JP2023529957A - がん治療 - Google Patents

Abstract

本発明は、がん治療の分野に関する。特に、本発明は、弱毒生グラム陰性菌の投与と同時に、別々に、又は経時的に、チェックポイント阻害薬療法、養子Ｔ細胞療法及び／又は同種若しくは自己ＣＡＲ－Ｔ療法を受ける又は受けるよう意図される対象における腫瘍性疾患の治療、低減、抑制又は制御に使用する弱毒生グラム陰性菌に関する。

Description

本発明は、がん治療の分野に関する。本発明は特に、対象における腫瘍性疾患の発生を予防、治療又は抑制する方法に関する。

がん治療の分野は、がんの形成及び進行に関連する根底にある機構についての理解が進むので、新規な治療を伴い絶えず発展している。

がん患者にとって現在最も有望な治療戦略の１つは、免疫療法の治療戦略である。この種類の治療法は、がん又は腫瘍と戦うために身体の自然防御力を上昇させることが目的である。免疫療法は、免疫系機能を改善する又は回復するために身体が作成する、又は実験室で人工的に作られた物質を利用する。免疫療法の種類としては、モノクローナル抗体、臓器横断的療法、非特異的免疫療法、腫瘍溶解性ウイルス療法、養子細胞移入、例えばＣＡＲ－Ｔ細胞療法及びがんワクチンが挙げられる。非特異的免疫療法としては、インターフェロン又はインターロイキン、免疫系ががんと戦い、がん細胞の増殖を遅くする、又はいくつかの例においてはがんを破壊するのに役立つ分子での治療が挙げられる。免疫療法は、化学療法若しくは放射線療法などの従来のがん治療の代わりに、又はこのような治療と併用して施してよい。

免疫療法はある程度は成功するが、克服すべき重要な難題がまだ残っている。このような問題点は、免疫療法の結果として生じる副作用である。免疫療法の目的は、免疫系が作用するように促し、結果としてがん又は腫瘍が巡回している免疫細胞の攻撃を受けやすくすることである。しかしながら、免疫活性化の制御機構を遮断することにより、免疫療法のなかには自己免疫毒性のため副作用を起こすものもある。さらに、免疫療法のなかには癌性及び健常細胞を区別できないものもある。結果として、個人の生活の質が深刻な影響を受けることができる。

さらに、免疫療法は有効であると分かっているが、がん治療に効果がないままの個人がまだ大部分いる。このような治療が、一部の個人では最初に予想したほど効果的ではない理由はたくさんある。これらには、治療すべきがんの複雑さ、治療を受ける個人の健康状態（高齢の個人及び基礎疾患を有する個人は、免疫系が弱いことが知られている）、がん細胞が免疫系から「隠れる」能力及び免疫系の応答を弱める能力を有するがん細胞の難題が挙げられる。

したがって、がんの分野には、現在用いられている免疫療法の毒性プロファイルを改善することができる一方、正に応答する個人におけるこの治療の有効性を維持する方法に対するかなりの必要性が残っている。同時に、免疫療法治療の有効性を改善できなければこの治療に効果がない個人の免疫療法治療の有効性を改善することができる方法に対するかなりの必要性がある。

国際公開第２０００／６８２６１号 国際公開第２０１９／１１０８１９号 国際公開第２０２０／１５７２０３号 国際公開第２０１２／００１３５２号 国際公開第２００５／０５２１６７号 国際公開第２０２０／１５７２０３号 欧州特許第１０９９４２号明細書 欧州特許第１８０５６４号明細書 欧州特許第２３１０３９号明細書

Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ＨａＲＢｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ ２００１） Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ Ｅｄ．（Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９９） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｂｏｌｌａｇら、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９６） ＯＲＴ－ＶＡＣ；Ｇａｒｍｏｒｙら、２００５年、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、７３巻：頁２００５～２０１１ Ｄｅｇｒｙｓｅ、１９９１年、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、２２７巻：頁４９～５１ Ａｄｏｐｔｉｖｅ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ：ｔｈｅ ｃｕｒｒｅｎｔ ｌａｎｄｓｃａｐｅ，Ｒｏｈａａｎら、２０１９，Ｖｉｒｃｈｏｗｓ Ａｒｃｈ．４７４（４）：４４９－４６１ Ｒｏｈａａｎら、２０１９， Ｖｉｒｃｈｏｗｓ Ａｒｃｈ．４７４（４）：４４９－４６１ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０，ｐｐ．１２８９－１３２９ Ｄｕａｎ ａｎｄ Ｌｕｏ，Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，２０２１（６：１２７） Ｑｕａｒａｎｔａ ａｎｄ Ｓｃｈｍｉｄ，Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｓｕｂｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉ－Ｔｕｍｏｕｒ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，Ｃｅｌｌｓ，２０１９ （８（７）：７４７

本発明は、弱毒生グラム陰性菌をチェックポイント阻害薬療法、養子細胞療法及び／又は同種若しくは自己ＣＡＲ－Ｔ療法と併用投与することにより、対象における腫瘍性疾患を治療及び／又は予防するのに有効な方法を提供する。発明者らは驚くべきことに、この組み合わせを用いると、対象をいずれかの要素単独で治療した場合より治療効果が高い、すなわち相加的又は相乗的効果を達成することを見出した。弱毒生グラム陰性菌の投与から観察される全身性改変は、この弱毒生グラム陰性菌の腸管からの取り込みと併せて、がん免疫療法の抗腫瘍活性を増強することができると考えられる。

本発明の第１の態様において、弱毒生グラム陰性菌の投与と同時に、別々に、又は経時的に、チェックポイント阻害薬療法、養子細胞療法及び／又は同種若しくは自己ＣＡＲ－Ｔ療法を受ける又は受けるよう意図される対象における腫瘍性疾患の治療、低減、抑制又は制御に使用する弱毒生グラム陰性菌であって、前記弱毒生グラム陰性菌は、経口投与され、皮下に投与され、又は筋肉内に投与される、弱毒生グラム陰性菌がある。

本発明の第２の態様において、チェックポイント阻害薬療法、養子細胞療法及び／又は同種若しくは自己ＣＡＲ－Ｔ療法を受ける又は受けるよう意図される対象における腫瘍性疾患の治療、低減、抑制又は制御に使用する弱毒生グラム陰性菌であって、前記弱毒生グラム陰性菌は、治療の第１期に投与されることになっており、前記チェックポイント阻害薬療法、前記養子Ｔ細胞療法及び／又は同種若しくは自己ＣＡＲ－Ｔ療法は、治療の第２期に投与されることになっている、弱毒生グラム陰性菌がある。

本発明の第３の態様において、弱毒生グラム陰性菌の投与と同時に、別々に、又は経時的に、チェックポイント阻害薬療法、養子細胞療法及び／又は同種若しくは自己ＣＡＲ－Ｔ療法を受ける又は受けるよう意図される対象における腫瘍性疾患の治療、低減、抑制又は制御に使用する弱毒生グラム陰性菌であって、前記弱毒生グラム陰性菌は、非組換え型であるか、又は前記弱毒生グラム陰性菌は、治療タンパク質をコードする真核生物の異種ＤＮＡを含まない、弱毒生グラム陰性菌がある。

本発明の第４の態様において、対象における腫瘍性疾患を治療、抑制又は制御する方法であって、前記方法は、（ｉ）弱毒生グラム陰性菌であって、前記弱毒生グラム陰性菌は、経口投与され、皮下に投与され、又は筋肉内に投与される、弱毒生グラム陰性菌、及び（ｉｉ）チェックポイント阻害薬療法、養子細胞療法及び／又は同種若しくは自己ＣＡＲ－Ｔ療法を、前記対象に同時に、別々に、又は経時的に投与することを含み、前記方法は、前記弱毒生グラム陰性菌又はチェックポイント阻害薬療法、養子細胞療法及び／若しくは同種若しくは自己ＣＡＲ－Ｔ療法の単独投与と比較して治療効果を増強する、方法がある。

本発明の第５の態様において、対象における腫瘍性疾患を治療、抑制又は制御する方法であって、前記方法は、（ｉ）弱毒生グラム陰性菌であって、前記弱毒生グラム陰性菌は、治療の第１期に投与されることになっている、弱毒生グラム陰性菌、及び（ｉｉ）チェックポイント阻害薬療法、養子細胞療法及び／又は同種若しくは自己ＣＡＲ－Ｔ療法は、治療の第２期に投与されることになっている、を前記対象に同時に、別々に、又は経時的に投与することを含み、前記方法は、前記弱毒生グラム陰性菌又はチェックポイント阻害薬療法、養子細胞療法及び／若しくは同種若しくは自己ＣＡＲ－Ｔ療法の単独投与と比較して治療効果を増強する、方法がある。

本発明の第６の態様において、対象の腫瘍性疾患を治療、抑制又は制御する方法であって、前記方法は、（ｉ）弱毒生グラム陰性菌であって、前記弱毒生グラム陰性菌は、非組換え型であるか、又は前記弱毒生グラム陰性菌は、治療タンパク質をコードする真核生物の異種ＤＮＡを含まない、弱毒生グラム陰性菌、及び（ｉｉ）チェックポイント阻害薬療法、養子細胞療法及び／又は同種若しくは自己ＣＡＲ－Ｔ療法を前記対象に同時に、別々に、又は経時的に投与することを含み、前記方法は、前記弱毒生グラム陰性菌又はチェックポイント阻害薬療法、養子細胞療法及び／若しくは同種若しくは自己ＣＡＲ－Ｔ療法の単独投与と比較して治療効果を増強する、方法がある。

