JP2024507771A - Ｅｂウイルス感染および関連疾患を予防および処置するためのエピトープペプチドおよび抗体 - Google Patents
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Abstract
ＥＢＶ感染を予防するか、または処置するために使用され得るエピトープペプチド（または、そのバリアント）、エピトープペプチド（または、そのバリアント）および担体タンパク質を含有する組換えタンパク質、ならびにエピトープペプチド（または、そのバリアント）および組換えタンパク質の使用が提供される。エピトープペプチドに対する抗体、ならびにＥＢＶ感染および／または感染によって生じる疾患の検出、予防および／または処置におけるその使用がさらに提供される。
Description
発明の分野
本発明は、免疫学および分子ウイルス学の分野、特に、ＥＢＶの予防および処置の分野に関する。具体的には本発明は、ＥＢＶ感染を予防または処置するために使用され得るエピトープペプチド（または、そのバリアント）、エピトープペプチド（または、そのバリアント）および担体タンパク質を含む組換えタンパク質、ならびにエピトープペプチド（または、そのバリアント）および組換えタンパク質の使用に関する。本発明は、エピトープペプチドに対する抗体、ならびにＥＢＶ感染および／または感染によって生じる疾患の検出、予防および／または処置のためのその使用にも関する。
本発明は、免疫学および分子ウイルス学の分野、特に、ＥＢＶの予防および処置の分野に関する。具体的には本発明は、ＥＢＶ感染を予防または処置するために使用され得るエピトープペプチド（または、そのバリアント）、エピトープペプチド（または、そのバリアント）および担体タンパク質を含む組換えタンパク質、ならびにエピトープペプチド（または、そのバリアント）および組換えタンパク質の使用に関する。本発明は、エピトープペプチドに対する抗体、ならびにＥＢＶ感染および／または感染によって生じる疾患の検出、予防および／または処置のためのその使用にも関する。
背景技術
エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）は、γ－ヘルペスウイルスサブファミリーのメンバーであり、免疫不全の宿主におけるリンパ球増殖性障害（ＬＰＤ）に関連し、多くのさまざまな種類のヒトＢ細胞悪性腫瘍および上皮細胞悪性腫瘍に関連する。免疫が正常な人々では、ＥＢＶ感染を有する患者の大部分は臨床症状を有しないか、または亜臨床的な症状だけを有するが、免疫不全患者では、高い罹患率および死亡率になる場合がある。現在、ＥＢＶ感染のための処置方法は非常に限定的で、ＣＤ２０モノクローナル抗体を用いる治療または化学薬物を用いる治療が主に挙げられる。しかし、ＣＤ２０モノクローナル抗体を用いる治療は、ＥＢＶ感染Ｂ細胞を死滅させるだけでなく、正常なＢリンパ球を死に至らしめ、患者の免疫機能をさらに弱める。化学薬物を用いる従来の治療は、患者の全体的な免疫機能の低下を生じる場合があり、他の重篤な副作用を生じる場合がある。
エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）は、γ－ヘルペスウイルスサブファミリーのメンバーであり、免疫不全の宿主におけるリンパ球増殖性障害（ＬＰＤ）に関連し、多くのさまざまな種類のヒトＢ細胞悪性腫瘍および上皮細胞悪性腫瘍に関連する。免疫が正常な人々では、ＥＢＶ感染を有する患者の大部分は臨床症状を有しないか、または亜臨床的な症状だけを有するが、免疫不全患者では、高い罹患率および死亡率になる場合がある。現在、ＥＢＶ感染のための処置方法は非常に限定的で、ＣＤ２０モノクローナル抗体を用いる治療または化学薬物を用いる治療が主に挙げられる。しかし、ＣＤ２０モノクローナル抗体を用いる治療は、ＥＢＶ感染Ｂ細胞を死滅させるだけでなく、正常なＢリンパ球を死に至らしめ、患者の免疫機能をさらに弱める。化学薬物を用いる従来の治療は、患者の全体的な免疫機能の低下を生じる場合があり、他の重篤な副作用を生じる場合がある。
したがって、ＥＢＶ感染の処置のための革新的でさらに有効な方法および薬物を開発することは喫緊であり、必要である。
本発明の内容
エプスタイン・バーウイルスの種々のタンパク質上には複数のＢ細胞応答（抗体応答）エピトープが存在し得るが、任意のエピトープに対するすべての抗体がＥＢＶ感染の処置に適用され得るのではない。したがって、ＥＢＶ感染を有効に処置できる免疫治療薬／方法の開発のために重要なことは、身体においてウイルスおよびウイルス感染細胞を有効に除去する抗体応答を誘導できる標的（エピトープ）を同定すること、ならびに標的（エピトープ）に対する抗体を得ることである。
エプスタイン・バーウイルスの種々のタンパク質上には複数のＢ細胞応答（抗体応答）エピトープが存在し得るが、任意のエピトープに対するすべての抗体がＥＢＶ感染の処置に適用され得るのではない。したがって、ＥＢＶ感染を有効に処置できる免疫治療薬／方法の開発のために重要なことは、身体においてウイルスおよびウイルス感染細胞を有効に除去する抗体応答を誘導できる標的（エピトープ）を同定すること、ならびに標的（エピトープ）に対する抗体を得ることである。
本発明は、そのような標的（エピトープ）を同定し、これに基づいて、ＥＢＶ感染を処置するために使用され得るエピトープペプチド（または、そのバリアント）、エピトープペプチド（または、そのバリアント）および担体タンパク質を含む組換えタンパク質、ならびにエピトープペプチド（または、そのバリアント）および組換えタンパク質の使用を提供する。本発明は、そのようなエピトープペプチド／エピトープに対する優れた特性を有するモノクローナル抗体も提供し、それは、ＥＢＶを効率的に中和でき、ＥＢＶと細胞の融合を遮断するか、もしくは阻害することができる。それにより本発明は、下記の態様を提供する。
モノクローナル抗体３Ａ３およびその誘導体抗体によって認識されるエピトープペプチド
エピトープペプチド
第１の態様では本発明は、単離されたエピトープペプチドまたはそのバリアントを提供し、ここでエピトープペプチドは、ＥＢＶ ｇＢタンパク質の３４１～３６２位のアミノ酸残基内に位置するエピトープを含み、エピトープはＥＢＶ ｇＢタンパク質の３５２、３５６および３６０位のアミノ酸残基を少なくとも含み、
バリアントは、１つもしくは複数（例えば、１個、２個もしくは３個）のアミノ酸残基の変異（例えば、置換、付加もしくは欠失）によってのみそれが由来するエピトープペプチドとは異なり、ＥＢＶ ｇＢタンパク質の３５２、３５６および３６０位のアミノ酸に対応する位置に変異を含まず、それが由来するエピトープペプチドの生物学的機能を保持している。
エピトープペプチド
第１の態様では本発明は、単離されたエピトープペプチドまたはそのバリアントを提供し、ここでエピトープペプチドは、ＥＢＶ ｇＢタンパク質の３４１～３６２位のアミノ酸残基内に位置するエピトープを含み、エピトープはＥＢＶ ｇＢタンパク質の３５２、３５６および３６０位のアミノ酸残基を少なくとも含み、
バリアントは、１つもしくは複数（例えば、１個、２個もしくは３個）のアミノ酸残基の変異（例えば、置換、付加もしくは欠失）によってのみそれが由来するエピトープペプチドとは異なり、ＥＢＶ ｇＢタンパク質の３５２、３５６および３６０位のアミノ酸に対応する位置に変異を含まず、それが由来するエピトープペプチドの生物学的機能を保持している。
本発明の第１の態様に記載のエピトープペプチドの生物学的機能として、これだけに限らないが、次の：
１）モノクローナル抗体３Ａ３（例えば、配列番号３～５に記載の重鎖ＣＤＲおよび配列番号６～８に記載の軽鎖ＣＤＲを有する）に特異的に結合すること、
２）ＥＢＶを中和する、および／またはＥＢＶと細胞の融合を遮断するか、もしくは阻害することができる抗血清を対象において誘導する能力（任意選択で、担体タンパク質とのエピトープペプチドの融合後）、
３）ｉｎ ｖｉｖｏでＥＢＶおよびＥＢＶ感染細胞を有効に排除するための抗体応答を誘導する能力（任意選択で、担体タンパク質とのエピトープペプチドの融合後）、ならびに
４）対象においてＥＢＶ感染またはＥＢＶ感染に関連する疾患を予防および／または処置する能力（任意選択で、担体タンパク質とのエピトープペプチドの融合後）
から選択される１つまたは複数が挙げられる。
１）モノクローナル抗体３Ａ３（例えば、配列番号３～５に記載の重鎖ＣＤＲおよび配列番号６～８に記載の軽鎖ＣＤＲを有する）に特異的に結合すること、
２）ＥＢＶを中和する、および／またはＥＢＶと細胞の融合を遮断するか、もしくは阻害することができる抗血清を対象において誘導する能力（任意選択で、担体タンパク質とのエピトープペプチドの融合後）、
３）ｉｎ ｖｉｖｏでＥＢＶおよびＥＢＶ感染細胞を有効に排除するための抗体応答を誘導する能力（任意選択で、担体タンパク質とのエピトープペプチドの融合後）、ならびに
４）対象においてＥＢＶ感染またはＥＢＶ感染に関連する疾患を予防および／または処置する能力（任意選択で、担体タンパク質とのエピトープペプチドの融合後）
から選択される１つまたは複数が挙げられる。
ある特定の実施形態では、ＥＢＶは、Ｍ８１株（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ ＩＤ：ＫＦ３７３７３０．１）である。ある特定の実施形態では、ＥＢＶ ｇＢタンパク質は、配列番号１７に記載の配列を有する。
ある特定の実施形態では、ＥＢＶ ｇＢタンパク質の３４１～３６２位のアミノ酸残基は配列番号１８に記載されている。
ある特定の実施形態では、エピトープは、直鎖状エピトープであり、ＥＢＶ ｇＢタンパク質の３４１～３６２位のアミノ酸残基内に位置する少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個または少なくとも２０個の連続したアミノ酸残基からなる。
ある特定の実施形態では、直鎖状エピトープはＥＢＶ ｇＢタンパク質の３４１～３６２位のアミノ酸残基からなる。
ある特定の実施形態では、エピトープペプチドは、ＥＢＶ ｇＢタンパク質の５～５０個（例えば、１０～５０個、１０～４０個、２０～４０個；例えば、２０～２５個または３５～４０個；例えば、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個または４０個）の連続したアミノ酸残基からなり、直鎖状エピトープを含む。
ある特定の実施形態では、エピトープペプチドは、ＥＢＶ ｇＢタンパク質の３４１～３６２位のアミノ酸残基または３３１～３６７位のアミノ酸残基からなる。
ある特定の実施形態では、エピトープペプチドは、配列番号１８または１９に記載の配列からなる。
ある特定の実施形態では、エピトープは、立体構造エピトープであり、ＥＢＶ ｇＢタンパク質の少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個または少なくとも２０個の連続していないアミノ酸残基からなり、ＥＢＶ ｇＢタンパク質の３５２、３５６および３６０位のアミノ酸残基を少なくとも含む。
ある特定の実施形態では、エピトープペプチドは、ＥＢＶ ｇＢタンパク質の５～５０個（例えば、１０～５０個、１０～４０個、２０～４０個；例えば、２０～２５個または３５～４０個；例えば、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個または４０個）の連続したアミノ酸残基からなり、立体構造エピトープを含む。
特に、本発明のエピトープペプチドまたはそのバリアントは、エピトープペプチドまたはそのバリアントの免疫原性を増強するために担体タンパク質に融合されてよく、それによりエピトープペプチドまたはそのバリアントは身体の免疫系によって認識され得、身体中のウイルスおよびウイルス感染細胞を有効に排除する抗体応答を誘導できる。
したがって、第２の態様では本発明は、第１の態様で記載された単離されたエピトープペプチドまたはそのバリアントおよび担体タンパク質を含む組換えタンパク質も提供し、組換えタンパク質は天然に存在するタンパク質またはその断片ではない。組換えタンパク質では、エピトープペプチドまたはそのバリアントは、使用される具体的な担体タンパク質に応じて、担体タンパク質のＮ末端またはＣ末端にライゲートされてよく、担体タンパク質の内部に挿入されてよく、または担体タンパク質のアミノ酸配列の一部を置き換えてよい。加えて、任意選択でエピトープペプチドまたはそのバリアントは、リンカーを介して担体タンパク質に繋がれる。本発明の組換えタンパク質は、その産生方法によって限定されない、例えばそれは、遺伝子操作法（組換え技術）によって、または化学合成法によって産生され得る。
ある特定の実施形態では、組換えタンパク質は、第１の態様に記載された単離されたエピトープペプチドまたはそのバリアントを提示することができ、エピトープペプチドまたはそのバリアントは、モノクローナル抗体３Ａ３またはその誘導体抗体によって特異的に結合され得る。
ある特定の実施形態では、担体タンパク質は、ＨＢｃＡｇまたはその断片から選択され、例えば、ＨＢｃＡｇの１個または複数個のアミノ酸残基（例えば、７９～８１位のアミノ酸）は本発明のエピトープペプチドで置換されている。ある特定の実施形態では、エピトープペプチドは、リンカー（例えば、グリシンリッチ可動性リンカー）を介してＨＢｃＡｇまたはその断片に繋がれている。ある特定の実施形態では、ＨＢｃＡｇの断片は、ＨＢｃＡｇのａａ１～１４９を含むか、またはＨＢｃＡｇのａａ１～１４９からなる。
ＨＢｃＡｇが担体タンパク質として使用される場合、全長ＨＢｃＡｇタンパク質またはその断片（例えば、ＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端のａａ１～１４９）が使用されてもよい（Ｙａｎｇ Ｈａｉｊｉｅら、Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｖｅｃｔｏｒ Ｂａｓｅｄ ｏｎ ＨＢＶ Ｃｏｒｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｘｉａｍｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ）２００４．０５ ４３巻、４号を参照されたい）。例えば、ＨＢｃＡｇタンパク質の断片（ａａ１～１４９）が担体タンパク質として使用される場合、ＨＢｃＡｇタンパク質断片（ａａ１～１４９）をコードするヌクレオチド配列中のＨＢｃＡｇ ａａ７９～８１をコードする配列は、欠失されてよく、リンカーは欠失の２つの末端のそれぞれに導入されてよく、ＢａｍＨ Ｉ／ＥｃｏＲ Ｉ制限部位は２つのリンカーの間に設計されてよく、それにより担体タンパク質ＨＢｃ１４９／ｍｕｔのコード配列（ＨＢｃ１４９／ｍｕｔのアミノ酸配列は配列番号２１として示され得る）を得ることができ、コード配列は、発現ベクターにクローニングされる。その後、ＢａｍＨ Ｉ／ＥｃｏＲ Ｉ制限部位を使用して、目的のエピトープペプチドのコード配列は、リンカーの間にクローニングされ、それによりエピトープペプチドを用いてキメラ化されたＨＢｃ１４９担体タンパク質を得る。
一部の実施形態では、組換えタンパク質は、配列番号２２に記載の配列を含む。
第３の態様では本発明は、本発明のエピトープペプチドもしくはそのバリアントまたは本発明の組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子も提供する。第４の態様では本発明は、上に記載の単離された核酸分子を含むベクターも提供する。本発明のベクターは、クローニングベクターまたは発現ベクターであり得る。好ましい実施形態では、本発明のベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、コスミドなどである。
第３の態様では本発明は、本発明のエピトープペプチドもしくはそのバリアントまたは本発明の組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子も提供する。第４の態様では本発明は、上に記載の単離された核酸分子を含むベクターも提供する。本発明のベクターは、クローニングベクターまたは発現ベクターであり得る。好ましい実施形態では、本発明のベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、コスミドなどである。
第５の態様では、本発明の単離された核酸分子またはベクターを含む宿主細胞も提供される。そのような宿主細胞として、これだけに限らないが、原核細胞、例えばＥ．ｃｏｌｉ細胞、ならびに真核細胞、例えば酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞および動物細胞（例えば、哺乳動物細胞、例えばマウス細胞、ヒト細胞など）が挙げられる。本発明の細胞は、２９３Ｔ細胞などの細胞系であってもよい。ある特定の実施形態では、宿主細胞は微生物である。
別の態様では、本発明の宿主細胞を好適な条件下で培養すること、および細胞培養物から本発明の組換えタンパク質を回収することを含む、本発明の組換えタンパク質を調製するための方法も提供される。
提示プラットフォーム
本発明の第１の態様によるエピトープペプチドまたはそのバリアントは、ｉｎ ｖｉｖｏでの抗原提示の有効性を増強するために粒子、例えば、リポソーム、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、ナノ粒子、ビロソームまたはエキソソーム上に提示され得る。
本発明の第１の態様によるエピトープペプチドまたはそのバリアントは、ｉｎ ｖｉｖｏでの抗原提示の有効性を増強するために粒子、例えば、リポソーム、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、ナノ粒子、ビロソームまたはエキソソーム上に提示され得る。
したがって、第６の態様では本発明は、その表面上に第１の態様のエピトープペプチドまたはそのバリアントが提示されている粒子を提供する。ある特定の実施形態では、粒子はウイルス様粒子（ＶＬＰ）である。ある特定の実施形態では、本発明の第１の態様によるエピトープペプチドまたはそのバリアントは、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）に融合されている、および／または提示されている。
抗体
第７の態様では本発明は、第１の態様に記載のエピトープペプチドまたはそのバリアントに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を提供する。抗体またはその抗原結合断片は、次の特徴：（ａ）ｉｎ ｖｉｔｒｏでまたは対象（例えば、ヒト）においてＥＢＶを中和すること；（ｂ）ｉｎ ｖｉｔｒｏでまたは対象（例えば、ヒト）においてＥＢＶと細胞の融合を遮断するか、または阻害すること；（ｃ）ＥＢＶ感染またはＥＢＶ感染に関連する疾患を予防するおよび／または処置すること；（ｄ）ＥＢＶ ｇＢタンパク質の７０ＫＤａサブユニットに特異的に結合すること、の１つまたは複数を有する。
第７の態様では本発明は、第１の態様に記載のエピトープペプチドまたはそのバリアントに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を提供する。抗体またはその抗原結合断片は、次の特徴：（ａ）ｉｎ ｖｉｔｒｏでまたは対象（例えば、ヒト）においてＥＢＶを中和すること；（ｂ）ｉｎ ｖｉｔｒｏでまたは対象（例えば、ヒト）においてＥＢＶと細胞の融合を遮断するか、または阻害すること；（ｃ）ＥＢＶ感染またはＥＢＶ感染に関連する疾患を予防するおよび／または処置すること；（ｄ）ＥＢＶ ｇＢタンパク質の７０ＫＤａサブユニットに特異的に結合すること、の１つまたは複数を有する。
ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は：
（ａ）次の３個の相補性決定領域（ＣＤＲ）：
（ｉ）ＶＨ ＣＤＲ１、次の配列からなる：配列番号３またはそれと比較して１個もしくは複数個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加（例えば、１個、２個もしくは３個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加）を有する配列、
（ｉｉ）ＶＨ ＣＤＲ２、次の配列からなる：配列番号４またはそれと比較して１個もしくは複数個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加（例えば、１個、２個もしくは３個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加）を有する配列、および
（ｉｉｉ）ＶＨ ＣＤＲ３、次の配列からなる：配列番号５またはそれと比較して１個もしくは複数個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加（例えば、１個、２個もしくは３個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加）を有する配列、
を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに／あるいは
（ｂ）次の３個の相補性決定領域（ＣＤＲ）：
（ｉｖ）ＶＬ ＣＤＲ１、次の配列からなる：配列番号６またはそれと比較して１個もしくは複数個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加（例えば、１個、２個もしくは３個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加）を有する配列、
（ｖ）ＶＬ ＣＤＲ２、次の配列からなる：配列番号７またはそれと比較して１個もしくは複数個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加（例えば、１個、２個もしくは３個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加）を有する配列、および
（ｖｉ）ＶＬ ＣＤＲ３、次の配列からなる：配列番号８またはそれと比較して１個もしくは複数個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加（例えば、１個、２個もしくは３個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加）を有する配列
を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、を含む。
（ａ）次の３個の相補性決定領域（ＣＤＲ）：
（ｉ）ＶＨ ＣＤＲ１、次の配列からなる：配列番号３またはそれと比較して１個もしくは複数個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加（例えば、１個、２個もしくは３個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加）を有する配列、
（ｉｉ）ＶＨ ＣＤＲ２、次の配列からなる：配列番号４またはそれと比較して１個もしくは複数個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加（例えば、１個、２個もしくは３個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加）を有する配列、および
（ｉｉｉ）ＶＨ ＣＤＲ３、次の配列からなる：配列番号５またはそれと比較して１個もしくは複数個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加（例えば、１個、２個もしくは３個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加）を有する配列、
を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに／あるいは
（ｂ）次の３個の相補性決定領域（ＣＤＲ）：
（ｉｖ）ＶＬ ＣＤＲ１、次の配列からなる：配列番号６またはそれと比較して１個もしくは複数個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加（例えば、１個、２個もしくは３個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加）を有する配列、
（ｖ）ＶＬ ＣＤＲ２、次の配列からなる：配列番号７またはそれと比較して１個もしくは複数個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加（例えば、１個、２個もしくは３個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加）を有する配列、および
（ｖｉ）ＶＬ ＣＤＲ３、次の配列からなる：配列番号８またはそれと比較して１個もしくは複数個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加（例えば、１個、２個もしくは３個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加）を有する配列
を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、を含む。
ある特定の実施形態では、（ｉ）から（ｖｉ）のいずれか１つに記載されるＣＤＲはＩＭＧＴ番号付けシステムに従って定義される。
ある特定の実施形態では、（ｉ）から（ｖｉ）のいずれか１つに記載される置換は保存的置換である。
ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は：
次の３個の重鎖ＣＤＲ：配列番号３に記載の配列を有するＶＨ ＣＤＲ１、配列番号４に記載の配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、配列番号５に記載の配列を有するＶＨ ＣＤＲ３、ならびに／または、
次の３個の軽鎖ＣＤＲ：配列番号６に記載の配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号７に記載の配列を有するＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号８に記載の配列を有するＶＬ ＣＤＲ３、
を含む。
次の３個の重鎖ＣＤＲ：配列番号３に記載の配列を有するＶＨ ＣＤＲ１、配列番号４に記載の配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、配列番号５に記載の配列を有するＶＨ ＣＤＲ３、ならびに／または、
次の３個の軽鎖ＣＤＲ：配列番号６に記載の配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号７に記載の配列を有するＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号８に記載の配列を有するＶＬ ＣＤＲ３、
を含む。
ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は：
配列番号１に記載の重鎖可変領域（ＶＨ）に含まれる３個のＣＤＲ、および／または
配列番号２に記載の軽鎖可変領域（ＶＬ）に含まれる３個のＣＤＲ
を含む。
配列番号１に記載の重鎖可変領域（ＶＨ）に含まれる３個のＣＤＲ、および／または
配列番号２に記載の軽鎖可変領域（ＶＬ）に含まれる３個のＣＤＲ
を含む。
ある特定の実施では、ＶＨに含まれる３個のＣＤＲ、および／またはＶＬに含まれる３個のＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴまたはＣｈｏｔｈｉａ番号付けシステムによって定義される。
ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は：
（ａ）（ｉ）配列番号１に記載の配列、
（ｉｉ）配列番号１に記載の配列と比較して１個もしくは複数個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加（例えば、１個、２個、３個、４個もしくは５個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加）を有する配列、または
（ｉｉｉ）配列番号１に記載の配列と比較して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％の配列同一性を有する配列、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、
および
（ｂ）（ｉｖ）配列番号２に記載の配列、
（ｖ）配列番号２に記載の配列と比較して１個もしくは複数個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加（例えば、１個、２個、３個、４個もしくは５個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加）を有する配列、または
（ｖｉ）配列番号２に記載の配列と比較して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％の配列同一性を有する配列、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、
を含む。
（ａ）（ｉ）配列番号１に記載の配列、
（ｉｉ）配列番号１に記載の配列と比較して１個もしくは複数個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加（例えば、１個、２個、３個、４個もしくは５個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加）を有する配列、または
（ｉｉｉ）配列番号１に記載の配列と比較して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％の配列同一性を有する配列、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、
および
（ｂ）（ｉｖ）配列番号２に記載の配列、
（ｖ）配列番号２に記載の配列と比較して１個もしくは複数個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加（例えば、１個、２個、３個、４個もしくは５個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加）を有する配列、または
（ｖｉ）配列番号２に記載の配列と比較して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％の配列同一性を有する配列、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、
を含む。
ある特定の実施形態では、（ｉｉ）または（ｖ）に記載の置換は保存的置換である。
ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は：配列番号１に記載の配列を含むＶＨおよび配列番号２に記載の配列を含むＶＬを含む。
ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は：配列番号１に記載の配列を含むＶＨおよび配列番号２に記載の配列を含むＶＬを含む。
ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片はヒト化される。
ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、ヒト免疫グロブリン由来のフレームワーク領域配列を含む。
ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、ヒト免疫グロブリン由来のフレームワーク領域配列を含む。
ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は：ヒト重鎖生殖系列配列由来の重鎖フレームワーク領域配列およびヒト軽鎖生殖系列配列由来の軽鎖フレームワーク領域配列を含む。
ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、ウサギまたはヒト免疫グロブリン由来の定常領域をさらに含む。
ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片の重鎖はヒト免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）由来の重鎖定常領域を含み、抗体またはその抗原結合断片の軽鎖はヒト免疫グロブリン（例えば、κまたはλ）由来の軽鎖定常領域を含む。
ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片の重鎖は、配列番号３０に記載の重鎖定常領域を含み、抗体またはその抗原結合断片の軽鎖は配列番号３１に記載の軽鎖定常領域を含む。
ある特定の実施形態では、抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ダイアボディおよび単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）からなる群から選択され；ならびに／または、抗体はウサギ由来抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、二特異性抗体もしくは多特異性抗体である。
本発明の抗体は、その産生方法によって限定されない、例えばそれは、遺伝子操作法（組換え技術）によって、または化学合成法によって産生され得る。本発明の抗原結合断片は、インタクトな抗体分子を加水分解することによって得ることができる（Ｍｏｒｉｍｏｔｏら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４：１０７～１１７（１９９２）およびＢｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８１（１９８５）を参照されたい）。加えて、これらの抗原結合断片は、組換え宿主細胞によって直接産生されてもよい（Ｈｕｄｓｏｎ，Ｃｕｒｒ、Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：５４８～５５７（１９９９）；Ｌｉｔｔｌｅら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ、２１：３６４～３７０（２０００）に概説されている）。例えば、Ｆａｂ’断片は宿主細胞から直接得ることができ；Ｆａｂ’断片はＦ（ａｂ’）２断片を形成するように化学的にカップリングされ得る（Ｃａｒｔｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：１６３～１６７（１９９２））。加えて、Ｆｖ、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２断片は、組換え宿主細胞の培養培地から直接単離されてもよい。これらの抗原結合断片を調製するための他の技術は、当業者に十分周知である。
したがって、第８の態様では本発明は、本発明の抗体もしくはその抗原結合断片またはその重鎖可変領域および／もしくは軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を提供する。ある特定の実施形態では、単離された核酸分子は、本発明の抗体もしくはその抗原結合断片またはその重鎖可変領域および／もしくは軽鎖可変領域をコードする。
