JP2024035042A - ウスチロキシンを生成しないサナギタケ菌株およびその作出方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】ウスチロキシンを生成しないサナギタケ菌株およびその作出方法を提供する。【解決手段】ウスチロキシンを生成しないサナギタケ菌株は、受託番号がＣＧＭＣＣ Ｎｏ．４０２６６であり、ＣＣＭ_０２０５９遺伝子、ＣＣＭ_０２０６０遺伝子又はＣＣＭ_０２０５９～ＣＣＭ_０２０６０遺伝子を含まない。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集による前記サナギタケ菌株の作出方法は、標的遺伝子のｓｇＲＮＡヌクレオチド配列を決定、合成するステップＳ１と、標的遺伝子の上流および下流の相同アームのヌクレオチド配列を決定、合成するステップＳ２と、前記ｓｇＲＮＡヌクレオチド配列および前記相同アームヌクレオチド配列を、ベクターのｐＡＭＡ１－Ｃａｓ９－ｈｙｇに結合させ、ノックアウトベクターを構築するステップＳ３と、前記ノックアウトベクターをサナギタケのプロトプラストへＰＥＧ媒介で形質転換するステップＳ４とを含む。【選択図】なし
Description
本発明は、食用菌の遺伝育種の技術分野に関し、具体的には、ウスチロキシンを生成しないサナギタケ菌株、および、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集によるその菌株の作出方法に関する。
サナギタケ（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｍｉｌｉｔａｒｉｓ（Ｌ．） Ｆｒ．）は、ノムシタケ属（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ）のタイプ種であり、コルジセピン、虫草多糖、虫草酸、カロテノイドなどのさまざまな活性成分に富み、抗菌、抗疲労、抗腫瘍、免疫調節などさまざまな薬理活性を有し、食品と医薬品開発において良好な資源となる。現在、サナギタケは、子実体が製品として販売されるだけでなく、さまざまな食品、健康食品、化粧品などとして開発され、中国では、年間産出額が百億元規模の産業チェーンとなっている。
真菌の二次代謝産物は、多様な構造と生物活性を有する。本発明者らのグループは、高速液体クロマトグラフィー－高分解能質量分析により、サナギタケがウスチロキシンＢを生成することを確認できた。ウスチロキシンＢの含有量は、蚕蛹を栽培基質とした虫体と菌糸との混合物のなかで１０６．５μｇ／ｇとなり、小麦培地を栽培基質とした子実体のなかで６６．９μｇ／ｇとなる。また、異なる原産地のものにより栽培されたサナギタケの子実体からいずれもウスチロキシンＢが検出された（王安寧、光によって制御された２つのサナギタケの二次代謝産物合成遺伝子クラスターに関する研究、中国科学院大学修士論文、２０２２）。
ウスチロキシンは、稲こうじ病菌から生成されたマイコトキシンであり、水源やイネを汚染し得る。現在、ウスチロキシンＢの毒性試験は報告されていないが、マウスを用いたウスチロキシンＡの毒性試験によれば、４００μｇ／ｋｇ体重の投与量で、ウスチロキシンＡをマウスの腹腔内に連続投与したところ、１０～１２日間経過後、マウス肝臓および腎臓の病変が観察された。現在のマウス毒性試験におけるウスチロキシンＡの投与量を参考にし、サナギタケの規定摂取量の範囲内（旧衛生部はサナギタケの摂取量を２ｇ／日以下とした）であれば、ウスチロキシンの含有量によるサナギタケの食安全問題を起こさないが、ウスチロキシンＢの毒性は現在不明であり、健康および亜健康の人に対するウスチロキシンの毒性研究も少ない。したがって、ウスチロキシンを生成しないサナギタケ菌株の作出は重要な意義を持つことである。
本発明は、上記の問題に鑑みてなされたものであり、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ／Ｃａｓ９）遺伝子編集により、ウスチロキシンを生成しないサナギタケ菌株を作出し、サナギタケの安全生産に新たな菌株を提供し、その新品種の指向的改良のための遺伝物質を提供することを目的とした。
一局面において、本発明は、ウスチロキシンを生成しないサナギタケ菌株を提供した。その菌株は、現在、中国微生物菌種保藏管理委員会普通微生物中心に寄託された（住所：北京市朝▲よう▼区北辰西路１号院３号、中国科学院微生物研究所、郵便番号：１００１０１、受託番号：ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．４０２６６、受託日：２０２２年８月３日）。
他の局面において、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集によるウスチロキシンを生成しないサナギタケ菌株の作出方法を提供し、その方法は以下のステップを含む。
ステップＳ１： 標的遺伝子のｓｇＲＮＡヌクレオチド配列を決定、合成する。
ステップＳ２： 標的遺伝子の上流および下流の相同アームのヌクレオチド配列を決定、合成する。
ステップＳ３： ステップＳ１で得られたｓｇＲＮＡヌクレオチド配列およびステップＳ２で得られた相同アームヌクレオチド配列を、ベクターのｐＡＭＡ１－Ｃａｓ９－ｈｙｇに結合させ、ノックアウトベクターを構築する。
ステップＳ４： ステップＳ３で上述したノックアウトベクターをサナギタケのプロトプラストへＰＥＧ媒介で形質転換し、ノックアウトベクターを含有する形質転換体を得る。
ステップＳ１： 標的遺伝子のｓｇＲＮＡヌクレオチド配列を決定、合成する。
ステップＳ２： 標的遺伝子の上流および下流の相同アームのヌクレオチド配列を決定、合成する。
ステップＳ３： ステップＳ１で得られたｓｇＲＮＡヌクレオチド配列およびステップＳ２で得られた相同アームヌクレオチド配列を、ベクターのｐＡＭＡ１－Ｃａｓ９－ｈｙｇに結合させ、ノックアウトベクターを構築する。
ステップＳ４： ステップＳ３で上述したノックアウトベクターをサナギタケのプロトプラストへＰＥＧ媒介で形質転換し、ノックアウトベクターを含有する形質転換体を得る。
本発明の実施形態において、標的遺伝子は、サナギタケのＣＣＭ_０２０５９遺伝子、ＣＣＭ_０２０６０遺伝子又はＣＣＭ_０２０５９～ＣＣＭ_０２０６０遺伝子である。ＣＣＭ_０２０５９遺伝子とＣＣＭ_０２０６０遺伝子のヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号１と配列番号２に示す。
本発明の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集によるウスチロキシンを生成しないサナギタケ菌株の作出方法はさらに以下のステップを含む。
ステップＳ５： ゲノムＤＮＡレベルで、ＰＣＲを用いてステップＳ４で得られた形質転換体から、前記標的遺伝子をノックアウトした形質転換体、すなわち陽性形質転換体を同定する。
ステップＳ６： ｃＤＮＡレベルで、ステップＳ５で得られた陽性形質転換体を半定量的ＲＴ－ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ＰＣＲ）で検証し、陽性形質転換体の標的遺伝子が転写レベルで発現しないことを確認する。
ステップＳ７： ステップＳ６で得られた陽性形質転換体を継代培養し、ベクターが削除された外来遺伝子挿入のないサナギタケ菌株を得る。
ステップＳ８： ステップＳ７で確認されたサナギタケ菌株の子実体のウスチロキシン含有量を検出する。
ステップＳ５： ゲノムＤＮＡレベルで、ＰＣＲを用いてステップＳ４で得られた形質転換体から、前記標的遺伝子をノックアウトした形質転換体、すなわち陽性形質転換体を同定する。
ステップＳ６： ｃＤＮＡレベルで、ステップＳ５で得られた陽性形質転換体を半定量的ＲＴ－ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ＰＣＲ）で検証し、陽性形質転換体の標的遺伝子が転写レベルで発現しないことを確認する。
ステップＳ７： ステップＳ６で得られた陽性形質転換体を継代培養し、ベクターが削除された外来遺伝子挿入のないサナギタケ菌株を得る。
ステップＳ８： ステップＳ７で確認されたサナギタケ菌株の子実体のウスチロキシン含有量を検出する。
第３局面において、本発明は、ｐＡＭＡ１－Ｃａｓ９－ｈｙｇをバックボーンベクターとして、さらに標的遺伝子のｓｇＲＮＡヌクレオチド配列および標的遺伝子の上流および下流の相同アームのヌクレオチド配列を含み、前記標的遺伝子がＣＣＭ_０２０５９遺伝子（配列番号１）、ＣＣＭ_０２０６０遺伝子（配列番号２）又はＣＣＭ_０２０５９～ＣＣＭ_０２０６０遺伝子であるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集ベクターを提供する。
