CN116113426A

CN116113426A - 癌症治疗

Info

Publication number: CN116113426A
Application number: CN202180056659.7A
Authority: CN
Inventors: L·德班; H·列维茨基
Original assignee: Procarrim Ltd
Current assignee: Procarrim Ltd
Priority date: 2020-06-10
Filing date: 2021-06-10
Publication date: 2023-05-12
Also published as: BR112022025245A2; WO2021250200A1; AU2021288622A1; US20220354904A1; JP2023529957A; US20210386794A1; US11529378B2; KR20230023731A; MX2022015623A; IL298865A; US20230143897A1; EP4164662A1; CA3186261A1; EP3922255A1

Abstract

本发明涉及癌症治疗领域。特别地，本发明涉及一种减活的革兰氏阴性菌，其用于治疗、减轻、抑制或控制正在接受或意欲接受检查点抑制剂疗法、过继性细胞疗法和/或同种异体或自体CAR‑T疗法的受试者的肿瘤性疾病，同时、分别或顺序给予减活的革兰氏阴性菌。

Description

癌症治疗

技术领域

本发明涉及癌症治疗领域。特别地，本发明涉及一种预防、治疗或抑制受试者的肿瘤性疾病发展的方法。

背景技术

随着我们对与癌症形成和进展相关的作用机制的理解的提高，癌症治疗领域正在不断地开展新的疗法。

目前，对癌症患者最有希望的治疗策略之一是免疫疗法。这种疗法的目的是提高身体的自然防御能力以对抗癌症或肿瘤。该疗法利用人体制造的物质，或在实验室中人工制造的物质来改善或恢复免疫系统功能。免疫疗法的类型包括单克隆抗体、不限肿瘤类型(tumour-agnostic)疗法、非特异性免疫疗法、溶瘤病毒疗法、过继性细胞转移(adoptivecell transfer)，如CAR T细胞疗法和癌症疫苗。非特异性免疫疗法包括使用干扰素或白细胞介素治疗，帮助免疫系统对抗癌症且减缓癌细胞生长的分子或在某些情况下摧毁癌症。免疫疗法可以代替传统的癌症治疗，如化疗或放疗给予，或与此类治疗结合使用。

虽然免疫疗法在一定程度上是成功的，但仍有大量挑战需要克服。其中一个问题是免疫疗法产生的副作用。免疫疗法的目的是刺激免疫系统发挥作用，从而使癌症或肿瘤更容易受到巡逻免疫细胞的攻击。然而，由于阻断了免疫激活的控制机制，一些免疫疗法由于自身免疫的毒性而导致了副作用。此外，一些免疫疗法无法区分癌细胞和健康细胞。因此，个体的生活质量可能受到严重影响。

此外，虽然免疫疗法已被证明是有效的，但仍有很大一部分个体对癌症治疗保持难治性。这类疗法在一些个体身上可能不如最初预期的有效，原因有很多。这些原因包括待治疗的癌症的复杂性、接受治疗个体的健康状况(已知老年个体和有潜在健康状况的个体的免疫系统较弱)、癌细胞对免疫系统的“隐藏”能力以及癌细胞有能力抑制免疫系统反应的挑战。

因此，在癌症领域，仍然非常需要能够改善目前使用的免疫疗法的毒性特征，同时在那些有积极反应的个体中保持所述治疗的疗效的方法。同时，对于能够提高免疫疗法在那些对所述治疗难于接受的个体中的疗效的方法有很大需求。

发明内容

本发明提供了一种治疗和/或预防受试者肿瘤性疾病的有效方法，所述方法是将减活(live attenuated)的革兰氏阴性菌与检查点抑制剂疗法、过继性细胞疗法和/或同种异体或自体CAR T细胞疗法联合给药。本发明人出人意料地发现，与受试者单独接受任何一种元素的治疗相比，这种结合产生一种更有效的疗法，即达到了加成或协同效应。据信，从给予减活的革兰氏阴性菌中观察到的系统性改变，与所述减活的革兰氏阴性菌的肠道吸收相结合，可以增强癌症免疫疗法的抗肿瘤活性。

在本发明的第一方面，存在一种减活的革兰氏阴性菌，其用于治疗、减轻、抑制或控制正在接受或意欲接受检查点抑制剂疗法、过继性细胞疗法和/或同种异体或自体CAR-T疗法的受试者肿瘤性疾病，同时、分别或顺序给予减活的革兰氏阴性菌，其中减活的革兰氏阴性菌为口服给药、皮下给药或肌内给药。

在本发明的第二方面，存在一种减活的革兰氏阴性菌，其用于治疗、减轻、抑制或控制正在接受或意欲接受检查点抑制剂疗法、过继性细胞疗法和/或同种异体或自体CAR-T疗法的受试者肿瘤性疾病，其中所述减活的革兰氏阴性菌将在第一治疗阶段给予，而检查点抑制剂疗法、过继性T细胞疗法和/或同种异体或自体CAR-T疗法将在第二治疗阶段给予。

在本发明的第三个方面，存在一种减活的革兰氏阴性菌，其用于治疗、减轻、抑制或控制正在接受或意欲接受检查点抑制剂疗法、过继性细胞疗法和/或同种异体或自体CAR-T疗法的受试者肿瘤性疾病，同时、分别或顺序给予减活的革兰氏阴性菌，其中所述减活的革兰氏阴性菌是非重组的，或其中所述减活的革兰氏阴性菌不包含编码治疗性蛋白的真核异源DNA。

在本发明的第四方面，存在一种治疗、抑制或控制受试者的肿瘤性疾病的方法，其中该方法包括同时、分别或顺序向受试者给予：(i)减活的革兰氏阴性菌，其中所述减活的革兰氏阴性菌是口服给药、皮下给药或肌内给药，和(ii)检查点抑制剂疗法、过继性细胞疗法和/或同种异体或自体CAR-T疗法，其中相对于单独给予减活的革兰氏阴性菌或检查点抑制剂疗法、过继性细胞疗法和/或同种异体或自体CAR-T疗法而言，所述方法产生了增强的治疗效果。

在本发明的第五方面，存在一种治疗、抑制或控制受试者肿瘤性疾病的方法，其中该方法包括同时、分别或顺序向受试者给予：(i)减活的革兰氏阴性菌，其中所述减活的革兰氏阴性菌将在第一治疗阶段给予，和(ii)检查点抑制剂疗法、过继性细胞疗法和/或同种异体或自体CAR-T疗法，其将在第二治疗阶段给予，其中相对于单独给予减活的革兰氏阴性菌或检查点抑制剂疗法、过继性细胞疗法和/或同种异体或自体CAR-T疗法而言，所述方法产生了增强的治疗效果。

在本发明的第六方面，存在一种治疗、抑制或控制受试者肿瘤性疾病的方法，其中该方法包括同时、分别或顺序向受试者给予：(i)减活的革兰氏阴性菌，其中所述减活的革兰氏阴性菌是非重组的，或其中所述减活的革兰氏阴性菌不包含编码治疗性蛋白的真核异源DNA，和(ii)检查点抑制剂疗法、过继性细胞疗法和/或同种异体或自体CAR-T疗法，其中相对于单独给予减活的革兰氏阴性菌或检查点抑制剂疗法、过继性细胞疗法和/或同种异体或自体CAR-T疗法而言，所述方法产生了增强的治疗效果。

附图说明

图1示出了口服给药沙门氏菌(Salmonella)诱导全身骨髓细胞长期表型的显著变化。A&B)图示出了标记物CD80、CD86和PD-L1在活的CD11c^高、HLA-DR⁺、CD11b^+/-、PDCA-1^-常规树突状细胞和活的CD11c^-/低、PDCA1⁺、HLA-DR^-/Int、CD11b^-浆细胞样树突状细胞上的中位荧光强度值；C&D)图示出了标记物PD-L1、CD80和HLA-DR在活的CD11c^-、CD11b⁺、Ly6C⁺、F4/80^-单核细胞和活的CD11c^-、CD11b⁺、Ly6C^-、F4/80⁺巨噬细胞上的中位荧光强度值。n＝4或5只小鼠/组。

图2示出了沙门氏菌诱导的表型变化的时间进程。A)实验示意图，详细说明了实验的时间轴；B)图示出了标记物CD80和CD86的中位荧光强度值占PBS对照组平均值的百分比，其对于活的CD11c^高、HLA-DR⁺、CD11b^+/-、PDCA-1^–常规树突状细胞(cDC)和活的CD11c^–/低、PDCA1⁺、HLA-DR^-/Int、CD11b^-浆细胞样树突状细胞(pDC)。图中示出了n＝4-5只小鼠/组的平均值；C)图示出了标记物CD80、PD-L1和HLA-DR的中位荧光强度值占PBS对照组平均值的百分比，其对于活的CD11c^-、CD11b⁺、Ly6C⁺、F4/80^-单核细胞和活的CD11c^-、CD11b⁺、Ly6C^-、F4/80⁺巨噬细胞。图中示出了n＝4-5只小鼠/组的平均值。

图3示出了口服给药沙门氏菌导致骨髓细胞生成增强。A)图示出了谱系阴性(CD5^-、CD11b^-、B220^-、GR-1^-、Terr-119^-、Ly-6B.2^-)活细胞表达c-Kit和Sca-1的百分比，称为骨髓细胞总数的LKS细胞。n＝4-5只小鼠/组；B)代表性的流式细胞仪图示出了用沙门氏菌口服治疗的动物骨髓中LKS活细胞增加；C)在用沙门氏菌治疗后的第14天，骨髓细胞总数中的LKS活细胞百分比与同一时间点的单核细胞(活的CD11c-、CD11b+、Ly6C+、F4/80-细胞)百分比使用Spearman等级相关相关联。

图4示出了口服给药沙门氏菌诱导全身树突状细胞的高反应状态，持续至少14天。单项研究中n＝5只小鼠/组；条形图是平均值+/-SEM；所示的统计数据是Mann-Whitney检验。

图5示出了口服给药沙门氏菌的治疗导致肿瘤生长减慢，而与免疫检查点抑制剂联合给予时疗效增强。A)图示出了MC38肿瘤体积随时间变化，描述了肿瘤的生长。表中总结了不同治疗方法在第14天和第30天之间相对于对照组(赋形剂+同种型)的平均肿瘤生长抑制百分比。数据是每组10只小鼠的平均值+/-SEM。B)图示出了肿瘤体积随时间的变化，描述了肿瘤的生长。表中总结了不同治疗方法在第16天和第18天之间相对于对照组(赋形剂+同种型)的平均肿瘤生长抑制百分比。数据是每组9-10只小鼠的平均值+/-SEM。

