JP2023550372A - リボ核酸の精製 - Google Patents
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Abstract
本発明は、ポリＡテールを含むリボ核酸の精製のための組成物及び方法に関する。組成物及び方法は、ポリスチレンジビニルベンゼン粒子、リンカー、及びポリデオキシチミジンオリゴヌクレオチドを含む。【選択図】図１
Description
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出される配列表を含み、その全容を参照によって本明細書に援用する。前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０２１年１１月１８日に作成され、ファイル名は、５０８５８－１１５ＷＯ２＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿１１＿１８＿２１＿ＳＴ２５であり、そのサイズは４１６バイトである。
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出される配列表を含み、その全容を参照によって本明細書に援用する。前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０２１年１１月１８日に作成され、ファイル名は、５０８５８－１１５ＷＯ２＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿１１＿１８＿２１＿ＳＴ２５であり、そのサイズは４１６バイトである。
本発明は、ポリアデノシン（ポリＡ）配列を有するＲＮＡの精製のための組成物及び方法の分野に関する。
生体試料から精製されたＲＮＡは、医療、分子生物学、及び環境分野で広く利用されており、過去３０年間でＲＮＡ精製法の発展には大きな成果があった。しかしながら、市販のＲＮＡ精製技術は通常、細胞／組織の粗抽出物または血液からベンチトップでの小規模（例えば、１ｍｇ未満）のＲＮＡ分離に最適化されている。小規模ＲＮＡ精製に利用される一般的な表面は、セルロース、ラテックス粒子、磁気ビーズである。そのような組成物は、治療用ｍＲＮＡのｃＧＭＰ（現在の適正製造基準）製造に合わせて設計された大規模なクロマトグラフィープロセスでは一般に実現可能ではない。特に、セルロースベースの表面は、多くの場合、浸出したリガンドを生じ、微粒子を含み、カラムクロマトグラフィーにおける流動性が不十分である。ＲＮＡの品質と純度に関して、セルロース表面は、エンドトキシンによる汚染など、相当の汚染を伴う溶出ＲＮＡを生成することが示されている。さらに、これらの市販の表面を使用して生成されたＲＮＡは、通常、さらなる分離方法で処理して、臨床及び治療用のＲＮＡ品質を確保する必要がある。特にエンドトキシン汚染は、ｍＲＮＡなどの治療用生体分子中のエンドトキシンの存在は患者の安全性にとって有害であることからバイオ製造における重要な問題となっている。
そのため、夾雑物のない大規模なＲＮＡ精製方法が必要とされている。
本発明は、ポリスチレンジビニルベンゼン粒子及びチミンオリゴマー（例えば、ポリデオキシチミジンオリゴヌクレオチド）を含む、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の精製のための組成物及び方法に関するものである。
一態様では、本開示は、式Ｉの構造を含む複数の結合体を含有する組成物であって：
Ａ－Ｌ－Ｂ
式Ｉ
［式中、
Ａは、ポリスチレンジビニルベンゼン（ＰＳＤＶＢ）粒子を含む表面であり、
Ｌは、下記構造を含むリンカーである：
（ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である）
Ｂは、ポリデオキシチミジンオリゴヌクレオチドを含むオリゴマーである］
ただし、複数のコンジュゲートが、
（ｉ）約３０～約６０μｍｏｌ／ｍＬのエポキシド密度を有し、
（ｉｉ）約０．１～約０．５μｍｏｌ／ｍＬのポリデオキシチミジンオリゴヌクレオチド密度を有し、
（ｉｉｉ）約５ｍｇ／ｍＬ未満のｄＴ／樹脂添加量を有し、
（ｉｖ）約５μｍｏｌ／ｍＬ超のイオン容量を有し、及び／または
（ｖ）約１．５μｍｏｌ／ｍＬ超の動的結合容量を有する、組成物に関する。
Ａ－Ｌ－Ｂ
式Ｉ
［式中、
Ａは、ポリスチレンジビニルベンゼン（ＰＳＤＶＢ）粒子を含む表面であり、
Ｌは、下記構造を含むリンカーである：
（ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である）
Ｂは、ポリデオキシチミジンオリゴヌクレオチドを含むオリゴマーである］
ただし、複数のコンジュゲートが、
（ｉ）約３０～約６０μｍｏｌ／ｍＬのエポキシド密度を有し、
（ｉｉ）約０．１～約０．５μｍｏｌ／ｍＬのポリデオキシチミジンオリゴヌクレオチド密度を有し、
（ｉｉｉ）約５ｍｇ／ｍＬ未満のｄＴ／樹脂添加量を有し、
（ｉｖ）約５μｍｏｌ／ｍＬ超のイオン容量を有し、及び／または
（ｖ）約１．５μｍｏｌ／ｍＬ超の動的結合容量を有する、組成物に関する。
いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、３０～６０μｍｏｌ／ｍＬ（例えば、３０μｍｏｌ／ｍＬ、３１μｍｏｌ／ｍＬ、３２μｍｏｌ／ｍＬ、３３μｍｏｌ／ｍＬ、３４μｍｏｌ／ｍＬ、３５μｍｏｌ／ｍＬ、３６μｍｏｌ／ｍＬ、３７μｍｏｌ／ｍＬ、３８μｍｏｌ／ｍＬ、３９μｍｏｌ／ｍＬ、４０μｍｏｌ／ｍＬ、４１μｍｏｌ／ｍＬ、４２μｍｏｌ／ｍＬ、４３μｍｏｌ／ｍＬ、４４μｍｏｌ／ｍＬ、４５μｍｏｌ／ｍＬ、４６μｍｏｌ／ｍＬ、４７μｍｏｌ／ｍＬ、４８μｍｏｌ／ｍＬ、４９μｍｏｌ／ｍＬ、５０μｍｏｌ／ｍＬ、５１μｍｏｌ／ｍＬ、５２μｍｏｌ／ｍＬ、５３μｍｏｌ／ｍＬ、５４μｍｏｌ／ｍＬ、５５μｍｏｌ／ｍＬ、５６μｍｏｌ／ｍＬ、５７μｍｏｌ／ｍＬ、５８μｍｏｌ／ｍＬ、５９μｍｏｌ／ｍＬ、または６０μｍｏｌ／ｍＬ）のエポキシド密度を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、４０～６０μｍｏｌ／ｍＬ（例えば、４０μｍｏｌ／ｍＬ、４１μｍｏｌ／ｍＬ、４２μｍｏｌ／ｍＬ、４３μｍｏｌ／ｍＬ、４４μｍｏｌ／ｍＬ、４５μｍｏｌ／ｍＬ、４６μｍｏｌ／ｍＬ、４７μｍｏｌ／ｍＬ、４８μｍｏｌ／ｍＬ、４９μｍｏｌ／ｍＬ、５０μｍｏｌ／ｍＬ、５１μｍｏｌ／ｍＬ、５２μｍｏｌ／ｍＬ、５３μｍｏｌ／ｍＬ、５４μｍｏｌ／ｍＬ、５５μｍｏｌ／ｍＬ、５６μｍｏｌ／ｍＬ、５７μｍｏｌ／ｍＬ、５８μｍｏｌ／ｍＬ、５９μｍｏｌ／ｍＬ、または６０μｍｏｌ／ｍＬ）のエポキシド密度を有する。
いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、０．１～０．５μｍｏｌ／ｍＬ（例えば、０．１μｍｏｌ／ｍＬ、０．２μｍｏｌ／ｍＬ、０．３μｍｏｌ／ｍＬ、０．４μｍｏｌ／ｍＬ、または０．５μｍｏｌ／ｍＬ）のポリデオキシチミジンオリゴヌクレオチド密度を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約０．３μｍｏｌ／ｍＬのポリデオキシチミジンオリゴヌクレオチド密度を有する。
いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、５ｍｇ／ｍＬ未満（例えば、１ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ、３、ｍｇ／ｍＬ、または４ｍｇ／ｍＬ）のｄＴ／樹脂添加量を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約３ｍｇ／ｍＬのｄＴ／樹脂添加量を有する。
いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、５μｍｏｌ／ｍＬ超のイオン容量を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、５～１０μｍｏｌ／ｍＬ（例えば、５μｍｏｌ／ｍＬ、６μｍｏｌ／ｍＬ、７μｍｏｌ／ｍＬ、８μｍｏｌ／ｍＬ、９μｍｏｌ／ｍＬ、または１０μｍｏｌ／ｍＬ）のイオン容量を有する。
いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、１．５μｍｏｌ／ｍＬ超（例えば、１．５～５μｍｏｌ／ｍＬ、例えば、１．５ｍｏｌ／ｍＬ、２μｍｏｌ／ｍＬ、２．５μｍｏｌ／ｍＬ、３μｍｏｌ／ｍＬ、３．５μｍｏｌ／ｍＬ、４μｍｏｌ／ｍＬ、４．５μｍｏｌ／ｍＬ、または５μｍｏｌ／ｍＬ）の動的結合容量を有する。
一態様では、本開示は、式Ｉの構造を含む複数のコンジュゲートを含む組成物：
Ａ－Ｌ－Ｂ
式Ｉ、
［式中、
Ａは、ポリスチレンジビニルベンゼン粒子であり、
Ｌは、以下の構造を含むリンカーであり、
（式中、ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である）
Ｂは、ポリデオキシチミジンオリゴヌクレオチドを含む］に関する。
Ａ－Ｌ－Ｂ
式Ｉ、
［式中、
Ａは、ポリスチレンジビニルベンゼン粒子であり、
Ｌは、以下の構造を含むリンカーであり、
（式中、ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である）
Ｂは、ポリデオキシチミジンオリゴヌクレオチドを含む］に関する。
一態様では、本開示は、式Ｉの構造を含む複数のコンジュゲートを含む組成物であって：
Ａ－Ｌ－Ｂ
式Ｉ、
［式中、
Ａは、ポリスチレンジビニルベンゼン粒子であり、
Ｌは、以下の構造を含むリンカーであり、
（式中、ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である）
Ｂは、ポリデオキシチミジンオリゴヌクレオチドを含む］
複数のコンジュゲートが、４０～６０μｍの平均粒径を有する、組成物に関する。
Ａ－Ｌ－Ｂ
式Ｉ、
［式中、
Ａは、ポリスチレンジビニルベンゼン粒子であり、
Ｌは、以下の構造を含むリンカーであり、
（式中、ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である）
Ｂは、ポリデオキシチミジンオリゴヌクレオチドを含む］
複数のコンジュゲートが、４０～６０μｍの平均粒径を有する、組成物に関する。
一態様では、本開示は、式Ｉの構造を含む複数のコンジュゲートを含む組成物であって：
Ａ－Ｌ－Ｂ
式Ｉ
［式中、
Ａは、ポリスチレンジビニルベンゼン粒子であり、
Ｌは、以下の構造を含むリンカーであり、
（式中、ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である）
Ｂは、ポリデオキシチミジンオリゴヌクレオチドを含む］
複数のコンジュゲートが、１０００Å超の平均細孔径を有する、組成物に関する。
Ａ－Ｌ－Ｂ
式Ｉ
［式中、
Ａは、ポリスチレンジビニルベンゼン粒子であり、
Ｌは、以下の構造を含むリンカーであり、
（式中、ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である）
Ｂは、ポリデオキシチミジンオリゴヌクレオチドを含む］
複数のコンジュゲートが、１０００Å超の平均細孔径を有する、組成物に関する。
一態様では、本開示は、式Ｉの構造を含む複数のコンジュゲートを含む組成物であって：
Ａ－Ｌ－Ｂ
式Ｉ
［式中、
Ａは、ポリスチレンジビニルベンゼン粒子であり、
Ｌは、以下の構造を含むリンカーであり、
（式中、ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である）
Ｂは、ポリデオキシチミジンオリゴヌクレオチドを含む］
複数のコンジュゲートが、５μｍｏｌ／ｍＬ超のイオン容量を有する、組成物に関する。
Ａ－Ｌ－Ｂ
式Ｉ
［式中、
Ａは、ポリスチレンジビニルベンゼン粒子であり、
Ｌは、以下の構造を含むリンカーであり、
（式中、ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である）
Ｂは、ポリデオキシチミジンオリゴヌクレオチドを含む］
複数のコンジュゲートが、５μｍｏｌ／ｍＬ超のイオン容量を有する、組成物に関する。
いくつかの実施形態では、ｍは、２、３、４、５、または６である。特定の実施形態では、ｍは６である。
いくつかの実施形態では、Ｌは、以下の構造を含む：
いくつかの実施形態では、ポリデオキシチミジンオリゴヌクレオチドは、５～２００個（例えば、５～２０個、５～５０個、５～１００個、１０～３０個、１５～２５個、２０～４０個、２０～１００個、２０～２００個、１００～２００個、または１５０～２００個）のデオキシチミジンを含む。いくつかの実施形態では、ポリデオキシチミジンオリゴヌクレオチドは、２０～４０個のデオキシチミジン（例えば、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０個のデオキシチミジン）を含む。いくつかの実施形態では、ポリデオキシチミジンオリゴヌクレオチドは、２０個のデオキシチミジンを含む。いくつかの実施形態では、ポリデオキシチミジンオリゴヌクレオチドは、２０個のデオキシチミジンからなる。
いくつかの実施形態では、ポリスチレンジビニルベンゼン粒子は、エポキシド官能化ポリスチレンジビニルベンゼン粒子である。
いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、３０～６０μｍｏｌ／ｍＬ（例えば、３０～４０μｍｏｌ／ｍＬ、４０～５０μｍｏｌ／ｍＬ、５０～６０μｍｏｌ／ｍＬ、または４０～６０μｍｏｌ／ｍＬ）のエポキシド密度を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、３０μｍｏｌ／ｍＬのエポキシド密度を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、４０～６０μｍｏｌ／ｍＬのエポキシド密度を有する。
いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約３０μｍｏｌ／ｍＬのエポキシド密度（例えば、３０μｍｏｌ／ｍＬのエポキシド密度）を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約３１μｍｏｌ／ｍＬのエポキシド密度（例えば、３１μｍｏｌ／ｍＬのエポキシド密度）を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約３２μｍｏｌ／ｍＬのエポキシド密度（例えば、３２μｍｏｌ／ｍＬのエポキシド密度）を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約３３μｍｏｌ／ｍＬのエポキシド密度（例えば、３３μｍｏｌ／ｍＬのエポキシド密度）を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約３４μｍｏｌ／ｍＬのエポキシド密度（例えば、３４μｍｏｌ／ｍＬのエポキシド密度）を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約３５μｍｏｌ／ｍＬのエポキシド密度（例えば、３５μｍｏｌ／ｍＬのエポキシド密度）を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約３６μｍｏｌ／ｍＬのエポキシド密度（例えば、３６μｍｏｌ／ｍＬのエポキシド密度）を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約３７μｍｏｌ／ｍＬのエポキシド密度（例えば、３７μｍｏｌ／ｍＬのエポキシド密度）を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約３８μｍｏｌ／ｍＬのエポキシド密度（例えば、３８μｍｏｌ／ｍＬのエポキシド密度）を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約３９μｍｏｌ／ｍＬのエポキシド密度（例えば、３９μｍｏｌ／ｍＬのエポキシド密度）を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約４０μｍｏｌ／ｍＬのエポキシド密度（例えば、４０μｍｏｌ／ｍＬのエポキシド密度）を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約４１μｍｏｌ／ｍＬのエポキシド密度（例えば、４１μｍｏｌ／ｍＬのエポキシド密度）を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約４２μｍｏｌ／ｍＬのエポキシド密度（例えば、４２μｍｏｌ／ｍＬのエポキシド密度）を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約４３μｍｏｌ／ｍＬのエポキシド密度（例えば、４３μｍｏｌ／ｍＬのエポキシド密度）を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約４４μｍｏｌ／ｍＬのエポキシド密度（例えば、４４μｍｏｌ／ｍＬのエポキシド密度）を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約４５μｍｏｌ／ｍＬのエポキシド密度（例えば、４５μｍｏｌ／ｍＬのエポキシド密度）を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約４６μｍｏｌ／ｍＬのエポキシド密度（例えば、４６μｍｏｌ／ｍＬのエポキシド密度）を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約４７μｍｏｌ／ｍＬのエポキシド密度（例えば、４７μｍｏｌ／ｍＬのエポキシド密度）を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約４８μｍｏｌ／ｍＬのエポキシド密度（例えば、４８μｍｏｌ／ｍＬのエポキシド密度）を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約４９μｍｏｌ／ｍＬのエポキシド密度（例えば、４９μｍｏｌ／ｍＬのエポキシド密度）を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約５０μｍｏｌ／ｍＬのエポキシド密度（例えば、５０μｍｏｌ／ｍＬのエポキシド密度）を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約５１μｍｏｌ／ｍＬのエポキシド密度（例えば、５１μｍｏｌ／ｍＬのエポキシド密度）を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約５２μｍｏｌ／ｍＬのエポキシド密度（例えば、５２μｍｏｌ／ｍＬのエポキシド密度）を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約５３μｍｏｌ／ｍＬのエポキシド密度（例えば、５３μｍｏｌ／ｍＬのエポキシド密度）を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約５４μｍｏｌ／ｍＬのエポキシド密度（例えば、５４μｍｏｌ／ｍＬのエポキシド密度）を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約５５μｍｏｌ／ｍＬのエポキシド密度（例えば、５５μｍｏｌ／ｍＬのエポキシド密度）を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約５６μｍｏｌ／ｍＬのエポキシド密度（例えば、５６μｍｏｌ／ｍＬのエポキシド密度）を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約５７μｍｏｌ／ｍＬのエポキシド密度（例えば、５７μｍｏｌ／ｍＬのエポキシド密度）を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約５８μｍｏｌ／ｍＬのエポキシド密度（例えば、５８μｍｏｌ／ｍＬのエポキシド密度）を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約５９μｍｏｌ／ｍＬのエポキシド密度（例えば、５９μｍｏｌ／ｍＬのエポキシド密度）を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約６０μｍｏｌ／ｍＬのエポキシド密度（例えば、６０μｍｏｌ／ｍＬのエポキシド密度）を有する。
いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、０．１～０．５μｍｏｌ／ｍＬ（例えば、０．１～０．３μｍｏｌ／ｍＬ、０．２～０．４μｍｏｌ／ｍＬ、または０．３～０．５μｍｏｌ／ｍＬ）のポリデオキシチミジンオリゴヌクレオチド密度を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約０．１μｍｏｌ／ｍＬのポリデオキシチミジンオリゴヌクレオチド密度（例えば、０．１μｍｏｌ／ｍＬのポリデオキシチミジンオリゴヌクレオチド密度）を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約０．２μｍｏｌ／ｍＬのポリデオキシチミジンオリゴヌクレオチド密度（例えば、０．２μｍｏｌ／ｍＬのポリデオキシチミジンオリゴヌクレオチド密度）を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約０．３μｍｏｌ／ｍＬのポリデオキシチミジンオリゴヌクレオチド密度（例えば、０．３μｍｏｌ／ｍＬのポリデオキシチミジンオリゴヌクレオチド密度）を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約０．４μｍｏｌ／ｍＬのポリデオキシチミジンオリゴヌクレオチド密度（例えば、０．４μｍｏｌ／ｍＬのポリデオキシチミジンオリゴヌクレオチド密度）を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約０．５μｍｏｌ／ｍＬのポリデオキシチミジンオリゴヌクレオチド密度（例えば、０．５μｍｏｌ／ｍＬのポリデオキシチミジンオリゴヌクレオチド密度）を有する。
いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、４０～６０μｍ（例えば、４０～５０μｍ、５０～６０μｍ、または４５～５５μｍ）の平均粒径を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約４０μｍの平均粒径（例えば、４０μｍの平均粒径）を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約４１μｍの平均粒径（例えば、４１μｍの平均粒径）を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約４２μｍの平均粒径（例えば、４２μｍの平均粒径）を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約４３μｍの平均粒径（例えば、４３μｍの平均粒径）を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約４４μｍの平均粒径（例えば、４４μｍの平均粒径）を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約４５μｍの平均粒径（例えば、４５μｍの平均粒径）を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約４６μｍの平均粒径（例えば、４６μｍの平均粒径）を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約４７μｍの平均粒径（例えば、４７μｍの平均粒径）を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約４８μｍの平均粒径（例えば、４８μｍの平均粒径）を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約４９μｍの平均粒径（例えば、４９μｍの平均粒径）を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約５０μｍの平均粒径（例えば、５０μｍの平均粒径）を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約５１μｍの平均粒径（例えば、５１μｍの平均粒径）を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約５２μｍの平均粒径（例えば、５２μｍの平均粒径）を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約５３μｍの平均粒径（例えば、５３μｍの平均粒径）を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約５４μｍの平均粒径（例えば、５４μｍの平均粒径）を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約５５μｍの平均粒径（例えば、５５μｍの平均粒径）を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約５６μｍの平均粒径（例えば、５６μｍの平均粒径）を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約５７μｍの平均粒径（例えば、５７μｍの平均粒径）を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約５８μｍの平均粒径（例えば、５８μｍの平均粒径）を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約５９μｍの平均粒径（例えば、５９μｍの平均粒径）を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約６０μｍの平均粒径（例えば、６０μｍの平均粒径）を有する。
特定の実施形態では、複数のコンジュゲートは、約５０μｍの平均粒径（例えば、５０μｍの平均粒径）を有する。
いくつかの実施形態では、１０％未満（例えば、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満）の複数のコンジュゲートが、２０μｍ未満の粒径を有する。
いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、１０００Å超（例えば、２０００Å超、３０００Å超、４０００Å超、５０００Å超、または１０，０００Å超）の平均細孔径を有する。
いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、１０００～４０００Å（例えば、１０００～２０００Å、２０００～３０００Å、３０００～４０００Å、１０００～３０００Å、または２０００～４０００Å）の平均孔径を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約１０００Åの平均細孔径を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約１１００Åの平均細孔径を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約１２００Åの平均細孔径を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約１３００Åの平均細孔径を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約１４００Åの平均細孔径を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約１５００Åの平均細孔径を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約１６００Åの平均細孔径を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約１７００Åの平均細孔径を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約１８００Åの平均細孔径を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約１９００Åの平均細孔径を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約２０００Åの平均細孔径を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約２１００Åの平均細孔径を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約２２００Åの平均細孔径を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約２３００Åの平均細孔径を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約２４００Åの平均細孔径を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約２５００Åの平均細孔径を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約２６００Åの平均細孔径を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約２７００Åの平均細孔径を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約２８００Åの平均細孔径を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約２９００Åの平均細孔径を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約３０００Åの平均細孔径を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約３１００Åの平均細孔径を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約３２００Åの平均細孔径を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約３３００Åの平均細孔径を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約３４００Åの平均細孔径を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約３６００Åの平均細孔径を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約３６００Åの平均細孔径を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約３７００Åの平均細孔径を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約３８００Åの平均細孔径を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約３９００Åの平均細孔径を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約４０００Åの平均細孔径を有する。