第４局面において、本発明は、配列番号１又は配列番号２に示すサナギタケウのスチロキシン合成の制御に関与するヌクレオチド配列を提供する。
本発明は、従来の工場で生産されたサナギタケ菌株と比べて、明らかに有益な効果を有する。本発明は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術により、サナギタケゲノムにおけるＣＣＭ_０２０５９遺伝子、ＣＣＭ_０２０６０遺伝子又はＣＣＭ_０２０５９～ＣＣＭ_０２０６０遺伝子をノックアウトすることで、子実体の生長に影響せず、ウスチロキシンを生成しないサナギタケ菌株を作出した。サナギタケの大量摂取による潜在的な健康被害を回避することができ、ゲノムへの遺伝子組換えによる食品の安全問題も回避できるため、サナギタケの指向的育種にアイデアおよび実験的根拠を提供した。
以下、具体的な実施形態を参照しながら、本発明の技術案を明瞭且つ完全に説明し、以下で説明される実施形態が本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものとみなすべきではないことが無論である。本発明の実施形態をもとに、当業者が発明能力を用いることなく得た全ての他の実施形態も、本発明の保護範囲に属する。
本発明者は、サナギタケゲノムにおける１つの遺伝子クラスター（ＣＣＭ_０２０５４～ＣＣＭ_０２０６６）がウスチロキシンＢの合成に関連していることを見出し、さらにウスチロキシンＢ合成遺伝子クラスターのコア遺伝子であるＣＣＭ_０２０５９およびＣＣＭ_０２０６０がコードする遺伝子産物であるタンパク質に、いずれも同一の酸化酵素の保存ドメインであるＤＵＦ３３２８が含まれることを確認できた。そのドメインは、ウスチロキシンの初期環状ペプチド骨格の形成に重要な役割を持っている。したがって、サナギタケゲノムにおけるＣＣＭ_０２０５９およびＣＣＭ_０２０６０遺伝子をノックアウトし、ウスチロキシン合成遺伝子クラスターを破壊すれば、ウスチロキシンを生成しないサナギタケ菌株を得ることができる。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集技術は、ゲノムへの指向的編集により菌株改良を実現可能であり、交雑、変異、家畜化などの従来の育種法と比べ、目的性が明確、操作時間が短い、簡便且つ効率的、外来ＤＮＡ断片の挿入がないなどのメリットを有する。さらに、ベクター要素ＡＭＡ１（糸状菌の自己複製ヌクレオチド配列）は、ベクターが染色体と独立して複製することを維持できるため、ベクターが真菌のゲノムにほとんど挿入されない。抗菌薬の選択圧がない条件下で、形質転換体のなかでベクターの削除を容易に実現できるため、真の外来遺伝子挿入のない遺伝子編集を実現でき、遺伝子導入の安全性の問題を回避することが可能である。
したがって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集技術を用いてサナギタケゲノムにおけるＣＣＭ_０２０５９およびＣＣＭ_０２０６０遺伝子をノックアウトし、ウスチロキシン合成遺伝子クラスターを破壊し、すなわちウスチロキシンを合成する能力を失わせることができれば、ウスチロキシンを生成しないサナギタケ菌株を得ることが可能となり、本発明の実現に至る。
一局面において、本発明は、ウスチロキシンを生成しないサナギタケ菌株を提供する。その菌株のゲノムは、ＣＣＭ_０２０５９遺伝子、ＣＣＭ_０２０６０遺伝子又はその両方、すなわちＣＣＭ_０２０５９～ＣＣＭ_０２０６０遺伝子が欠失する。本発明に係るサナギタケの遺伝子欠失菌株の平板培地における菌糸は、生長速度および光による変色（カロテノイドの蓄積）の程度が野生株と大きな差がなく、小麦培地および蚕蛹で子実体まで正常に発育できる。よって、遺伝子欠失によるサナギタケの栽培性状への悪影響がない。
本発明の実施形態において、ＣＣＭ_０２０５９遺伝子のヌクレオチド配列は配列番号１に示し、ＣＣＭ_０２０６０遺伝子のヌクレオチド配列は配列番号２に示す。
他の局面において、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集によるウスチロキシンを生成しないサナギタケ菌株の作出方法を提供し、その方法は、以下のステップを含む。
ステップＳ１： 標的遺伝子のｓｇＲＮＡヌクレオチド配列を決定、合成する。
ステップＳ２： 標的遺伝子の上流および下流の相同アームのヌクレオチド配列を決定、合成する。
ステップＳ３： ステップＳ１で得られたｓｇＲＮＡヌクレオチド配列およびステップＳ２で得られた相同アームヌクレオチド配列を、ベクターのｐＡＭＡ１－Ｃａｓ９－ｈｙｇに結合させ、ノックアウトベクターを構築する。
ステップＳ４： ステップＳ３で上述したノックアウトベクターをサナギタケのプロトプラストへＰＥＧ媒介で形質転換し、ノックアウトベクターを含有する形質転換体を得る。
ステップＳ１： 標的遺伝子のｓｇＲＮＡヌクレオチド配列を決定、合成する。
ステップＳ２： 標的遺伝子の上流および下流の相同アームのヌクレオチド配列を決定、合成する。
ステップＳ３： ステップＳ１で得られたｓｇＲＮＡヌクレオチド配列およびステップＳ２で得られた相同アームヌクレオチド配列を、ベクターのｐＡＭＡ１－Ｃａｓ９－ｈｙｇに結合させ、ノックアウトベクターを構築する。
ステップＳ４： ステップＳ３で上述したノックアウトベクターをサナギタケのプロトプラストへＰＥＧ媒介で形質転換し、ノックアウトベクターを含有する形質転換体を得る。
本発明の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集によるウスチロキシンを生成しないサナギタケ菌株の作出方法は、さらに以下のステップを含む。
ステップＳ５： ゲノムＤＮＡレベルでは、ＰＣＲを用いてステップＳ４で得られた形質転換体から、標的遺伝子をノックアウトした形質転換体、すなわち陽性形質転換体を同定する。
ステップＳ６： ｃＤＮＡレベルでは、ステップＳ５で得られた陽性形質転換体を半定量的ＲＴ－ＰＣＲで検証し、陽性形質転換体の標的遺伝子が転写レベルで発現しないことを確認する。
ステップＳ７： ステップＳ６で得られた陽性形質転換体を継代培養し、ベクターが削除された外来遺伝子挿入のないサナギタケ菌株を得る。
ステップＳ８： ステップＳ７で確認されたサナギタケ菌株の子実体のウスチロキシン含有量を検出する。
ステップＳ５： ゲノムＤＮＡレベルでは、ＰＣＲを用いてステップＳ４で得られた形質転換体から、標的遺伝子をノックアウトした形質転換体、すなわち陽性形質転換体を同定する。
ステップＳ６： ｃＤＮＡレベルでは、ステップＳ５で得られた陽性形質転換体を半定量的ＲＴ－ＰＣＲで検証し、陽性形質転換体の標的遺伝子が転写レベルで発現しないことを確認する。
ステップＳ７： ステップＳ６で得られた陽性形質転換体を継代培養し、ベクターが削除された外来遺伝子挿入のないサナギタケ菌株を得る。
ステップＳ８： ステップＳ７で確認されたサナギタケ菌株の子実体のウスチロキシン含有量を検出する。
本発明の実施形態において、標的遺伝子は、サナギタケゲノムにおけるＣＣＭ_０２０５９、ＣＣＭ_０２０６０又はＣＣＭ_０２０５９～ＣＣＭ_０２０６０遺伝子である。
本発明の実施形態において、ｓｇＲＮＡヌクレオチド配列は、標的遺伝子のプロトスペーサー隣接モチーフ（Ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｏｔｉｆ。ＰＡＭ）の上流２０ｂｐ塩基、すなわち５′－Ｎ２０－ＮＧＧ－３′であり、ＮＧＧはＰＡＭヌクレオチド配列であり、Ｎ２０は２０ｂｐ塩基の認識ヌクレオチド配列である。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を用いて標的遺伝子に二本鎖切断部位（Ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋ、ＤＳＢ）を形成させ、真菌自身のＤＳＢの修復メカニズムにより、両端に相同アームヌクレオチド配列を導入し、相同組換え修復を開始する。また、上流の相同アームヌクレオチド配列は、標的遺伝子のコーディング領域の上流に位置し、下流の相同アームヌクレオチド配列は、標的遺伝子のコーディング領域の下流に位置する。上流および下流の相同アームヌクレオチド配列を強固に結合することで、抵抗性遺伝子挿入のない状態で標的遺伝子を完全に欠失させる。
本発明の具体的な実施形態において、ＣＣＭ_０２０５９遺伝子について、つまりＣＣＭ_０２０５９遺伝子のみをノックアウトする場合、ｓｇＲＮＡヌクレオチド配列はＴａｒｇｅｔ１であり、そのヌクレオチド配列は配列番号３に示し、合成されたＴａｒｇｅｔ１発現カセットの配列は配列番号４に示す。
