KR20220119147A

KR20220119147A - Cd163 항체 또는 결합 단백질

Info

Publication number: KR20220119147A
Application number: KR1020227025626A
Authority: KR
Inventors: 찰스 오웬; 하피드 압델라리 벤차위; 크리스틴 테이트-버카드
Original assignee: 에코 애니몰 헬스 엘티디
Priority date: 2019-12-24
Filing date: 2020-12-24
Publication date: 2022-08-26
Also published as: EP4081542A1; BR112022012362A2; CA3162664A1; CN115151569A; JP2023508674A; CL2022001706A1; DOP2022000136A; WO2021130502A1; US20230203185A1; MX2022007957A; GB201919294D0; PE20230384A1; CO2022010294A2

Abstract

본 발명은 돼지에서 돼지 생식 및 호흡기 증후군 (PRRS) 바이러스 감염의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 돼지 CD163에 결합하는 단일클론 항체를 제공한다. 바람직한 항체는 돼지 CD163에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하고, 상기 항원 결합 도메인은 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 적어도 하나의 중쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역은 아미노산 서열 XYAD, XYAE 또는 XYAN을 포함하는 가변 중쇄 (VH) CDR2를 포함하고, 여기서 X는 임의의 아미노산일 수 있다. 또한, 핵산 분자, 발현 벡터 및 조성물도 제공된다.

Description

CD163 항체 또는 결합 단백질

본 발명은 일반적으로 CD163 (분화 클러스터 163)에 결합하는 결합 단백질, 구체적으로 항체, 구체적으로 돼지 CD163에 결합하는 결합 단백질 및 항체의 분야에 관한 것이다. 이러한 항-CD163 결합 단백질 및 항체는 돼지 생식 및 호흡기 증후군 (PRRS) 바이러스 감염과 같은 감염의 치료 또는 예방에서, 예를 들어 이들의 발병 및 중증도를 감소시키는 것과 같은 치료 및 보호 용도를 갖는다. 또한, 결합 단백질 및 항체 기반의 조성물, 방법 및 키트도 제공된다.

돼지 생식 및 호흡기 증후군 (PRRS)은 전세계적으로 가장 치명적인 바이러스성 돼지 질병 중 하나이고, 양돈 산업에 막대한 경제적 손실을 초래한다. 원인 병원체는 니도비랄레스 (Nidovirales) 목 내의 아르테리비리대 (Arteriviridae) 과로 분류되는 외피 RNA 바이러스인 PRRS 바이러스 (PRRSV)이다. PRRSV는 제한된 숙주 및 세포 굴성을 갖으며, 중요한 표적 세포로서 돼지 폐포 대식세포 (PAM)가 있다. 임상 증상은 다양하지만, 어린 돼지 및 새끼 돼지의 호흡 곤란 및 호흡기 질병, 어미 돼지 및 암퇘지의 말기 유산 및 사산, 임신 초기의 태아 재흡수 및 비육돈의 성장 감소를 포함한다. 임신 감소 또는 유산, 어린 새끼 돼지의 사망, PRRSV 감염된 돼지 모두의 성장률 감소로 인해 미국에서만 돼지고기 생산자에게 연간 6억 5천만 달러 이상이 손실을 끼치는 것으로 추산된다.

현재 알려진 모든 PRRSV 분리주는 2가지 유전형 (또는 종)인 제 1형 (PRRSV-1) 또는 제 2형 (PRRSV-2) 중 하나에 속하며, 이들은 둘 다 장기간 감염을 유발하고 유사한 임상 징후를 생성하지만 뉴클레오티드 수준에서 약 60%의 동일성만을 갖는다. 유전형 1은 유럽에서 기원하고, 유럽 PRRSV 분리주 또는 균주에서 발견되는 경향이 있는 반면, 유전형 2는 북미에서 기원하고 아시아 또는 미국 분리주 또는 균주에서 발견되는 경향이 있다 (Stoian and Rowland, 2019, Vet. Sci., 6, 9에 의한 리뷰 참조). 각 유전형 내에는 특히 중국과 베트남에서 2006년 이후 출현한 새로운 고병원성 균주를 포함하여 많은 수의 균주가 동정되어 상당한 다양성이 있다. 유사한 고병원성 균주는 말레이시아 반도부터 러시아 남부까지 이어지는 다른 곳에서도 출현하였으며, 돼지 개체군에 대한 위협을 증가시키고 있다 (An et al., 2011, Emerging Infect. Dis. 17(9): 1782). 중국에서만 2006년과 2007년에 PRRS 바이러스 감염으로 인해 2천만 마리 이상의 돼지가 도살되었다 (An et al., 2010, Emerging Infect. Dis. 16(2): 365). 보다 최근에, 유럽에서 발병을 초래한 병독성 균주의 사례 보고는 PRRS 바이러스의 출현 증가가 위협적임을 나타낸다 (Sinn et al., 2016, Porcine Health Management (2): 28).

스캐빈저 수용체 CD163은 PRRSV 감염의 핵심 진입 매개인자이므로 PRRSV 감염에서 핵심적인 역할을 한다. CD163은 130 kDa의 제 I형 막통과 단백질로, 신호펩티드 및 이어진 각각 대략 100개 아미노산 길이의 9개의 스캐빈저 수용체 시스테인 농축 (SRCR) 도메인을 SRCR 도메인 6 (SRCR6)과 SRCR7을 분리하는 35개의 아미노산 프롤린-세린-트레오닌 (PST) 농축 영역과 함께 갖는다. 제 2 PST 농축 영역은 SRCR9를 막통과 도메인 및 기능적 내재화 모티프를 포함하는 짧은 세포질 미단과 연결한다. CD163의 표면 발현은 단핵구-대식세포 계열의 세포에 제한된다. CD163의 SRCR5 도메인은 PRRSV에 의한 돼지 폐포 대식세포의 감염이 일어나기 위해 중요한 역할을 담당하는 것으로 확인되었다 (Gorp et al., 2010년 3월, J. of Virology, 3101-3105).

PRRSV 감염의 정확한 메커니즘은 알려져 있지 않다. 그러나, 이러한 메커니즘의 일부로서 PRRSV는 세포의 엔도좀 구획으로 진입하는 것으로 여겨지며, 여기서 CD163과 PRRSV의 GP2-GP3-GP4 헤테로삼량체 사이의 상호작용은 바이러스의 코팅 해제 및 바이러스 게놈의 세포질 내로 방출을 매개한다.

PRRSV에 대한 한 가지 제안된 치료 옵션은 PRRSV 감염에 저항하는 돼지를 만들기 위해 일종의 유전적 녹아웃 또는 CD163의 유전자 편집화를 포함하고, 다음으로 이들 돼지를 사육하여 유전자 변형을 전파시킨다 (Burkard et al., 2017, PLOS Pathogens 13(2): e1006206). 이것이 매우 효과적으로 작동하는 것으로 나타났지만, 이러한 치료는 유의한 비율의 돼지 개체군을 치료할 수 있는 견지에서 복잡하고 시간을 소모할 것이다. 또한 중요하게도, 예를 들어 이러한 동물로부터 생산된 동물 산물이 바람직하게 될 때 동물의 유전자 변형과 관련된 기법에 대해 많은 시장에서 상당한 저항이 있다.

PRRS의 경제적 영향을 제한하는데 사용되는 가장 공통적인 의료 개입은 백신접종이다. 백신은 질병이 만연한 모든 지역에서 일상적으로 사용된다. 2가지 유형의 백신이 일상적으로 사용되는데, 사멸 바이러스 백신 (비린) 또는 (대부분의 경우) 변형 생백신 (MLV)이다. 그러나, 현재 백신은 부분적으로만 효과적이며, 동시적인 생물보안 및 축산 결정이 밀접하게 연결되는 질병 관리에 대한 통합적인 접근법 내에서 배포될 때 가장 가치가 있다. 백신 효능이 부족한 이유는 복잡하지만, 바이러스의 생물학 (폐포 대식세포에 대한 굴성 및 높은 돌연변이도)과 연결된 PRRSV 개체군의 높은 유전적 다양성으로 인해 백신 균주와 순환하는 균주가 면역원성의 견지에서 밀접하게 매칭될 때 최상의 결과를 보인다 (Nan et al., 2017, Front. Immunol. 8: 1635에 의해 리뷰됨). 추가적으로, 생백신 균주는 병원성일 수 있는 새로운 현장 균주를 생성하도록 현장 균주와 재조합할 수 있다.

현재 PRRSV 감염에 대한 항-바이러스 치료 옵션은 없다.

따라서, 유의한 수의 동물에서 감염을 치료하거나 예방하는데 쉽게 사용할 수 있는 PRRSV 감염 (또는 기타 CD163 매개성 감염)에 대한 대안의, 바람직하게 개선된 치료 및 예방 옵션이 명백하게 필요하다.

본 발명은 PRRSV 감염을 감소시키거나 예방하도록 작용할 수 있는 돼지 CD163에게로 유도되는 항체 및 결합 단백질의 형태에서 이러한 대안의 치료 또는 예방 옵션 하나를 제공한다.

놀랍게도, 돼지 CD163 상의 동일한 에피토프를 표적으로 하는 단일 유형의 항체 (단일클론 항체)는 예를 들어 돼지 CD163 상의 다수의 상이한 에피토프를 표적으로 할 다중클론 항체 제제와 상반되는 바, PRRSV 감염을 유의하게 감소시키거나 예방하는데 효과적인 것으로 나타났다. 또한, 제 1형 및/또는 제 2형 PRRSV 감염을 차등적으로 억제하는 이러한 항-CD163 항체의 하위집합도 확인되었다.

본 발명자들은 따라서 CD163, 구체적으로 돼지 CD163에 결합하여 이의 활성 또는 기능을 억제할 수 있는 항-CD163 항체를 제공하였다. 이러한 항체 (또는 예를 들어 본원에 기재된 CD163 항원 결합 도메인을 포함하는 다른 결합 단백질)는 예를 들어 바이러스 단백질과 같은 다른 단백질과 상호작용하는 CD163의 능력을 억제할 수 있고, 이로써 돼지 폐포 대식세포와 같은 세포의 감염을 억제할 수 있다. 이러한 항체 (또는 예를 들어 본원에 기재된 CD163 항원 결합 도메인을 포함하는 다른 결합 단백질)는 예를 들어 돼지의 감염, 구체적으로 PRRSV 감염을 치료하거나 억제하는데 편리하게 및 유리하게 사용될 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명은 돼지에서 감염, 예를 들어 PRRS 바이러스 감염 또는 CD163 매개성 감염의 치료 또는 예방에 사용되는, CD163 예를 들어 돼지 CD163에 결합하는 결합 단백질, 예를 들어 항체, 예를 들어 단일클론 항체를 제공한다. 따라서, 구체적으로 본 발명은 돼지에서 PRRS 바이러스 감염의 치료 또는 예방에 사용되는, 돼지 CD163에 결합하는 단일클론 항체를 제공한다. 그러나, 본 발명의 항체는 CD163이 역할을 담당하는 것으로 확인된 돼지의 임의의 병리학의 치료 또는 예방에 사용될 수 있으며, 이 경우에 이러한 단백질의 결합 및 억제는 유용한 치료 도구일 수 있다.

본원의 다른 곳에서 논의된 바와 같이, 본원에 기재된 치료 방법에 사용하기에 적합한 본 발명의 바람직한 항체 (또는 결합 단백질)는 CD163의 SRCR5 도메인에 결합하는 능력을 갖으며, 예를 들어 CD163의 SRCR5 도메인에 에피토프가 있다. 또한, 바람직한 항체 (또는 결합 단백질)는 제 1형 및/또는 제 2형 PRRSV 감염, 더욱 바람직하게 제 1형 및 제 2형 PRRSV 감염을 억제하는 능력을 갖는다. 또한, 일부 바람직한 항체는 제 2형 PRRSV 감염을 억제하는 능력을 갖으며, 바람직하게 제 2형 PRRSV 감염을 특이적으로 억제하는 능력을 갖는다.

제 1형 및/또는 제 2형 PRRSV 감염을 억제하는 능력

패밀리 40

추가의 구현예에서, 본 발명은 CD163, 예를 들어 돼지 CD163에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는 결합 단백질, 예를 들어 항체로서, 상기 항원 결합 도메인은 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 적어도 하나의 중쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역은

(i) RYVMG (서열번호 2)의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 포함하고, 상기 실질적으로 상동성인 서열은 주어진 CDR 서열과 비교하여 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하는 서열인, 가변 중쇄 (VH) CDR1,

(ii) GIAWSGRAPYADSVKG (서열번호 3)의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 포함하고, 상기 실질적으로 상동성인 서열은 주어진 CDR 서열과 비교하여 1개, 2개, 3개 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 서열인, 가변 중쇄 (VH) CDR2 및

(iii) GEGAIRWTTLDAYDY (서열번호 4)의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 포함하고, 상기 실질적으로 상동성인 서열은 주어진 CDR 서열과 비교하여 1개, 2개, 3개 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 서열인, 가변 중쇄 (VH) CDR3을 포함하는, 결합 단백질을 제공한다.

(i) RYVMG (서열번호 10)의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 포함하고, 상기 실질적으로 상동성인 서열은 주어진 CDR 서열과 비교하여 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하는 서열인, 가변 중쇄 (VH) CDR1,

(ii) AISWSGRAPYADSVKG (서열번호 11)의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 포함하고, 상기 실질적으로 상동성인 서열은 주어진 CDR 서열과 비교하여 1개, 2개, 3개 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 서열인, 가변 중쇄 (VH) CDR2 및

(iii) GEGAIKWTTLDAYDY (서열번호 12)의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 포함하고, 상기 실질적으로 상동성인 서열은 주어진 CDR 서열과 비교하여 1개, 2개, 3개 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 서열인, 가변 중쇄 (VH) CDR3을 포함하는, 결합 단백질을 제공한다.

(i) RYVMG (서열번호 18)의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 포함하고, 상기 실질적으로 상동성인 서열은 주어진 CDR 서열과 비교하여 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하는 서열인, 가변 중쇄 (VH) CDR1,

(ii) GIAWSGRAPYADSVKG (서열번호 19)의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 포함하고, 상기 실질적으로 상동성인 서열은 주어진 CDR 서열과 비교하여 1개, 2개, 3개 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 서열인, 가변 중쇄 (VH) CDR2 및

(iii) GEGAILWTTPGAYNY (서열번호 20)의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 포함하고, 상기 실질적으로 상동성인 서열은 주어진 CDR 서열과 비교하여 1개, 2개, 3개 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 서열인, 가변 중쇄 (VH) CDR3을 포함하는, 결합 단백질을 제공한다.

바람직한 구현예에서, 본 발명은 CD163, 예를 들어 돼지 CD163에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는 결합 단백질, 예를 들어 항체로서, 상기 항원 결합 도메인은 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 적어도 하나의 중쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역은

(i) RYVMG (서열번호 2)의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) CDR1,

(ii) GIAWSGRAPYADSVKG (서열번호 3)의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) CDR2, 및

(iii) GEGAIRWTTLDAYDY (서열번호 4)의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) CDR3을 포함하는, 결합 단백질을 제공한다.

(i) RYVMG (서열번호 10)의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) CDR1,

(ii) AISWSGRAPYADSVKG (서열번호 11)의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) CDR2, 및

(iii) GEGAIKWTTLDAYDY (서열번호 12)의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) CDR3을 포함하는, 결합 단백질을 제공한다.

바람직한 구현예에서, 본 발명은 CD163, 예를 들어 돼지 CD163에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는 결합 단백질, 예를 들어 항체로서 상기 항원 결합 도메인은 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 적어도 하나의 중쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역은

(i) RYVMG (서열번호 18)의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) CDR1,

(ii) GIAWSGRAPYADSVKG (서열번호 19)의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) CDR2, 및

(iii) GEGAILWTTPGAYNY (서열번호 20)의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) CDR3을 포함하는, 결합 단백질을 제공한다.

본 발명의 추가의 구현예에서, VH CDR2는 X₁ I X₃ W S G R A P Y A D S V K G (서열번호: 73)의 아미노산 서열을 갖거나 포함한다. 이들 구현예에서, X₁ 또는 X₃은 임의의 아미노산일 수 있다. 이들 X 잔기 중 바람직하게 하나 이상, 가장 바람직하게 대부분은 다음과 같은 X₁은 G 또는 A이고 X₃은 A 또는 S인 군으로부터 선택된다. 따라서 바람직한 VH CDR2는 G/A I A/S W S G R A P Y A D S V K G (서열번호 74)의 아미노산 서열을 갖거나 포함한다. 예를 들어, 이러한 구현예의 바람직한 VH CDR2 서열은 서열번호 3, 11 또는 19를 갖거나 포함한다.

본 발명의 추가의 구현예에서, VH CDR3은 G E G A I X₆ W T T X₁₀ X₁₁ A Y X₁₄ Y (서열번호 75)의 아미노산 서열을 갖거나 포함한다. 이들 구현예에서, X₆, X₁₀ X₁₁ 및X₁₄는 임의의 아미노산일 수 있다. 이들 X 잔기 중 바람직하게 하나 이상, 가장 바람직하게 대부분은 다음과 같은 X₆는 R, K 또는 L이거나, X₁₀은 L 또는 P이거나, X₁₁은 D 또는 G이거나, X₁₄는 D 또는 N인 군으로부터 선택된다. 따라서 바람직한 VH CDR3은 G E G A I R/K/L W T T L/P D/G A Y D/N Y (서열번호 76)의 아미노산 서열을 갖거나 포함한다. 예를 들어, 이러한 구현예의 바람직한 VH CDR3 서열은 서열번호 4, 12 또는 20을 갖거나 포함한다.

추가의 구현예에서, 본 발명은 서열번호 2 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열로, 상기 실질적으로 상동성인 서열은 주어진 CDR 서열과 비교하여 1개 또는 2개 (바람직하게 1개)의 변경된 아미노산을 포함하는 서열인, VH CDR1, 서열번호 73의 VH CDR2, 및 서열번호 75의 VH CDR3를 포함하는 VH 영역을 포함하는 항체 (또는 결합 단백질)를 제공한다. 일부 이러한 구현예에서, VH CDR1은 바람직하게 서열번호 2이다. 일부 이러한 구현예에서, VH CDR2는 바람직하게 서열번호 3, 11 또는 19이다. 일부 이러한 구현예에서, VH CDR3은 바람직하게 서열번호 4, 12 또는 20이다.

일 구현예에서, 본 발명은 서열번호 2 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열로, 상기 실질적으로 상동성인 서열은 주어진 CDR 서열과 비교하여 1개 또는 2개 (바람직하게 1개)의 변경된 아미노산을 포함하는 서열인, VH CDR1, 서열번호 74의 VH CDR2, 및 서열번호 76의 VH CDR3를 포함하는 VH 영역을 포함하는 항체 (또는 결합 단백질)를 제공한다. 일부 이러한 구현예에서, VH CDR1은 바람직하게 서열번호 2이다. 일부 이러한 구현예에서, VH CDR2는 바람직하게 서열번호 3, 11 또는 19이다. 일부 이러한 구현예에서, VH CDR3은 바람직하게 서열번호 4, 12 또는 20이다.

본 발명의 추가의 구현예에서, 항체 (또는 결합 단백질)는 서열번호 2 또는 주어진 CDR 서열과 비교하여 1개 또는 2개 (바람직하게 1개)의 변경된 아미노산을 포함하는 서열의 VH CDR1, 서열번호 73 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열의 VH CDR2 및 서열번호 75 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열의 VH CDR3를 포함하는 VH 영역을 포함한다. 이러한 구현예에서, 상기 실질적으로 상동성인 서열은 주어진 CDR 서열과 비교하여 1개, 2개, 3개 또는 4개, 바람직하게 1개, 2개 또는 3개, 바람직하게 1개 또는 2개 (더욱 바람직하게 1개)의 변경된 아미노산을 포함하는 서열이다.

본 발명의 추가의 구현예에서, 항체 (또는 결합 단백질)는 서열번호 2 또는 주어진 CDR 서열과 비교하여 1개 또는 2개 (바람직하게 1개)의 변경된 아미노산을 포함하는 서열의 VH CDR1, 서열번호 74 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열의 VH CDR2 및 서열번호 76 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열의 VH CDR3를 포함하는 VH 영역을 포함한다. 이러한 구현예에서, 상기 실질적으로 상동성인 서열은 주어진 CDR 서열과 비교하여 1개, 2개, 3개 또는 4개, 바람직하게 1개, 2개 또는 3개, 바람직하게 1개 또는 2개 (더욱 바람직하게 1개)의 변경된 아미노산을 포함하는 서열이다.

패밀리 70

(i) TYSMG (서열번호 26)의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 포함하고, 상기 실질적으로 상동성인 서열은 주어진 CDR 서열과 비교하여 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하는 서열인, 가변 중쇄 (VH) CDR1,

(ii) AHRWSGSAYYAEHADSVEG (서열번호 27)의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 포함하고, 상기 실질적으로 상동성인 서열은 주어진 CDR 서열과 비교하여 1개, 2개, 3개 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 서열인, 가변 중쇄 (VH) CDR2 및

(iii) GVGSAAQYRY (서열번호 28)의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 포함하고, 상기 실질적으로 상동성인 서열은 주어진 CDR 서열과 비교하여 1개, 2개, 3개 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 서열인, 가변 중쇄 (VH) CDR3을 포함하는, 결합 단백질을 제공한다.

(i) PGSMG (서열번호 34)의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 포함하고, 상기 실질적으로 상동성인 서열은 주어진 CDR 서열과 비교하여 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하는 서열인, 가변 중쇄 (VH) CDR1,

(ii) AHRWSGSAYYADYADSVEG (서열번호 35)의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 포함하고, 상기 실질적으로 상동성인 서열은 주어진 CDR 서열과 비교하여 1개, 2개, 3개 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 서열인, 가변 중쇄 (VH) CDR2 및

(iii) GVGSAAQYTY (서열번호 36)의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 포함하고, 상기 실질적으로 상동성인 서열은 주어진 CDR 서열과 비교하여 1개, 2개, 3개 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 서열인, 가변 중쇄 (VH) CDR3을 포함하는, 결합 단백질을 제공한다.

(i) TYSMG (서열번호 42)의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 포함하고, 상기 실질적으로 상동성인 서열은 주어진 CDR 서열과 비교하여 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하는 서열인, 가변 중쇄 (VH) CDR1,

(ii) AHRWSGSAYYAEHADSVEG (서열번호 43)의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 포함하고, 상기 실질적으로 상동성인 서열은 주어진 CDR 서열과 비교하여 1개, 2개, 3개 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 서열인, 가변 중쇄 (VH) CDR2 및

(iii) GVGSEAQYRY (서열번호 44)의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 포함하고, 상기 실질적으로 상동성인 서열은 주어진 CDR 서열과 비교하여 1개, 2개, 3개 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 서열인, 가변 중쇄 (VH) CDR3을 포함하는, 결합 단백질을 제공한다.

(i) TYSMG (서열번호 26)의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) CDR1,

(ii) AHRWSGSAYYAEHADSVEG (서열번호 27)의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄(VH) CDR2 및

(iii) GVGSAAQYRY (서열번호 28)의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) CDR3을 포함하는, 결합 단백질을 제공한다.

(i) PGSMG (서열번호 34)의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) CDR1,

(ii) AHRWSGSAYYADYADSVEG (서열번호 35)의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) CDR2 및

(iii) GVGSAAQYTY (서열번호 36)의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) CDR3을 포함하는, 결합 단백질을 제공한다.

(i) TYSMG (서열번호 42)의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) CDR1,

(ii) AHRWSGSAYYAEHADSVEG (서열번호 43)의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) CDR2 및

(iii) GVGSEAQYRY (서열번호 44)의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) CDR3을 포함하는, 결합 단백질을 제공한다.

본 발명의 추가의 구현예에서, VH CDR1은 X₁ X₂ S M G (서열번호 77)의 아미노산 서열을 갖거나 포함한다. 이들 구현예에서, X₁ 또는 X₂는 임의의 아미노산일 수 있다. 이들 X 잔기 중 바람직하게 하나 이상, 가장 바람직하게 대부분은 다음과 같은 X₁은 T 또는 P이고 X₂는 Y 또는 G인 군으로부터 선택된다. 따라서 바람직한 VH CDR1은 T/P Y/G S M G (서열번호 78)의 아미노산 서열을 갖거나 포함한다. 예를 들어, 이러한 구현예의 바람직한 VH CDR1 서열은 서열번호 26, 34 또는 42를 갖거나 포함한다.

본 발명의 추가의 구현예에서, VH CDR2는 A H R W S G S A Y Y A X₁₂ X₁₃ A D S V E G (서열번호 79)의 아미노산 서열을 갖거나 포함한다. 이들 구현예에서, X₁₂ 또는 X₁₃은 임의의 아미노산일 수 있다. 이들 X 잔기 중 바람직하게 하나 이상, 가장 바람직하게 대부분은 다음과 같은 X₁₂는 E 또는 D이고 X₁₃는 H 또는 Y인 군으로부터 선택된다. 따라서 바람직한 VH CDR2는 A H R W S G S A Y Y A E/D H/Y A D S V E G (서열번호 80)의 아미노산 서열을 갖거나 포함한다. 예를 들어, 이러한 구현예의 바람직한 VH CDR2 서열은 서열번호 27, 35 또는 43을 갖거나 포함한다.

본 발명의 추가의 구현예에서, VH CDR3은 G V G S X₅ A Q Y X₉ Y (서열번호 81)의 아미노산 서열을 갖거나 포함한다. 이들 구현예에서, X₅ 및X₉는 임의의 아미노산일 수 있다. 이들 X 잔기 중 바람직하게 하나 이상, 가장 바람직하게 대부분은 다음과 같은 X₅는 A 또는 E이고 X₉는 R 또는 T인 군으로부터 선택된다. 따라서 바람직한 VH CDR3은 G V G S A/E A Q Y R/T Y (서열번호 82)의 아미노산 서열을 갖거나 포함한다. 예를 들어, 이러한 구현예의 바람직한 VH CDR3 서열은 서열번호 28, 36 또는 44를 갖거나 포함한다.

일 구현예에서, 본 발명은 서열번호 77의 VH CDR1, 서열번호 79의 VH CDR2 및 서열번호 81의 VH CDR3을 포함하는 VH 영역을 포함하는 항체 (또는 결합 단백질)를 제공한다. 일부 이러한 구현예에서, VH CDR1은 바람직하게 서열번호 26, 34 또는 42이다. 일부 이러한 구현예에서, VH CDR2는 바람직하게 서열번호 27, 35 또는 43이다. 일부 이러한 구현예에서, VH CDR3은 바람직하게 서열번호 28, 36 또는 44이다.

일 구현예에서, 본 발명은 서열번호 78의 VH CDR1, 서열번호 80의 VH CDR2 및 서열번호 82의 VH CDR3을 포함하는 VH 영역을 포함하는 항체 (또는 결합 단백질)를 제공한다. 일부 이러한 구현예에서, VH CDR1은 바람직하게 서열번호 26, 34 또는 42이다. 일부 이러한 구현예에서, VH CDR2는 바람직하게 서열번호 27, 35 또는 43이다. 일부 이러한 구현예에서, VH CDR3은 바람직하게 서열번호 28, 36 또는 44이다.

본 발명의 추가의 구현예에서, 항체 (또는 결합 단백질)는 서열번호 77 또는 주어진 CDR 서열과 비교하여 1개 또는 2개 (바람직하게 1개)의 변경된 아미노산을 포함하는 서열의 VH CDR1, 서열번호 79 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열의 VH CDR2 및 서열번호 81 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열의 VH CDR3를 포함하는 VH 영역을 포함한다. 이러한 구현예에서, 상기 실질적으로 상동성인 서열은 주어진 CDR 서열과 비교하여 1개, 2개, 3개 또는 4개, 바람직하게 1개, 2개 또는 3개, 바람직하게 1개 또는 2개 (더욱 바람직하게 1개)의 변경된 아미노산을 포함하는 서열이다.

본 발명의 추가의 구현예에서, 항체 (또는 결합 단백질)는 서열번호 78 또는 주어진 CDR 서열과 비교하여 1개 또는 2개 (바람직하게 1개)의 변경된 아미노산을 포함하는 서열의 VH CDR1, 서열번호 80 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열의 VH CDR2 및 서열번호 82 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열의 VH CDR3를 포함하는 VH 영역을 포함한다. 이러한 구현예에서, 상기 실질적으로 상동성인 서열은 주어진 CDR 서열과 비교하여 1개, 2개, 3개 또는 4개, 바람직하게 1개, 2개 또는 3개, 바람직하게 1개 또는 2개 (더욱 바람직하게 1개)의 변경된 아미노산을 포함하는 서열이다.

하나 이상의 CDR 서열이 X_X 잔기 (또는 본원에 정의된 또 다른 유형의 대안의 잔기)를 포함하는 본 발명의 구현예에서, 주어진 CDR 서열과 비교하여 1개, 2개, 3개 또는 4개, 바람직하게 1개, 2개 또는 3개 (더욱 바람직하게 1개 또는 2개, 또는 1개)의 변경된 아미노산 또는 아미노산 치환을 포함하여 이에 실질적으로 상동성인 서열을 갖는 CDR은 다음으로 본 발명에 의해 또한 포괄된다. 일부 이러한 구현예에서, 아미노산 잔기의 상기 변경 또는 치환은 하나 이상의 X_X잔기를 포함할 수 있거나 X_X 잔기가 아닌 잔기에 있을 수 있다. 다른 이러한 구현예에서, 상기 변경은 X_X 잔기 및 비-X_X 잔기의 혼합물에 존재한다.

클론 150 (#15)

(i) SYSMG (서열번호 50)의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 포함하고, 상기 실질적으로 상동성인 서열은 상기 주어진 CDR 서열과 비교하여 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하는 서열인, 가변 중쇄 (VH) CDR1,

(ii) AITWNGYITNYADSVKG (서열번호 51)의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 포함하고, 상기 실질적으로 상동성인 서열은 상기 주어진 CDR 서열과 비교하여 1개, 2개, 3개 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 서열인, 가변 중쇄 (VH) CDR2 및

(iii) TTFSTTSPISRTYNY (서열번호 52)의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 포함하고, 상기 실질적으로 상동성인 서열은 상기 주어진 CDR 서열과 비교하여 1개, 2개, 3개 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 서열인, 가변 중쇄 (VH) CDR3을 포함하는, 결합 단백질을 제공한다.

