JP2023549476A - ウイルスタンパク質配列由来のがん薬物を標的とする転写活性複合体 - Google Patents

Abstract

本発明は、ＭＹＣ依存性がん細胞などの細胞においてＭＹＣ活性を阻害することによって、不適切な若しくは過剰な細胞増殖が関与する疾患を治療するための組成物及び方法、又は炎症状態若しくは自己免疫疾患を治療するための組成物及び方法を提供する。

Description

関連出願
本出願は、２０２０年１０月２１日に出願された米国仮特許出願第６３／０９４，７６６号、２０２１年２月２４日に出願された米国仮特許出願第６３／１５２，９５９号、及び２０２１年７月１６日に出願された米国仮特許出願第６３／２２２，６９７号の優先権を主張するものである、上記の各々の内容は、その全体が全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。

連邦政府による資金提供を受けた研究開発の下でなされた発明に対する権利に関する声明
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与された、助成金番号ＣＡ２３２８４５及びＣＡ２２５２６６の下で政府の支援を受けてなされた。米国政府は本発明に関して一定の権利を有する。

ウイルスは、感染した宿主細胞の外側で複製するために必要な酵素をコードしていないので、自身の複製のために宿主細胞機構を乗っ取る。したがって、ウイルスは、細胞アポトーシス、細胞周期進行、及び宿主免疫応答を含む、細胞機能を制御する分子ウィザードである。ウイルス複製細胞では、宿主転写装置がウイルス遺伝子を転写するように転用されるので、宿主細胞遺伝子発現は頻繁に遮断される。どのウイルスタンパク質が特定の宿主細胞機能の制御に関与するかを研究することによって、重要なウイルス－宿主タンパク質間相互作用の表面におけるウイルスタンパク質配列に基づいて、ユニークなペプチド薬物を産生することができる。そのようなペプチド及びそのバリアントは、タンパク質機能を阻害するためのドミナントネガティブとして使用することができる。

細胞ｃ－Ｍｙｃタンパク質（ＭＹＣ）は極めて重要な転写因子である。ＭＹＣは、原発性滲出液リンパ腫（ＰＥＬ）及び多発性骨髄腫を含む全てのがんの最大７５％で過剰発現される。がんの発生及び細胞増殖における十分に確立された機能にもかかわらず、ＭＹＣは、多大な努力にもかかわらず、このタンパク質が今日まで薬理学的に治療適応（actionable）となり得なかったという事実を参照して、「創薬が困難（undruggable）」な標的であると考えられている。臨床的に意味のある方法でＭＹＣを標的化することができない理由としては、巨大タンパク質－タンパク質間又はタンパク質－ＤＮＡ間の相互作用界面、及び一般に転写因子の構造化されていない性質が挙げられる。その結果、ＭＹＣの機能を調節する分子を構築することは、がん研究の重要な課題の１つである（１）。ＭＹＣ機能を調節することができ、したがってがん細胞増殖を阻害する、又はＭＹＣ依存性（MYC-addicted）がん細胞を死滅させることさえできる、可能性のある薬物（群）の発見は、科学的及び臨床的に重大な影響を及ぼすはずである。

現在、代謝疾患、腫瘍学、及び心血管疾患の分野において、およそ７０種類の承認されたペプチド及び１５０種類を超える追加的なペプチドが活発に開発されている（２）。これらのうちいくつかは、ＭＹＣを標的としている調査中のペプチド薬物である。ＭＹＣ標的化ペプチド薬物のうちの１つの候補は、Ｐｅｐｔｏｍｙｃ製のＯｍｏＭｙｃ（３）であり、これは現在、第Ｉ／ＩＩ相臨床試験中である。ＯｍｏＭｙｃは、ロイシンジッパー領域に４つの点突然変異（Ｅ６３Ｔ、Ｅ７０Ｉ、Ｒ７７Ｑ、Ｒ７８Ｎ）を組み込むことによってＭＹＣのｂＨＬＨ－Ｚｉｐドメインを模倣し、したがって、ドミナントネガティブ様式で作用し、特定の標的遺伝子の転写活性化を阻害する。これはペプチド薬物として請求されているが、ＯｍｏＭｙｃは比較的大きく、９２アミノ酸からなる。サイズのために、ＯｍｏＭｙｃはそれ自体で、所望の細胞区画に対する生理学的障壁を越える送達が不十分であり、したがって、ＯｍｏＭｙｃの治療的使用は、インビボでの腫瘍細胞透過の欠如によって損なわれてきた。

したがって、細胞、特にがん細胞、並びにＢ細胞及びＴ細胞などのリンパ球系細胞の増殖又は活性化を調節するためにＭＹＣを標的とするための、新規で安全かつ効果的な治療が必要とされている。本開示はこの必要性に対処し、他の利点も提供する。

第１の態様では、本発明は、ＭＹＣ阻害ペプチド及び１又は複数の異種アミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。ＭＹＣ阻害ペプチドは、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含み、約１００アミノ酸長以下であり、細胞、特にがん細胞におけるＭＹＣ活性を阻害する。例として、ＭＹＣ阻害ペプチドは、約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、８０、又は９０アミノ酸もないものであってもよい。さらに、ＭＹＣ阻害ペプチドは、ＮＣｏＡ２タンパク質に結合する能力、及び／又はＳＷＩ／ＳＮＦ複合体に結合する能力に基づいて同定及びスクリーニングすることができる。いくつかの実施形態では、ＭＹＣ阻害ペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列及び追加的ペプチド、好ましくはＴＡＴ配列などの異種ペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＭＹＣ阻害ペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる。いくつかの場合、本発明のポリペプチドは、ＭＹＣ阻害ペプチド又は異種ペプチド（群）に位置し得る、１又は複数のＤ－アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、異種ペプチドは、抗体又はその抗原結合断片、例えば、目的の特定の細胞型（例えば、がん細胞）上に天然に存在する細胞表面抗原などの抗原を特異的に認識することができる、抗体又はその抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、抗体は、単鎖抗体であり、及び／又はヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗体によって認識される抗原は、ＭＹＣ依存性腫瘍細胞の表面に位置するものなどの細胞表面抗原である。いくつかの実施形態では、ＭＹＣ阻害ペプチド及び抗体又は断片は、場合によっては１又は複数のプロテアーゼ切断部位を含む、ペプチドリンカーによって接続されている。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、Ｎ末端に核局在化シグナル及び／又はシグナルペプチドをさらに含む。

いくつかの実施形態では、ＭＹＣ阻害ペプチドは、細胞、特にがん細胞におけるＭＹＣ活性を阻害する活性としての１３アミノ酸のペプチドである。ペプチドは配列番号４の保存配列に示されているアミノ酸配列を含む。例えば、例示的なＭＹＣ阻害ペプチドの配列番号１は、以下の可能性、すなわち、（ａ）１３個のアミノ酸のうちの少なくとも１つが、Ｄ－アミノ酸である；（ｂ）ペプチドのアミノ酸配列が、置換、付加、及び／又は欠失などの可能な改変を有し、３番目又は１３番目で配列番号１とは異なる；又は（ｃ）ペプチドが、ペプチド内の１又は複数のアミノ酸に結合した異種部分と複合体化している、のうちの少なくとも１つ、場合により２つ以上に従って改変され得る。

いくつかの実施形態では、ペプチドは、配列番号１の１２番目及び／又は１３番目にＤ－アミノ酸（群）を有する。いくつかの実施形態では、異種部分は、ＴＡＴペプチドである。例えば、ＴＡＴペプチド及びＭＹＣ阻害ペプチドは、同じポリペプチド鎖内に、例えば融合タンパク質の形態で存在する。例示的なＴＡＴペプチドは、配列番号２又は配列番号３のアミノ酸配列を含むか、又は配列番号２又は配列番号３のアミノ酸配列からなる。

いくつかの実施形態では、ペプチドは、抗体又は抗体断片と複合体化される。例えば、抗体断片は、ＳｃＦｖなどの単鎖抗体である。いくつかの実施形態では、ペプチド及び抗体（例えば、単鎖抗体）又は抗体断片は、融合タンパク質として単一のポリペプチド鎖内に存在する。いくつかの実施形態では、抗体又は抗体断片は、ヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗体又は抗体断片は、ＭＹＣ依存性腫瘍細胞上の抗原を特異的に認識するか、又はＭＹＣ依存性腫瘍細胞上の抗原に対する結合親和性を有する。

いくつかの実施形態では、本発明のペプチドは、配列番号１の３番目にトレオニンを有する。いくつかの実施形態では、本発明のペプチドは、配列番号１の１３番目にセリン又はグルタミン酸を有する。いくつかの実施形態では、配列番号１のペプチド又は配列番号１に由来するペプチドは、化学リンカーによって異種部分と連結されている。いくつかの実施形態では、本発明のペプチドは、核局在化シグナルをさらに含む。いくつかの実施形態では、配列番号１のペプチド又は配列番号１に由来するペプチドは、１又は複数のセリンプロテアーゼ切断部位を含むリンカーなどの切断可能なペプチドリンカーによって、ポリペプチド異種部分と連結されている。いくつかの実施形態では、本発明のペプチドは、Ｃ末端にシステイン残基を有する。いくつかの実施形態では、本発明のペプチドは、Ｎ末端にシグナルペプチドを有する。

いくつかの実施形態では、異種部分は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の形成を可能にする、ウイルスカプシドタンパク質（例えば、アデノウイルス若しくはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）又はＥ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）のカプシドタンパク質）又はその一部などのウイルス起源のタンパク質を含む。例えば、Buning and Srivastava, Mol Ther Methods Clin Dev. 12:248-265 (2019); Le, et al., Sci Rep 9, 18631 (2019)；米国特許第８，９０６，８６２号；国際公開第ＷＯ２０１９／１７８２８８号；国際公開第ＷＯ２０１９／２３６８７０号を参照されたい。他の実施形態では、異種部分は、治療用ＤＮＡ分子、治療用ＲＮＡ分子、小分子治療剤、又はそれらの任意の組合せを含有する、ウイルス（例えば、アデノウイルス又はＡＡＶ）又はＶＬＰを含む。

第２の態様では、本発明は、例えば、改変（例えば、置換、欠失、追加）された１又は複数の残基を有していてもよい、配列番号１のアミノ酸配列を含む若しくは配列番号１のアミノ酸配列からなる配列番号４のコンセンサス配列に適合するペプチド、又はＭＹＣ阻害ペプチドと異種起源に由来する第２のペプチドとの間の融合タンパク質など、ＭＹＣ阻害ペプチドの形態又は融合タンパク質の形態の本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。

第３の態様では、本発明は、プロモーター、特に異種プロモーターへ作動可能に連結された、上記及び本明細書に記載のＭＹＣ阻害ペプチド又は融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現カセットを提供する。また、ポリヌクレオチド配列又は発現カセットを含むベクターも提供される。ＭＹＣ阻害ペプチド又はその融合タンパク質をコードする上記ヌクレオチド配列、当該ヌクレオチド配列を含むベクター又は発現カセットを含む宿主細胞もまた、提供される。いくつかの場合、宿主細胞は、ＭＹＣ阻害ペプチド又は融合タンパク質を含有する。

関連する態様では、本発明はまた、本発明の融合タンパク質などのペプチド若しくはペプチド複合体、又はペプチド若しくは融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸、発現カセット、又はコード配列を含むベクターと共に、生理学的又は薬学的に許容される担体又は非薬効成分（excipient）を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本発明の融合タンパク質を含む宿主細胞、ペプチド若しくは融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸、又はペプチド若しくは融合タンパク質のコード配列を含む発現カセット若しくはベクターと共に、生理学的若しくは薬学的に許容される担体又は非薬効成分を含む、組成物である。

第４の態様では、本発明は、細胞、特にＭＹＣが過剰発現している若しくはそれ以外にＭＹＣ活性が増強されている細胞、例えばがん細胞などにおいてＭＹＣ活性を阻害する方法、又は不適切に活性化されたＢ細胞若しくはＴ細胞が関与する自己免疫疾患などのリンパ増殖性応答、免疫応答、若しくは炎症応答を阻害する方法を提供する。いくつかの実施形態では、がんにおける制御性Ｔ細胞などの望ましくない細胞のＭＹＣ依存性増殖又は機能を枯渇させる手段を提供する。この方法は、上記及び本明細書に記載の融合タンパク質及びペプチド複合体を含む、有効量の本発明のペプチドと、細胞を接触させる工程を含む。代替的には、この方法は、上記及び本明細書に記載される融合タンパク質を含む本発明のペプチドをコードする、有効量の核酸（発現カセット又はベクターなど）と、細胞を接触させる工程を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、上記及び本明細書に記載の融合タンパク質及びペプチド複合体を含む、有効量の本発明のペプチドを対象へ投与することによって、対象におけるＭＹＣ依存性がんを治療する方法、又はリンパ増殖性障害、炎症性障害、若しくは免疫障害を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法は、がん患者における制御性Ｔ細胞などの望ましくない抑制細胞のＭＹＣ依存性の増殖又は機能を阻害する手段を提供する。いくつかの実施形態では、自己免疫疾患などのリンパ増殖性障害、炎症性障害、又は免疫障害、特に、不適切に活性化されたＢ細胞又はＴ細胞によって媒介されるものである。代替的には、この方法は、上記及び本明細書に記載の融合タンパク質を含む本発明のペプチドをコードする有効量の核酸（発現カセット又はベクターなど）、又は上記及び本明細書に記載の有効量の医薬組成物を、対象へ投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、がんは、原発性滲出液リンパ腫（ＰＥＬ）である。

