JP2024073610A - Ｍｕｃ１６に対する抗体およびその使用方法 - Google Patents
Ｍｕｃ１６に対する抗体およびその使用方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2024073610A JP2024073610A JP2024043445A JP2024043445A JP2024073610A JP 2024073610 A JP2024073610 A JP 2024073610A JP 2024043445 A JP2024043445 A JP 2024043445A JP 2024043445 A JP2024043445 A JP 2024043445A JP 2024073610 A JP2024073610 A JP 2024073610A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- antibody
- muc16
- score
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title abstract description 83
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 abstract description 214
- 101000623901 Homo sapiens Mucin-16 Proteins 0.000 abstract description 202
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 abstract description 184
- 102100023123 Mucin-16 Human genes 0.000 abstract description 182
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 abstract description 173
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 abstract description 162
- 239000000427 antigen Substances 0.000 abstract description 107
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 abstract description 107
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 abstract description 107
- 230000027455 binding Effects 0.000 abstract description 86
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 82
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 82
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 abstract description 69
- 239000012634 fragment Substances 0.000 abstract description 54
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 abstract description 42
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 37
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 abstract description 28
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 27
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 abstract description 20
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 18
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 243
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 178
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 135
- 108010019670 Chimeric Antigen Receptors Proteins 0.000 description 87
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 82
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 79
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 73
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 56
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 45
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 35
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 35
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 34
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 34
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 34
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 32
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 29
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 28
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 28
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 28
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 27
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 27
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 26
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 26
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 22
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 21
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 21
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 21
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 20
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 20
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 20
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 20
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 20
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 20
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 20
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 20
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 19
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 19
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 19
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 19
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 18
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 18
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 18
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 18
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 18
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 17
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 description 16
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 15
- 102000055862 human MUC16 Human genes 0.000 description 15
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 15
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 15
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 15
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 14
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 14
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 14
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 14
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 14
- 108700028426 mouse MUC16 Proteins 0.000 description 14
- 238000012303 cytoplasmic staining Methods 0.000 description 13
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 13
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 13
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 12
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 12
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 12
- 102100034922 T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Human genes 0.000 description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 12
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 12
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 12
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 12
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 11
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 11
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 11
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 11
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 10
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 10
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 10
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 10
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 10
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 10
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 10
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 10
- OBMZMSLWNNWEJA-XNCRXQDQSA-N C1=CC=2C(C[C@@H]3NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](NC(=O)N(CC#CCN(CCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](CC4=CC=CC=C4)NC3=O)C(=O)N)CC=C)NC(=O)[C@@H](N)C)CC3=CNC4=C3C=CC=C4)C)=CNC=2C=C1 Chemical compound C1=CC=2C(C[C@@H]3NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](NC(=O)N(CC#CCN(CCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](CC4=CC=CC=C4)NC3=O)C(=O)N)CC=C)NC(=O)[C@@H](N)C)CC3=CNC4=C3C=CC=C4)C)=CNC=2C=C1 OBMZMSLWNNWEJA-XNCRXQDQSA-N 0.000 description 9
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 9
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 9
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 9
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 9
- 206010061309 Neoplasm progression Diseases 0.000 description 9
- 101710176384 Peptide 1 Proteins 0.000 description 9
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 9
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 9
- 210000003162 effector t lymphocyte Anatomy 0.000 description 9
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 9
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 9
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 9
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 9
- 108010045069 keyhole-limpet hemocyanin Proteins 0.000 description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 9
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 9
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 9
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 9
- 230000005751 tumor progression Effects 0.000 description 9
- 102000002627 4-1BB Ligand Human genes 0.000 description 8
- 108010082808 4-1BB Ligand Proteins 0.000 description 8
- 102000015728 Mucins Human genes 0.000 description 8
- 108010063954 Mucins Proteins 0.000 description 8
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 8
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 8
- 230000008029 eradication Effects 0.000 description 8
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 8
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 8
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 8
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 8
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 8
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 7
- 102000007269 CA-125 Antigen Human genes 0.000 description 7
- 108010008629 CA-125 Antigen Proteins 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 7
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 7
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 7
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 7
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 7
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 7
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 7
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 6
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 6
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 6
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 6
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 6
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 6
- 230000005917 in vivo anti-tumor Effects 0.000 description 6
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 6
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 6
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 6
- 208000037821 progressive disease Diseases 0.000 description 6
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 6
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 5
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 5
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 5
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 5
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 5
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 5
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 5
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 5
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 5
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 5
- 210000003200 peritoneal cavity Anatomy 0.000 description 5
- 210000004303 peritoneum Anatomy 0.000 description 5
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 5
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 5
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 5
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 5
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 5
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 5
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 5
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 5
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 4
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 4
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 4
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 4
- -1 IgM Proteins 0.000 description 4
- 102000009786 Immunoglobulin Constant Regions Human genes 0.000 description 4
- 108010009817 Immunoglobulin Constant Regions Proteins 0.000 description 4
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 4
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 4
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 4
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 4
- 208000000265 Lobular Carcinoma Diseases 0.000 description 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 4
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 4
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 4
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 4
- 230000004940 costimulation Effects 0.000 description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 4
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 4
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 4
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 4
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 4
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 4
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 4
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 4
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 4
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 4
- 229940051875 mucins Drugs 0.000 description 4
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 4
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 108010056030 retronectin Proteins 0.000 description 4
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 4
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 101000764263 Homo sapiens Tumor necrosis factor ligand superfamily member 4 Proteins 0.000 description 3
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 3
- 102000003812 Interleukin-15 Human genes 0.000 description 3
- 108090000172 Interleukin-15 Proteins 0.000 description 3
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 3
- 108010047620 Phytohemagglutinins Proteins 0.000 description 3
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 3
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 3
- 230000020385 T cell costimulation Effects 0.000 description 3
- 102100026890 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 4 Human genes 0.000 description 3
- 241000021375 Xenogenes Species 0.000 description 3
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 description 3
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 description 3
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 3
- 201000003714 breast lobular carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 3
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 3
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 3
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 3
- 210000005220 cytoplasmic tail Anatomy 0.000 description 3
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 3
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 3
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 230000009429 distress Effects 0.000 description 3
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 3
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 3
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 3
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 3
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 206010073095 invasive ductal breast carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 206010073096 invasive lobular breast carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 description 3
- 201000005249 lung adenocarcinoma Diseases 0.000 description 3
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 3
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 3
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 3
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 3
- 230000001885 phytohemagglutinin Effects 0.000 description 3
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 3
- 102220080600 rs797046116 Human genes 0.000 description 3
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 3
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 3
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 206010000060 Abdominal distension Diseases 0.000 description 2
- 208000010507 Adenocarcinoma of Lung Diseases 0.000 description 2
- 239000012114 Alexa Fluor 647 Substances 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000713813 Gibbon ape leukemia virus Species 0.000 description 2
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 2
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 2
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101001133056 Homo sapiens Mucin-1 Proteins 0.000 description 2
- 101000972286 Homo sapiens Mucin-4 Proteins 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010070999 Intraductal papillary mucinous neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000003735 Mesothelin Human genes 0.000 description 2
- 108090000015 Mesothelin Proteins 0.000 description 2
- 102100034256 Mucin-1 Human genes 0.000 description 2
- 102100022693 Mucin-4 Human genes 0.000 description 2
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 2
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 2
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 2
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 108010039491 Ricin Proteins 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 2
- 102100022153 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Human genes 0.000 description 2
- 101710165473 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Proteins 0.000 description 2
- SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N [4-(4-hydrazinylphenyl)phenyl]hydrazine Chemical compound C1=CC(NN)=CC=C1C1=CC=C(NN)C=C1 SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IEDXPSOJFSVCKU-HOKPPMCLSA-N [4-[[(2S)-5-(carbamoylamino)-2-[[(2S)-2-[6-(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)hexanoylamino]-3-methylbutanoyl]amino]pentanoyl]amino]phenyl]methyl N-[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(3R,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-3-[[(1S,2R)-1-hydroxy-1-phenylpropan-2-yl]amino]-1-methoxy-2-methyl-3-oxopropyl]pyrrolidin-1-yl]-3-methoxy-5-methyl-1-oxoheptan-4-yl]-methylamino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]-N-methylcarbamate Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H]([C@@H](CC(=O)N1CCC[C@H]1[C@H](OC)[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)c1ccccc1)OC)N(C)C(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)OCc1ccc(NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CCCCCN2C(=O)CCC2=O)C(C)C)cc1)C(C)C IEDXPSOJFSVCKU-HOKPPMCLSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 238000007818 agglutination assay Methods 0.000 description 2
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 2
- 230000006023 anti-tumor response Effects 0.000 description 2
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 2
- 108091008034 costimulatory receptors Proteins 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 2
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 210000000232 gallbladder Anatomy 0.000 description 2
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 2
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 2
- 230000002390 hyperplastic effect Effects 0.000 description 2
- 230000008073 immune recognition Effects 0.000 description 2
- 238000002991 immunohistochemical analysis Methods 0.000 description 2
- 238000011221 initial treatment Methods 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 230000002601 intratumoral effect Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 2
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 2
