TW202300657A - 一種引物探針組合物、試劑盒和檢測方法 - Google Patents
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Abstract
本發明涉及一種引物探針組合物、試劑盒和檢測方法,該引物探針組合物選自第(i)組至第(ix)組中的一組,該試劑盒包括上述引物探針組合物。本發明的引物探針組合物、試劑盒和檢測方法能夠實現對患者離體樣本的AKR1C3 RNA含量的檢測,並具有較好的準確性、分析特異性、精密度和較低的檢測限。
Description
本發明涉及分子生物學檢測技術領域,尤其涉及一種引物探針組合物、試劑盒和檢測方法。
醛-酮還原酶家族1的成員C3(AKR1C3)是人體中由AKR1C3基因編碼的一種酶。在許多類型的癌症中,AKR1C3在蛋白水平上過表達。由於AKR1C3在腫瘤中的高表達,OBI-3424(又稱為AST-3424和TH-3424)、OBI-3423和OBI-2870化合物被設計為在腫瘤中被特異性啟動,但在表達低水平AKR1C3的正常細胞中無法被啟動,以實現腫瘤特異性靶向。OBI-3424化合物目前在美國(NCT04315324和NCT03592264)和中國(CXHL1900137和CXHL2000263)的多個I期臨床試驗中進行研究,以治療14種以上的人類癌症,包括實體腫瘤和血液腫瘤。
OBI-3424化合物是由AKR1C3啟動的新型前藥雙烷基化劑。研究證實,OBI-3424化合物啟動是AKR1C3依賴性的,其細胞毒性和抗腫瘤功效與AKR1C3酶表達水平高度相關。OBI-3424化合物在多種人類癌症類型中均表現出AKR1C3依賴性的體外細胞毒性和體內抗腫瘤活性,這支持OBI-3424化合物作為抗癌劑的進一步發展,可用於治療不同類型的癌症。使用AKR1C3作為生物標誌物來分析癌症患者的病情,並進一步指導患者選擇OBI-3424化合物進行治療。因此,在實際應用中,可通過檢測患者離體樣本的AKR1C3酶含量,進而根據檢測結果確定是否給予患者OBI-3424化合物治療。
現有技術中,通常採用免疫印跡法(Western blotting)或免疫化學染色法(IHC)來檢測患者離體樣本的AKR1C3酶含量,文獻(Harvey D J , Singleton R S , Dachs G U , et al. The Bioreductive Prodrug PR-104A Is Activated under Aerobic Conditions by Human Aldo-Keto Reductase 1C3[J]. Cancer Research, 2010, 70(4):1573)使用IHC方法,統計2700份腫瘤組織樣本並分析,AKR1C3酶在肝癌、胃癌、食道癌、膀胱癌等具有較高表達,而在小細胞肺癌、乳腺癌、白血病、前列腺癌中具有較低表達,因此使用IHC方法來檢測實體腫瘤組織樣本中AKR1C3酶表達水平在理論上是可行的。
然而,癌症或腫瘤的類型是多種多樣的,除實體腫瘤外,血液癌(白血病)的患者無法提供組織樣本,因而並不能直接使用免疫印跡法或免疫化學染色法來檢測血液癌(白血病)樣本中的AKR1C3酶表達水平。
申請人的研發團隊實驗發現,不同實體瘤的癌細胞的AKR1C3酶表達水平、AKR1C3 RNA含量與AST-3424對該癌細胞增殖抑制的IC
50值具有顯著的相關性,不同血液癌細胞系的AKR1C3酶表達水平、AKR1C3 RNA含量與AST-3424對該癌細胞增殖抑制的IC
50值具有顯著的相關性,因此通過檢測ARKR1C3 RNA含量也能預測或表徵酶的含量,進而指導用藥。
而對於如何檢測AKR1C3 RNA含量,現有技術沒有相應的檢測方法。假定可以使用相應的檢測方法來評估AKR1C3 RNA含量,則可以選擇具有較高AKR1C3 RNA含量且最可能對前藥產生反應的患者來給予OBI-3424化合物,以達到更好的癌症治療效果。
有鑑於此,本發明的目的是提出一種引物探針組合物、試劑盒和檢測方法,該引物探針組合物、試劑盒和檢測方法能夠實現對患者離體樣本的AKR1C3 RNA含量的檢測,並具有較好的準確性、分析特異性、精密度和較低的檢測限。
基於上述目的,本發明的第一個方面提供了一種引物探針組合物,其用於檢測患者離體樣本的AKR1C3 RNA含量,該引物探針組合物選自以下的一組:
(i) 上游引物AKR1C3-F1、下游引物AKR1C3-R1和探針AKR1C3-P1,所述上游引物AKR1C3-F1、下游引物AKR1C3-R1和探針AKR1C3-P1的核苷酸序列分別如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示;
(ii) 上游引物AKR1C3-F2、下游引物AKR1C3-R2和探針AKR1C3-P1,所述上游引物AKR1C3-F2、下游引物AKR1C3-R2和探針AKR1C3-P1的核苷酸序列分別如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:3所示;
(iii) 上游引物AKR1C3-F2、下游引物AKR1C3-R6和探針AKR1C3-P1,所述上游引物AKR1C3-F2、下游引物AKR1C3-R6和探針AKR1C3-P1的核苷酸序列分別如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:3所示;
(iv) 上游引物AKR1C3-F6、下游引物AKR1C3-R2和探針AKR1C3-P1,所述上游引物AKR1C3-F6、下游引物AKR1C3-R2和探針AKR1C3-P1的核苷酸序列分別如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:3所示;
(v) 上游引物AKR1C3-F6、下游引物AKR1C3-R6和探針AKR1C3-P1,所述上游引物AKR1C3-F6、下游引物AKR1C3-R6和探針AKR1C3-P1的核苷酸序列分別如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:3所示;
(vi) 上游引物AKR1C3-F5、下游引物AKR1C3-R5和探針AKR1C3-P2,所述上游引物AKR1C3-F5、下游引物AKR1C3-R5和探針AKR1C3-P2的核苷酸序列分別如SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示;
(vii) 上游引物AKR1C3-F3、下游引物AKR1C3-R3和探針AKR1C3-P1,所述上游引物AKR1C3-F3、下游引物AKR1C3-R3和探針AKR1C3-P1的核苷酸序列分別如SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:3所示;
(viii) 上游引物AKR1C3-F4、下游引物AKR1C3-R3和探針AKR1C3-P2,所述上游引物AKR1C3-F4、下游引物AKR1C3-R3和探針AKR1C3-P2的核苷酸序列分別如SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:10所示;
(ix) 上游引物AKR1C3-F7、下游引物AKR1C3-R7和探針AKR1C3-P3,所述上游引物AKR1C3-F7、下游引物AKR1C3-R7和探針AKR1C3-P3的核苷酸序列分別如SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示。
在本發明的優選的實施方案中,其中,所述引物探針組合物選自第(iii)組、第(iv)組或第(v)組;
進一步優選地,所述引物探針組合物選自第(iv)組。
在本發明的優選的實施方案中,其中,所述探針AKR1C3-P1、AKR1C3-P2和AKR1C3-P3的5’端螢光基團均為FAM,所述探針AKR1C3-P1、AKR1C3-P2和AKR1C3-P3的3’端淬滅基團均為MGB。
基於相同的發明構思,本發明的第二個方面提供了一種試劑盒,其包括上述引物探針組合物。
在本發明的優選的實施方案中,其中,上述試劑盒還包括內參基因的引物探針組合物;
優選地,所述內參基因為ACTB。
在本發明的優選的實施方案中,其中,所述內參基因的引物探針組合物包括上游引物ACTB-F1、下游引物ACTB-R1和探針ACTB-P1,所述上游引物ACTB-F1、下游引物ACTB-R1和探針ACTB-P1的核苷酸序列分別如SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19所示。
在本發明的優選的實施方案中,其中,所述探針ACTB-P1的5’端螢光基團均為VIC,所述探針ACTB-P1的3’端淬滅基團均為BHQ1。
在本發明的優選的實施方案中,其中,上述試劑盒還包括聚合酶混合液,所述聚合酶混合液主要包括:DNA聚合酶、MgCl2、緩衝液和dNTPs;
優選地,所述聚合酶混合液為KAPA PROBE FAST RT-PCR Master Mix(2x)。
在本發明的優選的實施方案中,其中,上述試劑盒還包括反轉錄酶混合液;
優選地,所述反轉錄酶混合液為Superscript VILO MARSTER MIX。
在本發明的優選的實施方案中,其中,上述試劑盒還包括陰性對照和陽性對照;
優選地,所述陰性對照為無核酸酶水;和/或
優選地,所述陽性對照為已知拷貝數的參考品。
基於相同的發明構思,本發明的第三個方面提供了上述引物探針組合物或上述試劑盒在製備治療癌症的藥物中的用途。
在本發明的優選的實施方案中,其中,使用上述引物探針組合物或上述試劑盒獲得患者離體樣本中的AKR1C3 RNA含量;
對AKR1C3 RNA含量大於或等於預定含量的患者給予AKR1C3活化抗癌藥物。
在本發明的優選的實施方案中,其中,所述AKR1C3 RNA含量根據AKR1C3拷貝數/內參基因拷貝數的比值而獲得;
優選地,所述預定含量為0.0001~1;
進一步優選地,所述預定含量為0.00011~0.5;
更優選地,所述預定含量為0.00013~0.05。
在本發明的優選的實施方案中,其中,所述離體樣本包括血液樣本、骨髓樣本或組織樣本。
在本發明的優選的實施方案中,其中,所述AKR1C3活化抗癌藥物,在本發明中,當然包括AKR1C3活化的抗癌前藥,即前藥形式的化合物在細胞中的生化環境中通過AKR1C3酶的催化最終得到具有細胞毒性的毒素而發揮癌細胞毒殺作用,參見以下專利申請:
PCT/US2016/021581,公開號WO2016145092A1,對應中國申請號2016800150788,公開號CN107530556A;
PCT/US2016/025665,公開號WO2016161342,對應中國申請號2016800446081,公開號CN108290911A;
PCT/US2016/062114,公開號WO2017087428,對應中國申請號2016800200132,公開號CN108136214A;以及
PCT/NZ2019/050030,公開號WO2019190331,對應中國申請號201980023423.6,公開號CN111918864A。
上述專利申請公開的通式化合物、具體化合物均屬於AKR1C3活化的抗癌前藥(化合物),在此將上述申請引用到本申請說明書中。
廣義而言,AKR1C3活化的抗癌藥物應滿足以下條件:
在存在AKR1C3抑制劑(如上述三個專利中公開的TH-3021,Flanagan等人,Bioorganic and Medicinal Chemistry(2014)第962-977頁中的化合物36即
)的環境下,檢測得到的某化合物的癌細胞增殖抑制作用小於不存在AKR1C3抑制劑(如上述三個專利中公開的TH-3021)的環境下檢測得到的該化合物的癌細胞增殖抑制作用,如癌細胞增殖抑制作用使用IC
50進行量化,則如果某個化合物對某個癌細胞系在存在AKR1C3抑制劑時檢測得到的IC
50大於不存在AKR1C3抑制劑時檢測得到的IC
50,則可以判定該化合物為AKR1C3活化的抗癌藥物。
在本發明的優選的實施方案中,其中,所述癌症包括:
肺癌、非小細胞肺癌、肝癌、胰腺癌、乳腺癌、胃癌、骨癌、食管癌、乳房癌、前列腺癌、睾丸癌、結腸癌、卵巢癌、膀朧癌、宮頸癌、肝細胞癌、黑色素瘤、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、腎細胞癌、囊性腺癌、囊性癌、髓狀癌、支氣管癌、骨細胞癌、上皮癌、膽管癌、絨毛膜癌、胚癌、精原細胞癌、維爾姆斯癌、膠質細胞癌、星形細胞瘤、成神經管細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、成血細胞瘤、聲帶神經瘤、腦膜瘤、成神經細胞瘤、成視神經細胞瘤、成視網膜細胞瘤、神經纖維瘤、纖維肉瘤、成纖維細胞瘤、纖維瘤、纖維腺瘤、纖維軟骨瘤、纖維囊瘤、纖維粘液瘤、纖維骨瘤、纖維粘液肉瘤、纖維乳頭狀瘤、粘液肉瘤、粘液囊瘤、粘液軟骨瘤、粘液軟骨肉瘤、粘液軟骨纖維肉瘤、粘液腺瘤、成粘液細胞瘤、脂肉瘤、脂肪瘤、脂肪腺瘤、成脂細胞瘤、脂肪軟骨瘤、脂肪纖維瘤、脂肪血管瘤、粘液脂瘤、軟骨肉瘤、軟骨瘤、軟骨肌瘤、脊索瘤、絨毛膜腺瘤、絨毛上皮瘤、成絨毛膜細胞瘤、骨肉瘤、成骨細胞瘤、骨軟骨纖維瘤、骨軟骨肉瘤、骨軟骨瘤、骨囊瘤、骨牙質瘤、骨纖維瘤、骨纖維肉瘤、血管肉瘤、血管瘤、血管脂肪瘤、血管軟骨瘤、成血管細胞瘤、血管角質瘤、血管神經膠質瘤、血管內皮瘤、血管纖維瘤、血管肌瘤、血管脂肪瘤、血管淋巴管瘤、血管脂肪平滑肌瘤、血管肌脂瘤、血管肌神經瘤、血管粘液瘤、血管網狀內皮瘤、淋巴管肉瘤、淋巴肉芽瘤、淋巴管瘤、淋巴瘤、淋巴粘液瘤、淋巴肉瘤、淋巴管纖維瘤、淋巴細胞瘤、淋巴上皮瘤、成淋巴細胞瘤、外周性T細胞淋巴瘤、結節性NK/T細胞淋巴瘤、內皮瘤、成內皮細胞瘤、滑膜瘤、滑膜肉瘤、間皮瘤、結締組織瘤、尤因瘤、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、成平滑肌瘤、平滑肌纖維瘤、橫紋肌瘤、橫紋肌肉瘤、橫紋肌粘液瘤、急性淋巴白血病、急性骨髓性白血病、慢性病細胞、紅細胞增多症、淋巴瘤、子宮內膜癌、膠質瘤、結直腸癌、甲狀腺癌、尿路上皮癌或多發性骨髓瘤;
優選地,所述癌症包括:卵巢癌、宮頸癌、胰腺癌、乳腺癌、結直腸癌、食管癌、胃癌、肝細胞癌、非小細胞肺癌、前列腺癌、腎細胞癌、外周性T細胞淋巴瘤、結節性NK/T細胞淋巴瘤、急性淋巴白血病或急性骨髓性白血病。
基於相同的發明構思,本發明的第四個方面提供了一種檢測AKR1C3 RNA含量的方法,其包括以下步驟:
(1) 提取待測離體樣本的RNA,將提取的RNA加入到逆轉錄體系中並逆轉錄合成cDNA;
(2) 以cDNA為模板,使用上述引物探針組合物或上述試劑盒進行qPCR或數位PCR擴增;
(3) 根據qPCR或數位PCR擴增結果獲得待測離體樣本的AKR1C3 RNA含量。
在本發明的優選的實施方案中,其中,在步驟(1)中,對提取的RNA進行濃度檢測;
優選地,使用Qubit RNA HS Assay Kits對提取的RNA進行濃度檢測;和/或
逆轉錄體系包括反轉錄酶;
優選地,提取的RNA和反轉錄酶的品質體積比為(0.5~2):4,單位為μg/μL;
進一步優選地,提取的RNA和反轉錄酶的品質體積比為(1~1.8):4,單位為μg/μL;
更優選地,提取的RNA和反轉錄酶的品質體積比為2:4,單位為μg/μL。
在本發明的優選的實施方案中,其中,在步驟(2)中,在qPCR反應體系中,將選自第(i)組至第(ix)組中的一組引物探針組合物與內參基因的引物探針組合物混合;
優選地,在qPCR反應體系中,AKR1C3上游引物、AKR1C3下游引物和AKR1C3探針的摩爾比為(2~10):(2~10):3;
進一步優選地,AKR1C3上游引物、AKR1C3下游引物和AKR1C3探針的摩爾比為(3~7):(3~7):3;
更優選地,AKR1C3上游引物、AKR1C3下游引物和AKR1C3探針的摩爾比為5:5:3;和/或,
在qPCR反應體系中,優選地,上游引物ACTB-F1、下游引物ACTB-R1和探針ACTB-P1的摩爾比為(2~10):(2~10):3;
進一步優選地,上游引物ACTB-F1、下游引物ACTB-R1和探針ACTB-P1的摩爾比為(3~7):(3~7):3;
更優選地,上游引物ACTB-F1、下游引物ACTB-R1和探針ACTB-P1的摩爾比為5:5:3;和/或,
在qPCR反應體系中,優選地,AKR1C3上游引物、AKR1C3下游引物和AKR1C3探針的用量分別與上游引物ACTB-F1、下游引物ACTB-R1和探針ACTB-P1的用量相同。
在本發明的優選的實施方案中,其中,在步驟(2)中,在qPCR反應體系中,還加入dUTP、UNG酶、cDNA模板和聚合酶混合液;
優選地,聚合酶混合液的體積為qPCR反應體系總體積的(0.3~0.8);
更優選地,聚合酶混合液的體積為qPCR反應體系總體積的0.5。
在本發明的優選的實施方案中,其中,在步驟(2)中,分別使用AKR1C3數位PCR檢測體系和內參基因數位PCR檢測體系進行AKR1C3和內參基因的擴增;
優選地,在AKR1C3數位PCR檢測體系中,AKR1C3上游引物、AKR1C3下游引物和AKR1C3探針的摩爾比為(5~15):(5~15):3;
進一步優選地,AKR1C3上游引物、AKR1C3下游引物和AKR1C3探針的摩爾比為(8~14):(8~14):3;
更優選地,AKR1C3上游引物、AKR1C3下游引物和AKR1C3探針的摩爾比為12:12:3;和/或,在內參基因數位PCR檢測體系中,
優選地,上游引物ACTB-F1、下游引物ACTB-R1和探針ACTB-P1的摩爾比為(5~15):(5~15):3;
進一步優選地,上游引物ACTB-F1、下游引物ACTB-R1和探針ACTB-P1的摩爾比為(8~14):(8~14):3;
更優選地,上游引物ACTB-F1、下游引物ACTB-R1和探針ACTB-P1的摩爾比為12:12:3。
在本發明的優選的實施方案中,其中,在步驟(3)中,所述根據qPCR或數位PCR擴增結果獲得待測離體樣本的AKR1C3 RNA含量包括:
(A) 根據qPCR或數位PCR擴增結果分別獲得待測離體樣本的AKR1C3拷貝數和內參基因拷貝數;
(B) 計算AKR1C3拷貝數/內參基因拷貝數的比值,從而獲得待測離體樣本的AKR1C3 RNA含量。
在本發明的優選的實施方案中,其中,當採用qPCR法時,步驟(A)還包括:
(A1) 分別繪製AKR1C3的Ct值與初始拷貝數lg值的標準曲線和內參基因的Ct值與初始拷貝數lg值的標準曲線;
(A2) 根據標準曲線,通過檢測到的AKR1C3的Ct值和內參基因的Ct值分別獲得待測離體樣本的AKR1C3拷貝數和內參基因拷貝數。
在本發明的優選的實施方案中,其中,上述方法用於檢測血液樣本、骨髓樣本或組織樣本中的AKR1C3 RNA含量。
基於相同的發明構思,本發明的第五個方面提供了一種檢測AKR1C3酶表達水平的方法,其中,採用上述方法檢測待測離體樣本的AKR1C3 RNA含量,然後根據待測離體樣本的AKR1C3 RNA含量獲得待測離體樣本的AKR1C3酶表達水平。
在本發明的優選的實施方案中,其中,待測離體樣本的AKR1C3 RNA含量與待測離體樣本的AKR1C3酶表達水平存在線性相關性。
需要說明的是,除非另外定義,本說明書一個或多個實施例使用的技術術語或者科學術語應當為本公開所屬領域內具有一般技能的人士所理解的通常意義。
下述實施例中的實驗方法,如無特殊說明,均為常規方法。下述實施例中所用的藥材原料、試劑材料等,如無特殊說明,均為市售購買產品。
向患者“給予”藥物是指直接投與(其可由醫學專業人士向患者給予或可為自行給予)及/或間接給予,其可為開具藥物處方的操作。舉例而言,指導患者自行給予藥物及/或向患者提供藥物處方的醫師將向患者給予藥物。
