KR102604398B1 - 암의 진단 및 치료용 dna 컨스트럭트 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 DNA 컨스트럭트 및 상기 DNA 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터가 도입된 균주에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 DNA 컨스트럭트는 숙주 균주 또는 세포 내에서 제1 프로모터와 제2 프로모터 하류에 작동 가능하게 연결된 유전자의 발현 수준이 균형을 이룰 수 있도록 하여, 암의 치료와 진단을 동시에 할 수 있다. 또한, 본 발명의 상기 DNA 컨스트럭트는 독시사이클린이 부재하는 경우 상기 항암 단백질 및 리포터 단백질이 전혀 발현되도록 할 수 없기 때문에, 독시사이클린의 처리 여부를 조절함으로써 적절한 암 치료를 위한 용량으로 항암 단백질이 발현될 수 있도록 할 수 있음과 동시에, 리포터 단백질의 발현 수준에 따라 암의 크기를 실시간으로 모니터링할 수 있다.

Description

암의 진단 및 치료용 DNA 컨스트럭트{A gene construct for diagnosing and treating of tumors}
본 발명은 암의 진단 및 치료용 DNA 컨스트럭트 및 상기 DNA 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터가 도입된 균주에 관한 것이다.
현재까지 대부분의 암은 외과적 수술, 방사선 치료 및 화학 요법에 해당하는 각각의 개별적 방법 또는 이들의 조합에 의해 치료되고 있는 실정이다. 암 조직을 대부분 제거하는 외과적 수술은 특정 부위, 예컨대 유방, 결장 및 피부에 위치한 암 조직을 제거하는 데에는 매우 효과적일 수 있지만, 척추와 같이 일부 구역에 있는 암 조직을 치료하는 데는 사용되기 어렵다. 또한, 유방암, 폐암 및 정소암에 흔히 사용되는 전신성 화학 요법의 경우, 정상 세포의 복제 또는 대사 과정을 붕괴시키는 부작용이 유발될 수 있으며, 환자에게서 발생되는 화학 요법에 사용되는 치료제에 대한 내성이 발생될 수 있다.
한편, 개체에서 암이 발생될 때 혈관 형성과 세포 성장이 체내에서 매우 빠른 속도로 진행되기 때문에, 암 조직의 내부는 혈관 형성이 불완전하여 산소가 결핍된 환경이 조성되어, 살모넬라 속 균주 또는 대장균과 같은 혐기성 박테리아가 증식하기에 매우 적합할 수 있다. 이에 따라, 현재 살모넬라(Salmonella) 속 균주와 클로스트리디움(Clostrdium) 속 균주와 같은 암을 표적할 수 있는 박테리아를 이용한 암 치료는 고형종양을 표적으로 하고 종양 내에서 증식할 수 있는 특정 박테리아의 기능에 의존하지만 종양용해 단백질 또는 리포터 단백질을 상기 박테리아에 도입하고, 이렇게 형질전환된 박테리아를 개체에 투여하는 경우 암 조직을 특이적으로 확인하거나, 정상 세포에 대해 독성을 나타내는 부작용을 최소화하여 암을 치료할 수 있다.
자연계에 존재하는 다양한 박테리아 병원체에서 분비되는 독소에 의해 인간에게서 질병이 유발된다. 이렇게 질병이 유발될 수 있도록 하는 다양한 박테리아 병원체 중 우리의 식생활과 밀접한 관계가 있는 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica) 등은 인간을 포함한 영장류의 장관 내에 서식하는 장내 세균과로 알려져 있으며 외독소로 알려진 사이토라이신(cytolysin)을 분비한다. 이렇게 분비되는 사이토라이신은 약 34 kDa의 분자량을 가지는 세포독성 단백질로서 사람을 포함한 영장류의 장 내에서 적혈구를 파괴하는 용혈작용 및 정상세포의 막에 기공을 형성시켜 세포의 용해를 유발시켜 심각한 혈관 염증과 국소조직의 괴사로 인해 사망에까지 이르게 한다고 알려져 있다. 하지만, 최근 연구결과에서는 살모넬라 엔테리카에서 분리 및 정제된 사이토라이신이 체내 장관에 존재하는 암 조직에 특이적으로 반응하여 암 조직의 사멸을 유도하여 차세대 항암 치료제로써 주목받고 있다. 따라서 세포 독성 물질인 사이토라이신을 분비하는 유전자가 형질전환된 박테리아는 암 조직 표적용 항암 치료제로서의 활용 가능성이 매우 높을 수 있다.
이와 같이 박테리아를 이용한 암의 진단 또는 치료가 가능함에도 불구하고, 진단 및 치료에 적합한 단백질이 암 조직에서 특이적으로 발현될 수 있도록 하는 발현벡터에 대한 연구가 거의 이루어지지 않는 실정이다. 박테리아가 생체 내에 주입된 후에는 첫 3일 동안 간 및 비장과 같은 망상내피계에서 청소(Clearance)가 이루어지고, 이후 일정 기간 이후에 암조직에서 급증하게 되므로, 안전성 측면에서 일정기간이 지난 이후 치료 단백질이 발현될 수 있도록 하는 것이 요구되어진다. 이에, 치료 단백질의 발현을 위해 유도성 프로모터(Inducible promoter)의 사용이 추천되는데, 현재 실험단계에서 이용되는 PBAD 프로모터와 같은 유도성 프로모터는 인체사용이 허용되지 않은 L-아라비노스(L-arabinose)가 유도물질로 사용되어야 하기 때문에 임상적용의 문턱이 높다. 인체사용이 허용된 항생제인 독시사이클린(Doxycycline)을 사용하는 Ptet 프로모터는 상대적으로 임상적으로 사용되기 용이하고, TetA 프로모터와 TetR 프로모터를 이용하여 두가지 유전자의 양방향 전사가 가능하다는 이점을 가지고 있으나 TetA 프로모터와 TetR 프로모터 사이의 단백질 발현율이 100:1 이상 차이를 보여 이 부분의 균형을 맞춰야 활용도를 높일 것이다. 이와 같이 임상적용이 가능한 형태의 발현시스템을 갖고, 단백질의 발현 수준이 균형을 이룰 수 있도록 형질전환된 박테리아에 대한 새로운 기술의 개발이 필요한 실정이다.
본 발명의 일 목적은 DNA 컨스트럭트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 DNA 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 벡터가 도입된 균주; 및 이를 포함하는 암의 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 균주를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 균주를 처리하는 단계를 포함하는 암의 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 일 구현 예에서는 DNA 컨스트럭트를 제공한다.
본 발명의 상기 DNA 컨스트럭트는 조절 단백질을 암호화하는 유전자; 및 상기 조절 단백질에 의해 유도되는 제1 프로모터 및 제2 프로모터를 포함한다.
본 발명의 상기 제1 프로모터 및 제2 프로모터의 하류에 항암 단백질을 암호화하는 유전자; 사이토카인(Cytokine)을 암호화하는 유전자; 케모카인(Chemokine)을 암호화하는 유전자; 면역 조절자(Immune modulator)를 암호화하는 유전자; 암 항원에 특이적인 올리고 뉴클레오티드; 및 리포터 단백질을 암호화하는 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나가 작동 가능하게 연결될 수 있다.
본 발명의 상기 제1 프로모터 및 제2 프로모터는 별도의 프로모터에 의해 발현되는 하나의 조절 단백질에 의해 동시에 유도될 수 있기 때문에, 제2 프로모터의 하류에 조절 단백질을 암호화하는 유전자가 작동 가능하게 연결된 경우와 비교하여, 숙주 세포; 또는 숙주 세포 내에서 제1 프로모터 및 제2 프로모터의 하류에 작동 가능하게 연결된 유전자에 의해 암호화되는 단백질 간의 발현 수준이 균형을 이룰 수 있다. 이와 같이 본 발명에 따른 DNA 컨스트럭트를 이용하는 경우에는 진단과 치료가 동시에 수행될 수 있다.
본 발명의 상기 "DNA 컨스트럭트"는, 숙주 균주 또는 세포에 형질전환을 통해 도입되는 경우 목적하는 단백질 등이 발현될 수 있도록 하는 구조체로서, 목적하는 단백질을 암호화하는 유전자뿐만 아니라, 상기 유전자가 발현될 수 있도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절 요소인 프로모터에 해당하는 염기 서열 등을 포함하는 것을 의미한다.
본 발명의 상기 "프로모터"란, 숙주 균주 또는 세포에서 작동 가능하게 연결된 유전자의 상류 영역에 존재하는 염기 서열로서, 전사가 개시되도록 하기 위하여 RNA 폴리머라제(RNA Polymerase)가 결합될 수 있는 상기 DNA 컨스트럭트의 특정 부위의 염기 서열을 의미한다.
본 발명의 상기 조절 단백질의 발현 조절은 시스-작용 인자(cis-acting element, Cis-regulatory elements; CRE) 또는 트랜스-작용 인자(trans-acting element, Trans-regulatory elements; TRE)에 의할 수 있다.
본 발명에서 상기 “조절” 내지 “발현 조절”은 특정 유전자의 전사 및 번역이 활성화 또는 억제되는 것을 의미할 수 있다.
본 발명의 상기 시스-작용 인자는 이웃 유전자의 전사를 조절하는 비-코딩 DNA의 영역으로, 유전자 조절 네트워크의 필수 구성 요소이며, 유전자 발현을 제어한다. 상기 시스-작용 인자는 리보솜 결합 부위(ribosome binding site; RBS), 5'-비 번역 영역(5'-Untransrated Region; 5'-UTR), 전사 인자 결합 부위(transcription factor binding site) 및 종결자(terminators)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 리보솜 결합 부위(ribosome binding site; RBS)는 샤인-달가노 서열(Shine-Dalgarno sequence; SD sequence)이라고도 하며, DNA에 담겨 있는 유전 정보가 전령 RNA(mRNA)로 전사된 후, 번역(translation)이 일어나기 위해서는 이 mRNA에 리보솜(ribosome)이 결합해야 하는데 이때 리보솜이 효과적으로 결합할 수 있도록 mRNA 상에 존재하는 짧은 서열을 의미한다.
본 발명에서, 상기 5'-비 번역 영역(5'-Untransrated Region; 5'-UTR)은 5' 지역에서 mRNA의 아미노산으로 번역되는 부분인 코딩 부분 (coding region)의 양 쪽에 위치하는 번역이 되지 않는 부분으로, 진화 과정에서 불필요하게 버려지는 부분(junk)로 여겨졌으나, 유전자 발현 조절에 큰 역할을 하는 것으로 알려졌다.
본 발명에서, 상기 전사 인자 결합 부위(transcription factor binding site)는 근처의 특정 유전자를 켜거나 끄는 역할을 하는 DNA 부위이다. 상기 전사 인자 결합 부위는 상기 조절 단백질을 암호화하는 유전자의 프로모터, 인핸서(enhancer) 및 사일렌서(silencer)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 상기 조절 단백질을 암호화하는 유전자의 프로모터는 대부분의 숙주 균주 또는 세포의 환경 조건 및 발달 상태 등에서 활성이 유도될 수 있는 프로모터라면 모두 포함될 수 있고, 바람직하게는 약한 프로모터(Weak promoter)일 수 있다.
