JP2024506991A - デプスフィルタの再生および複数回使用 - Google Patents

デプスフィルタの再生および複数回使用 Download PDF

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Abstract

同じデプスフィルタを複数回使用して、すなわち、以前に使用されたことがありかつ再生されているデプスフィルタを使用して、治療用ポリペプチドを精製または製造するための方法が本明細書において報告される。治療用ポリペプチドを精製または製造するための方法であって、以下の工程：（ａ）デプスフィルタを通して、前記治療用ポリペプチドと不純物とを含有する水性組成物をろ過し、素通り画分を回収し、それによって、前記精製された治療用ポリペプチドを得る工程と、（ｂ）前記デプスフィルタを再生溶液と接触させ、それによって、前記デプスフィルタを再生する工程と、（ｃ）工程（ａ）および工程（ｂ）を１回以上繰り返す工程とを含むことを特徴とする方法が、本明細書において報告される。【選択図】なし

Description

本発明は、タンパク質精製の分野にある。特に、本発明は、タンパク質を精製または製造するための方法であって、同じデプスフィルタが複数回使用される、方法に関する。特に、本発明の方法は、不純物を除去するためにデプスフィルタを再使用する前に、デプスフィルタを再生溶液と接触させることを含む。
発明の背景
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）などの治療用生物製剤を製造するための商業的な製造方法は、細胞全体、細胞片、大きな粒子物質およびコロイド状物質を除去するために、しばしば様々な清澄化技術を使用する。これらの清澄化技術としては、遠心分離、デプスろ過、化学的軟凝集およびタンジェンシャルまたはノーマルフローろ過法を挙げることができ、下流の精製過程内の複数の工程に位置し得る。しばしば、清澄化工程の主要な役割は、細胞培養ブロスからｍＡｂ生成物を採取するためであり、これは、デプスろ過が後続する遠心分離の組み合わせによって達成され得る。採取清澄化工程は、不溶性物質を除去し、後続の無菌フィルタおよびクロマトグラフィーカラムを目詰まりから保護する。二次的清澄化および濁り除去用途のために、さらなる下流のデプスろ過工程も使用される。デプスフィルタはまた、ある程度の不純物除去を達成するために、特に、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）およびＤＮＡならびに凝集したｍＡｂ種などの生成物関連不純物などのプロセス関連不純物を除去するために使用されてきた（Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．２０１９，１４，１７００７７１（非特許文献1），Ｙｉｇｚａｗ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２００６，２２，２８８－２９６（非特許文献2））。
一般的に、デプスフィルタは、ろ過を実施するために、その深さまたは厚さを使用し、勾配密度を有するように構築された、一般的に、（流れの方向で見た時に）上部付近により大きな細孔および下部により小さな細孔を有する材料を使用して通例製造される。デプスフィルタは、多孔質媒体全体に粒子を保持し、孔径より大きな粒子と孔径より小さな粒子の両方の保持を可能にする。粒子保持は、サイズ排除ならびに疎水性、イオン性および他の相互作用を通じた吸着の両方を含むと考えられる。デプスフィルタは、いくつかの異なる形態で提供される。一般的な設計は、セルロースの層と、珪藻土（ＤＥ）などの多孔質ろ過助剤と、２つを結合する帯電したポリマー樹脂と、からなる。これらの主要な構成成分に基づいて、デプスフィルタは、下流での膜フィルタに対する不可欠な保護である不純物および粒子状材料を除去する。いくつかのデプスろ過システムが市販されている。全てのプロセス規模のモデル、例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＳｉｇｍａのＭｉｌｌｉｓｔａｋ＋Ｐｏｄ、Ｐａｌｌ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのＳｔａｘ、Ｃｕｎｏ Ｉｎｃ．の３Ｍ Ｚｅｔａ ＰｌｕｓおよびＳａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ ＢｉｏｔｅｃｈのＳａｒｔｏｃｌｅａｒ Ｐは、細胞を分離し、下流のクロマトグラフィーのための培養流体を調製する（Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，２０１７（非特許文献3））。
国際公開第２０１５／０３１８９９号（特許文献1）は、ポリアクリル系繊維、沈殿したシリカろ過助剤および帯電したポリマー結合剤樹脂から構成された合成デプスろ過媒体を開示する。この合成デプスフィルタは、Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ ＨＣ Ｐｒｏ Ｘ０ＳＰデプスフィルタとして知られており、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）から使い捨てフィルタとして市販されている。Ｘ０ＳＰデプスフィルタは、０．１ミクロンの公称孔径精度を有し、二次的清澄化用途が予定されている。Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）ＨＣ Ｐｒｏは、高容量合成媒体である。
一般的には、デプスフィルタは、使い捨てとして売られている。それによって、例えば、ＧＭＰ環境における必須条件である、ＣＩＰのためにシステムを停止する必要がないなどのある種の利点が提供されるとされている（Ｏ’Ｂｉｒａｎ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ １０，５０－６７（非特許文献4））。
しかしながら、複数回使用システムと比較して単回使用システムを用いると、ろ過コストが増大する。さらに、全体的なコスト低減の他に、資源の環境的節減に対する強い要望が存在する。
しかしながら、細孔封鎖、ケーク形成および／または細孔狭窄を含むデプスフィルタの汚染機構は、ろ過された不純物を除去するためのおよび少なくとも等しく有効なデプスフィルタを再生するために効率的な再生プロトコルを必要とする。
水酸化ナトリウムは、クロマトグラフィーカラムを清浄化し、衛生的にするための標準となっている。しかしながら、いくつかのクロマトグラフィー媒体は、水酸化ナトリウムと適合的でない。水酸化ナトリウムに対して感受性があるクロマトグラフィー媒体の例は、１）タンパク質リガンドを使用するクロマトグラフィー媒体、および２）シリカまたはガラスをベースとするクロマトグラフィー媒体（アプリケーションノート ２８－９８４５－６４ ＡＡ ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）である。ＮａＯＨが、シリカマトリックスには適切でないことがあり得ることは、シリカをベースとする材料の場合には、ｐＨ値をｐＨ１０より上にするＮａＯＨ処理は、多孔質構造の骨格である、シリカマトリックス中のシロキサン結合を加水分解する内在的なリスクを付随して有することを論述するＣｌａｅｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ；７２８（１９９６）２５９－２７０（非特許文献5）によっても示唆されている。
醸造所では、麦芽汁および保存されたビールのろ過の間に、珪藻土デプスフィルタ材がかなりの量で蓄積する。欧州特許第０，２５３，２３３号（特許文献2）は、高温および高濃度のＮａＯＨでの多段階手順を使用する、使用済みの珪藻土に対する時間のかかる退屈な再生プロトコルを記載する。さらに、ＮａＯＨ溶液は、使用前にＭｉｌｌｉｐｏｒｅデプスフィルタを無菌化／浄化するために使用された、米国特許出願公開第２０１６／０１１４２７２号（特許文献3）。通常、販売されている使い捨てフィルタは浄化されておらず、流す前に浄化を必要とする。
デプスフィルタの精製のために一般的に使用される別の方法は、（例えば、水泳用プールにおいて）例えば、緩衝液または水でバックフラッシュすることである。
国際公開第２０１５／０３１８９９号 欧州特許第０，２５３，２３３号 米国特許出願公開第２０１６／０１１４２７２号
Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．２０１９，１４，１７００７７１ Ｙｉｇｚａｗ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２００６，２２，２８８－２９６ Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，２０１７ Ｏ’Ｂｉｒａｎ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ １０，５０－６７ Ｃｌａｅｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ；７２８（１９９６）２５９－２７０
基礎となる発明は、デプスフィルタ、特に、シリカを含むデプスフィルタの複数回使用または再使用を可能にする方法を提供する。これは、例えば、酸性もしくはアルカリ溶液でフィルタ材を再生することによって、またはデプスフィルタの最初の使用より前にデプスフィルタを前処理すること、すなわち、デプスフィルタの状態を整えることによって、およびこれらの組み合わせによって達成される。より詳細には、本発明は、デプスフィルタの最初の使用より前にデプスフィルタにアルカリ溶液を流すか、またはデプスフィルタをアルカリ溶液で前処理することによって、デプスフィルタの有効性を増大させるための方法も提供する。本発明の方法を使用することによって、デプスフィルタの有効性を増大させることができるのみならず、同時に再生することができる。これは、デプスフィルタの使い捨てと比べて、多大な経済的および環境的利点をもたらす。
同じデプスフィルタを複数回使用して（すなわち、同じデプスフィルタが少なくとも２回使用されたことがありかつ使用の間に再生されている）、治療用ポリペプチドを精製または製造するための方法が本明細書において報告されている。本発明は、デプスフィルタ（ろ過助剤としてシリカを含有し、単回使用の使い捨てデプスフィルタであることが意図されているものなど）を複数回使用することができる、すなわち、本発明の方法に従って、例えば酸性またはアルカリ溶液と前記デプスフィルタを接触させ／例えば酸性またはアルカリ溶液で前記デプスフィルタを洗浄する／再生することによって、デプスフィルタを再生することができるという予想外の発見に、少なくとも部分的に基づいている。再生されたデプスフィルタは、驚くべきことに、（デプスフィルタの最初の使用におけるのと同等の純度および収率で）主要な生成物を回収する能力を保ちながら、例えば、とりわけ、加水分解的に活性である宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）などの、プロセス関連不純物を除去するその能力を維持する。
したがって、本発明の一態様は、治療用ポリペプチドを精製するための方法であって、前記方法は、以下の工程：
（ａ）デプスフィルタを通して、前記治療用ポリペプチドと不純物とを含有する水性組成物をろ過し、素通り画分を回収し、それによって、前記治療用ポリペプチドを精製する／前記精製された治療用ポリペプチドを得る工程と、
（ｂ）（工程（ａ）の後の）前記デプスフィルタを酸性（再生）溶液と接触させ、それによって、前記デプスフィルタを再生する工程と、
（ｃ）工程（ａ）および工程（ｂ）を１回以上繰り返す工程と
を含むことを特徴とする、方法である。
本発明の別の態様は、治療用ポリペプチドを製造するための方法であって、前記方法は、以下の工程：
（ａ）デプスフィルタを通して、前記治療用ポリペプチドと不純物とを含有する水性組成物をろ過し、素通り画分を回収し、それによって、前記治療用ポリペプチドを製造する／得る工程と、
（ｂ）（工程（ａ）の後の）前記デプスフィルタを酸性（再生）溶液と接触させ、それによって、前記デプスフィルタを再生する工程と、
（ｃ）工程（ａ）および工程（ｂ）を１回以上繰り返す工程と
を含むことを特徴とする、方法である。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、工程（ｂ）の酸性（再生）溶液は、リン酸を含む溶液である。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、工程（ｂ）の酸性（再生）溶液は、リン酸および酢酸を含む溶液である。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、工程（ｂ）の酸性（再生）溶液は、約０．１Ｍ～約０．８Ｍ、または約０．２Ｍ～約０．７Ｍ、または約０．４Ｍ～約０．６Ｍの濃度のリン酸を含む。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、工程（ｂ）の酸性（再生）溶液は、約０．３Ｍ、または約０．４Ｍ、または約０．５Ｍ、または約０．６Ｍの濃度のリン酸を含む。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、工程（ｂ）の酸性（再生）溶液は、約１０ｍＭ～約２Ｍ、または約２０ｍＭ～約１．５Ｍ、または約５０ｍＭ～約１Ｍ、または約８０ｍＭ～約８００ｍＭの濃度の酢酸を含む。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、工程（ｂ）の酸性（再生）溶液は、約１０ｍＭ、または約２０ｍＭ、または約５０ｍＭ、または約１００ｍＭ、または約１２０ｍＭ、または約１４０ｍＭ、または約１６０ｍＭ、または約１８０ｍＭ、または約２００ｍＭ、または約５００ｍＭ、または約１Ｍ、または約２Ｍの濃度の酢酸を含む。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、工程（ｂ）の酸性（再生）溶液は、約３００ｍＭの濃度のリン酸および約１６７ｍＭの濃度の酢酸を含む。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、工程（ｂ）の酸性（再生）溶液は、約１～約５．５、または約１～約５、または約１～約４．５、または約１～約４、または約１～約３．５、または約１～約３のｐＨ値を有する。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、工程（ｂ）の酸性（再生）溶液は、約１、または約１．３、または約１．５、または約１．７、または約１．９のｐＨ値を有する。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、工程（ｂ）の酸性（再生）溶液は、酸性の水性緩衝溶液である。
本発明による方法において、アルカリ再生溶液も使用することができることがさらに見出された。
したがって、本発明の一態様は、治療用ポリペプチドを精製するための方法であって、前記方法は、以下の工程：
（ａ）デプスフィルタを通して、前記治療用ポリペプチドと不純物とを含有する水性組成物をろ過し、素通り画分を回収し、それによって、前記治療用ポリペプチドを精製する／前記精製された治療用ポリペプチドを得る工程と、
（ｂ）（工程（ａ）の後の）前記デプスフィルタをアルカリ（再生）溶液と接触させ、それによって、前記デプスフィルタを再生する工程と、
（ｃ）工程（ａ）および工程（ｂ）を１回以上繰り返す工程と
を含むことを特徴とする、方法である。
本発明の１つのさらなる態様は、治療用ポリペプチドを製造するための方法であって、前記方法は、以下の工程：
（ａ）デプスフィルタを通して、前記治療用ポリペプチドと不純物とを含有する水性組成物をろ過し、素通り画分を回収し、それによって、前記治療用ポリペプチドを製造する／得る工程と、
（ｂ）（工程（ａ）の後の）前記デプスフィルタをアルカリ（再生）溶液と接触させ、それによって、前記デプスフィルタを再生する工程と、
（ｃ）工程（ａ）および工程（ｂ）を１回以上繰り返す工程と
を含むことを特徴とする、方法である。
アルカリ溶液は、再生溶液として使用されることに加えて、（デプスフィルタの最初の使用前に）デプスフィルタの前処理においても使用することができ、有益な効果をもたらすことがさらに見出された。
したがって、本発明による一態様は、治療用ポリペプチドを精製するための方法であって、前記方法は、以下の工程：
（ａ０）デプスフィルタをアルカリ溶液と接触させる／インキュベートする工程と、
（ａ）（工程（ａ０）において得られた）前記デプスフィルタを通して、前記治療用ポリペプチドと不純物とを含有する水性組成物をろ過し、素通り画分を回収し、それによって、前記治療用ポリペプチドを精製する／前記精製された治療用ポリペプチドを得る工程と、
（ｂ）（工程（ａ）の後の）前記デプスフィルタをアルカリ（再生）溶液と接触させ、それによって、前記デプスフィルタを再生する工程と、
（ｃ）工程（ａ）および工程（ｂ）を１回以上繰り返す工程と
を含むことを特徴とする、方法である。
本発明の１つのさらなる態様は、治療用ポリペプチドを製造するための方法であって、前記方法は、以下の工程：
（ａ０）デプスフィルタをアルカリ溶液と接触させる／インキュベートする工程と、
（ａ）（工程（ａ０）において得られた）前記デプスフィルタを通して、前記治療用ポリペプチドと不純物とを含有する水性組成物をろ過し、素通り画分を回収し、それによって、前記治療用ポリペプチドを得る工程と、
（ｂ）（工程（ａ）の後の）前記デプスフィルタをアルカリ（再生）溶液と接触させ、それによって、前記デプスフィルタを再生する工程と、
（ｃ）工程（ａ）および工程（ｂ）を１回以上繰り返す工程と
を含むことを特徴とする、方法である。
アルカリ溶液でのデプスフィルタの前処理と組み合わせて、本発明による方法における再生溶液として水性緩衝溶液を使用することができ、これは有益な効果をもたらすことがさらに見出された。
したがって、本発明による一態様は、治療用ポリペプチドを精製するための方法であって、前記方法は、以下の工程：
（ａ０）デプスフィルタをアルカリ溶液と接触させる／インキュベートする工程と、
（ａ）（工程（ａ０）において得られた）前記デプスフィルタを通して、前記治療用ポリペプチドと不純物とを含有する水性組成物をろ過し、素通り画分を回収し、それによって、前記精製された治療用ポリペプチドを得る工程と、
（ｂ）（工程（ａ）の後の）前記デプスフィルタを水性緩衝（再生）溶液と接触させ、それによって、前記デプスフィルタを再生する工程と、
（ｃ）工程（ａ）および工程（ｂ）を１回以上繰り返す工程と
を含むことを特徴とする、方法である。
本発明の１つのさらなる態様は、治療用ポリペプチドを製造するための方法であって、前記方法は、以下の工程：
（ａ０）デプスフィルタをアルカリ溶液とインキュベートする工程と、
（ａ）（工程（ａ０）において得られた）前記デプスフィルタを通して、前記治療用ポリペプチドと不純物とを含有する水性組成物をろ過し、素通り画分を回収し、それによって、前記治療用ポリペプチドを製造する／得る工程と、
（ｂ）（工程（ａ）の後の）前記デプスフィルタを水性緩衝（再生）溶液と接触させ、それによって、前記デプスフィルタを再生する工程と、
（ｃ）工程（ａ）および工程（ｂ）を１回以上繰り返す工程と
を含むことを特徴とする、方法である。
アルカリ溶液でのデプスフィルタの前処理と組み合わせて、本発明による方法における再生溶液として、水性緩衝溶液と組み合わせた／水性緩衝溶液が後続する水を使用することができ、これは有益な効果をもたらすことがさらに見出された。
したがって、本発明による一態様は、治療用ポリペプチドを精製するための方法であって、前記方法は、以下の工程：
（ａ０）デプスフィルタをアルカリ溶液と接触させる／インキュベートする工程と、
（ａ）（工程（ａ０）において得られた）前記デプスフィルタを通して、前記治療用ポリペプチドと不純物とを含有する水性組成物をろ過し、素通り画分を回収し、それによって、前記治療用ポリペプチドを精製する／前記精製された治療用ポリペプチドを得る工程と、
（ｂ）（工程（ａ）の後の）前記デプスフィルタを水と、その後水性緩衝（再生）溶液と接触させ、それによって、前記デプスフィルタを再生する工程と、
（ｃ）工程（ａ）および工程（ｂ）を１回以上繰り返す工程と
を含むことを特徴とする、方法である。
本発明の１つのさらなる態様は、治療用ポリペプチドを製造するための方法であって、前記方法は、以下の工程：
（ａ０）デプスフィルタをアルカリ溶液と接触させる／インキュベートする工程と、
（ａ）（工程（ａ０）において得られた）前記デプスフィルタを通して、前記治療用ポリペプチドと不純物とを含有する水性組成物をろ過し、素通り画分を回収し、それによって、前記治療用ポリペプチドを製造する／得る工程と、
（ｂ）（工程（ａ）の後の）前記デプスフィルタを水と、その後水性緩衝（再生）溶液と接触させ、それによって、前記デプスフィルタを再生する工程と、
（ｃ）工程（ａ）および工程（ｂ）を１回以上繰り返す工程と
を含むことを特徴とする、方法である。
アルカリ溶液でのデプスフィルタの前処理と組み合わせて、再生溶液として水を使用することができ、これは有益な効果をもたらすことがさらに見出された。
したがって、本発明による一態様は、治療用ポリペプチドを精製するための方法であって、前記方法は、以下の工程：
（ａ０）デプスフィルタをアルカリ溶液と接触させる／インキュベートする工程と、
（ａ）（工程（ａ０）において得られた）前記デプスフィルタを通して、前記治療用ポリペプチドと不純物とを含有する水性組成物をろ過し、素通り画分を回収し、それによって、前記治療用ポリペプチドを精製する／前記精製された治療用ポリペプチドを得る工程と、
（ｂ）（工程（ａ）の後の）前記デプスフィルタを水と接触させ、それによって、前記デプスフィルタを再生する工程と、
（ｃ）工程（ａ）および工程（ｂ）を１回以上繰り返す工程と
を含むことを特徴とする、方法である。
本発明の１つのさらなる態様は、治療用ポリペプチドを製造するための方法であって、前記方法は、以下の工程：
（ａ０）デプスフィルタをアルカリ溶液と接触させる／インキュベートする工程と、
（ａ）（工程（ａ０）において得られた）前記デプスフィルタを通して、前記治療用ポリペプチドと不純物とを含有する水性組成物をろ過し、素通り画分を回収し、それによって、前記治療用ポリペプチドを得る工程と、
（ｂ）（工程（ａ）の後の）前記デプスフィルタを水と接触させ、それによって、前記デプスフィルタを再生する工程と、
（ｃ）工程（ａ）および工程（ｂ）を１回以上繰り返す工程と
を含むことを特徴とする、方法である。
本発明による１つのさらなる態様は、治療用ポリペプチドの精製において少なくとも２回使用されている（シリカを含む）デプスフィルタの再生のための酸性溶液の使用である。
本発明による１つのさらなる態様は、治療用ポリペプチドの精製において少なくとも２回使用されている（シリカを含む）デプスフィルタの再生のための、アルカリ溶液の使用である。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、デプスフィルタは（ろ過助剤として）シリカを含む。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、前記方法は、（ＨＣＰに基づく／起因する）酵素的加水分解活性／加水分解活性速度を低下させる。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、前記方法は、酵素的加水分解活性を有するＨＣＰ（宿主細胞タンパク質）を低下させ／除去する。上記態様のある実施形態および他の実施形態において、前記方法は、（フィルタへの適用前の工程（ａ）の）水性組成物と比較して、精製された治療用ポリペプチドの酵素的加水分解活性速度を低下させる。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、前記方法は、（フィルタの適用前の工程（ａ）の）水性組成物と比較して、精製された治療用ポリペプチドの酵素的加水分解活性速度を少なくとも２５％、または少なくとも３０％、または少なくとも３５％、または少なくとも４０％低下させる。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、酵素的加水分解活性速度は、（実施例２１において本明細書に記載されているような）リパーゼ活性アッセイによって決定される。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、酵素的加水分解活性速度は、基質の酵素的加水分解によって決定される。上記態様のある実施形態および他の実施形態において、酵素的加水分解活性速度は、基質の変換をモニタリングすることによって決定される。上記態様のある実施形態および他の実施形態において、酵素的加水分解活性速度は、試料中に存在するヒドロラーゼ／精製された治療用ポリペプチドによるエステル結合の切断による、蛍光発生基質４－メチルウンベリフェリルカプリラート（４－ＭＵ－Ｃ８）の、蛍光部分、すなわち４－メチルウンベリフェリル（４－ＭＵ）への変換をモニタリングすることによって決定される。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、酵素的加水分解活性速度は、基質の酵素加水分解によって決定される。一実施形態において、加水分解速度は、４－メチルウンベリフェリルカプリラートまたは非イオン性界面活性剤、例えば、ポリソルベート（一実施形態において、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０）の加水分解速度である。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、精製された／製造された治療用ポリペプチドおよび非イオン性界面活性剤、例えば、ポリソルベートを含む薬学的製剤は、精製された／製造された治療用ポリペプチドの代わりに水性組成物を含む同一の薬学的製剤と比較して、非イオン性界面活性剤、例えば、ポリソルベートの低下した加水分解を示す。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、工程（ｂ）に従って処理された（すなわち、再生後の）デプスフィルタを使用して工程（ａ）で得られた（単量体）治療用ポリペプチドの収率は、デプスフィルタを初めて使用する工程（ａ）において、すなわち最初のろ過工程において得られた収率の少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％である。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、工程（ｂ）（すなわち、再生）を実施した後に工程（ａ）で得られた（単量体）治療用ポリペプチドの収率は、初めてデプスフィルタを使用する工程（ａ）において、すなわち最初のろ過工程において得られた収率の少なくとも９０％である。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、デプスフィルタは、
（ｉ）ポリアクリル系繊維およびシリカ、
（ｉｉ）セルロース繊維、珪藻土およびパーライト、ならびに
（ｉｉｉ）セルロース繊維および帯電した表面基（カチオン性電荷修飾）
からなる群から選択される材料を含む。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、デプスフィルタは、Ｘ０ＳＰデプスフィルタまたはＰＤＤ１デプスフィルタまたはａＶＲ０２デプスフィルタからなる群から選択される。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、デプスフィルタは、Ｘ０ＳＰデプスフィルタまたはＰＤＤ１デプスフィルタである。
