JP2023547405A - Ｃａｓ９－ＲＮＰ及び他の核タンパク質カーゴの形質導入のために適合された最小長のシャトル剤ペプチド及びそのバリアント - Google Patents

Ｃａｓ９－ＲＮＰ及び他の核タンパク質カーゴの形質導入のために適合された最小長のシャトル剤ペプチド及びそのバリアント Download PDF

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Abstract

合成ペプチドシャトル剤により真核細胞の細胞質/核コンパートメントにCas9-RNPゲノム編集及びABE-Cas9-RNP塩基編集複合体等の核タンパク質カーゴを送達するための組成物及び方法が、本明細書に記載される。また、カーゴ形質導入活性に関連する規定の幾何形状を有する20未満のアミノ酸長を有する短縮された合成ペプチドシャトル剤も、本明細書に記載される。合成ペプチドシャトル剤は、正に荷電した親水性の外面と、疎水性の外面との両方を有する両親媒性アルファヘリックスモチーフを含むペプチドであり、合成ペプチドシャトル剤は、カーゴから独立しているか、又はそれに共有結合していない。核タンパク質及び/又は細胞外DNA/RNAによる阻害に対する耐性の増大のために操作されたシャトル剤も、本明細書に記載される。

Description

本記載は、ペプチドに基づく送達系による核タンパク質カーゴの細胞内送達に関する。より具体的には、本記載は、Cas9-RNP等の核タンパク質カーゴの細胞内送達のための合成ペプチドシャトル剤の使用、並びに核タンパク質及び/又は細胞外DNA/RNAによる阻害に対する耐性の増大のために操作された合成ペプチドシャトル剤に関する。
本記載は、その内容が全体として参照により本明細書に組み込まれている多数の文書に言及する。
CRISPR-Cas酵素を使用するゲノム編集は、高い治療能力を提供するが、オフターゲットゲノム編集は、安全に対する懸念を突きつける。リボ核タンパク質(RNP)ゲノム編集複合体の直接細胞内送達は、ゲノム編集の速度及びその後のRNPの迅速なクリアランスのため、DNA送達の使用よりも好ましい。従来の方法は、治療的使用のためのその制限を有する、RNP送達のためのリポフェクション又はエレクトロポレーションに依拠する。細胞膜透過性ペプチドへのRNPコンジュゲーションも、探索されてきたが、成功は限定的であった。したがって、RNPの細胞内送達のための技術の改善が非常に望ましい。
国際公開第2016/161516号 国際公開第2018/068135号 CA 3,040,645 国際公開第2020/210916号 PCT/CA2021/051458
https://www.donarmstrong.com/cgi-bin/wheel.pl http://lbqp.unb.br/NetWheels/
合成ペプチドシャトル剤は、広範囲の標的真核細胞の細胞質及び/又は核に迅速且つ効率的にタンパク質カーゴを形質導入することが以前に報告されている、最近定義されたペプチドファミリーを表す。伝統的な細胞膜透過性ペプチドに基づく細胞内送達戦略とは対照的に、合成ペプチドシャトル剤は、細胞膜を渡る送達時にそのポリペプチドカーゴに共有結合されていないのが好ましい。事実、切断不可能な様式でそのカーゴにシャトル剤を共有結合させることは、一般に、その形質導入活性に対する負の効果を有する。このようなペプチドシャトル剤の第1世代は、国際公開第2016/161516号に記載され、ペプチドシャトル剤は、細胞膜透過性ドメイン(CPD)に操作可能に連結されたエンドソーム漏出ドメイン(ELD)を含む。その後、国際公開第2018/068135号は、第1世代ペプチドシャトル剤の毒性を低減しながら、タンパク質カーゴの迅速な形質導入を改善する唯一の目的で、一組の15の設計パラメーターに基づいて合理的に設計された合成ペプチドシャトル剤を更に記載した。
第1及び第2世代のシャトル剤の大部分は、少なくとも20アミノ酸長のペプチドである。カーゴの形質導入活性にとって十分な第1及び第2世代の合成ペプチドシャトル剤の最小断片を同定するためのシャトル剤トランケーション実験がここで行われた。これらの実験により、C末端トランケーションが、一般的にはN末端トランケーションよりも許容されると共に、生理的条件(例えば、中性pH)で溶液中にある時にN末端断片が両親媒性カチオン性アルファヘリックス構造に対応する「コア」領域を採用すると予測される場合に、C末端トランケーションが実質的なカーゴ形質導入活性を保持することが多いことが示された。このコア領域及び/又は20アミノ酸未満のシャトル剤の共通の物理化学的特性は、本明細書に記載される。
一態様では、カーゴ形質導入活性を有する20アミノ酸未満の長さの合成ペプチドシャトル剤及び真核細胞中で様々なカーゴを送達するためのその使用が、本明細書に記載される。シャトル剤は一般に、Schiffer-Edmundsonのホイール表示において140度～280度の疎水性角度を規定するヘリックスの一方の側の疎水性アミノ酸残基のクラスターと、Schiffer-Edmundsonのホイール表示において40度～160度の正に荷電した角度を規定するヘリックスの他方の側の正に荷電した残基のクラスターとを有する両親媒性ヘリックスを含むヘリックス領域を含む。
第1及び第2世代のシャトル剤はCpf1-RNP(Cas12a-RNP)ゲノム編集複合体を真核細胞の核に効率的に送達するが、それらはCas9-RNPの送達においてはあまり効率的ではないことが本明細書で示される。類似するサイズを有するが(SpCas9、170kDa及びAsCpf1、156kDa)、送達に影響する可能性がある2つの酵素間の大きな差異は、その対応するガイドRNAによって寄与される正味の負電荷密度である。AsCpf1は、単純なcrRNA(CRISPR RNA)(約42ヌクレオチド)を使用し、SpCas9はcrRNA及びtracrRNA(トランス活性化crRNA)(約100ヌクレオチド)を必要とする。より短いペプチド、並びに一方又は両方の隣接断片中にカチオン性電荷密度が低下したペプチドを含む、Cas-RNPの送達の改善にとって好適な合成ペプチドシャトル剤が、本明細書に記載される。
さらなる態様では、細胞内送達のための核タンパク質カーゴ及び前記核タンパク質カーゴから独立しているか、又はそれに共有結合していない合成ペプチドシャトル剤を含む組成物であって、合成ペプチドシャトル剤が、正に荷電した親水性の外面と、疎水性の外面との両方を有する両親媒性アルファヘリックスモチーフを含むペプチドであり、合成ペプチドシャトル剤が、合成ペプチドシャトル剤の非存在下と比較して真核細胞中での前記核タンパク質カーゴの細胞質/核送達を増加させる、組成物が、本明細書に記載される。実施形態では、核タンパク質カーゴは、Cas9-RNP等のデオキシリボ核タンパク質(DNP)又はリボ核タンパク質(RNP)複合体である。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるシャトル剤は、本明細書で定義される親シャトル剤の断片であって、カーゴ形質導入活性を保持し、正に荷電した親水性の外面と、疎水性の外面との両方を有する両親媒性アルファヘリックスモチーフを含む、断片を含み得る。一部の実施形態では、本明細書に記載されるシャトル剤は、本明細書で定義される親シャトル剤のバリアントであって、カーゴ形質導入活性を保持し、親シャトル剤と比較して低いC末端正電荷密度を有することによって(例えば、K/R等の1つ又は複数のカチオン性残基を、非カチオン性残基、好ましくは、非カチオン性親水性残基で置換することによって)、シャトル剤と異なる(又は唯一異なる)、バリアントを含み得る。一部の実施形態では、本明細書に記載されるシャトル剤断片及び/又はバリアントは、核タンパク質及び/若しくは細胞外DNA/RNAによる阻害に対する増大した耐性を有する、並びに/又は核タンパク質カーゴに関する増大した形質導入活性を有する。
一般的定義
表題及びその他の識別子、例えば、(a)、(b)、(i)、(ii)等は、単に、本明細書及び特許請求の範囲の読み取りを容易にするために提示される。本明細書及び特許請求の範囲における表題及びその他の識別子の使用は、工程又は要素が、アルファベット順又は番号順で、又はそれらが提示される順序で実施されることを必ずしも必要としない。
単語「1つの(a)」又は「1つの(an)」の使用は、特許請求の範囲及び/又は明細書において、用語「含んでいる(comprising)」と共に使用される場合には、「1つ」を意味し得るが、「1つ又は複数の」、「少なくとも1つの」及び「1つ又は2つ以上の」の意味とも一致する。
用語「約」は、本明細書で使用される場合には、値が、値を決定するために使用されているデバイス又は方法の誤差の標準偏差を含むことを示す。一般に、技術用語「約」は、最大10%の起こり得る変動を指定するものとする。したがって、値の1、2、3、4、5、6、7、8、9及び10%の変動が、用語「約」中に含まれる。別に示されない限り、範囲の前の用語「約」の使用は、範囲の両端に適用される。
本明細書及び特許請求の範囲において、使用されるように、単語「含んでいる(comprising)」(及び「含む(comprise)」及び「含む(comprises)」等の、含んでいるの任意の形態)、「有している(having)」(及び「有する(have)」及び「有する(has)」等の有しているの任意の形態)、「含んでいる(including)」(及び「含む(includes)」及び「含む(include)」等の、含んでいるの任意の形態)又は「含有している(containing)」(及び「含有する(contains)」及び含有する(contain)等の、含有しているの任意の形態)は、包括的又はオープンエンドであり、さらなる列挙されていない要素又は方法工程を排除しない。
本明細書で使用される場合、「タンパク質」又は「ポリペプチド」又は「ペプチド」は、任意の種類の修飾(例えば、アセチル化、リン酸化、グリコシル化、硫酸化(sulfatation)、SUMO化、プレニル化、ユビキチン化等といった化学又は翻訳後修飾)を含む場合も、含まない場合もある、アミノ酸の任意のペプチド連結している鎖を意味する。更に明瞭にするために、修飾が本明細書に記載のシャトル剤のカーゴ形質導入活性を破壊しない限り、タンパク質/ポリペプチド/ペプチド修飾が想定される。例えば、本明細書に記載されるシャトル剤は、直鎖状又は環状であり得て、1つ又は複数のD-又はL-アミノ酸で合成され得、及び/又は脂肪酸(例えば、それらのN末端)にコンジュゲートされ得る。本明細書に記載されるシャトル剤はまた、置き換えられるアミノ酸と同様の物理化学的特性(例えば、構造、疎水性、又は電荷)の側鎖を有する対応する合成アミノ酸で置き換えられる少なくとも1つのアミノ酸を有し得る。
本明細書で使用される場合、「ドメイン」又は「タンパク質ドメイン」は、一般に、特定の官能基又は機能を有するタンパク質の一部を指す。いくつかのドメインは、タンパク質の残部から分離された場合にその機能を保存し、したがって、モジュール方式で使用され得る。多数のタンパク質ドメインのモジュール特性は、本記載のシャトル剤内のそれらの配置により可撓性を提供し得る。しかしながら、いくつかのドメインは、シャトル剤の特定の位置に(例えば、N末端又はC末端領域に又はその間に)遺伝子操作された場合により良好に機能し得る。その内因性タンパク質内のドメインの位置は、ドメインが、シャトル剤内で遺伝子操作されるべき場所の指標及びリンカーのどの種類/長さが使用されるべきであるかの指標となることもある。標準組換えDNA技術は、本開示を考慮して本記載のシャトル剤内のドメインの配置及び/又は数を操作するために当業者により使用され得る。更に、シャトル剤の観点において、ドメインの各々の機能性(例えば、細胞膜を横切る細胞浸透、エンドソームエスケープ及び/又は細胞質へのアクセスを促進する能力)を評価するために、本明細書に開示される、並びにその他の当該技術分野において公知であるアッセイが使用され得る。また、標準的な方法を用いて、シャトル剤のドメインが、細胞内に送達されるべきカーゴの活性に影響を及ぼすか否かを評価することができる。この関連で、表現「作動可能に連結された」とは、本明細書で使用される場合、本記載のシャトル剤の観点で、ドメインのその意図される機能(例えば、細胞浸透、エンドソームエスケープ及び/又は細胞内ターゲッティング)を実施する能力を指す。より明確にするために、表現「作動可能に連結された」とは、それらの間の特定の順序又は距離に制限されない、2種以上のドメイン間の機能的結合を定義することを意味する。
本明細書で使用される場合、「合成ペプチド」、「合成ペプチドシャトル剤」又は「合成ポリペプチド」等の表現において使用される用語「合成」は、インビトロで製造され得る(例えば、化学的に合成される、及び/又は組換えDNA技術を使用して製造される)天然に存在しない分子を指すことが意図される。種々の合成調製物の純度は、例えば、高性能液体クロマトグラフィー解析及び質量分析法により評価され得る。化学合成アプローチは、それらが、大規模な組換えタンパク質精製工程(例えば、臨床使用のために必要とされる)の必要性を排除し得るため、細胞発現系(例えば、酵母又は細菌タンパク質発現系)よりも有利であり得る。対照的に、より長い合成ポリペプチドは、より複雑であり得、及び/又は化学合成アプローチによって、製造するのに費用がかさみ得、このようなポリペプチドは、細胞発現系を使用してより有利に製造され得る。一部の実施形態では、本記載のペプチド又はシャトル剤は、組換え宿主細胞から発現されるのとは対照的に、化学的に合成(例えば、固相又は液相ペプチド合成)され得る。一部の実施形態では、本記載のペプチド又はシャトル剤は、N末端メチオニン残基を欠き得る。当業者は、本記載の合成ペプチド又はシャトル剤を、1つ若しくは複数の修飾されたアミノ酸(例えば、天然に生じないアミノ酸)を使用することによって、又は本記載の合成ペプチド若しくはシャトル剤を化学的に修飾することによって、安定性の特定の必要性又はその他の必要性に合うように適応させることができる。
本明細書で使用される場合、用語「独立した」とは、一般に、互いに共有結合によって結合していない分子若しくは薬剤、又は分子若しくは薬剤(例えば、シャトル剤及びカーゴ)が投与後に(例えば、還元的細胞環境に曝露される時、及び/又はしかし、細胞内に送達される前、それと同時に、若しくはその直後に)結合の切断によって互いに分離するような、切断可能な結合によって一過的に共有結合され得る分子若しくは薬剤を指すことが意図される。例えば、表現「独立したカーゴ」は、細胞膜を渡る形質導入の時点で本記載のシャトル剤と共有結合によって結合していない(例えば、融合していない)、細胞内に送達される(形質導入される)カーゴを指すことが意図される。一部の態様では、カーゴと独立している(と融合していない)シャトル剤を有することは、シャトル剤の汎用性を増加させることによって、例えば、(シャトル剤とカーゴとの間の共有結合の場合に固定比率に限定されるのとは対照的に)カーゴに対するシャトル剤の比率を容易に変化させることができることにより有利であり得る。一部の態様では、シャトル剤とそのカーゴが標的細胞との接触時に互いに分離するように、それらを切断可能な結合によって共有結合させることは、製造及び/又は規制の観点から有利であり得る。
本明細書で使用される場合、表現「であるか又はに由来する」又は「に由来する」は、タンパク質ドメインの活性を抑制しない、保存的アミノ酸置換、欠失、修飾、並びにバリアント又は機能性誘導体等の所与のタンパク質又はペプチド(例えば、本明細書に記載されるシャトル剤)又はそのドメイン(例えば、CPD又はELD)の機能性バリアントを含む。
本記載の他の目的、利点及び特徴は、添付の図面を参照して、例示の目的のみで与えられたその特定の実施形態の以下の非制限的説明を読むと、より明らかとなる。
小分子カーゴ、ヨウ化プロピジウム(PI)、及びタンパク質カーゴ、GFPに関する、HeLa細胞中での短い/トランケートされた合成シャトル剤のカーゴ形質導入活性を示す図である。行は、それぞれのシャトル剤/ペプチドの毒性、並びにGFP及びPIを送達するその能力の原因となる単一の計算された数である「全体送達係数」に基づいて順位付けられる。アミノ酸配列、長さ、疎水性モーメント(μH)、ヘリカルホイール投影図、並びに正に荷電し、疎水性の角度を含む、構造特性がそれぞれのペプチドについて示される。結果は、少なくとも2回反復において実施された実験から計算された平均である。 図１Ａの続きである。 図１Ｂの続きである。 図１Ｃの続きである。 図１Ｄの続きである。 図１Ｅの続きである。 図１Ｆの続きである。 図１Ｇの続きである。 フローサイトメトリーによって評価された、RH-30細胞中での蛍光標識されたカーゴのシャトル剤媒介性形質導入に対する、形質導入媒体中に混合した増加量のsgRNAの阻害効果を示す図である。シャトル剤はFSD250であり、カーゴはFITC標識されたホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー(PMO-FITC)であった。 HeLa細胞が、RNA電荷中和剤としての、増加する濃度の小さく正に荷電した分子である1,3-ジアミノグアニジンモノヒドロクロリドで、Cas9-RNP複合体の存在下(+)又は非存在下(-)、シャトル剤FSD250及びカーゴとしてのGFPと同時インキュベートされる形質導入アッセイの結果を示す図である。結果は、少なくとも2回反復において実施された実験から計算された平均である。 HeLa細胞が、Cas9-RNPの存在下(+)又は非存在下(-)で、異なるペプチド/シャトル剤及びGFPカーゴと同時インキュベートされる形質導入アッセイの結果を示す図である。結果は、少なくとも2回反復において実施された実験から計算された平均である。 構造的に関連するペプチドFSD10-15、FSD375、FSD422、FSD424、FSD432、FSD241、FSD231、FSD10、及びFSD210に関するCas9-RNPの存在下(+)又は非存在下(-)、HeLa細胞中でのGFP形質導入効率の変化を示す図である。 構造的に関連するペプチドCM18、FSD440、CM18-L2-PTD4、His-CM18-トランスポータン、CM18-TAT、His-CM18-9Arg、及びHis-CM18-TATに関するCas9-RNPの存在下(+)又は非存在下(-)、HeLa細胞中でのGFP形質導入効率の変化を示す図である。 構造的に関連するペプチドFSD356、FSD357、FSD446、FSD250、FSD296、FSD246、及びFSD251に関するCas9-RNPの存在下(+)又は非存在下(-)、HeLa細胞中でのGFP形質導入効率の変化を示す図である。 構造的に関連するペプチドFSD374、FSD183、FSD168、FSD172、FSD189、FSD174、及びFSD187に関するCas9-RNPの存在下(+)又は非存在下(-)、HeLa細胞中でのGFP形質導入効率の変化を示す図である。 構造的に関連するペプチドFSD10及びFSD375に関するCas9-RNPの存在下(+)又は非存在下(-)、CFF-16HBEge細胞中でのGFP形質導入効率の変化を示す図である。 図6Aは、機能性Cpf1-RNP又はCas9-RNPゲノム編集複合体を送達し、HeLa細胞中でゲノム編集を行う、構造的に異なるシャトル剤の能力を示す図である。 図6Bは、機能性Cpf1-RNP又はCas9-RNPゲノム編集複合体を送達し、HeLa細胞中でゲノム編集を行う、構造的に異なるシャトル剤の能力を示す図である。 図6Cは、機能性Cpf1-RNP又はCas9-RNPゲノム編集複合体を送達し、HeLa細胞中でゲノム編集を行う、構造的に異なるシャトル剤の能力を示す図である。 図6Dは、機能性Cpf1-RNP又はCas9-RNPゲノム編集複合体を送達し、HeLa細胞中でゲノム編集を行う、構造的に異なるシャトル剤の能力を示す図である。 図6Eは、機能性Cpf1-RNP又はCas9-RNPゲノム編集複合体を送達し、HeLa細胞中でゲノム編集を行う、構造的に異なるシャトル剤の能力を示す図である。 機能性Cpf1-RNP又はCas9-RNPゲノム編集複合体を送達し、不応性ヒト気管支上皮細胞株CFF-16HBEge中でゲノム編集を行う、構造的に異なるシャトル剤の能力を示す図である。 図8Aは、CFF-16HBEge細胞中で機能性Cas9-RNPゲノム編集複合体対ABE-Cas9-RNP塩基編集複合体を送達する、シャトル剤FSD10、及びそのバリアントの能力を比較する図である。 図8Bは、CFF-16HBEge細胞中で機能性Cas9-RNPゲノム編集複合体対ABE-Cas9-RNP塩基編集複合体を送達する、シャトル剤FSD10、及びそのバリアントの能力を比較する図である。 図8Cは、CFF-16HBEge細胞中で機能性Cas9-RNPゲノム編集複合体対ABE-Cas9-RNP塩基編集複合体を送達する、シャトル剤FSD10、及びそのバリアントの能力を比較する図である。 PI及びGFP-NLS形質導入活性のための300を超える候補ペプチドシャトル剤の大規模スクリーニングの結果を示す図である。 図９Ａの続きである。 図９Ｂの続きである。 図９Ｃの続きである。 図９Ｄの続きである。 図９Ｅの続きである。 図９Ｆの続きである。 PyMOLによって生成された図1のペプチド/シャトル剤のコア及びサイドビュー3Dイメージを示す図である。様々に変わる色合いの緑は、疎水性の残基(Y、W、I、M、L、F)を表し、より暗い緑色は、高度疎水性の残基を表す;青色の残基は、荷電した親水性の残基(K、H、R、E、D)を表す;赤色の残基は、非荷電の親水性の残基(Q、N)を表す;黄色/橙色の残基は、弱い疎水性の残基(G、A、S、T)を表す。 図１０Ａの続きである。 図１０Ｂの続きである。 図１０Ｃの続きである。 図１０Ｄの続きである。 図１０Ｅの続きである。 図１０Ｆの続きである。
配列表
この出願は、2021年10月21日に作成されたコンピュータ可読形式の配列表を含む。コンピュータ可読形式は、参照により本明細書に組み込まれる。
詳細な説明