図１Ａは、経口投与したサルモネラ菌は、全身骨髄系細胞の長期的表現型に著しい変化を誘導することを示す。Ａ）グラフは、生存可能なＣＤ１１ｃ^ｈｉｇｈ、ＨＬＡ－ＤＲ^＋、ＣＤ１１ｂ^＋／－、ＰＤＣＡ－１^－通常型樹状細胞及び生存可能なＣＤ１１ｃ^{－／ｌｏｗ}、ＰＤＣＡ１^＋、ＨＬＡ－ＤＲ^{－／Ｉｎｔ}、ＣＤ１１ｂ^－形質細胞様樹状細胞のマーカーＣＤ８０、ＣＤ８６及びＰＤ－Ｌ１の蛍光強度の中央値を示す。ｎ＝４又は５匹のマウス／群。 図１Ｂは、経口投与したサルモネラ菌は、全身骨髄系細胞の長期的表現型に著しい変化を誘導することを示す。Ｂ）グラフは、生存可能なＣＤ１１ｃ^ｈｉｇｈ、ＨＬＡ－ＤＲ^＋、ＣＤ１１ｂ^＋／－、ＰＤＣＡ－１^－通常型樹状細胞及び生存可能なＣＤ１１ｃ^{－／ｌｏｗ}、ＰＤＣＡ１^＋、ＨＬＡ－ＤＲ^{－／Ｉｎｔ}、ＣＤ１１ｂ^－形質細胞様樹状細胞のマーカーＣＤ８０、ＣＤ８６及びＰＤ－Ｌ１の蛍光強度の中央値を示す。ｎ＝４又は５匹のマウス／群。 図１Ｃは、経口投与したサルモネラ菌は、全身骨髄系細胞の長期的表現型に著しい変化を誘導することを示す。Ｃ）グラフは、生存可能なＣＤ１１ｃ^－、ＣＤ１１ｂ^＋、Ｌｙ６Ｃ^＋、Ｆ４／８０^－単球及び生存可能なＣＤ１１ｃ^－、ＣＤ１１ｂ^＋、Ｌｙ６Ｃ^－、Ｆ４／８０^＋マクロファージのマーカーＰＤ－Ｌ１、ＣＤ８０及びＨＬＡ－ＤＲの蛍光強度の中央値を示す。ｎ＝４又は５匹のマウス／群。 図１Ｄは、経口投与したサルモネラ菌は、全身骨髄系細胞の長期的表現型に著しい変化を誘導することを示す。Ｄ）グラフは、生存可能なＣＤ１１ｃ^－、ＣＤ１１ｂ^＋、Ｌｙ６Ｃ^＋、Ｆ４／８０^－単球及び生存可能なＣＤ１１ｃ^－、ＣＤ１１ｂ^＋、Ｌｙ６Ｃ^－、Ｆ４／８０^＋マクロファージのマーカーＰＤ－Ｌ１、ＣＤ８０及びＨＬＡ－ＤＲの蛍光強度の中央値を示す。ｎ＝４又は５匹のマウス／群。 図２Ａは、サルモネラ菌で誘導された表現型変化の時間経過を示す。Ａ）実験の予定表を詳述した実験模式図である。 図２Ｂは、サルモネラ菌で誘導された表現型変化の時間経過を示す。Ｂ）グラフは、生存可能なＣＤ１１ｃ^ｈｉｇｈ、ＨＬＡ－ＤＲ^＋、ＣＤ１１ｂ^＋／－、ＰＤＣＡ－１^－通常型樹状細胞（ｃＤＣ）及び^－生存可能なＣＤ１１ｃ^{－／ｌｏｗ}、ＰＤＣＡ１^＋、ＨＬＡ－ＤＲ^{－／Ｉｎｔ}、ＣＤ１１ｂ形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）についてのＰＢＳ対照群平均割合としてのマーカーＣＤ８０及びＣＤ８６の蛍光強度の中央値を示す。ｎ＝４～５匹のマウス／群の平均を示す。 図２Ｃは、サルモネラ菌で誘導された表現型変化の時間経過を示す。Ｃ）グラフは、生存可能なＣＤ１１ｃ^－、ＣＤ１１ｂ^＋、Ｌｙ６Ｃ^＋、Ｆ４／８０^－単球及びＣＤ１１ｃ^－、ＣＤ１１ｂ^＋、Ｌｙ６Ｃ^－、Ｆ４／８０^＋マクロファージについてのＰＢＳ対照群平均割合としてのマーカーＣＤ８０、ＰＤ－Ｌ１及びＨＬＡ－ＤＲの蛍光強度の中央値を示す。ｎ＝４～５匹のマウス／群の平均を示す。 図３Ａは、サルモネラ菌を経口投与すると骨髄造血が増強されることを示す。Ａ）グラフは、骨髄細胞全体のＬＫＳ細胞と称される、ｃ－Ｋｉｔ及びＳｃａ－１の両方を発現する系統陰性（ＣＤ５^－、ＣＤ１１ｂ^－、Ｂ２２０^－、ＧＲ－１^－、Ｔｅｒｒ－１１９^－、Ｌｙ－６Ｂ．２^－）生存可能細胞の割合を示す。ｎ＝４～５匹のマウス／群である。 図３Ｂは、サルモネラ菌を経口投与すると骨髄造血が増強されることを示す。Ｂ）サルモネラ菌を経口的に処置した動物の骨髄中の生存可能なＬＫＳ細胞の増加を示す代表的なフローサイトメトリープロットである。 図３Ｃは、サルモネラ菌を経口投与すると骨髄造血が増強されることを示す。Ｃ）サルモネラ菌処置後１４日目の骨髄細胞全体に対する生存可能なＬＫＳ細胞の割合は、スピアマンの順位相関を用いると、同時点の単球（生存可能なＣＤ１１ｃ^－、ＣＤ１１ｂ^＋、Ｌｙ６Ｃ^＋、Ｆ４／８０^－細胞）の割合と相関した。 図４は、経口投与したサルモネラ菌は、全身樹状細胞の少なくとも１４日間持続する応答性亢進状態を誘導することを示す。単独試験で群あたりｎ＝５匹のマウス；バーは、平均＋／－ＳＥＭ；示される統計値は、マン・ホイットニー検定である。 図５Ａは、サルモネラ菌の経口投与により処置すると、免疫チェックポイント阻害薬と併用投与する場合、腫瘍増殖が遅くなり、有効性が増強されることを示す。Ａ）グラフは、経時的なＭＣ３８腫瘍体積を示し、腫瘍増殖を描写する。表は、対象群（溶媒＋アイソタイプ）に対する１４日目～３０日目の種々の処置による腫瘍増殖の平均抑制率を要約する。データは、１０匹のマウス／群の平均＋／－ＳＥＭである。 図５Ｂは、サルモネラ菌の経口投与により処置すると、免疫チェックポイント阻害薬と併用投与する場合、腫瘍増殖が遅くなり、有効性が増強されることを示す。Ｂ）グラフは、経時的な腫瘍体積を示し、腫瘍増殖を描写する。表は、対象群（溶媒＋アイソタイプ）に対する１６日目～１８日目の種々の処置による腫瘍増殖の平均抑制率を要約する。データは、９～１０匹のマウス／群の平均＋／－ＳＥＭである。 図６は、マクロファージをサルモネラ菌でインビトロで条件付けするとＭ１細胞が炎症性表現型へとさらに極性化し、Ｍ２をＭ１様表現型マクロファージにさらに誘導することを示す。データは、３人の別個のドナー由来の単球由来マクロファージを表す。 図７Ａは、ヒト単球をインビトロで条件付けするとＭ２極性化を克服し、Ｍ２の抑制能力を低減することを示す。Ａ）グラフは、応答するＴ細胞及び２回を超える分裂を受けるＴ細胞の割合が倍に拡大したことを示す複製指数を表す。 図７Ｂは、ヒト単球をインビトロで条件付けするとＭ２極性化を克服し、Ｍ２の抑制能力を低減することを示す。Ｂ）抗ＣＤ３／２８抗体によりＴ細胞を効果的に刺激することを示す正の対照データである。 図７Ｃは、ヒト単球をインビトロで条件付けするとＭ２極性化を克服し、Ｍ２の抑制能力を低減することを示す。Ｃ）サルモネラ菌で条件付けした単球由来マクロファージの存在下Ｔ細胞増殖が増加することを示す代表的なフローサイトメトリープロットである。 図８Ａは、ヒト単球をインビトロで条件付けするとＭ２極性化を克服し、抗ＰＤ－Ｌ１ Ａｂ活性を増強することを示す。サルモネラ菌で条件付けしたヒト単球由来マクロファージは、ＰＤ－Ｌ１遮断活性を増強する。Ａ）グラフは、応答するＴ細胞及び２回を超える分裂を受けるＴ細胞の割合が倍に拡大したことを示す複製指数を表す。 図８Ｂは、ヒト単球をインビトロで条件付けするとＭ２極性化を克服し、抗ＰＤ－Ｌ１ Ａｂ活性を増強することを示す。サルモネラ菌で条件付けしたヒト単球由来マクロファージは、ＰＤ－Ｌ１遮断活性を増強する。Ｂ）抗－ＣＤ３／２８抗体によりＴ細胞を効果的に刺激することを示す正の対照データである。 図８Ｃは、ヒト単球をインビトロで条件付けするとＭ２極性化を克服し、抗ＰＤ－Ｌ１ Ａｂ活性を増強することを示す。サルモネラ菌で条件付けしたヒト単球由来マクロファージは、ＰＤ－Ｌ１遮断活性を増強する。Ｃ）ＰＤ－Ｌ１遮断及びサルモネラ菌で条件付けされた単球由来マクロファージを組み合わせるとＴ細胞増殖が増加することを示すＣｅｌｌＴｒａｃｅ希釈の代表的なフローサイトメトリープロットである。

本発明をより容易に理解することができるように、まず特定の用語を定義する。追加の定義は、詳細な説明全体を通して説明する。

本明細書において用いられる場合、用語「弱毒」とは、ヒト又は動物対象／モデルに病気を起こさないよう遺伝子操作した細菌を指す。

「免疫療法」によって、抗体若しくは免疫細胞などの免疫系成分を調節することを目標とした、又は免疫系を刺激、抑制、若しくは調節する薬剤若しくは他の作用薬による特定の治療法を指す。本発明の文脈においては、用語「免疫療法」とは、チェックポイント阻害薬療法、養子細胞療法及び／又は同種若しくは自己ＣＡＲ－Ｔ細胞療法を指す。

「免疫系の細胞成分」によって、Ｔ及びＢリンパ球、γδＴ細胞、及びＮＫ細胞などのリンパ球などの免疫細胞を指し、これらの免疫細胞は、プリオン、ウイルス、細菌、酵母、真菌、寄生虫、腫瘍関連若しくは腫瘍特異的抗原、又は特定の疾患、障害若しくは条件と関連する他の抗原などの特異的抗原を認識することができる。言及する他の免疫細胞としては、白血球が挙げられ、白血球は、顆粒球又は無顆粒白血球であってよい。免疫細胞の例としては、好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球、単球及びマクロファージが挙げられる。樹状細胞、ミクログリア及び他の抗原提示細胞も本定義内に含まれる。

「免疫療法組成物」によって、免疫療法薬を含有する任意の組成物を指す。例は、薬学的に許容される担体、免疫応答を増強する生体応答修飾物質及び／又はアジュバント／添加物又は希釈剤であってよい。

本明細書において用いられる場合、本発明の文脈における用語「弱毒」とは、微生物の生存率を維持しながら、微生物の病原性を低減し、微生物を宿主に対して無害にする微生物の変化を指す。この方法は、許容される安全性プロファイルを維持しながら非常に特異的な免疫応答を誘発する能力のため、ワクチンの開発に通常用いられる。このようなワクチンの開発方法には多くの方法が関与してよいが、例としては、病原性が失われるまでインビトロ条件下で病原体を継代すること、化学的突然変異誘発及び遺伝子工学技術が挙げられるが、これらに限定されない。このような弱毒微生物は好ましくは弱毒生微生物であるが、非弱毒生微生物も開示されている。

「非天然細菌又は複数の非天然細菌」によって、天然起源の細胞に関して変化したような遺伝子を改変した又は「操作した」菌体（原核生物）を表す。このような遺伝子改変は例えば、細胞への追加の遺伝情報の組込み、既存の遺伝情報の改変又は実際は既存の遺伝情報の欠失であってよい。これを、例えば、細胞への組換えプラスミドの遺伝子導入又は細菌ゲノムの直接的な改変により実現してもよい。

「不活性化変異」によって、遺伝子の本来の機能が消失する又は測定できない程度まで減少するように特定の遺伝子が適切に転写されない若しくは翻訳されない又は非活性タンパク質へと発現されるように、ヌクレオチドコードの変化、又はヌクレオチドセクションの欠失又は非コードヌクレオチド若しくは非天然ヌクレオチドの追加による改変などの、特定の遺伝子又はその遺伝子に関連する遺伝子プロモーターの天然遺伝コードの改変を表す。したがって、遺伝子の変異は、その遺伝子の機能又はその遺伝子がコードするタンパク質の機能を不活性化する。

用語「腫瘍（ｔｕｍｏｕｒ）」、「がん（ｃａｎｃｅｒ）」及び「新生物（ｎｅｏｐｌａｓｉａ）」は、互換的に用いられ、成長（ｇｒｏｗｔｈ）、増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）若しくは生存率が正常な対応細胞の成長、増殖若しくは生存率より大きい細胞又は細胞集団、例えば、細胞増殖若又は分化障害を指す。典型的には、成長は制御されない。用語「悪性腫瘍（ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ）」とは、近くの組織の浸潤を指す。用語「転移」とは、腫瘍、がん又は新生物の対象内の他の部位、位置、又は領域への広がり又は播種を指し、この部位、位置、又は領域は、原発腫瘍又は癌とは異なる。

「チェックポイント阻害薬」は、免疫応答のチェックポイントとみなされる表面タンパク質に働く作用薬であり、表面タンパク質は、ＴＮＦ受容体若しくはＢ７スーパーファミリー、又は他の物のいずれかの種類であり、負の共刺激分子に結合する作用薬を含む。このようなチェックポイント阻害薬の例としては、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＴＩＭ－３、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ－３、及び／又はＰＤ－Ｌ１を含む、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＴＩＭ－３、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ－３のそれぞれのリガンドと結合する作用薬が挙げられるが、限定されない。本発明の文脈において、用語「作用薬」は、抗体、小分子、抗体断片又は任意の他の結合及び／又は遮断薬を指してよい。

用語「プログラム死１」、「プログラム細胞死１」、「タンパク質ＰＤ－１」、「ＰＤ－１」、ＣＤ２７９及び「ＰＤ１」は、互換的に用いられ、ヒトＰＤ－１の変異体、アイソフォーム、種の相同体、及びＰＤ－１と少なくとも１つの共通エピトープを有する類縁体を含む。完全なＰＤ－１配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号第ＮＰ００５００９．２で見ることができる。

用語「ＰＤ－Ｌ１」、「ＰＤＬ１」、「プログラム死リガンド１」、ＣＤ２７４及び「プログラム細胞死１」は、互換的に用いられ、ヒトＰＤ－Ｌ１の変異体、アイソフォーム、及び種の相同体、並びにＰＤ－Ｌ１と少なくとも１つの共通エピトープを有する類縁体を含むと考えられる。完全なＰＤ－Ｌ１配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号第ＮＰ０５４８６２．１で見ることができる。

用語「細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４」、「ＣＴＬＡ－４」、「ＣＴＬＡ４」、ＣＤ１５２及び「ＣＴＬＡ－４抗原」は、互換的に用いられ、ヒトＣＴＬＡ－４の変異体、アイソフォーム、種の相同体、及びＣＴＬＡ－４と少なくとも１つの共通エピトープを有する類縁体を含む。完全なＣＴＬＡ－４配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号第ＮＰ＿００５２０５．２で見ることができる。

用語「ＬＡＧ－３」、「ＬＡＧ３」、ＣＤ２２３及び「リンパ球活性化遺伝子３」は、互換的に用いられ、ヒトＬＡＧ－３の変異体、アイソフォーム、及び種の相同体、並びにＬＡＧ－３と少なくとも１つの共通エピトープを有する類縁体を含むと考えられる。完全なＬＡＧ－３配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号第ＮＰ＿００２２７７．４で見ることができる。

用語「ＴＩＭ－３」、「ＴＩＭ３」、「ＨＡＶＣＲ２」、「Ａ型肝炎ウイルス受容体２」、ＣＤ３６６及び「Ｔ細胞免疫グロブリンドメイン及びムチンドメイン３」は、互換的に用いられ、ヒトＴＩＭ－３の変異体、アイソフォーム、及び種の相同体、並びにＴＩＭ－３と少なくとも１つの共通エピトープを有する類縁体を含むと考えられる。完全なＴＩＭ－３配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号第ＮＰ＿１１６１７１．３で見ることができる。

用語「ＢＴＬＡ」、「Ｂ及びＴリンパ球アテニュエーター」及び「ＣＤ２７２」は、互換的に用いられ、ヒトＢＴＬＡの変異体、アイソフォーム、及び種の相同体、並びにＢＴＬＡと少なくとも１つの共通エピトープを有する類縁体を含むと考えられる。完全なＢＴＬＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号第ＮＰ＿８６１４４５．４で見ることができる。

用語「ＶＩＳＴＡ」、「Ｖセット免疫調節性受容体」、「Ｂ７Ｈ５」、「Ｂ７－Ｈ５」、「ＰＤ－１Ｈ」及び「Ｔ細胞活性化のＶドメイン抑制因子（Ｖ－ｄｏｍａｉｎ Ｉｇ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）」は、互換的に用いられ、ヒトＶＩＳＴＡの変異体、アイソフォーム、及び種の相同体、並びにＶＩＳＴＡと少なくとも１つの共通エピトープを有する類縁体を含むと考えられる。完全なＶＩＳＴＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号第ＮＰ＿０７１４３６．１で見ることができる。

用語「ＴＩＧＩＴ」、「Ｉｇ及びＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（Ｔ ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｗｉｔｈ Ｉｇ ａｎｄ ＩＴＩＭ ｄｏｍａｉｎｓ）」、「ＷＵＣＡＭ」及び「Ｖｓｔｍ３」は、互換的に用いられ、ヒトＴＩＧＩＴの変異体、アイソフォーム、及び種の相同体、並びにＴＩＧＩＴと少なくとも１つの共通エピトープを有する類縁体を含むと考えられる。完全なＴＩＧＩＴ配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号第ＮＰ＿７７６１６０．２で見ることができる。

