JP2023543141A - フィブリンおよび／またはフィブリノゲンを含む保存安定フィルム - Google Patents

Abstract

フィブリンおよび/またはフィブリノゲンを含む乾燥フィルムならびにそれを使用する方法が本明細書に記載される。特定の局面では、当該乾燥フィルムは室温で保存安定性がある。特定の局面では、本明細書に記載される乾燥フィルムは、それを必要とする対象における創傷を予防または治療するのに有効である。TIFF2023543141000009.tif74170

Description

関連出願の相互参照
本願は2020年8月31日に出願の米国特許出願第63/072,753号の優先権を主張し、該出願はその全体において参照により本明細書に組み入れられる。

背景
創傷へのフィブリノゲンまたはフィブリンのゲルまたはフィルムの適用は、創傷の治癒を向上させかつよくある合併症を予防することができる。例えば、瘢痕ヘルニアは腹部手術の合併症としてよく見られ、かなりの患者罹患率および増加した医療費をもたらしている。米国では毎年400～500万例の腹部切開(開腹術)が実施されており、これらの処置後11～23％にヘルニアが発生している。瘢痕ヘルニアは目に見える前腹壁の隆起という表面的な変形だけでなく、腸閉塞、腸管虚血、腸管皮膚瘻、ならびに患者の身体活動および就労に対する著しい制限を含む深刻な病的状態をもたらし得る。その結果、毎年400,000例を超える瘢痕ヘルニア修復術が実施されており、一般外科医によって実施される最も一般的な手術の1つとなっている。瘢痕ヘルニア修復術による米国の医療費の増加は、このある程度若年の患者集団向けの失業手当の費用を除いても、現在では年間80億ドルを超えると推定されている。研究では瘢痕ヘルニアは手術後の筋膜腹壁の治癒が不十分または不良であることが原因であると示されている。したがって、病的な肥満、糖尿病、喫煙、慢性肺疾患、手術部位感染症および未熟な手術手技を含むヘルニア形成の危険因子として認識されているものはいずれも創傷治癒を阻害する。主要な危険因子の発生率が増加しているため、瘢痕ヘルニアの有病率も増加すると予測される。

手術創などの創傷の治癒を向上させかつ瘢痕ヘルニアを予防するために利用可能な現在の組成物は調製に時間を要しかつ/または調製が困難であり、使用前の調製には保存安定性が著しく欠如している。特に臨床環境において、調製が容易でありかつ迅速な適用が可能な、創傷治癒を向上させるための新規な方法および組成物が必要とされている。

トロンビンおよび/またはカルシウムにより重合した薄い乾燥フィブリンフィルムがWO2017210267（特許文献1）に記載されている。しかしながら、これらのフィルムは、薄い乾燥フィブリンフィルムの創傷治癒特性を向上させるための臨床的に関連する量の銀または銀の好ましい物理的形態、すなわち銀マイクロ粒子、を記載していない。

使いやすく、経済的に実行可能であり、化学量論的に正確かつ一貫性のある、銀マイクロ粒子およびフィブリンのための送達システムを特定することは非常に困難であることが歴史的に証明されてきた。本開示はこれらの問題に対する解決策を提供する。フィブリンは現在では、フィブリノゲンとトロンビンとを含むキットとして、凍結されてまたは凍結乾燥粉末として販売されており、使用前に解凍するかまたは再構成する必要がある。微粉末として供給される銀マイクロ粒子は、それらの密度が高いために、どちらの製品成分にも均一に分散しない。液体フィブリンと、トロンビンと、銀とを含む従来の製品はWO2013138238に記載されている。それらの製品では、3つの成分が創傷において手で混合されていた。この送達方法は実験目的には許容可能であるが、広く使用するには不便であり、FDAの承認を受けた市販品としては実際には受け入れられない。

本開示は、銀とフィブリンとの治療用混合物を含有し、極端な温度で数年間安定しており、取り扱いおよび適用が容易であり、銀が耐擦傷性を有し、現在の創傷ケアのワークフローに容易に組み入れることができる乾燥した薄いフィルムを提供することによって、これらの重大な問題に対する解決策を提供する。

WO2017210267

概要
1つの局面では、フィブリン、フィブリノゲン、またはそれらの組み合わせと、銀マイクロ粒子とを含み、フィルム1cm²あたり約0.01国際単位(IU)以下のトロンビンを含有し、室温で少なくとも18ヶ月間安定な乾燥フィルムが本明細書において提供される。

いくつかの態様では、銀マイクロ粒子は1～50mg銀/cm²フィルムの濃度で存在する。

いくつかの態様では、銀マイクロ粒子は2.5～25mg銀マイクロ粒子/cm²フィルムの濃度で存在する。

いくつかの態様では、銀マイクロ粒子は約2μm～1,000μmの範囲の平均直径を有する。

いくつかの態様では、銀マイクロ粒子は約15μmの平均直径を有する。

いくつかの態様では、フィブリンまたはフィブリノゲンは全血または全血漿の成分として存在する。

いくつかの態様では、フィブリン、フィブリノゲンまたはそれらの組み合わせは0.5～20.0mg/cm²フィルムの量で存在する。

いくつかの態様では、フィブリノゲンは2.5～4.0mg/cm²フィルムの量で存在する。

いくつかの態様では、フィルムはトロンビンを含有しない。

いくつかの態様では、フィルムは対象に適用されると0.02～5.0ppmの銀イオンを放出する。

いくつかの態様では、フィルムは約0.5～2.0mg/cm²の水分含有量を有する。

いくつかの態様では、フィルムは約0.9mg/cm²の水分含有量を有する。

いくつかの態様では、フィルムはフィルムの表面に銀マイクロ粒子を含む。

いくつかの態様では、フィルムの表面の銀マイクロ粒子は耐擦傷性を有する。

いくつかの態様では、耐擦傷性はブラッシングによって判定される。

いくつかの態様では、フィルムの表面の銀マイクロ粒子は少なくとも100回のブラッシングアッセイの繰り返しに対して耐擦傷性を有する。

いくつかの態様では、フィルムは、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、または少なくとも5回の折り曲げ回数を有する。

いくつかの態様では、折り曲げ回数は、フィルムが破損または破断するまでフィルムを折り曲げることによって決定される。

いくつかの態様では、フィルムは、少なくとも5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、500、または1000回の耐折度を有する。

いくつかの態様では、耐折度は、フィルムが破損または破断するまで同じ折り線に沿ってフィルムを折り曲げて開くことによって決定される。

いくつかの態様では、フィルムは約50～1000mmの破裂圧を有する。

いくつかの態様では、フィルムは少なくとも800mmHgの破裂圧を有する。

いくつかの態様では、フィルムは室温で少なくとも15か月間安定している。

いくつかの態様では、安定性は、破裂圧および耐折度によって判定される。

いくつかの態様では、フィルムは、室温で15か月間の保存後、少なくとも5回の折り曲げ回数を有する。

いくつかの態様では、フィルムは、室温で15か月間の保存後、少なくとも100回の耐折度を有する。

いくつかの態様では、フィルムは、室温で15か月間の保存後、少なくとも800の破裂圧を有する。

いくつかの態様では、フィルムは粘着性コーティングをさらに含む。

いくつかの態様では、粘着性コーティングは酸化再生セルロースである。

いくつかの態様では、粘着性コーティングはフィルムの5重量％～25重量％の量でフィルム上に存在する。

いくつかの態様では、フィルムは無菌である。

いくつかの態様では、フィルムはガンマ線照射によって滅菌されている。

いくつかの態様では、フィルムはカルシウムをさらに含む。

いくつかの態様では、カルシウムは0.00005～0.20mg/cm²フィルムの濃度でフィルムに存在する。

いくつかの態様では、フィルムは0.1mm～1mmの厚さを有する。

いくつかの態様では、フィルムは約100μm、150μm、または200μmの厚さを有する。

別の局面では、有効量の乾燥フィルムを創傷に適用する工程を含む、対象における創傷を治療する方法が本明細書において提供される。

いくつかの態様では、乾燥フィルムを含む保存容器を開封してから15分未満後に乾燥フィルムが創傷に適用される。

いくつかの態様では、乾燥フィルムを含む保存容器を開封してから1～15分後に乾燥フィルムが創傷に適用される。

いくつかの態様では、創傷は急性創傷、慢性創傷、非治癒性創傷、糖尿病性足潰瘍、静脈性下肢潰瘍、褥瘡、手術創、動脈性創傷、外傷性創傷、またはICD-9コードによって定義される皮膚障害である。

いくつかの態様では、創傷は非治癒性創傷である。

いくつかの態様では、創傷は、減少した術後癒着初期形成、減少した術後癒着再形成、細胞および組織生着からの創傷、および熱傷からなる群より選択される。

いくつかの態様では、乾燥フィルムは対象の創傷へのフィルムの適用後28日未満で分解する。

別の局面では、ヒト血漿を取得する工程；血漿を型に入れる工程；血漿に重合剤を加えることによって血漿を重合してゲルを形成する工程；ゲルに銀マイクロ粒子を加えて銀マイクロ粒子含有血漿ゲルを生成する工程；重合ゲルから流体を除去してフィルムを生成する工程；フィルムを乾燥させる工程；およびフィルムをガンマ線滅菌する工程を含む、対象における創傷を治療するための乾燥フィルムを製造する方法が本明細書において提供される。

いくつかの態様では、フィルムを生成するための流体の除去は約1.25 Torr～125 Torrの圧力でゲルに真空圧をかけることによって実施される。

いくつかの態様では、重合剤はCaCl₂またはトロンビンである。

いくつかの態様では、重合剤はCaCl₂である。

いくつかの態様では、0.5～1mg/mlのCaCl₂が血漿に加えられる。

いくつかの態様では、約0.86mg/mlのCaCl₂が血漿に加えられる。

いくつかの態様では、方法はフィルムを乾燥させる前にフィルムをグリセリン溶液とインキュベートする工程をさらに含む。

いくつかの態様では、グリセリン溶液はグリセリンを2％含む。

いくつかの態様では、銀マイクロ粒子は血漿に加えられる。

いくつかの態様では、銀マイクロ粒子はゲルの重合前に加えられる。

いくつかの態様では、銀マイクロ粒子は銀マイクロ粒子を血漿と混合することによって加えられる。

いくつかの態様では、銀マイクロ粒子はゲルの重合後に加えられる。

いくつかの態様では、銀マイクロ粒子はゲルからの流体の除去前に加えられる。

いくつかの態様では、銀マイクロ粒子はゲルからの流体の除去後に加えられる。

いくつかの態様では、銀マイクロ粒子はグリセリン溶液インキュベーション後に加えられる。

いくつかの態様では、銀マイクロ粒子は銀マイクロ粒子を含むスプレーコーティングを重合ゲルに適用することによって加えられる。

いくつかの態様では、銀マイクロ粒子は1～50mg銀/cm²フィルムの濃度で存在する。

いくつかの態様では、銀マイクロ粒子は2.5～25mg銀/cm²フィルムの濃度で存在する。

いくつかの態様では、銀マイクロ粒子は2μm～1,000μmの範囲の平均直径を有する。

いくつかの態様では、銀マイクロ粒子は約15μmの平均直径を有する。

いくつかの態様では、フィルムはリン脂質をさらに含む。

いくつかの態様では、リン脂質はホスファチジルセリンまたはホスファチジルコリンである。

カルシウムが0.00005～0.20mg/cm²フィルムの濃度でフィルムに存在する、請求項44～65のいずれか一項記載の方法。

いくつかの態様では、フィルムはフィルム1cm²あたり約0.0999IU未満のトロンビンを含む。

いくつかの態様では、方法は血漿を型に入れた後に血漿を37℃でインキュベートする工程をさらに含む。

いくつかの態様では、血漿は37℃で5～30分間インキュベートされる。

いくつかの態様では、血漿は37℃で15分間インキュベートされる。

いくつかの態様では、方法はグリセリン溶液とのインキュベーション後にゲルを37℃でインキュベートする工程をさらに含む。

いくつかの態様では、ゲルは37℃で5～60分間インキュベートされる。

いくつかの態様では、ゲルは37℃で5分間インキュベートされる。

いくつかの態様では、フィルムは42℃～50℃の温度で乾燥される。

いくつかの態様では、フィルムは30分～120分間乾燥される。

いくつかの態様では、フィルムはコンベクションオーブン内で乾燥される。

いくつかの態様では、フィルムは約0.5～2.0mg/cm²の水分含有量を有する。

いくつかの態様では、フィルムは約0.9mg/cm²の水分含有量を有する。

いくつかの態様では、方法はフィルムに粘着性コーティングを加える工程をさらに含む。

いくつかの態様では、粘着性コーティングは酸化再生セルロースである。

いくつかの態様では、粘着性コーティングは5重量％～25重量％の量でフィルム上に存在する。

いくつかの態様では、方法はヒト血漿をウイルス不活性化する工程をさらに含む。

いくつかの態様では、ウイルス不活性化は溶媒/界面活性剤および/またはナノろ過を含む。

いくつかの態様では、溶剤/界面活性剤はトリトンX-100である。

いくつかの態様では、フィルムは約0.1mm～1mmの厚さを有する。

別の局面では、対象における創傷を形成しやすい領域に、有効量の乾燥フィルムを適用する工程を含む、対象における創傷を予防する方法が本明細書において提供される。

いくつかの態様では、乾燥フィルムは、乾燥フィルムを含む保存容器を開封してから15分未満後に、創傷を形成しやすい領域に適用される。

いくつかの態様では、乾燥フィルムは、乾燥フィルムを含む保存容器を開封してから1～15分間後に、創傷を形成しやすい領域に適用される。

いくつかの態様では、創傷は非治癒性創傷である。

いくつかの態様では、創傷は急性創傷、慢性創傷、非治癒性創傷、糖尿病性足潰瘍、静脈性下肢潰瘍、褥瘡、手術創、動脈性創傷、外傷性創傷、またはICD-9コードによって定義される皮膚障害である。

いくつかの態様では、創傷は非治癒性創傷である。

いくつかの態様では、創傷はヘルニアである。

いくつかの態様では、乾燥フィルムは、対象における創傷を形成しやすい領域へのフィルムの適用後28日未満で分解する。

本発明のこれらおよび他の特徴、局面、および利点は以下の説明および添付の図面に関連してよりよく理解されるであろう。

図1は本明細書において開示される乾燥フィルムの態様を示す図面である。 図2A～2Dは様々な溶液における銀マイクロ粒子のイオン化を示す。マイクロ粒子は4つの異なる時間/温度エンドポイント(37℃で1時間、24時間および7日間、ならびに50℃で72時間)まで4つの液体ベヒクル中で抽出された。データは平均±標準偏差(SD)である。図2Aは水中でのイオン化を示す。図2Bは擬似体液SBF中でのイオン化を示す。図2Cは生理食塩水中でのイオン化を示す。図2Dはヒト血漿中でのイオン化を示す。 図3Aは血漿フィルム内に混合された銀マイクロ粒子が遺伝的に糖尿病(db/db)のマウスにおいて皮膚創傷治癒を促進することを示す。平均曲線下面積(AUC)分析は、スチューデントt検定によって判定されるように、食塩水で処理した対照に対して銀マイクロ粒子含有血漿フィルムで処理した動物で有意に低かった。 図3Bは液体フィブリンシーラントを加えた銀マイクロ粒子が遺伝的に糖尿病(db/db)のマウスにおいて皮膚創傷治癒を促進することを示す。平均曲線下面積(AUC)分析は、スチューデントt検定によって判定されるように、食塩水で処理した対照に対して液体フィブリンシーラントを加えた銀マイクロ粒子で処理した動物で有意に低かった。 図4は銀マイクロ粒子Lを含有する乾燥フィブリンフィルムで処理した糖尿病マウス(C57BL/KsJ-db/db)における切除皮膚創傷を治癒する代表的な組織学的試料を示す。いくつかの多核巨細胞が銀マイクロ粒子を取り囲み(黒い矢印)、組織処理時の銀マイクロ粒子の遊離に起因する空間を取り囲んでいる(白い矢印)ことを見ることができる。倍率40X。 図5は提案した臨床試験のイベントのスケジュールを提供する。

詳細な説明
定義
特に明記しない限り請求項および明細書で用いられる用語を下に記載のように定義する。

「約」という用語は、明確に記載された場合を除いて、特定された値の+/-15％を意味する。いくつかの態様では、「約」は特定された値の+/-5％を意味する。

本明細書において用いられる「乾燥フィルム」という用語は、フィルムから水分を実質的に除去するためのプロセス(例えば、圧力および/または熱の印加)に供されたことのある、本明細書に記載されるフィブリン/フィブリノゲンを含むフィルム(例えば、全血または全血漿を含むフィルム)を指す。

安定性または「保存安定性」という用語は、製品が、特定された限度内ならびにその保存および使用期間全体にわたって、その製造時に有していたのと同じ特性および特徴を保持する程度を指す。例えば、製品の安定性はフィルム製品がその製造時に有していたのと同じ破裂圧、すなわち、800～1,300mmHgを有するものとして測定することができる。例示的な安定性の具体的な限度は、新しく合成したフィルムと比較して、選択された期間後に定量的な測定基準の少なくとも80％を維持することである。定量的な測定基準とは、破裂圧、折り曲げ回数、および耐折度を非限定的に含む。いくつかの態様では、安定性は2つ以上の定量的な測定基準の組み合わせである。

「向上した創傷治癒」という用語は、本開示の方法および組成物で治療されたことがない創傷と比較して、創傷治癒の効率の増加および/または得られる治癒した創傷部位の強度の増加を指す。特定の場合では、向上した創傷治癒とは、本開示の方法および組成物で治療されたことがない対応する創傷と比較して、創傷への成熟コラーゲンの沈着の増加を指す。

「非治癒性創傷」という用語は、医学的な介入をしないと治癒しない創傷、または医学的な介入をしないと十分な期間内に治癒せず、経時的な感染の危険性または創傷の重症度の増加に繋がる可能性がある創傷を指す。非治癒性創傷の例は糖尿病性足潰瘍、静脈性潰瘍、褥瘡、動脈性潰瘍、慢性潰瘍、外傷、手術創、および皮膚障害を非限定的に含む。

本明細書において用いられる「インサイチュ」という用語は、対象への(例えば、対象の創傷の部位への)薬学的組成物の適用を指す。

「インビボ」という用語は生体内で起きるプロセスを指す。

本明細書において用いられる「哺乳動物」という用語はヒトおよび非ヒトを両方含み、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ネズミ、ウシ、ウマ、およびブタを非限定的に含む。

「十分な量」という用語は所望の効果を生み出すのに十分な量、例えば、対象における創傷治癒を向上させるのに十分な量を意味する。

「治療有効量」という用語は疾患の症状を改善するのに有効な量である。

明細書および添付の請求項において用いられるように、単数形を表す「1つの（a）」、「1つの（an）」および「その（the）」は、文脈がそうでないことを明確に示している場合を除いて、指示対象の複数形を含むことに留意されたい。

簡潔には、そして下により詳細に記載されるように、対象における創傷治癒を向上するための方法および組成物が本明細書に記載される。本アプローチのいくつかの特徴に留意されたい。組成物は室温で最低でも3年間は安定しており、創傷に容易に適用し得る。組成物は、その中の成分の正確な投与を含め、創傷表面への組成物の均一な適用を可能にするドライフィルムとして適用される。銀を加えたフィブリノゲン/フィブリンの組成物は、単球/マクロファージの多核巨細胞への融合の増加および創傷全体にわたる成熟コラーゲンの沈着を含む、創傷治癒を向上する。

フィブリン/フィブリノゲンおよび銀を含むフィルム
フィブリン、フィブリノゲン、またはそれらの組み合わせを含む乾燥フィルムが本明細書に記載される。特定の局面では、乾燥フィルムは室温で保存安定性がある。特定の態様では、乾燥フィルムは室温で少なくとも3年間安定している。

フィブリンおよび/またはフィブリノゲンは全血、全血漿、寒冷沈降物、またはフィブリノゲン濃縮物の成分として供給し得る。フィブリノゲンは組換えフィブリノゲンにも由来する場合がある。よって、特定の態様では、フィブリンまたはフィブリノゲンは全血漿に由来する。特定の態様では、フィブリンまたはフィブリノゲンは組換えフィブリノゲンに由来する。特定の態様では、フィブリンまたはフィブリノゲンは寒冷沈降フィブリンまたはフィブリノゲンに由来する。

