JP2024502386A - 抗ＦＧＦＲ３抗体およびその用途 ｛Ａｎｔｉ－ＦＧＦＲ３ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｔｈｅｒｅｏｆ｝ - Google Patents

抗ＦＧＦＲ３抗体およびその用途 ｛Ａｎｔｉ－ＦＧＦＲ３ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｔｈｅｒｅｏｆ｝ Download PDF

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Abstract

本発明は、抗FGFR3(Fibroblast growth factor receptor 3)抗体またはその抗原結合断片、これをコードする核酸、前記核酸を含む組換え発現ベクター、前記組換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞、前記抗体またはその抗原結合断片の製造方法に関する、前記抗体またはその抗原結合断片を含む二重または多重特異性抗体、前記抗体のscFvおよび免疫細胞活性化抗原に結合する抗体のscFvを1つ以上含む第2結合ドメインで構成されたscFvを含む、免疫細胞エンゲージ(immune cell engage)二重特異性または多重特異性抗体、前記抗体またはその抗原結合断片が薬物に結合された抗体薬物複合体(ADC)、前記抗FGFR3抗体のscFvを細胞外ドメインの抗原結合部位として含むキメラ抗原受容体(CAR)、前記キメラ抗原受容体が導入されている免疫細胞、前記免疫細胞を含む併用治療用組成物、前記抗体またはその抗原結合断片を含む併用治療用組成物、がん治療用組成物、がん治療方法および前記抗体またはその抗原結合断片を含む小胞体(vesicle)に関する。

Description

本発明は、抗FGFR3(Fibroblast growth factor receptor 3)抗体またはその抗原結合断片、それをコードする核酸、前記核酸を含む組換え発現ベクター、前記組換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞、前記抗体またはその抗原結合断片の製造方法、前記抗体またはその抗原結合断片を含む二重または多重特異性抗体、前記抗体のscFvおよび免疫細胞活性化抗原に結合する抗体のscFvを1つ以上含む第2結合ドメインで構成されたscFvを含む、免疫細胞エンゲージ(immune cell engage)二重特異性または多重特異性抗体、前記抗体またはその抗原結合断片が薬物に結合された抗体薬物複合体(ADC)、前記抗FGFR3抗体のscFvを細胞外ドメインの抗原結合部位として含むキメラ抗原受容体(CAR)、前記キメラ抗原受容体が導入されている免疫細胞、前記免疫細胞を含む併用治療用組成物、前記抗体またはその抗原結合断片を含む併用治療用組成物、がん、炎症または免疫疾患治療用組成物、がん、炎症または免疫疾患の治療方法および前記抗体またはその抗原結合断片を含む小胞体(vesicle)に関する。
FGF(fibroblast growth factor)とその受容体型チロシンキナーゼ(FGFR)は、胚発生、様々な組織の恒常性維持、創傷治癒過程および代謝機能に重要な役割を果たす。ヒトでは高度な相同性を持つFGFR(FGFR1-4)と22個のFGF(FGF1-14とFGF16-23)が存在する。FGFRは3つの免疫ドメインであるD1、D2およびD3を含む細胞外領域、単一膜貫通領域および分割された細胞質キナーゼモイアティを含む。
FGFR1-4によるシグナル伝達の調節不全は、様々な種類のがんを引き起こす病因に関連している。遺伝子増幅、染色体転座および活性化変異を含むゲノムFGFRの変異により、FGF経路の異常な活性化誘導および正常細胞の腫瘍形質転換が促進される。特に、FGFR3の増幅は膀胱がんの誘発に関連することが知られている。特に、FGFRのミスセンス変異は複数の種類のがんで観察され、FGFR3のS249CによってFGF駆動シグナルと腫瘍細胞成長が強化される可能性があり、体細胞変異のホットスポットを示す。
このようなFGF/FGFR経路を標的にして重点的にがん治療薬の開発が行われてきた。一方、最近では、がん誘発変異として染色体の再配列によって引き起こされる融合タンパク質が、膠芽腫、肺がん、膀胱がん、口腔がん、頭頸部扁平上皮がん、胆嚢がんまたは子宮頸がんなどで発見されている。これらの融合タンパク質は、染色体4のタンデム重複により、FGFR3遺伝子とTACC3(transforming acidic coiled-coil containing protein 3)遺伝子の融合を通じて生成される。融合タンパク質のうちFGFRモノマーが十分に近く、活性化できるようにするパートナータンパク質のダイマー化ドメイン(dimerizing domain)によってFGFRは継続的に活性化することができる。FGFR3-TACC3では、TACC3のコイルドコイルドメイン(coiled-coil domain)により、リガンド結合がなくてもFGFR3が自己リン酸化および活性化されるようにする。
TACC3は、TACCファミリーに属し、TACC3とFGFR3を含有する領域に該当する染色体4p16で再配列される現象は多発性骨髄腫でしばしば確認され、この再配列はFGFR3またはTACC3の発現の増加につながる(KN Nelson et al.、Oncotarget. 2018 Sep 28; 9(76): 34306-34319)。
前記のように確認された内容に基づき、最近ではFGFR3またはFGFR3遺伝子との融合遺伝子を標的とする抗体に対する臨床試験が進行中である。
B701(Vofatamab)は、FGFR3に対するヒト免疫グロブリンG1モノクローナル抗体で、抗腫瘍活性を示すかどうか、およびドセタキセルとの併用の可能性を確認するための臨床試験が行われている。抗FGFR3モノクローナル抗体B-701を投与すると、FGFR3の野生型と変異型の両方に特異的に結合して抑制し、FGFR3のリン酸化を阻害することにより、FGFR3の活性化およびFGFR3を介したシグナル伝達経路を抑制する。これにより細胞成長が阻害され、FGFR3発現腫瘍で細胞死が誘導される。
LY3076226は、抗FGFR3抗体をDM4(microtubule inhibitor)に結合させた抗体薬物複合体(ADC)であり、進行がんや転移がんに使用できるかどうかの臨床試験が行われている。LY3076226がFGFR3の過剰発現または変異を有する多発性骨髄腫およびリンパ腫を含む進行がんまたは転移がん、局所進行性、切除不能または転移性尿路がんに効果を示すかどうかを確認する臨床第1相試験が進行中である(T Ibrahim et al.、Bladder Cancer、vol. 5、no. 2、pp. 87-102、2019)。
このような従来の抗FGFR3抗体では低い親和性、ターゲット分解能および効能を示すため、本発明者らは、従来の抗FGFR3抗体に比べて親和性、ターゲット分解能および効能などが改善された新規抗FGFR3抗体を開発しようと鋭意努力した結果、抗体の特性、例えば、親和性確認、FGFR3結合パターン分析、FGFR3分解能確認、がん細胞の増殖抑制結果および効能試験結果などを確認し、特に公知の抗FGFR3抗体よりFGFR3-TACC3過剰発現脳腫瘍患者由来細胞に対してより敏感な反応性を持つ抗体を選別する戦略を通じて差別化された特性を持つ抗体を選別し、選別された抗体が目的とするがん治療に使用できることを確認することにより、本発明を完成した。
本発明の目的は、FGFR3(Fibroblast growth factor receptor 3)に対する新規抗体またはその抗原結合断片を提供することである。
本発明の目的は、特に、公知の抗FGFR3抗体よりFGFR3-TACC3過剰発現脳腫瘍患者由来細胞に対してより敏感な反応性を有する抗体を選別することである。
本発明の他の目的は、前記抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸を提供することにある。
本発明の他の目的は、前記核酸を含む組換え発現ベクターまたは前記組換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞を提供することである。
本発明の他の目的は、FGFR3に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片の製造方法を提供することである。
本発明の他の目的は、前記抗体またはその抗原結合断片を含む二重または多重特異性抗体を提供することである。
本発明の他の目的は、前記抗体またはその抗原結合断片を含む免疫細胞エンゲージ(immune cell engage)二重特異性または多重特異性抗体を提供することである。
本発明の他の目的は、前記抗体またはその抗原結合断片が薬物に結合した抗体薬物複合体(ADC)を提供することである。
本発明の他の目的は、前記抗FGFR3抗体のscFvを細胞外ドメインの抗原結合部位として含むキメラ抗原受容体(CAR)、前記キメラ抗原受容体が導入されている免疫細胞、および前記免疫細胞を含む併用治療用組成物を提供することである。
本発明の他の目的は、前記抗体またはその抗原結合断片または前記免疫細胞エンゲージ(immune cell engage)二重特異性または多重特異性抗体を含む併用治療用組成物を提供することである。
本発明の他の目的は、抗体またはその抗原結合断片、前記抗体またはその抗原結合断片を含む二重または多重特異性抗体、前記抗体またはその抗原結合断片を含む抗体薬物複合体、前記抗体またはその抗原結合断片を含むキメラ抗原受容体、前記キメラ抗原受容体を含むがん治療用組成物またはがん治療方法を提供することである。
本発明の他の目的は、前記抗体またはその抗原結合断片を含む小胞体を提供することである。
前記目的を達成するために、本発明は、以下を含むFGFR3(Fibroblast growth factor receptor 3)に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を提供する。
配列番号1ないし配列番号18で構成される群から選択される1つ以上のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
配列番号19ないし配列番号41で構成される群から選択される1つ以上のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、
配列番号42ないし配列番号66、配列番号186ないし配列番号198で構成される群から選択される1つ以上のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、
配列番号67ないし配列番号88で構成される群から選択される1つ以上のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
配列番号89ないし配列番号109で構成される群から選択される1つ以上のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および
配列番号110ないし配列番号132、配列番号199ないし配列番号202で構成される群から選択される1つ以上のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3。
本発明は、前記抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸を提供する。
本発明はまた、前記核酸を含む組換え発現ベクターを提供する。
本発明はまた、前記組換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。
本発明はまた、宿主細胞を培養して抗体を生成する工程、および生成された抗体を分離および精製する工程を含む、FGFR3に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片の製造方法を提供する。
本発明はまた、前記抗体またはその抗原結合断片を含む二重または多重特異性抗体を提供する。
本発明はまた、前記抗体のscFvおよび免疫細胞の活性化抗原に結合する抗体のscFvを1つ以上含む第2結合ドメインで構成されるscFvを含む、免疫細胞エンゲージ(immune cell engage)二重特異性または多重特異性抗体を提供する。
本発明はまた、前記抗体またはその抗原結合断片が薬物に結合した抗体薬物複合体(ADC)を提供する。
本発明はまた、抗原結合部位を含む細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体(CAR)であり、前記細胞外ドメインの抗原結合部位は、前記抗体のscFvであることを特徴とするキメラ抗原受容体を提供する。
本発明はまた、前記キメラ抗原受容体(CAR)を含む免疫細胞を提供する。
本発明はまた、前記免疫細胞および抗FGFR3抗体以外の薬物を含む併用治療用組成物を提供する。
本発明はまた、前記抗体またはその抗原結合断片と、以下で構成される群から選択される1つ以上を含む併用治療用組成物を提供する。
(i) 免疫細胞、
(ii) 抗FGFR3抗体以外の抗体に対するscFv断片を細胞外ドメインとして含む抗原受容体(CAR)を含む免疫細胞、および
(iii) 免疫チェックポイント阻害剤(Immune checkpoint inhibitor)。
本発明はまた、前記二重特異性または多重特異性抗体と、以下で構成される群から選択される1つ以上を含む併用治療用組成物を提供する。
(i) 免疫細胞、
(ii) 抗FGFR3抗体以外の抗体に対するscFv断片を細胞外ドメインとして含む抗原受容体(CAR)を含む免疫細胞、および
(iii) 免疫チェックポイント阻害剤(Immune checkpoint inhibitor)。
本発明はまた、前記抗体またはその抗原結合断片、前記抗体またはその抗原結合断片を含む二重または多重特異性抗体、前記抗体またはその抗原結合断片を含む抗体薬物複合体、前記抗体またはその抗原結合断片を含むキメラ抗原受容体、または前記キメラ抗原受容体が導入されている免疫細胞を含む、がん治療用組成物を提供する。
本発明はまた、FGFR3とTACC3の融合遺伝子が増幅されているか、融合遺伝子に変異があるか、融合遺伝子が過剰発現しているか、または融合遺伝子が恒常的発現(constitutive activation)していることが確認されたがんを治療するための、前記抗体またはその抗原結合断片、前記抗体またはその抗原結合断片を含む二重または多重特異性抗体、前記抗体またはその抗原結合断片を含む抗体薬物複合体、前記抗体またはその抗原結合断片を含むキメラ抗原受容体、または前記キメラ抗原受容体が導入されている免疫細胞を含む、がん治療用組成物を提供する。
本発明はまた、患者由来のサンプルにおいてFGFR3とTACC3の融合遺伝子が増幅されているか、融合遺伝子に変異があるか、融合遺伝子が過剰発現しているか、または融合遺伝子が恒常的発現(constitive activation)しているかを確認する工程、FGFR3とTACC3の融合遺伝子が増幅されているか、融合遺伝子に変異があるか、融合遺伝子が過剰発現しているか、または融合遺伝子が恒常的発現(constitutive activation)しているが確認された場合、前記抗体またはその抗原結合断片、前記抗体またはその抗原結合断片を含む二重または多重特異性抗体、前記抗体またはその抗原結合断片を含む抗体薬物複合体、前記抗体またはその抗原結合断片を含むキメラ抗原受容体、または前記キメラ抗原受容体が導入されている免疫細胞を投与する工程を含む、がん治療方法を提供する。
本発明はまた、前記抗体またはその抗原結合断片がその外部に発現されるか、またはその内部に存在する小胞体(vesicle)を提供する。
図１は、本発明に使用したファージディスプレイ(phage display)ベースのバイオパニングの模式図を示す。
図１aは、FGFR3過剰発現の患者由来細胞を用いた細胞パンニング模式図を示す。
図１bは、FGFR3組換えタンパク質を用いた固定相バイオパニングの模式図を示す。
図１cは、FGFR3組換えタンパク質を用いた溶液相バイオパニングの模式図を示す。
図１dは、FGFR3組換えタンパク質を用いた磁気ベース準自動化パニングの模式図を示す。
図２aは、本発明による抗体スクリーニングのためのバイオパニング結果を示す。
図２bは、本発明による抗体スクリーニングのためのELISA screening結果を示す。
図２cは、本発明による抗体スクリーニングのためのMagnetic beads based panning結果を示す。
図３aは、scFvからIgGフォーマットへの転換の模式図を示す。
図３bは、Expi293ベースの抗体生産と純度・物性分析の結果を示す。
図４aないし図４dは、FGFR3抗体(IgG)のAffinity ELISAの結果を示す。図４aは、組換えタンパク質human FGFR3-IIIcに対する抗体の特異的結合能、図４bは、組換えタンパク質human FGFR3-IIIbに対する抗体の特異的結合能、図４cは、組換えタンパク質mouse FGFR3に対する抗体の特異的結合能、図４dは、組換えタンパク質cynomolgus monkey FGFR3に対する抗体の特異的結合能を示す。
図５は、FGFR3抗体(IgG)のBiacore 3000を通じたKD value評価の結果を示す。
図６は、脳腫瘍患者由来細胞のFGFR3発現確認およびFGFR3-TACC3 fusion分析結果を示す。図6aは、患者由来細胞のmRNA expression level(RPKM)分析、タンパク質発現量分析(western blotting)、細胞表面発現分析(FACS analysis)の結果、図6bは、RT-PCRを通じたFGFR3-TACC3 fusion有無の確認、fusion specific primerを示す。
図７aは、FGFR3(-TACC3)過剰発現脳腫瘍患者由来細胞に対するFGFR3抗体クローンの細胞表面結合分析結果を示す。図7bは、F309抗体のFGFR3(-TACC3)過剰発現脳腫瘍患者由来細胞に対する濃度別結合パターン分析結果を示す。図7cは、F309、FS306抗体のFGFR3発現のない細胞株に対する結合力分析の結果を示す。
図８は、FACSベースのFGFR3抗体の患者由来細胞表面FGFR3(-TACC3)分解能分析およびスクリーニングの結果を示す。
図９aは、F309、FS306抗体のFGFR3特異的結合能分析、リガンド非競合的特性の確認結果を示す。図９bは、F309、FS306抗体の固有のエピトープドメインの同定、Domain Iの結果を示す。図９cは、ドメインのエピトープマッピングのための組換えドメインデザインの結果を示す。
図１０は、F309、FS306抗体のFGFR3-TACC3過剰発現脳腫瘍患者由来細胞およびFGFR3過剰発現細胞株に対するターゲット分解能分析の結果を示す。図１０aは、F309、FS306抗体の細胞表面FGFR3-TACC3およびFGFR3分解能分析、FACS analysisの結果を示す。図１０bは、F309、FS306抗体のtotal FGFR3-TACC3およびFGFR3分解能分析、Western blottingの結果を示す。
図１１は、F309、FS306抗体の細胞内在化分析の結果を示す。図１１aは、FGFR3-TACC3過剰発現脳腫瘍患者由来細胞における細胞内在化分析、ICC analysis結果を示す。図１１bは、Lysosome inhibitor処理を通じたF309、FS306抗体のlysosomal degradationメカニズムの確認の結果を示す。
図１２は、F309、FS306抗体のFGFR3サブシグナル伝達抑制分析の結果を示す。
図１３aは、リガンド依存的な細胞成長力阻害分析(FGF1、FGF9)の結果を示す。図13bは、リガンド非依存的細胞成長力阻害分析(FGFR3-TACC3過剰発現脳腫瘍患者由来細胞、FGFR3低発現細胞株または脳腫瘍患者由来細胞)の結果を示す。
図１４aは、F309、FS306のshort-term PK解析の結果を示す。図１４bは、FGFR3-TACC3過剰発現脳腫瘍患者由来細胞移植マウス(PDX)での抗体効能評価の結果を示す図である。図１４cは、F309抗体のPDXモデルでの効能評価(FGFR3-TACC3過剰発現脳腫瘍患者由来細胞)の結果を示す。
図１５aは、F309抗体の3D、2D構造および戦略的親和性改良の模式図を示す。図１５bは、F309親和性改良抗体のaffinity ELISAによる親和性比較の結果を示す。図１５cは、F309親和性改良抗体のSPR分析結果を示す。図１５cは、F309改良抗体クローンのリガンド非依存的細胞成長力阻害分析(FGFR3-TACC3過剰発現脳腫瘍患者由来細胞)の結果を示す。
図１６aは、F309抗体の抗体薬物複合体(ADC)の適用可能性確認のための製造模式図である。図１６bは、F309-vc MMAEのFGFR3-TACC3過剰発現脳腫瘍患者由来細胞およびFGFR3過剰発現細胞株に対する細胞毒性の分析結果を示す。図１６cは、F309-vc MMAEのFGFR3発現量による細胞毒性分析1、図１６dは、F309-vc MMAEのFGFR3発現量による細胞毒性分析2の結果を示す。
図１７は、親和性成熟された抗体のFv構造とエピトープドメインマッピングおよび抗原特異的結合の分析結果を示す。
図１８は、FGFR3-TACC3脳腫瘍患者由来細胞の細胞および細胞株の細胞表面抗原発現度の分析結果を示す。
図１９は、親和性成熟された抗体の細胞内在化効率分析結果を示したものである。
図２０は、親和性成熟された抗体のFGFR3(-TACC3)ターゲット分解能の分析結果を示す。
図２１は、親和性成熟された抗体のマウスPK分析の結果を示す。
図２２は、親和性成熟された抗体のサルPK分析の結果を示す。
図２３は、親和性成熟された抗体を含むADC製造の模式図(Topoisomerase I inhibitor結合)を示す。
図２４は、親和性成熟された抗体を含むADC製造模式図(Topoisomerase I inhibitor結合)を示す。
図２５は、親和性成熟された抗体を含むADCの物性および結合能の分析結果を示す。
図２６は、親和性成熟された抗体を含むADCの物性の分析結果を示す。
図２７は、親和性成熟された抗体を含むADCのin vitro効能評価の結果を示す。
図２８は、親和性成熟された抗体を含むADCのin vitro効能評価の結果を示す。
図２９は、親和性成熟された抗体を含むADCのin vivo効能評価の結果を示す。
図３０は、親和性成熟された抗体を含むADCのin vivo効能評価の結果を示す。
図３１は、親和性成熟された抗体を含むADCのin vivo効能評価の結果を示す。
図３２は、親和性成熟された抗体を含むADCのFGFR3(TACC3融合)脳腫瘍定位 的動物モデルにおけるADC効能評価の結果を示す。
発明の詳細な説明および好ましい実施態様
他に定義されていない限り、本明細書において使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野で熟練した専門家によって通常理解されるのと同じ意味を有する。一般に、本明細書において使用される命名法は、本技術分野でよく知られており、通常使用されるものである。
抗FGFR3抗体
本発明は、一観点から、配列番号1ないし配列番号18で構成される群から選択される1つ以上のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号19ないし配列番号41で構成される群から選択される1つ以上のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、配列番号42ないし配列番号66、配列番号186ないし198で構成される群から選択される1つ以上のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、配列番号67ないし配列番号88で構成される群から選択される1つ以上のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号89ないし配列番号109で構成される群から選択される1つ以上のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2および配列番号110ないし配列番号132、配列番号199ないし配列番号202で構成される群から選択される1つ以上のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含むFGFR3(Fibroblast growth factor receptor 3)に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片に関する。
本明細書で使用される用語、「抗体(antibody)」は、FGFR3に特異的に結合する抗FGFR3抗体を意味する。本発明の範囲には、FGFR3に特異的に結合する完全な抗体形態だけでなく、前記抗体分子の抗原結合断片も含まれる。場合によって、本発明による抗体は、FGFR3-TACC3を標的とすることができる。特に、本発明による抗体は、公知の抗FGFR3抗体よりもFGFR3-TACC3過剰発現がん細胞に対してより優れた効力を有する抗体として選択された。
完全な抗体は、2つの全長の軽鎖および2つの全長の重鎖を持つ構造であり、それぞれの軽鎖は重鎖とジスルフィド結合でつながっている。
本明細書で使用される用語、「重鎖」は、抗原に特異性を付与するのに十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインVHおよび3つの不変領域ドメインCH1、CH2およびCH3を含む全長の重鎖およびその断片の両方を意味する。また、本明細書で使用される用語「軽鎖」は、抗原に特異性を付与するのに十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインVLおよび不変領域ドメインCLを含む全長の軽鎖およびその断片の両方を意味する。
前記抗体全体は、IgA、IgD、IgE、IgMおよびIgGの亜型(subtype)を含み、特にIgGは、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4を含む。重鎖の不変領域は、ガンマ(γ)、ミュー(μ)、アルファ(α)、デルタ(δ)およびエプシロン(ε)タイプを持ち、サブクラスとしてガンマ1(γ1)、ガンマ2(γ2)、ガンマ3(γ3)、ガンマ4(γ4)、アルファ1(α1)およびアルファ2(α2)を持つ。軽鎖の不変領域はカッパ(κ)およびラムダ(λ)タイプを持つ。