特定の実施形態では、複数のコンジュゲートは、約２０００Åの平均細孔径を有する。
いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、５ｍｇ／ｍＬ未満（例えば、４ｍｇ／ｍＬ未満、３ｍｇ／ｍＬ未満、２ｍｇ／ｍＬ未満、１ｍｇ／ｍＬ未満、または０．５ｍｇ／ｍＬ未満）のｄＴ／樹脂添加量を有する。
いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約３ｍｇ／ｍＬのｄＴ／樹脂添加量（例えば、３ｍｇ／ｍＬのｄＴ／樹脂添加量）を有する。
いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、５μｍｏｌ／ｍＬ超のイオン容量を有する。
いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、５～１０μｍｏｌ／ｍＬ（例えば、５～７μｍｏｌ／ｍＬ、６～８μｍｏｌ／ｍＬ、７～９μｍｏｌ／ｍＬ、または８～１０μｍｏｌ／ｍＬ）のイオン容量を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約５μｍｏｌ／ｍＬのイオン容量（例えば、５μｍｏｌ／ｍＬのイオン容量）を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約６μｍｏｌ／ｍＬのイオン容量（例えば、６μｍｏｌ／ｍＬのイオン容量）を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約７μｍｏｌ／ｍＬのイオン容量（例えば、７μｍｏｌ／ｍＬのイオン容量）を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約８μｍｏｌ／ｍＬのイオン容量（例えば、８μｍｏｌ／ｍＬのイオン容量）を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約９μｍｏｌ／ｍＬのイオン容量（例えば、９μｍｏｌ／ｍＬのイオン容量）を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約１０μｍｏｌ／ｍＬのイオン容量（例えば、１０μｍｏｌ／ｍＬのイオン容量）を有する。
いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、１．５μｍｏｌ／ｍＬを超える（例えば、２μｍｏｌ／ｍＬを超える、３μｍｏｌ／ｍＬを超える、４μｍｏｌ／ｍＬを超える、５μｍｏｌ／ｍＬを超える）動的結合能を有する。または１０μｍｏｌ／ｍＬを超える）。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、１．５μｍｏｌ／ｍＬ～１０μｍｏｌ／ｍＬの動的結合容量を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約２μｍｏｌ／ｍＬの動的結合容量（例えば、２μｍｏｌ／ｍＬの動的結合容量）を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約２．５μｍｏｌ／ｍＬの動的結合容量（例えば、２．５μｍｏｌ／ｍＬの動的結合容量）を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約３μｍｏｌ／ｍＬの動的結合容量（例えば、３μｍｏｌ／ｍＬの動的結合容量）を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約３．５μｍｏｌ／ｍＬの動的結合容量（例えば、３．５μｍｏｌ／ｍＬの動的結合容量）を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約４μｍｏｌ／ｍＬの動的結合容量（例えば、４μｍｏｌ／ｍＬの動的結合容量）を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約４．５μｍｏｌ／ｍＬの動的結合容量（例えば、４．５μｍｏｌ／ｍＬの動的結合容量）を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約５μｍｏｌ／ｍＬの動的結合容量（例えば、５μｍｏｌ／ｍＬの動的結合容量）を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約５．５μｍｏｌ／ｍＬの動的結合容量（例えば、５．５μｍｏｌ／ｍＬの動的結合容量）を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約６μｍｏｌ／ｍＬの動的結合容量（例えば、６μｍｏｌ／ｍＬの動的結合容量）を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約６．５μｍｏｌ／ｍＬの動的結合容量（例えば、６．５μｍｏｌ／ｍＬの動的結合容量）を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約７μｍｏｌ／ｍＬの動的結合容量（例えば、７μｍｏｌ／ｍＬの動的結合容量）を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約７．５μｍｏｌ／ｍＬの動的結合容量（例えば、７．５μｍｏｌ／ｍＬの動的結合容量）を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約８μｍｏｌ／ｍＬの動的結合容量（例えば、８μｍｏｌ／ｍＬの動的結合容量）を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約８．５μｍｏｌ／ｍＬの動的結合容量（例えば、８．５μｍｏｌ／ｍＬの動的結合容量）を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約９μｍｏｌ／ｍＬの動的結合容量（例えば、９μｍｏｌ／ｍＬの動的結合容量）を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約９．５μｍｏｌ／ｍＬの動的結合容量（例えば、９．５μｍｏｌ／ｍＬの動的結合容量）を有する。いくつかの実施形態では、複数のコンジュゲートは、約１０μｍｏｌ／ｍＬの動的結合容量（例えば、１０μｍｏｌ／ｍＬの動的結合容量）を有する。
別の態様では、本開示は、ポリアデノシンテールを含むリボ核酸（ＲＮＡ）転写物を精製する方法であって、
（ａ）ＲＮＡ転写物を含む第１の試料を取得することであって、第１の試料が少なくとも５％の不純物を含む、取得することと、
（ｂ）ＲＮＡ転写物が組成物中のコンジュゲートに結合するような条件下で、第１の試料を本開示の上記の実施形態のいずれかの組成物と接触させることと、
（ｃ）組成物からＲＮＡ転写物を溶出することと、
（ｄ）第２の試料中のＲＮＡ転写物を回収することと、を含む、方法に関する。
（ａ）ＲＮＡ転写物を含む第１の試料を取得することであって、第１の試料が少なくとも５％の不純物を含む、取得することと、
（ｂ）ＲＮＡ転写物が組成物中のコンジュゲートに結合するような条件下で、第１の試料を本開示の上記の実施形態のいずれかの組成物と接触させることと、
（ｃ）組成物からＲＮＡ転写物を溶出することと、
（ｄ）第２の試料中のＲＮＡ転写物を回収することと、を含む、方法に関する。
いくつかの実施形態では、第２の試料は、５％未満の不純物（例えば、４．５％未満の不純物、４％未満の不純物、３．５％未満の不純物）を含む。
いくつかの実施形態では、方法は、工程（ｂ）の後に溶液を用いて表面を有する組成物を洗浄することをさらに含む。
いくつかの実施形態では、方法は、工程（ｂ）の前に第１の試料を予熱することをさらに含む。
いくつかの実施形態では、第１の試料はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含み、第１の試料はＤＮａｓｅ処理に供されていない。
いくつかの実施形態では、１つ以上の不純物は、ポリアデノシンテールを含まないＲＮＡ、ＤＮＡ、炭水化物、毒素、ポリペプチド、及び／またはヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡはプラスミドＤＮＡである。他の実施形態では、ＤＮＡはポリメラーゼ連鎖反応産物ＤＮＡである。さらに他の実施形態では、ＤＮＡは、非増幅ＤＮＡ鋳型を含む。
いくつかの実施形態では、毒素は、リポ多糖である。特定の実施形態では、リポ多糖はエンドトキシンである。
いくつかの実施形態では、接触させる工程は、約６５℃の温度で行われる。
いくつかの実施形態では、接触させる工程が、１００ｃｍ／ｈの速度で行われる。
いくつかの実施形態では、第１の試料は、塩溶液を含む。特定の実施形態では、塩溶液は、塩化ナトリウム溶液である。
いくつかの実施形態では、洗浄する工程は、塩を含む１つ以上の溶液を適用することを含む。特定の実施形態では、塩は、塩化ナトリウムまたは塩化カリウムである。
いくつかの実施形態では、溶出工程は、溶出バッファーを用いて行われる。特定の実施形態では、溶出バッファーは、塩を含まない。
いくつかの実施形態では、溶出工程は、約６５℃の温度で行われる。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ転写物は、非増幅ＤＮＡ鋳型を使用したインビトロ転写産物である。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ転写物は、少なくとも１０００ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ転写物は、１０００ヌクレオチド～９０００ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ転写物は、１０００ヌクレオチド～８０００ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ転写物は、１０００ヌクレオチド～７０００ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ転写物は、１０００ヌクレオチド～６０００ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ転写物は、１０００ヌクレオチド～５０００ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ転写物は、１０００ヌクレオチド～４０００ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ転写物は、１０００ヌクレオチド～３０００ヌクレオチドの長さである。
定義
本出願では、文脈から明確でない限り、（ｉ）「１つの（ａ）」という用語は、「少なくとも１つ」を意味すると理解され得、（ｉｉ）「または（ｏｒ）」という用語は、「及び／または（ａｎｄ／ｏｒ）」を意味すると理解され得、（ｉｉｉ）「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、それ自体で示されるか、あるいは１つ以上のさらなる要素または工程と共に示されるかによらず、項目別の要素または工程を包含するものと理解され得る。
本出願では、文脈から明確でない限り、（ｉ）「１つの（ａ）」という用語は、「少なくとも１つ」を意味すると理解され得、（ｉｉ）「または（ｏｒ）」という用語は、「及び／または（ａｎｄ／ｏｒ）」を意味すると理解され得、（ｉｉｉ）「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、それ自体で示されるか、あるいは１つ以上のさらなる要素または工程と共に示されるかによらず、項目別の要素または工程を包含するものと理解され得る。
本明細書で使用される場合、「約」及び「およそ」という用語は、記載されている値の±１０％以内の値を指す。例えば、「約５０μｍ」という語は、４５μｍ～５５ｎＭまでの範囲を示す。
本明細書で使用される場合、「結合容量」とは、２５℃の０．５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４中で測定される、表面の単位体積当たりの表面に結合できるＲＮＡの量を指す。結合用量を測定する特定の実施形態では、ＲＮＡを６５℃で１５分間予熱した後、結合バッファーにより、１．５ｍｇ／ｍＬ未満のＲＮＡで、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４を含むように調整し、ＲＮＡ溶液を表面と接触させ、表面をスラリーとして６５℃で１５分間加熱した後、冷却し、バッチ反応器中、２０℃で３０分間連続的に混合しながらハイブリダイズさせ、樹脂を０．５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡで洗浄し、次いで０．１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡで洗浄し、ＲＮＡを１０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ及び１ｍＭ ＥＤＴＡにより６５℃で溶出した後、２６０ｎｍでのＵＶ分光光度法によって定量化する（ただし、結合容量は、表面の体積（ｍＬ）当たりの溶出ＲＮＡの総ｍｇ（ｍｇ）に等しい）。
本明細書で使用する場合、「ＤＮアーゼ処理」は、核酸を含む溶液へのエンドヌクレアーゼの添加を指す。エンドヌクレアーゼの関連する活性は、ＤＮＡを非特異的に分解して５’－リン酸化末端と３’－ヒドロキシル化末端を有するジヌクレオチド、トリヌクレオチド、及びオリゴヌクレオチド産物を放出することである。ＤＮａｓｅは、一本鎖及び二本鎖のＤＮＡ及びＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドに作用する。