特定の態様では、フィブリンおよび/またはフィブリノゲンは濃度が0.5～20.0mg/cm²フィルムである。特定の態様では、フィブリンおよび/またはフィブリノゲンは濃度が1.0～10.0mg/cm²フィルム、0.5～1.0mg/cm²フィルム、0.5～5.0mg/cm²フィルム、1.0～2.0mg/cm²フィルム、2.0～3.0mg/cm²フィルム、3.0～4.0mg/cm²フィルム、4.0～5.0mg/cm²フィルム、5.0～6.0mg/cm²フィルム、6.0～7.0mg/cm²フィルム、7.0～8.0mg/cm²フィルム、8.0～9.0mg/cm²フィルム、9.0～10.0mg/cm²フィルム、1.5～2.0mg/cm²フィルム、2.0～2.5mg/cm²フィルム、2.5～3.0mg/cm²フィルム、3.0～3.5mg/cm²フィルム、3.5～4.0mg/cm²フィルム、4.0～4.5mg/cm²フィルム、4.5～5.0mg/cm²フィルム、、5.0～5.5mg/cm²フィルム、5.5～6.0mg/cm²フィルム、6.0～6.5mg/cm²フィルム、または、6.5～7.0mg/cm²フィルム、7.0～7.5mg/cm²フィルム、7.5～8.0mg/cm²フィルム、8.0～8.5mg/cm²フィルム、8.5～9.0mg/cm²フィルム、9.0～9.5mg/cm²フィルム、または9.5～10.0mg/cm²フィルムである。特定の態様では、フィブリンおよび/またはフィブリノゲンは濃度が約4.0mg/cm²フィルムである。

特定の態様では、1mLの血漿ごとに1～5mgのフィブリノゲンがフィルムに存在する。特定の態様では、1mLの血漿ごとに2～5mg、2.5～4.5mg、3.0～5.0mg、2.0～3.0mg、3.0～4.0mg、4.0～5.0mg、2.5～3.0mg、3.0～3.5mg、3.5～4.0mg、4.0～4.5mg、または4.5～5.0mgのフィブリノゲンがフィルムに存在する。

特定の態様では、0.1～1.0mLの全血漿から1cm²の乾燥フィルムが得られる。特定の態様では、0.1～0.5mL、0.5～1.0mL、0.1～0.2mL、0.2～0.3mL、0.3～0.4mL、0.4～0.5mL、0.5～0.6mL、0.7～0.8mL、0.8～0.9mL、0.9～1.0mLの全血漿から1cm²の乾燥フィルムが得られる。特定の態様では、約0.1mL、約0.2mL、約0.3mL、約0.4mL、約0.5mL、約0.6mL、約0.7mL、0.8mL、0.9mL、または約1.0mLから1cm²の乾燥フィルムが得られる。

特定の態様では、フィルムは厚さが1mm未満である。特定の態様では、フィルムは厚さが1mm～5mm、0.1～1.5mm、0.1～1.0mm、0.5～1.0mm、または0.1～0.5mmである。特定の態様では、フィルムは厚さが0.1～0.3mmである。特定の態様では、フィルムは厚さが0.1～0.2mmである。特定の態様では、フィルムは厚さが0.15～0.2mmである。特定の態様では、フィルムは厚さが0.1～0.3mm、0.1～0.2mm、または0.15～0.2mmである。

特定の態様では、フィルムは力学的強度および弾性の両方を有する。特定の態様では、フィルムは1.5倍の弾性を可能にする弾性率および800mmHgを超える破裂圧を有する。

特定の態様では、フィルムはインプラント後50日未満で分解する。特定の態様では、フィルムは、インプラント後45日未満、40日未満、35日未満、30日未満、25日未満、24日未満、23日未満、22日未満、21日未満、20日未満、19日未満、18日未満、17日未満、16日未満、15日未満、14日未満、13日未満、12日未満、11日未満、10日未満、9日未満、8日未満、7日未満、6日未満、5日未満、4日未満、3日未満、または2日未満で分解する。特定の態様では、フィルムはインプラント後28日未満で分解する。特定の態様では、フィルムはインプラント後21日未満で分解する。

特定の態様では、フィルムは、放出制御特性を有する様々な化合物と共に組み込まれ、例えば、本記載のフィルムには、インプラント後にフィルムが分解するまで連続的に放出され得る銀マイクロ粒子が充填される。

特定の態様では、フィルムは銀をさらに含む。特定の態様では、銀は、金属銀マイクロ粒子(平均直径2μｍ～1,000μm)、銀化合物（炭酸銀、塩化銀、リン酸銀、フッ化銀、酢酸銀、硫酸銀、クエン酸銀、酸化銀）もしくはナノ銀（平均直径＜2μm）、またはこれらの組み合わせの形態であり得る。

様々な大きさの銀マイクロ粒子、例えば、5μm（Silpowder 225, Technic, Inc）、15μm（Atomized fine silver powder 81-800, Technic, Inc.）、および45μm（Silver powder 327093, Sigma Chemicals）が複数の市販業者から広く入手可能である。

特定の態様では、フィルムにおける銀の濃度は、総濃度がAg＞2nM（2.0×10^-9M）である。特定の態様では、金属銀の濃度は、2nM～1μM、2nM～100nM、2nM～10nM、10nM～100nM、100nM～1μM、5nM～10nM、10nM～20nM、20nM～50nM、2nM～5nM、または500nM～1μMである。特定の態様では、フィルムにおける銀の溶解濃度は、約2nM、約5nM、約10nM、約15nM、約20nM、約30nM、約40nM、約50nM、約50nM、約70nM、約80nM、約90nM、約100nM、約150nM、約200nM、約250nM、約300nM、約350nM、約400nM、約450nM、約500nM、約550nM、約600nM、約650nM、約700nM、約750nM、約800nM、約850nM、約900nM、約950nM、または約1μMである。

特定の態様では、フィルムは、銀とフィブリン/フィブリノゲンとの重量/重量比が、0.01(wt/wt)以上、0.1(wt/wt)以上、または0.2(wt/wt)以上、または0.3(wt/wt)以上、または0.4(wt/wt)以上、または0.5(wt/wt)以上、または0.6(wt/wt)以上、または0.7(wt/wt)以上、または0.8(wt/wt)以上、または0.9(wt/wt)以上、または1(wt/wt)以上、または1.1(wt/wt)以上、または1.2(wt/wt)以上、または1.3(wt/wt)以上、または1.4(wt/wt)以上、または1.5(wt/wt)以上、または1.6(wt/wt)以上、または1.7(wt/wt)以上、または1.8(wt/wt)以上、または1.9(wt/wt)以上、または2(wt/wt)以上、または2.1(wt/wt)以上、または2.2(wt/wt)以上、または2.3(wt/wt)以上、または2.4(wt/wt)以上、または2.5(wt/wt)以上、または2.6(wt/wt)以上、または2.7(wt/wt)以上、または2.8(wt/wt)以上、または2.9(wt/wt)以上、または3(wt/wt)以上、または4(wt/wt)以上、または5(wt/wt)以上、または10(wt/wt)以上である。例えば、有効量の薬学的組成物は、2.2(wt/wt)以上の銀とフィブリン/フィブリノゲンとの重量/重量比を含み得る。特定の態様では、有効量の薬学的組成物は、約1.5(wt/wt)、約1.6(wt/wt)、約1.7(wt/wt)、約1.8(wt/wt)、約1.9(wt/wt)、2.0(wt/wt)、約2.1(wt/wt)、約2.2(wt/wt)、約2.3(wt/wt)、約2.4(wt/wt)、約2.5(wt/wt)、約2.6(wt/wt)、約2.7(wt/wt)、約2.8(wt/wt)、約2.9(wt/wt)、約3.0(wt/wt)、約3.1(wt/wt)、約3.2(wt/wt)、約3.3(wt/wt)、約3.4(wt/wt)、約3.5(wt/wt)、約3.6(wt/wt)、約3.7(wt/wt)、約3.8(wt/wt)、約3.9(wt/wt)、約4.0(wt/wt)、または約5.0(wt/wt)の銀とフィブリン/フィブリノゲンとの重量/重量比を含んでもよい。

特定の態様では、フィルムは、対象に適用されると0.0002～50.0ppmの銀イオンを放出する。特定の態様では、フィルムは、対象に適用されると0.02～5.0ppmの銀イオンを放出する。特定の態様では、フィルムは、対象に適用されると0.0001～0.001、0.001～0.01、0.01～0.1、0.1～1.0、0.001～0.005、0.005～0.01、0.01～0.05、0.05～0.10、0.10～0.15、0.15～0.20、0.20～0.25、0.25～0.30、0.30～0.35、0.35～0.40、0.40～0.45、0.45～0.50、0.50～0.55、0.55～0.60、0.60～0.65、0.65～0.70、0.70～0.75、0.75～0.80、0.80～0.85、0.85～0.90、0.90～0.95、0.95～0.10、1～2、2～3、3～4、4～5、5～10、10～20、20～30、30～40、または40～50ppmの銀イオンを放出する。

特定の態様では、銀は実質的に中実の粒子の形態である。実質的に中実の粒子は、いくつかの場合では、多孔性（例えば、マイクロ多孔性、ナノ多孔性など）であってもよい。しかしながら、実質的に中実の粒子にはシェルに囲まれた空隙を有する中空の粒子は包含されない。これらの態様では、銀粒子は中空の粒子を含まない。特定の場合では、銀粒子はポリマー材料を含まない。例えば、銀粒子は銀のみ（例えば、銀、酸化銀、銀イオンなど）を含み得る。

特定の態様では、銀はマイクロ粒子またはナノ粒子の形態である。特定の態様では、マイクロ粒子またはナノ粒子は、金属銀マイクロ粒子または金属銀ナノ粒子である。特定の態様では、銀を含むマイクロ粒子またはナノ粒子は、金属銀ではなく、別の形態の銀（例えば、炭酸銀、塩化銀、リン酸銀、フッ化銀、酢酸銀、硫酸銀、クエン酸銀、酸化銀、またはそれらの組み合わせ）である。

特定の態様では、銀マイクロ粒子は2μm～1,000μmの平均直径範囲を有する。特定の態様では、銀マイクロ粒子は10μm～1,000μm、100μm～1,000μm、1μm～1,000μm、10μm～100μm、500μm～1,000μm、1μm～10μm、または10～500μmの平均直径範囲を有する。いくつかの態様では、銀マイクロ粒子は10～20μmの平均直径範囲を有する。いくつかの態様では、銀マイクロ粒子は約2μm、7μm、10μm、15μm、20μm、または25μmの平均直径を有する。いくつかの態様では、銀マイクロ粒子は約15μmの平均直径を有する。

特定の態様では、フィルムに存在する銀マイクロ粒子における金属銀の量は0.1～50mg銀/cm²フィルムである。特定の態様では、フィルムに存在する金属銀の量は、10～50mg銀/cm²、1～5mg銀/cm²、5～10mg銀/cm²、10～15mg銀/cm²、15～20mg銀/cm²、20～25mg銀/cm²、25～30mg銀/cm²、30～35mg銀/cm²、35～40mg銀/cm²、45～50mg銀/cm²、10～20mg銀/cm²、20～30mg銀/cm²、30～40mg銀/cm²、または40～50mg銀/cm²である 特定の態様では、銀マイクロ粒子は、約5mg銀/cm²、約10mg銀/cm²、約15mg銀/cm²、約20mg銀/cm²、約25mg銀/cm²、約30mg銀/cm²、約35mg銀/cm²、約40mg銀/cm²、約45mg銀/cm²、または約50mg銀/cm²の濃度で存在する。

特定の態様では、フィルムは約0.1～50mg銀マイクロ粒子/cm²フィルムを含む。特定の態様では、フィルムは、約10～50mg銀マイクロ粒子/cm²、1～5mg銀マイクロ粒子/cm²、5～10mg銀マイクロ粒子/cm²、10～15mg銀マイクロ粒子/cm²、15～20mg銀マイクロ粒子/cm²、20～25mg銀マイクロ粒子/cm²、25～30mg銀マイクロ粒子/cm²、30～35mg銀マイクロ粒子/cm²、35～40mg銀マイクロ粒子/cm²、45～50mg銀マイクロ粒子/cm²、10～20mg銀マイクロ粒子/cm²、20～30mg銀マイクロ粒子/cm²、30～40mg銀マイクロ粒子/cm²、または40～50mg銀マイクロ粒子/cm²を含む。特定の態様では、フィルムは、約5mg銀マイクロ粒子/cm²、約10mg銀/cm²、約15mg銀マイクロ粒子/cm²、約20mg銀マイクロ粒子/cm²、約25mg銀マイクロ粒子/cm²、約30mg銀マイクロ粒子/cm²、約35mg銀マイクロ粒子/cm²、約40mg銀マイクロ粒子/cm²、約45mg銀マイクロ粒子/cm²、または約50mg銀マイクロ粒子/cm²を含む。

いくつかの場合では、銀マイクロ粒子の大きさは適用部位において対象に異物反応を誘導するのに十分なものである。例えば、マイクロ粒子は2μm～1000μmの範囲の平均直径を有する。これに対し、ナノ粒子は1nm～1000nmの平均直径を有する。いくつかの場合では、銀マイクロ粒子は、2μm以上、例えば3μm以上、一例を挙げると4μm以上、または5μm以上、または7μm以上、または10μm以上、または15μm以上、または20μm以上、または25μm以上、または50μm以上、または75μm以上、または100μm以上、または150μm以上または200μm以上、または250μm以上または500μm以上の平均直径を有する。例えば、銀マイクロ粒子は、2μm～1000μm、例えば2μm～750μm、一例を挙げると3μm～500μm、または5μm～250μmの範囲の平均直径を有し得る。特定の場合では、銀マイクロ粒子は5μm以上の平均直径を有する。いくつかの場合では、銀マイクロ粒子は200μm以上の平均直径を有する。いくつかの態様では、銀マイクロ粒子は上記の大きさのうちで異なる大きさの範囲を有する銀マイクロ粒子の混合物を含む。本明細書において用いられるように、「平均」という用語は算術平均を意味する。

特定の場合では、銀粒子は実質的に対称な形状を有する。例えば、銀粒子は実質的に球形、楕円形、円筒形などの形状を有し得る。いくつかの態様では、銀粒子は実質的に球形の形状を有する。別の態様では、銀粒子は不規則な形状を有し得る。特定の場合では、銀粒子は実質的に平滑な外面を有する。別の場合では、銀粒子は凹凸のある(例えば、粗い)外面を有する。いくつかの場合では、銀粒子は上に記載される異なる形状および/または凹凸を有する銀粒子の混合物を含む。特定の場合では、銀粒子は、適用部位にて対象に異物反応を誘導するのに十分な形状および/または凹凸を有する。例えば、銀粒子は、球形、棒状、星形、不規則形状、およびそれらの組み合わせなどを有してもよい。

特定の態様では、フィルムはトロンビンをさらに含む。特定の態様では、フィルムは、フィルム1cm²あたり少なくとも2IU/mlのトロンビンを含む。特定の態様では、フィルムはフィルム1cm²あたり2.5IU超のトロンビンを有する。特定の態様では、フィルムは、フィルム1cm²あたり2～2,500IU、2～10IU、2～100IU、100～200IU、200～500IU、500～1,000IU、または1,000～2,500IUのトロンビンを有する。特定の態様では、フィルムは、フィルム1cm²あたり0.1IU未満のトロンビンを含む。特定の態様では、フィルムは、フィルム1cm²あたり0.105IU、0.1IU、0.095IU、0.09IU、0.05IU、0.01IU、0.009IU、0.005IU、または0.001IU未満のトロンビンを含む。特定の態様では、フィルムはトロンビンを含まない。

特定の態様では、フィルムは全血漿を含み、フィルム内の血漿はさらにトロンビンを含む。特定の態様では、全血漿は血漿1mlあたり少なくとも2IU/mlのトロンビンを有する。特定の態様では、全血漿は血漿1mlあたり2.5IU超のトロンビンを有する。特定の態様では、フィルムは、血漿1mlあたり2～2,500IU、2～10IU、2～100IU、100～200IU、200～500IU、500～1,000IU、または1,000～2,500IUのトロンビンを有する全血漿を含む。特定の態様では、全血漿は血漿1mlあたり0.105IU/ml、0.1IU/ml、0.095IU/ml、0.09IU/ml、0.05IU/ml、0.01IU/ml、0.009IU/ml、0.005IU/ml、または0.001IU/ml未満のトロンビンを有する。

特定の態様では、フィルムはカルシウムをさらに含む。特定の態様では、フィルムは0.01～1mg CaCl₂/cm²フィルムを含む。特定の態様では、フィルムは0.01～0.10、0.01～0.02、0.02～0.03、0.03～0.04、0.04～0.05、0.05～0.06、0.06～0.07、0.07～0.08、0.09～0.10、0.1～0.2、0.2～0.3、0.3～0.4、0.4～0.5、05～0.6、0.6～0.7、0.7～0.8、0.8～0.9、0.9～1.0mg/CaCl₂/cm²フィルムを含む。

特定の局面では、本明細書に記載される乾燥フィルムは乾燥フィルムを含む保存容器から取り出されて使用可能になる。特定の態様では、本明細書に記載される乾燥フィルムは使用可能であり、使用前にさらなる成分または添加剤を何ら必要としない。特定の態様では、本明細書に記載される乾燥フィルムは乾燥フィルムを含む保存容器から取り出した5分、4分、3分、2分、1分、45秒、30秒、20秒、10秒 5秒以内、またはその直後に用い得る。

特定の局面では、本明細書に記載される乾燥フィルムは最大で3年間安定している。例えば、乾燥フィルムは、少なくとも1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月、4ヶ月、5ヶ月、6ヶ月、7ヶ月、8ヶ月、9ヶ月、10ヶ月、11ヶ月、12ヶ月、13ヶ月、14ヶ月、15ヶ月、16ヶ月、17ヶ月、18ヶ月、19ヶ月、20ヶ月、21ヶ月、22ヶ月、23ヶ月、24ヶ月、25ヶ月、26ヶ月、27ヶ月、28ヶ月、29ヶ月、30ヶ月、31ヶ月、32ヶ月、33ヶ月、34ヶ月、35ヶ月、または36ヶ月以上にわたり安定であり得る。1つの局面では、安定性とは、新しく合成したフィルムと比較して、選択された時間の後に、破裂圧、折り曲げ回数、または耐折度などの定量的な測定基準の少なくとも80％の維持である。いくつかの局面では、安定性は単一の定量的な測定基準、または別の定量的な測定基準との組み合わせであり得る。1つの態様では、安定性は破裂圧と耐折度との組み合わせである。例示的な安定性測定基準は、少なくとも800mmHgの破裂圧、および少なくとも100回の耐折度である。いくつかの態様では、安定性測定基準は、少なくとも800mmHgの破裂圧、および少なくとも100回の耐折度である。いくつかの態様では、安定性測定基準は、少なくとも800mmHgの破裂圧、および少なくとも500回の耐折度である。いくつかの態様では、安定性測定基準は、少なくとも800mmHgの破裂圧、および少なくとも1000回の耐折度である。

銀マイクロ粒子含有フィルムの安定性は、医薬品規制調和国際会議(ICH) Q1A (R2)：新規有効成分・製剤の安定性試験に従って2つの条件でモニタリングし得る：1．条件A(2～8℃)は、製剤(銀マイクロ粒子含有フィルム)が保存される温度での安定性を評価し；2．条件B(23～27℃/相対湿度[RH]55～65％)は、室温が制御されている場合の、製剤(銀マイクロ粒子含有フィルム)に対する影響を評価する。銀マイクロ粒子含有フィルムは2～8℃および23～27℃/相対湿度55～65％で最大3年間保存し得る。フィルムの安定性は少なくとも1か月、3か月、6か月、9か月、12か月、18か月、24か月、30か月、および36か月後での業界で標準的な手順に従って破裂圧、折り曲げ回数、耐折度を測定することによって評価し得る。破裂圧はASTM Standard Test Method for Burst Pressure. Strength of Surgical Sealants (F 2392-04)に従って自社の方法で測定し得る。いくつかの態様では、柔軟性のある血漿ベースのフィルムの破裂圧は約50～1000mmHgである。

