JP2023548417A - 癌の予防および治療用サルモネラ菌株およびその用途 - Google Patents

Abstract

本発明は、ＤＮＡコンストラクトおよび前記ＤＮＡコンストラクトを含む組換えベクターが導入された菌株に関し、本発明によるＤＮＡコンストラクは、宿主菌株または細胞内で第１プロモーターと第２プロモーターの下流に作動可能に連結された抗癌遺伝子を発現させて癌の予防および治療効果を有する。また、本発明の前記ＤＮＡコンストラクは、ドキシサイクリンの処理の有無を調節することにより、適切な癌治療のための用量で抗癌タンパク質が発現できるようにする。

Description

本発明は、癌の予防および治療用ＤＮＡコンストラクトおよび前記ＤＮＡコンストラクトを含む組換えベクターが導入された菌株に関する。

現在まで大部分の癌は外科的手術、放射線治療および化学療法に相当するそれぞれの個別的方法またはこれらの組み合わせによって治療されているのが現状である。癌組織を大部分除去する外科的手術は、特定の部位、例えば、乳房、結腸および皮膚に位置した癌組織を除去するには極めて効果的であり得るが、脊椎のような一部区域にある癌組織を治療するには使用が困難である。また、乳癌、肺癌および精巣癌によく使用される全身性化学療法の場合、正常細胞の複製または代謝過程を崩壊させる副作用が誘発され、患者において化学療法による治療剤への耐性が発生することがある。

一方、個体で癌が発生する時、血管形成と細胞成長が体内で非常に速い速度で進行するため、癌組織の内部は血管形成が不完全で酸素の欠乏した環境が作られて、サルモネラ属菌株または大腸菌のような嫌気性バクテリアが増殖するのに極めて適しうる。これによって、現在、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属菌株とクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属菌株のような癌を標的可能なバクテリアを用いた癌治療は、固形腫瘍を標的とし、腫瘍内で増殖可能な特定のバクテリアの機能に依存するが、腫瘍溶解タンパク質またはレポータータンパク質を前記バクテリアに導入し、このように形質転換されたバクテリアを個体に投与する場合、癌組織を特異的に確認したり、正常細胞に対して毒性を示す副作用を最小化して癌を治療することができる。

自然界に存在する多様なバクテリア病原体から分泌する毒素によって人間に疾病が誘発される。このように疾病が誘発されうる多様なバクテリア病原体のうち、我々の食生活と密接な関係があるサルモネラエンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）などはヒトを含む霊長類の腸管内に生息する腸内細菌科と知られており、外毒素として知られたサイトリシン（ｃｙｔｏｌｙｓｉｎ）を分泌する。このように分泌するサイトリシンは、約３４ｋＤａの分子量を有する細胞毒性タンパク質であって、ヒトを含む霊長類の腸内で赤血球を破壊する溶血作用および正常細胞の膜に気孔を形成させて細胞の溶解を誘発させ、深刻な血管炎症と局所組織の壊死によって死亡にまで至らせることが知られている。しかし、最近の研究結果では、サルモネラエンテリカから分離および精製されたサイトリシンが体内腸管に存在する癌組織に特異的に反応して癌組織の死滅を誘導し、次世代抗癌治療剤として注目されている。したがって、細胞毒性物質であるサイトリシンを分泌する遺伝子が形質転換されたバクテリアは、癌組織標的用抗癌治療剤としての活用の可能性が非常に高いとされる。

このようにバクテリアを用いた癌の診断または治療が可能であるにもかかわらず、診断および治療に適したタンパク質が癌組織で特異的に発現できるようにする発現ベクターに関する研究がほとんど行われないのが現状である。バクテリアが生体内に注入された後には、最初の３日間肝および脾臓のような網状内皮系でクリアランス（Ｃｌｅａｒａｎｃｅ）が行われ、以後、一定期間後に癌組織で急増するので、安全性の面で一定期間経過後に治療タンパク質が発現できるようにすることが要求される。このため、治療タンパク質の発現のために誘導性プロモーター（Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）の使用が薦められるが、現在、実験段階で用いられるＰＢＡＤプロモーターのような誘導性プロモーターは人体使用が許容されていないＬ－アラビノース（Ｌ－ａｒａｂｉｎｏｓｅ）が誘導物質として使用されなければならないため、臨床適用の敷居が高い。人体使用が許容された抗生剤であるドキシサイクリン（Ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ）を使用するＰｔｅｔプロモーターは、相対的に臨床的使用が容易であり、ＴｅｔＡプロモーターとＴｅｔＲプロモーターを用いて２つの遺伝子の双方向転写が可能という利点があるが、ＴｅｔＡプロモーターとＴｅｔＲプロモーターとの間のタンパク質発現率が１００：１以上の差を示して、この部分のバランスを合わせてこそ活用度を高めるであろう。このように臨床適用可能な形態の発現システムを有し、タンパク質の発現レベルがバランスをなし得るように形質転換されたバクテリアに対する新たな技術の開発が必要なのが現状である。

本発明の一目的は、ＤＮＡコンストラクトを提供することである。
本発明の他の目的は、前記ＤＮＡコンストラクトを含む組換えベクターを提供することである。
本発明のさらに他の目的は、前記組換えベクターが導入された菌株；およびこれを含む癌の診断用組成物を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、前記菌株を有効成分として含む癌の予防または治療用薬学組成物を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、前記菌株を処理する段階を含む癌の診断のための情報提供方法を提供することである。
しかし、本発明が解決しようとする技術的課題は以上に言及した課題に制限されず、言及されていないさらに他の課題は以下の記載から当業界における通常の知識を有する者に明確に理解されるであろう。

本発明の一実施形態では、ＤＮＡコンストラクトを提供する。
本発明の前記ＤＮＡコンストラクトは、前記第１タンパク質および第２タンパク質を暗号化する遺伝子；およびこれに対応する第１プロモーターおよび第２プロモーターを含み、第１タンパク質は、フラジェリンであり、第２タンパク質は、毒素タンパク質である。
本発明において、前記フラジェリンは、フラジェリンＡまたはＢである。
本発明のＤＮＡコンストラクトは、調節タンパク質を暗号化する遺伝子を追加的に含む。

本発明の他の態様によれば、本発明は、第１タンパク質を暗号化する遺伝子およびこれに対応する第１プロモーターを含むＤＮＡコンストラクト；および第２タンパク質を暗号化する遺伝子およびこれに対応する第２プロモーターを含むＤＮＡコンストラクトを個別的に含む組換えベクターを含み、第１タンパク質は、フラジェリンであり、第２タンパク質は、毒素タンパク質である、前記組換えベクターが導入された菌株を提供する。
本発明の前記第１プロモーターおよび第２プロモーターは、別のプロモーターによって発現する１つの調節タンパク質によって同時に誘導できるため、第２プロモーターの下流に調節タンパク質を暗号化する遺伝子が作動可能に連結された場合と比較して、宿主細胞；または宿主細胞内で第１プロモーターおよび第２プロモーターの下流に作動可能に連結された遺伝子によって暗号化されるタンパク質間の発現レベルがバランスをなし得る。このように、本発明によるＤＮＡコンストラクトを用いる場合には、診断と治療が同時に行われる。

本発明の前記「ＤＮＡコンストラクト」は、宿主菌株または細胞に形質転換により導入される場合、目的とするタンパク質などが発現できるようにする構造体であって、目的とするタンパク質を暗号化する遺伝子だけでなく、前記遺伝子が発現できるように作動可能に連結された必須の調節要素であるプロモーターに相当する塩基配列などを含むものを意味する。
本発明の前記「プロモーター」とは、宿主菌株または細胞で作動可能に連結された遺伝子の上流領域に存在する塩基配列であって、転写が開始されるようにするためにＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）が結合可能な前記ＤＮＡコンストラクトの特定の部位の塩基配列を意味する。
本発明の前記調節タンパク質の発現調節は、シス－作用因子（ｃｉｓ－ａｃｔｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔ、Ｃｉｓ－ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔｓ；ＣＲＥ）またはトランス－作用因子（ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔ、Ｔｒａｎｓ－ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔｓ；ＴＲＥ）によることができる。

本発明において、前記「調節」乃至「発現調節」は、特定の遺伝子の転写および翻訳が活性化または抑制されることを意味することができる。
本発明の前記シス－作用因子は、隣り合う遺伝子の転写を調節する非－コードＤＮＡの領域で、遺伝子調節ネットワークの必須構成要素であり、遺伝子発現を制御する。前記シス－作用因子は、リボソーム結合部位（ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ；ＲＢＳ）、５’－非翻訳領域（５’－Ｕｎｔｒａｎｓｒａｔｅｄ Ｒｅｇｉｏｎ；５’－ＵＴＲ）、転写因子結合部位（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ）および終結子（ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ）からなる群より選択される少なくとも１つであってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明において、前記リボソーム結合部位（ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ；ＲＢＳ）は、シャイン・ダルガノ配列（Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ ｓｅｑｕｅｎｃｅ；ＳＤ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）ともいい、ＤＮＡに盛り込まれている遺伝情報が伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に転写された後、翻訳（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）が起こるためにはこのｍＲＮＡにリボソーム（ｒｉｂｏｓｏｍｅ）が結合しなければならないが、この時、リボソームが効果的に結合できるようにｍＲＮＡ上に存在する短い配列を意味する。

本発明において、前記５’－非翻訳領域（５’－Ｕｎｔｒａｎｓｒａｔｅｄ Ｒｅｇｉｏｎ；５’－ＵＴＲ）は、５’領域でｍＲＮＡのアミノ酸に翻訳される部分であるコード部分（ｃｏｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）の両側に位置する翻訳されない部分で、進化過程で無駄に捨てられる部分（ｊｕｎｋ）と思われていたが、遺伝子発現の調節に大きな役割を果たすことが知られるようになった。
本発明において、前記転写因子結合部位（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ）は、近くの特定の遺伝子をオンオフする役割をするＤＮＡ部位である。前記転写因子結合部位は、前記調節タンパク質を暗号化する遺伝子のプロモーター、エンハンサー（ｅｎｈａｎｃｅｒ）およびサイレンサー（ｓｉｌｅｎｃｅｒ）からなる群より選択される少なくとも１つであってもよいが、これに限定されない。