- 108010093470 monomethyl auristatin E Proteins 0.000 description 2
- 208000022669 mucinous neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 2
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 description 2
- 238000009520 phase I clinical trial Methods 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 210000004986 primary T-cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 238000010814 radioimmunoprecipitation assay Methods 0.000 description 2
- 210000000664 rectum Anatomy 0.000 description 2
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 2
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 2
- 230000002992 thymic effect Effects 0.000 description 2
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 2
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 2
- MFRNYXJJRJQHNW-DEMKXPNLSA-N (2s)-2-[[(2r,3r)-3-methoxy-3-[(2s)-1-[(3r,4s,5s)-3-methoxy-5-methyl-4-[methyl-[(2s)-3-methyl-2-[[(2s)-3-methyl-2-(methylamino)butanoyl]amino]butanoyl]amino]heptanoyl]pyrrolidin-2-yl]-2-methylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoic acid Chemical compound CN[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N(C)[C@@H]([C@@H](C)CC)[C@H](OC)CC(=O)N1CCC[C@H]1[C@H](OC)[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 MFRNYXJJRJQHNW-DEMKXPNLSA-N 0.000 description 1
- FJQZXCPWAGYPSD-UHFFFAOYSA-N 1,3,4,6-tetrachloro-3a,6a-diphenylimidazo[4,5-d]imidazole-2,5-dione Chemical compound ClN1C(=O)N(Cl)C2(C=3C=CC=CC=3)N(Cl)C(=O)N(Cl)C12C1=CC=CC=C1 FJQZXCPWAGYPSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HWAVIYAFGOQVNJ-UHFFFAOYSA-N 4-n,4-n-bis(2-chloroethyl)benzene-1,4-diamine Chemical compound NC1=CC=C(N(CCCl)CCCl)C=C1 HWAVIYAFGOQVNJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- STQGQHZAVUOBTE-UHFFFAOYSA-N 7-Cyan-hept-2t-en-4,6-diinsaeure Natural products C1=2C(O)=C3C(=O)C=4C(OC)=CC=CC=4C(=O)C3=C(O)C=2CC(O)(C(C)=O)CC1OC1CC(N)C(O)C(C)O1 STQGQHZAVUOBTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 208000025324 B-cell acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000010839 B-cell chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 238000011725 BALB/c mouse Methods 0.000 description 1
- 206010004146 Basal cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 108060000903 Beta-catenin Proteins 0.000 description 1
- 102000015735 Beta-catenin Human genes 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 102100024650 Carbonic anhydrase 3 Human genes 0.000 description 1
- 101800005309 Carboxy-terminal peptide Proteins 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 108091007741 Chimeric antigen receptor T cells Proteins 0.000 description 1
- 241000700114 Chinchillidae Species 0.000 description 1
- 102000000989 Complement System Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010069112 Complement System Proteins Proteins 0.000 description 1
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N Cytarabine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N 0.000 description 1
- 239000012626 DNA minor groove binder Substances 0.000 description 1
- WEAHRLBPCANXCN-UHFFFAOYSA-N Daunomycin Natural products CCC1(O)CC(OC2CC(N)C(O)C(C)O2)c3cc4C(=O)c5c(OC)cccc5C(=O)c4c(O)c3C1 WEAHRLBPCANXCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 208000037162 Ductal Breast Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 1
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N Fluorouracil Chemical compound FC1=CNC(=O)NC1=O GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical class C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710178376 Heat shock 70 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101000760630 Homo sapiens Carbonic anhydrase 3 Proteins 0.000 description 1
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 102100026878 Interleukin-2 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N Isoflurane Chemical compound FC(F)OC(Cl)C(F)(F)F PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000007766 Kaposi sarcoma Diseases 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N Leupeptin Natural products CC(C)CC(NC(C)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000031422 Lymphocytic Chronic B-Cell Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 101150001976 MUC16 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 206010027406 Mesothelioma Diseases 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 1
- 241000282339 Mustela Species 0.000 description 1
- 229910020700 Na3VO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 101100129406 Neurospora africana MTA-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Chemical group 0.000 description 1
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 208000007571 Ovarian Epithelial Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 1
- 206010035039 Piloerection Diseases 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 206010038111 Recurrent cancer Diseases 0.000 description 1
- 241000282849 Ruminantia Species 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 108091008035 T cell costimulatory receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 1
- 210000000662 T-lymphocyte subset Anatomy 0.000 description 1
- 229940123237 Taxane Drugs 0.000 description 1
- 208000034841 Thrombotic Microangiopathies Diseases 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 229940122803 Vinca alkaloid Drugs 0.000 description 1
- 206010000059 abdominal discomfort Diseases 0.000 description 1
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 1
- QPMSXSBEVQLBIL-CZRHPSIPSA-N ac1mix0p Chemical compound C1=CC=C2N(C[C@H](C)CN(C)C)C3=CC(OC)=CC=C3SC2=C1.O([C@H]1[C@]2(OC)C=CC34C[C@@H]2[C@](C)(O)CCC)C2=C5[C@]41CCN(C)[C@@H]3CC5=CC=C2O QPMSXSBEVQLBIL-CZRHPSIPSA-N 0.000 description 1
- 210000004100 adrenal gland Anatomy 0.000 description 1
- 229940009456 adriamycin Drugs 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 229940100198 alkylating agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002168 alkylating agent Substances 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 1
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 1
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 229960001561 bleomycin Drugs 0.000 description 1
- OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O bleomycin A2 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 210000000621 bronchi Anatomy 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 230000005773 cancer-related death Effects 0.000 description 1
- 230000004856 capillary permeability Effects 0.000 description 1
- 231100000357 carcinogen Toxicity 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 239000003183 carcinogenic agent Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 238000002737 cell proliferation kit Methods 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000010001 cellular homeostasis Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 108700010039 chimeric receptor Proteins 0.000 description 1
- JCKYGMPEJWAADB-UHFFFAOYSA-N chlorambucil Chemical compound OC(=O)CCCC1=CC=C(N(CCCl)CCCl)C=C1 JCKYGMPEJWAADB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004630 chlorambucil Drugs 0.000 description 1
- 208000032852 chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 238000011198 co-culture assay Methods 0.000 description 1
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 229960004397 cyclophosphamide Drugs 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 description 1
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004395 cytoplasmic granule Anatomy 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- STQGQHZAVUOBTE-VGBVRHCVSA-N daunorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(C)=O)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 STQGQHZAVUOBTE-VGBVRHCVSA-N 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- 208000002173 dizziness Diseases 0.000 description 1
- 229960004679 doxorubicin Drugs 0.000 description 1
- 238000002651 drug therapy Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 229960005501 duocarmycin Drugs 0.000 description 1
- 229930184221 duocarmycin Natural products 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 210000003890 endocrine cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002357 endometrial effect Effects 0.000 description 1
- 210000004696 endometrium Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 1
- 210000000918 epididymis Anatomy 0.000 description 1
- 201000010063 epididymitis Diseases 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 1
- 210000001508 eye Anatomy 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 210000002458 fetal heart Anatomy 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002949 fluorouracil Drugs 0.000 description 1
- 229940014144 folate Drugs 0.000 description 1
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 210000001156 gastric mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 238000012817 gel-diffusion technique Methods 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 1
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 1
- 230000000951 immunodiffusion Effects 0.000 description 1
- 238000000760 immunoelectrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000013115 immunohistochemical detection Methods 0.000 description 1
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 1
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 238000003017 in situ immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 1
- 230000004068 intracellular signaling Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 201000010985 invasive ductal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 229960002725 isoflurane Drugs 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N leupeptin Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- 108010052968 leupeptin Proteins 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 238000000504 luminescence detection Methods 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 238000007726 management method Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 108020004084 membrane receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 208000037819 metastatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000011575 metastatic malignant neoplasm Diseases 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 208000016044 mixed lobular and ductal breast carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000012120 mounting media Substances 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000013188 needle biopsy Methods 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 210000005170 neoplastic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 230000014207 opsonization Effects 0.000 description 1
- 210000003101 oviduct Anatomy 0.000 description 1
- 230000036407 pain Effects 0.000 description 1
- 201000002094 pancreatic adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000000277 pancreatic duct Anatomy 0.000 description 1
- 230000009996 pancreatic endocrine effect Effects 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006303 photolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000015843 photosynthesis, light reaction Effects 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 230000005371 pilomotor reflex Effects 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 108700028325 pokeweed antiviral Proteins 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 238000010837 poor prognosis Methods 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000000270 postfertilization Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 208000023958 prostate neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000013197 protein A assay Methods 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 230000012743 protein tagging Effects 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 1
- 238000013077 scoring method Methods 0.000 description 1
- 238000007423 screening assay Methods 0.000 description 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 1
- 210000002863 seminiferous tubule Anatomy 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 229940126586 small molecule drug Drugs 0.000 description 1
- 210000002460 smooth muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- DKPFODGZWDEEBT-QFIAKTPHSA-N taxane Chemical class C([C@]1(C)CCC[C@@H](C)[C@H]1C1)C[C@H]2[C@H](C)CC[C@@H]1C2(C)C DKPFODGZWDEEBT-QFIAKTPHSA-N 0.000 description 1
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 1
- 230000002381 testicular Effects 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 210000000115 thoracic cavity Anatomy 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- PXSOHRWMIRDKMP-UHFFFAOYSA-N triaziquone Chemical compound O=C1C(N2CC2)=C(N2CC2)C(=O)C=C1N1CC1 PXSOHRWMIRDKMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003656 tris buffered saline Substances 0.000 description 1
- IHIXIJGXTJIKRB-UHFFFAOYSA-N trisodium vanadate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-][V]([O-])([O-])=O IHIXIJGXTJIKRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 239000000439 tumor marker Substances 0.000 description 1
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 1
- 108010065816 zeta chain antigen T cell receptor Proteins 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
- C07K16/3076—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties
- C07K16/3092—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties against tumour-associated mucins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
- A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
- A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- A61K39/464411—Immunoglobulin superfamily
- A61K39/464412—CD19 or B4
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
- A61K39/464469—Tumor associated carbohydrates
- A61K39/46447—Mucins, e.g. MUC-1
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
- G01N33/57488—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds identifable in body fluids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/515—Animal cells
- A61K2039/5156—Animal cells expressing foreign proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the route of administration
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
- A61K2239/59—Reproductive system, e.g. uterus, ovaries, cervix or testes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
- A61K39/001169—Tumor associated carbohydrates
- A61K39/00117—Mucins, e.g. MUC-1
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
- C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/77—Internalization into the cell
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Oncology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
【課題】ＭＵＣ１６に対する抗体およびその使用方法の提供。【解決手段】本発明は、ポリペプチドまたはその抗原性部分に特異的に結合する抗体およびその抗原結合断片であって、上記ポリペプチドが、ａ）ＭＵＣ１６外部ドメインポリペプチド、ｂ）ＭＵＣ１６細胞質ドメインポリペプチド、およびｃ）システインループポリペプチドを含有するＭＵＣ１６細胞外ドメインポリペプチドから選択される、抗体およびその抗原結合断片を提供する。本発明の抗体およびそれらを含有する組成物は、癌などのＭＵＣ１６が過剰発現している疾患についての診断的および治療的適用に有用である。【選択図】図１
Description
本願は、２０１０年３月１６日に出願された同時係属中の米国仮特許出願第６１／３１７，９６４号への優先権を主張し、この米国仮特許出願はあらゆる目的のためにその全体が本明細書中に参考として援用される。
本発明は、米国公衆衛生局（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ；ＵＳ ＰＨＳ）により授与されたＰＯ１－ＣＡ５２４７７－１６の下、政府支援により成された。政府は本発明に一定の権利を有する。
発明の分野
本発明は、ポリペプチドまたはその抗原性部分に特異的に結合する抗体およびその抗原結合断片であって、そのポリペプチドが、ａ）ＭＵＣ１６外部ドメインポリペプチド、ｂ）ＭＵＣ１６細胞質ドメインポリペプチド、およびｃ）システインループポリペプチドを含有するＭＵＣ１６細胞外ドメインポリペプチドから選択される、抗体およびその抗原結合断片に関する。本発明の抗体およびそれらを含有する組成物は、癌などのＭＵＣ１６が過剰発現している疾患についての診断的および治療的適用に有用である。
本発明は、ポリペプチドまたはその抗原性部分に特異的に結合する抗体およびその抗原結合断片であって、そのポリペプチドが、ａ）ＭＵＣ１６外部ドメインポリペプチド、ｂ）ＭＵＣ１６細胞質ドメインポリペプチド、およびｃ）システインループポリペプチドを含有するＭＵＣ１６細胞外ドメインポリペプチドから選択される、抗体およびその抗原結合断片に関する。本発明の抗体およびそれらを含有する組成物は、癌などのＭＵＣ１６が過剰発現している疾患についての診断的および治療的適用に有用である。
発明の背景
細胞表面マーカーおよび脱落抗原（ｓｈｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ）は、いくつかの癌の診断に用いられる。例えば、ＯＣ１２５抗体によって認識されるＣＡ１２５抗原は、卵巣癌に発現する組織特異的な循環抗原である。ＣＡ１２５抗原は、ＬｌｏｙｄおよびＹｉｎによってクローニングされたＭＵＣ１６遺伝子によってコードされる。その完全長遺伝子は、おもに様々な婦人科系の組織、特に新生物に存在する複合連結型（ｃｏｍｐｌｅｘ ｔｅｔｈｅｒｅｄ）ムチンタンパク質を表す。ＯＣ１２５および他の関連抗体は、もっぱらその分子の切断部分に存在するグリコシル化依存性抗原と反応する。
細胞表面マーカーおよび脱落抗原（ｓｈｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ）は、いくつかの癌の診断に用いられる。例えば、ＯＣ１２５抗体によって認識されるＣＡ１２５抗原は、卵巣癌に発現する組織特異的な循環抗原である。ＣＡ１２５抗原は、ＬｌｏｙｄおよびＹｉｎによってクローニングされたＭＵＣ１６遺伝子によってコードされる。その完全長遺伝子は、おもに様々な婦人科系の組織、特に新生物に存在する複合連結型（ｃｏｍｐｌｅｘ ｔｅｔｈｅｒｅｄ）ムチンタンパク質を表す。ＯＣ１２５および他の関連抗体は、もっぱらその分子の切断部分に存在するグリコシル化依存性抗原と反応する。
血清アッセイは、多くの上皮卵巣癌患者において循環ＣＡ１２５抗原のレベルの上昇を検出することができ、卵巣細胞系ＯＶＣＡ４３３を用いて引き出されたこの抗原は、ＯＣ１２５抗体によって認識される（１～２）。血清中の循環ＣＡ１２５の検出は、卵巣癌患者および臨床試験の管理にとって有用なツールであることがわかっている（３～４）。しかしながら、ＣＡ１２５は、一般的な癌スクリーニングにとって十分感度が高いことも特異的であることもない（５～６）。ＶＫ８およびＭ１１を含むＣＡ１２５に連結される様々な抗体は、その後、卵巣癌細胞上に存在することが明かにされている（７～９）。これらの抗体は、卵巣癌における血清アッセイおよび様々な他の研究を開発するために用いられているが、それらは、スクリーニングまたは組織送達に臨床的に用いるには重大な欠陥を有する。これらの抗体は、スクリーニングツールとして有用ではなく、またそれらは、切断後の近位の残留ＭＵＣ１６タンパク質断片を検出することができない。このことにより、それらの診断的および治療的適用が制限されている。
例えば、卵巣癌細胞抽出物に対して調製されたＯＣ１２５、Ｍ１１、およびたいていの他の抗体は、複合グリコシル化依存性抗原に向けられる。これらの抗原は、もっぱらＭＵＣ１６の脱落部分に存在し、ＭＵＣ１６の近位部分の生物学的特徴をフォローするために用いることができず、そのグリコシル化パターンは組織間で実質的に異なり得るため、組織分布を正確には反映し得ない。ＯＣ１２５を含むＭＵＣ１６反応性抗体の大部分は、もっぱらその分子の切断部分に存在するグリコシル化依存性抗原と反応するため、ＭＵＣ１６発現の真の分布は知られていない（２１）。切断およびＣＡ１２５遊離後の残留ＭＵＣ１６タンパク質断片の運命を追跡するのに利用可能な抗体は現在、存在しない。
したがって、ＭＵＣ１６のペプチドバックボーンの配列に対して向けられ、かつＭＵＣ１６が発現し、および／または過剰発現している癌の診断および処置に有用である、抗体の同定が依然として必要とされている。
本発明は、ポリペプチドまたはその抗原性部分に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片であって、そのポリペプチドが、ａ）ＭＵＣ１６外部ドメインポリペプチド、ｂ）ＭＵＣ１６細胞質ドメインポリペプチド、およびｃ）システインループポリペプチド：ＣＱＶＳＴＦＲＳＶＰＮＲＨＨＴＧＶＤＳＬＣ（配列番号１９）を含有するＭＵＣ１６細胞外ドメインポリペプチドの群から選択される、抗体またはその抗原結合断片を提供する。一実施形態において、抗体は細胞内へ内部移行する。ＭＵＣ１６外部ドメインの特定の配列に本発明を限定するつもりはないが、一実施形態において、ＭＵＣ１６外部ドメインポリペプチドは、ポリペプチド１：ＮＦＳＰＬＡＲＲＶＤＲＶＡＩＹＥＥ（配列番号０１）およびポリペプチド２：ＴＬＤＲＳＳＶＬＶＤＧＹＳＰＮＲＮＥ（配列番号０２）の群から選択されるポリペプチドを含む。別の実施形態において、抗体は、グリコシル化ＭＵＣ１６細胞外ドメインへの特異的結合を欠く。なおさらなる実施形態において、抗体は、ＭＵＣ１６外部ドメインポリペプチドのポリペプチド２（配列番号０２）に特異的に結合し、その抗体は、配列番号０６によってコードされる可変重鎖（ＶＨ）および配列番号０７によってコードされる可変軽鎖（ＶＬ）を含む。なお別の代替の実施形態において、抗体は、ＭＵＣ１６外部ドメインポリペプチドのポリペプチド２（配列番号０２）に特異的に結合し、その抗体は、配列番号０４によってコードされる可変重鎖（ＶＨ）および配列番号０５によってコードされる可変軽鎖（ＶＬ）を含む。さらなる実施形態において、抗体は、ＭＵＣ１６外部ドメインポリペプチドのポリペプチド１（配列番号０１）に特異的に結合し、その抗体は、配列番号０８によってコードされる可変重鎖（ＶＨ）および配列番号０９および配列番号１０の少なくとも１つによってコードされる可変軽鎖（ＶＬ）を含む。一実施形態において、ＭＵＣ１６細胞質ドメインポリペプチドは、ＶＴＴＲＲ ＲＫＫＥＧＥＹＮＶＱ ＱＱ（配列番号１８）を含む。より好ましくは、非限定的に、ＭＵＣ１６細胞質ドメインポリペプチドは、ポリペプチド３：ＣＧＶＬＶＴＴＲＲＲＫＫＥＧＥＹＮＶＱＱＱ（配列番号０３）を含む。代替の実施形態において、システインループポリペプチドを含有するＭＵＣ１６細胞外ドメインポリペプチドは、ＣＱＶＳＴＦＲＳＶＰＮＲＨＨＴＧＶＤＳＬＣ（配列番号１９）を含む。より好ましくは、非限定的に、ＭＵＣ１６細胞外ドメインポリペプチドは、ポリペプチド４：ＫＳＹＦ ＳＤＣＱＶＳＴＦＲＳ
ＶＰＮＲＨＨＴＧＶＤ ＳＬＣＮＦＳＰＬ（配列番号１５）を含む。なお別の代替の実施形態において、抗体は、ＭＵＣ１６細胞外ドメインポリペプチドのポリペプチド４（配列番号１５）に特異的に結合し、その抗体は、配列番号１１によってコードされる可変重鎖（ＶＨ）および配列番号１２によってコードされる可変軽鎖（ＶＬ）を含む。さらなる代替の実施形態において、抗体は、キメラ抗体、モノクローナル抗体、組換え抗体、組換え抗体の抗原結合断片、ヒト化抗体、およびファージの表面にディスプレイされる抗体の群から選択される。別の実施形態において、抗原結合断片は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、およびＦｖ断片の群から選択される。代替の実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、細胞傷害性物質または細胞傷害性物質のプロドラッグに共有結合により連結される。好ましい実施形態において、抗体は、ハイブリドーマ細胞系によって産生されるモノクローナル抗体である。
ＶＰＮＲＨＨＴＧＶＤ ＳＬＣＮＦＳＰＬ（配列番号１５）を含む。なお別の代替の実施形態において、抗体は、ＭＵＣ１６細胞外ドメインポリペプチドのポリペプチド４（配列番号１５）に特異的に結合し、その抗体は、配列番号１１によってコードされる可変重鎖（ＶＨ）および配列番号１２によってコードされる可変軽鎖（ＶＬ）を含む。さらなる代替の実施形態において、抗体は、キメラ抗体、モノクローナル抗体、組換え抗体、組換え抗体の抗原結合断片、ヒト化抗体、およびファージの表面にディスプレイされる抗体の群から選択される。別の実施形態において、抗原結合断片は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、およびＦｖ断片の群から選択される。代替の実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、細胞傷害性物質または細胞傷害性物質のプロドラッグに共有結合により連結される。好ましい実施形態において、抗体は、ハイブリドーマ細胞系によって産生されるモノクローナル抗体である。