图6示出了用沙门氏菌体外调节巨噬细胞使M1细胞进一步极化为炎症表型，并诱导M2极化为M1样表型巨噬细胞。数据代表来自3个独立供体的单核细胞衍生的巨噬细胞。

图7示出了人单核细胞的体外调节克服了M2极化并降低了其抑制能力。A)图代表复制指数，示出了响应T细胞的倍数扩增和经历大于2次细胞分裂的T细胞的百分比；B)阳性对照数据显示了抗CD3/28抗体对T细胞的有效刺激；C)代表性流式细胞仪图示出了在用沙门氏菌调节的单核细胞衍生的巨噬细胞存在下，T细胞增殖增加。

图8示出了人单核细胞的体外调节克服了M2极化并增强了抗PD-L1抗体活性。用沙门氏菌调节的人单核细胞衍生的巨噬细胞增强了PD-L1阻断的功效。A)图示出了复制指数，其代表响应T细胞的倍数扩增和经历大于2次细胞分裂的T细胞的百分比；B)阳性对照数据显示了抗CD3/28抗体对T细胞的有效刺激；C)CellTrace稀释的代表性流式细胞仪图示出了当将PD-L1阻断与用沙门氏菌调节的单核细胞衍生的巨噬细胞相结合时，T细胞增殖增加。

具体实施方式

为了更容易理解本发明，首先定义某些术语。另外的定义在整个详细描述中阐述。

如本文所使用的，术语“减毒”是指经过基因修饰，以便在人类或动物受试者/模型中不引起疾病的细菌。

所谓“免疫疗法”，本申请是指旨在调节免疫系统成分(如抗体或免疫细胞)的特殊疗法，或通过刺激、抑制或以其他方式调节免疫系统的药物或其他药剂。在本发明的上下文中，术语“免疫疗法”是指检查点抑制剂疗法、过继性细胞疗法和/或自体或同种异体CAR T细胞疗法。

所谓“免疫系统的细胞成分”，本申请是指免疫细胞如淋巴细胞，如T和B淋巴细胞、γ-δT细胞和NK细胞，它们可以识别特定的抗原，如朊病毒、病毒、细菌、酵母、真菌、寄生虫、肿瘤相关或肿瘤特定的抗原，或其他与特定疾病、病症或病况相关的抗原。本申请提及的其他免疫细胞包括白血球，其可以是粒细胞或无粒细胞。免疫细胞的实例包括中性粒细胞、嗜酸粒细胞、嗜碱粒细胞、淋巴细胞、单核细胞和巨噬细胞。树突状细胞、小神经胶质细胞和其他抗原呈递细胞也包括在此定义内。

所谓“免疫治疗组合物”，本申请是指包含免疫治疗剂的任何组合物。实例可以是药学上可接受的载体、增强免疫应答的生物反应调节剂和/或佐剂/赋形剂或稀释剂。

如本文所使用的，在本发明的上下文中，术语“减毒”是指改变微生物以降低其致病性，使其对宿主无害，同时保持其活力。这种方法通常用于开发疫苗，因为它能够引起高度特异性的免疫应答，同时保持可接受的安全状况。这种疫苗的开发可能涉及一些方法，实例包括但不限于：在体外条件下传递病原体直到失去毒力，化学诱变和基因工程技术。虽然也公开了非减活的微生物，但这种减毒的微生物优选是减活的微生物。

所谓“非天然细菌”，本申请意指经过基因修饰或“工程化”的细菌(原核)细胞，其与自然产生的细胞相比发生了改变。例如，这种基因修饰可以是将额外的遗传信息并入到细胞中，修饰现有的遗传信息或实际上使现有的遗传信息缺失。例如，这可以通过将重组质粒转染到细胞中或直接对细菌基因组进行修饰的方式实现。

所谓“失活突变”，本申请意指对特定基因或与该基因相关的基因启动子的天然遗传密码的修饰，例如通过改变核苷酸密码或者使部分核苷酸缺失或者添加非编码核苷酸或非天然核苷酸进行修饰，从而使特定基因不能适当地转录或翻译，或表达为非活性蛋白，从而使该基因的天然功能被取消或减少到无法测量的程度。因此，基因的突变使该基因的功能或该基因所编码的蛋白的功能失活。

术语“肿瘤”、“癌症”和“瘤形成”可互换使用，是指其生长、增殖或存活大于正常对应细胞的生长、增殖或存活的细胞或细胞群，例如细胞增殖或分化障碍。通常，所述生长不受控制。术语“恶性”是指侵入邻近组织。术语“转移灶”是指肿瘤、癌症或瘤形成向受试者中其他部位、位置或区域的扩散或传播，其中所述部位、位置或区域不同于原发性肿瘤或癌症。

“检查点抑制剂”是一种作用于被认为是免疫应答检查点的表面蛋白的药剂，所述蛋白是TNF受体或B7超家族的成员，或其他成员，所述药剂包括与负性共刺激分子结合的药剂。这种检查点抑制剂的实例包括但不限于与CTLA-4、PD-1、TIM-3、BTLA、TIGIT、VISTA、LAG-3和/或它们各自包括PD-L1的配体结合的药剂。在本发明的上下文中，术语“药剂”可指抗体、小分子、抗体片段或任何其他结合剂和/或阻断剂。

术语“程序性死亡1”、“程序性细胞死亡1”、“蛋白质PD-1”、“PD-1”、CD279和“PD1”可互换使用，并且包括人PD-1的变体、异构体、物种同系物，以及与PD-1具有至少一个共同表位的类似物。完整的PD-1序列可以在GenBank登录号NP 005009.2下找到。

术语“PD-L1”、“PDL1”、“程序性死亡配体1”、CD274和“程序性细胞死亡1”可互换使用，并且包括人PD-L1的变体、异构体和物种同系物，以及与PD-L1具有至少一个共同表位的类似物。完整的PD-L1序列可以在GenBank登录号NP 054862.1下找到。

术语“细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4”、“CTLA-4”、“CTLA4”、CD152和“CTLA-4抗原”可互换使用，并且包括人CTLA-4的变体、异构体、物种同系物，以及与CTLA-4具有至少一个共同表位的类似物。完整的CTLA-4序列可以在GenBank登录号NP_005205.2下找到。

术语“LAG-3”、“LAG3”、CD223和“淋巴细胞激活基因3”可互换使用，并且包括人LAG-3的变体、异构体和物种同系物，以及与LAG-3具有至少一个共同表位的类似物。完整的LAG-3序列可以在GenBank登录号NP_002277.4下找到。

术语“TIM-3”、“TIM3”、“HAVCR2”、“甲型肝炎病毒细胞受体2”、CD366和“T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域3”可互换使用，并且包括人TIM-3的变体、异构体和物种同系物，以及与TIM-3具有至少一个共同表位的类似物。完整的TIM-3序列可以在GenBank登录号NP_116171.3下找到。

术语“BTLA”、“B和T淋巴细胞减弱剂”和“CD272”可互换使用，并且包括人BTLA的变体、异构体和物种同系物，以及与BTLA具有至少一个共同表位的类似物。完整的BTLA序列可以在GenBank登录号NP_861445.4下找到。

术语“VISTA”、“V-集免疫调节受体”、“B7H5”、“B7-H5”、“PD-1H”和“T细胞活化的V-结构域Ig抑制剂”可互换使用，并且包括人VISTA的变体、异构体和物种同系物，以及与VISTA具有至少一个共同表位的类似物。完整的VISTA序列可以在GenBank登录号NP_071436.1下找到。

术语“TIGIT”、“具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体”、“WUCAM”和“Vstm3”可互换使用，并且包括人TIGIT的变体、异构体和物种同系物，以及与TIGIT具有至少一个共同表位的类似物。完整的TIGIT序列可以在GenBank登录号NP_776160.2下找到。

本文提及的术语“治疗性抗体”包括完整抗体和任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或其产生治疗效果的单链。

这种治疗性抗体可以针对上述检查点抑制剂分子，或包括针对共刺激分子靶点的激动性抗体，如ICOS(诱导性T细胞共刺激/CD278)、GITR(糖皮质激素诱导的TNF受体/TNFRSF18/CD357/AITR)、4-1BB(CD137)、CD27和CD40。在某些情况下，受试者接受两种类型的治疗性抗体可能是可取的。

如本文所使用的，术语“单克隆抗体”是指抗体分子的单分子组合物的制品。单克隆抗体组合物对特定表位呈现出单一的结合特异性和亲和力。单克隆抗体可以是人抗体或人源化抗体。

术语“过继性细胞疗法”意指任何涉及将细胞转移/给予至受试者(优选人类)的疗法。这些细胞可以是自体的或同种异体的。优选地，这些细胞通常来自以提高免疫功能为目标的免疫系统。过继性细胞疗法包括但不限于CAR T细胞疗法(嵌合抗原受体T细胞)、TIL疗法(肿瘤浸润淋巴细胞)、TCR疗法、工程T细胞受体疗法、NK疗法(自然杀伤细胞)和/或iPSC-衍生疗法(诱导多能干细胞)。

术语“有效量”或“药学上有效量”是指足够量的药剂，以提供所期望的生物学或治疗结果。该结果可以是疾病的征象、症状或原因中的一种或多种的减少、改善、缓解、减轻、延缓和/或缓和，或生物系统的任何其他所期望的改变。就癌症而言，有效量可以包含足以引起肿瘤缩小和/或降低肿瘤生长速率(例如抑制肿瘤生长)或者预防或延缓其它不想要的细胞增殖的量。在一些实施方案中，有效量是足以延缓癌症或肿瘤的发展，或者延长癌症或肿瘤生存期或诱导癌症或肿瘤稳定的量。

在一些实施方案中，治疗有效量是足以预防或延缓复发的量。治疗有效量可以在一次或多次给药中给予。治疗有效量的药物或结合物可带来以下的一种或多种：(i)减少癌细胞的数量；(ii)减小肿瘤大小；(iii)在一定程度上抑制、延缓、减慢并优选阻止癌细胞浸润到外周器官中；(iv)抑制(即减慢至一定程度并优选停止)肿瘤转移；(v)抑制肿瘤生长；(vi)预防或延缓肿瘤的发生和/或复发；和/或(vii)在一定程度上减轻与癌症相关的一种或多种症状。

例如，为了治疗肿瘤，“治疗有效剂量”可相对于基线测量结果诱导肿瘤缩小至少约5％，例如至少约10％，或约20％，或约60％或更多。基线测量结果可来自未经治疗的受试者。

治疗有效量的治疗性化合物可以在受试者中减小肿瘤大小或者减轻症状。本领域技术人员将能够基于例如受试者的体型、受试者症状的严重程度以及所选择的特定组合物或给药途径等因素来确定这样的量。

