KR20230154252A - 프라이머-프로브 조성물, 키트 및 검출 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 프라이머-프로브 조성물, 키트 및 검출 방법에 관한 것이다. 프라이머-프로브 조성물은 (i) 군 내지 (ix) 군으로부터 선택되고, 키트는 상기 프라이머-프로브 조성물을 포함한다. 본 발명에 따르면, 환자의 생체외 샘플 내 AKRIC3 RNA 함량의 검출이 이루어질 수 있다.
Description
본 발명은 분자 생물학 검출 기술 분야에 관한 것으로, 특히 프라이머-프로브 조성물, 키트 및 검출 방법에 관한 것이다.
알데히드-케톤 환원효소 계열 1 구성원 C3(AKR1C3)은 인간의 AKR1C3 유전자에 의해 암호화되는 효소이다. 다양한 유형의 암에서, AKR1C3는 단백질 수준에서 과발현된다. 종양 내 AKR1C3의 높은 발현으로 인해 화합물 OBI-3424(AST-3424 및 TH-3424라고도 함), OBI-3423 및 OBI-2870은 종양에서 특이적으로 활성화되도록 설계되지만, 종양-특이적 표적화를 달성하기 위해서는 낮은 수준의 AKR1C3을 발현하는 정상 세포에서 활성화될 수는 없다. 화합물 OBI-3424는 고형 및 혈액 종양을 포함한 14개 초과 유형의 인간 암을 치료하기 위해 미국(NCT04315324 및 NCT03592264) 및 중국(CXHL1900137 및 CXHL2000263)에서 다수의 I상 임상시험에서 연구되고 있다.
화합물 OBI-3424는 AKR1C3에 의해 활성화되는 신규한 프로드러그 디알킬화제이다. 연구에서 화합물 OBI-3424 활성화는 AKR1C3-의존적이고, 이의 세포독성 및 항종양 효능은 AKR1C3 효소의 발현 수준과 높은 상관관계가 있음이 확인되었다. 화합물 OBI-3424는 생체외 AKR1C3-의존적 세포독성 및 다양한 인간 암 유형에서 생체내 항종양 활성을 보여주고, 상이한 유형의 암을 치료하기 위해 사용될 수 있는 항암제로서 화합물 OBI-3424의 추가적인 개발을 뒷받침한다. AKR1C3은 암 환자의 병태를 분석하는 생체표지자로서 사용되고, 치료를 위해 화합물 OBI-3424을 선택하도록 환자를 추가로 안내한다. 따라서, 실제 적용분야에서, 환자의 생체외 샘플 내 AKR1C3 효소 함량이 검출될 수 있고, 그 다음, 검출 결과에 따라 치료를 위해 환자에게 화합물 OBI-3424를 투여할지 여부가 결정된다.
선행 기술에서, 웨스턴 블롯 또는 면역화학 염색(IHC)은 일반적으로 환자의 생체외 샘플에서 AKR1C3 효소 함량을 검출하기 위해 사용된다. 참고문헌(Harvey DJ, Singleton RS, Dachs GU, 등, The Bioreductive Prodrug PR-104A Is Activated under Aerobic Conditions by Human Aldo-Keto Reductase 1C3[J]. Cancer Research, 2010, 70(4):1573)에서, 2700개의 종양 조직 샘플이 IHC 방법으로 계수 및 분석되었고, 여기서 AKR1C3 효소는 간암, 위암, 식도암 및 방광암에서 높게 발현되는 반면, 소세포폐암, 유방암, 백혈병 및 전립선암에서는 낮게 발현되었다. 따라서, 고형 종양 조직 샘플에서 AKR1C3 효소의 발현 수준을 검출하는 IHC 방법을 사용하는 것이 이론적으로 가능하다.
그러나, 많은 유형의 암 또는 종양이 있고, 고형 종양 이외의 혈액 암(백혈병) 환자는 조직 샘플을 제공할 수 없으므로, 혈액 암(백혈병) 샘플에서 AKR1C3 효소의 발현 수준을 검출하기 위해 웨스턴 블롯 또는 면역화학 염색을 직접 이용하는 것은 불가능하다.
본 출원인의 연구개발팀은 상이한 고형 종양 암 세포의 AKR1C3 효소의 발현 수준 및 AKR1C3 RNA 함량이 암 세포 증식에 대한 AST-3424 억제의 IC50 값과 유의하게 상관관계가 있음과, 상이한 혈액 암 세포주의 AKR1C3 효소의 발현 수준 및 AKR1C3 RNA 함량은 암 세포 증식에 대한 AST-3424 억제의 IC50 값과 유의하게 상관관계가 있음을 밝혀내었다. 따라서, 상기 효소 함량은 ARKR1C3 RNA 함량을 검출함으로써 예측되거나 특성규명될 수 있으며, 이에 의해 약물 투여를 안내할 수 있다.
그러나, 선행 기술에서 AKR1C3 RNA 함량을 검출하기 위한 상응하는 검출 방법이 없다. AKR1C3 RNA 함량을 평가하기 위해 상응하는 검출 방법이 사용될 수 있음을 가정하면, 우수한 암 치료적 효과를 달성하기 위해, 보다 높은 AKR1C3 RNA 함량을 갖고 이에 의해 프로드러그에 반응할 가능성이 가장 높은 환자가 선택되어 화합물 OBI-3424을 투여할 수 있다.
이러한 점을 고려하여, 본 발명의 목적은 프라이머-프로브 조성물, 키트 및 검출 방법을 제공하는 것으로, 상기 프라이머-프로브 조성물, 상기 키트 및 상기 검출 방법을 이용함으로써 양호한 정확도, 분석적 특이도, 정밀도 및 낮은 검출 한계를 가지며 환자의 생체외 샘플 내 AKRIC3 RNA 함량의 검출이 이루어질 수 있다.
상기 목적을 위해, 본 발명의 제1 측면은 다음 군 중 어느 하나로부터 선택되는, 환자의 생체외 샘플 내 AKR1C3 RNA 함량을 검출하기 위한 프라이머-프로브 조성물을 제공한다:
(i) 업스트림 프라이머 AKR1C3-F1, 다운스트림 프라이머 AKR1C3-R1 및 프로브 AKR1C3-P1로, 여기서 상기 업스트림 프라이머 AKR1C3-F1, 다운스트림 프라이머 AKR1C3-R1 및 프로브 AKR1C3-P1의 뉴클레오티드 서열은 각각 서열 번호:1, 서열 번호: 2 및 서열 번호: 3으로 표시되고;
(ii) 업스트림 프라이머 AKR1C3-F2, 다운스트림 프라이머 AKR1C3-R2 및 프로브 AKR1C3-P1로, 여기서 상기 업스트림 프라이머 AKR1C3-F2, 다운스트림 프라이머 AKR1C3-R2 및 프로브 AKR1C3-P1의 뉴클레오티드 서열은 각각 서열 번호: 4, 서열 번호: 5 및 서열 번호: 3으로 표시되고;
(iii) 업스트림 프라이머 AKR1C3-F2, 다운스트림 프라이머 AKR1C3-R6 및 프로브 AKR1C3-P1로, 여기서 상기 업스트림 프라이머 AKR1C3-F2, 다운스트림 프라이머 AKR1C3-R6 및 프로브 AKR1C3-P1의 뉴클레오티드 서열은 각각 서열 번호: 4, 서열 번호: 6 및 서열 번호: 3으로 표시되고;
(iv) 업스트림 프라이머 AKR1C3-F6, 다운스트림 프라이머 AKR1C3-R2 및 프로브 AKR1C3-P1로, 여기서 상기 업스트림 프라이머 AKR1C3-F6, 다운스트림 프라이머 AKR1C3-R2 및 프로브 AKR1C3-P1의 뉴클레오티드 서열은 각각 서열 번호: 7, 서열 번호: 5 및 서열 번호: 3으로 표시되고;
(v) 업스트림 프라이머 AKR1C3-F6, 다운스트림 프라이머 AKR1C3-R6 및 프로브 AKR1C3-P1로, 여기서 상기 업스트림 프라이머 AKR1C3-F6, 다운스트림 프라이머 AKR1C3-R6 및 프로브 AKR1C3-P1의 뉴클레오티드 서열은 각각 서열 번호: 7, 서열 번호: 6 및 서열 번호: 3으로 표시되고;
(vi) 업스트림 프라이머 AKR1C3-F5, 다운스트림 프라이머 AKR1C3-R5 및 프로브 AKR1C3-P2로, 여기서 상기 업스트림 프라이머 AKR1C3-F5, 다운스트림 프라이머 AKR1C3-R5 및 프로브 AKR1C3-P2의 뉴클레오티드 서열은 각각 서열 번호: 8, 서열 번호: 9 및 서열 번호: 10으로 표시되고;
(vii) 업스트림 프라이머 AKR1C3-F3, 다운스트림 프라이머 AKR1C3-R3 및 프로브 AKR1C3-P1로, 여기서 상기 업스트림 프라이머 AKR1C3-F3, 다운스트림 프라이머 AKR1C3-R3 및 프로브 AKR1C3-P1의 뉴클레오티드 서열은 각각 서열 번호: 11, 서열 번호: 12 및 서열 번호: 3으로 표시되고;
(viii) 업스트림 프라이머 AKR1C3-F4, 다운스트림 프라이머 AKR1C3-R3 및 프로브 AKR1C3-P2로, 여기서 상기 업스트림 프라이머 AKR1C3-F4, 다운스트림 프라이머 AKR1C3-R3 및 프로브 AKR1C3-P2의 뉴클레오티드 서열은 각각 서열 번호: 13, 서열 번호: 12 및 서열 번호: 10으로 표시되고;
(ix) 업스트림 프라이머 AKR1C3-F7, 다운스트림 프라이머 AKR1C3-R7 및 프로브 AKR1C3-P3으로, 여기서 상기 업스트림 프라이머 AKR1C3-F7, 다운스트림 프라이머 AKR1C3-R7 및 프로브 AKR1C3-P3의 뉴클레오티드 서열은 각각 서열 번호: 14, 서열 번호: 15 및 서열 번호: 16으로 표시된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 프라이머-프로브 조성물은 (iii), (iv) 및 (v) 군 중 어느 하나로부터 선택되고;
더 바람직하게, 상기 프라이머-프로브 조성물은 (iv) 군으로부터 선택된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 프로브 AKR1C3-P1, AKR1C3-P2 및 AKR1C3-P3의 5'-말단 리포터는 FAM이고, 상기 프로브 AKR1C3-P1, AKR1C3-P2 및 AKR1C3-P3의 3'-말단 소광체는 MGB이다.
동일한 발명 개념에 기반하여, 본 발명의 제2 측면은 전술한 바와 같은 프라이머-프로브 조성물을 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 키트는 참조 유전자의 프라이머-프로브 조성물을 더 포함하고;
바람직하게, 상기 참조 유전자는 ACTB이다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 참조 유전자의 프라이머-프로브 조성물은 업스트림 프라이머 ACTB-F1, 다운스트림 프라이머 ACTB-R1 및 프로브 ACTB-P1을 포함하고, 업스트림 프라이머 ACTB-F1, 다운스트림 프라이머 ACTB-R1 및 프로브 ACTB-P1의 뉴클레오티드 서열은 각각 서열 번호:17, 서열 번호: 18 및 서열 번호: 19로 나타난다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 프로브 ACTB-P1의 5'-말단 리포터는 VIC이고, 프로브 ACTB-P1의 3'-말단 소광체는 BHQ1이다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 전술한 바에 따른 키트는 중합효소 혼합물을 더 포함하고, 상기 중합효소 혼합물은 주로 DNA 중합효소, MgCl2, 버퍼 및 dNTP를 포함하고;
바람직하게, 상기 중합효소 혼합물은 KAPA PROBE FAST RT-PCR 마스터 믹스(2x)이다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 전술한 바에 따른 키트는 역전사효소 혼합물을 더 포함하고;
바람직하게, 상기 역전사효소 혼합물은 Superscript VILO 마스터 믹스이다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 전술한 바에 따른 키트는 음성 대조군 및 양성 대조군을 더 포함하고;
바람직하게, 상기 음성 대조군은 뉴클레아제 비함유 물이고/이거나;
바람직하게, 상기 양성 대조군은 공지된 카피 수를 갖는 참조물이다.
동일한 발명 개념에 기반하여, 본 발명의 제3 측면은 암 치료용 약물의 제조에 있어서 전술한 바에 따른 프라이머-프로브 조성물 또는 키트의 용도를 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 전술한 바에 따른 프라이머-프로브 조성물 또는 키트를 사용하여 환자의 생체외 샘플 내 AKR1C3 RNA 함량이 수득되고;
소정의 함량 이상의 AKR1C3 RNA 함량을 가진 환자에게 AKR1C3 활성화된 항암 약물이 투여된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, AKR1C3 RNA 함량이 AKR1C3 카피 수/참조 유전자 카피 수의 비에 따라 수득되고;
바람직하게, 상기 소정의 함량은 0.0001 내지 1이고;
더 바람직하게, 상기 소정의 함량은 0.00011 내지 0.5이고;
더욱 더 바람직하게, 상기 소정의 함량은 0.00013 내지 0.05이다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 생체외 샘플은 혈액 샘플, 골수 샘플 또는 조직 샘플을 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, AKR1C3 활성화된 항암 약물은 물론 본 발명에서 AKR1C3 활성화된 항암 프로드러그를 포함하여, 즉, 프로드러그 형태의 화합물이 세포 내 생체화학적 환경에서 AKR1C3의 촉매 작용 하에 환원되어 세포독성 독소를 수득하고, 이에 의해 암 세포에 대해 독성 효과를 발휘하며, 다음 특허 출원을 참조한다:
중국 출원 제2016800150788호, 공개공보 CN107530556A호에 해당하는 PCT/US2016/021581, 공개공보 WO2016145092A1호;
중국 출원 제 2016800446081호, 공개공보 CN108290911A호에 해당하는 PCT/US2016/025665, 공개공보 WO2016161342호;
중국 출원 제2016800200132호, 공개공보 CN108136214A호에 해당하는 PCT/US2016/062114, 공개공보 WO2017087428호; 및
중국 출원 제201980023423.6호, 공개공보 CN111918864A호에 해당하는 PCT/NZ2019/050030, 공개공보 WO2019190331호.
상기 특허 출원에 개시된 일반식의 화합물 및 특정 화합물 모두는 AKR1C3 활성화된 항암 프로드러그(화합물)에 속하며, 상기 출원은 여기서 전체적으로 본 특허 출원 내용에 통합된다.
개략적으로, AKR1C3 활성화된 항암 약물은 다음 조건을 충족해야 한다:
AKR1C3 억제제(예컨대 상기 3개의 특허에 개시된 TH-3021, 또는 화합물 36, 즉, Flanagan 등, Bioorganic and Medicinal Chemistry(2014), pp. 962-977의 )의 존재 하에서, 암 세포의 증식에 대한 화합물의 검출된 억제 효과는 AKR1C3 억제제(예컨대 상기 3개의 특허에 개시된 TH-3021)의 부재 하에서 암 세포의 경우보다 적고; 암 세포 증식에 대한 억제 효과가 IC50을 사용하여 정량화될 때, AKR1C3 억제제의 존재 하에 특정 암 세포주에 대한 화합물의 검출된 IC50이 AKR1C3 억제제의 부재 하에서의 경우보다 크다면, 상기 화합물이 AKR1C3-활성화된 항암 약물로 결정될 수 있다.
바람직하게, AKR1C3 활성화된 항암 약물은 하기 구조를 갖는 화합물로부터 선택된 화합물이다:
본 발명의 바람직한 구현예에서, 암은 폐암, 비소세포폐암, 간암, 췌장암, 유방암, 위암, 골암, 식도암, 비만암종, 전립선암, 고환암, 대장암, 난소암, 방광암, 자궁경부암, 간세포 암종, 흑색종, 편평세포암종, 기저세포암종, 선암종, 땀샘암종, 피지선 암종, 유두상 암종, 유두상 선암종, 신장세포 암종, 낭성 선암종, 낭성 암종, 수질 암종, 기관지 암종, 골세포 암종, 상피 암종, 담관 암종, 융모막암종, 배아 암종, 정상피종, 윌름 종양, 교모세포종, 성상세포종, 수모세포종, 두개인두종, 뇌실막종, 송과체 종양, 혈구모세포종, 성대 신경종, 수막종, 신경모세포종, 시신경모세포종, 망막모세포종, 신경섬유종, 섬유육종, 섬유모세포종, 섬유종, 섬유선종, 섬유연골종, 섬유낭포종, 섬유점액종, 섬유골종, 섬유점액육종, 섬유유두종, 점액육종, 점액낭포종, 점액연골종, 점액연골육종, 점액연골섬유육종, 점액종, 점액모세포종, 지방육종, 지방종, 지방선종, 지방모세포종, 지방연골종, 지방섬유종, 지방혈관종, 점액지방종, 연골육종, 연골종, 연골근종, 척색종, 융모막암종, 융모상피종, 맥락모세포종, 골육종, 골모세포종, 골연골섬유종, 골연골육종, 골연골종, 골낭종, 골치아종, 골섬유종, 골섬유육종, 혈관육종, 혈관종, 혈관지방종, 혈관연골종, 혈관모세포종, 혈관각화종, 혈관신경교종, 혈관내피종, 혈관섬유종, 혈관근종, 혈관지방종, 혈관림프관종, 혈관지질근육종, 혈관근육지방종, 혈관근신경종, 혈관점액종, 혈관세망종증, 림프관육종, 림프육아종, 림프관종, 림프종, 림프점액종, 림프육종, 림프관섬유종, 림프구종, 림프상피종, 림프모세포종, 말초 T-세포 림프종, 결절성 NK/T-세포 림프종, 내피종, 내모세포종, 윤활막종, 윤활막 육종, 중피종, 결합 조직 종양, 유윙 종양, 평활근종, 평활근육종, 평활근모세포종, 평활근섬유종, 횡문근종, 횡문근육종, 횡문근점액종, 급성 림프성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 질환 세포, 적혈구 증가증, 림프종, 자궁내막암, 신경아교종, 결장직장암, 갑상선암, 요로상피암 또는 다발성 골수종을 포함하고;
바람직하게, 암은 난소암, 자궁경부암, 췌장암, 유방암, 결장직장암, 식도암, 위암, 간세포 암종, 비소세포 폐암, 전립선암, 신장세포 암종, 말초 T-세포 림프종, 결절성 NK/T-세포 림프종, 급성 림프성 백혈병 또는 급성 골수성 백혈병을 포함한다.
동일한 발명 개념에 기반하여, 본 발명의 제4 측면은 다음 단계를 포함하는, AKR1C3 RNA 함량을 검출하기 위한 방법을 제공한다:
(1) 검출하려는 생체외 샘플의 RNA를 추출하고, 상기 추출된 RNA를 역전사 시스템에 첨가하고, 상기 추출된 RNA는 역전사되어 cDNA를 합성하는 단계;
(2) 전술한 바에 따른 프라이머-프로브 조성물 또는 키트를 사용하여 주형으로서 cDNA로 qPCR 또는 디지털 PCR을 증폭하는 단계;
(3) qPCR 또는 디지털 PCR 증폭 결과에 따라 검출하려는 생체외 샘플의 AKR1C3 RNA 함량을 수득하는 단계.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 단계 (1)에서, 추출된 RNA의 농도가 검출되고;
바람직하게, 추출된 RNA의 농도를 검출하기 위해 Qubit RNA HS Assay Kits가 사용되고/되거나;
상기 역전사 시스템은 역전사효소를 포함하고;
바람직하게, 추출된 RNA와 역전사효소의 질량 대 부피 비는 μg/μL의 단위로 (0.5 내지 2):4이고;
더 바람직하게, 추출된 RNA와 역전사효소의 질량 대 부피 비는 μg/μL의 단위로 (1 내지 1.8):4이고;
더욱 더 바람직하게, 추출된 RNA와 역전사효소의 질량 대 부피 비는 μg/μL의 단위로 2:4이다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 단계 (2)에서, qPCR 반응 시스템에서, (i) 내지 (ix) 군 중 어느 하나로부터 선택된 프라이머-프로브 조성물은 참조 유전자의 프라이머-프로브 조성물과 혼합되고;
바람직하게, qPCR 반응 시스템에서, AKR1C3 업스트림 프라이머, AKR1C3 다운스트림 프라이머 및 AKR1C3 프로브의 몰비는 (2 내지 10):(2 내지 10):3이고;
더 바람직하게, qPCR 반응 시스템에서, AKR1C3 업스트림 프라이머, AKR1C3 다운스트림 프라이머 및 AKR1C3 프로브의 몰비는 (3 내지 7):(3 내지 7):3이고;
더욱 더 바람직하게, qPCR 반응 시스템에서, AKR1C3 업스트림 프라이머, AKR1C3 다운스트림 프라이머 및 AKR1C3 프로브의 몰비는 5:5:3이고/이거나, qPCR 반응 시스템에서,
바람직하게, 업스트림 프라이머 ACTB-F1, 다운스트림 프라이머 ACTB-R1 및 프로브 ACTB-P1의 몰비는 (2 내지 10):(2 내지 10):3이고;
더 바람직하게, 업스트림 프라이머 ACTB-F1, 다운스트림 프라이머 ACTB-R1 및 프로브 ACTB-P1의 몰비는 (3 내지 7):(3 내지 7):3이고;
더욱 더 바람직하게, 업스트림 프라이머 ACTB-F1, 다운스트림 프라이머 ACTB-R1 및 프로브 ACTB-P1의 몰비는 5:5:3이고/이거나; qPCR 반응 시스템에서,
바람직하게, AKR1C3 업스트림 프라이머, AKR1C3 다운스트림 프라이머 및 AKR1C3 프로브의 양은 업스트림 프라이머 ACTB-F1, 다운스트림 프라이머 ACTB-R1 및 프로브 ACTB-P1 각각의 양과 동일하다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 단계 (2)에서, qPCR 반응 시스템에서, dUTP, UNG 효소, cDNA 주형 및 중합효소 혼합물이 또한 첨가되고;
바람직하게, 상기 중합효소 혼합물의 부피는 qPCR 반응 시스템의 총 부피의 (0.3 내지 0.8)이고;
더 바람직하게, 상기 중합효소 혼합물의 부피는 qPCR 반응 시스템의 총 부피의 0.5이다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 단계 (2)에서, AKR1C3 및 참조 유전자는 각각 AKR1C3 디지털 PCR 검출 시스템 및 참조 유전자 디지털 PCR 검출 시스템에 의해 증폭되고;
바람직하게, AKR1C3 디지털 PCR 검출 시스템에서, AKR1C3 업스트림 프라이머, AKR1C3 다운스트림 프라이머 및 AKR1C3 프로브의 몰비는 (5 내지 15):(5 내지 15):3이고;
더 바람직하게, AKR1C3 업스트림 프라이머, AKR1C3 다운스트림 프라이머 및 AKR1C3 프로브의 몰비는 (8 내지 14):(8 내지 14):3이고;
더욱 더 바람직하게, AKR1C3 업스트림 프라이머, AKR1C3 다운스트림 프라이머 및 AKR1C3 프로브의 몰비는 12:12:3이고/이거나; 참조 유전자 디지털 PCR 검출 시스템에서,
바람직하게, 업스트림 프라이머 ACTB-F1, 다운스트림 프라이머 ACTB-R1 및 프로브 ACTB-P1의 몰비는 (5 내지 15):(5 내지 15):3이고;
더 바람직하게, 업스트림 프라이머 ACTB-F1, 다운스트림 프라이머 ACTB-R1 및 프로브 ACTB-P1의 몰비는 (8 내지 14):(8 내지 14):3이고;
더욱 더 바람직하게, 업스트림 프라이머 ACTB-F1, 다운스트림 프라이머 ACTB-R1 및 프로브 ACTB-P1의 몰비는 12:12:3이다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 단계 (3)에서, qPCR 또는 디지털 PCR 증폭 결과에 따라 검출하려는 생체외 샘플의 AKR1C3 RNA 함량을 수득하는 단계는 다음을 포함한다:
(A) 각각 qPCR 또는 디지털 PCR 증폭 결과에 따라 검출하려는 생체외 샘플의 AKR1C3 및 참조 유전자의 카피 수를 수득하는 것;
(B) AKR1C3 카피 수/참조 유전자 카피 수의 비를 계산하여, 검출하려는 생체외 샘플의 AKR1C3 RNA 함량을 수득하는 것.