本発明はまた、ハイブリドーマ細胞系によって産生される単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、その抗体がポリペプチドまたはその抗原性部分に特異的に結合し、そのポリペプチドが、ａ）ＭＵＣ１６外部ドメインポリペプチド、ｂ）ＭＵＣ１６細胞質ドメインポリペプチド、およびｃ）システインループポリペプチド：ＣＱＶＳＴＦＲＳＶＰＮＲＨＨＴＧＶＤＳＬＣ（配列番号１９）を含有するＭＵＣ１６細胞外ドメインポリペプチドの群から選択される、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を提供する。一実施形態において、ＭＵＣ１６外部ドメインポリペプチドは、ポリペプチド１（配列番号０１）を含み、抗体は、９Ｂ１１．２０．１６、１０Ａ２、２Ｆ４、２３Ｄ３、３０Ｂ１、および３１Ｂ２の群から選択される。代替の実施形態において、ＭＵＣ１６外部ドメインポリペプチドは、ポリペプチド２（配列番号０２）を含み、抗体は、４Ｈ１１．２．５、１３Ｈ１、２９Ｇ９、９Ｃ９．２１．５．１３、２８Ｆ８、２３Ｇ１２、９Ｃ７．６、１１Ｂ６、２５Ｇ４、５Ｃ２．１７、４Ｃ７、２６Ｂ２、４Ａ５．３７、４Ａ２、２５Ｈ３、および２８Ｆ７．１８．１０の群から選択される。なおさらなる実施形態において、ＭＵＣ１６細胞質ドメインポリペプチドは、ポリペプチド３：ＣＧＶＬＶＴＴＲＲＲＫＫＥＧＥＹＮＶＱＱＱ（配列番号０３）を含み、抗体は、３１Ａ３．５．１、１９Ｄ１、１０Ｆ６、２２Ｅ１０、２２Ｆ１、３Ｈ８、２２Ｆ１１、４Ｄ７、２４Ｇ１２、１９Ｇ４、９Ａ５、４Ｃ２、３１Ｃ８、２７Ｇ４、および６Ｈ２の群から選択される。別の代替の実施形態において、ＭＵＣ１６細胞外ドメインポリペプチドは、ポリペプチド４：ＫＳＹＦ ＳＤＣＱＶＳＴＦＲＳ ＶＰＮＲＨＨＴＧＶＤ ＳＬＣＮＦＳＰＬ（配列番号１５）を含み、抗体は、２４Ｂ３および９Ｃ７の群から選択される。
本発明はさらに、（ａ）本明細書に記載されている抗体またはその抗原結合断片のいずれか１つまたは複数、および（ｂ）薬学的に許容され得るキャリアを含む組成物を提供する。
ａ）ＭＵＣ１６外部ドメインポリペプチド、ｂ）ＭＵＣ１６細胞質ドメインポリペプチド、およびｃ）システインループポリペプチド：ＣＱＶＳＴＦＲＳＶＰＮＲＨＨＴＧＶＤＳＬＣ（配列番号１９）を含有するＭＵＣ１６細胞外ドメインポリペプチドの群から選択される、ポリペプチドまたはその抗原性部分に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系もまた本発明によって提供される。
本発明はさらに、被験体においてＭＵＣ１６の過剰発現を含む疾患を検出するための方法であって、ａ）ｉ）被験体由来の試料およびｉｉ）本明細書に記載されている抗体またはその抗原結合断片のいずれか１つまたは複数を供給する工程、ｂ）抗体のそれの抗原との特異的結合のための条件下で試料を抗体と接触させる工程、およびｃ）上記疾患を欠く対照試料と比較した、抗体の試料への結合のレベルの増加を検出し、それによって被験体において上記疾患を検出する工程を含む方法を提供する。一実施形態において、疾患は癌である。好ましい実施形態において、癌は、卵巣癌および乳癌の群から選択される。検出方法を限定するつもりはないが、一実施形態において、抗体の試料への結合を検出する方法は、免疫組織化学検査、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）、ウェスタンブロット、免疫沈降、および／またはＸ線画像化である。
ＭＵＣ１６の過剰発現を含む疾患を処置するための方法であって、本明細書に記載されている抗体またはその抗原結合断片のいずれか１つまたは複数の治療上有効量を、上記疾患を有する被験体に投与する工程を含む方法もまた本明細書において提供される。一実施形態において、疾患は、卵巣癌および乳癌によって例示されるような癌である。
本発明はまた、ＭＵＣ１６ポリペプチドまたはその抗原性部分に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であって、ＭＵＣ１６ポリペプチドが
本発明はまた、（ａ）本発明の抗体および／またはその抗原結合断片のいずれか１つまたは複数、ならびに（ｂ）薬学的に許容され得るキャリアを含む組成物を提供する。
本発明はさらに、ＭＵＣ１６ポリペプチドまたはその抗原性部分に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を産生するハイブリドーマ細胞であって、ＭＵＣ１６ポリペプチドが
本発明はまた、ＭＵＣ１６ポリペプチドに特異的に結合する抗体の可変重鎖（ＶＨ）配列および可変軽鎖（ＶＬ）配列の少なくとも１つをコードするポリヌクレオチドを含む単離されたヌクレオチド配列であって、ＭＵＣ１６ポリペプチドが
本発明はまた、
本発明はさらに、本発明の抗体および／またはその抗原結合断片のいずれか１つまたは複数の、ＭＵＣ１６ポリペプチドまたはその抗原性部分との特異的結合の、被験体由来の試料におけるレベルを決定する工程を含む、疾患を有するとして被験体を同定するための方法を提供する。一実施形態において、疾患は、卵巣癌および乳癌によって例示される癌である。別の実施形態において、方法は、対照試料と比較した、抗体の試料への結合のレベルの変化を検出する工程をさらに含む。必要に応じて、検出は、免疫組織化学検査、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）、ウェスタンブロット、免疫沈降、およびＸ線画像化の群から選択される。
本発明はまた、疾患の１つまたは複数の症状を軽減するための方法であって、本発明の抗体および／またはその抗原結合断片のいずれか１つまたは複数の治療上有効量を、それを必要とする被験体に投与する工程を含む方法を提供する。一実施形態において、疾患は、卵巣癌および乳癌によって例示される癌である。必要に応じて、方法は、投与工程後、疾患の１つまたは複数の症状の軽減を検出する工程をさらに含む。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１） ＭＵＣ１６ポリペプチドまたはその抗原性部分に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であって、該ＭＵＣ１６ポリペプチドが
からなる群から選択される、抗体またはその抗原結合断片。
（項目２） モノクローナル抗体、キメラ抗体、組換え抗体、組換え抗体の抗原結合断片、ヒト化抗体、およびファージの表面にディスプレイされる抗体からなる群から選択される、項目１に記載の抗体。
（項目３） モノクローナル抗体である、項目２に記載の抗体。
（項目４） 前記モノクローナル抗体が、
からなる群から選択されるハイブリドーマ細胞によって産生される、項目３に記載の抗体。
（項目５） 前記ＭＵＣ１６ポリペプチドがＴＬＤＲＫＳＶＦＶＤＧＹＳＱＮＲＤＤ（配列番号２１）である、項目１に記載の抗体。
（項目６） 可変重鎖（ＶＨ）配列である配列番号２７および可変軽鎖（ＶＬ）配列である配列番号２９を含む、項目５に記載の抗体。
（項目７） ハイブリドーマ細胞１２Ｂ１０－３Ｇ１０によって産生されるモノクローナル抗体である、項目６に記載の抗体。
（項目８） 前記抗原結合断片が、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、およびＦｖ断片からなる群から選択される、項目１に記載の抗体。
（項目９） 前記抗体またはその抗原結合断片が、細胞傷害性物質、または細胞傷害性物質のプロドラッグに共有結合により連結されている、項目１に記載の抗体。
（項目１０） ヒトＭＵＣ１６（配列番号２５）に特異的に結合する、項目１に記載の抗体。
（項目１１） 細胞内へ内部移行する、項目１に記載の抗体。
（項目１２） グリコシル化ＭＵＣ１６細胞外ドメインへの特異的結合を欠く、項目１に記載の抗体。
（項目１３） （ａ）項目１に記載の抗体またはその抗原結合断片、および（ｂ）薬学的に許容され得るキャリアを含む組成物。
（項目１４） ＭＵＣ１６ポリペプチドまたはその抗原性部分に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を産生するハイブリドーマ細胞であって、該ＭＵＣ１６ポリペプチドが
からなる群から選択される、ハイブリドーマ細胞。
（項目１５） ＭＵＣ１６ポリペプチドに特異的に結合する抗体の可変重鎖（ＶＨ）配列および可変軽鎖（ＶＬ）配列のうちの少なくとも１つをコードするポリヌクレオチドを含む単離されたヌクレオチド配列であって、該ＭＵＣ１６ポリペプチドが
からなる群から選択される、ヌクレオチド配列。
（項目１６） 前記ＭＵＣ１６ポリペプチドがＴＬＤＲＫＳＶＦＶＤＧＹＳＱＮＲＤＤ（配列番号２１）である、項目１５に記載のヌクレオチド配列。
（項目１７） 前記可変重鎖（ＶＨ）配列をコードする前記ポリヌクレオチドが配列番号２６を含み、かつ前記可変軽鎖（ＶＬ）配列をコードする前記ポリヌクレオチドが配列番号２８を含む、項目１６に記載のヌクレオチド配列。
（項目１８）
からなる群から選択される、免疫学的有効量のＭＵＣ１６ポリペプチドを被験体に投与する工程を含む、ＭＵＣ１６ポリペプチドまたはその抗原性部分に特異的に結合する抗体を産生するための方法。
（項目１９） 疾患を有するとして被験体を同定するための方法であって、項目１に記載の抗体の前記ＭＵＣ１６ポリペプチドまたは前記その抗原性部分との特異的結合の、該被験体由来の試料におけるレベルを決定する工程を含み、ここで、対照試料と比較して、該特異的結合のレベルの変化を検出することにより、疾患を有するとして該被験体を同定する、方法。
（項目２０） 前記疾患が癌である、項目１９に記載の方法。
（項目２１） 前記癌が、卵巣癌および乳癌からなる群から選択される、項目２０に記載の方法。
（項目２２） 対照試料と比較して、前記抗体の前記試料への結合のレベルの変化を検出する工程をさらに含む、項目１９に記載の方法。
（項目２３） 前記検出が、免疫組織化学検査、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）、ウェスタンブロット、免疫沈降、およびＸ線画像化からなる群から選択される、項目１９に記載の方法。
（項目２４） 疾患の１つまたは複数の症状を軽減するための方法であって、治療上有効量の項目１に記載の抗体を、それを必要とする被験体に投与する工程を含む、方法。
（項目２５） 前記疾患が癌である、項目２４に記載の方法。
（項目２６） 前記癌が、卵巣癌および乳癌からなる群から選択される、項目２５に記載の方法。
（項目２７） 前記投与する工程の後に前記疾患の１つまたは複数の症状の軽減を検出する工程をさらに含む、項目２４に記載の方法。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１） ＭＵＣ１６ポリペプチドまたはその抗原性部分に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であって、該ＭＵＣ１６ポリペプチドが
（項目２） モノクローナル抗体、キメラ抗体、組換え抗体、組換え抗体の抗原結合断片、ヒト化抗体、およびファージの表面にディスプレイされる抗体からなる群から選択される、項目１に記載の抗体。
（項目３） モノクローナル抗体である、項目２に記載の抗体。
（項目４） 前記モノクローナル抗体が、
（項目５） 前記ＭＵＣ１６ポリペプチドがＴＬＤＲＫＳＶＦＶＤＧＹＳＱＮＲＤＤ（配列番号２１）である、項目１に記載の抗体。
（項目６） 可変重鎖（ＶＨ）配列である配列番号２７および可変軽鎖（ＶＬ）配列である配列番号２９を含む、項目５に記載の抗体。
（項目７） ハイブリドーマ細胞１２Ｂ１０－３Ｇ１０によって産生されるモノクローナル抗体である、項目６に記載の抗体。
（項目８） 前記抗原結合断片が、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、およびＦｖ断片からなる群から選択される、項目１に記載の抗体。
（項目９） 前記抗体またはその抗原結合断片が、細胞傷害性物質、または細胞傷害性物質のプロドラッグに共有結合により連結されている、項目１に記載の抗体。
（項目１０） ヒトＭＵＣ１６（配列番号２５）に特異的に結合する、項目１に記載の抗体。
（項目１１） 細胞内へ内部移行する、項目１に記載の抗体。
（項目１２） グリコシル化ＭＵＣ１６細胞外ドメインへの特異的結合を欠く、項目１に記載の抗体。
（項目１３） （ａ）項目１に記載の抗体またはその抗原結合断片、および（ｂ）薬学的に許容され得るキャリアを含む組成物。
（項目１４） ＭＵＣ１６ポリペプチドまたはその抗原性部分に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を産生するハイブリドーマ細胞であって、該ＭＵＣ１６ポリペプチドが
（項目１５） ＭＵＣ１６ポリペプチドに特異的に結合する抗体の可変重鎖（ＶＨ）配列および可変軽鎖（ＶＬ）配列のうちの少なくとも１つをコードするポリヌクレオチドを含む単離されたヌクレオチド配列であって、該ＭＵＣ１６ポリペプチドが
（項目１６） 前記ＭＵＣ１６ポリペプチドがＴＬＤＲＫＳＶＦＶＤＧＹＳＱＮＲＤＤ（配列番号２１）である、項目１５に記載のヌクレオチド配列。
（項目１７） 前記可変重鎖（ＶＨ）配列をコードする前記ポリヌクレオチドが配列番号２６を含み、かつ前記可変軽鎖（ＶＬ）配列をコードする前記ポリヌクレオチドが配列番号２８を含む、項目１６に記載のヌクレオチド配列。
（項目１８）
（項目１９） 疾患を有するとして被験体を同定するための方法であって、項目１に記載の抗体の前記ＭＵＣ１６ポリペプチドまたは前記その抗原性部分との特異的結合の、該被験体由来の試料におけるレベルを決定する工程を含み、ここで、対照試料と比較して、該特異的結合のレベルの変化を検出することにより、疾患を有するとして該被験体を同定する、方法。
（項目２０） 前記疾患が癌である、項目１９に記載の方法。
（項目２１） 前記癌が、卵巣癌および乳癌からなる群から選択される、項目２０に記載の方法。
（項目２２） 対照試料と比較して、前記抗体の前記試料への結合のレベルの変化を検出する工程をさらに含む、項目１９に記載の方法。
（項目２３） 前記検出が、免疫組織化学検査、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）、ウェスタンブロット、免疫沈降、およびＸ線画像化からなる群から選択される、項目１９に記載の方法。
（項目２４） 疾患の１つまたは複数の症状を軽減するための方法であって、治療上有効量の項目１に記載の抗体を、それを必要とする被験体に投与する工程を含む、方法。
（項目２５） 前記疾患が癌である、項目２４に記載の方法。
（項目２６） 前記癌が、卵巣癌および乳癌からなる群から選択される、項目２５に記載の方法。
（項目２７） 前記投与する工程の後に前記疾患の１つまたは複数の症状の軽減を検出する工程をさらに含む、項目２４に記載の方法。
定義
本発明の理解を促すために、いくつかの用語を下記に定義する。
本発明の理解を促すために、いくつかの用語を下記に定義する。
本明細書に用いられる場合、用語「精製された」、「単離された」、およびその文法的相当語句は、非限定的に、１０％から１００％まで、２０％から１００％まで、３０％から１００％まで、４０％から１００％まで、５０％から１００％まで、６０％から１００％まで、７０％から１００％まで、８０％から１００％まで、および９０％から１００％までなどの、５％から１００％までの任意の数値のパーセンテージの低減を含む、試料からの少なくとも１つの望ましくない成分（例えば、細胞、タンパク質、核酸配列、糖質など）の量の低減を指す。したがって、精製は、結果として、望ましい成分（細胞、タンパク質、核酸配列、糖質など）の量の「富化」、すなわち、増加を生じる。
用語「抗体」は、免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤなど）を指す。各抗体の基本的機能単位は、免疫グロブリン（Ｉｇ）モノマー（１つの免疫グロブリン（「Ｉｇ」）単位のみを含有する）である。ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、およびキメラ抗体はこの定義内に含まれる。
抗体の可変部はそれの「Ｖドメイン」（「可変領域」とも呼ばれる）であり、定常部は、κ、λ、α、γ、δ、ε、およびμ定常領域などのそれの「Ｃドメイン」（「定常領域」とも呼ばれる）である。「可変ドメイン」はまた、「Ｆｖ領域」とも呼ばれ、抗原への結合に最も重要な領域である。より具体的には、軽鎖（ＶＬ）および重鎖（ＶＨ）上にそれぞれ３つある可変ループが、抗原への結合に関与する。これらのループは、「相補性決定領域」、（「ＣＤＲ」、および「イディオタイプ」と呼ばれる。
抗体の免疫グロブリン（Ｉｇ）モノマーは、ジスルフィド架橋によって連結された４つのポリペプチド鎖：２つの軽鎖および２つの重鎖を含有する「Ｙ」形の分子である。
軽鎖は、（λ）かカッパ（κ）のいずれかとして分類される。軽鎖は、２つの連続的なドメイン：１つの定常ドメイン（「ＣＬ」）および１つの可変ドメイン（「ＶＬ」）を有する。可変ドメイン、ＶＬは、抗体の各型において異なり、特定の抗原と結合する分子の活性部分である。軽鎖のおよその長さは、２１１～２１７個のアミノ酸である。
各重鎖は、２つの領域である、定常領域および可変領域を有する。α、δ、ε、γ、およびμと表される５つの型の哺乳類Ｉｇ重鎖がある。存在する重鎖の型は、抗体のクラスを定義する；これらの鎖は、ＩｇＡ抗体、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＧ抗体、およびＩｇＭ抗体に、それぞれ見出される。別個の重鎖は、サイズおよび組成が異なる；αおよびγは約４５０個のアミノ酸を含有するが、μおよびεは約５５０個のアミノ酸を有する。各重鎖は、２つの領域である、定常領域（「ＣＨ」）および可変領域（「ＶＨ」）を有する。定常領域（ＣＨ）は、同じアイソタイプの全ての抗体において同一であるが、異なるアイソタイプの抗体においては異なる。重鎖γ、α、およびδは、３つの直列型（一列になった）Ｉｇドメイン、および可動性を加えるためのヒンジ領域で構成される定常領域を有する。重鎖μおよびεは、４つの免疫グロブリンドメインで構成される定常領域を有する。重鎖の可変領域（ＶＨ）は、異なるＢ細胞によって産生される抗体において異なるが、単一のＢ細胞またはＢ細胞クローンによって産生される全ての抗体については同じである。各重鎖の可変領域は、約１１０アミノ酸長である。
２つの分子の結合（例えば、抗体と抗原など）に関する場合の用語「特異的に結合する」および「特異的結合」は、その２つの分子の一方または両方における特定の構造の存在に依存する２つの分子の相互作用を指す。例えば、抗体が、分子上のエピトープ「Ａ」に特異的である場合には、標識「Ａ」およびその抗体を含有する反応物にエピトープＡを含有するタンパク質（または遊離の非標識Ａ）が存在することにより、抗体に結合する標識Ａの量を低下させる。
第１の分子（例えば、抗体、ポリペプチド、糖タンパク質、核酸配列など）および第２の分子（例えば、抗原、ポリペプチド、糖タンパク質、核酸配列など）との間の相互作用に関する場合の用語「結合する能力がある」とは、第１の分子が、適切な塩濃度、ならびに適切な温度およびｐＨの存在下で第２の分子に結合することを意味する。分子を結合するための条件は、日常的方法および／または市販の方法を用いて決定されてもよい。
分子に関する場合の用語「抗原」、「免疫原」、「抗原性の」、「免疫原性の」、「抗原活性がある」、「免疫性の」、および「免疫学的に活性がある」は、特定の体液性免疫応答（可溶性抗体応答を誘発することを含む）および／または細胞媒介性免疫応答（ＣＴＬ応答を誘発することを含む）を誘導する能力がある任意の物質を指す。抗原性ペプチドは、好ましくは、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、およびより好ましくは、少なくとも１０個のアミノ酸を含有する。抗体産生を誘発するために、一実施形態において、抗原は、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に結合体化されてもよく、またはグルタチオン－Ｓ－転移酵素（ＧＳＴ）に融合されてもよい。
抗体に結合する抗原に関する場合の「同種抗原（ｃｏｇｎａｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ）」とは、その抗体に特異的に結合する能力がある抗原を指す。
一実施形態において、抗原はエピトープを含む。用語「エピトープ」および「抗原決定基」とは、分子相補性の結果として抗体の結合部位またはＴ細胞受容体と相互作用する、抗原上の構造物を指す。エピトープは、抗体への結合について、それが由来する無傷の抗原と競合し得る。
本明細書で用いられる場合、核酸配列またはタンパク質配列に関する場合の用語「部分」および「断片」とは、サイズが、それぞれ、２個の連続したヌクレオチドおよびアミノ酸から、それぞれ、１個のヌクレオチドおよび１個のアミノ酸を引いた全配列までの範囲であり得るその配列の一片を指す。
本発明の方法から恩恵を受け得る「被験体」には、任意の多細胞動物、好ましくは哺乳類が挙げられる。哺乳類の被験体には、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ヒツジ、ウシ、反芻動物、ウサギ、ブタ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、鳥類などが挙げられる。したがって、哺乳類の被験体は、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、フェレット、およびチンチラによって例示される。本発明の組成物および方法はまた、疾患の「１つまたは複数の症状を軽減することを必要とする」、例えば、癌転移を低下させることを必要とし、および／または癌の１つもしくは複数の症状を軽減することを必要とする被験体にとって有用であり、その被験体には、疾患の１つもしくは複数の症状を示し、および／またはその症状を示すリスクがある被験体が挙げられる。例えば、被験体は、家族歴、遺伝因子、環境因子などに基づくリスクがあり得る。この用語は、疾患の動物モデルを含む。したがって、疾患を軽減し、および／または疾患の１つもしくは複数の症状を軽減することを必要とする被験体に、（疾患を軽減し、および／または疾患の１つもしくは複数の症状を軽減する）組成物を投与することは、組成物の予防的（すなわち、疾患および／または疾患の１つもしくは複数の症状が検出できる前の）投与および／または組成物の治療的（すなわち、疾患および／または疾患の１つもしくは複数の症状が検出できた後の）投与を含む。本発明の組成物および方法はまた、疾患に罹る素因がある、および／または疾患の１つもしくは複数の症状を現す素因がある被験体を指す、疾患（癌など）の「リスクがある」被験体にとって有用である。この素因は、遺伝的（例えば、遺伝性障害などの疾患の１つまたは複数の症状を現す特定の遺伝的傾向など）であってもよいし、または他の因子（例えば、環境条件、環境に存在する、発癌物質を含む有害な化合物への曝露など）によるものであってもよい。「リスクがある」被験体という用語は、「疾患を患う」被験体、すなわち、疾患の１つまたは複数の症状を経験中である被験体を含む。本発明がいかなる特定の徴候または症状にも限定されないものとする。したがって、本発明は、不顕性症状から末期の疾患まで任意の範囲の疾患を経験中である被験体であって、疾患に関連した徴候（例えば、徴候および症状）の少なくとも１つを示す被験体を包含する。
「癌細胞」とは、以前に記載されているように（Ｐｉｔｏｔら、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、１５－２８（１９７８））、多段階の新生物進行の初期、中間期、または進行期に至る細胞を指す。これには、「前癌細胞」（すなわち、「過形成細胞および異形成細胞」）を含む、新生物進行の初期、中間期、および進行期における細胞、ならびに異形成細胞の新生物進行の進行期における新生物細胞が挙げられる。
「転移性」癌細胞とは、原発癌部位（すなわち、癌細胞が正常細胞、過形成細胞、または異形成細胞から最初に形成された場所）から原発部位以外の部位へ移動している（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｅｄ）癌細胞を指し、その原発部位以外の部位で、移動した癌細胞が留まり、増殖する。
「癌」とは、卵巣癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、子宮頸癌、膵臓癌、結腸癌、胃癌、食道癌、口腔癌、舌癌、歯肉癌、皮膚癌（例えば、黒色腫、基底細胞癌腫、カポジ肉腫など）、筋肉癌、心臓癌、肝臓癌、気管支癌、軟骨癌、骨癌、精巣癌、腎臓癌、子宮内膜癌、子宮癌、膀胱癌、骨髄癌、リンパ腫癌、脾臓癌、胸腺癌、甲状腺癌、脳癌、ニューロン癌、中皮腫、胆嚢癌、眼癌（例えば、角膜の癌、ブドウ膜の癌、脈絡膜の癌、黄斑の癌、硝子体液癌など）、関節癌（滑膜癌など）、神経膠芽腫、リンパ腫、および白血病などの、転移性であっても、転移性でなくてもよい複数の癌細胞を指す。
本明細書で用いられる場合、「試料」および「検体」は、生物学的源、ならびに生体試料または環境試料と接触する試料採取デバイス（例えば、スワブ）から得られ、および／または由来する任意の組成物を含むように、それらの最も広い意味で用いられる。「生体試料」には、体液（尿、血液、血漿、糞便、脳脊髄液（ＣＳＦ）、精液、痰、および唾液など）ならびに固形組織を含む、被験体から得られるものが挙げられる。生体試料にはまた、細胞（例えば、細胞系、組織から単離された細胞（単離された細胞は、組織からの単離後、培養されていても、培養されていなくてもよい）、組織学的分析および／または免疫組織化学的分析のために固定された細胞などの固定細胞）、組織（生検材料など）、細胞抽出物、組織抽出物、ならびに細胞および／または組織から単離された核酸（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ）などが挙げられる。これらの例は例示であり、本発明に適用可能な試料型を限定するものとして解釈されるべきではない。
関心対象となる細胞（癌細胞など）による「ＭＵＣ１６の過剰発現」とは、対照細胞（非癌性細胞、正常細胞など）と比較して、関心対象となる細胞によって発現するＭＵＣ１６タンパク質および／またはｍＲＮＡのより高いレベルを指す。
細胞に関する場合の「内部に取り込む」とは、細胞外媒体から細胞膜および／または細胞質へ入ることを指す。
配列（例えば、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列）に関する場合の「グリコシル化された」とは、１つ以上のサッカライドに共有結合により連結されている配列を指す。
「薬学的」組成物および「生理学的に耐えられ得る」組成物とは、薬学的分子、すなわち、被験体へまたは被験体上へ投与する能力があり、かつ被験体に投与された場合、例えば、有害反応またはアレルギー反応、めまい、胃の不調、毒性などの望ましくない作用を実質的に生じない分子を含有する組成物を指す。好ましくはまた、薬学的分子は、本発明の組成物の活性を実質的に低下させない。薬学的分子には、「希釈剤」（すなわち、「キャリア」）分子および賦形剤が挙げられる。
分子の「免疫原的有効」量および「抗原的有効」量とは、特定の体液性免疫応答（（可溶性抗体応答を誘発することを含む））および／または細胞媒介性免疫応答（細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を誘発することを含む）を誘導する能力がある分子の量を、交換可能に指す。
疾患を「処置する」とは、疾患の１つまたは複数の症状（客観的、主観的、病理学的、臨床的、不顕性など）を軽減することを指す。
第２の試料に対して（または第２の被験体に対して）、第１の試料における（または第１の被験体における）任意の分子（例えば、アミノ酸配列および核酸配列、抗体など）、細胞、および／または現象（例えば、疾患症状、分子への結合、２つの分子の結合の特異性、２つの分子の結合の親和性、癌に対する特異性、癌に対する感度、結合の親和性、酵素活性など）のレベルに関する場合の用語「低下させる」、「阻害する」、「減弱させる」、「抑制する」、「減少させる」、および文法的相当語句（「より低い」、「より小さい」などを含む）とは、第１の試料における（または第１の被験体における）分子、細胞、および／または現象の量が、第２の試料において（または第２の被験体において）より、任意の技術分野容認の統計的解析方法を用いて統計的に有意である任意の量だけ低いことを意味する。一実施形態において、第１の試料における（または第１の被験体における）分子、細胞、および／または現象の量が、第２の試料における（または第２の被験体における）同じ分子、細胞、および／または現象の量より、少なくとも１０％低く、少なくとも２５％低く、少なくとも５０％低く、少なくとも７５％低く、および／または少なくとも９０％低い。別の実施形態において、第１の試料における（または第１の被験体における）分子、細胞、および／または現象の量が、第２の試料における（または第２の被験体における）同じ分子、細胞、および／または現象の量より、非限定的に、１０％から１００％まで、２０％から１００％まで、３０％から１００％まで、４０％から１００％まで、５０％から１００％まで、６０％から１００％まで、７０％から１００％まで、８０％から１００％まで、および９０％から１００％まで低いなどの、５％から１００％までの任意の数値のパーセンテージだけ低い。一実施形態において、第１の被験体は、本発明の組成物および／または方法を用いて操作されている被験体によって例示されるが、それに限定されない。さらなる実施形態において、第２の被験体は、本発明の組成物および／または方法を用いて操作されていない被験体によって例示されるが、それに限定されない。代替の実施形態において、第２の被験体は、第１の被験体と比較して、異なる投与量で、および／または異なる持続期間で、および／または異なる投与経路を介して、本発明の組成物および／または方法を用いて操作されている被験体によって例示されるが、それに限定されない。一実施形態において、第１の被験体と第２の被験体は、本発明の組成物および／または方法の異なる投与計画（例えば、投与量、持続期間、投与経路など）の効果が１つの個体において決定されるように求められる場合など、同じ個体であってもよい。別の実施形態において、第１の被験体と第２の被験体は、臨床試験に参加している１つの個体と入院中の別の個体への本発明の組成物および／または方法の効果を比較する場合など、異なる個体であってもよい。
第２の試料に対して（または第２の被験体に対して）、第１の試料における（または第１の被験体における）任意の分子（例えば、アミノ酸配列および核酸配列、抗体など）、細胞、および／または現象（例えば、疾患症状、分子への結合、２つの分子の結合の特異性、２つの分子の結合の親和性、癌に対する特異性、癌に対する感度、結合の親和性、酵素活性など）のレベルに関する場合の用語「増加させる」、「上昇させる」、「上げる」、および文法的相当語句（「より高い」、「より大きい」などを含む）とは、第１の試料における（または第１の被験体における）分子、細胞、および／または現象の量が、第２の試料において（または第２の被験体において）より、任意の技術分野容認の統計的解析方法を用いて統計的に有意である任意の量だけ高いことを意味する。一実施形態において、第１の試料における（または第１の被験体における）分子、細胞、および／または現象の量が、第２の試料における（または第２の被験体における）同じ分子、細胞、および／または現象の量より、少なくとも１０％多く、少なくとも２５％多く、少なくとも５０％多く、少なくとも７５％多く、および／または少なくとも９０％多い。これには、非限定的に、第２の試料における（または第２の被験体における）同じ分子、細胞、および／または現象の量より、少なくとも１０％多く、少なくとも１５％多く、少なくとも２０％多く、少なくとも２５％多く、少なくとも３０％多く、少なくとも３５％多く、少なくとも４０％多く、少なくとも４５％多く、少なくとも５０％多く、少なくとも５５％多く、少なくとも６０％多く、少なくとも６５％多く、少なくとも７０％多く、少なくとも７５％多く、少なくとも８０％多く、少なくとも８５％多く、少なくとも９０％多く、および／または少なくとも９５％多い、第１の試料における（または第１の被験体における）分子、細胞、および／または現象の量が挙げられる。一実施形態において、第１の被験体は、本発明の組成物および／または方法を用いて操作されている被験体によって例示されるが、それに限定されない。さらなる実施形態において、第２の被験体は、本発明の組成物および／または方法を用いて操作されていない被験体によって例示されるが、それに限定されない。代替の実施形態において、第２の被験体は、第１の被験体と比較して、異なる投与量で、および／または異なる持続期間で、および／または異なる投与経路を介して、本発明の組成物および／または方法を用いて操作されている被験体によって例示されるが、それに限定されない。一実施形態において、第１の被験体と第２の被験体は、本発明の組成物および／または方法の異なる投与計画（例えば、投与量、持続期間、投与経路など）の効果が１つの個体において決定されるように求められる場合など、同じ個体であってもよい。別の実施形態において、第１の被験体と第２の被験体は、臨床試験に参加している１つの個体と入院中の別の個体への本発明の組成物および／または方法の効果を比較する場合など、異なる個体であってもよい。
任意の分子および／または現象のレベルに関する場合の用語「変化させる」および「改変する」とは、増加または減少を指す。
本明細書における任意の数値的な範囲への言及は、その範囲によって包含されるそれぞれの数値（小数値および整数を含む）を含む。例として、非限定的に、本明細書における「少なくとも５０」の範囲への言及は、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０などの整数および小数値５０．１、５０．２、５０．３、５０．４、５０．５、５０．６、５０．７、５０．８、５０．９などを含む。さらなる例において、本明細書における「５０未満」の範囲への言及は、整数４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０など、および小数値４９．９、４９．８、４９．７、４９．６、４９．５、４９．４、４９．３、４９．２、４９．１、４９．０などを含む。なお別の例において、本明細書における「５から１０まで」の範囲への言及は、５、６、７、８、９、および１０の各整数、ならびに５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９などの各小数値を含む。
発明の説明
本発明は、ポリペプチドまたはその抗原性部分に特異的に結合する抗体およびその抗原結合断片であって、そのポリペプチドが、ａ）ＭＵＣ１６外部ドメインポリペプチド、ｂ）ＭＵＣ１６細胞質ドメインポリペプチド、およびｃ）システインループポリペプチドを含有するＭＵＣ１６細胞外ドメインポリペプチドから選択される、抗体およびその抗原結合断片を提供する。本発明の抗体およびそれらを含有する組成物は、癌などのＭＵＣ１６が過剰発現している疾患についての診断的および治療的適用に有用である。
本発明は、ポリペプチドまたはその抗原性部分に特異的に結合する抗体およびその抗原結合断片であって、そのポリペプチドが、ａ）ＭＵＣ１６外部ドメインポリペプチド、ｂ）ＭＵＣ１６細胞質ドメインポリペプチド、およびｃ）システインループポリペプチドを含有するＭＵＣ１６細胞外ドメインポリペプチドから選択される、抗体およびその抗原結合断片を提供する。本発明の抗体およびそれらを含有する組成物は、癌などのＭＵＣ１６が過剰発現している疾患についての診断的および治療的適用に有用である。
合成ペプチドを用いて、本発明者らは、推定の切断部位に対して近位にある、細胞によって保持されるＭＵＣ１６のカルボキシ末端部分に対する新規の特異的抗体を産生させた。これらの抗体を、蛍光活性化細胞ソーティング分析、酵素結合イムノアッセイ、ウェスタンブロット分析、および免疫組織化学検査を用いて特徴づけた。選択されたモノクローナル抗体のそれぞれは、組換えＧＳＴ－ΔＭＵＣ１６ｃ１１４タンパク質、およびＭＵＣ１６を形質移入したＳＫＯＶ３細胞系に対して反応性であった。３つの抗体、４Ｈ１１、９Ｃ９、および４Ａ５抗体は、形質移入したＳＫＯＶ３細胞のウェスタンブロット分析および飽和結合研究によって高い親和性を実証し、抗体の内部移行を示した。新規抗体４Ｈ１１に関して免疫組織化学的の陽性であることは、ＯＣ１２５と類似していたが、重要な違いがあり、それには、小葉乳癌およびわずかなパーセンテージのＯＣ１２５陰性卵巣癌腫におけるびまん性の陽性が挙げられ、それは強くかつびまん性の４Ｈ１１抗体結合を示した。
本発明の組成物および方法は、診断的および治療的適用に、加えて、膜受容体輸送および細胞内事象などの生物学的研究に有用である。診断的適用には、例えば、免疫組織化学検査、Ｘ線画像化、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）、ウェスタンブロット、および／または免疫沈降検出を用いる癌の検出が挙げられる。
本発明はさらに、（Ａ）ＭＵＣ１６、（Ｂ）先行技術の抗体、（Ｃ）本発明の抗体、（Ｄ）ハイブリドーマ細胞系、（Ｅ）細胞傷害性物質および／またはプロドラッグに連結された本発明の抗体のコンジュゲート、（Ｆ）Ｍｕｃ１６部分の検出および診断的適用、ならびに（Ｇ）治療的適用の項目下で記載されている。
Ａ．ＭＵＣ１６
「ＭＵＣ１６」、「ＭＵＣ－１６」、および「ムチン１６」とは交換可能に、連結型ムチンのファミリーの一部であるＩ型膜タンパク質を指す。Ｍｕｃ１６の概略図は図１０にあり、例示的なヒトＭｕｃ１６アミノ酸配列（配列番号１３）は図９Ａに示されている。マウスＭＵＣ１６アミノ酸配列（配列番号２４）とヒトＭＵＣ１６アミノ酸配列（配列番号２５）のアラインメントは図２０Ｂに示されている。用語「１型タンパク質」とは、細胞、およびウイルスなどの脂質二重層に少なくとも部分的に埋め込まれており、かつ細胞、およびウイルスなどの脂質二重層に埋め込まれた膜貫通ドメイン（ＴＭ）配列を含有する「膜タンパク質」を指す。ＴＭドメインのＮＨ２末端側のそのタンパク質の部分は、膜の外部側で露出しており、ＣＯＯＨ末端部分は細胞質側で露出している。
「ＭＵＣ１６」、「ＭＵＣ－１６」、および「ムチン１６」とは交換可能に、連結型ムチンのファミリーの一部であるＩ型膜タンパク質を指す。Ｍｕｃ１６の概略図は図１０にあり、例示的なヒトＭｕｃ１６アミノ酸配列（配列番号１３）は図９Ａに示されている。マウスＭＵＣ１６アミノ酸配列（配列番号２４）とヒトＭＵＣ１６アミノ酸配列（配列番号２５）のアラインメントは図２０Ｂに示されている。用語「１型タンパク質」とは、細胞、およびウイルスなどの脂質二重層に少なくとも部分的に埋め込まれており、かつ細胞、およびウイルスなどの脂質二重層に埋め込まれた膜貫通ドメイン（ＴＭ）配列を含有する「膜タンパク質」を指す。ＴＭドメインのＮＨ２末端側のそのタンパク質の部分は、膜の外部側で露出しており、ＣＯＯＨ末端部分は細胞質側で露出している。
最近、ＭＵＣ１６／ＣＡ１２５をコードするｃＤＮＡの配列が２００１年にＹｉｎおよびＬｌｏｙｄによって記載され、２００２年にＯ’Ｂｒｉｅｎによって完成された（１０～１２）。完全なＭＵＣ１６タンパク質は、潜在的リン酸化部位を有する細胞質側尾部、膜貫通ドメイン、および見かけ上の切断部位に対して近位にある外部ドメインからなる様々な構成要素を有する。切断部位に対して遠位においては、遊離される外部のドメインが、それぞれが多くの潜在的グリコシル化部位を有する、１５６個のアミノ酸の１６～２０個のタンデムリピートを含有する（１１）。全体の反復配列構造（図１０）は、哺乳類にわたってよく保存されているが、その反復配列は、正確なアミノ酸組成において完全に同一というわけではない。
ＭＵＣ１６タンパク質は、ＭＵＣ１とＭＵＣ４の両方を含む、連結型ムチンのファミリーの一部である（１３）。ＭＵＣ１は、様々な組織に存在し、βカテニン経路を介してシグナル伝達し、ＥＧＦ受容体と相互作用するようであり、薬物抵抗性を媒介し、そして癌遺伝子として作用することができる（１４～１７）。ＭＵＣ４タンパク質もまた、様々な組織に発現しているが、胃腸管（ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｔｒａｃｋ）の新生物によく見られる（１８～２０）。対照的に、ＣＡ１２５抗原は、その分布がより限定されており、おもに、婦人科系の組織に存在し、ミュラー管新生物において過剰発現する（２１）。しかしながら、ＯＣ１２５抗体によって認識されるＣＡ１２５抗原は、より大きいＭＵＣ１６タンパク質のタンデムリピート領域に発現する、高度にグリコシル化された抗原である。この糖タンパク質は、典型的には、ＭＵＣ１６ペプチドバックボーンの細胞外ドメインにおける推定の切断部位から脱落する。
したがって、「ＭＵＣ１６」タンパク質は、（ａ）「細胞質ドメイン」、（ｂ）「膜貫通ドメイン」、および（ｃ）「細胞外ドメイン」を含有する。ＭＵＣ１６細胞外ドメインは、タンデムリピートの非グリコシル化外部ドメインと大きなグリコシル化外部ドメインとの間に切断部位を含有する。
用語「細胞質ドメイン」、「細胞質側尾部」、および「ＣＴ」は、細胞、およびウイルスなどの脂質二重層の細胞質側にあるタンパク質配列およびその部分を指すように交換可能に用いられる。タンパク質のＣＴを決定するための方法は当技術分野において知られている（Ｅｌｏｆｓｓｏｎら、（２００７）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７６：１２５－１４０；Ｂｅｒｎｓｅｌら、（２００５）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ １４：１７２３－１７２８）。
用語「膜貫通ドメイン」および「ＴＭ」は、細胞、およびウイルスなどの脂質二重層にかかるタンパク質配列およびその部分を指すように交換可能に用いられる。タンパク質のＴＭを決定するための方法は当技術分野において知られている（Ｅｌｏｆｓｓｏｎら、（２００７）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７６：１２５－１４０；Ｂｅｒｎｓｅｌら、（２００５）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ １４：１７２３－１７２８）。
用語「外部ドメイン」および「細胞外ドメイン」は、膜タンパク質に関する場合、細胞、およびウイルスなどの脂質二重層の細胞外側で露出しているそのタンパク質の部分を指すように交換可能に用いられる。タンパク質の外部ドメインを決定するための方法は当技術分野において知られている（Ｓｉｎｇｅｒ（１９９０）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．６：２４７－２９６、およびＨｉｇｈら、（１９９３）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２１：７４３－７５０、およびＭｃＶｅｃｔｏｒ ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）。