“癌症”是指可通過侵襲而局部擴展且通過轉移而全身擴展的潛在無限制生長的白血病、淋巴瘤、癌及其他惡性腫瘤(包括實體腫瘤)。癌症的實例包括(但不限於)腎上腺、骨、腦、乳房、支氣管、結腸及/或直腸、膽囊、頭及頸、腎、喉、肝、肺、神經組織、胰臟、前列腺、副甲狀腺、皮膚、胃及甲狀腺的癌症。癌症的某些其他實例包括急性及慢性淋巴細胞及粒細胞腫瘤、腺癌、腺瘤、基底細胞癌、子宮頸上皮分化不良及原位癌、尤文氏肉瘤(Ewing’s sarcoma)、表皮樣癌、巨細胞瘤、多型性神經膠母細胞瘤、毛細胞腫瘤、腸神經節細胞瘤、增生性角膜神經腫瘤、胰島細胞癌、卡波西肉瘤(Kaposi’s sarcoma)、平滑肌瘤、白血病、淋巴瘤、惡性類癌瘤、惡性黑色素瘤、惡性高鈣血症、馬方樣體型腫瘤(marfanoid habitus tumor)、髓樣上皮癌、轉移性皮膚癌、黏膜神經瘤、骨髓瘤、蕈狀肉芽腫、神經胚細胞瘤、骨肉瘤、骨原性及其他肉瘤、卵巢瘤、嗜鉻細胞瘤、真性紅血球增多症、原發性腦瘤、小細胞肺癌、潰瘍型及乳頭型二者的鱗狀細胞癌、增生、精原細胞瘤、軟組織肉瘤、視網膜母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、腎細胞腫瘤、局部皮膚病灶、網狀細胞肉瘤及威爾姆氏腫瘤(Wilm’s tumor)。
“患者”及“個體”可互換使用,是指需要癌症治療的哺乳動物。通常,患者是人類。通常,患者是診斷患有癌症的人類。在某些實施例中,“患者”或“個體”可指用於篩選、表徵及評估藥物及療法的非人類哺乳動物,例如非人類靈長類動物、狗、貓、兔、豬、小鼠或大鼠。
“前藥”是指給予之後經新陳代謝或以其他方式轉化為關於至少一種性質的生物學活性或活性更高的化合物(或藥物)的化合物。相對於藥物,前藥以使其相對於藥物活性較低或無活性的方式化學修飾,但化學修飾使得在前藥給予之後通過代謝或其他生物過程產生相應藥物。前藥可相對於活性藥物具有改變的代謝穩定性或輸送特徵、較少副作用或較低毒性或經改良的風味(參見(例如)參考文獻Nogrady,1985,Medicinal Chemistry A Biochemical Approach,Oxford University Press,New York,第388頁至392頁,其以引用方式併入本文中)。前藥可使用除相應藥物以外的反應物來合成。
“實體腫瘤”是指包括(但不限於)骨、腦、肝、肺、淋巴結、胰臟、前列腺、皮膚及軟組織(肉瘤)中的轉移腫瘤的實體腫瘤。
病況或患者的“治療”是指採取步驟以獲得有益或期望結果(包括臨床結果)。出於本發明的目的,有益或期望臨床結果包括(但不限於)一或多種癌症症狀的緩和或改善;疾病程度的減弱;疾病進展的延遲或減緩;疾病狀態的改善、緩解或穩定;或其他有益結果。在一些情形下,癌症的治療可使得部分反應或穩定疾病。
“腫瘤細胞”是指任何適當物種(例如,哺乳動物,例如鼠類、犬、貓、馬或人類)的腫瘤細胞。
藥物的“治療有效量”是指當給予癌症患者時,經具有預期治療效果(例如緩解、改善、緩和或消除在患者體內的癌症的一或多種表現)的藥物的量。治療作用在投與一次劑量時未必會發生,且可能僅在給予一系列劑量之後發生。因此,可在一或多次給予中給予治療有效量。
在描述旋光化合物時,首碼R和S用於表示分子圍繞其手性中心的絕對構型。(+)和(-)用於表示化合物的光性,即,偏振光平面通過旋光化合物旋轉的方向。首碼(-)表示該化合物是左旋的,即,該化合物將偏振光平面的方向向左或逆時針旋轉。(+)首碼表示該化合物是右旋的,即,該化合物將偏振光的方向向右或順時針旋轉。但是,旋光的符號(+)和(-)與分子R和S的絕對構型無關。
其中,OBI-3424是S-對映異構體,OBI-3423是R-對映異構體,並且OBI-2870是OBI-3424和OBI-3423以1:1的比例的外消旋混合物。
前期研究表明,OBI-3424、OBI-3423和OBI-2870化合物對於多種人類癌症具有較好的治療效果,尤其是OBI-3424化合物在實體瘤和血液惡性腫瘤中均具有較好的治療效果;其中,OBI-3424化合物對實體瘤(包括肝癌、肝細胞癌(HCC)、非小細胞肺癌、黑素瘤、前列腺癌、乳癌、食道癌、腎癌、胃癌、結腸癌、腦癌、膀胱癌、子宮頸癌、卵巢癌、頭頸癌、子宮內膜癌、胰臟癌、肉瘤癌和直腸癌等)的治療效果參見專利CN108290911A;OBI-3424化合物對血液惡性腫瘤(包括B系急性淋巴細胞白血病(B-ALL)和T系急性淋巴細胞白血病(T-ALL))的治療效果參見專利WO2019/062919A1。
在許多類型的癌症中,尤其是在肝癌、胃癌、腎癌、CRPC和非小細胞肺癌中,AKR1C3在蛋白水平上過表達。由於AKR1C3在腫瘤中的高表達,OBI-3424化合物被設計為在腫瘤中被特異性啟動,但在表達低水平AKR1C3的正常細胞中無法被啟動,以實現腫瘤特異性靶向。OBI-3424被開發為由AKR1C3選擇性啟動的高效DNA烷基化前藥。在NADPH的存在下,OBI-3424由AKR1C3還原為中間體,該中間體自發地水解為OBI-2660,其是類似於thioTEPA(N,N′,N′′-三亞乙基硫代磷醯胺)的DNA雙烷基化劑,可導致鳥嘌呤N7(或O6)位置的DNA交聯,並隨後導致細胞死亡,如下所示。
申請人進一步研究證實,OBI-3424化合物啟動是AKR1C3依賴性的,其細胞毒性和抗腫瘤功效與AKR1C3蛋白水平高度相關。OBI-3424化合物在多種人類癌症類型中均表現出AKR1C3依賴性的體外細胞毒性和體內抗腫瘤活性,這支持OBI-3424化合物作為抗癌劑的進一步發展,可用於治療不同類型的癌症。使用AKR1C3作為生物標誌物來分析癌症患者的病情,並進一步指導患者選擇OBI-3424化合物進行治療。
本申請的實施例1證實了,實體腫瘤中AKR1C3酶和AKR1C3 RNA含量與OBI-3424化合物對癌細胞的IC
50值在經過數學轉換後的量線性相關,且線性相關係數足夠高;實施例2和3證實了,血液腫瘤中AKR1C3酶和AKR1C3 RNA含量與OBI-3424化合物對癌細胞的IC
50值在經過數學轉換後的量線性相關,且線性相關係數足夠高。本領域技術人員公知,只有關聯到IC
50值才能直接確認藥物對某個患者的治療效果;理論上和實際中,IC
50值越低,藥物對患者的療效會越好。實施例1-3的試驗資料都是測試一個可以客觀測量的相關生物特徵值來關聯IC
50值,進而預測藥物對具體癌症患者的療效,實現針對性給藥(實際上,直接獲取具體患者的腫瘤組織,然後在癌細胞存活條件下進行IC
50值測試最好,這樣是最好、最直觀和最準確的,但實際上不可行,因此只能測試可以客觀測量的相關生物特徵值來關聯IC
50值)。本申請經過大量試驗證實了,實體腫瘤和血液腫瘤中AKR1C3酶和AKR1C3 RNA含量與OBI-3424化合物對癌細胞的IC
50值不但線性相關,而且線性相關係數足夠高,這足以說明實體腫瘤和血液腫瘤中AKR1C3酶和AKR1C3 RNA含量與OBI-3424化合物對癌細胞的IC
50值高度相關。因此,在實際應用中,可通過檢測患者離體樣本的AKR1C3酶含量和AKR1C3 RNA含量,進而根據檢測結果確定是否給予患者OBI-3424化合物治療。
現有技術中,通常採用免疫印跡法或免疫化學染色法來檢測AKR1C3酶含量,而對於如何檢測AKR1C3 RNA含量,現有技術沒有相應的檢測方法。假定可以使用相應的檢測方法來評估AKR1C3 RNA含量,則可以選擇具有較高AKR1C3 RNA含量且最可能對前藥產生反應的患者來給予OBI-3424化合物,以達到更好的癌症治療效果。
基於上述目的,本發明基於即時螢光定量PCR技術(qPCR),採用RNA逆轉錄反應和聚合酶鏈式反應及Taqman探針技術,針對AKR1C3基因表達量進行檢測,並以此建立一個可應用於LDT(Laboratory developed test,臨床實驗室自建專案)體系下人AKR1C3基因表達量的方法和相應試劑盒,最終用於臨床試驗樣本伴隨診斷用藥檢測。
引物、探針設計基本原則:1) 引物探針的長度:每條引物長度為15~30個鹼基。2) 引物探針中GC%要求在30~80%,引物Tm值在55~60℃。3) 引物探針自身、引物之間的3'端盡可能避免鹼基配對。4) 引物探針自身、引物之間盡可能避免6對以上的連續鹼基配對。5) 上下游引物擴增的目的片段長度在50~180bp,探針位於上下游引物之間,盡可能靠近上游引物,探針的5’端應避免使用鳥嘌呤。當探針退火溫度過低時考慮採用LNA探針或者MGB探針進行設計。6) 選用的引物和探針要求設計在AKR1C3基因的保守區,能特異性檢出AKR1C3基因的表達情況。
技術原理:採用RNA逆轉錄反應、聚合酶鏈式反應及Taqman探針技術,針對AKR1C3基因表達設計特異性的引物和探針。利用特異性引物對靶序列進行PCR擴增,結合在模板上的Taqman探針被Taq酶(5’→3’外切酶活性)切斷,螢光基團與淬滅基團分離,產生並積累螢光信號。根據螢光信號與擴增循環數之間的關係可得到即時的擴增曲線,從而實現對AKR1C3 RNA表達水平檢測。
本發明針對AKR1C3共3個目標區域(分別為第2-3號外顯子、第4-5號外顯子和第5-6號外顯子)設計9對引物和探針,引物探針的位置資訊參見圖1。使用Beacon Designer 8.12 軟體進行輔助評估引物質量,均符合引物探針設計基本原則,並通過NCBI資料庫中Blast工具,確保每對引物探針特異性擴增人類基因序列,不會出現常見的SNP位點。
本發明的第一個方面提供了一種引物探針組合物,其選自以下的一組:
(i) 上游引物AKR1C3-F1、下游引物AKR1C3-R1和探針AKR1C3-P1,所述上游引物AKR1C3-F1、下游引物AKR1C3-R1和探針AKR1C3-P1的核苷酸序列分別如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示;
(ii) 上游引物AKR1C3-F2、下游引物AKR1C3-R2和探針AKR1C3-P1,所述上游引物AKR1C3-F2、下游引物AKR1C3-R2和探針AKR1C3-P1的核苷酸序列分別如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:3所示;
(iii) 上游引物AKR1C3-F2、下游引物AKR1C3-R6和探針AKR1C3-P1,所述上游引物AKR1C3-F2、下游引物AKR1C3-R6和探針AKR1C3-P1的核苷酸序列分別如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:3所示;
(iv) 上游引物AKR1C3-F6、下游引物AKR1C3-R2和探針AKR1C3-P1,所述上游引物AKR1C3-F6、下游引物AKR1C3-R2和探針AKR1C3-P1的核苷酸序列分別如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:3所示;
(v) 上游引物AKR1C3-F6、下游引物AKR1C3-R6和探針AKR1C3-P1,所述上游引物AKR1C3-F6、下游引物AKR1C3-R6和探針AKR1C3-P1的核苷酸序列分別如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:3所示;
(vi) 上游引物AKR1C3-F5、下游引物AKR1C3-R5和探針AKR1C3-P2,所述上游引物AKR1C3-F5、下游引物AKR1C3-R5和探針AKR1C3-P2的核苷酸序列分別如SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示;
(vii) 上游引物AKR1C3-F3、下游引物AKR1C3-R3和探針AKR1C3-P1,所述上游引物AKR1C3-F3、下游引物AKR1C3-R3和探針AKR1C3-P1的核苷酸序列分別如SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:3所示;
(viii) 上游引物AKR1C3-F4、下游引物AKR1C3-R3和探針AKR1C3-P2,所述上游引物AKR1C3-F4、下游引物AKR1C3-R3和探針AKR1C3-P2的核苷酸序列分別如SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:10所示;
(ix) 上游引物AKR1C3-F7、下游引物AKR1C3-R7和探針AKR1C3-P3,所述上游引物AKR1C3-F7、下游引物AKR1C3-R7和探針AKR1C3-P3的核苷酸序列分別如SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示。
本發明使用上述9組引物探針組合物進行AKR1C3擴增,並根據擴增效率和特異性,從9組引物探針組合物中選擇第(iii)組、第(iv)組和第(v)組作為候選的引物探針組合物,為了確定最佳引物探針組合物,分別使用第(iii)組、第(iv)組和第(v)組的引物探針組合物在不同樣本中進行進一步的AKR1C3擴增,根據擴增效率最終確定了第(iv)組的引物探針組合物(上游引物AKR1C3-F6、下游引物AKR1C3-R2和探針AKR1C3-P1)為本發明的最佳引物探針組合物。
需要說明一點,本發明的9組引物探針組合物不僅可用於qPCR法檢測AKR1C3 RNA含量,還可用於數位PCR法檢測AKR1C3 RNA含量,下文中詳細記載了qPCR法和數位PCR法檢測AKR1C3 RNA含量的步驟。
在本發明的優選的實施方案中,其中,所述探針AKR1C3-P1、AKR1C3-P2和AKR1C3-P3的5’端螢光基團均為FAM,所述探針AKR1C3-P1、AKR1C3-P2和AKR1C3-P3的3’端淬滅基團均為MGB。
用於實施本發明的優選探針為根據TaqMan系統標記的探針。TaqMan系統是可從製造商Life Technologies Inc.獲得的技術。根據TaqMan系統,被特別設計以與被擴增的靶DNA雜交的寡核苷酸探針的5’端與螢光基團共價連接,3’端與淬滅基團共價連接。用於TaqMan系統的適當的螢光基團的實例包括6羧基螢光素(FAM)或四氯螢光素(TET)。典型的淬滅基團為小溝結合基團(MGB)。該TaqMan系統的原理是,只要淬滅基團和螢光基團在探針上的位置非常接近,淬滅基團就抑制螢光基團的螢光。一旦寡核苷酸探針在qPCR擴增過程中與靶DNA雜交,它就會被Taq聚合酶降解,因為該酶使寡核苷酸引物沿著對應於靶DNA的DNA延伸。這種降解釋放了螢光基團和淬滅基團,淬滅基團變得不再與螢光基團非常接近,從而使螢光基團能夠發射它的螢光,該螢光隨後可通過通常整合在qPCR設備(即熱循環儀)中的適當工具來檢測和測量。
基於相同的發明構思,本發明的第二個方面提供了一種試劑盒,其包括上述引物探針組合物。
在本發明的優選的實施方案中,其中,上述試劑盒還包括內參基因的引物探針組合物;所述內參基因的引物探針組合物包括上游引物ACTB-F1、下游引物ACTB-R1和探針ACTB-P1,所述上游引物ACTB-F1、下游引物ACTB-R1和探針ACTB-P1的核苷酸序列分別如SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19所示。
利用qPCR技術測定基因的表達量時,往往不是直接測定目的基因的絕對表達量,而是分別測定目的基因和內參基因的表達量,並把內參基因的表達量作為一個標準來測出目的基因的相對表達量,最後再進行樣品間相對表達量的比較。在用相對定量法測定基因的表達水平時,qPCR得到的Ct值是指數關係,不是線性關係,因此不能將Ct值直接用於需要資料正態分佈的統計分析方法如t檢驗和方法分析(ANOVA)方法,所以統計資料時應先將原始Ct值進行2-Ct轉換,使資料達到線性關係後再進行統計分析。在用相對定量法得到資料後,進行資料分析時常用比較CT值法(2
-ΔΔCt法)。此方法基於2個假設:①擴增效率為100%,即每個PCR循環產物的量都翻倍,可以通過擴增效率的驗證來解決;②有合適的內參基因校正上樣量的誤差。根據公式計算差異倍數(fold change)=2
-ΔΔCt;ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct內參)處理組-(Ct目的基因-Ct內參)對照組。由計算公式可知,在相對定量法中,沒有內參基因的Ct值就無法計算出目的基因的相對表達量,由此可見內參基因具有非常重要的作用。
內參基因是指其表達水平不受研究條件的影響且可以在多種樣本間恒定表達的已知參照基因,用這個基因的表達水平可以準確量化初始材料的載量。由於管家基因的表達水平受環境因素影響較小,並能在生物體幾乎全部組織及各個生長階段持續表達,所以在試驗中通常選用管家基因作為內參基因。
根據文獻(董恩妮, 梁青, 李利,等. 即時螢光定量PCR內參基因的選擇[J]. 中國畜牧雜誌, 49(11):92-96.DOI:10.3969/j.issn.0258-7033.2013.11.025)及文獻(趙文靜, 徐潔, 包秋華,等. 即時螢光定量PCR中內參基因的選擇[J]. 微生物學通報, 2010(12):1825-1829.DOI:CNKI:SUN:WSWT.0.2010-12-019)可知在q-PCR中使用的內參基因如下表所示:
物種 | 樣品類型 | 內參基因 | |
穩定性好 | 穩定性差 | ||
血液(肺結核病人) | HuPO | GAPDH, β–Actin, HPRT | |
GAPDH, β–Actin, EF–1–α | |||
外周血單個核細胞 | HuPO, HPRT | ||
人 | β2–Microglobulin | ||
肺癌組織 | GUSB, β2–M | GAPDH | |
肝癌組織 | HMBS, C–TBP | UBC, HPT, 18SrRNA | |
腦(嗅球、小腦、皮質、下丘腦、海馬體、腦幹和紋狀體) | GAPDH, HPRT1, β–Actin, Aequorin | NT–3 | |
小鼠 | 小腸 | SDHA, HRPT1 | ARBP, ACTB, GAPDH, B2M |
肝臟 | ACTB, GAPDH | B2M, SDHA,HPRT1, ARBP | |
乳腺組織 | GAPDH, HRPT1 | ARBP, ACTB, SDHA, B2M ACTB, GAPDH, SDHA, TBP1 | |
豬 | 仔豬(心、肝、脾、肺、腎、腦、肌肉、子宮、大腸和腸淋巴結組織 | HMBS, HPRT1, RPL4 | B2M, YWHAZ |
牛 | 子宮內膜組織 | SUZ12 | GAPDH |
綿羊 | 血液 | SDHA, YWHAZ | GAPDH, PGK1 |
山羊 | 竇前卵泡 胚胎成纖維細胞(感染新城疫) | UBQ,β–Actin, 18SrRNA, GAPDH, SHDA | 18SrRNA ACTB, HPRT1, HMBS |
雞 | 血液(炎症前期) | β–Actin | HPRT, GAPDH |
鵝 | 仔鵝(肝、腎、心、肌肉和卵巢) | GAPDH, HRPT1 | 28SrRNA, TUB, SDH, ACT, 18SrRNA |
關於內參基因,本發明篩選出4種內參基因HPRT1(次黃嘌呤磷酸核糖基轉移酶)、GAP(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)、ACTB(又稱為β-actin、β-肌動蛋白)和GOLGA1(高爾基體蛋白,具體為高爾基體自身抗原A1),使用4種內參基因分別對應的引物探針組合物(如表1所示),並用細胞系CCRF-CEM進行測試,評估其螢光強度和擴增情況,並進一步用不同樣本(包括健康血液樣本和白血病患者骨髓樣本)和不同表達水平的細胞系(包括AKR1C3高表達細胞系和AKR1C3低表達細胞系)進行測試,驗證其表達穩定性和能否能夠對高低表達的樣本和細胞系進行區分。測試結果表明,與其他三個內參相比,ACTB作為內參時,能夠更好地將高表達細胞系RPMI8226、CCRF-CEM與低表達細胞系Jurkat區分開;在健康人中,數值維持在比較低的水平,而在白血病患者骨髓RNA樣本中能夠檢測到AKR1C3的高表達。結合擴增曲線的實驗結果,選擇ACTB作為內參基因。相應地,上述試劑盒中內參基因的引物探針組合物包括上游引物ACTB-F1、下游引物ACTB-R1和探針ACTB-P1。