본 발명의 바람직한 구현예에서, qPCR 방법이 사용되는 경우, 단계 (A)는 다음을 더 포함한다:
(A1) AKR1C3의 Ct 값 및 최초 카피 수 lg 값의 표준 곡선 및 참조 유전자의 Ct 값 및 최초 카피 수 lg 값의 표준 곡선을 각각 플롯팅하는것;
(A2) 상기 표준 곡선에 따라, AKR1C3 및 참조 유전자의 검출된 Ct 값에 의해 검출하려는 생체외 샘플의 AKR1C3 및 참조 유전자의 카피 수를 각각 수득하는 것.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 방법은 혈액 샘플, 골수 샘플 또는 조직 샘플 내 AKR1C3 RNA 함량을 검출하기 위해 사용된다.
동일한 발명 개념에 기반하여, 본 발명의 제5 양태는 AKR1C3 효소의 발현 수준을 검출하기 위한 방법을 제공하고, 여기서 상기 방법은 검출하려는 생체외 샘플의 AKR1C3 RNA 함량을 검출하고, 그 다음, 상기 검출하려는 생체외 샘플의 AKR1C3 RNA 함량에 따라, 검출하려는 생체외 샘플의 AKR1C3 효소의 발현 수준이 수득된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 검출하려는 생체외 샘플의 AKR1C3 RNA 함량과 검출하려는 생체외 샘플의 AKR1C3 효소의 발현 수준 사이에 선형 상관관계가 있다.
도 1은 생체외에서 화합물 OBI-3424의 AKR1C3-의존적 세포독성을 보여주고; 좌측 도면은 간세포 암 세포에서 AKR1C3 단백질의 발현 수준과 OBI-3424 IC50 사이의 상관관계를 보여주고; 중간 도면은 간세포 암종 세포에서 AKR1C3 RNA의 발현 수준과 OBI-3424 IC50 사이의 상관관계를 보여주고; 우측 도면은 NSCLC 암 세포에서 AKR1C3 RNA의 발현 수준과 OBI-3424 IC50 사이의 상관관계를 보여준다.
도 2는 백혈병 세포주에 대한 화합물 OBI-3424의 세포독성을 보여주고; 도 2a는 6가지 유형의 B-ALL 세포주에 대한 화합물 OBI-3424의 세포독성을 보여주고; 도 2b는 7가지 유형의 T-ALL 세포주에 대한 화합물 OBI-3424의 세포독성을 보여주고; 도 2c는 10 nmol/L 농도의 OBI-3424에서 생체외 18가지 유형의 ALL PDX의 세포 생존율과 AKR1C3 단백질 발현 수준 사이의 상관관계를 보여주고; 도 2d는 100 nmol/L 농도의 OBI-3424에서 생체외 18가지 유형의 ALL PDX의 세포 생존율과 AKR1C3 단백질 발현 수준 사이의 상관관계를 보여준다.
도 3은 백혈병 세포주에서 AKR1C3 mRNA 발현 수준과 단백질 발현 수준 사이의 상관관계를 보여주고, 여기서 도 3a는 RNA-Seq 분석에 의해 검출되는 다양한 ALL PDX의 AKR1C3 mRNA의 발현 수준을 보여주고, 도 3b는 웨스턴 블롯에 의해 검출된 다양한 ALL PDX의 AKR1C3 단백질의 발현 수준을 보여주고, 도 3c는 AKR1C3 RNA 발현 수준과 단백질 발현 수준의 상관관계를 보여주고, 도 3d는 AKR1C3 RNA의 발현 수준과 OBI-3424 IC50 사이의 상관관계를 보여준다.
도 4는 본 출원에서 AKR1C3 프라이머-프로브의 위치 정보를 보여준다.
도 5는 9쌍의 AKR1C3 프라이머-프로브의 증폭 결과를 보여주고; 여기서 도 5a는 F1R1P1 프라이머-프로브의 증폭 결과를 보여주고; 도 5b는 F2R2P1 프라이머-프로브의 증폭 결과를 보여주고; 도 5c는 F2R6P1 프라이머-프로브의 증폭 결과를 보여주고; 도 5d는 F6R2P1 프라이머-프로브의 증폭 결과를 보여주고; 도 5e는 F6R6P1 프라이머-프로브의 증폭 결과를 보여주고; 도 5f는 F5R5P2 프라이머-프로브의 증폭 결과를 보여주고; 도 5g는 F3R3P1 프라이머-프로브의 증폭 결과를 보여주고; 도 5h는 F4R3P2 프라이머-프로브의 증폭 결과를 보여주고; 도 5i는 F7R7P3 프라이머-프로브의 증폭 결과를 보여준다.
도 6은 3쌍의 AKR1C3 프라이머-프로브의 증폭 결과 및 표준 곡선을 보여주고; 여기서 도 6a는 F2R6P1 프라이머-프로브의 증폭 결과를 보여주고; 도 6b는 F2R6P1 프라이머-프로브의 표준 곡선을 보여주고(○는 표준을 나타내고; E(증폭 효율)=82.5%, R2=0.987, 기울기=-3.826, y-int(y-절편)=51.961); 도 6c는 F6R2P1 프라이머-프로브의 증폭 결과를 보여주고; 도 6d는 F6R2P1 프라이머-프로브의 표준 곡선을 보여주고(○는 표준을 나타내고; E(증폭 효율)=96.5%, R2=0.982, 기울기= -3.408, y-int(y-절편)=49.591); 도 6e는 F6R6P1 프라이머-프로브의 증폭 결과를 보여주고; 도 6f는 F6R6P1 프라이머-프로브의 표준 곡선을 보여준다(○는 표준을 나타내고; E(증폭 효율)=98.0%, R2=0.992, 기울기=-3.371, y-int(y-절편)=49.385).
도 7은 AKR1C3 플라스미드의 증폭 결과 및 표준 곡선을 보여주고; 여기서 도 7a는 AKR1C3 플라스미드의 증폭 결과를 보여주고; 도 7b는 AKR1C3 플라스미드의 표준 곡선을 보여준다(○는 표준을 나타내고; E(증폭 효율)=100.7%, R2=0.999, 기울기=-3.305, y-int(y-절편)=42.336).
도 8은 4가지 유형의 참조 유전자 프라이머-프로브의 증폭 결과를 보여주고; 여기서 도 8a는 참조 유전자 GAP의 증폭 결과를 보여주고; 도 8b는 참조 유전자 GOLGA1의 증폭 결과를 보여주고; 도 8c는 참조 유전자 ACTB의 증폭 결과를 보여주고; 도 8d는 참조 유전자 HPRT1의 증폭 결과를 보여준다.
도 9는 상이한 세포주에서 AKR1C3 발현의 웨스턴 블롯 결과를 보여준다.
도 10은 4가지 유형의 참조 유전자를 이용하여 상이한 세포주에서 AKR1C3 발현을 검출한 결과를 보여주고; 여기서 도 10a는 참조 유전자 HPRT1을 이용하여 상이한 세포주에서 AKR1C3 발현을 검출한 결과를 보여주고; 도 10b는 참조 유전자 GAP를 이용하여 상이한 세포주에서 AKR1C3의 발현을 검출한 결과를 보여주고; 도 10c는 참조 유전자 ACTB를 이용하여 상이한 세포주에서 AKR1C3 발현을 검출한 결과를 보여주고; 도 10d는 참조 유전자 GOLGA1을 이용하여 상이한 세포주에서 AKR1C3 발현을 검출한 결과를 보여준다.
도 11은 AKR1C3-ACTB 시스템에 의해 검출된 상이한 세포주의 결과를 보여준다.
도 12는 AKR1C3-ACTB 시스템에 의해 검출된 CCRF-CEM 세포주의 결과를 보여주고; 여기서 도 12a는 CCRF-CEM 세포주에서 AKR1C3의 증폭 결과를 보여주고; 도 12b는 CCRF-CEM 세포주에서 AKR1C3의 표준 곡선을 보여주고(표적: AKR1C3; Eff(증폭 효율)%=94.19%, R2=0.998, 기울기=-3.47, y-inter(y-절편)=34.595); 도 12c는 CCRF-CEM 세포주에서 ACTB의 증폭 결과를 보여주고; 도 12d는 CCRF-CEM 세포주에서 ACTB의 표준 곡선을 보여준다(표적: ACTB; Eff(증폭 효율)%=95.302%, R2 =0.991, 기울기=-3.44, y-inter(y-절편) =28.854).
도 13은 AKR1C3-ACTB 시스템에 의해 검출되는 플라스미드의 결과를 보여주고; 여기서 도 13a는 AKR1C3 플라스미드의 증폭 결과를 보여주고; 도 13b는 AKR1C3 플라스미드의 표준 곡선을 보여주고(표적: AKR1C3; Eff(증폭 효율)%=101.853%, R2 =0.998, 기울기=-3.278, y-inter(y-절편)=38.048)의 표준 곡선을 보여주고; 도 13c는 ACTB 플라스미드의 증폭 결과를 보여주고; 도 13d는 ACTB 플라스미드의 표준 곡선을 보여준다(표적: ACTB; Eff(증폭 효율)%=94.134%, R2=1, 기울기=-3.471, y-inter(y-절편)=40.821).
도 14는 주르카트(Jurkat) 세포주의 qPCR 검출 결과를 보여준다.
도 15는 세포주의 디지털 PCR 검출 결과를 보여준다(FAM 및 VIC가 동시에 검출되었다).
도 16은 디지털 PCR에 의해 검출된 2가지 유형의 세포주에서 AKR1C3 발현 결과를 보여주고; 여기서 도 16a는 디지털 PCR에 의해 검출된 CCRF-CEM 세포주에서 AKR1C3 발현 결과를 보여주고; 도 16b는 디지털 PCR에 의해 검출된 MOLT-4 세포주에서 AKR1C3 발현 결과를 보여준다.
도 17은 디지털 PCR에 의해 검출된 2가지 유형의 세포주에서 ACTB 발현 결과를 보여주고; 여기서 도 17a는 디지털 PCR에 의해 검출된 CCRF-CEM 세포주에서 ACTB 발현 결과를 보여주고; 도 17b는 디지털 PCR에 의해 검출된 MOLT-4 세포주에서 ACTB 발현 결과를 보여준다.
도 18은 실제 샘플 테스트에서 AKR1C3-ACTB 시스템에 의해 검출된 플라스미드의 결과를 보여주고; 여기서 도 18a는 AKR1C3 플라스미드의 증폭 결과를 보여주고; 도 18b는 AKR1C3 플라스미드의 표준 곡선을 보여주고(표적: AKR1C3; Eff(증폭 효율)%=99.108%, R2=0.996, 기울기=-3.344, y-inter(y-절편)=38.128); 도 18c는 ACTB 플라스미드의 증폭 결과를 보여주고; 도 18d는 ACTB 플라스미드의 표준 곡선을 보여준다(표적: ACTB; Eff(증폭 효율)%=93.445%, R2=0.998, 기울기=-3.49, y-inter(y-절편)=40.636).
도 19는 실제 샘플에서 FAM 카피 수/VIC 카피 수의 히스토그램이다.
도 20은 디지털 PCR로 검출된 세포주의 cDNA를 5배 희석한 카피 수 결과를 보여준다.
도 2는 백혈병 세포주에 대한 화합물 OBI-3424의 세포독성을 보여주고; 도 2a는 6가지 유형의 B-ALL 세포주에 대한 화합물 OBI-3424의 세포독성을 보여주고; 도 2b는 7가지 유형의 T-ALL 세포주에 대한 화합물 OBI-3424의 세포독성을 보여주고; 도 2c는 10 nmol/L 농도의 OBI-3424에서 생체외 18가지 유형의 ALL PDX의 세포 생존율과 AKR1C3 단백질 발현 수준 사이의 상관관계를 보여주고; 도 2d는 100 nmol/L 농도의 OBI-3424에서 생체외 18가지 유형의 ALL PDX의 세포 생존율과 AKR1C3 단백질 발현 수준 사이의 상관관계를 보여준다.
도 3은 백혈병 세포주에서 AKR1C3 mRNA 발현 수준과 단백질 발현 수준 사이의 상관관계를 보여주고, 여기서 도 3a는 RNA-Seq 분석에 의해 검출되는 다양한 ALL PDX의 AKR1C3 mRNA의 발현 수준을 보여주고, 도 3b는 웨스턴 블롯에 의해 검출된 다양한 ALL PDX의 AKR1C3 단백질의 발현 수준을 보여주고, 도 3c는 AKR1C3 RNA 발현 수준과 단백질 발현 수준의 상관관계를 보여주고, 도 3d는 AKR1C3 RNA의 발현 수준과 OBI-3424 IC50 사이의 상관관계를 보여준다.
도 4는 본 출원에서 AKR1C3 프라이머-프로브의 위치 정보를 보여준다.
도 5는 9쌍의 AKR1C3 프라이머-프로브의 증폭 결과를 보여주고; 여기서 도 5a는 F1R1P1 프라이머-프로브의 증폭 결과를 보여주고; 도 5b는 F2R2P1 프라이머-프로브의 증폭 결과를 보여주고; 도 5c는 F2R6P1 프라이머-프로브의 증폭 결과를 보여주고; 도 5d는 F6R2P1 프라이머-프로브의 증폭 결과를 보여주고; 도 5e는 F6R6P1 프라이머-프로브의 증폭 결과를 보여주고; 도 5f는 F5R5P2 프라이머-프로브의 증폭 결과를 보여주고; 도 5g는 F3R3P1 프라이머-프로브의 증폭 결과를 보여주고; 도 5h는 F4R3P2 프라이머-프로브의 증폭 결과를 보여주고; 도 5i는 F7R7P3 프라이머-프로브의 증폭 결과를 보여준다.
도 6은 3쌍의 AKR1C3 프라이머-프로브의 증폭 결과 및 표준 곡선을 보여주고; 여기서 도 6a는 F2R6P1 프라이머-프로브의 증폭 결과를 보여주고; 도 6b는 F2R6P1 프라이머-프로브의 표준 곡선을 보여주고(○는 표준을 나타내고; E(증폭 효율)=82.5%, R2=0.987, 기울기=-3.826, y-int(y-절편)=51.961); 도 6c는 F6R2P1 프라이머-프로브의 증폭 결과를 보여주고; 도 6d는 F6R2P1 프라이머-프로브의 표준 곡선을 보여주고(○는 표준을 나타내고; E(증폭 효율)=96.5%, R2=0.982, 기울기= -3.408, y-int(y-절편)=49.591); 도 6e는 F6R6P1 프라이머-프로브의 증폭 결과를 보여주고; 도 6f는 F6R6P1 프라이머-프로브의 표준 곡선을 보여준다(○는 표준을 나타내고; E(증폭 효율)=98.0%, R2=0.992, 기울기=-3.371, y-int(y-절편)=49.385).
도 7은 AKR1C3 플라스미드의 증폭 결과 및 표준 곡선을 보여주고; 여기서 도 7a는 AKR1C3 플라스미드의 증폭 결과를 보여주고; 도 7b는 AKR1C3 플라스미드의 표준 곡선을 보여준다(○는 표준을 나타내고; E(증폭 효율)=100.7%, R2=0.999, 기울기=-3.305, y-int(y-절편)=42.336).
도 8은 4가지 유형의 참조 유전자 프라이머-프로브의 증폭 결과를 보여주고; 여기서 도 8a는 참조 유전자 GAP의 증폭 결과를 보여주고; 도 8b는 참조 유전자 GOLGA1의 증폭 결과를 보여주고; 도 8c는 참조 유전자 ACTB의 증폭 결과를 보여주고; 도 8d는 참조 유전자 HPRT1의 증폭 결과를 보여준다.
도 9는 상이한 세포주에서 AKR1C3 발현의 웨스턴 블롯 결과를 보여준다.
도 10은 4가지 유형의 참조 유전자를 이용하여 상이한 세포주에서 AKR1C3 발현을 검출한 결과를 보여주고; 여기서 도 10a는 참조 유전자 HPRT1을 이용하여 상이한 세포주에서 AKR1C3 발현을 검출한 결과를 보여주고; 도 10b는 참조 유전자 GAP를 이용하여 상이한 세포주에서 AKR1C3의 발현을 검출한 결과를 보여주고; 도 10c는 참조 유전자 ACTB를 이용하여 상이한 세포주에서 AKR1C3 발현을 검출한 결과를 보여주고; 도 10d는 참조 유전자 GOLGA1을 이용하여 상이한 세포주에서 AKR1C3 발현을 검출한 결과를 보여준다.
도 11은 AKR1C3-ACTB 시스템에 의해 검출된 상이한 세포주의 결과를 보여준다.
도 12는 AKR1C3-ACTB 시스템에 의해 검출된 CCRF-CEM 세포주의 결과를 보여주고; 여기서 도 12a는 CCRF-CEM 세포주에서 AKR1C3의 증폭 결과를 보여주고; 도 12b는 CCRF-CEM 세포주에서 AKR1C3의 표준 곡선을 보여주고(표적: AKR1C3; Eff(증폭 효율)%=94.19%, R2=0.998, 기울기=-3.47, y-inter(y-절편)=34.595); 도 12c는 CCRF-CEM 세포주에서 ACTB의 증폭 결과를 보여주고; 도 12d는 CCRF-CEM 세포주에서 ACTB의 표준 곡선을 보여준다(표적: ACTB; Eff(증폭 효율)%=95.302%, R2 =0.991, 기울기=-3.44, y-inter(y-절편) =28.854).
도 13은 AKR1C3-ACTB 시스템에 의해 검출되는 플라스미드의 결과를 보여주고; 여기서 도 13a는 AKR1C3 플라스미드의 증폭 결과를 보여주고; 도 13b는 AKR1C3 플라스미드의 표준 곡선을 보여주고(표적: AKR1C3; Eff(증폭 효율)%=101.853%, R2 =0.998, 기울기=-3.278, y-inter(y-절편)=38.048)의 표준 곡선을 보여주고; 도 13c는 ACTB 플라스미드의 증폭 결과를 보여주고; 도 13d는 ACTB 플라스미드의 표준 곡선을 보여준다(표적: ACTB; Eff(증폭 효율)%=94.134%, R2=1, 기울기=-3.471, y-inter(y-절편)=40.821).
도 14는 주르카트(Jurkat) 세포주의 qPCR 검출 결과를 보여준다.
도 15는 세포주의 디지털 PCR 검출 결과를 보여준다(FAM 및 VIC가 동시에 검출되었다).
도 16은 디지털 PCR에 의해 검출된 2가지 유형의 세포주에서 AKR1C3 발현 결과를 보여주고; 여기서 도 16a는 디지털 PCR에 의해 검출된 CCRF-CEM 세포주에서 AKR1C3 발현 결과를 보여주고; 도 16b는 디지털 PCR에 의해 검출된 MOLT-4 세포주에서 AKR1C3 발현 결과를 보여준다.
도 17은 디지털 PCR에 의해 검출된 2가지 유형의 세포주에서 ACTB 발현 결과를 보여주고; 여기서 도 17a는 디지털 PCR에 의해 검출된 CCRF-CEM 세포주에서 ACTB 발현 결과를 보여주고; 도 17b는 디지털 PCR에 의해 검출된 MOLT-4 세포주에서 ACTB 발현 결과를 보여준다.
