JP2024014838A - 植物バイオマス糖化酵素組成物 - Google Patents
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Abstract
【課題】植物バイオマスを糖化処理する際の低粘度化に有効な酵素製剤及びその製造法を提供する。【解決手段】以下の（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）を含む酵素組成物：（Ａ）セルラーゼ、（Ｂ）ポリガラクツロナーゼ及びペクチンリアーゼを含むホモガラクツロナン分解酵素、（Ｃ）アラビノフラノシダーゼ及びガラクタナーゼから選択される１種以上。【選択図】なし
Description
本発明は、植物バイオマスの糖化酵素組成物に関する。
再生可能資源の植物バイオマス原料から糖や付加価値製品を製造するバイオリファイナリーの技術は持続可能な社会の構築方法として期待されている。バイオマス原料の中でも、デンプンやセルロースを含有する農産廃棄物は分解することで発酵原料として最もよく利用される糖であるグルコースが多く得られることから、これらのバイオマス原料から糖を回収する技術開発が多く実施されてきている。また、植物バイオマス原料中にはデンプンやセルロース以外にも、ヘミセルロースやペクチン、リグニンも含まれていることが知られている。
ペクチンは、植物の一次細胞壁や細胞の間隙にある中葉に多く存在し、主にホモガラクツロナン（ＨＧ）、ラムノガラクツロナンＩ（ＲＧ－Ｉ）及びラムノガラクツロナンＩＩ（ＲＧ－ＩＩ）の三つのドメインから構成される複合多糖類である。ＨＧは６位のカルボキシル基の一部がメチルエステル化、２位及び３位の水酸基の一部がアセチル化修飾を受けたＤ－ガラクツロン酸がα－１，４－結合したポリガラクツロン酸を主とする重合体である。ラムノガラクツロナンＩ（ＲＧ－Ｉ）はラムノースとガラクツロン酸の２糖のくり返し構造を主鎖とし、ガラクトース残基が連なったガラクタン側鎖やアラビノース残基が連なったアラビナン側鎖やアラビノース残基とガラクトース残基から構成したアラビノガラクタン側鎖をもつ重合体である。ラムノガラクツロナンＩＩ（ＲＧ－ＩＩ）はＨＧと同じくα－１，４－結合したポリガラクツロン酸を主鎖とし、ガラクツロン酸のＯ－２位又はＯ－３位に、Ｌ－ラムノース、Ｄ－又はＬ－ガラクトース、Ｌ－アラビノース、Ｄ－ガラクツロン酸、Ｄ－グルクロン酸、Ｄ－アピオース、Ｌ－フコース、２－Ｏ－メチル－Ｌ－フコース、２－Ｏ－メチル－Ｄ－キシロース、アセリン酸（ａｃｅｒｉｃ ａｃｉｄ，３－Ｏ－カルボキシ－５－デオキシ－Ｌ－キシロース）、２－ケト－３－デオキシ－Ｄ－マンノ－２－オクツロン酸、３－デオキシ－Ｄ－リクソ－２－ヘプツロン酸など、約３０種類の糖から構成された側鎖が結合した、ペクチンの中で最も複雑な構造を持つドメインである。
ペクチンの構成成分にはグルコースは含まれておらず、植物残渣から回収可能なグルコース量には影響しないと考えられるが、ペクチンの高粘性は植物バイオマスを分解して得られる糖液からの糖の回収効率と糖製造プロセスに大きな課題となる。
酵素を用いたペクチン含有植物バイオマスの糖化工程は、デンプンをグルコースに変換するアミラーゼ及びアミログルコシダーゼと、セルロースをグルコースに変換するセルラーゼが必要であるが、これに加えて糖液の粘度を低減させるために、セルラーゼにペクチナーゼを併用することが行われている。例えば、ポリガラクツロナーゼを添加すること（特許文献１）、アラビナンエンド－１、５－α－Ｌ－アラビノシダーゼを添加すること（特許文献２）等が知られている。
酵素を用いたペクチン含有植物バイオマスの糖化工程は、デンプンをグルコースに変換するアミラーゼ及びアミログルコシダーゼと、セルロースをグルコースに変換するセルラーゼが必要であるが、これに加えて糖液の粘度を低減させるために、セルラーゼにペクチナーゼを併用することが行われている。例えば、ポリガラクツロナーゼを添加すること（特許文献１）、アラビナンエンド－１、５－α－Ｌ－アラビノシダーゼを添加すること（特許文献２）等が知られている。
しかしながら、その粘度低減効果は必ずしも十分なものではなく、また、市販されているペクチナーゼ製剤には粘度低減に関わる酵素以外にも多種の酵素が混入しており、結果的に必要量が多くなるため、コストの面で実用的ではない。
したがって、ペクチン含有植物バイオマスの糖化に当たり、低コストで糖液を低粘度化できる酵素製剤が求められている。
したがって、ペクチン含有植物バイオマスの糖化に当たり、低コストで糖液を低粘度化できる酵素製剤が求められている。
本発明は、植物バイオマスを糖化処理する際の低粘度化に有効な酵素製剤及びその製造法を提供することに関する。
本発明者らは、セルラーゼと特定のペクチナーゼを配合した酵素組成物が、ペクチン含有植物バイオマスを糖化する際のスラリーの高粘度化を効果的に抑制できること、また、当該酵素組成物は組換え糸状菌を用いて容易に製造できることを見出した。
すなわち、本発明は、以下の１）～８）に係るものである。
１）以下の（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）を含む酵素組成物：
（Ａ）セルラーゼ、
（Ｂ）ポリガラクツロナーゼ及びペクチンリアーゼを含むホモガラクツロナン分解酵素、
（Ｃ）アラビノフラノシダーゼ及びガラクタナーゼから選択される１種以上。
２）１）の酵素組成物を植物バイオマスと接触させる工程を含む、植物バイオマスの糖化方法。
３）１）の酵素組成物を植物バイオマスと接触させる工程を含む、植物バイオマスからの糖の製造方法。
４）１）の酵素組成物を植物バイオマスと接触させる工程を含む、植物バイオマスからのエタノールの製造方法。
５）（ｂ１）ポリガラクツロナーゼ遺伝子、（ｂ２）ペクチンリアーゼ遺伝子、及び（ｃ）アラビノフラノシダーゼ遺伝子及びガラクタナーゼ遺伝子から選択される１種以上の遺伝子を導入した組換え糸状菌。
６）５）の組換え糸状菌を培養することを含む、１）の酵素組成物の製造方法。
７）１）の酵素組成物を有効成分とする植物バイオマス粘度低下剤。
８）１）の酵素組成物を植物バイオマスと接触させる工程を含む、植物バイオマス粘度低下方法。
１）以下の（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）を含む酵素組成物：
（Ａ）セルラーゼ、
（Ｂ）ポリガラクツロナーゼ及びペクチンリアーゼを含むホモガラクツロナン分解酵素、
（Ｃ）アラビノフラノシダーゼ及びガラクタナーゼから選択される１種以上。
２）１）の酵素組成物を植物バイオマスと接触させる工程を含む、植物バイオマスの糖化方法。
３）１）の酵素組成物を植物バイオマスと接触させる工程を含む、植物バイオマスからの糖の製造方法。
４）１）の酵素組成物を植物バイオマスと接触させる工程を含む、植物バイオマスからのエタノールの製造方法。
５）（ｂ１）ポリガラクツロナーゼ遺伝子、（ｂ２）ペクチンリアーゼ遺伝子、及び（ｃ）アラビノフラノシダーゼ遺伝子及びガラクタナーゼ遺伝子から選択される１種以上の遺伝子を導入した組換え糸状菌。
６）５）の組換え糸状菌を培養することを含む、１）の酵素組成物の製造方法。
７）１）の酵素組成物を有効成分とする植物バイオマス粘度低下剤。
８）１）の酵素組成物を植物バイオマスと接触させる工程を含む、植物バイオマス粘度低下方法。
本発明によれば、ペクチン質を含む植物バイオマスの糖化処理工程におけるスラリーの高粘度化を抑制し、植物バイオマスの効率的な糖化処理を可能とする糖化酵素組成物を安価に提供することができる。
（１．酵素組成物）
本発明の酵素組成物は、以下の（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）：
（Ａ）セルラーゼ、
（Ｂ）ポリガラクツロナーゼ及びペクチンリアーゼを含むホモガラクツロナン分解酵素、
（Ｃ）アラビノフラノシダーゼ及びガラクタナーゼから選択される１種以上、
を含むものである。
本発明の酵素組成物は、以下の（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）：
（Ａ）セルラーゼ、
（Ｂ）ポリガラクツロナーゼ及びペクチンリアーゼを含むホモガラクツロナン分解酵素、
（Ｃ）アラビノフラノシダーゼ及びガラクタナーゼから選択される１種以上、
を含むものである。
（Ａ）のセルラーゼは、セルロースを分解する酵素の総称であり、セルロースの分子内部から切断するエンドグルカナーゼ（ＥＣ ３．２．１．４）、セルロースの還元末端又は非還元末端から分解し、セロビオースを遊離するエキソグルカナーゼ（セロビオヒドロラーゼ、ＥＣ ３．２．１．９１）及びβ－グルコシダーゼ（ＥＣ ３．２．１．２１）を包含するが、本発明においては、これらの何れのクラスに属するものであって良く、複数種を組み合わせて使用することもできる。
斯かるセルラーゼの起源としては、バチルス・サブティリス（Bacillus subtilis）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、イルぺクス・ラクトース（Irpex lacteus）、ヒュミクラ・インソレンス（Humicura insorens）、トリコデルマ・ヴィリデ（Trichoderma viride）、トリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）等が知られているが、本発明においては、トリコデルマ属由来のセルラーゼを用いるのが好ましい。
本発明において、セルラーゼは、上記セルラーゼ生産菌を常法に従って固形培養又は液体培養して得られた培養物、これを精製した濃縮物又はこれらを乾燥した粗酵素粉末等の態様であり得る。また、市販されているセルラーゼ製剤、例えば、Ｃｅｌｌｕｃｌａｓｔ（ＮＯＶＯＺＹＭＥ）、メイセラーゼ（Ｍｅｉｊｉ Ｓｅｉｋａファルマ株式会社）、スミチームＣ、スミチームＡＣ（新日本化学工業株式会社）等を使用することもできる。
セルラーゼは、バイオマスの糖化及びスラリーの高粘度化抑制の点から、例えば、酵素組成物のセルラーゼ活性が、酵素組成物中のタンパク質１ｍｇあたり２．０Ｕ以上、好ましくは２．２Ｕ以上で、より好ましくは２．４Ｕ以上、かつ５．０Ｕ以下、好ましくは４．０Ｕ以下、より好ましくは３．６Ｕ以下であるか、又は２．０～５．０Ｕ、好ましくは２．２～４．０Ｕ、より好ましくは２．４～３．６Ｕとなるように配合される。
ここで、セルラーゼ活性は、ろ紙を基質としてセルラーゼをｐＨ４．８、５０℃で作用させ、酵素反応生成物である還元糖を比色法により定量して測定した値であり、酵素１単位（１Ｕ）は、１分間にグルコース相当の還元糖１μｍｏｌを生成する酵素量を意味する。
ここで、セルラーゼ活性は、ろ紙を基質としてセルラーゼをｐＨ４．８、５０℃で作用させ、酵素反応生成物である還元糖を比色法により定量して測定した値であり、酵素１単位（１Ｕ）は、１分間にグルコース相当の還元糖１μｍｏｌを生成する酵素量を意味する。
（Ｂ）のホモガラクツロナン分解酵素は、ペクチン中のホモガラクツロナン（ＨＧ）ドメインを分解する酵素であり、本発明においては、少なくともポリガラクツロナーゼ及びペクチンリアーゼを含むものである。
ポリガラクツロナーゼは、ペクチン酸を構成するＤ－ガラクツロン酸のα－１，４－グリコシド結合を加水分解する酵素（ＥＣ３．２．１．１５）である。
ペクチンリアーゼは、ペクチンを末端残基のＣ－４、Ｃ－５間に不飽和結合をもつオリゴ糖に変換する反応を触媒する酵素（ＥＣ４．２．２．１０）である。
ポリガラクツロナーゼは、ペクチン酸を構成するＤ－ガラクツロン酸のα－１，４－グリコシド結合を加水分解する酵素（ＥＣ３．２．１．１５）である。
ペクチンリアーゼは、ペクチンを末端残基のＣ－４、Ｃ－５間に不飽和結合をもつオリゴ糖に変換する反応を触媒する酵素（ＥＣ４．２．２．１０）である。
本発明のポリガラクツロナーゼ、ペクチンリアーゼとしては、アスペルギルス属、ペニシリウム属、リゾプス属等に由来するものを使用することができる。当該ポリガラクツロナーゼ、ペクチンリアーゼは、それぞれポリガラクツロナーゼ生産能又はペクチンリアーゼ生産能を有する微生物を常法に従って固形培養又は液体培養して得られた培養物、これを精製した濃縮物又はこれらを乾燥した粗酵素粉末等の態様であり得る。また、市販のポリガラクツロナーゼ製剤、ペクチンリアーゼ製剤、例えば、スミチームＡＰ２（新日本化学工業株式会社）、スクラーゼＮ（三菱ケミカル）、ポリガラクツロナーゼ 溶液 ｆｒｏｍ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ（Ｓｉｇｍａ、Ｐ４７１６）を用いることもできる。
ポリガラクツロナーゼは、例えば、酵素組成物のポリガラクツロナーゼ活性が、酵素組成物中のタンパク質１ｍｇあたり３０Ｕ以上となるように配合されるのが好ましく、具体的には３０Ｕ以上、好ましくは６０Ｕ以上、より好ましくは９０Ｕ以上、より好ましくは１５０Ｕ以上で、１２００Ｕ以下、好ましくは６００Ｕ以下、より好ましくは４５０Ｕ以下であるか、又は好ましくは３０～１２００Ｕ、より好ましくは６０～６００Ｕ、より好ましくは９０～４５０Ｕ、より好ましくは１５０～４５０Ｕとなるように配合される。
ここで、ポリガラクツロナーゼ活性は、ポリガラクツロン酸溶液を基質としてポリガラクツロナーゼをｐＨ４．０、５０℃で作用させ、酵素反応生成物である還元糖を比色法により定量して測定した値であり、酵素１単位（１Ｕ）は、１分間にＤ－ガラクツロン酸相当の還元糖１μｍｏｌを生成する酵素量を意味する。
ここで、ポリガラクツロナーゼ活性は、ポリガラクツロン酸溶液を基質としてポリガラクツロナーゼをｐＨ４．０、５０℃で作用させ、酵素反応生成物である還元糖を比色法により定量して測定した値であり、酵素１単位（１Ｕ）は、１分間にＤ－ガラクツロン酸相当の還元糖１μｍｏｌを生成する酵素量を意味する。
ペクチンリアーゼは、例えば、酵素組成物のペクチンリアーゼ活性が、酵素組成物中のタンパク質１ｍｇあたり１Ｕ以上となるように配合されるのが好ましく、具体的には１Ｕ以上、好ましくは１．５Ｕ以上、より好ましくは１．７Ｕ以上で、２７Ｕ以下、好ましくは１６Ｕ以下、より好ましくは１０Ｕ以下であるか、又は好ましくは１～２７Ｕ、より好ましくは１．５～１６Ｕ、より好ましくは１．７～１０Ｕとなるように配合される。
ここで、ペクチンリアーゼ活性は、ポリガラクツロン酸溶液を基質としてペクチンリアーゼをｐＨ４．０、５０℃で作用させ、酵素反応生成物である不飽和オリゴガラクツロニドを不飽和ジガラクツロニドのモル分子吸光係数４６００Ｍ-1ｃｍ-1を用いて測定した値であり、酵素１単位（１Ｕ）は、１分間に不飽和オリゴガラクツロニド１μｍｏｌを生成する酵素量を意味する。
ここで、ペクチンリアーゼ活性は、ポリガラクツロン酸溶液を基質としてペクチンリアーゼをｐＨ４．０、５０℃で作用させ、酵素反応生成物である不飽和オリゴガラクツロニドを不飽和ジガラクツロニドのモル分子吸光係数４６００Ｍ-1ｃｍ-1を用いて測定した値であり、酵素１単位（１Ｕ）は、１分間に不飽和オリゴガラクツロニド１μｍｏｌを生成する酵素量を意味する。
（ｃ）のアラビノフラノシダーゼは、アラビノース側鎖を非還元末端側から加水分解する酵素でありＥＣ３．２．１．５５に分類される。
また、ガラクタナーゼは、ガラクタンのグリコシド結合を加水分解するヒドロラーゼでありＥＣ３．２．１．８９、ＥＣ３．２．１．１６４、ＥＣ３．２．１．１８１に分類される。
ペクチン中のラムノガラクツロナンＩ（ＲＧ－Ｉ）は、ラムノースとガラクツロン酸の２糖のくり返し構造を主鎖とし、ガラクトース残基が連なったガラクタン側鎖やアラビノース残基が連なったアラビナン側鎖やアラビノース残基とガラクトース残基から構成したアラビノガラクタン側鎖をもつ重合体である。アラビノフラノシダーゼ及びガラクタナーゼは、ペクチン中のラムノガラクツロナンＩ（ＲＧ－Ｉ）構造の側鎖の分解に寄与する。斯かる意味から、本発明においては、当該アラビノフラノシダーゼ及びガラクタナーゼをペクチナーゼと称する場合もある。
また、ガラクタナーゼは、ガラクタンのグリコシド結合を加水分解するヒドロラーゼでありＥＣ３．２．１．８９、ＥＣ３．２．１．１６４、ＥＣ３．２．１．１８１に分類される。
ペクチン中のラムノガラクツロナンＩ（ＲＧ－Ｉ）は、ラムノースとガラクツロン酸の２糖のくり返し構造を主鎖とし、ガラクトース残基が連なったガラクタン側鎖やアラビノース残基が連なったアラビナン側鎖やアラビノース残基とガラクトース残基から構成したアラビノガラクタン側鎖をもつ重合体である。アラビノフラノシダーゼ及びガラクタナーゼは、ペクチン中のラムノガラクツロナンＩ（ＲＧ－Ｉ）構造の側鎖の分解に寄与する。斯かる意味から、本発明においては、当該アラビノフラノシダーゼ及びガラクタナーゼをペクチナーゼと称する場合もある。