本発明の前記調節タンパク質を暗号化する遺伝子のプロモーターは、大部分の宿主菌株または細胞の環境条件および発達状態などで活性が誘導できるプロモーターであればすべて含まれ、好ましくは、弱いプロモーター（Ｗｅａｋ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）であってもよい。
本発明の前記「弱いプロモーター」とは、下流に作動可能に連結された遺伝子から転写された転写体（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）の発現レベルが１×１０^－２以下、好ましくは１×１０^－３以下に発現するように誘導するプロモーターであって、このように転写体の発現レベルを１×１０^－３以下に発現させるプロモーターであればすべて含まれ、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ σ７０プロモーター；Ｅ．ｃｏｌｉ σＳプロモーター；Ｅ．ｃｏｌｉ σ３２プロモーター；Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ σＡプロモーター；Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ σＢプロモーター；サルモネラ由来プロモーターであるＫ１１２７０６またはＫ１１２７０７；バクテリオファージＴ７プロモーター；バクテリオファージＳＰ６プロモーター；酵母（ｙｅａｓｔ）由来プロモーター；真核細胞由来プロモーターであるＩ７１２００４またはＫ０７６０１７；および植物由来プロモーターから構成された群より選択される少なくとも１つであってもよいが、これに限定されるものではない。

本発明の前記Ｅ．ｃｏｌｉ σ７０プロモーターは、Ｉ１４０１８、Ｉ１４０３３、Ｉ１４０３４、Ｉ７３２０２１、Ｉ７４２１２６、Ｊ０１００６、Ｊ２３１０３、Ｊ２３１０９、Ｊ２３１１２、Ｊ２３１１３、Ｊ２３１１７、Ｊ２３１１９、Ｊ２３１５０、Ｊ２３１５１、Ｊ４４００２、Ｊ４８１０４、Ｊ５６０１５、Ｊ６４９５１、Ｋ０８８００７、Ｋ１１９０００、Ｋ１１９００１、Ｋ１３３０００２、Ｋ１３７０２９、Ｋ１３７０３０、Ｋ１３７０３１、Ｋ１３７０３２、Ｋ１３７０８５、Ｋ１３７０８６、Ｋ１３７０８７、Ｋ１３７０８８、Ｋ１３７０８９、Ｋ１３７０９０、Ｋ１３７０９１、Ｋ１５８５１００、Ｋ１５８５１０１、Ｋ１５８５１０２、Ｋ１５８５１０３、Ｋ１５８５１０４、Ｋ１５８５１０５、Ｋ１５８５１０６、Ｋ１５８５１１０、Ｋ１５８５１１３、Ｋ１５８５１１５、Ｋ１５８５１１６、Ｋ１５８５１１７、Ｋ１５８５１１８、Ｋ１５８５１１９、Ｋ２４８６１７１、Ｋ２５６００２、Ｋ２５６０１８、Ｋ２５６０２０、Ｋ２５６０３３、Ｋ２９２０００、Ｋ８２３００７、Ｋ８２３０１０、Ｋ８２３０１３、Ｍ１３１０１、Ｍ１３１０２、Ｍ１３１０３、Ｍ１３１０４、Ｍ１３１０５、Ｍ１３１０６、Ｍ１３１０８、Ｍ１３１１０、Ｍ３１５１９、Ｒ１０７４、Ｒ１０７５およびＳ０３３３１から構成された群より選択される少なくとも１つであってもよいが、これに限定されるものではない。

本発明の前記Ｅ．ｃｏｌｉ σＳプロモーターは、Ｊ４５９９２またはＪ４５９９３であってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明の前記Ｅ．ｃｏｌｉ σ３２プロモーターは、Ｊ４５５０４、Ｋ１８９５００２またはＫ１８９５００３であってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明の前記Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ σＡプロモーターは、Ｋ１４３０１２、Ｋ１４３０１３、Ｋ８２３０００、Ｋ８２３００２およびＫ８２３００３から構成された群より選択される少なくとも１つであってもよいが、これに限定されるものではない。

本発明の前記Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ σＢプロモーターは、Ｋ１４３０１０、Ｋ１４３０１１またはＫ１４３０１３であってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明の前記バクテリオファージＴ７プロモーターは、Ｉ７１９００５、Ｊ３４８１４、Ｊ６４９９７、Ｋ１１３０１０、Ｋ１１３０１１、Ｋ１１３０１２、Ｋ１６１４０００、Ｒ００８５、Ｒ０１８０、Ｒ０１８１、Ｒ０１８２、Ｒ０１８３、Ｚ０２５１、Ｚ０２５２およびＺ０２５３から構成された群より選択される少なくとも１つであってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明の前記バクテリオファージＳＰ６プロモーターは、Ｊ６４９９８であってもよいが、これに限定されるものではない。

本発明の前記酵母由来プロモーターは、Ｉ７６６５５７、Ｊ６３００５、Ｋ１０５０２７、Ｋ１０５０２８、Ｋ１０５０２９、Ｋ１０５０３０、Ｋ１０５０３１、Ｋ１２２０００、Ｋ１２４０００、Ｋ１２４００２、Ｋ３１９００５、Ｍ３１２０１、Ｋ２３６５０４０、Ｋ２３６５０３６、Ｋ２３６５０４１、Ｋ２３６５０４２、Ｋ２３６５０３２、Ｋ２３６５０５１、Ｋ２３６５５１４、Ｋ２３６５５１５およびＫ２３６５５１６から構成された群より選択される少なくとも１つであってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明の前記植物由来プロモーターは、ＰＬＰＲ０２０３、ＰＬＰＲ０２１０、ＰＬＰＲ０１７７、ＰＬＰＲ０１９３、ＰＬＰＲ０５０７、ＰＬＰＲ０４２２、ＰＬＰＲ０２２８、ＰＬＰＲ０２２６、ＰＬＰＲ０２２３、ＰＬＰＲ００４０、ＰＬＰＲ０４６５、ＰＬＰＲ０２３２、ＰＬＰＲ０２０５、ＰＬＰＲ０２４７、ＰＬＰＲ０３２８、ＰＬＰＲ０５２５、ＡｔＲＥＧ３８３、ＡｔＲＥＧ４１５、ＡｔＲＥＧ４１６、ＯｓＲＥＧ４３８、ＯｓＲＥＧ４４３、ＯｓＲＥＧ５０１、ＰｐＲＥＧ１８６、ＰｐＲＥＧ１９４およびＰｐＲＥＧ１９７から構成された群より選択される少なくとも１つであってもよいが、これに限定されるものではない。

本発明の目的上、前記弱いプロモーターの下流に調節タンパク質を暗号化する遺伝子が作動可能に連結される場合には、前記第１プロモーターまたは第２プロモーターの下流に作動可能に連結された場合と比較して、調節タンパク質を抑制する物質を投与した時にのみ特異的に前記第１および第２プロモーターの下流に存在する遺伝子の転写が起こるように調節することができる。
本発明の前記調節タンパク質を暗号化する遺伝子のプロモーターは、調節タンパク質を暗号化する遺伝子を基準として－３５部位の塩基配列は、配列番号８であり、－１０部位の塩基配列は、配列番号９であってもよいが、これに限定されるものではない。

本発明の前記エンハンサーは、原核および真核生物ともで発見される配列で、一般的に５０～１５００ｂｐの領域を有し、前記近くの遺伝子の出発地から上流または下流に位置して前記転写因子結合を誘導する。
本発明の前記サイレンサーは、エンハンサーと同一のメカニズムを維持し、エンハンサーの拮抗作用をする。前記サイレンサーに結合する転写因子は、リプレッサー（ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ）である。前記エンハンサーと前記サイレンサーは、互いに近接した領域に存在するものであるか、同一の領域に転写因子が異なる領域であってもよい。

本発明の前記終結子（ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ）は、転写終結子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）ともいい、誘電体で遺伝子またはオペロンの転写の終結を媒介し、原核生物ではＲｈｏ－依存的終結子とＲｈｏ－非依存的終結子とがある。
本発明の前記トランス－作用因子は、トランス活性化因子乃至トランス作用転写因子ともいい、遺伝子の転写をトランスとして活性化する因子である。前記トランス－作用因子は、前記転写因子、アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）、ｓＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡ；ａｓＲＮＡ）からなる群より選択される少なくとも１つであってもよいが、これに限定されるものではない。

本発明において、前記転写因子は、前記転写因子結合部位と結合して特定の遺伝子をオンオフするのに役立つタンパク質である。
本発明において、前記アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）は、リボスイッチ（ｒｉｂｏｓｗｉｔｃｈ）の一部分で、特定の標的分子に結合可能なオリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）あるいはペプチド（Ｐｅｐｔｉｄｅ）物質を通称し、前記アプタマーは、ペプチドアプタマーまたは核酸アプタマーであってもよい。前記リボスイッチは、遺伝子の発現を調節するｍＲＮＡの一種で、ｇｌｍＳリボスイッチ、ＦＭＮリボスイッチ、Ｃｏｂａｌａｍｉｎリボスイッチなどがあってもよいが、これに限定されるものではない。

本発明において、前記ｓＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡ；ａｓＲＮＡ）は、特定のＲＮＡに相補的に結合可能な一本鎖ＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ）を意味する。特定のタンパク質を表現する伝令ＲＮＡ（ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ；ｍＲＮＡ）であるｓｅｎｓｅ ＲＮＡに相補的に結合して、結局、当該タンパク質発現を調節する。
本発明の前記第１プロモーターおよび第２プロモーターは、前記調節タンパク質によって誘導される誘導性プロモーターであってもよい。