본 발명의 상기 "약한 프로모터"란, 하류에 작동 가능하게 연결된 유전자로부터 전사된 전사체(Transcript)의 발현 수준이 1 × 10-2 이하, 바람직하게는 1 × 10-3 이하로 발현되도록 유도하는 프로모터로서, 위와 같이 전사체의 발현 수준을 1 ×10-3 이하로 발현되도록 하는 프로모터라면 모두 포함될 수 있고, 예를 들면 E. coli σ70 프로모터; E. coli σS 프로모터; E. coli σ32 프로모터; B. subtilis σA 프로모터; B. subtilis σB 프로모터; 살모넬라 유래 프로모터인 K112706 또는 K112707; 박테리오파지 T7 프로모터; 박테리오파지 SP6 프로모터; 효모(yeast) 유래 프로모터; 진핵세포 유래 프로모터인 I712004 또는 K076017; OXB1 프로모터; 및 식물 유래 프로모터로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 E. coli σ70 프로모터는 I14018, I14033, I14034, I732021, I742126, J01006, J23103, J23109, J23112, J23113, J23117, J23119, J23150, J23151, J44002, J48104, J56015, J64951, K088007, K119000, K119001, K1330002, K137029, K137030, K137031, K137032, K137085, K137086, K137087, K137088, K137089, K137090, K137091, K1585100, K1585101, K1585102, K1585103, K1585104, K1585105, K1585106, K1585110, K1585113, K1585115, K1585116, K1585117, K1585118, K1585119, K2486171, K256002, K256018, K256020, K256033, K292000, K823007, K823010, K823013, M13101, M13102, M13103, M13104, M13105, M13106, M13108, M13110, M31519, R1074, R1075 및 S03331으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 E. coli σS 프로모터는 J45992 또는 J45993일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 E. coli σ32 프로모터는 J45504, K1895002 또는 K1895003일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 B. subtilis σA 프로모터는 K143012, K143013, K823000, K823002 및 K823003으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 B. subtilis σB 프로모터는 K143010, K143011 또는 K143013일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 박테리오파지 T7 프로모터는 I719005, J34814, J64997, K113010, K113011, K113012, K1614000, R0085, R0180, R0181, R0182, R0183, Z0251, Z0252 및 Z0253으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 박테리오파지 SP6 프로모터는 J64998일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 효모 유래 프로모터는 I766557, J63005, K105027, K105028, K105029, K105030, K105031, K122000, K124000, K124002, K319005, M31201, K2365040, K2365036, K2365041, K2365042, K2365032, K2365051, K2365514, K2365515 및 K2365516으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 식물 유래 프로모터는 PLPR0203, PLPR0210, PLPR0177, PLPR0193, PLPR0507, PLPR0422, PLPR0228, PLPR0226, PLPR0223, PLPR0040, PLPR0465, PLPR0232, PLPR0205, PLPR0247, PLPR0328, PLPR0525, AtREG383, AtREG415, AtREG416, OsREG438, OsREG443, OsREG501, PpREG186, PpREG194 및 PpREG197으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 약한 프로모터는 서열번호 16으로 표시되는 OXB1 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 목적상 상기 약한 프로모터의 하류에 조절 단백질을 암호화하는 유전자가 작동 가능하게 연결되는 경우에는, 상기 제1 프로모터 또는 제2 프로모터의 하류에 작동 가능하게 연결된 경우와 비교하여, 조절 단백질을 억제하는 물질을 투여하였을 때에만 특이적으로 상기 제1 및 제2 프로모터의 하류에 존재하는 유전자의 전사가 일어날 수 있도록 조절할 수 있다.
본 발명의 상기 조절 단백질을 암호화하는 유전자의 프로모터는 조절 단백질을 암호화하는 유전자를 기준으로 -35 부위의 염기 서열은 서열번호 8이고, -10 부위의 염기 서열은 서열번호 9인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 인핸서는 원핵과 진핵 생물 모두에서 발견되는 서열로, 일반적으로 50 내지 1500 bp의 영역을 가지고 상기 근처 유전자의 출발지로부터 상류 또는 하류에 위치하여 상기 전사인자 결합을 유도한다.
본 발명의 상기 사일렌서는 인핸서와 동일한 메커니즘을 유지하고 인핸서의 길항작용을 한다. 상기 사일렌서에 결합하는 전사 인자는 리프레서(repressor)이다. 상기 인핸서와 상기 사일렌서는 서로 근접한 영역에 존재하는 것일 수 있거나, 동일 영역에 전사 인자가 다른 영역인 것일 수 있다.
본 발명의 상기 종결자(terminators)는 전사 종결자(transcription terminator)라고도 하고, 유전체에서 유전자 또는 오페론의 전사의 종결을 매개하며, 원핵생물에서는 Rho-의존적 종결자와 Rho-비의존적 종결자가 있다.
본 발명의 상기 트랜스-작용 인자는 트랜스 활성화 인자 내지 트랜스 작용 전사 인자라고도 하고, 유전자의 전사를 트랜스로 활성화하는 인자이다. 상기 트랜스-작용 인자는 상기 전사 인자, 앱타머(aptamer), sRNA, 안티센스 RNA(antisense RNA; asRNA)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 전사 인자는 상기 전사 인자 결합 부위와 결합하여 특정 유전자를 켜거나 끄는데 도움이 되는 단백질이다.
본 발명에서, 상기 앱타머(aptamer)는 리보스위치(riboswitch)의 일부분으로, 특정 표적분자에 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 혹은 펩타이드(Peptide) 물질을 통칭하며, 상기 앱타머는 펩타이드 앱타머 또는 핵산 앱타머일 수 있다. 상기 리보스위치는 유전자의 발현을 조절하는 mRNA의 일종으로, glmS 리보스위치, FMN 리보스위치, Cobalamin 리보스위치 등이 있을 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 sRNA, 안티센스 RNA(antisense RNA; asRNA)는 특정 RNA에 상보적으로 결합할 수 있는 외줄 RNA(single-stranded RNA)을 뜻한다. 특정 단백질을 표현하는 전령 RNA(messenger RNA; mRNA)인 sense RNA에 상보적으로 결합하여, 결국 해당 단백질 발현을 조절한다.
본 발명의 상기 제1 프로모터 및 제2 프로모터는 상기 조절 단백질에 의해 유도되는 유도성 프로모터일 수 있다.
본 발명의 상기 "유도성 프로모터"란, 특정 화학적 또는 물리적 조건 하에서만 특이적으로 하류에 연결된 유전자가 발현될 수 있도록 전사하는 프로모터로서, 예를 들면 IPTG(isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside)와 같은 갈락토스의 존재하에서 발현되는 LacZ 유전자의 프로모터, L-아라비노스의 존재 하에서만 발현되는 아라비노스 오페론 araBAD 프로모터, 테트라사이클린에 의해 발현이 조절되는 tet 프로모터일 수 있고, 바람직하게는 상기 제1 프로모터 및 제2 프로모터는 tet 프로모터일 수 있고, 더욱 바람직하게는 상기 제1 프로모터는 tetA 프로모터, 상기 제2 프로모터는 tetR 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 조절 단백질을 암호화하는 유전자는 제1 프로모터 및 제2 프로모터에 결합하여 RNA 폴리머라제가 결합될 수 없도록 조절하는 단백질로서, 본 발명의 목적상 상기 제1 프로모터 및 제2 프로모터가 tet 프로모터인 경우, 상기 tet 프로모터의 조절 부위에 결합되어 tet 프로모터의 활성을 억제할 수 있는 TetR 단백질 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 "작동 가능하게 연결(Operably linked)"이란, 목적하는 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 기능적으로 연결됨으로써, 목적하는 하나의 핵산 단편의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 의미한다.
본 발명의 상기 "리포터 단백질"이란, 시각적으로 암이 진단될 수 있도록 하는 기능을 수행하는 단백질로서, 예를 들면, 형광 단백질, 루시퍼라아제(Luciferase) 및 핵의학 또는 MRI 영상 촬영에 사용되는 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 "형광 단백질은"은, 암이 시각적으로 진단될 수 있도록 자체적으로 형광을 띄는 단백질로서, 예를 들면 녹색 형광 단백질(Green Fluorescent Protein; GFP), 변형된 녹색 형광 단백질(Modified Green Fluorescent Protein; MGFP), 증강된 녹색 형광 단백질(Enhanced Green Fluorescent Protein; EGFP), 적색 형광 단백질(Red Fluorescent Protein; RFP), 증강된 적색 형광 단백질(Enhanced Red Fluorescent Protein; ERFP), 청색 형광 단백질(Blue Fluorescent Protein; BFP), 증강된 청색 형광 단백질 Enhanced Blue Fluorescent Protein; EBFP), 황색 형광 단백질(Yellow Fluorescent Protein; YFP) 및 증강된 황색 형광 단백질(Enhanced Yellow Fluorescent Protein; EYFP) 로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 핵의학 또는 MRI 영상 촬영에 사용되는 단백질은 예를 들면, 단순포진바이러스의 티미딘인산효소(Herpes simplex virus thymidine kinsease), 도파민수용체(Dopamine receptor), 소마토스타틴 수용체(Somatostatin receptor), 소디움-요오드 수송체(Sodium-iodide transporter), 철 수용체, 트렌스페린 수용체(Transferrin receptor), 페리틴(Ferritin) 및 철 수송체(magA)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 "사이토카인"이란, 면역 세포가 분비하는 단백질로서, 본 발명의 상기 사이토카인은 숙주 면역 반응을 조절하여 질환과 관련된 세포, 예를 들면 암 세포의 사멸을 유도할 수 있는 암 면역 요법에 사용될 수 있는 것이라면 모두 포함될 수 있고, 바람직하게는 IFN-α2, IL-2, IL-15, IL-21 및 IL-12일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 "케모카인"이란, 조직 사이의 세포 이동과 조직 내의 세포의 위치 및 상호 작용을 조절하는 역할을 하는 것으로서, 백혈구를 종양 미세 환경으로 유도하여 질환, 예를 들면 암에 대한 숙주 반응을 중재할 수 있는 것이라면 모두 포함될 수 있고, 바람직하게는 CXCR3, CCR5 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 "면역 조절자"란, 개체가 갖고 있는 고유의 면역 체계를 활용하여 다양한 치료가 가능하도록 하는 것으로서, 면역 세포를 활성화시켜 질환과 관련된 세포, 예를 들면 암 세포의 사멸을 유도할 수 있는 것이라면 모두 포함될 수 있다.
