CN116437945A - 包含纤维蛋白和/或纤维蛋白原的储存稳定膜 - Google Patents

Abstract

本文描述了包含纤维蛋白和/或纤维蛋白原的干燥膜及其使用方法。在某些方面，所述干燥膜在室温下是储存稳定的。在某些方面，本文描述的干燥膜有效地预防或治疗需要的受试者中的伤口。

Description

包含纤维蛋白和/或纤维蛋白原的储存稳定膜

相关申请的交叉引用

本申请要求基于2020年8月31日提交的美国申请序列号63/072,753的优先权，该美国申请通过引用整体并入本文。

背景技术

向伤口施加纤维蛋白原或纤维蛋白凝胶或膜可增强伤口的愈合并防止常见的并发症。例如，切口疝是腹部手术的常见并发症，这导致相当高的患者发病率和增加的健康护理成本。在美国每年有400-500万例腹部切口术(剖腹术)，11-23％的这些手术之后发生疝。切口疝可能导致超出前腹壁可见隆起的外观畸形的重症，包括肠梗阻、肠缺血、肠外瘘以及对患者身体活动和有酬就业的显著限制。因此，每年进行超过400,000例切口疝修补术，这使得其成为普通外科医生开展的最常见的手术之一。因切口疝修补术导致的美国医疗保健费用的增加据估计目前每年超过80亿美元，这还不包括这一中等年轻患者群体提供的失业救济费用。研究表明，切口疝是由于手术后肌筋膜腹壁的愈合不充分或受损所致。因此，疝形成的各种公认风险因素抑制伤口愈合，包括病态肥胖、糖尿病、吸烟、慢性肺病、手术部位感染和手术技术不佳。由于主要风险因素的发生率在增加，故预计切口疝的患病率也会增加。

目前可用于增强伤口(如手术伤口)愈合和预防切口疝的组合物是耗时和/或难以制备的，并且对于使用前制备，缺乏显著的储存稳定性。需要用于增强伤口愈合的新方法和组合物，其易于制备并允许快速施用，特别是在临床环境中。

WO2017210267中描述了用凝血酶和/或钙聚合的薄的、干燥的、纤维蛋白膜。然而，这些膜没有描述临床相关量的银或银的优选物理形式，即银微粒，来增强薄的、干燥的纤维蛋白膜的伤口愈合性质。

找到易于使用、经济上可行、化学计量上准确且一致的用于银微粒和纤维蛋白的递送系统在历史上被证明是非常成问题的。本公开提供了对这些问题的解决方案。纤维蛋白目前作为包含纤维蛋白原和凝血酶的试剂盒销售，其冷冻或作为冻干粉末提供，并因此需要在使用前解冻或重构。作为细粉提供的银微粒由于其高密度而不能均匀地分布到任一产品组分中。WO2013138238中描述了包含液体纤维蛋白、凝血酶和银的早期产品。在这些产品中，三种组分在伤口中手动混合。这种递送方法就实验目的而言是可接受的，但不便于广泛使用并且实际上作为FDA批准的商业产品是不可能的。

本公开通过提供含有银和纤维蛋白的治疗性混合物，在极端温度下稳定数年，易于操作和施用，银是耐磨的，并且可以容易地整合到目前的伤口护理工作流程中的干的薄膜而提供了对这些关键问题的解决方案。

发明内容

在一个方面，本文提供了干燥膜，其包含：纤维蛋白、纤维蛋白原或其组合以及银微粒，其中所述膜含有约0.01国际单位(IU)或更少的凝血酶/cm²膜；并且其中所述膜在室温下稳定至少18个月。

在一些实施方案中，银微粒以1-50mg银/cm²膜的浓度存在。

在一些实施方案中，银微粒以2.5-25mg银微粒/cm²膜的浓度存在。

在一些实施方案中，银微粒的平均直径在约2μm至1,000μm的范围内。

在一些实施方案中，银微粒的平均直径为约15μm。

在一些实施方案中，纤维蛋白或纤维蛋白原作为全血或全血浆的组分存在。

在一些实施方案中，纤维蛋白、纤维蛋白原或其组合以0.5至20.0mg/cm²膜的量存在。

在一些实施方案中，纤维蛋白原以2.5至4.0mg/cm²膜的量存在。

在一些实施方案中，膜不含凝血酶。

在一些实施方案中，当施用于受试者时，膜释放0.02至5.0ppm的银离子。

在一些实施方案中，膜的水分含量在约0.5至2.0mg/cm²之间。

在一些实施方案中，膜的水分含量为约0.9mg/cm²。

在一些实施方案中，膜包含在膜的表面上的银微粒。

在一些实施方案中，膜的表面上的银微粒是耐磨的。

在一些实施方案中，耐磨性通过刷擦来测定。

在一些实施方案中，膜的表面上的银微粒对于至少100次刷擦测定重复是耐磨的。

在一些实施方案中，膜具有至少2、至少3、至少4或至少5的折叠数。

在一些实施方案中，通过折叠膜直至膜断裂或破裂来测定折叠数。

在一些实施方案中，膜具有至少5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、500或1000的耐折性。

在一些实施方案中，通过在同一折线上折叠和展开膜直至膜断裂或破裂来测定耐折性。

在一些实施方案中，膜具有约50至1000mm的爆裂压力。

在一些实施方案中，膜具有至少800mmHg的爆裂压力。

在一些实施方案中，膜在室温下稳定至少15个月。

在一些实施方案中，稳定性由爆裂压力和耐折性测定。

在一些实施方案中，膜在室温下储存15个月后具有至少5的折叠数。

在一些实施方案中，膜在室温下储存15个月后具有至少100的耐折性。

在一些实施方案中，膜在室温下储存15个月后具有至少800的爆裂压力。

在一些实施方案中，膜还包含粘合剂涂层。

在一些实施方案中，粘合剂涂层为氧化再生纤维素。

在一些实施方案中，粘合剂涂层以膜的5重量％-25重量％的量存在于膜上。

在一些实施方案中，膜是无菌的。

在一些实施方案中，膜通过γ辐照来灭菌。

在一些实施方案中，膜还包含钙。

在一些实施方案中，钙以0.00005-0.20mg/cm²膜的浓度存在于膜中。

在一些实施方案中，膜的厚度在0.1mm至1mm之间。

在一些实施方案中，膜的厚度为约100μm、150μm或200μm。

在另一个方面，本文提供了处理受试者中的伤口的方法，其包括向伤口施用有效量的干燥膜。

在一些实施方案中，在打开包含干燥膜的储存容器后不到15分钟将干燥膜施用于伤口。

在一些实施方案中，在打开包含干燥膜的储存容器后1至15分钟之间将干燥膜施用于伤口。

在一些实施方案中，伤口为急性伤口、慢性伤口、不愈合性伤口、糖尿病足溃疡、下肢静脉溃疡、压力性溃疡、手术伤口、动脉伤口、外伤性伤口或由ICD-9代码定义的皮肤病症。

在一些实施方案中，伤口为不愈合性伤口。

在一些实施方案中，伤口选自减少的原发性术后粘连形成、减少的术后粘连再形成、来自细胞和组织移植的伤口，和烧伤伤口。

在一些实施方案中，干燥膜在向受试者的伤口施用膜后不到28天降解。

在另一个方面，本文提供了制造用于处理受试者中的伤口的干燥膜的方法，其包括：获得人血浆；将血浆置于模具中；通过向血浆中添加聚合剂来聚合血浆以形成凝胶；向凝胶中添加银微粒以生成含银微粒的血浆凝胶；从聚合的凝胶移除流体以生成膜；干燥膜；和对膜进行γ灭菌。

在一些实施方案中，通过在约1.25托至125托的压力下向凝胶施加真空压力来进行流体的移除以生成膜。

在一些实施方案中，聚合剂为CaCl₂或凝血酶。

在一些实施方案中，聚合剂为CaCl₂。

在一些实施方案中，向血浆中添加0.5-1mg/ml的CaCl₂。

在一些实施方案中，向血浆中添加约0.86mg/ml的CaCl₂。

在一些实施方案中，所述方法还包括在干燥膜之前用甘油溶液温育膜。

在一些实施方案中，甘油溶液包含2％的甘油。

在一些实施方案中，将银微粒添加到血浆中。

在一些实施方案中，在凝胶的聚合之前添加银微粒。

在一些实施方案中，通过将银微粒与血浆混合来添加银微粒。

在一些实施方案中，在凝胶的聚合之后添加银微粒。

在一些实施方案中，在从凝胶移除流体之前添加银微粒。

在一些实施方案中，在从凝胶移除流体之后添加银微粒。

在一些实施方案中，在甘油溶液温育之后添加银微粒。

在一些实施方案中，通过在聚合的凝胶上施加包含银微粒的喷涂层来添加银微粒。

在一些实施方案中，银微粒以1-50mg银/cm²膜的浓度存在。

在一些实施方案中，银微粒以2.5-25mg银/cm²膜的浓度存在。

在一些实施方案中，银微粒的平均直径在2μm至1,000μm的范围内。

在一些实施方案中，银微粒的平均直径为约15μm。

在一些实施方案中，膜还包含磷脂。

在一些实施方案中，磷脂为磷脂酰丝氨酸或磷脂酰胆碱。

权利要求44-65中任一项的方法，其中钙以0.00005-0.20mg/cm²膜的浓度存在于膜中。

在一些实施方案中，膜包含小于约0.0999IU凝血酶/cm²膜。

在一些实施方案中，所述方法还包括在将血浆置于模具中之后于37℃温育血浆。

在一些实施方案中，将血浆于37℃温育5至30分钟。

在一些实施方案中，将血浆于37℃温育15分钟。

在一些实施方案中，所述方法还包括在用甘油溶液温育之后于37℃温育凝胶。

在一些实施方案中，将凝胶于37℃温育5至60分钟。

在一些实施方案中，将凝胶于37℃温育5分钟。

在一些实施方案中，将膜在42℃至50℃的温度下干燥。

在一些实施方案中，将膜干燥30分钟至120分钟。

在一些实施方案中，将膜在对流烘箱中干燥。

在一些实施方案中，膜的水分含量在约0.5至2.0mg/cm²之间。

在一些实施方案中，膜的水分含量为约0.9mg/cm²。

在一些实施方案中，所述方法还包括向膜添加粘合剂涂层。

在一些实施方案中，粘合剂涂层为氧化再生纤维素。

在一些实施方案中，粘合剂涂层以5重量％-25重量％的量存在于膜上。

在一些实施方案中，所述方法还包括对人血浆进行病毒灭活。

在一些实施方案中，病毒灭活包括溶剂/去污剂和/或纳滤。

在一些实施方案中，溶剂/去污剂为Triton X-100。

在一些实施方案中，膜的厚度在约0.1mm至1mm之间。

在另一个方面，本文提供了在受试者中预防伤口的方法，其包括向受试者中易于形成伤口的区域施用有效量的干燥膜。

在一些实施方案中，在打开包含干燥膜的储存容器后不到15分钟将干燥膜施用于易于形成伤口的区域。

在一些实施方案中，在打开包含干燥膜的储存容器后1至15分钟之间将干燥膜施用于易于形成伤口的区域。

在一些实施方案中，伤口为不愈合性伤口。

在一些实施方案中，伤口为急性伤口、慢性伤口、不愈合性伤口、糖尿病足溃疡、下肢静脉溃疡、压力性溃疡、手术伤口、动脉伤口、外伤性伤口或由ICD-9代码定义的皮肤病症。