(i) SYSMG (서열번호 50)의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) CDR1,

(ii) AITWNGYITNYADSVKG (서열번호 51)의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) CDR2 및

(iii) TTFSTTSPISRTYNY (서열번호 52)의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) CDR3을 포함하는, 결합 단백질을 제공한다.

클론 70 (#23)

(i) TYAMG (서열번호 58)의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 포함하고, 상기 실질적으로 상동성인 서열은 상기 주어진 CDR 서열과 비교하여 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하는 서열인, 가변 중쇄 (VH) CDR1,

(ii) IISFGGTFYADSVKG (서열번호 59)의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 포함하고, 상기 실질적으로 상동성인 서열은 상기 주어진 CDR 서열과 비교하여 1개, 2개, 3개 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 서열인, 가변 중쇄 (VH) CDR2 및

(iii) GRTLSKRADSYAS (서열번호 60)의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 포함하고, 상기 실질적으로 상동성인 서열은 상기 주어진 CDR 서열과 비교하여 1개, 2개, 3개 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 서열인, 가변 중쇄 (VH) CDR3을 포함하는, 결합 단백질을 제공한다.

(i) TYAMG (서열번호 58)의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) CDR1,

(ii) IISFGGTFYADSVKG (서열번호 59)의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) CDR2 및

(iii) GRTLSKRADSYAS (서열번호 60)의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) CDR3을 포함하는, 결합 단백질을 제공한다.

클론 144 (#1)

(i) MYAMS (서열번호 66)의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 포함하고, 상기 실질적으로 상동성인 서열은 상기 주어진 CDR 서열과 비교하여 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하는 서열인, 가변 중쇄 (VH) CDR1,

(ii) AINTSGRYSRYADSVKG (서열번호 67)의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 포함하고, 상기 실질적으로 상동성인 서열은 상기 주어진 CDR 서열과 비교하여 1개, 2개, 3개 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 서열인, 가변 중쇄 (VH) CDR2 및

(iii) TDKGNWALAMSYDY (서열번호 68)의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 포함하고, 상기 실질적으로 상동성인 서열은 상기 주어진 CDR 서열과 비교하여 1개, 2개, 3개 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 서열인, 가변 중쇄 (VH) CDR3을 포함하는, 결합 단백질을 제공한다.

(i) MYAMS (서열번호 66)의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) CDR1,

(ii) AINTSGRYSRYADSVKG (서열번호 67)의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) CDR2 및

(iii) TDKGNWALAMSYDY (서열번호 68)의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) CDR3을 포함하는, 결합 단백질을 제공한다.

상기 섹션에 기술된 모든 항체 (또는 결합 단백질)는 제 1형 및 제 2형 PRRSV 감염을 억제하는 능력을 갖고, 따라서 제 1형 및 제 2형 PRRSV 감염의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다.

제 2형 PRRSV 감염을 억제하는 능력

상기 언급된 바와 같이, 본 발명의 다른 항-CD163 항체 및 결합 단백질은 제 2형 PRRSV 감염을 억제하고, 바람직하게는 제 2형 PRRSV 감염을 특이적으로 (또는 단독으로 또는 우선적으로) 억제하는 능력을 가지며, 예를 들어 제 2형 PRRSV 감염을 억제하지만 제 1형 PRRSV 감염을 억제하지 않는다 (또는 유의하게 억제하지 않음). 따라서, 본 발명의 추가의 구현예는 제 2형 PRRSV 감염을 특이적으로 억제할 수 있는 항체 (또는 결합 단백질)를 제공한다. 이러한 "제 2형" 항체 또는 결합 단백질의 예는 하기에 설명되어 있다. 다른 바람직한 구현예에서, 제 2형 PRRSV 감염을 억제할 수 있는 이러한 "제 2형" 항체 및 결합 단백질은 제 1형 및/또는 제 2형 PRRSV 감염을 억제할 수 있는, 바람직하게 제 1형, 또는 제 1형 및 제 2형 PRRSV 감염을 억제할 수 있는 상기 기재된 항체와 조합하여 사용될 수 있다.

클론 57 (#11)

따라서 추가의 구현예에서, 본 발명은 CD163, 예를 들어 돼지 CD163에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는 결합 단백질, 예를 들어 항체로서, 상기 항원 결합 도메인은 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 적어도 하나의 중쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역은

(i) VYGTG (서열번호 84)의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 포함하고, 상기 실질적으로 상동성인 서열은 상기 주어진 CDR 서열과 비교하여 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하는 서열인, 가변 중쇄 (VH) CDR1,

(ii) GISGTTGSTLYADSVKG (서열번호 85)의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 포함하고, 상기 실질적으로 상동성인 서열은 상기 주어진 CDR 서열과 비교하여 1개, 2개, 3개 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 서열인, 가변 중쇄 (VH) CDR2 및

(iii) GGRVYITTSSWAY (서열번호 86)의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 포함하고, 상기 실질적으로 상동성인 서열은 상기 주어진 CDR 서열과 비교하여 1개, 2개, 3개 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 서열인, 가변 중쇄 (VH) CDR3을 포함하는, 결합 단백질을 제공한다.

(i) VYGTG (서열번호 84)의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) CDR1,

(ii) GISGTTGSTLYADSVKG (서열번호 85)의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) CDR2 및

(iii) GGRVYITTSSWAY (서열번호 86)의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) CDR3을 포함하는, 결합 단백질을 제공한다.

클론 41 (#12)

(i) RYAMG (서열번호 92)의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 포함하고, 상기 실질적으로 상동성인 서열은 상기 주어진 CDR 서열과 비교하여 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하는 서열인, 가변 중쇄 (VH) CDR1,

(ii) AIAWSTGSTYYANSVKG (서열번호 93)의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 포함하고, 상기 실질적으로 상동성인 서열은 상기 주어진 CDR 서열과 비교하여 1개, 2개, 3개 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 서열인, 가변 중쇄 (VH) CDR2 및

(iii) ETRYCSGFGCLDPRTYGS (서열번호 94)의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 포함하고, 상기 실질적으로 상동성인 서열은 상기 주어진 CDR 서열과 비교하여 1개, 2개, 3개 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 서열인, 가변 중쇄 (VH) CDR3을 포함하는, 결합 단백질을 제공한다.

(i) RYAMG (서열번호 92)의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) CDR1,

(ii) AIAWSTGSTYYANSVKG (서열번호 93)의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) CDR2 및

(iii) ETRYCSGFGCLDPRTYGS (서열번호 94)의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) CDR3을 포함하는, 결합 단백질을 제공한다.

클론 171 (#14)

(i) TDTMA (서열번호 100)의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 포함하고, 상기 실질적으로 상동성인 서열은 상기 주어진 CDR 서열과 비교하여 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하는 서열인, 가변 중쇄 (VH) CDR1,

(ii) GIGRSGGSIYYADAVKG (서열번호 101)의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 포함하고, 상기 실질적으로 상동성인 서열은 상기 주어진 CDR 서열과 비교하여 1개, 2개, 3개 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 서열인, 가변 중쇄 (VH) CDR2 및

(iii) RQRIGLVVGALGYDY (서열번호 102)의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 포함하고, 상기 실질적으로 상동성인 서열은 상기 주어진 CDR 서열과 비교하여 1개, 2개, 3개 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 서열인, 가변 중쇄 (VH) CDR3을 포함하는, 결합 단백질을 제공한다.

(i) TDTMA (서열번호 100)의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) CDR1,

(ii) GIGRSGGSIYYADAVKG (서열번호 101)의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) CDR2 및

(iii) RQRIGLVVGALGYDY (서열번호 102)의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) CDR3을 포함하는, 결합 단백질을 제공한다.

클론 29 (#17)

(i) DYTIG (서열번호 108)의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 포함하고, 상기 실질적으로 상동성인 서열은 상기 주어진 CDR 서열과 비교하여 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하는 서열인, 가변 중쇄 (VH) CDR1,

(ii) CINSITSNTYYADSVKG (서열번호 109)의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 포함하고, 상기 실질적으로 상동성인 서열은 상기 주어진 CDR 서열과 비교하여 1개, 2개, 3개 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 서열인, 가변 중쇄 (VH) CDR2 및

(iii) DSGLFSGSSCLKYRAMRFGS (서열번호 110)의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 포함하고, 상기 실질적으로 상동성인 서열은 상기 주어진 CDR 서열과 비교하여 1개, 2개, 3개 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 서열인, 가변 중쇄 (VH) CDR3을 포함하는, 결합 단백질을 제공한다.

(i) DYTIG (서열번호 108)의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) CDR1,

(ii) CINSITSNTYYADSVKG (서열번호 109)의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) CDR2 및

(iii) DSGLFSGSSCLKYRAMRFGS (서열번호 110)의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) CDR3을 포함하는, 결합 단백질을 제공한다.

다른 실시예

본 발명의 특정 바람직한 구현예는 CD163, 예를 들어 돼지 CD163에 결합하고, 서열번호 1, 9, 17, 25, 33, 41, 49, 57 또는 65의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 갖는 VH 도메인을 포함하는 항체 (또는 결합 단백질)를 제공한다. 일부 구현예에서, 이러한 항체 (또는 결합 단백질)는 또한 최대 3개의 경쇄 CDR, 바람직하게는 3개의 경쇄 CDR을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.

바람직한 구현예에서 본 발명은 CD163, 예를 들어 돼지 CD163에 결합하고, 서열번호 1, 9, 17, 25, 33, 41, 49, 57 또는 65의 아미노산 서열 또는 이에 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 서열 (예로, 적어도 85%, 90%, 95% 또는 98%의 동일성)을 갖는 VH 도메인을 포함하는 항체 (또는 결합 단백질)를 제공한다. 일부 구현예에서, 이러한 항체 (또는 결합 단백질)는 또한 최대 3개의 경쇄 CDR, 바람직하게는 3개의 경쇄 CDR을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명은 CD163, 예를 들어 돼지 CD163에 결합하고, 서열번호 1, 9, 17, 25, 33, 41, 49, 57 또는 65의 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인을 포함하는 항체 (또는 결합 단백질)를 제공한다. 일부 구현예에서, 이러한 항체 (또는 결합 단백질)는 또한 최대 3개의 경쇄 CDR, 바람직하게는 3개의 경쇄 CDR을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.

본 발명의 특정 바람직한 구현예는 CD163, 예를 들어 돼지 CD163에 결합하고, 서열번호 83, 91, 99 또는 107의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 갖는 VH 도메인을 포함하는 항체 (또는 결합 단백질)를 제공한다. 일부 구현예에서, 이러한 항체 (또는 결합 단백질)는 또한 최대 3개의 경쇄 CDR, 바람직하게는 3개의 경쇄 CDR을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.

바람직한 구현예에서, 본 발명은 CD163, 예를 들어 돼지 CD163에 결합하고, 서열번호 83, 91, 99 또는 107의 아미노산 서열 또는 이에 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 서열 (예로, 적어도 85%, 90%, 95% 또는 98%의 동일성)을 갖는 VH 도메인을 포함하는 항체 (또는 결합 단백질)를 제공한다. 일부 구현예에서, 이러한 항체 (또는 결합 단백질)는 또한 최대 3개의 경쇄 CDR, 바람직하게는 3개의 경쇄 CDR을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명은 CD163, 예를 들어 돼지 CD163에 결합하고, 서열번호 83, 91, 99 또는 107의 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인을 포함하는 항체 (또는 결합 단백질)를 제공한다. 일부 구현예에서, 이러한 항체 (또는 결합 단백질)는 또한 최대 3개의 경쇄 CDR, 바람직하게는 3개의 경쇄 CDR을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.

다른 바람직한 구현예는 면역글로불린 (Ig) 형태, 예로 IgG 형태, 또는 본원에 정의된 다양한 항체 (또는 결합 단백질)의 면역글로불린 불변 영역, 예로 IgG 불변 영역의 전부 또는 일부를 포함하는 형태, 예를 들어 전장의 Ig 또는 IgG 형태이다. 물론 완전한 IgG 항체는 전형적으로 2개의 실질적으로 동일한 중쇄 및 2개의 실질적으로 동일한 경쇄를 포함할 것으로 이해된다. 면역글로불린 불변 영역의 일부를 포함하는 바람직한 형태는 Fc 영역 또는 도메인을 포함하는 형태, 예를 들어 Fc 융합이다. 이러한 Fc 영역 또는 도메인은 당업계에 공지되어 있으며, 일반적으로 회합하여 동종이량체를 형성하는 항체 중쇄의 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다. 이들 영역은 임의의 적절한 공급원 또는 종, 예로 면역화에 의해 항체를 생성하는데 사용되는 숙주 종과 상이한 공급원 또는 종, 또는 항체가 유래하는 곳과 상이한 공급원 또는 종으로부터 유래할 수 있지만, 바람직하게는 돼지 Fc 영역 또는 도메인에 상응하거나 이로부터 유래한다. 이러한 Fc 영역은 동종이량체이기 때문에 (또는 동종이량체를 형성함), 2개의 폴리펩티드 사슬을 이량체화하는데 편리하게 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 하나 이상의 단일 도메인 항체 (예로, VHH 항체)를 Fc 영역의 각 사슬에 연결하거나 융합함으로써, Fc 영역의 2개의 사슬이 이량체화될 때 본 발명의 단일 도메인 항체 (예로, VHH 항체)의 다수의 사본을 단일 구조물 또는 분자로 제공하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 하나 이상의 단일 도메인 항체 (예로, VHH 항체)가 Fc 영역의 각 사슬에 순서대로 연결되거나 융합되면, 이러한 항체는 동일한 항체 (예로, 동일한 VHH의 둘 이상의 사본이 각 사슬 위에 제공될 수 있음) 또는 상이한 항체일 수 있다. 따라서, 예를 들어 Fc 융합은 본 발명의 동일한 단일 도메인 항체의 하나 이상의 사본 또는 본 발명의 상이한 단일 도메인 항체의 하나 이상의 사본을 포함하는 구조물을 제공하는데 사용될 수 있다. 이러한 구조물은 일반적으로 본 발명의 동일한 항체의 하나 이상의 사본 (예로, 하나의 단일 도메인 항체 또는 VHH 항체의 하나 이상의 사본 또는 다수의 상이한 단일 도메인 항체 또는 VHH 항체의 하나 이상의 사본)을 포함하기 때문에, 이러한 구조물은 예를 들어 결합력 효과로 인한 CD163의 결합 개선을 나타낼 수 있다.

표 A, 표 B, 표 C, 표 D, 표 E, 표 F, 표 G, 표 H 또는 표 I에 제시된 49(#18), 47(#19), 48(#20), 76(#2), 77(#16), 78(#8), 150(#15), 70(#23) 또는 144(#1) 항체 서열을 기초로 한 결합 단백질, 예를 들어 항체가 바람직하다. 본 발명은 VHH 항체인 항체 (단일 도메인 항체)인 단일클론 항체에 의해 예시되고, 이들의 서열은 본원에서 표 A, 표 B, 표 C, 표 D, 표 E, 표 F, 표 G, 표 H 및 표 I에 나타낸다. 이들 VHH 항체 각각의 VH CDR 도메인 및 VH 도메인은 본원에서 표 A 내지 표 I에 나타낸다. VH CDR 도메인 또는 VH 도메인의 이러한 세트, 또는 이러한 도메인 (또는 이에 실질적으로 상동성인 서열)을 포함하는 IgG 서열을 포함하는 항체 (또는 결합 단백질)는 본 발명의 바람직한 구현예이다.

또한, 표 1, 표 2, 표 3 또는 표 4에 제시된 57(#11), 41(#12), 171(#14), 29(#17) 항체 서열을 기초로 한 결합 단백질, 예로 항체가 바람직하다. 본 발명은 VHH 항체인 항체 (단일 도메인 항체)인 단일클론 항체에 의해 예시되고, 이들의 서열은 본원에서 표 1, 표 2, 표 3 및 표 4에 나타낸다. 이들 VHH 항체 각각의 VH CDR 도메인 및 VH 도메인은 본원에서 표 1, 표 2, 표 3 및 표 4에 나타낸다. VH CDR 도메인 또는 VH 도메인의 이러한 세트, 또는 이러한 도메인 (또는 이에 실질적으로 상동성인 서열)을 포함하는 IgG 서열을 포함하는 항체 (또는 결합 단백질)는 본 발명의 바람직한 구현예이다.

실질적으로 상동성인 서열의 특정 예는 개시된 아미노산 서열에 적어도 60% 또는 65%의 동일성을 갖는 서열이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 항체 (또는 결합 단백질)는 서열번호 1, 9, 17, 25, 33, 41, 49, 57 또는 65의 아미노산 서열과 적어도 약 60%, 65%, 70% 또는 75%, 더욱 바람직하게 적어도 약 80%, 더욱 바람직하게 적어도 약 85%, 더욱 바람직하게 적어도 약 90% 또는 95%, 가장 바람직하게 적어도 약 97%, 98% 또는 99%의 아미노산 서열 동일성의 아미노산 서열 영역을 포함하는 적어도 하나의 중쇄 가변 영역을 포함한다.

실질적으로 상동성인 서열의 다른 특정 예는 개시된 아미노산 서열에 적어도 60% 또는 65%의 동일성을 갖는 서열이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 항체 (또는 결합 단백질)는 서열번호 83, 91, 99 또는 107의 아미노산 서열과 적어도 약 60%, 65%, 70% 또는 75%, 더욱 바람직하게 적어도 약 80%, 더욱 바람직하게 적어도 약 85%, 더욱 바람직하게 적어도 약 90% 또는 95%, 가장 바람직하게 적어도 약 97%, 98% 또는 99%의 아미노산 서열 동일성의 아미노산 서열 영역을 포함하는 적어도 하나의 중쇄 가변 영역을 포함한다.

실질적으로 상동성인 서열의 다른 바람직한 예는 개시된 아미노산 서열의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 서열이다.

실질적으로 상동성인 서열의 다른 바람직한 예는 개시된 하나의 CDR 영역 또는 하나 이상의 FR 영역에서 1개, 2개, 3개 또는 4개, 바람직하게 1개, 2개 또는 3개, 바람직하게 1개 또는 2개 (더욱 바람직하게 1개)의 변경된 아미노산을 포함하는 서열이다. 이러한 변경은 보존적 또는 비-보존적 아미노산 치환, 또는 이들의 혼합물일 수 있다.

이러한 구현예에서, 바람직한 변경은 보존적 아미노산 치환이다.

모든 구현예에서, 실질적으로 상동성인 서열을 포함하는 결합 단백질, 예로 항체는 CD163, 예로 돼지 CD163에 결합하는 능력을 보유한다. 바람직하게, 실질적으로 상동성인 서열을 포함하는 결합 단백질, 예로 항체는 49(#18), 47(#19), 48(#20), 76(#2), 77(#16), 78(#8), 150(#15), 70(#23) 또는 144(#1) 항체와 관련하여 본원에 기술된 하나 이상 (바람직하게 모두)의 다른 성질을 보유한다.

모든 구현예에서, 실질적으로 상동성인 서열을 포함하는 결합 단백질, 예로 항체는 CD163, 예로 돼지 CD163에 결합하는 능력을 보유한다. 바람직하게, 실질적으로 상동성인 서열을 포함하는 결합 단백질, 예로 항체는 57(#11), 41(#12), 171(#14) 또는 29(#17) 항체와 관련하여 본원에 기술된 하나 이상 (바람직하게 모두)의 다른 성질을 보유한다.

본 발명에 따른 실질적으로 상동성인 아미노산 서열의 추가의 예는 본원의 다른 곳에 기술되어 있다.

본 발명의 항체 (또는 결합 단백질)의 CDR은 바람직하게 자연 발생 항체 및/또는 효과적인 조작된 항체에서 발견되는 것과 같은 적절한 구조틀 영역에 의해 분리된다. 따라서, 본 발명의 V_H (예로, VHH), V_L 및 개별 CDR 서열은 바람직하게는 항원 (본원에서 CD163) 결합을 가능하게 하도록 적절한 구조틀 또는 스캐폴드 내에 제공되거나 이에 도입된다. 이러한 구조틀 서열 또는 영역은 적절한 스캐폴드를 형성하도록 적절한 경우 자연 발생 구조틀 영역, FR1, FR2, FR3 및/또는 FR4에 해당할 수 있거나, 예를 들어 다양한 자연 발생 구조틀 영역을 비교하여 확인된 공통 구조틀 영역에 해당할 수 있다. 대안적으로, 비-항체 스캐폴드 또는 구조틀, 예로 T 세포 수용체 구조틀을 사용할 수 있다.

구조틀 영역에 사용될 수 있는 적절한 서열은 당업계에 잘 알려져 있고, 기록되어 있으며 이들 중 임의의 것이 사용될 수 있다. 구조틀 영역의 바람직한 서열은 본 발명의 VHH 항체를 만드는 하나 이상의 구조틀 영역, 바람직하게 표 A, 표 B, 표 C, 표 D, 표 E, 표 F, 표 G, 표 H 및 표 I에 개시된 바와 같은 49(#18), 47(#19), 48(#20), 76(#2), 77(#16), 78(#8), 150(#15), 70(#23) 또는 144(#1) VHH 항체의 하나 이상의 구조틀 영역 또는 이에 실질적으로 상동성인 구조틀 영역, 구체적으로 항원 특이성의 유지를 허용하는 구조틀 영역, 예를 들어 항체의 실질적으로 동일한 구조 또는 동일한 3D 구조를 생성하는 구조틀 영역이다.

구조틀 영역, 구체적으로 본 발명의 "제 2형" 항체의 바람직한 서열은 본 발명의 VHH 항체를 만드는 하나 이상의 구조틀 영역, 바람직하게 표 1, 표 2, 표 3 및 표 4에 개시된 바와 같은 57(#11), 41(#12), 171(#14) 또는 29(#17) VHH 항체의 하나 이상의 구조틀 영역 또는 이에 실질적으로 상동성인 구조틀 영역, 구체적으로 항원 특이성의 유지를 허용하는 구조틀 영역, 예를 들어 항체의 실질적으로 동일한 구조 또는 동일한 3D 구조를 생성하는 구조틀 영역이다.

특정 바람직한 구현예에서, 모두 4개의 가변 중쇄 (서열번호 5, 6, 7 및 8) 구조틀 영역 (FR), 적절한 경우 또는 이에 실질적으로 상동성인 FR 영역은 본 발명의 항체에서 발견된다.

다른 바람직한 구현예에서, 모두 4개의 가변 중쇄 (서열번호 13, 14, 15 및 16) 구조틀 영역 (FR), 적절한 경우 또는 이에 실질적으로 상동성인 FR 영역은 본 발명의 항체에서 발견된다.

다른 바람직한 구현예에서, 모두 4개의 가변 중쇄 (서열번호 21, 22, 23 및 24) 구조틀 영역 (FR), 적절한 경우 또는 이에 실질적으로 상동성인 FR 영역은 본 발명의 항체에서 발견된다.

다른 바람직한 구현예에서, 모두 4개의 가변 중쇄 (서열번호 29, 30, 31 및 32) 구조틀 영역 (FR), 적절한 경우 또는 이에 실질적으로 상동성인 FR 영역은 본 발명의 항체에서 발견된다.

다른 바람직한 구현예에서, 모두 4개의 가변 중쇄 (서열번호 37, 38, 39 및 40) 구조틀 영역 (FR), 적절한 경우 또는 이에 실질적으로 상동성인 FR 영역은 본 발명의 항체에서 발견된다.

다른 바람직한 구현예에서, 모두 4개의 가변 중쇄 (서열번호 45, 46, 47 및 48) 구조틀 영역 (FR), 적절한 경우 또는 이에 실질적으로 상동성인 FR 영역은 본 발명의 항체에서 발견된다.

다른 바람직한 구현예에서, 모두 4개의 가변 중쇄 (서열번호 53, 54, 55 및 56) 구조틀 영역 (FR), 적절한 경우 또는 이에 실질적으로 상동성인 FR 영역은 본 발명의 항체에서 발견된다.

다른 바람직한 구현예에서, 모두 4개의 가변 중쇄 (서열번호 61, 62, 63 및 64) 구조틀 영역 (FR), 적절한 경우 또는 이에 실질적으로 상동성인 FR 영역은 본 발명의 항체에서 발견된다.

다른 바람직한 구현예에서, 모두 4개의 가변 중쇄 (서열번호 69, 70, 71 및 72) 구조틀 영역 (FR), 적절한 경우 또는 이에 실질적으로 상동성인 FR 영역은 본 발명의 항체에서 발견된다.

구체적으로, 본 발명의 "제 2형" 항체의 특정 바람직한 구현예에서, 모두 4개의 가변 중쇄 (서열번호 87, 88, 89 및 90) 구조틀 영역 (FR), 적절한 경우 또는 이에 실질적으로 상동성인 FR 영역은 본 발명의 항체에서 발견된다.

다른 바람직한 구현예에서, 모두 4개의 가변 중쇄 (서열번호 95, 96, 97 및 98) 구조틀 영역 (FR), 적절한 경우 또는 이에 실질적으로 상동성인 FR 영역은 본 발명의 항체에서 발견된다.

다른 바람직한 구현예에서, 모두 4개의 가변 중쇄 (서열번호 103, 104, 105 및 106) 구조틀 영역 (FR), 적절한 경우 또는 이에 실질적으로 상동성인 FR 영역은 본 발명의 항체에서 발견된다.

다른 바람직한 구현예에서, 모두 4개의 가변 중쇄 (서열번호 111, 112, 113 및 114) 구조틀 영역 (FR), 적절한 경우 또는 이에 실질적으로 상동성인 FR 영역은 본 발명의 항체에서 발견된다.

상기 기술된 바와 같이, 본 발명은 CD163에 결합하는 (또는 특이적으로 인식하거나 특이적으로 결합함) 결합 단백질, 예를 들어 항체를 제공한다. CD163은 M130, MM130, SCAR1, 대식세포 관련 항원, 헤모글로불린 스캐빈저 수용체 또는 스캐빈저 수용체 시스테인 농축 제 1형 단백질 M130으로도 알려져 있다. 본 발명의 바람직한 결합 단백질은 항체, 구체적으로 VHH 항체이다. 그러나, 항체 예로 VHH 항체와 관련된 본원에 기재된 구현예는 필요한 부분만 변경하여 다른 유형의 결합 단백질에 동등하게 적용하거나, 이의 역도 적용된다.

바람직한 결합 단백질은 돼지 CD163에 결합할 수 있는 (예로, 특이적으로 결합함) 임의의 단일 폴리펩티드 사슬이다. 본 발명에서 사용될 수 있는 적절한 유형의 결합 단백질은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서 일반적으로 CDR 영역 (및 선택적으로 FR 영역 또는 면역글로불린 기반의 스캐폴드)을 포함하는 면역글로불린 기반의 폴리펩티드가 사용되어, 본 발명의 항체의 CDR 영역 (및 선택적으로 FR 영역)이 적절한 스캐폴드 또는 구조틀, 예로 면역글로불린 스캐폴드 위에 이식될 수 있다.

그러나, 다른 구현예에서 특정한 표적 항원 (CD163 또는 돼지 CD163)에 자체로 특이적으로 결합하는 능력에 대해 선택될 수 있는 비-면역글로불린 기반의 단일 사슬 결합 단백질/스캐폴드 단백질이 사용될 수 있다. 이러한 분자는 항체 모방체 (또는 항체 모방체)로도 지칭된다. 적절한 비-면역글로불린 기반의 단일 사슬 결합 단백질의 예는 당업계에 공지되어 기술되어 있으며, 예를 들어 피브로넥틴 유형 ²도메인의 10번째 모듈을 기반으로 하는 피브로넥틴 (또는 피브로넥틴 기반의 분자), 예컨대 애드넥틴 (예로, MA 월탐, 컴파운드 제약사로부터 나옴), 애피머 (예로, 아박타사로부터 나옴), 안키린 반복서열 단백질 또는 다르핀 (예로, 스위스 쭈리히, 분자 파트너사로부터 나옴), 리포칼린 예로 안티칼린 (예로, 독일 프레이싱, 피에리스 프로테오랩 AG로부터 나옴), 인간 A-도메인(예로, 아비머), 스태필로코커스 단백질 A (예로, 스웨덴, 애피바디 AG로부터 나옴), 티오레독신; 및 감마 B-크리스탈린 또는 유비퀴틴 기반의 분자, 예로 애필린 (예로, 독일 할레, 스실 프로테인 GmbH로부터 나옴)을 포함한다. 이러한 분자는 또한 표적 항원 결합을 매개하는 적절한 CDR이 이식될 수 있는 스캐폴드로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체의 CDR 영역 (및 선택적으로 FR 영역)은 적절한 비-면역글로불린 스캐폴드 위에 이식될 수 있다.

본 발명의 다른 구현예에서, 앱타머와 같은 핵산 기반의 분자는 단 이러한 분자가 자체로 특정한 표적 항원 (CD163 또는 돼지 CD163)에 특이적으로 결합하는 능력에 대해 선택될 수 있으면 사용될 수 있다. 따라서, 결합 단백질이 본원에서 언급되는 곳에서, 이들 구현예는 핵산 기반의 분자와 같은 다른 유형의 결합 실체 또는 모이어티로 확장될 수 있다.

본 발명의 바람직한 비-항체 결합 단백질 (또는 결합 모이어티)은 본 발명의 항-CD163 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 능력을 갖으며, 이러한 결합 단백질 (또는 결합 모이어티)은 예를 들어 기준 항체로서 본 발명의 항체를 사용하여 예를 들어 본원의 다른 곳에서 기술된 것과 같은 경쟁 검정법에 의해 선별될 수 있다.