抗体の抗原結合断片または抗体断片は、抗原結合機能を保有している断片を意味し、Fab、F(ab')、F(ab')2およびFvなどを含む。抗体断片のうちFabは、軽鎖および重鎖可変領域と軽鎖の不変領域および重鎖の最初の不変領域(CH1)を持つ構造で、1つの抗原結合部位を持つ。Fab'は重鎖CH1ドメインのC末端に1つ以上のシステイン残基を含むヒンジ領域(hinge-region)を持つという点でFabと違いがある。F(ab')2は、Fab'のヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合を形成して生成される。
Fvは、重鎖可変領域および軽鎖可変領域のみを持つ最小の抗体断片に該当する。二重鎖Fv(two-chain Fv)は、非共有結合で重鎖可変領域と軽鎖可変領域が接続されており、単鎖Fv(single-chain Fv、scFv)は、一般的にペプチドリンカーを介して重鎖可変領域と軽鎖可変領域が共有結合で接続されているか、またはC末端で直接接続されており、二重鎖Fvのようにダイマーのような構造を形成することができる。このような抗体断片は、タンパク質加水分解酵素を利用したり(例えば、完全な形の抗体をパパインで制限切断するとFabが得られ、ペプシンで切断するとF(ab')2が得られる)、遺伝子組換え技術を利用して製作することができる。
「Fv」フラグメントは、完全な抗体認識および結合部位を含む抗体フラグメントである。これらの領域は、1つの重鎖可変ドメインと1つの軽鎖可変ドメインが結合した二量体である。
「Fab」フラグメントは、軽鎖の可変および不変ドメインと、重鎖の可変および第1不変ドメイン(CH1)を含む。F(ab')2抗体フラグメントは、通常、Fab'フラグメントのC末端に存在するヒンジ領域のシステインによって共有結合された一対のFab'フラグメントを含む。
「単鎖Fv(scFv)」抗体フラグメントは、抗体のVHおよびVLドメインを含む単一のポリペプチド鎖で構成される構造体である。scFvが抗原結合のために目的の構造を形成できるようにするポリペプチドリンカーをVHドメインとVLドメインの間にさらに含めることができる。
一実施形態において、本発明の抗体は、モノクローナル抗体、多特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、scFv、Fabフラグメント、F(ab')2フラグメント、ジスルフィド結合Fvs(sdFv)および抗イディオタイプ(抗Id)抗体、または前記抗体のエピトープ結合フラグメントなどを含むが、これらに限定されない。
前記重鎖不変領域は、ガンマ(γ)、ミュー(μ)、アルファ(α)、デルタ(δ)またはエプシロン(ε)のいずれかのアイソタイプから選択することができる。例えば、不変領域は、ガンマ1(IgG1)、ガンマ2(IgG2)、ガンマ3(IgG3)またはガンマ4(IgG4)である。軽鎖不変領域は、カッパ型またはラムダ型であってもよい。
前記モノクローナル抗体は、実質的に均質な抗体集団から得られた抗体、すなわち、集団を占める個々の抗体が微量に存在する可能性のある自然発生的変異を除いて、同一のものを指す。モノクローナル抗体は、非常に特異的で、単一の抗原部位に対抗して誘導される。典型的には、異なる決定因子(エピトープ)に対して異なる抗体を含む通常の(ポリクローナル)抗体とは対照的に、それぞれのモノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定因子に対して指示される。
「エピトープ(epitope)」は、抗体が特異的に結合できるタンパク質の決定部位(determinant)を意味する。エピトープは、通常、化学的に活性な表面分子群、例えばアミノ酸または糖側鎖で構成され、通常、特定の3次元の構造的特徴だけでなく、特定の電荷特性を有する。立体的エピトープおよび非立体的エピトープは、変性溶媒の存在下で前者に対する結合は消失するが、後者に対しては消失しない点で区別される。
本発明による抗体またはその抗原結合断片は、例えば、FGFR3の細胞外領域に存在する3つの免疫ドメインであるD1、D2およびD3で構成される群から選択されるいずれかの1つ、例えばD1、D2またはD3ドメインに結合することができる。場合によって、本発明による抗体またはその抗原結合断片は、前記配列番号183のFGFR3のうちドメイン1(配列番号184)に特異的に結合し、FGFリガンドと結合競合しない場合がある。
前記「ヒト化」形態の非人間(例えばマウス)抗体は、非人間免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、受容体の超可変領域からの残基を目的とする特異性、親和性および能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)、例えばマウス、マウス、ウサギまたは非ヒト霊長類の超可変領域からの残基で置換したヒト免疫グロブリン(受容体抗体)である。
前記「ヒト抗体」とは、ヒト免疫グロブリンに由来する分子で、相補性決定領域、構造領域を含む抗体を構成するアミノ酸配列全体がヒト免疫グロブリンで構成されているものを意味する。
重鎖および／または軽鎖の一部が特別な種に由来するか、または特別な抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体内の相応する配列と同一かこれと相同性である一方、残りの鎖(複数可)が別の種に由来するか、または別の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体内の相応する配列と同一または相同性である「キメラ」抗体(免疫グロブリン)だけでなく目的の生物学的活性を示す前記抗体の断片が含まれる。
本発明で使用される抗体の「可変領域」は、相補性決定領域(CDR；すなわち、CDR1、CDR2、およびCDR3)および骨格領域(FR)のアミノ酸配列を含む抗体分子の軽鎖および重鎖部分を意味する。VHは、重鎖の可変ドメインを意味する。VLは、軽鎖の可変ドメインを意味する。
「相補性決定領域(complement determining region、CDR)は、抗原結合のために必要な存在である、抗体可変ドメインのアミノ酸残基を意味する。各可変ドメインは典型的にCDR1、CDR2およびCDR3として確認された3つのCDR領域を有する。
本発明による抗FGFR3抗体またはその抗原結合断片は、公知の抗FGFR3抗体よりもFGFR3-TACC3過剰発現がん細胞に対してより優れた効力を有する抗体として選択されたものであり、例えば、以下を含むことができる。
配列番号1の重鎖CDR1、配列番号19の重鎖CDR2および配列番号42の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、配列番号67の軽鎖CDR1、配列番号89の軽鎖CDR2および配列番号110の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号2の重鎖CDR1、配列番号20の重鎖CDR2および配列番号43の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、配列番号68の軽鎖CDR1、配列番号90の軽鎖CDR2および配列番号111の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号3の重鎖CDR1、配列番号21の重鎖CDR2および配列番号44の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、配列番号69の軽鎖CDR1、配列番号91の軽鎖CDR2および配列番号112の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号4の重鎖CDR1、配列番号22の重鎖CDR2および配列番号45の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、配列番号70の軽鎖CDR1、配列番号92の軽鎖CDR2および配列番号113の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号5の重鎖CDR1、配列番号23の重鎖CDR2および配列番号46の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、配列番号71の軽鎖CDR1、配列番号93の軽鎖CDR2および配列番号114の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号5の重鎖CDR1、配列番号23の重鎖CDR2および配列番号186の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、配列番号71の軽鎖CDR1、配列番号93の軽鎖CDR2および配列番号114の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号5の重鎖CDR1、配列番号23の重鎖CDR2および配列番号187の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、配列番号71の軽鎖CDR1、配列番号93の軽鎖CDR2および配列番号114の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号5の重鎖CDR1、配列番号23の重鎖CDR2および配列番号188の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、配列番号71の軽鎖CDR1、配列番号93の軽鎖CDR2および配列番号114の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号5の重鎖CDR1、配列番号23の重鎖CDR2および配列番号189の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、配列番号71の軽鎖CDR1、配列番号93の軽鎖CDR2および配列番号114の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号5の重鎖CDR1、配列番号23の重鎖CDR2および配列番号190の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、配列番号71の軽鎖CDR1、配列番号93の軽鎖CDR2および配列番号114の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号5の重鎖CDR1、配列番号23の重鎖CDR2および配列番号191の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、配列番号71の軽鎖CDR1、配列番号93の軽鎖CDR2および配列番号114の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号5の重鎖CDR1、配列番号23の重鎖CDR2および配列番号192の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、配列番号71の軽鎖CDR1、配列番号93の軽鎖CDR2および配列番号114の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号5の重鎖CDR1、配列番号23の重鎖CDR2および配列番号193の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、配列番号71の軽鎖CDR1、配列番号93の軽鎖CDR2および配列番号114の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号5の重鎖CDR1、配列番号23の重鎖CDR2および配列番号194の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、配列番号71の軽鎖CDR1、配列番号93の軽鎖CDR2および配列番号114の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号5の重鎖CDR1、配列番号23の重鎖CDR2および配列番号195の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、配列番号71の軽鎖CDR1、配列番号93の軽鎖CDR2および配列番号114の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号5の重鎖CDR1、配列番号23の重鎖CDR2および配列番号196の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、配列番号71の軽鎖CDR1、配列番号93の軽鎖CDR2および配列番号114の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号5の重鎖CDR1、配列番号23の重鎖CDR2および配列番号197の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、配列番号71の軽鎖CDR1、配列番号93の軽鎖CDR2および配列番号114の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号5の重鎖CDR1、配列番号23の重鎖CDR2および配列番号198の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、配列番号71の軽鎖CDR1、配列番号93の軽鎖CDR2および配列番号114の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号5の重鎖CDR1、配列番号23の重鎖CDR2および配列番号46の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、配列番号71の軽鎖CDR1、配列番号93の軽鎖CDR2および配列番号199の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号5の重鎖CDR1、配列番号23の重鎖CDR2および配列番号46の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、配列番号71の軽鎖CDR1、配列番号93の軽鎖CDR2および配列番号200の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号5の重鎖CDR1、配列番号23の重鎖CDR2および配列番号46の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、配列番号71の軽鎖CDR1、配列番号93の軽鎖CDR2および配列番号201の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号5の重鎖CDR1、配列番号23の重鎖CDR2および配列番号46の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、配列番号71の軽鎖CDR1、配列番号93の軽鎖CDR2および配列番号202の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号4の重鎖CDR1、配列番号24の重鎖CDR2および配列番号47の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、配列番号72の軽鎖CDR1、配列番号94の軽鎖CDR2および配列番号115の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号6の重鎖CDR1、配列番号25の重鎖CDR2および配列番号48の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、配列番号73の軽鎖CDR1、配列番号95の軽鎖CDR2および配列番号112の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号7の重鎖CDR1、配列番号26の重鎖CDR2および配列番号49の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、配列番号74の軽鎖CDR1、配列番号96の軽鎖CDR2および配列番号116の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号8の重鎖CDR1、配列番号27の重鎖CDR2および配列番号50の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、配列番号75の軽鎖CDR1、配列番号97の軽鎖CDR2および配列番号117の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号9の重鎖CDR1、配列番号28の重鎖CDR2および配列番号51の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、配列番号76の軽鎖CDR1、配列番号98の軽鎖CDR2および配列番号118の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号10の重鎖CDR1、配列番号29の重鎖CDR2および配列番号52の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、配列番号77の軽鎖CDR1、配列番号97の軽鎖CDR2および配列番号119の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号11の重鎖CDR1、配列番号30の重鎖CDR2および配列番号53の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、配列番号78の軽鎖CDR1、配列番号99の軽鎖CDR2および配列番号120の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号11の重鎖CDR1、配列番号31の重鎖CDR2および配列番号54の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、配列番号79の軽鎖CDR1、配列番号100の軽鎖CDR2および配列番号121の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号12の重鎖CDR1、配列番号32の重鎖CDR2および配列番号55の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、配列番号80の軽鎖CDR1、配列番号101の軽鎖CDR2および配列番号122の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号3の重鎖CDR1、配列番号33の重鎖CDR2および配列番号56の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、配列番号81の軽鎖CDR1、配列番号102の軽鎖CDR2および配列番号123の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号13の重鎖CDR1、配列番号34の重鎖CDR2および配列番号57の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、配列番号82の軽鎖CDR1、配列番号103の軽鎖CDR2および配列番号124の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号14の重鎖CDR1、配列番号35の重鎖CDR2および配列番号58の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、配列番号83の軽鎖CDR1、配列番号104の軽鎖CDR2および配列番号125の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号1の重鎖CDR1、配列番号36の重鎖CDR2および配列番号59の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、配列番号84の軽鎖CDR1、配列番号105の軽鎖CDR2および配列番号126の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号6の重鎖CDR1、配列番号23の重鎖CDR2および配列番号60の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、配列番号69の軽鎖CDR1、配列番号91の軽鎖CDR2および配列番号127の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号15の重鎖CDR1、配列番号37の重鎖CDR2および配列番号61の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、配列番号85の軽鎖CDR1、配列番号89の軽鎖CDR2および配列番号128の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号16の重鎖CDR1、配列番号38の重鎖CDR2および配列番号62の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、配列番号86の軽鎖CDR1、配列番号106の軽鎖CDR2および配列番号129の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号17の重鎖CDR1、配列番号39の重鎖CDR2および配列番号63の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、配列番号87の軽鎖CDR1、配列番号107の軽鎖CDR2および配列番号130の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号4の重鎖CDR1、配列番号19の重鎖CDR2および配列番号64の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、配列番号88の軽鎖CDR1、配列番号108の軽鎖CDR2および配列番号131の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、
配列番号18の重鎖CDR1、配列番号40の重鎖CDR2および配列番号65の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、配列番号85の軽鎖CDR1、配列番号89の軽鎖CDR2および配列番号128の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、または
配列番号16の重鎖CDR1、配列番号41の重鎖CDR2および配列番号66の重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、配列番号72の軽鎖CDR1、配列番号109の軽鎖CDR2および配列番号132の軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域。
「骨格領域(FR)」は、CDR残基以外の可変ドメイン残基である。各可変ドメインは、典型的には、FR1、FR2、FR3およびFR4の4つのFRを有する。
抗FGFR3抗体のFGFR3に対する結合親和性は、10-5Mないし10-12Mの範囲内である。例えば、抗FGFR3抗体のFGFR3に対する結合親和性は、10-6Mないし10-12M、10-7Mないし10-12M、10-8Mないし10-12M、10-9Mないし10-12M、10-5Mないし10-11M、10-6Mないし10-11M、10-7Mないし10-11M、10-8Mないし10-11M、10-9 Mないし10-11M、10-10Mないし10-11M、10-5Mないし10-10M、10-6Mないし10-10M、10-7Mないし10-10M、10-8Mないし10-10M、10-9 Mないし10-10M、10-5 Mないし10-9M、10-6Mないし10-9 M、10-7Mないし10-9M、10-8Mないし10-9M、10-5Mないし10-8M、10-6Mないし10-8M、10M-7ないし10-8M、10-5Mないし10-7M、10-6Mないし10-7Mまたは10-5Mないし10-6Mである。
前記FGFR3に結合する抗体またはその抗原結合断片は、配列番号133ないし配列番号157、配列番号203ないし配列番号215で構成される群から選択される1つ以上のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含むことができる。また、前記FGFR3に結合する抗体またはその抗原結合断片は、配列番号158ないし配列番号182、配列番号216ないし配列番号219で構成される群から選択される1つ以上のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むことができる。
本発明による具体的な実施例において、以下を含むことができる。
配列番号133の重鎖可変領域および配列番号158の軽鎖可変領域、
配列番号134の重鎖可変領域および配列番号159の軽鎖可変領域、
配列番号135の重鎖可変領域および配列番号160の軽鎖可変領域、
配列番号136の重鎖可変領域および配列番号161の軽鎖可変領域、
配列番号137の重鎖可変領域および配列番号162の軽鎖可変領域、
配列番号203の重鎖可変領域および配列番号162の軽鎖可変領域、
配列番号204の重鎖可変領域および配列番号162の軽鎖可変領域、
配列番号205の重鎖可変領域および配列番号162の軽鎖可変領域、
配列番号206の重鎖可変領域および配列番号162の軽鎖可変領域、
配列番号207の重鎖可変領域および配列番号162の軽鎖可変領域、
配列番号208の重鎖可変領域および配列番号162の軽鎖可変領域、
配列番号209の重鎖可変領域および配列番号162の軽鎖可変領域、
配列番号210の重鎖可変領域および配列番号162の軽鎖可変領域、
配列番号211の重鎖可変領域および配列番号162の軽鎖可変領域、
配列番号212の重鎖可変領域および配列番号162の軽鎖可変領域、
配列番号213の重鎖可変領域および配列番号162の軽鎖可変領域、
配列番号214の重鎖可変領域および配列番号162の軽鎖可変領域、
配列番号215の重鎖可変領域および配列番号162の軽鎖可変領域、
配列番号137の重鎖可変領域および配列番号216の軽鎖可変領域、
配列番号137の重鎖可変領域および配列番号217の軽鎖可変領域、
配列番号137の重鎖可変領域および配列番号218の軽鎖可変領域、
配列番号137の重鎖可変領域および配列番号219の軽鎖可変領域、
配列番号138の重鎖可変領域および配列番号163の軽鎖可変領域、
配列番号139の重鎖可変領域および配列番号164の軽鎖可変領域、