上記態様のある実施形態および他の実施形態においては、デプスフィルタを、工程（ｂ）の（再生）溶液と約２０分間、２０分間以上、３０分間以上、４０分間以上、５０分間以上、または６０分間以上接触させる。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、デプスフィルタは、第１のクロマトグラフィー工程の前に／水性組成物をクロマトグラフィー材料に適用する前に使用される。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、フィルタは、第１のクロマトグラフィー工程の後に／水性組成物をクロマトグラフィー材料に適用した後に使用される、すなわち水溶液はクロマトグラフィーで精製された水溶液である。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、治療用ポリペプチドは組換え産生されたタンパク質である。上記態様のある実施形態および他の実施形態において、治療用ポリペプチドは、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベートとともに製剤化されている組換え産生されたタンパク質である。上記態様のある実施形態および他の実施形態において、治療用ポリペプチドは、抗体、抗体断片、抗体融合ポリペプチド、Ｆｃ領域融合ポリペプチド、インターフェロン、血液因子、サイトカインおよび酵素からなる治療用ポリペプチドの群から選択される。
示され、特許請求される様々な態様および実施形態に加えて、本発明はまた、本明細書に開示および特許請求されている態様および実施形態の他の組み合わせを有する他の実施形態も包含する。したがって、本明細書に提示される、特に態様または実施形態として提示される特定の特徴は、本開示の主題が本明細書に開示される特徴の任意の好適な組み合わせを含むように、本開示の主題の範囲内において他の様式で互いに組み合わせられ得る。開示される主題の特定の実施形態の説明は、例示および説明の目的のために提示されている。網羅的であること、または開示された主題を開示される実施形態に限定することは意図されていない。
発明の詳細な説明
同じデプスフィルタを複数回使用して、すなわち、以前に使用されたことがありかつ再生されているデプスフィルタを使用して治療用ポリペプチドを精製または製造するための方法が本明細書において報告される。
本発明は、少なくとも部分的には、本発明による方法における酸性またはアルカリ溶液がデプスフィルタの使用後にデプスフィルタに適用されると、すなわち、デプスフィルタがこれによって再生されると、デプスフィルタの容量限界に達した後に、デプスフィルタの機能性が維持され得るという予想外の発見に基づく。
本発明による再使用のためのデプスフィルタの再生は、一般原理に従う。再生は、異なる性質の再生溶液を用いて行うことができる。本発明の異なる態様において、再生は、
－酸性再生溶液、または
－アルカリ再生溶液
を適用することによって実施される。
酸性再生溶液またはアルカリ再生溶液は、酸性水性緩衝溶液またはアルカリ水性緩衝溶液であり得る。
本発明はさらに、少なくとも部分的には、デプスフィルタのアルカリ前処理と組み合わされれば、上記溶液の１つによる処理がもたらされ得るまたは改善され得るという発見に基づいている。
アルカリ前処理では、デプスフィルタをその最初の使用より前に規定の期間アルカリ溶液とインキュベートし、上記再生溶液の１つによって再生を行い、さらに水性緩衝再生溶液、または水、または水性緩衝再生溶液と組み合わせた水を使用することができる。
本発明はさらに、少なくとも部分的に、デプスフィルタのアルカリ前処理の後、デプスフィルタの再生は、
－水性緩衝再生溶液、または
－水もしくは水性緩衝再生溶液と組み合わせた水
を適用することによっても達成することができる。
本発明による方法は、抗体などの治療用ポリペプチドを製造する他、抗体などの治療用ポリペプチドを精製するために使用され得る。
より詳細には、再生溶液の使用は、治療用ポリペプチドを含む組成物の精製のためにデプスフィルタの複数回（サイクル）の再使用を可能にすることが見出された。本発明者らは、本発明の例示的な実施および実施形態として、いくつかの異なるデプスフィルタ、異なる再生溶液および（異なるフォーマットでの）異なる抗体／治療用ポリペプチドとの、本発明による方法の一般的な適用可能性を示した。
図１は、ＰＤＤ１デプスフィルタ（セルロース繊維、珪藻土およびパーライトを含むＰＤＤ１ ＳＵＰＲＡｃａｐ（商標）－５０（ＳＣ０５０ＰＤＤ１））の複数回使用に対する（実施例２１によるＬＥＡＰアッセイで測定された）加水分解活性の経過を示す。抗Ｃ５抗体である抗体クロバリマブを治療用ポリペプチドとして含有する水性組成物を使用した。各ろ過サイクル（＃１～＃６）において、デプスフィルタに同量の抗体組成物を搭載し、デプスフィルタを通過させた。得られた組成物、すなわちろ液＃１～＃６を分析した。一般に、ろ液中の加水分解活性の一定の増加を見ることができる。最初の２サイクルでは、デプスフィルタの結合容量限界をまだ超えていなかった。第２のサイクル（＃２）は、デプスフィルタが初めて再使用された後のろ液中の加水分解活性を示す。サイクルの間には、デプスフィルタの処理、すなわち再生を行わなかった。加水分解活性は増加するが、わずかに増加するに過ぎず、デプスフィルタの結合容量限界には未だ到達していないので、これは予想され得る。サイクル＃３以降では、すなわちデプスフィルタの結合容量を超えた後には、デプスフィルタは再生なしでさらに再使用される。加水分解活性が有意に増加することを見ることができる。
図２は、ＰＤＤ１デプスフィルタの複数回使用および、図１に示される前の例において使用されたのと同じ治療用ポリペプチド（抗体クロバリマブ、抗Ｃ５抗体）を含有する水性組成物中での加水分解活性を低下させるその能力を示すが、ここではサイクル間で異なる溶液を適用する。これらの例においても、各ろ過サイクルにおいて、デプスフィルタに同量の抗体組成物を搭載し、これをデプスフィルタに通し、ろ液を分析した。これは、（図１に示されている）先の例で使用されたのと同じフィルタの種類であり、同じ抗体組成物を用い、同じ搭載量を使用するので、第２のろ過サイクルの後に、デプスフィルタの結合容量に達し、第３のろ過サイクルでデプスフィルタの結合容量を超過する。各サイクルの後、デプスフィルタは、次のろ過サイクルの前に溶液で処理される。
第１の設定（実施例１１参照）では、溶液は酸性溶液（リン酸；灰色バー）であった。驚くべきことに、サイクルの間にデプスフィルタを酸性溶液と接触させると、デプスフィルタの機能を著しく損なうことなく、デプスフィルタを複数回再使用することができることが見出された。加水分解活性は、搭載（デプスろ過前）と比較して、全サイクルを通じて極めて低いレベルのままである。したがって、酸性溶液を用いて、デプスフィルタの効率的な再生を達成することができた。
第２の設定（実施例１０参照）では、サイクルの間にアルカリ溶液（水酸化ナトリウム；黒い点のバー）をデプスフィルタに適用した。さらに、約３０分間水酸化ナトリウムとインキュベートすることによって、デプスフィルタをその最初の使用前に前処理した（ｐｅｒ－ｔｒｅａｔｅｄ）。再び、驚くべきことに、その機能を著しく損なうことなく、デプスフィルタを複数回再使用することができることが見出された。加水分解活性は搭載（デプスろ過前）と比較して極めて低く、複数のろ過サイクルにわたって低いレベルのままである、すなわちデプスフィルタは再使用のために複数回再生することができる。
第３の設定では、ろ過サイクルの間にデプスフィルタを水および緩衝溶液で処理した。アルカリ溶液による前処理は行わなかった（実施例９参照；灰色点線バー）。結合容量限界に達した後、ろ液中の加水分解活性の実質的な増加を観察することができる（図２の＃２および＃３を参照）。
図３では、図２に示される３つの設定に対して、（単量体）抗Ｃ５抗体の収率（収率主ピーク）が示されている。第１の設定については、高い収率を達成することができ、複数回の再生サイクルおよび複数回の使用後でさえ収率が高いレベルのままであることを見ることができる。第２の設定では、複数回の使用後に収率の増加さえ見ることができる。第１の設定と同様に、主ピーク収率も高いレベルのままである。これは、デプスフィルタが再生および再使用されるときに、主要な所望の生成物の著しい喪失が存在しないことを示している。第３の設定においても、主ピークの収率は高いままである。
図１～３に示されているような本発明による方法のこの予想外の効果は、同じ抗体に対して、他の異なるデプスフィルタについても同様の様式で再現された。これは、Ｘ０ＳＰデプスフィルタ（ポリアクリル系繊維およびシリカを含むＭｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）ＨＣ Ｐｒｏ Ｘ０ＳＰ）については図４～６に、ＶＲ０２デプスフィルタ（セルロース繊維および帯電した表面基を含むＺｅｔａ Ｐｌｕｓ（商標）Ｂｉｏｃａｐ ＶＲ０２）については図７～９に示されている。再生溶液、前処理の実施および異なる治療用タンパク質に関するさらなる変形が実施例に提示されている。
例えば、実施例１では、二重特異性抗体が使用され、デプスフィルタは前処理なしにアルカリ溶液で再生される。実施例１の表から分かるように、加水分解活性は著しく低下し、低いレベルのままである。興味深いことに、最初は収率が減少し、４回のろ過サイクル後に再び増加し、最初のろ過サイクル後よりも高いレベルに達する。主ピーク収率のこの低下は、アルカリ溶液によるフィルタの前処理によって回避することができる（例えば、実施例７および実施例１０（＝上記の図２中の設定２）を参照）。
当業者は、水性組成物が適用される前に、すなわちデプスフィルタを使用することができる前に、デプスフィルタは（平衡化緩衝液を用いて）平衡化されなければならないことを認識するであろう。これに明示的に言及することなく、工程（ａ）は、デプスフィルタを平衡化緩衝液と接触させるというサブ工程を含む。
本発明の特定の実施形態
酸性溶液による再生
酸性再生溶液を本発明による方法において使用することができることが見出された。
本発明による一態様は、治療用ポリペプチドを精製するための方法であって、前記方法は、以下の工程：
（ａ）デプスフィルタを通して、前記治療用ポリペプチドと不純物とを含有する水性組成物をろ過し、素通り画分を回収し、それによって、前記精製された治療用ポリペプチドを得る工程と、
（ｂ）（工程（ａ）の後の）前記デプスフィルタを酸性（再生）溶液と接触させ、それによって、前記デプスフィルタを再生する工程と、
（ｃ）工程（ａ）および工程（ｂ）を１回以上繰り返す工程と
を含むことを特徴とする、方法である。
本発明による一態様は、治療用ポリペプチドを精製するための方法であって、前記方法は、以下の工程：
（ａ）（（ろ過助剤としての）シリカを含む）デプスフィルタを通して、前記治療用ポリペプチドと不純物とを含有する水性組成物をろ過し、素通り画分を回収し、それによって、前記精製された治療用ポリペプチドを得る工程と、
（ｂ）（工程（ａ）の後の）前記デプスフィルタを酸性（再生）溶液と接触させ、それによって、前記デプスフィルタを再生する工程と、
（ｃ）工程（ａ）および工程（ｂ）を１回以上繰り返す工程と
を含むことを特徴とする、方法である。
本発明のさらなる態様は、治療用ポリペプチドを製造するための方法であって、前記方法は、以下の工程：
（ａ）デプスフィルタを通して、前記治療用ポリペプチドと不純物とを含有する水性組成物をろ過し、素通り画分を回収し、それによって、前記治療用ポリペプチドを得る工程と、
（ｂ）（工程（ａ）の後の）前記デプスフィルタを酸性（再生）溶液と接触させ、それによって、前記デプスフィルタを再生する工程と、
（ｃ）工程（ａ）および工程（ｂ）を１回以上繰り返す工程と
を含むことを特徴とする、方法である。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、工程（ｂ）の酸性再生溶液は、リン酸を含む溶液である。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、工程（ｂ）の酸性再生溶液は、酢酸を含む溶液である。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、工程（ｂ）の酸性再生溶液は、クエン酸を含む溶液である。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、工程（ｂ）の酸性再生溶液は、リン酸および酢酸を含む溶液である。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、工程（ｂ）の酸性再生溶液は、リン酸、酢酸およびベンジルアルコールを含む溶液である。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、工程（ｂ）の酸性再生溶液は、約０．１Ｍ～約０．８Ｍ、または約０．２Ｍ～約０．７Ｍ、または１つの好ましい実施形態において約０．４Ｍ～約０．６Ｍの濃度のリン酸を含む。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、工程（ｂ）の酸性再生溶液は、約０．３Ｍ、または約０．４Ｍ、または約０．５Ｍ、または約０．６Ｍの濃度のリン酸を含む。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、酸性再生溶液は、約１０ｍＭ～約２Ｍ、または約２０ｍＭ～約１．５Ｍ、または約５０ｍＭ～約１Ｍ、または１つの好ましい実施形態において約８０ｍＭ～約８００ｍＭの濃度の酢酸を含む。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、工程（ｂ）の酸性再生溶液は、約１０ｍＭ、または約２０ｍＭ、または約５０ｍＭ、または約１００ｍＭ、または約１２０ｍＭ、または約１４０ｍＭ、または約１６０ｍＭ、または約１８０ｍＭ、または約２００ｍＭ、または約５００ｍＭ、または約１Ｍ、または約２Ｍの濃度の酢酸を含む。
上記態様の１つの好ましい実施形態および他の実施形態において、工程（ｂ）の酸性再生溶液は、約３００ｍＭの濃度のリン酸および約１６７ｍＭの濃度の酢酸を含む。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、工程（ｂ）の酸性再生溶液は、約５０ｍＭ～約２００ｍＭの濃度の酢酸を含む溶液である。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、工程（ｂ）の酸性再生溶液は、約１０ｍＭ～約１００ｍＭの濃度のクエン酸を含む溶液である。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、酸性再生溶液は、約１～約５．５、または約１～約５、または約１～約４．５、または約１～約４、または約１～約３．５、または１つの好ましい実施形態において約１～約３のｐＨ値を有する。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、工程（ｂ）の酸性再生溶液は、約１、または約１．３、または約１．５のｐＨ値を有する。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、工程（ｂ）の酸性再生溶液は、酸性の水性緩衝溶液である。
アルカリ溶液を用いた再生
アルカリ再生溶液を本発明による方法において使用することができることが見出された。
本発明による一態様は、治療用ポリペプチドを精製するための方法であって、前記方法は、以下の工程：
（ａ）デプスフィルタを通して、前記治療用ポリペプチドと不純物とを含有する水性組成物をろ過し、素通り画分を回収し、それによって、前記精製された治療用ポリペプチドを得る工程と、
（ｂ）（工程（ａ）の後の）前記デプスフィルタをアルカリ（再生）溶液と接触させ、それによって、前記デプスフィルタを再生する工程と、
（ｃ）工程（ａ）および工程（ｂ）を１回以上繰り返す工程と
を含むことを特徴とする、方法である。
本発明の１つのさらなる態様は、治療用ポリペプチドを製造するための方法であって、前記方法は、以下の工程：
（ａ）デプスフィルタを通して、前記治療用ポリペプチドと不純物とを含有する水性組成物をろ過し、素通り画分を回収し、それによって、前記治療用ポリペプチドを得る工程と、
（ｂ）（工程（ａ）の後の）前記デプスフィルタをアルカリ（再生）溶液と接触させ、それによって、前記デプスフィルタを再生する工程と、
（ｃ）工程（ａ）および工程（ｂ）を１回以上繰り返す工程と
を含むことを特徴とする、方法である。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、工程（ｂ）のアルカリ再生溶液は、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）または水酸化カリウム（ＫＯＨ）を含む溶液である。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、工程（ｂ）のアルカリ溶液は、約０．１Ｍ～約１．５Ｍ、約０．２Ｍ～約１．４Ｍ、約０．３Ｍ～約１．２Ｍ、約０．４Ｍ～約１．１Ｍ、または約０．５Ｍ～約１Ｍの濃度のＮａＯＨを含む。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、工程（ｂ）のアルカリ溶液は、少なくとも約０．０１Ｍ、少なくとも約０．０５Ｍ、少なくとも約０．１Ｍ、少なくとも約０．２Ｍ、少なくとも約０．３Ｍ、少なくとも約０．４Ｍ、少なくとも約０．５Ｍ、少なくとも約０．６Ｍ、少なくとも約０．７Ｍ、少なくとも約０．８Ｍ、少なくとも約０．９Ｍ、少なくとも約１Ｍ、少なくとも約１．１Ｍ、少なくとも約１．２Ｍ、少なくとも約１．３Ｍ、少なくとも約１．４Ｍ、または少なくとも約１．５Ｍの濃度のＮａＯＨを含む。１つの好ましい実施形態において、工程（ｂ）のアルカリ溶液は、少なくとも約１ＭのＮａＯＨを含む。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、工程（ｂ）のアルカリ再生溶液は、アルカリ水性緩衝溶液である。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、工程（ｂ）のアルカリ溶液は、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）をさらに含む。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、工程（ｂ）のアルカリ溶液は、約０．５Ｍ～約２．５Ｍ、約０．６Ｍ～約２．３Ｍ、約０．７Ｍ～２Ｍ、約０．８Ｍ～約１．８Ｍ、または１つの好ましい実施形態において約０．９Ｍ～約１．５Ｍの濃度のＮａＣｌを含む。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、工程（ｂ）のアルカリ溶液は、約０．５Ｍ、約０．７Ｍ、約０．８Ｍ、または１つの好ましい実施形態において約１Ｍの濃度のＮａＣｌを含む。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、工程（ｂ）のアルカリ（再生）溶液は、約９～１４、約９．５～１４、または１つの好ましい実施形態において約１０～１４のｐＨ値を有する。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、工程（ｂ）のアルカリ再生溶液は、約９以上、約９．５以上、１つの好ましい実施形態において、約１０以上、約１０．５以上、または約１１以上のｐＨ値を有する。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、本方法は、工程（ａ）の前に、（ろ過助剤として）シリカを含むデプスフィルタをアルカリ溶液とともにインキュベートする工程（ａ０）をさらに含む。
当業者は、アルカリ溶液とのプレインキュベーション／前処理時間（接触時間）が、アルカリ溶液の濃度および／またはｐＨ値および／または流量に応じて変化し得ることを理解する。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、プレインキュベーションは、１００ｍＭ～１．２Ｍ ＮａＯＨ溶液とともに行われる。上記態様のある実施形態および他の実施形態において、プレインキュベーションは、３０分間～４．５時間、ＮａＯＨ溶液とともに行われる。上記態様の一実施形態および他の実施形態において、プレインキュベーションは、少なくとも約３０分間、少なくとも１００ｍＭ ＮａＯＨアルカリ溶液と行われる。上記態様の１つの好ましい実施形態および他の実施形態において、プレインキュベーションは、１ＭＮａＯＨアルカリ溶液とともに約４時間行われる。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、プレインキュベーションは、デプスフィルタ面積のｍ２当たり少なくとも５０Ｌ、または５０Ｌ～２００Ｌ、または１００Ｌ～１５０Ｌのアルカリ溶液とともに行われる。上記態様の１つの好ましい実施形態および他の実施形態において、プレインキュベーションは、デプスフィルタ面積のｍ２当たり１００Ｌ（１００Ｌ／ｍ２）のアルカリ溶液とともに行われる。
アルカリ溶液による再生およびアルカリ前処理
再生溶液としてアルカリ溶液を使用することができること、およびアルカリ溶液によるデプスフィルタの前処理が有益な効果を有することが見出された。
本発明による一態様は、治療用ポリペプチドを精製するための方法であって、前記方法は、以下の工程：
（ａ０）デプスフィルタをアルカリ溶液とインキュベートする工程と、
（ａ）（工程（ａ０）において得られた）前記デプスフィルタを通して、前記治療用ポリペプチドと不純物とを含有する水性組成物をろ過し、素通り画分を回収し、それによって、前記精製された治療用ポリペプチドを得る工程と、
（ｂ）（工程（ａ）の後の）前記デプスフィルタをアルカリ（再生）溶液と接触させ、それによって、前記デプスフィルタを再生する工程と、
（ｃ）工程（ａ）および工程（ｂ）を１回以上繰り返す工程と
を含むことを特徴とする、方法である。
本発明による一態様は、治療用ポリペプチドを精製するための方法であって、前記方法は、以下の工程：
（ａ０）（（ろ過助剤として）シリカを含む）デプスフィルタをアルカリ溶液とインキュベートする工程と、
（ａ）（工程（ａ０）において得られた）前記デプスフィルタを通して、前記治療用ポリペプチドと不純物とを含有する水性組成物をろ過し、素通り画分を回収し、それによって、前記精製された治療用ポリペプチドを得る工程と、
（ｂ）（工程（ａ）の後の）前記デプスフィルタをアルカリ（再生）溶液と接触させ、それによって、前記デプスフィルタを再生する工程と、
（ｃ）工程（ａ）および工程（ｂ）を１回以上繰り返す工程と
を含むことを特徴とする、方法である。
本発明の１つのさらなる態様は、治療用ポリペプチドを製造するための方法であって、前記方法は、以下の工程：
（ａ０）デプスフィルタをアルカリ溶液とインキュベートする工程と、
（ａ）（工程（ａ０）において得られた）前記デプスフィルタを通して、前記治療用ポリペプチドと不純物とを含有する水性組成物をろ過し、素通り画分を回収し、それによって、前記治療用ポリペプチドを得る工程と、
（ｂ）（工程（ａ）の後の）前記デプスフィルタをアルカリ（再生）溶液と接触させ、それによって、前記デプスフィルタを再生する工程と、
（ｃ）工程（ａ）および工程（ｂ）を１回以上繰り返す工程と
を含むことを特徴とする、方法である。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、工程（ａ０）のアルカリ溶液は、ＮａＯＨまたはＫＯＨを含む溶液である。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、工程（ｂ）のアルカリ再生溶液は、ＮａＯＨまたはＫＯＨを含む溶液である。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、工程（ａ０）または工程（ｂ）のアルカリ溶液は、約０．１Ｍ～約１．５Ｍ、約０．２Ｍ～約１．４Ｍ、約０．３Ｍ～約１．２Ｍ、約０．４Ｍ～約１．１Ｍ、約０．５Ｍ～約１Ｍの濃度のＮａＯＨを含む。１つの好ましい実施形態において、工程（ａ０）および（ｂ）のアルカリ溶液は、約０．９Ｍ～約１．１Ｍの濃度のＮａＯＨを含む。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、工程（ａ０）または工程（ｂ）のアルカリ溶液は、少なくとも約０．０５Ｍ、少なくとも約０．１Ｍ、少なくとも約０．２Ｍ、少なくとも約０．３Ｍ、少なくとも約０．４Ｍ、少なくとも約０．５Ｍ、少なくとも約０．６Ｍ、少なくとも約０．７Ｍ、少なくとも約０．８Ｍ、１つの好ましい実施形態において、少なくとも約０．９Ｍ、少なくとも約１Ｍ、少なくとも約１．１Ｍ、少なくとも約１．２Ｍ、少なくとも約１．３Ｍ、少なくとも約１．４Ｍ、または少なくとも約１．５Ｍの濃度のＮａＯＨを含む。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、プレインキュベーションは、１００ｍＭ～１．２Ｍ ＮａＯＨ溶液とともに行われる。上記態様のある実施形態および他の実施形態において、プレインキュベーションは、３０分間～４．５時間、ＮａＯＨ溶液とともに行われる。上記態様の一実施形態および他の実施形態において、プレインキュベーションは、少なくとも約３０分間、少なくとも１００ｍＭ ＮａＯＨアルカリ溶液と行われる。上記態様の１つの好ましい実施形態および他の実施形態において、プレインキュベーションは、１ＭＮａＯＨアルカリ溶液とともに約４時間行われる。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、プレインキュベーションは、デプスフィルタ面積のｍ２当たり少なくとも５０Ｌ、または５０Ｌ～２００Ｌ、または１００Ｌ～１５０Ｌのアルカリ溶液とともに行われる。上記態様の１つの好ましい実施形態および他の実施形態において、プレインキュベーションは、デプスフィルタ面積のｍ２当たり１００Ｌ（１００Ｌ／ｍ２）のアルカリ溶液とともに行われる。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、工程（ｂ）のアルカリ再生溶液は、アルカリ水性緩衝溶液である。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、工程（ａ０）および／または工程（ｂ）のアルカリ溶液は、ＮａＣｌをさらに含む。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、工程（ａ０）または工程（ｂ）のアルカリ溶液は、約０．５Ｍ～約２．５Ｍ、約０．６Ｍ～約２．３Ｍ、約０．７Ｍ～約２Ｍ、約０．８Ｍ～約１．８Ｍ、または１つの好ましい実施形態において約０．９Ｍ～約１．５Ｍの濃度のＮａＣｌを含む。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、工程（ａ０）または工程（ｂ）のアルカリ溶液は、約０．５Ｍ、約０．７Ｍ、約０．８Ｍ、または１つの好ましい実施形態において約１Ｍの濃度のＮａＣｌを含む。
水性緩衝溶液による再生およびアルカリ前処理
本発明による方法における再生溶液として水性緩衝溶液を使用することができること、およびデプスフィルタのアルカリ溶液での前処理は有益な効果を有することが見出された。
本発明による一態様は、治療用ポリペプチドを精製するための方法であって、前記方法は、以下の工程：
（ａ０）デプスフィルタをアルカリ溶液とインキュベートする工程と、
（ａ）（工程（ａ０）において得られた）前記デプスフィルタを通して、前記治療用ポリペプチドと不純物とを含有する水性組成物をろ過し、素通り画分を回収し、それによって、前記精製された治療用ポリペプチドを得る工程と、
（ｂ）（工程（ａ）の後の）前記デプスフィルタを水性緩衝（再生）溶液と接触させ、それによって、前記デプスフィルタを再生する工程と、
（ｃ）工程（ａ）および工程（ｂ）を１回以上繰り返す工程と
を含むことを特徴とする、方法である。
本明細書において報告される１つのさらなる態様は、治療用ポリペプチドを製造するための方法であって、前記方法は、以下の工程：
（ａ０）デプスフィルタをアルカリ溶液とインキュベートする工程と、