在本發明的優選的實施方案中,其中,所述探針ACTB-P1的5’端螢光基團均為VIC(綠色螢光蛋白),所述探針ACTB-P1的3’端淬滅基團均為BHQ1(Black Hole Quencher 1,黑洞淬滅基團1)。
本發明經過篩選最終確定的最佳AKR1C3引物探針組合物和內參ACTB的引物探針組合物如表1所示。
表1 AKR1C3使用引物探針序列資訊表
名稱 | 序列 | 標記 | 來源說明 |
AKR1C3-F1 | CTCAACAAGCCAGGACTCAAGTACAAGC | ||
AKR1C3-F2 | ACAAGCCAGGACTCAAGTACAA | ||
AKR1C3-F3 | CAGTGTGAAGAGAGAAGACATATTCTACA | ||
AKR1C3-F4 | GCAGATGGCAGTGTGAAGAG | ||
AKR1C3-F5 | TGGCAGTGTGAAGAGAGRAGAC | ||
AKR1C3-F6 | GATGATCCTCAACAAGCCAGGA | ||
AKR1C3-F7 | CACCAACAGATGAAAATGGAAAAGTAA | ||
AKR1C3-R1 | ACTTGCAGAAATCTAGCAATTTACTCCGGTTG | ||
AKR1C3-R2 | AATCTAGCAATTTACTCCGGTTGAAATAC | ||
AKR1C3-R3 | CAAGGCTGGTCGGACCAA | ||
AKR1C3-R5 | GGTCAACATAGTCCAATTGAGCT | ||
AKR1C3-R6 | ACTTGCAGAAATCTAGCAATTTACTCC | ||
AKR1C3-R7 | GGTTGAAGTTTGACACCCCAA | ||
AKR1C3-P1 | CTGCAACCAGGTAGAATGTCA | 5’FAM, 3’MGB | |
AKR1C3-P2 | CTTTGGTCCACTTTTCATCGAC | 5’FAM, 3’MGB | |
AKR1C3-P3 | TTGACATAGTGGATCTCTGTACCA | 5’FAM, 3’MGB | |
ACTB-F1 | CACCTTCTACAATGAGCTGCG | ||
ACTB-R1 | GTCTCAAACATGATCTGGGTCATC | ||
ACTB-P1 | CCTCGGTCAGCAGCACGGGGT | 5’VIC, 3’BHQ1 | |
HPRT1-F1 | CAGCCTCAACATCCTGCACT | 來源於文獻1 | |
HPRT1-R1 | CACACAATAGCTCTTCAGTCTG | 來源於文獻1 | |
HPRT1-P1 | TGACCTTGATTTATTTTGCATACC | 來源於文獻2 | |
GAP-F1 | AGGCTGGGGCTCATTTGC | 來源與文獻3 | |
GAP-R1 | GTG CTCAGTGTAGCCCAGGATG | 來源於文獻3 | |
GAP-P1 | GAGCCACACAAACACCAG | 來源於文獻4 | |
GOLGA1-F1 | 高爾基體自身抗原A1(GOLGA1)基因的上游核酸片段 | 核酸序列未測定 | |
GOLGA1-R1 | 高爾基體自身抗原A1(GOLGA1)基因的下游核酸片段 | 核酸序列未測定 | |
GOLGA1-P1 | 高爾基體自身抗原A1(GOLGA1)基因的探針核酸片段 | 核酸序列未測定 |
文獻1:Wu, X., Blackburn, P., Tschumper, R. et al. TALEN-mediated genetic tailoring as a tool to analyze the function of acquired mutations in multiple myeloma cells. Blood Cancer Journal 4, e210 (2014). https://doi.org/10.1038/bcj.2014.32中公開的相應核酸序列。
文獻2: WO2018123764A1 中公開的HPRT1的核酸序列。
文獻3:Werner Kempf, Marshall E. Kadin, Ann M. Dvorak, Carol C. Lord, Günter Burg, Norman L. Letvin, Igor J. Koralnik, Endogenous retroviral elements, but not exogenous retroviruses, are detected in CD30-positive lymphoproliferative disorders of the skin, Carcinogenesis, Volume 24, Issue 2, February 2003, Pages 301–306, https://doi.org/10.1093/carcin/24.2.301中公開的相應核酸序列。
文獻4:Stecker C, Johann A, Herzberg C, Averhoff B, Gottschalk G. Complete nucleotide sequence and genetic organization of the 210-kilobase linear plasmid of Rhodococcus erythropolis BD2. J Bacteriol. 2003;185(17):5269-5274. doi:10.1128/jb.185.17.5269-5274.2003中公開的相應核酸序列。
未標明來源的均為新的序列或專為本次試劑盒新開發或新挑選的序列。
在本發明的優選的實施方案中,其中,上述試劑盒還包括聚合酶混合液,所述聚合酶混合液主要包括:DNA聚合酶、MgCl2、緩衝液和dNTPs;
優選地,所述聚合酶混合液選用實驗室長期使用,並且經過反復驗證擴增效率良好的聚合酶KAPA PROBE FAST RT-PCR Master Mix(2x)。
在本發明的優選的實施方案中,其中,上述試劑盒還包括反轉錄酶混合液;
優選地,所述反轉錄酶混合液為Superscript VILO MARSTER MIX。
每次PCR反應中,都必須和陽性參考品、陰性對照品(NC,無核酸酶水)共同進行檢測和分析。因此,在本發明的優選的實施方案中,其中,上述試劑盒還包括陰性對照和陽性對照;
優選地,所述陰性對照(NC)為無核酸酶水;和/或
優選地,所述陽性對照為已知拷貝數的參考品。
上述試劑盒還可包含實施qPCR必需的要素,例如試劑,如技術人員已知的。除了引物對和探針,試劑盒還可包含一種或多種酶(Taq聚合酶)或用於qPCR反應中的試劑。酶可以以凍乾形式存在或存在於適合的緩衝劑中。另外,試劑盒可包含實施qPCR必需的所有額外的要素,例如緩衝劑、提取試劑、酶、移液管、板、核酸、濾紙、凝膠材料、轉移材料、放射自顯影設備、說明書(記載相關操作方法)等。
基於相同的發明構思,本發明的第三個方面提供了上述引物探針組合物或上述試劑盒在製備治療癌症的藥物中的用途。
在本發明的優選的實施方案中,其中,使用上述引物探針組合物或上述試劑盒獲得患者離體樣本中的AKR1C3 RNA含量;
對AKR1C3 RNA含量大於或等於預定含量的患者給予AKR1C3活化抗癌藥物。
相應地,本發明提供了一種治療患者的癌症的方法,該方法包括:
使用上述引物探針組合物或上述試劑盒獲得患者離體樣本中的AKR1C3 RNA含量;
對AKR1C3 RNA含量大於或等於預定含量的患者給予AKR1C3活化抗癌藥物;優選地,向患者給予治療有效量的OBI-3424、OBI-3423和OBI-2870化合物。
在本發明的優選的實施方案中,其中,所述AKR1C3 RNA含量根據AKR1C3拷貝數/內參基因拷貝數的比值而獲得,例如,計算AKR1C3拷貝數/ACTB拷貝數的比值,若AKR1C3拷貝數/ACTB拷貝數的比值>X,則判定此為AKR1C3高表達,則向患者給予治療有效量的OBI-3424、OBI-3423和OBI-2870化合物;若AKR1C3拷貝數/ACTB拷貝數的比值≤X,則判定此為AKR1C3低表達,則不向患者給予治療有效量的OBI-3424、OBI-3423和OBI-2870化合物,但可向患者給予其他癌症治療藥物。
而預定含量X的確定取值需要通過大量樣本檢測確定,發明人根據大量臨床試驗樣本並通過統計學方法最終確定了預定含量X為0.0001~1;進一步優選地,預定含量X為0.00011~0.5;更優選地,預定含量X為0.00013~0.05,特別優選地,預定含量X為0.00014~0.015。例如預定含量X為0.0001~0.0005、0.0001~0.001、0.0001~0.005、0.0001~0.01、0.0001~0.05、0.0001~0.1、0.0001~0.5、0.0001~0.9、0.00011~0.0005、0.00011~0.001、0.00011~0.005、0.00011~0.01、0.00011~0.05、0.00011~0.1、0.00011~0.5、0.00011~1、0.00013~0.0005、0.00013~0.001、0.00013~0.01、0.00013~0.05、0.00013~0.1、0.00013~0.5、0.00013~1、0.0005~0.001、0.0005~0.005、0.0005~0.01、0.0005~0.05、0.0005~0.1、0.0005~0.5、0.0005~1、0.00091~0.001、0.00091~0.05、0.00091~0.1、0.00091~0.5、0.00091~1、0.001~0.005、0.001~0.01、0.001~0.05、0.001~0.1、0.001~0.5、0.001~1、0.005~0.01、0.005~0.05、0.005~0.1、0.005~0.5、0.005~1、0.01~0.05、0.01~0.1、0.01~0.5、0.01~1、0.05~0.1、0.05~0.5或0.05~1;更優選地,預定含量X為0.0001、0.00011、0.00012、0.00013、0.00014、0.00015、0.000156、0.00016、0.000163、0.000165、0.00017、0.000177、0.00018、0.000181、0.00019、0.000195、0.0002、0.000201、0.000216、0.000221、0.00023、0.000239、0.00025、0.00029、0.0003、0.00035、0.0004、0.00045、0.0005、0.00054、0.0006、0.00065、0.0007、0.00075、0.0008、0.00085、0.0009、0.00095、0.001、0.0015、0.00177、0.002、0.00238、0.0025、0.00266、0.00296、0.003、0.00315、0.0035、0.004、0.0045、0.005、0.0055、0.006、0.0065、0.00679、0.007、0.00710、0.0075、0.00778、0.00791、0.008、0.0085、0.009、0.00939、0.0095、0.01、0.011、0.012、0.01207、0.013、0.01365、0.014、0.015、0.016、0.017、0.018、0.019、0.02、0.025、0.03、0.035、0.04、0.045、0.05、0.055、0.06、0.065、0.07、0.075、0.08、0.085、0.09、0.095、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95或1。
基於相同的發明構思,本發明的第四個方面提供了一種檢測AKR1C3 RNA含量的方法,其包括以下步驟:
(1) 提取待測離體樣本的RNA,將提取的RNA加入到逆轉錄體系中並逆轉錄合成cDNA;
(2) 以cDNA為模板,使用上述引物探針組合物或上述試劑盒進行qPCR或數位PCR擴增;
(3) 根據qPCR或數位PCR擴增結果獲得待測離體樣本的AKR1C3 RNA含量。
本發明檢測AKR1C3 RNA含量的方法的方法學原理:首先將樣本RNA反轉錄成cDNA,然後利用特異性引物探針對cDNA進行擴增,其中AKR1C3基因和內參基因分別由FAM和VIC信號指示,外周血樣本RNA中AKR1C3基因表達定量水平通過樣本與質控品進行計算。同時,AKR1C3反應液中VIC信號用於監控樣本品質。
在本發明中,在樣本充足的情況下,本發明採用qPCR和數位PCR兩種方法同時做對比實驗,數位PCR與qPCR用同一套引物探針,先用qPCR溫度梯度優化引物探針,選擇最合適溫度及引物探針組合物用到數位PCR平臺,用於定量參考品原料及作為對比方法。
數位PCR的檢測過程主要包括兩部分內容,即PCR擴增和螢光信號分析。在PCR反應前,將樣品分散至幾萬個單元(反應室)中,使每個單元中只存在單個DNA分子。數位PCR擴增階段的擴增程式、擴增體系與普通PCR基本相同,與傳統qPCR方法不同的是數位PCR採用直接計數的方法進行定量分析,也就是在PCR擴增結束後有螢光信號(產物)記為1,無螢光信號(產物)記為0,有螢光信號的反應單元中至少包含一個拷貝的目標分子。理論上,在樣品中的目標DNA濃度極低的情況下,有螢光信號的反應單元數目等於目標DNA分子的拷貝數。但是,在通常情況下,數位PCR的反應單元中可能包含兩個或兩個以上的目標分子,這時可以採用泊松概率分佈公式(Poisson distribution)進行計算。
上式中
λ為每個反應單元中包含目標DNA分子的平均拷貝數(濃度),
p為在一定的
λ條件下,每個反應單元中包含
k拷貝目標DNA分子的概率。
λ由樣品溶液的稀釋係數
m決定,有
λ=
cm,其中
c為樣品的原始拷貝數(濃度)。當
k=0(不含目標DNA分子)時,上式可簡化為
p=
e -λ=
e -cm,
p可以看作是無螢光信號的反應單元數與反應單元總數的比值,即
從數位PCR反應單元總數和有螢光信號的單元數以及樣品的稀釋係數,就可以得到樣本的最初拷貝數(濃度)。數位PCR的定量方法不依賴於擴增曲線的循環閾值,因此不受擴增效率的影響,也不必採用標準曲線,具有很好的準確度和重現性,可以實現絕對定量分析。
在本發明中,數位PCR與qPCR的具體反應體系不同在於,在qPCR反應體系中,將選自第(i)組至第(ix)組中的一組引物探針組合物與內參基因ACTB的引物探針組合物混合;而在數位PCR反應體系中,因為在樣本及細胞系中AKR1C3和ACTB的表達量差異較大,Ct差異最大的可能達到10個Ct值,所以在數位PCR檢測時,VIC的拷貝數會遠大於FAM的拷貝數,鑒於此,不將選自第(i)組至第(ix)組中的一組引物探針組合物與內參基因ACTB的引物探針組合物混合,而是分別使用AKR1C3數位PCR檢測體系和內參基因數位PCR檢測體系進行AKR1C3和內參基因的擴增。
PCR擴增結果受反應體系各因素條件變化(包括引物濃度、探針濃度等)和擴增程式的影響,為了獲得最佳的擴增效率和最少的非特異性產物,本申請根據多年研發經驗確定了數位PCR與qPCR反應體系和擴增程式,結合探針引物的篩選,確保標準曲線的相關係數大於等於0.98及E值(擴增效率)在85%-110%之間。
在本發明的優選的實施方案中,其中,在步驟(3)中,所述根據qPCR或數位PCR擴增結果獲得待測離體樣本的AKR1C3 RNA含量包括:
(A) 根據qPCR或數位PCR擴增結果分別獲得待測離體樣本的AKR1C3拷貝數和內參基因拷貝數;
(B) 計算AKR1C3拷貝數/內參基因拷貝數的比值,從而獲得待測離體樣本的AKR1C3 RNA含量;
其中,當採用qPCR法時,步驟(A)還包括:
(A1) 分別繪製AKR1C3的Ct值與初始拷貝數lg值的標準曲線和內參基因的Ct值與初始拷貝數lg值的標準曲線;
(A2) 根據標準曲線,通過檢測到的AKR1C3的Ct值和內參基因的Ct值分別獲得待測離體樣本的AKR1C3拷貝數和內參基因拷貝數(可通過軟體自動計算)。
數位PCR與qPCR法的另一個不同之處在於,qPCR法需要根據標準曲線獲得待測離體樣本的AKR1C3拷貝數和內參基因拷貝數,而數位PCR直接根據擴增結果即可獲得待測離體樣本的AKR1C3拷貝數和內參基因拷貝數,無需繪製標準曲線。
需要對目標基因AKR1C3 Ct值和內參基因Ct值的讀取進行說明,目標基因AKR1C3 Ct值是目標基因AKR1C3對應的擴增信號(FAM信號)對應的Ct值;內參基因Ct值是內參基因對應的擴增信號(VIC信號)的Ct值,FAM和VIC的閾值設定在指數擴增期。
在本發明的優選的實施方案中,其中,所述方法用於檢測血液樣本、骨髓樣本或組織樣本中的AKR1C3 RNA含量。本發明的數位PCR與qPCR不僅可以測試血液樣本或骨髓樣本,還可以測試實體腫瘤的組織樣本,只是前處理過程(例如RNA提取過程)有所不同。例如,對於血液樣本,可直接採用Qiagen成品提取試劑盒進行RNA提取;對於骨髓樣本或組織樣本,可用液態氮預冷研缽,取骨髓樣本或組織樣本在研缽中研磨至粉末,將乾燥的組織粉末置於1.5ml EP管中,然後使用RNA提取試劑盒進行提取。
本申請對上述試劑盒和檢測方法進行了性能測試,測試結果如下:
1. 最低檢出限:以低表達細胞系梯度稀釋確定最低檢出限,以此作為待檢樣本,重複10次,檢出結果100%一致;
2. 精密度:不同的時間、儀器、實驗人員重複檢測,CV值<15%;
3. 陽性符合率:對已知陽性樣本和標準曲線進行qPCR檢測,檢出結果100%一致,標準曲線E值在90%-110%之間,R
2≥0.98;
4. 陰性符合率:對已知陰性樣本進行qPCR檢測,檢測結果一致檢測率100%;
5. 不同上樣模板量:選取已知陰性陽性樣本分別以200ng和10ng的RNA為反轉錄起始量,驗證上樣量的範圍,檢測結果一致檢測率100%;
6. 分析特異性:選擇2個濃度的陰性參考品,每個濃度水平重複檢測3次,陰性率100%;
7. 實際樣本檢測:選用8例正常人外周血RNA,進行實際樣本檢測,檢測結果符合率100%。
通過最低檢出限、精密度、陰性符合率、陽性符合率、模板量、分析特異性和實際樣本檢測的性能驗證,7項性能均符合驗證的標準,該檢測方法的性能符合臨床應用要求,可用於臨床樣本檢測。
基於相同的發明構思,本發明的第五個方面提供了一種檢測AKR1C3酶表達水平的方法,其中,採用上述方法檢測待測離體樣本的AKR1C3 RNA含量,然後根據待測離體樣本的AKR1C3 RNA含量獲得待測離體樣本的AKR1C3酶表達水平。
在本發明的優選的實施方案中,其中,待測離體樣本的AKR1C3 RNA含量與待測離體樣本的AKR1C3酶表達水平存在線性相關性。
現有技術中,通常根據AKR1C3還原酶含量是否等於大於預定含量,來判斷是否給予OBI-3424、OBI-3423和OBI-2870化合物,而且本發明的實施例4證明了,AKR1C3酶表達水平與AKR1C3 RNA表達水平高度相關。因此,在實際應用中,可以根據上述方法測得的AKR1C3 RNA含量推算出AKR1C3酶含量,再根據AKR1C3酶含量是否達到預定含量,來判斷是否給予OBI-3424、OBI-3423和OBI-2870化合物。
下面結合具體的實施例對本發明提供的技術方案做進一步的描述。下述實施例僅用於對本發明進行說明,並不會對本發明的保護範圍進行限制。
以下實施例中使用的AKR1C3活化抗癌前藥OBI-3424(又名AST-3424或TH-3424),其合成方法參見WO2017087428A1或CN108290911A中記載的方法。
實施例1 在肝癌細胞系和非小細胞肺癌(NSCLC)細胞系中,AKR1C3蛋白水平和RNA水平分別與IC
50值的相關性
1. 試驗材料和方法
1.1 細胞系
所有人類癌細胞系均來自美國典型培養物保藏中心(ATCC,Manassas,VA)或日本研究生物資源保藏中心(JCRB,日本大阪)或Cobioer Biosciences(南京,中國)。
1.2 體外增殖測定方法