配列番号140の重鎖可変領域および配列番号165の軽鎖可変領域、
配列番号141の重鎖可変領域および配列番号166の軽鎖可変領域、
配列番号142の重鎖可変領域および配列番号167の軽鎖可変領域、
配列番号143の重鎖可変領域および配列番号168の軽鎖可変領域、
配列番号144の重鎖可変領域および配列番号169の軽鎖可変領域、
配列番号145の重鎖可変領域および配列番号170の軽鎖可変領域、
配列番号146の重鎖可変領域および配列番号171の軽鎖可変領域、
配列番号147の重鎖可変領域および配列番号172の軽鎖可変領域、
配列番号148の重鎖可変領域および配列番号173の軽鎖可変領域、
配列番号149の重鎖可変領域および配列番号174の軽鎖可変領域、
配列番号150の重鎖可変領域および配列番号175の軽鎖可変領域、
配列番号151の重鎖可変領域および配列番号176の軽鎖可変領域、
配列番号152の重鎖可変領域および配列番号177の軽鎖可変領域、
配列番号153の重鎖可変領域および配列番号178の軽鎖可変領域、
配列番号154の重鎖可変領域および配列番号179の軽鎖可変領域、
配列番号155の重鎖可変領域および配列番号180の軽鎖可変領域、
配列番号156の重鎖可変領域および配列番号181の軽鎖可変領域、または
配列番号157の重鎖可変領域および配列番号182の軽鎖可変領域。
scFv
scFvは、抗体のVHおよびVLドメインを含む単一のポリペプチド鎖で構成される構造体で、抗体の断片である。scFvが抗原結合のために目的とする構造を形成できるようにするポリペプチドリンカーをVHドメインとVLドメインの間にさらに含むことができる。
一実施形態において、抗体のVHおよびVLドメインを含む単鎖Fv(scFv)において、VHおよびVLドメインは、リンカーを介して接続することができる。配列番号133ないし配列番号157、配列番号203なしし配列番号215で構成される群から選択される1つ以上のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域は、リンカーを介して、配列番号158ないし配列番号182、配列番号216ないし配列番号219で構成される群から選択される1つ以上のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と接続することができる。
本発明による具体的な実施例において、以下を含むことができる。
配列番号133の重鎖可変領域および配列番号158の軽鎖可変領域、
配列番号134の重鎖可変領域および配列番号159の軽鎖可変領域、
配列番号135の重鎖可変領域および配列番号160の軽鎖可変領域、
配列番号136の重鎖可変領域および配列番号161の軽鎖可変領域、
配列番号137の重鎖可変領域および配列番号162の軽鎖可変領域、
配列番号203の重鎖可変領域および配列番号162の軽鎖可変領域、
配列番号204の重鎖可変領域および配列番号162の軽鎖可変領域、
配列番号205の重鎖可変領域および配列番号162の軽鎖可変領域、
配列番号206の重鎖可変領域および配列番号162の軽鎖可変領域、
配列番号207の重鎖可変領域および配列番号162の軽鎖可変領域、
配列番号208の重鎖可変領域および配列番号162の軽鎖可変領域、
配列番号209の重鎖可変領域および配列番号162の軽鎖可変領域、
配列番号210の重鎖可変領域および配列番号162の軽鎖可変領域、
配列番号211の重鎖可変領域および配列番号162の軽鎖可変領域、
配列番号212の重鎖可変領域および配列番号162の軽鎖可変領域、
配列番号213の重鎖可変領域および配列番号162の軽鎖可変領域、
配列番号214の重鎖可変領域および配列番号162の軽鎖可変領域、
配列番号215の重鎖可変領域および配列番号162の軽鎖可変領域、
配列番号137の重鎖可変領域および配列番号216の軽鎖可変領域、
配列番号137の重鎖可変領域および配列番号217の軽鎖可変領域、
配列番号137の重鎖可変領域および配列番号218の軽鎖可変領域、
配列番号137の重鎖可変領域および配列番号219の軽鎖可変領域、
配列番号138の重鎖可変領域および配列番号163の軽鎖可変領域、
配列番号139の重鎖可変領域および配列番号164の軽鎖可変領域、
配列番号140の重鎖可変領域および配列番号165の軽鎖可変領域、
配列番号141の重鎖可変領域および配列番号166の軽鎖可変領域、
配列番号142の重鎖可変領域および配列番号167の軽鎖可変領域、
配列番号143の重鎖可変領域および配列番号168の軽鎖可変領域、
配列番号144の重鎖可変領域および配列番号169の軽鎖可変領域、
配列番号145の重鎖可変領域および配列番号170の軽鎖可変領域、
配列番号146の重鎖可変領域および配列番号171の軽鎖可変領域、
配列番号147の重鎖可変領域および配列番号172の軽鎖可変領域、
配列番号148の重鎖可変領域および配列番号173の軽鎖可変領域、
配列番号149の重鎖可変領域および配列番号174の軽鎖可変領域、
配列番号150の重鎖可変領域および配列番号175の軽鎖可変領域、
配列番号151の重鎖可変領域および配列番号176の軽鎖可変領域、
配列番号152の重鎖可変領域および配列番号177の軽鎖可変領域、
配列番号153の重鎖可変領域および配列番号178の軽鎖可変領域、
配列番号154の重鎖可変領域および配列番号179の軽鎖可変領域、
配列番号155の重鎖可変領域および配列番号180の軽鎖可変領域、
配列番号156の重鎖可変領域および配列番号181の軽鎖可変領域、または
配列番号157の重鎖可変領域および配列番号182の軽鎖可変領域。
前記リンカーは、ペプチドリンカーである可能性があり、約10～25aaの長さを有することができる。例えば、グリシンおよび／またはセリンなどの親水性アミノ酸を含むことができるが、これに限定されない。
具体的に前記リンカーは、例えば、(GS)n、(GGS)n、(GSGGS)nまたは(GnS)m(n、mはそれぞれ1ないし10)を含むことができるが、前記リンカーは、例えば、(GnS)m(n、mはそれぞれ1ないし10)であることができる。具体的に前記リンカーは、GGGGSを含むことができ、例えば3回繰り返された配列番号185のGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSであることができる。
「ファージディスプレイ」は、変異体ポリペプチドをファージ、例えば繊維状ファージ粒子の表面上に外皮タンパク質の少なくとも一部との融合タンパク質としてディスプレイする技術である。ファージディスプレイの有用性は、ランダム化されたタンパク質変異体の大規模なライブラリーを対象として、標的抗原と高親和性で結合する配列を迅速かつ効率的に分類できることにある。ペプチドおよびタンパク質ライブラリーをファージ上にディスプレイすることは、特異的な結合特性を持つポリペプチドを見つけるために数百万個のポリペプチドをスクリーニングするために使用されてきた。
ファージディスプレイ技術は、特定のリガンド(抗原など)と結合する新規タンパク質を生成および選別するための強力なツールを提供した。ファージディスプレイ技術を使用して、タンパク質変異体の大規模なライブラリーを生成し、標的抗原と高親和性で結合する配列を迅速に分類することができる。変異体ポリペプチドを暗号化する核酸をウイルス性外皮タンパク質、例えば遺伝子IIIタンパク質または遺伝子VIIIタンパク質を暗号化する核酸配列と融合させる。タンパク質またはポリペプチドを暗号化する核酸配列を遺伝子IIIタンパク質の一部を暗号化する核酸配列と融合させた1価ファージディスプレイシステムが開発された。1価ファージディスプレイシステムでは、遺伝子融合物が低レベルで発現され、野生型遺伝子IIIタンパク質も発現され、粒子感染性が維持される。
繊維状ファージ表面上でのペプチドの発現と大腸菌の周辺細胞質での機能性抗体断片の発現を証明することは、抗体ファージディスプレイライブラリーを開発する上で重要である。抗体または抗原結合性ポリペプチドのライブラリーは、数多くの方法、例えば、ランダムなDNA配列を挿入することにより単一遺伝子を改変させる方法や、関連する遺伝子系列をクローニングする方法で製造した。ライブラリーを対象に、目的とする特徴を伴う抗体または抗原結合性タンパク質の発現についてスクリーニングすることができる。
ファージディスプレイ技術は、目的とする特徴を持つ抗体を製造するための通常のハイブリドーマや組換え方法に比べ、いくつかの利点がある。これらの技術は、動物を使用することなく、短時間で様々な配列を持つ大規模な抗体ライブラリーを生成することができる。ハイブリドーマの製造やヒト化抗体の製造は、数ヶ月の製造期間を必要とする場合がある。また、免疫が全く要求されないため、ファージ抗体ライブラリーは、毒性や抗原性の低い抗原に対しても抗体を生成することができる。ファージ抗体ライブラリーを使用して、新規の治療的抗体を生成および確認することもできる。
ファージディスプレイライブラリーを使用して免疫化した、非免疫化したヒト、生殖細胞系配列、または未感作B細胞Igレパートリーからヒト抗体を生成する技術が使用できる。各種リンパ系組織を使用して、未感作または非免疫抗原結合性ライブラリーを製造することができる。
ファージディスプレイライブラリーから高親和性抗体を確認および分離できる技術は、治療用の新規抗体分離において重要である。ライブラリーから高親和性抗体を分離することは、ライブラリーのサイズ、細菌性細胞中での生産効率、およびライブラリーの多様性に左右される。ライブラリーのサイズは、抗体または抗原結合性タンパク質の不適切な折り畳みと終止コドンの存在による非効率的な生産によって減少する。細菌性細胞での発現は、抗体または抗原結合性ドメインが適切に折り畳まれない場合には抑制される可能性がある。発現は、可変/不変界面の表面または選択されたCDR残基の残基を交互に変異させることによって改善することができる。骨格領域の配列は、細菌性細胞から抗体ファージライブラリーを生成する場合に適切な折り畳みを提供するための1つの要素である。
高親和性抗体分離では、抗体または抗原結合性タンパク質の多様なライブラリーを生成することが重要である。CDR3領域では、これらがしばしば抗原結合に参加することがわかっている。重鎖上のCDR3領域は、サイズ、配列および構造的立体形態の面でかなり多様であるため、これを利用して様々なライブラリーを製造することができる。
また、各位置で20個のアミノ酸すべてを使用して可変重鎖および軽鎖のCDR領域をランダム化することで、多様性を発生させることができる。20個の全てのアミノ酸を使用すると、多様性の大きい変異体抗体配列が生成され、新規な抗体を確認する機会が増える可能性がある。
本発明の抗体または抗体フラグメントは、FGFR3を特異的に認識できる範囲内で、本明細書に記載の本発明の抗FGFR3抗体の配列だけでなく、その生物学的同等物を含むことができる。例えば、抗体の結合親和性および／または他の生物学的特性をさらに改善させるために、抗体のアミノ酸配列に追加の変更を加えることができる。このような変更は、例えば、抗体のアミノ酸配列残基の欠失、挿入、および／または置換を含む。このようなアミノ酸変異は、アミノ酸側鎖置換体の相対的な類似性、例えば、疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づいて行われる。アミノ酸側鎖置換体のサイズ、形状および種類の分析により、アルギニン、リジンおよびヒスチジンはすべて正に帯電した残基であり、アラニン、グリシンおよびセリンは同様のサイズを有し、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは同様の形状を有することが分かる。したがって、これらの考慮事項に基づいて、アルギニン、リジンとヒスチジン、アラニン、グリシン、セリン、そしてフェニルアラニン、トリプトファンとチロシンは生物学的に機能同等物であると言える。
前記の生物学的同等活性を有する変異を考慮すれば、本発明の抗体またはそれをコードする核酸分子は、配列番号に記載された配列と実質的同一性(substantial identity)を示す配列も含むものと解釈される。前記の実質的同一性とは、前記の本発明の配列と任意の他の配列に最大限対応するようにアラインし、当分野で通常利用されるアルゴリズムを用いてアラインされた配列を分析した場合に、少なくとも90％の相同性、最も好ましくは少なくとも95％の相同性、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上の相同性を示す配列を意味する。配列比較のためのアラインメント方法は当分野の公知である。NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)は、NBCIなどでアクセス可能で、インターネット上でblastp、blasm、blastx、tblastnおよびtblastxなどの配列分析プログラムと連携して利用できる。BLASTは、 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/で接続可能である。このプログラムを利用した配列相同性比較方法は、www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_ help.htmlで確認することができる。
これに基づいて、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、明細書に記載された記載された配列または全体と比較して、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上の相同性を有することができる。このような相同性は、当分野の公知の方法による配列比較および／またはアライメントによって決定することができる。例えば、配列比較アルゴリズム(すなわち、BLASTまたはBLAST 2.0)、手動アライメント、および目視検査を用いて、本発明の核酸またはタンパク質のパーセント配列相同性を決定することができる。
本発明は、別の観点から、前記抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸に関する。本発明の抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸を分離することにより、抗体またはその抗原結合断片を組換え式に生産することができる。
「核酸」は、DNA(gDNAおよびcDNA)およびRNA分子を包括的に含む意味を持ち、核酸の基本構成単位であるヌクレオチドは、自然のヌクレオチドだけでなく、糖または塩基部位が変形された類似体(analogue)も含む。本発明の重鎖および軽鎖可変領域をコードする核酸の配列は変形することができる。前記変形は、ヌクレオチドの追加、欠失、または非保存的な置換または保存的な置換を含む。
前記抗体を暗号化するDNAは、通常の分子生物学的手法を使用して(例えば、抗体と重鎖および軽鎖を暗号化するDNAと特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより)容易に分離または合成することができ、核酸を分離し、これを複製可能なベクター内に挿入してさらにクローニングするか(DNAの増幅)、またはさらに発現させる。これに基づいて、本発明は別の観点から、前記核酸を含む組換え発現ベクターに関する。
本明細書で使用される用語「ベクター」は、宿主細胞で目的遺伝子を発現させるための手段であり、プラスミドベクター、コズミドベクター、バクテリオファージベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなどのウイルスベクターなどを含む。ベクターの成分としては、一般的に次のうちの1つ以上が含まれるが、これに限定されない。シグナル配列、複製起点、1つ以上の抗生物質耐性マーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター、転写終結配列。抗体をコードする核酸は、プロモーターや転写終結配列など、作動的に連結されている。
「作動的に連結」は、核酸発現制御配列(例えば、プロモーター、シグナル配列または転写制御因子の結合位置のアレイ)と他の核酸配列との間の機能的な結合を意味し、これにより、前記制御配列は前記他の核酸配列の転写および/または解読を制御する。
原核細胞を宿主とする場合には、転写を進行させることができる強力なプロモーター(例えば、tacプロモーター、lacプロモーター、lacUV5プロモーター、lppプロモーター、pLλプロモーター、pRλプロモーター、rac5プロモーター、ampプロモーター、recAプロモーター、SP6プロモーター、trpプロモーターおよびT7プロモーターなど)、解読の開始のためのリボソーム結合部位および転写/解読終結配列を含むことが一般的である。また、例えば、真核細胞を宿主とする場合には、哺乳動物細胞のジノムに由来するプロモーター(例えば、メタロチオニンプロモーター、β-アクチンプロモーター、ヒトヘログロビンプロモーターおよびヒト筋クレアチンプロモーター)または哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター(例えば、アデノウイルス後期プロモーター、バクシニアウイルス7.5Kプロモーター、SV40プロモーター、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、HSVのtkプロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス(MMTV)プロモーター、HIVのLTRプロモーター、モロニーウイルスのプロモーター、エプスタインバールウイルス(EBV)のプロモーターおよびラウス肉腫ウイルス(RSV)のプロモーター)が利用することができ、転写終結配列としてポリアデニル化配列を一般的に有する。
場合によっては、ベクターは、そこから発現される抗体の精製を容易にするために、他の配列と融合することもできる。融合される配列は、例えば、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(Pharmacia、米国)、マルトース結合タンパク質(NEB、米国)、FLAG(IBI、米国)および6x His(hexahistidine; Quiagen、米国)などがある。
前記ベクターは選択標識として当分野で通常利用される抗生物質耐性遺伝子を含み、例えばアンピシリン、ゲンタマイシン、カベニシリン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、カナマイシン、ゲネチシン、ネオマイシンおよびテトラサイクリンに対する耐性遺伝子がある。
本発明は、別の観点から、前記組換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞に関する。本発明の抗体を生成するために使用される宿主細胞は、原核生物、酵母または高等真核生物細胞であることができ、これに限定されない。
エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)、バチルス・サブチルス(Bacillus subtilus)およびバチルス・チューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis)などのバチルス属の菌株、ストレプトマイセス(Streptomyces)、シュードモナス(Pseudomonas)(例えば、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida))、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)およびスタフィロコッカス(Staphylococcus)(例えば、スタフィロコッカス・カルノサス(Staphylocus carnosus))などの原核宿主細胞を利用することができる。
ただし、動物細胞への関心が最も高く、有用な宿主細胞株の例としては、COS-7、BHK、CHO、CHOK1、DXB-11、DG-44、CHO/-DHFR、CV1、COS-7、HEK293、BHK、TM4、VERO、HELA、MDCK、BRL 3A、W138、Hep G2、SK-Hep、MMT、TRI、MRC 5、FS4、3T3、RIN、A549、PC12、K562、PER.C6、SP2/0、NS-0、U20S、またはHT1080でる可能性があり、これに限定されない。
本発明は、別の観点から、前記宿主細胞を培養して抗体を生成する工程、および生成された抗体を分離および精製する工程を含む、FGFR3に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片の製造方法に関する。
前記宿主細胞は各種培地で培養することができる。市販の培地のうち、制限なく培養培地として使用することができる。当業者の公知の他のすべての必須サプリメントが適切な濃度で含まれることもできる。培養条件、例えば、温度、pHなどが発現のために選択された宿主細胞と共に既に使用されており、これは当業者に明らかであろう。
前記抗体またはその抗原結合断片の回収は、例えば、遠心分離または限外ろ過により不純物を除去し、その結果物を、例えば親和性クロマトグラフィーなどを用いて精製することができる。さらなるその他の精製技術、例えば、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーなどを使用することができる。
二重または多重特異性抗体
本発明は、別の観点から、前記抗体またはその抗原結合断片を含む二重または多重特異性抗体に関する。
二重特異性抗体は、1つ以上のターゲットに結合能または拮抗能を持つ抗体を意味し、2つの異なるターゲットに対する結合能または拮抗能を持つ抗体が結合した形態、または1つのターゲットに対する結合能を持つ抗体と他のターゲットに対する拮抗能を持つ物質が結合している抗体を意味する。
多重特異性抗体は、少なくとも3つ以上の異なる抗原に対して結合特異性を持つ抗体を意味する。多重特異性(multi-specific)抗体は、三重特異性(Tri-specific)以上の抗体、例えば、三重特異性(Tri-specific)抗体、四重特異性(Tetra-specific)抗体またはそれ以上のターゲットを標的とする抗体を含むことができる。
二重特異性または多重特異性抗体に属する抗体は、scFvベースの抗体、Fabベースの抗体およびIgGベースの抗体などに区分することができる。二重特異性または多重特異性抗体の場合、二つ以上の信号を同時に抑制または増幅させることができるため、1つの信号を抑制/増幅する場合よりも効果的であり、それぞれの信号をそれぞれの信号阻害剤で処理した場合と比較すると、低用量投与が可能であり、同じ時間および空間における二つ以上の信号を抑制/増幅させることができる。
二重特異性または多重特異性抗体の製造方法は広く知られている。伝統的に、二重特異性抗体の組換え生産は、2つ以上の重鎖が異なる特異性を有する条件下で、2つ以上の免疫グロブリンの重鎖/軽鎖ペアの共発現に基づいている。
scFvを基盤とする二重特異性または多重特異性抗体の場合、異なるscFvのVLとVHをそれぞれ組み合わせて混成scFvをheterodimeric形で製造してディアボディ(diabody)を作ることができ、異なるscFvを互いに連結してtendem ScFvを製造することができ、FabのCH1とCLをそれぞれのscFvの末端に発現させてheterodimericミニ抗体(miniantibody)を製造することができ、FcのhomodimericドメインであるCH3ドメインの一部のアミノ酸を置換して「knob into hole」型のheterodimeric構造に変更させ、これらの変更されたCH3ドメインを異なるそれぞれのscFv末端に発現させることで、heterodimeric scFv型のミニボディ(minibody)を製造することができる。
Fabを基盤とする二重特異性または多重特異性抗体の場合、特定の抗原に対する個々のFab'をジスルフィド結合または媒介体を利用して互いに組み合わせてheterodimeric Fabの形で製造することができ、特定のFabの重鎖または軽鎖の末端に異なる抗原に対するscFvを発現させることで抗原結合価(valency)を2つにしたり、FabとscFvの間にヒンジ部位(hinge region)を置くことでhomodimericの形で4つの抗原結合価を持つように製造することができる。また、Fabの軽鎖末端と重鎖末端に異なる抗原に対するscFvを融合させることで抗原に対する結合価を3つにした二重標的バイボディ(bibody)、Fabの軽鎖末端と重鎖末端に異なるscFvをそれぞれ融合させることで抗原に対する結合価を3つにした三重標的バイボディ、異なる3つのFabを化学的に接合させることで得ることができる。
IgGをベースとする二重特異性または多重特異性抗体の場合、トリオンファーマ(Trion Pharma)社によってマウスとレットのハイブリドーマを再度交配することにより、ハイブリッドハイブリドーマ、別名クワドローマ(quadromas)を製造して二重特異性抗体を生産する方法が知られている。また、軽鎖部分は共有しながら、異なる重鎖に対してFcのCH3 homodimericドメインの一部のアミノ酸を変形させてheterodimeric形態で製作したいわゆる「Holes and Knob」形態で二重特異性抗体を製造することができる。heterodimeric形態の二重特異性抗体以外に、異なる2種のscFvをIgGの軽鎖と重鎖の可変ドメインの代わりにconstantドメインにそれぞれ融合発現させてhomodimeric形態の(scFv)4-IgGとして製造することができる。また、イムクローン(ImClone)社は、ヒトVEGFR-2に対するキメラ型モノクローナル抗体であるIMC-1C11をベースに、この抗体の軽鎖アミノ末端にマウスの血小板由来成長因子受容体α(Platelet-derived Growth Factor Receptor-α)に対するsingle variable domainのみを融合させた二重特異性抗体を作製して報告した。また、プロテインキナーゼA(protein kinase A、PKA)Rサブユニットのdimerization and docking domain(DDD)とPKAのanchoring domainを利用したいわゆる「dock and lock(DNL)」方法を通じて、CD20に対する多数の抗原結合価を持つ抗体として製作することができる。
非常に多様な組換え抗体フォーマット、例えば、2価以上、3価以上または4価以上の二重特異性または多重特異性抗体が開発されている。例えば、国際特許出願公開第WO2001/077342号、第WO2009/080251号、第WO2009/080252号、第WO2009/080253号、第WO2009/080254号、第WO2010/112193号、第WO2010/115589号、第WO2010/136172号、第WO2010/145792号、第WO2010/145793号および第WO2011/117330号に記載された2価以上、3価以上または4価以上の抗体も含む。2価以上、3価以上または4価以上の抗体は、それぞれ2つ以上の結合ドメイン、3つ以上の結合ドメインまたは4つ以上の結合ドメインが抗体分子に存在することを示す。