ウイルスタンパク質配列系がん薬物。図１Ａは、ＫＳＨＶ再活性化細胞における転写機構の乗っ取りの発見（Chen et al., J.Virol 2017）を示す。新生ＲＮＡ－ＦＩＳＨ及びＩＦＡにより、ウイルス遺伝子転写部位における細胞ＲＮＡポリメラーゼＩＩの蓄積が示される。 ウイルスタンパク質配列系がん薬物。図１Ｂは、レポータアッセイを示す。ＫＳＨＶ ＯＲＦ５０過剰発現はＭＹＣ活性化を阻害する。 ウイルスタンパク質配列系がん薬物。図１Ｃは、クロマチン免疫沈降及び質量分析を示す。ＯＲＦ５０及びＲＮＡ ｐｏｌＩＩの両方と誘導的に相互作用するタンパク質が示されている。 ウイルスタンパク質配列系がん薬物。図１Ｄは、個々の相互作用分子のノックダウンは、ＫＳＨＶ遺伝子発現のための重要な分子としてＮＣｏＡ２を示したことを示す。 ウイルスタンパク質配列系がん薬物。図１Ｅは、相互作用ドメインのマッピングを示す。ＧＳＴプルダウンを実施して、ＮＣｏＡ２結合ドメインを同定した。組換えバキュロウイルス感染細胞から精製ＮＣｏＡ２を作製し、ＫＳＨＶ ＯＲＦ５０欠失タンパク質を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で作製した。次いで、細胞透過のためのＴＡＴ融合としてペプチドを産生する。 ウイルスタンパク質配列系がん薬物。図１Ｆは、ＣｈＩＰ－Ｓｅｑ及びＲＮＡ－Ｓｅｑを示す。ＣｈＩＰ－Ｓｅｑを実施して、原発性滲出液リンパ腫細胞におけるＮＣＯＡ２標的遺伝子を同定した。ＮＣｏＡ２の局在化は、活性遺伝子と高度に関連し、エンハンサー領域でＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩに局在する。 ウイルスタンパク質配列系がん薬物。図１Ｇは、野生型ペプチドによるＭＹＣ発現の抑制的調節を示す。ｑＲＴ－ＰＣＲを特異的プライマーにより行った。 ウイルスタンパク質配列系がん薬物。図１Ｈは、遺伝子セットエンリッチメント解析（ＧＳＥＡ）を示す。ＲＮＡ－Ｓｅｑを、ペプチド処理したＰＥＬ細胞を用いて行った。ＧＳＥＡ分析は、偽発見率が０であるＭＹＣ標的遺伝子の有意な濃縮を示した。３種類のＰＥＬ細胞株（ＢＣＢＬ－１、ＢＣ３、及びＢＣ１）は、最高スコアとしてＭＹＣ標的遺伝子セットと同様の濃縮スコアを示した。 ウイルスタンパク質配列系がん薬物。図１Ｉは、ペプチド薬物を示す。野生型ペプチド又は変異ペプチドを培養培地中でインキュベートした。４８時間後、ＭＴＳを適用することによって生細胞を測定した。細胞生存率を無処理試料と比較した。無処理試料を１とした。 アミノ酸置換の非限定的な例を示す。重要なタンパク質エレメントは他のガンマヘルペスウイルスホモログにおいて保存されていた。本発明者らの現在のペプチドを中央に示し、提案されているアミノ酸の置換を赤色で示す。新規のペプチドを用いてインビトロ及びインビボ実験を繰り返し、安定性（ＰＫ／ＰＤ）及び腫瘍殺傷効果（ＰＥＬ異種移植片モデル）の変化による改善もまた調べる。 ｓＣＤ４０Ｌ刺激の際のＣＤ１９＋Ｂ細胞応答に対する効果を示す。 刺激に応答したＣＤ１９＋Ｂ細胞増殖に対する効果を示す。 （ａ）～（ｅ）は、抗ＣＤ３刺激に応答したＣＤ３＋Ｔ細胞増殖に対する効果を示す。 Ｋ－Ｒｔａペプチドに対するウイルス応答及び細胞応答；ＶＧＮ５０の同定。（ａ）タンパク質配列アラインメント。図６Ａは、様々ながん細胞型に対するＶＧＮ５０の効果を示す。様々なＶＧＮ５０濃度で処理した示された細胞株を用いてＭＴＴアッセイを行った。モック処理された試料のＯ．Ｄ．を１００％に設定し、界面活性剤処理細胞からのＯ．Ｄ．を０％に設定した。生存率＋／－ＳＤを、各処理について計算した（Ｎ＝３試料／処理）。 Ｋ－Ｒｔａペプチドに対するウイルス応答及び細胞応答；ＶＧＮ５０の同定。（ａ）タンパク質配列アラインメント。図６Ｂは、フローサイトメトリーを用いた生存率アッセイを示す。生／死染色を用いて３連にて細胞生存率を測定し、がん細胞に対する細胞殺傷効果を、３人の健常ドナー由来の正常な末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）と比較した。結果を生存率＋／－ＳＤ偏差（Ｎ＝３試料／群）として提示する。 欠失ペプチドによる細胞増殖阻害により重要なアミノ酸残基を同定した。 異なるガンマヘルペスウイルストランス活性化因子タンパク質間のアミノ酸保存を示す。がん阻害機能を有する種々の変異ペプチドを同定した。必須タンパク質モチーフ及び切り替え可能な残基を赤色で示す。 がん増殖に対する非天然変異ペプチドの効果を示す。ｄ－３：３種類のＬ－アミノ酸をＤ－アミノに置換した。ＤＥ；Ｄ置換されたグルタミン酸、ＤＳ：Ｄ置換されたセリン。＿ＳＴ；トレオニンに置換されたセリン（赤色でマーク）。 ＲＮＡの代謝配列決定のためのチオール（ＳＨ）結合アルキル化によるペプチド標的のプロファイリング（ＳＬＡＭ－Ｓｅｑ）を示す。＿ペプチド薬物の存在下における活性転写の違いを調べた。ペプチド薬物は、ＢＣＢＬ－１及びＢＣ１の両方において活性転写を強く阻害した。Ｍｙｃ転写はペプチド薬物の存在下において強く下方制御された。薬物インキュベーションの２４時間後に全ＲＮＡ配列を行った。遺伝子セットエンリッチメント解析（ＧＳＥＡ）は、ＭＹＣ経路の抑制的調節を実証した。 ペプチドの長期処理はＢ細胞表現型を変化させる。ペプチド薬物抵抗性細胞集団を産生した後、ＲＮＡ－Ｓｅｑを行った。ＲＣ細胞は、親細胞から区別される遺伝子発現パターンを示し、潜在感染ガンマヘルペスウイルス遺伝子発現は、細胞において有意に消失した。 活性化Ｔ細胞による炎症性サイトカイン生成に対する効果を示す。 ＰＥＬ細胞のサイトカインプロファイルに対する効果を示す。 ＰＥＬ細胞のサイトカインプロファイルに対する効果を示す。 ＰＥＬ細胞のサイトカインプロファイルに対する効果を示す。 ＣＤ１４＋単球に対するＭＢＫ５０の効果。図１３Ａは、実験手順のスキームを示す。ＣＤ１４＋単球を、健常ドナーのＰＢＭＣからの磁気ビーズを用いて調製した。細胞を洗浄し、９６ウェルプレート（１ウェル当たり２００μＬ、三連）中、１×１０^６／ｍＬで、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）又はポリＩ：Ｃ（１０μｇ／ｍＬ）を用いて、又は用いずに、ＭＢＫ（１６μＭ若しくは３２μＭ）又は変異ペプチド（３２μＭ）の存在下において、２日間培養した。生細胞を、生／死染色、及びそれに続くフローサイトメトリー分析を用いて決定した。 ＣＤ１４＋単球に対するＭＢＫ５０の効果。図１３Ｂは、生細胞に対するゲーティング戦略による代表的なフロープロファイルを示す。 ＣＤ１４＋単球に対するＭＢＫ５０の効果。図１３Ｃは、各培養条件に対する生細胞の平均割合を示す。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１ ＣＤ１４＋単球に対するＭＢＫ５０の効果。図１４Ａは、実験手順のスキームを示す。単球由来樹状細胞は、ＧＭ－ＣＳＦ＋ＩＬ－４（各５０ｎｇ／ｍＬ）の存在下において４日間培養した後に、磁気ビーズで選別されたＣＤ１４＋細胞（健常ドナーのＰＢＭＣ由来）から調製した。細胞を洗浄し、９６ウェルプレート（１ウェル当たり２００μＬ、三連）中、１×１０^６／ｍＬで、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ポリＩ：Ｃ（１０μｇ／ｍＬ）、又はｓＣＤ４０Ｌ（１μｇ／ｍＬ）を用いて、又は用いずに、ＭＢＫ５０（１６μＭ若しくは３２μＭ）又は変異ペプチド（３２μＭ）の存在下において、２日間培養した。生細胞を、生／死染色、及びそれに続くフローサイトメトリー分析を用いて決定した。 ＣＤ１４＋単球に対するＭＢＫ５０の効果。図１４Ｂは、生細胞に対するゲーティング戦略による代表的なフロープロファイルを示す。 ＣＤ１４＋単球に対するＭＢＫ５０の効果。図１４Ｃは、各培養条件に対する生細胞の平均割合を示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１ Ｕ底９６ウェル培養中におけるＭＢＫ５０、変異ペプチド、又はＰＢＳによる２日間の処理後の、２人のヒト健常ドナー由来の単球由来樹状細胞（ＭＤＣ）の代表的な画像を示す。リングの直径は、各ウェル内の細胞体積／数におよそ対応する。ＭＢＫ５０処理細胞は凝集しておらず、かつ対照と比較してより広がり、接着性であることに留意すべきであり、このことは、ＭＢＫ５０によるＭＹＣ駆動増殖の阻害に起因する細胞死及び／又は細胞分化を示唆している。 ＬＰＳ活性化単球性白血病細胞株ＴＨＰ－１細胞におけるＭＹＣ及びＩＲＦ４発現に対するＭＢＫ５０の効果。ＴＨＰ－１細胞を、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）と共に、８μＭのＭＢＫ５０、変異対照、又はＰＢＳの存在下において２４時間培養した。ＭＹＣ及びＩＲＦ４の発現レベルを、アイソタイプ対照染色と共にＭＹＣ及びＩＲＦ４の細胞内染色、及びそれに続くフローサイトメトリーによって調べた。図１６Ａは、実験手順のスキームを示す。 ＬＰＳ活性化単球性白血病細胞株ＴＨＰ－１細胞におけるＭＹＣ及びＩＲＦ４発現に対するＭＢＫ５０の効果。ＴＨＰ－１細胞を、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）と共に、８μＭのＭＢＫ５０、変異対照、又はＰＢＳの存在下において２４時間培養した。ＭＹＣ及びＩＲＦ４の発現レベルを、アイソタイプ対照染色と共にＭＹＣ及びＩＲＦ４の細胞内染色、及びそれに続くフローサイトメトリーによって調べた。図１６Ｂは、アイソタイプ対照と共に、ＭＢＫ５０、変異対照ペプチド、又はＰＢＳで処理したＴＨＰ－１細胞におけるＭＹＣ発現の代表的なヒストグラムオーバーレイを示す。各処理に対するＭＹＣ発現（ｎ＝３）の平均的な平均蛍光強度（ＭＦＩ）を右パネルに示す。 ＬＰＳ活性化単球性白血病細胞株ＴＨＰ－１細胞におけるＭＹＣ及びＩＲＦ４発現に対するＭＢＫ５０の効果。ＴＨＰ－１細胞を、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）と共に、８μＭのＭＢＫ５０、変異対照、又はＰＢＳの存在下において２４時間培養した。ＭＹＣ及びＩＲＦ４の発現レベルを、アイソタイプ対照染色と共にＭＹＣ及びＩＲＦ４の細胞内染色、及びそれに続くフローサイトメトリーによって調べた。図１６Ｃは、アイソタイプ対照（青色）と共に、ＭＢＫ５０、変異対照ペプチド、又はＰＢＳで処理したＴＨＰ－１細胞におけるＩＲＦ４発現（赤色）の代表的なヒストグラムオーバーレイを示す。各処理に対するＩＲＦ４発現の平均ＭＦＩを右パネルに示す。 バキュロウイルス感染Ｓｆ９細胞から個別に調製した、５種類のＳＷＩ／ＳＮＦ成分のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。 ＶＧＮ５０とＳＷＩ／ＳＮＦとの相互作用を評価するためのＥＬＩＳＡアッセイの概略図である。 ＥＬＩＳＡによるＳＷＩ／ＳＮＦ成分へのＶＧＮ５０結合の分析を示す。４５０ｎｍでＯＤ値として測定したペプチド結合を示す。独立ｔ検定を用いて、各濃度のＶＧＮ５０と変異Ｐとの間で平均ＯＤ値を比較した。＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５、ＮＳ：有意性なし。データを平均±ＳＤとして提示する。

１．序論
本開示は、増殖細胞、例えば、がん細胞、及びＢ細胞又はＴ細胞などのリンパ球系細胞においてＭＹＣ活性を阻害するための方法及び組成物を提供する。本開示は、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）由来の改変ペプチドが、がん細胞などの細胞におけるＭＹＣ活性を効果的に阻害できるという、驚くべき発見に基づいている。ＭＹＣ依存性がん細胞のＭＹＣ活性を阻害することにより、細胞の増殖を阻害することができ、場合によっては細胞を死滅させることができる。いかなる特定の理論にも拘束されないが、ペプチドは、デコイとして作用して、ＭＹＣの発現及びトランス活性化のためのＭＹＣプロモーターに対する核内受容体コアクチベーター２（ＮＣＯＡ２）、ｐ３００、及びＳＷＩ／ＳＮＦタンパク質からなるコアクチベーター複合体の動員を遮断することによって、ＭＹＣ活性を阻害するものと考えられる。

本発明の別の実施形態では、増殖細胞（がん細胞及びリンパ球系細胞など）におけるＭＹＣ活性を阻害するために使用されるペプチドは、様々な方法のいずれかで改変される。例えば、いくつかの実施形態では、ペプチドは、ペプチドの１又は複数のアミノ酸のＤ－アミノ酸による置換を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドは、配列番号１に対して１又は複数のアミノ酸の相違を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドは、これらに限定されないが、検出可能な部分、基質（例えば、固体支持体として作用）、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）又は前記ペプチドに連結されている抗体などの別の起源のペプチド（配列番号１がセグメントである同じタンパク質由来ではない）を含む、異種部分を含む。さらに、ペプチドの有効性及び／又は適用範囲を高めるために、１又は複数のアミノ酸残基でペプチドを化学修飾して、溶解性、安定性、及びバイオアベイラビリティなどのペプチドの特性を最適化してもよい。例えば、ペプチドはグリコシル化及びＰＥＧ化によって修飾され得る。ＭＹＣを発現するがん細胞又はリンパ球系細胞の増殖を阻害する方法、及びＭＹＣに関連するがん又は自己免疫疾患などの炎症性障害を有する対象を治療する方法と同様に、細胞においてＭＹＣ活性を阻害するためにペプチドを用いる方法が提供される。

２．定義
本明細書で使用される場合、以下の用語は、特に指定されない限り、それらに帰する意味を有する。

本明細書で使用される「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、又は「その（ｔｈｅ）」という用語は、１つの構成要素を有する態様を含むだけでなく、２つ以上の構成要素を有する態様も含む。例として、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」という単数形は、文脈上、特に明確に指示されない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「細胞」への言及は複数のそのような細胞を含み、「薬剤」への言及は当業者に公知である１又は複数の薬剤への言及などを含む。

本明細書で使用される「約」及び「およそ」という用語は、概して、測定の性質又は精度を考慮して、測定された分量の許容可能な程度の誤差を意味するものとする。通常は、例示的な誤差の程度は、所与の値又は値の範囲の２０パーセント（％）以内、好ましくは１０％以内、より好ましくは５％以内である。「約Ｘ」への任意の言及は、値Ｘ、値０．８Ｘ、値０．８１Ｘ、値０．８２Ｘ、値０．８３Ｘ、値０．８４Ｘ、値０．８５Ｘ、値０．８６Ｘ、値０．８７Ｘ、値０．８８Ｘ、値０．８９Ｘ、値０．９Ｘ、値０．９１Ｘ、値０．９２Ｘ、値０．９３Ｘ、値０．９４Ｘ、値０．９５Ｘ、値０．９６Ｘ、値０．９７Ｘ、値０．９８Ｘ、値０．９９Ｘ、値１．０１Ｘ、値１．０２Ｘ、値１．０３Ｘ、値１．０４Ｘ、値１．０５Ｘ、値１．０６Ｘ、値１．０７Ｘ、値１．０８Ｘ、値１．０９Ｘ、値１．１Ｘ、値１．１１Ｘ、値１．１２Ｘ、値１．１３Ｘ、値１．１４Ｘ、値１．１５Ｘ、値１．１６Ｘ、値１．１７Ｘ、値１．１８Ｘ、値１．１９Ｘ、及び値１．２Ｘを少なくとも具体的に示す。したがって、「約Ｘ」とは、例えば「０．９８Ｘ」という特許請求の範囲の限定を支持する記述を教示及び提示することが意図される。

「ペプチドをコードする核酸配列」という用語は、いくつかの実施形態ではペプチド鎖（例えば、抗原又は融合タンパク質）の生成に関与する遺伝子又はその一部であり得る、ＤＮＡのセグメントを指す。遺伝子は、概して、遺伝子産物の転写／翻訳、及び転写／翻訳の調節に関与する、コード領域（リーダー及びトレーラー）の前後に続く領域を含む。遺伝子はまた、個々のコードセグメント（エクソン）の間に介在配列（イントロン）を含むことができる。リーダー、トレーラー、及びイントロンは、遺伝子の転写及び翻訳中に必要な調節エレメント（例えば、プロモーター、ターミネーター、リボソーム結合部位及び内部リボソーム進入部位などの翻訳調節配列、エンハンサー、サイレンサー、インシュレーター、境界エレメント、複製起点、マトリックス付着部位、及び遺伝子座制御領域など）を含むことができる。「遺伝子産物」とは、特定の遺伝子から発現されるｍＲＮＡ又はタンパク質のいずれかを指すことができる。

「発現」及び「発現された」という用語は、転写産物及び／又は翻訳産物、例えばタンパク質（例えば、抗原又は融合タンパク質）をコードする核酸配列の生成を指す。いくつかの実施形態では、用語は、遺伝子（例えば、抗原をコードする遺伝子）又はその一部によってコードされる転写産物及び／又は翻訳産物の生成を指す。細胞におけるＤＮＡ分子の発現レベルは、細胞内に存在する対応するｍＲＮＡの量、又は細胞によって生成されるそのＤＮＡによってコードされるタンパク質の量のいずれかに基づいて評価され得る。

「組換え」という用語は、例えばポリヌクレオチド、タンパク質、ベクター、又は細胞に関して使用される場合、ポリヌクレオチド、タンパク質、ベクター、又は細胞が、異種核酸若しくはタンパク質の導入、又は天然核酸若しくはタンパク質の変更によって改変されていること、又は細胞がそのように改変された細胞に由来することを示す。例えば、組換えポリヌクレオチドは、天然の（非組換え）形態であるポリヌクレオチド内には見出されない核酸配列を含有する。

本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）及びそれらのポリマーを指す。この用語には、単鎖、二重鎖、又は多重鎖のＤＮＡ又はＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、及びＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、並びにプリン及び／若しくはピリミジン塩基、又は他の天然ヌクレオチド塩基、化学修飾されたヌクレオチド塩基、生化学的修飾されたヌクレオチド塩基、非天然ヌクレオチド塩基、合成ヌクレオチド塩基、若しくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含む他のポリマーが含まれるが、これらに限定されない。具体的に限定されない限り、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有する天然ヌクレオチドの既知の類似体を含有する核酸を包含する。別段示されない限り、特定の核酸配列はまた、その保存的に改変されたバリアント（例えば、縮重コドン置換）、ホモログ、及び相補的配列、並びに明示的に示された配列も暗黙的に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１又は複数の選択された（又は全ての）コドンの３番目の位置が混合塩基及び／又はデオキシイノシン残基で置換された配列を産生することによって達成され得る（Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985);及びRossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98(1994)）。

用語「ベクター」及び「発現ベクター」は、宿主細胞又は操作された細胞における特定の核酸配列（例えば、本発明の抗原及び／又は融合タンパク質をコード）の転写を可能にする一連の特定の核酸エレメントを有する、組換えにより又は合成により産生された核酸構築物を指す。いくつかの実施形態では、ベクターは、転写され、プロモーターに作動可能に連結されるポリヌクレオチドを含む。ベクター中に存在し得る他のエレメントとしては、転写を増強するエレメント（例えば、エンハンサー）、転写を終結させるエレメント（例えば、ターミネーター）、ベクターから生成されたタンパク質（例えば、組換えタンパク質）に一定の結合親和性又は抗原性を付与するエレメント、並びにベクター及びその（例えば、ウイルス粒子への）パッケージングの複製を可能にするエレメントが挙げられる。いくつかの実施形態では、ベクターは、ウイルスベクター（すなわち、ウイルスゲノム又はその一部）である。ベクターは、例えば、指向性を増加させ、及び／又は免疫機能を調節する、核酸配列又は変異を含有し得る。「発現カセット」は、プロモーターに作動可能に連結されたコード配列、及び任意にポリアデニル化配列を含む。

「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために本明細書で互換的に使用される。３つの用語は全て、１又は複数のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工化学模倣物であるアミノ酸ポリマー、並びに天然アミノ酸ポリマー及び非天然アミノ酸ポリマーに適用される。本明細書で使用される場合、この用語は、全長タンパク質を含む、任意の長さのアミノ酸鎖を包含し、ここで、アミノ酸残基は共有結合性ペプチド結合によって連結されている。

「対象」、「個体」、及び「患者」という用語は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを指すために本明細書で互換的に使用される。哺乳動物としては、齧歯類（マウス、ラットなど）、ネコ、ウシ、サル、霊長類（ヒトを含む）、家畜、スポーツ動物、及びペットが挙げられるが、これらに限定されない。インビボで得られた又はインビトロで培養された生物学的実体の組織、細胞、及びそれらの子孫もまた包含される。

本明細書で使用される場合、「投与する」という用語は、対象への経口投与、局所接触、坐剤としての投与、静脈内、腹腔内、筋肉内、病巣内、腫瘍内、髄腔内、鼻腔内、骨内、又は皮下投与を含む。投与は、非経口及び経粘膜（例えば、頬側、舌下、口蓋、歯肉、鼻、膣、直腸、又は経皮）を含む、任意の経路によるものである。非経口投与には、例えば、静脈内、筋肉内、動脈内、皮内、皮下、腹腔内、脳室内、骨内、及び頭蓋内が含まれる。他の送達様式には、リポソーム製剤、静脈内注入、経皮パッチなどの使用が含まれるが、これらに限定されない。

「治療する」という用語は、治療上の利益及び／又は予防上の利益を含むがこれらに限定されない、有益な又は所望の結果を得るためのアプローチを指す。「治療上の利益」とは、治療中の１又は複数の疾患、状態、又は症状の任意の治療上の関連した改善、又はこれらに対する効果を意味する。治療上の利益はまた、治療中の１又は複数の疾患、状態、又は症状の治癒をもたらすことを意味し得る。さらに、治療上の利益はまた、生存率の上昇を意味し得る。予防的利益のために、組成物は、特定の疾患、状態、若しくは症状を発症するリスクがある対象、又は疾患、状態、若しくは症状がまだ存在しない可能性がある場合も、疾患の生理学的症状の１又は複数を報告する対象に投与され得る。