本発明のアラビノフラノシダーゼ及びガラクタナーゼとしては、アスペルギルス属、ペニシリウム属、リゾプス属等に由来するものを使用することができる。当該アラビノフラノシダーゼ、ガラクタナーゼは、それぞれアラビノフラノシダーゼ生産能又はガラクタナーゼ生産能を有する微生物を常法に従って固形培養又は液体培養して得られた培養物、これを精製した濃縮物又はこれらを乾燥した粗酵素粉末等の態様であり得る。また、市販のアラビノフラノシダーゼ製剤、ガラクタナーゼ製剤、例えば、α－Ｌ－アラビノフラノシダーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）（Ｍｅｇａｚｙｍｅ、Ｅ－ＡＦＡＳＥ）、α－Ｌ－アラビノフラノシダーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）（Ｍｅｇａｚｙｍｅ、Ｅ－ＡＢＦＡＮ）、エンドβ－１，４－ガラクタナーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）（Ｍｅｇａｚｙｍｅ、Ｅ－ＥＧＡＬＮ）、エンドβ－１，４－ガラクタナーゼ（Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）（Ｍｅｇａｚｙｍｅ、Ｅ－ＧＡＬＣＪ）、エンドβ－１，４－ガラクタナーゼ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）（Ｍｅｇａｚｙｍｅ、Ｅ－ＧＡＬＣＴ）を用いることもできる。
アラビノフラノシダーゼは、例えば、酵素組成物のアラビノフラノシダーゼ活性が、酵素組成物中のタンパク質１ｍｇあたり０．１Ｕ以上となるように配合されるのが好ましく、具体的には０．１Ｕ以上、好ましくは１Ｕ以上、より好ましくは３Ｕ以上で、５０Ｕ以下、好ましくは２５Ｕ以下、より好ましくは１５Ｕ以下であるか、又は好ましくは０．１～５０Ｕ、より好ましくは１～２５Ｕ、より好ましくは３～１５Ｕとなるように配合される。
ここで、アラビノフラノシダーゼ活性は、４－ニトロフェニル－α－Ｌ－アラビノフラノシド溶液を基質としてアラビノフラノシダーゼをｐＨ４．０、５０℃で作用させ、酵素反応生成物である４－ニトロフェノールを比色法により定量して測定した値であり、酵素１単位（１Ｕ）は、１分間に４－ニトロフェノール１μｍｏｌを生成する酵素量を意味する。
ここで、アラビノフラノシダーゼ活性は、４－ニトロフェニル－α－Ｌ－アラビノフラノシド溶液を基質としてアラビノフラノシダーゼをｐＨ４．０、５０℃で作用させ、酵素反応生成物である４－ニトロフェノールを比色法により定量して測定した値であり、酵素１単位（１Ｕ）は、１分間に４－ニトロフェノール１μｍｏｌを生成する酵素量を意味する。
ガラクタナーゼは、例えば、酵素組成物のガラクタナーゼ活性が、酵素組成物中のタンパク質１ｍｇあたり３Ｕ以上となるように配合されるのが好ましく、具体的には３Ｕ以上、好ましくは５Ｕ以上、より好ましくは２０Ｕ以上で、２５０Ｕ以下、好ましくは１００Ｕ以下、より好ましくは８０Ｕ以下であるか、又は好ましくは３～２５０Ｕ、より好ましくは５～１００Ｕ、より好ましくは２０～８０Ｕとなるように配合される。
ここで、ガラクタナーゼ活性は、ガラクタン溶液を基質としてガラクタナーゼをｐＨ４．０、５０℃で作用させ、酵素反応生成物である還元糖を比色法により定量して測定した値であり、酵素１単位（１Ｕ）は、１分間にガラクトース相当の還元糖１μｍｏｌを生成する酵素量を意味する。
ここで、ガラクタナーゼ活性は、ガラクタン溶液を基質としてガラクタナーゼをｐＨ４．０、５０℃で作用させ、酵素反応生成物である還元糖を比色法により定量して測定した値であり、酵素１単位（１Ｕ）は、１分間にガラクトース相当の還元糖１μｍｏｌを生成する酵素量を意味する。
本発明の酵素組成物は、上述した（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）の３種類の酵素及び必要に応じてこの種の酵素製剤に従来より用いられている種々の担体、賦形剤、その他の添加剤を配合して製剤化することができる。剤型は、錠剤、散剤、顆粒剤、液剤等であり、常法により製剤化することができる。
また、本発明の酵素組成物において、（Ｂ）ホモガラクツロナン分解酵素及び（Ｃ）アラビノフラノシダーゼ及びガラクタナーゼから選択される１種以上(（Ｂ）＋(Ｃ)）の含有割合は、酵素組成物中のタンパク質に含まれる割合が、好ましくは１質量％以上、より好ましくは５質量％以上、より好ましくは１０質量％以上であり、且つ好ましくは５０質量％以下、より好ましくは４５質量％以下、より好ましくは４０質量％以下である。また、好ましくは１質量％～５０質量％、より好ましくは５質量％～４５質量％、より好ましくは１０質量％～４０質量％である。
なお、（Ｂ）ホモガラクツロナン分解酵素において、ポリガラクツロナーゼ及びペクチンリアーゼの使用比率は特に限定されず、任意の比率で配合できる。
なお、（Ｂ）ホモガラクツロナン分解酵素において、ポリガラクツロナーゼ及びペクチンリアーゼの使用比率は特に限定されず、任意の比率で配合できる。
また、本発明の酵素組成物には、（Ａ）～（Ｃ）以外の酵素、例えば、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、β－グルコシダーゼ、グルカナーゼ、ヘミセルラーゼ、キシラナーゼ、キシロシダーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ等を適宜配合してもよい。
本発明の酵素組成物は、植物バイオマス、好ましくはペクチン含有植物バイオマスを糖化するための酵素組成物（植物バイオマス糖化剤）であり、より詳細には、糖化処理された植物バイオマスの粘度を、セルラーゼのみを用いて糖化処理された場合に比べて低下させる酵素組成物である。
当該酵素組成物により処理されるバイオマスとしては、例えば、セルロース及びペクチン含有物質、例えば、キャッサバ、サツマイモ、ジャガイモ等の芋類又はこれらの残渣、コーン、コーンハル、リンゴの残渣、柑橘類の皮等が挙げられ、好ましくはキャッサバ又はキャッサバ残渣である。
当該酵素組成物により処理されるバイオマスとしては、例えば、セルロース及びペクチン含有物質、例えば、キャッサバ、サツマイモ、ジャガイモ等の芋類又はこれらの残渣、コーン、コーンハル、リンゴの残渣、柑橘類の皮等が挙げられ、好ましくはキャッサバ又はキャッサバ残渣である。
（２．組換え糸状菌による酵素組成物の製造）
本発明の酵素組成物は、（ｂ１）ポリガラクツロナーゼ遺伝子、（ｂ２）ペクチンリアーゼ遺伝子、及び（ｃ）アラビノフラノシダーゼ遺伝子及びガラクタナーゼ遺伝子から選択される１種以上の遺伝子を導入した組換え糸状菌を培養することによっても製造することができる。
本発明の酵素組成物は、（ｂ１）ポリガラクツロナーゼ遺伝子、（ｂ２）ペクチンリアーゼ遺伝子、及び（ｃ）アラビノフラノシダーゼ遺伝子及びガラクタナーゼ遺伝子から選択される１種以上の遺伝子を導入した組換え糸状菌を培養することによっても製造することができる。
（ｂ１）ポリガラクツロナーゼ遺伝子としては、例えば、ＰｇａＢ遺伝子、ＰｇａＩ遺伝子、ＰｇａＩＩ遺伝子等が挙げられる。
斯かるポリガラクツロナーゼ遺伝子は、糸状菌に由来するものが好ましく、例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属微生物（例えば、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・ジャポニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・アクリータス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ））、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属微生物（例えば、リゾプス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、リゾプス・デレマ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｄｅｌｅｍａｒ））、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属微生物（例えば、タラロマイセス・セルロリティカス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ））、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属微生物（例えば、ペニシリウム・ロッケフォーティ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ））等に由来するものが好適に挙げられる。
このうち、アスペルギルス・ニガーのＰｇａＢ遺伝子、ＰｇａＩ遺伝子、ＰｇａＩＩ遺伝子がより好ましい。
斯かるポリガラクツロナーゼ遺伝子は、糸状菌に由来するものが好ましく、例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属微生物（例えば、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・ジャポニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・アクリータス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ））、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属微生物（例えば、リゾプス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、リゾプス・デレマ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｄｅｌｅｍａｒ））、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属微生物（例えば、タラロマイセス・セルロリティカス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ））、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属微生物（例えば、ペニシリウム・ロッケフォーティ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ））等に由来するものが好適に挙げられる。
このうち、アスペルギルス・ニガーのＰｇａＢ遺伝子、ＰｇａＩ遺伝子、ＰｇａＩＩ遺伝子がより好ましい。
アスペルギルス・ニガーのＰｇａＢ遺伝子は、ＮＣＢＩの公開データベースにアクセッション番号ＸＭ＿０２５５９７７５６として登録されている（配列番号１）。
アスペルギルス・ニガーのＰｇａＩ遺伝子は、ＮＣＢＩの公開データベースにアクセッション番号ＸＭ＿０２５５９６７６８として登録されている（配列番号３）。
アスペルギルス・ニガーのＰｇａＩＩ遺伝子は、ＮＣＢＩの公開データベースにアクセッション番号ＸＭ＿０２５６０２３４３．１として登録されている（配列番号５）。
アスペルギルス・ニガーのＰｇａＩ遺伝子は、ＮＣＢＩの公開データベースにアクセッション番号ＸＭ＿０２５５９６７６８として登録されている（配列番号３）。
アスペルギルス・ニガーのＰｇａＩＩ遺伝子は、ＮＣＢＩの公開データベースにアクセッション番号ＸＭ＿０２５６０２３４３．１として登録されている（配列番号５）。
（ｂ２）ペクチンリアーゼ遺伝子としては、例えば、ＰｅｌＤ遺伝子、ＰｅｌＦ遺伝子等が挙げられる。
斯かるペクチンリアーゼ遺伝子は、糸状菌に由来するものが好ましく、例えば、アスペルギルス属微生物（例えば、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・ジャポニクス、アスペルギルス・ルチュエンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｌｕｄｈｕｅｎｓｉｓ）、アスペルギルス・アクリータス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ））、ペニシリウム属微生物（例えば、ペニシリウム・ディギタータム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄｉｇｉｔａｔｕｍ）、ペニシリウム・ソリタム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｏｌｉｔｕｍ））、タラロマイセス属微生物（例えば、タラロマイセス・ルガロサス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｕｇｕｌｏｓｕｓ）、タラロマイセス・セルロリティカス））等に由来するものが挙げられる。
このうち、アスペルギルス・ニガーのＰｅｌＤ遺伝子、ＰｅｌＦ遺伝子がより好ましい。
斯かるペクチンリアーゼ遺伝子は、糸状菌に由来するものが好ましく、例えば、アスペルギルス属微生物（例えば、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・ジャポニクス、アスペルギルス・ルチュエンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｌｕｄｈｕｅｎｓｉｓ）、アスペルギルス・アクリータス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ））、ペニシリウム属微生物（例えば、ペニシリウム・ディギタータム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄｉｇｉｔａｔｕｍ）、ペニシリウム・ソリタム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｏｌｉｔｕｍ））、タラロマイセス属微生物（例えば、タラロマイセス・ルガロサス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｕｇｕｌｏｓｕｓ）、タラロマイセス・セルロリティカス））等に由来するものが挙げられる。
このうち、アスペルギルス・ニガーのＰｅｌＤ遺伝子、ＰｅｌＦ遺伝子がより好ましい。
上記アスペルギルス・ニガーのＰｅｌＤ遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースにアクセッション番号ＸＭ＿０２５６０４０３９．１として登録されている（配列番号７）。
上記アスペルギルス・ニガーのＰｅｌＦ遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースにアクセッション番号：ＸＭ＿００１４０１０２４．２として登録されている（配列番号９）。
上記アスペルギルス・ニガーのＰｅｌＦ遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースにアクセッション番号：ＸＭ＿００１４０１０２４．２として登録されている（配列番号９）。
（ｃ）アラビノフラノシダーゼ遺伝子としては例えばＡｂｆ遺伝子、ガラクタナーゼ遺伝子としては例えばＧａｌ遺伝子が挙げられる。
斯かるアラビノフラノシダーゼ遺伝子及びガラクタナーゼ遺伝子は、糸状菌に由来するものが好ましく、例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属微生物（例えば、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・ジャポニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・アクリータス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ））、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属微生物（例えば、リゾプス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、リゾプス・デレマ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｄｅｌｅｍａｒ））、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属微生物（例えば、タラロマイセス・セルロリティカス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ））、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属微生物（例えば、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ））、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属微生物（例えば、ペニシリウム・ロッケフォーティ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ）、ぺニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ））等に由来するものが好適に挙げられる。