本発明の具体的な実施形態において、ＣＣＭ_０２０５９遺伝子について、つまりＣＣＭ_０２０５９遺伝子のみをノックアウトする場合、その上流の相同アームヌクレオチド配列は配列番号５に示し、下流の相同アームヌクレオチド配列は配列番号６に示す。上流の相同アームヌクレオチド配列を合成するためのプライマーはｕｐ １－Ｆ（配列番号７）／ｕｐ １－Ｒ（配列番号８）であり、下流の相同アームヌクレオチド配列を合成するためのプライマーはｄｏｗｎ １－Ｆ（配列番号９）／ｄｏｗｎ １－Ｒ（配列番号１０）である。
本発明の具体的な実施形態において、ＣＣＭ_０２０６０遺伝子について、つまりＣＣＭ_０２０６０遺伝子のみをノックアウトする場合、ｓｇＲＮＡヌクレオチド配列はＴａｒｇｅｔ２であり、そのヌクレオチド配列は配列番号１１に示す。合成されたＴａｒｇｅｔ２発現カセットの配列は配列番号１２に示す。
本発明の具体的な実施形態において、ＣＣＭ_０２０６０遺伝子について、つまりＣＣＭ_０２０６０遺伝子のみをノックアウトする場合、その上流の相同アームヌクレオチド配列は配列番号１３に示し、下流の相同アームヌクレオチド配列は配列番号１４に示す。上流および下流の相同アームヌクレオチド配列を合成するためのプライマーは、それぞれｕｐ ２－Ｆ（配列番号１５）／ｕｐ ２－Ｒ（配列番号１６）およびｄｏｗｎ １－Ｆ（配列番号１７）／ｄｏｗｎ １－Ｒ（配列番号１８）である。
ＣＣＭ_０２０５９遺伝子がＣＣＭ_０２０６０遺伝子と隣接するため、遺伝子間のスペーサーヌクレオチド配列にｓｇＲＮＡを導入し、上流の相同アームヌクレオチド配列をＣＣＭ_０２０５９遺伝子のコーディング領域の上流に位置させ、下流の相同アームヌクレオチド配列をＣＣＭ_０２０６０遺伝子のコーディング領域の下流に位置させれば、ＣＣＭ_０２０５９遺伝子と、ＣＣＭ_０２０６０遺伝子と、そのスペーサー配列とを同時にノックアウトすることができる。すなわち、ＣＣＭ_０２０５９～ＣＣＭ_０２０６０遺伝子を同時にノックアウトすることができる。
したがって、本発明の他の実施形態において、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集によるウスチロキシンを生成しないサナギタケ菌株の作出方法を提供し、その方法は以下のステップを含む。
ステップＳ１： ＣＣＭ_０２０５９遺伝子とＣＣＭ_０２０６０遺伝子との間のスペーサー配列のｓｇＲＮＡヌクレオチド配列を決定、合成する。
ステップＳ２： ＣＣＭ_０２０５９～ＣＣＭ_０２０６０遺伝子の上流および下流の相同アームのヌクレオチド配列を決定、合成する。
ステップＳ３： ステップＳ１で得られたｓｇＲＮＡヌクレオチド配列およびステップＳ２で得られた相同アームヌクレオチド配列を、ベクターのｐＡＭＡ１－Ｃａｓ９－ｈｙｇに結合させ、ノックアウトベクターを構築する。
ステップＳ４： ステップＳ３で上述したノックアウトベクターをサナギタケのプロトプラストへＰＥＧ媒介で形質転換し、ノックアウトベクターを含有する形質転換体を得る。
ステップＳ１： ＣＣＭ_０２０５９遺伝子とＣＣＭ_０２０６０遺伝子との間のスペーサー配列のｓｇＲＮＡヌクレオチド配列を決定、合成する。
ステップＳ２： ＣＣＭ_０２０５９～ＣＣＭ_０２０６０遺伝子の上流および下流の相同アームのヌクレオチド配列を決定、合成する。
ステップＳ３： ステップＳ１で得られたｓｇＲＮＡヌクレオチド配列およびステップＳ２で得られた相同アームヌクレオチド配列を、ベクターのｐＡＭＡ１－Ｃａｓ９－ｈｙｇに結合させ、ノックアウトベクターを構築する。
ステップＳ４： ステップＳ３で上述したノックアウトベクターをサナギタケのプロトプラストへＰＥＧ媒介で形質転換し、ノックアウトベクターを含有する形質転換体を得る。
具体的な実施形態において、ＣＣＭ_０２０５９遺伝子とＣＣＭ_０２０６０遺伝子との間のスペーサー配列は配列番号１９に示す。
具体的な実施形態において、ＣＣＭ_０２０５９～ＣＣＭ_０２０６０遺伝子について、つまりＣＣＭ_０２０５９遺伝子およびＣＣＭ_０２０６０遺伝子を同時にノックアウトする場合、ｓｇＲＮＡヌクレオチド配列はＴａｒｇｅｔ３であり、そのヌクレオチド配列を配列番号２０に示す。合成されたＴａｒｇｅｔ３発現カセットの配列は配列番号２１に示す。
具体的な実施形態において、ＣＣＭ_０２０５９～ＣＣＭ_０２０６０遺伝子の上流の相同アームヌクレオチド配列は配列番号２２に示し、下流の相同アームヌクレオチド配列は配列番号２３に示す。上流の相同アームヌクレオチド配列を合成するためのプライマーはｕｐ ３－Ｆ（配列番号２４）／ｕｐ ３－Ｒ（配列番号２５）であり、下流の相同アームヌクレオチド配列を合成するためのプライマーはｄｏｗｎ ３－Ｆ（配列番号２６）／ｄｏｗｎ ３－Ｒ（配列番号２７）である。
したがって、ＣＣＭ_０２０５９～ＣＣＭ_０２０６０遺伝子をノックアウトしたサナギタケ菌株を得る実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集によるウスチロキシンを生成しないサナギタケ菌株の作出方法は、具体的に以下のステップを含む。
ステップＳ１： Ｔａｒｇｅｔ３のヌクレオチド配列（配列番号２０）を設計し、Ｔａｒｇｅｔ３発現カセットの配列を合成する。
そのうち、合成されたＴａｒｇｅｔ３発現カセットのヌクレオチド配列は配列番号２１である。
そのうち、合成されたＴａｒｇｅｔ３発現カセットのヌクレオチド配列は配列番号２１である。
ステップＳ２： ＣＣＭ_０２０５９～ＣＣＭ_０２０６０遺伝子の上流および下流の相同アームヌクレオチド配列を合成するためのプライマーを設計し、ＰＣＲにより上流および下流の相同アームヌクレオチド配列を増幅する。
そのうち、上流および下流の相同アームヌクレオチド配列に基づいて、プライマーであるｕｐ ３－Ｆ／ｕｐ ３－Ｒおよびｄｏｗｎ ３－Ｆとｄｏｗｎ ３－Ｒを設計する。野生株のサナギタケ菌株のゲノムＤＮＡを鋳型として、上流の相同アームヌクレオチド配列（配列番号２２）および下流の相同アームヌクレオチド配列（配列番号２３）をそれぞれ増幅する。ＰＣＲ増幅産物を回収し、前記プライマーヌクレオチド配列は以下である。
ｕｐ ３－Ｆ：
５′－ＡＣＣＣＴＧＡＴＡＡＡＴＧＣＴＴＣＡＡＴＡＡＴＡＴＴｇｔｃｇａｃａａｇａｇａｇｇｔｇｇｔｃｃ－３′（配列番号２４）、
ｕｐ ３－Ｒ：５′－ＡＧＡＴＴＣＧＣＡＧｃｃｔｇｇａｃａａｔｃｔａｃｔｃｃｇａｔｔｃａ－３′（配列番号２５）、
ｄｏｗｎ ３－Ｆ：５′－ａｇａｔｔｇｔｃｃａｇｇＣＴＧＣＧＡＡＴＣＴＧＡＧＴＧＧＴＴＧＧ－３′（配列番号２６）、
ｄｏｗｎ ３－Ｒ：
５′－ＡＣＴＣＡＴＡＣＴＣＴＴＣＣＴＴＴＴＴＣＡＡＴＡＴＴＣＡＧＣＧＣＣＣＴＧＴＡＴＣＣＴＴＴＧＡ－３′（配列番号２７）。
そのうち、上流および下流の相同アームヌクレオチド配列に基づいて、プライマーであるｕｐ ３－Ｆ／ｕｐ ３－Ｒおよびｄｏｗｎ ３－Ｆとｄｏｗｎ ３－Ｒを設計する。野生株のサナギタケ菌株のゲノムＤＮＡを鋳型として、上流の相同アームヌクレオチド配列（配列番号２２）および下流の相同アームヌクレオチド配列（配列番号２３）をそれぞれ増幅する。ＰＣＲ増幅産物を回収し、前記プライマーヌクレオチド配列は以下である。
ｕｐ ３－Ｆ：
５′－ＡＣＣＣＴＧＡＴＡＡＡＴＧＣＴＴＣＡＡＴＡＡＴＡＴＴｇｔｃｇａｃａａｇａｇａｇｇｔｇｇｔｃｃ－３′（配列番号２４）、
ｕｐ ３－Ｒ：５′－ＡＧＡＴＴＣＧＣＡＧｃｃｔｇｇａｃａａｔｃｔａｃｔｃｃｇａｔｔｃａ－３′（配列番号２５）、
ｄｏｗｎ ３－Ｆ：５′－ａｇａｔｔｇｔｃｃａｇｇＣＴＧＣＧＡＡＴＣＴＧＡＧＴＧＧＴＴＧＧ－３′（配列番号２６）、
ｄｏｗｎ ３－Ｒ：
５′－ＡＣＴＣＡＴＡＣＴＣＴＴＣＣＴＴＴＴＴＣＡＡＴＡＴＴＣＡＧＣＧＣＣＣＴＧＴＡＴＣＣＴＴＴＧＡ－３′（配列番号２７）。
ステップＳ３： ステップＳ１で得られたＴａｒｇｅｔ３およびステップＳ２で得られた相同アームヌクレオチド配列を、ベクターのｐＡＭＡ１－Ｃａｓ９－ｈｙｇに結合し、ノックアウトベクターを構築する。
ステップＳ３では、まず、ステップＳ１で合成されたＴａｒｇｅｔ３発現カセットの配列をベクターのｐＡＭＡ１－Ｃａｓ９－ｈｙｇに結合し、結合に成功したベクターをｐＡＭＡ１－Ｃａｓ９－ｈｙｇ－Ｔａｒｇｅｔ３と名づける。結合に成功したか否かは、以下のように検証できる。結合されたベクターを、例えばＥ． ｃｏｌｉ ＤＨ５αコンピテントセルに形質転換し、Ｅ． ｃｏｌｉコロニーを選別して、ステップＳ１で得られえたＴａｒｇｅｔ３がベクターのｐＡＭＡ１－Ｃａｓ９－ｈｙｇに結合されたか否かをＰＣＲにより検証する。ＰＣＲに使用したプライマーのヌクレオチド配列は配列番号２８と配列番号２９に示す。ＰＣＲにより正しく同定されたコロニーを増幅し、ベクターを抽出して配列を決定し、その結果をステップＳ１で得られたＴａｒｇｅｔ３発現カセットの配列と比較する。