「治療有効量」又は「十分な量」という用語は、有益な又は所望の結果をもたらすのに十分である、本明細書に記載の系、組換えポリヌクレオチド、又は組成物の量を指す。治療有効量は、治療される対象及び疾患状態、対象の体重及び年齢、疾患状態の重症度、対象の免疫状態、及び投与様式などのうちの１又は複数に応じて変動してもよく、これらは、当業者によって容易に決定され得る。具体的な量は、選択される特定の薬剤、標的細胞型、対象における標的細胞の位置、従うべき投与レジメン、他の化合物と組み合わせて投与されるかどうか、投与のタイミング、及びそれが担持される物理的送達系のうちの１又は複数に応じて変動してもよい。

本明細書の目的のために、有効量は、当技術分野で知られているような留意事項によって決定される。その量は、感染性疾患又はがんなどの疾患に罹患している対象において所望の治療効果を達成するために有効でなければならない。所望の治療効果としては、例えば、疾患に関連した望ましくない症状の改善、そのような症状が生じる前の症状の発現の予防、疾患に関連した症状の進行の減速、疾患によって引き起こされる任意の不可逆的な損傷の減速若しくは制限、疾患の重症度の軽減若しくは治癒、又は生存率の改善若しくは疾患からのより迅速な回復の提供が挙げられ得る。さらに、予防的処置の文脈において、その量はまた、疾患の発症を予防するのに有効であり得る。

「薬学的に許容される担体」という用語は、細胞、生物、又は対象への活性薬剤の投与を補助する物質を指す。「薬学的に許容される担体」はまた、本発明の組成物に含めることができ、かつ患者に有意な有害毒性作用を引き起こさない、担体又は非薬効成分を指す。薬学的に許容される担体の非限定的な例としては、水、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、生理食塩水、乳酸加リンゲル、通常のスクロース、通常のグルコース、結合剤、充填剤、崩壊剤、潤滑剤、コーティング、甘味料、フレーバ及び着色剤、リポソーム、分散媒、マイクロカプセル、カチオン性脂質担体、等張剤及び吸収遅延剤などが挙げられる。担体はまた、安定性、無菌性、及び等張性（例えば、抗菌保存剤、抗酸化剤、キレート剤、及び緩衝剤）を製剤に提供するため、微生物（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、及びソルビン酸などの抗菌剤及び抗真菌剤）の作用を防止するため、又は食用香料などを製剤に提供するための物質を含み得るか、又はこれらの物質からなり得る。いくつかの例では、担体は、標的細胞又は組織へのポリペプチド、融合タンパク質、又はポリヌクレオチドの送達を促進する薬剤である。当業者は他の医薬担体が本発明において有用であることを認識するであろう。

「特異的に結合する」という語句は、非標的化合物に結合するよりも、試料中の標的に対してより高い親和性、結合活性で、より容易に、及び／又はより長い期間で標的に結合する分子（例えば、がん細胞抗原に対する抗体又は抗体断片）を指す。いくつかの実施形態では、標的へ特異的に結合する分子は、非標的化合物よりも２倍以上大きい親和性、例えば、３倍以上、４倍以上、５倍以上、６倍以上、７倍以上、８倍以上、９倍以上、１０倍以上、２０倍以上、２５倍以上、５０倍以上、又はそれ以上の親和性で標的に結合する。

本明細書で使用される場合、２つ以上のポリヌクレオチド又はアミノ酸配列について記載する文脈における「同一」又は「同一性」パーセントという用語は、同じである２つ以上の配列又は特定の部分配列を指す。「実質的に同一」である２つの配列は、配列比較アルゴリズムを用いて、又は特定の領域が指定されていない場合に手動でのアライメント及び目視検査によって測定した場合、比較ウィンドウ上で最大の対応のために比較及びアライメントされた場合に、６０％以上の同一性、好ましくは６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有する。ポリヌクレオチド配列に関して、この定義はまた、試験配列の相補体を指す。アミノ酸配列に関して、いくつかの場合、同一性は、少なくとも約５０アミノ酸長又はヌクレオチド長である領域にわたって、又はより好ましくは７５～１００アミノ酸長又はヌクレオチド長である領域にわたって存在する。

配列比較のために、通常は、１つの配列が、試験配列と比較される参照配列として作用する。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験配列及び参照配列をコンピュータへ入力し、必要に応じて部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。デフォルトのプログラムパラメータを使用することができ、又は代替パラメータを指定することができる。次いで、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを計算する。核酸及びタンパク質の配列比較のために、ＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズム及びデフォルトパラメータを使用する。

２つのエレメントの相対位置について記載する文脈で使用される「異種」という用語は、同じ相対位置で天然には見られない、ポリヌクレオチド配列（例えば、プロモーター又はタンパク質／ポリペプチドコード配列）又はポリペプチド配列（例えば、融合ポリペプチドの形態である複合体中の、配列番号１及び配列番号１との融合パートナーとして働く別のペプチド配列）などの２つのエレメントを指す。したがって、ある遺伝子の「異種プロモーター」とは、その遺伝子に天然には作動可能に連結されていないプロモーターを指す。同様に、配列番号１に対する「異種ポリペプチド」若しくは「異種ポリヌクレオチド」又はそのコード配列は、配列番号１が天然発生断片であるタンパク質とは異なる起源に由来するものである。配列番号１（又はそのコード配列）と異種ポリペプチド（又はポリヌクレオチド配列）との融合は、インタクトタンパク質（又はそのコード配列）又はそのセグメントとして天然で見出すことができるものより長いポリペプチド又はポリヌクレオチド配列をもたらさない。

配列番号１のＭＹＣ阻害ペプチド又はその誘導体を含む複合体について記載する文脈で使用する場合、「異種部分」という用語は、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）のＯＲＦ５０タンパク質以外の供給源に由来するものとしてのＭＹＣ阻害ペプチドの複合パートナーを指す。ＭＹＣ阻害ペプチドと異種部分との複合体が融合タンパク質である実施形態、すなわち、異種部分が別のポリペプチドであり、ペプチド結合を介してＭＹＣ阻害ペプチドに融合している実施形態では、２つのペプチドパートナーの融合は、全長ＫＳＨＶＯＲＦ５０タンパク質をもたらすべきではなく、好ましくは、配列番号１より有意に長いＫＳＨＶ ＯＲＦ５０タンパク質のセグメント、例えば、１３アミノ酸長、１４アミノ酸長、１５アミノ酸長、１６アミノ酸長、又は１７アミノ酸長を超えるセグメントをもたらさない。いくつかの実施形態では、異種部分は、治療有効性、例えば、直接殺傷又はプログラム細胞死（アポトーシス）の誘発のいずれかによって標的細胞の死を引き起こす能力を有するものであり得る。そのような治療部分は、天然のポリペプチド（例えば、抗体、例えば抗ＣＤ３抗体など、特に単鎖抗体ＳｃＦｖ）又は非ポリペプチド（例えば、炭水化物又はオリゴヌクレオチドの形態である細胞傷害剤）であり得る。他の実施形態では、異種部分は、本質的に非治療的であり得るが、配列番号１のペプチド又はその誘導体を含む複合体の検出、単離、精製、組織／細胞標的化送達、及び／又は固定化を容易にするために、親和性部分、標的化部分、検出可能／シグナル部分、若しくは固体支持体として働くか、又は他の有用性を提供する。

「炎症」という用語は、刺激作用、毒性物質、病原体、又は他の刺激に対する、生物（例えば、哺乳動物）の免疫応答を指す。応答は、自然免疫成分及び／又は適応免疫を含み得る。炎症は概して慢性又は急性のいずれかとして特徴付けられる。急性炎症は、非限定的な例として、患部への血漿タンパク質及び白血球の浸潤に起因する赤み、疼痛、熱、腫脹、及び／又は機能喪失によって特徴付けられ得る。慢性炎症は、非限定的な例として、持続性炎症、組織破壊、及び／又は修復の試みによって特徴付けられ得る。単球、マクロファージ、形質Ｂ細胞、及び他のリンパ球が一般に患部に動員され、血管新生及び線維症が起こり、場合によっては瘢痕組織につながる可能性がある。

「炎症状態」又は「炎症性障害」という用語は、上記のように、炎症応答を特徴とする又は炎症性応答を伴う、状態又は障害を指す。例示的な炎症状態のリストには、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、糖尿病、慢性腎疾患、喘息、自己免疫疾患、慢性炎症、慢性前立腺炎、糸球体腎炎、過敏症及びアレルギー、湿疹などの皮膚障害、炎症性腸疾患、骨盤内炎症性疾患、再灌流傷害、関節リウマチ、移植拒絶反応（例えば、移植片対宿主病）、サイトカインストーム症候群、二次性血球貪食性リンパ組織球症、敗血症、マクロファージ活性化症候群、及び血管炎が含まれる。

「自己免疫疾患」とは、患者の免疫系が自身の組織を異物として認識し、その組織を攻撃するために異常な免疫応答を開始する疾患である。罹患組織の連続的で低グレードの炎症の一般的な症状と共に、多数の自己免疫疾患が認識されており、これらとしては（これらに限定されないが）、アカラシア、アジソン病、成人スチル病、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、アミロイドーシス、強直性脊椎炎、抗ＧＢＭ／抗ＴＢＭ腎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫性血管浮腫、自己免疫性自律神経障害、自己免疫性脳脊髄炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫性心筋炎、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性精巣炎、自己免疫性膵炎、自己免疫性網膜症、自己免疫性じんま疹、軸索性＆神経ニューロパチー（ＡＭＡＮ）、バロー病、ベーチェット病、良性粘膜類天疱瘡、水疱性類天疱瘡、キャッスルマン病（ＣＤ）、セリアック病、シャーガス病、慢性炎症性脱髄性多発神経炎（ＣＩＤＰ）、慢性再発性多巣性骨髄炎（ＣＲＭＯ）、チャーグ・ストラウス症候群（ＣＳＳ）又は好酸球性肉芽腫症（ＥＧＰＡ）、瘢痕性類天疱瘡、コーガン症候群、寒冷凝集素症、先天性心ブロック、コクサッキー心筋炎、ＣＲＥＳＴ症候群、クローン病、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、デビック病（視神経脊髄炎）、円板状ループス、ドレスラー症候群、子宮内膜症、好酸球性食道炎（ＥｏＥ）、好酸球性筋膜炎、結節性紅斑、本態性混合型ヘモグロビン血症、エバンス症候群、線維筋痛症、線維性肺胞炎、巨細胞性動脈炎（側頭動脈炎）、巨細胞性心筋炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、多発血管炎性肉芽腫症、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病（ＨＳＰ）、妊娠性ヘルペス又は妊娠性類天疱瘡（ＰＧ）、化膿性汗腺炎（ＨＳ）（反対型ざ瘡）、低ガンマグロブリン血症、ＩｇＡ腎症、ＩｇＧ４関連硬化性疾患、免疫性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、封入体筋炎（ＩＢＭ）、間質性膀胱炎（ＩＣ）、若年性関節炎、若年性糖尿病（１型糖尿病）、若年性筋炎（ＪＭ）、川崎病、ランベルト・イートン症候群、白血球破砕性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、木質性結膜炎、線状ＩｇＡ病（ＬＡＤ）、ループス、ライム病慢性、メニエール病、顕微鏡的多発血管炎（ＭＰＡ）、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）、モーレン潰瘍、ムッハ・ハーベルマン病、多巣性運動ニューロパチー（ＭＭＮ）又はＭＭＮＣＢ、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、ナルコレプシー、新生児ループス、視神経脊髄炎、好中球減少症、眼部瘢痕性類天疱瘡、視神経炎、回帰性リウマチ（ＰＲ）、ＰＡＮＤＡＳ、傍腫瘍性小脳変性症（ＰＣＤ）、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、パリー・ロンベルク症候群、毛様体扁平部炎（周辺性ブドウ膜炎）、パーソネージ・ターナー症候群、天疱瘡、末梢神経障害、脳周囲炎、悪性貧血（ＰＡ）、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発動脈炎、多腺性症候群Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎、心筋梗塞後症候群、心膜切開後症候群、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、プロゲステロン皮膚炎、乾癬、乾癬性関節炎、赤芽球癆（ＰＲＣＡ）、壊疽性膿皮症、レイノー現象、反応性関節炎、反射性交感神経性ジストロフィー、再発性多発軟骨炎、レストレスレッグス症候群（ＲＬＳ）、後腹膜線維症、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、シュミット症候群、強膜炎、強皮症、シェーグレン症候群、精子及び精巣自己免疫、全身硬直症候群（ＳＰＳ）、亜急性細菌性心内膜炎（ＳＢＥ）、スザック症候群、交感神経性眼炎（ＳＯ）、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、甲状腺眼症（ＴＥＤ）、トロサ・ハント症候群（ＴＨＳ）、横断性脊髄炎、１型糖尿病、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、未分化結合組織疾患（ＵＣＴＤ）、ブドウ膜炎、血管炎、白斑、並びにフォークト－小柳－原田症候群が挙げられる。

「がん」という用語は、周囲組織に浸潤し、かつ新しい身体部位に転移する傾向がある未分化細胞の増殖を特徴とする、様々な悪性新生物のいずれかを指す。本発明の組成物及び方法を用いた治療に好適な種々の種類のがんの非限定的な例としては、結腸直腸がん、結腸がん、肛門がん、肝臓がん、卵巣がん、乳がん、肺がん、膀胱がん、甲状腺がん、胸膜がん、膵臓がん、子宮頸がん、前立腺がん、精巣がん、胆管がん、消化管カルチノイド腫瘍、食道がん、胆嚢がん、直腸がん、虫垂がん、小腸がん、胃（胃部）がん、腎臓がん（例えば、腎細胞がん）、中枢神経系のがん、皮膚がん、口腔扁平上皮がん、絨毛がん、頭頸部がん、骨がん、骨原性肉腫、線維肉腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、黒色腫、白血病（例えば、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、又は有毛細胞白血病）、リンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、又はバーキットリンパ腫）、及び多発性骨髄腫が挙げられる。

「リンパ増殖性障害」という用語は、モノクローナルリンパ球増加症へのリンパ球の異常な増殖を特徴とする任意の障害を指す。上記のような白血病の他に、本発明の組成物及び方法を用いた治療に好適である様々な種類のリンパ増殖性障害の非限定的な例としては、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ウィスコット・アルドリッチ症候群、ランゲルハンス細胞組織球症、リンパ球バリアント好酸球増加症、苔癬状粃糠疹、移植後リンパ増殖性障害、自己免疫リンパ増殖性症候群、リンパ球様間質性肺炎、エプスタイン・バーウイルス関連リンパ増殖性疾患、キャッスルマン病、及びＸ連鎖リンパ増殖性疾患が挙げられる。

「抑制細胞」という用語は、細胞間接触、サイトカイン、及び殺傷を含む様々な機構を介して抗体産生又はＴ細胞増殖などの生産免疫応答を抑制することができる任意のリンパ球を指す。本発明の組成物及び方法を用いた治療に好適な種々の種類の抑制性免疫細胞の非限定的な例としては、制御性Ｔ細胞、Ｔｒ１細胞、制御性Ｂ細胞、及び骨髄由来抑制細胞が挙げられる。

３．細胞においてＭＹＣ活性を阻害するペプチド
配列
本開示は、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）、特にＭＹＣの細胞コアクチベーターであるＮＣｏＡ２との相互作用に重要であり、かつ核内受容体コアクチベーター２（ＮＣＯＡ２）、ｐ３００、及びＳＷＩ／ＳＮＦタンパク質からなるコアクチベーター複合体のＭＹＣプロモーターへの動員を遮断するウイルスＫＳＨＶタンパク質である、ＯＲＦ５０の保存された１３アミノ酸領域に由来するペプチドを提供する。ＯＲＦ５０由来の１３アミノ酸のペプチドは、本明細書ではＭＢＫ５０又はＶＧＮ５０ペプチドと呼ばれる。本明細書に記載のＭＢＫ５０ペプチド又はＭＢＫ５０に基づく／ＭＢＫ５０に由来するペプチドを細胞へ導入することによって、例えばＭＹＣが過剰発現されているがん細胞において、ＭＹＣ遺伝子発現を阻害し、それによってＭＹＣ誘導性遺伝子転写及び細胞増殖を阻害し、場合によっては細胞を殺傷させることができる。

特定の実施形態では、ペプチドは、少なくとも１３アミノ酸長であり、配列番号１のアミノ酸配列を含む（若しくは配列番号１のアミノ酸配列からなる）か、又は１番目、２番目、３番目、若しくは４番目を除いて配列番号１と全く同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１と、約７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、又はそれ以上同一である。特定の実施形態では、ペプチドは、３番目及び／又は１３番目を除く全てのアミノ酸位置で配列番号１と同一である。ペプチドは、３番目及び／又は１３番目に任意の他のアミノ酸を含むことができる。いくつかの実施形態では、ペプチドの３番目のアミノ酸は、トレオニンである。いくつかの実施形態では、ペプチドの１３番目のアミノ酸は、セリン又はグルタミン酸である。いくつかの実施形態では、ペプチドは、１３アミノ酸よりも短く、例えば、１０アミノ酸、１１アミノ酸、又は１２アミノ酸であり、いくつかの実施形態では、ペプチドは、１３アミノ酸よりも長く、例えば、１４アミノ酸、１５アミノ酸、１６アミノ酸、１７アミノ酸、１８アミノ酸、１９アミノ酸、２０アミノ酸、又はそれを超えるアミノ酸である。いくつかの実施形態では、例えばＭＢＫ５０ペプチドが抗体又は細胞透過性タンパク質などの別の部分との融合タンパク質内に存在する場合、ペプチドを含む全ポリペプチドは、任意の長さ、例えば、約１５アミノ酸、約２０アミノ酸、約２１アミノ酸、約２２アミノ酸、約２３アミノ酸、約２４アミノ酸、約２５アミノ酸、約３０アミノ酸、約３５アミノ酸、約４０アミノ酸、約４５アミノ酸、約５０アミノ酸、約５５アミノ酸、約６０アミノ酸、約６５アミノ酸、約７０アミノ酸、約７５アミノ酸、約８０アミノ酸、約８５アミノ酸、約９０アミノ酸、約９５アミノ酸、約１００アミノ酸、約１５０アミノ酸、約２００アミノ酸、約２５０アミノ酸、約３００アミノ酸、約３５０アミノ酸、約４００アミノ酸、約４５０アミノ酸、約５００アミノ酸、若しくはそれ以上のアミノ酸、又は約１０～２０アミノ酸、約１５～２０アミノ酸、約２０～３０アミノ酸、約３０～４０アミノ酸、約４０～５０アミノ酸、約５０～６０アミノ酸、約６０～７０アミノ酸、約７０～８０アミノ酸、約８０～９０アミノ酸、約９０～１００アミノ酸、約１００～１５０アミノ酸、約１５０～２００アミノ酸、約２００～３００アミノ酸、約３００～４００アミノ酸、約４００～５００アミノ酸、若しくはそれ以上のアミノ酸の長さであり得る。