図９の例示的なＭｕｃ１６は、（ａ）細胞内シグナル伝達機構と相互作用する、アミノ酸１４４７６から１４５０７まで：ｖｔｔｒｒ ｒｋｋｅｇｅｙｎｖｑ ｑｑｃｐｇｙｙｑｓｈ ｌｄｌｅｄｌｑ（配列番号１６）の「ＭＵＣ１６細胞質ドメイン」；（ｂ）原形質膜にかかる、アミノ酸１４４５２から１４４７５まで：ｆｗａｖｉｌｉｇｌ ａｇｌｌｇｖｉｔｃｌ ｉｃｇｖｌ（配列番号１４）の「ＭＵＣ１６膜貫通ドメイン」；および（ｃ）タンデムリピートの非グリコシル化外部ドメインと大きなグリコシル化外部ドメインとの間に切断部位を含有する、アミノ酸１～１４３９２（配列番号１３）の「ＭＵＣ１６細胞外ドメイン」を含有する。「ＭＵＣ１６外部ドメイン」は、図９Ａの配列番号１３のアミノ酸１４３９４から１４４５１まで：ｎｆｓｐｌａｒ ｒｖｄｒｖａｉｙｅｅ ｆｌｒｍｔｒｎｇｔｑ ｌｑｎｆｔｌｄｒｓｓ ｖｌｖｄｇｙｓｐｎｒ ｎｅｐｌｔｇｎｓｄｌ ｐ（配列番号１７）によって例示される。
例示的なＭＵＣ１６外部ドメインは、ポリペプチド１（配列番号１３のアミノ酸１４３９４から１４４１０までである、ｎｆｓｐｌａｒ ｒｖｄｒｖａｉｙｅｅ（配列番号０１））、およびポリペプチド２（配列番号１３のアミノ酸１４４２５から１４４４２までである、ｔｌｄｒｓｓ ｖｌｖｄｇｙｓｐｎｒ ｎｅ（配列番号０２））の両方を含有し、それらに対して、本発明の例示的な抗体が産生された。ポリペプチド３：ｃｇｖｌｖｔｔｒｒ ｒｋｋｅｇｅｙｎｖｑ ｑｑ（配列番号０３）は、配列番号１３のアミノ酸１４４７２から１４４９２までであり、膜貫通ドメイン部分（ｃｇｖｌ）および細胞質ドメイン部分（ｖｔｔｒｒ ｒｋｋｅｇｅｙｎｖｑ ｑｑ（配列番号１８））の両方を含有する。したがって、ＣＧＶＬは、それが膜貫通ドメインの一部であるので、配列番号０３において任意選択である。
ポリペプチド４（ｋｓｙｆ ｓｄｃｑｖｓｔｆｒｓ ｖｐｎｒｈｈｔｇｖｄ ｓｌｃｎｆｓｐｌ（配列番号１５））は、Ｍｕｃ１６細胞外ドメインの非グリコシル化部分に位置し、配列番号１３のアミノ酸１４３６７から１４３９８までであり、システインループポリペプチド：ｃｑｖｓｔｆｒｓｖｐｎｒｈｈｔｇｖｄｓｌｃ（配列番号１３）を含有する。
Ｂ．先行技術の抗体
ＭＵＣ１６／ＣＡ１２５抗原の発現は、長い間、婦人科系の組織と関連づけられてきた。「ＣＡ１２５」、「ＣＡ－１２５」、「切断されたＣＡ１２５」、および「切断されたＣＡ－１２５」は交換可能に、切断部位に対して遠位にある、連結型ムチンＭＵＣ１６のグリコシル化外部ドメインを指す（Ｐａｙｎｅら、米国特許第７，２０２，３４６号）。この遊離される外部のドメインは、それぞれが潜在的グリコシル化部位を有する、１５６個のアミノ酸の１６～２０個のタンデムリピートを含有する。１９個のアミノ酸の見かけのシステインに基づいたジスルフィドループが、全ての反復配列に存在し、Ｎ末端は、高度にＯ－グリコシル化されているヘアブラシ構造を含有する（１１）。推定サイズは、タンパク質部分について２．５ＭＤであり、糖質を加えると、これは５ＭＤまで増加し得る（１０、２６）。
ＭＵＣ１６／ＣＡ１２５抗原の発現は、長い間、婦人科系の組織と関連づけられてきた。「ＣＡ１２５」、「ＣＡ－１２５」、「切断されたＣＡ１２５」、および「切断されたＣＡ－１２５」は交換可能に、切断部位に対して遠位にある、連結型ムチンＭＵＣ１６のグリコシル化外部ドメインを指す（Ｐａｙｎｅら、米国特許第７，２０２，３４６号）。この遊離される外部のドメインは、それぞれが潜在的グリコシル化部位を有する、１５６個のアミノ酸の１６～２０個のタンデムリピートを含有する。１９個のアミノ酸の見かけのシステインに基づいたジスルフィドループが、全ての反復配列に存在し、Ｎ末端は、高度にＯ－グリコシル化されているヘアブラシ構造を含有する（１１）。推定サイズは、タンパク質部分について２．５ＭＤであり、糖質を加えると、これは５ＭＤまで増加し得る（１０、２６）。
ＣＡ１２５は、一般的なスクリーニングツールとして用いられるのに十分な感度も特異性もないが、卵巣癌腫を有する患者をモニターするために日常的に用いられている。ＣＡ１２５を測定するために用いられる試験は、診断を目的として免疫組織化学的染色が日常的に実施されているように、抗体に基づいた検出方法である。ＭＵＣ１６に対する２６個の抗体のエピトープ特異性は、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｏｎｃｏｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（ＩＳＯＢＭ） ＴＤ－１ Ｗｏｒｋｓｈｏｐからの最初のレポートにおいて研究されており、２２個の抗体の免疫組織化学への適用が、ＴＤ－１ Ｗｏｒｋｓｈｏｐからの２番目のレポートにおいて報告された（７、２１）。既存の抗体は、ＯＣ１２５様、Ｍ１１様、またはＯＶ１９７様として分類され、既知の抗体の全てが、推定の切断部位に対して遠位にある、連結型ムチンＭＵＣ１６の外部のドメイン内の反復するグリコシル化エレメント中のＣＡ１２５エピトープを認識した。
ＯＣ１２５を含むＭＵＣ１６反応性抗体の大部分は、もっぱらその分子の切断部分に存在するグリコシル化依存性抗原と反応するため、ＭＵＣ１６発現の真の分布は知られていない（２１）。切断およびＣＡ１２５遊離後の残留ＭＵＣ１６タンパク質断片の運命を追跡するのに利用可能な抗体は現在、存在しない。
Ｃ．本発明の抗体
ヒトＭＵＣ１６の生物学的特徴をより良く探求するために、本発明者らは、推定の切断部位に対して近位にある、ＭＵＣ１６－カルボキシ末端の細胞外部分に対するモノクローナル抗体、ならびに内部の細胞質ドメインに対する１つのモノクローナル抗体を誘導した。先行の抗体とは対照的に、これらは、ＭＵＣ１６のペプチドバックボーンに対して誘導され、複合糖タンパク質エピトープに向けられていない。これらのエピトープは、切断部位に対して近位にあるので、それらは、循環中に見出される可能性が低く、診断方法および治療的介入に新規な標的を提供する。本明細書におけるデータは、ＭＵＣ１６ペプチドバックボーンに対して発生した例示的な抗体の同定および特徴づけを実証している。
ヒトＭＵＣ１６の生物学的特徴をより良く探求するために、本発明者らは、推定の切断部位に対して近位にある、ＭＵＣ１６－カルボキシ末端の細胞外部分に対するモノクローナル抗体、ならびに内部の細胞質ドメインに対する１つのモノクローナル抗体を誘導した。先行の抗体とは対照的に、これらは、ＭＵＣ１６のペプチドバックボーンに対して誘導され、複合糖タンパク質エピトープに向けられていない。これらのエピトープは、切断部位に対して近位にあるので、それらは、循環中に見出される可能性が低く、診断方法および治療的介入に新規な標的を提供する。本明細書におけるデータは、ＭＵＣ１６ペプチドバックボーンに対して発生した例示的な抗体の同定および特徴づけを実証している。
本発明者らは、ＭＵＣ１６の切断されない、非グリコシル化のペプチドバックボーンに向けられる新規の抗体を開発している。これらは、４Ｈ１１抗体および９Ｃ９抗体の両方によって例示され、それらは、ＭＵＣ１６の切断されない外部ドメイン内のペプチド配列と反応し、卵巣癌細胞系の表面で、およびヒト卵巣癌の外科標本由来のパラフィン固定組織において、検出可能である。抗体は、高親和性を示し、ＭＵＣ１６の外部ドメインに結合した場合、卵巣癌細胞によって内部へ容易に取り込まれる。これは、ＭＵＣ１６の近位の部分が、ムチンのより遠位の切断される部分から独立した生物学的特徴を有することを示唆する。それはまた、ＭＵＣ１６の近位の部分が、診断的および治療的介入に好都合の標的を提供し得ることを示唆する。ＭＵＣ１６のペプチドバックボーンを標的にすることにより、遺伝子操作された細胞、リポソーム、または本発明の抗体との結合体化を含む抗体コンジュゲートに、特異性の高い組織送達をもたらす。
抗体４Ｈ１１によって例示される本発明の抗体は、免疫組織化学検査におけるツールとして有用である。本明細書におけるデータは、４Ｈ１１が、高悪性度の漿液性卵巣癌腫に対して相対的に特異性があることを示している。浸潤性小葉乳癌腫は、主な例外であり、４Ｈ１１によって検出された場合、広範囲のＭＵＣ１６タンパク質を示す。乳房の小葉癌腫は、漿膜表面へ転移する性向によって特徴づけられる独特な生物学的特徴を有する（２７）。ＭＵＣ１６は、メソテリンの同種結合パートナーであるため、これは、小葉癌について重要な意味を有し得る（２８）。ＯＣ１２５と４Ｈ１１についての不一致率はまた、４Ｈ１１が卵巣癌腫のサブセットにおいて、ＯＣ１２５から独立した、追加の情報を提供する可能性があることを示唆する。ＯＣ１２５に関して陰性であるいくつかの腫瘍は、ＭＵＣ１６糖タンパク質の細胞質部分および細胞外部分を保持し、上記分子のそれらの部分は、悪性表現型において潜在的に重要なシグナル伝達に関与する可能性がある。
したがって、一実施形態において、本発明は、ポリペプチドまたはその抗原性部分に特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合断片であって、そのポリペプチドが、ａ）ＭＵＣ１６外部ドメインポリペプチド（ＮＦＳＰＬＡＲ ＲＶＤＲＶＡＩＹＥＥ ＦＬＲＭＴＲＮＧＴＱ ＬＱＮＦＴＬＤＲＳＳ ＶＬＶＤＧＹＳＰＮＲ ＮＥＰＬＴＧＮＳＤＬ Ｐ（配列番号１７）によって例示される）、ｂ）ＭＵＣ１６細胞質ドメインポリペプチド（ＶＴＴＲＲ ＲＫＫＥＧＥＹＮＶＱ ＱＱ（配列番号１８）によって例示され、それは、
本発明の抗体の１つの利点は、抗体が細胞の内部へ移行することであり、それにより、疾患治療などの、細胞の内部への送達に適用するのに有用である。細胞によって内部移行する分子に関する場合、「内部移行する」とは、細胞膜の細胞外表面と接触している分子の、細胞膜を横切っての、細胞膜の細胞内表面および／または細胞の細胞質への通過を指す。内部移行を決定するための方法は、本明細書に開示されており、それには、細胞の内部での放射標識分子の検出が挙げられる（図５Ｂ）。
一実施形態において、本発明の抗体は、ポリペプチド１：ＮＦＳＰＬＡＲＲＶＤＲＶＡＩＹＥＥ（配列番号０１）およびポリペプチド２：ＴＬＤＲＳＳＶＬＶＤＧＹＳＰＮＲＮＥ（配列番号０２）からなる群から選択されるポリペプチドを含むＭＵＣ１６外部ドメインポリペプチドに特異的に結合する。本明細書におけるデータは、本発明の抗体が、ＧＳＴ－ΔＭＵＣ１６ｃ１１４に特異的に結合することを示している（実施例２、表１Ａ）。本発明の抗体の特異性は、ＧＳＴ－ΔＭＵＣ１６ｃ１１４精製タンパク質またはＳＫＯＶ３－ｐｈｒＧＦＰ－ΔＭＵＣ１６ｃ１１４細胞系の細胞溶解産物に結合しなかった先行技術の抗体（例えば、ＶＫ８抗体、Ｍ１１抗体、およびＯＣ１２５抗体）とは対照的である（実施例２、図２）。
さらなる実施形態において、本発明の抗体は、Ｐａｙｎｅら、米国特許第７，２０２，３４６号に記載された切断されたＣＡ－１２５によって例示される、グリコシル化ＭＵＣ１６細胞外ドメインへの特異的結合を欠く。
本発明の抗体のＶＬ領域およびＶＨ領域の配列を限定するつもりはないが、一実施形態において、抗体は、ＭＵＣ１６外部ドメインポリペプチドのポリペプチド２（配列番号０２）に特異的に結合し、その抗体は、配列番号０６（すなわち、図８の抗体４Ｈ１１可変重鎖（ＶＨ）アミノ酸配列）によってコードされる可変重鎖（ＶＨ）および配列番号０７（すなわち、図８の抗体４Ｈ１１可変軽鎖（ＶＬ）アミノ酸配列）によってコードされる可変軽鎖（ＶＬ）を含む。特定の実施形態において、抗体はキメラであり、ＶＬ鎖およびＶＨ鎖の少なくとも１つが、ヒト免疫グロブリン定常領域と融合している。
同様に、本発明の抗体のＶＬ領域およびＶＨ領域の配列を限定するつもりはないが、一実施形態において、抗体は、ＭＵＣ１６外部ドメインポリペプチドのポリペプチド２（配列番号０２）に特異的に結合し、その抗体は、配列番号０４（すなわち、図８の抗体４Ａ５可変重鎖（ＶＨ）ヌクレオチド配列）によってコードされる可変重鎖（ＶＨ）および配列番号０５（すなわち、図８の抗体４Ａ５可変軽鎖（ＶＬ）ヌクレオチド配列）によってコードされる可変軽鎖（ＶＬ）を含む。特定の実施形態において、抗体はキメラであり、ＶＬ鎖およびＶＨ鎖の少なくとも１つが、ヒト免疫グロブリン定常領域と共有結合により連結されている。
なおまた、本発明の抗体のＶＬ領域およびＶＨ領域の配列を限定するつもりはないが、一実施形態において、抗体は、ＭＵＣ１６外部ドメインポリペプチドのポリペプチド１（配列番号０１）に特異的に結合し、その抗体は、配列番号０８（すなわち、図８の抗体９Ｂ１１可変重鎖（ＶＨ）ヌクレオチド配列）によってコードされる可変重鎖（ＶＨ）および配列番号０９（すなわち、図８の抗体９Ｂ１１可変軽鎖（ＶＬＡ）ヌクレオチド配列）および配列番号１０（すなわち、図８の抗体９Ｂ１１可変軽鎖（ＶＬＢ）ヌクレオチド配列）の少なくとも１つによってコードされる可変軽鎖（ＶＬ）を含む。特定の実施形態において、抗体はキメラであり、ＶＬ鎖およびＶＨ鎖の少なくとも１つが、ヒト免疫グロブリン定常領域と共有結合により連結されている。
本発明の抗体が結合する抗原源を制限するつもりはないが、一実施形態において、ＭＵＣ１６外部ドメインポリペプチドは、細胞によって発現する。本明細書におけるデータは、本発明の例示的な抗体が、ｐｈｒＧＦＰ－ΔＭＵＣ１６ｃ１１４を形質導入されたＳＫＯＶ３細胞に結合することを示している（実施例２）。
本発明の抗体が結合する抗原の配列を限定しないが、さらなる実施形態において、本発明の抗体は、ＶＴＴＲＲ ＲＫＫＥＧＥＹＮＶＱ ＱＱ（配列番号１８）を含むＭＵＣ１６細胞質ドメインポリペプチドに特異的に結合する。特定の実施形態において、ＭＵＣ１６細胞質ドメインポリペプチドは、ポリペプチド３：ＣＧＶＬＶＴＴＲＲＲＫＫＥＧＥＹＮＶＱＱＱ（配列番号０３）を含む。いくつかの実施形態において、ＭＵＣ１６細胞質ドメインポリペプチドは、細胞によって発現する。例えば、本明細書におけるデータは、本発明の例示的な抗体が、ｐｈｒＧＦＰ－ΔＭＵＣ１６ｃ１１４を形質導入されたＳＫＯＶ３細胞に結合することを示している（実施例２）。特定の実施形態において、細胞は、抗体の細胞への内部移行を促進するために透過処理され、その結果、抗体はそれの細胞質抗原と接触する。
なおまた、本発明の抗体が結合する抗原の配列を限定することなく、さらなる実施形態において、本発明の抗体は、システインループポリペプチド：ＣＱＶＳＴＦＲＳＶＰＮＲＨＨＴＧＶＤＳＬＣ（配列番号１９）を含有するＭＵＣ１６細胞外ドメインポリペプチドに結合する。より好ましい実施形態において、ＭＵＣ１６細胞外ドメインポリペプチドは、ポリペプチド４：ＫＳＹＦ ＳＤＣＱＶＳＴＦＲＳ ＶＰＮＲＨＨＴＧＶＤ ＳＬＣＮＦＳＰＬ（配列番号１５）を含む。
なおまた、本発明の抗体のＶＬ領域およびＶＨ領域の配列を限定するつもりはないが、一実施形態において、抗体は、ＭＵＣ１６細胞外ドメインポリペプチドのポリペプチド４（配列番号１５）に特異的に結合し、その抗体は、配列番号１１（すなわち、図８の抗体２４Ｂ３可変重鎖（ＶＨ）アミノ酸配列）によってコードされる可変重鎖（ＶＨ）および配列番号１２（すなわち、図８の抗体２４Ｂ３可変軽鎖（ＶＬ）アミノ酸配列）によってコードされる可変軽鎖（ＶＬ）を含む。
本発明は、キメラ抗体（米国特許第７，６６２，３８７号参照）、モノクローナル抗体、組換え抗体、組換え抗体の抗原結合断片、ヒト化抗体、およびファージの表面にディスプレイされる抗体（米国特許第７，２０２，３４６号）を企図する。特に、本発明は、抗体分子のイディオタイプ（「抗原結合領域」または「抗原結合断片」）を含有する抗体断片を企図する。例えば、そのような抗原結合断片には、Ｆａｂ領域、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｐＦｃ’断片、およびＦａｂ’断片が挙げられるが、それらに限定されない。
「Ｆａｂ領域」および「断片、抗原結合領域」は交換可能に、抗原を結合する場合に機能する免疫グロブリン「Ｙ」の抗体アームの部分を指す。Ｆａｂ領域は、抗体の重鎖および軽鎖、それぞれ由来の１つの定常ドメインおよび１つの可変ドメインで構成される。所望の特異性をもつモノクローナルＦａｂ断片の迅速かつ簡単な同定を可能にするＦａｂ発現ライブラリーの構築のための方法は、当技術分野において知られている（Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６：１２７５－１２８１（１９８９））。別の実施形態において、Ｆｃ断片およびＦａｂ断片は、免疫グロブリンモノマーを２つのＦａｂ断片およびＦｃ断片へと切断する酵素パパインを用いることによって生成することができる。酵素ペプシンは、ヒンジ領域より下を切断するので、「Ｆ（ａｂ’）２断片」および「ｐＦｃ断片」が形成される。Ｆ（ａｂ’）２断片は、穏やかな還元によって２つの「Ｆａｂ’断片」へと分裂することができる。
本発明はまた、「一本鎖抗体」断片、すなわち、全抗体の可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）の少なくとも１つを有し、かつ抗体の定常ドメインの一部または全部を欠損するアミノ酸配列を企図する。これらの定常ドメインは、抗原結合に必要ではないが、全抗体の構造の主要な部分を構成する。一本鎖抗体断片は、全抗体より小さく、それゆえに、全抗体より大きい毛細血管透過性を有し得、一本鎖抗体断片が局在化し、より効率的に抗原結合部位を標的に結合することを可能にする。また、抗体断片は、原核生物細胞において相対的にラージスケールで産生することができ、したがって、それらの生成を促進することができる。さらに、一本鎖抗体断片の相対的に小さいサイズにより、それらがレシピエントにおいて免疫応答を誘発する可能性を全抗体より低くさせる。一本鎖抗体の作製のための技術は知られている（米国特許第４，９４６，７７８号）。重鎖および軽鎖の可変領域は、一緒に融合して、「一本鎖可変断片」（「ｓｃＦｖ断片」）を形成することができ、それはＦａｂ断片のサイズの半分だけであり、それでもなお、親免疫グロブリンの元の特異性を保持する。
「Ｆｃ領域」および「断片、結晶化可能領域」は交換可能に、免疫細胞活性を調節する役割を果たす免疫グロブリン「Ｙ」の底部の部分を指す。Ｆｃ領域は、抗体のクラスに依存して２つまたは３つの定常ドメインを与える２つの重鎖で構成される。特定のタンパク質に結合することによって、Ｆｃ領域は、各抗体が所定の抗原に対して適切な免疫応答を生じることを確実にする。Ｆｃ領域はまた、Ｆｃ受容体などの様々な細胞受容体、および補体タンパク質などの他の免疫分子に結合する。これを行うことによって、Ｆｃ領域は、オプソニン作用、細胞溶解、ならびにマスト細胞、好塩基球、および好酸球の脱顆粒を含む異なる生理学的効果を媒介する。実験設定において、Ｆｃ断片およびＦａｂ断片は、免疫グロブリンモノマーを酵素パパインで２つのＦａｂ断片およびＦｃ断片へ切断することによって、実験室内で生成することができる。
本発明は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を企図する。「ポリクローナル抗体」とは、複数種の単一クローンのプラズマ細胞から産生された免疫グロブリンを指す；対照的に、「モノクローナル抗体」とは、単一クローンのプラズマ細胞から産生された免疫グロブリンを指す。所望のポリペプチドに特異的であるポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を作製するための一般的な方法が利用できる。モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の産生について、様々な宿主動物を、本発明における関心対象となる任意の分子に対応するペプチドの注射によって免疫することができ、その宿主動物には、ハムスター、ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギなどが挙げられるが、それらに限定されない。モノクローナル抗体の調製について、細胞系の連続培養による抗体分子の産生を与える任意の技術を用いてもよい（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ参照）。これらには、ＫｏｅｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（ＫｏｅｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５－４９７（１９７５））によって最初に開発されたハイブリドーマ技術、無菌（ｇｅｒｍ－ｆｒｅｅ）動物を用いて、ＰＣＴ／ＵＳ９０／０２５４５に記載されたものなどのテクノロジーを利用する技術、加えて、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（例えば、Ｋｏｚｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ、４：７２（１９８３）参照）、およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、７７－９６ページ（１９８５））が挙げられるが、それらに限定されない。本発明のいくつかの特定の好ましい実施形態において、本発明はモノクローナル抗体を提供する。
キメラ抗体もまた企図される。本明細書に用いられる場合、用語「キメラ抗体」は、典型的には２つの異なる種の、２つの異なる抗体の部分を含有する。例えば、Ｃａｂｉｌｌｙらに対する米国特許第４，８１６，５６７号；Ｓｈｏｅｍａｋｅｒらに対する米国特許第４，９７８，７４５号；Ｂｅａｖｅｒｓらに対する米国特許第４，９７５，３６９号；およびＢｏｓｓらに対する米国特許第４，８１６，３９７号を参照されたい。キメラ抗体は、一価、二価、または多価免疫グロブリンを含む。一価キメラ抗体は、キメラＬ鎖とジスルフィド架橋を介して結合したキメラＨ鎖によって形成されるダイマー（ＨＬ）である。二価キメラ抗体は、少なくとも１つのジスルフィド架橋を介して結合した２つのＨＬダイマーによって形成されるテトラマー（Ｈ２Ｌ２）である。多価キメラ抗体もまた、例えば、凝集するＨｃ領域（例えば、ＩｇＭ Ｈ鎖）を用いることによって、作製することができる。
本発明はまた、「ヒト化抗体」、すなわち、ヒト抗体定常領域に実質的に、または独占的に由来する定常領域、およびヒト以外の哺乳類由来の可変領域の配列に実質的に、または独占的に由来する可変領域を有するキメラ抗体を企図する。ヒト化抗体は、好ましくは、対応するヒト抗体領域に実質的に、または独占的に由来する、定常領域、および相補性（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）決定領域（ＣＤＲ）以外の可変領域、ならびにヒト以外の哺乳類に実質的に、または独占的に由来するＣＤＲを有する。したがって、一実施形態において、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域由来の残基が、所望の特異性、親和性、および能力（ｃａｐａｃｉｔｙ）を有するマウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類などの非ヒト種の超可変領域（ドナー抗体）由来の残基によって置き換えられている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基が、対応する非ヒト残基によって置き換えられている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体に見出されない残基を含んでもよい。これらの改変は、一般的に、抗体のパフォーマンスをさらに精巧にするために行われる。一般的に、ヒト化抗体は、超可変ループの全部または実質的に全部が非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに対応し、かつＦＲ残基の全部または実質的に全部がヒト免疫グロブリン配列のＦＲ残基である、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全部を含む。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでもよい。ヒト化抗体は、ヒトハイブリドーマを用いること（Ｃｏｔｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：２０２６－２０３０（１９８３））、またはインビトロでヒトＢ細胞をＥＢＶウイルスで形質転換することによること（Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ、７７－９６ページ（１９８５））を含む、当技術分野において知られた方法、例えば、Ｗｉｎｔｅｒらに対する米国特許第５，２２５，５３９号を用いて作製されてもよい。追加の方法として、例えば、ヒト免疫グロブリン鎖遺伝子を含有し、かつヒト免疫グロブリン遺伝子によってコードされる様々なアイソタイプの抗体のレパートリーを作製するためにこれらの遺伝子を発現する能力があるトランスジェニック非ヒト動物の作製が挙げられる（米国特許第５，５４５，８０６号、同第５，５６９，８２５号、および同第５，６２５，１２６号）。ヒト化抗体はまた、例えばマウス抗体の相補性決定領域をヒトフレームワークドメインの中に置き換えることによって作製されてもよい（ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／２２６５３号）。
重要なことには、抗体をヒト化するための初期の方法は、非ヒト抗体の出発材料より低い親和性をもつ抗体を生じる場合が多かった。抗体をヒト化する、より最近のアプローチは、ＣＤＲに変更を加えることによってこの問題と取り組んでいる。参照により本明細書に組み入れられている、米国特許出願第２００４０１６２４１３号を参照されたい。いくつかの実施形態において、本発明のヒト化抗体は、ドナーのヘテロマー可変領域より同等またはより高い抗原結合親和性を有する最適化されたヘテロマー可変領域（例えば、完全抗体である他の分子（ａ ｆｕｌｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｔｈｅｒ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）の部分であってもよいし、そうでなくてもよい）を含有し、上記ドナーのヘテロマー可変領域が３つのドナーの軽鎖ＣＤＲを含み、かつその最適化されたヘテロマー可変領域が、ａ）ｉ）４つの変化のないヒト生殖系列軽鎖フレームワーク領域、およびｉｉ）３つの変化した軽鎖可変領域ＣＤＲを含む変化した軽鎖可変領域を含み、上記３つの変化した軽鎖可変領域ＣＤＲのうちの少なくとも１つがドナーの軽鎖ＣＤＲ変異体であり、かつ上記ドナーの軽鎖ＣＤＲ変異体が、上記３つのドナーの軽鎖ＣＤＲのうちの１つと比較してたった１つ、２つ、３つ、または４つの位置において異なるアミノ酸を含む（例えば、少なくとも１つのドナーの軽鎖ＣＤＲ変異体は、１個、２個、３個、または４個のアミノ酸の違いを除いて、ドナーの軽鎖ＣＤＲのうちの１つと同一である）。
ヒト抗体由来の定常領域に、または毒素に、または細胞傷害性効果をもつ分子に融合しているアミノ酸配列を含有するキメラ抗体は、当技術分野において知られている（例えば、米国特許第７，５８５，９５２号；同第７，２２７，００２号；同第７，６３２，９２５号；同第７，５０１，１２３号；同第７，２０２，３４６号；同第６，３３３，４１０号；同第５，４７５，０９２号；同第５，５８５，４９９号；同第５，８４６，５４５号；同第７，２０２，３４６号；同第６，３４０，７０１号；同第６，３７２，７３８号；同第７，２０２，３４６号；同第５，８４６，５４５号；同第５，５８５，４９９号；同第５，４７５，０９２号；同第７，２０２，３４６号；同第７，６６２，３８７号；同第６，４２９，２９５号；同第７，６６６，４２５号；および同第５，０５７，３１３号）。
特定の抗原に特異的である抗体を、当技術分野において知られた方法（例えば、米国特許第７，２０２，３４６号）および本明細書に開示された方法を用いてスクリーニングしてもよい。例えば、抗体の産生において、所望の抗体のスクリーニングは、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫放射線アッセイ、ゲル拡散沈降素反応（ｇｅｌ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ｐｒｅｃｉｐｉｔｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ）、免疫拡散アッセイ、インサイチュイムノアッセイ（例えば、コロイド金標識、酵素標識、または放射性同位元素標識を用いる）、ウェスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ（例えば、ゲル凝集アッセイ、血球凝集アッセイなど）、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインＡアッセイ、および免疫電気泳動アッセイなどによって達成することができる。
一実施形態において、抗体結合は、一次抗体上の標識を検出することによって検出される。別の実施形態において、一次抗体は、一次抗体への二次抗体または試薬の結合を検出することによって検出される。さらなる実施形態において、二次抗体は標識される。イムノアッセイにおいて結合を検出するための多くの手段が当技術分野において知られており、それらは本発明の範囲内である。当技術分野においてよく知られているように、免疫原性ペプチドは、いかなる免疫プロトコールに用いられるキャリア分子も含まずに供給されるべきである。例えば、ペプチドがＫＬＨに結合体化していたならば、スクリーニングアッセイにおいて、それをＢＳＡに結合体化してもよいし、または直接、用いてもよい。
一実施形態において、本発明の抗体は、ハイブリドーマ細胞系によって産生されるモノクローナル抗体である。特定の実施形態において、モノクローナル抗体は、９Ｂ１１．２０．１６、１０Ａ２、２Ｆ４、２３Ｄ３、３０Ｂ１、および３１Ｂ２（表１および２）からなる群から選択される抗体によって例示されるように、ポリペプチド１（配列番号０１）を含むＭＵＣ１６外部ドメインポリペプチドに特異的に結合する。好ましい実施形態において、抗体は９Ｂ１１である。
別の実施形態において、モノクローナル抗体は、ポリペプチド２（配列番号０２）を含むＭＵＣ１６外部ドメインポリペプチドに特異的に結合し、その抗体は、４Ｈ１１．２．５、１３Ｈ１、２９Ｇ９、９Ｃ９．２１．５．１３、２８Ｆ８、２３Ｇ１２、９Ｃ７．６、１１Ｂ６、２５Ｇ４、５Ｃ２．１７、４Ｃ７、２６Ｂ２、４Ａ５．３７、４Ａ２、２５Ｈ３、および２８Ｆ７．１８．１０（表１および２）によって例示される。好ましい実施形態において、抗体は、４Ｈ１１．２．５、４Ａ５．３７、９Ｃ９．２１．５．１３、２８Ｆ７．１８．１０、９Ｃ７．６、および５Ｃ２．１７によって例示される。
さらなる実施形態において、モノクローナル抗体は、ポリペプチド３：ＣＧＶＬＶＴＴＲＲＲＫＫＥＧＥＹＮＶＱＱＱ（配列番号０３）を含むＭＵＣ１６細胞質ドメインポリペプチドに特異的に結合し、その抗体は、３１Ａ３．５．１、１９Ｄ１、１０Ｆ６、２２Ｅ１０、２２Ｆ１、３Ｈ８、２２Ｆ１１、４Ｄ７、２４Ｇ１２、１９Ｇ４、９Ａ５、４Ｃ２、３１Ｃ８、２７Ｇ４、および６Ｈ２（表１および２）によって例示される。好ましい実施形態において、抗体は３１Ａ３．５．１である。
別の実施形態において、モノクローナル抗体は、ポリペプチド４：ＫＳＹＦ ＳＤＣＱＶＳＴＦＲＳ ＶＰＮＲＨＨＴＧＶＤ ＳＬＣＮＦＳＰＬ（配列番号１５）を含むＭＵＣ１６細胞外ドメインポリペプチドに特異的に結合し、その抗体は、２４Ｂ３および９Ｃ７（表２）によって例示される。
本発明の抗体およびそれらを（診断的および治療的の両方に）用いるための方法は疾患特異的である。「癌に対する特異性」（「癌特異性」と交換可能に用いられる）などの、疾患に対する方法および／または分子の「特異性」とは、正しく同定される陰性者（すなわち、疾患を有しない健康な個体）の割合（例えば、パーセンテージ、率など）、すなわち、疾患を有しないと正しく同定される健康な被験体のパーセンテージを指す。特異性を、以下の式に従って計算してもよい：
特異性＝真の陰性者の数／（真の陰性者の数＋偽陽性者の数）
したがって、いくつかの実施形態において、本発明の組成物および／または方法は、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％などの５１％から１００％までの任意の数値を含む、５０％より高い「癌特異性」を有する。１００％特異性、すなわち、健康な群からの誰もが癌を有すると予測されないことが最も望ましいが、必要ではない。本明細書におけるデータは、本発明の癌特異性を実証している（表３）。
特異性＝真の陰性者の数／（真の陰性者の数＋偽陽性者の数）
したがって、いくつかの実施形態において、本発明の組成物および／または方法は、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％などの５１％から１００％までの任意の数値を含む、５０％より高い「癌特異性」を有する。１００％特異性、すなわち、健康な群からの誰もが癌を有すると予測されないことが最も望ましいが、必要ではない。本明細書におけるデータは、本発明の癌特異性を実証している（表３）。
代替の実施形態において、特異性は、「受診者動作特性（ＲＯＣ）曲線」を用いることなどの二元分類試験のパフォーマンスの統計的尺度として（感度と共に）表される。いかなる試験についても、通常、特異性と感度の間にトレードオフがある。例えば、ヒト被験体の癌スクリーニング試験において、コストが高くかかるため、健康な人々が癌を有すると誤って同定される（低特異性）リスクを負うことは望ましくない。これらのコストは物理的（不必要なリスクを伴う手順）および財政的の両方である。このトレードオフは、ＲＯＣ曲線を用いてグラフに表すことができる。「受診者動作特性曲線」および「ＲＯＣ曲線」とは、真の陰性率（ＡＫＡ１－特異性）に対する真の陽性率（ＡＫＡ感度）のプロットを指す。試験の測定された結果は、ｘ軸に表され、ｙ軸は対照（例えば、健康な）被験体または症例（例えば、癌）被験体の数を表す。任意の所定のカットポイント（ｘ軸に沿った各点）について、アッセイの感度および特異性を測定することができる。任意の所定のアッセイについての感度および特異性の範囲は、選択されたカットポイントに依存して、０％から１００％までの範囲であり得る。このため、いくつかの好ましい実施形態において、アッセイの特異性および／または感度の標準尺度としてＡＵＣが用いられる。ＲＯＣ曲線プロットについての「曲線下面積」（「ＡＵＣ」）は、分類子（ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ）が、無作為に選択された陽性の事例を無作為に選択された陰性の事例より高くランクづける確率と等しい。したがって、ＡＵＣは、症例（例えば、癌）被験体と対照（例えば、健康な）被験体の間を成功裏に識別する試験の能力の一般的な尺度である。偶然（ｒａｎｄｏｍ ｃｈａｎｃｅ）は、０．５のＡＵＣを生じる。それゆえに、一実施形態において、有用な試験は、好ましくは、０．５５から１．００まで、０．６０から１．００まで、０．６５から１．００まで、０．７０から１．００まで、０．７５から１．００まで、０．８０から１．００まで、０．８５から１．００まで、０．９０から１．００まで、０．９５から１．００まで、および最も好ましくは１．００などの０．５１から１．００までの任意の値を含む、０．５０より大きいＡＵＣを有する。０．５０より大きいＡＵＣ値には、０．５１、０．５２、０．５２、０．５４、０．５５、０．５６、０．５７、０．５８、０．５９、０．６０、０．６１、０．６２、０．６３、０．６４、０．６５、０．６６、０．６７、０．６８、０．６９、０．７０、０．７１、０．７２、０．７３、０．７４、０．７５、０．７６、０．７７、０．７８、０．７９、０．８０、０．８１、０．８２、０．８３、０．８４、０．８５、０．８６、０．８７、０．８８、０．８９、０．９０、０．９１、０．９２、０．９３、０．９４、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８、および０．９９が挙げられる。
本発明の抗体およびそれらを（診断的および治療的の両方に）用いるための方法は疾患の感度である。「癌に対する感度」（「癌の感度」と交換可能に用いられる）などの、疾患に対する方法および／または分子の「感度」とは、正しく同定される陽性者（すなわち、癌を有する個体）の割合（例えば、パーセンテージ、率など）（例えば、癌を有すると同定される癌をもつ人々のパーセンテージ）を指す。感度を、以下の式に従って計算してもよい：
感度＝真の陽性者の数／（真の陽性者の数＋偽陰性者の数）
したがって、いくつかの実施形態において、本発明の組成物および／または方法は、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％などの５１％から１００％までの任意の数値を含む、５０％より高い「癌の感度」などの「疾患の感度」を有する。１００％の感度（すなわち、癌の群からの全被験体が癌を有すると予測されること）が最も望ましいが、それは必要ではない。
感度＝真の陽性者の数／（真の陽性者の数＋偽陰性者の数）
したがって、いくつかの実施形態において、本発明の組成物および／または方法は、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％などの５１％から１００％までの任意の数値を含む、５０％より高い「癌の感度」などの「疾患の感度」を有する。１００％の感度（すなわち、癌の群からの全被験体が癌を有すると予測されること）が最も望ましいが、それは必要ではない。
代替の実施形態において、本発明の組成物および／または方法は、１％、２％、３％、４％、６％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、および４９％などの０％から５０％までの任意の数値を含む、５０％以下の「癌の感度」などの「疾患の感度」を有する。
いくつかの実施形態において、特異性に関して上記で論じられているように、感度は、ＲＯＣ曲線のＡＵＣを用いることなどの二元分類試験のパフォーマンスの統計的尺度として（特異性と共に）表される。
Ｄ．ハイブリドーマ細胞系
本発明の新規な抗体に加えて、本発明はまた、これらの抗体を産生するハイブリドーマ細胞系を提供する。「ハイブリドーマ細胞」とは、組織培養で成長するその能力について、および抗体鎖を合成しないことについて選択される、骨髄腫（Ｂ細胞癌）細胞と特定の抗体産生Ｂ細胞とを融合することによって産生される細胞系を指す。ハイブリドーマ細胞によって産生される抗体は、全く単一の特異性であり、それゆえ、（ポリクローナル抗体と対照的に）モノクローナル抗体である。
本発明の新規な抗体に加えて、本発明はまた、これらの抗体を産生するハイブリドーマ細胞系を提供する。「ハイブリドーマ細胞」とは、組織培養で成長するその能力について、および抗体鎖を合成しないことについて選択される、骨髄腫（Ｂ細胞癌）細胞と特定の抗体産生Ｂ細胞とを融合することによって産生される細胞系を指す。ハイブリドーマ細胞によって産生される抗体は、全く単一の特異性であり、それゆえ、（ポリクローナル抗体と対照的に）モノクローナル抗体である。
特定の実施形態において、本発明は、ａ）ＭＵＣ１６外部ドメインポリペプチド（例えば、ＮＦＳＰＬＡＲ ＲＶＤＲＶＡＩＹＥＥ ＦＬＲＭＴＲＮＧＴＱ ＬＱＮＦＴＬＤＲＳＳ ＶＬＶＤＧＹＳＰＮＲ ＮＥＰＬＴＧＮＳＤＬ Ｐ（配列番号１７））、ｂ）ＭＵＣ１６細胞質ドメインポリペプチド（例えば、ＶＴＴＲＲ ＲＫＫＥＧＥＹＮＶＱ ＱＱ（配列番号１８））、およびｃ）システインループポリペプチド：ＣＱＶＳＴＦＲＳＶＰＮＲＨＨＴＧＶＤＳＬＣ（配列番号１９）を含有するＭＵＣ１６細胞外ドメインポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドまたはその抗原性部分に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系を提供する。ＭＵＣ１６ポリペプチド配列番号１８は、ＬＶＴＴＲＲ ＲＫＫＥＧＥＹＮＶＱ ＱＱ（配列番号２０）内に含有される。したがって、配列番号２０は、膜貫通ドメインアミノ酸（Ｌ）および細胞質ドメイン部分ＶＴＴＲＲ ＲＫＫＥＧＥＹＮＶＱ ＱＱ（配列番号１８）の両方を含有する、すなわち、Ｌは、それが膜貫通ドメインの一部であるため、任意選択である。ＭＵＣ１６ポリペプチド配列番号１８はまた、ＣＧＶＬＶＴＴＲＲ ＲＫＫＥＧＥＹＮＶＱ ＱＱ（配列番号０３）内に含有される。したがって、配列番号０３は、膜貫通ドメイン部分（ＣＧＶＬ）および細胞質ドメイン部分ＶＴＴＲＲ ＲＫＫＥＧＥＹＮＶＱ ＱＱ（配列番号１８）の両方を含有する、すなわち、ＣＧＶＬは、それが膜貫通ドメインの一部であるため、任意選択である。
Ｅ．細胞傷害性物質および／またはプロドラッグに連結された本発明の抗体のコンジュゲート
本発明はコンジュゲート抗体を企図する。「コンジュゲート」抗体とは、細胞傷害性物質および／または細胞傷害性物質のプロドラッグに共有結合により連結された本発明の抗体を指す。
本発明はコンジュゲート抗体を企図する。「コンジュゲート」抗体とは、細胞傷害性物質および／または細胞傷害性物質のプロドラッグに共有結合により連結された本発明の抗体を指す。
「細胞傷害性物質」とは、標的細胞の成長を低下させる能力、および／または標的細胞を死滅させる能力がある任意の作用物質を指す。「プロドラッグ」は、活性化工程に付されるまで細胞傷害性活性を実質的に欠く細胞傷害性物質の類似体を表す。活性化工程として、酵素切断、還元剤への曝露などの化学的活性化工程、または光分解などの物理的活性化工程を挙げることができる。
本発明の抗体と細胞傷害性物質またはプロドラッグとの間の共有結合性連結には、ジスルフィド結合などの切断可能な連結を挙げることができ、それは、有利には、標的細胞の還元性環境内で共有結合性連結の切断を生じ得る。そのようなコンジュゲートは、腫瘍細胞特異的治療剤として有用である。
一実施形態において、細胞傷害性物質は、低分子薬物である（Ｐａｙｎｅら、米国特許第７，２０２，３４６号）。別の実施形態において、細胞傷害性物質は、マイタンシノイド、マイタンシノイドの類似体、マイタンシノイドのプロドラッグ、またはマイタンシノイドの類似体のプロドラッグである（米国特許第６，３３３，４１０号；同第５，４７５，０９２号；同第５，５８５，４９９号；同第５，８４６，５４５号；同第７，２０２，３４６号）。別の実施形態において、細胞傷害性物質は、タキサン（米国特許第６，３４０，７０１号および同第６，３７２，７３８号および同第７，２０２，３４６号参照）またはＣＣ－１０６５類似体（米国特許第５，８４６，５４５号；同第５，５８５，４９９号；同第５，４７５，０９２号、および同第７，２０２，３４６号参照）であってもよい。
別の実施形態において、細胞傷害性物質は、アウリスタチン、ＤＮＡ副溝結合剤、ＤＮＡ副溝アルキル化剤、エンジイン、デュオカルマイシン、マイタンシノイド、およびビンカアルカロイドによって例示される（米国特許第７，６６２，３８７号）。