术语“免疫应答”是指例如淋巴细胞、抗原呈递细胞、吞噬细胞、粒细胞和由上述细胞或肝脏产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补体)的作用，所述作用导致对癌细胞的选择性损伤、破坏或从人体内清除。

术语“治疗(treatment)”或“治疗(therapy)”是指以治愈、痊愈、减轻、缓解、改变、补救、缓和、改善或影响病症(例如疾病)、病症的症状，或预防或延缓疾病的症状、并发症、生化征象的发作，或者以统计学上显著的方式阻止或抑制疾病、病况或病症的进一步发展为目的而施用活性剂。

如本文所使用的，术语“受试者”旨在包括人类和非人类动物。优选的受试者包括需要增强免疫应答的人类患者。所述方法特别适用于治疗患有可通过增强免疫应答治疗的病症的人类患者。在一个具体的实施方案中，所述方法特别适合于癌症的体内治疗。

如本文所定义，“同时”给予包括在约2小时或约1小时内或更少的时间内、甚至更优选在同一时间给予减活的细菌和免疫治疗组合物。

如本文所定义，“分别”给予包括间隔多于约12小时或约8小时，或约6小时或约4小时或约2小时给予减活的细菌和免疫治疗组合物。

如本文所定义，“顺序”给予包括将减活的细菌和免疫治疗组合物各自以多个等分试样和/或剂量给予和/或在单独的时机给予。免疫治疗组合物可在给予减活的细菌之前和/或之后给予至患者。或者，免疫治疗组合物在用减活的细菌治疗后继续给予至患者。

替代方案(例如，“或”)的使用应理解为意指这些替代方案中的任一个、两个或它们的任何组合。如本文所使用的，不定冠词“一(a)”或“一个(an)”应理解为是指任何记载或列举的成分中的“一个或多个”。

如本文所使用的，“约”意指在由本领域技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，其将部分取决于如何测量或确定该值，即测量系统的限制。例如，“约”可意指本领域的每次操作在1个或多于1个标准偏差内。或者，“约”可意指最高达20％的范围。当在本申请和权利要求中提供特定值时，除非另有说明，否则“约”的含义应被假定为在该特定值的可接受误差范围内。

如本文所使用的，术语“非重组”和“非重组菌株”可互换使用，在本发明的上下文中，其是指这些菌株不含有来自真核生物的基因或基因片段。因此，本文所公开的菌株不作为“载体菌株”来向受试者/患者递送治疗分子。因此，本文所公开的菌株不编码真核异源DNA，或编码治疗分子的真核异源DNA，或编码拟作为抗原的蛋白质或其片段的真核DNA。

如本文所使用的，术语“全身”和“全身性激活”可互换使用，在本发明的上下文中，其是指受试者全身广泛的免疫应答，而不是局部的、空间上受限制的免疫应答。优选地，全身免疫应答涉及骨髓细胞(例如树突状细胞、单核细胞和/或巨噬细胞)的激活和/或成熟，在本发明的上下文中被认为有助于控制受试者的免疫系统，从而使受试者对例如检查点抑制剂、过继性细胞疗法和/或CAR T细胞疗法的免疫疗法更具反应性。因此，革兰氏阴性菌可以起到“激发”、“提高”、“扩大”、“加强”、“改善”、“增强”、“预激活”或“促进”受试者在给予第二组合物后的免疫应答。上述术语可与术语“调节(conditioned)”互换使用。

如本文所使用的，术语“不限肿瘤类型疗法”或“与肿瘤类型无关”可互换使用，其是指根据遗传和/或分子特征使用药物或其他物质治疗癌症的疗法类型，而不考虑癌症类型或癌症在体内的起始位置。

因此设想，减活的革兰氏阴性菌可以作为受试者免疫系统的调节剂，导致受试者的免疫系统在接受检查点抑制剂、过继性细胞疗法和/或自体或同种异体CAR-T疗法治疗时能够对肿瘤性疾病产生有效的免疫应答。

本发明的减活的细菌为革兰氏阴性菌。用于本发明的革兰氏阴性菌的实例包括但不限于大肠杆菌(Escherichia coli)、沙门氏菌、志贺氏菌(Shigella)、假单胞菌(Pseudomonas)、莫拉氏菌(Moraxella)、螺旋菌(Helicobacter)、寡养单胞菌(Stenotrophomonas)、噬菌蛭弧菌(Bdellovibrio)、军团菌(Legionella)、衣原体(Chlamydia)和耶尔森氏菌(Yersinia)。

优选地，减活的革兰氏阴性菌为沙门氏菌属。用于本发明的沙门氏菌属的实例是肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)和邦戈尔沙门氏菌(Salmonella bongori)。肠道沙门氏菌可进一步细分为不同的血清分型(serotypes)或血清变型(serovars)。用于本发明的所述血清分型或血清变型的实例是伤寒肠道沙门氏菌(Salmonella enterica Typhi)、甲型副伤寒肠道沙门氏菌(Salmonella enterica Paratyphi A)、乙型副伤寒肠道沙门氏菌(Salmonella enterica Paratyphi B)、丙型副伤寒肠道沙门氏菌(Salmonellaenterica Paratyphi C)、鼠伤寒肠道沙门氏菌(Salmonella enterica Typhimurium)和肠炎肠道沙门氏菌(Salmonella enterica Enteritidis)。在一个优选的实施方案中，减活的革兰氏阴性菌是伤寒肠道沙门氏菌或肠炎肠道沙门氏菌。

在本发明的另一个实施方案中，减活的革兰氏阴性菌是基因工程的非天然细菌。在一个优选的实施方案中，减活的革兰氏阴性菌是一种非重组细菌。在另一个优选的实施方案中，本文公开的革兰氏阴性菌不含有来自真核生物的基因或基因片段。

如本领域技术人员所理解的，基因可以通过本领域一些熟知的方法进行突变，例如与靶向目的基因的重组质粒进行同源重组，在这种情况下，将与靶基因同源的工程基因纳入合适的核酸载体(如质粒或噬菌体)，将其转染到靶细胞。然后，同源工程基因与天然基因重组以替换天然基因或使天然基因突变，从而实现所需的失活突变。这种修饰可以是在基因的编码部分或任何调节部分，如启动子区域。如本领域技术人员所理解的，任何合适的遗传修饰技术都可用于突变目的基因，如CRISPR/Cas系统，如CRISPR/Cas 9。

因此，许多用于基因工程细菌菌株的方法和技术将是本领域技术人员所熟知的。这些技术包括那些通过染色体整合或通过引入稳定的常染色体自我复制的遗传元素将异源基因引入细菌所需的技术。对细菌细胞进行基因修饰(也称为“转化”或“工程化”)的示例性方法包括噬菌体感染、转导、接合、脂染或电穿孔。关于这些方法以及分子和细胞生物化学的其他方法的综合讨论可以在如下述标准教科书中找到：Molecular Cloning:ALaboratory Manual,第三版(Sambrook等人,HaRBor Laboratory Press 2001)；ShortProtocols in Molecular Biology,第四版(Ausubel等人编辑,John Wiley&Sons 1999)；Protein Methods(Bollag等人,John Wiley&Sons 1996)，将其通过引用并入本文。

因此，本发明公开了一种使用的减活的细菌，其中所述减活的细菌选自：Ty21a、CVD 908-htrA、CVD 909、Ty800、M01ZH09、x9633、x9640、x8444、DTY88 ZH9PA、MD58、WT05、ZH26、SL7838、SL7207、VNP20009或A1-R。优选地，本文所公开的细菌是非重组菌株，例如，Ty21a、CVD 908-htrA、CVD 909、Ty800、M01ZH09、x9633、x9640、x8444、DTY88、MD58、WT05、ZH26、SL7838、SL7207、VNP20009或A1-R。在另一个实施方案中，本文所公开的细菌是经过修饰以含有原核异源DNA的菌株，例如ZH9PA。除上述菌株外，设想任何减毒的、非致病性的伤寒或鼠伤寒肠道沙门氏菌血清型菌株可以按本文所公开的方式使用，即作为调节剂，导致在对受试者进行免疫疗法后产生更有效的免疫应答。

在一个实施方案中，基因工程的非天然细菌可来自于沙门氏菌属，所述沙门氏菌属可包含沙门氏菌致病岛2(SPI-2)基因的减毒突变和第二基因的减毒突变。合适的基因和这种减活细菌的详细说明如WO2000/68261中所记载的，通过引用将其整体并入本文。

在一个实施方案中，SPI-2基因是ssa基因。例如，本发明包括在ssaV、ssaJ、ssaU、ssaK、ssaL、ssaM、ssaO、ssaP、ssaQ、ssaR、ssaS、ssaT、ssaD、ssaE、ssaG、ssaI、ssaC和ssaH中的一个或多个的减毒突变。优选地，减毒的突变是在ssaV或ssaJ基因中。甚至更优选地，减毒的突变是在ssaV基因中。

遗传工程的非天然细菌还可以包含第二基因的减毒突变，该基因可以在或不在SPI-2区域。该突变可以在SPI-2区域之外，并参与芳族化合物的生物合成。例如，本发明包括在aro基因中的减毒突变。在一个优选的实施方案中，aro基因为aroA或aroC。甚至更优选地，aro基因为aroC。

遗传工程的非天然细菌可进一步包含一个或多个基因盒。这种基因盒可用于递送额外的原核生物分子以支持基因工程的非天然细菌调节免疫系统的功能，或支持相关免疫疗法(即检查点抑制剂疗法、过继性细胞疗法和/或CAR T细胞疗法)的活性。技术人员将认识到，以这种方式递送的支持性分子可能取决于待施用的免疫疗法。

在另一个实施方案中，基因工程的非天然细菌可来自沙门氏菌属，并且可包含选自pltA、pltB、cdtB和tsA的一个或多个基因的失活突变，并进一步包含选自aroA和/或aroC和/或ssaV的一个或多个基因的减毒突变。所述基因和突变的详细说明如WO 2019/110819中所记载的，通过引用将其整体并入本文。

设想基因pltA、pltB和cdtB的失活突变(例如缺失)将阻止沙门氏菌属产生伤寒毒素，而ttsA的失活突变(例如缺失)将阻止沙门氏菌属分泌伤寒毒素。具体地，设想该非天然细菌可以来自肠道沙门氏菌。