本明細書で使用する場合、「ＤＮＡ鋳型」とは、ＲＮＡポリメラーゼの核酸鋳型を指す。一般的には、ＤＮＡ鋳型は、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列に連結された目的遺伝子の配列を含む。ＤＮＡ鋳型には、増幅されないＤＮＡが含まれる場合もある。
本明細書で使用する場合、「リンカー」とは、２つ以上の分子または実体（例えば、表面（例えば、ポリスチレンジビニルベンゼン粒子）とオリゴマー（例えば、オリゴヌクレオチド（例えば、ポリデオキシチミジンオリゴヌクレオチド）））を接続する部分を指す。そのようなリンカーの例としては、これらに限定されるものではないが、以下の構造を含むリンカーが挙げられる：
（式中、ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である）。
（式中、ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である）。
本明細書で使用する場合、「核酸」とは、２つ以上のヌクレオチドまたは代替もしくは修飾ヌクレオチドからなる分子を指す。「ヌクレオチド」という用語は、本明細書に記載される糖分子（例えば、ペントースもしくはリボース）またはその誘導体と有機塩基（例えば、プリンもしくはピリミジン）またはその誘導体との組み合わせと、リン酸基または代替基とを含む化合物を指す。核酸には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｔＲＮＡ（トランスファーＲＮＡ）、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ（ショートヘアピンＲＮＡ）、ｎｃＲＮＡ（ノンコーディングＲＮＡ）、アプタマー、リボザイム、及び上記のいずれかのより短いオリゴヌクレオチド配列が含まれる。ヌクレオチドの塩基、糖、及びリン酸部分の改変は、この定義に包含される。例示的な核酸としては、これらに限定されるものではないが、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロック核酸（β－Ｄ－リボ立体配置を有するＬＮＡ、α－Ｌ－リボ立体配置を有するα－ＬＮＡ（ＬＮＡのジアステレオマー）、２’－アミノ官能基を有する２’－アミノ－ＬＮＡ、及び２’－アミノ官能基を有する２’－アミノ－α－ＬＮＡを含む各ＬＮＡ）、及びこれらのハイブリッドが挙げられる。
本明細書で使用する場合、「オリゴマー」とは、繰り返し構造単位からなる分子を指す。本発明では、オリゴマーの例として、これらに限定されるものではないが、少なくとも２個のチミンを有するものが挙げられる。オリゴマーには、チミジン、デオキシチミジン、及びそれらの組み合わせが含まれ得る。チミンのオリゴマーは、アラビノース、キシロース、グルコース、ガラクトース、またはそれらのデオキシ誘導体、または糖の他の混合物など、他の５炭糖または６炭糖を含むことができる。その類似体及びさまざまな長さのオリゴマーも含まれる。オリゴマーは、ロック核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ核酸、２’修飾ＲＮＡ、炭水化物もしくはその誘導体、または上記のいずれかの任意の組み合わせなどの１つ以上の修飾を含むことができる。
本明細書で使用する場合、「ポリＡ」または「ポリＡ配列」という用語は、アデニンヌクレオチドの鎖を指す。一般的には、ポリＡ配列はポリＡテールである。以下により詳細に記載されるように、ポリＡ配列は、一般的には５～３００ヌクレオチドの長さを有する。ポリＡ配列を有するＲＮＡは、一般的には、目的の遺伝子のコード配列を含む。アデノシンは、天然に存在するアデノシンまたは誘導体化型、例えば、チミンにハイブリダイズできるＮ６－メチルアデノシンであり得る。本明細書に記載されるように、一般に核酸に関して、ポリＡ配列は、糖部分またはリン酸部分、例えば２’－ＯＭｅアデノシンへの改変を有してもよい。
本明細書で使用する場合、「アクセス可能なポリＡ配列」を含まないＲＮＡとは、チミン及び／またはウラシルのオリゴマーに結合するのに十分なポリＡ配列または構造が欠失または欠落しているＲＮＡを指す。例示的な態様では、「アクセス可能なポリＡ配列」を含まないＲＮＡとは、ポリＡ配列が欠失または欠落しているＲＮＡ、及び／または別の種（例えばＲＮＡ、ＤＮＡ、またはハイブリッドなどの別の核酸）に結合しているか、及び／またはポリＡ配列がチミン及び／またはウラシルのオリゴマーに結合できないようにそれ自体に結合しているポリＡ配列を有するＲＮＡ、及び／またはそうでない場合、ポリＡ配列がチミン及び／またはウラシルのオリゴマーに結合することを妨げる構造（例えば二次構造）を呈するポリＡ配列を有するＲＮＡを指す。例示的な態様では、「アクセス可能なポリＡ配列」を含まないＲＮＡは、本明細書では、アクセス不可能なポリＡ配列を有する、または含むＲＮＡ（例えば、別の種（例えばＲＮＡ、ＤＮＡ、もしくはハイブリッドなどの別の核酸）に結合しているか、及び／またはポリＡ配列がチミン及び／またはウラシルのオリゴマーに結合できないようにそれ自体に結合しているポリＡ配列を有するＲＮＡ、及び／またはそうでない場合、ポリＡ配列がチミン及び／またはウラシルのオリゴマーに結合することを妨げる構造（例えば二次構造）を呈するポリＡ配列を有するＲＮＡ）と呼ばれる場合もある。
本明細書で使用する場合、「ポリヌクレオチド」という用語は、核酸と互換的に用いられ、ヌクレオチドのポリマーを含む任意の化合物及び／または物質を包含する。本発明の方法によって生成されるＲＮＡ転写物及び本発明の方法で使用されるＤＮＡ鋳型はポリヌクレオチドである。例示的なポリヌクレオチドとしては、これらに限定されるものではないが、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロック核酸（β－Ｄ－リボ立体配置を有するＬＮＡ、α－Ｌ－リボ立体配置を有するα－ＬＮＡ（ＬＮＡのジアステレオマー）、２’－アミノ官能基を有する２’－アミノ－ＬＮＡ、及び２’－アミノ官能基を有する２’－アミノ－α－ＬＮＡを含む各ＬＮＡ）、またはこれらのハイブリッドが挙げられる。
本明細書で使用する場合、「精製」という用語は、標的核酸及び夾雑化学物質または生物学的物質（例えばエンドトキシン）を含む溶液からの核酸（例えばリボ核酸）の単離を指す。精製には、後の工程で化学的または生物学的成分の活性を低下させ得る、反応混合物中の未反応の生成物または作用物質を除去することが含まれる。本明細書で使用する場合、ポリＡ配列を有するＲＮＡの精製は、これらに限定されるものではないが、ＤＮＡ（例えば、プラスミド、ポリメラーゼ連鎖反応産物、または非増幅鋳型）、炭水化物、毒素（例えば、リポ多糖類）（例えば、エンドトキシン））、ポリペプチド、及びアクセス可能なポリＡテールを欠失したＲＮＡを含む試料不純物の除去をもたらす。
本明細書で使用する場合、「ＲＮＡ転写物」とは、ＤＮＡ鋳型及びＲＮＡポリメラーゼを用いたインビトロ転写反応によって生成されるリボ核酸を指す。ＲＮＡ転写物は、一般的には、目的の遺伝子のコード配列とポリＡテールを含む。ＲＮＡ転写物にはｍＲＮＡが含まれる。ＲＮＡ転写物は、修飾、例えば修飾ヌクレオチドを含むことができる。
本明細書で使用する場合、「表面」という用語は、１つ以上の試薬またはオリゴマー（例えば、オリゴヌクレオチド（例えば、ポリデオキシチミジンオリゴヌクレオチド））と接触しやすい固体または半固体構造の部分を指す。
本発明は、表面（例えば、ポリスチレンジビニルベンゼン粒子）に結合されたチミンオリゴマー（例えば、ポリデオキシチミジンオリゴヌクレオチド）を特徴とするＲＮＡ精製のための組成物及び方法を提供する。ラージスケールのＲＮＡ精製は、分子生物学及び医療分野、特に治療への応用において大きな関心を集めている。本発明の組成物は、従来の組成物よりもポリＡ配列を有するＲＮＡに対して有利に高い結合能力を示し、ラージスケールのＲＮＡ精製を可能とするものである。本明細書には、これらの組成物を用いたポリＡ配列を含むＲＮＡの精製、及びチミンオリゴマー（例えば、ポリデオキシチミジンオリゴヌクレオチド）に結合されたこれらの表面の合成のための方法も記載される。
組成物
本発明の組成物は、式Ｉの構造を有する複数のコンジュゲートを含む：
Ａ－Ｌ－Ｂ
式Ｉ、
［式中、Ａは、ポリスチレンジビニルベンゼン粒子を含む表面であり、Ｌは、以下の構造を含むリンカーであり：
（式中、ｍは１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である）、
Ｂは、ポリデオキシチミジンオリゴヌクレオチドを含むオリゴマーである）］。
本発明の組成物は、式Ｉの構造を有する複数のコンジュゲートを含む：
Ａ－Ｌ－Ｂ
式Ｉ、
［式中、Ａは、ポリスチレンジビニルベンゼン粒子を含む表面であり、Ｌは、以下の構造を含むリンカーであり：
（式中、ｍは１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である）、
Ｂは、ポリデオキシチミジンオリゴヌクレオチドを含むオリゴマーである）］。
ポリデオキシチミジンオリゴヌクレオチドは、表面に共有結合を介して固定化、コーティング、結合、固着、接着、または付着させることができる。一実施形態では、表面は、オリゴマーを表面上の別個の部位または位置に結合させるために使用できる部位を含む。オリゴマーの結合点は、一般的に対応する反応性官能基も含む、オリゴマーを共有結合させるために使用することができるアミノ基またはエポキシ基を含む化学官能基を含むことができる。表面上に自然に見出されるか、または表面に付加することができる化学反応性基の例としては、アミノ、エポキシ、及び／またはヌクレオシド誘導体、またはそれらの任意の組み合わせが含まれる。
組成物のＲＮＡ結合容量は、好ましくはＲＮＡ１ｍｇ／ｍＬ超、例えば、ＲＮＡ２～１５ｍｇ／ｍＬ超またはＲＮＡ５ｍｇ／ｍＬ超、ＲＮＡ１０ｍｇ／ｍＬ超、ＲＮＡ２０ｍｇ／ｍＬ超、ＲＮＡ３０ｍｇ／ｍＬ超、またはＲＮＡ４０ｍｇ／ｍＬ超である。
複数のコンジュゲートは、好ましくは、４０～６０μｍ（例えば、４０～５０μｍ、５０～６０μｍ、または４５～５５μｍ）の平均粒径、１０００Å超（例えば、２０００Å超、３０００Å超、４０００Å超、５０００Å超、または１０，０００Å超）の平均孔径、及び／または５～１０μｍｏｌ／ｍＬ（例えば、５～７μｍｏｌ／ｍＬ、６～８μｍｏｌ／ｍＬ、７～９μｍｏｌ／ｍＬ、または８～１０μｍｏｌ／ｍＬ）のイオン容量を有する。
表面
単一の樹脂または複数の樹脂の混合物によって、本発明で有用な表面を形成することができる。樹脂は、多孔性であっても非多孔性であってもよい。
単一の樹脂または複数の樹脂の混合物によって、本発明で有用な表面を形成することができる。樹脂は、多孔性であっても非多孔性であってもよい。
詳細には、本発明の組成物及び方法は、ポリスチレンジビニルベンゼン粒子（例えば、エポキシドで官能化されたポリスチレンジビニルベンゼン粒子）を含む多孔性表面を特徴とする。ポリスチレンジビニルベンゼン粒子の形状、形態、材質、修飾は、用途に応じてさまざまな選択肢から選択することができる。
表面は、ビーズ、ボックス、カラム、シリンダー、ディスク、ディッシュ（例えば、ガラスまたはペトリ皿）、繊維、フィルム、フィルター、マイクロタイタープレート（例、９６ウェルマイクロタイタープレート）、マルチブレード付きスティック、ネット、ペレット、プレート、リング、ロッド、ロール、シート、スライド、スティック、トレイ、チューブ、またはバイアルの形態であってよい。表面は、実質的に平坦または平面であってよい。あるいは、表面に丸みを付けるかまたは形状を与えることができる。表面に含めることができる形状の例としては、ウェル、凹部、ピラー、リッジ、チャネルなどである。表面は、多孔性であっても非多孔性であってもよい。一実施形態では、表面は、チャネル、パターン、層、または他の構成（例えば、パターン化された表面）を含む。表面は、単一の別個の本体（例えば、単一のチューブ、単一のビーズ）、任意の数の複数の表面（例えば、１０本のチューブのラック、いくつかのビーズ）、またはそれらの組み合わせ（例えば、トレイは、複数のマイクロタイタープレート、ビーズが充填されたカラム、ビーズが充填されたマイクロタイタープレートを含む）であってよい。
いくつかの実施形態では、表面は、１つ以上の細孔を含む。いくつかの実施形態では、細孔径は、１，０００～４，０００Å（例えば、１，０００～２，０００Å、２，０００～３，０００Å、３，０００～４，０００Å、または１，０００～３，０００Å）である。
いくつかの実施形態では、表面は、１つ以上の粒子（例えば、ポリスチレンジビニルベンゼン粒子）を含む。いくつかの実施形態では、粒径は５～５００μｍ（例えば、２０～３００μｍ、３０～１００μｍ、３０～１００μｍ、３０～１００μｍ、３０～１００μｍ）である。いくつかの実施形態では、粒径は、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００μｍである。
ポリデオキシチミジンオリゴヌクレオチド
上記に述べたように、本発明の組成物は、ポリデオキシチミジンオリゴヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、ポリデオキシチミジンオリゴヌクレオチドは、５～２００個のデオキシチミジン（例えば、５～２０個、５～５０個、５～１００個、１０～３０個、１５～２５個、２０～４０個、２０～１００個、２０～２００個、１００～２００個、または１５０～２００個のデオキシチミジン）を含む。
上記に述べたように、本発明の組成物は、ポリデオキシチミジンオリゴヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、ポリデオキシチミジンオリゴヌクレオチドは、５～２００個のデオキシチミジン（例えば、５～２０個、５～５０個、５～１００個、１０～３０個、１５～２５個、２０～４０個、２０～１００個、２０～２００個、１００～２００個、または１５０～２００個のデオキシチミジン）を含む。
いくつかの実施形態では、ポリデオキシチミジンオリゴヌクレオチドの１つ以上の塩基を修飾することができる。いくつかの実施形態では、ポリデオキシチミジンオリゴヌクレオチドを修飾して、その化学的安定性、例えばｐＨ安定性または熱安定性を高めることができる。特定の実施形態では、ポリデオキシチミジンオリゴヌクレオチドは、２’－オリゴヌクレオチド修飾、５’－オリゴヌクレオチド修飾、ホスホロチオエート、ＬＮＡ、ＰＮＡ、モルホリノ、他の代替骨格、またはそれらの組み合わせもしくは誘導体を含むことができる。
適当なポリデオキシチミジンオリゴヌクレオチドとしては、天然に存在するヌクレオシド、例えばチミジン、置換デオキシヌクレオシド、またはそれらの組み合わせを挙げることができる。ヌクレオシドは、非天然ヌクレオシドでもよい。ヌクレオシド同士は、ホスホジエステル結合または修飾結合によって結合することができる。ヌクレオシド同士は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、またはメチルホスホネート結合によって結合することができる。