フィルムの柔軟性を判定するための折り曲げ回数は、フィルムの折り曲げ回数の評価である。そのような判定は、フィルムの半分を残りの半分に折り重ね、スタックを90°回転させ、スタックの半分をもう一方の上に再度折り重ね、フィルムが破損または破断するまで繰り返すことによって達成される。フィルムの破断を引き起こすことなく折り曲げるたびに折り曲げ回数が1ずつ増えていく。この試験は、血漿ベースのフィルムがきつく曲げられた際のその完全性を維持する能力を評価するのに特に有用である。いくつかの態様では、本発明の柔軟性のある血漿ベースのフィルムは、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45、少なくとも50回の折り曲げ回数を有する。

フィルムの柔軟性を判定する別の試験は耐折度の評価である。そのような判定は、フィルムの半分を別の半分に折り重ね、元の位置まで開くことを繰り返すことによって達成される。耐折度は、そのような折り曲げ/開くことの繰り返しの回数によって表され、耐摩耗性を推定するための手段を提供する。いくつかの態様では、本発明の柔軟性のある血漿ベースのフィルムは、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45、少なくとも50、少なくとも100、少なくとも150、少なくとも200、少なくとも250、少なくとも300、少なくとも350、少なくとも400、少なくとも450、少なくとも500、少なくとも550、少なくとも600、少なくとも650、少なくとも700、少なくとも750、少なくとも800、少なくとも850、少なくとも900、少なくとも950、または少なくとも1000回もしくは以上、またはそれより大きな耐折度を有する。

別の局面では、フィルム表面の銀または銀マイクロ粒子は耐擦傷性を有する。本明細書において用いられるように、「耐擦傷性(abrasion resistant)」または「耐擦傷性(abrasion resistance)」とは乾燥後にフィルムから剥がれ落ちるかまたは払い落とされる銀または銀マイクロ粒子残留物の分量がないことである。耐擦傷性は、銀含有フィルムを秤量し、ブラシまたは器具でフィルムを繰り返しブラッシングし、ブラッシング後にフィルムを再度秤量することによって判定し得る。摩擦によって除去された銀の量は総重量、または失われた重量のパーセンテージとして評価し得る。いくつかの態様では、該分量は製造時にフィルムに適用された銀の総量の0.1％未満、0.5％未満、1％未満、2％未満、3％未満、4％未満、または5％未満である。いくつかの態様では、該分量は製造時にフィルムに適用された銀の総mg量の0.25mg/cm²未満、0.5mg/cm²未満、0.75mg/cm²未満、1mg/cm²未満、または1.25mg/cm²未満である。

特定の局面では、本明細書に記載される乾燥フィルムは約0.5～2.0mg/cm²の水分含有量(含水量)を有する。例えば、乾燥フィルムは約0.5～2.0mg/cm²、0.5～1.0mg/cm²、0.5～0.9mg/cm²、0.7～0.9mg/cm²、0.7～1.0mg/cm²、0.7～1.1mg/cm²、0.7～1.2mg/cm²、0.7～1.5mg/cm²、0.7～1.8mg/cm²、0.7～2.0mg/cm²、0.8～0.9mg/cm²、0.8～1.0mg/cm²、0.8～1.1mg/cm²、0.8～1.2mg/cm²、0.8～1.5mg/cm²、0.8～1.8mg/cm²、0.8～2.0mg/cm²、0.9～1.0mg/cm²、0.9～1.1mg/cm²、0.9～1.2mg/cm²、0.9～1.5mg/cm²、0.9～1.8mg/cm²、0.9～2.0mg/cm²、1.0～1.1mg/cm²、1.0～1.2mg/cm²、1.0～1.5mg/cm²、1～1.8mg/cm²、1.0～2.0mg/cm²、1.2～1.5mg/cm²、1.2～1.8mg/cm²、1.2～2.0mg/cm²、1.5～1.8mg/cm²、1.5～2mg/cm²、または1.8～2mg/cm²の水分含有量を有し得る。いくつかの態様では、乾燥フィルムは約0.5mg/cm²、0.6mg/cm²、0.7mg/cm²、0.8mg/cm²、0.9mg/cm²、1.0mg/cm²、1.1mg/cm²、1.2mg/cm²、1.3mg/cm²、1.4mg/cm²、1.5mg/cm²、1.6mg/cm²、1.7mg/cm²、1.8mg/cm²、1.9mg/cm²、または2.0mg/cm²の水分含有量を有し得る。いくつかの態様では、乾燥フィルムは0.9mg/cm²の水分含有量を有する。フィルムの水分含有量は乾燥フィルムを秤量し、オーブン内でさらなる期間、例えば、3時間、80℃でフィルムを乾燥させ、次いでフィルムを再度秤量して水分の蒸発による重量損失を測定することによって評価し得る。

特定の局面では、本明細書に記載される乾燥フィルムは約2％～5％の水分含有量(含水量)を有する。例えば、乾燥フィルムは約2％～2.5％、2％～3％、2％～3.5％、2％～4％、2％～4.5％、2％～5％、3％～3.3％、3％～3.5％、3％～4％、3％～4.5％、3％～5％、4％～4.5％、または4％～5％の水分含有量を有し得る。いくつかの態様では、乾燥フィルムは約2％、2.3％、2.5％、2.7％、3％、3.3％、3.5％、3.7％、4％、4.3％、4.5％、4.7％、または5％の水分含有量を有する。いくつかの態様では、乾燥フィルムは約3.3％の水分含有量を有する。

いくつかの態様では、銀マイクロ粒子を含有する乾燥フィルムは少なくとも1つのリン脂質も含む。リン脂質は重合工程時に加え得る。例示的なリン脂質はホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、およびホスファチジルエタノールアミンである。いくつかの態様では、フィルムはホスファチジルセリンを含む。いくつかの態様では、フィルムはホスファチジルコリンを含む。いくつかの態様では、フィルムはホスファチジルエタノールアミンを含む。いくつかの態様では、フィルムはホスファチジルセリンおよびホスファチジルコリンを含む。

銀マイクロ粒子などの銀はフィルム全体に均一またはフィルム全体に不均一に分布し得る。いくつかの態様では、銀マイクロ粒子などの銀はフィルムの厚さ全体に均一に分布する。いくつかの態様では、銀マイクロ粒子などの銀はフィルムの厚さ全体に不均一に分布する。例えば、フィルムの上面および/または底面に近づくほど銀の量が多くなり、フィルムの中心に近づくほど銀の量が少なくなるという濃度勾配を形成し得る。例示的な濃度勾配(フィルム中の銀全体のパーセントとして)は99％～1％(表面から中心に向かって)、97％～3％(表面から中心に向かって)、95％～5％(表面から中心に向かって)、90％～10％(表面から中心に向かって)、85％～15％(表面から中心に向かって)、80％～20％(表面から中心に向かって)、75％～25％(表面から中心に向かって)、70％～30％(表面から中心に向かって)、65％～35％(表面から中心に向かって)、60％～40％(表面から中心に向かって)、および55％～45％(表面から中心に向かって)を非限定的に含む。フィルムは、フィルムの厚さのうちの上および/または下5％、10％、15％、20％、30％または40％の表面により多くの量の銀マイクロ粒子を有し得る。例えば、1mmのフィルムでは、上および下0.1mmにより多くの量の銀マイクロ粒子などの銀を有する場合、フィルムはフィルムの厚さのうちの上および下10％の表面により多くの量の銀を有する。

追加の薬剤を含むフィルム
本明細書に記載される乾燥フィルムは、治療すべき状態に応じて、単独で、または他の治療と組み合わせて同時もしくは逐次的のいずれかで、投与し得る。

特定の態様では、フィルムは追加の成分、例えば、非限定的には線維素溶解阻害剤、アルブミン(例えば、ヒトアルブミン)、クエン酸三ナトリウム、ヒスチジン、ナイアシンアミド、ポリソルベート80、水(例えば、注射用水などの滅菌水)、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、それらの組み合わせなどを含む。例えば、第1の材料前駆体剤は、フィブリノゲンに加えて、線維素溶解阻害剤、アルブミン(例えば、ヒトアルブミン)、クエン酸三ナトリウム、ヒスチジン、ナイアシンアミド、ポリソルベート80、水(例えば、注射用水などの滅菌水)などのうちの1つまたは複数を含み得る。いくつかの場合では、第2の材料前駆体剤は、トロンビンに加えて、アルブミン(例えば、ヒトアルブミン)、水(例えば、注射用水などの滅菌水)、塩化カルシウム、塩化ナトリウムなどのうちの1つまたは複数を含み得る。フィルムに含まれ得る成分の追加の例はアプロチニンなどのプロテアーゼ阻害剤を非限定的に含む。特定の態様では、フィルムが全血または血漿に由来する場合、フィルムはフィルムを生成するために血液または血漿を取得する時点で血液または血漿に存在する追加の成分を含む。

粘着性コーティングを含むフィルム
特定の態様では、本明細書に記載される乾燥フィルムは粘着性コーティングをさらに含む。粘着性コーティングは、セルロースを非限定的に含む、粘着力を高める任意の好適な材料からなり得る。シグマからの低、中または高粘度CMCも再生セルロースの代わりに用い得る。特定の態様では、粘着性コーティングはセルロースを含む。特定の態様では、粘着性コーティングは酸化再生セルロースを含む。特定の態様では、粘着性コーティングはカルボキシメチルセルロースを含む。特定の態様では、粘着性コーティングは、1重量％～25重量％、10重量％～20重量％、5重量％～10重量％、10重量％～15重量％、15重量％～20重量％、20重量％～25重量％、5重量％～20重量％、または15重量％～25重量％の量でフィルムに存在する。特定の態様では、粘着性コーティングは約5重量％、6重量％、7重量％、8重量％、9重量％、10重量％、11重量％、12重量％、13重量％、14重量％、15重量％、16重量％、17重量％、18重量％、19重量％、20重量％、21重量％、22重量％、23重量％、24重量％、または25重量％の量でフィルムに存在する。

セリウムを含むフィルム
特定の局面では、セリウムを含む乾燥フィルムが本明細書において提供される。特定の態様では、乾燥フィルムは銀マイクロ粒子およびセリウムを含む。特定の態様では、セリウムは、フィルムを生成するための流体の除去前に、重合ゲルに10～500mM、20～400mM、10～100mM、20～50mM、50～100mM、100～150mM、150～200mM、200～250mM、250～300mM、300～350mM、350～400mM、または400～500mMの濃度で存在する。特定の態様では、セリウムは、フィルムを生成するための流体の除去前に、重合ゲルに約20mM、約30mM、約40mM、約50mM、約60mM、約70mM、約80mM、約90mM、約100mM、約110mM、約120mM、約130mM、約140mM、約150mM、約160mM、約170mM、約180mM、約190mM、約200mM、約210mM、約220mM、約230mM、約240mM、約250mM、約260mM、約270mM、約280mM、約290mM、約300mM、約310mM、約320mM、約320mM、約330mM、約340mM、約350mM、約360mM、約370 mM 約380mM、約390mMまたは約400mMの濃度で存在する。

特定の態様では、セリウムを含む乾燥フィルムは銀をさらに含む。特定の態様では、銀は銀ナノ粒子または銀マイクロ粒子の形態である。特定の態様では、銀は金属銀ナノ粒子または金属銀マイクロ粒子の形態である。特定の態様では、セリウムおよび銀マイクロ粒子を含む乾燥フィルムは10～50mg銀マイクロ粒子/cm²フィルムを含む。特定の態様では、セリウムを含む乾燥フィルムはフィルムに存在する銀マイクロ粒子を、10～50mg銀/cm²、1～5mg銀/cm²、5～10mg銀/cm²、10～15mg銀/cm²、15～20mg銀/cm²、20～25mg銀/cm²、25～30mg銀/cm²、30～35銀mg/cm²、35～40mg銀/cm²、45～50mg銀/cm²、10～20mg銀/cm²、20～30mg銀/cm²、30～40mg銀/cm²、または40～50mg銀/cm²創傷表面積で、さらに含む。特定の態様では、銀マイクロ粒子は約5mg銀/cm²、約10mg銀/cm²、約15mg銀/cm²、約20mg銀/cm²、約25mg銀/cm²、約30mg銀/cm²、約35mg銀/cm²、約40mg銀/cm²、約45mg銀/cm²、または約50mg銀/cm²フィルムの濃度で存在する。

全血からのフィルム
特定の局面では、本明細書に記載される乾燥フィルムは全血を含む。特定の局面では、全血を含む乾燥フィルムは患者の創傷を治療するかまたは予防するために用いることを意図した自己全血である。

例としては、フィルムは、本明細書に記載される方法を介して、患者からの採血の直後に作製され得る。例示的な方法は、患者の血液をカルシウムおよび/またはトロンビンと混合して血餅(ゲル)を形成し、血餅(ゲル)を小型の真空治具に入れ、低真空を5分間かける。真空工程の前または後に銀を加え得、次いでフィルムを創傷に貼付し得る。そのような製作は患者側で実施し得、10分未満で創傷にフィルムを貼付して開始および完了し得るプロセスが得られる。小さなフィルムはドナーまたは患者からのわずか10mLの全血で作製し得る。

特定の態様では、本明細書に記載される乾燥フィルムは全血を含み、銀をさらに含む。特定の態様では、本明細書に記載される乾燥フィルムは全血を含み、マイクロ粒子またはナノ粒子の形態の銀をさらに含む。特定の態様では、本明細書に記載される乾燥フィルムは全血を含み、金属銀マイクロ粒子または金属銀ナノ粒子の形態の銀をさらに含む。特定の態様では、全血からの乾燥フィルムはフィルムに存在する銀マイクロ粒子を、10～50mg銀/cm²、1～5mg銀/cm²、5～10mg銀/cm²、10～15mg銀/cm²、15～20mg銀/cm²、20～25mg銀/cm²、25～30mg銀/cm²、30～35mg銀/cm²、35～40mg銀/cm²、45～50mg銀/cm²、10～20mg銀/cm²、20～30mg銀/cm²、30～40mg銀/cm²、または40～50mg銀/cm²創傷表面積で、さらに含む。特定の態様では、銀マイクロ粒子は約5mg銀/cm²、約10mg銀/cm²、約15mg銀/cm²、約20mg銀/cm²、約25mg銀/cm²、約30mg銀/cm²、約35mg銀/cm²、約40mg銀/cm²、約45mg銀/cm²、または約50mg銀/cm²フィルムの濃度で存在する。

創傷治癒を向上させるための方法および創傷を治療するための方法
特定の局面では、本明細書に記載される方法は、創傷を治療する、ならびに急性創傷、慢性創傷、非治癒性創傷、糖尿病性足潰瘍、静脈性下肢潰瘍、褥瘡、動脈性創傷、潰瘍、腹部切開創傷、手術創、外傷性創傷、脂肪皮弁、およびICD-9コードによって定義される皮膚障害を非限定的に含む様々な創傷の治癒を向上させるためのものである。第9回改訂国際疾病分類(ICD-9)コードはCDCからcdc.gov/nchs/icd/icd9で入手可能である。

本発明が適用される頻度は治療下にある創傷の臨床状況に応じて異なり、腹部切開創傷または脂肪皮弁を治療する際の単回適用から、潰瘍、手術創、外傷性創傷、火傷または皮膚疾患を治療する際の創傷被覆材の交換と同時の複数回適用までの範囲であり得る。特定の局面では、本明細書に記載される方法は、減少した術後癒着初期形成、術後癒着再形成、ならびに細胞および組織生着（例えば、膵島または肝細胞（肝臓細胞）移植片の生存）を含む損傷した組織および細胞の治癒を向上させる。

いくつかの場合では、創傷の治癒を向上することは、本開示の方法および組成物で治療されたことのない創傷と比較して、創傷治癒の効率の増加および/または得られる治癒した創傷部位の強度の増加を含む。いくつかの場合では、創傷の治癒を向上することは、本開示の方法および組成物で治療されたことがない創傷と比較して、創傷治癒不良の発生を低減することおよび/または創傷治癒不良の重症度を低減することを含む。

特定の局面では、本明細書に記載される方法および銀含有フィルムは異物巨細胞の形成を誘導する。理論に拘束されることは望むものではないが、フィルムが5μmより大きい銀マイクロ粒子を含むいくつかの態様では、銀マイクロ粒子はマクロファージなどの細胞によって貪食され得ないことが提唱されている。これはマクロファージ細胞の融合および多核異物巨細胞の形成をもたらすことが提唱されている。理論に拘束されることを望むものではないが、そのような細胞は次いでIL-1α、IL-1β、IL-10TNF-α、TGF-β、IFN-γ、マトリクスメタロプロテアーゼ(MMP)、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2などの様々な細胞因子およびサイトカインを分泌し、かつ成長および血管新生因子も分泌する。理論に拘束されることは望むものではないが、異物巨細胞はまた線維芽細胞の活性を刺激し、細胞外マトリクスタンパク質を過剰発現させ、コラーゲンを分泌する細胞を動員する。よって、理論に拘束されることは望むものではないが、大きすぎてマクロファージによって貪食されない銀マイクロ粒子を含めることが創傷治癒の増加をもたらす。いくつかの態様では、大きすぎてマクロファージに貪食されない銀マイクロ粒子は大きさが少なくとも5μm、7μm、10μm、12μm、15μm、17μm、20μm、25μm、または30μm以上である。いくつかの態様では、大きすぎてマクロファージに貪食されない銀マイクロ粒子は大きさが少なくとも15μmである。

いくつかの場合では、本明細書に記載される方法は瘢痕ヘルニアのリスクを30％以上、例えば35％以上、一例を挙げると40％以上、または45％以上、または50％以上、または55％以上、または60％以上、または65％以上、または70％以上、または75％以上、または80％以上、または85％以上、または90％以上、または95％以上、例えば99％以上低減させる。特定の場合では、方法は瘢痕ヘルニアのリスクを60％以上低減させる。例えば、方法は対象における臨床的ヘルニアのリスクを低減させ得る。「リスクを低減させる」とは、本開示の方法によって治療された対象における瘢痕ヘルニアの発生リスクが、本開示の方法によって治療されたことがない対象におけるものよりも低くなることを意味する。「臨床的ヘルニア」とは、実験室での試験によって判定されるというよりも、むしろ患者の治療時に観察される(例えば、視覚、触覚、聴覚、嗅覚などによる)ヘルニアを意味する。例えば、臨床的ヘルニアは腹壁の目に見える膨らみとして観察され得る。

特定の態様では、対象における創傷を治療するための方法は、対象にヘルニアが発生した場合に、対象におけるヘルニアの重症度を低減させる。いくつかの場合では、ヘルニアの重症度の低減は対象におけるヘルニアの大きさの低減に対応する。例えば、方法は対象の解剖学的ヘルニアの大きさを減少させ得る。「解剖学的ヘルニア」とは臨床観察以外の方法によって、またはそれに加えて(例えば、対象の解剖、MRI、CT、超音波などによる)、検出可能なヘルニアを意味する。解剖学的ヘルニアの大きさは、切開部位における腹筋(例えば、直筋)の離間を測定することによって決定し得る。例えば、解剖学的ヘルニアの大きさは頭尾方向の最大直径に2つの横方向の直径測定値(例えば、楕円の近似値)の平均を乗じることによって推定し得る。場合によっては、方法は瘢痕ヘルニアの大きさを15％以上、例えば20％以上、一例を挙げると25％以上、または30％以上、例えば35％以上、一例を挙げると40％以上、または45％以上、または50％以上、または55％以上、または60％以上、または65％以上、または70％以上、または75％または45以上、または80％以上、または85％以上、または90％以上、または95％以上、例えば99％以上減少させる。特定の場合では、方法は瘢痕ヘルニアのリスクを55％以上低減させる。

個体に付与される本明細書に記載されるフィブリノゲン/フィブリンフィルムは、投与は好ましくは個体に利益を呈するのに十分な「治療有効量」の薬学的組成物におけるものである。「有効量」とは、所望のように、標的となる対象において有意に検出可能な効果を引き起こすのに十分な用量を意味する。いくつかの場合では、有効量の薬学的組成物は適用の部位で対象における異物反応を誘導するのに十分な量の薬学的組成物である。特定の場合では、異物反応は類上皮組織球を伴わない巨細胞からなる炎症性浸潤を含む。