一態様では、カーゴ形質導入活性を有する短い合成ペプチドシャトル剤及び真核細胞中で様々な独立したカーゴを送達するためのその使用が、本明細書に記載される。本明細書で使用される場合、「短い合成ペプチドシャトル剤」又は「短いシャトル剤」という表現は、20アミノ酸未満の長さの合成ペプチドシャトル剤を指してもよく、又はより長いシャトル剤内の20アミノ酸未満の長さの「コア」両親媒性カチオン性アルファヘリックス領域を指してもよい。
一部の実施形態では、短いシャトル剤は一般に、Schiffer-Edmundsonのホイール表示において140度～280度の疎水性角度を規定するヘリックスの一方の側の疎水性アミノ酸残基のクラスターと、Schiffer-Edmundsonのホイール表示において40度～160度の正に荷電した角度を規定するヘリックスの他方の側の正に荷電した残基のクラスターとを有する両親媒性ヘリックスを含むヘリックス領域を含む。一部の実施形態では、ヘリックスの一方の側の疎水性アミノ酸残基のクラスターは、Schiffer-Edmundsonのホイール表示において140度～280度、160度～260度、又は180度～240度の疎水性角度を規定する。一部の実施形態では、ヘリックスの他方の側の正に荷電した残基のクラスターは、Schiffer-Edmundsonのホイール表示において40度～160度、40度～140度、又は60度～140度の正に荷電した角度を規定する。前記の幾何形状は一般に、実施例3に記載されるように、短いシャトル剤によって共有されていた。
一部の実施形態では、疎水性クラスター中の残基の少なくとも20%、30%、40%、又は50%が、疎水性の残基である。一部の実施形態では、疎水性の残基は、フェニルアラニン、イソロイシン、トリプトファン、ロイシン、バリン、メチオニン、チロシン、システイン、グリシン、及びアラニンからなる群から選択される。一部の実施形態では、疎水性の残基は、フェニルアラニン、イソロイシン、トリプトファン、及び/又はロイシンからなる群から選択される。
一部の実施形態では、正荷電クラスター中の残基の少なくとも20%、30%、40%、又は50%が、正に荷電した残基である。一部の実施形態では、正に荷電した残基は、リシン、アルギニン、及びヒスチジンからなる群から選択される。一部の実施形態では、正に荷電した残基は、リシン及びアルギニンからなる群から選択される。
一部の実施形態では、短い合成ペプチドシャトル剤は、少なくとも8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、又は19アミノ酸長である。
一部の実施形態では、短い合成ペプチドシャトル剤は、少なくとも3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、又は5.5の疎水性モーメント(μH)を有し得る。好ましくは、短いシャトル剤は、少なくとも3.5、4、又は4.5の疎水性モーメントを有する。
一部の実施形態では、短いシャトル剤は、ポリペプチド、ペプチド、核タンパク質、小分子、又はオリゴヌクレオチド類似体(例えば、非アニオン性オリゴヌクレオチド類似体)等のカーゴを形質導入するために使用され得る。
一部の態様では、核タンパク質カーゴの形質導入のための組成物及び方法が、本明細書に記載される。組成物は一般に、細胞内送達のための核タンパク質カーゴ及び前記核タンパク質カーゴから独立しているか、又はそれに共有結合していない合成ペプチドシャトル剤を含む。合成ペプチドシャトル剤は、正に荷電した親水性の外面と、疎水性の外面との両方を有する両親媒性アルファヘリックスモチーフを含むペプチドであり、合成ペプチドシャトル剤は、合成ペプチドシャトル剤の非存在下と比較して、真核細胞中での前記核タンパク質カーゴの細胞質/核送達を増加させる。
一部の実施形態では、核タンパク質カーゴは、デオキシリボ核タンパク質(DNP)及び/又はリボ核タンパク質(RNP)複合体であってよい。一部の実施形態では、核タンパク質カーゴは、RNAガイド型ヌクレアーゼ、Casヌクレアーゼ、例えば、Cas I、II、III、IV、V、若しくはVI型ヌクレアーゼ、又はヌクレアーゼ活性を欠くそのバリアント、塩基エディター、CRISPR関連トランスポザーゼ、Cas-リコンビナーゼ(例えば、recCas9)、又はCasプライムエディターであってよい。一部の実施形態では、核タンパク質カーゴは、Cpf1-RNP(Cas12a-RNP)又はCas9-RNPであってよい。一部の実施形態では、核タンパク質カーゴは、10～50塩基、50～75塩基、50～100塩基、50～150塩基、50～200塩基、50～250塩基、75～150塩基、又は75～125塩基のポリヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、核タンパク質カーゴは、細胞膜透過性又はカチオン性ペプチドと共有結合していないか、又はそれと予め複合体化していない。一部の実施形態では、核タンパク質カーゴは、脂質に基づく担体と共に封入されていないか、又はそれと混合されていない。
合理的設計パラメーター及びペプチドシャトル剤
一部の態様では、本明細書に記載されるシャトル剤は、標的真核細胞中の、核タンパク質カーゴ、タンパク質カーゴ、小分子、非アニオン性ポリヌクレオチド類似体、又はその任意の組合せのための形質導入活性を有するペプチドであり得る(国際公開第2018/068135号、CA 3,040,645、国際公開第2020/210916号、PCT/CA2021/051458)。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるシャトル剤は、好ましくは、以下の15の合理的設計パラメーターのうちの1つ若しくは複数又は任意の組合せを満たす。
(1)いくつかの実施形態では、シャトル剤は、少なくとも12、13、14、15、16、17、18、19又は20アミノ酸長のペプチドである。例えば、ペプチドは、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29又は30個のアミノ酸残基の最小長及び35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145又は150個のアミノ酸残基の最大長さを含み得る。いくつかの実施形態では、より短いペプチド(例えば、17～50個又は20～50個のアミノ酸の範囲の)は、化学的合成手法により、より容易に合成され、精製され得、臨床使用により適し得る(細胞発現系から精製しなければならない組換えタンパク質とは対照的に)ので特に有利であり得る。本記載における数及び範囲は、5の倍数として列挙されることが多いが、本記載は、そのように制限されてはならない。例えば、本明細書に記載される最大長さは、本記載において、56、57、58…61、62等の長さも包含し、本記載において、列挙されないことは、単に簡潔さのためであると理解されなければならない。同じ論拠は、本明細書で記載される同一性の%にも当てはまる。
(2)いくつかの実施形態では、ペプチドシャトル剤は、中性pHで両親媒性のアルファヘリックスモチーフを含む。本明細書で使用される場合、表現の「アルファヘリックスモチーフ」又は「アルファヘリックス」は、別段の指定がない限り、100度の連続アミノ酸間の回転角度及び/又はターン当たり3.6残基を有するアルファヘリックスを有する右巻きコイル状又はスパイラル構造(らせん体)を意味する。本明細書で使用される場合、表現の「アルファヘリックスモチーフを含む」又は「両親媒性のアルファヘリックスモチーフ」等は、ペプチドがシャトル剤として細胞中で使用される場合に実際に取るかどうかに関係なく、ペプチド一次アミノ酸配列に基づく中性pHでの生物学的設定で本記載のペプチド(又はペプチドのセグメント)が取ると予測される3次元構造を意味する。更に、本記載のペプチドは、種々のペプチドの位置で1つ又は複数のアルファヘリックスモチーフを含み得る。例えば、国際公開第2018/068135号中のシャトル剤FSD5は、その長さ全体にわたりアルファヘリックスを取ることが予測される(国際公開第2018/068135号の図49Cを参照されたい)が、国際公開第2018/068135号のシャトル剤FSD18は、ペプチドのN及びC末端領域に向いた2つの別々のアルファヘリックスを含むことが予測される(国際公開第2018/068135号の図49Dを参照されたい)。いくつかの実施形態では、本記載のシャトル剤は、例えば、国際公開第2018/068135号の図49E及び49Fに示すようなベータシートモチーフを含むと予測されない。タンパク質及びペプチド中のアルファヘリックス及びベータシートの存在を予測する方法は、当該技術分野において周知である。例えば、1つのこのような方法は、新規ペプチド構造予測のためのオンライン情報源(http://bioserv.rpbs.univ-paris-diderot.fr/services/PEP-FOLD/)である、PEP-FOLD(商標)を用いた3Dモデリングに基づくものである(Lamiable et al.,2016;Shen et al.,2014;Thevenet et al.,2012)。ペプチド及びタンパク質中のアルファヘリックスの存在の他の予測方法が既知であり、当業者なら容易に利用できる。
本明細書で使用される場合、表現の「両親媒性の」は、疎水性及び親水性要素(例えば、ペプチドを構成するアミノ酸の側鎖に基づいて)の両方を有するペプチドを意味する。例えば、表現の「両親媒性のアルファヘリックス」又は「両親媒性アルファヘリックスモチーフ」は、らせん体を形成するアミノ酸の側鎖の性質に基づいて、非極性疎水性面及び極性親水性面を有するアルファヘリックスモチーフを取ると予測されるペプチドを意味する。
(3)いくつかの実施形態では、本記載のペプチドシャトル剤は、R及び/又はK残基に富むもの等の正に帯電した親水性の外面を有する両親媒性のアルファヘリックスモチーフを含む。本明細書で使用される場合、表現の「正に帯電した親水性外面」は、アルファヘリックスホイール投影図に基づいて、両親媒性アルファヘリックスモチーフの片側にクラスター化された少なくとも3個のリシン(K)及び/又はアルギニン(R)残基の存在を意味する(例えば、国際公開第2018/068135号の図49Aの左パネルを参照されたい)。このようなヘリカルホイール投影図は、Don Armstrong及びRaphael Zidovetzkiによって作成されたオンラインヘリカルホイール投影図ツール(例えば、https://www.donarmstrong.com/cgi-bin/wheel.plで入手可能)又はMolら、2018によって開発されたオンラインツール(例えば、http://lbqp.unb.br/NetWheels/で入手可能)等の種々のプログラムを用いて調製することができる。いくつかの実施形態では、両親媒性のアルファヘリックスモチーフは、正に帯電した親水性外面を含み、この外面は、(a)少なくとも2個、3個又は4個の隣接する正に帯電したK及び/又はR残基;及び/又は(b)ヘリカルホイール投影図上に、100度の連続アミノ酸間の回転角度及び/又はターン当たり3.6残基を有するアルファヘリックスに基づいて、3個から5個のK及び/又はR残基を含む6個の隣接する残基のセグメントを含む。
いくつかの実施形態では、本記載のペプチドシャトル剤は、疎水性の外面を含む両親媒性のアルファヘリックスモチーフを含み、疎水性の外面は、(a)ヘリカルホイール投影図上で、少なくとも2個の隣接するL残基;及び/又は(b)ヘリカルホイール投影図上で、100度の連続アミノ酸間の回転角度及び/又はターン当たり3.6残基を有するアルファヘリックスに基づいて、L、I、F、V、W、及びMから選択される少なくとも5個の疎水性の残基を含む10個の隣接する残基のセグメント、を含む。
(4)いくつかの実施形態では、本記載のペプチドシャトル剤は、空間的に隣接する高度疎水性残基(例えば、L、I、F、V、W、及び/又はM)から構成される高度疎水性コアを有する両親媒性アルファヘリックスモチーフを含む。いくつかの実施形態では、例えば、国際公開第2018/068135号の図49A、右パネルに示すように、ターン当たり3.6残基を有するアルファヘリックスのオープンシリンダー表現に基づいて、高度疎水性コアは、空間的に隣接し、ヒスチジンリッチドメインを除外して計算して(下記参照)、ペプチドのアミノ酸の12～50%に相当するL、I、F、V、W、及び/又はMアミノ酸から構成され得る。いくつかの実施形態では、高度疎水性コアは、ペプチドのアミノ酸の12.5%、13%、13.5%、14%、14.5%、15%、15.5%、16%、16.5%、17%、17.5%、18%、18.5%、19%、19.5%、又は20%から25%、30%、35%、40%、又は45%に相当する空間的に隣接するL、I、F、V、W、及び/又はMアミノ酸から構成され得る。より具体的には、高度疎水性コアパラメーターは、最初に、ペプチドのアミノ酸をオープンシリンダー表現に配置し、その後、国際公開第2018/068135号の図49A、右パネルに示すように、連続した高度疎水性残基(L、I、F、V、W、M)の領域を描写することにより計算し得る。この描写された高度疎水性コアに含まれる高度疎水性残基の数は、その後、ヒスチジンリッチドメイン(例えば、N及び/又はC末端ヒスチジンリッチドメイン)を除くペプチドの合計アミノ酸長さで除算される。例えば、国際公開第2018/068135号の図49Aに示したペプチドの場合、描写した高度疎水性コア中に8個の残基が、及びペプチド中に25個の合計残基(末端の12個のヒスチジンを除く)が存在する。したがって、高度疎水性コアは32%(8/25)である。
(5)疎水性モーメントは、アミノ酸の側鎖の疎水性のベクトル和から計算される、らせん体、ペプチド、又はその一部の両親媒性の尺度に関する(Eisenberg et al.,1982)。ポリペプチドの疎水性モーメントを計算するためのオンラインツールは、http://rzlab.ucr.edu/scripts/wheel/wheel.cgi.から利用可能である。高疎水性モーメントは強力な両親媒性を示すが、低疎水性モーメントは不十分な両親媒性を示す。いくつかの実施形態では、本記載のペプチドシャトル剤は、3.5～11(μ)の疎水性モーメントを有するペプチド又はアルファヘリックスドメインからなり得る又はそれを含み得る。いくつかの実施形態では、シャトル剤は、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0の下限値と、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、10.1、10.2、10.3、10.4、10.5、10.6、10.7、10.8、10.9、又は11.0の上限値との間の疎水性モーメントを有する両親媒性アルファヘリックスモチーフを含むペプチドであり得る。いくつかの実施形態では、シャトル剤は、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0の下限値と、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、10.1、10.2、10.3、10.4、又は10.5の上限値との間の疎水性モーメントを有するペプチドであり得る。いくつかの実施形態では、疎水性モーメントは、ペプチドに存在し得る全てのヒスチジンリッチドメインを除外して、計算される。
(6)いくつかの実施形態では、本記載のペプチドシャトル剤は、側鎖K、R、D、及びEから計算して、生理学的pHで、少なくとも+3又は+4の予測される実効電荷を有し得る。例えば、ペプチドの実効電荷は、生理学的pHで少なくとも+5、+6、+7、少なくとも+8、少なくとも+9、少なくとも+10、少なくとも+11、少なくとも+12、少なくとも+13、少なくとも+14又は少なくとも+15であり得る。これらの正電荷は、一般に、負に帯電したアスパラギン酸及び/又はグルタミン酸残基とは対照的に、正に帯電したリシン及び/又はアルギニン残基のより多い存在により付与される。
(7)いくつかの実施形態では、本記載のペプチドシャトル剤は、8～13、好ましくは10～13の予測等電点(pI)を有し得る。ペプチド又はタンパク質の等電点を計算及び/又は測定するプログラム及び方法は、当技術分野において既知である。例えば、pIは、http://web.expasy.org/protparam/で入手可能なProt Paramソフトウェアを用いて計算し得る。
(8)いくつかの実施形態では、本記載のペプチドシャトル剤は、35～65%の疎水性残基(A、C、G、I、L、M、F、P、W、Y、V)から構成され得る。特定の実施形態では、ペプチドシャトル剤は36%～64%、37%～63%、38%～62%、39%～61%、40%～60%のアミノ酸:A、C、G、I、L、M、F、P、W、Y、及びVの任意の組合せから構成され得る。
(9)いくつかの実施形態では、本記載のペプチドシャトル剤は、0～30%の中性親水性残基(N、Q、S、T)から構成され得る。特定の実施形態では、ペプチドシャトル剤は、1%～29%、2%～28%、3%～27%、4%～26%、5%～25%、6%～24%、7%～23%、8%～22%、9%～21%、又は10%～20%のアミノ酸:N、Q、S、及びTの任意の組合せから構成され得る。
(10)いくつかの実施形態では、本記載のペプチドシャトル剤は、35～85%のアミノ酸:A、L、K及び/又はRから構成され得る。特定の実施形態では、ペプチドシャトル剤は36%～80%、37%～75%、38%～70%、39%～65%、又は40%～60%のアミノ酸:A、L、K、又はRの任意の組合せから構成され得る。
(11)いくつかの実施形態では、本記載のペプチドシャトル剤は、15～45%のアミノ酸:A及び/又はLから構成され得る。ただし、ペプチド中に少なくとも5%のLが存在するという条件下の場合である。特定の実施形態では、ペプチドシャトル剤は、15%～40%、20%～40%、20～35%、又は20～30%のアミノ酸:A及びLの任意の組合せから構成され得る。ただし、ペプチド中に少なくとも5%のLが存在するという条件下の場合である。
(12)いくつかの実施形態では、本記載のペプチドシャトル剤は、20～45%のアミノ酸:K及び/又はRから構成され得る。特定の実施形態では、ペプチドシャトル剤は、20%～40%、20～35%、又は20～30%のアミノ酸:K及びRの任意の組合せから構成され得る。
(13)いくつかの実施形態では、本記載のペプチドシャトル剤は、0～10%のアミノ酸:D及び/又はEから構成され得る。特定の実施形態では、ペプチドシャトル剤は、5～10%のアミノ酸:D及びEの任意の組合せから構成され得る。
(14)いくつかの実施形態では、ペプチドシャトル剤中のA及び/又はLのパーセンテージと、K及び/又はRのパーセンテージとの絶対的差異は、10%以下であり得る。特定の実施形態では、ペプチドシャトル剤中のA及び/又はLのパーセンテージと、K及び/又はRのパーセンテージとの絶対的差異は、9%、8%、7%、6%、又は5%以下であり得る。
(15)いくつかの実施形態では、本記載のペプチドシャトル剤は、10%～45%のアミノ酸:Q、Y、W、P、I、S、G、V、F、E、D、C、M、N、T、又はH(すなわち、A、L、K、又はR以外)から構成され得る。特定の実施形態では、ペプチドシャトル剤は、15～40%、20%～35%、又は20%～30%のアミノ酸:Q、Y、W、P、I、S、G、V、F、E、D、C、M、N、T、及びHの任意の組合せから構成され得る。
いくつかの実施形態では、本記載のペプチドシャトル剤は、少なくとも1個の、少なくとも2個の、少なくとも3個の、少なくとも4個の、少なくとも5個の、少なくとも6個の、少なくとも7個の、少なくとも8個の、少なくとも9個の、少なくとも10個の、少なくとも11個の、少なくとも12個の、少なくとも13個の、少なくとも14個の、又は全ての本明細書に記載のパラメーター(1)～(15)を満たす。特定の実施形態では、本記載のペプチドシャトル剤は、パラメーター(1)～(3)の全てを満たし、また、少なくとも6個の、少なくとも7個の、少なくとも8個の、少なくとも9個の、少なくとも10個の、少なくとも11個の、又は全ての本明細書に記載のパラメーター(4)～(15)を満たす。
いくつかの実施形態では、本記載のペプチドシャトル剤は、1個のみのヒスチジンリッチドメインを含み、1個のヒスチジンリッチドメインの残基は、本明細書に記載のパラメーター(1)～(15)の計算/評価に含めてよい。いくつかの実施形態では、本記載のペプチドシャトル剤は、2個以上のヒスチジンリッチドメインを含む場合、1個のヒスチジンリッチドメインの残基のみを、本明細書に記載のパラメーター(1)～(15)の計算/評価に含めてよい。例えば、本記載のペプチドシャトル剤が、最初のN末端を向いたヒスチジンリッチドメインの及びC末端を向いて第2のヒスチジンリッチドメインの2個のヒスチジンリッチドメインを含む場合、最初のヒスチジンリッチドメインのみを、本明細書に記載のパラメーター(1)～(15)の計算/評価に含めてよい。
いくつかの実施形態では、機械学習又はコンピュータ支援設計手法を実行して、本明細書に記載のパラメーター(1)～(15)の1個又は複数を満たすペプチドを生成し得る。パラメーター(1)及び(5)～(15)等のいくつかのパラメーターは、コンピュータ支援設計手法でより実施し易いが、パラメーター(2)、(3)及び(4)等の構造的パラメーターは、マニュアル設計手法により適用し易い。したがって、いくつかの実施形態では、1個又は複数のパラメーター(1)～(15)を満たすペプチドは、コンピュータ支援及びマニュアル設計手法を組み合わせて生成し得る。例えば、本明細書(又はその他のもの)で効果的シャトル剤として機能することが示される複数のペプチドの複数の配列アラインメント分析は、いくつかのコンセンサス配列-すなわち、共通に認められる疎水性、カチオン性、親水性のアラニン及びグリシンアミノ酸の交互変化のパターンの存在を明らかにした。これらのコンセンサス配列の存在は、構造的パラメーター(2)、(3)及び(4)を満たすように(すなわち、両親媒性のアルファヘリックス形成、正に帯電した面、及び12%～50%の高度疎水性コアを)誘発する可能性がある。したがって、これらの及びその他のコンセンサス配列を機械学習及び/又はコンピュータ支援設計手法に採用して、1個又は複数のパラメーター(1)～(15)を満たすペプチドを生成し得る。
したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載のペプチドシャトル剤は、以下のアミノ酸配列を含むか又はこれらからなり得る:
(a)[X1]-[X2]-[リンカー]-[X3]-[X4](式1);
(b)[X1]-[X2]-[リンカー]-[X4]-[X3](式2);
(c)[X2]-[X1]-[リンカー]-[X3]-[X4](式3);
(d)[X2]-[X1]-[リンカー]-[X4]-[X3](式4);
(e)[X3]-[X4]-[リンカー]-[X1]-[X2](式5);
(f)[X3]-[X4]-[リンカー]-[X2]-[X1](式6);
(g)[X4]-[X3]-[リンカー]-[X1]-[X2](式7);
(h)[X4]-[X3]-[リンカー]-[X2]-[X1](式8);
(i)[リンカー]-[X1]-[X2]-[リンカー](式9);
(j)[リンカー]-[X2]-[X1]-[リンカー](式10);
(k)[X1]-[X2]-[リンカー](式11);
(l)[X2]-[X1]-[リンカー](式12);
(m)[リンカー]-[X1]-[X2](式13);
(n)[リンカー]-[X2]-[X1](式14);
(o)[X1]-[X2](式15);又は
(p)[X2]-[X1](式16)、
式中、
[X1]は、次記から選択される:2[Φ]-1[+]-2[Φ]-1[ζ]-1[+]-;2[Φ]-1[+]-2[Φ]-2[+]-;1[+]-1[Φ]-1[+]-2[Φ]-1[ζ]-1[+]-;及び1[+]-1[Φ]-1[+]-2[Φ]-2[+]-;
[X2]は、次記から選択される:-2[Φ]-1[+]-2[Φ]-2[ζ]-;-2[Φ]-1[+]-2[Φ]-2[+]-;-2[Φ]-1[+]-2[Φ]-1[+]-1[ζ]-;-2[Φ]-1[+]-2[Φ]-1[ζ]-1[+]-;-2[Φ]-2[+]-1[Φ]-2[+]-;-2[Φ]-2[+]-1[Φ]-2[ζ]-;-2[Φ]-2[+]-1[Φ]-1[+]-1[ζ]-;及び2[Φ]-2[+]-1[Φ]-1[ζ]-1[+]-;
[X3]は、次記から選択される:-4[+]-A-;-3[+]-G-A-;-3[+]-A-A-;-2[+]-1[Φ]-1[+]-A-;-2[+]-1[Φ]-G-A-;-2[+]-1[Φ]-A-A-;又は2[+]-A-1[+]-A;-2[+]-A-G-A;-2[+]-A-A-A-;-1[Φ]-3[+]-A-;-1[Φ]-2[+]-G-A-;-1[Φ]-2[+]-A-A-;-1[Φ]-1[+]-1[Φ]-1[+]-A;-1[Φ]-1[+]-1[Φ]-G-A;-1[Φ]-1[+]-1[Φ]-A-A;-1[Φ]-1[+]-A-1[+]-A;-1[Φ]-1[+]-A-G-A;-1[Φ]-1[+]-A-A-A;-A-1[+]-A-1[+]-A;-A-1[+]-A-G-A;及びA-1[+]-A-A-A;
[X4]は、次記から選択される:-1[ζ]-2A-1[+]-A;-1[ζ]-2A-2[+];-1[+]-2A-1[+]-A;-1[ζ]-2A-1[+]-1[ζ]-A-1[+];-1[ζ]-A-1[ζ]-A-1[+];-2[+]-A-2[+];-2[+]-A-1[+]-A;-2[+]-A-1[+]-1[ζ]-A-1[+];-2[+]-1[ζ]-A-1[+];-1[+]-1[ζ]-A-1[+]-A;-1[+]-1[ζ]-A-2[+];-1[+]-1[ζ]-A-1[+]-1[ζ]-A-1[+];-1[+]-2[ζ]-A-1[+];-1[+]-2[ζ]-2[+];-1[+]-2[ζ]-1[+]-A;-1[+]-2[ζ]-1[+]-1[ζ]-A-1[+];-1[+]-2[ζ]-1[ζ]-A-1[+];-3[ζ]-2[+];-3[ζ]-1[+]-A;-3[ζ]-1[+]-1[ζ]-A-1[+];-1[ζ]-2A-1[+]-A;-1[ζ]-2A-2[+];-1[ζ]-2A-1[+]-1[ζ]-A-1[+];-2[+]-A-1[+]-A;-2[+]-1[ζ]-1[+]-A;-1[+]-1[ζ]-A-1[+]-A;-1[+]-2A-1[+]-1[ζ]-A-1[+];及び1[ζ]-A-1[ζ]-A-1[+];及び
[リンカー]は次記から選択される:-Gn-;-Sn-;-(GnSn)n-;-(GnSn)nGn-;-(GnSn)nSn-;-(GnSn)nGn(GnSn)n-;及び-(GnSn)nSn(GnSn)n-;
式中、[Φ]はアミノ酸:Leu、Phe、Trp、Ile、Met、Tyr、又はVal、好ましくはLeu、Phe、Trp又はIleであり;[+]は、アミノ酸:Lys又はArgであり;[ζ]は、アミノ酸:Gln、Asn、Thr、又はSerであり;Aはアミノ酸:Alaであり;Gはアミノ酸:Glyであり;Sはアミノ酸:Serであり;nは、1～20、1～19、1～18、1～17、1～16、1～15、1～14、1～13、1～12、1～11、1～10、1～9、1～8、1～7、1～6、1～5、1～4、又は1～3の整数である。
一部の実施形態では、本記載のペプチドシャトル剤は、配列番号1～50、58～78、80～107、109～139、141～146、149～161、163～169、171、174～234、236～240、242～260、262～285、287～294、296～300、302～308、310、311、313～324、326～332、338～342、344、346、348、352、355、356、358～360、362、363、366、369、370、若しくは379のいずれかのアミノ酸配列、又は国際公開第2018/068135号に開示される配列番号104、105、107、108、110～131、133～135、138、140、142、145、148、151、152、169～242、及び243～10242のいずれか1つのアミノ酸配列、若しくはその機能性バリアントと少なくとも50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、若しくは99%同一であるペプチドを含むか又はそれからなり得る。一部の実施形態では、本記載のペプチドシャトル剤は、FSD5、FSD16、FSD18、FSD19、FSD20、FSD22及びFSD23の各ペプチドに見出された、国際公開第2018/068135号の配列番号158及び/又は159のアミノ酸配列モチーフを含み得る。一部の実施形態では、本記載のペプチドシャトル剤は、国際公開第2018/068135号の配列番号159のアミノ酸配列モチーフに機能し得るように連結された国際公開第2018/068135号の配列番号158のアミノ酸配列モチーフを含み得る。本明細書で使用される場合「機能性バリアント」とは、1つ又は複数の保存的アミノ酸置換によって参照ペプチドと異なる、カーゴ形質導入活性を有するペプチドを指す。本明細書において機能性バリアントの文脈で使用される場合、「保存的アミノ酸置換」とは、1つのアミノ酸残基が類似の側鎖を有する別のアミノ酸残基で置き換えられるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において十分に定義されており、塩基性側鎖(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、及び場合によりプロリン)、ベータ-分枝側鎖(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)及び芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)が含まれる。
一部の実施形態では、本記載のペプチドシャトル剤は、国際公開第2018/068135号の配列番号57～59、66～72、又は82～102のいずれか1つのアミノ酸配列の1つ又は複数を含まない。一部の実施形態では、本記載のペプチドシャトル剤は、国際公開第2018/068135号に開示される配列番号104、105、107、108、110～131、133～135、138、140、142、145、148、151、152、169～242、及び243～10242のいずれか1つのアミノ酸配列の1つ又は複数を含まない。むしろ、一部の実施形態では、本記載のペプチドシャトル剤は、このような先に記載されたシャトル剤ペプチドのバリアントに関することができ、バリアントは、改善された形質導入活性(すなわち、より確実に核タンパク質カーゴを形質導入することができる)のために更に操作される。
一部の実施形態では、本記載のペプチドシャトル剤は、真核細胞モデル系(例えば、不死化された真核細胞株)又はモデル生物において測定した場合、「代理」カーゴについての形質導入効率及び/又はカーゴ送達スコアの最小閾値を有し得る。「形質導入効率」という表現は、例えば、フローサイトメトリー、免疫蛍光顕微鏡法、及びカーゴ形質導入効率を評価するために使用することができる他の適切な方法(例えば、国際公開第2018/068135号に記載される)によって決定することができる、目的のカーゴが細胞内に送達される標的細胞集団のパーセンテージ又は比率を指す。一部の実施形態では、形質導入効率は、カーゴ陽性細胞のパーセンテージとして表され得る。一部の実施形態では、形質導入効率は、カーゴ及びシャトル剤の非存在下(「無処理」;NT)又はシャトル剤の非存在下(「カーゴ単独」)を除き、同一の条件下で評価された適切な陰性対照に対して倍増(又は倍減)として表され得る。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるシャトル剤は、
(i)配列番号1～50、58～78、80～107、109～139、141～146、149～161、163～169、171、174～234、236～240、242～260、262～285、287～294、296～300、302～308、310、311、313～324、326～332、338～342、344、346、348、352、355、356、358～360、362、363、366、369、370、若しくは379のいずれか1つのアミノ酸配列;
(ii)1、2、3、4、5、6、7、8、9、若しくは10個以下のアミノ酸によって配列番号1～50、58～78、80～107、109～139、141～146、149～161、163～169、171、174～234、236～240、242～260、262～285、287～294、296～300、302～308、310、311、313～324、326～332、338～342、344、346、348、352、355、356、358～360、362、363、366、369、370、若しくは379のいずれか1つと異なるアミノ酸配列(例えば、リンカードメインを除く);
(iii)配列番号1～50、58～78、80～107、109～139、141～146、149～161、163～169、171、174～234、236～240、242～260、262～285、287～294、296～300、302～308、310、311、313～324、326～332、338～342、344、346、348、352、355、356、358～360、362、363、366、369、370、若しくは379のいずれか1つと少なくとも50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、若しくは99%同一であるアミノ酸配列(例えば、リンカードメイン若しくはグリシン/セリンリッチ隣接ドメインを除いて計算される);
(iv)保存的アミノ酸置換のみによって(例えば、好ましくは、リンカードメイン若しくはグリシン/セリンリッチ隣接ドメインを除く、1、2、3、4、5、6、7、8、9、若しくは10個以下の保存的アミノ酸置換によって)配列番号1～50、58～78、80～107、109～139、141～146、149～161、163～169、171、174～234、236～240、242～260、262～285、287～294、296～300、302～308、310、311、313～324、326～332、338～342、344、346、348、352、355、356、358～360、362、363、366、369、370、若しくは379のいずれか1つと異なるアミノ酸配列であって、それぞれの保存的アミノ酸置換が、同じアミノ酸クラス内のアミノ酸から選択され、アミノ酸クラスが、脂肪族:G、A、V、L、及びI;ヒドロキシル若しくは硫黄/セレン含有:S、C、U、T、及びM;芳香族:F、Y、及びW;塩基性:H、K、及びR;酸性及びそのアミド:D、E、N、及びQである、アミノ酸配列;又は
(v)(i)～(iv)の任意の組合せ
を含む、又はそれからなる。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるシャトル剤は、好ましくは、細胞膜透過性ドメインを欠く、又はエンドソーム漏出ドメインに融合された細胞膜透過性ドメインを欠く第2世代のシャトル剤である。一部の実施形態では、核タンパク質カーゴの送達にとって特に好適な本明細書に記載されるシャトル剤は、好ましくは、高い送達スコアよりも相対的に高い形質導入効率を有するものであり、これは、シャトル剤がより高いパーセンテージの細胞にカーゴを送達する(細胞当たりのカーゴ分子の総数が多い代わりに)ことを意味する。実際、細胞内に送達された過剰のCRISPR-Casゲノム編集複合体は、オフターゲット効果の確率を増大させ得る。一部の実施形態では、本明細書に記載されるシャトル剤(及び/又は前記段落において上で引用された配列番号)は、少なくとも20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、又は75%のPI+細胞の平均%又はGFP+細胞の平均%を有する図9に列挙されるものである。
一部の実施形態では、本明細書に記載のシャトル剤は、合成ペプチドシャトル剤のバリアントを含むか、又はそれからなり、バリアントは、少なくとも1個のアミノ酸が、置き換えられるアミノ酸と類似する物理化学的特性(例えば、構造、疎水性、又は電荷)の側鎖を有する対応する合成アミノ酸で置き換えられることを除いて、本明細書で定義される合成ペプチドシャトル剤と同一であり、バリアントは、合成ペプチドシャトル剤の非存在下と比較して真核細胞中での前記カーゴの細胞質/核送達を増加させる。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるシャトル剤は、本明細書に記載又は言及されるより長い親シャトル剤の断片であって、カーゴ形質導入活性を保持し、正に荷電した親水性の外面と、疎水性の外面との両方を有する両親媒性アルファヘリックスモチーフを含む、断片を含むか、又はそれからなってもよい。一部の実施形態では、本明細書に記載されるシャトル剤は、本明細書に記載又は言及される親シャトル剤のバリアントであって、カーゴ形質導入活性を保持し、親シャトル剤と比較して低いN末端及び/又はC末端の正の電荷密度を有することによって親シャトル剤と異なる(又は唯一異なる)、バリアントを含むか、又はそれからなってもよい。本明細書で使用される場合、「正の電荷密度」とは、ペプチドの長さ当たり、生理的pHで正に荷電した側鎖を有する残基の総数を指す。例えば、3個の連続したアルギニン残基(RRR)は、非カチオン性残基によって遠く隔てられた3個のアルギニン残基(例えば、RARAR)よりも高い電荷密度を有する。一部の実施形態では、K/R等の1つ又は複数のカチオン性残基を、非カチオン性残基、好ましくは、非カチオン性の親水性残基で置換することによって、及び/又は2つの隣接したカチオン性残基間の疎水性残基(例えば、A、V、L、I、F、又はW)を操作することによって、正の電荷密度を減少させることができる。一部の実施形態では、ペプチド中でごく近くにある正電荷残基間の距離を増大させることによって、正の電荷密度を減少させることができる。一部の実施形態では、本明細書に記載されるシャトルペプチド断片若しくはバリアント、又は本明細書に記載される短いシャトル剤は、好ましくは、核タンパク質カーゴによる阻害に対する増大した耐性を有する、及び/又は核タンパク質カーゴに関する増大した形質導入活性を有する。一部の実施形態では、本明細書に記載されるシャトルペプチド断片若しくはバリアント、又は本明細書に記載される短いシャトル剤は、より長い親シャトル剤のC末端トランケーションを含むか、又はそれからなってもよい。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるシャトルペプチド断片若しくはバリアント、又は本明細書に記載される短いシャトル剤は、断片又はバリアントが、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、若しくは50個の非カチオン性の親水性残基に隣接する、又は少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、若しくは50個の非カチオン性の親水性残基に隣接する、正に荷電した親水性の外面と、疎水性の外面との両方を有する「コア」両親媒性アルファヘリックスモチーフを含み得、その結果、カーゴ形質導入活性を保持する、及び/又は核タンパク質カーゴによる、若しくは細胞外DNA/RNAの存在による阻害に対する増大した耐性を有する。
化学修飾及び合成アミノ酸
一部の実施形態では、本記載のシャトル剤は、本明細書に記載されるペプチドのオリゴマー(例えば、二量体、三量体等)を含み得る。このようなオリゴマーは、同じか又は異なるタイプのシャトル剤モノマーを共有結合すること(例えば、ジスルフィド架橋を用いて、モノマー配列に導入されるシステイン残基を連結すること)によって構築することができる。一部の実施形態では、本記載のシャトル剤は、N末端及び/又はC末端のシステイン残基を含み得る。
一部の実施形態では、本記載のシャトル剤は、環状ペプチドを含むか又はそれからなり得る。一部の実施形態では、環状ペプチドは、シャトル剤のN末端に向かって配置された第1の残基と、シャトル剤のC末端に向かって配置された第2の残基との間の共有結合を介して形成され得る。一部の実施形態では、第1及び第2の残基は、シャトル剤のN末端及びC末端に位置する隣接する残基である。一部の実施形態では、第1及び第2の残基は、アミド結合を介して連結されて環状ペプチドを形成することができる。一部の実施形態では、環状ペプチドは、シャトル剤内の2つのシステイン残基間のジスルフィド結合によって形成され得、2つのシステイン残基は、シャトル剤のN末端及びC末端に向かって配置される。一部の実施形態では、シャトル剤は、N末端及びC末端に隣接するシステイン残基を含み、又は含むように操作され得、ジスルフィド結合を介して連結されて環状ペプチドを形成する。一部の実施形態では、本明細書に記載される環状シャトル剤は、分解(例えば、プロテアーゼによる)に対してより耐性であり得、及び/又は対応する直鎖状ペプチドよりも長い半減期を有し得る。
一部の実施形態では、本記載のシャトル剤は、1つ又は複数のD-アミノ酸を含み得る。一部の実施形態では、本記載のシャトル剤は、シャトル剤のN末端及び/又はC末端におけるD-アミノ酸を含み得る。一部の実施形態では、シャトル剤は、D-アミノ酸のみで構成され得る。一部の実施形態では、1つ又は複数のD-アミノ酸を有する本明細書に記載されるシャトル剤は、分解(例えば、プロテアーゼによる)により耐性であり得、及び/又はL-アミノ酸のみで構成される対応するペプチドよりも長い半減期を有し得る。
一部の実施形態では、本記載のシャトル剤は、1つ又は複数のアミノ酸に対する化学的修飾を含み得、化学的修飾は、合成ペプチドシャトル剤の形質導入活性を破壊しない。本明細書で使用される場合、用語「破壊」は、化学修飾が、本明細書に記載されるペプチドシャトル剤のカーゴ形質導入活性を不可逆的に消失させることを意味する。本明細書に記載されるペプチドシャトル剤のカーゴ形質導入活性を一時的に阻害し、減弱し、又は遅延させ得る化学的修飾は、本記載のシャトル剤に対する化学的修飾に含まれ得る。一部の実施形態では、本明細書に記載されるシャトル剤のいずれか1つに対する化学修飾は、シャトル剤のN末端及び/又はC末端であり得る。化学修飾の例としては、アセチル基(例えば、N末端アセチル基)、システアミド基(例えば、C末端システアミド基)、又は脂肪酸(例えば、C4～C16、C6～C14、C6～C12、C6～C8、又はC8脂肪酸、好ましくはN末端である)の付加が挙げられる。
一部の実施形態では、本記載のシャトル剤は、標的真核細胞におけるカーゴ形質導入活性を有するシャトル剤バリアントを含み、バリアントは、少なくとも1つのアミノ酸が、置き換えられるアミノ酸と同様の物理化学的特性(例えば、構造、疎水性、又は電荷)の側鎖を有する対応する合成アミノ酸又はアミノ酸類似体で置き換えられることを除き、本記載のいずれかのシャトル剤と同一である。一部の実施形態では、合成アミノ酸の置き換えは、
(a)α-アミノグリシン、α,γ-ジアミノ酪酸、オルニチン、α,β-ジアミノプロピオン酸、2,6-ジアミノ-4-ヘキシン酸、β-(1-ピペラジニル)-アラニン、4,5-デヒドロキシリジン、δ-ヒドロキシリジン、ω,ω-ジメチルアルギニン、ホモアルギニン、ω,ω'-ジメチルアルギニン、ω-メチルアルギニン、β-(2-キノリル)-アラニン、4-アミノピペリジン-4-カルボン酸、α-メチルヒスチジン、2,5-ジヨードヒスチジン、1-メチルヒスチジン、3-メチルヒスチジン、スピナシン、4-アミノフェニルアラニン、3-アミノチロシン、β-(2-ピリジル)-アラニン、若しくはβ-(3-ピリジル)-アラニンのいずれか1つで塩基性アミノ酸を置き換える;