いくつかの実施形態では、ポリデオキシチミジンオリゴヌクレオチドは、チミジン類似体、ウリジン類似体などのピリミジン誘導体、及び／またはアデノシンとのハイブリダイゼーションの維持を助ける部分などの複素環修飾を含むことができる。
さまざまな実施形態において、ポリデオキシチミジンオリゴヌクレオチドは、５～２００個のデオキシチミジン（例えば、２０～４０個のデオキシチミジン（例えば、２０個のデオキシチミジン））を含む。
ポリデオキシチミジンオリゴヌクレオチドは、固相核酸合成法を含む、当該技術分野では周知の任意の方法によって生成することができる。
リンカー
上記に述べたように、本発明の組成物は、以下の構造を含むリンカーを含む：
（式中、ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である）。
上記に述べたように、本発明の組成物は、以下の構造を含むリンカーを含む：
（式中、ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である）。
特定の実施形態では、リンカーは、ポリデオキシチミジンオリゴヌクレオチドの５’末端に位置することができる。代替的な実施形態では、リンカーは、ポリデオキシチミジンオリゴヌクレオチドの３’末端に位置することができる。特定の実施形態では、リンカーは、ポリデオキシチミジンオリゴヌクレオチドの両末端の間に位置することができる。内部リンカーは、修飾を伴うもしくは伴わないスペーサー誘導体、または修飾を伴うもしくは伴わないヌクレオシド誘導体を含み得る。
本発明の方法
本発明の組成物は、例えば、ラージスケールまたは分取スケールでのポリＡ配列を有するＲＮＡの精製方法において使用することができる。
本発明の組成物は、例えば、ラージスケールまたは分取スケールでのポリＡ配列を有するＲＮＡの精製方法において使用することができる。
ＲＮＡの精製
精製方法は、ＲＮＡを、以下の構造を有するリンカーを介してポリスチレンジビニルベンゼン粒子を含むオリゴマーに連結されたポリスチレンジビニルベンゼン粒子を含む表面と接触させることを含む：
（式中、ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である）。
方法は、必要に応じて表面を洗浄し、表面からＲＮＡを溶出することを含む。通常、溶液の塩濃度は工程ごとに減少する。
精製方法は、ＲＮＡを、以下の構造を有するリンカーを介してポリスチレンジビニルベンゼン粒子を含むオリゴマーに連結されたポリスチレンジビニルベンゼン粒子を含む表面と接触させることを含む：
（式中、ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である）。
方法は、必要に応じて表面を洗浄し、表面からＲＮＡを溶出することを含む。通常、溶液の塩濃度は工程ごとに減少する。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、１つ以上の不純物を含む組成物中に存在する。不純物は、溶媒を除いた組成物の１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％であり得る。特定の実施形態では、１つ以上の不純物には、アクセス可能なポリＡテールを含まないＲＮＡ、ＤＮＡ、炭水化物、毒素（例えば、リポ多糖（ＬＰＳ）（例えば、エンドトキシン））、ポリペプチド、及び／またはヌクレオチドが含まれる。特定の実施形態では、ＤＮＡは、プラスミド、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）産物、または非増幅ＤＮＡ鋳型である。上記実施形態のいずれにおいても、ＤＮＡはＤＮａｓｅ処理が行われていてもいなくてもよい。この方法を用いて不純物を少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または９９．９％減少させることができる。
いくつかの実施形態では、接触工程は、４～９０℃、例えば２０～７０℃の温度で行われる。特定の実施形態では、接触させる工程は、４℃、２５℃、３５℃、４５℃、５５℃、６５℃、７０℃、７５℃、８０℃、８５℃、または９０℃で行われる。
いくつかの実施形態では、接触させる工程は、５～７０００ｃｍ／ｈ、例えば、５０～５００ｃｍ／ｈの速度で行われる。特定の態様では、接触させる工程は、再循環モードで行うことができる。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡを、ハイブリダイゼーションを促進する組成物中で表面と接触させる。そのような組成物は、水、塩、有機溶媒、賦形剤、及び／または緩衝剤を含み得る。特定の実施形態では、塩濃度は、０．１～５Ｍ、０．３～２．５Ｍ、または０．５～１Ｍである。さらなる実施形態では、塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＬｉＣｌ、硫酸アンモニウム、リン酸カリウム、または別のリオトロピック塩である。有機溶媒としては、アセトニトリル、アルコール（例えば、エタノール及びイソプロパノール）、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、及び他の極性非プロトン性溶媒が挙げられる。賦形剤としては、ＤＴＴ、界面活性剤（例えば、ＴｒｉｔｏｎＸ）、及びキレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）が挙げられる。適当なバッファーの例は本明細書に示される。
いくつかの実施形態では、方法は、ＲＮＡ結合後に表面を溶液で洗浄することをさらに含んでもよい。さまざまな実施形態において、洗浄溶液は塩を含む。特定の実施形態では、塩は、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、リチウム塩、カルシウム塩、マンガン塩、セシウム塩、アンモニウム塩、及び／またはアルキルアンモニウム塩、例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、ＭｎＣｌ２、及び／またはＬｉＣｌとすることができる。
いくつかの実施形態では、洗浄する工程は、第１の塩バッファー及び第２の塩バッファーを適用することを含み、第１の塩バッファーは第２の塩バッファーよりも高い塩濃度を有し、第１の塩バッファーは第２の塩バッファーの前に適用される。特定の実施形態では、第１の塩バッファーは、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、及び１ｍＭ ＥＤＴＡを含み、ｐＨ７．４である。有する。さまざまな実施形態において、ｐＨは４～９、例えば６～８であってよい。特定の実施形態では、第２の塩バッファーは、０．１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、及び１ｍＭ ＥＤＴＡを含み、ｐＨ７．４である。特定の実施形態では、ｐＨは４～９、例えば６～８であってよい。
いくつかの実施形態では、第１の塩バッファーは、４～９０℃、例えば２５～６５℃の温度で表面に適用される。特定の実施形態では、第１の塩バッファーは表面に２回適用され、第１の適用はより高い第１の温度、例えば６５±５℃であり、第２の適用はより低い第２の温度、例えば２５±５℃である。特定の実施形態では、第２の塩バッファーは、４～９０℃、例えば２５±５℃の温度で表面に適用される。
いくつかの実施形態では、溶出工程は、溶出バッファーを用いて行われる。溶出バッファーは、塩、有機溶媒、及び／または競合的ポリＡオリゴマーを含むことができる。適当な塩としては、グアニジンチオシアネート、グアニジニウムＨＣｌ、過塩素酸ナトリウム、過塩素酸リチウム、ヨウ化ナトリウム、及び他のカオトロピック塩が挙げられる。適当な有機溶媒としては、アセトニトリル、アルコール（例えば、エタノール及びイソプロパノール）、及び極性非プロトン性溶媒（例えば、Ｎ－メチルピロリドン、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、及びホルムアミド）が含まれる。適当な競合的ポリＡオリゴマーとしては、２’Ｆまたは２’ＯＭｅポリＡまたはポリＡ ＬＮＡが含まれる。特定の実施形態では、溶出バッファーは、塩を含まない。特定の実施形態では、溶出バッファーは、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ及び１ｍＭ ＥＤＴＡを含み、ｐＨ７．４である。いくつかの実施形態では、溶出バッファーは、低イオン強度の非緩衝塩溶液を含む。別の態様では、溶出バッファーは、低イオン強度の緩衝塩溶液を含む。いくつかの実施形態では、溶出工程は、４～９５℃、例えば２５～８０℃の温度で行われる。特定の実施形態では、溶出工程は、２５～６５℃の温度で行われる。特定の実施形態では、溶出工程は、４５～７０℃の温度で行われる。
この方法の任意の工程で使用できるバッファーの例としては、ＡＣＥＳ、酢酸塩、ＡＤＡ、ＡＭＰ（２－アミノ－２－メチル－１－プロパノール）、ＡＭＰＤ（２－アミノ－２－メチル－１，３－プロパンジオール）、ＡＭＰＳＯ、ＢＥＳ、ＢＩＣＩＮＥ、ｂｉｓ－ｔｒｉｓ、ＢＩＳ－ＴＲＩＳプロパン、ホウ酸塩、カコジル酸塩、炭酸塩、ＣＨＥＳ、クエン酸塩、ＤＩＰＳＯ、ＥＰＰＳ、ＨＥＰＰＳ、エタノールアミン、ギ酸塩、グリシン、グリシルグリシン、ＨＥＰＢＳ、ＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＰＳＯ、ヒスチジン、ヒドラジン、イミダゾール、リンゴ酸塩、ＭＥＳ、ＭＯＢＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、リン酸塩、ピペラジン、ピペリジン、ＰＩＰＥＳ、ＰＯＰＳＯ、プロピオン酸塩、ピリジン、ピロリン酸塩、コハク酸塩、ＴＡＢＳ、ＴＡＰＳ、ＴＡＰＳＯ、タウリン（ＡＥＳ）、ＴＥＳ、トリシン、トリエタノールアミン（ＴＥＡ）、及びＴｒｉｚｍａ（トリス）が挙げられる。
ポリＡ配列を有する任意のＲＮＡを、本発明の方法を使用して精製することができる。通常、ポリＡ配列は３’末端のポリＡテールであるが、本方法は、分子の５’末端または内部にあるアクセス可能なポリＡ配列にも適用することができる。ＲＮＡは、天然に産生されたものでも単離されたものでもよい。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、非増幅ＤＮＡ鋳型または化学合成法またはそれらの組み合わせを使用したインビトロ転写産物である。ＲＮＡは、糖、塩基、または骨格部分への修飾を含んでも含まなくてもよい。ＲＮＡ分子はまた、例えば、別の部分と化学的に連結させて誘導体化されてもよい。そのような改変の例は、米国特許出願第１３／７９１，９２２号に示されている。さらなる実施形態では、ＲＮＡは１００～１０，０００ヌクレオチドの長さである。さまざまな実施形態では、ＲＮＡは、５００～４，０００ヌクレオチドの長さである。特定の実施形態では、ＲＮＡは、８００～３，０００ヌクレオチドの長さである。
いくつかの実施形態では、方法は、同じ表面に、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１５回、２０回、２５回、３０回、３５回、４０回、４５回、５０回、または５０回よりも多い回数、繰り返される。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、溶出前に、例えば、２５℃、３５℃、４５℃、５５℃、６５℃、７０℃、７５℃、８０℃、８５℃、または９０℃まで加熱される。
いくつかの実施形態では、１つ以上の工程は、バッチプロセスを使用して行われる。さまざまな実施形態において、本方法の１つ以上の工程は、カラムを使用して行われる。特定の実施形態では、カラムは加熱するか、及び／またはジャケットを設けることができる。
表面合成
本明細書では、オリゴマーの表面合成及び結合の方法も開示する。方法は、第１の反応基を含む表面を提供することと、チミン及び第２の反応基を含む複数のオリゴマーと表面とを、第１の反応基と第２の反応基とが反応してオリゴマーを表面に結合させるような条件下で接触させることと、を含む。反応基の一方または両方は、オリゴマーまたは表面に結合したリンカーによって与えられる点は理解されよう。例示的な反応基は、本明細書に示される。他の実施形態では、第１の基はエポキシドであり、第２の基は第一級アミノ基であり、エポキシドの開環条件下でこれらの基を反応させて、ヒドロキシル基で置換された第二級アミンにする。
本明細書では、オリゴマーの表面合成及び結合の方法も開示する。方法は、第１の反応基を含む表面を提供することと、チミン及び第２の反応基を含む複数のオリゴマーと表面とを、第１の反応基と第２の反応基とが反応してオリゴマーを表面に結合させるような条件下で接触させることと、を含む。反応基の一方または両方は、オリゴマーまたは表面に結合したリンカーによって与えられる点は理解されよう。例示的な反応基は、本明細書に示される。他の実施形態では、第１の基はエポキシドであり、第２の基は第一級アミノ基であり、エポキシドの開環条件下でこれらの基を反応させて、ヒドロキシル基で置換された第二級アミンにする。
以下は、本明細書を実施するための具体的な実施形態の例である。これらの例はあくまで例示の目的で示されるものにすぎず、本発明の範囲をいかなる意味においても限定しようとするものではない。
実施例１－Ｐｏｒｏｓ ＥＰ４５０樹脂５’ヘキシルアミンリンカー、及び２０マーｄＴオリゴヌクレオチドを使用したコンジュゲートの合成（「コンジュゲートＥＰ４５０」）
Ｐｏｒｏｓ Ｅｐ４５０は、粒径４０μｍ、細孔径１０００Åのエポキシド官能基で活性化された多孔性架橋ポリ（スチレン－ジビニルベンゼン）樹脂である。以下の方法を用い、Ｐｏｒｏｓ ＥＰ４５０を使用して５’ヘキシルアミンリンカーである５’－ＮＨ２－（ＣＨ２）６－ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ－３’（配列番号１）を含む２０マーのポリデオキシチミジンオリゴヌクレオチド（「２０マーポリｄＴオリゴ」）を固定化した。
Ｐｏｒｏｓ Ｅｐ４５０は、粒径４０μｍ、細孔径１０００Åのエポキシド官能基で活性化された多孔性架橋ポリ（スチレン－ジビニルベンゼン）樹脂である。以下の方法を用い、Ｐｏｒｏｓ ＥＰ４５０を使用して５’ヘキシルアミンリンカーである５’－ＮＨ２－（ＣＨ２）６－ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ－３’（配列番号１）を含む２０マーのポリデオキシチミジンオリゴヌクレオチド（「２０マーポリｄＴオリゴ」）を固定化した。
ｄＴカップリング：最初に、以下の各バッファーを調製した。すなわち、カップリングバッファー（１６ｍＭ炭酸ナトリウム、ｐＨ９．５または９．７、または５５ｍＭ炭酸ナトリウム、３Ｍリン酸カリウム、ｐＨ９．９）、洗浄バッファー（０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０または７．５）、ｄＴカップリング溶液（ｄＴリガンドのＵＶ変換比を決定した後、５０ｍｇ／ｍＬのｄＴストック水溶液を調製し、ＯＤ２６０測定を行って実際のｄＴ濃度を測定し、カップリングバッファーの量を計算して製剤溶液を調製する）、ブロッキングバッファー（１Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０）、及び保存液（２０％エタノール／８０％水）。