（ａ）（工程（ａ０）において得られた）前記デプスフィルタを通して、前記治療用ポリペプチドと不純物とを含有する水性組成物をろ過し、素通り画分を回収し、それによって、前記治療用ポリペプチドを得る工程と、
（ｂ）（工程（ａ）の後の）前記デプスフィルタを水性緩衝（再生）溶液と接触させ、それによって、前記デプスフィルタを再生する工程と、
（ｃ）工程（ａ）および工程（ｂ）を１回以上繰り返す工程と
を含むことを特徴とする、方法である。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、工程（ｂ）の水性緩衝再生溶液は、平衡化緩衝液／デプスフィルタを平衡化するために使用される緩衝液である。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、平衡化緩衝液は、約３．５～約８、または約３．５～約６、または好ましい実施形態において約４～約５．５のｐＨ値を有する。１つの好ましい実施形態において、平衡化緩衝液はｐＨ４＋／－０．２のｐＨ値を有する。１つの好ましい実施形態において、平衡化緩衝液はｐＨ５．５＋／－０．２のｐＨ値を有する。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、平衡化緩衝液は１５０ｍＭ酢酸／Ｔｒｉｓ（ヒドロキシメチル）アミノメタンを含む。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、工程（ａ０）のアルカリ溶液は、ＮａＯＨまたはＫＯＨを含む溶液である。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、工程（ａ０）のアルカリ溶液は、約０．１Ｍ～約１．５Ｍ、約０．２Ｍ～約１．４Ｍ、約０．３Ｍ～約１．２Ｍ、約０．４Ｍ～約１．１Ｍ、約０．５Ｍ～約１Ｍの濃度のＮａＯＨを含む。１つの好ましい実施形態において、工程（ａ０）のアルカリ溶液は、約０．９Ｍ～約１．１Ｍの濃度のＮａＯＨを含む。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、工程（ａ０）のアルカリ溶液は、少なくとも約０．０５Ｍ、少なくとも約０．１Ｍ、少なくとも約０．２Ｍ、少なくとも約０．３Ｍ、少なくとも約０．４Ｍ、少なくとも約０．５Ｍ、少なくとも約０．６Ｍ、少なくとも約０．７Ｍ、少なくとも約０．８Ｍ、１つの好ましい実施形態において、少なくとも約０．９Ｍ、少なくとも約１Ｍ、少なくとも約１．１Ｍ、少なくとも約１．２Ｍ、少なくとも約１．３Ｍ、少なくとも約１．４Ｍ、または少なくとも約１．５Ｍの濃度のＮａＯＨを含む。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、プレインキュベーションは、１００ｍＭ～１．２Ｍ ＮａＯＨ溶液とともに行われる。上記態様のある実施形態および他の実施形態において、プレインキュベーションは、３０分間～４．５時間、ＮａＯＨ溶液とともに行われる。上記態様の一実施形態および他の実施形態において、プレインキュベーションは、少なくとも約３０分間、少なくとも１００ｍＭ ＮａＯＨアルカリ溶液と行われる。上記態様の１つの好ましい実施形態および他の実施形態において、プレインキュベーションは、１ＭＮａＯＨアルカリ溶液とともに約４時間行われる。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、プレインキュベーションは、デプスフィルタ面積のｍ２当たり少なくとも５０Ｌ、または５０Ｌ～２００Ｌ、または１００Ｌ～１５０Ｌのアルカリ溶液とともに行われる。上記態様の１つの好ましい実施形態および他の実施形態において、プレインキュベーションは、デプスフィルタ面積のｍ２当たり１００Ｌ（１００Ｌ／ｍ２）のアルカリ溶液とともに行われる。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、工程（ｂ）のアルカリ再生溶液は、アルカリ水性緩衝溶液である。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、工程（ａ０）のアルカリ溶液は、ＮａＣｌをさらに含む。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、工程（ａ０）のアルカリ溶液は、約０．５Ｍ～約２．５Ｍ、約０．６Ｍ～約２．３Ｍ、約０．７Ｍ～約２Ｍ、約０．８Ｍ～約１．８Ｍ、または約０．９Ｍ～約１．５Ｍの濃度のＮａＣｌを含む。１つの好ましい実施形態において、工程（ａ０）のアルカリ溶液は、約０．９Ｍ～約１．１Ｍの濃度のＮａＯＨを含む。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、工程（ａ０）のアルカリ溶液は、少なくとも約０．５Ｍ、少なくとも約０．７Ｍ、少なくとも約０．８Ｍ、少なくとも約０．９Ｍ、または１つの好ましい実施形態において少なくとも約１Ｍの濃度のＮａＣｌを含む。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、工程（ａ０）のアルカリ再生溶液は、約９～１４、約９．５～１４、または約１０～１４のｐＨ値を有する。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、工程（ａ０）のアルカリ再生溶液は、約９以上、約９．５以上、１つの好ましい実施形態において、約１０以上、約１０．５以上、または約１１以上のｐＨ値を有する。
水性緩衝溶液が後続する水による再生およびアルカリ前処理
本発明による方法における再生溶液として水性緩衝溶液と組み合わせた／水性緩衝溶液が後続する水を使用することができること、およびデプスフィルタのアルカリ溶液での前処理は有益な効果を有することが見出された。
本明細書において報告される１つの態様は、治療用ポリペプチドを精製するための方法であって、前記方法は、以下の工程：
（ａ０）デプスフィルタをアルカリ溶液とインキュベートする工程と、
（ａ）（工程（ａ０）において得られた）前記デプスフィルタを通して、前記治療用ポリペプチドと不純物とを含有する水性組成物をろ過し、素通り画分を回収し、それによって、前記精製された治療用ポリペプチドを得る工程と、
（ｂ）（工程（ａ）の後の）前記デプスフィルタを水と、その後水性緩衝（再生）溶液と接触させ、それによって、前記デプスフィルタを再生する工程と、
（ｃ）工程（ａ）および工程（ｂ）を１回以上繰り返す工程と
を含むことを特徴とする、方法である。
本明細書において報告される１つのさらなる態様は、治療用ポリペプチドを製造するための方法であって、前記方法は、以下の工程：
（ａ０）デプスフィルタをアルカリ溶液とインキュベートする工程と、
（ａ）（工程（ａ０）において得られた）前記デプスフィルタを通して、前記治療用ポリペプチドと不純物とを含有する水性組成物をろ過し、素通り画分を回収し、それによって、前記治療用ポリペプチドを得る工程と、
（ｂ）（工程（ａ）の後の）前記デプスフィルタを水と、その後水性緩衝（再生）溶液と接触させ、それによって、前記デプスフィルタを再生する工程と、
（ｃ）工程（ａ）および工程（ｂ）を１回以上繰り返す工程と
を含むことを特徴とする、方法である。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、工程（ａ０）のアルカリ溶液は、ＮａＯＨまたはＫＯＨを含む溶液である。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、工程（ａ０）のアルカリ溶液は、約０．１Ｍ～約１．５Ｍ、約０．２Ｍ～約１．４Ｍ、約０．３Ｍ～約１．２Ｍ、約０．４Ｍ～約１．１Ｍ、約０．５Ｍ～約１Ｍの濃度のＮａＯＨを含む。１つの好ましい実施形態において、工程（ａ０）のアルカリ溶液は、約０．９Ｍ～約１．１Ｍの濃度のＮａＯＨを含む。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、工程（ａ０）のアルカリ溶液は、少なくとも約０．０５Ｍ、少なくとも約０．１Ｍ、少なくとも約０．２Ｍ、少なくとも約０．３Ｍ、少なくとも約０．４Ｍ、少なくとも約０．５Ｍ、少なくとも約０．６Ｍ、少なくとも約０．７Ｍ、少なくとも約０．８Ｍ、１つの好ましい実施形態において、少なくとも約０．９Ｍ、少なくとも約１Ｍ、少なくとも約１．１Ｍ、少なくとも約１．２Ｍ、少なくとも約１．３Ｍ、少なくとも約１．４Ｍ、または少なくとも約１．５Ｍの濃度のＮａＯＨを含む。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、プレインキュベーションは、１００ｍＭ～１．２ＭのＮａＯＨ溶液とともに行われる。上記態様のある実施形態および他の実施形態において、プレインキュベーションは、３０分間～４．５時間、ＮａＯＨ溶液とともに行われる。上記態様の一実施形態および他の実施形態において、プレインキュベーションは、少なくとも約３０分間、少なくとも１００ｍＭ ＮａＯＨアルカリ溶液と行われる。上記態様の１つの好ましい実施形態および他の実施形態において、プレインキュベーションは、１ＭＮａＯＨアルカリ溶液とともに約４時間行われる。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、プレインキュベーションは、デプスフィルタ面積のｍ２当たり少なくとも５０Ｌ、または５０Ｌ～２００Ｌ、または１００Ｌ～１５０Ｌのアルカリ溶液とともに行われる。上記態様の１つの好ましい実施形態および他の実施形態において、プレインキュベーションは、デプスフィルタ面積のｍ２当たり１００Ｌ（１００Ｌ／ｍ２）のアルカリ溶液とともに行われる。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、工程（ｂ）のアルカリ再生溶液は、アルカリ水性緩衝溶液である。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、工程（ａ０）のアルカリ溶液は、ＮａＣｌをさらに含む。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、工程（ａ０）のアルカリ溶液は、約０．５Ｍ～約２．５Ｍ、約０．６Ｍ～約２．３Ｍ、約０．７Ｍ～約２Ｍ、約０．８Ｍ～約１．８Ｍ、または約０．９Ｍ～約１．５Ｍの濃度のＮａＣｌを含む。１つの好ましい実施形態において、工程（ａ０）のアルカリ溶液は、約０．９Ｍ～約１．１Ｍの濃度のＮａＯＨを含む。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、工程（ａ０）のアルカリ溶液は、少なくとも約０．５Ｍ、少なくとも約０．７Ｍ、少なくとも約０．８Ｍ、少なくとも約０．９Ｍ、または１つの好ましい実施形態において少なくとも約１Ｍの濃度のＮａＣｌを含む。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、工程（ａ０）のアルカリ再生溶液は、約９～１４、約９．５～１４、または約１０～１４のｐＨ値を有する。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、工程（ａ０）のアルカリ再生溶液は、約９以上、約９．５以上、１つの好ましい実施形態において、約１０以上、約１０．５以上、または約１１以上のｐＨ値を有する。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、工程（ｂ）の水性緩衝再生溶液は、平衡化緩衝液／デプスフィルタを平衡化するために使用される緩衝液である。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、平衡化緩衝液は、約３．５～約８、または約３．５～約６、または好ましい実施形態において約４～約５．５のｐＨ値を有する。１つの好ましい実施形態において、平衡化緩衝液はｐＨ４＋／－０．２のｐＨ値を有する。１つの好ましい実施形態において、平衡化緩衝液はｐＨ５．５＋／－０．２のｐＨ値を有する。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、平衡化緩衝液は１５０ｍＭ酢酸／Ｔｒｉｓ（ヒドロキシメチル）アミノメタンを含む。
水による再生およびアルカリ前処理
再生溶液として水を使用することができること、およびアルカリ溶液によるデプスフィルタの前処理が有益な効果を有することが見出された。
本発明による一態様は、治療用ポリペプチドを精製するための方法であって、前記方法は、以下の工程：
（ａ０）デプスフィルタをアルカリ溶液とインキュベートする工程と、
（ａ）（工程（ａ０）において得られた）前記デプスフィルタを通して、前記治療用ポリペプチドと不純物とを含有する水性組成物をろ過し、素通り画分を回収し、それによって、前記精製された治療用ポリペプチドを得る工程と、
（ｂ）（工程（ａ）の後の）前記デプスフィルタを水と接触させ、それによって、前記デプスフィルタを再生する工程と、
（ｃ）工程（ａ）および工程（ｂ）を１回以上繰り返す工程と
を含むことを特徴とする、方法である。
本発明の１つのさらなる態様は、治療用ポリペプチドを製造するための方法であって、前記方法は、以下の工程：
（ａ０）デプスフィルタをアルカリ溶液とインキュベートする工程と、
（ａ）（工程（ａ０）において得られた）前記デプスフィルタを通して、前記治療用ポリペプチドと不純物とを含有する水性組成物をろ過し、素通り画分を回収し、それによって、前記治療用ポリペプチドを得る工程と、
（ｂ）（工程（ａ）の後の）前記デプスフィルタを水と接触させ、それによって、前記デプスフィルタを再生する工程と、
（ｃ）工程（ａ）および工程（ｂ）を１回以上繰り返す工程と
を含むことを特徴とする、方法である。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、工程（ａ０）のアルカリ溶液は、ＮａＯＨまたはＫＯＨを含む溶液である。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、工程（ａ０）のアルカリ溶液は、約０．１Ｍ～約１．５Ｍ、約０．２Ｍ～約１．４Ｍ、約０．３Ｍ～約１．２Ｍ、約０．４Ｍ～約１．１Ｍ、約０．５Ｍ～約１Ｍの濃度のＮａＯＨを含む。１つの好ましい実施形態において、工程（ａ０）のアルカリ溶液は、約０．９Ｍ～約１．１Ｍの濃度のＮａＯＨを含む。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、工程（ａ０）のアルカリ溶液は、少なくとも約０．０５Ｍ、少なくとも約０．１Ｍ、少なくとも約０．２Ｍ、少なくとも約０．３Ｍ、少なくとも約０．４Ｍ、少なくとも約０．５Ｍ、少なくとも約０．６Ｍ、少なくとも約０．７Ｍ、少なくとも約０．８Ｍ、１つの好ましい実施形態において、少なくとも約０．９Ｍ、少なくとも約１Ｍ、少なくとも約１．１Ｍ、少なくとも約１．２Ｍ、少なくとも約１．３Ｍ、少なくとも約１．４Ｍ、または少なくとも約１．５Ｍの濃度のＮａＯＨを含む。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、プレインキュベーションは、１００ｍＭ～１．２ＭのＮａＯＨ溶液とともに行われる。上記態様のある実施形態および他の実施形態において、プレインキュベーションは、３０分間～４．５時間、ＮａＯＨ溶液とともに行われる。上記態様の一実施形態および他の実施形態において、プレインキュベーションは、少なくとも約３０分間、少なくとも１００ｍＭ ＮａＯＨアルカリ溶液と行われる。上記態様の１つの好ましい実施形態および他の実施形態において、プレインキュベーションは、１ＭＮａＯＨアルカリ溶液とともに約４時間行われる。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、プレインキュベーションは、デプスフィルタ面積のｍ２当たり少なくとも５０Ｌ、または５０Ｌ～２００Ｌ、または１００Ｌ～１５０Ｌのアルカリ溶液とともに行われる。上記態様の１つの好ましい実施形態および他の実施形態において、プレインキュベーションは、デプスフィルタ面積のｍ２当たり１００Ｌ（１００Ｌ／ｍ２）のアルカリ溶液とともに行われる。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、工程（ｂ）のアルカリ再生溶液は、アルカリ水性緩衝溶液である。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、工程（ａ０）のアルカリ溶液は、ＮａＣｌをさらに含む。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、工程（ａ０）のアルカリ溶液は、約０．５Ｍ～約２．５Ｍ、約０．６Ｍ～約２．３Ｍ、約０．７Ｍ～約２Ｍ、約０．８Ｍ～約１．８Ｍ、または約０．９Ｍ～約１．５Ｍの濃度のＮａＣｌを含む。１つの好ましい実施形態において、工程（ａ０）のアルカリ溶液は、約０．９Ｍ～約１．１Ｍの濃度のＮａＯＨを含む。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、工程（ａ０）のアルカリ溶液は、少なくとも約０．５Ｍ、少なくとも約０．７Ｍ、少なくとも約０．８Ｍ、少なくとも約０．９Ｍ、または１つの好ましい実施形態において少なくとも約１Ｍの濃度のＮａＣｌを含む。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、工程（ａ０）のアルカリ再生溶液は、約９～１４、約９．５～１４、または約１０～１４のｐＨ値を有する。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、工程（ａ０）のアルカリ再生溶液は、約９以上、約９．５以上、１つの好ましい実施形態において、約１０以上、約１０．５以上、または約１１以上のｐＨ値を有する。
本発明による１つのさらなる態様は、治療用ポリペプチドの精製において少なくとも２回使用されている（シリカを含む）デプスフィルタの再生のための、酸性溶液の使用である。
本発明による１つのさらなる態様は、治療用ポリペプチドの精製において少なくとも２回使用されている（シリカを含む）デプスフィルタの再生のための、アルカリ溶液の使用である。
本発明による方法の効果および使用
全ての上記態様および実施形態のある実施形態において、前記方法は、（ＨＣＰに基づく／起因する）酵素的加水分解活性／加水分解活性速度を低下させる。
全ての上記態様および実施形態のある実施形態において、前記方法は、酵素的加水分解活性を有するＨＣＰ（宿主細胞タンパク質）を低下させ／除去する。
全ての上記態様のある実施形態および本発明の実施形態において、前記方法は、（フィルタへの適用前の工程（ａ）の）水性組成物と比較して、製造された／精製された治療用ポリペプチドの酵素的加水分解活性速度を低下させる。
全ての上記態様のある実施形態および本発明の実施形態において、前記方法は、（フィルタへの適用前の工程（ａ）の）水性組成物と比較して、製造された／精製された治療用ポリペプチドの酵素的加水分解活性速度を低下させる。
全ての上記態様のある実施形態および本発明の実施形態において、前記方法は、（フィルタへの適用前の工程（ａ）の）水性組成物と比較して、製造された／精製された治療用ポリペプチドの酵素的加水分解活性速度を少なくとも２５％、または少なくとも３０％、または少なくとも３５％、または少なくとも４０％低下させる。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、酵素的加水分解活性速度は、（本明細書に記載されているような）リパーゼ活性アッセイによって決定される。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、酵素的加水分解活性速度は、基質の酵素的加水分解によって決定される。上記態様のある実施形態および他の実施形態において、酵素的加水分解活性速度は、基質の変換をモニタリングすることによって決定される。上記態様のある実施形態および他の実施形態において、酵素的加水分解活性速度は、試料中に存在するヒドロラーゼ／精製された治療用ポリペプチドによるエステル結合の切断による、蛍光発生基質「４－メチルウンベリフェリルカプリラート」（４－ＭＵ－Ｃ８）の、蛍光部分、すなわち４－メチルウンベリフェリル（４－ＭＵ）への変換をモニタリングすることによって決定される。
全ての上記態様および実施形態のある実施形態において、酵素的加水分解活性速度は、基質の酵素的加水分解によって決定される。一実施形態において、加水分解速度は、４－メチルウンベリフェリルカプリラートまたはポリソルベート（一実施形態において、ポリソルベート２０）の加水分解速度である。
全ての上記態様および実施形態のある実施形態において、精製された／製造された治療用ポリペプチドおよびポリソルベートを含む薬学的製剤は、精製された／製造された治療用ポリペプチドの代わりに水性組成物を含む同一の薬学的製剤と比較して、ポリソルベートの低下した加水分解を示す。全ての上記態様のある実施形態および本発明の実施形態において、再生後にデプスフィルタを使用する場合に得られる（単量体）治療用ポリペプチドの収率は、初めて、すなわち再生なしに／デプスフィルタによる最初のろ過後にデプスフィルタを使用する場合に得られる収率の少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％である。
全ての上記態様のある実施形態および本発明の実施形態において、再生後にデプスフィルタを使用して得られる（単量体）治療用ポリペプチドの収率は、初めて、すなわち再生なしに／デプスフィルタによる最初のろ過後にデプスフィルタを使用する場合に得られる収率の少なくとも９０％である。
全ての上記態様のある実施形態および本発明の実施形態において、デプスフィルタは、珪藻土組成物、シリカ組成物、セルロース繊維、ポリマー繊維、凝集性樹脂、または／および灰組成物のうちの１つ以上を含む基材を含む。
全ての上記態様のある実施形態および本発明の実施形態において、デプスフィルタは、珪藻土材料（組成物）、シリカ材料（組成物）、セルロース繊維およびポリマー繊維から選択される１つ以上（を含む基材）を含む。
全ての上記態様のある実施形態および本発明の実施形態において、デプスフィルタの基材の少なくとも一部は表面修飾を含む。
全ての上記態様のある実施形態および本発明の実施形態において、デプスフィルタの基材の少なくとも一部は、第４級アミン表面修飾、帯電した表面基修飾（カチオン性表面修飾またはアニオン性表面修飾）から選択される１つ以上の表面修飾を含む。１つの好ましい実施形態において、表面修飾はカチオン性表面修飾である。
全ての上記態様のある実施形態および本発明の実施形態において、デプスフィルタは、
（ｉ）ポリアクリル系繊維およびシリカ、
（ｉｉ）セルロース繊維、珪藻土およびパーライト、ならびに
（ｉｉｉ）セルロース繊維および帯電した表面基（カチオン性電荷修飾）
の群から選択される材料を含む。
全ての上記態様のある実施形態および本発明の実施形態において、デプスフィルタは、Ｘ０ＳＰデプスフィルタ（Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）ＨＣ Ｐｒｏ Ｘ０ＳＰ）、またはＰＤＤ１デプスフィルタ（ＳＵＰＲＡｃａｐ（商標）－５０（ＳＣ０５０ＰＤＤ１））、またはａＶＲ０２デプスフィルタ（Ｚｅｔａ Ｐｌｕｓ（商標）Ｂｉｏｃａｐ ＶＲ０２）からなる群から選択される。
全ての上記態様のある実施形態および本発明の実施形態において、デプスフィルタは、Ｘ０ＳＰデプスフィルタ（Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）ＨＣ Ｐｒｏ Ｘ０ＳＰ）、またはＰＤＤ１デプスフィルタ（ＳＵＰＲＡｃａｐ（商標）－５０（ＳＣ０５０ＰＤＤ１））である。
全ての上記態様のある実施形態および本発明の実施形態において、デプスフィルタを再生溶液と約２０分以上、約３０分以上、約４０分以上、約５０分以上、または約６０分以上接触させる。
第１のクロマトグラフィー工程の前または後にデプスフィルタを使用することができることが理解される。第２、第３、第４または任意のさらなるクロマトグラフィー工程の前または後に、デプスフィルタを使用することもできる。全ての態様の１つの好ましい実施形態および本発明の他の実施形態において、デプスフィルタは、水性組成物を用いて行われる第１のクロマトグラフィー工程の前または後にある。１つの特に好ましい使用は、第１のクロマトグラフィー工程前（すなわち、細胞培養からの細胞の採取後）である。
全ての上記態様のある実施形態および本発明の実施形態において、本発明による方法は、最初の工程としてまたは最後の工程としてクロマトグラフィー工程を含む。全ての上記態様の１つの好ましい実施形態および本発明の実施形態において、前記方法は、第１工程としてクロマトグラフィー工程を含み、工程（ａ）の水性組成物は、治療用ポリペプチドを含むクロマトグラフィー工程の溶出液（画分）である。
全ての上記態様の１つの好ましい実施形態および本発明の実施形態において、前記方法は、最後の工程としてクロマトグラフィー工程を含み、工程（ａ）で得られた製造された／精製された治療用ポリペプチドは、クロマトグラフィー工程において使用される／クロマトグラフィー材料に適用される。
上記態様のある実施形態および他の実施形態において、治療用ポリペプチドは組換え産生されたタンパク質である。上記態様のある実施形態および他の実施形態において、治療用ポリペプチドは、例えばポリソルベートなどの非イオン性界面活性剤とともに製剤化されている組換え産生されたタンパク質である。上記態様のある実施形態および他の実施形態において、治療用ポリペプチドは、抗体、抗体断片、抗体融合ポリペプチド、Ｆｃ領域融合ポリペプチド、インターフェロン、血液因子、サイトカイン、ワクチン接種のためのタンパク質および酵素からなる治療用ポリペプチドの群から選択される。
定義
本明細書および添付の特許請求の範囲において、特に指示しない限り、成分の量、材料のパーセンテージまたは割合、反応条件、ならびに本明細書および特許請求の範囲で使用される他の数値を表す全ての数字は、明示的に示されているか否かにかかわらず、全ての場合において「約」という用語によって修飾されると理解されるものとする。用語「約」は、その後に続く数値の±２０％の範囲を意味する。一実施形態において、約という用語は、その後に続く数値の±１０％の範囲を意味する。一実施形態において、約という用語は、その後に続く数値の±５％の範囲を意味する。
本発明の広い範囲を示す数値範囲およびパラメータは近似値であるにもかかわらず、特定の実施例において示されている数値は可能な限り正確に報告される。しかしながら、任意の数値は、それぞれの試験測定値に見られる標準偏差から必然的に生じる特定の誤差を本質的に含む。さらに、本明細書に開示される全ての範囲は、その中に包含される全ての下位範囲を包含すると理解されるべきである。例えば、「１～１０」の範囲は、最小値１と最大値１０との間（およびそれらを含む）のありとあらゆる部分範囲、すなわち、最小値が１以上で最大値が１０以下のありとあらゆる部分範囲、例えば５．５～１０を含む。