次に、ステップＳ２で得られた上流および下流の相同アームヌクレオチド配列をベクターのｐＡＭＡ１－Ｃａｓ９－ｈｙｇ－Ｔａｒｇｅｔ３に結合し、結合に成功したベクターをｐＡＭＡ１－Ｃａｓ９－ｈｙｇ－Ｔａｒｇｅｔ３－ＨＲと名づけ、すなわちノックアウトベクターになる。結合に成功したか否かは、以下のように検証できる。結合されたベクターを、例えばＥ． ｃｏｌｉ ＤＨ５αコンピテントセルに形質転換し、Ｅ． ｃｏｌｉコロニーを選別して、ステップＳ２で得られた上流および下流の相同アームヌクレオチド配列がｐＡＭＡ１－Ｃａｓ９－ｈｙｇ－Ｔａｒｇｅｔ３ベクターに結合されたか否かをＰＣＲにより検証する。ＰＣＲに使用したプライマーのヌクレオチド配列は配列番号３０と配列番号３１に示す。ＰＣＲにより正しく同定されたコロニーを増幅し、ベクターを抽出して配列を決定し、その結果をステップＳ２で得られた上流および下流の相同アームヌクレオチド配列と比較する。
ステップＳ３では、まず、ステップＳ１で合成されたＴａｒｇｅｔ３発現カセットの配列をベクターのｐＡＭＡ１－Ｃａｓ９－ｈｙｇに結合し、結合に成功したベクターをｐＡＭＡ１－Ｃａｓ９－ｈｙｇ－Ｔａｒｇｅｔ３と名づける。結合に成功したか否かは、以下のように検証できる。結合されたベクターを、例えばＥ． ｃｏｌｉ ＤＨ５αコンピテントセルに形質転換し、Ｅ． ｃｏｌｉコロニーを選別して、ステップＳ１で得られえたＴａｒｇｅｔ３がベクターのｐＡＭＡ１－Ｃａｓ９－ｈｙｇに結合されたか否かをＰＣＲにより検証する。ＰＣＲに使用したプライマーのヌクレオチド配列は配列番号２８と配列番号２９に示す。ＰＣＲにより正しく同定されたコロニーを増幅し、ベクターを抽出して配列を決定し、その結果をステップＳ１で得られたＴａｒｇｅｔ３発現カセットの配列と比較する。
次に、ステップＳ２で得られた上流および下流の相同アームヌクレオチド配列をベクターのｐＡＭＡ１－Ｃａｓ９－ｈｙｇ－Ｔａｒｇｅｔ３に結合し、結合に成功したベクターをｐＡＭＡ１－Ｃａｓ９－ｈｙｇ－Ｔａｒｇｅｔ３－ＨＲと名づけ、すなわちノックアウトベクターになる。結合に成功したか否かは、以下のように検証できる。結合されたベクターを、例えばＥ． ｃｏｌｉ ＤＨ５αコンピテントセルに形質転換し、Ｅ． ｃｏｌｉコロニーを選別して、ステップＳ２で得られた上流および下流の相同アームヌクレオチド配列がｐＡＭＡ１－Ｃａｓ９－ｈｙｇ－Ｔａｒｇｅｔ３ベクターに結合されたか否かをＰＣＲにより検証する。ＰＣＲに使用したプライマーのヌクレオチド配列は配列番号３０と配列番号３１に示す。ＰＣＲにより正しく同定されたコロニーを増幅し、ベクターを抽出して配列を決定し、その結果をステップＳ２で得られた上流および下流の相同アームヌクレオチド配列と比較する。
ステップＳ４： ステップＳ３で得られたノックアウトベクターのｐＡＭＡ１－Ｃａｓ９－ｈｙｇ－Ｔａｒｇｅｔ３－ＨＲを、サナギタケのプロトプラストへＰＥＧ媒介で形質転換し、ノックアウトベクターのｐＡＭＡ１－Ｃａｓ９－ｈｙｇ－Ｔａｒｇｅｔ３－ＨＲを含む形質転換体を得る。
そのうち、例えば、ノックアウトベクターのｐＡＭＡ１－Ｃａｓ９－ｈｙｇ－Ｔａｒｇｅｔ３－ＨＲを含む形質転換体は、５００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンを加えたプロトプラスト再生培地プレートでスクリーニングすることにより得ることができる。
そのうち、例えば、ノックアウトベクターのｐＡＭＡ１－Ｃａｓ９－ｈｙｇ－Ｔａｒｇｅｔ３－ＨＲを含む形質転換体は、５００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンを加えたプロトプラスト再生培地プレートでスクリーニングすることにより得ることができる。
２つの遺伝子をノックアウトする（すなわちＣＣＭ_０２０５９～ＣＣＭ_０２０６０遺伝子をノックアウトする）更なる実施形態において、前記方法はステップＳ５をさらに含んでもよい。つまり、ゲノムＤＮＡレベルでは、ＰＣＲを用いてステップＳ４で得られた形質転換体から、標的遺伝子をノックアウトした形質転換体、すなわち陽性形質転換体を同定する。また、ＣＣＭ_０２０５９～ＣＣＭ_０２０６０遺伝子をノックアウトした形質転換体、すなわち陽性形質転換体を同定するために、ステップＳ４で得られた形質転換体のゲノムＤＮＡを抽出し、これを鋳型として、プライマーの配列番号３２および配列番号３３を用いて形質転換体に対してＰＣＲを行う。
２つの遺伝子をノックアウトする（すなわちＣＣＭ_０２０５９遺伝子およびＣＣＭ_０２０６０遺伝子をノックアウトする）更なる実施形態において、前記方法はステップＳ６をさらに含んでもよい。つまり、ｃＤＮＡレベルでは、ステップＳ５で得られた陽性形質転換体を半定量的ＲＴ－ＰＣＲで検証し、陽性形質転換体が転写レベルで発現しないことを確認する。また、ステップＳ５で得られた陽性形質転換体のＲＮＡを抽出してｃＤＮＡに逆転写し、これを鋳型として、半定量的プライマーの配列番号３４および配列番号３５を用いて半定量的ＲＴ－ＰＣＲを行い、ステップＳ５で得られた陽性形質転換体が転写レベルで発現しないことを確認する。転写レベルでは、ＣＣＭ_０２０５９～ＣＣＭ_０２０６０遺伝子をノックアウトしたことを検証する。
２つの遺伝子をノックアウトする更なる実施形態において、前記方法はステップＳ７をさらに含む。ウスチロキシンを合成しないことが確認された陽性形質転換体を、分生胞子の分離および継代により遊離ベクターの削除を実現し、蚕蛹又は小麦培地で培養し、ウスチロキシンを生成せずに子実体まで正常に発育するサナギタケ菌株を得る。
２つの遺伝子をノックアウトする更なる実施形態において、前記方法はステップＳ８をさらに含んでもよい。つまり、ステップＳ７で得られたウスチロキシン含有量を検出する。例えば、ステップＳ７で得られたサナギタケ菌株の子実体のウスチロキシンを抽出して精製し、高速液体クロマトグラフィーを用いてそのウスチロキシン含有量を検出する。
第３局面において、本発明は、ｐＡＭＡ１－Ｃａｓ９－ｈｙｇをバックボーンベクターとして、標的遺伝子のｓｇＲＮＡヌクレオチド配列および標的遺伝子の上流および下流の相同アームのヌクレオチド配列をさらに含み、前記標的遺伝子がＣＣＭ_０２０５９遺伝子（配列番号１）、ＣＣＭ_０２０６０遺伝子（配列番号２）又はＣＣＭ_０２０５９～ＣＣＭ_０２０６０遺伝子であるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集ベクターを提供する。
実施形態
以下、具体的な実施形態を参照しながら本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は本発明を説明するためのものにすぎず、本発明の範囲を制限するためのものではない。
以下、具体的な実施形態を参照しながら本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は本発明を説明するためのものにすぎず、本発明の範囲を制限するためのものではない。
以下の実施例において、特に説明のない限り、使用される実験方法は、いずれも常用方法であり、当該技術分野の文献に記載された技術又は条件、或いは製品説明書に従って実施される。以下の実施例において、特に説明のない限り、使用される材料、試薬などは、いずれも購入できるものである。
以下の実施例で使用された野生株のサナギタケ菌株はＣＧＭＣＣ ３．１６３２３であり、使用されたベクターのｐＡＭＡ１－Ｃａｓ９－ｈｙｇは中国科学院微生物研究所の劉鋼研究グループから提供され、２つの遺伝子をノックアウトすることを例として具体的な実施形態を説明する。
１．１ ｓｇＲＮＡの設計
標的ヌクレオチド配列として、サナギタケゲノムＣＣＭ_０２０５９遺伝子とＣＣＭ_０２０６０遺伝子との間のスペーサー配列を選択し、サナギタケのＣＭ０１（ＣＧＭＣＣ ３．１４２４２）ゲノム（Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｓｅｃｔＰａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｆｕｎｇｕｓ Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓｍｉｌｉｔａｒｉｓ，ａ ｖａｌｕｅｄ ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ｃｈｉｎｅｓｅｍｅｄｉｃｉｎｅ．ｇｅｎｏｍｅｂｉｏｌｏｇｙ，２０１２，ｒ１１６）を参考ゲノムとして、ＥｕｋａｒｙｏｔｉｃＰａｔｈｏｇｅｎ ＣＲＩＳＰＲｇｕｉｄｅｒＮＡ／ＤＮＡ Ｄｅｓｉｇｎ Ｔｏｏｌ（ｈｔｔｐ：／／ｇｒｎａ．ｃｔｅｇｄ．ｕｇａ．ｅｄｕ／）でｓｇＲＮＡをオンラインで設計した。パラメータはいずれもデフォルトのパラメータを使用した。