本発明の前記「誘導性プロモーター」とは、特定の化学的または物理的条件下でのみ特異的に下流に連結された遺伝子が発現できるように転写するプロモーターであって、例えば、ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ－ｂｅｔａ－Ｄ－１－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）のようなガラクトースの存在下で発現するＬａｃＺ遺伝子のプロモーター、Ｌ－アラビノースの存在下でのみ発現するアラビノースオペロンａｒａＢＡＤプロモーター、テトラサイクリンによって発現が調節されるｔｅｔプロモーターであってもよく、好ましくは、前記第１プロモーターおよび第２プロモーターはｔｅｔプロモーターであってもよく、さらに好ましくは、前記第１プロモーターはｔｅｔＡプロモーター、前記第２プロモーターはｔｅｔＲプロモーターであってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明の前記調節タンパク質を暗号化する遺伝子は、第１プロモーターおよび第２プロモーターに結合してＲＮＡポリメラーゼが結合できないように調節するタンパク質であって、本発明の目的上、前記第１プロモーターおよび第２プロモーターがｔｅｔプロモーターの場合、前記ｔｅｔプロモーターの調節部位に結合されてｔｅｔプロモーターの活性を抑制できるＴｅｔＲタンパク質であってもよいが、これに限定されるものではない。

本発明の前記「作動可能に連結（Ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」とは、目的とする１つの核酸断片が他の核酸断片と機能的に連結されることにより、目的とする１つの核酸断片の機能または発現が他の核酸断片によって影響されることを意味する。
本発明の前記「レポータータンパク質」とは、視覚的に癌が診断できるようにする機能を行うタンパク質であって、例えば、蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）および核医学またはＭＲＩ映像撮影に使用されるタンパク質からなる群より選択される少なくとも１つであってもよいが、これに限定されるものではない。

本発明の前記「蛍光タンパク質」は、癌が視覚的に診断できるように自ら蛍光を呈するタンパク質であって、例えば、緑色蛍光タンパク質（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ；ＧＦＰ）、変形された緑色蛍光タンパク質（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ；ＭＧＦＰ）、増強された緑色蛍光タンパク質（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ；ＥＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（Ｒｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ；ＲＦＰ）、増強された赤色蛍光タンパク質（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｒｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ；ＥＲＦＰ）、青色蛍光タンパク質（Ｂｌｕｅ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ；ＢＦＰ）、増強された青色蛍光タンパク質（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｂｌｕｅ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ；ＥＢＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（Ｙｅｌｌｏｗ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ；ＹＦＰ）および増強された黄色蛍光タンパク質（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｙｅｌｌｏｗ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ；ＥＹＦＰ）からなる群より選択される少なくとも１つであってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明の前記核医学またはＭＲＩ映像撮影に使用されるタンパク質は、例えば、単純ヘルペスウイルスのチミジンリン酸酵素（Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｋｉｎｓｅａｓｅ）、ドーパミン受容体（Ｄｏｐａｍｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ソマトスタチン受容体（Ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ソジウム－ヨウ素受容体（Ｓｏｄｉｕｍ－ｉｏｄｉｄｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）、鉄受容体、トランスフェリン受容体（Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、フェリチン（Ｆｅｒｒｉｔｉｎ）および鉄輸送体（ｍａｇＡ）からなる群より選択される少なくとも１つであってもよいが、これに限定されるものではない。

本発明の前記「サイトカイン」とは、免疫細胞が分泌するタンパク質であって、本発明の前記サイトカインは、宿主免疫反応を調節して疾患に関連する細胞、例えば、癌細胞の死滅を誘導できる癌免疫療法に使用できるものであればすべて含まれ、好ましくは、ＩＦＮ－ａｌｐｈａ２、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１およびＩＬ－１２であってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明の前記「ケモカイン」とは、組織間の細胞移動と組織内の細胞の位置および相互作用を調節する役割を果たすものであって、白血球を腫瘍微細環境に誘導して疾患、例えば、癌に対する宿主反応を仲裁できるものであればすべて含まれ、好ましくは、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ５などであってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明の前記「免疫調節子」とは、個体が持っている固有の免疫体系を活用して多様な治療を可能にするものであって、免疫細胞を活性化させて疾患に関連する細胞、例えば、癌細胞の死滅を誘導できるものであればすべて含まれる。

本発明の前記「抗癌タンパク質」とは、癌細胞の死滅を直間接的に誘導できる機能を有するペプチドであって、例えば、毒素タンパク質、癌抗原に特異的な抗体または前記抗体の断片、腫瘍抑制タンパク質（Ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）、血管新生抑制剤、癌抗原、前駆薬物転換酵素（Ｐｒｏｄｒｕｇ－ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅｓ）、プロアポトーシスタンパク質（ｐｒｏ－ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）から構成された群より選択される少なくとも１つであってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明の前記「毒素タンパク質」とは、癌細胞の死滅を直間接的に誘導できる機能を有するタンパク質であって、例えば、リシン（Ｒｉｃｉｎ）、サポリン（Ｓａｐｏｒｉｎ）、ゲロニン（Ｇｅｌｏｎｉｎ）、モモルジン（Ｍｏｍｏｒｄｉｎ）、デボウガニン（Ｄｅｂｏｕｇａｎｉｎ）、ジフテリア毒素、シュードモナス毒素（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｔｏｘｉｎ）、ヘモリシン（ＨｌｙＡ）、ＦＡＳリガンド（ＦＡＳ ｌｉｇａｎｄ；ＦＡＳＬ）、腫瘍壊死因子－ａｌｐｈａ（Ｔｕｍｏｕｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ－ａｌｐｈａ；ＴＮＦ－ａｌｐｈａ）、ＴＮＦ－関連細胞死滅－誘発リガンド（ＴＮＦ－ｒｅｌａｔｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ－ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｌｉｇａｎｄ；ＴＲＡＩＬ）およびサイトリシンＡ（Ｃｙｔｏｌｙｓｉｎ Ａ、ＣｌｙＡ）からなる群より選択される少なくとも１つであってもよく、さらに好ましくは、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるサイトリシンＡであってもよいが、これに限定されるものではない。

本発明の前記「腫瘍抑制タンパク質」とは、正常細胞に存在しながら機能を維持するが、その機能が失われた場合には、正常細胞が無分別な細胞の分裂および成長が誘導されて癌細胞に転換されるようにする機能をする遺伝子であって、例えば、ＲＢ（Ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ ｐｒｏｔｅｉｎ）タンパク質、ｐ５３タンパク質、ＡＰＣ（Ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ ｃｏｌｉ）タンパク質、ＰＴＥＮ（Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ａｎｄ ｔｅｎｓｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ）タンパク質、ＣＤＫＮ２Ａ（ｃｙｃｌｉｎ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ２Ａ）タンパク質などであってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明の前記癌抗原に特異的な抗体または前記抗体の断片は、癌細胞の表面または細胞質に特異的に発現レベルが高いタンパク質である抗原に特異的に結合できる抗体であって、例えば、乳癌または胃癌細胞に特異的に発現レベルが高いＨＥＲ２などに特異的な抗体のようなものであってもよいが、これに限定されるものではない。

本発明の前記抗体は、タンパク質またはペプチド分子の抗原性部位に特異的に結合できるタンパク質分子を意味する。前記抗体の形態は特に限定されず、ポリクロナール抗体、モンクロナール抗体または抗原結合性を有するものであれば、抗体の一部の場合でも含まれ、すべての種類の免疫グロブリン抗体が含まれる。また、ヒト化抗体などの特殊抗体が含まれ、前記抗体は、２個の全長の軽鎖および２個の全長の重鎖を有する完全な形態だけでなく抗体分子の機能的な断片を含む。抗体分子の機能的な断片とは、少なくとも抗原結合機能を保有している断片を意味し、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖなどになってもよいが、これに限定されるものではない。

本発明の前記「抗体」とは、本発明の前記癌抗原を暗号化する遺伝子を通常の方法により発現ベクターにクローニングして前記遺伝子によって暗号化されるタンパク質を得た後に、通常の方法により製造できる。
本発明の前記「血管新生抑制剤」とは、癌細胞周辺で新しい血管が生成されることを抑制して癌細胞の死滅を直接または間接的に誘導できる機能を有するタンパク質または化合物を意味する。好ましくは、前記血管新生抑制剤は、アンギオスタチン（ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）、エンドスタチン（ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）、トロンボスポンジン（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ）、および蛋白分解酵素抑制タンパク質などであってもよいが、これに限定されるものではない。

本発明の前記「癌抗原」とは、癌細胞では発現するが、正常細胞ではほとんど発現しないタンパク質を抗原として、これにより、抗腫瘍免疫反応を誘導することによって癌細胞の直接または間接的死滅を誘導できるタンパク質を意味する。本発明の前記癌抗原は、好ましくは、アルファ－フェトプロテイン（ａｌｐｈａ－ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ；ＡＦＰ）、血管内皮成長因子受容体２（Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２；ＶＥＧＦＲ２）、サバイビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）、レグマイン（Ｌｅｇｕｍａｉｎ）、前立腺癌特異的抗原（Ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ；ＰＣＳＡ）などであってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明の前記「前駆薬物転換酵素」とは、不活性薬物を酵素反応による代謝により活性薬物に転換されるようにする機能を有するタンパク質であって、このような前駆薬物転換酵素を用いる場合、不活性薬物が代謝されて癌細胞の死滅を直接または間接的に誘導できる活性薬物に転換されるようにして、癌の予防または治療に非常に有用に使用可能である。本発明の前記前駆薬物転換酵素は、好ましくは、チミジンキナーゼ（Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ）、シトシンデアミナーゼ（ｃｙｔｏｓｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ）、ニトロレダクターゼ（ｎｉｔｒｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ｐｕｒｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ）、カルボキシペプチダーゼＧ２（ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅ Ｇ２）、クロメートレダクターゼＹｉｅＦ（ｃｈｒｏｍａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ＹｉｅＦ）、ヘルペスシンプレックスウイルスＩ型チミジンキナアーゼ／ガンシクロビル（ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ Ｉ ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ／ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ；ＨＳＶ１－ＴＫ／ＧＣＶ）、ｂｅｔａ－グルクロニダーゼ（ｂｅｔａ－ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ）などであってもよいが、これに限定されるものではない。