非標準アミノ酸
いくつかの実施形態では、ペプチドは、Ｄ－アミノ酸、β－アラニン、又はオルニチンなどの１又は複数の非標準アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ペプチド内のアミノ酸の１又は複数は、Ｄ－アミノ酸である。Ｄ－アミノ酸は、ペプチドの任意の位置、例えば、１番目、２番目、３番目、４番目、５番目、６番目、７番目、８番目、９番目、１０番目、１１番目、１２番目、１３番目、又はこれらの位置のいずれかの任意の組合せに存在し得る。特定の実施形態では、１又は複数のＤ－アミノ酸は、ペプチドの１又は複数のＣ末端アミノ酸に、例えば、１３番目の位置、１２番目及び１３番目の位置、又は１１番目、１２番目、及び１３番目の位置に存在する。特定の実施形態では、ペプチドの２つのＣ末端アミノ酸がＤ－アミノ酸である。特定の実施形態では、２つのＣ末端アミノ酸は、アスパラギン酸及びトレオニン、セリン、又はグルタミン酸（すなわち、－ＤＴ、－ＤＳ、－ＤＥ）である。Ｄ－アミノ酸はまた、１３アミノ酸のＭＢＫ５０ペプチドを含む、融合タンパク質などのより大きなペプチド又はポリペプチドに組み込むこともできる。例えば、いくつかの実施形態では、ペプチド全体のＮ末端アミノ酸（例えば、ＴＡＴペプチド内のアルギニン）及び２つのＣ末端アミノ酸（例えば、ＭＢＫ５０ペプチド内のアスパラギン酸＋トレオニン／セリン／グルタミン酸）の両方がＤ－アミノ酸である、ＭＢＫ５０ペプチドに連結された改変ＴＡＴペプチドを含むペプチドが使用される。例えば、図２を参照されたい。

いくつかの実施形態では、ペプチドは、オルニチン、ｂ－アラニンなどの他の非標準アミノ酸を含む。そのようなアミノ酸は、１３アミノ酸のＭＢＫ５０ペプチド内の任意の位置に、又はＭＢＫ５０ペプチド並びに抗体若しくは細胞透過性タンパク質などの１又は複数の追加的な部分を含むより大きなペプチド、ポリペプチド、若しくは融合タンパク質に組み込むことができる。

Ｄ－アミノ酸及び他の非標準アミノ酸は、任意の好適な方法を用いてペプチドに組み込むことができる。例えば、それらは、公知の方法を用いたペプチドの化学合成中に、又は遺伝子コード再プログラミングを用いた無細胞系における組換えペプチドの生成中に組み込むことができる（例えば、Katoh et al., Cell Chem Biol 24:46-64を参照されたい）。

複合体（conjugate）
いくつかの実施形態では、本発明のペプチドは、異種部分、例えば、ペプチドの容易な単離／同定を可能にし、ペプチドの安定性／バイオアベイラビリティを改善し、又は特定の細胞型にペプチドを標的化し、及び／又は細胞への進入を促進するように設計された部分に複合体化される。この部分は化学リンカーを用いてペプチドに結合させることができ、又はこの部分がまたポリペプチドでもある場合、ペプチド結合を介して結合させることができ、すなわち２つのペプチド又はポリペプチドが融合タンパク質として単一のポリペプチド鎖に存在する。いくつかの場合、リンカーは、適切なプロテアーゼの存在下においてペプチド及びその複合体パートナーの容易な分離を可能にするように、切断可能なペプチドリンカーである。

いくつかの実施形態では、この部分は、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）である（例えば、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれるPatel et al. (2019) Scientific Reports 9: article no. 298を参照されたい）。特定の実施形態では、ＣＰＰは、ＴＡＴペプチド（ＨＩＶの転写トランス作用因子（ＴＡＴ）に由来するＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＱ）、又はそのバリアント若しくは誘導体である。いくつかの実施形態では、ＣＰＰは、１又は複数の非標準アミノ酸、例えばＤ－アミノ酸、β－アラニン、及び／又はオルニチンを含む。特定の実施形態では、ＴＡＴペプチドは、Ｄ－アミノ酸、β－アラニン、又はオルニチン、例えば、図２に示す配列：ｄ－Ａｒｇ－ＫＫＲＲ－オルニチン－ＲＲＲ－β－アラニンを含む。特定の実施形態では、ＴＡＴペプチド（又は他のＣＰＰ）は、１３アミノ酸のＭＹＣ阻害ペプチドを有する単一のポリペプチド鎖、例えば、ＭＹＣ阻害ペプチドのＮ末端に存在する。いくつかの実施形態では、ＴＡＴペプチドは、ＭＹＣ阻害ペプチドの直接のＮ末端である（例えば、図２を参照のこと）。他の実施形態では、ＴＡＴペプチドとＭＹＣ阻害ペプチドとの間にリンカー及び／又は他のエレメントが存在する。ある実施形態では、ペプチドは、例えば、ｄ－Ａｒｇ－ＫＫＲＲ－オルニチン－ＲＲＲ－β－アラニン－ＬＳＳＩＬＱＧＬＹＱＬＤＴ、又はｄ－Ａｒｇ－ＫＫＲＲ－オルニチン－ＲＲＲ－β－アラニン－ＬＳＳＩＬＱＧＬＹＱＬ－ｄ－Ａｓｐ－ｄＴｈｒ、又はｄ－Ａｒｇ－ＫＫＲＲ－オルニチン－ＲＲＲ－β－アラニン－ＬＳＳＩＬＱＧＬＹＱＬ－－ｄ－Ａｓｐ－ｄＳｅｒ、又はｄ－Ａｒｇ－ＫＫＲＲ－オルニチン－ＲＲＲ－β－アラニン－ＬＳＳＩＬＱＧＬＹＱＬ－－ｄ－Ａｓｐ－ｄＧｌｕ、又はｄ－Ａｒｇ－ＫＫＲＲ－オルニチン－ＲＲＲ－β－アラニン－ＬＳＴＩＬＱＧＬＹＱＬ－－ｄ－Ａｓｐ－ｄＴｈｒのような改変ＴＡＴタンパク質との複合体として投与される。例えば、図２を参照されたい。

いくつかの実施形態では、ＭＹＣ阻害ペプチドの複合体化パートナーは、治療部分であり、これは、ＭＹＣ阻害ペプチドの治療上の利益と類似する、又は異なる治療利益を提供し得る。２つのパートナーの複合体化は、その治療用途において複合体の別個の態様を加えることができるだけでなく、各パートナー単独の有効性を高めることもできる。例として、治療部分の存在は、ＭＹＣ阻害ペプチドの抗増殖又は抗炎症有効性の、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、１００％以上、又はそれ以上、例えば１．５倍以上、２倍以上、２．５倍以上、３倍以上、５倍以上、１０倍以上、２０倍以上、２５倍以上、５０倍以上、８０倍以上、１００倍以上、若しくは５００倍以上、又は１０００倍以上などの増加をもたらし得る。さらに、物理的に近接した２つのパートナーの存在は、２つのパートナーの併用治療有効性の相乗効果を生み出すことができる。例えば、複合体の得られた抗がん効果は、２つのパートナーの相加効果から、５０％以上、１００％以上、１５０％以上、２００％以上、又はそれ以上、例えば３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、又はそれ以上などの増加を表し得る。

いくつかの実施形態では、異種部分は、所定の標的器官、組織、又は細胞型、例えば、がん細胞、Ｔ細胞又はＢ細胞などの免疫細胞に複合体を送達するのに役立ち、これにより、乳がん、肺がん、並びに白血病及びリンパ腫（例えば、Ｂ細胞リンパ腫）を含む様々な種類のリンパ増殖性障害、並びに自己反応性Ｂ細胞を標的とすることによる全身性エリテマトーデス、又は自己反応性Ｔ細胞を標的とすることによる糖尿病及び多発性硬化症の悪性腫瘍の標的化治療などの自己免疫疾患を含む炎症状態の標的化された治療が可能となる。移植拒絶における移植片対宿主病については、宿主組織を攻撃するＴ細胞を軽減することができる。別の例には、アトピー性皮膚炎などのアレルギー性疾患における、皮膚における、又は全身的なＩｇＥ産生Ｂ細胞の標的化が含まれる。いくつかの実施形態では、腫瘍を直接標的化することに加えて、腫瘍中のＦｏｘｐ３^＋制御性Ｔ細胞又は骨髄由来抑制細胞などの抑制細胞を、同時に標的化して、全体的な抗腫瘍効果を高めることができる。

抗体複合体
いくつかの実施形態では、本発明のペプチドは、抗体又はその断片、例えばＭＹＣが過剰発現されているがん細胞（すなわち、「ＭＹＣ関連がん」若しくは「ＭＹＣ依存性がん」）又は炎症性障害に関与するＢ細胞若しくはＴ細胞などのリンパ球系細胞へ特異的又は優先的に結合する抗体に複合体化されている。そのような実施形態では、抗体又は抗体断片は、ペプチドが細胞によって内在化され、かつＭＹＣ活性を阻害することができるＭＹＣ依存性がん細胞に、インビボでペプチドを誘導することができる。そのような実施形態では、抗体は、単鎖抗体とペプチドの両方を単一のポリペプチド鎖に含めることによって、ペプチドに連結することができる。いくつかの実施形態では、ペプチド及び抗体は、標的細胞の近傍でペプチドを遊離させるために、リンカー、例えばプロテアーゼ（例えば、マトリックスメタロプロテアーゼ）切断部位を有するリンカーによって分離される。他の実施形態では、抗体又は抗体断片を、ペプチドへ化学的に連結することができる。

抗体及び抗体断片に加えて、ＭＹＣ依存性がん細胞又は標的リンパ球系細胞（Ｂ細胞又はＴ細胞など）に特異的に結合する任意の分子を、本発明のペプチドと連結することができる。例えば、ＭＹＣ依存性がん細胞の表面上の受容体に対するリガンドを使用することができる。任意の種類のＭＹＣ関連がんのように、ＭＹＣ依存性がん細胞又はリンパ球系細胞の表面上の任意の分子を標的とすることができる（例えば、Dang (2012) Cell 149(1):22-35; Gabay et al. (2014) Cold Spr. Harb. Persp. Med. 4(6):a014241を参照されたい。いくつかの実施形態では、がんは、原発性滲出液リンパ腫（ＰＥＬ）又は多発性骨髄腫である。いくつかの実施形態では、抗体によって認識される抗原はＣＤ３であり、これにより、Ｔ細胞リンパ腫などのがんを治療するためのＭＹＣ阻害ペプチド複合体の使用が可能になる。いくつかの実施形態では、抗体によって認識される抗原はＥＧＦＲであり、これにより、乳がんなどのがんを治療するためのＭＹＣ阻害ペプチド複合体の使用が可能になる。多くの場合、そのような抗体自体は抗がん効果を有し、相乗効果が期待される。同じ細胞を標的とするためのペプチド複合体形態及び非複合体形態の組合せは、ＡＤＣＣによる免疫効果の活性化及びＭＹＣ阻害剤によるがん細胞増殖阻害をさらにもたらすだろう。したがって、ペプチドは、ＥＧＦＲ又はＶＥＧＦを標的とするものなどの治療用抗体、例えば、ベバシズマブ、ＶＥＧＦを標的とするラムシルマブ、セツキシマブ、及びＥＧＦＲ受容体を標的とするトラスツズマブ、並びにＨＥＲ２に対するハーセプチンを含む、ＦＤＡ承認抗がん抗体薬の有効性を増強し得る。多くの場合、そのような抗体は、任意の望ましくない免疫応答を最小限に抑えるためにヒト化される。いくつかの場合、本発明のペプチドは、所望の抗体と連結され、マトリックスメタロプロテアーゼなどのプロテアーゼと共に切断可能なリンカーを採用することによって使用される。

例示的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は四量体を含む。各四量体は、ポリペプチド鎖の２つの同一の対から構成され、各対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）及び１つの「重」鎖（約５０～７０ｋＤａ）を有する。各鎖のＮ末端は、抗原認識を主に担う約１００～１１０又はそれ以上のアミノ酸の可変領域を規定する。したがって、「可変重鎖」、「Ｖ_Ｈ」、又は「ＶＨ」という用語は、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、又はＦａｂを含む免疫グロブリン重鎖の可変領域を指すが、一方で、「可変軽鎖」、「Ｖ_Ｌ」、又は「ＶＬ」という用語は、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、又はＦａｂを含む免疫グロブリン軽鎖の可変領域を指す。同等の分子には、例えば抗体断片を改変することによって、又はファージディスプレイライブラリーからの選択によって誘導される、所望の抗原特異性を有する抗原結合タンパク質が含まれる。

いくつかの実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ポリクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、キメラ抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト化抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、ｓｃＦｖなどの抗原結合断片である。「抗体又は抗原結合断片」という用語はまた、二重又は複数の抗原又はエピトープ特異性を有する、多重特異性抗体及びハイブリッド抗体を包含し得る。特定の実施形態では、抗体は、単鎖抗体である。

いくつかの実施形態では、抗体は、本明細書に開示された、抗体配列の重鎖配列若しくはその一部、及び／又は軽鎖配列若しくはその一部を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、本明細書に開示された抗体の１又は複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、単一の単量体可変抗体ドメイン、例えば単一のＶＨＨドメインを含む、ナノボディ又は単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）である。

その他のエレメント
ＭＢＫ５０ペプチド、及びＣＰＰ又は抗体若しくは抗体断片などの任意の部分に加えて、本発明で使用されたペプチドは、ペプチド内の異なるエレメントを分離するリンカー、シグナル配列、及び核局在化配列などの他のエレメントを含むことができる。

いくつかの実施形態では、本発明のペプチド内の２つ以上のエレメントは、柔軟なリンカーによって分離されている。タンパク質ドメインを分離するための好適なリンカーが当技術分野で公知であり、例えばグリシン残基及びセリン残基、例えば２～２０グリシン残基及び／又はセリン残基を含むことができる。いくつかの実施形態では、例えばＭＹＣ依存性細胞に指向された後にペプチドを抗体から分離することができるように、リンカーは、プロテアーゼ切断部位、例えばセリンプロテアーゼ切断部位を含むことができる。いくつかの実施形態では、ペプチドは、ペプチドが核に入ることを可能にする核局在化シグナルを含むことができ、ここで、このペプチドはＮＣｏＡ２に結合し、ＭＹＣ活性を阻害することができる。いくつかの実施形態では、ペプチドは、さらなる化学的複合体化を可能にするために、Ｃ末端にシステイン残基を含む。特定の実施形態では、ペプチド（又はポリペプチド）は、本発明の１３アミノ酸のＭＢＫ５０ペプチド、目的の特定の細胞又は組織型を標的化するヒト化抗体、及び抗体をＭＹＣ阻害ペプチドから分離するリンカーを含み、ここで、リンカーは、プロテアーゼ切断部位、及び任意に核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む。

抗体の調製
ＭＹＣ関連がん細胞又はＢ細胞若しくはＴ細胞などの標的リンパ球系細胞へ結合する抗体を調製するために、当技術分野で公知の多くの技術を使用することができる。例えば、Kohler & Milstein, Nature 256:495-497 (1975); Kozbor et al., Immunology Today 4: 72(1983); Cole et al., pp.77-96 in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985); Coligan, Current Protocols in Immunology (1991); Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (1988);及びGoding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2nd ed. 1986)を参照されたい。いくつかの実施形態では、抗体は、抗体応答の誘導のための抗原で、１又は複数の動物（例えば、マウス、ウサギ、又はラットなど）を免疫化することによって調製される。いくつかの実施形態では、抗原は、アジュバント（例えば、フロイントアジュバント）との複合体で投与される。いくつかの実施形態では、最初の免疫化後、抗原の１回以上のその後のブースター注射を行って、抗体産生を改善することができる。免疫化後、抗原特異的Ｂ細胞を、例えば脾臓及び／又はリンパ組織から採取する。モノクローナル抗体を産生するために、Ｂ細胞を骨髄腫細胞と融合し、その後、抗原特異性についてスクリーニングする。

目的の抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子は細胞からクローニングすることができ、例えば、モノクローナル抗体をコードする遺伝子はハイブリドーマからクローニングし、組換えモノクローナル抗体を産生するために使用することができる。モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子ライブラリはまた、ハイブリドーマ又は形質細胞から作製することもできる。加えて、ファージ又は酵母ディスプレイ技術を使用して、選択された抗原へ特異的に結合する抗体及びヘテロマーＦａｂ断片を同定することができる（例えば、McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990); Marks et al., Biotechnology 10:779-783 (1992); Lou et al. m PEDS 23:311 (2010);及びChao et al., Nature Protocols, 1:755-768 (2006)を参照されたい）。あるいは、抗体及び抗体配列は、例えば、Xu et al., Protein Eng Des Sel, 2013, 26:663-670；国際公開第２００９／０３６３７９号；国際公開第２０１０／１０５２５６号；及び国際公開第２０１２／００９５６８号に開示されるような酵母系抗体提示システムを用いて、単離及び／又は同定することができる。重鎖及び軽鎖遺伝子産物のランダムな組合せは、異なる抗原特異性を有する抗体の大きなプールを産生する（例えば、Kuby, Immunology (3rd ed. 1997)を参照されたい）。単鎖抗体又は組換え抗体を産生するための技術（米国特許第４，９４６，７７８号、米国特許第４，８１６，５６７号）もまた、抗体を産生するように適合させることができる。

抗体は、原核生物及び真核生物の発現系を含む任意の数の発現系を用いて産生され得る。いくつかの実施形態では、発現系は、ハイブリドーマなどの哺乳動物細胞、又はＣＨＯ細胞である。そのような系の多くは商業的供給業者から広く入手可能である。抗体がＶＨ領域及びＶＬ領域の両方を含む実施形態では、ＶＨ領域及びＶＬ領域は、単一のベクターを用いて、例えば、ジシストロニック発現単位で発現され得るか、又は異なるプロモーターの制御下にあり得る。他の実施形態では、ＶＨ領域及びＶＬ領域は、別々のベクターを用いて発現されてもよい。