본 발명의 상기 "항암 단백질"이란, 암 세포의 사멸을 직간접적으로 유도할 수 있는 기능을 갖는 펩티드로서, 예를 들면 독소 단백질, 암 항원에 특이적인 항체 또는 상기 항체의 단편, 종양억제 단백질(Tumor suppressor protein), 혈관신생 억제제, 암 항원, 전구약물 전환 효소(Prodrug-converting enzymes) 및 전세포사멸 단백질(pro-apoptotic protein)로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 "독소 단백질"이란, 암 세포의 사멸을 직간접적으로 유도할 수 있는 기능을 갖는 단백질로서, 예를 들면, 리신(Ricin), 사포린 (Saporin), 젤로닌(Gelonin), 모로딘(Momordin), 데보가닌(Debouganin), 디프테리아독소, 녹농균독소(Pseudomonas toxin), 헤모라이신(HlyA), FAS 리간드(FAS ligand; FASL), 종양 괴사 인자-α(Tumour necrosis factor-α; TNF-α), TNF-연관 세포사멸-유발 리간드(TNF-related apoptosis-inducing ligand; TRAIL) 및 사이토라이신 A(Cytolysin A, ClyA)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있고, 더욱 바람직하게는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 사이토라이신 A일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 "종양억제 단백질"이란, 정상 세포에 존재하면서 기능을 유지하지만, 그 기능이 상실된 경우에는 정상세포가 무분별한 세포의 분열 및 성장이 유도되어 암 세포로 전환되도록 하는 기능을 하는 유전자로서, 예를 들면, RB(Retinoblastoma protein) 단백질, p53 단백질, APC(Adenomatous polyposis coli) 단백질, PTEN(Phosphatase and tensin homologue) 단백질, CDKN2A(cyclin dependent kinase inhibitor 2A) 단백질 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 암 항원에 특이적인 항체 또는 상기 항체의 단편은 암 세포의 표면 또는 세포질에 특이적으로 발현 수준이 높은 단백질인 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항체로서, 예를 들면, 유방암 또는 위암 세포에 특이적으로 발현 수준이 높은 HER2 등에 특이적인 항체와 같은 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 항체는 단백질 또는 펩티드 분자의 항원성 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 분자를 의미한다. 상기 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이라면, 항체의 일부인 경우라도 포함될 수 있고, 모든 종류의 면역 글로불린 항체가 포함될 수 있다. 또한, 인간화 항체 등의 특수 항체가 포함될 수 있고, 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2, Fv 등이 될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 "항체"란, 본 발명의 상기 암 항원을 암호화하는 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현 벡터에 클로닝하여 상기 유전자에 의해 암호화되는 단백질을 얻은 뒤에 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 상기 "혈관신생 억제제"란, 암 세포 주변에서 새로운 혈관이 생성되는 것을 억제하여 암 세포의 사멸을 직접 또는 간접적으로 유도할 수 있는 기능을 갖는 단백질 또는 화합물을 의미한다. 바람직하게 상기 혈관신생 억제제는 안지오스타틴(angiostatin), 엔도스타틴(endostatin), 트롬보스폰딘(Thrombospondin), 및 단백 분해효소 억제 단백질 등일 수 있으나. 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 "암 항원"이란, 암 세포에서는 발현되지만 정상세포에서는 거의 발현되지 않는 단백질을 항원으로 하여, 이를 통해 항 종양 면역반응을 유도함으로써 암 세포의 직접 또는 간접적 사멸을 유도할 수 있는 단백질을 의미한다. 본 발명의 상기 암 항원은 바람직하게는 알파-페토프로테인(α-fetoprotein; AFP), 혈관내피성장인자 수용체 2(Vascular endothelial growth factor receptor 2; VEGFR2), 서비빈(Survivin), 레구메인(Legumain), 전립선 암 특이적 항원(Prostate cancer specific antigen; PCSA) 등일 수 있으나. 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 "전구약물 전환 효소" 란, 비활성 약물을 효소반응에 의한 대사를 통해 활성 약물로 전환되도록 하는 기능을 갖는 단백질로서, 이와 같은 전구약물 전환 효소를 이용하는 경우 비활성 약물이 대사 되어 암 세포의 사멸을 직접 또는 간접적으로 유도할 수 있는 활성 약물로 전환되도록 하여, 암의 예방 또는 치료에 매우 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명의 상기 전구 약물 전환 효소는 바람직하게 티미딘 키나제(Thymidine kinase), 시토신 디아미나아제(cytosine deaminase), 니트로리덕타아제(nitroreductase), 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라아제(purine nucleoside phosphorylase), 카르복시펩티다아제 G2(carboxypeptidase G2), 크로메이트 리덕타아제 YieF(chromate reductase YieF), 헤르페스 심플렉스 바이러스 I형 티미딘 키나아제/간시클로비르(herpes simplex virus type I thymidine kinase/ganciclovir; HSV1-TK/GCV), β-글루터로니다아제(β-glucuronidase) 등일 수 있으나. 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 "전세포사멸 단백질"이란, 암 세포가 성장 또는 유지되는데 필수적인 인자(단백질, 영양분, 올리고 뉴클레오티드 등)가 결핍되도록 함으로써, 암 세포의 직접 또는 간접적인 사멸을 유도하는 단백질을 의미한다. 본 발명의 상기 전세포사멸 단백질은, 바람직하게는 L-아스나아제(L-ASNase), RNA-결합 모티프 단백질 5(RNA-binding motif protein 5; RBM5) 등일 수 있으나. 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 암 항원에 특이적인 올리고 뉴클레오티드는, 암 항원의 유전자 또는 mRNA에 상보적으로 결합함으로써 암 항원의 발현 또는 그 기능을 억제할 수 있는 뉴클레오티드로서, 안티센스 올리고 뉴클레오티드, 앱타머(aptamer), siRNA 및 shRNA로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 "안티센스 올리고 뉴클레오티드"란, 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 포함하고 있는 DNA, RNA 또는 이들의 유도체를 의미하는 것으로서, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로 번역을 저해할 수 있다. 상기 안티센스 올리고 뉴클레오티드는, 예를 들면 RNA 폴리머라제Ⅰ 등을 이용하는 통상의 방법을 이용하여 시험관 내에서 합성한 뒤 생체 내로 투여하거나, 또는, 인식부위(MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하는 방법 등을 통해 생체 내에서 합성되도록 할 수 있다.
본 발명의 상기 "앱타머"란, 높은 친화성으로 타겟 물질을 특이적으로 인지할 수 있는 작은 단일가닥 올리고핵산을 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 타겟 물질은 암 항원의 유전자 또는 mRNA일 수 있다.
본 발명의 상기 "siRNA"란, 특정 mRNA의 절단(cleavage)을 통하여 RNA 간섭(RNA interference; RNAi) 현상을 유도할 수 있는 짧은 이중가닥 RNA를 의미한다. 표적 유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA 가닥으로 구성되며, 본 발명의 목적상 상기 siRNA는 암 항원을 암호화하는 유전자로부터 전사된 mRNA에 특이적으로 결합하여 이와 같은 유전자의 발현을 효과적으로 억제할 수 있다.
본 발명의 상기 "shRNA"란, 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA)로서 siRNA에 비해 세포 형질 감염율이 높고, RNA 간섭이 장기간 유지될 수 있다는 장점이 존재하며, RNA 중합효소 Ⅲ의 프로모터로부터 아데노바이러스, 렌티 바이러스 및 플라스미드 발현 벡터 시스템 등을 세포 내로 형질전환한 뒤, 발현시키는 과정을 통해 RNA 간섭을 유도할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 목적상 상기 shRNA는 암 항원을 암호화하는 유전자로부터 전사된 mRNA에 특이적으로 결합하여 이와 같은 유전자의 발현을 효과적으로 억제할 수 있다.
본 발명의 다른 구현 예에서는 본 발명의 상기 DNA 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명의 상기 재조합 벡터는 본 발명의 상기 DNA 컨스트럭트를 포함하여, 조절 단백질이 별도의 프로모터에 의해 발현됨으로써, 조절 단백질을 억제하는 물질이 외부에서 투여될 때에만 특이적으로 제1 프로모터 및 제2 프로모터의 하류에 작동 가능하게 연결된 유전자가 균형적으로 발현될 수 있도록 할 수 있다.
본 발명의 상기 재조합 벡터에서 상기 DNA 컨스트럭트, 항암 단백질, 사이토카인, 케모카인, 면역 조절자, 암 항원에 특이적인 올리고 뉴클레오티드, 리포터 단백질 및 프로모터 등에 대한 내용은 상기 DNA 컨스트럭트에 기재된 바와 동일하여, 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 생략한다.
본 발명의 상기 재조합 벡터는 세포 내에 도입되어 단백질을 발현시키기 위한 수단으로서, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파지 벡터 등 공지의 재조합 벡터를 사용할 수 있으며, 상기 재조합 벡터는 DNA 재조합 기술을 이용한 임의의 공지된 방법에 따라 당업자에 의해 용이하게 제조될 수 있다.
본 발명에서 상기 재조합 벡터의 구체적인 예시로는 상업적으로 널리 사용되는 pCDNA 벡터, F, R1, RP1, Col, pBR322, ToL, Ti 벡터, 코스미드, 람다, 람도이드(lambdoid), M13, Mu, p1 P22, Qμ, T-even, T2, T3, T7 등의 파아지, 식물 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 목적상 숙주 세포의 성질에 따라 적합한 재조합 벡터를 선택할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에서는 본 발명의 상기 DNA 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터가 도입된 숙주 세포; 또는 균주를 제공한다.
본 발명의 상기 숙주 세포로는 포유동물, 식물, 곤충, 균류 또는 세포성 기원의 세포가 포함될 수 있고, 예를 들면 대장균, 스트렙토미세스 또는 살모넬라(Salmonella) 속 균주 등의 박테리아 세포, 효모 세포, 피치아 파스 토리스 등의 균류 세포; 드로조필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의 곤충 세포, CHO(중국 햄스터 난소 세포, Chinese hamster ovary cells), SP2/0(생쥐 골수종), 인간 림프아구(Human lymphoblastoid), COS, NSO(생쥐 골 수종), 293T 세포, 보우 멜라노마 세포, HT-1080 세포, BHK 세포(베이비 햄스터 신장세포, Baby Hamster Kidney cells), HEK 세포(인간 배아신장 세포, Human Embryonic Kidney cells) 또는 PERC.6 세포(인간 망막 세포)와 같은 동물 세포, 및 식물 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 목적상 상기 균주는 혐기성 균주, 예를 들면 살모넬라 속 균주, 클로스트리듐(Clostridium) 속 균주, 비피도박테리움(Bifidobacterium) 속 균주 및 대장균 속 균주로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있고, 바람직하게는 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 살모넬라 콜레라수스(Salmonella choleraesuis) 및 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis)로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 살모넬라 티피뮤리움일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 균주는 약독화된 것일 수 있다.