このうち、アスペルギルス・ニガーのＡｂｆ遺伝子、Ｇａｌ遺伝子がより好ましい。
斯かるアラビノフラノシダーゼ遺伝子及びガラクタナーゼ遺伝子は、糸状菌に由来するものが好ましく、例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属微生物（例えば、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・ジャポニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・アクリータス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ））、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属微生物（例えば、リゾプス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、リゾプス・デレマ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｄｅｌｅｍａｒ））、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属微生物（例えば、タラロマイセス・セルロリティカス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ））、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属微生物（例えば、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ））、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属微生物（例えば、ペニシリウム・ロッケフォーティ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ）、ぺニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ））等に由来するものが好適に挙げられる。
このうち、アスペルギルス・ニガーのＡｂｆ遺伝子、Ｇａｌ遺伝子がより好ましい。
上記アスペルギルス・ニガーのＡｂｆ遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースにアクセッション番号Ｌ２９００５．１（アミノ酸配列ＡＡＣ４１６４４．１）として登録されている（配列番号１１）。上記アスペルギルス・ニガーのＧａｌ遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースにアクセッション番号ＡＪ３０５３０３．１（アミノ酸配列ＣＡＣ８３７３５．１）として登録されている（配列番号１３）。
本発明の（ｂ１）ポリガラクツロナーゼ遺伝子、（ｂ２）ペクチンリアーゼ遺伝子、及び（ｃ）アラビノフラノシダーゼ遺伝子及びガラクタナーゼ遺伝子から選択される１種以上の遺伝子を糸状菌に導入する手段としては、例えば、各酵素遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含有するベクター又はＤＮＡ断片を宿主糸状菌（親株）に導入することが挙げられる。
ここで、各酵素遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターは発現ベクターであり、好ましくは該ポリヌクレオチドを宿主糸状菌に導入することができ、かつ宿主内で該ポリヌクレオチドを発現することができる発現ベクターである。また、該ベクターは、好ましくは当該ポリヌクレオチド、及びこれと作動可能に連結された制御領域を含む。該ベクターは、プラスミド等の染色体外で自立増殖及び複製可能なベクターであってもよく、又は染色体内に組込まれるベクターであってもよい。
ここで、「作動可能な連結」とは、遺伝子と制御領域とが、該遺伝子が該制御領域の制御の下で発現し得るように連結されていることをいう。遺伝子と制御領域との「作動可能な連結」の手順は当業者に周知である。
ここで、各酵素遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターは発現ベクターであり、好ましくは該ポリヌクレオチドを宿主糸状菌に導入することができ、かつ宿主内で該ポリヌクレオチドを発現することができる発現ベクターである。また、該ベクターは、好ましくは当該ポリヌクレオチド、及びこれと作動可能に連結された制御領域を含む。該ベクターは、プラスミド等の染色体外で自立増殖及び複製可能なベクターであってもよく、又は染色体内に組込まれるベクターであってもよい。
ここで、「作動可能な連結」とは、遺伝子と制御領域とが、該遺伝子が該制御領域の制御の下で発現し得るように連結されていることをいう。遺伝子と制御領域との「作動可能な連結」の手順は当業者に周知である。
具体的なベクターの例としては、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（－）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＵＣ１８／１９、ｐＵＣ１１８／１１９等のｐＵＣ系ベクター（タカラバイオ）、ｐＥＴ系ベクター（タカラバイオ）、ｐＧＥＸ系ベクター（ＧＥヘルスケア）、ｐＣｏｌｄ系ベクター（タカラバイオ）、ｐＨＹ３００ＰＬＫ（タカラバイオ）、ｐＵＢ１１０（Ｍｃｋｅｎｚｉｅ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｐｌａｓｍｉｄ １５（２）：９３－１０３）、ｐＢＲ３２２（タカラバイオ）、ｐＲＳ４０３（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＭＷ２１８／２１９（ニッポンジーン）、ｐＲＩ９０９／９１０等のｐＲＩ系ベクター（タカラバイオ）、ｐＢＩ系ベクター（クロンテック）、ＩＮ３系ベクター（インプランタイノベーションズ）、ｐＰＴＲ１／２（タカラバイオ）、ｐＤＪＢ２（Ｄ．Ｊ．Ｂａｌｌａｎｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，３６，３２１－３３１，１９８５）、ｐＡＢ４－１（ｖａｎ Ｈａｒｔｉｎｇｓｖｅｌｄｔ Ｗ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ，２０６，７１－７５，１９８７）、ｐＬｅｕ４（Ｍ．Ｉ．Ｇ．Ｒｏｎｃｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，８４，３３５－３４３，１９８９）、ｐＰｙｒ２２５（Ｃ．Ｄ．Ｓｋｏｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２６８，３９７－４０６，２００２）、ｐＦＧ１（Ｇｒｕｂｅｒ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅｔ，１８，４４７－４５１，１９９０）等が挙げられる。
各酵素遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含有するＤＮＡ断片の例としては、例えば、ＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片及び制限酵素切断ＤＮＡ断片が挙げられる。好ましくは、該ＤＮＡ断片は、本発明のポリヌクレオチド、及びこれと作動可能に連結された制御領域を含む発現カセットであり得る。
上記ベクター又はＤＮＡ断片に含まれる制御領域は、該ベクター又はＤＮＡ断片が導入された宿主内で、本発明の各酵素遺伝子を発現させるための配列であり、例えばプロモーターやターミネーター等の発現調節領域、複製開始点等が挙げられる。該制御領域の種類は、ベクター又はＤＮＡ断片を導入する宿主細胞の種類に応じて適宜選択することができる。必要に応じて、該ベクター又はＤＮＡ断片はさらに、抗生物質耐性遺伝子、アミノ酸合成関連遺伝子等の選択マーカーを有していてもよい。
好ましくは、上記ベクター又はＤＮＡ断片に含まれる制御領域は、（ｂ１）ポリガラクツロナーゼ遺伝子、（ｂ２）ペクチンリアーゼ遺伝子及び（ｃ）アラビノフラノシダーゼ遺伝子及びガラクタナーゼ遺伝子から選択される１種以上の遺伝子の上流に作動可能に連結され、下流遺伝子を構成的に発現又は高発現させる機能を有する制御領域（いわゆる強制御領域）である。当該強制御領域の例としては、例えば、トリコデルマ・リーセイのｃｂｈ１プロモーター、ｃｂｈ２プロモーター、ｅｇｌ１プロモーター、ｘｙｎ１プロモーター、ｘｙｎ２プロモーター、ｘｙｎ３プロモーター等が挙げられる。
強制御領域のさらなる例としては、これらに限定されないが、ｒＲＮＡオペロンの制御領域、リボソームタンパク質をコードする遺伝子の制御領域等が挙げられる。
強制御領域のさらなる例としては、これらに限定されないが、ｒＲＮＡオペロンの制御領域、リボソームタンパク質をコードする遺伝子の制御領域等が挙げられる。
上記ベクター又はＤＮＡ断片に含まれる目的のポリヌクレオチド及び制御領域は、宿主の核に導入されてもよいが、宿主ゲノムに導入されてもよい。あるいは、上記ベクター又はＤＮＡ断片に含まれる目的のポリヌクレオチドを、宿主ゲノムに直接導入して、該ゲノム上の高発現プロモーターと作動可能に連結させてもよい。ポリヌクレオチドをゲノムに導入する手段としては、相同組換え法が挙げられる。
上記宿主細胞へのベクター又はＤＮＡ断片の導入には、一般的な形質転換法、例えばエレクトロポレーション法、トランスフォーメーション法、トランスフェクション法、接合法、プロトプラスト法、パーティクル・ガン法、アグロバクテリウム法等を用いることができる。
目的のベクター又はＤＮＡ断片が導入された組換え糸状菌は、選択マーカーを利用して選択することができる。例えば、選択マーカーが抗生物質耐性遺伝子である場合、該抗生物質添加培地で細胞を培養することで、目的のベクター又はＤＮＡ断片が導入された形質転換細胞を選択することができる。また例えば、選択マーカーがアミノ酸合成関連遺伝子である場合、該アミノ酸要求性の糸状菌株に遺伝子導入した後、該アミノ酸要求性の有無を指標に、目的のベクター又はＤＮＡ断片が導入された糸状菌株を選択することができる。あるいは、ＰＣＲ等によって組換え株のＤＮＡ配列を調べることで目的のベクター又はＤＮＡ断片の導入を確認することもできる。
以上の手順で、糸状菌株に、本発明の（ｂ１）ポリガラクツロナーゼ遺伝子、（ｂ２）ペクチンリアーゼ遺伝子及び（ｃ）アラビノフラノシダーゼ遺伝子及びガラクタナーゼ遺伝子から選択される１種以上の遺伝子が導入された組換え糸状菌を作製することができる。本発明の組換え糸状菌はセルラーゼ、ホモガラクツロナン分解酵素、並びにアラビノフラノシダーゼ及び／又はガラクタナーゼ生産能を有している。
本発明において宿主（親株）として用いる糸状菌は、バイオマス糖化酵素としてセルラーゼを生産する菌であって、導入する（ｂ１）ポリガラクツロナーゼ遺伝子、（ｂ２）ペクチンリアーゼ遺伝子及び（ｃ）アラビノフラノシダーゼ遺伝子及びガラクタナーゼ遺伝子から選択される１種以上の遺伝子と異なる属又は種の糸状菌であれば、限定されず、真菌門（Ｅｕｍｙｃｏｔａ）及び卵菌門（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）に属する糸状菌が挙げられる。具体的には、上記糸状菌としては、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、アルペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、エメリセラ（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）属、ハイポクレア（Ｈｙｐｏｃｒｅａ）属、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、ミセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）属、ピロマイセス（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）属、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属、サーモアスカス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）属、チエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）属等の糸状菌が挙げられるが、好ましくはトリコデルマ属の糸状菌である。
前記トリコデルマ属の糸状菌としては、トリコデルマ・リーセイ、トリコデルマ・ロンジブラキアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・ハリジアウム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｋｏｎｉｎｇｉｉ）及びトリコデルマ・ヴィリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）等が挙げられるが、好ましくはトリコデルマ・リーセイであり、より好ましくはトリコデルマ・リーセイＰＣＤ－１０株（ＦＥＲＭ Ｐ－８１７２）及びトリコデルマ・リーセイＰＣ－３－７株（ＡＴＣＣ６６５８９）である。
親株である糸状菌は、野生型株であってもよく、当該野生型株から人工的に育種された株でもよく、そのゲノム中のヌクレオチド配列が置換、付加、欠失又は修飾された変異型株（変異体）又は突然変異体であってもよい。
本発明の組換え糸状菌の好適な例としては、トリコデルマ・リーセイ ＰＣ－３－７株（ＡＴＣＣ６６５８９）やその変異体に、アスペルギルス・ニガーのＰｇａＢ遺伝子、アスペルギルス・ニガーのＰｅｌＤ遺伝子、及びアスペルギルス・ニガーのＡｂｆ遺伝子又はアスペルギルス・ニガーのＧａｌ遺伝子を導入した組換え糸状菌が挙げられ、具体的には、後述する実施例に開示した株を挙げることができる。
上記の組換え糸状菌をセルラーゼ誘導物質の存在下で培養し、培養物中に酵素を生成、蓄積させ、当該培養物から当該酵素を採取することにより、（Ａ）セルラーゼ、（Ｂ）ポリガラクツロナーゼ及びペクチンリアーゼを含むホモガラクツロナン分解酵素、（Ｃ）アラビノフラノシダーゼ及びガラクタナーゼから選択される１種以上、を含む酵素組成物を製造することができる。
ここで、「セルラーゼ誘導物質」としては、セルラーゼ生産性糸状菌のセルラーゼ生産を誘導する物質であれば制限はないが、例えばセルロース；ソホロース；並びにセロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペンタオース及びセロヘキサオース等のセロオリゴ糖から選ばれる化合物を挙げることができる。
ここで、セルロースには、グルコースがβ－１，４－グルコシド結合により重合した重合体及びその誘導体が包含される。グルコースの重合度は特に限定されない。また、誘導体としては、カルボキシメチル化、アルデヒド化、又はエステル化等の誘導体が挙げられる。さらに、セルロースは、配糖体であるβグルコシド、リグニン及び／又はヘミセルロースとの複合体であるリグノセルロース、さらにペクチン等との複合体であってもよい。セルロースは、結晶性セルロースであってもよいし、非結晶性セルロースであってもよい。
セルラーゼ誘導物質は、一括（バッチ法）、分割添加（フェドバッチ法）あるいは連続添加（フィード法）等の任意の方法で添加することができる。培地中に添加するセルラーゼ誘導物質の量は、本発明の糸状菌がセルラーゼ及びペクチナーゼ産生を誘導できる量であればよく、添加法によっても異なるが、培地に対して、総量で、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは０．５質量％以上、より好ましくは１質量％以上であり、かつ好ましくは４０質量％以下、より好ましくは３５質量％以下、より好ましくは３０質量％以下である。また、好ましくは０．１～４０質量％、より好ましくは０．５～３５質量％、より好ましくは１～３０質量％である。
このうち、一括添加する場合の添加量は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは０．５質量％以上、より好ましくは１質量％以上であり、かつ好ましくは１６質量％以下、より好ましくは１４質量％以下、より好ましくは１２質量％以下である。また、好ましくは０．１～１６質量％、より好ましくは０．５～１４質量％、より好ましくは１～１２質量％である。