도 18은 실제 샘플 테스트에서 AKR1C3-ACTB 시스템에 의해 검출된 플라스미드의 결과를 보여주고; 여기서 도 18a는 AKR1C3 플라스미드의 증폭 결과를 보여주고; 도 18b는 AKR1C3 플라스미드의 표준 곡선을 보여주고(표적: AKR1C3; Eff(증폭 효율)%=99.108%, R2=0.996, 기울기=-3.344, y-inter(y-절편)=38.128); 도 18c는 ACTB 플라스미드의 증폭 결과를 보여주고; 도 18d는 ACTB 플라스미드의 표준 곡선을 보여준다(표적: ACTB; Eff(증폭 효율)%=93.445%, R2=0.998, 기울기=-3.49, y-inter(y-절편)=40.636).
도 19는 실제 샘플에서 FAM 카피 수/VIC 카피 수의 히스토그램이다.
도 20은 디지털 PCR로 검출된 세포주의 cDNA를 5배 희석한 카피 수 결과를 보여준다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서의 하나 이상의 실시예에서 사용되는 기술 용어 또는 과학 용어는 본 개시내용이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 이해하는 통상적인 의미를 가져야 함을 나타낼 필요가 있다.
이하 실시예의 실험 방법은 달리 명시되지 않는 한, 모두 통상적인 방법이다. 이하 실시예에서 사용되는 의약, 시약 등의 원료는 달리 명시되지 않는 한, 모두 시판되는 제품이다.
환자에게 약물을 "투여하는 것"은 직접 투여(의료인에 의해 환자에게 투여되거나 자가-투여될 수 있음) 및/또는 약물 처방을 하는 작업일 수 있는 간접 투여를 의미한다. 예를 들어, 환자에게 약물을 자가-투여하도록 지시하고/하거나 환자에게 약물 처방을 제공하는 의사는 환자에게 약물을 투여하는 것이다.
"암"은 백혈병, 림프종, 암, 및 침습에 의해 국소적으로 퍼지고 잠재적으로 무제한 증식하는 전이에 의해 전신에 퍼질 수 있는 기타 악성 종양(고형 종양을 포함함)을 의미한다. 암의 예는 부신암, 골암, 뇌암, 유방암, 기관지암, 대장암 및/또는 직장암, 담낭암, 두경부암, 신장암, 인후암, 간암, 폐암, 신경조직암, 췌장암, 전립선암, 부속 갑상선암, 피부암, 위암 및 갑상선암을 포함한다(그러나, 이에 제한되지 않는다). 암의 특정 다른 예는 급성 및 만성 림프구 및 과립구 종양, 선암종, 선종, 기저 세포 암종, 잘 분화되지 않는 자궁경부 상피 및 상피내 암종, 유잉육종, 표피양암종, 거대세포종양, 다형교모세포종, 털상세포종양, 장 신경절 세포종양, 증식성 각막신경종양, 섬세포암종, 카포시육종, 평활근종, 백혈병, 림프종, 악성 카르시노이드, 악성 흑색종, 악성 고칼슘혈증, 마파노이드 아비투스 종양, 골수 상피 암종, 전이성 피부암, 점막 신경종, 골수종, 육아종 식육종, 신경모세포종, 골육종, 골형성 및 기타 육종, 난소 종양, 갈색세포종, 진성 적혈구증, 원발성 뇌종양, 소세포 폐암, 궤양성 및 유두상 유형 둘 모두의 편평 세포 암종, 과형성, 정상피종, 연조직 육종, 망막모세포종, 횡문근 육종, 신장 세포 종양, 국소 피부 병변, 세망 세포 육종 및 윌름 종양을 포함한다.
용어 "환자" 및 "개체"는 본원에서 상호교환하여 사용될 수 있고, 암 치료를 필요로 하는 포유동물을 의미한다. 일반적으로, 환자는 인간이다. 일반적으로, 환자는 암 진단을 받은 인간이다. 특정 예에서, "환자" 또는 "개체"는 약물 및 요법의 스크리닝, 특성규명 및 평가에서 이용되는 비인간 포유동물, 예컨대 비인간 영장류, 개, 고양이, 토끼, 돼지, 마우스 또는 랫트이다.
"프로드러그"는 투여 후 적어도 하나의 특성에 대해 대사되거나 또는 다르게는 생물학적으로 활성인 또는 더 활성인 화합물(또는 약물)로 전환되는 화합물을 의미한다. 약물에 비해 프로드러그는 이를 약물에 비해 덜 활성 또는 불활성으로 만드는 방식으로 화학적으로 변형되지만, 화학적 변형은 프로드러그가 투여된 후 대사적 또는 기타 생물학적 프로세스에 의해 해당 약물이 생성되도록 하는 것이다. 프로드러그는 활성 약물에 비해 변경된 대사적 안정성 또는 수송 특징, 더 적은 부작용 또는 더 낮은 독성 또는 개선된 향미를 가질 수 있다(예를 들어, 본원에 참고문헌으로 통합된 참고문헌 Nogrady, 1985, Medicinal Chemistry A Biochemical Approach, Oxford University Press, New York, 388-392 페이지 참조). 프로드러그는 해당 약물 이외의 반응물을 사용하여 합성될 수 있다.
"고형 종양"은 뼈, 뇌, 간, 폐, 림프절, 췌장, 전립선, 피부 및 연조직(육종)의 전이성 종양을 포함하는(그러나, 이에 제한되지 않는) 고형 종양을 의미한다.
병태 또는 환자"의 치료"는 임상 결과를 포함하여 유익한 또는 원하는 결과를 수득하기 위해 조치를 취함을 의미한다. 본 발명의 목적을 위해, 유익한 또는 원하는 임상 결과는 암의 하나 이상의 증상의 경감 또는 개선; 질병 정도의 저감; 질병 진행의 지연 또는 둔화; 질병 상태의 경감, 완화 또는 안정화; 또는 기타 유익한 결과를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 암 치료는 경우에 따라 부분적인 반응 또는 안정적인 질병을 초래할 수 있다.
"종양 세포"는 임의의 적절한 종, 예를 들어 쥐과, 개, 고양이, 말 또는 인간과 같은 포유동물의 종양 세포를 의미한다.
약물의 "치료적 유효량"은 약물이 암 환자에게 투여될 때 의도된 치료적 효과, 예를 들어 환자에서 암의 하나 이상의 증상을 경감, 개선, 완화 또는 제거하는 양을 의미한다. 치료적 효과는 반드시 1회 용량 투여로 발생하는 것은 아니고, 일련의 용량 투여 후에야 발생할 수 있다. 따라서, 치료적 유효량은 하나 이상의 투여로 투여될 수 있다.
광학적 활성 화합물의 설명에서, 접두사 R 및 S는 키랄 중심 주위에서 분자의 절대 형태를 나타내기 위해 사용된다. (+) 및 (-)는 화합물의 광학적 활성, 즉 편광면이 광학적 활성 화합물을 투과하여 회전하는 방향을 나타내기 위해 사용된다. 접두사 (-)는 화합물이 좌회전성, 즉, 화합물이 편광면 방향을 좌측으로 또는 반시계 방향으로 회전시킴을 나타낸다. 접두사 (+)는 화합물이 우회전성, 즉, 화합물이 편광면 방향을 우측으로 또는 시계 방향으로 회전시킴을 나타낸다. 그러나, 광학 기호 (+) 및 (-)는 분자의 R 및 S의 절대 형태와는 독립적이다.
화합물 OBI-3424(AST-3424 및 TH-3424라고도 함), OBI-3423 및 OBI-2870의 구조는 다음과 같이 나타난다:
여기서 OBI-3424는 S-거울상 이성질체이고, OBI-3423은 R-거울상 이성질체이고, OBI-2870은 OBI-3424와 OBI-3423의 1:1 비의 라세미 혼합물이다.
이전 연구에서는 화합물 OBI-3424, OBI-3423 및 OBI-2870은 다양한 인간 암에 대해 양호한 치료적 효과를 가지며, 특히 화합물 OBI-3424가 고형 종양 및 혈액 악성종양에 대해 양호한 치료적 효과를 가짐을 보여주었고; 여기서 고형 종양(간암, 간세포 암종(HCC), 비소세포폐암, 흑색종, 전립선암, 비만암종, 식도암, 신장암, 위암, 대장암, 뇌암, 방광암, 자궁경부암, 난소암, 두경부암, 자궁 내막암, 췌장암, 육종양 암종 및 직장암 등을 포함함)에 대한 화합물 OBI-3424의 치료적 효과는 특허 CN108290911A호에 인용되어 있고; 혈액 악성종양(B 계열 급성 림프구성 백혈병(B-ALL) 및 T 계열 급성 림프구성 백혈병(T-ALL)을 포함함)에 대한 화합물 OBI-3424의 치료적 효과가 특허 WO2019/062919A1호에 인용되어 있다.
AKR1C3은 많은 유형의 암, 특히 간암, 위암, 신장암, CRPC 및 비소세포 폐암에서 단백질 수준으로 과발현된다. 종양에서 AKR1C3의 높은 발현으로 인해, 화합물 OBI-3424은 종양에서 특이적으로 활성화되도록 설계되지만, 화합물 OBI-3424는 낮은 수준의 AKR1C3을 발현하는 정상 세포에서 활성화될 수 없어 종양-특이적 표적화를 달성할 수 없다. OBI-3424는 AKR1C3에 의해 선택적으로 활성화되는 매우 강력한 DNA 알킬화 프로드러그로 개발된다. NADPH의 존재 하에서, OBI-3424는 AKR1C3으로부터, 자발적으로 OBI-2660으로 가수 분해되는 중간체로 환원되고, OBI-2660은 티오TEPA(N,N',N"-트리에틸렌티오포스포아미드)와 유사한 DNA 디알킬화제이어서, 아래에 나타낸 바와 같이 구아닌의 N7(또는 O6) 위치에서 DNA 가교 결합을 이끌고 이어서 세포 사멸로 이끈다.
본 출원인에 의해 이루어진 추가 연구에서 화합물 OBI-3424 활성화는 AKR1C3-의존적이고, 그의 세포독성 및 항종양 효능은 AKR1C3 단백질의 발현 수준과 높은 상관관계가 있음이 확인되었다. 화합물 OBI-3424은 생체외 AKR1C3-의존적 세포독성 및 다양한 유형의 인간 암에서 생체내 항종양 활성을 보여주고, 이는 상이한 유형의 암을 치료하기 위해 사용될 수 있는 항암제로서 화합물 OBI-3424의 추가적인 개발을 뒷받침한다. AKR1C3은 암 환자의 병태를 분석하는 생체표지자로서 사용되고, 치료를 위해 화합물 OBI-3424을 선택하도록 환자에게 추가로 안내한다.
본 출원의 실시예 1은 고형 종양에서 AKR1C3 효소 및 AKR1C3 RNA 함량이 암세포에 대한 화합물 OBI-3424의 IC50 값에 대한 수학적 변환 후 양과 선형 상관관계가 있고 선형 상관계수가 충분히 높음을 확인하였고; 실시예 2와 실시예 3은 혈액 종양에서 AKR1C3 효소와 AKR1C3 RNA 함량이 암 세포에 대한 화합물 OBI-3424의 IC50 값에 대한 수학적 변환 후 양과 선형 상관관계가 있고 선형 상관계수는 충분히 높음을 확인하였다. 환자에 대한 약물의 치료적 효과는 IC50 값과의 연관성에 의해서만 직접적으로 확인될 수 있음이 당업자에게 잘 알려져 있다; 이론적으로 그리고 실제로, IC50 값이 낮을수록 환자에 대한 약물의 효능이 우수하다. 실시예 1 내지 실시예 3의 모든 실험 데이터는 IC50 값과 상관관계가 있는 것으로 객관적으로 측정될 수 있는 관련 생체 값을 검출하였고, 그 다음, 특정 암 환자에 대한 약물의 효능을 예측하였고, 표적화된 약물 전달을 달성하였다(사실상, 특정 환자의 종양 조직을 직접 채취한 후 암 세포 생존 조건 하에서 IC50 값을 검출하는 것이 가장 좋다. 이것이 가장 좋고 가장 직관적이고 정확하지만, 실제로 불가능하므로, IC50 값과 상관관계를 보여주기 위해서 객관적으로 측정될 수 있는 관련 생체 측정 값만이 검출될 수 있다.). 광범위한 검출 후, 본 출원은 고형 종양 및 혈액 종양에서 AKR1C3 효소 및 AKR1C3 RNA 함량이 암 세포에 대한 화합물 OBI-3424의 IC50 값과 선형 상관관계를 가질 뿐만 아니라 선형 상관계수가 충분히 높고, 이는 고형 및 혈액 종양에서 AKR1C3 효소 및 AKR1C3 RNA 함량이 암 세포에 대한 화합물 OBI-3424의 IC50 값과 높은 상관관계가 있음을 실증하기에 충분함을 확인하였다. 따라서, 실제 적용에서, 환자의 생체외 샘플의 AKR1C3 효소 함량과 AKR1C3 RNA 함량이 검출될 수 있고, 그 다음, 검출 결과에 따라 치료를 위해 화합물 OBI-3424가 환자에게 투여될 수 있다.
선행 기술에서, 웨스턴 블롯 또는 면역화학적 염색이 AKR1C3 효소 함량을 검출하기 위해 일반적으로 사용되지만, 선행 기술에서 AKR1C3 RNA 함량을 검출하기 위한 해당 검출 방법이 없다. 해당 검정이 AKR1C3 RNA 함량을 평가하기 위해 사용될 수 있다고 가정하면, 우수한 암 치료 효과를 달성하기 위해 AKR1C3 RNA 함량이 더 높고 프로드러그에 반응할 가능성이 가장 높은 환자가 선택되어 화합물 OBI-3424를 투여할 수 있다.
상기 목적에 기반하여, 실시간 형광 정량적 PCR 기술(qPCR)에 기반할 때, 본 발명은 AKR1C3 유전자의 발현을 검출하기 위해 RNA 역전사 반응, 중합효소 연쇄 반응 및 Taqman 프로브 기술을 채택하고, LDT(실험실 개발 시험) 시스템에 적용될 수 있는 인간 AKR1C3 유전자 발현의 해당 키트를 규명하고, 최종적으로는 임상 시험 샘플 동반 진단의 약물 검출을 위해 사용될 수 있다.
프라이머 및 프로브를 설계하기 위한 기본 원칙: 1) 프라이머-프로브의 길이: 각 프라이머의 길이는 15 내지 30개 염기이다. 2) 프라이머-프로브의 GC%는 30 내지 80% 범위이어야 하고, 프라이머의 Tm 값은 55 내지 60 ℃ 범위이다. 3) 프라이머-프로브 자체의 염기쌍 및 프라이머 사이의 3' 말단은 가능한 한 피해야 한다. 4) 프라이머-프로브 자체 및 프라이머 사이의 6개를 초과하는 연속적인 염기 쌍은 가능한 한 피해야 한다. 5) 업스트림 및 다운스트림 프라이머에 의해 증폭되는 표적 단편의 길이는 50 내지 180bp 범위이고, 프로브는 업스트림 및 다운스트림 프라이머 사이에 위치하되, 가능한 한 업스트림 프라이머에 근접하고, 프로브의 5' 말단에서 구아닌의 사용은 피해야 한다. 프로브의 어닐링 온도가 지나치게 낮은 경우, LNA 프로브 또는 MGB 프로브가 설계에 고려된다. 6) 선택된 프라이머 및 프로브는 AKR1C3 유전자의 발현을 특이적으로 검출할 수 있는 AKR1C3 유전자의 보존 영역에서 설계되어야 한다.
기술 원리: RNA 역전사 반응, 중합효소 연쇄 반응 및 Taqman 프로브 기술이 사용되어, AKR1C3 유전자 발현을 지시하는 특이적 프라이머 및 프로브를 설계한다. 표적 서열은 특이적 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭되고, 주형에 결합된 Taqman 프로브가 Taq 효소(5'→ 3' 엑소뉴클레아제 활성)에 의해 절단되고, 리포터가 소광체로부터 분리되어 형광 신호를 생성하고 축적한다. 형광 신호와 증폭 사이클 수의 관계에 따라 실시간 증폭 곡선이 수득될 수 있고, 그 다음, AKR1C3 RNA의 발현 수준에 대한 검출이 달성될 수 있다.
본 발명에서는 AKR1C3의 3개 표적 영역(각각 엑손 2-3, 4-5 및 5-6)에 대한 9쌍의 프라이머 및 프로브를 설계한다. 프라이머-프로브의 위치 정보는 도 1에서 알 수 있다. Beacon Designer 8.12 소프트웨어가 사용되어 프라이머-프로브 설계를 위한 기본 원칙과 일치하는 프라이머 품질 평가를 지원하고, NCBI 데이터베이스의 Blast 툴이 사용되어 프라이머-프로브 쌍 각각이 공통 SNP 부위없이 인간 유전자 서열을 특이적으로 증폭하도록 보장한다.
본 발명의 제1 측면은 하기 군 중 어느 하나로부터 선택된 프라이머-프로브 조성물을 제공한다:
(i) 업스트림 프라이머 AKR1C3-F1, 다운스트림 프라이머 AKR1C3-R1 및 프로브 AKR1C3-P1로, 여기서, 상기 업스트림 프라이머 AKR1C3-F1, 다운스트림 프라이머 AKR1C3-R1 및 프로브 AKR1C3-P1의 뉴클레오티드 서열이 각각 서열 번호:1, 서열 번호: 2 및 서열 번호: 3으로 표시되고;
(ii) 업스트림 프라이머 AKR1C3-F2, 다운스트림 프라이머 AKR1C3-R2 및 프로브 AKR1C3-P1로, 여기서 상기 업스트림 프라이머 AKR1C3-F2, 다운스트림 프라이머 AKR1C3-R2 및 프로브 AKR1C3-P1의 뉴클레오티드 서열은 각각 서열 번호: 4, 서열 번호: 5 및 서열 번호: 3으로 표시되고;
(iii) 업스트림 프라이머 AKR1C3-F2, 다운스트림 프라이머 AKR1C3-R6 및 프로브 AKR1C3-P1로, 여기서 상기 업스트림 프라이머 AKR1C3-F2, 다운스트림 프라이머 AKR1C3-R6 및 프로브 AKR1C3-P1의 뉴클레오티드 서열은 각각 서열 번호: 4, 서열 번호: 6 및 서열 번호: 3으로 표시되고;
(iv) 업스트림 프라이머 AKR1C3-F6, 다운스트림 프라이머 AKR1C3-R2 및 프로브 AKR1C3-P1로, 여기서 상기 업스트림 프라이머 AKR1C3-F6, 다운스트림 프라이머 AKR1C3-R2 및 프로브 AKR1C3-P1의 뉴클레오티드 서열은 각각 서열 번호: 7, 서열 번호: 5 및 서열 번호: 3으로 표시되고;
(v) 업스트림 프라이머 AKR1C3-F6, 다운스트림 프라이머 AKR1C3-R6 및 프로브 AKR1C3-P1로, 여기서 상기 업스트림 프라이머 AKR1C3-F6, 다운스트림 프라이머 AKR1C3-R6 및 프로브 AKR1C3-P1의 뉴클레오티드 서열은 각각 서열 번호: 7, 서열 번호: 6 및 서열 번호: 3으로 표시되고;
(vi) 업스트림 프라이머 AKR1C3-F5, 다운스트림 프라이머 AKR1C3-R5 및 프로브 AKR1C3-P2로, 여기서 상기 업스트림 프라이머 AKR1C3-F5, 다운스트림 프라이머 AKR1C3-R5 및 프로브 AKR1C3-P2의 뉴클레오티드 서열은 각각 서열 번호: 8, 서열 번호: 9 및 서열 번호: 10으로 표시되고;
(vii) 업스트림 프라이머 AKR1C3-F3, 다운스트림 프라이머 AKR1C3-R3 및 프로브 AKR1C3-P1로, 여기서 상기 업스트림 프라이머 AKR1C3-F3, 다운스트림 프라이머 AKR1C3-R3 및 프로브 AKR1C3-P1의 뉴클레오티드 서열은 각각 서열 번호: 11, 서열 번호: 12 및 서열 번호: 3으로 표시되고;
(viii) 업스트림 프라이머 AKR1C3-F4, 다운스트림 프라이머 AKR1C3-R3 및 프로브 AKR1C3-P2로, 여기서 상기 업스트림 프라이머 AKR1C3-F4, 다운스트림 프라이머 AKR1C3-R3 및 프로브 AKR1C3-P2의 뉴클레오티드 서열은 각각 서열 번호: 13, 서열 번호: 12 및 서열 번호: 10으로 표시되고;
(ix) 업스트림 프라이머 AKR1C3-F7, 다운스트림 프라이머 AKR1C3-R7 및 프로브 AKR1C3-P3으로, 여기서 상기 업스트림 프라이머 AKR1C3-F7, 다운스트림 프라이머 AKR1C3-R7 및 프로브 AKR1C3-P3의 뉴클레오티드 서열은 각각 서열 번호: 14, 서열 번호: 15 및 서열 번호: 16으로 표시된다.
본 발명은 상기 9개 군의 프라이머-프로브 조성물을 이용하여 AKR1C3 증폭을 실시하였고, 증폭 효율 및 특이도에 따라 후보 프라이머-프로브 조성물로서 프라이머-프로브 조성물의 9개 군으로부터 (iii), (iv) 및 (v) 군을 선택하였다. 최상의 프라이머-프로브 조성물을 결정하기 위해, 각각 (iii), (iv) 및 (v) 군으로부터 프라이머-프로브 조성물을 사용하여 상이한 샘플에서 추가적인 AKR1C3 증폭이 실시되었다. 증폭 효율에 따라, (iv) 군의 프라이머-프로브 조성물(업스트림 프라이머 AKR1C3-F6, 다운스트림 프라이머 AKR1C3-R2 및 프로브 AKR1C3-P1)이 최종적으로 본 발명의 최상의 프라이머-프로브 조성물로 결정되었다.