具体的な実施例では、本発明による二重または多重特異性抗体は、前記抗FGFR3抗体または抗原結合断片を、具体的には、IgG完全抗体またはその断片形態、例えば、単鎖Fv、VHドメインおよび/またはVLドメイン、Fabまたは(Fab)2の形で含むことができる。
また、前記FGFR3をターゲットとする抗体と異なる標的に結合する抗体、例えば、PD-1、PD-L1、BTLA、CTLA-4、VISTA、LAG3、TIM3、CD137(4-1BB)、VISTA、CD258(LIGHT)、TIGIT、CD134(OX40)、CD28、CD278(ICOS)、CD27、CD154(CD40L)、CD357(GITR)、CD30、DR3、CD226(DNAM1)、CD96、CD200、CD200R、Transferrin receptor、c-Met、EGFR、HER2、KDR、PDGFRa、NRP1、MARCOで構成される群から選択される1つ以上をターゲットとする抗体、具体的には、IgG完全抗体またはその断片形態、例えば、単鎖Fv、VHドメインおよび/またはVLドメイン、Fabまたは(Fab)2の形態を含むことができる。
本発明による二重または多重特異性抗体により、FGFR3以外に、他のターゲットによって誘導または媒介された追加の結合特異性を確保することができる。
例えば、本発明による二重特異性抗体は、FGFR3とPD-1、PD-L1、BTLA、CTLA-4、VISTA、LAG3、TIM3、CD137(4-1BB)、VISTA、CD258(LIGHT)、TIGIT、CD134(OX40)、CD28、CD278(ICOS)、CD27、CD154(CD40L)、CD357(GITR)、CD30、 DR3、CD226(DNAM1)、CD96、CD200、CD200R、Transferrin receptor、c-Met、EGFR、HER2、KDR、PDGFRa、NRP1、MARCOで構成される群から選択された1つ以上を同時にターゲットとすることができる。
例えば、本発明による多重特異性抗体は、FGFR3とPD-1、PD-L1、BTLA、CTLA-4、VISTA、LAG3、TIM3、CD137(4-1BB)、VISTA、CD258(LIGHT)、TIGIT、CD134(OX40)、CD28、CD278(ICOS)、CD27、CD154(CD40L)、CD357(GITR)、CD30、DR3、CD226(DNAM1)、CD96、CD200、CD200R、Transferrin receptor、c-Met、EGFR、HER2、KDR、PDGFRa、NRP1、MARCOで構成される群から選択された2つ以上を同時にターゲットとすることができる。
免疫細胞エンゲージ(immune cell engage)二重特異性または多重特異性抗体
本発明は、別の観点から、抗体のscFvおよび免疫細胞活性化抗原に結合する抗体のscFvを1つ以上含む第2結合ドメインで構成されるscFvを含む、免疫細胞エンゲージ(immune cell engage)二重特異性または多重特異性抗体に関する。
前記免疫細胞インゲージング二重特異性または多重特異性抗体を通じて、細胞傷害性T細胞とがん標的細胞間の細胞溶解性シナプスを一時的に誘導して毒物を放出するようにする。
一実施形態において、前記免疫細胞は、T細胞、NK細胞、サイトカイン誘導キラー細胞(Cytokine Induced Killer cell、CIK)、活性化細胞傷害性Tリンパ球(Cytotoxic T Lymphocyte、CTL)、マクロファージ、腫瘍組織内浸潤T細胞(Tumor-Infiltrating Lymphocytes、TIL)、および樹状細胞で構成される群から選択される1つ以上であることができる。
一実施形態において、前記免疫細胞活性化抗原は、例えば、以下から選択することができ、これに結合する抗体が免疫細胞エンゲージング(immune cell engage)役割を果たすことができる。
T細胞活性化抗原は、CD3、TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRξ、ICOS、CD28、CD27、HVEM、LIGHT、CD40、4-1BB、OX40、DR3、GITR、CD30、TIM1、SLAM、CD2、またはCD226、
NK細胞活性化抗原は、NKp30、NKp40、NKp44、NKp46、NKG2D、DNAM1、DAP10、CD16(e.g.、CD16a、CD16b)、CRTAM、CD27、CD27、PSGL1、CD96、CD100(SEMA4D)、NKp80、CD244(SLAMF4または2B4)、SLAMF6、SLAMF7、KIR2DS2、KIR2DS4、KIR3DS1、KIR2DS3、KIR2DS5、KIR2DS1、CD94、NKG2C、NKG2EまたはCD160、
B細胞活性化抗原は、OX40、CD40またはCD70、
マクロファージ活性化抗原は、CD2アゴニスト、CD40、CD70、TCR(Toll-like Receptor)アゴニスト、CD47、STINGまたはOX40L、または
樹状細胞活性化抗原はCD2アゴニスト、OX40、OX40L、41BBアゴニスト、TCRアゴニスト、CD47アゴニスト、またはSTINGアゴニスト。
免疫細胞エンゲイザー(immune cell engager)は、米国特許出願公開第2017/0368169号に具体的に記載されており、本発明に参照として導入することができる。
具体的には、前記免疫細胞エンゲージ二重特異性または多重特異性抗体は、直列型scFvを含み、以下の抗原およびがん細胞上の表面抗原に結合することができる。前記がん細胞上の表面抗原は、本発明による抗体が標的とするFGFR3である。
CD3、TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRξ、ICOS、CD28、CD27、HVEM、LIGHT、CD40、4-1BB、OX40、DR3、GITR、CD30、TIM1、SLAM、CD2、またはCD226、
NKp30、NKp40、NKp44、NKp46、NKG2D、DNAM1、DAP10、CD16(e.g.、CD16a、CD16b)、CRTAM、CD27、PSGL1、CD96、CD100(SEMA4D)、NKp80、CD244(SLAMF4または2B4)、SLAMF6、SLAMF7、KIR2DS2、KIR2DS4、KIR3DS1、KIR2DS3、KIR2DS5、KIR2DS1、CD94、NKG2C、NKG2E、またはCD160、
OX40、CD40またはCD70、
CD2アゴニスト、CD40、CD70、TCR(Toll-like Receptor)アゴニスト、CD47、STINGまたはOX40L、または
CD2アゴニスト、OX40、OX40L、41BBアゴニスト、TCRアゴニスト、CD47アゴニスト、またはSTINGアゴニスト。
前記免疫細胞エンゲージ二重特異性または多重特異性抗体は、例えば、VL(FGFR3)-VH(FGFR3)-VH(CD3またはCD16A)-VL(CD3またはCD16A)、VH(FGFR3)-VL(FGFR3)-VH(CD3またはCD16A)-VL(CD3またはCD16A)、VH(CD3またはCD16A)-VL(CD3またはCD16A)-VH(FGFR3)-VL(FGFR3)またはVH(CD3またはCD16A)-VL(CD3またはCD16A)-VL(FGFR3)-VH(FGFR3)の形態の構造を含むことができる。
前記scFvは、例えば、配列番号133ないし配列番号157、配列番号203ないし配列番号215で構成される群から選択される1つ以上のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号158ないし配列番号182、配列番号216ないし配列番号219で構成される群から選択される1つ以上のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域と軽鎖可変領域は、リンカーで連結することができる。
前記リンカーは、ペプチドリンカーである可能性があり、約10～25aaの長さを有することができる。例えば、グリシンおよび／またはセリンなどの親水性アミノ酸を含むことができる。
前記リンカーは、例えば、(GS)n、(GGS)n、(GGSGGS)nまたは(GnS)m(n、mはそれぞれ1ないし10)を含むことができるが、前記リンカーは、例えば、(GnS)m(n、mはそれぞれ1ないし10)であることができる。具体的には、前記リンカーは、GGGGSを含むことができ、例えば3回繰り返された配列番号185のGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSであることができる。
前記免疫細胞エンゲージ二重特異性または多重特異性抗体の例としては、CD3およびCD19に結合するブリナツモマブ(blinatumomab)(Amgen)、CD3およびEpCAMに結合するソリトマブ(solitomab)(Amgen)、CD3およびCEAに結合するMEDI 565(MedImmune、Amgen)、およびCD3およびPSMAに結合するBAY2010112(Bayer、Amgen)を含む。例示的なDARTには、CD3およびCD123に結合するMGD006(Macrogenics)、およびCD3およびgpA33に結合するMGD007(Macrogenics)を含む。例示的なTandAbsは、CD3およびCD19に結合するAFM11(Affimed Therapeutics)、およびCD30およびCD16Aに結合するAFM13(Affimed Therapeutics)を含むことができる。
抗体薬物複合体(ADC)
本発明は、別の観点から、前記抗体またはその抗原結合断片が薬物に結合した抗体薬物複合体(ADC)に関する。
抗体薬物複合体は、標的がん細胞に抗がん薬物を届けるまで、抗がん薬物が抗体に安定的に結合していなければならない。ターゲットに送達された薬物は、抗体から遊離され、ターゲット細胞の死滅を誘導しなければならない。このためには、薬物が抗体に安定的に結合すると同時に、ターゲット細胞から遊離される時はターゲット細胞の死滅を誘導する十分な細胞毒性を持たなければならない。
一実施形態において、前記抗体は、リンカーを介して薬物に結合することができる。前記リンカーは、抗FGFR3抗体と薬物の間をつなぐ部位であり、細胞内条件下で切断可能な形態、すなわち、細胞内環境において抗体から薬物を放出できるようにし、抗体の長い半減期を反映して、抗体が全身循環中は安定し、リンカーと薬物の結合が抗体の安定性および薬物動態に影響を与えないようにする。
前記リンカーは、例えば切断性リンカーまたは非切断性リンカーを含むことができる。切断性リンカーの場合、ペプチドリンカーなど細胞内ペプチダーゼまたはプロテアーゼ酵素、例えば、リソソームまたはエンドソームプロテアーゼによって切断することができ、非切断性リンカーの場合、例えば、チオエーテルリンカーは、抗体が細胞内加水分解によって非選択的に分解された後に薬物が放出されることがある。
一実施形態において、前記切断性リンカーは、ペプチドリンカーを含むことができる。前記ペプチドリンカーは、少なくとも2つ以上のアミノ酸の長さを有する。例えば、Val-Cit、Val-Ala、またはVal-Citのジペプチド、またはPhe-LeuまたはGly-Phe-Leu-Glyを含むことができる。リンカーの例は、国際特許出願公開第WO2004/010957号に具体的に記載されており、本発明に参照として導入することができる。
前記抗体薬物複合体は、標的がん細胞の抗原にADCの抗体領域が結合してADC抗原複合体を形成した後、エンドソーム・リソソーム経路でがん細胞内部に内包される。この場合、細胞毒性薬物の細胞内放出はエンドソーム・リソソームの内部環境によって調節される。
一実施形態において、前記切断性リンカーはpH感受性であり、特定のpH値での加水分解に敏感であり得る。一般に、pH感受性リンカーは、酸性条件下で加水分解することができることを示す。例えば、リソソームで加水分解することができる酸性不安定リンカーは、例えば、ヒドラゾン、セミカバゾン、チオセミカバゾン、シスアコニチンアミド(cis-aconitic amide)、オルソエステル、アセタール、ケタールなどであってよい。
他の実施例において、前記リンカーは、還元条件下で切断することもあり、例えば、ジスルフィドリンカーがこれに該当する。SATA(N-succinimidyl-S-acetylthioacetate)、SPDP(N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionate)、SPDB(N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)butyrate)およびSMPT(N-succinimidyl-oxycarbonyl-alpha-methyl-alpha-(2-pyridyl-dithio)toluene)を使用して、様々なジスルフィド結合を形成することができる。これらのジスルフィドリンカーは、細胞内グルタチオンのチオールとのジスルフィド交換によって分解される可能性がある。
前記薬物および/または薬物リンカーは、抗体のリジンを介してランダムに接合するか、またはジスルフィド結合鎖を還元したときに露出するシステインを介して接合されることがある。場合によっては、遺伝子工学的に製作されたタグ、例えば、ペプチドまたはタンパク質に存在するシステインを介してリンカー薬物を結合させることができる。前記遺伝子工学的に製作されたタグ、例えば、ペプチドまたはタンパク質は、例えば、イソプレノイドトランスフェラーゼによって認識されるアミノ酸モチーフを含むことができる。前記ペプチドまたはタンパク質は、ペプチドまたはタンパク質のカルボキシ末端で欠失(deletion)を有するか、ペプチドまたはタンパク質のカルボキシ(C)末端にスペーサーユニットの共有結合による付加を有する。
前記ペプチドまたはタンパク質は、アミノ酸モチーフと直接共有結合するか、スペーサーユニットと共有結合してアミノ酸モチーフと連結することがある。前記アミノ酸スペーサーユニットは、1ないし20個のアミノ酸で構成され、その中でグリシン(Glycine)ユニットが好ましい。
前記イソプレノイドトランスフェラーゼは、例えば、ファルネシルトランスフェラーゼ(FTase、farnesyl protein transferase)またはゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ(GGTase、geranylgeranyl transferase)であることができ、FTaseおよびGGTase Iは、前述の化学式1のうちCAAXモチーフを認識することができ、GGTase IIは、XXCC、XCCCまたはCXXモチーフを認識することができ、GGTase IIは、XXCC、XCXCまたはCXXモチーフ(ここで、Cはシステイン、Aは脂肪族アミノ酸、Xはイソプレノイドトランスフェラーゼの基質特異性を決定するアミノ酸である)を認識することができる。
別の実施例において、前記リンカーは、リソソームに多数存在するか、またはいくつかの腫瘍細胞で過剰発現されるβ-グルクロニダーゼ(β-glucuronidase)によって認識されて加水分解されるβ-グルクロニドリンカーを含むことができる。ペプチドリンカーとは異なり、親水性(hydrophilicity)が大きく、疎水性の性質が高い薬物との結合時、抗体薬物複合体の溶解度を増加させる利点を有する。
これに関連して、国際特許出願公開第WO2015/182984号に開示されたβ-グルクロニドリンカー、例えば、自己犠牲基(self-immolative group)を含むβ-グルクロニドリンカーを使用することができ、前記文献は参照として導入される。
場合によって、前記リンカーは、例えば非切断性リンカーであり、細胞内で抗体加水分解の1つの工程のみで薬物が放出され、例えばアミノ酸リンカー薬物複合体を生成する。このタイプのリンカーは、チオエーテル基またはマレイミドカプロイル基(maleimidocaproyl)であってよく、血液中で安定性を維持することができる。
本発明の一実施形態によれば、抗体のジスルフィド結合鎖を還元したときに露出するシステインを介してリンカー薬物がランダム結合または配列GGGGGGGCVIMを有する抗体末端結合ペプチドを導入することにより、リンカー薬物が結合することがある。
前記薬物(化学式(1)のDを含む)は、薬理学的効果を示す薬剤として抗体に結合することができ、具体的には、化学療法剤、毒素、マイクロRNA(miRNA)、siRNA、shRNAまたは放射性同位体であってよい。前記化学療法剤は、例えば、細胞毒性剤または免疫阻害剤であってよい。具体的には、マイクロツブリン阻害剤、有糸分裂阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、またはDNAインターカレーターとして機能することができる化学療法剤を含むことができる。また、がん、炎症または免疫疾患治療用の薬物を含むことができる。例えば、免疫調節化合物、抗がん剤、抗ウイルス剤、抗細菌剤、抗真菌剤、駆虫剤、またはこれらの組み合わせを含むことができる。
前記抗がん剤としては、例えば、マイタンシノイド、オリスタチン(MMAE、MMAFを含む)、アミノフテリン、アクチノマイシン、ブレオマイシン、タリソマイシン、カンプトテシン、N8-アセチルスパーミジン、1-(2-クロロエチル)-1、2-ジメチルスルホニルヒドラジド、エスパラマイシン、エトポシド、6-マカプトプリン、ドロスタチン、トリコテセン、カリケアミシン、タキソール(taxol)、タキサン、パクリタキセル(paclitaxel)、ドセタキセル(docetaxel)、メトトレキサート、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ドキソルビシン、メルファラン、ミトマイシンA、ミトマイシンC、クロラムブシル、デュオカマイシン、L-アスパラギナーゼ(L-asparaginase)、メルカプトプリン(mercaptopurine)、チオグアニン(thioguanine)、ヒドロキシ尿素(hydroxyurea)、シタラビン(cytarabine)、シクロホスファミド(cyclophosphamide)、イホスファミド(ifosfamide)、ニトロソ尿素(nitrosourea)、シスプラチン(cisplatin)、カルボプラチン(carboplatin)、ミトマイシン(mitomycin)、ダカルバジン(dacarbazine)、プロカルバジン(procarbazine)、トポテカン(topotecan)、窒素マスタード(nitrogen mustard)、シトキサン(cytoxan)、エトポシド(etoposide)、5-フルオロウラシル(5-fluorouracil)、CNU(bischloroethylnitrosourea)、イリノテカン(irinotecan)、カンプトテシン(camptothecin)、ブレオマイシン(bleomycin)、イダルビシン(idarubicin)、ダウノルビシン(daunorubicin)、ダクチノマイシン(dactinomycin)、プリカマイシン(plicamycin)、ミトキサントロン(mitoxantrone)、アスパラギナーゼ(asparaginase)、ビノレルビン(vinorelbine)、クロラムブシル(chlorambucil)、メルファラン(melphalan)、カルムスチン(carmustine)、ロムスチン(lomustine)、ブスルファン(busuLfan)、トレオスルファン(treosulfan)、デカバジン(decarbazine)、エトポシド(etoposide)、テニポシド(teniposide)、トポテカン(topotecan)、9-アミノカムプトテシン(9-aminocamptothecin)、クリスナトール(crisnatol)、ミトマイシンC(mitomycin C)、トリメトレキサート(trimetrexate)、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、チアゾプリン(tiazofurin)、リバビリン(ribavirin)、EICAR(5-ethynyl-1-beta-Dribofuranosylimidazole-4-carboxamide)、ヒドロキシ尿素(hydroxyurea)、デフロキサミン(deferoxamine)、フルクスリジン(flixuridine)、ドキシフルリジン(doxifluridine)、ラルチトレキセド(raltitrexed)、シタラビン(cytarabine(ara C))、シトシンアラビノシド(cytosine arabinoside)、フルダラビン(fludarabine)、タモキシフェン(tamoxifen)、ラロキシフェン(raloxifene)、メゲストロール(megestrol)、ゴセレリン(goserelin)、酢酸リュープロライド(leuprolide acetate)、フルタミド(flutamide)、バイカルタミド(bicalutamide)、EB1089、CB1093、KH1060、ベルテポルフィン(verteporfin)、フタロシアニン(phthalocyanine)、光増感剤Pe4(photosensitizer Pe4)、デメトキシ-ヒポクレリンA(demethoxy-hypocrellin A)、インターフェロン-α(Interferon-α)、インターフェロン-γ(Interferon-γ)、腫瘍壊死因子(tumor necrosis factor)、ゲムシタビン(Gemcitabine)、ベルケイド(velcade)、レバミド(revamid)、タラミド(thalamid)、ロバスタチン(lovastatin)、1-メチル-4-フェニルピリジニウムイオン(1-methyl-4-phenylpyridiniumion)、スタウロスポリン(staurosporine)、アクチノマイシンD(actinomycin D)、ダクチノマイシン(dactinomycin)、ブレオマイシンA2(bleomycin A2)、ブレオマイシンB2(bleomycin B2)、ペプロマイシン(peplomycin)、エピルビシン(epirubicin)、ピラルビシン(pirarubicin)、ゾルビシン(zorubicin)、ミトキサントン(mitoxantrone)、ベラパミル(verapamil)およびタプシガルギン(thapsigargin)、核酸分解酵素および細菌や動植物由来の毒素で構成される群から選択される1つ以上であってよいが、これらに限定されない。
前記抗炎症剤は、糖質コルチコイド受容体に結合して炎症や腫れを減らすステロイド剤、炎症を作るプロスタグランジンを合成するシクロオキシゲナーゼ(COX)に対応して痛みを緩和する非ステロイド性抗炎症剤(NSAIDs)または炎症細胞の活性化と移動を変える免疫選択的抗炎症誘導体(ImSAIDs)などが含まれるが、これらに限定されない。
前記免疫疾患治療薬として、アザチオプリン、クロラムブシル、シクロホスファミド、シクロスポリン、ミコフェノール酸塩、アザチオプリン(azathioprine)、またはメトトレキサート(methotrexate)を含むことができるが、これらに限定されない。
具体的には、免疫阻害剤としては、カルシニューリン阻害剤であるタクロリムス(tacrolimus)、遺伝子合成阻害剤であるミコフェノール酸モフェチル(mycopheno late mofetil)、または抗炎症ステロイドであるプレドニゾン(predni sone)などであってよいが、これらに限定されない。
場合によって、前記薬物は、リンカーおよびリンカー試薬上の親電子性基と共有結合を形成するために反応することができるアミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカバゾン、ヒドラジンカルボキシレート、およびアリールヒドラジド基で構成される群から選択される1つ以上の求核基を含むことができる。
本発明による具体的な実施例において、MC-vc-PABリンカーを介して、本発明による抗体またはその抗原結合断片を薬物、例えばオリスタチン(MMAE)と連結したADCを製作した。このようなADCは、目的とする細胞毒性を示すことを確認した。
キメラ抗原受容体(CAR)
本発明は、別の観点から、抗原結合部位を含む細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体(CAR)であり、前記細胞外ドメインの抗原結合部位は、前記抗体のscFvであることを特徴とするキメラ抗原受容体に関する。
キメラ抗原受容体(CAR)は、標的抗原およびその抗原を発現する細胞に対して免疫反応を誘導できるように設計された合成コンストラクトである。CARは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含む。がん細胞の表面に特異的に発現するがん細胞表面抗原を認識する受容体をコードする遺伝子を免疫細胞に導入し、がん細胞を死滅させることができる。がん細胞で特異的に発現する抗原と結合する受容体を含む免疫細胞を通じて、がん細胞のみを標的にして免疫反応を起こすことができる。前記CARは、本発明による抗FGFR3抗体のscFvを細胞外ドメインの抗原認識部位として含む。
第1世代CARでは、がん細胞で特異的に発現する抗原認識部位を含む細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含み、シグナル伝達ドメインとしてCD3ζのみを利用したが、がんに対する治療効果が微々たるものであり、持続時間が短いという問題があった。このような第1世代CARは、米国登録特許第6,319,494号に具体的に記載されており、本発明に参照として導入される。
免疫細胞に対する反応性向上のために補助刺激ドメイン(CD28またはCD137/4-1BB)とCD3ζを組み合わせた第2世代CARが製造されたが、第1世代CARと比べて体内に残存するCARを含む免疫細胞の数が著しく増加した。第2世代CARは、1つの補助刺激ドメインを利用したのに対し、第3世代CARでは、2つ以上の補助刺激ドメインを利用した。生体内CARを含む免疫細胞の拡張および持続性を達成するために、補助刺激ドメインを4-1BB、CD28またはOX40などと組み合わせることができる。第2世代CARは、米国登録特許第7,741,465号、第7,446,190号または第9,212,229号に具体的に記載されており、第3世代CARは、米国登録特許第8,822,647号に具体的に記載されており、本発明に参照として導入される。