このうち、一括添加する場合の添加量は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは０．５質量％以上、より好ましくは１質量％以上であり、かつ好ましくは１６質量％以下、より好ましくは１４質量％以下、より好ましくは１２質量％以下である。また、好ましくは０．１～１６質量％、より好ましくは０．５～１４質量％、より好ましくは１～１２質量％である。
本発明の方法で用いられる培地は、炭素源、窒素源、無機塩、ビタミン等、本発明の糸状菌の増殖並びにセルラーゼ及びペクチナーゼの生産に必要な栄養素を含む限り、合成培地、天然培地のいずれでもよい。
炭素源としては、本発明の組換え糸状菌が資化できる炭素源であればいずれでもよく、具体的には、上記したセルラーゼ誘導物質の他、グルコース、フラクトースのような糖質、エタノール、グリセロールのようなアルコール類、酢酸のような有機酸類等を挙げることができる。これらは単独で、又は複数を組み合わせて使用することができる。炭素源としては、グルコース、フラクトースのような糖質が望ましく、グルコースがより好ましい。その際のグルコースの添加量は、培地に対して、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは０．５質量％以上、より好ましくは２．５質量％以上であり、かつ好ましくは１５質量％以下、より好ましくは１０質量％以下、より好ましくは５質量％以下である。また、好ましくは０．１～１５質量％、より好ましくは０．５～１０質量％、より好ましくは２．５～５質量％である。また、培地中のセルラーゼ誘導物質とグルコースの量は、質量比で１０：１～１：１であるのが好ましく、４：１～２：１であるのがより好ましい。
窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム等のアンモニウム塩、アミン等の窒素化合物、ペプトン、大豆加水分解物のような天然窒素源等をあげることができる。
無機塩としては、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、炭酸カリウム等をあげることができる。
ビタミンとしては、ビオチンやチアミン等を挙げることができる。さらに必要に応じて本発明の組換え糸状菌が生育に要求する物質を添加することができる。
培養は、好ましくは振とう培養や通気攪拌培養のような好気的条件で行う。培養温度は好ましくは１０℃以上、より好ましくは２０℃以上、より好ましくは２５℃以上であり、且つ好ましくは５０℃以下、より好ましくは４２℃以下、より好ましくは３５℃以下である。また、好ましくは１０～５０℃、より好ましくは２０～４２℃、より好ましくは２５～３５℃である。
培養時のｐＨは３～９、好ましくは４～５である。培養時間は、１０時間～１０日間、好ましくは２～７日間である。
培養時のｐＨは３～９、好ましくは４～５である。培養時間は、１０時間～１０日間、好ましくは２～７日間である。
培養終了後、培養物を回収し、必要に応じて超音波や加圧等による菌体破砕処理を行い、ろ過や遠心分離等によって固液分離した後、限外ろ過、塩析、透析、クロマトグラフィー等を適宜組み合わせることにより、（Ａ）セルラーゼ、（Ｂ）ポリガラクツロナーゼ及びペクチンリアーゼを含むホモガラクツロナン分解酵素、（Ｃ）アラビノフラノシダーゼ及びガラクタナーゼから選択される１種以上、を含む酵素組成物を取得できる。なお、分離精製の程度は特に限定されない。培養上清やその粗分離精製物自体を本発明の酵素組成物として利用することもできる。
（３．植物バイオマスの糖化）
本発明の酵素組成物を用いることにより、植物バイオマスを分解、糖化し、単糖を製造することができる。具体的には、本発明の酵素組成物とバイオマスを水性媒体中に接触（共存）させ、撹拌又は振とうしながら加温することにより、植物バイオマスを糖化し、単糖を製造することができる。この場合において、糖化処理したスラリーの粘度を、セルラーゼのみを用いて糖化処理した場合に比べて、５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上低下することが可能となる。すなわち、本発明の酵素組成物によれば、ペクチン質を多く含むキャッサバ等の植物バイオマスの糖化処理において、高粘度化を抑制し、糖化効率を高めることができる。したがって、本発明の酵素組成物は、植物バイオマス粘度低下剤にもなり得、植物バイオマスの粘度低下のために使用することができる。すなわち、本発明の酵素組成物を植物バイオマスと接触させることにより、植物バイオマスの粘度低下を図ることができる。
なお、粘度としては、例えば、Ｂ型粘度計で、固形分濃度１０－２０質量％及び５０℃にて測定される粘度が挙げられる。
本発明の酵素組成物を用いることにより、植物バイオマスを分解、糖化し、単糖を製造することができる。具体的には、本発明の酵素組成物とバイオマスを水性媒体中に接触（共存）させ、撹拌又は振とうしながら加温することにより、植物バイオマスを糖化し、単糖を製造することができる。この場合において、糖化処理したスラリーの粘度を、セルラーゼのみを用いて糖化処理した場合に比べて、５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上低下することが可能となる。すなわち、本発明の酵素組成物によれば、ペクチン質を多く含むキャッサバ等の植物バイオマスの糖化処理において、高粘度化を抑制し、糖化効率を高めることができる。したがって、本発明の酵素組成物は、植物バイオマス粘度低下剤にもなり得、植物バイオマスの粘度低下のために使用することができる。すなわち、本発明の酵素組成物を植物バイオマスと接触させることにより、植物バイオマスの粘度低下を図ることができる。
なお、粘度としては、例えば、Ｂ型粘度計で、固形分濃度１０－２０質量％及び５０℃にて測定される粘度が挙げられる。
植物バイオマスの糖化において、反応液のｐＨ及び温度は、セルラーゼ及びペクチナーゼが失活しない範囲内であればよく、一般的に、常圧で反応を行う場合、温度は５～９５℃、ｐＨは１～１１の範囲で行われる。
植物バイオマスの糖化の工程は、バッチ式で行っても、連続式で行ってもよい。
植物バイオマスの糖化の工程は、バッチ式で行っても、連続式で行ってもよい。
（４．エタノールの製造）
植物バイオマスを糖化し得られた糖液に対して、エタノール発酵微生物を添加し、発酵させることによってエタノールを製造することができる。エタノール発酵微生物としては、例えばサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クリュイベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）の酵母や、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の細菌などが知られているが、これらに限定されるものではない。発酵は、例えば、２４～９６時間、温度は、２６～３４℃、ｐＨは、ｐＨ３～６、好ましくはｐＨ４～５前後で実施される。また、糖化工程と発酵工程は別々に実施されてもよく、同時に実施する並行複発酵（ＳＳＦ）であってもよい。ＳＳＦは、酵母と酵素を一緒に添加することで実施され、例えば、２４～９６時間、温度は、２６～３４℃、ｐＨは、ｐＨ３～６、好ましくはｐＨ４～５前後で実施される。ＳＳＦを実施する際、５０℃を超える温度での前糖化ステップを発酵の直前に実施しても良い。糖化、発酵を実施する方法に関するさらなる詳細について当業者は周知である。
植物バイオマスを糖化し得られた糖液に対して、エタノール発酵微生物を添加し、発酵させることによってエタノールを製造することができる。エタノール発酵微生物としては、例えばサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クリュイベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）の酵母や、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）の細菌などが知られているが、これらに限定されるものではない。発酵は、例えば、２４～９６時間、温度は、２６～３４℃、ｐＨは、ｐＨ３～６、好ましくはｐＨ４～５前後で実施される。また、糖化工程と発酵工程は別々に実施されてもよく、同時に実施する並行複発酵（ＳＳＦ）であってもよい。ＳＳＦは、酵母と酵素を一緒に添加することで実施され、例えば、２４～９６時間、温度は、２６～３４℃、ｐＨは、ｐＨ３～６、好ましくはｐＨ４～５前後で実施される。ＳＳＦを実施する際、５０℃を超える温度での前糖化ステップを発酵の直前に実施しても良い。糖化、発酵を実施する方法に関するさらなる詳細について当業者は周知である。
本発明はまた、例示的実施形態として以下を包含する。但し、本発明はこれらの実施形態に限定されない。
＜１＞以下の（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）を含む酵素組成物：
（Ａ）セルラーゼ、
（Ｂ）ポリガラクツロナーゼ及びペクチンリアーゼを含むホモガラクツロナン分解酵素、
（Ｃ）アラビノフラノシダーゼ及びガラクタナーゼから選択される１種以上。
＜２＞植物バイオマスを糖化するための、＜１＞の酵素組成物。
＜３＞糖化処理された植物バイオマスの粘度を、セルラーゼのみを用いて糖化処理された場合に比べて低下させるものである、＜２＞の酵素組成物。
＜４＞植物バイオマスのスラリー粘度を、セルラーゼのみを用いて糖化処理した場合に比べて、５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上低下させる、＜３＞の酵素組成物。
＜５＞セルラーゼ活性が、酵素組成物中のタンパク質１ｍｇあたり２．０Ｕ以上、好ましくは２．２Ｕ以上で、より好ましくは２．４Ｕ以上、かつ５．０Ｕ以下、好ましくは４．０Ｕ以下、より好ましくは３．６Ｕ以下であるか、又は２．０～５．０Ｕ、好ましくは２．２～４．０Ｕ、より好ましくは２．４～３．６Ｕである、＜１＞～＜４＞のいずれかの酵素組成物。
＜６＞ポリガラクツロナーゼ活性が、酵素組成物中のタンパク質１ｍｇあたり３０Ｕ以上、好ましくは６０Ｕ以上、より好ましくは９０Ｕ以上、より好ましくは１５０Ｕ以上で、１２００Ｕ以下、好ましくは６００Ｕ以下、より好ましくは４５０Ｕ以下であるか、または、好ましくは３０～１２００Ｕ、より好ましくは６０～６００Ｕ、より好ましくは９０～４５０Ｕ、より好ましくは１５０～４５０Ｕである、＜１＞～＜５＞のいずれかの酵素組成物。
＜７＞ペクチンリアーゼ活性が、酵素組成物中のタンパク質１ｍｇあたり１Ｕ以上、好ましくは１．５Ｕ以上、より好ましくは１．７Ｕ以上で、２７Ｕ以下、好ましくは１６Ｕ以下、より好ましくは１０Ｕ以下であるか、または、好ましくは１～２７Ｕ、より好ましくは１．５～１６Ｕ、より好ましくは１．７～１０Ｕである、＜１＞～＜６＞のいずれかの酵素組成物。
＜８＞アラビノフラノシダーゼ活性が、酵素組成物中のタンパク質１ｍｇあたり０．１Ｕ以上、好ましくは１Ｕ以上、より好ましくは３Ｕ以上で、５０Ｕ以下、好ましくは２５Ｕ以下、より好ましくは１５Ｕ以下であるか、または、好ましくは０．１～５０Ｕ、より好ましくは１～２５Ｕ、より好ましくは３～１５Ｕである、＜１＞～＜７＞のいずれかの酵素組成物。
＜９＞ガラクタナーゼ活性が、酵素組成物中のタンパク質１ｍｇあたり３Ｕ以上、好ましくは５Ｕ以上、より好ましくは２０Ｕ以上で、２５０Ｕ以下、好ましくは１００Ｕ以下、より好ましくは８０Ｕ以下であるか、または、好ましくは３～２５０Ｕ、より好ましくは５～１００Ｕ、より好ましくは２０～８０Ｕである、＜１＞～＜８＞のいずれかの酵素組成物。
＜１０＞酵素組成物中の（Ｂ）ホモガラクツロナン分解酵素及び（Ｃ）アラビノフラノシダーゼ及びガラクタナーゼから選択される１種以上（（Ｂ）＋（Ｃ））のタンパク質あたりの含有比率が好ましくは１以上、より好ましくは５以上、より好ましくは１０以上であり、且つ好ましくは５０以下、より好ましくは４５以下、より好ましくは４０以下であるか、または、好ましくは１～５０、より好ましくは５～４５、より好ましくは１０～４０である、＜１＞～＜９＞のいずれかの酵素組成物。
＜１１＞＜１＞～＜１０＞のいずれかの酵素組成物を植物バイオマスと接触させる工程を含む、植物バイオマスの糖化方法。
＜１２＞＜１＞～＜１０＞のいずれかの酵素組成物を植物バイオマスと接触させる工程を含む、植物バイオマスからの糖の製造方法。
＜１３＞＜１＞～＜１０＞のいずれかの酵素組成物を植物バイオマスと接触させる工程を含む、植物バイオマスからのエタノールの製造方法。
＜１４＞植物バイオマスがペクチン含有植物バイオマスである、＜１１＞～＜１３＞のいずれかの方法。
＜１５＞植物バイオマスがキャッサバ又はその残渣である、＜１１＞～＜１３＞のいずれかの方法。
＜１６＞＜１＞～＜１０＞のいずれかの酵素組成物と接触した植物バイオマスの粘度を、セルラーゼのみを用いて接触場合に比べて低下させるものである、＜１４＞又は＜１５＞の方法。
＜１７＞（ｂ１）ポリガラクツロナーゼ遺伝子、（ｂ２）ペクチンリアーゼ遺伝子、及び（ｃ）アラビノフラノシダーゼ遺伝子及びガラクタナーゼ遺伝子から選択される１種以上の遺伝子を導入した組換え糸状菌。
＜１８＞＜１７＞の組換え糸状菌を培養することを含む、＜１＞～＜１０＞のいずれかの酵素組成物の製造方法。
＜１９＞（ｂ１）ポリガラクツロナーゼ遺伝子がＰｇａＢ遺伝子であり、（ｂ２）ペクチンリアーゼ遺伝子がＰｅｌＤ遺伝子であり、（ｃ）Ａｂｆ遺伝子又はＧａｌ遺伝子である、＜１７＞の組換え糸状菌。
＜２０＞（ｂ１）ポリガラクツロナーゼ遺伝子がＰｇａＢ遺伝子であり、（ｂ２）ペクチンリアーゼ遺伝子がＰｅｌＤ遺伝子であり、（ｃ）Ａｂｆ遺伝子又はＧａｌ遺伝子である、＜１８＞の方法。
＜２１＞＜１＞～＜２＞，＜５＞～＜１０＞のいずれかの酵素組成物を有効成分とする植物バイオマス粘度低下剤。
＜２２＞＜１＞～＜２＞，＜５＞～＜１０＞のいずれかの酵素組成物を植物バイオマスと接触させる工程を含む、植物バイオマス粘度低下方法。
＜２３＞＜１＞～＜２＞，＜５＞～＜１０＞のいずれかの酵素組成物の、植物バイオマス粘度低下のための使用。
＜１＞以下の（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）を含む酵素組成物：
（Ａ）セルラーゼ、
（Ｂ）ポリガラクツロナーゼ及びペクチンリアーゼを含むホモガラクツロナン分解酵素、
（Ｃ）アラビノフラノシダーゼ及びガラクタナーゼから選択される１種以上。
＜２＞植物バイオマスを糖化するための、＜１＞の酵素組成物。
＜３＞糖化処理された植物バイオマスの粘度を、セルラーゼのみを用いて糖化処理された場合に比べて低下させるものである、＜２＞の酵素組成物。
＜４＞植物バイオマスのスラリー粘度を、セルラーゼのみを用いて糖化処理した場合に比べて、５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上低下させる、＜３＞の酵素組成物。
＜５＞セルラーゼ活性が、酵素組成物中のタンパク質１ｍｇあたり２．０Ｕ以上、好ましくは２．２Ｕ以上で、より好ましくは２．４Ｕ以上、かつ５．０Ｕ以下、好ましくは４．０Ｕ以下、より好ましくは３．６Ｕ以下であるか、又は２．０～５．０Ｕ、好ましくは２．２～４．０Ｕ、より好ましくは２．４～３．６Ｕである、＜１＞～＜４＞のいずれかの酵素組成物。
＜６＞ポリガラクツロナーゼ活性が、酵素組成物中のタンパク質１ｍｇあたり３０Ｕ以上、好ましくは６０Ｕ以上、より好ましくは９０Ｕ以上、より好ましくは１５０Ｕ以上で、１２００Ｕ以下、好ましくは６００Ｕ以下、より好ましくは４５０Ｕ以下であるか、または、好ましくは３０～１２００Ｕ、より好ましくは６０～６００Ｕ、より好ましくは９０～４５０Ｕ、より好ましくは１５０～４５０Ｕである、＜１＞～＜５＞のいずれかの酵素組成物。
＜７＞ペクチンリアーゼ活性が、酵素組成物中のタンパク質１ｍｇあたり１Ｕ以上、好ましくは１．５Ｕ以上、より好ましくは１．７Ｕ以上で、２７Ｕ以下、好ましくは１６Ｕ以下、より好ましくは１０Ｕ以下であるか、または、好ましくは１～２７Ｕ、より好ましくは１．５～１６Ｕ、より好ましくは１．７～１０Ｕである、＜１＞～＜６＞のいずれかの酵素組成物。
＜８＞アラビノフラノシダーゼ活性が、酵素組成物中のタンパク質１ｍｇあたり０．１Ｕ以上、好ましくは１Ｕ以上、より好ましくは３Ｕ以上で、５０Ｕ以下、好ましくは２５Ｕ以下、より好ましくは１５Ｕ以下であるか、または、好ましくは０．１～５０Ｕ、より好ましくは１～２５Ｕ、より好ましくは３～１５Ｕである、＜１＞～＜７＞のいずれかの酵素組成物。
＜９＞ガラクタナーゼ活性が、酵素組成物中のタンパク質１ｍｇあたり３Ｕ以上、好ましくは５Ｕ以上、より好ましくは２０Ｕ以上で、２５０Ｕ以下、好ましくは１００Ｕ以下、より好ましくは８０Ｕ以下であるか、または、好ましくは３～２５０Ｕ、より好ましくは５～１００Ｕ、より好ましくは２０～８０Ｕである、＜１＞～＜８＞のいずれかの酵素組成物。