接種指數生長的細胞,24小時後,加入測試化合物OBI-3424。加入測試化合物OBI-3424後,將模板在標準組織培養箱中於37℃下孵育指定的小時。試驗結束時,使用CellTiter Glo(CTG)測定試劑盒或AlamarBlue檢測活細胞。使用XLfit(IDBS,Boston,MA)或Prism 6(GraphPad,San Diego,CA)計算相對於未經處理的對照導致50%生長抑制的藥物濃度(IC
50)。
1.3 免疫印跡法
製備人細胞提取物並測定蛋白質濃度。使用識別人AKR1C3和微管蛋白或β-肌動蛋白的抗體檢測蛋白質。使用Odyssey雷射成像系統和軟體(LI-COR Biosciences,Lincoln,NE)或UVP ChemStudio成像系統和VisionWorks軟體(Analytik Jena AG)對AKR1C3和微管蛋白或β-肌動蛋白的條帶密度進行掃描和定量,並計算了AKR1C3對微管蛋白或β-肌動蛋白的比例。
2. 試驗結果
分別將肝癌細胞系暴露於化合物OBI-3424 96h和將NSCLC細胞系暴露於化合物OBI-3424 72h後,使用體外增殖測定方法測定了IC
50值,並使用免疫印跡法測定了肝癌細胞系中AKR1C3蛋白的表達(微管蛋白用作上樣對照),肝癌細胞系和NSCLC細胞系中AKR1C3 RNA表達資料來自CrownBio資料庫(https://db.crownbio.com/Crownbio/OncoExpress_Login.aspx)。結果如表2和表3所示。
表2 OBI-3424暴露96小時後,對一組人類肝癌細胞系的細胞毒性
表3 OBI-3424暴露72小時後,對一組人非小細胞肺癌細胞系(NSCLC)的細胞毒性
肝癌細胞系 | 標準化的AKR1C3表達 | AKR1C3蛋白表達水平 | AKR1C3 RNA表達水平(Log2 FPKM) | 3424 IC 50(nM) |
SNU-475 | 1.22 | 高 | 9.19 | 15 |
SNU-449 | 1.19 | 高 | 8.3 | 45 |
C3A | 0.95 | 高 | 4.58 | 5 |
SNU-387 | 0.64 | 中 | 6.42 | 103 |
PLC/PRF/5 | 0.63 | 高 | 4.66 | 167 |
HLE | 0.3 | 高 | 4.36 | 113 |
HuCCT1 | 0.21 | 低 | 0.19 | 696 |
SNU-182 | 0.17 | 低 | -0.05 | >1000 |
HLF | 0.15 | 低 | -1.69 | >1000 |
SK-HEP-1 | 0.13 | 低 | -1.39 | >1000 |
SNU-398 | 0.08 | 低 | -1.33 | >1000 |
NSCLC癌細胞系 | AKR1C3 RNA表達水平(Log2 FPKM) | 3424 IC 50(nM) |
NCI-H1944 | 11.06 | 2.3 |
NCI-H2228 | 9.25 | 0.21 |
NCIH1755 | 9 | 8.2 |
NCI-H1563 | 8.61 | 2.5 |
NCI-H2110 | 8.23 | 1.1 |
NCI-H1792 | 8.07 | 4.5 |
CAL12T | 3.86 | 29.1 |
NCIH2106 | 2.68 | >1000 |
NCI-H23 | -1.98 | >1000 |
NCI-H522 | -1.88 | >1000 |
如表2和表3所示,在蛋白質和RNA水平都具有高AKR1C3表達的肝癌細胞系對OBI-3424的敏感性更強,其中IC
50值處於低奈莫耳範圍內。另一方面,表達低AKR1C3的細胞對OBI-3424的敏感性較低,其中IC
50值高於1000 nM。同樣地,NSCLC細胞在暴露於OBI-3424 72h後也顯示出AKR1C3依賴性的細胞毒特性(表3)。肝細胞中3424 IC
50與AKR1C3蛋白水平有高度相關性(R
2=0.71,圖1,左),也與AKR1C3 RNA表達水平有高度相關性(R
2=0.87,圖1,中),NSCLC中3424 IC
50與AKR1C3 RNA表達水平有高度相關性(R
2=0.80,圖1,右)。這些結果表明,在肝細胞系和NSCLC細胞系中3424介導的細胞毒性與AKR1C3表達水平高度相關。
實施例2 在白血病細胞系中,AKR1C3蛋白水平與IC
50值的相關性
1. 試驗材料和方法
1.1 體外研究中的細胞系和PDX
所有細胞系均購自HD Biosciences。所有實驗工作均是在各自的機構審查委員會和每個機構的動物道德委員會的批准下進行的,使用人類相關組織樣本均符合實驗所在地的倫理和相關法律規定。實驗使用了先前在20–25 g雌性非肥胖/SCID(NOD.CB17-Prkdcscid/SzJ, NOD/SCID)或NOD/SCID/IL2受體γ–陰性(NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJAusb, NSG)中建立的連續PDX,如別處所述(Lock RB, Liem N, Farnsworth ML, Milross CG, Xue C, Tajbakhsh M, et al. The nonobese diabetic/severe combined immunodeficient (NOD/SCID) mouse model of childhood acute lymphoblastic leukemia reveals intrinsic differences in biologic characteristics at diagnosis and relapse. Blood 2002; 99:4100–8.)。慢病毒轉導的ALL-11 PDX的開發[空載體(EV)和AKR1C3過表達]已在之前描述(Jamieson SM, Gu Y, Manesh DM, El-Hoss J, Jing D, Mackenzie KL, et al. A novel fluorometric assay for aldo-keto reductase 1C3 predicts metabolic activation of the nitrogen mustard prodrug PR-104A in human leukaemia cells. Biochem Pharmacol 2014;88:36–45.)。
1.2 體外細胞毒性試驗
白血病細胞系懸浮在補充有FBS(Biosera)的RPMI培養基中,而ALL PDX細胞在補充有Flt-3配體(20 ng/mL,BioNovus Life Sciences)或IL7(10–20 ng/mL,Jomar Life Research)的QBSF培養基(Quality Biological Inc,)中培養。根據最佳細胞密度接種細胞,並孵育3小時或過夜(37℃,5%CO2)。PDX細胞和白血病細胞系用OBI-3424(10 mmol/L–1 pmol/L)或媒介物對照分別處理48或72小時。使用Alamar Blue還原測定法或Cell Titer-Glo發光細胞活力測定法(Promega)確定活力。50%最大抑制濃度(IC
50)通過GraphPad Prism 7軟體計算非線性回歸曲線的插值。
1.3 免疫印跡法
將冷凍保存的白血病細胞解凍,並在RIPA裂解緩衝液中裂解,並通過BCA測定法定量蛋白質濃度。每個樣品均在NuPAGE 4-12%Bis-Tris蛋白凝膠中上樣20 µg蛋白質裂解物,然後在120V下電泳,並在30V下轉移至聚偏二氟乙烯膜上1 h。用小鼠抗AKR1C3(#A6229,Sigma-Aldrich,St. Louis, MO)或兔抗肌動蛋白一抗(#A2066,Sigma-Aldrich),然後分別用辣根過氧化物酶結合的抗小鼠或抗兔IgG二抗(GE Healthcare,Buckingham,UK)探測膜。Immobilon Western化學發光HRP底物(Merck Millipore,Billerica,MA)用於通過定量BioRad Chemidoc觸摸成像系統中的信號來檢測結合的二抗。
2. 試驗結果
AKR1C3相關的OBI-3424的體外細胞毒性在11種T-ALL細胞系、一種用粒細胞集落刺激因子轉染的B-ALL細胞系和一種BCP-ALL細胞系。AKR1C3蛋白的表達水平使用免疫印跡分析法測定。使用CellTiter-Glo分析法測定OBI-3424的體外細胞毒性,計算為50%最大抑制濃度(IC
50)。
OBI-3424顯示的體外細胞毒性中,在6種表達高(強)水平AKR1C3的細胞系中IC
50的範圍為3.0-30.0 nM。對於具有中等AKR1C3表達水平的細胞系,IC
50範圍為3.0-84.0 nM(表4)。
表4 在ALL細胞系中,OBI-3424的AKR1C3依賴性體外細胞毒性
註:G-CSF=粒細胞集落刺激因子;BCP-ALL=B細胞前體ALL
白血病 | 細胞系 | AKR1C3表達 | IC 50(nM) |
T-ALL(兒童) | PF-382 | 強 | 15.0 |
T-ALL(兒童) | SUP-T1 | 強 | 3.0 |
T-ALL(兒童) | TALL-1 | 強 | 30.0 |
T-ALL(19歲) | MOLT-4 | 強 | 10.0 |
T-ALL(兒童) | CCRF-CEM | 強 | 3.7 |
T-ALL(兒童) | Jurkat | 中等 | 40.0 |
T-ALL(兒童) | Jurkat, Clone E6-1 | 中等 | 24.0 |
T-ALL(成人) | NOMO-1 | 中等 | 11.0 |
T-ALL(Jurkat突變體) | P116 | 中等 | 84.0 |
B-ALL(用G-CSF轉染) | GR-ST | 強 | 9.9 |
BCP-ALL | Reh | 中等 | 3.0 |
為了評估OBI-3424的潛在抗白血病活性,在多種白血病細胞系上進行了體外細胞毒性測定。證明了,OBI-3424可治療T-ALL、B-ALL、急性髓性白血病、急性早幼粒細胞白血病(APL)和紅白血病。OBI-3424顯示出有效的細胞毒性,特別針對衍生自高AKR1C3表達的T-ALL(T系急性淋巴細胞白血病)的細胞系,其中IC
50值在低nmol/L範圍內(參見表5)。細胞系之間IC
50值的差異具有高/中等AKR1C3表達和低表達表達具有統計學意義(P=0.0016)。
表5 OBI-3424暴露於白血病細胞系中72小時後,對白血病細胞系的體外細胞毒性
AKR1C3表達通過免疫印跡法評估,並相對於對照β-微管蛋白表達。高,AKR1C3/β-微管蛋白>5.0;中等,AKR1C3/β-微管蛋白2.0-5.0;低,AKR1C3/β-微管蛋白<2.0。
細胞系 | AKR1C3表達* | IC 50(nM) | 疾病特徵 |
CCRF-CEM | 高 | 3.7 | T-ALL |
KG-1 | 高 | 153 | 紅白血病(59歲) |
MOLT-4 | 中等 | 10 | T-ALL(19歲) |
NOMO-1 | 中等 | 11 | T-ALL(成年) |
PF-382 | 中等 | 15 | T-ALL(兒科) |
SUP-T1 | 中等 | 3 | T-ALL(兒科) |
TALL-1 | 中等 | 30 | T-ALL(兒科) |
GR-ST | 中等 | 9.9 | B-ALL(用G-CSF轉染) |
TF-1 | 中等 | 2.8 | 紅白血病(35歲) |
Jurkat | 低 | 40 | T-ALL(兒科) |
Jurkat,克隆E6-1 | 低 | 24 | T-ALL |
P116 | 低 | 84 | Jurkat突變體 |
P30/OHK | 低 | >1μM | T-ALL(兒科) |
HEL | 低 | 224 | 紅白血病(30歲) |
Reh | 低 | 3 | ALL(非T,非B) |
HL-60 | 低 | 52.6 | APL(36歲) |
HL-60克隆15 | 低 | 87 | APL(36歲) |
K-562 | 低 | >1μM | CML(53歲) |
ATN-1 | 低 | >1μM | T-ALL(成年) |
單Mac-6 | 低 | 29.8 | AML-M5(64歲) |
THP-1 | 低 | >1μM | AML(兒科) |
Kasumi-1 | 低 | >1μM | AML |
P31/FUJ | 低 | >1μM | AML |
與白血病細胞系獲得的結果相似,OBI-3424對所有白血病細胞系發揮了有效的細胞殺傷作用。圖2a中給出了OBI-3424對6種B-ALL細胞系的細胞毒性,圖2b中給出了OBI-3424對7種T-ALL細胞系的細胞毒性。由圖2a和圖2b可以看出,OBI-3424的AKR1C3依賴性啟動為DNA烷基化試劑。此外,參見圖2c,在OBI-3424的濃度為10 nmol/L下,AKR1C3蛋白表達顯示與18種ALL PDX的體外細胞存活率顯著負相關(r=-0.53,P=0.023);同樣地,參見圖2d,在OBI-3424的濃度為100 nmol/L下,AKR1C3蛋白表達顯示與18種ALL PDX的體外細胞存活率顯著負相關(r=-0.56,P=0.015)。
實施例3 在白血病細胞系中,AKR1C3 RNA水平分別與IC
50值的相關性
分別將血液癌細胞系暴露於化合物OBI-3424 72h後,使用體外增殖測定方法測定了IC
50值,血液癌細胞系中AKR1C3 RNA表達資料來自CrownBio資料庫(https://db.crownbio.com/Crownbio/OncoExpress_Login.aspx)。結果如表6所示。
表6:暴露72小時後,AST-3424對一組人類血液癌細胞系的細胞毒性測定結果
血液癌細胞系 | AKR1C3 RNA的表達水平(Log2 FPKM) | IC 50(nM) |
CCRF-CEM | 5.9566 | 1.7 |
SUP-T1 | 5.1574 | 3.9 |
PF-382 | 4.0971 | 6 |
TF-1 | 5.5893 | 16.8 |
KG-1 | 2.6621 | 153 |
P31/FUJ | -1.2529 | 1000 |
Kasumi-1 | -1.6608 | 1000 |
TALL-1 | 4.0126 | 24 |
HEL | 2.1127 | 224 |
THP-1 | -0.4299 | 1000 |
Jurkat | 1.1763 | 51.1 |
將上述表6中AKR1C3 RNA的表達水平(Log2 FPKM)與IC
50(nM)繪製為曲線圖,如圖3d所示,將IC
50與AKR1C3 RNA的表達水平的代數變換值Log2 FPKM進行一次曲線擬合,得到相應的一次曲線擬合公式,其相關係數R
2=0.7889,由此顯示AKR1C3 RNA的表達水平與IC
50值具有顯著的線性相關性。
實施例4 在白血病細胞系中,AKR1C3蛋白水平與AKR1C3 RNA水平的相關性
1. 試驗材料和方法
1.1 體外研究中的細胞系和PDX
所有細胞系均購自HD Biosciences。所有實驗工作均是在各自的機構審查委員會和每個機構的動物道德委員會的批准下進行的。實驗使用了先前在20–25 g雌性非肥胖/SCID(NOD.CB17-Prkdcscid/SzJ, NOD/SCID)或NOD/SCID/IL2受體γ–陰性(NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJAusb, NSG)中建立的連續PDX,如別處所述(Lock RB, Liem N, Farnsworth ML, Milross CG, Xue C, Tajbakhsh M, et al. The nonobese diabetic/severe combined immunodeficient (NOD/SCID) mouse model of childhood acute lymphoblastic leukemia reveals intrinsic differences in biologic characteristics at diagnosis and relapse. Blood 2002; 99:4100–8.)。慢病毒轉導的ALL-11 PDX的開發[空載體(EV)和AKR1C3過表達]已在之前描述(Jamieson SM, Gu Y, Manesh DM, El-Hoss J, Jing D, Mackenzie KL, et al. A novel fluorometric assay for aldo-keto reductase 1C3 predicts metabolic activation of the nitrogen mustard prodrug PR-104A in human leukaemia cells. Biochem Pharmacol 2014;88:36–45.)。
1.2 免疫印跡法
將冷凍保存的白血病細胞解凍,並在RIPA裂解緩衝液中裂解,並通過BCA測定法定量蛋白質濃度。每個樣品均在NuPAGE 4-12%Bis-Tris蛋白凝膠中上樣20 µg蛋白質裂解物,然後在120V下電泳,並在30V下轉移至聚偏二氟乙烯膜上1 h。用小鼠抗AKR1C3(#A6229,Sigma-Aldrich,St. Louis, MO)或兔抗肌動蛋白一抗(#A2066,Sigma-Aldrich),然後分別用辣根過氧化物酶結合的抗小鼠或抗兔IgG二抗(GE Healthcare,Buckingham,UK)探測膜。Immobilon Western化學發光HRP底物(Merck Millipore,Billerica,MA)用於通過定量BioRad Chemidoc觸摸成像系統中的信號來檢測結合的二抗。
1.3 RNA-Seq分析
為了分析原發患者吸出物中AKR1C3的表達,將患者分為B-ALL和T-ALL及其相關亞組。配對末端讀數由STAR(Dobin A, Davis CA, Schlesinger F, Drenkow J, Zaleski C, Jha S, et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics 2013;29:15–21.)通過具有默認參數的推薦的雙程映射管線映射到GRCh37人類基因組參考,並且使用Picard MarkDuplicates模組標記重複率。基因注釋文件是從Ensembl(http://www.ensembl.org/)下載的,用於STAR定位和隨後的基因表達水平評估。為了評估基因表達譜,由HTSeq調用帶注釋基因的讀數計數(Anders S, Pyl PT, Huber W. HTSeq–a Python framework to work with highthroughput sequencing data. Bioinformatics 2015;31:166–9.),並由DESeq2 R套裝程式處理(Anders S, Huber W. Differential expression analysis for sequence count data. Genome Biol 2010;11:R106.),以將基因表達標準化為正則化log2值。
為了對PDX樣品進行分析,使用quantMode參數設置為TranscriptomeSAM的STAR,將Illumina配對末端RNA-seq資料與人類基因組裝配體(構建hg38)進行比對,將比對轉換為轉錄物座標。通過RSEM(版本1.2.31)命令rsem-calculate-expression運行比對,以計算原始基因計數、TPM、FPKM和同工型表達。所有RNA-seq值均表示為每千百萬鹼基片段數(FPKM)。將FPKM資料進行log2轉換。
2. 試驗結果
通過RNA-Seq分析(圖3a)和免疫印跡法(圖3b)檢測了多種ALL 的AKR1C3 mRNA表達水平和蛋白質表達水平,對檢測結果進行分析,證實了T-ALL(n=25)相對於B-ALL(n=65;P<0.0001)顯著更高的AKR1C3表達。而且,在AKR1C3 mRNA和蛋白質表達之間有顯著相關性(r=0.58;P=0.0003;參見圖3c)。
