の化合物ＯＢＩ－３４２４のＩＣ_５０価の数学的変換後の量と線形的に相関し、線形相関係数が十分に高いことを確認した。実施例２および３では、血液腫瘍中のＡＫＲ１Ｃ３酵素およびＡＫＲ１Ｃ３ ＲＮＡ含有量ががん細胞上の化合物ＯＢＩ－３４２４のＩＣ_５０価の数学的変換後の量と線形的に相関し、線形相関係数が十分に高いことを確認した。患者に対する薬剤の治療効果は、ＩＣ_５０値との関連によってのみ直接的に確認することができることは当業者に周知である。理論的および実際には、ＩＣ_５０値が低いほど、患者に対する薬剤の有効性はより良好である。実施例１～３の全ての実験データにおいて、客観的に測定してＩＣ_５０値を相関させることができる関連するバイオメトリック値を検出し、その後、特定のがん患者における薬剤の有効性を予測し、標的薬剤送達を達成した（実際には特定の患者の腫瘍組織を直接採取し、がん細胞生存の条件下でＩＣ_５０値を検出することが最良である。これは最良で最も直観的かつ正確であるが、実際には実行可能ではなく、したがって、客観的に測定することができる関連するバイオメトリック値のみを検出して、ＩＣ_５０値を相関させることができる）。広範囲にわたる検出の後、本出願は、固形腫瘍および血液腫瘍中のＡＫＲ１Ｃ３酵素およびＡＫＲ１Ｃ３ ＲＮＡ含有量ががん細胞上の化合物ＯＢＩ－３４２４のＩＣ_５０値と線形的に相関するだけでなく、線形相関係数も十分に高いことを確認した。これは、固形腫瘍および血液腫瘍中のＡＫＲ１Ｃ３酵素およびＡＫＲ１Ｃ３ ＲＮＡ含有量ががん細胞上の化合物ＯＢＩ－３４２４のＩＣ_５０値と高度に相関することを十分に実証している。したがって、実際の適用において、患者のｅｘ ｖｉｖｏ試料のＡＫＲ１Ｃ３酵素含有量およびＡＫＲ１Ｃ３ ＲＮＡ含有量を検出することができ、その後、前記検出結果に従って、化合物ＯＢＩ－３４２４を治療のために患者に投与することができる。

従来技術では、通常、ウェスタンブロッティングまたは免疫化学染色を使用してＡＫＲ１Ｃ３酵素含有量を検出するが、従来技術ではＡＫＲ１Ｃ３ ＲＮＡ含有量を検出するための対応する検出方法はない。対応するアッセイを用いてＡＫＲ１Ｃ３ ＲＮＡ含有量を評価することができると仮定すると、ＡＫＲ１Ｃ３ ＲＮＡ含有量がより高く、プロドラッグに最も反応する可能性が高い患者に、より良好ながん治療効果を達成するために化合物ＯＢＩ－３４２４を投与するように選択することができる。

上記の目的に基づき、本発明はリアルタイム蛍光定量ＰＣＲ技術（ｑＰＣＲ）に基づき、ＲＮＡ逆転写反応、ポリメラーゼ連鎖反応、およびＴａｑｍａｎプローブ技術を採用してＡＫＲ１Ｃ３遺伝子の発現を検出し、自家調製検査法（ＬＤＴ）システムに適用可能なヒトＡＫＲ１Ｃ３遺伝子発現の方法および対応するキットを確立し、最終的にそれらを臨床試験試料コンパニオン診断の薬剤検出に使用することができる。

プライマーとプローブを設計するための基本原理は次の通りである。（１）プライマー－プローブの長さ：各プライマーの長さは１５～３０塩基である。（２）プライマー－プローブにおけるＧＣ％は３０～８０％の範囲である必要があり、プライマーのＴｍ値は５５～６０℃の範囲である。（３）プライマー－プローブ自体とプライマー間の３’末端との塩基対合は、できるだけ避けるべきである。（４）プライマー－プローブ自体とプライマー間の６つ以上の連続した塩基対は、できるだけ避けるべきである。（５）上流プライマーおよび下流プライマーによって増幅される標的断片の長さは５０～１８０ｂｐの範囲であり、プローブは上流プライマーと下流プライマーの間で、できるだけ上流プライマーの近くに位置し、プローブの５’末端でのグアニンの使用は避けるべきである。プローブのアニーリング温度が低すぎる場合、ＬＮＡプローブまたはＭＧＢプローブの設計に考慮する。（６）選択されたプライマーおよびプローブは、ＡＫＲ１Ｃ３遺伝子の発現を特異的に検出することができるＡＫＲ１Ｃ３遺伝子の保存領域において設計すること。

技術的原理：ＲＮＡ逆転写反応、ポリメラーゼ連鎖反応およびＴａｑｍａｎプローブ技術を使用して、ＡＫＲ１Ｃ３遺伝子発現を指向する特異的プライマーおよびプローブを設計する。標的配列は特異的プライマーを用いたＰＣＲにより増幅され、テンプレートに結合したＴａｑｍａｎプローブはＴａｑ酵素（５’→３’エキソヌクレアーゼ活性）により切断され、レポーターはクエンチャーから分離され、蛍光信号を生成し蓄積する。リアルタイム増幅曲線は蛍光信号と増幅サイクル数との関係に従って求めることができ、その後、ＡＫＲ１Ｃ３ ＲＮＡの発現量を検出することができる。

本発明は、ＡＫＲ１Ｃ３の３つの標的領域（それぞれエクソン２～３、エクソン４～５およびエクソン５～６）の９対のプライマーおよびプローブを設計する。プライマー－プローブの位置情報を図１に示す。Ｂｅａｃｏｎ Ｄｅｓｉｇｎｅｒ ８．１２ソフトウェアを使用してプライマー－プローブの設計の基本原理と一致するプライマー品質の評価を支援し、ＮＣＢＩデータベースにおいてブラストツールを使用してプライマー－プローブの各対が共通のＳＮＰ部位なしにヒト遺伝子配列を特異的に増幅することを確実にする。

本発明の第１の態様は、
（ｉ）それらのヌクレオチド配列がそれぞれ配列番号１、配列番号２および配列番号３で示される上流プライマーＡＫＲ１Ｃ３－Ｆ１、下流プライマーＡＫＲ１Ｃ３－Ｒ１およびプローブＡＫＲ１Ｃ３－Ｐ１と、
（ｉｉ）それらのヌクレオチド配列がそれぞれ配列番号４、配列番号５および配列番号３で示される上流プライマーＡＫＲ１Ｃ３－Ｆ２、下流プライマーＡＫＲ１Ｃ３－Ｒ２およびプローブＡＫＲ１Ｃ３－Ｐ１と、
（ｉｉｉ）それらのヌクレオチド配列がそれぞれ配列番号４、配列番号６および配列番号３で示される上流プライマーＡＫＲ１Ｃ３－Ｆ２、下流プライマーＡＫＲ１Ｃ３－Ｒ６およびプローブＡＫＲ１Ｃ３－Ｐ１と、
（ｉｖ）それらのヌクレオチド配列がそれぞれ配列番号７、配列番号５および配列番号３で示される上流プライマーＡＫＲ１Ｃ３－Ｆ６、下流プライマーＡＫＲ１Ｃ３－Ｒ２およびプローブＡＫＲ１Ｃ３－Ｐ１と、
（ｖ）それらのヌクレオチド配列がそれぞれ配列番号７、配列番号６および配列番号３で示される上流プライマーＡＫＲ１Ｃ３－Ｆ６、下流プライマーＡＫＲ１Ｃ３－Ｒ６およびプローブＡＫＲ１Ｃ３－Ｐ１と、
（ｖｉ）それらのヌクレオチド配列がそれぞれ配列番号８、配列番号９および配列番号１０で示される上流プライマーＡＫＲ１Ｃ３－Ｆ５、下流プライマーＡＫＲ１Ｃ３－Ｒ５およびプローブＡＫＲ１Ｃ３－Ｐ２と、
（ｖｉｉ）それらのヌクレオチド配列がそれぞれ配列番号１１、配列番号１２および配列番号３で示される上流プライマーＡＫＲ１Ｃ３－Ｆ３、下流プライマーＡＫＲ１Ｃ３－Ｒ３およびプローブＡＫＲ１Ｃ３－Ｐ１と、
（ｖｉｉｉ）それらのヌクレオチド配列がそれぞれ配列番号１３、配列番号１２および配列番号１０で示される上流プライマーＡＫＲ１Ｃ３－Ｆ４、下流プライマーＡＫＲ１Ｃ３－Ｒ３およびプローブＡＫＲ１Ｃ３－Ｐ２と、
（ｉｘ）それらのヌクレオチド配列がそれぞれ配列番号１４、配列番号１５、および配列番号１６で示される上流プライマーＡＫＲ１Ｃ３－Ｆ７、下流プライマーＡＫＲ１Ｃ３－Ｒ７、およびプローブＡＫＲ１Ｃ３－Ｐ３
の群のいずれか１つから選択されるプライマー－プローブ組成物を提供する。

本発明は、上記９群のプライマー－プローブ組成物、ならびに９群のプライマー－プローブ組成物から選択された群（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖ）を、増幅率および特異性に応じて、候補プライマー－プローブ組成物として使用することによって、ＡＫＲ１Ｃ３の増幅を行った。最良のプライマー－プローブ組成物を決定するために、群（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖ）それぞれからのプライマー－プローブ組成物を使用することによって、異なる試料においてさらなるＡＫＲ１Ｃ３増幅を行った。増幅率に応じて、群（ｉｖ）のプライマー－プローブ組成物（上流プライマーＡＫＲ１Ｃ３－Ｆ６、下流プライマーＡＫＲ１Ｃ３－Ｒ２およびプローブＡＫＲ１Ｃ３－Ｐ１）を、最終的に、本発明の最良のプライマー－プローブ組成物として決定した。

本発明の９群のプライマー－プローブ組成物は、ｑＰＣＲ法によるＡＫＲ１Ｃ３ ＲＮＡ含有量の検出のためだけでなく、デジタルＰＣＲ法によるＡＫＲ１Ｃ３ ＲＮＡ含有量の検出のためにも使用することができる。ｑＰＣＲ方法およびデジタルＰＣＲ方法によるＡＫＲ１Ｃ３ ＲＮＡ含有量の検出の工程を、以下に詳細に記載する。

本発明の好ましい実施形態では、プローブＡＫＲ１Ｃ３－Ｐ１、ＡＫＲ１Ｃ３－Ｐ２およびＡＫＲ１Ｃ３－Ｐ３の５’末端レポーターはＦＡＭであり、プローブＡＫＲ１Ｃ３－Ｐ１、ＡＫＲ１Ｃ３－Ｐ２およびＡＫＲ１Ｃ３－Ｐ３の３’末端クエンチャーはＭＧＢである。

本発明の実施に好ましいプローブは、ＴａｑＭａｎシステムに従って標識されたプローブである。ＴａｑＭａｎシステムは、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から入手可能である。ＴａｑＭａｎシステムによれば、増幅された標的ＤＮＡにハイブリダイズするように特異的に設計されたオリゴヌクレオチドプローブは、レポーターの５’末端およびクエンチャーの３’末端に共有結合される。ＴａｑＭａｎシステムで使用する適切なレポーターとしては、例えば、６－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）またはテトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）が挙げられる。典型的なクエンチャーは、副溝バインダー（ＭＧＢ）である。このＴａｑＭａｎシステムの原理はクエンチャーとレポーターの位置がプローブ上で互いに非常に近い限り、クエンチャーがレポーターの蛍光を阻害することである。オリゴヌクレオチドプローブがｑＰＣＲ増幅中に標的ＤＮＡにハイブリダイズすると、酵素がオリゴヌクレオチドプライマーを標的ＤＮＡに対応するＤＮＡに沿って伸長させるので、Ｔａｑポリメラーゼによって分解される。この分解によってレポーターおよびクエンチャーは放出され、クエンチャーはレポーターに非常に近くなくなるため、レポーターは、ｑＰＣＲ装置（すなわち、サーマルサイクラー）に一般的に組み込まれる適切なツールによって検出および測定することができる蛍光を発光することがでる。

同様の発明概念に基づいて、本発明の第２の態様は、上記のプライマー－プローブ組成物を含むキットを提供する。

本発明の好ましい実施形態では、前記キットは、さらに、参照遺伝子のプライマー－プローブ組成物を含み、好ましくは、前記参照遺伝子のプライマー－プローブ組成物は、それらのヌクレオチド配列がそれぞれ配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９で示される上流プライマーＡＣＴＢ－Ｆ１、下流プライマーＡＣＴＢ－Ｒ１およびプローブＡＣＴＢ－Ｐ１を含む。

ｑＰＣＲ技術を使用して遺伝子の発現量を測定する場合、標的遺伝子の絶対発現量が直接測定されることはあまりないが、標的遺伝子および参照遺伝子の発現量はそれぞれ測定される。具体的には、標準となる参照遺伝子の発現量を収集して標的遺伝子の相対発現量を測定し、試料間の相対発現量を比較する。相対定量法を使用して遺伝子の発現量を測定する場合、ｑＰＣＲによって求められるＣｔ値は、線形関係ではなく、指数関数的関係である。したがって、ｔ検定や分散分析（ＡＮＯＶＡ）方法など、データの正規分布を必要とする統計解析手方法には、Ｃｔ値を直接用いることはできない。そのため、統計解析を行う前に、まず元のＣｔ値を２^－Ｃｔに変換し、データを線形関係にする必要がある。相対定量法でデータを求めた後、データ解析には比較ＣＴ法（２^{－ΔΔＣＴ}法）が多く用いられる。この方法は以下の２つの仮定に基づく。（１）増幅率が１００％、すなわち、各ＰＣＲサイクルにおける生成物の量が２倍になるが、増幅率の検証によって解決することができる。（２）試料の装填量の誤差を補正するための適切な参照遺伝子が存在する。倍率変化＝２^{－ΔΔＣｔ}を計算する式によると、ΔΔＣｔ＝処理群の（標的遺伝子のＣｔ－参照遺伝子のＣｔ）－対照群の（標的遺伝子のＣｔ－参照遺伝子のＣｔ）である。この計算式によれば、相対定量法では、参照遺伝子のＣｔ値がなければ、標的遺伝子の相対発現を計算することができず、参照遺伝子が非常に重要な役割を果たしていることが示唆される。

参照遺伝子は、その発現量が研究条件に影響されず複数の試料の間で一貫して発現され得る既知の参照遺伝子を指し、この遺伝子の発現量を使用して初期材料の使用量を高確度で定量することができる。ハウスキーピング遺伝子の発現量は環境因子の影響を受けにくく、生物のほとんど全ての組織および様々な成長段階において連続的に発現され得るので、ハウスキーピング遺伝子は通常、実験において参照遺伝子として使用される。