さらなる実施形態において、細胞傷害性物質は、抗チューブリン剤である（米国特許第７，６６２，３８７号）。さらに別の実施形態において、細胞傷害性物質は、ジメチルバリン－バリン－ドライソロイイン－ドラプロイン－フェニルアラニン－ｐ－フェニレンジアミン（ＡＦＰ）、ドバリン－バリン－ドライソロイイン－ドラプロイン－フェニルアラニン（ＭＭＡＦ）、およびモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＡＥ）によって例示される（米国特許第７，６６２，３８７号）。
追加の実施形態において、毒性物質は、放射性同位元素が放射する放射線、免疫調節物質、レクチン、および毒素によって例示される（米国特許第６，４２９，２９５号）。特に、放射性同位元素が放射する放射線は、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、および２１１Ａｔからなる群から選択されるα放射体、または１８６Ｒｅおよび９０Ｙからなる群から選択されるβ放射体、またはγ放射体１３１Ｉである（米国特許第７，６６６，４２５号）。
代替の実施形態において、毒素は、リシン、リシンのＡ鎖、およびアメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質によって例示される（米国特許第５，０５７，３１３号）。
さらに別の実施形態において、細胞傷害性物質は、メトトレキセート、５－フルオロウラ徴候クロヘキシミド、ダウノマイシン、ドキソルビシン、クロラムブシル、トレニモン、フェニレンジアミンマスタード、アドリアマイシン、ブレオマイシン、シトシンアラビノシド、またはシクロホスファミドからなる群から選択される抗癌薬である（米国特許第５，０５７，１３号）。
Ｆ．Ｍｕｃ１６部分の検出および診断的適用
本発明は、被験体においてＭＵＣ１６の過剰発現を含む疾患を検出するための方法であって、ａ）ｉ）被験体由来の試料、およびｉｉ）本発明の抗体のいずれか１つまたは複数を供給する工程、ｂ）抗体のその同種抗原との特異的結合のための条件下で試料を抗体に接触させる工程、ならびにｃ）疾患を欠く対照試料と比較して抗体の試料への結合のレベルの増加を検出し、それによって被験体において疾患を検出する工程を含む方法を提供する。抗体を用いて疾患を検出するための一般的な方法は当技術分野において知られている（Ｐａｙｎｅら、米国特許第７，２０２，３４６号）。本発明の方法は、卵巣癌および乳癌などの癌を検出するのに特に有用である。
本発明は、被験体においてＭＵＣ１６の過剰発現を含む疾患を検出するための方法であって、ａ）ｉ）被験体由来の試料、およびｉｉ）本発明の抗体のいずれか１つまたは複数を供給する工程、ｂ）抗体のその同種抗原との特異的結合のための条件下で試料を抗体に接触させる工程、ならびにｃ）疾患を欠く対照試料と比較して抗体の試料への結合のレベルの増加を検出し、それによって被験体において疾患を検出する工程を含む方法を提供する。抗体を用いて疾患を検出するための一般的な方法は当技術分野において知られている（Ｐａｙｎｅら、米国特許第７，２０２，３４６号）。本発明の方法は、卵巣癌および乳癌などの癌を検出するのに特に有用である。
本発明の方法は、本発明の抗体のそれらの抗原への結合を検出するための特定のアプローチに限定されない。一実施形態において、本発明の抗体への結合を検出することは、典型的には、放射性同位元素（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、および／または１２５Ｉ）、蛍光または化学発光化合物（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、および／またはルシフェリン）、および／または酵素（例えば、アルカリフォスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、および／または西洋ワサビペルオキシダーゼ）などの検出可能な部分で標識されている抗体を用いることを含む。
抗体を検出可能な部分に結合体化するための方法は、当技術分野において知られている（例えば、Ｈｕｎｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ １４４：９４５（１９６２）；Ｄａｖｉｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １３：１０１４（１９７４）；Ｐａｉｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．４０：２１９（１９８１）；およびＮｙｇｒｅｎ、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．ａｎｄ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．３０：４０７（１９８２））。
したがって、本発明の抗体を、免疫組織化学検査、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）、およびウェスタンブロットを含む、競合結合アッセイ、直接および間接サンドイッチアッセイ、および免疫沈降アッセイなどのイムノアッセイに用いてもよい。
例えば、免疫組織化学的検出に関して、本明細書におけるデータは、高悪性度の漿液性卵巣癌腫、小葉癌（２８）、およびＯＣ１２５について陰性であり、かつＭＵＣ１６糖タンパク質の細胞質部分および細胞外部分を保持している卵巣癌腫のサブセットを検出するのに抗体４Ｈ１１が有用であることを実証している。
本発明の抗体はまた、インビボのＸ線画像化に有用であり、放射線不透過性物質または放射性同位元素などの検出可能な部分で標識された抗体が被験体に、好ましくは血流に投与され、宿主における標識抗体の存在および位置がアッセイされる。この画像化技術は、悪性腫瘍の病期診断および処置において有用である。
本発明の抗体はさらに、アフィニティー精製剤として有用である。このプロセスにおいて、抗体は、Ｓｅｐｈａｄｅｘ樹脂または濾紙などの適切な支持体に、当技術分野において周知の方法を用いて、固定化されて、本発明の抗体に特異的に結合する抗原を含有する分子を捕獲および精製する。
Ｇ．治療的適用
本発明は、ＭＵＣ１６の過剰発現を含む疾患を処置するための方法であって、上記疾患を有する被験体に、本発明の抗体のいずれか１つまたは複数の治療上有効量を投与する工程を含む方法を提供する。抗体を用いて疾患を処置するための一般的な方法は当技術分野において知られている（Ｐａｙｎｅら、米国特許第７，２０２，３４６号）。本発明の方法は、卵巣癌および乳癌などの癌を処置するのに特に有用である。これらの方法はまた、原発癌、転移癌、および再発癌に適用可能である。
本発明は、ＭＵＣ１６の過剰発現を含む疾患を処置するための方法であって、上記疾患を有する被験体に、本発明の抗体のいずれか１つまたは複数の治療上有効量を投与する工程を含む方法を提供する。抗体を用いて疾患を処置するための一般的な方法は当技術分野において知られている（Ｐａｙｎｅら、米国特許第７，２０２，３４６号）。本発明の方法は、卵巣癌および乳癌などの癌を処置するのに特に有用である。これらの方法はまた、原発癌、転移癌、および再発癌に適用可能である。
被験体に「投与すること」という用語は、分子を被験体に供給することを意味する。これは、当技術分野において知られた方法（例えば、Ｅｒｉｃｋｓｏｎら、米国特許第６，６３２，９７９号；Ｆｕｒｕｔａら、米国特許第６，９０５，８３９号；Ｊａｃｋｏｂｓｅｎら、米国特許第６，２３８，８７８号；Ｓｉｍｏｎら、米国特許第５，８５１，７８９号）を用いて行われてもよい。本発明の組成物は、予防的に（すなわち、疾患症状が観察される前に）、および／または治療的に（すなわち、疾患症状が観察された後に）投与されてもよい。投与はまた、１つまたは複数の疾患症状の発現と同時で（すなわち、同じ時点で、またはその間中）あってもよい。また、本発明の組成物は、別の型の薬物または治療手段（例えば、手術）の投与の前、それと同時に、および／またはそれの後に、投与されてもよい。本発明の組成物を投与する方法には、非限定的に、非経口、経口、腹腔内、鼻腔内、局所的、および舌下の形での投与が挙げられる。非経口の投与経路には、例えば、皮下、静脈内、筋肉内、胸骨内（ｉｎｔｒａｓｔｅｍａｌ）の注射および注入の経路が挙げられる。
一実施形態において、本発明の組成物は、リポソームとしての送達のための脂質を含む。そのような組成物を作製するための方法は、当技術分野において知られている（Ｂｏｒｇｈｏｕｔｓら、（２００５）Ｊ Ｐｅｐｔ Ｓｃｉ １１、７１３－７２６；Ｃｈａｎｇら、（２００９）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ４、ｅ４１７１；Ｆａｉｓａｌら、（２００９）Ｖａｃｃｉｎｅ ２７、６５３７－６５４５；Ｈｕｗｙｌｅｒｅｔら、（２００８）Ｉｎｔ Ｊ Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ３、２１－２９；Ｓｏｎｇら、（２００８）Ｉｎｔ
Ｊ Ｐｈａｒｍ ３６３、１５５－１６１；Ｖｏｉｎｅａら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ６、４６５－４７４）。
Ｊ Ｐｈａｒｍ ３６３、１５５－１６１；Ｖｏｉｎｅａら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ６、４６５－４７４）。
癌を有する人間の抗体処置は当技術分野において知られており、例えば、米国特許第５，７３６，１３７号；同第６，３３３，４１０号；同第５，４７５，０９２号；同第５，５８５，４９９号；同第５，８４６，５４５号；同第７，２０２，３４６号；同第６，３４０，７０１号；同第６，３７２，７３８号；同第７，２０２，３４６号；同第５，８４６，５４５号；同第５，５８５，４９９号；同第５，４７５，０９２号；同第７，２０２，３４６号；同第７，６６２，３８７号；同第７，６６２，３８７号；同第６，４２９，２９５号；同第７，６６６，４２５号；同第５，０５７，３１３号にある。
本発明の抗体は、薬学的に許容され得るキャリア、希釈剤、および／または賦形剤と共に投与されてもよい。適切なキャリア、希釈剤、および／または賦形剤の例として、（１）約１ｍｇ／ｍｌ～２５ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミンを含有するＤｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝食塩水、ｐＨ約７．４、（２）０．９％の食塩水（０．９％ｗ／ｖ ＮａＣｌ）、および（３）５％（ｗ／ｖ）のデキストロースが挙げられる。
本発明の抗体は、典型的には、治療的量で投与される。用語「治療的量」、「薬学的有効量」、「治療上有効量」、および「生物学的有効量」は、定量的か定性的かに関わらず、所望の結果を達成するのに十分である量を指すように、本明細書において交換可能に用いられる。特に、薬学的有効量は、疾患に関連している望ましくない作用（病理学的、臨床的、および生化学的など）の軽減、遅延、および／または除去をもたらす量である。例えば、「癌を軽減する治療的量」は、癌の１つまたは複数の症状を軽減し、遅らせ、および／または除去する量である。
例えば、「治療的量」の特定の「投薬量」は、投与経路、処置される被験体のタイプ、および考慮される特定の被験体の身体特性に依存する。これらの因子、およびこの量を決定するためのそれらの因子の関係は、医学、獣医学、および他の関連分野の熟練従事者によく知られている。この量および投与方法は、最適な効力を達成するように調整することができるが、体重、食事、併用薬物療法、および他の因子のような因子に依存するものであり、そのことを当業者は認識している。投薬の量および頻度は、実質的に有害な作用を生じることなく、化合物の有効レベルを生むように選択される。
凍結乾燥されているよりむしろ、水性剤形で存在する場合、抗体は、典型的には、約０．１ｍｇ／ｍｌ～１００ｍｇ／ｍｌの濃度で処方される。
疾患の型および重症度に依存して、例えば、１回もしくは複数回の別々の投与によるか、または持続注入によるかに関わらず、患者体重の１ｋｇあたり約０．０１５～１５ｍｇの抗体が、患者への投与のための初回候補投薬量である。数日間またはそれを超える期間にわたる反復投与については、状態に依存して、処置が、疾患症状の所望の抑制が起こるまで繰り返される。
本発明の方法は、インビトロで、インビボで、またはエキソビボで実施することができる。
以下の実施例は、本発明の特定の好ましい実施形態および態様を例証する役割を果たし、それらが本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
実施例１
材料および方法
以下は、その後の実施例に用いられる例示的な材料および方法の簡単な記載である。
材料および方法
以下は、その後の実施例に用いられる例示的な材料および方法の簡単な記載である。
細胞培養：
ＯＶＣＡＲ３、ＳＫＯＶ３、およびＡ２７８０細胞系を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ
Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手し、ＡＴＣＣ文献に従い、培養で維持した。ＭＵＣ１６＋形質移入した細胞系の作製のために、ＭＵＣ１６ ｃＤＮＡのカルボキシ末端部分を、Ｖｉｔａｌｉｔｙ ｐｈｒＧＦＰベクター発現系（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を用いて、緑色蛍光タンパク質融合タンパク質として導入した。それらのそれぞれの培地中にジェネティシン（Ｇ４１８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を用いて安定な細胞系を選択し、緑色蛍光タンパク質の発現によって単離した。安定なトランスフェクタントを、それぞれ、それらの培地中Ｇ４１８の存在下で日常的に維持した。ΔＭＵＣ１６ｃ１１４トランスフェクタントは、推定の切断部位からカルボキシ末端まで（アミノ酸１７７６～１８９０）のＭＵＣ１６タンパク質の細胞表面発現を有する（１２）。
ＯＶＣＡＲ３、ＳＫＯＶ３、およびＡ２７８０細胞系を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ
Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手し、ＡＴＣＣ文献に従い、培養で維持した。ＭＵＣ１６＋形質移入した細胞系の作製のために、ＭＵＣ１６ ｃＤＮＡのカルボキシ末端部分を、Ｖｉｔａｌｉｔｙ ｐｈｒＧＦＰベクター発現系（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を用いて、緑色蛍光タンパク質融合タンパク質として導入した。それらのそれぞれの培地中にジェネティシン（Ｇ４１８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を用いて安定な細胞系を選択し、緑色蛍光タンパク質の発現によって単離した。安定なトランスフェクタントを、それぞれ、それらの培地中Ｇ４１８の存在下で日常的に維持した。ΔＭＵＣ１６ｃ１１４トランスフェクタントは、推定の切断部位からカルボキシ末端まで（アミノ酸１７７６～１８９０）のＭＵＣ１６タンパク質の細胞表面発現を有する（１２）。
モノクローナル調製：
ＭＵＣ１６配列を用いて、ΔＭＵＣ１６ｃ１１４アミノ酸配列のエレメントをコードするペプチド配列をＭｅｍｏｒｉａｌ Ｓｌｏａｎ－Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ（ＭＳＫＣＣ）微量化学コア施設で合成した。本発明者らは、３つのポリペプチド（図１）を合成し、ポリペプチド１およびポリペプチド２を、ＫＬＨへのより良い結合体化のためにＮ末端においてシステインで修飾した。等濃度のＫＬＨ結合体化ペプチドを混合し、その後、５匹のＢＡＬＢ／ｃマウスへの免疫原として用いた。本発明者らは、ＥＬＩＳＡによって、血清が個々のペプチドに対して最も高い反応性を示した、５匹のマウスのうちの１匹を選択し、ＭＳＫＣＣモノクローナル抗体コア施設は、融合を実施し、標準プロトコールを用いて抗体を選択した。融合から１０日後、上清を選択し、個々の合成ペプチドに対するＥＬＩＳＡにより、反応性についてスクリーニングした。
ＭＵＣ１６配列を用いて、ΔＭＵＣ１６ｃ１１４アミノ酸配列のエレメントをコードするペプチド配列をＭｅｍｏｒｉａｌ Ｓｌｏａｎ－Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ（ＭＳＫＣＣ）微量化学コア施設で合成した。本発明者らは、３つのポリペプチド（図１）を合成し、ポリペプチド１およびポリペプチド２を、ＫＬＨへのより良い結合体化のためにＮ末端においてシステインで修飾した。等濃度のＫＬＨ結合体化ペプチドを混合し、その後、５匹のＢＡＬＢ／ｃマウスへの免疫原として用いた。本発明者らは、ＥＬＩＳＡによって、血清が個々のペプチドに対して最も高い反応性を示した、５匹のマウスのうちの１匹を選択し、ＭＳＫＣＣモノクローナル抗体コア施設は、融合を実施し、標準プロトコールを用いて抗体を選択した。融合から１０日後、上清を選択し、個々の合成ペプチドに対するＥＬＩＳＡにより、反応性についてスクリーニングした。
ＥＬＩＳＡ：
個々のペプチドおよびＧＳＴ－ΔＭＵＣ１６ｃ１１４融合タンパク質に対する抗体の陽性を調べるために、ＥＬＩＳＡアッセイについての通例のコア施設プロトコールに従ってサンドイッチＥＬＩＳＡを実施した。
個々のペプチドおよびＧＳＴ－ΔＭＵＣ１６ｃ１１４融合タンパク質に対する抗体の陽性を調べるために、ＥＬＩＳＡアッセイについての通例のコア施設プロトコールに従ってサンドイッチＥＬＩＳＡを実施した。
ＦＡＣＳ分析：
付着標的細胞を、０．０５％のトリプシンおよび０．１％のＥＤＴＡによって取り出し、洗浄し、血球計算器によってカウントした。細胞を、複数個のＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブへ、チューブあたり少なくとも０．５×１０６～１×１０６細胞で分配した。細胞を、１％ＦＣＳおよび０．０２５％アジ化ナトリウムを含有するリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（ＦＡＣＳ緩衝液）で洗浄した。内部のＦＡＣＳ染色のために、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ内の細胞を、１：１０に希釈したＦＡＣＳ透過処理溶液２（ＢＤ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を用いて室温で１０分間、透過処理し、その後、氷冷ＦＡＣＳ緩衝液で２回、洗浄した。その後、それらを、氷上で３０分間、１μｇ／チューブのマウスＭＵＣ１６モノクローナルの生物反応性上清を含まずに（二次抗体の対照として）か、またはそれを含んでかのいずれかでインキュベートした。表面ＦＡＣＳ染色のために、細胞を、氷上で３０分間、１μｇ／チューブのマウスＭＵＣ１６モノクローナル（９Ｂ１１．２０．１６、９Ｃ９．２１．５．１３、および４Ｈ１１．２．５）、マウス抗ヒトＯＣ１２５（Ｍ３５１９）、マウス抗ヒトＭ１１（Ｍ３５２０）（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ、Ｄａｋｏ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ Ｉｎｃ．、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、ＣＡ）、またはＶＫ８（ＭＳＫＣＣ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹのＢｅａｔｒｉｃｅ Ｙｉｎ博士およびＫｅｎ Ｌｌｏｙｄ博士のご厚意により提供された）の生物反応性上清を含まずに（二次抗体の対照として）か、またはそれを含んでかのいずれかでインキュベートした。Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ内の細胞をまた、１μｇ／チューブの非特異的アイソタイプ適合対照マウス抗体（ＭＳＫＣＣモノクローナルコア施設から入手された、ＩｇＧｌモノクローナルについての１３Ｃ４およびＩｇＧ２ｂモノクローナルについての４Ｅ１１）で表面染色し、氷上で３０分間、インキュベートした。全ての細胞をＦＡＣＳ緩衝液で３回、洗浄した。細胞を、１μｇ／チューブの二次抗体ヤギ抗マウスＩｇＧ１－ＰＥまたはＩｇＧ２ｂ－ＰＥと、氷上で３０分間、インキュベートし、その後、ＦＡＣＳ緩衝液で３回、洗浄した。細胞を、ＭＳＫＣＣフローサイトメトリーコア施設におけるＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ機によって分析した。
付着標的細胞を、０．０５％のトリプシンおよび０．１％のＥＤＴＡによって取り出し、洗浄し、血球計算器によってカウントした。細胞を、複数個のＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブへ、チューブあたり少なくとも０．５×１０６～１×１０６細胞で分配した。細胞を、１％ＦＣＳおよび０．０２５％アジ化ナトリウムを含有するリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（ＦＡＣＳ緩衝液）で洗浄した。内部のＦＡＣＳ染色のために、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ内の細胞を、１：１０に希釈したＦＡＣＳ透過処理溶液２（ＢＤ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を用いて室温で１０分間、透過処理し、その後、氷冷ＦＡＣＳ緩衝液で２回、洗浄した。その後、それらを、氷上で３０分間、１μｇ／チューブのマウスＭＵＣ１６モノクローナルの生物反応性上清を含まずに（二次抗体の対照として）か、またはそれを含んでかのいずれかでインキュベートした。表面ＦＡＣＳ染色のために、細胞を、氷上で３０分間、１μｇ／チューブのマウスＭＵＣ１６モノクローナル（９Ｂ１１．２０．１６、９Ｃ９．２１．５．１３、および４Ｈ１１．２．５）、マウス抗ヒトＯＣ１２５（Ｍ３５１９）、マウス抗ヒトＭ１１（Ｍ３５２０）（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ、Ｄａｋｏ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ Ｉｎｃ．、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、ＣＡ）、またはＶＫ８（ＭＳＫＣＣ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹのＢｅａｔｒｉｃｅ Ｙｉｎ博士およびＫｅｎ Ｌｌｏｙｄ博士のご厚意により提供された）の生物反応性上清を含まずに（二次抗体の対照として）か、またはそれを含んでかのいずれかでインキュベートした。Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ内の細胞をまた、１μｇ／チューブの非特異的アイソタイプ適合対照マウス抗体（ＭＳＫＣＣモノクローナルコア施設から入手された、ＩｇＧｌモノクローナルについての１３Ｃ４およびＩｇＧ２ｂモノクローナルについての４Ｅ１１）で表面染色し、氷上で３０分間、インキュベートした。全ての細胞をＦＡＣＳ緩衝液で３回、洗浄した。細胞を、１μｇ／チューブの二次抗体ヤギ抗マウスＩｇＧ１－ＰＥまたはＩｇＧ２ｂ－ＰＥと、氷上で３０分間、インキュベートし、その後、ＦＡＣＳ緩衝液で３回、洗浄した。細胞を、ＭＳＫＣＣフローサイトメトリーコア施設におけるＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ機によって分析した。
ウェスタンブロット分析：
安定な細胞系を、それらのそれぞれの培養培地を含む１０ｃｍのディッシュ中で培養し、５％ＣＯ２、３７℃で３日間、インキュベートした。それらを、氷冷ＰＢＳで２回、洗浄して、血清含有培地を除去した。付着細胞を、１～２ｍｌの氷冷ＰＢＳで掻爬し、細胞を、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心機において４℃で、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ内に遠心沈殿させた。上清を捨て、細胞を、０．２ｍｌの改変Ｒｉｐａ溶解緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ；ｐＨ７．４；１５０ｍＭ ＮａＣｌ；１％ＮＰ－４０；１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４；１ｍＭ ＰＭＳＦ；１ｍＭ ＤＴＴ；１０μｇ／ｍｌロイペプチン；および１０μｇ／ｍｌアプロチニン）を用いて氷上で３０分間、溶解させ、４℃で１０分間、回転させた。可溶性溶液をチューブへと分離し、残渣のペレットを廃棄した。タンパク質濃度を、Ｂｉｏ－Ｒａｄタンパク質アッセイ（ＢｉｏＲａＤ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を用いて測定した。等量のタンパク質（ＧＳＴ－ＭＵＣ１６－ＣＤ融合タンパク質または安定な細胞系抽出物）を、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）によって分離し、４℃の低温室においてＢｉｏＲａｄ転写装置を用いてニトロセルロース膜へ転写した。膜を、０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で４℃、一晩、ブロッキングした。膜を、室温で１時間、一次抗体（１：１０００希釈）で探索し、その後、ＰＢＳＴで３回、洗浄した。その後、対応する二次抗体である、ヒツジ由来の抗マウスＩｇＧ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）連結型全抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＫ）（１：５０００希釈）を用いて、室温で１時間、膜を染色した。膜をＰＢＳＴで３回、洗浄し、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ（登録商標）化学発光試薬（ＥＣＬ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を用いて、室温で１～５分間、発色させ、シグナルをＫｏｄａｋ ＢｉｏＭａｘ Ｆｉｌｍ上に現像した。
安定な細胞系を、それらのそれぞれの培養培地を含む１０ｃｍのディッシュ中で培養し、５％ＣＯ２、３７℃で３日間、インキュベートした。それらを、氷冷ＰＢＳで２回、洗浄して、血清含有培地を除去した。付着細胞を、１～２ｍｌの氷冷ＰＢＳで掻爬し、細胞を、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心機において４℃で、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ内に遠心沈殿させた。上清を捨て、細胞を、０．２ｍｌの改変Ｒｉｐａ溶解緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ；ｐＨ７．４；１５０ｍＭ ＮａＣｌ；１％ＮＰ－４０；１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４；１ｍＭ ＰＭＳＦ；１ｍＭ ＤＴＴ；１０μｇ／ｍｌロイペプチン；および１０μｇ／ｍｌアプロチニン）を用いて氷上で３０分間、溶解させ、４℃で１０分間、回転させた。可溶性溶液をチューブへと分離し、残渣のペレットを廃棄した。タンパク質濃度を、Ｂｉｏ－Ｒａｄタンパク質アッセイ（ＢｉｏＲａＤ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を用いて測定した。等量のタンパク質（ＧＳＴ－ＭＵＣ１６－ＣＤ融合タンパク質または安定な細胞系抽出物）を、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）によって分離し、４℃の低温室においてＢｉｏＲａｄ転写装置を用いてニトロセルロース膜へ転写した。膜を、０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で４℃、一晩、ブロッキングした。膜を、室温で１時間、一次抗体（１：１０００希釈）で探索し、その後、ＰＢＳＴで３回、洗浄した。その後、対応する二次抗体である、ヒツジ由来の抗マウスＩｇＧ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）連結型全抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＫ）（１：５０００希釈）を用いて、室温で１時間、膜を染色した。膜をＰＢＳＴで３回、洗浄し、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ（登録商標）化学発光試薬（ＥＣＬ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を用いて、室温で１～５分間、発色させ、シグナルをＫｏｄａｋ ＢｉｏＭａｘ Ｆｉｌｍ上に現像した。
モノクローナル抗体に関する結合および内部移行の研究、ならびにＯＶＣＡＲ３およびＳＫＯＶ３の安定なトランスフェクタント：
精製されたモノクローナル抗体を、ヨードゲン法を用いて１３１Ｉで標識し、サイズ排除クロマトグラフィーによって精製した（２２）。飽和結合研究を、無傷ＯＶＣＡＲ－３細胞の基質を用いて放射標識抗体で実施した。簡単に述べれば、１０個の試験溶液を調製し（３連で）、それらは、総体積５００μＬのＰＢＳ（０．２％ＢＳＡ；ｐＨ７．４）中に漸増量の放射性ヨウ素標識抗体、３０００００～５０００００細胞を含有した。細胞を、ガラス繊維膜を通す急速濾過によって単離し、氷冷トリス緩衝食塩水で洗浄した。細胞を、加えられた総活性の標準物質と共に、ガンマカウンターにおいてカウントした。放射標識抗体の各濃度について、非特異的結合を、１００ｎＭの非修飾抗体の存在下で決定した。データを、最小二乗回帰法（Ｏｒｉｇｉｎ、Ｍｉｃｒｏｃａｌ、Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．、Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ、ＭＡ）で分析し、Ｋｄ値およびＢｍａｘ値を決定し、スキャッチャード変換を実行した。
精製されたモノクローナル抗体を、ヨードゲン法を用いて１３１Ｉで標識し、サイズ排除クロマトグラフィーによって精製した（２２）。飽和結合研究を、無傷ＯＶＣＡＲ－３細胞の基質を用いて放射標識抗体で実施した。簡単に述べれば、１０個の試験溶液を調製し（３連で）、それらは、総体積５００μＬのＰＢＳ（０．２％ＢＳＡ；ｐＨ７．４）中に漸増量の放射性ヨウ素標識抗体、３０００００～５０００００細胞を含有した。細胞を、ガラス繊維膜を通す急速濾過によって単離し、氷冷トリス緩衝食塩水で洗浄した。細胞を、加えられた総活性の標準物質と共に、ガンマカウンターにおいてカウントした。放射標識抗体の各濃度について、非特異的結合を、１００ｎＭの非修飾抗体の存在下で決定した。データを、最小二乗回帰法（Ｏｒｉｇｉｎ、Ｍｉｃｒｏｃａｌ、Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．、Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ、ＭＡ）で分析し、Ｋｄ値およびＢｍａｘ値を決定し、スキャッチャード変換を実行した。
抗体の細胞内部移行研究を、１３１Ｉ－４Ｈ１１モノクローナル抗体および１３１Ｉ－ＯＣ１２５モノクローナル抗体、ならびにＳＫＯＶ３－ｐｈｒＧＦＰ－ΔＭＵＣ１６ｃ３３４の安定な形質移入細胞を用いて実施した。簡単に述べれば、２ｍＬの培地中の放射標識抗体（３７０ＭＢｑ／ｍｇ、１００ｋｃｐｍ）を、６ウェルプレートに蒔かれたＳＫＯＶ３細胞に加えた。プレートを３７℃で２４時間までインキュベートした。様々な時点において、３つのウェルから培地を取り出し、細胞を２×２ｍＬ ＰＢＳで洗浄した。その後、細胞表面に結合した活性を、２×２ｍＬの氷冷酸洗浄（１００ｍＭ酢酸、１００ｍＭグリシン；ｐＨ３．０）でストリップし、収集した。その後、細胞を２×１ｍｌの１Ｍ ＮａＯＨで溶解し、収集した。研究の終わりに、全ての試料を、加えられた放射活性の最初の量を表す標準物質と共に、ガンマカウンターでカウントした。全ての培地試料を、５％ＴＣＡの移動相を用いてＩＴＬＣ－ＳＧによって分析し、結合していない１３１Ｉを決定した。
組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）：
組織マイクロアレイは、本発明者らの施設内で構築するか、または内部で入手できないならば、商業的研究所から購入するかのいずれかであった。簡単に述べれば、既存のパラフィン包埋組織のコア針生検を、いわゆるドナーブロックから入手し、その後、Ｋｏｎｏｎｅｎら、および続いてＨｅｄｖａｔらによって改変された技術を用いることによって、レシピエントパラフィンアレイ「マスター」ブロックへ再配置した（２３～２４）。Ｂｅｅｃｈｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．（Ｓｕｎ Ｐｒａｉｒｉｅ、ＷＩ）製の手動で操作されるＴｉｓｓｕｅ Ａｒｒａｙｅｒ ＭＴＡ－１を用いて、直径が０．６～１．０ｍｍと測定された試料円形スポット（コア）を作製した。コアを、お互いから０．３～０．４ｍｍ離してアレイした。対照組織の層を、エッジ効果を避けるために実際の組織マイクロアレイの周りに戦略的に置いた。各組織マイクロアレイの特定の組成は、下記に描写されている。卵巣癌、前立腺癌、肺腺癌、膵臓の粘液性新生物、ならびに浸潤性腺管癌および浸潤性小葉乳癌腫についての組織マイクロアレイのスライドを、ホルマリン固定パラフィン包埋組織から４ｕｍ切片を切ることによって調製した。正常な成人および胎児の組織マイクロアレイを商業的供給源（Ｂｉｏｍａｘ、ＵＳ）から入手した。ＯＶＣＡＲ３細胞を陽性対照として用いた。
組織マイクロアレイは、本発明者らの施設内で構築するか、または内部で入手できないならば、商業的研究所から購入するかのいずれかであった。簡単に述べれば、既存のパラフィン包埋組織のコア針生検を、いわゆるドナーブロックから入手し、その後、Ｋｏｎｏｎｅｎら、および続いてＨｅｄｖａｔらによって改変された技術を用いることによって、レシピエントパラフィンアレイ「マスター」ブロックへ再配置した（２３～２４）。Ｂｅｅｃｈｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．（Ｓｕｎ Ｐｒａｉｒｉｅ、ＷＩ）製の手動で操作されるＴｉｓｓｕｅ Ａｒｒａｙｅｒ ＭＴＡ－１を用いて、直径が０．６～１．０ｍｍと測定された試料円形スポット（コア）を作製した。コアを、お互いから０．３～０．４ｍｍ離してアレイした。対照組織の層を、エッジ効果を避けるために実際の組織マイクロアレイの周りに戦略的に置いた。各組織マイクロアレイの特定の組成は、下記に描写されている。卵巣癌、前立腺癌、肺腺癌、膵臓の粘液性新生物、ならびに浸潤性腺管癌および浸潤性小葉乳癌腫についての組織マイクロアレイのスライドを、ホルマリン固定パラフィン包埋組織から４ｕｍ切片を切ることによって調製した。正常な成人および胎児の組織マイクロアレイを商業的供給源（Ｂｉｏｍａｘ、ＵＳ）から入手した。ＯＶＣＡＲ３細胞を陽性対照として用いた。
免疫組織化学検査：
標準ＯＣ１２５（Ｖｅｎｔａｎａ、Ｔｕｓｃｏｎ、ＡＺ）および新規なモノクローナル抗体の両方に関して組織マイクロアレイで免疫組織化学検査を実施した。組織マイクロアレイの切片を４ミクロンに切断し、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ／Ｐｌｕｓ顕微鏡スライド（Ｆｉｓｈｅｒ ｂｒａｎｄ）上に置き、６０°のオーブンで少なくとも６０分間、焼いた。その後、スライドを脱パラフィンし、蒸留水に水和させ、ｐＨ６．００におけるクエン酸緩衝液中に９７℃で３０分間、浸漬し、流水で２～５分間、洗浄し、蒸留水に希釈された３％過酸化水素中で５分間、インキュベートした。スライドを蒸留水で１分間、洗浄し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．２の浴槽へ移し、各５分間で２回交換し、ＰＢＳ中に希釈された０．０５％ＢＳＡ中に最低１分間、置いた。組織切片の周囲を乾燥させた後、正常血清を、２％ＢＳＡ／ＰＢＳ中に１：２０希釈で添加し、湿度チャンバー内、室温で最低１０分間、インキュベートした。その後、血清を、切片を乾燥させないように、吸い出し、１：１０００の希釈度における約１５０ラムダの新規抗体を組織上に置いた。スライドを湿度チャンバー内、４℃で一晩（約１５～１８時間）、インキュベートした。一次抗体を、各１０分間の３回のＰＢＳ交換を用いて洗い流した。二次抗体のＶｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、Ｃａ）製のビオチン化α－マウスを、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中１：５００希釈で添加し、湿度チャンバー内、室温で４５～６０分間、インキュベートした。上記のように再び、３回のＰＢＳ交換を用いて上記抗体を洗い流した。その後、スライドを、ＰＢＳ中に希釈されたジアミノベンジジン（ＤＡＢ）の浴槽へ５～１５分間、移した。その後、スライドを水道水中で１分間、洗浄し、Ｈａｒｒｉｓ改変ヘマトキシリン（Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて対比染色し、１％酸アルコールで脱色し、アンモニア水中で青色にし、各２分間のそれぞれが９５％エタノール、１００％エタノール、およびキシレンの３回の交換で脱水し、永久封入剤を用いてカバーグラスで覆った。
標準ＯＣ１２５（Ｖｅｎｔａｎａ、Ｔｕｓｃｏｎ、ＡＺ）および新規なモノクローナル抗体の両方に関して組織マイクロアレイで免疫組織化学検査を実施した。組織マイクロアレイの切片を４ミクロンに切断し、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ／Ｐｌｕｓ顕微鏡スライド（Ｆｉｓｈｅｒ ｂｒａｎｄ）上に置き、６０°のオーブンで少なくとも６０分間、焼いた。その後、スライドを脱パラフィンし、蒸留水に水和させ、ｐＨ６．００におけるクエン酸緩衝液中に９７℃で３０分間、浸漬し、流水で２～５分間、洗浄し、蒸留水に希釈された３％過酸化水素中で５分間、インキュベートした。スライドを蒸留水で１分間、洗浄し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．２の浴槽へ移し、各５分間で２回交換し、ＰＢＳ中に希釈された０．０５％ＢＳＡ中に最低１分間、置いた。組織切片の周囲を乾燥させた後、正常血清を、２％ＢＳＡ／ＰＢＳ中に１：２０希釈で添加し、湿度チャンバー内、室温で最低１０分間、インキュベートした。その後、血清を、切片を乾燥させないように、吸い出し、１：１０００の希釈度における約１５０ラムダの新規抗体を組織上に置いた。スライドを湿度チャンバー内、４℃で一晩（約１５～１８時間）、インキュベートした。一次抗体を、各１０分間の３回のＰＢＳ交換を用いて洗い流した。二次抗体のＶｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、Ｃａ）製のビオチン化α－マウスを、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中１：５００希釈で添加し、湿度チャンバー内、室温で４５～６０分間、インキュベートした。上記のように再び、３回のＰＢＳ交換を用いて上記抗体を洗い流した。その後、スライドを、ＰＢＳ中に希釈されたジアミノベンジジン（ＤＡＢ）の浴槽へ５～１５分間、移した。その後、スライドを水道水中で１分間、洗浄し、Ｈａｒｒｉｓ改変ヘマトキシリン（Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて対比染色し、１％酸アルコールで脱色し、アンモニア水中で青色にし、各２分間のそれぞれが９５％エタノール、１００％エタノール、およびキシレンの３回の交換で脱水し、永久封入剤を用いてカバーグラスで覆った。
免疫組織化学検査のスコア化：
ＯＣ１２５およびＭ１１などの市販されている抗体は、複合グリコシル化依存性エピトープを標的にする。本発明者らの仮説は、グリコシル化は組織特異的であるということである；それゆえに、パラフィン固定組織におけるペプチド指向性抗体の利用を試験し、ＭＵＣ１６発現の存在率を調査することは重要であった。３つの候補抗体の４Ｈ１１、９Ｃ９、および４Ａ５を、ＯＶＣＡＲ３細胞系ペレットを用いて特徴づけた。その３つのうち、４Ｈ１１抗体は、最小量のバックグラウンド染色をもち、複数の希釈度において最も強く、最もびまん性および一貫性が高い染色パターンを示し、したがって、それを、病理学コア施設においてヒト組織に用いるために最適化した。
ＯＣ１２５およびＭ１１などの市販されている抗体は、複合グリコシル化依存性エピトープを標的にする。本発明者らの仮説は、グリコシル化は組織特異的であるということである；それゆえに、パラフィン固定組織におけるペプチド指向性抗体の利用を試験し、ＭＵＣ１６発現の存在率を調査することは重要であった。３つの候補抗体の４Ｈ１１、９Ｃ９、および４Ａ５を、ＯＶＣＡＲ３細胞系ペレットを用いて特徴づけた。その３つのうち、４Ｈ１１抗体は、最小量のバックグラウンド染色をもち、複数の希釈度において最も強く、最もびまん性および一貫性が高い染色パターンを示し、したがって、それを、病理学コア施設においてヒト組織に用いるために最適化した。
４Ｈ１１を使用して、本発明者らは、高病期、高悪性度の漿液性卵巣癌腫からの組織マイクロアレイを用いて染色し、陽性をスコア化した（図２）。これらの腫瘍は、西側先進国において全卵巣癌腫の約８０～８５％に相当する（２５）、卵巣癌の最も一般的な型であった。新規な抗体の特異性を試験するために、本発明者らはまた、前立腺、肺、乳房、および膵臓の癌の組織マイクロアレイを染色し、それらの染色強度をＯＣ１２５モノクローナル抗体のものと比較した（図６Ａ～Ｄ）。正常ヒト組織といくらかの交差反応性があるかどうかを決定するために、抗体をまた、正常なヒト成人および胎児ＴＭＡにおいて試験した。