本明細書において言及される用語「治療抗体」は、治療効果をもたらす抗体全体及び任意の抗原結合断片（すなわち「抗原結合部分」）又は抗原結合断片の単鎖を含む。

このような治療抗体は、上で指示されたチェックポイント阻害薬に向けられてよく、ＩＣＯＳ（誘導性Ｔ細胞共刺激分子／ＣＤ２７８）、ＧＩＴＲ（グルココルチコイド誘導性ＴＮＦ受容体／ＴＮＦＲＳＦ１８／ＣＤ３５７／ＡＩＴＲ）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２７及びＣＤ４０などの共刺激分子に向けられるアゴニスト抗体を含む。いくつかの例において、対象にとっては両方の種類の治療抗体を受けることが望ましくてよい。

本明細書において用いられる用語「モノクローナル抗体」とは、単一分子組成物の抗体分子の製剤を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性及び親和性を示す。このモノクローナル抗体は、ヒト抗体であってもヒト化抗体であってもよい。

用語「養子細胞療法」は、対象、好ましくはヒトへの細胞の移入／投与を含む任意の治療を指すことを意図する。細胞は、同種であっても自己であってもよい。好ましくは、細胞は通常、免疫機能性を改善することを目的として、免疫系に由来する。養子細胞療法としては、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法（キメラ抗原受容体Ｔ細胞）、ＴＩＬ療法（腫瘍浸潤リンパ球）、ＴＣＲ療法）操作したＴ細胞受容体療法、ＮＫ療法（ナチュラルキラー細胞）及び／又はｉＰＳＣ由来療法（人工多能性幹細胞）を挙げてよいが、限定されない。

用語「有効量」又は「薬学的有効量」とは、望ましい生物学的又は治療的結果をもたらすのに充分な作用薬の量を指す。その結果は、１つ又は複数の徴候、症状又は疾患の原因の減少、回復、寛解、軽減（ｌｅｓｓｅｎｉｎｇ）、遅延、及び／若しくは軽減（ａｌｌｅｖｉａｔｉｏｎ）又は生命システムの他の任意の望ましい変化であってよい。がんに関しては、有効量は、腫瘍を収縮させる及び／若しくは腫瘍の増殖速度を低下させる（腫瘍増殖を抑制するなど）又は他の望まれない細胞増殖を阻止又は遅延させるのに充分な量を含んでよい。いくつかの実施形態において、有効量は、癌又は腫瘍の発生を遅延させる若しくは生存期間を延ばす又は安定化を誘導するのに充分な量である。

いくつかの実施形態において、治療有効量は、再発を予防又は遅延させるのに充分な量である。治療有効量は、１回又は複数回の投与で投与されてよい。治療有効量の薬剤又は組み合わせは、以下の１つ又は複数、（ｉ）がん細胞の数を減少させる、（ｉｉ）腫瘍サイズを減少させる、（ｉｉｉ）がん細胞の末梢臓器への浸潤をある程度抑制する、遅延させる（ｒｅｔａｒｄ）、遅くし（ｓｌｏｗ）、好ましくは停止する、（ｉｖ）腫瘍転移を抑制する（すなわちある程度遅くし、好ましくは停止する）、（ｖ）腫瘍増殖を抑制する、（ｖｉ）腫瘍の発生及び／若しくは再発を予防する又は遅延させる、並びに／又は（ｖｉｉ）癌に関連する１つ又は複数の症状をある程度軽減する、を起こしてよい。

例えば、腫瘍の治療に関して、「治療有効量の用量」は、少なくとも約１０％、又は約２０％、又は約６０％又はそれ以上など、ベースライン測定値と比較して、少なくとも約５％の腫瘍の収縮を含んでよい。ベースライン測定値は、未治療の対象に由来してよい。

治療有効量の治療化合物は、腫瘍サイズを減少させる、又は対象の症状を回復することができる。当業者の一人ならば、対象の大きさ、対象の症状の重症度、及び選択される特定の組成物又は投与経路などの要素に基づいてこのような量を決定することができるだろう。

用語「免疫応答」とは、例えば、人体の癌性細胞に対する選択的障害、破壊、又は除去を引き起こすリンパ球、抗原提示細胞、貪食細胞、顆粒球、及び上の細胞又は肝臓によって産生される可溶性高分子（抗体、サイトカイン、及び補体を含む）の作用を指す。

用語「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」又は「治療（ｔｈｅｒａｐｙ）」とは、状態（例
えば疾患）、病態の症状を治癒する、治す、軽減する（ａｌｌｅｖｉａｔｅ）、軽減する（ｒｅｌｉｅｖｅ）、変化させる、治療する、回復する、改善する、若しくは影響する又は症状、合併症、疾患の生化学的兆候の開始を予防する若しくは遅延させる、又は疾患、病態、若しくは障害のさらなる悪化を統計的に有意に停止する又は抑制する目的で作用薬を投与することを指す。

本明細書において用いられる場合、用語「対象」は、ヒト及び非ヒト動物を含むよう意図される。好ましい対象には、免疫応答の増強を必要とするヒト患者が含まれる。方法は、免疫応答を増強することにより治療することができる障害を有するヒト患者の治療に特に好適である。特定の実施形態において、方法は、癌のインビボ治療に特に好適である。

本明細書において定義される「同時」投与は、弱毒生細菌及び免疫療法組成物を互いに約２時間又は約１時間以内、さらにずっと好ましくは同時に投与することを含む。

本明細書において定義される「個別」投与は、弱毒生細菌及び免疫療法組成物を約１２時間超、又は約８時間、又は約６時間又は約４時間又は約２時間離して投与することを含む。

本明細書において定義される「連続」投与は、弱毒生細菌及び免疫療法組成物を各々複数アリコート及び／又は用量で及び／又は別の時に投与することを含む。弱毒生細菌の投与の前後に、免疫療法組成物を患者に投与してよい。あるいは、弱毒生細菌での治療後に、免疫療法組成物を患者に投与し続ける。

代替物の使用（例えば「又は」）は、代替物のこれらのいずれか１つ、両方、又は代替物の任意の組み合わせを表すと理解されるべきである。本明細書において用いられる場合、不定冠詞「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」は、任意の記載された又は列挙された構成要素の「１つ又は複数」を指すと理解されるべきである。

本明細書において用いられる場合、「約」は、当業者によって決定された特定の値の許容誤差範囲内を表し、この範囲は値をどう測定する又は決定するか、すなわち測定システムの限界に部分的に依存する。例えば、「約」は、当該技術分野の実行あたり１以内又は１超の標準偏差を表してよい。あるいは、「約」は、２０％以下の範囲を表してよい。本願及び特許請求の範囲において特定の値を提供する場合、別段の定めがない限り、「約」の意味は、その特定の値についての許容誤差範囲内にあると推定されるべきである。

本明細書において用いられる場合、用語「非組換え」及び「非組換え菌株」は、互換的に用いられ、本発明の文脈においてはこれらの菌株は真核生物由来の遺伝子又は遺伝子断片を含有しないという事実を指す。このように、本明細書に開示される菌株は、対象／患者に治療分子を送達する目的の「キャリア菌株」として働かない。したがって、本明細書に開示される菌株は、真核生物の異種ＤＮＡ、又は治療分子をコードする真核生物の異種ＤＮＡ、又は抗原を意図するタンパク質、若しくはタンパク質の断片をコードする真核生物のＤＮＡをコードしない。

本明細書において用いられる場合、用語「全身性」及び「全身で活性化された」は、互換的に用いられ、本発明の文脈においては、局所的な、空間的に制限された応答とは対照的に、対象の身体全体の広範な免疫応答を指す。好ましくは、全身性免疫応答は、骨髄系細胞、例えば、樹状細胞、単球及び／又はマクロファージなどの活性化及び／又は成熟化に関わり、本発明の文脈においては、対象がチェックポイント阻害薬、養子細胞療法及び／又はＣＡＲ－Ｔ細胞療法などの免疫療法により反応するように、対象の免疫系を条件付けするのに役立つと考えられる。したがって、グラム陰性菌は、第２の組成物の投与後に
対象の免疫応答を「刺激する」、「ブーストする」、「増幅する」、「増強する」、「改善する」、「増大する」、「予め活性化する」又は「促進する」よう働いてよい。前述の用語は、用語「条件付けられた」と互換的に用いられる。

本明細書において用いられる場合、用語「臓器横断的療法（ｔｕｍｏｕｒ－ａｇｎｏｓｔｉｃ ｔｈｅｒａｐｙ）」又は「腫瘍タイプに依存しない（ａｇｎｏｓｔｉｃ ｔｏ ｔｕｍｏｕｒ ｔｙｐｅ）」は、互換的に用いられ、癌の種類又は体内で癌が始まった場所にかかわらず遺伝的及び／又は分子的特徴に基づいて癌を治療するために薬剤又は他の物質を用いる治療の種類を指す。

本発明の第１の態様において、弱毒生グラム陰性菌の投与と同時に、別々に、又は経時的に、チェックポイント阻害薬療法、養子細胞療法及び／又は同種若しくは自己ＣＡＲ－Ｔ療法を受ける又は受けるよう意図される対象における腫瘍性疾患の治療、低減、抑制又は制御に使用する弱毒生グラム陰性菌であって、前記弱毒生グラム陰性菌は、経口投与され、皮下に投与され、又は筋肉内に投与される、弱毒生グラム陰性菌がある。

本発明の第２の態様において、チェックポイント阻害薬療法、養子細胞療法及び／又は同種若しくは自己ＣＡＲ－Ｔ療法を受ける又は受けるよう意図される対象における腫瘍性疾患の治療、低減、抑制又は制御に使用する弱毒生グラム陰性菌であって、前記弱毒生グラム陰性菌は、治療の第１期に投与されることになっており、前記チェックポイント阻害薬療法、前記養子Ｔ細胞療法及び／又は前記同種若しくは自己ＣＡＲ－Ｔ療法は、治療の第２期に投与されることになっている、弱毒生グラム陰性菌がある。

本発明の第３の態様において、弱毒生グラム陰性菌の投与と同時に、別々に、又は経時的に、チェックポイント阻害薬療法、養子細胞療法及び／又は同種若しくは自己ＣＡＲ－Ｔ療法を受ける又は受けるよう意図される対象における腫瘍性疾患の治療、低減、抑制又は制御に使用する弱毒生グラム陰性菌であって、前記弱毒生グラム陰性菌は、非組換え型であるか、又は前記弱毒生グラム陰性菌は、治療タンパク質をコードする真核生物の異種ＤＮＡを含まない、弱毒生グラム陰性菌がある。

前記弱毒生グラム陰性菌はしたがって、対象の免疫系の調整剤として働いてよく、チェックポイント阻害薬、養子細胞療法及び／又は同種若しくは自己ＣＡＲ－Ｔ療法で治療した場合、対象の免疫系は腫瘍性疾患に対する有効な免疫応答を開始することができると想定される。

本発明の弱毒生細菌は、グラム陰性菌である。本発明において使用するグラム陰性菌の例としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、モラクセラ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、ステノトロホモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）、デロビブリオ（Ｂｄｅｌｌｏｖｉｂｒｉｏ）、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）及びエルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）が挙げられるが、限定されない。

好ましくは、弱毒生グラム陰性菌は、サルモネラ菌種である。本発明において使用するサルモネラ菌種の例は、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｅｎｔｅｒｉｃａ）及びサルモネラ・ボンゴリ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｂｏｎｇｏｒｉ）である。サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｅｎｔｅｒｉｃａ）は、異なる血清型又は血清型（ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ ｏｒ ｓｅｒｏｖａｒｓ）にさらに細分することができる。本発明において使用するこの血清型又は血清型（ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ ｏｒ ｓｅｒｏｖａｒｓ）の例は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ Ｔｙｐｈｉ、Ｓａｌｍ
ｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ Ｐａｒａｔｙｐｈｉ Ａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ Ｐａｒａｔｙｐｈｉ Ｂ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ Ｐａｒａｔｙｐｈｉ Ｃ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ及びＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓである。好ましい実施形態において、弱毒生グラム陰性菌は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ Ｔｙｐｈｉ又はＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍである。

本発明の別の実施形態において、弱毒生グラム陰性菌は、遺伝子操作した非天然細菌である。好ましい実施形態において、弱毒生グラム陰性菌は、非組換え型細菌である。別の好ましい実施形態において、本明細書に開示されるグラム陰性菌は、真核生物由来の遺伝子又は遺伝子断片を含有しない。

当業者によって理解されるように、遺伝子は、関心のある遺伝子を標的にする組換えプラスミドを用いる相同組換えなどの、当該技術分野において周知の多くの方法によって変異導入してよく、相同組換えの場合、標的遺伝子に対する相同性を有する遺伝子操作した遺伝子を適切な核酸ベクター（プラスミド又はバクテリオファージなど）に組み入れ、組み入れた核酸ベクターを標的細胞に遺伝子導入する。相同的な遺伝子操作した遺伝子は、天然遺伝子を置換又は変異導入のいずれかを行って望ましい不活性化変異を達成するよう天然遺伝子と組み換えられる。このような改変は、遺伝子の翻訳部又はプロモーター領域などの任意の調節部にあってもよい。当業者によって理解されるように、関心のある遺伝子に変異導入するために、例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９などのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムなどの、任意の適切な遺伝子改変技術を用いてよい。

したがって、菌種を遺伝子操作するための多数の方法及び技術が当業者にとって周知である。これらの技術には、染色体組込又は安定な常染色体性自己複製遺伝要素の導入により、異種遺伝子を細菌に導入するために必要とされるものが含まれる。菌体を遺伝子改変する（「形質転換する」又は「遺伝子操作する」とも称される）方法の例としては、バクテリオファージの感染、形質導入、接合、リポフェクション又は電気穿孔が挙げられる。分子細胞生化学におけるこれらの及び他の方法についての一般的な議論は、非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３などの標準的な教科書に見出すことができ、これらは、参照により本明細書に援用される。