在一个实施方案中，基因工程的微生物可来自伤寒肠道沙门氏菌血清型，并包含其中表达甲型副伤寒肠道沙门氏菌血清型的脂多糖O2 O-抗原的修饰。在另一个优选的实施方案中，基因工程的微生物来自伤寒肠道沙门氏菌血清型，其中所述菌株包含其中表达甲型副伤寒肠道沙门氏菌血清型的鞭毛蛋白的修饰。在某些情况下，基因工程的微生物可来自伤寒肠道沙门氏菌血清型，并包含其中表达甲型副伤寒肠道沙门氏菌血清型的脂多糖O2 O-抗原和鞭毛蛋白的修饰。这种修饰的详细说明可以在WO2020/157203中找到。在本发明的上下文中，这样的菌株被认为是非重组的，因为术语“非重组”是指不含有真核基因或基因片段的细菌，或作为“载体”菌株的细菌，其目的是递送治疗分子，或递送编码治疗分子的真核异源DNA。

当本文所述的方法涉及使用质粒时，所述质粒优选具有选自pMB1、ColEI、p15A、pSC101和RK2的复制源。该质粒可含有选自β-内酰胺酶(bla)、卡那霉素磷酸转移酶(kan)、四环素外排(efflux)蛋白(tetA)或氯霉素乙酰转移酶(cat)的抗生素抗性基因。理想情况下，抗生素抗性基因将在转化为活的细菌载体菌株之前或之后不久被切除，例如通过“X-标记”(Cranenburgh&Leckenby 2012,WO2012/001352)等机制。可能需要质粒维持系统来防止质粒丢失。这些可能包括将原生染色体基因置于异源启动子下的机制，如“操纵基因-抑制基因(Repressor)疫苗滴定”(ORT-VAC；Garmory等人2005,Infect.Immun.73:2005-2011)或“oriSELECT”(Cranenburgh 2005,WO 2005/052167)系统，它们都不需要在质粒上存在额外的可选择标记基因。或者，将使用为非抗生素抗性基因的可选择标记基因，如补充宿主细胞突变的基因(Degryse 1991,Mol.Gen.Genet.227:49-51)。

设想本发明还可以包括上述减活的菌株，其中所述菌株可以将其原生fliC基因用甲型副伤寒肠道沙门氏菌血清型的fliC基因进行，从而使赋予的血清型从Hd血清型改变为Ha血清型，其中“血清型”是指细菌属中的明显变异。这种修饰的详细说明可以在WO2020/157203中找到。

本发明的另一个实施方案是上述减活的菌株，其中所述菌株可进一步修饰以含有功能性fepE基因，从而产生长的O-抗原链，优选地，其中O-抗原链的长度为三糖骨架的100个重复单位。这种修饰的详细说明可以在WO2020/157203中找到。

fepE基因编码非常长的O-抗原链的长度调节器，其中“非常长”是指超过100个三糖骨架的重复单位。伤寒肠道沙门氏菌血清型不具备这些长的O-抗原链，因为该基因中引入了一个终止密码子的突变。伤寒肠道沙门氏菌血清型可以通过一些方法被操纵来表达这些长的O-抗原链；fepE的天然启动子可以被替代性启动子(例如P_araBAD)所替换，可以修复伤寒肠道沙门氏菌血清型中fepE的染色体突变，或者可以将fepE的功能性拷贝插入伤寒肠道沙门氏菌血清型染色体的其他地方。可以利用体内诱导型启动子或组成型启动子，这种启动子的实例包括P_pagC、P_nirB、P_ssaG、P_sifA、P_sifB、P_sseA、P_sseG、P_sseJ、P_lac、P_tac、P_trc和λP_L/P_R。类似的修饰序列可包括与P_pagC、P_nirB、P_ssaG、P_sifA、P_sifB、P_sseA、P_sseG、P_sseJ和λP_L/P_R中任何一种的野生型序列具有至少约70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

优选地，引入这些长的O-抗原链可有利于诱导LPS特异性免疫应答。在LPS天然非常长(如来自fepE的表达)的情况下，可能会有额外的益处。

进一步设想上述减活的菌株可以被修饰为组成型表达gtrC或反式表达gtrC。这种修饰的详细说明可以在WO2020/157203中找到。

进一步设想上述减活的菌株可以进一步被修饰以包含在吞噬体诱导的启动子控制下的tviA基因的额外拷贝。这种修饰的详细说明可以在WO2020/157203中找到。

给予受试者无论是天然的还是非天然的减活的革兰氏阴性菌的量都足以引起受试者的免疫应答，从而使受试者的免疫系统有效地适应接受检查点抑制剂疗法、过继性细胞疗法和/或CAR T细胞疗法，导致受试者的免疫系统在用所述疗法治疗时能够对癌症或肿瘤产生有效的免疫应答。通过给予减活的革兰氏阴性菌所启动的免疫应答本身可以达到治疗水平，或可以达到亚治疗水平，需要给予上述免疫疗法以发挥治疗效果。

设想减活的革兰氏阴性菌可以给药至少一次或至少两次，间隔两周。减活的革兰氏阴性菌可以在检查点抑制剂疗法、过继性细胞输注疗法和/或CAR T细胞疗法之前、期间或之后给予。优选地，至少有一次减活的革兰氏阴性菌的给予将发生在免疫疗法治疗之前，这种给予可发生在免疫疗法治疗之前至少一周。可设想根据免疫疗法的治疗方案，减活的革兰氏阴性菌的给予可以重复。减活的革兰氏阴性菌的给予剂量可为10⁵至10¹²CFU，其中CFU为菌落形成单位。例如，合适的剂量可以为10⁵至10⁶CFU、10⁵至10⁷CFU、10⁵至10⁸CFU、10⁵至10⁹CFU、10⁵至10¹⁰CFU、10⁵至10¹¹CFU、10⁶至10⁷CFU、10⁶至10⁸CFU、10⁶至10⁹CFU、10⁶至10¹⁰CFU、10⁶至10¹¹CFU、10⁶至10¹²CFU、10⁷至10⁸CFU、10⁷至10⁹CFU、10⁷至10¹⁰CFU、10⁷至10¹¹CFU、10⁷至10¹²CFU、10⁸至10⁹CFU、10⁸至10¹⁰CFU、10⁸至10¹¹CFU、10⁸至10¹²CFU、10⁹至10¹⁰CFU、10⁹至10¹¹CFU、10⁹至10¹²CFU、10¹⁰至10¹¹CFU、10¹⁰至10¹²CFU或10¹¹至10¹²CFU。

在一个实施方案中，免疫疗法是一种检查点抑制剂，本文中的术语“检查点抑制剂”是指针对检查点分子的阻断剂。该阻断剂可以是拮抗剂、抑制剂或阻断抗体。因此，该阻断剂可以是小分子或生物药物，在特定情况下，它是一种单克隆抗体。在一个优选的实施方案中，检查点抑制剂针对CTLA-4、PD-1、PD-L1、LAG-3、TIM-3、BTLA、TIGIT、VISTA或其任何组合。例如，检查点抑制剂可以针对PD-1和PD-L1、PD-1和CTLA-4、PD-L1和CTLA-4。

甚至更优选地，检查点抑制剂针对CTLA-4、PD-1或PD-L1。在某些情况下，阻断剂可以是伊匹木单抗(ipilimumab)(

-靶向CTLA-4)、纳武利尤单抗(nivolumab)(

-靶向PD-1)、帕博利珠单抗(pembrolizumab)(

-靶向PD-1)、阿替利珠单抗(atezolizumab)(

-靶向PD-L1)、西米普利单抗(cemiplimab)(

-靶向PD-1)或度伐利尤单抗(duvalumab)(

-靶向PD-L1)。

PD-L1/PD-1信号通路是癌症免疫逃避的主要机制，原因有以下几点。首先，最重要的是，该通路参与了对外周发现的活化T效应细胞的免疫应答的负调控。第二，PD-L1在癌症微环境中被上调，而PD-1在激活的肿瘤浸润T细胞上也被上调，因此可能加剧了恶性的抑制循环。第三，该通路通过双向信号错综复杂地参与了先天和适应性免疫调节。这些因素使PD-1/PD-L1复合体成为一个中心点，癌症通过该点可以操纵免疫应答并促进自身的发展。因此，肿瘤能够激活抑制性免疫检查点分子途径，导致免疫系统受到抑制且癌细胞继续不受阻碍地生长。在T细胞激活后，CTLA-4被运送到表面，在那里它与CD28竞争抗原呈递细胞(APC)上的相同配体，导致CD28被抑制，随后抑制T细胞的激活和增殖。靶向PD-1、PD-L1和CTLA-4旨在防止这些事件的发生。

设想本文所公开的本发明可允许调节先天免疫系统，从而为检查点抑制剂诱导的适应性抗肿瘤反应的发展、激活和/或维持提供更强、更完整和/或更持久的支持。

在一个实施方案中，免疫疗法是过继性细胞疗法，其中免疫细胞被转移到患者/受试者体内，最常见的原因是它们的功能和特性得到改善。要转移的细胞可能来自于受试者(自体)或另一个受试者(同种异体)。这种过继性细胞疗法的实例包括但不限于工程或非工程的巨噬细胞、工程或非工程的γδT细胞、工程或非工程的自然杀伤细胞。因此，在本发明的上下文中，过继性细胞疗法包括但不限于肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)疗法、工程T细胞受体(TCR)疗法和/或自然杀伤细胞(NK)疗法，其详细说明将为本领域的技术人员所熟知(Adoptive cellular therapies:the current landscape,Rohaan等人2019,VirchowsArch.474(4):449-461)。

在另一个实施方案中，免疫疗法是CAR T细胞疗法。该CAR T细胞疗法可以是同种异体的或自体的。在某些情况下，CAR T细胞疗法将针对抗原CD19，它存在于B细胞衍生的癌症中。因此，这种疗法特别适用于B细胞衍生的癌症，如急性淋巴细胞白血病(ALL)和弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。在其他情况下，CAR T细胞疗法将针对肿瘤相关抗原(TAA)，因此更适合于治疗实体瘤。这种抗原的实例包括但不限于CD133、CD138、BCMA、CEA、EGFR、EpCAM、GD2、GPC3、HER2、HerinCAR-PD1、MSLN、MG7、MUC1、LMP1、PSMA和PSCA。这类技术将是本领域技术人员所熟知的，读者可参阅标题为“Adoptive cellular therapies:the currentlandscape”的评论以了解更多信息(Rohaan等人2019,Virchows Arch.474(4):449-461)。

检查点抑制剂可为针对癌症或肿瘤的治疗性抗体。在特别的实施方案中，治疗性抗体可为单克隆抗体，甚至更优选地人源化或人单克隆抗体。获得这种单克隆抗体的方法是本领域技术人员已知的。治疗性抗体可以阻断癌细胞中的异常蛋白质附着在癌细胞上的特定蛋白质上，或与细胞毒性分子(如抗癌药物)结合。后者将癌细胞标示给免疫系统，以便异常细胞随后可以被免疫系统的细胞成分靶向并摧毁。作为检查点抑制剂的单克隆抗体的实例包括但不限于伊匹木单抗