いくつかの実施形態では、抗体は、親和性成熟された１又は複数のＣＤＲ、重鎖配列、及び／又は軽鎖配列を含む。キメラ抗体の場合、キメラ抗体を作製する方法は当技術分野で公知である。例えば、マウスなどのある種に由来する抗原結合領域（重鎖可変領域及び軽鎖可変領域）が、ヒトなどの別の種のエフェクタ領域（定常ドメイン）に融合されたキメラ抗体を作製することができる。別の例として、抗体のエフェクタ領域が異なる免疫グロブリンクラス又はサブクラスのエフェクタ領域で置換された、「クラススイッチされた」キメラ抗体を作製することができる。

いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト化された１又は複数のＣＤＲ、重鎖配列、及び／又は軽鎖配列を含む。ヒト化抗体の場合、ヒト化抗体を作製する方法は当技術分野で公知である。例えば、米国特許第８，０９５，８９０号を参照されたい。概して、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源から導入された１又は複数のアミノ酸残基を有する。ヒト化の代替として、ヒト抗体を産生することができる。非限定的な例として、免疫化の際、内因性免疫グロブリン産生の非存在下においてヒト抗体の完全なレパートリーを産生することができる、トランスジェニック動物（例えば、マウス）を作り出すことができる。例えば、キメラ変異マウス及び生殖系列変異マウスにおける抗体重鎖結合領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合性欠失は、内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。そのような生殖系列変異マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイの導入は、抗原負荷の際に、ヒト抗体の産生をもたらすことになる。例えば、Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immun., 7:33 (1993)；並びに米国特許第５，５９１，６６９号、米国特許第５，５８９，３６９号、及び米国特許第５，５４５，８０７号を参照されたい。

いくつかの実施形態では、抗体断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ナノボディ、又は二重特異性抗体など）が産生される。インタクトな抗体のタンパク質分解消化（例えば、Morimoto et al., J. Biochem. Biophys. Meth., 24:107-117 (1992);及びBrennan et al., Science, 229:81 (1985)を参照）、及び断片を産生するための組換え宿主細胞の使用など、抗体断片の産生のための様々な技術が開発されている。例えば、抗体断片は、抗体ファージライブラリから単離することができる。あるいは、Ｆａｂ’－ＳＨ断片を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞から直接回収し、化学的に結合させて、Ｆ（ａｂ’）２断片を形成することができる（例えばCarter et al., BioTechnology, 10:163-167 (1992)を参照されたい）。別のアプローチによれば、Ｆ（ａｂ’）２断片は、組換え宿主細胞培養物から直接単離することができる。抗体断片の産生のための他の技術は当業者には明らかであろう。

結合親和性及び結合速度論を測定するための方法は当技術分野で公知である。これらの方法には、固相結合アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ）、免疫沈降、表面プラズモン共鳴（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ニュージャージー州、ピスカタウェイ））、結合平衡除外法（例えば、ＫｉｎＥｘＡ（登録商標））、フローサイトメトリー、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）、ＢｉｏＬａｙｅｒ干渉法（例えば、Ｏｃｔｅｔ（商標）（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、Ｉｎｃ．、カルフォルニア州、メンローパーク））、及びウエスタンブロット分析が含まれるが、これらに限定されない。

４．組換えペプチドの調製
本発明のペプチド、すなわち単離されたＭＢＫ５０ペプチド、及び／又はＭＢＫ５０ペプチドを含む融合タンパク質若しくはポリペプチド、及び抗体若しくはＣＰＰなどの他の部分は、化学的ペプチド合成又は組換え方法を含む任意の数の方法で調製することができる。

化学合成
いくつかの実施形態では、ペプチドは、Merrifield et al., J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2156 (1963); Barany and Merrifield, Solid-Phase Peptide Synthesis, in The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology Gross and Meienhofer (eds.), Academic Press, N.Y., vol. 2, pp. 3-284 (1980);及びStewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis 2nd ed., Pierce Chem. Co., Rockford, Ill.(1984)に記載される手順と同様の手順を用いて、固相ペプチド合成法により合成してもよい。合成中、保護側鎖を有するＮ－α保護アミノ酸を、そのＣ末端によって連結された増殖中のポリペプチド鎖、及び固体支持体、すなわちポリスチレンビーズに段階的に添加する。ペプチドは、Ｎ－α－脱保護アミノ酸のアミノ基を、ジシクロヘキシルカルボジイミドなどの試薬と反応させることで活性化したＮ－α保護アミノ酸のα－カルボキシ基に連結することにより合成される。活性化カルボキシルへの遊離アミノ基の結合は、ペプチド結合の形成をもたらす。最も一般的に使用されるＮ－α－保護基としては、酸に不安定なＢｏｃ、及び塩基に不安定なＦｍｏｃが挙げられる。

ペプチドはまた、Merrifield et al., J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2156 (1963); Barany and Merrifield, Solid-Phase Peptide Synthesis, in The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology Gross and Meienhofer (eds.), Academic Press, N.Y., vol. 2, pp. 3-284 (1980);及びStewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis 2nd ed., Pierce Chem. Co., Rockford, Ill. (1984)により記載される手順と同様の手順を用いて、固相ペプチド合成法により合成してもよい。合成中、保護側鎖を有するＮ－α保護アミノ酸を、そのＣ末端によって連結された増殖中のポリペプチド鎖、及び固体支持体、すなわちポリスチレンビーズに段階的に添加する。ペプチドは、Ｎ－α－脱保護アミノ酸のアミノ基を、ジシクロヘキシルカルボジイミドなどの試薬と反応させることで活性化したＮ－α保護アミノ酸のα－カルボキシ基に連結することにより合成される。活性化カルボキシルへの遊離アミノ基の結合は、ペプチド結合形成をもたらす。最も一般的に使用されるＮ－α－保護基としては、酸に不安定なＢｏｃ、及び塩基に不安定なＦｍｏｃが挙げられる。

組換え体産生
いくつかの実施形態では、ペプチド又は融合タンパク質は、標準的な分子生物学的方法を用いて組換えにより産生される。例えば、ＭＢＫ５０ペプチド、及び任意に単鎖抗体又はＴＡＴペプチドなどの追加の配列をコードするヌクレオチド配列は、標準的な方法を用いて合成し、好適な発現ベクター（例えば、Ｈｉｓタグ発現ベクターｐＥＴ３０（ａ）＋）にクローニングすることができる。次いで、組換えＴｎＣ及びＦＡＢＰを、好適な細胞（例えば、大腸菌）中で発現させ、精製し、タンパク質濃度及び純度を、例えばＢＣＡアッセイ及びＳＤＳ－ＰＡＧＥによってそれぞれ決定することができる。

組換え遺伝学の分野における一般的な方法及び技術を開示する基本的な教科書としては、Sambrook and Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd ed. 2001); Kriegler,Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990);並びにAusubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology (1994)が挙げられる。

核酸の場合、サイズはキロベース（ｋｂ）又は塩基対（ｂｐ）のいずれかで与えられる。これらは、アガロース電気泳動又はアクリルアミドゲル電気泳動、配列決定された核酸、又は公開されたＤＮＡ配列に由来する推定値である。タンパク質の場合、サイズはキロダルトン（ｋＤａ）又はアミノ酸残基数で与えられる。タンパク質サイズは、ゲル電気泳動、配列決定されたタンパク質、由来するアミノ酸の配列、又は公開されたタンパク質配列から推定される。

市販されていないオリゴヌクレオチドは、Van Devanter et.al., Nucleic Acids Res. 12:6159-6168 (1984)に記載されているように、自動合成機を用いて、例えば、Beaucage & Caruthers, Tetrahedron Lett. 22:1859-1862 (1981)によって最初に記載された固相ホスホラミダイトトリエステル法に従って化学合成することができる。オリゴヌクレオチドの精製は、任意の当技術分野で認識されている戦略、例えば、Pearson & Reanier, J. Chrom. 255:137-149 (1983)に記載されるような、天然アクリルアミドゲル電気泳動又はアニオン交換ＨＰＬＣを用いて行う。

本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列は、例えば、Wallace et al., Gene 16:21-26 (1981)の二本鎖鋳型を配列決定するための連鎖終止反応法を用いて、クローニング又はサブクローニングの後に検証することができる。

本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、それらのアミノ酸配列に基づいて決定することができる。これらは、例えばＫＳＨＶゲノムライブラリから単離することができ、又は商業的供給業者によって合成することができる。本発明のペプチドをコードする核酸配列は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの標準的なクローニング技術を用いて単離することができる。この目的のために最も一般的に使用される技術は、標準的な教科書、例えば前出のSambrook and Russellに記載されている。

配列相同性に基づいて、縮重オリゴヌクレオチドをプライマーセットとして設計することができ、ＰＣＲは、好適な条件下（例えば、White et al., PCR Protocols: Current Methods and Applications, 1993; Griffin and Griffin, PCR Technology, CRC Press Inc. 1994を参照）において実施して、ｃＤＮＡ又はゲノムライブラリからヌクレオチド配列のセグメントを増幅することができる。増幅されたセグメントをプローブとして用いて、本発明のペプチドをコードするより長い核酸を得る。

本発明のペプチドをコードする核酸配列を取得する際、例えばコード配列に作動可能に連結されたプロモーターによって指示される組換えタンパク質発現を可能にする条件下においてトランスフェクション及び宿主細胞の培養後に、得られた構築物から組換えペプチドを生成することができるように、コード配列を、必要に応じて修飾し（例えば、親和性タグ、例えば６×Ｈｉｓタグ又はＧＳＴタグなどの異種タグに対するコード配列を付加すること）、次いで、ベクター、例として発現ベクターにサブクローニングすることができる。

いくつかの実施形態では、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、特定の宿主の好ましいコドン使用頻度と一致するようにさらに変更することができる。例えば、細菌細胞のある株の好ましいコドン使用頻度を使用して、本発明のペプチドをコードし、この株に有利なコドンを含むポリヌクレオチドを誘導することができる。宿主細胞が示す好ましいコドン使用頻度は、宿主細胞により発現される多数の遺伝子における好ましいコドン使用頻度を平均することによって、計算することができる（例えば、計算サービスは、Kazusa DNA Research Institute（日本）のウェブサイトから利用できる）。この分析は、好ましくは、宿主細胞によって高度に発現される遺伝子に限定される。

本発明のペプチドをコードする核酸の高レベル発現を得るために、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、転写を指示する強力なプロモーター（通常、異種）、転写／翻訳ターミネーター、及び翻訳開始のためのリボソーム結合部位を含有する発現ベクターにサブクローニングすることができる。好適な細菌プロモーターは当技術分野で周知であり、例えば、前出のSambrook and Russell、及び前出のAusubel et al.に記載されている。組換えポリペプチドを発現させるための細菌発現系は、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、及びカウロバクター属（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ）において利用可能である。このような発現系のためのキットは市販されている。哺乳動物細胞、酵母、及び昆虫細胞のための真核生物発現系は、当技術分野で周知であり、また市販されている。ある実施形態では、真核生物発現ベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ベクター、又はレトロウイルスベクターである。

異種核酸の発現を指示するために使用されるプロモーターは、特定の用途に依存する。プロモーターは、任意に、異種転写開始部位から、自然環境における転写開始部位からの距離とほぼ同じ距離に位置する。しかしながら、当技術分野で知られているように、この距離のいくらかの変動は、プロモーター機能を失うことなく適応され得る。ある実施形態では、プロモーターは、ＩＰＴＧ誘導性プロモーターである。

プロモーターに加えて、発現ベクターは、通常、宿主細胞におけるペプチドの発現に必要な全ての追加的エレメントを含有する、転写単位又は発現カセットを含む。したがって、典型的な発現カセットは、コード配列に作動可能に連結されたプロモーター、及び転写物の効率的なポリアデニル化、リボソーム結合部位、及び翻訳終結に必要なシグナルを含有する。ペプチドをコードする核酸配列は、通常、切断可能なシグナルペプチド配列へ連結されて、形質転換細胞による組換えポリペプチドの分泌を促進する。そのようなシグナルペプチドには、とりわけ、組織プラスミノーゲン活性化因子、インスリン、及びニューロン増殖因子、並びにオオタバコガ（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）の幼若ホルモンエステラーゼ由来のシグナルペプチドが含まれる。カセットの追加的なエレメントは、エンハンサー、並びにゲノムＤＮＡが構造遺伝子として使用される場合には、機能的スプライスドナー部位及びアクセプター部位を有するイントロンを含み得る。

プロモーター配列に加えて、発現カセットはまた、効率的な終結を提供するために、構造遺伝子の下流に転写終結領域も含有すべきである。終結領域は、プロモーター配列と同じ遺伝子から得てもよく、又は異なる遺伝子から得てもよい。

遺伝情報を細胞に輸送するために使用される特定の発現ベクターは、特に重要ではない。真核細胞又は原核細胞における発現のために使用される従来のベクターのいずれを使用してもよい。標準的な細菌発現ベクターとしては、ｐＢＲ３２２系プラスミド、ｐＳＫＦ、ｐＥＴ２３Ｄ、ｐＥＴ３０（ａ）＋などのプラスミド、並びにＧＳＴ及びＬａｃＺなどの融合発現系が挙げられる。エピトープタグ（例えば、ｃ－ｍｙｃ）を組換えタンパク質に付加して、簡便な単離方法を提供することもできる。

真核生物ウイルス由来の調節エレメントを含有する発現ベクターは、通常、真核生物発現ベクター、例えば、ＳＶ４０ベクター、パピローマウイルスベクター、及びエプスタイン・バー・ウイルス由来のベクターにおいて使用される。他の例示的な真核生物ベクターとしては、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ^＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ^＋、ｐＭＡＭｎｅｏ－５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥ、及びＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、又は真核細胞における発現に有効であることが示された他のプロモーターの指示下においてタンパク質の発現を可能にする、任意の他のベクターが挙げられる。

いくつかの発現系は、チミジンキナーゼ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、及びジヒドロ葉酸レダクターゼなどの遺伝子増幅を提供するマーカを有する。あるいは、ポリヘドリンプロモーター又は他の強力なバキュロウイルスプロモーターの指示下においてペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を有する、昆虫細胞中のバキュロウイルスベクターなど、遺伝子増幅を伴わない高収率発現系も好適である。

発現ベクターに通常含まれるエレメントとしては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において機能するレプリコン、組換えプラスミドを保有する細菌の選択を可能にする抗生物質耐性を与えるタンパク質をコードする遺伝子、及び真核生物配列の挿入を可能にするプラスミドの非必須領域に固有の制限部位も挙げられる。選択される特定の抗生物質耐性遺伝子は重要ではなく、当技術分野で公知の多くの耐性遺伝子のいずれも好適である。原核生物配列は、必要に応じて、真核細胞におけるＤＮＡの複製を妨害しないように任意に選択されてもよい。抗生物質耐性選択マーカと同様に、既知の代謝経路に基づく代謝選択マーカもまた、形質転換された宿主細胞を選択するための手段として使用され得る。

組換えタンパク質（例えば、本発明のＭＢＫ５０ペプチド又は融合タンパク質）の周辺質発現が望まれる場合、発現ベクターは、発現されるタンパク質のコード配列の５’に直接接続されている、分泌シグナル（例えば、大腸菌ＯｐｐＡ（周辺質オリゴペプチド結合タンパク質）分泌シグナル）又はその改変バージョンなどをコードする配列をさらに含む。このシグナル配列は、細胞質で産生された組換えタンパク質を、細胞膜を通って、細胞膜周辺腔に導く。発現ベクターはシグナルペプチダーゼ１のコード配列をさらに含んでもよく、これは、組換えタンパク質が細胞膜周辺腔に入る場合にシグナル配列を酵素的に切断することができる。組換えタンパク質の周辺質産生についてのより詳細な説明は、例えば、Gray et al., Gene 39:247-254 (1985)、米国特許第６，１６０，０８９号及び米国特許第６，４３６，６７４号に見出すことができる。

トランスフェクション
標準的なトランスフェクション方法を使用して、大量の組換えポリペプチドを発現する細菌、哺乳動物、酵母、昆虫、又は植物の細胞株を生成し、次いで、これらを標準的な技術（例えば、Colley et al., J. Biol. Chem. 264:17619-17622 (1989); Guide to Protein Purification, in Methods in Enzymology, vol. 182 (Deutscher,ed.,1990)を参照）を用いて精製する。真核細胞及び原核細胞の形質転換は、標準的な技術にしたがって実施される（例えば、Morrison, J. Bact. 132:349-351 (1977); Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology 101:347-362 (Wu et al., eds, 1983)。

外来ヌクレオチド配列を宿主細胞へ導入するための周知の手順のいずれを使用してもよい。これらとしては、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム、マイクロインジェクション、プラズマベクター、ウイルスベクター、及びクローニングされたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、又は他の外来遺伝子材料を宿主細胞へ導入するための任意の他の周知の方法（例えば、前出のSambrook and Russellを参照のこと）の使用が挙げられる。使用される特定の遺伝子操作手順が、組換えポリペプチドを発現することができる宿主細胞への少なくとも１つの遺伝子の導入に成功可能であることのみが必要である。

宿主細胞における発現の検出
発現ベクターが適切な宿主細胞に導入された後、トランスフェクトされた細胞は、ペプチドの発現を促進する条件下において培養される。次いで、細胞を組換えポリペプチドの発現についてスクリーニングし、その後、標準的な技術（例えば、Scopes, Protein Purification: Principles and Practice (1982)；米国特許第４，６７３，６４１号；上記のAusubel et al.；及び、前出のSambrook and Russell）を用いて培養物から回収する。

遺伝子発現をスクリーニングするためのいくつかの一般的な方法は、当業者の間で周知である。第１に、核酸レベルで遺伝子発現を検出することができる。核酸ハイブリダイゼーション技術を用いた特異的ＤＮＡ測定及び特異的ＲＮＡ測定の様々な方法が、一般的に使用されている（例えば、前出のSambrook and Russell）。いくつかの方法は、電気泳動分離（例えば、ＤＮＡを検出するためのサザンブロット及びＲＮＡを検出するためのノーザンブロット）を含むが、（例えば、ドットブロットによってなど）ＤＮＡ又はＲＮＡの検出も電気泳動なしで行うことができる。トランスフェクト細胞におけるペプチドをコードする核酸の存在はまた、配列特異的プライマーを用いてＰＣＲ又はＲＴ－ＰＣＲによって検出することもできる。