したがって、本発明は、使用するための弱毒生グラム陰性菌を開示し、この弱毒生グラム陰性菌は、Ｔｙ２１ａ、ＣＶＤ ９０８－ｈｔｒＡ、ＣＶＤ ９０９、Ｔｙ８００、Ｍ０１ＺＨ０９、ｘ９６３３、ｘ９６４０、ｘ８４４４、ＤＴＹ８８ ＺＨ９ＰＡ、ＭＤ５８、ＷＴ０５、ＺＨ２６、ＳＬ７８３８、ＳＬ７２０７、ＶＮＰ２０００９又はＡ１－Ｒを含む群から選択されてよい。好ましくは、本明細書に開示される細菌は、例えばＴｙ２１ａ、ＣＶＤ ９０８－ｈｔｒＡ、ＣＶＤ ９０９、Ｔｙ８００、Ｍ０１ＺＨ０９、ｘ９６３３、ｘ９６４０、ｘ８４４４、ＤＴＹ８８、ＭＤ５８、ＷＴ０５、ＺＨ２６、ＳＬ７８３８、ＳＬ７２０７、ＶＮＰ２０００９又はＡ１－Ｒなどの非組換え菌株である。別の実施形態において、本明細書に開示される細菌は、例えばＺＨ９ＰＡなどの原核生物の異種ＤＮＡを含有するよう改変されている菌株である。前述の菌株に加えて、任意の弱毒、非病原性のチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ Ｔｙｐｈｉ）又はネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）菌株を、本明細書に開示されるように、すなわち調整剤として用いて、対象への免疫療法投与後により有効な免疫応答を開始してよいと想定される。

１つの実施形態において、遺伝子操作した非天然細菌は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｐａ
ｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ Ｉｓｌａｎｄ ２（ＳＰＩ－２）遺伝子の弱毒化変異及び第２の遺伝子の弱毒化変異を含んでよいサルモネラ菌種に由来してよい。このような弱毒生細菌の適した遺伝子及び詳細は、特許文献１に記載され、その全体を参照により本明細書に援用される。

１つの実施形態において、ＳＰＩ－２遺伝子は、ｓｓａ遺伝子である。例えば、本発明は、１つ又は複数のｓｓａＶ、ｓｓａＪ、ｓｓａＵ、ｓｓａＫ、ｓｓａＬ、ｓｓａＭ、ｓｓａＯ、ｓｓａＰ、ｓｓａＱ、ｓｓａＲ、ｓｓａＳ、ｓｓａＴ、ｓｓａＤ、ｓｓａＥ、ｓｓａＧ、ｓｓａＩ、ｓｓａＣ及びｓｓａＨの弱毒化変異を含む。好ましくは、弱毒化変異は、ｓｓａＶ又はｓｓａＪ遺伝子にある。さらにずっと好ましくは、弱毒化変異は、ｓｓａＶ遺伝子にある。

遺伝子操作した非天然細菌はまた、第２の遺伝子に弱毒化変異を含んでよく、弱毒化変異は、ＳＰＩ－２領域にあってもなくてもよい。この変異は、ＳＰＩ－２領域の外側にあってよく、芳香族化合物の生合成に関与してよい。例えば、本発明は、ａｒｏ遺伝子に弱毒化変異を含む。好ましい実施形態において、ａｒｏ遺伝子は、ａｒｏＡ又はａｒｏＣである。さらにずっと好ましくは、ａｒｏ遺伝子は、ａｒｏＣである。

遺伝子操作した非天然細菌は、１つ又は複数の遺伝子カセットをさらに含んでよい。このような遺伝子カセットは、免疫系を条件付けする目的で遺伝子操作した非天然細菌の機能を維持するために、又は関連する免疫療法、すなわちチェックポイント阻害薬療法、養子細胞療法及び／又はＣＡＲ－Ｔ細胞療法の活性を維持するために追加の原核生物の分子を送達するために用いてよい。当業者は、このように送達される維持分子は、投与予定の免疫療法に依存してよいことを認識する。

さらに別の実施形態において、遺伝子操作した非天然細菌は、サルモネラ菌種に由来してよく、ｐｌｔＡ、ｐｌｔＢ、ｃｄｔＢ及びｔｔｓＡから選択される１つ又は複数の遺伝子に不活性化変異を含んでよく、ａｒｏＡ及び／又はａｒｏＣ及び／又はｓｓａＶから選択される１つ又は複数の遺伝子に弱毒化変異をさらに含んでよい。これらの遺伝子及び変異の詳細は、特許文献２に記載され、その全体を参照により本明細書に援用される。

遺伝子ｐｌｔＡ、ｐｌｔＢ及びｃｄｔＢに不活性化変異（例えば欠失）があると、サルモネラ菌種は腸チフス毒素の産生を妨げられ、ｔｔｓＡに不活性化変異（例えば欠失）があると、サルモネラ菌種は腸チフス毒素の分泌を妨げられると想定される。非天然細菌は、特にサルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｅｎｔｅｒｉｃａ）に由来してよい。

ある実施形態において、遺伝子操作した微生物は、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ Ｔｙｐｈｉ）に由来してよく、パラチフスＡ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖｅｒ Ｐａｒａｔｙｐｈｉ Ａ）のリポ多糖Ｏ２ Ｏ抗原を発現する改変を含んでよい。さらに別の好ましい実施形態において、遺伝子操作した微生物は、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ Ｔｙｐｈｉ）に由来し、この菌株は、パラチフスＡ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖｅｒ Ｐａｒａｔｙｐｈｉ Ａ）の鞭毛タンパク質を発現する改変を含む。いくつかの例において、遺伝子操作した微生物は、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ Ｔｙｐｈｉ）に由来してよく、パラチフスＡ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖｅｒ Ｐａｒａｔｙｐｈｉ Ａ）のリポ多糖Ｏ２ Ｏ抗原及び鞭毛タンパク質の両方を発現する改変を含んでよい。このような改変の詳細は、特許文献３に見出すことができる。このような菌株は、用語「非組換え」が真核生物の遺伝子若しくは遺伝子断片を含有しない細菌、又は治療分子の送達、若しくは治療分子をコードする真核生物の異種ＤＮＡの送達を目的とする「キャリア」菌株として働く細菌を指すので、本発明の文脈においては非組換えであるとみなされる。

本明細書に記載される方法がプラスミドの使用に関わる場合、このプラスミドは理想的には、ｐＭＢ１、ＣｏｌＥＩ、ｐ１５Ａ、ｐＳＣ１０１及びＲＫ２から選択される複製起点を有する。プラスミドは、β－ラクタマーゼ（ｂｌａ）、カナマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｋａｎ）、テトラサイクリン排出タンパク質（ｔｅｔＡ）、又はクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ｃａｔ）から選択される抗生物質耐性遺伝子を含んでもよい。理想的には、抗生物質耐性遺伝子は、例えば「Ｘ－ｍａｒｋ」（Ｃｒａｎｅｎｂｕｒｇｈ及びＬｅｃｋｅｎｂｙ、２０１２年、特許文献４）などの機構により、媒介生菌株への形質転換の前又は直後に切除される。プラスミドの損失を防ぐために、プラスミド保持システムを必要としてよい。これらは、天然染色体遺伝子を異種プロモーター下に置くための機構を含んでもよく、例えば、「Ｏｐｅｒａｔｏｒ－Ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ Ｔｉｔｒａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｖａｃｃｉｎｅｓ」システム（非特許文献４）又は「ｏｒｉＳＥＬＥＣＴ」システム（Ｃｒａｎｅｎｂｕｒｇｈ、２００５年、特許文献５）などがあり、これらはいずれも、追加の選択マーカー遺伝子をプラスミド上に存在させる必要がない。あるいは、例えば、宿主細胞変異を補完するための遺伝子（非特許文献５）など、抗生物質耐性遺伝子ではない選択マーカー遺伝子を用いる。

本発明はまた、上記の弱毒化生菌株であって、この菌株は、得られる血清型をＨｄ血清型からＨａ血清型に変化させるように、菌株の天然ｆｌｉＣ遺伝子をパラチフスＡ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖｅｒ Ｐａｒａｔｙｐｈｉ Ａ）のｆｌｉＣ遺伝子と置換させてよく、「血清型」とは細菌種内の別個の変種を指す、菌株も含んでよいと想定される。このような改変の詳細は、特許文献６に見出すことができる。

本発明のさらなる実施形態は、上述した弱毒化生菌株であって、この菌株は、長鎖Ｏ抗原鎖が生成されるような機能的なｆｅｐＥ遺伝子を含むようさらに改変されてよく、好ましくはこのＯ抗原鎖は１００反復単位長の三糖骨格である、菌株である。このような改変の詳細は、特許文献６に見出すことができる。

ｆｅｐＥ遺伝子は、超長鎖Ｏ抗原鎖の長さを制御する因子をコードし、「超長鎖」とは、１００反復単位超の三糖骨格を表すものとみなされる。チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ Ｔｙｐｈｉ）は、この遺伝子に終止コドンを導入する変異により、これらの長鎖Ｏ抗原鎖を有していない。多くの方法により、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ Ｔｙｐｈｉ）にこれらの長鎖Ｏ抗原鎖を発現させるよう操作してよく、ｆｅｐＥの天然プロモーターを、Ｐ_{ａｒａＢＡＤ}などの別のプロモーターと置換してもよく、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ Ｔｙｐｈｉ）におけるｆｅｐＥの染色体変異を修復してもよく、又はｆｅｐＥの機能的コピーをチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ Ｔｙｐｈｉ）染色体のどこかに挿入してもよい。インビボ誘導性プロモーター又は構成的プロモーターを利用してよく、このようなプロモーターの例としては、Ｐ_ｐａｇＣ、Ｐ_ｎｉｒＢ、Ｐ_ｓｓａＧ、Ｐ_ｓｉｆＡ、Ｐ_ｓｉｆＢ、Ｐ_ｓｓｅＡ、Ｐ_ｓｓｅＧ、Ｐ_ｓｓｅＪ、Ｐ_ｌａｃ、Ｐ_ｔａｃ、Ｐ_ｔｒｃ、及びλＰ_Ｌ／Ｐ_Ｒが挙げられる。類似の改変配列としては、Ｐ_ｐａｇＣ、Ｐ_ｎｉｒＢ、Ｐ_ｓｓａＧ、Ｐ_ｓｉｆＡ、Ｐ_ｓｉｆＢ、Ｐ_ｓｓｅＡ、Ｐ_ｓｓｅＧ、Ｐ_ｓｓｅＪ、及びλＰ_Ｌ／Ｐ_Ｒのいずれかの野生型配列に対し、少なくとも約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の同一性を有するものを挙げることができる。

好ましくは、これらの長鎖Ｏ抗原鎖の導入は、ＬＰＳ特異的な免疫応答を誘導するのに
有益であってよい。ＬＰＳがｆｅｐＥの発現などから天然で超長鎖型である場合には、さらなる利点があってよい。

上述した弱毒生菌株は、ｇｔｒＣを構成的に発現する、又はｇｔｒＣをトランス型で発現するよう改変されてもよいことが、さらに想定される。このような改変の詳細は、特許文献６に見出すことができる。

上述した弱毒生菌株は、ファゴソーム誘導型のプロモーターの制御下に追加のｔｖｉＡ遺伝子コピーを含むようさらに改変されてもよいことが、さらに想定される。このような改変の詳細は、特許文献６に見出すことができる。

対象に投与される弱毒生グラム陰性菌の量は、天然又は非天然にかかわらず、対象の免疫応答を誘発するのに充分であり、その結果対象の免疫系は、チェックポイント阻害薬療法、養子細胞療法及び／又はＣＡＲ－Ｔ細胞療法を受けるよう効果的に条件付けされ、この治療法で治療される場合、対象の免疫系は癌又は腫瘍に対する有効な免疫応答を開始することができる。弱毒生グラム陰性菌の投与により開始される免疫応答は、免疫応答自体が治療レベルであっても、治療効果を発揮するために前述の免疫療法の投与を必要とする治療レベル以下であってもよい。

弱毒生グラム陰性菌を、２週間離して少なくとも１回又は２回投与してよいと想定される。弱毒生グラム陰性菌を、チェックポイント阻害薬療法、養子細胞移入療法及び／又はＣＡＲ－Ｔ細胞療法の前、治療中、又は後に投与してよい。好ましくは、少なくとも１回の弱毒生グラム陰性菌の投与が免疫療法治療の前に起こり、このような投与は免疫療法治療の少なくとも１週間前に起こってよい。弱毒生グラム陰性菌の投与は、免疫療法の治療計画に応じて繰り返してよいと想定される。弱毒生グラム陰性菌を１０^５～１０^１２ＣＦＵの投与量で投与してよく、ここでＣＦＵはコロニー形成単位である。例えば、適した投与量は、１０^５～１０^６ＣＦＵ、１０^５～１０^７ＣＦＵ、１０^５～１０^８ＣＦＵ、１０^５～１０^９ＣＦＵ、１０^５～１０^１０ＣＦＵ、１０^５～１０^１１ＣＦＵ、１０^６～１０^７ＣＦＵ、１０^６～１０^８ＣＦＵ、１０^６～１０^９ＣＦＵ、１０^６～１０^１０ＣＦＵ、１０^６～１０^１１ＣＦＵ、１０^６～１０^１２ＣＦＵ、１０^７～１０^８ＣＦＵ、１０^７～１０^９ＣＦＵ、１０^７～１０^１０ＣＦＵ、１０^７～１０^１１ＣＦＵ、１０^７～１０^１２ＣＦＵ、１０^８～１０^９ＣＦＵ、１０^８～１０^１０ＣＦＵ、１０^８～１０^１１ＣＦＵ、１０^８～１０^１２ＣＦＵ、１０^９～１０^１０ＣＦＵ、１０^９～１０^１１ＣＦＵ、１０^９～１０^１２ＣＦＵ、１０^１０～１０^１１ＣＦＵ、１０^１０～１０^１２ＣＦＵ、又は１０^１１～１０^１２ＣＦＵであってよい。

１つの実施形態において、免疫療法は、チェックポイント阻害薬であり、本明細書における用語「チェックポイント阻害薬」とは、チェックポイント分子に対して作られた遮断薬を指す。遮断薬は、拮抗薬、阻害薬又は遮断抗体であってよい。したがって、遮断薬は、小分子又は生物学的製剤であってよく、特定の例においてはモノクローナル抗体である。好ましい実施形態において、チェックポイント阻害薬は、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ又はこれらの任意の組み合わせに対して作られる。例えば、チェックポイント阻害薬は、ＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１及びＣＴＬＡ－４、ＰＤ－Ｌ１及びＣＴＬＡ－４に対して作られてよい。