본 발명의 상기 "약독화"는 미생물을 환자에 투여하는 경우 독성 및 다른 부작용 등을 감소시킬 수 있도록 유전자 등에 변형을 가한 것을 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 균주가 살모넬라 속 균주인 경우에는, 약독화를 위하여 aroA, aroC, aroD, aroE, Rpur, htrA, ompR, ompF, ompC, galE, cya, crp, cyp, phoP, phoQ, rfaY, dksA, hupA, sipC, clpB, clpP, clpX, pab, nadA, pncB, pmi, rpsL, hemA, rfc, poxA, galU, cdt, pur, ssa, guaA, guaB, fliD, flgK, flgL, relA 및 spoA로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자에 변형을 가한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 유전자에 변형을 가하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 유전자의 결실 또는 파괴하는 방법에 의해 수행될 수 있고, 예를 들면, 상기 결실 및 파괴 방법은 상동성 재조합, 화학적 변이유발, 조사 변이유발 또는 트랜스포존 변이유발 등과 같은 방법에 의해 수행될 수 있다.
본 발명에서 상기 균주는 혐기성 균주가 증식하기에 매우 적합한 혈관 형성이 불완전하여 산소가 결핍된 환경인 암 조직의 내부를 표적하기 때문에, 이와 같은 균주 내에 실시간으로 이미징이 가능한 리포터 단백질과 항암 단백질이 동시에 균형적으로 발현될 수 있는 재조합 벡터가 도입되어 있는 경우 암을 매우 효과적으로 진단과 동시에 치료할 수 있다.
본 발명의 상기 균주에서 상기 DNA 컨스트럭트, 항암 단백질, 사이토카인, 케모카인, 면역 조절자, 암 항원에 특이적인 올리고 뉴클레오티드, 리포터 단백질, 프로모터 및 재조합 벡터 등에 대한 내용은, 상기 DNA 컨스트럭트 및 재조합 벡터에 기재한 바와 동일하여, 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 생략한다.
본 발명의 상기 재조합 벡터는 형질 전환(또는 형질 감염)을 통하여 숙주 세포; 또는 균주 내로 도입될 수 있는데, 본 발명에서 사용되는 형질 전환 방법은 임의의 형질 전환 방법이 사용될 수 있고, 당업계의 통상적인 방법에 따라 용이하게 수행될 수 있다. 구체적으로, 통상적으로 사용될 수 있는 상기 살모넬라 속 균주와 같은 박테리아의 형질 전환 방법, CaCl2 침전법, CaCl2 방법에 환원물질인 DMSO(Dimethyl sulfoxide)를 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법(Electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로 박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등을 사용하여 상기 균주에 재조합 벡터를 도입할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현 예에서는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 상기 약학 조성물은 본 발명의 상기 균주를 유효성분으로 포함한다.
본 발명의 상기 균주는 본 발명에 따른 상기 DNA 컨스트럭트가 형질전환되어, 개체 내에서 암을 표적한 뒤에, 조절 단백질을 억제하는 물질이 투여되는 경우 이와 같은 균주 내에 실시간으로 이미징이 가능한 리포터 단백질과 항암 단백질이 동시에 균형적으로 발현되기 때문에, 암을 매우 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있고, 이와 동시에 실시간으로 암을 진단할 수 있다.
본 발명의 상기 "암"은 변종 세포의 신속하고 제어되지 않은 성장을 특징으로 하는 질병으로서, 흑색종, 나팔관암, 뇌암, 소장암, 식도암, 임파선암, 담낭암, 혈액암, 갑상선암, 내분비선암, 구강암, 간암, 담도암, 대장암, 직장암, 자궁경부암, 난소암, 신장암, 위암, 십이지장암, 전립선암, 유방암, 뇌종양, 폐암, 갑상선 미분화암, 자궁암, 결장암, 방광암, 요관암, 췌장암, 뼈/연부조직 육종, 피부암, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 다발성 골수종, 백혈병, 골수이형성증후군, 급성 림프모구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병 및 고립성 골수종으로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것일 수 있고, 바람직하게는 간암, 담도암, 대장암, 직장암, 자궁경부암, 난소암, 신장암, 위암, 십이지장암, 전립선암, 유방암, 뇌종양, 폐암, 갑상선 미분화암, 자궁암, 결장암, 방광암, 요관암, 췌장암, 뼈/연부조직 육종 및 피부암으로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있고, 더욱 바람직하게는 결장암일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 "예방"이란, 본 발명의 상기 유효성분을 이용하여 암으로 인해 발생된 증상을 차단하거나, 그 증상을 억제 또는 지연시키는 행위라면 제한없이 모두 포함될 수 있다.
본 발명의 상기 "치료"란, 본 발명의 상기 유효성분을 이용하여 암으로 인해 발생된 증상이 호전되거나, 개체가 이롭게 되는 모든 행위를 의미하며, 임상적 결과를 포함하는 유용한 결과 또는 바람직한 결과를 얻기 위한 시도를 의미한다. 유용한 또는 바람직한 임상적 결과는 검출 가능하거나 가능하지 않더라도, 하나 이상의 증상 또는 상태의 완화 또는 개선, 질병 범위의 축소, 질병 상태의 안정화, 질병 발생의 억제, 질병 확산의 억제, 질병 진행의 지연 또는 늦춤, 질병 발병의 지연 또는 늦춤, 질병 상태의 개선 또는 경감, 및 감퇴 (부분 또는 전체)를 포함할 수 있으며, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, "치료"는 치료의 부재에서 예측되는 것 이상으로 환자의 생존이 연장되는 것을 의미할 수 있다. 또한, "치료"는 질병 진행의 억제, 일시적으로 질병 진행의 늦춤을 의미할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 질병의 진행을 영원히 정지시키는 것과 관련이 있다. 당업자에 의해 이해된 바와 같이, 특정 질병 상태를 향상시키는 동안 치료가 치료된 환자에서 반대의 결과, 즉 치료에 의해 영향을 받는 모든 이점보다 큰 결과를 초래한다면 결과는 유익하지 않거나 바람직하지 않을 수도 있다.
본 발명의 상기 약학 조성물에서 상기 DNA 컨스트럭트, 항암 단백질, 사이토카인, 케모카인, 면역 조절자, 암 항원에 특이적인 올리고 뉴클레오티드, 리포터 단백질, 프로모터 재조합 벡터, 균주 및 형질전환 등에 대한 내용은, 상기 DNA 컨스트럭트, 재조합 벡터 및 균주에 기재한 바와 동일하여, 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 생략한다.
본 발명의 상기 약학 조성물은 캡슐, 정제, 과립, 주사제, 연고제, 분말 또는 음료 형태임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 약학 조성물은 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 상기 약학 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사 용액의 형태로 제형화되어 사용될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체는 경구 투여 시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등이 사용될 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등이 혼합되어 사용될 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등이 사용될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형화할 수 있다.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항 응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 약학 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다.
본 발명의 상기 "비경구"란, 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 약학 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.
본 발명의 상기 약학 조성물은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여 시간, 투여 경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약학 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약무 형태, 투여 경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 0.0001 내지 50mg/kg 또는 0.001 내지 50mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 따른 의약 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형화될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에서는 암의 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 상기 진단용 조성물은 본 발명에 따른 상기 균주를 유효성분으로 포함한다.
본 발명의 상기 균주는 본 발명에 따른 상기 DNA 컨스트럭트가 형질전환되어, 개체 내에서 암 세포를 표적한 뒤에, 조절 단백질을 억제하는 물질이 투여되는 경우 이와 같은 균주 내에 실시간으로 이미징이 가능한 리포터 단백질과 항암 단백질이 동시에 균형적으로 발현되기 때문에, 암을 매우 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있고, 이와 동시에 실시간으로 암을 진단할 수 있다.
본 발명의 상기 "진단"이란, 본 발명의 상기 균주가 암을 표적하여 위치될 때, 상기 균주에 도입된 DNA 컨스트럭트로부터 발현된 리포터 단백질에 의해 실시간으로 암의 존재 여부를 모니터링할 수 있는 것을 포함하는 생체 내 암 조직을 확인하는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 상기 진단용 조성물에서, 상기 DNA 컨스트럭트, 항암 단백질, 리포터 단백질, 항시적 프로모터, 유도성 프로모터, 재조합 벡터, 살모넬라 속 균주, 형질전환, 암 등에 대한 내용은, 상기 DNA 컨스트럭트, 재조합 벡터, 균주 및 약학 조성물에 기재한 바와 동일하여, 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 생략한다.
본 발명의 또 다른 구현 예에서는 암의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 방법은 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에 본 발명에 따른 상기 재조합 벡터가 도입된 균주를 처리하는 단계를 포함한다.
본 발명의 상기 암의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법은 상기 균주로부터 리포터 단백질이 발현되는 경우 암으로 진단하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 "생물학적 시료"란, 개체로부터 얻어지거나 개체로부터 유래된 임의의 물질, 조직 또는 세포를 의미하는 것으로, 예를 들면, 조직, 세포(cell), 또는 세포 추출물(cell extract)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 진단을 위한 정보 제공 방법에서 상기 DNA 컨스트럭트, 항암 단백질, 사이토카인, 케모카인, 면역 조절자, 암 항원에 특이적인 올리고 뉴클레오티드, 리포터 단백질, 프로모터, 재조합 벡터, 균주, 형질전환, 암, 진단 등에 대한 내용은, 상기 DNA 컨스트럭트, 재조합 벡터, 균주, 약학 조성물 및 진단용 조성물에 기재한 바와 동일하여, 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 생략한다.