参考文献（ＤＯＮＧ Ｅｎｎｉ、ＬＩＡＮＧ Ｑｉｎｇ，ＬＩ Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．、「リアルタイム定量ＰＣＲにおける参照遺伝子の選択」［Ｊ］．Ｃｈｉｎａ Ａｎｉｍａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，４９（１１）：９２－９６）．ＤＯＩ：１０．３９６９／Ｊ．ｉｓｓｎ．０２５８－７０３３．２０１３．１１．０２５）および参考文献（ＺＨＡＯ Ｗｅｎ－Ｊｉｎｇ，ＸＵ Ｊｉｅ，ＢＡＯ Ｑｉｕｈｕａ，ｅｔ ａｌ．、「リアルタイム定量ＰＣＲ用の参照遺伝子の選択」［Ｊ］．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｃｈｉｎａ，２０１０（１２）：１８２５－１８２９．ＤＯＩ：ＣＮＫＩ：ＳＵＮ：ＷＳＷＴ．０．２０１０－１２－０１９）によると、ｑ－ＰＣＲで使用した参照遺伝子は以下の表の通りである。

参照遺伝子に関しては、４種類の参照遺伝子（ＨＰＲＴ１（ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ）、ＧＡＰ（グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ）、ＡＣＴＢ（β－アクチンとしても知られる）およびＧＯＬＧＡ１（ゴルジタンパク質、特にゴルジ自己抗原Ａ１））を本発明においてスクリーニングした。４種類の参照遺伝子（表１に示す）のそれぞれに対応するプライマー－プローブ組成物を使用し、細胞株ＣＣＲＦ－ＣＥＭで検出して、蛍光強度および増幅を評価した。異なる試料（健康な血液試料および白血病患者の骨髄試料を含む）および発現量が異なる細胞株（ＡＫＲ１Ｃ３発現が高い細胞株およびＡＫＲ１Ｃ３発現が低い細胞株を含む）をさらに検出して、発現安定性を検証し、発現量が高い試料および細胞株と発現量が低い試料および細胞株を区別することができるかどうかを検証した。検出された結果から、基準として他の３つの参照遺伝子を使用する場合と比較して、基準としてＡＣＴＢを使用することにより発現量が高い細胞株ＲＰＭＩ８２２６およびＣＣＲＦ－ＣＥＭと発現量が低い細胞株Ｊｕｒｋａｔとを区別しやすいことがわかった。白血病患者の骨髄ＲＮＡ試料ではＡＫＲ１Ｃ３の発現量が高かったが、健常者の値は比較的低量のままであった。増幅曲線の結果に基づいて、ＡＣＴＢを参照遺伝子として選択した。したがって、上記キットにおける参照遺伝子のプライマー－プローブ組成物は、上流プライマーＡＣＴＢ－Ｆ１、下流プライマーＡＣＴＢ－Ｒ１およびプローブＡＣＴＢ－Ｐ１を含む。

本発明の好ましい実施形態では、プローブＡＣＴＢ－Ｐ１の５’末端レポーターがＶＩＣ（緑色蛍光タンパク質）であり、プローブＡＣＴＢ－Ｐ１の３’末端クエンチャーがＢＨＱ１（ブラックホールクエンチャー１）である。

スクリーニング後に最終的に決定された最良のＡＫＲ１Ｃ３プライマー－プローブ組成物および基準ＡＣＴＢプライマー－プローブ組成物を表１に示す。

参考文献１：Ｗｕ，Ｘ．，Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｐ．，Ｔｓｃｈｕｍｐｅｒ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．、「多発性骨髄腫細胞における後天性突然変異の機能を分析するツールとしてのＴＡＬＥＮが介在する遺伝子調整」Ｂｌｏｏｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｊｏｕｒｎａｌ ４，ｅ２１０（２０１４）ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｂｃｊ．２０１４．３２に開示されている対応する核酸配列。
参考文献２：国際公開第２０１８／１２３７６４号に開示されているＨＰＲＴ１核酸配列。
参考文献３：Ｗｅｒｎｅｒ Ｋｅｍｐｆ，Ｍａｒｓｈａｌｌ Ｅ．Ｋａｄｉｎ，Ａｎｎ Ｍ．Ｄｖｏｒａｋ，Ｃａｒｏｌ Ｃ．Ｌｏｒｄ，Ｇｕｎｔｅｒ Ｂｕｒｇ，Ｎｏｒｍａｎ Ｌ．Ｌｅｔｖｉｎ，Ｉｇｏｒ Ｊ．Ｋｏｒａｌｎｉｋ、「皮膚のＣＤ３０陽性リンパ増殖性疾患では、内因性レトロウイルス要素は検出されるが、外因性レトロウイルス要素は検出されない」Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，Ｖｏｌｕｍｅ ２４，Ｉｓｓｕｅ ２，Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２００３，Ｐａｇｅｓ ３０１－３０６，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０９３／ｃａｒｃｉｎ／２４．２．３０１に開示されている対応する核酸配列。
参考文献４：Ｓｔｅｃｋｅｒ Ｃ，Ｊｏｈａｎｎ Ａ，Ｈｅｒｚｂｅｒｇ Ｃ，Ａｖｅｒｈｏｆｆ Ｂ，Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ Ｇ．、「ロドコッカス・エリスロポリスＢＤ２の２１０キロベースの線状プラスミドの完全なヌクレオチド配列と遺伝子構成」Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．２００３；１８５（１７）：５２６９－５２７４．ｄｏｉ：１０．１１２８／ｊｂ．１８５．１７．５２６９－５２７４．２００３に開示されている対応する核酸配列。

出典に記載されていない全ての塩基配列は、新たな塩基配列またはキットのために新たに開発された、もしくは、選択された塩基配列であった。

本発明の好ましい実施形態では、前記キットは、さらに、ポリメラーゼ混合物を含み、
前記ポリメラーゼ混合物は、ＤＮＡポリメラーゼ、ＭｇＣｌ_２、緩衝液およびｄＮＴＰを主に含み、
好ましくは、前記ポリメラーゼ混合物は、研究室で長年使用されており、増幅率が良いことが反復検証されているＫＡＰＡ ＰＲＯＢＥ ＦＡＳＴ ＲＴ－ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（２×）を選択する。

本発明の好ましい実施形態では、前記キットは、さらに、逆転写酵素混合物を含み、好ましくは、前記逆転写酵素混合物がＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＶＩＬＯ ＭＡＲＳＴＥＲ ＭＩＸである。

各ＰＣＲ反応は、いずれも陽性対照および陰性対照（ＮＣ、ヌクレアーゼを含まない水）と共に検出して分析しなければならない。本発明の好ましい実施形態では、前記キットは、陰性対照および陽性対照をさらに含み、好ましくは、前記陰性対照がヌクレアーゼを含まない水であり、および／または、好ましくは、前記陽性対照がコピー数が既知の参照である。

前記キットはｑＰＣＲを実施するために必要な要素、例えば、当業者に公知の試薬をさらに含んでもよい。プライマー対およびプローブに加えて、前記キットは、さらにｑＰＣＲ反応において使用される１つ以上の酵素（Ｔａｑポリメラーゼ）または試薬を含んでもよい。前記酵素は、凍結乾燥形態または適切な緩衝液中に存在することができる。加えて、前記キットは、例えば、緩衝液、抽出試薬、酵素、ピペット、プレート、核酸、濾紙、ゲル材料、転写材料、オートラジオグラフィー装置、説明書（記録関連操作方法）などのｑＰＣＲを実施するために必要な全ての追加の要素を含んでもよい。

同様の発明概念に基づいて、本発明の第３の態様は、がん治療薬の調製における、前記プライマー－プローブ組成物またはキットの使用を提供する。

本発明の好ましい実施形態では、患者のｅｘ ｖｉｖｏ試料中のＡＫＲ１Ｃ３ ＲＮＡ含有量を、前記プライマー－プローブ組成物または前記キットを用いて求め、ＡＫＲ１Ｃ３ ＲＮＡ含有量が所定の含有量以上の患者に、ＡＫＲ１Ｃ３活性化抗がん剤を投与する。

したがって、本発明は、
上記のようなプライマー－プローブ組成物またはキットを用いて、患者のｅｘ ｖｉｖｏ試料中のＡＫＲ１Ｃ３ ＲＮＡ含有量を求める工程と、
ＡＫＲ１Ｃ３ ＲＮＡ含有量が所定の含有量以上の患者にＡＫＲ１Ｃ３活性化抗がん剤を投与する、好ましくは、治療有効量の化合物ＯＢＩ－３４２４、ＯＢＩ－３４２３およびＯＢＩ－２８７０を患者に投与する工程と
を含むがん患者を治療する方法を提供する。

本発明の好ましい実施形態では、前記ＡＫＲ１Ｃ３ ＲＮＡ含有量をＡＫＲ１Ｃ３コピー数／参照遺伝子コピー数の比に従って求め、例えば、ＡＫＲ１Ｃ３コピー数／ＡＣＴＢコピー数の比を計算し、ＡＫＲ１Ｃ３コピー数／ＡＣＴＢコピー数の比がＸより大きい場合、ＡＫＲ１Ｃ３の発現が高いと判定し、患者に治療有効量の化合物ＯＢＩ－３４２４、ＯＢＩ－３４２３およびＯＢＩ－２８７０を与え、ＡＫＲ１Ｃ３コピー数／ＡＣＴＢコピー数の比がＸ以下である場合、ＡＫＲ１Ｃ３の発現が低いと判定し、患者に治療有効量の化合物ＯＢＩ－３４２４、ＯＢＩ－３４２３およびＯＢＩ－２８７０を与えず、他のがん薬剤を与えることができる。

所定の含有量Ｘの値は、多数の試料を検出することによって決定する必要がある。多数の臨床試験試料および統計的方法によって、本発明者らは最終的に、前記所定の含有量Ｘを０．０００１～１、より好ましくは、前記所定の含有量Ｘを０．０００１１～０．５、さらにより好ましくは、前記所定の含有量Ｘを０．０００１３～０．０５、特に好ましくは前記所定の含有量Ｘを０．０００１４～０．０１５と決定した。例えば、前記所定の含有量Ｘは０．０００１～０．０００５、０．０００１～０．００１、０．０００１～０．００５、０．０００１～０．０１、０．０００１～０．０５、０．０００１～０．１、０．０００１～０．５、０．０００１～０．９、０．０００１１～０．０００５、０．０００１１～０．００１、０．０００１１～０．００５、０．０００１１～０．０１、０．０００１１～０．０５、０．０００１１～０．１、０．０００１１～０．５、０．０００１１～１、０．０００１３～０．０００５、０．０００１３～０．００１、０．０００１３～０．０１、０．０００１３～０．０５、０．０００１３～０．１、０．０００１３～０．５、０．０００１３～１、０．０００５～０．００１、０．０００５～０．００５、０．０００５～０．０１、０．０００５～０．０５、０．０００５～０．１、０．０００５～０．５、０．０００５～１、０．０００９１～０．００１、０．０００９１～０．０５、０．０００９１～０．１、０．０００９１～０．５、０．０００９１～１、０．００１～０．００５、０．００１～０．０１、０．００１～０．０５、０．００１～０．１、０．００１～０．５、０．００１～１、０．００５～０．０１、０．００５～０．０５、０．００５～０．１、０．００５～０．５、０．００５～１、０．０１～０．０５、０．０１～０．１、０．０１～０．５、０．０１～１、０．０５～０．１、０．０５～０．５または０．０５～１であり、より好ましくは前記所定の含有量Ｘは０．０００１、０．０００１１、０．０００１２、０．０００１３、０．０００１４、０．０００１５、０．０００１５６、０．０００１６、０．０００１６３、０．０００１６５、０．０００１７、０．０００１７７、０．０００１８、０．０００１８１、０．０００１９、０．０００１９５、０．０００２、０．０００２０１、０．０００２１６、０．０００２２１、０．０００２３、０．０００２３９、０．０００２５、０．０００２９、０．０００３、０．０００３５、０．０００４、０．０００４５、０．０００５、０．０００５４、０．０００６、０．０００６５、０．０００７、０．０００７５、０．０００８、０．０００８５、０．０００９、０．０００９５、０．００１、０．００１５、０．００１７７、０．００２、０．００２３８、０．００２５、０．００２６６、０．００２９６、０．００３、０．００３１５、０．００３５、０．００４、０．００４５、０．００５、０．００５５、０．００６、０．００６５、０．００６７９、０．００７、０．００７１０、０．００７５、０．００７７８、０．００７９１、０．００８、０．００８５、０．００９、０．００９３９、０．００９５、０．０１、０．０１１、０．０１２、０．０１２０７、０．０１３、０．０１３６５、０．０１４、０．０１５、０．０１６、０．０１７、０．０１８、０．０１９、０．０２、０．０２５、０．０３、０．０３５、０．０４、０．０４５、０．０５、０．０５５、０．０６、０．０６５、０．０７、０．０７５、０．０８、０．０８５、０．０９、０．０９５、０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．３５、０．４、０．４５、０．５、０．５５、０．６、０．６５、０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．９、０．９５または１である。

同様の発明概念に基づいて、本発明の第４の態様は、
（１）検出対象のｅｘ ｖｉｖｏ試料のＲＮＡを抽出し、前記抽出したＲＮＡを逆転写系に添加し、前記抽出したＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを合成する工程と、
（２）上記のプライマー－プローブ組成物またはキットを用いて、ｃＤＮＡをテンプレートとしてｑＰＣＲまたはデジタルＰＣＲ増幅を行う工程と、
（３）ｑＰＣＲまたはデジタルＰＣＲ増幅結果に従って検出対象のｅｘ ｖｉｖｏ試料のＡＫＲ１Ｃ３ ＲＮＡ含有量を求める工程と、
を含む、ＡＫＲ１Ｃ３ ＲＮＡ含有量を検出する方法を提供する。

本発明のＡＫＲ１Ｃ３ ＲＮＡ含有量を検出する方法の方法論的原理は次の通りである。まず、試料ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、その後、特異的プライマーおよびプローブによってｃＤＮＡを増幅する。ＡＫＲ１Ｃ３遺伝子および参照遺伝子はそれぞれ、ＦＡＭおよびＶＩＣ信号によって示し、末梢血ＲＮＡ試料中のＡＫＲ１Ｃ３遺伝子の定量的発現量は試料およびＱＣ（ｑｕａｌｉｔｙ ｃｏｎｔｒｏｌ）生成物によって計算する。同時に、ＡＫＲ１Ｃ３反応溶液中のＶＩＣ信号を用いて、試料の品質をモニターする。