第4世代CARでは、IL-12またはIL-15などサイトカインを暗号化する追加の遺伝子を含み、サイトカインのCARベースの免疫タンパク質がさらに発現できるようにし、第5世代CARは、免疫細胞強化のためにインターロイキン受容体チェーン、例えば、IL-2Rβをさらに含む。第4世代CARは、米国登録特許第10,316,102号、第5世代CARは、米国登録特許第10,336,810号に具体的に記載されており、本発明に参照として導入される。
一実施形態において、前記細胞外ドメインの抗原結合部位は、抗体のscFvである。抗体のVHおよびVLドメインを含むscFvにおいて、VHおよびVLドメインは、リンカーを介して接続することができる。配列番号133ないし配列番号157、配列番号203ないし配列番号215で構成される群から選択される1つ以上のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域は、リンカーを介して、配列番号158ないし配列番号182、配列番号216ないし配列番号219で構成される群から選択される1つ以上のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と連結することができる。
前記リンカーは、ペプチドリンカーであってよく、約10～25aaの長さを有することができる。例えば、グリシンおよび／またはセリンなどの親水性アミノ酸を含むことができる。
前記リンカーは、例えば、(GS)n、(GGS)n、(GSGGS)nまたは(GnS)m(n、mはそれぞれ1ないし10)を含むことができるが、前記リンカーは、例えば、(GnS)m(n、mはそれぞれ1ないし10)であることができる。具体的に前記リンカーは、GGGGSを含むことができ、例えば3回繰り返された配列番号185のGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSであることができる。
前記膜貫通ドメインは、天然または合成供給源に由来することができる。供給源が天然の場合、ドメインは任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来することができる。前記膜貫通ドメインは、T細胞受容体、CD28、CD3エプシロン、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、ICOSのアルファ、ベータまたはゼータ鎖を含むことができる。前記膜貫通ドメインを合成する場合、ロイシンやバリンなどの疎水性残基を含めるか、フェニルアラニン、トリプトファンおよびバリン含有ペプチドを各末端に含めることができる。2個ないし10個のアミノ酸の長さである短いオリゴまたはポリペプチドリンカーが、膜貫通ドメインとCARの細胞質シグナル伝達ドメインの間に結合を形成することができる。グリシン-セリンペプチドをリンカーとして利用することができる。
前記シグナル伝達ドメインは、CARが位置する免疫細胞の正常なエフェクター機能に対する活性化を誘導することができる。例えば、サイトカインの分泌を通じて細胞溶解活性化またはヘルパー活性化を誘導することができる。前記シグナル伝達ドメインは、エフェクター機能信号を形質導入するのに十分な細胞内シグナル伝達ドメインの切断された断片を含むことができる。
前記シグナル伝達ドメインとして、抗原受容体関与後にシグナル伝達を開始するために協調して作用するT細胞受容体(TCR)および共受容体の細胞質が含まれることがある。
TCR単独で生成されるシグナルは、T細胞の完全な活性化には不十分であり、共刺激シグナルが必要であることも知られている。したがって、T細胞の活性化には、TCRを介して抗原依存的な一次活性化を開始すること、および二次または共刺激シグナルを提供するように抗原依存的に作用することが関与している可能性がある。一次細胞質シグナル伝達配列は、刺激的または抑制的な方法でTCR複合体の一次活性化を調節する。刺激的に作用する一次細胞質シグナル伝達配列は、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフまたはITAMとして公知とするシグナル伝達モチーフを含むことができる。一次細胞質シグナル伝達配列を含むITAMの例としては、TCRゼータ、FcRガンマ、FcRベータ、CD3ガンマ、CD3デルタ、CD3エプシロン、CD5、CD22、CD79a、CD79b、およびCD66dを含むことができる。
場合によっては、CARの細胞質ドメインは、CD3ゼータ鎖部分および共刺激シグナル伝達領域を含むことができる。共刺激シグナル伝達領域は、共刺激分子の細胞内ドメインを含むCARの一部分を意味する。例えば、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、リンパ球機能関連抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、およびCD83と特異的に結合するリガンドなどが含まれることがある。CARの細胞質シグナル伝達部分内の細胞質シグナル伝達配列は、2個ないし10個のアミノ酸、例えば、グリシンとセリンを含むペプチドリンカーを介して連結することができる。
本発明は、別の観点から、前記キメラ抗原受容体(CAR)が導入された免疫細胞に関する。
前記免疫細胞は、免疫を誘導して目的とするがん治療効果を引き起こすことができるもので、例えば、T細胞、NK細胞、サイトカイン誘導キラー細胞(Cytokine Induced Killer cell、CIK)、活性化細胞傷害性Tリンパ球(Cytotoxic T Lymphocyte、CTL)、マクロファージ、腫瘍組織内浸潤T細胞(Tumor-Infiltrating Lymphocytes、TIL)、樹状細胞で構成される群から選択することができるが、これらに限定されない。
場合によっては、前記抗FGFR3抗体以外の抗体に対するscFvが細胞外ドメインの抗原結合部位として含まれるキメラ抗原受容体(CAR)がさらに導入されることがある。
前記抗FGFR3抗体以外の抗体としては、例えば、PD-1、PD-L1、BTLA、CTLA-4、VISTA、LAG3、TIM3、CD137(4-1BB)、VISTA、CD258(LIGHT)、TIGIT、CD134(OX40)、CD28、CD278(ICOS)、CD27、CD154(CD40L)、CD357(GITR)、CD30、DR3、CD226(DNAM1)、CD96、CD200、CD200R、Transferrin receptor、c-Met、EGFR、HER2、KDR、PDGFRa、NRP1、MARCOで構成される群から選択される1つ以上を標的とする抗体またはその抗原結合断片であることができる。
小胞体(vesicle)およびエクソソーム
本発明は、別の観点から、抗体またはその抗原結合断片がその外部に発現されるか、またはその内部に存在する小胞体に関する。
前記小胞体は、細胞膜を通過して目的タンパク質を細胞内に直接流入させることができるベシクロ、細胞膜および本発明による抗体またはその抗原結合断片を含む。
本発明による小胞体は、細胞膜および送達しようとする標的製剤を含む形態とすることができる。このような小胞体の例としては、米国特許公開第2018/0177725号に具体的に記載されており、本発明に参照として導入することができる。
前記小胞体は、例えば40～500nm、具体的には100～300nm、80～200nmまたは100nmの平均直径を有することができる。前記小胞体は、例えば、約100、200、300、400または500nmであることができる。
前記小胞体は、細胞膜および本発明による抗体またはその抗原結合断片以外に、ミトコンドリア、リソソームまたはゴルジ体など他の細胞内小器官を含まない場合がある。
前記小胞体は、膜を含めて内部と外部が区別されることがあり、前記抗体またはその抗原結合断片は、膜に存在し、外部に発現されたり、内部に発現されたり、膜から分離されて小胞体内部に存在することができる。
前記小胞体の膜は、抗体またはその抗原結合断片を適用しようとするターゲットによって異なる場合があり、本発明による抗体またはその抗原結合断片が結合するFGFR3が発現されるがん細胞に伝達するために、例えばがん細胞膜であってよいが、これに限定されない。
前記がん細胞は、例えば、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫(例えば、B細胞リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、慢性リンパ性白血病、上皮細胞リンパ腫、辺縁帯B細胞リンパ腫、バケットリンパ腫、リンパ形質細胞リンパ腫、母細胞性白血病)、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、または急性リンパ球性白血病を引き起こすがん細胞を含むことができる。
また、固形がん例えば、卵巣がん、直腸がん、胃がん、精巣がん、肛門部がん、子宮がん、結腸がん、直腸がん、腎細胞がん腫、肝臓がん、肺の非小細胞がん腫、小腸がん、食道がん、黒色腫、カポジ肉腫、内分泌系がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部がん、皮膚または案内悪性黒色腫、子宮がん、脳幹神経膠腫、下垂体腺がん、表皮状がん、子宮頸部扁平上皮がんのがん腫、卵管がん、子宮内膜がん、膣がん、軟部組織肉腫、尿道がん、外陰部がん、陰茎がん、膀胱がん、腎臓がんまたは尿管がん、腎盂がん、脊椎腫瘍、中枢神経系(CNS)の新生物、原発性CNSリンパ腫、腫瘍血管新生、前記がんの転移病変を引き起こすがん細胞を含むことができる。
さらに、例えば、膠芽腫、肺がん、膀胱がん、口腔がん、頭頸部扁平上皮がん、胆嚢がんまたは子宮頸がんを引き起こすがん細胞を含むことができる。
前記小胞体は、例えばエクソソームであることができる。前記エクソソームは、細胞間シグナル伝達をするために、タンパク質、DNA、RNAなどを持って細胞外に分泌される50～200 nmサイズの膜構造の小さなベシクルを意味する。
エクソソームには細胞内の様々なタンパク質、DNA、RNAなどが含まれている。これらのエクソソームに含まれて細胞外に分泌される物質は、細胞膜との融合(fusion)あるいはエンドサイトーシス(endocytosis)によって他の細胞内に再び流入し、細胞間のコミュニケーションツールとしての役割を果たすこともある。また、これらのエクソソームに含まれて細胞外に分泌される物質を分析し、特定の疾患の診断に利用することができる。
本発明により、前記抗体またはその抗原結合断片は、エクソソームの外部に発現されるか、またはその内部に存在する。前記エクソソームは膜構造を有しており、内部および外部が区分され、エクソソーム膜に存在し、前記抗体またはその抗原結合断片が存在し、外部に発現されるか、内部に発現されるか、または膜から分離されてエクソソーム内部に存在することができる。
前記エクソソームは、多様な標的化特性を有する免疫細胞/幹細胞由来の人工エクソソームに特定の薬物を搭載し、人体内の特定の病変組織に標的化して伝達することにより、他の組織に与える副作用は大幅に減少させ、少量の薬物でも治療効能を最大化できる形態であり、例えば国際公開特許第WO2011/002239号に具体的に記載されており、本発明に参照として導入される。
前記抗体またはその抗原結合断片がエクソソーム膜に存在し、外部に発現されたり、内部に発現される場合、前記抗体またはその抗原結合断片をエクソソームの特異的マーカーに融合させた形で発現させ、エクソソーム内部に前記抗体またはその抗原結合断片を捕捉することができる。前記エクソソーム膜がFGFR3が発現される細胞の細胞膜に融合される場合、前記抗体またはその抗原結合断片が細胞に伝達されることができる。
前記エクソソーム表面に前記抗体またはその抗原結合断片がディスプレイすることがある。例えば、PTGFRN(Prostaglandin F2 Receptor Negative Regularator)タンパク質をエクソソーム表面に発現させ、PTGFRNタンパク質に他のターゲットタンパク質を融合させることができる。このようなエクソソームは、国際公開特許第WO2014/076137号、第WO2018/09119号などに具体的に記載されており、本発明に参照として導入される。
前記抗体またはその抗原結合断片が内部に含まれるエクソソームの場合、光特異的結合タンパク質を使用して、一時的に前記抗体またはその抗原結合断片を前記マーカータンパク質と結合させて製造することができる。前記エクソソームの内部に目的タンパク質が膜に結合されていない状態で捕捉することができる。前記エクソソームが内在化によって細胞内に伝達されたとき、エクソソームが分解され、前記抗体またはその抗原結合断片が細胞に伝達されることができる。
前記抗体またはその抗原結合断片が内部に存在できるようにする工程は、国際公開特許第WO2016/178532号および第WO2018/062973号などに具体的に記載されており、本発明に参照として導入される。
例えば、光特異的結合タンパク質であるCIBNとCRY2を利用することができ、具体的に前記CIBNは、前記マーカータンパク質の1つであるCD9と融合された形で発現されるようにし、前記CRY2は、前記抗体またはその抗原結合断片と融合された形で発現されるように、これらの融合タンパク質をコードする遺伝子をエクソソーム生産細胞に導入することができる。前記エクソソーム生産細胞で発現されたCIBN-CD9融合タンパク質は、CD9によりエクソソームに含まれるが、この時、前記細胞に青色光LED照明を照射すると、前記エクソソーム生産細胞で発現された目的タンパク質-CRY2融合タンパク質のCRY2ドメインがCD9に融合されたCIBNドメインに結合するので、目的タンパク質-CRY2-CIBN-CD9形態の可逆的に誘導された融合タンパク質が形成され、このような融合タンパク質は、CD9によりエクソソーム内部に含まれることができる。このように目的タンパク質が内部に含まれたエクソソームが生産された後、前記青色光LED照明をこれ以上照射しなければ、CIBN-CRY2結合は解除され、目的タンパク質がエクソソームの細胞膜に結合されない状態でエクソソーム内部に含まれることができる。
治療用組成物
本発明は、別の観点から、前記抗体またはその抗原結合断片、前記抗体またはその抗原結合断片を含む二重または多重特異性抗体、前記抗体またはその抗原結合断片を含む抗体薬物複合体、前記抗体またはその抗原結合断片を含むキメラ抗原受容体、または前記キメラ抗原受容体を含む免疫細胞を含むがん、炎症または免疫疾患治療用組成物に関する。
本発明は、例えば、(a)本発明によるFGFR3に対する抗体またはその抗原結合断片、前記抗体またはその抗原結合断片を含む二重または多重特異性抗体、前記抗体またはその抗原結合断片を含む抗体薬物複合体、前記抗体またはその抗原結合断片を含むキメラ抗原受容体、または前記抗体またはその抗原結合断片を含むキメラ抗原受容体を含む免疫細胞の製薬学的な有効量、および(b)製薬学的に許容される担体を含む、がんの予防または治療用の製薬学的組成物であることができる。本発明はまた、本発明によるFGFR3に対する抗体またはその抗原結合断片、前記抗体またはその抗原結合断片を含む二重または多重特異性抗体、前記抗体またはその抗原結合断片を含む抗体薬物複合体、前記抗体またはその抗原結合断片を含むキメラ抗原受容体、または前記キメラ抗原受容体を含む免疫細胞をがん患者に投与する工程を含むがんの予防または治療方法であってよい。
「予防」は、本発明による組成物の投与によりがんの成長を抑制させたり、進行を遅らせる全ての行為を意味し、「治療」は、がんの進行の抑制、腫瘍の軽減またはがんの除去を意味する。
前記がんは、例えば、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫(例えば、B細胞リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、慢性リンパ性白血病、外皮細胞リンパ腫、辺縁帯B細胞リンパ腫、バケットリンパ腫、リンパ形質細胞リンパ腫、母細胞性白血病)、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、または急性リンパ球性白血病を含む。
前記がんは、例えば、卵巣がん、直腸がん、胃がん、精巣がん、肛門部がん、子宮がん、結腸がん、直腸がん、腎細胞がん腫、肝臓がん、肺の非小細胞がん腫、小腸がん、食道がん、黒色腫、カポジ肉腫、内分泌系がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部がん、皮膚または案内悪性黒色腫、子宮がん、脳幹神経膠腫、下垂体腺がん、表皮状がん、子宮頸部扁平上皮がんのがん腫、卵管がん、子宮内膜がん、膣がん、軟部組織肉腫、尿道がん、外陰部がん、陰茎がん、膀胱がん、腎臓がんまたは尿管がん、腎盂がん、脊椎腫瘍、中枢神経系(CNS)の新生物、原発性CNSリンパ腫、腫瘍血管新生、前記がんの転移病変、または前記がんの組み合わせを含む。
前記がんは、例えば、膠芽腫、肺がん、膀胱がん、口腔がん、頭頸部扁平上皮がん、胆嚢がんまたは子宮頸がんであることができる。特に、膠芽腫の場合、前記抗体またはその抗原結合断片が脳および脊椎とその周辺の循環系の間に存在する脳の毛細血管内皮細胞膜内にタイト結合(junction)によって形成された関門である血液脳関門(blood-brain barrier)を通過する必要がある。BBB通過のために伝達体と連結して使用することができる。BBBを介して薬物を伝達するために、例えばブラジキニン、またはHIFU(Hign density foucues ultrasound)などの方法を使用してBBBの浸透圧を破壊する方法がある。また、細胞に内在するグルコースおよびアミノ酸伝達体、インスリンまたはトランスフェリンの受容体媒介トランスサイトーシスなどの伝達システムの使用、または糖タンパク質の排出輸送系トランスポーター(efflux transporter)を遮断することが含まれる。
前記炎症は、例えば、慢性閉塞性肺疾患、慢性消化器疾患、結膜炎、耳炎、アレルギー性鼻炎、歯肉炎、舌炎、気管支炎、胃食道逆流症(GERD)、食道炎、胃炎、腸炎、消化性潰瘍、炎症性腸疾患(IBD)、クローン病、過敏性腸症候群(IBS)、腸炎やアレルギー、尿道炎、膀胱炎、膣炎、直腸肛門炎、好酸球性胃腸炎またはリウマチ性関節炎である可能性があるが、これらに限定されない。
前記免疫疾患は、例えば、後天性免疫不全、自己免疫疾患、全身性紅斑性嚢胞、強皮症、シェーグレン症候群、多発性筋炎と皮膚筋炎、リウマチ性多発性筋肉痛、側頭動脈炎、結節性多発性動脈炎、またはベーチェット症候群などである。
本発明の組成物に含まれる製薬学的に許容される担体は、製剤時に通常用いられるものであり、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシ安息香酸塩、プロピルヒドロキシ安息香酸塩、タルク、ステアリン酸マグネシウムおよびミネラルオイル等を含むが、これらに限定されない。本発明の組成物は、前記成分に加えて、潤滑剤、湿潤剤、甘味料、香料、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。
本発明の製薬学的組成物は、経口または非経口で投与することができ、非経口投与の場合は、静脈内注入、皮下注入、筋肉内注入、腹腔内注入、内皮投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与および直腸内投与などで投与することができる。
経口投与の場合、タンパク質またはペプチドは消化されるため、経口用組成物は、活性薬剤をコーティングするか、または胃での分解から保護するように製剤化する必要がある。さらに、製薬学的組成物は、活性物質が標的細胞に移動できる任意の装置によって投与することができる。
本発明による組成物の適切な投与量は、製剤化方法、投与方法、患者の年齢、体重、性別、病状、食物、投与時間、投与経路、排泄速度および反応感受性などの要因によって多様であり、通常、熟練した医師は、希望の治療または予防に効果的な投与量を容易に決定および処方することができる。例えば、本発明の製薬学的組成物の1日投与量は、0.0001～100mg／kgである。本明細書において、「製薬学的有効量」という用語は、がんまたは自己免疫疾患を予防または治療するのに十分な量を意味する。
本発明の製薬学的組成物は、当該発明が属する技術分野で通常の知識を有する者が容易に実施できる方法により、製薬学的に許容される担体および/または賦形剤を利用して製剤化することにより、単位容量の形で製造されるか、または多容量容器内に内包させて製造することができる。この時、製剤はオイルまたは水性媒体中の溶液、懸濁液または乳化液の形態であったり、エキス剤、酸剤、坐剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤またはカプセル剤の形態であることもでき、分散剤または安定化剤をさらに含むことができる。
併用治療
本発明は、免疫細胞および抗FGFR3抗体以外の薬物を含む併用治療用組成物に関する。
一実施形態において、前記抗FGFR3抗体以外の薬剤は、化学療法剤または抗FGFR3抗体以外の抗体を含むことができる。
前記薬物は、マイタンシノイド、オリスタチン(MMAE、MMAFを含む)、アミノフテリン、アクチノマイシン、ブレオマイシン、タリソマイシン、カンプトテシン、N8-アセチルスパーミジン、1-(2-クロロエチル)-1、2-ジメチルスルホニルヒドラジド、エスパラマイシン、エトポシド、6-メルカプトプリン、ドロスタチン、トリコテセン、カリケアミシン、タキソール、タキサン、パクリタキセル、ドセタキセル、メトトレキサート、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ドキソルビシン、メルファラン、ミトマイシンA、ミトマイシンC、クロラムブシル、デュオカミシン、L-アスパラギナーゼ(L-asparaginase)、メルカプトプリン(mercaptopurine)、チオグアニン(thioguanine)、ヒドロキシ尿素(hydroxyurea)、シタラビン(cytarabine)、シクロホスファミド(cyclophosphamide)、イホスファミド(ifosfamide)、ニトロソ尿素(nitrosourea)、シスプラチン(cisplatin)、カルボプラチン(carboplatin)、ミトマイシン(mitomycin)、ダカルバジン(dacarbazine)、プロカルバジン(procarbazine)、トポテカン(topotecan)、窒素マスタード(nitrogen mustard)、シトキサン(cytoxan)、エトポシド(etoposide)、5-フルオロウラシル(5-fluorouracil)、CNU(bischloroethylnitrosourea)、イリノテカン(irinotecan)、カンプトテシン(camptothecin)、ブレオマイシン(bleomycin)、イダルビシン(idarubicin)、ダウノルビシン(daunorubicin)、ダクチノマイシン(dactinomycin)、プリカマイシン(plicamycin)、ミトキサントロン(mitoxantrone)、アスパラギナーゼ(asparaginase)、ビノレルビン(vinorelbine)、クロラムブシル(chlorambucil)、メルファラン(melphalan)、カルムスチン(carmustine)、ロムスチン(lomustine)、ブスルファン(busuLfan)、トレオスルファン(treosulfan)、デカバジン(decarbazine)、エトポシド(etoposide)、テニポシド(teniposide)、トポテカン(topotecan)、9-アミノカンプトテシン(9-aminocamptothecin)、クリスナトール(crisnatol)、ミトマイシンC(mitomycin C)、トリメトレキサート(trimetrexate)、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、チアゾプリン(tiazofurin)、リバビリン(ribavirin)、EICAR(5-ethynyl-1-beta-Dribofuranosylimidazole-4-carboxamide)、ヒドロキシ尿素(hydroxyurea)、デフロキサミン(deferoxamine)、フルクスリジン(flixuridine)、ドキシフルリジン(doxifluridine)、ラルチトレキセド(raltitrexed)、シタラビン(cytarabine(ara C))、シトシンアラビノシド(cytosine arabinoside)、フルダラビン(fludarabine)、タモキシフェン(tamoxifen)、ラロキシフェン(raloxifene)、メゲストロール(megestrol)、ゴセレリン(goserelin)、酢酸リュープロライド(leuprolide acetate)、フルタミド(flutamide)、バイカルタミド(bicalutamide)、EB1089、CB1093、KH1060、ベルテポルフィン(verteporfin)、フタロシアニン(phthalocyanine)、光増感剤Pe4(photosensitizer Pe4)、デメトキシ-ハイポクレリンA(demethoxy-hypocrellin A)、インターフェロン-α(Interferon-α)、インターフェロン-γ(Interferon-γ)、腫瘍壊死因子(tumor necrosis factor)、ゲムシタビン(Gemcitabine)、ベルケイド(velcade)、レバミド(revamid)、タラミド(thalamid)、ロバスタチン(lovastatin)、1-メチル-4-フェニルピリジニウムイオン(1-methyl-4-phenylpyridiniumion)、スタウロスポリン(staurosporine)、アクチノマイシンD(actinomycin D)、ダクチノマイシン(dactinomycin)、ブレオマイシンA2(bleomycin A2)、ブレオマイシンB2(bleomycin B2)、ペプロマイシン(peplomycin)、エピルビシン(epirubicin)、ピラルビシン(pirarubicin)、ゾルビシン(zorubicin)、ミトキサントロン(mitoxantrone)、ベラパミル(verapamil)およびタプシガルギン(thapsigargin)、核酸分解酵素および細菌または動植物由来の毒素で構成される群から選択される1つ以上である。
一実施形態において、前記抗FGFR3抗体以外の抗体は、例えば、PD-1、PD-L1、BTLA、CTLA-4、VISTA、LAG3、TIM3、CD137(4-1BB)、VISTA、CD258(LIGHT)、TIGIT、CD134(OX40)、CD28、CD278(ICOS)、CD27、CD154(CD40L)、CD357(GITR)、CD30、DR3、CD226(DNAM1)、CD96、CD200、CD200R、Transferrin receptor、c-Met、EGFR、HER2、KDR、PDGFRa、NRP1、MARCOで構成される群から選択される1つ以上を標的とする抗体またはその抗原結合断片であることができる。