纳武利尤单抗

和帕博利珠单抗

由于病因的多因素性，可以理解本文所述的免疫疗法(即检查点抑制剂疗法、过继性细胞疗法和/或CAR T细胞疗法)可以联合给予患者/受试者。例如，过继性细胞疗法和检查点抑制剂可以联合使用。可以理解的是，对联合疗法的需求将逐案决定，并取决于许多因素，例如待治疗的肿瘤性疾病的复杂性和/或待治疗的患者/受试者的病史。

预计无论对受试者给予何种免疫疗法类型(所使用的免疫疗法可能取决于肿瘤性疾病的形式和复杂性)，在给予减活的革兰氏阴性菌后，所述免疫疗法的疗效将大于单独给予免疫疗法成分的疗效。在某些情况下，在给予减活的革兰氏阴性菌后，免疫疗法的疗效将大于单独给予的任何一种成分。因此，本发明提供了一种治疗肿瘤性疾病的加成的或协同的方法。据设想，在治疗更复杂的肿瘤和/或实体瘤时，这种加成或协同作用将特别有利，并且对那些对单独用免疫疗法治疗的无反应患者/受试者尤其有利。

用于本发明的减活的革兰氏阴性菌可用于治疗肿瘤性疾病，该疾病与实体瘤或血液恶性肿瘤有关。此类疾病包括肉瘤、癌、腺癌、黑色素瘤、骨髓瘤、胚胎瘤、胶质瘤、淋巴瘤或白血病。在一个优选的实施方案中，肿瘤性疾病与实体瘤有关。在特定方面，肿瘤性疾病与选自以下的癌症有关：前列腺癌、肝癌、肾癌、肺癌、乳腺癌、结直肠癌、膀胱癌、胰腺癌、脑癌、肝细胞癌、淋巴瘤、白血病、胃癌、宫颈癌、卵巢癌、甲状腺癌、黑色素瘤、癌、头颈癌、皮肤癌或肉瘤。

瘤形成、肿瘤和癌症包括良性、恶性、转移性和非转移性类型，并包括瘤形成、肿瘤或癌症的任何阶段(I、II、III、IV或V)或等级(G1、G2、G3等)，或者正在进展、恶化、稳定或缓解的瘤形成、肿瘤、癌症或转移灶。可根据本发明治疗的癌症包括但不限于下述的细胞或肿瘤：膀胱、血液、骨骼、骨髓、脑、乳房、结肠、食道、胃肠、牙龈、头部、肾脏、肝脏、肺、鼻咽、颈部、卵巢、前列腺、皮肤、胃、睾丸、舌头或子宫。此外，癌症可具体为以下组织学类型，但不限于以下类型：肿瘤，恶性；癌；未分化；巨细胞癌和纺锤形细胞癌；小细胞癌；乳头状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；毛母质癌；过渡细胞癌；乳头状过渡细胞癌；腺癌；胃泌素瘤，恶性；胆管癌；肝细胞癌；合并肝细胞癌和胆管癌；小梁状腺癌；腺样囊性癌；腺瘤性息肉中的腺癌；腺癌，家族性息肉病大肠杆菌；实体癌；类癌，恶性；支气管肺泡腺癌；乳头状腺癌；嫌色性癌(chromophobe carcinoma)；嗜酸细胞癌；嗜氧性腺癌(oxyphilicadenocarcinoma)；嗜碱细胞癌；透明细胞腺癌；颗粒细胞癌；滤泡性腺癌；乳头状和滤泡性腺癌；非包裹性硬化癌；肾上腺皮质癌；子宫内膜癌；皮肤附属物癌；分泌性腺癌；皮脂腺性腺癌；耵聍(ceruminous)腺癌；粘液表皮细胞癌；囊腺癌；乳头状囊腺癌；乳头状浆液性囊腺癌；粘液性囊腺癌；粘液腺癌；印戒(signet ring)细胞癌；浸润性导管癌；髓样癌；小叶癌；炎症性癌；佩吉特氏病(Paget'sdisease)，乳腺；腺泡细胞癌；腺鳞癌；鳞状化生的腺癌；胸腺瘤，恶性；卵巢间质瘤，恶性；泡膜细胞瘤(thecoma)，恶性；颗粒细胞瘤，恶性；雄性细胞瘤，恶性；Sertoli细胞癌；Leydig细胞瘤，恶性；脂肪细胞瘤，恶性；副神经节瘤，恶性；乳腺外副神经节瘤，恶性；嗜铬细胞瘤；血管球肉瘤(glomangiosarcoma)；恶性黑色素瘤；无色素性黑色素瘤；浅表扩散性黑色素瘤；巨大色素痣中的恶性黑色素瘤；上皮细胞黑色素瘤；蓝痣，恶性；肉瘤；纤维肉瘤；纤维组织细胞瘤，恶性；黏液肉瘤(myxosarcoma)；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎性横纹肌肉瘤；肺泡性横纹肌肉瘤；间质肉瘤；混合瘤；穆勒氏(Mullerian)混合瘤；肾母细胞瘤；肝母细胞瘤；癌肉瘤；间质瘤，恶性；Brenner瘤，恶性；叶状肿瘤，恶性；滑膜肉瘤；间皮瘤，恶性；无性细胞瘤；胚胎性癌；畸胎瘤，恶性；卵巢甲状腺肿，恶性；绒毛膜癌；中肾瘤，恶性；血管肉瘤；血管内皮瘤，恶性；卡波西(Kaposi)肉瘤；血管外皮细胞瘤，恶性；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；皮质旁骨肉瘤；软骨肉瘤；软骨母细胞瘤，恶性；间质软骨肉瘤；骨巨细胞瘤；尤文氏(Ewing)肉瘤；牙源性肿瘤，恶性；成釉细胞牙肉瘤；成釉细胞瘤，恶性；成釉细胞纤维肉瘤；松果体瘤，恶性；脊索瘤；胶质瘤，恶性；室管膜瘤(ependymoma)；星形细胞瘤；原生星形细胞瘤；纤维性星形细胞瘤；星形母细胞瘤；胶质母细胞瘤；少突胶质细胞瘤；少突胶质母细胞瘤；原始神经外胚层；小脑肉瘤；神经节成神经细胞瘤(ganglioneuroblastoma)；神经母细胞瘤；视网膜母细胞瘤；嗅觉神经源性肿瘤；脑膜瘤，恶性；神经纤维肉瘤；神经鞘瘤，恶性；颗粒细胞瘤，恶性；恶性淋巴瘤；霍奇金(Hodgkin)病；霍奇金氏；类肉芽肿；恶性淋巴瘤，小淋巴细胞型；恶性淋巴瘤，大细胞、弥漫性；恶性淋巴瘤，滤泡性；蕈样肉芽肿；其他特定的非霍奇金淋巴瘤；恶性组织细胞增生症；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增生性小肠病；白血病；淋巴性白血病；浆细胞白血病；红细胞白血病；淋巴肉瘤细胞白血病；骨髓性白血病；嗜碱性白血病；嗜酸性白血病；单核细胞白血病；肥大细胞白血病；巨核细胞白血病；骨髓肉瘤；和毛细胞白血病。优选地，肿瘤性疾病可以是与选自以下的癌症相关的肿瘤：前列腺癌、肝癌、肾癌、肺癌、乳腺癌、结直肠癌、胰腺癌、脑癌、肝细胞癌、淋巴瘤、白血病、胃癌、宫颈癌、卵巢癌、甲状腺癌、黑色素瘤、头颈癌、皮肤癌和软组织肉瘤和/或其他形式的癌。肿瘤可能是转移性的或恶性的肿瘤。

在一个优选的实施方案中，肿瘤性疾病与选自肺癌、肾癌、膀胱癌、胃癌、卵巢癌、结直肠癌、黑色素瘤、头颈癌或乳腺癌的癌症有关。

在本发明的一个优选实施方案中，由于这些给予方式与免疫系统的全身性激活相适应，所以口服、皮下或肌内给药减活的革兰氏阴性菌。如本文所使用的，术语“口服”或“口服给药”可互换使用，其是指通过患者/受试者的口腔给予革兰氏阴性菌。术语“皮下”或“皮下给药”可互换使用，其是指在患者/受试者的皮肤下给药革兰氏阴性菌。术语“肌内”或“肌内给药”可互换使用，其是指将革兰氏阴性菌注射到患者/受试者的肌肉中。在一个最优选的实施方案中，口服给药减活的革兰氏阴性菌。然而，也可以考虑在某些情况下使用其他给药方法。因此，在某些情况下，本发明的减活的革兰氏阴性菌可以通过以下方式给药：注射、输注、连续输注、静脉内、皮内、动脉内、病灶内、阴道内、直肠内、肌内、腹膜内、皮下、结膜下、粘膜、心包内、脐内、眼内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鼻内、吸入(例如气雾剂吸入)、经导管、经灌洗或经其他方法或前述方法的任何组合，如本领域技术人员已知的(参见，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版,Mack PrintingCompany,1990)。优选地，本发明的革兰氏阴性菌可通过粘膜、阴道内、静脉内、鼻内、胸膜内或皮内给药。在一个优选的实施方案中，本文公开的革兰氏阴性菌不进行瘤内给药。

在本发明的另一个实施方案中，在第一治疗阶段向受试者给予减活的革兰氏阴性菌，在第二治疗阶段给予检查点抑制剂疗法、过继性T细胞疗法和/或同种异体或自体CAR-T疗法。

所谓“第一治疗阶段”和“第二治疗阶段”，本申请是指一个疗程，其中第一治疗阶段和第二治疗阶段在时间上是有间隔的，这样在第一和第二治疗阶段之间有一个间隔，在此间隔内患者/受试者未接受本文公开的革兰氏阴性菌，或本文公开的免疫疗法。

在不受理论约束的情况下，据认为，在所讨论的免疫疗法之前(即在第一个治疗阶段中)给予减活的革兰氏阴性菌可使免疫系统在免疫疗法发生之前得到有效调节，从而在给予检查点抑制剂疗法、过继性细胞疗法和/或CAR T细胞疗法时更有效地靶向癌症或肿瘤。

虽然优选在免疫治疗组合物之前给予减活的革兰氏阴性菌，但在某些情况下，有必要同时或在之后给予它们。因此，减活的革兰氏阴性菌和免疫疗法可以存在于相同或单独的药物制剂中，并在相同或不同的时间给予。