實施例5 引物和探針的設計和篩選
5.1 試驗材料
5.1.1 樣本資訊
本實施例使用的細胞系購買自南京科佰生物和國家實驗細胞資源分享平臺;白血病樣本來源於急性淋巴細胞白血病病人志願者(臨床),正常樣本來源於健康志願者(Donor),志願者已簽署知情同意書。新鮮血液樣本存於PAXGENE管中,保存於-20℃冰箱中。
所有人類樣本的採集及使用和後續處理均按照實驗所在地中國的相關管理法規進行,並且符合國際倫理的相關要求。
表7 樣本資訊表
樣本類型 | 樣本號 | 樣本類型 | 樣本來源 |
正常樣本(11例) | 1 | 外周血 | Donor |
2 | 外周血 | Donor | |
3 | 外周血 | Donor | |
5 | 外周血 | Donor | |
6 | 外周血 | Donor | |
7 | 外周血 | Donor | |
8 | 外周血 | Donor | |
9 | 外周血 | Donor | |
10 | 外周血 | Donor | |
11 | 外周血 | Donor | |
12 | 外周血 | Donor | |
細胞系樣本(5例) | TF-1 | 人紅系白血病細胞 | 國家實驗細胞資源分享平臺(NICR,平臺網址http://www.cellresource.cn/) |
CCRF-CEM | 人T細胞白血病細胞 | 國家實驗細胞資源分享平臺 | |
RPMI8226 | 多發性骨髓瘤細胞 | 南京科佰生物(該公司網址www.cobioer.com) | |
MOLT-4 | 人急性T淋巴母細胞白血病細胞 | 國家實驗細胞資源分享平臺 | |
Jurkat | 人T細胞白血病細胞 | 南京科佰生物 | |
白血病樣本(10例) | GZJ | ALL外周血 | 臨床 |
HCL | B-ALL外周血 | 臨床 | |
HXB | B-ALL外周血 | 臨床 | |
JRZ | B-ALL外周血 | 臨床 | |
LBJ | T-ALL外周血 | 臨床 | |
LSX | B-ALL外周血 | 臨床 | |
PSS | B-ALL外周血 | 臨床 | |
ZYQ | B-ALL外周血 | 臨床 | |
BZQ | B-ALL骨髓 | 臨床 | |
QQY | B-ALL骨髓 | 臨床 | |
質粒 | AKR1C3 | 質粒(濃度16.7ng/ul,插入片段長度355bp,質粒總長度3065bp) | 生工生物工程(上海)股份有限公司(Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.) |
ACTB | 質粒(濃度57.8ng/ul,插入片段長度500bp,質粒總長度2606bp) | 生工生物工程(上海)股份有限公司(Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.) |
5.1.2 儀器資訊
表8 儀器平臺資訊
儀器 | 廠家 | 型號 |
螢光定量PCR儀器 | Thermo Fisher | ABI 7500 |
核酸定量儀 | Life | Qubit 3.0 |
數位PCR儀 | Thermo Fisher | QuantStudio 3D Digital PCR |
5.1.3 試劑信息
表9 試劑信息
儀器 | 廠家 | 型號 | 批號 | 效期 |
QIAamp RNA Blood Mini Kit | Qiagen | 52304 | 166034744 | 13個月 |
PAXgene Blood RNA Kit-IVD | Qiagen | 762174 | 166011286 | 7個月 |
SuperScript™ VILO™ Master Mix | Thermo Fisher | 11755050 | 2200704 | 6個月 |
KAPA PROBE FAST RT-PCR Master Mix(2x) | KAPA | KK4702 | 0000100987 | 9個月 |
dUTP | TAKARA | 4020 | B301E | 12個月 |
UNG | TAKARA | 2820 | AK40810A | 12個月 |
5.2 提取核酸
RNA提取試劑盒為:Qiagen成品提取試劑盒:PAXGENE BloodRNA Kit(貨號:762174,用於PAXGENE管保存的血液)和Qiagen成品提取試劑盒:QIAamp RNA Blood Mini Kit(貨號:52304,用於EDTA管保存的血液)。
按照說明書要求,使用提取純化試劑盒PAXgene Blood RNA Kit-IVD對PAXgene管保存的血液進行RNA提取,並使用QIAamp RNA Blood Mini Kit對EDTA管保存的血液進行RNA提取。使用推薦的RNA核酸定量試劑盒(Qubit RNA HS Assay Kits, Thermo Fisher Scientific, Q32852)對提取的RNA進行濃度檢測。
5.3 反轉錄
吸取4 μL AKR1C3反轉錄酶混合液(Thermo Fisher的Superscript VILO MARSTER MIX(貨號11755050))加入到16 μL RNA樣本(體積不足的補水到16 μL)中,輕微渦旋混勻,暫態離心,並將裝有反應液的PCR管置於PCR儀中,設置PCR程式,進行cDNA的合成。
5.4 AKR1C3引物的設計和選擇
針對AKR1C3共3個目的地區域設計9對引物和探針,引物探針的位置資訊見圖4。AKR1C3基因引物由合同研發組織(CRO)設計和合成。
5.5 聚合酶、反轉錄酶的選擇
聚合酶混合液是PCR成功或者失敗及影響擴增效率的關鍵成分。聚合酶混合液主要成分包括:聚合酶、MgCl2、緩衝液和dNTPs。一般市售聚合酶混合液已經將上述成分按照一定比例優化到最佳狀態,做成濃縮的母液,使用時只要根據聚合酶緩衝液的乘數按比例加入,即可進行相應檢測。本實施例使用的是經過反復驗證擴增效率良好的聚合酶KAPA PROBE FAST RT-PCR Master Mix(2x)(貨號KK4702)。
每次PCR反應中,都必須和陽性參考品,陰性對照品(NC,無核酸酶水)共同進行檢測和分析。qPCR檢測過程:
1) 取出AKR1C3聚合酶混合液、AKR1C3反應液、參考品,振盪混勻,瞬離備用。
2) 根據待檢測樣本數、質控品所需反應管總數,按每測試分別含11.1 μL AKR1C3 qPCR聚合酶混合液、2.6 μL AKR1C3反應混合液和4.3 μL無核酸酶水,渦旋混勻瞬離,以每管18 μL分裝到qPCR八聯排中。(注:待檢樣本和質控品均需要做2次重複,NTC檢測次數≥1即可。)
3) 在相應qPCR八聯排分別加入待檢樣本cDNA、質控品、參考品,蓋上8連排蓋,渦旋混勻瞬離。
4) 將8聯排放入qPCR儀樣本槽中並記錄放置順序,按照優化的反應條件設置儀器擴增程式進行擴增。
5) 實驗結束後,使用2層PE手套包紮好PCR反應條,並按生物垃圾處理。嚴禁打開PCR管蓋,以防造成污染。
5.6 引物探針的選擇
5.6.1 AKR1C3引物探針的篩選測試
採用上述步驟5.2-5.5,首先對9對引物探針進行擴增,擴增情況如圖5所示。
健康志願者外周血提取的總RNA,經過反轉錄後合成的cDNA。擴增結果可以看出,從螢光強度值來看,F1R1P1、F2R2P1、F2R6P1、F6R2P1、F6R6P1、F3R3P1比其他F5R5P2、F4R3P2、F7R7P3高。
結合引物探針的特異性考慮,對9對引物進行BLAST,F2R6P1、F6R2P1、F6R6P1的特異性較好,沒有非特異性產物的出現。
5.6.2 AKR1C3引物探針實際樣本測試
選擇F2R6P1、F6R2P1、F6R6P1三套引物探針用健康志願者外周血提取的總RNA反轉錄獲得的cDNA,選擇了6個樣本進行測試,結果如下表所示。
表10 引物探針實際樣本測試結果
引物對 | F2R6 | F6R2 | F6R6 | |||
樣本號 | FAM (重複1) | FAM (重複2) | FAM (重複1) | FAM (重複2) | FAM (重複1) | FAM (重複2) |
6 | 29.00 | 29.02 | 29.03 | 28.95 | 28.97 | 28.88 |
7 | 29.19 | 29.14 | 29.07 | 29.15 | 29.11 | 29.18 |
8 | 28.33 | 28.29 | 28.27 | 28.31 | 28.36 | 28.41 |
9 | 27.41 | 27.25 | 27.20 | 27.26 | 27.24 | 27.36 |
10 | 27.47 | 27.45 | 27.42 | 27.51 | 27.47 | 27.55 |
11 | 28.86 | 28.58 | 28.61 | 28.60 | 28.65 | 28.82 |
12 | 29.51 | 29.36 | 29.53 | 29.61 | 29.68 | 29.51 |
NTC | N/A | N/A | N/A | N/A | N/A | N/A |
從表10中可以看出,可以看出目的基因AKR1C3表達Ct值在健康人群中的範圍相對穩定,在27-30範圍內。
5.6.3 AKR1C3引物探針擴增效率測試
F2R6P1、F6R2P1、F6R6P1三套引物探針用1例健康志願者外周血提取RNA後反轉錄成的cDNA進行擴增效率測試。cDNA的濃度為100ng/μL,5倍稀釋後,再梯度稀釋25倍、125倍和625倍,5倍-625倍總共4個濃度梯度,每個濃度2個重複,進行qPCR測試。根據Ct值與初始濃度log值的線性關係,確定標準曲線和擴增效率,結果如圖6所示。
從結果可以看出,F6R2P1和F6R6P1的擴增效率比F2R6P1高,均大於95%,故選擇這F6R2P1和F6R6P1引物探針進行後續測試。
選擇4例健康志願者血液提取RNA樣本分別對F6R2P1和F6R6P1進行擴增效率測試,結果下表所示:
表11 F6R2P1和F6R6P1更多樣本標準曲線測試
引物探針對 | F6R2P1 | F6R6P1 | |||||||
樣本號 | 1 | 2 | 3 | 5 | 1 | 2 | 3 | 5 | |
標靶 | 效率 | 81.90% | 75.50% | 88.50% | 81.40% | 83.20% | 70.20% | 89.50% | 84% |
R 2(樣本標準曲線擬合的相關係數的平方) | 0.998 | 0.993 | 1.000 | 0.999 | 0.999 | 0.995 | 0.996 | 0.996 |
根據結果可以看到,兩對引物探針的擴增效率差別不大,在不同樣本中均有些微的波動,但F6R2P1的R
2更優秀,在3號樣本達到了R
2等於1,所以選擇F6R2P1為本試劑盒AKR1C3的引物探針。
5.6.4 AKR1C3質粒標準曲線測試
AKR1C3質粒乾粉用40μL無核酸酶水溶解後,10倍稀釋,用Qubit測得濃度為5.78ng/μL。對質粒原液進行梯度稀釋,分別稀釋10
5、10
6、10
7、10
8倍,共獲得4個梯度濃度的樣品,進行qPCR測試,每個梯度重複2次,測得AKR1C3的標準曲線如圖7所示。
從圖7中的標準曲線可以看出,AKR1C3引物探針的擴增效率達到100%,且R
2=0.999,說明擴增效率良好。
實施例6 內參基因的篩選以及相應的引物和探針的設計和篩選
關於內參基因的選擇,參考了有關白血病基因表達的文獻([1] Yanlan Wang, Yue Liu, Changhua Zhou et al. An AKR1C3-specific prodrug with potent antitumor activities against T-ALL. [J] .Leukemia&Lymphoma, 2020, Feb. DOI: 10.1080/10428194.2020.1728746;[2] Donya Moradi Manesh, Jad El-Hoss, Kathryn Evans et al. Growth factor AKR1C3 is a biomarker of sensitivity to PR-104 in preclinical models of T-cell acute lymphoblastic leukemiaas treatment targets in clinical oncology.[J]. BLOOD, 2015, 125: 1193-1201;[3] Yuantong Tian, Lijing Zhao, Haitao Zhang et al. AKR1C3 overexpression may serve as a promising biomarker for prostate cancer progression. [J]. Diagnostic Pathology, 2014, 9: 42.),結合既往使用引物探針,選出了四種內參基因HPRT1、GAP、ACTB和GOLGA1用細胞系CCRF-CEM進行測試,評估其螢光強度及擴增情況,結果如圖8所示。
螢光強度方面:ACTB的最高,其次是HPRT1。
擴增曲線方面:除GOLGA1的擴增曲線不是典型的S型,其他的三個都是比較典型的S擴增曲線。
Ct方面:GAP和ACTB的Ct值較小,表達量相對較高,而HPRT1、GOLGA1的Ct值較大,表達量相對較小。
用樣本和細胞系進行測試,驗證表達穩定性和是否能夠對高低表達的樣本進行區分。
實驗中使用了健康志願者血液樣本RNA編號為5、6、7;白血病患者骨髓RNA編號為BZQ、QQY;AKR1C3表達細胞系RPMI8226、CCRF-CEM、Jurkat。根據資料及以往結果驗證,細胞系RPMI8226和CCRF-CEM為高表達細胞系,Jurkat為低表達細胞系(如圖9所示)。
實驗結果採用的是ΔΔCt計算方法,即ΔΔCt=未知樣品FAM Ct-未知樣品VIC Ct-(質控品FAM Ct-質控品VIC Ct),各組均用CCRF-CEM作為質控品。結果如圖10所示。
從結果中可以看出,與其他三個內參相比,ACTB作為內參時,能夠更好地將高表達細胞系RPMI8226、CCRF-CEM與低表達細胞系Jurkat區分開。在健康人中,數值維持在比較低的水平,而在白血病患者骨髓RNA樣本中能夠檢測到AKR1C3的高表達。結合擴增曲線的實驗結果,選擇ACTB作為內參基因。
確定用ACTB作為內參基因後,分別對5種細胞系進行了測試,測試結果如圖11所示。
從結果可以看出,細胞系的測試結果與Western blot的驗證結果(圖9)一致,證明了AKR1C3-ACTB引物探針的測試結果的準確性。
實施例7 qPCR反應體系和條件研究
qPCR反應體系的品質是開發、檢測成功的一個必要條件,必須對其各主要組分進行優化。
7.1 反應體系的確定
逆轉錄體系見下:
表 12 逆轉錄體系
逆轉錄反應條件如下表: 表 13 逆轉錄反應條件
逆轉錄體系 | 用量(20μL) |
RNA | 最高2ug |
逆轉錄酶 | 4μL |
無核酸酶水 | 補齊至20μL |
反應溫度 | 反應時間 |
25℃ | 10min |
42℃ | 60min |
85℃ | 5min |
10℃ | Hold |
聚合酶混合液是影響PCR擴增效率的關鍵成分。本實施例使用的聚合酶混合液KAPA PROBE FAST RT-PCR Master Mix(2x)已經將所含成分按照一定比例優化到最佳狀態,做成濃縮的母液,使用時根據聚合酶混合液的乘數按比例加入,進行相應檢測。按照其說明書推薦使用量為反應體系的一半,即20μL的反應體系中,使用量應為10μL。具體體系下表:
表 14 AKR1C3 qPCR 反應體系配製
qPCR體系 | 用量(μL) |
AKR1C3-F6 (10μM) | 0.5 |
AKR1C3-R2 | 0.5 |
ACKR1C3-P1 | 0.3 |
ACTB-F1 | 0.5 |
ACTB-R1 | 0.5 |
ACTB-P1 | 0.3 |
dUTP(2mM) | 1 |
UNG酶 | 0.1 |
cDNA模板(按照RNA用量換算) | 20-50ng |
聚合酶混合液 | 10 |
H 2O | 補至20μl |
7.2 qPCR反應條件的優化
本實施例研究所用反應條件下表15所示。該反應條件經過前期的長期驗證,作為RNA反應的優選反應條件進行測試。
表 15 擴增反應條件
體系 | 總體積為20μl | |||
採集 | AKR1C3基因-FAM通道採集螢光信號。ACTB內參基因-VIC通道採集螢光信號,兩種信號同時收集。 | |||
擴增程式 | 循環數 | 溫度(℃) | 時間 | 收集螢光信號 |
1 | 1 cycle | 37℃ | 3min | 否 |
2 | 1 cycle | 95℃ | 3min | 否 |
3 | 40 cycle | 95℃ | 15s | 否 |
60℃ | 45s | 是 |
循環數是影響PCR結果的直接因素之一,循環數決定了PCR擴增程度。qPCR使用的循環數通常在30-45個循環,循環數越多,非特異擴增越顯著,而循環數越少,對檢測靈敏度有一定的影響。
7.3 AKR1C3-ACTB體系標準曲線測試
7.3.1 細胞系標準曲線測試
優化後的反應體系,將AKR1C3和ACTB的引物探針混合後,進行標準曲線的測試,考查引物探針的擴增效率。細胞系選用CCRF-CEM,根據7.1的逆轉錄體系進行逆轉錄,獲得cDNA後,按照5倍的梯度稀釋,獲得原液、5、25、125倍稀釋的4個梯度,每個梯度做2個平行,用qPCR反應體系進行檢測,根據Ct值與初始拷貝數lg值的線性關係獲得標準曲線如圖12所示。
從圖12中可以看到,AKR1C3引物探針的擴增效率為94.2%,ACTB引物探針的擴增效率為95.3%,均滿足要求,R
2大於0.99,說明線性關係較好,滿足要求。
7.3.2 質粒標準曲線測試
所用的AKR1C3、ACTB質粒乾粉溶於40μL無核酸酶水,10倍稀釋後,用Qubit測得濃度分別為1.67ng/μL,5.78ng/μL。分別將AKR1C3的質粒稀釋至10
-5,ACTB的質粒稀釋至10
-3,將兩種質粒各取100μL混勻,再10倍、100倍、1000倍梯度稀釋,每個梯度做2個重複,用qPCR進行檢測,根據Ct值與初始濃度log值的線性關係製作標準曲線,結果如圖13所示。
從結果圖中可以看到,AKR1C3的擴增效率達到101.9%,ACTB的擴增效率達到94.1%,R
2均大於0.99,符合要求。
實施例8 AKR1C3-ACTB引物探針數位PCR測試
8.1 數位PCR檢測體系和反應條件
本實施例嘗試使用AKR1C3-ACTB引物探針進行數位PCR測試。因為在樣本及細胞系中AKR1C3和ACTB的表達量差異較大,Ct差異最大的可能達到10個Ct值,圖14為低表達細胞系Jurkat的qPCR檢測圖。
所以在數位PCR檢測時,VIC的拷貝數會遠大於FAM的拷貝數,如圖15所示。
鑒於此,將AKR1C3和ACTB單獨檢測,以CCRF-CEM和MOLT-4兩個細胞系為例,2ug RNA經過反轉錄後,進行5倍稀釋,用以下體系進行數位PCR檢測AKR1C3拷貝數:
表 16 AKR1C3 數位 PCR 檢測體系
試劑 | 用量(μL) |
AKR1C3-F6 (10uM) | 1.2 |
AKR1C3-R2 | 1.2 |
AKR1C3-P1 | 0.3 |
2×3D LIFE MIX | 7.5 |
cDNA | 0.5 |
H 2O | 4.3 |
數位PCR的反應程式如下表所示:
表 17 數位 PCR 反應條件
循環數 | 程式 | 用量(μL) |
1 | 96℃ | 10min |
39 | 60℃ | 2min |
98℃ | 30s | |
1 | 60℃ | 3min |
10℃ | ∞ |
檢測結果分別如圖16所示。
對於ACTB的檢測,需要將cDNA經5倍稀釋後,再進行200倍稀釋,之後用以下體系進行ACTB拷貝數檢測:
表 18 ACTB 數位 PCR 檢測體系
試劑 | 用量(μL) |
ACTB-F1 (10uM) | 1.2 |