本発明は、抗体またはその抗原結合断片と、以下で構成される群から選択される1つ以上を含む併用治療用組成物に関する。
(i) 免疫細胞、
(ii) 抗FGFR3抗体以外の抗体に対するscFvを細胞外ドメインとして含む抗原受容体(CAR)を含む免疫細胞、および
(iii) 免疫チェックポイント阻害剤(Immune checkpoint inhibitor)。
また、本発明は、前記免疫細胞エンゲージ(immune cell engage)二重特異性または多重特異性抗体と、以下で構成される群から選択される1つ以上を含む併用治療用組成物に関する。
(i) 免疫細胞、
(ii) 抗FGFR3抗体以外の抗体に対するscFv断片を細胞外ドメインとして含む抗原受容体(CAR)を含む免疫細胞、および
(iii) 免疫チェックポイント阻害剤(Immune checkpoint inhibitor)。
前記免疫細胞は、免疫治療、例えば免疫を誘導して目的とするがん治療効果を引き起こすことができるもので、例えば、T細胞、NK細胞、サイトカイン誘導キラー細胞(Cytokine Induced Killer cell、CIK)、活性化細胞傷害性Tリンパ球(Cytotoxic T Lymphocyte、CTL)、マクロファージ、腫瘍組織内浸潤T細胞(Tumor-Infiltrating Lymphocytes、TIL)、樹状細胞で構成される群から選択することができるが、これらに限定されない。
前記抗FGFR3抗体以外の抗体は、FGFR3以外の標的をターゲットとする抗体で、例えば、LAG3、TIM3、CD137(4-1BB)、VISTA、CD258(LIGHT)、TIGIT、CD134(OX40)、CD28、CD278(ICOS)、CD27、CD154(CD40L)、CD357(GITR)、CD30、DR3、CD226(DNAM1)、CD96、CD200、CD200R、Transferrin receptor、c-Met、EGFR、HER2、KDR、PDGFRa、NRP1、またはMARCOに結合する抗体またはその抗原結合断片であってもよいが、これらに限定されない。
本発明は、抗体またはその抗原結合断片と、以下で構成される群から選択される1つ以上を含む併用治療用組成物に関する。
(i) 免疫細胞、
(ii) 抗FGFR3抗体以外の抗体に対するscFvを細胞外ドメインとして含む抗原受容体(CAR)を含む免疫細胞、および
(iii) 免疫チェックポイント阻害剤(Immune checkpoint inhibitor)。
また、本発明は、前記免疫細胞エンゲージ(immune cell engage)二重特異性または多重特異性抗体と、以下で構成される群から選択される1つ以上を含む併用治療用組成物に関する。
(i) 免疫細胞、
(ii) 抗FGFR3抗体以外の抗体に対するscFv断片を細胞外ドメインとして含む抗原受容体(CAR)を含む免疫細胞、および
(iii) 免疫チェックポイント阻害剤(Immune checkpoint inhibitor)。
前記免疫細胞は、免疫治療、例えば免疫を誘導して目的とするがん治療効果を引き起こすことができるもので、例えば、T細胞、NK細胞、サイトカイン誘導キラー細胞(Cytokine Induced Killer cell、CIK)、活性化細胞傷害性Tリンパ球(Cytotoxic T Lymphocyte、CTL)、マクロファージ、腫瘍組織内浸潤T細胞(Tumor-Infiltrating Lymphocytes、TIL)、樹状細胞で構成される群から選択することができるが、これらに限定されない。
前記抗FGFR3抗体以外の抗体は、FGFR3以外の標的をターゲットとする抗体で、例えばLAG3、TIM3、CD137(4-1BB)、VISTA、CD258(LIGHT)、TIGIT、CD134(OX40)、CD28、CD278(ICOS)、CD27、CD154(CD40L)、CD357(GITR)、CD30、DR3、CD226(DNAM1)、CD96、CD200、CD200R、Transferrin receptor、c-Met、EGFR、HER2、KDR、PDGFRa、NRP1、またはMARCOに結合する抗体またはその抗原結合断片であってよいが、これらに限定されない。
前記免疫チェックポイント阻害剤は、抗原提示細胞(APC、antigen presenting cell)と免疫細胞、例えばT細胞が出会う部位でT細胞抑制シグナルを遮断し、T細胞の活性化を誘導することができる製剤を意味する。前記免疫チェックポイント阻害剤は、例えば、PD-1、PD-L1、BTLA、CTLA-4、VISTA、LAG3、TIM3、CD137(4-1BB)、CD258(LIGHT)、TIGIT、CD134(OX40)、CD28、CD278(ICOS)、CD27、CD154(CD40L)、CD357(GITR)、CD30、DR3、CD226(DNAM1)、CD96、CD200、またはCD200Rを標的とする薬物であってよいが、これらに限定されない。
前記併用投与対象の第1成分および第2成分のそれぞれは、同時に投与することができる。また、前記併用投与対象の第1成分および第2成分それぞれは、一定時間間隔をおいて別々に投与することもできる。前記併用投与対象のうち、第1成分投与前または後に第2成分を別々に投与することができる。
コンパニオン診断(Companion diagnostics、CDx)
コンパニオン診断は、特定の薬物治療に対する患者の反応性を予測するための分子診断技術の一種で、薬物の適用において、適用対象患者の選別基準を提示し、これに適合する診断、予後および予測バイオマーカーの特異度および感度を考慮して、患者に適した薬物を処理できるようにする基準を提示することができる。
抗がん薬物の場合、反応を示す患者では高い効果を示すが、反応する患者の割合が低いため、効果を示す患者を選別することが重要であり、コンパニオン診断を通じて抗がん薬物に反応する患者を選別し、患者の治療効率を高めることができる。
本発明は、別の観点から、FGFR3とTACC3の融合遺伝子が増幅されているか、融合遺伝子に変異があるか、融合遺伝子が過剰発現しているか、または融合遺伝子が恒常的発現(constitutive activation)していることが確認されたがんを治療するための、前記抗体またはその抗原結合断片、前記抗体またはその抗原結合断片を含む二重または多重特異性抗体、抗体薬物複合体、キメラ抗原受容体、または前記キメラ抗原受容体を含む免疫細胞を含む、がん治療用組成物に関する。
本発明はまた、患者由来のサンプルにおいてFGFR3とTACC3の融合遺伝子が増幅されているか、融合遺伝子に変異があるか、融合遺伝子が過剰発現しているか、または融合遺伝子が恒常的発現(constitive activation)していることが確認された場合、前記抗体またはその抗原結合断片、前記抗体またはその抗原結合断片を含む二重または多重特異性抗体、抗体薬物複合体、キメラ抗原受容体、または前記キメラ抗原受容体を含む免疫細胞を投与する工程を含むがん治療方法に関する。
前記サンプルは、患者の組織または体液から得られる生物学的試料を意味する。組織サンプルの供給源は、凍結および／または保存された臓器、組織サンプル、生検または吸引物に由来するような固形組織、血液または任意の血液成分(例えば、血清、血漿)、骨髄または任意の骨髄成分、尿、脳脊髄液、全血、血漿および血清などの体液であり得る。サンプルは、非細胞画分(例えば、尿、血漿、血清または他の非細胞体液)を含むことができる。サンプルは、体液、例えば、血液(例えば、全血)を含むことができる。具体的には、前記サンプルは、患者から得られる全血サンプル、全骨髄サンプル、全末梢血サンプル、または全腫瘍サンプルであり得る。前記「全」サンプルは、当該サンプルから除去または分離された成分(例えば、細胞)が実質的にないサンプルである。前記サンプル、例えば血液サンプルは、使用する前に希釈(例えば、生理的融和緩衝液または培地によって)されることがある。他の具体例において、「全」サンプル、例えば、全組織サンプルまたは全腫瘍サンプルは、起源組織由来の微小環境を実質的に維持し、例えば、腫瘍または免疫微小環境の構造を実質的に維持することができる。具体的には、サンプル、例えば腫瘍サンプルは、より小さな断片に加工(例えば、粉砕、圧縮、混合、粉砕など)され、希釈(例えば、生理的融和性緩衝液または培地によって)されることがある。
前記遺伝子の発現確認は、当該遺伝子の存在有無と発現程度を確認する過程で、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって行うことができ、場合によっては、転写ポリメラーゼ反応(RT-PCR)、競争的逆転写ポリメラーゼ反応(Competitive RT-PCR)、リアルタイム逆転写ポリメラーゼ反応(Real-time RT-PCR)、RNase保護分析法(RPA; RNase protection assay)、ノーザンブロッティング(Northern blotting)、DNAチップを使用して行うことができる。
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、プライマーを利用して遺伝子増幅反応を通じて行うことができる。マルチプルPCR、リアルタイムPCR、分別ディスプレイPCR(differential display PCR: DD-PCR)、cDNA末端の迅速増幅(rapid amplification of cDNA ends: RACE)、インバースポリメラーゼ連鎖反応(inverse polymerase chain reaction: IPCR)、ベクトレット(vectorette)PCRおよびTAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)などが実行することができる。
遺伝子コードによるタンパク質発現の有無を検出することもできる。前記遺伝子から発現されたタンパク質の存在有無と発現の程度を確認する過程である。前記タンパク質に対して特異的に結合する抗体、オリゴペプチド、リガンド、PNA(Peptide nucleic acid)またはアプタマー(aptamer)などを用いてタンパク質の量を確認することができる。
このための分析方法としては、ウエスタンブロット、エライザ(enzyme linked immunosorbent assay、ELISA)、放射線免疫分析(RIA：Radioimmunoassay)、放射免疫拡散法(radioimmunodiffusion)、Ouchterlony免疫拡散法、ロケット(rocket)免疫電気泳動、 組織免疫染色、免疫沈殿分析法(Immunoprecipitation Assay)、補体固定分析法(Complement Fixation Assay)、流動細胞分析(Fluorescence Activated Cell Sorter、FACS)、タンパク質チップ(protein chip)を利用した方法などが含まれる。
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、もっぱら本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例によって限定されるものと解釈されないことは、当分野において通常の知識を有する者にとっては明らかであろう。
実施例1：FGFR3に特異的なファージ抗体選別、細胞パンニング(ファージディスプレイ技術)
本研究グループは、synthetic scFv phage library {(1)Bai, Xuelian & Kim, Jihye & Kang, Seungmin & Kim, Wankyu & Shim, Hyunbo. (2015).A Novel Human scFv Library with Non-Combinatorial Synthetic CDR Diversity. PloS one.10. e0141045. 10.1371/journal.pone.0141045., (2) Yang, Hye & Kang, Kyung & TCW, Julia & Shim, Hyunbo. (2009).6種類の多様なCDRと高い機能的多様性を有する大型合成ヒトscFvライブラリーの構築. Molecules and Cells.27. 225-35. 10.1007/s10059-009-0028-9.}を使用して、細胞内在化機能を持つ抗体を選別するためのcell panning法を行った。FGFR3過剰発現細胞(682T)、FGFR3低発現細胞(626T)をRPKM分析値とwestern blottingによるタンパク質発現確認を通じて検証し、該当細胞を選定した。予め回収したphage library stockをFGFR3低発現細胞に処理して4度で1時間反応させた後、遠心分離機を通して上層液だけを回収して予め準備したFGFR3過剰発現細胞に処理して4度で1時間反応させた。その後、培養培地を通して非特異的なphageを除去し、37度で30分培養して細胞内在化された抗体を回収した。回収方法は、非特異的な細胞表面結合phageを除去するためにlow pH bufferを通じて洗浄をして除去した後、lysis bufferを通じて細胞を溶かし、細胞内部にあるFGFR3特異的結合を通じた細胞内在化機能を持つ抗体を回収してe.coliに感染させた。感染させたe.coliは再び増幅し、同じcell panning方法を2回追加進行して、合計3回cell panningを進行した後、ELISA screeningを進行してFGFR3特異的な抗体を選別した。当該実験模式図は、図1aの通りである。
実施例2：FGFR3に特異的なファージ抗体選別、抗原固定パンニング(ファージディスプレイ技術)
同じphage libraryを使用して、通常広く使用されているimmobilized antigen panningを行った。FGFR3-IIIc/Fc抗原とnegative/Fc抗原をimmune-tubeにそれぞれ3ug/mlコーティング(overnight、4度)し、予め回収したphage library stockをまずpre-blocked negative/Fc抗原に室温で1時間反応させた。その後、上層液を回収し、pre-blocked FGFR3-IIIc/Fc tubeに室温で1時間反応させた。その後、PBSTで洗浄して非特異的なphageを除去した後、low pH bufferを通してFGFR3-lllc/Fc抗原に特異的なphageを回収した。これをe.coliに感染させた後、増幅過程を経て同じpanning方法を3回追加進行し、合計4回bio-panningを進行した後、ELISA screeningを進行してFGFR3特異的な抗体を選別した。当該実験模式図は、図1bの通りである。
実施例3：FGFR3に特異的なファージ抗体選別、磁気ビーズパンニング、半自動パンニング(ファージディスプレイ技術)
同じphage libraryを使用して、semi-automation bio-panningを行った。当該方法は、magnetic beads based panningで、従来通常使用されていたmanual方式でbiotinylationされたターゲット抗原にphageを処理し、結合過程を経た後、カラムまたはmagnetic chamberなどを利用して洗浄および抗原特異的なphageを回収する方式である(図1c)。本発明者は、このような一連の過程を半自動化システムに導入して進行した。Kingfisher Flex(Thermo scientific)機器にphage library stock、biotinylated FGFR3-IIIc/Fc antigen、streptavidin-M280 dynabeads、0.1% PBST wash buffer、elution bufferなどのreagentをKingfisher Flex 24 deep wellに分注し、予め製作されたsoftware protocol(BindItTM Software)を通じてbio-panningを行った(図1d)。3～4回bio-panningを繰り返し、FGFR3抗原に特異的に結合するphageを増幅して回収した。これを使用して、ELISA screeningを行い、FGFR3特異的な抗体を選別した。
実施例4：親和性ELISAベースの抗体スクリーニング
各bio-panning方法の産出物は、e.coli宿主細胞(TG1)状態であり、これらを単クローンでAgar LB/Ampicillin培地に塗抹して確保し、任意にSB/ampicillin培養培地に接種して培養した(3時間、37度)。その後、scFv-pIIIタンパク質の誘導のために、各wellに最終濃度1mM IPTGを処理して30度、overnight培養した。翌日、培養96well plateは遠心分離機を使用して上層液は除去し、e.coliだけを回収して1x TES溶液(20% w/v sucrose、50mM Tris、1 mM EDTA、pH 8.0)を処理して4度で1時間以上懸濁し、その後、さらに0.2x TES溶液を処理して2時間以上懸濁し、e.coli周辺細胞質部位に存在するscFv-pIIIタンパク質を抽出した。あらかじめ一日前にFGFR3組換えタンパク質とネガティブ組換えタンパク質を96well plateに1ug/mlでovernight、4度の条件でコーティングしたplateに抽出したscFv-pIIIを各plateに処理して常温で1時間反応させた。反応させた後、PBSTを通じて洗浄を行い、HRPが結合された抗HA抗体を1時間処理し、再び洗浄過程を経て発色反応(TMB substrate)を誘導してO.D値を測定した(450nm)。FGFR3組換えタンパク質/ negative組換えタンパク質のO.D ratioを計算し、FGFR3特異的なscFv-pIIIクローンを選別した。選別基準は相対的なratioで変換計算(positive / negative)し、値が2以上のクローンに対して抗体配列分析を行った。
患者由来細胞を利用したbio-panningの場合には、完了したoutputファージに対して564個の単クローンを取り、ELISAスクリーニングを行い、そのうち10個のpositive cloneが確認された(図2a)。抗原固定bio-panningの場合には、2回の別々の実験進行でそれぞれ658個の単一クローンに対するELISAスクリーニングを行い(合計1,316個)、そのうち328個のpositiveクローンが確認された(図2b)。磁気基盤半自動bio-panning完了後、376個のクローンをELISAスクリーニングを行い、26個のpositiveクローンが確認された(図2c)。
実施例5：抗体配列解析
Affinity ELISA screening分析の結果、O.D ratio(FGFR3抗原/Negative抗原)が2以上のクローンに対する抗体配列を分析した。14ml round tubeに選別したクローンのphagemid vectorを持つe.coliをLB/ampicillin培地に培養して育てた後、DAN prep(mini-prep)を行ってplasmid DNAを抽出した。抽出したDNAは、phagemid vectorのscFv配列がある部分に合わせてprimerを使用して分析した。
各方法による配列分析の結果、細胞パニングは2種の抗体固有配列、抗原固定パニングは26種の抗体固有配列、半自動パニングの場合は8種の抗体固有配列が分析された。これを基に、それぞれの該当するクローンに対してscFvの形で繰り返しELISAを行った結果、最終的に25種のFGFR3特異的結合能を示すクローンが確認され、重鎖、軽鎖に対する配列を分析した。
Figure 2024502386000002
Figure 2024502386000003
Figure 2024502386000004
Figure 2024502386000005
Figure 2024502386000006
Figure 2024502386000007
実施例6：scFv抗体切片からIgGへの変換および抗体生産
配列分析に基づいて確認したFGFR3抗体配列をもとに、本研究グループで保有している重鎖生産ベクターと軽鎖生産ベクターにクローニングを行い、IgG生産ベクターを構築した。構築した生産ベクターを基にmammalian protein expression system(Expi293F)を使用してFGFR3抗体を生産し、AKTA prime plus装置を基に親和性クロマトグラフィーカラムであるMabSelect SuReTMで高純度抗体を回収および精製した。完成された試料は、SDS-PAGE、size-exclusion chromatography HPLC(SEC-HPLC)分析に基づいて高純度試料特性を分析した(図3a、3b)。
実施例7：FGFR3抗体の抗原結合能評価; ELISA
生産された抗体(IgG)のFGFR3抗原に対する結合能を確認するためにAffinity ELISAを実施した。96well plateにFGFR3抗原を1~2 ug/mlでコーティング(4度、overnight)した後、3% skim milk(PBS)で blockingを行った(室温、1時間)。その後、あらかじめ連続希釈した抗体サンプルをduplicate、triplicate処理して室温で1時間反応させた。その後、PBST洗浄を2~3回行った後、HRPが結合されたanti-human Fab抗体をskim milkに希釈して処理し(室温、1時間)、再びPBST洗浄をして発色反応(TMB substrate)を行った。その後、O.D 450nmで測定して値を確認した。
同じ方法でHuman FGFR3 IIIb(1264-FR-050、R&D)、IIIc(766-FR-050、R&D)、mouse FGFR3(9089-FR、R&D)、monkey FGFR3(90313-C02H、sino biological)抗原で確認した。
各抗体に対する結合能は、濃度別に確認し(図4a~4d)、O.D値は相対値に変換してグラフ化した。EC50に基づいてKD valueを計算した(表5a~5d)。
実施例8：FGFR3抗体の抗原結合能評価; SPR
生産された抗体(IgG)のFGFR3 subtypeおよびsubfamilyに対する結合能を評価するためにSPR分析を行った。FGFR3抗原に対するFGFR3抗体候補群のSRPベースの親和性測定は、Biacore-T200機器を使用した。ELISA結合能で記載されたのと同じ抗原をアミンカップリングによりCM5バイオセンサーチップ上に直接固定化し、約300RUを達成した。30 ug/分の流速で結合時間180秒間、約20nM濃度で2回ずつ連続希釈液を(25度)順番に注入し、その後180秒間同じ流速で分離工程を行った。それぞれの注入の間に10mMグリシン-HClを緩衝剤として注入してCM5バイオセンサーチップを再生させた。結合速度および解離速度を一対一のランミュール結合モデルを使用して計算した。平衡解離定数(KD)をKoff/Konの比で計算した。(図5、表6)
実施例9：FGFR3タンパク質発現量の確認; Western blotting、FACS analysis
本発明で発見したFGFR3抗体に対するcell surface bindingおよびそれ以外のassayを進める上で、FGFR3過剰発現細胞を選定するためにwestern blottingとFACS分析を行った。患者由来細胞およびがん細胞株をmRNA expression level(RPKM)で選定し、それぞれの細胞を継代培養を通じて一定の細胞数を確保した後、Western blottingの場合にはlysateを製作して検証し、FACS分析の場合には直接的に細胞表面FGFR3発現を確認した。まず、Western blottingの場合には、それぞれの細胞をcOmpleteTM Lysis-M(Roche)で溶解した後、bradfordタンパク質定量分析を行い、20ugの溶解産物をwestern blottingを行った。Total FGFR3(sc-13121、santa-cruz)とβ-actinを確認し、細胞株間の相対的なFGFR3タンパク質発現量を比較した。FACSの場合は、継代培養されたそれぞれの細胞を3.0~5.0E+05 cells / tubeで分注し、FGFR3-PE direct antibody(FAB766P、R&D)を1時間、4度反応させた後、洗浄を2~3回行った後、BD FACSAriaTM III(BD Biosciences)で分析した。
Western blotの結果、682T、526T患者由来細胞は、FGFR3過剰発現細胞であることが確認された。一方、626T、559Tは、FGFR3発現がほとんどないことが確認された。同じ様相はFACS結果でも検証された。特に、682T細胞は、細胞表面にFGFR3発現レベルが非常に高いものと思われる(図6a)。
実施例10: FGFR3-TACC3 fusion検証; RT-PCR
FGFR3は、様々ながん腫において過剰発現、増幅、変異、融合の形で現れた。その中でもFGFR3-TACC3融合を持つ患者は、膀胱がんや脳腫瘍で予後が悪いことが報告されている。したがって、これに対する治療薬は、未充足の医療ニーズを克服できる可能性を秘めている。したがって、本発明で患者由来細胞に対するFGFR3-TACC3 fusion分析を基にグループ化し、これにRT-PCR技法を使用して確認した。患者由来細胞GBM15-682T、GBM14-526T、BT16-1154T、GBM14-606T、NS10-783Tを継代培養を通じて増殖させた後、一定量を回収してRNeasy Mini Kit(Qiagen)を使用してRNAを抽出した。抽出したRNAは不安定なので、RT-PCR(Superscript IV Reverse transcriptase)を行ってcDNAに合成した。FGFR3-TACC3のfusion siteを分析するためにUCSC genome browserを使用して研究されているfusion siteを確認し、FGFR3-TACC3特異的な領域を認識できるようにprimerを製作した(FW: 5'-TGATCATGCGGGGAGTGCTG-3'、RV: 5'-CTCCTCACACCTGACACCTGCTCCTC-3')。製作したプライマーを使用してcDNAにPCR実験を行い、FGFR3-TACC3 fusion特異的な領域が増幅されるかを確認した。それと同時に対照群としてGAPDHも一緒に確認した。その結果、GBM15-682T、GBM14-526T、BT16-1154Tは、FGFR3-TACC3 fusionで確認された(PCR予想サイズ、400~500bp)。その中で、GBM15-682T、GBM14-526Tは同じfusionと予想され、BT16-1154Tは別のfusionと予想される(図6b)。FGFR3-TACC3 fusion脳腫瘍患者由来細胞を基に、追加のFGFR3抗体クローンの特性および抗がん効果を分析した。
実施例11.FGFR3抗体の細胞結合能評価; FACS analysis.