標的ヌクレオチド配列として、サナギタケゲノムＣＣＭ_０２０５９遺伝子とＣＣＭ_０２０６０遺伝子との間のスペーサー配列を選択し、サナギタケのＣＭ０１（ＣＧＭＣＣ ３．１４２４２）ゲノム（Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｓｅｃｔＰａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｆｕｎｇｕｓ Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓｍｉｌｉｔａｒｉｓ，ａ ｖａｌｕｅｄ ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ｃｈｉｎｅｓｅｍｅｄｉｃｉｎｅ．ｇｅｎｏｍｅｂｉｏｌｏｇｙ，２０１２，ｒ１１６）を参考ゲノムとして、ＥｕｋａｒｙｏｔｉｃＰａｔｈｏｇｅｎ ＣＲＩＳＰＲｇｕｉｄｅｒＮＡ／ＤＮＡ Ｄｅｓｉｇｎ Ｔｏｏｌ（ｈｔｔｐ：／／ｇｒｎａ．ｃｔｅｇｄ．ｕｇａ．ｅｄｕ／）でｓｇＲＮＡをオンラインで設計した。パラメータはいずれもデフォルトのパラメータを使用した。
１．２ 中間ベクターのｐＡＭＡ１－Ｃａｓ９－ｈｙｇ－Ｔａｒｇｅｔ３の構築
ａ．Ｔａｒｇｅｔ３発現カセットの合成
合成されたＴａｒｇｅｔ３発現カセットのヌクレオチド配列は配列番号２１である。
ａ．Ｔａｒｇｅｔ３発現カセットの合成
合成されたＴａｒｇｅｔ３発現カセットのヌクレオチド配列は配列番号２１である。
ｂ．ベクターのｐＡＭＡ１－Ｃａｓ９－ｈｙｇの酵素切断および断片結合
ｐＡＭＡ１－Ｃａｓ９－ｈｙｇを出発ベクターとして、合成されたＴａｒｇｅｔ３発現カセットおよびｐＡＭＡ１－Ｃａｓ９－ｈｙｇ（制限酵素ＢｓｔＥＩＩの線形化）を、北京康潤誠業生物科技有限公司のゲル回収キット（Ｄ２０５－０１）でゲルから回収して精製した。上記のＤＮＡ断片および線形化されたベクターのヌクレオチド濃度を、サーモフィッシャー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）社製のＮａｎｏＤｒｏｐＬｉｔｅ分光光度計（ＮＤ－ＮＤＬ－ＵＳ－ＣＡＮ）で測定し、Ｖａｚｙｍｅ社製のワンステップクローニングキット（Ｃ１１５－０２）を用いて説明書を参照しながら結合反応を行った。制限酵素ＢｓｔＥＩＩの酵素切断の反応系は以下である。
ベクター：２μｇ、
制限酵素：２μＬ、
１０×ｂｕｆｆｅｒ Ｂ：１０μＬ、
Ｎｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ：１００μＬまで、
最適な作業温度で５～１２時間反応させる。
ｐＡＭＡ１－Ｃａｓ９－ｈｙｇを出発ベクターとして、合成されたＴａｒｇｅｔ３発現カセットおよびｐＡＭＡ１－Ｃａｓ９－ｈｙｇ（制限酵素ＢｓｔＥＩＩの線形化）を、北京康潤誠業生物科技有限公司のゲル回収キット（Ｄ２０５－０１）でゲルから回収して精製した。上記のＤＮＡ断片および線形化されたベクターのヌクレオチド濃度を、サーモフィッシャー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）社製のＮａｎｏＤｒｏｐＬｉｔｅ分光光度計（ＮＤ－ＮＤＬ－ＵＳ－ＣＡＮ）で測定し、Ｖａｚｙｍｅ社製のワンステップクローニングキット（Ｃ１１５－０２）を用いて説明書を参照しながら結合反応を行った。制限酵素ＢｓｔＥＩＩの酵素切断の反応系は以下である。
ベクター：２μｇ、
制限酵素：２μＬ、
１０×ｂｕｆｆｅｒ Ｂ：１０μＬ、
Ｎｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ：１００μＬまで、
最適な作業温度で５～１２時間反応させる。
ベクターのｐＡＭＡ１－Ｃａｓ９－ｈｙｇの構造は図１に示す。
ｃ． コロニーのＰＣＲ検証および配列決定
上記の結合産物をヒートショック法および凍結融解法でコンピテントセルのＥ． ｃｏｌｉ ＤＨ５αに形質転換し、ＬＢ／Ａｍｐ＋（トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ）のプレートでＥ． ｃｏｌｉコロニーを選別した。配列番号２８、配列番号２９のプライマーヌクレオチド配列を用いてＰＣＲ同定を行い、ＰＣＲにより正しく同定されたコロニーをＬＢ／Ａｍｐ＋液体培地に接種し、３７℃、２００ｒｐｍの条件で１２時間培養して増幅させた。増幅された細菌菌液について、北京康潤誠業生物科技有限公司のプラスミド抽出キット（Ｄ２０１－０４）を用いて説明書を参照しながらそのベクターを抽出した。さらに、そのベクターの配列を生工生物工程（上海）股▲ふん▼有限公司北京子公司で決定した。配列アライメントにより、配列決定の結果は、上記のＴａｒｇｅｔ３発現カセットの配列に一致しており、つまり、ベクターのｐＡＭＡ１－Ｃａｓ９－ｈｙｇ－Ｔａｒｇｅｔ３の構築に成功した。
上記の結合産物をヒートショック法および凍結融解法でコンピテントセルのＥ． ｃｏｌｉ ＤＨ５αに形質転換し、ＬＢ／Ａｍｐ＋（トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ）のプレートでＥ． ｃｏｌｉコロニーを選別した。配列番号２８、配列番号２９のプライマーヌクレオチド配列を用いてＰＣＲ同定を行い、ＰＣＲにより正しく同定されたコロニーをＬＢ／Ａｍｐ＋液体培地に接種し、３７℃、２００ｒｐｍの条件で１２時間培養して増幅させた。増幅された細菌菌液について、北京康潤誠業生物科技有限公司のプラスミド抽出キット（Ｄ２０１－０４）を用いて説明書を参照しながらそのベクターを抽出した。さらに、そのベクターの配列を生工生物工程（上海）股▲ふん▼有限公司北京子公司で決定した。配列アライメントにより、配列決定の結果は、上記のＴａｒｇｅｔ３発現カセットの配列に一致しており、つまり、ベクターのｐＡＭＡ１－Ｃａｓ９－ｈｙｇ－Ｔａｒｇｅｔ３の構築に成功した。
Ｅ． ｃｏｌｉ ＤＨ５αコロニーのＰＣＲ同定の反応系は以下である。
２×Ｒａｐｉｄ Ｔａｑ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ：５μＬ、
プライマーＦ（１０μｍｏｌ／Ｌ）：０．２μＬ、
プライマーＲ（１０μｍｏｌ／Ｌ）：０．２μＬ、
細菌懸濁液（ＬＢ／Ａｍｐ＋プレート上のコロニーを取り、１０μＬｄｄＨ２Ｏに入れる）：４．６μＬ。
２×Ｒａｐｉｄ Ｔａｑ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ：５μＬ、
プライマーＦ（１０μｍｏｌ／Ｌ）：０．２μＬ、
プライマーＲ（１０μｍｏｌ／Ｌ）：０．２μＬ、
細菌懸濁液（ＬＢ／Ａｍｐ＋プレート上のコロニーを取り、１０μＬｄｄＨ２Ｏに入れる）：４．６μＬ。
ＰＣＲ増幅反応の手順は以下である。
ステップ１：９５℃、３分間、
ステップ２：９５℃、３０秒間、
ステップ３：５８℃、３０秒間、
ステップ４：７２℃、５秒間、
ステップ５：ステップ２～４を３５サイクル繰り返す、
ステップ６：７２℃、１０分間。
ステップ２：９５℃、３０秒間、
ステップ３：５８℃、３０秒間、
ステップ４：７２℃、５秒間、
ステップ５：ステップ２～４を３５サイクル繰り返す、
ステップ６：７２℃、１０分間。
１．３ ベクターのｐＡＭＡ１－Ｃａｓ９－ｈｙｇ－Ｔａｒｇｅｔ３－ＨＲの構築
プライマーのｕｐ ３－Ｆ／ｕｐ ３－Ｒおよびｄｏｗｎ ３－Ｆ／ｄｏｗｎ ３－Ｒを用いて、野生株のサナギタケ菌株のゲノムＤＮＡを鋳型として、ＣＣＭ_０２０５９～ＣＣＭ_０２０６０遺伝子の上流および下流の相同アームヌクレオチド配列をそれぞれ増幅した。上記のプライマーのヌクレオチド配列は以下である。
ｕｐ ３－Ｆ：
５′－ＡＣＣＣＴＧＡＴＡＡＡＴＧＣＴＴＣＡＡＴＡＡＴＡＴＴｇｔｃｇａｃａａｇａｇａｇｇｔｇｇｔｃｃ－３′ （配列番号２４）、
ｕｐ ３－Ｒ：５′－ＡＧＡＴＴＣＧＣＡＧＣＣＴＧＧＡＣＡＡＴＣＴＡＣＴＣＣＧＡＴＴＣＡ－３′ （配列番号２５）、
ｄｏｗｎ ３－Ｆ：５′－ＡＧＡＴＴＧＴＣＣＡＧＧＣＴＧＣＧＡＡＴＣＴＧＡＧＴＧＧＴＴＧＧ－３′ （配列番号２６）、
ｄｏｗｎ ３－Ｒ：
５′－ＡＣＴＣＡＴＡＣＴＣＴＴＣＣＴＴＴＴＴＣＡＡＴＡＴＴＣＡＧＣＧＣＣＣＴＧＴＡＴＣＣＴＴＴＧＡ－３′ （配列番号２７）である ことを特徴とする請求項６に記載の方法。
プライマーのｕｐ ３－Ｆ／ｕｐ ３－Ｒおよびｄｏｗｎ ３－Ｆ／ｄｏｗｎ ３－Ｒを用いて、野生株のサナギタケ菌株のゲノムＤＮＡを鋳型として、ＣＣＭ_０２０５９～ＣＣＭ_０２０６０遺伝子の上流および下流の相同アームヌクレオチド配列をそれぞれ増幅した。上記のプライマーのヌクレオチド配列は以下である。