CD163은 130 kDa의 제 I형 막통과 단백질로, 신호펩티드 및 이어진 각각 대략 100개 아미노산 길이의 9개의 스캐빈저 수용체 시스테인 농축 (SRCR) 도메인을 SRCR 도메인 6 (SRCR6)과 SRCR7을 분리하는 35개의 아미노산 프롤린-세린-트레오닌 (PST) 농축 영역과 함께 갖는다. 제 2 PST 농축 영역은 SRCR9를 막통과 도메인 및 기능적 내재화 모티프를 포함하는 짧은 세포질 미단과 연결한다. CD163의 표면 발현은 단핵구-대식세포 계열의 세포에 제한된다.

구체적으로 본 발명과 관련하여, CD163은 돼지 폐포 대식세포 (PAM)의 표면에서 발현되고, 돼지에서 질병을 일으키는 바이러스성 병원체, 특히 PRRSV를 포함한 다양한 병원체의 능력에서 중요한 역할을 하는 것으로 여겨진다.

따라서, 본 발명의 결합 단백질 또는 항체는 CD163에 결합하거나 결합할 수 있다. 본 발명에 따르면, CD163은 임의의 종, 예를 들어 돼지 (돼지), 인간, 소 (소), 개 (개), 고양이 (고양이), 양 (양), 말 (말), 마우스 및 원숭이로부터 나올 수 있다. 바람직한 구현예에서, CD163은 돼지 CD163이고, 항체는 돼지 CD163에 결합하거나 결합할 수 있다 (또는 특이적으로 인식하거나 특이적으로 결합함).

특정 구현예에서, 항체는 CD163의 다른 종과 교차 반응할 수 있다 (또는 이에 결합할 수도 있음). 따라서, 일부 구현예에서 항체는 CD163의 하나 이상의 다른 종, 예를 들어 하나 이상의 다른 포유동물 종, 예를 들어 상기 언급된 종과 함께 돼지 CD163에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 돼지 CD163 및 인간 CD163에도 결합할 수 있다. 다른 말로 하면, 항체는 돼지 CD163 및 인간 CD163 모두와 교차 반응할 수 있다. 다른 구현예에서, 항체는 돼지 CD163에 결합할 수 있지만 인간 CD163에는 결합하지 않는다 (또는 유의하게 결합하지 않거나 교차 반응하지 않음).

본 발명의 결합 단백질 및 항체는 임의의 적절한 형태의 CD163, 구체적으로 SRCR5 도메인을 포함하는 CD163의 형태에 결합할 수 있다. 따라서 이러한 형태는 전장의 CD163, 또는 CD163의 비-전장의 형태, 예를 들어 CD163의 절단된 형태, 또는 예를 들어 SRCR 도메인의 하위집합을 포함하지만 일반적으로 SRCR5 도메인을 포함하는 CD163의 다른 변이체 형태를 포함할 수 있다. 본 발명의 결합 단백질 및 항체가 결합할 수 있는 CD163의 바람직하고 편리한 형태는 재조합 CD163, 예를 들어 재조합 돼지 CD163, 또는 세포 표면에서 발현될 때의 CD163 (세포 표면 발현 CD163)을 포함한다. 따라서 이러한 세포 표면 형태는 많은 경우에 고유의 또는 천연 형태의 CD163, 예를 들어 자연적으로 CD163을 발현하거나 과발현하는 세포에서 발견되는 형태일 것이다.

CD163을 자연적으로 발현하는 적절한 세포 유형은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 단핵구 및 대식세포를 포함한다. 바람직한 세포 유형은 PAM이다. 대안적으로, CD163은 예를 들어 CD163을 정상적으로 발현하지 않는 세포 유형에서 재조합 수단 (또는 다른 조작 수단)에 의해 발현되거나 과발현될 수 있으며, 다른 말로 하면 CD163의 재조합 형태를 발현하는 세포가 사용될 수 있다.

본원에서 결합 단백질 및 항체의 결합 성능을 평가하는데 사용될 수 있는 CD163의 예시적인 형태, 예를 들어 재조합 CD163은 전장의 CD163, 또는 CD163-SRCR1-9, CD163-SRCR4-7 또는 CD163-SRCR5-6와 같은 상이한 CD163 SRCR 도메인의 하위집합을 포함하는 구조물이다. 동등하게, 단 SRCR5 도메인의 전부 또는 일부 (바람직하게는 전부)가 존재하면, CD163 SRCR 도메인 및 상이한 CD163 SRCR 도메인의 하위집합을 포함하는 단편의 다른 조합이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 SRCR5 도메인의 또는 내부의 결실, 또는 내부의 돌연변이를 포함하는 CD163 분자에 결합하지 않는다 (또는 이에 유의하게 결합하지 않음). 다른 종, 예로 다른 포유동물 종으로부터의 동등한 형태가 예를 들어 교차 반응성을 평가하는데도 사용될 수 있지만, 돼지 형태는 바람직하게 본 발명의 항체를 평가하는데 사용된다.

다양한 종의 CD163 서열은 당업계에 잘 알려져 있고 기술되어 있으며, 예를 들어 유니프로트와 같은 다양한 서열 데이터베이스로부터 획득될 수 있다. 참조의 편의상, 돼지 CD163는 유니프로트 번호 Q2VL90를 갖고, 인간 CD163은 유니프로트 번호 Q86VB7를 갖는다.

따라서, 본 발명의 바람직한 결합 단백질 또는 항체는 CD163의 SRCR5 도메인 또는 SRCR5 도메인, 바람직하게 돼지 SRCR5 도메인의 에피토프에 결합하는 능력을 갖는다.

돼지 SRCR5 도메인의 서열은 하기에 나타내고, 유니프로트 Q2VL90의 잔기 477번 내지 577번에 해당한다. PRLVGGDIPCSGRVEVQHGDTWGTVCDSDFSLEAASVLCRELQCGTVVSLLGGAHFGEGSGQIWAEEFQCEGHESHLSLCPVAPRPDGTCSHSRDVGVVCS(서열번호 115)

돼지 CD163의 서열은 하기에 나타내고, 유니프로트 Q2VL90의 전체 서열에 해당한다.

MDKLRMVLHENSGSADFRRCSAHLSSFTFAVVAVLSACLVTSSLGGKDKELRLTGGENKCSGRVEVKVQEEWGTVCNNGWDMDVVSVVCRQLGCPTAIKATGWANFSAGSGRIWMDHVSCRGNESALWDCKHDGWGKHNCTHQQDAGVTCSDGSDLEMGLVNGGNRCLGRIEVKFQGRWGTVCDDNFNINHASVVCKQLECGSAVSFSGSANFGEGSGPIWFDDLVCNGNESALWNCKHEGWGKHNCDHAEDAGVICLNGADLKLRVVDGVTECSGRLEVKFQGEWGTICDDGWDSDDAAVACKQLGCPTAVTAIGRVNASEGTGHIWLDSVSCHGHESALWQCRHHEWGKHYCNHDEDAGVTCSDGSDLELRLKGGGSHCAGTVEVEIQKLVGKVCDRSWGLKEADVVCRQLGCGSALKTSYQVYSKTKATNTWLFVSSCNGNETSLWDCKNWQWGGLSCDHYDEAKITCSAHRKPRLVGGDIPCSGRVEVQHGDTWGTVCDSDFSLEAASVLCRELQCGTVVSLLGGAHFGEGSGQIWAEEFQCEGHESHLSLCPVAPRPDGTCSHSRDVGVVCSRYTQIRLVNGKTPCEGRVELNILGSWGSLCNSHWDMEDAHVLCQQLKCGVALSIPGGAPFGKGSEQVWRHMFHCTGTEKHMGDCSVTALGASLCSSGQVASVICSGNQSQTLSPCNSSSSDPSSSIISEENGVACIGSGQLRLVDGGGRCAGRVEVYHEGSWGTICDDSWDLNDAHVVCKQLSCGWAINATGSAHFGEGTGPIWLDEINCNGKESHIWQCHSHGWGRHNCRHKEDAGVICSEFMSLRLISENSRETCAGRLEVFYNGAWGSVGRNSMSPATVGVVCRQLGCADRGDISPASSDKTVSRHMWVDNVQCPKGPDTLWQCPSSPWKKRLASPSEETWITCANKIRLQEGNTNCSGRVEIWYGGSWGTVCDDSWDLEDAQVVCRQLGCGSALEAGKEAAFGQGTGPIWLNEVKCKGNETSLWDCPARSWGHSDCGHKEDAAVTCSEIAKSRESLHATGRSSFVALAIFGVILLACLIAFLIWTQKRRQRQRLSVFSGGENSVHQIQYREMNSCLKADETDMLNPSGDHSEVQ (서열번호 116).

CD163의 적절한 형태에 대한 결합 (또는 결합하는 능력)을 평가하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 임의의 적절한 방법이 사용될 수 있다.

결합을 평가하기 위한 편리하고 적절한 방법은 고정화된 항원, 예컨대 상기 기재된 고정화된 형태의 CD163에 대한 항체의 결합을 평가하기 위한 ELISA 검정법과 같은 시험관내 결합 검정을 포함한다. 당업자라면 ELISA 검정법에 익숙하고, 이러한 검정에서 결합 단백질 또는 항체가 CD163에 결합하는 능력을 평가하는데 적합한 조건을 쉽게 확립할 수 있을 것이다. 특히 바람직한 ELISA 검정법은 실시예 섹션에 설명되어 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 세포 표면 발현된 CD163에 대한 항체의 결합은 유세포 분석법 (예로, FACS 분석)에 의해, 예를 들어 CD163의 재조합 형태, 예로 본원의 다른 곳에서 설명된 형태를 발현하는 PAM 또는 세포를 사용하는 것을 포함한 임의의 적절한 수단에 의해 평가될 수 있다. 특히 바람직한 유세포 분석법은 실시예 섹션에 설명되어 있다. 항체가 세포 표면의 CD163에 결합하는 능력을 테스트하는 또 다른 방법은 면역조직화학법이다.

특정 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질 또는 항체는 표면 플라스몬 공명 (SPR) 검정법 (예로, BIA코아 검정법)에서 (결정된 바와 같이) CD163 (예로, 돼지 CD163 또는 인간 CD163)에 결합한다. 적합한 SPR 검정법은 당업계에 공지되어 있다. 특정 바람직한 SPR 검정법에서, 적절한 형태의 CD163은 예를 들어 아민 커플링 (예로, 2000 반응 단위 (RU) CD163이 고정화됨)에 의해 고체 지지체 (예로, 센서 칩) 상에 포획되고 (또는 고정화됨), 다음으로 다양한 농도 (예로, 일련의 희석, 예로 2배 또는 3배 일련의 희석)의 테스트될 결합 단백질 또는 항체가 주입된다. 주입을 위한 바람직한 농도 및 유속은 실시예 섹션에 설명되어 있다.

이러한 SPR 검정 방법은 또한 항체-항원 상호작용의 결합 동역학을 측정하는데, 예를 들어 결합 속도 (ka), 해리 속도 (kd) 및 친화도 (KD)를 결정하는데 편리하게 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 측정은 적합한 완충액, 예로 HBS-EP (GE 헬스케어 라이프 사이언스사로부터 구입함, 0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.0005% 계면활성제 P20)와 같은 표준 HEPES-EDTA 완충액으로 pH 7.4, 25

에서 수행될 수 있다. 동력학 매개변수는 예를 들어 BIA평가 소프트웨어를 사용하여 1 : 1 상호작용을 가정하는 센소그램 실험 데이터를 피팅함으로써 임의의 적합한 모델 또는 소프트웨어에 의해 결정되거나 계산될 수 있다. 특히 바람직한 SPR 검정법은 본원에서 실시예 섹션에 설명되어 있다.

따라서, 구체적으로 바람직한 구현예에서 본 발명의 결합 단백질 또는 항체는 표면 플라스몬 공명 (SPR) 검정법 (예로, BIA코아 검정법)으로 (결정된 바와 같이, 평가될 때) CD163 (예로, 돼지 또는 인간 CD163, 바람직하게 돼지 CD163)에 결합한다.

특정 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체는 VHH 형식일 때 CD163 (예로, 돼지 CD163)에 대해 높은 결합 친화도를 갖고, 예를 들어 50 nM 이하 (더 우수함) 범위의 K_D (평형 해리 상수)를 갖는다.

따라서, 바람직하게 본 발명의 항체는 VHH 형식일 때 100 nM 미만, 80 nM 미만, 60 nM 미만, 50 nM 미만, 45 nM 미만, 40 nM 미만, 35 nM 미만, 30 nM 미만, 25 nM 미만, 20 nM 미만, 15 nM 미만 또는 10 nM 미만, 더욱 바람직하게 10.0, 9.5, 9.0, 8.5, 8.0, 7.5, 7.0, 6.5, 6.0, 5.5, 5.0, 4.5, 4.0, 3.5, 3.0, 2.5, 2.0, 1.5 또는 1.0 nM의 K_D에 해당하는 CD163 (예로, 돼지 CD163)에 대한 결합 친화도를 갖는다. 특정한 예시적인 결합 친화도는 실시예에 개시되어 있다. 이러한 결합 친화도를 평가하는데 사용될 수 있는 CD163의 예시적인 형태는 SRCR4-7을 포함하는 재조합 돼지 CD163 또는 SRCR1-9를 포함하는 재조합 돼지 CD163이다. 적절한 예시적 형태, 예를 들어 구조물 pCD163-SRCR4-7huFc 또는 pCD163-SRCR1-9huFc는 실시예 섹션에 기재되어 있다. 따라서, 상기 결합 친화도는 본 발명의 항체가 이러한 구조물을 사용하여, 예를 들어 SPR 검정법으로 검정될 때 또는 검정되는 경우에 관찰될 수 있다.

상기 언급된 바와 같이, 본 발명의 일부 구현예에서, 항체는 돼지 CD163에 결합할 수 있지만 인간 CD163에는 결합하지 않는다 (또는 유의하게 결합하지 않음). 대안적으로 보면, 이들은 인간 CD163과 달리 돼지 CD163에 우선적으로 결합한다.

본 발명의 결합 단백질 또는 항체의 바람직한 용도는 CD163가 관여하는 병원성 감염, 가장 명확하게 PRRSV 감염의 치료 또는 예방이기 때문에, 전형적으로 본 발명의 결합 단백질 또는 항체는 병원체 (예로, PRRSV) 감염을 억제하고 (또는 차단 또는 감소시킴), 예를 들어 병원체, 예로 PRRSV가 감염을 유발하는 (예로, 적절한 숙주 세포를 감염시킴) 능력을 억제시킨다 (또는 차단 또는 감소시킴). 바람직하게는, 억제 또는 감소는 측정가능한 억제 또는 감소, 더욱 바람직하게 유의한 억제 또는 감소, 예를 들어 ≤ 0.05 또는 < 0.05의 확률 값과 같은 통계적으로 유의한 억제 또는 감소이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질 또는 항체는 병원체, 예로 PRRSV가 숙주 세포를 감염시키는 능력을 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 92%, 적어도 95% 또는 적어도 98%로 억제할 수 있다. 전형적으로, 이러한 억제% (및 본원에 기술된 다른 억제 백분율 수준)는 적절한 대조군 검정법 또는 대조군 수준, 예를 들어 결합 단백질 또는 항체 (항-CD163 항체)의 부재 하에 대조군 검정법 또는 대조군 수준 (예를 들어, 음성 대조군 또는 배경 수준 또는 검정)과 비교된다. 따라서, 0% 억제 (대조군) 수준 (또는 역으로 100% 또는 최대 감염 수준)은 전형적으로 결합 단백질 또는 항체 (항-CD163 항체)의 부재 하의 수준이다.

감염을 억제하는 이러한 능력은 임의의 적절한 검정법에서 결정되거나 테스트될 수 있으며, 이의 예는 당업자라면 쉽게 유도될 수 있다. 적절한 검정법은 예를 들어 시험관내 또는 생체외 검정일 수 있으며, 예를 들어 본원의 다른 곳에서 논의된 바와 같은 CD163 발현하는 PAM과 같은 숙주 세포 또는 재조합 CD163 발현하는 숙주 세포의 사용이 관여한다. 이러한 세포는 세포의 감염을 유발할 수준에서 PRRSV 또는 기타 적절한 병원체와 접촉할 수 있다. 적절한 검정법은 전형적으로 혈청, 예를 들어 돼지 혈청 또는 소 태아 혈청 (FBS)의 존재 하에 수행될 수 있다. 사용할 혈청의 적절한 백분율은 당업자에 의해 쉽게 결정되며, 예를 들어 10% FBS 및 80% 돼지 혈청의 수준이 실시예 섹션에 기재된 검정법에 사용되었다. 다음으로, 본 발명의 결합 단백질 또는 항체가 이러한 감염을 억제하거나 감소시키는 능력은, 예를 들어 대조군 검정법에 의해 설정된 100% 감염 수준과 비교하여 (또는 이와 대비하여) 쉽게 분석될 수 있다. 적절하고 예시적인 감염 검정법은 실시예 섹션에 설명되어 있다.

임의의 적절한 농도의 결합 단백질 또는 항체는 감염을 억제하거나 감소시키는데 사용될 수 있다. 본 발명의 예시적인 항체는 적어도 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 300 또는 400 μg/mL의 농도, 예로 최대 200, 300 또는 400 μg/mL의 농도, 예로 50 또는 100 내지 200, 300 또는 400 μg/mL의 농도의 항체, 구체적으로 VHH를 사용할 때, 억제 예로 본원에 개략된 바와 같은 억제 수준을 야기하는 능력을 갖는다. 항체 (예로, VHH 항체)의 조합이 사용되는 경우 일부 구현예에서 이러한 수준은 존재하는 항체 (예로, VHH)의 총량, 즉 존재하는 항체의 개별 농도의 합을 말할 수 있다.

일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질 또는 항체는 제 1형 PRRSV 또는 제 2형 PRRSV가 감염을 유발하는 (예로, CD163 발현하는 숙주 세포를 감염시킴) 능력을 억제할 수 있다 (또는 차단 또는 감소시킴). 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질 또는 항체는 제 1형 PRRSV 및 제 2형 PRRSV 둘 다가 감염을 유발하는 (예로, CD163 발현하는 숙주 세포를 감염시킴) 능력을 억제할 수 있다 (또는 차단 또는 감소시킴). 본 발명의 결합 단백질 또는 항체는 본질적으로 PRRSV (또는 다른 병원체 실체)와 달리 숙주 세포 CD163을 표적으로 하는 것을 알 수 있다. 이것은 감염 또는 발병기전에 대해 CD163의 동일한 결합 영역을 사용하는 임의의 바이러스, 예로 PRRSV에 의한 감염을 억제할 수 있는 중요한 장점을 제공한다. 이러한 방식으로, 본 발명의 항체 등은 단 세포를 감염시키는데 CD163을 사용하면 고병원성 균주 또는 분리주를 포함하는 PRRSV의 많은 균주 또는 분리주를 차단하는 수단을 제공할 수 있다. CD163 활용은 다수의 PRRSV 균주에 의한 감염에 공통적인 것으로 여겨진다. 따라서, 본 발명의 항체는 광범위한 유용성을 갖는다. 이것은 예를 들어 PRRSV에 대한 알려진 일부 접근법, 예로 균주 특이적일 수 있는 백신 접종과는 대조되며, 이들의 효과 (또는 이들이 효과적인지 여부)는 균주에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체는 이러한 선행 방법을 능가하는 중요한 장점 및 유연성을 제공한다.

본 발명의 바람직한 항체는 제 1형 PRRSV 감염을 거의 완전히 억제하는 능력을 갖으며, 예를 들어 적어도 90%의 억제가 관찰될 수 있다. 대안적으로, 적어도 50%, 60%, 70%, 75% 또는 80%의 억제가 관찰될 수 있다. 일부 구현예에서, 제 1형 PRRSV 감염의 적어도 80%의 억제, 더욱 바람직하게 적어도 85%, 90% 또는 95%의 억제를 나타내는 능력을 갖는 항체가 바람직하다.

본 발명의 바람직한 항체는 제 2형 PRRSV 감염을 적어도 50%, 적어도 55% 또는 적어도 60%, 더욱 바람직하게 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75% 또는 적어도 80%의 억제하는 능력을 갖는다.

본 발명의 일부 바람직한 항체는 제 1형 및 제 2형 PRRSV 감염 둘 다를, 예를 들어 상기 및 본원의 다른 곳에 기재된 수준에서 억제하는 능력을 갖는다. 이러한 항체는 때로 본원에서 "이중" 항체로 지칭된다. 따라서 예시적인 항체는 제 1형 PRRSV의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%의 억제와 조합하여 제 2형 PRRSV의 적어도 50%의 억제를 할 수 있다. 대안의 예시적인 항체는 제 1형 PRRSV의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%의 억제와 조합하여 제 2형 PRRSV의 적어도 55% 또는 60%의 억제를 할 수 있다. 대안의 예시적인 항체는 제 1형 PRRSV의 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%의 억제와 조합하여 제 2형 PRRSV의 적어도 65%, 70% 또는 75%의 억제를 할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 바람직한 항체는 제 1형 PRRSV의 적어도 90% 또는 95%의 억제와 조합하여 제 2형 PRRSV의 적어도 65%, 70% 또는 75%의 억제를 할 수 있다.

VHH 항체의 형태에서 예시적인 "이중" 항체는 표 A, 표 B, 표 C, 표 D, 표 E, 표 F, 표 G, 표 H 및 표 I에 각각 나타낸 바와 같은 49(#18), 47(#19), 48(#20), 76(#2), 77(#16), 78(#8), 150(#15), 70(#23) 및 144(#1)이다.

일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질 또는 항체는 제 2형 PRRSV가 숙주 세포를 감염시키는 능력을 억제할 수 있다 (또는 차단 또는 감소시킴). 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질 또는 항체는 제 2형 PRRSV가 감염을 유발하는 능력을 특이적으로 억제하는 (또는 차단 또는 감소시킴) (예로, CD163 발현하는 숙주 세포를 감염시키거나, 제 2형 PRRSV 감염을 특이적으로 억제하는) 능력을 갖는다. 이러한 결합 단백질 또는 항체는 PRRSV 제 1형 감염과 달리 PRRSV 제 2형 감염을 우선적으로 억제하거나 감소시킨다. 따라서 예시적인 항체는 제 2형 PRRSV 감염을 적어도 40%, 45% 또는 50%의 억제를 할 수 있다 (예로, 제 2형 PRRSV가 숙주 세포를 감염시키는 능력을 적어도 40%, 45% 또는 50%로 억제함).

다른 구현예에서, 이러한 결합 단백질 또는 항체는 제 1형 PRRSV 감염을 억제하거나 감소시키지 않거나 (예로 유의하게 억제하거나 감소시키지 않음) (예로, 제 1형 PRRSV가 숙주 세포를 감염시키는 능력을 억제 또는 감소시키지 않거나, 유의하게 억제 또는 감소시키지 않음). 순수하게 예로서, 제 1형 PRRSV 감염을 유의하게 억제하거나 감소시키지 않는 이러한 항체는 이러한 감염을 단지 10% 미만, 또는 5% 미만, 또는 2% 미만으로 감소시키거나, 바람직하게 전혀 감소시키지 않을 수 있다 (0%로). 이러한 항체는 때로 본원에서 "제 2형 특이적" 또는 "제 2형 전용" 항체로 지칭된다. VHH 항체의 형태에서 예시적인 이러한 항체는 각각 표 1, 표 2, 표 3 및 표 4에 나타낸 바와 같이 57(#11), 41(#12), 171(#14) 및 29(#17)이다.

제 1형과 제 2형 PRRSV 억제 사이의 비교는 예를 들어 검정 조건이 동일하게 유지되는, 예로 동일한 농도의 테스트 항체 또는 결합 단백질을 사용하는 적절한 검정법을 사용하여 쉽게 수행할 수 있지만, 하나의 검정법이 제 1형 PRRSV을 사용하여 수행되고, 나머지는 제 2형 PRRSV를 사용하여 수행된다. 이러한 억제를 평가하기 위한 적절한 대조군도 본원의 다른 곳에 설명되어 있다.

특정 구현예에서, 본 발명의 항체는 (숙주 세포, 예로 PAM의 PRRSV1 감염 억제의 경우) 350 μg/mL 이하, 300 μg/mL 이하, 280 μg/mL 이하, 260 μg/mL 이하, 240 μg/mL 이하, 220 μg/mL 이하, 200 μg/mL 이하, 190 μg/mL 이하, 180 μg/mL 이하, 170 μg/mL 이하, 160 μg/mL 이하, 150 μg/mL 이하, 140 μg/mL 이하, 130 μg/mL 이하, 120 μg/mL 이하, 110 μg/mL 이하, 100 μg/mL 이하, 90 μg/mL 이하 또는 80 μg/mL 이하의 IC₅₀을 갖는다. 일부 구현예에서, IC₅₀은 80 μg/mL 내지 350, 300, 250 또는 200 μg/mL, 또는 80 μg/mL 내지 160 μg/mL, 또는 80 μg/mL 내지 120 μg/mL, 또는 100 μg/mL 내지 200 μg/mL, 또는 100 μg/mL 내지 160 μg/mL, 또는 100 μg/mL 내지 120 μg/mL이다. 특정한 예시적인 IC₅₀ 값은 또한 실시예에 나타낸다.

특정 구현예에서, 본 발명의 항체는 (숙주 세포, 예로 PAM의 PRRSV2 감염 억제의 경우) 300 μg/mL 이하, 280 μg/mL 이하, 260 μg/mL 이하, 240 μg/mL 이하, 220 μg/mL 이하, 210 μg/mL 이하, 200 μg/mL 이하, 180 μg/mL 이하, 170 μg/mL 이하, 160 μg/mL 이하, 150 μg/mL 이하, 140 μg/mL 이하, 130 μg/mL 이하, 120 μg/mL 이하, 110 μg/mL 이하 또는 100 μg/mL 이하의 IC₅₀을 갖는다. 일부 구현예에서, IC₅₀은 100 μg/mL 내지 150 μg/mL, 200 μg/mL 내지 300 μg/mL, 또는 200 μg/mL 내지 260 μg/mL, 또는 200 μg/mL 내지 220 μg/mL, 또는 220 μg/mL 내지 300 μg/mL, 또는 220 μg/mL 내지 260 μg/mL, 또는 220 μg/mL 내지 240 μg/mL이다. 특정한 예시적인 IC₅₀ 값은 또한 실시예에 나타낸다.

상기에 기술된 바람직한 IC₅₀ 값은 바람직하게 예로 상기 기재된 바와 같이 또는 실시예 섹션에서 적절한 바이러스 감염도 검정법에서 결정된 바와 같다.

본원에 기술된 이중 항체는 제 2형 PRRSV 감염을 억제하는 우수한 능력을 나타내지만, 일반적으로 제 2형 PRRSV 감염의 억제가 완전하지 않거나 제 1형 PRRSV 감염 억제에 대해 관찰된 수준만큼 높은 수준에 도달하지 않는 것으로 관찰된다. 이론에 얽매이는 것은 아니지만, 제 2형 감염과 관련된 CD163 상의 하나 이상의 에피토프가 있을 수 있다. 따라서, 본 발명의 바람직한 구현예에서, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 이중 항체 및 제 2형 특이적 항체가 조합하여 사용될 수 있다. 이러한 조합은 구체적으로 제 2형 PRRSV 감염의 치료 또는 예방이 필요하거나 바람직할 때 유용할 수 있다.

본 발명의 대안의 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질 또는 항체는 PRRSV 감염의 위험을 감소시키거나 예방하는데 사용될 수 있다.

바람직하게, 상기 기술된 능력 및 특성은 적절한 대조군 수준과 비교할 때 측정가능한 또는 유의한 수준에서, 더욱 바람직하게는 통계적으로 유의한 수준에서 관찰된다. 적절한 유의성 수준은 본원의 다른 곳에서 논의된다. 더욱 바람직하게, 상기 기술된 능력 및 특성 중 하나 이상은 선행 기술 항체에 대해 관찰된 능력과 비교할 때, 측정가능하게 더 우수하거나 더욱 바람직하게는 유의하게 더 우수한 (바람직하게 통계적으로 유의하게 더 우수함) 수준에서 관찰된다.

본원에 언급된 임의의 통계적 분석에서, 바람직하게 관련 대조군 또는 다른 비교 실체 또는 측정과 비교한 통계적으로 유의한 차이는 ≤ 0.1 또는 < 0.1, 바람직하게 ≤ 0.05 또는 < 0.05의 확률 값을 갖는다. 통계적 유의성을 결정하는 적절한 방법은 당업계에 잘 알려져 있고, 기록되어 있으며 이들 중 임의의 것은 사용될 수 있다.

일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질 또는 항체는 본원에 기재된 기능적 특성, 구체적으로 바람직한 기능적 특성 중 하나 이상, 바람직하게 2개 이상 또는 3개 이상, 가장 바람직하게 모두를 갖는다.

전체 출원에 걸쳐 사용된 용어 "a" 및 "an"은 상한이 이후에 구체적으로 언급되는 경우를 제외하고, 언급된 구성요소 또는 단계의 "적어도 하나", "적어도 제 1", "하나 이상" 또는 "다수"를 의미하는 맥락으로 사용된다. 따라서, 본원에 사용된 "항체"는 "적어도 제 1 항체"를 의미한다.

또한, 용어 "포함하다", "포함하다", "갖다" 또는 "갖는", 또는 기타 동등한 용어가 본원에서 사용되는 경우, 일부 보다 구체적인 구현예에서, 예를 들어 본원의 CDR 또는 FR 서열의 정의에서, 이들 용어는 용어 "로 구성되는" 또는 "로 필수적으로 구성되는" 또는 기타 동등한 용어를 포함한다.

본원에 정의된 본 발명의 결합 단백질 또는 항체 또는 이들의 부분 또는 단편을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자, 또는 이에 실질적으로 상동성인 핵산 분자는 본 발명의 추가의 양태를 형성한다.

바람직한 핵산 분자는 본 발명의 VHH 항체 또는 VH 영역 또는 도메인을 인코딩하는 핵산 분자 (예를 들어, 서열번호 1, 9, 17, 25, 33, 41, 49, 57 또는 65를 인코딩하는 핵산 분자)이다. 다른 바람직한 핵산 분자는 표 A, 표 B, 표 C, 표 D, 표 E, 표 F, 표 G, 표 H 또는 표 I 중 어느 하나에 정의된 3개의 CDR 서열 세트를 인코딩하는 핵산 분자이다. 바람직한 이러한 핵산 분자는 또한 적절한 구조틀 영역, 예를 들어, FR1, FR2, FR3 및 FR4 영역, 바람직하게 표 A, 표 B, 표 C, 표 D, 표 E, 표 F, 표 G, 표 H 또는 표 I 중 어느 하나에 정의된 FR 서열의 세트를 인코딩한다.