서열번호 1: 사이토라이신 A 아미노산 서열
10 20 30 40 50
MIMTGIFAEQ TVEVVKSAIE TADGALDLYN KYLDQVIPWK TFDETIKELS
60 70 80 90 100
RFKQEYSQEA SVLVGDIKVL LMDSQDKYFE ATQTVYEWCG VVTQLLSAYI
110 120 130 140 150
LLFDEYNEKK ASAQKDILIR ILDDGVKKLN EAQKSLLTSS QSFNNASGKL
160 170 180 190 200
LALDSQLTND FSEKSSYFQS QVDRIRKEAY AGAAAGIVAG PFGLIISYSI
210 220 230 240 250
AAGVIEGKLI PELNNRLKTV QNFFTSLSAT VKQANKDIDA AKLKLATEIA
260 270 280 290 300
AIGEIKTETE TTRFYVDYDD LMLSLLKGAA KKMINTCNEY QQRHGKKTLF
EVPDV
서열번호 2: Forward primer
5'-CGGAATTCACCATGTCTAGATTAGATAAAAGTAAAGTGATTAACAG-3'
서열번호 3: Reverse primer
5'-GCTCTAGACAGCTGTTAAGACCCACTTTCACATTTAAGTTGTTTTTCT-3'
서열번호 4: Forward primer
5'-CTACTCCGTCAAGCCGTCAAGCTGTTGTGACCGCTTGCT-3'
서열번호 5: Reverse primer
5'-TGAATTCCTCCTGCTAGCTAGTTGGTAACGAATCAGACGCCGGGTAATACCGGATAG-3'
서열번호 6: Forward primer
5'-TGCTACTCCGTCAAGCCGTCAAGCTGTTGTGACCGCTTG-3'
서열번호 7: Reverse primer
5'-AGCTTGGTAACGAATCAGACGCCGGGTAATACCGGATAG-3'
서열번호 8: -35 promoter
TTCGCG
서열번호 9: -10 promoter
ATGCATAAT
서열번호 10: Forward primer
5'-CCCTATGCTACTCCGTCAAGCCGTCAATTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTCTGATTCGTTACCAAGCT-3'
서열번호 11: Reverse primer
5'-AGCTTGGTAACGAATCAGACATTATACGAGCCGATGATTAATTGTCAACAATTGACGGCTTGACGGAGTAGCATAGGG-3'
서열번호 12: Forward primer
5'-TGCTACTCCGTCAAGCCGTCTTTACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATGCTAGCCAATTGTCTGATTCGTTACC-3'
서열번호 13: Reverse primer
5'- GGTAACGAATCAGACAATTGGCTAGCATTATACCTAGGACTGAGCTAGCTGTAAAGACGGCTTGACGGAGTAGCA-3'
서열번호 14: Forward primer
5'- TGCTACTCCGTCAAGCCGTCTTGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATGCTAGCCAATTGTCTGATTCGTTACC-3'
서열번호 15: Reverse primer
5'- GGTAACGAATCAGACAATTGGCTAGCATTATACCTAGGACTGAGCTAGCTGTCAAGACGGCTTGACGGAGTAGCA-3'
서열번호 16: OXB1 promoter
5'- AAGCTGTTGTGACCGCTTGCTCTAGCCAGCTATCGAGTTGTGAACCGATCCATCTAGCAATTGGTCTCGATCTAGCGATAGGCTTCGATCTAGCTATGTAGAAACGCCGTGTGCTCGATCGCCTGACGCTTTTTATCGCAACTCTCTACTGTTGCTTCAACAGAACATATTGACTATCCGGTATTACCCGGC-3'
본 발명에 따른 DNA 컨스트럭트는 숙주 균주 또는 세포 내에서 제1 프로모터와 제2 프로모터 하류에 작동 가능하게 연결된 유전자의 발현 수준이 균형을 이룰 수 있도록 하여, 암의 치료와 진단을 동시에 할 수 있다.
또한, 본 발명의 상기 DNA 컨스트럭트는 독시사이클린이 부재하는 경우 상기 항암 단백질 및 리포터 단백질이 전혀 발현되도록 할 수 없기 때문에, 독시사이클린의 처리 여부를 조절함으로써 적절한 암 치료를 위한 용량으로 항암 단백질이 발현될 수 있도록 할 수 있음과 동시에, 리포터 단백질의 발현 수준에 따라 암의 크기를 실시간으로 모니터링할 수 있다.
도 1의 A 및 B는 본 발명의 일 실시예에 따른 DNA 컨스트럭트의 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 DNA 컨스트럭트에서 예측된 terR 단백질의 프로모터 -35 부위 및 -10 부위의 염기 서열이 표시된 모식도를 나타낸 것이다.
도 3의 A 내지 C는 본 발명의 일 실시예에 따른 리포터 단백질의 루시퍼라아제(Luciferase) 활성 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4의 A 및 B는 본 발명의 일 실시예에 따른 리포터 단백질의 루시퍼라아제 활성 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 5의 A 및 B는 본 발명의 일 실시예에 따른 리포터 단백질의 루시퍼라아제 활성 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 6의 A는 본 발명의 일 실시예에 따른 웨스턴 블롯 분석 및 쿠마시 블루 염색을 수행한 결과이고, 도 6의 B는 리포터 단백질의 발현 정도를 루시퍼라아제 활성 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이며, 도 6의 C는 균주의 혈액 아가에 대한 용혈 활성 정도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7의 A는 본 발명의 일 실시예에 따른 웨스턴 블롯 분석 및 쿠마시 블루 염색을 수행한 결과이고, 도 7의 B 및 C는 리포터 단백질의 발현 정도를 루시퍼라아제 활성 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 8의 A 및 B는 본 발명의 일 실시예에 따른 루시퍼라아제 활성 분석을 통해 종앙 동물 모델에서 리포터 단백질의 발현 정도를 확인한 결과를 나타낸 것이며, 도 8의 C는 웨스턴 블롯 분석을 통해 종양 조직 내 사이토라이신 A(Cytolysin A, ClyA) 단백질 발현 정도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 9의 A는 본 발명의 일 실시예에 따른 종양 크기를 평가한 결과이고, 도 9의 B는 본 발명에 따른 균주가 처리된 종양 동물 모델에서 생존율을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 pTetTac-RR, pTetJ23101-RR 및 pTetJ23119-RR 플라스미드를 균주에 도입한 뒤, 상기 균주 간의 루시퍼라아제 활성을 측정하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 pTetTac-RR, pTetJ23101-RR 및 pTetJ23119-RR 플라스미드를 균주에 도입한 뒤, 상기 균주 간의 루시퍼라아제 활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
[준비예 1] 독시사이클린(Doxycycline)에 의해 조절될 수 있는 DNA 컨스트럭트 제작
[1-1] OXB1 프로모터를 포함하는 DNA 컨스트럭트 제작
pJL39 플라스미드(Mol Ther., 21(11), p. 1985-1995, (2013))를 주형 가닥으로 하여(도 1의 A), 제한효소 EcoRI 부위를 포함하도록 제작된 정방향 프라이머(5'-CGGAATTCACCATGTCTAGATTAGATAAAAGTAAAGTGATTAACAG-3'; 서열번호 2) 및 제한 효소 PvuII-XbaI 부위를 포함하도록 제작된 역방향 프라이머(5'-GCTCTAGACAGCTGTTAAGACCCACTTTCACATTTAAGTTGTTTTTCT-3'; 서열번호 3)를 이용하여 tetR 유전자를 증폭하였다. 이후, 상기 증폭 산물에 제한효소 EcoRI 및 XbaI을 넣어 절단하고 이를 정제하여, tetR 유전자 증폭 산물을 얻은 뒤에, 이를 pBAD24(카탈로그 번호. ATCC® 87399TM, ATCC, 미국) 플라스미드에 도입하는 과정을 통해 pBAD-TetR 플라스미드를 제작하였다.
그런 다음, 상기 pJL39 플라스미드의 PvuⅡ 및 HindⅢ 단편을 통해, 다중 클로닝 사이트를 포함하는 다이버전트(Divergent) 프로모터 영역을 상기 pBAD-TetR 플라스미드에 도입하여 pTetR-BAD 플라스미드를 제작하였다. NheI 및 Pcil 제한효소를 사용하여 상기 pTetR-BAD 플라스미드로부터 araC 및 araBAD 프로모터를 제거하여, pTetⅡ 플라스미드를 제작하였다.
pSF-OXB1 (Oxford Genetics, England)를 주형으로 하여 정방향 프라이머 (5'-CTACTCCGTCAAGCCGTCAAGCTGTTGTGACCGCTTGCT-3'; 서열번호 4) 및 역방향 프라이머 (5'-TGAATTCCTCCTGCTAGCTAGTTGGTAACGAATCAGACGCCGGGTAATACCGGATAG-3'; 서열번호 5)로 증폭된 항시적 프로모터인 OXB1(서열번호 16)을 깁슨 어셈블리 방식을 사용하여 상기 pTetⅡ 플라스미드에 도입함으로써 최종적으로 OXB1, tetA 및 tetR 프로모터를 포함하는 pJH18 플라스미드를 제작하였다.
상기 pJH18 플라스미드를 백본으로 하여, tetR, Rluc8 및 사이토라이신 A(Cytolysin A, ClyA)를 암호화하는 유전자를 상기 프로모터의 하류에 하기 표 1과 같은 조합으로 도입하는 과정을 통해 pJH18-RR, pJH18-AR 및 pJH18-CR 플라스미드를 제작하였다(도 1의 B).
플라스미드 OXB1 tetA tetR
pJH18-RR tetR - Rluc8
pJH18-AR tetR Rluc8 -
pJH18-CR tetR cly A Rluc8
[1-2] OXB11, 13 및 20 프로모터를 포함하는 DNA 컨스트럭트 제작 상기 준비예 [1-1]과 동일한 방식으로, pSF-OXB11, pSF-OXB13 또는 pSF-OXB20을 주형으로 하여 정방향 프라이머 (5'-TGCTACTCCGTCAAGCCGTCAAGCTGTTGTGACCGCTTG-3': 서열번호 6) 및 역방향 프라이머 (5'-AGCTTGGTAACGAATCAGACGCCGGGTAATACCGGATAG-3': 서열번호 7)로 증폭된 항시적 프로모터인 OXB11, OXB13 및 OBX20을 깁슨 어셈블리 방식을 사용하여 상기 준비예 [1-1]에서 제작된 pJH18 플라스미드에 도입하였다(pTetOXB11-AR, pTetOXB11-RR, pTetOXB13-AR, pTetOXB13-RR, pTetOXB20-AR, pTetOXB20-RR). 여기서, 상기 플라스미드에 의한 단백질의 발현 효율은 OXB11, OXB13 및 OXB20 순으로 높으며, OXB1의 경우 가장 약한 단백질의 발현 효율을 나타낸다.
[1-3] Tac 프로모터를 포함하는 DNA 컨스트럭트 제작
상기 준비예 [1-1]에서 제작된 pJH18 플라스미드에 항시적 프로모터인 Tac를 도입하였다. 구체적으로는 Tac 정방향 프라이머 (5'-CCCTATGCTACTCCGTCAAGCCGTCAATTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTCTGATTCGTTACCAAGCT-3': 서열번호 10) 및 역방향 프라이머(5'-AGCTTGGTAACGAATCAGACATTATACGAGCCGATGATTAATTGTCAACAATTGACGGCTTGACGGAGTAGCATAGGG-3': 서열번호 11)로 항시적 프로모터인 Tac 프로모터 서열을 증폭한 뒤, 깁슨 어셈블리 방식을 사용하여 pJH18 플라스미드에 Tac 프로모터를 도입하여 pTetTac-RR 플라스미드를 제작하였다.
[1-4] J23101 프로모터를 포함하는 DNA 컨스트럭트 제작
마찬가지로, 상기 준비예 [1-1]에서 제작된 pJH18 플라스미드에 항시적 프로모터인 J23101를 도입하였다. 구체적으로는 J23101 정방향 프라이머 (5'-TGCTACTCCGTCAAGCCGTCTTTACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATGCTAGCCAATTGTCTGATTCGTTACC-3': 서열번호 12) 및 역방향 프라이머 (5'- GGTAACGAATCAGACAATTGGCTAGCATTATACCTAGGACTGAGCTAGCTGTAAAGACGGCTTGACGGAGTAGCA-3': 서열번호 13)로 항시적 프로모터인 J23101 프로모터 서열을 증폭한 뒤, 깁슨 어셈블리 방식을 사용하여 pJH18 플라스미드에 J23101 프로모터를 도입하여 pTetJ23101-RR 플라스미드를 제작하였다.