染色切片の全てが委託病理学者（ＫＪＰ）によって再検査された。不定の染色があったコアのサブセットは、スコア化法における一貫性を確実にするために、二番目の病理学者（ＲＡＳ）によって独立してスコア化された。細胞質染色および／または膜染色のみが陽性とみなされた。細胞の一部が膜染色を示したならば、それは部分的染色とみなされた。個々のコアにおける染色分布および強度の半定量的評価を提供するためにスコア化システムを工夫した。同時に、染色分布および強度をＯＣ１２５と新規抗体との間で比較するのに有用であるようにそれを設計した。スコアは、以下の標準に従って、細胞のパーセンテージ、染色の強度およびパターンを組み入れた：スコア０：染色なし；スコア１：＜５％強いまたは弱い染色；スコア２：５～５０％強いまたは弱い染色；スコア３：５１～７５％強いまたは５１～１００％弱い染色；スコア４：７６～９９％強い染色；およびスコア５：１００％強い染色（図３）。病理学者はまず、ＯＣ１２５で染色された全ての組織マイクロアレイを再検査し、各コアをスコア化した。その後、ＯＣ１２５でのスコア化から１～数日後、前の結果を参照することなく、新規抗体で染色された同じコアをスコア化した。全てのスコア化が完了した後初めて、各コアについての染色間のスコア化の直接比較を行った。全ての非卵巣組織マイクロアレイについて同じプロセスを用いた。比較後、コア染色を、ポイント差に基づいて一致、不定、または不一致であると決定した。一致したコアは、０～１ポイントだけ異なり、不定のコアは２ポイントだけ異なり、不一致のコアは３～５ポイントだけ異なった。このルールの１つの例外は、１ポイントの差が０と１のスコアの間であったときであり、その場合、その差は不定とみなされた。これは、陰性症例を、まさに限局的に陽性の症例から正確に区別するためであった。
実施例２
抗ＭＵＣ１６モノクローナル抗体の生成および特徴づけ
個々のペプチドおよび組換えＧＳＴ－ΔＭＵＣ１６ｃ１１４タンパク質の両方を用いるＥＬＩＳＡに基づいたスクリーニングによって、ＭＵＣ１６指向性モノクローナル抗体を単離し、続いて、単一細胞クローンの連続サブクローニングを行った。
表１Ａおよび１Ｂ：ＭＵＣ１６カルボキシ末端モノクローナル抗体の、ＧＳＴ－ΔＭＵＣ１６ｃ１１４に対する反応性を示すウェスタン分析、ＯＶＣＡＲ３野生型細胞におけるＦＡＣＳ分析
抗ＭＵＣ１６モノクローナル抗体の生成および特徴づけ
個々のペプチドおよび組換えＧＳＴ－ΔＭＵＣ１６ｃ１１４タンパク質の両方を用いるＥＬＩＳＡに基づいたスクリーニングによって、ＭＵＣ１６指向性モノクローナル抗体を単離し、続いて、単一細胞クローンの連続サブクローニングを行った。
表１Ａおよび１Ｂ：ＭＵＣ１６カルボキシ末端モノクローナル抗体の、ＧＳＴ－ΔＭＵＣ１６ｃ１１４に対する反応性を示すウェスタン分析、ＯＶＣＡＲ３野生型細胞におけるＦＡＣＳ分析
本発明者らは、ＯＶＣＡＲ３野生型およびｐｈｒＧＦＰ－ΔＭＵＣ１６ｃ１１４を形質導入されたＳＫＯＶ３細胞を用いて、選択された抗体をＦＡＣＳ分析によって特徴づけた。選択されたモノクローナル抗体の全ては、両方の細胞系に結合し、一方、市販のＶＫ８、Ｍ１１、およびＯＣ１２５抗体はＯＶＣＡＲ３細胞に結合したが、ＳＫＯＶ３－ｐｈｒＧＦＰ－ΔＭＵＣ１６ｃ１１４細胞系に結合しなかった。ポリペプチド３に対する抗体は、それが内部エピトープであるため、透過処理を必要とした（図７）。
ＧＳＴ－ΔＭＵＣ１６ｃ１１４精製タンパク質を用いたウェスタンブロット分析は、４Ｈ１１および９Ｃ９抗体との強い結合を示したが（図４Ａ）、他の選択された抗体は、より弱い結合を示した。ＳＫＯＶ３－ｐｈｒＧＦＰ－ΔＭＵＣ１６ｃ１１４トランスフェクタントもまた、４Ｈ１１および９Ｃ９抗体を用いたウェスタンブロット分析によって陽性であった（図４Ｂ）。前述同様に、市販の抗体は、ＧＳＴ－ΔＭＵＣ１６ｃ１１４精製タンパク質またはＳＫＯＶ３－ｐｈｒＧＦＰ－ΔＭＵＣ１６ｃ１１４細胞系の細胞溶解産物と相互作用しなかった。
６個のモノクローナル抗体のＯＶＣＡＲ３ ＭＵＣ１６に対する結合を、親和性結合研究において調べた。多数のＭＵＣ１６結合部位を有する３つの抗体、９Ｃ７、５Ｃ２、および２８Ｆ７は、これらの抗体のＯＶＣＡＲ３細胞への非特異的結合と比較して、わずかなレベルの結合を示した。対照的に、４Ｈ１１、９Ｃ９、および４Ａ５モノクローナル抗体は、図５Ａに示されているように、高特異的な結合親和性を示し、ＯＶＣＡＲ３細胞の細胞表面エピトープに対して６．８～８．６ｎＭの結合親和性であった。本発明者らはまた、細胞表面ＭＵＣ１６タンパク質に結合した抗体の内部移行を調べた。本発明者らは、４Ｈ１１エピトープを含むＭＵＣ１６のカルボキシ末端、およびＯＣ１２５抗体と相互作用する単一の縮重タンデムリピート配列を有する形質移入ＳＫＯＶ３－ｐｈｒＧＦＰ－ΔＭＵＣ１６ｃ３３４における内部移行を調べた。市販の抗体ＯＣ１２５、Ｍ１１、およびＶＫ８は全て、この形質導入された細胞系の細胞表面に結合する。１３１Ｉ標識４Ｈ１１は、高レベルでの迅速な内部移行を示したが、１３１Ｉ標識ＯＣ１２５抗体ははるかに低い速度で内部移行した（図５Ｂ）。
実施例３
免疫組織化学検査の結果：
高特異的結合親和性を示したため、抗体９Ｃ９、４Ａ５、および４Ｈ１１を、ＯＶＣＡＲ３細胞系を用いる免疫組織化学検査での有用性について特徴づけた。３つのうち、４Ｈ１１抗体を、その他の２つの抗体と比較して、そのロバストで、高感度で、かつ特異的な染色パターンに基づいて、選択し、ヒト組織に用いるために最適化した。
免疫組織化学検査の結果：
高特異的結合親和性を示したため、抗体９Ｃ９、４Ａ５、および４Ｈ１１を、ＯＶＣＡＲ３細胞系を用いる免疫組織化学検査での有用性について特徴づけた。３つのうち、４Ｈ１１抗体を、その他の２つの抗体と比較して、そのロバストで、高感度で、かつ特異的な染色パターンに基づいて、選択し、ヒト組織に用いるために最適化した。
Ａ．卵巣
４０人の患者由来の原発腫瘍、転移腫瘍、および再発腫瘍を表す４１９個のコアで構成される２つの高病期、高悪性度の漿液性卵巣癌腫組織マイクロアレイスライドを、ＯＣ１２５および４Ｈ１１モノクローナル抗体の両方を用いて染色した（図２）。ＯＣ１２５組織マイクロアレイは、３～５染色を有する２７９個（６６％）のコア、１～２染色を有する９９個（２４％）のコア、および染色なしの４１個（１０％）のコアを示した。４Ｈ１１組織マイクロアレイは、３～５染色を有する２３６個（５６％）、１～２染色を有する９１個（２２％）、および染色なしの９２個（２２％）を示した。その２つの抗体は、２３３個（５６％）のコアにおいて一致、１６１個（３８％）において不定、および２５個（６％）において不一致であった。２５個の不一致のコアのうち、１２個（不一致の症例の４８％、全症例の３％）は、ＯＣ１２５より高い４Ｈ１１の陽性を示した。９個は、４ポイントの差だけ不一致であり、３個は５ポイントの差だけ不一致であった。不一致と不定のコアが合わせて、合計１８６個あり、そのうちの４８個（２６％）が、４Ｈ１１に関してＯＣ１２５より高い染色を示した。４Ｈ１１およびＯＣ１２５の両方の染色パターンは細胞質および膜であったが、ＯＣ１２５の膜パターンは、症例の大部分において、４Ｈ１１より強くかつより良く画定された。不一致の症例から、他の症例より４Ｈ１１のより高いレベルを実証された。
４０人の患者由来の原発腫瘍、転移腫瘍、および再発腫瘍を表す４１９個のコアで構成される２つの高病期、高悪性度の漿液性卵巣癌腫組織マイクロアレイスライドを、ＯＣ１２５および４Ｈ１１モノクローナル抗体の両方を用いて染色した（図２）。ＯＣ１２５組織マイクロアレイは、３～５染色を有する２７９個（６６％）のコア、１～２染色を有する９９個（２４％）のコア、および染色なしの４１個（１０％）のコアを示した。４Ｈ１１組織マイクロアレイは、３～５染色を有する２３６個（５６％）、１～２染色を有する９１個（２２％）、および染色なしの９２個（２２％）を示した。その２つの抗体は、２３３個（５６％）のコアにおいて一致、１６１個（３８％）において不定、および２５個（６％）において不一致であった。２５個の不一致のコアのうち、１２個（不一致の症例の４８％、全症例の３％）は、ＯＣ１２５より高い４Ｈ１１の陽性を示した。９個は、４ポイントの差だけ不一致であり、３個は５ポイントの差だけ不一致であった。不一致と不定のコアが合わせて、合計１８６個あり、そのうちの４８個（２６％）が、４Ｈ１１に関してＯＣ１２５より高い染色を示した。４Ｈ１１およびＯＣ１２５の両方の染色パターンは細胞質および膜であったが、ＯＣ１２５の膜パターンは、症例の大部分において、４Ｈ１１より強くかつより良く画定された。不一致の症例から、他の症例より４Ｈ１１のより高いレベルを実証された。
Ｂ．乳癌
４Ｈ１１の抗体の特異性を試験するために、４Ｈ１１染色について、様々な他の組織もまた調べた。乳房（患者の数は入手できなかった）の浸潤性腺管癌の５０個のコアのうち、２個（４％）のみが４以上の４Ｈ１１染色のスコアを示し、ＯＣ１２５染色について３～５のスコアを有するものはなかった。ＯＣ１２５に関する染色パターンはほとんど頂端／管腔であり、いくらかの顆粒状細胞質染色があった。細胞質内管腔を有するいくつかの腫瘍もまた、ＯＣ１２５染色に反応した。４Ｈ１１は、膜を染色強化することなしに、よりびまん性の細胞質濃染（ｂｌｕｓｈ）を示した。
４Ｈ１１の抗体の特異性を試験するために、４Ｈ１１染色について、様々な他の組織もまた調べた。乳房（患者の数は入手できなかった）の浸潤性腺管癌の５０個のコアのうち、２個（４％）のみが４以上の４Ｈ１１染色のスコアを示し、ＯＣ１２５染色について３～５のスコアを有するものはなかった。ＯＣ１２５に関する染色パターンはほとんど頂端／管腔であり、いくらかの顆粒状細胞質染色があった。細胞質内管腔を有するいくつかの腫瘍もまた、ＯＣ１２５染色に反応した。４Ｈ１１は、膜を染色強化することなしに、よりびまん性の細胞質濃染（ｂｌｕｓｈ）を示した。
対照的に、浸潤性小葉乳癌腫組織マイクロアレイ（生存腫瘍を有する１７９個のコアで構成される、患者の数は入手できなかった）は、４Ｈ１１に関する高頻度のＭＵＣ１６染色を生じた。この組織マイクロアレイにおいて、１６８個（９４％）のコアは、ＯＣ１２５についての染色を示さず、５個（３％）は１～２染色を示し、６個（３％）だけが３の染色強度を示した。４Ｈ１１染色は、分布パターンで異なり、４９個（２７％）が染色なし、８１個（４５％）が１～２染色を示し、４９個（２７％）が３～４染色を示した。ＯＣ１２５も４Ｈ１１も、５の染色強度をもつコアはなかった。染色パターンは、ＯＣ１２５および４Ｈ１１の両方について、細胞質、管腔／膜、管腔内の染色パターンであった。管腔内パターンは、両方の染色について強くかつ濃く、小葉癌腫において一般的に存在する細胞質内管腔を強調した。一致率は、３４％一致、４３％不定、および２３％不一致であった。不定と不一致の症例のうち、ＯＣ１２５が４Ｈ１１より高いものはなかった。全ての４２個の不一致の症例、および７７個の不定の症例のうちの７６個は、ＯＣ１２５より高い４Ｈ１１を有した。インサイチュの良性の乳管および小葉癌腫において４Ｈ１１について限局的な管腔染色もあった。
Ｃ．肺、膵臓、および前立腺の腺癌
他の器官由来の腫瘍はどちらの抗体とも反応性ではなかった。肺腺癌ＴＭＡは、生存腫瘍を含有する８６人の患者由来の２３７個のコアを有した。膵臓ＴＭＡにおいて、腺管内乳頭粘液性新生物（ＩＰＭＮ）および浸潤性腺管癌腫を含む膵臓粘液性腫瘍を含有する２１人の患者由来の９２個のコアがあった。前立腺癌ＴＭＡにおいて、１６９個のコアがあった（患者の数は入手できなかった）。これらの癌組織マイクロアレイのいずれも、ＯＣ１２５も４Ｈ１１のどちらに対しても有意な結合を生じなかった。この情報は表３に要約されている。
表３．組織マイクロアレイにおける４Ｈ１１と比較したＯＣ１２５の染色強度
他の器官由来の腫瘍はどちらの抗体とも反応性ではなかった。肺腺癌ＴＭＡは、生存腫瘍を含有する８６人の患者由来の２３７個のコアを有した。膵臓ＴＭＡにおいて、腺管内乳頭粘液性新生物（ＩＰＭＮ）および浸潤性腺管癌腫を含む膵臓粘液性腫瘍を含有する２１人の患者由来の９２個のコアがあった。前立腺癌ＴＭＡにおいて、１６９個のコアがあった（患者の数は入手できなかった）。これらの癌組織マイクロアレイのいずれも、ＯＣ１２５も４Ｈ１１のどちらに対しても有意な結合を生じなかった。この情報は表３に要約されている。
表３．組織マイクロアレイにおける４Ｈ１１と比較したＯＣ１２５の染色強度
Ｄ．正常組織
正常な成人の結腸、直腸、子宮頸外部（ｅｃｔｏｃｅｒｖｉｘ）、小腸、卵巣、肝臓、膵管、脾臓、腎臓、および皮膚においてＯＣ１２５または４Ｈ１１での染色はなかった。ＯＣ１２５および４Ｈ１１の両方が、子宮頸管内腺（ｅｎｄｏｃｅｒｖｉｃａｌ ｇｌａｎｄ）（ＯＣ１２５管腔、４Ｈ１１細胞質で弱い）、食道腺（管腔）、気管支上皮（ＯＣ１２５管腔、４Ｈ１１細胞質内顆粒）、および胸腺小体（細胞質）を染色した。４Ｈ１１は、胃腺の、特に陰窩において、細胞質内顆粒状パターンで、弱～中程度の染色を実証した。４Ｈ１１のみでの斑状細胞質内染色を示した他の器官は、前立腺、精巣の精細管、および膵臓の島細胞であった。膵島細胞における染色は特に強く、一貫していた。４Ｈ１１での肝臓、腎臓、および脳の非特異的染色もあった。ＯＣ１２５で染色され、かつ４Ｈ１１で染色されなかった症例はなかった。
同様に、胎児心臓、胆嚢、結腸、小腸、肝臓、直腸、副腎、甲状腺、脾臓、皮膚、骨、精巣上体、脳、肺、筋肉、平滑筋、腎臓、眼、臍帯、および胎盤においてＯＣ１２５も４Ｈ１１のどちらについても染色はなかった。ＯＣ１２５のみが、成体組織のものと類似したパターンで胸腺小体を染色した。４Ｈ１１は、胎児の膵内分泌細胞および子宮頸管内腺の両方を、それらの成人の対応物のものと類似したパターンで染色した。島細胞は、顆粒状細胞質パターンを示し、子宮頸管内腺は線状管腔パターンを示し、それは、成体組織におけるＯＣ１２５パターンにより類似していた。
実施例４
ＭＵＣ１６抗原に向けて遺伝的に標的化されたＴ細胞の養子移入後のＳＣＩＤ－Ｂｅｉｇｅマウスにおける確立した腹膜卵巣腫瘍の根絶の成功
目的：卵巣癌と診断されたほとんどの患者は、最終的には彼らの疾患で死亡する。このため、この悪性腫瘍の処置への新規なアプローチが必要とされている。腫瘍関連抗原へ標的化される、人工的Ｔ細胞受容体であるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする遺伝子の導入によりエキソビボで遺伝子改変された、患者自身のＴ細胞の養子移入は、卵巣癌の処置に適用可能な癌治療への新規かつ有望なアプローチである。
ＭＵＣ１６抗原に向けて遺伝的に標的化されたＴ細胞の養子移入後のＳＣＩＤ－Ｂｅｉｇｅマウスにおける確立した腹膜卵巣腫瘍の根絶の成功
目的：卵巣癌と診断されたほとんどの患者は、最終的には彼らの疾患で死亡する。このため、この悪性腫瘍の処置への新規なアプローチが必要とされている。腫瘍関連抗原へ標的化される、人工的Ｔ細胞受容体であるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする遺伝子の導入によりエキソビボで遺伝子改変された、患者自身のＴ細胞の養子移入は、卵巣癌の処置に適用可能な癌治療への新規かつ有望なアプローチである。
実験設計：本発明者らは、大多数の卵巣癌腫で高度に発現する抗原である、ＭＵＣ－ＣＤと名付けられたＭＵＣ１６の保持される細胞外ドメインへ標的化されるいくつかのＣＡＲを作製している。本発明者らは、標的ＭＵＣ－ＣＤ抗原を発現するように遺伝子改変されたＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞から作製された人工の抗原提示細胞（ＡＡＰＣ）上での共培養アッセイにより、ならびにヒトＯＶ－ＣＡＲ３（ＭＵＣ－ＣＤ）卵巣腫瘍細胞系および原発性の患者の腫瘍細胞を利用する細胞傷害性アッセイにより、これらのＣＡＲを発現するようにレトロウイルスにより形質導入されたヒトＴ細胞のインビトロの生物学的特徴を調べる。最後に、本発明者らは、ＳＣＩＤ－Ｂｅｉｇｅの同所性の異種ＯＶ－ＣＡＲ３（ＭＵＣ－ＣＤ）マウス腫瘍モデルにおいてＭＵＣ－ＣＤ標的化Ｔ細胞のインビボの抗腫瘍効力を評価する。
この研究に用いられる例示的な配列は図１７～１９にある。
結果：健常ドナーおよび卵巣癌患者の両方由来のＣＡＲ改変ＭＵＣ－ＣＤ標的化Ｔ細胞は、ヒト卵巣細胞系ならびに原発卵巣癌腫細胞の両方に対して、効率的なインビトロの細胞溶解活性を示した。ＭＵＣ－ＣＤ標的化Ｔ細胞は、３Ｔ３（ＭＵＣ－ＣＤ／Ｂ７．１）ＡＡＰＣ上での複数回サイクルの共培養によってエキソビボでさらに増殖させてもよい。腹腔内ヒトＯＶ－ＣＡＲ３（ＭＵＣ－ＣＤ）腫瘍を担持するＳＣＩＤ－Ｂｅｉｇｅマウスへ注入された増殖したＭＵＣ－ＣＤ標的化Ｔ細胞は、進行性疾患の状況においてさえも進行を遅らせるか、または腫瘍を完全に根絶するかのいずれかであった。
結論：これらの有望な前臨床試験は、高リスクＭＵＣ－１６＋卵巣癌腫をもつ患者を処置する臨床実践場面における潜在的な治療的アプローチとして、ＭＵＣ－ＣＤ標的化Ｔ細胞のさらなる研究を正当化している。
序論
卵巣癌は、世界中で６番目に最も頻度の高い癌であり、女性における癌関連死亡原因の第７位である（１、２）。手術および化学療法による複数様式（ｍｕｌｔｉｍｏｄａｌｉｔｙ）治療にも関わらず、卵巣癌腫を有するたいていの患者は、予後が良くない。このため、この疾患を処置するための代わりとなるアプローチが緊急に必要とされている。
卵巣癌は、世界中で６番目に最も頻度の高い癌であり、女性における癌関連死亡原因の第７位である（１、２）。手術および化学療法による複数様式（ｍｕｌｔｉｍｏｄａｌｉｔｙ）治療にも関わらず、卵巣癌腫を有するたいていの患者は、予後が良くない。このため、この疾患を処置するための代わりとなるアプローチが緊急に必要とされている。
腫瘍細胞の表面に発現した抗原にエキソビボで遺伝子的に標的化された患者自身のＴ細胞の注入は、癌の養子免疫治療への有望な新規のアプローチであり、臨床実践場面において唯一、最近、真剣に探求されているものである。Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と名付けられた人工的Ｔ細胞受容体をコードする遺伝子のレトロウイルスによる導入により、腫瘍関連抗原を標的にするように遺伝子改変されてもよい。細胞傷害性を腫瘍細胞へ向ける人工的Ｔ細胞受容体を発現するためのＴ細胞の遺伝子改変は、癌細胞の免疫認識および排除を増強する手段を提示する。ＣＡＲは、最も一般的には、ＴＣＲζ鎖細胞質シグナル伝達ドメインに融合した、膜貫通ドメイン（典型的には、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＯＸ－４０、および４－１ＢＢ）に融合した、所定の腫瘍関連抗原を標的にするマウスモノクローナル抗体に由来する一本鎖断片長抗体（ｓｃＦｖ）で構成される（３～１３）。Ｔ細胞特異性を再プログラムするために用いられる場合、これらの融合受容体は、天然の抗原の認識を可能にする。Ｔ細胞によって発現した場合、生じた構築物は、標的にされた抗原との会合で、Ｔ細胞活性化、増殖、および標的細胞の溶解を誘導する。これらの融合受容体は、一次Ｔ細胞において機能的な抗原依存性共刺激シグナルを伝達し、刺激シグナル伝達のために内因性ＴＣＲおよびキメラ受容体の両方が会合した場合、持続性Ｔ細胞増殖を可能にする。今まで、ＣＡＲ改変Ｔ細胞を利用する前臨床試験が、幅広い種類の悪性腫瘍において有望な結果を実証している（３、４、１１、１４～１８）。最近になって、このアプローチは、第一相試験の形で臨床的に調査されている（６、１９～２１）。これらの遺伝的アプローチは、癌細胞の免疫認識および排除を増強する手段を提供する。
卵巣癌腫は、患者の長期予後が腫瘍に対する内因性免疫応答の程度および質によって著しく影響を及ぼされるという事実に基づいて、内因性免疫応答を誘導する能力がある比較的、免疫原性腫瘍であるようにみえる。具体的には、卵巣癌腫瘍微小環境内の内因性エフェクターＴ細胞の存在が、患者生存の長期化に直接的に相関することが実証づけられている（２２～２５）。対照的に、腫瘍内の免疫抑制性ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉ制御Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の数の増加は、それが次におそらく浸潤性エフェクターＴ細胞の抗腫瘍活性を無効にし、より短い患者生存と相関する（２６～２９）。実際、癌に対する内因性免疫応答が患者にとって有益であるのか有害であるのかを最終的に示すのは、腫瘍微小環境内のＴｒｅｇ対エフェクターＴ細胞の比率であることが明らかである（２４、２８）。この状況において、後で患者へ注入して戻される、腫瘍標的化エフェクターＴ細胞の集団をエクビボで生成し、次に増殖させる能力は、次には、Ｔｒｅｇ対エフェクターＴ細胞比を、疾患を根絶するのにより有利なものへと傾け得る。
ムチンは、細胞恒常性および上皮表面の保護にとって重要な生体分子である。卵巣癌におけるムチンの発現の変化は、診断、予後、および処置に活用される可能性がある（１）。ＭＵＣ１６は、たいていの卵巣癌腫に過剰発現する、そのようなムチンの１つであり、卵巣癌の検出および進行についての確立された代用血清マーカー（ＣＡ－１２５）である（３０～３３）。ＭＵＣ１６は、複数の反復配列からなる、ＣＡ－１２５と名付けられた、大きな切断され、遊離されるドメイン、ならびに残留する非反復の細胞外断片、膜貫通ドメイン、および細胞質側尾部を含む保持されるドメイン（ＭＵＣ－ＣＤ）で構成される高グリコシル化ムチンである（３４）。その抗原は、別の方法で、子宮、子宮内膜、ファロピウス管、卵巣、ならびに腹腔および胸腔の漿膜において低レベルで発現するのみであるため、ＭＵＣ１６は、免疫に基づいた治療にとって潜在的に魅力的な標的である。
しかしながら、ＭＵＣ１６の細胞外ドメインの大部分が切断され、分泌されるという事実によって、卵巣癌腫における標的抗原としてのＭＵＣ１６の有用性は限定される。実際、今まで、ＭＵＣ１６に対する全ての報告されたモノクローナル抗体は、その糖タンパク質の大きな分泌されたＣＡ－１２５画分に存在するエピトープに結合し、その抗原の保持される細胞外画分（ＭＵＣ－ＣＤ）に結合することが知られているものはない（３５～３７）。その抗原のＭＵＣ－ＣＤ画分は、細胞表面に保持され、ＭＵＣ１６のこの部分に特異的なＴ細胞を発生させることは、養子細胞免疫治療のための標的としてのＭＵＣ１６の限界を大いに克服し得る。この目的を達成するために、本発明者らは、保持されるＭＵＣ－ＣＤ細胞外ドメインに特異的な一連のマウスモノクローナル抗体を以前に生成している（３８）。そのようなモノクローナル抗体の１つである４Ｈ１１を発現するハイブリドーマを利用して、本発明者らは、ＭＵＣ－ＣＤ抗原に特異的ないくつかのＣＡＲを構築することに成功している。この発明は、少なくともζ鎖、シグナル伝達領域、および選択された標的と特異的に相互作用する結合エレメントで構成されるキメラＴ細胞受容体をコードする核酸、ならびに、ζ鎖部分、シグナル伝達領域、および結合エレメントを含むキメラＴ細胞受容体を提供する。
この報告書において、本発明者らは、これらのＭＵＣ－ＣＤ標的化ＣＡＲをヒトＴ細胞へ高効率的にレトロウイルスにより形質導入し、生じたＴ細胞が、インビトロでＭＵＣ－ＣＤ＋腫瘍細胞を特異的に標的にして溶解し得ることを実証している。さらに、本発明者らは、ＭＵＣ－ＣＤおよび共刺激リガンドＢ７．１（ＣＤ８０）を発現するように遺伝子改変されたＮＩＨ（３Ｔ３）線維芽細胞上での反復した共培養によって、インビトロでの効率的なＭＵＣ－ＣＤ標的化Ｔ細胞増殖を実証している。改変Ｔ細胞の増殖の成功により、本発明者らが次に、確立した腹腔内ＭＵＣ－ＣＤ＋ヒト卵巣腫瘍を担持する免疫無防備状態のＳＣＩＤ－Ｂｅｉｇｅマウスにおけるインビボ研究を行うのに十分なＴ細胞数を生成することが可能になった。意義深いことには、これらの研究において、本発明者らは、処置されていないマウスかまたは無関係の抗原に向けて標的化されたＣＡＲを担持するＴ細胞で処置されたマウスのいずれかと比較した場合、直接的な腹腔内注射後ならびに静脈内注射後のどちらも、ＭＵＣ－ＣＤ標的化Ｔ細胞の著しい抗腫瘍効力を実証している。加えて、本発明者らは、癌患者由来の一次腹水由来卵巣癌腫細胞を標的にする４Ｈ１１－２８ｚ＋患者のＴ細胞および健常ドナーのＴ細胞の有意な細胞傷害性を実証している。
本発明者らの知る限りでは、これは、ＭＵＣ１６抗原へ遺伝的に標的化されたＴ細胞が、インビトロまたはインビボのどちらでもＭＵＣ１６＋腫瘍に対して著しい抗腫瘍効力を実証するという最初の報告である。これらのデータは、高リスク卵巣癌腫を有する患者においてこのアプローチを利用する将来の臨床試験を提案するための原理的説明の役割を果たす。
材料および方法
細胞系およびＴ細胞
ＯＶ－ＣＡＲ３腫瘍細胞系を、１０％熱不活化ＦＢＳ、非必須アミノ酸、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ピルビン酸塩、およびＢＭＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したＲＰＭＩ １６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）中で培養した。ＰＧ１３およびｇｐｇ２９レトロウイルスの産生細胞系を、１０％ＦＣＳを補充したＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養し、以前に記載された（３）ＮＩＨ－３Ｔ３人工の抗原提示細胞（ＡＡＰＣ）を、１０％熱不活化ドナー仔ウシ血清を補充したＤＭＥＭ中で培養した。Ｔ細胞を、ＢＤ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ ＣＰＴチューブ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）中に、製造業者の指示に従って、ＩＲＢ承認プロトコール＃９５－０５４の下、健常ドナーの末梢血から採取した。全ての培地に、２ｍｍｏｌ／ＬのＬ－グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１００ユニット／ｍＬのペニシリン、および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充した。Ｔ細胞を、２０ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２（Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｅａｓｔ Ｈａｎｏｖｅｒ、ＮＪ）を補充した上記のようなＲＰＭＩ １６４０で培養し、示される場合、培地に、１０ｎｇ／ｍＬのインターロイキン１５（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を補充した。
細胞系およびＴ細胞
ＯＶ－ＣＡＲ３腫瘍細胞系を、１０％熱不活化ＦＢＳ、非必須アミノ酸、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ピルビン酸塩、およびＢＭＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したＲＰＭＩ １６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）中で培養した。ＰＧ１３およびｇｐｇ２９レトロウイルスの産生細胞系を、１０％ＦＣＳを補充したＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養し、以前に記載された（３）ＮＩＨ－３Ｔ３人工の抗原提示細胞（ＡＡＰＣ）を、１０％熱不活化ドナー仔ウシ血清を補充したＤＭＥＭ中で培養した。Ｔ細胞を、ＢＤ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ ＣＰＴチューブ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）中に、製造業者の指示に従って、ＩＲＢ承認プロトコール＃９５－０５４の下、健常ドナーの末梢血から採取した。全ての培地に、２ｍｍｏｌ／ＬのＬ－グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１００ユニット／ｍＬのペニシリン、および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充した。Ｔ細胞を、２０ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２（Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｅａｓｔ Ｈａｎｏｖｅｒ、ＮＪ）を補充した上記のようなＲＰＭＩ １６４０で培養し、示される場合、培地に、１０ｎｇ／ｍＬのインターロイキン１５（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を補充した。
患者腹水由来癌細胞の単離
原発性ヒト腹水由来癌細胞を、ＩＲＢ承認プロトコール＃９７－１３４の下、新たに診断された進行性漿液性卵巣癌腫の手術を受けた卵巣癌患者から入手した。腫瘍細胞を、患者の腹水から、室温で１０分間の６００ｇでの遠心分離によって単離した。細胞を、１×ＰＢＳで１回、洗浄し、将来の分析のために、１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ １６４０培地中で培養した。
原発性ヒト腹水由来癌細胞を、ＩＲＢ承認プロトコール＃９７－１３４の下、新たに診断された進行性漿液性卵巣癌腫の手術を受けた卵巣癌患者から入手した。腫瘍細胞を、患者の腹水から、室温で１０分間の６００ｇでの遠心分離によって単離した。細胞を、１×ＰＢＳで１回、洗浄し、将来の分析のために、１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ １６４０培地中で培養した。
ＭＵＣ－ＣＤ標的化４Ｈ１１ｚおよび４Ｈ１１－２８ｚ ＣＡＲの作製
４Ｈ１１モノクローナル抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、ハイブリドーマ細胞系４Ｈ１１に由来した。４Ｈ１１ ＲＮＡから作製したｃＤＮＡを利用して、本発明者らは、他のところで記載されているように、改変型プライマーを利用するＲＡＣＥ ＰＣＲによってＶＨコード領域を単離した（３９、４０）。ＶＬ鎖可変領域を、Ｏｒｌａｎｄｉらによって記載されているように改変型プライマーを利用する標準ＰＣＲによってクローニングした（４１、４２）。生じたＶＨおよびＶＬ断片を、ＴｏｐｏＴＡ ＰＣＲ ２．１クローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へサブクローニングし、配列決定した。その後、ＶＨおよびＶＬ断片を（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３スペーサードメインにライゲーションし、４Ｈ１１ ｓｃＦｖを作製し、それをオーバーラップＰＣＲによってヒトＣＤ８リーダーペプチド（ＣＤ８Ｌ）に融合した（９、４１）。ＭＵＣ－ＣＤ標的化４Ｈ１１
ＣＡＲを構築するために、ＣＤ８Ｌ－４Ｈ１１ ｓｃＦｖのコード領域を、Ｔ細胞受容体ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインに融合した、ヒトＣＤ８ヒンジドメインおよび膜貫通ドメインに融合し（４Ｈ１１ｚ ＣＡＲが生成）、または代替としてＣＤ２８膜貫通ドメインおよび細胞質シグナル伝達ドメインに融合した（４Ｈ１１－２８ｚ ＣＡＲが生成）（３、９、４３）。その後、生じたＣＡＲ構築物を、改変型ＭＭＬＶレトロウイルスベクターＳＦＧへサブクローニングした（４４）。形質導入されたｇｐｇ２９線維芽細胞由来のＶＳＶ－Ｇ偽型（ｐｒｅｕｄｏｔｙｐｅｄ）レトロウイルス上清を用いて、安定なＰＧ１３テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬ Ｖ）エンベロープ偽型レトロウイルス産生細胞系を構築した（４１）。
４Ｈ１１モノクローナル抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、ハイブリドーマ細胞系４Ｈ１１に由来した。４Ｈ１１ ＲＮＡから作製したｃＤＮＡを利用して、本発明者らは、他のところで記載されているように、改変型プライマーを利用するＲＡＣＥ ＰＣＲによってＶＨコード領域を単離した（３９、４０）。ＶＬ鎖可変領域を、Ｏｒｌａｎｄｉらによって記載されているように改変型プライマーを利用する標準ＰＣＲによってクローニングした（４１、４２）。生じたＶＨおよびＶＬ断片を、ＴｏｐｏＴＡ ＰＣＲ ２．１クローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へサブクローニングし、配列決定した。その後、ＶＨおよびＶＬ断片を（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３スペーサードメインにライゲーションし、４Ｈ１１ ｓｃＦｖを作製し、それをオーバーラップＰＣＲによってヒトＣＤ８リーダーペプチド（ＣＤ８Ｌ）に融合した（９、４１）。ＭＵＣ－ＣＤ標的化４Ｈ１１
ＣＡＲを構築するために、ＣＤ８Ｌ－４Ｈ１１ ｓｃＦｖのコード領域を、Ｔ細胞受容体ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインに融合した、ヒトＣＤ８ヒンジドメインおよび膜貫通ドメインに融合し（４Ｈ１１ｚ ＣＡＲが生成）、または代替としてＣＤ２８膜貫通ドメインおよび細胞質シグナル伝達ドメインに融合した（４Ｈ１１－２８ｚ ＣＡＲが生成）（３、９、４３）。その後、生じたＣＡＲ構築物を、改変型ＭＭＬＶレトロウイルスベクターＳＦＧへサブクローニングした（４４）。形質導入されたｇｐｇ２９線維芽細胞由来のＶＳＶ－Ｇ偽型（ｐｒｅｕｄｏｔｙｐｅｄ）レトロウイルス上清を用いて、安定なＰＧ１３テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬ Ｖ）エンベロープ偽型レトロウイルス産生細胞系を構築した（４１）。
レトロウイルス遺伝子移入
単離された健常ドナー末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に対し、レロネクチン（ｒｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ）をコーティングした非組織培養プレート上で、２μｇ／ｍｌの植物性血球凝集素（ＰＨＡ）（Ｓｉｇｍａ．Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で活性化し、レトロウイルスで形質導入した（４５）。簡単に述べれば、６ウェル非組織培養プレート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）をＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（ＲＮ）（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、Ｏｔｓｕ、Ｊａｐａｎ）で、製造業者の指示に従って、コーティングした。ＰＨＡ活性化から４８時間後、１ｍｌの補充されたＲＰＭＩ培地中１×１０６個のＴ細胞のアリコートを、１ｍｌのＳＦＧレトロウイルス上清と共に、ＲＮをコーティングしたプレートの各ウェルに入れた。Ｔ細胞を、毎日新鮮なレトロウイルス上清を加えながら、３日間連続して、毎日、３０℃で１時間、２０００ｇで遠心分離した（４５）。７日目に遺伝子移入をＦＡＣＳによって評価した。
単離された健常ドナー末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に対し、レロネクチン（ｒｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ）をコーティングした非組織培養プレート上で、２μｇ／ｍｌの植物性血球凝集素（ＰＨＡ）（Ｓｉｇｍａ．Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で活性化し、レトロウイルスで形質導入した（４５）。簡単に述べれば、６ウェル非組織培養プレート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）をＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（ＲＮ）（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、Ｏｔｓｕ、Ｊａｐａｎ）で、製造業者の指示に従って、コーティングした。ＰＨＡ活性化から４８時間後、１ｍｌの補充されたＲＰＭＩ培地中１×１０６個のＴ細胞のアリコートを、１ｍｌのＳＦＧレトロウイルス上清と共に、ＲＮをコーティングしたプレートの各ウェルに入れた。Ｔ細胞を、毎日新鮮なレトロウイルス上清を加えながら、３日間連続して、毎日、３０℃で１時間、２０００ｇで遠心分離した（４５）。７日目に遺伝子移入をＦＡＣＳによって評価した。
関連のＮＩＨ－３Ｔ３マウス線維芽細胞の人工の抗原提示細胞を作製するために、ＭＵＣ－１６抗原の保持される細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインをコードするＭＵＣ－ＣＤ構築物を、最初にＳＦＧレトロウイルスベクターへサブクローニングした（ＳＦＧ（ＭＵＣ－ＣＤ））。ＳＦＧ（ＭＵＣ－ＣＤ）の野生型ＮＩＨ－３Ｔ３線維芽細胞へのレトロウイルスによる形質導入を行なうことによって、３Ｔ３（ＭＵＣ－ＣＤ）ＡＡＰＣを作製し、一方、以前に確立した３Ｔ３（Ｂ７．１）線維芽細胞をレトロウイルスによる形質導入を行なうことによって、３Ｔ３（ＭＵＣ－ＣＤ／Ｂ７．１）ＡＡＰＣを作製した（４１、４６）。高度に富化された細胞系をＦＡＣＳによって単離した。
ＯＶ－ＣＡＲ３（ＭＵＣ－ＣＤ）細胞系およびＯＶ－ＣＡＲ３（ＭＵＣ－ＣＤ／ＧＦＰ－ＦＦＬｕｃ）細胞系を作製するために、本発明者らは、ＷＴ ＯＶ－ＣＡＲ３ヒト卵巣癌細胞系に、以前に記載されているような（４７）ＳＦＧ（ＧＦＰ－ＦＦＬｕｃ）および／または他のところで記載されているような（４４）ｇｐｇ２９線維芽細胞由来のＳＦＧ（ＭＵＣ－ＣＤ）ＶＳＶ－Ｇ偽型レトロウイルスの上清を用いて、レトロウイルスによる形質導入を行なった。生じた腫瘍細胞を、ＯＶＣＡＲ３（ＭＵＣ－ＣＤ）細胞系についてはＭＵＣ－ＣＤ発現のみか、またはＯＶＣＡＲ３（ＭＵＣ－ＣＤ／ＧＦＰ－ＦＦＬｕｃ）細胞系についてはＭＵＣ－ＣＤとＧＦＰの二重発現のいずれかをＦＡＣＳによって分別した。ＦＡＣＳによるＭＵＣ－ＣＤ発現を、４Ｈ１１モノクローナル抗体を用いて評価した。
ＣＡＲ＋ヒトＴ細胞のインビトロ分析
刺激による増殖およびサイトカイン放出をインビトロで評価するために、形質導入されたＴ細胞を、６ウェル組織培養プレート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）において、サイトカインを補充せずに１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ培地中、コンフルエントなＮＩＨ ３Ｔ３ ＡＡＰＣ上でレトロウイルスによる形質導入を行なった後７日間、共培養した。インビボ研究のための十分な数のＣＡＲ改変Ｔ細胞を生成するために、形質導入されたＴ細胞を、以前に記載されているように、２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２および１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５を補充したＲＰＭＩ培地中、Ｂ７．１＋ＡＡＰＣ（３Ｔ３（ＭＵＣ－ＣＤ／Ｂ７．１））上で共培養した（３、４３）。患者Ｔ細胞を、ヒトＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（ＤＹＮＡＬ（登録商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて、製造業者の指示に従い、活性化し、かつ増殖させた。
刺激による増殖およびサイトカイン放出をインビトロで評価するために、形質導入されたＴ細胞を、６ウェル組織培養プレート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）において、サイトカインを補充せずに１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ培地中、コンフルエントなＮＩＨ ３Ｔ３ ＡＡＰＣ上でレトロウイルスによる形質導入を行なった後７日間、共培養した。インビボ研究のための十分な数のＣＡＲ改変Ｔ細胞を生成するために、形質導入されたＴ細胞を、以前に記載されているように、２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２および１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５を補充したＲＰＭＩ培地中、Ｂ７．１＋ＡＡＰＣ（３Ｔ３（ＭＵＣ－ＣＤ／Ｂ７．１））上で共培養した（３、４３）。患者Ｔ細胞を、ヒトＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（ＤＹＮＡＬ（登録商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて、製造業者の指示に従い、活性化し、かつ増殖させた。
ＣＡＲ発現のウェスタンブロット分析
０．１ｍｏｌ／ＬのＤＴＴ（Ｓｉｇｍａ）による還元条件下でのＴ細胞溶解産物のウェスタンブロット分析を、以前に記載されているように行った（４６）。簡単に述べれば、形質導入されたＴ細胞を、ＰＢＳ中で洗浄し、ミニコンプリートプロテアーゼインヒビターを用いて、製造業者の指示に従い（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）、放射免疫沈降アッセイ（ＲＩＰＡ）緩衝液（Ｂｏｓｔｏｎ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、ＭＡ）中に再懸濁した。生じたタンパク質を、６×還元ローディング緩衝液（Ｂｏｓｔｏｎ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、ＭＡ）の添加および１００℃で１０分間の加熱後、１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥミニゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）で分離した。その後、分離されたタンパク質を、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ膜に転写し、抗ヒトＣＤ３ζ鎖モノクローナル抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて探索した。抗体結合を、ヤギ抗マウス西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体化抗体でそのブロットを探索し、続いて、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｌｉｇｈｔｉｎｇ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｌｕｓ（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）を用いて製造業者の指示に従って、発光を検出した。