特定の態様では、有効量の薬学的組成物は0.1(wt/wt)以上、または0.2(wt/wt)以上、または0.3(wt/wt)以上、または0.4(wt/wt)以上、または0.5(wt/wt)以上、または0.6(wt/wt)以上、または0.7(wt/wt)以上、または0.8(wt/wt)以上、または0.9(wt/wt)以上、または1(wt/wt)以上、または1.1(wt/wt)以上、または1.2(wt/wt)以上、または1.3(wt/wt)以上、または1.4(wt/wt)以上、または1.5(wt/wt)以上、または1.6(wt/wt)以上、または1.7(wt/wt)以上、または1.8(wt/wt)以上、または1.9(wt/wt)以上、または2(wt/wt)以上、または2.1(wt/wt)以上、または2.2(wt/wt)以上、または2.3(wt/wt)以上、または2.4(wt/wt)以上、または2.5(wt/wt)以上、または2.6(wt/wt)以上、または2.7(wt/wt)以上、または2.8(wt/wt)以上、または2.9(wt/wt)以上、または3(wt/wt)以上の銀とフィブリノゲンの重量/重量比を含む。例えば、有効量の薬学的組成物は2.2(wt/wt)以上の銀とフィブリノゲンの重量/重量比を含み得る。

特定の態様では、有効量の薬学的組成物は、例えば、0.5cm²以上、または1cm²以上、または2cm²以上、または3cm²以上、または4cm²以上、または5cm²以上、または6cm²以上、または7cm²以上、または8cm²以上、または9cm²以上、または10cm²以上、または11cm²以上、または12cm²以上、または13cm²以上、または14cm²以上、または15cm²以上、または16cm²以上、または17cm²以上、または18cm²以上、または19cm²以上、または20cm²以上、または25cm²以上、または30cm²以上、または35cm²以上、または40cm²以上、または45cm²以上、または50cm²以上の特定の創傷表面領域に適用される、本明細書に記載される量の銀を含む。例えば、有効量の薬学的組成物は10cm²以上の創傷表面領域に適用される、例えば、250mg/mLの量の銀粒子を含み得る。いくつかの場合では、有効量の薬学的組成物は、10cm²以上の創傷表面領域に適用される、例えば、2.2(wt/wt)の量の銀粒子を含み得る。

特定の局面では、有効量の薬学的組成物は銀マイクロ粒子を含む。特定の場合では、有効量の薬学的組成物は1mg銀マイクロ粒子/cm²フィルム以上、10mg銀マイクロ粒子/cm²フィルム以上、例えば25mg銀マイクロ粒子/cm²フィルム以上、一例を挙げると50mg銀マイクロ粒子/cm²フィルム以上、または75mg銀マイクロ粒子/cm²フィルム以上、または100mg銀マイクロ粒子/cm²フィルム以上、または150mg銀マイクロ粒子/cm²フィルム以上、または200mg銀マイクロ粒子/cm²フィルム以上、または250mg銀マイクロ粒子/cm²フィルム以上、または300mg銀マイクロ粒子/cm²フィルム以上含む。特定の場合では、有効量の薬学的組成物は10mg銀マイクロ粒子/cm²フィルム以上、例えば25mg銀マイクロ粒子/cm²フィルム以上、一例を挙げると50mg銀マイクロ粒子/cm²フィルム以上、または75mg銀マイクロ粒子/cm²フィルム以上、または100mg銀マイクロ粒子/cm²フィルム以上、または150mg銀マイクロ粒子/cm²フィルム以上、または200mg銀マイクロ粒子/cm²フィルム以上、または250mg銀マイクロ粒子/cm²フィルム以上、または300mg銀マイクロ粒子/cm²フィルム以上、または350mg銀マイクロ粒子/cm²フィルム以上、または400mg銀マイクロ粒子/cm²フィルム以上、または450mg銀マイクロ粒子/cm²フィルム以上、または500mg銀マイクロ粒子/cm²フィルム以上、または550mg銀マイクロ粒子/cm²フィルム以上、または600mg銀マイクロ粒子/cm²フィルム以上、または650mg銀マイクロ粒子/cm²フィルム以上、または700mg銀マイクロ粒子/cm²フィルム以上、または750mg銀マイクロ粒子/cm²フィルム以上含む。特定の場合では、有効量の薬学的組成物は50mg銀マイクロ粒子/cm²フィルムを含む。いくつかの場合では、有効量の薬学的組成物は500mg銀マイクロ粒子/cm²フィルムを含む。

創傷を予防するための方法
本明細書では創傷を予防する方法が含まれる。特定の態様では、本明細書における方法は創傷の発生を予防するか、または既存の創傷の悪化を予防する。特定の局面では、本明細書に記載される乾燥フィルムは、対象における創傷を形成しやすい対象における領域に適用される。例えば、本明細書に記載されるフィルムはヘルニアの予防、またはあらゆる軟組織補強のために適用し得る。特定の態様では、本明細書において提供されるフィルムは手術創などの創傷が悪化するのを予防するために適用される。特定の態様では、本明細書において提供されるフィルムは、例えば、外科的処置時の軟組織(死腔)の管理のために用いられる。

フィブリン/フィブリノゲンフィルムを製造する方法
本明細書にはフィブリンおよび/またはフィブリノゲンを含むフィルムを製造する方法が含まれる。特定の態様では、フィルムは任意でウイルス不活性化された全血または全血漿を取得することによって製造される。特定の態様では、全血または全血漿は好適な溶媒/界面活性剤(S/D)処理および/またはナノろ過によってウイルス不活性化されて、ウイルス粒子をさらに不活性化する/除去する。

特定の態様では、フィルムはフィブリンおよび/またはフィブリノゲンを含む溶液を型に入れる(例えば、血漿を入れる)ことによって製造される。特定の態様では、フィブリンおよび/またはフィブリノゲンを含む溶液はヒト血漿である。特定の態様では、フィブリンおよび/またはフィブリノゲンを含む溶液は精製されたかまたは組換え精製されたフィブリンおよび/またはフィブリノゲンを伴う溶液である。

特定の態様では、0.1～1.5mLの全血漿から1cm²の乾燥フィルムが得られる。特定の態様では、0.1～0.5mL、0.5～1.0mL、0.1～0.2mL、0.2～0.3mL、0.3～0.4mL、0.4～0.5mL、0.5～0.6mL、0.7～0.8mL、0.8～0.9mL、0.9～1.0mLの全血漿から1cm²の乾燥フィルムが得られる。特定の態様では、約0.1mL、約0.2mL、約0.3mL、約0.4mL、約0.5mL、約0.6mL、約0.7mL、約0.8mL、約0.9mL、約1.0mL、約1.1mL、約1.2mL、約1.3mL、約1.4mL、または約1.5mLから1cm²の乾燥フィルムが得られる。

特定の態様では、フィブリンおよび/またはフィブリノゲンを含む溶液はトロンビンと混合される。いくつかの態様では、血漿の重合は血漿の再石灰化によって達成し得る。フィブリンおよび/またはフィブリノゲンを含む溶液にCaCl₂を加えて、溶液を重合(凝固)させてゲルを形成し得る。特定の態様では、フィブリンおよび/またはフィブリノゲンを含む溶液とCaCl₂とを混合する。特定の態様では、フィブリンおよび/またはフィブリノゲンを含む溶液に約0.01～1mg CaCl₂/ml血漿を加えて溶液を重合(凝固)させてゲルを形成させる。特定の態様では、フィブリンおよび/またはフィブリノゲンを含む溶液に約0.01～0.10、0.01～0.02、0.02～0.03、0.03～0.04、0.04～0.05、0.05～0.06、0.06～0.07、0.07～0.08、0.09～0.10、0.1～0.2、0.2～0.3、0.3～0.4、0.4～0.5、05～0.6、0.6～0.7、0.7～0.8、0.8～0.9、0.9～1.0mg CaCl₂/mL血漿を加えて溶液を重合(凝固)させてゲルを形成させる。いくつかの態様では、約0.8～0.9mg CaCl₂/mL血漿を加える。いくつかの態様では、約0.85、0.86、または0.87mg CaCl₂/mL血漿を加える。

さらに、凝固系の外因性経路を活性化して血漿の重合を誘導し得る。そのような外因性活性化因子はホスファチジルセリンおよびホスファチジルコリンなどのリン脂質である。1つの態様では、フィブリンおよび/またはフィブリノゲンを含む溶液はホスファチジルセリンと混合される。1つの態様では、フィブリンおよび/またはフィブリノゲンを含む溶液はホスファチジルコリンと混合される。1つの態様では、フィブリンおよび/またはフィブリノゲンを含む溶液は0.1～1mg/ml、0.1～0.2mg/ml、0.2～0.3mg/ml、0.3～0.4mg/ml、0.4～0.5mg/ml、0.5～0.6mg/ml、0.6～0.7mg/ml、0.7～0.8mg/ml、0.8～0.9mg/ml、または0.9～1.0mg/mlのリン脂質と混合される。

特定の態様では、フィブリンおよび/またはフィブリノゲンを含む溶液は型に溶液を注ぐ前にウイルス不活性化される。溶液は当技術分野における任意の公知の方法、例えば、溶媒-界面活性剤処理によってウイルス不活性化し得る。トリトンX-100を非限定的に含む、任意の好適な溶媒-界面活性剤を用い得る。本開示のフィルムの作製における使用に好適なウイルス不活性化された血漿は、Octapaharma USA, (Paramus, New Jersey)からのOctaplasなど、市販されている。

フィブリンおよび/またはフィブリノゲン(例えば、血漿)を含む溶液は型の中で重合してゲルになる。特定の態様では、ゲル(例えば、血漿)の重合は37℃で起きる。特定の態様では、フィブリンおよび/またはフィブリノゲンを含む溶液(例えば、血漿)の重合は室温で起きる。重合は5分～60分かかり得る。いくつかの態様では、フィブリンおよび/またはフィブリノゲンを含む溶液(例えば、血漿)を5分～60分間、例えば、5～10分間、5～15分間、5～30分間、5～45分間、5～60分間、10～20分間、10～30分間、10～45分間、10～60分間、15～30分間、15～45分間、15～60分間、30～45分間、30～60分間、5、8、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55または60分間インキュベートする。いくつかの態様では、フィブリンおよび/またはフィブリノゲンを含む溶液(例えば、血漿)を37℃で5～30分間インキュベートする。いくつかの態様では、フィブリンおよび/またはフィブリノゲンを含む溶液(例えば、血漿)を37℃で15分間インキュベートする。

重合ゲルから流体を除去してフィルムを形成する。特定の態様では、流体の除去は圧力の印加によって実施される。特定の態様では、流体の除去は真空の使用またはゲルの遠心分離によって実施される。

特定の態様では、重合ゲルは5～15分間、1～30分間、1～60分間、1分～12時間、または1分間～24時間にわたり500～5,000PSI、または1,000～3,000PSI、または1,000～2,000PSI、または2,000～3,000PSIの機械的圧力に供される(すなわち「プレスされる」)。特定の態様では、プレスされた重合体はゲルを乾燥させて乾燥フィルムにするのに十分な時間にわたり十分な圧力に供される。

特定の態様では、重合ゲルは約1～150 Torr、1～1.5 Torr、1.5～125 Torr、1.5～10 Torr、10～20 Torr、20～30 Torr、30～40 Torr、40～50 Torr、50～60 Torr、60～70 Torr、70～80 Torr、80～90 Torr、90～100 Torr、100～110 Torr、110～120 Torr、120～130 Torr、130～140 Torr、または140～150 Torrの真空に供される。特定の態様では、重合ゲルは5～15分間、1～30分間、1～60分間、1分間～12時間、または1分間～24時間にわたり約1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、120、130、140、または150 Torrの真空に供される。特定の態様では、重合ゲルは15分間にわたり1.5torr～125torrの真空圧に供される。特定の態様では、重合ゲルは15分間にわたり約1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、120、130、140、または150torrの真空圧に供される。

特定の態様では、フィルムはグリセリンまたはグリセロール溶液浴中でインキュベートされる。フィルムは銀マイクロ粒子などの銀の添加前または銀の添加後にグリセリンまたはグリセロール溶液浴中でインキュベートし得る。浴は1～5％グリセロール溶液であり得る。例えば、溶液は1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、または5％グリセリン溶液であり得る。溶液は1～5％グリセロール溶液であり得る。例えば、浴は1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、または5％グリセリン溶液であり得る。いくつかの態様では、溶液は2％グリセリン溶液である。いくつかの態様では、溶液は5％グリセリン溶液である。フィルムはグリセリンまたはグリセロール浴中で直接的にインキュベートし得るか、または真空プレスモジュール内にある間にグリセリンまたはグリセロール溶液をフィルムに塗布し、真空引きしてグリセリンまたはグリセロール溶液をフィルムに引き込み得る。

特定の態様では、銀はフィルムを乾燥させる前に加えられる。特定の態様では、銀は血漿に加えられる。特定の態様では、銀は重合ゲルに加えられる。特定の態様では、銀は溶液をプレスする前に加えられる。特定の態様では、銀は銀のスプレーコーティングを適用することによってプレスした後に加えられる。いくつかの態様では、銀はスプレーコーティングを介して適用される。特定の態様では、銀は溶液に真空圧を印加する前に加えられる。特定の態様では、銀は溶液に真空圧を印加した後に加えられる。特定の態様では、銀はあらゆる流出液を除去する前に加えられる。特定の態様では、銀はあらゆる流出液を除去した後に加えられる。特定の態様では、銀はグリセリンまたはグリセロール溶液のインキュベーションまたは浴の前に加えられる。特定の態様では、銀はグリセリンまたはグリセロール溶液のインキュベーションまたは浴の後に加えられる。

いくつかの態様では、銀は銀マイクロ粒子である。特定の態様では、銀マイクロ粒子はフィルムを乾燥させる前に加えられる。特定の態様では、銀マイクロ粒子は血漿に加えられる。特定の態様では、銀マイクロ粒子は重合ゲルに加えられる。特定の態様では、銀マイクロ粒子はゲルの重合前に加えられる。特定の態様では、銀マイクロ粒子はゲルの重合後に加えられる。特定の態様では、銀マイクロ粒子はゲルからの流体の除去前に加えられる。特定の態様では、銀マイクロ粒子はゲルからの流体の除去後に加えられる。特定の態様では、銀マイクロ粒子はグリセリンまたはグリセロール溶液のインキュベーションまたは浴の前に加えられる。特定の態様では、銀マイクロ粒子はグリセリンまたはグリセロール溶液のインキュベーションまたは浴の後に加えられる。

いくつかの態様では、銀マイクロ粒子などの銀はフィルムの片面に適用し得る。いくつかの態様では、銀マイクロ粒子などの銀はフィルムの両面に適用し得る。いくつかの態様では、銀マイクロ粒子などの銀はフィルム内部に散在するかまたは分布し得る。

特定の態様では、銀マイクロ粒子は2μm～1,000μmの平均直径範囲を有する。特定の態様では、銀マイクロ粒子は10μm～1,000μm、100μm～1,000μm、1μm～1,000μm、10μm～100μm、500μm～1,000μm、1μm～10μm、または10～500μmの平均直径範囲を有する。いくつかの態様では、銀マイクロ粒子は10～20μmの平均直径範囲を有する。いくつかの態様では、銀マイクロ粒子は約2μm、7μm、10μm、15μm、20μm、または25μmの平均直径を有する。いくつかの態様では、銀マイクロ粒子は約15μmの平均直径を有する。

特定の態様では、血漿、ゲル、またはフィルムに加えられる銀マイクロ粒子中の金属銀の量は0.1～50mg銀/cm²フィルムである。特定の態様では、血漿、ゲル、またはフィルムに加えられた存在する金属銀の量は10～50mg銀/cm²、1～5mg銀/cm²、5～10mg銀/cm²、10～15mg銀/cm²、15～20mg銀/cm²、20～25mg銀/cm²、25～30mg銀/cm²、30～35mg銀/cm²、35～40mg銀/cm²、45～50mg銀/cm²、10～20mg銀/cm²、20～30mg銀/cm²、30～40mg銀/cm²、または40～50mg銀/cm²である。特定の態様では、血漿、ゲル、またはフィルムに加えられた存在する金属銀の量は10～50mg銀/ml、1～5mg銀/ml、5～10mg銀/ml、10～15mg銀/ml、15～20mg銀/ml、20～25mg銀/ml、25～30mg銀/ml、30～35mg銀/ml、35～40mg銀/ml、45～50mg銀/ml、10～20mg銀/ml、20～30mg銀/ml、30～40mg銀/ml、または40～50mg銀/mlである。特定の態様では、銀マイクロ粒子は約5mg銀/cm²、約10mg銀/cm²、約15mg銀/cm²、約20mg銀/cm²、約25mg銀/cm²、約30mg銀/cm²、約35mg銀/cm²、約40mg銀/cm²、約45mg銀/cm²、または約50mg銀/cm²血漿、ゲル、またはフィルムの濃度で存在する。特定の態様では、銀マイクロ粒子は約5mg銀/ml、約10mg銀/ml、約15mg銀/ml、約20mg銀/ml、約25mg銀/ml、約30mg銀/ml、約35mg銀/ml、約40mg銀/ml、約45mg銀/ml、または約50mg銀/ml血漿、ゲル、またはフィルムの濃度で存在する。

特定の態様では、血漿、ゲル、またはフィルムに約0.1～50mg銀マイクロ粒子/cm²フィルム、または0.1～50mg銀マイクロ粒子/ml血漿もしくはゲルが加えられる。特定の態様では、血漿、ゲル、またはフィルムに約10～50mg銀マイクロ粒子/cm²フィルムまたはmg銀マイクロ粒子/ml血漿もしくはゲル、1～5mg銀マイクロ粒子/cm²フィルムまたはmg銀マイクロ粒子/ml血漿もしくはゲル、5～10mg銀マイクロ粒子/cm²フィルムまたはmg銀マイクロ粒子/ml血漿もしくはゲル、10～15mg銀マイクロ粒子/cm²フィルムまたはmg銀マイクロ粒子/ml血漿もしくはゲル、15～20mg銀マイクロ粒子/cm²フィルムまたはmg銀マイクロ粒子/ml血漿もしくはゲル、20～25mg銀マイクロ粒子/cm²フィルムまたはmg銀マイクロ粒子/ml血漿もしくはゲル、25～30mg銀マイクロ粒子/cm²フィルムまたはmg銀マイクロ粒子/ml血漿もしくはゲル、30～35mg銀マイクロ粒子/cm²フィルムまたはmg銀マイクロ粒子/ml血漿もしくはゲル、35～40mg銀マイクロ粒子/cm²フィルムまたはmg銀マイクロ粒子/ml血漿もしくはゲル、45～50mg銀マイクロ粒子/cm²フィルムまたはmg銀マイクロ粒子/ml血漿もしくはゲル、10～20mg銀マイクロ粒子/cm²、20～30mg銀銀マイクロ粒子/cm²フィルムまたはmg銀マイクロ粒子/ml血漿もしくはゲル、30～40mg銀マイクロ粒子/cm²フィルムまたはmg銀マイクロ粒子/ml血漿もしくはゲル、あるいは40～50mg銀マイクロ粒子/cm²フィルムまたはmg銀マイクロ粒子/ml血漿もしくはゲルが加えられる。特定の態様では、血漿、ゲル、またはフィルムに約5mg銀マイクロ粒子/cm²、約10mg銀/cm²、約15mg銀マイクロ粒子/cm²、約20mg銀マイクロ粒子/cm²、約25mg銀マイクロ粒子/cm²、約30mg銀マイクロ粒子/cm²、約35mg銀マイクロ粒子/cm²、約40mg銀マイクロ粒子/cm²、約45mg銀マイクロ粒子/cm²、または約50mg銀マイクロ粒子/cm²が加えられる。特定の態様では、血漿、ゲル、またはフィルムに約5mg銀マイクロ粒子/ml、約10mg銀/ml、約15mg銀マイクロ粒子/ml、約20mg銀マイクロ粒子/ml、約25mg銀マイクロ粒子/ml、約30mg銀マイクロ粒子/ml、約35mg銀マイクロ粒子/ml、約40mg銀マイクロ粒子/ml、約45mg銀マイクロ粒子/ml、または約50mg銀マイクロ粒子/mlが加えられる。

特定の態様では、流体除去から生成されたフィルムはガンマ線照射に供される。特定の態様では、フィルムは流体の除去後に室温で保存される。特定の態様では、フィルムはガンマ線照射後に室温で保存される。

特定の態様では、本明細書において開示されるフィルムおよびフィルムを含む薬学的組成物は無菌容器に包装される。特定の態様では、ガンマ線照射後、圧縮された重合ゲルが室温で保存される。