本発明では、ｑＰＣＲおよびデジタルＰＣＲの２つの方法を用いて、十分な試料の条件下で比較実験を同時に実施する。同じプライマー－プローブセットをデジタルＰＣＲおよびｑＰＣＲに使用する。まず、ｑＰＣＲの温度勾配を用いてプライマー－プローブを最適化し、定量的参照物質用のデジタルＰＣＲプラットフォームおよび比較方法のために最も適切な温度およびプライマー－プローブ組成物を選択する。

デジタルＰＣＲの検出プロセスは、主に２つの部分、すなわちＰＣＲ増幅および蛍光信号解析を含む。ＰＣＲ反応の前に、試料を数万単位（反応チャンバー）に分割し、各単位に単一のＤＮＡ分子のみが存在するようにする。デジタルＰＣＲの増幅手順および増幅段階のシステムは基本的には通常のＰＣＲと同じであるが、従来のｑＰＣＲ法とは異なり、デジタルＰＣＲは定量分析に直接計数法を採用する。すなわち、ＰＣＲ増幅の終了後に、蛍光信号（生成物）が存在する場合には１とマークし、蛍光信号（生成物）が存在しない場合には０としてマークする。蛍光信号を有する反応単位は、標的分子の少なくとも１つのコピーを含む。理論的には、試料中の標的ＤＮＡの濃度が非常に低い場合、蛍光信号を有する反応単位の数は標的ＤＮＡ分子のコピー数に等しい。しかしながら、通常の状況下では、デジタルＰＣＲの反応単位がポアソン分布によって計算できる２つ以上の標的分子を含有することもある。

上記の式において、λは各反応単位に含まれる標的ＤＮＡ分子の平均コピー数（濃度）であり、ｐは、特定のλ条件下における各反応単位に含まれる標的ＤＮＡ分子のｋコピーの確率である。λは試料溶液の希釈係数ｍによって決定され、λ＝ｃｍであり、ここで、ｃは、試料の元のコピー数（濃度）である。ｋ＝０（標的ＤＮＡ分子なし）の場合、上記式はｐ＝ｅ^－λ＝ｅ^－ｃｍとして簡略化することができ、ｐは反応単位の総数に対する蛍光信号なしの反応単位の数の比率、すなわち、以下の式で表される。

式中、ｎは反応単位の総数であり、ｆは蛍光信号を有する反応単位の数である。上記の式の両辺の対数（ｌｎ）を取って、

を求める。

試料の初期コピー数（濃度）は、デジタルＰＣＲにおける反応単位の総数および蛍光信号を有する単位の数、ならびに試料の希釈係数から求めることができる。デジタルＰＣＲの定量的方法は、増幅曲線の環状閾値に依存しないため、増幅率に影響されず、検量線を使用する必要がない。高確度で再現性が良いため、絶対定量分析が可能である。

本発明において、デジタルＰＣＲの特異的反応系はｑＰＣＲの特異的反応系とは次の点で異なる。ｑＰＣＲ反応系では、群（ｉ）～（ｉｘ）から選択されるプライマー－プローブ組成物の群が参照遺伝子ＡＣＴＢのプライマー－プローブ組成物と混合される。一方、デジタルＰＣＲ反応系では、試料および細胞株におけるＡＫＲ１Ｃ３およびＡＣＴＢの発現量の差が大きいことから、Ｃｔの最大差が１０Ｃｔ値に達し得る。したがって、ＶＩＣのコピー数は、デジタルＰＣＲ検出中のＦＡＭのコピー数よりもはるかに大きい可能性がある。そこで、群（ｉ）～（ｉｘ）から選択されるプライマー－プローブ組成物の群は参照遺伝子ＡＣＴＢのプライマー－プローブ組成物と混合されないが、ＡＫＲ１Ｃ３デジタルＰＣＲ検出システムおよび参照遺伝子デジタルＰＣＲ検出システムはそれぞれ、ＡＫＲ１Ｃ３および参照遺伝子の増幅のために使用される。

ＰＣＲ増幅結果は、反応系の様々な因子（プライマー濃度、プローブ濃度などを含む）および増幅手順の変化の影響を受ける。最良の増幅率および最少の非特異的産物を得るために、本出願は、数年の研究および開発経験に基づいて、デジタルＰＣＲおよびｑＰＣＲの反応系および増幅手順を決定する。プローブ－プライマーの選択と組み合わせて、検量線の相関係数を確実に０．９８以上とし、Ｅ値（増幅率）は８５％～１１０％とする。

本発明の好ましい実施形態では、前記工程（３）において、ｑＰＣＲまたはデジタルＰＣＲ増幅結果により、検出対象のｅｘ ｖｉｖｏ試料のＡＫＲ１Ｃ３ ＲＮＡ含有量を求める工程が、
（Ａ）ｑＰＣＲまたはデジタルＰＣＲ増幅結果により、検出対象のｅｘ ｖｉｖｏ試料のＡＫＲ１Ｃ３および参照遺伝子のコピー数をそれぞれ求める工程と、
（Ｂ）ＡＫＲ１Ｃ３コピー数／参照遺伝子コピー数の比を計算して、検出対象のｅｘ ｖｉｖｏ試料のＡＫＲ１Ｃ３ ＲＮＡ含有量を求める工程と
を含む。

前記ｑＰＣＲ法を用いる場合、前記工程（Ａ）はさらに
（Ａ_１）ＡＫＲ１Ｃ３のＣｔ値および初期コピー数ｌｇ値の検量線、並びに参照遺伝子のＣｔ値および初期コピー数ｌｇ値の検量線をそれぞれプロットする工程と、
（Ａ_２）前記検量線により、検出されたＡＫＲ１Ｃ３および参照遺伝子のＣｔ値によって検出対象のｅｘ ｖｉｖｏ試料のＡＫＲ１Ｃ３および参照遺伝子のコピー数をそれぞれ求める工程（これは、ソフトウェアによって自動的に計算することができる）と
を含む。

デジタルＰＣＲとｑＰＣＲとのその他の違いは、ｑＰＣＲは検量線に従ってＡＫＲ１Ｃ３のコピー数と検出対象のｅｘ ｖｉｖｏ試料の参照遺伝子を取得するのに対し、デジタルＰＣＲは検量線を描くことなく増幅結果に従って検出対象のｅｘ ｖｉｖｏ試料のＡＫＲ１Ｃ３と参照遺伝子のコピー数を直接取得できることである。

標的遺伝子ＡＫＲ１Ｃ３のＣｔ値と参照遺伝子のＣｔ値を説明する。標的遺伝子ＡＫＲ１Ｃ３のＣｔ値は、標的遺伝子ＡＫＲ１Ｃ３の増幅信号（ＦＡＭ信号）に対応するＣｔ値である。参照遺伝子のＣｔ値は、参照遺伝子の増幅信号（ＶＩＣ信号）に対応するＣｔ値である。ＦＡＭおよびＶＩＣの閾値は、指数増幅段階中に設定される。

本発明の好ましい実施形態では、前記方法を使用して血液試料、骨髄試料、または組織試料中のＡＫＲ１Ｃ３ ＲＮＡ含有量を検出する。本発明のデジタルＰＣＲおよびｑＰＣＲは、血液試料または骨髄試料を検出するだけでなく、前処理プロセス（ＲＮＡ抽出プロセスなど）が異なること以外は、固形腫瘍の組織試料を検出することもできる。例えば、血液試料では、ＲＮＡ抽出をＱｉａｇｅｎ製の抽出キットを使用して直接実施することができ、骨髄試料または組織試料では、乳鉢を液体窒素で予冷することができ、骨髄試料または組織試料を乳鉢中で粉末にすりつぶし、乾燥した組織粉末を１．５ｍｌのＥＰチューブに入れた後、ＲＮＡ抽出キットを抽出に使用する。

本願は上記キットおよび検出方法について性能試験を行ったものであり、その試験結果は以下の通りである。
１．最低検出限界：最低検出限界を検出対象の試料として使用した低発現細胞株の勾配希釈により決定し、１０回反復したところ、検出結果は１００％一致した。
２．精度：異なる時間、機器、実験者による検出を反復したところ、ＣＶ値は１５％未満であった。
３．陽性一致率：既知の陽性試料と検量線をｑＰＣＲ法で検出したところ、検出率は１００％一致し、検量線のＥ値は９０～１１０％であり、Ｒ^２は０．９８以上であった。
４．陰性一致率：既知の陰性試料をｑＰＣＲにより検出したところ、検出結果の一貫した検出率は１００％であった。
５．異なる装填テンプレート量：既知の陰性および陽性試料の２００ｎｇおよび１０ｎｇのＲＮＡをそれぞれ逆転写の初期量として選択し、装填量の範囲を検証したところ、検出結果の一貫した検出率は１００％であった。
６．解析特異性：陰性基準の２つの濃度を選択し、各濃度量を３回反復したところ、陰性率は１００％であった。
７．実物試料検出：実物試料検出のために８個の正常な末梢血ＲＮＡ試料を選択したところ、検出結果の一致率は１００％であった。

最低検出限界、精度、陰性一致率、陽性一致率、テンプレート量、分析特異性および実物試料検出の性能検証を行ったところ、７つの性能の全てが検証基準を満たした。前記検出方法の性能は臨床適用の要件を満たしたため、臨床試料検出に使用可能である。

同様の発明概念に基づき、本発明の第５の態様は、前記方法を用いて、検出対象のｅｘ ｖｉｖｏ試料のＡＫＲ１Ｃ３ ＲＮＡ含有量を検出し、その後、前記検出対象のｅｘ ｖｉｖｏ試料のＡＫＲ１Ｃ３ ＲＮＡ含有量に従って、前記検出対象のｅｘ ｖｉｖｏ試料のＡＫＲ１Ｃ３酵素の発現量を求める。

本発明の好ましい実施形態では、前記検出対象のｅｘ ｖｉｖｏ試料中のＡＫＲ１Ｃ３ ＲＮＡ含有量と、前記検出対象のｅｘ ｖｉｖｏ試料中のＡＫＲ１Ｃ３酵素の発現量との間に線形相関がある。

従来技術では、化合物ＯＢＩ－３４２４、ＯＢＩ－３４２３およびＯＢＩ－２８７０の投与は通常、ＡＫＲ１Ｃ３レダクターゼ含有量が所定の含有量以上であるかどうかに基づいて判断するが、本発明の実施例４ではＡＫＲ１Ｃ３酵素の発現量がＡＫＲ１Ｃ３ ＲＮＡの発現量と高度に相関することを証明する。したがって、実用化においては、上記の方法で測定したＡＫＲ１Ｃ３ ＲＮＡ含有量によりＡＫＲ１Ｃ３酵素含有量を算出し、その後、ＡＫＲ１Ｃ３酵素含有量が前記所定の含有量に達したか否かにより、化合物ＯＢＩ－３４２４、ＯＢＩ－３４２３およびＯＢＩ－２８７０の投与を判断する。

本発明によって提供される技術的実施形態を、以下の実施例においてさらに説明する。以下の実施例は、本発明を説明するためにのみ使用され、本発明の保護範囲を限定するものではない。

以下の実施例で使用されるＡＫＲ１Ｃ３活性化抗がんプロドラッグＯＢＩ－３４２４（ＡＳＴ－３４２４またはＴＨ－３４２４ともいう）の合成方法は、国際公開第２０１７／０８７４２８号または中国特許出願公開第１０８２９０９１１号明細書を参照できる。

［実施例１］
肝臓がん細胞株と非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）細胞株におけるＡＫＲ１Ｃ３タンパク質量およびＲＮＡ量とＩＣ_５０値との相関性

１．実験材料および方法

１．１ 細胞株
全てのヒトがん細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ社（ＡＴＣＣ社、バージニア州マナサス）またはＪＣＲＢ細胞バンク（ＪＣＲＢ、日本、大阪）またはＣｏｂｉｏｅｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（中国、南京）から入手した。

１．２ ｅｘ ｖｉｖｏ増殖アッセイ法
指数関数的に増殖する細胞を播種した。２４時間後、試験化合物ＯＢＩ－３４２４を加えた。試験化合物ＯＢＩ－３４２４を加えた後、プレートを、標準的な組織インキュベーターの中で、３７℃で指示された時間インキュベートした。実験の終わりに、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏ（ＣＴＧ）アッセイキットまたはＡｌａｍａｒＢｌｕｅを使用して、生存細胞を検出した。未処理対照と比較して５０％の増殖抑制をもたらす薬剤濃度（ＩＣ_５０）を、ＸＬｆｉｔ（ＩＤＢＳ社、マサチューセッツ州ボストン）またはプリズム６（ＧｒａｐｈＰａｄ社、カリフォルニア州サンディエゴ）を用いて計算した。

１．３ ウェスタンブロット法
ヒト細胞抽出物を調製し、タンパク質濃度を決定した。タンパク質を、ヒトＡＫＲ１Ｃ３およびチューブリンまたはβ－アクチンを認識する抗体を用いて検出した。Ｏｄｙｓｓｅｙレーザーイメージングシステムおよびソフトウェア（ＬＩ－ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ネブラスカ州リンカーン）またはＵＶＰ ＣｈｅｍＳｔｕｄｉｏイメージングシステムおよびＶｉｓｉｏｎＷｏｒｋｓソフトウェア（Ａｎａｌｙｔｉｋ Ｊｅｎａ社）を使用して、ＡＫＲ１Ｃ３とチューブリンまたはβ－アクチンのバンド密度を走査して定量し、ＡＫＲ１Ｃ３のチューブリンまたはβ－アクチンに対する比を計算した。

２． 実験結果
肝細胞がん細胞株を化合物ＯＢＩ－３４２４に９６時間曝露し、ＮＳＣＬＣ細胞株を化合物ＯＢＩ－３４２４に７２時間曝露した後、ｅｘ ｖｉｖｏ増殖アッセイによりＩＣ_５０を決定し、肝細胞がん細胞株におけるＡＫＲ１Ｃ３タンパク質の発現をウェスタンブロット法により決定した（チューブリンを装填対照として使用した）。肝細胞がん細胞株およびＮＳＣＬＣ細胞株におけるＡＫＲ１Ｃ３ ＲＮＡの発現データは、ＣｒｏｗｎＢｉｏデータベース（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｂ．ＣｒｏｗｎＢｉｏ．ｃｏｍ／ｃｒｏｗｎｂｉｏ／ＯｎｃｏＥｘｐｒｅｓｓ＿Ｌｏｇｉｎ．ａｓｐｘ）から入手した。結果を、表２および３に示す。