在一些实施方案中，伤口为不愈合性伤口。

在一些实施方案中，伤口为疝。

在一些实施方案中，干燥膜在向受试者中易于形成伤口的区域施用膜后不到28天降解。

附图的简要说明

结合以下描述和附图，本发明的这些及其他特征、方面和优点将得到更好的理解，在附图中：

图1为示意本文公开的干燥膜的一个实施方案的图。

图2A-2D示出了在各种溶液中的银微粒电离。在四种液体媒介物中提取微粒至四个不同的时间/温度终点(37℃下1小时、24小时和7天以及50℃下72小时)。数据为平均值±标准差(SD)。图2A示出了在水中的电离。图2B示出了在模拟体液SBF中的电离。图2C示出了在生理盐水中的电离。图2D示出了在人血浆中的电离。

图3A示出混合在血浆膜内的银微粒在遗传性糖尿病(db/db)小鼠中加速皮肤伤口愈合。如通过Student t-检验所确定的，用含银微粒的血浆膜治疗的动物与盐水治疗的对照相比，平均曲线下面积(AUC)分析显著较低。图3B示出银微粒加液体纤维蛋白密封剂在遗传性糖尿病(db/db)小鼠中加速皮肤伤口愈合。如通过Student t-检验所确定的，用银微粒加液体纤维蛋白密封剂治疗的动物与盐水治疗的对照相比，平均曲线下面积(AUC)分析显著较低。

图4示出了用含银微粒L的干燥纤维蛋白膜治疗的糖尿病小鼠(C57BL/KsJ-db/db)中愈合的切除性皮肤伤口的代表性组织学样本。可以在银微粒周围(黑色箭头)和在组织处理期间由银微粒的脱落导致的空气空间周围(白色箭头)看到若干多核巨细胞。40倍放大。

图5提供了拟定的临床试验的事件时间表。

具体实施方式

定义

除非另有指定，否则权利要求书和说明书中使用的术语如下文所阐述的那样定义。

除非另有明确说明，否则术语“约”指的是指定值的+/-15％。在一些实施方案中，“约”指的是指定值的+/-5％。

如本文所用，术语“干燥膜”是指本文描述的包含纤维蛋白/纤维蛋白原的膜(例如，包含全血或全血浆的膜)，其中所述膜已经经受处理(例如，施加压力和/或热)以从膜基本上除去水。

术语稳定性或“储存稳定性”是指产品在指定限度内和在其整个储存和使用期间保持与其在其制造时所具有的相同性质和特征的程度。例如，产品的稳定性可以测量为膜产品具有与其在其制造时所具有的相同爆裂压力(即，800至1,300mmHg)。一种示例性的稳定性特定限度为与新合成的膜相比在选定的时间量之后保持定量度量指标的至少80％。定量度量指标包括但不限于爆裂压力、折叠数和耐折性。在一些实施方案中，稳定性为两个或更多个定量度量指标的组合。

术语“增强的伤口愈合”是指与未用本公开的方法和组合物治疗的伤口相比伤口愈合效率的增加和/或最终愈合伤口部位的强度的增加。在某些情况下，增强的伤口愈合是指与未用本公开的方法和组合物治疗的相应伤口相比伤口上成熟胶原的沉积的增加。

术语“不愈合性伤口”是指在没有医疗干预的情况下不愈合的伤口或在没有医疗干预的情况下在充分的时间内不愈合的伤口，其很可能导致感染风险的增加或伤口严重程度随时间的增加。不愈合性伤口的实例包括但不限于：糖尿病足溃疡、静脉溃疡、压力性溃疡、动脉溃疡、慢性溃疡、创伤性伤口、手术伤口和皮肤病症。

如本文所用，术语“原位”是指将药物组合物施加于受试者上(例如，受试者的伤口部位处)。

术语“体内”是指在活生物体中发生的过程。

如本文所用，术语“哺乳动物”包括人类和非人类，并包括但不限于人类、非人灵长类动物、犬科动物、猫科动物、鼠科动物、牛科动物、马科动物和猪科动物。

术语“足够量”是指足以产生所需效果的量，例如足以增强受试者中的伤口愈合的量。

术语“治疗有效量”为有效改善疾病症状的量。

必须指出，如说明书和附随的权利要求书中所用，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代，上下文另有明确指出除外。

简而言之，并且如下文更详细地描述的，本文描述了用于增强受试者中的伤口愈合的方法和组合物。应注意当前方法的若干特征。所述组合物在室温下稳定至少三年并可容易地施用于伤口。所述组合物作为干燥膜施用，其允许将组合物均匀地施加到伤口表面，包括其中组分的精确给药。具有纤维蛋白原/纤维蛋白加银的组合物增强伤口愈合，包括增加单核细胞/巨噬细胞融合成多核巨细胞和成熟胶原在整个伤口上的沉积。

包含纤维蛋白/纤维蛋白原和银的膜

本文描述了包含纤维蛋白、纤维蛋白原或其组合的干燥膜。在某些方面，所述干燥膜在室温下是储存稳定的。在某些实施方案中，所述干燥膜在室温下稳定至少3年。

纤维蛋白和/或纤维蛋白原可作为全血、全血浆、冷沉淀物或纤维蛋白原浓缩物的组分提供。纤维蛋白原也可以源自重组纤维蛋白原。因此，在某些实施方案中，纤维蛋白或纤维蛋白原源自全血浆。在某些实施方案中，纤维蛋白或纤维蛋白原源自重组纤维蛋白原。在某些实施方案中，纤维蛋白或纤维蛋白原源自冷沉淀的纤维蛋白或纤维蛋白原。

在某些实施方案中，纤维蛋白和/或纤维蛋白原浓度为0.5至20.0mg/cm²膜。在某些实施方案中，纤维蛋白和/或纤维蛋白原浓度为1.0至10.0mg/cm²膜、0.5至1.0mg/cm²膜、0.5至5.0mg/cm²膜、1.0至2.0mg/cm²膜、2.0至3.0mg/cm²膜、3.0至4.0mg/cm²膜、4.0至5.0mg/cm²膜、5.0至6.0mg/cm²膜、6.0至7.0mg/cm²膜、7.0至8.0mg/cm²膜、8.0至9.0mg/cm²膜、9.0至10.0mg/cm²膜、1.5至2.0mg/cm²膜、2.0至2.5mg/cm²膜、2.5至3.0mg/cm²膜、3.0至3.5mg/cm²膜、3.5至4.0mg/cm²膜、4.0至4.5mg/cm²膜、4.5至5.0mg/cm²膜、5.0至5.5mg/cm²膜、5.5至6.0mg/cm²膜、6.0至6.5mg/cm²膜、或6.5至7.0mg/cm²膜、7.0至7.5mg/cm²膜、7.5至8.0mg/cm²膜、8.0至8.5mg/cm²膜、8.5至9.0mg/cm²膜、9.0至9.5mg/cm²膜、或9.5至10.0mg/cm²膜。在某些实施方案中，纤维蛋白和/或纤维蛋白原浓度为约4.0mg/cm²膜。

在某些实施方案中，对于每1mL血浆，膜中存在1-5mg纤维蛋白原。在某些实施方案中，对于每1mL血浆，膜中存在2-5mg、2.5-4.5mg、3.0-5.0mg、2.0-3.0mg、3.0-4.0mg、4.0-5.0mg、2.5-3.0mg、3.0-3.5mg、3.5-4.0mg、4.0-4.5mg或4.5-5.0mg纤维蛋白原。

在某些实施方案中，0.1-1.0mL的全血浆产生1cm²的干燥膜。在某些实施方案中，0.1-0.5mL、0.5-1.0mL、0.1-0.2mL、0.2-0.3mL、0.3-0.4mL、0.4-0.5mL、0.5-0.6mL、0.7-0.8mL、0.8-0.9mL、0.9-1.0mL的全血浆产生1cm²的干燥膜。在某些实施方案中，约0.1mL、约0.2mL、约0.3mL、约0.4mL、约0.5mL、约0.6mL、约0.7mL、0.8mL、0.9mL或约1.0mL产生1cm²的干燥膜。

在某些实施方案中，膜的厚度小于1mm。在某些实施方案中，膜的厚度为1mm-5mm、0.1-1.5mm、0.1-1.0mm、0.5-1.0mm、或0.1-0.5mm。在某些实施方案中，膜的厚度为0.1-0.3mm。在某些实施方案中，膜的厚度为0.1-0.2mm。在某些实施方案中，膜的厚度为0.15-0.2mm。在某些实施方案中，膜的厚度为0.1-0.3mm、0.1-0.2mm或0.15-0.2mm。

在某些实施方案中，膜同时具有机械强度和弹性。在某些实施方案中，膜具有允许1.5倍弹性的弹性模量和大于800mmHg的爆裂压力。

在某些实施方案中，膜在植入后不到50天降解。在某些实施方案中，膜在植入后不到45天、40天、35天、30天、25天、24天、23天、22天、21天、20天、19天、18天、17天、16天、15天、14天、13天、12天、11天、10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天或2天降解。在某些实施方案中，膜在植入后不到28天降解。在某些实施方案中，膜在植入后不到21天降解。

在某些实施方案中，膜掺入具有受控释放性质的各种化合物，例如对所描述的膜加载银微粒，其可以在植入后连续地释放直至膜降解。

在某些实施方案中，膜还包含银。在某些实施方案中，银可呈金属银微粒(平均直径2μm至1,000μm)、银化合物(碳酸银、氯化银、磷酸银、氟化银、乙酸银、硫酸银、柠檬酸银、氧化银)或纳米银(平均直径<2μm)或其组合的形式。

不同尺寸的银微粒通常可从多个商业供应商获得，如5μm(Silpowder 225,Technic,Inc)、15μm(Atomized fine silver powder 81-800,Technic,Inc.)和45μm(Silver powder 327093,Sigma Chemicals)。

在某些实施方案中，膜中银的浓度为总Ag浓度>2nM(2.0×10^-9M)。在某些实施方案中，金属银的浓度为2nM–1μM、2nM–100nM、2nM–10nM、10nM–100nM、100nM–1μM、5nM–10nM、10nM–20nM、20nM–50nM、2nM–5nM或500nM–1μM。在某些实施方案中，膜中银的可溶浓度为约2nM、约5nM、约10nM、约15nM、约20nM、约30nM、约40nM、约50nM、约50nM、约70nM、约80nM、约90nM、约100nM、约150nM、约200nM、约250nM、约300nM、约350nM、约400nM、约450nM、约500nM、约550nM、约600nM、约650nM、约700nM、约750nM、约800nM、约850nM、约900nM、约950nM、或约1μM。