Ｐｏｒｏｓ ＥＰ４５０樹脂を０．２Ｍ炭酸ナトリウム／重炭酸バッファーに再懸濁した。樹脂バッファーを、４．４Ｍリン酸カリウム、２４ｍＭ炭酸／重炭酸ナトリウムに交換した。次いで、樹脂を５Ｍリン酸カリウム（カップリング反応中、総量の５０％のＰＯ４）で再スラリー化し、反応容器に移した。
５０ｍＬのガラス製反応器を０．５ＭのＮａＯＨ溶液で滅菌し、プロセス水ですすいで中性ｐＨとし、風乾した。次いで、８ｍＬのＰｏｒｏｓ ＥＰ４５０樹脂溶液を５０ｍＬのガラス製反応器に加えた。混合物を２５℃、１６５ｒｐｍで４８時間振盪した。
次に、適量の配合したリガンド溶液を反応器に加えた。カップリング後、試料を濾過し、Ｎａｌｇｅｎｅ（商標）Ｒａｐｉｄ－Ｆｌｏｗ滅菌使い捨てフィルター（５×２５ｍＬ）上で０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ＝７．０）により洗浄した。濾液と洗液を回収して加え合わせ、カップリングの収率を評価するために使用した。
ブロッキング：カップリングした試料を１Ｍ Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ＝８．０、２×２５ｍＬ）で洗浄した後、５０ｍＬガラス製リアクターに２５ｍＬの１ＭＴｒｉｓバッファー（ｐＨ＝８．０）とともに加え、２５℃、１６５ｒｐｍで２４時間振盪した。
最終仕上げ：ブロッキング後、カップリングした試料を０．１Ｍ Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ７．５、２×２５ｍＬ）で洗浄した。次に、試料を２５μｍスクリーンで篩にかけ、３０％エタノール（２×２５ｍＬ）で洗浄した。カップリングした試料を２０％エタノール中、５０％のスラリー濃度に調合し、２～８℃で保存した。
以下のコンジュゲートＥＰ４５０の試料（表１）は、上記の方法を使用して合成した。
結果：表１及び図１、図２、図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃ、図４、図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃ、及び図６は、ポリｄＴオリゴ／ＥＰ４５０樹脂の比率、カップリング反応のｐＨ、及びスラリー濃度を変化させた試料のｄＴ密度、カップリング収率、及びｍＲＮＡ結合用量を示す。一般に、ポリｄＴオリゴ密度は２．４３～３．８７ｍｇ／ｍＬの範囲であり、カップリング収率は５４．５％～６８．７％の範囲であり、ｍＲＮＡ結合容量は７．４３～８．７５ｍｇ／ｍＬの範囲であった。試料１ＩのＦＴ－ＩＲスペクトルを図７に示す。
ＰｏｒｏｓＥＰ４５０コンジュゲートを合成するための好ましいプロセス条件は、表２に示すように決定された。
実施例２－Ｐｏｒｏｓ ＥＰ４５０コンジュゲートの生産スケール合成
実施例１に記載のコンジュゲートＥＰ４５０の合成を、８００ｍＬ及び１０Ｌの生産スケールで支障なく完了した（図８Ａ及び図８Ｂ）。以下の表（表３）は、生産スケールの合成の最適化された入力を示す。
実施例１に記載のコンジュゲートＥＰ４５０の合成を、８００ｍＬ及び１０Ｌの生産スケールで支障なく完了した（図８Ａ及び図８Ｂ）。以下の表（表３）は、生産スケールの合成の最適化された入力を示す。
以下の表（表４）は、Ｐｏｒｏｓ ＥＰ４５０コンジュゲートの生産スケール合成の生産スケール試行の入力パラメータを示す。
カップリング反応からの濾液及び各洗浄工程からのバッファーの２０マーポリｄＴオリゴ含有量を、Ａ２６０測定によって評価した（図９）。リガンドは、８００ｍＬスケールと１０，０００ｍＬスケールの両方で樹脂の細孔に保持される。８００ｍＬ浴の調製では、リン酸バッファーで９回洗浄することにより、未結合の２０マーポリｄＴオリゴリガンドを除去した。合計１５回のリン酸リン酸バッファー洗浄を用いて、未結合の２０マーｄＴオリゴを１０Ｌ生産スケールから確実に除去した。濾液と洗液とを合わせたリガンドを測定することによる物質収支評価を使用して、固定化リガンド密度を推定した。
以下の表（表５）は、オリゴ密度、カップリング収率、コンジュゲートの平均粒径（Ｃｏｕｌｔｅｒの平均粒径体積に５０を掛け、３７で割ることによって計算される（すなわち、約１．３５の補正係数））、及びコンジュゲートＥＰ４５０の生産スケール合成でのエンドトキシンレベルを示す。コンジュゲートＥＰ４５０の合成に使用されるカップリング反応は、５ｍｇ／ｍＬの添加量で行う。製品の一貫性が、２つの生産スケールの合成で実証された。試料２ＢのＦＴ－ＩＲスペクトルを図１０に示す。
実施例３－コンジュゲートＥＰ４５０の安定性
２０％エタノール中のコンジュゲートＥＰ４５０の安定性を加速条件下で試験した（Ｋｅｎｎｏｎ， Ｌ．， Ｕｓｅ ｏｆ ｍｏｄｅｌｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ Ｊ． ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ５：８１５－８１８ （１９６４））。加速安定性試料は、６０℃で１５．７日間保存し（２５℃で１８ヶ月の保存に相当）、６０℃で２．６日（２５℃で３ヶ月に相当）及び６０℃で１０．６日Ｃ（２５℃で１２ヶ月に相当）でサンプリングした。コントロール試料は２～８℃で保存した。すべての試料は、２０％（ｖ／ｖ）エタノール中で保存した。試料の活性を、プレートベースのＨＴアッセイを使用して測定し、４０マーｄＡオリゴヌクレオチドを使用して静的結合容量（ＳＢＣ）を得た（表６）。
２０％エタノール中のコンジュゲートＥＰ４５０の安定性を加速条件下で試験した（Ｋｅｎｎｏｎ， Ｌ．， Ｕｓｅ ｏｆ ｍｏｄｅｌｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ Ｊ． ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ５：８１５－８１８ （１９６４））。加速安定性試料は、６０℃で１５．７日間保存し（２５℃で１８ヶ月の保存に相当）、６０℃で２．６日（２５℃で３ヶ月に相当）及び６０℃で１０．６日Ｃ（２５℃で１２ヶ月に相当）でサンプリングした。コントロール試料は２～８℃で保存した。すべての試料は、２０％（ｖ／ｖ）エタノール中で保存した。試料の活性を、プレートベースのＨＴアッセイを使用して測定し、４０マーｄＡオリゴヌクレオチドを使用して静的結合容量（ＳＢＣ）を得た（表６）。
試験の結果によれば、コンジュゲートＥＰ４５０の活性は、２５℃の２０％エタノール中で１８ヶ月の保存後に約１１％低下することが予測された（図１１Ａ及び図１１Ｂ）。
実施例４－Ｐｏｒｏｓ ＥＰ４５０樹脂、５’ヘキシルアミンリンカー、及び２０マーｄＴオリゴヌクレオチドを使用したコンジュゲート （「コンジュゲートＥＰ４５０」）の合成の最適化
Ｐｏｒｏｓ Ｅｐ４５０樹脂は、粒径４５μｍ、細孔径１０００Åのエポキシド官能基で活性化された多孔性架橋ポリ（スチレン－ジビニルベンゼン）樹脂である。以下の方法を用い、Ｐｏｒｏｓ ＥＰ４５０を使用して５’ヘキシルアミンリンカーである５’－ＮＨ２－（ＣＨ２）６－ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ－３’（配列番号１）を含む２０マーのポリデオキシチミジンオリゴヌクレオチド（「ポリｄＴオリゴ」）を固定化した。
Ｐｏｒｏｓ Ｅｐ４５０樹脂は、粒径４５μｍ、細孔径１０００Åのエポキシド官能基で活性化された多孔性架橋ポリ（スチレン－ジビニルベンゼン）樹脂である。以下の方法を用い、Ｐｏｒｏｓ ＥＰ４５０を使用して５’ヘキシルアミンリンカーである５’－ＮＨ２－（ＣＨ２）６－ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ－３’（配列番号１）を含む２０マーのポリデオキシチミジンオリゴヌクレオチド（「ポリｄＴオリゴ」）を固定化した。
ｄＴカップリングの最適化：５０ｍＬのガラス製反応器を０．５Ｍ ＮａＯＨ溶液で滅菌し、プロセス水ですすいだ。次いで、４ｍＬのＥＰ４５０溶液を５０ｍＬのガラス製反応器に入れた。適量の配合したリガンド溶液を反応器に加えた。次いで、混合物を異なる温度で１６５ｒｐｍで異なる時間振盪した（表７）。
カップリング後、試料をＮａｌｇｅｎｅ（商標）Ｒａｐｉｄ－Ｆｌｏｗ滅菌使い捨てフィルター（７×１０ｍＬ）上で１５０ｍＬの０．１Ｍのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ＝７．０）で洗浄した。濾液及び洗液のＯＤ２６０測定を行ってカップリング収率を評価した。次いで、試料を１Ｍ Ｔｒｉｓブロッキングバッファー（２×２５ｍＬ）で洗浄した。次いで、樹脂を１０ｍＬの１Ｍ Ｔｒｉｓブロッキングバッファーと２５℃で１８時間混合した。次いで、試料を０．１Ｍ Ｔｒｉｓバッファー（２×１０ｍＬ）、続いて０．１Ｍリン酸バッファー（３×１０ｍＬ）、次いで２０％エタノール（３×１０ｍＬ）で洗浄した。試料を、２～８℃で２０％エタノール中で保存してさらに評価を行った。
表７のコンジュゲートＥＰ４５０の以下の各試料を、上記に述べた最適化条件を用いて合成し、各試料のイオン容量及び４０マーｄＡ結合容量を測定した（表８、図１２、図１３Ａ、図１３Ｂ、図１４、図１５Ａ、図１５Ｂ、図１６Ａ、及び図１６Ｂ）。
結果：試料８－１（３ｍｇ／ｍＬのｄＴ／樹脂添加量）は、約９０％の４０マーｄＡ結合容量を維持した。４５℃で固定化した試料８～９（４．５ｍｇ／ｍＬのｄＴ／樹脂添加量）は、約３０％高い４０マーｄＡ結合容量を有していた。
実施例５－樹脂の粒径及び細孔モードの変化
規定のカップリング条件下で、異なる粒径及び細孔モード（すなわち、サイズ）のＥＰ樹脂を合成することができる。ＥＰ樹脂Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６（表９）を、２０マーポリデオキシチミジンオリゴヌクレオチドとの下記の３つのカップリング条件（表１０）に供して、オリゴヌクレオチドｄＴカップリング及びその後のｄＡ４０マー結合容量に対する樹脂形態の影響を評価した。条件１～３（表１０）に供した各樹脂Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６のイオン容量、ｄＡ４０マー結合容量、及び平均粒径を、以下の表１１ならびに図１７及び図１８に示す。樹脂Ｒ１はＥＰ１５０のベースビーズであり、樹脂Ｒ２はＥＰ４５０のベースビーズである。条件１はＥＰ１５０を生成するために使用され、条件２はＥＰ４５０を生成するために使用される。
規定のカップリング条件下で、異なる粒径及び細孔モード（すなわち、サイズ）のＥＰ樹脂を合成することができる。ＥＰ樹脂Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６（表９）を、２０マーポリデオキシチミジンオリゴヌクレオチドとの下記の３つのカップリング条件（表１０）に供して、オリゴヌクレオチドｄＴカップリング及びその後のｄＡ４０マー結合容量に対する樹脂形態の影響を評価した。条件１～３（表１０）に供した各樹脂Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６のイオン容量、ｄＡ４０マー結合容量、及び平均粒径を、以下の表１１ならびに図１７及び図１８に示す。樹脂Ｒ１はＥＰ１５０のベースビーズであり、樹脂Ｒ２はＥＰ４５０のベースビーズである。条件１はＥＰ１５０を生成するために使用され、条件２はＥＰ４５０を生成するために使用される。
ＥＰ４５０樹脂（試料１４）は、表１０に記載される３つのカップリング条件下で、一貫したイオン容量とｄＡ４０マー結合容量の値を示した。試料１１－１及び試料１１－７は、おそらくはそれらのより大きな細孔モード及びより低い表面積のために、より低いイオン結合容量及びｄＡ４０マー結合容量の値を示した。細孔モードが１００Åである試料は、最も低いｄＡ４０マー結合容量の値を示したが、これはおそらくはより小さい細孔へのｄＡ４０マーオリゴヌクレオチドのアクセスが限定的であることによるものと考えられる。試料３及び試料９は、最も高いｄＡ結合容量の値を示した。
実施例６－異なる長さのｍＲＮＡでのサイズ排除による評価
非誘導体化樹脂：非誘導体化親水性樹脂を２ｍＬカラムに充填し、２種類のモデルｍＲＮＡ（４，０００ｎｔ及び８５０ｎｔ）を使用してサイズ排除モードで試験した。各樹脂の細孔径及び粒径を下記表１２に示す。図１９に、塩化ナトリウムの割合（％）としてのロード保持時間を示す。
非誘導体化樹脂：非誘導体化親水性樹脂を２ｍＬカラムに充填し、２種類のモデルｍＲＮＡ（４，０００ｎｔ及び８５０ｎｔ）を使用してサイズ排除モードで試験した。各樹脂の細孔径及び粒径を下記表１２に示す。図１９に、塩化ナトリウムの割合（％）としてのロード保持時間を示す。
１００μＬパルスの保持時間を塩の保持時間と比較した。細孔径が大きいほど保持時間は長くなり、ｍＲＮＡの一部が細孔内に拡散することが示唆された。
誘導体化樹脂：樹脂スラリー（５０μＬ／ウェル）を、ローディングバッファーで平衡化した９６ウェルの２ｍＬフリットプレート（Ｓｅａｈｏｒｓｅ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ、２５μｍ ＰＥフリット）に分注した。４０００ｎｔのｍＲＮＡと８５０ｎｔのｍＲＮＡを３０Ｋ Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎｓを使用して濃縮し、下記表１３に従ってローディングバッファーで１２カラムリザーバ中で調合した。
ウェル当たり２００μＬの調整されたロードをロードし、周囲温度（２２℃）で２０分間、１０００ｒｐｍに設定された振盪プラットフォームでインキュベートした。プレートを１０００ｒｐｍで２分間スピンし、フロースルーを回収した。フロースルーの濃度が遊離濃度（ＣＳ）に対応するのに対して、結合濃度（ＣＲ）はＣＲ＝２０００＊（Ｃロード－ＣＳ）／５０として計算される。プレートを、７０℃に加熱した３００μＬ／ウェルの溶出バッファーで溶出した。濾液中の平衡ｍＲＮＡ濃度ＣＳ（ｍｇ／ｍＬ）をＵＶで測定し、下記表１４Ａ（８５０ｎｔのｍＲＮＡ）及び表１４Ｂ（４０００ｎｔのｍＲＮＡ）に示す。
８５０ｎｔのｍＲＮＡ及び４０００ｎｔのｍＲＮＡの計算された結合濃度を図２０Ａ及び図２０Ｆに示す。コンジュゲート試料を用いた８５０ｎｔのｍＲＮＡと４０００ｎｔのｍＲＮＡの解離定数（Ｋｄ）及び最大結合容量（Ｑｍ）を、ラングミュアモデルフィットを用いて計算し（図２１Ａ及び図２１Ｂ）、下記表１５Ａ（８５０ｎｔ ｍＲＮＡ）及び表１５Ｂ（４０００ｎｔ ｍＲＮＡ）に示す。
樹脂試料１３（ｄＴ添加量５．０ｍｇ／ｍＬ）の吸着等温線を図２２Ａに示す。樹脂試料１３の二重逆数プロットを図２２Ｂに示す。
コンジュゲート試料１～１４について計算されたｄＴ／樹脂添加量、イオン容量、及びｄＡ４０マーオリゴヌクレオチドに対するＳＢＣ、ならびにＫｄ及びＱｍ値を要約した表を図２３に示す。
平衡バッチ結合実験から、試料１４は８５０ｎｔのｍＲＮＡで最も高い性能を示し、試料３及び試料９（５０μｍ樹脂／ビーズ粒径及び１２００Å樹脂／ビーズ細孔径）は、４０００ｎｔのｍＲＮＡで試料１４よりも優れた性能を示した。列の試験結果は、４０００ｎｔのｍＲＮＡのＤＢＣが樹脂／ビーズの細孔径と相関することを示した。