다른 구현예에서, 바람직한 핵산 분자는 본 발명의 VHH 항체 또는 VH 영역 또는 도메인을 인코딩하는 핵산 분자 (예를 들어, 서열번호 83, 91, 99 또는 107을 인코딩하는 핵산 분자)이다. 다른 바람직한 핵산 분자는 표 1, 표 2, 표 3 또는 표 4 중 어느 하나에 정의된 3개의 CDR 서열의 세트를 인코딩하는 핵산 분자이다. 바람직한 이러한 핵산 분자는 또한 적절한 구조틀 영역, 예를 들어, FR1, FR2, FR3 및 FR4 영역, 바람직하게 표 1, 표 2, 표 3 또는 표 4 중 어느 하나에 정의된 FR 서열의 세트 (예로, 본 발명의 제 2형 특이적 항체)를 인코딩한다.

아미노산 또는 핵산 서열과 관련하여 본원에 사용된 용어 "실질적으로 상동성인"은 개시된 아미노산 또는 핵산 서열과 적어도 60%, 65%, 70% 또는 75%, 바람직하게는 적어도 80%, 훨씬 더 바람직하게 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 따라서, 본 발명의 실질적으로 상동성인 서열은 본 발명의 서열에 대한 단일 또는 다수의 염기 또는 아미노산 변경 (첨가, 치환, 삽입 또는 결실)을 포함한다. 아미노산 수준에서 바람직한 실질적으로 상동성인 서열은 본 발명의 서열을 구성하는 하나 이상의 구조틀 영역 및/또는 하나 이상의 CDR에서, 최대 5개, 예로 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개, 바람직하게 1개, 2개, 3개 또는 4개, 바람직하게 1개, 2개 또는 3개, 더욱 바람직하게 1개 또는 2개의 변경된 아미노산을 포함한다. 상기 변경은 보존적 또는 비-보존적 아미노산으로 이루어질 수 있다. 바람직하게 상기 변경은 치환, 바람직하게는 보존적 아미노산 치환이다.

특정 구현예에서, 주어진 출발 서열이 비교적 짧은 경우 (예로, 5개의 아미노산 길이), 더 긴 출발 서열에 실질적으로 상동성인 서열에서 임의적으로 만들어질 수 있는 아미노산 치환의 수와 비교하여, 이 짧은 서열에 실질적으로 상동성인 서열에 더 적은 수의 아미노산 치환이 존재할 수 있다. 예를 들어, 특정 구현예에서 본 발명에 따른 출발 VH CDR1 서열, 예를 들어 일부 구현예에서 5개 아미노산 잔기의 길이일 수 있는 출발 VH CDR1 서열은 출발 서열과 비교하여 바람직하게 1 또는 2개 (더욱 바람직하게 1개)의 변경된 아미노산을 갖는다. 따라서, 일부 구현예에서 실질적으로 상동성인 서열 (예로, 실질적으로 상동성인 CDR 서열)에서 변경된 아미노산의 수는 주어진 출발 CDR 서열의 길이에 맞춰질 수 있다. 예컨대 CDR에서 특정한 %의 서열 동일성, 예를 들어 적어도 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 달성하도록, 주어진 출발 CDR 서열의 길이에 따라 상이한 수의 변경된 아미노산이 존재할 수 있다.

알라닌 스캐닝 돌연변이 생성기전 및/또는 항원-항체 복합체의 결정 구조 분석과 같은 당업계의 일상적인 방법을 사용하여 CDR의 해당 아미노산 잔기가 항원 결합에 기여하지 않거나 항원 결합에 유의하게 기여하지 않는지 여부, 따라서 실질적으로 상동성인 서열이 관여하는 본 발명의 구현예에서 변경 또는 치환을 위한 우수한 후보인 점을 결정할 수 있다.

일단 확인되면, 부모 항체의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산의 첨가, 결실, 치환 또는 삽입을 통해 새로운 항체를 형성하고, 여기서 상기 부모 항체는 본원의 다른 곳에서 정의된 바와 같은 본 발명의 항체 중 하나이며, 생성된 새로운 항체를 테스트하여 CD163에 결합하는 항체를 본 발명에 따라 식별하는 것이 당업계의 통상적인 기법을 사용하여 수행될 수 있다. 이러한 방법은 CD163에 결합하는 능력에 대해 모두 테스트할 수 있는 다수의 새로운 항체를 형성하는데 사용할 수 있다. 바람직하게, 하나 이상의 아미노산의 상기 첨가, 결실, 치환 또는 삽입은 하나 이상의 CDR 도메인에서 발생한다.

예를 들어, 상기 조작은 적절한 결합 단백질 및 이들의 도메인을 인코딩하는 핵산 분자가 결과적으로 발현된 단백질의 아미노산 서열이 순서대로 적절한 방식으로 변형되도록 변형되는 핵산 수준에서 유전자 조작에 의해 편리하게 수행될 수 있다. 하나 이상의 변형된 항체가 CD163에 결합하는 능력을 테스트하는 것은 당업계에 잘 알려져 있고 기술된 임의의 적절한 방법에 의해 수행될 수 있다. 적절한 방법은 또한 본원의 다른 곳에 및 실시예 섹션에 설명되어 있다.

이들 방법에 의해 생산되거나, 획득되거나, 획득가능한 새로운 항체는 본 발명의 또 다른 양태를 형성한다.

용어 "실질적으로 상동성인"은 또한 실질적으로 동일한 방식으로 본 발명의 단백질 또는 핵산 분자와 실질적으로 동일한 기능을 수행하는 본 발명의 아미노산 및 뉴클레오티드 서열의 변형 또는 화학적 동등물을 포함한다. 예를 들어, 임의의 실질적으로 상동성인 항체는 상기에 설명한 바와 같이 CD163에 결합하는 능력을 보유해야 한다. 바람직하게, 임의의 실질적으로 상동성인 항체는 출발 항체의 기능적 성능 중 하나 이상(또는 모두)을 보유해야 한다.

바람직하게는, 임의의 실질적으로 상동성인 항체는 문제가 되는 출발 항체에 의해 인식되는 것과 동일한 CD163 에피토프, 예를 들어 본 발명의 하나 이상의 항체의 CDR 도메인에 의해 인식되는 동일한 에피토프, 또는 본원에 기재된 본 발명의 VH (VHH) 도메인에 특이적으로 결합하고, 예로 본 발명의 다양한 항체 중 하나 이상 (예로, 표 A, 표 B, 표 C, 표 D, 표 E, 표 F, 표 G, 표 H 및 표 I에 각각 나타낸 바와 같은 VHH 항체 49(#18), 47(#19), 48(#20), 76(#2), 77(#16), 78(#8), 150(#15), 70(#23) 또는 144(#1) 중 하나 이상)과 동일한 에피토프에 결합하는 능력을 보유해야 한다. 따라서, 바람직하게 임의의 실질적으로 상동성인 항체는 적합한 검정법으로 본 발명의 다양한 항체 (예로, 표 A, 표 B, 표 C, 표 D, 표 E, 표 F, 표 G, 표 H 및 표 I에 각각 나타낸 바와 같은 VHH 항체 49(#18), 47(#19), 48(#20), 76(#2), 77(#16), 78(#8), 150(#15), 70(#23) 또는 144(#1)) 중 하나 이상과 CD163에 대한 결합을 경쟁하는 능력을 보유해야 한다.

다른 구현예에서, 임의의 실질적으로 상동성인 항체는 문제가 되는 출발 항체에 의해 인식되는 것과 동일한 CD163 에피토프, 예를 들어 본 발명의 하나 이상의 항체의 CDR 도메인에 의해 인식되는 동일한 에피토프, 또는 본원에 기재된 본 발명의 VH (VHH) 도메인에 특이적으로 결합하고, 예로 본 발명의 다양한 제 2형 항체 중 하나 이상 (예로, 표 1, 표 2, 표 3 및 표 4에 각각 나타낸 바와 같은 VHH 항체 57(#11), 41(#12), 171(#14) 또는 29(#17) 중 하나 이상)과 동일한 에피토프에 결합하는 능력을 보유해야 한다. 따라서, 바람직하게 임의의 실질적으로 상동성인 항체는 본 발명의 다양한 제 2형 항체 (예로, 표 1, 표 2, 표 3 및 표 4에 각각 나타낸 바와 같은 VHH 항체 57(#11), 41(#12), 171(#14) 또는 29(#17), 예로, 본 발명의 제 2형 특이적 항체) 중 하나 이상과 CD163에 대한 결합을 경쟁하는 능력을 보유해야 한다.

동일한 에피토프/항원에 대한 결합은 예를 들어 결합 검정법, 예로 경쟁 검정법을 사용하거나 항원-항체 복합체의 결정 구조 분석에 의해 당업계에 잘 알려져 있고 기술된 방법에 의해 쉽게 테스트할 수 있다. 다른 기능적 특성의 보유도 당업계 또는 본원에서 잘 알려져 있고 기술된 방법에 의해 쉽게 테스트될 수 있다.

따라서, 당업자라면 결합 검정법, 예를 들어 본원의 다른 곳에서 기술된 바와 같은 경쟁 검정법 또는 ELISA 검정법과 같은 결합 검정법이 임의의 항체, 예를 들어 "실질적으로 상동성인" 항체가 본 발명의 항체 및 항체 단편과 동일한 결합 특이성을 갖는지, 예로 동일한 에피토프에 결합하는지, 또는 동일한 또는 동등한 친화도로인지 여부를 테스트하는데 사용될 수 있음을 이해할 것이다. BIA코아 검정법은 또한 항체, 예를 들어 "실질적으로 상동성인" 항체가 CD163에 결합할 수 있는지 여부를 확립하는 데 쉽게 사용될 수 있다. 당업자라면 다른 적합한 방법 및 변형을 알고 있을 것이다.

하기에 개략된 바와 같이, 경쟁 결합 검정법은 항체, 예를 들어 "실질적으로 상동성인" 항체가 본원이 다양한 서열 표에 나타낸 바와 같이 본 발명의 하나 이상의 항체에 의해 인식되는 CD163의 실질적으로 동일한 에피토프에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는지 여부, 또는 본원의 다양한 서열 표에 나타낸 바와 같이 본 발명의 다양한 항체 중 하나 이상과 경쟁하는 능력을 갖는지 여부를 테스트하는데 사용될 수 있다. 하기에 설명된 방법은 적합한 경쟁 검정법의 일 예일 뿐이다. 당업자라면 다른 적합한 방법 및 변형을 알고 있을 것이다.

예시적인 경쟁 검정법은 다양한 농도의 테스트 항체 (예로, 실질적으로 상동성인 항체)의 존재 하에 다양한 유효 농도의 본 발명의 항체의 CD163에 대한 결합을 평가하는 것이 관여한다. 다음으로, 테스트 항체에 의해 유도된 결합 억제의 양이 평가될 수 있다. 증가하는 농도의 본 발명의 항체와의 증가된 경쟁을 나타내는 테스트 항체 (즉, 테스트 항체의 농도 증가는 CD163에 결합하는 본 발명의 항체의 양의 상응하는 감소를 유도함)는 실질적으로 동일한 에피토프에 대한 결합의 증거이다. 바람직하게, 테스트 항체는 CD163에 결합하는 본 발명의 항체의 양을 유의하게 감소시킨다. 바람직하게, 테스트 항체는 CD163에 결합하는 본 발명의 항체의 양을 적어도 약 95%로 감소시킨다. ELISA 및 유세포 분석 검정법은 이러한 경쟁 검정법에서 결합 억제를 평가하는데 사용될 수 있지만 다른 적합한 기법도 당업자에게 잘 알려져 있다.

본 발명의 항체 (예로, 표 A, 표 B, 표 C, 표 D, 표 E, 표 F, 표 G, 표 H 및 표 I에 각각 나타낸 바와 같은 VHH 항체 49(#18), 47(#19), 48(#20), 76(#2), 77(#16), 78(#8), 150(#15), 70(#23) 또는 144(#1))에 의해 인식되는 CD163의 실질적으로 동일한 (또는 동일한) 에피토프 또는 CD163의 중첩하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 능력를 갖거나, 본 발명의 다양한 항체 (예로, 표 A, 표 B, 표 C, 표 D, 표 E, 표 F, 표 G, 표 H 및 표 I에 각각 나타낸 바와 같은 VHH 항체 49(#18), 47(#19), 48(#20), 76(#2), 77(#16), 78(#8), 150(#15), 70(#23) 또는 144(#1)) 중 하나 이상과 경쟁하는 능력을 갖는 이러한 항체 (단일클론항체)는 본 발명의 추가의 구현예이다.

또 다른 구현예에서, 본 발명의 항체 (예로, 표 1, 표 2, 표 3 및 표 4에 각각 나타낸 바와 같은 VHH 항체 57(#11), 41(#12), 171(#14) 또는 29(#17))에 의해 인식되는 CD163의 실질적으로 동일한 (또는 동일한) 에피토프 또는 CD163의 중첩하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 능력을 갖거나, 본 발명의 다양한 항체 (예로, 표 1, 표 2, 표 3 및 표 4에 각각 나타낸 바와 같은 VHH 항체 57(#11), 41(#12), 171(#14) 또는 29(#17)) 중 하나 이상과 경쟁하는 능력을 갖는 항체 (단일클론항체)는 본 발명의 추가의 구현예이다. 일부 구현예에서, 바람직한 이러한 항체는 표 3에 개략된 서열번호 99 (또는 상기 서열의 관련 3개의 CDR 서열)를 포함하는 VHH 항체 171(#14)이다.

본원에 사용된 용어 "경쟁 항체"는 "기준 항체"와 거의, 실질적으로 또는 필수적으로 동일하거나 심지어 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 말한다. "경쟁 항체"는 중첩하는 에피토프 특이성을 갖는 항체를 포함한다. 따라서 경쟁 항체는 CD163에 대한 결합을 기준 항체와 효과적으로 경쟁할 수 있다. 바람직하게, 경쟁 항체는 기준 항체와 동일한 에피토프에 결합할 수 있다. 대안적으로 보면, 경쟁 항체는 바람직하게 기준 항체와 동일한 에피토프 특이성을 갖는다.

본원에 사용된 "기준 항체"는 바람직하게 본원에 정의된 VH 도메인을 갖거나, 더욱 바람직하게 VH 도메인을 갖거나, 표 A, 표 B, 표 C, 표 D, 표 E, 표 F, 표 G, 표 H 및 표 I에 개략된 바와 같은 서열번호 1, 9, 17, 25, 33, 41, 49, 57 또는 65 (또는 상기 서열의 관련 3개의 CDR 서열)를 포함하는 VHH 항체인, 본 발명에 따라 CD163에 결합할 수 있는 항체이다.

본원에 사용된 다른 "기준 항체"는 바람직하게 본원에 정의된 VH 도메인을 갖거나, 더욱 바람직하게 VH 도메인을 갖거나, 표 1, 표 2, 표 3 및 표 4에 개략된 바와 같이 서열번호 83, 91, 99 또는 107을 포함하는 VHH 항체 (예로, 본 발명의 제 2형 특이적 항체)인, 본 발명에 따라 CD163에 결합할 수 있는 항체이다. 일부 구현예에서, 바람직한 기준 항체는 표 3에 개략된 서열번호 99 (또는 상기 서열의 관련 3개의 CDR 서열)를 포함하는 VHH 항체이다.

동일한 에피토프에 결합하는 하나 이상의 경쟁 항체 또는 항체들의 식별은 이제 본원의 서열 표에 개략된 것과 같은 기준 항체가 제공되었던 간단한 기술적 문제이다. 동일한 에피토프에 결합하는 경쟁 항체 또는 항체들의 식별은 기준 항체와 비교하여 결정될 수 있기 때문에, 하나 또는 둘 다의 항체가 결합하는 에피토프를 실제로 결정하는 것은 경쟁 항체 또는 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 식별하기 위해 어떠한 방식으로도 필요하지 않음을 이해할 것이다. 그러나 원하는 경우 표준 기술을 사용하여 에피토프 매핑이 수행될 수 있다.

서열번호 115에 기재된 돼지 CD163의 SRCR5 도메인 및 VHH 항체 171(#14), 즉 표 3에 나타낸 아미노산 서열 (서열번호 17' 또는 99)을 갖는 VHH 014 (2D01) 사이의 항원-항체 복합체의 결정 구조의 분석이 수행되어 이러한 항체가 결합하는 CD163의 영역 (에피토프)을 결정하였다 (도 6 참조). 항원 결합에 기여하는 돼지 CD163 상의 잔기는 돼지 CD163의 S507, E509, L526 및 L527로서 식별되었다 (서열번호 116에 기재된 유니프로트 Q2VL90 서열 참조). 결정 구조는 S507 및 E509가 VHH 014 (2D01)의 L104와 상호작용하고, L526이 VHH 014 (2D01)의 Y59와 상호작용하고, L527이 VHH 014 (2D01)의 D62와 상호작용함을 나타낸다.

CD163 상의 에피토프

따라서, 추가의 양태는 돼지 CD163에 결합하거나 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는 항체 (또는 결합 단백질)를 제공하며, 여기서 상기 항체 (항원 결합 도메인)는 서열번호 116의 아미노산 S507, E509, L526 및 L527, 또는 대안의 CD163 서열, 예로 또 다른 종으로부터의 CD163 서열에서 상응하는 잔기를 포함하는 (또는 이들에 의해 정의됨) 돼지 CD 163의 SRCR5 도메인에 있는 에피토프에 결합한다.

대안적으로 보면, 추가의 양태는 돼지 CD163에 결합하거나 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는 항체 (또는 결합 단백질)를 제공하며, 여기서 상기 항체 (항원 결합 도메인)는 서열번호 115의 아미노산 S32, E34, L51 및 L52, 또는 대안의 CD163 서열, 예로 또 다른 종으로부터의 CD163 서열에서 상응하는 잔기를 포함하는 (또는 이들에 의해 정의됨) 돼지 CD163의 SRCR5 도메인에 있는 에피토프에 결합한다. 관련 잔기는 하기 서열번호 115에 밑줄로 표시된다.

PRLVGGDIPCSGRVEVQHGDTWGTVCDSDFSLEAASVLCRELQCGTVVSLLGGAHFGEGSGQIWAEEFQCEGHESHLSLCPVAPRPDGTCSHSRDVGVVCS (서열번호 115)

구체적으로, VHH의 CDR2 및 돼지 CD163 (서열번호 116)의 잔기 L526 및 L527 사이의 상호작용은 항원-항체 (항원 결합 도메인) 상호작용에 중요한 것으로 보인다. 따라서, 본 발명의 추가의 양태는 돼지 CD163에 결합하거나 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는 항체 (또는 결합 단백질)를 제공하며, 여기서 상기 항체 (항원 결합 도메인)는 서열번호 116의 아미노산 L526 및 L527, 또는 대안의 CD163 서열, 예로 또 다른 종으로부터의 CD163 서열에서 상응하는 잔기를 포함하는 (또는 이들에 의해 정의됨) 돼지 CD163의 SRCR5 도메인에 있는 에피토프에 결합한다.

다른 구현예에서, 본 발명은 돼지 CD163에 결합하거나 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는 항체 (또는 결합 단백질)를 제공하며, 여기서 상기 항체 (항원 결합 도메인)는 서열번호 116의 아미노산 L526, L527 및 S507, 또는 L526, L527 및 E509, 또는 아미노산 L526, L527, S507 및 E509, 또는 대안의 CD163 서열, 예로 또 다른 종으로부터의 CD163 서열에서 상응하는 잔기를 포함하는 (또는 이들에 의해 정의됨) 돼지 CD163의 SRCR5 도메인에 있는 에피토프에 결합한다.

다른 구현예에서, 상기 항체 (항원 결합 도메인)는 서열번호 116의 잔기 S507, E509, L526 및 L527 중 1개, 2개, 3개 또는 모두, 또는 대안의 CD163 서열, 예로 또 다른 종으로부터의 CD163 서열에서 상응하는 잔기를 포함하는 (또는 이들에 의해 정의됨) 돼지 CD163의 SRCR5 도메인에 있는 에피토프에 결합한다. 다른 말로 하면, 본 발명의 항체 (또는 결합 단백질)에 의해 결합된 CD163 상의 에피토프의 적어도 하나의 아미노산은 서열번호 116의 S507, E509, L526 또는 L527, 또는 대안의 CD163 서열, 예로 또 다른 종으로부터의 CD163 서열에서 상응하는 잔기를 포함한다. 이러한 항체는 중첩하는 에피토프에 결합하는 항체의 예로서 간주될 수 있다.

대안적으로 보면, 상기 항체 (항원 결합 도메인)는 서열번호 115의 잔기 S32, E34, L51 및 L52 중 1개, 2개, 3개 또는 모두, 또는 대안의 CD163 서열, 예로 또 다른 종으로부터의 CD163 서열에서 상응하는 잔기를 포함하는 (또는 이들에 의해 정의됨) 돼지 CD163의 SRCR5 도메인에 있는 에피토프에 결합한다. 다른 말로 하면, 본 발명의 항체 (또는 결합 단백질)에 의해 결합된 CD163 상의 에피토프의 적어도 하나의 아미노산은 서열번호 115의 S32, E34, L51 또는 L52, 또는 대안의 CD163 서열, 예로 또 다른 종으로부터의 CD163 서열에서 상응하는 잔기를 포함한다. 이러한 항체는 중첩하는 에피토프에 결합하는 항체의 예로서 간주될 수 있다.

본 발명자들이 아는 한, 돼지 CD163, 구체적으로 돼지 CD163의 SRCR5 도메인에 있는 에피토프에 결합하거나 특이적으로 결합할 수 있고, 제 2형 PRRSV 감염을 억제하거나 감소시킬 수 있는 단일클론 항체는 제 2형 PRRSV 감염만이 억제 또는 감소되는 형태, 또는 상기 항체가 제 1형 및 제 2형 PRRSV 감염을 억제 또는 감소시킬 수 있는 형태로 당업계에 기술되어 있지 않았다.

따라서, 본원에 기재된 개별 단일클론 항체는 특별하고도 유리하다. 또한 상기에 제시된 바와 같이, 본 발명자들은 제 2형 PRRSV 감염에 중요하고, 따라서 PRRSV 감염을 감소시키거나 억제하기 위해 일반적으로 항체 및 결합 단백질의 표적이 되는 돼지 CD163 상의 에피토프를 확인한 것으로 생각한다. 본원에서 에피토프의 일부인 것으로 확인된 돼지 CD163 상의 잔기가 PRRSV 감염에 잠재적으로 중요한 것으로 이전에 확인된 잔기와 상이한 CD163 영역에 위치하는 점을 추가로 주목할 수 있다. 예를 들어 이전의 보고, 예로 Ma et al., 2017 (Am. Soc. For Microbiology, 91(3): e01897-16)는 CD163의 SRCR5 도메인에 있는 R561 잔기가 제 1형 PRRSV 감염에 중요한 것으로서 확인하였다. 이러한 잔기는 CD163의 잔기 Phe 544번 및 Arg 570번 사이에 위치한 돼지 CD163의 루프 5번 내지 6번에서 발견된다. 다른 보고서는 CD163의 잔기 S487 및 G499 사이에 위치한 CD163의 리간드 결합 포켓 (LBP)도 PRRSV 감염의 중요한 영역일 수 있음을 예상하였다. 현재 연구에서 에피토프의 일부로 확인된 4개의 잔기는 이들 영역에 전혀 존재하지 않는다.

따라서, 본 발명은 PRRSV 감염, 구체적으로 제 2형 PRRSV 감염에 중요한 돼지 CD163의 SRCR5 영역의 구별된 부분에서 신규한 에피토프를 식별한 것으로 여겨지고, 이러한 에피토프 또는 중첩하는 에피토프에 결합하는 항체 (또는 결합 단백질)는 특히 바람직하다. 상기 기재된 바와 같이, 표 3에 나타낸 항체 171(#14)은 이 에피토프에 결합하는 것으로 나타났다. 경쟁 결합 연구를 사용한 초기 실험은 적어도 항체 57(#11), 70(#23), 144(#1) 및 150(#15)이 동일하거나 중첩하는 에피토프에 결합할 수 있음을 보여준다.

항체 상의 파라토프

CD163의 2개의 L 잔기 L526 및 L527은 VHH 항체 171(#14), 즉 VHH 014(2D01)의 CDR2에서 발견되는 YYAD 모티프의 Y59 및 D62와 상호작용하는 것으로 나타났다. 이러한 VHH 항체는 제 2형 PRRSV 감염에 미치는 억제성 효과를 갖거나 이를 감소시키는 것으로 나타났다. 서열 YYAD 또는 서열 YYAD와 매우 유사한 서열이 본원에 기재된 모든 VHH 항체의 CDR2의 동등한 또는 상응하는 영역에서 발견되는 점을 주목할 수 있다. 본원에 기술된 모든 VHH 항체는 제 2형 PRRSV 감염에 미치는 억제성 효과를 갖거나 이를 감소시키는 것으로 나타났다. 따라서, 이러한 VH CDR2 영역은 제 2형 PRRSV 감염을 억제하거나 감소시키는 능력을 갖는 항체 (예로, VHH 항체)에서 중요한 특징인 것으로 보인다.

따라서, 본 발명의 바람직한 항체 (또는 결합 단백질)는 아미노산 서열 YAD 또는 YAE, 바람직하게 XYAD 또는 XYAE를 포함하는 CDR2, 구체적으로 VH CDR2를 포함하며, 여기서 X는 임의의 아미노산, 바람직하게 Y, L, P, N, F 또는 R, 더욱 바람직하게 Y, F, L, N 또는 R, 또는 Y, P 또는 L, 가장 바람직하게 Y이다. 다른 구현예에서, 서열은 YAD 또는 YAE에 대한 대안으로서 YAN 또는 XYAN을 포함할 수 있다.

구현예에서, X 잔기는 VHH 항체 171(#14), 즉 표 3에 나타낸 VHH 014(2D01)의 서열번호 17' 또는 99에서 위치 59번, 또는 대안의 항체 (또는 VHH)의 VH CDR2에서 상응하는 위치에 위치한다. 대안적으로 보면, X 잔기는 VHH 항체 171(#14), 즉 표 3에 나타낸 VHH 014(2D01)의 서열번호 19' 또는 101 (CDR2)에서 위치 10번, 또는 대안의 항체 (또는 VHH)의 VH CDR2에서 상응하는 위치에 위치하고, 이는 예를 들어 본원에 기재된 다른 VHH 항체의 CDR2에서 위치 8번 또는 9번일 수 있다. XYAD, XYAE 또는 XYAN 모티프에서 다른 잔기의 위치는 이들 위치를 참조하여 이에 따라 결정될 수 있다.

CD163의 2개의 잔기 S507 및 E509는 VHH 항체 171(#14), 즉 VHH 014(2D01)의 CDR3에서 L104와 상호작용하는 것으로 나타났다. 이러한 VHH 항체는 제 2형 PRRSV 감염에 미치는 억제성 효과를 갖거나 이를 감소시키는 것으로 나타났다. 따라서, 이러한 CDR3 잔기 (또는 다른 항체, 예로 VHH 항체의 상응하는 잔기)는 제 2형 PRRSV 감염을 억제하거나 감소시키는 능력을 갖는 항체 (예로, VHH 항체)에서 중요한 잔기일 수 있다.

따라서, 일부 구현예에서 본 발명의 항체 (또는 결합 단백질)은 아미노산 잔기 L을 VHH 항체 171(#14), 즉 표 3에 나타낸 VHH 014(2D01)의 서열번호 17' 또는 99에서 위치 104번, 또는 대안의 항체 (또는 VHH)의 VH CDR3에서 상응하는 위치에 포함하는 CDR3, 구체적으로 VH CDR3를 포함한다. 대안적으로 보면, L 잔기는 VHH 항체 171(#14), 즉 표 3에 나타낸 VHH 014(2D01)의 서열번호 20' 또는 102에서 위치 6번, 또는 대안의 항체 (또는 VHH)의 VH CDR3에서 상응하는 위치에 위치한다.

일부 구현예에서, CDR3의 상기 L 잔기는 CDR2의 상기 기술된 YAD, YAE 또는 YAN 서열, 바람직하게 XYAD, XYAE 또는 XYAN에 추가하여 존재하고, 여기서 X는 임의의 아미노산, 바람직하게 Y, L, P, N, F 또는 R, 더욱 바람직하게 Y, F, L, N 또는 R, 또는 Y, P 또는 L, 가장 바람직하게 Y일 수 있다.

실질적으로 상동성인 서열이 제공되는 본 발명의 구현예에서, 일부 구현예에서 상기 정의된 잔기 YAD, YAE 또는 YAN, 또는 XYAD, XYAE 또는 XYAN은 유지되거나 존재하고, 변경이 이들 잔기 외부에서 발생한다.

본 발명의 단백질의 실질적으로 상동성인 서열은 보존적 아미노산 치환, 예를 들어 항체, 예로 항원의 결합에 기여하지 않는 태그 서열, 독소 또는 기타 구성성분이 첨가된 항체의 VH, VL 또는 CDR 도메인에 영향을 주지 않는 변경, 또는 결합 단백질, 항체 분자 또는 단편의 하나의 유형 또는 형식을 결합 단백질, 항체 분자 또는 단편의 또 다른 유형 또는 형식으로 전환시키는 변경 (예로, VHH로부터 Fab 또는 scFv 또는 전체 항체로의 전환 또는 이의 역), 또는 항체 분자의 항체 분자의 특정한 클래스 또는 서브클래스로의 전환 (예로, 항체 분자의 IgG 또는 이의 서브클래스, 예로 IgG₂로의 전환)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

본원에 사용된 용어 "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 또 다른 아미노산 잔기로 대체되는 아미노산 치환이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 염기성 측쇄 (예로, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예로, 아스파라긴산, 글루탐산), 하전되지 않은 극성 측쇄 (예로, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 타이로신), 비극성 측쇄 (예로, 글리신, 시스테인, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판) 및 방향족 측쇄 (예로, 타이로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 포함하여, 당업계에서 정의되어 있다. 다른 예에서, 아미노산 잔기의 패밀리는 소수성 측기 또는 친수성 측기를 기반으로 하여 그룹화될 수 있다.