本発明を実施するための有用な方法および技術は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（ｅｄ．）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第Ｉ～ＩＩＩ巻（１９９７）；Ｇｌｏｖｅｒ，Ｎ．Ｄ．およびＨａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．ｅｄ．、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、第ＩおよびＩＩ巻（１９８５）、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．（ｅｄ．）、Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ－ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ（１９８６）；Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ら、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ、第２版、ＣＨＳＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９２）；Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｅ．Ｌ．、Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｌｏｎｅｓ；Ｎ．Ｙ．，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９８７）；Ｃｅｌｉｓ，Ｊ．，ｅｄ．、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９８）；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．、Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、第２版、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｎ．Ｙ．（１９８７）に記載されている。
組換えＤＮＡ技術を使用することにより、核酸の誘導体の作製が可能になる。このような誘導体は、例えば、置換、改変、交換、欠失または挿入によって、個々のまたはいくつかのヌクレオチド位置で修飾され得る。修飾または誘導体化は、例えば、部位特異的突然変異誘発によって行われ得る。このような修飾は、当業者によって容易に行われ得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（１９９９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ；Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｓ．Ｇ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ－ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（１９８５）ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）。
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明白に反対の指示をしていなければ、複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。したがって、例えば、「１つの細胞（ａ ｃｅｌｌ）」への言及は、複数のこのような細胞および当業者に公知のその均等物を含む、などである。同様に、用語「１つの（ａ）」（または「１つの（ａｎ）」）、「１つ以上の」、および「少なくとも１つの」という用語も、本明細書において互換的に使用され得る。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」は互換的に使用され得ることにも留意すべきである。
本明細書で使用される「水溶液」または「水性組成物」という用語は、溶媒中の水（Ｈ２Ｏ）の濃度が少なくとも５０％（ｗ／ｖ）、一実施形態においては少なくとも７５％（ｗ／ｖ）、さらなる実施形態においては少なくとも９０％（ｗ／ｖ）、さらなる実施形態においては少なくとも９５％（ｗ／ｖ）、さらなる実施形態においては少なくとも９８％（ｗ／ｖ）、さらなる実施形態においては少なくとも９９％（ｗ／ｖ）、さらなる実施形態においては少なくとも９９．５％（ｗ／ｖ）である任意の液体調製物に関する。したがって、水溶液という用語は、最大５０％（ｗ／ｖ）のＤ２ＯまたはＰＥＧ（ポリエチレングリコール）を含む液体調製物を包含する。
さらに、本明細書で使用される場合、「溶液」という用語は、溶液中の化合物（溶質）の少なくとも一部分が溶媒に溶解していることを示す。溶液を調製する方法は、当技術分野で公知である。よって、一実施形態では、水溶液という用語は、少なくとも部分的に、緩衝溶液を含む、一実施形態では緩衝溶液からなる溶媒中に溶解されている治療用ポリペプチドを含む液体調製物に関する。
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」も含む。
抗体の製造および精製
デプスフィルタは、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の製造／精製過程の様々な段階で使用され得る。このような過程は、以下の順序または異なる順序で、以下の工程の１つ以上を含むことができる。
採取する：細胞および細胞破片をタンパク質含有上清から分離する。採取工程は、典型的には、遠心分離および／またはろ過を用いて行われる。
Ｆｃ結合／プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー（捕捉工程）：この工程は、中性ｐＨでＦｃ領域に優先的に結合することによってｍＡｂ分子を捕捉し、採取された上清の残りを除去することを可能にする。次いで、ｍＡｂ分子を低ｐＨで溶出させて、親和性溶出プールを得ることができる。
ウイルス不活化：低ｐＨでの親和性溶出プールのインキュベーションは、ウイルスを不活化することができる。
陽イオン交換クロマトグラフィー：この工程は、ＨＣＰ、ｍＡｂ凝集体および抗体断片を除去することができ、結合溶出または素通り工程を含むことができる。
陰イオン交換クロマトグラフィー：この工程は、ＤＮＡ、浸出プロテインＡおよび他の微量汚染物質を除去することができ、結合溶出または素通りで行うことができる。
ウイルスろ過：ウイルスを除去するように設計された膜を用いたシングルパス（デッドエンド）ろ過。
限外ろ過：この工程では、試料を半透膜（孔径は０．１～０．０１μｍの範囲であり得る）に通過させることによって、ｍＡｂ分子をさらに濃縮することができる。これが最終精製工程である場合、溶出緩衝液を最終製剤緩衝液に交換することができる。
例えば、ウイルス不活化、イオン交換クロマトグラフィー、ウイルスろ過または／および限外ろ過の前または後に、デプスろ過を使用することができる。（プロセス関連の）不純物を低減するために、デプスろ過を使用することができる。加水分解的に活性であるかまたは加水分解活性を有する（プロセス関連の）不純物を低減するために、デプスろ過を使用することができる。言い換えれば、デプスろ過は酵素的加水分解活性速度を低下させることができる。この効果／速度は、当業者に公知の方法によって決定／測定され得、そのいくつかは本明細書に記載されている（例えば、実施例２１におけるリパーゼ活性アッセイ（ＬＥＡＰ））。いくつかの実施形態において、デプスろ過は、水性組成物の加水分解活性を低下させるために使用される。いくつかの実施形態において、デプスろ過は、水溶液中の宿主細胞ＤＮＡを低下させるために使用される。
二次清澄化および濁り除去のために、ならびに本明細書に開示されるプロセス関連不純物のさらなる除去のために、精製過程のさらなる下流段階においてデプスろ過を使用することもできる。
本明細書で使用される場合、「デプスフィルタ」という用語は、フィルタ材料の深さ内でろ過、すなわち材料の分離を達成するフィルタを意味する。いくつかの実施形態において、デプスフィルタは、例えば、細胞成分および破片などの試料の一部を保持することができる多孔質ろ過媒体を含み、ろ過は、例えば、フィルタ材の深さ内で行われる。このようなフィルタの一般的なクラスは、結合された（または他の方法で固定された）繊維の（ランダムな）マトリックスを含み、複雑で曲がりくねった流路の迷路を形成するものである。これらのフィルタにおける粒子分離は、一般に、フィルタ材による捕捉またはフィルタ材への吸着から生じる。細胞培養ブロスおよび他の供給原料のバイオ処理のために頻繁に使用されるデプスフィルタ媒体は、セルロース繊維（マトリックスとして）および珪藻土（ＤＥ）などのろ過助剤からなる。本発明の文脈において使用される別のデプスフィルタは、シリカおよびポリアクリル系繊維を含むデプスフィルタである。いくつかの実施形態において、デプスフィルタは合成フィルタである。いくつかの実施形態において、デプスフィルタは、シリカろ過助剤および／またはポリアクリル系繊維を含む。いくつかの実施形態において、デプスフィルタは、シリカろ過助剤、および／またはポリアクリル系繊維、および／または不織材料を含む。いくつかの実施形態において、デプスフィルタは、不織材料としてシリカおよびポリアクリル系繊維を含む。デプスフィルタ媒体は、アブソリュートフィルタとは異なり、多孔質媒体全体に粒子および他の不純物を保持し、例えば、孔径より大きい粒子と小さい粒子の両方の保持を可能にする。粒子および不純物の保持は、サイズ排除ならびに疎水性、イオン性および他の相互作用を通じた吸着を含むと考えられる。デプスフィルタは、汚染物質／不純物を除去するので有利である。デプスフィルタは、直列に積層された複数レベルのデプスフィルタ媒体を含む多層デプスフィルタであり得る。複数のデプスフィルタを使用することにより、より多くのろ液流がデプスフィルタ媒体と効率的に接触することが保証され、不純物に対するより良好な吸着プロファイルが可能になる。
いくつかの実施形態において、デプスフィルタは、合成材料、非合成材料、またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、デプスフィルタは、珪藻土組成物、シリカ組成物、セルロース繊維、ポリマー繊維、凝集性樹脂、および灰組成物のうちの１つ以上を含む基材を含む。いくつかの実施形態において、デプスフィルタは、Ｘ０ＳＰデプスフィルタ（Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）ＨＣ Ｐｒｏ Ｘ０ＳＰ）、ＰＤＤ１デプスフィルタ（Ｐａｌｌ／３Ｍ ＰＤＤ１ ＳＵＰＲＡｃａｐ（商標）－５０（ＳＣ０５０ＰＤＤ１））、またはＶＲ０２デプスフィルタ（Ｚｅｔａ Ｐｌｕｓ（商標）Ｂｉｏｃａｐ ＶＲ０２）からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、デプスフィルタは、セルロース繊維、珪藻土およびパーライトを含む。いくつかの実施形態において、デプスフィルタは２つの層を含み、各層はセルロースフィルタマトリックスを含み、セルロースフィルタマトリックスは、珪藻土またはパーライトの１つ以上を含むろ過助剤で含浸されている。いくつかの実施形態において、デプスフィルタは２つの層を含み、各層はセルロースフィルタマトリックスを含み、セルロースフィルタマトリックスは珪藻土またはパーライトの１つ以上を含むろ過助剤で含浸されており、各層は樹脂バインダーをさらに含む。いくつかの実施形態において、デプスフィルタはＰＤＤ１デプスフィルタである。
いくつかの実施形態において、デプスフィルタは、シリカろ過助剤などのシリカと、ポリアクリル系繊維とを含む。いくつかの実施形態において、デプスフィルタは２層のろ材を含み、第１の層はシリカろ過助剤などのシリカを含み、第２の層はポリアクリル系繊維パルプなどのポリアクリル系繊維を含む。いくつかの実施形態において、デプスフィルタは、合成材料を含むデプスフィルタであり、珪藻土および／またはパーライトを含まない。いくつかの実施形態において、デプスフィルタはＸ０ＳＰデプスフィルタである。
いくつかの実施形態において、デプスフィルタは、セルロース繊維（マトリックスとして）および帯電した表面基（イオン性電荷修飾）を含む。いくつかの実施形態においては、デプスフィルタは、セルロース繊維（マトリックスとして）と、マトリックス成分に化学的に結合したカチオン性電荷調整剤とを含む。いくつかの実施形態において、デプスフィルタはＶＲ０２デプスフィルタである。
いくつかの実施形態において、シリカろ過助剤は沈降シリカろ過助剤である。いくつかの実施形態において、ろ過助剤は、フィルタ機能の実行を助ける層などのフィルタの一態様である。いくつかの実施形態において、シリカろ過助剤はシリカゲルろ過助剤である。いくつかの実施形態において、デプスフィルタは、約０．０５μｍ～約０．２μｍ、例えば約０．１μｍの孔径を有する。いくつかの実施形態において、デプスフィルタは、約０．１ｍ２～約１．５ｍ２の範囲、例えば少なくとも約２２ｃｍ２、少なくとも約２３ｃｍ２、または少なくとも約２５ｃｍ２、少なくとも約０．１１ｍ２、少なくとも約０．５５ｍ２、または少なくとも約１．１ｍ２またはそれより大きな表面積を有する。
デプスフィルタは一定の容量（結合容量）を有することが理解される。この結合容量は、フィルタ特性（分離効率および収率）を損なうことなくフィルタに適用することができる表面あたりの治療用ポリペプチド分子の量の上限を規定する。各デプスフィルタおよび各分子について前記結合容量限界を決定する方法は、当業者に公知である。これは、標準的な方法を使用して行うことができる。
所与のデプスフィルタの容量限界を超えると、フィルタが搭載から不純物を効果的に除去する能力、したがって、例えば、関心対象の分子の取得可能な収率および／または純度が減少する。
当業者は、デプスフィルタがその結合容量限界に達するまで十分に機能し、デプスフィルタを事前に再生する必要が存在しないことを理解している。
デプスフィルタの最初の使用前の、デプスフィルタの前処理に関連して「インキュベートする」という用語は、前処理のために使用される溶液の、デプスフィルタとの異なる種類の接触を含む。これは、例えば、溶液をある期間にわたってデプスフィルタに流すことによって、すなわち、特定の流速（例えば、７または１０ｍＬ／分）で、デプスフィルタを溶液で洗浄することによって、デプスフィルタを溶液と接触させる形態とすることができるデプスフィルタを（前処理）溶液中に配置し、デプスフィルタをある時間溶液中に保存することによっても、デプスフィルタを接触させることができる。溶液の通過／洗浄を最初に実行し、続いてフローを停止し、したがってデプスフィルタを溶液中に置くことまたはその逆（すなわち、洗浄前および／または洗浄後の保存）も可能である。
本発明は、治療用ポリペプチドの精製および製造を包含する。治療用ポリペプチドは、異なる性質のものであり得る。治療用ポリペプチドは、治療目的および診断目的のために設計され、適している。上記態様のある実施形態および他の実施形態において、治療用ポリペプチドは組換え産生されたタンパク質である。上記態様のある実施形態および他の実施形態において、治療用ポリペプチドは、例えばポリソルベートなどの非イオン性界面活性剤とともに製剤化されている組換え産生されたタンパク質である。上記態様のある実施形態および他の実施形態において、治療用ポリペプチドは、抗体、抗体断片、抗体融合ポリペプチド、Ｆｃ領域融合ポリペプチド、インターフェロン、血液因子、サイトカイン、ワクチン接種のためのタンパク質および酵素からなる治療用ポリペプチドの群から選択される。上記態様の好ましい実施形態および他の実施形態において、治療用ポリペプチドは抗体である。
「抗体」という用語は、完全長抗体およびその抗原結合断片を含む。いくつかの実施形態において、完全長抗体は、２つの重鎖および２つの軽鎖を含む。軽鎖および重鎖の可変領域は、抗原結合を担う。両方の鎖の可変領域は、一般に、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる３つの高度に可変なループを含有する（ＬＣ－ＣＤＲ１、ＬＣ－ＣＤＲ２およびＬＣ－ＣＤＲ３を含む軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ、ＨＣ－ＣＤＲ１、ＨＣ－ＣＤＲ２およびＨＣ－ＣＤＲ３を含む重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ）。本明細書に開示される抗体および抗原結合断片のＣＤＲ境界は、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、またはＡｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ（Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ １９９７；Ｃｈｏｔｈｉａ １９８５；Ｃｈｏｔｈｉａ １９８７；Ｃｈｏｔｈｉａ １９８９；Ｋａｂａｔ １９８７；Ｋａｂａｔ １９９１）の慣例によって定義または同定され得る。重鎖または軽鎖の３つのＣＤＲは、ＣＤＲよりも高度に保存されており、超可変ループを支持するための足場を形成するフレームワーク領域（ＦＲ）として公知の隣接するストレッチの間に介在する。重鎖および軽鎖の定常領域は抗原結合に関与しないが、様々なエフェクター機能を示す。抗体は、その重鎖の定常領域のアミノ酸配列に基づいてクラスに割り当てられる。抗体の５つの主要なクラスまたはアイソタイプは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭであり、それぞれα、δ、ε、γおよびμ重鎖の存在を特徴とする。主要な抗体クラスのいくつかは、ＩｇＧ１（γ１重鎖）、ＩｇＧ２（γ２重鎖）、ＩｇＧ３（γ３重鎖）、ＩｇＧ４（γ４重鎖）、ＩｇＡ１（α１重鎖）、またはＩｇＡ２（α２重鎖）などのサブクラスに分けられる。いくつかの実施形態において、抗体は、モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体である。いくつかの実施形態において、抗体はキメラ抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、半合成抗体である。いくつかの実施形態において、抗体はダイアボディである。いくつかの実施形態において、抗体はヒト化抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、二重特異性抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、融合タンパク質に連結される。いくつかの実施形態において、抗体は、インターロイキンなどの免疫刺激タンパク質に連結されている。いくつかの実施形態において、抗体は、血液脳関門を横切る侵入を促進するタンパク質に連結されている。
「多重特異性抗体」という用語は、本明細書で使用するとき、少なくとも２つの異なる部位、すなわち、異なる抗原上の異なるエピトープまたは同じ抗原上の異なるエピトープに対して結合特異性を有するモノクローナル抗体を指す。ある態様において、多重特異性抗体は２つの結合特異性を有する（二重特異性抗体）。ある態様において、多重特異性抗体は３つ以上の結合特異性を有する。多重特異性抗体は、完全長抗体または抗体断片として調製され得る。
抗体または抗体部分に関して「半合成」という用語は、抗体または抗体部分が１つ以上の天然に存在する配列および１つ以上の天然に存在しない（すなわち、合成）配列を有することを意味する。
以下の実施例および図面は、本発明の理解を助けるために提供され、本発明の真の範囲は添付の特許請求の範囲に記載されている。本発明の思想から逸脱することなく、記載された手順に変更を加えることができると理解される。
ＬＥＡＰによって測定された加水分解活性の基準値（再生なし）（実施例１５、２１を参照）；フィルタ：ＰＤＤ１；治療用ポリペプチド：クロバリマブ；マーカー（細い縦線）：１３２０ｇ／ｍ２の質量スループット（結合容量限界）。 ３つの異なる設定に対してＬＥＡＰによって測定された加水分解活性：１）灰色点あり：ろ過サイクルの間に水および緩衝液の適用（実施例９参照）、２）黒点あり：前処理およびろ過サイクル間にアルカリ溶液の適用（実施例１０参照）、３）灰色：酸性溶液の適用（実施例１１参照）；フィルタ：ＰＤＤ１；治療用ポリペプチド：クロバリマブ；マーカー（細い縦線）：１３２０ｇ／ｍ２の質量スループット（結合容量限界）。 ３つの異なる設定についての主ピーク／主生成物の収率：１）灰色点あり：ろ過サイクルの間に水および緩衝液の適用（実施例９参照）、２）黒点あり：前処理およびろ過サイクル間にアルカリ溶液の適用（実施例１０参照）、３）灰色：酸性溶液の適用（実施例１１参照）；フィルタ：ＰＤＤ１；治療用ポリペプチド：クロバリマブ。 ＬＥＡＰによって測定された加水分解活性の基準値（再生なし）（実施例１２、２１を参照）；フィルタ：Ｘ０ＳＰ；治療用ポリペプチド：クロバリマブ；マーカー（細い縦線）：２６４０ｇ／ｍ２の質量スループット（結合容量限界）。 ３つの異なる設定に対してＬＥＡＰによって測定された加水分解活性：１）灰色点あり：ろ過サイクルの間に水および緩衝液の適用（実施例６参照）、２）黒点あり：前処理および再生サイクル間にアルカリ溶液の適用（実施例７参照）、３）灰色：ろ過サイクル間に酸性溶液の適用（実施例８参照）；フィルタ：Ｘ０ＳＰ；治療用ポリペプチド：クロバリマブ；マーカー（細い縦線）：２６４０ｇ／ｍ２の質量スループット（結合容量限界）。 ３つの異なる設定についての主ピーク／主生成物の収率：１）灰色点あり：ろ過サイクルの間に水および緩衝液の適用（実施例６参照）、２）黒点あり：前処理および再生サイクル間にアルカリ溶液の適用（実施例７参照）、３）灰色：ろ過サイクル間に酸性溶液の適用（実施例８参照）；フィルタ：Ｘ０ＳＰ；治療用ポリペプチド：クロバリマブ。 ＬＥＡＰによって測定された加水分解活性の基準値（再生なし）（実施例１８、２１を参照）；フィルタ：ＶＲ０２；治療用ポリペプチド：クロバリマブ；マーカー（細い縦線）：６６０ｇ／ｍ２の質量スループット（結合容量限界）。 ２つの異なる設定に対してＬＥＡＰによって測定された加水分解活性：１）灰色点あり：ろ過サイクルの間に水および緩衝液の適用（実施例１９参照）、２）黒点あり：ろ過サイクル間に酸性溶液の適用（実施例２０参照）；フィルタ：ＶＲ０２；治療用ポリペプチド：クロバリマブ；マーカー（細い縦線）：６６０ｇ／ｍ２の質量スループット（結合容量限界） ２つの異なる設定についての主ピーク／主生成物の収率：１）灰色点あり：ろ過サイクルの間に水および緩衝液の適用（実施例１９参照）、２）黒点あり：ろ過サイクル間に酸性溶液の適用（実施例２０参照）；フィルタ：ＶＲ０２；治療用ポリペプチド：クロバリマブ。
概要：
Figure 2024506991000001
材料および方法
抗体：
ヒト免疫グロブリンの軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）に与えられる。抗体鎖のアミノ酸は、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１））によるナンバリングに従ってナンバリングされ、参照される。
本発明は、国際公開第２０１７／０５５５４２号ならびにその中で配列番号０１～０３および１０に報告されている抗ＣＤ２０／ＴｆＲ二重特異性抗体；国際公開第２０１７／１０４７７９号およびその中で配列番号１０６～１１１に報告されている抗Ｃ５抗体（クロバリマブ）；国際公開第２０１５／１１８０１６号ならびにその中で配列番号１９および５０に報告されている、ヒトＩＬ－２（インターロイキン２）に重鎖のＣ末端においてコンジュゲートされた不活性抗体を含む融合タンパク質；国際公開第２０２１／０１８８５９号に報告されている２＋１フォーマットの抗ＧＰＲＣ５Ｄ／抗ＣＤ３二重特異性抗体を含む多数の例示的抗体を使用して例示される。
合成デプスフィルタ媒体：
ここでは、合成デプスフィルタＭｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）ＨＣ Ｐｒｏ Ｘ０ＳＰが使用される。これは、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）から市販されている。Ｘ０ＳＰデプスフィルタは、０．１ミクロンの公称孔径精度を有し、二次的清澄化用途が予定されている。
セルロース／珪藻土含有（シリカも含有）ＰＤＤ１デプスフィルタ（Ｐａｌｌ ＰＤＤ１ ＳＵＰＲＡｃａｐ（商標）－５０（ＳＣ０５０ＰＤＤ１））も使用した。
セルロース含有（シリカも含有する）ＶＲ０２デプスフィルタ（Ｚｅｔａ Ｐｌｕｓ（商標）Ｂｉｏｃａｐ ＶＲ０２）も使用した。
デプスろ過装置：
全ての試験は、２２ｃｍ２、２３ｃｍ２または２５ｃｍ２のμＰｏｄ１スケール装置を使用して実施した。デプスフィルタ装置は、使い捨ての外側被覆装置ハウジング内に封入された２層のデプスろ過媒体を使用して製造された。
組換えＤＮＡ技術：
標準的な方法を使用し、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９に記載されるように、ＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬を製造者の指示書に従って使用した。
遺伝子合成：
化学合成によって作られるオリゴヌクレオチドから、所望の遺伝子セグメントを調製した。ＰＣＲ増幅を含めて、オリゴヌクレオチドをアニーリングおよび連結することによって、単一の制限エンドヌクレアーゼ切断部位に隣接する長い遺伝子セグメントを構築し、その後、示された制限部位を介してクローニングした。ＤＮＡ配列決定によって、サブクローニングされた遺伝子断片のＤＮＡ配列を確認した。所与の仕様に従って、Ｇｅｎｅａｒｔ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に遺伝子合成断片を注文した。
ＤＮＡ配列決定：
ＭｅｄｉＧｅｎｏｍｉｘ ＧｍｂＨ（Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）またはＳｅｑｕｉＳｅｒｖｅ ＧｍｂＨ（Ｖａｔｅｒｓｔｅｔｔｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で行われた二本鎖配列決定によって、ＤＮＡ配列を決定した。
ＤＮＡおよびタンパク質配列解析ならびに配列データ管理：
配列作成、マッピング、分析、注釈付けおよび図示のために、ＧＣＧ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）ソフトウェアパッケージバージョン１０．２およびＩｎｆｏｍａｘのＶｅｃｔｏｒ ＮＴ１ Ａｄｖａｎｃｅ ｓｕｉｔｅバージョン８．０を使用した。
発現ベクター：
記載される二重特異性抗体の発現のために、ＣＭＶ－イントロンＡプロモーターを用いたもしくは用いないｃＤＮＡ構成またはＣＭＶプロモーターを用いたゲノム構成のいずれかに基づく（例えば、ＨＥＫ２９３細胞における）一過性発現のための発現プラスミドを適用することができる。
抗体発現カセット以外に、ベクターは、
－大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）においてこのプラスミドの複製を可能にする複製起点、
－大腸菌においてアンピシリン耐性を与えるβ－ラクタマーゼ遺伝子
を含有する。
抗体遺伝子の転写ユニットは、以下の要素：
－５’末端の固有の制限部位
－ヒトサイトメガロウイルス由来の最初期エンハンサーおよびプロモーター、
－ｃＤＮＡ構成の場合におけるイントロンＡ配列、
－ヒト抗体遺伝子由来の５’－非翻訳領域、
－免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
－ｃＤＮＡとしてのまたはゲノムエクソン－イントロン構成での、それぞれの抗体鎖をコードする核酸、
－ポリアデニル化シグナル配列を有する３’非翻訳領域、
－ターミネーター配列、および
－３’末端の固有の制限部位
から構成される。
抗体鎖をコードする融合遺伝子は、ＰＣＲおよび／または遺伝子合成によって作製され、例えば、それぞれのベクター中の固有の制限部位を用いて、一致した核酸セグメントの接続によって、公知の組換え方法および技術によって組み立てられる。ＤＮＡ配列決定によって、サブクローニングされた核酸配列を確認する。一過性形質移入のために、形質転換された大腸菌培養物（Ｎｕｃｌｅｏｂｏｎｄ ＡＸ、Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）からのプラスミド調製によって、大量のプラスミドを調製する。