本発明の前記「プロアポトーシスタンパク質」とは、癌細胞が成長または維持されるのに必須の因子（タンパク質、営養分、オリゴヌクレオチドなど）を欠乏させることにより、癌細胞の直接または間接的な死滅を誘導するタンパク質を意味する。本発明の前記プロアポトーシスタンパク質は、好ましくは、Ｌ－アスナーゼ（Ｌ－ＡＳＮａｓｅ）、ＲＮＡ－結合モチーフタンパク質５（ＲＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｔｉｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ５；ＲＢＭ５）などであってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明の前記癌抗原に特異的なオリゴヌクレオチドは、癌抗原の遺伝子またはｍＲＮＡに相補的に結合することにより、癌抗原の発現またはその機能を抑制できるヌクレオチドであって、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）、ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡから構成された群より選択されるいずれか１つであってもよいが、これに限定されるものではない。

本発明の前記「アンチセンスオリゴヌクレオチド」とは、特定のｍＲＮＡの配列に相補的な核酸配列を含んでいるＤＮＡ、ＲＮＡまたはこれらの誘導体を意味するものであって、ｍＲＮＡ内の相補的な配列に結合してｍＲＮＡのタンパク質に翻訳を阻害することができる。前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、ＲＮＡポリメラーゼＩなどを用いる通常の方法を用いて試験管内で合成した後、生体内に投与したり、または、認識部位（ＭＣＳ）の起源が反対方向にあるベクターを使用する方法などにより生体内で合成できるようにする。
本発明の前記「アプタマー」とは、高い親和性でターゲット物質を特異的に認知できる小さな一本鎖オリゴ核酸を意味する。本発明の目的上、前記ターゲット物質は、癌抗原の遺伝子またはｍＲＮＡであってもよい。

本発明の前記「ｓｉＲＮＡ」とは、特定のｍＲＮＡの切断（ｃｌｅａｖａｇｅ）によりＲＮＡ干渉（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ；ＲＮＡｉ）現象を誘導できる短い二本鎖ＲＮＡを意味する。標的遺伝子のｍＲＮＡと相同の配列を有するセンスＲＮＡ鎖と、これと相補的な配列を有するアンチセンスＲＮＡ鎖とから構成され、本発明の目的上、前記ｓｉＲＮＡは、癌抗原を暗号化する遺伝子から転写されたｍＲＮＡに特異的に結合して、このような遺伝子の発現を効果的に抑制することができる。
本発明の前記「ｓｈＲＮＡ」とは、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）であって、ｓｉＲＮＡに比べて細胞形質感染率が高く、ＲＮＡ干渉が長期間維持できるというメリットが存在し、ＲＮＡ重合酵素ＩＩＩのプロモーターからアデノウイルス、レンチウイルスおよびプラスミド発現ベクターシステムなどを細胞内に形質転換した後、発現させる過程によりＲＮＡ干渉を誘導することができるが、これに限定されるものではない。本発明の目的上、前記ｓｈＲＮＡは、癌抗原を暗号化する遺伝子から転写されたｍＲＮＡに特異的に結合してこのような遺伝子の発現を効果的に抑制することができる。

本発明の他の実施形態では、本発明の前記ＤＮＡコンストラクトを含む組換えベクターを提供する。
本発明の前記組換えベクターは、本発明の前記ＤＮＡコンストラクトを含むことで、調節タンパク質が別のプロモーターによって発現することにより、調節タンパク質を抑制する物質が外部から投与される時にのみ特異的に第１プロモーターおよび第２プロモーターの下流に作動可能に連結された遺伝子がバランスよく発現できるようにする。

本発明の前記組換えベクターにおいて、前記ＤＮＡコンストラクト、抗癌タンパク質、サイトカイン、ケモカイン、免疫調節子、癌抗原に特異的なオリゴヌクレオチド、レポータータンパク質およびプロモーターなどに関する内容は、前記ＤＮＡコンストラクトに記載されたものと同一で、本明細書の過度の複雑性を避けるために省略する。
本発明の前記組換えベクターは、細胞内に導入されてタンパク質を発現させるための手段として、プラスミドベクター、コスミドベクター、バクテリオファージベクターなど公知の組換えベクターを使用することができ、前記組換えベクターは、ＤＮＡ組換え技術を用いた任意の公知の方法により当業者によって容易に製造できる。

本発明において、前記組換えベクターの具体例としては、商業的に広く使用されるｐＣＤＮＡベクター、Ｆ、Ｒ１、ＲＰ１、Ｃｏｌ、ｐＢＲ３２２、ＴｏＬ、Ｔｉベクター、コスミド、ラムダ、ラムダ状（ｌａｍｂｄｏｉｄ）、Ｍ１３、Ｍｕ、ｐ１ Ｐ２２、Ｑμ、Ｔ－ｅｖｅｎ、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ７などのファージ、植物ウイルスからなる群より選択できるが、これに限定されるものではない。本発明の目的上、宿主細胞の性質によって適した組換えベクターを選択することができる。
本発明のさらに他の実施形態では、本発明の前記ＤＮＡコンストラクトを含む組換えベクターが導入された宿主細胞；または菌株を提供する。

本発明の前記宿主細胞としては、哺乳動物、植物、昆虫、菌類または細胞性起源の細胞が含まれ、例えば、大腸菌、ストレプトマイセスまたはサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属菌株などのバクテリア細胞、酵母細胞、ピキアパストリスなどの菌類細胞；ドロソフィラ、スポドプテラＳｆ９細胞などの昆虫細胞、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞、Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ ｃｅｌｌｓ）、ＳＰ２／０（マウス骨髄腫）、ヒトリンパ芽球（Ｈｕｍａｎ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ）、ＣＯＳ、ＮＳＯ（マウス骨髄腫）、２９３Ｔ細胞、ボウズメラノーマ細胞、ＨＴ－１０８０細胞、ＢＨＫ細胞（ベビーハムスター腎臓細胞、Ｂａｂｙ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｋｉｄｎｅｙ ｃｅｌｌｓ）、ＨＥＫ細胞（ヒト胚腎臓細胞、Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｋｉｄｎｅｙ ｃｅｌｌｓ）またはＰＥＲＣ．６細胞（ヒト網膜細胞）のような動物細胞、および植物細胞から構成された群より選択される少なくとも１つであってもよいが、これに限定されるものではない。本発明の目的上、前記菌株は、嫌気性菌株、例えば、サルモネラ属菌株、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属菌株、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌株および大腸菌属菌株から構成された群より選択される少なくとも１つであってもよく、好ましくは、サルモネラティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、サルモネラコレラスイス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ）およびサルモネラエンテリティディス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）から構成された群より選択される少なくとも１つであってもよいし、さらに好ましくは、サルモネラティフィムリウムであってもよいが、これに限定されるものではない。

本発明の前記菌株は、弱毒化されたものであってもよい。
本発明の前記「弱毒化」は、微生物を患者に投与する場合、毒性および他の副作用などを減少させることができるように遺伝子などに変形を加えたことを意味する。本発明の目的上、前記菌株がサルモネラ属菌株の場合には、弱毒化のために、ａｒｏＡ、ａｒｏＣ、ａｒｏＤ、ａｒｏＥ、Ｒｐｕｒ、ｈｔｒＡ、ｏｍｐＲ、ｏｍｐＦ、ｏｍｐＣ、ｇａｌＥ、ｃｙａ、ｃｒｐ、ｃｙｐ、ｐｈｏＰ、ｐｈｏＱ、ｒｆａＹ、ｄｋｓＡ、ｈｕｐＡ、ｓｉｐＣ、ｃｌｐＢ、ｃｌｐＰ、ｃｌｐＸ、ｐａｂ、ｎａｄＡ、ｐｎｃＢ、ｐｍｉ、ｒｐｓＬ、ｈｅｍＡ、ｒｆｃ、ｐｏｘＡ、ｇａｌＵ、ｃｄｔ、ｐｕｒ、ｓｓａ、ｇｕａＡ、ｇｕａＢ、ｆｌｉＤ、ｆｌｇＫ、ｆｌｇＬ、ｒｅｌＡおよびｓｐｏＡから構成された群より選択される少なくとも１つの遺伝子に変形を加えたものであってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明の前記遺伝子に変形を加える方法は、当業界にて公知の多様な遺伝子の欠失または破壊する方法により行われ、例えば、前記欠失および破壊方法は、相同性組換え、化学的変異誘発、照射変異誘発またはトランスポゾン変異誘発などのような方法により行われる。

本発明において、前記菌株は、嫌気性菌株が増殖するのに極めて適した血管形成が不完全で酸素が欠乏した環境である癌組織の内部を標的するため、このような菌株内にリアルタイムにイメージング可能なレポータータンパク質と抗癌タンパク質が同時にバランスよく発現できる組換えベクターが導入されている場合、癌を非常に効果的に診断と同時に治療することができる。
本発明の前記菌株において、前記ＤＮＡコンストラクト、抗癌タンパク質、サイトカイン、ケモカイン、免疫調節子、癌抗原に特異的なオリゴヌクレオチド、レポータータンパク質、プロモーターおよび組換えベクターなどに関する内容は、前記ＤＮＡコンストラクトおよび組換えベクターに記載されたものと同一で、本明細書の過度の複雑性を避けるために省略する。

本発明の前記組換えベクターは、形質転換（または形質感染）により宿主細胞；または菌株内に導入されるが、本発明で使用される形質転換方法は、任意の形質転換方法が使用可能であり、当業界の通常の方法により容易に行われる。具体的には、通常使用可能な前記サルモネラ属菌株のようなバクテリアの形質転換方法、ＣａＣｌ_２沈殿法、ＣａＣｌ_２方法に還元物質のＤＭＳＯ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）を使用することにより、効率を高めたＨａｎａｈａｎ方法、電気穿孔法（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、リン酸カルシウム沈殿法、原形質融合法、シリコンカーバイド繊維を用いた撹拌法、アグロバクテリア媒介された形質転換法、ＰＥＧを用いた形質転換法、デキストランスルフェート、リポフェクタミンおよび乾燥／抑制媒介された形質転換方法などを用いて前記菌株に組換えベクターを導入することができるが、これに限定されるものではない。
本発明のさらに他の実施形態では、癌の予防または治療用薬学組成物を提供する。
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、本発明の前記菌株を有効成分として含む癌の予防または治療用薬学組成物を提供する。