特定の態様では、フィルムを生成するための流体の除去前にセリウムが重合ゲルに加えられる。特定の態様では、セリウムは10～500mM、20～400mM、10～100mM、20～50mM、50～100mM、100～150mM、150～200mM、200～250mM、250～300mM、300～350mM、350～400mM、または400～500mMの濃度で重合ゲルに存在する。特定の態様では、セリウムは約20mM、約30mM、約40mM、約50mM、約60mM、約70mM、約80mM、約90mM、約100mM、約110mM、約120mM、約130mM、約140mM、約150mM、約160mM、約170mM、約180mM、約190mM、約200mM、約210mM、約220mM、約230mM、約240mM、約250mM、約260mM、約270mM、約280mM、約290mM、約300mM、約310mM、約320mM、約320mM、約330mM、約340mM、約350mM、約360mM、約370mM 約380mM、約390mMまたは約400mMの濃度で重合ゲルに存在する。

フィルムは銀の適用および/またはグリセリンもしくはグリセロール浴中でのインキュベーション後に乾燥させ得る。いくつかの態様では、フィルムは40～70℃、例えば、40～45℃、45～50℃、50～55℃、55～60℃、60～65℃、または65～70℃にてオーブン中で乾燥される。いくつかの態様では、フィルムは42～50℃にてオーブン中で乾燥される。いくつかの態様では、フィルムは約40、42℃、45℃、47℃、50℃、55℃、60℃、65℃、または70℃にてオーブン中で乾燥される。いくつかの態様では、フィルムは約42℃にてオーブン中で乾燥される。いくつかの態様では、フィルムは約50℃にてオーブン中で乾燥される。フィルムは約15分～3時間乾燥させ得る。いくつかの態様では、フィルムは約15分～30時間、30分～2時間、45分～1.5時間、または約1時間乾燥される。いくつかの態様では、フィルムは約15分、30分、45分、60分、75分、90分、105分、120分、135分、150分、165分、または180分間乾燥される。

特定の態様では、粘着性コーティングがフィルムに加えられる。

キット
上に記載される主題の方法を実施する際に用いられるキットも提供される。例えば、主題の方法を実施するためのキットは、創傷(例えば、腹部切開部位)の治癒を促進するのに有効な量で本明細書に記載される乾燥フィルムを含む無菌容器を含み得る。特定の態様では、キットは無菌容器の無菌性を維持するように構成された密閉パッケージを含む。密閉パッケージは、汚れ、微生物(例えば、真菌、細菌、ウイルス、胞子形態など)、液体、気体などの外部汚染物質が密閉パッケージに入ることが実質的にできないように密閉し得る。例えば、密閉パッケージはパッケージが水密および/または気密になるように密閉し得る。

上の構成要素に加えて、主題のキットは主題の方法を実施するための指示書をさらに含み得る。これらの指示書は様々な形態で対象のキットに存在し得、そのうちの1つまたは複数がキットに存在し得る。これらの指示書が存在し得る1つの形態は、好適な媒体または基材上の印刷された情報、例えば、キットの包装、パッケージ添付文書などに情報が印刷された紙片または紙片群として存在し得る。別の手段は、情報が記録されたかまたは保存されたコンピュータ可読媒体、例えば、CD、DVD、Blu-ray、コンピュータ可読メモリなどであろう。存在し得るさらに別の手段は、除去部位での情報にアクセスするためにインターネットを介して用られ得るウェブサイトアドレスである。任意の簡便な手段がキットに存在し得る。

追加の態様
創傷を治療するかまたは予防するための乾燥フィルムが本明細書において開示される。特定の局面では、室温で少なくとも3年間安定である、フィブリン、フィブリノゲン、またはそれらの組み合わせを含む乾燥フィルムが本明細書に記載される。特定の態様では、フィブリンまたはフィブリノゲンは全血または全血漿の成分として存在する。特定の態様では、フィブリン、フィブリノゲン、またはそれらの組み合わせは0.5～20.0mg/cm²フィルムの濃度で存在する。特定の態様では、フィブリノゲンは2.5～4.0mg/cm²フィルムの濃度で存在する。特定の態様では、乾燥フィルムは銀または銀含有化合物をさらに含む。特定の態様では、銀または銀含有化合物は炭酸銀、塩化銀、リン酸銀、フッ化銀、酢酸銀、硫酸銀、クエン酸銀、酸化銀、またはそれらの組み合わせである。特定の態様では、銀は0.1～50mg/cm²フィルムの総濃度でフィルムに存在する。特定の態様では、銀はナノ粒子またはマイクロ粒子またはそれらの組み合わせの形態である。特定の態様では、ナノ粒子またはマイクロ粒子は金属銀ナノ粒子または金属銀マイクロ粒子である。特定の態様では、金属銀は0.1～50mg/cm²フィルムの総濃度でフィルムに存在する。特定の態様では、銀マイクロ粒子の平均直径は2μm未満である。特定の態様では、銀マイクロ粒子の平均直径は2μm～1,000μmである。特定の態様では、銀マイクロ粒子は10～50mg銀/cm²フィルムの濃度で存在する。特定の態様では、銀マイクロ粒子は10～25mg銀/cm²フィルムの濃度で存在する。特定の態様では、フィルムは対象に適用されると0.0002～10.0ppmの銀イオンを放出する。特定の態様では、フィルムはセリウムをさらに含む。特定の態様では、セリウムは20～400mMの濃度でフィルムに存在する。特定の態様では、フィルムは粘着性コーティングをさらに含む。特定の態様では、粘着性コーティングは酸化再生セルロースである。特定の態様では、粘着性コーティングは5重量％～25重量％の量でフィルムに存在する。特定の態様では、フィルムは無菌である。特定の態様では、フィルムはガンマ線照射によって滅菌される。特定の態様では、フィルムはカルシウムをさらに含む。特定の態様では、カルシウムは0.00005～0.20mg/cm²フィルムの濃度でフィルムに存在する。特定の態様では、フィルムはトロンビンをさらに含む。特定の態様では、トロンビンはフィルム1cm²あたり少なくとも2IUのトロンビン濃度でフィルムに存在する。特定の態様では、トロンビン濃度はフィルム1cm²あたりトロンビンが2.5IU超である。特定の態様では、トロンビン濃度はフィルム1cm²あたりトロンビンが2,500IU未満である。特定の態様では、フィルムは厚さが1mm未満である。

特定の局面では、有効量の請求項1～29のいずれか一項記載の乾燥フィルムを創傷に適用する工程を含む、対象における創傷を治療する方法が本明細書において開示される。特定の態様では、乾燥フィルムは、乾燥フィルムを含む保存容器を開封してから15分未満後に創傷に適用される。特定の態様では、乾燥フィルムは、乾燥フィルムを含む保存容器を開封してから1～15分後に創傷に適用される。特定の態様では、創傷は非治癒性創傷である。特定の態様では、創傷は、減少した術後癒着初期形成、減少した術後癒着再形成、細胞および組織生着からの創傷、熱傷からなる群より選択される。特定の態様では、乾燥フィルムは対象の創傷へのフィルムの適用後21日未満で分解する。

特定の局面では、ヒト血漿を取得する工程；血漿を型に入れる工程；血漿を重合してゲルを形成する工程；銀含有化合物を血漿に加えて銀含有血漿混合物を生成する工程；重合ゲルから流体を除去してフィルムを生成する工程；およびフィルムをガンマ線滅菌する工程を含む、対象における創傷を治療するための乾燥フィルムを製造する方法が本明細書に記載される。特定の態様では、流体の除去は100～10,000PSIの圧力でゲルに圧力を印加してフィルムを生成することによって実施される。特定の態様では、ゲルに印加される圧力は約1,000PSIである。特定の態様では、血漿はCaCl₂とさらに混合される。特定の態様では、血漿はトロンビンとさらに混合される。特定の態様では、血漿は血漿を型に入れる前にCaCl₂およびトロンビンと混合される。特定の態様では、銀は重合ゲルからの流体の除去後に加えられる。特定の態様では、銀は銀含有化合物を含む血漿重合ゲルにスプレーコーティングを適用することによって加えられる。特定の態様では、銀含有化合物は炭酸銀、塩化銀、リン酸銀、フッ化銀、酢酸銀、硫酸銀、クエン酸銀、および酸化銀からなる群より選択される。特定の態様では、銀は0.1～50mg/cm²フィルムの総濃度でフィルムに存在する。特定の態様では、銀は銀ナノ粒子、銀マイクロ粒子、またはそれらの組み合わせの形態である。特定の態様では、ナノ粒子またはマイクロ粒子は金属銀ナノ粒子または金属銀マイクロ粒子である。特定の態様では、金属銀は0.1～50mg/cm²フィルムの総濃度でフィルムに存在する。特定の態様では、銀マイクロ粒子は10～50mg銀/cm²フィルムの濃度で存在する。特定の態様では、銀マイクロ粒子は10～25mg銀/cm²フィルムの濃度で存在する。特定の態様では、銀マイクロ粒子は2μm未満の平均直径を有する。特定の態様では、銀マイクロ粒子は2μm～1,000μmの平均直径を有する。特定の態様では、カルシウムは0.00005～0.20mg/cm²フィルムの濃度でフィルムに存在する。特定の態様では、トロンビンはフィルム1cm²あたり少なくとも2国際単位(IU)のトロンビン濃度でフィルムに存在する。特定の態様では、トロンビン濃度はフィルム1cm²あたり2.5IU超のトロンビンである。特定の態様では、トロンビン濃度はフィルム1cm²あたり2,500IU未満のトロンビンである。特定の態様では、血漿はさらにセリウムと混合される。特定の態様では、セリウムは20～400mMの濃度で重合ゲルに存在する。特定の態様では、方法はフィルムに粘着性コーティングを加える工程をさらに含む。特定の態様では、粘着性コーティングは酸化再生セルロースである。特定の態様では、粘着性コーティングは5重量％～25重量％の量でフィルムに存在する。特定の態様では、方法はヒト血漿をウイルス不活性化する工程をさらに含む。特定の態様では、方法は血漿を型に入れた後に血漿を37℃でインキュベートする工程をさらに含む。特定の態様では、フィルムは厚さが1mm未満である。

特定の局面では、対象における創傷を形成しやすい領域に、有効量の請求項1～29のいずれか一項記載の乾燥フィルムを適用する工程を含む、対象における創傷を予防する方法が本明細書に記載される。特定の態様では、乾燥フィルムは、乾燥フィルムを含む保存容器を開封してから15分未満後に、創傷を形成しやすい領域に適用される。特定の態様では、乾燥フィルムは、乾燥フィルムを含む保存容器を開封してから1～15分後に、創傷を形成しやすい領域に適用される。特定の態様では、創傷は非治癒性創傷である。特定の態様では、創傷はヘルニアである。特定の態様では、乾燥フィルムは、対象における創傷を形成しやすい領域へのフィルムの適用後21日未満で分解する。

以下は本発明を実施するための具体的な態様の実施例である。実施例は説明目的のためにのみ提示され、本発明の範囲を限定することを何ら意図していない。用いられる数値(例えば、量、温度など)に関して正確性を担保するために尽力はしたが、当然のことながら多少の実験誤差およびバラツキは許容されたい。

本発明の実施は、特に示されていない限り、当業者の技術の範囲内であるタンパク質化学、生化学、組換えDNA技術および薬理学の従来の方法を利用するであろう。そのような技術は文献において十分に説明されている。例えば、T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993); A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., current addition); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990); Carey and Sundberg Advanced Organic Chemistry 3rd Ed. (Plenum Press) Vols A and B(1992)を参照されたい。

実施例1：銀を含む血漿フィルムの製造
ウイルス不活性化(ウイルスを除去するためにS/D処理およびナノろ過)したヒト血漿(100ml)を1mlのCaCl₂(2M)および1mlのトロンビンと混合した。CaCl₂を緩やかに混合し、次いで10×10cmの型に流し込み、37℃×15分間インキュベーターに入れた。プレス工程の前またはプレス後のいずれかにスプレーコーティングを介して銀(25mg/ml血漿)を加えた。プレス治具に設置する前に固体(重合)ゲルを含む型にフィルタートップを設置した。プレス治具に機械的圧力をかけて1,000PSIを5～15分間印加した。フィルムをプレス治具から取り出し、室温(25℃)で4時間バイオセーフティキャビネットに入れた後、ガンマ線滅菌した。滅菌フィルムをバイオセーフティキャビネットから取り出し、使用まで室温で滅菌容器に保存した。

実施例2：ヘルニアの予防のための銀マイクロ粒子を含む血漿フィルムの適用
ウイルス不活性化(S/D処理)したヒト血漿(100ml)を1mlのCaCl₂(2M)および1mlのトロンビンと混合する。CaCl₂を緩やかに混合し、次いで10×10cmの型に流し込み、37℃×15分間インキュベーターに入れる。プレス工程の前またはプレス後のいずれかにスプレーコーティングを介して銀マイクロ粒子(25mg/ml血漿)を加える。プレス治具に設置する前に固体(重合)ゲルを含む型にフィルタートップを設置する。プレス治具に機械的圧力をかけて1,000PSIを5～15分間印加する。フィルムをプレス治具から取り出し、室温(25℃)で4時間バイオセーフティキャビネットに入れた後、ガンマ線滅菌する。滅菌フィルムをバイオセーフティキャビネットから取り出し、使用まで室温で滅菌容器に保存する。ヘルニアを予防するために、十分な量のフィルムを対象に適用する。フィルムはフィルムが分解するまで対象におけるヘルニアの予防に有効である。

実施例3：熱傷の治療のためのセリウムを含む血漿フィルム。
ウイルス不活性化(S/D処理)したヒト血漿(100ml)を1mlのCaCl₂(2M)および1mlのトロンビン(50mLの滅菌水中の0.125gのトロンビン)と混合する。CaCl₂を緩やかに混合し、次いで10×10cmの型に流し込み、37℃×15分間インキュベーターに入れる。プレス工程の前またはプレス後にスプレーコーティングを介して銀(25mg/ml血漿)およびセリウム(20～400mM/cm²フィルム)を加える。プレス治具に設置する前に固体(重合)ゲルを含む型にフィルタートップを設置する。プレス治具に機械的圧力をかけて1,000PSIを5～15分間印加する。フィルムをプレス治具から取り出し、室温(25℃)で4時間バイオセーフティキャビネットに入れた後、ガンマ線滅菌する。十分な量のフィルムを熱傷を有する対象に適用する。フィルムは、フィルムで治療されたことのない同等の熱傷を有する対象と比較して、熱傷に起因する炎症性傷害を軽減し、熱傷の創傷治癒を向上するのに有効である。

実施例4：軟部組織管理における使用のための粘着性コーティングを含む血漿フィルム
ウイルス不活性化(S/D処理)したヒト血漿(100ml)を1mlのCaCl₂(2M)および1mlのトロンビンと混合する。CaCl₂を緩やかに混合し、次いで10×10cmの型に流し込み、37℃×15分間インキュベーターに入れる。プレス工程の前またはプレス後のいずれかにスプレーコーティングを介して銀(25mg/ml血漿)を加える。プレス治具に設置する前に固体(重合)ゲルを含む型にフィルタートップを設置する。プレス治具に機械的圧力をかけて1,000PSIを5～15分間印加する。フィルムをプレス冶具から取り除き、5重量％～25重量％の酸化再生セルロースを含む粘着性コーティングをフィルムに塗布する。コーティングフィルムを室温(25℃)で4時間バイオセーフティキャビネットに入れた後、ガンマ線滅菌する。十分な量のフィルムをそれを必要とする対象の軟組織に適用する。コーティングフィルムは、開いた組織ポケットを閉塞させて、これによって、脂肪皮弁を生じる外科的処置に起因し得る漿液腫形成および他の手術部位事象のリスクを低減させるのに有効である。

実施例5：非治癒性創傷に適用するための自己全血からなるフィルム
ウイルス不活性化(S/D処理)したヒト自己全血をヒト対象から取得する。次いで全血を10×10cmの型に流し込み、37℃×15分間インキュベーターに入れる。プレス治具に設置する前に固体(重合)ゲルを含む型にフィルタートップを設置する。プレス治具に機械的圧力をかけて1,000PSIを5～15分間印加する。フィルムをプレス治具から取り出し、室温(25℃)で4時間バイオセーフティキャビネットに入れた後、ガンマ線滅菌する。十分な量のフィルムを全血が由来する対象に適用する。フィルムは対象における非治癒性創傷の創傷治癒を促進するかまたは向上するのに有効である。

実施例6：真空を介した銀マイクロ粒子を含む血漿フィルムの製造
真空を介して銀マイクロ粒子を含む血漿フィルムを製造する2つの方法を開発した。血漿フィルムがまだ湿っている間の銀マイクロ粒子の添加は最終フィルムにおける銀の耐擦傷性に重要であった。耐擦傷性は、包装および保存、または例えば創傷、ヘルニアもしくは熱傷へのフィルムの適用時に、フィルムから銀が容易に遊離しないことを確実にするために重要である。

方法1
ウイルス不活性化(ウイルス除去のために溶媒/界面活性剤処理およびナノろ過、Octaplas, Octapharma AG; Lachen, Switzerland)したヒト血漿(1,000ml)をガラスビーカー内で0.86gのCaCl₂および0.21gのホスファチジルセリンと混合し、中速で2分間にわたり撹拌棒で混ぜた。次いで血漿溶液を30×30cmの型に注ぎ、粉体塗装スプレー(RaplixaSpray, Nordson Corporation, Westlake, OH)を用いて金属銀マイクロ粒子(2.5～25mg/ml血漿、15μmサイズ分布、Technic Engineered Powders, Woonsocket、RI Product code: 81-800)を噴霧した。銀の塗布後、型を37℃のインキュベーターに15分～60分間入れて重合(凝固)させてゲルを形成した。凝固後、別の銀の層を重合ゲルに噴霧した。次いで、重合ゲルの底部に、最終的な血漿フィルムの基材として機能させるポリ塩化ビニル(PVC)ろ過シートを設置した状態で重合ゲルを真空成形型に入れた。ろ紙はミシン目またはスリットを有していた。いくつかの製造ランでは、幅0.02インチの単一スリットを備えたスリット紙を用い、全長30cmの型を用いた。別の製造ランでは、幅0.02インチおよび長さ30cmの複数のスリットが0.05インチ間隔で配置されたろ紙を用いた。重合ゲルに1.5～125 Torrの低真空圧を15分間印加してゲルからの流出液を除去し血漿フィルムを形成した。流出液はさらなる使用のためまたは廃棄するために袋に集めた。真空圧を介してフィルムを形成した後、フィルムに2％グリセリンを加えた。グリセリンを加える2つの様式が開発された。第1の方法では、フィルムを真空プレスから取り出し、2％グリセリン浴(滅菌水中のグリセリン)で15分間インキュベートした。第2の方法では、フィルムを真空プレスに入れたまま、フィルムの表面に2％グリセリン溶液を200mL加えた。次いで再び真空にしてグリセリンをフィルムに取り込んだ。次いでフィルムを42℃～50℃のオーブンで30分～2時間乾燥させた。フィルムを50℃で乾燥させるとフィルム強度を損なうことなく乾燥プロセスが促進されることが示された。完成したフィルムは耐擦傷性を有した。実施例8を参照されたい。

方法2
ウイルス不活性化(ウイルス除去のために溶媒/界面活性剤処理およびナノろ過)したヒト血漿(1,000ml)をガラスビーカー内で0.86gのCaCl₂および0.21gのホスファチジルセリンと混合し、中速で2分間にわたり撹拌棒で混ぜた。次いで血漿溶液を30×30cmの型に注ぎ、37℃のインキュベーターに15分間入れて重合(凝固)させてゲルを形成した。次いで、重合ゲルの底部に、最終的な血漿フィルムの基材として機能させるポリ塩化ビニル(PVC)製のろ過シートを設置した状態で重合ゲルを真空成形型に入れた。ろ紙はミシン目またはスリットを有していた。いくつかの製造ランでは、幅0.02インチの単一スリットを備えたスリット紙を用い、全長30cmの型を用いた。別の製造ランでは、幅0.02インチおよび長さ30cmの複数のスリットが0.05インチ間隔で配置されたろ紙を用いた。重合ゲルに1.5～125 Torrの低真空圧を印加してゲルからの流出液を除去し血漿フィルムを形成した。流出液はさらなる使用のためまたは廃棄するために袋に集めた。真空圧を介してフィルムを形成した後、これを2％グリセリン浴で15分間インキュベートした。フィルムをグリセリン浴から取り出し、粉体塗装スプレーを用いて片側に直ちに金属銀マイクロ粒子(2.5～25mg/ml血漿、15μmサイズ分布)を噴霧した。フィルムを37℃のオーブンに5分間入れ、取り出し、反対側に銀マイクロ粒子を噴霧した。フィルムを37℃のオーブンで1時間乾燥させた。最終的な乾燥工程後、完成したフィルムは耐擦傷性を有した。実施例8を参照されたい。