본 발명의 프라이머-프로브 조성물의 9개 군은 qPCR 방법에 의한 AKR1C3 RNA 함량의 검출을 위해서 뿐만 아니라 디지털 PCR 방법에 의한 AKR1C3 RNA 함량의 검출을 위해서도 사용될 수 있다. qPCR 방법과 디지털 PCR 방법에 의한 AKR1C3 RNA 함량의 검출 단계는 이하에 상세히 설명되어 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 프로브 AKR1C3-P1, AKR1C3-P2 및 AKR1C3-P3의 5'-말단 리포터는 FAM이고, 프로브 AKR1C3-P1, AKR1C3-P2 및 AKR1C3-P3의 3'-말단 소광체는 MGB이다.
본 발명의 구현을 위한 바람직한 프로브는 TaqMan 시스템에 따라 표지된 프로브이다. TaqMan 시스템은 제조업체 Life Technologies Inc.에서 입수할 수 있다. TaqMan 시스템에 따르면, 증폭된 표적 DNA에 혼성화하도록 특이적으로 설계된 올리고뉴클레오티드 프로브는 5'-말단에서 리포터에 공유 결합되고 3'-말단에서 소광체에 공유 결합된다. TaqMan 시스템에서 사용하기에 적합한 리포터의 예는 6-카복시플루오레세인(FAM) 또는 테트라클로로플루오레세인(TET)을 포함한다. 전형적인 소광체는 마이너 그루브 바인더(MGB)이다. 이 TaqMan 시스템의 원리는 소광체와 리포터의 위치가 프로브 상에서 서로 매우 근접하는 한, 소광체가 리포터의 형광을 억제한다는 것이다. qPCR 증폭 동안 올리고뉴클레오티드 프로브가 표적 DNA에 혼성화하면, 올리고뉴클레오티드 프라이머가 표적 DNA에 상응하는 DNA를 따라 연장되도록 효소가 만들기 때문에 Taq 중합효소에 의해 분해된다. 이 분해는 리포터와 소광체를 방출시키고 소광체는 더 이상 리포터에 매우 근접하지 않게 되므로, 리포터가 형광을 방출할 수 있게 되어, 전형적으로 qPCR 장비(예: 열 사이클러)에 통합된 적절한 툴에 의해 검출 및 측정될 수 있다.
동일한 발명 개념에 기반하여, 본 발명의 제2 측면은 전술한 바에 따른 프라이머-프로브 조성물을 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 전술한 바에 따른 키트는 참조 유전자의 프라이머-프로브 조성물을 추가로 포함하고; 참조 유전자의 프라이머-프로브 조성물은 업스트림 프라이머 ACTB-F1, 다운스트림 프라이머 ACTB-R1 및 프로브 ACTB-P1을 포함하고, 업스트림 프라이머 ACTB-F1, 다운스트림 프라이머 ACTB-R1 및 프로브 ACTB-P1의 뉴클레오티드 서열은 각각 서열 번호:17, 서열 번호: 18 및 서열 번호: 19로 나타난다.
유전자의 발현 수준을 측정하기 위해 qPCR 기술을 이용할 때, 표적 유전자의 절대 발현 수준이 자주 직접 측정되지는 않지만, 표적 유전자와 참조 유전자의 발현 수준이 각각 측정된다. 구체적으로, 표준물로서 참조 유전자의 발현 수준이 취해져서 표적 유전자의 상대 발현 수준을 측정한 다음, 샘플 간의 상대 발현 수준이 비교된다. 유전자의 발현 수준을 측정하기 위해 상대 정량법이 이용될 때, qPCR로 수득된 Ct 값은 선형 관계가 아닌 기하급수적 관계이다. 따라서, Ct 값은 t 테스트 및 분산 분석(ANOVA) 방법과 같이 데이터의 정규 분포를 요하는 통계 분석 방법을 위해 직접적으로 사용될 수는 없다. 따라서, 원래의 Ct 값을 우선 2-Ct으로 전환하여, 통계 분석 전에 데이터가 선형 관계에 도달하도록 해야 한다. 데이터가 상대 정량법으로 수득된 후, 데이터 분석을 위해 비교 CT 값 방법(2-ΔΔCt 방법)이 자주 사용된다. 이 방법은 두 가지 가정에 기반한다: ① 증폭 효율이 100%이다, 즉 각 PCR 사이클에서 산물의 양이 두 배가 되어, 증폭 효율의 검증에 의해 해결될 수 있다; ② 샘플의 로딩량 오차를 보정하기 위한 적절한 참조 유전자가 있다. 식에 따르면 배 변화(fold change)=2-ΔΔCt 계산; ΔΔCt=치료군의 (표적 유전자의 Ct - 참조 유전자의 Ct) - 대조군의 (표적 유전자의 Ct - 참조 유전자의 Ct). 계산 식에 따르면, 상대 정량법에서는 참조 유전자의 Ct 값없이 표적 유전자의 상대 발현이 계산될 수 없어, 참조 유전자가 매우 중요한 역할을 함을 시사한다.
참조 유전자는 연구 조건에 의해 영향을 받지 않는 발현 수준을 갖는 공지된 참조 유전자를 의미하고, 다수 샘플 중에서 일치되게 발현될 수 있고, 이 유전자의 발현 수준은 최초 물질의 로딩을 정확하게 정량화하기 위해 사용될 수 있다. 세포유지 유전자(housekeeping gene)의 발현 수준은 환경적 요인에 의해 덜 영향을 받고 생물체의 거의 모든 조직 및 다양한 성장 단계에서 연속적으로 발현될 수 있으므로, 세포유지 유전자가 실험에서 일반적으로 참조 유전자로서 사용된다.
참고문헌(DONG Enni, LIANG Qing, LI Li, 등, The Selection Of Reference Gene in Real-time Quantitative PCR [J]. China Animal Industry, 49(11):92-96. DOI:10.3969/j.issn.0258-7033.2013.11.025) 및 참고문헌(ZHAO Wen-Jing, XU Jie, BAO Qiu hua, 등, Selection of Reference Genes for Real-time Quantitative PCR [J]. Microbiology China, 2010(12):1825-1829. DOI:CNKI:SUN:WSWT.0.2010-12-019)에 따르면, q-PCR에 사용된 참조 유전자는 다음 표에 나와 있다.
참조 유전자의 경우, 4가지 유형의 참조 유전자: HPRT1(히포크산틴 포스포리보실 전달효소), GAP(글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소), ACTB(β-액틴으로도 알려짐) 및 GOLGA1(골지 단백질, 구체적으로 골지 자가항원 A1)가 본 발명에서 스크리닝되었다. 4가지 유형의 참조 유전자 각각에 상응하는 프라이머-프로브 조성물(표 1에 나타나 있음)이 사용되었고, 세포주 CCRF-CEM으로 검출되어 형광 강도 및 증폭을 평가하였다. 상이한 샘플(백혈병 환자의 건강한 혈액 샘플 및 골수 샘플을 포함함) 및 상이한 발현 수준을 갖는 세포주(AKR1C3 발현이 높은 세포주와 AKR1C3 발현이 낮은 세포주를 포함함)가 추가로 검출되어, 발현 안정성을 검증하고샘플 및 발현 수준이 높고 낮은 세포주가 구별될 수 있는지 여부를 검증했다. 검출된 결과는 다른 3개의 참조 유전자를 참조물로서 사용하는 것에 비해 ACTB를 참조물로서 사용함으로써 발현 수준이 높은 세포주 RPMI8226 및 CCRF-CEM이 발현 수준이 낮은 세포주 주르카트와 더 잘 구별될 수 있음을 보여주었다. 건강한 사람에서 상기 값이 상대적으로 낮은 수준으로 유지되는 반면, 백혈병 환자의 골수 RNA 샘플에서는 AKR1C3의 높은 발현 수준이 검출되었다. ACTB는 증폭 곡선의 결과에 기반하여 참조 유전자로서 선택되었다. 따라서, 상기 키트에서 참조 유전자의 프라이머-프로브 조성물은 업스트림 프라이머 ACTB-F1, 다운스트림 프라이머 ACTB-R1 및 프로브 ACTB-P1을 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 프로브 ACTB-P1의 5'-말단 리포터는 VIC(녹색 형광 단백질)이고, 프로브 ACTB-P1의 3'-말단 소광체는 BHQ1(Black Hole Quencher 1)이다.
스크리닝 후에 최종 결정된 최상의 AKR1C3 프라이머-프로브 조성물 및 참조 ACTB 프라이머-프로브 조성물이 표 1에 나타나 있다.
표 1 프라이머-프로브를 이용한 AKR1C3의 서열 정보표
참고문헌 1: Wu, X., Blackburn, P., Tschumper, R. 등 TALEN-mediated genetic tailoring as a tool to analyze the function of acquired mutations in multiple myeloma cells. Blood Cancer Journal 4, e210 (2014). https://doi.org/10.1038/bcj.2014.32에 개시된 해당 핵산 서열.
참고문헌 2: WO2018123764A1에 개시된 HPRT1 핵산 서열.
참고문헌 3: Werner Kempf, Marshall E. Kadin, Ann M. Dvorak, Carol C. Lord, Gunter Burg, Norman L. Letvin, Igor J. Koralnik, Endogenous retroviral elements, but not exogenous retroviruses, are detected in CD30-positive lymphoproliferative disorders of the skin, Carcinogenesis, Volume 24, Issue 2, February 2003, Pages 301-306, https://doi.org/10.1093/carcin/24.2.301에 개시된 해당 핵산 서열.
참고문헌 4: Stecker C, Johann A, Herzberg C, Averhoff B, Gottschalk G. Complete nucleotide sequence and genetic organization of the 210-kilobase linear plasmid of Rhodococcus erythropolis BD2. J Bacteriol. 2003;185(17):5269-5274. doi:10.1128/jb.185.17.5269-5274.2003에 개시된 해당 핵산 서열.
소스가 표시되지 않은 모든 서열은 신규 서열이거나 키트를 위해 신규하게 개발 또는 선택된 서열이다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 전술한 바에 따른 키트는 중합효소 혼합물을 추가로 포함하고, 중합효소 혼합물은 주로 DNA 중합효소, MgCl2, 버퍼 및 dNTP를 포함하고;
바람직하게, 상기 중합효소 혼합물은 KAPA PROBE FAST RT-PCR 마스터 믹스(2x)로서 선택되고, 이는 오랫동안 실험실에서 사용되어 왔고 양호한 증폭 효율을 갖는 것으로 반복적으로 검증되었다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 전술한 바에 따른 키트는 역전사효소 혼합물을 더 포함하고;
바람직하게, 상기 역전사효소 혼합물은 Superscript VILO 마스터 믹스이다.
각각의 PCR 반응에서, 양성 대조군과 음성 대조군(NC, 뉴클레아제 비함유 물)을 함께 검출 및 분석해야 한다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 전술한 바에 따른 키트는 음성 대조군 및 양성 대조군을 더 포함하고;
바람직하게, 상기 음성 대조군(NC)은 뉴클레아제 비함유 물이고/이거나;
바람직하게, 상기 양성 대조군은 공지된 카피 수를 갖는 참조물이다.
전술한 바에 따른 키트는 qPCR을 실시하기 위해 필요한 요소, 예를 들어 당업자에게 알려진 시약을 더 포함할 수 있다. 프라이머 쌍 및 프로브 이외에, 키트는 qPCR 반응에 사용되는 하나 이상의 효소(Taq 중합효소) 또는 시약을 더 포함할 수 있다. 효소는 동결건조된 형태로 또는 적합한 버퍼에 존재할 수 있다. 또한, 키트는 qPCR을 실시하기 위해 필요한 모든 추가적인 요소, 예컨대 버퍼, 추출 시약, 효소, 피펫, 플레이트, 핵산, 여과지, 겔 물질, 전달 물질, 자가방사 장비, 지침서(관련 작업 방법의 기록) 등을 포함할 수 있다.
동일한 발명 개념에 기반하여, 본 발명의 제3 측면은 암 치료를 위한 약물의 제조에 있어서 전술한 바에 따른 프라이머-프로브 조성물 또는 키트의 용도를 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 환자의 생체외 샘플에서 AKR1C3 RNA 함량은 전술한 바에 따른 프라이머-프로브 조성물 또는 키트를 사용함으로써 수득되고;
소정의 함량 이상의 AKR1C3 RNA 함량을 갖는 환자에게 AKR1C3 활성화된 항암 약물을 투여한다.
따라서, 본 발명은 암으로 고통받는 환자를 치료하기 위한 방법을 제공하되, 상기 방법은
전술한 바에 따른 프라이머-프로브 조성물 또는 키트를 사용함으로써 환자의 생체외 샘플에서 AKR1C3 RNA 함량을 수득하는 것;
소정의 함량 이상의 AKR1C3 RNA 함량을 갖는 환자에게 AKR1C3 활성화된 항암 약물을 투여하는 것을 포함하고; 바람직하게, 화합물 OBI-3424, OBI-3423 및 OBI-2870의 치료적 유효량이 환자에게 투여된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, AKR1C3 RNA 함량은 AKR1C3 카피 수/참조 유전자 카피 수의 비에 따라 수득되어, 예를 들어, AKR1C3 카피 수/ACTB 카피 수의 비가 계산되고, AKR1C3 카피 수/ACTB 카피 수의 비가 > X인 경우, AKR1C3의 발현이 높은 것으로 결정되고, 환자에게 치료적 유효량의 화합물 OBI-3424, OBI-3423 및 OBI-2870이 제공될 것이다; AKR1C3 카피 수/ACTB 카피 수의 비가 ≤ X인 경우, AKR1C3의 발현이 낮은 것으로 결정되고, 환자에게 치료적 유효량의 화합물 OBI-3424, OBI-3423 및 OBI-2870이 제공되지 않을 것이지만, 다른 항암 약물이 환자에게 투여될 수 있다.
소정의 함량 X의 값은 다수의 샘플을 검출함으로써 결정되어야 한다. 다수의 임상 시험 샘플에 따라 통계적 방법을 거쳐, 본 발명자는 소정의 함량 X는 0.0001 내지 1이고; 더 바람직하게, 소정의 함량 X는 0.00011 내지 0.5이고; 더욱 더 바람직하게, 소정의 함량 X는 0.00013 내지 0.05이고; 특히 바람직하게, 소정의 함량 X는 0.00014 내지 0.015인 것으로 최종적으로 결정하였다. 예를 들어, 소정의 함량 X는 0.0001 내지 0.0005, 0.0001 내지 0.001, 0.0001 내지 0.005, 0.0001 내지 0.01, 0.0001 내지 0.05, 0.0001 내지 0.1, 0.0001 내지 0.5, 0.0001 내지 0.9, 0.00011 내지 0.0005, 0.00011 내지 0.001, 0.00011 내지 0.005, 0.00011 내지 0.01, 0.00011 내지 0.05, 0.00011 내지 0.1, 0.00011 내지 0.5, 0.00011 내지 1, 0.00013 내지 0.0005, 0.00013 내지 0.001, 0.00013 내지 0.01, 0.00013 내지 0.05, 0.00013 내지 0.1, 0.00013 내지 0.5, 0.00013 내지 1, 0.0005 내지 0.001, 0.0005 내지 0.005, 0.0005 내지 0.01, 0.0005 내지 0.05, 0.0005 내지 0.1, 0.0005 내지 0.5, 0.0005 내지 1, 0.00091 내지 0.001, 0.00091 내지 0.05, 0.00 091 내지 0.1, 0.00091 내지 0.5, 0.00091 내지 1, 0.001 내지 0.005, 0.001 내지 0.01, 0.001 내지 0.05, 0.001 내지 0.1, 0.001 내지 0.5, 0.001 내지 1, 0.005 내지 0.01, 0.005 내지 0.05, 0.005 내지 0.1, 0.005 내지 0.5, 0.005 내지 1, 0.01 내지 0.05, 0.01 내지 0.1, 0.01 내지 0.5, 0.01 내지 1, 0.05 내지 0.1, 0.05 내지 0.5 또는 0.05 내지 1이다; 더 바람직하게, 소정의 함량 X는 0.0001, 0.00011, 0.00012, 0.00013, 0.00014, 0.00015, 0.000156, 0.00016, 0.000163, 0.000165, 0.00017, 0.000177, 0.00018, 0.000181, 0.00019, 0.000195, 0.0002, 0.000201, 0.000216, 0.000221, 0.00023, 0.000239, 0.00025, 0.00029, 0.0003, 0.00035, 0.0004, 0.00045, 0.0005, 0.00054, 0.0006, 0.00065, 0.0007, 0.00075, 0.0008, 0.00085, 0.0009, 0.00095, 0.001, 0.0015, 0.00177, 0.002, 0.00238, 0.0025, 0.00266, 0.00296, 0.003, 0.00315, 0.0035, 0.004, 0.0045, 0.005, 0.0055, 0.006, 0.0065, 0.00679, 0.007, 0.00710, 0.0075, 0.00778, 0.00791, 0.008, 0.0085, 0.009, 0.00939, 0.0095, 0.01, 0.011, 0.012, 0.01207, 0.013, 0.01365, 0.014, 0.015, 0.016, 0.017, 0.018, 0.019, 0.02, 0.025, 0.03, 0.035, 0.04, 0.045, 0.05, 0.055, 0.06, 0.065, 0.07, 0.075, 0.08, 0.085, 0.09, 0.095, 0.1, 0.15, 0.2, 0.25, 0.3, 0.35, 0.4, 0.45, 0.5, 0.55, 0.6, 0.65, 0.7, 0.75, 0.8, 0.85, 0.9, 0.95 또는 1이다.
동일한 발명의 개념에 기반하여, 본 발명의 제4 측면은 다음 단계를 포함하는, AKR1C3 RNA 함량을 검출하기 위한 방법을 제공한다:
(1) 검출하려는 생체외 샘플의 RNA를 추출하고, 추출된 RNA를 역전사 시스템에 첨가하고, 상기 추출된 RNA는 역전사되어 cDNA를 합성하는 단계;
(2) 전술한 바에 따른 프라이머-프로브 조성물 또는 키트를 사용하여 주형으로서 cDNA로 qPCR 또는 디지털 PCR 증폭을 실시하는 단계;
(3) qPCR 또는 디지털 PCR 증폭 결과에 따라 검출하려는 생체외 샘플의 AKR1C3 RNA 함량을 수득하는 단계.
본 발명의 AKR1C3 RNA 함량을 검출하기 위한 방법의 방법론적 원리: 첫째, 샘플 RNA는 cDNA로 역전사되고, 그 다음 cDNA는 특이적 프라이머 및 프로브에 의해 증폭되고, 여기서 AKR1C3 유전자 및 참조 유전자는 각각 FAM 및 VIC 신호로 표시되고; 그리고 말초 혈액 RNA 샘플에서 AKR1C3 유전자의 정량적 발현 수준은 샘플 및 품질 관리 제품별로 계산된다. 동시에, AKR1C3 반응 용액에서의 VIC 신호는 샘플 품질을 모니터링하기 위해 사용된다.
본 발명에서 qPCR과 디지털 PCR의 두 방법이 이용되어 충분한 샘플의 조건 하에서 동시에 비교 실험을 수행한다. 동일한 프라이머-프로브 세트가 디지털 PCR 및 qPCR에 사용된다. 첫째, qPCR의 온도 구배가 이용되어 프라이머-프로브를 최적화하고, 가장 적절한 온도와 프라이머-프로브 조성물이 정량적 표준물질을 위한 디지털 PCR 플랫폼에 대해 비교 방법으로서 선택된다.
디지털 PCR의 검출 프로세스는 두 파트, 즉, PCR 증폭 및 형광 신호 분석을 포함한다. PCR 반응 전에, 샘플은 수만 유닛(반응 챔버)로 나뉘어져서, 단일 DNA 분자만이 각 유닛에 존재한다. 디지털 PCR의 증폭 절차 및 증폭 단계 시스템은 기본적으로 일반 PCR의 경우와 동일하지만, 전통적인 qPCR 방법과 다르고, 디지털 PCR은 정량적 분석을 위해 직접 계수 방법을 채택하여, 즉, PCR 증폭의 종료 후, 형광 신호(산물)가 존재하면 1로 표지되고, 형광 신호(산물)가 존재하지 않으면 0으로 표지된다. 형광 신호가 있는 반응 유닛은 표적 분자의 적어도 하나의 카피를 함유한다. 이론적으로, 샘플 내 표적 DNA의 농도가 매우 낮은 경우, 형광 신호를 갖는 반응 유닛의 수는 표적 DNA 분자의 카피 수와 동일하다. 그러나, 정상적인 상황에서 디지털 PCR의 반응 유닛은 둘 이상의 표적 분자를 함유할 수 있고, 이는 포아송 분포로 계산될 수 있다.
상기 식에서, λ는 각 반응 유닛에 함유된 표적 DNA 분자의 평균 카피 수(농도)이고, p는 특정 λ 조건 하에서 각 반응 유닛에 함유된 표적 DNA 분자의 k 카피의 확률이다. λ는 λ=cm인 샘플 용액의 희석 계수 m에 의해 결정되고, 여기서 c는 샘플의 원래 카피 수(농도)이다. k=0일 때(표적 DNA 분자가 없는 경우) 상기 식은 p=e -λ =e -cm 로 단순화될 수 있고, p는 반응 유닛의 총 수에 대하여 형광 신호가 없는 반응 유닛 수의 비, 즉, 다음으로 간주될 수 있다
상기에서 n은 반응 유닛의 총 수이고 f는 형광 신호가 있는 반응 유닛의 수이다. 상기 식의 양 변에 로그(ln)를 취하여 다음을 수득한다
샘플의 최초 카피 수(농도)는 디지털 PCR의 반응 유닛의 총 수와 형광 신호가 있는 유닛의 수 뿐만 아니라 샘플의 희석 계수로부터 수득될 수 있다. 디지털 PCR의 정량 방법은 증폭 곡선의 순환 임계값에 의존하지 않아, 증폭 효율의 영향을 받지 않고 표준 곡선을 사용할 필요가 없다. 이는 양호한 정확도 및 재현가능성을 갖고, 절대 정량 분석이 달성될 수 있다.