表２および３に示すように、タンパク質量およびＲＮＡ量の両方でＡＫＲ１Ｃ３発現が高い肝細胞がん細胞株はＯＢＩ－３４２４に対してより感度が高く、ＩＣ_５０は低ナノモル範囲内であった。一方、ＡＫＲ１Ｃ３発現が低い細胞は、ＯＢＩ－３４２４に対する感度が低く、ＩＣ_５０は１０００ｎＭより高かった。同様に、ＮＳＣＬＣ細胞を化合物ＯＢＩ－３４２４に７２時間曝露した後、ＮＳＣＬＣ細胞もＡＫＲ１Ｃ３依存的細胞毒性を示した（表３）。肝細胞における３４２４ＩＣ_５０はＡＫＲ１Ｃ３タンパク質量と高度に相関し（Ｒ^２＝０．７１、図１、左）、肝細胞における３４２４ＩＣ_５０はＡＫＲ１Ｃ３ ＲＮＡの発現量と高度に相関し（Ｒ^２＝０．８７、図１、中央）、非小細胞肺がんにおける３４２４ＩＣ_５０はＡＫＲ１Ｃ３ ＲＮＡの発現量と高度に相関した（Ｒ^２＝０．８０、図１、右）。これらの結果は、肝細胞株およびＮＳＣＬＣ細胞株における３４２４媒介性細胞毒性がＡＫＲ１Ｃ３の発現量と高度に相関することを示した。

［実施例２］
白血病細胞株におけるＡＫＲ１Ｃ３タンパク質量とＩＣ_５０値との相関性

１． 実験材料および方法

１．１ 細胞株およびＰＤＸのｅｘ ｖｉｖｏ試験
全ての細胞株は、ＨＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社から購入した。すべての実験作業はそれぞれの施設の審査委員会および動物倫理委員会の承認の下で実施し、ヒト関連組織試料の使用は実験を行う地域の倫理的および関連する法的規制に従って実施した。２０～２５ｇの女性非肥満／ＳＣＩＤ（ＮＯＤ．ＣＢ１７－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／ＳｚＪ、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）またはＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２受容体γ陰性（ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}／ＳｚＪＡｕｓｂ、ＮＳＧ）で以前に確立された連続ＰＤＸを、他の箇所で記載されているように実験に使用した（Ｌｏｃｋ ＲＢ，Ｌｉｅｍ Ｎ，Ｆａｒｎｓｗｏｒｔｈ ＭＬ，Ｍｉｌｒｏｓｓ ＣＧ，Ｘｕｅ Ｃ，Ｔａｊｂａｋｈｓｈ Ｍ，ｅｔ ａｌ．、「小児急性リンパ芽球性白血病の非肥満糖尿病／重症複合免疫不全（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）マウスモデルは、診断時および再発時の生物学的特徴の内因性の差異を明らかにする」、Ｂｌｏｏｄ ２００２；９９：４１００－８）。レレンチウイルス形質導入ＡＬＬ－１１ ＰＤＸ［空ベクター（ＥＶ）およびＡＫＲ１Ｃ３過剰発現］の開発は、以前から記載されている（Ｊａｍｉｅｓｏｎ ＳＭ，Ｇｕ Ｙ，Ｍａｎｅｓｈ ＤＭ，Ｅｌ－Ｈｏｓｓ Ｊ，Ｊｉｎｇ Ｄ，Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ ＫＬ，ｅｔ ａｌ．、「アルドケト還元酵素１Ｃ３の新しい蛍光分析アッセイは、ヒト白血病細胞におけるナイトロジェンマスタードプロドラッグＰＲ－１０４Ａの代謝活性化を予測する」、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ２０１４；８８：３６－４５）。

１．２ ｅｘ ｖｉｖｏ細胞毒性アッセイ
白血病細胞株を、ＦＢＳ（Ｂｉｏｓｅｒａ社）を加えたＲＰＭＩ培地に懸濁する一方で、ＡＬＬ ＰＤＸ細胞を、Ｆｌｔ－３リガンド（２０ｎｇ／ｍＬ、ＢｉｏＮｏｖｕｓ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）またはＩＬ７（１０～２０ｎｇ／ｍＬ、Ｊｏｍａｒ Ｌｉｆｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）を加えたＱＢＳＦ培地（Ｑｕａｌｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社）で培養した。最適な細胞密度に応じて細胞を播種し、３時間または一晩インキュベートした（３７℃、５％ＣＯ_２）。ＰＤＸ細胞および白血病細胞株を、それぞれＯＢＩ－３４２４（１０ｍｍｏｌ／Ｌ－１ｐｍｏｌ／Ｌ）または培地対照で４８時間または７２時間処理した。生存率を、Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ還元アッセイまたはＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏ発光細胞生存アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて決定した。半最大抑制濃度（ＩＣ_５０）を用いてＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７ソフトウェアにより非線形回帰曲線の内挿を計算した。

１．３ ウェスタンブロット法
凍結保存した白血病細胞を解凍し、ＲＩＰＡ溶解緩衝液中で溶解し、タンパク質濃度をＢＣＡアッセイによって定量した。各試料にＮｕＰＡＧＥ濃度４～１２％のＢｉｓ－Ｔｒｉｓタンパク質ゲル中の２０μｇのタンパク質溶解物を装填し、その後１２０Ｖで電気泳動し、ポリビニレンジフルオリド膜に３０Ｖで１時間移した。マウス抗ＡＫＲ１Ｃ３（＃Ａ６２２９、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｓミズーリ州セントルイス）またはウサギ抗アクチン一次抗体（＃Ａ２０６６、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）を使用し、続いてセイヨウワサビペルオキシダーゼ結合抗マウスまたは抗ウサギＩｇＧ二次抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、イギリス、バッキンガム）をそれぞれ使用して膜をプローブした。Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎウェスタン化学発光ＨＲＰ基質（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、マサチューセッツ州ビレリカ）を使用して、ＢｉｏＲａｄ Ｃｈｅｍｉｄｏｃ ｔｏｕｃｈイメージングシステムにおける信号を定量化することによって、共役二次抗体を検出した。

２． 実験結果
ＡＫＲ１Ｃ３関連ＯＢＩ－３４２４のｅｘ ｖｉｖｏ細胞毒性を、１１種類のＴ－ＡＬＬ細胞株、顆粒球コロニー刺激因子をトランスフェクトした１つのＢ－ＡＬＬ細胞株、および１つのＢＣＰ－ＡＬＬ細胞株において観察した。ＡＫＲ１Ｃ３タンパク質の発現量を、ウェスタンブロット分析によって決定した。ＯＢＩ－３４２４のｅｘ ｖｉｖｏ細胞毒性を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏアッセイを用いて決定し、５０％最高発育阻止濃度（ＩＣ_５０）として計算した。

ＯＢＩ－３４２４によってｅｘ ｖｉｖｏ細胞毒性は実証され、ＡＫＲ１Ｃ３発現量の高い（強い）６種類の細胞株において、ＩＣ_５０は３．０～３０．０ｎＭの範囲であった。ＡＫＲ１Ｃ３発現量が中程度の細胞株において、ＩＣ_５０は３．０～８４．０ｎＭの範囲であった（表４）。

ＯＢＩ－３４２４の潜在的な抗白血病活性を評価するために、ｅｘ ｖｉｖｏ細胞毒性アッセイを様々な白血病細胞株に対して行った。それにより、ＯＢＩ－３４２４は、Ｔ－ＡＬＬ、Ｂ－ＡＬＬ、急性骨髄性白血病、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）および赤白血病を治療できることが証明された。ＯＢＩ－３４２４は、ＡＫＲ１Ｃ３発現が特に高いＴ－ＡＬＬ（Ｔ－系統急性リンパ芽球性白血病）に由来する細胞株に対して強力な細胞毒性を示し、ＩＣ_５０は低範囲（ｎｍｏｌ／Ｌ）であった（表５参照）。ＡＫＲ１Ｃ３発現が高い／中程度の細胞株およびＡＫＲ１Ｃ３発現が低い細胞株間のＩＣ_５０の差異は、統計的に顕著であった（Ｐ＝０．００１６）。

白血病細胞株から得られた結果と同様に、ＯＢＩ－３４２４は、全ての白血病細胞株に対して強力な細胞死滅効果を発揮した。図２ａは６種類のＢ－ＡＬＬ細胞株に対するＯＢＩ－３４２４の細胞毒性を示し、図２ｂは７種類のＴ－ＡＬＬ細胞株に対するＯＢＩ－３４２４の細胞毒性を示した。図２ａおよび図２ｂから、ＯＢＩ－３４２４のＡＫＲ１Ｃ３依存性活性がＤＮＡアルキル化試薬であることが分かる。また、図２ｃに示すように、ＯＢＩ－３４２４の濃度１０ｎｍｏｌ／Ｌで、ＡＫＲ１Ｃ３タンパク質発現は、１８種類のＡＬＬ ＰＤＸのｅｘ ｖｉｖｏの細胞生存率と有意な負の相関を示した（ｒ＝－０．５３、Ｐ＝０．０２３）。同様に、図２ｄに示すように、ＯＢＩ－３４２４の濃度１００ｎｍｏｌ／Ｌで、ＡＫＲ１Ｃ３タンパク質発現は、１８種類のＡＬＬ ＰＤＸのｅｘ ｖｉｖｏでの細胞生存率と有意な負の相関を示した（ｒ＝－０．５６、Ｐ＝０．０１５）。

［実施例３］
白血病細胞株におけるＡＫＲ１Ｃ３ ＲＮＡ量とＩＣ_５０価の相関性

血液がん細胞株を化合物ＯＢＩ－３４２４に７２時間曝露した後、ｅｘ ｖｉｖｏ増殖アッセイによってＩＣ_５０を決定した。血液がん細胞株におけるＡＫＲ１Ｃ３ ＲＮＡの発現データは、ＣｒｏｗｎＢｉｏデータベース（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｂ．ＣｒｏｗｎＢｉｏ．ｃｏｍ／ｃｒｏｗｎｂｉｏ／ＯｎｃｏＥｘｐｒｅｓｓ＿Ｌｏｇｉｎ．ａｓｐｘ）から入手した。結果を表６に示す。

表６のＡＫＲ１Ｃ３ ＲＮＡ（Ｌｏｇ２ ＦＰＫＭ）の発現量およびＩＣ_５０（ｎＭ）を、図３ｄに示すように曲線グラフとしてプロットした。ＩＣ_５０とＡＫＲ１Ｃ３発現量の代数変換値Ｌｏｇ２ ＦＰＫＭとのカーブフィッティングを行い、対応するカーブフィッティング式を求めた。相関係数Ｒ^２＝０．７８８９であり、ＡＫＲ１Ｃ３ ＲＮＡの発現量がＩＣ_５０と有意な線形相関を持つことを示した。

［実施例４］ 白血病細胞株におけるＡＫＲ１Ｃ３タンパク質量とＡＫＲ１Ｃ３ ＲＮＡ量との相関性

１． 実験材料および方法

１．１ 細胞株およびＰＤＸのｅｘ ｖｉｖｏ試験
全ての細胞株は、ＨＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社から購入した。すべての実験作業はそれぞれの施設の審査委員会および動物倫理委員会の承認の下で実施した。２０～２５ｇの女性非肥満／ＳＣＩＤ（ＮＯＤ．ＣＢ１７－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／ＳｚＪ、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）またはＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２受容体γ陰性（ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}／ＳｚＪＡｕｓｂ、ＮＳＧ）で以前に確立された連続ＰＤＸを、他の箇所で記載されているように実験に使用した（Ｌｏｃｋ ＲＢ，Ｌｉｅｍ Ｎ，Ｆａｒｎｓｗｏｒｔｈ ＭＬ，Ｍｉｌｒｏｓｓ ＣＧ，Ｘｕｅ Ｃ，Ｔａｊｂａｋｈｓｈ Ｍ，ｅｔ ａｌ．、「小児急性リンパ芽球性白血病の非肥満糖尿病／重症複合免疫不全（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）マウスモデルは、診断時および再発時の生物学的特徴の内因性の差異を明らかにする」、Ｂｌｏｏｄ ２００２；９９：４１００－８）。レレンチウイルス形質導入ＡＬＬ－１１ ＰＤＸ［空ベクター（ＥＶ）およびＡＫＲ１Ｃ３過剰発現］の開発は、以前から記載されている（Ｊａｍｉｅｓｏｎ ＳＭ，Ｇｕ Ｙ，Ｍａｎｅｓｈ ＤＭ，Ｅｌ－Ｈｏｓｓ Ｊ，Ｊｉｎｇ Ｄ，Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ ＫＬ，ｅｔ ａｌ．、「アルドケト還元酵素１Ｃ３の新しい蛍光分析アッセイは、ヒト白血病細胞におけるナイトロジェンマスタードプロドラッグＰＲ－１０４Ａの代謝活性化を予測する」、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ２０１４；８８：３６－４５）。

１．２ ウェスタンブロット法
凍結保存した白血病細胞を解凍し、ＲＩＰＡ溶解緩衝液中で溶解し、タンパク質濃度をＢＣＡアッセイによって定量した。各試料にＮｕＰＡＧＥ濃度４～１２％のＢｉｓ－Ｔｒｉｓタンパク質ゲル中の２０μｇのタンパク質溶解物を装填し、その後１２０Ｖで電気泳動し、ポリビニレンジフルオリド膜に３０Ｖで１時間移した。マウス抗ＡＫＲ１Ｃ３（＃Ａ６２２９、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｓミズーリ州セントルイス）またはウサギ抗アクチン一次抗体（＃Ａ２０６６、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）を使用し、続いてセイヨウワサビペルオキシダーゼ結合抗マウスまたは抗ウサギＩｇＧ二次抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、イギリス、バッキンガム）をそれぞれ使用して膜をプローブした。Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎウェスタン化学発光ＨＲＰ基質（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、マサチューセッツ州ビレリカ）を使用して、ＢｉｏＲａｄ Ｃｈｅｍｉｄｏｃ ｔｏｕｃｈイメージングシステムにおける信号を定量化することによって、共役二次抗体を検出した。

１．３ ＲＮＡ－Ｓｅｑ解析
一次患者由来の吸引液中のＡＫＲ１Ｃ３発現を分析するために、患者をＢ－ＡＬＬおよびＴ－ＡＬＬとそれらの関連サブグループに分けた。ペアエンド読み取りを、ＳＴＡＲ（Ｄｏｂｉｎ Ａ，Ｄａｖｉｓ ＣＡ，Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ Ｆ，Ｄｒｅｎｋｏｗ Ｊ，Ｚａｌｅｓｋｉ Ｃ，Ｊｈａ Ｓ，ｅｔ ａｌ．、「ＳＴＡＲ：超高速ユニバーサルＲＮＡ－ｓｅｑアライナー」、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２０１３；２９：１５－２１）により、ＧＲＣｈ３７ヒトゲノム参照に対して、推奨ラウンドトリップマッピングパイプラインを介してデフォルトパラメータでマッピングし、Ｐｉｃａｒｄ ＭａｒｋＤｕｐｌｉｃａｔｅｓモジュールを使用して、複製率をマークした。遺伝子アノテーションファイルはＥｎｓｅｍｂｌ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ／）からダウンロードし、ＳＴＡＲ局在化およびその後の遺伝子発現量の評価を行った。遺伝子発現プロフィールを評価するために、注釈された遺伝子の読み値のカウントを、ＨＴＳｅｑ（Ａｎｄｅｒｓ Ｓ，Ｐｙｌ ＰＴ，Ｈｕｂｅｒ Ｗ．、「ＨＴＳｅｑ－高スループットのシーケンスデータを処理するＰｙｔｈｏｎフレームワーク」、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２０１５；３１：１６６－９．）によって呼び出し、ＤＥＳｅｑ２ Ｒプログラムパッケージ（Ａｎｄｅｒｓ Ｓ，Ｈｕｂｅｒ Ｗ．、「配列数データの差次的発現解析」、Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ ２０１０；１１：Ｒ１０６）によって処理して遺伝子発現を正規化ｌｏｇ_２値に正規化した。