在某些实施方案中，膜具有的银与纤维蛋白/纤维蛋白原的重量/重量比率为0.01(wt/wt)或更大、0.1(wt/wt)或更大、或0.2(wt/wt)或更大、或0.3(wt/wt)或更大、或0.4(wt/wt)或更大、或0.5(wt/wt)或更大、或0.6(wt/wt)或更大、或0.7(wt/wt)或更大、或0.8(wt/wt)或更大、或0.9(wt/wt)或更大、或1(wt/wt)或更大、或1.1(wt/wt)或更大、或1.2(wt/wt)或更大、或1.3(wt/wt)或更大、或1.4(wt/wt)或更大、或1.5(wt/wt)或更大、或1.6(wt/wt)或更大、或1.7(wt/wt)或更大、或1.8(wt/wt)或更大、或1.9(wt/wt)或更大、或2(wt/wt)或更大、或2.1(wt/wt)或更大、或2.2(wt/wt)或更大、或2.3(wt/wt)或更大、或2.4(wt/wt)或更大、或2.5(wt/wt)或更大、或2.6(wt/wt)或更大、或2.7(wt/wt)或更大、或2.8(wt/wt)或更大、或2.9(wt/wt)或更大、或3(wt/wt)或更大、或4(wt/wt)或更大、或5(wt/wt)或更大、或10(wt/wt)或更大。例如，药物组合物的有效量可以包括2.2(wt/wt)或更大的银与纤维蛋白/纤维蛋白原的重量/重量比率。在某些实施方案中，药物组合物的有效量可以包括约1.5(wt/wt)、约1.6(wt/wt)、约1.7(wt/wt)、约1.8(wt/wt)、约1.9(wt/wt)、2.0(wt/wt)、约2.1(wt/wt)、约2.2(wt/wt)、约2.3(wt/wt)、约2.4(wt/wt)、约2.5(wt/wt)、约2.6(wt/wt)、约2.7(wt/wt)、约2.8(wt/wt)、约2.9(wt/wt)、约3.0(wt/wt)、约3.1(wt/wt)、约3.2(wt/wt)、约3.3(wt/wt)、约3.4(wt/wt)、约3.5(wt/wt)、约3.6(wt/wt)、约3.7(wt/wt)、约3.8(wt/wt)、约3.9(wt/wt)、约4.0(wt/wt)、或约5.0(wt/wt)的银与纤维蛋白/纤维蛋白原的重量/重量比率。

在某些实施方案中，当施用于受试者时，膜释放0.0002至50.0ppm的银离子。在某些实施方案中，当施用于受试者时，膜释放0.02至5.0ppm的银离子。在某些实施方案中，当施用于受试者时，膜释放0.0001-0.001、0.001-0.01、0.01-0.1、0.1-1.0、0.001-0.005、0.005-0.01、0.01-0.05、0.05-0.10、0.10-0.15、0.15-0.20、0.20-0.25、0.25-0.30、0.30-0.35、0.35-0.40、0.40-0.45、0.45-0.50、0.50-0.55、0.55-0.60、0.60-0.65、0.65-0.70、0.70-0.75、0.75-0.80、0.80-0.85、0.85-0.90、0.90-0.95、0.95-0.10、1-2、2-3、3-4、4-5、5-10、10-20、20-30、30-40或40-50ppm的银离子。

在某些实施方案中，银为基本上实心的颗粒的形式。在一些情况下，基本上实心的颗粒可以是多孔的(例如，微米多孔的、纳米多孔的等)。然而，基本上实心的颗粒不包括具有被壳包围的空隙空间的中空颗粒。在这些实施方案中，银颗粒不包括中空颗粒。在某些情况下，银颗粒不包括聚合物材料。例如，银颗粒可以仅包括银(例如，银、氧化银、银离子等)。

在某些实施方案中，银为微粒或纳米颗粒的形式。在某些实施方案中，微粒或纳米颗粒为金属银微粒或金属银纳米颗粒。在某些实施方案中，包含银的微粒或纳米颗粒不是金属银而为另一形式的银(例如，碳酸银、氯化银、磷酸银、氟化银、乙酸银、硫酸银、柠檬酸银、氧化银或其组合)。

在某些实施方案中，银微粒的平均直径范围为2μm至1,000μm。在某些实施方案中，银微粒的平均直径范围为10μm至1,000μm、100μm至1,000μm、1μm至1,000μm、10μm至100μm、500μm至1,000μm、1μm至10μm、或10至500μm。在一些实施方案中，银微粒的平均直径范围为10-20μm。在一些实施方案中，银微粒的平均直径为约2μm、7μm、10μm、15μm、20μm或25μm。在一些实施方案中，银微粒的平均直径为约15μm。

在某些实施方案中，膜中存在的银微粒中金属银的量为0.1-50mg银/cm²膜。在某些实施方案中，膜中存在的金属银的量为10–50mg银/cm²、1–5mg银/cm²、5–10mg银/cm²、10–15mg银/cm²、15–20mg银/cm²、20–25mg银/cm²、25–30mg银/cm²、30–35mg银/cm²、35–40mg银/cm²、45–50mg银/cm²、10–20mg银/cm²、20–30mg银/cm²、30–40mg银/cm²或40–50mg银/cm²。在某些实施方案中，银微粒以约5mg银/cm²、约10mg银/cm²、约15mg银/cm²、约20mg银/cm²、约25mg银/cm²、约30mg银/cm²、约35mg银/cm²、约40mg银/cm²、约45mg银/cm²、或约50mg银/cm²的浓度存在。

在某些实施方案中，膜包含约0.1–50mg银微粒/cm²膜。在某些实施方案中，膜包含约10–50mg银微粒/cm²、1–5mg银微粒/cm²、5–10mg银微粒/cm²、10–15mg银微粒/cm²、15–20mg银微粒/cm²、20–25mg银微粒/cm²、25–30mg银微粒/cm²、30–35mg银微粒/cm²、35–40mg银微粒/cm²、45–50mg银微粒/cm²、10–20mg银微粒/cm²、20–30mg银微粒/cm²、30–40mg银微粒/cm²、或40–50mg银微粒/cm²。在某些实施方案中，膜包含约5mg银微粒/cm²、约10mg银/cm²、约15mg银微粒/cm²、约20mg银微粒/cm²、约25mg银微粒/cm²、约30mg银微粒/cm²、约35mg银微粒/cm²、约40mg银微粒/cm²、约45mg银微粒/cm²、或约50mg银微粒/cm²。

在一些情况下，银微粒的尺寸足以在受试者中在施加部位处诱导异物反应。例如，微粒具有在2μm至1000μm的范围内的平均直径。相比之下，纳米颗粒具有1nm至1000nm的平均直径。在一些情况下，银微粒具有2μm或更大，如3μm或更大，包括4μm或更大、或5μm或更大、或7μm或更大、或10μm或更大、或15μm或更大、或20μm或更大、或25μm或更大、或50μm或更大、或75μm或更大、或100μm或更大、或150μm或更大或200μm或更大、或250μm或更大或500μm或更大的平均直径。例如，银微粒可以具有2μm至1000μm，如2μm至750μm，包括3μm至500μm、或5μm至250μm的范围内的平均直径。在某些情况下，银微粒具有5μm或更大的平均直径。在一些情况下，银微粒具有200μm或更大的平均直径。在一些实施方案中，银微粒包括具有如上所述尺寸的一系列不同尺寸的银微粒的混合物。如本文所用，术语“平均”为算术平均。

在某些情况下，银颗粒具有基本上对称的形状。例如，银颗粒可以具有基本上球形、椭圆形、圆柱形等的形状。在一些实施方案中，银颗粒具有基本上球形的形状。在其他实施方案中，银颗粒可以具有不规则的形状。在某些情况下，银颗粒具有基本上光滑的外表面。在其他情况下，银颗粒具有纹理化(例如，粗糙的)外表面。在一些情况下，银颗粒包括具有如上所述的不同形状和/或纹理的银颗粒的混合物。在某些情况下，银颗粒具有足以在受试者中在施加部位处诱导异物反应的形状和/或纹理。例如，银颗粒可以具有球形形状、杆形形状、星形形状、不规则形状、其组合等。

在某些实施方案中，膜还包含凝血酶。在某些实施方案中，膜包含至少2IU/ml的凝血酶/cm²膜。在某些实施方案中，膜具有多于2.5IU凝血酶/cm²膜。在某些实施方案中，膜具有2-2,500IU、2-10IU、2-100IU、100-200IU、200-500IU、500-1,000IU或1,000-2,500IU凝血酶/cm²膜。在某些实施方案中，膜包含小于0.1IU凝血酶/cm²膜。在某些实施方案中，膜包含小于0.105IU、0.1IU、0.095IU、0.09IU、0.05IU、0.01IU、0.009IU、0.005IU或0.001IU凝血酶/cm²膜。在某些实施方案中，膜不包含凝血酶。

在某些实施方案中，膜包含全血浆，并且膜内的血浆还包含凝血酶。在某些实施方案中，全血浆具有至少2IU/ml的凝血酶/ml血浆。在某些实施方案中，全血浆具有多于2.5IU凝血酶/ml血浆。在某些实施方案中，膜包含具有2-2,500、2-10IU、2-100IU、100-200IU、200-500IU、500-1,000IU或1,000-2,500IU IU凝血酶/ml血浆的全血浆。在某些实施方案中，全血浆具有小于0.105IU/ml、0.1IU/ml、0.095IU/ml、0.09IU/ml、0.05IU/ml、0.01IU/ml、0.009IU/ml、0.005IU/ml或0.001IU/ml的凝血酶/ml血浆。

在某些实施方案中，膜还包含钙。在某些实施方案中，膜包含0.01-1mg CaCl₂/cm²膜。在某些实施方案中，膜包含0.01-0.10、0.01-0.02、0.02-0.03、0.03-0.04、0.04-0.05、0.05-0.06、0.06-0.07、0.07-0.08、0.09-0.10、0.1-0.2、0.2-0.3、0.3-0.4、0.4-0.5、05-0.6、0.6-0.7、0.7-0.8、0.8-0.9、0.9-1.0mg/CaCl₂/cm²膜。

在某些方面，本文描述的干燥膜在从包含该干燥膜的储存容器取出时可用。在某些实施方案中，本文描述的干燥膜可供使用并且在使用之前不需要任何其他的组分或添加剂。在某些实施方案中，本文描述的干燥膜可在从包含该干燥膜的储存容器取出后5分钟、4分钟、3分钟、2分钟、1分钟、45秒、30秒、20秒、10秒、5秒内或立即使用。

在某些方面，本文描述的干燥膜稳定长达3年。例如，所述干燥膜可稳定至少1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月、18个月、19个月、20个月、21个月、22个月、23个月、24个月、25个月、26个月、27个月、28个月、29个月、30个月、31个月、32个月、33个月、34个月、35个月或36个月或更长时间。在一个方面，稳定性为与新合成的膜相比在选定的时间量之后保持定量度量指标(如爆裂压力、折叠数或耐折性)的至少80％。在一些方面，稳定性可以是单独的定量度量指标或与另一定量度量指标组合。在一个实施方案中，稳定性为爆裂压力和耐折性的组合。示例性的稳定性度量指标为至少800mmHg的爆裂压力和至少100的耐折性。在一些实施方案中，稳定性度量指标为至少800mmHg的爆裂压力和至少100的耐折性。在一些实施方案中，稳定性度量指标为至少800mmHg的爆裂压力和至少500的耐折性。在一些实施方案中，稳定性度量指标为至少800mmHg的爆裂压力和至少1000的耐折性。