本発明の前記薬学組成物は、癌の成長抑制または癌転移を抑制する。
本発明の前記菌株は、本発明による前記ＤＮＡコンストラクトが形質転換されて、個体内で癌を標的した後に、調節タンパク質を抑制する物質が投与される場合、このような菌株内にリアルタイムにイメージング可能なレポータータンパク質と抗癌タンパク質が同時にバランスよく発現するため、癌を非常に効果的に予防または治療することができ、これと同時にリアルタイムに癌を診断することができる。

本発明の前記「癌」は、変種細胞の迅速かつ制御されない成長を特徴とする疾病であって、黒色腫、卵管癌、脳癌、小腸癌、食道癌、リンパ腺癌、胆嚢癌、血液癌、甲状腺癌、内分泌腺癌、口腔癌、肝癌、胆道癌、大腸癌、直腸癌、子宮頸癌、卵巣癌、腎臓癌、胃癌、十二指腸癌、前立腺癌、乳癌、脳腫瘍、肺癌、甲状腺未分化癌、子宮癌、結腸癌、膀胱癌、尿管癌、膵臓癌、骨／軟部組織肉腫、皮膚癌、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、白血病、骨髄異形成症候群、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病および孤立性骨髄腫から構成される群より選択される少なくとも１つであってもよく、好ましくは、肝癌、胆道癌、大腸癌、直腸癌、子宮頸癌、卵巣癌、腎臓癌、胃癌、十二指腸癌、前立腺癌、乳癌、脳腫瘍、肺癌、甲状腺未分化癌、子宮癌、結腸癌、膀胱癌、尿管癌、膵臓癌、骨／軟部組織肉腫および皮膚癌から構成される群より選択される少なくとも１つであってもよく、さらに好ましくは、結腸癌であってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明の前記「予防」とは、本発明の前記有効成分を用いて癌によって発生した症状を遮断したり、その症状を抑制または遅延させる行為であれば制限なくすべて含まれる。

本発明の前記「治療」とは、本発明の前記有効成分を用いて癌によって発生した症状が好転したり、個体が有利になるすべての行為を意味し、臨床的結果を含む有用な結果または好ましい結果を得るための試みを意味する。有用なまたは好ましい臨床的結果は、検出可能であるか、可能でなくても、１つ以上の症状または状態の緩和または改善、疾病範囲の縮小、疾病状態の安定化、疾病発生の抑制、疾病拡散の抑制、疾病進行の遅延または引き延ばし、疾病発病の遅延または引き延ばし、疾病状態の改善または軽減、および減退（部分または全体）を含むことができ、必ずしもこれに限定されるものではない。また、「治療」は、治療の不在で予測されるもの以上に患者の生存が延長されることを意味することができる。さらに、「治療」は、疾病進行の抑制、一時的に疾病進行の引き延ばしを意味することができ、さらに好ましくは、疾病の進行を永遠に停止させることと関連がある。当業者によって理解されているように、特定の疾病状態を向上させる間に治療された患者において反対の結果、すなわち治療によって影響されるすべての利点より大きな結果をもたらす場合、結果は有益でなかったり、好ましくない。
本発明において、前記治療は、癌転移または癌再発を抑制するものであってもよい。

本発明において、前記「癌転移」は、癌が原発した器官や部分から距離上分離されている他の所に移る性質を意味する。転移性癌は、転移しようとする性質を有する癌または転移が行われた癌である。特に、前記転移性癌は、肝、肺、骨、リンパ節または腹腔に転移するものであってもよいが、これに限定されない。前記転移性癌は、治療が難しく、最初の治療過程より進行様相および治療が複雑でありうる。
本発明において、前記「癌再発」は、治療後癌を発見できなかったものの一定期間経過後に再度発見されることを意味する。再発性癌は、前記のように癌の再発が起きた結果生じた癌を意味する。癌が再発した場合、切除が難しい場合が多く、切除が可能な場合でも、相当規模の手術をするしかない。また、抗癌治療および放射線治療にも制限がありうる。
本発明の前記薬学組成物において、前記ＤＮＡコンストラクト、抗癌タンパク質、サイトカイン、ケモカイン、免疫調節子、癌抗原に特異的なオリゴヌクレオチド、レポータータンパク質、プロモーター組換えベクター、菌株および形質転換などに関する内容は、前記ＤＮＡコンストラクト、組換えベクターおよび菌株に記載したものと同一で、本明細書の過度の複雑性を避けるために省略する。

本発明の前記薬学組成物は、カプセル、錠剤、顆粒、注射剤、軟膏剤、粉末または飲料形態であることを特徴とし、前記薬学組成物は、ヒトを対象にすることを特徴とする。
本発明の前記薬学組成物はこれらに限定されるものではないが、それぞれ通常の方法により、散剤、顆粒剤、カプセル、錠剤、水性懸濁液などの経口型剤形、外用剤、坐剤および滅菌注射溶液の形態に剤形化されて使用可能である。本発明の薬学組成物は、薬学的に許容可能な担体を含むことができる。薬学的に許容される担体は、経口投与時には、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁化剤、色素、香料などが使用可能であり、注射剤の場合には、緩衝剤、保存剤、無痛化剤、可溶化剤、等張剤、安定化剤などが混合されて使用可能であり、局所投与用の場合には、基剤、賦形剤、潤滑剤、保存剤などが使用可能である。本発明の薬学組成物の剤形は、上述のような薬剤学的に許容される担体と混合して多様に製造できる。例えば、経口投与時には、錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル（ｅｌｉｘｉｒ）、サスペンション、シロップ、ウエハなどの形態に製造することができ、注射剤の場合には、単位投薬アンプルまたは複数回投薬形態に製造することができる。その他、溶液、懸濁液、錠剤、カプセル、徐放型製剤などに剤形化することができる。

一方、製剤化に適した担体、賦形剤および希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アカシアガム、アルギネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウムステアレートまたは鉱物油などが使用できる。また、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤、防腐剤などを追加的に含むことができる。
本発明の前記薬学組成物の投与経路はこれらに限定されるものではないが、口腔、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、硬膜内、心臓内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸管、局所、舌下または直腸が含まれる。経口または非経口投下が好ましい。

本発明の前記「非経口」とは、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、滑液嚢内、胸骨内、硬膜内、病巣内および頭蓋骨内注射または注入技術を含む。本発明の薬学組成物はさらに、直腸投与のための坐剤の形態で投与できる。
本発明の前記薬学組成物は、使用された特定化合物の活性、年齢、体重、一般的な健康、性別、食事、投与時間、投与経路、排出率、薬物配合および予防または治療される特定疾患の重症度を含む様々な要因によって多様に変化可能であり、前記薬学組成物の投与量は、患者の状態、体重、疾病の程度、薬物形態、投与経路および期間によって異なるが、当業者によって適宜選択可能であり、１日０．０００１～５０ｍｇ／ｋｇまたは０．００１～５０ｍｇ／ｋｇで投与することができる。投与は、１日に１回投与してもよく、数回分けて投与してもよい。前記投与量は、いかなる面でも本発明の範囲を限定するものではない。本発明による医薬組成物は、丸剤、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁剤に剤形化される。

本発明のさらに他の実施形態では、癌の診断用組成物を提供する。
本発明の前記診断用組成物は、本発明による前記菌株を有効成分として含む。
本発明の前記菌株は、本発明による前記ＤＮＡコンストラクトが形質転換されて、個体内で癌細胞を標的した後に、調節タンパク質を抑制する物質が投与される場合、このような菌株内にリアルタイムにイメージング可能なレポータータンパク質と抗癌タンパク質が同時にバランスよく発現するため、癌を非常に効果的に予防または治療することができ、これと同時にリアルタイムに癌を診断することができる。

本発明の前記「診断」とは、本発明の前記菌株が癌を標的して位置する時、前記菌株に導入されたＤＮＡコンストラクトから発現したレポータータンパク質によってリアルタイムに癌の存在の有無をモニタリングできることを含む生体内癌組織を確認するすべての行為を意味する。
本発明の前記診断用組成物において、前記ＤＮＡコンストラクト、抗癌タンパク質、レポータータンパク質、恒常的プロモーター、誘導性プロモーター、組換えベクター、サルモネラ属菌株、形質転換、癌などに関する内容は、前記ＤＮＡコンストラクト、組換えベクター、菌株および薬学組成物に記載したものと同一で、本明細書の過度の複雑性を避けるために省略する。

本発明のさらに他の実施形態では、癌の診断のための情報を提供する方法を提供する。
本発明の前記方法は、目的とする個体から分離された生物学的試料に本発明による前記組換えベクターが導入された菌株を処理する段階を含む。
本発明の前記癌の診断のための情報を提供する方法は、前記菌株からレポータータンパク質が発現した場合、癌と診断する段階をさらに含むことができる。

本発明の前記「生物学的試料」とは、個体から得られるか、個体に由来する任意の物質、組織または細胞を意味するもので、例えば、組織、細胞（ｃｅｌｌ）、または細胞抽出物（ｃｅｌｌ ｅｘｔｒａｃｔ）を含むことができるが、これに限定されるものではない。
本発明の前記診断のための情報提供方法において、前記ＤＮＡコンストラクト、抗癌タンパク質、サイトカイン、ケモカイン、免疫調節子、癌抗原に特異的なオリゴヌクレオチド、レポータータンパク質、プロモーター、組換えベクター、菌株、形質転換、癌、診断などに関する内容は、前記ＤＮＡコンストラクト、組換えベクター、菌株、薬学組成物および診断用組成物に記載したものと同一で、本明細書の過度の複雑性を避けるために省略する。