ＰＤＸ試料を分析するために、ＩｌｌｕｍｉｎａペアエンドＲＮＡ－ｓｅｑデータを、ＳＴＡＲを用いてＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅＳＡＭに設定されたｑｕａｎｔＭｏｄｅパラメータでヒトゲノムアセンブリー（構築物ｈｇ３８）にアラインメントし、アラインメントを転写物座標に変換した。ＲＳＥＭ（バージョン１．２．３１）によってコマンドされたｒｓｅｍ計算式を用いてアラインメントを行い、だいたいの遺伝子カウント、ＴＰＭ、ＦＰＫＭ、およびアイソフォーム発現を算出した。すべてのＲＮＡ－ｓｅｑ値は、１００万キロベース当たりの断片の数として表した（ＦＰＫＭ）。ＦＰＫＭデータをｌｏｇ_２換算で実行した。

２． 実験結果
ＲＮＡ－Ｓｅｑ解析（図３ａ）およびウェスタンブロット（図３ｂ）により、様々な種類のＡＬＬにおけるＡＫＲ１Ｃ３ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現量を検出した。結果の分析から、Ｔ－ＡＬＬ（ｎ＝２５）がＢ－ＡＬＬ（ｎ＝６５、Ｐ＜０．０００１）と比較してＡＫＲ１Ｃ３発現が有意に高いことを確認した。さらに、ＡＫＲ１Ｃ３ｍＲＮＡとタンパク質発現との間に有意な相関が認められた（ｒ＝０．５８、Ｐ＝０．０００３、図３ｃ参照）。

［実施例５］ プライマーおよびプローブの設計およびスクリーニング

５．１ 実験材料

５．１．１ 試料情報
本実施例で使用した細胞株はＮａｎｊｉｎｇ Ｃｏｂｉｏｅｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社およびＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｆｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｒｅｓｏｕｒｃｅから購入した。白血病試料は急性リンパ芽球性白血病患者ボランティア（臨床）から入手し、正常試料は健常ボランティア（ドナー）から入手し、ボランティアはインフォームドコンセントに署名した。鮮血試料をＰＡＸＧＥＮＥチューブに保存し、－２０℃で冷蔵庫に保存した。

全てのヒト試料の採取、使用およびその後の処理は、実験の場所に関する中国の関連規制および国際倫理の関連要件に従って実施した。

５．１．２ 機器情報

５．１．３ 試薬情報

５．２ 核酸抽出
ＲＮＡ抽出キットは、Ｑｉａｇｅｎ製の抽出キットであるＰＡＸＧＥＮＥ ＢｌｏｏｄＲＮＡキット（カタログ番号：７６２１７４、ＰＡＸＧＥＮＥチューブに保存された血液に使用）およびＱｉａｇｅｎ製の抽出キットであるＱＩＡａｍｐ ＲＮＡ Ｂｌｏｏｄミニキット（カタログ番号：５２３０４、ＥＤＴＡチューブに保存された血液に使用）を使用した。

説明書に従って、抽出・精製キット（ＰＡＸｇｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ＲＮＡ Ｋｉｔ－ＩＶＤ）を用いて、ＰＡＸｇｅｎｅチューブ中に保存した血液のＲＮＡ抽出を行い、ＱＩＡａｍｐ ＲＮＡ Ｂｌｏｏｄミニキットを用いて、ＥＤＴＡチューブ中に保存された血液のＲＮＡ抽出を行った。推奨されるＲＮＡ核酸定量キット（Ｑｕｂｉｔ ＲＮＡ ＨＳアッセイキット、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｑ３２８５２）を用いて、抽出したＲＮＡの濃度検出を行った。

５．３ 逆転写
４μＬのＡＫＲ１Ｃ３逆転写酵素混合物（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社のＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＶＩＬＯ ＭＡＲＳＴＥＲ ＭＩＸ（カタログ番号：１１７５５０５０））を吸収させ、１６μＬのＲＮＡ試料に添加し（容量が不十分な場合、１６μＬまで水を補充する）、わずかにボルテックスし、混合した後、一時的に遠心分離した。反応溶液を含むＰＣＲチューブをＰＣＲ機器に入れ、ＰＣＲプログラムをｃＤＮＡの合成用に設定した。

５．４ ＡＫＲ１Ｃ３プライマーの設計および選択
９対のプライマーおよびプローブを、ＡＫＲ１Ｃ３の合計３つの標的領域について設計した。プライマー－プローブの位置情報を図４に示す。ＡＫＲ１Ｃ３遺伝子プライマーを設計し、Ｃｏｎｔｒａｃｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ（ＣＲＯ）によって合成した。

５．５ ポリメラーゼと逆転写酵素の選択
ポリメラーゼ混合物はＰＣＲの成功または失敗の重要な要素であり、増幅の効率に影響を及ぼす。ポリメラーゼ混合物の主成分は、ポリメラーゼ、ＭｇＣｌ_２、緩衝液およびｄＮＴＰを含む。市販のポリメラーゼ混合物中の上記成分を特定の割合で最良の状態に最適化し、濃縮母液を作製する。使用する際、ポリメラーゼ緩衝液を増倍剤に比例して添加する限り、対応する検出を行うことができる。良好な増幅率を有することが繰り返し検証されているポリメラーゼＫＡＰＡ ＰＲＯＢＥ ＦＡＳＴ ＲＴ－ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（２×）（カタログ番号：ＫＫ４７０２）を本実施例で使用した。

各ＰＣＲ反応において、陽性基準および陰性対照（ＮＣ、ヌクレアーゼを含まない水）と共に検出および分析しなければならない。ｑＰＣＲ検出プロセスは以下の通りであった。
（１）ＡＫＲ１Ｃ３ポリメラーゼ混合物、ＡＫＲ１Ｃ３反応溶液および基準を取り出し、振盪によって混合し、将来の使用のために一時的に遠心分離する。
（２）被検出試料の数、およびＱＣに必要な反応チューブの総数に応じて、１１．１μＬのＡＫＲ１Ｃ３ｑＰＣＲポリメラーゼ混合物、２．６μＬのＡＫＲ１Ｃ３反応混合物および４．３μＬのヌクレアーゼを含まない水をそれぞれ各試験に含め、ボルテックスによって混合し、一時的に遠心分離した後、ｑＰＣＲ８連チューブに各チューブ１８μＬとなるように分割した。（注：被検出試料とＱＣの両方を２回反復し、ＮＴＣの検出回数が１回以上である必要がある。）。
（３）対応するｑＰＣＲ８連チューブに、それぞれ、被検出試料のｃＤＮＡ、ＱＣおよび基準を加え、８連キャップで蓋をし、ボルテックスにより混合し、一時的に遠心分離する。
（４）ｑＰＣＲ装置の試料槽に８連チューブを入れ、配置順序を記録し、増幅用に最適化された反応条件に従って装置増幅プログラムを設定する。
（５）実験終了後、ＰＣＲ反応ストリップを２層のＰＥ手袋で包み、生物学的廃棄物として処理する。ＰＣＲチューブのキャップは、汚染を防ぐために開けることを禁じた。

５．６ プライマー－プローブの選択

５．６．１ ＡＫＲ１Ｃ３プライマー－プローブのスクリーニング試験
上記の工程５．２～５．５を採用し、まず９対のプライマー－プローブを増幅し、増幅結果を図５に示した。

健常ボランティアの末梢血から全ＲＮＡを抽出し、逆転写によりｃＤＮＡを合成した。Ｆ１Ｒ１Ｐ１、Ｆ２Ｒ２Ｐ１、Ｆ２Ｒ６Ｐ１、Ｆ６Ｒ２Ｐ１、Ｆ６Ｒ６Ｐ１、およびＦ３Ｒ３Ｐ１は、蛍光強度値に関して他のＦ５Ｒ５Ｐ２、Ｆ４Ｒ３Ｐ２、およびＦ７Ｒ７Ｐ３よりも高かったことが増幅結果から分かる。

プライマー－プローブの特異性を考慮して、９対のプライマーに対してブラストを行ったところ、Ｆ２Ｒ６Ｐ１、Ｆ６Ｒ２Ｐ１およびＦ６Ｒ６Ｐ１はより良好な特異性を示し、非特異的産物は出現しなかった。

５．６．２ ＡＫＲ１Ｃ３プライマー－プローブの実物試料試験
３セットのプライマー－プローブ（Ｆ２Ｒ６Ｐ１、Ｆ６Ｒ２Ｐ１、およびＦ６Ｒ６Ｐ１）を用いて、健常ボランティアの末梢血から抽出した全ＲＮＡを用いた逆転写によりｃＤＮＡを得、６つの試料を試験用に選択した。結果を以下の表に示す。

表１０から分かるように、標的遺伝子ＡＫＲ１Ｃ３発現のＣｔ値は、健常集団において２７～３０の範囲で比較的安定している。

５．６．３ ＡＫＲ１Ｃ３プライマー－プローブの増幅率試験
ｃＤＮＡは、増幅率試験用の３セットのプライマー－プローブ（Ｆ２Ｒ６Ｐ１、Ｆ６Ｒ２Ｐ１およびＦ６Ｒ６Ｐ１）を用いて健常ボランティア１人の末梢血から抽出したＲＮＡで逆転写することにより得た。ｃＤＮＡの濃度は１００ｎｇ／μＬであり、５倍希釈後、さらに２５倍、１２５倍および６２５倍希釈して５～６２５倍の合計４つの濃度勾配とし、各濃度についてｑＰＣＲ試験用の複写物を２個得た。Ｃｔ値と初期濃度のｌｏｇ値との間の線形関係に基づいて、検量線および増幅率を決定した。結果を図６に示す。

結果から、Ｆ６Ｒ２Ｐ１およびＦ６Ｒ６Ｐ１の増幅率は、Ｆ２Ｒ６Ｐ１の増幅率よりも高く、９５％超であったことがわかる。したがって、Ｆ６Ｒ２Ｐ１およびＦ６Ｒ６Ｐ１プライマー－プローブを、その後の試験用に選択した。

４人の健常ボランティアの血液から抽出したＲＮＡ試料を、それぞれＦ６Ｒ２Ｐ１およびＦ６Ｒ６Ｐ１の増幅率試験のために選択した。結果を以下の表に示す。

結果によれば、２対のプライマー－プローブの増幅率にはほとんど差がなく、異なる試料においてわずかな変動があったことがわかる。しかしながら、Ｆ６Ｒ２Ｐ１のＲ^２はより良好であり、Ｒ^２は試料３において１に等しい。したがって、このキットでは、Ｆ６Ｒ２Ｐ１をＡＫＲ１Ｃ３のプライマー－プローブとして選択した。

５．６．４ ＡＫＲ１Ｃ３プラスミドの検量線試験
４０μＬのヌクレアーゼを含まない水に溶解した後、ＡＫＲ１Ｃ３プラスミド乾燥粉末を、Ｑｕｂｉｔによって測定される５．７８ｎｇ／μＬの濃度まで１０倍希釈した。プラスミドストック溶液をそれぞれ１０^５、１０^６、１０^７および１０^３倍の勾配で希釈し、ｑＰＣＲ試験用試料の合計４つの勾配濃度を求めた。各勾配を２回反復し、図７に示すようにＡＫＲ１Ｃ３の検量線を測定した。

図７の検量線からわかるように、ＡＫＲ１Ｃ３プライマー－プローブの増幅率は１００％に達し、Ｒ^２＝０．９９９であり、良好な増幅率が示唆された。

［実施例６］ 参照遺伝子のスクリーニングならびに対応するプライマーおよびプローブの設計およびスクリーニング

参照遺伝子の選択に関しては、白血病遺伝子発現に関する参考文献（［１］Ｙａｎｌａｎ Ｗａｎｇ，Ｙｕｅ Ｌｉｕ，Ｃｈａｎｇｈｕａ Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．、「Ｔ－ＡＬＬに対する強力な抗腫瘍活性を有するＡＫＲ１Ｃ３特異的プロドラッグ」［Ｊ］、Ｌｅｕｋｅｍｉａ＆Ｌｙｍｐｈｏｍａ，２０２０，Ｆｅｂ．ＤＯＩ：１０．１０８０／１０４２８１９４．２０２０．１７２８７４６、［２］Ｄｏｎｙａ Ｍｏｒａｄｉ Ｍａｎｅｓｈ，Ｊａｄ Ｅｌ－Ｈｏｓｓ，Ｋａｔｈｒｙｎ Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．、「増殖因子ＡＫＲ１Ｃ３は、臨床腫瘍学におけるＴ細胞急性リンパ芽球性白血病治療標的の前臨床モデルにおけるＰＲ－１０４に対する感度のバイオマーカーである」［Ｊ］、ＢＬＯＯＤ，２０１５，１２５：１１９３－１２０１、［３］Ｙｕａｎｔｏｎｇ Ｔｉａｎ，Ｌｉｊｉｎｇ Ｚｈａｏ，Ｈａｉｔａｏ Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．、「ＡＫＲ１Ｃ３の過剰発現は、前立腺がん進行の有望なバイオマーカーとして役立ち得る」［Ｊ］、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０１４，９：４２．）を参照し、以前に使用されたプライマー－プローブと組み合わせて、４つの参照遺伝子（ＨＰＲＴ１、ＧＡＰ、ＡＣＴＢおよびＧＯＬＧＡ１）を、細胞株ＣＣＲＦ－ＣＥＭを用いた試験のために選択し、それらの蛍光強度および増幅を評価した。結果を図８に示す。

蛍光強度に関しては、ＡＣＴＢが最も高く、次いでＨＰＲＴ１であった。

増幅曲線に関しては、ＧＯＬＧＡ１の増幅曲線は一般的なＳ字形ではなく、他の３つは一般的なＳ字形増幅曲線である。

Ｃｔに関しては、ＧＡＰおよびＡＣＴＢのＣｔ値は低く、それらの発現量は比較的高かったが、ＨＰＲＴ１およびＧＯＬＧＡ１のＣｔ値は高く、それらの発現量は比較的低かった。