含银微粒的膜的稳定性可根据人用药物注册技术要求国际协调会议(ICH)Q1A(R2):新原料药和产品的稳定性试验(Stability Testing of New Drug Substances andProducts)在两种条件下监测：1.条件A(2-8℃)评价在药品(含银微粒的膜)储存的温度下的稳定性；和2.条件B(23-27℃/55-65％的相对湿度[RH])评估保持在药品(含银微粒的膜)上的受控室温的影响(如果有的话)。含银微粒的膜可在2-8℃下和23-27℃/55-65％相对湿度下储存长达3年。膜的稳定性可通过根据行业标准程序测定至少1个月、3个月、6个月、9个月、12个月、18个月、24个月、30个月和36个月的爆裂压力、折叠数和耐折性来评估。爆裂压力可根据ASTM爆裂压力标准测试方法通过内部方法测定。外科密封剂的强度(F 2392-04)。在一些实施方案中，基于血浆的柔性膜具有约50至1000mmHg的爆裂压力。

测定膜柔韧性的折叠数为对膜折叠数量的评价。这样的测定通过如下进行：将膜的一半折叠在另一半的顶部上，将堆叠转动90°，然后再次将堆叠的一半折叠在另一半的顶部上，依此类推，直至膜断裂或破裂。不触发膜破裂的每次折叠都将折叠数增加1。该测试对于评估基于血浆的膜在以紧密转角弯曲时保持其完整性的能力特别有用。在一些实施方案中，本发明的基于血浆的柔性膜具有至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50的折叠数。

测定膜柔韧性的另一个试验为对耐折性的评价。这样的测定通过重复地将膜的一半折叠在另一半的顶部上并展开到其原始位置来进行。耐折性由这样的折叠/展开重复的数目表示并提供用于耐磨损性估计的手段。在一些实施方案中，本发明的基于血浆的柔性膜具有至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少100、至少150、至少200、至少250、至少300、至少350、至少400、至少450、至少500、至少550、至少600、至少650、至少700、至少750、至少800、至少850、至少900、至少950、或至少1000或更多的耐折性。

在另一个方面，膜的表面上的银或银微粒是耐磨的。如本文所用，“耐磨”或“耐磨性”为没有在干燥后从膜剥落或刷擦掉的银或银微粒残余物的材料量。耐磨性可通过称取含银膜的重量、用刷子或工具反复刷擦膜并在刷擦后再次称取膜的重量来测定。通过磨擦除去的银的量可以作为损失的总重量或重量百分数来评估。在一些实施方案中，该材料量少于生产期间施加到膜的银的总量的0.1％、少于0.5％、少于1％、少于2％、少于3％、少于4％或少于5％。在一些实施方案中，该材料量少于生产期间施加到膜的银的总mg量的0.25mg/cm²、少于0.5mg/cm²、少于0.75mg/cm²、少于1mg/cm²或少于1.25mg/cm²。

在某些方面，本文描述的干燥膜具有约0.5至2.0mg/cm²的水分含量(水含量)。例如，干燥膜可具有约0.5-2.0mg/cm²、0.5-1.0mg/cm²、0.5-0.9mg/cm²、0.7-0.9mg/cm²、0.7-1.0mg/cm²、0.7-1.1mg/cm²、0.7-1.2mg/cm²、0.7-1.5mg/cm²、0.7-1.8mg/cm²、0.7-2.0mg/cm²、0.8-0.9mg/cm²、0.8-1.0mg/cm²、0.8-1.1mg/cm²、0.8-1.2mg/cm²、0.8-1.5mg/cm²、0.8-1.8mg/cm²、0.8-2.0mg/cm²、0.9-1.0mg/cm²、0.9-1.1mg/cm²、0.9-1.2mg/cm²、0.9-1.5mg/cm²、0.9-1.8mg/cm²、0.9-2.0mg/cm²、1.0-1.1mg/cm²、1.0-1.2mg/cm²、1.0-1.5mg/cm²、1-1.8mg/cm²、1.0-2.0mg/cm²、1.2-1.5mg/cm²、1.2-1.8mg/cm²、1.2-2.0mg/cm²、1.5-1.8mg/cm²、1.5-2mg/cm²或1.8-2mg/cm²的水分含量。在一些实施方案中，干燥膜具有约0.5mg/cm²、0.6mg/cm²、0.7mg/cm²、0.8mg/cm²、0.9mg/cm²、1.0mg/cm²、1.1mg/cm²、1.2mg/cm²、1.3mg/cm²、1.4mg/cm²、1.5mg/cm²、1.6mg/cm²、1.7mg/cm²、1.8mg/cm²、1.9mg/cm²或2.0mg/cm²的水分含量。在一些实施方案中，干燥膜具有约0.9mg/cm²的水分含量。可通过称取干燥膜的重量，在烘箱中于80℃干燥膜另外的时间量如3小时，和然后再次称取膜的重量以测定由于水分蒸发引起的重量损失来评估膜的水分含量。

在某些方面，本文描述的干燥膜具有约2％至5％的水分含量(水含量)。例如，干燥膜可具有约2％-2.5％、2％-3％、2％-3.5％、2％-4％、2％-4.5％、2％-5％、3％-3.3％、3％-3.5％、3％-4％、3％-4.5％、3％-5％、4％-4.5％或4％-5％的水分含量。在一些实施方案中，干燥膜具有约2％、2.3％、2.5％、2.7％、3％、3.3％、3.5％、3.7％、4％、4.3％、4.5％、4.7％或5％的水分含量。在一些实施方案中，干燥膜具有约3.3％的水分含量。

在一些实施方案中，含有银微粒的干燥膜还包含至少一种磷脂。所述磷脂可在聚合步骤期间加入。示例性的磷脂有磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺。在一些实施方案中，膜包含磷脂酰丝氨酸。在一些实施方案中，膜包含磷脂酰胆碱。在一些实施方案中，膜包含磷脂酰乙醇胺。在一些实施方案中，膜包含磷脂酰丝氨酸和磷脂酰胆碱。

银，如银微粒，可均匀地分布在整个膜中或不均匀地分布在整个膜中。在一些实施方案中，银如银微粒均匀地分布在膜的整个厚度上。在一些实施方案中，银如银微粒不均匀地分布在膜的整个厚度上。例如，在更靠近膜的顶部和/或底部表面处可存在较高量的银，而在更靠近膜的中心处可存在较低量的银，从而形成浓度梯度。示例性的浓度梯度(作为膜中总银的百分数)包括但不限于99％-1％(表面到中心)、97％-3％(表面到中心)、95％-5％(表面到中心)、90％-10％(表面到中心)、85％-15％(表面到中心)、80％-20％(表面到中心)、75％-25％(表面到中心)、70％-30％(表面到中心)、65％-35％(表面到中心)、60％-40％(表面到中心)和55％-45％(表面到中心)。膜可在5％、10％、15％、20％、30％或40％膜厚度的膜表面顶部和/或底部中具有较高量的银微粒。例如，在1mm膜中，如果膜在0.1mm顶部和底部中具有较高量的银如银微粒，则该膜在膜厚度的10％表面顶部和底部中具有较高量的银。

包含另外的试剂的膜

取决于待治疗的病症，本文描述的干燥膜可单独施用或者与其他治疗同时或依次地组合施用。

在某些实施方案中，膜包含另外的组分，例如但不限于纤维蛋白溶解抑制剂、白蛋白(例如，人白蛋白)、柠檬酸三钠、组氨酸、烟酰胺、聚山梨醇酯80、水(例如，无菌水，如注射用水)、氯化钙、氯化钠、其组合等。例如，除了纤维蛋白原之外，第一材料前体试剂可以包括纤维蛋白溶解抑制剂、白蛋白(例如，人白蛋白)、柠檬酸三钠、组氨酸、烟酰胺、聚山梨醇酯80、水(例如，无菌水，如注射用水)等中的一种或多种。在一些情况下，除了凝血酶之外，第二材料前体试剂可以包括白蛋白(例如，人白蛋白)、水(例如，无菌水，如注射用水)、氯化钙、氯化钠等中的一种或多种。可以包含在膜中的组分的另外的实例包括但不限于蛋白酶抑制剂，如抑肽酶。在某些实施方案中，当膜源自全血或血浆时，膜包含在获得血液或血浆以生成膜时存在于血液或血浆中的另外的组分。

包含粘合剂涂层的膜

在某些实施方案中，本文描述的干燥膜还包含粘合剂涂层。粘合剂涂层可由增加粘合性的任何合适的材料制成，包括但不限于纤维素。也可使用来自Sigma的低、中或高粘度的CMC代替再生纤维素。在某些实施方案中，粘合剂涂层包含纤维素。在某些实施方案中，粘合剂涂层包含氧化再生纤维素。在某些实施方案中，粘合剂涂层包含羧甲基纤维素。在某些实施方案中，粘合剂涂层以1重量％-25重量％、10重量％-20重量％、5重量％-10重量％、10重量％-15重量％、15重量％-20重量％、20重量％-25重量％、5重量％-20重量％或15重量％-25重量％的量存在于膜中。在某些实施方案中，粘合剂涂层以约5重量％、6重量％、7重量％、8重量％、9重量％、10重量％、11重量％、12重量％、13重量％、14重量％、15重量％、16重量％、17重量％、18重量％、19重量％、20重量％、21重量％、22重量％、23重量％、24重量％或25重量％的量存在于膜中。

包含铈的膜

在某些方面，本文提供了包含铈的干燥膜。在某些实施方案中，干燥膜包含银微粒和铈。在某些实施方案中，在移除流体以生成膜之前，铈以10-500mM、20-400mM、10-100mM、20-50mM、50-100mM、100-150mM、150-200mM、200-250mM、250-300mM、300-350mM、350-400mM或400-500mM的浓度存在于聚合的凝胶中。在某些实施方案中，在移除流体以生成膜之前，铈以约20mM、约30mM、约40mM、约50mM、约60mM、约70mM、约80mM、约90mM、约100mM、约110mM、约120mM、约130mM、约140mM、约150mM、约160mM、约170mM、约180mM、约190mM、约200mM、约210mM、约220mM、约230mM、约240mM、约250mM、约260mM、约270mM、约280mM、约290mM、约300mM、约310mM、约320mM、约320mM、约330mM、约340mM、约350mM、约360mM、约370mM、约380mM、约390mM或约400mM的浓度存在于聚合的凝胶中。

在某些实施方案中，包含铈的干燥膜还包含银。在某些实施方案中，银为银纳米颗粒或银微粒的形式。在某些实施方案中，银为金属银纳米颗粒或金属银微粒的形式。在某些实施方案中，包含铈和银微粒的干燥膜包含10-50mg银微粒/cm²膜。在某些实施方案中，包含铈的干燥膜还包含以10–50mg银/cm²、1–5mg银/cm²、5–10mg银/cm²、10–15mg银/cm²、15–20mg银/cm²、20–25mg银/cm²、25–30mg银/cm²、30–35mg银/cm²、35–40mg银/cm²、45–50mg银/cm²、10–20mg银/cm²、20–30mg银/cm²、30–40mg银/cm²或40–50mg银/cm²伤口表面积存在于膜中的银微粒。在某些实施方案中，银微粒以约5mg银/cm²、约10mg银/cm²、约15mg银/cm²、约20mg银/cm²、约25mg银/cm²、约30mg银/cm²、约35mg银/cm²、约40mg银/cm²、约45mg银/cm²或约50mg银/cm²膜的浓度存在。