优选地，第一治疗阶段和第二治疗阶段至少相隔一周给予，优选地，其中第一治疗阶段和第二治疗阶段相隔两周给予。

本文公开的减活的革兰氏阴性菌在使用时可在受试者体内产生全身性免疫应答。优选地，减活的革兰氏阴性菌产生全身免疫应答，导致骨髓细胞的激活和/或成熟增加。这种骨髓细胞的实例包括但不限于常规树突状细胞、浆细胞样树突状细胞、单核细胞和/或巨噬细胞。因此，在本发明的上下文中，全身免疫应答是指循环/全身骨髓细胞区的长期表型变化。

在本发明的第四方面，存在一种治疗、抑制或控制受试者肿瘤性疾病的方法，其中该方法包含同时、分别或顺序向受试者给予(i)减活的革兰氏阴性菌，其中所述减活的革兰氏阴性菌是口服给药、皮下给药或肌内给药，和(ii)检查点抑制剂疗法、过继性细胞疗法和/或同种异体或自体CAR-T疗法，其中相对于单独给予减活的革兰氏阴性菌或检查点抑制剂疗法、过继性细胞疗法和/或同种异体或自体CAR-T疗法而言，所述方法产生了增强的治疗效果。

在本发明的第五方面，存在一种治疗、抑制或控制受试者肿瘤性疾病的方法，其中该方法包含同时、分别或顺序向受试者给予(i)减活的革兰氏阴性菌，其中减活的革兰氏阴性菌将在第一治疗阶段给予，和(ii)检查点抑制剂疗法、过继性细胞疗法和/或同种异体或自体CAR-T疗法，前述疗法将在第二治疗阶段给予，其中相对于单独给予减活的革兰氏阴性菌或检查点抑制剂疗法、过继性细胞疗法和/或同种异体或自体CAR-T疗法而言，所述方法产生了增强的治疗效果。

在本发明的第六方面，存在一种治疗、抑制或控制受试者肿瘤性疾病的方法，其中该方法包含同时、分别或顺序向受试者给予(i)减活的革兰氏阴性菌，其中所述减活的革兰氏阴性菌是非重组的，或其中所述减活的革兰氏阴性菌不包含编码治疗性蛋白的真核异源DNA，和(ii)检查点抑制剂疗法、过继性细胞疗法和/或同种异体或自体CAR-T疗法，其中相对于单独给予减活的革兰氏阴性菌或检查点抑制剂疗法、过继性细胞疗法和/或同种异体或自体CAR-T疗法而言，所述方法产生了增强的治疗效果。

因此，本发明的方法可用于减少或抑制原发性肿瘤或癌症向其他部位的转移，或在原发性肿瘤或癌症的远端其他部位形成或建立转移性肿瘤或癌症，从而抑制或减少肿瘤或癌症的复发或肿瘤或癌症的进展。因此，本发明提供了在给定受试者的病症中的可检测或可测量的改善，例如缓解或减轻与细胞增殖或细胞过度增殖性障碍、瘤形成、肿瘤或癌症或转移灶的存在相关的一种或多种不良(身体)症状或后果，即治疗益处或有益效果。

因此，本发明的方法是一种有可能引起有效和持久的免疫应答并增强治疗效果的结合疗法，所述疗法包含给予减活的革兰氏阴性菌和免疫疗法(即检查点抑制剂疗法、过继性细胞疗法和/或CAR T细胞疗法)。本文所公开的治疗结合的加成性或协同性可能导致所需的疗法或治疗水平下降，由于更有利的毒理学特征而导致不良反应的减少。

治疗益处或有益效果是病症或病理学中的任何客观的或主观的、短暂的、暂时的或长期的改善，或者与细胞增殖或细胞过度增殖性障碍(例如瘤形成、肿瘤或癌症或转移灶)相关或由其引起的不良症状的发作、严重程度、持续时间或频率的减轻。这可带来改善的存活。例如，当存在一种或多种相关病理学、不良症状或并发症的严重程度、持续时间或频率的递增或部分减少，或抑制或逆转一种或多种细胞增殖或细胞过度增殖性障碍(例如瘤形成、肿瘤或癌症或转移灶)的生理学、生物化学或细胞表现或特征时，则达到了根据本发明的治疗方法的令人满意的临床终点。因此，治疗益处或改善可以是但不限于破坏靶增殖细胞(例如瘤形成、肿瘤或癌症或转移灶)或消融一种或多种、大多数或所有与细胞增殖或细胞过度增殖性障碍(例如瘤形成、肿瘤或癌症或转移灶)相关或由其引起的病理学、不良症状或并发症。然而，治疗益处或改善不一定是治愈或完全破坏所有靶增殖细胞(例如瘤形成、肿瘤或癌症，或转移灶)，或消融所有与细胞增殖或细胞过度增殖性障碍(例如瘤形成、肿瘤或癌症或转移灶)相关或由其引起的病理学、不良症状或并发症。例如，通过抑制肿瘤或癌症的进展或恶化来部分地破坏肿瘤或癌细胞团块，或稳定肿瘤或癌症肿块、大小或细胞数目，可降低死亡率并延长预期寿命，即使仅有数天、数周或数月，即使部分或大部分的肿瘤或癌症肿块、大小或细胞仍然存在。

治疗益处的具体的非限制性实例包括：瘤形成，肿瘤或癌症，或转移灶体积(大小或细胞质量)或细胞数目的减少，抑制或预防瘤形成、肿瘤或癌症体积的增加(例如稳定化)，减缓或抑制瘤形成、肿瘤或癌症的进展、恶化或转移，或抑制瘤形成、肿瘤或癌症的增殖、生长或转移。

一个发明方法可能不会立即生效。例如，治疗后可能增加瘤形成、肿瘤或癌细胞数量或质量，但是随着时间的推移，在给定受试者中可随后发生肿瘤细胞质量、大小或细胞数目的最终稳定或减少。

可被抑制、减轻、减少、延缓或预防的其他与瘤形成、肿瘤、癌症和转移灶相关的不良症状和并发症包括例如恶心、食欲不振、嗜睡、疼痛和不适。因此，与细胞过度增殖性障碍相关或由其引起的不良症状或并发症的严重程度、持续时间或频率的部分或完全降低或减轻，受试者生活质量和/或健康状况的改善(如增加的精力、食欲、心理健康)都是治疗益处的具体的非限制性实例。

因此，治疗益处或改善还可包括所治疗的受试者的生活质量的主观改善。在另外的实施方案中，方法延长了或延伸了受试者的寿命(生存期)。在其他实施方案中，方法改善了受试者的生活质量。

据设想，本发明可能特别适用于对先前用检查点抑制剂、过继性细胞疗法和/或CAR T细胞疗法治疗的难治性个体。所谓“难治性”，本申请是指对治疗没有反应的任何肿瘤性疾病。还设想，本发明将特别适用于对先前的免疫疗法治疗的低反应者、中度反应者或高度反应者的个体。

减活的革兰氏阴性菌和免疫疗法通常将以组合物的形式给予受试者，该组合物包含有效量的减活的革兰氏阴性菌或免疫疗法，并进一步包含药学上可接受的载体/佐剂/稀释剂或赋形剂。短语“药学上或药理学上可接受的”是指当给予至动物(例如人，如适用)时不产生不良反应、过敏反应或其他不利反应的分子实体和组合物。这类制剂对于本领域技术人员而言是已知的。此外，对于动物(例如人)给药，如适用，可以理解为制剂应符合无菌性、热原性、一般安全和纯度标准。

如本文所使用的，“药学上可接受的载体/佐剂/稀释剂/赋形剂”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗细菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物、药物稳定剂、凝胶剂、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料等诸如此类的材料及其组合，如本领域技术人员已知的(参见，例如Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版,Mack Printing Company,1990,第1289-1329页)。实例包括但不限于磷酸氢二钠、大豆蛋白胨、磷酸二氢钾、氯化铵、氯化钠、硫酸镁、氯化钙、蔗糖、硼酸盐缓冲液、无菌盐水(0.9％ NaCl)和无菌水。

该组合物(减活的革兰氏阴性菌组合物或免疫疗法)还可包含用于增强免疫应答的附加成分。这些附加成分的实例包括但不限于：铝盐(如氢氧化铝、氧化铝和磷酸铝)，油基佐剂(如费氏(Freund's)完全佐剂和费氏不完全佐剂)，基于霉菌酸酯的佐剂(如海藻糖二聚体)，细菌脂多糖(LPS)，肽聚糖(如胞壁质、粘肽或糖蛋白，如N-Opaca、胞壁酰二肽[MDP]或MDP类似物)，蛋白聚糖(如从肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)中提取)，链球菌制剂(如OK432)，胞壁酰二肽，免疫刺激复合物(如EP 109 942、EP 180 564和EP 231039中公开的“Iscoms”)，皂苷，DEAE-葡聚糖，中性油(如辛酸癸酸甘油三酯(miglyol))，植物油(如落花生油)，脂质体，多元醇，Ribi佐剂系统(例如参见GB-A-2 189 141)，维生素E，聚羧乙烯，干扰素(如IFN-α、IFN-γ或IFN-β)或白细胞介素，特别是刺激细胞介导的免疫的那些白细胞介素(例如IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16和IL-17)。

本发明的发明人出人意料地发现，减活的革兰氏阴性菌和免疫疗法的结合使预防和/或治疗肿瘤性疾病的疗效比单独使用任何一种成分都要好。将参照以下非限制性实施例对本发明进行进一步描述。

实施例

实施例1-诱导全身骨髓细胞的长期表型变化

将成年雌性BALB/c小鼠用1×10⁹CFU鼠伤寒肠道沙门氏菌血清型菌株MD58(ΔaroC)口服治疗。21天后采集脾脏，生成单细胞悬液并进行流式细胞仪染色。测量标记物CD80、CD86和PD-L1在活的CD11c^高、HLA-DR⁺、CD11b^+/-、PDCA-1^-常规树突状细胞和活的CD11c^-/低、PDCA1⁺、HLA-DR^-/Int、CD11b^-浆细胞样树突状细胞上的中位荧光强度值(见图1A和1B)。还测量标记物PD-L1、CD80和HLA-DR在活的CD11c^-、CD11b⁺、Ly6C⁺、F4/80^-单核细胞和活的CD11c^-、CD11b⁺、Ly6C^-、F4/80⁺巨噬细胞上的中位荧光强度值(见图1C和1D)。

从图1可以看出，骨髓细胞的各种细胞标志物(例如常规树突状细胞、浆细胞样树突状细胞、单核细胞和巨噬细胞)在用沙门氏菌治疗后的21天显示出明显的增加，这表明用沙门氏菌治疗后对免疫细胞的激活效果在相当长的时间内是可持续的。