第９の態様では本発明は、上に記載の単離された核酸分子を含むベクター（例えば、クローニングベクターまたは発現ベクター）を提供する。ある特定の実施形態では本発明のベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ファージなどである。
ある特定の実施形態では、ベクターは、本発明の抗体もしくはその抗原結合断片の重鎖可変領域をコードする第１のヌクレオチド配列、および／または本発明の抗体もしくはその抗原結合断片の軽鎖可変領域をコードする第２のヌクレオチド配列を含み、ここで第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列は、同じまたは異なるベクター上に提供される。
ある特定の実施形態では、ベクターは、本発明の抗体もしくはその抗原結合断片の重鎖をコードする第１のヌクレオチド配列、および／または本発明の抗体もしくはその抗原結合断片の軽鎖をコードする第２のヌクレオチド配列を含み、ここで第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列は、同じまたは異なるベクター上に提供される。
第１０の態様では本発明は、上に記載の単離された核酸分子またはベクターを含む宿主細胞を提供する。そのような宿主細胞として、これだけに限らないが、原核細胞、例えばＥ．ｃｏｌｉ細胞、ならびに真核細胞、例えば酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞および動物細胞（例えば、哺乳動物細胞、例えば、マウス細胞、ヒト細胞など）が挙げられる。ある特定の好ましい実施形態では、本発明の宿主細胞は、哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ－Ｓ、ＣＨＯ ＤＧ４４）である。ある特定の実施形態では、宿主細胞は微生物である。
別の態様では、上に記載の宿主細胞を抗体またはその抗原結合断片の発現を可能にする条件下で培養すること、および宿主細胞の細胞培養物から抗体またはその抗原結合断片を回収することを含む、本発明の抗体またはその抗原結合断片を産生するための方法も提供される。
コンジュゲート
本発明の抗体またはその抗原結合断片は、誘導体化、例えば、別の分子（例えば、別のポリペプチドまたはタンパク質）に連結され得る。典型的には、抗体またはその抗原結合断片の誘導体化（例えば、標識）は、ＥＢＶへのその結合に悪影響を与えない。したがって、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、そのような誘導体形態を含むことも意図する。例えば、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、１つまたは複数の他の分子成分、例えば、別の抗体（例えば、二特異性抗体を形成する）、検出試薬、薬学的試薬および／または、抗体もしくは抗原結合断片の別の分子への結合を媒介することができるタンパク質もしくはポリペプチド（例えば、アビジンもしくはポリヒスチジンタグ）に（化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合または他の方法によって）機能的に連結され得る。加えて、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、化学基、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、メチルもしくはエチルまたは糖類基を用いても誘導体化され得る。これらの基は、抗体の生物学的特性を改善するため、例えば、その血清半減期を増加させるために使用され得る。
本発明の抗体またはその抗原結合断片は、誘導体化、例えば、別の分子（例えば、別のポリペプチドまたはタンパク質）に連結され得る。典型的には、抗体またはその抗原結合断片の誘導体化（例えば、標識）は、ＥＢＶへのその結合に悪影響を与えない。したがって、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、そのような誘導体形態を含むことも意図する。例えば、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、１つまたは複数の他の分子成分、例えば、別の抗体（例えば、二特異性抗体を形成する）、検出試薬、薬学的試薬および／または、抗体もしくは抗原結合断片の別の分子への結合を媒介することができるタンパク質もしくはポリペプチド（例えば、アビジンもしくはポリヒスチジンタグ）に（化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合または他の方法によって）機能的に連結され得る。加えて、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、化学基、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、メチルもしくはエチルまたは糖類基を用いても誘導体化され得る。これらの基は、抗体の生物学的特性を改善するため、例えば、その血清半減期を増加させるために使用され得る。
したがって、第１１の態様では本発明は、本発明の抗体またはその抗原結合断片およびそれに連結された検出可能な標識を含むコンジュゲートも提供する。
ある特定の実施形態では、検出可能な標識は、免疫学的検出（例えば、酵素結合免疫測定法、放射免疫アッセイ、蛍光免疫アッセイ、化学発光免疫アッセイなど）における使用のために適合されていてよい。ある特定の実施形態では、検出可能な標識は、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼもしくはβ－ガラクトシダーゼ）、化学発光試薬（例えば、アクリジニウムエステル、ルミノールおよびその誘導体、もしくはルテニウム誘導体）、蛍光色素（例えば、フルオレセインもしくは蛍光タンパク質、例えばＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣもしくはＰＥ）、放射性核種またはビオチンからなる群から選択され得る。
ある特定の実施形態では、上に記載の検出可能な標識は、立体障害の可能性を低減するように種々の長さのリンカーを介して本発明の抗体またはその抗原結合断片に連結され得る。
モノクローナル抗体３Ａ５およびその誘導体抗体によって認識されるエピトープペプチド
エピトープペプチド
第１２の態様では、本発明は、単離されたエピトープペプチドまたはそのバリアントを提供し、ここでエピトープペプチドは、ＥＢＶ ｇＢタンパク質の５２８～６１６位のアミノ酸残基内に位置するエピトープを含み、エピトープはＥＢＶ ｇＢタンパク質の５４０、５６７、６１０および６１３位のアミノ酸残基を少なくとも含み、
バリアントは、１つもしくは複数（例えば、１個、２個もしくは３個）のアミノ酸残基の変異（例えば、置換、付加もしくは欠失）によってのみそれが由来するエピトープペプチドとは異なり、ＥＢＶ ｇＢタンパク質の５４０、５６７、６１０および６１３位のアミノ酸に対応する位置に変異を含まず、それが由来するエピトープペプチドの生物学的機能を保持している。
エピトープペプチド
第１２の態様では、本発明は、単離されたエピトープペプチドまたはそのバリアントを提供し、ここでエピトープペプチドは、ＥＢＶ ｇＢタンパク質の５２８～６１６位のアミノ酸残基内に位置するエピトープを含み、エピトープはＥＢＶ ｇＢタンパク質の５４０、５６７、６１０および６１３位のアミノ酸残基を少なくとも含み、
バリアントは、１つもしくは複数（例えば、１個、２個もしくは３個）のアミノ酸残基の変異（例えば、置換、付加もしくは欠失）によってのみそれが由来するエピトープペプチドとは異なり、ＥＢＶ ｇＢタンパク質の５４０、５６７、６１０および６１３位のアミノ酸に対応する位置に変異を含まず、それが由来するエピトープペプチドの生物学的機能を保持している。
本発明の第１２の態様に記載のエピトープペプチドの生物学的機能として、これだけに限らないが、次の：
１）モノクローナル抗体３Ａ５（例えば、配列番号１１～１３に記載の重鎖ＣＤＲおよび配列番号１４～１６に記載の軽鎖ＣＤＲを有する）に特異的に結合すること、
２）ＥＢＶを中和する、および／またはＥＢＶと細胞の融合を遮断するか、もしくは阻害することができる抗血清を対象において誘導する能力（任意選択で、担体タンパク質とのエピトープペプチドの融合後）、
３）ｉｎ ｖｉｖｏでＥＢＶおよびＥＢＶ感染細胞を有効に排除するための抗体応答を誘導する能力（任意選択で、担体タンパク質とのエピトープペプチドの融合後）、ならびに
４）対象においてＥＢＶ感染またはＥＢＶ感染に関連する疾患を予防および／または処置する能力（任意選択で、担体タンパク質とのエピトープペプチドの融合後）
から選択される１つまたは複数が挙げられる。
１）モノクローナル抗体３Ａ５（例えば、配列番号１１～１３に記載の重鎖ＣＤＲおよび配列番号１４～１６に記載の軽鎖ＣＤＲを有する）に特異的に結合すること、
２）ＥＢＶを中和する、および／またはＥＢＶと細胞の融合を遮断するか、もしくは阻害することができる抗血清を対象において誘導する能力（任意選択で、担体タンパク質とのエピトープペプチドの融合後）、
３）ｉｎ ｖｉｖｏでＥＢＶおよびＥＢＶ感染細胞を有効に排除するための抗体応答を誘導する能力（任意選択で、担体タンパク質とのエピトープペプチドの融合後）、ならびに
４）対象においてＥＢＶ感染またはＥＢＶ感染に関連する疾患を予防および／または処置する能力（任意選択で、担体タンパク質とのエピトープペプチドの融合後）
から選択される１つまたは複数が挙げられる。
ある特定の実施形態では、ＥＢＶはＭ８１株（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ ＩＤ：ＫＦ３７３７３０．１）である。ある特定の実施形態では、ＥＢＶ ｇＢタンパク質は、配列番号１７に記載の配列を有する。
ある特定の実施形態では、ＥＢＶ ｇＢタンパク質の５２８～６１６位のアミノ酸残基は、配列番号２０に記載されている。
ある特定の実施形態では、エピトープは、直鎖状エピトープであり、ＥＢＶ ｇＢタンパク質の５２８～６１６位のアミノ酸残基内に位置する少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個または少なくとも２０個の連続したアミノ酸残基からなる。
ある特定の実施形態では、直鎖状エピトープは、ＥＢＶ ｇＢタンパク質の５２８～６１６位のアミノ酸残基またはその断片からなる。
一部の実施形態では、エピトープペプチドは、ＥＢＶ ｇＢタンパク質の５～１００個（例えば、１０～１００個、１０～９０個、２０～９０個；例えば、５～１０個、１０～２０個、２０～３０個、３０～４０個、４０～５０個、５０～６０個、６０～７０個、７０～８０個、８０～９０個）の連続したアミノ酸残基からなり、直鎖状エピトープを含む。
ある特定の実施形態では、エピトープペプチドは、ＥＢＶ ｇＢタンパク質の５２８～６１６位のアミノ酸残基またはその断片からなる。
ある特定の実施形態では、エピトープペプチドは、配列番号２０に記載の配列またはその断片からなる。
ある特定の実施形態では、エピトープは、立体構造エピトープであり、ＥＢＶ ｇＢタンパク質の５２８～６１６位のアミノ酸残基内に位置する少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個または少なくとも２０個の連続していないアミノ酸残基からなり、ＥＢＶ ｇＢタンパク質の５４０、５６７、６１０および６１３位のアミノ酸残基を少なくとも含む。
一部の実施形態では、エピトープペプチドは、ＥＢＶ ｇＢタンパク質の５～１００個（例えば、１０～１００個、１０～９０個、２０～９０個；例えば、５～１０個、１０～２０個、２０～３０個、３０～４０個、４０～５０個、５０～６０個、６０～７０個、７０～８０個、８０～９０個）の連続したアミノ酸残基からなり、立体構造エピトープを含む。
特に、本発明のエピトープペプチドまたはそのバリアントは、エピトープペプチドまたはそのバリアントの免疫原性を増強するために担体タンパク質に融合されてよく、それによりエピトープペプチドまたはそのバリアントは身体の免疫系によって認識され得、身体中のウイルスおよびウイルス感染細胞を有効に排除する抗体応答を誘導できる。
したがって、第１３の態様では本発明は、第１２の態様に記載の単離されたエピトープペプチドまたはそのバリアントおよび担体タンパク質を含む組換えタンパク質も提供し、組換えタンパク質は天然に存在するタンパク質またはその断片ではない。組換えタンパク質では、エピトープペプチドまたはそのバリアントは、使用される具体的な担体タンパク質に応じて、担体タンパク質のＮ末端またはＣ末端にライゲートされてよく、担体タンパク質の内部に挿入されてよく、または担体タンパク質のアミノ酸配列の一部を置き換えてよい。加えて、任意選択でエピトープペプチドまたはそのバリアントは、リンカーを介して担体タンパク質に繋がれる。本発明の組換えタンパク質は、その産生方法によって限定されない、例えばそれは、遺伝子操作法（組換え技術）によって、または化学合成法によって産生され得る。
ある特定の実施形態では、組換えタンパク質は、第１２の態様に記載の単離されたエピトープペプチドまたはそのバリアントを提示することができ、エピトープペプチドまたはそのバリアントは、モノクローナル抗体３Ａ５またはその誘導体抗体によって特異的に結合され得る。
ある特定の実施形態では、担体タンパク質は、ＨＢｃＡｇまたはその断片から選択され、例えば、ＨＢｃＡｇの１個または複数個のアミノ酸残基（例えば、７９～８１位のアミノ酸）は本発明のエピトープペプチドで置換されている。ある特定の実施形態では、エピトープペプチドは、リンカー（例えば、グリシンリッチ可動性リンカー）を介してＨＢｃＡｇまたはその断片に繋がれている。ある特定の実施形態では、ＨＢｃＡｇの断片は、ＨＢｃＡｇのａａ１～１４９を含むか、またはＨＢｃＡｇのａａ１～１４９からなる。
ＨＢｃＡｇが担体タンパク質として使用される場合、全長ＨＢｃＡｇタンパク質またはその断片（例えば、ＨＢｃＡｇタンパク質のＮ末端のａａ１～１４９）が使用されてもよい（Ｙａｎｇ Ｈａｉｊｉｅら、Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｖｅｃｔｏｒ Ｂａｓｅｄ ｏｎ ＨＢＶ Ｃｏｒｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｘｉａｍｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ）２００４．０５ ４３巻、４号を参照されたい）。例えば、ＨＢｃＡｇタンパク質の断片（ａａ１～１４９）が担体タンパク質として使用される場合、ＨＢｃＡｇタンパク質断片（ａａ１～１４９）をコードするヌクレオチド配列中のＨＢｃＡｇ ａａ７９～８１をコードする配列は、欠失されてよく、リンカーは欠失の２つの末端のそれぞれに導入されてよく、ＢａｍＨ Ｉ／ＥｃｏＲ Ｉ制限部位は２つのリンカーの間に設計されてよく、それにより担体タンパク質ＨＢｃ１４９／ｍｕｔのコード配列（ＨＢｃ１４９／ｍｕｔのアミノ酸配列は配列番号２１として示され得る）を得ることができ、コード配列は、発現ベクターにクローニングされる。その後、ＢａｍＨ Ｉ／ＥｃｏＲ Ｉ制限部位を使用して、目的のエピトープペプチドのコード配列は、リンカーの間にクローニングされ、それによりエピトープペプチドを用いてキメラ化されたＨＢｃ１４９担体タンパク質を得る。
一部の実施形態では、組換えタンパク質は、配列番号２２に記載の配列を含む。
第１４の態様では本発明は、本発明のエピトープペプチドもしくはそのバリアントまたは本発明の組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子も提供する。第１５の態様では本発明は、上に記載の単離された核酸分子を含むベクターも提供する。本発明のベクターは、クローニングベクターまたは発現ベクターであり得る。好ましい実施形態では、本発明のベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、コスミドなどである。
第１４の態様では本発明は、本発明のエピトープペプチドもしくはそのバリアントまたは本発明の組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子も提供する。第１５の態様では本発明は、上に記載の単離された核酸分子を含むベクターも提供する。本発明のベクターは、クローニングベクターまたは発現ベクターであり得る。好ましい実施形態では、本発明のベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、コスミドなどである。
第１６の態様では本発明の単離された核酸分子またはベクターを含む宿主細胞も提供される。そのような宿主細胞として、これだけに限らないが、原核細胞、例えばＥ．ｃｏｌｉ細胞、ならびに真核細胞、例えば酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞および動物細胞（例えば、哺乳動物細胞、例えばマウス細胞、ヒト細胞など）が挙げられる。本発明の細胞は、２９３Ｔ細胞などの細胞系であってもよい。ある特定の実施形態では、宿主細胞は微生物である。
別の態様では、本発明の宿主細胞を好適な条件下で培養すること、および細胞培養物から本発明の組換えタンパク質を回収することを含む、本発明の組換えタンパク質を調製するための方法も提供される。
提示プラットフォーム
本発明の第１２の態様によるエピトープペプチドまたはそのバリアントは、ｉｎ ｖｉｖｏで抗原提示の有効性を増強するために、粒子、例えば、リポソーム、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、ナノ粒子、ビロソームまたはエキソソーム上に提示され得る。
本発明の第１２の態様によるエピトープペプチドまたはそのバリアントは、ｉｎ ｖｉｖｏで抗原提示の有効性を増強するために、粒子、例えば、リポソーム、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、ナノ粒子、ビロソームまたはエキソソーム上に提示され得る。
したがって、第１７の態様では本発明は、第１２の態様のエピトープペプチドまたはそのバリアントをその表面に提示する粒子を提供する。ある特定の実施形態では、粒子はウイルス様粒子（ＶＬＰ）である。ある特定の実施形態では、本発明の第１２の態様によるエピトープペプチドまたはそのバリアントは、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）に融合および／または提示される。
抗体
第１８の態様では本発明は、第１２の態様のエピトープペプチドまたはそのバリアントに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を提供する。抗体またはその抗原結合断片は、次の特徴：（ａ）ｉｎ ｖｉｔｒｏでまたは対象（例えば、ヒト）においてＥＢＶを中和すること；（ｂ）ｉｎ ｖｉｔｒｏでまたは対象（例えば、ヒト）においてＥＢＶと細胞の融合を遮断するか、または阻害すること；（ｃ）ＥＢＶ感染またはＥＢＶ感染に関連する疾患を予防するおよび／または処置すること；（ｄ）ＥＢＶ ｇＢタンパク質の４０ＫＤａサブユニットに特異的に結合すること、の１つまたは複数を有する。
第１８の態様では本発明は、第１２の態様のエピトープペプチドまたはそのバリアントに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を提供する。抗体またはその抗原結合断片は、次の特徴：（ａ）ｉｎ ｖｉｔｒｏでまたは対象（例えば、ヒト）においてＥＢＶを中和すること；（ｂ）ｉｎ ｖｉｔｒｏでまたは対象（例えば、ヒト）においてＥＢＶと細胞の融合を遮断するか、または阻害すること；（ｃ）ＥＢＶ感染またはＥＢＶ感染に関連する疾患を予防するおよび／または処置すること；（ｄ）ＥＢＶ ｇＢタンパク質の４０ＫＤａサブユニットに特異的に結合すること、の１つまたは複数を有する。
ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は：
（ａ）次の３個の相補性決定領域（ＣＤＲ）：
（ｉ）ＶＨ ＣＤＲ１、次の配列からなる：配列番号１１またはそれと比較して１個もしくは複数個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加（例えば、１個、２個もしくは３個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加）を有する配列、
（ｉｉ）ＶＨ ＣＤＲ２、次の配列からなる：配列番号１２またはそれと比較して１個もしくは複数個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加（例えば、１個、２個もしくは３個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加）を有する配列、および
（ｉｉｉ）ＶＨ ＣＤＲ３、次の配列からなる：配列番号１３またはそれと比較して１個もしくは複数個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加（例えば、１個、２個もしくは３個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加）を有する配列、
を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに／あるいは
（ｂ）次の３個の相補性決定領域（ＣＤＲ）：
（ｉｖ）ＶＬ ＣＤＲ１、次の配列からなる：配列番号１４またはそれと比較して１個もしくは複数個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加（例えば、１個、２個もしくは３個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加）を有する配列、
（ｖ）ＶＬ ＣＤＲ２、次の配列からなる：配列番号１５またはそれと比較して１個もしくは複数個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加（例えば、１個、２個もしくは３個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加）を有する配列、および
（ｖｉ）ＶＬ ＣＤＲ３、次の配列からなる：配列番号１６またはそれと比較して１個もしくは複数個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加（例えば、１個、２個もしくは３個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加）を有する配列
を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、を含む。
（ａ）次の３個の相補性決定領域（ＣＤＲ）：
（ｉ）ＶＨ ＣＤＲ１、次の配列からなる：配列番号１１またはそれと比較して１個もしくは複数個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加（例えば、１個、２個もしくは３個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加）を有する配列、
（ｉｉ）ＶＨ ＣＤＲ２、次の配列からなる：配列番号１２またはそれと比較して１個もしくは複数個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加（例えば、１個、２個もしくは３個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加）を有する配列、および
（ｉｉｉ）ＶＨ ＣＤＲ３、次の配列からなる：配列番号１３またはそれと比較して１個もしくは複数個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加（例えば、１個、２個もしくは３個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加）を有する配列、
を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに／あるいは
（ｂ）次の３個の相補性決定領域（ＣＤＲ）：
（ｉｖ）ＶＬ ＣＤＲ１、次の配列からなる：配列番号１４またはそれと比較して１個もしくは複数個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加（例えば、１個、２個もしくは３個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加）を有する配列、
（ｖ）ＶＬ ＣＤＲ２、次の配列からなる：配列番号１５またはそれと比較して１個もしくは複数個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加（例えば、１個、２個もしくは３個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加）を有する配列、および
（ｖｉ）ＶＬ ＣＤＲ３、次の配列からなる：配列番号１６またはそれと比較して１個もしくは複数個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加（例えば、１個、２個もしくは３個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加）を有する配列
を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、を含む。
ある特定の実施形態では、（ｉ）から（ｖｉ）のいずれか１つに記載されるＣＤＲはＩＭＧＴ番号付けシステムに従って定義される。
ある特定の実施形態では、（ｉ）から（ｖｉ）のいずれか１つに記載される置換は保存的置換である。
ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は：
次の３個の重鎖ＣＤＲ：配列番号１１に記載の配列を有するＶＨ ＣＤＲ１、配列番号１２に記載の配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、および配列番号１３に記載の配列を有するＶＨ ＣＤＲ３、ならびに／または、
次の３個の軽鎖ＣＤＲ：配列番号１４に記載の配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号１５に記載の配列を有するＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号１６に記載の配列を有するＶＬ ＣＤＲ３
を含む。
次の３個の重鎖ＣＤＲ：配列番号１１に記載の配列を有するＶＨ ＣＤＲ１、配列番号１２に記載の配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、および配列番号１３に記載の配列を有するＶＨ ＣＤＲ３、ならびに／または、
次の３個の軽鎖ＣＤＲ：配列番号１４に記載の配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号１５に記載の配列を有するＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号１６に記載の配列を有するＶＬ ＣＤＲ３
を含む。
ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は：
配列番号９に記載の重鎖可変領域（ＶＨ）に含まれる３個のＣＤＲ、および／または、
配列番号１０に記載の軽鎖可変領域（ＶＬ）に含まれる３個のＣＤＲ
を含む。
配列番号９に記載の重鎖可変領域（ＶＨ）に含まれる３個のＣＤＲ、および／または、
配列番号１０に記載の軽鎖可変領域（ＶＬ）に含まれる３個のＣＤＲ
を含む。
ある特定の実施形態では、ＶＨに含まれる３個のＣＤＲおよび／またはＶＬに含まれる３個のＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴまたはＣｈｏｔｈｉａ番号付けシステムによって定義される。
ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は：
（ａ）（ｉ）配列番号９に記載の配列、
（ｉｉ）配列番号９に記載の配列と比較して１個もしくは複数個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加（例えば、１個、２個、３個、４個もしくは５個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加）を有する配列、または
（ｉｉｉ）配列番号９に記載の配列と比較して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％の配列同一性を有する配列、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、
および
（ｂ）（ｉｖ）配列番号１０に記載の配列、
（ｖ）配列番号１０に記載の配列と比較して１個もしくは複数個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加（例えば、１個、２個、３個、４個もしくは５個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加）を有する配列、または
（ｖｉ）配列番号１０に記載の配列と比較して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％の配列同一性を有する配列、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、
を含む。
（ａ）（ｉ）配列番号９に記載の配列、
（ｉｉ）配列番号９に記載の配列と比較して１個もしくは複数個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加（例えば、１個、２個、３個、４個もしくは５個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加）を有する配列、または
（ｉｉｉ）配列番号９に記載の配列と比較して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％の配列同一性を有する配列、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、
および
（ｂ）（ｉｖ）配列番号１０に記載の配列、
（ｖ）配列番号１０に記載の配列と比較して１個もしくは複数個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加（例えば、１個、２個、３個、４個もしくは５個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加）を有する配列、または
（ｖｉ）配列番号１０に記載の配列と比較して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％の配列同一性を有する配列、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、
を含む。
ある特定の実施形態では、（ｉｉ）または（ｖ）に記載される置換は保存的置換である。
ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は：配列番号９に記載の配列を含むＶＨおよび配列番号１０に記載の配列を含むＶＬを含む。
ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片はヒト化されている。
ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、ヒト免疫グロブリン由来のフレームワーク領域配列を含む。
ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、ヒト免疫グロブリン由来のフレームワーク領域配列を含む。
ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は：ヒト重鎖生殖系列配列由来の重鎖フレームワーク領域配列およびヒト軽鎖生殖系列配列由来の軽鎖フレームワーク領域配列を含む。
ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、ウサギまたはヒト免疫グロブリン由来の定常領域をさらに含む。
ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片の重鎖はヒト免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）由来の重鎖定常領域を含み、抗体またはその抗原結合断片の軽鎖はヒト免疫グロブリン（例えば、κまたはλ）由来の軽鎖定常領域を含む。
ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片の重鎖は、配列番号３０に記載の重鎖定常領域を含み、抗体またはその抗原結合断片の軽鎖は配列番号３１に記載の軽鎖定常領域を含む。
ある特定の実施形態では、抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ダイアボディおよび単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）からなる群から選択され；ならびに／または、抗体はウサギ由来抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、二特異性抗体または多特異性抗体である。
本発明の抗体は、その産生方法によって限定されない、例えばそれは、遺伝子操作法（組換え技術）によって、または化学合成法によって産生され得る。本発明の抗原結合断片は、インタクトな抗体分子を加水分解することによって得られ得る（Ｍｏｒｉｍｏｔｏら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４：１０７～１１７（１９９２）およびＢｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８１（１９８５）を参照されたい）。加えて、これらの抗原結合断片は、組換え宿主細胞によっても直接産生され得る（Ｈｕｄｓｏｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：５４８～５５７（１９９９）；Ｌｉｔｔｌｅら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ、２１：３６４～３７０（２０００）に概説されている）。例えば、Ｆａｂ’断片は宿主細胞から直接得ることができ、Ｆａｂ’断片はＦ（ａｂ’）２断片を形成するように化学的にカップリングされ得る（Ｃａｒｔｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：１６３～１６７（１９９２））。加えて、Ｆｖ、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２断片は、組換え宿主細胞の培養培地から直接単離されてもよい。これらの抗原結合断片を調製するための他の技術は、当業者に十分周知である。