来自全血的膜

在某些方面，本文描述的干燥膜包含全血。在某些方面，包含全血的干燥膜为自体全血，旨在用于治疗或预防患者中的伤口。

作为一个实例，可经由本文描述的方法在采集患者血液之后立即制备膜。示例性方法是：将患者血液与钙和/或凝血酶混合以形成凝块(凝胶)，将凝块(凝胶)置于小真空夹具上并施加5分钟的低真空。可在真空步骤之前或之后加入银，并且接着可将膜置于伤口上。这样的制备可在患者旁边进行，使得可在不到10分钟内开始并完成膜安置于伤口上的过程。可用少至10mL的来自供体或患者的全血来制备小膜。

在某些实施方案中，本文描述的干燥膜包含全血并且还包含银。在某些实施方案中，本文描述的干燥膜包含全血并且还包含微粒或纳米颗粒形式的银。在某些实施方案中，本文描述的干燥膜包含全血并且还包含金属银微粒或金属银纳米颗粒形式的银。在某些实施方案中，来自全血的干燥膜还包含以10–50mg银/cm²、1–5mg银/cm²、5–10mg银/cm²、10–15mg银/cm²、15–20mg银/cm²、20–25mg银/cm²、25–30mg银/cm²、30–35mg银/cm²、35–40mg银/cm²、45–50mg银/cm²、10–20mg银/cm²、20–30mg银/cm²、30–40mg银/cm²或40–50mg银/cm²伤口表面积存在于膜中的银微粒。在某些实施方案中，银微粒以约5mg银/cm²、约10mg银/cm²、约15mg银/cm²、约20mg银/cm²、约25mg银/cm²、约30mg银/cm²、约35mg银/cm²、约40mg银/cm²、约45mg银/cm²或约50mg银/cm²膜的浓度存在。

用于增强伤口愈合和治疗伤口的方法

在某些方面，本文描述的方法用于治疗伤口和增强各种伤口的愈合，所述伤口包括但不限于急性伤口、慢性伤口、不愈合性伤口、糖尿病足溃疡、下肢静脉溃疡、压力性溃疡、动脉伤口、溃疡、腹部切口伤口、手术伤口、外伤性伤口、脂皮瓣(lipocutaneous flaps)和由ICD-9代码定义的皮肤病症。国际疾病分类第九版(ICD-9)代码可于cdc.gov/nchs/icd/icd9上从CDC获得。

本发明施用的频率取决于所治疗的伤口的临床环境，并且可以在从治疗腹部切口伤口或脂皮瓣时的单次应用到治疗溃疡、手术伤口、外伤性伤口、烧伤或皮肤病症时与伤口敷料更换同时进行的多次应用的范围内。在某些方面，本文描述的方法增强受损组织和细胞的愈合，包括减少的原发性术后粘连形成、术后粘连再形成及细胞和组织移植(例如，胰岛或肝细胞(肝脏细胞)移植物存活)。

在一些情况下，增强伤口的愈合包括与未用本公开的方法和组合物治疗的伤口相比伤口愈合效率的提高和/或最终愈合伤口部位的强度的增加。在一些情况下，增强伤口的愈合包括与未用本公开的方法和组合物治疗的伤口相比减少伤口愈合缺陷的发生和/或降低伤口愈合缺陷的严重程度。

在某些方面，本文描述的方法和含银膜诱导异物巨细胞的形成。不希望受理论的束缚，据认为在其中膜包含大于5μm的银微粒的一些实施方案中，银微粒不能被细胞如巨噬细胞吞噬。这被认为导致巨噬细胞的融合和多核异物巨细胞的形成。不希望受理论束缚，这样的细胞然后分泌各种细胞因子和细胞活素，如IL-1α、IL-1β、IL-10、TNF-α、TGF-β、IFN-γ、基质金属蛋白酶(MMP)MMP-9、TIMP-1、TIMP-2以及分泌生长和血管生成因子。不希望受理论束缚，异物巨细胞还刺激成纤维细胞活性、过表达细胞外基质蛋白质并募集分泌胶原蛋白的细胞。因此，不希望受理论束缚，包含太大而不能被巨噬细胞吞噬的银微粒导致伤口愈合增加。在一些实施方案中，太大而不能被巨噬细胞吞噬的银微粒的尺寸为至少5μm、7μm、10μm、12μm、15μm、17μm、20μm、25μm、或30μm或更大。在一些实施方案中，太大而不能被巨噬细胞吞噬的银微粒的尺寸为至少15μm。

在一些情况下，本文描述的方法将切口疝的风险降低30％或更多，如35％或更多，包括40％或更多、或45％或更多、或50％或更多、或55％或更多、或60％或更多、或65％或更多、或70％或更多、或75％或更多、或80％或更多、或85％或更多、或90％或更多、或95％或更多，例如99％或更多。在某些情况下，所述方法将切口疝的风险降低60％或更多。例如，所述方法可以降低受试者中临床疝的风险。“降低风险”指的是在通过本公开的方法治疗的受试者中发生切口疝的风险低于未通过本公开的方法治疗的受试者。“临床疝”指的是在患者治疗期间(例如，通过视觉、触觉、声音、嗅觉等)观察到的疝，而不是通过实验室研究确定的疝。例如，临床疝可以作为腹壁中的可见隆起被观察到。

在某些实施方案中，如果受试者中发生了疝，则用于治疗受试者中的伤口的方法将降低受试者中疝的严重程度。在一些情况下，疝的严重程度的降低对应于受试者中疝的尺寸的减小。例如，所述方法可以减小受试者中解剖学疝的尺寸。“解剖学疝”指的是可通过临床观察以外的方法或除临床观察之外还通过一些方法(例如，通过受试者的解剖、MRI、CT、超声等)检测到的疝。解剖学疝的尺寸可以通过测定切口部位处腹部肌肉(例如，直肌)之间的间隔来测量。例如，可以通过将最大头尾向直径乘以两个横向直径测量值的平均值(例如，椭圆的近似值)来估计解剖学疝的尺寸。在一些情况下，所述方法将切口疝的尺寸减小15％或更多，如20％或更多，包括25％或更多、或30％或更多，如35％或更多，包括40％或更多、或45％或更多、或50％或更多、或55％或更多、或60％或更多、或65％或更多、或70％或更多、或75％或更多、或80％或更多、或85％或更多、或90％或更多、或95％或更多，例如99％或更多。在某些情况下，所述方法将切口疝的风险降低55％或更多。

待给予个体的本文描述的纤维蛋白原/纤维蛋白膜优选以足以对个体显示益处的“治疗有效量”的药物组合物施用。“有效量”指的是根据需要足以在目标受试者中引起显著可检测的效果的剂量。在一些情况下，药物组合物的有效量为足以在受试者中在施用部位处诱导异物反应的药物组合物的量。在某些情况下，异物反应包括由不含上皮样组织细胞的巨细胞组成的炎性浸润。

在某些实施方案中，有效量的药物组合物包括0.1(wt/wt)或更大、或0.2(wt/wt)或更大、或0.3(wt/wt)或更大、或0.4(wt/wt)或更大、或0.5(wt/wt)或更大、或0.6(wt/wt)或更大、或0.7(wt/wt)或更大、或0.8(wt/wt)或更大、或0.9(wt/wt)或更大、或1(wt/wt)或更大、或1.1(wt/wt)或更大、或1.2(wt/wt)或更大、或1.3(wt/wt)或更大、或1.4(wt/wt)或更大、或1.5(wt/wt)或更大、或1.6(wt/wt)或更大、或1.7(wt/wt)或更大、或1.8(wt/wt)或更大、或1.9(wt/wt)或更大、或2(wt/wt)或更大、或2.1(wt/wt)或更大、或2.2(wt/wt)或更大、或2.3(wt/wt)或更大、或2.4(wt/wt)或更大、或2.5(wt/wt)或更大、或2.6(wt/wt)或更大、或2.7(wt/wt)或更大、或2.8(wt/wt)或更大、或2.9(wt/wt)或更大、或3(wt/wt)或更大的银与纤维蛋白原的重量/重量比率。例如，有效量的药物组合物可以包括2.2(wt/wt)或更大的银与纤维蛋白原的重量/重量比率。

在某些实施方案中，有效量的药物组合物包括施加到一定伤口表面积如0.5cm²或更大、或1cm²或更大、或2cm²或更大、或3cm²或更大、或4cm²或更大、或5cm²或更大、或6cm²或更大、或7cm²或更大、或8cm²或更大、或9cm²或更大、或10cm²或更大、或11cm²或更大、或12cm²或更大、或13cm2或更大、或14cm²或更大、或15cm²或更大、或16cm²或更大、或17cm²或更大、或18cm²或更大、或19cm²或更大、或20cm²或更大、或25cm²或更大、或30cm²或更大、或35cm²或更大、或40cm²或更大、或45cm²或更大、或50cm²或更大上的如本文所述的银的量。例如，有效量的药物组合物可以包括施加到10cm²或更大的伤口表面积上的银颗粒的量，如250mg/mL。在一些情况下，有效量的药物组合物可以包括施加到10cm²或更大的伤口表面积的银颗粒的量，如2.2(wt/wt)。

在某些方面，有效量的药物组合物包含银微粒。在某些情况下，有效量的药物组合物包括1mg银微粒/cm²膜或更大、10mg银微粒/cm²膜或更大，如25mg银微粒/cm²膜或更大，包括50mg/银微粒/cm²膜或更大、或75mg银微粒/cm²膜或更大、或100mg银微粒/cm²膜或更大、或150mg银微粒/cm²膜或更大、或200mg银微粒/cm²膜或更大、或250mg银微粒/cm²膜或更大、或300mg银微粒/cm²膜或更大。在某些情况下，有效量药的物组合物包括10mg银微粒/cm²膜或更大，如25mg银微粒/cm²膜或更大，包括50mg银微粒/cm²膜或更大、或75mg银微粒/cm²膜或更大、或100mg银微粒/cm²膜或更大、或150mg银微粒/cm²膜或更大、或200mg银微粒/cm²膜或更大、或250mg银微粒/cm²膜或更大、或300mg银微粒/cm²膜或更大、或350mg银微粒/cm²膜或更大、或400mg银微粒/cm²膜或更大、或450mg银微粒/cm²膜或更大、或500mg银微粒/cm²膜或更大、或550mg银微粒/cm²膜或更大、或600mg银微粒/cm²膜或更大、或650mg银微粒/cm²膜或更大、或700mg银微粒/cm²膜或更大、或750mg银微粒/cm²膜或更大。在某些情形下，有效量的药物组合物包括50mg银微粒/cm²膜。在一些情况下，有效量的药物组合物包括500mg银微粒/cm²膜。

预防伤口的方法

本文包括预防伤口的方法。在某些实施方案中，本文的方法预防伤口的发生或预防现有伤口的恶化。在某些方面，将本文描述的干燥膜施加到受试者中易于在受试者中形成伤口的区域。例如，可施加本文描述的膜以预防疝或增强任何软组织。在某些实施方案中，施加本文提供的膜以防止伤口如手术伤口变得恶化。在某些实施方案中，本文提供的膜用于软组织(死空间)管理，例如在外科手术过程中。

产生纤维蛋白/纤维蛋白原膜的方法

本文包括产生包含纤维蛋白和/或纤维蛋白原的膜的方法。在某些实施方案中，通过获得全血或全血浆来产生膜，所述全血或全血浆任选经病毒灭活。在某些实施方案中，全血或全血浆通过合适的溶剂/去污剂(S/D)处理和/或纳滤来病毒灭活，以进一步灭活/移除病毒颗粒。