試料１、３、及び１４：８５０ｎｔのｍＲＮＡ及び４０００ｎｔのｍＲＮＡに対する試料１、試料３、及び試料１４のイオン容量、ＳＢＣ、及びＤＢＣを図２４及び下記表１６に示す。
小さい細孔の樹脂（１００～４００Å）は、ｍＲＮＡに対する容量が低い。４０マーｄＡオリゴヌクレオチドに対するサイズカットオフは１００Åであり、ｍＲＮＡに対するサイズカットオフは４００Åである。細孔モード／径が１０００～２０００Åの樹脂は、ｍＲＮＡに対してより高い容量を有する。ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）の結合を最大化するには、細孔内へのＲＮＡの拡散が必要である。
最適化されたｄＴ固定化条件（リガンド添加量３ｍｇ／ｍＬ、カップリング温度６５℃）により、コントロール樹脂と比較してｍＲＮＡ結合容量が低い樹脂が得られる。８５０ｎｔのｍＲＮＡの動的結合容量（ＤＢＣ）はイオン容量と相関しているが、４０００ｎｔのｍＲＮＡのＤＢＣは細孔径と相関している。
より大きな細孔モード／径の樹脂は、広範囲のｍＲＮＡの精製に有用である。２０００Å及び１２００Åの細孔を有する樹脂ＯＨ１５０及びＯＨ５５０ではリガンド添加量が低くても、ｍＲＮＡの容量は損なわれないと考えられる。
実施例７－エポキシ密度レベル、カップリング速度論、カップリング温度
手順：Ｐｏｒｏｓ ＯＨ１５０ビーズ／樹脂を５つのレベルの塩基含有量（ＮａＯＨ濃度）でエポキシ官能化してＥＰ１５０樹脂を生成した。０．８３％ＮａＯＨ（重量％）の濃度では、エポキシレベルは最も高くなる（約５０μｍｏｌ／ｍＬ）。塩基含有量を減らすと、エポキシ密度は低下する。より高いＮａＯＨ濃度は、競合する副反応としてエポキシの加水分解を促進し、機能レベルの低下につながる。１．５％以下の塩基濃度は、反応混合物中のｂ－エポキシ分子間の架橋を誘発し、エポキシ官能化の不良を引き起こす（図２５）。
手順：Ｐｏｒｏｓ ＯＨ１５０ビーズ／樹脂を５つのレベルの塩基含有量（ＮａＯＨ濃度）でエポキシ官能化してＥＰ１５０樹脂を生成した。０．８３％ＮａＯＨ（重量％）の濃度では、エポキシレベルは最も高くなる（約５０μｍｏｌ／ｍＬ）。塩基含有量を減らすと、エポキシ密度は低下する。より高いＮａＯＨ濃度は、競合する副反応としてエポキシの加水分解を促進し、機能レベルの低下につながる。１．５％以下の塩基濃度は、反応混合物中のｂ－エポキシ分子間の架橋を誘発し、エポキシ官能化の不良を引き起こす（図２５）。
カップリング及び樹脂性能に対するエポキシ官能基の効果を調べるために、３４～５１μｍｏｌ／ｍＬの範囲の４つのレベルのエポキシ密度を有するＥＰ１５０樹脂を調製した（図２５）。４種類の樹脂をｄＴリガンドと結合させ、イオン容量試験及び４０マーｄＡ ＨＴＰアッセイで評価した。
結果：ＥＰ１５０／ｄＴ樹脂のプロセスを、ビーズ表面のエポキシ密度、カップリング速度論、カップリングｄＴリガンド添加量及び温度、ならびにブロッキング時間の影響を調べることによって試験した。ビーズ表面のエポキシ密度のプロセス許容範囲は、４０～５２μｍｏｌ／ｍＬと特定された。このエポキシ範囲は、ＥＰ１５０ビーズの調製時に塩基含有量を０．６％～１．０％に制御することによって実現することができる。２４±２時間のカップリング時間、６５±２℃のカップリング温度、３±０．２ｍｇ／ｍＬのｄＴ／ビーズ添加量、及び１８±３時間のブロッキング時間が、ＥＰ１５０／ｄＴ樹脂を調製するためのプロセス許容範囲のウィンドウとして決定された。
エポキシ密度レベル：エポキシ密度が５１～４０μｍｏｌ／ｍＬに減少しても、イオン容量及び４０マーｄＡ結合容量の値はいずれも同じレベルに維持される（図２６）。エポキシ密度を３４μｍｏｌ／ｍＬに下げると、イオン容量と４０マーｄＡ結合容量の値はいずれも約１０％低下する（図２６）。約０．５％のエポキシ官能基がｄＴリガンドカップリングに使用される（結合したｄＴリガンド密度は０．３μｍｏｌ／ｍＬ未満である）。４０μｍｏｌ／ｍＬよりも高いエポキシレベルは、塩基含有量を０．６％～１．０％に調整することで得られるが、４０μｍｏｌ／ｍＬよりも高いこのようなエポキシレベルは、カップリングプロセスと樹脂の性能に大きく影響しない。
カップリング速度論：ＥＰ１５０／ｄＴ２０樹脂の調製に２４±２時間のカップリング時間を使用した。ＥＰ１５０ビーズ表面でのｄＴカップリング速度論を、カップリング反応開始から９時間、１８時間、２１時間、２４時間、及び２７時間後に試料を評価することによって調べた（図２７）。カップリング反応の最初の１８時間以内に、イオン容量及び４０マーｄＡ結合容量が大幅に増加した。どちらの値も１８～２７時間でプラトーに達した。樹脂性能への影響はみられなかった。
カップリング温度：ＥＰ１５０／ｄＴ２０樹脂の調製に６５±３℃のカップリング温度を使用した。試料を収集し、６１℃、６５℃、及び６９℃で評価した（図２８）。
ｄＴリガンド添加量：３±０．２ｍｇ／ｍＬのｄＴリガンド／ビーズ添加量をＥＰ１５０／ｄＴ２０樹脂の調製に使用した。試料を収集し、２．７ｍｇ／ｍＬ、３．０ｍｇ／ｍＬ、及び３．３ｍｇ／ｍＬで評価した（図２９）。
ブロッキング時間：ＥＰ１５０／ｄＴ２０樹脂の調製に１８±３時間のブロッキング時間を使用した。試料を収集し、１５時間、１８時間、及び２１時間で評価した（図３０）。
実施例８－コンジュゲートＥＰ１５０（コンジュゲート１）及びコンジュゲートＥＰ４５０（コンジュゲート２）の安定性評価
手順：２０％エタノール中のコンジュゲートＥＰ１５０及びコンジュゲートＥＰ４５０の安定性を加速条件下で試験した（Ｋｅｎｎｏｎ， Ｌ．， Ｕｓｅ ｏｆ ｍｏｄｅｌｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ Ｊ． ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ５：８１５－８１８（１９６４））。加速安定性試料を６０℃で保存し、コントロール試料を２～８℃で保存した（表１７）。
手順：２０％エタノール中のコンジュゲートＥＰ１５０及びコンジュゲートＥＰ４５０の安定性を加速条件下で試験した（Ｋｅｎｎｏｎ， Ｌ．， Ｕｓｅ ｏｆ ｍｏｄｅｌｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ Ｊ． ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ５：８１５－８１８（１９６４））。加速安定性試料を６０℃で保存し、コントロール試料を２～８℃で保存した（表１７）。
各試料を、ＨＴＰアッセイによる４０マーｄＡオリゴヌクレオチド結合容量及びイオン容量試験により評価した。水及び０．１Ｍ ＮａＣｌ溶液で十分に洗浄し、浸出したｄＴオリゴヌクレオチドリガンドをすべて除去した。
結果：イオン容量試験及びｄＡ４０マー結合容量アッセイは、複数ロットでの同じプロトタイプで同じ傾向を示し、データが信頼できることを示唆している。ｄＡ４０マー結合容量アッセイの結果は、コンジュゲート１を５℃で４５ヶ月間保存して最初の活性の９０％を維持できることを示唆しており、コンジュゲート１のプロトタイプの高い安定性を示している。コンジュゲート２（新しいＥＰ４５０／ｄＴ）は、１０Ｌの製造バッチからのコンジュゲート２と極めて類似した安定性を有している。
ベースビーズの種類は安定性に影響する。評価した保存期間中、イオン容量の減少は、３つの樹脂すべてでｄＡ結合容量よりも遅くなっている。これは、結合したｄＴリガンドは樹脂表面に残るものの、長期の保存後には最初の活性がある程度失われ得ることを示している。したがって、Ｐｏｒｏｓ Ｏｌｉｇｏ ｄＴ樹脂のより効果的な保存溶液をさらに調べて定義することは有用と考えられる。
４０マーｄＡのＳＢＣ：結合容量を、各コントロール試料に基づいて正規化し、より適切な比較のためにパーセンテージ値として示す。これらのデータをプロットして、５℃及び２５℃の２つの保存条件での安定性を予測した（表１８Ａ、図３１Ａ、及び図３１Ｂ）。
イオン容量：イオン容量を、各コントロール試料に基づいて正規化し、より適切な比較のためにパーセンテージ値として示す。これらのデータをプロットして、５℃及び２５℃の２つの保存条件での安定性を予測した（表１８Ｂ、図３２Ａ、及び図３２Ｂ）。
実施例９－大きな細孔のポリスチレンジビニルベンゼンベースビーズ
手順：細孔モードが３０００Å、４０００Å、５０００Åのポリスチレンジビニルベンゼンベースのビーズを合成した。３つのポリスチレン－ｃｏ－ジビニルベンゼンプロトタイプのそれぞれの試料を、親水性コーティング（ＯＨポリマー）でコーティングした。ＯＨコーティングＲ１５０の標準的な手順と、添加されるＯＨポリマーの質量を２０％削減して表面のコーティングを薄くするための改変手順の両方に従う。すべての試料は、２５μｍ未満の微粒子を除去するように粒径を調整し、２０％エタノール／水（各約６０ｍＬ）中の約５０％スラリーとして保存した。
手順：細孔モードが３０００Å、４０００Å、５０００Åのポリスチレンジビニルベンゼンベースのビーズを合成した。３つのポリスチレン－ｃｏ－ジビニルベンゼンプロトタイプのそれぞれの試料を、親水性コーティング（ＯＨポリマー）でコーティングした。ＯＨコーティングＲ１５０の標準的な手順と、添加されるＯＨポリマーの質量を２０％削減して表面のコーティングを薄くするための改変手順の両方に従う。すべての試料は、２５μｍ未満の微粒子を除去するように粒径を調整し、２０％エタノール／水（各約６０ｍＬ）中の約５０％スラリーとして保存した。
ビーズ（多孔度６３．１重量％、架橋剤６６２．６重量％）を、ポリスチレンとジビニルベンゼンの従来の懸濁重合を用いて調製した（図３３Ａ、図３３Ｂ、及び図３３Ｃ）。
結果：ベースビーズの細孔径をＰｒｏｓｉｍｅｔｅｒｙを使用して測定し、結果を細孔モードで表した（表１９及び図３４）。細孔モードが増加するにつれて細孔径分布が広がり、細孔モードの範囲は＞２０００Åとなる。ベースビーズの粒径は、コールター法により測定した。３つの試料すべての平均粒径は約５０μｍであった。すべての試料は、２５μｍ未満の微粒子を除去するように粒径調整されている（表１９）。
他の実施形態
以上、本発明をその具体的な実施形態に関連して説明したが、本発明はさらなる変更が可能であり、本出願は、本発明の原理に一般的に従い、本発明が関連する当該技術分野における周知のまたは従来の慣例に含まれる、上記に記載した基本的な特徴に適用されうる、請求項の範囲に示される本発明からの逸脱を含む本発明のあらゆる変形例、用途、または適応例を包含することを意図したものである点は理解されよう。他の実施形態は、請求項の範囲内に包含される。
以上、本発明をその具体的な実施形態に関連して説明したが、本発明はさらなる変更が可能であり、本出願は、本発明の原理に一般的に従い、本発明が関連する当該技術分野における周知のまたは従来の慣例に含まれる、上記に記載した基本的な特徴に適用されうる、請求項の範囲に示される本発明からの逸脱を含む本発明のあらゆる変形例、用途、または適応例を包含することを意図したものである点は理解されよう。他の実施形態は、請求項の範囲内に包含される。
Claims (104)
- 式Ｉの構造：
Ａ－Ｌ－Ｂ
式Ｉ
を含む複数のコンジュゲートを含む組成物であって、
式中、
Ａは、ポリスチレンジビニルベンゼン（ＰＳＤＶＢ）粒子を含む表面であり、
Ｌは、以下の構造：
を含むリンカーであり、
ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
Ｂは、ポリデオキシチミジンオリゴヌクレオチドを含むオリゴマーであり、
前記複数のコンジュゲートが、
（ｉ）約３０～約６０μｍｏｌ／ｍＬのエポキシド密度、
（ｉｉ）約０．１～約０．５μｍｏｌ／ｍＬのポリデオキシチミジンオリゴヌクレオチド密度、
（ｉｉｉ）約５ｍｇ／ｍＬ未満のｄＴ／樹脂添加量、
（ｉｖ）約５μｍｏｌ／ｍＬ超のイオン容量、及び／または
（ｖ）約１．５μｍｏｌ／ｍＬ超の動的結合容量
を有する、組成物。 - 前記複数のコンジュゲートが、３０～６０μｍｏｌ／ｍＬのエポキシド密度を有する、請求項１に記載の組成物。
- 前記複数のコンジュゲートが、４０～６０μｍｏｌ／ｍＬのエポキシド密度を有する、請求項２に記載の組成物。
- 前記複数のコンジュゲートが、０．１～０．５μｍｏｌ／ｍＬのポリデオキシチミジンオリゴヌクレオチド密度を有する、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記複数のコンジュゲートが、約０．３μｍｏｌ／ｍＬのポリデオキシチミジンオリゴヌクレオチド密度を有する、請求項４に記載の組成物。
- 前記複数のコンジュゲートが、５ｍｇ／ｍＬ未満のｄＴ／樹脂添加量を有する、請求項１～５のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記複数のコンジュゲートが、約３ｍｇ／ｍＬのｄＴ／樹脂添加量を有する、請求項６に記載の組成物。
- 前記複数のコンジュゲートが、５μｍｏｌ／ｍＬ超のイオン容量を有する、請求項１～７のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記複数のコンジュゲートが、５～１０μｍｏｌ／ｍＬのイオン容量を有する、請求項１～７のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記複数のコンジュゲートが、１．５μｍｏｌ／ｍＬ超の動的結合容量を有する、請求項１～９のいずれか１項に記載の組成物。
- 式Ｉの構造：
Ａ－Ｌ－Ｂ
式Ｉ
を含む複数のコンジュゲートを含む組成物であって、
式中、
Ａは、ポリスチレンジビニルベンゼン粒子を含む表面であり、
Ｌは、以下の構造：
を含むリンカーであり、
ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
Ｂは、ポリデオキシチミジンオリゴヌクレオチドを含むオリゴマーである、組成物。 - ｍが、２、３、４、５、または６である、請求項１～１１のいずれか１項に記載の組成物。
- Ｌが、以下の構造：
を含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の組成物。 - 前記ポリデオキシチミジンオリゴヌクレオチドが、５～２００個のデオキシチミジンを含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記ポリデオキシチミジンオリゴヌクレオチドが、２０～４０個のデオキシチミジンを含む、請求項１４に記載の組成物。
- 前記ポリデオキシチミジンオリゴヌクレオチドが、２０個のデオキシチミジンを含む、請求項１５に記載の組成物。
- 前記ポリスチレンジビニルベンゼン粒子が、エポキシド官能化ポリスチレンジビニルベンゼン粒子である、請求項１～１６のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記複数のコンジュゲートが、３０～６０μｍｏｌ／ｍＬのエポキシド密度を有する、請求項１１～１７のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記複数のコンジュゲートが、４０～６０μｍｏｌ／ｍＬのエポキシド密度を有する、請求項１８に記載の組成物。