본 발명에서, 디지털 PCR의 특이적 반응 시스템은 다음과 같은 점에서 qPCR의 특이적 반응 시스템과는 다르다: qPCR 반응 시스템에서, (i) 내지 (ix) 군으로부터 선택된 프라이머-프로브 조성물의 군이 참조 유전자 ACTB의 프라이머-프로브 조성물과 혼합된다; 반면, 디지털 PCR 반응 시스템에서는 샘플과 세포주에서 AKR1C3와 ACTB의 발현 수준의 차이가 크기 때문에 Ct의 최대 차이는 10 Ct 값에 도달할 수 있다. 따라서, VIC의 카피 수는 디지털 PCR 검출 동안 FAM의 카피 수보다 훨씬 클 수 있다. 이러한 점을 고려하여, (i) 내지 (ix) 군으로부터 선택된 프라이머-프로브 조성물의 군은 참조 유전자 ACTB의 프라이머-프로브 조성물과 혼합되지 않지만, AKR1C3 디지털 PCR 검출 시스템 및 참조 유전자 디지털 PCR 검출 시스템이 AKR1C3 및 참조 유전자 각각의 증폭을 위해 사용된다.
PCR 증폭 결과는 반응 시스템의 다양한 요인(프라이머 농도, 프로브 농도 등) 및 증폭 절차의 변화에 영향을 받는다. 최고의 증폭 효율 및 최소의 비특이적 산물을 수득하기 위해 본 출원은 다년간의 연구개발 경험에 기반하여 디지털 PCR 및 qPCR의 반응 시스템 및 증폭 절차를 결정한다. 프로브-프라이머 선택과 조합하여, 표준 곡선의 상관계수가 0.98 이상이 되도록 보장하고, E 값(증폭 효율)이 85% 내지 110%이다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 단계 (3)에서, qPCR 또는 디지털 PCR 증폭 결과에 따라 검출하려는 생체외 샘플의 AKR1C3 RNA 함량을 수득하기 위한 단계는 다음을 포함한다:
(A) 각각 qPCR 또는 디지털 PCR 증폭 결과에 따라 검출하려는 생체외 샘플의 AKR1C3 및 참조 유전자의 카피 수를 수득하는 것;
(B) AKR1C3 카피 수/참조 유전자 카피 수의 비를 계산하여, 검출하려는 생체외 샘플의 AKR1C3 RNA 함량을 수득하는 것.
qPCR 방법이 사용되는 경우, 단계 (A)는 다음을 더 포함한다:
(A1) AKR1C3의 Ct 값 및 최초 카피 수 lg 값의 표준 곡선 및 참조 유전자의 Ct 값 및 최초 카피 수 lg 값의 표준 곡선을 각각 플롯팅하는 것;
(A2) 표준 곡선에 따라, AKR1C3 및 참조 유전자의 검출된 Ct 값에 의해 검출하려는 생체외 샘플의 AKR1C3 및 참조 유전자의 카피 수를 각각 수득하는 것(소프트웨어에 의해 자동 계산될 수 있음).
디지털 PCR과 qPCR 간의 또 다른 차이점은 검출하려는 생체외 샘플의 AKR1C3과 참조 유전자의 카피 수는 표준 곡선에 따라 qPCR에 의해 수득되는 한편, 검출하려는 생체외 샘플의 AKR1C3 및 참조 유전자의 카피 수는 표준 곡선의 플롯팅 없이 증폭 결과에 따라 디지털 PCR에 의해 직접 수득될 수 있다.
표적 유전자 AKR1C3의 Ct 값 및 참조 유전자의 Ct 값이 해석되어야 한다. 표적 유전자 AKR1C3의 Ct 값은 표적 유전자 AKR1C3의 증폭 신호(FAM 신호)에 해당하는 Ct 값이다. 참조 유전자의 Ct 값은 참조 유전자의 증폭 신호(VIC 신호)에 해당하는 Ct 값이다. 기하급수적인 증폭 단계 동안에 FAM 및 VIC의 임계값이 설정된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 방법은 혈액 샘플, 골수 샘플 또는 조직 샘플 내 AKR1C3 RNA 함량을 검출하기 위해 사용된다. 본 발명의 디지털 PCR 및 qPCR은 전처리 프로세스(예: RNA 추출 프로세스)가 상이한 점을 제외하고는 혈액 샘플 또는 골수 샘플을 검출할 뿐만 아니라 고형 종양의 조직 샘플도 검출할 수 있다. 예를 들어, 혈액 샘플의 경우, RNA 추출은 Qiagen 구성 추출 키트를 사용하여 직접 실시될 수 있다; 골수 샘플 또는 조직 샘플의 경우, 유발은 액체 질소로 사전 냉각될 수 있고, 골수 샘플 또는 조직 샘플은 유발에서 분말로 분쇄되고, 건조된 조직 분말은 1.5 ml EP 시험관에 넣은 다음, 추출을 위해 RNA 추출 키트가 사용된다.
본 출원에서는 상기 키트 및 검출 방법에 대하여 성능 테스트를 수행하였으며, 테스트 결과는 다음과 같다:
1. 최소 검출 한계: 검출하려는 샘플로 사용된 낮은 발현 세포주의 구배 희석에 의해 최소 검출 한계가 결정되었고 10회 반복되었으며, 검출 결과는 100% 일치하였다;
2. 정밀도: 상이한 시간, 장비 및 실험자에 의한 검출을 반복했고 CV 값 < 15%;
3. 양성 일치율: 공지된 양성 샘플과 표준 곡선은 qPCR에 의해 검출되었고 검출 결과는 100% 일관되었고, 표준 곡선의 E 값은 90% 내지 110%였고 R2는 ≥0.98였다;
4. 음성 일치율: 공지된 음성 샘플은 qPCR에 의해 검출되었고 검출 결과의 일관된 검출률은 100%였다;
5. 상이한 로딩 주형 양: 각각 로딩량의 범위를 검증하기 위한 역전사의 시작량으로 공지된 음성 및 양성 샘플의 RNA 200ng 및 10ng가 선택되었고, 검출 결과의 일관된 검출률은 100%였다;
6. 분석 특이도: 음성 참조물의 2가지 농도가 선택되었고, 각 농도 수준이 3회 반복되었고, 100% 음성률을 가졌다;
7. 실제 샘플 검출: 실제 샘플 검출을 위해 8개의 정상 말초 혈액 RNA 샘플이 선택되었고, 검출 결과의 일치율은 100%였다.
최소 검출 한계, 정밀도, 음성 일치율, 양성 일치율, 주형 양, 분석 특이도 및 실제 샘플 검출의 성능 검증을 통해, 7가지 성능 모두가 검증 표준을 충족하였다. 검출 방법의 성능은 임상 적용의 요건을 충족하였고, 임상 샘플 검출을 위해 사용될 수 있다.
동일한 발명 개념에 기반하여, 본 발명의 제5 양태는 AKR1C3 효소의 발현 수준을 검출하기 위한 방법을 제공하고, 여기서 상기 방법은 검출하려는 생체외 샘플의 AKR1C3 RNA 함량을 검출하고, 그 다음, 상기 검출하려는 생체외 샘플의 AKR1C3 RNA 함량에 따라, 검출하려는 생체외 샘플의 AKR1C3 효소의 발현 수준이 수득된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 검출하려는 생체외 샘플의 AKR1C3 RNA 함량 과 검출하려는 생체외 샘플의 AKR1C3 효소의 발현 수준 사이에 선형 상관관계가 있다.
선행 기술에서, 화합물 OBI-3424, OBI-3423 및 OBI-2870의 투여는 일반적으로 AKR1C3 환원효소 함량이 소정의 함량 이상인지 여부에 기반하여 판단되고, 본 발명의 실시예 4는 AKR1C3 효소의 발현 수준은 AKR1C3 RNA의 발현 수준과 높은 상관관계를 가짐을 증명한다. 따라서, 실제 적용에서, AKR1C3 효소 함량은 상기 방법으로 측정된 AKR1C3 RNA 함량에 따라 계산될 수 있고, 그 다음, 화합물 OBI-3424, OBI-3423 및 OBI-2870의 투여는 AKR1C3 효소 함량이 소정의 함량에 도달하는지 여부에 기반하여 판단된다.
본 발명에 의해 제공되는 기술적 구현예는 하기 실시예에서 더 설명된다. 하기 실시예는 단지 본 발명을 설명하기 위해 사용되며 본 발명의 보호 범위를 제한하지 않는다.
하기 실시예에서 사용된 AKR1C3 활성화된 항암 프로드러그 OBI-3424(AST-3424 또는 TH-3424로도 지칭됨)의 합성 방법은 WO2017087428A1호 또는 CN108290911A호에서 볼 수 있다.
실시예 1. 간암 세포주 및 비소세포폐암(NSCLC) 세포주에서 IC50 값을 갖는 AKR1C3 단백질 수준과 RNA 수준 사이의 상관관계
1. 실험 재료 및 방법
1.1 세포주
모든 인간 암 세포주는 American Type Culture Collection(ATCC, 매너새스, 버지니아주) 또는 Japanese Collection of Research Bioresources(JCRB, 오사카, 일본) 또는 Cobioer Biosciences(난징, 중국)로부터 입수했다.
1.2 생체외 증식 검정 방법
기하급수적으로 성장하는 세포가 접종되었다. 24시간 후, 테스트 화합물 OBI-3424가 첨가되었다. 테스트 화합물 OBI-3424의 첨가 후, 플레이트는 지정된 시간 동안 표준 조직 항온처리기에서 37 ℃로 항온처리되었다. 실험 종료 시, CellTiter Glo(CTG) 검정 키트 또는 AlamarBlue를 사용하여 생존 가능한 세포가 검출되었다. 미처리 대조군에 비해 50% 성장 억제를 초래한 약물 농도(IC50)는 XLfit(IDBS, 보스톤, 매사츄세츠주) 또는 Prism 6(GraphPad, 샌디에고, 캘리포니아주)을 사용하여 계산되었다.
1.3 웨스턴 블롯
인간 세포 추출물이 준비되었고, 단백질 농도가 결정되었다. 인간 AKR1C3 및 튜불린 또는 β-액틴을 인식하는 항체를 사용하여 단백질이 검출되었다. Odyssey Laser Imaging Systems and software(LI-COR Biosciences, 링컨, 네브래스카주) 또는 UVP ChemStudio imaging system and VisionWorks software(Analytik Jena AG)가 사용되어 AKR1C3 및 튜불린 또는 β-액틴의 밴드 밀도를 스캔하고 정량화했으며, 튜불린 또는 β-액틴에 대한 AKR1C3의 비가 계산되었다.
2. 실험 결과
간세포 암종 세포주를 96시간 동안 화합물 OBI-3424에 노출하고 NSCLC 세포주를 72시간 동안 화합물 OBI-3424에 노출한 후, IC50 값은 생체외 증식 검정에 의해 결정되었고, 간세포 암종 세포주에서 AKR1C3 단백질의 발현은 웨스턴 블롯에 의해 결정되었다(튜불린이 로딩 대조군으로 사용되었다). 간세포 암종 세포주 및 NSCLC 세포주에서 AKR1C3 RNA의 발현 데이터는 CrownBio 데이터베이스(https://db.crownbio.com/Crownbio/OncoExpress_Login.aspx)에서 입수되었다. 결과는 표 2와 표 3에 나타내었다.
표 2. 96시간 노출 후 인간 간세포 암종 세포주 군에 대한 OBI-3424의 세포독성
표 3. 72시간 노출 후 비소세포폐암(NSCLC) 세포주 군에 대한 OBI-3424의 세포독성
표 2 및 표 3에 나타낸 바와 같이, 단백질 및 RNA 수준 둘 모두에서 AKR1C3 발현이 높은 간세포 암종 세포주는 OBI-3424에 대해 더 민감했고, 여기서 IC50 값은 낮은 나노몰 범위이었다. 한편, AKR1C3 발현이 낮은 세포는 OBI-3424에 대해 덜 민감했고, IC50 값이 1000 nM보다 높았다. 유사하게, NSCLC 세포는 또한 NSCLC 세포를 화합물 OBI-3424에 72시간 동안 노출시킨 후 AKR1C3-의존적 세포독성 특성을 보였다(표 3). 간세포에서 3424 IC50은 AKR1C3 단백질 수준과 높은 상관관계를 보였고(R2=0.71, 도 1, 좌측), 간세포에서 3424 IC50은 AKR1C3 RNA의 발현 수준과 높은 상관관계를 보였고(R2=0.87, 도 1, 가운데), NSCLC에서 3424 IC50은 AKR1C3 RNA의 발현 수준과 높은 상관관계를 보였다(R2=0.80, 도 1, 우측). 이들 결과는 간세포주 및 NSCLC 세포주에서 3424-매개된 세포독성이 AKR1C3의 발현 수준과 높은 상관관계가 있음을 보여주었다.
실시예 2. 백혈병 세포주에서 AKR1C3 단백질 수준과 IC50 값 사이의 상관관계
1. 실험 재료 및 방법
1.1 세포주 및 PDX 생체외 연구
모든 세포주는 HD Biosciences에서 입수되었다. 모든 실험 작업은 각 임상시험 심의위원회와 각 기관의 동물윤리위원회의 승인 하에 수행되었고, 인간 관련 조직 샘플의 사용은 실험이 이루어지는 장소의 윤리적 및 관련 법규에 따랐다. 다른 곳에서 기술된 바와 같이(Lock RB, Liem N, Farnsworth ML, Milross CG, Xue C, Tajbakhsh M, 등 The nonobese diabetic/severe combined immunodeficient (NOD/SCID) mouse model of childhood acute lymphoblastic leukemia reveals intrinsic differences in biologic characteristics at diagnosis and relapse. Blood 2002; 99:4100-8.), 20 내지 25g 암컷의 비-비만/SCID(NOD.CB17-Prkdcscid/SzJ, NOD/SCID) 또는 NOD/SCID/IL2 수용체 γ-음성(NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJAusb, NSG)에서 이전에 규명된 연속적인 PDX가 실험에서 사용되었다. 렌티바이러스-형질도입된 ALL-11 PDX[빈 벡터(EV) 및 AKR1C3 과발현]의 개발은 이전에 기술된 바 있다(Jamieson SM, Gu Y, Manesh DM, El-Hoss J, Jing D, Mackenzie KL, 등 A novel fluorometric assay for aldo-keto reductase 1C3 predicts metabolic activation of the nitrogen mustard prodrug PR-104A in human leukaemia cells. Biochem Pharmacol 2014; 88:36-45.).
1.2 생체외 세포독성 검정
백혈병 세포주는 FBS(Biosera)로 보충된 RPMI 배지에 현탁된 반면, ALL PDX 세포는 Flt-3 리간드(20ng/mL, BioNovus Life Sciences) 또는 IL7(10 내지 20ng/mL, Jomar Life Research)로 보충된 QBSF 배지(Quality Biological Inc.,)에서 배양되었다. 세포는 최적의 세포 밀도에 따라 접종되었고, 3시간 또는 하룻밤(37 ℃, 5% CO2) 동안 항온처리되었다. PDX 세포 및 백혈병 세포주는 OBI-3424(10mmol/L 내지 1pmol/L) 또는 배지 대조군으로 각각 48시간 또는 72시간 동안 처리했다. 생존도는 Alamar Blue 환원 검정 또는 Cell Titer-Glo Luminescent Cell Viability Assay(Promega)를 사용하여 결정되었다. 반수 최대 억제 농도(IC50)가 사용되어 GraphPad Prism 7 소프트웨어로 비선형 회귀 곡선의 보간을 계산했다.
1.3 웨스턴 블롯
동결보존된 백혈병 세포가 해동되었고 RIPA 용해 버퍼에서 용해되었고, 단백질 농도는 BCA 검정으로 정량화되었다. NuPAGE 4 내지 12% Bis-Tris 단백질 겔 중 20 μg의 단백질 용해물을 사용하여 각 샘플이 로딩되었고, 그 다음 120V에서 전기영동된 후 30V에서 1시간 동안 폴리비닐렌디플루오라이드 멤브레인으로 이동되었다. 멤브레인을 탐침하기 위해 마우스 항-AKR1C3(#A6229, Sigma-Aldrich, 세인트 루이스, 미주리주) 또는 토끼 항-액틴 일차 항체(#A2066, Sigma-Aldrich)가 사용되었고, 이 후 호스래디쉬 퍼옥시다제 접합된 항-마우스 또는 항-토끼 IgG 이차 항체(GE Healthcare, 버킹엄, 영국)이 사용되었다. BioRad Chemidoc 터치 영상화 시스템에서 신호를 정량함으로써 접합된 이차 항체를 검출하기 위해 Immobilon Western chemiluminescent HRP 기질(Merck Millipore, 빌레리카, 매사츄세츠주)이 사용되었다.
2. 실험 결과
AKR1C3-관련된 OBI-3424의 생체외 세포독성은 T-ALL 세포주 11가지 유형, 과립구-집락 자극 인자로 형질감염된 B-ALL 세포주 1가지 및 BCP-ALL 세포주 1가지에서 관찰되었다. AKR1C3 단백질의 발현 수준은 웨스턴 블롯 분석으로 결정되었다. CellTiter-Glo 검정을 사용하여 OBI-3424의 생체외 세포독성이 결정되었고 50% 최대 억제 농도(IC50)로 계산되었다.
높은(강한) 수준의 AKR1C3을 발현하는 6가지 유형의 세포주에서 생체외 세포독성은 OBI-3424에 의해 증명되었고 IC50는 3.0 내지 30.0 nM 범위이었다. 중간 정도의 AKR1C3 발현 수준을 갖는 세포주의 경우, IC50는 3.0 내지 84.0 nM 범위이었다(표 4).
표 4. ALL 세포주에서 OBI-3424의 AKR1C3-의존적 생체외 세포독성
OBI-3424의 잠재적 항백혈병 활성을 평가하기 위해 다양한 백혈병 세포주에 대하여 생체외 세포독성 검정이 실시되었다. OBI-3424는 T-ALL, B-ALL, 급성 골수성 백혈병, 급성 전골수성 백혈병(APL) 및 적백혈병을 치료할 수 있음이 증명되었다. OBI-3424는 특히 AKR1C3 발현이 높은 T-ALL(T-계열 급성 림프구성 백혈병)로부터 유래된 세포주에서 강력한 세포독성을 보였으며, 여기서 IC50 값은 낮은 nmol/L 범위였다(표 5 참조). 높은/중간 AKR1C3 발현이 있는 세포주와 낮은 발현이 있는 세포주 사이의 IC50 값의 차이는 통계적으로 유의했다(P=0.0016).
표 5. 72시간 동안 OBI-3424을 백혈병 세포주에 노출한 후 백혈병 세포주에 대한 OBI-3424의 생체외 세포 독성
AKR1C3 발현은 웨스턴 블롯에 의해 대조 β-튜불린 발현에 상대적으로 평가되었다: 높음, AKR1C3/β-튜불린 >5.0; 중간, AKR1C3/β-튜불린은 2.0 내지 5.0임; 낮음, AKR1C3/β-튜불린 <2.0.
백혈병 세포주로부터 수득된 결과와 유사하게, OBI-3424는 모든 백혈병 세포주에 대해 강력한 세포 사멸 효과를 발휘했다. 도 2a는 6가지 유형의 B-ALL 세포주에 대하여 OBI-3424의 세포독성을 보여주었고, 도 2b는 7가지 유형의 T-ALL 세포주에 대하여 OBI-3424의 세포독성을 보여주었다. 도 2a 및 도 2b로부터, OBI-3424의 AKR1C3-의존적 활성화가 DNA 알킬화 시약임을 알 수 있다. 또한, 도 2c에 나타난 바와 같이, 10 nmol/L 농도의 OBI-3424에서 AKR1C3 단백질 발현은 18가지 유형의 ALL PDX의 생체외 세포 생존율과 유의한 음의 상관관계를 보여주었다(r=-0.53, P=0.023). 유사하게, 도 2d에 나타난 바와 같이, 100 nmol/L 농도의 OBI-3424에서 AKR1C3 단백질 발현은 18가지 유형의 ALL PDX의 생체외 세포 생존율과 유의한 음의 상관관계를 보여주었다(r=-0.56, P=0.015).
실시예 3. 백혈병 세포주에서 AKR1C3 RNA 수준과 IC50 값 사이의 상관관계
혈액 암 세포주를 화합물 OBI-3424에 72시간 동안 노출시킨 후, IC50 값은 생체외 증식 검정에 의해 결정되었다. 혈액암 세포주에서 AKR1C3 RNA의 발현 데이터는 CrownBio 데이터베이스 (https://db.crownbio.com/Crownbio/OncoExpress_Login.aspx)에서 입수했다. 그 결과는 표 6에 나타나 있다.
표 6. 72시간 노출 후 인간 혈액 암 세포주 군에 대한 AST-3424의 세포독성
도 3d에 나타난 바와 같이, 상기 표 6에서 AKR1C3 RNA(Log2 FPKM) 및 IC50(nM)의 발현 수준은 곡선 그래프로 플롯팅되었다. AKR1C3 RNA 발현 수준의 대수 변환 값 Log2 FPKM과 IC50 사이의 곡선 정합이 실시되어 해당 곡선 정합 공식을 수득하였다. 상관 계수 R2=0.7889는 AKR1C3 RNA의 발현 수준이 IC50 값과 유의한 선형 상관관계를 가짐을 보여준다.