さらにずっと好ましくは、チェックポイント阻害薬は、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１に対して作られる。いくつかの例において、遮断薬は、イピリムマブ（ＣＴＬＡ－４を標的とするヤーボイ（登録商標））、ニボルマブ（ＰＤ－１を標的とするオプジーボ（登録商標））、ペムブロリズマブ（ＰＤ－１を標的とするキイトルーダ（登録商標）
）、アテゾリズマブ（ＰＤ－Ｌ１を標的とするテセントリク（登録商標））、セミプリマブ（ＰＤ－１を標的とするＬｉｂｔａｙｏ（登録商標））又はデュルバルマブ（ＰＤ－Ｌ１を標的とするイミフィンジ（登録商標））であってよい。

ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１シグナル伝達経路は、いくつかの理由によりがんが免疫逃避する主要な機構である。第１に、そして最も重要なことに、この経路は、末梢組織に見出される活性化されたエフェクターＴ細胞の免疫応答の負の制御に関わる。第２に、ＰＤ－Ｌ１は、がんの微小環境で上方制御されるが、ＰＤ－１も活性化された腫瘍浸潤性Ｔ細胞上で上方制御されるので、事によると抑制の悪循環を増強する可能性もある。第３に、この経路は、双方向的なシグナル伝達により自然及び適応免疫制御の両方に複雑に関与する。これらの要因により、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１複合体はがんが免疫応答を操作でき、がん自身の悪化を促進できる主要な問題となる。結果として、腫瘍は免疫チェックポイント分子の抑制経路を活性化することができ、免疫系を抑制し、癌性細胞を継続的に無妨害で増殖する。Ｔ細胞の活性化後、ＣＴＬＡ－４は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上の同一のリガンドについてＣＤ２８と競合する表面に輸送され、ＣＤ２８を抑制し、続けてＴ細胞の活性化及び増殖を抑制する。ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１及びＣＴＬＡ－４を標的化するのは、これらの事象が生じるのを防ぐことを目標としている。

本明細書に開示される本発明は、自然免疫系を条件付けできてよく、したがってチェックポイント阻害薬によって誘導される抗腫瘍適応応答の発生、活性化及び／又は維持の優れた、より完全な、及び／又はより耐久性のある支持を提供すると想定される。

１つの実施形態において、免疫療法は、養子細胞療法であり、免疫細胞は、最も一般的には改善された機能性及び特性のため、患者／対象に移入される。移入されることになっている細胞は、この対象（自己）又は別の対象（同種）に起源をもったものでよい。このような養子細胞療法の例としては、操作した又は非操作のマクロファージ、操作した又は非操作のγδＴ細胞、操作した又は非操作のナチュラルキラー細胞が挙げられるが、限定されない。したがって、本発明の文脈における養子細胞療法としては、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）療法、遺伝子操作Ｔ細胞受容（ＴＣＲ）体療法及び／又はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞療法が挙げられるが、限定されず、これらの詳細は当業者に周知である（非特許文献６）。

別の実施形態において、免疫療法は、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法である。ＣＡＲ－Ｔ細胞療法は、同種であっても自己であってもよい。いくつかの例において、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法は、Ｂ細胞に由来するがんに存在する抗原ＣＤ１９に対して作られる。したがって、このような治療法は、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）及びびまん性大細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）などのＢ細胞に由来するがんに特に好適であってよい。他の例において、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対して作られ、したがって固形腫瘍の治療により好適である。このような抗原の例としては、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＢＣＭＡ、ＣＥＡ、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＧＤ２、ＧＰＣ３、ＨＥＲ２、ＨｅｒｉｎＣＡＲ－ＰＤ１、ＭＳＬＮ、ＭＧ７、ＭＵＣ１、ＬＭＰ１、ＰＳＭＡ及びＰＳＣＡが挙げられるが、限定されない。このような技術は当業者に公知であり、読者は、さらなる情報については「Ａｄｏｐｔｉｖｅ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ： ｔｈｅ ｃｕｒｒｅｎｔ ｌａｎｄｓｃａｐｅ」と表題を付けられた総説を指示される（非特許文献７）。

チェックポイント阻害薬は、がん又は腫瘍を対象とした治療抗体であってよい。特定の実施形態において、治療抗体は、モノクローナル抗体であってよく、さらにずっと好ましい実施形態においては、ヒト化又はヒトモノクローナル抗体であってよい。このようなモノクローナル抗体の取得方法は、当業者に公知である。治療抗体は、がん細胞の異常タンパク質を遮断し、がん細胞上の特定のタンパク質に付着する又は抗癌剤などの細胞傷害性
分子と結合することができる。後者のものはがん細胞を免疫系に知らせ、その結果異常細胞は続けて免疫系の細胞成分によって標的とされ、破壊されることができる。チェックポイント阻害薬であるモノクローナル抗体の例としては、イピリムマブ（ヤーボイ（登録商標））、ニボルマブ（オプジーボ（登録商標））及びペムブロリズマブ（キイトルーダ（登録商標））が挙げられるが、限定されない。

病因の多因子性のため、本明細書に記載される免疫療法、すなわちチェックポイント阻害薬療法、養子細胞療法及び／又はＣＡＲ－Ｔ細胞療法は、患者／対象に併用投与してよいと理解される。例えば、養子細胞療法及びチェックポイント阻害薬を併せて用いてよい。併用療法が必要かどうかは、個別の症例に基づいて判断され、多数の要因、例えば治療すべき腫瘍性疾患の複雑さ、及び／又は治療予定の患者／対象の病歴などに依存すると理解される。

対象に投与される免疫療法がどんな種類であれ（用いられる免疫療法は腫瘍性疾患の形態及び複雑さに依存してよい）、弱毒生グラム陰性菌の投与後のこの免疫療法の有効性は、免疫療法成分の単独投与より大きくなる。いくつかの例において、弱毒生グラム陰性菌の投与後の免疫療法の有効性は、単独で投与される成分のいずれかよりも大きくなる。したがって、本発明は、腫瘍性疾患を治療する相加的又は相乗的方法のいずれかを提供する。この相加的又は相乗的効果は、より複雑な及び／又は固形腫瘍を治療する場合特に有利であり、免疫療法単独での治療に対して無反応者である患者／対象にとって特に有利である。

本発明において使用する弱毒生グラム陰性菌を、固形腫瘍又は造血器腫瘍に関連する腫瘍性疾患を治療するために用いてよい。このような疾患としては、肉腫、癌腫、腺癌、メラノーマ、骨髄腫、芽細胞腫（ｂｌａｓｔｏｍａ）、神経膠腫、リンパ腫又は白血病が挙げられる。好ましい実施形態において、腫瘍性疾患は、固形腫瘍に関連する。特定の態様において、腫瘍性疾患は、前立腺癌、肝癌、腎癌、肺癌、乳癌、結腸直腸癌、膀胱癌、膵癌、脳癌、肝細胞癌、リンパ腫、白血病、胃癌、子宮頸癌、卵巣癌、甲状腺癌、メラノーマ、癌腫、頭頸部癌、皮膚癌又は肉腫から選択される癌に関連する。

新生物、腫瘍及びがんには、良性、悪性、転移性及び非転移性の種類が含まれ、任意のステージ（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ若しくはＶ）若しくはグレード（Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、など）の新生物、腫瘍、若しくはがん、又は進行中、悪化中、安定化した又は寛解している、新生物、腫瘍、若しくはがん若しくは転移が含まれる。本発明により治療することができる癌としては、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳房、結腸、食道、胃腸（ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎｅｓ）、歯肉、頭部、腎臓、肝臓、肺、上咽頭、頸部、卵巣、前立腺、皮膚、胃、精巣、舌、又は子宮の細胞又は新生物が挙げられるが、限定されない。さらに、癌は、以下に限定されないが、特に以下の組織タイプ、新生物、悪性癌、癌腫、未分化癌、巨細胞及び紡錐形細胞の癌、小細胞癌、乳頭癌、扁平上皮癌、リンパ上皮癌、基底細胞癌、ｐｉｌｏｍａｔｒｉｘ ｃａｒｃｉｎｏｍａ、移行上皮癌、乳頭移行上皮癌、腺癌、ガストリン産生腫瘍、悪性癌、胆管細胞、癌、肝細胞癌、複合肝細胞癌及び胆管細胞癌、線維柱帯腺癌（ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、腺様嚢胞癌、腺腫性ポリープの腺癌、腺癌、家族性大腸ポリポーシス、固形癌、カルチノイド腫瘍、悪性癌、細気管支肺胞腺癌、乳頭状腺癌、嫌色素性癌、好酸球がん、好酸性腺癌、好塩基性癌、明細胞腺癌、顆粒細胞がん、濾胞腺癌、乳頭及び濾胞腺癌、非被包性硬化性癌、副腎皮質癌、類内膜癌、皮膚付属器癌、アポクリン腺癌、皮脂腺癌、耳道腺癌、粘表皮癌、嚢胞腺癌、乳頭状嚢腺癌、乳頭漿液性嚢胞腺癌、粘液性嚢胞腺癌、粘液癌、印環細胞癌、浸潤性乳管癌、髄様癌、小葉癌、炎症性癌、パジェット病、乳腺、腺房細胞癌、腺扁平上皮癌、扁平上皮化生を伴う腺癌、悪性胸腺腫、悪性卵巣間質腫瘍（ｏｖａｒｉａｎ ｓｔｒｏｍａｌ ｔｕｍｏｕｒ）、悪性莢膜細胞腫、悪性顆粒膜細胞腫、悪性アンドロブラストーマ、セルトリ細胞癌、悪性ライディッヒ細胞腫、悪性脂肪細胞腫瘍（ｌｉｐｉｄ ｃｅｌｌ ｔｕｍｏｕｒ）、悪性パラガングリオーマ、悪性乳房外パラガングリオーマ、褐色細胞腫、血管球血管肉腫（ｇｌｏｍａｎｇｉｏｓａｒｃｏｍａ）、悪性メラノーマ、無色素性メラノーマ、表在拡大型黒色腫、巨大色素性母斑の悪性メラノーマ、類上皮細胞メラノーマ、悪性青色母斑、肉腫、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、胎児性横紋筋肉腫、胞巣状横紋筋肉腫、間質肉腫、混合腫瘍、ミュラー管混合腫瘍、腎芽腫、肝芽腫、癌肉腫、悪性間葉腫、悪性ブレンナー腫瘍、悪性葉状腫瘍、滑膜肉腫、悪性中皮腫、未分化胚細胞腫、胚性癌腫、悪性奇形腫、悪性卵巣甲状腺腫、絨毛癌、悪性中腎腫、血管肉腫、悪性血管内皮腫、カポジ肉腫、悪性血管外皮腫、リンパ管肉腫、骨肉腫、傍骨性骨肉腫、軟骨肉腫、悪性軟骨芽細胞腫、間葉性軟骨肉腫、骨の巨細胞腫、ユーイング肉腫、悪性歯原性腫瘍、ａｍｅｌｏｂｌａｓｔｉｃ ｏｄｏｎｔｏｓａｒｃｏｍａ、悪性エナメル上皮腫、エナメル芽細胞線維肉腫（ａｍｅｌｏｂｌａｓｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓａｒｃｏｍａ）、悪性松果体腫、脊索腫、悪性神経膠腫、上衣腫、星状細胞腫、原形質星状細胞腫、線維性星細胞腫、星状芽細胞腫、神経膠芽腫、乏突起神経膠腫、ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｂｌａｓｔｏｍａ、原始神経外胚葉性腫瘍、小脳肉腫、神経節芽細胞腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、嗅覚神経因性腫瘍（ｏｌｆａｃｔｏｒｙ ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｃ ｔｕｍｏｕｒ）、悪性髄膜腫、神経線維肉腫、悪性神経鞘腫、悪性顆粒細胞腫、悪性リンパ腫、ホジキン病、Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ； ｐａｒａｇｒａｎｕｌｏｍａ、悪性リンパ腫、小リンパ球性、悪性リンパ腫、大細胞型、びまん性、悪性リンパ腫、ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ、菌状息肉症、他の特定の非ホジキンリンパ腫、悪性組織球症、多発性骨髄腫、マスト細胞肉腫、免疫増殖性小腸疾患、白血病、リンパ性白血病、形質細胞性白血病、赤白血病、リンパ肉腫細胞白血病（ｌｙｍｐｈｏｓａｒｃｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、骨髄性白血病、好塩基球性白血病、好酸球性白血病、単球性白血病、マスト細胞白血病、巨核芽球性白血病、骨髄性白血病、及びヘアリーセル白血病であってよい。好ましくは、腫瘍性疾患は、前立腺癌、肝癌、腎癌、肺癌、乳癌、結腸直腸癌、膵癌、脳癌、肝細胞癌、リンパ腫、白血病、胃癌、子宮頸癌、卵巣癌、甲状腺癌、メラノーマ、頭頸部癌、皮膚癌並びに軟部肉腫及び／又は他の形態の細胞腫から選択される癌に換算する腫瘍であってよい。腫瘍は、転移性又は悪性腫瘍であってよい。