したがって、第１９の態様では本発明は、本発明の抗体もしくはその抗原結合断片またはその重鎖可変領域および／もしくは軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を提供する。ある特定の実施形態では、単離された核酸分子は、本発明の抗体もしくはその抗原結合断片またはその重鎖可変領域および／もしくは軽鎖可変領域をコードする。
第２０の態様では本発明は、上に記載の単離された核酸分子を含むベクター（例えば、クローニングベクターまたは発現ベクター）を提供する。ある特定の実施形態では本発明のベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ファージなどである。
ある特定の実施形態では、ベクターは、本発明の抗体もしくはその抗原結合断片の重鎖可変領域をコードする第１のヌクレオチド配列、および／または本発明の抗体もしくはその抗原結合断片の軽鎖可変領域をコードする第２のヌクレオチド配列を含み、ここで第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列は、同じまたは異なるベクター上に提供される。
ある特定の実施形態では、ベクターは、本発明の抗体もしくはその抗原結合断片の重鎖をコードする第１のヌクレオチド配列、および／または本発明の抗体もしくはその抗原結合断片の軽鎖をコードする第２のヌクレオチド配列を含み、ここで第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列は、同じまたは異なるベクター上に提供される。
第２１の態様では本発明は、上に記載の単離された核酸分子またはベクターを含む宿主細胞を提供する。そのような宿主細胞として、これだけに限らないが、原核細胞、例えばＥ．ｃｏｌｉ細胞、ならびに真核細胞、例えば酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞および動物細胞（例えば、哺乳動物細胞、例えば、マウス細胞、ヒト細胞など）が挙げられる。ある特定の好ましい実施形態では、本発明の宿主細胞は、哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ－Ｓ、ＣＨＯ ＤＧ４４）である。ある特定の実施形態では、宿主細胞は微生物である。
別の態様では、上に記載の宿主細胞を抗体またはその抗原結合断片の発現を可能にする条件下で培養すること、および宿主細胞の細胞培養物から抗体またはその抗原結合断片を回収することを含む、本発明の抗体またはその抗原結合断片を産生するための方法も提供される。
コンジュゲート
本発明の抗体またはその抗原結合断片は、誘導体化、例えば、別の分子（例えば、別のポリペプチドまたはタンパク質）に連結され得る。典型的には、抗体またはその抗原結合断片の誘導体化（例えば、標識）は、ＥＢＶへのその結合に悪影響を与えない。したがって、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、そのような誘導体形態を含むことも意図する。例えば、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、１つまたは複数の他の分子成分、例えば、別の抗体（例えば、二特異性抗体を形成する）、検出試薬、薬学的試薬および／または、抗体もしくは抗原結合断片の別の分子への結合を媒介することができるタンパク質もしくはポリペプチド（例えば、アビジンもしくはポリヒスチジンタグ）に（化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合または他の方法によって）機能的に連結され得る。加えて、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、化学基、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、メチルもしくはエチルまたは糖類基を用いても誘導体化され得る。これらの基は、抗体の生物学的特性を改善するため、例えば、その血清半減期を増加させるために使用され得る。
本発明の抗体またはその抗原結合断片は、誘導体化、例えば、別の分子（例えば、別のポリペプチドまたはタンパク質）に連結され得る。典型的には、抗体またはその抗原結合断片の誘導体化（例えば、標識）は、ＥＢＶへのその結合に悪影響を与えない。したがって、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、そのような誘導体形態を含むことも意図する。例えば、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、１つまたは複数の他の分子成分、例えば、別の抗体（例えば、二特異性抗体を形成する）、検出試薬、薬学的試薬および／または、抗体もしくは抗原結合断片の別の分子への結合を媒介することができるタンパク質もしくはポリペプチド（例えば、アビジンもしくはポリヒスチジンタグ）に（化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合または他の方法によって）機能的に連結され得る。加えて、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、化学基、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、メチルもしくはエチルまたは糖類基を用いても誘導体化され得る。これらの基は、抗体の生物学的特性を改善するため、例えば、その血清半減期を増加させるために使用され得る。
したがって、第２２の態様では本発明は、本発明の抗体またはその抗原結合断片およびそれに連結された検出可能な標識を含むコンジュゲートも提供する。
ある特定の実施形態では、検出可能な標識は、免疫学的検出（例えば、酵素結合免疫測定法、放射免疫アッセイ、蛍光免疫アッセイ、化学発光免疫アッセイなど）における使用に適合されていてよい。ある特定の実施形態では、検出可能な標識は、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼもしくはβ－ガラクトシダーゼ）、化学発光試薬（例えば、アクリジニウムエステル、ルミノールおよびその誘導体、もしくはルテニウム誘導体）、蛍光色素（例えば、フルオレセインもしくは蛍光タンパク質、例えばＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣもしくはＰＥ）、放射性核種またはビオチンからなる群から選択され得る。
ある特定の実施形態では、上に記載の検出可能な標識は、立体障害の可能性を低減するように種々の長さのリンカーを介して本発明の抗体またはその抗原結合断片に連結され得る。
エピトープペプチドに基づく治療用または予防適用
本発明のエピトープペプチドまたは組換えタンパク質は、ＥＢＶに対する免疫応答を誘導することによって種々の治療用または予防適用において容易に使用され得る。例えば、それはＥＢＶに対する免疫応答を誘導するため、例えば、ＥＢＶに対する中和抗体の産生を誘導するために対象に投与され得る。ＥＢＶ感染を発症するリスクのある対象に、本発明のエピトープペプチドまたは組換えタンパク質は、ウイルス感染に対する予防的防御を与えるように投与され得る。
本発明のエピトープペプチドまたは組換えタンパク質は、ＥＢＶに対する免疫応答を誘導することによって種々の治療用または予防適用において容易に使用され得る。例えば、それはＥＢＶに対する免疫応答を誘導するため、例えば、ＥＢＶに対する中和抗体の産生を誘導するために対象に投与され得る。ＥＢＶ感染を発症するリスクのある対象に、本発明のエピトープペプチドまたは組換えタンパク質は、ウイルス感染に対する予防的防御を与えるように投与され得る。
したがって、第２３の態様では本発明は：（ｉ）第１の態様に記載のエピトープペプチドもしくはそのバリアント、第２の態様に記載の組換えタンパク質または第６の態様に記載の粒子、あるいは（ｉｉ）第１２の態様に記載のエピトープペプチドもしくはそのバリアント、第１３の態様に記載の組換えタンパク質または第１７の態様に記載の粒子を含む、免疫原性組成物を提供する。
ある特定の実施形態では、免疫原性組成物は、薬学的に許容される担体および／または賦形剤をさらに含む。
ある特定の実施形態では、免疫原性組成物は、ＥＢＶに対する免疫応答を誘導する、刺激するか、または増強することができる。
ある特定の実施形態では、免疫原性組成物はワクチンである。
ある特定の実施形態では、薬学的に許容される担体および／または賦形剤は、アジュバントを含む。本発明による免疫原性組成物との同時投与またはそれへの含有のためのアジュバントは、好ましくはヒトにおいて安全であり、十分に許容され、有効であるべきである。そのようなアジュバントは、当業者に十分周知である。
ある特定の実施形態では、薬学的に許容される担体および／または賦形剤は、アジュバントを含む。本発明による免疫原性組成物との同時投与またはそれへの含有のためのアジュバントは、好ましくはヒトにおいて安全であり、十分に許容され、有効であるべきである。そのようなアジュバントは、当業者に十分周知である。
本発明の免疫原性組成物は、ＥＢＶ感染の処置または予防のために当技術分野において周知の追加的薬剤との組合せで使用されてもよい。
本発明の免疫原性組成物は、医学分野において周知の任意の剤形、例えば、錠剤、丸剤、懸濁剤、乳剤、液剤、ゲル、カプセル、粉剤、顆粒剤、エリキシル剤、トローチ剤（lozenge）、座薬、注射剤（注射用液、注射用滅菌粉末および注射用濃縮液を含む）、吸入剤、スプレーなどに製剤化されてよい。好ましい剤形は、目的の投与様式および治療用使用に依存する。本発明の免疫原性組成物は、滅菌されているべきであり、製造および保存の条件下で安定であるべきである。好ましい剤形は注射剤である。そのような注射剤は、注射用滅菌溶液であり得る。加えて、注射用滅菌溶液は、保存および使用を容易にするために滅菌凍結乾燥粉剤（例えば、真空乾燥または凍結乾燥による）として調製され得る。そのような滅菌凍結乾燥粉剤は、好適なビヒクル、例えば、注射用水（ＷＦＩ）、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、塩化ナトリウム溶液（例えば、０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ）、ブドウ糖溶液（例えば、５％ブドウ糖）、界面活性剤含有溶液（例えば、０．０１％ポリソルベート２０）、ｐＨ緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、リンゲル液およびこれらの任意の組合せに使用前に分散され得る。
本発明の免疫原性組成物は、これだけに限らないが、経口、頬側、舌下、点眼、局所、非経口、直腸内、くも膜下腔内、大槽内、鼠径部、膀胱内、局所（例えば、粉剤、軟膏もしくは液滴）または経鼻経路が挙げられる、当技術分野において周知の任意の好適な方法を介して投与され得る。しかし、多くの治療用使用のために投与の好ましい経路／様式は、非経口（例えば、静脈内もしくはボーラス注射、皮下注射、腹腔内注射、筋肉内注射）である。当業者は、投与の経路および／または様式が、意図される目的に応じて変化することを理解する。
本発明の免疫原性組成物は、ＥＢＶに対する免疫応答を誘導するために十分な量で投与されるべきである。免疫原の適切な量は、処置または予防される具体的な疾患または状態、その重症度、対象の年齢および具体的な対象の他の個人的な特質（例えば、対象の全体的な健康状態および対象の免疫系の強さ）に応じて決定され得る。有効量の決定は、動物モデル研究に続くヒト臨床試験によって、および対象における標的疾患症状または状態の発生頻度または重症度を顕著に低下させる投与レジメンによっても導かれ得る。
別の態様では、本発明は、対象におけるＥＢＶ感染またはＥＢＶ感染に関連する疾患を予防するおよび／または処置するための免疫原性組成物の製造における、第１の態様もしくは第１２の態様に記載のエピトープペプチドもしくはそのバリアント、または第２の態様もしくは第１３の態様に記載の組換えタンパク質、または第３の態様もしくは第１４の態様に記載の単離された核酸分子、または第４の態様もしくは第１５の態様に記載のベクター、または第５の態様もしくは第１６の態様に記載の宿主細胞、または第６の態様もしくは第１７の態様に記載の粒子の使用を提供する。同様に提供されるのは、第１の態様または第１２の態様に記載のエピトープペプチドもしくはそのバリアント、または第２の態様もしくは第１３の態様に記載の組換えタンパク質、または第３の態様もしくは第１４の態様に記載の単離された核酸分子、または第４の態様もしくは第１５の態様に記載のベクター、または第５の態様もしくは第１６の態様に記載の宿主細胞、または第６の態様もしくは第１７の態様に記載の粒子、または第２３の態様に記載の免疫原性組成物の有効量をそれを必要とする対象に投与することを含む、対象（例えば、ヒト）においてＥＢＶ感染またはＥＢＶ感染に関連する疾患を予防するおよび／または処置するための方法である。
ある特定の実施形態では、ＥＢＶ感染は慢性活動性ＥＢＶ（ＣＡＥＢＶ）感染または一次ＥＢＶ感染である。
ある特定の実施形態では、ＥＢＶ感染に関連する疾患は単核球症またはＥＢＶに関連するがんである。
ある特定の実施形態では、ＥＢＶに関連するがんは、リンパ球増殖性障害（ＬＰＤ）、例えばバーキットリンパ腫（ＢＬ）、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）もしくは移植後リンパ球増殖性障害（ＰＴＬＤ）などのＢ細胞リンパ腫、または上皮（鼻咽頭、肺、乳房）癌、リンパ上皮腫、リンパ球浸潤を伴う癌（ＧＣＬＳ、胃がんなど）、または神経膠腫からなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、対象はヒトなどの哺乳動物である。
予防適用のために、本発明のエピトープペプチド、組換えタンパク質、粒子または免疫原性組成物は、任意の症状より先に、例えば、感染前に提供される。免疫原性組成物の予防投与は、任意の続く感染の予防もしくは回復のために、ウイルスへの曝露後もしくは曝露が疑われた後に、または感染の実際の開始後に感染および／またはそれに関連する疾患症状の予測される重症度、持続期間もしくは程度を弱めるために使用される。それにより一部の実施形態では、処置される対象は、例えば、ＥＢＶに曝露された、または曝露された可能性によってＥＢＶ感染を有するか、またはそれを発症するリスクがある対象である。
予防適用のために、本発明のエピトープペプチド、組換えタンパク質、粒子または免疫原性組成物は、任意の症状より先に、例えば、感染前に提供される。免疫原性組成物の予防投与は、任意の続く感染の予防もしくは回復のために、ウイルスへの曝露後もしくは曝露が疑われた後に、または感染の実際の開始後に感染および／またはそれに関連する疾患症状の予測される重症度、持続期間もしくは程度を弱めるために使用される。それにより一部の実施形態では、処置される対象は、例えば、ＥＢＶに曝露された、または曝露された可能性によってＥＢＶ感染を有するか、またはそれを発症するリスクがある対象である。
治療適用のために、本発明のエピトープペプチド、組換えタンパク質、粒子または免疫原性組成物は、疾患または感染の症状の発症時または発症後、例えば、ＥＢＶ感染の症状の発症後、またはＥＢＶ感染の診断後に提供される。
抗体に基づく治療用または予防適用
本発明の抗体は、ＥＢＶ感染に関連する種々の治療用または予防適用において容易に使用され得る。例えば、それは、ウイルスを中和するため、ウイルスと細胞の融合を遮断するか、または阻害するために対象に投与されてよく、それによりウイルスを排除する。ＥＢＶ感染を発症するリスクがある対象のために、本発明の抗体は、ウイルス感染に対する予防的防御を与えるように投与され得る。
本発明の抗体は、ＥＢＶ感染に関連する種々の治療用または予防適用において容易に使用され得る。例えば、それは、ウイルスを中和するため、ウイルスと細胞の融合を遮断するか、または阻害するために対象に投与されてよく、それによりウイルスを排除する。ＥＢＶ感染を発症するリスクがある対象のために、本発明の抗体は、ウイルス感染に対する予防的防御を与えるように投与され得る。
ある特定の実施形態では、本発明の第７の態様に記載の抗体またはその抗原結合断片を、第１８の態様に記載の抗体またはその抗原結合断片との組合せで使用することは有益である。
したがって、第２４の態様では本発明は：
（ｉ）第７の態様に記載の抗体もしくはその抗原結合断片、第８の態様に記載の単離された核酸分子、第９の態様に記載のベクターまたは第１０の態様に記載の宿主細胞、
および
（ｉｉ）第１８の態様に記載の抗体もしくはその抗原結合断片、第１９の態様に記載の単離された核酸分子、第２０の態様に記載のベクターまたは第２１の態様に記載の宿主細胞、
を含む、組成物を提供する。
（ｉ）第７の態様に記載の抗体もしくはその抗原結合断片、第８の態様に記載の単離された核酸分子、第９の態様に記載のベクターまたは第１０の態様に記載の宿主細胞、
および
（ｉｉ）第１８の態様に記載の抗体もしくはその抗原結合断片、第１９の態様に記載の単離された核酸分子、第２０の態様に記載のベクターまたは第２１の態様に記載の宿主細胞、
を含む、組成物を提供する。
ある特定の実施形態では、組成物は、第７の態様に記載の抗体またはその抗原結合断片、および第１８の態様に記載の抗体またはその抗原結合断片を含む。
一部の実施形態では、組成物について（ｉ）の抗体はキメラ抗体であり、および／または（ｉｉ）の抗体はキメラ抗体である。
組成物の（ｉ）および（ｉｉ）が、別々の構成成分として、または混合された組合せとして提供され得ることは容易に理解される。
組成物を使用する場合、組成物の（ｉ）および（ｉｉ）は、同時にまたは連続して使用され得る。例えば、組成物が対象に投与される場合、組成物の（ｉ）および（ｉｉ）は、対象に同時にまたは連続して投与され得る。
第２５の態様では本発明は、第７の態様もしくは第１８の態様に記載の抗体もしくはその抗原結合断片、または第２４の態様に記載の組成物ならびに任意選択で薬学的に許容される担体および／または賦形剤を含む、医薬組成物を提供する。
ある特定の実施形態では、医薬組成物は、追加的な薬学的に活性な薬剤も含み得る。
ある特定の例示的実施形態では、薬学的に許容される担体および／または賦形剤は、滅菌注射可能な液体（例えば、水性または非水性懸濁液または溶液）を含む。ある特定の例示的実施形態では、そのような滅菌注射可能な液体は、注射用水（ＷＦＩ）、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、塩化ナトリウム溶液（例えば、０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ）、ブドウ糖溶液（例えば、５％ブドウ糖）、界面活性剤含有溶液（例えば、０．０１％ポリソルベート２０）、ｐＨ緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、リンゲル液およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される。
ある特定の例示的実施形態では、薬学的に許容される担体および／または賦形剤は、滅菌注射可能な液体（例えば、水性または非水性懸濁液または溶液）を含む。ある特定の例示的実施形態では、そのような滅菌注射可能な液体は、注射用水（ＷＦＩ）、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、塩化ナトリウム溶液（例えば、０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ）、ブドウ糖溶液（例えば、５％ブドウ糖）、界面活性剤含有溶液（例えば、０．０１％ポリソルベート２０）、ｐＨ緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、リンゲル液およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される。
別の態様では、本発明は、本発明の抗体もしくはその抗原結合断片または医薬組成物を使用することを含む、ＥＢＶを中和するための方法を提供する。方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでまたは対象（例えば、ヒト）においてＥＢＶを中和するために使用され得る。
ある特定の実施形態では、方法は、試料中のＥＢＶの病原性を中和するために使用される。ある特定の実施形態では、方法は：ＥＢＶを含む試料を本発明の抗体もしくはその抗原結合断片または医薬組成物に接触させることを含む。
別の態様では、本発明は、ＥＢＶの病原性を中和するため、またはＥＢＶと細胞の融合を阻害するか、もしくは遮断するため、または対象においてＥＢＶ感染もしくはＥＢＶ感染に関連する疾患を予防するおよび／もしくは処置するための医薬の製造における、第７のもしくは第１８の態様に記載の抗体もしくはその抗原結合断片、または第８のもしくは第１９の態様に記載の単離された核酸分子、または第９のもしくは第２０の態様に記載のベクター、または第１０のもしくは第２１の態様に記載の宿主細胞、または第２４の態様に記載の組成物、または第２５の態様に記載の医薬組成物の使用を提供する。同様に提供されるのは、本発明の抗体もしくはその抗原結合断片、抗体もしくはその抗原結合断片をコードする単離された核酸分子もしくはベクターもしくは宿主細胞、組成物または医薬組成物の有効量をそれを必要とする対象に投与することを含む、対象においてＥＢＶ感染またはＥＢＶ感染に関連する疾患を予防するか、または処置するための方法である。
ある特定の実施形態では、ＥＢＶ感染は慢性活動性ＥＢＶ（ＣＡＥＢＶ）感染または一次ＥＢＶ感染である。
ある特定の実施形態では、ＥＢＶ感染に関連する疾患は単核球症またはＥＢＶに関連するがんである。
ある特定の実施形態では、ＥＢＶに関連するがんは、リンパ球増殖性障害（ＬＰＤ）、例えばバーキットリンパ腫（ＢＬ）、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）もしくは移植後リンパ球増殖性障害（ＰＴＬＤ）などのＢ細胞リンパ腫、または上皮（鼻咽頭、肺、乳房）癌、リンパ上皮腫、リンパ球浸潤を伴う癌（ＧＣＬＳ、胃がんなど）、または神経膠腫からなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、対象はヒトなどの哺乳動物である。
ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、単独で、または追加的な薬学的に活性な薬剤（例えば、追加的な抗ウイルス剤）との組合せで使用される。本発明の抗体またはその抗原結合断片と追加的な薬学的に活性な薬剤とは、同時に、別々にまたは連続的に投与されてよい。加えて、本発明の第７の態様に記載の抗体および第１８の態様に記載の抗体は、組合せでも投与され得る。
ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、単独で、または追加的な薬学的に活性な薬剤（例えば、追加的な抗ウイルス剤）との組合せで使用される。本発明の抗体またはその抗原結合断片と追加的な薬学的に活性な薬剤とは、同時に、別々にまたは連続的に投与されてよい。加えて、本発明の第７の態様に記載の抗体および第１８の態様に記載の抗体は、組合せでも投与され得る。
本発明の抗体もしくはその抗原結合断片または本発明の医薬組成物は、医学分野において周知の任意の剤形、例えば、錠剤、丸剤、懸濁剤、乳剤、液剤、ゲル、カプセル、粉剤、顆粒剤、エリキシル剤、トローチ剤、座薬、注射剤（注射用液、注射用滅菌粉末および注射用濃縮液を含む）、吸入剤、スプレーなどに製剤化されてよい。好ましい剤形は、目的の投与様式および治療用使用に依存する。本発明の抗体もしくはその抗原結合断片または医薬組成物は、滅菌されているべきであり、製造および保存の条件下で安定であるべきである。好ましい剤形は注射剤である。そのような注射剤は、注射用滅菌溶液であり得る。例えば、注射用滅菌溶液は、本発明の抗体またはその抗原結合断片の必要用量を適切な溶媒に包含すること、および任意選択で、他の望ましい成分（これだけに限らないが、ｐＨ調整剤、界面活性剤、アジュバント、イオン強度増強剤、等張剤、保存剤、希釈剤またはこれらの任意の組合せが挙げられる）を同時に包含することに続くろ過滅菌によって調製され得る。加えて、注射用滅菌溶液は、保存および使用を容易にするために滅菌凍結乾燥粉剤（例えば、真空乾燥または凍結乾燥による）として調製され得る。そのような滅菌凍結乾燥粉剤は、好適なビヒクル、例えば、注射用水（ＷＦＩ）、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、塩化ナトリウム溶液（例えば、０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ）、ブドウ糖溶液（例えば、５％ブドウ糖）、界面活性剤含有溶液（例えば、０．０１％ポリソルベート２０）、ｐＨ緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、リンゲル液およびこれらの任意の組合せに使用前に分散され得る。
本発明の抗体もしくはその抗原結合断片または本発明の医薬組成物は、これだけに限らないが、経口、頬側、舌下、点眼、局所、非経口、直腸内、くも膜下腔内、大槽内、鼠径部、膀胱内、局所（例えば、粉剤、軟膏もしくは液滴）または経鼻経路が挙げられる、当技術分野において周知の任意の好適な方法によって投与され得る。しかし、多くの治療用使用のために投与の好ましい経路／様式は、非経口（例えば、静脈内もしくはボーラス注射、皮下注射、腹腔内注射、筋肉内注射）である。当業者は、投与の経路および／または様式が、意図される目的に応じて変化することを理解する。ある特定の実施形態では、本発明の抗体もしくはその抗原結合断片または医薬組成物は、静脈内注射またはボーラス注射によって投与される。
抗体に基づく検出応用
本発明の抗体またはその抗原結合断片は、ＥＢＶのｇＢタンパク質（特に、外部ドメイン）に特異的に結合でき、そのため、ＥＢＶまたはそのｇＢタンパク質を検出するため、および任意選択で対象がＥＢＶに感染しているかどうかを診断するために使用され得る。
本発明の抗体またはその抗原結合断片は、ＥＢＶのｇＢタンパク質（特に、外部ドメイン）に特異的に結合でき、そのため、ＥＢＶまたはそのｇＢタンパク質を検出するため、および任意選択で対象がＥＢＶに感染しているかどうかを診断するために使用され得る。
したがって、別の態様では、本発明は、本発明の抗体もしくはその抗原結合断片または本発明のコンジュゲートを含むキットを提供する。
一部の実施形態では、キットは、本発明のコンジュゲートを含む。
他の実施形態では、キットは、本発明の抗体またはその抗原結合断片を含む。ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、検出可能な標識を含まない。ある特定の実施形態では、キットは、本発明の抗体またはその抗原結合断片を特異的に認識する二次抗体をさらに含み；任意選択で、二次抗体は、検出可能な標識、例えば、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼ）、化学発光試薬（例えば、アクリジニウムエステル、ルミノールおよびその誘導体、もしくはルテニウム誘導体）、蛍光色素（例えば、フルオレセインもしくは蛍光タンパク質）、放射性核種またはビオチンをさらに含む。
他の実施形態では、キットは、本発明の抗体またはその抗原結合断片を含む。ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、検出可能な標識を含まない。ある特定の実施形態では、キットは、本発明の抗体またはその抗原結合断片を特異的に認識する二次抗体をさらに含み；任意選択で、二次抗体は、検出可能な標識、例えば、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼ）、化学発光試薬（例えば、アクリジニウムエステル、ルミノールおよびその誘導体、もしくはルテニウム誘導体）、蛍光色素（例えば、フルオレセインもしくは蛍光タンパク質）、放射性核種またはビオチンをさらに含む。
ある特定の実施形態では、二次抗体は、本発明の抗体またはその抗原結合断片が含む定常領域が由来する種（例えば、ウサギまたはヒト）の抗体に特異的である。
ある特定の実施形態では、二次抗体は、抗免疫グロブリン（例えば、ヒトまたはウサギ免疫グロブリン）抗体、例えば、抗ＩｇＧ抗体である。ある特定の実施形態では、二次抗体は、抗ウサギＩｇＧ抗体または抗ヒトＩｇＧ抗体である。
ある特定の実施形態では、本発明のキットは、対応する検出可能な標識が検出されるようにするための試薬をさらに含み得る。例えば、検出可能な標識が酵素である場合、キットは、対応する酵素のための発色基質、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼのためのｏ－フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、ＡＢＴＳもしくはルミノール化合物、またはアルカリホスファターゼのためのｐ－ニトロフェニルリン酸（ｐ－ＮＰＰ）もしくはＡＭＰＰＤも含み得る。例えば、検出可能な標識が化学発光試薬（例えば、アクリジニウムエステル化合物）である場合、キットは、化学発光のための励起前溶液（pre-excitation solution）および／または励起溶液をさらに含み得る。
別の態様では、本発明は、本発明の抗体またはその抗原結合断片を使用することを含む、試料中のＥＢＶもしくはそのｇＢタンパク質またはＥＢＶ感染細胞の存在またはレベルを検出する方法を提供する。ある特定の実施形態では、ｇＢタンパク質は細胞表面に発現されている。
ある特定の実施形態では、方法は、免疫学的アッセイ、例えば、ウエスタンブロット、酵素免疫アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）、化学発光免疫アッセイ、蛍光免疫アッセイまたは放射免疫アッセイである。
一部の実施形態では、方法は、本発明のコンジュゲートを使用することを含む。
他の実施形態では、方法は、本発明の抗体またはその抗原結合断片を使用することを含む。ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、検出可能な標識を含まない。一部の実施形態では、方法は、抗体またはその抗原結合断片を検出するための検出可能な標識（例えば、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼ）、化学発光試薬（例えば、アクリジニウムエステル、ルミノールもしくはルテニウム誘導体）、蛍光色素（例えば、フルオレセインもしくは蛍光タンパク質）、放射性核種またはビオチン）を有する二次抗体を使用することをさらに含む。
他の実施形態では、方法は、本発明の抗体またはその抗原結合断片を使用することを含む。ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、検出可能な標識を含まない。一部の実施形態では、方法は、抗体またはその抗原結合断片を検出するための検出可能な標識（例えば、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼ）、化学発光試薬（例えば、アクリジニウムエステル、ルミノールもしくはルテニウム誘導体）、蛍光色素（例えば、フルオレセインもしくは蛍光タンパク質）、放射性核種またはビオチン）を有する二次抗体を使用することをさらに含む。
ある特定の実施形態では、二次抗体は、本発明の抗体またはその抗原結合断片が含む定常領域が由来する種（例えば、ウサギまたはヒト）の抗体に特異的である。
ある特定の実施形態では、二次抗体は、抗免疫グロブリン（例えば、ヒトまたはウサギ免疫グロブリン）抗体、例えば、抗ＩｇＧ抗体である。ある特定の実施形態では、二次抗体は、抗ウサギＩｇＧ抗体または抗ヒトＩｇＧ抗体である。
ある特定の実施形態では、方法は：（１）試料を本発明の抗体またはその抗原結合断片と接触させること；（２）抗原抗体免疫複合体の形成を検出することまたは免疫複合体の量を検出すること、を含む。免疫複合体の形成は、ｇＢタンパク質、ＥＢＶまたはＥＢＶ感染細胞の存在を示す。
ある特定の実施形態では、方法は、診断目的のために使用され得る、例えば、対象がＥＢＶに感染しているかどうかは、試料中のＥＢＶまたはそのｇＢタンパク質の存在またはレベルに基づいて診断され得る。そのような実施形態では、試料は、対象（例えば、哺乳動物、好ましくはヒト）由来の体液試料（例えば、全血、血漿、血清、唾液、排泄物または尿）である。
ある特定の実施形態では、方法は診断ではない目的のために使用され得る、例えば試料は対象由来ではなく、例えば、ワクチン試料である。
ある特定の実施形態では、対象はヒトなどの哺乳動物である。
別の態様では、試料中のＥＢＶもしくはそのｇＢタンパク質またはＥＢＶ感染細胞の存在またはレベルを検出するため、および／あるいは、対象がＥＢＶに感染しているかどうかを診断するための検出試薬の調製における本発明の抗体もしくはその抗原結合断片またはコンジュゲートの使用が提供される。
別の態様では、試料中のＥＢＶもしくはそのｇＢタンパク質またはＥＢＶ感染細胞の存在またはレベルを検出するため、および／あるいは、対象がＥＢＶに感染しているかどうかを診断するための検出試薬の調製における本発明の抗体もしくはその抗原結合断片またはコンジュゲートの使用が提供される。
ある特定の実施形態では、方法は、免疫学的アッセイ、例えば、ウエスタンブロット、酵素免疫アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）、化学発光免疫アッセイ、蛍光免疫アッセイまたは放射免疫アッセイである。
ある特定の実施形態では、検出試薬は、上に記載の検出方法によって試料中のＥＢＶもしくはそのｇＢタンパク質、またはＥＢＶに感染した細胞の存在またはレベルを検出し、任意選択で、検出結果から対象がＥＢＶに感染しているかどうかを診断する。
ある特定の実施形態では、試料は、対象（例えば、哺乳動物、好ましくはヒト）由来の体液試料（例えば、全血、血漿、血清、唾液、排泄物または尿）である。
用語の定義
本発明では、他に規定のない限り、本明細書において使用される科学的および技術的用語は、当業者によって一般に理解される意味を有する。加えて、本明細書において使用されるウイルス学、生化学、核酸化学および免疫学の検査手技は、対応する分野において広く使用される日常的な手技である。一方で、本発明をより良好に理解するために、関連する用語の定義および説明を下に提供する。
本発明では、他に規定のない限り、本明細書において使用される科学的および技術的用語は、当業者によって一般に理解される意味を有する。加えて、本明細書において使用されるウイルス学、生化学、核酸化学および免疫学の検査手技は、対応する分野において広く使用される日常的な手技である。一方で、本発明をより良好に理解するために、関連する用語の定義および説明を下に提供する。