ACTB-R1 | 1.2 |
ACTB-P1 | 0.3 |
2×3D LIFE MIX | 10 |
cDNA | 0.5 |
H 2O | 4.3 |
檢測結果見圖17。由結果可知細胞系CCRF-CEM的FAM拷貝數/VIC拷貝數=0.0092,細胞系MOLT-4的FAM拷貝數/VIC拷貝數=0.00129。
8.2 實際樣本測試及計算方法確定
使用健康志願者9號樣本,白血病患者8例(編號為PSS、GZJ、HXB、HCL、ZYQ、LBJ、JRZ、LSX),以及細胞系5種(TF-1、CCRF-CEM、RPMI8226、MOLT-4、Jurkat)。標準曲線使用的質粒及濃度如實施例7中的步驟7.3.2所述,配製方式為分別將AKR1C3的質粒稀釋至10-4,ACTB的質粒稀釋至10-2,將兩種質粒各取100μL混勻,再10倍、100倍、1000、10000倍梯度稀釋,拷貝數用數位PCR定量。共同進行qPCR測試,每例樣本做2個重複。通過標準曲線,可獲得各個未知樣本的AKR1C3和ACTB的拷貝數,將AKR1C3拷貝數/ACTB拷貝數的比值作為衡量AKR1C3表達的方式。測得的標準曲線見圖18。
從圖18中可以看到,AKR1C3的擴增效率達到99.1%,ACTB的擴增效率達到93.4%,R
2均大於0.99,符合要求。
樣本檢測結果見下表:
表 19 樣本檢測結果
Sample Name | Target Name | Cт | Quantity | FAM/VIC拷貝數比值 |
9 | AKR1C3 | 25.87238503 | 4631 | 0.00394 |
9 | ACTB | 19.45120239 | 1176619 | |
c-8226 | AKR1C3 | 24.11899948 | 15491 | 0.00939 |
c-8226 | ACTB | 18.93831253 | 1650472 | |
c-CCRF | AKR1C3 | 21.87590218 | 72603 | 0.00710 |
c-CCRF | ACTB | 16.17395782 | 10227160 | |
c-JUR | AKR1C3 | 28.83884048 | 600 | 0.00029 |
c-JUR | ACTB | 18.57073402 | 2103491 | |
c-MOLT-4 | AKR1C3 | 26.2293644 | 3621 | 0.00177 |
c-MOLT-4 | ACTB | 18.61536598 | 2042448 | |
c-TF-1 | AKR1C3 | 22.73562241 | 40163 | 0.01365 |
c-TF-1 | ACTB | 18.06160355 | 2943309 | |
GZJ | AKR1C3 | 20.59411812 | 175517 | 0.00266 |
GZJ | ACTB | 13.34858036 | 65976364 | |
HCL | AKR1C3 | 27.93593407 | 1118 | 0.00014 |
HCL | ACTB | 16.5698204 | 7876216 | |
HXB | AKR1C3 | 25.07105827 | 8041 | 0.00023 |
HXB | ACTB | 14.28288174 | 35616992 | |
JRZ | AKR1C3 | 27.13578415 | 1940 | 0.00054 |
JRZ | ACTB | 17.76814651 | 3572138 | |
LBJ | AKR1C3 | 24.13855743 | 15283 | 0.01207 |
LBJ | ACTB | 19.34033203 | 1265921 | |
LSX | AKR1C3 | 20.65554237 | 168247 | 0.00238 |
LSX | ACTB | 13.24556828 | 70616680 | |
PSS | AKR1C3 | 20.97867584 | 134680 | 0.00315 |
PSS | ACTB | 14.00572395 | 42764056 | |
ZYQ | AKR1C3 | 20.80658913 | 151625 | 0.00296 |
ZYQ | ACTB | 13.72992897 | 51299136 |
FAM拷貝數/VIC拷貝數柱狀圖結果見圖19。
從圖19中可見,細胞系的檢測結果與細胞系Western blot的結果一致,驗證了計算方式的準確性。同時,白血病患者樣本中檢測出了AKR1C3高表達的樣本,見圖中LBJ所示。8例患者均為接受過骨髓移植的患者。
通過以上AKR1C3引物探針設計、反應體系和反應條件研究,建立AKR1C3在RNA水平表達檢測方法,並達到了一定地靈敏度和準確性。
實施例9 檢測AKR1C3 RNA含量的方法的性能測試
根據實施例5-8確定了qPCR法和數位PCR法中的最佳引物探針組合物、內參基因以及相應的引物探針組合物、反應體系和反應條件,本實施例基於上述條件,採用qPCR法和數位PCR法相結合的方式進行性能測試試驗,包括靈敏度、特異性、重複性、準確性等。
qPCR反應過程包括以下步驟:
(1) 樣本準備
RNA濃度應>5ng/μL,取20~200ng RNA加入無核酸酶水補至一定的體積;
(2) 反轉錄
按照表12所示,向上述PCR管中依次加入反轉錄混合液,渦旋或移液器上下吹打混勻,短暫離心,置於普通PCR儀,按照表13所示,進行反轉錄,反轉錄產物cDNA,作為qPCR反應體系的模板,可儲存於-20℃。
(3) 引物工作液的配製
使用TE緩衝液分別將引物、探針乾粉在室溫溶解2小時(或4℃過夜溶解),引物工作液的濃度為10μM,溶解後按一定比例和組合,將引物,探針進行混合。充分混勻後,-20℃冰箱保存。引物工作液可以在-20℃穩定保存1年。
每次使用前,將裝有DNA擴增引物混合液的離心管振盪混勻後瞬離,根據標示量(20μL/反應),按單次使用量分裝備用。
(4) 反應體系配製
每次需使用陽性對照品(STD)、陰性對照品(Neg)和空白對照品(NTC)做質控,按照表14所示配製qPCR反應體系,混勻瞬離,然後按照表15所示擴增反應條件進行qPCR擴增。
以下試驗中涉及的樣本編號對應的含義為:W1—AKR1C3不表達標準品,P1—AKR1C3表達強陽細胞系,P2—AKR1C3-內參拷貝數不同梯度標準品,用於檢測標準曲線,P3—AKR1C3表達弱陽細胞系,S1—AKR1C3最低檢測限標準品,R1—AKR1C3表達強陽細胞系,R2—AKR1C3不表達標準品。
9.1 最低檢出限
9.1.1 測定方法
選擇低表達細胞系提取的RNA進行反轉錄,RNA用量2ug。反轉錄後的cDNA稀釋25倍作為最低檢出限參考品,用數位PCR的方法確定參考品的拷貝數,每個參考品重複檢測10次。
9.1.2. 最低檢出限參考品拷貝數確認過程及結果
1) PCR mix配製及分裝:取7.5 μL(每測試用量)的PCR master Mix,3μL的Pimer Mix,及需要加入水的總量,渦旋混勻,離心,分裝至PCR反應管中。
2) 加樣:向對應的PCR反應管中分別加入0.5μL待測樣本,渦旋混勻,離心。
3) 上樣:準備相應數目的晶片,取14.5 μL反應液進行上樣。注意此過程中不要碰觸晶片及晶片外蓋的中央,壓制晶片至少20 s,注入礦物油時緩加,注意不要讓油溢出,加完礦物油後封口。
4) 上機:將晶片擺排至數位PCR儀的架子上,注意二維碼及架子上的數字朝向自己。
5) 晶片讀取:從專用PCR儀中取出晶片並放至室溫後,將晶片放入晶片掃描器中掃描螢光信號,電腦根據螢光信號計算突變比例。
6) 檢測結果:
拷貝數計算:目標拷貝數=copies(目標)*14.5/上樣量
圖20為該細胞系cDNA稀釋5倍的檢測結果,為261.8 copies/μL,故檢出限參考品中的拷貝數為52.4 copies/μL。
9.1.3 qPCR驗證結果
表 20 檢測線參考品檢測結果
Sample Name | Target Name | Cт | CV | Quantity | Target Name | Cт | CV | Quantity | FAM/VIC拷貝數 |
Jurkat | AKR1C3 | 31.97866 | 0.584% | 73 | ACTB | 21.659 | 0.688% | 303652 | 0.000239 |
Jurkat | AKR1C3 | 32.12123 | 66 | ACTB | 21.36 | 372154 | 0.000177 | ||
Jurkat | AKR1C3 | 32.34266 | 56 | ACTB | 21.626 | 310465 | 0.000181 | ||
Jurkat | AKR1C3 | 32.17264 | 63 | ACTB | 21.562 | 324296 | 0.000195 | ||
Jurkat | AKR1C3 | 31.96986 | 73 | ACTB | 21.531 | 331262 | 0.000221 | ||
Jurkat | AKR1C3 | 32.4185 | 53 | ACTB | 21.549 | 327325 | 0.000163 | ||
Jurkat | AKR1C3 | 31.81558 | 81 | ACTB | 21.232 | 405964 | 0.000201 | ||
Jurkat | AKR1C3 | 32.25435 | 60 | ACTB | 21.534 | 330640 | 0.000181 | ||
Jurkat | AKR1C3 | 31.99182 | 72 | ACTB | 21.52 | 333726 | 0.000216 | ||
Jurkat | AKR1C3 | 32.19634 | 62 | ACTB | 21.259 | 398636 | 0.000156 |
由表20可知,最低檢出限參考品重複進行10次qPCR檢測,陽性檢出率均為100%,最低檢出限符合驗證標準。
9.2 精密度
精密度是指在相同條件下,多次平行測試結果相互接近的程度。各測試值之間越接近,精密度就越高。精密度反應的是試劑盒操作的可重複性。本實施例選擇陰性、弱表達和高表達精密度參考品進行批內精密度的測定,通過計算陰性精密度參考品的陰性符合率、弱表達和高表達精密度參考品AKR1C3相對表達量的變異係數(CV),來判斷本試劑盒的精密度性能。
9.2.1 測定方法
本實驗以2個精密度參考品為檢測樣本,使用2台儀器、2個操作人員、3個驗證日期,每例參考品檢測24次,陰性全部為陰性,陽性CV值<15%。
CV值=(標準差SD/平均值Mean)×100%
9.2.2 實驗結果
表 21 AKR1C3 精密度結果
實驗日期 | 實驗人 | 儀器型號 | Sample Name | Target Name | Cт | Cт CV | Target Name | Cт | Cт CV |
20201026上午 | A | 275053849 | R1 | AKR1C3 | 24.11411476 | 0.78% | ACTB | 19.088524 | 1.73% |
20201026上午 | A | 275053849 | R1 | AKR1C3 | 24.16817093 | ACTB | 19.390919 | ||
20201026上午 | A | 275053849 | R1 | AKR1C3 | 24.0476532 | ACTB | 19.034349 | ||
20201026上午 | A | 275053849 | R1 | AKR1C3 | 23.91945457 | ACTB | 18.850056 | ||
20201026上午 | B | 275051628 | R1 | AKR1C3 | 24.11411476 | ACTB | 19.088524 | ||
20201026上午 | B | 275051628 | R1 | AKR1C3 | 24.16817093 | ACTB | 19.390919 | ||
20201026上午 | B | 275051628 | R1 | AKR1C3 | 24.0476532 | ACTB | 19.034349 | ||
20201026上午 | B | 275051628 | R1 | AKR1C3 | 23.91945457 | ACTB | 18.850056 | ||
20201027上午 | A | 275053849 | R1 | AKR1C3 | 24.40969276 | ACTB | 19.163565 | ||
20201027上午 | A | 275053849 | R1 | AKR1C3 | 24.28497124 | ACTB | 18.652203 | ||
20201027上午 | A | 275053849 | R1 | AKR1C3 | 24.29683304 | ACTB | 18.56831 | ||
20201027上午 | A | 275053849 | R1 | AKR1C3 | 24.219944 | ACTB | 18.605289 | ||
20201023下午 | B | 275051628 | R1 | AKR1C3 | 23.9898243 | ACTB | 19.041698 | ||
20201023下午 | B | 275051628 | R1 | AKR1C3 | 24.13328171 | ACTB | 19.094217 | ||
20201023下午 | B | 275051628 | R1 | AKR1C3 | 23.93481636 | ACTB | 18.961788 | ||
20201023下午 | B | 275051628 | R1 | AKR1C3 | 23.92903328 | ACTB | 19.025682 | ||
20201028下午 | B | 275053849 | R1 | AKR1C3 | 24.27304268 | ACTB | 18.652338 | ||
20201028下午 | B | 275053849 | R1 | AKR1C3 | 24.26483727 | ACTB | 18.751188 | ||
20201028下午 | B | 275053849 | R1 | AKR1C3 | 24.30420494 | ACTB | 19.012062 | ||
20201028下午 | B | 275053849 | R1 | AKR1C3 | 24.20526314 | ACTB | 19.029068 | ||
20201022下午 | A | 275051628 | R1 | AKR1C3 | 24.31328773 | ACTB | 19.504038 | ||
20201022下午 | A | 275051628 | R1 | AKR1C3 | 24.57431793 | ACTB | 19.716539 | ||
20201022下午 | A | 275051628 | R1 | AKR1C3 | 24.55712318 | ACTB | 19.723076 | ||
20201022下午 | A | 275051628 | R1 | AKR1C3 | 24.47789192 | ACTB | 19.65189 | ||
20201026上午 | A | 275053849 | R2 | AKR1C3 | Undetermined | NA | ACTB | 39.802425 | NA |
20201026上午 | A | 275053849 | R2 | AKR1C3 | Undetermined | ACTB | Undetermined | ||
20201026上午 | A | 275053849 | R2 | AKR1C3 | Undetermined | ACTB | Undetermined | ||
20201026上午 | A | 275053849 | R2 | AKR1C3 | Undetermined | ACTB | 39.324535 | ||
20201026上午 | B | 275051628 | R2 | AKR1C3 | 39.69240952 | ACTB | Undetermined | ||
20201026上午 | B | 275051628 | R2 | AKR1C3 | Undetermined | ACTB | 39.547302 | ||
20201026上午 | B | 275051628 | R2 | AKR1C3 | Undetermined | ACTB | 39.802425 | ||
20201026上午 | B | 275051628 | R2 | AKR1C3 | Undetermined | ACTB | Undetermined | ||
20201027上午 | A | 275053849 | R2 | AKR1C3 | Undetermined | ACTB | Undetermined | ||
20201027上午 | A | 275053849 | R2 | AKR1C3 | Undetermined | ACTB | Undetermined | ||
20201027上午 | A | 275053849 | R2 | AKR1C3 | Undetermined | ACTB | Undetermined | ||
20201027上午 | A | 275053849 | R2 | AKR1C3 | Undetermined | ACTB | Undetermined | ||
20201023下午 | B | 275051628 | R2 | AKR1C3 | Undetermined | ACTB | Undetermined | ||
20201023下午 | B | 275051628 | R2 | AKR1C3 | Undetermined | ACTB | Undetermined | ||
20201023下午 | B | 275051628 | R2 | AKR1C3 | Undetermined | ACTB | 38.619129 | ||
20201023下午 | B | 275051628 | R2 | AKR1C3 | Undetermined | ACTB | Undetermined | ||
20201028下午 | B | 275053849 | R2 | AKR1C3 | Undetermined | ACTB | Undetermined | ||
20201028下午 | B | 275053849 | R2 | AKR1C3 | Undetermined | ACTB | 39.244194 | ||
20201028下午 | B | 275053849 | R2 | AKR1C3 | Undetermined | ACTB | Undetermined | ||
20201028下午 | B | 275053849 | R2 | AKR1C3 | Undetermined | ACTB | Undetermined | ||
20201022下午 | A | 275051628 | R2 | AKR1C3 | Undetermined | ACTB | 36.976463 | ||
20201022下午 | A | 275051628 | R2 | AKR1C3 | Undetermined | ACTB | 36.03307 | ||
20201022下午 | A | 275051628 | R2 | AKR1C3 | Undetermined | ACTB | 36.125805 | ||
20201022下午 | A | 275051628 | R2 | AKR1C3 | Undetermined | ACTB | 36.806549 |
陽性精密度參考品24次結果的AKR1C3 Ct的CV值為0.78%,ACTB Ct的CV值為1.73%,陰性精密度參考品24次檢測結果均為陰性。