０．１ｍｏｌ／ＬのＤＴＴ（Ｓｉｇｍａ）による還元条件下でのＴ細胞溶解産物のウェスタンブロット分析を、以前に記載されているように行った（４６）。簡単に述べれば、形質導入されたＴ細胞を、ＰＢＳ中で洗浄し、ミニコンプリートプロテアーゼインヒビターを用いて、製造業者の指示に従い（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）、放射免疫沈降アッセイ（ＲＩＰＡ）緩衝液（Ｂｏｓｔｏｎ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、ＭＡ）中に再懸濁した。生じたタンパク質を、６×還元ローディング緩衝液（Ｂｏｓｔｏｎ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、ＭＡ）の添加および１００℃で１０分間の加熱後、１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥミニゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）で分離した。その後、分離されたタンパク質を、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ膜に転写し、抗ヒトＣＤ３ζ鎖モノクローナル抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて探索した。抗体結合を、ヤギ抗マウス西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体化抗体でそのブロットを探索し、続いて、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｌｉｇｈｔｉｎｇ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｌｕｓ（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）を用いて製造業者の指示に従って、発光を検出した。
細胞傷害性アッセイ
インビトロでの改変Ｔ細胞の細胞傷害性を、ＤＥＬＦＩＡ（登録商標）ＥｕＴＤＡアッセイ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＬＡＳ，Ｉｎｃ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）を用い、製造業者の推奨に従って評価した。細胞傷害性を、示された比でのエフェクターＴ細胞対標的ＯＶ－ＣＡＲ３（ＭＵＣ－ＣＤ）細胞または原発腫瘍細胞（Ｅ：Ｔ）において２時間で評価した。これらのアッセイにおけるエフェクターＴ細胞はＣＤ８＋ＣＡＲ＋Ｔ細胞の数を表す。
インビトロでの改変Ｔ細胞の細胞傷害性を、ＤＥＬＦＩＡ（登録商標）ＥｕＴＤＡアッセイ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＬＡＳ，Ｉｎｃ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）を用い、製造業者の推奨に従って評価した。細胞傷害性を、示された比でのエフェクターＴ細胞対標的ＯＶ－ＣＡＲ３（ＭＵＣ－ＣＤ）細胞または原発腫瘍細胞（Ｅ：Ｔ）において２時間で評価した。これらのアッセイにおけるエフェクターＴ細胞はＣＤ８＋ＣＡＲ＋Ｔ細胞の数を表す。
サイトカイン検出アッセイ
サイトカインアッセイを、Ｌｕｍｉｎｅｘ ＩＳ １００システムを利用するＩＬ－２およびＩＦＮγを検出するためのマルチプレックスＨｕｍａｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎアッセイ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を用いて製造業者の仕様書に従って、実施した。サイトカイン濃度を、ＩＳ ２．３ソフトウェア（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐ．、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を用いて評価した。
サイトカインアッセイを、Ｌｕｍｉｎｅｘ ＩＳ １００システムを利用するＩＬ－２およびＩＦＮγを検出するためのマルチプレックスＨｕｍａｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎアッセイ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を用いて製造業者の仕様書に従って、実施した。サイトカイン濃度を、ＩＳ ２．３ソフトウェア（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐ．、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を用いて評価した。
インビボのＳＣＩＤ－Ｂｅｉｇｅマウス腫瘍モデル
全てのインビボ研究において、８～１２週齢のＦＯＸ ＣＨＡＳＥ Ｃ．Ｂ．－１７（ＳＣＩＤ－Ｂｅｉｇｅマウス）（Ｔａｃｏｎｉｃ、Ｈｕｄｓｏｎ、ＮＹ）に最初、３×１０６個のＯＶ－ＣＡＲ３（ＭＵＣ－ＣＤ）腫瘍細胞か、または生物発光画像化（ＢＬＩ）研究のために、３×１０６個のＯＶ－ＣＡＲ３（ＭＵＣ－ＣＤ／ＧＦＰ－ＦＦＬｕｃ）腫瘍細胞のいずれかを腹腔内に注射した。その後、３×１０７個のＣＡＲ＋Ｔ細胞を、示されている通り、腫瘍注射後１日目または７日目に、腹腔内または静脈内に注射した。腹囲の増加、立毛、および刺激に対する応答の低下によって評価される苦痛（ｄｉｓｔｒｅｓｓ）についてマウスをモニターした。苦しんでいるマウスを安楽死させた。全てのマウス研究を、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ承認プロトコール（＃００－０５－０６５）の関係において行った。
全てのインビボ研究において、８～１２週齢のＦＯＸ ＣＨＡＳＥ Ｃ．Ｂ．－１７（ＳＣＩＤ－Ｂｅｉｇｅマウス）（Ｔａｃｏｎｉｃ、Ｈｕｄｓｏｎ、ＮＹ）に最初、３×１０６個のＯＶ－ＣＡＲ３（ＭＵＣ－ＣＤ）腫瘍細胞か、または生物発光画像化（ＢＬＩ）研究のために、３×１０６個のＯＶ－ＣＡＲ３（ＭＵＣ－ＣＤ／ＧＦＰ－ＦＦＬｕｃ）腫瘍細胞のいずれかを腹腔内に注射した。その後、３×１０７個のＣＡＲ＋Ｔ細胞を、示されている通り、腫瘍注射後１日目または７日目に、腹腔内または静脈内に注射した。腹囲の増加、立毛、および刺激に対する応答の低下によって評価される苦痛（ｄｉｓｔｒｅｓｓ）についてマウスをモニターした。苦しんでいるマウスを安楽死させた。全てのマウス研究を、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ承認プロトコール（＃００－０５－０６５）の関係において行った。
ＳＣＩＤ－ＢｅｉｇｅマウスにおけるＯＶＣＡＲ３（ＭＵＣ－ＣＤ／ＧＦＰ－ＦＦＬｕｃ）腫瘍細胞の生物発光画像化（ＢＬＩ）
ＢＬＩを、Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅソフトウェアを備えたＸｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ画像化システム（Ｘｅｎｏｇｅｎ；Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ）を用いて実施した。簡単に述べれば、ＯＶＣＡＲ３（ＭＵＣ－ＣＤ／ＧＦＰ－ＦＦＬｕｃ）腫瘍を担持するマウスに、２００μｌのＰＢＳ中に懸濁されたＤ－ルシフェリン（１５０ｍｇ／ｋｇ；Ｘｅｎｏｇｅｎ）を腹腔内に注射し、１０分後、２％イソフルラン麻酔下で画像化した。画像収集を、２５ｃｍの視野において中間ビニングレベルで０．５分の露光時間で行った（３、４３）。
ＢＬＩを、Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅソフトウェアを備えたＸｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ画像化システム（Ｘｅｎｏｇｅｎ；Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ）を用いて実施した。簡単に述べれば、ＯＶＣＡＲ３（ＭＵＣ－ＣＤ／ＧＦＰ－ＦＦＬｕｃ）腫瘍を担持するマウスに、２００μｌのＰＢＳ中に懸濁されたＤ－ルシフェリン（１５０ｍｇ／ｋｇ；Ｘｅｎｏｇｅｎ）を腹腔内に注射し、１０分後、２％イソフルラン麻酔下で画像化した。画像収集を、２５ｃｍの視野において中間ビニングレベルで０．５分の露光時間で行った（３、４３）。
フローサイトメトリー
Ｔ細胞および腫瘍細胞の全てのフローサイトメトリー分析を、Ｃｅｌｌｑｕｅｓｔソフトウェアを備えたＦＡＣＳｃａｎサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて実施した。Ｔ細胞を、ＣＡＲ特異的ポリクローナルヤギＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）、フィコエリトリン標識抗ヒトＣＤ４、ＣＤ８、Ｂ７．１（Ｃａｌｔａｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）、Ｂ７．２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｍａｒｉｌｌｏ、ＣＡ）、４－１ＢＢＬ、およびＯＸ４０抗体（Ａｎｃｅｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂａｙｐｏｒｔ、ＭＮ）を用いて分析した。３Ｔ３（ＭＵＣ－ＣＤ）細胞およびＯＶ－ＣＡＲ３（ＭＵＣ－ＣＤ）細胞を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７標識４Ｈ１１抗体（ＭＳＫＣＣモノクローナル抗体コア施設において作製および標識された）で染色した。
Ｔ細胞および腫瘍細胞の全てのフローサイトメトリー分析を、Ｃｅｌｌｑｕｅｓｔソフトウェアを備えたＦＡＣＳｃａｎサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて実施した。Ｔ細胞を、ＣＡＲ特異的ポリクローナルヤギＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）、フィコエリトリン標識抗ヒトＣＤ４、ＣＤ８、Ｂ７．１（Ｃａｌｔａｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）、Ｂ７．２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｍａｒｉｌｌｏ、ＣＡ）、４－１ＢＢＬ、およびＯＸ４０抗体（Ａｎｃｅｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂａｙｐｏｒｔ、ＭＮ）を用いて分析した。３Ｔ３（ＭＵＣ－ＣＤ）細胞およびＯＶ－ＣＡＲ３（ＭＵＣ－ＣＤ）細胞を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７標識４Ｈ１１抗体（ＭＳＫＣＣモノクローナル抗体コア施設において作製および標識された）で染色した。
ＣＡＲ＋Ｔ細胞のＣＦＳＥ標識
ＣＡＲ＋Ｔ細胞を、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）ＣＦＳＥ細胞増殖キットを用いて製造業者の推奨（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）に従って、ＣＦＳＥで染色した。ＣＦＳＥ標識Ｔ細胞の増殖を、ＦＡＣＳによって分析した。ＣＦＳＥ標識Ｔ細胞のインビボでの検出のために、卵巣腫瘍を４０μｍの細胞ストレーナー（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）を介して解離させ、抗体染色およびＦＡＣＳ分析の前に２％ＦＢＳ／ＰＢＳで２回、洗浄した。
ＣＡＲ＋Ｔ細胞を、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）ＣＦＳＥ細胞増殖キットを用いて製造業者の推奨（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）に従って、ＣＦＳＥで染色した。ＣＦＳＥ標識Ｔ細胞の増殖を、ＦＡＣＳによって分析した。ＣＦＳＥ標識Ｔ細胞のインビボでの検出のために、卵巣腫瘍を４０μｍの細胞ストレーナー（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）を介して解離させ、抗体染色およびＦＡＣＳ分析の前に２％ＦＢＳ／ＰＢＳで２回、洗浄した。
統計
生存データを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いる対数順位解析によって評価した。サイトカインデータを、スチューデント片側ｔ検定によって解析した。
生存データを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いる対数順位解析によって評価した。サイトカインデータを、スチューデント片側ｔ検定によって解析した。
結果
本発明者らは、ＭＵＣ－ＣＤ抗原に特異的なモノクローナル抗体を産生する４Ｈ１１ハイブリドーマを用いてＭＵＣ－ＣＤ抗原に対して標的とする第１世代（４Ｈ１１ｚ）および第２世代（４Ｈ１１－２８ｚ）のＣＡＲをコードするＳＦＧレトロウイルスベクターを構築している（図１１Ａ）。本発明者らは、ζ鎖特異的抗体で探索される、生じたＰＧ－１３レトロウイルス産生細胞（ＳＦＧ－４Ｈ１１ｚおよびＳＦＧ－４Ｈ１１－２８ｚ）のウェスタンブロット分析によって、適切なサイズのＣＡＲタンパク質の発現を確認した（データ未呈示）。
本発明者らは、ＭＵＣ－ＣＤ抗原に特異的なモノクローナル抗体を産生する４Ｈ１１ハイブリドーマを用いてＭＵＣ－ＣＤ抗原に対して標的とする第１世代（４Ｈ１１ｚ）および第２世代（４Ｈ１１－２８ｚ）のＣＡＲをコードするＳＦＧレトロウイルスベクターを構築している（図１１Ａ）。本発明者らは、ζ鎖特異的抗体で探索される、生じたＰＧ－１３レトロウイルス産生細胞（ＳＦＧ－４Ｈ１１ｚおよびＳＦＧ－４Ｈ１１－２８ｚ）のウェスタンブロット分析によって、適切なサイズのＣＡＲタンパク質の発現を確認した（データ未呈示）。
第１世代４Ｈ１１ｚ ＣＡＲの機能を評価するために、末梢血から単離された健常ドナーＴ細胞にレトロウイルスで形質導入して、４Ｈ１１ｚ ＣＡＲおよび対照１９ｚｌ ＣＡＲを発現させた（図１１Ｂ）。３Ｔ３（ＭＵＣ－ＣＤ／Ｂ７．１）ＡＡＰＣ上での共培養後の４Ｈ１１ｚ形質導入Ｔ細胞の増殖によって、４Ｈ１１ｚ ＣＡＲの機能を評価した。結果は、１９ｚｌ改変Ｔ細胞と比較して、４Ｈ１１ｚ形質導入Ｔ細胞の特異的増殖を実証している（図１１Ｃ）。これらのデータは、ＭＵＣ－ＣＤ抗原への４Ｈ１１ｚ ＣＡＲ媒介性特異的結合およびその後のＴ細胞活性化と一致している。
たいていの悪性腫瘍は、共刺激リガンドを発現しないため、本発明者らは４Ｈ１１ｚ ＣＡＲを、ＣＤ２８の膜貫通ドメインおよび細胞質共刺激シグナル伝達ドメインを発現するようにさらに改変し、第２世代の４Ｈ１１－２８ｚ ＣＡＲを構築した（図１１Ａ）。ヒトＴ細胞によって発現した場合、４Ｈ１１－２８ｚ ＣＡＲが、ζ鎖を介しての一次活性化シグナル（「シグナル１」と呼ばれる）ならびにＣＤ２８細胞質ドメインを介しての共刺激シグナル（「シグナル２」と呼ばれる）（それは、次に、外因性共刺激リガンドの非存在下で効率的なＴ細胞増殖を可能にする）の両方を生じる能力があるかどうかを評価するために、本発明者らは、外因性サイトカインの非存在下で、３Ｔ３（ＭＵＣ－ＣＤ）ＡＡＰＣ上または３Ｔ３（ＭＵＣ－ＣＤ／Ｂ７．１）ＡＡＰＣ上のいずれかでの共培養後のＴ細胞増殖を比較した。予想した通り、第２世代４Ｈ１１－２８ｚ＋Ｔ細胞は、３Ｔ３（ＭＵＣ－ＣＤ）ＡＡＰＣとの共培養で、４Ｈ１１ｚ＋Ｔ細胞と比較して、著しく増殖した。対照的に、４Ｈ１１ｚ＋Ｔ細胞および４Ｈ１１－２８ｚ＋Ｔ細胞は、３Ｔ３（ＭＵＣ－ＣＤ／Ｂ７．１）ＡＡＰＣ上で同じように増殖した（図１２Ａ）。４Ｈ１１－２８ｚ ＣＡＲによって媒介される共刺激を、３Ｔ３（ＭＵＣ－ＣＤ）ＡＡＰＣ上での共培養実験からの２日目の組織培養上清の分析によってさらに検証し、対照１９ｚｌ＋および１９－２８ｚ＋Ｔ細胞、ならびに第１世代４Ｈ１１ｚ＋Ｔ細胞と比較して、ＩＬ－２（Ｔ細胞共刺激との関連において典型的に分泌されるサイトカイン）分泌の増強が実証された（図１２Ｂ）。ＩＦＮγの分泌は、４Ｈ１１ｚ＋活性化Ｔ細胞と４Ｈ１１－２８ｚ＋活性化Ｔ細胞の間で同等であった。
本発明者らは次に、外因性ＩＬ－２およびＩＬ－１５との関連において、３Ｔ３（ＭＵＣ－ＣＤ／Ｂ７．１）ＡＡＰＣ上での共培養による毎週の再刺激後にＭＵＣ－ＣＤ標的化Ｔ細胞が増殖する能力を評価した（３）。４Ｈ１１ｚ＋Ｔ細胞および４Ｈ１１－２８ｚ＋Ｔ細胞の両方が３週間にわたって２ｌｏｇより多く増殖した（図１２Ｃ）。４Ｈ１１－２８ｚを形質導入されたＴ細胞をさらに、ＡＡＰＣ上での最初の活性化後７日間の、およびＡＡＰＣ上でのその後の２回の共刺激後７日間の、ＣＡＲ発現についてＦＡＣＳによって分析し、ＣＡＲ＋Ｔ細胞画分の予想された富化が実証された（図１２Ｄ）。増殖した４Ｈ１１ｚ＋Ｔ細胞に関して同様のデータが生じた（データ未呈示）。
ＯＶ－ＣＡＲ３（ＭＵＣ－ＣＤ）細胞および新鮮に単離された腹水由来卵巣腫瘍細胞との共培養後のＭＵＣ－ＣＤ標的化Ｔ細胞のインビトロの細胞傷害性および増殖
４Ｈ１１ｚ＋Ｔ細胞および４Ｈ１１－２８ｚ＋Ｔ細胞のヒト卵巣癌腫腫瘍を標的にし、かつ溶解する能力を評価するために、本発明者らは、ＭＵＣ－ＣＤ抗原を発現するように遺伝子改変されたヒトＯＶ－ＣＡＲ３細胞系を利用し、そのことにより、４Ｈ１１が標的にするＭＵＣ－ＣＤ抗原を発現する臨床的卵巣腫瘍試料の大部分をより良く反映している（４８）。本発明者らは、最初に、ＭＵＣ－ＣＤ標的化Ｔ細胞による特異的な溶解を検証し、無関係の第１世代および第２世代のＣＤ１９標的化１９ｚｌ ＣＡＲおよび１９２８ｚ ＣＡＲを発現する対照Ｔ細胞と比較して、ＯＶ－ＣＡＲ３（ＭＵＣ－ＣＤ）腫瘍細胞を標的にする、４Ｈ１１ｚ ＣＡＲ改変Ｔ細胞および４Ｈ１１－２８ｚ ＣＡＲ改変Ｔ細胞の類似した著しい細胞傷害活性が実証された（図１３Ａ）。４Ｈ１１－２８ｚ ＣＡＲを発現するように改変された健常ドナーＴ細胞は同様に、１９－２８ｚ形質導入Ｔ細胞と比較して、新鮮に単離された腹水由来ＭＵＣ－ＣＤ＋卵巣癌腫細胞の溶解を示した（図１３Ｂ）。さらに、４Ｈ１１－２８ｚ ＣＡＲを発現するように改変された患者の末梢血Ｔ細胞は同様に、対照１９－２８ｚ ＣＡＲを発現するように改変されたＴ細胞と比較して、同じ腹水試料由来の自己一次ＭＵＣ－ＣＤ＋腫瘍細胞を溶解した（図１３Ｃ）。
４Ｈ１１ｚ＋Ｔ細胞および４Ｈ１１－２８ｚ＋Ｔ細胞のヒト卵巣癌腫腫瘍を標的にし、かつ溶解する能力を評価するために、本発明者らは、ＭＵＣ－ＣＤ抗原を発現するように遺伝子改変されたヒトＯＶ－ＣＡＲ３細胞系を利用し、そのことにより、４Ｈ１１が標的にするＭＵＣ－ＣＤ抗原を発現する臨床的卵巣腫瘍試料の大部分をより良く反映している（４８）。本発明者らは、最初に、ＭＵＣ－ＣＤ標的化Ｔ細胞による特異的な溶解を検証し、無関係の第１世代および第２世代のＣＤ１９標的化１９ｚｌ ＣＡＲおよび１９２８ｚ ＣＡＲを発現する対照Ｔ細胞と比較して、ＯＶ－ＣＡＲ３（ＭＵＣ－ＣＤ）腫瘍細胞を標的にする、４Ｈ１１ｚ ＣＡＲ改変Ｔ細胞および４Ｈ１１－２８ｚ ＣＡＲ改変Ｔ細胞の類似した著しい細胞傷害活性が実証された（図１３Ａ）。４Ｈ１１－２８ｚ ＣＡＲを発現するように改変された健常ドナーＴ細胞は同様に、１９－２８ｚ形質導入Ｔ細胞と比較して、新鮮に単離された腹水由来ＭＵＣ－ＣＤ＋卵巣癌腫細胞の溶解を示した（図１３Ｂ）。さらに、４Ｈ１１－２８ｚ ＣＡＲを発現するように改変された患者の末梢血Ｔ細胞は同様に、対照１９－２８ｚ ＣＡＲを発現するように改変されたＴ細胞と比較して、同じ腹水試料由来の自己一次ＭＵＣ－ＣＤ＋腫瘍細胞を溶解した（図１３Ｃ）。
本発明者らはさらに、腫瘍との共培養後７日間にわたってのＣＦＳＥ標識Ｔ細胞のＦＡＣＳならびに絶対的Ｔ細胞数により評価する場合の、健常ドナー由来の４Ｈ１１ｚ＋Ｔ細胞および４Ｈ１１－２８ｚ＋Ｔ細胞のＯＶ－ＣＡＲ３（ＭＵＣ－ＣＤ）上での共培養後に増殖する能力を評価した（図１３Ｄおよび１３Ｅ）。驚くべきことに、本発明者らは、４Ｈ１１ｚ＋Ｔ細胞および４Ｈ１１－２８ｚ＋Ｔ細胞の両方が、ＯＶ－ＣＡＲ３（ＭＵＣ－ＣＤ）腫瘍細胞との共培養後、同等に十分に増殖し、この腫瘍細胞系の共刺激リガンドの発現によりＴ細胞を共刺激する能力を示唆した。この可能性に取り組むために、本発明者らはさらに、ＯＶ－ＣＡＲ３（ＭＵＣ－ＣＤ）腫瘍細胞のＦＡＣＳ分析を行い、共刺激４－１ＢＢＬリガンドは発現する（図１３Ｆ）が、Ｂ７．１、Ｂ７．２、またはＯＸ－４０Ｌ共刺激リガンドは発現しないことが実証された（データ未呈示）。
ＳＣＩＤ－ＢｅｉｇｅマウスにおけるＭＵＣ－ＣＤ標的化Ｔ細胞のインビボ抗腫瘍活性
４Ｈ１１ｚ＋Ｔ細胞および４Ｈ１１－２８ｚ＋Ｔ細胞のインビボの抗腫瘍活性を評価するために、本発明者らは次に、ＯＶ－ＣＡＲ３（ＭＵＣ－ＣＤ）腫瘍細胞のＳＣＩＤ－Ｂｅｉｇｅマウスへの腹腔内注射によって、同所性異種移植卵巣癌腫瘍モデルを作製した。未処置のままであった場合には、これらのマウスでは、腫瘍細胞注射後３週間までに、著しい腹水および複数の結節性腹膜腫瘍が発生した（図１４Ａ）。未処置の腫瘍を担持する全てのマウスは、腫瘍細胞注射後７週間までに苦痛の徴候により安楽死させなければならなかった。
４Ｈ１１ｚ＋Ｔ細胞および４Ｈ１１－２８ｚ＋Ｔ細胞のインビボの抗腫瘍活性を評価するために、本発明者らは次に、ＯＶ－ＣＡＲ３（ＭＵＣ－ＣＤ）腫瘍細胞のＳＣＩＤ－Ｂｅｉｇｅマウスへの腹腔内注射によって、同所性異種移植卵巣癌腫瘍モデルを作製した。未処置のままであった場合には、これらのマウスでは、腫瘍細胞注射後３週間までに、著しい腹水および複数の結節性腹膜腫瘍が発生した（図１４Ａ）。未処置の腫瘍を担持する全てのマウスは、腫瘍細胞注射後７週間までに苦痛の徴候により安楽死させなければならなかった。
ＭＵＣ－ＣＤ標的化Ｔ細胞のインビボ抗腫瘍効力を評価するために、ＳＣＩＤ－Ｂｅｉｇｅマウスに、１日目にＯＶ－ＣＡＲ３（ＭＵＣ－ＣＤ／ＧＦＰ－ＦＦＬｕｃ）腫瘍細胞を腹腔内に注射し、続いて２日目に、４Ｈ１１ｚ＋Ｔ細胞または４Ｈ１１－２８ｚ＋Ｔ細胞を腹腔内に注射した。陰性対照として、腫瘍を担持するマウスを、処置しないか、または無関係のＣＤ１９標的化ＣＡＲを発現するように改変されたＴ細胞で処置するかのいずれかであった。まとめると、本発明者らは、ＭＵＣ－ＣＤ標的化Ｔ細胞で処置された全てのマウスの２７％（３匹／１１匹のマウス）が、腫瘍注射から１２０日間、疾患の臨床的証拠なしに生き続け、４Ｈ１１ｚ＋Ｔ細胞および４Ｈ１１－２８ｚ＋Ｔ細胞で処置されたコホートと比較して、生存において統計的有意差はない（図１４Ｂ）ことを見出した。対照的に、両方のＭＵＣ－ＣＤ標的化Ｔ細胞で処置されたコホートにおいては、未処置対照コホートおよび１９ｚｌ＋Ｔ細胞で処置された対照コホートと比較して、統計的に有意な生存の増強が実証された。
全身性に注入されたＭＵＣ－ＣＤ標的化Ｔ細胞が腹腔内腫瘍にうまく輸送されるかどうかを評価するために、本発明者らは次に、腹腔内にＯＶ－ＣＡＲ３（ＭＵＣ－ＣＤ／ＧＦＰ－ＦＦＬｕｃ）腫瘍を担持するＳＣＩＤ－Ｂｅｉｇｅマウスにおいて４Ｈ１１－２８ｚ＋Ｔ細胞の腹腔内注入を静脈内注入と比較した。腹腔内および静脈内４Ｈ１１－２８ｚ＋Ｔ細胞処置マウスの両方が、全体的な生存（図１５Ａ）ならびに腫瘍進行のＢＬＩ（図１５Ｂ）によって評価した場合、未処置対照コホートまたは１９－２８ｚ＋Ｔ細胞で処置された対照コホートと比較して、統計的に生存の増強を示した。さらに、本発明者らは、腹腔内処置群と静脈内処置群との間での全体的な生存が対数順位解析によって統計的に等価であることを見出した。これらのデータは、静脈内注入された４Ｈ１１－２８ｚ＋Ｔ細胞の腹膜腫瘍への輸送の成功を意味している。本発明者らはさらに、解離されたＯＶ－ＣＡＲ３（ＭＵＣ－ＣＤ）腫瘍の単一細胞懸濁物のＦＡＣＳ分析により、静脈内注入されたＣＦＳＥ標識４Ｈ１１－２８ｚ＋Ｔ細胞の腹膜への輸送を確認した（図１５Ｃ）。
十分確立したＯＶ－ＣＡＲ３（ＭＵＣ－ＣＤ／ＧＦＰ－ＦＦＬｕｃ）腫瘍を担持するＳＣＩＤ－ＢｅｉｇｅマウスにおけるＭＵＣ－ＣＤ標的化Ｔ細胞のインビボの抗腫瘍活性
４Ｈ１１－２８ｚ＋Ｔ細胞が、より臨床的に関連した腫瘍負荷量を根絶することができるかどうかをさらに評価するために、本発明者らは、養子Ｔ細胞治療の７日前に注射された、十分確立した腹腔内ＯＶ－ＣＡＲ３（ＭＵＣ－ＣＤ／ＧＦＰ－ＦＦＬｕｃ）腫瘍を担持するＳＣＩＤ－Ｂｅｉｇｅマウスを処置した。もう一度、本発明者らは、ＭＵＣ－ＣＤ標的化Ｔ細胞での治療が、全ての処置されたマウスにおいてＢＬＩ顕性疾患を著しく根絶したことを見出し（図１６Ａ）、腫瘍細胞注入後１２０日間までのＢＬＩ画像化（未呈示）により評価した場合、８匹の処置されたマウスのうち５匹が、最終的に、進行性疾患の再発をおこし、３匹のマウスは疾患がないままであった（図１６Ｂ）。これらのデータは、進行性疾患の状況においてさえもＭＵＣ－ＣＤ標的化Ｔ細胞により媒介される強力なインビボ抗腫瘍活性を実証している。
４Ｈ１１－２８ｚ＋Ｔ細胞が、より臨床的に関連した腫瘍負荷量を根絶することができるかどうかをさらに評価するために、本発明者らは、養子Ｔ細胞治療の７日前に注射された、十分確立した腹腔内ＯＶ－ＣＡＲ３（ＭＵＣ－ＣＤ／ＧＦＰ－ＦＦＬｕｃ）腫瘍を担持するＳＣＩＤ－Ｂｅｉｇｅマウスを処置した。もう一度、本発明者らは、ＭＵＣ－ＣＤ標的化Ｔ細胞での治療が、全ての処置されたマウスにおいてＢＬＩ顕性疾患を著しく根絶したことを見出し（図１６Ａ）、腫瘍細胞注入後１２０日間までのＢＬＩ画像化（未呈示）により評価した場合、８匹の処置されたマウスのうち５匹が、最終的に、進行性疾患の再発をおこし、３匹のマウスは疾患がないままであった（図１６Ｂ）。これらのデータは、進行性疾患の状況においてさえもＭＵＣ－ＣＤ標的化Ｔ細胞により媒介される強力なインビボ抗腫瘍活性を実証している。
考察
患者腫瘍試料の広範な分析に基づいて、卵巣癌腫は、比較的免疫原性腫瘍であるようにみえる。具体的には、研究者らは、手術および化学療法後の予後と、処置前の腫瘍試料における腫瘍浸潤性エフェクターＴ細胞（ＴＩＬ）の量との間に直接的相関があることをそこに見出している（２５、４９、５０）。さらに、別の研究者らが、治療後の予後と、腫瘍内のＴｒｅｇ（それらは、次に、おそらく、腫瘍特異的エフェクターＴＩＬの抗腫瘍機能を抑制する（２６、２８、５１））の処置前レベルとの間の逆相関を記載している。これらの所見のどちらも、最初の治療の前と後の両方での疾患進行の制御における、内因性エフェクターＴ細胞の腫瘍に対する応答についての役割を意味し、卵巣癌腫が、卵巣腫瘍細胞抗原に対して標的化した自己Ｔ細胞の養子注入による死滅化に感受性が高い可能性があるという主張を強く支持している。
患者腫瘍試料の広範な分析に基づいて、卵巣癌腫は、比較的免疫原性腫瘍であるようにみえる。具体的には、研究者らは、手術および化学療法後の予後と、処置前の腫瘍試料における腫瘍浸潤性エフェクターＴ細胞（ＴＩＬ）の量との間に直接的相関があることをそこに見出している（２５、４９、５０）。さらに、別の研究者らが、治療後の予後と、腫瘍内のＴｒｅｇ（それらは、次に、おそらく、腫瘍特異的エフェクターＴＩＬの抗腫瘍機能を抑制する（２６、２８、５１））の処置前レベルとの間の逆相関を記載している。これらの所見のどちらも、最初の治療の前と後の両方での疾患進行の制御における、内因性エフェクターＴ細胞の腫瘍に対する応答についての役割を意味し、卵巣癌腫が、卵巣腫瘍細胞抗原に対して標的化した自己Ｔ細胞の養子注入による死滅化に感受性が高い可能性があるという主張を強く支持している。
内因性エフェクターＴＩＬが、推定される腫瘍特異的Ｔ細胞の１つの源であるが、養子Ｔ細胞治療への代替のアプローチは、自己末梢血Ｔ細胞を単離することであり、そのＴ細胞が、次に、腫瘍細胞抗原を標的にするようにエキソビボで遺伝子改変されてもよい。１つのそのような遺伝的アプローチは、腫瘍に固有かまたは腫瘍によって過剰発現されるかのいずれかである表面露出抗原に対して標的化したＣＡＲを患者Ｔ細胞にレトロウイルスにより形質導入することである。この目的を達成するために、他の悪性腫瘍においてこのアプローチを利用する有望な前臨床試験が最近、臨床実践場面に移されている（６、１６、１９、５２）。同様に、本発明者らは、正常Ｂ細胞ならびにたいていのＢ細胞悪性腫瘍に発現したＣＤ１９抗原に対して標的化したＣＡＲを以前に作製しており、再発したＢ細胞慢性リンパ性白血病および急性リンパ芽球性白血病を有する患者を、ＣＤ１９特異的ＣＡＲを発現するように改変された自己Ｔ細胞で処置する臨床試験を現在、行っている（５３）。
このアプローチの卵巣癌腫への適用は、腫瘍細胞表面に発現する適切な標的抗原の同定を必要とする。意義深いことには、他の研究者らが、前臨床実践場面および臨床実践場面の両方においてこのアプローチを研究している（４、１１、５４～５７）。具体的には、いくつかのグループが、皮下ヒト卵巣癌腫細胞系腫瘍に対する顕著な抗腫瘍応答を、これらの腫瘍細胞系に過剰発現したメソテリンおよびルイスＹ抗原に特異的なＣＡＲを発現するＴ細胞の腫瘍内および／または静脈内注入後、免疫無防備状態のマウスにおいて実証している（５６、５８、５９）。さらに、Ｋｅｒｓｈａｗらは、α－葉酸受容体に特異的なＣＡＲを発現するように改変された自己Ｔ細胞を用いて、再発した卵巣癌腫を有する患者を処置する第一相臨床試験の結果を最近、発表した（６）。この研究の著者らは、標的化Ｔ細胞での治療は耐容性がよいことを見出したが、時間経過での改変Ｔ細胞の持続性の悪さ、ならびに幾人かの処置された患者の血清中のまだ未決定のＴ細胞阻害因子に関連した、これらの研究における抗腫瘍応答の不足を指摘した。
本発明者らの研究において、本発明者らは、大部分の卵巣癌腫で過剰発現するＭＵＣ－１６糖タンパク質を標的にするように選択している（１、３０、３２、３３）。養子Ｔ細胞治療のための標的抗原としてのＭＵＣ－１６の有用性は、この分子の細胞外部分の大部分が腫瘍細胞によって切断され、分泌され、ＣＡ－１２５腫瘍マーカーとして血清中で検出することができるという事実によって損なわれている。しかしながら、ＭＵＣ－１６のこの分泌された画分の切断後、腫瘍表面に保持される、ＭＵＣ－ＣＤと名付けられた、その糖タンパク質の残りの細胞外画分が残存し、それゆえに、免疫に基づいた治療にとって魅力的な標的である。この目的を達成するために、本発明者らは、ＭＵＣ－ＣＤに特異的なＣＡＲを構築するためにＭＵＣ－ＣＤ抗原に対して産生された一連のマウスハイブリドーマを利用した。これらのＣＡＲのうち、本発明者らは、４Ｈ１１ｚと名付けられた４Ｈ１１マウスハイブリドーマから産生されたＣＡＲを同定し、それは、ヒトＴ細胞において発現した場合、３Ｔ３（ＭＵＣ－ＣＤ／Ｂ７．１）ＡＡＰＣ上での共培養後、ＡＡＰＣ単層の迅速な破壊、ならびに著しい改変Ｔ細胞増殖を生じた。意義深いことには、４Ｈ１１抗体に対する抗原は、免疫組織化学検査により評価した場合、本発明者らの施設で処置された患者から得られた、処置前の卵巣癌腫の外科的腫瘍試料の大部分において高度に発現している（４８）。
最適なＴ細胞活性化は、一次Ｔ細胞受容体媒介性シグナルである「シグナル１」、加えて共刺激「シグナル２」の両方を必要とする。古典的には、この共刺激シグナルは、標的細胞上のＢ７．１（ＣＤ８０）かまたはＢ７．２（ＣＤ８６）のいずれかのＴ細胞共刺激受容体ＣＤ２８とのライゲーションによって供給され得る。あるいは、共刺激は、標的細胞上の４－１ＢＢＬまたはＯＸ－４０Ｌの、Ｔ細胞上のそれぞれの４－１ＢＢまたはＯＸ－４０共刺激受容体とのライゲーションによって生じ得る（１２、６０、６１）。たいていの腫瘍細胞が共刺激リガンドを発現しないため、本発明者らおよび他の研究者らは、共刺激受容体のＣＤ２８、４－１ＢＢ、および／またはＯＸ４０の細胞質シグナル伝達ドメインをさらに組み入れた第２世代ＣＡＲが、外因性共刺激リガンドの非存在下で、同種抗原への結合により、シグナル１およびシグナル２の両方をＴ細胞へ供給する能力があるＣＡＲを生じることを以前に実証している（７～１０、１２、１３、１５、１６、６２～６５）。この目的を達成するために、本発明者らは、他のところで記載されているように、ＣＤ２８の膜貫通および細胞質シグナル伝達ドメインを組み入れた、４Ｈ１１ｚ ＣＡＲ由来の第２世代ＣＡＲを構築した（３、９、４３）。以前の研究と一致して、本発明者らは、得られた４Ｈ１１－２８ｚ ＣＡＲを発現するように形質導入されたＴ細胞が、外因性共刺激の非存在下で３Ｔ３（ＭＵＣ－ＣＤ）線維芽細胞との共培養で効率的に増殖したが、第１世代の４Ｈ１１ｚ ＣＡＲでは効率的に増殖せず、それは、シグナル１とシグナル２の両方をＴ細胞へ送達する４Ｈ１１－２８ｚ ＣＡＲの能力と一致しているということを見出した。この結論は、４Ｈ１１－２８ｚ＋Ｔ細胞が、第１世代４Ｈ１１ｚ ＣＡＲを発現するように形質導入されたＴ細胞と比較して、３Ｔ３（ＭＵＣ－ＣＤ）線維芽細胞上での共培養により、有意により高いレベルのＩＬ－２（Ｔ細胞共刺激を示すサイトカイン）を分泌したという所見によってさらに支持される。
本発明者らは次に、ヒト卵巣癌腫腫瘍細胞を標的にし、かつ溶解する４Ｈ１１ｚ＋Ｔ細胞および４Ｈ１１－２８ｚ＋Ｔ細胞の能力を評価した。この目的を達成するために、本発明者らは、最初に、ＯＶ－ＣＡＲ３ヒト卵巣癌細胞系を利用した。ＯＶ－ＣＡＲ３腫瘍細胞系は４Ｈ１１抗体に弱く結合するため、本発明者らはさらに、臨床的卵巣癌腫腫瘍検体の大部分が４Ｈ１１ ＭＵ－ＣＤ抗原を高度に発現する臨床実践場面をより良く模倣するために、ＭＵＣ－ＣＤを発現するようにその細胞系を遺伝子改変した（ＯＶ－ＣＡＲ３（ＭＵＣ－ＣＤ））（４８）。本発明者らは、４Ｈ１１ｚかまたは４Ｈ１１－２８ｚのいずれかを発現するように改変されたヒトＴ細胞が、インビトロでＯＶ－ＣＡＲ３（ＭＵＣ－ＣＤ）腫瘍細胞を根絶することを実証し、驚くべきことに、４Ｈ１１ｚ＋Ｔ細胞および４Ｈ１１－２８ｚ＋Ｔ細胞の両方が、インビトロで腫瘍との共培養後、増殖することを観察した。この予期しない４Ｈ１１ｚ＋Ｔ細胞増殖の原因を明らかにするために、本発明者らはさらに、ＯＶ－ＣＡＲ３（ＭＵＣ－ＣＤ）腫瘍細胞が共刺激リガンドを発現するかどうかを評価し、この腫瘍細胞系が４－１ＢＢＬを発現することを見出し、そこことは、本発明者らの実験所見、ならびに様々な癌腫細胞系による４－１ＢＢＬ発現を実証する以前に発表された報告と一致した（６６～６８）。これらの所見の臨床的関連をさらに確証するために、本発明者らは、その後、健常ドナー同種異系４Ｈ１１－２８ｚ＋Ｔ細胞ならびに、より一層著しく自己性の４Ｈ１１－２８ｚ＋患者末梢血Ｔ細胞の両方による、未処置の卵巣癌腫から単離された原発腹水由来腫瘍細胞の特異的インビトロでの溶解を実証した。これらのデータは、自己４Ｈ１１に基づいたＣＡＲ＋Ｔ細胞での処置が、将来の臨床適用において有望であるという主張を強く支持している。
本発明者らのインビトロでの所見のインビボでの関連性を評価するために、本発明者らは次に、ＳＣＩＤ－Ｂｅｉｇｅマウスにおいてマウス同所性ＯＶ－ＣＡＲ３（ＭＵＣ－ＣＤ）腫瘍モデルを作製した。本発明者らは、マウスに、ＯＶ－ＣＡＲ３（ＭＵＣ－ＣＤ）腫瘍細胞を腹腔内に注射し、次の日、４Ｈ１１ｚ＋Ｔ細胞、４Ｈ１１－２８ｚ＋Ｔ細胞、および対照１９ｚｌ＋Ｔ細胞を腹腔内に注入した。この処置のアプローチは、未処置のマウスまたは無関係のＣＤ１９抗原に対して標的化した対照Ｔ細胞で処置されたマウスと比較して、４Ｈ１１ｚ＋Ｔ細胞で処置されたコホートおよび４Ｈ１１－２８ｚ＋Ｔ細胞で処置されたコホートの両方において、有意であるが類似した腫瘍進行の遅延および長期生存を生じた。本発明者らは次に、同所性ＯＶ－ＣＡＲ３（ＭＵＣ－ＣＤ／ＧＦＰ－ＦＦＬｕｃ）を担持するマウスの４Ｈ１１－２８ｚ＋Ｔ細胞での腹腔内処置を静脈内処置と比較し、Ｔ細胞の直接的な腹腔内注入または標的化Ｔ細胞の全身性静脈内注入のどちらに関しても、時間とともに、類似した、統計的に有意なマウスの生存を見出した。意義深いことには、処置後１日目までに静脈内処置されたマウスは、標的化Ｔ細胞の腹膜への上首尾の輸送を示した。これらのデータは、標的化Ｔ細胞での養子治療が、腹膜への直接的注入によって、または全身性静脈内注入を介してのどちらででも、等しく効力があり得ることを示唆している。これらの所見は、疾患の局所的再発ならびに腹膜以外の部位への転移性再発の両方を有する患者を処置することにおける、このアプローチの将来の臨床的潜在力をさらに支持している。
最後に、本発明者らは、改変Ｔ細胞の腹腔内注入を７日間、遅らせる（その場合、生物発光画像化により評価して、マウスはより大きい確立した腫瘍負荷量を有した）ことによって、より一層確立した疾患を根絶させる４Ｈ１１－２８ｚ＋Ｔ細胞の能力を評価した。この実験状況は、この養子Ｔ細胞アプローチが利用されることになる最初の臨床実践場面をよりよく反映している。意義深いことには、著しく確立した疾患の状況にも関わらず、４Ｈ１１－２８ｚ＋Ｔ細胞は、より大きい腫瘍負荷量を溶解し、腫瘍の再発を遅らせ、かなりのパーセンテージのマウスにおいて、疾患を完全に根絶する能力を保持した。
本明細書に提示された研究において、本発明者らは、インビトロおよびインビボの両方の抗腫瘍活性を評価するためにＣＤ４＋ＣＡＲ＋Ｔ細胞とＣＤ８＋ＣＡＲ＋Ｔ細胞の混合集団を一貫して利用している。このために、進行中の研究は、このＳＣＩＤ－Ｂｅｉｇｅ
ＯＶ－ＣＡＲ３（ＭＵＣ－ＣＤ）腫瘍モデルでの疾患の根絶の成功における単離されたＣＤ４＋ＣＡＲ＋Ｔ細胞サブセットとＣＤ８＋ＣＡＲ＋Ｔ細胞サブセットの役割に取り組む。これらの研究の結果は、この治療アプローチを臨床実践場面へ移行させることへの意味合いを含み得る。さらに、本発明者らは、提示されたＳＣＩＤ－Ｂｅｉｇｅ腫瘍モデルに関連した限界を認める。すなわち、これは、免疫無防備状態のマウスにおける異種移植モデルである。このために、本発明者らの（ｏｒ）研究室における進行中の研究は、無傷の免疫系という状況においてＭＵＣ－ＣＤ標的化ＣＡＲ改変Ｔ細胞の生物学的特徴および抗腫瘍効力をより良く明確にするために、臨床的により一層関連性のある同系免疫適格性腫瘍モデルを作製することに焦点をおいている。
ＯＶ－ＣＡＲ３（ＭＵＣ－ＣＤ）腫瘍モデルでの疾患の根絶の成功における単離されたＣＤ４＋ＣＡＲ＋Ｔ細胞サブセットとＣＤ８＋ＣＡＲ＋Ｔ細胞サブセットの役割に取り組む。これらの研究の結果は、この治療アプローチを臨床実践場面へ移行させることへの意味合いを含み得る。さらに、本発明者らは、提示されたＳＣＩＤ－Ｂｅｉｇｅ腫瘍モデルに関連した限界を認める。すなわち、これは、免疫無防備状態のマウスにおける異種移植モデルである。このために、本発明者らの（ｏｒ）研究室における進行中の研究は、無傷の免疫系という状況においてＭＵＣ－ＣＤ標的化ＣＡＲ改変Ｔ細胞の生物学的特徴および抗腫瘍効力をより良く明確にするために、臨床的により一層関連性のある同系免疫適格性腫瘍モデルを作製することに焦点をおいている。
結論として、本明細書において、本発明者らは、ＭＵＣ－１６抗原の保持されるＭＵＣ－ＣＤ部分に対して標的化した遺伝子改変Ｔ細胞を用いた養子治療による、大多数の卵巣癌腫に過剰発現する抗原である、ＭＵＣ－１６を標的にすることの実行可能性を実証する最初の刊行されたデータを提示する。さらに、この報告は、卵巣癌の同所性の、臨床的に関連したマウスモデルにおいてＴ細胞の効率的なターゲティングを実証する最初のものであり、改変Ｔ細胞の腹腔内注入および静脈内注入の両方による効力を実証している。最後に、これらのデータは、手術および化学療法での最初の治療後の遷延性または再発した卵巣癌腫を有する患者における第一相臨床試験の形をとる臨床実践場面へのこのアプローチのさらなる移行を支持している。
実施例５
マウスおよびハムスターにおけるマウスＭＵＣ１６モノクローナル抗体の産生
本発明者らは、モノクローナル抗体がマウスおよびハムスターにおいて生じるための、マウスＭＵＣ１６ゲノムの３つの異なる領域を選択した。マウスＭＵＣ１６の選択された領域は、ペプチド１（配列番号２１、細胞質ドメインの外部領域）、ペプチド２（配列番号２２、第１のシステインループ）、およびペプチド３（配列番号２３、第２のシステインループ）であり（図２０Ａ）、それのヒトＭＵＣ１６との比較は、図２０Ｂに示されている。ＫＬＨとのより良い結合体化のために、ペプチド１（配列番号２１）およびペプチド３（配列番号２３）のＮ末端のペプチド配列にシステインを付加した。個々のペプチドを、Ｐｒｏｍｅｇａキットを用いてＫＬＨに結合体化した。これらの３つの結合体化されたペプチドをプールし、５匹のマウスおよび４匹のハムスターへ免疫した。１回の免疫ごとに３週間の間隔をあけて５回の免疫を施した。これらの動物由来の血清を、個々のペプチド（配列番号２１、２２、および２３）との特異的な反応性についてＥＬＩＳＡによって試験した。陽性選択された動物を１ヶ月間、休ませ、その後、プールされたペプチド免疫原（配列番号２１、２２、および２３）で静脈内にブーストし、４日後、脾臓を採取した。脾細胞をハイブリドーマパートナーと混合し、様々なクローン密度でマイクロタイタープレートへ蒔いた。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で１０日間、培養し、その後、クローンを選択した。これらの選択されたクローンからの上清を、個々のペプチド（配列番号２１、２２、および２３）との特異的な反応性についてＥＬＩＳＡによって試験した。陽性クローンの上清を、２つのマウス細胞系（ＩＤ８およびＢＲ５－ＦＶＢ１）およびヒト細胞系（ＯＶＣＡＲ－３）を用いるＦＡＣＳ、ウェスタンブロット、および画像化により試験した。
表４は、マウスＭＵＣ１６ペプチド抗原ペプチド１（配列番号２１）、ペプチド２（配列番号２２）、およびペプチド３（配列番号２３）に対するマウスおよびハムスターのモノクローナル抗体の概要を示す。非常に強い抗原応答は、ペプチド１（配列番号２１）に関して見られた。
マウスおよびハムスターにおけるマウスＭＵＣ１６モノクローナル抗体の産生
本発明者らは、モノクローナル抗体がマウスおよびハムスターにおいて生じるための、マウスＭＵＣ１６ゲノムの３つの異なる領域を選択した。マウスＭＵＣ１６の選択された領域は、ペプチド１（配列番号２１、細胞質ドメインの外部領域）、ペプチド２（配列番号２２、第１のシステインループ）、およびペプチド３（配列番号２３、第２のシステインループ）であり（図２０Ａ）、それのヒトＭＵＣ１６との比較は、図２０Ｂに示されている。ＫＬＨとのより良い結合体化のために、ペプチド１（配列番号２１）およびペプチド３（配列番号２３）のＮ末端のペプチド配列にシステインを付加した。個々のペプチドを、Ｐｒｏｍｅｇａキットを用いてＫＬＨに結合体化した。これらの３つの結合体化されたペプチドをプールし、５匹のマウスおよび４匹のハムスターへ免疫した。１回の免疫ごとに３週間の間隔をあけて５回の免疫を施した。これらの動物由来の血清を、個々のペプチド（配列番号２１、２２、および２３）との特異的な反応性についてＥＬＩＳＡによって試験した。陽性選択された動物を１ヶ月間、休ませ、その後、プールされたペプチド免疫原（配列番号２１、２２、および２３）で静脈内にブーストし、４日後、脾臓を採取した。脾細胞をハイブリドーマパートナーと混合し、様々なクローン密度でマイクロタイタープレートへ蒔いた。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で１０日間、培養し、その後、クローンを選択した。これらの選択されたクローンからの上清を、個々のペプチド（配列番号２１、２２、および２３）との特異的な反応性についてＥＬＩＳＡによって試験した。陽性クローンの上清を、２つのマウス細胞系（ＩＤ８およびＢＲ５－ＦＶＢ１）およびヒト細胞系（ＯＶＣＡＲ－３）を用いるＦＡＣＳ、ウェスタンブロット、および画像化により試験した。