在某些实施方案中，通过将包含纤维蛋白和/或纤维蛋白原的溶液放置(例如，放置血浆)到模具中来产生膜。在某些实施方案中，包含纤维蛋白和/或纤维蛋白原的溶液为人血浆。在某些实施方案中，包含纤维蛋白和/或纤维蛋白原的溶液为具有经纯化或经重组纯化的纤维蛋白和/或纤维蛋白原的溶液。

在某些实施方案中，0.1-1.5mL的全血浆产生1cm²的干燥膜。在某些实施方案中，0.1-0.5mL、0.5-1.0mL、0.1-0.2mL、0.2-0.3mL、0.3-0.4mL、0.4-0.5mL、0.5-0.6mL、0.7-0.8mL、0.8-0.9mL、0.9-1.0mL的全血浆产生1cm²的干燥膜。在某些实施方案中，约0.1mL、约0.2mL、约0.3mL、约0.4mL、约0.5mL、约0.6mL、约0.7mL、约0.8mL、约0.9mL、约1.0mL、约1.1mL、约1.2mL、约1.3mL、约1.4mL或约1.5mL产生1cm²的干燥膜。

在某些实施方案中，将包含纤维蛋白和/或纤维蛋白原的溶液与凝血酶混合。在一些实施方案中，血浆的聚合可通过血浆的再钙化实现。可向包含纤维蛋白和/或纤维蛋白原的溶液添加CaCl₂以使溶液聚合(凝结)并形成凝胶。在某些实施方案中，将包含纤维蛋白和/或纤维蛋白原的溶液与CaCl₂混合。在某些实施方案中，向包含纤维蛋白和/或纤维蛋白原的溶液添加约0.01-1mg的CaCl₂/ml血浆以使溶液聚合(凝结)并形成凝胶。在某些实施方案中，向包含纤维蛋白和/或纤维蛋白原的溶液添加约0.01-0.10、0.01-0.02、0.02-0.03、0.03-0.04、0.04-0.05、0.05-0.06、0.06-0.07、0.07-0.08、0.09-0.10、0.1-0.2、0.2-0.3、0.3-0.4、0.4-0.5、05-0.6、0.6-0.7、0.7-0.8、0.8-0.9、0.9-1.0mg CaCl₂/mL血浆以使溶液聚合(凝结)并形成凝胶。在一些实施方案中，添加约0.8-0.9mg CaCl₂/mL血浆。在一些实施方案中，添加约0.85、0.86或0.87mg CaCl₂/mL血浆。

另外，可激活凝血系统的外源性途径以诱导血浆的聚合。这样的外源性激活剂是磷脂如磷脂酰丝氨酸和磷脂酰胆碱。在一个实施方案中，将包含纤维蛋白和/或纤维蛋白原的溶液与磷脂酰丝氨酸混合。在一个实施方案中，将包含纤维蛋白和/或纤维蛋白原的溶液与磷脂酰胆碱混合。在一个实施方案中，将包含纤维蛋白和/或纤维蛋白原的溶液与0.1-1mg/ml、0.1-0.2mg/ml、0.2-0.3mg/ml、0.3-0.4mg/ml、0.4-0.5mg/ml、0.5-0.6mg/ml、0.6-0.7mg/ml、0.7-0.8mg/ml、0.8-0.9mg/ml或0.9-1.0mg/ml的磷脂混合。

在某些实施方案中，在将包含纤维蛋白和/或纤维蛋白原的溶液倒入模具中之前将溶液病毒灭活。可通过本领域的任何已知方法(例如溶剂-去污剂处理)将溶液病毒灭活。可使用任何合适的溶剂-去污剂，包括但不限于Triton-X-100。适合用于制备本公开的膜的病毒灭活血浆是可商购获得的，如来自美国Octapaharma(新泽西州帕拉默斯)的Octaplas。

包含纤维蛋白和/或纤维蛋白原的溶液(例如，血浆)允许在模具中聚合成凝胶。在某些实施方案中，凝胶(例如，血浆)的聚合在37℃下进行。在某些实施方案中，包含纤维蛋白和/或纤维蛋白原的溶液(例如，血浆)的聚合在室温下进行。聚合可进行5分钟至60分钟。在一些实施方案中，将包含纤维蛋白和/或纤维蛋白原的溶液(例如，血浆)温育5分钟至60分钟，如5-10分钟、5-15分钟、5-30分钟、5-45分钟、5-60分钟、10-20分钟、10-30分钟、10-45分钟、10-60分钟、15-30分钟、15-45分钟、15-60分钟、30-45分钟、30-60分钟、5、8、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60分钟。在一些实施方案中，将包含纤维蛋白和/或纤维蛋白原的溶液(例如，血浆)在37℃下温育5至30分钟。在一些实施方案中，将包含纤维蛋白和/或纤维蛋白原的溶液(例如，血浆)在37℃下温育15分钟。

从聚合的凝胶移除流体以形成膜。在某些实施方案中，通过施加压力来进行流体的移除。在某些实施方案中，通过使用真空或凝胶的离心来进行流体的移除。

在某些实施方案中，使聚合的凝胶经受500-5,000PSI、或1,000-3,000PSI或1,000-2,000PSI或2,000-3,000PSI的机械压力(即，“压制”)达5-15分钟、1-30分钟、1-60分钟、1分钟-12小时或1分钟-24小时。在某些实施方案中，使被压制的聚合凝胶经受足够的压力达足够长的时间以将凝胶干燥成干燥膜。

在某些实施方案中，使聚合的凝胶经受约1-150托、1-1.5托、1.5-125托、1.5-10托、10-20托、20-30托、30-40托、40-50托、50-60托、60-70托、70-80托、80-90托、90-100托、100-110托、110-120托、120-130托、130-140托或140-150托的真空。在某些实施方案中，使聚合的凝胶经受约1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、120、130、140或150托的真空达5-15分钟、1-30分钟、1-60分钟、1分钟-12小时或1分钟-24小时。在某些实施方案中，使聚合的凝胶经受1.5托至125托的真空压力达15分钟。在某些实施方案中，使聚合的凝胶经受约1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、120、130、140或150托的真空压力达15分钟。

在某些实施方案中，将膜在甘油或甘油溶液浴中温育。可以在加入银之前或在加入银(如银微粒)之后将膜在甘油或甘油溶液浴中温育。所述浴可为1-5％的甘油溶液。例如，所述溶液可为1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％或5％的甘油溶液。所述溶液可为1-5％的甘油溶液。例如，所述浴可为1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％或5％的甘油溶液。在一些实施方案中，所述溶液为2％的甘油溶液。在一些实施方案中，所述溶液为5％的甘油溶液。可将膜在甘油或甘油浴中直接温育，或者可在膜仍在真空加压模块中时向膜施加甘油或甘油溶液并施加真空以将甘油或甘油溶液吸进膜中。

在某些实施方案中，在干燥膜之前添加银。在某些实施方案中，将银添加到血浆中。在某些实施方案中，将银添加到聚合的凝胶中。在某些实施方案中，在加压溶液之前添加银。在某些实施方案中，在加压之后通过施加银喷涂层来添加银。在一些实施方案中，经由喷涂来施加银。在某些实施方案中，在向溶液施加真空压力之前添加银。在某些实施方案中，在向溶液施加真空压力之后添加银。在某些实施方案中，在移除任何流出流体之前添加银。在某些实施方案中，在移除任何流出流体之后添加银。在某些实施方案中，在甘油或甘油溶液温育或浴之前添加银。在某些实施方案中，在甘油或甘油溶液温育或浴之后添加银。

在一些实施方案中，银为银微粒。在某些实施方案中，在干燥膜之前添加银微粒。在某些实施方案中，将银微粒添加到血浆中。在某些实施方案中，将银微粒添加到聚合的凝胶中。在某些实施方案中，在凝胶的聚合之前添加银微粒。在某些实施方案中，在凝胶的聚合之后添加银微粒。在某些实施方案中，在从凝胶移除流体之前添加银微粒。在某些实施方案中，在从凝胶移除流体之后添加银微粒。在某些实施方案中，在甘油或甘油溶液温育或浴之前添加银微粒。在某些实施方案中，在甘油或甘油溶液温育或浴之后添加银微粒。

在一些实施方案中，可将银如银微粒施加到膜的一侧。在一些实施方案中，可将银如银微粒施加到膜的两侧。在一些实施方案中，可将银如银微粒散布或分布在膜内。

在某些实施方案中，银微粒的平均直径范围为2μm至1,000μm。在某些实施方案中，银微粒的平均直径范围为10μm至1,000μm、100μm至1,000μm、1μm至1,000μm、10μm至100μm、500μm至1,000μm、1μm至10μm、或10至500μm。在一些实施方案中，银微粒的平均直径范围为10-20μm。在一些实施方案中，银微粒的平均直径为约2μm、7μm、10μm、15μm、20μm或25μm。在一些实施方案中，银微粒的平均直径为约15μm。

在某些实施方案中，添加到血浆、凝胶或膜的银微粒中金属银的量为0.1-50mg银/cm²膜。在某些实施方案中，添加到血浆、凝胶或膜的所存在的金属银的量为10–50mg银/cm²、1–5mg银/cm²、5–10mg银/cm²、10–15mg银/cm²、15–20mg银/cm²、20–25mg银/cm²、25–30mg银/cm²、30–35mg银/cm²、35–40mg银/cm²、45–50mg银/cm²、10–20mg银/cm²、20–30mg银/cm²、30–40mg银/cm²或40–50mg银/cm²。在某些实施方案中，添加到血浆、凝胶或膜的所存在的金属银的量为10–50mg银/ml、1–5mg银/ml、5–10mg银/ml、10–15mg银/ml、15–20mg银/ml、20–25mg银/ml、25–30mg银/ml、30–35mg银/ml、35–40mg银/ml、45–50mg银/ml、10–20mg银/ml、20–30mg银/ml、30–40mg银/ml或40–50mg银/ml。在某些实施方案中，银微粒以约5mg银/cm²、约10mg银/cm²、约15mg银/cm²、约20mg银/cm²、约25mg银/cm²、约30mg银/cm²、约35mg银/cm²、约40mg银/cm²、约45mg银/cm²或约50mg银/cm²血浆、凝胶或膜的浓度存在。在某些实施方案中，银微粒以约5mg银/ml、约10mg银/ml、约15mg银/ml、约20mg银/ml、约25mg银/ml、约30mg银/ml、约35mg银/ml、约40mg银/ml、约45mg银/ml或约50mg银/ml血浆、凝胶或膜的浓度存在。