＜１０＞酵素組成物中の（Ｂ）ホモガラクツロナン分解酵素及び（Ｃ）アラビノフラノシダーゼ及びガラクタナーゼから選択される１種以上（（Ｂ）＋（Ｃ））のタンパク質あたりの含有比率が好ましくは１以上、より好ましくは５以上、より好ましくは１０以上であり、且つ好ましくは５０以下、より好ましくは４５以下、より好ましくは４０以下であるか、または、好ましくは１～５０、より好ましくは５～４５、より好ましくは１０～４０である、＜１＞～＜９＞のいずれかの酵素組成物。
＜１１＞＜１＞～＜１０＞のいずれかの酵素組成物を植物バイオマスと接触させる工程を含む、植物バイオマスの糖化方法。
＜１２＞＜１＞～＜１０＞のいずれかの酵素組成物を植物バイオマスと接触させる工程を含む、植物バイオマスからの糖の製造方法。
＜１３＞＜１＞～＜１０＞のいずれかの酵素組成物を植物バイオマスと接触させる工程を含む、植物バイオマスからのエタノールの製造方法。
＜１４＞植物バイオマスがペクチン含有植物バイオマスである、＜１１＞～＜１３＞のいずれかの方法。
＜１５＞植物バイオマスがキャッサバ又はその残渣である、＜１１＞～＜１３＞のいずれかの方法。
＜１６＞＜１＞～＜１０＞のいずれかの酵素組成物と接触した植物バイオマスの粘度を、セルラーゼのみを用いて接触場合に比べて低下させるものである、＜１４＞又は＜１５＞の方法。
＜１７＞（ｂ１）ポリガラクツロナーゼ遺伝子、（ｂ２）ペクチンリアーゼ遺伝子、及び（ｃ）アラビノフラノシダーゼ遺伝子及びガラクタナーゼ遺伝子から選択される１種以上の遺伝子を導入した組換え糸状菌。
＜１８＞＜１７＞の組換え糸状菌を培養することを含む、＜１＞～＜１０＞のいずれかの酵素組成物の製造方法。
＜１９＞（ｂ１）ポリガラクツロナーゼ遺伝子がＰｇａＢ遺伝子であり、（ｂ２）ペクチンリアーゼ遺伝子がＰｅｌＤ遺伝子であり、（ｃ）Ａｂｆ遺伝子又はＧａｌ遺伝子である、＜１７＞の組換え糸状菌。
＜２０＞（ｂ１）ポリガラクツロナーゼ遺伝子がＰｇａＢ遺伝子であり、（ｂ２）ペクチンリアーゼ遺伝子がＰｅｌＤ遺伝子であり、（ｃ）Ａｂｆ遺伝子又はＧａｌ遺伝子である、＜１８＞の方法。
＜２１＞＜１＞～＜２＞，＜５＞～＜１０＞のいずれかの酵素組成物を有効成分とする植物バイオマス粘度低下剤。
＜２２＞＜１＞～＜２＞，＜５＞～＜１０＞のいずれかの酵素組成物を植物バイオマスと接触させる工程を含む、植物バイオマス粘度低下方法。
＜２３＞＜１＞～＜２＞，＜５＞～＜１０＞のいずれかの酵素組成物の、植物バイオマス粘度低下のための使用。
＜実施例１ セルラーゼの調製＞
セルラーゼは、トリコデルマ・リーセイＥ１ＡＢ１株（Enzyme and Microbial Technology Volume 82, January 2016, Pages 89-95）を培養することで得た。
培養は以下のように行った。酵素生産培地（３％ ＫＣフロック Ｗ－４００Ｇ（日本製紙）、０．１４％ （ＮＨ4）2ＳＯ4、１．２８％ クエン酸水素二アンモニウム、０．２％ ＫＨ2ＰＯ4、０．０３％ Ｃａｃｌ2・２Ｈ2Ｏ、０．０３％ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．１％ Ｂａｃｔｏ Ｐｅｐｔｏｎｅ、０．０５％ Ｂａｃｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ８０、０．１％ Ｔｒａｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔ、５０ｍＭ 酒石酸バッファー（ｐＨ４．０）；％はいずれもｗ／ｖ％）に、菌株の胞子を２×１０5個／ｍＬとなるよう植菌し、２８℃にて５日間振とう培養を行った。
Ｔｒａｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔの組成は以下のとおりである：６ｍｇ Ｈ3ＢＯ3、２６ｍｇ （ＮＨ4）６Ｍｏ7Ｏ24・４Ｈ2Ｏ、１００ｍｇ ＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏ、４０ｍｇ ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、８ｍｇ ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ、２００ｍｇ ＺｎＣｌ2を蒸留水にて１００ｍＬにメスアップ。得られた培養物を遠心分離した後に上清をフィルターろ過したものをセルラーゼとして以下の検討に使用した。
セルラーゼは、トリコデルマ・リーセイＥ１ＡＢ１株（Enzyme and Microbial Technology Volume 82, January 2016, Pages 89-95）を培養することで得た。
培養は以下のように行った。酵素生産培地（３％ ＫＣフロック Ｗ－４００Ｇ（日本製紙）、０．１４％ （ＮＨ4）2ＳＯ4、１．２８％ クエン酸水素二アンモニウム、０．２％ ＫＨ2ＰＯ4、０．０３％ Ｃａｃｌ2・２Ｈ2Ｏ、０．０３％ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．１％ Ｂａｃｔｏ Ｐｅｐｔｏｎｅ、０．０５％ Ｂａｃｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ８０、０．１％ Ｔｒａｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔ、５０ｍＭ 酒石酸バッファー（ｐＨ４．０）；％はいずれもｗ／ｖ％）に、菌株の胞子を２×１０5個／ｍＬとなるよう植菌し、２８℃にて５日間振とう培養を行った。
Ｔｒａｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔの組成は以下のとおりである：６ｍｇ Ｈ3ＢＯ3、２６ｍｇ （ＮＨ4）６Ｍｏ7Ｏ24・４Ｈ2Ｏ、１００ｍｇ ＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏ、４０ｍｇ ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、８ｍｇ ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ、２００ｍｇ ＺｎＣｌ2を蒸留水にて１００ｍＬにメスアップ。得られた培養物を遠心分離した後に上清をフィルターろ過したものをセルラーゼとして以下の検討に使用した。
＜実施例２ ペクチナーゼの調整＞
（１）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ＮＢＲＣ１０５６４９株のｃＤＮＡ合成
Ａ．ｎｉｇｅｒ ＮＢＲＣ１０５６４９株は、製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンターより購入した。ＮＢＲＣ１０５６４９株を、ペクチン培地（１％ Ｐｅｃｔｉｎ， ｆｒｏｍ ｃｉｔｒｕｓ（和光純薬）、０．１４％ （ＮＨ4）2ＳＯ4、０．２％ ＫＨ2ＰＯ4、０．０３％ Ｃａｃｌ2・２Ｈ2Ｏ、０．０３％ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．１％ Ｂａｃｔｏ Ｐｅｐｔｏｎｅ、０．０５％ Ｂａｃｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、０．１％ Ｔｒａｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔ、５０ｍＭ 酒石酸バッファー（ｐＨ４．０）に植菌した。２８℃にて３日間振とう培養を行い、培養した菌体をＭｉｒａｃｌｏｔｈ（ミリポア）を用いて回収後、液体窒素にて凍結し、マルチビーズショッカー（安井器械）を用いて破砕した。この際、粉砕媒体にはメタルコーンを使用し１７００ｒｐｍにて３０秒破砕を行った。破砕した菌体からはＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（キアゲン）を用いプロトコルに従ってＲＮＡを抽出した。その後、ＲＮＡ溶液はＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ－ＰＣＲ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に供することで、ＮＢＲＣ１０５６４９株のｃＤＮＡを合成した。
（１）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ＮＢＲＣ１０５６４９株のｃＤＮＡ合成
Ａ．ｎｉｇｅｒ ＮＢＲＣ１０５６４９株は、製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンターより購入した。ＮＢＲＣ１０５６４９株を、ペクチン培地（１％ Ｐｅｃｔｉｎ， ｆｒｏｍ ｃｉｔｒｕｓ（和光純薬）、０．１４％ （ＮＨ4）2ＳＯ4、０．２％ ＫＨ2ＰＯ4、０．０３％ Ｃａｃｌ2・２Ｈ2Ｏ、０．０３％ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．１％ Ｂａｃｔｏ Ｐｅｐｔｏｎｅ、０．０５％ Ｂａｃｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、０．１％ Ｔｒａｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔ、５０ｍＭ 酒石酸バッファー（ｐＨ４．０）に植菌した。２８℃にて３日間振とう培養を行い、培養した菌体をＭｉｒａｃｌｏｔｈ（ミリポア）を用いて回収後、液体窒素にて凍結し、マルチビーズショッカー（安井器械）を用いて破砕した。この際、粉砕媒体にはメタルコーンを使用し１７００ｒｐｍにて３０秒破砕を行った。破砕した菌体からはＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（キアゲン）を用いプロトコルに従ってＲＮＡを抽出した。その後、ＲＮＡ溶液はＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ－ＰＣＲ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に供することで、ＮＢＲＣ１０５６４９株のｃＤＮＡを合成した。
（２）Ｐｇａ、Ｐｅｌ、Ａｂｆ、Ｇａｌ、Ｂｇａ１発現用ベクターの作製
ピキア発現ベクターｐＤ９１２（ＡＴＵＭ社）を鋳型とし、表１に示したＦｗプライマー１（配列番号１５）とＲｖプライマー１（配列番号１６）を用いてＰＣＲすることで断片（Ａ）を増幅した。ＮＢＲＣ１０５６４９株のｃＤＮＡを鋳型として表１に示したＦｗプライマー２（配列番号１７）とＲｖプライマー２（配列番号１８）を用いてＰＣＲすることで増幅された断片（Ｂ）を増幅した。得られたＤＮＡ断片（Ａ）及び（Ｂ）はＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ）のプロトコルに従って処理し、連結されたプラスミドｐＤ９１２－Ｐｇａを構築した。
ＮＢＲＣ１０５６４９株のｃＤＮＡを鋳型として表１に示したＦｗプライマー３（配列番号１９）とＲｖプライマー３（配列番号２０）を用いてＰＣＲすることで増幅された断片（Ｃ）を増幅した。得られたＤＮＡ断片（Ａ）及び（Ｃ）はＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔのプロトコルに従って処理し、連結されたプラスミドｐＤ９１２－Ｐｅｌを構築した。
ＮＢＲＣ１０５６４９株のｃＤＮＡを鋳型として表１に示したＦｗプライマー４（配列番号２１）とＲｖプライマー５（配列番号２２）を用いてＰＣＲすることで増幅された断片（Ｄ）を増幅した。得られたＤＮＡ断片（Ａ）及び（Ｄ）はＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔのプロトコルに従って処理し、連結されたプラスミドｐＤ９１２－ＡｎＡｂｆを構築した。
ＮＢＲＣ１０５６４９株のｃＤＮＡを鋳型として表１に示したＦｗプライマー５（配列番号２３）とＲｖプライマー５（配列番号２４）を用いてＰＣＲすることで増幅された断片（Ｅ）を増幅した。得られたＤＮＡ断片（Ａ）及び（Ｅ）はＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔのプロトコルに従って処理し、連結されたプラスミドｐＤ９１２－ＡｎＧａｌを構築した。
ＮＢＲＣ１０５６４９株のｃＤＮＡを鋳型として表１に示したＦｗプライマーＸ（配列番号４８）とＲｖプライマーＸ（配列番号４９）を用いてＰＣＲすることで増幅された断片（Ｉ）を増幅した。得られたＤＮＡ断片（Ａ）及び（Ｉ）はＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔのプロトコルに従って処理し、連結されたプラスミドｐＤ９１２－Ｂｇa１を構築した。
ピキア発現ベクターｐＤ９１２（ＡＴＵＭ社）を鋳型とし、表１に示したＦｗプライマー１（配列番号１５）とＲｖプライマー１（配列番号１６）を用いてＰＣＲすることで断片（Ａ）を増幅した。ＮＢＲＣ１０５６４９株のｃＤＮＡを鋳型として表１に示したＦｗプライマー２（配列番号１７）とＲｖプライマー２（配列番号１８）を用いてＰＣＲすることで増幅された断片（Ｂ）を増幅した。得られたＤＮＡ断片（Ａ）及び（Ｂ）はＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ）のプロトコルに従って処理し、連結されたプラスミドｐＤ９１２－Ｐｇａを構築した。
ＮＢＲＣ１０５６４９株のｃＤＮＡを鋳型として表１に示したＦｗプライマー３（配列番号１９）とＲｖプライマー３（配列番号２０）を用いてＰＣＲすることで増幅された断片（Ｃ）を増幅した。得られたＤＮＡ断片（Ａ）及び（Ｃ）はＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔのプロトコルに従って処理し、連結されたプラスミドｐＤ９１２－Ｐｅｌを構築した。
ＮＢＲＣ１０５６４９株のｃＤＮＡを鋳型として表１に示したＦｗプライマー４（配列番号２１）とＲｖプライマー５（配列番号２２）を用いてＰＣＲすることで増幅された断片（Ｄ）を増幅した。得られたＤＮＡ断片（Ａ）及び（Ｄ）はＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔのプロトコルに従って処理し、連結されたプラスミドｐＤ９１２－ＡｎＡｂｆを構築した。
ＮＢＲＣ１０５６４９株のｃＤＮＡを鋳型として表１に示したＦｗプライマー５（配列番号２３）とＲｖプライマー５（配列番号２４）を用いてＰＣＲすることで増幅された断片（Ｅ）を増幅した。得られたＤＮＡ断片（Ａ）及び（Ｅ）はＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔのプロトコルに従って処理し、連結されたプラスミドｐＤ９１２－ＡｎＧａｌを構築した。
ＮＢＲＣ１０５６４９株のｃＤＮＡを鋳型として表１に示したＦｗプライマーＸ（配列番号４８）とＲｖプライマーＸ（配列番号４９）を用いてＰＣＲすることで増幅された断片（Ｉ）を増幅した。得られたＤＮＡ断片（Ａ）及び（Ｉ）はＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔのプロトコルに従って処理し、連結されたプラスミドｐＤ９１２－Ｂｇa１を構築した。
（３）形質転換体の作製
（２）で作製した各目的遺伝子発現ベクターをＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＰＰＳ－９０１０２（ＡＴＵＭ社）に対して、ＡＴＵＭ社のプロトコルに従って形質転換を行った。
（２）で作製した各目的遺伝子発現ベクターをＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＰＰＳ－９０１０２（ＡＴＵＭ社）に対して、ＡＴＵＭ社のプロトコルに従って形質転換を行った。
（４）形質転換体の培養
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓの培養は以下のように行った。ＢＭＤ１％培地（０．２Ｍ リン酸カリウム（ｐＨ６．０）、１３．４ｇ／Ｌ Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ、０．４ｍｇ／Ｌ Ｂｉｏｔｉｎ、１．１％ グルコース）に各形質転換体を植菌し、２８℃で振とう培養し、菌体が一定量に増えたらメタノールを添加し、発現誘導を行い、３－５日後に得られた各培養物はＳＤＳ－ＰＡＧＥで酵素発現量を確認した後、各培養物を遠心分離した後フィルターろ過することで、各培養上清を取得した。得られた培養上清を濃縮し、各種ペクチナーゼ（Ｐｇａ、Ｐｅｌ、Ａｂｆ、Ｇａｌ）酵素液として使用した。