实施例2-沙门氏菌诱导表型变化的时间进程

为了探索图1中观察到的骨髓细胞的激活/成熟表型变化的动力学，发明人进行了时间进程研究。将成年雌性BALB/c小鼠用1×10⁹CFU鼠伤寒肠道沙门氏菌血清型菌株MD58(ΔaroC)口服治疗。第1、14、21或42天后采集脾脏和股骨，生成单细胞悬液并进行流式细胞仪染色(见图2A的实验示意图)。

全身常规(cDC)和浆细胞样(pDC)树突状细胞上的活化标记物在口服给药沙门氏菌后被证明是上调的，在给予后3周达到高峰，在给予后6周恢复到接近基线水平(见图2B)。口服给药沙门氏菌后，也显示出全身单核细胞和巨噬细胞的活化标志物上调，在给予后3周达到峰值，在给予后6周恢复到接近基线水平(见图2C)。

实施例3-口服给药沙门氏菌可增强骨髓细胞生成

将成年雌性BALB/c小鼠用1×10⁹CFU鼠伤寒肠道沙门氏菌血清型菌株MD58(ΔaroC)口服治疗。第1、14、21或42天后对分离的骨髓细胞进行流式细胞仪染色。

显示骨髓中的造血干细胞/多能祖细胞的数量在口服给药2周后明显增加(见图3A)。代表性的流式细胞仪图也表明，用沙门氏菌口服治疗的动物的骨髓中的LKS活细胞有所增加(见图3B)。此外，在用沙门氏菌治疗后的第14天，将骨髓细胞总数中的LKS活细胞百分比与同一时间点的单核细胞(活的CD11c^-、CD11b⁺、Ly6C⁺、F4/80^-细胞)百分比使用Spearman等级相关相关联(见图3C)。

因此，本文的数据支持这样的假设，即给予沙门氏菌可调节免疫系统，特别是免疫系统的骨髓臂(myeloid arm)。此外，这些数据证明了用沙门氏菌调节对免疫系统的长期影响，如所显示的用沙门氏菌诱导的持续3-6周的调节变化。这些变化可能是系统/中心介导的，如由骨髓造血祖细胞和脾脏单核细胞数量之间的正相关关系所表明的那样。

实施例4-口服给药沙门氏菌诱导全身树突状细胞的高反应状态至少持续14天

将成年雌性BALB/c小鼠用1×10⁹CFU鼠伤寒肠道沙门氏菌血清型菌株MD58(ΔaroC)口服治疗。14天后采集脾脏，生成单细胞悬液，通过磁分离法富集CD11c表达细胞，将1×10⁵个细胞/孔与指定的刺激物(TLR9、TLR2/6或TLR4/2激动剂或对照)孵育24小时。用LegendPlex检测法测量上清液中的IL-6(见图4)。

从图4可以看出，当与赋形剂对照组相比时，用革兰氏阴性菌(如沙门氏菌)处理过的动物的CD11c表达细胞在对各种刺激物的反应中表现出增强的IL-6分泌(细胞免疫应答性水平的指标)。这进一步支持了本发明的给予革兰氏阴性菌导致免疫细胞的调节，使它们对随后的刺激物更有反应。

如实施例1至4所示，本文公开的实验数据表明，用减活的革兰氏阴性菌(例如沙门氏菌)处理会导致多种免疫细胞类型(例如树突状细胞、单核细胞和巨噬细胞)的意外长期激活，以及骨髓中造血干细胞/多能祖细胞的增加。在不受理论约束的情况下，据认为，通过给予这种减活的革兰氏阴性菌诱导的全身反应能够调节受试者或患者的免疫系统，从而在与免疫疗法(例如检查点抑制剂疗法、过继性细胞疗法或CAR T细胞疗法)联合给予时，增强这种免疫疗法的抗肿瘤活性。这在下文的实施例5中进一步证明。据认为，从给予减活的革兰氏阴性菌中观察到的全身性改变，即多种免疫细胞类型的激活和对骨髓细胞生成的影响(如本文所示)，与所述减活的革兰氏阴性菌的肠道吸收相结合，是观察到抗肿瘤效果增强的原因。技术人员很容易理解，由减活的革兰氏阴性菌诱导的广泛的全身效应可以调节患者/受试者的免疫系统，从而在大量的检查点抑制剂和/或过继性细胞疗法中观察到有利的效应，即它们不限于单一的疗法，而是适用于整个类别的疗法。此外，使用革兰氏阴性菌来调节受试者/患者的免疫系统，对那些在单独使用时被证明对免疫疗法有抵抗力的患者/受试者而言可能特别有利。

实施例5-口服给药沙门氏菌治疗导致肿瘤生长减慢，与免疫检查点抑制剂联合使用时疗效增强

将成年雌性C57BL/6小鼠皮下接种1×10⁶个MC38(结肠癌)或B16-F10(黑色素瘤)肿瘤细胞。

对于图5A，在肿瘤接种后15天和22天，将携带MC38肿瘤的动物用1×10⁹CFU鼠伤寒肠道沙门氏菌血清型菌株MD58(ΔaroC)或PBS对照口服治疗，并从第17天开始每周两次用10mg/kg抗PD-L1治疗。图中示出了肿瘤体积随时间的变化，描述了肿瘤的生长，相应的表中总结了第14天至第30天用沙门氏菌和同种型对照(沙门氏菌和αPD-L1或赋形剂和αPD-L1)处理后，相对于对照赋形剂和同种型组的平均肿瘤生长抑制率(见图5A)。

对于图5B，在肿瘤接种后的第8天，将携带B16-F10肿瘤的动物用1×10⁹CFU鼠伤寒肠道沙门氏菌血清型菌株MD58(ΔaroC)或PBS对照口服治疗，并在第10、13和17天用10mg/kg抗PD-1抗体治疗。图中示出了肿瘤体积随时间的变化，描述了肿瘤的生长，相应的表中总结了不同治疗方法在第14天至第30天之间相对于对照组(赋形剂+同种型)的平均肿瘤生长抑制率(见图5B)。

如上文所述，已知虽然检查点抑制剂疗法、过继性细胞疗法和CAR-T疗法等免疫疗法在患者的亚群体中取得了成功，但这些疗法仍对很大一部分患者几乎没有效果。因此，在肿瘤学领域找到解决这一未满足需求的疗法是至关重要的。这个问题反映在图5A和5B的表中，其中使用检查点抑制剂的治疗显示对肿瘤生长抑制没有效果或效果很小，但没有显示出明显优于赋形剂和同种型对照所产生的效果。然而，与此形成鲜明对比的是，当检查点抑制剂与减活的革兰氏阴性菌(例如沙门氏菌)联合给予时，肿瘤生长抑制率明显提高(约为图5A中单独使用检查点抑制剂组的生长抑制率的13倍)。这一效果也明显高于单独使用沙门氏菌治疗所观察到的效果，突出了两种成分联合使用的优势。因此，本发明的发明人出人意料地表明，免疫疗法如检查点抑制剂、过继性细胞疗法和CAR-T疗法在与减活的革兰氏阴性菌联合给予时，其抗肿瘤疗效可得到明显增强。

此外，本发明人在两种不相关的肿瘤模型中并且用两种不同的检查点抑制剂证明了同样的加成和/或协同效应的趋势，其支撑并支持这样的假设，即由减活的革兰氏阴性菌诱导的调节效应将以下述方式调节患者/受试者的免疫系统，所述方式为在大量的检查点抑制剂和/或过继性细胞疗法中观察到有利的效应，以及可能对许多癌症适应症有益。因此，技术人员很容易理解本发明的效果是与肿瘤类型无关的。

实施例6-用沙门氏菌体外调节巨噬细胞，使M1细胞进一步极化为炎症表型，并诱导M2极化为M1样表型巨噬细胞

众所周知，根据巨噬细胞的表型和功能，通常可以将其分为M1巨噬细胞(促炎性，经典激活)和M2巨噬细胞(抗炎性，交替激活/抑制)。巨噬细胞先前已被证明直接或间接地参与了恶性肿瘤的几个关键特征，包括血管生成、侵袭性、转移、肿瘤微环境的调节和治疗阻力。然而，它们也有能力呈递肿瘤抗原，支持肿瘤特异性T细胞的增殖和扩增，吞噬癌细胞和重塑肿瘤环境，使肿瘤更容易受到治疗方法的影响。还已知M2再极化为M1表型巨噬细胞足以引起抗癌效果(Duan and Luo,Targeting macrophages in cancer immunotherapy,Signal Transduction and Targeted Therapy,2021(6:127))。因此，能够启动这种再极化效应的治疗策略将特别有利，有助于支持和加强其他免疫疗法(如过继性细胞疗法和检查点抑制剂)的抗肿瘤效果。

如本文所示，在体外用革兰氏阴性菌处理M2巨噬细胞，不仅导致一系列免疫细胞和骨髓细胞生成的激活(见实施例1至4)，而且还启动了抑制性M2巨噬细胞表型转换为M1样表型(见图6)。在不受理论约束的情况下，据认为，这种M2巨噬细胞再极化为M1巨噬细胞进一步促进了本文所展示的抗肿瘤效果。

通过Ficoll-Paque梯度离心法从3个独立的供体中的血沉棕黄层(Buffy Coat)分离出PBMC。使用CD14 MicroBeads分离试剂盒(MiltenyiBiotec)分离出CD14⁺单核细胞，用GM-CSF培养M1细胞且用M-CSF培养M2细胞6天。在第8天加入细胞因子混合物(cocktail)，使细胞向M1和M2细胞极化。收集由此产生的的巨噬细胞，洗涤并以MOI为1的伤寒肠道沙门氏菌菌株ZH9(ΔaroC，ΔssaV)处理或不进行处理。1小时后，收集细胞，洗涤并在培养基中培养48小时。然后在流式细胞仪分析前用针对CD163和CD86的抗体进行染色。

图6中的结果显示，沙门氏菌对M1和M2巨噬细胞都有影响。当用沙门氏菌调节M1巨噬细胞时，几乎所有的细胞都表达CD86并下调CD163，其为促炎抗肿瘤巨噬细胞的特征组合。同样，在M2抑制性巨噬细胞中不存在/含少量这种CD86⁺CD163^-群体，在用沙门氏菌调节后出现在这个细胞群中。这表明，通常与肿瘤微环境相关的抑制性M2巨噬细胞(通常被称为TAM-肿瘤相关的巨噬细胞)和预后不良的巨噬细胞可以通过用沙门氏菌调节而改变为更有利于炎症的表型，从而更好地支持抗肿瘤反应。