試料および細胞株を試験して、それらの発現安定性、ならびに高発現試料と低発現試料とを区別することができるかどうかを検証した。

健常ボランティア由来の血液試料のＲＮＡ番号５、６および７、白血病患者の骨髄ＲＮＡ番号ＢＺＱおよびＱＱＹ、ならびにＡＫＲ１Ｃ３を発現する細胞株（ＲＰＭＩ８２２６、ＣＣＲＦ－ＣＥＭおよびＪｕｒｋａｔ）を、この実験で使用した。データおよび以前の結果によれば、細胞株ＲＰＭＩ８２２６およびＣＣＲＦ－ＣＥＭは高発現細胞株であり、Ｊｕｒｋａｔは低発現細胞株であった（図９に示す）。

ΔΔＣｔ算出法を実験結果に採用し、つまり、ΔΔＣｔ＝未知試料ＦＡＭ Ｃｔ－未知試料ＶＩＣ Ｃｔ－（ＱＣ ＦＡＭ Ｃｔ－ＱＣ ＶＩＣ Ｃｔ）とし、ＣＣＲＦ－ＣＥＭを各群のＱＣとした。結果を図１０に示す。

この結果から、ＡＣＴＢを参照遺伝子として使用した場合、他の３つの参照遺伝子と比較して、ＡＣＴＢが高発現細胞株ＲＰＭＩ８２２６およびＣＣＲＦ－ＣＥＭと低発現細胞株Ｊｕｒｋａｔとをよりよく区別することができることが分かる。健常者では値は比較的低いままであったが、白血病患者の骨髄ＲＮＡ試料ではＡＫＲ１Ｃ３の高発現が検出された。増幅曲線の結果に基づいて、ＡＣＴＢを参照遺伝子として選択した。

ＡＣＴＢを参照遺伝子として決定した後、５種類の細胞株をそれぞれ試験した。試験結果を図１１に示す。

細胞株の試験結果からウェスタンブロットの検証結果（図９）と一致していることがわかり、ＡＫＲ１Ｃ３－ＡＣＴＢプライマー－プローブの試験結果の正確度が証明された。

［実施例７］ｑＰＣＲ反応系および条件の検討
ｑＰＣＲ反応系の品質は開発と検出を成功させるために必要な条件であり、その主成分を最適化しなければならない。

７．１ 反応系の判定
逆転写系を以下に示す。

逆転写反応条件を以下に示す。

ポリメラーゼ混合物は、ＰＣＲ増幅率に影響を及ぼす重要な成分であった。本実施例で使用されるポリメラーゼ混合物ＫＡＰＡ ＰＲＯＢＥ ＦＡＳＴ ＲＴ－ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（２×）の含有成分を特定の割合で最良の状態に最適化して濃縮母液を作製する。使用する際、ポリメラーゼ緩衝液を増倍剤に比例して添加する限り、対応する検出を行うことができる。説明書によれば、推奨量は反応系の半分であり、すなわち、２０μＬの反応系では、量は１０μＬであるべきである。具体的な系を以下の表に示す。

７．２ ｑＰＣＲ反応条件の最適化
本実施例で使用した反応条件を下記表１５に示す。反応条件は、初期段階での長期検証後のＲＮＡ反応の好ましい反応条件として試験した。

サイクル数はＰＣＲの結果に影響を及ぼす直接的な因子の１つであり、サイクル数はＰＣＲ増幅の程度を決定した。使用したｑＰＣＲのサイクル数は、通常、３０～４５サイクルであった。サイクルが多いほど非特異的増幅はより顕著になる一方、サイクルが少ないほど、検出感度に対する効果はより顕著になった。

７．３ ＡＫＲ１Ｃ３－ＡＣＴＢシステムの検量線試験

７．３．１ 細胞株の検量線試験
最適化反応系では、ＡＫＲ１Ｃ３とＡＣＴＢのプライマー－プローブを混合し、検量線の検定を行ってプライマー－プローブの増幅率を調べた。細胞株としてＣＣＲＦ－ＣＥＭを用い、７．１に記載の逆転写系によって逆転写を行った。ｃＤＮＡを得た後、５倍勾配希釈に従って、５倍、２５倍および１２５倍希釈の４つの勾配ストック溶液と各濃度について複写物を２個得、ｑＰＣＲ反応系によって検出を行った。図１２に示すように、Ｃｔ値と初期コピー数ｌｇ値との間の線形関係に基づいて検量線を求めた。

図１２から、ＡＫＲ１Ｃ３プライマー－プローブの増幅率が９４．２％であり、ＡＣＴＢプライマー－プローブの増幅率が９５．３％であり、いずれも要件を満たしていることがわかる。Ｒ^２は０．９９以上であることから、線形関係が良好であり、必要条件を満たしていたことがわかる。

７．３．２ プラスミドの検量線試験
使用したＡＫＲ１Ｃ３およびＡＣＴＢプラスミド乾燥粉末を、４０μＬのヌクレアーゼを含まない水に溶解した。１０倍に希釈した後、濃度をＱｕｂｉｔで測定したところ、それぞれ１．６７ｎｇ／μＬ、５．７８ｎｇ／μＬであった。ＡＫＲ１Ｃ３のプラスミドを１０^－５に希釈し、ＡＣＴＢのプラスミドを１０^－３に希釈した。１００μＬの各プラスミドを混合した後、１０倍、１００倍および１０００倍の勾配で希釈した。各勾配をｑＰＣＲ試験のために２回反復した。検量線は、Ｃｔ値と初期濃度のｌｏｇ値との間の線形関係に従って作成した。結果を図１３に示す。

図示する結果から、ＡＫＲ１Ｃ３の増幅率は１０１．９％に達し、ＡＣＴＢの増幅率は９４．１％に達し、Ｒ^２は０．９９より大きく、要求を満たしていることがわかる。

［実施例８］ ＡＫＲ１Ｃ３－ＡＣＴＢプライマー－プローブのデジタルＰＣＲ試験

８．１ デジタル ＰＣＲ検出システムおよび反応条件
本実施例では、ＡＫＲ１Ｃ３－ＡＣＴＢプライマー－プローブを用いたデジタルＰＣＲ試験を試みた。試料および細胞株におけるＡＫＲ１Ｃ３およびＡＣＴＢの発現量は全く異なっているため、最大Ｃｔ差は１０Ｃｔ値に達し得る。図１４に低発現のＪｕｒｋａｔ細胞株のｑＰＣＲ検出図を示す。

したがって、デジタルＰＣＲ検出では、図１５に示すように、ＶＩＣのコピー数はＦＡＭのコピー数よりもはるかに大きくなる。

このことから、ＡＫＲ１Ｃ３とＡＣＴＢは別々に検出された。２つの細胞株、ＣＣＲＦ－ＣＥＭおよびＭＯＬＴ－４を例として取り上げた。２μｇのＲＮＡを逆転写した後、転写産物を５倍に希釈し、以下のシステムを用いてデジタルＰＣＲによりＡＫＲ１Ｃ３のコピー数を検出した。

デジタルＰＣＲの反応手順を以下の表に示す。

検出結果をそれぞれ図１６に示す。

ＡＣＴＢの検出は、ｃＤＮＡを５倍希釈した後、２００倍希釈し、その後、以下のシステムを用いてＡＣＴＢのコピー数を検出した。

検出結果を図１７に示す。結果からわかるように、細胞株ＣＣＲＦ－ＣＥＭのＦＡＭコピー数／ＶＩＣコピー数は０．００９２であり、細胞株ＭＯＬＴ－４のＦＡＭコピー数／ＶＩＣコピー数は０．００１２９であった。

８．２ 実物試料試験および計算方法の判定
健常ボランティアの試料番号９、白血病患者の８つの例（番号：ＰＳＳ、ＧＺＪ、ＨＸＢ、ＨＣＬ、ＺＹＱ、ＬＢＪ、ＪＲＺ、ＬＳＸ）、および５種類の細胞株（ＴＦ－１、ＣＣＲＦ－ＣＥＭ、ＲＰＭＩ８２２６、ＭＯＬＴ－４、Ｊｕｒｋａｔ）を用いた。検量線で使用したプラスミドおよび濃度は、実施例７の工程７．３．２に記載した通りとした。調製法は、ＡＫＲ１Ｃ３のプラスミドを１０^－４に希釈し、ＡＣＴＢのプラスミドを１０^－２に希釈し、各プラスミド１００μＬを混合した後、１０倍、１００倍および１０００倍の勾配で希釈することによって行った。コピー数は、デジタルＰＣＲによって定量した。ｑＰＣＲ試験を各試料について２つの複写物を用いて共同で実施した。各未知試料のＡＫＲ１Ｃ３およびＡＣＴＢのコピー数は検量線により求めることができ、ＡＫＲ１Ｃ３の発現を測定する方法として、ＡＫＲ１Ｃ３コピー数／ＡＣＴＢコピー数の比を用いた。測定した検量線を図１８に示す。

図１８から、ＡＫＲ１Ｃ３の増幅率は９９．１％に達し、ＡＣＴＢの増幅率は９３．４％に達し、Ｒ^２は０．９９より大きく、要求を満たしていることがわかる。

試料試験結果を以下の表に示す。

ＦＡＭコピー数／ＶＩＣコピー数の結果を図１９に示す。

図１９からわかるように、細胞株の検出結果は細胞株のウェスタンブロットの結果と一致しており、計算方法の正確度が検証された。同時に、図中のＬＢＪによって示されるように、ＡＫＲ１Ｃ３発現が高い試料が白血病患者の試料において検出された。８つの例は全て骨髄移植を受けた患者の例であった。

上記のＡＫＲ１Ｃ３プライマー－プローブ設計、反応系および反応条件の研究に基づいて、ＲＮＡ量でのＡＫＲ１Ｃ３発現の検出方法が確立され、一定の感度および正確度が達成された。

［実施例９］ ＡＫＲ１Ｃ３ ＲＮＡ量の検出方法の性能試験

実施例５～８に従って、ｑＰＣＲ方法およびデジタルＰＣＲ方法における最良のプライマー－プローブ組成、参照遺伝子および対応するプライマー－プローブ組成、反応系および反応条件を決定した。以上の条件に基づき、本実施例では、ｑＰＣＲ方法とデジタルＰＣＲ方法を組み合わせて、感度、特異度、再現性、正確度等を含む性能試験を行った。

ｑＰＣＲ反応プロセスは、以下の工程を含んだ。
（１）試料調製
ＲＮＡの濃度は５ｎｇ／μＬ超とするとし、２０～２００ｎｇのＲＮＡを採取し、ヌクレアーゼを含まない水で特定の容積まで補充した。
（２）逆転写
表１２に示すように、上記のＰＣＲチューブに逆転写混合物を順次添加し、混合物をボルテックスによってまたはピペッターでブローすることにより混合した。短時間の遠心分離の後、混合物を通常のＰＣＲ機器上に置いた。表１３に示すように逆転写を行い、逆転写産物ｃＤＮＡをｑＰＣＲ反応系のテンプレートとして使用し、－２０℃で保存することができた。
（３）プライマー希釈標準溶液の調製
プライマーおよびプローブの乾燥粉末を、室温で２時間（または４℃で一晩）ＴＥ緩衝液に溶解した。プライマー希釈標準溶液の濃度は１０μＭとした。溶解後、プライマーおよびプローブを特定の割合および組合せに従って混合した。完全に混合した後、－２０℃で冷蔵庫に保存した。プライマー希釈標準溶液は－２０℃で１年間安定して保存できる。
各使用の前に、ＤＮＡプライマー増幅混合物を含有する遠心分離管を振盪し、混合し、その後一時的に遠心分離した。表示量（２０μＬ／反応）に従い、単回使用に必要な量を分注し、保存した。
（４）反応系の調製
ＱＣには、陽性対照品（ＳＴＤ）、陰性対照品（Ｎｅｇ）、ブランク対照品（ＮＴＣ）を毎回使用することとする。ｑＰＣＲ反応系を表１４に従って調製し、混合し、一時的に遠心分離した。その後、表１５に示すように、増幅条件下でｑＰＣＲ増幅を行った。

以下の試験に関与する試料番号の対応する意味は、以下の通りである。Ｗ１：ＡＫＲ１Ｃ３を発現しない標準、Ｐ１：ＡＫＲ１Ｃ３を発現する強陽性細胞株、Ｐ２：検量線を検出するために使用する異なるコピー数のＡＫＲ１Ｃ３参照用の標準の勾配、Ｐ３：ＡＫＲ１Ｃ３を発現する弱陽性細胞株、Ｓ１：ＡＫＲ１Ｃ３の最低検出限界の標準、Ｒ１：ＡＫＲ１Ｃ３を発現する強陽性細胞株、Ｒ２：ＡＫＲ１Ｃ３を発現しない標準。

９．１ 最低検出限界

９．１．１ 検出方法
発現の低い細胞株から抽出したＲＮＡを逆転写用に選択し、ＲＮＡ量を２μｇとした。逆転写後のｃＤＮＡを最低検出限界基準として２５倍に希釈し、デジタルＰＣＲにより参照のコピー数を決定し、各参照に対し１０回反復した。

９．１．２． 最低検出限界基準のコピー数の確認プロセスと結果
（１）ＰＣＲ混合物の調製：７．５μＬのＰＣＲマスター混合物（アッセイあたり）、３μＬのプライマー混合物、および必要な総量の水を採取し、ボルテックスによって混合し、遠心分離し、ＰＣＲ反応チューブに分注した。
（２）試料の添加：０．５μＬの被検出試料を対応するＰＣＲ反応管にそれぞれ添加し、ボルテックスで混合した後、遠心分離した。
（３）試料装填：対応する数のチップを調製し、１４．５μＬの反応液を装填のために採取した。なお、この工程では、チップの中心部およびチップの外側カバーには触れないようにする。チップを少なくとも２０秒間プレスした。鉱油をゆっくりと添加し、油をこぼさないことに留意した。鉱油を添加した後、チップを密封した。
（４）オンライン試験：チップをデジタルＰＣＲ機器の棚に配置し、その際、棚上の二次元コードおよび数字が自分の方に向くようにする。
（５）チップの読み取り：チップを専用のＰＣＲ機器から取り出し、室温に置いた後、チップスキャナーに入れて蛍光信号をスキャンした。コンピュータは、蛍光信号に従って突然変異比を計算した。
（６）検出結果：
コピー数算出：標的コピー数＝コピー（標的）×１４．５／装填量