在某些实施方案中，向血浆、凝胶或膜中添加约0.1–50mg银微粒/cm²膜或0.1–50mg银微粒/ml血浆或凝胶。在某些实施方案中，向血浆、凝胶或膜中添加约10–50mg银微粒/cm²膜或mg银微粒/ml血浆或凝胶、1–5mg银微粒/cm²膜或mg银微粒/ml血浆或凝胶、5–10mg银微粒/cm²膜或mg银微粒/ml血浆或凝胶、10–15mg银微粒/cm²膜或mg银微粒/ml血浆或凝胶、15–20mg银微粒/cm²膜或mg银微粒/ml血浆或凝胶、20–25mg银微粒/cm²膜或mg银微粒/ml血浆或凝胶、25–30mg银微粒/cm²膜或mg银微粒/ml血浆或凝胶、30–35mg银微粒/cm²膜或mg银微粒/ml血浆或凝胶、35–40mg银微粒/cm²膜或mg银微粒/ml血浆或凝胶、45–50mg银微粒/cm²膜或mg银微粒/ml血浆或凝胶、10–20mg银微粒/cm²、20–30mg银银微粒/cm²膜或mg银微粒/ml血浆或凝胶、30–40mg银微粒/cm²膜或mg银微粒/ml血浆或凝胶、或40–50mg银微粒/cm²膜或mg银微粒/ml血浆或凝胶。在某些实施方案中，向血浆、凝胶或膜中添加约5mg银微粒/cm²、约10mg银/cm²、约15mg银微粒/cm²、约20mg银微粒/cm²、约25mg银微粒/cm²、约30mg银微粒/cm²、约35mg银微粒/cm²、约40mg银微粒/cm²、约45mg银微粒/cm²、或约50mg银微粒/cm²。在某些实施方案中，向血浆、凝胶或膜中添加约5mg银微粒/ml、约10mg银/ml、约15mg银微粒/ml、约20mg银微粒/ml、约25mg银微粒/ml、约30mg银微粒/ml、约35mg银微粒/ml、约40mg银微粒/ml、约45mg银微粒/ml、或约50mg银微粒/ml。

在某些实施方案中，从流体移除生成的膜经受γ辐照。在某些实施方案中，在移除流体之后将膜储存在室温下。在某些实施方案中，在γ辐照之后将膜储存在室温下。

在某些实施方案中，将本文公开的膜和包含所述膜的药物组合物包装在无菌容器中。在某些实施方案中，在γ辐照之后将压制的聚合凝胶储存在室温下。

在某些实施方案中，在移除流体以生成膜之前向聚合的凝胶中添加铈。在某些实施方案中，铈以10-500mM、20-400mM、10-100mM、20-50mM、50-100mM、100-150mM、150-200mM、200-250mM、250-300mM、300-350mM、350-400mM或400-500mM的浓度存在于聚合的凝胶中。在某些实施方案中，铈以约20mM、约30mM、约40mM、约50mM、约60mM、约70mM、约80mM、约90mM、约100mM、约110mM、约120mM、约130mM、约140mM、约150mM、约160mM、约170mM、约180mM、约190mM、约200mM、约210mM、约220mM、约230mM、约240mM、约250mM、约260mM、约270mM、约280mM、约290mM、约300mM、约310mM、约320mM、约320mM、约330mM、约340mM、约350mM、约360mM、约370mM、约380mM、约390mM或约400mM的浓度存在于聚合的凝胶中。

可在施加银和/或在甘油或甘油浴中温育之后干燥膜。在一些实施方案中，将膜在烘箱中于40-70℃，如40-45℃、45-50℃、50-55℃、55-60℃、60-65℃或65-70℃下干燥。在一些实施方案中，将膜在烘箱中于42-50℃下干燥。在一些实施方案中，将膜在烘箱中于约40、42℃、45℃、47℃、50℃、55℃、60℃、65℃或70℃干燥。在一些实施方案中，将膜在烘箱中于约42℃干燥。在一些实施方案中，将膜在烘箱中于约50℃干燥。可将膜干燥约15分钟至3小时。在一些实施方案中，将膜干燥约15分钟至30小时、30分钟至2小时、45分钟至1.5小时或约1小时。在一些实施方案中，将膜干燥约15分钟、30分钟、45分钟、60分钟、75分钟、90分钟、105分钟、120分钟、135分钟、150分钟、165分钟或180分钟。

在某些实施方案中，向膜添加粘合剂涂层。

试剂盒

还提供了用于实施如上所述的主题方法的试剂盒。例如，用于实施主题方法的试剂盒可以包括含有有效促进伤口(例如，腹部切口部位)愈合的量的本文描述的干燥膜的无菌容器。在某些实施方案中，试剂盒包含配置为保持无菌容器的无菌性的密封包装。密封包装可以被密封使得基本上没有外部污染物如灰尘、微生物(例如，真菌、细菌、病毒、孢子形式等)、液体、气体等能够进入密封包装。例如，密封包装可以被密封使得包装是水密的和/或气密的。

除了上述组分之外，主题试剂盒还可以包含对实施主题方法的说明。这些说明可以以多种形式存在于主题试剂盒中，其中的一种或多种可以存在于试剂盒中。其中可以呈现这些说明的一种形式是作为在合适的介质或基底上的印刷信息，例如，在试剂盒的包装中、在包装插页中等印刷信息的一张或多张纸。另一种方式将是在其上记录或存储信息的计算机可读介质，例如CD、DVD、Blu-ray、计算机可读存储器等。可能存在的还另一种方式是网站地址，其可以经由互联网使用以访问在移除位点(removed site)处的信息。试剂盒中可以存在任何方便的手段。

另外的实施方案

本文公开了用于治疗或预防伤口的干燥膜。在某些方面，本文描述了一种干燥膜，其包含：纤维蛋白、纤维蛋白原或其组合；其中所述膜在室温下稳定至少三年。在某些实施方案中，纤维蛋白或纤维蛋白原作为全血或全血浆的组分存在。在某些实施方案中，纤维蛋白、纤维蛋白原或其组合以0.5至20.0mg/cm²膜的浓度存在。在某些实施方案中，纤维蛋白原以2.5至4.0mg/cm²膜的浓度存在。在某些实施方案中，干燥膜还包含银或含银化合物。在某些实施方案中，银或含银化合物为碳酸银、氯化银、磷酸银、氟化银、乙酸银、硫酸银、柠檬酸银、氧化银或其组合。在某些实施方案中，银以0.1-50mg/cm²膜的总浓度存在于膜中。在某些实施方案中，银为纳米颗粒或微粒或其组合的形式。在某些实施方案中，纳米颗粒或微粒为金属银纳米颗粒或金属银微粒。在某些实施方案中，金属银以0.1-50mg/cm²膜的总浓度存在于膜中。在某些实施方案中，银微粒的平均直径小于2μm。在某些实施方案中，银微粒的平均直径范围为2μm至1,000μm。在某些实施方案中，银微粒以10-50mg银/cm²膜的浓度存在。在某些实施方案中，银微粒以10-25mg银/cm²膜的浓度存在。在某些实施方案中，当施加于受试者时，膜释放0.0002至10.0ppm的银离子。在某些实施方案中，膜还包含铈。在某些实施方案中，铈以20-400mM的浓度存在于膜中。在某些实施方案中，膜还包含粘合剂涂层。在某些实施方案中，粘合剂涂层为氧化再生纤维素。在某些实施方案中，粘合剂涂层以5重量％-25重量％的量存在于膜中。在某些实施方案中，膜是无菌的。在某些实施方案中，膜通过γ辐照来灭菌。在某些实施方案中，膜还包含钙。在某些实施方案中，钙以0.00005-0.20mg/cm²膜的浓度存在于膜中。在某些实施方案中，膜还包含凝血酶。在某些实施方案中，凝血酶以至少2IU凝血酶/cm²膜的浓度存在于膜中。在某些实施方案中，凝血酶浓度大于2.5IU凝血酶/cm²膜。在某些实施方案中，凝血酶浓度小于2,500IU凝血酶/cm²膜。在某些实施方案中，膜的厚度小于1mm。

在某些方面，本文公开了一种治疗受试者中的伤口的方法，其包括向伤口施加有效量的根据权利要求1-29中任一项的干燥膜。在某些实施方案中，在打开包含干燥膜的储存容器后不到15分钟将干燥膜施加于伤口。在某些实施方案中，在打开包含干燥膜的储存容器后1至15分钟将干燥膜施加于伤口。在某些实施方案中，伤口为不愈合性伤口。在某些实施方案中，伤口选自减少的原发性术后粘连形成、减少的术后粘连再形成、来自细胞和组织移植的伤口、烧伤伤口。在某些实施方案中，干燥膜在向受试者的伤口施加膜后不到21天降解。

在某些方面，本文描述了一种制造用于治疗受试者中的伤口的干燥膜的方法，其包括：获得人血浆；将血浆置于模具中；使血浆聚合以形成凝胶；向血浆中添加含银化合物以生成含银的血浆混合物；从聚合的凝胶移除流体以生成膜；和对膜进行γ灭菌。在某些实施方案中，通过在100-10,000PSI的压力下向凝胶施加压力来进行流体的移除以生成膜。在某些实施方案中，向凝胶施加的压力为约1,000PSI。在某些实施方案中，血浆进一步与CaCl₂混合。在某些实施方案中，血浆进一步与凝血酶混合。在某些实施方案中，血浆与CaCl₂和凝血酶混合，然后将血浆置于模具中。在某些实施方案中，在从聚合的凝胶移除流体之后添加银。在某些实施方案中，通过在血浆聚合凝胶上施加包含含银化合物的喷涂层来添加银。在某些实施方案中，含银化合物选自：碳酸银、氯化银、磷酸银、氟化银、乙酸银、硫酸银、柠檬酸银和氧化银。在某些实施方案中，银以0.1-50mg/cm²膜的总浓度存在于膜中。在某些实施方案中，银为银纳米颗粒、银微粒或其组合的形式。在某些实施方案中，纳米颗粒或微粒为金属银纳米颗粒或金属银微粒。在某些实施方案中，金属银以0.1-50mg/cm²膜的总浓度存在于膜中。在某些实施方案中，银微粒以10-50mg银/cm²膜的浓度存在。在某些实施方案中，银微粒以10-25mg银/cm²膜的浓度存在。在某些实施方案中，银微粒的平均直径小于2μm。在某些实施方案中，银微粒的平均直径范围为2μm至1,000μm。在某些实施方案中，钙以0.00005-0.20mg/cm²膜的浓度存在于膜中。在某些实施方案中，凝血酶以至少2国际单位(IU)凝血酶/cm²膜的浓度存在于膜中。在某些实施方案中，凝血酶浓度大于2.5IU凝血酶/cm²膜。在某些实施方案中，凝血酶浓度小于2,500IU凝血酶/cm²膜。在某些实施方案中，将血浆与铈进一步混合。在某些实施方案中，铈以20-400mM的浓度存在于聚合的凝胶中。在某些实施方案中，所述方法还包括向膜添加粘合剂涂层。在某些实施方案中，粘合剂涂层为氧化再生纤维素。在某些实施方案中，粘合剂涂层以5重量％-25重量％的量存在于膜中。在某些实施方案中，所述方法还包括对人血浆进行病毒灭活。在某些实施方案中，所述方法还包括在将血浆置于模具中之后于37℃温育血浆。在某些实施方案中，膜的厚度小于1mm。

在某些方面，本文描述了一种在受试者中预防伤口的方法，其包括向受试者中易于形成伤口的区域施加有效量的根据权利要求1-29中任一项的干燥膜。在某些实施方案中，在打开包含干燥膜的储存容器后不到15分钟将干燥膜施加于易于形成伤口的区域。在某些实施方案中，在打开包含干燥膜的储存容器后1至15分钟将干燥膜施加于易于形成伤口的区域。在某些实施方案中，伤口为不愈合性伤口。在某些实施方案中，伤口为疝。在某些实施方案中，干燥膜在向受试者中易于形成伤口的区域施加膜后不到21天降解。