实施例7-人单核细胞的体外调节克服了M2极化并降低了其抑制能力

众所周知，M2样巨噬细胞(例如肿瘤相关的巨噬细胞)通过多种机制对包括T细胞在内的各种免疫细胞类型产生免疫抑制作用(Quaranta和Schmid,Macrophage-MediatedSubversion of Anti-Tumour Immunity,Cells,2019(8(7):747)。由于具有已知的抗原定向细胞毒性的能力，T细胞为开发各种免疫疗法的一个关键目标。因此，研究了用革兰氏阴性菌体外调节人单核细胞后对T细胞增殖的影响。

通过Ficoll-Paque梯度离心法从血沉棕黄层分离出PBMC，使用CD14 MicroBeads分离试剂盒(MiltenyiBiotec)分离出CD14⁺单核细胞。用伤寒肠道沙门氏菌菌株ZH9(ΔaroC，ΔssaV)以MOI为1(经调节的细胞)下或仅在培养基(未经调节的细胞)中处理单核细胞30分钟。细胞用PBS洗涤两次以去除沙门氏菌，用补充庆大霉素的培养基培养6天。然后加入IL-4、IL-10和TGFβ48小时，以使细胞极化为免疫抑制性巨噬细胞。分离自体CD4⁺T细胞，并用CellTrace Far Red进行标记。然后将T细胞与巨噬细胞在抗CD3/CD28抗体存在下共同培养。5天后，收集细胞，并使用流式细胞仪评估T细胞增殖。

用沙门氏菌调节的人单核细胞衍生的M2巨噬细胞对T细胞增殖的抑制作用较小，已证明与未经调节的巨噬细胞相比，在用沙门氏菌调节的巨噬细胞存在的情况下，T细胞增殖增加(见图7A和7C)。从图7C可以看出，未经调节(培养基)的骨髓细胞表现为抑制性M2细胞，有效地抑制了T细胞的增殖，平均只有10％的活化T细胞经历大于2次的分裂。相反，用沙门氏菌调节的骨髓细胞的抑制性较低，平均有20％的T细胞经历大于2次的分裂。因此，用沙门氏菌调节的单核细胞衍生的巨噬细胞不太容易被M2极化。

这些数据表明，用革兰氏阴性菌调节的骨髓细胞可以在抑制性条件(如肿瘤微环境)下增强T细胞增殖，并支持这样的假设，即通过口服给药革兰氏阴性菌调节将增强过继性输注和CAR T细胞疗法的增殖。

实施例8-人单核细胞的体外培养克服了M2极化并增强了抗PD-L1抗体的活性

在观察到用革兰氏阴性菌调节的骨髓细胞可以增强T细胞在抑制条件下的增殖后，随后探讨了这种效果是否对免疫疗法的疗效有影响。

通过Ficoll-Paque梯度离心法从血沉棕黄层中分离出PBMC，使用CD14MicroBeads分离试剂盒(MiltenyiBiotec)分离出CD14⁺单核细胞。用伤寒肠道沙门氏菌菌株ZH9(ΔaroC，ΔssaV)以MOI为1(经调节的细胞)下或仅在培养基(未经调节的细胞)中处理单核细胞30分钟。细胞用PBS洗涤两次以去除沙门氏菌，用补充庆大霉素的培养基培养6天。然后加入IL-4、IL-10和TGFβ48小时，以使细胞极化为免疫抑制性M2巨噬细胞。分离自体CD4⁺T细胞，并用CellTrace Far Red进行标记。然后在抗CD3/CD28抗体和抗PD-L1抗体或相关的同种型抗体对照的存在下，将细胞与巨噬细胞共同培养。5天后，收集细胞，并使用流式细胞仪评估T细胞增殖。

与未接触沙门氏菌的巨噬细胞相比，用沙门氏菌调节的人单核细胞衍生的巨噬细胞被证明能增强PD-L1阻断疗效(见图8A和C)。从图8C可以看出，在这种模拟肿瘤微环境的实验环境中，未经调节的(培养基)骨髓细胞与PD-L1阻断相结合不能有效逆转对T细胞增殖的抑制。然而，用沙门氏菌调节的骨髓细胞与PD-L1阻断相结合使抑制检查点敏感，在PD-L1阻断存在下逆转了对T细胞增殖的抑制，约50％的细胞经历了大于2次的分裂。

这些数据显示，用革兰氏阴性菌调节的骨髓细胞能够实现并增强检查点阻断疗效，以在强免疫抑制条件(如对检查点抑制疗法无反应的患者的肿瘤微环境)下逆转对T细胞增殖的抑制。因此，数据支持这样的假设，即通过给予革兰氏阴性菌进行调节将提高免疫疗法(如检查点抑制剂、过继性细胞疗法和CAR-T疗法)的疗效。

因此，本发明的发明人在啮齿动物和人类细胞中的一些试验证明，与单独使用免疫疗法相比，将革兰氏阴性菌与免疫疗法如检查点抑制剂疗法、过继性细胞疗法和/或同种异体或自体CAR-T疗法结合使用可以提高所述疗法的抗肿瘤疗效。因此，本发明代表了肿瘤学领域的一个重大进步，并且至少为那些目前由于未知原因对目前临床上使用的免疫疗法没有反应的患者提供了一种新的治疗策略。

Claims

1.一种减活的革兰氏阴性菌，其用于治疗、减轻、抑制或控制正在接受或意欲接受检查点抑制剂疗法、过继性细胞疗法和/或同种异体或自体CAR-T疗法的受试者的肿瘤性疾病，同时、分别或顺序给予减活的革兰氏阴性菌，其中减活的革兰氏阴性菌为口服给药、皮下给药或肌内给药。

2.一种减活的革兰氏阴性菌，其用于治疗、减轻、抑制或控制正在接受或意欲接受检查点抑制剂疗法、过继性细胞疗法和/或同种异体或自体CAR-T疗法的受试者的肿瘤性疾病，其中所述减活的革兰氏阴性菌将在第一治疗阶段给予，而检查点抑制剂疗法、过继性T细胞疗法和/或同种异体或自体CAR-T疗法将在第二治疗阶段给予。

3.一种减活的革兰氏阴性菌，其用于治疗、减轻、抑制或控制正在接受或意欲接受检查点抑制剂疗法、过继性细胞疗法和/或同种异体或自体CAR-T疗法的受试者的肿瘤性疾病，同时、分别或顺序给予减活的革兰氏阴性菌，其中所述减活的革兰氏阴性菌是非重组的，或其中所述减活的革兰氏阴性菌不包含编码治疗性蛋白的真核异源DNA。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的用于所述用途的减活的革兰氏阴性菌，其中所述减活的革兰氏阴性菌为沙门氏菌属。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的用于所述用途的减活的革兰氏阴性菌，其中所述减活的革兰氏阴性菌为肠道沙门氏菌。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的用于所述用途的减活的革兰氏阴性菌，其中所述减活的革兰氏阴性菌为伤寒沙菌，或其中所述减活的革兰氏阴性菌为鼠伤寒沙门氏菌。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的用于所述用途的减活的革兰氏阴性菌，其中所述减活的革兰氏阴性菌是基因工程的非天然细菌。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的用于所述用途的减活的革兰氏阴性菌，其中所述减活的革兰氏阴性菌选自Ty21a、CVD 908-htrA、CVD 909、Ty800、M01ZH09、x9633、x9640、x8444、DTY88、ZH9PA、MD58、WT05、ZH26、SL7838、SL7207、VNP20009或A1-R。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的用于所述用途的减活的革兰氏阴性菌，其中所述检查点抑制剂是针对CTLA-4、PD-1、PD-L1、LAG-3、TIM-3、BTLA、TIGIT、VISTA或其任何组合的阻断剂。

10.根据权利要求9所述的用于所述用途的减活的革兰氏阴性菌，其中检查点抑制剂是针对CTLA-4、PD-1或PD-L1的阻断剂。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的用于所述用途的减活的革兰氏阴性菌，其中所述过继性细胞疗法是肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)疗法、工程T细胞受体(TCR)疗法和/或自然杀伤(NK)细胞疗法。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的用于所述用途的减活的革兰氏阴性菌，其中所述肿瘤性疾病与实体瘤或血液恶性肿瘤有关，优选地，其中肿瘤性疾病与实体瘤有关。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的用于所述用途的减活的革兰氏阴性菌，其中所述肿瘤性疾病与选自以下的癌症有关：前列腺癌、肝癌、肾癌、肺癌、乳腺癌、结直肠癌、膀胱癌、胰腺癌、脑癌、肝细胞癌、淋巴瘤、白血病、胃癌、宫颈癌、卵巢癌、甲状腺癌、黑色素瘤、癌、头颈癌、皮肤癌或肉瘤。

14.根据权利要求13所述的用于所述用途的减活的革兰氏阴性菌，其中所述肿瘤性疾病与选自以下的癌症有关：肺癌、膀胱癌、胃癌、卵巢癌、结直肠癌、头颈癌、黑色素瘤、肾癌或乳腺癌。

15.根据权利要求1至14中任一项所述的用于所述用途的减活的革兰氏阴性菌，其中所述减活的革兰氏阴性菌是口服给药。

16.根据权利要求1、3或其任一项从属权利要求所述的用于所述用途的减活的革兰氏阴性菌，其中减活的革兰氏阴性菌在第一治疗阶段给予，而检查点抑制剂疗法、过继性T细胞疗法和/或同种异体或自体CAR-T疗法在第二治疗阶段给予。

17.根据权利要求2或其任一项从属权利要求，或权利要求16所述的用于所述用途的减活的革兰氏阴性菌，其中第一治疗阶段和第二治疗阶段至少相隔一周给予，优选地其中第一治疗阶段和第二治疗阶段相隔两周给予。

18.根据权利要求1至17中任一项所述的用于所述用途的减活的革兰氏阴性菌，其中在使用时，所述减活的革兰氏阴性菌在受试者中产生全身免疫应答。

19.根据权利要求18所述的用于所述用途的减活的革兰氏阴性菌，其中所述全身免疫应答导致骨髓细胞的激活和/或成熟度的增加。

20.一种治疗、抑制或控制受试者的肿瘤性疾病的方法，其中所述方法包括同时、分别或顺序向受试者给予：(i)减活的革兰氏阴性菌，其中所述减活的革兰氏阴性菌是口服给药、皮下给药或肌内给药，和(ii)检查点抑制剂疗法、过继性细胞疗法和/或同种异体或自体CAR-T疗法，其中相对于单独给予减活的革兰氏阴性菌或检查点抑制剂疗法、过继性细胞疗法和/或同种异体或自体CAR-T疗法而言，所述方法产生了增强的治疗效果。

21.根据权利要求20所述的治疗、抑制或控制受试者的肿瘤性疾病的方法，其中所述方法包括根据权利要求1或其任一项从属权利要求所述的用于所述用途的减活的革兰氏阴性菌。