[1-5] J23119 프로모터를 포함하는 DNA 컨스트럭트 제작
마찬가지로, 상기 준비예 [1-1]에서 제작된 pJH18 플라스미드에 항시적 프로모터인 J23119를 도입하였다. 구체적으로는 J23119 정방향 프라이머 (5'- TGCTACTCCGTCAAGCCGTCTTGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATGCTAGCCAATTGTCTGATTCGTTACC-3': 서열번호 14) 및 역방향 프라이머 (5'- GGTAACGAATCAGACAATTGGCTAGCATTATACCTAGGACTGAGCTAGCTGTCAAGACGGCTTGACGGAGTAGCA-3': 서열번호 15)로 항시적 프로모터인 J23119 프로모터 서열을 증폭한 뒤, 깁슨 어셈블리 방식을 사용하여 pJH18 플라스미드에 J23119 프로모터를 도입하여 pTetJ23119-RR 플라스미드를 제작하였다.
[준비예 2] 암 세포주 및 배양 조건
CT26 결장암 세포주인 CRL-2638 및 HB-8064(ATCC, 미국)와 쥐의 대장 선암종 세포주인 MC38(Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School, 미국 및 전남대학교, 한국)을 실험에 사용하였다.
10% 우태아혈청(Fetal bovine serum;FBS) 및 1% 의 페니실린-스트렙토 마이신이 포함된 고 포도당 DMEM(Dulbecco's Modified Eagles Medium) 배지(카탈로그 번호: #LM 001-05, 웰진, 한국)을 사용하여, 5% CO2 배양기에서 37℃의 조건으로 상기 세포들을 배양하였다.
[준비예 3] 플라스미드가 도입된 살모넬라 균주 제작
살모넬라 균주는 ppGpp가 결핍되어 있는 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium; S.typhimurium)인 SHJ2037(relA::cat, spoT::kan)을 사용하였다.
살모넬라 균주에 상기 준비예 1에서 제작한 플라스미드를 전기청공법(Electroporation)을 이용하여 형질전환 한 뒤, 100㎍/ml의 엠피실린(Ampicillin)이 포함된 LB 배지를 이용하여 상기 형질전환된 각각의 균주를 밤새 배양하였다. 그 뒤, 상기 배양액을 엠피실린이 포함된 새로운 LB 배지를 사용하여 1:100의 비율로 희석하고, 추가 배양을 통해 OD600 값이 0.5 내지 0.7에 도달할 때, 상기 배양액에 최종 농도가 0, 10, 50, 100, 300, 500ng/ml으로 되도록 에탄올로 희석된 독시사이클린을 첨가하고 200rpm 및 37℃의 조건으로 진탕 배양기에서 배양하였다.
[준비예 4] 실험 동물 모델 준비
*20 내지 30g 무게에 해당하는 5 ~ 6 주령의 C57BL/6 및 BALB/C 쥐(오리엔트컴퍼니, 한국)를 사용하였다. 상기 준비예 2의 MC38 또는 CT26을 상기 쥐의 옆구리에 피하 주사하여, 종양 동물 모델을 구축하였다.
상기 종양 동물 모델의 영상화 및 종양 크기의 평가를 위해, 마취를 위해서는 2% 이소플루란(Isoflurane)을 사용하였으며, 수술 시에는 200mg/kg의 케타민(Ketamine) 및 10mg/kg의 실라신(Xylasine)을 사용하였다.
상기 종양 크기(mm3)의 평가는 (길이 × 높이 × 너비)/2를 이용하여 계산될 수 있도록 하였으며, 동물 모델의 종양 크기가 1500mm3 이상인 경우에는 동물 모델을 안락사 시켰다.
[실시예 1] pTetⅡ 플라스미드의 tetR 프로모터 예측
상기 준비예 [1-1]에서 중간산물로 제작된 pTetⅡ 플라스미드에서, tetR 단백질의 발현을 조절할 수 있는 프로모터의 서열을 BPROM(Bacterial sigma 70 promoter prediction program)을 이용하여 예측하고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에서 보는 바와 같이, pTetⅡ 플라스미드의 tetR 단백질을 기준으로 하여, -35 부위에 서열번호 6의 염기 서열이 예측되었고, -10 부위에 서열번호 7의 염기 서열이 예측되었다.
상기 결과를 통해, 본 발명에 따른 pTetⅡ 플라스미드는 별도의 OXB1과 같은 프로모터를 포함하지 않는 경우에도, -35 및 -10 부위에 서열번호 6 및 7이 각각 위치할 수 있는 경우에는 tetR 단백질이 자연적으로 발현될 수 있음을 알 수 있다.
[실시예 2] pJH18-RR 및 pJH18-AR 플라스미드가 도입된 균주에서 단백질의 발현 수준 및 루시퍼라아제의 활성 정도 비교
[2-1] 웨스턴 블롯 분석 및 쿠마시 블루(Coomassie Blue) 염색을 통한 단백질 발현 수준 비교
상기 준비예 [1-1]에서 제작된 플라스미드에서, tetA 및 tetR 프로모터의 하류에 도입된 유전자 간의 발현 수준이 균형을 이루는지 여부를 확인하기 위하여, 상기 준비예 [1-1]에서 제작된 플라스미드가 각각 도입되어 있는 상기 준비예 3의 균주에서 발현된 Rluc8 단백질을 쿠마시 블루 염색약을 통해 염색하거나, 상기 단백질에 특이적인 항체를 이용하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다.
구체적으로, 상기 준비예 3의 균주의 배양액을 4 x 107 CFU/ml이 되도록 PBS를 이용하여 희석하고, 13,000rpm에서 5분동안 원심분리 하여 펠렛을 수집하였다. 상기 펠렛 분획을 PBS를 이용하여 세척하고, 0.2% β-머캅토에탄올(β-mercaptoethanol) (카탈로그 번호: EBA-1052, ELPIS BIOTECH)이 포함된 SDS 샘플 완충액과 혼합하여 균주 용해물을 수득하였다. 그런 다음, 15% SDS-PAGE에서 상기 균주 용해물을 전기영동 하고, 상기 겔을 쿠마시 블루 염색약을 통해 염색하거나, 상기 겔로부터 니트로 셀룰로스 막에 단백질을 옮긴 뒤 5% 탈지유를 이용하여 상온에서 블로킹 하였다. 이후, Rluc8 항체(카탈로그 번호: AB3256, 밀리포어, 미국)를 이용하여 Rluc8 단백질의 발현 수준을 확인하고, 그 결과를 도 3의 A에 나타내었다.
도 3의 A에서 보는 바와 같이, tetA 프로모터로부터의 RLuc8 단백질의 발현 수준은 tetR 프로모터로부터 발현된 단백질의 수준 보다 2 내지 6 배 더 높았고, 독시사이클린 (10ng/ml)의 최저 농도에서도 포화된 유도제의 농도에 매우 민감하게 반응하였다.
[2-2] 루시퍼라아제 활성 분석을 통한 단백질의 기능적 발현 수준 비교
상기 준비예 [1-1]에서 제작된 플라스미드가 각각 도입되어 있는 상기 준비예 3의 균주에서 루시퍼라아제 활성의 측정을 위해, 상기 균주를 1ml의 PBS에 재현탁 시켰다. 그런 다음, 상기 재현탁된 균주에 기질인 에탄올에 희석된 1μg/ml의 코엘렌테라진(Coelenterazine)을 첨가한 뒤, NightOWL II LB 983 In Vivo 이미징 시스템(Berthold technologies, GmbH & Co. KG, 독일) 또는 바이오래드 이미저 ChemoDocTM XRS+시스템을 사용하여 1초 노출 시간의 조건으로 루시퍼라아제 활성 값을 측정하였다. 이렇게 측정된 값은 각 균주의 CFU에 의한 표준화를 수행하고, Rluc8이 포함되어 있지 않은 대조군 플라스미드가 포함되어 있는 값을 이용하여 정규화된 값인 상대적 발광 유닛(Relative luminescence units; RLU)으로 계산하여, 그 결과를 도 3의 B 및 C에 나타내었다.
도 3의 B 및 C에서 보는 바와 같이, 루시퍼라아제 활성 값은 독시사이클린이 존재하는 경우에서만 확인되었으며(도 3의 B), tetA 및 tetR 프로모터에 의해 조절되는 단백질의 활성 수준은 tetA 프로모터가 tetR 프로모터에 비하여 3배 정도로 높게 나타나는 것을 확인하였다(도 3의 C).
상기 결과를 통해, tetA 프로모터 및 tetR 프로모터를 억제할 수 있는 조절 단백질인 tetR 단백질이 별도의 프로모터에 의해 계속적으로 발현되는 경우에는 tetR 단백질의 억제제가 존재하는 경우에서만 tetA 프로모터 및 tetR 프로모터를 동시에 유도할 수 있음을 알 수 있다.
[2-3] pTetⅡ 플라스미드와 pJH18-CR 플라스미드 간의 루시퍼라아제 활성 비교
*상기 준비예 [1-1]에서 중간 산물로 제작된 pTetⅡ 플라스미드와 pJH18-CR 플라스미드를 각각 상기 준비예 3에서와 동일한 방법으로 균주에 도입한 뒤, 상기 균주 간의 루시퍼라아제 활성을 상기 실시예 [2-2]와 동일한 방법으로 측정하고, 그 결과를 도 4의 A 및 B에 나타내었다.
도 4의 A 및 B에서 보는 바와 같이, 루시퍼라아제 활성 값은 OXB1 프로모터가 존재하는 경우(pJH18-CR)에서뿐만 아니라, -35 부위 및 -10 부위에 각각 서열번호 8 및 서열번호 9로 표시되는 염기 서열이 위치하는 경우에도 동일하게 루시퍼라아제 활성 농도가 독시사이클린의 농도에 의존적으로 증가되는 것을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 본 발명에 따른 DNA 컨스트럭트가 포함된 플라스미드의 경우, 플라스미드에 내제되어 있는 염기 서열이 프로모터로 작용하여 조절 단백질의 발현이 유도될 수 있기 때문에, 조절 단백질의 상류에 별도의 프로모터를 인위적으로 도입하지 않더라도, 조절 단백질을 계속하여 발현시킬 수 있는 것을 알 수 있다.
[2-4] OXB1과 OXB11 프로모터가 포함된 DNA 컨스트럭트 간의 루시퍼라아제 활성 비교
상기 준비예 [1-2]에서 제작된 pTetOXB11 플라스미드와 pJH18 플라스미드를 각각 상기 준비예 3에서와 동일한 방법으로 균주에 도입한 뒤, 상기 균주 간의 루시퍼라아제 활성을 상기 실시예 [2-2]와 동일한 방법으로 측정하고, 그 결과를 도 5의 A 및 B에 나타내었다.