상동성은 임의의 편리한 방법에 의해 평가될 수 있다. 그러나, 서열 사이의 상동성 정도를 결정하기 위해, 서열의 다중 정렬을 만드는 컴퓨터 프로그램, 예를 들어 클러스탈 W (Thompson, Higgins, Gibson, Nucleic Acids Res., 22: 4673-4680, 1994)가 유용한다. 원하는 경우, 클러스탈 W 알고리즘은 BLOSUM 62 채점 매트릭스 (Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 10915-10919, 1992) 및 갭 개방 패널티 10 및 갭 연장 패널티 0.1과 함께 사용될 수 있어, 2가지 서열 사이에서 가장 높은 순위의 매칭이 획득되고, 여기서 서열 중 하나의 총 길이의 적어도 50%가 정렬에 관여된다. 서열을 정렬하는데 사용될 수 있는 다른 방법은 스미스 및 워터만 (Smith and Waterman, Adv. Appl. Math., 2: 482, 1981)에 의해 개정된 니들만 및 운쉬 (Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol., 48: 443, 1970)의 정렬 방법이고, 2가지 서열 사이의 가장 높은 순위의 매칭이 획득되고, 2가지 서열 사이에 일치하는 아미노산의 수가 결정되도록 한다. 2가지 아미노산 서열 사이의 동일성 백분율을 계산하는 다른 방법은 일반적으로 당업계에 인식되어 있으며, 예를 들어 카릴로 및 립톤 (Carillo and Lipton, SIAM J. Applied Math., 48: 1073, 1988)에 의해 기술된 방법 및 Computational Molecular Biology, Lesk, 개정판, 뉴욕 옥스포드 대학 출판사, 1988, Biocomputing: Informatics and Genomics Projects에 기술된 방법을 포함한다.

일반적으로 이러한 계산에는 컴퓨터 프로그램이 채용될 것이다. 서열 쌍을 비교하고 정렬하는 프로그램, 예컨대 ALIGN (Myers and Miller, CABIOS, 4: 11-17, 1988), FASTA (Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444-2448, 1988; Pearson, Methods in Enzymology, 183: 63-98, 1990) 및 갭 형성된 BLAST (Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402, 1997), BLASTP, BLASTN, 또는 GCG (Devereux, Haeberli, Smithies, Nucleic Acids Res., 12: 387, 1984)도 이러한 목적으로 유용하다. 또한, 유럽 생물정보학 연구소의 달리 서버는 단백질 서열의 구조 기반의 정렬을 제공한다 (Holm, Trends in Biochemical Sciences, 20: 478-480, 1995; Holm, J. Mol. Biol., 233: 123-38, 1993; Holm, Nucleic Acid Res., 26: 316-9, 1998).

기준점을 제공함으로써, 본 발명에 따른 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 상동성, 서열 동일성 등을 갖는 서열은 기본 매개변수가 있는 ALIGN 프로그램 (예를 들어 프랑스 몽펠리에, GENESTREAM 네트워크 서버 IGH사)을 사용하여 결정될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "항체" 및 "면역글로불린"은 다중클론 및 단일클론 항체를 포함하여, 항원 결합 도메인을 포함하는 임의의 면역학적 결합제를 광범위하게 말한다. 그러나, 단일클론 항체가 바람직하다. 다른 말로 하면, 일부 구현예에서 본 발명의 항체는 다중클론 항체가 아니다. 중쇄의 불변 도메인의 유형에 의존하여, 전체 항체는 5가지 주요 클래스, IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM 중 하나로 지정되고, 본 발명의 항체는 이들 클래스 중 어느 하나일 수 있다. 이들 중 여럿은 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 등과 같은 서브클래스 또는 이소형으로 추가로 구분된다. 면역글로불린의 다른 클래스에 해당하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 명명된다. 상이한 클래스의 면역글로불린의 소단위체 구조 및 3차원 입체구조는 잘 알려져 있다.

일반적으로, 항원 결합 영역가 아닌 전체 항체가 본 발명에서 사용되는 곳에서, IgG는 생리학적 상황에서 가장 공통적인 항체이고, 실험실 설정에서 가장 용이하게 만들어지기 때문에 선호된다.

포유동물 항체의 "경쇄"는 불변 도메인의 아미노산 서열 및 가변 도메인의 구조틀 영역의 일부 아미노산을 기반으로 하여, 명백하게 구별되는 2가지 유형 카파 (k) 및 람다 (l)중 하나로 지정된다.

본원에 사용된 용어 "중쇄 상보성 결정 영역" ("중쇄 CDR")은 항체 분자의 중쇄 가변 영역 (V_H 도메인) 또는 VHH 항체 분자 내의 과가변성 영역을 말한다. 중쇄 가변 영역은 아미노 말단부터 카르복시 말단까지 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2 및 중쇄 CDR3으로 명명되는 3개의 CDR을 갖는다. 중쇄 가변 영역은 또한 4개의 구조틀 영역 (아미노 말단부터 카르복시 말단까지 FR1, FR2, FR3 및 FR4)을 갖는다. 이러한 구조틀 영역은 CDR을 분리시킨다.

본원에 사용된 용어 "중쇄 가변 영역" (V_H 도메인)은 항체 분자의 중쇄의 가변 영역을 말한다.

본원에 사용된 용어 "경쇄 상보성 결정 영역" ("경쇄 CDR")은 항체 분자의 경쇄 가변 영역 (V_L 도메인) 내의 과가변 영역을 말한다. 경쇄 가변 영역은 아미노 말단부터 카르복시 말단까지 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3으로 명명되는 3개의 CDR을 갖는다. 경쇄 가변 영역은 또한 4개의 구조틀 영역 (아미노 말단부터 카르복시 말단까지 FR1, FR2, FR3 및 FR4)을 갖는다. 이러한 구조틀 영역은 CDR을 분리시킨다.

본원에 사용된 용어 "경쇄 가변 영역" (V_L 도메인)은 항체 분자의 경쇄의 가변 영역을 말한다.

당업자라면 이해할 바와 같이, 용어 "항체"에 의해 포괄되는 면역학적 결합 시약은 전체 항체, 이량체, 삼량체 및 다량체 항체; 이중특이성 항체; 키메라 항체; 재조합 및 조작된 항체, 및 이들의 단편을 포함하는 모든 항체 및 이들의 항원 결합 단편을 포함하거나, 이로 확장된다.

따라서, 용어 "항체"는 항원 결합 영역을 갖는 임의의 항체-유사 분자를 말하는데 사용되며, 이러한 용어는 Fab', Fab, F(ab')₂, 단일 도메인 항체 (DAB), 탠드Ab 이량체, Fv, scFv (단일 사슬 Fv), dsFv, ds-scFv, Fd, 선형 항체, 미니체, 다이아체, 이중특이적 항체 단편, 바이바디, 트리바디 (각각 이중특이적 또는 삼중특이적인 scFv-Fab 융합); sc-다이아체, 카파(람다)체 (scFv-CL 융합), BiTE (이중특이적 T-세포 인게이저, T 세포를 유인하는 scFv-scFv 일렬 서열), DVD-Ig (이중 가변 도메인 항체, 이중특이적 형식), SIP (작은 면역단백질, 일종의 미니체), SMIP ("작은 모듈형 면역약제" scFv-Fc 이량체), DART (ds-안정화 다이아체 "이중 친화 재표적화"), 및 하나 이상의 CDR을 포함하는 작은 항체 모방체 등과 같은 항원 결합 도메인을 포함하는 항체 단편을 포함한다.

다양한 항체 기반의 구조물 및 단편을 제조하고 사용하는 기법은 당업계에 잘 알려져 있다.

항체는 통상적인 기법을 사용하여 단편화될 수 있다. 예를 들어, F(ab')₂ 단편은 항체에 펩신으로 처리하여 생성될 수 있다. 생성된 F(ab')₂ 단편은 이황화 가교를 환원하도록 처리하여 Fab' 단편을 생산할 수 있다. 파파인 소화는 Fab 단편의 형성시킬 수 있다. Fab, Fab' 및 F(ab')₂, scFv, Fv, dsFv, Fd, dAbs, 탠드Abs, ds-scFv, 이량체, 미니체, 다이아체, 이중특이적 항체 단편 및 기타 단편은 또한 재조합 기법에 의해 합성될 수 있거나, 화학적으로 합성될 수 있다. 항체 단편을 생산하는 기법은 잘 알려져 있고, 당업계에 기술되어 있다.

본 발명의 모든 구현예에서, 단일 도메인 항체 (VHH 항체, sdAb, DAB, dAb, 나노체, 낙타 항체, vNAR (상어) 항체, VH 항체 또는 VL 항체로도 지칭됨)가 바람직하고, 구체적으로 VHH 항체, 나노체, 낙타 항체 및 vNAR (상어) 항체이다. 이러한 항체는 (항원에 결합하는 능력을 갖는 단일 VL 도메인이 기재되어 사용될 수 있지만) 항원에 결합할 수 있는 단일 단량체 가변 항체 도메인, 보통 VH 도메인을 포함한다. 따라서, 일부 이러한 바람직한 구현예에서 본 발명의 항체 (또는 항원 결합 도메인)는 하나의 (또는 단일) 중쇄 가변 영역 (VH 또는 VHH)을 포함하지만, 일부 구현예에서 동일한 또는 상이한 서열을 갖는 많은 이러한 개별 중쇄 가변 영역은 동일한 구조물 또는 분자에 함께 존재할 수 있다.

이러한 항체는 당업계에 잘 알려져 있고 기술된 표준 기법을 사용하여 획득되거나 제조될 수 있다. 예를 들어, 이러한 항체는 적절한 동물, 예로 라마와 같은 낙타, 또는 상어를 원하는 항원으로 면역화한 다음 생성된 항체의 VH 도메인을 적절한 발현 벡터 내에 클로닝하고 결합제에 대해 선별함으로써 획득될 수 있다. VH 도메인의 라이브러리 (예로, 인간 VH 도메인의 파지 디스플레이 라이브러리)도 사용 가능하거나 생성될 수 있으며, 다음으로 스크리닝될 수 있다.

비교적 작은 크기로 인해 단일 도메인 항체는 비교적 짧은 반감기, 예를 들어 비교적 짧은 혈장 반감기를 갖을 수 있다. 따라서, 이러한 항체는 반감기를 확장하거나 연장하기 위해 때로 변형된다. 이것을 시행하는 기법은 당업계에서 잘 알려지고 기재되어 있으며, 이들 중 임의의 것이 사용될 수 있다. 예로는 항체를 알부민 (또는 자체가 긴 (또는 더 긴) 반감기를 갖는 또 다른 단백질 또는 실체)에 부착, 컨쥬게이션 또는 융합하는 것, 또는 항체를 자체가 긴 (또는 더 긴) 반감기를 갖는 단백질 또는 실체와 상호작용할 수 있는 또 다른 단백질 또는 실체에 부착, 컨쥬게이션 또는 융합하는 것, 항체를 PEG (또는 다른 중합체)에 부착 또는 컨쥬게이션하는 것, 또는 항체를 FcRn에 결합하는 항체 또는 다른 단백질 또는 실체에 부착 또는 컨쥬게이션 또는 융합하는 것을 포함한다.

특정 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항체 단편은 중쇄 불변 영역, 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgE, IgM 또는 IgD 불변 영역의 전부 또는 일부를 포함한다. 바람직하게, 중쇄 불변 영역은 IgG 중쇄 불변 영역, 예를 들어 IgG2 중쇄 불변 영역, 또는 이의 일부이다. 또한, 항체 또는 항체 단편은 카파 경쇄 불변 영역 또는 람다 경쇄 불변 영역의 전부 또는 일부, 또는 이들의 일부를 포함할 수 있다. 이러한 불변 영역의 전부 또는 일부는 자연적으로 생성되거나, 전체적으로 또는 부분적으로 합성될 수 있다. 이러한 불변 영역에 대한 적절한 서열은 당업계에 잘 알려져 있고, 기록되어 있다. 중쇄 및 경쇄로부터의 불변 영역의 완전한 상보체가 본 발명의 항체에 포함될 때, 이러한 항체는 전형적으로 본원에서 "전장의" 항체 또는 "전체" 항체로 지칭된다. 일부 구현예에서, IgG₂ 항체가 바람직하다.

다른 구현예에서, 불변 영역, 예로 중쇄 또는 경쇄 불변 영역이 존재하지 않는 것이 바람직하고, 예를 들어 가변 도메인 또는 중쇄 가변 도메인 (VH)이 존재하는 항체의 유일한 부분이다.

항체 또는 항체 단편은 자연적으로 생산될 수 있거나, 전체적으로 또는 부분적으로 합성적으로 생산될 수 있다.

많은 항체 또는 항체 단편은 3개의 CDR 도메인을 포함하는 항체 경쇄 가변 영역 (V_L) 및 3개의 CDR 도메인을 포함하는 항체 중쇄 가변 영역 (V_H)을 포함한다. 상기 VL 및 VH는 일반적으로 항원 결합 부위를 형성한다.

그러나, 당업계에서 항체의 경쇄 가변 도메인으로부터의 3개의 CDR 및 중쇄 가변 도메인으로부터의 3개의 CDR의 존재가 항원 결합에 항상 필요하지는 않은 것으로 잘 보고되어 있다. 따라서, 상기 고전적인 항체 단편보다 작은 구조물이 효과적인 것으로 알려져 있다.

예를 들어, 낙타 항체는 광범위한 항원 결합 레퍼토리를 갖고 있지만, 경쇄가 결여된다. 또한, VH 도메인 단독 또는 VL 도메인 단독을 포함하는 단일 도메인 항체를 사용한 결과는 이들 도메인이 허용가능한 높은 친화도로 항원에 결합할 수 있고 이들의 작은 크기 및 생산 용이성과 같은 다른 장점을 갖을 수 있음을 보여준다. 따라서, 3개의 CDR은 항원에 효과적으로 결합할 수 있고, 본원에서는 이러한 단일 도메인 항체 (예를 들어, VHH 항체, sdAb, DAB, dAb, 나노체, 낙타 항체, vNAR (상어) 항체, VH 항체 또는 VL 항체, 구체적으로 VHH 항체, 나노체, 낙타 항체 및 vNAR (상어) 항체)가 예시되고, 이러한 유형의 항체 (예로, VHH 항체)가 바람직하다.

본 발명의 항체, 결합 단백질 및 핵산 분자는 인간 또는 동물의 신체 (예로, 낙타) 또는 인간 또는 동물 신체 (예로, 낙타)로부터 유래한 조직 시료 내에 제자리 존재할 수 있는 임의의 이러한 구성성분과 구분되는 한, 일반적으로 "단리된" 또는 "정제된" 분자이다. 그러나, 서열은 인간 또는 동물의 신체 (예로, 낙타)에서 발견되는 서열에 상응하거나 실질적으로 상동성일 수 있다. 따라서, 핵산 분자 또는 서열 및 단백질 또는 폴리펩티드, 예로 항체와 관련하여 본원에 사용된 용어 "단리된" 또는 "정제된"은 예를 들어 이들의 자연 환경으로부터 단리, 정제 또는 이들이 실질적으로 없는 때, 예로 인간 또는 동물의 신체로부터 단리되거나 정제된 때 (실제로 자연적으로 발생하는 경우) 이러한 분자를 말하거나, 기술적 공정에 의해 생산된 때 이러한 분자를 말하고, 즉 재조합 및 합성적으로 생산된 분자를 포함한다.

본 발명의 항체 등은 자연에서 발생하지 않으며, 해당 관점에서 자연적으로 발생하는 분자에 해당하지 않는 관점에서 인공적인 구조물인 점을 주목할 수 있다. 예를 들어, 바람직한 항체는 조작되거나 재조합으로 생산될 수 있는 단일 도메인 항체이며, 심지어 이러한 항체를 자연적으로 생산하는 종 (예로, 낙타)에서도 이러한 종은 실험적으로, 예로 면역화에 의해 이와 같이 유도되지 않는 경우 CD163, 구체적으로 돼지 CD163에 대한 항체를 생성하지 않을 것이다. 다른 말로 하면, 본 발명의 항체 등은 고유하지 않다.

본원에 사용된 용어 "단편"은 생물학적 관련 단편, 예로 항원 결합에 기여하는 단편, 예로 항원 결합 부위의 일부를 형성하고/하거나 CD163 항체의 기능적 특성에 기여하는 단편을 말한다. 특정 바람직한 단편은 본 발명의 항체의 중쇄 가변 영역 (V_H 도메인 또는 3개의 VH CDR)을 포함하거나 이로 구성된다.

당업자라면 중쇄 및 경쇄 CDR, 중쇄 및 경쇄 가변 영역, 항체 및 항체 단편과 같은 본 발명의 단백질 및 폴리펩티드가 당업계에 잘 알려지고 기술된 여러 방식 중 임의의 것으로 제조될 수 있지만, 가장 바람직하게 재조합 방법을 사용하여 제조됨을 이해할 것이다.

본 발명의 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 핵산 단편은 적절한 경우 임의의 적절한 방법, 예로 클로닝 또는 합성에 의해 유도되거나 생산될 수 있다.

일단 본 발명의 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 핵산 단편이 획득되면, 이들 단편은 표준 재조합 DNA 기법에 의해 추가로 조작되어, 예를 들어 가변 영역 단편을 적절한 불변 영역 도메인을 갖는 전장의 항체로, 또는 본원의 다른 곳에서 논의된 항체 단편의 특정한 형식, 예로 VHH, Fab 단편, scFv 단편 등과 같은 단일 도메인 항체로 전환시킬 수 있다. 전형적으로 또는 이러한 추가의 조작 절차의 일부로서, 본 발명의 항체 분자를 인코딩하는 핵산 단편은 일반적으로 본 발명의 항체의 생산을 용이하게 하기 위해, 예를 들어 파지 디스플레이 벡터 내로 도입함으로써 선별 또는 스크리닝을 용이하게 하기 위해 하나 이상의 적절한 발현 벡터 내로 도입된다.

가능한 발현 벡터는 벡터가 사용된 숙주 세포와 호환가능한 한 코스미드, 플라스미드 또는 변형된 바이러스 (예로, 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노 관련 바이러스)를 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 발현 벡터는 "숙주 세포의 형질전환에 적합한"이며, 이는 발현 벡터가 본 발명의 핵산 분자 및 발현에 사용될 숙주 세포를 기초로 하여 선택되고, 핵산 분자에 작동가능하게 연결된 조절 서열을 포함하는 것을 의미한다. 작동가능하게 연결된은 핵산이 핵산의 발현을 허용하는 방식으로 조절 서열에 연결된 것을 의미하도록 의도된다.

따라서, 본 발명은 발현 벡터, 예로 본 발명의 핵산 분자 또는 이의 단편, 및 본 발명의 핵산 분자에 의해 인코딩되는 단백질 서열의 전사 및 번역에 필요한 조절 서열을 포함하거나 포함하는 재조합 발현 벡터를 고려한다.

발현 벡터는 형질전환된 숙주 세포를 생산하도록 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 용어 "로 형질전환된", "로 형질감염된", "형질전환" 및 "형질감염"은 당업계에 공지된 많은 가능한 기법 중 하나에 의한 세포 내로 핵산 (예로, 벡터)의 도입을 포괄하도록 의도된다. 숙주 세포의 형질전환 및 형질감염에 적합한 방법은 샘브룩 등 1989 (Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 제 2판, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) 및 다른 연구실 교과서에서 찾아볼 수 있다.

적합한 숙주 세포는 매우 다양한 진핵 숙주 세포 및 원핵 세포를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 단백질은 효모 세포 또는 포유동물 세포에서 발현될 수 있다. 또한, 본 발명의 단백질은 대장균과 같은 원핵 세포에서 발현될 수 있다.

본 발명의 단백질은 또한 고체상 합성과 같은 단백질 화학에서 잘 알려진 기법을 사용한 화학적 합성에 의해 제조될 수 있다.

추가의 양태는 본 발명의 핵산 단편 또는 분절 또는 분자 중 하나 이상을 포함하는 발현 구조물, 발현 벡터 또는 발현 시스템 (예로, 바이러스 또는 박테리아 또는 기타 발현 구조물, 벡터 또는 시스템)을 제공한다. 바람직하게, 발현 구조물, 벡터 또는 시스템은 재조합이다. 바람직하게, 상기 구조물, 벡터 또는 시스템은 본 발명의 핵산 분자에 의해 인코딩되는 단백질 서열의 전사 및 번역에 필요한 조절 서열을 추가로 포함한다. 바람직한 구조물 등은 숙주 표적 종, 예로 돼지 내에서 본 발명의 항체 (또는 결합 단백질)의 연장된 또는 지속적인 발현을 허용하는 구조물이다. 이러한 발현은 단 치료 또는 생물학적 효과가 관찰되기 위해 충분한 수준 및 발현 기간이 달성되면, 일시적 예로 에피좀으로, 또는 예로 게놈 혼입을 통해 더 영구적일 수 있다.

추가의 양태는 본 발명의 하나 이상의 발현 구조물 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포 (예를 들어, 포유동물, 박테리아 또는 효모 숙주 세포) 또는 바이러스를 제공한다. 또한, 본 발명의 핵산 분자 중 하나 이상을 포함하는 숙주 세포 또는 바이러스가 제공된다. 본 발명의 항체 (또는 결합 단백질)를 발현하는 숙주 세포 (예를 들어, 포유동물 숙주 세포, 박테리아 숙주 세포 또는 효모 숙주 세포) 또는 바이러스는 추가의 양태를 형성한다.

이러한 발현 구조물, 벡터 또는 시스템, 또는 숙주 세포 또는 바이러스, 또는 본 발명의 항체 (또는 결합 단백질)를 인코딩하는 다른 핵산 산물 또는 단편은 대상체 내에서 치료제로서 본 발명의 항체 (또는 본 발명의 결합 단백질)의 제자리 생산을 허용하고 이로써 치료 효과를 발휘하도록 투여될 수 있다.

본 발명의 추가의 양태는 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 본 발명의 항체를 생산 (또는 제조)하는 방법을 제공한다. 바람직한 방법은 (i) 본 발명의 하나 이상의 재조합 발현 벡터 또는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 숙주 세포를 인코딩된 항체 또는 단백질의 발현에 적합한 조건 하에서 배양하는 단계; 및 선택적으로 (ii) 숙주 세포 또는 성장 배지/상청액으로부터 항체 또는 단백질을 단리하거나 획득하는 단계를 포함한다. 이러한 생산 (또는 제조) 방법은 또한 항체 또는 단백질 산물의 정제 및/또는 항체 또는 산물을 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제와 같은 적어도 하나의 추가적인 구성성분을 포함하는 조성물 내에 제형화하는 단계를 포함할 수 있다.

구현예에서, 본 발명의 항체 또는 단백질이 하나 이상의 폴리펩티드 사슬 (예로, Fab 단편 또는 전체 항체와 같은 특정 단편)으로 구성될 때, 모든 폴리펩티드는 숙주 세포에서 바람직하게 동일한 또는 상이한 발현 벡터로부터 발현되어, 완전한 단백질, 예로 본 발명의 항체 단백질은 숙주 세포에서 조립될 수 있고 이로부터 단리되거나 정제될 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 CD163에 결합시키는 방법으로서, CD163을 포함하는 조성물을 본 발명의 항체와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 CD163을 검출하는 방법으로서, CD163/항체 복합체의 형성하는데 효과적인 조건 하에 CD163을 포함하는 것으로 의심되는 조성물을 본 발명의 항체와 접촉시키는 단계 및 이와 같이 형성된 복합체를 검출하는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다.

적어도 본 발명의 제 1 항체 (또는 결합 단백질)를 포함하는 조성물은 본 발명의 추가의 양태를 구성한다. 적합한 희석제, 담체 또는 부형제와 혼합된 본 발명의 하나 이상의 항체를 포함하는 제형물 (조성물)은 본 발명의 바람직한 구현예를 구성한다. 이러한 제형물은 약제학적 용도, 예로 수의학적 용도를 위한 것일 수 있으며, 따라서 본 발명의 조성물은 바람직하게 약제학적으로 허용가능하거나, 비-인간 동물, 예로 포유동물, 바람직하게 돼지에게 투여에 허용가능하다. 적합한 희석제, 부형제 및 담체는 당업자에게 공지되어 있다.

본 발명에 따른 조성물은 예를 들어 경구, 비강, 비경구, 정맥내, 국소 또는 직장 투여에 적합한 형태로 제공될 수 있다.

본원에 정의된 활성 화합물 (예로, 본 발명의 항체)은 정제, 코팅된 정제, 비강 스프레이, 용액, 에멀젼, 리포좀, 분말, 캡슐 또는 지속 방출 형태와 같은 통상적인 약리학적 투여 형태로 제공될 수 있다. 통상적인 약제학적 부형제, 뿐만 아니라 보통의 생산 방법을 이러한 형태의 제조에 채용될 수 있다.

주사 용액은 예를 들어 p-하이드록시벤조에이트와 같은 보존제 또는 EDTA와 같은 안정화제를 첨가하는 것과 같은 통상적인 방식으로 생산될 수 있다. 그런 다음 용액은 주사 바이알 또는 앰플에 충전될 수 있다.

적합한 용량 단위는 당업자에 의해 결정될 수 있다.

약제학적 조성물은 추가적으로 공동 투여 요법 또는 조합 섭생의 맥락에서 추가의 활성 성분 (예로, 본원의 다른 곳에서 기술됨)을 포함할 수 있다.

본 발명의 추가의 양태는 치료에 사용되는, 구체적으로 CD163과 관련된 임의의 질병 또는 병태의 치료 또는 예방에 사용되는, 또는 CD163이 역할을 하는, 예를 들어 원인적 (예로, 전체적으로 또는 부분적으로 원인이 되는 역할) 또는 필수적인 역할을 하는 항-CD163 항체 (또는 결합 단백질)을 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 항-CD163 항체는 바이러스 또는 다른 병원체에 의해 유발된 임의의 감염의 치료 또는 예방에 사용될 수 있으며, 여기서 상기 감염은 CD163과 관련되거나, CD163이 역할을 하는, 예를 들어 원인적 (예로, 전체적으로 또는 부분적으로 원인이 되는 역할) 또는 필수적인 역할을 한다. 또 다른 말로 하면, 본 발명에 따른 항-CD163 항체 (또는 결합 단백질)는 CD163, 구체적으로 PAM 또는 기타 CD163 양성 세포 내에 또는 상에 발현되는 CD163의 기능을 표적하여 억제하거나 감소시킬 수 있다. 따라서, 본원에 정의된 항-CD163 항체 (또는 결합 단백질)는 CD163의 억제 또는 CD163 기능의 차단 또는 감소가 유용한 임의의 질병 또는 병태의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다.

바람직한 구현예는 돼지의 감염, 바람직하게 돼지의 바이러스 감염의 치료 또는 예방에 사용되는 본 발명의 항-CD163 항체 (또는 결합 단백질)를 제공한다. 구체적으로, PRRSV 감염의 치료 또는 예방이 바람직하다. 돼지가 치료되는 구현예에서, 본 발명의 항-CD163 항체 (또는 결합 단백질)는 전형적으로 항-돼지 CD163 항체 (또는 결합 단백질)이다.

CD163은 모든 PRRS 바이러스에 대한 수용체로 여겨진다. 그러나, 본원의 다른 곳에서 설명한 바, PRRSV의 2가지 혈청형, 제 1형 및 제 2형 바이러스가 있다. 제 1형 및 제 2형 바이러스는 여러 수준에서 표현형이 유사하지만 바이러스 유전형은 차이가 있다. 본 발명의 항체 (또는 결합 단백질)는 제 1형 및/또는 제 2형 PRRS 바이러스, 예를 들어 제 1형 및 제 2형 PRRS 바이러스를 치료하거나 예방하는데 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명은 제 2형 PRRSV 감염을 억제하는, 바람직하게 제 2형 PRRSV 감염을 특이적으로 억제하는 능력을 갖는 항체 (또는 결합 단백질)를 제공하고,, 따라서 제 2형 PRRS 바이러스를 치료하거나 예방하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 치료 방법 및 용도에서 결합 단백질 또는 항체의 투여는 치료를 필요로 하는 대상체 (동물, 또는 포유동물, 예로 돼지)에게 약제학적, 치료적 또는 생리학적 유효량으로 수행된다. 따라서, 상기 방법 및 용도는 치료를 필요로 하는 대상체를 식별하는 추가적인 단계를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 질병 또는 병태의 치료 (예를 들어, 기존 질병의 치료)는 상기 질병 또는 병태의 치유, 또는 질병 또는 질병의 증상의 임의의 감소 또는 완화 (예로, 질병 중증도의 감소)를 포함한다.

본 발명의 치료 방법 및 용도는 질병의 예방뿐만 아니라 질병의 적극적인 치료 (예를 들어, 기존 질병의 치료)에 적합하다. 따라서 예방적 및 메타-치료적 (질병의 발병에 직면한 치료, 예를 들어 밀접 접촉한 및/또는 유의한 위험이 있는 동물에게 감염성 질병의 확산을 방지할 목적으로, 대상체 군의 일부에서 감염 및/또는 임상적 질병 진단 이후에 대상체 군을 치료함) 치료도 본 발명에 포함된다. 본 발명의 방법 및 용도에서는 이러한 이유로, 치료는 또한 적절한 곳에서 예방, 메타치료 또는 예방을 포함한다.

이러한 예방적 (또는 보호적) 양태는 건강한 또는 정상적 또는 위험이 있는 대상체에 대해 편리하게 수행될 수 있으며, 완전한 예방 및 유의한 예방을 모두 포함할 수 있다. 유사하게, 유의한 예방은 치료가 주어지지 않을 경우 예상되는 중증도 또는 증상과 비교하여 질병 또는 질병의 증상의 중증도가 감소되는 (예로, 측정가능하게 또는 유의하게 감소됨) 시나리오를 포함할 수 있다.