ｕｐ ３－Ｆ：
５′－ＡＣＣＣＴＧＡＴＡＡＡＴＧＣＴＴＣＡＡＴＡＡＴＡＴＴｇｔｃｇａｃａａｇａｇａｇｇｔｇｇｔｃｃ－３′ （配列番号２４）、
ｕｐ ３－Ｒ：５′－ＡＧＡＴＴＣＧＣＡＧＣＣＴＧＧＡＣＡＡＴＣＴＡＣＴＣＣＧＡＴＴＣＡ－３′ （配列番号２５）、
ｄｏｗｎ ３－Ｆ：５′－ＡＧＡＴＴＧＴＣＣＡＧＧＣＴＧＣＧＡＡＴＣＴＧＡＧＴＧＧＴＴＧＧ－３′ （配列番号２６）、
ｄｏｗｎ ３－Ｒ：
５′－ＡＣＴＣＡＴＡＣＴＣＴＴＣＣＴＴＴＴＴＣＡＡＴＡＴＴＣＡＧＣＧＣＣＣＴＧＴＡＴＣＣＴＴＴＧＡ－３′ （配列番号２７）である ことを特徴とする請求項６に記載の方法。
増幅された上流および下流の相同アームヌクレオチド配列およびｐＡＭＡ１－Ｃａｓ９－ｈｙｇ－Ｔａｒｇｅｔ３（制限酵素ＳｓｐＩの線形化）を、北京康潤誠業生物科技有限公司のゲル回収キット（Ｄ２０５－０１）でゲルから回収して精製した。また、制限酵素ＳｓｐＩの線形化反応系は１．２に記載した方法を参照する。上記のＤＮＡ断片および線形化されたベクターのヌクレオチド濃度を、サーモフィッシャー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）社製のＮａｎｏＤｒｏｐＬｉｔｅ分光光度計（ＮＤ－ＮＤＬ－ＵＳ－ＣＡＮ）で測定し、Ｖａｚｙｍｅ社製のワンステップクローニングキット（Ｃ１１５－０２）を用いて説明書を参照しながら結合反応を行った。上記の結合産物をヒートショック法および凍結融解法でコンピテントセルのＥ． ｃｏｌｉ ＤＨ５αに形質転換し、ＬＢ／Ａｍｐ＋プレートでＥ． ｃｏｌｉコロニーを選別した。配列番号３０、配列番号３１プライマーヌクレオチド配列を用いてＰＣＲ同定を行い、ＰＣＲにより正しく同定されたコロニーをＬＢ／Ａｍｐ＋液体培地に接種し、増幅させた。増幅された細菌菌液について、北京康潤誠業生物科技有限公司のプラスミド抽出キット（Ｄ２０１－０４）を用いて説明書を参照しながらそのベクターを抽出した。さらに、そのベクターの配列を生工生物工程（上海）股▲ふん▼有限公司北京子公司で決定した。配列アライメントにより、配列決定の結果は、上記の相同アームヌクレオチド配列に一致しており、つまり、ベクターのｐＡＭＡ１－Ｃａｓ９－ｈｙｇ－Ｔａｒｇｅｔ３－ＨＲの構築に成功した。
１．４ ｐＡＭＡ１－Ｃａｓ９－ｈｙｇ－Ｔａｒｇｅｔ３－ＨＲから野生株のサナギタケのプロトプラストへ形質転換
野生株のサナギタケ菌糸を採取し、２％細胞壁溶解酵素（広東省微生物研究所製、細胞壁溶解酵素の粉末を０．８ｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌに溶解、ｐＨ＝６．５）を１ｍＬ加え、３２℃、９０ｒｐｍの条件下で３時間酵素分解した。酵素分解された菌糸を４層のガーゼでろ過し、下部のろ液１ｍＬを１．５ｍＬ遠沈管に入れ、３０００ｒｐｍ、室温で１０分間遠心分離した後、上清を捨てた。その後、１００－２００μＬＳＴＣ緩衝液（ソルビトール：１８．２ｇ、Ｔｒｉｓ：０．１２１ｇ、ＣａＣｌ２：０．３６８ｇ、ｄｄＨ２Ｏで１００ｍＬまで定容した）を入れ、プロトプラストの濃度が１×１０７個／ｍＬになるように、ピペットで繰り返して軽く吸ったり吹いたりして再懸濁した。
野生株のサナギタケ菌糸を採取し、２％細胞壁溶解酵素（広東省微生物研究所製、細胞壁溶解酵素の粉末を０．８ｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌに溶解、ｐＨ＝６．５）を１ｍＬ加え、３２℃、９０ｒｐｍの条件下で３時間酵素分解した。酵素分解された菌糸を４層のガーゼでろ過し、下部のろ液１ｍＬを１．５ｍＬ遠沈管に入れ、３０００ｒｐｍ、室温で１０分間遠心分離した後、上清を捨てた。その後、１００－２００μＬＳＴＣ緩衝液（ソルビトール：１８．２ｇ、Ｔｒｉｓ：０．１２１ｇ、ＣａＣｌ２：０．３６８ｇ、ｄｄＨ２Ｏで１００ｍＬまで定容した）を入れ、プロトプラストの濃度が１×１０７個／ｍＬになるように、ピペットで繰り返して軽く吸ったり吹いたりして再懸濁した。
ベクターのｐＡＭＡ１－Ｃａｓ９－ｈｙｇ－Ｔａｒｇｅｔ３－ＨＲ ２μｇを１００μＬの上記のサナギタケのプロトプラストに入れ、氷上に５分間放置した。そして、プロトプラストとベクターの混合液に５０μＬのＰＥＧ緩衝液（ＰＥＧ４０００：２５ｇ、Ｔｒｉｓ：０．１２１ｇ、ＣａＣｌ２：０．３６８ｇ、ｄｄＨ２Ｏで１００ｍＬまで定容した）を加え、氷上に３０分間放置した。その後、上記系に０．５ｍＬのＰＥＧ緩衝液を加え、軽く吹いて均一に混ぜ、２８℃の金属浴中で２０分間静置した。最後に１ｍＬのＳＴＣ緩衝液を加え、軽く吹いて均一に混ぜ、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上清を廃棄した。遠沈管の底のプロトプラストの沈殿物をＳＴＣ緩衝液で再懸濁し、５００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンを添加したプロトプラスト再生培地（剥皮して茹でてろ過したジャガイモ２００ｇ、グルコース２０ｇ、トリプトン１０ｇ、マンニトール０．６ｍ、ｄｄＨ２Ｏで１Ｌまで定容した）のプレートに塗りつけた。形質転換体の菌糸が発芽してコロニーになるまで、２５℃の暗所で５～７日間培養し、ＰＣＲ同定を行うために形質転換体のゲノムＤＮＡを抽出した。
１．５ 形質転換体のＰＣＲ検証
上記の形質転換体のゲノムＤＮＡをＣＴＡＢ法（閻慶祥ら、改良されたＣＴＡＢ法によるキャッサバ芋のゲノムＤＮＡの抽出、中国農学通報、２０１０、（４）：３０－３２）で抽出し、プライマーの配列番号３２、配列番号３３を用いて形質転換体に対しＰＣＲで１次スクリーニングを行う。図３Ａに示すように、３３号の形質転換体の増幅産物のバンドサイズは１１９７ｂｐであり、野生株のサナギタケ菌株の増幅産物のバンドサイズは３５４４ｂｐである。３３号の形質転換体は遺伝子のノックアウトに成功し、陽性形質転換体（Ｍ３３）であることが示された。上記の３３号の形質転換体に対して遺伝子の転写レベルでのノックアウト検証を行った。ＯＭＥＧＡ社製のＲＮＡＰｌａｎｔＫｉｔキット（Ｒ６８２７－０２）で３３号の形質転換体および野生株のサナギタケ菌株のＲＮＡを抽出した。ＶａｚｙｍｅｈｉＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩ ＱｒＴ ＳｕｐｅｒＭｉｘ ｆｏｒ ｑＰＣＲ（＋ｇＤＮＡ ｗｉｐｅｒ）キット（Ｒ２２３－０１）で、説明書を参照しながらＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、これを鋳型として、半定量的プライマーの配列番号３４、配列番号３５、およびｒｐｂ１－Ｆ／Ｒ（Ｌｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＳＳＵｒＤＮＡｇｒｏｕｐＩ ｉｎｔｒｏｎｓ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓｍｉｌｉｔａｒｉｓ ａｎｄ ｔｈｅＬｏｓｓ ｏｆ ａｎ ｉｎｔｒｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｃｒｏｓｓ－ｍａｔｉｎｇ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ． ２０１４ ５２（８）：６５９－６６６）の２ペアのプライマーを用いて、半定量的ＲＴ－ＰＣＲにより、さらに遺伝子の転写レベルでＣＣＭ_０２０５９～ＣＣＭ_０２０６０遺伝子がノックアウトされたか否かを検証した。図３Ｂに示すように、３３号の形質転換体においてＣＣＭ_０２０５９遺伝子の転写レベルでの発現は見られず、３３号の形質転換体（Ｍ３３）は陽性の形質転換（ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．４０２６６）であり、すなわちＣＣＭ_０２０５９～ＣＣＭ_０２０６０遺伝子の欠失が実現されたことが示された。