第２に、遺伝子発現をポリペプチドレベルで検出することができる。特に、本発明のペプチドと特異的に反応するポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を用いて、遺伝子産物のレベルを測定するために、様々な免疫学的アッセイが当業者によって日常的に使用されている（例えば、Harlow and Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Chapter 14, Cold Spring Harbor, 1988; Kohler and Milstein, Nature, 256:495-497 (1975)）。そのような技術は、ペプチドに対する高い特異性を有する抗体を選択することによる抗体調製を必要とする。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を作製する方法は十分に確立されており、それらの説明は文献に見出すことができる（例えば、前出のHarlow and Lane; Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol., 6:511-519 (1976)を参照されたい）。

組換え産生ペプチドの精製
トランスフェクトされた宿主細胞における本発明の組換えペプチドの発現が確認されると、次いで、宿主細胞は、組換えポリペプチドを精製する目的のために適切な規模で培養される。

本発明のペプチドが、通常はプロモーター誘導後に、大量の形質転換細菌によって組換えにより産生される場合、発現は構成的であり得るが、ポリペプチドは不溶性凝集体を形成し得る。タンパク質封入体の精製に適したいくつかのプロトコルがある。例えば、凝集体タンパク質（以下、封入体と称する）の精製は、通常、例えば、約１００～１５０μｇ／ｍＬのリゾチーム及び０．１％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０（非イオン性界面活性剤）の緩衝液中でのインキュベーションによる、細菌細胞の破壊による封入体の抽出、分離、及び／又は精製を含む。細胞懸濁液は、Ｐｏｌｙｔｒｏｎグラインダ（Ｂｒｉｎｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ニューヨーク州、ウェストベリー）を用いて粉砕することができる。あるいは、細胞を氷上で超音波処理することができる。細菌を溶解する代替方法は、Ausubel et al.並びにSambrook and Russell（いずれも前出）に記載されており、当業者には明らかであろう。

細胞懸濁液は、概して遠心分離され、封入体を含有するペレットは、例えば、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、及び２％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００（非イオン性界面活性剤）などの、封入体を溶解しないが洗浄する緩衝液に再懸濁される。可能な限り多くの細胞の残骸を除去するために洗浄工程を繰り返すことが必要な場合がある。封入体の残りのペレットを、適切な緩衝液（例えば、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）に再懸濁してもよい。他の適切な緩衝液が当業者には明らかであろう。

洗浄工程に続いて、強水素受容体であり、かつ強水素供与体でもある溶媒（又は各々がこれらの特性のうちの１つを有する溶媒の組合せ）の添加によって、封入体を可溶化する。次いで、封入体を形成したタンパク質を、適合する緩衝液による希釈又は透析によって再生することができる。好適な溶媒としては、尿素（約４Ｍ～約８Ｍ）、ホルムアミド（約８０％以上、体積／体積基準）、及び塩酸グアニジン（約４Ｍ～約８Ｍ）が挙げられるが、これらに限定されない。ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）及び７０％ギ酸などの凝集体形成タンパク質を可溶化することができるいくつかの溶媒は、免疫原性及び／又は活性の欠如を伴うタンパク質の不可逆的変性の可能性のため、この手順での使用には不適切であり得る。塩酸グアニジン及び類似の薬剤は変性剤であるが、この変性は不可逆的ではなく、変性剤の（例えば、透析による）除去又は希釈の際に再生が起こり得るので、目的の免疫学的及び／又は生物学的に活性なタンパク質の再形成を可能にする。可溶化後、タンパク質は、標準的な分離技術によって他の細菌タンパク質から分離することができる。細菌封入体からの組換えポリペプチドの精製のさらなる説明については、例えば、Patra et al., Protein Expression and Purification 18:182-190 (2000)を参照されたい。

あるいは、細菌周辺質から組換えポリペプチドを精製することが可能である。組換えタンパク質が細菌の周辺質に輸送される場合、細菌の周辺質画分は、当業者に公知の他の方法（例えば、前出のAusubel et al.を参照）に加えて、冷浸透圧ショックによって単離することができる。周辺質から組換えタンパク質を単離するために、細菌細胞を遠心分離してペレットを形成する。ペレットを、２０％スクロースを含有する緩衝液に再懸濁する。細胞を溶解するために、細菌を遠心分離し、ペレットを氷冷５ｍＭ ＭｇＳＯ_４に再懸濁し、およそ１０分間氷浴中に保持する。細胞懸濁液を遠心分離し、上清をデカントし、保存する。上清中に存在する組換えタンパク質は、当業者に周知の標準的な分離技術によって宿主タンパク質から分離することができる。

精製のためのタンパク質分離技術
組換えポリペプチドが可溶性形態で宿主細胞において発現される場合、その精製は、本明細書に記載の標準的なタンパク質精製手順に従うことができる。そのような標準的な精製手順はまた、化学合成から得られたポリペプチドの精製にも好適である。

溶解性分画
最初の工程として多くの場合では、タンパク質混合物が複雑である場合、最初の塩分画は、目的の組換えタンパク質から望ましくない宿主細胞タンパク質（又は細胞培養培地に由来するタンパク質）の多くを分離することができる。好ましい塩は硫酸アンモニウムである。硫酸アンモニウムは、タンパク質混合物中の水の量を効果的に減少させることによってタンパク質を沈殿させる。次いで、タンパク質は、それらの溶解性に基づいて沈殿する。タンパク質が疎水性であるほど、より低い硫酸アンモニウム濃度で沈殿する可能性が高くなる。典型的なプロトコルは、得られる硫酸アンモニウム濃度が２０％～３０％になるように、飽和硫酸アンモニウムをタンパク質溶液に添加することである。これにより、最も疎水性のタンパク質が沈殿する。沈殿物を、（目的のタンパク質が疎水性でない限り）廃棄し、目的のタンパク質を沈殿させることが知られている濃度まで上清に硫酸アンモニウムを添加する。次いで、沈殿物を緩衝液に可溶化し、必要に応じて、透析又は透析濾過のいずれかによって過剰な塩を除去する。冷エタノール沈殿などのタンパク質の溶解性に依存する他の方法は、当業者に周知であり、複雑なタンパク質混合物を分画するために使用することができる。

サイズ差次的濾過
計算された分子量に基づいて、異なる孔径の膜（例えば、Ａｍｉｃｏｎ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ膜）を通した限外濾過を用いて、より大きいサイズ及びより小さいサイズのタンパク質を単離することができる。第１の工程として、タンパク質混合物を、目的のタンパク質、例えばＭＹＣ阻害ペプチドの分子量よりも低い分子量カットオフを有する孔径を有する膜を通して限外濾過を行う。次いで、限外濾過の保持液を、目的のタンパク質の分子量より大きい分子カットオフを有する膜に対して限外濾過を行う。組換えタンパク質は膜を通過して濾液に入る。次いで、以下に記載されるように濾液をクロマトグラフィーに供することができる。

カラムクロマトグラフィー
目的のタンパク質（本発明のペプチドなど）はまた、それらのサイズ、正味の表面電荷、疎水性、又はリガンドに対する親和性に基づいて、他のタンパク質から分離することもできる。さらに、ペプチドに対して産生された抗体を、カラムマトリックスに複合体化し、対応するペプチドを免疫精製することができる。これらの方法の全ては当技術分野で周知である。クロマトグラフィー技術は、任意の規模で、多くの異なる製造業者（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）からの装置を用いて実施することができることが、当業者には明らかであろう。

５．ＭＹＣ活性の阻害の評価
いくつかの方法のいずれかを使用して、細胞、例えばＭＹＣ依存性がん細胞におけるＭＹＣ活性のレベルを評価することができる。任意のＭＹＣ発現細胞を使用することができる。特定の実施形態では、原発性滲出液リンパ腫（ＰＥＬ）細胞、例えばＢＣ－１、ＢＣ－３、ＢＣＢＬ－１、又はＢＪＡＢ細胞などが使用される。

いくつかの実施形態では、この方法は、ＲＴ－ＰＣＲ、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ、半定量的ＲＴ－ＰＣＲ、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、定量的ＲＴ－ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）、多重分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）アッセイ、マイクロアレイハイブリダイゼーション、又は配列分析（例えば、ＲＮＡ配列決定（「ＲＮＡ－Ｓｅｑ」））などの日常的な技術を用いて分析することができる、ＭＹＣ（例えば、ｍＲＮＡ）発現の検出を伴う。ポリヌクレオチド発現を定量化する方法は、例えば、Fassbinder-Orth, Integrative and Comparative Biology, 2014, 54:396-406; Thellin et al., Biotechnology Advances, 2009, 27:323-333;及びZheng et al., Clinical Chemistry, 2006, 52:7 (doi: 10/1373/clinchem.2005.065078)に記載される。いくつかの実施形態では、リアルタイムＰＣＲ若しくは定量的ＰＣＲ又はＲＴ－ＰＣＲが、生物学的試料におけるポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）のレベルを測定するために使用される。例えば、Nolan et al., Nat. Protoc, 2006, 1:1559-1582; Wong et al., BioTechniques, 2005, 39:75-75を参照されたい。遺伝子発現を測定するための定量的ＰＣＲアッセイ及びＲＴ－ＰＣＲアッセイもまた市販されている（例えば、TaqMan(登録商標）Gene Expression Assays, ThermoFisher Scientific）。

いくつかの実施形態では、この方法は、例えば、当業者に公知である免疫測定法、二次元ゲル電気泳動、及び定量的質量分析などの日常的な技術を用いる、ＭＹＣタンパク質レベルの検出を伴う。タンパク質定量化技術は、概して、“Strategies for Protein Quantitation,” Principles of Proteomics, 2nd Edition, R. Twyman, ed., Garland Science, 2013に記載されている。いくつかの実施形態では、タンパク質の発現又は安定性は、酵素多重免疫測定法（ＥＭＩＴ）、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、ＩｇＭ抗体捕捉ＥＬＩＳＡ（ＭＡＣ ＥＬＩＳＡ）、及び微粒子酵素免疫測定法（ＭＥＩＡ）などの酵素免疫測定法（ＥＩＡ）；キャピラリ電気泳動免疫測定法（ＣＥＩＡ）；放射性免疫測定法（ＲＩＡ）；免疫放射定量測定法（ＩＲＭＡ）；免疫蛍光法（ＩＦ）；蛍光偏光免疫測定法（ＦＰＩＡ）；並びに、化学発光免疫測定法（ＣＬ）によって検出されるが、これらに限定されない。必要に応じて、そのような免疫測定法を自動化することができる。免疫測定法はまた、レーザー誘起蛍光と併せて使用することもできる（例えば、Schmalzing et al., Electrophoresis, 18:2184-93 (1997); Bao, J. Chromatogr. B. Biomed. Sci., 699:463-80 (1997)を参照されたい）。

いくつかの実施形態では、ペプチドは、インビトロでＭＹＣ依存性がん細胞増殖を阻害する能力を決定することによって評価される。例えば、培養中のＢＣ３細胞などのＰＥＬ細胞の増殖及び／又は生存は、例えば、ＭＴＳアッセイを用いて測定することができる。いくつかの実施形態では、ＮＵ－ＤＵＬ－１などのヒト悪性リンパ腫細胞などの細胞の増殖、例えば、軟寒天中でのそれらの増殖を評価することができる。

ペプチドはまた、インビボで動物モデルを用いて、例えば、ＰＥＬ細胞異種移植片モデルなどの異種移植片モデルにおける腫瘍増殖アッセイで評価することができる。

単離されたＭＢＫ５０ペプチド、並びにＭＢＫ５０ペプチドを含むより大きなペプチド又はポリペプチド、並びに抗体又は他のエレメントを含むペプチドもまた、それらの薬物動態学的特性及び／又は薬力学的特性について評価することができる。いくつかの実施形態では、ペプチド及び／又は融合タンパク質の安定性が評価され、例えばインビボで評価される。いくつかの実施形態では、ペプチド及び／又は融合タンパク質の局在化は、例えば、融合タンパク質内の抗体によって標的化される細胞の近傍を含む、インビボでの局在化が評価される。特定の実施形態では、ペプチドは、ＰＫ／ＰＤモデリングを用いて評価される（例えば、Danhof et al., (2008) Trends in Pharm. Sci. 29(4):186-191; Standing (2017) Br. J. Clin. Pharmacol. 83:247-254）。

いくつかの実施形態では、配列番号１のＭＢＫ５０ペプチド若しくは配列番号１に由来するＭＢＫ５０ペプチド、又はその融合ペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、ウイルスベクターを用いることによって、意図するレシピエントに送達される。好適なウイルスベクターは、ヒトアデノウイルス又は動物のアデノウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、マウス微小ウイルス（ＭＶＭ）、ＨＩＶ、シンドビスウイルス、及びレトロウイルス（ラウス肉腫ウイルス及びレンチウイルスを含むが、これらに限定されない）、及びモロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）などのゲノムに由来し得る。通常は、目的のコード配列（例えば、本明細書に記載される、配列番号１若しくはその誘導体又はその融合タンパク質をコードするもの）を、そのようなベクターへ挿入して、通常は付随するウイルスＤＮＡと共に遺伝子構築物をパッケージングして感受性宿主細胞を感染させ、目的のコード配列を発現させる。他の実施形態では、配列番号１のＭＢＫ５０ペプチド若しくは配列番号１に由来するＭＢＫ５０ペプチド、若しくはその融合ペプチド、ペプチド若しくは融合ペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、又はポリヌクレオチドコード配列を含む発現カセットなどのベクターを含む細胞は、本明細書に記載の医薬組成物中で意図されたレシピエントへ送達される。

６．用量及び投与
対象
対象は、過剰なＭＹＣ活性に関連した状態を伴う、任意の対象、例えばヒト又は別の哺乳動物であり得る。特定の実施形態では、対象は、原発性滲出液リンパ腫（ＰＥＬ）又は多発性骨髄腫などのＭＹＣ依存性がんを有する。いくつかの実施形態では、対象は、Ｂ細胞又はＴ細胞などの不適切に活性化されたリンパ球系細胞を伴う炎症性障害を有する。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。いくつかの実施形態では、対象は、成人である。いくつかの実施形態では、対象は、子供（例えば、早老症の子供）である。いくつかの実施形態では、対象は、女性（例えば、成人女性）である。いくつかの実施形態では、対象は、男性（例えば、成人男性）である。

医薬組成物
本開示は、ＮＣｏＡ２及びＳＷＩ／ＳＮＦ複合体成分ペプチドに結合して、細胞内のＭＹＣ活性を阻害することができる単離ＭＢＫ５０ペプチド及び／又は精製ＭＢＫ５０ペプチドと、薬学的に許容される担体と、を含む、組成物を提供する。したがって、本開示は、対象の細胞においてＭＹＣ活性を阻害するため、対象におけるＭＹＣ依存性がん細胞又はＢ細胞若しくはＴ細胞などの不適切に活性化されたリンパ球系細胞を殺傷するため、及び対象におけるＭＹＣ依存性がん又は自己免疫疾患などの炎症性障害を治療するための、医薬組成物を提供する。

本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される担体を含み得る。ある特定の態様では、薬学的に許容される担体は、投与される特定の組成物、及び組成物を投与するために使用される特定の方法によって、部分的に決定される。したがって、本発明の医薬組成物の多種多様な好適な製剤が存在する（例えば、REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18TH ED., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990)を参照されたい）。

医薬組成物は、多くの場合、１又は複数の緩衝液（例えば、中性緩衝食塩水又はリン酸緩衝食塩水）、炭水化物（例えば、グルコース、マンノース、スクロース、又はデキストラン）、マンニトール、タンパク質、ポリペプチド又はグリシンなどのアミノ酸、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム、ブチル化ヒドロキシトルエン、ブチル化ヒドロキシアニソールなど）、細菌発育阻止因子、ＥＤＴＡ又はグルタチオンなどのキレート剤、製剤をレシピエントの血液と等張性、低張性、又は弱高張性にする溶質、懸濁化剤、増粘剤、保存剤、香味剤、甘味剤、及び着色化合物を、必要に応じてさらに含むことになる。

本発明の医薬組成物は、投与製剤と適合する様式で、及び治療的又は予防的に有効となる量で投与される。投与される分量は、例えば、個体の年齢、体重、身体活動、遺伝形質、健康全般、性別、及び食事、治療又は予防される状態又は疾患、並びに状態又は疾患の病期又は重症度を含む、様々な因子に依存する。ある特定の実施形態では、投与のサイズはまた、特定の個体における治療剤（群）又は予防剤（群）の投与に伴う、任意の有害な副作用の存在、性質、及び程度によって決定され得る。任意の特定の患者に対する特定の用量レベル及び投与頻度に影響を及ぼし得る他の因子としては、採用される特定の化合物の活性、その化合物の代謝安定性及び作用の長さ、投与の様式及び時間、並びに排泄速度が挙げられる。

概して、治療目的又は予防目的のために、化合物（例えば、ＭＢＫ５０ペプチド若しくはそのバリアント及び異種部分を含む複合体、又はＭＢＫ５０ペプチド若しくはそのバリアント及び異種ポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする核酸、又はリポソーム形態）を投与するために、化合物は、治療的又は予防的に有効な用量で投与される。特に、本発明の医薬組成物の有効量は、対象の１又は複数の細胞においてＭＹＣ活性を阻害する、又は対象においてＭＹＣ依存性がん細胞の増殖を遅延、予防、若しくは逆転させるのに十分な量である。

ある特定の実施形態では、用量は、固体、半固体、凍結乾燥粉末、又は液体剤形の形態、例えば、錠剤、丸剤、ペレット剤、カプセル剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、坐剤、停留浣腸剤、クリーム剤、軟膏、ローション剤、ゲル剤、エアロゾル剤、又は泡剤などの形態、好ましくは正確な投与量の単純な投与に好適な単位剤形の形態であり得る。

本明細書で使用される場合、「単位剤形」という用語は、ヒト及び他の哺乳動物のための単位用量として好適な物理的に別個の単位（例えば、アンプル）を指し、各単位は、好適な医薬品賦形剤と組み合わせて、所望の発症、耐容性、及び／又は治療効果若しくは予防効果をもたらすように計算された、所定量の治療薬又は予防薬を含有する。さらに、より濃縮された剤形を調製することができ、そこからより希釈された単位剤形を生成することができる。したがって、より濃縮された剤形は、例えば、１倍以上、２倍以上、３倍以上、４倍以上、５倍以上、６倍以上、７倍以上、８倍以上、９倍以上、１０倍以上、又はそれを超える量の治療用化合物又は予防用化合物を実質的に含有することになる。