(b)デヒドロアラニン、β-フルオロアラニン、β-クロロアラニン、β-ヨードアラニン、α-アミノ酪酸、α-アミノイソ酪酸、β-シクロプロピルアラニン、アゼチジン-2-カルボン酸、α-アリルグリシン、プロパルギルグリシン、tert-ブチルアラニン、β-(2-チアゾリル)-アラニン、チアプロリン、3,4-デヒドロプロリン、tert-ブチルグリシン、β-シクロペンチルルアラニン、β-シクロヘキシルアラニン、α-メチルプロリン、ノルバリン、α-メチルバリン、ペニシラミン、β,β-ジシクロヘキシルアラニン、4-フルオロプロリン、1-アミノシクロペンタンカルボン酸、ピペコリン酸、4,5-デヒドロロイシン、アロイソロイシン、ノルロイシン、α-メチルロイシン、シクロヘキシルグリシン、シス-オクタヒドロインドール-2-カルボン酸、β-(2-チエニル)-アラニン、フェニルグリシン、α-メチルフェニルアラニン、ホモフェニルアラニン、1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-3-カルボン酸、β-(3-ベンゾチエニル)-アラニン、4-ニトロフェニルアラニン、4-ブロモフェニルアラニン、4-tert-ブチルフェニルアラニン、α-メチルトリプトファン、β-(2-ナフチル)-アラニン、β-(1-ナフチル)-アラニン、4-ヨードフェニルアラニン、3-フルオロフェニルアラニン、4-フルオロフェニルアラニン、4-メチルトリプトファン、4-クロロフェニルアラニン、3,4-ジクロロ-フェニルアラニン、2,6-ジフルオロ-フェニルアラニン、n-イン-メチルトリプトファン、1,2,3,4-テトラヒドロノルハルマン-3-カルボン酸、β,β-ジフェニルアラニン、4-メチルフェニルアラニン、4-フェニルフェニルアラニン、2,3,4,5,6-ペンタフルオロ-フェニルアラニン、若しくは4-ベンゾイルフェニルアラニンのいずれか1つで非極性(疎水性)アミノ酸を置き換える;
(c)β-シアノアラニン、β-ウレイドアラニン、ホモシステイン、アロ-スレオニン、ピログルタミン酸、2-オキソチアゾリジン-4-カルボン酸、シトルリン、チオシトルリン、ホモシトルリン、ヒドロキシプロリン、3,4-ジヒドロキシフェニルアラニン、β-(1,2,4-トリアゾール-1-イル)-アラニン、2-メルカプトヒスチジン、β-(3,4-ジヒドロキシフェニル)-セリン、β-(2-チエニル)-セリン、4-アジドフェニルアラニン、4-シアノフェニルアラニン、3-ヒドロキシメチルチロシン、3-ヨードチロシン、3-ニトロチロシン、3,5-ジニトロチロシン、3,5-ジブロモチロシン、3,5-ジヨードチロシン、7-ヒドロキシ-1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-3-カルボン酸、5-ヒドロキシトリプトファン、チロニン、β-(7-メトキシクマリン-4-イル)-アラニン、若しくは4-(7-ヒドロキシ-4-クマリニル)-アミノ酪酸のいずれか1つで極性の非荷電アミノ酸を置き換える;及び/又は
(d)γ-ヒドロキシグルタミン酸、γ-メチレングルタミン酸、γ-カルボキシグルタミン酸、α-アミノアジピン酸、2-アミノヘプタン二酸、α-アミノスベリン酸、4-カルボキシフェニルアラニン、システイン酸、4-ホスホノフェニルアラニン、若しくは4-スルホメチルフェニルアラニンのいずれか1つで酸性アミノ酸を置き換える。
ヒスチジンリッチドメイン
いくつかの実施形態では、本記載のシャトル剤は、1つ又は複数のヒスチジンリッチドメインを更に含み得る。いくつかの実施形態では、ヒスチジンリッチドメインは、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%又は少なくとも90%のヒスチジン残基を含む、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個又は少なくとも6個のアミノ酸のストレッチであり得る。いくつかの実施形態では、ヒスチジンリッチドメインは、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個 少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個又は少なくとも9個の連続するヒスチジン残基を含み得る。理論に束縛されるものではないが、ELDに作動可能に連結されたCPDを含む第1世代のシャトル剤の文脈において、シャトル剤中のヒスチジンリッチドメインは、エンドソームの酸性条件下での、そのイミダゾール基のプロトン化によって、エンドソームにおいて、プロトンスポンジとして作用し得、エンドソーム膜不安定化の別の機序を提供し、したがって、エンドソームにより捕捉されたカーゴが、サイトゾルに到達する能力を更に促進する。いくつかの実施形態では、ヒスチジンリッチドメインは、ペプチドシャトル剤のN及び/又はC末端に位置し得る又はN及び/又はC末端を向いて位置し得る。
リンカー
いくつかの実施形態では、本記載のペプチドシャトル剤は、1つ又は複数の好適なリンカー(例えば、フレキシブルポリペプチドリンカー)を含み得る。一部の実施形態では、そのようなリンカーは、2つ以上の両親媒性アルファヘリックスモチーフ(例えば、国際公開第2018/068135号の図49D中のシャトル剤FSD18を参照されたい)、又は別のモチーフに由来するコア両親媒性カチオン性モチーフを離れさせ得る。いくつかの実施形態では、リンカーを用いて、更に2つのドメイン(CPD、ELD、又はヒスチジンリッチドメイン)を相互から分離できる。いくつかの実施形態では、リンカーは、回転能力を有する又は有さない小さい疎水性アミノ酸(グリシン等)及び安定性及び可動性を付与する極性セリン残基の配列を付加することにより形成され得る。リンカーは、柔らかく、シャトル剤のドメインが動くのを可能にし得る。いくつかの実施形態では、プロリンは、大きな立体構造剛性を付加する場合があるので回避され得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、セリン/グリシンリッチリンカーであり得る。いくつかの実施形態では、適したリンカーを含むシャトル剤の使用は、カーゴを、付着細胞ではなく懸濁細胞に送達するために有利であり得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、-Gn-;-Sn-;-(GnSn)n-;-(GnSn)nGn-;-(GnSn)nSn-;-(GnSn)nGn(GnSn)n-;又は-(GnSn)nSn(GnSn)n-を含む又はこれらからなり、Gはアミノ酸Glyであり;Sはアミノ酸Serであり、nは1～5の整数である。一部の実施形態では、フレキシブル及び/又は親水性アミノ酸の短いストレッチ又は「リンカー」(例えば、グリシン/セリンリッチストレッチ)は、本明細書に記載されるシャトル剤若しくはコアアルファヘリックス両親媒性カチオン性ドメインのN末端、C末端、若しくはN末端とC末端との両方、又は本明細書に記載されるC末端トランケートされたシャトル剤に付加され得る。一部の実施形態では、そのようなストレッチは、そうでなければ不溶性であるか、又は水性溶液中で部分的にのみ可溶性である、シャトル剤、特に、より短いシャトル剤(例えば、強い疎水性の部分を有する両親媒性アルファヘリックス構造を有する)の分解を促進し得る。一部の実施形態では、シャトル剤ペプチドの溶解度の増大は、カーゴ形質導入結果を曖昧にし得る、及び/又はシャトル剤を治療適用にとって不適合にし得る有機溶媒(例えば、DMSO)の使用を回避し得る。一部の実施形態では、中央コアアルファヘリックス両親媒性カチオン性ドメインに隣接するフレキシブルリンカーの存在は、核タンパク質及び/又は細胞外DNA/RNAによる阻害に対するシャトル剤の耐性の増強を提供し得る。
ドメインに基づくペプチドシャトル剤
一部の態様では、本明細書に記載されるシャトル剤は、国際公開第2016/161516号に記載される第1世代のシャトル剤であり得、細胞膜透過性ドメイン(CPD)に作動可能に連結されたエンドソーム漏出ドメイン(ELD)を含む。
エンドソーム漏出ドメイン(ELD)
いくつかの態様では、本記載のペプチドシャトル剤は、エンドソーム溶解活性を有するエンドソーム漏出ドメイン(ELD)を含み得る。本明細書で使用される場合、表現「エンドソーム漏出ドメイン」は、エンドソームにより捕捉されたカーゴに、細胞質区画に到達する能力を付与するアミノ酸の配列を指す。理論に束縛されるものではないが、エンドソーム漏出ドメインは、短い配列(ウイルス又は細菌ペプチドに由来することが多い)であり、これは、エンドソーム膜の不安定化及びエンドソーム内容物の細胞質への放出を誘導すると考えられている。本明細書で使用される場合、表現「エンドソーム溶解性」又は「エンドソーム溶解性ペプチド」は、エンドソーム膜不安定化特性を有するペプチドのこの全般的なクラスを指すものとする。したがって、いくつかの実施形態では、本記載の合成ペプチド又はポリペプチドベースのシャトル剤は、エンドソーム溶解性ペプチドであるELDを含み得る。このようなペプチドの活性は、例えば、国際公開第2016/161516号の実施例2に記載されるカルセインエンドソーム脱出アッセイを使用して評価され得る。
いくつかの実施形態では、ELDは、pH依存性膜活性ペプチド(PMAP)又はpH依存性溶解性ペプチド等の酸性pHで膜を破壊するペプチドであり得る。例えば、ペプチドGALA及びINF-7は、pHの低下が、それらが含有するアミノ酸の電荷を修飾する場合にアルファヘリックスを形成する両親媒性ペプチドである。理論に束縛されるものではないが、より詳しくは、GALA等のELDは、pHの低減によるコンホメーション変化後に、膜脂質の細孔及びフリップフロップの形成によって、エンドソーム漏出を誘導することが示唆される(Kakudo et al., 2004; Li et al., 2004)。対照的に、INF-7等のELDは、エンドソーム膜中に蓄積すること及びそれを不安定化することによって、エンドソーム漏出を誘導することが示唆されている(El-Sayed et al., 2009)。したがって、エンドソーム成熟の過程で、同時に起こるpHの低下が、ペプチドの構造の変化を引き起こし、これが、エンドソーム膜を不安定化し、エンドソーム内容物の放出につながる。同一原理が、シュードモナスの毒素Aに当てはまると考えられる(Varkouhi et al., 2011)。pHの低下後、毒素のトランスロケーションドメインの構造が変化し、細孔が形成されたエンドソーム膜へのその挿入が可能となる(London, 1992; O'Keefe, 1992)。これは最終的に、エンドソーム不安定化をもたらし、エンドソームの外側へ複合体を移動させる。上記のELDは、本記載のELD並びにその作用機序が十分に明らかにされ得ないエンドソーム漏出のその他の機序内に包含される。
いくつかの実施形態では、ELDは、直鎖状カチオン性アルファヘリックス抗菌性ペプチド(AMP)等の抗菌性ペプチド(AMP)であり得る。これらのペプチドは、細菌膜と強力に相互作用するその能力のために自然免疫応答において、重要な役割を果たす。理論に束縛されるものではないが、これらのペプチドは、水溶液中で無秩序な状態をとるが、疎水性環境においては、アルファヘリックス二次構造をとると考えられる。後者の構造は、通常の濃度依存性膜破壊特性に寄与すると考えられる。エンドソーム中に特定の濃度で蓄積すると、一部の抗菌ペプチドは、エンドソーム漏出を誘導し得る。
いくつかの実施形態では、ELDは、セクロピン-A/メリチンハイブリッド(CM)ペプチド等の抗菌性ペプチド(AMP)であり得る。このようなペプチドは、膜破壊能力を有する、最小の最も有効なAMP由来ペプチドの中1つであると考えられる。セクロピンは、グラム陽性及びグラム陰性菌の両方に対して膜撹乱能を有する抗菌ペプチドのファミリーである。セクロピンA(CA)、第1の特定された抗菌ペプチドは、直鎖状構造を有する37個のアミノ酸から構成される。メリチン(M)、26個のアミノ酸のペプチドは、ハチ毒において、見られる細胞膜溶解性因子である。セクロピン-メリチンハイブリッドペプチドは、どの抗菌剤においても望ましい特性である、真核細胞に対する細胞毒性を有さない(すなわち、非溶血性の)短い効率的な抗生物質ペプチドを生成するとわかっている。これらのキメラペプチドは、セクロピンAの親水性N末端ドメインの、メリチンの疎水性N末端ドメインとの種々の組合せから構築され、細菌モデル系で試験されてきた。2つの26マー、CA(1-13)M(1-13)及びCA(1-8)M(1-18)(Boman et al., 1989)が、メリチンの細胞傷害性効果を伴わずに、天然セクロピンAのより広範な、改善された効力を実証するとわかっている。
より短いCMシリーズペプチドを製造しようとする試みでは、Andreuら、1992の著者は、26マー(CA、1-8)M、1-18等のハイブリッドペプチドを構築し、それらを、20マー(CA、1-8)M、1-12、18マー(CA、1-8)M、1-10並びに6種の15マー(CA(1-7)M(1-8)、CA(1-7)M(2-9)、CA(1-7)M(3-10)、CA(1-7)M(4-11)、CA(1-7)M(5-12)及びCA、1-7)M、6-13と比較した。20及び18マーは、CA(1-8)M(1-18)と比較して同様の活性を維持した。6種の15マーの中でも、CA(1-7)M(1-8)は、低い抗菌活性を示したが、その他の5種は、溶血性効果を有さない26マーと比較して、同様の抗生物質効力を示した。したがって、いくつかの実施形態では、本記載の合成ペプチド又はポリペプチドベースのシャトル剤は、上記のもの等のCMシリーズペプチドバリアントであるか、又はそれに由来するELDを含み得る。
いくつかの実施形態では、ELDは、メリチン(YGRKKRRQRRR)の残基2～12と融合している、セクロピン-A(KWKLFKKIGAVLKVLTTG)の残基1～7から構成されるCMシリーズペプチドCM18であり得る[C(1-7)M(2-12)]CM18は、細胞膜透過性ペプチドTATと融合される場合には、独立に細胞膜を越え、エンドソーム膜を不安定化し、一部のエンドソームにより捕捉されたカーゴが、サイトゾルに放出されることを可能にする(Salomone et al.,2012)。しかし、著者の実験の一部における、フルオロフォア(atto-633)と融合されたCM18-TAT11ペプチドの使用は、フルオロフォア自体の使用が、例えば、エンドソーム膜の光化学的破壊によるエンドソーム溶解(endosomolysis)に寄与するとわかったので(Erazo-Oliveras et al., 2014)、フルオロフォアに対するペプチドの寄与についての不確実性を強める。
いくつかの実施形態では、ELDは、国際公開第2016/161516号の配列番号1のアミノ酸配列を有するCM18、又は国際公開第2016/16516号の配列番号1に対して少なくとも70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、85%、90%、91%、92%、93%、94%若しくは95%の同一性を有し、エンドソーム溶解活性を有するそのバリアントであり得る。
いくつかの実施形態では、ELDは、エンドソーム中に蓄積するとエンドソーム膜不安定化を引き起こし得る、インフルエンザ血球凝集素(HA)のHA2サブユニットのN末端に由来するペプチドであり得る。
いくつかの実施形態では、本記載の合成ペプチド又はポリペプチドベースのシャトル剤は、表Iに示されるELDであるか、又はそれに由来するELD、又はエンドソーム脱出活性及び/若しくはpH依存性膜破壊活性を有するそのバリアントを含み得る。
いくつかの実施形態では、本記載のシャトル剤は、1種又は複数のELD又はELDのタイプを含み得る。より詳しくは、それらは、少なくとも2種、少なくとも3種、少なくとも4種、少なくとも5種又はそれ多くのELDを含み得る。いくつかの実施形態では、シャトル剤は、1～10種のELD、1～9種のELD、1～8種のELD、1～7種のELD、1～6種のELD、1～5種のELD、1～4種のELD、1～3種のELD等を含み得る。
いくつかの実施形態では、本記載のシャトル剤内のその他のドメイン(CPD、ヒスチジンリッチドメイン)に対するELDの順序又は配置は、シャトル剤の折返し輸送能力が保持される限り変わってもよい。
いくつかの実施形態では、ELDは、表I中に列挙されるいずれか1種のバリアント又は断片であり、エンドソーム溶解活性を有し得る。いくつかの実施形態では、ELDは、国際公開第2016/16516号の配列番号1～15、63若しくは64のいずれか1種のアミノ酸配列又は国際公開第2016/16516号の配列番号1～15、63若しくは64のいずれか1種に対して少なくとも70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、85%、90%、91%、92%、93%、94%若しくは95%同一であり、エンドソーム溶解活性を有する配列を含み得る、又はそれからなり得る。
いくつかの実施形態では、本記載のシャトル剤は、国際公開第2016/16516号の配列番号1～15、63、又は64の内のいずれか1つの配列番号の内の1つ又は複数のアミノ酸配列を含まない。
細胞浸透ドメイン(CPD)
いくつかの態様では、本記載のシャトル剤は、細胞浸透ドメイン(CPD)を含み得る。本明細書で使用される場合、表現「細胞浸透ドメイン」とは、CPDを含有する高分子(例えば、ペプチド又はタンパク質)に、細胞に形質導入される能力を付与するアミノ酸の配列を意味する。
いくつかの実施形態では、CPDは、細胞膜透過性ペプチド又は細胞膜透過性ペプチドのタンパク質形質導入ドメインであり得る(又は由来し得る)。細胞膜透過性ペプチドは、様々なカーゴ(例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、小分子化合物又はそうでなければ膜不透過性であるその他の高分子/化合物)を細胞内にうまく送達するためのキャリアとして機能し得る。細胞膜透過性ペプチドは、塩基性アミノ酸に富み、高分子と融合される(又は、そうではなく作動可能に連結される)と、細胞内への内部移行を媒介する短いペプチドを含むことが多い(Shaw et al., 2008)。最初の細胞膜透過性ペプチドは、転写のHIV-1トランスアクチベーター(Tat)タンパク質の細胞浸透能力を解析することにより特定された(Green and Loewenstein 1988, Vives et al., 1997)。このタンパク質は、その細胞膜内への挿入及び細孔の形成を促進する「TAT」と名付けられた短い親水性アミノ酸配列を含有する。この発見以来、多数のその他の細胞膜透過性ペプチドが報告されてきた。この関連で、いくつかの実施形態では、CPDは、表IIに記載されるような細胞膜透過性ペプチド又は細胞膜透過性活性を有するそのバリアントであり得る。
理論に束縛されるものではないが、細胞膜透過性ペプチドは、細胞膜と相互作用し、その後、ピノサイトーシス又はエンドサイトーシスによって、細胞膜を通過すると考えられる。TATペプチドの場合には、その親水性及び電荷は、その細胞膜内の挿入及び細孔の形成を促進すると考えられる(Herce and Garcia 2007)。疎水性ペプチド内のアルファヘリックスモチーフ(例えば、SP)も、細胞膜内に細孔を形成すると考えられる(Veach et al., 2004)。
いくつかの実施形態では、本記載のシャトル剤は、1種若しくは複数のCPD又はCPDのタイプを含み得る。より詳しくは、それらは、少なくとも2種、少なくとも3種、少なくとも4種又は少なくとも5種又はそれより多いCPDを含み得る。いくつかの実施形態では、シャトル剤は、1から10種の間のCPD、1から6種の間のCPD、1から5種の間のCPD、1から4種の間のCPD、1から3種の間のCPD等を含み得る。
いくつかの実施形態では、CPDは、国際公開第2016/16516号の配列番号17のアミノ酸配列を有するTAT、又は国際公開第2016/16516号の配列番号17に対して少なくとも70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%若しくは95%の同一性を有し、細胞膜透過性活性を有するそのバリアント、或いは国際公開第2016/16516号の配列番号18のアミノ酸配列を有するペネトラチン、又は国際公開第2016/16516号の配列番号18に対して少なくとも70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%若しくは95%の同一性を有し、細胞膜透過性活性を有するそのバリアントであり得る。
いくつかの実施形態では、CPDは、国際公開第2016/16516号の配列番号65のアミノ酸配列を有するPTD4、又は国際公開第2016/16516号の配列番号65に対して少なくとも70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%若しくは95%の同一性を有するそのバリアントであり得る。
いくつかの実施形態では、本記載のシャトル剤内のその他のドメイン(ELD、ヒスチジンリッチドメイン)に対するCPDの順序又は配置は、シャトル剤の折返し形質導入能力が保持される限り変わってよい。
いくつかの実施形態では、CPDは、表IIに記載されるいずれか1種のバリアント又は断片であり、細胞膜透過性活性を有し得る。いくつかの実施形態では、CPDは、国際公開第2016/16516号の配列番号16～27若しくは65のいずれか1種のアミノ酸配列又は国際公開第2016/16516号の配列番号16～27若しくは65のいずれか1種に対して少なくとも70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、85%、90%、91%、92%、93%、94%若しくは95%同一であり、細胞膜透過性活性を有する配列を含み得る、又はからなり得る。
いくつかの実施形態では、本記載のシャトル剤は、国際公開第2016/16516号の配列番号16～27又は65の内の1つ又は複数のアミノ酸配列を含まない。
方法、キット、使用、組成物、及び細胞