図２０はこの細胞株におけるｃＤＮＡの５倍希釈の試験結果を示す。２６１．８コピー／μＬであり、検出限界基準のコピー数は５２．４コピー／μＬであった。

９．１．３ ｑＰＣＲ検証結果

表２０から分かるように、最低検出限界基準は、１０回の反復によるｑＰＣＲによって検出された。陽性検出率は１００％であり、最低検出限界は検証基準を満たした。

９．２ 精度
精度は、同じ条件下における複数の平行試験結果間の近さの度合いをいう。試験値が互いに近ければ近いほど、精度は高くなる。精度は、キット操作の再現性が反映された。本実施例では、陰性基準、発現の弱い精度基準、および発現の高い精度基準を選択してバッチ内精度を決定した。キットの精度性能を、陰性精度基準の陰性一致率、弱発現および高発現の精度基準のＡＫＲ１Ｃ３の相対発現量の変動係数（ＣＶ）を計算することによって評価した。

９．２．１ 検出方法
この実験では、２つの精度基準を検出試料として使用し、２つの機器、２人の操作者および３日の検証日を用いて、各基準について２４回検出を行った。全ての陰性基準は陰性であり、陽性ＣＶ値は１５％未満であった。
ＣＶ値＝（標準偏差ＳＤ／平均）×１００％

９．２．２ 実験結果

陽性精度基準の２４回のＡＫＲ１Ｃ３のＣｔのＣＶ値は０．７８％、ＡＣＴＢのＣＴのＣＶ値は１．７３％であった。２４回の陰性精度基準は全て陰性であった。

表２１から分かるように、精度および再現性検出の試料はｑＰＣＲによって２４回検出され、ＣＶ値は全て５％未満であり、精度および再現性が検証基準を満たすことが示唆された。

９．３ 陰性一致率

９．３．１ 検出方法
陰性基準（ＡＫＲ１Ｃ３相同プラスミドＡＫＲ１Ｃ４、９．０６×１０^３コピー）を選択し、キットによって検出を３回反復して、偽陽性について評価した。

９．３．２ 実験結果

表２２から分かるように、反復検出結果は全て陰性であり、陰性一致率は１００％であり、検証基準を満たした。

９．４ 陰性一致率

９．４．１ 検出方法
２つの陽性基準（ウェスタンブロットによって検証されたＡＫＲ１Ｃ３細胞株）を選択し、キットにより検出して、検出の正確度を評価した。ＡＫＲ１Ｃ３およびＡＣＴＢプラスミド（デジタルＰＣＲによって定量化）を勾配希釈に用いて検量線を作成し、これをキットにより検出して増幅率および線形関係を評価した。

９．４．２ 実験結果

表２３から分かるように、選択された陽性基準（ウェスタンブロットによって検証された細胞株）は、上記の検出方法を用いて検出された。Ｐ１は強陽性標準であり、ＦＡＭコピー数／ＶＩＣコピー数の比は高く、Ｐ３は弱陽性標準であり、ＦＡＭコピー数／ＶＩＣコピー数の比は低く、ＣＶは要件を満たした。この方法の検出正確度は要求を満たした。

９．５ 特異性

９．５．１ 検出方法
２種類の陰性基準（それぞれ１．１４×１０^４および１．１４×１０^３のコピー数のＡＫＲ１Ｃ３相同プラスミドＡＫＲ１Ｃ２）を選択した。各濃度レベルを３回反復し、特異性を評価した。

９．５．２ 検出結果

陰性基準の２つの勾配を３回反復したところ、結果は全部陰性であった。キット試験の特異性は要件を満たした。

９．６ 実物試料検出

９．６．１ 検出方法
検出のために８つの正常血液試料を選択し、装填量はＲＮＡ逆転写の４０ｎｇのｃＤＮＡとした。各試料を２回検出し、ＦＡＭコピー数／ＶＩＣコピー数比の正確度を算出した。

９．６．２ 検出結果
検出結果を以下の表に示した。

８つの正常血液試料が２回検出したところ、ＦＡＭコピー数／ＶＩＣコピー数の比は０．００１未満であり、検出ＣＶは５％未満であった。キットの正確度は要件を満たした。

９．７ テンプレート量検証
２００ｎｇと１０ｎｇのＲＮＡを逆転写の初期量として用い、３人の臨床白血病患者由来の骨髄試料の装填量の範囲を検証した。

結論：１０ｎｇおよび２００ｎｇの装填試料の検出結果は一致した。

９．８ 検証の結論

結論：最低検出限界、精度、陰性一致率、陽性一致率、テンプレート量、分析特異性および実物試料検出の性能検証を行ったところ、７つの性能の全てが検証基準を満たした。この検出方法の性能は臨床適用の要件を満たしたため、臨床試料検出に使用可能である。

［実施例１０］ ＡＫＲ１Ｃ３ ＲＮＡ含有量検出用キット（ｑＰＣＲ法）

本実施例では、ＡＫＲ１Ｃ３ ＲＮＡ含有量検出用キットは、
（１）ｑＰＣＲポリメラーゼ混合物（主にＤＮＡポリメラーゼ、ＭｇＣｌ_２、緩衝液およびｄＮＴＰ（加えてＵＮＧ酵素およびｄＵＴＰ）を含むｑＰＣＲポリメラーゼ混合物であり、好ましくは、前記ポリメラーゼ混合物はＫＡＰＡ ＰＲＯＢＥ ＦＡＳＴ ＲＴ－ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（２×）である）と、
（２）逆転写酵素混合物（好ましくはＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＶＩＬＯ ＭＡＲＳＴＥＲ ＭＩＸである）と、
（３） ＡＫＲ１Ｃ３反応混合物（前記ＡＫＲ１Ｃ３反応混合物はＡＫＲ１Ｃ３遺伝子検出用プライマー－プローブ組成物および参照遺伝子検出用プライマー－プローブ組成物を含み、前記ＡＫＲ１Ｃ３遺伝子検用プライマー－プローブ組成物は上記のような群（ｉ）～（ｉｘ）のいずれか１つから選択され、より好ましくは群（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖ）の１つの群から選択され、さらにより好ましくは群（ｉｖ）から選択される。ＡＫＲ１Ｃ３遺伝子検出用プローブにおいて５’末端レポーターはＦＡＭであり、３’末端クエンチャーはＭＧＢであった。参照遺伝子検出用プライマー－プローブ組成物は、それぞれ配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９で示される、上流プライマーＡＣＴＢ－Ｆ１、下流プライマーＡＣＴＢ－Ｒ１およびプローブＡＣＴＢ－Ｐ１を含む。参照遺伝子のプローブの５’末端レポーターはＶＩＣであり、３’末端クエンチャーはＢＨＱ１であった）と、
（４）陰性対照（ＮＣ）（例えばヌクレアーゼを含まない水）と、
（５）陽性対照（例えば、既知のコピー数の参照）と、
（６）関連する操作方法を記録した説明書と、
を含む。

［実施例１１］ ＡＫＲ１Ｃ３ ＲＮＡ含有量検出用キット（デジタルＰＣＲ方法）

実施例８に記載されるように、デジタルＰＣＲ方法において、ＡＫＲ１Ｃ３およびＡＣＴＢについて別々の検出が必要であった。そのため、本実施例のキットは、ＡＫＲ１Ｃ３反応混合物がＡＫＲ１Ｃ３遺伝子検出用のプライマー－プローブ組成物のみを含み、参照遺伝子ＡＣＴＢ検出用のプライマー－プローブ組成物を含まない点で、実施例１０のキットと異なる。本実施例におけるキットはＡＫＲ１Ｃ３反応混合物（ＡＫＲ１Ｃ３遺伝子検出用プライマー－プローブ組成物を含む）および参照遺伝子ＡＣＴＢ反応混合物（参照遺伝子ＡＣＴＢ検出用プライマー－プローブ組成物を含む）の両方を含み、残りの成分は同じである。

実施例１０または１１に記載されるように、ＡＫＲ１Ｃ３ ＲＮＡ含有量検出用キットを、ＡＫＲ１Ｃ３活性化抗がん剤と一緒に使用し、通常の患者スクリーニングを行った。前記キットを使用することにより、患者に薬剤を投与することを決定する前に、医療従事者が均一検出キット標準操作手順（ＳＯＰ）により異なる研究室で検出を行うことが容易になる。このように、同じ試薬および同じ手順によって得られたＡＫＲ１Ｃ３検出結果は、ＡＫＲ１Ｃ３活性化がん薬剤の薬剤指示において、特定のがんについての推奨検出結果を満たすことができる。

キットの具体的な操作方法は説明書、すなわち、上記の説明書における具体的な操作条件に記録される。必要に応じて、または好ましい実施形態として、説明書はまた、種類の異なるがん（腫瘍）についてのＡＫＲ１Ｃ３活性化抗がん剤の所定の量Ｘ値を提供する。例えば、Ｂ系急性リンパ芽球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）およびＴ系急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）の前記所定のＸ値は０．０００１４～０．０１５であり、上記キットにより検出された患者由来のｅｘ ｖｉｖｏ末梢血試料のＡＫＲ１Ｃ３コピー数／ＡＣＴＢコピー数の比は０．００９２であった。統計によれば、ＡＫＲ１Ｃ３活性化抗がん剤を用いたＢ－ＡＬＬ患者のＡＫＲ１Ｃ３コピー数／ＡＣＴＢコピー数の比は０．０００１４を下回ってはいけない。そのため、医師は、この患者にＡＫＲ１Ｃ３活性化抗がん剤を処方することができる。別の例として、Ｔ系急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）については、上記キットにより検出された患者由来のｅｘ ｖｉｖｏ末梢血試料のＡＫＲ１Ｃ３コピー数／ＡＣＴＢコピー数の比は０．０００１２であった。統計によれば、ＡＫＲ１Ｃ３活性化抗がん剤を用いたＴ－ＡＬＬ患者のＡＫＲ１Ｃ３コピー数／ＡＣＴＢコピー数の比は０．０００１４を下回ってはいけない。そのため、医師はこの患者にＡＫＲ１Ｃ３活性化抗がん剤を処方すべきではない。

［実施例１２］ＡＫＲ１Ｃ３ ＲＮＡ含有量の検出方法およびがん治療薬の調整におけるＡＫＲ１Ｃ３ ＲＮＡ含有量検出用キットの使用

実施例５～９で確立されたＡＫＲ１Ｃ３ ＲＮＡ含有量の検出方法または実施例１０もしくは１１で確立されたＡＫＲ１Ｃ３ ＲＮＡ含有量検出キットによって検出されたＢ－ＡＬＬ患者由来のｅｘ ｖｉｖｏ末梢血試料のＡＫＲ１Ｃ３コピー数／ＡＣＴＢコピー数の比は０．００９２であり、所定の含有量の０．０００１４より大きかった。

Ｂ－ＡＬＬ患者にＡＫＲ１Ｃ３活性化抗がん剤を投与した。

既存の実験の検証によると、以下の構造から選択されるＡＫＲ１Ｃ３活性化抗がん剤は、より良好な治療効果を有する。

Claims (26)