本発明において、フラジェリンは、フラジェリンＡまたはＢである、ＤＮＡコンストラクトを含むことができるが、これに限定されるものではない。
本発明の癌を予防または治療するのに使用される組換えベクターまたはフラジェリンおよび毒素タンパク質である組換えベクターが導入された菌株を含む。

本発明の前記組換えベクターまたはフラジェリンおよび毒素タンパク質である組換えベクターが導入された菌株の有効量を目的とする被検体に投与して癌を予防または治療する方法を含む。
本発明のさらに他の実施形態では、外来フラジェリンを発現する菌株と外来毒素タンパク質を発現する菌株の有効量を被検体に併用投与して癌を予防または治療する方法を提供する。
本発明の前記「フラジェリン（ｆｌａｇｅｌｌｉｎ）」とは、これに限定しないが、細菌の鞭毛の螺旋状繊維を構成する粒状タンパク質で、分子量は菌種によって大きく異なるが（３０，０００～７０，０００）、アミノ酸組成においてシステインとトリプトファンは現れず、サルモネラ菌の場合、約半分のリシンがメチル化されている。その類型としてフラジェリンＡとＢなどがあり、機能は多様であるが、免疫増強効果があることが知られている。

本発明において、「併用投与」することは、癌治療のために多様な方法（手術、放射線治療、化学療法、免疫療法など）を共に使用するか、段階的に使用する方法で、これに限定しないが、２種以上の抗癌剤または異なる機序を有する薬物を投与するか、放射線治療のような物理的療法と抗癌剤のような化学療法を同時に使用する。２つの薬物を使用する場合、相互補完的な機序または薬物の用量調節に基づいてシナジー効果を示す。ただし、実際の臨床ではシナジー効果が著しく減少した結果を示すが、それによる免疫抑制作用や心臓毒性などのような深刻な副作用の危険ももたらされる。
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、フラジェリンまたはこれを暗号化するヌクレオチド；および毒素タンパク質またはこれを暗号化するヌクレオチドを有効成分として含む癌の予防または治療用組成物を提供する。

本発明で用いられるフラジェリンまたは毒素タンパク質の遺伝子についてはすでに詳述したので、過度の重複を避けるためにその記載を省略する。
本発明の遺伝子は、遺伝子伝達体に伝達されてもよいが、翻訳が完了したペプチドの形態で投与されて類似の薬理効果を発揮することもできる。

本発明によるＤＮＡコンストラクは、宿主菌株または細胞内で第１プロモーターと第２プロモーターの下流に作動可能に連結された抗癌遺伝子の発現レベルを調節できるようにして、癌の予防および治療を行うことができる。
また、本発明の前記ＤＮＡコンストラクは、ドキシサイクリンの処理の有無を調節することにより、適切な癌治療のための用量で抗癌タンパク質が発現できるようにする。

本発明の準備例１によるＤＮＡコンストラクトの模式図を示す図である。 本発明の実験例１によるＤＮＡコンストラクトが組換えられた菌株の成長パターンを分析した結果を示す図である。 本発明の実験例１による菌株の血液寒天の溶血活性結果を示す図である。 本発明の実験例１によるＴＬＲ－５シグナル活性化を測定した結果を示す図である。 本発明の実験例１によるドキシサイクリン濃度による組換え菌株の発現量の差を確認した図である。 本発明の実験例２による組換え菌株の抗癌効果を確認した結果を示す図である。 本発明の実験例３による組換え菌株の癌ターゲッティング効果を確認した結果を示す図である。 本発明の実験例３による組換え菌株の癌ターゲッティング効果を確認した結果を示す図である。 本発明の実験例４による組換え菌株の抗癌効果を確認した結果を示す図である。 本発明の実験例４による組換え菌株の抗癌効果を確認した結果を示す図である。 本発明の実験例による組換え菌株の抗癌効果を確認するための実験方法を示す図である。 本発明の実験例５による組換え菌株の抗癌効果を確認した結果を示す図である。 本発明の実験例５による組換え菌株の抗癌効果を確認した結果を示す図である。 本発明の実験例６による組換え菌株の抗癌効果を確認した結果を示す図である。 本発明の実験例６による組換え菌株の抗癌効果を確認した結果を示す図である。 本発明の実験例７による組換え菌株の癌再発抑制効果を確認した結果を示す図である。 本発明の実験例７による組換え菌株の癌再発抑制効果を確認した結果を示す図である。 本発明の実験例８による組換え菌株の癌転移抑制効果を確認した結果を示す図である。 本発明の実験例８による組換え菌株の癌転移抑制効果を確認した結果を示す図である。 本発明の実験例９による組換え菌株の抗癌効果を確認した結果を示す図である。 本発明の実験例９による組換え菌株の抗癌効果を確認した結果を示す図である。 本発明の実験例９による組換え菌株の抗癌効果を確認した結果を示す図である。

以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されないことは当業界における通常の知識を有する者にとって自明であろう。

［準備例１］●ドキシサイクリン（Ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ）によって調節可能なＤＮＡコンストラクトの作製
ｐＪＬ３９プラスミド（Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．，２１（１１），ｐ．１９８５－１９９５，（２０１３））を鋳型鎖として、図１のＡのように制限酵素ＥｃｏＲＩ部位を含むように作製された正方向プライマー（５’－ＣＧＧＡＡＴＴＣＡＣＣＡＴＧＴＣＴＡＧＡＴＴＡＧＡＴＡＡＡＡＧＴＡＡＡＧＴＧＡＴＴＡＡＣＡＧ－３’；配列番号２）および制限酵素ＰｖｕＩＩ－ＸｂａＩ部位を含むように作製された逆方向プライマー（５’－ＧＣＴＣＴＡＧＡＣＡＧＣＴＧＴＴＡＡＧＡＣＣＣＡＣＴＴＴＣＡＣＡＴＴＴＡＡＧＴＴＧＴＴＴＴＴＣＴ－３’；配列番号３）を用いてｔｅｔＲ遺伝子を増幅した。以後、前記増幅産物に制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩを入れて切断し、これを精製して、ｔｅｔＲ遺伝子増幅産物を得た後に、これをｐＢＡＤ２４（カタログ番号．ＡＴＣＣ（登録商標） ８７３９９^ＴＭ、ＡＴＣＣ、米国）プラスミドに導入する過程によりｐＢＡＤ－ＴｅｔＲプラスミドを作製した。

その後、前記ｐＪＬ３９プラスミドのＰｖｕＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ断片により、多重クローニングサイトを含むダイバージェント（Ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ）プロモーター領域を前記ｐＢＡＤ－ＴｅｔＲプラスミドに導入してｐＴｅｔＲ－ＢＡＤプラスミドを作製した。ＮｈｅＩおよびＰｃｉｌ制限酵素を用いて前記ｐＴｅｔＲ－ＢＡＤプラスミドからａｒａＣおよびａｒａＢＡＤプロモーターを除去して、ｐＴｅｔＩＩプラスミドを作製した。
ｐＳＦ－ＯＸＢ１（Ｏｘｆｏｒｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｅｎｇｌａｎｄ）を鋳型として、正方向プライマー（５’－ＣＴＡＣＴＣＣＧＴＣＡＡＧＣＣＧＴＣＡＡＧＣＴＧＴＴＧＴＧＡＣＣＧＣＴＴＧＣＴ－３’；配列番号４）および逆方向プライマー（５’－ＴＧＡＡＴＴＣＣＴＣＣＴＧＣＴＡＧＣＴＡＧＴＴＧＧＴＡＡＣＧＡＡＴＣＡＧＡＣＧＣＣＧＧＧＴＡＡＴＡＣＣＧＧＡＴＡＧ－３’；配列番号５）で増幅された恒常的プロモーターであるＯＸＢ１（配列番号１６）をギブソンアセンブリ方式を用いて前記ｐＴｅｔＩＩプラスミドに導入することにより、最終的にＯＸＢ１、ｔｅｔＡおよびｔｅｔＲプロモーターを含むｐＪＨ１８プラスミドを作製した。

［準備例２］●癌細胞株および培養条件
ＣＴ２６結腸癌細胞株であるＣＲＬ－２６３８およびＨＢ－８０６４（ＡＴＣＣ、米国）とマウスの大腸腺癌腫細胞株であるＭＣ３８（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ａｎｄ Ｈａｒｖａｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ、米国、および全南（チョンナム）大学、韓国）を実験に使用した。
１０％ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ；ＦＢＳ）および１％のペニシリン－ストレプトマイシンが含まれた高ブドウ糖ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅｓ Ｍｅｄｉｕｍ）培地（カタログ番号：＃ＬＭ００１－０５、ウェルジーン、韓国）を用いて、５％ＣＯ_２培養器で３７℃の条件で前記細胞を培養した。

［準備例３］●プラスミドが導入されたサルモネラ菌株の作製
サルモネラ菌株はｐｐＧｐｐが欠乏しているサルモネラティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ；Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）であるＳＨＪ２０３７（ｒｅｌＡ：：ｃａｔ、ｓｐｏＴ：：ｋａｎ）を使用した。
サルモネラ菌株に前記準備例１で作製したプラスミドを電気穿孔法（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて形質転換した後、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン（Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）が含まれたＬＢ培地を用いて前記形質転換されたそれぞれの菌株を一晩培養した。その後、前記培養液をアンピシリンが含まれた新しいＬＢ培地を用いて１：１００の割合で希釈し、追加培養によりＯＤ_６００値が０．５～０．７に到達した時、前記培養液に最終濃度が０、１０、５０、１００、３００、５００ｎｇ／ｍｌとなるようにエタノールで希釈されたドキシサイクリンを添加し、２００ｒｐｍおよび３７℃の条件で振盪培養器で培養した。