실시예 4. 백혈병 세포주에서 AKR1C3 단백질 수준과 AKR1C3 RNA 수준 사이의 상관관계
1. 실험 재료 및 방법
1.1 세포주 및 PDX 생체외 연구
모든 세포주는 HD Biosciences에서 구입하였다. 모든 실험 작업은 각 임상시험 심의위원회와 각 기관의 동물윤리위원회의 승인 하에 수행되었다. 다른 곳에서 기술된 바와 같이(Lock RB, Liem N, Farnsworth ML, Milross CG, Xue C, Tajbakhsh M, 등 The nonobese diabetic/severe combined immunodeficient (NOD/SCID) mouse model of childhood acute lymphoblastic leukemia reveals intrinsic differences in biologic characteristics at diagnosis and relapse. Blood 2002; 99:4100-8.), 20 내지 25g 암컷의 비-비만/SCID(NOD.CB17-Prkdcscid/SzJ, NOD/SCID) 또는 NOD/SCID/IL2 수용체 γ-음성(NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJAusb, NSG)에서 이전에 규명된 연속적인 PDX가 실험에 사용되었다. 렌티바이러스-형질도입된 ALL-11 PDX[빈 벡터(EV) 및 AKR1C3 과발현]의 개발은 이전에 기술된 바 있다(Jamieson SM, Gu Y, Manesh DM, El-Hoss J, Jing D, Mackenzie KL, 등 A novel fluorometric assay for aldo-keto reductase 1C3 predicts metabolic activation of the nitrogen mustard prodrug PR-104A in human leukaemia cells. Biochem Pharmacol 2014; 88:36-45.).
1.2 웨스턴 블롯
동결보존된 백혈병 세포가 해동되었고 RIPA 용해 버퍼에서 용해되었고, 단백질 농도는 BCA 검정으로 정량화되었다. NuPAGE 4 내지 12% Bis-Tris 단백질 겔 중 20 μg의 단백질 용해물을 사용하여 각 샘플이 로딩되었고, 그 다음 120V에서 전기영동된 후 30V에서 1시간 동안 폴리비닐렌디플루오라이드 멤브레인으로 이동되었다. 멤브레인을 탐침하기 위해 마우스 항-AKR1C3(#A6229, Sigma-Aldrich, 세인트 루이스, 미주리주) 또는 토끼 항-액틴 일차 항체(#A2066, Sigma-Aldrich)가 사용되었고, 이 후 호스래디쉬 퍼옥시다제 접합된 항-마우스 또는 항-토끼 IgG 이차 항체(GE Healthcare, 버킹엄, 영국)이 사용되었다. BioRad Chemidoc 터치 영상화 시스템에서 신호를 정량함으로써 접합된 이차 항체를 검출하기 위해 Immobilon Western chemiluminescent HRP 기질(Merck Millipore, 빌레리카, 매사츄세츠주)이 사용되었다.
1.3 RNA-Seq 분석
일차 환자의 흡인물에서 AKR1C3 발현을 분석하기 위해, 환자를 B-ALL과 T-ALL 및 이들의 관련 하위군으로 나누었다. 쌍을 이룬 말단 판독값이 GRCh37 인간 게놈 참조에 대하여 디폴트 파라미터를 갖는 권장 왕복 맵핑 파이프라인을 통해 STAR(Dobin A, Davis CA, Schlesinger F, Drenkow J, Zaleski C, Jha S, 등 STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics 2013;29:15-21.)에 의해 맵핑되었고, Picard MarkDuplicates 모듈이 사용되어 복제율을 표지했다. STAR 현지화 및 이후 유전자 발현 수준의 평가를 위해 유전자 주석 파일이 Ensembl(//www.ensembl.org/)에서 다운로드되었다. 유전자 발현 프로필을 평가하기 위해, HTSeq(Anders S, Pyl PT, Huber W. HTSeq-a Python framework to work with highthroughput sequencing data. Bioinformatics 2015;31:166-9.)에 의해 주석달린 유전자 판독값이 계수되었고, DESeq2 R 프로그램 패키지(Anders S, Huber W. Differential expression analysis for sequence count data. Genome Biol 2010;11:R106.)에 의해 처리되어 유전자 발현을 정규화된 log2 값으로 정규화하였다.
PDX 샘플을 분석하기 위해, Illumina 쌍을 이룬 말단 RNA-seq 데이터는 TranscriptomeSAM으로 설정된 quantMode 파라미터를 갖는 STAR를 사용하여 인간 게놈 어셈블리(작제물 hg38)에 정렬되었고, 정렬이 전사체 좌표로 변환되었다. 정렬은 RSEM(버전 1.2.31)에 의해 rsem-calculate-expression 명령어로 실행되어, 원자료 유전자 수, TPM, FPKM 및 동형단백질 발현을 계산했다. 모든 RNA-seq 값은 킬로베이스 백만당 단편 수(FPKM)로 표현되었다. FPKM 데이터는 log2 변환하여 실시되었다.
2. 실험 결과
다양한 유형의 ALL에서 AKR1C3 mRNA와 단백질의 발현 수준이 RNA-Seq 분석(도 3a) 및 웨스턴 블롯(도 3b)에 의해 검출되었다. 결과 분석에서 T-ALL(n=25)이 B-ALL(n=65; P<0.0001)에 비해 유의하게 더 높은 AKR1C3 발현을 가짐이 확인되었다. 또한, AKR1C3 mRNA와 단백질 발현 사이에 유의한 상관관계가 있었다(r=0.58; P=0.0003; 도 3c 참조).
실시예 5. 프라이머 및 프로브의 설계 및 스크리닝
5.1 실험 재료
5.1.1 샘플 정보
본 실시예에서 사용된 세포주는 Nanjing Cobioer Biosciences Co., Ltd 및 National Infrastructure of Cell Line Resource에서 구입했다; 백혈병 샘플은 급성 림프구성 백혈병 환자 지원자(임상기관)로부터 수득했고, 정상 샘플은 건강한 지원자(기증자)로부터 수득했고, 지원자는 임상시험동의서에 서명했다. 신선한 혈액 샘플은 PAXGENE 시험관에 보존되었고 냉장고에서 -20 ℃로 보관되었다.
모든 인간 샘플의 채취, 사용 및 후속 처리는 실험 장소인 중국 관련 규제 규정에 따라 그리고 관련 국제 윤리 요건에 따라 수행되었다.
표 7. 샘플 정보표
5.1.2 장비 정보
표 8. 장비 플랫폼 정보
5.1.3 시약 정보
표 9. 시약 정보
5.2 핵산 추출
RNA 추출 키트는 Qiagen 구성 추출 키트: PAXGENE BloodRNA 키트(카탈로그 번호: 762174, PAXGENE 시험관에 보존된 혈액에 사용됨) 및 Qiagen 구성 추출 키트: QIAamp RNA Blood Mini Kit(카탈로그 번호: 52304, EDTA 시험관에 보존된 혈액에 사용됨)이었다.
지침서에 따라, 추출 및 정제 키트(PAXgene Blood RNA Kit-IVD)를 사용하여 PAXgene 시험관에 보존된 혈액에 대해 RNA 추출이 실시되었고, QIAamp RNA Blood Mini Kit를 사용하여 EDTA 시험관에 보존된 혈액에 대해 RNA 추출이 실시되었다. 농도 검출은 추출된 RNA에 대해 권장 RNA 핵산 정량화 키트(Qubit RNA HS Assay Kits, Thermo Fisher Scientific, Q32852)를 사용하여 실시되었다.
5.3 역전사
4μL의 AKR1C3 역전사효소 혼합물(Thermo Fisher의 Superscript VILO 마스터 믹스(카탈로그 번호: 11755050))이 흡수되었고, 16μL의 RNA 샘플(부피가 불충분한 경우 16 μL까지 물을 보충함)에 첨가되었고, 약간 진탕하고 혼합한 다음, 일시적으로 원심분리되었다. 반응 용액을 함유한 PCR 시험관을 PCR 장비에 놓았고, cDNA 합성되도록 PCR 프로그램이 설정되었다.
5.4 AKR1C3 프라이머의 설계 및 선택
AKR1C3의 총 3개 표적 영역을 위해 9쌍의 프라이머 및 프로브가 설계되었다. 프라이머-프로브의 위치 정보는 도 4에서 볼 수 있다. AKR1C3 유전자 프라이머는 임상시험수탁기관(CRO)에서 설계 및 합성되었다.
5.5 중합효소 및 역전사효소의 선택
중합효소 혼합물은 PCR 성공 또는 실패의 핵심 요소이고, 증폭 효율에 영향을 미친다. 중합효소 혼합물의 주 성분은 중합효소, MgCl2, 버퍼 및 dNTP를 포함한다. 농축된 모액을 만들기 위해 시판되는 중합효소 혼합물 중 상기 성분이 특정 비율로 최상의 상태로 최적화되었다. 사용 시, 중합효소 버퍼가 배율기에 따른 비율로 첨가되는 한, 해당 검출이 수행될 수 있다. 양호한 증폭 효율을 갖는 것으로 반복 검증된 중합효소 KAPA PROBE FAST RT-PCR 마스터 믹스(2x)(카탈로그 번호: KK4702)가 본 실시예에서 사용되었다.
각각의 PCR 반응에서, 이는 양성 참조물 및 음성 대조물(NC, 뉴클레아제 비함유 물)을 사용하여 함께 검출 및 분석되어야 한다. qPCR 검출 프로세스는 다음과 같았다:
1) AKR1C3 중합효소 혼합물, AKR1C3 반응 용액 및 참조물을 취하고, 진탕하여 혼합하고, 향후 사용을 위해 일시적으로 원심 분리함.
2) 검출하려는 샘플의 수 및 품질 관리를 위해 필요한 반응 시험관의 총 수에 따라, 11.1μL의 AKR1C3 qPCR 중합효소 혼합물, 2.6μL의 AKR1C3 반응 혼합물 및 4.3μL의 뉴클레아제 비함유 물이 각 시험관에 각각 함유되었고, 이는 진탕기로 혼합되었고 일시적으로 원심분리된 후, 18μL의 각 시험관이 있는 qPCR 8열 각 시험관에 나누었다(비고: 검출하려는 샘플과 품질 관리물 둘 모두는 2회 반복해야 하고, NTC의 검출 수는 ≥1이어야 한다.).
3) 해당 qPCR 8열 각 시험관의 검출하려는 샘플, 품질 대조물 및 참조물의 cDNA 각각을 첨가하고, 8열 뚜껑을 덮고, 진탕기로 혼합하고 일시적으로 원심분리함.
4) 8열 시험관을 qPCR 장비의 샘플 탱크에 놓고, 위치 순서를 기록하고, 증폭을 위한 최적화된 증폭 반응 조건에 따라 장비 증폭 프로그램을 설정함.
5) 실험 종료 후, 2겹의 PE 장갑을 사용하여 PCR 반응 스트립을 감싸고, 생물학적 폐기물로 처리한다. 오염 방지를 위해 PCR 시험관의 뚜껑 개봉은 금지되었다.
5.6 프라이머-프로브의 선택
5.6.1 AKR1C3 프라이머-프로브의 스크리닝 테스트
상기 5.2-5.5 단계가 채택되었고, 9쌍의 프라이머-프로브가 먼저 증폭되었고, 증폭 결과는 도 5에 나타내었다.
총 RNA가 건강한 지원자의 말초 혈액으로부터 추출되었고, 역전사를 통해 cDNA가 합성되었다. 증폭 결과로부터, 형광 강도 값 측면에서 F1R1P1, F2R2P1, F2R6P1, F6R2P1, F6R6P1 및 F3R3P1이 다른 F5R5P2, F4R3P2 및 F7R7P3보다 더 높았음을 알 수 있다.
프라이머-프로브의 특이도를 고려하여, 9쌍의 프라이머에 대해 BLAST가 수행되었고, F2R6P1, F6R2P1 및 F6R6P1이 우수한 특이도를 나타내었고, 비-특이적 산물이 나타나지 않았다.
5.6.2 AKR1C3 프라이머-프로브의 실제 샘플 테스트
3세트의 프라이머-프로브(F2R6P1, F6R2P1 및 F6R6P1)를 사용하여 건강한 지원자의 말초 혈액으로부터 추출된 총 RNA로 역전사하여 cDNA가 수득되었고, 테스트를 위해 6개의 샘플이 선택되었다. 결과는 다음 표에 나와 있다.
표 10. 프라이머-프로브의 실제 샘플 테스트 결과
표 10에서 알 수 있듯이, 표적 유전자 AKR1C3 발현의 Ct 값은 건강한 모집단에서 27 내지 30 범위에서 비교적 안정적이다.
5.6.3 AKR1C3 프라이머-프로브의 증폭 효율 테스트
증폭 효율 테스트를 위해 3세트의 프라이머-프로브(F2R6P1, F6R2P1 및 F6R6P1)를 사용하여 1명의 건강한 지원자의 말초 혈액으로부터 추출된 RNA로 역전사하여 cDNA가 수득되었다. cDNA의 농도는 100ng/μL였으며, 5배 희석 후, 25배, 125배, 625배로 추가 희석되었고, 5 내지 625배까지 총 4가지 농도 구배가 있었으며, qPCR 테스트를 위해 각 농도에 대해 2회 반복 실험하였다. 표준 곡선 및 증폭 효율은 Ct 값과 최초 농도의 로그 값 사이의 선형 관계에 기반하여 결정되었다. 그 결과는 도 6에 도시되었다.
결과로부터, F6R2P1 및 F6R6P1의 증폭 효율이 F2R6P1의 경우보다 95% 초과하게 더 높음을 알 수 있다. 따라서, F6R2P1 및 F6R6P1 프라이머-프로브가 후속 테스트를 위해 선택되었다.
F6R2P1 및 F6R6P1 각각의 증폭 효율 테스트를 위해 4명의 건강한 지원자의 혈액으로부터 추출된 RNA 샘플이 선택되었다. 결과는 다음 표에 나와 있다:
표 11. F6R2P1 및 F6R6P1의 더 많은 샘플 표준 곡선 테스트
결과에 따르면, 2쌍의 프라이머-프로브의 증폭 효율의 차이가 거의 없었고 상이한 샘플에서 약간의 변동이 있었음을 알 수 있다. 그러나, F6R2P1의 R2가 더 우수했고, R2가 샘플 3에서 1과 동일하였다. 따라서, F6R2P1이 이 키트에서 AKR1C3의 프라이머-프로브로 선택되었다.
5.6.4 AKR1C3 플라스미드의 표준 곡선 시험
40μL의 뉴클레아제 비함유 물에 용해시킨 후, AKR1C3 플라스미드 건조 분말이 Qubit에서 측정한 5.78ng/μL 농도까지 10배 희석되었다. 플라스미드 원액이 각각 105, 106, 107 및 108배의 구배로 희석되어, qPCR 테스트를 위한 총 4가지 샘플 구배 농도를 수득하였다. 각각의 구배는 2회 반복되었고, AKR1C3의 표준 곡선이 도 7에 도시된 바와 같이 측정되었다.
도 7의 표준 곡선에서 알 수 있듯이, AKR1C3 프라이머-프로브의 증폭 효율은 100%에 도달하였고 R2 =0.999이어서, 양호한 증폭 효율을 시사하였다.
실시예 6. 참조 유전자의 스크리닝 및 해당 프라이머 및 프로브의 설계와 스크리닝
참조 유전자의 선택 관련하여, 백혈병 유전자 발현에 대한 참고문헌(([1] Yanlan Wang, Yue Liu, Changhua Zhou 등 An AKR1C3-specific prodrug with potent antitumor activities against T-ALL. [J] .Leukemia&Lymphoma, 2020, Feb. DOI: 10.1080/10428194.2020.1728746；[2] Donya Moradi Manesh, Jad El-Hoss, Kathryn Evans 등 Growth factor AKR1C3 is a biomarker of sensitivity to PR-104 in preclinical models of T-cell acute lymphoblastic leukemiaas treatment targets in clinical oncology.[J]. BLOOD, 2015, 125: 1193-1201；[3] Yuantong Tian, Lijing Zhao, Haitao Zhang 등 AKR1C3 overexpression may serve as a promising biomarker for prostate cancer progression. [J]. Diagnostic Pathology, 2014, 9: 42.)이 참조되었고, 형광 강도 및 증폭을 평가하기 위한 세포주 CCRF-CEM를 사용하는 테스트를 위해 이전에 사용된 프라이머-프로브와 조합하여 4개의 참조 유전자(HPRT1, GAP, ACTB 및 GOLGA1)가 선택되었다. 결과는 도 8에 나타내었다.
형광 강도의 측면: ACTB가 가장 높았고, HPRT1이 뒤를 이었다.
증폭 곡선의 측면: GOLGA1의 증폭 곡선은 전형적인 S자-형상이 아니고, 나머지 3개는 전형적인 S자-형상의 증폭 곡선이다.
Ct의 측면: GAP와 ACTB의 Ct 값이 낮았고 이들의 발현 수준이 상대적으로 높은 반면, HPRT1과 GOLGA1의 Ct 값이 높았고 이들의 발현 수준이 상대적으로 낮았다.
샘플과 세포주를 테스트하여 이들의 발현 안정성, 그리고 높은 발현 샘플과 낮은 발현 샘플이 구별될 수 있는지 여부를 검증했다.
건강한 지원자의 혈액 샘플의 RNA 번호 5, 6 및 7, 백혈병 환자의 골수 RNA 번호 BZQ 및 QQY, 및 AKR1C3을 발현하는 세포주(RPMI8226, CCRF-CEM 및 주르카트)가 이 실험에 사용되었다. 데이터 및 이전 결과에 따르면, 세포주 RPMI8226 및 CCRF-CEM은 높은 발현 세포주였고, 주르카트는 낮은 발현 세포주였다(도 9에 나타냄).
실험 결과에 대해 ΔΔCt 계산 방법이 채택되어, 즉, ΔΔCt= 미지 샘플 FAM Ct- 미지 샘플 VIC Ct-(품질 관리물 FAM Ct- 품질 관리물 VIC Ct)이었고, CCRF-CEM은 각 군의 품질 관리물로서 사용되었다. 결과는 도 10에 나타내었다.
결과로부터, 다른 3개의 참조 유전자와 비교되는 참조 유전자로서 ACTB가 사용되었을 때 ACTB가 고-발현 세포주 RPMI8226 및 CCRF-CEM을 저-발현 세포주 주르카트와 더 잘 구별할 수 있음을 알 수 있다. 건강한 사람에서는 상기 값이 상대적으로 낮은 수준으로 유지된 반면, 백혈병 환자의 골수 RNA 샘플에서는 고 발현의 AKR1C3이 검출되었다. 증폭 곡선의 결과에 기반하여 참조 유전자로서 ACTB가 선택되었다.
ACTB는 참조 유전자로 결정된 후, 5가지 유형의 세포주가 각각 테스트되었고 테스트 결과는 도 11에 나타내었다.
결과로부터, 세포주의 테스트 결과는 웨스턴 블롯의 검증 결과(도 9)와 일치하여, AKR1C3-ACTB 프라이머-프로브의 테스트 결과의 정확도를 입증하였다.
실시예 7. qPCR 반응 시스템 및 조건의 연구
qPCR 반응 시스템의 품질은 성공적인 개발 및 검출을 위한 필요 조건이었고, 그의 주요 구성 요소가 최적화되어야 한다.
7.1 반응 시스템의 결정
역전사 시스템은 이하에 나타내었다:
표 12. 역전사 시스템
역전사 반응 조건은 이하에 나타내었다:
표 13. 역전사 반응 조건
중합효소 혼합물은 PCR 증폭 효율에 영향을 미치는 핵심 요소였다. 농축 모액을 만들기 위해, 본 실시예에서 사용된 중합효소 혼합물 KAPA PROBE FAST RT-PCR 마스터 믹스(2x)의 함유 성분은 일정 비율로 최상의 상태로 최적화되었다. 사용 시, 중합효소 버퍼가 배율기에 따른 비율로 첨가되는 한, 해당 검출이 수행될 수 있다. 지침에 따르면, 권장되는 양은 반응 시스템, 즉, 20μL의 반응 시스템의 절반이어서 양은 10μL이어야 한다. 구체적인 시스템이 다음 표에 나타나 있다:
표 14. AKR1C3 qPCR 반응 시스템의 제조
7.2 qPCR 반응 조건의 최적화
본 실시예에서 사용된 반응 조건을 하기 표 15에 나타내었다. 반응 조건은 초기 단계에서 장기간 검증 후 RNA 반응에 바람직한 반응 조건으로 테스트되었다.
표 15. 증폭 반응 조건
사이클 수는 PCR 결과에 영향을 미치는 직접 요인 중 하나였고, 사이클 수는 PCR 증폭 정도를 결정하였다. 사용된 qPCR의 사이클 수는 일반적으로 30 내지 45주기였다. 사이클이 더 많을수록 비특이적 증폭이 더 유의한 반면, 사이클이 적을수록 검출 민감도에 대한 영향이 더 유의했다.
7.3 AKR1C3-ACTB 시스템의 표준 곡선 테스트
7.3.1 세포주의 표준 곡선 테스트
최적화된 반응 시스템에서, AKR1C3와 ACTB의 프라이머-프로브가 혼합되었고, 프라이머-프로브의 증폭 효율을 조사하기 위해 표준 곡선의 테스트가 수행되었다. CCRF-CEM이 세포주로 사용되었고, 7.1항의 역전사 시스템에 따라 역전사가 수행되었다. cDNA가 수득된 후, 원액, 5배, 25배 및 125배 희석의 4가지 구배가 5배 희석에 따라 수득되었고 각 농도에 대해 2회 반복하였고, qPCR 반응 시스템에 의해 검출이 수행되었다. 도 12에 나타낸 바와 같이 Ct 값과 최초 카피 수 lg 값 사이의 선형 관계에 기반하여 표준 곡선이 수득되었다.