1. （ｉ）それらのヌクレオチド配列がそれぞれ配列番号１、配列番号２および配列番号３で示される上流プライマーＡＫＲ１Ｃ３－Ｆ１、下流プライマーＡＫＲ１Ｃ３－Ｒ１およびプローブＡＫＲ１Ｃ３－Ｐ１と、
   （ｉｉ）それらのヌクレオチド配列がそれぞれ配列番号４、配列番号５および配列番号３で示される上流プライマーＡＫＲ１Ｃ３－Ｆ２、下流プライマーＡＫＲ１Ｃ３－Ｒ２およびプローブＡＫＲ１Ｃ３－Ｐ１と、
   （ｉｉｉ）それらのヌクレオチド配列がそれぞれ配列番号４、配列番号６および配列番号３で示される上流プライマーＡＫＲ１Ｃ３－Ｆ２、下流プライマーＡＫＲ１Ｃ３－Ｒ６およびプローブＡＫＲ１Ｃ３－Ｐ１と、
   （ｉｖ）それらのヌクレオチド配列がそれぞれ配列番号７、配列番号５および配列番号３で示される上流プライマーＡＫＲ１Ｃ３－Ｆ６、下流プライマーＡＫＲ１Ｃ３－Ｒ２およびプローブＡＫＲ１Ｃ３－Ｐ１と、
   （ｖ）それらのヌクレオチド配列がそれぞれ配列番号７、配列番号６および配列番号３で示される上流プライマーＡＫＲ１Ｃ３－Ｆ６、下流プライマーＡＫＲ１Ｃ３－Ｒ６およびプローブＡＫＲ１Ｃ３－Ｐ１と、
   （ｖｉ）それらのヌクレオチド配列がそれぞれ配列番号８、配列番号９および配列番号１０で示される上流プライマーＡＫＲ１Ｃ３－Ｆ５、下流プライマーＡＫＲ１Ｃ３－Ｒ５およびプローブＡＫＲ１Ｃ３－Ｐ２と、
   （ｖｉｉ）それらのヌクレオチド配列がそれぞれ配列番号１１、配列番号１２および配列番号３で示される上流プライマーＡＫＲ１Ｃ３－Ｆ３、下流プライマーＡＫＲ１Ｃ３－Ｒ３およびプローブＡＫＲ１Ｃ３－Ｐ１と、
   （ｖｉｉｉ）それらのヌクレオチド配列がそれぞれ配列番号１３、配列番号１２および配列番号１０で示される上流プライマーＡＫＲ１Ｃ３－Ｆ４、下流プライマーＡＫＲ１Ｃ３－Ｒ３およびプローブＡＫＲ１Ｃ３－Ｐ２と、
   （ｉｘ）それらのヌクレオチド配列がそれぞれ配列番号１４、配列番号１５、および配列番号１６で示される上流プライマーＡＫＲ１Ｃ３－Ｆ７、下流プライマーＡＫＲ１Ｃ３－Ｒ７、およびプローブＡＫＲ１Ｃ３－Ｐ３
   の群のいずれか１つから選択されるプライマー－プローブ組成物。
2. 前記プライマー－プローブ組成物が、前記群（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖ）のいずれか１つから選択され、
   好ましくは、前記プライマー－プローブ組成物が群（ｉｖ）から選択される請求項１に記載のプライマー－プローブ組成物。
3. 前記プローブＡＫＲ１Ｃ３－Ｐ１、ＡＫＲ１Ｃ３－Ｐ２およびＡＫＲ１Ｃ３－Ｐ３の５’末端レポーターがＦＡＭであり、前記プローブＡＫＲ１Ｃ３－Ｐ１、ＡＫＲ１Ｃ３－Ｐ２およびＡＫＲ１Ｃ３－Ｐ３の３’末端クエンチャーがＭＧＢである請求項１または２に記載のプライマー－プローブ組成物。
4. 請求項１～３のいずれか一項に記載のプライマー－プローブ組成物を含むキット。
5. さらに、参照遺伝子のプライマー－プローブ組成物を含み、
   好ましくは、前記参照遺伝子がＡＣＴＢである請求項４に記載のキット。
6. 前記参照遺伝子のプライマー－プローブ組成物が、それらのヌクレオチド配列がそれぞれ配列番号１７、配列番号１８および配列番号１９で示される上流プライマーＡＣＴＢ－Ｆ１、下流プライマーＡＣＴＢ－Ｒ１およびプローブＡＣＴＢ－Ｐ１を含む請求項４または５に記載のキット。
7. 前記プローブＡＣＴＢ－Ｐ１の５’末端レポーターがＶＩＣであり、前記プローブＡＣＴＢ－Ｐ１の３’末端クエンチャーがＢＨＱ１である請求項４～６のいずれか一項に記載のキット。
8. さらに、ポリメラーゼ混合物を含み、
   前記ポリメラーゼ混合物が、ＤＮＡポリメラーゼ、ＭｇＣｌ_２、緩衝液およびｄＮＴＰを主に含み、
   好ましくは、前記ポリメラーゼ混合物がＫＡＰＡ ＰＲＯＢＥ ＦＡＳＴ ＲＴ－ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（２×）である請求項４～７のいずれか一項に記載のキット。
9. さらに、逆転写酵素混合物を含み、
   好ましくは、前記逆転写酵素混合物がＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＶＩＬＯ ＭＡＲＳＴＥＲ ＭＩＸである請求項４～８のいずれか一項に記載のキット。
10. さらに、陰性対照および陽性対照を含み、
    好ましくは、前記陰性対照がヌクレアーゼを含まない水であり、および／または
    好ましくは、前記陽性対照が既知のコピー数の参照である請求項４～９のいずれか一項に記載のキット。
11. がん治療薬の調製における、請求項１～３のいずれか一項に記載のプライマー－プローブ組成物または請求項４～１０のいずれか一項に記載のキットの使用。
12. 患者のｅｘ ｖｉｖｏ試料中のＡＫＲ１Ｃ３ ＲＮＡ含有量を、請求項１～３のいずれか一項に記載のプライマー－プローブ組成物または請求項４～１０のいずれか一項に記載のキットを用いて求め、
    ＡＫＲ１Ｃ３ ＲＮＡ含有量が所定の含有量以上の患者に、ＡＫＲ１Ｃ３活性化抗がん剤を投与する請求項１１に記載の使用。
13. 前記ＡＫＲ１Ｃ３ ＲＮＡ含有量を、ＡＫＲ１Ｃ３コピー数／参照遺伝子コピー数の比に従って求め、
    好ましくは、前記所定の含有量が０．０００１～１であり、
    より好ましくは、前記所定の含有量が０．０００１１～０．５であり、
    さらに好ましくは、前記所定の含有量が０．０００１３～０．０５である請求項１１または１２に記載の使用。
14. 前記ｅｘ ｖｉｖｏ試料が、血液試料、骨髄試料、または組織試料を含む、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の使用。
15. 前記ＡＫＲ１Ｃ３活性化抗がん剤が、以下の構造
    を有する化合物から選択される化合物である請求項１１～１４のいずれか一項に記載の使用。
16. 前記がんが、肺がん、非小細胞肺がん、肝臓がん、膵臓がん、乳がん、胃がん、骨がん、食道がん、乳房がん、前立腺がん、精巣がん、大腸がん、卵巣がん、膀胱がん、子宮頸がん、肝細胞がん、メラノーマ、扁平上皮がん、基底細胞がん、腺がん、汗腺がん、皮脂腺がん、乳頭がん、乳頭腺がん、腎細胞がん、嚢胞腺がん、嚢胞がん、髄様がん、気管支がん、骨細胞がん、上皮がん、胆管がん、絨毛がん、胎児性がん、セミノーマ、ウィルムス腫瘍、神経膠芽腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫瘍、血球芽腫、声帯神経腫、髄膜腫、神経芽腫、視神経芽腫、網膜芽細胞腫、神経線維腫、線維肉腫、線維症芽細胞腫、線維腫、線維腺腫、線維軟骨腫、線維嚢腫、線維粘液腫、線維骨肉腫、線維粘液肉腫、線維乳頭腫、粘液肉腫、粘液嚢腫、粘液軟骨腫、粘液軟骨肉腫、粘液線維肉腫、粘液腺腫、粘液芽腫、脂肪肉腫、脂肪腫、脂肪腺腫、脂肪芽腫、脂肪軟骨腫、脂肪線維腫、脂肪血管腫、粘液脂肪腫、軟骨肉腫、軟骨腫、軟骨筋腫、脊索腫、絨毛がん、絨毛上皮腫、絨毛芽腫、骨肉腫、骨芽細胞腫、骨軟骨線維腫、骨軟骨肉腫、骨軟骨腫、骨細胞腫、骨歯腫、骨線維腫、骨の線維肉腫、血管肉腫、血管腫、血管脂肪腫、血管軟骨腫、血管芽腫、血管角腫、血管膠腫、血管内皮腫、血管線維腫、血管筋腫、血管脂肪腫、血管リンパ腫、血管脂肪平滑筋腫、血管筋脂肪腫、血管筋神経腫、血管粘液腫、血管細網腫、リンパ管肉腫、リンパ肉芽腫、リンパ管腫、リンパ腫、リンパ粘液腫、リンパ肉腫、リンパ管線維腫、リンパ球腫、リンパ上皮腫、リンパ芽腫、末梢性Ｔ細胞リンパ腫、結節性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、内皮腫、内芽腫、滑膜腫、滑膜肉腫、中皮腫、結合組織腫瘍、ユーイング腫瘍、平滑筋腫、平滑筋肉腫、平滑筋芽腫、平滑筋線維腫、横紋筋腫、横紋筋肉腫、横紋筋粘液腫、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性疾患細胞、赤血球増加症、リンパ腫、子宮内膜がん、神経膠腫、結腸直腸がん、甲状腺がん、尿路上皮がんまたは多発性骨髄腫を含み、
    好ましくは、前記がんが、卵巣がん、子宮頸がん、膵臓がん、乳がん、結腸直腸がん、食道がん、胃がん、肝細胞がん、非小細胞肺がん、前立腺がん、腎細胞がん、末梢Ｔ細胞リンパ腫、結節性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、急性リンパ性白血病または急性骨髄性白血病を含む請求項１１から１５のいずれか一項に記載の使用。
17. （１）検出対象のｅｘ ｖｉｖｏ試料のＲＮＡを抽出し、前記抽出したＲＮＡを逆転写系に添加し、前記抽出したＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを合成する工程と、
    （２）請求項１～３のいずれか一項に記載のプライマー－プローブ組成物または請求項４～１０のいずれか一項に記載のキットを用いて、ｃＤＮＡをテンプレートとしてｑＰＣＲまたはデジタルＰＣＲ増幅を行う工程と、
    （３）ｑＰＣＲまたはデジタルＰＣＲ増幅結果に従って検出対象のｅｘ ｖｉｖｏ試料のＡＫＲ１Ｃ３ ＲＮＡ含有量を求める工程と、
    を含む、ＡＫＲ１Ｃ３ ＲＮＡ含有量を検出する方法。
18. 前記工程（１）において、前記抽出したＲＮＡの濃度を検出し、
    好ましくは、Ｑｕｂｉｔ ＲＮＡ ＨＳアッセイキットを使用して前記抽出したＲＮＡの濃度を検出し、
    前記逆転写系が逆転写酵素を含み、
    好ましくは、前記抽出したＲＮＡおよび逆転写酵素の質量対体積比がμｇ／μＬの単位で（０．５～２）：４であり、
    より好ましくは、前記抽出したＲＮＡおよび逆転写酵素の質量対体積比が、μｇ／μＬの単位で（１～１．８）：４であり、
    さらにより好ましくは、前記抽出したＲＮＡおよび逆転写酵素の質量対体積比がμｇ／μＬの単位で２：４である請求項１７に記載の方法。
19. 前記工程（２）では、ｑＰＣＲ反応系において、前記群（ｉ）～（ｉｘ）のいずれか１つから選択されるプライマー－プローブ組成物を、参照遺伝子のプライマー－プローブ組成物と混合し、
    好ましくは、前記ｑＰＣＲ反応系において、ＡＫＲ１Ｃ３上流プライマー、ＡＫＲ１Ｃ３下流プライマーおよびＡＫＲ１Ｃ３プローブのモル比が（２～１０）：（２～１０）：３であり；
    より好ましくは、前記ｑＰＣＲ反応系において、ＡＫＲ１Ｃ３上流プライマー、ＡＫＲ１Ｃ３下流プライマーおよびＡＫＲ１Ｃ３プローブのモル比が（３～７）：（３～７）：３であり、
    さらにより好ましくは、前記ｑＰＣＲ反応系において、ＡＫＲ１Ｃ３上流プライマー、ＡＫＲ１Ｃ３下流プライマーおよびＡＫＲ１Ｃ３プローブのモル比が５：５：３であり、および／または
    前記ｑＰＣＲ反応系において、
    好ましくは、上流プライマーＡＣＴＢ－Ｆ１、下流プライマーＡＣＴＢ－Ｒ１およびプローブＡＣＴＢ－Ｐ１のモル比が（２～１０）：（２～１０）：３であり、
    より好ましくは、上流プライマーＡＣＴＢ－Ｆ１、下流プライマーＡＣＴＢ－Ｒ１およびプローブＡＣＴＢ－Ｐ１のモル比が（３～７）：（３～７）：３であり、
    さらにより好ましくは、上流プライマーＡＣＴＢ－Ｆ１、下流プライマーＡＣＴＢ－Ｒ１およびプローブＡＣＴＢ－Ｐ１のモル比が５：５：３であり、および／または
    前記ｑＰＣＲ反応系において、
    好ましくは、ＡＫＲ１Ｃ３上流プライマー、ＡＫＲ１Ｃ３下流プライマーおよびＡＫＲ１Ｃ３プローブの量がそれぞれ上流プライマーＡＣＴＢ－Ｆ１、下流プライマーＡＣＴＢ－Ｒ１およびプローブＡＣＴＢ－Ｐ１の量と同じである請求項１７または１８に記載の方法。
20. 前記工程（２）にでは、前記ｑＰＣＲ反応系において、ｄＵＴＰ、ＵＮＧ酵素、ｃＤＮＡテンプレートおよびポリメラーゼ混合物も添加され、
    好ましくは、前記ポリメラーゼ混合物の体積が前記ｑＰＣＲ反応系の総体積の（０．３～０．８）であり、
    より好ましくは、前記ポリメラーゼ混合物の体積が前記ｑＰＣＲ反応系の総体積の０．５倍である請求項１７～１９のいずれか一項に記載の方法。
21. 前記工程（２）では、ＡＫＲ１Ｃ３および参照遺伝子が、それぞれＡＫＲ１Ｃ３デジタルＰＣＲ検出システムおよび参照遺伝子デジタルＰＣＲ検出システムによって増幅され、
    好ましくは、前記ＡＫＲ１Ｃ３デジタルＰＣＲ検出システムにおいて、ＡＫＲ１Ｃ３上流プライマー、ＡＫＲ１Ｃ３下流プライマーおよびＡＫＲ１Ｃ３プローブのモル比が（５～１５）：（５～１５）：３であり、
    より好ましくは、ＡＫＲ１Ｃ３上流プライマー、ＡＫＲ１Ｃ３下流プライマーおよびＡＫＲ１Ｃ３プローブのモル比が（８～１４）：（８～１４）：３であり、
    さらにより好ましくは、ＡＫＲ１Ｃ３上流プライマー、ＡＫＲ１Ｃ３下流プライマーおよびＡＫＲ１Ｃ３プローブのモル比が１２：１２：３であり、および／または
    前記参照遺伝子デジタルＰＣＲ検出システムにおいて、
    好ましくは、上流プライマーＡＣＴＢ－Ｆ１、下流プライマーＡＣＴＢ－Ｒ１およびプローブＡＣＴＢ－Ｐ１のモル比が（５～１５）：（５～１５）：３であり、
    より好ましくは、上流プライマーＡＣＴＢ－Ｆ１、下流プライマーＡＣＴＢ－Ｒ１およびプローブＡＣＴＢ－Ｐ１のモル比が（８～１４）：（８～１４）：３であり、
    さらにより好ましくは、上流プライマーＡＣＴＢ－Ｆ１、下流プライマーＡＣＴＢ－Ｒ１およびプローブＡＣＴＢ－Ｐ１のモル比が１２：１２：３である請求項１７～２０のいずれか一項に記載の方法。
22. 前記工程（３）において、ｑＰＣＲまたはデジタルＰＣＲ増幅結果に従って検出対象のｅｘ ｖｉｖｏ試料のＡＫＲ１Ｃ３ ＲＮＡ含有量を求める工程が、
    （Ａ）ｑＰＣＲまたはデジタルＰＣＲ増幅結果に従って検出対象のｅｘ ｖｉｖｏ試料のＡＫＲ１Ｃ３および参照遺伝子のコピー数をそれぞれ求める工程と、
    （Ｂ）ＡＫＲ１Ｃ３コピー数／参照遺伝子コピー数の比を計算して、検出対象のｅｘ ｖｉｖｏ試料のＡＫＲ１Ｃ３ ＲＮＡ含有量を求める工程と
    を含む請求項１７～２１のいずれか一項に記載の方法。
23. 前記ｑＰＣＲ法を用いる場合、前記工程（Ａ）はさらに
    （Ａ_１）ＡＫＲ１Ｃ３のＣｔ値および初期コピー数ｌｇ値の検量線、並びに参照遺伝子のＣｔ値および初期コピー数ｌｇ値の検量線をそれぞれプロットする工程と、
    （Ａ_２）前記検量線に従って、検出されたＡＫＲ１Ｃ３および参照遺伝子のＣｔ値によってそれぞれ検出対象のｅｘ ｖｉｖｏ試料のＡＫＲ１Ｃ３および参照遺伝子のコピー数を求める工程と
    を含む、請求項１７～２２のいずれか一項に記載の方法。
24. 血液試料、骨髄試料または組織試料中のＡＫＲ１Ｃ３ ＲＮＡ含有量を検出するために使用される、請求項１７～２３のいずれか一項に記載の方法。
25. 請求項１７～２４のいずれか一項に記載の方法を用いて、検出対象のｅｘ ｖｉｖｏ試料のＡＫＲ１Ｃ３ ＲＮＡ含有量を検出し、その後、前記検出対象のｅｘ ｖｉｖｏ試料のＡＫＲ１Ｃ３ ＲＮＡ含有量に従って、前記検出対象のｅｘ ｖｉｖｏ試料のＡＫＲ１Ｃ３酵素の発現量を求めるＡＫＲ１Ｃ３酵素の発現量を検出する方法。
26. 前記検出対象のｅｘ ｖｉｖｏ試料中のＡＫＲ１Ｃ３ ＲＮＡ含有量と、前記検出対象のｅｘ ｖｉｖｏ試料中のＡＫＲ１Ｃ３酵素の発現量との間に線形相関がある請求項２５に記載の方法。

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