上記の形質転換体のゲノムＤＮＡをＣＴＡＢ法（閻慶祥ら、改良されたＣＴＡＢ法によるキャッサバ芋のゲノムＤＮＡの抽出、中国農学通報、２０１０、（４）：３０－３２）で抽出し、プライマーの配列番号３２、配列番号３３を用いて形質転換体に対しＰＣＲで１次スクリーニングを行う。図３Ａに示すように、３３号の形質転換体の増幅産物のバンドサイズは１１９７ｂｐであり、野生株のサナギタケ菌株の増幅産物のバンドサイズは３５４４ｂｐである。３３号の形質転換体は遺伝子のノックアウトに成功し、陽性形質転換体（Ｍ３３）であることが示された。上記の３３号の形質転換体に対して遺伝子の転写レベルでのノックアウト検証を行った。ＯＭＥＧＡ社製のＲＮＡＰｌａｎｔＫｉｔキット（Ｒ６８２７－０２）で３３号の形質転換体および野生株のサナギタケ菌株のＲＮＡを抽出した。ＶａｚｙｍｅｈｉＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩ ＱｒＴ ＳｕｐｅｒＭｉｘ ｆｏｒ ｑＰＣＲ（＋ｇＤＮＡ ｗｉｐｅｒ）キット（Ｒ２２３－０１）で、説明書を参照しながらＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、これを鋳型として、半定量的プライマーの配列番号３４、配列番号３５、およびｒｐｂ１－Ｆ／Ｒ（Ｌｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＳＳＵｒＤＮＡｇｒｏｕｐＩ ｉｎｔｒｏｎｓ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓｍｉｌｉｔａｒｉｓ ａｎｄ ｔｈｅＬｏｓｓ ｏｆ ａｎ ｉｎｔｒｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｃｒｏｓｓ－ｍａｔｉｎｇ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ． ２０１４ ５２（８）：６５９－６６６）の２ペアのプライマーを用いて、半定量的ＲＴ－ＰＣＲにより、さらに遺伝子の転写レベルでＣＣＭ_０２０５９～ＣＣＭ_０２０６０遺伝子がノックアウトされたか否かを検証した。図３Ｂに示すように、３３号の形質転換体においてＣＣＭ_０２０５９遺伝子の転写レベルでの発現は見られず、３３号の形質転換体（Ｍ３３）は陽性の形質転換（ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．４０２６６）であり、すなわちＣＣＭ_０２０５９～ＣＣＭ_０２０６０遺伝子の欠失が実現されたことが示された。
半定量的ＲＴ－ＰＣＲの反応系は以下である。
２×Ｒａｐｉｄ Ｔａｑ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ：５μＬ、
プライマーＦ（１０μｍｏｌ／Ｌ）：０．２μＬ、
プライマーＲ（１０μｍｏｌ／Ｌ）：０．２μＬ、
ｄｄＨ２Ｏ：３．６μＬ、
鋳型：１μＬ。
ＰＣＲの増幅反応の手順は上記と同様である。
２×Ｒａｐｉｄ Ｔａｑ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ：５μＬ、
プライマーＦ（１０μｍｏｌ／Ｌ）：０．２μＬ、
プライマーＲ（１０μｍｏｌ／Ｌ）：０．２μＬ、
ｄｄＨ２Ｏ：３．６μＬ、
鋳型：１μＬ。
ＰＣＲの増幅反応の手順は上記と同様である。
１．６ ウスチロキシンの抽出、精製、検出
ウスチロキシンの抽出および精製のステップは、先行文献（Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｕｓｔｉｌｏｘｉｎｓ ｉｎｒｉｃｅ ｕｓｉｎｇＰｏｌｙｍｅｒ ｃａｔｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｌｅａｎｕｐｆｏｌｌｏｗｅｄｂｙＬｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－ｔａｎｄｅｍｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ，２０１６，１４７６：４６－５２）を参照した上で、適宜調整した。具体的なステップは以下である。
ウスチロキシンの抽出および精製のステップは、先行文献（Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｕｓｔｉｌｏｘｉｎｓ ｉｎｒｉｃｅ ｕｓｉｎｇＰｏｌｙｍｅｒ ｃａｔｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｌｅａｎｕｐｆｏｌｌｏｗｅｄｂｙＬｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－ｔａｎｄｅｍｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ，２０１６，１４７６：４６－５２）を参照した上で、適宜調整した。具体的なステップは以下である。
野生株のサナギタケ菌糸体と上記の形質転換体Ｍ３３（ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．４０２６６）菌糸体を凍結乾燥機で凍結乾燥し、各サンプルについて３つの生物学的複製をとった。凍結乾燥したサンプルを乳鉢でよく粉砕しておいた。凍結乾燥サンプル粉末１００ｍｇを秤量して２ｍＬ遠沈管に入れ、さらに１ｍＬｄｄＨ２Ｏとセラミックビーズを入れ、組織粉砕機で十分に粉砕した。粉砕機で得られたホモジネートを４．５ｍＬ遠沈管に移し、ｄｄＨ２Ｏで３ｍＬまで定容し、超音波抽出器に置いて１時間処理した後、１２０００ｒｐｍ、室温で６分間遠心分離し、得られた上清を１０ｍＬ遠沈管に移した。その後、上清にジクロロメタン２ｍＬを加えて十分に混合し、１２０００ｒｐｍで６分間遠心分離した。上清を吸い取り５％ギ酸含有の液に調整し、０．２２μｍの水系膜でろ過し、メタノール３ｍＬ（クロマトグラフィー的純度）でＰＣＸ固相抽出カラムに対して前処理をし、５％ギ酸３ｍＬで平衡化させた。上記の酸性にしたサンプルを、液面がカラムの吸着層に達した時点で添加し、５％ギ酸３ｍＬ、メタノール３ｍＬで順次カラムを洗い、５％アンモニア水（ＮＨ３・Ｈ２Ｏ ２５％－２８％）含有のメタノール３ｍＬで目的物質を溶出した。上記の溶出液を減圧下４５℃でほぼ乾固に濃縮した後、１５％メタノール１ｍＬを加え、超音波装置で１５分間処理して再溶解させ、再溶解液を０．２２μｍ水系膜で濾過した。
島津ＬＣ－２０ＡｈＰＬＣシステムによりウスチロキシンの検出を行った。カラムはＬｕｎａ ＯｍｅｇａＰｏｌａｒ Ｃ１８カラム（４．６ｍｍ × ２５０ｍｍ、５μｍ）、移動相は０．０１％トリフルオロ酢酸水溶液（Ａ）－メタノール（Ｂ）、検出波長は１９０－４００ｎｍである。
ＨＰＬＣの検出結果は図４に示す。図４からわかるように、野生株のサンプルにおいてウスチロキシンの保持時間は２２～２３分間であったのに対し、形質転換体Ｍ３３（ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．４０２６６）に対応する化合物は保持時間で検出されず、ウスチロキシンを生成しないサナギタケ菌株を得たことが示された。
１．７ ベクターのｐＡＭＡ１－Ｃａｓ９－ｈｙｇ－Ｔａｒｇｅｔ３－ＨＲの削除
形質転換体Ｍ３３（ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．４０２６６）の分生胞子を滅菌された爪楊枝に浸し、ハイグロマイシンを含まない上記の蘇生培地プレートにスポットし、ハイグロマイシン耐性を有するベクターのｐＡＭＡ１－Ｃａｓ９－ｈｙｇ－Ｔａｒｇｅｔ３－ＨＲが削除されるまで継代培養した。つまり、耐性スクリーニングラベルを持たないノックアウト菌株を得た。
形質転換体Ｍ３３（ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．４０２６６）の分生胞子を滅菌された爪楊枝に浸し、ハイグロマイシンを含まない上記の蘇生培地プレートにスポットし、ハイグロマイシン耐性を有するベクターのｐＡＭＡ１－Ｃａｓ９－ｈｙｇ－Ｔａｒｇｅｔ３－ＨＲが削除されるまで継代培養した。つまり、耐性スクリーニングラベルを持たないノックアウト菌株を得た。
１．８ 蚕蛹および小麦培地における子実体の形成実験
野生株および形質転換体Ｍ３３（ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．４０２６６）をＰＤＡプレートに接種し、２０℃で１６日間培養した。培地プレートにおける菌糸体を滅菌水で洗浄後、４層のガーゼでろ過した。ろ液１ｍＬを１．５ｍＬ遠沈管に入れ、８０００ｒｐｍ、６分間遠心し、野生株および形質転換体Ｍ３３（ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．４０２６６）の分生胞子を採取した。濃度が１×１０６個／ｍＬの懸濁液を調製し、滅菌注射器を用いて各蚕蛹に１００μＬずつ注射した。その後、蚕蛹を食用菌知能結実箱（北京知態康興生物科技有限公司）内で２０℃で培養し、子実体の発育状態を観察した。