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓの培養は以下のように行った。ＢＭＤ１％培地（０．２Ｍ リン酸カリウム（ｐＨ６．０）、１３．４ｇ／Ｌ Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｂａｓｅ、０．４ｍｇ／Ｌ Ｂｉｏｔｉｎ、１．１％ グルコース）に各形質転換体を植菌し、２８℃で振とう培養し、菌体が一定量に増えたらメタノールを添加し、発現誘導を行い、３－５日後に得られた各培養物はＳＤＳ－ＰＡＧＥで酵素発現量を確認した後、各培養物を遠心分離した後フィルターろ過することで、各培養上清を取得した。得られた培養上清を濃縮し、各種ペクチナーゼ（Ｐｇａ、Ｐｅｌ、Ａｂｆ、Ｇａｌ）酵素液として使用した。
＜実施例３＞タンパク質の定量
酵素溶液のタンパク質濃度の定量は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法にて測定した。Ｂｒａｄｆｏｒｄ法はＱｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔプロテインアッセイ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用し、ウシ血清アルブミンを標準タンパク質とした検量線をもとにタンパク質濃度を計算した。
酵素溶液のタンパク質濃度の定量は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法にて測定した。Ｂｒａｄｆｏｒｄ法はＱｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔプロテインアッセイ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用し、ウシ血清アルブミンを標準タンパク質とした検量線をもとにタンパク質濃度を計算した。
＜実施例４＞酵素ユニットの測定
（１）ペクチン酸リアーゼ活性
ペクチン酸リアーゼ活性測定は、２５μＬの１％（ｗ／ｖ）ポリガラクツロン酸（ポリガラクツロン酸 ナトリウム塩、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１０μＬの０．５Ｍ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）、４５μＬのｍｉｌｌｉＱ水を混合した８０μＬの基質液に対して、ｍｉｌｌｉＱ水にて適宜希釈した酵素液２０μＬを加え、５０℃で５分反応させた後、１００μＬの５０ｍＭ塩酸水溶液を添加し、酵素反応を停止させた。攪拌・混合後に、２３５ｎｍの吸光度を測定した。ブランクは酵素液を加えずに処理した反応液に塩酸水溶液を加えた後に酵素液を添加したものを用意した。生成される不飽和オリゴガラクツロニド量を不飽和ジガラクツロニドのモル分子吸光係数４６００Ｍ-1ｃｍ-1を用いて求めた。酵素１単位（１Ｕ）は、上記反応条件下において１分間に１μｍｏｌの不飽和ジガラクツロニド相当の不飽和オリゴガラクツロニドを生成する酵素量と定義した。
（１）ペクチン酸リアーゼ活性
ペクチン酸リアーゼ活性測定は、２５μＬの１％（ｗ／ｖ）ポリガラクツロン酸（ポリガラクツロン酸 ナトリウム塩、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１０μＬの０．５Ｍ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）、４５μＬのｍｉｌｌｉＱ水を混合した８０μＬの基質液に対して、ｍｉｌｌｉＱ水にて適宜希釈した酵素液２０μＬを加え、５０℃で５分反応させた後、１００μＬの５０ｍＭ塩酸水溶液を添加し、酵素反応を停止させた。攪拌・混合後に、２３５ｎｍの吸光度を測定した。ブランクは酵素液を加えずに処理した反応液に塩酸水溶液を加えた後に酵素液を添加したものを用意した。生成される不飽和オリゴガラクツロニド量を不飽和ジガラクツロニドのモル分子吸光係数４６００Ｍ-1ｃｍ-1を用いて求めた。酵素１単位（１Ｕ）は、上記反応条件下において１分間に１μｍｏｌの不飽和ジガラクツロニド相当の不飽和オリゴガラクツロニドを生成する酵素量と定義した。
（２）ポリガラクツロナーゼ活性
ポリガラクツロナーゼ活性の測定は、２５μＬの１％（ｗ／ｖ）ポリガラクツロン酸（ポリガラクツロン酸 ナトリウム塩、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１０μＬの０．５Ｍ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）、４５μＬのｍｉｌｌｉＱ水を混合した８０μＬの基質液に対して、ｍｉｌｌｉＱ水にて適宜希釈した酵素液２０μＬを加え、５０℃で５分反応させた後、１００μＬの３，５－ジニトロサリチル酸試薬を添加し、９９℃で１０分間還元糖の発色を行った。氷水中で急冷した後、５４０ｎｍにおける吸光度を測定し還元糖の生成量を求めた。ブランクは酵素を加えずに処理した反応液に３，５－ジニトロサリチル酸試薬を加えた後、酵素液を添加し、同様に発色させたものを用意した。酵素１単位（１Ｕ）は、上記反応条件下において１分間に１μｍｏｌのＤ－ガラクツロン酸相当の還元糖を遊離する酵素量と定義した。ただし、酵素溶液中にポリガラクツロナーゼとペクチンリアーゼの両方が存在する場合においては、還元糖量から計算されたユニットから（１）で得られたペクチンリアーゼのユニットを減算したものとポリガラクツロナーゼ活性とした。
ポリガラクツロナーゼ活性の測定は、２５μＬの１％（ｗ／ｖ）ポリガラクツロン酸（ポリガラクツロン酸 ナトリウム塩、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１０μＬの０．５Ｍ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）、４５μＬのｍｉｌｌｉＱ水を混合した８０μＬの基質液に対して、ｍｉｌｌｉＱ水にて適宜希釈した酵素液２０μＬを加え、５０℃で５分反応させた後、１００μＬの３，５－ジニトロサリチル酸試薬を添加し、９９℃で１０分間還元糖の発色を行った。氷水中で急冷した後、５４０ｎｍにおける吸光度を測定し還元糖の生成量を求めた。ブランクは酵素を加えずに処理した反応液に３，５－ジニトロサリチル酸試薬を加えた後、酵素液を添加し、同様に発色させたものを用意した。酵素１単位（１Ｕ）は、上記反応条件下において１分間に１μｍｏｌのＤ－ガラクツロン酸相当の還元糖を遊離する酵素量と定義した。ただし、酵素溶液中にポリガラクツロナーゼとペクチンリアーゼの両方が存在する場合においては、還元糖量から計算されたユニットから（１）で得られたペクチンリアーゼのユニットを減算したものとポリガラクツロナーゼ活性とした。
（３）アラビノフラノシダーゼ活性
アラビノフラノシダーゼ活性は２０μＬの５ｍＭ ４－ニトロフェニル－α－Ｌ－アラビノフラノシド（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１０μＬの０．５Ｍ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）、４０μＬのｍｉｌｌｉＱ水を混合した８０μＬの基質液に対して、ｍｉｌｌｉＱ水にて適宜希釈した酵素液２０μＬを加え、５０℃で５分反応した後、１００μＬの０．４Ｍ炭酸ナトリウムを加えた後、４２０ｎｍの吸光度を測定した。ブランクは酵素液を加えずに処理した反応液に炭酸ナトリウム溶液を加えた後に９９℃で失活させた酵素液を添加したものを用意した。酵素１単位（１Ｕ）は、上記反応条件下において１分間に１μｍｏｌの４－ニトロフェノールを生成する酵素量と定義した。
アラビノフラノシダーゼ活性は２０μＬの５ｍＭ ４－ニトロフェニル－α－Ｌ－アラビノフラノシド（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１０μＬの０．５Ｍ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）、４０μＬのｍｉｌｌｉＱ水を混合した８０μＬの基質液に対して、ｍｉｌｌｉＱ水にて適宜希釈した酵素液２０μＬを加え、５０℃で５分反応した後、１００μＬの０．４Ｍ炭酸ナトリウムを加えた後、４２０ｎｍの吸光度を測定した。ブランクは酵素液を加えずに処理した反応液に炭酸ナトリウム溶液を加えた後に９９℃で失活させた酵素液を添加したものを用意した。酵素１単位（１Ｕ）は、上記反応条件下において１分間に１μｍｏｌの４－ニトロフェノールを生成する酵素量と定義した。
（４）ガラクタナーゼ活性
ガラクタナーゼ活性の測定は、２５μＬの１％（ｗ／ｖ）ガラクタン（Ｇａｌａｃｔａｎ（Ｐｏｔａｔｏ）、Ｍｅｇａｚｙｍｅ）、１０μＬの０．５Ｍ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）、４５μＬのｍｉｌｌｉＱ水を混合した８０μＬの基質液に対して、ｍｉｌｌｉＱ水にて適宜希釈した酵素液２０μＬを加え、５０℃で５分反応した後、１００μＬの３，５－ジニトロサリチル酸試薬を添加し、９９℃で１０分間還元糖の発色を行った。氷水中で急冷した後、５４０ｎｍにおける吸光度を測定し還元糖の生成量を求めた。ブランクは酵素を加えずに処理した反応液に３，５－ジニトロサリチル酸試薬を加えた後、酵素液を添加し、同様に発色させたものを用意した。酵素１単位（１Ｕ）は、上記反応条件下において１分間に１μｍｏｌのガラクトース相当の還元糖を遊離する酵素量と定義した。
ガラクタナーゼ活性の測定は、２５μＬの１％（ｗ／ｖ）ガラクタン（Ｇａｌａｃｔａｎ（Ｐｏｔａｔｏ）、Ｍｅｇａｚｙｍｅ）、１０μＬの０．５Ｍ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）、４５μＬのｍｉｌｌｉＱ水を混合した８０μＬの基質液に対して、ｍｉｌｌｉＱ水にて適宜希釈した酵素液２０μＬを加え、５０℃で５分反応した後、１００μＬの３，５－ジニトロサリチル酸試薬を添加し、９９℃で１０分間還元糖の発色を行った。氷水中で急冷した後、５４０ｎｍにおける吸光度を測定し還元糖の生成量を求めた。ブランクは酵素を加えずに処理した反応液に３，５－ジニトロサリチル酸試薬を加えた後、酵素液を添加し、同様に発色させたものを用意した。酵素１単位（１Ｕ）は、上記反応条件下において１分間に１μｍｏｌのガラクトース相当の還元糖を遊離する酵素量と定義した。
（５）セルラーゼ活性
セルラーゼの活性は、ＭＩＣＲＯＰＬＡＴＥ－ＢＡＳＥＤ ＦＩＬＴＥＲ ＰＡＰＥＲＡＳＳＡＹ ＴＯ ＭＥＡＳＵＲＥ ＴＯＴＡＬ ＣＥＬＬＵＬＡＳＥ ＡＣＴＩＶＩＴＹ（ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＢＩＯＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ. ２００４ ＤＥＣ ３０；８８(７)：８３２―７．ＤＯＩ：１０．１００２／ＢＩＴ．２０２８６．）が報告したマイクロプレートスケールろ紙分解活性試験法で測定した。直径７ｍｍに裁断したろ紙(ＷＨＡＴＭＡＮ ＮＯ．１、ＧＥ ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ)を含む４０μＬのクエン酸緩衝液(５０ｍＭ、ｐＨ ４．８)に、２０μＬの適宜希釈した試料を加え、５０℃で１時間反応を行った。ろ紙を含まないサンプルを同様に用意し、ブランクサンプルとして用意した。その後１２０μＬのＤＮＳ溶液を添加し反応を停止し、９５℃で５分間加熱し、氷水中５分間冷却した。得られた溶液を３６μＬとｍｉｌｌｉＱ水１６０μＬを混合し、混合液の５４０ｎｍの吸光度を測定し、ブランクを引いた値で吸光度増加量を算出した。次に、段階的に希釈したグルコース濃度と５４０ｎｍの吸光度で作成した検量線を用いて、反応液中生成した還元糖量をグルコース量換算で算出した。同様の操作を異なる希釈率の試料で行い、０.０８ｍｇグルコース／２０μＬセルラーゼ溶液に相当する還元糖を生成するのに必要な試料の希釈率を求め、希釈前の試料のろ紙分解活性(ＦＰＵ/ｍＬ)を算出した。さらに、セルラーゼの濃度を実施例４の方法で測定し、セルラーゼ活性の表示単位をＦＰＵ/ｍｇ－ＰＲＯＴＥＩＮに換算した。活性単位は、１分間に１μｍｏｌのグルコースに相当する還元糖を生成する酵素活性を「１Ｕ」とした。
セルラーゼの活性は、ＭＩＣＲＯＰＬＡＴＥ－ＢＡＳＥＤ ＦＩＬＴＥＲ ＰＡＰＥＲＡＳＳＡＹ ＴＯ ＭＥＡＳＵＲＥ ＴＯＴＡＬ ＣＥＬＬＵＬＡＳＥ ＡＣＴＩＶＩＴＹ（ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＢＩＯＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ. ２００４ ＤＥＣ ３０；８８(７)：８３２―７．ＤＯＩ：１０．１００２／ＢＩＴ．２０２８６．）が報告したマイクロプレートスケールろ紙分解活性試験法で測定した。直径７ｍｍに裁断したろ紙(ＷＨＡＴＭＡＮ ＮＯ．１、ＧＥ ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ)を含む４０μＬのクエン酸緩衝液(５０ｍＭ、ｐＨ ４．８)に、２０μＬの適宜希釈した試料を加え、５０℃で１時間反応を行った。ろ紙を含まないサンプルを同様に用意し、ブランクサンプルとして用意した。その後１２０μＬのＤＮＳ溶液を添加し反応を停止し、９５℃で５分間加熱し、氷水中５分間冷却した。得られた溶液を３６μＬとｍｉｌｌｉＱ水１６０μＬを混合し、混合液の５４０ｎｍの吸光度を測定し、ブランクを引いた値で吸光度増加量を算出した。次に、段階的に希釈したグルコース濃度と５４０ｎｍの吸光度で作成した検量線を用いて、反応液中生成した還元糖量をグルコース量換算で算出した。同様の操作を異なる希釈率の試料で行い、０.０８ｍｇグルコース／２０μＬセルラーゼ溶液に相当する還元糖を生成するのに必要な試料の希釈率を求め、希釈前の試料のろ紙分解活性(ＦＰＵ/ｍＬ)を算出した。さらに、セルラーゼの濃度を実施例４の方法で測定し、セルラーゼ活性の表示単位をＦＰＵ/ｍｇ－ＰＲＯＴＥＩＮに換算した。活性単位は、１分間に１μｍｏｌのグルコースに相当する還元糖を生成する酵素活性を「１Ｕ」とした。
＜実施例５＞粘度の測定
粘度の測定には、音叉振動式粘度計（株式会社エー・アンド・デイ社製ＳＶ－１０Ｈ）を用いた。
粘度の測定には、音叉振動式粘度計（株式会社エー・アンド・デイ社製ＳＶ－１０Ｈ）を用いた。
試験例：キャッサバ残渣の糖化
<試験例１－比較例>
キャッサバ残渣を１００ｍＬ容バッフル付き三角フラスコに乾燥重量として４ｇとなるよう量りとり、α－アミラーゼを０．００２ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇ－基質、ｍｉｌｌｉ－Ｑ水を基質濃度が１５ｗｔ％となるように加えた。その後、バッフルフラスコを十分に混和し、綿栓で封をした上にアルミホイルを被せ、９０℃、２ｈ（オートクレーブ、ＴＯＭＹ社製ＬＳＸ－７００）の糊化処理を行った。その後、５０℃に設定した振盪機（ＰＲＥＣＩ社製ＰＲＸＹ－３０－Ｒ－３Ｆ）にて５０℃になるまで冷却した後、グルコアミラーゼを０．０５ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇ－基質となるように添加し、５０℃、２００ｒｐｍで１８時間反応させた。糖化後は液体の状態とならず、粘度は測定不可であった。
<試験例１－比較例>
キャッサバ残渣を１００ｍＬ容バッフル付き三角フラスコに乾燥重量として４ｇとなるよう量りとり、α－アミラーゼを０．００２ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇ－基質、ｍｉｌｌｉ－Ｑ水を基質濃度が１５ｗｔ％となるように加えた。その後、バッフルフラスコを十分に混和し、綿栓で封をした上にアルミホイルを被せ、９０℃、２ｈ（オートクレーブ、ＴＯＭＹ社製ＬＳＸ－７００）の糊化処理を行った。その後、５０℃に設定した振盪機（ＰＲＥＣＩ社製ＰＲＸＹ－３０－Ｒ－３Ｆ）にて５０℃になるまで冷却した後、グルコアミラーゼを０．０５ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇ－基質となるように添加し、５０℃、２００ｒｐｍで１８時間反応させた。糖化後は液体の状態とならず、粘度は測定不可であった。
＜試験例２－比較例＞
糊化処理後の基質に更に、表２に示す酵素組成物１を０．２ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇ－基質で添加した以外は、試験例１と同様の検討を行った。糖化後のスラリーは液体の状態とならず、粘度は測定不可であった。
糊化処理後の基質に更に、表２に示す酵素組成物１を０．２ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇ－基質で添加した以外は、試験例１と同様の検討を行った。糖化後のスラリーは液体の状態とならず、粘度は測定不可であった。
＜試験例３－比較例＞