全ての構築物について、第１のＣＨ３ドメインにおける典型的なノブ（Ｔ３６６Ｗ）置換および第２のＣＨ３ドメインにおける対応するホール置換（Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ）（ならびに２つのさらなる導入されたシステイン残基Ｓ３５４Ｃ／Ｙ３４９’Ｃ）（上記のそれぞれの対応する重鎖（ＨＣ）配列中に含有される）とともに、ノブ－イントゥ－ホールヘテロ二量体化技術を使用した。
細胞培養技術：
Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０００），Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏ，Ｊ．Ｓ．，Ｄａｓｓｏ，Ｍ．，Ｈａｒｆｏｒｄ，Ｊ．Ｂ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｊ．ａｎｄ Ｙａｍａｄａ，Ｋ．Ｍ．（ｅｄｓ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．に記載されている標準的な細胞培養技術が使用される
ＨＥＫ２９３系における一過性形質移入：
二重特異性抗体は、一過性発現によって産生される。したがって、製造業者の指示に従ってＨＥＫ２９３系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用したそれぞれのプラスミドでの形質移入が行われる。簡潔に述べれば、シェークフラスコまたは撹拌発酵槽のいずれかにおいて、無血清ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で懸濁状態で増殖させたＨＥＫ２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、各々の発現プラスミドおよび２９３ｆｅｃｔｉｎ（商標）またはｆｅｃｔｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の混合物で形質移入する。２Ｌシェークフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に、ＨＥＫ２９３細胞を６００ｍＬ中１．０×１０６細胞／ｍＬの密度で播種し、１２０ｒｐｍ、８％のＣＯ２でインキュベートする。翌日、約１．５＊１０６細胞／ｍＬの細胞密度で、細胞を、Ａ）６００μｇの総プラスミドＤＮＡ（１μｇ／ｍＬ）を含む２０ｍＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＢ）１．２ｍＬの２９３ ｆｅｃｔｉｎまたはｆｅｃｔｉｎ（２μＬ／ｍＬ）が補充された２０ｍｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地の約４２ｍＬの混合物で形質移入する。グルコース消費に従って、発酵の経過の間、グルコース溶液を加える。分泌された抗体を含有する上清を５～１０日後に採取し、抗体を上清から直接精製するか、または上清を凍結および貯蔵する。
光学密度の決定：
Ｐａｃｅ，ら，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ４（１９９５）２４１１－１４２３に従って、アミノ酸配列に基づいて計算されるモル吸光係数を用いて、２８０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）を決定することによって、精製された抗体および誘導体のタンパク質濃度を決定した。
タンパク質濃度の決定（収率）：
測光決定：
Ｃａｒｙ（登録商標）５０ ＵＶ－Ｖｉｓ分光光度計（Ｖａｒｉａｎ）を使用するＵＶ分光法によって、タンパク質濃度を決定した。タンパク質試料をそれぞれの緩衝液で希釈し、二連として測定した。ランベルト・ベールの法則から導き出される以下の式に従って濃度を決定した：ｃ＝（Ａ２８０ｎｍ－Ａ３２０ｎｍ）／ε・ｄ・Ｆ、ｃはタンパク質濃度［ｍｇ／ｍｌ］、Ａは吸光度、εは吸光係数［ｍｌ／（ｍｇ・ｃｍ）］、ｄは細胞長［ｃｍ］およびＦは希釈係数。抗Ｃ５抗体比吸光係数は１．４４ｍｌ／（ｍｇ・ｃｍ）であり、二重特異性抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体比吸光係数は１．４３ｍｌ／（ｍｇ・ｃｍ）であり、二重特異性抗ＣＤ２０／ＴｆＲ比吸光係数は１．５７ｍｌ／（ｍｇ・ｃｍ）であり、抗体－ＩＬ２融合ポリペプチド比吸光係数は１．２５ｍｌ／（ｍｇ・ｃｍ）である。
クロマトグラフィー決定：
アフィニティーＨＰＬＣクロマトグラフィーによって、抗体の濃度を定量的に測定した。簡単に説明すると、プロテインＡに結合する抗体を含有する溶液を、例えば、２００ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１００ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．４中、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｏｒｏｓ Ａ／２０カラムに適用し、Ａｇｉｌｅｎｔ ＨＰＬＣ １１００システムで、２００ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭクエン酸、ｐＨ２．５を用いて溶出させた。ＵＶ吸光度およびピーク面積の積分によって、溶出された抗体を定量する。精製された標準ＩｇＧ１抗体を標準とした。
ＥＬＩＳＡ決定：
あるいは、サンドイッチ－ＩｇＧ－ＥＬＩＳＡによって、溶液中の抗体および誘導体の濃度を測定する。簡単に説明すると、０．１μｇ／ｍＬで、室温で１時間または４℃で一晩、１００μＬ／ウェルのビオチン化抗ヒトＩｇＧ捕捉分子Ｆ（ａｂ’）２＜ｈ－Ｆｃγ＞ＢＩ（Ｄｉａｎｏｖａ）で、ＳｔｒｅｐｔａＷｅｌｌ Ｈｉｇｈ Ｂｉｎｄ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ａ－９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）をコーティングし、その後、２００μＬ／ウェルのＰＢＳ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳＴ、Ｓｉｇｍａ）を用いて３回洗浄した。その後、それぞれの抗体含有溶液のＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ）中の１００μＬ／ウェルの希釈系列をウェルに加え、振盪機上において室温で１～２時間インキュベートする。２００μＬ／ウェルのＰＢＳＴでウェルを３回洗浄し、振盪機上において室温で１～２時間、インキュベートすることにより、検出抗体として０．１μｇ／ｍＬの１００μＬのＦ（ａｂ’）２＜ｈＦｃγ＞ＰＯＤ（Ｄｉａｎｏｖａ）を用いて、結合した抗体を検出する。２００μＬ／ウェルのＰＢＳＴで３回洗浄することによって、結合していない検出抗体を除去する。１００μＬＡＢＴＳ／ウェルを添加し、続いてインキュベートすることによって、結合した検出抗体を検出する。吸光度の決定は、Ｔｅｃａｎ Ｆｌｕｏｒ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒで、４０５ｎｍの測定波長（参照波長４９２ｎｍ）で行う。
調製用抗体精製：
標準プロトコルを参照して、ろ過された細胞培養物上清から抗体を精製した。簡潔に述べると、抗体をプロテインＡ Ｍａｂ Ｓｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用し、緩衝液で洗浄した。低ｐＨで抗体の溶出を達成した後、直ちに中和した。抗体画分をプールし、凍結し、－２０℃、－４０℃または－８０℃で保存した。
加水分解活性の決定－リパーゼ活性アッセイ（ＬＥＡＰ）：
非蛍光基質などの基質の、蛍光生成物などの、加水分解酵素の検出可能な生成物への変換をモニタリングすることによって、リパーゼ活性を決定した。例示的な方法は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる国際公開第２０１８／０３５０２５号に記載されている。
より詳細には、ＬＥＡＰアッセイを用いて、試料中のヒドロラーゼ活性を決定した。これは、試料中に存在するヒドロラーゼによるエステル結合の切断による、蛍光発生基質’４－メチルウンベリフェリルカプリラート’（Ｃｈｅｍ Ｉｍｐｅｘ Ｉｎｔ’ｌ Ｉｎｃ Ａｒｔ．Ｎｒ．０１５５２から入手可能な４－ＭＵ－Ｃ８）の、蛍光部分、すなわち４－メチルウンベリフェリル（４－ＭＵ）への変換をモニタリングすることによって行った。切断された４－ＭＵ－Ｃ８、すなわち４－ＭＵは、波長３５５ｎｍの光で励起された。４６０ｎｍの異なる波長で放出された放射を、Ｔｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ（登録商標）２００ＰＲＯ装置で読み取りとして記録した。３７℃で２時間決定を行い、基質加水分解の速度を計算するために１０分ごとに記録した。
Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５ｍｌ遠心フィルタユニット（１０，０００Ｄａカットオフ、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ａｒｔ．Ｎｒ．ＵＦＣ５０１０９６）を使用することによって、最初に、分析すべき試料を１５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ、ｐＨ８．０に緩衝液交換した。アッセイ反応混合物は、８０μＬの反応緩衝液（１５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ ｐＨ８．０、０．２５％（ｗ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、０．１２５％（ｗ／ｖ）アラビアガム）、１０μＬの４－ＭＵ－Ｃ８基質溶液（ＤＭＳＯ中１ｍＭ）および１０μＬのタンパク質含有試料から構成された。タンパク質試料の濃度を１～３０ｇ／Ｌの範囲になるように調整し、各決定について２～３の希釈系列を実施した。各反応は、９６ウェル半エリアポリスチレンプレート（蓋および透明平底付き黒色、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ Ａｒｔ．Ｎｒ．３８８２）中に少なくとも二連で設定された。
宿主細胞タンパク質（ＣＨＯＰ）決定：
プロセス試料中の残存ＣＨＯ ＨＣＰ含有量は、ｃｏｂａｓ ｅ ４１１イムノアッセイ分析装置（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）で電気化学発光イムノアッセイ（ＥＣＬＩＡ）によって測定される。
アッセイは、ヒツジ由来のポリクローナル抗ＣＨＯ ＨＣＰ抗体を使用するサンドイッチ原理に基づく。
第１のインキュベーション：１５μＬの試料（原液のままおよび／または希釈）由来のチャイニーズハムスター卵巣宿主細胞タンパク質（ＣＨＯ ＨＣＰ）およびビオチン結合ポリクローナルＣＨＯ ＨＣＰ特異的抗体はサンドイッチ複合体を形成し、これはストレプトアビジンとのビオチンの相互作用を介してストレプトアビジン被覆微粒子に結合する。
第２のインキュベーション：ルテニウム錯体（Ｔｒｉｓ（２，２’－ビピリジル）ルテニウム（ＩＩ）錯体）で標識されたポリクローナルＣＨＯ ＨＣＰ特異的抗体の添加後に、三元サンドイッチ錯体が微粒子上に形成される。
反応混合物を測定セル内に吸引し、そこで微粒子は電極の表面上に磁気的に捕捉される。次いで、洗浄工程において、結合されていない物質を除去する。その後、電極へ電圧を印加すると化学発光による発光が誘発され、それを光電子増倍管によって測定する。
試験試料中のＣＨＯ ＨＣＰの濃度は、既知の濃度のＣＨＯ ＨＣＰ標準曲線から最終的に算出される。
宿主細胞ＤＮＡ決定：
プロセス試料中の残存チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）をＦＬＯＷ ＦＬＥＸ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で決定する。
ＦＬＯＷ ＦＬＥＸ Ｓｙｓｔｅｍは、３つのモジュール：ＦＬＯＷ ＰＣＲ ＳＥＴＵＰ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、ＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ ９６ ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔおよびＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０からなる。
ＦＬＯＷ ＰＣＲ ＳＥＴＵＰ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔモジュールは、一次チューブから９６ウェル処理プレート中への試料移送のためのＰＳＨ（ＦＬＯＷ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｓａｍｐｌｅ Ｈａｎｄｌｉｎｇ）として、および抽出されたＤＮＡを９６ウェル出力プレートからＰＣＲプレート中へ移送するためのＰＳＵ（ＦＬＯＷ ＰＣＲ ＳＥＴＵＰ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）として使用される。
ＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ ９６ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔモジュールは、核酸の自動化された単離のために使用される。ＤＮＡを放出するために、試料材料を変性条件下でインキュベートする。放出されたＤＮＡは、磁石を介して磁性ガラス粒子に結合することにより、他の緩衝液および試料成分から分離され、次いで、結合されたＤＮＡは緩衝液で溶出される。最大９６個の試料を同時に処理することができる。
ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０モジュール（μプレートＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標））は、ＰＣＲ技術に基づくＤＮＡまたはＲＮＡの定量のために使用される。Ｒｅｓｉｄｕａｌ ＤＮＡ ＣＨＯ Ｋｉｔは、ＣＨＯのＤＮＡ内の高度に保存された領域の特異的ＰＣＲを使用する。高度に特異的なフォワードプライマーおよびリバースプライマーは、一本鎖ＤＮＡの標的配列の末端に特異的に結合する。５’末端を蛍光レポーター色素（ＦＡＭ）で標識され、３’末端を消光剤色素で標識されたＣＨＯ ＤＮＡプローブは、プライマーと一本鎖ＤＮＡの標的配列の間でハイブリッドを形成する。プローブが完全な状態である限り、Ｑｕｅｎｃｈｅｒ色素の近接はレポーター色素の蛍光を抑制する。増幅に際して、Ｔａｑポリメラーゼは、その５’→３’エキソヌクレアーゼ活性のために、標的配列に結合したプローブを破壊する。これはレポーター色素を放出し、蛍光が増加する。蛍光の増加は、ＰＣＲ産物の量に正比例する。試料中のＣＨＯ ＤＮＡの量を標準曲線で定量する。
サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ－ＨＰＬＣ）：
抗体の凝集およびオリゴマー状態を決定するためのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、ＨＰＬＣクロマトグラフィーによって行われた。簡単に説明すると、Ｄｉｏｎｅｘ Ｕｌｔｉｍａｔｅ（登録商標）システム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上で、２５０ｍＭ ＫＣｌ、２００ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４／Ｋ２ＨＰＯ４緩衝液（ｐＨ７．０）中、Ｔｏｓｏｈ ＴＳＫ－Ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷＸＬ（７．８×３００ｍｍ；５μｍ（ＴＯＳＯＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｎｒ．０８５４１））にプロテインＡ精製された抗体を適用した。溶出した抗体をＵＶ吸光度およびピーク面積の積分によって定量した。ＢｉｏＲａｄ Ｇｅｌ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ １５１－１９０１を標準とした。
ＭＣＥ（Ｃａｌｉｐｅｒ）：
マイクロ流体Ｌａｂｃｈｉｐ技術（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、ＵＳＡ）を使用して、ＣＥ－ＳＤＳによって純度および抗体完全性を分析した。したがって、製造業者の説明書に従ってＨＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔを使用して、ＣＥ－ＳＤＳ分析用に５μｌの抗体溶液を調製し、ＨＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｃｈｉｐを使用してＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩシステムで分析した。ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸ Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用してデータを分析した。
実施例１
アルカリ処理で再生された、シリカ含有Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）ＨＣ Ｐｒｏ Ｘ０ＳＰフィルタによるＴ細胞二重特異性抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体溶液のろ過
材料：
１）ＡＫＴＡ Ａｖａｎｔ １５０（Ｃｙｔｉｖａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）クロマトグラフィースキッドを用いて実験を行った。カラムに代えて、カラムバルブにフィルタを取り付けた。圧力、ｐＨ値、導電率、ＯＤ２８０を監視した。適用される体積は、サンプルポンプによって制御された。
２）２３ｃｍ２のフィルタ面積を有するＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）ＨＣ Ｐｒｏ Ｘ０ＳＰフィルタ；ロット：ＣＰ８ＭＡ８９８０４
３）平衡化緩衝液：１５０ｍＭ酢酸／Ｔｒｉｓ、精製水タイプＩＩ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｕｐｅｒ Ｑ）中でｐＨ５．５に調整
４）アルカリ再生溶液：１ＭＮａＣｌ、０．５ＭＮａＯＨ、ｐＨ１２．６
フィルタの状態調整：
以下の工程を順次実施した：
１）１００Ｌ／ｍ２の水をフィルタに適用した／フィルタを通して流した。その後、フィルタを脱気した。洗浄流は、５．０バールの最大供給圧力で１０．０ｍＬ／分であった。
２）１００Ｌ／ｍ２の平衡化緩衝液をフィルタに適用する／フィルタを通して流した（系およびフィルタの平衡化）。平衡流は、５．０バールの最大供給圧力で１０．０ｍＬ／分であった。
実験の設定：
以下の工程を順次実施した：
１）Ｔ細胞二重特異性抗体を含有する中間の「Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｐｏｏｌ ｐＨ５．５」を、状態を調整された２３ｃｍ２のＸ０ＳＰフィルタユニットに適用した。質量スループットは６００ｇ／ｍ２であった。対応する計算された体積スループットは５２．１７Ｌ／ｍ２であった。供給流を２００ＬＭＨ（リットル／平方メートル／時間；Ｌ＊ｍ－２＊ｈ－１）に調整した。これにより、７．６７ｍＬ／分の計算された搭載流量が得られた。最大供給圧力は５．０バールであった。
２）１ｃｍの光路長のＵＶセルを使用して決定されたＯＤ２８０（２８０ｎｍ）が０．５ＡＵを超えるまで、フィルタ素通り画分を収集しなかった。閾値シグナルレベルを超えた後、秤量された無菌ボトル（Ｎａｌｇｅｎｅ）中に素通り画分を収集し、ろ過プールを得た。
３）意図した搭載体積が適用されたら、平衡化緩衝液でフィルタを洗い流した（残存タンパク質溶液の洗い流し）。
４）ＯＤ２８０値が０．５ＡＵ（１ｃｍＵＶセル）未満に低下するまで、洗い流し素通り画分を収集した。その後、収集を停止した。これにより、（フィルタ素通り画分および洗い流し素通り画分を含む）最終ろ過プールが得られた。
５）その後、中間の「Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｐｏｏｌ ｐＨ５．５」と同じ流量（７．６７ｍＬ／分（２００ＬＭＨ）でアルカリ再生溶液をフィルタに適用した。したがって、接触時間は約３０分であった。
６）フィルタから再生溶液を除去するために、「フィルタの状態調整：１）」に記載されているのと同じ条件での水洗浄を行った。合計で、フィルタは約５０分間、１０を超えるｐＨ値であった。
７）次のろ過サイクルのためにフィルタを平衡化するために、「フィルタの状態調整：２）」に記載されているのと同じ条件で平衡化緩衝液を適用した。
８）さらに９回の生成物ろ過サイクル（工程１）～４））およびさらに８回の再生サイクル（工程５）～７））のために、工程１）～７）を繰り返した。合計で６ｋｇ／ｍ２（１０×０．６ｋｇ／ｍ２）の抗体をフィルタに適用した。
９）分析のために、別個の最終ろ過プールをー８０℃に保った。
分析および結果：
それぞれの最終ろ過プールを用いて以下の分析を行った：
－タンパク質濃度（参照として、１ｍｇ／ｍｌで１．４３の吸光度を使用）
－搭載質量、最終ろ過プール体積および最終ろ過プールタンパク質濃度から計算した総生成物収率
－ＬＥＡＰ（リパーゼ活性アッセイ；加水分解活性）
－ｃｏｂａｓ＿ＨＣＰによるＣＨＯＰ値（宿主細胞タンパク質）
－ｑＰＲＣ＿ＤＮＡによるＤＮＡ値（宿主細胞ＤＮＡ）
－ＳＥ－ＨＰＬＣ（サイズ排除ＨＰＬＣ）
－ＭＣＥ（Ｃａｌｉｐｅｒ）
結果を以下の表Ｘ－１に示す。
（表Ｘ－１）
Figure 2024506991000002
Figure 2024506991000003
Ｎ／Ａ＝分析せず
Figure 2024506991000004
実施例２
アルカリ処理で再生された、シリカ含有Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）ＨＣ Ｐｒｏ Ｘ０ＳＰフィルタによる二重特異性抗ＣＤ２０／ＴｆＲ抗体溶液のろ過
材料：
１）ＡＫＴＡ Ａｖａｎｔ １５０（Ｃｙｔｉｖａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）クロマトグラフィースキッドを用いて実験を行った。カラムに代えて、カラムバルブにフィルタを取り付けた。圧力、ｐＨ値、導電率、ＯＤ２８０を監視した。適用される体積は、サンプルポンプによって制御された。
２）２３ｃｍ２のフィルタ面積を有するＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）ＨＣ Ｐｒｏ Ｘ０ＳＰフィルタ；ロット：ＣＰ０ＢＢ０８６２４
３）平衡化緩衝液：４０ｍＭ酢酸ナトリウム、精製水タイプＩＩ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｕｐｅｒ Ｑ）中でｐＨ５．５に調整
４）アルカリ再生溶液：１ＭＮａＣｌ、０．５ＭＮａＯＨ、ｐＨ１２．６
フィルタの状態調整：
以下の工程を順次実施した：
１）１００Ｌ／ｍ２の水をフィルタに適用した／フィルタを通して流した。その後、フィルタを脱気した。洗浄流は、５．０バールの最大供給圧力で１０．０ｍＬ／分であった。
２）１００Ｌ／ｍ２の平衡化緩衝液をフィルタに適用する／フィルタを通して流した（系およびフィルタの平衡化）。平衡流は、５．０バールの最大供給圧力で１０．０ｍＬ／分であった。
実験の設定：
以下の工程を順次実施した：
１）二重特異性抗ＣＤ２０／ＴｆＲ抗体を含有する中間の「Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｐｏｏｌ ｐＨ５．５」を、状態を調整された２３ｃｍ２のＸ０ＳＰフィルタユニットに適用した。質量スループットは８００ｇ／ｍ２であった。対応する計算された体積スループットは１００Ｌ／ｍ２であった。供給流を２００ＬＭＨ（リットル／平方メートル／時間；Ｌ＊ｍ－２＊ｈ－１）に調整した。これにより、７．６７ｍＬ／分の計算された搭載流量が得られた。最大供給圧力は５．０バールであった。
２）１ｃｍの光路長のＵＶセル］を使用して決定されたＯＤ２８０（２８０ｎｍ）が０．５ＡＵを超えるまで、フィルタ素通り画分を収集しなかった。閾値シグナルレベルを超えた後、秤量された無菌ボトル（Ｎａｌｇｅｎｅ）中に素通り画分を収集し、ろ過プールを得た。
３）意図した搭載体積が適用されたら、平衡化緩衝液でフィルタを洗い流した（残存タンパク質溶液の洗い流し）。
４）ＯＤ２８０が０．５ＡＵ［１ｃｍＵＶセル］を上回るまで、洗い流し素通り画分を収集した。ＯＤ２８０値が０．５ＡＵ（１ｃｍＵＶセル）未満に低下したら、収集を停止した。これにより、（フィルタ素通り画分および洗い流し素通り画分を含む）最終ろ過プールが得られた。
５）その後、中間の「Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｐｏｏｌ ｐＨ５．５」と同じ流量（７．６７ｍＬ／分（２００ＬＭＨ）でアルカリ再生溶液をフィルタに適用した。したがって、接触時間は約３０分であった。
６）フィルタから再生溶液を除去するために、「フィルタの状態調整：１）」に記載されているのと同じ条件での水洗浄を行った。合計で、フィルタは約５０分間、１０を超えるｐＨ値であった。
７）次のろ過サイクルのためにフィルタを平衡化するために、「フィルタの状態調整：２）」に記載されているのと同じ条件で平衡化緩衝液を適用した。
８）さらに４回の生成物ろ過サイクル（工程１）～４））およびさらに３回の再生サイクル（工程５）～７））のために、工程１）～７）を繰り返した。合計で４ｋｇ／ｍ２（５×０．８ｋｇ／ｍ２）の抗体をフィルタに適用した。
９）分析のために、別個の最終ろ過プールをー８０℃に保った。
分析および結果：
以下の分析を行った：
－タンパク質濃度（参照として、１ｍｇ／ｍｌで１．５７の吸光度を使用）
－搭載質量、最終ろ過プール体積および最終ろ過プールタンパク質濃度から計算した総生成物収率
－ＬＥＡＰ（リパーゼ活性アッセイ；加水分解活性）
－ｃｏｂａｓ＿ＨＣＰによるＣＨＯＰ値（宿主細胞タンパク質）
－ｑＰＲＣ＿ＤＮＡによるＤＮＡ値（宿主細胞ＤＮＡ）
－ＳＥ－ＨＰＬＣ（サイズ排除ＨＰＬＣ）
結果を以下の表Ｘ－２に示す。
（表Ｘ－２）
Figure 2024506991000005
Figure 2024506991000006
Figure 2024506991000007
実施例３
酸性処理で再生された、シリカ含有Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）ＨＣ Ｐｒｏ Ｘ０ＳＰフィルタによる二重特異性抗ＣＤ２０／ＴｆＲ抗体溶液のろ過
材料：
１）ＡＫＴＡ Ａｖａｎｔ １５０（Ｃｙｔｉｖａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）クロマトグラフィースキッドを用いて実験を行った。カラムに代えて、カラムバルブにフィルタを取り付けた。圧力、ｐＨ値、導電率、ＯＤ２８０を監視した。適用される体積は、サンプルポンプによって制御された。
２）２３ｃｍ２のフィルタ面積を有するＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）ＨＣ Ｐｒｏ Ｘ０ＳＰフィルタ；ロット：ＣＰ０ＢＢ０８６２４
３）平衡化緩衝液４０ｍＭ酢酸ナトリウム、精製水タイプＩＩ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｕｐｅｒ Ｑ）中でｐＨ５．５に調整
４）酸性再生溶液：１６７ｍＭ酢酸（ａｃｉｄｉｃ ａｃｉｄ）、３００ｍＭリン酸、ｐＨ１．３４。