도 5의 A 및 B에서 보는 바와 같이, OXB11 프로모터가 존재하는 경우(pTetOXB11)보다, 약한 프로모터인 OXB1 프로모터가 존재하는 경우(pJH18)에서 루시퍼라아제 활성이 더 높은 것을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 중간 프로모터가 포함된 플라스미드와 비교하여, 약한 프로모터가 포함된 플라스미드의 경우, 그 프로모터의 하류에 존재하는 조절 단백질의 발현이 낮은 수준으로 발현되도록 함으로써 독시사이클린의 농도에 민감하게 반응되도록 하여 목적 단백질 발현 수준을 효과적으로 증가시키며, 궁극적으로 tetA 및 tetR 프로모터의 하류에 존재하는 유전자의 발현 수준이 균형을 이루도록 하는 것을 알 수 있다.
[실시예 3] pJH18-CR 플라스미드가 도입된 균주에서 단백질의 발현 및 활성 수준 비교
[3-1] 단백질 발현 및 활성 수준 비교
상기 실시예 [2-1] 및 [2-2]에 기재된 웨스턴 블롯 분석, 쿠마시 블루 염색 및 루시퍼라아제 활성 분석 방법과 동일한 방법을 통해, 상기 준비예 [1-1]의 pJH18-CR(POXB1::tetR, PtetA::ClyA 및 PtetR::Rluc8)이 준비예 3에 기재된 방법에 의해 도입된 균주에서 단백질 발현 수준 분석을 수행하여, 그 결과를 도 6의 A 및 B에 나타내었다.
도 6의 A 및 B에서 보는 바와 같이, pJH18-CR이 도입된 균주에 독시사이클린이 처리된 경우, 사이토라이신 A 단백질의 발현 수준과 Rluc8 단백질의 발현 수준이 거의 동등하게 균형적으로 발현되는 것을 확인하였다.
[3-2] 용혈 활성 확인
PBS에 희석된 상기 준비예 [1-1]의 pJH18-CR이 준비예 3에 기재된 방법에 의해 도입된 균주를 0 또는 20ng/ml의 독시사이클린이 포함된 혈액 아가 플레이트에 도말하고, 37℃에서 하룻밤 배양한 뒤 플레이트 사진을 촬영하여, 그 결과를 도 6의 C에 나타내었다.
도 6의 C에서 보는 바와 같이, 균주의 혈액 아가의 용혈 활성은 사이토라이신 A를 암호화하는 유전자의 상류에 존재하는 프로모터의 종류와 무관하게 독시사이클린이 포함된 경우(+)에서만 나타나는 것을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 본 발명에 따른 플라스미드의 tetA 및 tetR 프로모터가 독시사이클린에 의해서만 활성이 유도됨으로써 동시에 단백질 발현 수준을 효과적으로 조절할 수 있음을 알 수 있다.
[실시예 4] pJH87 및 pJH18-CR 플라스미드가 도입된 균주에서 단백질의 발현 수준 비교
상기 실시예 [2-1] 및 [2-2]에 기재된 웨스턴 블롯 분석, 쿠마시 블루 염색 및 루시퍼라아제 활성 분석 방법과 동일한 방법을 통해, 상기 pJH87(PtetA::ClyA 및 PtetR::TetR::Rluc8) 및 pJH18-CR(POXB1::tetR, PtetA::ClyA 및 PtetR::Rluc8)이 준비예 3에 기재된 방법에 의해 도입된 균주에서 독시사이클린의 농도가 20ng/ml 이상으로 투여함으로써 사이토라이신 A 단백질의 발현 수준이 포화되도록 유도한 상태에서 단백질 발현 수준 분석을 수행하여, 그 결과를 도 7의 A 내지 C에 나타내었다.
도 7의 A 내지 C에서 보는 바와 같이, pJH18-CR 플라스미드가 도입된 균주에서 사이토라이신 A 단백질의 발현 수준이 pJH87 플라스미드가 도입된 균주에 비하여 5배 정도 높게 나타나는 것을 확인하였다. 나아가, Rluc8 단백질의 활성 수준은 pJH87 플라스미드가 도입된 균주에 비하여, pJH18-CR 플라스미드가 도입된 균주에서 약 80배 정도 더 높게 나타나는 것을 확인하였다.
상기 결과를 통해, tetR을 암호화하는 유전자가 tetR 프로모터의 하류에 존재하도록 구성된 플라스미드에 비하여, 본 발명에서와 같이 tetR을 암호화하는 유전자가 별도의 프로모터, 특히 약한 프로모터에 의해 조절될 수 있도록 하는 경우에는 하나의 조절 인자에 의해 활성이 유도될 수 있는 tetA 및 tetR 프로모터에 의해 항암 단백질 및 리포터 유전자가 동시에 높은 수준으로 발현 및 활성이 유도될 수 있을 뿐만 아니라, 그 발현 및 활성 비율이 비교적 균형을 이룰 수 있음을 알 수 있다.
[실시예 5] 암이 발생되도록 한 종양 동물 모델에서 재조합 균주의 종양 억제 능력 및 영상화 분석
상기 준비예 3에 기재된 방식을 이용하여 pJH18-CR 또는 pJH18이 도입된 살모넬라 균주를 상기 준비예 4에서 구축된 종양 동물 모델의 꼬리 정맥에 주입하였다. 그런 다음, 상기 실시예 [2-1] 및 [2-2]에 기재된 루시퍼라아제 활성 분석 방법 및 웨스턴 블롯 분석 방법을 통해, 종양 동물 모델 내 균주의 영상화와 사이토라이신 A 단백질의 발현 수준 분석을 수행하여, 그 결과를 도 8의 A 내지 C에 나타내었다.
또한, 상기 종양 동물 모델에서 상기 준비예 4에서와 같이 0일 내지 34일동안 종양의 크기를 측정하고, 50일동안 상기 종양 동물 모델의 생존율을 측정하여, 그 결과를 도 9의 A 및 B에 나타내었다. 여기서, 대조군으로 상기 종양 동물 모델의 꼬리 정맥에 PBS만을 주입하였다.
도 8의 A 및 B에서 보는 바와 같이, 대조군과 비교하여, pJH18-CR이 도입된 살모넬라 균주가 주입된 종양 동물 모델의 종양 조직에서만 루시퍼라아제 활성이 측정되는 것을 확인하였다. 나아가, 상기 pJH18-CR이 도입된 살모넬라 균주가 주입된 종양 동물 모델의 종양 조직을 적출한 경우에도 루시퍼라아제의 활성이 측정되는 것을 확인하였다. 또한, 도 8의 C에서 보는 바와 같이, pJH18-CR이 도입된 살모넬라 균주의 경우 독시사이클린이 존재하는 경우(Dox+)에서만 특이적으로 사이토라이신 A 단백질이 발현되는 것을 확인하였다.
도 9의 A 및 B에서 보는 바와 같이, PBS 및 pJH18이 주입된 경우와 비교하여, pJH18-CR이 도입된 살모넬라 균주로부터 사이토라이신 A 단백질이 발현된 종양 동물 모델에서 종양의 크기가 현저하게 감소되고, 생존율이 증가됨을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 본 발명에 따른 pJH18-CR이 도입된 살모넬라 균주의 경우 하나의 조절 인자로 인하여 영상화가 가능한 단백질 및 항암 단백질의 발현을 조절하는 프로모터를 활성화함으로써, 종양이 발생된 개체에서 종양의 위치를 정확하게 영상화 할 수 있는 동시에 종양의 성장을 억제하여 암이 발생된 개체의 생존율을 현저하게 개선할 수 있음을 알 수 있다.
[실시예 6] 프로모터가 포함된 DNA 컨스트럭트 간의 루시퍼라아제 활성 비교
상기 준비예 [1-3] 내지 [1-5]에서 제작된 pTetTac-RR, pTetJ23101-RR, 및 pTetJ23119-RR 플라스미드를 각각 상기 준비예 3에서와 동일한 방법으로 균주에 도입한 뒤, 상기 균주 간의 루시퍼라아제 활성을 상기 실시예 [2-2]와 동일한 방법으로 측정하고, 그 결과를 도 10 및 11에 나타내었다.