15分間のグリセリン浴浸漬および42℃で90分間の乾燥工程による方法1によって作製された例示的な銀マイクロ粒子含有フィルムの組成を表1に示す。

（表１）

製造後、フィルムはガンマ線照射(25kGy、医療製品には標準的)により滅菌し、保存のためにテフロンパウチに包装し得る。

実施例7：銀マイクロ粒子を含む血漿フィルムの物性評価
銀含有量、タンパク質組成、および賦形剤レベルは、製造プロセス時に生成されたフィルムの破壊分析によって決定される。タンパク質組成はトリプシンによる消化に供されたフィルム試料から決定され、ナノフロー超高速液体クロマトグラフィー(UPLC)と組み合わせた高分解能質量分析で分析した。

詳細なタンパク質およびペプチド分析が特定されかつ定量化される。銀の濃度および分布は試料の複数領域を分析するフィルムの蛍光X線分光法によって定量化される。グリセリン濃度は統計的に代表的な数のフィルム試料からラボアッセイ法によって測定される。

エンドトキシン
エンドトキシンはUSP <85> BACTERIAL ENDOTOXINS TESTによって判定される。

無菌性
無菌性はUSP <71> STERILITY TESTSによって判定される。

銀含有量
Ag⁰の含有量および分布は、ポータブル蛍光X線(XRF)分光計(X-550, SCiAps, Inc., Woburn, MA)を用いて決定される。試験用の10cm×10cmフィルムから無作為に選んだ、銀マイクロ粒子を含む1cm×1cmの正方形の血漿フィルムを100枚取得する。各1cm²試料を無菌表面に置く。分析装置の電源を入れ、分析モードを選択し、メーカー説明書に従って測定する。1回の測定は数秒かかり、データはワイヤレスでノートパソコンに記録され、クラウドに保存およびバックアップする。

フィブリン含有量
フィブリンの含有量は、ESIナノスプレーソースを備えたQ Exactive HF質量分析計(Thermo Fisher Scientific, US)と組み合わせたUltimate 3000 nano超高速液体クロマトグラフィー(UHPLC)システムを用いたプロテオーム解析によって決定される。

試料であるタンパク質ペレットを50mM重炭酸アンモニウムに溶解する。溶液をMicrocon YM-10装置(Millipore)に移し、12,000xgにて4℃で10分間遠心分離を行う。濃縮液に50mM重炭酸アンモニウムを200μL加えた後に遠心分離し、もう1回繰り返す。試料を10mMジチオスレイトール(DTT)の添加によって56℃で1時間還元し、20mMインドール-3-酢酸(IAA)を加えることによって室温にて1時間暗所でアルキル化する。装置を12,000xgにて4℃で10分間遠心分離し、50mM重炭酸アンモニウムで1回洗浄する。100μLの50mM重炭酸アンモニウムおよび0.25％遊離トリプシンを1:50の比率でタンパク質溶液に加え、溶液を37℃で一晩インキュベートする。最後に、装置を12,000xgにて4℃で10分間遠心分離する。100μLの50mM重炭酸アンモニウムを装置に加えて遠心分離した後、もう1回繰り返す。抽出したペプチドを次いでほぼ乾燥するまで凍結させ、液体クロマトグラフィータンデム質量分析(LC-MS/MS)分析のために10μLの0.1％ギ酸に再懸濁する。カラムおよび緩衝液。ナノカラムトラッピングカラム(PepMap C18、100Å、100μm×2cm、5um)および分析xlカラム(PepMap C18、100Å、75μm×50cm、2μm)。試料の充填量は1μgであり；移動相A：水中で0.1％ギ酸；B：80％アセトニトリル中で0.1％ギ酸。合計流量：250nL/分。LC線形勾配：3分間で緩衝液Bを2から8％、50分間で緩衝液Bを8％から20％、43分間で緩衝液Bを20％から40％、次いで4分間で緩衝液Bを40％から90％。

抗菌力
力価は阻害領域(ZOI)試験によって決定される。この試験は、製品の銀マイクロ粒子からの低レベルの銀(Ag+)イオンの溶出を通じた銀マイクロ粒子含有フィルムの抗菌効果を実証する。例えば、フィブリンを加えた銀は25mg/cm²という濃度でグラム陽性およびグラム陰性菌の両方で≦1.5mmのZOIを生じるはずである。

以下の標準的な菌株が用いられる：黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)(メチシリン耐性、(mr) ATCC# 43300)、黄色ブドウ球菌(メチシリン感受性、(ms) ATCC# 25923)、大腸菌(Escherichia coli)(ATCC# 35218)、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)(ATCC# 27853)、および表皮ブドウ球菌(Staphylococcus epidermidis)(ATCC# 35984)。ルリア・ベルターニ(LB)栄養寒天培地を含むペトリ皿(100mm×15mm)に異なる細菌培養物を画線する。銀マイクロ粒子含有フィルム(1cmディスク)の試料を栄養寒天培地上に3枚置く。ゲンタマイシン(2μg/ディスク)および食塩水処理(50μl)ろ紙(1cm)ディスクをそれぞれ陽性および陰性対象とする。プレートを至適な細菌増殖のために36℃で24時間インキュベートし、次いで写真を撮り、ImageJ(National Institutes of Health [NIH])を用いてディスクのZOIの直径を測定する。抗菌活性はZOIの直径(mm)からディスクの直径を引いた平均(±標準誤差[SEM])として表される。統計分析は一元配置分散分析(ANOVA)を用いて実施される。

プロセス残渣
クエン酸ナトリウム二水和物、リン酸二水素ナトリウム二水和物、およびグリシンなどの血漿からのプロセス残渣は、質量分析と生化学分析との組み合わせによって決定される。

実施例8：銀マイクロ粒子を含む血漿フィルムの力学的特性および安定性の評価
材料および方法
実施例6に記載のようにフィルムを調製し、包装し、滅菌した。簡単に説明すると、100mLのOctaplas血漿(Ocatapharma AG)を型に入れ、1.0mlの2M CaCl₂で再石灰化し、37℃で15分間凝固させた。15分後、型を真空ポンプに取り付け、1.25mmHg～125mmHgの低真空を5分間印加した。ゲルを5％グリセリンに15分間浸漬させ、次いで銀マイクロ粒子を25mg/cm²の濃度でコーティングし、乾燥させてフィルムにした。フィルムをホイルパウチで包装し、20kGyでガンマ線滅菌し、室温で15か月間保存した。

破裂圧
破裂圧はStandard Test Method for Burst Strength of Surgical Sealants (ASTM-F 2392-04)に従って測定した。ASTM-F 2392-04に従って治具にフィルムを固定し、ポンプに治具を接続して、ポンプと破裂圧治具との間に圧力変換器を一列に取り付けた。システムに流体を圧送するとフィルムが破裂するまで圧力が増加した。破裂圧は[mmHg]で表わされる。

折り曲げ回数および耐折度
銀マイクロ粒子含有フィルムの折り曲げ回数および耐折度も決定した。

折り曲げ回数は、フィルムの柔軟性を判定するためにフィルムを折り曲げることができる回数の決定である。そのような決定は、フィルムの半分を残りの半分に折り重ね、スタックを90°回転させ、スタックの半分をもう一方の上に再度折り重ね、フィルムが破損または破断するまで繰り返すことによって達成される。フィルムの破断を引き起こすことなく折り曲げるたびに折り曲げ回数が1ずつ増えていく。この試験は、血漿ベースのフィルムがきつく曲げられた際のその完全性を維持する能力を評価するのに特に有用である。

耐折度は、フィルムを折り曲げて開くことができる回数の決定であり、フィルムの柔軟性の指標でもある。そのような決定は、フィルムの半分を別の半分に繰り返し折り重ね、元の位置まで開くことによって達成される。耐折度は、そのような折り曲げ/開くことの繰り返しの回数によって表され、耐摩耗性を推定するための手段を提供する。

安定性
銀マイクロ粒子でコーティングされた複数の血漿フィルムを調製した。調製後に5枚のフィルムの破裂圧、折り曲げ回数、耐久性回数、およびフィルム厚を試験した。室温で464日(約15ヶ月)間保存後、さらに5枚のフィルムの折り曲げ回数、耐久性回数、およびフィルム厚を再評価した。

擦傷
5cm×5cmの銀コーティングフィルムを秤量し、幅2インチのペイントブラシを用いてフィルムの両面を100回ブラッシングする。フィルムは連続100回のブラッシング後に再び秤量される。

結果
新しく合成したフィルムの力学的特性を表2に示す。

（表２）

室温で15か月間保存したフィルムの力学的特性を表3に示す。

（表３）

表2および3に示すように、新しく合成したフィルムおよび15か月間保存したフィルムのいずれについても折り曲げ回数は5および耐折度は100であり、室温での15か月間のフィルムの保存は、同じ折り曲げ回数および耐折度の測定基準によって示されるように、フィルムの柔軟性は低下しなかった。さらに、フィルムの破裂圧は著しくは低下しなかった。事実、平均破裂圧はわずか5mmHgしか低下しなかった。15か月間保存したフィルムの破裂圧は新しく合成したフィルムの99.5％であった。

フィルムの耐擦傷性を表4に示す。

（表４）

表4に示されるように、銀マイクロ粒子含有フィルムは両面を100回ブラッシングした後も重量が著しくは減少していなかったので、フィルムに埋め込まれた銀は耐擦傷性を有する。

フィルム由来の銀マイクロ粒子の耐擦傷性は重要な特性である。耐擦傷性フィルムは銀がフィルムから遊離して、銀/血漿フィルムで処理することを意図していない組織と接触することがない。銀の耐擦傷性フィルムはフィルムの正確な投与量も可能にし、銀マイクロ粒子は包装、滅菌または保存時にフィルムから遊離することがない。ウェットフィルムにスプレーコーティングによって銀を塗布すると、その後の乾燥後に銀が表面から遊離するのを防止する。理論に拘束されることを望むものではないが、スプレーコーティングによって銀マイクロ粒子をウェットフィルムに塗布すると銀マイクロ粒子がフィルムのフィブリン表面に物理的に取り込まれて、接触、取扱い、滅菌または包装によって擦り減ることがない。

銀マイクロ粒子を含有する新しく合成したフィブリンフィルムの耐折度を評価するために追加の実験を実施した。5cm×5cmのフィルムを3枚、記載の耐折度アッセイに従って折り曲げて開くことを1000回繰り返して耐折度を試験した。アッセイは1000回の折り曲げで停止されたが、フィルムはその時点では破損しておらず、アッセイは継続できたはずである。よってフィルムは耐折度が少なくとも1000を超えている。破裂圧は同じフィルム製造ランで作製された5cm×5cmフィルムからも測定され、表5に示されている。表5に示すように、耐折度アッセイは銀マイクロ粒子を含有するフィブリンフィルムの破裂圧を著しく低下させなかった。

（表５）

実施例9：銀マイクロ粒子のインビトロイオン化
公開済みのプロトコルに従って様々な液体ベヒクル中の銀マイクロ粒子からの銀イオンの溶出を調べた(Sussman, Assessment of total silver and silver nanoparticle extraction from medical devices. Food Chem Toxicol 2015;85:10-19)。4種類のベヒクル溶液を用いた：(１)蒸留脱イオン水(図2A)、(2)生理(0.9％)食塩水(図2C)、(3)ヒト血漿(図2D)、および(4)模擬体液(SBF)(図2B)。10mLの無菌ベヒクル中で40mg/mLまたは250mg/mLの最終濃度まで銀マイクロ粒子を秤量し、ポリエチレン製の円錐形の内蓋が付いた20mL HDPEシンチレーションバイアルに入れ、次いで温度制御されたシェーカー中37℃で1時間、37℃で24時間、50℃で72時間、37℃で7日間撹拌した。インキュベーション後、ベヒクルをバイアルから取り出し、15mLポリスチレン遠心管に入れ、一定分量を1.2N HCl中で1:100に希釈し、誘導結合血漿質量分析(ICP-MS)によって銀含有量を分析した。すべての試料は3回繰り返した。

金属銀マイクロ粒子は、特に水、SBF、食塩水には事実上不溶性であり、測定された可溶性銀(Ag+)の最高濃度はそれぞれ約0.2ppm、2.6ppm、および5ppmであった(図2A～D)。食塩水およびSBF中に存在する銀イオンおよび塩の間で平衡が達成され(図2Cおよび2B)；この平衡はマイクロ粒子を脱イオン水中でインキュベートした場合よりも10倍を超える高い濃度のAg+で達成された(図2A)。銀は血漿中でより溶解しやすく、44ppmの最大濃度が得られた(図2D)。理論に拘束されることを望むものではないが、Ag+は血漿アルブミンおよびマクログロブリンに強く結合するので、タンパク質などの有機物は可溶性銀の平衡をシフトさせる。しかしながら、至適な溶出条件下であってもインキュベートした総銀金属の溶解は＜0.02％であった。さらに、高濃度の金属銀をインキュベートしても、予想された可溶性Ag+の増加は得られなかった。銀マイクロ粒子を250mg/mLでインキュベートするとベヒクルまたはインキュベーション条件に関係なく40mg/mLの濃度よりも高い濃度の銀イオンが概して得られたが、可溶性Ag+の相対的な増加は銀金属の開始濃度間の差異が＞600％であったにもかかわらず約＋50％～＋75％であった。

要約すると、金属銀は生物学的には不活性であるので、吸入、摂取、または皮膚接触を介した体内への吸収が少ないと広く認識される。上記のデータは金属銀の不活性で不溶性の性質をさらに明確に示しているので、生体内での全身吸収レベルが非常に低いことが予測される。

実施例10：銀のインビボ組織分布
金属銀は不活性であるので、体液の存在下でイオン化してタンパク質、アミノ酸および細胞膜のスルフヒドリル基および他のアニオン性リガンドに強い親和性を示す生物学的に活性なAg+を放出する硝酸銀(AgNO₃)およびスルファジアジン銀(SSD)などの銀塩よりも毒性が低くなる。銀は身体のどの臓器にも保持されないことを示す多くの実験および臨床試験からのエビデンスがある(まれにアルギリアの症例がある皮膚を除いて)が、金属銀マイクロ粒子(15μm；Technic, Inc.)を含有するフィブリンフィルムの皮下移植から28日後に、選択されたラットの臓器および血漿で検出された銀の量を評価する。

方法
マウス
雄雌同数のラット(n=12/性別/群)に瘢痕ヘルニアを誘導し、GLP下で治療群(2.5mg/cm²および25mg/cm²の金属銀マイクロ粒子を含有するフィブリンフィルム、15μm)と対照群に無作為に割り付ける。28日目に独立盲検化獣医病理医によって剖検が実施される。血漿および組織試料を採取し、肉眼病理組織診断、全血球計算および臨床化学、ICP-MSによる銀含有量決定を行う。銀の検出限界は0.003～0.018ppb範囲であり、このレベル未満の測定値は0.0として記録される。絶食させた動物から全血を採取し、ヘパリンと混合して、臨床化学、血液学、および凝固アッセイ用の血漿を抽出する。

ブタ
2.5mg/cm²および25mg/cm²の金属銀マイクロ粒子(15μm)を含有するフィブリンフィルムの適用後の銀の分布も瘢痕ヘルニア予防のブタモデルで評価される。簡単に説明すると、正中筋膜を通じて10cmの全層開腹を行う。腸を短時間処置した後、開腹部の両端から0.5cmおよび互いに1.5cm離間した5本の吸収性2-0 BIOSYN(商標)縫合糸(Covidien, Mansfield, MA)で結節縫合して筋膜開腹を閉じる。合計6匹の動物(ヨークシャーブタ、雌、90～105kg)を無作為に割り付けて、2.5mg/cm²の金属銀マイクロ粒子15μを含有するフィブリンフィルム、25mg/cm²の金属銀マイクロ粒子15μを含有するフィブリンフィルム、または縫合した筋膜切開部に皮膚閉鎖前に局所的に適用される食塩水のいずれかを与える。治療される総表面は長さ10cmの筋膜切開部を囲む2cmの領域である。次いで皮弁を二層で閉じる。加熱ランプ下での30～60分間回復後、ブタを新しい個別のケージに戻す。

28日目または90日目に、選択した動物を安楽死させ、剖検を実施し、複数の臓器を秤量し、食塩水で洗浄し、胃、小腸、大腸、心臓、肝臓、腎臓、肺、骨格筋、脾臓、膵臓、副腎、精巣、脂肪組織、脳および皮膚から複数の1グラム試料を採取し、クライオバイアルに入れ、その後の分析のために液体窒素中で凍結させる。各組織の銀含有量はICP-MSで測定する。

結果
マウス
マウスモデルでは生化学的臓器損傷または肉眼的臓器病変のエビデンスはほとんどまたはまったく観察されない。2.5mg/cm²および25mg/cm²の金属銀マイクロ粒子を含有するフィブリンフィルムで処理された動物における創傷部位はマクロファージおよび多核巨細胞の浸潤と関連している。処理または対照動物のいずれにおいても移植部位に壊死は認められない。

肝臓、筋骨格、腎臓、または血液系に関与する行動学的、臨床的、肉眼解剖学的または組織病理学的な疾患のエビデンス(すなわち、出血)はほとんどまたはまったく観察されない。

ブタ
銀は小腸、大腸、膵臓、副腎、精巣、脂肪組織、肝臓、または皮膚では検出されない。動物は試験期間にわたって正常な成長および体重増加を示す。剖検では肝臓、脾臓、腎臓または皮膚を含む任意の臓器に関与する臨床的または組織病理学的なエビデンスはない。

実施例11：銀マイクロ粒子含有血漿フィルムによるインビボ創傷治療
フィブリンが創傷で形成するポリマーネットワークは止血バリアとしてだけでなく、免疫細胞の移動を助けかつ可溶性シグナル伝達分子を隔離するタンパク質足場としても機能するため、フィブリンは組織修復の中心となる。しかしながら、フィブリンの生理学的特性は複雑であり、フィブリンの高分子構造に対するそれらの関係は完全には理解されていない。例えば、Litvinov RI, Weisel JW. Fibrin mechanical properties and their structural origins. Matrix Biol 2017;60-61:110-23を参照されたい。よって、フィブリンの供給源が液体組織シーラントと乾燥平面血漿フィルムである場合の糖尿病マウスにおける創傷治癒に対するフィブリンを加えた銀マイクロ粒子の有効性を評価した。

材料および方法
動物。すべての手順はLabCoreのInstitutional Animal Care and Use Committeeの事前承認を得て実施した。遺伝的に糖尿病であるC57BL/KsJ-db/db(雄、14～16週)マウスをJackson Laboratories(Bar Harbor, ME)から入手した。動物は手術を受ける前の少なくとも2日間実験室条件に順応させ、すべての動物に水および標準的なラット用飼料を自由摂取させた。これらのレプチン受容体欠損動物は治療の有無による創傷治癒における変化の比較を可能にした広く受け入れられている2型糖尿病モデルである。例えば、Kleinert M, Clemmensen C, Hofmann SM, et al. Animal models of obesity and diabetes mellitus. Nat Rev Endocrinol 2018;14:140-62を参照されたい。