フィルタの状態調整：
以下の工程を順次実施した：
１）１００Ｌ／ｍ２の水をフィルタに適用した／フィルタを通して流した。その後、フィルタを脱気した。洗浄流は、５．０バールの最大供給圧力で１０．０ｍＬ／分であった。
２）１００Ｌ／ｍ２の平衡化緩衝液をフィルタに適用する／フィルタを通して流した（系およびフィルタの平衡化）。平衡流は、５．０バールの最大供給圧力で１０．０ｍＬ／分であった。
実験の設定：
以下の工程を順次実施した：
１）二重特異性抗ＣＤ２０／ＴｆＲ抗体を含有する中間の「Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｐｏｏｌ ｐＨ５．５」を、状態を調整された２３ｃｍ２のＸ０ＳＰフィルタユニットに適用した。質量スループットは８１４ｇ／ｍ２であった。対応する計算された体積スループットは１００Ｌ／ｍ２であった。供給流を２００ＬＭＨ（リットル／平方メートル／時間；Ｌ＊ｍ－２＊ｈ－１）に調整した。これにより、７．６７ｍＬ／分の計算された搭載流量が得られた。最大供給圧力は５．０バールであった。
２）１ｃｍの光路長のＵＶセルを使用して決定されたＯＤ２８０（２８０ｎｍ）が０．５ＡＵを超えるまで、フィルタ素通り画分を収集しなかった。閾値シグナルレベルを超えた後、秤量された無菌ボトル（Ｎａｌｇｅｎｅ）中に素通り画分を収集し、ろ過プールを得た。
３）意図した搭載体積が適用されたら、平衡化緩衝液でフィルタを洗い流した（残存タンパク質溶液の洗い流し）。
４）ＯＤ２８０値が０．５ＡＵ（１ｃｍＵＶセル）未満に低下するまで、洗い流し素通り画分を収集した。その後、収集を停止した。これにより、（フィルタ素通り画分および洗い流し素通り画分を含む）最終ろ過プールが得られた。
５）その後、中間の「Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｐｏｏｌ ｐＨ５．５」と同じ流量（７．６７ｍＬ／分（２００ＬＭＨ）で酸性再生溶液をフィルタに適用した。したがって、接触時間は約３０分であった。
６）フィルタから再生溶液を除去するために、「フィルタの状態調整：１）」に記載されているのと同じ条件での水洗浄を行った。合計で、フィルタは約５０分間、２を下回るｐＨ値であった。
７）次のろ過サイクルのためにフィルタを平衡化するために、「フィルタの状態調整：２）」に記載されているのと同じ条件で平衡化緩衝液を適用した。
８）さらに４回の生成物ろ過サイクル（工程１）～４））およびさらに３回の再生サイクル（工程５）～７））のために、工程１）～７）を繰り返した。合計で４．０７ｋｇ／ｍ２（５×０．８１４ｋｇ／ｍ２）の抗体をフィルタに適用した。
９）分析のために、別個の最終ろ過プールをー８０℃に保った。
分析および結果：
それぞれの最終ろ過プールを用いて以下の分析を行った：
－タンパク質濃度（参照として、１ｍｇ／ｍｌで１．５７の吸光度を使用）
－搭載質量、最終ろ過プール体積および最終ろ過プールタンパク質濃度から計算した総生成物収率
－ＬＥＡＰ（リパーゼ活性アッセイ；加水分解活性）
－ｃｏｂａｓ＿ＨＣＰによるＣＨＯＰ値（宿主細胞タンパク質）
－ｑＰＲＣ＿ＤＮＡによるＤＮＡ値（宿主細胞ＤＮＡ）
－ＳＥ－ＨＰＬＣ（サイズ排除ＨＰＬＣ）
結果を以下の表Ｘ－３に示す。
（表Ｘ－３）
Figure 2024506991000008
Figure 2024506991000009
Figure 2024506991000010
実施例４
酸性処理で再生された、シリカ含有Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）ＨＣ Ｐｒｏ Ｘ０ＳＰフィルタによるＩｇＧ抗体ＩＬ－２融合タンパク質溶液のろ過
材料：
１）ＡＫＴＡ Ａｖａｎｔ １５０（Ｃｙｔｉｖａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）クロマトグラフィースキッドを用いて実験を行った。カラムに代えて、カラムバルブにフィルタを取り付けた。圧力、ｐＨ値、導電率、ＯＤ２８０を監視した。適用される体積は、サンプルポンプによって制御された。
２）２３ｃｍ２のフィルタ面積を有するＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）ＨＣ Ｐｒｏ Ｘ０ＳＰフィルタ；ロット：ＣＰ０ＢＢ０８６２４
３）平衡化緩衝液１５０ｍＭ酢酸（ａｃｉｄｉｃ ａｃｉｄ）／Ｔｒｉｓ、精製水タイプＩＩ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｕｐｅｒ Ｑ）中でｐＨ５．５に調整
４）酸性再生溶液：１６７ｍＭ酢酸（ａｃｉｄｉｃ ａｃｉｄ）、３００ｍＭリン酸、ｐＨ１．３４。
フィルタの状態調整：
以下の工程を順次実施した：
１）１００Ｌ／ｍ２の水をフィルタに適用した／フィルタを通して流した。その後、フィルタを脱気した。洗浄流は、５．０バールの最大供給圧力で１０．０ｍＬ／分であった。
２）１００Ｌ／ｍ２の平衡化緩衝液をフィルタに適用する／フィルタを通して流した（系およびフィルタの平衡化）。平衡流は、５．０バールの最大供給圧力で１０．０ｍＬ／分であった。
実験の設定：
以下の工程を順次実施した：
１）ＩｇＧ－ＩＬ２抗体融合タンパク質を含有する中間の「Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｐｏｏｌ ｐＨ５．５」を、状態を調整された２３ｃｍ２のＸ０ＳＰフィルタユニットに適用した。質量スループットは５４８ｇ／ｍ２であった。対応する計算された体積スループットは５６Ｌ／ｍ２であった。供給流を２００ＬＭＨ（リットル／平方メートル／時間；Ｌ＊ｍ－２＊ｈ－１）に調整した。これにより、７．６７ｍＬ／分の計算された搭載流量が得られた。最大供給圧力は５．０バールであった。
２）１ｃｍの光路長のＵＶセルを使用して決定されたＯＤ２８０（２８０ｎｍ）が０．５ＡＵを超えるまで、フィルタ素通り画分を収集しなかった。閾値シグナルレベルを超えた後、秤量された無菌ボトル（Ｎａｌｇｅｎｅ）中に素通り画分を収集し、ろ過プールを得た。
３）意図した搭載体積が適用されたら、平衡化緩衝液でフィルタを洗い流した（残存タンパク質溶液の洗い流し）。
４）ＯＤ２８０値が０．５ＡＵ（１ｃｍＵＶセル）未満に低下するまで、洗い流し素通り画分を収集した。その後、収集を停止した。これにより、（フィルタ素通り画分および洗い流し素通り画分を含む）最終ろ過プールが得られた。
５）その後、中間の「Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｐｏｏｌ ｐＨ５．５」と同じ流量（７．６７ｍＬ／分（２００ＬＭＨ）で酸性再生溶液をフィルタに適用した。したがって、接触時間は約３０分であった。
６）フィルタから再生溶液を除去するために、「フィルタの状態調整：１）」に記載されているのと同じ条件での水洗浄を行った。合計で、フィルタは約５０分間、２を下回るｐＨ値であった。
７）次のろ過サイクルのためにフィルタを平衡化するために、「フィルタの状態調整：２）」に記載されているのと同じ条件で平衡化緩衝液を適用した。
８）さらに５回の生成物ろ過サイクル（工程１）～４））およびさらに４回の再生サイクル（工程５）～７））のために、工程１）～７）を繰り返した。合計で２．２８８ｋｇ／ｍ２（６×０．５４８ｋｇ／ｍ２）の融合タンパク質をフィルタに適用した。
９）分析のために、別個の最終ろ過プールをー８０℃に保った。
分析および結果：
それぞれの最終ろ過プールを用いて以下の分析を行った：
－タンパク質濃度（参照として、１ｍｇ／ｍｌで１．２５の吸光度を使用）
－搭載質量、最終ろ過プール体積および最終ろ過プールタンパク質濃度から計算した総生成物収率
－ＬＥＡＰ（リパーゼ活性アッセイ；加水分解活性）
－ｃｏｂａｓ＿ＨＣＰによるＣＨＯＰ値（宿主細胞タンパク質）
－ｑＰＲＣ＿ＤＮＡによるＤＮＡ値（宿主細胞ＤＮＡ）
－ＳＥ－ＨＰＬＣ（サイズ排除ＨＰＬＣ）
結果を以下の表Ｘ－４に示す。
（表Ｘ－４）
Figure 2024506991000011
Figure 2024506991000012
Figure 2024506991000013
実施例５
酸性処理で再生された、シリカ含有Ｐａｌｌ ＰＤＤ１ ＳＵＰＲＡｃａｐ ５０フィルタによるＩｇＧ－ＩＬ２融合ポリペプチド溶液のろ過
材料：
１）ＡＫＴＡ Ａｖａｎｔ １５０（Ｃｙｔｉｖａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）クロマトグラフィースキッドを用いて実験を行った。カラムに代えて、カラムバルブにフィルタを取り付けた。圧力、ｐＨ値、導電率、ＯＤ２８０を監視した。適用される体積は、サンプルポンプによって制御された。
２）２２ｃｍ２のフィルタ面積を有するＰａｌｌ ＰＤＤ１ ＳＵＰＲＡｃａｐ ５０（ＳＣ０５０ＰＤＤ１）フィルタ；ロット：１０３８６４０４２
３）平衡化緩衝液１５０ｍＭ酢酸／Ｔｒｉｓ、精製水タイプＩＩ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｕｐｅｒ Ｑ）中でｐＨ５．５に調整
４）酸性再生溶液：１６７ｍＭ酢酸、３００ｍＭリン酸、ｐＨ１．３４
フィルタの状態調整：
以下の工程を順次実施した：
１）１００Ｌ／ｍ２の水をフィルタに適用した／フィルタを通して流した。その後、フィルタを脱気した。洗浄流は、５．０バールの最大供給圧力で１０．０ｍＬ／分であった。
２）１００Ｌ／ｍ２の平衡化緩衝液をフィルタに適用する／フィルタを通して流した（系およびフィルタの平衡化）。平衡流は、５．０バールの最大供給圧力で１０．０ｍＬ／分であった。
実験の設定：
以下の工程を順次実施した：
１）ＩｇＧ－ＩＬ２融合ポリペプチドを含有する中間の「Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｐｏｏｌ ｐＨ５．５」を、状態を調整された２２ｃｍ２のＰＤＤ１フィルタユニットに適用した。質量スループットは５４７ｇ／ｍ２であった。対応する計算された体積スループットは５５Ｌ／ｍ２であった。供給流を１９１ＬＭＨ（リットル／平方メートル／時間；Ｌ＊ｍ－２＊ｈ－１）に調整した。これにより、７．６７ｍＬ／分の計算された搭載流量が得られた。最大供給圧力は５．０バールであった。
２）１ｃｍの光路長のＵＶセルを使用して決定されたＯＤ２８０（２８０ｎｍ）が０．５ＡＵを超えるまで、フィルタ素通り画分を収集しなかった。閾値シグナルレベルを超えた後、秤量された無菌ボトル（Ｎａｌｇｅｎｅ）中に素通り画分を収集し、ろ過プールを得た。
３）意図した搭載体積が適用されたら、平衡化緩衝液でフィルタを洗い流した（残存タンパク質溶液の洗い流し）。
４）ＯＤ２８０値が０．５ＡＵ（１ｃｍＵＶセル）未満に低下するまで、洗い流し素通り画分を収集した。その後、収集を停止した。これにより、（フィルタ素通り画分および洗い流し素通り画分を含む）最終ろ過プールが得られた。
５）その後、中間の「Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｐｏｏｌ ｐＨ５．５」と同じ流量（７．６７ｍＬ／分（１９１ＬＭＨ）で酸性再生溶液をフィルタに適用した。したがって、接触時間は約３０分であった。
６）フィルタから再生溶液を除去するために、「フィルタの状態調整：１）」に記載されているのと同じ条件での水洗浄を行った。合計で、フィルタは約５０分間、２を下回るｐＨ値であった。
７）次のろ過サイクルのためにフィルタを平衡化するために、「フィルタの状態調整：２）」に記載されているのと同じ条件で平衡化緩衝液を適用した。
８）さらに５回の生成物ろ過サイクル（工程１）～４））およびさらに４回の再生サイクル（工程５）～７））のために、工程１）～７）を繰り返した。合計で３．２８２ｋｇ／ｍ２（６×０．５４７ｋｇ／ｍ２）の融合タンパク質をフィルタに適用した。
９）分析のために、別個の最終ろ過プールをー８０℃に保った。
分析および結果：
それぞれの最終ろ過プールを用いて以下の分析を行った：
－タンパク質濃度（参照として、１ｍｇ／ｍｌで１．２５の吸光度を使用）
－搭載質量、最終ろ過プール体積および最終ろ過プールタンパク質濃度から計算した総生成物収率
－ＬＥＡＰ（リパーゼ活性アッセイ；加水分解活性）
－ｃｏｂａｓ＿ＨＣＰによるＣＨＯＰ値（宿主細胞タンパク質）
－ｑＰＲＣ＿ＤＮＡによるＤＮＡ値（宿主細胞ＤＮＡ）
－ＳＥ－ＨＰＬＣ（サイズ排除ＨＰＬＣ）
結果を以下の表Ｘ－５に示す。
（表Ｘ－５）
Figure 2024506991000014
Figure 2024506991000015
実施例６
（アルカリまたは酸性フィルタ再生なしで）水および緩衝液を適用した、シリカ含有Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）ＨＣ Ｐｒｏ Ｘ０ＳＰフィルタユニットによるクロバリマブ（抗Ｃ５抗体）溶液のろ過－比較例
材料：
１）ＡＫＴＡ Ａｖａｎｔ １５０（Ｃｙｔｉｖａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）クロマトグラフィースキッドを用いて実験を行った。カラムに代えて、カラムバルブにフィルタを取り付けた。圧力、ｐＨ値、導電率、ＯＤ２８０を監視した。適用される体積は、サンプルポンプによって制御された。
２）２３ｃｍ２のフィルタ面積を有するＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）ＨＣ Ｐｒｏ Ｘ０ＳＰフィルタ；ロット：ＣＰ０ＢＢ０８６２４
３）平衡化緩衝液１５０ｍＭ酢酸／Ｔｒｉｓ、精製水タイプＩＩ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｕｐｅｒ Ｑ）中でｐＨ５．５に調整
４）中間溶液：水および平衡化緩衝液
フィルタの状態調整：
以下の工程を順次実施した：
１）１００Ｌ／ｍ２の水をフィルタに適用した／フィルタを通して流した。その後、フィルタを脱気した。洗浄流は、５．０バールの最大供給圧力で１０．０ｍＬ／分であった。
２）１００Ｌ／ｍ２の平衡化緩衝液をフィルタに適用する／フィルタを通して流した（系およびフィルタの平衡化）。平衡流は、５．０バールの最大供給圧力で１０．０ｍＬ／分であった。
実験の設定：
以下の工程を順次実施した：
１）クロバリマブを含有する中間の「Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｐｏｏｌ ｐＨ５．５」を、状態を調整された２３ｃｍ２のＸ０ＳＰフィルタユニットに適用した。質量スループットは６００ｇ／ｍ２であった。対応する計算された体積スループットは４１．３Ｌ／ｍ２であった。供給流を２００ＬＭＨ（リットル／平方メートル／時間；Ｌ＊ｍ－２＊ｈ－１）に調整した。これにより、７．６７ｍＬ／分の計算された搭載流量が得られた。最大供給圧力は５．０バールであった。
２）１ｃｍの光路長のＵＶセルを使用して決定されたＯＤ２８０（２８０ｎｍ）が０．５ＡＵを超えるまで、フィルタ素通り画分を収集しなかった。閾値シグナルレベルを超えた後、秤量された無菌ボトル（Ｎａｌｇｅｎｅ）中に素通り画分を収集し、ろ過プールを得た。
３）意図した搭載体積が適用されたら、平衡化緩衝液でフィルタを洗い流した（残存タンパク質溶液の洗い流し）。
４）フィルタの素通り画分を７０Ｌ／ｍ２について回収した。７０Ｌ／ｍ２の素通り画分に達したら、回収を停止した。これにより、最終的なろ過プールが得られた。
５）次のろ過サイクルのためにフィルタを準備するために、「フィルタの状態調整：１）」に記載されているのと同じ条件で水洗浄を行った。
６）次のろ過サイクルのためにフィルタを平衡化するために、「フィルタの状態調整：２）」に記載されているのと同じ条件で平衡化緩衝液を適用した。
７）ろ過サイクルの間に刺激の強い再生溶液を用いることなく、さらに９回の生成物ろ過サイクルについて、工程１）～６）を繰り返した。合計で６．０ｋｇ／ｍ２（１０×０．６ｋｇ／ｍ２）の抗体をフィルタに適用した。
８）分析のために、別個の最終ろ過プールをー８０℃に保った。
分析および結果：
それぞれの最終ろ過プールを用いて以下の分析を行った：
－タンパク質濃度（参照として、１ｍｇ／ｍｌで１．４４の吸光度を使用）
－搭載質量、最終ろ過プール体積および最終ろ過プールタンパク質濃度から計算した総生成物収率
－ＬＥＡＰ（リパーゼ活性アッセイ；加水分解活性）
－ｃｏｂａｓ＿ＨＣＰによるＣＨＯＰ値（宿主細胞タンパク質）
－ｑＰＲＣ＿ＤＮＡによるＤＮＡ値（宿主細胞ＤＮＡ）
－ＳＥ－ＨＰＬＣ（サイズ排除ＨＰＬＣ）
－ＭＣＥ（Ｃａｌｉｐｅｒ）
結果を以下の表Ｘ－６に示す。
（表Ｘ－６）
Figure 2024506991000016
Figure 2024506991000017
Ｎ／Ａ＝分析せず
Figure 2024506991000018
実施例７
アルカリ前処理で誘導体化され、アルカリ処理で再生されたシリカ含有Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）ＨＣ Ｐｒｏ Ｘ０ＳＰフィルタによるクロバリマブ（抗Ｃ５抗体）溶液のろ過
材料：
１）ＡＫＴＡ Ａｖａｎｔ １５０（Ｃｙｔｉｖａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）クロマトグラフィースキッドを用いて実験を行った。カラムに代えて、カラムバルブにフィルタを取り付けた。圧力、ｐＨ値、導電率、ＯＤ２８０を監視した。適用される体積は、サンプルポンプによって制御された。
２）２３ｃｍ２のフィルタ面積を有するＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）ＨＣ Ｐｒｏ Ｘ０ＳＰフィルタ；ロット：ＣＰ０ＢＢ０８６２４
３）平衡化緩衝液１５０ｍＭ酢酸／Ｔｒｉｓ、精製水タイプＩＩ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｕｐｅｒ Ｑ）中でｐＨ５．５に調整
４）アルカリ前処理および再生溶液：１Ｍ ＮａＯＨ
フィルタ誘導体化：
以下の工程を順次実施した：
１）１００Ｌ／ｍ２の水をフィルタに適用した／フィルタを通して流した。その後、フィルタを脱気した。洗浄流は、５．０バールの最大供給圧力で１０．０ｍＬ／分であった。
２）１００Ｌ／ｍ２の平衡化緩衝液をフィルタに適用する／フィルタを通して流した（系およびフィルタの平衡化）。平衡流は、５．０バールの最大供給圧力で１０．０ｍＬ／分であった。
３）１００Ｌ／ｍ２のアルカリ前処理／再生溶液をフィルタに適用した／フィルタを通して流した。７０Ｌ／ｍ２の素通り画分の後、システム流を４時間一時停止して、アルカリ再生溶液とともにフィルタをインキュベートした。再生流は、５．０バールの最大供給圧力で７．６７ｍＬ／分であった。
実験の設定：
以下の工程を順次実施した：
１）クロバリマブを含有する中間の「Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｐｏｏｌ ｐＨ５．５」を、誘導体化された２３ｃｍ２のＸ０ＳＰフィルタユニットに適用した。質量スループットは６００ｇ／ｍ２であった。対応する計算された体積スループットは４１．３Ｌ／ｍ２であった。供給流を２００ＬＭＨ（リットル／平方メートル／時間；Ｌ＊ｍ－２＊ｈ－１）に調整した。これにより、７．６７ｍＬ／分の計算された供給流が得られた。最大供給圧力は５．０バールであった。
２）１ｃｍの光路長のＵＶセルを使用して決定されたＯＤ２８０（２８０ｎｍ）が０．５ＡＵを超えるまで、フィルタ素通り画分を収集しなかった。閾値シグナルレベルを超えた後、秤量された無菌ボトル（Ｎａｌｇｅｎｅ）中に素通り画分を収集し、ろ過プールを得た。
３）意図した搭載体積が適用されたら、平衡化緩衝液でフィルタを洗い流した（残存タンパク質溶液の洗い流し）。
４）フィルタの素通り画分を７０Ｌ／ｍ２について回収した。７０Ｌ／ｍ２の素通り画分に達したら、回収を停止した。これにより、最終的なろ過プールが得られた。
５）その後、中間の「Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｐｏｏｌ ｐＨ５．５」と同じ流量（７．６７ｍＬ／分（２００ＬＭＨ）でアルカリ再生溶液をフィルタに適用した。したがって、接触時間は約３０分であった。
６）フィルタから再生溶液を除去するために、「フィルタの誘導体化：１）」に記載されているのと同じ条件で水洗浄を行った。合計で、フィルタは約５０分間、１０を超えるｐＨ値であった。
７）次のろ過サイクルのためにフィルタを平衡化するために、「フィルタの誘導体化：２）」に記載されているのと同じ条件で平衡化緩衝液を適用した。
８）さらに９回の生成物ろ過サイクル（工程１）～４））およびさらに８回の再生サイクル（工程５）～７））のために、工程１）～７）を繰り返した。合計で６．０ｋｇ／ｍ２（１０×０．６ｋｇ／ｍ２）の抗体をフィルタに適用した。
９）分析のために、別個の最終ろ過プールをー８０℃に保った。
分析および結果：
それぞれの最終ろ過プールを用いて以下の分析を行った：
－タンパク質濃度（参照として、１ｍｇ／ｍｌで１．４４の吸光度を使用）
－搭載質量、最終ろ過プール体積および最終ろ過プールタンパク質濃度から計算した総生成物収率
－ＬＥＡＰ（リパーゼ活性アッセイ；加水分解活性）
－ｃｏｂａｓ＿ＨＣＰによるＣＨＯＰ値（宿主細胞タンパク質）
－ｑＰＲＣ＿ＤＮＡによるＤＮＡ値（宿主細胞ＤＮＡ）
－ＳＥ－ＨＰＬＣ（サイズ排除ＨＰＬＣ）
結果を以下の表Ｘ－７に示す。
（表Ｘ－７）
Figure 2024506991000019
Figure 2024506991000020
Ｎ／Ａ＝分析せず
Figure 2024506991000021
実施例８
酸性処理で再生された、シリカ含有Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）ＨＣ Ｐｒｏ Ｘ０ＳＰフィルタによるクロバリマブ（抗Ｃ５抗体）溶液のろ過
材料：
１）ＡＫＴＡ Ａｖａｎｔ １５０（Ｃｙｔｉｖａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）クロマトグラフィースキッドを用いて実験を行った。カラムに代えて、カラムバルブにフィルタを取り付けた。圧力、ｐＨ値、導電率、ＯＤ２８０を監視した。適用される体積は、サンプルポンプによって制御された。
２）２３ｃｍ２のフィルタ面積を有するＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）ＨＣ Ｐｒｏ Ｘ０ＳＰフィルタ；ロット：ＣＰ０ＢＢ０８６２４
３）平衡化緩衝液１５０ｍＭ酢酸／Ｔｒｉｓ、精製水タイプＩＩ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｕｐｅｒ Ｑ）中でｐＨ５．５に調整
４）酸再生溶液：０．５Ｍリン酸
フィルタの状態調整：
以下の工程を順次実施した：
１）１００Ｌ／ｍ２の水をフィルタに適用した／フィルタを通して流した。その後、フィルタを脱気した。洗浄流は、５．０バールの最大供給圧力で１０．０ｍＬ／分であった。
２）１００Ｌ／ｍ２の平衡化緩衝液をフィルタに適用する／フィルタを通して流した（系およびフィルタの平衡化）。平衡流は、５．０バールの最大供給圧力で１０．０ｍＬ／分であった。
実験の設定：
以下の工程を順次実施した：
１）クロバリマブを含有する中間の「Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｐｏｏｌ ｐＨ５．５」を、状態を調整された２３ｃｍ２のＸ０ＳＰフィルタユニットに適用した。質量スループットは６００ｇ／ｍ２であった。対応する計算された体積スループットは４１．３Ｌ／ｍ２であった。供給流を２００ＬＭＨ（リットル／平方メートル／時間；Ｌ＊ｍ－２＊ｈ－１）に調整した。これにより、７．６７ｍＬ／分の計算された供給流が得られた。最大供給圧力は５．０バールであった。
２）１ｃｍの光路長のＵＶセルを使用して決定されたＯＤ２８０（２８０ｎｍ）が０．５ＡＵを超えるまで、フィルタ素通り画分を収集しなかった。閾値シグナルレベルを超えた後、秤量された無菌ボトル（Ｎａｌｇｅｎｅ）中に素通り画分を収集し、ろ過プールを得た。
３）意図した搭載体積が適用されたら、平衡化緩衝液でフィルタを洗い流した（残存タンパク質溶液の洗い流し）。
４）フィルタの素通り画分を７０Ｌ／ｍ２について回収した。７０Ｌ／ｍ２の素通り画分に達したら、回収を停止した。これにより、最終的なろ過プールが得られた。
５）その後、中間の「Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｐｏｏｌ ｐＨ５．５」と同じ流量（７．６７ｍＬ／分（２００ＬＭＨ）で酸性再生溶液をフィルタに適用した。したがって、接触時間は約３０分であった。
６）フィルタから再生溶液を除去するために、「フィルタの状態調整：１）」に記載されているのと同じ条件で水洗浄を行った。合計で、フィルタは約５０分間、２を下回るｐＨ値であった。
７）次のろ過サイクルのためにフィルタを平衡化するために、「フィルタの状態調整：２）」に記載されているのと同じ条件で平衡化緩衝液を適用した。
８）さらに９回の生成物ろ過サイクル（工程１）～４））およびさらに８回の再生サイクル（工程５）～７））のために、工程１）～７）を繰り返した。合計で６．０ｋｇ／ｍ２（１０×０．６ｋｇ／ｍ２）の抗体をフィルタに適用した。
９）分析のために、別個の最終ろ過プールをー８０℃に保った。
分析および結果：
それぞれの最終ろ過プールを用いて以下の分析を行った：
－タンパク質濃度（参照として、１ｍｇ／ｍｌで１．４４の吸光度を使用）
－搭載質量、最終ろ過プール体積および最終ろ過プールタンパク質濃度から計算した総生成物収率
－ＬＥＡＰ（リパーゼ活性アッセイ；加水分解活性）
－ｃｏｂａｓ＿ＨＣＰによるＣＨＯＰ値（宿主細胞タンパク質）
－ｑＰＲＣ＿ＤＮＡによるＤＮＡ値（宿主細胞ＤＮＡ）
－ＳＥ－ＨＰＬＣ（サイズ排除ＨＰＬＣ）
結果を以下の表Ｘ－８に示す。
（表Ｘ－８）
Figure 2024506991000022
Figure 2024506991000023
Ｎ／Ａ＝分析せず
Figure 2024506991000024
実施例９
（アルカリまたは酸性フィルタ再生なしで）水および緩衝液を適用した、シリカ含有Ｐａｌｌ ＰＤＤ１ ＳＵＰＲＡｃａｐ ５０フィルタによるクロバリマブ（抗Ｃ５抗体）溶液のろ過－比較例
材料：
１）ＡＫＴＡ Ａｖａｎｔ １５０（Ｃｙｔｉｖａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）クロマトグラフィースキッドを用いて実験を行った。カラムに代えて、カラムバルブにフィルタを取り付けた。圧力、ｐＨ値、導電率、ＯＤ２８０を監視した。適用される体積は、サンプルポンプによって制御された。
２）２２ｃｍ２のフィルタ面積を有するＰａｌｌ ＰＤＤ１ ＳＵＰＲＡｃａｐ ５０（ＳＣ０５０ＰＤＤ１）フィルタ；ロット：１０３８６４０４２
３）平衡化緩衝液１５０ｍＭ酢酸／Ｔｒｉｓ、精製水タイプＩＩ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｕｐｅｒ Ｑ）中でｐＨ５．５に調整
４）中間溶液：水および平衡化緩衝液
フィルタの状態調整：
以下の工程を順次実施した：
１）１００Ｌ／ｍ２の水をフィルタに適用した／フィルタを通して流した。その後、フィルタを脱気した。洗浄流は、５．０バールの最大供給圧力で１０．０ｍＬ／分であった。
２）１００Ｌ／ｍ２の平衡化緩衝液をフィルタに適用する／フィルタを通して流した（系およびフィルタの平衡化）。平衡流は、５．０バールの最大供給圧力で１０．０ｍＬ／分であった。
実験の設定：
以下の工程を順次実施した：
１）クロバリマブを含有する中間の「Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｐｏｏｌ ｐＨ５．５」を、状態を調整された２２ｃｍ２のＰＤＤ１フィルタユニットに適用した。質量スループットは５９９ｇ／ｍ２であった。対応する計算された体積スループットは１２０Ｌ／ｍ２であった。供給流を１９１ＬＭＨ（リットル／平方メートル／時間；Ｌ＊ｍ－２＊ｈ－１）に調整した。これにより、７．６７ｍＬ／分の計算された供給流が得られた。最大供給圧力は５．０バールであった。