一部の実施形態では、本記載は、標的真核細胞の細胞外空間から細胞質及び/又は核にカーゴを送達するための方法に関する。方法は、シャトル剤の非存在下と比較して、標的真核細胞を、前記カーゴの形質導入効率を増加させるのに十分な濃度で、シャトル剤の存在下でカーゴと接触させる工程を含む。一部の実施形態では、シャトル剤の存在下での標的真核細胞とカーゴの接触は、前記シャトル剤の非存在下と比較して、少なくとも3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、20、30、40、50、又は100倍だけ前記カーゴの形質導入効率の増加をもたらす。一部の実施形態では、本明細書に記載される組成物中のカーゴ及び/又は合成ペプチドシャトル剤の濃度は、少なくとも1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、又は40μMであり得る。
一部の実施形態では、本記載は、標的真核細胞の細胞質及び/又は核へのカーゴの形質導入効率を増加させるための方法に関する。本明細書で使用される場合、表現「形質導入効率の増加」とは、目的のカーゴが細胞内に送達される標的細胞集団のパーセンテージ又は比率を改善する、本記載のシャトル剤の能力を指す。免疫蛍光顕微鏡法、フローサイトメトリー、及び他の適切な方法を用いて、カーゴ形質導入効率を評価することができる。一部の実施形態では、本記載のシャトル剤は、例えば、免疫蛍光顕微鏡法、フローサイトメトリー、FACS、及び他の適切な方法によって測定した場合、少なくとも25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、又は85%の形質導入効率を可能にすることができる。一部の実施形態ではて、本記載のシャトル剤は、例えば、国際公開第2018/068135号の実施例3.3aに記載されたアッセイによって、又は当該技術分野において公知である別の適切なアッセイによって測定した場合、少なくとも25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%又は95%の細胞生存率と共に、前述の形質導入効率のうちの1つを可能にし得る。
標的細胞形質導入効率を増加させることに加えて、本記載のシャトル剤は、目的のカーゴの標的細胞の細胞質及び/又は核への送達を容易にし得る。この点に関して、ペプチドを使用して標的細胞の細胞質及び/又は核に細胞外カーゴを効率的に送達させることは困難であり得る。これは、カーゴが、しばしば、細胞膜を通過した後、細胞内エンドソームにトラップされるようになるためであり、その細胞内利用可能性を制限し、その最終的な代謝分解をもたらす可能性があるからである。例えば、HIV-1 Tatタンパク質由来のタンパク質形質導入ドメインの使用は、カーゴを細胞内小胞に大量に隔離する結果となることが報告されている。一部の態様では、本記載のシャトル剤は、エンドソームでトラップされたカーゴがエンドソームからエスケープし、細胞質コンパートメントへのアクセスを得る能力を促進し得る。この点に関し、例えば、「カーゴの細胞質への形質導入効率を増加させる」という語句における「細胞質へ」という表現は、本記載のシャトル剤が、細胞内に送達された目的のカーゴがエンドソームの閉じ込めからエスケープされ、細胞質及び/又は核コンパートメントへのアクセスを得ることを可能にする能力を指すことが意図される。目的のカーゴが細胞質へのアクセスを得た後、それは細胞内標的(例えば、細胞質、核、核小体、ミトコンドリア、ペルオキシソーム内)に自由に結合することができる。一部の実施形態では、したがって、「細胞質へ」という表現は、細胞質への送達だけでなく、最初にカーゴが細胞質コンパートメントへのアクセスを得ることを必要とする他の細胞内コンパートメントへの送達も含むことが意図される。
一部の実施形態では、本記載の方法は、インビトロ方法(例えば、治療目的及び/又は診断目的のため)である。他の実施形態では、本記載の方法は、インビボ方法(例えば、治療目的及び/又は診断目的のため)である。一部の実施形態では、本記載の方法は、カーゴ及び合成ペプチドシャトル剤の局所、経腸/消化管(例えば、経口)、又は非経口投与を含む。一部の実施形態では、本明細書には、カーゴ及び合成ペプチドシャトル剤の局所、経腸/消化管(例えば、経口)、又は非経口投与のために製剤化された組成物が記載される。
一部の実施形態では、本記載の方法は、標的真核細胞を、本明細書に定義されるシャトル剤又は組成物、及びカーゴと接触させる工程を含み得る。一部の実施形態では、シャトル剤、又は組成物は、標的真核細胞をその混合物に曝露する前に、カーゴと予めインキュベートして混合物を形成することができる。一部の実施形態では、シャトル剤のタイプは、細胞内に送達されるカーゴの同一性及び/又は物理化学的特性に基づいて選択され得る。他の実施形態では、シャトル剤のタイプは、細胞内に送達されるカーゴの同一性及び/又は物理化学的特性、細胞のタイプ、組織のタイプ等を考慮に入れるように選択され得る。
一部の実施形態では、方法は、シャトル剤、又は組成物による標的細胞の複数の処理(例えば、1日当たり1、2、3、4回以上、及び/又は所定のスケジュール)を含み得る。このような場合、シャトル剤又は組成物のより低い濃度が望ましい場合がある(例えば、毒性を低減するため)。一部の実施形態では、細胞は、懸濁細胞又は接着細胞であり得る。一部の実施形態では、当業者は、シャトル、ドメイン、使用、及び方法の異なる組合せを用いて、所望の生存率で特定の細胞にカーゴを送達する特定の必要性に適合するように、本記載の教示を適応させることができる。
一部の実施形態では、本記載の方法は、カーゴを細胞内にインビボで細胞に送達する方法に適用することができる。このような方法は、非経口投与又は組織、臓器、若しくは系への直接注射によって達成することができる。
一部の態様では、本記載の組成物又は合成ペプチドシャトル剤は、標的真核細胞へのカーゴ(例えば、治療的又は生物学的に関連する分子又は薬物)の形質導入効率を増加させるためのインビトロ又はインビボの方法に使用することができ、合成ペプチドシャトル剤又は合成ペプチドシャトル剤バリアントは、合成ペプチドシャトル剤又は合成ペプチドシャトル剤バリアントの非存在下と比較して、標的真核細胞へのカーゴの形質導入効率並びに細胞質送達及び/又は核送達を増加させるのに十分な濃度で使用されるか又は使用のために製剤化される。
一部の実施形態では、本記載の組成物又は合成ペプチドシャトル剤は、治療に使用することができ、合成ペプチドシャトル剤又は合成ペプチドシャトル剤バリアントは、治療的に関連するカーゴを標的真核細胞の細胞質及び/又は核に形質導入し、合成ペプチドシャトル剤又は合成ペプチドシャトル剤バリアントは、合成ペプチドシャトル剤の非存在下と比較して、標的真核細胞へのカーゴの形質導入効率を増加させるのに十分な濃度で使用される(又は使用のために製剤化される)。
一部の態様では、本明細書には、カーゴを標的真核細胞に形質導入するのに使用するための組成物が記載され、組成物は、薬学的に適切な賦形剤と共に製剤化された合成ペプチドシャトル剤を含み、組成物中の合成ペプチドシャトル剤の濃度は、前記合成ペプチドシャトル剤の非存在下と比較して、投与時に前記標的真核細胞へのカーゴの形質導入効率並びに細胞質送達及び/又は核送達を増加させるのに十分である。一部の実施形態では、組成物は、カーゴを更に含む。一部の実施形態では、組成物は、投与又は治療的使用の前に、カーゴと混合され得る。
一部の態様では、本明細書には、治療に使用するための組成物が記載され、組成物は、合成ペプチドシャトル剤によって標的真核細胞に形質導入されるカーゴと共に製剤化された合成ペプチドシャトル剤を含み、組成物中の合成ペプチドシャトル剤の濃度は、前記合成ペプチドシャトル剤の非存在下と比較して、投与時に前記標的真核細胞へのカーゴの形質導入効率並びに細胞質送達及び/又は核送達を増加させるのに十分である。
一部の態様では、(a)真核細胞の細胞質/核コンパートメントへの核タンパク質カーゴの形質導入効率を増大させるのに使用するため;(b)真核細胞中でのゲノム編集、塩基編集、又はプライム編集における使用のため;(c)真核細胞中での遺伝子発現をモジュレートするのに使用するため;(d)核タンパク質カーゴが真核細胞中の治療標的に結合する療法における使用のため;(e)診断剤としての非治療的核タンパク質カーゴを送達するのに使用するため;(f)医薬若しくは診断剤の製造における使用のため;(g)がん(例えば、皮膚がん、基底細胞癌、母斑性基底細胞癌症候群)、炎症若しくは炎症関連疾患(例えば、乾癬、アトピー性皮膚炎、潰瘍性大腸炎、蕁麻疹、ドライアイ疾患、萎縮型若しくは滲出型加齢黄斑変性、指潰瘍、日光角化症、特発性肺線維症)、疼痛(例えば、慢性若しくは急性)、若しくは肺に影響を及ぼす疾患(例えば、嚢胞性線維症、喘息、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、若しくは特発性肺線維症)を治療するのに使用するため;又は(h)(a)～(g)の任意の組合せのための組成物が、本明細書に記載される。
一部の態様では、細胞内送達のためのカーゴ及び前記カーゴから独立しているか、又はそれに共有結合していない合成ペプチドシャトル剤を含む組成物であって、合成ペプチドシャトル剤が、正に荷電した親水性の外面と、疎水性の外面との両方を有する両親媒性アルファヘリックスモチーフを含むペプチドであり、合成ペプチドシャトル剤が、合成ペプチドシャトル剤の非存在下と比較して真核細胞中での前記カーゴの細胞質/核送達を増加させる、組成物が、本明細書に記載される。一部の実施形態では、本明細書に記載される組成物及び/又はシャトル剤は、有機溶媒(例えば、DMSO)を含まないか、又は治療的使用若しくはヒトでの使用にとって好適ではない濃度の有機溶媒を含まない。一部の実施形態では、本明細書に記載されるシャトル剤は、水性溶解度を考慮して有利に設計され、それによって有機溶媒を使用する必要性を除去する。
一部の実施形態では、シャトル剤、又は組成物、及びカーゴは、血清の存在下又は非存在下で標的細胞に曝露され得る。一部の実施形態では、方法は、臨床的又は治療的使用に適切であり得る。
一部の実施形態では、本記載は、標的真核細胞の細胞外空間から細胞質及び/又は核にカーゴを送達させるためのキットに関する。一部の実施形態では、本記載は、標的真核細胞の細胞質へのカーゴの形質導入効率を増加させるためのキットに関する。キットは、シャトル剤、又は本明細書に定義される組成物、及び適切な容器を含み得る。
一部の実施形態では、標的真核細胞は、動物細胞、哺乳動物細胞、又はヒト細胞であり得る。一部の実施形態では、標的真核細胞は、幹細胞(例えば、胚性幹細胞、多能性幹細胞、誘導多能性幹細胞、神経幹細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、末梢血幹細胞)、初代細胞(例えば、筋芽細胞、線維芽細胞)、免疫細胞(例えば、NK細胞、T細胞、樹状細胞、抗原提示細胞)、上皮細胞、皮膚細胞、胃腸細胞、粘膜細胞、又は肺細胞であり得る。一部の実施形態では、標的細胞は、エンドサイトーシスのための細胞装置(すなわち、エンドソームを産生する)を有するものを含む。
一部の実施形態では、本記載は、本明細書に定義される合成ペプチドシャトル剤を含む単離された細胞に関する。一部の実施形態では、細胞は、多能性幹細胞であり得る。しばしばDNAトランスフェクションに耐性であるか又はそれに適さない細胞は、本記載の合成ペプチドシャトル剤の興味深い候補であり得ることが理解される。
合成ペプチドシャトル剤は、不応性気道上皮細胞への組換えタンパク質カーゴの効率的な送達を可能にすることが示されている(Krishnamurthyら、2018)。特に、呼吸器疾患(例えば、嚢胞性線維症)を有する対象における粘液/唾液は、DNAが上昇していることが知られており(Chanceら、2020)、これは一部の合成ペプチドシャトル剤に対する阻害効果を有し得る。一部の態様では、粘液産生膜(例えば、気道上皮)を渡る非アニオン性カーゴの送達における使用のための、又は使用にとって好適な合成ペプチドシャトル剤であって、フレキシブルリンカードメインにN及びC末端で隣接する、シャトル剤活性を有する中央コア両親媒性アルファヘリックス領域を含むか、又はそれから本質的になり、フレキシブルリンカードメインの一方又は両方が、十分な数の非カチオン性の親水性残基を含むか、又はそれから本質的になり、その結果、合成ペプチドシャトル剤の粘液産生膜を渡るカーゴ形質導入活性がフレキシブルリンカードメインを欠く中央コア両親媒性アルファヘリックス領域のものと比較して増大している、合成ペプチドシャトル剤が本明細書に記載される。一部の実施形態では、中央コア両親媒性アルファヘリックス領域は、(a)エンドソーム溶解性ペプチドであり得る;(b)少なくとも8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、若しくは19アミノ酸長であり得る;(c)請求項14(a)若しくは15で定義される親シャトル剤の断片であり得る;(d)請求項18から29若しくは49から60のいずれか一項で定義される両親媒性ヘリックスであり得る;(e)少なくとも3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、若しくは5.5の疎水性モーメント(μH)を有し得る;又は(f)(a)～(e)の任意の組合せであり得る。一部の実施形態では、非カチオン性の親水性残基は、グリシン、セリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、チロシン、スレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミン、又はその任意の組合せを含むか、又はそれから本質的になってもよい。一部の実施形態では、フレキシブルリンカードメインは、本明細書で定義される任意のリンカードメインである。
(実施例1)
材料及び方法
本明細書に記載も特定もされていない全ての材料及び方法は、一般的には、国際公開第2018/068135号、CA 3,040,645、国際公開第2020/210916号、又はPCT/CA2021/051458で実施された通りであった。本明細書の実施例で使用される材料及び試薬は、表IIIに示される。全ての細胞株を、表IVに示されるように、製造業者の使用説明書に従って増殖させた。
ヘリカルホイール投影図及び3Dペプチドイメージの生成
図1中の合成ペプチドシャトル剤のヘリカルホイール投影図イメージを、Don Armstrong及びRaphael Zidovetzkiによって作成されたオンラインヘリカルホイール投影図ツールを使用して生成した(例えば、https://www.donarmstrong.com/cgi-bin/wheel.plで入手可能)。図10において、3Dペプチド構造を、アルファヘリックスコンフォメーションを取るペプチドに関して「fab」コマンド及び「ss=1」アーギュメントを使用してPyMol(Linux Version 2.4.0a0のためのオープンソースバージョン)中で構築した。オリエンテーションを手動で行った。着色を、スクリプトを使用して行い、それにより、様々に変わる色合いの緑は、強い疎水性の残基(Y、W、I、M、L、F)を表し、より暗い緑色は、高度疎水性の残基を表す;青色の残基は、荷電した親水性の残基(K、H、R、E、D)を表す;赤色の残基は、非荷電の親水性の残基(Q、N)を表す;黄色/橙色の残基は、弱い疎水性の残基(G、A、S、T)を表した。
形質導入プロトコール
GFP-NLSの形質導入
10%FBSを含有するDMEM中、実験の前日に96ウェルプレート中にHeLa細胞を播種した(20,000細胞/ウェル)。合成ペプチドシャトル剤(10～30μM)及びGFP-NLS(10μM)を含む各送達混合物を調製し、RPMI 1640培地で50μLに達成させた。細胞をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で1回洗浄し、シャトル/GFP-NLS混合物を細胞に添加し、5分間インキュベートした。次に、10%FBSを含有する100μLのDMEMを混合物に添加した。直後に、細胞をPBSで1回洗浄し、10%FBSを含有するDMEM中で2時間インキュベートした。次いで、細胞をフローサイトメトリーによって分析した。
PIの形質導入
10%FBSを含有するDMEM中、実験の前日に96ウェルプレート中にHeLa細胞を播種した(20,000細胞/ウェル)。合成ペプチドシャトル剤(10～30μM)及びヨウ化プロピジウム(PI)(10μg/mL)を含む各送達混合物を調製し、PBSで50μLに達成させた。細胞をPBSで1回洗浄し、シャトル/PI混合物を細胞に添加し、1分間インキュベートした。次に、10%FBSを含有する100μLのDMEMを混合物に添加した。直後に、細胞をPBSで1回洗浄し、10%FBSを含有するDMEM中で2時間インキュベートした。次いで、細胞をフローサイトメトリーによって分析した。
Cas9-RNP複合体の存在下でのGFP-NLS形質導入
10%FBSを含有するDMEM中、実験の前日に96ウェルプレート中にHeLa細胞を播種した(20,000細胞/ウェル)。ベータ-2ミクログロブリン(B2M)遺伝子を標的とするcrRNA/tracrRNA(2μM)と複合体化したCas9-NLS組換えタンパク質(2.5μM)と共に、又はそれなしで、合成ペプチドシャトル剤(10～30μM)、GFP-NLS(10μM)を含有する混合物を調製し、PBSで50μLに達成させた。細胞をPBSで1回洗浄し、シャトル/GFP-NLS/Cas9-RNP混合物を細胞に添加し、1分間インキュベートした。次に、10%FBSを含有する100μLのDMEMを混合物に添加した。直後に、細胞をPBSで1回洗浄し、10%FBSを含有するDMEM中で2時間インキュベートした。細胞をフローサイトメトリーによって分析した。
小分子でコーティングされたCas9-RNP複合体の存在下でのGFP-NLS形質導入のプロトコール
10%FBSを含有するDMEM中、実験の前日に96ウェルプレート中にHeLa細胞を播種した(20,000細胞/ウェル)。ベータ-2ミクログロブリン(B2M)遺伝子を標的とするcrRNA/tracrRNA(4μM)と複合体化したCas9-NLS組換えタンパク質(5μM)を、0、100nM、1μM、10μM、100μM、1mM又は10mMの1,3-ジアミノグアニジンモノヒドロクロリド、3,5-ジアミノ-1,2,4-トリアゾール、グアニジンヒドロクロリド又はL-アルギニンアミドジヒドロクロリドのいずれかと混合することによって、小分子でコーティングされたCas9-RNP複合体を調製した。小分子でコーティングされたCas9 RNP複合体を、PBSで25μLに達成させた。小分子でコーティングされた、又はされていないCas9 RNP複合体と共に、又はそれなしで、合成ペプチドシャトル剤(10μM)、GFP-NLS(10μM)を混合することによって、送達混合物を調製し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で50μLに達成させた。細胞をPBSで1回洗浄し、シャトル/GFP-NLS/Cas9-RNP混合物を細胞に添加し、1分間インキュベートした。次に、10%FBSを含有する100μLのDMEMを混合物に添加した。直後に、細胞をPBSで1回洗浄し、10%FBSを含有するDMEM中で2時間インキュベートした。次いで、細胞をフローサイトメトリーによって分析した。
CRISPR Cas9-又はCpf1-RNPの形質導入
形質導入
10%FBSを含有するDMEM中、実験の前日に96ウェルプレート中にHeLa細胞を播種した(10,000細胞/ウェル)。10%FBSを含有するアルファ-MEM中、実験の前日に96ウェルプレート中にCFF-16HBEge細胞を播種した(10,000細胞/ウェル)。
Cpf1-RNP形質導入のために、ベータ-2ミクログロブリン(B2M)遺伝子を標的とするcrRNA(2μM)と複合体化したCpf1-NLS組換えタンパク質(1.33μM)の混合物を、PBSで最終容量50μLに達成させた10～20μMの合成ペプチドシャトル剤と同時インキュベートした。細胞をPBSで1回洗浄し、シャトル/Cpf1-RNP混合物を細胞に添加し、90秒間インキュベートした。次いで、10%FBSを含有する100μLのDMEM(HeLa)又はアルファ-MEM(CFF-16HBEge)を混合物に添加した。直後に、細胞をPBSで1回洗浄し、10%FBSを含有するDMEM(HeLa)又はアルファ-MEM(CFF-16HBEge)中でインキュベートした。
Cas9-RNP又はABE-Cas9-RNP形質導入のために、ベータ-2ミクログロブリン(B2M)遺伝子を標的とするcrRNA/tracrRNA(2μM)と複合体化したCas9-NLS又はABE-Cas9組換えタンパク質(2.5μM)の混合物を、PBSで最終容量50μLに達成させた10～20μMの合成ペプチドシャトル剤と同時インキュベートした。細胞をPBSで1回洗浄し、シャトル/Cas9-RNP複合体を細胞に添加し、60～90秒間インキュベートした。次いで、10%FBSを含有する100μLのDMEM(HeLa)又はアルファ-MEM(CFF-16HBEge)を混合物に添加した。直後に、細胞をPBSで1回洗浄し、10%FBSを含有するDMEM(HeLa)又はアルファ-MEM(CFF-16HBEge)中でインキュベートした。
フローサイトメトリーによるノックアウト分析
細胞表面のB2Mタンパク質の非存在下(ノックアウト)で得られるゲノム編集事象を、形質導入の6日後にフローサイトメトリーによって決定した。細胞をPBSで1回洗浄し、室温で45分間、抗B2ミクログロブリン抗体(PEコンジュゲート化)(50μLの0.5%BSA/PBS中の0.5μLの抗B2M-PE)と共にインキュベートした。細胞をPBSで2回洗浄し、37℃で10分間、50μLのトリプシン-EDTAで分離させた後、10%FBSを含有する100μLの培地を添加することによって不活化した。ノックアウト細胞のパーセンテージ(B2M抗体シグナルを含まない細胞)を、フローサイトメトリーによって決定した。