- 前記複数のコンジュゲートが、０．１～０．５μｍｏｌ／ｍＬのポリデオキシチミジンオリゴヌクレオチド密度を有する、請求項１１～１９のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記複数のコンジュゲートが、約０．３μｍｏｌ／ｍＬのポリデオキシチミジンオリゴヌクレオチド密度を有する、請求項２０に記載の組成物。
- 前記複数のコンジュゲートが、４０～６０μｍの平均粒径を有する、請求項１～２１のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記複数のコンジュゲートが、約５０μｍの平均粒径を有する、請求項２２に記載の組成物。
- 前記複数のコンジュゲートの１０％未満が、２０μｍ未満の粒径を有する、請求項１～２３のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記複数のコンジュゲートが、１０００Å超の平均細孔径を有する、請求項１～２４のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記複数のコンジュゲートが、１０００～４０００μｍの平均細孔径を有する、請求項１～２４のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記複数のコンジュゲートが、約２０００Åの平均細孔径を有する、請求項２６に記載の組成物。
- 前記複数のコンジュゲートが、５ｍｇ／ｍＬ未満のｄＴ／樹脂添加量を有する、請求項１１～２７のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記複数のコンジュゲートが、約３ｍｇ／ｍＬのｄＴ／樹脂添加量を有する、請求項２８に記載の組成物。
- 前記複数のコンジュゲートが、５μｍｏｌ／ｍＬ超のイオン容量を有する、請求項１１～２９のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記複数のコンジュゲートが、５～１０μｍｏｌ／ｍＬのイオン容量を有する、請求項１１～２９のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記複数のコンジュゲートが、１．５μｍｏｌ／ｍＬ超の動的結合容量を有する、請求項１１～３２のいずれか１項に記載の組成物。
- ポリアデノシンテールを含むリボ核酸（ＲＮＡ）転写物を精製する方法であって、
（ａ）前記ＲＮＡ転写物を含む第１の試料を取得することであって、前記第１の試料が少なくとも５％の不純物を含む、前記取得することと、
（ｂ）前記ＲＮＡ転写物が前記組成物中のコンジュゲートに結合するような条件下で、前記第１の試料を請求項１～３２のいずれか１項に記載の組成物と接触させることと、
（ｃ）前記組成物から前記ＲＮＡ転写物を溶出することと、
（ｄ）第２の試料中の前記ＲＮＡ転写物を回収することと、を含み、前記第２の試料が５％未満の不純物を含む、前記方法。 - 工程（ｂ）の後に溶液を用いて表面を有する前記組成物を洗浄することをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
- 工程（ｂ）の前に、前記第１の試料を予熱することをさらに含む、請求項３３または３４に記載の方法。
- 前記第１の試料がデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含み、前記第１の試料はＤＮａｓｅ処理に供されていない、請求項３３～３５のいずれか１項に記載の方法。
- 前記１つ以上の不純物が、ポリアデノシンテールを含まないＲＮＡ、ＤＮＡ、炭水化物、毒素、ポリペプチド、及び／またはヌクレオチドを含む、請求項３３～３６のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ＤＮＡが、プラスミドＤＮＡである、請求項３６または３７に記載の方法。
- 前記ＤＮＡが、ポリメラーゼ連鎖反応産物ＤＮＡである、請求項３６～３８のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ＤＮＡが、非増幅ＤＮＡ鋳型を含む、請求項３６～３９のいずれか１項に記載の方法。
- 前記毒素が、リポ多糖である、請求項３７に記載の方法。
- 前記リポ多糖が、エンドトキシンである、請求項４１に記載の方法。
- 前記接触させる工程が、約６５℃の温度で行われる、請求項３３～４２のいずれか１項に記載の方法。
- 前記接触させる工程が、１００ｃｍ／ｈの速度で行われる、請求項３３～４３のいずれか１項に記載の方法。
- 前記第１の試料が、塩溶液を含む、請求項３３～４４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記塩溶液が、塩化ナトリウム溶液である、請求項４５に記載の方法。
- 前記洗浄する工程が、塩を含む１つ以上の溶液を適用することを含む、請求項３４～４６のいずれか１項に記載の方法。
- 前記塩が、塩化ナトリウムまたは塩化カリウムである、請求項４７に記載の方法。
- 前記溶出工程が、溶出バッファーを用いて行われる、請求項３３～４８のいずれか１項に記載の方法。
- 前記溶出バッファーが、塩を含まない、請求項４９に記載の方法。
- 前記溶出工程が、約６５℃の温度で行われる、請求項３３～５０のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ＲＮＡ転写物が、非増幅ＤＮＡ鋳型を使用したインビトロ転写の産物である、請求項３３～５１のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ＲＮＡ転写物が、少なくとも１０００ヌクレオチドの長さである、請求項３３～５２のいずれか１項に記載の方法。
- 式Ｉの構造：
Ａ－Ｌ－Ｂ
式Ｉ
を含む複数のコンジュゲートを含む組成物であって、
式中、
Ａは、ポリスチレンジビニルベンゼン粒子を含む表面であり、
Ｌは、以下の構造：
を含むリンカーであり、
ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
Ｂは、ポリデオキシチミジンオリゴヌクレオチドを含むオリゴマーであり、
前記複数のコンジュゲートが、４０～６０μｍの平均粒径を有する、組成物。 - 前記複数のコンジュゲートが、約５０μｍの平均粒径を有する、請求項５４に記載の組成物。
- 前記複数のコンジュゲートの１０％未満が、２０μｍ未満の粒径を有する、請求項５４または５５に記載の組成物。
- 式ＩＶの構造：
Ａ－Ｌ－Ｂ
式Ｉ
を含む複数のコンジュゲートを含む組成物であって、
式中、
Ａは、ポリスチレンジビニルベンゼン粒子を含む表面であり、
Ｌは、以下の構造：
を含むリンカーであり、
ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
Ｂは、ポリデオキシチミジンオリゴヌクレオチドを含むオリゴマーであり、
前記複数のコンジュゲートが、１０００Å超の平均細孔径を有する、組成物。 - 前記複数のコンジュゲートが、１０００～４０００Åの平均細孔径を有する、請求項５７に記載の組成物。
- 前記複数のコンジュゲートが、約２０００Åの平均細孔径を有する、請求項５８に記載の組成物。
- 式Ｉの構造：
Ａ－Ｌ－Ｂ
式Ｉ
を含む複数のコンジュゲートを含む組成物であって、
式中、
Ａは、ポリスチレンジビニルベンゼン粒子を含む表面であり、
Ｌは、以下の構造：
を含むリンカーであり、
ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
Ｂは、ポリデオキシチミジンオリゴヌクレオチドを含むオリゴマーであり、
前記複数のコンジュゲートが、５μｍｏｌ／ｍＬ超のイオン容量を有する、組成物。 - 前記複数のコンジュゲートが、５～１０μｍｏｌ／ｍＬのイオン容量を有する、請求項６０に記載の組成物。
- 式Ｉの構造：
Ａ－Ｌ－Ｂ
式Ｉ
を含む複数のコンジュゲートを含む組成物であって、
式中、
Ａは、ポリスチレンジビニルベンゼン粒子を含む表面であり、
Ｌは、以下の構造：
を含むリンカーであり、
ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
Ｂは、ポリデオキシチミジンオリゴヌクレオチドを含むオリゴマーである、組成物。 - ｍが、２、３、４、５、または６である、請求項５４～６２のいずれか１項に記載の組成物。
- Ｌが、以下の構造：
を含む、請求項５４～６３のいずれか１項に記載の組成物。 - 前記ポリデオキシチミジンオリゴヌクレオチドが、５～２００個のデオキシチミジンを含む、請求項５４～６４のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記ポリデオキシチミジンオリゴヌクレオチドが、２０～４０個のデオキシチミジンを含む、請求項６５に記載の組成物。
- 前記ポリデオキシチミジンオリゴヌクレオチドが、２０個のデオキシチミジンを含む、請求項６６に記載の組成物。
- 前記ポリスチレンジビニルベンゼン粒子が、エポキシド官能化ポリスチレンジビニルベンゼン粒子である、請求項５４～６７のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記複数のコンジュゲートが、３０～６０μｍｏｌ／ｍＬのエポキシド密度を有する、請求項６８に記載の組成物。
- 前記複数のコンジュゲートが、４０～６０μｍｏｌ／ｍＬのエポキシド密度を有する、請求項６９に記載の組成物。
- 前記複数のコンジュゲートが、０．１～０．５μｍｏｌ／ｍＬのポリデオキシチミジンオリゴヌクレオチド密度を有する、請求項５４～７０のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記複数のコンジュゲートが、約０．３μｍｏｌ／ｍＬのポリデオキシチミジンオリゴヌクレオチド密度を有する、請求項７１に記載の組成物。
- 前記複数のコンジュゲートが、４０～６０μｍの平均粒径を有する、請求項６２～７２のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記複数のコンジュゲートが、約５０μｍの平均粒径を有する、請求項７３に記載の組成物。
- 前記複数のコンジュゲートの１０％未満が、２０μｍ未満の粒径を有する、請求項６２～７４のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記複数のコンジュゲートが、１０００Å超の平均細孔径を有する、請求項６２～７５のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記複数のコンジュゲートが、１０００～４０００μｍの平均細孔径を有する、請求項６２～７５のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記複数のコンジュゲートが、約２０００Åの平均細孔径を有する、請求項７７に記載の組成物。
- 前記複数のコンジュゲートが、５ｍｇ／ｍＬ未満のｄＴ／樹脂添加量を有する、請求項５４～７８のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記複数のコンジュゲートが、約３ｍｇ／ｍＬのｄＴ／樹脂添加量を有する、請求項７９に記載の組成物。
- 前記複数のコンジュゲートが、５μｍｏｌ／ｍＬ超のイオン容量を有する、請求項６２～８０のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記複数のコンジュゲートが、５～１０μｍｏｌ／ｍＬのイオン容量を有する、請求項８１に記載の組成物。
- 前記複数のコンジュゲートが、１．５μｍｏｌ／ｍＬ超の動的結合容量を有する、請求項５４～８２のいずれか１項に記載の組成物。
- ポリアデノシンテールを含むリボ核酸（ＲＮＡ）転写物を精製する方法であって、
（ａ）前記ＲＮＡ転写物を含む第１の試料を取得することであって、前記第１の試料が少なくとも５％の不純物を含む、前記取得することと、
（ｂ）前記ＲＮＡ転写物が前記組成物中のコンジュゲートに結合するような条件下で、前記第１の試料を請求項５４～８３のいずれか１項に記載の組成物と接触させることと、
（ｃ）前記組成物から前記ＲＮＡ転写物を溶出することと、
（ｄ）第２の試料中の前記ＲＮＡ転写物を回収することと、を含み、前記第２の試料が５％未満の不純物を含む、前記方法。 - 工程（ｂ）の後に溶液を用いて表面を有する前記組成物を洗浄することをさらに含む、請求項８４に記載の方法。
- 工程（ｂ）の前に、前記第１の試料を予熱することをさらに含む、請求項８４または８５に記載の方法。
- 前記第１の試料がデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含み、前記第１の試料はＤＮａｓｅ処理に供されていない、請求項８４～８６のいずれか１項に記載の方法。
- 前記１つ以上の不純物が、ポリアデノシンテールを含まないＲＮＡ、ＤＮＡ、炭水化物、毒素、ポリペプチド、及び／またはヌクレオチドを含む、請求項８４～８７のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ＤＮＡが、プラスミドＤＮＡである、請求項８７または８８に記載の方法。
- 前記ＤＮＡが、ポリメラーゼ連鎖反応産物ＤＮＡである、請求項８７～８９のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ＤＮＡが、非増幅ＤＮＡ鋳型を含む、請求項８７～９０のいずれか１項に記載の方法。
- 前記毒素が、リポ多糖である、請求項８８に記載の方法。
- 前記リポ多糖が、エンドトキシンである、請求項９２に記載の方法。
- 前記接触させる工程が、約６５℃の温度で行われる、請求項８４～９３のいずれか１項に記載の方法。
- 前記接触させる工程が、１００ｃｍ／ｈの速度で行われる、請求項８４～９４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記第１の試料が、塩溶液を含む、請求項８４～９５のいずれか１項に記載の方法。
- 前記塩溶液が、塩化ナトリウム溶液である、請求項９６に記載の方法。
- 前記洗浄する工程が、塩を含む１つ以上の溶液を適用することを含む、請求項８５～９７のいずれか１項に記載の方法。
- 前記塩が、塩化ナトリウムまたは塩化カリウムである、請求項９８に記載の方法。
- 前記溶出工程が、溶出バッファーを用いて行われる、請求項８４～９９のいずれか１項に記載の方法。
- 前記溶出バッファーが、塩を含まない、請求項１００に記載の方法。
- 前記溶出工程が、約６５℃の温度で行われる、請求項８４～１０１のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ＲＮＡ転写物が、非増幅ＤＮＡ鋳型を使用したインビトロ転写の産物である、請求項８４～１０２のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ＲＮＡ転写物が、少なくとも１０００ヌクレオチドの長さである、請求項８４～１０３のいずれか１項に記載の方法。
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