２）１ｃｍの光路長のＵＶセルを使用して決定されたＯＤ２８０（２８０ｎｍ）が０．５ＡＵを超えるまで、フィルタ素通り画分を収集しなかった。閾値シグナルレベルを超えた後、秤量された無菌ボトル（Ｎａｌｇｅｎｅ）中に素通り画分を収集し、ろ過プールを得た。
３）意図した搭載体積が適用されたら、平衡化緩衝液でフィルタを洗い流した（残存タンパク質溶液の洗い流し）。
４）フィルタの素通り画分を７０Ｌ／ｍ２について回収した。７０Ｌ／ｍ２の素通り画分に達したら、回収を停止した。これにより、最終的なろ過プールが得られた。
５）次のろ過サイクルのためにフィルタを準備するために、「フィルタの状態調整：１）」に記載されているのと同じ条件で水洗浄を行った。
６）次のろ過サイクルのためにフィルタを平衡化するために、「フィルタの状態調整：２）」に記載されているのと同じ条件で平衡化緩衝液を適用した。
７）ろ過サイクルの間に刺激の強い再生溶液の適用を用いることなく、さらに９回の生成物ろ過サイクルについて、工程１）～６）を繰り返した。合計で５．９９ｋｇ／ｍ２（１０×０．５９９ｋｇ／ｍ２）の抗体をフィルタに適用した。
８）分析のために、別個の最終ろ過プールをー８０℃に保った。
分析および結果：
それぞれの最終ろ過プールを用いて以下の分析を行った：
－タンパク質濃度（参照として、１ｍｇ／ｍｌで１．４４の吸光度を使用）
－搭載質量、最終ろ過プール体積および最終ろ過プールタンパク質濃度から計算した総生成物収率
－ＬＥＡＰ（リパーゼ活性アッセイ；加水分解活性）
－ｃｏｂａｓ＿ＨＣＰによるＣＨＯＰ値（宿主細胞タンパク質）
－ｑＰＲＣ＿ＤＮＡによるＤＮＡ値（宿主細胞ＤＮＡ）
－ＳＥ－ＨＰＬＣ（サイズ排除ＨＰＬＣ）
結果を以下の表Ｘ－９に示す。
（表Ｘ－９）
Figure 2024506991000025
Figure 2024506991000026
Ｎ／Ａ＝分析せず
Figure 2024506991000027
実施例１０
アルカリ前処理で誘導体化され、アルカリ処理で再生されたシリカ含有Ｐａｌｌ ＰＤＤ１ ＳＵＰＲＡｃａｐ ５０フィルタによるクロバリマブ（抗Ｃ５抗体）溶液のろ過
材料：
１）ＡＫＴＡ Ａｖａｎｔ １５０（Ｃｙｔｉｖａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）クロマトグラフィースキッドを用いて実験を行った。カラムに代えて、カラムバルブにフィルタを取り付けた。圧力、ｐＨ値、導電率、ＯＤ２８０を監視した。適用される体積は、サンプルポンプによって制御された。
２）２２ｃｍ２のフィルタ面積を有するＰａｌｌ ＰＤＤ１ ＳＵＰＲＡｃａｐ ５０（ＳＣ０５０ＰＤＤ１）フィルタ；ロット：１０３８６４０４２
３）平衡化緩衝液１５０ｍＭ酢酸／Ｔｒｉｓ、精製水タイプＩＩ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｕｐｅｒ Ｑ）中でｐＨ５．５に調整
４）アルカリ再生溶液：１Ｍ ＮａＯＨ
フィルタ誘導体化：
以下の工程を順次実施した：
１）１００Ｌ／ｍ２の水をフィルタに適用した／フィルタを通して流した。その後、フィルタを脱気した。洗浄流は、５．０バールの最大供給圧力で１０．０ｍＬ／分であった。
２）１００Ｌ／ｍ２の平衡化緩衝液をフィルタに適用する／フィルタを通して流した（系およびフィルタの平衡化）。平衡流は、５．０バールの最大供給圧力で１０．０ｍＬ／分であった。
３）１００Ｌ／ｍ２のアルカリ前処理／再生溶液をフィルタに適用した／フィルタを通して流した。７０Ｌ／ｍ２の素通り画分の後、システム流を４時間一時停止して、アルカリ再生溶液とともにフィルタをインキュベートした。再生流は、５．０バールの最大供給圧力で７．６７ｍＬ／分であった。
実験の設定：
以下の工程を順次実施した：
１）クロバリマブを含有する中間の「Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｐｏｏｌ ｐＨ５．５」を、誘導体化された２２ｃｍ２のＰＤＤ１フィルタユニットに適用した。質量スループットは６００ｇ／ｍ２であった。対応する計算された体積スループットは４１．３Ｌ／ｍ２であった。供給流を１９１ＬＭＨ（リットル／平方メートル／時間；Ｌ＊ｍ－２＊ｈ－１）に調整した。これにより、７．６７ｍＬ／分の計算された供給流が得られた。最大供給圧力は５．０バールであった。
２）１ｃｍの光路長のＵＶセルを使用して決定されたＯＤ２８０（２８０ｎｍ）が０．５ＡＵを超えるまで、フィルタ素通り画分を収集しなかった。閾値シグナルレベルを超えた後、秤量された無菌ボトル（Ｎａｌｇｅｎｅ）中に素通り画分を収集し、ろ過プールを得た。
３）意図した搭載体積が適用されたら、平衡化緩衝液でフィルタを洗い流した（残存タンパク質溶液の洗い流し）。
４）洗い流し素通り画分を７０Ｌ／ｍ２について回収した。７０Ｌ／ｍ２の洗い流し素通り画分に達したら、回収を停止した。これにより、（フィルタ素通り画分および洗い流し素通り画分を含む）最終ろ過プールが得られた。
５）その後、中間の「Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｐｏｏｌ ｐＨ５．５」と同じ流量（７．６７ｍＬ／分（１９１ＬＭＨ）でアルカリ再生溶液をフィルタに適用した。したがって、接触時間は約３０分であった。
６）フィルタから再生溶液を除去するために、「フィルタの誘導体化：１）」に記載されているのと同じ条件で水洗浄を行った。合計で、フィルタは約５０分間、１０を超えるｐＨ値であった。
７）次のろ過サイクルのためにフィルタを平衡化するために、「フィルタの誘導体化：２）」に記載されているのと同じ条件で平衡化緩衝液を適用した。
８）さらに９回の生成物ろ過サイクル（工程１）～４））およびさらに８回の再生サイクル（工程５）～７））のために、工程１）～７）を繰り返した。合計で６．０ｋｇ／ｍ２（１０×０．６ｋｇ／ｍ２）の抗体をフィルタに適用した。
９）分析のために、別個の最終ろ過プールをー８０℃に保った。
分析および結果：
それぞれの最終ろ過プールを用いて以下の分析を行った：
－タンパク質濃度（参照として、１ｍｇ／ｍｌで１．４４の吸光度を使用）
－搭載質量、最終ろ過プール体積および最終ろ過プールタンパク質濃度から計算した総生成物収率
－ＬＥＡＰ（リパーゼ活性アッセイ；加水分解活性）
－ｃｏｂａｓ＿ＨＣＰによるＣＨＯＰ値（宿主細胞タンパク質）
－ｑＰＲＣ＿ＤＮＡによるＤＮＡ値（宿主細胞ＤＮＡ）
－ＳＥ－ＨＰＬＣ（サイズ排除ＨＰＬＣ）
結果を以下の表Ｘ－１０に示す。
（表Ｘ－１０）
Figure 2024506991000028
Figure 2024506991000029
Figure 2024506991000030
実施例１１
酸性処理で再生された、シリカ含有Ｐａｌｌ ＰＤＤ１ ＳＵＰＲＡｃａｐ ５０フィルタによるクロバリマブ（抗Ｃ５抗体）溶液のろ過
材料：
１）ＡＫＴＡ Ａｖａｎｔ １５０（Ｃｙｔｉｖａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）クロマトグラフィースキッドを用いて実験を行った。カラムに代えて、カラムバルブにフィルタを取り付けた。圧力、ｐＨ値、導電率、ＯＤ２８０を監視した。適用される体積は、サンプルポンプによって制御された。
２）２２ｃｍ２のフィルタ面積を有するＰａｌｌ ＰＤＤ１ ＳＵＰＲＡｃａｐ ５０（ＳＣ０５０ＰＤＤ１）フィルタ；ロット：１０３８６４０４２
３）平衡化緩衝液１５０ｍＭ酢酸／Ｔｒｉｓ、精製水タイプＩＩ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｕｐｅｒ Ｑ）中でｐＨ５．５に調整
４）酸再生溶液：０．５Ｍリン酸
フィルタの状態調整：
以下の工程を順次実施した：
１）１００Ｌ／ｍ２の水をフィルタに適用した／フィルタを通して流した。その後、フィルタを脱気した。洗浄流は、５．０バールの最大供給圧力で１０．０ｍＬ／分であった。
２）１００Ｌ／ｍ２の平衡化緩衝液をフィルタに適用する／フィルタを通して流した（系およびフィルタの平衡化）。平衡流は、５．０バールの最大供給圧力で１０．０ｍＬ／分であった。
実験の設定：
以下の工程を順次実施した：
１）クロバリマブを含有する中間の「Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｐｏｏｌ ｐＨ５．５」を、状態を調整された２２ｃｍ２のＰＤＤ１フィルタユニットに適用した。質量スループットは６００ｇ／ｍ２であった。対応する計算された体積スループットは４１．３Ｌ／ｍ２であった。供給流を１９１ＬＭＨ（リットル／平方メートル／時間；Ｌ＊ｍ－２＊ｈ－１）に調整した。これにより、７．６７ｍＬ／分の計算された供給流が得られた。最大供給圧力は５．０バールであった。
２）１ｃｍの光路長のＵＶセルを使用して決定されたＯＤ２８０（２８０ｎｍ）が０．５ＡＵを超えるまで、フィルタ素通り画分を収集しなかった。閾値シグナルレベルを超えた後、秤量された無菌ボトル（Ｎａｌｇｅｎｅ）中に素通り画分を収集し、ろ過プールを得た。
３）意図した搭載体積が適用されたら、平衡化緩衝液でフィルタを洗い流した（残存タンパク質溶液の洗い流し）。
４）洗い流し素通り画分を７０Ｌ／ｍ２について回収した。７０Ｌ／ｍ２の洗い流し素通り画分に達したら、回収を停止した。これにより、（フィルタ素通り画分および洗い流し素通り画分を含む）最終ろ過プールが得られた。
５）その後、中間の「Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｐｏｏｌ ｐＨ５．５」と同じ流量（７．６７ｍＬ／分（１９１ＬＭＨ）で酸性再生溶液をフィルタに適用した。したがって、接触時間は約３０分であった。
６）フィルタから再生溶液を除去するために、「フィルタの状態調整：１）」に記載されているのと同じ条件で水洗浄を行った。合計で、フィルタは約５０分間、２を下回るｐＨ値であった。
７）次のろ過サイクルのためにフィルタを平衡化するために、「フィルタの状態調整：２）」に記載されているのと同じ条件で平衡化緩衝液を適用した。
８）さらに９回の生成物ろ過サイクル（工程１）～４））およびさらに８回の再生サイクル（工程５）～７））のために、工程１）～７）を繰り返した。合計で６．０ｋｇ／ｍ２（１０×０．６ｋｇ／ｍ２）の抗体をフィルタに適用した。
９）分析のために、別個の最終ろ過プールをー８０℃に保った。
分析および結果：
それぞれの最終ろ過プールを用いて以下の分析を行った：
－タンパク質濃度（参照として、１ｍｇ／ｍｌで１．４４の吸光度を使用）
－搭載質量、最終ろ過プール体積および最終ろ過プールタンパク質濃度から計算した総生成物収率
－ＬＥＡＰ（リパーゼ活性アッセイ；加水分解活性）
－ｃｏｂａｓ＿ＨＣＰによるＣＨＯＰ値（宿主細胞タンパク質）
－ｑＰＲＣ＿ＤＮＡによるＤＮＡ値（宿主細胞ＤＮＡ）
－ＳＥ－ＨＰＬＣ（サイズ排除ＨＰＬＣ）
結果を以下の表Ｘ－１１に示す。
（表Ｘ－１１）
Figure 2024506991000031
Figure 2024506991000032
Figure 2024506991000033
実施例１２
シリカ含有Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）ＨＣ Ｐｒｏ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｄｅｐｔｈ Ｆｉｌｔｅｒ Ｘ０ＳＰによるクロバリマブ（抗Ｃ５抗体）溶液のろ過（基準例）
材料：
１）ＡＫＴＡ Ａｖａｎｔ １５０（Ｃｙｔｉｖａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）クロマトグラフィースキッドを用いて実験を行った。カラムに代えて、カラムバルブにフィルタを取り付けた。圧力、ｐＨ値、導電率、ＯＤ２８０を監視した。適用される体積は、サンプルポンプによって制御された。
２）２３ｃｍ２のフィルタ面積を有するＭｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）ＨＣ Ｐｒｏ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｄｅｐｔｈ Ｆｉｌｔｅｒ Ｘ０ＳＰ
３）平衡化緩衝液１５０ｍＭ酢酸／Ｔｒｉｓ、精製水タイプＩＩ（Ａｄｖａｎｔｅｃ ＣＣＳ－０２０－Ｄ１ＤＳ）中でｐＨ５．５に調整。
フィルタの状態調整：
最初の試料適用の前に、以下の工程を実施した：
１）１００Ｌ／ｍ２の水をフィルタに適用した／フィルタを通して流した。その後、フィルタを脱気した。洗浄流は、５．０バールの最大供給圧力で１０．０ｍＬ／分であった。
２）１００Ｌ／ｍ２の平衡化緩衝液をフィルタに適用する／フィルタを通して流した（系およびフィルタの平衡化）。平衡流は、５．０バールの最大供給圧力で１０．０ｍＬ／分であった。
実験の設定：
以下の工程を順次実施した：
１）クロバリマブを含有する中間の「Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｐｏｏｌ ｐＨ５．５」を、状態を調整された２３ｃｍ２のＸ０ＳＰフィルタユニットに適用した。質量スループットは６６０ｇ／ｍ２であった。対応する計算された体積スループットは４９．６Ｌ／ｍ２であった。供給流を２００ＬＭＨ（リットル／平方メートル／時間；Ｌ＊ｍ－２＊ｈ－１）に調整した。これにより、７．６７ｍＬ／分の計算された供給流が得られた。最大供給圧力は５．０バールであった。
２）１ｃｍの光路長のＵＶセルを使用して決定されたＯＤ２８０（２８０ｎｍ）が０．５ＡＵを超えるまで、フィルタ素通り画分を収集しなかった。閾値シグナルレベルを超えた後、秤量された無菌ボトル（Ｎａｌｇｅｎｅ）中に素通り画分を収集し、ろ過プールを得た。
３）意図した搭載体積が適用されたら、平衡化緩衝液でフィルタを洗い流した（残存タンパク質溶液の洗い流し）。
４）フィルタの素通り画分を７０Ｌ／ｍ２について回収した。７０Ｌ／ｍ２の素通り画分に達したら、回収を停止した。これにより、（フィルタ素通り画分および洗い流し素通り画分を含む）最終ろ過プールが得られた。
５）ろ過サイクルの間に溶液の適用を用いることなく、さらに５回の生成物ろ過サイクルについて、工程１）～４）を繰り返した。合計で３．９６ｋｇ／ｍ２（６×０．６６ｋｇ／ｍ２）の抗体をフィルタに適用した。
６）この手順は、６つの画分をもたらした。さらなる分析のために、それぞれの画分を１２ｍＬの最終体積でプールした（例えば、４ｍＬの画分１、４ｍＬの画分２および４ｍＬの画分３が、画分「プール＃３」をもたらした。）。
７）分析のために、最終プールをー８０℃に保った。
分析および結果：
それぞれの最終ろ過プールを用いて以下の分析を行った：
－タンパク質濃度（参照として、１ｍｇ／ｍｌで１．４４の吸光度を使用）
－搭載質量、最終ろ過プール体積および最終ろ過プールタンパク質濃度から計算した総生成物収率
－ＬＥＡＰ（リパーゼ活性アッセイ；加水分解活性）
－ｃｏｂａｓ＿ＨＣＰによるＣＨＯＰ値（宿主細胞タンパク質）
－ｑＰＲＣ＿ＤＮＡによるＤＮＡ値（宿主細胞ＤＮＡ）
－ＳＥ－ＨＰＬＣ（サイズ排除ＨＰＬＣ）
結果を以下の表Ｘ－１２に示す。
（表Ｘ－１２）
Figure 2024506991000034
Figure 2024506991000035
Ｎ／Ａ＝分析せず
Figure 2024506991000036
（＊）理論体積に基づく計算であり、実際のサンプル体積ではない
実施例１３
酸性処理で再生された、シリカ含有Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）ＨＣ Ｐｒｏ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｄｅｐｔｈ Ｆｉｌｔｅｒ Ｘ０ＳＰによるクロバリマブ（抗Ｃ５抗体）溶液のろ過。
材料：
１）ＡＫＴＡ Ａｖａｎｔ １５０（Ｃｙｔｉｖａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）クロマトグラフィースキッドを用いて実験を行った。カラムに代えて、カラムバルブにフィルタを取り付けた。圧力、ｐＨ値、導電率、ＯＤ２８０を監視した。適用される体積は、サンプルポンプによって制御された。
２）２３ｃｍ２のフィルタ面積を有するＭｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）ＨＣ Ｐｒｏ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｄｅｐｔｈ Ｆｉｌｔｅｒ Ｘ０ＳＰ。
３）平衡化緩衝液１５０ｍＭ酢酸／Ｔｒｉｓ、精製水タイプＩＩ（Ａｄｖａｎｔｅｃ ＣＣＳ－０２０－Ｄ１ＤＳ）中でｐＨ５．５に調整。
４）酸性再生溶液：１６７ｍＭ酢酸、３００ｍＭリン酸、ｐＨ１．３４
フィルタの状態調整：
以下の工程を順次実施した：
１）１００Ｌ／ｍ２の水をフィルタに適用した／フィルタを通して流した。その後、フィルタを脱気した。洗浄流は、５．０バールの最大供給圧力で１０．０ｍＬ／分であった。
２）１００Ｌ／ｍ２の平衡化緩衝液をフィルタに適用する／フィルタを通して流した（系およびフィルタの平衡化）。平衡流は、５．０バールの最大供給圧力で１０．０ｍＬ／分であった。
実験の設定：
以下の工程を順次実施した：
１）クロバリマブを含有する中間の「Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｐｏｏｌ ｐＨ５．５」を、状態を調整された２３ｃｍ２のＸ０ＳＰフィルタユニットに適用した。質量スループットは６６０ｇ／ｍ２であった。対応する計算された体積スループットは４９．６Ｌ／ｍ２であった。供給流を２００ＬＭＨ（リットル／平方メートル／時間；Ｌ＊ｍ－２＊ｈ－１）に調整した。これにより、７．６７ｍＬ／分の計算された供給流が得られた。最大供給圧力は５．０バールであった。
２）１ｃｍの光路長のＵＶセルを使用して決定されたＯＤ２８０（２８０ｎｍ）が０．５ＡＵを超えるまで、フィルタ素通り画分を収集しなかった。閾値シグナルレベルを超えた後、秤量された無菌ボトル（Ｎａｌｇｅｎｅ）中に素通り画分を収集し、ろ過プールを得た。
３）意図した搭載体積が適用されたら、平衡化緩衝液でフィルタを洗い流した（残存タンパク質溶液の洗い流し）。
４）洗い流し素通り画分を７０Ｌ／ｍ２について回収した。７０Ｌ／ｍ２の洗い流し素通り画分に達したら、回収を停止した。これにより、（フィルタ素通り画分および洗い流し素通り画分を含む）最終ろ過プールが得られた。
５）その後、中間の「Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｐｏｏｌ ｐＨ５．５」と同じ流量（７．６７ｍＬ／分（２００ＬＭＨ）で酸性再生溶液をフィルタに適用した。したがって、接触時間は約３０分であった。
６）フィルタから再生溶液を除去するために、「フィルタの状態調整：１）」に記載されているのと同じ条件で水洗浄を行った。合計で、フィルタは約５０分間、２を下回るｐＨ値であった。
７）次のろ過サイクルのためにフィルタを平衡化するために、「フィルタの状態調整：２）」に記載されているのと同じ条件で平衡化緩衝液を適用した。
８）さらに５回の生成物ろ過サイクル（工程１）～４））およびさらに４回の再生サイクル（工程５）～７））のために、工程１）～７）を繰り返した。合計で３．９６ｋｇ／ｍ２（６×０．６６ｋｇ／ｍ２）の抗体をフィルタに適用した。
９）この手順は、６つの画分をもたらした。さらなる分析のために、画分を１２ｍＬの最終体積でプールした（例えば、４ｍＬの画分１、４ｍＬの画分２および４ｍＬの画分３が、画分「プール＃３」をもたらした。）。
１０）分析のために、別個の最終ろ過プールをー８０℃に保った。
分析および結果：
それぞれの最終ろ過プールを用いて以下の分析を行った：
－タンパク質濃度（参照として、１ｍｇ／ｍｌで１．４４の吸光度を使用）
－搭載質量、最終ろ過プール体積および最終ろ過プールタンパク質濃度から計算した総生成物収率
－ＬＥＡＰ（リパーゼ活性アッセイ；加水分解活性）
－ｃｏｂａｓ＿ＨＣＰによるＣＨＯＰ値（宿主細胞タンパク質）
－ｑＰＲＣ＿ＤＮＡによるＤＮＡ値（宿主細胞ＤＮＡ）
－ＳＥ－ＨＰＬＣ（サイズ排除ＨＰＬＣ）
結果を以下の表Ｘ－１３に示す。
（表Ｘ－１３）
Figure 2024506991000037
Figure 2024506991000038
Figure 2024506991000039
（＊）理論体積に基づく計算であり、実際のサンプル体積ではない
実施例１４
最初の使用前に１Ｍ ＮａＯＨとの４時間のプレインキュベーションあり、水および緩衝液再生あり（アルカリまたは酸性フィルタ再生なし）でのシリカ含有Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）ＨＣ Ｐｒｏ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｄｅｐｔｈ Ｆｉｌｔｅｒ Ｘ０ＳＰによるクロバリマブ（抗Ｃ５抗体）溶液のろ過
材料：
１）ＡＫＴＡ Ａｖａｎｔ １５０（Ｃｙｔｉｖａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）クロマトグラフィースキッドを用いて実験を行った。カラムに代えて、カラムバルブにフィルタを取り付けた。圧力、ｐＨ値、導電率、ＯＤ２８０を監視した。適用される体積は、サンプルポンプによって制御された。
２）２３ｃｍ２のフィルタ面積を有するＭｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）ＨＣ Ｐｒｏ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｄｅｐｔｈ Ｆｉｌｔｅｒ Ｘ０ＳＰ。
３）平衡化緩衝液１５０ｍＭ酢酸／Ｔｒｉｓ、精製水タイプＩＩ（Ａｄｖａｎｔｅｃ ＣＣＳ－０２０－Ｄ１ＤＳ）中でｐＨ５．５に調整。
４）再生溶液：水および平衡化緩衝液
フィルタ誘導体化：
以下の工程を順次実施した：
１）Ｘ０ＳＰフィルタに１Ｍ ＮａＯＨを流し、脱気し、１Ｍ ＮａＯＨとの最終インキュベーション時間が４時間に達するまで流れを停止した。流速は、５．０バールの最大供給圧力で１０．０ｍＬ／分であった。
２）１００Ｌ／ｍ２の水をフィルタに適用した／フィルタを通して流した。洗浄流は、５．０バールの最大供給圧力で１０．０ｍＬ／分であった。
３）１００Ｌ／ｍ２の平衡化緩衝液をフィルタに適用する／フィルタを通して流した（系およびフィルタの平衡化）。平衡流は、５．０バールの最大供給圧力で１０．０ｍＬ／分であった。
実験の設定：
以下の工程を順次実施した：
１）クロバリマブを含有する中間の「Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｐｏｏｌ ｐＨ５．５」を、誘導体化された２３ｃｍ２のＸ０ＳＰフィルタユニットに適用した。質量スループットは６６０ｇ／ｍ２であった。対応する計算された体積スループットは５０．６５Ｌ／ｍ２であった。供給流を２００ＬＭＨ（リットル／平方メートル／時間；Ｌ＊ｍ－２＊ｈ－１）に調整した。これにより、７．６７ｍＬ／分の計算された供給流が得られた。最大供給圧力は５．０バールであった。
２）１ｃｍの光路長のＵＶセルを使用して決定されたＯＤ２８０（２８０ｎｍ）が０．５ＡＵを超えるまで、フィルタ素通り画分を収集しなかった。閾値シグナルレベルを超えた後、秤量された無菌ボトル（Ｎａｌｇｅｎｅ）中に素通り画分を収集し、ろ過プールを得た。
３）意図した搭載体積が適用されたら、平衡化緩衝液でフィルタを洗い流した（残存タンパク質溶液の洗い流し）。
４）洗い流し素通り画分を７０Ｌ／ｍ２について回収した。７０Ｌ／ｍ２の洗い流し素通り画分に達したら、回収を停止した。これにより、（フィルタ素通り画分および洗い流し素通り画分を含む）最終ろ過プールが得られた。
５）次のろ過サイクルのためにフィルタを準備するために、「フィルタの誘導体化：２）および３）」に記載されているのと同じ条件で水および平衡化緩衝液を適用した。
６）さらに５回の生成物ろ過サイクルのために工程１）～４）を繰り返し、さらに４回の再生サイクルのために工程５）を繰り返した。合計で３．９６ｋｇ／ｍ２（６×０．６６ｋｇ／ｍ２）の抗体をフィルタに適用した。
７）この手順は、６つの画分をもたらした。さらなる分析のために、画分を１２ｍＬの最終体積でプールした（例えば、４ｍＬの画分１、４ｍＬの画分２および４ｍＬの画分３が、画分「プール＃３」をもたらした。）。
８）分析のために、別個の最終ろ過プールをー８０℃に保った。
分析および結果：
それぞれの最終ろ過プールを用いて以下の分析を行った：
－タンパク質濃度（参照として、１ｍｇ／ｍｌで１．４４の吸光度を使用）
－搭載質量、最終ろ過プール体積および最終ろ過プールタンパク質濃度から計算した総生成物収率
－ＬＥＡＰ（リパーゼ活性アッセイ；加水分解活性）
－ｃｏｂａｓ＿ＨＣＰによるＣＨＯＰ値（宿主細胞タンパク質）
－ｑＰＲＣ＿ＤＮＡによるＤＮＡ値（宿主細胞ＤＮＡ）
－ＳＥ－ＨＰＬＣ（サイズ排除ＨＰＬＣ）
結果を以下の表Ｘ－１４に示す。
（表Ｘ－１４）
Figure 2024506991000040
Figure 2024506991000041
Figure 2024506991000042
実施例１５
シリカ含有Ｐａｌｌ ＰＤＤ１ ＳＵＰＲＡｃａｐ ５０フィルタによるクロバリマブ（抗Ｃ５抗体）溶液のろ過（基準例）
材料：
１）ＡＫＴＡ Ａｖａｎｔ １５０（Ｃｙｔｉｖａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）クロマトグラフィースキッドを用いて実験を行った。カラムに代えて、カラムバルブにフィルタを取り付けた。圧力、ｐＨ値、導電率、ＯＤ２８０を監視した。適用される体積は、サンプルポンプによって制御された。
２）２２ｃｍ２のフィルタ面積を有するＰａｌｌ ＰＤＤ１ ＳＵＰＲＡｃａｐ ５０（ＳＣ０５０ＰＤＤ１）フィルタ。
３）平衡化緩衝液１５０ｍＭ酢酸／Ｔｒｉｓ、精製水タイプＩＩ（Ａｄｖａｎｔｅｃ ＣＣＳ－０２０－Ｄ１ＤＳ）中でｐＨ５．５に調整。
フィルタの状態調整：
最初の試料適用の前に、以下の工程を実施した：
１）１００Ｌ／ｍ２の水をフィルタに適用した／フィルタを通して流した。その後、フィルタを脱気した。洗浄流は、５．０バールの最大供給圧力で１０．０ｍＬ／分であった。
２）１００Ｌ／ｍ２の平衡化緩衝液をフィルタに適用する／フィルタを通して流した（系およびフィルタの平衡化）。平衡流は、５．０バールの最大供給圧力で１０．０ｍＬ／分であった。
実験の設定：
以下の工程を順次実施した：
１）クロバリマブを含有する中間の「Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｐｏｏｌ ｐＨ５．５」を、状態を調整された２２ｃｍ２のＰＤＤ１フィルタユニットに適用した。質量スループットは６９０ｇ／ｍ２であった。対応する計算された体積スループットは５１．９Ｌ／ｍ２であった。供給流を１９１ＬＭＨ（リットル／平方メートル／時間；Ｌ＊ｍ－２＊ｈ－１）に調整した。これにより、７．６７ｍＬ／分の計算された供給流が得られた。最大供給圧力は５．０バールであった。
２）１ｃｍの光路長のＵＶセルを使用して決定されたＯＤ２８０（２８０ｎｍ）が０．５ＡＵを超えるまで、フィルタ素通り画分を収集しなかった。閾値シグナルレベルを超えた後、秤量された無菌ボトル（Ｎａｌｇｅｎｅ）中に素通り画分を収集し、ろ過プールを得た。
３）意図した搭載体積が適用されたら、平衡化緩衝液でフィルタを洗い流した（残存タンパク質溶液の洗い流し）。
４）フィルタの素通り画分を７０Ｌ／ｍ２について回収した。７０Ｌ／ｍ２の素通り画分に達したら、回収を停止した。これにより、（フィルタ素通り画分および洗い流し素通り画分を含む）最終ろ過プールが得られた。
５）ろ過サイクルの間に溶液の適用を用いることなく、さらに５回の生成物ろ過サイクルについて、工程１）～４）を繰り返した。合計で４．１４ｋｇ／ｍ２（６×０．６９ｋｇ／ｍ２）の抗体をフィルタに適用した。
６）この手順は、６つの画分をもたらした。さらなる分析のために、画分を１２ｍＬの最終体積でプールした（例えば、４ｍＬの画分１、４ｍＬの画分２および４ｍＬの画分３が、画分「プール＃３」をもたらした。）。
７）分析のために、最終プールをー８０℃に保った。
分析および結果：
それぞれの最終ろ過プールを用いて以下の分析を行った：
－タンパク質濃度（参照として、１ｍｇ／ｍｌで１．４４の吸光度を使用）