全ての形質導入実験について、細胞生存率は、別途指摘しない限り75%より上であった。
(実施例2)
合成ペプチドシャトル剤:新しいクラスの細胞内送達ペプチド
シャトル剤と呼ばれる合成ペプチドは、ポリペプチドカーゴを真核細胞の細胞質/核コンパートメントに迅速に形質導入する能力を有する新しいクラスの細胞内送達ペプチドである。伝統的な細胞膜透過性ペプチドに基づく細胞内送達戦略とは対照的に、合成ペプチドシャトル剤は、細胞膜を渡る形質導入時にそのポリペプチドカーゴから独立しているか、又はそれに共有結合されていない。事実、非切断可能な様式でそのカーゴにシャトル剤を共有結合させることは、一般に、その形質導入活性に対する負の効果を有する。
第1世代の合成ペプチドシャトル剤は、国際公開第2016/161516号に記載されており、細胞膜透過性ドメイン(CPD)に作動可能に連結されたエンドソーム漏出ドメイン(ELD)を有し、必要に応じて、1つ又は複数のヒスチジンリッチドメインを更に含む、マルチドメインに基づくペプチドからなっていた。シャトル剤媒介性カーゴ形質導入は従来の細胞膜透過性ペプチドのものと類似する機序によって起こると最初は考えられていたが、細胞質/核コンパートメントへのカード送達の速度及び効率は、完全なエンドソーム形成を必要とすることなく、細胞膜を渡るより直接的な送達機序からの強い寄与を示唆した(Del'Guidiceら、2018)。したがって、出発点として第1世代のシャトル剤を使用して、大規模な反復設計及びスクリーニングプログラムを行って、細胞毒性を低減させながら、ポリペプチドカーゴの迅速且つ効率的な形質導入のためのシャトル剤を最適化した。このプログラムは、ほぼ11,000の合成ペプチドの手動の及びコンピュータ支援設計/モデリング、並びに複数の細胞及び組織において種々のポリペプチドカーゴを迅速且つ効率的に形質導入するその能力に関する数百個の異なるペプチドの試験を含んでいた。文献に由来する公知の細胞膜透過性ペプチド(CPD)及びエンドソーム溶解性ペプチド(ELD)の融合物としてシャトル剤を考慮するよりもむしろ、それぞれのペプチドは、その予測された三次元構造及び物理化学的特性に基づいて総体的に考慮された。設計及びスクリーニングプログラムは、最終的には第1世代のシャトル剤を超えるポリペプチドカーゴに関する改善された形質導入/毒性プロファイルを有するシャトル剤の合理的設計を管理する国際公開第2018/068135号に記載された15のパラメーターのセットによって定義される第2世代の合成ペプチドシャトル剤になった。これらの第2世代の合成ペプチドシャトル剤は、ポリペプチドカーゴの迅速な形質導入(すなわち、典型的には、5分未満以内)のために設計及び経験的にスクリーニングされ、したがって、主に原型的なCPDを欠くように設計された。
(実施例3)
トランケートされた合成ペプチドシャトル剤は形質導入活性を保持する
カーゴの形質導入活性にとって十分な第1及び第2世代の合成ペプチドシャトル剤の最小断片を同定するためのシャトル剤トランケーション実験が行われた。これらの実験により、C末端トランケーションが、一般的にはN末端トランケーションよりも許容されると共に、生理的条件で溶液中にある時にN末端断片が両親媒性カチオン性アルファヘリックス構造を採用すると予測された場合に、C末端トランケーションが実質的なカーゴ形質導入活性を保持することが多いことが示された。
短い/トランケートされた合成シャトル剤(例えば、一般的には20個未満のアミノ酸を有する)の形質導入活性を試験するために、HeLa細胞を対照ペプチド及び異なる長さのN末端シャトル剤断片と共にインキュベートし、実施例1に記載されたようにフローサイトメトリーによってGFP又はPIの送達を評価した。図1に示される結果は、それぞれのシャトル剤又は対照(未処理[NT]及びGFP/PIのみ[シャトル剤なし])によるGFP及びPIの送達を順位付けたものであり、その「全体送達係数」に従って順位付けられている。全体送達係数は、それぞれのシャトル剤/ペプチドの毒性の原因となる単一の数、並びにGFP及びPIを送達するその能力を表し、以下のように算出された:
(平均PI送達スコア)×(平均生存能力[PI])+(平均GFP送達スコア)×(平均生存能力[GFP])
2
0.5より高い全体送達係数を有するシャトル剤は、一般的には共通の特徴を有していた(図1)。典型的には、これらのシャトル剤は、少なくとも4の疎水性モーメント(μH)を有していた。更に、両親媒性アルファヘリックスモチーフを描写するSchiffer-Edmundsonのホイール表示に投影した場合(ヘリカルホイール投影図)、シャトル剤は、特定の角度及びある特定のパーセンテージの特異的残基を有する疎水性で正に荷電した外面を有していた。18アミノ酸の典型的なSchiffer-Edmundsonのホイール表示によれば、2個の連続したアミノ酸の間の角度は、Schifferら、1967に記載されたように、20度である。ここで、本発明者らは、最初に疎水性アミノ酸に富む領域又はクラスターを決定し、20度に、領域又はクラスター中のそれぞれの連続するアミノ酸の間の空間の数を乗じることによって疎水性角度を決定する。同様に、正に荷電した角度は、最初に正に荷電した残基であるリシン(K)及びアルギニン(R)に富む領域又はクラスターを決定することによって算出される。K及びR残基は最も頻繁に連続的に出現するが、領域又はクラスターも弱い疎水性、又は非疎水性の残基を含み得る。多くの場合、有効なシャトル剤は、50%を超えるリシン(K)及び/又はアルギニン(R)残基を含む、60～120度の角度によって規定される正に荷電した領域を有していた。これらのシャトル剤のより大きい疎水性角度は、多くは180～240度で規定され、50%を超えるフェニルアラニン(F)、イソロイシン(I)、ロイシン(L)及び/又はトリプトファン(W)を含んでいた。同様の観察は、リンカー配列又はヒスチジンリッチドメインを含む20アミノ酸より長いシャトル剤についても行われた。興味深いことに、この実験において、一部の第1世代のシャトル剤におけるN末端断片(エンドソーム漏出ドメイン)であるCM18ペプチド(18アミノ酸長)について形質導入活性が観察された。図1のペプチドのコンピュータ生成された3Dイメージを、図9においてコア及びサイドビューで示す。
(実施例4)
電荷中和剤でコーティングすることによって軽減されないCas9-RNP複合体によるシャトル剤形質導入活性の阻害
第1及び第2世代の合成ペプチドシャトル剤によるCas9-sgRNA複合体(本明細書では以後、Cas9-RNP)の核送達は一般に、Cas9タンパク質カーゴのみ(すなわち、その対応するsgRNAを含まない;Krishnamurthyら、2019、追加の図6を参照されたい)の送達よりも低い効率で起こる。蛍光標識された電荷中性ポリヌクレオチド類似体カーゴ(ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー(PMO))のシャトル剤媒介性形質導入に対するsgRNA(Cas9を含まない)の負の効果も、図2Aに示される。簡単に述べると、RH-30細胞(24ウェル皿中の150,000細胞/ウェル)を、培地中に混合した増加量のsgRNAの存在下、RPMI中で2分間にわたって、6μMのPMO-FITC及び5μMの合成ペプチドシャトル剤FSD250を含有する送達混合物と接触させた。次いで、細胞を洗浄し、完全培地中でインキュベートした後、1h後にフローサイトメトリーによる分析のために収集した。図2Aにおける結果は、2μgのsgRNA(4μg/mL)の存在下で低下したカーゴ形質導入効率が観察されたことを示す。
sgRNAの阻害効果がRNAの負に荷電したリン酸骨格に起因するものであったと仮定して、本発明者らは、形質導入の前にCas9-RNA複合体を小さい正に荷電した分子でコーティングすることによって負の電荷を中和することを試みた。Cas9-RNPの存在下、HeLa細胞中でのGFPの送達を、1,3-ジアミノグアニジンモノヒドロクロリド;3,5-ジアミノ-1,2,4-トリアゾール;グアニジンヒドロクロリド;又はL-アルギニンアミドジヒドロクロリド等の小さい正に荷電した分子の存在下で評価した。図2Bに示されるように、Cas9-RNPの存在は、最大10mMの1,3-ジアミノグアニジンモノヒドロクロリドの存在にも拘わらず、GFP形質導入活性(「平均%細胞GFP+」)と平均GFP送達スコアとの両方を有意に阻害した。同様の結果が、3,5-ジアミノ-1,2,4-トリアゾール;グアニジンヒドロクロリド;又はL-アルギニンアミドジヒドロクロリドの存在下でも見られた(データは示さず)。
(実施例5)
Cas9-RNPによる阻害に対する耐性が増大したシャトル剤
シャトル剤形質導入活性に対するCas9-RNPの阻害効果をより良く理解するために、Cas9-RNPの存在下又は非存在下で、異なるペプチド/シャトル剤及びGFPカーゴと共にHeLa細胞をインキュベートし、GFPの送達を、実施例1に記載されたようにフローサイトメトリーによって評価した。図3に示されるように、Cas9-RNPの存在は、大部分のシャトル剤についてGFPカーゴの形質導入効率を低下させた。一部のシャトル剤については、その効果は特に顕著であった。例えば、FSD268のGFP形質導入効率は92%から29%まで低下し、FSD250のGFP形質導入効率は83%から13%まで低下し、FSD10のGFP形質導入効率は76%から22%まで低下し、FSD395のGFP形質導入効率は91%から17%まで低下した。しかしながら、シャトル剤のサブセットは、Cas9-RNPの負の効果に対するある程度の耐性を示した。これらのより耐性の高いペプチドは、FSD10-15、CM18、及びFSD356を含んでいた。FSD10-15(図4A)、CM18(図4B)、及びFSD356(図4C)と同じ「コア」両親媒性カチオン性アルファヘリックス領域を共有するシャトル剤バリアントを用いて上記の形質導入実験を更に繰り返すことによって、構造活性相関を探索した。
FSD10-15について、GFP形質導入効率は、Cas9-RNPの存在下で21%から24%までわずかに増加した(図3)。興味深いことに、FSD10-15は、FSD375、FSD422、FSD424、FSD432、FSD241、FSD231、FSD10、及びFSD210を含む、いくつかのより長いシャトル剤の15アミノ酸の断片である。図4Aに示されるように、FSD10-15に隣接するグリシン/セリンリッチ残基を付加することにより(FSD375及びFSD424を参照されたい)、FSD10-15よりもGFP形質導入活性を改善しながらCas9-RNPに対するペプチドの耐性が保持された。グリシン/セリンリッチ残基を隣接するヒスチジン残基(FSD422を参照されたい)で置き換えることにより、同レベルのCas9-RNP耐性は維持されなかった。注目すべきことに、ヒスチジンリッチドメインは、そのイミダゾール側鎖のpKaに達するpH値(約6)でますますカチオン性になり得る。最後に、第2のカチオン性ドメイン(FSD432、FSD241、FSD231、FSD10、及びFSD210)に融合されたC末端グリシン/セリンリッチリンカーの存在は、シャトル剤を、Cas9-RNPによる阻害に対してより高感度にすると考えられ、FSD10及びFSD210の効果が特に顕著であった。FSD231は、最もC末端にあるリシン残基(K)の直前への単一のロイシン残基(L)の挿入によってのみFSD210と異なり、それによって、FSD210と比較してFSD231のC末端正電荷密度を低下させる。興味深いことに、この疎水性ロイシン残基の挿入は、FSD231を、FSD210と比較してCas9-RNPによる阻害に対して実質的により耐性にした(図4A)。
CM18については、Cas9-sgRNAの非存在下(32%)及び存在下(28%)でGFP形質導入効率は依然として類似していた(図3)。図3及び図4Bに示されるように、隣接するグリシン/セリンリッチ残基をCM18(FSD440を参照されたい)に付加することにより、Cas9-RNPに対するペプチドの耐性は保持されたが、GFP送達スコアは2倍増加した(CM18に関する1.8からFSD440に関する3.6まで)。高いC末端正電荷密度を有するシャトル剤(例えば、CM18-TAT、His-CM18-9Arg、及びHis-CM18-TAT)は、Cas9-RNPによる阻害に対する特に顕著な感度を示したが(図4B)、より低いC末端正電荷密度を有するシャトル剤(例えば、CM18-L2-PTD4及びHis-CM18-トランスポータン)は、Cas9-RNPによる阻害に対して実質的により耐性であった(図4B)。図4B中の結果はまた、C末端の正に荷電した残基間にある疎水性残基(例えば、A、L、及びI)の存在、並びにC末端の正に荷電した残基を「コア」両親媒性カチオン性アルファヘリックス領域から遠ざけること(例えば、CM18)が、Cas9-RNP耐性にとって有利であることも示唆する。図3で試験した全てのペプチドのうち、FSD356が、Cas9-RNPの存在下で最も高いGFP形質導入効率(51%)を示した。FSD356のN末端セグメントは、FSD446、FSD357、FSD250、FSD296、FSD246、及びFSD251のものと同一である。図4Cに示されるように、FSD356の最後の3個のC末端残基(QAG)を、3個の正に荷電したアルギニン残基(RRR;FSD357を参照されたい)で置き換えることにより、Cas9-RNPの存在下でGFP形質導入効率の顕著な低下、すなわち、FSD356に関する51%からFSD357に関するわずか4%への低下が得られた。対照的に、FSD357におけるC末端のRRR残基を、負に荷電したアスパラギン酸(D)基を含む非カチオン性の親水性残基によって置き換えることにより、Cas9-RNPの存在下でのGFP形質導入効率は34%まで戻った。最後に、FSD446のC末端の非カチオン性の親水性セグメントをカチオン性セグメントで置き換えることにより(FSD250を参照されたい)、Cas9-RNPの存在下でのGFP形質導入効率は13%まで低下した。C末端の正に荷電した残基間への極性残基(例えば、Q)の挿入(例えば、FSD296)及び/又はC末端正電荷密度の増大(例えば、FSD246)は、Cas9-RNPによる阻害に対するシャトル剤の感度を増大させた(図4C)。際立って、ペプチドのC末端領域中に3個の負に荷電したグルタミン酸(E)残基を含有するシャトル剤FSD251は、図4Cにおいて比較されるバリアントのうち最も低いCas9-RNP阻害に対する感度を示した。
図3で試験したペプチドのうち、FSD174はCas9-RNPの阻害効果に対して特に高感度であり、そのGFP形質導入効率は、Cas9-RNPの存在下で66%から11%まで低下した。FSD174と同じ「コア」両親媒性カチオン性アルファヘリックス領域を共有するシャトル剤バリアントを用いて上記の形質導入実験を繰り返すことにより、この阻害に関する構造活性相関を探索した。図4Dに示されるように、より高いC末端正電荷密度を有するシャトル剤(例えば、FSD189、FSD174及びFSD187)は、一般に、より低いC末端正電荷密度を有するシャトル剤よりも高いCas9-RNP阻害に対する感度を示した。FSD168対FSD172、及びFSD189対FSD174の形質導入効率及び構造の比較は、N末端「コア」両親媒性カチオン性アルファヘリックス領域からのC末端カチオン性残基の距離を増加させるグリシン/セリンリッチ残基の存在が、Cas9-RNP阻害に対する耐性の増大にとって有利であり得ることを示唆する。際立って、FSD374は、Cas9-RNPの存在下又は非存在下で実質的に同じGFP形質導入効率を示した(図4D)。図4AにおいてFSD375について観察されるものを反映するこれらの結果は、「コア」両親媒性カチオン性アルファヘリックス領域をグリシン/セリンリッチ残基に隣接させることが、Cas9-RNP阻害に対する耐性にとって有利であることを示唆する。
嚢胞性線維症のヒト気管支上皮細胞株モデルであるCFF-16HBEge中で、FSD10及びFSD375を用いて上記の形質導入実験を繰り返した。図5に示されるように、FSD375は、同様にCFF-16HBEge細胞中でFSD10よりもCas9-RNP阻害に対する高い耐性を示した。
全体として、本実施例における構造機能試験は、例えば、ペプチドセグメント長当たりの正に荷電した残基の数を減少させること、及び/又はC末端の正に荷電した残基の間に疎水性残基(例えば、A、L、及びI)を置くことによって、シャトル剤の少なくともC末端領域におけるカチオン性電荷密度(すなわち、ペプチドセグメント長当たりのK/R残基)を低下させることは、Cas9-RNP阻害に対するその耐性を増大させることを強く示唆する(図4及び図5)。更に、図4及び図5は、より長いシャトル剤のコア両親媒性カチオン性N末端セグメントを非カチオン性及び/又は負に荷電した親水性残基に隣接させることは、Cas9-sgRNA阻害及びおそらく他の核タンパク質複合体に対する耐性を増大させ得ることを示す。
(実施例6)
HeLa細胞中での機能性Cas9/Cpf1-RNP複合体のシャトル剤媒介性送達
Cas9-RNP複合体を細胞内に送達するシャトル剤の能力を、GFPの同時送達に対する複合体の阻害効果を介して実施例5において間接的に測定した。本実施例では、本発明者らは、ゲノム編集の成功の表現型の結果を測定することによって、シャトル剤が機能性CRISPR Cas9-RNP又はCpf1-RNP複合体を標的細胞の核に送達する能力を評価した。実施例1に記載されたように、HeLa細胞を、様々なシャトル剤及びB2M(β2ミクログロブリン)をコードする遺伝子を標的とするCas9-RNP又はCpf1-RNPと共にインキュベートした。Cas9-RNP又はCpf1-RNP複合体の送達の6日後、フローサイトメトリーによるB2M発現を欠く細胞(B2Mノックアウト)の検出によってゲノム編集効率を評価した。図6A～図6Eは、種々の合成シャトル剤による機能性Cas9-又はCpf1-sgRNA複合体の送達に関する結果を示す。図6A～図6Eにおける結果は、Cpf1-RNPと比較して、Cas9-RNPゲノム編集効率の低下は、一般に、より低いC末端カチオン性電荷密度を有する、及び/又は1つ若しくは複数の非カチオン性親水性残基によって隣接されたコア両親媒性カチオン性セグメントを有するシャトル剤について、より小さかったことを示す。
(実施例7)
嚢胞性線維症のヒト気管支上皮細胞株モデルにおける機能性Cas9/Cpf1/ABE-Cas9-sgRNA複合体のシャトル剤媒介性送達
実施例6に記載されたものと類似するゲノム編集実験を、嚢胞性線維症のヒト気管支上皮細胞株モデルであるCFF-16HBEgeにおいて実施した。ゲノム編集の結果を、図7に示す。全体として、HeLa細胞と比較して、CFF-16HBEge細胞においてより低いゲノム編集効率が観察された。これは肺上皮細胞の不応性と一致している。図6A～図6E中のHeLa細胞における結果に見られるように、シャトル剤は、CFF-16HBEge細胞中でCas9-RNPよりも良好にCpf1-RNP複合体を形質導入した(図7)。シャトル剤FSD10、FSD322、FSD395、及びFSD397は全て、Cpf1-RNPに関して10%より高いゲノム編集効率を示したが、Cas9-RNPに関しては未処理(標識)陰性対照を超えるゲノム編集のいかなる増加も示すことができなかった。カーゴとしてのCas9-RNPに関する有意なゲノム編集を示した、試験したもののうちのただ2つのシャトル剤は、FSD374及びFSD375であったが、これらは非カチオン性親水性残基の短いセグメントによって隣接されたコア両親媒性カチオン性ドメインの類似する構造を有する。
CFF-16HBEge細胞におけるさらなる形質導入実験を行って、機能性Cas9-RNPゲノム編集と、ABE-Cas9-RNP塩基編集複合体とを送達するシャトル剤の能力を比較した。シャトル剤FSD10のバリアント(図8A)を、同時に試験した。次世代配列決定(NGS)によって評価されたゲノム編集/塩基編集の結果を、それぞれ、Cas9-RNP及びABE-Cas9-RNPについて、図8B及び図8Cに示す。興味深いことに、シャトル剤FSD375を用いたABE-Cas9-RNP塩基編集複合体の送達は、試験した他のシャトル剤(FSD10、FSD10-15、及びFSD448)よりも有意に高い塩基編集効率(約15%)をもたらした(図8C)。FSD10のC末端カチオン性部分のみ(「FSD10-Cter」)からなる、又は隣接したグリシン/セリンリッチリンカー(「リンカー-(FSD10-Cter)-リンカー」)陰性対照ペプチド(図8A)は、未処理の細胞と比較して検出可能なゲノム編集又は塩基編集を示さなかった(図8B及び図8C)。
(実施例8)
ヨウ化プロピジウム(PI)及びGFP-NLS形質導入活性に関する候補ペプチドシャトル剤の大規模スクリーニング
300を超える候補ペプチドシャトル剤の特許で守られたライブラリーを、実施例1に一般的に記載されたようにフローサイトメトリーを使用してHeLa細胞中でヨウ化プロピジウム(PI)とGFP-NLSとの両方の形質導入活性について同時にスクリーニングした。PIは、ゲノムDNAに結合した後にのみ、20～30倍の増強された蛍光及び最大励起/発光スペクトルの検出可能なシフトを示し、この特性は、エンドソームでトラップされたカーゴを、細胞質/核コンパートメントにアクセスさせるエンドソームで放出されたカーゴから区別するのに特に適しているため、PIをカーゴとして使用した。したがって、エンドソームにトラップされたままであるいずれのPIも核に到達せず、増強された蛍光もスペクトルシフトも示さないため、細胞内送達及びエンドソームの逃避はともにフローサイトメトリーによって測定可能である。