糊化処理後の基質に更に、表２に示す酵素組成物２を０．２ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇ－基質で添加した以外は、試験例１と同様の検討を行った。糖化後のスラリーの粘度の値は８４ｍＰａ・ｓであった。
糊化処理後の基質に更に、表２に示す酵素組成物２を０．２ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇ－基質で添加した以外は、試験例１と同様の検討を行った。糖化後のスラリーの粘度の値は８４ｍＰａ・ｓであった。
＜試験例４－比較例＞
糊化処理後の基質に更に、表２に示す酵素組成物３を０．２ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇ－基質で添加した以外は、試験例１と同様の検討を行った。糖化後のスラリーの粘度の値は７９ｍＰａ・ｓであった。
糊化処理後の基質に更に、表２に示す酵素組成物３を０．２ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇ－基質で添加した以外は、試験例１と同様の検討を行った。糖化後のスラリーの粘度の値は７９ｍＰａ・ｓであった。
＜試験例５－比較例＞
糊化処理後の基質に更に、表２に示す酵素組成物４を０．２ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇ－基質で添加した以外は、試験例１と同様の検討を行った。糖化後のスラリーの粘度の値は４５９ｍＰａ・ｓであった。
糊化処理後の基質に更に、表２に示す酵素組成物４を０．２ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇ－基質で添加した以外は、試験例１と同様の検討を行った。糖化後のスラリーの粘度の値は４５９ｍＰａ・ｓであった。
＜試験例６＞
糊化処理後の基質に更に、表３に示す酵素組成物５を０．１６ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇ－基質で添加した以外は、試験例１と同様の検討を行った。糖化後のスラリーの粘度の値は２６．８ｍＰａ・ｓであった。
糊化処理後の基質に更に、表３に示す酵素組成物５を０．１６ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇ－基質で添加した以外は、試験例１と同様の検討を行った。糖化後のスラリーの粘度の値は２６．８ｍＰａ・ｓであった。
＜試験例７＞
糊化処理後の基質に更に、表３に示す酵素組成物６を０．１６ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇ－基質で添加した以外は、試験例１と同様の検討を行った。糖化後のスラリーの粘度の値は１６．６ｍＰａ・ｓであった。
糊化処理後の基質に更に、表３に示す酵素組成物６を０．１６ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇ－基質で添加した以外は、試験例１と同様の検討を行った。糖化後のスラリーの粘度の値は１６．６ｍＰａ・ｓであった。
＜試験例８＞
糊化処理後の基質に更に、表３に示す酵素組成物７を０．１６ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇ－基質で添加した以外は、試験例１と同様の検討を行った。糖化後のスラリーの粘度の値は１４．５ｍＰａ・ｓであった。
糊化処理後の基質に更に、表３に示す酵素組成物７を０．１６ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇ－基質で添加した以外は、試験例１と同様の検討を行った。糖化後のスラリーの粘度の値は１４．５ｍＰａ・ｓであった。
＜試験例９＞
糊化処理後の基質に更に、表３に示す酵素組成物８を０．１６ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇ－基質で添加した以外は、試験例１と同様の検討を行った。糖化後のスラリーの粘度の値は１７．３ｍＰａ・ｓであった。
糊化処理後の基質に更に、表３に示す酵素組成物８を０．１６ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇ－基質で添加した以外は、試験例１と同様の検討を行った。糖化後のスラリーの粘度の値は１７．３ｍＰａ・ｓであった。
＜試験例１０＞
糊化処理後の基質に更に、表４に示す酵素組成物９を０．１５ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇ－基質で添加した以外は、試験例１と同様の検討を行った。糖化後のスラリーの粘度の値は４７．３ｍＰａ・ｓであった。
糊化処理後の基質に更に、表４に示す酵素組成物９を０．１５ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇ－基質で添加した以外は、試験例１と同様の検討を行った。糖化後のスラリーの粘度の値は４７．３ｍＰａ・ｓであった。
＜試験例１１＞
糊化処理後の基質に更に、表４に示す酵素組成物１０を０．１５ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇ－基質で添加した以外は、試験例１と同様の検討を行った。糖化後のスラリーの粘度の値は３７．９ｍＰａ・ｓであった。
糊化処理後の基質に更に、表４に示す酵素組成物１０を０．１５ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇ－基質で添加した以外は、試験例１と同様の検討を行った。糖化後のスラリーの粘度の値は３７．９ｍＰａ・ｓであった。
＜試験例１２＞
糊化処理後の基質に更に、表４に示す酵素組成物１１を０．１５ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇ－基質で添加した以外は、試験例１と同様の検討を行った。糖化後のスラリーの粘度の値は１９．７ｍＰａ・ｓであった。
糊化処理後の基質に更に、表４に示す酵素組成物１１を０．１５ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇ－基質で添加した以外は、試験例１と同様の検討を行った。糖化後のスラリーの粘度の値は１９．７ｍＰａ・ｓであった。
＜試験例１３＞
糊化処理後の基質に更に、表４に示す酵素組成物１２を０．１５ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇ－基質で添加した以外は、試験例１と同様の検討を行った。糖化後のスラリーの粘度の値は１７．３ｍＰａ・ｓであった。
糊化処理後の基質に更に、表４に示す酵素組成物１２を０．１５ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇ－基質で添加した以外は、試験例１と同様の検討を行った。糖化後のスラリーの粘度の値は１７．３ｍＰａ・ｓであった。
＜試験例１４＞
糊化処理後の基質に更に、表４に示す酵素組成物１３を０．１５ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇ－基質で添加した以外は、試験例１と同様の検討を行った。糖化後のスラリーの粘度の値は２３．１ｍＰａ・ｓであった。
糊化処理後の基質に更に、表４に示す酵素組成物１３を０．１５ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇ－基質で添加した以外は、試験例１と同様の検討を行った。糖化後のスラリーの粘度の値は２３．１ｍＰａ・ｓであった。
＜試験例１５＞
糊化処理後の基質に更に、表４に示す酵素組成物１４を０．１５ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇ－基質で添加した以外は、試験例１と同様の検討を行った。糖化後のスラリーの粘度の値は２３．８ｍＰａ・ｓであった。
糊化処理後の基質に更に、表４に示す酵素組成物１４を０．１５ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇ－基質で添加した以外は、試験例１と同様の検討を行った。糖化後のスラリーの粘度の値は２３．８ｍＰａ・ｓであった。
＜試験例１６＞
糊化処理後の基質に更に、表４に示す酵素組成物１５を０．１５ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇ－基質で添加した以外は、試験例１と同様の検討を行った。糖化後のスラリーの粘度の値は１９．９ｍＰａ・ｓであった。
糊化処理後の基質に更に、表４に示す酵素組成物１５を０．１５ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇ－基質で添加した以外は、試験例１と同様の検討を行った。糖化後のスラリーの粘度の値は１９．９ｍＰａ・ｓであった。
＜試験例１７＞
糊化処理後の基質に更に、表４に示す酵素組成物１６を０．１５ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇ－基質で添加した以外は、試験例１と同様の検討を行った。糖化後のスラリーの粘度の値は３９．０ｍＰａ・ｓであった。
糊化処理後の基質に更に、表４に示す酵素組成物１６を０．１５ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇ－基質で添加した以外は、試験例１と同様の検討を行った。糖化後のスラリーの粘度の値は３９．０ｍＰａ・ｓであった。
＜試験例１８－比較例＞
糊化処理後の基質に更に、表５に示す酵素組成物１７を０．１４ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇ－基質で添加した以外は、試験例１と同様の検討を行った。糖化後のスラリーの粘度の値は１１５ｍＰａ・ｓであった。
糊化処理後の基質に更に、表５に示す酵素組成物１７を０．１４ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇ－基質で添加した以外は、試験例１と同様の検討を行った。糖化後のスラリーの粘度の値は１１５ｍＰａ・ｓであった。
＜試験例１９＞
糊化処理後の基質に更に、表５に示す酵素組成物１８を０．１４ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇ－基質で添加した以外は、試験例１と同様の検討を行った。糖化後のスラリーの粘度の値は７１．８ｍＰａ・ｓであった。
糊化処理後の基質に更に、表５に示す酵素組成物１８を０．１４ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇ－基質で添加した以外は、試験例１と同様の検討を行った。糖化後のスラリーの粘度の値は７１．８ｍＰａ・ｓであった。
＜試験例２０＞
糊化処理後の基質に更に、表６に示す酵素組成物１９を０．１３ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇ－基質で添加した以外は、試験例１と同様の検討を行った。糖化後のスラリーの粘度の値は４９．１ｍＰａ・ｓであった。
＜試験例２1＞
糊化処理後の基質に更に、表６に示す酵素組成物２０を０．１５ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇ－基質で添加した以外は、試験例１と同様の検討を行った。糖化後のスラリーの粘度の値は４７．５ｍＰａ・ｓであった。
糊化処理後の基質に更に、表６に示す酵素組成物１９を０．１３ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇ－基質で添加した以外は、試験例１と同様の検討を行った。糖化後のスラリーの粘度の値は４９．１ｍＰａ・ｓであった。
＜試験例２1＞
糊化処理後の基質に更に、表６に示す酵素組成物２０を０．１５ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇ－基質で添加した以外は、試験例１と同様の検討を行った。糖化後のスラリーの粘度の値は４７．５ｍＰａ・ｓであった。
＜試験例２２－比較例＞
糊化処理後の基質に更に、表７に示すペクチン側鎖分解酵素のＡｎＢｇａ１を含む酵素組成物２１を０．１５ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇ－基質で添加した以外は、試験例１と同様の検討を行った。糖化後のスラリーの粘度の値は１４４０ｍＰａ・ｓであった。なお、ＡｎＢｇａ１はエキソタイプのガラクタン分解酵素であるβ－ガラクトシダーゼである。
糊化処理後の基質に更に、表７に示すペクチン側鎖分解酵素のＡｎＢｇａ１を含む酵素組成物２１を０．１５ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇ－基質で添加した以外は、試験例１と同様の検討を行った。糖化後のスラリーの粘度の値は１４４０ｍＰａ・ｓであった。なお、ＡｎＢｇａ１はエキソタイプのガラクタン分解酵素であるβ－ガラクトシダーゼである。
＜試験例２３－比較例＞
糊化処理後の基質に更に、表７に示すペクチン側鎖分解酵素のＥ－ＡＲＡＢＣＪ（Ｍｅｇａｚｙｍｅ）を含む酵素組成物２２を０．１５ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇ－基質で添加した以外は、試験例１と同様の検討を行った。糖化後のスラリーの粘度の値は４０１０ｍＰａ・ｓであった。なお、Ｅ－ＡＲＡＢＣＪはエンドタイプのアラビナン分解酵素である。
糊化処理後の基質に更に、表７に示すペクチン側鎖分解酵素のＥ－ＡＲＡＢＣＪ（Ｍｅｇａｚｙｍｅ）を含む酵素組成物２２を０．１５ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇ－基質で添加した以外は、試験例１と同様の検討を行った。糖化後のスラリーの粘度の値は４０１０ｍＰａ・ｓであった。なお、Ｅ－ＡＲＡＢＣＪはエンドタイプのアラビナン分解酵素である。
＜試験例２４－比較例＞
糊化処理後の基質に更に、表７に示すペクチン側鎖分解酵素のＥ－ＢＧＬＡＮ（Ｍｅｇａｚｙｍｅ）酵素組成物２３を０．１５ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇ－基質で添加した以外は、試験例１と同様の検討を行った。糖化後のスラリーの粘度の値は５３０ｍＰａ・ｓであった。なお、Ｅ－ＢＧＬＡＮはエキソタイプのガラクタン分解酵素であるβ－ガラクトシダーゼである。
糊化処理後の基質に更に、表７に示すペクチン側鎖分解酵素のＥ－ＢＧＬＡＮ（Ｍｅｇａｚｙｍｅ）酵素組成物２３を０．１５ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇ－基質で添加した以外は、試験例１と同様の検討を行った。糖化後のスラリーの粘度の値は５３０ｍＰａ・ｓであった。なお、Ｅ－ＢＧＬＡＮはエキソタイプのガラクタン分解酵素であるβ－ガラクトシダーゼである。
＜実施例６＞ セルラーゼ・ペクチナーゼ生産株の構築
（１）Ｇａｌ発現用べクターの構築
ｐＵＣ１１８（タカラバイオ）のＨｉｎｃＩＩ制限酵素切断点にトリコデルマ・リーセイ由来のｅｇ３遺伝子の上流から下流までの領域（配列番号４７）を挿入したプラスミドｐＵＣ－ｅｇ3を鋳型とし、表７に示したＦｗプライマー６（配列番号２５）とＲｖプライマー６（配列番号２６）を用いてＰＣＲすることで断片（Ａ）を増幅した。また、トリコデルマ・リーセイのゲノムＤＮＡを鋳型として表７に示したＦｗプライマー７（配列番号２７）とＲｖプライマー７（配列番号２８）を用いてＰＣＲすることで増幅された断片（Ｂ）を増幅した。得られたＤＮＡ断片（Ａ）及び（Ｂ）はＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ）のプロトコルに従って処理し、ｅｇ３遺伝子下流にｐｙｒ４遺伝子が連結されたプラスミドｐＵＣ－ｅｇ３－ｐｙｒ４を構築した。
さらに、このｐＵＣ－ｅｇ３－ｐｙｒ４を鋳型とし、表７に示したＦｗプライマー８（配列番号２９）とＲｖプライマー８（配列番号３０）を用いてＰＣＲすることで増幅した断片（Ｃ）と、トリコデルマ・リーセイのゲノムＤＮＡを鋳型として表７に示したＦｗプライマー９（配列番号３１）とＲｖプライマー９（配列番号３２）を用いてＰＣＲすることで増幅された断片（Ｄ）とを、同様にはＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔによって処理することで、プラスミドｐＵＣ－Δｅｇ３：：Ｐｃｂｈ１－ｃｂｈ１－ｐｙｒ４を得た。