由表21可知,精密度-重複性檢測的樣本各重複進行24次qPCR檢測,CV值均<5%,精密度-重複性符合驗證標準。
9.3 陰性符合率
9.3.1 測定方法
選擇了陰性參考品(AKR1C3同源性質粒AKR1C4,拷貝數9.06×10
3copies),用該試劑盒重複檢測3次,評估是否出現假陽性。
9.3.2 實驗結果
表 22 陰性參考品 qPCR 檢測結果
Well | Sample Name | Target Name | Reporter | Cт | Target Name | Reporter | Cт |
A3 | W1 | AKR1C3 | FAM | Undetermined | ACTB | VIC | 39.62632 |
B3 | W1 | AKR1C3 | FAM | Undetermined | ACTB | VIC | Undetermined |
C3 | W1 | AKR1C3 | FAM | Undetermined | ACTB | VIC | Undetermined |
由表22可知,重複檢測結果均為陰性,陰性符合率100%,符合驗證標準。
9.4 陽性符合率
9.4.1 測定方法
選擇2個陽性參考品(經Western blot驗證的AKR1C3細胞系),使用該試劑盒檢測,評估檢測的準確性。用AKR1C3和ACTB的質粒(經數位PCR定量)進行梯度稀釋配製標準曲線,用該試劑盒檢測,評估擴增效率和線性關係。
9.4.2 實驗結果
表 23 陽性參考品 qPCR 檢測結果
Sample Name | Target Name | Cт | Cт Mean | Cт SD | Cт CV | Quantity | Target Name | Cт | Cт Mean | Cт SD | Cт CV | Quantity | FAM 拷貝數 /VIC 拷貝數 |
P1 | AKR1C3 | 24.18057 | 24.17021 | 0.011876 | 0.05% | 11074.48 | ACTB | 18.75349 | 18.68381 | 0.135132 | 0.72% | 1423347 | 0.00778 |
P1 | AKR1C3 | 24.15725 | 11254.97 | ACTB | 18.52806 | 1657402 | 0.00679 | ||||||
P1 | AKR1C3 | 24.17281 | 11134.24 | ACTB | 18.76988 | 1407672 | 0.00791 | ||||||
P3 | AKR1C3 | 29.13986 | 29.04446 | 0.122427 | 0.42% | 355.8989 | ACTB | 18.15344 | 18.18871 | 0.030965 | 0.17% | 2134538 | 0.00017 |
P3 | AKR1C3 | 29.08711 | 369.154 | ACTB | 18.2114 | 2052591 | 0.00018 | ||||||
P3 | AKR1C3 | 28.90641 | 418.4136 | ACTB | 18.2013 | 2066642 | 0.00020 | ||||||
P2 | AKR1C3 | 22.36224 | 22.20885 | 0.21693 | 44200 | ACTB | 15.31071 | 15.21909 | 0.129568 | 15780000 | |||
P2 | AKR1C3 | 22.05546 | 22.20885 | 0.21693 | 44200 | ACTB | 15.12747 | 15.21909 | 0.129568 | 15780000 | |||
P2 | AKR1C3 | 25.50587 | 25.48958 | 0.023043 | 4420 | ACTB | 18.49942 | 18.59612 | 0.136749 | 1578000 | |||
P2 | AKR1C3 | 25.47328 | 25.48958 | 0.023043 | 4420 | ACTB | 18.69281 | 18.59612 | 0.136749 | 1578000 | |||
P2 | AKR1C3 | 28.66143 | 28.78446 | 0.173985 | 442 | ACTB | 21.82707 | 21.93377 | 0.150898 | 157800 | |||
P2 | AKR1C3 | 28.90748 | 28.78446 | 0.173985 | 442 | ACTB | 22.04047 | 21.93377 | 0.150898 | 157800 | |||
P2 | AKR1C3 | 32.32851 | 32.18291 | 0.205901 | 44.2 | ACTB | 25.45004 | 25.47176 | 0.030727 | 15780 | |||
P2 | AKR1C3 | 32.03732 | 32.18291 | 0.205901 | 44.2 | ACTB | 25.49349 | 25.47176 | 0.030727 | 15780 |
由表23可知,選擇的陽性參考品(經過Western blot驗證的細胞系),使用該檢測方法檢測,P1為強陽性標準品,FAM拷貝數/VIC拷貝數比值較高,P3為弱陽性標準品,FAM拷貝數/VIC拷貝數比值較低,且CV均符合要求,該檢測方法檢測準確性符合要求。
9.5 特異性
9.5.1 測定方法
選擇2個濃度的陰性參考品(AKR1C3同源性質粒AKR1C2,拷貝數分別為1.14×10
4拷貝、1.14×10
3拷貝,每個濃度水平重複檢測3次,評估特異性。
9.5.2 測定結果
檢測結果如下表所示:
表 24 特異性參考品 qPCR 檢測結果
Dilution | Target Name | Reporter | Cт | Target Name | Reporter | Cт |
10 -6 | AKR1C3 | FAM | Undetermined | ACTB | VIC | Undetermined |
10 -6 | AKR1C3 | FAM | Undetermined | ACTB | VIC | Undetermined |
10 -6 | AKR1C3 | FAM | Undetermined | ACTB | VIC | Undetermined |
10 -7 | AKR1C3 | FAM | Undetermined | ACTB | VIC | Undetermined |
10 -7 | AKR1C3 | FAM | Undetermined | ACTB | VIC | Undetermined |
10 -7 | AKR1C3 | FAM | Undetermined | ACTB | VIC | Undetermined |
2個梯度的陰性參考品,重複檢測3次,結果均為陰性,試劑盒檢測特異性符合要求。
9.6 實際樣本檢測
9.6.1 測定方法
選擇8個正常人血液樣本進行檢測,上樣量為40ng RNA反轉錄的cDNA量,每個樣本重複檢測2次,計算FAM拷貝數/VIC拷貝數比值的準確性。
9.6.2 測定結果
檢測結果如下表所示:
表 25 正常人血液樣本 qPCR 檢測結果
Sample Name | Target Name | Cт | Cт Mean | Cт SD | Cт CV | Quantity | Target Name | Cт | Cт Mean | Cт SD | Cт CV | Quantity | FAM 拷貝數 /VIC 拷貝數 |
1 | AKR1C3 | 29.19695 | 29.18378 | 0.018623 | 0.06% | 342.0897 | ACTB | 17.85256 | 17.7661 | 0.122284 | 0.69% | 2615471 | 0.00013 |
1 | AKR1C3 | 29.17061 | 348.3924 | ACTB | 17.67963 | 2939487 | 0.00012 | ||||||
3 | AKR1C3 | 27.59087 | 27.47804 | 0.159567 | 0.58% | 1041.478 | ACTB | 17.17691 | 17.13873 | 0.054002 | 0.32% | 4127791 | 0.00025 |
3 | AKR1C3 | 27.36521 | 1217.828 | ACTB | 17.10054 | 4346273 | 0.00028 | ||||||
6 | AKR1C3 | 28.04806 | 28.00367 | 0.062777 | 0.22% | 758.603 | ACTB | 18.27402 | 18.05006 | 0.316733 | 1.75% | 1967602 | 0.00039 |
6 | AKR1C3 | 27.95928 | 806.755 | ACTB | 17.82609 | 2662646 | 0.00030 | ||||||
7 | AKR1C3 | 27.65212 | 27.55965 | 0.130763 | 0.47% | 998.1864 | ACTB | 16.47845 | 16.47723 | 0.001732 | 0.01% | 6615674 | 0.00015 |
7 | AKR1C3 | 27.46719 | 1134.708 | ACTB | 16.476 | 6626625 | 0.00017 | ||||||
8 | AKR1C3 | 26.84116 | 26.84425 | 0.004378 | 0.02% | 1751.268 | ACTB | 17.08492 | 17.04245 | 0.060062 | 0.35% | 4392362 | 0.00040 |
8 | AKR1C3 | 26.84735 | 1743.768 | ACTB | 16.99998 | 4651691 | 0.00037 | ||||||
10 | AKR1C3 | 25.80928 | 25.76475 | 0.062972 | 0.24% | 3580.959 | ACTB | 17.2306 | 17.18045 | 0.070927 | 0.41% | 3980807 | 0.00090 |
10 | AKR1C3 | 25.72022 | 3808.989 | ACTB | 17.13029 | 4259813 | 0.00089 | ||||||
11 | AKR1C3 | 27.16312 | 27.22639 | 0.089475 | 0.33% | 1400.954 | ACTB | 16.77766 | 16.76808 | 0.013548 | 0.08% | 5405273 | 0.00026 |
11 | AKR1C3 | 27.28966 | 1283.304 | ACTB | 16.7585 | 5475667 | 0.00023 | ||||||
12 | AKR1C3 | 27.55924 | 26.98829 | 0.807451 | 2.99% | 1064.568 | ACTB | 16.55035 | 16.75941 | 0.295644 | 1.76% | 6302104 | 0.00017 |
12 | AKR1C3 | 26.41733 | 2349.339 | ACTB | 16.96846 | 4751781 | 0.00049 |
8個正常人血液樣本,重複檢測2次,FAM拷貝數/VIC拷貝數的比值均<0.001,檢測CV<5%,試劑盒檢測準確性符合要求。
9.7 模板量驗證
分別以200ng和10ng的RNA為反轉錄起始量,驗證3例臨床白血病患者的骨髓樣本的上樣量的範圍。
表 26 不同反轉錄起始量的陰陽性樣本 qPCR 檢測結果
Sample Name | Target Name | Cт | Quantity | FAM 拷貝數 /VIC 拷貝數 |
u8099-10ng | AKR1C3 | 27.94 | 1249 | 0.00300 |
u8099-10ng | ACTB | 21.16 | 415745 | |
u8099-10ng | AKR1C3 | 28.22 | 1032 | 0.00254 |
u8099-10ng | ACTB | 21.19 | 405838 | |
u8099-200ng | AKR1C3 | 23.30 | 29525 | 0.00293 |
u8099-200ng | ACTB | 16.48 | 10070348 | |
u8099-200ng | AKR1C3 | 23.23 | 31032 | 0.00299 |
u8099-200ng | ACTB | 16.43 | 10370063 | |
x9375-10ng | AKR1C3 | 24.86 | 10204 | 0.01243 |
x9375-10ng | ACTB | 20.16 | 820935 | |
x9375-10ng | AKR1C3 | 24.87 | 10142 | 0.01478 |
x9375-10ng | ACTB | 20.42 | 686215 | |
x9375-200ng | AKR1C3 | 20.40 | 213177 | 0.00986 |
x9375-200ng | ACTB | 15.36 | 21623626 | |
x9375-200ng | AKR1C3 | 20.37 | 217756 | 0.00916 |
x9375-200ng | ACTB | 15.22 | 23766040 | |
c5233-10ng | AKR1C3 | 27.50 | 1689 | 0.00262 |
c5233-10ng | ACTB | 20.51 | 645796 | |
c5233-10ng | AKR1C3 | 27.48 | 1710 | 0.00304 |
c5233-10ng | ACTB | 20.71 | 562264 | |
c5233-200ng | AKR1C3 | 23.36 | 28377 | 0.00214 |
c5233-200ng | ACTB | 16.07 | 13286656 | |
c5233-200ng | AKR1C3 | 23.16 | 32533 | 0.00256 |
c5233-200ng | ACTB | 16.13 | 12732719 |
結論:10ng和200ng上樣量檢測結果一致。
9.8 驗證結論
表 27 驗證結論總結表
驗證類型 | 驗證項目 | 樣本 | 重複次數 | 標準 | 檢測結果 |
準確性驗證 | 陰性符合率 | W1 | 3 | 3次結果均為陰性 | 3次結果均為陰性 |
陽性參考品 | P1 | 3 | 3次結果均為陽性 | 3次結果均為陽性 | |
P2 | 3 | 標準曲線擴增效率≥90%,R 2>0.99 | 標準曲線擴增效率≥90%,R 2>0.99 | ||
P3 | 3 | 3次結果均為陽性 | 3次結果均為陽性 | ||
最低檢測限 | 最低檢測限 | S1 | 10 | 檢出率為100% | 10次結果均為陽性,檢出率100% |
分析特異性 | 特異性 | 陰性參考品(10 -6稀釋) | 3 | 3次結果均為陰性 | 3次結果均為陰性 |
陰性參考品(10 -7稀釋) | 3 | 3次結果均為陰性 | 3次結果均為陰性 | ||
精密度 | 精密度 | R1 | 24 | 2台儀器、2個操作人員、3個驗證日期,每例參考品檢測24次,陰性全部為陰性,陽性計算CV值,<15% | R1 24次結果的AKR1C3 CV值為0.78%,ACTB CV值為1.73%,R2 24次檢測結果均為陰性 |
R2 | 24 | ||||
樣本檢測 | 實際樣本檢測 | 8個正常人血液樣本 | 2 | CV<15% | CV<15%,FAM拷貝數/VIC拷貝數處於低值水平 |
結論:通過最低檢出限、精密度、陰性符合率、陽性符合率、模板量、分析特異性和實際樣本檢測的性能驗證,7項性能均符合驗證的標準,該檢測方法的性能符合臨床應用要求,可用於臨床樣本檢測。
實施例10 檢測AKR1C3 RNA含量的試劑盒(qPCR法)
在本實施例中,檢測AKR1C3 RNA含量的試劑盒包括:
1) qPCR聚合酶混合液,聚合酶混合液主要包括:DNA聚合酶、MgCl
2、緩衝液和dNTPs(外加UNG酶和dUTP),優選地,聚合酶混合液為KAPA PROBE FAST RT-PCR Master Mix(2x);
2) 反轉錄酶混合液,優選地,反轉錄酶混合液為Superscript VILO MARSTER MIX;
3) AKR1C3反應混合液,其包括檢測AKR1C3基因的引物探針組合物和內參基因的引物探針組合物;其中,檢測AKR1C3基因的引物探針組合物選自上述記載的第(i)組至第(ix)組中的一種,進一步優選地,選自第(iii)組、第(iv)組或第(v)組,更有選地,選自第(iv)組;檢測AKR1C3基因的探針的5’端螢光基團為FAM,3’端淬滅基團為MGB;內參基因的引物探針組合物包括上游引物ACTB-F1、下游引物ACTB-R1和探針ACTB-P1,上游引物ACTB-F1、下游引物ACTB-R1和探針ACTB-P1的核苷酸序列分別如SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19所示;內參基因的探針的5’端螢光基團為VIC,3’端淬滅基團為BHQ1;
4) 陰性對照品(NC),例如為無核酸酶水;
5) 陽性對照品,例如已知拷貝數的參考品;
6) 記載相關操作方法的說明書。
實施例11 檢測AKR1C3 RNA含量的試劑盒(數位PCR法)
如實施例8所述,數位PCR法中需要將AKR1C3和ACTB單獨檢測,因此,本實施例的試劑盒與實施例10的試劑盒的區別在於,AKR1C3反應混合液僅包括檢測AKR1C3基因的引物探針組合物,並不包括內參基因ACTB的引物探針組合物。本實施例的試劑盒同時包括AKR1C3反應混合液(包括檢測AKR1C3基因的引物探針組合物)和內參基因ACTB反應混合液(包括內參基因ACTB的引物探針組合物),其餘均相同。
如實施例10或實施例11所述的,檢測AKR1C3 RNA含量的試劑盒,其被作為AKR1C3活化抗癌藥物一同使用,通常對患者進行篩選。使用該試劑盒,便於醫務人員在決定對患者施用藥物前使用統一的檢測試劑盒標準操作(SOP)在不同的實驗室中進行檢測,這樣經過同樣的試劑、同樣的操作得到的AKR1C3檢測結果才能與AKR1C3活化抗癌藥物的藥品說明書中針對特定癌症的推薦檢測結果相匹配。
在說明書中記載了試劑盒的具體操作方法,即上述說明書中的具體操作條件。可選的或作為一種優選方案,在該說明書中還針對不同的癌(腫瘤)類型給出了使用AKR1C3活化抗癌藥物的預定含量X值。比如說,針對B系急性淋巴細胞白血病(B-ALL)和T系急性淋巴細胞白血病(T-ALL),預定含量X值為0.00014~0.015,某個患者的離體的外周血樣本使用上述試劑盒檢測得出的AKR1C3拷貝數/ACTB拷貝數的比值為0.0092,而根據統計得出B-ALL患者使用AKR1C3活化抗癌藥物的AKR1C3拷貝數/ACTB拷貝數的比值不能低於0.00014,為此醫生對於該患者是可以開出使用AKR1C3活化抗癌藥物的處方的。再比如說,針對T系急性淋巴細胞白血病(T-ALL),某個患者的離體的外周血樣本使用上述試劑盒檢測得出的AKR1C3拷貝數/ACTB拷貝數的比值為0.00012,而根據統計得出T-ALL患者使用AKR1C3活化抗癌藥物的AKR1C3拷貝數/ACTB拷貝數的比值不能低於0.00014,為此醫生對於該患者是不可以開出使用AKR1C3活化抗癌藥物的處方的。
實施例12 AKR1C3 RNA含量的檢測方法和檢測AKR1C3 RNA含量的試劑盒在製備治療癌症的藥物中的用途