本発明で確認したFGFR3-TACC3過剰発現患者由来細胞に対する発見抗体の結合能を確認するためにFACS分析を行った。各細胞を3.0~5.0E+05 cells / tubeで分注し、洗浄(PBS)工程を行った後、発見抗体を100~200nMを4度で処理した。その後、同じ洗浄方法により付着していない抗体サンプルを除去した後、anti-human alexa-488 conjugate(Catalog # A-11013、Invitrogen)抗体を処理して細胞表面に付着した抗体をBD FACSAriaTM III(BD Biosciences)を通じて検出し、細胞表面結合能を確認した。発見した抗体は、それぞれ異なる親和性の細胞結合能を示した(図7a)。同じ条件でF309クローンに対して濃度による細胞表面結合能を分析し、濃度に比例して細胞表面結合能があることが確認され、FGFR3特異的結合能があることを検証した(図7b)。FGFR3が発現していない細胞株に対しては、結合しないこともさらに確認した(図7c)。
実施例12：FGFR3抗体のターゲット分解能評価; FACS
本発明で発見した候補抗体に対するFGFR3ターゲット分解能をFACSを通じてスクリーニングした。代表的にFGFR3過剰発現細胞であるGBM15-682T患者由来細胞を継代培養して3.0E+05 cells/tubeで分注し、候補抗体をそれぞれ40ug/ml処理(2時間、37度)した。その後、洗浄を2-3回行った後、FGFR3-PE(FAB766P、R&D)を処理して1時間、4度反応させた。同じ方法で2-3回洗浄を行った後、BD FACSAriaTM III(BD Biosciences)で分析した。これは、抗体処理後の細胞表面の全体FGFR3発現レベルを比較することができる。IgG controlと比較し、Geomean値を基に比較分析した。同じ方法で時間別(4時間、2時間、1時間、30分、15分)に抗体を処理し、時間による発見抗体の細胞表面FGFR3の分解能を確認した。KMS11細胞株でも同様に行った。
優先的に発見された抗体に対して、同じ条件とした濃度で相対的な比較を行い、これに基づいてF309、FS306抗体が細胞表面のFGFR3を効果的に減少させることが確認された(図8)。また、F309、FS306クローンの場合、時間とともに細胞表面の全体FGFR3発現が減少することから、当該クローンは、FGFR3分解能があることがさらに確認される。また、F309、FS306は他の抗体であるB701、LY3076226(D11)抗体より優れた分解能があると考えられる。(図10a)
実施例13：FGFR3エピトープドメインマッピング
FGFR3は3つのドメインで構成されているので、発見抗体のFGFR3結合ドメインを分析するために、それぞれのドメイン(FGFR3 Ig domain I、domain II、domain III)をFcタグを付けて哺乳類細胞タンパク質発現システムを通じて生産および精製した(図9c)。精製されたドメインに対する抗体の結合能分析は、前記ELISAと同じ方法で行い、1ug/mlでコーティングした後、抗体を処理し、TMB発色反応を誘導して測定した。F309、FS306クローンは、FGFR3ドメイン1番に特異的に結合することが確認された(図9b)。比較群抗体であるB701(Vofatamab、Rainier Therapeutics)とD11(LY3076226、Eli Lilly)は、文献に報告されているようにドメイン2番、3番間に結合することが確認された。ただ、本発明で行ったドメイン2番に比較群抗体のエピトープが含まれている。また、FGFR3とFGF1、FGF9などのリガンドは、FGFR3のIg domain II、domain IIIに結合することが報告されている。これに基づき、Competition ELISA assayを行った。その結果、B701、D11抗体は予想通りFGFリガンドと競合的にFGFR3に結合する様相を示した一方、F309抗体は、FGFリガンドと関係なくFGFR3に結合することが観察される。これは前述のFGFR3 Ig domain Iに結合することを裏付ける根拠として判断できる(図9a)。
実施例14：FGFR3抗体のターゲット分解能評価; Western blotting
本発明で発見した候補抗体に対するFGFR3ターゲット分解能をWestern blottingを通じて検証しようとし、FACS方法と同様に代表的な細胞としてGBM15-682T患者由来細胞を使用した。細胞を6 well plateに2.0E+06 cells/wellを分注し、各抗体を30ug/ml濃度で処理して3時間、37度で反応させた。その後、Lysateを製作してBradford定量法により各サンプルを20ug計算してwestern blottingを行った。全体FGFR3はsc-13121抗体で観察した。KMS11細胞株においても同じ濃度および反応条件で実験を行った。FACS結果と同様に、F309、FS306クローンの全体FGFR3分解能が優れていることが確認された(図10b)。
実施例15: Antibody cellular internalization; Immunocytochemistry(ICC)
抗体の細胞内在化メカニズムをICC法を通じてさらに検証した。FGFR3過剰発現細胞としてGBM15-682Tを使用し、低発現細胞としてU87MGを使用した。GBM15-682T患者由来細胞の場合にはICCスライドに付着しないため、あらかじめPLO試薬をコーティングしてその上に細胞を培養し、U87MGの場合には、付着細胞としてPLO処理せずに進行した。まず、細胞内在化条件としては、それぞれの抗体をICCスライドに付着した細胞に30ug/mlで処理し、37度、2時間反応させた。細胞内在化の不活性化条件は、同じ濃度で4度で2時間反応させた。その後、洗浄を行い、2% PFAで固定した(10分、4度)。同じ洗浄方法をもう一度行い、0.1% Triton-Xを室温で3min反応させて細胞を透過させ、再び洗浄を行った。その後、1% BSAでブロッキングを30分常温で行い、1次抗体を4度の条件下でovernight処理した。1次抗体はリソソームマーカーであるLAMP-1抗体とanti-human IgGを使用した。翌日洗浄を行い、2次抗体を光が遮蔽された条件で4度、1時間反応させた。2次抗体は、1次抗体をプローブする蛍光発色を持つ抗体を使用した(Alexa 488; Anti-human LAMP1、Alexa 594; Anti-human IgG)。洗浄後、DAPI染色後、共焦点顕微鏡で各サンプルを分析した。分析結果、F309、FS306クローンは4度条件で処理するとFGFR3過剰発現細胞であるGBM15-682T表面に付着していることが確認され、37度条件では細胞内在化が進行するため、抗体がリソソーム位置(LAMP-1)と同じように観察されることが確認される。これに基づいて、クローンは細胞表面FGFR3に結合した後、細胞内在化されてリソソームで分解されると予想される(図11a)。
実施例16：FGFR3抗体のターゲット分解メカニズム; リソソーム阻害による抗体メカニズム分析
本発明で前記発見抗体のFGFR3ターゲット分解メカニズムを解明するために、リソソーム阻害剤による検証を行った。抗体は、細胞表面に特異的な抗原に結合すると、受容体(抗原)媒介細胞内在化(Receptor mediated endocytosis)となり、リソソームにおいて受容体と抗体が一緒に分解されるメカニズムが報告された。したがって、FGFR3抗体のうちFGFR3分解能が確認された抗体のリソソームにおける分解を検証し、リソソーム阻害剤を処理したサンプルと処理しなかったサンプルに対する全体FGFR3レベルをwestern blottingを通じて確認した。GBM15-682Tを6 well plateに1.5E+06 cells/wellで分注し、リソソーム阻害剤として知られているConcanamycinを100nM濃度で2時間、37度の条件で処理した。対照群としてはDMSOを処理した。2時間後、抗体をそれぞれ30ug/mlの条件で37度で3時間処理した。その後、前記western blotting方法と同様に進行し、全体FGFR3レベルを確認した。リソソーム阻害剤であるconcanamycin処理条件では、F309、FS306クローンを処理しても全体FGFR3は減少せず、処理しない条件では全体FGFR3が有意に減少することから、F309、FS306クローンは、細胞表面FGFR3に付着した後、細胞内在化されてリソソームでFGFR3と共に分解されると考えられる(図11b)。
実施例17: Signaling pathway inhibition assay; Western blotting
FGFR3サブシグナル伝達阻害分析はwestern blottingにより分析した。前記Western blotting方法と同様に進行し、GBM15-682T患者由来細胞を6 well plateに分注し、それぞれの抗体を30ug/ml処理した(37度、3時間)。その後、FGFR3関連サブシグナル伝達を活性化させるためにFGF1、FGF9代表リガンドを50ng/ml(heparin sulfate 50ug/mlと一緒に処理)処理し、37度、30分間反応させた。その後、lysateを作製し、それぞれのサンプル20ugに対してwestern blottingを行った。FGFR3サブシグナル伝達経路のリン酸化および活性化は、次の抗体を使用して検証した。p-FGFR3(ab155960、Abcam)、p-ERK(4370s、CST)、p-AKT(9271s、CST).F309、FS306クローンは、FGFR3サブシグナル伝達であるp-FGFR3、p-ERK、p-AKTを阻害することが確認された(図12)。
実施例18：がん細胞成長阻害能分析;リガンド依存的環境
本発明で発見した抗体に対するリガンド依存的環境におけるがん細胞成長阻害能を確認するために、GBM15-682Tを96well black-flat bottomプレートにserum free条件で10000 cells/wellで分注し、1日間starvationさせた後、翌日リガンドであるFGF1(232-FA、R&D)、FGF9(273-F9、R&D)を最終濃度が50ng/mlになるように処理し、抗体も段階的に希釈して濃度別に処理した。その後、7日間の37度CO2インキュベーターで培養を行った。細胞成長測定は、CellTiter-Glo(R) Luminescent Cell Viability Assay を通じて測定し、対照群に対して抗体処理群の細胞成長を比較した。当該細胞にリガンドを処理すると、1.5~2倍程度リガンドによってがんの成長が速いことを確認することができ、これにクローンを濃度別に処理するとIgG control(対照群)に対して20~30%細胞成長が抑制されることを確認した(図13a)。
実施例19：がん細胞成長阻害能分析;リガンド非依存的環境
本発明で記載した細胞成長測定法に基づき、リガンド非依存的環境における抗体のがん細胞成長阻害能を評価した。GBM15-682T患者由来細胞を96well black-flat bottomプレートに10000 cells/wellで分注し、抗体を段階的に希釈して濃度別に処理した。その後、7日間の37度CO2インキュベーターで培養を行った。細胞成長測定は、CellTiter-Glo(R) Luminescent Cell Viability Assayを通じて測定し、対照群に対して抗体処理群の細胞成長を比較した。リガンドなしの環境で抗体を処理した場合、F309、FS306クローンはIgG control(対照群)に対して30~40%細胞成長を抑制することが確認された。FGFR3低発現細胞株であるU87MGおよび患者由来細胞(626T)では、がん細胞成長阻害能が見られなかった。これはFGFR3発現による生長阻害の特徴であると考えられる(図13b)。
実施例20: In vivo短期PK分析と異種移植モデルにおける有効性評価
発見した抗体の生体内投与時の初期クリアランス有無を確認するために短期PKを実施した。Balb/cマウスに抗体を10 mg/kg投与し、投与直後、1hr、2hr、4hr、1day、2dayの間隔で個体別の血液サンプルを確保した。血液中の血球を除去するために、遠心分離機により血漿を確保し、血漿中の抗体titerをELISAベースで定量した。その結果、対照抗体と同様に、F309、FS306抗体ともに初期にクリアランスされるパターンなく、正常な抗体の初期PKがあることが確認された(図14a)。
発見抗体のin vivo効果を評価するために、本研究グループは異種移植モデルを作製した。Bab/c nudeマウスに皮下注射を通じてマウスの脇腹にGBM15-682Tを注入(1.0E+06 cells)して腫瘍形成を行い、腫瘍が平均100~150mm3形成されると、マウスを再グループ化して5匹ずつグループを指定した。各グループごとに抗体およびvehicleを週3回または週2回、濃度別に腹腔内注射を行った。腫瘍容積は、キャリパー(calipers)を使用してV=0.5a X b2(a:腫瘍長軸の長さ、b:腫瘍短軸の長さ)の式で計算した。腫瘍測定と同じ日にマウスの体重測定も行った。F309、FS306クローンはそれぞれ10mg/kg(週3回)投与時、それぞれがんの成長を約50%、40%抑制することが確認された(図14a)。F309の場合は、濃度別週2回投与時(30mpk、10mpk、3mpk)で優れた抗がん効果でがんの成長を抑制すると考えられる(図14b)。
実施例21：F309抗体親和性成熟エンジニアリング
F309の優れたFGFR3分解能とがん成長阻害能に対する更なる改善のために親和性成熟を進めた。M13バクテリオファージ表面にF309 scFv切片(重鎖可変部位; VH、軽鎖可変部位; VL)を表示するファージミドベクターを製作し、これをライブラリー鋳型として使用した。親和性成熟のために抗体のKabatナンバーリングを基にCDR H1、H2、H3とCDR L1、L2、L3を選定し、それぞれのCDRに対してNNK degeneration codonが含まれたプライマーを使用してF309 mutantライブラリーを製作した(図15a)。各ライブラリーについて前記バイオパニング(抗原固定パニング)を3~4回行い、これを基にF309親抗体よりさらに親和性が上昇した抗体をELISAベースの親和性スクリーニングでクローンを確保した。確保したクローンは、再現実験を行って再検証を行い、最終的に抗体配列分析を通じてF309の親和性成熟変異体を確保した。確保されたF309変異体は、FGFR3組換えタンパク質に対する特異的結合能が親抗体に比べて有意に上昇すると判断される(図15b)。さらに、SSM001~SSM010変異体に対するアミノ酸残基組み合わせで追加の変異体SSM023、SSM024、SSM026、SSM034、SSM036、SSM234、SSM236を設計および製造した。これらの抗体に対してFGFR3抗原特異的な結合能分析を検証するためにELISAを行い、その結果、さらに上昇したFGFR3抗原親和性が確認された(図15b、図15c)。変異体抗体の生物学的活性に対する分析をGBM15-682Tで行い、その結果、F309親抗体に比べて増加したがんの成長抑制を確認することができた(図15d)。
Figure 2024502386000013
Figure 2024502386000014
Figure 2024502386000015
Figure 2024502386000016
Figure 2024502386000017
実施例22：F309抗体ADCの適用可能性の検証
抗体薬物複合体の場合には、抗体が細胞表面の抗原に特異的に結合し、受容体-媒介細胞内在化を通じて細胞内部に流入し、細胞内部のリゾソームおよびプロテアーゼによって分解され、接合している毒性物質によって細胞を死滅させるメカニズムを持つ。これは、治療効果を最大化できるプマウスフォームで、次世代抗体治療薬のプマウスフォームとして広く使用されている。本発明では、FGFR3、FGFR3-TACC3 fusion細胞に対する内在化およびターゲット分解能に優れたクローンに対して、抗体薬物複合体としての適用可能性を確認しようとした。F309、FS306クローンは、本発明に記載されているようにFGFR3ターゲット分解能と細胞内在化が実証されたため、抗体薬物複合体プマウスフォームとして適用可能であると判断し、これについて実施した。その中で、F309クローンに対する抗体薬物複合体の製造は、PerKitTM Antibody MMAE Conjugation Kit(CellMosaic)を使用し、このプマウスフォームは第1世代抗体薬物複合体技術として(a method developed by Seattle Genetics: Sun et al. 2005, Bioconjugate Chem.16, 1282-1290)抗体のinterchain disulfideに対して任意に-vc MMAEを接合させる方式である(図16a)。様々な患者由来細胞およびがん細胞株をFACS発現基準で選定し、High、Mild、Lowに相対的にグループ化し、これに対してF309の細胞毒性実験を行った。評価方法は、本発明に記載したようにCellTiter-Glo(R) Luminescent Cell Viability Assayを通じて測定した。その結果、FGFR3細胞表面発現量に比例してF309-vc MMAEの細胞毒性が優れていることを確認し(図16b~16c)、さらなる競争力を確保するためにFGFR3-ADCとして臨床開発中のLY3076226親抗体を同じKitで適用して効果を比較した。F309-vc MMAEは、FGFR3-TACC3 fusionであるGBM15-682TにおいてLY3076266-vc MMAEより優れた細胞毒性を示した。各FGFR3発現量によるADCの細胞に対する生長抑制効果は、IC50およびMAX inhibitionで分析して図16dのtableに表記した。
実施例23：親和性成熟された抗体のエピトープドメインマッピングおよび抗原親和性分析
先に行ったエピトープドメインマッピングを親和性成熟された抗体F309#SSM236(以下、AMB302#1.2)に対しても行った。親抗体の場合、ドメインD1に結合することが確認され、同じ各ドメイン(Domain I、Domain II、Domain III)を使用して分析した場合においても、親和性成熟された抗体はドメインD1に特異的に結合することが確認された。当該抗体の場合、human/cyno FGFR3に特異的な結合能を持つことを再確認した(図17)。各抗原によるKD valueは次の表14の通りである。
実施例24：親和性成熟された抗体の細胞内在化およびターゲット分解能評価
親和性がかなり成熟したF309変異体に対して、細胞表面のFGFR3ターゲットを効率的に分解することを検証した。先の発明で行ったのと同じ方法を通じて、まずFGFR3細胞表面発現量の確認および細胞内在化評価はFACSを通じて検証し、Western blottingを通じてはターゲット分解能を行った。親和性成熟された変異体の場合、かなりの細胞内在化効能とターゲット分解能があることが確認された(図18ないし図20)。
実施例25：親和性成熟された抗体のマウス/サルのPK分析
親和性成熟された抗体(AMB302#1.2、SSM236)の生体PKプロファイルを検証するために、マウス/サル個体で分析を行った。マウスBALB/c mice(8 weeks、~20g、n=3、female)にモノクローナル抗体を10mg/kg、1mg/kg、0.1mg/kgを投与し、投与直後、10min、1h、3h、5h、8h、24h、Day 2、3、7、10、14、17、21、28日間隔で生きた個体を3匹ずつ交差させて時間別に眼窩採血を行った。血液の血球を除去するために、遠心分離機を通じて血漿を確保し、血漿中の抗体titerをquantification ELISAベースで定量した。その結果、AMB302#1.2抗体の場合には、マウス生体内で10日以上の安定した半減期(t 1/2)特性とCLを持っていることを確認した。また、すべての投与濃度において生体的に特異的な臨床的副作用と体重変化は観察されなかった(図21)。
一匹のサル(2-3 years、~3kg、female、naive)では、25mg/kg投与後、50mg/kg単回投与を行い、各時間別に血液サンプルを採取した(10 minutes、1 and 6 hours、1、2、3、7、10、14、21、and 28 days)。確保された血液は、血球除去のために遠心分離機を通じて血漿を確保し、血漿中の抗体は、quantification ELISAを通じて定量した。その結果、マウスでの結果と同様に安定した半減期(10日以上)とCL傾向性が確認された。また、すべての投与濃度において生体的に特異的な臨床的副作用と体重変化は観察されなかった(図22)。
実施例26：親和性成熟された抗体ADCの製造
本発明で親和性成熟エンジニアリングを通じて確保した変異体に対してADCの製造を行った(図23)。精製された抗体サンプルにtris(2-Carboxyethyl) phosphine hydrochloride(TCEP)を当量比8.0以上処理して2時間37度で完全還元した。還元後はPBS pH7.4でバッファー交換を行い、当該サンプルに対してリンカーペイロード(Topoisomerase I inhibitor、当量比10.0)をDMAに溶解し、一緒に還元された抗体と2時間37度で接合した。結合後は、遠心カラム(Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units)を通してバッファを交換した。
同じ方法で抗体を部分還元してリンカーペイロード(Duocarmycin derivatives、 linker-AMB401)を接合したADCを製造した(図24)。
実施例27：親和性成熟された抗体ADCの分析(TOPOI)
合成が完了したADCサンプル(TOPOI結合ADC)に対する抗原親和性をELISAを通して確認し、本発明で行ったaffinity ELISAと同じ方法で行い、親抗体と同じ抗原結合能があることを確認した。また、SEC-HPLC分析を通して製造されたADCの高純度物性特徴を確認した。
DAR分析は、LC-MSを通して行い、製造されたADCに対してそれぞれ重鎖、軽鎖に付着したリンカーペイロードの質量分析を行い、これを換算した場合、おおよそDAR 6以上であることが確認できた(図25)。
実施例28：親和性成熟された抗体ADCの分析(Duocarmycin、Linker-AMB401)
合成が完了したADCサンプル(duocarmycin、linker-AMB401; ADC)に対して、当該物質の分析は、SEC-HPLCを通じて純度を分析し、HIC-HPLCとPLRP分析を通じてDARを分析した。当該物質の場合には、純度98%以上とDAR約4程度の均一な物性特徴があることを確認した(図26: 20 mM Histidine-acetate pH 6.0)。
実施例29：患者由来オルガノイドEx vivoモデルにおける親和性成熟された変異体ADCの有効性評価(ADC-TOPOI)
製造されたADCを使用して、FGFR3(TACC3 fusion)過剰発現患者由来オルガノイドに対する有効性評価を行った。脳腫瘍患者由来のがん組織からがん細胞を分離し、single spheroid organoidモデルを作成した。FGFR3-TACC3 fusionがある患者由来細胞2種(AMB-BT-0050T、AMB-BT-0112T)とそうでない患者由来細胞(AMB-BT-0013T)を活用し、overnight incubationしてsingle spheroidを形成した後、ADCを処理して1週間incubationした後、その結果を確認した。Negative controlではADCとcontrol ADC間のsensitivityの差はなく、FGFR3-TACC3 fusionがある患者由来細胞2種でcontrol ADCに比べて有意にspheroid growthをFGFR3発現量に比例して特異的に阻害し、細胞死を誘導することが分析された。特に、親和性成熟された変異抗体-ADCの場合には、FGFR3(TACC3 fusion)過剰発現細胞に親抗体-ADCに比べてかなり改善された細胞毒性と死滅を誘導することを確認した。FGFR3(TACC3 fusion)過剰発現細胞に対しては0.3 nM以下のIC50を示し、negative細胞に対しては90 nM以上のIC50を示した(図27)。
実施例30：患者由来有機体Ex vivoモデルにおける親和性成熟された変異体ADCの効能評価(ADC-Duocarmycin、linker-AMB401)
実施例27と同じ方法でAMB302#1.2-Duocarmycin ADCのex vivo効能評価を行った。FGFR3(TACC3)過剰発現脳腫瘍患者由来細胞に対しては約0.3 nMの低いIC 50を示し、negative細胞に対しては100 nM以上の高いIC50を示した。これは、当該ADCがFGFR3発現にかなり比例した細胞死を誘導することを示す(図28)。
実施例31：FGFR3(TACC3融合)脳腫瘍定位的動物モデルにおけるADCの有効性評価(ADC-TOPOI)
ADC治療による脳腫瘍定位的動物モデル(脳腫瘍、GBM)における生存率増加を評価した(図29)。FGFR3過剰発現細胞であるAMB-BT-0050T(682T)患者由来細胞を培養し、2X10^5の細胞を5 ulの培地と混合して準備した。準備した細胞株を免疫不全マウスのブレグマから左に1.7 mm、上に0.5 mmの位置に3.2 mmの深さで注入して脳腫瘍マウスモデルを製作した。Control、Control-TOPOI、AMB302#1.2-TOPOI(単回投与、反復投与)の合計4グループに分け、1グループ当たり7匹のマウスで評価を行った。候補薬物はモデル作製後7日目に静脈内注射により単回投与した。15日目にBiomarker分析などのためにグループ当たり2匹ずつ中間サンプリングを行った。マウスの体重を週2回測定し、20%以上の体重減少がある場合、安楽死を行いマウスの脳を摘出した。AMB302#1.2-TOPOIの場合には、単回投与でも、マウスの生存期間が70%以上増加したことを確認した。