도 12로부터, AKR1C3 프라이머-프로브의 증폭 효율은 94.2%였고, ACTB 프라이머-프로브의 경우는 95.3%여서, 이들 둘 모두는 요건을 충족하였음을 알 수 있다. R2는 0.99보다 커서, 선형 관계가 양호하고 요건을 충족하였음을 시사한다.
7.3.2 플라스미드의 표준 곡선 테스트
AKR1C3 및 ACTB 플라스미드 건조 분말이 40μL의 뉴클레아제 비함유 물에 용해되었다. 10배 희석 후, 농도는 Qubit에 의해 각각 1.67ng/μL, 5.78ng/μL로 측정되었다. AKR1C3의 플라스미드는 10-5로 희석되었고, ACTB의 플라스미드는 10-3으로 희석되었다. 100μL의 플라스미드 각각이 혼합되었고, 그 다음, 10배, 100배 및 1000 배의 구배로 희석되었다. 각 구배는 qPCR 테스트에 대해 2회 반복되었다. 표준 곡선은 Ct 값과 최초 농도의 로그 값 사이의 선형 관계에 따라 플롯팅되었다. 결과는 도 13에 나타내었다.
도면의 결과로부터, AKR1C3의 증폭 효율이 101.9%에 도달했고 ACTB의 경우는 94.1%에 도달했고 R2는 0.99보다 크고 요건을 충족했음을 알 수 있다.
실시예 8. AKR1C3-ACTB 프라이머-프로브의 디지털 PCR 테스트
8.1 디지털 PCR 검출 시스템 및 반응 조건
본 실시예에서 AKR1C3-ACTB 프라이머-프로브를 사용한 디지털 PCR 테스트가 시도되었다. 샘플 및 세포주에서 AKR1C3 및 ACTB의 발현 수준이 상당히 다르기 때문에 최대 Ct 차이는 10 Ct 값에 도달할 수 있다. 도 14는 낮은 발현을 갖는 주르카트 세포주의 qPCR 검출 다이어그램을 보여주었다.
따라서, 도 15에 나타난 바와 같이, 디지털 PCR 검출에서 VIC의 카피 수는 FAM의 경우보다 훨씬 클 것이다.
이를 고려하여, AKR1C3와 ACTB가 별도로 검출되었다. 2개의 세포주 CCRF-CEM 및 MOLT-4가 예로 취해졌다. 2ug RNA가 역전사된 후, 전사된 산물이 5배 희석되었고, AKR1C3의 카피 수는 다음 시스템을 사용하여 디지털 PCR로 검출되었다.
표 16. AKR1C3 디지털 PCR 검출 시스템
디지털 PCR의 반응 절차는 다음 표에 나타나 있다:
표 17. 디지털 PCR 반응 조건
검출 결과는 도 16에 각각 나타내었다.
ACTB 검출 관련하여, cDNA의 5배 희석, 이어서 200배 희석이 요구되었고, 그 다음, 다음 시스템을 사용하여 ACTB의 카피 수가 검출되었다:
표 18. ACTB 디지털 PCR 검출 시스템
검출 결과는 도 17에 나타내었다. 결과로부터, 세포주 CCRF-CEM의 FAM 카피 수/VIC 카피 수가 0.0092였고, 세포주 MOLT-4의 FAM 카피 수/VIC 카피 수가 0.00129였음을 알 수 있다.
8.2 실제 샘플 테스트 및 계산 방법의 결정
건강한 지원자의 9번 샘플, 백혈병 환자의 8 건 사례(PSS, GZJ, HXB, HCL, ZYQ, LBJ, JRZ, LSX로 번호 부여됨) 및 5가지 유형의 세포주(TF-1, CCRF-CEM, RPMI8226, MOLT-4, 주르카트)이 사용되었다. 표준 곡선에 사용된 플라스미드 및 농도는 실시예 7의 단계 7.3.2에 기재된 바와 같았다. 제조 방법은 다음과 같았다: AKR1C3의 플라스미드가 10-4로 희석되었고 ACTB의 플라스미드가 10-2로 희석되었다; 100μL의 각 플라스미드가 혼합되었고, 그 다음 10배, 100배 및 1000배의 구배가 희석되었다. 카피 수는 디지털 PCR로 정량화되었다. qPCR 테스트는 공동으로 실시되었고, 각 샘플에 대해 2회 반복되었다. 미지의 샘플 각각의 AKR1C3 및 ACTB의 카피 수는 표준 곡선에 의해 수득될 수 있고, AKR1C3의 발현을 측정하는 방법으로 AKR1C3 카피 수/ACTB 카피 수의 비가 사용되었다. 측정된 표준 곡선은 도 18에 나타내었다.
도 18로부터, AKR1C3의 증폭 효율이 99.1%에 도달했고 ACTB의 경우는 93.4%에 도달하였으며 R2가 0.99를 초과했고 요건을 충족하였음을 알 수 있다.
샘플 테스트 결과가 다음 표에 나타나 있다:
표 19. 샘플 테스트 결과
FAM 카피 수/VIC 카피 수의 결과는 도 19에 나타내었다.
도 19로부터, 세포주의 검출 결과는 세포주의 웨스턴 블롯의 결과와 일치하였고, 이는 계산 방법의 정확도를 검증하였다. 동시에, 도면에서 LBJ로 나타낸 바와 같이, 높은 AKR1C3 발현을 갖는 샘플이 백혈병 환자의 샘플에서 검출되었다. 환자의 8건 사례는 모두 골수 이식을 받은 환자였다.
상기 AKR1C3 프라이머-프로브 설계, 반응 시스템 및 반응 조건의 연구에 기반하여, RNA 수준에서 AKR1C3 발현의 검출 방법이 규명되었고, 일정한 민감도와 정확도가 달성되었다.
실시예 9. AKR1C3 RNA 함량을 검출하기 위한 방법의 성능 테스트
실시예 5 내지 실시예 8에 따르면, qPCR 방법 및 디지털 PCR 방법에서 최상의 프라이머-프로브 조성물, 참조 유전자 및 해당 프라이머-프로브 조성물, 반응 시스템 및 반응 조건이 결정되었다. 상기 조건에 기반하여, qPCR 방식과 디지털 PCR 방식을 조합함으로써 감도, 특이도, 반복가능성, 정확도 등을 포함하는 성능 테스트가 본 실시예에서 실시되었다.
qPCR 반응 프로세스는 다음 단계를 포함한다:
(1) 샘플 준비
RNA의 농도는 5ng/μL를 초과해야 하고, 20 내지 200ng의 RNA를 취하고, 뉴클레아제 비함유 물로 특정 부피까지 보충되었다;
(2) 역전사
표 12에 나타낸 바와 같이, 역전사 혼합물이 상기 PCR 시험관에 연속적으로 첨가되었고, 혼합물이 진탕기로 또는 피펫으로 불어서 혼합되었다. 짧은 원심분리 후, 혼합물이 일반 PCR 장비에 놓였다. 표 13에 나타낸 바와 같이 역전사가 실시되었고, 역전사 산물인 cDNA가 qPCR 반응 시스템의 주형으로 사용되었고, -20℃로 보관될 수 있었다.
(3) 프라이머 작업 용액의 조제
프라이머 및 프로브의 건조 분말이 실온에서 2시간 동안 TE 버퍼에 용해되었다(또는 4℃에서 밤새 용해되었다). 프라이머 작업 용액의 농도는 10μM이었다. 용해 후, 프라이머와 프로브는 일정한 비율과 조합에 따라 혼합되었다. 완전한 혼합 후, 냉장고에서 -20℃로 보관되었다. 프라이머 작업 용액은 -20 ℃에서 1년 동안 안정적으로 보관될 수 있다.
각 사용 전, DNA 프라이머 증폭 혼합물을 함유한 원심분리 시험관이 진탕 및 혼합되었고, 그 다음, 일시적으로 원심분리되었다. 표시된 양(20μL/반응)에 따라, 일회 사용에 필요한 양이 분주되었고 비축되었다.
(4) 반응 시스템의 준비
양성 대조 산물(STD), 음성 대조 산물(Neg) 및 블랭크 대조 산물(NTC)은 매회 품질 관리를 위해 사용되어야 한다. qPCR 반응 시스템은 표 14에 따라 제조되었고, 혼합되었고, 일시적으로 원심분리되었다. 그 다음, 표 15에 나타난 바와 같은 증폭 조건 하에서 qPCR 증폭이 실시되었다.
다음 테스트와 관련된 샘플 번호의 해당 의미는 다음과 같다: W1--AKR1C3 발현이 없는 표준물, P1--AKR1C3 발현이 있는 강한 양성 세포주, P2--표준 곡선을 검출하기 위해 사용된 AKR1C3 표준물-상이한 카피 수를 갖는 참조물의 구배, P3--AKR1C3 발현이 있는 약한 양성 세포주, S1--최저 검출 한계가 있는 AKR1C3 표준물, R1--AKR1C3 발현이 있는 강한 양성 세포주, R2--AKR1C3 발현이 없는 표준물.
9.1 최저 검출 한계
9.1.1 검출 방법
낮은 발현을 갖는 세포주로부터 추출된 RNA가 역전사를 위해 선택되었고, RNA의 양은 2μg이었다. 역전사 후의 cDNA는 최저 검출 한계 참조물로 25배 희석되었고, 참조물의 카피 수는 디지털 PCR로 결정되었고, 각 참조물은 10회 반복되었다.
9.1.2. 최저 검출 한계 참조물의 카피 수의 확인 프로세스 및 결과
1) PCR 믹스의 제조 및 포장: 7.5μL의 PCR 마스터 믹스(검정 당), 3μL의 Primer 믹스, 및 첨가에 필요한 총 물의 양이 취해졌고, 진탕기로 혼합되었고, 원심분리되었고, PCR 반응 시험관에 분주되었다.
2) 샘플 첨가: 0.5μL의 검출하려는 샘플이 해당 PCR 반응 시험관에 각각 첨가되었고, 진탕기로 혼합되었고, 그 다음 원심분리되었다.
3) 샘플 로딩: 해당 수의 칩이 제조되었고, 로딩을 위해 14.5μL의 반응 용액이 취해졌다. 이 프로세스 동안에 칩 중앙과 칩 외부 커버를 만지지 않음을 유의한다. 칩이 최소 20초 동안 가압되었다. 미네랄 오일이 천천히 첨가되었고, 오일을 흘리지 않도록 유의했다. 미네랄 오일을 첨가한 후 칩이 밀봉되었다.
4) 온-라인 테스트: 칩이 디지털 PCR 장비의 선반 위에 배열되었고, 선반 위의 2치수 코드와 숫자가 자신을 향해야 함을 유의한다.
5) 칩 판독: 칩을 특수 PCR 장비에서 꺼내져 실온에 놓은 후, 칩을 칩 스캐너에 넣어 형광 신호를 스캔하였다. 컴퓨터는 형광 신호에 따라 돌연변이 비를 계산했다.
6) 검출 결과:
카피 수 계산: 표적 카피 수 = 카피(표적) × 14.5/로딩량.
도 20은 이 세포주에서 cDNA를 5배 희석한 테스트 결과인 261.8 카피/μL을 보여주었고, 검출 한계 참조물의 카피 수는 52.4 카피/μL였다.
9.1.3 qPCR 검증 결과
표 20. 검출 한계 참조물의 검출 결과
표 20으로부터 알 수 있는 바와 같이, 최저 검출 한계 참조물은 qPCR로 검출되었고 10회 반복되었다. 양성 검출률은 100%였고, 최저 검출 한계는 검증 표준을 충족시켰다.
9.2 정밀도
정밀도는 동일 조건 하에서 다수의 평행 테스트 결과 간의 근접 정도를 나타 낸다. 테스트 값이 서로 근접할수록, 정밀도가 더 높다. 정밀도는 키트 작업의 반복 가능성을 반영했다. 이 실시예에서, 음성 참조물, 약한 발현을 갖는 정밀도 참조물 및 높은 발현을 갖는 정밀도 참조물이 선택되어, 배치-내 정밀도를 결정하였다. 음성 발현 참조물의 음성 일치율, 약한 발현 및 높은 발현을 갖는 정밀도 참조물에 대한 AKR1C3의 상대 발현 수준의 변동계수(CV)를 계산함으로써 키트의 정밀도 성능이 평가되었다.
9.2.1 검출 방법
본 실험에서, 2개의 정밀도 참조물은 검출 샘플로서 사용되었고, 2개의 장비, 2명의 작업자 및 3가지 검증 날짜가 사용되었고, 각 참조물은 24회 검출되었다. 모든 음성 참조물은 음성이었고, 양성 CV 값은 < 15%였다.
CV 값 =(표준편차 SD/평균) ×100%
9.2.2 실험 결과
표 21. AKR1C3 정밀도 결과
양성 정밀도 참조물의 24회 동안 AKR1C3 Ct의 CV 값은 0.78%였고, ACTB CT의 CV 값은 1.73%였다. 음성 정밀도 참조물의 24회는 모두 음수였다.
표 21으로부터 알 수 있듯이, 정밀도와 반복 가능성 검출의 샘플이 24회 동안 qPCR로 검출되었고, CV 값은 모두 < 5%이었고, 정밀도와 반복 가능성이 검증 표준을 충족하였음을 시사한다.
9.3 음성 일치율
9.3.1 검출 방법
위양성 평가를 위해 음성 참조물(AKR1C3 동종 플라스미드 AKR1C4, 9.06×103 카피)이 선택되었고 키트로 3회 반복하여 검출되었다.
9.3.2 실험 결과
표 22. 음성 참조물의 qPCR 검출 결과
표 22로부터 알 수 있듯이, 반복된 검출 결과는 모두 음성이었고, 음성 일치율은 100%였고, 검증 표준을 충족하였다.
9.4 음성 일치율
9.4.1 검출 방법
검출 정확도를 평가하기 위해 2개의 양성 참조물(웨스턴 블롯으로 검증된 AKR1C3 세포주)이 선택되었고 키트로 검출되었다. 구배 희석을 위해 AKR1C3 및 ACTB 플라스미드(디지털 PCR로 정량화됨)가 사용되어 표준 곡선을 플롯팅하였고, 이는 키트로 검출되어 증폭 효율 및 선형 관계를 평가하였다.
9.4.2 실험 결과
표 23. 양성 참조물의 qPCR 검출 결과
표 23으로부터 알 수 있는 바와 같이, 선택된 양성 참조물(웨스턴 블롯으로 검증된 세포주)은 상기 검출 방법을 사용하여 검출되었다. P1은 강한 양성 표준물이었고 FAM 카피 수/VIC 카피 수의 비가 높았고, P3은 약한 양성 표준물이었고, FAM 카피 수/VIC 카피 수의 비가 낮았고, CV는 요건을 충족했다. 방법의 검출 정확도는 요건을 충족했다.
9.5 특이도
9.5.1 검출 방법
2가지 농도의 음성 참조물(카피 수가 각각 1.14×104 및 1.14×103인 AKR1C3 동종 플라스미드 AKR1C2)이 선택되었다. 특이도를 평가하기 위해 각 농도 수준이 3회 반복되었다.
9.5.2 검출 결과
표 24. 특이적 참조물의 qPCR 검출 결과
2가지 구배의 음성 참조물이 3회 반복되었고, 결과는 모두 음성이었다. 키트 테스트의 특이도는 요건을 충족했다.
9.6 실제 샘플 검출
9.6.1 검출 방법
8개의 정상 혈액 샘플이 검출을 위해 선택되었고, 로딩량은 RNA 역전사의 cDNA 40ng였다. 각 샘플은 2회 검출되었고, FAM 카피 수/VIC 카피 수의 비의 정확도가 계산되었다.
9.6.2 검출 결과
검출 결과는 다음 표에 나타나 있다:
표 25. 정상 혈액 샘플의 qPCR 검출 결과
8개의 정상 혈액 샘플이 2회 검출되었고, FAM 카피 수/VIC 카피 수의 비는 <0.001이었고, 검출 CV는 <5%였다. 키트의 정확도는 요건을 충족했다.
9.7 주형 양 검증
200ng 및 10ng의 RNA가 역전사의 최초량으로 사용되었고, 임상기관 백혈병 환자 3명의 골수 샘플의 로딩량 범위가 검증되었다.
표 26. 역전사 최초량이 상이한 음성 및 양성 샘플의 qPCR 검출 결과
결론: 10ng 및 200ng의 로딩 샘플의 검출 결과는 일치하였다.
9.8 검증 결론
표 27. 검증 결론의 요약표
결론: 최저 검출 한계, 정밀도, 음성 일치율, 양성 일치율, 주형 양, 분석 특이도 및 실제 샘플 검출의 성능 검증을 통해, 7가지 성능 모두는 검증 표준을 충족하였다. 이 검출 방법의 성능은 임상 적용의 요건을 충족하였고, 임상 샘플 검출에 사용될 수 있다.
실시예 10. AKR1C3 RNA 함량 검출용 키트(qPCR 방법)
본 실시예에서, AKR1C3 RNA 함량 검출용 키트는 다음을 포함한다:
1) qPCR 중합효소 혼합물, 여기서 qPCR 중합효소 혼합물은 주로 다음을 포함한다: DNA 중합효소, MgCl2, 버퍼 및 dNTP(+ UNG 효소 및 dUTP). 바람직하게, 중합효소 혼합물은 KAPA PROBE FAST RT-PCR 마스터 믹스(2x)이다;
2) 역전사효소 혼합물, 바람직하게, 역전사효소 혼합물은 Superscript VILO 마스터 믹스이다;
3) AKR1C3 반응 혼합물, 여기서 AKR1C3 반응 혼합물은 AKR1C3 유전자를 검출하기 위한 프라이머-프로브 조성물 및 참조 유전자를 검출하기 위한 프라이머-프로브 조성물을 포함하고; AKR1C3 유전자를 검출하기 위한 프라이머-프로브 조성물이 전술한 바와 같은 (i) 내지 (ix) 군 중 어느 하나로부터 선택되었고; 더욱 바람직하게, 이는 (iii), (iv) 및 (v) 군의 어느 한 군으로부터 선택되었고; 더욱 더 바람직하게, 이는 (iv) 군으로부터 선택되었다. AKR1C3 유전자를 검출하기 위한 프로브에서 5'-말단 리포터는 FAM였고, 3'-말단 소광체는 MGB였다. 참조 유전자를 검출하기 위한 프라이머-프로브 조성물은 업스트림 프라이머 ACTB-F1, 다운스트림 프라이머 ACTB-R1 및 프로브 ACTB-P1을 포함하고, 업스트림 프라이머 ACTB-F1, 다운스트림 프라이머 ACTB-R1 및 프로브 ACTB-P1의 뉴클레오티드 서열은 각각 서열 번호:17, 서열 번호:18 및 서열 번호:19로 나타난다. 참조 유전자의 프로브의 5'-말단 리포터는 VIC였고, 3'-말단 소광체는 BHQ1였다;
4) 음성 대조군(NC), 예를 들어 뉴클레아제 비함유 물;
5) 양성 대조군, 예를 들어 공지된 카피 수를 가진 참조물;
6) 관련 작업 방법을 기록한 지침서.
실시예 11. AKR1C3 RNA 함량 검출용 키트(디지털 PCR 방법)
실시예 8에서 설명한 바와 같이, 디지털 PCR 방법에서 AKR1C3 및 ACTB에 대한 별도의 검출이 필요했다. 따라서, AKR1C3 반응 혼합물이 AKR1C3 유전자 검출용 프라이머-프로브 조성물만을 포함하고 참조 유전자 ACTB 검출용 프라이머-프로브 조성물을 포함하지 않는다는 점에서 본 실시예의 키트는 실시예 10의 키트와는 상이하다. 본 실시예의 키트는 AKR1C3 반응 혼합물(AKR1C3 유전자 검출용 프라이머-프로브 조성물을 포함함) 및 참조 유전자 ACTB 반응 혼합물(참조 유전자 ACTB 검출용 프라이머-프로브 조성물을 포함함)을 둘 모두 포함하고, 나머지 요소는 동일하다.
실시예 10 또는 실시예 11에서 설명된 바와 같이, AKR1C3 RNA 함량 검출용 키트는 AKR1C3 활성화된 항암 약물과 함께 사용되었고, 일반적으로 환자를 스크리닝하였다. 이 키트를 사용하면, 환자에게 약물 투여를 결정하기 전에 균일한 검출 키트 표준 작업 절차(SOP)를 사용하여 다른 실험실에서 의료진이 더 쉽게 검출할 수 있다. 이와 같이, 동일 시약 및 동일 절차로 수득된 AKR1C3 검출 결과는 AKR1C3 활성화된 항암 약물의 약물 지침에서 특정 암에 대한 권장 검출 결과에 필적할 수 있다.