好ましい実施形態において、腫瘍性疾患は、肺癌、腎癌、膀胱癌、胃癌、卵巣癌、結腸直腸癌、メラノーマ、頭頸部癌又は乳癌から選択される癌に関連する。

本発明の好ましい実施形態において、弱毒生グラム陰性菌は、免疫系の全身活性化と適合する投与方法なので、経口で、皮下に、又は筋肉内に投与される。本明細書において用いられる場合、用語「経口の」又は「経口投与される」は互換的に用いられ、グラム陰性菌が患者／対象の口から投与されることを指す。用語「皮下の」又は「皮下に投与される」は、互換的に用いられ、グラム陰性菌を患者／対象の皮下に投与することを指す。用語「筋肉内」又は「筋肉内に投与される」は、互換的に用いられ、グラム陰性菌を患者／対象の筋肉中に投与することを指す。最も好ましい実施形態において、弱毒生グラム陰性菌は経口投与される。しかし、他の投与方法を使用してよい場合もあるとも考えられる。したがって、特定の例において、本発明の弱毒生グラム陰性菌は、当業者であれば既知であろう注射、注入、持続点滴、静脈内、皮内、動脈内、病巣内、腟内、直腸内、筋肉内、腹腔内、皮下、結膜下、粘膜、心膜内、臍内、眼内（ｉｎｔｒａｏｃｕｌａｒａｌｌｙ）、頭蓋内、関節内、前立腺内（ｉｎｔｒａｐｒｏｓｔａｔｉｃａｌｙ）、胸膜内、気管内、鼻腔内、吸入（例えばエアロゾル吸入）、カテーテル経由、洗浄経由（ｖｉａ ａ ｌａｖａｇｅ）、若しくは他の方法により、又は前述のものの任意の組み合わせにより投与されてよい（例えば非特許文献８を参照する）。好ましくは、本発明のグラム陰性菌は、粘膜、腟内、静脈内、鼻腔内、胸膜内又は皮内に投与されてよい。好ましい実施形態において、本明細書に開示されるグラム陰性菌は、腫瘍内には投与されない。

本発明の別の実施形態において、弱毒生グラム陰性菌は、この対象に治療の第１期に投与され、チェックポイント阻害薬療法、養子Ｔ細胞療法及び／又は同種若しくは自己ＣＡＲ－Ｔ療法は、治療の第２期に投与される。

「治療の第１期」及び「治療の第２期」によって、治療の第１期及び第２期の間に患者／対象が本明細書に開示されるグラム陰性菌又は本明細書に開示される免疫療法を受けていない時間の間隙があるように、治療の第１期及び治療の第２期が時間的に間隔を隔てる治療過程を意図する。

理論によって拘束されるものではないが、問題になっている免疫療法前に（すなわち治療の第１期に）弱毒生グラム陰性菌を投与すると、免疫療法が行われる前に免疫系を効果的に条件付けすることが可能にされ、チェックポイント阻害薬療法、養子細胞療法、及び／又はＣＡＲ－Ｔ細胞療法の投与前にがん又は腫瘍をより効果的に標的にすることができると考えられる。

弱毒生グラム陰性菌を免疫療法組成物より前に投与することは好ましい一方、弱毒生グラム陰性菌を同時又は後で投与することが必要とされる例もあってよい。したがって、弱毒生グラム陰性菌及び免疫療法は、同一の又は別々の医薬製剤に存在し、同時又は異なる時点で投与してよい。

好ましくは、治療の第１期及び治療の第２期は、少なくとも１週間離して投与され、好ましくは治療の第１期及び治療の第２期は、２週間離して投与される。

本明細書に開示される弱毒生グラム陰性菌は、使用すると、対象に全身性免疫応答を発生させる。好ましくは、弱毒生グラム陰性菌は、骨髄系細胞の活性化及び／又は成熟化を増強する全身性免疫応答を発生させる。このような骨髄系細胞の例としては、通常型樹状細胞、形質細胞様樹状細胞、単球及び／又はマクロファージが挙げられるが、限定されない。したがって、本発明の文脈における全身性免疫応答は、循環／全身骨髄コンパートメントの長期的な表現型の変化を指してよい。

本発明の第４の態様において、対象の腫瘍性疾患を治療、抑制又は制御する方法であって、前記方法は、（ｉ）弱毒生グラム陰性菌であって、前記弱毒生グラム陰性菌は、経口投与され、皮下に投与され、又は筋肉内に投与される、弱毒生グラム陰性菌、及び（ｉｉ）チェックポイント阻害薬療法、養子細胞療法及び／又は同種若しくは自己ＣＡＲ－Ｔ療法を、前記対象に同時に、別々に、又は経時的に投与することを含み、前記方法は、前記弱毒生グラム陰性菌又はチェックポイント阻害薬療法、養子細胞療法及び／若しくは同種若しくは自己ＣＡＲ－Ｔ療法の単独投与と比較して治療効果を増強する、方法がある。

本発明の第５の態様において、対象の腫瘍性疾患を治療、抑制又は制御する方法であって、前記方法は、（ｉ）弱毒生グラム陰性菌であって、前記弱毒生グラム陰性菌は、治療の第１期に投与されることになっている、弱毒生グラム陰性菌、及び（ｉｉ）チェックポイント阻害薬療法、養子細胞療法及び／又は同種若しくは自己ＣＡＲ－Ｔ療法は、治療の第２期に投与されることになっている、を前記対象に同時に、別々に、又は経時的に投与することを含み、前記方法は、前記弱毒生グラム陰性菌又はチェックポイント阻害薬療法、養子細胞療法及び／若しくは同種若しくは自己ＣＡＲ－Ｔ療法の単独投与と比較して治療効果を増強する、方法がある。

本発明の第６の態様において、対象の腫瘍性疾患を治療、抑制又は制御する方法であって、前記方法は、（ｉ）弱毒生グラム陰性菌であって、前記弱毒生グラム陰性菌は、非組換え型であるか、又は前記弱毒生グラム陰性菌は、治療タンパク質をコードする真核生物
の異種ＤＮＡを含まない、弱毒生グラム陰性菌、及び（ｉｉ）チェックポイント阻害薬療法、養子細胞療法及び／又は同種若しくは自己ＣＡＲ－Ｔ療法をこの対象に同時に、別々に、又は経時的に投与することを含み、前記方法は、前記弱毒生グラム陰性菌又はチェックポイント阻害薬療法、養子細胞療法及び／若しくは同種若しくは自己ＣＡＲ－Ｔ療法の単独投与と比較して治療効果を増強する、方法がある。

したがって、本発明の方法は、原発腫瘍若しくはがんが他の部位へ転移すること又は転移性腫瘍若しくはがんが原発腫瘍若しくはがんから遠位の他の部位に形成される若しくは樹立されることを低減する若しくは抑制し、これにより腫瘍若しくはがんの再発若しくは腫瘍若しくはがんの悪化を抑制又は低減するために使用されてよい。したがって、本発明は、細胞増殖性若しくは細胞過剰増殖障害、新生物、腫瘍若しくはがん、又は転移の存在に関連する１つ又は複数の有害な（身体的）症状又は結果を軽減又は寛解させること、すなわち治療効果又は有益な効果など、特定の対象の状態の検出可能又は測定可能な改善を提供する。

本発明の方法はしたがって、弱毒生グラム陰性菌及び免疫療法、すなわちチェックポイント阻害薬療法、養子細胞療法及び／又はＣＡＲ－Ｔ細胞療法の投与を含む併用療法であり、治療効果が増強した強力で持続的な免疫応答を誘発する可能性がある。本明細書に開示される併用療法の相加的又は相乗的性質により、より低レベルの治療法又は治療が必要とされてよく、毒性プロファイルが有利なので有害作用が低減する。

治療効果又は有益な効果は、状態若しくは病態の任意の客観的若しくは主観的な、一過性の、一時的な若しくは長期的な改善、又は新生物、腫瘍若しくはがん、又は転移などの細胞増殖若しくは細胞過剰増殖障害に関連する若しくは細胞増殖若しくは細胞過剰増殖障害によって起こる有害症状の発生、重症度、持続期間若しくは頻度の減少である。治療効果又は有益な効果により、生存期間が改善してよい。本発明による治療法の満足な臨床エンドポイントは、例えば１つ又は複数の関連する病態、有害症状若しくは合併症の重症度、持続期間若しくは頻度の増加的な若しくは部分的な減少、又は新生物、腫瘍若しくはがん、又は転移などの細胞増殖若しくは細胞過剰増殖障害の１つ又は複数の生理学的、生化学的若しくは細胞性の徴候若しくは特性の抑制若しくは回復がある場合に達成される。治療効果又は改善はしたがって、標的増殖性細胞（例えば新生物、腫瘍若しくはがん、又は転移）の破壊又は新生物、腫瘍若しくはがん、又は転移などの細胞増殖若しくは細胞過剰増殖障害に関連する若しくは細胞増殖若しくは細胞過剰増殖障害によって起こる１つ又は複数の、たいていの又は全ての病態、有害症状若しくは合併症の消失であってよいが、限定されない。しかしながら、治療効果又は改善は、全ての標的増殖性細胞（例えば新生物、腫瘍若しくはがん、又は転移）の治癒若しくは完全な破壊又は新生物、腫瘍若しくはがん、又は転移などの細胞増殖若しくは細胞過剰増殖障害に関連する若しくは細胞増殖若しくは細胞過剰増殖障害によって起こる全ての病態、有害症状若しくは合併症の消失である必要はない。例えば、腫瘍若しくはがん細胞集団を部分的に破壊する、又は腫瘍若しくはがんの進行若しくは悪化を抑制することにより腫瘍若しくはがんの量、大きさ若しくは細胞数を安定化させると、腫瘍若しくはがんの量、大きさ若しくは細胞の一部若しくは大部分が残るとしても、死亡率を減少させ、たった数日、数週間又は数か月であっても寿命を延ばすことができる。

治療効果の特定の非限定的な例としては、新生物、腫瘍若しくはがん、若しくは転移体積（大きさ又は細胞量）若しくは細胞数の減少、新生物、腫瘍若しくはがん体積の増加の抑制若しくは予防（例えば安定化）新生物、腫瘍若しくはがんの進行、悪化若しくは転移の緩徐化若しくは抑制、又は新生物、腫瘍若しくはがんの増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）、増殖（ｇｒｏｗｔｈ）若しくは転移の抑制が挙げられる。

発明の方法は、即時には奏功しなくてよい。例えば、治療後に新生物、腫瘍若しくはがんの細胞数若しくは体積が増加してよいが、その後特定の対象の腫瘍細胞体積、大きさ又は細胞数の安定化又は減少が徐々に結局起こってよい。

抑制、低減、減少、遅延又は予防することができる新生物、腫瘍、がん及び転移に関連する追加の有害症状及び合併症としては、例えば、悪心、食欲不振、倦怠感（ｌｅｔｈａｒｇｙ）、疼痛及び不快感が挙げられる。したがって、細胞過剰増殖障害に関連する又は細胞過剰増殖障害によって起こる有害症状又は合併症の重症度、持続期間又は頻度の部分的な若しくは完全な減少又は低減、活力、食欲、心理的幸福の増加などの対象の生活の質の改善及び／又は幸福は全て、治療効果の特定の非限定的な例である。

治療効果又は改善はしたがって、治療された対象の生活の質の主観的改善を含むこともできる。さらなる実施形態において、方法は、対象の寿命（生存時間）を延長する又は延ばす。さらなる実施形態において、方法は、対象の生活の質を改善する。

本発明は、チェックポイント阻害薬、養子細胞療法及び／又はＣＡＲ－Ｔ細胞療法での以前の治療で効果がなかった個人に対して特に適してよい。「効果がなかった」によって、治療に反応しない任意の腫瘍性疾患への言及を意図する。本発明は、前の免疫療法治療に対して以前は低い反応者、中程度の反応者又は高い反応者だった個人に特に適するとも想定される。

問題になっている弱毒生グラム陰性菌及び免疫療法は典型的には、有効量の弱毒生グラム陰性菌又は免疫療法を含み、薬学的に許容される担体／アジュバント／希釈剤又は添加物をさらに含む組成で対象に投与される。フレーズ「薬学的に又は薬理学的に許容される」とは、必要に応じて、例えばヒトなどの動物に投与した場合、有害な、アレルギー性の又は他の都合悪い反応を生じない分子実体及び組成物を指す。このような製剤は、当業者に公知である。さらに、動物（例えばヒト）投与については、製剤は、適用できる場合、無菌性、発熱性、一般的安全性及び純度の基準を満たすべきであると理解される。

本明細書において用いられる場合、「薬学的に許容される担体／アジュバント／希釈剤／添加物」には、当業者に公知であるように、任意の及び全ての溶媒、分散媒、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、保存剤（例えば、抗菌薬、抗真菌薬）、等張剤、吸収遅延剤、塩、保存剤、薬剤、薬剤安定剤、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味料、香味料、色素、このような物質及びこれらの組み合わせが挙げられる（例えば、非特許文献９を参照する）。例としては、リン酸水素二ナトリウム、大豆ペプトン、リン酸二水素カリウム、塩化アンモニウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、スクロース、ホウ酸緩衝液、滅菌生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）及び滅菌水が挙げられるが、限定されない。

組成物、弱毒生グラム陰性菌組成物又は免疫療法のいずれかはまた、免疫応答を増強することを目的とする追加成分を含んでよい。このような追加成分の例としては、水酸化アルミニウム、酸化アルミニウム及びリン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩、フロイント完全アジュバント及びフロイント不完全アジュバントなどの油性アジュバント，ミコール酸系アジュバント（例えばトレハロースジミコレート）、細菌リポ多糖（ＬＰＳ）、ペプチドグリカン（例えばムレイン、ムコペプチド又はＮ－Ｏｐａｃａなどの糖タンパク質、ムラミルジペプチド［ＭＤＰ］、又はＭＤＰ類似物）、プロテオグリカン（例えば、肺炎杆菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）から抽出した）、連鎖球菌性調製物（例えば、ＯＫ４３２）、ムラミルジペプチド、免疫刺激複合体（特許文献７、特許文献８及び特許文献９に開示される「Ｉｓｃｏｍｓ」）、サポニン、ＤＥＡＥ－デキストラン、中性油脂（ミグリオールなど）、植物油脂（落花生油など）、リポソーム、ポリオ
ール、Ｒｉｂｉアジュバント系（例えば、ＧＢ－Ａ－２ １８９１４１を参照する）、ビタミンＥ、カーボポール、インターフェロン（例えば、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－γ、若しくはＩＦＮ－β）、又はインターロイキン、特に細胞免疫を刺激するもの（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、ＩＬ－１５、ＩＬ－１６及びＩＬ－１７）が挙げられるが、限定されない。

本発明の発明者らは驚くべきことに、弱毒生グラム陰性菌及び免疫療法を併用すると、いずれかの成分を単独で用いた場合よりも腫瘍性疾患を予防及び／又は治療する治療法が有効であることを見出した。本発明を、以下の非限定的な例を参照してさらに説明する。