예를 들어 PRRS 감염의 임상 증상은 임신한 암퇘지 또는 어미 돼지의 태아 재흡수, 사산 및 말기 유산, 및 모든 돼지 특히 어린 돼지 및 새끼 돼지의 호흡기 질병 및 증상 예로 호흡 곤란을 포함한다. 다른 증상은 식욕 부진 (종종 성장 속도 감소로 이어짐), 발열, 혼수, 호흡 곤란, 생식 장애 및 설사 (특히 어린 새끼 돼지에서) 및 중추 신경계 (CNS) 징후를 포함한다. PRRSV 감염이 있는 대상체는 또한 수막염, 글래서병, 삼출성 피부염, 옴진드기 피부병 및 세균성 기관지폐렴과 같은 풍토병에 대해 취약하고, 공통적으로 증가하는 것으로 보고되어 있으며 (Diseases of Swine, 제 11판, 편집자: Jeffrey J. Zimmerman Locke A. Karriker Alejandro Ramirez Kent J. Schwartz Gregory W. Stevenson Jianqiang Zhang, 2019년 3월 29일에 처음 출간됨), 이러한 질병은 일반적으로 항생제와 같은 항균 제품의 사용으로 관리된다. 결론적으로, 본 발명은 농장에서 항균 제품 사용을 줄이는 역할을 한다.

따라서, 본 발명의 항체는 임상 질병 또는 증상, 예로 PRRSV 감염과 관련된 임상 질병 또는 증상 또는 상기 개략된 질병과 같은 이어지는 풍토병을 치료하거나 예방하거나, 바이러스, 예로 PRRSV 순환 (예로, 순환하는 바이러스 입자의 수 또는 역가)를 감소시키거나, 감염 (예로, 제 1 감염) 또는 새로운 감염 (예로, 제 2 또는 후속적 감염), 예로 PRRSV 감염 (예로, 제 1 PRRSV 감염) 또는 새로운 PRRSV 감염 (예로, 제 2 또는 후속적 PRRSV 감염)을 예방하는데 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 치료를 위한 바람직한 대상체는 단 본원에 정의된 병원체, 구체적으로 PRRSV에 대해 취약하거나, 이로 감염될 수 있으면 모든 연령 및 종의 돼지를 포함하여, 모든 유형의 돼지 (때로 돼지 (swine)로도 지칭됨), 예를 들어 임의의 돼지, 돼지 또는 돼지 종을 포함한다. 새끼 돼지, 특히 어린 새끼 돼지 또는 감염된 암퇘지로부터 살아서 태어난 새끼 돼지 (최대 80%가 사망함)는 새끼 돼지 (예를 들어 최대 12주령의 이유기 후 돼지) 및 성장 중 또는 비육 중인 돼지 (예로, 도축 연령 이하의 돼지), 특히 성장 중인 돼지와 마찬가지로 특히 대상체로 선호된다. 이유기 전의 새끼 돼지, 예로 최대 4주령의 새끼 돼지 (특히 감염이 감염된 암퇘지 유선 분비를 통해 전염될 수 있는 감염된 암퇘지의 새끼)는 암퇘지 및 임신한 암퇘지와 마찬가지로 치료될 대상체로 선호된다.

예로 예방과 관련된 일부 구현예에서, 대상체는 문제가 되는 질병 또는 병태에 의해 영향을 받을 위험이 있는 대상체, 예를 들어 상기 기재된 병원체 또는 바이러스 (예로, PRRSV)에 감염되어 질병이 발병할 위험이 있는 대상체이다. 이러한 대상체는 건강한 대상체, 또는 임의의 질병의 증상을 나타내지 않는 대상체 또는 기타 적절한 "위험이 있는" 대상체일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 대상체는 상기 기재된 문제가 되는 질병 또는 병태에 걸리거나, 걸린 (또는 발병함) 또는 잠재적으로 걸린 (또는 발병함) 것으로 의심되는 대상체이다.

대안적으로 보면, 본 발명은 CD163과 관련된, 또는 CD163이 역할을 하는, 예를 들어 원인적 (예로, 전체적으로 또는 부분적으로 원인이 되는 역할) 또는 필수적인 역할을 하는 질병 또는 병태를 치료하거나 예방하는 방법을 제공하고, 이 방법은 본원에 제공된 항-CD163 항체 (또는 결합 단백질)의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 적절한 질병 또는 병태는 본원의 다른 곳에서 설명된다.

돼지의 감염, 바람직하게 돼지의 바이러스 감염의 치료 또는 예방이 바람직하다. 구체적으로, PRRSV 감염의 치료 또는 예방, 예로 제 1형 및/또는 제 2형 PRRS 바이러스 감염, 예를 들어 제 1형 및 제 2형 PRRS 바이러스 감염을 치료 또는 예방하거나, 또는 제 2형 PRRS 바이러스 감염을 치료 또는 예방 (예로, 특이적으로 치료 또는 예방)하는 것이 바람직하다.

따라서, 또 다른 추가의 양태는 돼지에서 PRRSV 감염의 치료 또는 예방 방법, 예를 들어 돼지에서 제 1형 및/또는 제 2형 PRRS 바이러스 감염의 치료 또는 예방 방법을 제공하며, 이 방법은 돼지 CD163에 결합하는 단일클론 항체의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 이러한 방법에 사용되는 적절한 CD163 항체 (또는 결합 단백질)는 본원에 설명되어 있다.

본원에 기재된 본 발명의 치료적 용도의 구현예는 필요한 부분만 변경하여 본 발명의 이러한 양태에 적용한다.

치료적 유효량은 임상적 평가를 기반으로 하여 결정될 것이고, 쉽게 모니터링될 수 있다.

추가로 대안적으로 보면, 본 발명은 치료법에 사용하기 위한 약제의 제조에서 본 발명의 항-CD163 항체 (또는 결합 단백질), 예로 본원에 정의된 본 발명의 단일클론 항체의 용도를 제공한다. 바람직한 치료적 용도, 구체적으로 CD163과 관련된 임의의 질병 또는 병태의 치료 또는 예방에서 사용되는, 또는 CD163이 역할을 하는, 예를 들어 원인적 (예로, 전체적으로 또는 부분적으로 원인이 되는 역할) 또는 필수적인 역할을 하는 용도는 본원의 다른 곳에서 설명된다. 예를 들어, 본 발명의 항-CD163 항체 (또는 결합 단백질)는 바이러스 또는 다른 병원체에 의해 유발된 임의의 감염의 치료 또는 예방에 사용될 수 있으며, 여기서 상기 감염은 CD163과 관련되거나, CD163이 역할을 하는, 예를 들어 원인적 (예로, 전체적으로 또는 부분적으로 원인이 되는 역할) 또는 필수적인 역할을 한다. 또 다른 말로 하면, 본 발명에 따른 항-CD163 항체 (또는 결합 단백질)는 CD163, 구체적으로 PAM 또는 기타 CD163 양성 세포 내에 또는 상에 발현되는 CD163의 기능을 표적하여 억제하거나 감소시킬 수 있다. 따라서, 본원에 정의된 항-CD163 항체 (또는 결합 단백질)는 CD163의 억제 또는 CD163 기능의 차단 또는 감소가 유용한 임의의 질병 또는 병태의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다.

바람직한 구현예는 돼지의 감염, 바람직하게 돼지의 바이러스 감염의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 약제의 제조에서 본 발명의 항-CD163 항체 (또는 결합 단백질)의 용도를 제공한다. 구체적으로, PRRSV 감염의 치료 또는 예방, 예로 제 1형 및/또는 제 2형 PRRS 바이러스 감염, 예를 들어 제 1형 및 제 2형 PRRS 바이러스 감염을 치료 또는 예방하거나, 또는 제 2형 PRRS 바이러스 감염을 치료 또는 예방 (예로, 특이적으로 치료 또는 예방)하는 것이 바람직하다.

따라서, 또 다른 추가의 양태는 돼지에서 PRRSV 감염, 바람직하게 제 1형 및/또는 제 2형 PRRS 바이러스 감염의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 약제의 제조에서, 돼지 CD163에 결합하는 단일클론 항체의 용도를 제공한다. 이러한 용도를 위한 적절한 CD163 항체 (또는 결합 단백질)는 본원에 설명되어 있다.

일부 구현예에서, 본 발명의 항체는 조합하여 사용될 수 있다.

표 A, 표 B, 표 C, 표 D, 표 E, 표 F, 표 G, 표 H 및 표 I에 각각 나타낸 바와 같은 VHH 항체 49(#18), 47(#19), 48(#20), 76(#2), 77(#16), 78(#8), 150(#15), 70(#23) 및 144(#1)의 임의의 조합이 사용될 수 있다. 따라서, 이들 중 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개 또는 모두 9개, 바람직하게 2개 또는 3개, 더욱 바람직하게 2개가 조합하여 사용될 수 있다.

바람직한 조합은 다음을 포함한다:

70(#23), 및 76(#2), 78(#8), 77(#16), 49(#18), 47(#19) 또는 48(#20) 중 하나 이상, 바람직하게 1개;

144(#1), 및 76(#2), 78(#8), 77(#16), 49(#18), 47(#19) 또는 48(#20) 중 하나 이상, 바람직하게 1개;

150(#15), 및 76(#2), 78(#8), 77(#16), 49(#18), 47(#19) 또는 48(#20) 중 하나 이상, 바람직하게 1개, 예로 150(#15) 및 47(#19);

76(#2), 및 70(#23) 또는 144(#1) 또는 150(#15) 중 하나 이상, 바람직하게 1개;

77(#16), 및 70(#23), 144(#1) 또는 150(#15) 중 하나 이상, 바람직하게 1개;

49(#18), 및 70(#23), 144(#1) 또는 150(#15) 중 하나 이상, 바람직하게 1개;

47(#19), 및 70(#23), 144(#1) 또는 150(#15) 중 하나 이상, 바람직하게 1개;

48(#20), 및 70(#23), 144(#1) 또는 150(#15) 중 하나 이상, 바람직하게 1개; 또는

78(#8), 및 70(#23), 144(#1) 또는 150(#15) 중 하나 이상, 바람직하게 1개.

바람직한 조합은 다음을 포함한다:

76(#2) 및 150(#15);

76(#2) 및 77(#16);

76(#2) 및 48(#20);

150(#15) 및 77(#16);

150(#15) 및 48(#20);

77(#16) 및 48(#20); 또는

150(#15), 77(#16) 및 48(#20).

표 1, 표 2, 표 3 및 표 4에 각각 나타낸 바와 같은 VHH 항체 57(#11), 41(#12), 171(#14) 및 29(#17)의 임의의 조합은 본 발명에 사용될 수 있다. 따라서 이들 중 2개, 3개 또는 모두 4개가 조합하여, 바람직하게 2개 또는 3개, 더욱 바람직하게 2개가 사용될 수 있다.

바람직한 조합은 다음을 포함한다:

57(#11), 및 41(#12) 또는 29(#17) 중 하나 이상, 바람직하게 1개, 예로 57(#11) 및 29(#17);

171(#14), 및 41(#12) 또는 29(#17) 중 하나 이상, 바람직하게 1개;

41(#12), 및 57(#11) 또는 171(#14) 중 하나 이상, 바람직하게 1개; 또는

29(#17), 및 57(#11) 또는 171(#14) 중 하나 이상, 바람직하게 1개.

다른 조합은 다음을 포함한다:

표 A, 표 B, 표 C, 표 D, 표 E, 표 F, 표 G, 표 H 및 표 I에 각각 나타낸 바와 같은 VHH 항체 49(#18), 47(#19), 48(#20), 76(#2), 77(#16), 78(#8), 150(#15), 70(#23) 또는 144(#1) 중 하나 이상, 바람직하게 1개, 및 표 1, 표 2, 표 3 및 표 4에 각각 나타낸 바와 같은 VHH 항체 57(#11), 41(#12), 171(#14) 또는 29(#17) 중 하나 이상 바람직하게 1개의 임의의 조합.

바람직한 조합은 다음을 포함한다:

150(#15) 및 29(#17);

47(#19) 및 29(#17); 또는

144(#1) 및 29(#17).

다른 바람직한 조합은 다음을 포함한다:

57(#11), 및 41(#12) 또는 29(#17) 중 하나 이상, 바람직하게 1개;

57(#11), 및 76(#2), 78(#8), 77(#16), 49(#18), 47(#19) 또는 48(#20) 중 하나 이상, 바람직하게 1개;

171(#14), 및 41(#12) 또는 29(#17) 중 하나 이상, 바람직하게 1개;

171(#14), 및 76(#2), 78(#8), 77(#16), 49(#18), 47(#19) 또는 48(#20) 중 하나 이상, 바람직하게 1개;

70(#23), 및 41(#12) 또는 29(#17) 중 하나 이상, 바람직하게 1개;

144(#1), 및 41(#12) 또는 29(#17) 중 하나 이상, 바람직하게 1개;

150(#15), 및 41(#12) 또는 29(#17) 중 하나 이상, 바람직하게 1개; 또는

150(#15), 및 76(#2), 78(#8), 77(#16), 49(#18), 47(#19) 또는 48(#20) 중 하나 이상, 바람직하게 1개.

대안의 바람직한 조합은 다음을 포함한다:

41(#12), 및 57(#11), 171(#14), 70(#23), 144(#1) 또는 150(#15) 중 하나 이상, 바람직하게 1개;

41(#12), 및 76(#2), 78(#8), 77(#16), 49(#18), 47(#19) 또는 48(#20) 중 하나 이상, 바람직하게 1개;

29(#17), 및 57(#11), 171(#14), 70(#23), 144(#1) 또는 150(#15) 중 하나 이상, 바람직하게 1개; 또는

29(#17), 및 76(#2), 78(#8), 77(#16), 49(#18), 47(#19) 또는 48(#20) 중 하나 이상, 바람직하게 1개.

대안의 바람직한 조합은 다음을 포함한다:

76(#2), 및 57(#11), 171(#14), 70(#23), 144(#1) 또는 150(#15) 중 하나 이상, 바람직하게 1개;

76(#2), 및 41(#12) 또는 29(#17) 중 하나 이상, 바람직하게 1개;

77(#16), 및 57(#11), 171(#14), 70(#23), 144(#1) 또는 150(#15) 중 하나 이상, 바람직하게 1개;

77(#16), 및 41(#12) 또는 29(#17) 중 하나 이상, 바람직하게 1개;

49(#18), 및 57(#11), 171(#14), 70(#23), 144(#1) 또는 150(#15) 중 하나 이상, 바람직하게 1개;

49(#18), 및 41(#12) 또는 29(#17) 중 하나 이상, 바람직하게 1개;

47(#19), 및 57(#11), 171(#14), 70(#23), 144(#1) 또는 150(#15) 중 하나 이상, 바람직하게 1개;

47(#19), 및 41(#12) 또는 29(#17) 중 하나 이상, 바람직하게 1개;

48(#20), 및 57(#11), 171(#14), 70(#23), 144(#1) 또는 150(#15) 중 하나 이상, 바람직하게 1개;

48(#20), 및 41(#12) 또는 29(#17) 중 하나 이상, 바람직하게 1개;

78(#8), 및 57(#11), 171(#14), 70(#23), 144(#1) 또는 150(#15) 중 하나 이상, 바람직하게 1개; 또는

78(#8), 및 41(#12) 또는 29(#17) 중 하나 이상, 바람직하게 1개.

바람직한 조합은 다음을 포함한다:

70(#23), 및 41(#12) 또는 29(#17) 중 하나 이상, 바람직하게 1개;

144(#1), 및 41(#12) 또는 29(#17) 중 하나 이상, 바람직하게 1개;

150(#15), 및 41(#12) 또는 29(#17) 중 하나 이상, 바람직하게 1개;

41(#12), 및 70(#23), 144(#1) 또는 150(#15) 중 하나 이상, 바람직하게 1개;

29(#17), 및 70(#23), 144(#1) 또는 150(#15) 중 하나 이상, 바람직하게 1개;

29(#17), 및 76(#2), 78(#8), 77(#16), 49(#18), 47(#19) 또는 48(#20) 중 하나 이상, 바람직하게 1개;

76(#2), 및 57(#11) 또는 171(#14) 중 하나 이상, 바람직하게 1개;

76(#2), 및 41(#12) 또는 29(#17) 중 하나 이상, 바람직하게 1개;

77(#16), 및 57(#11) 또는 171(#14) 중 하나 이상, 바람직하게 1개;

77(#16), 및 41(#12) 또는 29(#17) 중 하나 이상, 바람직하게 1개;

49(#18), 57(#11) 또는 171(#14) 중 하나 이상, 바람직하게 1개;

49(#18), 및 41(#12) 또는 29(#17) 중 하나 이상, 바람직하게 1개;

47(#19), 및 57(#11) 또는 171(#14) 중 하나 이상, 바람직하게 1개;

47(#19), 및 41(#12) 또는 29(#17) 중 하나 이상, 바람직하게 1개;

48(#20), 및 57(#11) 또는 171(#14) 중 하나 이상, 바람직하게 1개;

48(#20), 및 41(#12) 또는 29(#17) 중 하나 이상, 바람직하게 1개;

78(#8), 및 57(#11) 또는 171(#14) 중 하나 이상, 바람직하게 1개; 또는

78(#8), 및 41(#12) 또는 29(#17) 중 하나 이상, 바람직하게 1개.

상기 모든 조합에서, 적절한 경우 표 A 내지 표 I 그리고 표 1 내지 표4에 나타낸 바와 같은 3개의 CDR을 갖는 항체도 사용될 수 있다.

바람직한 조합은 단독 활성 제제 (단일요법), 단독 항체 또는 단독 항-CD163 제제로서 투여된 임의의 본 발명의 항체 (예로, VHH)와 비교하여 개선되거나 증가된, 바람직하게 유의하게 개선되거나 증가된 치료 효능을 유도하는 조합이다. 다른 바람직한 조합은 조합의 개별 항-CD163 항체가 CD163 분자 상의 상이한 에피토프에 결합하는 조합이다.

본 발명의 둘 이상의 항체 (또는 결합 단백질)를 사용하는 이러한 조합 치료의 경우, 제 2 (또는 후속적) 항-CD163 항체는 예컨대 단일 약제학적 조성물 또는 밀접하게 함께 (동일한 또는 유사한 시간에) 투여되는 2가지 약제학적 조성물로부터의 본 발명의 제 1 항-CD163 항체와 실질적으로 동시에 대상체에게 투여될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 제 2 (또는 후속적) 항-CD163 항체는 본 발명의 제 1 항-CD163 항체의 투여 전에 또는 투여와 순차적으로 대상체에게 투여될 수 있다. 본원에 사용된 바, "전에 또는 순차적으로"는 "시차를 둔"을 의미하여, 제 2 항체는 제 1 항-CD163 항체 구성성분의 투여와 구별된 시간에 대상체에게 투여된다. 일반적으로, 2개 (또는 둘 이상) 구성성분은 개별 구성성분이 각각의 치료 효과를 발휘할 수 있도록 효과적으로 이격된 시간에 별도로 또는 다함께 투여될 수 있으며, 즉 "생물학적으로 유효한 시간 간격"으로 "생물학적 유효량"이 투여되고, 동일한 치료 섭생의 일부로서 투여된다.

본 발명의 항-CD163 항체 (또는 결합 단백질)의 조합은 적절한 경우 동일한 분자 또는 구조물의 일부로서 편리하게 투여될 수 있고, 예를 들어 인공적인 링커를 사용하여 컨쥬게이션되거나 연결될 수 있다. 이러한 투여 방식은 구체적으로 VHH 항체 (또는 단일 폴리펩티드 사슬로 구성된 다른 유형의 항체 분자)에 적합할 수 있으며, 이의 개별 항체는 본 발명의 또는 VHH 또는 다른 항체와 조합하여 다수의 VHH (또는 다른) 항체를 포함하는 단일 폴리펩티드 사슬에서, 적절한 펩티드 (또는 기타) 링커, 예로 고유하지 않은 펩티드 또는 인공적인 링커에 의해 편리하게 연결될 수 있다. 이러한 구현예에서, 제제는 일반적으로 적절한 기법, 예를 들어 이격화를 사용하여 함께 연결되어, 각 구성성분이 이들 각각의 효과, 예를 들어 CD163에 대한 결합을 발휘할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항-CD163 항체가 CD163 상의 상이한 에피토프에 결합하는 구현예에서, 이러한 항체의 조합이 바람직하고, 구조물은 각 개별 항체가 CD163, 예로 이의 CD163 에피토프에 결합할 수 있도록 적절하게 설계된다.

따라서, 일부 구현예에서 본 발명의 항-CD163 항체 (또는 결합 단백질)는 치료 섭생 (단일요법)에서 단독 활성 제제로서 사용될 수 있거나, 본 발명의 항-CD163 항체 중 하나 이상이 조합하여, 예를 들어 상기에 설명한 바와 같이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명 (또는 적절한 조합)의 항-CD163 항체 (또는 결합 단백질)는 치료 섭생에서 단독 활성 항-CD163 제제(들) 또는 단독 활성 항-CD163 항체로서 사용될 수 있거나, 이들은 치료 섭생에서 단독 활성 항-PRRSV 제제(들)일 수 있다. 그러나, 일부 구현예에서 추가적인 항-CD163 제제 또는 항-PRRSV 제제가 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명 (또는 적절한 조합)의 항-CD163 결합 단백질 또는 항체는 하나 이상의 추가의 (추가적인 CD163 표적화 또는 비-CD163 표적화) 활성 제제, 예를 들어 적어도 하나의 제 2 치료제 또는 생물학적 제제와 조합될 수 있으며, 여기서 본 발명 (또는 이러한 결합 단백질 또는 항체의 조합)의 항-CD163 결합 단백질 또는 항체가 먼저이다.

본 발명 (또는 적절한 조합)의 항-CD163 항체 (또는 결합 단백질)는 예를 들어 본원의 다른 곳에서 기술된 바와 같이 문제가 되는 질병, 예를 들어 PRRSV을 치료하는데 유용한 임의의 다른 치료제와 조합될 수 있다.

이러한 조합 치료의 경우, 제 2 제제 (본 발명의 항-CD163 항체가 아님)는 일반적으로 말하면 예컨대 단일 약제학적 조성물 또는 밀접하게 함께 (동일한 또는 유사한 시간에) 투여되는 2가지 약제학적 조성물로부터의 본 발명의 항-CD163 항체 (또는 이러한 항체의 조합)와 실질적으로 동시에 대상체에게 투여될 수 있다. 대안적으로, 제 2 제제 (본 발명의 항-CD163 항체가 아님)는 본 발명의 구성성분의 항-CD163 항체의 투여 전에 또는 투여와 순차적으로 대상체에게 투여될 수 있다. 본원에 사용된 바, "전에 또는 순차적으로"는 "시차를 둔"을 의미하여, 제 2 제제 (본 발명의 항-CD163 항체가 아님)는 항-CD163 항체 구성성분의 투여와 구별된 시간에 대상체에게 투여된다. 일반적으로, 2개 (또는 둘 이상) 구성성분은 2개의 구성성분이 각각의 치료 효과를 발휘할 수 있도록 효과적으로 이격된 시간에 별도로 또는 다함께 투여될 수 있으며, 즉 "생물학적으로 유효한 시간 간격"으로 "생물학적 유효량"이 투여되고, 동일한 치료 섭생의 일부로서 투여된다.

본 발명은 하나 이상의 본 발명의 항체, 또는 본 발명의 조성물, 또는 본 발명의 항체를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 분자, 또는 본 발명의 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 재조합 발현 벡터, 또는 본 발명의 재조합 발현 벡터 또는 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 숙주 세포 또는 바이러스를 포함하는 키트를 추가로 포함한다. 바람직하게, 상기 키트는 본원에 기재된 바와 같은 방법 및 용도, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 치료 방법에 사용하기 위한 것이다. 바람직하게, 상기 키트는 키트 구성요소의 사용 설명서를 포함한다. 바람직하게 상기 키트는 본원의 다른 곳에서 기술된 바와 같은 질병 또는 병태를 치료하기 위한 것이고, 선택적으로 이러한 질병 또는 병태를 치료하기 위한 키트 구성요소의 사용 설명서를 포함한다. 본 발명의 결합 단백질을 사용한 동등한 구현예도 제공된다.

본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 항체 (또는 결합 단백질)은 또한 시험관내 또는 생체내 적용 및 검정을 위한 분자 도구로서 사용될 수 있다. 항체 (및 일부 결합 단백질)은 항원 결합 부위를 갖기 때문에, 이들은 특이적 결합 쌍의 구성원으로서 기능할 수 있으며, 이러한 분자는 특정한 결합 쌍 구성원이 요구되는 모든 검정법에 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명의 추가의 양태는 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 항체 (또는 결합 단백질)를 포함하는 시약, 및 예를 들면 시험관내 또는 생체내 검정법에서 분자 도구로서 이러한 항체 (또는 결합 단백질)의 용도를 제공한다.

본원에 개시된 아미노산 서열 및 이들의 서열 식별자 (서열번호)의 표

모든 아미노산 서열은 본 기술 분야의 관례에 따라 N-말단부터 C-말단까지 본원에서 인용된다.

본 발명은 이제 다음의 도면을 참조하여 다음의 비-제한적인 실시예에서 추가로 설명될 것이다.
도 1은 고농도 돼지 혈청 존재 하에 제 1형 PRRS 바이러스 BOR57의 차단을 나타낸다.
패널 a 내지 i의 데이터는 80% 돼지 혈청의 존재 하에 돼지 폐포 대식구 세포와 함께 17시간 동안 배양된 때 제 1형 BOR57 PRRS 바이러스에 의한 생산적인 바이러스 감염을 억제하는 후보 VHH 항체의 능력을 입증한다. 후보 VHH 항체는 50 내지 400 μg/mL 사이의 용량 반응 범위에 걸쳐 평가되었다. 데이터는 평균 +/- SEM (n > 3)으로서 표시되는 바, 모의 대조군과 비교하여 테스트 항목의 부재 하의 감염과 대비하여 표시된다.
도 2는 10% FBS 포함하는 배지에서 제 2형 PRRS 바이러스 MN184의 차단을 나타낸다.
데이터는 10% FBS 존재 하에 돼지 폐포 대식구 세포와 함께 17시간 동안 배양된 때 제 2형 MN184 PRRS 바이러스에 의한 생산적인 바이러스 감염을 억제하는 후보 VHH 항체의 능력을 입증한다. 후보 항체는 50 내지 300 μg/mL 사이의 용량 반응 범위에 걸쳐 평가되었다. 데이터는 평균 +/- SEM (n > 3)으로서 표시되는 바, 모의 대조군과 비교하여 테스트 항목의 부재 하의 감염과 대비하여 표시된다.
도 3은 제 2형 PRRS 바이러스에 특이적인 VHH 억제성 항체에 의한 제 1형 바이러스 감염의 차단을 나타낸다.
데이터는 80% 돼지 혈청의 존재 하에 돼지 폐포 대식구 세포와 함께 17시간 동안 배양된 때 제 1형 BOR57 PRRS 바이러스에 의한 생산적인 바이러스 감염을 억제하는 후보 VHH 항체의 능력을 입증한다. 후보 항체는 1 내지 100 μg/mL 사이의 용량 반응 범위에 걸쳐 평가되었다. 데이터는 평균 +/- SEM (n > 3)으로서 표시되는 바, 모의 대조군과 비교하여 테스트 항목의 부재 하의 감염과 대비하여 표시된다.
도 4는 VHH15, VHH16 및 VHH20을 포함하는 VHH 조합을 사용한 제 1형 PRRS 바이러스 BOR57의 차단을 나타낸다.
데이터는 제 1형 PRRS 바이러스에 의한 감염을 차단하기 위해 개별 VHH가 조합하여 사용될 수 있음을 보여준다. VHH15 및 VHH16, VHH15 및 VHH20, 그리고 VHH16 및 VHH20의 조합은 생산적인 바이러스 감염의 효과적인 차단을 나타낸다. VHH 쌍의 각 VHH의 100 μg/mL의 단일 농도가 테스트되었다. 추가적으로, VHH15+VHH16+VHH20의 삼중 조합이 평가되었으며, 각 VHH는 50 μg/mL의 농도로 존재한다. 데이터는 VHH 조합이 PRRS 바이러스에 의한 감염을 차단하는데 사용될 잠재력을 입증한다. 데이터는 모의 대조군과 비교하여 테스트 항목의 부재 하에 감염과 대비하여 표시된다.
도 5a 및 5b는 VHH02, VHH15, VHH16 및 VHH20을 포함하는 VHH 조합을 사용한 제 1형 PRRS 바이러스 BOR57의 차단을 나타낸다.
데이터는 제 1형 PRRS 바이러스에 의한 감염을 차단하기 위해 개별 VHH가 조합하여 사용될 수 있음을 보여준다. VHH02 및 VHH15, VHH02 및 VHH16, 그리고 VHH02 및 VHH20의 조합은 VHH 쌍 각각의 3 μg/mL 내지 100 μg/mL의 농도 범위에 걸쳐 생산적인 바이러스 감염의 효과적인 차단을 보여준다. 데이터는 VHH 조합이 PRRS 바이러스에 의한 감염을 차단하는데 사용될 잠재력을 입증한다. 데이터는 모의 대조군과 비교하여 테스트 항목의 부재 하에 감염과 대비하여 표시된다.
도 6은 돼지 CD163 SRCR5 도메인과의 VHH14(02D01) 상호작용의 X선 결정분석 구조를 나타낸다.
왼쪽 패널은 VHH14:SRCR5 복합체의 정련된 구조를 나타낸다. 왼쪽 측면은 N 말단을 향해 구부러진 역평행 방식으로 2개의 더 짧은 β-시트가 연접되는 1개의 긴 β-시트에 이어진 단일 α-나선으로 구성된 CD163:SRCR5 도메인이 있다. 오른쪽에는 7개의 역평행 β-시트 및 코어 주변에 위치한 3개의 짧은 α-나선으로 구성된 VHH14(02D01)의 코어 구조가 있다. C- 및 N-말단 둘 다는 각 단백질에 대해 표시된다.
오른쪽 패널은 1 시그마 수준에서 윤곽을 그리는 전자 밀도 (2m|Fo|-D|Fc|)의 예이다. 단백질 사슬 및 개별 아미노산은 선으로 표시된다. 데이터는 VHH14의 CDR2 도메인 내의 타이로신 (Y59) 및 아스파라긴산 (D62) 잔기와 돼지 SRCR5 도메인 내의 한 쌍의 류신 잔기 (Leu 526번, Leu 527번) 사이의 명백한 상호작용을 나타낸다. VHH14 (CDR3)의 류신 104번와 SRCR5 세린 507번 (S507) 및 글루탐산 509번에서 한 쌍의 아미노산 사이의 추가적인 상호작용도 관찰된다. 결정 구조는 2.0 내지 2.3Å으로 정련되었다. 이 도면에서 Leu (L) 52번은 서열번호 116에 나타낸 전장의 CD163 분자의 Leu (L) 527번에 해당한다. 이 도면에서 Leu (L) 51번은 서열번호 116에 제시된 전장의 CD163 분자의 Leu (L) 526번에 해당한다. 이 도면에서 Ser (S) 32번은 서열번호 116에 제시된 전장의 CD163 분자의 Ser (S) 507번에 해당한다. 이 도면에서 Glu (E) 34번은 서열번호 116에 제시된 전장의 CD163 분자의 Glu (E) 509번에 해당한다. VHH 02D01의 Asp (D) 62번, Tyr (Y) 59번 및 Leu (L) 104번은 서열번호 17' 또는 99에 제시된다 (표 3).