［準備例４］●実験動物モデルの用意
２０～３０ｇの重量に相当する５～６週齢のＣ５７ＢＬ／６およびＢＡＬＢ／Ｃマウス（オリエントカンパニー、韓国）を使用した。前記準備例２のＭＣ３８またはＣＴ２６を前記マウスの脇腹に皮下注射して、腫瘍動物モデルを構築した。
前記腫瘍動物モデルの映像化および腫瘍サイズの評価のために、痲酔のためには２％イソフルラン（Ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ）を使用して、手術時には２００ｍｇ／ｋｇのケタミン（Ｋｅｔａｍｉｎｅ）および１０ｍｇ／ｋｇのキシラジン（Ｘｙｌａｓｉｎｅ）を使用した。
前記腫瘍サイズ（ｍｍ^３）の評価は（長さ×高さ×幅）／２を用いて計算できるようにし、動物モデルの腫瘍サイズが１５００ｍｍ^３以上の場合には、動物モデルを安楽死させた。

［準備例４］●実験動物モデルの用意
２０～３０ｇの重量に相当する５～６週齢のＣ５７ＢＬ／６およびＢＡＬＢ／Ｃマウス（オリエントカンパニー、韓国）を使用した。前記準備例２のＭＣ３８またはＣＴ２６を前記マウスの脇腹に皮下注射して、腫瘍動物モデルを構築した。
前記腫瘍動物モデルの映像化および腫瘍サイズの評価のために、痲酔のためには２％イソフルラン（Ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ）を使用し、手術時には２００ｍｇ／ｋｇのケタミン（Ｋｅｔａｍｉｎｅ）および１０ｍｇ／ｋｇのキシラジン（Ｘｙｌａｓｉｎｅ）を使用した。
前記腫瘍サイズ（ｍｍ^３）の評価は（長さ×高さ×幅）／２を用いて計算できるようにし、動物モデルの腫瘍サイズが１５００ｍｍ^３以上の場合には、動物モデルを安楽死させた。

［実験例１］組換え菌株のタンパク質発現および活性評価
［１－１］組換え菌株と既存の菌株の成長の比較
前記準備例３で作製された組換え菌株であるＳＬｐＣＲ、ＳＬｐＦＲおよびＳＬｐＦＣと、対照群として使用されたＳＬｐＥｍｐｔｙをアンピシリンが含まれたＬＢ液体培地に一晩成長させた後、新しいＬＢ培地を用いて１：１００の割合で希釈し、追加培養によりＯＤ_６００値が０．５～０．７に到達した時、前記培養液に最終濃度が２００ｎｇ／ｍｌとなるようにエタノールで希釈されたドキシサイクリンを添加し、２００ｒｐｍおよび３７℃の条件で振盪培養器で培養した。培養時間によってＯＤ_６００値を測定して菌株の成長パターンを分析して、その結果を図２に示した。
図２に示すように、ＳＬｐＣＲ、ＳＬｐＦＲおよびＳＬｐＦＣ組換え菌株は、対照群であるＳＬｐＥｍｐｔｙ菌株と成長速度の差がほとんどなく、ドキシサイクリンを用いたタンパク質発現中にも特別な成長阻害を持っていなかった。したがって、前記のように作製された菌株の病原性遺伝子の欠如が菌株の成長および遺伝子発現に影響を及ぼさないことを確認した。

［１－２］組換え菌株の選択的溶血活性の確認
前記準備例３で培養された組換え菌株に対して、ＰＢＳ希釈させた後、０または２０ｎｇ／ｍｌのドキシサイクリンが含まれた血液寒天プレートに塗抹し、３７℃で一晩培養した後、プレート写真を撮影して、その結果を図３に示した。
図３に示すように、菌株の血液寒天の溶血活性はサイトリシンＡを暗号化する遺伝子のドキシサイクリンが含まれた場合（＋）でのみ現れることを確認した。

［１－３］組換え菌株のＦｌａＢによるＴＬＲ－５シグナル活性化の確認
組換え菌株のＦｌａＢ発現確認のために、ＦｌａＢによって発生するＴＬＲ－５シグナル活性化を確認した。まず、対照群としてＦｌａＢ４０ｎｇおよびＳＬｐＥｍｐｔｙ菌株に対してＴＬＲ－５シグナル活性化を測定し、前記準備例３で製造されたＳＬｐＦＣ組換え菌株をドキシサイクリンがない場合（－）と、投与した場合（＋）とに分けて培養した後、ＴＬＲ－５シグナル活性化を測定して図４に示した。
図４のように、前記ＳＬｐＦＣ組換え菌株は、対照群に比べてＴＬＲ－５シグナルが活性化されたことを確認し、特に、ドキシサイクリンを投与した状態で培養した組換え菌株（＋）は、ＴＬＲ－５シグナル活性化程度が著しく高いことを確認したことから、ドキシサイクリンを投与する場合に、組換え菌株のＦｌａＢ発現量が著しいことを確認した。

［１－４］ドキシサイクリン濃度によるＦｌａＢおよびＣｌｙＡ発現レベルの確認
ドキシサイクリン濃度による組換え菌株のＦｌａＢおよびＣｌｙＡ発現レベルの確認のために、ウェスタンブロット分析を行った。ＳＬｐＪＨ１８－ＦＣ組換え菌株を培養する培地にドキシサイクリン０、１０、１００、２００、３００、５００ｎｇ／ｍｌをそれぞれ投与して、中間ログファージである継代培養後２時間まで組換え菌株が分泌したＣｌｙＡ（３４ＫＤａ）およびＦｌａＢ（４３ＫＤａ）をウェスタンブロッティングを行って図５に示した。
図５のように、ドキシサイクリンを投与した濃度が０、１０、１００、２００、３００、５００ｎｇ／ｍｌに増加するにつれ、ＣｌｙＡ（３４ＫＤａ）およびＦｌａＢ（４３ＫＤａ）の発現量が増加したことを確認したことから、ドキシサイクリンの濃度を調節して前記組換え菌株のＣｌｙＡおよびＦｌａＢ発現量を調節できることを確認し、その発現および活性比率が比較的バランスをなし得ることが分かる。

［実験例２］組換え菌株の抗癌効果の確認（１）
組換え菌株の抗癌効果を確認するために、ＣＴ２６細胞株に対する細胞毒性実験をｉｎ ｖｉｔｒｏで進行させた。準備例３で作製されたＳＬｐＣＲ、ＳＬｐＦＲおよびＳＬｐＦＣ菌株と、対照群として使用されたＳＬｐＥｍｐｔｙ菌株をＣＴ２６に処理した後、損傷したＣＴ２６から放出された壊死細胞死滅（ＬＤＨ）の細胞質酵素を分析して図６に示した。
図６に示されているように、ＣｌｙＡおよびＦｌａＢを発現するＳＬｐＦＣ組換え菌株の細胞毒性効果が他の組換え菌株および対照群に比べて著しいことから、ＳＬｐＦＣ組換え菌株の抗癌効果が著しいことを確認することができた。

［実験例３］組換え菌株の癌ターゲッティング効果の確認
組換え菌株の癌ターゲッティング効果を確認するために、ｉｎ ｖｉｖｏ実験を実施して、腫瘍内の組換え菌株数、およびターゲッティングイメージを確認した。準備例４のＣＴ２６マウスモデルに弱毒化されたＳＬｐＪＨ１８－ＦＣおよびＳＬｐＪＨ１８－ＦＲ組換え菌株を１×１０^７ＣＦＵで静脈投与し、ドキシサイクリンを毎日３ｄｐｉ経口投与し、対照群にはドキシサイクリンを投与しない実験を実施して、その結果、腫瘍内のＳＬｐＪＨ１８－ＦＣ菌株数を測定して図７に示し、腫瘍内のＳＬｐＪＨ１８－ＦＲ菌株が発現させる蛍光イメージを確認して図８に示した。
図７および図８に示されているように、ドキシサイクリンの投与に関係なく腫瘍内に組換え菌株が１×１０^８ＣＦＵ以上存在し、腫瘍に特異的に存在することを確認して、前記組換え菌株が癌細胞に特異的にターゲッティングすることを確認することができた。

［実験例４］組換え菌株の抗癌効果の確認（２）
組換え菌株の抗癌効果を確認するために、ｉｎ ｖｉｖｏ実験を実施して、腫瘍内のＳＬｐＪＨ１８－ＦＣ組換え菌株のＦｌａＢ発現量およびＣｌｙＡ発現量を確認した。準備例４のＣＴ２６マウスモデルに弱毒化されたＳＬｐＪＨ１８－ＦＣ組換え菌株を１×１０^７ＣＦＵで静脈投与し、ドキシサイクリンを毎日３ｄｐｉ経口投与し、対照群にはドキシサイクリンを投与しない実験を実施して、腫瘍内のＦｌａＢ発現量を図９に示し、腫瘍内のＣｌｙＡ発現量を図１０に示した。
図９および１０に示されるように、ドキシサイクリンを投与する場合、ＦｌａＢおよびＣｌｙＡ発現量が著しく上昇することを確認したことから、前記ＳＬｐＪＨ１８－ＦＣ組換え菌株を投与した後、ドキシサイクリンの投与量を調節する場合、ＦｌａＢおよびＣｌｙＡ発現量を調節できることを確認することができた。

［実験例５］組換え菌株の抗癌効果の確認（３）
組換え菌株の抗癌効果を確認するために、図１１のような方法でｉｎ ｖｉｖｏ実験を実施して、腫瘍内のＳＬｐＪＨ１８－ＦＣ組換え菌株のＣＴ２６細胞株に対する成長抑制効果を確認した。準備例４のＣＴ２６マウスモデルに弱毒化されたＳＬｐＪＨ１８－ＦＣ組換え菌株を１×１０^７ＣＦＵで静脈投与し、ドキシサイクリンを毎日１．７ｍｇ／ｋｇ経口投与し、対照群にはドキシサイクリンを投与しない実験を実施して、腫瘍サイズを図１２に示し、マウスの生存率を図１３に示した。
図１２および１３に示されているように、ＳＬｐＪＨ１８－ＦＣ組換え菌株を投与した場合、対照群に比べて腫瘍抑制能力およびマウスの生存率が著しく上昇したことを確認したことから、ＳＬｐＪＨ１８－ＦＣ組換え菌株の抗癌効果を確認することができた。