－搭載質量、最終ろ過プール体積および最終ろ過プールタンパク質濃度から計算した総生成物収率
－ＬＥＡＰ（リパーゼ活性アッセイ；加水分解活性）
－ｃｏｂａｓ＿ＨＣＰによるＣＨＯＰ値（宿主細胞タンパク質）
－ｑＰＲＣ＿ＤＮＡによるＤＮＡ値（宿主細胞ＤＮＡ）
－ＳＥ－ＨＰＬＣ（サイズ排除ＨＰＬＣ）
結果を以下の表Ｘ－１５に示す。
（表Ｘ－１５）
Figure 2024506991000043
Figure 2024506991000044
Figure 2024506991000045
（＊）理論体積に基づく計算であり、実際のサンプル体積ではない
実施例１６
酸性処理で再生された、シリカ含有Ｐａｌｌ ＰＤＤ１ ＳＵＰＲＡｃａｐ ５０フィルタによるクロバリマブ（抗Ｃ５抗体）溶液のろ過
材料：
１）ＡＫＴＡ Ａｖａｎｔ １５０（Ｃｙｔｉｖａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）クロマトグラフィースキッドを用いて実験を行った。カラムに代えて、カラムバルブにフィルタを取り付けた。圧力、ｐＨ値、導電率、ＯＤ２８０を監視した。適用される体積は、サンプルポンプによって制御された。
２）２２ｃｍ２のフィルタ面積を有するＰａｌｌ ＰＤＤ１ ＳＵＰＲＡｃａｐ ５０（ＳＣ０５０ＰＤＤ１）フィルタ。
３）平衡化緩衝液１５０ｍＭ酢酸／Ｔｒｉｓ、精製水タイプＩＩ（Ａｄｖａｎｔｅｃ ＣＣＳ－０２０－Ｄ１ＤＳ）中でｐＨ５．５に調整。
４）酸性再生溶液：１６７ｍＭ酢酸、３００ｍＭリン酸、ｐＨ１．３４
フィルタの状態調整：
以下の工程を順次実施した：
１）１００Ｌ／ｍ２の水をフィルタに適用した／フィルタを通して流した。その後、フィルタを脱気した。洗浄流は、５．０バールの最大供給圧力で１０．０ｍＬ／分であった。
２）１００Ｌ／ｍ２の平衡化緩衝液をフィルタに適用する／フィルタを通して流した（系およびフィルタの平衡化）。平衡流は、５．０バールの最大供給圧力で１０．０ｍＬ／分であった。
実験の設定：
以下の工程を順次実施した：
１）クロバリマブを含有する中間の「Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｐｏｏｌ ｐＨ５．５」を、状態を調整された２２ｃｍ２のＰＤＤ１フィルタユニットに適用した。質量スループットは６９０ｇ／ｍ２であった。対応する計算された体積スループットは５２．３９Ｌ／ｍ２であった。供給流を１９１ＬＭＨ（リットル／平方メートル／時間；Ｌ＊ｍ－２＊ｈ－１）に調整した。これにより、７．６７ｍＬ／分の計算された供給流が得られた。最大供給圧力は５．０バールであった。
２）１ｃｍの光路長のＵＶセルを使用して決定されたＯＤ２８０（２８０ｎｍ）が０．５ＡＵを超えるまで、フィルタ素通り画分を収集しなかった。閾値シグナルレベルを超えた後、秤量された無菌ボトル（Ｎａｌｇｅｎｅ）中に素通り画分を収集し、ろ過プールを得た。
３）意図した搭載体積が適用されたら、平衡化緩衝液でフィルタを洗い流した（残存タンパク質溶液の洗い流し）。
４）洗い流し素通り画分を７０Ｌ／ｍ２について回収した。７０Ｌ／ｍ２の洗い流し素通り画分に達したら、回収を停止した。これにより、（フィルタ素通り画分および洗い流し素通り画分を含む）最終ろ過プールが得られた。
５）その後、中間の「Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｐｏｏｌ ｐＨ５．５」と同じ流量（７．６７ｍＬ／分（１９１ＬＭＨ）で酸性再生溶液をフィルタに適用した。したがって、接触時間は約３０分であった。
６）フィルタから再生溶液を除去するために、「フィルタの状態調整：１）」に記載されているのと同じ条件で水洗浄を行った。合計で、フィルタは約５０分間、２を下回るｐＨ値であった。
７）次のろ過サイクルのためにフィルタを平衡化するために、「フィルタの状態調整：２）」に記載されているのと同じ条件で平衡化緩衝液を適用した。
８）さらに５回の生成物ろ過サイクル（工程１）～４））およびさらに４回の再生サイクル（工程５）～７））のために、工程１）～７）を繰り返した。合計で４．１４ｋｇ／ｍ２（６×０．６９ｋｇ／ｍ２）の抗体をフィルタに適用した。
９）この手順は、６つの画分をもたらした。さらなる分析のために、画分を１２ｍＬの最終体積でプールした（例えば、４ｍＬの画分１、４ｍＬの画分２および４ｍＬの画分３が、画分「プール＃３」をもたらした。）。
１０）分析のために、別個の最終ろ過プールをー８０℃に保った。
分析および結果：
それぞれの最終ろ過プールを用いて以下の分析を行った：
－タンパク質濃度（参照として、１ｍｇ／ｍｌで１．４４の吸光度を使用）
－搭載質量、最終ろ過プール体積および最終ろ過プールタンパク質濃度から計算した総生成物収率
－ＬＥＡＰ（リパーゼ活性アッセイ；加水分解活性）
－ｃｏｂａｓ＿ＨＣＰによるＣＨＯＰ値（宿主細胞タンパク質）
－ｑＰＲＣ＿ＤＮＡによるＤＮＡ値（宿主細胞ＤＮＡ）
－ＳＥ－ＨＰＬＣ（サイズ排除ＨＰＬＣ）
結果を以下の表Ｘ－１６に示す。
（表Ｘ－１６）
Figure 2024506991000046
Figure 2024506991000047
Ｎ／Ａ＝分析せず
Figure 2024506991000048
実施例１７
プロセス時間を短縮するために中間の水洗い流しなしに、酸性処理で再生された、シリカ含有Ｐａｌｌ ＰＤＤ１ ＳＵＰＲＡｃａｐ ５０フィルタによるクロバリマブ（抗Ｃ５抗体）溶液のろ過
材料：
１）ＡＫＴＡ Ａｖａｎｔ １５０（Ｃｙｔｉｖａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）クロマトグラフィースキッドを用いて実験を行った。カラムに代えて、カラムバルブにフィルタを取り付けた。圧力、ｐＨ値、導電率、ＯＤ２８０を監視した。適用される体積は、サンプルポンプによって制御された。
２）２２ｃｍ２のフィルタ面積を有するＰａｌｌ ＰＤＤ１ ＳＵＰＲＡｃａｐ ５０（ＳＣ０５０ＰＤＤ１）フィルタ；ロット：１０４０７２５８６。
３）平衡化緩衝液１５０ｍＭ酢酸／Ｔｒｉｓ、精製水タイプＩＩ（Ａｄｖａｎｔｅｃ ＣＣＳ－０２０－Ｄ１ＤＳ）中でｐＨ５．５に調整。
４）酸性再生溶液：１６７ｍＭ酢酸、３００ｍＭリン酸、ｐＨ１．５
フィルタの状態調整：
以下の工程を実施した：
１）２００Ｌ／ｍ２の平衡化緩衝液をフィルタに適用する／フィルタを通して流した（系およびフィルタの平衡化）。平衡流は、５．０バールの最大供給圧力で１０．０ｍＬ／分であった。
実験の設定：
以下の工程を順次実施した：
１）クロバリマブを含有する中間の「Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｐｏｏｌ ｐＨ５．５」を、状態を調整された２２ｃｍ２のＰＤＤ１フィルタユニットに適用した。質量スループットは６２７ｇ／ｍ２であった。対応する計算された体積スループットは４８Ｌ／ｍ２であった。供給流を１９１ＬＭＨ（リットル／平方メートル／時間；Ｌ＊ｍ－２＊ｈ－１）に調整した。これにより、７．６７ｍＬ／分の計算された供給流が得られた。最大供給圧力は５．０バールであった。
２）１ｃｍの光路長のＵＶセルを使用して決定されたＯＤ２８０（２８０ｎｍ）が０．５ＡＵを超えるまで、フィルタ素通り画分を収集しなかった。閾値シグナルレベルを超えた後、秤量された無菌ボトル（Ｎａｌｇｅｎｅ）中に素通り画分を収集し、ろ過プールを得た。
３）意図した搭載体積が適用されたら、平衡化緩衝液でフィルタを洗い流した（残存タンパク質溶液の洗い流し）。
４）洗い流し素通り画分を７０Ｌ／ｍ２について回収した。７０Ｌ／ｍ２の洗い流し素通り画分に達したら、回収を停止した。これにより、（フィルタ素通り画分および洗い流し素通り画分を含む）最終ろ過プールが得られた。
５）その後、中間の「Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｐｏｏｌ ｐＨ５．５」と同じ流量（７．６７ｍＬ／分（１９１ＬＭＨ）で酸性再生溶液をフィルタに適用した。したがって、接触時間は約３０分であった。
６）次のろ過サイクルのためにフィルタを平衡化するために、「フィルタの状態調整：１）」に記載されているのと同じ条件で平衡化緩衝液を適用した。合計で、フィルタは約５０分間、２を下回るｐＨ値であった。
７）さらに５回の生成物ろ過サイクル（工程１）～４））およびさらに４回の再生サイクル（工程５）および６））のために、工程１）～６）を繰り返した。合計で３．７６２ｋｇ／ｍ２（６×０．６２７ｋｇ／ｍ２）の抗体をフィルタに適用した。
８）この手順は、６つの画分をもたらした。さらなる分析のために、画分を１２ｍＬの最終体積でプールした（例えば、４ｍＬの画分１、４ｍＬの画分２および４ｍＬの画分３が、画分「プール＃３」をもたらした。）。
９）分析のために、別個の最終ろ過プールをー８０℃に保った。
分析および結果：
それぞれの最終ろ過プールを用いて以下の分析を行った：
－タンパク質濃度（参照として、１ｍｇ／ｍｌで１．４４の吸光度を使用）
－搭載質量、最終ろ過プール体積および最終ろ過プールタンパク質濃度から計算した総生成物収率
－ＬＥＡＰ（リパーゼ活性アッセイ；加水分解活性）
－ｃｏｂａｓ＿ＨＣＰによるＣＨＯＰ値（宿主細胞タンパク質）
－ｑＰＲＣ＿ＤＮＡによるＤＮＡ値（宿主細胞ＤＮＡ）
－ＳＥ－ＨＰＬＣ（サイズ排除ＨＰＬＣ）
結果を以下の表Ｘ－１７に示す。
（表Ｘ－１７）
Figure 2024506991000049
Figure 2024506991000050
Figure 2024506991000051
実施例１８
中間の洗い流しなしでの、Ｚｅｔａ Ｐｌｕｓ（商標）Ｂｉｏｃａｐ ＶＲ０２によるクロバリマブ（抗Ｃ５抗体）溶液のろ過（基準例）
材料：
１）ＡＫＴＡ Ａｖａｎｔ １５０（Ｃｙｔｉｖａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）クロマトグラフィースキッドを用いて実験を行った。カラムに代えて、カラムバルブにフィルタを取り付けた。圧力、ｐＨ値、導電率、ＯＤ２８０を監視した。適用される体積は、サンプルポンプによって制御された。
２）２５ｃｍ２のフィルタ面積を有するＺｅｔａ Ｐｌｕｓ（商標）Ｂｉｏｃａｐ ＶＲ０２フィルタ；（ロット：３９２３４５１）。
３）平衡化緩衝液１５０ｍＭ酢酸／Ｔｒｉｓ、精製水タイプＩＩ（Ａｄｖａｎｔｅｃ ＣＣＳ－０２０－Ｄ１ＤＳ）中でｐＨ５．５に調整。
フィルタの状態調整：
最初の試料適用の前に、以下の工程を実施した：
１）１００Ｌ／ｍ２の水をフィルタに適用した／フィルタを通して流した。その後、フィルタを脱気した。洗浄流は、５．０バールの最大供給圧力で１０．０ｍＬ／分であった。
２）１００Ｌ／ｍ２の平衡化緩衝液をフィルタに適用する／フィルタを通して流した（系およびフィルタの平衡化）。平衡流は、５．０バールの最大供給圧力で１０．０ｍＬ／分であった。
実験の設定：
以下の工程を順次実施した：
１）クロバリマブを含有する中間の「Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｐｏｏｌ ｐＨ５．５」を、状態を調整された２５ｃｍ２のＶＲ０２フィルタユニットに適用した。質量スループットは６５９ｇ／ｍ２であった。対応する計算された体積スループットは５４．８Ｌ／ｍ２であった。供給流を１８４ＬＭＨ（リットル／平方メートル／時間；Ｌ＊ｍ－２＊ｈ－１）に調整した。これにより、７．６７ｍＬ／分の計算された供給流が得られた。最大供給圧力は５．０バールであった。
２）１ｃｍの光路長のＵＶセルを使用して決定されたＯＤ２８０（２８０ｎｍ）が０．５ＡＵを超えるまで、フィルタ素通り画分を収集しなかった。閾値シグナルレベルを超えた後、秤量された無菌ボトル（Ｎａｌｇｅｎｅ）中に素通り画分を収集し、ろ過プールを得た。
３）意図した搭載体積が適用されたら、平衡化緩衝液でフィルタを洗い流した（残存タンパク質溶液の洗い流し）。
４）フィルタの素通り画分を７０Ｌ／ｍ２について回収した。７０Ｌ／ｍ２の素通り画分に達したら、回収を停止した。これにより、（フィルタ素通り画分および洗い流し素通り画分を含む）最終ろ過プールが得られた。
５）ろ過サイクルの間に溶液の適用を用いることなく、さらに５回の生成物ろ過サイクルについて、工程１）～４）を繰り返した。合計で３．９５ｋｇ／ｍ２（６×０．６５９ｋｇ／ｍ２）の抗体をフィルタに適用した。
６）この手順は、６つの画分をもたらした。さらなる分析のために、画分を１２ｍＬの最終体積でプールした（例えば、４ｍＬの画分１、４ｍＬの画分２および４ｍＬの画分３が、画分「プール＃３」をもたらした。）。
７）分析のために、最終プールをー８０℃に保った。
分析および結果：
それぞれの最終ろ過プールを用いて以下の分析を行った：
－タンパク質濃度（参照として、１ｍｇ／ｍｌで１．４４の吸光度を使用）
－搭載質量、最終ろ過プール体積および最終ろ過プールタンパク質濃度から計算した総生成物収率
－ＬＥＡＰ（リパーゼ活性アッセイ；加水分解活性）
－ｃｏｂａｓ＿ＨＣＰによるＣＨＯＰ値（宿主細胞タンパク質）
－ｑＰＲＣ＿ＤＮＡ ＳＥ－ＨＰＬＣ（サイズ排除ＨＰＬＣ）によるＤＮＡ値（宿主細胞ＤＮＡ）
結果を以下の表Ｘ－１８に示す。
（表Ｘ－１８）
Figure 2024506991000052
Figure 2024506991000053
Figure 2024506991000054
実施例１９
（アルカリまたは酸性フィルタ再生なしで）水および緩衝液を適用した、Ｚｅｔａ Ｐｌｕｓ（商標）Ｂｉｏｃａｐ ＶＲ０２フィルタによるクロバリマブ（抗Ｃ５抗体）溶液のろ過－比較例
材料：
１）ＡＫＴＡ Ａｖａｎｔ １５０（Ｃｙｔｉｖａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）クロマトグラフィースキッドを用いて実験を行った。カラムに代えて、カラムバルブにフィルタを取り付けた。圧力、ｐＨ値、導電率、ＯＤ２８０を監視した。適用される体積は、サンプルポンプによって制御された。
２）２５ｃｍ２のフィルタ面積を有するＺｅｔａ Ｐｌｕｓ（商標）Ｂｉｏｃａｐ ＶＲ０２フィルタ；（ロット：３９２３４５１）。
３）平衡化緩衝液：１５０ｍＭ酢酸／Ｔｒｉｓ、精製水タイプＩＩ（Ａｄｖａｎｔｅｃ ＣＣＳ－０２０－Ｄ１ＤＳ）中でｐＨ５．５に調整。
４）中間溶液：水および平衡化緩衝液
フィルタの状態調整：
以下の工程を順次実施した：
１）１００Ｌ／ｍ２の水をフィルタに適用した／フィルタを通して流した。その後、フィルタを脱気した。洗浄流は、５．０バールの最大供給圧力で１０．０ｍＬ／分であった。
２）１００Ｌ／ｍ２の平衡化緩衝液をフィルタに適用する／フィルタを通して流した（系およびフィルタの平衡化）。平衡流は、５．０バールの最大供給圧力で１０．０ｍＬ／分であった。
実験の設定：
以下の工程を順次実施した：
１）クロバリマブを含有する中間の「Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｐｏｏｌ ｐＨ５．５」を、平衡化された２５ｃｍ２のＶＲ０２フィルタユニットに適用した。質量スループットは６５９ｇ／ｍ２であった。対応する計算された体積スループットは５４．８Ｌ／ｍ２であった。供給流を１８４ＬＭＨ（リットル／平方メートル／時間；Ｌ＊ｍ－２＊ｈ－１）に調整した。これにより、７．６７ｍＬ／分の計算された供給流が得られた。最大供給圧力は５．０バールであった。
２）１ｃｍの光路長のＵＶセルを使用して決定されたＯＤ２８０（２８０ｎｍ）が０．５ＡＵを超えるまで、フィルタ素通り画分を収集しなかった。閾値シグナルレベルを超えた後、秤量された無菌ボトル（Ｎａｌｇｅｎｅ）中に素通り画分を収集し、ろ過プールを得た。
３）意図した搭載体積が適用されたら、平衡化緩衝液でフィルタを洗い流した（残存タンパク質溶液の洗い流し）。
４）洗い流し素通り画分を７０Ｌ／ｍ２について回収した。７０Ｌ／ｍ２の洗い流し素通り画分に達したら、回収を停止した。これにより、（フィルタ素通り画分および洗い流し素通り画分を含む）最終ろ過プールが得られた。
５）次のろ過サイクルのためにフィルタを準備するために、「フィルタの状態調整：１）および２）」に記載されているのと同じ条件で水および平衡化緩衝液を適用した。
６）さらに５回の生成物ろ過サイクルのために工程１）～４）を繰り返し、さらに４回の再生サイクルのために工程５）を繰り返した。合計で３．９５ｋｇ／ｍ２（６×０．６５９ｋｇ／ｍ２）の抗体をフィルタに適用した。
７）この手順は、６つの画分をもたらした。さらなる分析のために、画分を１２ｍＬの最終体積でプールした（例えば、４ｍＬの画分１、４ｍＬの画分２および４ｍＬの画分３が、画分「プール＃３」をもたらした。）。
８）分析のために、別個の最終ろ過プールをー８０℃に保った。
分析および結果：
それぞれの最終ろ過プールを用いて以下の分析を行った：
－タンパク質濃度（参照として、１ｍｇ／ｍｌで１．４４の吸光度を使用）
－搭載質量、最終ろ過プール体積および最終ろ過プールタンパク質濃度から計算した総生成物収率
－ＬＥＡＰ（リパーゼ活性アッセイ；加水分解活性）
－ｃｏｂａｓ＿ＨＣＰによるＣＨＯＰ値（宿主細胞タンパク質）
－ｑＰＲＣ＿ＤＮＡによるＤＮＡ値（宿主細胞ＤＮＡ）
－ＳＥ－ＨＰＬＣ（サイズ排除ＨＰＬＣ）
結果を以下の表Ｘ－１９に示す。
（表Ｘ－１９）
Figure 2024506991000055
Figure 2024506991000056
Figure 2024506991000057
実施例２０
酸性処理で再生された、Ｚｅｔａ Ｐｌｕｓ（商標）Ｂｉｏｃａｐ ＶＲ０２フィルタによるクロバリマブ（抗Ｃ５抗体）溶液のろ過
材料：
１）ＡＫＴＡ Ａｖａｎｔ １５０（Ｃｙｔｉｖａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）クロマトグラフィースキッドを用いて実験を行った。カラムに代えて、カラムバルブにフィルタを取り付けた。圧力、ｐＨ値、導電率、ＯＤ２８０を監視した。適用される体積は、サンプルポンプによって制御された。
２）２５ｃｍ２のフィルタ面積を有するＺｅｔａ Ｐｌｕｓ（商標）Ｂｉｏｃａｐ ＶＲ０２フィルタ；ロット：３９２３４５１。
３）平衡化緩衝液：１５０ｍＭ酢酸／Ｔｒｉｓ、精製水タイプＩＩ（Ａｄｖａｎｔｅｃ ＣＣＳ－０２０－Ｄ１ＤＳ）中でｐＨ５．５に調整。
４）酸性再生溶液：１６７ｍＭ酢酸、３００ｍＭリン酸、ｐＨ１．３４
フィルタの状態調整：
以下の工程を順次実施した：
１）１００Ｌ／ｍ２の水をフィルタに適用した／フィルタを通して流した。その後、フィルタを脱気した。洗浄流は、５．０バールの最大供給圧力で１０．０ｍＬ／分であった。
２）１００Ｌ／ｍ２の平衡化緩衝液をフィルタに適用する／フィルタを通して流した（系およびフィルタの平衡化）。平衡流は、５．０バールの最大供給圧力で１０．０ｍＬ／分であった。
実験の設定：
以下の工程を順次実施した：
１）クロバリマブを含有する中間の「Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｐｏｏｌ ｐＨ５．５」を、状態を調整された２５ｃｍ２のＶＲ０２フィルタユニットに適用した。質量スループットは６５９ｇ／ｍ２であった。対応する計算された体積スループットは５４．８Ｌ／ｍ２であった。供給流を１８４ＬＭＨ（リットル／平方メートル／時間；Ｌ＊ｍ－２＊ｈ－１）に調整した。これにより、７．６７ｍＬ／分の計算された供給流が得られた。最大供給圧力は５．０バールであった。
２）１ｃｍの光路長のＵＶセルを使用して決定されたＯＤ２８０（２８０ｎｍ）が０．５ＡＵを超えるまで、フィルタ素通り画分を収集しなかった。閾値シグナルレベルを超えた後、秤量された無菌ボトル（Ｎａｌｇｅｎｅ）中に素通り画分を収集し、ろ過プールを得た。
３）意図した搭載体積が適用されたら、平衡化緩衝液でフィルタを洗い流した（残存タンパク質溶液の洗い流し）。
４）洗い流し素通り画分を７０Ｌ／ｍ２について回収した。７０Ｌ／ｍ２の洗い流し素通り画分に達したら、回収を停止した。これにより、（フィルタ素通り画分および洗い流し素通り画分を含む）最終ろ過プールが得られた。
５）その後、中間の「Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｐｏｏｌ ｐＨ５．５」と同じ流量（７．６７ｍＬ／分（１８４ＬＭＨ）で酸性再生溶液をフィルタに適用した。したがって、接触時間は約３０分であった。
６）フィルタから再生溶液を除去するために、「フィルタの状態調整：１）」に記載されているのと同じ条件で平衡化緩衝液を適用した。合計で、フィルタは約５０分間、２を下回るｐＨ値であった。
７）次のろ過サイクルのためにフィルタを平衡化するために、「フィルタの状態調整：２）」に記載されているのと同じ条件で平衡化緩衝液を適用した。
８）さらに５回の生成物ろ過サイクル（工程１）～４））およびさらに４回の再生サイクル（工程５）～７））のために、工程１）～７）を繰り返した。合計で３．９５ｋｇ／ｍ２（６×０．６５９ｋｇ／ｍ２）の抗体をフィルタに適用した。
９）この手順は、６つの画分をもたらした。さらなる分析のために、画分を１２ｍＬの最終体積でプールした（例えば、４ｍＬの画分１、４ｍＬの画分２および４ｍＬの画分３が、「プール＃３」である。）。
１０）分析のために、別個の最終ろ過プールをー８０℃に保った。
分析および結果：
それぞれの最終ろ過プールを用いて以下の分析を行った：
－タンパク質濃度（参照として、１ｍｇ／ｍｌで１．４４の吸光度を使用）
－搭載質量、最終ろ過プール体積および最終ろ過プールタンパク質濃度から計算した総生成物収率
－ＬＥＡＰ（リパーゼ活性アッセイ；加水分解活性）
－ｃｏｂａｓ＿ＨＣＰによるＣＨＯＰ値（宿主細胞タンパク質）
－ｑＰＲＣ＿ＤＮＡによるＤＮＡ値（宿主細胞ＤＮＡ）
－ＳＥ－ＨＰＬＣ（サイズ排除ＨＰＬＣ）
結果を以下の表Ｘ－２０に示す。
（表Ｘ－２０）
Figure 2024506991000058
Figure 2024506991000059
Figure 2024506991000060
実施例２１
加水分解活性の決定－リパーゼ活性アッセイ（ＬＥＡＰ）：
非蛍光基質などの基質の、蛍光生成物などの、加水分解酵素の検出可能な生成物への変換をモニタリングすることによって、リパーゼ活性を決定した。
より詳細には、ＬＥＡＰアッセイを用いて、試料中のヒドロラーゼ活性を決定した。これは、試料中に存在するヒドロラーゼによるエステル結合の切断による、蛍光発生基質’４－メチルウンベリフェリルカプリラート’（Ｃｈｅｍ Ｉｍｐｅｘ Ｉｎｔ’ｌ Ｉｎｃ Ａｒｔ．Ｎｒ．０１５５２から入手可能な４－ＭＵ－Ｃ８）の、蛍光部分、すなわち４－メチルウンベリフェリル（４－ＭＵ）への変換をモニタリングすることによって行った。切断された４－ＭＵ－Ｃ８、すなわち４－ＭＵは、波長３５５ｎｍの光で励起された。４６０ｎｍの異なる波長で放出された放射を、Ｔｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ（登録商標）２００ＰＲＯ装置で読み取りとして記録した。３７℃で２時間決定を行い、基質加水分解の速度を計算するために１０分ごとに記録した。
Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５ｍｌ遠心フィルタユニット（１０，０００Ｄａカットオフ、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ａｒｔ．Ｎｒ．ＵＦＣ５０１０９６）を使用することによって、最初に、分析すべき試料を１５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ、ｐＨ８．０に緩衝液交換した。アッセイ反応混合物は、８０μＬの反応緩衝液（１５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ ｐＨ８．０、０．２５％（ｗ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、０．１２５％（ｗ／ｖ）アラビアガム）、１０μＬの４－ＭＵ－Ｃ８基質溶液（ＤＭＳＯ中１ｍＭ）および１０μＬのタンパク質含有試料から構成された。タンパク質試料の濃度を１～３０ｇ／Ｌの範囲になるように調整し、各決定について２～３の希釈系列を実施した。各反応は、９６ウェル半エリアポリスチレンプレート（蓋および透明平底付き黒色、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ Ａｒｔ．Ｎｒ．３８８２）中に少なくとも二連で設定された。

Claims (15)

  1. 治療用ポリペプチドを精製するための方法であって、以下の工程：
    （ａ）デプスフィルタを通して、前記治療用ポリペプチドと不純物とを含有する水性組成物をろ過し、素通り画分を回収し、それによって、前記精製された治療用ポリペプチドを得る工程と、
    （ｂ）前記デプスフィルタを酸性溶液と接触させ、それによって、前記デプスフィルタを再生する工程と、
    （ｃ）工程（ａ）および工程（ｂ）を１回以上繰り返す工程と
    を含むことを特徴とする、前記方法。
  2. 治療用ポリペプチドを製造するための方法であって、以下の工程：
    （ａ）デプスフィルタを通して、前記治療用ポリペプチドと不純物とを含有する水性組成物をろ過し、素通り画分を回収し、それによって、前記治療用ポリペプチドを得る工程と、
    （ｂ）（工程（ａ）の後の）前記デプスフィルタを酸性溶液と接触させ、それによって、前記デプスフィルタを再生する工程と、
    （ｃ）工程（ａ）および工程（ｂ）を１回以上繰り返す工程と
    を含むことを特徴とする、前記方法。
  3. 工程（ｂ）の前記酸性溶液が、１から３までのｐＨ値を有する、請求項１または２に記載の方法。
  4. 工程（ｂ）の前記酸性溶液が、リン酸を含む溶液である、請求項１または３に記載の方法。
  5. 工程（ｂ）の前記酸性溶液が、リン酸および酢酸を含む溶液である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 工程（ｂ）の前記酸性溶液が、約０．１Ｍ～約０．８Ｍ、または約０．２Ｍ～約０．７Ｍ、または約０．４Ｍ～０．６Ｍの濃度のリン酸を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 工程（ｂ）の前記酸性溶液が、約１０ｍＭ～２Ｍ、または約２０ｍＭ～１．５Ｍ、または約５０ｍＭ～１Ｍ、または約８０ｍＭ～８００ｍＭの濃度の酢酸を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 工程（ｂ）の前記酸性溶液が、約３００ｍＭの濃度のリン酸および約１６７ｍＭの濃度の酢酸を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記デプスフィルタがシリカを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 酵素の加水分解活性速度を低下させる、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記デプスフィルタが、
    （ｉ）ポリアクリル系繊維およびシリカ、
    （ｉｉ）セルロース繊維、珪藻土およびパーライト、ならびに
    （ｉｉｉ）セルロース繊維および帯電した表面基
    の群から選択される材料を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記デプスフィルタが、Ｘ０ＳＰデプスフィルタまたはＰＤＤ１デプスフィルタまたはＶＲ０２デプスフィルタからなる群から選択される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記デプスフィルタを、約２０分間以上、３０分間以上、４０分間以上、５０分間以上または６０分間以上、工程（ｂ）の再生溶液と接触させる、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 治療用ポリペプチドの精製において少なくとも２回使用されているデプスフィルタの再生のための、酸性溶液の使用。
  15. 治療用ポリペプチドの精製において少なくとも２回使用されているデプスフィルタの再生のための、アルカリ性溶液の使用。
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