切除創傷。糖尿病の創傷治癒に対する液体フィブリンシーラントを加えたかまたは乾燥血漿フィルムに組み込まれたかのいずれかの銀の効果を調べるために、マウスをイソフルラン麻酔下に置き、電気バリカンで背部を剃った。0.3mg/mlのブプレノルフィンの1/30希釈液を100マイクロリットル(100μl)皮下注射し、次いで背部をベタジン消毒液およびアルコールで調製した。ステンシルおよびハサミを用いて各マウスの背中に、皮膚筋層の除去を含む、直径2cmの円形の切除創を作製した。次いで、食塩水対照と比較した、銀を含む液体フィブリンシーラントまたは銀を含む乾燥血漿フィルムのいずれかによる処置に動物を無作為に割り付けた。対照マウスは開放創に250μlの食塩水を塗布した一方で、実験マウスは液体フィブリンシーラント[6mg/cm²の銀マイクロ粒子(15μm, Technic, Inc., Woonsocket, RI)を加えた300μlの液体フィブリンシーラント(TISSEEL Baxter Healthcare Corp, Hayward, CA)]または銀を含む乾燥血漿フィルム(10または25mg/cm²の銀マイクロ粒子を含有する血漿フィルムの2cmディスク)のいずれかで処理した。その後、動物が被覆材を剥がすのを防ぐために縫合糸で固定した密閉被覆材(Tegaderm(商標), 3M, St. Paul, MN)で創傷をカバーし、これによって創傷を清潔かつ湿った状態に保った。さらに、これは患者における糖尿病性潰瘍の管理に類似している。次いでマウスを個別のケージに戻し、目覚めさせて通常の活動を再開させた。マウスを検査し、0日目から1週間間隔で背部創傷の写真を撮った。処置の28日後にマウスを安楽死させた。標準的な画像処理プログラムImage J (NIH)を用いて一連の創傷写真を分析した。

創傷治癒評価。各動物の毎週の創傷写真を測定し、一連の写真を比較して創傷閉鎖率を決定した[(ベースライン面積 - 検出面積) / ベースライン面積×100％]。各創傷治癒曲線下面積(AUC)は台形公式を用いて決定した。

統計。P＜0.05を有意とするスチューデントt検定を用いて対照および実験群からの平均AUC値を比較する統計分析を実施した。

結果
28日目の終わりに、処理にかかわらずほとんどの背部創傷が治癒した(図3Aおよび3B)。しかしながら、液体フィブリンシーラントおよび銀マイクロ粒子、または銀マイクロ粒子を含む乾燥血漿フィルムのいずれかで処理したマウスは、より小さな創傷治癒曲線下面積によって証明されるように、食塩水で処理した対照よりも早く創傷が治癒した(それぞれ、182±29対271±37、p<0.001および205±28対287±74、p=0.04)。

フィブリンを加えた銀で処理した創傷は、食塩水のみと比較して28日以内に完全に再上皮形成して、より早く治癒した。図3Aは銀マイクロ粒子含有フィルムでの処理後の創傷領域を示す。図3Bは銀マイクロ粒子＋液体フィブリンでの処理後の創傷領域を示す。銀含有フィルムおよび銀＋液体フィブリンで処理した創傷について創傷治癒時間の平均曲線下面積(AUC)を決定した。表6は銀マイクロ粒子含有フィルムのAUCを示し、表6は銀マイクロ粒子＋液体フィブリンのAUCを示す。

（表６）銀マイクロ粒子含有フィルムで処理した創傷のAUC

（表７）銀マイクロ粒子および液体フィブリンで処理した創傷のAUC

データは平均±標準偏差(SD)である。

糖尿病マウスモデルであるため、銀治療は創傷治癒を正常な状態まで回復しなかった。しかしながら、銀マイクロ粒子(10mg/cm²および25mg/cm²)を含む両フィルムは食塩水と比較して治癒時間の向上をもたらした(平均AUCは食塩水の244と比較して銀含有フィルムでは205および209であった)。意外にも、銀マイクロ粒子を含有する乾燥フィルムも銀を加えた液体フィブリンと同じくらい創傷治癒に効果的であった(平均AUCが182)。驚くべきことに、処理された動物で観察された創傷治癒の促進の程度は試験した2つの製剤を比較すると実質的に同等であった。血漿フィルム中の乾燥平面フィブリンは液体フィブリンと比較して同じくらい効果的であった。これは、血漿フィルム内のフィブリンの水和状態と三次構造が液体形態のフィブリンの構造と比較した際に製造時の乾燥および圧縮によって大幅に変化しているため、予想外の知見であった。フィブリンのような複雑な繊維状タンパク質はそのような物理化学的変化の後も創傷治癒に対するその生物学的効力および効果を維持するとは予想されないであろう。例えば、Weisel JW, Litvinov RI. Fibrin Formation, Structure and Properties. Subcell Biochem 2017;82:405-56を参照されたい。

ドライフィルムおよび銀で観察された改善のレベルは様々な薬物、成長因子および幹細胞療法によって実証されたものに匹敵する。例えば、Brown RL, Breeden MP, Greenhalgh DGを参照されたい。PDGFおよびTGF-アルファは相乗的に作用して遺伝性糖尿病マウスの創傷治癒を改善する。J Surg Res 1994;56:562-70; Sun Y, Song L, Zhang Y, Wang H, Dong X。2型糖尿病マウスからの脂肪幹細胞は創傷治癒における治療可能性を示す。Stem Cell Res Ther 2020;11:298;およびWang F, Zhang C, Dai L, et al. Bafilomycin A1 Accelerates Chronic Refractory Wound Healing in db/db Mice.Biomed Res Int 2020;2020:6265701。特に、銀で処理した動物における治癒の促進は処理後の最初の14日間で最も顕著であった。この観察結果は、マクロファージが創傷治癒の初期段階で重要となるので、マクロファージの活性化と一致していた。

要約すると、乾燥フィブリン(血漿フィルム)と組み合わせた銀マイクロ粒子は遺伝的に糖尿病のマウスの創傷治癒を予想外に促進させた。

図4は銀マイクロ粒子を含有する乾燥フィブリンフィルムで処理した糖尿病マウス(C57BL/KsJ-db/db)における皮膚切除創傷を治癒する代表的な組織学試料を示す。いくつかの多核巨細胞が銀マイクロ粒子(黒い矢印)を取り囲み、かつ組織処理時の銀マイクロ粒子の遊離に起因する空間(白い矢印)を取り囲んでいることを見ることができる。倍率40X。理論に拘束されることを望むものではないが、多核異物巨細胞は創傷治癒にとって重要であると考えられている。

実施例12：インビボでの銀マイクロ粒子含有フィルムの分解
材料
切開
スプラーグ・ドーリーラット(雄、250～300g、Charles River, Cambridge, MA)をイソフルランで麻酔し、腹側腹壁の毛を電気バリカンで剃り、手術野を70％アルコールで調製する。腹部正中線の2cm外側にある6cm×3cmの矩形の全層皮弁を無血管前筋膜面から持ち上げ、これによって下にある筋膜創傷治癒環境から皮膚切開部を分離させる。皮弁の長さと幅の比率を1:2に維持して皮弁の虚血を防止する。5cmの正中開腹切開を行い、腸を操作し、次いで筋膜切開を筋膜の切断端から5mmおよび正中線開腹切開の頭側および尾側の端からそれぞれ3分の1の距離にある2本の離間した5-0プレーン腸線(急速吸収性)縫合糸で閉じた後、皮弁を連続した4-0ビクリル縫合糸で閉じて腸管剥離を防止する。手術直後に0.4mLのブピバカイン0.25％を腹部切開部の周囲に皮下注入し、目覚めて通常の活動を再開するまでラットを2分ごとに観察する。その後、ラットを個々のケージに戻し、1日2回モニタリングする。手術の12および18時間後に0.05mg/kgのブプレノルフィンを皮下注射する。

銀マイクロ粒子含有フィルムの適用
合計82匹のラットを3つの対照群(WO2013138238に記載のように、食塩水のみ、乾燥フィブリンフィルムのみ、および銀マイクロ粒子を含む液体フィブリンシーラント)と2つの実験群(2.5mg/cm²および25mg/cm²の銀マイクロ粒子(15μ)を含有する乾燥フィブリンフィルム)とに無作為に分ける。動物は、皮膚閉鎖の前に、縫合した筋膜切開部に選択された治療が適用される。21および28日目に、明らかな腹部の突出(臨床的ヘルニア)が存在するかどうかすべての動物を調べ、そのまま記録する。次いで動物を安楽死させ、腹壁を切除し、上層の皮膚を筋膜面、および存在する場合はヘルニア嚢、から慎重に分離する。各検体を注意深く検査し、直筋間の全ての間隙を測定する。間隙の直径が2mmを超えることが分かった場合、解剖学的ヘルニアに分類される。筋膜欠損の総面積は、横方向および頭尾方向の最大寸法を測定することによっても決定され、次いで楕円方程式(π×r₁×r₂；r₁＝横方向の直径の1/2、r₂＝頭尾方向の直径の1/2)を用いて計算される。瘢痕ヘルニアの発生率および大きさ、引張強度、ならびに組織構造は21および/または28日後に評価される。腹壁の筋肉および周囲のコラーゲンの組織構造はヘマトキシリン・エオジンおよびシリウスレッド染色によって評価される。さらに、Hansen et al, Am J Pathol 2003;163:2421-2431に記載の方法に従って巨細胞、線維形成、線維化密度、および血管新生についてスライドを採点する。炎症はMace et al, Wound Repair Regen 2007;15:636-645に記載の方法に従って一般的な炎症細胞の数をカウントすることによって評価される。

引張強度アッセイ
正常に治癒する腹部切開部の引張強度が銀マイクロ粒子含有フィルムを用いた治療によって影響を受けないことを確認するために、ラットでのさらなる試験が行われる。5cmの正中開腹切開部が2本の離間した5-0プレーン腸線縫合糸ではなく、連続する4-0ビクリル縫合糸を用いて閉じられることを除いて、瘢痕ヘルニアを形成するための確立されたプロトコルが用いられる(Dubay, Ann Surg 2004;240:179-186)。急速に溶解する縫合糸ではなく、ゆっくりと溶解する縫合糸を用いて連続的に閉じることで、筋膜の創傷が正常に治癒するのに十分な時間(患者における標準治療と同じ)があり、瘢痕ヘルニアの形成が回避される。動物を2つの対照群(食塩水のみおよびフィブリンフィルムのみ)および2つの実験群(2.5mg/cm2対25mg/cm2の銀マイクロ粒子含有フィブリンフィルム)に無作為に入れる。21または28日目にすべての動物を安楽死させ、腹側腹壁全体を切除し、力学的試験のために2つの筋肉片を採取する。腹壁筋片の張力分析は剖検の6時間以内に実施される。伸張負荷を用い、Instron Tensiometer (model MicroTester(登録商標))を用いて筋膜-筋膜界面の力学的特性評価を容易にする。力および組織変形データがコンピュータを介して同時に取得され、データ分析はBluehill(登録商標)ソフトウェアを用いて実施される。試験片の破損は最終的な組織破壊の時点ではなく降伏点で規定される。

結果
21または28日目では2.5mg/cm²および25mg/cm²の銀マイクロ粒子を含有する乾燥フィブリンフィルムで処理したマウスでは間隙は観察されない。

食塩水対照群と銀マイクロ粒子を含有するフィブリンフィルムで処理したマウスとの間では瘢痕ヘルニア発生率およびヘルニアの大きさ両方の減少が観察される。組織学的試料は、食塩水対照と比較して、処理された動物における新しい線維症の増加を示す。21または28日後では筋膜切開部の引張強度は治療群にかかわらず同じである。

実施例13：糖尿病性足潰瘍(DFU)のヒト試験
糖尿病性足潰瘍は糖尿病の一般的な複雑かつ深刻な合併症であり、著しい罹患率、死亡率および医療費と関連している。DFUは毎年世界中で約2,600万人が影響をうけており(Armstrong, N Engl J Med 2017;376:2367-2375)、米国だけで130億ドルを超える費用がかかり(Rice, Diabetes Care 2014;37:651-658)、5年死亡率が食道癌、肝臓癌、肺癌と同等である(Singh, JAMA 2005;293:217-228)。しかしながら、DFUを発症することの最も恐ろしい結果はおそらく切断のリスクである。2016年には糖尿病患者における下肢切断が130,000件を超え、これは4分ごとに1件の切断に相当する(CDC, National Diabetes Statistics Report, 2020)。これらの切断のうちの85％で潰瘍が先行していた(Singh, JAMA 2005;293:217-228; Driver, J Am Podiatr Med Assoc 2010;100:335-341)。残念ながらDFUのための現在の治療法には1つの大きな制限がある。治療は細胞の再生を妨げる細菌の増殖を減少させるか、または細胞の増殖を促進するが抗菌活性が制限されるかのいずれかである。現在利用可能な治療で、細菌を抑制しつつ細胞増殖を効果的に促進するものはない。DFUは一般的に、微生物負荷(バイオバーデン)が増加すると同時に十分な再生細胞応答および成長因子応答が欠如している(不十分な治癒)ため、至適な治療では安全かつ無毒な様式で創傷の再生能力も回復させながら、同時に創傷バイオバーデンに対処しなければならない。銀マイクロ粒子を含有するフィブリンフィルムは銀の薬効を利用して、局所的なバイオバーデンを制御しつつ創傷治癒を著しく向上させる。

試験デザイン
糖尿病性足潰瘍の治療を受けている30人の成人患者を対象とした多施設、並行群、標準治療対照、第1相試験。参加者は試験群に均等に無作為に割り付けられる。治療は創傷が治癒するまでの銀マイクロ粒子含有フィルム(2.5～25mg/cm²フィルムで15μm粒子)の週一回の適用を伴うが、標準治療に対して連続12週を超えないようにする。ベースラインの訪問時(1日目)に、すべての創傷を検査し、デブリードマンを行いかつ/または洗浄した後に銀マイクロ粒子含有フィルムを局所的に適用して創傷の表面全体を覆い、その後7±2日間被覆材を付ける。被覆材は、過敏反応の可能性を調査するための3日目(±1日)の、および過剰な創傷滲出液を管理するための試験者の裁量による被覆材交換を除き、週1回の訪問時にのみ取り除かれる。試験者が必要と判断して、壊死したかまたは不要な組織を除去するためにその後の訪問時に追加のデブリードマンが実施される。患者の糖尿病性足潰瘍は潰瘍の悪化、疼痛、または感染の兆候の評価とともに大きさおよび深さの測定を含め週一回モニタリングされる。

継続期間
試験期間は登録から試験終了まで最大で合計で26週間である。これは、2週間の導入期間に続く最大12週間の無作為化された処理、参加者の創傷が完全に閉塞してから2週間後の経過観察訪問、および最後の処理から12週間後の最後の経過観察訪問を含む。

有効性の評価
臨床試験の主要評価項目は、非治癒性糖尿病性足潰瘍患者に金属銀マイクロ粒子を含有する血漿フィルムを局所的に適用した場合の安全性である。

副次的評価項目は：
・治療後1～12週間の間に治癒した試験創傷の割合
・創傷閉鎖を完了するまでの時間
・治療後1～12週間の面積(cm2)減少の割合
・治療3ヶ月後の潰瘍再発率
・試験期間中の創傷感染率
・疼痛(VAS)
・生活の質(創傷-QoL、SF-36)および
・治療費
を含む。

安全性の評価
安全性の評価は有害事象(AE)、重篤な有害事象(SAE)、身体検査、バイタルサイン測定、臨床検査評価、および毒性による治療中止理由を含む。

試験対象集団
糖尿病が制御されており、動脈循環が著しく損なわれていない、くるぶしより遠位に位置する糖尿病性足潰瘍を有する成人患者。

選択基準
1．18～75歳の男性または女性。
2．対象は試験手順を順守することができかつこれに自発的に同意して、インフォームドコンセントが得られる。
3．元から糖尿病性であり、足首のくるぶしより下から開始することによって規定されるように足に位置し、従来の創傷治癒療法に適切に応答しなかったスクリーニング日以前に30日間より長く持続する非治癒性潰瘍。
4．活動性感染のないデブリードマン後の1～10cm2の潰瘍表面積。無作為化の前にシャープデブリードマンが行われる。この試験に参加するための対象のインフォームドコンセントはシャープデブリードマンを進める前に取得しなければならない。
5．1型または2型糖尿病の患者(米国糖尿病協会による糖尿病の診断基準)。
6．標的潰瘍の3cm以内でなければさらなる創傷が存在してもよい。
7．患者は過去90日以内に次のいずれか1つによって示されるように患肢に十分な動脈灌流がある：足指圧(プレチスモグラフィー)＞50mm/Hg、または収縮期血圧ABIの結果が≧0.70および≦1.2、または足からのTcPO2≧30mmHg、または足における適切な流れと一致するドップラー動脈波形(影響を受けた下肢の足首での二相性または三相性波形)。
8．標的潰瘍は全層皮膚喪失を伴うが、≧4週間存在する腱、筋肉、骨の露出がない。
9．無作為化前の90日以内に採取したHbA1cが＜12％。
10．過去6か月以内の血清クレアチニンが＜3.0mg/dL。
11．必要なオフローディング(潰瘍の部位に応じて適用される)を維持する意思および能力がある(対象または担当する介護者)。
12．妊娠検査が陰性
13．妊娠が可能な女性の場合、治療製品に曝露されている期間にわたり信頼できる避妊および/または禁欲法を使用。

除外基準
1．創傷感染の徴候/症状が疑われるかまたは確認される(登録前に感染が治療されて、対象は試験への参加が再検討される場合がある)。
2．骨まで達する潰瘍を呈する患者(University of Texas Grade IIIA-D)。無菌眼科用プローブで骨または関節を触知できる場合、プローブ・トゥ・ボーンが陽性であることが確認される。
3．銀に対する過敏症。
4．FFPに対するか、または任意の血漿タンパク質を含む血漿由来製品に対する過敏症。
5．対象は過去にこの試験に参加したか、または登録の30日以内に何らかの治験薬または医療機器の試験に参加したことがある。
6．試験者の意見では創傷治癒を妨げることが公知である治療レジメンまたは投薬を現在受けている(例えば、癌化学療法または同等の免疫抑制剤、＞10日間の全身性ステロイド、細胞増殖抑制剤、特定のアレルギー薬、COX-2阻害剤、または放射線療法)。
7．試験者の意見では創傷治癒を妨げる過度のリンパ浮腫。
8．治療レジメンに従う対象の能力を妨げる任意の状態。
9．試験者の意見では創傷治癒を阻害する活動的シャルコー足または骨の隆起を伴うシャルコー変形。
10．血管炎、新生物、または血液疾患に続発する創傷。抗凝固薬を服用する患者は他の外科的処置と同様に、登録センターで採用されているプロトコルに従ってモニタリングされる。
11．試験者の意見では対象の安全性もしくはデータ品質を損なうか、または創傷治癒プロセスの通常のパラメーターに深刻な悪影響を及ぼす糖尿病以外の状態。
12．透析中の患者。
13．足への放射線照射歴。
14．＞18か月間存在する潰瘍。
15．アルコールまたは薬物使用障害の臨床的に関連する病歴。
16．制御されていない自己免疫性結合組織疾患を有する患者。
17．妊娠または授乳中の患者。
18．制御されていない貧血を有する患者(女性でHb＜10g/dL；男性で＜12g/dL)。
19．重度の栄養失調(CRPは正常で血清アルブミンが＜2.0)。
20．銀マイクロ粒子含有フィルムの先進創傷ケア製品または標準治療被覆材を装着した時点で対象が以下を有する：
i．膿疱、紅斑、蜂巣炎、潰瘍内外の過度な高温、異臭、および/または潰瘍内外の過度な疼痛をエビデンスとする創傷感染の明らかな徴候(感染が治療されて、試験への参加が再検討される場合がある)。
ii．軟骨の壊死を伴う骨髄炎。(試験者の意見では診断の追加確認が必要な場合はX線写真が取得される)
iii．2週間の導入期間中に＞20％の面積が治癒した創傷
iv．30日以内の高圧酸素、および成長因子、人工組織、または代用皮膚(例えば、Regranex、Dermagraft、Apligrafなど)を含むアクティブ被覆材の使用。
21．シャープデブリードマン後に表面積が＞10cm²または深さが＞5mmの創傷。
22．生検で除外されなかった潰瘍部位での、またはその近傍の皮膚がんの臨床的疑い。

除外される先行薬または併用薬
1．試験登録前の90日以内の高用量コルチコステロイド(すなわち、≧1.5mg/kg/日のプレドニゾンまたは均等物)。
2．試験登録前の90日以内の化学療法または放射線療法。
3．試験登録前の90日以内の免疫グロブリンまたは顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)の投与。

治療
治療は銀マイクロ粒子含有フィルムを週一回適用することによる。ベースラインの訪問時に鋭利な刃物、ハサミ、キュレット、またはバーサジェットシステムを用いたデブリードマンにより壊死組織を切除する。次いで銀マイクロ粒子含有フィルムを局所的に適用して創傷の全表面領域を覆い、続いて被覆材を7±2日間配置する。定期的な被覆材の交換は、2日目(±1日)にする最初の被覆材交換を除いて、12週まで週一回(±2日)の試験訪問時に行われる(すなわち、対象または介護者による家庭での被覆材の交換はない)。12週目以降、治癒していない潰瘍については、被覆材の材料、被覆材の交換頻度、家庭での被覆材の交換は試験者の裁量に委ねられる。患者の糖尿病性足潰瘍は潰瘍の悪化、疼痛、または感染の兆候の評価とともに大きさおよび体積の測定を含め毎週モニタリングされる。全ての壊死したかまたは不要な組織を除去するために試験者の裁量によりその後の訪問時に追加の創傷デブリードマンが実施される。