도 10 및 11에서 보는 바와 같이, Tac, J23101 및 J23119 프로모터가 존재하는 플라스미드의 경우(pTetTac-RR, pTetJ23101-RR, pTetJ23119-RR)보다, OXB1 프로모터가 존재하는 플라스미드의 경우(pJH18)에서 독시사이클린에 대한 민감성과 루시퍼라아제 활성이 더 높은 것을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 공개된 항시적 프로모터가 포함된 플라스미드와 비교하여, 본 발명의 약한 프로모터가 포함된 플라스미드의 경우, 그 프로모터의 하류에 존재하는 조절 단백질의 발현이 낮은 수준으로 발현되도록 함으로써 독시사이클린의 농도에 민감하게 반응되도록 하여 목적 단백질 발현 수준을 효과적으로 증가시키며, 궁극적으로 tetA 및 tetR 프로모터의 하류에 존재하는 유전자의 발현 수준이 균형을 이루도록 하는 것을 알 수 있다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Industry Foundation of Channam National University CN CURE Co.,Ltd. <120> A gene construct for diagnosing and treating of tumors <130> PDPB187374k01d01 <150> KR 10-2019-0055063 <151> 2019-05-10 <160> 16 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 305 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ile Met Thr Gly Ile Phe Ala Glu Gln Thr Val Glu Val Val Lys 1 5 10 15 Ser Ala Ile Glu Thr Ala Asp Gly Ala Leu Asp Leu Tyr Asn Lys Tyr 20 25 30 Leu Asp Gln Val Ile Pro Trp Lys Thr Phe Asp Glu Thr Ile Lys Glu 35 40 45 Leu Ser Arg Phe Lys Gln Glu Tyr Ser Gln Glu Ala Ser Val Leu Val 50 55 60 Gly Asp Ile Lys Val Leu Leu Met Asp Ser Gln Asp Lys Tyr Phe Glu 65 70 75 80 Ala Thr Gln Thr Val Tyr Glu Trp Cys Gly Val Val Thr Gln Leu Leu 85 90 95 Ser Ala Tyr Ile Leu Leu Phe Asp Glu Tyr Asn Glu Lys Lys Ala Ser 100 105 110 Ala Gln Lys Asp Ile Leu Ile Arg Ile Leu Asp Asp Gly Val Lys Lys 115 120 125 Leu Asn Glu Ala Gln Lys Ser Leu Leu Thr Ser Ser Gln Ser Phe Asn 130 135 140 Asn Ala Ser Gly Lys Leu Leu Ala Leu Asp Ser Gln Leu Thr Asn Asp 145 150 155 160 Phe Ser Glu Lys Ser Ser Tyr Phe Gln Ser Gln Val Asp Arg Ile Arg 165 170 175 Lys Glu Ala Tyr Ala Gly Ala Ala Ala Gly Ile Val Ala Gly Pro Phe 180 185 190 Gly Leu Ile Ile Ser Tyr Ser Ile Ala Ala Gly Val Ile Glu Gly Lys 195 200 205 Leu Ile Pro Glu Leu Asn Asn Arg Leu Lys Thr Val Gln Asn Phe Phe 210 215 220 Thr Ser Leu Ser Ala Thr Val Lys Gln Ala Asn Lys Asp Ile Asp Ala 225 230 235 240 Ala Lys Leu Lys Leu Ala Thr Glu Ile Ala Ala Ile Gly Glu Ile Lys 245 250 255 Thr Glu Thr Glu Thr Thr Arg Phe Tyr Val Asp Tyr Asp Asp Leu Met 260 265 270 Leu Ser Leu Leu Lys Gly Ala Ala Lys Lys Met Ile Asn Thr Cys Asn 275 280 285 Glu Tyr Gln Gln Arg His Gly Lys Lys Thr Leu Phe Glu Val Pro Asp 290 295 300 Val 305 <210> 2 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 2 cggaattcac catgtctaga ttagataaaa gtaaagtgat taacag 46 <210> 3 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 3 gctctagaca gctgttaaga cccactttca catttaagtt gtttttct 48 <210> 4 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 4 ctactccgtc aagccgtcaa gctgttgtga ccgcttgct 39 <210> 5 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 5 tgaattcctc ctgctagcta gttggtaacg aatcagacgc cgggtaatac cggatag 57 <210> 6 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 6 tgctactccg tcaagccgtc aagctgttgt gaccgcttg 39 <210> 7 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 7 agcttggtaa cgaatcagac gccgggtaat accggatag 39 <210> 8 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> -35 promoter sequence <400> 8 ttcgcg 6 <210> 9 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> -10 promoter sequence <400> 9 atgcataat 9 <210> 10 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 10 ccctatgcta ctccgtcaag ccgtcaattg ttgacaatta atcatcggct cgtataatgt 60 ctgattcgtt accaagct 78 <210> 11 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 11 agcttggtaa cgaatcagac attatacgag ccgatgatta attgtcaaca attgacggct 60 tgacggagta gcataggg 78 <210> 12 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 12 tgctactccg tcaagccgtc tttacagcta gctcagtcct aggtataatg ctagccaatt 60 gtctgattcg ttacc 75 <210> 13 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 13 ggtaacgaat cagacaattg gctagcatta tacctaggac tgagctagct gtaaagacgg 60 cttgacggag tagca 75 <210> 14 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 14 tgctactccg tcaagccgtc ttgacagcta gctcagtcct aggtataatg ctagccaatt 60 gtctgattcg ttacc 75 <210> 15 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 15 ggtaacgaat cagacaattg gctagcatta tacctaggac tgagctagct gtcaagacgg 60 cttgacggag tagca 75 <210> 16 <211> 192 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> OXB1 promoter <400> 16 aagctgttgt gaccgcttgc tctagccagc tatcgagttg tgaaccgatc catctagcaa 60 ttggtctcga tctagcgata ggcttcgatc tagctatgta gaaacgccgt gtgctcgatc 120 gcctgacgct ttttatcgca actctctact gttgcttcaa cagaacatat tgactatccg 180 gtattacccg gc 192

Claims (29)

  1. 조절 단백질을 암호화하는 유전자;
    상기 조절 단백질을 암호화하는 유전자의 프로모터; 및
    항암 단백질을 암호화하는 유전자; 사이토카인을 암호화하는 유전자; 케모카인을 암호화하는 유전자; 면역 조절자(Immune modulator)를 암호화하는 유전자; 암 항원에 특이적인 올리고 뉴클레오티드; 및 리포터 단백질을 암호화하는 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나를 포함하는 DNA 컨스트럭트로서,
    상기 조절 단백질은 TetR 단백질이고,
    상기 조절 단백질을 암호화하는 유전자의 프로모터는 OXB1 프로모터인 것인 DNA 컨스트럭트.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제 1항에 있어서,
    시스-작용 인자(cis-acting element) 또는 트랜스-작용 인자(trans-acting element)에 의해 상기 조절 단백질의 발현이 조절되는, DNA 컨스트럭트.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 시스-작용 인자는 리보솜 결합 부위(ribosome binding site; RBS), 5'-비 번역 영역(5'-Untransrated Region; 5'-UTR), 전사 인자 결합 부위(transcription factor binding site) 및 종결자(terminators)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것인, DNA 컨스트럭트.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 전사 인자 결합 부위는, 상기 조절 단백질을 암호화하는 유전자의 프로모터; 인핸서(enhancer); 및 사일렌서(silencer);로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것인, DNA 컨스트럭트.
  7. 제 4항에 있어서,
    상기 트랜스-작용 인자는 전사 인자, 앱타머(aptamer), sRNA, 안티센스 RNA(antisense RNA; asRNA)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것인, DNA 컨스트럭트.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 항암 단백질은 독소 단백질, 암 항원에 특이적인 항체 또는 상기 항체의 단편, 종양억제 단백질(Tumor suppressor protein), 혈관신생 억제제, 암 항원, 전구약물 전환 효소(Prodrug-converting enzymes), 및 전세포사멸 단백질(pro-apoptotic protein)로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것인, DNA 컨스트럭트.
  9. 제 8항에 있어서,
    상기 독소 단백질은 리신(Ricin), 사포린 (Saporin), 젤로닌(Gelonin), 모로딘(Momordin), 데보가닌(Debouganin), 디프테리아독소, 녹농균독소(Pseudomonas toxin), 헤모라이신(HlyA), FAS 리간드(FAS ligand; FASL), 종양 괴사 인자-α(Tumour necrosis factor-α; TNF-α), TNF-연관 세포사멸-유발 리간드(TNF-related apoptosis-inducing ligand; TRAIL) 및 사이토라이신 A(Cytolysin A, ClyA)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것인, DNA 컨스트럭트.
  10. 제 8항에 있어서,
    상기 종양억제 단백질은 RB(Retinoblastoma protein) 단백질, p53 단백질, APC(Adenomatous polyposis coli) 단백질, PTEN(Phosphatase and tensin homologue) 단백질 및 CDKN2A(cyclin dependent kinase inhibitor 2A) 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것인, DNA 컨스트럭트.
  11. 제 8항에 있어서,
    상기 혈관신생 억제제는 안지오스타틴(angiostatin), 엔도스타틴(endostatin), 트롬보스폰딘(Thrombospondin) 및 단백 분해효소 억제 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것인, DNA 컨스트럭트.
  12. 제 8항에 있어서,
    상기 암 항원은 알파-페토프로테인(α-fetoprotein; AFP), 혈관내피성장인자 수용체 2(Vascular endothelial growth factor receptor 2; VEGFR2), 서비빈(Survivin), 레구메인(Legumain) 및 전립선 암 특이적 항원(Prostate cancer specific antigen; PCSA)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것인, DNA 컨스트럭트.
  13. 제 8항에 있어서,
    상기 전구약물 전환 효소는 티미딘 키나제(Thymidine kinase), 시토신 디아미나아제(cytosine deaminase), 니트로리덕타아제(nitroreductase), 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라아제(purine nucleoside phosphorylase), 카르복시펩티다아제 G2(carboxypeptidase G2), 크로메이트 리덕타아제 YieF(chromate reductase YieF), 헤르페스 심플렉스 바이러스 I형 티미딘 키나아제/간시클로비르(herpes simplex virus type I thymidine kinase/ganciclovir; HSV1-TK/GCV) 및 β글루터로니다아제(β-glucuronidase)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것인, DNA 컨스트럭트.
  14. 제 8항에 있어서,
    상기 전세포사멸 단백질은 L-아스나아제(L-ASNase) 또는 RNA-결합 모티프 단백질 5(RNA-binding motif protein 5; RBM5)인 것인, DNA 컨스트럭트.
  15. 제 1항에 있어서,
    상기 암 항원에 특이적인 올리고 뉴클레오티드는 안티센스 올리고 뉴클레오티드, 앱타머(aptamer), siRNA 및 shRNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 암호화하는 염기 서열인 것인, DNA 컨스트럭트.
  16. 제 1항에 있어서,
    상기 리포터 단백질은 형광 단백질, 루시퍼라아제(Luciferase) 및 핵의학 또는 MRI 영상 촬영에 사용되는 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것인, DNA 컨스트럭트.
  17. 제 16항에 있어서,
    상기 형광 단백질은 녹색 리포터 단백질(Green Fluorescent Protein; GFP), 변형된 녹색 리포터 단백질(Modified Green Fluorescent Protein; MGFP), 증강된 녹색 리포터 단백질(Enhanced Green Fluorescent Protein; EGFP), 적색 리포터 단백질(Red Fluorescent Protein; RFP), 증강된 적색 리포터 단백질(Enhanced Red Fluorescent Protein; ERFP), 청색 리포터 단백질(Blue Fluorescent Protein; BFP), 증강된 청색 리포터 단백질 Enhanced Blue Fluorescent Protein; EBFP), 황색 리포터 단백질(Yellow Fluorescent Protein; YFP) 및 증강된 황색 리포터 단백질(Enhanced Yellow Fluorescent Protein; EYFP)로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것인, DNA 컨스트럭트.
  18. 제 16항에 있어서,
    상기 핵의학 또는 MRI 영상 촬영에 사용되는 단백질은 단순포진바이러 스의 티미딘인산효소(Herpes simplex virus thymidine kinsease), 도파민수용체(Dopamine receptor), 소마토스타틴 수용체(Somatostatin receptor), 소디움-요오드 수송체(Sodium-iodide transporter), 철 수용체, 트렌스 페린 수용체(Transferrin receptor), 페리틴(Ferritin) 및 철 수송체(magA)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것인, DNA 컨스트럭트.
  19. 제 1항의 DNA 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터.
  20. 제 19항의 재조합 벡터가 도입된 균주.
  21. 제 20항에 있어서,
    상기 균주는 살모넬라 속 균주, 클로스트리듐(Clostridium) 속 균주, 비피도박테리움(Bifidobacterium) 속 균주 및 대장균 속 균주로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것인, 균주.
  22. 제 20항의 균주를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  23. 제 22항에 있어서,
    상기 암은 흑색종, 나팔관암, 뇌암, 소장암, 식도암, 임파선암, 담낭암, 혈액암, 갑상선암, 내분비선암, 구강암, 간암, 담도암, 대장암, 직장암, 자궁경부암, 난소암, 신장암, 위암, 십이지장암, 전립선암, 유방암, 뇌종양, 폐암, 갑상선 미분화암, 자궁암, 결장암, 방광암, 요관암, 췌장암, 뼈/연부조직 육종, 피부암, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 다발성 골수종, 백혈병, 골수이형성증후군, 급성 림프모구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병 및 고립성 골수종으로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것인, 약학 조성물.
  24. 제 20항의 균주를 유효성분으로 포함하는 암의 진단용 조성물.
  25. 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에 제 20항의 균주를 처리하는 단계를 포함하는 암의 진단을 위한 정보 제공 방법.
  26. 제 25항에 있어서,
    상기 균주로부터 리포터 단백질이 발현되는 경우 암으로 진단하는 단계를 더 포함하는, 암의 진단을 위한 정보 제공 방법.
  27. 삭제
  28. 삭제
  29. 삭제
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