実施例１―全身骨髄系細胞の長期的表現型変化の誘導
成体の、メスのＢＡＬＢ／ｃマウスを１×１０^９ＣＦＵのネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）株ＭＤ５８（ΔａｒｏＣ）で経口的に処置した。２１日後、脾臓を回収し、単一の細胞懸濁液を作成し、フローサイトメトリー染色を実行した。生存可能なＣＤ１１ｃ^ｈｉｇｈ、ＨＬＡ－ＤＲ^＋、ＣＤ１１ｂ^＋／－、ＰＤＣＡ－１通常型樹状細胞及び^－生存可能なＣＤ１１ｃ^{－／ｌｏｗ}、ＰＤＣＡ１^＋、ＨＬＡ－ＤＲ^{－／Ｉｎｔ}、ＣＤ１１ｂ^－形質細胞様樹状細胞のマーカーＣＤ８０、ＣＤ８６及びＰＤ－Ｌ１の蛍光強度の中央値を測定した（図１Ａ及び１Ｂを参照する）。生存可能なＣＤ１１ｃ^－、ＣＤ１１ｂ^＋、Ｌｙ６Ｃ^＋、Ｆ４／８０^－単球及び生存可能なＣＤ１１ｃ^－、ＣＤ１１ｂ^＋、Ｌｙ６Ｃ^－、Ｆ４／８０^＋マクロファージのマーカーＰＤ－Ｌ１、ＣＤ８０及びＨＬＡ－ＤＲの蛍光強度の中央値も測定した（図１Ｃ及び１Ｄを参照する）。

図１に見られるように、骨髄系細胞、例えば通常型樹状細胞、形質細胞様樹状細胞、単球及びマクロファージの各種細胞マーカーは、サルモネラ菌での治療２１日後に有意な増加を示し、サルモネラ菌での治療後の免疫細胞の活性化に対する効果は、かなりの期間にわたり持続可能であると示唆される。

実施例２－サルモネラ菌で誘導された表現型変化の時間経過
図１で観察された骨髄系細胞の活性化／成熟化表現型変化の動態を調査するために、時間経過試験を実行した。成体の、メスのＢＡＬＢ／ｃマウスを１×１０^９ＣＦＵのネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）株ＭＤ５８（ΔａｒｏＣ）で経口的に処置した。１、１４、２１又は４２日後に脾臓及び大腿骨を回収し、単一の細胞懸濁液を作成し、フローサイトメトリー染色を実行した（図２Ａの実験模式図を参照する）。

全身性の通常型（ｃＤＣ）及び形質細胞様（ｐＤＣ）樹状細胞の活性化マーカーは、サルモネラ菌の経口投与後増加し、投与後３週間でピークになり、投与後６週間までにベースラインレベル近くに戻ることが分かった（図２Ｂを参照する）。全身性単球及びマクロファージの活性化マーカーもまた、サルモネラ菌の経口投与後増加し、投与後３週間でピークになり、投与後６週間までにベースラインレベル近くに戻ることが分かった（図２Ｃを参照する）。

実施例３－サルモネラ菌の経口投与は、骨髄造血を増強する
成体の、メスのＢＡＬＢ／ｃマウスを１×１０^９ＣＦＵのネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）株ＭＤ５８（ΔａｒｏＣ）で経口的に処置した。１、１４、２１又は４２日後に分離した骨髄細胞のフローサイトメトリー染色を実行した。

骨髄中の造血幹細胞／前駆細胞の数は、経口投与後２週間で有意に増加したことが分かる（図３Ａを参照する）。代表的なフローサイトメトリープロットから、サルモネラ菌で経口的に処置した動物の骨髄中の生存可能なＬＫＳ細胞が増加したことも実証される（図３Ｂを参照する）。さらに、サルモネラ菌処置後１４日での骨髄細胞全体に対する生存可能なＬＫＳ細胞の割合は、スピアマンの順位相関を用いると、同時点の単球（生存可能なＣＤ１１ｃ^－、ＣＤ１１ｂ^＋、Ｌｙ６Ｃ^＋、Ｆ４／８０^－細胞）の割合と相関した（図３Ｃを参照する）。

したがって、本実施例のデータは、サルモネラ菌を投与すると免疫系、特に免疫系の骨髄アームが条件付けされるという仮説を支持する。そのうえ、サルモネラ菌によって誘導される条件付け変化が３～６週間の期間であると実証されるように、これらのデータから、サルモネラ菌が免疫系を条件付けする長期的な効果が示される。これらの変化は、骨髄造血前駆細胞及び脾臓単球の間の正の相関によって示唆されるように、全身的に／中枢的に媒介されるようである。

実施例４－サルモネラ菌の経口投与は、全身樹状細胞の少なくとも１４日間持続する応答性亢進状態を誘導する
成体の、メスのＢＡＬＢ／ｃマウスを１×１０^９ＣＦＵのネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）株ＭＤ５８（ΔａｒｏＣ）で経口的に処置した。１４日後、脾臓を回収し、単一の細胞懸濁液を作成し、ＣＤ１１ｃ発現細胞を磁気分離により濃縮し、１×１０^５細胞／ウェルを２４時間、指示された刺激（ＴＬＲ９、ＴＬＲ２／６、若しくはＴＬＲ４／２アゴニスト又は溶媒）と共にインキュベートした。上清中のＩＬ－６をＬｅｇｅｎｄＰｌｅｘアッセイにより測定した（図４を参照する）。

図４から明らかなように、グラム陰性菌、例えばサルモネラ菌で処置した動物由来のＣＤ１１ｃ発現細胞は、溶媒対照群と比較すると多様な刺激に応じてＩＬ－６分泌（細胞の免疫応答性レベルの指標）の増加を示した。このことはさらに、本発明のグラム陰性菌を投与すると免疫細胞が条件付けされ、免疫細胞を続く刺激に対してより応答性にすることを裏付ける。

実施例１～４に示されるように、本実施例において開示される実験データから、弱毒生グラム陰性菌、例えばサルモネラ菌で処置すると、複数の免疫細胞型（例えば樹状細胞、単球及びマクロファージ）が予想外に長期的に活性化され、加えて骨髄中の造血幹細胞／前駆細胞が増加することが示される。理論によって拘束されるものではないが、このような弱毒生グラム陰性菌の投与によって誘導される全身性応答は、免疫療法、例えばチェックポイント阻害薬療法、養子細胞療法又はＣＡＲ－Ｔ細胞療法と併用投与される場合に、このような免疫療法の抗腫瘍活性を増強するように、対象又は患者の免疫系を条件付けすることができると考えられる。このことは以下の実施例５でさらに実証される。弱毒生グラム陰性菌の投与から観察される全身性改変、すなわち複数の免疫細胞型の活性化及び骨髄造血に対する効果（本明細書において示される）は、この弱毒生グラム陰性菌の腸管からの取り込みと併せて、観察される抗腫瘍効果の増強の原因となると考えられる。当業者は、弱毒生グラム陰性菌によって誘導される広範な全身性効果は、有利な効果が無数のチェックポイント阻害薬及び／又は養子細胞療法にわたり観測される、すなわち有利な効果が単一の治療法に制限されず、治療法の種類全体に適用できるように、患者／対象の免疫系を条件付けすることができると容易に理解するだろう。さらに、対象／患者の免疫系を条件付けするためにグラム陰性菌を用いることは、免疫療法を単独で用いた場合に免疫療法に対して抵抗性であると分かっている患者／対象に特に有利であってよい。

実施例５－サルモネラ菌の経口投与により処置すると腫瘍増殖が遅くなり、免疫チェックポイント阻害薬と併用投与すると有効性が増強される
成体の、メスのＣ５７ＢＬ／６マウスに１×１０^６ＭＣ３８（結腸癌）又はＢ１６－Ｆ１０（メラノーマ）腫瘍細胞を皮下に播種した。

図５Ａについては、ＭＣ３８腫瘍を有する動物を、腫瘍播種後１５及び２２日後に１×１０^９ＣＦＵネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）株ＭＤ５８（ΔａｒｏＣ）、又はＰＢＳ対照で、並びに１７日目から毎週２回１０ｍｇ／ｋｇ抗ＰＤ－Ｌ１で経口的に処置した。グラフは、経時的な腫瘍体積を示し、腫瘍増殖を描写し、対応する表は、１４日目～３０日目にサルモネラ菌及びアイソタイプ対照、サルモネラ菌及びαＰＤ－Ｌ１、又は溶媒及びαＰＤ－Ｌ１で処置した後の、対照溶媒及びアイソタイプ群に対する腫瘍増殖の平均抑制率を要約する（図５Ａを参照する）。

図５Ｂについては、Ｂ１６－Ｆ１０腫瘍を有する動物を、腫瘍播種後８日目に１×１０^９ＣＦＵネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）株ＭＤ５８（ΔａｒｏＣ）、又はＰＢＳ対照で、及び１０、１３及び１７日目に１０ｍｇ／ｋｇ抗ＰＤ－１抗体で経口的に処置した。グラフは、経時的な腫瘍体積を示し、腫瘍増殖を描写し、対応する表は、対照群（溶媒＋アイソタイプ）に対する１４日目～３０日目の種々の処置による腫瘍増殖の平均抑制率を要約する（図５Ｂを参照する）。

上で論じたように、チェックポイント阻害薬療法、養子細胞療法及びＣＡＲ－Ｔ療法などの免疫療法は、患者の亜集団には奏功するが、これらの治療法がほとんど効果を示さないからなんの効果も示さない大部分の患者が依然としていることが知られている。このように、腫瘍学の分野において未だ対処されていないこの必要性に対処する治療法を見出すことは最も重要である。この問題は図５Ａ及び５Ｂに示される表に反映されており、チェックポイント阻害薬での処置は腫瘍増殖の抑制になんの効果も示さない又は最小の効果しか示さないが、溶媒及びアイソタイプ対照によって生じる効果より有意に良好な効果とは示されない。しかしながら、全く対照的に、チェックポイント阻害薬を弱毒生グラム陰性菌、例えばサルモネラ菌と併用投与する場合、腫瘍増殖抑制率は有意に改善される（図５Ａのチェックポイント阻害薬単独群で見られるものの約１３倍の増殖抑制）。この効果はまた、サルモネラ菌単独処置で見られるものよりかなり高く、２個の成分を組み合わせて用いる利点が強調される。したがって、本発明の発明者らは驚くべきことに、チェックポイント阻害薬、養子細胞療法及びＣＡＲ－Ｔ療法などの免疫療法の抗腫瘍活性は、弱毒生グラム陰性菌と併用投与する場合、有意に増強することができることが分かった。

さらに、発明者らは、２個の無関係の腫瘍モデルにおける、２個の異なるチェックポイント阻害薬による相加的及び／又は相乗的効果の同一の傾向も実証し、弱毒生グラム陰性菌によって誘導される条件付け効果は、有利な効果が無数のチェックポイント阻害薬及び／又は養子細胞療法にわたり観察され、さらに多数のがんの徴候にわたり潜在的に有利であるように、患者／対象の免疫系を条件付けするという仮説を実証し、裏付ける。したがって、当業者は、本発明の効果は腫瘍タイプに依存しないことを容易に理解するだろう。

実施例６－マクロファージをサルモネラ菌でインビトロで条件付けするとＭ１細胞が炎症性表現型へとさらに極性化し、Ｍ２をＭ１様表現型マクロファージにさらに誘導する
マクロファージは典型的には、マクロファージの表現型及び機能性に基づいてＭ１マクロファージ（炎症誘発性、古典的に活性化される）及びＭ２マクロファージ（抗炎症性、選択的に活性化される／抑制性）に分けることができると広く受け入れられている。マクロファージは従来、血管新生、侵襲性、転移、腫瘍微小環境の制御、及び治療抵抗性を含
む、悪性腫瘍のいくつかの主要な特徴に、直接的又は間接的のいずれかで、関与することが分かっている。しかしながら、マクロファージは、腫瘍が治療法に対してより影響されやすくなるように、腫瘍抗原を提示し、腫瘍特異的なＴ細胞の増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）及び増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）を支援し、癌性細胞を貪食し、そして腫瘍微小環境を再構築する能力も有する。Ｍ２表現型マクロファージをＭ１表現型マクロファージに再極性化することは、抗腫瘍効果を起こすのに充分であることも知られている（非特許文献１０）。したがって、このような再極性効果を開始することができる治療方針があれば、養子細胞療法及びチェックポイント阻害薬などの他の免疫療法の抗腫瘍効果を支援し、強化するのに役立てるために特に有利だろう。

本明細書に示されるように、Ｍ２マクロファージをグラム陰性菌でインビトロ処理すると、様々な免疫細胞を活性化し骨髄造血を起こすだけでなく（実施例１～４を参照する）、抑制性Ｍ２マクロファージからＭ１様表現型への表現型の切り替えも開始する（実施例６を参照する）。理論によって拘束されるものではないが、Ｍ２マクロファージからＭ１マクロファージへのこのような再極性化は、本明細書に示される抗腫瘍効果にさらに寄与すると考えられる。

３人の別個のドナー由来のＰＢＭＣをバフィーコートのＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ勾配遠心分離法により分離した。ＣＤ１４^＋単球をＣＤ１４ミクロビーズ分離キット（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）を用いて分離し、Ｍ１細胞はＧＭ－ＣＳＦで、Ｍ２細胞はＭ－ＣＳＦで６日間培養した。サイトカインカクテルを８日目に加えて細胞をＭ１及びＭ２細胞に極性化した。結果として生じるマクロファージを回収、洗浄し、感染効率１でＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ Ｔｙｐｈｉ菌株ＺＨ９（ΔａｒｏＣ， ΔｓｓａＶ）を用いて処理するか、未処理のままにした。１時間後、細胞を回収、洗浄し、４８時間培地中で培養した。フローサイトメトリー解析前に、細胞をＣＤ１６３及びＣＤ８６に対する抗体で染色した。