［実験例６］組換え菌株の抗癌効果の確認（４）
組換え菌株の抗癌効果を確認するために、図１１のような方法でｉｎ ｖｉｖｏ実験を実施して、腫瘍内のＳＬｐＪＨ１８－ＦＣ組換え菌株のＭＣ３８細胞株に対する成長抑制効果を確認した。準備例４のＣＴ２６マウスモデルに弱毒化されたＳＬｐＪＨ１８－ＦＣ組換え菌株を１×１０^７ＣＦＵで静脈投与し、ドキシサイクリンを毎日１．７ｍｇ／ｋｇ経口投与し、対照群にはドキシサイクリンを投与しない実験を実施して、腫瘍サイズを図１４に示し、マウスの生存率を図１５に示した。
図１４および図１５に示されているように、ＳＬｐＪＨ１８－ＦＣ組換え菌株を投与した場合、対照群に比べて腫瘍抑制能力およびマウスの生存率が著しく上昇したことを確認したことから、ＳＬｐＪＨ１８－ＦＣ組換え菌株の抗癌効果を確認することができた。

［実験例７］組換え菌株の癌再発抑制効果の確認
組換え菌株の癌再発抑制効果を確認するために、図１１のような方法でｉｎ ｖｉｖｏ実験を実施して、腫瘍内のＳＬｐＪＨ１８－ＦＣ組換え菌株のＣＴ２６細胞株に対する成長抑制効果を確認した。準備例４のＣＴ２６マウスモデルに弱毒化されたＳＬｐＪＨ１８－ＦＣ組換え菌株を１×１０^７ＣＦＵで静脈投与し、ドキシサイクリンを毎日１．７ｍｇ／ｋｇ経口投与して癌を完全に治療させた後、９０日後にＣＴ２６細胞を再投与して再投与した腫瘍サイズを図１６に示し、マウスの生存率を図１７に示した。
図１６および１７に示されているように、ＳＬｐＪＨ１８－ＦＣ組換え菌株を投与した場合、対照群に比べて再投与した腫瘍成長抑制効果が著しく、マウスの生存率が著しく上昇したことを確認したことから、ＳＬｐＪＨ１８－ＦＣ組換え菌株の癌再発抑制効果を確認することができた。

［実験例８］組換え菌株の癌転移抑制効果の確認
組換え菌株の癌転移抑制効果を確認するために、ｉｎ ｖｉｖｏ実験を実施して、腫瘍内のＳＬｐＪＨ１８－ＦＣ組換え菌株の４Ｔ１－Ｌｕｃ細胞株に対する成長抑制効果を確認した。Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅを発現する４Ｔ１－Ｌｕｃ細胞株を用意して、前記４Ｔ１－Ｌｕｃ細胞株を注入したマウスモデルを用意した。以後、弱毒化されたＳＬｐＪＨ１８－ＦＣ組換え菌株を１×１０^７ＣＦＵで静脈投与し、ドキシサイクリンを毎日１．７ｍｇ／ｋｇ経口投与した後、前記腫瘍の位置を撮影して図１８に示し、肺を摘出して肺に転移した前記腫瘍の個数を測定して図１９に示した。
図１８および図１９に示されているように、ＳＬｐＪＨ１８－ＦＣ組換え菌株を投与した場合、対照群に比べて腫瘍が肺に転移していないことを確認可能で、ＳＬｐＪＨ１８－ＦＣ組換え菌株の腫瘍転移抑制効果が著しいことを確認することができた。

［実験例９］組換え菌株の抗癌効果の確認（５）
組換え菌株の抗癌効果を確認するために、ｉｎ ｖｉｖｏ実験を実施して、腫瘍内のＳＬｐＪＨ１８－ＦＣ組換え菌株のＣＴ２６細胞株に対するＡｂｓｃｏｐａｌ Ｅｆｆｅｃｔ効果を確認した。両太ももにＣＴ２６を注入したマウスモデルを用意して、弱毒化されたＳＬｐＪＨ１８－ＦＣ組換え菌株を片側にのみ処理した後、ドキシサイクリンを毎日経口投与した場合、両腫瘍のサイズを測定して図２０に示し、腫瘍イメージを撮影して図２１に示し、マウスＴ細胞のＫｉ６７レベルを測定して図２２に示した。
図２０および図２１に示されているように、片側の腫瘍にのみＳＬｐＪＨ１８－ＦＣ組換え菌株を投与した場合にも、残りの腫瘍に対する抑制効果があることが分かった。また、図２２に示されているように、ＳＬｐＪＨ１８－ＦＣ組換え菌株を処理した場合、Ｋｉ６７レベルが高くなって兔疫細胞が活性化されることが分かり、ＳＬｐＪＨ１８－ＦＣ組換え菌株の抗癌効果が著しいことを確認することができた。

前記結果を通して、本発明のプロモーターが含まれたプラスミドの場合、そのプロモーターの下流に存在する調節タンパク質の発現を調節可能で、窮極的にｔｅｔＡおよびｔｅｔＲプロモーターの下流に存在する抗癌遺伝子の発現レベルを調節できることが分かる。
以上、本発明の特定の部分を詳細に記述したが、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的な記述は単に好ましい実施形態に過ぎず、これによって本発明の範囲が制限されるわけではないことは明らかである。したがって、本発明の実質的な範囲は添付した請求項とその等価物によって定義される。

前記結果を通して、本発明のプロモーターが含まれたプラスミドの場合、そのプロモーターの下流に存在する調節タンパク質の発現を調節可能で、窮極的にｔｅｔＡおよびｔｅｔＲプロモーターの下流に存在する抗癌遺伝子の発現レベルを調節できることが分かる。
以上、本発明の特定の部分を詳細に記述したが、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的な記述は単に好ましい実施形態に過ぎず、これによって本発明の範囲が制限されるわけではないことは明らかである。したがって、本発明の実質的な範囲は添付した請求項とその等価物によって定義される。

Claims (18)

1. 第１タンパク質および第２タンパク質を暗号化する遺伝子；および
   これに対応する第１プロモーターおよび第２プロモーターを含み、
   第１タンパク質は、フラジェリンであり、第２タンパク質は、毒素タンパク質であるＤＮＡコンストラクト。
2. フラジェリンは、フラジェリンＡまたはＢである、請求項１に記載のＤＮＡコンストラクト。
3. 前記毒素タンパク質は、リシン（Ｒｉｃｉｎ）、サポリン（Ｓａｐｏｒｉｎ）、ゲロニン（Ｇｅｌｏｎｉｎ）、モモルジン（Ｍｏｍｏｒｄｉｎ）、デボウガニン（Ｄｅｂｏｕｇａｎｉｎ）、ジフテリア毒素、シュードモナス毒素（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｔｏｘｉｎ）、ヘモリシン（ＨｌｙＡ）、ＦＡＳリガンド（ＦＡＳ ｌｉｇａｎｄ；ＦＡＳＬ）、腫瘍壊死因子－ａｌｐｈａ（Ｔｕｍｏｕｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ－ａｌｐｈａ；ＴＮＦ－ａｌｐｈａ）、ＴＮＦ－関連細胞死滅－誘発リガンド（ＴＮＦ－ｒｅｌａｔｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ－ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｌｉｇａｎｄ；ＴＲＡＩＬ）およびサイトリシンＡ（Ｃｙｔｏｌｙｓｉｎ Ａ、ＣｌｙＡ）からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項１に記載のＤＮＡコンストラクト。
4. 調節タンパク質を暗号化する遺伝子を追加的に含む、請求項１に記載のＤＮＡコンストラクト。
5. 前記第１プロモーターは、ｔｅｔＡプロモーターであり、前記第２プロモーターは、ｔｅｔＲプロモーターである、請求項１に記載のＤＮＡコンストラクト。
6. 前記調節タンパク質は、ＴｅｔＲタンパク質である、請求項４に記載のＤＮＡコンストラクト。
7. 請求項１～６のいずれか１項に記載のＤＮＡコンストラクトを含む組換えベクター。
8. 請求項７に記載の組換えベクターが導入された菌株。
9. 前記菌株は、サルモネラ属菌株、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属菌株、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌株および大腸菌属菌株からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項８に記載の菌株。
10. 請求項８に記載の菌株を有効成分として含む癌の予防または治療用薬学組成物。
11. 前記癌は、黒色腫、卵管癌、脳癌、小腸癌、食道癌、リンパ腺癌、胆嚢癌、血液癌、甲状腺癌、内分泌腺癌、口腔癌、肝癌、胆道癌、大腸癌、直腸癌、子宮頸癌、卵巣癌、腎臓癌、胃癌、十二指腸癌、前立腺癌、乳癌、脳腫瘍、肺癌、甲状腺未分化癌、子宮癌、結腸癌、膀胱癌、尿管癌、膵臓癌、骨／軟部組織肉腫、皮膚癌、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、白血病、骨髄異形成症候群、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病および孤立性骨髄腫から構成される群より選択される少なくとも１つである、請求項１０に記載の薬学組成物。
12. 前記癌は、癌の成長抑制または癌転移を抑制する、請求項１０に記載の薬学組成物。
13. 第１タンパク質およびこれに対応する第１プロモーターを含むＤＮＡコンストラクト；および
    第２タンパク質を暗号化する遺伝子およびこれに対応する第２プロモーターを含むＤＮＡコンストラクトを個別的に含む組換えベクターを含み、
    第１タンパク質は、フラジェリンであり、第２タンパク質は、毒素タンパク質である、前記組換えベクターが導入された菌株。
14. 請求項１３に記載の菌株を有効成分として含む癌の予防または治療用薬学組成物。
15. フラジェリンまたはこれをエンコードするヌクレオチド；および毒素タンパク質またはこれをエンコードするヌクレオチドを有効成分として含む癌の予防または治療用組成物。
16. 癌を予防または治療するのに使用される、請求項８または請求項１３に記載の菌株。
17. 請求項８または１３に記載の菌株の有効量を目的とする被検体に投与して癌を予防または治療する方法。
18. 外来フラジェリンを発現する菌株と外来毒素タンパク質を発現する菌株の有効量を被検体に併用投与して癌を予防または治療する方法。