실시예

실시예 1: 면역화, 라이브러리 생성, 스크리닝 및 클론 선별

재료 및 방법

면역화

단일 도메인 항체는 재조합 단백질로 면역화된 라마로부터 획득되었다. 라마에게 불완전 프로인트 아주반트 (pCD163-SRCR1-9-huFc 및 pCD163-SRCR4-7-huFc)로 제형화된 돼지 CD163 Fc 융합 항원 제제를 주사하였다. 동물을 매주 간격으로 6회의 피하 주사 (100 μg/용량으로 2회 주사하고, 이어서 50 μg/용량으로 4회 주사)로 면역화하였다. 마지막 추가 접종 이후 1주째, 혈청을 수집하여 ELISA에 의해 pCD163-SRCR1-9-huFc 및 pCD163-SRCR4-7-huFc에 대한 항체 역가를 정의하였다.

이러한 ELISA에서, 96-웰 플레이트 (맥시소르프, 눈크사)를 재조합 단백질로 코팅하였다. 희석된 혈청 시료를 차단하고 첨가한 이후, 항-CD163 항체의 존재는 마우스 항-낙타 IgG2/3 (EMD 밀리포아사; 카탈로그 번호 MAC131), 이어서 항-마우스 면역글로불린 퍼옥시다제 컨쥬게이트 (JIR, 카탈로그 번호 715-035-150)를 사용하여 입증하였다.

라이브러리 제작

RNA는 3마리의 면역화된 라마 (각각 400 mL)의 PBMC로부터 추출하였다. 40 μg의 RNA를 무작위 프라이머를 사용한 cDNA 합성에 사용하였다. cDNA는 리더 서열 및 힌지 CH1 영역에서 어닐링되는 태그가 없는 프라이머를 사용한 일차 PCR 증폭, 이어진 pDCL1 파지미드 벡터에서 VHH 유전자의 클로닝을 위한 제한 엔도뉴클레아제 부위를 도입한 이차 PCR 증폭에 사용하였다. 라이브러리를 TG1 대장균 세포에 전기천공하고, 면역 라이브러리의 세균 글리세롤 스톡을 -80℃에 보관하였다 (FL1158 및 FL1159).

선별

라마 VHH 라이브러리 풀로부터로부터의 파지 생산은 pCD163 재조합 단백질 또는 돼지 폐포 대식세포 (pPAM)를 사용한 파지 디스플레이 선별의 2회 연속 과정에 사용되었다. 재조합 단백질에 대한 선별 과정은 10 μg/mL의 pCD163-SRCR1-9-huFc 또는 pCD163-SRCR4-7-huFc pH 7.4 (PBS 완충액)를 사용하여 비-특이적 파지의 세척, 이어진 트립신으로 특이적 파지 용출로 수행하였다 (총 용출). pPAM에 대한 선별 과정은 pH 7.4 (PBS 완충액) 중 5E106 세포를 사용하여 비-특이적 파지의 세척, 이어진 트립신으로 특이적 파지 용출로 수행하였다 (총 용출). 용출된 파지의 일련 희석을 수행하고, 기하급수적으로 성장하는 TG1을 감염시키는데 사용하였다. 감염된 TG1을 LBCarb100Glu 2% 플레이트에 도말하고, 농축 값을 배경에 대비하여 계산하였다 (선별을 위한 항원 없음).

ELISA 스크리닝

선택 조건 결과의 두 번째 과정에서 개별 클론을 96-웰 마스터 플레이트 내에 선택하고, ELISA 결합을 통해 pH 7.0에서 pCD163-SRCR4-7-huFc 또는 pCD163-SRCR5-6-huFc 단백질에 대한 결합을 세포질주변 추출물 (PE)로서 테스트하였다. PE 결합 ELISA의 경우, 맥시소로프^TM 고-단백질-결합 성능 96-웰 ELISA 플레이트를 PBS에 희석한 1 μg/mL의 pCD163-SRCR4-7-huFc 단백질로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 다음날, 플레이트를 PBS 트윈 0.05% (pH 7.4)로 3회 세척하고, 250 μL/웰의 4% 마르벨/CPA 또는 4% 마르벨/PBS로 실온에서 1시간 동안 차단하였다. 차단 이후, 플레이트를 PBS 트윈 0.05% (pH 7.4)로 3회 세척하고, 웰 당 1% 마르벨/PBS (pH 7.4) 중 20 μL의 P.E + 80 μL과 함께 진탕하면서 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 플레이트를 PBS 트윈 0.05% (pH 7.4)로 3회 세척하고, 1% 마르벨PBS (pH 7.4) 중 항-c-Myc 항체 (로슈사, 카탈로그 번호 11667203001), 이어진 이차 항체 DAM-HRP (JIR, 카탈로그 번호 715-035-150) 100 μL와 함께 진탕하면서 RT에서 1시간 동안 배양하였다. 플레이트를 PBS 트윈 0.05% (pH 7.4)로 3회 세척하고, 기질 용액 (TMB 용액)을 플레이트에 첨가하였다. 반응은 H₂SO₄로 중단시키고, 플레이트는 450 nm에서 플레이트 판독기로 판독되었다.

세포 상의 스크리닝 (FACS)

선별된 클론으로부터의 세포질주변 추출물 (PE)을 가용성 VHH에 존재하는 c-myc 태그에 특이적인 항-c-myc 항체 (로슈사; 카탈로그 번호 11667203001)와 함께 실온 (RT)에서 30분 동안 교반하면서 배양하였다. 혼합물 (PE + 항-c-myc 항체)을 pPAM 또는 pPAM△5 도메인 (SRCR 도메인 5가 결실된 세포)에 첨가하고, 가만히 진탕하면서 4℃에서 60분 동안 배양하였다.

세포를 150 μL/웰의 FACS 완충액으로 3회 세척하고, 50 μL/웰의 2차 항체 GAM-APC와 함께 진탕하면서 4℃에서 30분 동안 배양하며, 광선으로부터 보호하였다.

세포를 150 μL/웰의 FACS 완충액으로 3회 세척하고, FACS 완충액 75 μL/웰에 재현탁하여 RL-1 채널 (APC 채널)에서 FACS 장치 (아튠^TM NxT)로 측정하였으며, 총 10,000개의 세포가 시료 당 획득되었다.

서열결정

양성 결합은 서열결정을 위해 보내졌다. 클론은 상이한 HCDR3 서열에 따라 패밀리로 분류되었다.

결과 및 논의

라마를 재조합 CD163으로 면역화하고 이어서 이후 2회의 파지 패닝으로 파지 클론을 선별하였다. 대조군 인간 IgG와 비교하여, 파지 후보를 ELISA에 의해 재조합 CD163 발현 구조물(pCD163SRCR1-9-Fc 또는 pCD163-SRCR4-7-Fc)을 결합시킴으로써 확인하였다. 선택적 결합은 표 5에서 나타낸 바와 같이 돼지 CD163에 대한 여러 후보에 의해 입증되었다.

클론은 공여자 동물로부터의 기관지폐포 세척액으로부터 회수된 세포로부터 제조되는, 단리된 일차 돼지 폐포 대식세포 상의 고유한 막 결합 CD163에 결합하는 능력에 대해 추가로 선별되었다 (Burkard C., et al., PLOS Pathogens 2017). 후보 파지는 CD163 수용체가 세포내이입 메커니즘에 의해 내재화될 가능성이 더 높을 때 4℃ 뿐만 아니라 실온 모두에서 고유한 막 결합된 CD163에 결합하는 것으로 입증되었다.

모든 후보는 또한 CD163 유전자에서 이러한 도메인이 결실된 돼지에서 분리된 돼지로부터 단리된 돼지 폐포 대식세포에 결합할 수 없는 후보를 선별하여 CD163의 SRCR5 도메인에 대한 선택적 결합에 대해 평가되었다 (Burkard C., et al., PLOS Pathogens 2017). 선별된 모든 후보는 이들 동물로부터 분리된 PAM에 결합할 수 없었으므로 돼지 CD163의 SRCR5 도메인에 대한 우선적 결합을 입증하였다.

따라서, 재조합 CD163 단백질 구조로 라마를 면역화하면 일차 돼지 폐포 대식세포 상에 발현되는 CD163에 결합할 수 있는 파지 항체 후보가 성공적으로 분리되었으며, 특히 이러한 세포의 PRRS 바이러스 감염에 필수적인 것으로 알려진 SRCR5 도메인을 표적으로 한다.

참고 문헌

Burkard C., Lillico S.G., Reid E., Jackson B., Mileham A.J., Ait-Ali T., et al. (2017) Precision engineering for PRRSV resistance in pigs: Macrophages from genome edited pigs lacking CD163 SRCR5 domain are fully resistant to both PRRSV genotypes while maintaining biological function. PLoS Pathog 13(2): e1006206. doi:10.1371/journal.ppat.1006206

실시예 2: 돼지 CD163에 대한 항-CD163 VHH 항체의 친화도 측정

재료 및 방법

확인된 각 VHH 항체 후보에 의한 돼지 CD163에 대한 결합 친화도를 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정하였다.

VHH 후보 항체의 발현 및 정제

FLAG 및 His 태그가 있는 VHH 가변 도메인을 코딩하는 합성 유전자를 구입하고 제조사 지침에 따라 재구성하였다. 각 DNA 구조물은 제한효소로 소화시키고, 삽입물을 젤 정제하여, 각 가변 도메인 삽입물은 포유동물 발현 벡터 pcDNA3.1과 라이게이션하였다. ExpiCHO-S 세포는 40 μg의 총 DNA 플라스미드 구조물을 사용하여 23개의 선도 패널 서열로 형질감염시켰다. 25 mL 총 부피의 세포는 8일 동안의 단백질 생산 (32℃, 5% CO₂)에 사용하였다. 생산된 VHH 항체는 AKTA 퓨어 25 FPLC 시스템 상의 HisTrap HP 5 mL IMAC 컬럼 (GE 헬스케어사, 카탈로그 번호 17-5248-02)을 사용하여 정화된 상청액으로부터 포획하였다. 용출된 항체 피크 분획을 1Х PBS pH 7.4로 완충액 교환하고, 3kDa MCO 스핀 농축기 (아미콘사, 카탈로그 번호 UFC900324)를 사용하여 농축시켰다. 정제된 단백질은 정확한 사슬의 존재에 대해 분석용 크기 배제 크로마토그래피 (aSEC) 및 SDS-PAGE에 의해 분석하였다.

친화도 결정

pCD163에 대한 선택된 정제된 클론의 친화도를 평가하기 위해, pCD163-SRCR1-9-huFc 또는 pCD163-SRCR4-7-huFc 단백질을 CM5 센서 칩 (GE 헬스케어사) 상의 아민 커플링에 의해 코팅하였다. 표면 플라즈몬 공명 (SPR) (비아코아 3000, GE 헬스케어사)을 사용하여 pH 7.4에서 선택된 단일 도메인 항체의 결합 동역학을 결정하였다. 대략 2000 RU의 pCD163-SRCR1-9-huFc 또는 pCD163-SRCR4-7-huFc, 아세테이트 완충액 pH 5.0 또는 pH 5.5 중 20 또는 30 μg/mL의 단백질을 표준 아민 커플링 절차를 사용하여 CM5 칩 상에 고정화하였다. 고정화의 QC는 30.0 μg/mL 농도의 시판되는 항체 항-huFc (JIR, 카탈로그 번호 109-005-098)를 사용하여 시행하였다.

1Х HBS-EP pH 7.4를 결합 동역학 측정 동안 전개 완충액으로 사용하였다. 정제된 VHH를 3배 희석 (300 nM, 100 nM, 33 nM, 11 nM, 3.7 nM, 1.2 nM, 0.4 nM, 0 nM)으로 30 μL/분의 유속으로 120초 동안 주입하였다. RU 수준은 시료 사이에 10 μL의 10 mM NaOH/1 M NaCl 및 10 μL의 10 mM 글리신 pH 1.5를 사용한 재생 이후에 기저 수준으로 회복되었다. 결합 속도 (ka), 해리 속도 (kd) 및 친화도 (KD)를 포함한 항체-항원 상호작용의 동역학 상수를 계산하기 위해 BIA평가 소프트웨어의 동시적 피팅 옵션을 사용하여 질량 전달을 사용한 피팅 1 : 1 결합을 설정된 시료 곡선에 적용하였다. 곡선은 잔류물의 육안 검사 및 Chi2 값을 고려한 이후에 피팅으로부터 제거되었다. 동시적 피팅에는 최소 4개의 곡선이 고려되었다.

결과 및 논의

파지 후보는 상기 기술된 바와 같이 VHH로서 발현되고 정제되었다. 전장의 또는 절단된 형태의 CD163에 대한 각 VHH 결합의 특성화는 표면 플라즈몬 공명에 의해 상기 기재된 바와 같이 수행하였다. 각 항체에 대해 결합 및 해리 속도를 측정하고 친화도 결정을 계산하였다. 표 7에서 볼 수 있는 바, 항체 후보에 대한 KD 값은 1 nM 내지 75 nM의 범위이었다. 전장의 또는 절단된 pCD163-SRCR4-7 구조물에 대한 상대 친화도는 대체로 유사하였다.

실시예 3: 후보 CD163-특이적 후보 항체에 의한 일차 돼지 폐포 대식세포의 돼지 호흡기 및 생식 (PRRS) 바이러스 감염의 억제

재료 및 방법

PRRS 바이러스 감염 프로토콜

시약

VHH 후보 항체는 1 mg/mL의 농도로 분취하였다.

대조군 항체:

일차 항체: 항-PRRS 1AC7, 인게나사사

이차 항체: 염소 항-마우스 IgG (H+L) 알렉사 플루오르 플러스 488, 써모피셔사, A32723

배양 배지:

완전한 RPMI (10% FBS 또는 80% 높은 돼지 혈청, 울트라글루타민, Pen/Strep)

PAM 단리: 돼지 폐포 대식세포 단리는 Burkard et al., PLoS Pathogens 2017에 설명된 바와 같이 시행하였다.

바이러스 분리주:

제 1형 바이러스: BOR57 분리주 (영국 에든버러, 로슬린 연구소)

제 2형 바이러스: MN184 a US 균주 (Han et al., 2006)

감염 프로토콜

1일차 - 종자 세포

돼지 폐포 대식세포를 48-웰 플레이트에 있는 완전한 RPMI에서 플레이트 당 2천만 개로 접종하고, CO₂ 배양기에 밤새 방치하였다.

2일차 - VHH 치료 및 감염 접종

1. 전처리 (감염 30분 전)

a. 세포에서 배지를 흡인으로 제거한다.

b. 100 mL 배양 배지를 미처리된 감염되지 않은 대조군 및 미처리된 감염된 대조군에 첨가한다.

c. 100 mL 배양 배지 중 20 mL PBS를 모의 처리된 감염된 대조군에 첨가한다.

d. 100 mL 배양 배지 중 적당량의 VHH 스톡을 처리되고 감염된 시료에 첨가한다.

e. 플레이트를 30분 동안 CO₂ 배양기로 돌려보낸다.

2. 바이러스 스톡을 해동시키고, 사용 전에 15초 동안 초음파 처리한다.

3. 감염 접종 (2시간)

a. 세포로부터 배양 배지를 제거하고, 밤샘 배양 단계 동안 VHH 포함하는 배양 배지를 넣어둔다.

b. 100 mL 배양 배지를 미처리된 감염되지 않은 대조군에 첨가한다.

c. 100 mL 배양 배지 중 10 mL 바이러스를 미처리된 감염된 대조군에 첨가한다.

d. 100 mL 배양 배지 중 20 mL PBS를 더한 10 mL 바이러스를 모의 처리된 감염된 대조군에 첨가한다.

e. 100 mL 배양 배지 중 적당량의 VHH 스톡 및 10 mL 바이러스를 처리되고 감염된 시료에 첨가한다.

f. 플레이트를 가만히 교반하고, CO₂ 배양기로 돌려보낸다.

g. 플레이트를 2시간 동안 15분마다 가만히 교반한다.

4. 밤샘 배양 (15시간)

a. 세포에서 배지를 흡인으로 제거한다.

d. 전처리 단계로부터의 배양 배지를 포함하는 보유된 VHH를 적절한 시료에 첨가한다.

e. 플레이트를 15시간 동안 CO₂ 배양기로 돌려보낸다.

3일차 - 웰-내 고정 및 염색 프로토콜

5. 세포로부터 배지를 흡인으로 제거한다.

6. 4% 포름알데히드/PBS++ (칼슘 및 마그네슘을 포함함) 용액에서 세포를 실온에서 30분 동안 고정시킨다.

7. PBS++로 1회 세척한다.

8. 트리톤-X (PBS++ 중 1%)로 RT에서 5분 동안 투과화한다.

9. PBS++ 또는 차단 용액 (PBS++/5% FBS)으로 1회 세척한다.

10. 차단 용액 (PBS++/5% FBS)으로 20분 동안 실온에서 차단시킨다.

11. 1 : 5000의 일차 항체 항-PRRS 1AC7을 염색되지 않은 대조군 및 이차 항체만의 대조군을 제외한 모든 웰에 첨가한다.

12. 1시간 동안 실온에서 배양한다.

13. PBS++로 3회 세척한다.

14. 1 : 5000의 일차 항체 염소 항-마우스 IgG (H+L) 알렉사 플루오르 플러스 488을 염색되지 않은 대조군을 제외한 모든 웰에 첨가한다.

15. 45분 동안 실온에서 배양한다.

16. PBS++로 3회 세척한다.

17. 300 mL의 PBS++를 첨가한다.

18. 넓은 구경의 p200 피펫 팁을 사용하여 세포를 긁어낸 다음 일반 p200 팁으로 웰의 모서리를 긁은 다음 p1000을 사용하여 웰 표면을 3회 세척하고, FAC 튜브로 운반할 세포를 수집한다.

19. 측정은 포르테사 Х20 (전압: FSC=418, SSC=308 & B530-30=386) 상에서 시행하였다.

결과 및 논의

PRRS 바이러스 패밀리 구성원에 의한 PAM 숙주 세포의 감염을 차단하는 개별 VHH의 능력은 하기에 설명되어 있다. 17시간의 감염 주기 이후 FACS에 의해 측정된 바와 같이, 상기 기재된 검정법을 사용하여 바이러스를 전파하는 능력에 의해 정량화되는 바이러스 감염 정도를 측정하였다. 제시된 데이터는 도 1 및 도 2에 나타낼 뿐만 아니라 하기 표 8에 요약되어 있다.

데이터는 PRRS 제 1형 (도 1 참조)과 제 2형 (도 2 참조) 이소형 모두에 의해 돼지 폐포 대식세포의 생산적인 감염을 억제할 수 있는 VHH를 명백하게 보여준다. 감염 검정법에서 활성을 나타내는 VHH는 제 1형 및 제 2형 바이러스 감염 모두에 대해 효과적인 것 (VHH 001, 002, 008, 015, 016, 018, 019, 020 및 023), 및 제 1형 PRRS 바이러스 감염에 대해 억제 활성이 나타내지 않았으나 제 2형 PRRS 바이러스 감염에 대해 선택적인 억제 활성을 보이는 것 (VHH 011, 012, 014, 017)으로 구분될 수 있다. 데이터는 PRRS 제 1형 및 제 2형 이소형 모두에 의해 돼지 폐포 대식세포의 생산적인 감염을 억제할 수 있는 VHH를 명백하게 보여준다.

일부 VHH는 최대 300 μg/mL의 농도 범위에서 제 2형 바이러스 감염 (VHH 011, 012, 014, 017)에서만 억제 활성을 나타내었다 (도 2). 이러한 후보 VHH는 PRRS 제 2형 바이러스에 대한 특이성을 나타내고, 최대 100 μg/mL의 유사한 용량 반응 농도 범위에 걸쳐 제 1형 바이러스 감염 검정법에서 억제 활성을 나타내지 않았다 (도 3).

참고문헌

Burkard C., et al., Precision engineering for PRRSV resistance in pigs: Macrophages from genome edited pigs lacking CD163 SRCR5 domain are fully resistant to both PRRSV genotypes while maintaining biological function PLoS Pathogens, 13(2) 2017: e1006206;

Han J., Y. Wang, KSFaaberg. Complete genome analysis of RFLP 184 isolates of porcine reproductive and respiratory syndrome virus Virus Research,　122　(2006), pp.　175.

실시예 4: 후보 CD163-특이적 후보 항체의 조합에 의한 일차 돼지 폐포 대식세포의 돼지 호흡기 및 생식 (PRRS) 바이러스 감염의 억제

재료 및 방법

PRRS 바이러스 감염 프로토콜

시약

VHH 후보 항체는 1 mg/mL의 농도로 분취하였다.

대조군 항체:

일차 항체: 항-PRRS 1AC7, 인게나사사

배양 배지:

바이러스 분리주:

제 2형 바이러스: MN184 a US 균주 (Han et al., 2006)

감염 프로토콜

1일차 - 종자 세포

2일차 - VHH 치료 및 감염 접종

1. 전처리 (감염 30분 전)

a. 세포에서 배지를 흡인으로 제거한다.

e. 플레이트를 30분 동안 CO₂ 배양기로 돌려보낸다.

3. 감염 접종 (2시간)

e. 100 mL 배양 배지 중 적당량의 개별 VHH 스톡 (또는 VHH의 조합) 및 10 mL 바이러스를 처리되고 감염된 시료에 첨가한다.

f. 플레이트를 가만히 교반하고, CO₂ 배양기로 돌려보낸다.

g. 플레이트를 2시간 동안 15분마다 가만히 교반한다.

4. 밤샘 배양 (15시간)

a. 세포에서 배지를 흡인으로 제거한다.

e. 플레이트를 15시간 동안 CO₂ 배양기로 돌려보낸다.

3일차 - 웰-내 고정 및 염색 프로토콜

5. 세포로부터 배지를 흡인으로 제거한다.

7. PBS++로 1회 세척한다.

8. 트리톤-X (PBS++ 중 1%)로 RT에서 5분 동안 투과화한다.

9. PBS++ 또는 차단 용액 (PBS++/5% FBS)으로 1회 세척한다.

12. 1시간 동안 실온에서 배양한다.

13. PBS++로 3회 세척한다.

15. 45분 동안 실온에서 배양한다.

16. PBS++로 3회 세척한다.

17. 300 mL의 PBS++를 첨가한다.

결과 및 논의

PRRS 바이러스 패밀리 구성원에 의한 PAM 숙주 세포의 감염을 차단하는 개별 VHH의 능력은 하기에 설명되어 있다. 17시간의 감염 주기 이후 FACS에 의해 측정된 바와 같이, 상기 기재된 검정법을 사용하여 바이러스를 전파하는 능력에 의해 정량화되는 바이러스 감염 정도를 측정하였다. 제시된 데이터는 도 4 및 도 5에 나타낸다.

VHH 15, 16 및 20의 조합은 10% FBS를 포함하는 배지의 존재 하에 BOR57 PRRS 제 1형 바이러스를 사용한 감염 검정법에 사용되었다. 100 mg의 각 VHH 15 및 VHH16, VHH15 및 VHH20, VHH16 및 VHH20의 특이적 조합, 및 50 mg의 각 VHH15+VHH16+VHH20의 삼중 조합은 제 1형 PRRS 바이러스의 감염 잠재력을 매우 낮은 수준의 감염도로 감소시킬 잠재력을 나타낸다 (도 4 참조).

10% FBS를 포함하는 배지의 존재 하에 BOR57 PRRS 제 1형 바이러스를 사용한 감염 검정법에서 VHH의 상이한 쌍 조합의 잠재력을 조사하였다. VHH02(01B04)는 감염 차단 잠재력을 평가하는데 VHH15(02G01), VHH16(02H11) 및 VHH20(03H11)과의 파트너로서 사용되었다. 각 파트너 VHH의 농도를 증가시키면서 조합을 테스트하였다. 데이터는 VHH의 조합이 제 1형 PRRS 바이러스 감염을 차단하는데 사용될 수 있음을 입증한다 (도 5 참조).

데이터는 VHH의 조합이 개별 VHH 후보보다 잠재적으로 더 큰 정도로 PRRS 제 1형 이소형에 의한 돼지 폐포 대식세포의 생산적 감염의 억제를 증진할 수 있음을 보여준다. 데이터는 개별 VHH를 조합하여 PRRS 바이러스 패밀리 구성원에 의한 감염의 잠재적인 차단을 증진하는 것이 가능할 수 있음을 시사한다.

참고문헌

Burkard C., et al., 상동; Han J.,　Y.　Wang,　K.S. Faaberg, 상동.

실시예 5: 돼지 CD163 SRCR5에 결합하는 항-CD163 VHH 항체의 결정

재료 및 방법

VHH 항체 후보 2D01(VHH14)에 결합하는 돼지 CD163 SRCR5 도메인에 대한 X-선 결정분석 구조를 결정하였다.

VHH14 항체의 발현 및 정제

돼지 SRCR5의 발현 및 정제

HIS 태그가 있는 돼지 CD163 SRCR5 영역을 코딩하는 합성 유전자를 pTXBac1 (독점 지적재산권 벡터) 내에 서브클로닝한 이후 대장균 DH10Bac 내로 형질전환하여 재조합 백미드를 생산하였다. 재조합 백미드를 사용하여 스포도프테라 프루지퍼다 (Sf) 세포를 형질전환하여 P1 바이러스 클론을 생성하였다. P1 클론으로부터의 세포 및 배지 시료는 고발현 클론을 확인하도록 단백질 발현에 대해 일상적으로 조사하였다. 고발현 클론은 P1 바이러스 스톡으로 Sf 세포를 감염시켜 증폭되어 P2 바이러스 스톡을 생성하고, 후속적으로 감염 다중도 (MOI) ~1에서 72시간 동안 Sf1 세포에서 재조합 SRCR5 단백질을 발현하는데 사용하였다.

생산 규모 확대는 Sf 세포의 10 L 배양에서 시행되었다. 상기 기술한 최적의 발현 조건이 사용되었다. 표준 프로토콜에 의해 IMAC 상의 HIS 태그를 사용하여 정제 이전에 배양 상청액을 포스페이트 완충 식염수 (PBS) pH 7.5로 평형화하였다. 시료를 PBS pH 7.5 및 0.1% 트리톤 X-114 완충액으로 세척하였다. 제조사 지침에 따라 단백질을 이미다졸로 용출시켰다. 용출된 시료는 코발트 레진에 대한 추가의 정제 이전에 PBS pH 7.5로 완충액 교환되었다. 이미다졸 변위를 사용한 세척 이후에 (상기 기술된 바와 같음) 시료를 용출하였다. 생성된 용출 시료를 20 mM 트리스-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl로 완충제 교환하였다.

결정화 및 X-선 구조 결정 연구

CD163 SRCR5:VHH14 복합체는 PBS pH 7.4 완충액 중 11.84 mg/mL의 농도로 제조하였다. 판형 결정을 0.2 M NaCl, 0.1 M 포스페이트/시트레이트 pH 4.5, 20% w/v PEG8000에서 성장시켰다. 개별 결정은 0.14 M NaCl, 0.07 M 인산염/시트레이트 완충액 pH 4.5, 13.9% PEG 8000 및 46% 에틸렌 글리콜을 포함하는 동결 용액을 첨가한 이후 액체 질소에서 급속 냉동하였다.

데이터는 스웨덴 MAX ₃의 바이오맥스 빔라인 (l = 0.97625Å으로 100K에서 수집하였다. 빔라인은 아이거 16 M 하이브리드-픽셀 검출기가 장착되었다.

구조는 페이저 소프트웨어 및 2개의 상동성인 단백질 (PDB 코드: 5DA4 및 5JFB)을 사용하여 결정되었으며, 각각 2.4Å및 2.0Å으로 결정되었다. CD163 SRCR5 도메인의 103개 아미노산 (볼드체 표 9), 및 잔기 4번부터 볼드체로 표시되는 VHH014(02D01)에 대한 122개 아미노산을 모델화하는 것이 가능하였다 (표 9).

결과 및 논의

CD163 SRCR5:VHH014 복합체의 구조는 도 6에 나타낸 바와 같이 단일 단량체 VHH014 항체 (오른쪽)와 상호작용하는 단일 단량체 SRCR5 도메인 (왼쪽)을 보여준다. 전자 밀도 지도는 VHH014의 잔기와 CD163:SRCR5 도메인의 확인된 아미노산 사이의 특이적 상호작용을 드러낸다. 구체적으로, 확인된 모든 VHH 후보 간에 공유되는 모티프인 VHH14의 CDR2에 있는 XYAD/E/N 모티프에 따라, 돼지 CD163 SRCR5 도메인 내의 류신 526번 및 류신 527번은 특이적인 보존된 잔기와 상호작용을 형성하는 것으로 보인다. VHH14(02D01)는 제 1형 PRRS 바이러스에 의한 감염을 억제하지 않지만 제 2형 PRRS 패밀리 바이러스에 의한 감염을 감소시킬 수 있기 때문에 흥미롭다. 돼지 CD163 SRCR5에서 확인된 이중-류신 모티프는 제 2형 PRRS 바이러스와 SRCR5의 상호작용 및 돼지 폐포 대식세포의 생산적인 감염에 중요한 특징일 수 있다.