同じモデルでAMB302#1.1-TOPO1を2回投与(1週間間隔、10mg/kg)した場合でも、マウスの生存期間を100%以上とかなり増加させた。また、中間サンプリングを通じてマウスの脳の腫瘍サイズを比較したところ、ADC処理個体の場合には、control集団に比べて腫瘍が発見されなかった。また、親和性成熟ADCが親抗体ベースADCよりも確実に改善された腫瘍抑制と生存率増加を誘導することを確認した(図30)。
実施例32：FGFR3(TACC3融合)皮下移植モデルにおけるADCの有効性評価(ADC-TOPOI)
Bab/c nudeマウスに皮下注射(s.c、subcutaneous)を通じてマウスの脇腹にRT112細胞を注入(1.0E+06 cells)して腫瘍形成を行い、腫瘍が平均100~150 mm3形成されると、マウスを再グループ化して5匹ずつグループを指定した。各グループごとにADCおよびvehicleを2回(1週間間隔、5mp/kg)で静脈注射を行った。腫瘍容積は、キャリパー(calipers)を使用してV=0.5a X b2(a:腫瘍長軸の長さ、b:腫瘍短軸の長さ)の式で計算した。腫瘍測定と同じ日にマウスの体重測定も行った。ADC-TOPOI投与時、それぞれがんの成長を完全に抑制することが確認され、優れた抗がん効果を有することを確認した(図31)。
実施例33：FGFR3(TACC3融合)脳腫瘍定位的動物モデルにおけるADC効能評価(ADC-Duocarmycin、linker-AMB401)
先に行った同じモデルを用いてAMB302#1.1-AMB401を単回投与(10 mg/kg)または反復投与(10 mg/kg、Q4D)を行い、効能評価を行った。当該ADC投与群で有意に生存率が増加することを確認し、特に反復投与を行った群では30%以上の生存率増加を確認した(図32)。
本発明による抗FGFR3抗体またはその抗原結合断片は、従来の抗FGFR3抗体よりもFGFR3に対して優れた結合力を示し、目的とする腫瘍またはがんの予防または治療に有用に使用することができる。
特に、FGFR3-TACC3過剰発現脳腫瘍患者由来細胞を通じたスクリーニングで、公知の抗FGFR3抗体よりもFGFR3-TACC3過剰発現がん細胞に対してより優れた効能を持つ抗体を選別した。
以上、本発明内容の特定部分を詳細に説明したが、当分野における通常の知識を有する者にとって、これらの具体的な記述は単なる好ましい実施態様に過ぎず、これによって本発明の範囲が限定されるものではないことは明らかであろう。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とそれらの等価物によって定義されるといえる。

Claims (45)

  1. 以下を含むFGFR3(Fibroblast growth factor receptor 3)に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片：
    配列番号1ないし配列番号18で構成される群から選択される1つ以上のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、
    配列番号19ないし配列番号41で構成される群から選択される1つ以上のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、
    配列番号42ないし配列番号66、配列番号186ないし198で構成される群から選択される1つ以上のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、
    配列番号67ないし配列番号88で構成される群から選択される1つ以上のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、
    配列番号89ないし配列番号109で構成される群から選択される1つ以上のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、および
    配列番号110ないし配列番号132、配列番号199ないし配列番号202で構成される群から選択される1つ以上のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3。
  2. 配列番号133ないし配列番号157、配列番号203ないし配列番号215で構成される群から選択される1つ以上のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  3. 配列番号158ないし配列番号182、配列番号216ないし配列番号219で構成される群から選択される1つ以上のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  4. 前記抗体は、配列番号5の重鎖CDR1、配列番号23の重鎖CDR2および配列番号203ないし215で構成される群から選択されるいずれか1つの重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、並びに配列番号71の軽鎖CDR1、配列番号93の軽鎖CDR2および配列番号216ないし219で構成される群から選択されるいずれか1つの軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  5. 短鎖Fvs(scFv)、短鎖抗体、Fab、F(ab')、ジスルフィド結合Fvs(sdFv)を含む、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  6. 前記scFvは、配列番号133ないし配列番号157で構成される群から選択される1つ以上のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号158ないし配列番号182で構成される群から選択される1つ以上のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域がリンカーを介して連結されていることを特徴とする、請求項５に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  7. 前記リンカーは、(GnS)m(n、mはそれぞれ1ないし10)を含む、請求項６に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  8. 請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸。
  9. 請求項８に記載の核酸を含む組換え発現ベクター。
  10. 請求項９に記載の組換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
  11. COS-7、BHK、CHO、CHOK1、DXB-11、DG-44、CHO/-DHFR、CV1、COS-7、HEK293、BHK、TM4、VERO、HELA、MDCK、BRL 3A、W138、Hep G2、SK-Hep、MMT、TRI、MRC 5、FS4、3T3、RIN、A549、PC12、K562、PER.C6、SP2/0、NS-0、U20S、またはHT1080である、請求項１０に記載の宿主細胞。
  12. 請求項１０に記載の宿主細胞を培養して抗体を生成する工程、および生成された抗体を分離および精製する工程を含む、FGFR3に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片の製造方法。
  13. 請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片を含む二重または多重特異性抗体。
  14. PD-1、PD-L1、BTLA、CTLA-4、VISTA、LAG3、TIM3、CD137(4-1BB)、VISTA、CD258(LIGHT)、TIGIT、CD134(OX40)、CD28、CD278(ICOS)、CD27、CD154(CD40L)、CD357(GITR)、CD30、DR3、CD226(DNAM1)、CD96、CD200、CD200R、トランスフェリン受容体、c-Met、EGFR、HER2、KDR、PDGFRa、NRP1、MARCOで構成される群から選択された1つ以上をパートナーとして含む、請求項１３に記載の二重または多重特異性抗体。
  15. 請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体のscFvおよび免疫細胞活性化抗原に結合する抗体のscFvを1つ以上含む第2結合ドメインで構成されるscFvを含む、免疫細胞エンゲージ(immunecell engage)二重特異性または多重特異性抗体。
  16. 前記scFvは、配列番号133ないし配列番号157、配列番号203ないし配列番号215で構成される群から選択される1つ以上のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号158ないし配列番号182、配列番号216ないし配列番号219で構成される群から選択される1つ以上のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とがリンカーを介して連結されていることを特徴とする、請求項１５に記載の二重特異性または多重特異性抗体。
  17. 前記リンカーは、(GnS)m(n、mはそれぞれ1ないし10)を含む、請求項１６に記載の二重特異性または多重特異性抗体。
  18. 請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片が薬物に結合した抗体薬物複合体(ADC)。
  19. 前記薬物は、(1)マイタンシノイド、オリスタチン(MMAE、MMAFを含む)、アミノフテリン、アクチノマイシン、ブレオマイシン、タリソマイシン、カンプトテシン、N8-アセチルスパーミジン、1-(2-クロロエチル)-1、2-ジメチルスルホニルヒドラジド、エスパラマイシン、エトポシド、6-メルカプトプリン、ドロスタチン、トリコテセン、カリケアミシン、タキソール、タキサン、パクリタキセル、ドセタキセル、メトトレキサート、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ドキソルビシン、メルファラン、ミトマイシンA、ミトマイシンC、クロラムブシル、デュオカミシン、L-アスパラギナーゼ(L-asparaginase)、メルカプトプリン(mercaptopurine)、チオグアニン(thioguanine)、ヒドロキシ尿素(hydroxyurea)、シタラビン(cytarabine)、シクロホスファミド(cyclophosphamide)、イホスファミド(ifosfamide)、ニトロソ尿素(nitrosourea)、シスプラチン(cisplatin)、カルボプラチン(carboplatin)、ミトマイシン(mitomycin)、ダカルバジン(dacarbazine)、プロカルバジン(procarbazine)、トポテカン(topotecan)、窒素マスタード(nitrogen mustard)、シトキサン(cytoxan)、エトポシド(etoposide)、5-フルオロウラシル(5-fluorouracil)、CNU(bischloroethylnitrosourea)、イリノテカン(irinotecan)、カンプトテシン(camptothecin)、ブレオマイシン(bleomycin)、イダルビシン(idarubicin)、ダウノルビシン(daunorubicin)、ダクチノマイシン(dactinomycin)、プリカマイシン(plicamycin)、ミトキサントロン(mitoxantrone)、アスパラギナーゼ(asparaginase)、ビノレルビン(vinorelbine)、クロラムブシル(chlorambucil)、メルファラン(melphalan)、カルムスチン(carmustine)、ロムスチン(lomustine)、ブスルファン(busuLfan)、トレオスルファン(treosulfan)、デカバジン(decarbazine)、エトポシド(etoposide)、テニポシド(teniposide)、トポテカン(topotecan)、9-アミノカンプトテシン(9-aminocamptothecin)、クリスナトール(crisnatol)、ミトマイシンC(mitomycin C)、トリメトレキサート(trimetrexate)、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、チアゾプリン(tiazofurin)、リバビリン(ribavirin)、EICAR(5-ethynyl-1-beta-Dribofuranosylimidazole-4-carboxamide)、ヒドロキシ尿素(hydroxyurea)、デフロキサミン(deferoxamine)、フルクスリジン(flixuridine)、ドキシフルリジン(doxifluridine)、ラルチトレキセド(raltitrexed)、シタラビン(cytarabine(ara C))、シトシンアラビノシド(cytosine arabinoside)、フルダラビン(fludarabine)、タモキシフェン(tamoxifen)、ラロキシフェン(raloxifene)、メゲストロール(megestrol)、ゴセレリン(goserelin)、酢酸リュープロライド(leuprolide acetate)、フルタミド(flutamide)、バイカルタミド(bicalutamide)、EB1089、CB1093、KH1060、ベルテポルフィン(verteporfin)、フタロシアニン(phthalocyanine)、光増感剤Pe4(photosensitizer Pe4)、デメトキシ-ハイポクレリンA(demethoxy-hypocrellin A)、インターフェロン-α(Interferon-α)、インターフェロン-γ(Interferon-γ)、腫瘍壊死因子(tumor necrosis factor)、ゲムシタビン(Gemcitabine)、ベルケイド(velcade)、レバミド(revamid)、タラミド(thalamid)、ロバスタチン(lovastatin)、1-メチル-4-フェニルピリジニウムイオン(1-methyl-4-phenylpyridiniumion)、スタウロスポリン(staurosporine)、アクチノマイシンD(actinomycin D)、ダクチノマイシン(dactinomycin)、ブレオマイシンA2(bleomycin A2)、ブレオマイシンB2(bleomycin B2)、ペプロマイシン(peplomycin)、エピルビシン(epirubicin)、ピラルビシン(pirarubicin)、ゾルビシン(zorubicin)、ミトキサントロン(mitoxantrone)、ベラパミル(verapamil)およびタプシガルギン(thapsigargin)、核酸分解酵素および細菌または動植物由来の毒素で構成される群から選択される1つ以上の抗がん薬物、
    (2)ステロイド剤、非ステロイド系抗炎症薬(NSAIDs)または免疫選択的抗炎症誘導体(ImSAIDs)を含む抗炎症薬、または
    (3)アザチオプリン、クロラムブシル、シクロホスファミド、シクロスポリン、ミコフェノール酸塩、アザチオプリン(azathioprine)、またはメトトレキサート(methotrexate)を含む免疫疾患治療薬であることを特徴とする、請求項１８に記載の抗体薬物複合体。
  20. 前記抗体またはその抗原結合断片は、薬物とリンカーを介して結合されることを特徴とする、請求項１８に記載の抗体薬物複合体。
  21. 前記リンカーは、切断性リンカーまたは非切断性リンカーであることを特徴とする、請求項２０に記載の抗体薬物複合体。
  22. 前記切断性リンカーは、酸不安定リンカー(acid-labile linker)、ジスルフィドリンカー、ペプチドリンカー、またはβ-グルクロニド(beta-glucuronide)リンカーであり、前記非切断性リンカーは、チオエーテル基またはマレイミドカプロイル基を含むことを特徴とする、請求項２１に記載の抗体薬物複合体。
  23. 前記リンカーは、抗体のジスルフィド結合還元時に露出するシステイン残基または抗体に結合したタグに存在するシステイン残基に結合することを特徴とする、請求項２０に記載の抗体薬物複合体。
  24. 抗原結合部位を含む細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体(CAR)であり、前記細胞外ドメインの抗原結合部位は、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体のscFvであることを特徴とするキメラ抗原受容体。
  25. 前記scFvは、配列番号133ないし配列番号157で構成される群から選択される1つ以上のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号158ないし配列番号182で構成される群から選択される1つ以上のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とがリンカーを介して連結されていることを特徴とする、請求項２４に記載の組成物。
  26. 前記リンカーは、(GnS)m(n、mはそれぞれ1～10)を含む請求項２５に記載の組成物。
  27. 請求項２４に記載のキメラ抗原受容体(CAR)が導入されている免疫細胞。
  28. 前記T細胞、NK細胞、サイトカイン誘導キラー細胞(Cytokine Induced Killer cell、CIK)、活性化細胞傷害性Tリンパ球(Cytotoxic T Lymphocyte、CTL)、マクロファージ、腫瘍組織内浸潤T細胞(Tumor-Infiltrating Lymphocytes、TIL)、樹状細胞で構成される群から選択される1つ以上である、請求項２７に記載の免疫細胞。
  29. 前記抗FGFR3抗体以外の抗体に対するscFvが細胞外ドメインの抗原結合部位として含まれるキメラ抗原受容体(CAR)がさらに導入されている、請求項２７に記載の免疫細胞。
  30. 前記抗FGFR3抗体以外の抗体は、PD-1、PD-L1、BTLA、CTLA-4、VISTA、LAG3、TIM3、CD137(4-1BB)、VISTA、CD258(LIGHT)、TIGIT、CD134(OX40)、CD28、CD278(ICOS)、CD27、CD154(CD40L)、CD357(GITR)、CD30、DR3、CD226(DNAM1)、CD96、CD200、 CD200R、Transferrin receptor、c-Met、EGFR、HER2、KDR、PDGFRa、NRP1、MARCOで構成される群から選択された1つ以上を標的とする抗体である、請求項２９に記載の免疫細胞。
  31. 請求項２７に記載の免疫細胞および抗FGFR3抗体以外の薬物を含む併用治療用組成物。
  32. 前記抗FGFR3抗体以外の薬物は、PD-1、PD-L1、BTLA、CTLA-4、VISTA、LAG3、TIM3、CD137(4-1BB)、VISTA、CD258(LIGHT)、TIGIT、CD134(OX40)、CD28、CD278(ICOS)、CD27、CD154(CD40L)、CD357(GITR)、CD30、DR3、CD226(DNAM1)、CD96、CD200、CD200R、Transferrin receptor、c-Met、EGFR、HER2、KDR、PDGFRa、NRP1、MARCOで構成される群から選択される1つ以上を標的とする、請求項３１に記載の抗体である組成物。
  33. 請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片と、以下で構成される群から選択される1つ以上を含む併用治療用組成物。
    (i) 免疫細胞、
    (ii) 抗FGFR3抗体以外の抗体に対するscFvを細胞外ドメインとして含む抗原受容体(CAR)を含む免疫細胞、および
    (iii) 免疫チェックポイント阻害剤(Immune checkpoint inhibitor)。
  34. 前記免疫細胞は、T細胞、NK細胞、サイトカイン誘導キラー細胞(Cytokine Induced Killer cell、CIK)、活性化細胞傷害性Tリンパ球(Cytotoxic T Lymphocyte、CTL)、マクロファージ、腫瘍組織内浸潤T細胞(Tumor-Infiltrating Lymphocytes、TIL)、樹状細胞で構成される群から選択される1つ以上である、請求項２３に記載の組成物。
  35. 請求項３３に記載の抗FGFR3抗体以外の抗体は、PD-1、PD-L1、BTLA、CTLA-4、VISTA、LAG3、TIM3、CD137(4-1BB)、VISTA、CD258(LIGHT)、TIGIT、CD134(OX40)、CD28、CD278(ICOS)、CD27、CD154(CD40L)、CD357(GITR)、CD30、DR3、CD226(DNAM1)、CD96、CD200、CD200R、Transferrin receptor、c-Met、EGFR、HER2、KDR、PDGFRa、NRP1、MARCOで構成される群から選択される1つ以上を標的とする、請求項３３に記載の抗体である組成物。
  36. 前記免疫チェックポイント阻害剤は、PD-1、PD-L1、BTLA、CTLA-4、VISTA、LAG3、TIM3、CD137(4-1BB)、VISTA、CD258(LIGHT)、TIGIT、CD134(OX40)、CD28、CD278(ICOS)、CD27、CD154(CD40L)、CD357(GITR)、CD30、DR3、CD226(DNAM1)、CD96、CD200、CD200R、Transferrin receptor、c-Met、EGFR、HER2、KDR、PDGFRa、NRP1、MARCOで構成される群から選択される1つ以上を標的とする薬物である、請求項３３に記載の組成物。
  37. 請求項１３に記載の二重特異性または多重特異性抗体と、以下で構成される群から選択される1つ以上を含む併用治療用組成物：
    (i) 免疫細胞、
    (ii) 抗FGFR3抗体以外の抗体に対するscFv断片を細胞外ドメインとして含む抗原受容体(CAR)を含む免疫細胞、および
    (iii) 免疫チェックポイント阻害剤(Immune checkpoint inhibitor)。
  38. 前記抗FGFR3抗体以外の抗体は、PD-1、PD-L1、BTLA、CTLA-4、VISTA、LAG3、TIM3、CD137(4-1BB)、VISTA、CD258(LIGHT)、TIGIT、CD134(OX40)、CD28、CD278(ICOS)、CD27、CD154(CD40L)、CD357(GITR)、CD30、DR3、CD226(DNAM1)、CD96、CD200、CD200R、Transferrin receptor、c-Met、EGFR、HER2、KDR、PDGFRa、NRP1、MARCOで構成される群から選択される1つ以上を標的とする、請求項３７に記載の抗体である組成物。
  39. 前記免疫チェックポイント阻害剤は、PD-1、PD-L1、BTLA、CTLA-4、VISTA、LAG3、TIM3、CD137(4-1BB)、VISTA、CD258(LIGHT)、TIGIT、CD134(OX40)、CD28、CD278(ICOS)、CD27、CD154(CD40L)、CD357(GITR)、CD30、DR3、CD226(DNAM1)、CD96、CD200、CD200R、Transferrin receptor、c-Met、EGFR、HER2、KDR、PDGFRa、NRP1、MARCOで構成される群から選択される1つ以上を標的とする薬物である、請求項３７に記載の組成物。
  40. 請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片、前記抗体またはその抗原結合断片を含む二重または多重特異性抗体、前記抗体またはその抗原結合断片を含む抗体薬物複合体、前記抗体またはその抗原結合断片を含むキメラ抗原受容体、または前記キメラ抗原受容体を含む免疫細胞を含むがん、炎症または免疫疾患治療用組成物。
  41. 請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片、前記抗体またはその抗原結合断片を含む抗体薬物複合体を含む、がん、炎症または免疫疾患治療用組成物。
  42. FGFR3とTACC3の融合遺伝子が増幅されているか、融合遺伝子に変異があるか、融合遺伝子が過剰発現しているか、または融合遺伝子が恒常的発現(constitutive activation)していることが確認されたがんを治療するための、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片、前記抗体またはその抗原結合断片を含む二重または多重特異性抗体、抗体薬物複合体、キメラ抗原受容体または前記キメラ抗原受容体を含む免疫細胞を含む、がん、炎症または免疫疾患治療用組成物。
  43. 患者由来サンプルからFGFR3とTACC3の融合遺伝子が増幅されているか、融合遺伝子に変異があるか、融合遺伝子が過剰発現しているか、または融合遺伝子が恒常的発現(constitive activation)していることを確認する工程、
    FGFR3とTACC3の融合遺伝子が増幅されるか、融合遺伝子に変異があるか、融合遺伝子が過剰発現されるか、または融合遺伝子が恒常的発現(constitutive activation)することが確認された場合、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片、前記抗体またはその抗原結合断片を含む二重または多重特異性抗体、抗体薬物複合体、キメラ抗原受容体または前記キメラ抗原受容体を含む免疫細胞を投与する工程を含む、がん、炎症または免疫疾患の治療方法。
  44. 請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片がその外部に発現されるか、またはその内部に存在する小胞体(vesicle)。
  45. エクソソームである、請求項４４に記載の小胞体。
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