続いて、このｐＵＣ－Δｅｇ３：：Ｐｃｂｈ１－ｃｂｈ１－ｐｙｒ４を鋳型とし、表７に示したＦｗプライマー１０（配列番号３３）とＲｖプライマー１０（配列番号３４）を用いてＰＣＲすることで増幅した断片（Ｅ）と、プラスミドｐＵＣ－ｅｇ３を鋳型として表７に示したＦｗプライマー１１（配列番号３５）とＲｖプライマー１１（配列番号３６）を用いてＰＣＲすることで増幅された断片（Ｆ）とを、同様にＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔによって処理することで、プラスミドｐＵＣ－Δｅｇ３：：Ｐｃｂｈ１－ｃｂｈ１－ｐｙｒ４#１０００を得た。
次に、ｐＵＣ－Δｅｇ３：：Ｐｃｂｈ１－ｃｂｈ１－ｐｙｒ４#１０００を鋳型とし、表７に示したＦｗプライマー７（配列番号２７）とＲｖプライマー９（配列番号３２）を用いてＰＣＲすることで増幅した断片（Ｇ）と、トリコデルマ・リーセイのゲノムＤＮＡを鋳型とし、表８に示したＦｗプライマー１２（配列番号３７）とＲｖプライマー１２（配列番号３８）を用いてＰＣＲすることで増幅した断片（Ｈ）とを、同様にＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔによって処理することで、プラスミドｐＵＣ－Δｅｇ３：：Ｐｃｂｈ１－ｃｂｈ１－ｐｙｒ４（ｒｅ）を得た。
ｐＵＣ－Δｅｇ３：：Ｐｃｂｈ１－ｃｂｈ１－ｐｙｒ４（ｒｅ）を鋳型とし、表７に示したＦｗプライマー１３（配列番号３９）とＲｖプライマー１３（配列番号４０）を用いてＰＣＲすることで増幅した断片（Ｉ）と、トリコデルマ・リーセイのゲノムＤＮＡを鋳型とし、表７に示したＦｗプライマー１４（配列番号４１）とＲｖプライマー１４（配列番号４２）を用いてＰＣＲすることで増幅した断片（Ｊ）とを、同様にＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔによって処理することで、プラスミドｐＵＣ－Δｅｇ３：：Ｐｘｙｎ１－ｃｂｈ１－ｐｙｒ４（ｒｅ）を得た。
そして、ｐＵＣ－Δｅｇ３：：Ｐｘｙｎ１－ｃｂｈ１－ｐｙｒ４（ｒｅ）を鋳型とし、表７に示したＦｗプライマー１５（配列番号４３）とＲｖプライマー１５（配列番号４４）を用いてＰＣＲすることで増幅した断片（Ｋ）と、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ＮＢＲＣ１０５６４９株のｃＤＮＡを鋳型とし、表７に示したＦｗプライマー１６（配列番号４５）とＲｖプライマー１６（配列番号４６）を用いてＰＣＲすることで増幅した断片（Ｌ）とを、同様にＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔによって処理することで、ＧＡＬ２発現用プラスミドｐＵＣ－Δｅｇ３：：Ｐｘｙｎ１－ＡｎＧＡＬ－ｐｙｒ４（ｒｅ）を得た。
（１）Ｇａｌ発現用べクターの構築
ｐＵＣ１１８（タカラバイオ）のＨｉｎｃＩＩ制限酵素切断点にトリコデルマ・リーセイ由来のｅｇ３遺伝子の上流から下流までの領域（配列番号４７）を挿入したプラスミドｐＵＣ－ｅｇ3を鋳型とし、表７に示したＦｗプライマー６（配列番号２５）とＲｖプライマー６（配列番号２６）を用いてＰＣＲすることで断片（Ａ）を増幅した。また、トリコデルマ・リーセイのゲノムＤＮＡを鋳型として表７に示したＦｗプライマー７（配列番号２７）とＲｖプライマー７（配列番号２８）を用いてＰＣＲすることで増幅された断片（Ｂ）を増幅した。得られたＤＮＡ断片（Ａ）及び（Ｂ）はＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ）のプロトコルに従って処理し、ｅｇ３遺伝子下流にｐｙｒ４遺伝子が連結されたプラスミドｐＵＣ－ｅｇ３－ｐｙｒ４を構築した。
さらに、このｐＵＣ－ｅｇ３－ｐｙｒ４を鋳型とし、表７に示したＦｗプライマー８（配列番号２９）とＲｖプライマー８（配列番号３０）を用いてＰＣＲすることで増幅した断片（Ｃ）と、トリコデルマ・リーセイのゲノムＤＮＡを鋳型として表７に示したＦｗプライマー９（配列番号３１）とＲｖプライマー９（配列番号３２）を用いてＰＣＲすることで増幅された断片（Ｄ）とを、同様にはＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔによって処理することで、プラスミドｐＵＣ－Δｅｇ３：：Ｐｃｂｈ１－ｃｂｈ１－ｐｙｒ４を得た。
続いて、このｐＵＣ－Δｅｇ３：：Ｐｃｂｈ１－ｃｂｈ１－ｐｙｒ４を鋳型とし、表７に示したＦｗプライマー１０（配列番号３３）とＲｖプライマー１０（配列番号３４）を用いてＰＣＲすることで増幅した断片（Ｅ）と、プラスミドｐＵＣ－ｅｇ３を鋳型として表７に示したＦｗプライマー１１（配列番号３５）とＲｖプライマー１１（配列番号３６）を用いてＰＣＲすることで増幅された断片（Ｆ）とを、同様にＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔによって処理することで、プラスミドｐＵＣ－Δｅｇ３：：Ｐｃｂｈ１－ｃｂｈ１－ｐｙｒ４#１０００を得た。
次に、ｐＵＣ－Δｅｇ３：：Ｐｃｂｈ１－ｃｂｈ１－ｐｙｒ４#１０００を鋳型とし、表７に示したＦｗプライマー７（配列番号２７）とＲｖプライマー９（配列番号３２）を用いてＰＣＲすることで増幅した断片（Ｇ）と、トリコデルマ・リーセイのゲノムＤＮＡを鋳型とし、表８に示したＦｗプライマー１２（配列番号３７）とＲｖプライマー１２（配列番号３８）を用いてＰＣＲすることで増幅した断片（Ｈ）とを、同様にＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔによって処理することで、プラスミドｐＵＣ－Δｅｇ３：：Ｐｃｂｈ１－ｃｂｈ１－ｐｙｒ４（ｒｅ）を得た。
ｐＵＣ－Δｅｇ３：：Ｐｃｂｈ１－ｃｂｈ１－ｐｙｒ４（ｒｅ）を鋳型とし、表７に示したＦｗプライマー１３（配列番号３９）とＲｖプライマー１３（配列番号４０）を用いてＰＣＲすることで増幅した断片（Ｉ）と、トリコデルマ・リーセイのゲノムＤＮＡを鋳型とし、表７に示したＦｗプライマー１４（配列番号４１）とＲｖプライマー１４（配列番号４２）を用いてＰＣＲすることで増幅した断片（Ｊ）とを、同様にＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔによって処理することで、プラスミドｐＵＣ－Δｅｇ３：：Ｐｘｙｎ１－ｃｂｈ１－ｐｙｒ４（ｒｅ）を得た。
そして、ｐＵＣ－Δｅｇ３：：Ｐｘｙｎ１－ｃｂｈ１－ｐｙｒ４（ｒｅ）を鋳型とし、表７に示したＦｗプライマー１５（配列番号４３）とＲｖプライマー１５（配列番号４４）を用いてＰＣＲすることで増幅した断片（Ｋ）と、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ＮＢＲＣ１０５６４９株のｃＤＮＡを鋳型とし、表７に示したＦｗプライマー１６（配列番号４５）とＲｖプライマー１６（配列番号４６）を用いてＰＣＲすることで増幅した断片（Ｌ）とを、同様にＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔによって処理することで、ＧＡＬ２発現用プラスミドｐＵＣ－Δｅｇ３：：Ｐｘｙｎ１－ＡｎＧＡＬ－ｐｙｒ４（ｒｅ）を得た。
（２）形質転換体の作製
トリコデルマ・リーセイＥ１ＡＢ１株のウラシル要求性株に対してｐｇａＢ、ｐｅｌＤを発現させた株（特願２０２１－１５４７４９）をＳＰ２１とし、この株に対して上記（１）で構築したベクターの形質転換を行った。導入はプロトプラストＰＥＧ法で行った。形質転換体はアセトアミドを単一窒素源とした選択培地（２．０％ グルコース、１．１Ｍ ソルビトール、２．０％ アガー、０．２％ ＫＨ2ＰＯ4、０．０６％ ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、０．０６％ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．０６％ アセトアミド、０．１％ Ｔｒａｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔ２；％はいずれもｗ／ｖ％）にて選抜した。Ｔｒａｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔ２の組成は以下のとおりである：０．５ｇ ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．２ｇ ＣｏＣｌ2、０．１６ｇ ＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ、０．１４ｇ ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏを蒸留水にて１００ｍＬにメスアップ。選抜した形質転換体を植え継ぎにより安定化した後、コロニーＰＣＲにより目的の遺伝子が安定に保持された菌株をさらに選別した。得られた形質転換体をＳＰ２１・Ｇａｌとした。
トリコデルマ・リーセイＥ１ＡＢ１株のウラシル要求性株に対してｐｇａＢ、ｐｅｌＤを発現させた株（特願２０２１－１５４７４９）をＳＰ２１とし、この株に対して上記（１）で構築したベクターの形質転換を行った。導入はプロトプラストＰＥＧ法で行った。形質転換体はアセトアミドを単一窒素源とした選択培地（２．０％ グルコース、１．１Ｍ ソルビトール、２．０％ アガー、０．２％ ＫＨ2ＰＯ4、０．０６％ ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、０．０６％ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．０６％ アセトアミド、０．１％ Ｔｒａｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔ２；％はいずれもｗ／ｖ％）にて選抜した。Ｔｒａｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔ２の組成は以下のとおりである：０．５ｇ ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．２ｇ ＣｏＣｌ2、０．１６ｇ ＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ、０．１４ｇ ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏを蒸留水にて１００ｍＬにメスアップ。選抜した形質転換体を植え継ぎにより安定化した後、コロニーＰＣＲにより目的の遺伝子が安定に保持された菌株をさらに選別した。得られた形質転換体をＳＰ２１・Ｇａｌとした。
（３）酵素の生産
酵素生産培地に、ＳＰ２１、又はＳＰ２１・Ｇａｌの胞子を２×１０5個／ｍＬとなるよう植菌し、２８℃にて５日間振とう培養を行った。得られた培養物を遠心分離した後フィルターろ過することで、各培養上清を取得した。得られた培養上清は酵素溶液として検討に使用した。
酵素生産培地に、ＳＰ２１、又はＳＰ２１・Ｇａｌの胞子を２×１０5個／ｍＬとなるよう植菌し、２８℃にて５日間振とう培養を行った。得られた培養物を遠心分離した後フィルターろ過することで、各培養上清を取得した。得られた培養上清は酵素溶液として検討に使用した。
試験例：キャッサバ残渣の糖化
＜試験例２１＞
糊化処理した基質に対し、グルコアミラーゼ０．０５ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇ－基質、ＳＰ２１由来培養上清０．２ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇ－基質を添加した以外は、試験例１と同様の検討を行った。糖化後のスラリーの粘度の値は６０．０ｍＰａ・ｓであった。
＜試験例２１＞
糊化処理した基質に対し、グルコアミラーゼ０．０５ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇ－基質、ＳＰ２１由来培養上清０．２ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇ－基質を添加した以外は、試験例１と同様の検討を行った。糖化後のスラリーの粘度の値は６０．０ｍＰａ・ｓであった。
＜試験例２２＞
糊化処理した基質に対し、グルコアミラーゼ０．０５ ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇ－基質、ＳＰ２１・Ｇａｌ由来培養上清０．２ｍｇ／ｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇ－基質を添加した以外は、試験例１と同様の検討を行った。糖化後のスラリーの粘度の値は１８．０ｍＰａ・ｓであった。
糊化処理した基質に対し、グルコアミラーゼ０．０５ ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇ－基質、ＳＰ２１・Ｇａｌ由来培養上清０．２ｍｇ／ｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇ－基質を添加した以外は、試験例１と同様の検討を行った。糖化後のスラリーの粘度の値は１８．０ｍＰａ・ｓであった。
＜試験例２３＞
ＳＰ２１、ＳＰ２１・Ｇａｌ由来の培養上清中における酵素ユニットを測定した。その結果、これらの酵素における各酵素ユニットは表９に示した通りであった。
ＳＰ２１、ＳＰ２１・Ｇａｌ由来の培養上清中における酵素ユニットを測定した。その結果、これらの酵素における各酵素ユニットは表９に示した通りであった。
Claims (21)
- 以下の（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）を含む酵素組成物：
（Ａ）セルラーゼ、
（Ｂ）ポリガラクツロナーゼ、及びペクチンリアーゼを含むホモガラクツロナン分解酵素、
（Ｃ）アラビノフラノシダーゼ及びガラクタナーゼから選択される１種以上。 - 植物バイオマスを糖化するための、請求項１記載の酵素組成物。
- 糖化処理された植物バイオマスの粘度を、セルラーゼのみを用いて糖化処理された場合に比べて低下させるものである、請求項２記載の酵素組成物。
- セルラーゼ活性が、酵素組成物中のタンパク質１ｍｇあたり２．０～３．５Ｕである、請求項１～３のいずれか１項記載の酵素組成物。
- ポリガラクツロナーゼ活性が、酵素組成物中のタンパク質１ｍｇあたり３０Ｕ～１２００である、請求項１～４のいずれか１項記載の酵素組成物。
- ペクチンリアーゼ活性が、酵素組成物中のタンパク質１ｍｇあたり、１～２７Ｕである、請求項１～５のいずれか１項記載の酵素組成物。
- アラビノフラノシダーゼ活性が、酵素組成物中のタンパク質１ｍｇあたり０．１～５０Ｕである、請求項１～６のいずれか１項記載の酵素組成物。
- ガラクタナーゼ活性が、酵素組成物中のタンパク質１ｍｇあたり３～２５０Ｕである、請求項１～７のいずれか１項記載の酵素組成物。
- 酵素組成物中の（Ｂ）ホモガラクツロナン分解酵素及び（Ｃ）アラビノフラノシダーゼ及びガラクタナーゼから選択される１種以上（（Ｂ）＋（Ｃ））のタンパク質に含まれる割合が１質量％～５０質量％である、請求項１～８のいずれか１項記載の酵素組成物。
- 請求項１～９のいずれか１項記載の酵素組成物を植物バイオマスと接触させる工程を含む、植物バイオマスの糖化方法。
- 請求項１～９のいずれか１項記載の酵素組成物を植物バイオマスと接触させる工程を含む、植物バイオマスからの糖の製造方法。
- 請求項１～９のいずれか１項記載の酵素組成物を植物バイオマスと接触させる工程を含む、植物バイオマスからのエタノールの製造方法。
- 植物バイオマスがペクチン含有植物バイオマスである、請求項１０～１２のいずれか１項記載の方法。
- 植物バイオマスがキャッサバ又はその残渣である、請求項１０～１２のいずれか１項記載の方法。
- 請求項１～９のいずれか１項記載の酵素組成物と接触した植物バイオマスの粘度を、セルラーゼのみを用いて接触場合に比べて低下させるものである、請求項１３又は１４記載の方法。
- （ｂ１）ポリガラクツロナーゼ遺伝子、（ｂ２）ペクチンリアーゼ遺伝子、及び（ｃ）アラビノフラノシダーゼ遺伝子及びガラクタナーゼ遺伝子から選択される１種以上の遺伝子を導入した組換え糸状菌。
- 請求項１６記載の組換え糸状菌を培養することを含む、請求項１～９のいずれか１項記載の酵素組成物の製造方法。
- （ｂ１）ポリガラクツロナーゼ遺伝子がＰｇａＢ遺伝子であり、（ｂ２）ペクチンリアーゼ遺伝子がＰｅｌＤ遺伝子であり、（ｃ）Ａｂｆ遺伝子又はＧａｌ遺伝子である、請求項１６記載の組換え糸状菌。
- （ｂ１）ポリガラクツロナーゼ遺伝子がＰｇａＢ遺伝子であり、（ｂ２）ペクチンリアーゼ遺伝子がＰｅｌＤ遺伝子であり、（ｃ）Ａｂｆ遺伝子又はＧａｌ遺伝子である、請求項１７記載の方法。
- 請求項１～２，４～９のいずれか１項に記載の酵素組成物を有効成分とする植物バイオマス粘度低下剤。
- 請求項１～２，４～９のいずれか１項に記載の酵素組成物を植物バイオマスと接触させる工程を含む、植物バイオマス粘度低下方法。
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