<110> ECO Animal Health Ltd. <120> CD163 Antibodies or Binding Proteins <130> MPI22-013 <150> GB 1919294.7 <151> 2019-12-24 <160> 118 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 123 <212> PRT <213> Llama <400> 1 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Val Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Ala Pro Ser Arg Tyr 20 25 30 Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Gln Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Gly Ile Ala Trp Ser Gly Arg Ala Pro Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Ser Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Gly Gly Glu Gly Ala Ile Arg Trp Thr Thr Leu Asp Ala Tyr Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Llama <400> 2 Arg Tyr Val Met Gly 1 5 <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> Llama <400> 3 Gly Ile Ala Trp Ser Gly Arg Ala Pro Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 4 <211> 15 <212> PRT 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Gln His Gly Asp Thr Trp Gly Thr Val Cys Asp Ser Asp Phe Ser Leu 20 25 30 Glu Ala Ala Ser Val Leu Cys Arg Glu Leu Gln Cys Gly Thr Val Val 35 40 45 Ser Leu Leu Gly Gly Ala His Phe Gly Glu Gly Ser Gly Gln Ile Trp 50 55 60 Ala Glu Glu Phe Gln Cys Glu Gly His Glu Ser His Leu Ser Leu Cys 65 70 75 80 Pro Val Ala Pro Arg Pro Asp Gly Thr Cys Ser His Ser Arg Asp Val 85 90 95 Gly Val Val Cys Ser 100 <210> 116 <211> 1115 <212> PRT <213> Porcine <400> 116 Met Asp Lys Leu Arg Met Val Leu His Glu Asn Ser Gly Ser Ala Asp 1 5 10 15 Phe Arg Arg Cys Ser Ala His Leu Ser Ser Phe Thr Phe Ala Val Val 20 25 30 Ala Val Leu Ser Ala Cys Leu Val Thr Ser Ser Leu Gly Gly Lys Asp 35 40 45 Lys Glu Leu Arg Leu Thr Gly Gly Glu Asn Lys Cys Ser Gly Arg Val 50 55 60 Glu Val Lys Val Gln Glu Glu Trp Gly Thr Val Cys Asn Asn Gly Trp 65 70 75 80 Asp Met Asp Val Val Ser Val Val Cys Arg Gln Leu Gly Cys Pro Thr 85 90 95 Ala Ile Lys Ala Thr Gly Trp Ala Asn Phe Ser Ala Gly Ser Gly Arg 100 105 110 Ile Trp Met Asp His Val Ser Cys Arg Gly Asn Glu Ser Ala Leu Trp 115 120 125 Asp Cys Lys His Asp Gly Trp Gly Lys His Asn Cys Thr His Gln Gln 130 135 140 Asp Ala Gly Val Thr Cys Ser Asp Gly Ser Asp Leu Glu Met Gly Leu 145 150 155 160 Val Asn Gly Gly Asn Arg Cys Leu Gly Arg Ile Glu Val Lys Phe Gln 165 170 175 Gly Arg Trp Gly Thr Val Cys Asp Asp Asn Phe Asn Ile Asn His Ala 180 185 190 Ser Val Val Cys Lys Gln Leu Glu Cys Gly Ser Ala Val Ser Phe Ser 195 200 205 Gly Ser Ala Asn Phe Gly Glu Gly Ser Gly Pro Ile Trp Phe Asp Asp 210 215 220 Leu Val Cys Asn Gly Asn Glu Ser Ala Leu Trp Asn Cys Lys His Glu 225 230 235 240 Gly Trp Gly Lys His Asn Cys Asp His Ala Glu Asp Ala Gly Val Ile 245 250 255 Cys Leu Asn Gly Ala Asp Leu Lys Leu Arg Val Val Asp Gly Val Thr 260 265 270 Glu Cys Ser Gly Arg Leu Glu Val Lys Phe Gln Gly Glu Trp Gly Thr 275 280 285 Ile Cys Asp Asp Gly Trp Asp Ser Asp Asp Ala Ala Val Ala Cys Lys 290 295 300 Gln Leu Gly Cys Pro Thr Ala Val Thr Ala Ile Gly Arg Val Asn Ala 305 310 315 320 Ser Glu Gly Thr Gly His Ile Trp Leu Asp Ser Val Ser Cys His Gly 325 330 335 His Glu Ser Ala Leu Trp Gln Cys Arg His His Glu Trp Gly Lys His 340 345 350 Tyr Cys Asn His Asp Glu Asp Ala Gly Val Thr Cys Ser Asp Gly Ser 355 360 365 Asp Leu Glu Leu Arg Leu Lys Gly Gly Gly Ser His Cys Ala Gly Thr 370 375 380 Val Glu Val Glu Ile Gln Lys Leu Val Gly Lys Val Cys Asp Arg Ser 385 390 395 400 Trp Gly Leu Lys Glu Ala Asp Val Val Cys Arg Gln Leu Gly Cys Gly 405 410 415 Ser Ala Leu Lys Thr Ser Tyr Gln Val Tyr Ser Lys Thr Lys Ala Thr 420 425 430 Asn Thr Trp Leu Phe Val Ser Ser Cys Asn Gly Asn Glu Thr Ser Leu 435 440 445 Trp Asp Cys Lys Asn Trp Gln Trp Gly Gly Leu Ser Cys Asp His Tyr 450 455 460 Asp Glu Ala Lys Ile Thr Cys Ser Ala His Arg Lys Pro Arg Leu Val 465 470 475 480 Gly Gly Asp Ile Pro Cys Ser Gly Arg Val Glu Val Gln His Gly Asp 485 490 495 Thr Trp Gly Thr Val Cys Asp Ser Asp Phe Ser Leu Glu Ala Ala Ser 500 505 510 Val Leu Cys Arg Glu Leu Gln Cys Gly Thr Val Val Ser Leu Leu Gly 515 520 525 Gly Ala His Phe Gly Glu Gly Ser Gly Gln Ile Trp Ala Glu Glu Phe 530 535 540 Gln Cys Glu Gly His Glu Ser His Leu Ser Leu Cys Pro Val Ala Pro 545 550 555 560 Arg Pro Asp Gly Thr Cys Ser His Ser Arg Asp Val Gly Val Val Cys 565 570 575 Ser Arg Tyr Thr Gln Ile Arg Leu Val Asn Gly Lys Thr Pro Cys Glu 580 585 590 Gly Arg Val Glu Leu Asn Ile Leu Gly Ser Trp Gly Ser Leu Cys Asn 595 600 605 Ser His Trp Asp Met Glu Asp Ala His Val Leu Cys Gln Gln Leu Lys 610 615 620 Cys Gly Val Ala Leu Ser Ile Pro Gly Gly Ala Pro Phe Gly Lys Gly 625 630 635 640 Ser Glu Gln Val Trp Arg His Met Phe His Cys Thr Gly Thr Glu Lys 645 650 655 His Met Gly Asp Cys Ser Val Thr Ala Leu Gly Ala Ser Leu Cys Ser 660 665 670 Ser Gly Gln Val Ala Ser Val Ile Cys Ser Gly Asn Gln Ser Gln Thr 675 680 685 Leu Ser Pro Cys Asn Ser Ser Ser Ser Asp Pro Ser Ser Ser Ile Ile 690 695 700 Ser Glu Glu Asn Gly Val Ala Cys Ile Gly Ser Gly Gln Leu Arg Leu 705 710 715 720 Val Asp Gly Gly Gly Arg Cys Ala Gly Arg Val Glu Val Tyr His Glu 725 730 735 Gly Ser Trp Gly Thr Ile Cys Asp Asp Ser Trp Asp Leu Asn Asp Ala 740 745 750 His Val Val Cys Lys Gln Leu Ser Cys Gly Trp Ala Ile Asn Ala Thr 755 760 765 Gly Ser Ala His Phe Gly Glu Gly Thr Gly Pro Ile Trp Leu Asp Glu 770 775 780 Ile Asn Cys Asn Gly Lys Glu Ser His Ile Trp Gln Cys His Ser His 785 790 795 800 Gly Trp Gly Arg His Asn Cys Arg His Lys Glu Asp Ala Gly Val Ile 805 810 815 Cys Ser Glu Phe Met Ser Leu Arg Leu Ile Ser Glu Asn Ser Arg Glu 820 825 830 Thr Cys Ala Gly Arg Leu Glu Val Phe Tyr Asn Gly Ala Trp Gly Ser 835 840 845 Val Gly Arg Asn Ser Met Ser Pro Ala Thr Val Gly Val Val Cys Arg 850 855 860 Gln Leu Gly Cys Ala Asp Arg Gly Asp Ile Ser Pro Ala Ser Ser Asp 865 870 875 880 Lys Thr Val Ser Arg His Met Trp Val Asp Asn Val Gln Cys Pro Lys 885 890 895 Gly Pro Asp Thr Leu Trp Gln Cys Pro Ser Ser Pro Trp Lys Lys Arg 900 905 910 Leu Ala Ser Pro Ser Glu Glu Thr Trp Ile Thr Cys Ala Asn Lys Ile 915 920 925 Arg Leu Gln Glu Gly Asn Thr Asn Cys Ser Gly Arg Val Glu Ile Trp 930 935 940 Tyr Gly Gly Ser Trp Gly Thr Val Cys Asp Asp Ser Trp Asp Leu Glu 945 950 955 960 Asp Ala Gln Val Val Cys Arg Gln Leu Gly Cys Gly Ser Ala Leu Glu 965 970 975 Ala Gly Lys Glu Ala Ala Phe Gly Gln Gly Thr Gly Pro Ile Trp Leu 980 985 990 Asn Glu Val Lys Cys Lys Gly Asn Glu Thr Ser Leu Trp Asp Cys Pro 995 1000 1005 Ala Arg Ser Trp Gly His Ser Asp Cys Gly His Lys Glu Asp Ala Ala 1010 1015 1020 Val Thr Cys Ser Glu Ile Ala Lys Ser Arg Glu Ser Leu His Ala Thr 1025 1030 1035 1040 Gly Arg Ser Ser Phe Val Ala Leu Ala Ile Phe Gly Val Ile Leu Leu 1045 1050 1055 Ala Cys Leu Ile Ala Phe Leu Ile Trp Thr Gln Lys Arg Arg Gln Arg 1060 1065 1070 Gln Arg Leu Ser Val Phe Ser Gly Gly Glu Asn Ser Val His Gln Ile 1075 1080 1085 Gln Tyr Arg Glu Met Asn Ser Cys Leu Lys Ala Asp Glu Thr Asp Met 1090 1095 1100 Leu Asn Pro Ser Gly Asp His Ser Glu Val Gln 1105 1110 1115 <210> 117 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> His-tagged Porcine SRCR5 <400> 117 Met Pro Arg Leu Val Gly Gly Asp Ile Pro Cys Ser Gly Arg Val Glu 1 5 10 15 Val Gln His Gly Asp 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Leu Gly Tyr Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Asp Tyr Lys Asp 115 120 125 Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly Gly Ser His His His His His His 130 135 140

Claims

돼지에서 PRRS 바이러스 감염의 치료 또는 예방에 사용되는, 돼지 CD163에 결합하는 단일클론 항체.
제 1항에 있어서,
상기 항체는 상기 돼지 CD163의 SRCR5 도메인에 결합하는 능력을 갖는, 단일클론 항체.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 항체는 제 1형 및/또는 제 2형 PRRSV 감염을 억제하는 능력을 갖는, 단일클론 항체.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 사용에 적합한 항체로서, 돼지 CD163에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하고, 상기 항원 결합 도메인은 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 적어도 하나의 중쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역은 아미노산 서열 XYAD, XYAE 또는 XYAN을 포함하는 가변 중쇄 (VH) CDR2를 포함하고, 여기서 X는 임의의 아미노산, 바람직하게 Y, L, P, N, F 또는 R, 더욱 바람직하게 Y, F, L, N 또는 R, 또는 Y, P 또는 L, 가장 바람직하게 Y일 수 있는, 항체.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 사용에 적합한 항체 또는 제 4항의 항체로서, 돼지 CD163 (서열번호 116)의 아미노산 L526 및 L527을 포함하거나 이에 상응하는 돼지 CD163의 SRCR5 도메인에 있는 에피토프에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는, 항체.
제 5항에 있어서,
상기 항원 결합 도메인은 서열번호 116의 아미노산 L526, L527 및 S507, 또는 L526, L527 및 E509, 또는 L526, L527, S507 및 E509을 포함하거나 이에 상응하는 상기 돼지 CD163의 SRCR5 도메인에 있는 에피토프에 결합하는, 항체.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 사용에 적합한 항체 또는 제 4항 내지 제 6항 중 어느 한 항의 항체로서, 돼지 CD163에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하고, 상기 항원 결합 도메인은 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 적어도 하나의 중쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역은
(i) RYVMG (서열번호 2)의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 포함하고, 상기 실질적으로 상동성인 서열은 상기 주어진 CDR 서열과 비교하여 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하는 서열인, 가변 중쇄 (VH) CDR1,
(ii) GIAWSGRAPYADSVKG (서열번호 3)의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 포함하고, 상기 실질적으로 상동성인 서열은 주어진 CDR 서열과 비교하여 1개, 2개, 3개 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 서열인, 가변 중쇄 (VH) CDR2, 및
(iii) GEGAIRWTTLDAYDY (서열번호 4)의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 포함하고, 상기 실질적으로 상동성인 서열은 주어진 CDR 서열과 비교하여 1개, 2개, 3개 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 서열인, 가변 중쇄 (VH) CDR3을 포함하는, 항체.
제 7항에 있어서, 상기 중쇄 가변 영역은
(i) RYVMG (서열번호 2) 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열로서, 상기 실질적으로 상동성인 서열은 상기 주어진 CDR 서열과 비교하여 1개 또는 2개의 아미노산 변경을 포함하는 서열인, VH CDR1,
(ii) X₁ I X₃ W S G R A P Y A D S V K G (서열번호 73), 여기서 X₁ 또는 X₃은 임의의 아미노산일 수 있고, 바람직하게 X₁은 G 또는 A이고/거나 X₃은 A 또는 S인, VH CDR2, 및
(iii) G E G A I X₆ W T T X₁₀ X₁₁ A Y X₁₄ Y (서열번호 75), 여기서 X₆, X₁₀,X₁₁및 X₁₄는 임의의 아미노산일 수 있고, 바람직하게 X₆은 R 또는 K 또는 L이고, X₁₀은 L 또는 P이고, X₁₁은 D 또는 G이고/거나 X₁₄는 D 또는 N인, VH CDR3를 포함하는, 항체.
제 7항 또는 제 8항에 있어서,
상기 중쇄 가변 영역은
(i) RYVMG (서열번호 10)의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) CDR1,
(ii) AISWSGRAPYADSVKG (서열번호 11)의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) CDR2, 및
(iii) GEGAIKWTTLDAYDY (서열번호 12)의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) CDR3를 포함하는, 항체.
제 7항 또는 제 8항에 있어서,
상기 중쇄 가변 영역은
(i) RYVMG (서열번호 2)의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) CDR1,
(ii) GIAWSGRAPYADSVKG (서열번호 3)의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) CDR2, 및
(iii) GEGAIRWTTLDAYDY (서열번호 4)의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) CDR3을 포함하는, 항체.
제 7항 또는 제 8항에 있어서,
상기 중쇄 가변 영역은
(i) RYVMG (서열번호 18)의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) CDR1,
(ii) GIAWSGRAPYADSVKG (서열번호 19)의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) CDR2, 및
(iii) GEGAILWTTPGAYNY (서열번호 20)의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) CDR3를 포함하는, 항체.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 사용에 적합한 항체 또는 제 4항 내지 제 6항 중 어느 한 항의 항체로서, 돼지 CD163에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하고, 상기 항원 결합 도메인은 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 적어도 하나의 중쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역은
(i) TYSMG (서열번호 26)의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 포함하고, 상기 실질적으로 상동성인 서열은 상기 주어진 CDR 서열과 비교하여 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하는 서열인, 가변 중쇄 (VH) CDR1,
(ii) AHRWSGSAYYAEHADSVEG (서열번호 27)의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 포함하고, 상기 실질적으로 상동성인 서열은 상기 주어진 CDR 서열과 비교하여 1개, 2개, 3개 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 서열인, 가변 중쇄 (VH) CDR2, 및
(iii) GVGSAAQYRY (서열번호 28)의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 포함하고, 상기 실질적으로 상동성인 서열은 상기 주어진 CDR 서열과 비교하여 1개, 2개, 3개 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 서열인, 가변 중쇄 (VH) CDR3을 포함하는, 항체.
제 12항에 있어서,
상기 중쇄 가변 영역은
(i) X₁ X₂ S M G (서열번호 77), 여기서 X₁ 또는 X₂는 임의의 아미노산일 수 있고, 바람직하게 X₁은 T 또는 P이고/거나 X₂는 Y 또는 G인, VH CDR1,
(ii) A H R W S G S A Y Y A X₁₂ X₁₃ A D S V E G (서열번호 79), 여기서 X₁₂ 또는 X₁₃은 임의의 아미노산일 수 있고, 바람직하게 X₁₂는 E 또는 D이고/거나 X₁₃은 H 또는 Y인, VH CDR2, 및
(iii) G V G S X₅ A Q Y X₉ Y (서열번호 81), 여기서 X₅ 및X₉는 임의의 아미노산일 수 있고, 바람직하게 X₅는 A 또는 E이고/이거나 X₉는 R 또는 T인, VH CDR3을 포함하는, 항체.
제 12항 또는 제 13항에 있어서,
상기 중쇄 가변 영역은
(i) TYSMG (서열번호 26)의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) CDR1,
(ii) AHRWSGSAYYAEHADSVEG (서열번호 27)의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄(VH) CDR2, 및
(iii) GVGSAAQYRY (서열번호 28)의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) CDR3을 포함하는, 항체.
제 12항 또는 제 13항에 있어서,
상기 중쇄 가변 영역은
(i) PGSMG의 아미노산 서열 (서열번호 34)을 포함하는 가변 중쇄 (VH) CDR1,
(ii) AHRWSGSAYYADYADSVEG (서열번호 35)의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) CDR2, 및
(iii) GVGSAAQYTY (서열번호 36)의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) CDR3을 포함하는, 항체.
제 12항 또는 제 13항에 있어서,
상기 중쇄 가변 영역은
(i) TYSMG의 아미노산 서열 (서열번호 42)을 포함하는 가변 중쇄 (VH) CDR1,
(ii) AHRWSGSAYYAEHADSVEG (서열번호 43)의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) CDR2, 및
(iii) GVGSEAQYRY (서열번호 44)의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) CDR3을 포함하는, 항체.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 사용에 적합한 항체 또는 제 4항 내지 제 6항 중 어느 한 항의 항체로서, 돼지 CD163에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하고, 상기 항원 결합 도메인은 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 적어도 하나의 중쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역은
(i) SYSMG (서열번호 50)의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 포함하고, 상기 실질적으로 상동성인 서열은 상기 주어진 CDR 서열과 비교하여 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하는 서열인, 가변 중쇄 (VH) CDR1,
(ii) AITWNGYITNYADSVKG (서열번호 51)의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 포함하고, 상기 실질적으로 상동성인 서열은 상기 주어진 CDR 서열과 비교하여 1개, 2개, 3개 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 서열인, 가변 중쇄 (VH) CDR2, 및
(iii) TTFSTTSPISRTYNY (서열번호 52)의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 포함하고, 상기 실질적으로 상동성인 서열은 상기 주어진 CDR 서열과 비교하여 1개, 2개, 3개 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 서열인, 가변 중쇄 (VH) CDR3을 포함하는, 항체.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 사용에 적합한 항체 또는 제 4항 내지 제 6항 중 어느 한 항의 항체로서, 돼지 CD163에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하고, 상기 항원 결합 도메인은 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 적어도 하나의 중쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역은
(i) TYAMG (서열번호 58)의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 포함하고, 상기 실질적으로 상동성인 서열은 상기 주어진 CDR 서열과 비교하여 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하는 서열인, 가변 중쇄 (VH) CDR1,
(ii) IISFGGTFYADSVKG (서열번호 59)의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 포함하고, 상기 실질적으로 상동성인 서열은 상기 주어진 CDR 서열과 비교하여 1개, 2개, 3개 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 서열인, 가변 중쇄 (VH) CDR2, 및
(iii) GRTLSKRADSYAS (서열번호 60)의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 포함하고, 상기 실질적으로 상동성인 서열은 상기 주어진 CDR 서열과 비교하여 1개, 2개, 3개 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 서열인, 가변 중쇄 (VH) CDR3을 포함하는, 항체.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 사용에 적합한 항체 또는 제 4항 내지 제 6항 중 어느 한 항의 항체로서, 돼지 CD163에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하고, 상기 항원 결합 도메인은 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 적어도 하나의 중쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역은
(i) MYAMS (서열번호 66)의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 포함하고, 상기 실질적으로 상동성인 서열은 상기 주어진 CDR 서열과 비교하여 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하는 서열인, 가변 중쇄 (VH) CDR1,
(ii) AINTSGRYSRYADSVKG (서열번호 67)의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 포함하고, 상기 실질적으로 상동성인 서열은 상기 주어진 CDR 서열과 비교하여 1개, 2개, 3개 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 서열인, 가변 중쇄 (VH) CDR2, 및
(iii) TDKGNWALAMSYDY (서열번호 68)의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 포함하고, 상기 실질적으로 상동성인 서열은 상기 주어진 CDR 서열과 비교하여 1개, 2개, 3개 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 서열인, 가변 중쇄 (VH) CDR3을 포함하는, 항체.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 사용에 적합한 항체 또는 제 4항 내지 제 6항 중 어느 한 항의 항체로서, 상기 항체는 제 2형 PRRSV 감염을 특이적으로 억제할 수 있는, 항체.
제 20항에 있어서,
상기 항체는 제 2형 PRRSV 감염을 특이적으로 억제할 수 있고, 돼지 CD163에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하고, 상기 항원 결합 도메인은 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 적어도 하나의 중쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역은
(i) VYGTG (서열번호 84)의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 포함하고, 상기 실질적으로 상동성인 서열은 상기 주어진 CDR 서열과 비교하여 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하는 서열인, 가변 중쇄 (VH) CDR1,
(ii) GISGTTGSTLYADSVKG (서열번호 85)의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 포함하고, 상기 실질적으로 상동성인 서열은 상기 주어진 CDR 서열과 비교하여 1개, 2개, 3개 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 서열인, 가변 중쇄 (VH) CDR2, 및
(iii) GGRVYITTSSWAY (서열번호 86)의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 포함하고, 상기 실질적으로 상동성인 서열은 상기 주어진 CDR 서열과 비교하여 1개, 2개, 3개 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 서열인, 가변 중쇄 (VH) CDR3을 포함하는, 항체.
제 20항에 있어서,
상기 항체는 제 2형 PRRSV 감염을 특이적으로 억제할 수 있고, 돼지 CD163에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하고, 상기 항원 결합 도메인은 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 적어도 하나의 중쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역은
(i) RYAMG (서열번호 92)의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 포함하고, 상기 실질적으로 상동성인 서열은 상기 주어진 CDR 서열과 비교하여 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하는 서열인, 가변 중쇄 (VH) CDR1,
(ii) AIAWSTGSTYYANSVKG (서열번호 93)의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 포함하고, 상기 실질적으로 상동성인 서열은 상기 주어진 CDR 서열과 비교하여 1개, 2개, 3개 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 서열인, 가변 중쇄 (VH) CDR2, 및
(iii) ETRYCSGFGCLDPRTYGS (서열번호 94)의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 포함하고, 상기 실질적으로 상동성인 서열은 상기 주어진 CDR 서열과 비교하여 1개, 2개, 3개 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 서열인, 가변 중쇄 (VH) CDR3을 포함하는, 항체.
제 20항에 있어서,
상기 항체는 제 2형 PRRSV 감염을 특이적으로 억제할 수 있고, 돼지 CD163에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하고, 상기 항원 결합 도메인은 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 적어도 하나의 중쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역은
(i) TDTMA (서열번호 100)의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 포함하고, 상기 실질적으로 상동성인 서열은 상기 주어진 CDR 서열과 비교하여 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하는 서열인, 가변 중쇄 (VH) CDR1,
(ii) GIGRSGGSIYYADAVKG (서열번호 101)의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 포함하고, 상기 실질적으로 상동성인 서열은 상기 주어진 CDR 서열과 비교하여 1개, 2개, 3개 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 서열인, 가변 중쇄 (VH) CDR2, 및
(iii) RQRIGLVVGALGYDY (서열번호 102)의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 포함하고, 상기 실질적으로 상동성인 서열은 상기 주어진 CDR 서열과 비교하여 1개, 2개, 3개 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 서열인, 가변 중쇄 (VH) CDR3을 포함하는, 항체.
제 20항에 있어서,
상기 항체는 제 2형 PRRSV 감염을 특이적으로 억제할 수 있고, 돼지 CD163에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하고, 상기 항원 결합 도메인은 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 적어도 하나의 중쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역은
(i) DYTIG (서열번호 108)의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 포함하고, 상기 실질적으로 상동성인 서열은 상기 주어진 CDR 서열과 비교하여 1개 또는 2개의 아미노산 치환을 포함하는 서열인, 가변 중쇄 (VH) CDR1,
(ii) CINSITSNTYYADSVKG (서열번호 109)의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 포함하고, 상기 실질적으로 상동성인 서열은 상기 주어진 CDR 서열과 비교하여 1개, 2개, 3개 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 서열인, 가변 중쇄 (VH) CDR2, 및
(iii) DSGLFSGSSCLKYRAMRFGS (서열번호 110)의 아미노산 서열 또는 이에 실질적으로 상동성인 서열을 포함하고, 상기 실질적으로 상동성인 서열은 상기 주어진 CDR 서열과 비교하여 1개, 2개, 3개 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 서열인, 가변 중쇄 (VH) CDR3을 포함하는, 항체.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 사용에 적합한 항체 또는 제 4항 내지 제 24항 중 어느 한 항의 항체로서, 상기 항체는 단일 도메인 항체인, 항체.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 사용에 적합한 항체 또는 제 4항 내지 제 19항 또는 제 25항 중 어느 한 항의 항체로서, 상기 항체는 제 1형 및 제 2형 PRRSV 감염을 억제할 수 있고, 바람직하게 상기 항체는 숙주 세포를 감염시키는 제 2형 PRRSV의 능력을 적어도 50%로 억제할 수 있고/거나, 숙주 세포를 감염시키는 제 1형 PRRSV의 능력을 적어도 50%, 적어도 80% 또는 적어도 90%로 억제할 수 있는, 항체.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 사용에 적합한 항체 또는 제 4항 내지 제 6항 또는 제 20항 내지 제 25항 중 어느 한 항의 항체로서, 상기 항체는 제 2형 PRRSV 감염을 특이적으로 억제할 수 있고, 바람직하게 상기 항체는 숙주 세포를 감염시키는 제 2형 PRRSV의 능력을 적어도 40%로 억제할 수 있고, 더욱 바람직하게 상기 항체는 숙주 세포를 감염시키는 제 1형 PRRSV의 능력을 유의하게 억제하지 못하는, 항체.
제 7항 내지 제 24항 중 어느 한 항의 항체와 동일한 돼지 CD163의 에피토프에 결합하는 항체.
제 7항 내지 제 24항 중 어느 한 항의 둘 이상의 항체의 조합, 또는 제 7항 내지 제 19항 중 어느 한 항의 항체와 제 21항 내지 제 24항 중 어느 한 항의 항체의 조합.
제 4항 내지 제 28항 중 어느 한 항의 항체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 하나 이상의 핵산 분자; 또는
이러한 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 발현 벡터; 또는
상기 발현 벡터 또는 핵산 분자를 포함하거나 제 4항 내지 제 28항 중 어느 한 항의 항체를 발현하는 하나 이상의 숙주 세포.
제 4항 내지 제 28항 중 어느 한 항의 항체를 생산하는 방법으로서, (i) 제 30항에 정의된 바와 같은 하나 이상의 발현 벡터 또는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 숙주 세포를 상기 인코딩된 항체의 발현에 적합한 조건 하에 배양하는 단계; 및 선택적으로 (ii) 상기 숙주 세포 또는 상기 성장 배지/상청액으로부터 상기 발현된 항체를 단리하거나 획득하는 단계를 포함하는, 방법.
제 4항 내지 제 28항 중 어느 한 항의 항체, 또는 제 29항의 항체의 조합, 또는 제 30항의 하나 이상의 핵산 분자 또는 발현 벡터를 포함하는, 바람직하게 약제학적으로 허용가능한 조성물인, 조성물.
돼지에서 치료법에 사용되는, 바람직하게 PRRS 바이러스 감염의 치료 또는 예방에 사용되는, 제 4항 내지 제 28항 중 어느 한 항의 항체, 또는 제 29항의 항체의 조합, 또는 제 30항의 하나 이상의 핵산 분자 또는 발현 벡터의 용도.
돼지의 PRRS 바이러스 감염의 치료 또는 예방에 사용되는, 제 4항 내지 제 28항 중 어느 한 항의 항체, 제 29항의 항체의 조합 또는 제 30항의 하나 이상의 핵산 분자 또는 발현 벡터의 용도.
돼지의 PRRS 바이러스 감염의 치료 또는 예방 방법으로서, 제 4항 내지 제 28항 중 어느 한 항의 항체, 제 29항의 항체의 조합 또는 제 30항의 하나 이상의 핵산 분자 또는 발현 벡터의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
제 1형 및/또는 제 2형 PRRSV 감염의 치료 또는 예방에서 제 33항의 용도의 분자, 제 34항의 용도 또는 제 35항의 방법.