安全性評価
2日目±1：患者は最初の適用から2～3日以内に評価されて、局所的な疼痛、浮腫、紅斑、排液、臭気、またはアレルギーの徴候(例えば、皮膚炎)の増加を介して局所的な忍容性を評価する。

1～12週目：試験者は糖尿病性足潰瘍における感染のエビデンスを探す。有害な評価項目は赤み、腫れ、疼痛、臭気または排液の増加を含む。試験者は感染症の徴候および症状に関して知識が豊富である。感染の臨床的徴候が存在する場合、積極的なシャープデブリードマンの後に、潰瘍基部での掻爬術によって創傷培養物が取得される。感染症がなくなるまで適切な抗生物質治療が全身に行われる。抗生物質療法の微生物学的な確認および選択が記録される。

1～12週目：試験者は潰瘍の何らかの悪化、例えば、疼痛もしくは排液の増加または大きさの増加などをモニタリングする。潰瘍の悪化のエビデンスがある場合、銀マイクロ粒子含有フィルム治療は中止され、患者は標準治療を受け、試験期間にわたって追跡調査される。治癒していない創傷のスワブ培養物を週一回取得し、銀耐性遺伝子を含む細菌の存在についてアッセイする。

13～24週目：患者は銀マイクロ粒子含有フィルム治療の中止から12(±2)週間後に評価されて、DFUの治癒状態および長期的な安全性に関する懸念の有無が判定される。

好ましい態様および様々な代替的な態様を参照して発明を具体的に示しかつ説明してきたが、発明の精神および範囲から逸脱することなく形態および細部に様々な変更を行い得ることが当業者には理解される。

統計的方法
疼痛、生活の質および潰瘍の大きさの継続的な評価項目はマン・ホイットニーのU検定によって比較される。カプラン・マイヤー生存分析を用いて治癒までの時間を測定し、ログランクχ2検定を用いて治癒率を測定する。平均、中央値、標準偏差、度数およびパーセンテージを含む記述統計を用いて数値データを記述する。人口統計学的変数、糖尿病タイプ、創傷の大きさ、治癒した創傷の完全治癒までの時間、および治癒しなかった潰瘍についてはベースラインから最新の追跡調査評価までの創傷の大きさの変化を試験群間で比較する。ピアソンのカイ二乗分析を用いてカテゴリ情報を比較する。正規分布する連続変数については、一元配置分散分析を用いて統計的有意さを判定する。創傷治癒までの時間を生存事象として用いて、カプラン・マイヤー生存分析(積極限プロット)を用いて治療群間の創傷治癒を評価する。創傷が12週間の評価項目または最新の利用可能な臨床評価までに治癒しない場合、または患者が試験を中止した場合、創傷は打ち切られる。最新の追跡調査評価で得られた創傷測定値が分析のために用いられる。ログランク検定を用いて生存曲線間の有意差を特定する。Cox比例ハザードモデル分析を行い創傷治癒と以下の共変量との関係を明らかにする：発症時の潰瘍の大きさ；指標となる潰瘍の期間；患者の年齢；ボディ・マス・インデックス；栄養状態に関する対象の全身評価(SGA)；部位、虚血、神経障害、細菌感染、面積および深さ(SINBAD)DFU分類スコア；ならびに糖尿病タイプ。さらにハザード比推定を実施して創傷治癒までの時間と有意な共変量との関連を評価する。統計的差異は少なくとも0.80の検定力でP＜0.05の場合であれば有意と見なされる。統計分析全体で90％の信頼区間が用いられる。

データおよび安全性のモニタリング計画
安全性情報の審査。ビトルビアン(Vitruvian)およびERCが安全性データを継続的に審査する。ERCは糖尿病(Robert Rushakoff, MD, Professor, UCSF)、血管外科(Joseph H. Rapp, MD, Professor Emeritus, UCSF)、足病医学(Chia-Ding (JD) Shih, DPM, MPH, MA, California School of Podiatric Medicine)の専門家で構成される。ERCはビトルビアンによる審査および最終的な試験報告書に含めるための試験データ報告書を作製する。

試験停止規則。ERCの審査の結果、安全性に重大な懸念があるという結論があった場合は、いつでも試験治療の登録および開始を中止し得る。試験が保留された場合、ビトルビアンの審査が行われるまであらゆる新規の試験対象のスクリーニング、登録、および開始が停止される。

試験は以下のSAEの発生に基づいて保留される：死亡、またはグレード3以上(下に定義)の感染症として定義される重篤な感染症。ビトルビアンは予期せぬ有害作用の評価を行い、3ヶ月毎に予定される安全性データ審査会議時に安全性データを審査することをERCに通知する。予定された安全性審査のためのデータは、少なくとも、すべての報告されたAEおよびSAEのリストを含むであろう。さらにERCは臨時に審査を求める場合がある。ビトルビアンは速やか(5営業日以内)に実施するであろう。

有害事象は、ビトルビアンによって等級付けされ、最終的にERCによって帰属が判定される。

有害事象の等級付け、報告および帰属。等級付け基準。試験施設は、感染を除くすべてのAEについて、国立がん研究所の有害事象に関する共通用語基準(NCICTCAE - バージョン4.0)に規定されている基準に従って、試験対象が経験したAEの重症度を等級付けする。この文書は重症度のレベルを記述し、データを分析しかつ解釈し、すべてのAEの臨床的重要性を明確にするための共通言語を提供する。

有害事象はNCI-CTCAEマニュアルにおける以下の基準に従って1～5段階で等級付けされる。
・グレード1＝軽度の有害事象。
・グレード2＝中程度の有害事象。
・グレード3＝重度および望ましくない有害事象。
・グレード4＝生命を脅かすかまたは障害を引き起こす有害事象。
・グレード5＝死亡。

グレード2以上の事象は本試験の適切なAE症例報告用紙に記録される。

感染のいずれのAEについても、以下の等級付けシステムが試験参加者に用いられる：
・グレード1の感染＝無症候性；臨床的または診断的な所見のみ；経口抗菌薬による介入のみ。侵襲的な介入の必要はない。
・グレード2の感染＝症候性；静脈内抗菌薬による介入；侵襲的介入が必要な場合がある。
・グレード3の感染＝昇圧剤を必要とする血行動態の悪化に関連するか、集中治療室レベルのケアを必要とするか、または壊死性軟部組織感染症を伴う何らかの感染。
・グレード4の感染＝生命を脅かす感染。
・グレード5の感染＝感染による死亡。

有害事象の報告。試験者は、事象の発見から24時間以内に、関係するものかまたは予測されたものにかかわらず、すべてのSAEをビトルビアンおよびIRBに報告し、すべてのIND安全性報告書をFDAに提出する。SAEについては、要求されるすべての情報がAE/SAEフォームに提供される。

図5は提案した臨床試験のイベントのスケジュールを提供する。

帰属の定義。AEと試験レジメンとの関係性または帰属は、まず試験者によって判定され、適切なAE/SAEフォームに記録される。安全性報告書の帰属の最終判定は、ビトルビアンおよびERCによって判定される。AEと試験の関係性は、NCI-CTCAEの定義により、関連がない、可能性がある、または確定的であると判定される。

本明細書の本文中で引用されるすべての参考文献、発行済み特許および特許出願は、あらゆる目的のために、参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる。

Claims (92)

1. フィブリン、フィブリノゲン、またはそれらの組み合わせと銀マイクロ粒子とを含み、フィルム1cm²あたり約0.01国際単位(IU)以下のトロンビンを含有し、室温で少なくとも18ヶ月間安定である、乾燥フィルム。
2. 前記銀マイクロ粒子が、1～50mg銀/cm²フィルムの濃度で存在する、請求項1記載の乾燥フィルム。
3. 前記銀マイクロ粒子が、2.5～25mg銀マイクロ粒子/cm²フィルムの濃度で存在する、請求項2記載の乾燥フィルム。
4. 前記銀マイクロ粒子が、約2μm～1,000μmの範囲の平均直径を有する、請求項1～3のいずれか一項記載の乾燥フィルム。
5. 前記銀マイクロ粒子が、約15μmの平均直径を有する、請求項4記載の乾燥フィルム。
6. 前記フィブリンまたはフィブリノゲンが、全血または全血漿の成分として存在する、前記請求項のいずれか一項記載の乾燥フィルム。
7. 前記フィブリン、フィブリノゲンまたはそれらの組み合わせが、0.5～20.0mg/cm²フィルムの量で存在する、前記請求項のいずれか一項記載の乾燥フィルム。
8. 前記フィブリノゲンが、2.5～4.0mg/cm²フィルムの量で存在する、請求項7記載の乾燥フィルム。
9. トロンビンを含有しない、前記請求項のいずれか一項記載の乾燥フィルム。
10. 対象に適用されると0.02～5.0ppmの銀イオンを放出する、前記請求項のいずれか一項記載の乾燥フィルム。
11. 約0.5～2.0mg/cm²の水分含有量を有する、前記請求項のいずれか一項記載の乾燥フィルム。
12. 約0.9mg/cm²の水分含有量を有する、請求項11記載の乾燥フィルム。
13. 前記フィルムの表面に銀マイクロ粒子を含む、前記請求項のいずれか一項記載の乾燥フィルム。
14. 前記フィルムの表面の銀マイクロ粒子が耐擦傷性を有する、前記請求項のいずれか一項記載の乾燥フィルム。
15. 前記耐擦傷性が、ブラッシングによって判定される、請求項14記載の乾燥フィルム。
16. 前記フィルムの表面の銀マイクロ粒子が、少なくとも100回のブラッシングアッセイの繰り返しに対して耐擦傷性を有する、請求項14または15記載の乾燥フィルム。
17. 少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、または少なくとも5回の折り曲げ回数を有する、前記請求項のいずれか一項記載の乾燥フィルム。
18. 前記折り曲げ回数が、前記フィルムが破損または破断するまで該フィルムを折り曲げることによって決定される、請求項17記載の乾燥フィルム。
19. 少なくとも5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、500、または1000回の耐折度を有する、前記請求項のいずれか一項記載の乾燥フィルム。
20. 前記耐折度が、前記フィルムが破損または破断するまで同じ折れ線に沿って該フィルムを折り曲げて開くことによって決定される、請求項19記載の乾燥フィルム。
21. 約50～1000mmの破裂圧を有する、前記請求項のいずれか一項記載の乾燥フィルム。
22. 少なくとも800mmHgの破裂圧を有する、請求項21記載の乾燥フィルム。
23. 室温で少なくとも15ヶ月間安定である、前記請求項のいずれか一項記載の乾燥フィルム。
24. 安定性が、破裂圧および耐折度によって決定される、請求項23記載の乾燥フィルム。
25. 室温で15ヶ月間の保存後、少なくとも5回の折り曲げ回数を有する、請求項23または24記載の乾燥フィルム。
26. 室温で15ヶ月間の保存後、少なくとも100回の耐折度を有する、請求項23または24記載の乾燥フィルム。
27. 室温で15ヶ月間の保存後、少なくとも800の破裂圧を有する、請求項23または24記載の乾燥フィルム。
28. 粘着性コーティングをさらに含む、前記請求項のいずれか一項記載の乾燥フィルム。
29. 前記粘着性コーティングが酸化再生セルロースである、請求項28記載の乾燥フィルム。
30. 前記粘着性コーティングが、フィルムの5重量％～25重量％の量で前記フィルム上に存在する、請求項28または29記載の乾燥フィルム。
31. 無菌である、前記請求項のいずれか一項記載の乾燥フィルム。
32. ガンマ線照射によって滅菌されている、請求項31記載の乾燥フィルム。
33. カルシウムをさらに含む、前記請求項のいずれか一項記載の乾燥フィルム。
34. 前記カルシウムが、0.00005～0.20mg/cm²フィルムの濃度で前記フィルムに存在する、請求項33記載の乾燥フィルム。
35. 0.1mm～1mmの厚さを有する、前記請求項のいずれか一項記載の乾燥フィルム。
36. 約100μm、150μm、または200μmの厚さを有する、請求項35記載の乾燥フィルム。
37. 有効量の請求項1～36のいずれか一項記載の乾燥フィルムを創傷に適用する工程
    を含む、対象における創傷を治療する方法。
38. 前記乾燥フィルムが、該乾燥フィルムを含む保存容器を開封してから15分未満後に前記創傷に適用される、請求項37記載の方法。
39. 前記乾燥フィルムが、該乾燥フィルムを含む保存容器を開封してから1～15分後に前記創傷に適用される、請求項37記載の方法。
40. 前記創傷が、急性創傷、慢性創傷、非治癒性創傷、糖尿病性足潰瘍、静脈性下肢潰瘍、褥瘡、手術創、動脈性創傷、外傷性創傷、またはICD-9コードによって定義される皮膚障害である、請求項37～39のいずれか一項記載の方法。
41. 前記創傷が非治癒性創傷である、請求項40記載の方法。
42. 前記創傷が、減少した術後癒着初期形成、減少した術後癒着再形成、細胞および組織生着からの創傷、ならびに熱傷からなる群より選択される、請求項41記載の方法。
43. 前記乾燥フィルムが、前記対象の創傷への該フィルムの適用後28日未満で分解する、請求項37～42のいずれか一項記載の方法。
44. 対象における創傷を治療するための乾燥フィルムを製造する方法であって、
    ヒト血漿を取得する工程；
    該血漿を型に入れる工程；
    該血漿に重合剤を加えることによって該血漿を重合させてゲルを形成させる工程；
    該ゲルに銀マイクロ粒子を加えて銀マイクロ粒子含有血漿ゲルを生成させる工程；
    重合した該ゲルから流体を除去してフィルムを生成させる工程；
    該フィルムを乾燥させる工程；および
    該フィルムをガンマ線滅菌する工程
    を含む、方法。
45. 前記流体の除去が、約1.25 Torr～125 Torrの圧力で前記ゲルに真空圧をかけることによって実施される、請求項44記載の方法。
46. 前記重合剤がCaCl₂またはトロンビンである、請求項44～45のいずれか一項記載の方法。
47. 前記重合剤がCaCl₂である、請求項46記載の方法。
48. 0.5～1mg/mlのCaCl₂が前記血漿に加えられる、請求項46または47記載の方法。
49. 約0.86mg/mlのCaCl₂が前記血漿に加えられる、請求項48記載の方法。
50. 前記フィルムを乾燥させる前に前記フィルムをグリセリン溶液とインキュベートする工程をさらに含む、請求項44～49のいずれか一項記載の方法。
51. 前記グリセリン溶液がグリセリンを2％含む、請求項50記載の方法。
52. 前記銀マイクロ粒子が前記血漿に加えられる、請求項44～51のいずれか一項記載の方法。
53. 前記銀マイクロ粒子が、前記ゲルの重合前に加えられる、請求項44～51のいずれか一項記載の方法。
54. 前記銀マイクロ粒子が、該銀マイクロ粒子を前記血漿と混合することによって加えられる、請求項44～53のいずれか一項記載の方法。
55. 前記銀マイクロ粒子が、前記ゲルの重合後に加えられる、請求項44～51のいずれか一項記載の方法。
56. 前記銀マイクロ粒子が、前記ゲルから流体を除去する前に加えられる、請求項44～51のいずれか一項記載の方法。
57. 前記銀マイクロ粒子が、前記ゲルから流体を除去した後に加えられる、請求項44～51のいずれか一項記載の方法。
58. 前記銀マイクロ粒子が、グリセリン溶液インキュベーション後に加えられる、請求項44～51のいずれか一項記載の方法。
59. 前記銀マイクロ粒子が、該銀マイクロ粒子を含むスプレーコーティングを前記重合したゲルに適用することによって加えられる、請求項44～51および55～58のいずれか一項記載の方法。
60. 前記銀マイクロ粒子が、1～50mg銀/cm²フィルムの濃度で存在する、請求項44～59のいずれか一項記載の方法。
61. 前記銀マイクロ粒子が、2.5～25mg銀/cm²フィルムの濃度で存在する、請求項60記載の方法。
62. 前記銀マイクロ粒子が、2μm～1,000μmの範囲の平均直径を有する、請求項44～61のいずれか一項記載の方法。
63. 前記銀マイクロ粒子が、約15μmの平均直径を有する、請求項62記載の方法。
64. 前記フィルムがリン脂質をさらに含む、請求項44～63のいずれか一項記載の方法。
65. 前記リン脂質が、ホスファチジルセリンまたはホスファチジルコリンである、請求項64記載の方法。
66. 前記カルシウムが、0.00005～0.20mg/cm²フィルムの濃度で前記フィルムに存在する、請求項44～65のいずれか一項記載の方法。
67. 前記フィルムが、フィルム1cm²あたり約0.0999IU未満のトロンビンを含む、請求項44～66のいずれか一項記載の方法。
68. 前記血漿を型に入れた後に該血漿を37℃でインキュベートする工程をさらに含む、請求項44～62のいずれか一項記載の方法。
69. 前記血漿が、37℃で5～30分間インキュベートされる、請求項69記載の方法。
70. 前記血漿が、37℃で15分間インキュベートされる、請求項69記載の方法。
71. グリセリン溶液とのインキュベーション後に前記ゲルを37℃でインキュベートする工程をさらに含む、請求項44～62のいずれか一項記載の方法。
72. 前記ゲルが、37℃で5～60分間インキュベートされる、請求項71記載の方法。
73. 前記ゲルが、37℃で5分間インキュベートされる、請求項71記載の方法。
74. 前記フィルムが、42℃～50℃の温度で乾燥される、請求項44～73のいずれか一項記載の方法。
75. 前記フィルムが、30分～120分間乾燥される、請求項44～74のいずれか一項記載の方法。
76. 前記フィルムが、コンベクションオーブン内で乾燥される、請求項44～75のいずれか一項記載の方法。
77. 前記フィルムが、約0.5～2.0mg/cm²の水分含有量を有する、請求項44～76のいずれか一項記載の方法。
78. 前記フィルムが、約0.9mg/cm²の水分含有量を有する、請求項77記載の方法。
79. 前記フィルムに粘着性コーティングを加える工程をさらに含む、請求項44～78のいずれか一項記載の方法。
80. 前記粘着性コーティングが酸化再生セルロースである、請求項79記載の方法。
81. 前記粘着性コーティングが、5重量％～25重量％の量で前記フィルム上に存在する、請求項79または80の一項記載の乾燥フィルム。
82. 前記ヒト血漿をウイルス不活性化する工程をさらに含む、請求項44～81のいずれか一項記載の方法。
83. 前記ウイルス不活性化が、溶媒/界面活性剤および/またはナノろ過を含む、請求項82記載の方法。
84. 前記溶媒/界面活性剤がトリトンX-100である、請求項83記載の方法。
85. 前記フィルムが、約0.1mm～1mmの厚さを有する、請求項44～84のいずれか一項記載の方法。
86. 対象における創傷を予防する方法であって、該対象における創傷を形成しやすい領域に有効量の請求項1～36のいずれか一項記載の乾燥フィルムを適用する工程を含む、方法。
87. 前記乾燥フィルムが、該乾燥フィルムを含む保存容器を開封してから15分未満後に、創傷を形成しやすい領域に適用される、請求項86記載の方法。
88. 前記乾燥フィルムが、該乾燥フィルムを含む保存容器を開封してから1～15分後に、創傷を形成しやすい領域に適用される、請求項87記載の方法。
89. 前記創傷が、急性創傷、慢性創傷、非治癒性創傷、糖尿病性足潰瘍、静脈性下肢潰瘍、褥瘡、手術創、動脈性創傷、外傷性創傷、またはICD-9コードによって定義される皮膚障害である、請求項86～88のいずれか一項記載の方法。
90. 前記創傷が非治癒性創傷である、請求項89記載の方法。
91. 前記創傷がヘルニアである、請求項86～88のいずれか一項記載の方法。
92. 前記乾燥フィルムが、前記対象における創傷を形成しやすい領域への該フィルムの適用後28日未満で分解する、請求項86～91のいずれか一項記載の方法。

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