키트의 구체적인 작업 방법이 지침서에 기록되어 있고, 즉 특정 작업 조건이 상기 지침서에 기록되어 있다. 선택적으로 또는 바람직한 구현예로서, 지침서는 또한 상이한 암(종양) 유형에 대해 AKR1C3 활성화된 항암 약물에 대한 소정의 양의 X 값을 제공한다. 예를 들어, B 계통 급성 림프구성 백혈병(B-ALL) 및 T 계통 급성 림프구성 백혈병(T-ALL)의 경우, 소정의 X 값은 0.00014 내지 0.015였고, 상기 키트에 의해 검출된 환자의 생체외 말초 혈액 샘플의 AKR1C3 카피 수/ACTB 카피 수의 비는 0.0092였다. 통계에 따르면, AKR1C3 활성화된 항암 약물을 사용하는 B-ALL 환자의 AKR1C3 카피 수/ACTB 카피 수의 비는 0.00014 미만이 아니어야 한다. 따라서, 의사는 이 환자에게 AKR1C3 활성화된 항암 약물을 처방할 수 있다. 또 다른 예로서, T 계통 급성 림프구성 백혈병(T-ALL)의 경우, 상기 키트에 의해 검출된 환자의 생체외 말초 혈액 샘플의 AKR1C3 카피 수/ACTB 카피 수의 비는 0.00012였다. 통계에 따르면, AKR1C3 활성화된 항암 약물을 사용하는 T-ALL 환자의 AKR1C3 카피 수/ACTB 카피 수의 비는 0.00014 미만이 아니어야 한다. 따라서, 의사는 이 환자에게 AKR1C3 활성화된 항암 약물을 처방해서는 안 된다.
실시예 12. AKR1C3 RNA 함량에 대한 검출 방법 및 암 치료용 약물의 제조에서 AKR1C3 RNA 함량 검출용 키트의 사용
실시예 5 내지 실시예 9에서 규명된 AKR1C3 RNA 함량에 대한 검출 방법 또는 실시예 10 또는 실시예 11에서 규명된 AKR1C3 RNA 함량 검출용 키트에 의해 검출된 B-ALL 환자의 생체외 말초 혈액 샘플의 AKR1C3 카피 수/ACTB 카피 수의 비는 0.0092이었고, 소정의 함량 0.00014보다 컸다.
B-ALL 환자에게 AKR1C3 활성화된 항암 약물이 투여되었다. 기존 실험의 검증에 의하면, 다음 구조식으로부터 선택된 AKR1C3 활성화된 항암 약물이 더 우수한 치료 효과를 가진다.
Sequence Listing
<110> ASCENTAWITS PHARMACEUTICALS, LTD.
<120> PRIMER-PROBE COMPOSITION, KIT, AND DETECTION METHOED
<130> FP1210046P
<160> 19
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> AKR1C3-F1
<400> 1
ctcaacaagc caggactcaa gtacaagc 28
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> AKR1C3-R1
<400> 2
acttgcagaa atctagcaat ttactccggt tg 32
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> AKR1C3-P1
<400> 3
ctgcaaccag gtagaatgtc a 21
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> AKR1C3-F2
<400> 4
acaagccagg actcaagtac aa 22
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> AKR1C3-R2
<400> 5
aatctagcaa tttactccgg ttgaaatac 29
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> AKR1C3-R6
<400> 6
acttgcagaa atctagcaat ttactcc 27
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> AKR1C3-F6
<400> 7
gatgatcctc aacaagccag ga 22
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> AKR1C3-F5
<400> 8
tggcagtgtg aagagagrag ac 22
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> AKR1C3-R5
<400> 9
ggtcaacata gtccaattga gct 23
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> AKR1C3-P2
<400> 10
ctttggtcca cttttcatcg ac 22
<210> 11
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> AKR1C3-F3
<400> 11
cagtgtgaag agagaagaca tattctaca 29
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> AKR1C3-R3
<400> 12
caaggctggt cggaccaa 18
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> AKR1C3-F4
<400> 13
gcagatggca gtgtgaagag 20
<210> 14
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> AKR1C3-F7
<400> 14
caccaacaga tgaaaatgga aaagtaa 27
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> AKR1C3-R7
<400> 15
ggttgaagtt tgacacccca a 21
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> AKR1C3-P3
<400> 16
ttgacatagt ggatctctgt acca 24
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> ACTB-F1
<400> 17
caccttctac aatgagctgc g 21
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> ACTB-R1
<400> 18
gtctcaaaca tgatctgggt catc 24
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> ACTB-P1
<400> 19
cctcggtcag cagcacgggg t 21
Claims (26)
- 하기 군 중 어느 하나로부터 선택되는 프라이머-프로브 조성물:
(i) 업스트림 프라이머 AKR1C3-F1, 다운스트림 프라이머 AKR1C3-R1 및 프로브 AKR1C3-P1로, 여기서, 상기 업스트림 프라이머 AKR1C3-F1, 다운스트림 프라이머 AKR1C3-R1 및 프로브 AKR1C3-P1의 뉴클레오티드 서열이 각각 서열 번호:1, 서열 번호: 2 및 서열 번호: 3으로 표시되고;
(ii) 업스트림 프라이머 AKR1C3-F2, 다운스트림 프라이머 AKR1C3-R2 및 프로브 AKR1C3-P1로, 여기서 상기 업스트림 프라이머 AKR1C3-F2, 다운스트림 프라이머 AKR1C3-R2 및 프로브 AKR1C3-P1의 뉴클레오티드 서열은 각각 서열 번호: 4, 서열 번호: 5 및 서열 번호: 3으로 표시되고;
(iii) 업스트림 프라이머 AKR1C3-F2, 다운스트림 프라이머 AKR1C3-R6 및 프로브 AKR1C3-P1로, 여기서 상기 업스트림 프라이머 AKR1C3-F2, 다운스트림 프라이머 AKR1C3-R6 및 프로브 AKR1C3-P1의 뉴클레오티드 서열은 각각 서열 번호: 4, 서열 번호: 6 및 서열 번호: 3으로 표시되고;
(iv) 업스트림 프라이머 AKR1C3-F6, 다운스트림 프라이머 AKR1C3-R2 및 프로브 AKR1C3-P1로, 여기서 상기 업스트림 프라이머 AKR1C3-F6, 다운스트림 프라이머 AKR1C3-R2 및 프로브 AKR1C3-P1의 뉴클레오티드 서열은 각각 서열 번호: 7, 서열 번호: 5 및 서열 번호: 3으로 표시되고;
(v) 업스트림 프라이머 AKR1C3-F6, 다운스트림 프라이머 AKR1C3-R6 및 프로브 AKR1C3-P1로, 여기서 상기 업스트림 프라이머 AKR1C3-F6, 다운스트림 프라이머 AKR1C3-R6 및 프로브 AKR1C3-P1의 뉴클레오티드 서열은 각각 서열 번호: 7, 서열 번호: 6 및 서열 번호: 3으로 표시되고;
(vi) 업스트림 프라이머 AKR1C3-F5, 다운스트림 프라이머 AKR1C3-R5 및 프로브 AKR1C3-P2로, 여기서 상기 업스트림 프라이머 AKR1C3-F5, 다운스트림 프라이머 AKR1C3-R5 및 프로브 AKR1C3-P2의 뉴클레오티드 서열은 각각 서열 번호: 8, 서열 번호: 9 및 서열 번호: 10으로 표시되고;
(vii) 업스트림 프라이머 AKR1C3-F3, 다운스트림 프라이머 AKR1C3-R3 및 프로브 AKR1C3-P1로, 여기서 상기 업스트림 프라이머 AKR1C3-F3, 다운스트림 프라이머 AKR1C3-R3 및 프로브 AKR1C3-P1의 뉴클레오티드 서열은 각각 서열 번호: 11, 서열 번호: 12 및 서열 번호: 3으로 표시되고;
(viii) 업스트림 프라이머 AKR1C3-F4, 다운스트림 프라이머 AKR1C3-R3 및 프로브 AKR1C3-P2로, 여기서 상기 업스트림 프라이머 AKR1C3-F4, 다운스트림 프라이머 AKR1C3-R3 및 프로브 AKR1C3-P2의 뉴클레오티드 서열은 각각 서열 번호: 13, 서열 번호: 12 및 서열 번호: 10으로 표시되고;
(ix) 업스트림 프라이머 AKR1C3-F7, 다운스트림 프라이머 AKR1C3-R7 및 프로브 AKR1C3-P3으로, 여기서 상기 업스트림 프라이머 AKR1C3-F7, 다운스트림 프라이머 AKR1C3-R7 및 프로브 AKR1C3-P3의 뉴클레오티드 서열은 각각 서열 번호: 14, 서열 번호: 15 및 서열 번호: 16으로 표시됨. - 제1항에 있어서, 상기 프라이머-프로브 조성물은 (iii), (iv) 및 (v) 군 중 어느 하나로부터 선택되고;
바람직하게, 상기 프라이머-프로브 조성물은 (iv) 군으로부터 선택되는, 프라이머-프로브 조성물. - 제1항 또는 제2항에 있어서, 프로브 AKR1C3-P1, AKR1C3-P2 및 AKR1C3-P3의 5'-말단 리포터는 FAM이고, 프로브 AKR1C3-P1, AKR1C3-P2 및 AKR1C3-P3의 3'-말단 소광체는 MGB인, 프라이머-프로브 조성물.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 프라이머-프로브 조성물을 포함하는 키트.
- 제4항에 있어서, 상기 키트는 참조 유전자의 프라이머-프로브 조성물을 더 포함하고;
바람직하게, 상기 참조 유전자는 ACTB인, 키트. - 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 참조 유전자의 프라이머-프로브 조성물은 업스트림 프라이머 ACTB-F1, 다운스트림 프라이머 ACTB-R1 및 프로브 ACTB-P1을 포함하고, 업스트림 프라이머 ACTB-F1, 다운스트림 프라이머 ACTB-R1 및 프로브 ACTB-P1의 뉴클레오티드 서열은 각각 서열 번호:17, 서열 번호: 18 및 서열 번호: 19로 표시된, 키트.
- 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 프로브 ACTB-P1의 5'-말단 리포터는 VIC이고, 프로브 ACTB-P1의 3'-말단 소광체는 BHQ1인, 키트.
- 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키트는 중합효소 혼합물을 더 포함하고, 상기 중합효소 혼합물은 주로 DNA 중합효소, MgCl2, 버퍼 및 dNTP를 포함하고;
바람직하게, 상기 중합효소 혼합물은 KAPA PROBE FAST RT-PCR 마스터 믹스(2x)인, 키트. - 제4항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키트는 역전사효소 혼합물을 더 포함하고;
바람직하게, 상기 역전사효소 혼합물은 Superscript VILO 마스터 믹스인, 키트. - 제4항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키트는 음성 대조군 및 양성 대조군을 더 포함하고;
바람직하게, 상기 음성 대조군은 뉴클레아제 비함유 물이고/이거나;
바람직하게, 상기 양성 대조군은 공지된 카피 수를 갖는 참조물인, 키트. - 암 치료용 약물의 제조에 있어서 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 프라이머-프로브 조성물 또는 제4항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 키트의 용도.
- 제11항에 있어서, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 프라이머-프로브 조성물 또는 제4항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 키트를 사용하여 환자의 생체외 샘플 내 AKR1C3 RNA 함량이 수득되고;
소정의 함량 이상의 AKR1C3 RNA 함량을 가진 환자에게 AKR1C3 활성화된 항암 약물이 투여되는, 용도. - 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 AKR1C3 RNA 함량이 AKR1C3 카피 수/참조 유전자 카피 수의 비에 따라 수득되고;
바람직하게, 상기 소정의 함량은 0.0001 내지 1이고;
더 바람직하게, 상기 소정의 함량은 0.00011 내지 0.5이고;
더욱 더 바람직하게, 상기 소정의 함량은 0.00013 내지 0.05인, 용도. - 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생체외 샘플은 혈액 샘플, 골수 샘플 또는 조직 샘플을 포함하는, 용도.
- 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AKR1C3 활성화된 항암 약물이 하기 구조를 갖는 화합물로부터 선택된 화합물인, 용도:
. - 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 폐암, 비소세포폐암, 간암, 췌장암, 유방암, 위암, 골암, 식도암, 비만암종, 전립선암, 고환암, 대장암, 난소암, 방광암, 자궁경부암, 간세포 암종, 흑색종, 편평세포암종, 기저세포암종, 선암종, 땀샘암종, 피지선 암종, 유두상 암종, 유두상 선암종, 신장세포 암종, 낭성 선암종, 낭성 암종, 수질 암종, 기관지 암종, 골세포 암종, 상피 암종, 담관 암종, 융모막암종, 배아 암종, 정상피종, 윌름 종양, 교모세포종, 성상세포종, 수모세포종, 두개인두종, 뇌실막종, 송과체 종양, 혈구모세포종, 성대 신경종, 수막종, 신경모세포종, 시신경모세포종, 망막모세포종, 신경섬유종, 섬유육종, 섬유모세포종, 섬유종, 섬유선종, 섬유연골종, 섬유낭포종, 섬유점액종, 섬유골종, 섬유점액육종, 섬유유두종, 점액육종, 점액낭포종, 점액연골종, 점액연골육종, 점액연골섬유육종, 점액종, 점액모세포종, 지방육종, 지방종, 지방선종, 지방모세포종, 지방연골종, 지방섬유종, 지방혈관종, 점액지방종, 연골육종, 연골종, 연골근종, 척색종, 융모막암종, 융모상피종, 맥락모세포종, 골육종, 골모세포종, 골연골섬유종, 골연골육종, 골연골종, 골낭종, 골치아종, 골섬유종, 골섬유육종, 혈관육종, 혈관종, 혈관지방종, 혈관연골종, 혈관모세포종, 혈관각화종, 혈관신경교종, 혈관내피종, 혈관섬유종, 혈관근종, 혈관지방종, 혈관림프관종, 혈관지질근육종, 혈관근육지방종, 혈관근신경종, 혈관점액종, 혈관세망종증, 림프관육종, 림프육아종, 림프관종, 림프종, 림프점액종, 림프육종, 림프관섬유종, 림프구종, 림프상피종, 림프모세포종, 말초 T-세포 림프종, 결절성 NK/T-세포 림프종, 내피종, 내모세포종, 윤활막종, 윤활막 육종, 중피종, 결합 조직 종양, 유윙 종양, 평활근종, 평활근육종, 평활근모세포종, 평활근섬유종, 횡문근종, 횡문근육종, 횡문근점액종, 급성 림프성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 질환 세포, 적혈구 증가증, 림프종, 자궁내막암, 신경아교종, 결장직장암, 갑상선암, 요로상피암 또는 다발성 골수종을 포함하고;
바람직하게, 상기 암은 난소암, 자궁경부암, 췌장암, 유방암, 결장직장암, 식도암, 위암, 간세포 암종, 비소세포 폐암, 전립선암, 신장세포 암종, 말초 T-세포 림프종, 결절성 NK/T-세포 림프종, 급성 림프성 백혈병 또는 급성 골수성 백혈병을 포함하는, 용도. - AKR1C3 RNA 함량을 검출하기 위한 방법으로서, 상기 방법은,
(1) 검출하려는 생체외 샘플의 RNA를 추출하고, 상기 추출된 RNA를 역전사 시스템에 첨가하고, 상기 추출된 RNA는 역전사되어 cDNA를 합성하는 단계;
(2) 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 프라이머-프로브 조성물 또는 제4항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 키트를 사용하여 주형으로서의 cDNA로 qPCR 또는 디지털 PCR 증폭을 실시하는 단계;
(3) qPCR 또는 디지털 PCR 증폭 결과에 따라 검출하려는 생체외 샘플의 AKR1C3 RNA 함량을 수득하는 단계
를 포함하는, 방법. - 제17항에 있어서, 단계 (1)에서, 상기 추출된 RNA의 농도가 검출되고;
바람직하게, 상기 추출된 RNA의 농도를 검출하기 위해 Qubit RNA HS Assay Kits가 사용되고/되거나;
상기 역전사 시스템은 역전사효소를 포함하고;
바람직하게, 상기 추출된 RNA와 역전사효소의 질량 대 부피 비는 μg/μL의 단위로 (0.5 내지 2):4이고;
더 바람직하게, 상기 추출된 RNA와 역전사효소의 질량 대 부피 비는 μg/μL의 단위로 (1 내지 1.8):4이고;
더욱 더 바람직하게, 상기 추출된 RNA와 역전사효소의 질량 대 부피 비는 μg/μL의 단위로 2:4인, 방법. - 제17항 또는 제18항에 있어서, 단계 (2)에서, qPCR 반응 시스템에서, (i) 내지 (ix) 군 중 어느 하나로부터 선택된 프라이머-프로브 조성물은 참조 유전자의 프라이머-프로브 조성물과 혼합되고;
바람직하게, qPCR 반응 시스템에서, AKR1C3 업스트림 프라이머, AKR1C3 다운스트림 프라이머 및 AKR1C3 프로브의 몰비는 (2 내지 10):(2 내지 10):3이고;
더 바람직하게, qPCR 반응 시스템에서, AKR1C3 업스트림 프라이머, AKR1C3 다운스트림 프라이머 및 AKR1C3 프로브의 몰비는 (3 내지 7):(3 내지 7):3이고;
더욱 더 바람직하게, qPCR 반응 시스템에서, AKR1C3 업스트림 프라이머, AKR1C3 다운스트림 프라이머 및 AKR1C3 프로브의 몰비는 5:5:3이고/이거나, qPCR 반응 시스템에서,
바람직하게, 업스트림 프라이머 ACTB-F1, 다운스트림 프라이머 ACTB-R1 및 프로브 ACTB-P1의 몰비는 (2 내지 10):(2 내지 10):3이고;
더 바람직하게, 업스트림 프라이머 ACTB-F1, 다운스트림 프라이머 ACTB-R1 및 프로브 ACTB-P1의 몰비는 (3 내지 7):(3 내지 7):3이고;
더욱 더 바람직하게, 업스트림 프라이머 ACTB-F1, 다운스트림 프라이머 ACTB-R1 및 프로브 ACTB-P1의 몰비는 5:5:3이고/이거나, qPCR 반응 시스템에서,
바람직하게, AKR1C3 업스트림 프라이머, AKR1C3 다운스트림 프라이머 및 AKR1C3 프로브의 양은 업스트림 프라이머 ACTB-F1, 다운스트림 프라이머 ACTB-R1 및 프로브 ACTB-P1의 양과 각각 동일한, 방법. - 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (2)에서, qPCR 반응 시스템에서, dUTP, UNG 효소, cDNA 주형 및 중합효소 혼합물이 또한 첨가되고;
바람직하게, 상기 중합효소 혼합물의 부피는 qPCR 반응 시스템의 총 부피의 (0.3 내지 0.8)이고;
더 바람직하게, 상기 중합효소 혼합물의 부피는 qPCR 반응 시스템의 총 부피의 0.5인, 방법. - 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (2)에서, AKR1C3 및 참조 유전자는 각각 AKR1C3 디지털 PCR 검출 시스템 및 참조 유전자 디지털 PCR 검출 시스템에 의해 증폭되고;
바람직하게, AKR1C3 디지털 PCR 검출 시스템에서, AKR1C3 업스트림 프라이머, AKR1C3 다운스트림 프라이머 및 AKR1C3 프로브의 몰비는 (5 내지 15):(5 내지 15):3이고;
더 바람직하게, AKR1C3 업스트림 프라이머, AKR1C3 다운스트림 프라이머 및 AKR1C3 프로브의 몰비는 (8 내지 14):(8 내지 14):3이고;
더욱 더 바람직하게, AKR1C3 업스트림 프라이머, AKR1C3 다운스트림 프라이머 및 AKR1C3 프로브의 몰비는 12:12:3이고/이거나; 참조 유전자 디지털 PCR 검출 시스템에서,
바람직하게, 업스트림 프라이머 ACTB-F1, 다운스트림 프라이머 ACTB-R1 및 프로브 ACTB-P1의 몰비는 (5 내지 15):(5 내지 15):3이고;
더 바람직하게, 업스트림 프라이머 ACTB-F1, 다운스트림 프라이머 ACTB-R1 및 프로브 ACTB-P1의 몰비는(8 내지 14):(8 내지 14):3이고;
더욱 더 바람직하게, 업스트림 프라이머 ACTB-F1, 다운스트림 프라이머 ACTB-R1 및 프로브 ACTB-P1의 몰비는 12:12:3인, 방법. - 제17항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (3)에서, qPCR 또는 디지털 PCR 증폭 결과에 따라 검출하려는 생체외 샘플의 AKR1C3 RNA 함량을 수득하는 단계는
(A) 각각 qPCR 또는 디지털 PCR 증폭 결과에 따라 검출하려는 생체외 샘플의 AKR1C3 및 참조 유전자의 카피 수를 수득하는 것;
(B) AKR1C3 카피 수/참조 유전자 카피 수의 비를 계산하여, 검출하려는 생체외 샘플의 AKR1C3 RNA 함량을 수득하는 것
을 포함하는, 방법. - 제17항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, qPCR 방법이 사용되는 경우, 단계 (A)는
(A1) AKR1C3의 Ct 값 및 최초 카피 수 lg 값의 표준 곡선 및 참조 유전자의 Ct 값 및 최초 카피 수 lg 값의 표준 곡선을 각각 플롯팅하는 것;
(A2) 상기 표준 곡선에 따라, AKR1C3 및 참조 유전자의 검출된 Ct 값에 의해 검출하려는 생체외 샘플의 AKR1C3 및 참조 유전자의 카피 수를 각각 수득하는 것
을 더 포함하는, 방법. - 제17항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 혈액 샘플, 골수 샘플 또는 조직 샘플 내 AKR1C3 RNA 함량을 검출하기 위해 사용되는, 방법.
- AKR1C3 효소의 발현 수준을 검출하기 위한 방법으로서, 상기 방법은, 제17항 내지 제24항 중 어느 한 항에 따른 방법을 사용하여, 검출하려는 생체외 샘플의 AKR1C3 RNA 함량을 검출하고, 그 다음, 상기 검출하려는 생체외 샘플의 AKR1C3 RNA 함량에 따라, 검출하려는 생체외 샘플의 AKR1C3 효소의 발현 수준이 수득되는 것을 포함하는, 방법.
- 제25항에 있어서, 검출하려는 생체외 샘플의 AKR1C3 RNA 함량과 검출하려는 생체외 샘플의 AKR1C3 효소의 발현 수준 사이에 선형 상관관계가 있는, 방법.
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