スクリーニングされた多数のペプチドのために、陰性対照を各実験バッチについて並行して行い、細胞をシャトルペプチド又はカーゴに曝露しない「無処置」(NT)対照、並びに細胞をシャトル剤の非存在下でカーゴに曝露する「カーゴ単独」対照を含んだ。結果は、図9に示され、「形質導入効率」は、カーゴ(PI又はGFP-NLS)に対して陽性である全生存細胞のパーセンテージを指す。「平均送達スコア」は、全てのカーゴ陽性細胞の中で、細胞当たりに送達されたカーゴの総量をさらなる指標を提供する。平均PI又はGFP-NLS送達スコアは、生存PI+又はGFP+細胞について測定された平均蛍光強度(少なくとも重複試料の)に、生存PI+又はGFP+細胞の平均パーセンテージを乗じ、GFP送達については100,000で除した値、又はPI送達については10,000で除した値を算出した。次に、各候補シャトル剤についてのPI及びGFP-NLSの平均デリバリースコアを、各実験バッチについて並行して行われた「カーゴ単独」陰性対照についての平均送達スコアで除することによって標準化した。したがって、図9における「標準化平均送達スコア」は、「カーゴのみ」の陰性対照に比べて、平均送達スコアが倍増したことを示す。
陰性対照で観察されたバッチ間の変動は、GFP-NLSでは比較的小さかったが、カーゴとしてのPIではかなり高かった。例えば、「カーゴ単独」陰性対照の形質導入効率の変動は、GFP-NLSで0.4%～1.3%、PIで0.9%～6.3%の範囲であった。更に、並行して(例えば、FSD174スクランブル;データは示さず)試験されたいくつかの陰性対照ペプチド(すなわち、GFP形質導入活性が低い又はないことが公知であるペプチド)の形質導入効率は、時として、「カーゴ単独」陰性対照よりもPI(ただしGFP-NLSではない)の方が、場合によっては5%も低い形質導入効率を示したが、これはおそらくPIとペプチドの間の非特異的相互作用によるものである。この現象は、GFP-NLS形質導入実験では観察されなかった。前述のことは、少なくともPIについてのシャトル剤形質導入効率が、「カーゴ単独」条件よりもむしろ陰性対照ペプチドのそれと比較してより適切であり得ることを示唆した。
少なくとも20%の平均PI形質導入効率を有する図9の候補ペプチドシャトル剤の中には、20残基未満の長さ:FSD390(17aa)、FSD367(19aa)、及びFSD366(18aa)を有するペプチドが含まれた。また、少なくとも20%の平均PI形質導入効率を有する候補ペプチドシャトル剤の中には、非生理的アミノ酸類似体(例えば、L-2,4-ジアミノ酪酸残基で置き換えられるリジン残基(K)を除くFSD395に対応するFSD435)又は化学修飾(例えば、N-末端オクタン酸修飾を除くFSD10に対応するFSD438;(2-ナフチル)-L-アラニン残基で置き換えられるフェニルアラニン残基(F)を除くFSD222に対応するFSD436;N-末端アセチル基及びC-末端システアミド基を有することを除くFSD168に対応するFSD171のいずれかを含むペプチドが含まれた。これらの結果は、生理学的アミノ酸及び/又は化学的修飾の代わりに非生理的アミノ酸又はその類似体の使用に耐えるためのペプチドシャトル剤プラットフォーム技術の確実性を確認する。
(参考文献)

Claims (72)

  1. 細胞内送達のための核タンパク質カーゴ及び前記核タンパク質カーゴから独立しているか、又はそれに共有結合していない合成ペプチドシャトル剤を含む組成物であって、合成ペプチドシャトル剤が、正に荷電した親水性の外面と、疎水性の外面との両方を有する両親媒性アルファヘリックスモチーフを含むペプチドであり、合成ペプチドシャトル剤が、合成ペプチドシャトル剤の非存在下と比較して真核細胞中での前記核タンパク質カーゴの細胞質/核送達を増加させる、組成物。
  2. 核タンパク質カーゴが、デオキシリボ核タンパク質(DNP)又はリボ核タンパク質(RNP)カーゴである、請求項1に記載の組成物。
  3. 核タンパク質カーゴが、RNAガイド型ヌクレアーゼ、Casヌクレアーゼ、例えば、Cas I、II、III、IV、V、若しくはVI型ヌクレアーゼ、又はヌクレアーゼ活性を欠いているそのバリアント、塩基エディター、又はプライムエディター、CRISPR関連トランスポザーゼ、又はCas-リコンビナーゼ(例えば、recCas9)である、請求項1又は2に記載の組成物。
  4. 核タンパク質カーゴがCpf1-RNPである、請求項1から3のいずれか一項に記載の組成物。
  5. 核タンパク質カーゴがCas9-RNPである、請求項1から3のいずれか一項に記載の組成物。
  6. 核タンパク質カーゴが、細胞膜透過性ペプチドと共有結合していない、又はそれと予め複合体化していない、請求項1から5のいずれか一項に記載の組成物。
  7. シャトル剤が、
    (1)少なくとも12、13、14、15、16、17、18、19、又は20アミノ酸長であり、
    (2)両親媒性のアルファヘリックスモチーフであって、
    (3)正に荷電した親水性の外面、及び疎水性の外面
    を有する両親媒性のアルファヘリックスモチーフを含むペプチドであり、
    次のパラメーター(4)～(15):
    (4)疎水性の外面が、ターン当たり3.6残基を有するアルファヘリックスのオープンシリンダー表示に基づいて、ペプチドのアミノ酸の12～50%に相当する空間的に隣接するL、I、F、V、W、及び/又はMアミノ酸からなる高度疎水性コアを含む;
    (5)ペプチドが3.5～11の疎水性モーメント(μ)を有する;
    (6)ペプチドが生理学的pHで少なくとも+3又は+4の予測正味電荷を有する;
    (7)ペプチドが8～13の等電点(pI)を有する;
    (8)ペプチドが、35%～65%のアミノ酸:A、C、G、I、L、M、F、P、W、Y及びVの任意の組合せから構成される;
    (9)ペプチドが、0%～30%のアミノ酸:N、Q、S及びTの任意の組合せから構成される;
    (10)ペプチドが、35%～85%のアミノ酸:A、L、K又はRの任意の組合せから構成される;
    (11)少なくとも5%のLがペプチド中に存在するという条件で、ペプチドが、15%～45%のアミノ酸:A及びLの任意の組合せから構成される;
    (12)ペプチドが、20%～45%のアミノ酸:K及びRの任意の組合せから構成される;
    (13)ペプチドが、0%～10%のアミノ酸:D及びEの任意の組合せから構成される;
    (14)ペプチド中のA及びL残基のパーセンテージ(A+L%)と、ペプチド中のK及びR残基のパーセンテージ(K+R)との差異が、10%以下である;並びに
    (15)ペプチドが、10%～45%のアミノ酸:Q、Y、W、P、I、S、G、V、F、E、D、C、M、N、T及びHの任意の組合せから構成される
    のうちの少なくとも5つが満たされる、請求項1から6のいずれか一項に記載の組成物。
  8. (a)シャトル剤が、少なくとも6個の、少なくとも7個の、少なくとも8個の、少なくとも9個の、少なくとも10個の、少なくとも11個の、又は全てのパラメーター(4)～(15)を満たし;
    (b)シャトル剤が、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、又は30アミノ酸の最小長、及び40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、60、65、70、80、90、110、120、130、140、又は150アミノ酸の最大長を有するペプチドであり;
    (c)前記両親媒性のアルファヘリックスモチーフが、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0の下限値と、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、10.1、10.2、10.3、10.4、10.5、10.6、10.7、10.8、10.9、又は11.0の上限値との間の疎水性モーメント(μ)を有し、
    (d)前記両親媒性のアルファヘリックスモチーフが、正に帯電した親水性外面を含み、この外面が、(i)ヘリカルホイール投影図上に、少なくとも2個、3個又は4個の隣接する正に帯電したK及び/又はR残基;及び/又は(ii)ヘリカルホイール投影図上に、100度の連続アミノ酸間の回転角度及び/又はターン当たり3.6残基を有するアルファヘリックスに基づいて、3個から5個のK及び/又はR残基を含む6個の隣接する残基のセグメントを含み;
    (e)前記両親媒性のアルファヘリックスモチーフが、疎水性の外面を含み、この疎水性の外面は、(i)ヘリカルホイール投影図上で、少なくとも2個の隣接するL残基;及び/又は(ii)ヘリカルホイール投影図上で、100度の連続アミノ酸間の回転角度及び/又はターン当たり3.6残基を有するアルファヘリックスに基づいて、L、I、F、V、W、及びMから選択される少なくとも5個の疎水性の残基を含む10個の隣接する残基のセグメントを含み;
    (f)前記疎水性の外面が、シャトル剤のアミノ酸の12.5%、13%、13.5%、14%、14.5%、15%、15.5%、16%、16.5%、17%、17.5%、18%、18.5%、19%、19.5%、又は20%から25%、30%、35%、40%、又は45%に相当する空間的に隣接するL、I、F、V、W、及び/又はMアミノ酸から構成される高度疎水性コアを含み;
    (g)シャトル剤が、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0の下限値と、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、10.1、10.2、10.3、10.4、又は10.5の上限値との間の疎水性モーメント(μ)を有し、
    (h)シャトル剤が、+3、+4、+5、+6、+7、+8、+9、+10、+11、+12、+13、+14、又は+15の予測実効電荷を有し;
    (i)シャトル剤が、10～13の予測pIを有し;又は
    (j)(a)～(i)の内の任意の組合せである、請求項7に記載の組成物。
  9. 前記シャトル剤が、次のパラメーターの少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、又は全てを満たす、請求項7又は8に記載の組成物:
    (8)シャトル剤が、36%～64%、37%～63%、38%～62%、39%～61%、又は40%～60%のアミノ酸:A、C、G、I、L、M、F、P、W、Y、及びVの任意の組合せから構成される;
    (9)シャトル剤が、1%～29%、2%～28%、3%～27%、4%～26%、5%～25%、6%～24%、7%～23%、8%～22%、9%～21%、又は10%～20%のアミノ酸:N、Q、S、及びTの任意の組合せから構成される;
    (10)シャトル剤が、36%～80%、37%～75%、38%～70%、39%～65%、又は40%～60%のアミノ酸:A、L、K、又はRの任意の組合せから構成される;
    (11)シャトル剤が、15%～40%、20%～40%、20%～35%、又は20%～30%のアミノ酸:A及びLの任意の組合せから構成される;
    (12)シャトル剤が、20%～40%、20%～35%、又は20%～30%のアミノ酸:K及びRの任意の組合せから構成される;
    (13)シャトル剤が、5%～10%のアミノ酸:D及びEの任意の組合せから構成される;
    (14)シャトル剤中のA及びL残基パーセンテージ(A+L%)と、シャトル剤中のK及びR残基のパーセンテージと(K+R)の差異が、9%、8%、7%、6%、又は5%以下である;並びに
    (15)シャトル剤が、15～40%、20%～35%、又は20%～30%のアミノ酸:Q、Y、W、P、I、S、G、V、F、E、D、C、M、N、T、及びHの任意の組合せから構成される。
  10. 前記シャトル剤が、ヒスチジンリッチドメインを含み、任意選択でヒスチジンリッチドメインが、
    (i)シャトル剤のN末端に向けて及び/又はC末端に向けて配置され;
    (ii)少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%若しくは少なくとも90%のヒスチジン残基を含む、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個のアミノ酸のストレッチであり、及び/又は少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、又は少なくとも9個の連続するヒスチジン残基を含み;又は
    (iii)(i)及び(ii)の両方である、請求項1から9のいずれか一項に記載の組成物。
  11. 前記シャトル剤が、セリン及び/又はグリシン残基に富むフレキシブルリンカードメイン(例えば、シャトル剤のN末端セグメントとC末端セグメントとを分離する;又は中央両親媒性カチオン性アルファヘリックスドメインのN及び/若しくはC末端に位置する)を含む、請求項1から10のいずれか一項に記載の組成物。
  12. 前記シャトル剤が、次記のアミノ酸配列を含む又はそれからなる、請求項1から11のいずれか一項に記載の組成物:
    (a)[X1]-[X2]-[リンカー]-[X3]-[X4](式1);
    (b)[X1]-[X2]-[リンカー]-[X4]-[X3](式2);
    (c)[X2]-[X1]-[リンカー]-[X3]-[X4](式3);
    (d)[X2]-[X1]-[リンカー]-[X4]-[X3](式4);
    (e)[X3]-[X4]-[リンカー]-[X1]-[X2](式5);
    (f)[X3]-[X4]-[リンカー]-[X2]-[X1](式6);
    (g)[X4]-[X3]-[リンカー]-[X1]-[X2](式7);
    (h)[X4]-[X3]-[リンカー]-[X2]-[X1](式8);
    (i)[リンカー]-[X1]-[X2]-[リンカー](式9);
    (j)[リンカー]-[X2]-[X1]-[リンカー](式10);
    (k)[X1]-[X2]-[リンカー](式11);
    (l)[X2]-[X1]-[リンカー](式12);
    (m)[リンカー]-[X1]-[X2](式13);
    (n)[リンカー]-[X2]-[X1](式14);
    (o)[X1]-[X2](式15);又は
    (p)[X2]-[X1](式16)、
    式中、
    [X1]が次記から選択され: 2[Φ]-1[+]-2[Φ]-1[ζ]-1[+]-;2[Φ]-1[+]-2[Φ]-2[+]-;1[+]-1[Φ]-1[+]-2[Φ]-1[ζ]-1[+]-;及び1[+]-1[Φ]-1[+]-2[Φ]-2[+]-;
    [X2]が次記から選択され: -2[Φ]-1[+]-2[Φ]-2[ζ]-;-2[Φ]-1[+]-2[Φ]-2[+]-;-2[Φ]-1[+]-2[Φ]-1[+]-1[ζ]-;-2[Φ]-1[+]-2[Φ]-1[ζ]-1[+]-;-2[Φ]-2[+]-1[Φ]-2[+]-;-2[Φ]-2[+]-1[Φ]-2[ζ]-;-2[Φ]-2[+]-1[Φ]-1[+]-1[ζ]-;及び-2[Φ]-2[+]-1[Φ]-1[ζ]-1[+]-;
    [X3]が、次記から選択され: -4[+]-A-;-3[+]-G-A-;-3[+]-A-A-;-2[+]-1[Φ]-1[+]-A-;-2[+]-1[Φ]-G-A-;-2[+]-1[Φ]-A-A-;又は-2[+]-A-1[+]-A;-2[+]-A-G-A;-2[+]-A-A-A-;-1[Φ]-3[+]-A-;-1[Φ]-2[+]-G-A-;-1[Φ]-2[+]-A-A-;-1[Φ]-1[+]-1[Φ]-1[+]-A;-1[Φ]-1[+]-1[Φ]-G-A;-1[Φ]-1[+]-1[Φ]-A-A;-1[Φ]-1[+]-A-1[+]-A;-1[Φ]-1[+]-A-G-A;-1[Φ]-1[+]-A-A-A;-A-1[+]-A-1[+]-A;-A-1[+]-A-G-A;及び-A-1[+]-A-A-A;
    [X4]が次記から選択され: -1[ζ]-2A-1[+]-A;-1[ζ]-2A-2[+];-1[+]-2A-1[+]-A;-1[ζ]-2A-1[+]-1[ζ]-A-1[+];-1[ζ]-A-1[ζ]-A-1[+];-2[+]-A-2[+];-2[+]-A-1[+]-A;-2[+]-A-1[+]-1[ζ]-A-1[+];-2[+]-1[ζ]-A-1[+];-1[+]-1[ζ]-A-1[+]-A;-1[+]-1[ζ]-A-2[+];-1[+]-1[ζ]-A-1[+]-1[ζ]-A-1[+];-1[+]-2[ζ]-A-1[+];-1[+]-2[ζ]-2[+];-1[+]-2[ζ]-1[+]-A;-1[+]-2[ζ]-1[+]-1[ζ]-A-1[+];-1[+]-2[ζ]-1[ζ]-A-1[+];-3[ζ]-2[+];-3[ζ]-1[+]-A;-3[ζ]-1[+]-1[ζ]-A-1[+];-1[ζ]-2A-1[+]-A;-1[ζ]-2A-2[+];-1[ζ]-2A-1[+]-1[ζ]-A-1[+];-2[+]-A-1[+]-A;-2[+]-1[ζ]-1[+]-A;-1[+]-1[ζ]-A-1[+]-A;-1[+]-2A-1[+]-1[ζ]-A-1[+];及び1[ζ]-A-1[ζ]-A-1[+];及び
    [リンカー]が次記から選択され: -Gn-;-Sn-;-(GnSn)n-;-(GnSn)nGn-;-(GnSn)nSn-;-(GnSn)nGn(GnSn)n-;及び(GnSn)nSn(GnSn)n-;
    式中、
    [Φ]はアミノ酸:Leu、Phe、Trp、Ile、Met、Tyr、又はVal、好ましくはLeu、Phe、Trp、又はIleであり;
    [+]は、アミノ酸:Lys又はArgであり;
    [ζ]は、アミノ酸:Gln、Asn、Thr、又はSerであり;
    Aは、アミノ酸:Alaであり;
    Gは、アミノ酸:Glyであり;
    Sは、アミノ酸:Serであり;
    nは、1～20、1～19、1～18、1～17、1～16、1～15、1～14、1～13、1～12、1～11、1～10、1～9、1～8、1～7、1～6、1～5、1～4、又は1～3の整数である。
  13. シャトル剤が、
    (i)配列番号1～50、58～78、80～107、109～139、141～146、149～161、163～169、171、174～234、236～240、242～260、262～285、287～294、296～300、302～308、310、311、313～324、326～332、338～342、344、346、348、352、355、356、358～360、362、363、366、369、370、若しくは379のいずれか1つのアミノ酸配列;
    (ii)1、2、3、4、5、6、7、8、9、若しくは10個以下のアミノ酸によって配列番号1～50、58～78、80～107、109～139、141～146、149～161、163～169、171、174～234、236～240、242～260、262～285、287～294、296～300、302～308、310、311、313～324、326～332、338～342、344、346、348、352、355、356、358～360、362、363、366、369、370若しくは379のいずれか1つと異なるアミノ酸配列(例えば、リンカードメインを除く);
    (iii)配列番号1～50、58～78、80～107、109～139、141～146、149～161、163～169、171、174～234、236～240、242～260、262～285、287～294、296～300、302～308、310、311、313～324、326～332、338～342、344、346、348、352、355、356、358～360、362、363、366、369、370、若しくは379のいずれか1つと少なくとも50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、若しくは99%同一であるアミノ酸配列(例えば、リンカードメインを除いて計算される);
    (iv)保存的アミノ酸置換のみによって(例えば、好ましくは、リンカードメインを除く、1、2、3、4、5、6、7、8、9、若しくは10個以下の保存的アミノ酸置換によって)配列番号1～50、58～78、80～107、109～139、141～146、149～161、163～169、171、174～234、236～240、242～260、262～285、287～294、296～300、302～308、310、311、313～324、326～332、338～342、344、346、348、352、355、356、358～360、362、363、366、369、370若しくは379のいずれか1つと異なるアミノ酸配列であって、それぞれの保存的アミノ酸置換が、同じアミノ酸クラス内のアミノ酸から選択され、アミノ酸クラスが、脂肪族:G、A、V、L、及びI;ヒドロキシル若しくは硫黄/セレン含有:S、C、U、T、及びM;芳香族:F、Y、及びW;塩基性:H、K、及びR;酸性及びそのアミド:D、E、N、及びQである、アミノ酸配列;又は
    (v)(i)～(iv)の任意の組合せ
    を含む、又はそれからなる、請求項1から12のいずれか一項に記載の組成物。
  14. シャトル剤が、
    (a)請求項7から13のいずれか一項に規定の親シャトル剤の断片であって、カーゴ形質導入活性を保持し、正に荷電した親水性の外面と、疎水性の外面との両方を有する両親媒性アルファヘリックスモチーフを含む、断片、又は
    (b)請求項7から13のいずれか一項に規定の親シャトル剤のバリアントであって、カーゴ形質導入活性を保持し、親シャトル剤と比較して低いC末端正電荷密度を有することによって(例えば、K/R等の1つ若しくは複数のカチオン性残基を、非カチオン性残基、好ましくは、非カチオン性親水性残基で置換することによって;及び/又は2つの隣接したカチオン性残基間の疎水性残基(例えば、A、V、L、I、F、若しくはW)を操作することによって)、親シャトル剤と異なる(又は唯一異なる)、バリアントを含むか、又はそれからなり;
    断片又はバリアントが、核タンパク質カーゴ並びに/又はDNA及び/若しくはRNAの存在による阻害に対する増大した耐性を有する、並びに/又は核タンパク質カーゴに対する増加した形質導入活性を有する、請求項1から13のいずれか一項に記載の組成物。