本明細書において使用される場合、用語「エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）」、ヒトヘルペスウイルス４型（ＨＨＶ－４）としても周知、は、ヘルペスウイルスファミリーのメンバーであり、最も一般的なヒトウイルスの内の１つである。ＥＢＶのゲノム配列は、当業者に周知であり、ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ＫＦ３７３７３０．１（Ｍ８１株）、ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ＡＢ８２８１９０．１（１ ＬＧＹ－Ｃ６６６－１株）、Ｇｅｎｂａｎｋ ＩＤ：ＫＣ６１７８７５．１（Ｃ６６６－１株）、ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ＪＱ００９３７６．２（ＨＫＮＰＣ１株）など、種々の公共データベースで参照され得る。
本明細書において使用される場合、用語「ｇＢ」または「ｇＢタンパク質」は、ＥＢＶの糖タンパク質を指し、ｇＨおよびｇＬタンパク質と共に、ＥＢＶの細胞への進入を媒介するコア膜融合過程を構成する。融合に関与することに加えて、ＥＢＶ ｇＢは、ウイルスの成熟および放出にも不可欠であり、ｇＢ欠損ウイルスは産生され得ない。ｇＢタンパク質のアミノ酸配列は、当業者に十分周知である（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＦ３７３７３０．１に記載の配列を参照されたい）。
本明細書において使用される場合、ｇＢのアミノ酸配列を参照する場合は、配列番号１７に記載の配列を使用して記載される。例えば、表現「ｇＢタンパク質の３４１～３６２位のアミノ酸残基」は、配列番号１７に記載のポリペプチドの３４１～３６２位のアミノ酸残基を指す。しかし、当業者は、ｇＢのアミノ酸配列において、変異または多様性（これだけに限らないが、置換、欠失および／または付加、例えば、異なる遺伝子型または遺伝子サブタイプのｇＢなどを含む）が、その生物学的機能に影響を与えることなく天然で産生され得るか、または人工的に導入され得ることを理解する。したがって本発明では、用語「ｇＢ」は、例えば、配列番号１７に記載の配列およびその天然または人工バリアントが挙げられる、すべてのそのような配列を含む。ｇＢの配列断片を記載する場合、それは、配列番号１７の配列断片だけでなく、その天然または人工バリアント中の対応する配列断片も含む。例えば、表現「ｇＢタンパク質の３４１～３６２位のアミノ酸残基」は、配列番号１７の３４１～３６２位および、その（天然または人工）バリアント中の対応する断片のアミノ酸残基を含む。本発明により、表現「対応する配列断片」または「対応する断片」は、配列が最適にアラインされる場合に、すなわち配列が最も高い百分率同一性についてアラインされる場合に、比較される配列中の同等の位置の断片を指す。
本明細書において使用される場合、用語「エピトープ」は、特定の抗体によって認識され、特異的に結合され得る抗原の一部を指す。抗原がポリペプチドである場合、エピトープは、連続的なアミノ酸によって、またはタンパク質の三次フォールディングによって集められた非連続的なアミノ酸によって形成される場合があり、それぞれ直鎖状エピトープまたは立体構造エピトープと呼ばれる。連続的なアミノ酸から形成されるエピトープがタンパク質変性において典型的には保持される一方で、三次フォールディングによって形成されるエピトープはタンパク質変性において典型的には失われる。エピトープは、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個の連続的なまたは非連続的なアミノ酸を固有の空間的コンホメーションで典型的には含む。
本明細書において使用される場合、用語「エピトープペプチド」は、エピトープとして作用できる抗原上のペプチドセグメントを指す。一部の場合では、エピトープペプチドは単独で、エピトープに対する抗体によって特異的に認識／結合され得る。他の場合では、エピトープペプチドが特異的抗体によって認識され得るように、エピトープペプチドを担体タンパク質に融合する必要がある場合がある。本明細書において使用される場合、用語「担体タンパク質」は、エピトープペプチドについての担体として作用できる、すなわち、エピトープペプチドが提示され得るように、エピトープペプチドが抗体または免疫系によって認識され得るように、その特定の位置（例えば、タンパク質の中またはＮ末端もしくはＣ末端）でエピトープペプチドが挿入され得るタンパク質を指す。そのような担体タンパク質は、当業者に十分周知であり、例えば、ＨＰＶ Ｌ１タンパク質（ここで、エピトープペプチドは、タンパク質のアミノ酸１３０～１３１の間またはアミノ酸４２６～４２７の間に挿入され得る、Ｓｌｕｐｅｔｚｋｙ，Ｋ．ら、Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ、２００１，８２：２７９９～２８０４；Ｖａｒｓａｎｉ，Ａ．ら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ、２００３、７７：８３８６～８３９３を参照されたい）、ＨＢＶコア抗原（ここで、タンパク質のアミノ酸７９～８１はエピトープペプチドを用いて置き換えられ得る、Ｋｏｌｅｔｚｋｉ，Ｄ．ら、Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、１９９９、３８０：３２５～３３３を参照されたい）、ウッドチャック肝炎ウイルスコアタンパク質（ここで、タンパク質のアミノ酸７９～８１はエピトープペプチドによって置き換えられ得る、Ｓａｂｉｎｅ Ｋｏｎｉｇ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９８、７２（６）：４９９７を参照されたい）、ＣＲＭ１９７タンパク質（ここで、エピトープペプチドはタンパク質またはその断片のＮ－またはＣ末端に連結され得る）が挙げられる。任意選択でリンカーは、エピトープペプチドと担体タンパク質との間で、それぞれのフォールディングを促進するように使用され得る。
本明細書において使用される場合、用語「抗体」は、２対のポリペプチド鎖から通常構成される免疫グロブリン分子を指し、各対は１本の軽鎖（ＬＣ）および１本の重鎖（ＨＣ）を有する。抗体軽鎖は、κ（カッパ）およびλ（ラムダ）軽鎖として分類され得る。重鎖は、μ、δ、γ、αまたはεとして分類でき、抗体のアイソタイプは、それぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥと定義される。軽鎖および重鎖内で可変および定常領域は、約１２個またはそれを超えるアミノ酸の「Ｊ」領域によって繋がれ、重鎖は約３個またはそれを超えるアミノ酸の「Ｄ」領域も含む。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）および重鎖定常領域（ＣＨ）から構成される。重鎖定常領域は、３個のドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬからなる。定常ドメインは、抗体抗原結合に直接関与しないが、免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１の構成成分（Ｃ１ｑ）を含む、宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介するなどの種々のエフェクター機能を示す。ＶＨおよびＶＬ領域も、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるさらに保存された領域が散在した相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる高可変性の領域に細分され得る。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へ次の順：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配置された３個のＣＤＲと４個のＦＲからなる。各重鎖／軽鎖対の可変領域（ＶＨおよびＶＬ）は、抗原結合部位をそれぞれ形成する。各領域またはドメイン中のアミノ酸の配置は、Ｋａｂａｔ、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７および１９９１））またはＣｈｏｔｈｉａ＆Ｌｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１～９１７；の定義、Ｃｈｏｔｈｉａら、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７８～８８３による定義による。
本明細書において使用される場合、用語「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」は、抗原結合に関与する抗体可変領域中のアミノ酸残基を指す。重鎖および軽鎖の可変領域は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と名付けられた３個のＣＤＲをそれぞれ含む。これらのＣＤＲの正確な境界は、当技術分野において周知の種々の番号付けシステムにより定義され得る、例えば、Ｋａｂａｔ番号付けシステム（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９９１）、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けシステム（Ｃｈｏｔｈｉａ＆Ｌｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１～９１７；Ｃｈｏｔｈｉａら、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７８～８８３）またはＩＭＧＴ番号付けシステム（Ｌｅｆｒａｎｃら、Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐａｒａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：５５～７７，２００３）。所与の抗体について当業者は、各番号付けシステムによって定義されたＣＤＲを容易に同定する。同様に、異なる番号付けシステム間の対応関係は、当業者に十分周知である（例えば、Ｌｅｆｒａｎｃら、Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐａｒａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：５５～７７，２００３を参照されたい）。
本発明では、本発明の抗体またはその抗原結合断片に含まれるＣＤＲは、当技術分野において周知の種々の番号付けシステムにより決定され得る。ある特定の実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片に含まれるＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、ＣｈｏｔｈｉａまたはＩＭＧＴ番号付けシステムによって好ましくは決定される。ある特定の実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片に含まれるＣＤＲは、ＩＭＧＴ番号付けシステムによって好ましくは決定される。
本明細書において使用される場合、用語「フレームワーク領域」または「ＦＲ」残基は、上に定義されるＣＤＲ残基以外の抗体可変領域中のアミノ酸残基を指す。
用語「抗体」は、抗体を産生するいかなる具体的な方法にも限定されない。例えば、それは、組換え抗体、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を含む。抗体は、さまざまなアイソタイプのもの、例えば、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４サブタイプ）、ＩｇＡｌ、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭ抗体であり得る。
本明細書において使用される場合、用語、抗体の「抗原結合断片」は、全長抗体が結合する同じ抗原に特異的に結合する能力を保持している、および／または抗原への特異的結合について全長抗体と競合する、全長抗体の断片を含むポリペプチドを指し、これは「抗原結合成分」とも称される。すべての目的についてその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．編、第２版、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８９））を一般に参照されたい。抗体の抗原結合断片は、組換えＤＮＡ技術によって、またはインタクトな抗体の酵素的もしくは化学的切断によって得ることができる。抗原結合断片の非限定的例として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、単一ドメイン抗体、キメラ抗体、線状抗体（linear antibody）、ナノボディ（Ｄｏｍａｎｔｉｓからの技術）、プロボディ（probody）、およびポリペプチドに抗原結合能力を付与するために十分な抗体の一部を少なくとも含むようなポリペプチドが挙げられる。操作された抗体バリアントは、Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、２００５；Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２３：１１２６～１１３６によって概説されている。
本明細書において使用される場合、用語「全長抗体」は、２本の「全長重鎖」および２本の「全長軽鎖」からなる抗体を指す。これらの内「全長重鎖」は、重鎖可変領域（ＶＨ）、重鎖定常領域ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域（ＨＲ）、重鎖定常領域ＣＨ２ドメインおよび重鎖定常領域ＣＨ３ドメインからなるポリペプチド鎖を指し；全長抗体がＩｇＥアイソタイプのものである場合、任意選択で重鎖定常領域ＣＨ４ドメインをさらに含む。好ましくは、「全長重鎖」は、Ｎ末端からＣ末端の方向でＶＨ、ＣＨ１、ＨＲ、ＣＨ２およびＣＨ３からなるポリペプチド鎖である。「全長軽鎖」は、Ｎ末端からＣ末端の方向で軽鎖可変領域（ＶＬ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）からなるポリペプチド鎖である。２対の全長抗体鎖は、ＣＬとＣＨ１との間、および２つの全長重鎖のＨＲの間のジスルフィド結合によって合わせて連結されている。本発明の全長抗体は、ヒトなどの単一の種由来であってよく；キメラ抗体またはヒト化抗体である場合もある。本発明の全長抗体は、ＶＨおよびＶＬ対によってそれぞれ形成された２つの抗原結合部位を含み、これら２つの抗原結合部位は、同じ抗原を特異的に認識／結合する。
本明細書において使用される場合、用語「Ｆｄ」はＶＨおよびＣＨ１ドメインからなる抗体断片を指し；用語「ｄＡｂ断片」はＶＨドメインからなる抗体断片を指し（Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４ ５４６（１９８９））；用語「Ｆａｂ断片」はＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる抗体断片を指し；用語「Ｆ（ａｂ’）２断片」はヒンジ領域でジスルフィド架橋を介して連結された２つのＦａｂ断片を含む抗体断片を指し；用語「Ｆａｂ’断片」はＦ（ａｂ’）２断片中の２つの重鎖断片を連結しているジスルフィド結合を還元することによって得られ、インタクトな軽鎖、および重鎖のＦｄ断片からなる（ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなる）断片を指す。
本明細書において使用される場合、用語「Ｆｖ」は、抗体の単一のアームのＶＬおよびＶＨドメインからなる抗体断片を指す。Ｆｖ断片は、完全な抗原結合部位を形成することができる最小の抗体断片であると一般に考えられている。６個のＣＤＲが抗体に抗原結合特異性を付与すると一般に考えられている。しかし、完全な結合部位のものよりもおそらく低い親和性を有するが、１つの可変領域（例えば、Ｆｄ断片、抗原に対して特異的な３個だけのＣＤＲを含む）でさえ、抗原を認識し、結合することができる。
本明細書において使用される場合、用語「Ｆｃ」は、抗体の第１の重鎖の第２および第３の定常領域を第２の重鎖の第２のおよび第３の定常領域とジスルフィド結合を介して連結することによって形成される抗体断片を指す。抗体のＦｃ断片は、多種多様な異なる機能を有するが、抗原結合には関与しない。
本明細書において使用される場合、用語「ｓｃＦｖ」は、ＶＬおよびＶＨドメインを含む単一のポリペプチド鎖を指し、ここでＶＬとＶＨとは、リンカーを介して繋がれている（例えば、Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６（１９８８）；Ｈｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９～５８８３（１９８８）；およびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ、１１３巻，ＲｏｓｅｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２６９～３１５頁（１９９４）を参照されたい）。そのようなｓｃＦｖ分子は、一般構造：ＮＨ２－ＶＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＯＯＨまたはＮＨ２－ＶＨ－リンカー－ＶＬ－ＣＯＯＨを有し得る。先行技術の好適なリンカーは、反復アミノ酸配列ＧＧＧＧＳまたはそのバリアントからなり得る。例えば、アミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）４を有するリンカーは使用されてよく、そのバリアントも使用され得る（Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、（１９９３）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４～６４４８）。Ａｌｆｔｈａｎら、（１９９５）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８：７２５～７３１、Ｃｈｏｉら、（２００１）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：９４～１０６、Ｈｕら、（１９９６）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６：３０５５～３０６１によって記載された、Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら、（１９９９）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：４１～５６およびＲｏｏｖｅｒｓら、（２００１）、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌによって記載された他のリンカーも本発明において使用され得る。一部の場合では、ｓｃＦｖのＶＨとＶＬとの間にジスルフィド結合がある場合もある。本発明のある特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、２つ以上の単一のｓｃＦｖが抗体を形成するように順に繋がれているジ－ｓｃＦｖを形成できる。本発明のある特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、２つ以上の単一のｓｃＦｖが抗体を形成するように並行して繋がれている（ｓｃＦｖ）２を形成できる。
本明細書において使用される場合、用語「ダイアボディ」は、そのＶＨおよびＶＬドメインが単一のポリペプチド鎖上に発現されているが、同じ鎖の２つのドメイン間を対合させるためには短すぎるリンカーが使用されており、そのためドメインが、別の鎖の相補性ドメインと対合するように、および２つの抗原結合部位を産生するように仕向けられているものを意味する（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４～６４４８（１９９３）およびＰｏｌｊａｋ Ｒ． Ｊ．ら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：１１２１～１１２３（１９９４）を参照されたい）。
本明細書において使用される場合、用語「単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）」は、当業者によって一般に理解される意味を有し、単一のモノマー可変抗体ドメイン（例えば、単一の重鎖可変領域）からなる抗体断片を指し、それは、全長抗体が結合する同じ抗原に特異的に結合する能力を保持している。単一ドメイン抗体はナノボディとも呼ばれる。
上記の各抗体断片は、全長抗体が結合する、および／または抗原に対する特異的結合について全長抗体と競合する同じ抗原に特異的に結合する能力を維持している。
抗体の抗原結合断片（例えば、上に記載の抗体断片）は、当業者に周知の従来の技術（例えば、組換えＤＮＡ技術または酵素的もしくは化学的切断法）を使用して所与の抗体（例えば、本明細書で提供する抗体）から得ることができ、抗体の抗原結合断片はインタクトな抗体のためと同じ様式で特異性についてスクリーニングされ得る。
本明細書において、文脈が他を明確に示さない限り、用語「抗体」を参照する場合、それは、インタクトな抗体だけでなく抗体の抗原結合断片も含む。
本明細書において使用される場合、用語「キメラ抗体」は、その軽鎖および／または重鎖の一部が抗体（特定の種由来でよい、またはある特定の具体的な抗体クラスもしくはサブクラスに属していてよい）由来であり、その軽鎖または／および重鎖の他の部分が別の抗体（同じ種もしくは異なる種由来であってよい、または同じもしくは異なる抗体クラスもしくはサブクラスに属していてよい）由来であるが、いずれの場合でも、標的抗原への結合活性を保持したままである抗体を指す（Ｃａｂｉｌｌｙらへの米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：６８５１ ６８５５（１９８４））。ある特定の実施形態では、用語「キメラ抗体」は、抗体の重鎖および軽鎖可変領域が第１の抗体（例えば、マウス抗体）由来であり、抗体の重鎖および軽鎖定常領域が第２の抗体（例えば、ヒト抗体）由来であるような抗体（例えば、ヒトマウスキメラ抗体）を含み得る。
本明細書において使用される場合、用語「ヒト化抗体」は、そのアミノ酸配列がヒト抗体との配列相同を増加させるように改変されている遺伝的に操作された非ヒト抗体を指す。一般に述べると、ヒト化抗体のＣＤＲ領域のすべてまたは一部は非ヒト抗体（ドナー抗体）由来であり、非ＣＤＲ領域（例えば、可変領域ＦＲおよび／または定常領域）のすべてまたは一部はヒト免疫グロブリン（レセプター抗体（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ））由来である。典型的には、ヒト化抗体の（免疫グロブリンの重鎖および／または軽鎖の）少なくとも１つまたは２つ、しかし通常は３つすべてのアクセプターＣＤＲは、ドナーＣＤＲによって置き換えられる。ＣＤＲを提供する免疫グロブリンは「ドナー」と呼ばれ、フレームワークを提供する免疫グロブリンは「アクセプター」と呼ばれる。一実施形態では、ドナー免疫グロブリンは非ヒト（例えば、ウサギ）抗体であり、アクセプターフレームワークは天然に存在するヒトフレームワークまたはそれと比較して約８５％、９０％、９５％、９９％またはこれより高い同一性を有する配列であってよい。一般にヒト化抗体は、これだけに限らないが、抗原特異性、親和性、反応性などが挙げられるドナー抗体の望ましい特性を保持している。ドナー抗体は、望ましい特性（例えば、抗原特異性、親和性、反応性など）を有するマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類抗体であってよい。
本発明のキメラ抗体またはヒト化抗体は、免疫化された動物（例えば、ウサギ）によって産生されたモノクローナル抗体の配列に従って調製され得る。重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡは、融合細胞または免疫化された動物由来の目的の特定のＢ細胞から得ることができ、標準的な分子生物学技術を使用してヒト免疫グロブリン配列を含むように操作され得る。
キメラ抗体を調製するために、免疫化された動物（例えば、ウサギ）の免疫グロブリン可変領域は、当技術分野において周知の方法（例えば、Ｃａｂｉｌｌｙら、への米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）を使用してヒト免疫グロブリン定常領域に連結され得る。例えば、全長重鎖遺伝子を得るために、ＶＨをコードするＤＮＡは、重鎖定常領域をコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結される。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は、当技術分野において周知であり（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１号－３２４２を参照されたい）、これらの領域を含むＤＮＡ断片は、標準的ＰＣＲによって増幅され得る。重鎖定常領域は、ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤ定常領域であってよいが、ＩｇＧｌまたはＩｇＧ４定常領域が一般に好ましい。例えば、全長軽鎖遺伝子（およびＦａｂ軽鎖遺伝子）を得るために、ＶＬをコードするＤＮＡは、軽鎖定常領域ＣＬをコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結される。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は、当技術分野において周知であり（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１号－３２４２を参照されたい）、これらの領域を含むＤＮＡ断片は、標準的ＰＣＲによって増幅され得る。軽鎖定常領域はκまたはλ定常領域であってよいが、κ定常領域が一般に好ましい。
ヒト化抗体を調製するために、免疫化された動物（例えば、ウサギ）のＣＤＲ領域は、当技術分野において周知の方法（Ｗｉｎｔｅｒへの米国特許第５，２２５，５３９号；Ｑｕｅｅｎら、への米国特許第５，５３０，１０１号；同第５，５８５，０８９号；同第５，６９３，７６２号および同第６，１８０，３７０号；ならびにＬｏ，Ｂｅｎｎｙ，Ｋ．Ｃ．編、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２４８巻，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、２００４を参照されたい）を使用してヒトフレームワーク配列に移植され得る。ヒトフレームワーク配列は、例えば、生殖系列抗体遺伝子由来であり得る。用語「生殖系列抗体遺伝子」は、特定の免疫グロブリンの発現をもたらし得る遺伝子再構成および変異のための成熟工程を受けていない、生物のゲノム中に存在する免疫グロブリンをコードする配列を指す。「重鎖生殖系列遺伝子」は、免疫グロブリンの重鎖をコードする生殖系列抗体遺伝子または遺伝子断片を指し、Ｖ遺伝子（可変）、Ｄ遺伝子（多様性）、Ｊ遺伝子（結合）およびＣ遺伝子（定常）を含み；同様に、表現「軽鎖生殖系列遺伝子」は、免疫グロブリンの軽鎖をコードする生殖系列抗体遺伝子または遺伝子断片を指し、Ｖ遺伝子（可変）、Ｊ遺伝子（結合）およびＣ遺伝子（定常）を含む。本発明では、生殖系列抗体遺伝子または生殖系列抗体遺伝子断片によってコードされるアミノ酸配列は「生殖系列配列」とも呼ばれ、重鎖生殖系列遺伝子によってコードされるアミノ酸配列は重鎖生殖系列配列と呼ばれ、軽鎖生殖系列遺伝子によってコードされるアミノ酸配列は軽鎖生殖系列配列と呼ばれる。生殖系列抗体遺伝子または生殖系列抗体遺伝子断片およびこれらの対応する生殖系列配列は、当業者に十分周知であり、専門データベース（例えば、ＩＭＧＴ、ＵＮＳＷＩｇ、ＮＣＢＩまたはＶＢＡＳＥ２）から得ることができるか、または検索され得る。
本明細書において使用される場合、用語「特異的結合」は、抗体とそれが標的にする抗原との間の反応などの、２つの分子間の非無作為結合反応を指す。特異的結合の相互作用の強度および親和性は、その相互作用についての平衡解離定数（ＫＤ）の用語で表され得る。本発明では、用語「ＫＤ」は、抗体と抗原との間の結合親和性を記載するために使用される、特異的抗体抗原相互作用の平衡解離定数を指す。平衡解離定数が小さいほど、抗体抗原結合は強く、抗体と抗原との間の親和性が高い。２分子間の特異的結合特性は、当技術分野において十分周知の方法を使用して、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ装置において表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して決定され得る。
本明細書において使用される場合、本発明による検出可能な標識は、蛍光、分光法的、光化学的、生化学的、免疫学的、電気的、光学的または化学的手段によって検出可能な任意の物質であり得る。そのような標識は、当技術分野において十分周知であり、その例として、これだけに限らないが、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼなど）、放射性核種（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃもしくは３２Ｐ）、蛍光色素（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フルオレセイン、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、テキサスレッド、ローダミン、量子ドットまたはシアニン色素誘導体（例えば、Ｃｙ７、Ａｌｅｘａ ７５０））、発光物質（化学発光物質、例えば、アクリジニウムエステル化合物、ルミノールおよびその誘導体、ルテニウムテルピリジンなどのルテニウム誘導体）、磁気ビーズ（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標））、熱量測定マーカー、例えばコロイド金または着色ガラスもしくはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、天然ゴムなど）ビーズおよび上記マーカーを用いて修飾されたアビジン（例えば、ストレプトアビジン）への結合のためのビオチンが挙げられる。
本明細書において使用される場合、用語「ベクター」は、ポリヌクレオチドが挿入され得る核酸送達ビヒクルを指す。ベクターが、挿入されたポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質を発現するようにし得る場合、ベクターは発現ベクターと呼ばれる。ベクターは、形質転換、形質導入またはトランスフェクションによって宿主細胞に導入されてよく、それによりそれが保有する遺伝子材料エレメントは、宿主細胞において発現され得る。ベクターは、当業者に十分周知であり、これだけに限らないが：プラスミド；ファージミド；コスミド；人工染色体、例えば、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌の人工染色体（ＢＡＣ）またはＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）；ファージ、例えばλファージまたはＭ１３ファージおよび動物ウイルスが挙げられる。ベクターとして使用され得る動物ウイルスとして、これだけに限らないが、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、パポーバウイルス（例えば、ＳＶ４０）が挙げられる。ベクターは、これだけに限らないが、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択エレメント、およびレポーター遺伝子が挙げられる発現を調節する種々のエレメントを含み得る。加えてベクターは、複製開始点も含み得る。
本明細書において使用される場合、用語「宿主細胞」は、ベクターが導入され得る細胞を指し、これだけに限らないが、原核細胞、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉもしくはＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、真菌細胞、例えば酵母細胞もしくはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、昆虫細胞、例えばＳ２ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞もしくはＳｆ９、または動物細胞、例えば線維芽細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＳＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞もしくはヒト細胞が挙げられる。
本明細書において使用される場合、用語「同一性」は、２つのポリペプチド間、または２つの核酸間の配列のマッチを指して使用される。比較される両方の配列中のある位置が、同じ塩基またはアミノ酸モノマーサブユニットによって占められている（例えば、２つのＤＮＡ分子のそれぞれにおけるある位置がアデニンによって占められているか、または２つのポリペプチドのそれぞれにおけるある位置がリジンによって占められている）場合、分子はその位置で同一である。２つの配列の間の「同一性パーセント」は、２つの配列によって共有されるマッチしている位置の数を比較される位置の数で割り、×１００した関数である。例えば、１０個の位置の内６個がマッチしている場合、２つの配列は６０％の同一性を有する。例えば、ＤＮＡ配列ＣＴＧＡＣＴとＣＡＧＧＴＴとは、５０％の同一性（合計６個の位置の内３個がマッチ）を有する。典型的には、比較は、２つの配列が最大の同一性についてアラインされる場合に行われる。そのような配列比較は、例えば、Ａｌｉｇｎ ｐｒｏｇｒａｍ（ＤＮＡｓｔａｒ、Ｉｎｃ．）などのコンピュータープログラムによって便利に実施され得るＮｅｅｄｌｅｍａｎら、（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３～４５３、の方法を使用して達成され得る。ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれたＥ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ Ｂｉｏｓｃｉ．、４：１１～１７（１９８８））のアルゴリズムも、ＰＡＭ１２０重み付け残基表（weight residue table）、ギャップ長ペナルティ１２およびギャップペナルティ４を使用して、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントを決定するために使用され得る。加えて、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）のＧＡＰプログラムに組み込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ ＭｏＩ Ｂｉｏｌ．４８：４４４～４５３（１９７０））のアルゴリズムは、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２マトリクスまたはＰＡＭ２５０マトリクス、１６、１４、１２、１０、８、６もしくは４のギャップ重み（gap weight）、および１、２、３、４、５もしくは６の長さ重み（length weight）を使用することによって、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントを決定するために使用され得る。