そのような剤形を調製する方法は当業者に公知である（例えば、前出のREMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCESを参照されたい）。剤形は、通常、従来の医薬担体又は非薬効成分を含み、かつ、他の医薬剤、担体、アジュバント、希釈剤、組織透過促進剤、及び可溶化剤などを追加的に含み得る。適切な非薬効成分は、当技術分野で周知の方法（例えば、前出のREMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCESを参照されたい）によって特定の剤形及び投与経路に適合させることができる。

投与
いくつかの実施形態では、予防及び／又は治療は、本発明の組成物を対象へ直接投与することを含む。非限定的な例として、本発明の医薬組成物（例えば、本発明のＭＹＣ阻害ペプチド複合体、ＭＹＣ阻害ペプチドを含む融合タンパク質をコードする核酸、又は本明細書中に記載されるようなＭＹＣ阻害ペプチドを含む融合タンパク質をコードする発現カセットを含むそのような核酸を含む改変細胞＋薬学的に許容される担体を含む）は、対象へ（例えば、局所適用又は全身投与によって）直接送達され得る。

本発明の組成物は、単回用量として、又は複数回用量、例えば約１カ月、約２カ月、約３カ月、約６カ月、又は約１２カ月の間隔で投与される二回用量として投与され得る。他の好適な投与スケジュールは医療従事者によって決定することができる。

いくつかの実施形態では、追加的な化合物又は薬物療法を対象へ同時投与することができる。そのような化合物又は薬物療法は、治療されている疾患の徴候又は症状を緩和すること、ペプチドによる処置によって引き起こされる副作用を低減すること、異なる機構を介してがんの増殖を低減すること又はがん細胞を殺傷することなどを目的として、同時投与され得る。

本発明の医薬組成物は、対象へ局所的又は全身的に、例えば、腹腔内、筋肉内、動脈内、経口、静脈内、頭蓋内、髄腔内、脊髄内、病巣内、鼻腔内、皮下、脳室内、局所的に、及び／又は吸入によって投与することができる。

７．キット
別の態様では、キットが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、キットは、本発明のＭＢＫ５０ペプチド及び／又は融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、キットは、対象における、ＭＹＣ依存性がん細胞又はＢ細胞若しくはＴ細胞などのリンパ球系細胞の増殖を、低下、遅延、停止、又は逆行させるためのものである。いくつかの実施形態では、キットは、疾患、例えばＰＥＬなどのがん又は自己免疫疾患を予防又は治療するためのものである。

本発明のキットは、（例えば、箱又は蓋を有する他の容器内に）安全又は便利な保管又は使用を可能にする方法で包装することができる。通常、本発明のキットは、１又は複数の容器を含み、各容器は、試薬及び対照試料などの特定のキット成分を保存する。容器の選択は、その内容物の特定の形態、例えば、液体形態、粉末形態などであるキット構成要素に依存する。さらに、容器は、キット構成要素の貯蔵寿命を最大にするように設計された材料で作製することができる。非限定的な例として、感光性であるキット構成要素は、不透明な容器に保存することができる。

いくつかの実施形態では、キットは、組成物（すなわち、本発明の医薬組成物）を対象へ投与するのに有用な、１又は複数の要素、例えばシリンジを備える。さらに他の実施形態では、キットは、使用説明書、例えば、本発明の方法を実施するための指示書（すなわち、プロトコル）（例えば、細胞におけるＭＹＣ活性を阻害するための、又はＭＹＣ依存性がん若しくは自己免疫疾患などの炎症状態を有する対象を治療するための、キットを用いるための説明書）を備える。説明書は、通常、文書又は印刷された資料を含むが、これらに限定されない。そのような説明書を保存し、それらをエンドユーザに伝達することができる任意の媒体が、本発明によって企図される。そのような媒体には、電子記憶媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）及び光学媒体（例えば、ＣＤ－ＲＯＭ）などが含まれるが、これらに限定されない。そのような媒体は、そのような説明資料を提供するインターネットサイトへのアドレスを含んでもよい。

本発明を、具体例を用いてより詳細に説明する。以下の実施例は、例示のみを目的として提供されており、決して本発明を限定することを意図するものではない。当業者は、本質的に同じ結果をもたらすように変更又は修正することができる、様々な重要でないパラメータを容易に認識するであろう。

実施例１．ウイルスタンパク質配列由来のがん薬物を標的とする転写活性複合体
本発明者らは、最近、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）によってコードされるウイルスタンパク質がＭＹＣ転写機能を乗っ取ることを見出した。本発明者らは、生化学的アプローチ及び遺伝的アプローチを用いて、原因となるドメイン及び分子機構をマッピングした（図１）。機構的には、ウイルスタンパク質は、その機能がＭＹＣ発現及びＭＹＣトランス活性化にとって重要である、細胞コアクチベーターのＮＣｏＡ２と物理的に相互作用する。本発明者らの研究は、ＭＹＣからコアクチベーター複合体を乗っ取ることによって、ウイルスが感染細胞において自身の＋８０遺伝子転写を大幅に活性化することを示した。その後の研究により、他のガンマヘルペスウイルスで保存されている１３アミノ酸配列ストレッチ（図２）が、コアクチベーターとの相互作用に重要であったことが同定された。注目すべきことに、変異（対照）ペプチドではなくペプチドを、ＭＹＣ依存性がんであるＰＥＬへ送達することで、がん細胞を殺傷した（図１Ｊ）。トランスクリプトーム研究は、ペプチドが、偽発見率０で最も高い濃縮スコアを持つＭＹＣ経路を標的とすることを、明確に実証した。したがって、ＭＢＫ５０（ＭＹＣ Ｂｕｓｔｅｒ ＫＳＨＶ ＯＲＦ５０）と命名された本発明者らのペプチドは、ＭＹＣを特異的かつ効果的に標的とし、これは、最終的には創薬が困難な薬物を投与するための独特のアプローチを表す。さらに、本発明者らの最近の異種移植片研究は、宿主（ＮＲＧ）マウスに対するいかなる測定可能な毒性もなしに、ＰＥＬを標的とするＭＢＫ５０の有効性を実証した。

アプローチ：
概要：最近のゲノミクス研究により、他の細胞タンパク質とのＮＣｏＡ２融合が異なるがん型で頻繁に起こることが同定された。これは、ＮＣｏＡ２が、動員されたゲノム部位に遺伝子エンハンサーを確立する能力を有するという本発明者らのモデルと一致する（図１）。ペプチドが実際に他のコアクチベーター酵素によるＮＣｏＡ２タンパク質複合体形成の阻害を介してエンハンサー形成を標的としている場合（図１Ｃ）、このペプチド薬物は、ＭＹＣ依存性がん細胞に加えて、ＮＣｏＡ２遺伝子再構成を有するがん細胞に対してさらに有効であるはずである。したがって、本明細書の他の箇所に記載されるように、本発明者らは、アミノ酸配列を改変することによってペプチドの安定性を増加させる。第２に、その小さなサイズを利用して、本発明者らは、融合タンパク質として、又はＦＤＡ承認の抗体ベースの薬物との化学的な複合体として、ペプチドを調製及び発現させる。本発明者らは、本発明者らのペプチドを既存の抗体ベースの薬物に複合体化することによって、がん細胞殺傷の効果の有効性及び特異性が増加するはずであると仮定する。本発明者らのペプチドと（ＡＤＣの場合のような）毒素複合体との重要な違いは、本発明者らのペプチドががん細胞の大部分で上昇するが、正常細胞では上昇しないＭＹＣ経路を標的としている点である。したがって、ＭＹＣ活性化は正常細胞において厳密に制御されているので、本発明者らのペプチドは正常な静止細胞に害を及ぼさないはずである。これは、本発明者らの異種移植片研究で見られた毒性の欠如と一致する。

ラットにおいて、特許問題を回避するためにアミノ酸を置換し、安定性を高め、ＰＫ／ＰＤを測定することによる、新規ペプチドの設計
天然配列の特許的制限を回避するために、本発明者らは、アミノ酸を、（ｉ）非天然配列を有し、かつ（ｉｉ）ペプチドの安定性を増加させるように改変する。ＭＢＫ５０の１３アミノ酸内で、９アミノ酸は、５種類の異なる型のガンマヘルペスウイルス間で完全に保存されていた。しかしながら、４つのアミノ酸は、類似の生化学的特性を有するにもかかわらず、わずかに異なる（図２）。この遺伝子の本質的な機能を依然として保持しているガンマヘルペスウイルスにおける進化は、それらのアミノ酸位置が交換可能であることを示唆している。したがって、本発明者らは、ＭＢＫ５０ペプチド（群）中のアミノ酸を置換して、生物学的活性を保持しているはずである「非天然ペプチド配列」を産生する。次に、本発明者らは、図１Ｈ～図１ＪのようにＭＹＣ阻害の有効性を試験する。さらに、Ｃ末端の２つのアミノ酸もまたＤ－アミノ酸に改変される。Ｄ－アミノ酸への変更は、血清中での分解を防止することにより、安定性をさらに高めることが期待される（４）。

インビトロでのペプチドの細胞殺傷効果に基づいて、本発明者らは、２つのペプチドを選択し、かつ異種移植片モデルにおいて腫瘍増殖を阻害する効果を調べる。本発明者らはＰＥＬ細胞異種移植片モデルを使用する。これは、（ｉ）ＰＥＬがＫＳＨＶ感染によって引き起こされ、かつ本発明者らがＫＳＨＶタンパク質配列に基づいて薬物ペプチドを開発しているため、（ｉｉ）本発明者ら自身の研究室で異種移植片モデルを既に確立しているため、並びに（ｉｉｉ）ＰＥＬが、Ｂ細胞リンパ腫の非常に攻撃的なサブタイプであり、また非常にまれながんであり、オーファンドラッグとしてのＦＤＡレビュープロセスを促進し、将来の臨床試験数が少なくなるためである。ＰＥＬの現在の臨床アプローチはうまく機能せず、本発明者らは新しい方向を緊急に必要としている。標準化されたＰＫ／ＰＤ研究は、UCD comprehensive cancer centerのＰＫ／ＰＤコア施設でラットモデルにおいて完了される。

実施例２：ＭＢＫ５０ペプチドによるブラストＢ細胞の標的化
ＣＤ１９^＋Ｂ細胞を、健常ドナーのＰＢＭＣから磁気ビーズを用いて単離した（ｎ＝１）。細胞を洗浄し、９６ウェルプレート中、１×１０^６／ｍＬ（１ウェル当たり２００μＬ、三連）で、ｓＣＤ４０Ｌ（１μｇ／ｍＬ）を用いて、又は用いずに、ＭＢＫ５０（１６μＭ若しくは３２μＭ）又は変異ペプチド（３２μＭ）の存在下において、２日間培養した。生細胞を、図３の左パネルに示すように、生／死赤色染色を用いて決定した（生細胞は赤色染色陰性集団としてゲーティングされる）。生細胞の頻度（％）を図３の中央パネルに示す。３２μＭのＭＢＫ５０は総細胞数を増加させたが、生細胞割合（％）の減少を示し、これは、Ｂ細胞におけるペプチドによる活性化細胞死の誘導を示した。ペプチド薬物は活発に複製するＢ細胞を標的とし、これはＭＹＣを標的とするＭＢＫ５０と一致する。

Ｂ細胞を、健常ドナーのＰＢＭＣから磁気ビーズを用いて調製した（ｎ＝２）。ＭＢＫ５０（１６μＭ、３２μＭ）又は変異ペプチド（３２μＭ）を用いて、又は用いずに、示した濃度のｓＣＤ４０Ｌ（Ｔ細胞依存性刺激）又はＯＤＮ ２００６（ＴＬＲ９リガンド）（Ｔ細胞非依存性刺激）の存在下における、９６ウェルＵ底プレートでのＢ細胞培養の代表的な写真。各ウェルの細胞体積の半径は、総細胞数とおおよそ相関する。細胞体積は、ドナー＃４６についてはＯＤＮ又はｓＣＤ４０Ｌ刺激の際に３２μＭのＭＢＫ５０によって有意に減少され、ドナー＃４７についてはそれ未満であった。

これらの結果は、このペプチドが、活性化Ｂ細胞の増殖を阻止するために使用することができ、したがって、ループスなどの自己免疫疾患における病原性Ｂ細胞増殖を治療するために使用することができることを示している。

実施例３：ＭＢＫ５０ペプチドによる芽球化Ｔ細胞の標的化
ヒトＣＤ３Ｔ細胞に対するペプチドの効果を評価するために、ＣＤ３Ｔ細胞を、５人の健常ドナー由来のＰＢＭＣ試料から磁気ビーズ（ＣＤ３陽性選択ビーズ、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて濃縮し、抗ＣＤ３／２８四量体（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で三連にて１６時間刺激した後、ＰＢＳ、ＭＢＫ５０（３２μＭ）、及び変異ペプチド（３２μＭ）で２４時間処理した。培養物中の活性化増殖ＩＲＦ４^＋Ｋｉ６７^＋ＣＤ３ Ｔ細胞（図５の赤色の四角）を、生／死赤色染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、並びに抗Ｋｉ６７－ＦＩＴＣ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）及び抗ＩＲＦ４－ＡＰＣ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）による細胞内染色によって分析した。代表的なフローサイトメトリープロファイルを、ゲーティングした生ＣＤ３Ｔ細胞集団について図５（ａ）に、及びゲーティングした生ＣＤ３Ｔ細胞について図５（ｂ）のＫｉ６７対ＩＲＦ４に示す。図５（ｃ～ｅ）については、生細胞％（ｃ、ｎ＝５）、総ＣＤ３Ｔ細胞数（ｄ、ｎ＝５）、及びＫｉ６７^＋細胞％（ｅ、ｎ＝３）についての各実験における三連培養物の平均を、上部パネルに示す。下部パネルはＰＢＳ対照培養物に対する正規化データである。Ｐ値は、一対比較法によるｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ分析を用いてＰｒｉｓｍで計算した。ｐ＜０．０５ 統計学的に有意。

これらの結果は、ＭＢＫペプチドが活発に分裂している細胞を再び優先的に標的とすることを示している。ペプチド薬物は、自己免疫疾患又は急性炎症性疾患の使用に対する指標である大幅なリンパ球系細胞の増殖の弱毒化によって、急性炎症中のＴ細胞増殖を阻害するために使用することができる。

実施例４：ＭＢＫ５０ペプチドは異なる有効性で他の細胞型を標的とする
図６Ａに示すように、複数のがん細胞株をＭＴＴアッセイに使用して、異なる濃度のＭＢＫ５０ペプチドのがん細胞殺傷効果を評価した（細胞生存率試験）。様々な濃度（０μＭ、２μＭ、４μＭ、８μＭ、１６μＭ、３２μＭ、６４μＭ、９６μＭ）のペプチドを、示された細胞株とインキュベートした：ＢＣＢＬ－１（原発性滲出液リンパ腫細胞株）、Ｒａｍｏｓ（バーキットリンパ腫細胞株）、ＳＵ－ＤＨＬ－１０（大細胞型Ｂ細胞リンパ腫）、ＨＨ（Ｔ細胞非ホジキンリンパ腫）、Ｊｕｒｋａｔ（急性Ｔ細胞白血病細胞株）、ＴＨＰ－１（単球）、Ｕ９３７細胞株（単球）、及びＡ５４９（肺上皮細胞株）を、比較のために使用した。結果は、ペプチド薬物がリンパ球系細胞株に対してより効果的であることを示している。重要なことに、健常ドナー由来のヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、生／死染色後にフローサイトメトリーによって評価した場合、骨髄系及びリンパ系のがん細胞株（例えば、ＴＨＰ－１及びＢＣＢＬ－１）と比較して、ＭＢＫ媒介性殺傷に対する感受性がおよそ１０倍低かった（図６Ｂ）。したがって、適切に選択された用量の場合、ＭＢＫ５０は、正常な細胞及び組織を損傷することなくがんを選択的に殺傷することができる。

実施例５：ペプチド薬物はＢＣＬ２変異非ホジキンＢ細胞リンパ腫を標的とする
ＢＣＬ２変異はＢ細胞リンパ腫で頻繁に見られ、この細胞型は抗アポトーシス表現型に起因して化学療法に対し難治性であることが多い。結果は、ペプチド薬物が依然としてＢＣＬ２陰性リンパ腫細胞株に作用し、これはペプチド薬物に価値を付加することを示す。さらに、欠失ペプチドを用いて必須ロイシン残基を同定する。ペプチド１及びペプチド３は両方ともＮＵ－ＤＵＬ１細胞増殖を阻害したが、ロイシン（ペプチド２）の欠失は機能を減少させた。図７を参照されたい。

実施例６：非天然ペプチドの産生及びインビトロでの細胞殺傷におけるそれらの有効性
アミノ酸配列アラインメントにより、他のガンマヘルペスウイルスタンパク質配列における相同なタンパク質配列が同定された（図８Ａの上部の表、図２にも示されている）。それらのアラインメントに基づいて、「非天然」タンパク質配列を、特定のアミノ酸の置換によって産生した（ペプチドは、図８Ａの下部の表の上から下に向かって、Ｗｔ ｄ１－１、ＤＳ ３－１、ＤＥ ３－１、及びＭｕｔ ｄ１－１（対照ペプチド）である）。これらの４つのペプチドを図８ＢのＭＴＴアッセイで使用して、ＢＣＢＬ－１原発性滲出液リンパ腫（ＰＥＬ）細胞株の細胞増殖に対する効果を調べた。１つのＤ－アミノ酸ペプチド（Ｎ末端）（Ｗｔｄ３－１）と比較して、最初の２つのアミノ酸及びｃ末端アミノ酸（ＳＴｄ３－１）の３つのＤ－アミノ酸置換もまた試験する。図８Ｂは、５つのペプチド（Ｗｔ ｄ１－１、ＤＳ ３－１、ＤＥ ３－１、ＳＴ ｄ３－１、及びＷｔ ｄ３－１）が、Ｍｕｔ ｄ１－１対照ペプチドと比較して、同様の効力でインビトロにてＢＣＢＬ－１細胞を殺傷したことを示す。ＢＣＢＬ－１ ＰＥＬ細胞株のインビボ異種移植片試験はまた、ペプチドＷｔ ｄ１－１及びペプチドＷｔ ｄ３－１（１つのＤ－アミノ酸野生型配列を有する３つのＤ－アミノ酸を意味する）は共に、類似の抗腫瘍増殖効果を有することを示した。