野生株および形質転換体Ｍ３３（ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．４０２６６）をＰＤＡプレートに接種し、２０℃で１６日間培養した。培地プレートにおける菌糸体を滅菌水で洗浄後、４層のガーゼでろ過した。ろ液１ｍＬを１．５ｍＬ遠沈管に入れ、８０００ｒｐｍ、６分間遠心し、野生株および形質転換体Ｍ３３（ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．４０２６６）の分生胞子を採取した。濃度が１×１０６個／ｍＬの懸濁液を調製し、滅菌注射器を用いて各蚕蛹に１００μＬずつ注射した。その後、蚕蛹を食用菌知能結実箱（北京知態康興生物科技有限公司）内で２０℃で培養し、子実体の発育状態を観察した。
野生株および形質転換体Ｍ３３（ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．４０２６６）のＰＤＡプレートにおける菌株を、種菌培地（剥皮して茹でたジャガイモ２００ｇ、グルコース２０ｇ、トリプトン３ｇ、ＫＨ２ＰＯ４１ｇおよびＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．５ｇ、水道水で１Ｌまで定容した）に接種し、１５０ｒｐｍで３日間培養して液体種菌を得た。上記の液体種菌５ｍＬを小麦培地（小麦：２０ｇ、栄養液：グルコース２０ｇ、トリプトン１０ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ２ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １ｇ、クエン酸アンモニウム１ｇ、ビタミンＢ１２０ｍｇ、水道水で１Ｌまで定容した）に接種し、食用菌知能結実箱（北京知態康興生物科技有限公司）内で２０℃で培養し、小麦培地における子実体の発育状態を観察した。
その結果、形質転換体Ｍ３３（ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．４０２６６）は、蚕蛹および小麦培地でいずれも子実体まで正常に発育できる。その子実体は、図５に示すように、整然かつ均一で、まっすぐに伸び、色が鮮やかである。また、小麦培地における野生株の子実体よりも生長速度が速い。
Claims (10)
- ウスチロキシンを生成しないサナギタケ菌株であって、受託番号がＣＧＭＣＣ Ｎｏ．４０２６６であることを特徴とするサナギタケ菌株。
- 標的遺伝子のｓｇＲＮＡヌクレオチド配列を決定、合成するステップＳ１と、
標的遺伝子の上流および下流の相同アームのヌクレオチド配列を決定、合成するステップＳ２と、
ステップＳ１で得られたｓｇＲＮＡヌクレオチド配列およびＳ２で得られた相同アームヌクレオチド配列を、ベクターのｐＡＭＡ１－Ｃａｓ９－ｈｙｇに結合させ、ノックアウトベクターを構築するステップＳ３と、
ステップＳ３で得られたノックアウトベクターをサナギタケのプロトプラストへＰＥＧ媒介で形質転換し、前記ノックアウトベクターを含有する形質転換体を得るステップＳ４と、
を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集によるウスチロキシンを生成しないサナギタケ菌株の作出方法。 - 前記標的遺伝子は、ＣＣＭ_０２０５９遺伝子（配列番号１）、ＣＣＭ_０２０６０遺伝子（配列番号２）又はＣＣＭ_０２０５９～ＣＣＭ_０２０６０遺伝子であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
- 前記ｓｇＲＮＡヌクレオチド配列はＴａｒｇｅｔ１、２又は３であり、そのヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号３、配列番号１１又は配列番号２０に示すことを特徴とする請求項３に記載の方法。
- 合成されたＴａｒｇｅｔ１、２又は３発現カセットのヌクレオチド配列は、配列番号４、配列番号１２又は配列番号２１に示すことを特徴とする請求項４に記載の方法。
- 前記ＣＣＭ_０２０５９遺伝子について、上流の相同アームのヌクレオチド配列が配列番号５であり、下流の相同アームのヌクレオチド配列が配列番号６であり、前記ＣＣＭ_０２０６０遺伝子について、上流の相同アームのヌクレオチド配列が配列番号１３であり、下流の相同アームのヌクレオチド配列が配列番号１４であり、前記ＣＣＭ_０２０５９～ＣＣＭ_０２０６０遺伝子について、上流の相同アームのヌクレオチド配列が配列番号２２であり、下流の相同アームのヌクレオチド配列が配列番号２３であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
- 前記ＣＣＭ_０２０５９遺伝子について、上流の相同アームヌクレオチド配列を合成するためのプライマーがｕｐ １－Ｆ／ｕｐ １－Ｒであり、下流の相同アームヌクレオチド配列を合成するためのプライマーがｄｏｗｎ １－Ｆ／ｄｏｗｎ １－Ｒであり、前記ＣＣＭ_０２０６０遺伝子について、上流の相同アームヌクレオチド配列を合成するためのプライマーがｕｐ ２－Ｆ／ｕｐ ２－Ｒであり、下流の相同アームヌクレオチド配列を合成するためのプライマーがｄｏｗｎ ２－Ｆ／ｄｏｗｎ ２－Ｒであり、前記ＣＣＭ_０２０５９～ＣＣＭ_０２０６０遺伝子について、上流の相同アームヌクレオチド配列を合成するためのプライマーがｕｐ ３－Ｆ／ｕｐ ３－Ｒであり、下流の相同アームヌクレオチド配列を合成するためのプライマーがｄｏｗｎ ３－Ｆ／ｄｏｗｎ ３－Ｒであり、前記プライマーのヌクレオチド配列は、
ｕｐ １－Ｆ：
５′－ＡＣＣＣＴＧＡＴＡＡＡＴＧＣＴＴＣＡＡＴＡＡＴＡＴＴｃａａｇａｇｃａｇａｔｔｃｇｔｃａａｇ－３′ （配列番号７）、
ｕｐ １－Ｒ：
５′－ＧＣＣＡＡＣＣＴＣＧＴＣＡＡＣＧＧＣＣａｇｃｔａｇｔｔｇｇｃａａｔａｃｃｇｃｔａ－３′ （配列番号８）、
ｄｏｗｎ １－Ｆ：
５′－ｃａａｃｔａｇｃｔＧＧＣＣＧＴＴＧＡＣＧＡＧＧＴＴＧＧＣＡＡＡＧＡＡＧＣＡＧ－３′ （配列番号９）、
ｄｏｗｎ １－Ｒ：
５′－ＡＣＴＣＡＴＡＣＴＣＴＴＣＣＴＴＴＴＴＣＡＡＴＡＴＴＡＡＧＡＣＧＧＡＧＣＡＣＡＣＣＡＣＧＧ－３′ （配列番号１０）、
ｕｐ ２－Ｆ：
５′－ＡＣＣＣＴＧＡＴＡＡＡＴＧＣＴＴＣＡＡＴＡＡＴＡＴＴｇｔｃｇａｃａａｇａｇａｇｇｔｇｇ－３′ （配列番号１５）、
ｕｐ ２－Ｒ：
５′－ＣＣＣＴＧＧＴＴＧＡＴＣＡＧＣＧＴＣｃｃｔｇｇａｃａａｔｃｔａｃｔｃｃｇａｔｔｃ－３′ （配列番号１６）、
ｄｏｗｎ ２－Ｆ：
５′－ａｇｇＧＡＣＧＣＴＧＡＴＣＡＡＣＣＡＧＧＧＣＧＣＧＧＴＣＡＡＴＣＧＧＡＡＧ－３′ （配列番号１７）、
ｄｏｗｎ ２－Ｒ：
５′－ＡＣＴＣＡＴＡＣＴＣＴＴＣＣＴＴＴＴＴＣＡＡＴＡＴＴＡＴＣＡＣＣＡＴＧＴＧＧＡＣＣＡＣＴＧＴ－３′ （配列番号１８）、
ｕｐ ３－Ｆ：
５′－ＡＣＣＣＴＧＡＴＡＡＡＴＧＣＴＴＣＡＡＴＡＡＴＡＴＴｇｔｃｇａｃａａｇａｇａｇｇｔｇｇｔｃｃ－３′ （配列番号２４）、
ｕｐ ３－Ｒ：５′－ＡＧＡＴＴＣＧＣＡＧＣＣＴＧＧＡＣＡＡＴＣＴＡＣＴＣＣＧＡＴＴＣＡ－３′ （配列番号２５）、
ｄｏｗｎ ３－Ｆ：５′－ＡＧＡＴＴＧＴＣＣＡＧＧＣＴＧＣＧＡＡＴＣＴＧＡＧＴＧＧＴＴＧＧ－３′ （配列番号２６）、
ｄｏｗｎ ３－Ｒ：
５′－ＡＣＴＣＡＴＡＣＴＣＴＴＣＣＴＴＴＴＴＣＡＡＴＡＴＴＣＡＧＣＧＣＣＣＴＧＴＡＴＣＣＴＴＴＧＡ－３′ （配列番号２７）であることを特徴とする請求項６に記載の方法。 - ゲノムＤＮＡレベルで、ＰＣＲを用いてステップＳ４で得られた形質転換体から、前記標的遺伝子をノックアウトした形質転換体、すなわち陽性形質転換体を同定するステップＳ５と、
ｃＤＮＡレベルで、ステップＳ５で得られた陽性形質転換体を半定量的ＲＴ－ＰＣＲで検証し、陽性形質転換体の標的遺伝子が転写レベルで発現しないことを確認するステップＳ６と、
ステップＳ６で得られた陽性形質転換体を継代培養し、ベクターが削除された外来遺伝子挿入のないサナギタケ菌株を得るステップＳ７と、
ステップＳ７で得られたサナギタケ菌株の子実体のウスチロキシン含有量を検出するステップＳ８と、
をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。 - ｐＡＭＡ１－Ｃａｓ９－ｈｙｇをバックボーンベクターとして、さらに標的遺伝子のｓｇＲＮＡヌクレオチド配列および標的遺伝子の上流および下流の相同アームのヌクレオチド配列を含み、前記標的遺伝子がＣＣＭ_０２０５９遺伝子（配列番号１）、ＣＣＭ_０２０６０遺伝子（配列番号２）又はＣＣＭ_０２０５９～ＣＣＭ_０２０６０遺伝子であることを特徴とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集ベクター。
- 配列番号１又は配列番号２に示すことを特徴とするサナギタケウのスチロキシン合成の制御に関与するヌクレオチド配列。
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