本明細書において使用される場合、用語「保存的置換」は、アミノ酸配列を含むタンパク質／ポリペプチドの予測される特性に悪影響を与えない、または変更しないアミノ酸置換を指す。例えば、保存的置換は、部位特異的変異導入およびＰＣＲ媒介変異導入などの当技術分野において周知の標準的な技術によって導入され得る。保存的アミノ酸置換は、類似の側鎖を有するアミノ酸残基でのアミノ酸残基の置換、例えば、物理的にまたは機能的に同様である（例えば、共有結合または水素結合を形成する能力などを含む、同様のサイズ、形状、電荷、化学的特性を有する）残基を用いたアミノ酸残基の置換を含む。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において明確にされている。これらのファミリーとして、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニンおよびヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシンアミノ酸（ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分枝側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）ならびに芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が挙げられる。したがって、対応するアミノ酸残基を同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基を用いて置き換えることは好ましい。アミノ酸保存的置換を同定するための方法は、当技術分野において十分周知である（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｒｕｍｍｅｌｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：１１８０～１１８７（１９９３）；Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１２（１０）：８７９～８８４（１９９９）；およびＢｕｒｋｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｅｔ ＵＳＡ ９４：４１２～４１７（１９９７）を参照されたい）。
本明細書において参照する２０個の従来のアミノ酸の記載は、従来の慣用法に従う。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ－Ａ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（第２版、Ｅ．Ｓ．ＧｏｌｕｂおよびＤ．Ｒ．Ｇｒｅｎ編、Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．（１９９１））を参照されたい。本発明では、用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、同じ意味を有し、互換的に用いられる。本発明では、アミノ酸は、当技術分野において周知の１文字および３文字の略号によって一般に表される。例えば、アラニンは、ＡまたはＡｌａによって表され得る。
本明細書において使用される場合、用語「薬学的に許容される担体および／または賦形剤」は、当技術分野において十分周知である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．Ｇｅｎｎａｒｏ ＡＲ編、第１９版 Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９５を参照されたい）、対象および活性成分に薬理学的におよび／または生理学的に適合性である担体および／または賦形剤を指し、これだけに限らないが：ｐＨ調整剤、界面活性剤、アジュバント、イオン強度増強剤、希釈剤、浸透圧を維持するための薬剤、吸収を遅らせるための薬剤、保存剤が挙げられる。例えば、ｐＨ調整剤として、これだけに限らないがリン酸緩衝液が挙げられる。界面活性剤として、これだけに限らないが、Ｔｗｅｅｎ－８０などのカチオン性、アニオン性または非イオン性界面活性剤が挙げられる。イオン強度増強剤として、これだけに限らないが、塩化ナトリウムが挙げられる。保存剤として、これだけに限らないが、種々の抗菌および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などが挙げられる。浸透圧を維持するための薬剤として、これだけに限らないが、糖類、ＮａＣｌなどが挙げられる。吸収を遅らせるための薬剤として、これだけに限らないが、モノステアレートおよびゼラチンが挙げられる。希釈剤として、これだけに限らないが、水、水性緩衝液（例えば、緩衝生理食塩水）、アルコールおよびポリオール（例えば、グリセリン）などが挙げられる。保存剤として、これだけに限らないが、種々の抗菌および抗真菌剤、例えば、チメロサール、２－フェノキシエタノール、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などが挙げられる。安定剤は、当業者によって一般に理解される意味を有し、医薬中の活性成分の望ましい活性を安定化することができ、これだけに限らないが、グルタミン酸ナトリウム、ゼラチン、ＳＰＧＡ、糖類（例えば、ソルビトール、マンニトール、デンプン、ショ糖、乳糖、デキストランもしくはグルコース）、アミノ酸（例えば、グルタミン酸、グリシン）、タンパク質（例えば、乾燥乳清、アルブミンもしくはカゼイン）またはこれらの分解産生物（例えば、ラクトアルブミン加水分解物）などが挙げられる。ある特定の例示的実施形態では、薬学的に許容される担体または賦形剤は、滅菌注射可能な液体（例えば、水性または非水性懸濁液または溶液）を含む。ある特定の例示的実施形態では、そのような滅菌注射可能な液体は、注射用水（ＷＦＩ）、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、塩化ナトリウム溶液（例えば、０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ）、ブドウ糖溶液（例えば、５％ブドウ糖）、界面活性剤含有溶液（例えば、０．０１％ポリソルベート２０）、ｐＨ緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、リンゲル液およびこれらの任意の組合せから選択される。
本明細書において使用される場合、用語「予防」は、対象において疾患または障害または症状（例えば、ＥＢＶ感染）の発症を予防するか、または遅らせるために実施される方法を指す。本明細書において使用される場合、用語「処置」は、有益なまたは望ましい臨床結果を得るために実施される方法を指す。本発明の目的のために、有益なまたは望ましい臨床結果として、これだけに限らないが、検出可能または検出不可能であるかに関わらず、症状の軽減、疾患の程度の低減、疾患状態の安定化（すなわち、悪化しない）、疾患進行を遅らせるもしくはゆっくりにする、疾患状態の回復または緩和および症状の軽減（部分的または全体的に関わらず）が挙げられる。加えて「処置」は、処置を受けなかった場合に予測される生存期間と比較した生存期間の延長も指し得る。
本明細書において使用される場合、用語「対象」は、ヒトなどの哺乳動物を指す。ある特定の実施形態では、対象（例えば、ヒト）は、ＥＢＶ感染またはＥＢＶ感染に関連する疾患を有するかまたはそのリスクがある。
本明細書において使用される場合、用語「有効量」は、望ましい効果を達成するか、または少なくとも部分的に達成するために十分な量を指す。例えば、疾患（例えば、ＥＢＶ感染）を予防するための有効量は、疾患（例えば、ＥＢＶ感染）の発症を予防する、抑止するまたは遅らせるために十分な量を指し；疾患を処置するための有効量は、疾患を罹患している患者において既にある疾患またはその合併症を治癒させるか、または少なくとも部分的に予防するために十分な量を指す。そのような有効量を決定することは、当業者の能力の十分範囲内である。例えば、治療用使用のための有効量は、処置される疾患の重症度、患者の自身の免疫系の全般的な状態、年齢、体重および性別などの患者の全般的な状態、薬物の投与の様式ならびに同時に投与される他の処置などに依存する。
本明細書において使用される場合、用語「中和活性」は、ウイルス上の抗原タンパク質に結合する抗体または抗体断片の機能活性を指し、それにより、ウイルスが細胞に感染すること、および／またはウイルス後代の成熟、および／またはウイルス後代の放出、を予防し、中和活性を有する抗体または抗体断片はウイルスの増幅を妨げることができ、それにより、ウイルスの感染を阻害するかまたは除去する。
本発明の有益な効果
本発明のエピトープペプチドおよび組換えタンパク質は、ｉｎ ｖｉｖｏでＥＢＶおよびＥＢＶ感染細胞を有効に除去するための抗体応答を誘導でき、ＥＢＶワクチンに開発される可能性を有する。本発明は、本発明のエピトープペプチドを特異的に認識する／それに結合することができるモノクローナル抗体およびその抗原結合断片も提供する。そのようなモノクローナル抗体およびその抗原結合断片は、ＥＢＶを効率的に中和でき、ＥＢＶが細胞に融合することを阻害し、それによりＥＢＶ感染またはＥＢＶ感染によって生じる疾患の予防および／または処置のために使用され得る。加えて、本発明の抗体は、ＥＢＶまたはそのｇＢタンパク質の特異的な検出のためにも使用でき、ＥＢＶ感染の診断のために臨床的価値を有する。
本発明のエピトープペプチドおよび組換えタンパク質は、ｉｎ ｖｉｖｏでＥＢＶおよびＥＢＶ感染細胞を有効に除去するための抗体応答を誘導でき、ＥＢＶワクチンに開発される可能性を有する。本発明は、本発明のエピトープペプチドを特異的に認識する／それに結合することができるモノクローナル抗体およびその抗原結合断片も提供する。そのようなモノクローナル抗体およびその抗原結合断片は、ＥＢＶを効率的に中和でき、ＥＢＶが細胞に融合することを阻害し、それによりＥＢＶ感染またはＥＢＶ感染によって生じる疾患の予防および／または処置のために使用され得る。加えて、本発明の抗体は、ＥＢＶまたはそのｇＢタンパク質の特異的な検出のためにも使用でき、ＥＢＶ感染の診断のために臨床的価値を有する。
本発明の実施形態は、図面および実施例を参照して以下に詳細に記載されるが、当業者は、以下の図面および実施例が本発明の範囲を限定することよりも本発明を例示するためのみであることを理解する。本発明の種々の目的および有利点は、添付の図面および好ましい実施形態の以下の詳細な記載から当業者に明らかである。
配列情報
本発明に含まれる部分配列についての情報は、下の表１に提供される。
本発明に含まれる部分配列についての情報は、下の表１に提供される。
本発明は、本発明を例示することを意図するが、限定することを意図しない以下の実施例を参照してここに記載される。
他に規定のない限り、本発明において使用される分子生物学実験法および免疫アッセイ法は、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９およびＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｇｕｉｄｅ、第３版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、１９９５によって記載された方法を基本的に参照し；制限酵素は、製品の製造者によって推奨される条件に従って使用した。当業者は、実施例が本発明を例示の方法によって記載し、本発明の範囲を限定することを意図しないことを理解する。
実施例１：抗ＥＢＶ ｇＢタンパク質ウサギモノクローナル抗体の調製
１．１ ＥＢＶ ｇＢタンパク質の調製
ＥＢＶ Ｍ８１株のｇＢタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１７）中のＷＹ１１２～１１３およびＷＬＩＷ１９３～１９６を、ＨＳＶ－１ ｇＢタンパク質のアミノ酸配列中のＨＲ１７７～１７８およびＲＶＥＡ２５８～２６１を用いてそれぞれ置換し、発現されるタンパク質の多型を回避する。置換したｇＢタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２３に記載し、その外部ドメイン（２４～６８３ａａ）を配列番号２４に記載した。
１．１ ＥＢＶ ｇＢタンパク質の調製
ＥＢＶ Ｍ８１株のｇＢタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１７）中のＷＹ１１２～１１３およびＷＬＩＷ１９３～１９６を、ＨＳＶ－１ ｇＢタンパク質のアミノ酸配列中のＨＲ１７７～１７８およびＲＶＥＡ２５８～２６１を用いてそれぞれ置換し、発現されるタンパク質の多型を回避する。置換したｇＢタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２３に記載し、その外部ドメイン（２４～６８３ａａ）を配列番号２４に記載した。
置換したｇＢ外部ドメイン（２４～６８３ａａ）をコードする配列を、ギブソンアセンブリ法を使用することによって真核生物での発現のために使用できるｐＣＤＮＡ３．１発現ベクターで構築し、タンパク質のＣ末端は、親和性クロマトグラフィー精製のための６個のＨｉｓタグタンパク質配列を有した。良好に構築した組換えプラスミドを発現および精製のために２９３Ｆ細胞にトランスフェクトした。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動結果は、ｇＢタンパク質の三量体が３００ＫＤａより長く、モノマーサイズが約１１０ＫＤａであったことを示した。メルカプトエタノールを用いた変性処置後、タンパク質のフューリン切断部位のジスルフィド結合は開き、それぞれ７０ＫＤａおよび４０ＫＤａのサイズを有する２個のサブユニットが形成された。
１．２ ニュージーランドウサギ
１０週齢メスニュージーランドウサギは、Ｓｏｎｇｌｉａｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｆａｒｍ、Ｓｏｎｇｊｉａｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ、Ｓｈａｎｇｈａｉから購入した。
１０週齢メスニュージーランドウサギは、Ｓｏｎｇｌｉａｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｆａｒｍ、Ｓｏｎｇｊｉａｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ、Ｓｈａｎｇｈａｉから購入した。
１．３ 実験用ウサギの免疫処置
Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗら、“ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ １９８８に詳述されている標準的ｉｎ ｖｉｖｏ免疫処置法を使用した。簡潔な手順は次のとおりであった：
上記ステップ１．１で精製した５００μｇのＥＢＶ ｇＢ外部ドメイン（配列番号２４）を等体積のフロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）（ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨから購入、品目番号：Ｆ５８８１）と混合し、２ｍＬの乳剤を得て、首および背中の多点注射を通じて実験用ウサギに投与した。最初の免疫処置の１４日目および２８日目に、上記ステップ１．１で精製したＥＢＶ ｇＢタンパク質５００μｇを等体積のフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）（ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨから購入、品目番号：Ｆ５５０６）と混合し、２ｍＬの乳剤を得て、首および背中の多点注射を通じて実験用ウサギに投与した。最初の免疫処置の４２日目に、全血をウサギの耳の中心動脈を通じて回収し、血清を分離し、ｇＢタンパク質に対する抗体力価を決定した。
Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗら、“ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ １９８８に詳述されている標準的ｉｎ ｖｉｖｏ免疫処置法を使用した。簡潔な手順は次のとおりであった：
上記ステップ１．１で精製した５００μｇのＥＢＶ ｇＢ外部ドメイン（配列番号２４）を等体積のフロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）（ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨから購入、品目番号：Ｆ５８８１）と混合し、２ｍＬの乳剤を得て、首および背中の多点注射を通じて実験用ウサギに投与した。最初の免疫処置の１４日目および２８日目に、上記ステップ１．１で精製したＥＢＶ ｇＢタンパク質５００μｇを等体積のフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）（ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨから購入、品目番号：Ｆ５５０６）と混合し、２ｍＬの乳剤を得て、首および背中の多点注射を通じて実験用ウサギに投与した。最初の免疫処置の４２日目に、全血をウサギの耳の中心動脈を通じて回収し、血清を分離し、ｇＢタンパク質に対する抗体力価を決定した。
ウサギ血清抗体力価決定の結果を図２に示し、結果は血清力価が１０６を超えたことを示した。
１．４ ウサギ末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の調製
ウサギ全血を無血清ＲＰＭＩ１６４０培地を用いて１：１の比で希釈し、末梢血単核細胞をフィコール試薬を使用する密度傾斜遠心分離によって分離し、ウサギ全血の体積の１．５倍のフィコール溶液を遠心チューブの底に入れ、次に希釈したウサギ全血をゆっくり加え、ランプアップ遠心分離（ramp-up centrifugation）を８００ｇ、３０分間、４℃で実施し、遠心分離完了後、フィコールとＲＰＭＩ１６４０培地との間の界面に浮遊した細胞をＰＢＭＣとして回収し、ＰＢＭＣ細胞を１５００ｒｐｍ、５分間、４℃での第２の遠心分離に供し、次いで回収した。
ウサギ全血を無血清ＲＰＭＩ１６４０培地を用いて１：１の比で希釈し、末梢血単核細胞をフィコール試薬を使用する密度傾斜遠心分離によって分離し、ウサギ全血の体積の１．５倍のフィコール溶液を遠心チューブの底に入れ、次に希釈したウサギ全血をゆっくり加え、ランプアップ遠心分離（ramp-up centrifugation）を８００ｇ、３０分間、４℃で実施し、遠心分離完了後、フィコールとＲＰＭＩ１６４０培地との間の界面に浮遊した細胞をＰＢＭＣとして回収し、ＰＢＭＣ細胞を１５００ｒｐｍ、５分間、４℃での第２の遠心分離に供し、次いで回収した。
１．５ 抗ＥＢＶ ｇＢに対する特異的Ｂ細胞スクリーニング
ウサギＣＤ４０Ｌの全長遺伝子配列をｐＬＶ ＣＳ２．０レンチウイルスベクター中に構築し、レンチウイルスパッケージに供し、２９３Ｔ細胞の感染のために使用し、ウサギＣＤ４０Ｌを過発現する安定細胞株２９３Ｔ－ｒＣＤ４０Ｌを、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのウサギＢ細胞の追跡培養のためのフィーダー細胞として構築した。
ウサギＣＤ４０Ｌの全長遺伝子配列をｐＬＶ ＣＳ２．０レンチウイルスベクター中に構築し、レンチウイルスパッケージに供し、２９３Ｔ細胞の感染のために使用し、ウサギＣＤ４０Ｌを過発現する安定細胞株２９３Ｔ－ｒＣＤ４０Ｌを、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのウサギＢ細胞の追跡培養のためのフィーダー細胞として構築した。
単離したウサギＰＢＭＣ細胞を１００μＬの滅菌ＰＢＳ溶液に懸濁し、ビオチン標識ｇＢタンパク質（配列番号２４）を、３ｍｌのウサギ全血ＰＢＭＣあたり１μｇのタンパク質の基準に従って対応する量で加え、ピペッティングによって穏やかに混合し、４℃で３０分間インキュベートした。遠心分離を１５００ｒｐｍ、３分間、４℃で実施し、上清を廃棄し、細胞を保持し、細胞をＰＢＳ中に再懸濁し、２～３回洗浄し、下の表に示す染色系１００μＬを各チューブに加え、４℃、暗所で３０分間インキュベートした。
９６ウエル細胞培養プレートに、プレスクリーニングした２９３Ｔ－ｒＣＤ４０Ｌ細胞を広げた、細胞２×１０４個／ウエル、各ウエルは、１０％ＦＢＳおよび２０ｎｇ／ｍＬヒトインターロイキン２、５０ｎｇ／ｍＬヒトインターロイキン２１を含んで処方された２００μＬのＲＰＭＩ１６４０培地を含んだ。１ウエルあたり細胞２個の基準に従ってＢ細胞を対応する細胞プレートに選別した。培養をインキュベーター中３７℃および５％ＣＯ２で７日間実行し、ＥＢＶ－ｇＢタンパク質への特異的反応性を有する陽性細胞ウエルを間接ＥＬＩＳＡ方法によってスクリーニングした。
陽性細胞ウエルの細胞上清を廃棄し、３００μＬの可溶化溶液を各ウエルに加え、可溶化物をＰＣＲプレートにピペットで移し、逆転写を実施し、次いで、抗体軽鎖および重鎖可変領域配列をそれぞれネステッドＰＣＲによって増幅させた。
対合した重鎖および軽鎖のＰＣＲ産生物を選び出し、核酸回収キットを用いて回収し、配列決定した。配列決定結果を、得られた遺伝子が抗体遺伝子であるかどうか、遺伝子が完全であるかどうか、抗体を良好にコードできるかどうかを決定するため、および抗体遺伝子（Ｖ領域およびＪ領域）が属するファミリーを決定するための比較のためにＩＭＧＴデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／）に送った。
クローニングベクターを消化し、重鎖発現プラスミドベクターの制限部位はＥｃｏＲ Ｉ／ＢａｍＨ Ｉであり、軽鎖発現プラスミドベクターの制限部位はＮｈｅ Ｉ／Ｓａｌ Ｉであった。軽鎖および重鎖可変領域遺伝子を、ギブソンアセンブリ法によってそれぞれ対応する真核生物発現ベクターｐＲＶＲＣＬおよびｐＲＶＲＣＨ中に構築し、ＩｇＫプラスミドおよびＩｇＨプラスミドを得た。ｐＲＶＲＣＨは、ウサギモノクローナル抗体の重鎖定常領域をコードする核酸配列を含有し、ｐＲＶＲＣＬはウサギモノクローナル抗体の軽鎖定常領域をコードする核酸配列を含有した。
発現ベクターを構築後、ＥＢＶ－ｇＢタンパク質に対するウサギモノクローナル抗体を発現するようにリポソーム法によってＨＥＫ２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションを実施した。トランスフェクション１２時間前に、細胞１０４個を９６ウエル細胞培養プレートに播種した；チューブＡ：０．２μｇのＩｇＨプラスミドおよび０．２μｇのＩｇＫプラスミドを１０μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭに加えた；チューブＢ：０．４μＬのＮｏｖｏｚｙｍｅ ＥｘＦｅｃｔ（登録商標）２０００トランスフェクション試薬を１０μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭに加えた。チューブＡおよびチューブＢの内容物をそれぞれ穏やかに混合し、室温に５分間置き、次に希釈したプラスミドを希釈したトランスフェクション試薬に滴下で加え、穏やかに混合し、室温、１０分間インキュベートした。プラスミドトランスフェクション試薬複合体を細胞に滴下で加え、細胞インキュベーターで培養し；４８時間後、細胞上清を回収し、３０００ｒｐｍ、５分間、４℃で遠心分離し、上清を取り、細胞デブリ沈殿物を廃棄した。トランスフェクトした抗体とｇＢタンパク質との反応性を間接的ＥＬＩＳＡ法によって決定した。
１．６ ＥＢＶ ｇＢタンパク質に対するウサギモノクローナル抗体の配列決定
ＥＢＶ－ｇＢタンパク質に特異的な２つのウサギモノクローナル抗体３Ａ３および３Ａ５を上記方法によって得た。配列決定後、３Ａ３および３Ａ５の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を次のとおり決定し、それらのＣＤＲ領域配列をＩＭＧＴデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／）を通じて分析した。３Ａ３および３Ａ５の重鎖可変領域および軽鎖可変領域ならびに対応するＣＤＲ領域のアミノ酸配列を下の表に示す。
ＥＢＶ－ｇＢタンパク質に特異的な２つのウサギモノクローナル抗体３Ａ３および３Ａ５を上記方法によって得た。配列決定後、３Ａ３および３Ａ５の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を次のとおり決定し、それらのＣＤＲ領域配列をＩＭＧＴデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／）を通じて分析した。３Ａ３および３Ａ５の重鎖可変領域および軽鎖可変領域ならびに対応するＣＤＲ領域のアミノ酸配列を下の表に示す。
１．７ ＥＢＶ ｇＢタンパク質に対するウサギモノクローナル抗体の調製
３Ａ３および３Ａ５モノクローナル抗体の強力な発現のために、対数増殖期の懸濁細胞２９３Ｆを調製し、セルシェーカーに置き、１００ｒｐｍ、３７℃、５％ＣＯ２で密度１．５×１０６／ｍＬ、細胞生存率＞９５％まで培養した。４００ｍＬの細胞を取り、トランスフェクション系としての新たな細胞培養フラスコに置いた。チューブＡ：３Ａ３および３Ａ５軽鎖および重鎖を発現する６００μｇのプラスミドを別々に２０ｍＬの懸濁細胞培養培地に加え、振とうし、十分混合した；チューブＢ：１．２ｍｇのＰＥＩトランスフェクション試薬を２０ｍＬの懸濁細胞培養培地に加え、振とうし、十分混合した。チューブＢの溶液をチューブＡに加え、振とうし、十分混合し、室温で、１５分間インキュベートし、次に混合液を４００ｍＬ細胞培養系に加え、セルシェーカーに置き、１００ｒｐｍ、３７℃、５％ＣＯ２で抗体発現のために６日間培養した。培養が完了した後、細胞上清を回収し、４℃で、４０００ｒｐｍ、１０分間インキュベートした。
３Ａ３および３Ａ５モノクローナル抗体の強力な発現のために、対数増殖期の懸濁細胞２９３Ｆを調製し、セルシェーカーに置き、１００ｒｐｍ、３７℃、５％ＣＯ２で密度１．５×１０６／ｍＬ、細胞生存率＞９５％まで培養した。４００ｍＬの細胞を取り、トランスフェクション系としての新たな細胞培養フラスコに置いた。チューブＡ：３Ａ３および３Ａ５軽鎖および重鎖を発現する６００μｇのプラスミドを別々に２０ｍＬの懸濁細胞培養培地に加え、振とうし、十分混合した；チューブＢ：１．２ｍｇのＰＥＩトランスフェクション試薬を２０ｍＬの懸濁細胞培養培地に加え、振とうし、十分混合した。チューブＢの溶液をチューブＡに加え、振とうし、十分混合し、室温で、１５分間インキュベートし、次に混合液を４００ｍＬ細胞培養系に加え、セルシェーカーに置き、１００ｒｐｍ、３７℃、５％ＣＯ２で抗体発現のために６日間培養した。培養が完了した後、細胞上清を回収し、４℃で、４０００ｒｐｍ、１０分間インキュベートした。
上記の細胞上清を０．２２μｍフィルターを用いてろ過した。ＡＫＴＡ装置を作動させ、チューブＡおよびチューブＢを最初に溶液Ａ（２００ｍＭリン酸水素二ナトリウム十二水和物）および溶液Ｂ（１００ｍＭクエン酸一水和物）を用いてそれぞれ洗浄し、プロテインＡカラムを設置した。プロテインＡカラムを溶液Ａを流速８ｍＬ／分で１５分間超用いて平衡化し、装置によって検出したＵＶ値、ｐＨ値および伝導度が安定した後に試料をロードした。試料を流速６～１０ｍＬ／分でロードし、その後ＵＶ値は上昇し、このピークはブレークスルーピークであり、カラムを溶液Ａを用いて持続的に洗浄し、ブレークスルーピーク試料を検出後に回収した。ｐＨ値が変化しなくなった後、溶液Ｂを流速６～１０ｍＬ／分で供給し、その後ｐＨ値は下降し、ＵＶ値は上昇し、このピークは溶出ピークであり、抗体はこの溶出ピークに主に存在し、溶出ピーク試料を検出後に回収した。カラムを溶液Ａを用いて平衡化し、次に経路およびプロテインＡカラムを２０％エタノールで満たし、カラムを取り出し、４℃で保存した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ同定を回収したブレークスルーピークおよび溶出ピーク試料について実施した。精製したモノクローナル抗体を２０ｍＭ ＰＢＳ緩衝液を用いて一晩透析し、ＵＶ分光測定またはＢＣＡによって測定して濃度を決定し、１．５ｍＬチューブにサブパッケージ（subpackage）し、後の使用のために－２０℃で保存した。
実施例２：ｇＢタンパク質との抗ＥＢＶ ｇＢタンパク質ウサギモノクローナル抗体の反応性
２．１ 反応プレートの調製
最終濃度２μｇ／ｍＬのｇＢタンパク質を含むコーティング溶液を調製するために、ｇＢタンパク質（配列番号２４）を５０ｍＭ ＣＢ緩衝液（ＮａＨＣＯ３／Ｎａ２ＣＯ３緩衝液、最終濃度は５０ｍＭであり、ｐＨ値は９．６であった）を用いてｐＨ９．６で希釈した。１００μＬのコーティング溶液を９６ウエルマイクロタイタープレートの各ウエルに加え、３７℃で、２時間コーティングし；ＰＢＳＴ洗浄溶液（２０ｍＭ ＰＢ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）を用いて１回洗浄し；次に、２００μＬのブロッキング溶液（２０％仔ウシ血清および１％カゼインを含有する２０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４緩衝液、ｐＨ７．４）を各ウエルに加え、３７℃で２時間ブロッキングした。ブロッキング溶液を廃棄し、プレートを乾燥させ、後の使用のためにアルミホイルバッグ中、２～８℃で保存した。
２．１ 反応プレートの調製
最終濃度２μｇ／ｍＬのｇＢタンパク質を含むコーティング溶液を調製するために、ｇＢタンパク質（配列番号２４）を５０ｍＭ ＣＢ緩衝液（ＮａＨＣＯ３／Ｎａ２ＣＯ３緩衝液、最終濃度は５０ｍＭであり、ｐＨ値は９．６であった）を用いてｐＨ９．６で希釈した。１００μＬのコーティング溶液を９６ウエルマイクロタイタープレートの各ウエルに加え、３７℃で、２時間コーティングし；ＰＢＳＴ洗浄溶液（２０ｍＭ ＰＢ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）を用いて１回洗浄し；次に、２００μＬのブロッキング溶液（２０％仔ウシ血清および１％カゼインを含有する２０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４緩衝液、ｐＨ７．４）を各ウエルに加え、３７℃で２時間ブロッキングした。ブロッキング溶液を廃棄し、プレートを乾燥させ、後の使用のためにアルミホイルバッグ中、２～８℃で保存した。
２．２ ｇＢタンパク質を用いたウサギモノクローナル抗体３Ａ３および３Ａ５のＥＬＩＳＡ検出
実施例１で得られたモノクローナル抗体３Ａ３および３Ａ５ならびに報告されたモノクローナル抗体ＡＭＭＯ５（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、２０１８、４８：７９９－８１１．ｅ９）を得て、２０ｍＭ ＰＢＳ緩衝液を用いて２倍グラジエント希釈によって、開始濃度として５μｇ／ｍＬから開始して合計１５個のグラジエントで希釈した。上記ステップ２．１でｇＢタンパク質を用いてコートしたマイクロタイタープレートを取り、希釈した試料１００μＬを各ウエルに加え、反応させるために３７℃のインキュベーターに３０分間置いた。マイクロタイタープレートをＰＢＳＴ洗浄溶液（２０ｍＭ ＰＢ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）を用いて５回洗浄し、１００μＬのＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ反応溶液（Ａｂｃａｍから購入、品目番号：ａｂ６７２１）を各ウエルに加え、反応させるために３７℃のインキュベーターに３０分間置いた。酵素標識反応ステップが完了した後、マイクロプレートプレート（ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｐｌａｔｅ）をＰＢＳＴ洗浄溶液（２０ｍＭ ＰＢ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）を用いて５回洗浄し、５０μＬのＴＭＢ発色試薬（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｗａｎｔａｉ Ｂｉｏ－Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入）を各ウエルに加え、反応させるために３７℃のインキュベーターに１５分間置いた。発色反応ステップが完了した後、５０μＬの停止溶液（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｗａｎｔａｉ Ｂｉｏ－Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入）をマイクロプレートプレートの各ウエルに加え、各ウエルのＯＤ４５０／６３０値をマイクロプレートリーダーによって検出した。
実施例１で得られたモノクローナル抗体３Ａ３および３Ａ５ならびに報告されたモノクローナル抗体ＡＭＭＯ５（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、２０１８、４８：７９９－８１１．ｅ９）を得て、２０ｍＭ ＰＢＳ緩衝液を用いて２倍グラジエント希釈によって、開始濃度として５μｇ／ｍＬから開始して合計１５個のグラジエントで希釈した。上記ステップ２．１でｇＢタンパク質を用いてコートしたマイクロタイタープレートを取り、希釈した試料１００μＬを各ウエルに加え、反応させるために３７℃のインキュベーターに３０分間置いた。マイクロタイタープレートをＰＢＳＴ洗浄溶液（２０ｍＭ ＰＢ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）を用いて５回洗浄し、１００μＬのＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ反応溶液（Ａｂｃａｍから購入、品目番号：ａｂ６７２１）を各ウエルに加え、反応させるために３７℃のインキュベーターに３０分間置いた。酵素標識反応ステップが完了した後、マイクロプレートプレート（ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｐｌａｔｅ）をＰＢＳＴ洗浄溶液（２０ｍＭ ＰＢ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）を用いて５回洗浄し、５０μＬのＴＭＢ発色試薬（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｗａｎｔａｉ Ｂｉｏ－Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入）を各ウエルに加え、反応させるために３７℃のインキュベーターに１５分間置いた。発色反応ステップが完了した後、５０μＬの停止溶液（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｗａｎｔａｉ Ｂｉｏ－Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入）をマイクロプレートプレートの各ウエルに加え、各ウエルのＯＤ４５０／６３０値をマイクロプレートリーダーによって検出した。