某B-ALL患者離體的外周血樣本使用實施例5-9建立的AKR1C3 RNA含量的檢測方法或實施例10或11的檢測AKR1C3 RNA含量的試劑盒檢測後得出的AKR1C3拷貝數/ACTB拷貝數的比值為0.0092,大於預定含量0.00014;
對該B-ALL患者給予AKR1C3活化抗癌藥物。
無
圖1為OBI-3424化合物的AKR1C3依賴性體外細胞毒性;左圖為肝癌細胞中AKR1C3蛋白表達水平與OBI-3424 IC
50之間的相關性;中間圖為肝癌細胞中AKR1C3 RNA表達水平與OBI-3424 IC
50之間的相關性;右圖為NSCLC癌細胞中AKR1C3 RNA表達水平與OBI-3424 IC
50之間的相關性;
圖2為OBI-3424化合物對白血病細胞系的細胞毒性;圖2a為OBI-3424化合物對6種B-ALL細胞系的細胞毒性;圖2b為OBI-3424化合物對7種T-ALL細胞系的細胞毒性;圖2c為在OBI-3424的濃度為10 nmol/L下,AKR1C3蛋白表達水平與18種ALL PDX的體外細胞存活率的相關性;圖2d為在OBI-3424的濃度為100 nmol/L下,AKR1C3蛋白表達水平與18種ALL PDX的體外細胞存活率的相關性;
圖3為白血病細胞系中AKR1C3 mRNA表達水平與蛋白表達水平之間的相關性;其中圖3a為通過RNA-Seq分析檢測的多種ALL PDX的AKR1C3 mRNA表達水平,圖3b為通過免疫印跡法檢測的多種ALL PDX的AKR1C3蛋白表達水平,圖3c為AKR1C3 RNA表達水平與蛋白表達水平之間的的相關性;圖3d為AKR1C3 RNA表達水平與OBI-3424 IC
50之間的相關性;
圖4為本申請的AKR1C3引物探針的位置資訊;
圖5為9對AKR1C3引物探針的擴增結果;其中圖5a為F1R1P1引物探針擴增結果;圖5b為F2R2P1引物探針擴增結果;圖5c為F2R6P1引物探針擴增結果;圖5d為F6R2P1引物探針擴增結果;圖5e為F6R6P1引物探針擴增結果;圖5f為F5R5P2引物探針擴增結果;圖5g為F3R3P1引物探針擴增結果;圖5h為F4R3P2引物探針擴增結果;圖5i為F7R7P3引物探針擴增結果;
圖6為3對AKR1C3引物探針的擴增結果和標準曲線;其中圖6a為F2R6P1引物探針的擴增結果;圖6b為F2R6P1引物探針的標準曲線(○表示標準品;E(擴增效率)=82.5%,R
2=0.987,Slope(斜率)=-3.826,y-int(y軸截距)=51.961);圖6c為F6R2P1引物探針的擴增結果;圖6d為F6R2P1引物探針的標準曲線(○表示標準品;E(擴增效率)=96.5%,R
2=0.982,Slope(斜率)=-3.408,y-int(y軸截距)=49.591);圖6e為F6R6P1引物探針的擴增結果;圖6f為F6R6P1引物探針的標準曲線(○表示標準品;E(擴增效率)=98.0%,R
2=0.992,Slope(斜率)=-3.371,y-int(y軸截距)=49.385);
圖7為AKR1C3質粒的擴增結果和標準曲線;其中圖7a為AKR1C3質粒的擴增結果;圖7b為AKR1C3質粒的標準曲線(○表示標準品;E(擴增效率)=100.7%,R
2=0.999,Slope(斜率)=-3.305,y-int(y軸截距)=42.336);
圖8為4種內參基因引物探針的擴增結果;其中圖8a為內參基因GAP的擴增結果;圖8b為內參基因GOLGA1的擴增結果;圖8c為內參基因ACTB的擴增結果;圖8d為內參基因HPRT1的擴增結果;
圖9為不同細胞系中AKR1C3表達的Western blot(免疫印跡)結果圖;
圖10為使用4種內參基因檢測不同細胞系中AKR1C3表達的結果圖;其中圖10a為使用內參基因HPRT1檢測不同細胞系中AKR1C3表達的結果圖;圖10b為使用內參基因GAP檢測不同細胞系中AKR1C3表達的結果圖;圖10c為使用內參基因ACTB檢測不同細胞系中AKR1C3表達的結果圖;圖10d為使用內參基因GOLGA1檢測不同細胞系中AKR1C3表達的結果圖;
圖11為AKR1C3-ACTB體系測試不同細胞系的結果圖;
圖12為AKR1C3-ACTB體系測試細胞系CCRF-CEM的結果圖;其中圖12a為細胞系CCRF-CEM中AKR1C3的擴增結果;圖12b為細胞系CCRF-CEM中AKR1C3的標準曲線(目標:AKR1C3;Eff(擴增效率)%=94.19%,R
2=0.998,Slope(斜率)=-3.47,y-inter(y軸截距)=34.595);圖12c為細胞系CCRF-CEM中ACTB的擴增結果;圖12d為細胞系CCRF-CEM中ACTB的標準曲線(目標:ACTB;Eff(擴增效率)%=95.302%,R
2=0.991,Slope(斜率)=-3.44,y-inter(y軸截距)=28.854);
圖13為AKR1C3-ACTB體系測試質粒的結果圖;其中圖13a為AKR1C3質粒的擴增結果;圖13b為AKR1C3質粒的標準曲線(目標:AKR1C3;Eff(擴增效率)%=101.853%,R
2=0.998,Slope(斜率)=-3.278,y-inter(y軸截距)=38.048);圖13c為ACTB質粒的擴增結果;圖13d為ACTB質粒的標準曲線(目標:ACTB;Eff(擴增效率)%=94.134%,R
2=1,Slope(斜率)=-3.471,y-inter(y軸截距)=40.821);
圖14為細胞系Jurkat的qPCR檢測結果圖;
圖15為細胞係數位PCR檢測圖(FAM和VIC同時檢測);
圖16為數位PCR檢測2種細胞系中的AKR1C3表達結果;其中圖16a為數位PCR檢測細胞系CCRF-CEM中的AKR1C3表達結果;圖16b為數位PCR檢測細胞系MOLT-4中的AKR1C3表達結果;
圖17為數位PCR檢測2種細胞系中的ACTB表達結果;其中圖17a為數位PCR檢測細胞系CCRF-CEM中的ACTB表達結果;圖17b為數位PCR檢測細胞系MOLT-4中的ACTB表達結果;
圖18為實際樣本測試時,AKR1C3-ACTB體系測試質粒的結果圖;其中圖18a為AKR1C3質粒的擴增結果;圖18b為AKR1C3質粒的標準曲線(目標:AKR1C3;Eff(擴增效率)%=99.108%,R
2=0.996,Slope(斜率)=-3.344,y-inter(y軸截距)=38.128);圖18c為ACTB質粒的擴增結果;圖18d為ACTB質粒的標準曲線(目標:ACTB;Eff(擴增效率)%=93.445%,R
2=0.998,Slope(斜率)=-3.49,y-inter(y軸截距)=40.636);
圖19為實際樣本中FAM拷貝數/VIC拷貝數的柱狀圖;
圖20為細胞系cDNA稀釋5倍的數位PCR檢測拷貝數結果圖。
Claims (26)
- 一種引物探針組合物,其選自以下的一組: (i) 上游引物AKR1C3-F1、下游引物AKR1C3-R1和探針AKR1C3-P1,所述上游引物AKR1C3-F1、下游引物AKR1C3-R1和探針AKR1C3-P1的核苷酸序列分別如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示; (ii) 上游引物AKR1C3-F2、下游引物AKR1C3-R2和探針AKR1C3-P1,所述上游引物AKR1C3-F2、下游引物AKR1C3-R2和探針AKR1C3-P1的核苷酸序列分別如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:3所示; (iii) 上游引物AKR1C3-F2、下游引物AKR1C3-R6和探針AKR1C3-P1,所述上游引物AKR1C3-F2、下游引物AKR1C3-R6和探針AKR1C3-P1的核苷酸序列分別如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:3所示; (iv) 上游引物AKR1C3-F6、下游引物AKR1C3-R2和探針AKR1C3-P1,所述上游引物AKR1C3-F6、下游引物AKR1C3-R2和探針AKR1C3-P1的核苷酸序列分別如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:3所示; (v) 上游引物AKR1C3-F6、下游引物AKR1C3-R6和探針AKR1C3-P1,所述上游引物AKR1C3-F6、下游引物AKR1C3-R6和探針AKR1C3-P1的核苷酸序列分別如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:3所示; (vi) 上游引物AKR1C3-F5、下游引物AKR1C3-R5和探針AKR1C3-P2,所述上游引物AKR1C3-F5、下游引物AKR1C3-R5和探針AKR1C3-P2的核苷酸序列分別如SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示; (vii) 上游引物AKR1C3-F3、下游引物AKR1C3-R3和探針AKR1C3-P1,所述上游引物AKR1C3-F3、下游引物AKR1C3-R3和探針AKR1C3-P1的核苷酸序列分別如SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:3所示; (viii) 上游引物AKR1C3-F4、下游引物AKR1C3-R3和探針AKR1C3-P2,所述上游引物AKR1C3-F4、下游引物AKR1C3-R3和探針AKR1C3-P2的核苷酸序列分別如SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:10所示; (ix) 上游引物AKR1C3-F7、下游引物AKR1C3-R7和探針AKR1C3-P3,所述上游引物AKR1C3-F7、下游引物AKR1C3-R7和探針AKR1C3-P3的核苷酸序列分別如SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示。
- 如請求項1所述的引物探針組合物,其中,所述引物探針組合物選自第(iii)組、第(iv)組或第(v)組; 進一步優選地,所述引物探針組合物選自第(iv)組。
- 如請求項1或2所述的引物探針組合物,其中,所述探針AKR1C3-P1、AKR1C3-P2和AKR1C3-P3的5’端螢光基團均為FAM,所述探針AKR1C3-P1、AKR1C3-P2和AKR1C3-P3的3’端淬滅基團均為MGB。
- 一種試劑盒,其包括請求項1-3之一所述的引物探針組合物。
- 如請求項4所述的試劑盒,更包括內參基因的引物探針組合物; 其中所述內參基因為ACTB。
- 如請求項4或5所述的試劑盒,其中,所述內參基因的引物探針組合物包括上游引物ACTB-F1、下游引物ACTB-R1和探針ACTB-P1,所述上游引物ACTB-F1、下游引物ACTB-R1和探針ACTB-P1的核苷酸序列分別如SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19所示。
- 如請求項4-6之一所述的試劑盒,其中,所述探針ACTB-P1的5’端螢光基團均為VIC,所述探針ACTB-P1的3’端淬滅基團均為BHQ1。
- 如請求項4-7之一所述的試劑盒,更包括聚合酶混合液,所述聚合酶混合液包括:DNA聚合酶、MgCl2、緩衝液和dNTPs; 優選地,所述聚合酶混合液為KAPA PROBE FAST RT-PCR Master Mix(2x)。
- 如請求項4-8之一所述的試劑盒,更包括反轉錄酶混合液, 其中所述反轉錄酶混合液為Superscript VILO MARSTER MIX。
- 如請求項4-9之一所述的試劑盒,更包括陰性對照和陽性對照; 其中所述陰性對照為無核酸酶水;和/或 所述陽性對照為已知拷貝數的參考品。
- 請求項1-3之一所述的引物探針組合物或請求項4-10之一所述的試劑盒在製備治療癌症的藥物中的用途。
- 如請求項11所述的用途,其中,使用請求項1-3之一所述的引物探針組合物或請求項4-10之一所述的試劑盒獲得患者離體樣本中的AKR1C3 RNA含量; 對AKR1C3 RNA含量大於或等於預定含量的患者給予AKR1C3活化抗癌藥物。
- 如請求項11或12所述的用途,其中,所述AKR1C3 RNA含量根據AKR1C3拷貝數/內參基因拷貝數的比值而獲得; 優選地,所述預定含量為0.0001~1; 進一步優選地,所述預定含量為0.00011~0.5; 更優選地,所述預定含量為0.00013~0.05。
- 如請求項11-13之一所述的用途,其中,所述離體樣本包括血液樣本、骨髓樣本或組織樣本。
- 如請求項11-15之一所述的用途,其中,所述癌症包括: 肺癌、非小細胞肺癌、肝癌、胰腺癌、乳腺癌、胃癌、骨癌、食管癌、乳房癌、前列腺癌、睾丸癌、結腸癌、卵巢癌、膀朧癌、宮頸癌、肝細胞癌、黑色素瘤、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、腎細胞癌、囊性腺癌、囊性癌、髓狀癌、支氣管癌、骨細胞癌、上皮癌、膽管癌、絨毛膜癌、胚癌、精原細胞癌、維爾姆斯癌、膠質細胞癌、星形細胞瘤、成神經管細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、成血細胞瘤、聲帶神經瘤、腦膜瘤、成神經細胞瘤、成視神經細胞瘤、成視網膜細胞瘤、神經纖維瘤、纖維肉瘤、成纖維細胞瘤、纖維瘤、纖維腺瘤、纖維軟骨瘤、纖維囊瘤、纖維粘液瘤、纖維骨瘤、纖維粘液肉瘤、纖維乳頭狀瘤、粘液肉瘤、粘液囊瘤、粘液軟骨瘤、粘液軟骨肉瘤、粘液軟骨纖維肉瘤、粘液腺瘤、成粘液細胞瘤、脂肉瘤、脂肪瘤、脂肪腺瘤、成脂細胞瘤、脂肪軟骨瘤、脂肪纖維瘤、脂肪血管瘤、粘液脂瘤、軟骨肉瘤、軟骨瘤、軟骨肌瘤、脊索瘤、絨毛膜腺瘤、絨毛上皮瘤、成絨毛膜細胞瘤、骨肉瘤、成骨細胞瘤、骨軟骨纖維瘤、骨軟骨肉瘤、骨軟骨瘤、骨囊瘤、骨牙質瘤、骨纖維瘤、骨纖維肉瘤、血管肉瘤、血管瘤、血管脂肪瘤、血管軟骨瘤、成血管細胞瘤、血管角質瘤、血管神經膠質瘤、血管內皮瘤、血管纖維瘤、血管肌瘤、血管脂肪瘤、血管淋巴管瘤、血管脂肪平滑肌瘤、血管肌脂瘤、血管肌神經瘤、血管粘液瘤、血管網狀內皮瘤、淋巴管肉瘤、淋巴肉芽瘤、淋巴管瘤、淋巴瘤、淋巴粘液瘤、淋巴肉瘤、淋巴管纖維瘤、淋巴細胞瘤、淋巴上皮瘤、成淋巴細胞瘤、外周性T細胞淋巴瘤、結節性NK/T細胞淋巴瘤、內皮瘤、成內皮細胞瘤、滑膜瘤、滑膜肉瘤、間皮瘤、結締組織瘤、尤因瘤、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、成平滑肌瘤、平滑肌纖維瘤、橫紋肌瘤、橫紋肌肉瘤、橫紋肌粘液瘤、急性淋巴白血病、急性骨髓性白血病、慢性病細胞、紅細胞增多症、淋巴瘤、子宮內膜癌、膠質瘤、結直腸癌、甲狀腺癌、尿路上皮癌或多發性骨髓瘤; 優選地,所述癌症包括:卵巢癌、宮頸癌、胰腺癌、乳腺癌、結直腸癌、食管癌、胃癌、肝細胞癌、非小細胞肺癌、前列腺癌、腎細胞癌、外周性T細胞淋巴瘤、結節性NK/T細胞淋巴瘤、急性淋巴白血病或急性骨髓性白血病。
- 一種檢測AKR1C3 RNA含量的方法,其包括以下步驟: (1) 提取待測離體樣本的RNA,並將提取的RNA加入到逆轉錄體系中並逆轉錄合成cDNA; (2) 以cDNA為模板,使用請求項1-3之一所述的引物探針組合物或請求項4-10之一所述的試劑盒進行qPCR或數位PCR擴增; (3) 根據qPCR或數位PCR擴增結果獲得待測離體樣本的AKR1C3 RNA含量。
- 如請求項17所述的方法,其中,在步驟(1)中,對提取的RNA進行濃度檢測; 優選地,使用Qubit RNA HS Assay Kits對提取的RNA進行濃度檢測;和/或 逆轉錄體系包括反轉錄酶; 優選地,提取的RNA和反轉錄酶的品質體積比為(0.5~2):4,單位為μg/μL; 進一步優選地,提取的RNA和反轉錄酶的品質體積比為(1~1.8):4,單位為μg/μL; 更優選地,提取的RNA和反轉錄酶的品質體積比為2:4,單位為μg/μL。
- 如請求項17或18所述的方法,其中,在步驟(2)中,在qPCR反應體系中,將選自第(i)組至第(ix)組中的一組引物探針組合物與內參基因的引物探針組合物混合; 優選地,在qPCR反應體系中,AKR1C3上游引物、AKR1C3下游引物和AKR1C3探針的摩爾比為(2~10):(2~10):3; 進一步優選地,AKR1C3上游引物、AKR1C3下游引物和AKR1C3探針的摩爾比為(3~7):(3~7):3; 更優選地,AKR1C3上游引物、AKR1C3下游引物和AKR1C3探針的摩爾比為5:5:3;和/或,在qPCR反應體系中, 優選地,上游引物ACTB-F1、下游引物ACTB-R1和探針ACTB-P1的摩爾比為(2~10):(2~10):3; 進一步優選地,上游引物ACTB-F1、下游引物ACTB-R1和探針ACTB-P1的摩爾比為(3~7):(3~7):3; 更優選地,上游引物ACTB-F1、下游引物ACTB-R1和探針ACTB-P1的摩爾比為5:5:3;和/或,在qPCR反應體系中, 優選地,AKR1C3上游引物、AKR1C3下游引物和AKR1C3探針的用量分別與上游引物ACTB-F1、下游引物ACTB-R1和探針ACTB-P1的用量相同。
- 如請求項17-19之一所述的方法,其中,在步驟(2)中,在qPCR反應體系中,還加入dUTP、UNG酶、cDNA模板和聚合酶混合液; 優選地,聚合酶混合液的體積為qPCR反應體系總體積的(0.3~0.8); 更優選地,聚合酶混合液的體積為qPCR反應體系總體積的0.5。
- 如請求項17-20之一所述的方法,其中,在步驟(2)中,分別使用AKR1C3數位PCR檢測體系和內參基因數位PCR檢測體系進行AKR1C3和內參基因的擴增; 優選地,在AKR1C3數位PCR檢測體系中,AKR1C3上游引物、AKR1C3下游引物和AKR1C3探針的摩爾比為(5~15):(5~15):3; 進一步優選地,AKR1C3上游引物、AKR1C3下游引物和AKR1C3探針的摩爾比為(8~14):(8~14):3; 更優選地,AKR1C3上游引物、AKR1C3下游引物和AKR1C3探針的摩爾比為12:12:3;和/或,在內參基因數位PCR檢測體系中, 優選地,上游引物ACTB-F1、下游引物ACTB-R1和探針ACTB-P1的摩爾比為(5~15):(5~15):3; 進一步優選地,上游引物ACTB-F1、下游引物ACTB-R1和探針ACTB-P1的摩爾比為(8~14):(8~14):3; 更優選地,上游引物ACTB-F1、下游引物ACTB-R1和探針ACTB-P1的摩爾比為12:12:3。
- 如請求項17-21之一所述的方法,其中,在步驟(3)中,所述根據qPCR或數位PCR擴增結果獲得待測離體樣本的AKR1C3 RNA含量包括: (A) 根據qPCR或數位PCR擴增結果分別獲得待測離體樣本的AKR1C3拷貝數和內參基因拷貝數; (B) 計算AKR1C3拷貝數/內參基因拷貝數的比值,從而獲得待測離體樣本的AKR1C3 RNA含量。
- 如請求項17-22之一所述的方法,其中,當採用qPCR法時,步驟(A)包括: (A1) 分別繪製AKR1C3的Ct值與初始拷貝數lg值的標準曲線和內參基因的Ct值與初始拷貝數lg值的標準曲線; (A2) 根據標準曲線,通過檢測到的AKR1C3的Ct值和內參基因的Ct值分別獲得待測離體樣本的AKR1C3拷貝數和內參基因拷貝數。
- 如請求項17-23之一所述的方法,其中,所述方法用於檢測血液樣本、骨髓樣本或組織樣本中的AKR1C3 RNA含量。
- 一種檢測AKR1C3酶表達水平的方法,其中,採用請求項17-24之一所述的方法檢測待測離體樣本的AKR1C3 RNA含量,然後根據待測離體樣本的AKR1C3 RNA含量獲得待測離體樣本的AKR1C3酶表達水平。
- 如請求項25的方法,其中,待測離體樣本的AKR1C3 RNA含量與待測離體樣本的AKR1C3酶表達水平存在線性相關性。
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