表４は、マウスＭＵＣ１６ペプチド抗原ペプチド１（配列番号２１）、ペプチド２（配列番号２２）、およびペプチド３（配列番号２３）に対するマウスおよびハムスターのモノクローナル抗体の概要を示す。非常に強い抗原応答は、ペプチド１（配列番号２１）に関して見られた。
マウスＩＤ８およびＢＲ５－ＦＶＢ１細胞抽出物を用いるウェスタンブロット分析もまた、それぞれ、図２１および図２２に示されているように、全ての選択されたモノクローナル抗体について実施した。
マウスＭＵＣ１６モノクローナル抗体の中から、本発明者らは、さらなるスクリーニングのために１２Ｂ１０－３Ｇ１０サブクローンのマウスモノクローナル抗体を選択した。同様に、ハムスターのモノクローナル抗体である、１５Ａ８－２Ｅ１０、２２Ｂ５－２Ｇ８、および４Ｈ１－２Ｅ１サブクローンをさらなるスクリーニングのために選択した。
ＩＤ８（マウス）、ＯＶＣＡＲ－３（ヒト）、ＢＲ５－ＦＶＢ１（マウス）細胞系、および受精後１３．５日目の胚のパラフィン切片および凍結切片について免疫組織化学的分析を実施した。パラフィン切片または凍結切片を、マウスＭＵＣ１６の初期発生を調べるために、マウス１２Ｂ１０モノクローナル抗体、ハムスター１５Ａ８モノクローナル抗体、ハムスター２２Ｂ５モノクローナル抗体、およびハムスター４Ｅ１モノクローナル抗体で探索した（図２３）。
１２Ｂ１０－３Ｇ１０サブクローンを、一本鎖Ｆｖ断片のためにさらに分析した。図２４は、１２Ｂ１０－３Ｇ１０ ＶＨおよびＶＬのＤＮＡ配列ならびにアミノ酸配列を示している。生物反応性上清および精製１２Ｂ１０－３Ｇ１０を、動物研究および他の特徴づけ研究のために作製した。ＩＤ８細胞、ＯＶＣＡＲ３細胞、およびＢＲ５－ＦＶＢ１細胞に関して精製１２Ｂ１０－３Ｇ１０を用いて、ＦＡＣＳ分析を実施し、マウスおよびヒトの両方のＭＵＣ１６外部ドメイン断片に対して９０％を超える陽性を示した（図２５）。
明細書および実施例１～３で引用された文献
重要なことには、抗体をヒト化するための初期の方法は、非ヒト抗体の出発材料より低い親和性をもつ抗体を生じる場合が多かった。抗体をヒト化する、より最近のアプローチは、ＣＤＲに変更を加えることによってこの問題と取り組んでいる。参照により本明細書に組み入れられている、米国特許出願公開第２００４０１６２４１３号を参照されたい。いくつかの実施形態において、本発明のヒト化抗体は、ドナーのヘテロマー可変領域より同等またはより高い抗原結合親和性を有する最適化されたヘテロマー可変領域（例えば、完全抗体である他の分子（ａｆｕｌｌａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｔｈｅｒ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）
の部分であってもよいし、そうでなくてもよい）を含有し、上記ドナーのヘテロマー可変領域が３つのドナーの軽鎖ＣＤＲを含み、かつその最適化されたヘテロマー可変領域が、ａ）ｉ）４つの変化のないヒト生殖系列軽鎖フレームワーク領域、およびｉｉ）３つの変化した軽鎖可変領域ＣＤＲを含む変化した軽鎖可変領域を含み、上記３つの変化した軽鎖可変領域ＣＤＲのうちの少なくとも１つがドナーの軽鎖ＣＤＲ変異体であり、かつ上記ドナーの軽鎖ＣＤＲ変異体が、上記３つのドナーの軽鎖ＣＤＲのうちの１つと比較してたった１つ、２つ、３つ、または４つの位置において異なるアミノ酸を含む（例えば、少なくとも１つのドナーの軽鎖ＣＤＲ変異体は、１個、２個、３個、または４個のアミノ酸の違いを除いて、ドナーの軽鎖ＣＤＲのうちの１つと同一である）。
の部分であってもよいし、そうでなくてもよい）を含有し、上記ドナーのヘテロマー可変領域が３つのドナーの軽鎖ＣＤＲを含み、かつその最適化されたヘテロマー可変領域が、ａ）ｉ）４つの変化のないヒト生殖系列軽鎖フレームワーク領域、およびｉｉ）３つの変化した軽鎖可変領域ＣＤＲを含む変化した軽鎖可変領域を含み、上記３つの変化した軽鎖可変領域ＣＤＲのうちの少なくとも１つがドナーの軽鎖ＣＤＲ変異体であり、かつ上記ドナーの軽鎖ＣＤＲ変異体が、上記３つのドナーの軽鎖ＣＤＲのうちの１つと比較してたった１つ、２つ、３つ、または４つの位置において異なるアミノ酸を含む（例えば、少なくとも１つのドナーの軽鎖ＣＤＲ変異体は、１個、２個、３個、または４個のアミノ酸の違いを除いて、ドナーの軽鎖ＣＤＲのうちの１つと同一である）。
Claims (1)
- 明細書に記載のモノクローナル抗体。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US31796410P | 2010-03-26 | 2010-03-26 | |
| US61/317,964 | 2010-03-26 | ||
| JP2019012878A JP7100595B2 (ja) | 2010-03-26 | 2019-01-29 | Ｍｕｃ１６に対する抗体およびその使用方法 |
| JP2022063412A JP2022088649A (ja) | 2010-03-26 | 2022-04-06 | Ｍｕｃ１６に対する抗体およびその使用方法 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2022063412A Division JP2022088649A (ja) | 2010-03-26 | 2022-04-06 | Ｍｕｃ１６に対する抗体およびその使用方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2024073610A true JP2024073610A (ja) | 2024-05-29 |
Family
ID=44673895
Family Applications (8)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2013501520A Active JP5837567B2 (ja) | 2010-03-26 | 2011-03-25 | Ｍｕｃ１６に対する抗体およびその使用方法 |
| JP2014210674A Active JP6463068B2 (ja) | 2010-03-26 | 2014-10-15 | Ｍｕｃ１６に対する抗体およびその使用方法 |
| JP2016080611A Pending JP2016144468A (ja) | 2010-03-26 | 2016-04-13 | Ｍｕｃ１６に対する抗体およびその使用方法 |
| JP2018061671A Withdrawn JP2018117634A (ja) | 2010-03-26 | 2018-03-28 | Ｍｕｃ１６に対する抗体およびその使用方法 |
| JP2019012878A Active JP7100595B2 (ja) | 2010-03-26 | 2019-01-29 | Ｍｕｃ１６に対する抗体およびその使用方法 |
| JP2019232781A Pending JP2020072681A (ja) | 2010-03-26 | 2019-12-24 | Ｍｕｃ１６に対する抗体およびその使用方法 |
| JP2022063412A Pending JP2022088649A (ja) | 2010-03-26 | 2022-04-06 | Ｍｕｃ１６に対する抗体およびその使用方法 |
| JP2024043445A Pending JP2024073610A (ja) | 2010-03-26 | 2024-03-19 | Ｍｕｃ１６に対する抗体およびその使用方法 |
Family Applications Before (7)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2013501520A Active JP5837567B2 (ja) | 2010-03-26 | 2011-03-25 | Ｍｕｃ１６に対する抗体およびその使用方法 |
| JP2014210674A Active JP6463068B2 (ja) | 2010-03-26 | 2014-10-15 | Ｍｕｃ１６に対する抗体およびその使用方法 |
| JP2016080611A Pending JP2016144468A (ja) | 2010-03-26 | 2016-04-13 | Ｍｕｃ１６に対する抗体およびその使用方法 |
| JP2018061671A Withdrawn JP2018117634A (ja) | 2010-03-26 | 2018-03-28 | Ｍｕｃ１６に対する抗体およびその使用方法 |
| JP2019012878A Active JP7100595B2 (ja) | 2010-03-26 | 2019-01-29 | Ｍｕｃ１６に対する抗体およびその使用方法 |
| JP2019232781A Pending JP2020072681A (ja) | 2010-03-26 | 2019-12-24 | Ｍｕｃ１６に対する抗体およびその使用方法 |
| JP2022063412A Pending JP2022088649A (ja) | 2010-03-26 | 2022-04-06 | Ｍｕｃ１６に対する抗体およびその使用方法 |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (4) | US9169328B2 (ja) |
| EP (2) | EP3222632A1 (ja) |
| JP (8) | JP5837567B2 (ja) |
| AU (1) | AU2011230590C1 (ja) |
| CA (3) | CA2793753C (ja) |
| DK (1) | DK2552959T3 (ja) |
| ES (1) | ES2621874T3 (ja) |
| HK (1) | HK1244496A1 (ja) |
| HU (1) | HUE032519T2 (ja) |
| ME (1) | ME02670B (ja) |
| PL (1) | PL2552959T3 (ja) |
| PT (1) | PT2552959T (ja) |
| WO (1) | WO2011119979A2 (ja) |
Families Citing this family (49)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2793753C (en) | 2010-03-26 | 2018-06-05 | Memorial Sloan-Kettering Cancer Center | Antibodies to muc16 and methods of use thereof |
| JP6130307B2 (ja) | 2011-03-17 | 2017-05-17 | ザ ユニバーシティ オブ バーミンガム | 再指向性免疫療法 |
| WO2014134165A1 (en) | 2013-02-26 | 2014-09-04 | Memorial Sloan-Kettering Cancer Center | Compositions and methods for immunotherapy |
| CA2900974A1 (en) * | 2013-03-13 | 2014-10-02 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Compositions and methods for treating cancer |
| US10435453B2 (en) * | 2014-02-07 | 2019-10-08 | Mcmaster University | Trifunctional T cell-antigen coupler and methods and uses thereof |
| US20170065702A1 (en) * | 2014-02-19 | 2017-03-09 | Cangene Corporation | Methods of modulating an immune response |
| SG10202104804PA (en) | 2014-10-20 | 2021-06-29 | Juno Therapeutics Inc | Methods and compositions for dosing in adoptive cell therapy |
| SG11201704519YA (en) * | 2014-12-02 | 2017-07-28 | Roger Williams Hospital | Methods and compositons for treating cancer |
| CN115368460A (zh) | 2015-03-17 | 2022-11-22 | 纪念斯隆-凯特林癌症中心 | 抗muc16抗体及其应用 |
| AU2016243043B2 (en) | 2015-04-02 | 2021-12-09 | Memorial Sloan Kettering Cancer Center | TNFRSF14/ HVEM proteins and methods of use thereof |
| KR20180029201A (ko) | 2015-05-18 | 2018-03-20 | 티씨알2 테라퓨틱스 인크. | 융합 단백질을 이용하는 tcr 리프로그래밍을 위한 조성물 및 방법 |
| PE20230321A1 (es) | 2015-07-01 | 2023-02-22 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Nuevos peptidos y nuevas combinaciones de peptidos para el uso en la inmunoterapia contra el cancer de ovario y otros tipos de cancer |
| GB201511546D0 (en) | 2015-07-01 | 2015-08-12 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against ovarian cancer and other cancers |
| EP3363814A4 (en) | 2015-10-14 | 2019-09-25 | Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd. | CANINE ANTI-TARC ANTIBODY FOR THE TREATMENT AND DIAGNOSIS OF CANINE ATOPIC DERMATITIS |
| ES2979220T3 (es) | 2015-10-23 | 2024-09-24 | Eureka Therapeutics Inc | Constructos quiméricos de anticuerpos/receptores de células T y usos de los mismos |
| WO2018026953A1 (en) | 2016-08-02 | 2018-02-08 | TCR2 Therapeutics Inc. | Compositions and methods for tcr reprogramming using fusion proteins |
| SI3515487T1 (sl) * | 2016-09-23 | 2023-09-29 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Bispecifična protitelesa proti-MUC16-CD3 in konjugati zdravil proti-MUC16 |
| EP3848392A1 (en) | 2016-10-07 | 2021-07-14 | TCR2 Therapeutics Inc. | Compositions and methods for tcr reprogramming using fusion proteins |
| CN110177803A (zh) | 2016-11-22 | 2019-08-27 | T细胞受体治疗公司 | 用于使用融合蛋白进行tcr重新编程的组合物和方法 |
| US10239862B2 (en) | 2017-03-15 | 2019-03-26 | Silverback Therapeutics, Inc. | Benzazepine compounds, conjugates, and uses thereof |
| CN110753555A (zh) | 2017-04-19 | 2020-02-04 | 得克萨斯州大学系统董事会 | 表达工程化抗原受体的免疫细胞 |
| AU2018258045B2 (en) | 2017-04-26 | 2024-02-29 | Eureka Therapeutics, Inc. | Chimeric antibody/T-cell receptor constructs and uses thereof |
| CN107557336B (zh) * | 2017-09-15 | 2020-02-14 | 山东兴瑞生物科技有限公司 | 一种抗muc16安全型嵌合抗原受体修饰的免疫细胞及其应用 |
| AU2018349093A1 (en) | 2017-10-12 | 2020-05-28 | Mcmaster University | T cell-antigen coupler with Y182T mutation and methods and uses thereof |
| RU2747095C2 (ru) * | 2018-05-11 | 2021-04-26 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Российский научный центр рентгенорадиологии" Министерства здравоохранения российской федерации (ФГБУ "РНЦРР" Минздрава России) | Мономолекулярный химерный т-клеточный рецептор к раковому антигену са125 |
| EP3802615A4 (en) * | 2018-06-04 | 2022-04-13 | Precigen, Inc. | MUC16 SPECIFIC CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS AND USES THEREOF |
| US10640562B2 (en) | 2018-07-17 | 2020-05-05 | Mcmaster University | T cell-antigen coupler with various construct optimizations |
| US11110123B2 (en) | 2018-07-17 | 2021-09-07 | Triumvira Immunologics Usa, Inc. | T cell-antigen coupler with various construct optimizations |
| SG11202100838QA (en) * | 2018-07-26 | 2021-02-25 | Tcr2 Therapeutics Inc | Compositions and methods for tcr reprogramming using target specific fusion proteins |
| WO2020056194A1 (en) | 2018-09-12 | 2020-03-19 | Silverback Therapeutics, Inc. | Benzazepine compounds, conjugates, and uses thereof |
| JP2022500414A (ja) | 2018-09-12 | 2022-01-04 | シルバーバック セラピューティックス インコーポレイテッド | 免疫刺激性コンジュゲートにより疾患を処置する方法および組成物 |
| EP3849665A1 (en) | 2018-09-12 | 2021-07-21 | Silverback Therapeutics, Inc. | Antibody conjugates of toll-like receptor agonists |
| US20220048895A1 (en) | 2018-09-12 | 2022-02-17 | Silverback Therapeutics, Inc. | Substituted benzazepine compounds, conjugates, and uses thereof |
| EP3872087B1 (en) * | 2018-10-26 | 2024-09-25 | Shinshu University | High-efficiency method for producing genetically modified cells |
| CN113366022A (zh) * | 2018-11-16 | 2021-09-07 | 纪念斯隆凯特琳癌症中心 | 针对粘蛋白-16的抗体及其使用方法 |
| CA3120800A1 (en) | 2018-12-17 | 2020-06-25 | Revitope Limited | Twin immune cell engager |
| WO2020227538A1 (en) * | 2019-05-08 | 2020-11-12 | Memorial Sloan Kettering Cancer Center | Humanized antibodies to mucin-16 and methods of use thereof |
| WO2021019706A1 (ja) * | 2019-07-31 | 2021-02-04 | 国立大学法人信州大学 | Ｃａｒ発現免疫細胞を含む細胞集団の製造方法 |
| BR112022002720A2 (pt) | 2019-08-15 | 2022-10-11 | Silverback Therapeutics Inc | Formulações de conjugados de benzazepinas e usos das mesmas |
| AU2020358726A1 (en) | 2019-10-01 | 2022-04-07 | Silverback Therapeutics, Inc. | Combination therapy with immune stimulatory conjugates |
| JP2023514727A (ja) | 2020-02-21 | 2023-04-07 | シルバーバック セラピューティックス インコーポレイテッド | ネクチン－４抗体コンジュゲートおよびその使用 |
| KR20230047361A (ko) | 2020-07-01 | 2023-04-07 | 아르스 파마슈티컬스 인크. | 항-asgr1 항체 접합체 및 이의 용도 |
| CN116490518A (zh) | 2020-07-17 | 2023-07-25 | 西穆尔克斯股份有限公司 | 用于重定向免疫抑制信号传导的嵌合MyD88受体及相关组合物和方法 |
| EP4263600A1 (en) | 2020-12-18 | 2023-10-25 | Century Therapeutics, Inc. | Chimeric antigen receptor systems with adaptable receptor specificity |
| CA3201115A1 (en) | 2020-12-21 | 2022-06-30 | Shanshan LANG | Protease-activating cd45-gate car |
| IL303853A (en) | 2021-01-29 | 2023-08-01 | Allogene Therapeutics Inc | Knockdown or knockout of one or more TAP2, NLRC5, B2m, TRAC, RFX5, RFXAP, and RFXANK to reduce T cell recognition of allogeneic cell products |
| WO2022256449A1 (en) | 2021-06-01 | 2022-12-08 | Triumvira Immunologics Usa, Inc. | Claudin 18.2 t cell-antigen couplers and uses thereof |
| WO2024026445A1 (en) | 2022-07-29 | 2024-02-01 | Allogene Therapeutics Inc. | Engineered cells with reduced gene expression to mitigate immune cell recognition |
| CN117024596B (zh) * | 2023-08-18 | 2024-02-27 | 镜像绮点(上海)细胞技术有限公司 | 肿瘤原代细胞特异性标记与活体成像 |
Family Cites Families (41)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US505713A (en) | 1893-09-26 | Thomas j | ||
| GB8308235D0 (en) | 1983-03-25 | 1983-05-05 | Celltech Ltd | Polypeptides |
| US4816567A (en) | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
| US5057313A (en) | 1986-02-25 | 1991-10-15 | The Center For Molecular Medicine And Immunology | Diagnostic and therapeutic antibody conjugates |
| US5225539A (en) | 1986-03-27 | 1993-07-06 | Medical Research Council | Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies |
| US4946778A (en) | 1987-09-21 | 1990-08-07 | Genex Corporation | Single polypeptide chain binding molecules |
| US4978745A (en) | 1987-11-23 | 1990-12-18 | Centocor, Inc. | Immunoreactive heterochain antibodies |
| US4975369A (en) | 1988-04-21 | 1990-12-04 | Eli Lilly And Company | Recombinant and chimeric KS1/4 antibodies directed against a human adenocarcinoma antigen |
| AU5554190A (en) | 1989-05-08 | 1990-11-29 | Mark I. Farber | Process and apparatus for the recovery of precious metals from slag, tailings and other materials |
| US5625126A (en) | 1990-08-29 | 1997-04-29 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies |
| US5545806A (en) | 1990-08-29 | 1996-08-13 | Genpharm International, Inc. | Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies |
| DK0814159T3 (da) | 1990-08-29 | 2005-10-24 | Genpharm Int | Transgene, ikke-humane dyr, der er i stand til at danne heterologe antistoffer |
| LU91067I2 (fr) | 1991-06-14 | 2004-04-02 | Genentech Inc | Trastuzumab et ses variantes et dérivés immuno chimiques y compris les immotoxines |
| US5976818A (en) * | 1991-12-16 | 1999-11-02 | The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas | Monoclonal antibodies which identify the glycoprotein carrying the CA 125 epitope |
| CA2076465C (en) | 1992-03-25 | 2002-11-26 | Ravi V. J. Chari | Cell binding agent conjugates of analogues and derivatives of cc-1065 |
| US5736137A (en) | 1992-11-13 | 1998-04-07 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma |
| WO1995021381A1 (en) | 1994-02-01 | 1995-08-10 | The Rockefeller University | Methods and agents for measuring and controlling multidrug resistance |
| US6107090A (en) | 1996-05-06 | 2000-08-22 | Cornell Research Foundation, Inc. | Treatment and diagnosis of prostate cancer with antibodies to extracellur PSMA domains |
| DK0970126T3 (da) | 1997-04-14 | 2001-08-13 | Micromet Ag | Hidtil ukendt fremgangsmåde til fremstillingen af anti-humant antigen-receptorer og anvendelser deraf |
| US20030148463A1 (en) | 1997-04-14 | 2003-08-07 | Micromet Ag | Novel method for the production of anti-human antigen receptors and uses thereof |
| CU22731A1 (es) | 1998-02-05 | 2002-02-28 | Centro Inmunologia Molecular | Anticuerpo monoclonal que reconoce el oligosacárido ácido siálico n´glicolilado-galactosa-glucosa (ngcneu-gal-glu) en tumores malignos y composiciones farmacéuticas que los contienen |
| US20020119158A1 (en) | 1998-12-17 | 2002-08-29 | Corixa Corporation | Compositions and methods for the therapy and diagnosis of ovarian cancer |
| AU5062100A (en) | 1999-06-14 | 2001-01-02 | Novo Nordisk A/S | Fviia/tf activity inhibiting compounds |
| US6849425B1 (en) | 1999-10-14 | 2005-02-01 | Ixsys, Inc. | Methods of optimizing antibody variable region binding affinity |
| CA2388063C (en) | 1999-11-24 | 2010-06-08 | Immunogen, Inc. | Cytotoxic agents comprising taxanes and their therapeutic use |
| US6632979B2 (en) | 2000-03-16 | 2003-10-14 | Genentech, Inc. | Rodent HER2 tumor model |
| US6333410B1 (en) | 2000-08-18 | 2001-12-25 | Immunogen, Inc. | Process for the preparation and purification of thiol-containing maytansinoids |
| ITRM20010408A1 (it) | 2001-07-10 | 2003-01-10 | Univ Napoli Federico Ii | Mini-anticorpo umano citotossico per cellule tumorali che esprimono il recettore erbb2. |
| CA2491017A1 (en) | 2002-07-03 | 2004-01-15 | Immunogen, Inc. | Antibodies to non-shed muc1 and muc16, and uses thereof |
| US6905839B2 (en) | 2002-07-31 | 2005-06-14 | Takashi Furuta | In vivo phenotyping for human cytochrome P450 3A activity |
| GB2424273B (en) * | 2002-11-14 | 2007-06-27 | Univ Nottingham | Method for preparing tumour marker protein |
| ES2457538T3 (es) | 2003-02-20 | 2014-04-28 | Seattle Genetics, Inc. | Conjugados de anticuerpo anti-CD70-fármaco y su uso para el tratamiento de cánder y trastornos inmunológicos |
| EP1723178A4 (en) | 2004-03-12 | 2007-12-12 | Human Genome Sciences Inc | HUMAN G-PROTEIN CHEMOKIN RECEPTOR (CCR5) HDGNR10 |
| US20060040883A1 (en) | 2004-05-14 | 2006-02-23 | The Regents Of The University Of California | Methods for treating cancer using anti-Wnt2 monoclonal antibodies and siRNA |
| DK1791565T3 (en) | 2004-09-23 | 2016-08-01 | Genentech Inc | Cysteingensplejsede antibodies and conjugates |
| NZ563370A (en) | 2005-06-20 | 2010-10-29 | Genentech Inc | Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor |
| PE20090245A1 (es) * | 2007-05-08 | 2009-03-17 | Genentech Inc | Anticuerpos anti-muc16 disenados con cisteina y conjugados de anticuerpos y farmacos |
| CA2793753C (en) | 2010-03-26 | 2018-06-05 | Memorial Sloan-Kettering Cancer Center | Antibodies to muc16 and methods of use thereof |
| US9002545B2 (en) | 2011-01-07 | 2015-04-07 | Wabtec Holding Corp. | Data improvement system and method |
| JP2016523961A (ja) | 2013-07-09 | 2016-08-12 | ボード オブ リージェンツ オブ ザ ユニヴァーシティー オブ ネブラスカＢｏａｒｄ Ｏｆ Ｒｅｇｅｎｔｓ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｏｆ Ｎｅｂｒａｓｋａ | 癌を治療するための糖タンパク質の標的化方法 |
| CN115368460A (zh) | 2015-03-17 | 2022-11-22 | 纪念斯隆-凯特林癌症中心 | 抗muc16抗体及其应用 |
-
2011
- 2011-03-25 CA CA2793753A patent/CA2793753C/en active Active
- 2011-03-25 ES ES11760326T patent/ES2621874T3/es active Active
- 2011-03-25 WO PCT/US2011/030025 patent/WO2011119979A2/en active Application Filing
- 2011-03-25 DK DK11760326.6T patent/DK2552959T3/en active
- 2011-03-25 PT PT117603266T patent/PT2552959T/pt unknown
- 2011-03-25 CA CA3188287A patent/CA3188287A1/en active Pending
- 2011-03-25 EP EP17150631.4A patent/EP3222632A1/en active Pending
- 2011-03-25 HU HUE11760326A patent/HUE032519T2/en unknown
- 2011-03-25 ME MEP-2017-89A patent/ME02670B/me unknown
- 2011-03-25 JP JP2013501520A patent/JP5837567B2/ja active Active
- 2011-03-25 CA CA3002192A patent/CA3002192C/en active Active
- 2011-03-25 PL PL11760326T patent/PL2552959T3/pl unknown
- 2011-03-25 AU AU2011230590A patent/AU2011230590C1/en active Active
- 2011-03-25 US US13/635,090 patent/US9169328B2/en active Active
- 2011-03-25 EP EP11760326.6A patent/EP2552959B1/en active Active
-
2014
- 2014-10-15 JP JP2014210674A patent/JP6463068B2/ja active Active
-
2015
- 2015-09-10 US US14/850,675 patent/US9790283B2/en active Active
-
2016
- 2016-04-13 JP JP2016080611A patent/JP2016144468A/ja active Pending
-
2017
- 2017-09-05 US US15/695,311 patent/US10759869B2/en active Active
-
2018
- 2018-03-23 HK HK18104038.6A patent/HK1244496A1/zh unknown
- 2018-03-28 JP JP2018061671A patent/JP2018117634A/ja not_active Withdrawn
-
2019
- 2019-01-29 JP JP2019012878A patent/JP7100595B2/ja active Active
- 2019-12-24 JP JP2019232781A patent/JP2020072681A/ja active Pending
-
2020
- 2020-07-28 US US16/941,348 patent/US11834513B2/en active Active
-
2022
- 2022-04-06 JP JP2022063412A patent/JP2022088649A/ja active Pending
-
2024
- 2024-03-19 JP JP2024043445A patent/JP2024073610A/ja active Pending
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2024073610A (ja) | Ｍｕｃ１６に対する抗体およびその使用方法 | |
| JP2021138700A (ja) | 癌診断に有用なクローディン１８．２に対する抗体 | |
| AU2003247762B2 (en) | Antibodies to non-shed MUC1 and MUC16, and uses thereof | |
| JP2018162257A (ja) | Ｄｌｌ３モジュレーター及び使用方法 | |
| US8440188B2 (en) | Therapeutic and diagnostic anti-HSP70 antibodies | |
| TW201431880A (zh) | 抗切口３（ａｎｔｉ－ｎｏｔｃｈ３）抗體及抗體－藥物共軛體 | |
| AU2019232796B2 (en) | Antibodies to MUC16 and methods of use thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20240319 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20240319 |