結果を図３に示す。ｇＢタンパク質に対するウサギモノクローナル抗体３Ａ３、３Ａ５のＥＣ５０値は、それぞれ７．０ｎｇ／ｍＬおよび５．２ｎｇ／ｍＬであり、ｇＢタンパク質に対するヒトモノクローナル抗体ＡＭＭＯ５のＥＣ５０値は、１４．３ｎｇ／ｍＬであった。結果は、上記抗体すべてが精製されたｇＢタンパク質に対して良好な結合活性を有したことを示した。
２．３ ｇＢタンパク質を用いたウサギモノクローナル抗体３Ａ３および３Ａ５のウエスタンブロット検出
ｇＢタンパク質（配列番号２４）試料を還元緩衝液に加え、試料を調製するために１００℃で１０分間加熱し、次いでＳＤＳ－ＰＡＧＥタンパク質電気泳動に供した。
ｇＢタンパク質（配列番号２４）試料を還元緩衝液に加え、試料を調製するために１００℃で１０分間加熱し、次いでＳＤＳ－ＰＡＧＥタンパク質電気泳動に供した。
膜移行：プロテイングルー（ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｌｕｅ）上のタンパク質を膜移行デバイスを使用してニトロセルロース膜に移行させた。
ブロッキング：膜を超純水を用いて１回リンスし、市販のブロッキング溶液－１（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｗａｎｔａｉ Ｂｉｏ－Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入）を加え、室温、２時間インキュベートした。
一次抗体インキュベーション：ブロッキング溶液を廃棄し、抗体を市販の酵素希釈溶液ＥＤ－１３（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｗａｎｔａｉ Ｂｉｏ－Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入）を用いて１μｇ／ｍＬに希釈し、膜に加え、穏やかに振とうし、シェーカー上で室温、１時間インキュベートした。
二次抗体インキュベーション：膜上の未結合一次抗体をＰＢＳＴ洗浄溶液（２０ｍＭ ＰＢ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）を用いて洗浄することによって除去した、すなわち、膜を３回、各回５分間洗浄し、次に希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ反応溶液（Ａｂｃａｍから購入、品目番号：ａｂ６７２１）を加え、穏やかに振とうし、シェーカー上で室温、１時間インキュベートした。
洗浄をＰＢＳＴ洗浄溶液（２０ｍＭ ＰＢ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）を用いて３回、各回５分間実行した。適量の化学発光基質混合物をニトロセルロース膜の表面を覆うように加え、画像化および撮影を化学発光画像化装置で実施した。結果を図４に示した。
図４の結果から、ｇＢタンパク質外部ドメイン（２４～６８３ａａ）の変性処置後、フューリン制限部位近くのジスルフィド結合は破壊され、それぞれ分子量約７０ＫＤａおよび４０ＫＤａを有する２つのタンパク質断片が形成されたと考えられた。すべてのウサギモノクローナル抗体３Ａ３、３Ａ５およびヒトモノクローナル抗体ＡＭＭＯ５は、ｇＢタンパク質を用いるウエスタンブロット検出のために使用され得る。モノクローナル抗体３Ａ３およびＡＭＭＯ５は変性処置後のｇＢタンパク質の外部ドメインの７０ＫＤａ断片を認識でき、モノクローナル抗体３Ａ５は変性処置後のｇＢタンパク質の４０ＫＤａ断片を認識でき、ウサギモノクローナル抗体３Ａ３および３Ａ５がｇＢタンパク質の異なる領域を認識したことを示している。
実施例３：ＥＢＶ ｇＢタンパク質に対するウサギモノクローナル抗体のｇＢタンパク質との親和定数の検出
モノクローナル抗体の抗原への結合の動態分析をＢｉａｃｏｒｅ ８Ｋシステムを使用して実施した。すべてのステップはＰＢＳ緩衝液中で行い、その企業の適合するプロテインＡチップを１μｇ／ｍＬに希釈したモノクローナル抗体を捕捉するために使用し、ＥＢＶ－ｇＢタンパク質（配列番号２４）を検出抗原として使用し、検出の際に抗原を８個のグラジエントに希釈した：２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、６．７５ｎＭ、３．１２５ｎＭ、１．５６２５ｎＭ。検出を次の手順に従って実行した：捕捉、６０秒；分析物、６０秒；解離、６００秒；再生、６０秒。抗体の平衡解離定数を装置によってサポートされているデータ取得および分析ソフトウェアを使用して算出した。
モノクローナル抗体の抗原への結合の動態分析をＢｉａｃｏｒｅ ８Ｋシステムを使用して実施した。すべてのステップはＰＢＳ緩衝液中で行い、その企業の適合するプロテインＡチップを１μｇ／ｍＬに希釈したモノクローナル抗体を捕捉するために使用し、ＥＢＶ－ｇＢタンパク質（配列番号２４）を検出抗原として使用し、検出の際に抗原を８個のグラジエントに希釈した：２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、６．７５ｎＭ、３．１２５ｎＭ、１．５６２５ｎＭ。検出を次の手順に従って実行した：捕捉、６０秒；分析物、６０秒；解離、６００秒；再生、６０秒。抗体の平衡解離定数を装置によってサポートされているデータ取得および分析ソフトウェアを使用して算出した。
結果を図５に示す。ＥＢＶ－ｇＢタンパク質に対する３Ａ３および３Ａ５の平衡解離定数（ＫＤ）は、それぞれ０．８６３ｎＭおよび０．４１１ｎＭであり、ヒトモノクローナル抗体ＡＭＭＯ５のＫＤ値は１．１９ｎＭであり、ウサギモノクローナル抗体３Ａ３、３Ａ５のすべてがｇＢタンパク質に対して高い親和性を有することを示している。
実施例４：細胞によって発現されたｇＢタンパク質のＥＢＶ ｇＢタンパク質に対するウサギモノクローナル抗体を使用した検出
ＭＤＣＫ（ＡＴＣＣから購入、品目番号：ＣＣＬ－３４）を１０ｃｍ細胞培養プレートに播種し、細胞の培養密度が６０～８０％に達したらトランスフェクションを実行した。チューブＡ：野生型ＥＢＶ ｇＢタンパク質の全長遺伝子を含む哺乳動物発現プラスミド３０μｇを２ｍＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭに加えた；チューブＢ：６０μＬのＮｏｖｏｚｙｍｅ ＥｘＦｅｃｔ（登録商標）２０００トランスフェクション試薬を２ｍＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭに加えた。チューブＡおよびチューブＢの内容物をそれぞれ穏やかな混合に供し、室温で、５分間置き、次に、希釈したプラスミドを希釈したトランスフェクション試薬に滴下で加え、穏やかに混合し、室温で、１０分間インキュベートした。プラスミド－トランスフェクション試薬複合体を細胞に滴下で加え、細胞培養インキュベーターで培養した。トランスフェクションの３６時間後、細胞をトリプシンを用いて消化し、９６ウエル細胞培養プレートに１ウエル当たり細胞１０４個の割合で播種し、細胞培養インキュベーターで培養した。９６ウエル細胞培養プレートへの播種の１２時間後、細胞上清を廃棄し、洗浄を１００μＬのＰＢＳを各ウエルに加えることによって１回実施し、ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒド１００μＬを各ウエルに加え、暗所で、１５分間、細胞を固定し、洗浄を１００μＬの２０ｍＭ ＰＢＳを各ウエルに加えることにより３回実施した。ＰＢＳ中３‰Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００ １００μＬを各ウエルに加え、１５分間細胞を透過処理し、洗浄を１００μＬのＰＢＳを各ウエルに加えることによって３回実施した。モノクローナル抗体を２％ＢＳＡを含有するＰＢＳを用いて１μｇ／ｍＬに希釈し、９６ウエル細胞培養プレートに１ウエル当たり１００μＬ加え、室温で、３０分間インキュベートし、１００μＬ ＰＢＳを各ウエルに加えることによって３回洗浄した。蛍光二次抗体Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ロバ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入、品目番号：Ａ－２１２０６）を２％ＢＳＡを含有するＰＢＳを用いて１μｇ／ｍＬに希釈し、９６ウエル細胞培養プレートに１ウエル当たり１００μＬ加え、室温で、３０分間インキュベートし、１００μＬのＰＢＳを各ウエルに加えることによって３回洗浄した。細胞核色素ＤＡＰＩを２％ＢＳＡを含有するＰＢＳを用いて１：２０００の比で希釈し、各ウエルに１ウエルあたり５０μＬ加え、室温で、５分間インキュベートし、１００μＬのＰＢＳを各ウエルに加えることによって３回洗浄した。９６ウエル細胞培養プレートを観察のために蛍光顕微鏡下に置き、結果を撮影した。
ＭＤＣＫ（ＡＴＣＣから購入、品目番号：ＣＣＬ－３４）を１０ｃｍ細胞培養プレートに播種し、細胞の培養密度が６０～８０％に達したらトランスフェクションを実行した。チューブＡ：野生型ＥＢＶ ｇＢタンパク質の全長遺伝子を含む哺乳動物発現プラスミド３０μｇを２ｍＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭに加えた；チューブＢ：６０μＬのＮｏｖｏｚｙｍｅ ＥｘＦｅｃｔ（登録商標）２０００トランスフェクション試薬を２ｍＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭに加えた。チューブＡおよびチューブＢの内容物をそれぞれ穏やかな混合に供し、室温で、５分間置き、次に、希釈したプラスミドを希釈したトランスフェクション試薬に滴下で加え、穏やかに混合し、室温で、１０分間インキュベートした。プラスミド－トランスフェクション試薬複合体を細胞に滴下で加え、細胞培養インキュベーターで培養した。トランスフェクションの３６時間後、細胞をトリプシンを用いて消化し、９６ウエル細胞培養プレートに１ウエル当たり細胞１０４個の割合で播種し、細胞培養インキュベーターで培養した。９６ウエル細胞培養プレートへの播種の１２時間後、細胞上清を廃棄し、洗浄を１００μＬのＰＢＳを各ウエルに加えることによって１回実施し、ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒド１００μＬを各ウエルに加え、暗所で、１５分間、細胞を固定し、洗浄を１００μＬの２０ｍＭ ＰＢＳを各ウエルに加えることにより３回実施した。ＰＢＳ中３‰Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００ １００μＬを各ウエルに加え、１５分間細胞を透過処理し、洗浄を１００μＬのＰＢＳを各ウエルに加えることによって３回実施した。モノクローナル抗体を２％ＢＳＡを含有するＰＢＳを用いて１μｇ／ｍＬに希釈し、９６ウエル細胞培養プレートに１ウエル当たり１００μＬ加え、室温で、３０分間インキュベートし、１００μＬ ＰＢＳを各ウエルに加えることによって３回洗浄した。蛍光二次抗体Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ロバ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入、品目番号：Ａ－２１２０６）を２％ＢＳＡを含有するＰＢＳを用いて１μｇ／ｍＬに希釈し、９６ウエル細胞培養プレートに１ウエル当たり１００μＬ加え、室温で、３０分間インキュベートし、１００μＬのＰＢＳを各ウエルに加えることによって３回洗浄した。細胞核色素ＤＡＰＩを２％ＢＳＡを含有するＰＢＳを用いて１：２０００の比で希釈し、各ウエルに１ウエルあたり５０μＬ加え、室温で、５分間インキュベートし、１００μＬのＰＢＳを各ウエルに加えることによって３回洗浄した。９６ウエル細胞培養プレートを観察のために蛍光顕微鏡下に置き、結果を撮影した。
結果を図６に示す。３Ａ３、３Ａ５およびＡＭＭＯ５の検出結果は、緑色蛍光がｇＢタンパク質を発現しているＭＤＣＫ細胞の細胞膜および細胞質に分布していたことを示している。上記の結果は、３Ａ３および３Ａ５が細胞上に発現されたｇＢタンパク質への特異的結合活性を有し、３Ａ３および３Ａ５が細胞膜表面上に発現された天然ｇＢタンパク質を認識できたことを示している。
実施例５：ウイルス感染モデルにおけるＥＢＶ ｇＢタンパク質に対するウサギモノクローナル抗体の中和活性の分析
ＥＢＶのＢ細胞中和モデル：
モノクローナル抗体３Ａ３、３Ａ５、報告されたモノクローナル抗体ＡＭＭＯ５および対照ウサギモノクローナル抗体１Ｅ１２（ｇＢタンパク質に対する非中和ウサギモノクローナル抗体、そのＶＨおよびＶＬのヌクレオチド配列は配列番号２８～２９にそれぞれ記載された）を取り、ＲＰＭＩ１６４０無血清培地を用いて２倍グラジエント希釈によって、初期濃度として１００μｇ／ｍＬから開始して合計１５個のグラジエントで希釈した。５０μＬの希釈した抗体を取り、９６ウエル細胞プレートに加え、ＣＮＥ２細胞によって産生された、ＧＦＰ緑色蛍光タンパク質遺伝子を保有するウイルスの希釈溶液２０μＬを加え、十分混合し、３７℃のインキュベーターにおいて２時間培養した。ＡＫＡＴＡ細胞１×１０６個（ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｓｕｎ Ｙａｔ－ｓｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙから贈られた）を１３ｍＬの１０％ＦＢＳ ＲＰＭＩ１６４０培地で再懸濁し、１３０μＬの細胞懸濁物をウイルスおよび抗体の混合液に加え、３７℃のインキュベーターにおいて４８時間インキュベートし、ＢＤ ｃｏｍｐａｎｙのフローサイトメーターＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａＸ－２０をＡＫＡＴＡ細胞のウイルス感染率を検出するために使用し、感染対照群と比較した抗体処置群でのＧＦＰ陽性細胞の数の低下率（％）を算出し、Ｂ細胞感染モデルでの抗体の阻害率（％）を算出した。
ＥＢＶのＢ細胞中和モデル：
モノクローナル抗体３Ａ３、３Ａ５、報告されたモノクローナル抗体ＡＭＭＯ５および対照ウサギモノクローナル抗体１Ｅ１２（ｇＢタンパク質に対する非中和ウサギモノクローナル抗体、そのＶＨおよびＶＬのヌクレオチド配列は配列番号２８～２９にそれぞれ記載された）を取り、ＲＰＭＩ１６４０無血清培地を用いて２倍グラジエント希釈によって、初期濃度として１００μｇ／ｍＬから開始して合計１５個のグラジエントで希釈した。５０μＬの希釈した抗体を取り、９６ウエル細胞プレートに加え、ＣＮＥ２細胞によって産生された、ＧＦＰ緑色蛍光タンパク質遺伝子を保有するウイルスの希釈溶液２０μＬを加え、十分混合し、３７℃のインキュベーターにおいて２時間培養した。ＡＫＡＴＡ細胞１×１０６個（ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｓｕｎ Ｙａｔ－ｓｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙから贈られた）を１３ｍＬの１０％ＦＢＳ ＲＰＭＩ１６４０培地で再懸濁し、１３０μＬの細胞懸濁物をウイルスおよび抗体の混合液に加え、３７℃のインキュベーターにおいて４８時間インキュベートし、ＢＤ ｃｏｍｐａｎｙのフローサイトメーターＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａＸ－２０をＡＫＡＴＡ細胞のウイルス感染率を検出するために使用し、感染対照群と比較した抗体処置群でのＧＦＰ陽性細胞の数の低下率（％）を算出し、Ｂ細胞感染モデルでの抗体の阻害率（％）を算出した。
ＥＢＶの上皮細胞中和モデル：
ＨＮＥ１細胞（ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｓｕｎ Ｙａｔ－ｓｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙから贈られた）を体積１６０μＬ中、細胞５０００個／ウエルの基準に従って１０％ＦＢＳ ＤＭＥＭ培地を使用して９６ウエルプレートに予め蒔き、３７℃のインキュベーターで２４時間培養した。壁に細胞が接着した後、モノクローナル抗体をＤＭＥＭ０無血清培地を用いて２倍グラジエント希釈によって、初期濃度として１００μｇ／ｍＬから開始して合計１５個のグラジエントで希釈した。さまざまな濃度の２０μＬの希釈した抗体をピペッティングし、ＡＫＡＴＡ細胞によって産生された２０μＬのＥＢＶウイルス懸濁物と十分に混合し、３７℃で、３時間インキュベートし、抗体およびウイルスの混合液を、ＨＮＥ１細胞をコートした９６ウエルプレートに加え、３７℃のインキュベーターで４８時間培養し、次に９６ウエルプレート中のＨＮＥ１細胞を消化し、ＧＦＰ緑色蛍光タンパク質を発現しているＨＮＥ１細胞の割合をＢＤ ｃｏｍｐａｎｙのフローサイトメーターＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａＸ－２０によって検出し、感染対照群と比較した抗体処置群でのＧＦＰ陽性細胞の数の低下率（％）を算出し、上皮細胞感染モデルでの抗体の阻害率（％）を算出した。
ＨＮＥ１細胞（ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｓｕｎ Ｙａｔ－ｓｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙから贈られた）を体積１６０μＬ中、細胞５０００個／ウエルの基準に従って１０％ＦＢＳ ＤＭＥＭ培地を使用して９６ウエルプレートに予め蒔き、３７℃のインキュベーターで２４時間培養した。壁に細胞が接着した後、モノクローナル抗体をＤＭＥＭ０無血清培地を用いて２倍グラジエント希釈によって、初期濃度として１００μｇ／ｍＬから開始して合計１５個のグラジエントで希釈した。さまざまな濃度の２０μＬの希釈した抗体をピペッティングし、ＡＫＡＴＡ細胞によって産生された２０μＬのＥＢＶウイルス懸濁物と十分に混合し、３７℃で、３時間インキュベートし、抗体およびウイルスの混合液を、ＨＮＥ１細胞をコートした９６ウエルプレートに加え、３７℃のインキュベーターで４８時間培養し、次に９６ウエルプレート中のＨＮＥ１細胞を消化し、ＧＦＰ緑色蛍光タンパク質を発現しているＨＮＥ１細胞の割合をＢＤ ｃｏｍｐａｎｙのフローサイトメーターＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａＸ－２０によって検出し、感染対照群と比較した抗体処置群でのＧＦＰ陽性細胞の数の低下率（％）を算出し、上皮細胞感染モデルでの抗体の阻害率（％）を算出した。
結果を図７に示した、上皮細胞感染モデルでのモノクローナル抗体３Ａ３および３Ａ５のＩＣ５０値は、それぞれ０．０７μｇ／ｍＬおよび０．３１μｇ／ｍＬであった、上皮細胞感染モデルでのＡＭＭＯ５のＩＣ５０値は０．１３μｇ／ｍＬであり；Ｂ細胞感染モデルでの３Ａ３および３Ａ５のＩＣ５０値はそれぞれ２．９７μｇ／ｍＬおよび４．９０μｇ／ｍＬであり、Ｂ感染モデルでのＡＭＭＯ５のＩＣ５０値は３６．６０μｇ／ｍＬであり、モノクローナル抗体３Ａ３および３Ａ５が２つの感染モデルにおいてウイルス感染の完全な中和を達成できたことを示している。
実施例６：細胞融合モデルでのＥＢＶ ｇＢタンパク質に対するウサギモノクローナル抗体の遮断能力の分析
２９３Ｔ細胞を１０ｃｍ細胞培養プレートに播種し、細胞の培養密度が６０～８０％に達したらトランスフェクトした。手順：プレートＡ：ＰＥＩをトランスフェクション試薬として使用し、全長ｇＢ、ｇＨ、ｇＬをコードする遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ ＩＤ：ＫＦ３７３７３０．１を参照）およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを保有する、２．５μｇの量の真核生物発現プラスミドをそれぞれ調製し、トランスフェクションのために使用した；プレートＢ：ＰＥＩをトランスフェクション試薬として使用し、Ｔ７プロモーターによって調節されるルシフェラーゼ遺伝子を含む１０μｇの真核生物発現プラスミドを２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。
２９３Ｔ細胞を１０ｃｍ細胞培養プレートに播種し、細胞の培養密度が６０～８０％に達したらトランスフェクトした。手順：プレートＡ：ＰＥＩをトランスフェクション試薬として使用し、全長ｇＢ、ｇＨ、ｇＬをコードする遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ ＩＤ：ＫＦ３７３７３０．１を参照）およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを保有する、２．５μｇの量の真核生物発現プラスミドをそれぞれ調製し、トランスフェクションのために使用した；プレートＢ：ＰＥＩをトランスフェクション試薬として使用し、Ｔ７プロモーターによって調節されるルシフェラーゼ遺伝子を含む１０μｇの真核生物発現プラスミドを２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。
トランスフェクション２４時間後、プレートＡ上の２９３Ｔ細胞を消化し、ＥＰチューブに各群細胞２×１０５個の割合でサブパッケージし、さまざまな濃度の２００μＬの抗体を加え、３７℃インキュベーターにおいて３０分間インキュベートし、次に２４ウエルプレートに移した。プレートＢ上の細胞を予め消化し、細胞２×１０５個を上記の２４ウエルプレートの各ウエルに加え、３７℃、２４時間培養した。
Ｐｒｏｍｅｇａ ｃｏｍｐａｎｙのＤｕａｌ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ ｋｉｔのホタルルシフェラーゼ基質１００μＬを２４ウエルプレートに加え、溶解を室温で、２０分間実施し、蛍光定量的検出のために各ウエルから８０μＬの細胞可溶化物上清を取った。未処置対照ウエルと比較した抗体処置群における蛍光読み取り値の低下率を算出し、細胞融合モデルでの抗体の遮断効率（％）を算出した。
結果を図８に示した。結果は、モノクローナル抗体３Ａ３および３Ａ５が細胞融合モデルで濃度依存的遮断効果を有していたことを示し、それらが、細胞膜融合に特異的遮断効果を有し、同じ濃度条件下で、３Ａ３および３Ａ５の膜融合阻害効果がＡＭＭＯ５のものよりも良好であったことを示した。
実施例７：動物モデルでのＥＢＶ ｇＢタンパク質に対するウサギモノクローナル抗体の防御効果の分析
ＡＫＡＴＡ細胞由来のＥＢＶを取り、１０００ ＴＤ５０（形質転換単位（Transform unit）用量）の用量で３００μｇの抗体と４℃で混合し、一晩、４℃でインキュベートし、混合物をヒト臍帯血から単離した１０７個の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に加え、３７℃で、１時間インキュベートし、次に４～５週齢ＮＳＧ免疫不全マウス（Ｂｅｉｊｉｎｇ ＩＤＭＯ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入）の腹腔に注射した。マウスの眼窩血を注射後０日目、１４日目、２８日目および４２日目に回収し、ウイルスコピー数を検出した。ＰＢＭＣ注射後７日目にヒトＴ細胞を標的にするＯＫＴ３抗体（Ｎｏｂｉｍｐｅｘから購入、品目番号：Ｂ１０４－０００５）をＰＢＭＣ中のヒトＴ細胞によるエプスタイン・バーウイルスの非特異的クリアランスを遮断するためにマウスに腹腔内注射した。ＰＢＭＣ注射後６５日目に、ＮＳＧマウスを安楽死させ、脾臓のサイズにおける変化およびがん性組織の外観を観察した。回収したマウス末梢血中のＥＢＶ ＤＮＡのコピー数をリアルタイム蛍光定量的ＰＣＲによって同定するために、ＥＢＶ ＢＡＲＦ５特異的プライマー（上流プライマー：ＧＧＴＣＡＣＡＡＴＣＴＣＣＡＣＧＣＴＧＡ；下流プライマー：ＣＡＡＣＧＡＧＧＣＴＧＡＣＣＴＧＡＴＣＣ）を使用した。市販のキット（Ｚｈｏｎｇｓｈａｎ Ｊｉｎｑｉａｏから購入、カタログ番号：ＩＳＨ－７００１）を、脾臓にウイルスがあったかどうかを同定するために脾臓組織切片でのＥＢＥＲインサイツハイブリダイゼーション検出を実施するために使用した。
ＡＫＡＴＡ細胞由来のＥＢＶを取り、１０００ ＴＤ５０（形質転換単位（Transform unit）用量）の用量で３００μｇの抗体と４℃で混合し、一晩、４℃でインキュベートし、混合物をヒト臍帯血から単離した１０７個の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に加え、３７℃で、１時間インキュベートし、次に４～５週齢ＮＳＧ免疫不全マウス（Ｂｅｉｊｉｎｇ ＩＤＭＯ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入）の腹腔に注射した。マウスの眼窩血を注射後０日目、１４日目、２８日目および４２日目に回収し、ウイルスコピー数を検出した。ＰＢＭＣ注射後７日目にヒトＴ細胞を標的にするＯＫＴ３抗体（Ｎｏｂｉｍｐｅｘから購入、品目番号：Ｂ１０４－０００５）をＰＢＭＣ中のヒトＴ細胞によるエプスタイン・バーウイルスの非特異的クリアランスを遮断するためにマウスに腹腔内注射した。ＰＢＭＣ注射後６５日目に、ＮＳＧマウスを安楽死させ、脾臓のサイズにおける変化およびがん性組織の外観を観察した。回収したマウス末梢血中のＥＢＶ ＤＮＡのコピー数をリアルタイム蛍光定量的ＰＣＲによって同定するために、ＥＢＶ ＢＡＲＦ５特異的プライマー（上流プライマー：ＧＧＴＣＡＣＡＡＴＣＴＣＣＡＣＧＣＴＧＡ；下流プライマー：ＣＡＡＣＧＡＧＧＣＴＧＡＣＣＴＧＡＴＣＣ）を使用した。市販のキット（Ｚｈｏｎｇｓｈａｎ Ｊｉｎｑｉａｏから購入、カタログ番号：ＩＳＨ－７００１）を、脾臓にウイルスがあったかどうかを同定するために脾臓組織切片でのＥＢＥＲインサイツハイブリダイゼーション検出を実施するために使用した。
結果を図９に示した。図９Ａは動物モデルの処置工程の模式図を示す。図９Ｂは各抗体処置群におけるマウスの生存率を示す。図９Ｃは各抗体処置群におけるマウスの末梢血中のＥＢＶ ＤＮＡコピー数を示す。図９Ｄは各抗体処置群におけるマウスの安楽死後の脾臓サイズを示す。図９Ｅは各抗体処置群におけるマウスの脾臓組織切片のＥＢＥＲインサイツハイブリダイゼーション検出結果を示す。モノクローナル抗体３Ａ３および３Ａ５を用いて処置したマウスの生存率が１００％に達し、報告されたモノクローナル抗体ＡＭＭＯ５および対照ウサギモノクローナル抗体１Ｅ１２のものよりも顕著に良好であったことが図から観察できる（図９Ｂ）。経時的に、３Ａ３、３Ａ５およびＡＭＭＯ５を用いた処置したマウスの末梢血中のＥＢＶ ＤＮＡコピー数は、減少傾向を示した。抗体処置後６週目に、対照抗体１Ｅ１２処置群と比較して、３Ａ３、３Ａ５およびＡＭＭＯ５処置群のＤＮＡコピー数は、低いレベルにあった（図９Ｃ）。同時に、実験の終了時にマウスを安楽死させた後に、対照抗体群の脾臓は明らかな肥大および病変を示した（図９Ｄ）。同時に、ＥＢＶのＥＢＥＲの存在をＲＮＡインサイツハイブリダイゼーション法によって検出し（図９Ｅ）、脾臓組織中のウイルスの存在を示していた。しかし、３Ａ３、３Ａ５およびＡＭＭＯ５モノクローナル抗体を用いて処置したマウスの脾臓は、正常な形状およびサイズを維持しており（図９Ｄ）、ＥＢＥＲは検出されず（図９Ｅ）、脾臓でのウイルス含有量が低かったか、またはウイルスがなかったことを示していた。上記の結果は、３Ａ３および３Ａ５が動物におけるウイルス感染の遮断に良好な効果を有したことを示した。
実施例８：ＥＢＶ ｇＢタンパク質に対するウサギモノクローナル抗体とＥＢＶ ｇＢタンパク質に対する報告された中和抗体とのエピトープ競合の同定
８．１ 西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート抗体の調製
１ｍｇ／ｍＬの濃度で１ｍｇの標的抗体を調製し、ＣＢ緩衝液（ＮａＨＣＯ３／Ｎａ２ＣＯ３緩衝液、最終濃度は５０ｍＭであり、ｐＨは９．６であった）に対して４℃で透析し、媒体交換を４時間ごとに合計２回実施した。ＨＲＰ乾燥粉末およびＮａＩＯ４乾燥粉末を超純水中それぞれ２０ｍｇ／ｍＬに溶解し、次に２つの溶液を体積比１：１で十分混合し、ＨＲＰ活性化を４℃、暗所、３０分間のインキュベーションによって実施した。ＨＲＰ活性化をエチレングリコールを加えることによって停止させ、ここでエチレングリコールは、２０μＬのエチレングリコールを２０ｍｇのＨＲＰに加える基準に従って対応する量で加え、インキュベーションを暗所で３０分間実施した。活性化を停止した後に１ｍｇのＨＲＰを抗体溶液に加え、十分混合し、次にＣＢ緩衝液に対して４℃で透析し、媒体交換を４時間ごとに１回、合計２回実施した。超純水を２０ｍｇ／ｍＬの濃度のＮａＢＨ４溶液を調製するために使用し、１０μＬのＮａＢＨ４溶液を上記抗体溶液に加え、酵素標識反応を終結させた。４℃の条件下で混合を３０分間ごとに１回、合計３回実施した。等量の飽和硫酸アンモニウム溶液を加えて酵素標識抗体を沈降させ、遠心分離を１２，０００ｒｐｍ、１０分間実施し、上清を廃棄し、飽和硫酸アンモニウムで沈殿させた抗体を、ＰＢＳ緩衝液を用いて調製され、グリセリンを最終濃度５０％で、および１０％ＮＢＳ（新生仔ウシ血清）を含有する緩衝液に再懸濁し、溶解させた。
８．１ 西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート抗体の調製
１ｍｇ／ｍＬの濃度で１ｍｇの標的抗体を調製し、ＣＢ緩衝液（ＮａＨＣＯ３／Ｎａ２ＣＯ３緩衝液、最終濃度は５０ｍＭであり、ｐＨは９．６であった）に対して４℃で透析し、媒体交換を４時間ごとに合計２回実施した。ＨＲＰ乾燥粉末およびＮａＩＯ４乾燥粉末を超純水中それぞれ２０ｍｇ／ｍＬに溶解し、次に２つの溶液を体積比１：１で十分混合し、ＨＲＰ活性化を４℃、暗所、３０分間のインキュベーションによって実施した。ＨＲＰ活性化をエチレングリコールを加えることによって停止させ、ここでエチレングリコールは、２０μＬのエチレングリコールを２０ｍｇのＨＲＰに加える基準に従って対応する量で加え、インキュベーションを暗所で３０分間実施した。活性化を停止した後に１ｍｇのＨＲＰを抗体溶液に加え、十分混合し、次にＣＢ緩衝液に対して４℃で透析し、媒体交換を４時間ごとに１回、合計２回実施した。超純水を２０ｍｇ／ｍＬの濃度のＮａＢＨ４溶液を調製するために使用し、１０μＬのＮａＢＨ４溶液を上記抗体溶液に加え、酵素標識反応を終結させた。４℃の条件下で混合を３０分間ごとに１回、合計３回実施した。等量の飽和硫酸アンモニウム溶液を加えて酵素標識抗体を沈降させ、遠心分離を１２，０００ｒｐｍ、１０分間実施し、上清を廃棄し、飽和硫酸アンモニウムで沈殿させた抗体を、ＰＢＳ緩衝液を用いて調製され、グリセリンを最終濃度５０％で、および１０％ＮＢＳ（新生仔ウシ血清）を含有する緩衝液に再懸濁し、溶解させた。
８．２ 反応プレートの調製
ｇＢタンパク質（配列番号２４）をＣＢ緩衝液（ＮａＨＣＯ３／Ｎａ２ＣＯ３緩衝液、最終濃度は５０ｍＭであり、ｐＨは９．６であった）を用いて希釈し、最終濃度は０．１μｇ／ｍＬであった。１００μＬのコーティング溶液を９６ウエルマイクロタイタープレートの各ウエルに加え、コーティングを３７℃、２時間実施した。洗浄をＰＢＳＴ洗浄溶液（２０ｍＭ ＰＢ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）を用いて１回実施した。次に２００μＬのブロッキング溶液（２０％仔牛血清および１％カゼインを含有する２０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４緩衝液、ｐＨ７．４）を各ウエルに加え、３７℃で、２時間置き、ブロッキング溶液を廃棄した。乾燥後、後の使用のためにアルミホイルバッグ中にパッケージし、２～８℃で保存した。
ｇＢタンパク質（配列番号２４）をＣＢ緩衝液（ＮａＨＣＯ３／Ｎａ２ＣＯ３緩衝液、最終濃度は５０ｍＭであり、ｐＨは９．６であった）を用いて希釈し、最終濃度は０．１μｇ／ｍＬであった。１００μＬのコーティング溶液を９６ウエルマイクロタイタープレートの各ウエルに加え、コーティングを３７℃、２時間実施した。洗浄をＰＢＳＴ洗浄溶液（２０ｍＭ ＰＢ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）を用いて１回実施した。次に２００μＬのブロッキング溶液（２０％仔牛血清および１％カゼインを含有する２０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４緩衝液、ｐＨ７．４）を各ウエルに加え、３７℃で、２時間置き、ブロッキング溶液を廃棄した。乾燥後、後の使用のためにアルミホイルバッグ中にパッケージし、２～８℃で保存した。
８．３ ｇＢタンパク質中和抗体のエピトープ競合検出
本実施例のステップ８．１のとおり調製した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート抗体標識モノクローナル抗体３Ａ３、３Ａ５およびＡＭＭＯ５を取り、２０ｍＭ ＰＢＳ緩衝液を用いて５倍グラジエント希釈によって、１：１００の比から開始して合計８個のグラジエントで希釈した。上記ステップ８．２のｇＢタンパク質を用いてコーティングしたマイクロタイタープレートを取り、１００μＬの希釈した試料を各ウエルに加え、３７℃インキュベーターに置いて３０分間反応させた。マイクロタイタープレートをＰＢＳＴ洗浄溶液（２０ｍＭ ＰＢ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）を用いて５回洗浄し、５０μＬのＴＭＢ発色試薬（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｗａｎｔａｉ Ｂｉｏ－Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入）を各ウエルに加え、３７℃インキュベーターに置いて１５分間反応させた。発色反応ステップの完了後、５０μＬの停止溶液（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｗａｎｔａｉ Ｂｉｏ－Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入）を反応後のマイクロプレートプレートの各ウエルに加え、各ウエルのＯＤ４５０／６３０値をマイクロプレートリーダーで検出した。約１のＯＤ値に対応するＨＲＰ標識抗体の希釈倍率を続く使用のための希釈倍率として使用した。