図６に示す結果から、サルモネラ菌は、Ｍ１及びＭ２マクロファージの両方に効果を有することが示される。Ｍ１マクロファージをサルモネラ菌で条件付けする場合、ほとんど全ての細胞がＣＤ８６を発現し、ＣＤ１６３を減少させ、これらの特徴の組み合わせは、炎症促進性抗腫瘍マクロファージに特有である。同様に、Ｍ２抑制性マクロファージに存在しない／少ないこの同一のＣＤ８６^＋ＣＤ１６３^－集団は、サルモネラ菌で条件付けした後のこの細胞集団に現れる。このことから、腫瘍微小環境（ＴＡＭ―腫瘍関連マクロファージと称されることも多い）及び予後不良に一般的に関連する抑制性Ｍ２マクロファージは、サルモネラ菌で変化することができ、抗腫瘍応答を良く支援するようなより炎症促進性の表現型へと条件付けする。

実施例７－ヒト単球をインビトロで条件付けするとＭ２極性化を克服し、Ｍ２の抑制能力を低減する
Ｍ２様マクロファージ、例えば腫瘍関連マクロファージは、いくつかの機構を介して、Ｔ細胞を含む多様な免疫細胞タイプに免疫抑制効果を与えることが知られている（非特許文献１１）。Ｔ細胞の抗原に向けられる既知の細胞傷害性能力により、Ｔ細胞は種々の免疫療法の開発の主要な標的である。したがって、グラム陰性菌でヒト単球をインビトロで条件付けした後のＴ細胞増殖に対する効果を調べた。

ＰＢＭＣをバフィーコートのＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ勾配遠心分離法により分離し、ＣＤ１４^＋単球をＣＤ１４ミクロビーズ分離キット（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）を用いて分離した。単球を感染効率１で３０分間、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ Ｔｙｐｈｉ菌株ＺＨ９（ΔａｒｏＣ，ΔｓｓａＶ）で処理するか（条件細胞）、培地のみでインキュベートした（非条件細胞）。細胞をＰＢＳで２回洗浄してサルモネラ菌を
除去し、ゲンタマイシンを補充した培地で６日間培養した。細胞を免疫抑制マクロファージへと極性化するために、次にＩＬ－４、ＩＬ－１０及びＴＧＦβを４８時間加えた。自己ＣＤ４^＋Ｔ細胞を分離し、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｆａｒ Ｒｅｄで標識した。Ｔ細胞を抗ＣＤ３／ＣＤ２８Ａｂの存在下マクロファージと共培養した。５日後、細胞を回収し、フローサイトメトリーを用いてＴ細胞増殖を評価した。

サルモネラ菌で条件付けしたヒト単球由来のＭ２マクロファージは、非条件付けマクロファージと比べてサルモネラ菌で条件付けしたマクロファージの存在下Ｔ細胞増殖が大きかったことにより実証されるように、Ｔ細胞増殖をあまり抑制しないことが分かった（図７Ａ及び７Ｃを参照する）。図７Ｃから分かるように、非条件付け（培地）骨髄系細胞は、抑制性Ｍ２細胞のようにふるまい、２回を超える分裂を受ける活性化Ｔ細胞はわずか平均１０％で、Ｔ細胞増殖を効果的に抑制する。対照的に、サルモネラ菌で条件付けした骨髄系細胞は、２回を超える分裂を受けるＴ細胞は平均２０％で、あまり抑制しない。したがって、サルモネラ菌で条件付けした単球由来マクロファージは、Ｍ２極性化にあまり影響されない。

これらのデータから、骨髄系細胞をグラム陰性菌で条件付けすると、腫瘍微小環境などの抑制性条件下においてＴ細胞増殖を増強することができ、グラム陰性菌の経口投与により条件付けすると養子的に移入された、及びＣＡＲ－Ｔ細胞療法の増殖を増強するという仮説を支持する。

実施例８－ヒト単球をインビトロで訓練するとＭ２極性化を克服し、抗ＰＤ－Ｌ１ Ａｂ活性を増強する
骨髄系細胞をグラム陰性菌で条件付けすると抑制条件においてＴ細胞増殖を増強することができるという知見を得た後、このような効果が免疫療法の有効性に影響を及ぼすかどうかを続けて調べた。

ＰＢＭＣをバフィーコートのＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ勾配遠心分離法により分離し、ＣＤ１４^＋単球をＣＤ１４ミクロビーズ分離キット（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）を用いて分離した。単球を感染効率１で３０分間、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ Ｔｙｐｈｉ菌株ＺＨ９（ΔａｒｏＣ，ΔｓｓａＶ）で処理するか（条件細胞）、培地のみでインキュベートした（非条件細胞）。細胞をＰＢＳで２回洗浄してサルモネラ菌を除去し、ゲンタマイシンを補充した培地で６日間培養した。細胞を免疫抑制Ｍ２マクロファージへと極性化するために、次にＩＬ－４、ＩＬ－１０及びＴＧＦβを４８時間加えた。自己ＣＤ４^＋ Ｔ細胞を分離し、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｆａｒ Ｒｅｄで標識した。細胞を抗ＣＤ３／ＣＤ２８ Ａｂ、及び抗ＰＤ－Ｌ１ Ａｂ又は関連するアイソタイプＡｂ対照のいずれかの存在下マクロファージと共培養した。５日後、細胞を回収し、フローサイトメトリーを用いてＴ細胞増殖を評価した。

サルモネラ菌で条件付けしたヒト単球由来マクロファージでは、サルモネラ菌に曝露しなかったヒト単球由来マクロファージと比べてＰＤ－Ｌ１遮断活性が増強したことが分かった（図８Ａ及びＣを参照する）。図８Ｃから分かるように、ＰＤ－Ｌ１遮断と併せた非条件付け（培地）骨髄系細胞は、腫瘍微小環境を模倣したこの実験設定においてはＴ細胞増殖の抑制を反転させるのに有効でない。しかしながら、ＰＤ－Ｌ１遮断と併せたサルモネラ菌で条件付けした骨髄系細胞では、この抑制がチェックポイント阻害薬に感受性になり、２回を超える分裂を受ける細胞が～５０％と、ＰＤ－Ｌ１遮断の存在下Ｔ細胞増殖の抑制を反転する。

これらのデータから、骨髄系細胞をグラム陰性菌で条件付けすると、チェックポイント阻害薬療法に応答性でない患者においても、腫瘍微小環境などの免疫抑制性が強い条件に
おいてチェックポイント遮断がＴ細胞増殖の抑制を反転する有効性を可能にし、増強する。したがって、このデータは、グラム陰性菌の投与による条件付けは、チェックポイント阻害薬、養子細胞療法及びＣＡＲ－Ｔ療法などの免疫療法の有効性を増強するという仮説を支持する。

したがって、本発明の発明者らは、げっ歯類及びヒト細胞の両方での多くのアッセイ全体を通して、グラム陰性菌を、例えばチェックポイント阻害薬療法、養子細胞療法及び／又は同種又は自己ＣＡＲ－Ｔ療法などの免疫療法と組み合わせると、免疫療法を単独で用いる場合と比較してこれらの治療法の抗腫瘍効果を増強することができることを示した。したがって、本発明は、腫瘍学の分野において著しい改善を示し、少なくとも、現在、理由は分からないが、診療所で用いられている現在の免疫療法に無応答な患者にとって新規な治療方針を提供する。

Claims (21)

1. 弱毒生グラム陰性菌の投与と同時に、別々に、又は経時的に、チェックポイント阻害薬療法、養子細胞療法及び／又は同種若しくは自己ＣＡＲ－Ｔ療法を受ける又は受けるよう意図される対象における腫瘍性疾患の治療、低減、抑制又は制御に使用する弱毒生グラム陰性菌であって、
   前記弱毒生グラム陰性菌は、経口投与され、皮下に投与され、又は筋肉内に投与される、
   弱毒生グラム陰性菌。
2. チェックポイント阻害薬療法、養子細胞療法及び／又は同種若しくは自己ＣＡＲ－Ｔ療法を受ける又は受けるよう意図される対象における腫瘍性疾患の治療、低減、抑制又は制御に使用する弱毒生グラム陰性菌であって、
   前記弱毒生グラム陰性菌は、治療の第１期に投与されることになっており、
   前記チェックポイント阻害薬療法、前記養子Ｔ細胞療法又は前記同種若しくは自己ＣＡＲ－Ｔ療法は、治療の第２期に投与されることになっている、
   弱毒生グラム陰性菌。
3. 弱毒生グラム陰性菌の投与と同時に、別々に、又は経時的に、チェックポイント阻害薬療法、養子細胞療法及び／又は同種若しくは自己ＣＡＲ－Ｔ療法を受ける又は受けるよう意図される対象における腫瘍性疾患の治療、低減、抑制又は制御に使用する弱毒生グラム陰性菌であって、
   前記弱毒生グラム陰性菌は、非組換え型である、又は前記弱毒生グラム陰性菌は、治療タンパク質をコードする真核生物の異種ＤＮＡを含まない、
   弱毒生グラム陰性菌。
4. 前記弱毒生グラム陰性菌は、サルモネラ菌種である、請求項１～３のいずれか一項に記載の使用に供するための弱毒生グラム陰性菌。
5. 前記弱毒生グラム陰性菌は、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｅｎｔｅｒｉｃａ）である、請求項１～４のいずれか一項に記載の使用に供するための弱毒生グラム陰性菌。
6. 前記弱毒生グラム陰性菌は、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ Ｔｙｐｈｉ）であるか、又は前記弱毒生グラム陰性菌は、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）である、請求項１～５のいずれか一項に記載の使用に供するための弱毒生グラム陰性菌。
7. 前記弱毒生グラム陰性菌は、遺伝子操作した非天然細菌である、請求項１～６のいずれか一項に記載の使用に供するための弱毒生グラム陰性菌。
8. 前記弱毒生グラム陰性菌は、Ｔｙ２１ａ、ＣＶＤ９０８－ｈｔｒＡ、ＣＶＤ９０９、Ｔｙ８００、Ｍ０１ＺＨ０９、ｘ９６３３、ｘ９６４０、ｘ８４４４、ＤＴＹ８８、ＺＨ９ＰＡ、ＭＤ５８、ＷＴ０５、ＺＨ２６、ＳＬ７８３８、ＳＬ７２０７、ＶＮＰ２０００９又はＡ１－Ｒを含む群から選択される、請求項１～７のいずれか一項に記載の使用に供するための弱毒生グラム陰性菌。
9. 前記チェックポイント阻害薬は、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ又はこれらの任意の組み合わせに対して
   作られた遮断薬である、請求項１～８のいずれか一項に記載の使用に供するための弱毒生グラム陰性菌。
10. 前記チェックポイント阻害薬は、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１に対して作られた遮断薬である、請求項９に記載の使用に供するための弱毒生グラム陰性菌。
11. 前記養子細胞療法は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）療法、操作したＴ細胞受容体（ＴＣＲ）療法及び／又はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞療法である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の使用に供するための弱毒生グラム陰性菌。
12. 前記腫瘍性疾患は、固形腫瘍又は造血器腫瘍に関連し、好ましくは前記腫瘍性疾患は、固形腫瘍に関連する、請求項１～１１のいずれか一項に記載の使用に供するための弱毒生グラム陰性菌。
13. 前記腫瘍性疾患は、前立腺癌、肝癌、腎癌、肺癌、乳癌、結腸直腸癌、膀胱癌、膵癌、脳癌、肝細胞、リンパ腫、白血病、胃癌、子宮頸癌、卵巣癌、甲状腺癌、メラノーマ、細胞腫、頭頸部癌、皮膚癌又は肉腫から選択される癌に関連する、請求項１～１２のいずれか一項に記載の使用に供するための弱毒生グラム陰性菌。
14. 前記腫瘍性疾患は、肺癌、膀胱癌、胃癌、卵巣癌、結腸直腸癌、頭頸部癌、メラノーマ、腎癌又は乳癌から選択される癌に関連する、請求項１３に記載の使用に供するための弱毒生グラム陰性菌。
15. 前記弱毒生グラム陰性菌は、経口投与される、請求項１～１４のいずれか一項に記載の使用に供するための弱毒生グラム陰性菌。
16. 前記弱毒生グラム陰性菌は、治療の第１期に投与され、前記チェックポイント阻害薬療法、前記養子Ｔ細胞療法及び／又は前記同種若しくは自己ＣＡＲ－Ｔ療法は、治療の第２期に投与される、請求項１、３又は請求項１、３に係属中の任意の請求項のいずれか一項に記載の使用に供するための弱毒生グラム陰性菌。
17. 前記治療の第１期及び治療の第２期は、少なくとも１週間離して投与され、好ましくは、前記治療の第１期及び治療の第２期は、２週間離して投与される、請求項２、若しくは請求項２に係属中の任意の請求項、又は請求項１６に記載の使用に供するための弱毒生グラム陰性菌。
18. 使用時に、前記弱毒生グラム陰性菌は、前記対象において全身性免疫応答を発生させる、請求項１～１７のいずれか一項に記載の使用に供するための弱毒生グラム陰性菌。
19. 前記全身性免疫応答は、骨髄系細胞の活性化及び／又は成熟を増大させる、請求項１８に記載の使用に供するための弱毒生グラム陰性菌。
20. 対象における腫瘍性疾患を治療、抑制又は制御する方法であって、
    前記方法は、（ｉ）弱毒生グラム陰性菌であって、前記弱毒生グラム陰性菌は、経口投与され、皮下に投与され、又は筋肉内に投与される、弱毒生グラム陰性菌、及び（ｉｉ）チェックポイント阻害薬療法、養子細胞療法及び／又は同種若しくは自己ＣＡＲ－Ｔ療法を、前記対象に、同時に、別々に、又は経時的に投与することを含み、
    前記方法は、前記弱毒生グラム陰性菌又はチェックポイント阻害薬療法、養子細胞療法及び／若しくは同種若しくは自己ＣＡＲ－Ｔ療法の単独投与と比較して治療効果を増強する、
    方法。
21. 前記方法は、請求項１又は請求項１に係属中の任意の請求項に記載の使用に供するための弱毒生グラム陰性菌を含む、請求項２０に記載の対象における腫瘍性疾患を治療、抑制又は制御する方法。

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