実施例７：ＳＬＡＭ－ＳｅｑによるＭＢＫ５０標的の同定
直交化学に基づくＲＮＡ配列決定技術であるＲＮＡの代謝配列決定（ＳＬＡＭ－Ｓｅｑ）のためのチオール（ＳＨ）結合アルキル化は、ＲＮＡ種における４－チオウリジン（ｓ４Ｕ）取り込みを単一ヌクレオチド分解能で検出する。ＳＬＡＭ－Ｓｅｑ法を用いて、ＢＣ－１細胞をペプチド薬物と共にインキュベートし、アラニンに対する３つのアミノ酸置換を有するペプチドを対照ペプチドとして使用した。ペプチド薬物をＢＣ－１細胞培養物（２４μＭ）中でインキュベートし、３０分間の薬物インキュベーション後、４ｓＵ（最終濃度３００μＭ）を培養培地に１時間添加した。１時間の４ｓＵインキュベーションの最後に全ＲＮＡを単離し、アルキル化ＲＮＡ試料をＳＬＡＭ－Ｓｅｑに供した。試料は二連とし、モック処理細胞（Ｐ＜０．０５）に対する遺伝子発現の変化を赤色でマークした。変異ペプチドではなく野生型ペプチドが、複数の細胞遺伝子発現を阻害した（図９の右側パネル、赤色ドットでマーク、Ｐ＜０．０５）。ＩＧＶビューアを使用してＭＹＣ領域の配列リードを可視化した（第８染色体）。Ｔ→Ｃ変異を含有する転写種は、ＭＢＫ５０ペプチドの存在下において有意に減少したが、変異ペプチドの存在下では減少しなかった。ＢＣＢＬ－１細胞及びＢＣ－１細胞の両方におけるＭＹＣ下方制御のＬｏｇ２倍率変化及び調整されたＰ値を、パネルの下方に示す。最後に、薬物処置から２４時間後の総ＲＮＡ配列の遺伝子セットエンリッチメント解析は、ＭＹＣ標的遺伝子下方制御の濃縮を示した。これは、野生型ペプチド（ＭＢＫ５０）の存在下におけるＭＹＣ発現の有意な阻害と一致する。

実施例８：カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）複製の阻害
ペプチド配列は、ＫＳＨＶトランス作用因子タンパク質配列に基づいており、このペプチドは、細胞トランス活性化複合体の動員のためにウイルストランス活性化タンパク質と競合することが予想される。本発明者らは、ＫＳＨＶ自然感染Ｂ細胞においてペプチド薬物とのインキュベーションを継続し、抵抗性細胞（ＲＣ）を産生した。次いで、抵抗性細胞を使用して、親細胞を全ＲＮＡ配列決定と比較することによって推定薬物標的を同定した。図１０に示すように、最も有意に変化した遺伝子発現を同定するＺスコアデータは、潜伏感染したＫＳＨＶ遺伝子発現が継続したペプチドインキュベーションによって有意に下方制御されたことを実証している。結果は、このペプチド薬物をＫＳＨＶ感染Ｂ細胞へ送達することが、Ｍｙｃ下方制御を介して原発性滲出液リンパ腫を死滅させるだけでなく、潜伏感染したＫＳＨＶ複製もまた抑制することを示し、ＫＳＨＶ関連悪性腫瘍（例えば、カポジ肉腫、多中心性キャッスルマン病、及び原発性滲出液リンパ腫）を使用する二重の利益を実証している。

実施例９：インビボでの炎症性サイトカイン生成の阻害
ヒトリンパ球によるサイトカイン生成に対するペプチドの効果を、インビトロ培養系によって試験した。ＰＢＭＣを、抗ＣＤ３抗体により、ＰＢＳ、ＭＢＫ５０（３２μＭ）、又は変異ペプチド（３２μＭ）の存在下において二連で４８時間刺激した。上清を回収し、１０種類の一般的なサイトカイン（ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮγ、ＴＮＦα）について、Ｌｕｍｉｎｅｘによりヒト１０プレックスビーズアッセイキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてアッセイした。アッセイ条件では、７種類のサイトカイン（図１１に示す）が検出された。全てのサイトカインは、活性化ＣＤ３Ｔ細胞によって主に生成された非刺激（青色、ＣＤ３なし）培養物と比較して、抗ＣＤ３抗体（赤色、ＣＤ３－ＰＢＳ）で刺激された培養物において、実質的に増加した。ＩＬ－１β及びＴＮＦαを除く全てのサイトカインレベルは、未処理対照（赤色、ＣＤ３－ＰＢＳ）及び対照ペプチド処理培養物（紫、ＣＤ３－Ｍｕｔ３２）と比較して、ペプチド処理培養物（緑色、ＣＤ３－ＭＢＫ３２）において有意に減少した。これらの結果は、ペプチドＭＢＫ５０を、Ｔ細胞からのサイトカイン生成を遮断するために使用することができ、したがって、炎症性疾患又は自己免疫疾患における病原性Ｔ細胞応答を制御するために使用することができることを示している。

また、異種移植片マウスモデルにおけるＢＣＢＬ－１ ＰＥＬ細胞によるサイトカイン産生に対するペプチドの効果を研究した。２０日間、野生型ＭＢＫ５０（Ｗｔ）ペプチド（ｎ＝３）で処理したか、対照変異ペプチド（ｎ＝３）で処理したか、又は未処理のまま（ｎ＝３）としたかのいずれかで、ＢＣＢＬ－１ ＰＥＬを保有するＮＲＧマウスから、腹水を回収した。腹水中のサイトカインのレベルを、９２種類の炎症性タンパク質を検出することができる炎症性パネルを用いて、Ｏｌｉｎｋ技術によって測定した。データをＯｌｉｎｋ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ Ｓｔａｔ分析ソフトウェアで分析した。９２種類のタンパク質発現プロファイルのＰＣ分析は、未処置のマウス及び変異ペプチド処置マウス由来の試料の密接なクラスタ化を示すが、一方で、野生型ペプチドで処置したマウス由来の試料はクラスタから離れていた（図１２Ａ）。したがって、野生型ペプチドの炎症性タンパク質発現プロファイルは、他の群のプロファイルとは異なる。パネル中の９２種類のサイトカインのうち、１５種類のサイトカインは、ヒートマップに示されるように、野生型ペプチドで処置したマウスにおいて有意に上方制御又は下方制御された（Ａｎｎｏｖａによる、ｐ＜０．０５）（図１２Ｂ）。図１２Ｃの右側のパネルでは、ｌｏｇ２スケールで、Ｏｌｉｎｋの任意単位であるＮＰＸ単位で発現される１５種類のサイトカイン発現レベルを、未処理、変異ペプチド、及び野生型ペプチド処理群の間で比較した。発現変化の大部分は、約２倍であったが、血管形成因子であるＶＥＧＦＡ（約４倍）、及び白血球動員因子であるＣＸＣＬ１０（約２００倍）は実質的に減少した。これらの結果は、ペプチドが血管新生及び白血球動員を効果的に遮断する可能性があり、かつ炎症応答を遮断するために使用される可能性があることを示している。

実施例１０：単球細胞に対するＭＢＫ効果
単球細胞は、自然免疫応答と抗原特異的免疫応答とを橋渡しする重要な抗原提示細胞である。単球細胞に対するＭＢＫの効果を評価するために、健常ドナーのＰＢＭＣから磁気ビーズを用いてＣＤ１４＋単球を調製した。細胞を洗浄し、９６ウェルプレート（１ウェル当たり２００μＬ、三連）中、１×１０^６／ｍＬで、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）又はポリＩ：Ｃ（１０μｇ／ｍＬ）を用いて、又は用いずに、ＭＢＫ（１６μＭ若しくは３２μＭ）又は変異ペプチド（３２μＭ）の存在下において、２日間培養した。生細胞を、生／死染色、及びそれに続くフローサイトメトリー分析を用いて決定した。図１３に示すように、生細胞の割合は、対照ペプチド又はＰＢＳ対照と比較して、ＭＢＫ５０で処理した後、非刺激（ＰＢＳ）条件及び刺激（ＬＰＳ、ポリＩＣ）条件の両方で有意に減少し、これにより、ＣＤ１４＋単球に対するＭＢＫの細胞殺傷効果を実証した。

同様の実験をまた、ヒト樹状細胞のモデルとして単球由来の樹状細胞を用いて行った。簡潔には、単球由来樹状細胞は、ＧＭ－ＣＳＦ＋ＩＬ－４（各５０ｎｇ／ｍＬ）の存在下において４日間培養した後、磁気ビーズ選別ＣＤ１４＋細胞（健常ドナーのＰＢＭＣ由来）から調製した。細胞を洗浄し、９６ウェルプレート（１ウェル当たり２００μＬ、三連）中、１×１０^６／ｍＬで、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ポリＩ：Ｃ（１０μｇ／ｍＬ）、又はｓＣＤ４０Ｌ（１μｇ／ｍＬ）を用いて、又は用いずに、ＭＢＫ（１６μＭ若しくは３２μＭ）又は変異ペプチド（３２μＭ）の存在下において、２日間培養した。生細胞を、生／死染色を用いて上記のように決定した。図１６に示すように、生細胞の割合は、対照ペプチド又はＰＢＳ対照と比較して、ＭＢＫ５０で処理した後、非刺激（ＰＢＳ）条件及び刺激（ＬＰＳ、ｓＣＤ４０Ｌ）条件で有意に減少し、これにより、ＭＤＣに対するＭＢＫの細胞殺傷効果を実証した。

特に、図１３に示すように、ＭＢＫ処理ＭＤＣは凝集せず、対照群と比較してより広がり、かつ接着性であった。これは、ＭＢＫによるＭＹＣ駆動増殖の阻害に起因する潜在的な細胞分化を示した。

図６に示すように、単球性白血病細胞株であるＴＨＰ－１及びＵ９７３はいずれも、ＭＢＫ５０媒介性の細胞殺傷に対して感受性であった。ＭＹＣは、単球性細胞増殖、特にＬＰＳ刺激の際に重要である。ＭＢＫ５０が、ＭＹＣ、及び直接的なＭＹＣ標的遺伝子であるＩＲＦ４を下方制御することによって単球性細胞増殖を阻止することを実証するために、単球性白血病細胞株ＴＨＰ－１細胞を、１６μＭのＭＢＫ、変異対照、又はＰＢＳの存在下において、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）と共に２４時間培養した。ＭＹＣ及びＩＲＦ４の発現レベルを、アイソタイプ対照染色と共にＭＹＣ及びＩＲＦ４の細胞内染色、及びそれに続くフローサイトメトリーによって調べた（図１６Ａ）。図１６Ｂに示すように、ＴＨＰ－１細胞におけるＭＹＣ発現は、ＭＹＣのＭＦＩの有意な減少によって明らかなように、変異対照ペプチド又はＰＢＳと比較して、ＭＢＫ処理の際に有意に減少した。また、ＩＲＦ４発現が低下したＴＨＰ－１細胞の割合は、変異対照ペプチド又はＰＢＳ処理と比較して、ＭＢＫ５０処理によって増加した。これらの結果は、ＭＢＫ５０が、単球性白血病細胞におけるＭＹＣ及びＩＲＦ４の発現を直接的に標的化及び下方制御し、それらのＭＹＣ依存性増殖を阻害することを示している。

まとめると、これらの結果は、ＭＢＫ５０が、慢性炎症性疾患及び自己免疫疾患を含む炎症状態において単球細胞の増殖及び機能を阻害するために使用され得ることを示している。データはまた、ＭＢＫ５０を使用して、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）などの単球性白血病細胞を殺傷することができることも示している。

実施例１１：ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体とのＭＢＫ相互作用
ＶＧＮ５０（別名、ＭＢＫ５０）の作用機序の基礎を確認するために、ＶＧＮ５０とＳＷＩ／ＳＮＦタンパク質（すなわち、ＶＧＮ５０標的分子）との間の生化学的相互作用を、バキュロウイルス感染Ｓｆ９細胞から調製した精製した５種類の個々のＳＷＩ／ＳＮＦ成分を用いて、ＥＬＩＳＡ系結合アッセイにより調べた（図１７Ａ）。漸増濃度のビオチン複合体化ＶＧＮ５０又は変異Ｐを、各ＳＷＩ／ＳＮＦ成分でコーティングしたＥＬＩＳＡプレート中でインキュベートし、結合ペプチドをＨＲＰ－ストレプトアビジンによって検出した（図１７Ｂ）。結果は、ＶＧＮ５０が５０ｎＭという低い濃度で５種類のＳＷＩ／ＳＮＦ成分に結合することを示した（図１７Ｃ）。これらの結果は、ＶＧＮ５０がＳＷＩ／ＳＮＦ複合体の成分と相互作用し得ることを示している。これらのアッセイは、同じ分子相互作用及び作用機構を介してＭＹＣ活性を抑制する能力を有するＭＢＫ／ＶＧＮ５０バリアントを検証するために使用することができる。

本出願で引用された、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号又は均等物を含む全ての特許、特許出願、及び他の刊行物は、その全体が全ての目的のために参照により組み込まれる。

参考文献
1. Dang, C.V., Reddy, E.P., Shokat, K.M. & Soucek, L. Drugging the ‘undruggable’ cancer targets. Nat Rev Cancer 17, 502-508 (2017).
2. Lau, J.L. & Dunn, M.K. Therapeutic peptides: Historical perspectives, current development trends, and future directions. Bioorg Med Chem 26, 2700-2707 (2018).
3. Beaulieu, M.E.et al. Intrinsic cell-penetrating activity propels Omomyc from proof of concept to viable anti-MYC therapy. Sci Transl Med 11 (2019).
4. Tugyi, R.et al.Partial D-amino acid substitution: Improved enzymatic stability and preserved Ab recognition of a MUC2 epitope peptide. Proc Natl Acad Sci U S A 102, 413-418 (2005).

INFORMAL SEQUENCE LISTING
SEQ ID NO:1 MBK50 peptide amino acid sequence
LSSILQGLYQLDT
SEQ ID NO:2 TAT peptide amino acid sequence
GRKKRRQRRRPQ
SEQ ID NO:3 TAT peptide amino acid sequence (modified)
{d-Arg}KKRR{Ornithine}RRR{Beta-Ala}
SEQ ID NO:4 MYC-inhibiting peptide consensus sequence (x = any amino acid)
LxxILQ(G/D)LyxLDx

Claims (33)

1. ＭＹＣ阻害ペプチド及び異種アミノ酸配列を含むポリペプチドであって、前記ＭＹＣ阻害ペプチドが、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含み、約１００アミノ酸長以下であり、細胞におけるＭＹＣ活性を阻害する、前記ポリペプチド。
2. 前記ＭＹＣ阻害ペプチドが、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
3. 前記ＭＹＣ阻害ペプチドが、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる、請求項１に記載のポリペプチド。
4. １又は複数のＤ－アミノ酸を含む、請求項１～請求項３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
5. 前記ＭＹＣ阻害ペプチドが、１又は複数のＤ－アミノ酸を含む、請求項４に記載のポリペプチド。
6. 異種アミノ酸配列が、ＴＡＴ配列である、請求項１～請求項５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
7. 前記ＴＡＴペプチドが、配列番号２又は配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む、請求項４に記載のポリペプチド。
8. 前記ＴＡＴペプチドが、１又は複数のＤ－アミノ酸を含む、請求項６又は請求項７に記載のポリペプチド。
9. 前記異種ペプチドが、抗体又はその抗原結合断片である、請求項１に記載のポリペプチド。
10. ＴＡＴペプチド、前記ＭＹＣ阻害ペプチド、及び抗体又はその抗原結合断片を含む、請求項９に記載のポリペプチド。
11. 前記抗体が、単鎖抗体である、請求項９又は請求項１０に記載のポリペプチド。
12. 前記抗体又は断片が、ヒト化されている、請求項９～請求項１１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
13. 前記抗体又は断片が、ＭＹＣ依存性腫瘍細胞上の細胞表面抗原に特異的に結合する、請求項９～請求項１２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
14. 前記ＭＹＣ阻害ペプチド及び前記抗体又は断片が、１又は複数のプロテアーゼ切断部位を含むペプチドリンカーによって接続されている、請求項９～請求項１３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
15. 配列番号４の３番目又は１３番目のアミノ酸が、配列番号１のアミノ酸における当該アミノ酸とは異なる、請求項１～請求項１４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
16. 配列番号４の３番目のアミノ酸が、トレオニンである、請求項１５に記載のポリペプチド。
17. 配列番号４の１３番目のアミノ酸が、セリン又はグルタミン酸である、請求項１５又は請求項１６に記載のポリペプチド。
18. 核局在化シグナルをさらに含む、請求項１～請求項１７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
19. Ｃ末端にシステイン残基を含む、請求項１～請求項１８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
20. Ｎ末端にシグナルペプチドを含む、請求項１～請求項１９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
21. 前記細胞が、がん細胞である、請求項１～請求項１７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
22. 前記細胞が、Ｂ細胞又はＴ細胞である、請求項１～請求項１７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
23. 請求項１～請求項２２のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
24. プロモーターへ作動可能に連結された、請求項２３に記載のポリヌクレオチドを含む発現カセット。
25. 請求項２３に記載のポリヌクレオチド又は請求項２４に記載の発現ベクターを含む、ベクター。
26. 請求項２３に記載されるポリヌクレオチド、又は請求項２４に記載される発現ベクター、又は請求項２２に記載されるベクターを含む、宿主細胞。
27. 請求項１～請求項１９のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項２３に記載のポリヌクレオチド、請求項２４に記載の発現カセット、請求項２５に記載のベクター、又は請求項２６に記載の宿主細胞、及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
28. 細胞においてＭＹＣ活性を阻害する方法であって、細胞を、有効量の請求項１～請求項２２のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項２４に記載の発現カセット、又は請求項２５に記載のベクターと接触させることを含む、前記方法。
29. 前記細胞が、がん細胞である、請求項２５に記載の方法。
30. 前記細胞が、Ｂ細胞又はＴ細胞である、請求項２５に記載の方法。
31. 炎症状態又は自己免疫疾患を治療する方法であって、有効量の請求項１～請求項２２のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項２３に記載のポリヌクレオチド、請求項２４に記載の発現カセット、請求項２５に記載のベクター、請求項２６に記載の宿主細胞、又は請求項２７に記載の医薬組成物を、投与を必要とする患者へ投与することを含む、方法。
32. 対象のＭＹＣ依存性がんを治療する方法であって、有効量の請求項１～請求項２２のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項２３に記載のポリヌクレオチド、請求項２４に記載の発現カセット、請求項２５に記載のベクター、請求項２６に記載の宿主細胞、又は請求項２７に記載の医薬組成物を、前記対象へ投与することを含む、前記方法。
33. 前記がんが、原発性滲出液リンパ腫（ＰＥＬ）である、請求項３２に記載の方法。