本実施例のステップ８．１のとおり調製した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート抗体標識モノクローナル抗体３Ａ３、３Ａ５およびＡＭＭＯ５を取り、２０ｍＭ ＰＢＳ緩衝液を用いて５倍グラジエント希釈によって、１：１００の比から開始して合計８個のグラジエントで希釈した。上記ステップ８．２のｇＢタンパク質を用いてコーティングしたマイクロタイタープレートを取り、１００μＬの希釈した試料を各ウエルに加え、３７℃インキュベーターに置いて３０分間反応させた。マイクロタイタープレートをＰＢＳＴ洗浄溶液（２０ｍＭ ＰＢ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）を用いて５回洗浄し、５０μＬのＴＭＢ発色試薬（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｗａｎｔａｉ Ｂｉｏ－Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入）を各ウエルに加え、３７℃インキュベーターに置いて１５分間反応させた。発色反応ステップの完了後、５０μＬの停止溶液（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｗａｎｔａｉ Ｂｉｏ－Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入）を反応後のマイクロプレートプレートの各ウエルに加え、各ウエルのＯＤ４５０／６３０値をマイクロプレートリーダーで検出した。約１のＯＤ値に対応するＨＲＰ標識抗体の希釈倍率を続く使用のための希釈倍率として使用した。
モノクローナル抗体３Ａ３、３Ａ５、報告された抗体７２Ａ１（ＥＢＶ ｇｐ３５０糖タンパク質に対するマウスモノクローナル抗体、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、１９８０、７７：２９７９－８３）およびＡＭＭＯ５を取り、２０ｍＭ ＰＢＳ緩衝液を用いて１０μｇ／ｍＬに希釈し、ｇＢタンパク質を用いてコーティングしたマイクロタイタープレートを取り、１００μＬの希釈した抗体試料（「一次抗体」と名付ける）を各ウエルに加え、３７℃インキュベーターに置いて３０分間反応させた。マイクロタイタープレートをＰＢＳＴ洗浄溶液（２０ｍＭ ＰＢ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）を用いて５回洗浄し、１００μＬの希釈したＨＲＰ標識抗体（「二次抗体」と名付けた）を各ウエルに加え、３７℃インキュベーターに置いて３０分間反応させた。ＨＲＰ標識抗体反応ステップの完了後、マイクロタイタープレートをＰＢＳＴ洗浄溶液（２０ｍＭ ＰＢ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）を用いて５回洗浄し、５０μＬのＴＭＢ発色試薬（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｗａｎｔａｉ Ｂｉｏ－Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入）を各ウエルに加え、３７℃インキュベーターに置いて１５分間反応させた。発色反応ステップの完了後、５０μＬの停止溶液（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｗａｎｔａｉ Ｂｉｏ－Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入）を反応後のマイクロプレートプレートの各ウエルに加え、各ウエルのＯＤ４５０／６３０値をマイクロプレートリーダーで検出し、競合率を算出した。抗体の競合率を算出するための式は：
競合率％＝［ＯＤ（－一次／＋二次）－ＯＤ（＋一次／＋二次）］／ＯＤ（－一次／＋二次）×１００
であった。
競合率％＝［ＯＤ（－一次／＋二次）－ＯＤ（＋一次／＋二次）］／ＯＤ（－一次／＋二次）×１００
であった。
抗体における競合率を図１０に示した。結果は、スクリーニングされ、得られたウサギモノクローナル抗体３Ａ３および３Ａ５の認識エピトープが報告されたｇＢ中和抗体ＡＭＭＯ５および７２Ａ１のものとは異なっていたことを示し、ウサギモノクローナル抗体３Ａ３および３Ａ５は、異なるエピトープを認識し、抗体３Ａ３および３Ａ５が新たなエピトープを認識したことを示している。
実施例９：ＥＢＶ ｇＢタンパク質に対するウサギモノクローナル抗体によって認識される重要な部位の同定
９．１ ｇＢ外部ドメイン点変異体タンパク質の構築
ｇＢタンパク質に対するウサギ中和抗体によって認識される重要な部位を同定するために、ｇＢタンパク質外部ドメイン点変異のクローニング、発現および評価を実行した。
９．１ ｇＢ外部ドメイン点変異体タンパク質の構築
ｇＢタンパク質に対するウサギ中和抗体によって認識される重要な部位を同定するために、ｇＢタンパク質外部ドメイン点変異のクローニング、発現および評価を実行した。
プライマーをＭｕｔ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＩＩ Ｆａｓｔ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ Ｖ２（Ｎｏｖｉｚｙｍｅから購入）の説明書に従って設計し、点変異クローニングをｇＢタンパク質外部ドメイン（配列番号２４）の対応する部位のアミノ酸をアラニンに変異させるために実行し、点変異クローンが正確に構築されたかどうかを配列決定によって確認した。正確な点変異クローンを真核生物での発現のために２９３Ｆ細胞に一過的に移行させ、点変異体タンパク質をニッケルカラムによって精製した。
９．２ ウエスタンブロット法による抗体認識のために重要な部位の同定
野生型（ＷＴ）または上記ステップ９．１で得られた各点変異体ｇＢタンパク質試料を取り、還元緩衝液に加え、試料を調製するために１００℃で１０分間加熱し、次いでＳＤＳ－ＰＡＧＥタンパク質電気泳動に供した。
野生型（ＷＴ）または上記ステップ９．１で得られた各点変異体ｇＢタンパク質試料を取り、還元緩衝液に加え、試料を調製するために１００℃で１０分間加熱し、次いでＳＤＳ－ＰＡＧＥタンパク質電気泳動に供した。
膜移行：タンパク質ゲル上のタンパク質を膜移行デバイスを使用してニトロセルロース膜に移行させた。
ブロッキング：膜を超純水を用いて１回リンスし、市販のブロッキング溶液－１（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｗａｎｔａｉ Ｂｉｏ－Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入）を加え、室温で、２時間インキュベートした。
一次抗体インキュベーション：ブロッキング溶液を廃棄し、抗体を市販の酵素希釈溶液ＥＤ－１３（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｗａｎｔａｉ Ｂｉｏ－Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入）を用いて１μｇ／ｍＬに希釈し、膜に加え、穏やかに振とうし、シェーカー上で室温、１時間インキュベートした。
二次抗体の添加：膜上の未結合一次抗体をＰＢＳＴ洗浄溶液（２０ｍＭ ＰＢ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）を用いて洗浄除去し、膜を３回、各回５分間洗浄し、次に希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ反応溶液（Ａｂｃａｍから購入、品目番号：ａｂ６７２１）を加え、シェーカー上で室温、１時間インキュベートした。
膜上の未結合二次抗体をＰＢＳＴ洗浄溶液（２０ｍＭ ＰＢ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）を用いて各回５分間洗浄除去した。適量の化学発光基質混合物をニトロセルロース膜の表面を覆うように加え、画像化および撮影を化学発光画像化装置で実施し、結果を記録した。
ウエスタンブロットの結果を図１１に示した、図１１Ａは、３Ａ３抗体によるタンパク質試料のウエスタンブロット染色の結果を示し、図１１Ｂは、３Ａ５抗体によるタンパク質試料のウエスタンブロット染色の結果を示した。図１１Ａは、一部の点変異が抗体へのタンパク質の結合能力に影響を与えたことを示した。ここで、３５２、３５６および３６０位の３個のアミノ酸が３Ａ３抗体認識のために重要な位置であり、これらの位置での任意のアミノ酸変異は、モノクローナル抗体３Ａ３をタンパク質に反応させなくするか、または弱く反応するようにできた。図１１Ｂは、５４０、５６７、６１０および６１３位の４個のアミノ酸が３Ａ５抗体認識のために重要な位置であることを示し、これらの位置での任意のアミノ酸変異は、モノクローナル抗体３Ａ５をタンパク質に反応させなくするか、または弱く反応するようにできた。
９．３ ＥＬＩＳＡ法による点変異体タンパク質に対するｇＢモノクローナル抗体の反応性の同定
野生型（ＷＴ）または上記ステップ９．１で得た各点変異体ｇＢタンパク質試料を取り、５０ｍＭ ＣＢ緩衝液（ＮａＨＣＯ３／Ｎａ２ＣＯ３緩衝液、最終濃度は５０ｍＭであり、ｐＨは９．６であった）をｐＨ９．６で用いて最終濃度２μｇ／ｍＬに希釈した。１００μＬのコーティング溶液を９６ウエルマイクロタイタープレートの各ウエルに加え、コーティングを３７℃で２時間実施した。洗浄をＰＢＳＴ洗浄溶液（２０ｍＭ ＰＢ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）を用いて１回実施した。次に２００μＬのブロッキング溶液（２０％仔牛血清および１％カゼインを含有する２０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４緩衝液、ｐＨ７．４）を各ウエルに加え、ブロッキングを３７℃、２時間実施した。ブロッキング溶液を廃棄した。乾燥後、プレートを後の使用のためにアルミホイルバッグ中にパッケージし、２～８℃で保存した。
野生型（ＷＴ）または上記ステップ９．１で得た各点変異体ｇＢタンパク質試料を取り、５０ｍＭ ＣＢ緩衝液（ＮａＨＣＯ３／Ｎａ２ＣＯ３緩衝液、最終濃度は５０ｍＭであり、ｐＨは９．６であった）をｐＨ９．６で用いて最終濃度２μｇ／ｍＬに希釈した。１００μＬのコーティング溶液を９６ウエルマイクロタイタープレートの各ウエルに加え、コーティングを３７℃で２時間実施した。洗浄をＰＢＳＴ洗浄溶液（２０ｍＭ ＰＢ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）を用いて１回実施した。次に２００μＬのブロッキング溶液（２０％仔牛血清および１％カゼインを含有する２０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４緩衝液、ｐＨ７．４）を各ウエルに加え、ブロッキングを３７℃、２時間実施した。ブロッキング溶液を廃棄した。乾燥後、プレートを後の使用のためにアルミホイルバッグ中にパッケージし、２～８℃で保存した。
実施例１で得たモノクローナル抗体３Ａ３および３Ａ５を２０ｍＭ ＰＢＳ緩衝液を用いて２倍グラジエント希釈によって、初期濃度として０．５μｇ／ｍＬから開始して合計１５個のグラジエントで希釈した。ｇＢタンパク質を用いてコーティングしたマイクロタイタープレートを取り、１００μＬの希釈した試料を各ウエルに加え、３７℃インキュベーターに置いて３０分間反応させた。マイクロタイタープレートをＰＢＳＴ洗浄溶液（２０ｍＭ ＰＢ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）を用いて５回洗浄し、１００μＬのＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ反応溶液を各ウエルに加え、３７℃インキュベーターに置いて３０分間反応させた。酵素標識反応ステップの完了後、マイクロプレートプレートをＰＢＳＴ洗浄溶液（２０ｍＭ ＰＢ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）を用いて５回洗浄し、５０μＬのＴＭＢ発色試薬（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｗａｎｔａｉ Ｂｉｏ－Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入）を各ウエルに加え、３７℃インキュベーターに置いて１５分間反応させた。発色反応ステップが完了した後、５０μＬの停止溶液（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｗａｎｔａｉ Ｂｉｏ－Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入）を反応後のマイクロプレートプレートの各ウエルに加え、各ウエルのＯＤ４５０／６３０値をマイクロプレートリーダーで検出した。
ＥＬＩＳＡ ＯＤ４５０検出の結果を図１２に示した、図１２Ａは３Ａ３抗体によるタンパク質試料のＥＬＩＳＡ検出の結果を示し、図１２Ｂは３Ａ５抗体によるタンパク質試料のＥＬＩＳＡ検出の結果を示した。結果は、一部の点変異が抗体へのタンパク質の結合能力に影響を与えたことを示した。ここで、３５２、３５６および３６０位の３個のアミノ酸が３Ａ３抗体認識のために重要な位置であり、これらの位置での任意のアミノ酸変異は、タンパク質へのモノクローナル抗体３Ａ３の反応を弱くできた。５４０、５６７、６１０および６１３位の４個のアミノ酸は３Ａ５抗体認識のために重要な位置であり、これらの位置での任意のアミノ酸変異は、タンパク質へのモノクローナル抗体３Ａ５の反応を弱くできた。結果は、ウエスタンブロット同定の結果と一致し、３５２、３５６および３６０位の３個のアミノ酸がモノクローナル抗体３Ａ３認識のための重要な位置であり、５４０、５６７、６１０および６１３位の４個のアミノ酸はモノクローナル抗体３Ａ５認識のための重要な位置であった。
実施例１０：ＥＢＶ ｇＢに対するウサギモノクローナル抗体によって認識されるエピトープの同定
１０．１ ｇＢタンパク質セグメントのクローニングおよび発現
２つのモノクローナル抗体によって認識されるエピトープを同定するために、ｐＴＯ－Ｔ７－ＨＢｃ１４９ベクターをｇＢタンパク質の部分配列を提示するために使用し、さまざまな短縮型エピトープへの抗体の反応性をウエスタンブロット法によって同定した。ＨＢｃ１４９／ｍｕｔ担体タンパク質のヌクレオチド配列およびタンパク質配列をそれぞれ配列番号２７および２１に記載した、式中、太字および下線付き部分は、制限部位ＢａｍＨ ＩおよびＥｃｏＲ Ｉに対応するヌクレオチドおよびアミノ酸配列である。本発明者らは、標的配列をＢａｍＨ ＩとＥｃｏＲ Ｉ制限部位との中央に挿入した、すなわちｇＢ断片をＳＥ．．．ＦＧの中央に挿入した。
１０．１ ｇＢタンパク質セグメントのクローニングおよび発現
２つのモノクローナル抗体によって認識されるエピトープを同定するために、ｐＴＯ－Ｔ７－ＨＢｃ１４９ベクターをｇＢタンパク質の部分配列を提示するために使用し、さまざまな短縮型エピトープへの抗体の反応性をウエスタンブロット法によって同定した。ＨＢｃ１４９／ｍｕｔ担体タンパク質のヌクレオチド配列およびタンパク質配列をそれぞれ配列番号２７および２１に記載した、式中、太字および下線付き部分は、制限部位ＢａｍＨ ＩおよびＥｃｏＲ Ｉに対応するヌクレオチドおよびアミノ酸配列である。本発明者らは、標的配列をＢａｍＨ ＩとＥｃｏＲ Ｉ制限部位との中央に挿入した、すなわちｇＢ断片をＳＥ．．．ＦＧの中央に挿入した。
ｇＢタンパク質（配列番号１に記載の配列）上のさまざまなドメイン配列を短縮し、相互プライマー（mutual primer）を設計し、ｇＢタンパク質粒子は、ＰＣＲによってさまざまな短縮長の標的断片を得るための鋳型としてであり、ゲル回収キットを標的断片を回収するために使用し、クローニングベクターを酵素消化に供し、制限部位はＢａｍＨ Ｉ／ＥｃｏＲ Ｉであり、ギブソンアセンブリ法をｐＴＯ－Ｔ７－ＨＢｃ１４９ベクターでの構築のために使用した。クローンを構築した後、コンピテントＥＲ２５６６（ＤＥ３）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｗｅｉｄｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入、品目番号：ＥＣ１０６０）に形質転換した。単一クローンコロニーを取り出し、ＬＢ液体培地に播種し、培養のために５００ｍＬ培地に増やし、培地のＯＤ６００が０．８になったら誘導物質として０．５ｍＭ ＩＰＴＧをタンパク質発現を誘導するために３２℃で加えた。発現の誘導を８時間実行した後、細胞を７０００ｇ、１０分間の遠心分離によって回収し、次に超音波処理し、超音波処理後の上清を回収するために２５０００ｇ、１０分間遠心分離し、タンパク質を沈殿させるために３０％の体積の飽和硫酸アンモニウム溶液を超音波処理後の上清に加え、沈殿物をＰＢＳ緩衝液を用いて再懸濁し、ＰＢＳ溶液に透析し、予め充填されたＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラムを使用するゲルろ過によって最終精製した。
１０．２ ウエスタンブロットによる抗体認識エピトープの同定
上記ステップ１０．１で得られたさまざまな短縮長を有するタンパク質試料を取り、還元緩衝液に加え、試料を調製するために１００℃で１０分間加熱し、次いでＳＤＳ－ＰＡＧＥタンパク質電気泳動に供した。
上記ステップ１０．１で得られたさまざまな短縮長を有するタンパク質試料を取り、還元緩衝液に加え、試料を調製するために１００℃で１０分間加熱し、次いでＳＤＳ－ＰＡＧＥタンパク質電気泳動に供した。
膜移行：プロテイングルー上のタンパク質を膜移行デバイスを使用してニトロセルロース膜に移行させた。
ブロッキング：膜を超純水を用いて１回リンスし、市販のブロッキング溶液－１（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｗａｎｔａｉ Ｂｉｏ－Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入）を加え、室温で、２時間インキュベートした。
一次抗体インキュベーション：ブロッキング溶液を廃棄し、抗体を市販の酵素希釈溶液ＥＤ－１３（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｗａｎｔａｉ Ｂｉｏ－Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入）を用いて１μｇ／ｍＬに希釈し、膜に加え、穏やかに振とうし、シェーカー上で室温、１時間インキュベートした。
二次抗体の添加：膜上の未結合一次抗体をＰＢＳＴ洗浄溶液（２０ｍＭ ＰＢ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）を用いて洗浄除去した、膜を３回、各回５分間洗浄し、次に希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ反応溶液（Ａｂｃａｍから購入、品目番号：ａｂ６７２１）を加え、シェーカー上で室温、１時間インキュベートした。
洗浄をＰＢＳＴ（２０ｍＭ ＰＢ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）を用いて各回５分間実施した。適量の化学発光基質混合物をニトロセルロース膜の表面を覆うように加え、画像化および撮影を化学発光画像化装置で実施し、結果を記録した。
ウエスタンブロットの結果を図１３に示した。３Ａ３によって認識されるエピトープは３４１～３６２位のアミノ酸配列であり、３Ａ５によって認識されるエピトープは５２８～６１６位のアミノ酸配列であったことが図から理解でき、モノクローナル抗体３Ａ３および３Ａ５によって認識されるエピトープの位置をタンパク質の３Ｄ構造において図１４に示す（ｐｙｍｏｌソフトウェアによる描画、ＥＢＶ ｇＢのＰＤＢ ＩＤ：３ＦＶＣ）。
実施例１１：キメラウイルス様粒子の調製および免疫原性評価
１１．１ ３Ａ３認識配列に基づくキメラウイルス様粒子（ｃＶＬＰ）の構築および同定
ｇＢタンパク質の構造分析により（図１４）、３Ａ３が連続エピトープを認識したと考えられた。このエピトープが、エピトープワクチンを開発する実現可能性を有するかどうかを調査するために、野生型全長ｇＢタンパク質（配列番号１７）の３３１～３６７位の配列を選択し、実施例１０．１に記載の方法により発現クローンを構築し、タンパク質を発現させ、精製した。実施例２．３の方法により、ｇＢ－３３１～３６７ａａエピトープを用いてキメラ化したＨＢｃ１４９タンパク質（配列番号２２）の活性検出をウエスタンブロットによって実施した。
１１．１ ３Ａ３認識配列に基づくキメラウイルス様粒子（ｃＶＬＰ）の構築および同定
ｇＢタンパク質の構造分析により（図１４）、３Ａ３が連続エピトープを認識したと考えられた。このエピトープが、エピトープワクチンを開発する実現可能性を有するかどうかを調査するために、野生型全長ｇＢタンパク質（配列番号１７）の３３１～３６７位の配列を選択し、実施例１０．１に記載の方法により発現クローンを構築し、タンパク質を発現させ、精製した。実施例２．３の方法により、ｇＢ－３３１～３６７ａａエピトープを用いてキメラ化したＨＢｃ１４９タンパク質（配列番号２２）の活性検出をウエスタンブロットによって実施した。
検出結果を図１５に示した、ｇＢ－３３１～３６７ａａエピトープ特異的ウサギモノクローナル抗体３Ａ３およびＨＢＣ１４９タンパク質特異的マウスモノクローナル抗体１１Ｈ１０（Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ．２０２０ Ａｐｒ ２７；１０（１３）：５７０４－５７１８）がすべてＨＢｃ１４９キメラタンパク質と反応できたことを示し、ｇＢ－３３１～３６７ａａエピトープが良好に発現され、ウエスタンブロットにおいて３Ａ３への結合の活性が維持されていたことを示した。
実施例２．２の方法により、ｇＢ－３３１～３６７ａａエピトープを用いてキメラ化したＨＢｃ１４９タンパク質の活性の検出をＥＬＩＳＡによって実施した。
検出結果を図１６に示した。ｇＢ－３３１～３６７ａａエピトープ特異的ウサギモノクローナル抗体３Ａ３およびＨＢＣ１４９タンパク質特異的マウスモノクローナル抗体１１Ｈ１０は、すべてＨＢｃ１４９キメラタンパク質と反応できたことが図から理解でき、ｇＢ－３３１～３６７ａａエピトープが良好に提示されており、ＥＬＩＳＡにおいて３Ａ３への結合の活性が維持されていたことを示した。
ｇＢ－３３１～３６７ａａエピトープを用いてキメラ化したＨＢｃ１４９ウイルス様粒子（１４９－αＢ）および野生型ＨＢｃ１４９ウイルス様粒子（１４９－ＷＴ）の純度を高速液体クロマトグラフィーによって同定した。試料同定をＴＳＫｇｅｌ Ｇ５０００ＰＷｘｌカラムを使用して実施した。
ＨＰＬＣ同定結果を図１７に示した。結果は、ウイルス様粒子がそれぞれ１３．７５分間および１３．８２分間のピーク時間を有する単一のピークをもたらしたことを示し、ウイルス様粒子が高い純度を有したことを示した。
キメラウイルス様粒子を０．５ｍｇ／ｍＬに希釈し、２００メッシュ炭素コート銅グリッドに滴下で加え、５分間インキュベートし、次に過剰量の溶液を吸い出し、洗浄を２倍の蒸留水を用いて２回実施し、２％リンタングステン酸を用いた染色を直ちに３０秒間実施した。撮影およびデータ回収をＦＥＩ Ｔｅｃｎａｉ Ｔ１２ ＴＥＭ透過型電子顕微鏡を使用して実施した。
電子顕微鏡の結果を図１８に示した、結果は、キメラウイルス様粒子が良好にアセンブルし、試料が均一であったことを示した。
１１．２ ３Ａ３認識エピトープに基づくキメラウイルス様粒子の免疫学的評価
上記ステップ１１．１で構築したキメラウイルス様粒子５００μｇを等量のフロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）と混合し、２ｍＬの乳剤を得て、首および背中での複数点注射によって実験用ウサギに投与した。最初の免疫処置後１４日目および２８日目に、同じ用量のタンパク質を等量のフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）と混合し、２ｍＬの乳剤を得て、首および背中での複数点注射によって実験用ウサギに投与した。最初の免疫処置後４２日目に、全血をウサギの耳の中心動脈を通じて回収し、血清を分離し、免疫血清結合力価を実施例２．２のＥＬＩＳＡ法により検出し、免疫血清中和力価を実施例５のＥＢＶのＢ細胞および上皮細胞感染モデルにより評価した。
上記ステップ１１．１で構築したキメラウイルス様粒子５００μｇを等量のフロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）と混合し、２ｍＬの乳剤を得て、首および背中での複数点注射によって実験用ウサギに投与した。最初の免疫処置後１４日目および２８日目に、同じ用量のタンパク質を等量のフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）と混合し、２ｍＬの乳剤を得て、首および背中での複数点注射によって実験用ウサギに投与した。最初の免疫処置後４２日目に、全血をウサギの耳の中心動脈を通じて回収し、血清を分離し、免疫血清結合力価を実施例２．２のＥＬＩＳＡ法により検出し、免疫血清中和力価を実施例５のＥＢＶのＢ細胞および上皮細胞感染モデルにより評価した。
ｇＢ－３３１～３６７ａａエピトープを用いてキメラ化したＨＢｃ１４９ウイルス様粒子（１４９－ｃＶＬＰ）および野生型ＨＢｃ１４９ウイルス様粒子（１４９－ＷＴ）を用いて免疫化したウサギ血清の結合力価のＥＬＩＳＡ検出結果を図１９に示した。Ｂ細胞および上皮細胞モデルでの、ウイルス様粒子１４９－ｃＶＬＰおよび１４９－ＷＴ免疫化ウサギ血清のＥＢＶ中和力価検出結果を図２０に示した。結果は、３Ａ３認識エピトープに基づくキメラウイルス様粒子を用いて実験用ウサギを免疫化した後に、高い力価結合抗体（１０６を超える）が誘導され得たことを示した（図１９）。免疫血清は、２つの細胞モデルでウイルス感染を同時に中和でき（図２０）、エピトープワクチンを開発するエピトープの可能性が示された。
実施例１２：ウイルス感染モデルでのモノクローナル抗体３Ａ３および３Ａ５の相乗的中和活性の分析
実施例５に示した方法を使用して、モノクローナル抗体３Ａ３および３Ａ５、報告されたモノクローナル抗体ＡＭＭＯ５、対照ウサギモノクローナル抗体１Ｅ１２ならびに混合抗体３Ａ３＋３Ａ５（ここで、３Ａ３：３Ａ５のモル濃度比は１：１であった）のウイルス感染モデルでの中和活性を決定した。
実施例５に示した方法を使用して、モノクローナル抗体３Ａ３および３Ａ５、報告されたモノクローナル抗体ＡＭＭＯ５、対照ウサギモノクローナル抗体１Ｅ１２ならびに混合抗体３Ａ３＋３Ａ５（ここで、３Ａ３：３Ａ５のモル濃度比は１：１であった）のウイルス感染モデルでの中和活性を決定した。
結果を図２１に示した。結果は、抗体３Ａ３および３Ａ５がｏｎ ｖｉｔｒｏ Ｂ細胞中和モデルにおいて相乗的中和効果（１＋１＞２）を示し、それらの中和力価が１０倍近く増加したことを示した。これは、抗体３Ａ３および３Ａ５を臨床において組合せで使用することの将来性を示唆している。
実施例１３：ヒト化マウスモデルでの３Ａ３キメラ抗体および３Ａ５キメラ抗体の動物防御効果
抗体３Ａ３および３Ａ５の定常領域配列をヒト重鎖定常領域配列（配列番号３０）およびヒト軽鎖定常領域配列（配列番号３１）を用いてそれぞれ置換し、３Ａ３キメラ抗体および３Ａ５キメラ抗体を構築した。
抗体３Ａ３および３Ａ５の定常領域配列をヒト重鎖定常領域配列（配列番号３０）およびヒト軽鎖定常領域配列（配列番号３１）を用いてそれぞれ置換し、３Ａ３キメラ抗体および３Ａ５キメラ抗体を構築した。
ＣＤ３４＋陽性造血性幹細胞再構成ヒト化マウスモデルにおいて、３Ａ３キメラ抗体および３Ａ５キメラ抗体、ならびに混合抗体（３Ａ３キメラ抗体＋３Ａ５キメラ抗体、ここで３Ａ３キメラ抗体の３Ａ５キメラ抗体に対するモル濃度比は１：１であった）の防御効果を評価した。
ヒト化マウスモデルにおけるキメラモノクローナル抗体の処置工程（図２２に示すとおり）は以下を含んだ：ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃｅｍ１ＩＤＭＯＩｌ２ｒｇｅｍ２ＩＤＭＯ（ＮＯＤ－ＰｒｋｄｃヌルＩＬ２Ｒγヌル、ＮＰＩ（登録商標））ヒト化マウスモデル（Ｂｅｉｊｉｎｇ ＩＤＭＯ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．により提供）を取った、ここでマウス処置方法は次のとおりであった：ヒト臍帯血中の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）由来のＣＤ３４陽性細胞を取り、ブスルファンを用いて予め骨髄破壊した４～５週齢マウスに尾静脈注射によって接種し、８週間のヒト免疫系の再構成後、マウスの眼窩血を回収し、ヒト化免疫細胞の割合を同定した；ヒトＣＤ４５陽性免疫細胞の割合が１０％から２０％であり、ＮＳＧヒト化マウスモデルが良好に構築された後に、抗体（３Ａ３キメラ抗体および３Ａ５キメラ抗体ならびに混合抗体（３Ａ３キメラ抗体＋３Ａ５キメラ抗体））および対照抗体ＶＲＣ０１（これはＨＩＶ ｇｐ１２０特異的ヒトモノクローナル抗体であった、ＶＲＣ０１ ＶＨおよびＶＬアミノ酸配列は配列番号３２および３３にそれぞれ記載された：Ｒａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ｂｒｏａｄｌｙ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ＨＩＶ－１を参照されたい））を各群あたりマウス６匹にマウス１匹当たり４００μｇの用量で各群のマウスの腹腔にそれぞれ注射し；抗体注射２４時間後に、１００μＬの２５０００グリーンラジ単位（green Raji units）（ＧＲＵ）用量のＡＫＡＴＡ由来エプスタイン・バーウイルス（その調製方法は文献を参照した：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｒｏｂｕｓｔ，ｈｉｇｈｅｒ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ）－ｂａｓｅｄ Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ Ｖｉｒｕｓ（ＥＢＶ）ｍｉｃｒｏ－ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）を尾静脈を通じて注射し；ウイルスを注射した後、抗体をマウスの体重１ｋｇあたり２０ｍｇの用量でマウスに隔週で腹腔内注射し、注射を４週間継続した。マウスの眼窩血を、免疫細胞における変化および末梢血中のウイルスコピー数を検出し、体重をモニターするために毎週回収した。ＮＳＧマウスをウイルス注射後の７週間で安楽死させ、脾臓サイズにおける変化およびがん性組織の存在を観察した。回収されたマウス末梢血中のＥＢウイルスＤＮＡコピー数をリアルタイム蛍光定量的ＰＣＲによってＥＢウイルスＢＡＬＦ５遺伝子特異的プライマーを使用して決定し；脾臓細胞または腫瘍細胞がウイルス陽性であったかどうかを、市販のキットを使用してマウス脾臓組織切片でのＥＢＥＲインサイツハイブリダイゼーション検出を実施することによって決定した。
結果を図２３および２４に示した。図２３は、ヒト化マウスモデルにおける３Ａ３キメラ抗体、３Ａ５キメラ抗体、混合抗体（３Ａ３キメラ抗体＋３Ａ５キメラ抗体）、ＡＭＭＯ５および対照抗体ＶＲＣ０１の防御効果を示す。ここで、図２３Ａは、各抗体処置群でのマウスの体重変化を示す。図２３Ｂは、各抗体処置群でのマウスの生存率を示す。図２３Ｃは、各抗体処置群のマウスの末梢血中のｈＣＤ１９＋Ｂ細胞の割合における変化を示す。図２３Ｄは、各抗体処置群におけるマウスの末梢血中のｈＣＤ３＋ｈｈＣＤ４＋二重陽性Ｔ細胞の割合の変化を示す。図２３Ｅは、各抗体処置群におけるマウスの末梢血中のｈＣＤ３＋ｈＣＤ８＋二重陽性Ｔ細胞の割合の変化を示す。図２３Ｆは、各抗体処置群におけるマウスの末梢血中のＥＢＶ ＤＮＡコピー数を示す。図２３Ｇは、各抗体処置群における安楽死後のマウスの脾臓中のｈＣＤ９＋Ｂ細胞の割合を示す。図２３Ｈは、各抗体処置群における安楽死後のマウスの脾臓中のｈＣＤ３＋ｈＣＤ４＋二重陽性Ｔ細胞の割合を示す。図２３Ｉは、各抗体処置群における安楽死後のマウスの脾臓中のｈＣＤ３＋ｈＣＤ８＋二重陽性Ｔ細胞の割合を示す。図２３Ｊは、各抗体処置群における安楽死後のマウスの脾臓中のＥＢＶ ＤＮＡコピー数を示す。図２３Ｋは、各抗体処置群における安楽死後のマウスの脾臓重量の比較を示す。
図２４は、各抗体処置群における安楽死後のマウスの脾臓組織切片のＥＢＥＲインサイツハイブリダイゼーション検出、ｈＣＤ２０染色およびＨ＆Ｅ染色の結果を示す。
３Ａ３キメラ抗体、３Ａ５キメラ抗体および混合抗体（３Ａ３キメラ抗体＋３Ａ５キメラ抗体）が、ヒト化マウスにおけるウイルス複製によって生じるウイルス血症、ｈＣＤ１９＋Ｂ細胞およびｈＣＤ３＋ｈＣＤ８＋二重陽性Ｔ細胞の割合における変化を有効に予防でき、ウイルス感染によって生じる死からマウスを防御できることが、図２３および２４から理解された。上の結果は、３Ａ３キメラ抗体、３Ａ５キメラ抗体および混合抗体（３Ａ３キメラ抗体＋３Ａ５キメラ抗体）がヒト化マウスでのウイルス感染の遮断に良好な効果を有したことを示した。
本発明の具体的な実行は詳細に記載されたが、当業者は：開示されたすべての教示により、種々の改変および変更が細部に行われ得、これらの変更がすべて本発明の保護範囲内であることを理解する。本発明の範囲全体は、本明細書に添付される特許請求の範囲およびその任意の等価物によって与えられる。
Claims (42)
- ＥＢＶ ｇＢタンパク質の３４１～３６２位のアミノ酸残基に含まれるエピトープに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片であって、前記エピトープが前記ＥＢＶ ｇＢタンパク質の３５２、３５６および３６０位のアミノ酸残基を少なくとも含み、
好ましくは前記エピトープが、直鎖状エピトープであり、前記ＥＢＶ ｇＢタンパク質の３４１～３６２位のアミノ酸残基内に位置する少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個または少なくとも２０個の連続したアミノ酸残基からなり、
好ましくは前記エピトープが、立体構造エピトープであり、前記ＥＢＶ ｇＢタンパク質の３４１～３６２位のアミノ酸残基内に位置する少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個または少なくとも２０個の連続していないアミノ酸残基からなり、ＥＢＶ ｇＢタンパク質の３５２、３５６および３６０位のアミノ酸残基を少なくとも含み、
好ましくは、前記エピトープが前記ＥＢＶ ｇＢタンパク質の３４１～３６２位のアミノ酸残基からなる、
抗体またはその抗原結合断片。 - ＥＢＶのｇＢタンパク質に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片であって：
（ａ）次の３個の相補性決定領域（ＣＤＲ）：
（ｉ）ＶＨ ＣＤＲ１、次の配列からなる：配列番号３、またはそれと比較して１個もしくは複数個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加（例えば、１個、２個もしくは３個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加）を有する配列、
（ｉｉ）ＶＨ ＣＤＲ２、次の配列からなる：配列番号４、またはそれと比較して１個もしくは複数個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加（例えば、１個、２個もしくは３個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加）を有する配列、および