  15. 断片又はバリアントが、親シャトル剤のC末端トランケーションを含むか、又はそれからなる、請求項14に記載の組成物。
  16. 断片又はバリアントが、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、若しくは50個の非カチオン性の親水性残基に隣接する、又は少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、若しくは50個の非カチオン性の親水性残基に隣接する、正に荷電した親水性の外面と、疎水性の外面との両方を有する両親媒性アルファヘリックスモチーフを含み、その結果、カーゴ形質導入活性を保持する、及び/又は核タンパク質カーゴによる阻害に対する増大した耐性を有する、請求項14又は15に記載の組成物。
  17. シャトル剤が、20未満のアミノ酸長のペプチドを含むか、又はそれからなる、請求項1から16のいずれか一項に記載の組成物。
  18. シャトル剤が、
    - Schiffer-Edmundsonのホイール表示において140度から280度の疎水性角度を規定するヘリックスの一方の側の疎水性アミノ酸残基のクラスター、及び
    - Schiffer-Edmundsonのホイール表示において40度から160度の正に荷電した角度を規定するヘリックスの他方の側の正に荷電した残基のクラスター
    を有する両親媒性ヘリックスを含むヘリックス領域を含む、請求項1から17のいずれか一項に記載の組成物。
  19. 疎水性角度が、Schiffer-Edmundsonのホイール表示において160度から260度である、請求項18に記載の組成物。
  20. 疎水性角度が、Schiffer-Edmundsonのホイール表示において180度から240度である、請求項18に記載の組成物。
  21. 正に荷電した角度が、Schiffer-Edmundsonのホイール表示において40度から140度である、請求項18から20のいずれか一項に記載の組成物。
  22. 正に荷電した角度が、Schiffer-Edmundsonのホイール表示において60度から140度である、請求項18から20のいずれか一項に記載の組成物。
  23. 正に荷電した角度が、Schiffer-Edmundsonのホイール表示において60度から120度である、請求項18から20のいずれか一項に記載の組成物。
  24. 疎水性クラスター中の残基の少なくとも20%、30%、40%、又は50%が疎水性残基である、請求項18から23のいずれか一項に記載の組成物。
  25. 疎水性残基が、フェニルアラニン、イソロイシン、トリプトファン、ロイシン、バリン、メチオニン、チロシン、システイン、グリシン、及びアラニンからなる群から選択される、請求項24に記載の組成物。
  26. 疎水性残基が、フェニルアラニン、イソロイシン、トリプトファン、及びロイシンからなる群から選択される、請求項24に記載の組成物。
  27. 正に荷電したクラスター中の残基の少なくとも20%、30%、40%、又は50%が正に荷電した残基である、請求項18から26のいずれか一項に記載の組成物。
  28. 正に荷電した残基が、リシン、アルギニン、及びヒスチジンからなる群から選択される、請求項27に記載の組成物。
  29. 正に荷電した残基が、リシン及びアルギニンからなる群から選択される、請求項28に記載の組成物。
  30. 合成ペプチドシャトル剤が、少なくとも8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、又は19アミノ酸長である、請求項18から29のいずれか一項に記載の組成物。
  31. 合成ペプチドシャトル剤が、少なくとも3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、又は5.5の疎水性モーメント(μH)を有する、請求項1から30のいずれか一項に記載の組成物。
  32. シャトル剤が、合成ペプチドシャトル剤のバリアントを含むか、又はそれからなり、バリアントが、置き換えられるアミノ酸と類似する物理化学的特性(例えば、構造、疎水性、又は電荷)の側鎖を有する対応する合成アミノ酸で置き換えられる少なくとも1個のアミノ酸を有することを除いて、請求項1又は請求項7から31のいずれか一項に規定の合成ペプチドシャトル剤と同一であり、バリアントが、合成ペプチドシャトル剤の非存在下と比較して真核細胞中で前記カーゴの細胞質/核送達を増加させ、好ましくは、合成アミノ酸の置き換えが、
    (a)α-アミノグリシン、α,γ-ジアミノ酪酸、オルニチン、α,β-ジアミノプロピオン酸、2,6-ジアミノ-4-ヘキシン酸、β-(1-ピペラジニル)-アラニン、4,5-デヒドロ-リジン、δ-ヒドロキシリジン、ω,ω-ジメチルアルギニン、ホモアルギニン、ω,ω'-ジメチルアルギニン、ω-メチルアルギニン、β-(2-キノリル)-アラニン、4-アミノピペリジン-4-カルボン酸、α-メチルヒスチジン、2,5-ジヨードヒスチジン、1-メチルヒスチジン、3-メチルヒスチジン、スピナシン、4-アミノフェニルアラニン、3-アミノチロシン、β-(2-ピリジル)-アラニン、若しくはβ-(3-ピリジル)-アラニンのいずれか1つで塩基性アミノ酸を置き換える;
    (b)デヒドロアラニン、β-フルオロアラニン、β-クロロアラニン、β-ロドアラニン、α-アミノ酪酸、α-アミノイソ酪酸、β-シクロプロピルアラニン、アゼチジン-2-カルボン酸、α-アリルグリシン、プロパルギルグリシン、tert-ブチルアラニン、β-(2-チアゾリル)-アラニン、チアプロリン、3,4-デヒドロプロリン、tert-ブチルグリシン、β-シクロペンチルアラニン、β-シクロヘキシルアラニン、α-メチルプロリン、ノルバリン、α-メチルバリン、ペニシラミン、β、β-ジシクロヘキシルアラニン、4-フルオロプロリン、1-アミノシクロペンタンカルボン酸、ピペコリン酸、4,5-デヒドロロイシン、アロイソロイシン、ノルロイシン、α-メチルロイシン、シクロヘキシルグリシン、シス-オクタヒドロインドール-2-カルボン酸、β-(2-チエニル)-アラニン、フェニルグリシン、α-メチルフェニルアラニン、ホモフェニルアラニン、1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-3-カルボン酸、β-(3-ベンゾチエニル)-アラニン、4-ニトロフェニルアラニン、4-ブロモフェニルアラニン、4-tert-ブチルフェニルアラニン、α-メチルトリプトファン、β-(2-ナフチル)-アラニン、β-(1-ナフチル)-アラニン、4-ヨードフェニルアラニン、3-フルオロフェニルアラニン、4-フルオロフェニルアラニン、4-メチルトリプトファン、4-クロロフェニルアラニン、3,4-ジクロロ-フェニルアラニン、2,6-ジフルオロ-フェニルアラニン、n-in-メチルトリプトファン、1,2,3,4-テトラヒドロノルハルマン-3-カルボン酸、β、β-ジフェニルアラニン、4-メチルフェニルアラニン、4-フェニルフェニルアラニン、2,3,4,5,6-ペンタフルオロ-フェニルアラニン、若しくは4-ベンゾイルフェニルアラニンのいずれか1つで非極性(疎水性)アミノ酸を置き換える;
    (c)β-シアノアラニン、β-ウレイドアラニン、ホモシステイン、アロスレオニン、ピログルタミン酸、2-オキソチアゾリジン-4-カルボン酸、シトルリン、チオシトルリン、ホモシトルリン、ヒドロキシプロリン、3,4-ジヒドロキシフェニルアラニン、β-(1,2,4-トリアゾール-1-イル)-アラニン、2-メルカプトヒスチジン、β-(3,4-ジヒドロキシフェニル)-セリン、β-(2-チエニル)-セリン、4-アジドフェニルアラニン、4-シアノフェニルアラニン、3-ヒドロキシメチルチロシン、3-ヨードチロシン、3-ニトロチロシン、3,5-ジニトロチロシン、3,5-ジブロモチロシン、3,5-ジヨードチロシン、7-ヒドロキシ-1,2,3,4-テトラヒドロイソ-キノリン-3-カルボン酸、5-ヒドロキシトリプトファン、チロニン、β-(7-メトキシクマリン-4-イル)-アラニン、若しくは4-(7-ヒドロキシ-4-クマリニル)-アミノ酪酸のいずれか1つで極性非荷電アミノ酸を置き換える;及び/又は
    (d)γ-ヒドロキシグルタミン酸、γ-メチレングルタミン酸、γ-カルボキシグルタミン酸、α-アミノアジピン酸、2-アミノヘプタン二酸、α-アミノスベリン酸、4-カルボキシフェニルアラニン、システイン酸、4-ホスホノフェニルアラニン若しくは4-スルホメチルフェニルアラニンのいずれか1つで酸性アミノ酸を置き換える、
    請求項1から31のいずれか一項に記載の組成物。
  33. シャトル剤が、
    - 細胞膜透過性ドメイン(CPD)、細胞膜透過性ペプチド(CPP)、若しくはタンパク質形質導入ドメイン(PTD)を含まない;又は
    - エンドソーム漏出ドメイン(ELD)に融合されたCPDを含まない、
    請求項1から32のいずれか一項に記載の組成物。
  34. シャトル剤が、エンドソーム漏出ドメイン(ELD)及び/又は細胞膜透過性ドメイン(CPD)を含む、請求項1から32のいずれか一項に記載の組成物。
  35. (i)前記ELDが、エンドソーム溶解性ペプチド;抗菌性ペプチド(AMP);直鎖状カチオン性アルファヘリックス抗菌性ペプチド;セクロピン-A/メリチンハイブリッド(CM)ペプチド;pH依存性膜活性ペプチド(PAMP);ペプチド両親媒性物質;インフルエンザ血球凝集素(HA)のHA2サブユニットのN末端に由来するペプチド;CM18;ジフテリア毒素Tドメイン(DT);GALA;PEA;INF-7;LAH4;HGP;H5WYG;HA2;EB1;VSVG;シュードモナス毒素;メリチン;KALA;JST-1;C(LLKK)3C;G(LLKK)3G又はそれらの任意の組合せであるか、若しくはそれに由来する;
    (ii)前記CPDが、細胞膜透過性ペプチド若しくは細胞膜透過性ペプチド由来のタンパク質形質導入ドメイン;TAT;PTD4;ペネトラチン;pVEC;M918;Pep-1;Pep-2;キセントリー;アルギニンストレッチ;トランスポータン;SynB1;SynB3;若しくはそれらの任意の組合せであるか、若しくはそれに由来する;又は
    (iii)(i)及び(ii)の両方である、
    請求項33又は34に記載の組成物。
  36. シャトル剤が、環状ペプチドであり、及び/又は1つ若しくは複数のD-アミノ酸を含む、請求項1から35のいずれか一項に記載の組成物。
  37. シャトル剤が、前記シャトル剤を欠く対応する陰性対照よりも少なくとも3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、又は10倍、真核細胞において細胞内に送達される核タンパク質カーゴの形質導入効率及び/又は総量を増加させる、請求項1から36のいずれか一項に記載の組成物。
  38. シャトル剤が、1つ又は複数のアミノ酸に対する化学修飾を更に含み、化学修飾が、合成ペプチドシャトル剤の形質導入活性を破壊しない、請求項1から37のいずれか一項に記載の組成物。
  39. 化学修飾が、シャトル剤のN末端及び/又はC末端にある、請求項38に記載の組成物。
  40. 化学修飾が、アセチル基(例えば、N末端アセチル基)、システアミド基(例えば、C末端システアミド基)、又は脂肪酸(例えば、C4～C16脂肪酸、好ましくはN末端)の付加である、請求項38又は39に記載の組成物。
  41. 組成物中の核タンパク質カーゴ及び/又は合成ペプチドシャトル剤の濃度が、少なくとも1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、又は40μMである、請求項1から40のいずれか一項に記載の組成物。
  42. (a)真核細胞の細胞質/核コンパートメントに対する核タンパク質カーゴの形質導入効率を増加させるのに使用するため;
    (b)真核細胞中でのゲノム編集、塩基編集、若しくはプライム編集における使用のため;
    (c)真核細胞中での遺伝子発現をモジュレートするのに使用するため;
    (d)核タンパク質カーゴが真核細胞中の治療標的に結合する、治療における使用のため;
    (e)診断剤として非治療的核タンパク質カーゴを送達するのに使用するため;
    (f)医薬若しくは診断剤の製造における使用のため;
    (g)がん(例えば、皮膚がん、基底細胞癌、母斑基底細胞癌症候群)、炎症若しくは炎症関連疾患(例えば、乾癬、アトピー性皮膚炎、潰瘍性大腸炎、蕁麻疹、ドライアイ疾患、萎縮型若しくは滲出型加齢黄斑変性、指潰瘍、日光角化症、特発性肺線維症)、疼痛(例えば、慢性若しくは急性)、又は肺に影響を及ぼす疾患(例えば、嚢胞性線維症、喘息、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、若しくは特発性肺線維症)を治療するのに使用するため;又は
    (h)(a)～(g)の任意の組合せのための、
    請求項1から41のいずれか一項に記載の組成物。
  43. 真核細胞が、動物細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞、幹細胞、初代細胞、免疫細胞、T細胞、NK細胞、樹状細胞、上皮細胞、皮膚細胞、胃腸細胞、肺細胞、又は眼細胞である、請求項1から41のいずれか一項に記載の組成物、又は請求項42に規定の使用のための組成物。
  44. (a)真核細胞の集団における細胞内送達のための核タンパク質カーゴを提供する工程;
    (b)前記核タンパク質カーゴから独立している、又はそれに共有結合していない合成ペプチドシャトル剤を提供する工程;
    (c)合成ペプチドシャトル剤の非存在下と比較して、核タンパク質カーゴの形質導入効率及び/又は細胞質/核送達を増加させるのに十分な濃度の前記合成ペプチドシャトル剤の存在下で真核細胞を核タンパク質カーゴと接触させる工程
    を含み、
    核タンパク質カーゴが、細胞内標的に結合し、それによって前記使用を行う、請求項42に規定の使用のための方法。
  45. インビトロ方法(例えば、治療及び/又は診断目的のための)である、請求項44に記載の方法。
  46. インビボ方法(例えば、治療及び/又は診断目的のための)である、請求項44に記載の方法。
  47. (i)核タンパク質カーゴが、請求項1から6のいずれか一項に規定の通りである;
    (ii)合成ペプチドシャトル剤が、請求項1又は7から23のいずれか一項に規定の通りである;
    (iii)真核細胞が、ある濃度の請求項24に規定のカーゴ及び/若しくは合成ペプチドシャトル剤と接触される;
    (iv)方法が請求項25に規定の使用のためのものである;
    (v)真核細胞が請求項26に規定の通りである;又は
    (vi)(i)～(v)の任意の組合せである、
    請求項44から46のいずれか一項に記載の方法。
  48. カーゴ形質導入のための方法であって、標的真核細胞を、前記カーゴ及び合成ペプチドシャトル剤の非存在下と比較して、前記カーゴの形質導入効率を増加させるのに十分な濃度の前記合成ペプチドシャトル剤と接触させる工程を含み、前記合成ペプチドシャトル剤が、20未満のアミノ酸長のペプチドであり、シャトル剤及びカーゴが、細胞膜を渡る形質導入の時点で共有結合していない、方法。
  49. 合成ペプチドシャトル剤が、
    - Schiffer-Edmundsonのホイール表示において140度から280度の疎水性角度を規定するヘリックスの一方の側の疎水性アミノ酸残基のクラスター、及び
    - Schiffer-Edmundsonのホイール表示において40度から160度の正に荷電した角度を規定するヘリックスの他方の側の正に荷電した残基のクラスター
    を有する両親媒性ヘリックスを含むヘリックス領域を含む、請求項48に記載の方法。
  50. 疎水性角度が、Schiffer-Edmundsonのホイール表示において160度から260度である、請求項49に記載の方法。
  51. 疎水性角度が、Schiffer-Edmundsonのホイール表示において180度から240度である、請求項49に記載の方法。
  52. 正に荷電した角度が、Schiffer-Edmundsonのホイール表示において40度から140度である、請求項49から51のいずれか一項に記載の方法。
  53. 正に荷電した角度が、Schiffer-Edmundsonのホイール表示において60度から140度である、請求項49から51のいずれか一項に記載の方法。
  54. 正に荷電した角度が、Schiffer-Edmundsonのホイール表示において60度から120度である、請求項49から51のいずれか一項に記載の方法。
  55. 疎水性クラスター中の残基の少なくとも20%、30%、40%、又は50%が疎水性残基である、請求項49から54のいずれか一項に記載の方法。
  56. 疎水性残基が、フェニルアラニン、イソロイシン、トリプトファン、ロイシン、バリン、メチオニン、チロシン、システイン、グリシン、及びアラニンからなる群から選択される、請求項55に記載の方法。
  57. 疎水性残基が、フェニルアラニン、イソロイシン、トリプトファン、及び/又はロイシンからなる群から選択される、請求項55に記載の方法。
  58. 正に荷電したクラスター中の残基の少なくとも20%、30%、40%、又は50%が正に荷電した残基である、請求項49から57のいずれか一項に記載の方法。
  59. 正に荷電した残基が、リシン、アルギニン、及びヒスチジンからなる群から選択される、請求項49から58のいずれか一項に記載の方法。
  60. 正に荷電した残基が、リシン及びアルギニンからなる群から選択される、請求項49から58のいずれか一項に記載の方法。
  61. 合成ペプチドシャトル剤が、少なくとも8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、又は19アミノ酸長である、請求項49から60のいずれか一項に記載の方法。
  62. 合成ペプチドシャトル剤が、少なくとも3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、又は5.5の疎水性モーメント(μH)を有する、請求項49から61のいずれか一項に記載の方法。
  63. カーゴが、ポリペプチド、ペプチド、核タンパク質(例えば、請求項1から6のいずれか一項に規定の通りの)、小分子、オリゴヌクレオチド、又はオリゴヌクレオチド類似体(例えば、非アニオン性オリゴヌクレオチド類似体)である、請求項49から62のいずれか一項に記載の方法。
  64. 請求項1から63のいずれか一項に規定のシャトル剤である合成ペプチド。
  65. シャトル剤が、前記合成ペプチドシャトル剤の非存在下と比較して、前記カーゴの形質導入効率を増加させるのに十分な濃度で使用され、合成ペプチドシャトル剤及びカーゴが共有結合していない、治療及び/又は真核細胞中でのカーゴ形質導入(例えば、ポリペプチド、ペプチド、核タンパク質(例えば、請求項1から6のいずれか一項に規定の通り)、小分子、オリゴヌクレオチド、若しくはオリゴヌクレオチド類似体(例えば、非アニオン性オリゴヌクレオチド類似体))における使用のための、請求項64に記載の合成ペプチド。
  66. 医薬(例えば、請求項42に規定の疾患を治療するための)の製造のための、請求項1から63のいずれか一項に規定の合成ペプチドシャトル剤の使用。
  67. 請求項64に規定の合成ペプチドシャトル剤及び好適な賦形剤を含む組成物。
  68. 粘液産生膜(例えば、気道上皮)を渡る非アニオン性カーゴの送達における使用のための、又は使用にとって好適な合成ペプチドシャトル剤であって、フレキシブルリンカードメインにN及びC末端で隣接する、シャトル剤活性を有する中央コア両親媒性アルファヘリックス領域を含むか、又はそれから本質的になり、フレキシブルリンカードメインの一方又は両方が、十分な数の非カチオン性の親水性残基を含むか、又はそれから本質的になり、その結果、合成ペプチドシャトル剤の粘液産生膜を渡るカーゴ形質導入活性がフレキシブルリンカードメインを欠く中央コア両親媒性アルファヘリックス領域のものと比較して増大している、合成ペプチドシャトル剤。
  69. 中央コア両親媒性アルファヘリックス領域が、
    (a)エンドソーム溶解性ペプチドである;
    (b)少なくとも8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、若しくは19アミノ酸長である;
    (c)請求項14(a)若しくは15に規定の親シャトル剤の断片である;
    (d)請求項18から29若しくは49から60のいずれか一項に規定の両親媒性ヘリックスである;
    (e)少なくとも3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、若しくは5.5の疎水性モーメント(μH)を有する;又は
    (f)(a)～(e)の任意の組合せである、
    請求項68に記載の合成ペプチドシャトル剤。
  70. 非カチオン性の親水性残基が、グリシン、セリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、チロシン、スレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミン、又はその任意の組合せを含む、又はそれから本質的になる、請求項68又は69に記載の合成ペプチドシャトル剤。
  71. フレキシブルリンカードメインが、請求項12に規定の通りである、請求項68から70のいずれか一項に記載の合成ペプチドシャトル剤。
  72. 請求項42又は43に規定の使用のための、請求項68から71のいずれか一項に記載の合成ペプチドシャトル剤。
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