（ｉｉｉ）ＶＨ ＣＤＲ３、次の配列からなる：配列番号５、またはそれと比較して１個もしくは複数個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加（例えば、１個、２個もしくは３個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加）を有する配列、
を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに／または
（ｂ）次の３個の相補性決定領域（ＣＤＲ）：
（ｉｖ）ＶＬ ＣＤＲ１、次の配列からなる：配列番号６、またはそれと比較して１個もしくは複数個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加（例えば、１個、２個もしくは３個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加）を有する配列、
（ｖ）ＶＬ ＣＤＲ２、次の配列からなる：配列番号７、またはそれと比較して１個もしくは複数個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加（例えば、１個、２個もしくは３個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加）を有する配列、および
（ｖｉ）ＶＬ ＣＤＲ３、次の配列からなる：配列番号８、またはそれと比較して１個もしくは複数個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加（例えば、１個、２個もしくは３個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加）を有する配列、
を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、を含み、
好ましくは、（ｉ）から（ｖｉ）のいずれか１つに記載されるＣＤＲがＩＭＧＴ番号付けシステムに従って定義されており、
好ましくは、（ｉ）から（ｖｉ）のいずれか１つに記載される置換が保存的置換である、
抗体またはその抗原結合断片。 - （ａ）次の３個の重鎖ＣＤＲ：配列番号３に記載の配列を有するＶＨ ＣＤＲ１、配列番号４に記載の配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、配列番号５に記載の配列を有するＶＨ ＣＤＲ３；ならびに／もしくは、次の３個の軽鎖ＣＤＲ：配列番号６に記載の配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号７に記載の配列を有するＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号８に記載の配列を有するＶＬ ＣＤＲ３、
または、
（ｂ）配列番号１に記載の重鎖可変領域（ＶＨ）に含まれる３個のＣＤＲ；および／もしくは、配列番号２に記載の軽鎖可変領域（ＶＬ）に含まれる３個のＣＤＲ；
を含み、好ましくは、前記ＶＨに含まれる前記３個のＣＤＲおよび／または前記ＶＬに含まれる前記３個のＣＤＲがＫａｂａｔ、ＩＭＧＴまたはＣｈｏｔｈｉａ番号付けシステムによって定義される、
請求項１または２に記載の抗体またはその抗原結合断片。 - （ａ）（ｉ）配列番号１に記載の配列、
（ｉｉ）配列番号１に記載の配列と比較して１個もしくは複数個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加（例えば、１個、２個、３個、４個もしくは５個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加）を有する配列、または
（ｉｉｉ）配列番号１に記載の配列と比較して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％の配列同一性を有する配列、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、
および
（ｂ）（ｉｖ）配列番号２に記載の配列、
（ｖ）配列番号２に記載の配列と比較して１個もしくは複数個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加（例えば、１個、２個、３個、４個もしくは５個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加）を有する配列、または
（ｖｉ）配列番号２に記載の配列と比較して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％の配列同一性を有する配列、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、
を含み、
好ましくは、（ｉｉ）または（ｖ）に記載される置換が保存的置換であり、
好ましくは、配列番号１に記載の配列を含むＶＨおよび配列番号２に記載の配列を含むＶＬを含む、
請求項１～３のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。 - ＥＢＶ ｇＢタンパク質の５２８～６１６位のアミノ酸残基に含まれるエピトープに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片であって、前記エピトープが前記ＥＢＶ ｇＢタンパク質の５４０、５６７、６１０および６１３位のアミノ酸残基を少なくとも含み、
好ましくは前記エピトープが、直鎖状エピトープであり、前記ＥＢＶ ｇＢタンパク質の５２８～６１６位のアミノ酸残基内に位置する少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個または少なくとも２０個の連続したアミノ酸残基からなり、
好ましくは前記エピトープが、立体構造エピトープであり、前記ＥＢＶ ｇＢタンパク質の５２８～６１６位のアミノ酸残基内に位置する少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個からなり、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個または少なくとも２０個の連続していないアミノ酸残基からなり、ＥＢＶ ｇＢタンパク質の５４０、５６７、６１０および６１３位のアミノ酸残基を少なくとも含み、
好ましくは、前記エピトープがＥＢＶ ｇＢタンパク質の５２８～６１６位のアミノ酸残基からなる
抗体またはその抗原結合断片。 - ＥＢＶのｇＢタンパク質に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片であって：
（ａ）次の３個の相補性決定領域（ＣＤＲ）：
（ｉ）ＶＨ ＣＤＲ１、次の配列からなる：配列番号１１、またはそれと比較して１個もしくは複数個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加（例えば、１個、２個もしくは３個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加）を有する配列、
（ｉｉ）ＶＨ ＣＤＲ２、次の配列からなる：配列番号１２、またはそれと比較して１個もしくは複数個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加（例えば、１個、２個もしくは３個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加）を有する配列、および
（ｉｉｉ）ＶＨ ＣＤＲ３、次の配列からなる：配列番号１３、またはそれと比較して１個もしくは複数個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加（例えば、１個、２個もしくは３個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加）を有する配列、
を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、
ならびに／あるいは、
（ｂ）次の３個の相補性決定領域（ＣＤＲ）：
（ｉｖ）ＶＬ ＣＤＲ１、次の配列からなる：配列番号１４、またはそれと比較して１個もしくは複数個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加（例えば、１個、２個もしくは３個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加）を有する配列、
（ｖ）ＶＬ ＣＤＲ２、次の配列からなる：配列番号１５、またはそれと比較して１個もしくは複数個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加（例えば、１個、２個もしくは３個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加）を有する配列、および
（ｖｉ）ＶＬ ＣＤＲ３、次の配列からなる：配列番号１６、またはそれと比較して１個もしくは複数個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加（例えば、１個、２個もしくは３個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加）を有する配列；を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、
を含み、
好ましくは、（ｉ）から（ｖｉ）のいずれか１つに記載されるＣＤＲがＩＭＧＴ番号付けシステムに従って定義されており、
好ましくは、（ｉ）から（ｖｉ）のいずれか１つに記載される置換が保存的置換である、
抗体またはその抗原結合断片。 - （ａ）次の３個の重鎖ＣＤＲ：配列番号１１に記載の配列を有するＶＨ ＣＤＲ１、配列番号１２に記載の配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、配列番号１３に記載の配列を有するＶＨ ＣＤＲ３；ならびに／もしくは、次の３個の軽鎖ＣＤＲ：配列番号１４に記載の配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号１５に記載の配列を有するＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号１６に記載の配列を有するＶＬ ＣＤＲ３、
または、
（ｂ）配列番号９に記載の重鎖可変領域（ＶＨ）に含まれる３個のＣＤＲ；および／もしくは、配列番号１０に記載の軽鎖可変領域（ＶＬ）に含まれる３個のＣＤＲ
を含み、好ましくは、前記ＶＨに含まれる前記３個のＣＤＲおよび／または前記ＶＬに含まれる前記３個のＣＤＲがＫａｂａｔ、ＩＭＧＴまたはＣｈｏｔｈｉａ番号付けシステムによって定義される、
請求項５または６に記載の抗体またはその抗原結合断片。 - （ａ）（ｉ）配列番号９に記載の配列、
（ｉｉ）配列番号９に記載の配列と比較して１個もしくは複数個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加（例えば、１個、２個、３個、４個もしくは５個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加）を有する配列、または
（ｉｉｉ）配列番号９に記載の配列と比較して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％の配列同一性を有する配列、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、
および
（ｂ）（ｉｖ）配列番号１０に記載の配列、
（ｖ）配列番号１０に記載の配列と比較して１個もしくは複数個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加（例えば、１個、２個、３個、４個もしくは５個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加）を有する配列、または
（ｖｉ）配列番号１０に記載の配列と比較して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％の配列同一性を有する配列、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、
を含み、
好ましくは、（ｉｉ）または（ｖ）に記載される置換が保存的置換であり、
好ましくは、配列番号９に記載の配列を含むＶＨおよび配列番号１０に記載の配列を含むＶＬを含む、
請求項５～７のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。 - ヒト化されており、
好ましくは、ヒト免疫グロブリン由来のフレームワーク領域配列を含み、
好ましくは、ヒト重鎖生殖系列配列由来の重鎖フレームワーク領域配列およびヒト軽鎖生殖系列配列由来の軽鎖フレームワーク領域配列を含む、
請求項１～８のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。 - ウサギまたはヒト免疫グロブリン由来の定常領域をさらに含み、
好ましくは、前記抗体またはその抗原結合断片の前記重鎖がヒト免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）由来の重鎖定常領域を含み、前記抗体またはその抗原結合断片の前記軽鎖がヒト免疫グロブリン（例えば、κまたはλ）由来の軽鎖定常領域を含み、
好ましくは、前記抗体またはその抗原結合断片の前記重鎖が配列番号３０に記載の重鎖定常領域を含み、前記抗体またはその抗原結合断片の前記軽鎖が配列番号３１に記載の軽鎖定常領域を含む、
請求項１～９のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。 - 前記抗原結合断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ダイアボディおよび単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）からなる群から選択され；ならびに／または、前記抗体がウサギ抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、二特異性抗体もしくは多特異性抗体である、請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 次の特徴：
（ａ）ｉｎ ｖｉｔｒｏでまたは対象（例えば、ヒト）においてＥＢＶを中和すること、
（ｂ）ｉｎ ｖｉｔｒｏでまたは対象（例えば、ヒト）においてＥＢＶと細胞の融合を遮断するか、または阻害すること、
（ｃ）ＥＢＶ感染またはＥＢＶ感染に関連する疾患を予防するおよび／または処置すること
の１つまたは複数を有する、請求項１～１１のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。 - 請求項１～１２のいずれか１項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片またはその重鎖可変領域および／もしくは軽鎖可変領域をコードする、単離された核酸分子。
- 請求項１３に記載の核酸分子を含み；好ましくは、クローニングベクターまたは発現ベクターである、ベクター。
- 請求項１３に記載の核酸分子または請求項１４に記載のベクターを含む、宿主細胞。
- 請求項１５に記載の宿主細胞を前記抗体またはその抗原結合断片の発現を可能にする条件下で培養すること、および培養された前記宿主細胞の培養物から前記抗体またはその抗原結合断片を回収することを含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片を調製するための方法。
- （ｉ）請求項１～４のいずれか１項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片、または請求項１～４のいずれか１項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片をコードする核酸分子、ベクターもしくは宿主細胞、
ならびに
（ｉｉ）請求項５～８のいずれか１項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片、または請求項５～８のいずれか１項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片をコードする核酸分子、ベクターもしくは宿主細胞、
を含み、
好ましくは、請求項１～４のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片、および請求項５～８のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片を含み、
好ましくは、（ｉ）における抗体がキメラ抗体である、および／または、（ｉｉ）における抗体がキメラ抗体である、
組成物。 - 請求項１～１２のいずれか１項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片、または請求項１７に記載の組成物、ならびに任意選択で薬学的に許容される担体および／または賦形剤を含む、医薬組成物。
- 請求項１～１２のいずれか１項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片、請求項１３に記載の単離された核酸分子、請求項１４に記載のベクター、請求項１５に記載の宿主細胞、請求項１７に記載の組成物、または請求項１８に記載の医薬組成物の医薬の製造における使用であって、前記医薬が前記ＥＢＶの病原性を中和するため、または前記ＥＢＶと細胞の融合を阻害もしくは遮断するため、または対象においてＥＢＶ感染もしくはＥＢＶ感染に関連する疾患を予防するおよび／もしくは処置するために使用され、
好ましくは、前記ＥＢＶ感染が慢性活動性ＥＢＶ（ＣＡＥＢＶ）感染または一次ＥＢＶ感染であり、
好ましくは、前記ＥＢＶ感染に関連する疾患が、単核球症またはＥＢＶに関連するがんであり、
好ましくは、前記ＥＢＶに関連するがんが、リンパ球増殖性障害（ＬＰＤ）、例えばバーキットリンパ腫（ＢＬ）、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）もしくは移植後リンパ球増殖性障害（ＰＴＬＤ）などのＢ細胞リンパ腫、または上皮（鼻咽頭、肺、乳房）癌、リンパ上皮腫、リンパ球浸潤を伴う癌（ＧＣＬＳ、胃がんなど）、または神経膠腫からなる群から選択され、
好ましくは、前記対象がヒトなどの哺乳動物であり、
好ましくは、前記抗体またはその抗原結合断片が、単独で、または追加的な薬学的に活性な薬剤との組合せで使用される、
使用。 - 対象（例えば、ヒト）においてＥＢＶ感染またはＥＢＶ感染に関連する疾患を予防するおよび／または処置するための方法であって、それを必要とする前記対象に、請求項１～１２のいずれか１項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片、請求項１３に記載の単離された核酸分子、請求項１４に記載のベクター、請求項１５に記載の宿主細胞、請求項１７に記載の組成物、または請求項１８に記載の医薬組成物の有効量を投与することを含む、方法。
- 請求項１～１２のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片、および前記抗体またはその抗原結合断片に連結された検出可能な標識を含むコンジュゲートであって、
好ましくは、前記検出可能な標識が、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼ）、化学発光試薬（例えば、アクリジニウムエステル、ルミノールもしくはその誘導体、またはルテニウム誘導体）、蛍光色素（例えば、フルオレセインもしくは蛍光タンパク質）、放射性核種、またはビオチンからなる群から選択される、
コンジュゲート。 - 請求項１～１２のいずれか１項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片または請求項２１に記載のコンジュゲートを含むキットであって、
好ましくは、請求項２１に記載のコンジュゲートを含み、
好ましくは、請求項１～１２のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片、および前記抗体またはその抗原結合断片を特異的に認識する二次抗体を含み；任意選択で、前記二次抗体が、検出可能な標識、例えば酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼ）、化学発光試薬（例えば、アクリジニウムエステル、ルミノールおよびその誘導体、もしくはルテニウム誘導体）、蛍光色素（例えば、フルオレセインもしくは蛍光タンパク質）、放射性核種またはビオチンをさらに含む、
キット。 - 試料中のＥＢＶの存在またはレベルを検出するための方法であって、請求項１～１２のいずれか１項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片または請求項２１に記載のコンジュゲートを使用することを含み、
好ましくは、免疫学的アッセイ、例えば、ウエスタンブロット、酵素免疫アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）、化学発光免疫アッセイ、蛍光免疫アッセイまたは放射免疫アッセイであり、
好ましくは、請求項２１に記載のコンジュゲートを使用することを含み、
好ましくは、請求項１～１２のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片を使用することを含み、前記抗体またはその抗原結合断片を検出するために検出可能な標識（例えば、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼ）、化学発光試薬（例えば、アクリジニウムエステル、ルミノールおよびその誘導体、もしくはルテニウム誘導体）、蛍光色素（例えば、フルオレセインもしくは蛍光タンパク質）、放射性核種またはビオチン）を保有する二次抗体を使用することをさらに含む、方法。 - 請求項１～１２のいずれか１項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片または請求項２１に記載のコンジュゲートの検出試薬の製造における使用であって、前記検出試薬が、試料中のＥＢＶの存在もしくはレベルを検出するために、および／または対象がＥＢＶに感染しているかどうかを診断するために使用され、
好ましくは、前記検出試薬が請求項２３に記載の方法によって前記試料中のＥＢＶの存在またはレベルを検出し、
好ましくは、前記試料が対象（例えば、哺乳動物、好ましくはヒト）由来の体液試料（例えば、全血、血漿、血清、唾液、排泄物または尿）である、
使用。 - 単離されたエピトープペプチドまたはそのバリアントであって、前記エピトープペプチドが、ＥＢＶ ｇＢタンパク質の３４１～３６２位のアミノ酸残基内に位置するエピトープを含み、前記エピトープが、ＥＢＶ ｇＢタンパク質の３５２、３５６および３６０位のアミノ酸残基を少なくとも含み；前記バリアントが、１つまたは複数（例えば、１個、２個または３個）のアミノ酸残基の変異（例えば、置換、付加または欠失）によってのみそれが由来する前記エピトープペプチドとは異なり、前記ＥＢＶ ｇＢタンパク質の３５２、３５６および３６０位のアミノ酸に対応する位置に変異を含まず、それが由来する前記エピトープペプチドの生物学的機能を保持しており、
好ましくは、前記エピトープペプチドまたはそのバリアントが請求項１～４のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片によって特異的に結合され得、
好ましくは、前記ＥＢＶ ｇＢタンパク質の３４１～３６２位のアミノ酸残基が配列番号１８に記載されており、
好ましくは、前記ＥＢＶ ｇＢタンパク質が配列番号１７に記載の配列を有する、
単離されたエピトープペプチドまたはそのバリアント。 - 前記エピトープが、直鎖状エピトープであり、前記ＥＢＶ ｇＢタンパク質の３４１～３６２位のアミノ酸残基内に位置する少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個または少なくとも２０個の連続したアミノ酸残基からなり、
好ましくは、前記直鎖状エピトープが前記ＥＢＶ ｇＢタンパク質の３４１～３６２位のアミノ酸残基からなり、
好ましくは、前記エピトープペプチドが、ＥＢＶ ｇＢタンパク質の５～５０個（例えば、１０～５０個、１０～４０個、２０～４０個；例えば２０～２５個または３５～４０個；例えば、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個または４０個）の連続したアミノ酸残基からなり、前記直鎖状エピトープを含み、
好ましくは、前記エピトープペプチドが、前記ＥＢＶ ｇＢタンパク質の３４１～３６２位のアミノ酸残基または３３１～３６７位のアミノ酸残基からなり、
好ましくは、前記エピトープペプチドが、配列番号１８または１９に記載の配列からなる
請求項２５に記載の単離されたエピトープペプチドまたはそのバリアント。 - 前記エピトープが、立体構造エピトープであり、前記ＥＢＶ ｇＢタンパク質の３４１～３６２位のアミノ酸残基内に位置する少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個または少なくとも２０個の連続していないアミノ酸残基からなり、ＥＢＶ ｇＢタンパク質の３５２、３５６および３６０位のアミノ酸残基を少なくとも含み、
好ましくは、前記エピトープペプチドがＥＢＶ ｇＢタンパク質の５～５０個（例えば、１０～５０個、１０～４０個、２０～４０個；例えば、２０～２５個または３５～４０個；例えば、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個または４０個）の連続したアミノ酸残基からなり、前記立体構造エピトープを含む、
請求項２５に記載のエピトープペプチドまたはそのバリアント。 - 単離されたエピトープペプチドまたはそのバリアントであって、前記エピトープペプチドが、ＥＢＶ ｇＢタンパク質の５２８～６１６位のアミノ酸残基内に位置するエピトープを含み、前記エピトープがＥＢＶ ｇＢタンパク質の５４０、５６７、６１０および６１３のアミノ酸残基を少なくとも含み；前記バリアントが、１つまたは複数（例えば、１個、２個または３個）のアミノ酸残基の変異（例えば、置換、付加または欠失）によってのみそれが由来する前記エピトープペプチドとは異なり、前記ＥＢＶ ｇＢタンパク質の５４０、５６７、６１０および６１３位のアミノ酸に対応する位置に変異を含まず、それが由来する前記エピトープペプチドの生物学的機能を保持しており、
好ましくは、前記エピトープペプチドまたはそのバリアントが、請求項５～８のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片によって特異的に結合され得、
好ましくは、前記ＥＢＶ ｇＢタンパク質の５２８～６１６位のアミノ酸残基は、配列番号２０に記載されており、
好ましくは、前記ＥＢＶ ｇＢタンパク質が配列番号１７に記載の配列を有する
単離されたエピトープペプチドまたはそのバリアント。 - 前記エピトープが、直鎖状エピトープであり、前記ＥＢＶ ｇＢタンパク質の５２８～６１６位のアミノ酸残基内に位置する少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個または少なくとも２０個の連続したアミノ酸残基からなり、
好ましくは、前記直鎖状エピトープが前記ＥＢＶ ｇＢタンパク質の５２８～６１６位のアミノ酸残基からなり、
好ましくは、前記エピトープペプチドがＥＢＶ ｇＢタンパク質の５～１００個（例えば、１０～１００個、１０～９０個、２０～９０個；例えば、５～１０個、１０～２０個、２０～３０個、３０～４０個、４０～５０個、５０～６０個、６０～７０個、７０～８０個、８０～９０個）の連続したアミノ酸残基からなり、前記直鎖状エピトープを含み；
好ましくは、前記エピトープペプチドが前記ＥＢＶ ｇＢタンパク質の５２８～６１６位のアミノ酸残基またはその断片からなり、
好ましくは、前記エピトープペプチドが配列番号２０に記載の配列またはその断片からなる、
請求項２８に記載の単離されたエピトープペプチドまたはそのバリアント。 - 前記エピトープが、立体構造エピトープであり、前記ＥＢＶ ｇＢタンパク質の５２８～６１６位のアミノ酸残基内の少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個または少なくとも２０個の連続していないアミノ酸残基からなり、ＥＢＶ ｇＢタンパク質の５４０、５６７、６１０および６１３位のアミノ酸残基を少なくとも含み、
好ましくは、前記エピトープペプチドがＥＢＶ ｇＢタンパク質の５～１００個（例えば、１０～１００個、１０～９０個、２０～９０個；例えば５～１０個、１０～２０個、２０～３０個、３０～４０個、４０～５０個、５０～６０個、６０～７０個、７０～８０個、８０～９０個）の連続したアミノ酸残基からなり、前記立体構造エピトープを含む
請求項２８に記載のエピトープペプチドまたはそのバリアント。 - 請求項２５～３０のいずれか１項に記載の単離されたエピトープペプチドまたはそのバリアントおよび担体タンパク質を含む組換えタンパク質であって、天然に存在するタンパク質またはその断片ではなく、
好ましくは、前記エピトープペプチドまたはそのバリアントが前記担体タンパク質に、任意選択でリンカーを介して連結されている、
組換えタンパク質。 - 請求項２５～２７のいずれか１項に記載の単離されたエピトープペプチドまたはそのバリアントを提示することができ、前記エピトープペプチドまたはそのバリアントが請求項１～４のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片によって特異的に結合され得る、
請求項３１に記載の組換えタンパク質。 - 請求項２８～３０のいずれか１項に記載の単離されたエピトープペプチドまたはそのバリアントを提示することができ、前記エピトープペプチドまたはそのバリアントが請求項５～８のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片によって特異的に結合され得る、
請求項３１に記載の組換えタンパク質。 - 次の特徴：
（ａ）対象においてＥＢＶを中和すること、および／または前記ＥＢＶと細胞の融合を遮断するか、もしくは阻害することができる抗血清を誘導すること、
（ｂ）ｉｎ ｖｉｖｏでＥＢＶおよびＥＢＶ感染細胞を排除することに有効な抗体応答を誘導すること、
（ｃ）対象においてＥＢＶ感染またはＥＢＶ感染に関連する疾患を予防するおよび／または処置すること
の１つまたは複数を有する、請求項３１～３３のいずれか１項に記載の組換えタンパク質。 - 請求項２５～３０のいずれか１項に記載のエピトープペプチドもしくはそのバリアント、または請求項３１～３４のいずれか１項に記載の組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
- 請求項３５に記載の単離された核酸分子を含む、ベクター。
- 請求項３５に記載の単離された核酸分子または請求項３６に記載のベクターを含む、宿主細胞。
- 請求項２５～３０のいずれか１項に記載のエピトープペプチドもしくはそのバリアントまたは請求項３１～３４のいずれか１項に記載の組換えタンパク質を調製するための方法であって、請求項３７に記載の宿主細胞を好適な条件下で培養すること、および細胞培養物から前記エピトープペプチドもしくはそのバリアントまたは前記組換えタンパク質を回収することを含む、方法。
- 請求項２５～３０のいずれか１項に記載の単離されたエピトープペプチドまたはそのバリアントをその表面上に提示する粒子であって、
好ましくは、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）である、
粒子。 - 請求項２５～３０のいずれか１項に記載のエピトープペプチドもしくはそのバリアント、または請求項３１～３４のいずれか１項に記載の組換えタンパク質、または請求項３９に記載の粒子、ならびに任意選択で薬学的に許容される担体および／または賦形剤（例えば、アジュバント）を含み、
好ましくは、ワクチンである
免疫原性組成物。 - 請求項２５～３０のいずれか１項に記載のエピトープペプチドもしくはそのバリアント、または請求項３１～３４のいずれか１項に記載の組換えタンパク質、または請求項３５に記載の単離された核酸分子、または請求項３６に記載のベクター、または請求項３７に記載の宿主細胞、または請求項３９に記載の粒子、または請求項４０に記載の免疫原性組成物の、免疫原性組成物の製造における使用であって、前記免疫原性組成物が、対象においてＥＢＶに対する免疫応答を誘導するため、ならびに／または対象においてＥＢＶ感染もしくはＥＢＶ感染に関連する疾患を予防するおよび／もしくは処置するために使用され、
好ましくは、前記免疫原性組成物がワクチンであり、
好ましくは、前記ＥＢＶ感染が慢性活動性ＥＢＶ（ＣＡＥＢＶ）感染または一次ＥＢＶ感染であり、
好ましくは、前記ＥＢＶ感染に関連する疾患が単核球症またはＥＢＶに関連するがんであり、
好ましくは、前記ＥＢＶに関連するがんが、リンパ球増殖性障害（ＬＰＤ）、例えばバーキットリンパ腫（ＢＬ）、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）もしくは移植後リンパ球増殖性障害（ＰＴＬＤ）などのＢ細胞リンパ腫、または上皮（鼻咽頭、肺、乳房）癌、リンパ上皮腫、リンパ球浸潤を伴う癌（ＧＣＬＳ、胃がんなど）、または神経膠腫からなる群から選択され、
好ましくは、前記対象がヒトなどの哺乳動物である
使用。 - 対象においてＥＢＶに対する免疫応答を誘導するため、ならびに／または対象（例えば、ヒト）においてＥＢＶ感染もしくはＥＢＶ感染に関連する疾患を予防するおよび／または処置するための方法であって：請求項２５～３０のいずれか１項に記載のエピトープペプチドもしくはそのバリアント、または請求項３１～３４のいずれか１項に記載の組換えタンパク質、または請求項３５に記載の単離された核酸分子、または請求項３６に記載のベクター、または請求項３７に記載の宿主細胞、または請求項３９に記載の粒子、または請求項４０に記載の免疫原性組成物の有効量をそれを必要とする前記対象に投与すること、
を含み、
好ましくは、前記ＥＢＶ感染が慢性活動性ＥＢＶ（ＣＡＥＢＶ）感染または一次ＥＢＶ感染であり、
好ましくは、前記ＥＢＶ感染に関連する疾患が、単核球症またはＥＢＶに関連するがんであり、
好ましくは、前記ＥＢＶに関連するがんが、リンパ球増殖性障害（ＬＰＤ）、例えばバーキットリンパ腫（ＢＬ）、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）もしくは移植後リンパ球増殖性障害（ＰＴＬＤ）などのＢ細胞リンパ腫、または上皮（鼻咽頭、肺、乳房）癌、リンパ上皮腫、リンパ球浸潤を伴う癌（ＧＣＬＳ、胃がんなど）、または神経膠腫からなる群から選択され、
好ましくは、前記対象がヒトなどの哺乳動物である
方法。
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