实施例

下面为实施本发明的具体实施方案的实施例。提供实施例仅是出于示意的目的，而不意在以任何方式限制本发明的范围。已努力确保所用数字(例如，量、温度等)的准确性，但当然应将一定的实验误差和偏差考虑在内。

除非另有说明，否则本发明的实施将采用本领域技术范围内的蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术和药理学的常规方法。这样的技术在文献中有充分的解释。参见例如T.E.Creighton,Proteins:Structures and Molecular Properties(W.H.Freeman andCompany,1993)；A.L.Lehninger,Biochemistry(Worth Publishers,Inc.,currentaddition)；Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版,1989)；Methods In Enzymology(S.Colowick and N.Kaplan eds.,Academic Press,Inc.)；Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版(Easton,Pennsylvania:MackPublishing Company,1990)；Carey和Sundberg Advanced Organic Chemistry第3版(Plenum Press)卷A和卷B(1992)。

实施例1：包含银的血浆膜的制备

将经病毒灭活(经S/D处理和纳滤以移除病毒)的人血浆(100ml)与1ml CaCl₂(2M)和1ml凝血酶混合。轻轻混合CaCl₂，并且接着倒入放置在37℃温箱中的10×10cm模具中15分钟。在加压步骤之前或加压之后经由喷涂添加银(25mg/ml血浆)。将过滤器顶部置于含有固体(聚合的)凝胶的模具上方，然后将其置于压机夹具中。将压机夹具置于机械压力中并施加1,000PSI达5-15分钟。从压机夹具移出膜并置于室温(25℃)下的生物安全柜中保持4小时，然后进行γ灭菌。从生物安全柜取出经灭菌的膜并在室温下储存在无菌容器中直至使用。

实施例2：施加包含银微粒的血浆膜来预防疝

将经病毒灭活(经S/D处理)的人血浆(100ml)与1ml CaCl₂(2M)和1ml凝血酶混合。轻轻混合CaCl₂，并且接着倒入放置在37℃温箱中的10×10cm模具中保持15分钟。在加压步骤之前或加压之后经由喷涂添加银微粒(25mg/ml血浆)。将过滤器顶部置于含有固体(聚合的)凝胶的模具上方，然后将其置于压机夹具中。将压机夹具置于机械压力中并施加1,000PSI达5-15分钟。从压机夹具取下膜并置于室温(25℃)下的生物安全柜中保持4小时，然后进行γ灭菌。从生物安全柜取出经灭菌的膜并在室温下储存在无菌容器中直至使用。向受试者施加足够量的膜以预防疝。该膜有效地预防受试者中的疝，直到该膜降解。

实施例3：包含铈的血浆膜用于治疗烧伤伤口

将经病毒灭活(经S/D处理)的人血浆(100ml)与1ml CaCl₂(2M)和1ml凝血酶(0.125g凝血酶在50mL无菌水中)混合。轻轻混合CaCl₂，并且接着倒入放置在37℃温箱中的10×10cm模具中保持15分钟。在加压步骤之前或加压之后经由喷涂添加银(25mg/ml血浆)和铈(20-400mM/cm²膜)。将过滤器顶部置于含有固体(聚合的)凝胶的模具上方，然后将其置于压机夹具中。将压机夹具置于机械压力中并施加1,000PSI达5-15分钟。从压机夹具取下膜并置于室温(25℃)下的生物安全柜中保持4小时，然后进行γ灭菌。向具有烧伤伤口的受试者施加足够量的膜。与具有未用该膜治疗的相当的烧伤伤口的受试者相比，该膜有效地减轻由烧伤伤口引起的炎性损伤并增强烧伤的伤口愈合。

实施例4：包含粘合剂涂层的血浆膜用于软组织管理

将经病毒灭活(经S/D处理)的人血浆(100ml)与1ml CaCl₂(2M)和1ml凝血酶混合。轻轻混合CaCl₂，并且接着倒入放置在37℃温箱中的10×10cm模具中保持15分钟。在加压步骤之前或加压之后经由喷涂添加银(25mg/ml血浆)。将过滤器顶部置于含有固体(聚合的)凝胶的模具上方，然后将其置于压机夹具中。将压机夹具置于机械压力中并施加1,000PSI达5-15分钟。从压机夹具取下膜并向膜施加5重量％-25重量％的包含氧化再生纤维素的粘合剂涂层。将经涂覆的膜置于室温(25℃)下的生物安全柜中保持4小时，然后进行γ灭菌。向有此需要的受试者的软组织施加足够量的膜。经涂覆的膜有效地封闭开放的组织口袋，从而降低血清肿形成和其他手术部位发生的风险，所述风险可因产生脂皮瓣的手术过程而产生。

实施例5：由自体全血组成的膜用于施加到不愈合性伤口

自人受试者获得经病毒灭活(经S/D处理)的人自体全血。然后将全血倒入放置在37℃温箱中的10×10cm模具中保持15分钟。将过滤器顶部置于含有固体(聚合的)凝胶的模具上方，然后将其置于压机夹具中。将压机夹具置于机械压力中并施加1,000PSI达5-15分钟。从压机夹具取下膜，置于室温(25℃)下的生物安全柜中保持4小时，然后进行γ灭菌。向全血所源自的受试者施加足够量的膜。该膜有效地促进或增强受试者中不愈合性伤口的伤口愈合。

实施例6：经由真空制备包含银微粒的血浆膜

开发了两种经由真空制备包含银微粒的血浆膜的方法。在血浆膜仍湿时添加银微粒对于最终膜中银的耐磨性是重要的。耐磨性对于确保在膜的包装和储存或例如向伤口、疝或烧伤施加的过程中银不易从膜脱落是重要的。

方法1

将经病毒灭活(溶剂/去污剂处理和纳滤以移除病毒,Octaplas,Octapharma AG；瑞士拉亨)的人血浆(1,000ml)与0.86g CaCl₂和0.21g磷脂酰丝氨酸在玻璃烧杯中混合并用搅拌棒以中等速度混合2分钟。然后将血浆溶液倒入30×30cm模具中并使用粉末喷涂机(RaplixaSpray,Nordson Corporation,Westlake,OH)喷涂金属银微粒(2.5至25mg/ml血浆,15μm粒度分布,Technic Engineered Powders,Woonsocket,RI产品代码:81-800)。在施加银之后，将模具在37℃的温箱中放置15分钟至60分钟以允许聚合(凝结)而形成凝胶。凝结之后，向聚合的凝胶上喷涂另一层银。然后将聚合的凝胶放入带有聚氯乙烯(PVC)过滤片的真空模具中，其中所述聚氯乙烯(PVC)过滤片置于聚合的凝胶的底部上以充当最终血浆膜的基底。该滤纸具有穿孔或狭缝。在一些制备轮次中，使用具有0.02英寸宽的单个狭缝的带狭缝纸并使用全长30cm的模具。在其他制备轮次中，使用具有多个0.02英寸宽和30cm长的狭缝的滤纸，这些狭缝每个间隔0.05英寸。对聚合的凝胶施加1.5至125托的低真空压力达15分钟以形成血浆膜并从凝胶移除流出物。将流出物收集在袋中以供进一步使用或丢弃。在经由真空压力形成膜之后，向膜中添加2％的甘油。开发了两种添加甘油的方式。在第一种方法中，从真空压机取下膜并在2％的甘油浴(甘油在无菌水中)中温育15分钟。在第二种方法中，将膜留在真空压机中并向膜的表面添加200ml的2％甘油溶液。然后重新打开真空以将甘油牵拉到膜上。然后将膜在烘箱中于42℃至50℃干燥30分钟至2小时。50℃下干燥膜显示加速干燥过程而不削弱膜强度。成品膜是耐磨的，参见实施例8。

方法2

将经病毒灭活(溶剂/去污剂处理和纳滤以移除病毒)的人血浆(1,000ml)与0.86gCaCl₂和0.21g磷脂酰丝氨酸在玻璃烧杯中混合并用搅拌棒以中等速度混合2分钟。然后将血浆溶液倒入30×30cm模具中并在37℃的温箱中放置15分钟以允许聚合(凝结)而形成凝胶。然后将聚合的凝胶放入带有由聚氯乙烯(PVC)制成的过滤片的真空模具中，所述过滤片置于聚合的凝胶的底部上以充当最终血浆膜的基底。该滤纸具有穿孔或狭缝。在一些制备轮次中，使用具有0.02英寸宽的单个狭缝的带狭缝纸并使用全长30cm的模具。在其他制备轮次中，使用具有多个0.02英寸宽和30cm长的狭缝的滤纸，这些狭缝每个间隔0.05英寸。对聚合的凝胶施加1.5至125托的低真空压力以形成血浆膜并从凝胶移除流出物。将流出物收集在袋中以供进一步使用或丢弃。在经由真空压力形成膜之后，将其在2％的甘油浴中温育15分钟。从甘油浴中取出膜并立即使用粉末喷涂机对一面喷涂金属银微粒(2.5至25mg/ml血浆，15μm粒度分布)。将膜在37℃烘箱中放置5分钟，取出，并对另一面喷涂银微粒。将膜在37℃烘箱中干燥1小时。在最终的干燥步骤之后，成品膜是耐磨的，参见实施例8。

表1中示出了通过方法1用15分钟甘油浴浸泡和42℃下的90分钟干燥步骤制得的示例性含银微粒的膜的组成。

制备后，可用γ辐照(25kGy，医疗产品的标准)对膜灭菌并包装在Teflon袋中用于储存。

实施例7：包含银微粒的血浆膜的物理性质表征

经由对制造过程中产生的膜进行破坏性分析来测定银含量、蛋白质组成和赋形剂水平。从进行胰蛋白酶消化的膜样品测定蛋白质组成并在与纳流超高效液相色谱(UPLC)联用的高分辨率质谱分析仪上进行分析。

鉴定并定量详细的蛋白质和肽分析。银浓度和分布通过分析多个样品区域中膜的x-射线荧光光谱来定量。甘油浓度通过实验室测定法从统计学上代表性数量的膜样品测量。

内毒素

内毒素通过USP<85>细菌内毒素试验测定。

无菌性

无菌性通过USP<71>无菌性试验测定。

银含量

使用手持式x-射线荧光(XRF)光谱仪(X-550,SCiAps,Inc.,Woburn,MA)测定Ag⁰的含量和分布。从随机选择的10cm×10cm膜获得一百(100)个1cm×1cm正方形的包含银微粒的血浆膜用于测试。将每个1cm²样品置于无菌表面上。打开分析仪，选择分析模式，并按照制造商的说明获得测量值。每次测量花费几秒钟，数据被无线记录在具有基于云的存储和备份的膝上型计算机上。

纤维蛋白含量

使用与具有ESI纳米喷雾源的Q Exactive HF质谱仪(Thermo FisherScientific,US)联用的Ultimate 3000纳米超高效液相色谱(UHPLC)系统通过蛋白质组学分析测定纤维蛋白的含量。

将样品蛋白质沉淀物溶解在50mM碳酸氢铵中。将溶液转移到Microcon装置YM-10(Millipore)中并在4℃下以12,000xg离心10分钟。向浓缩物中加入200μL的50mM碳酸氢铵，然后离心并重复一次。样品通过在56℃下添加10mM的二硫苏糖醇(DTT)持续1小时来还原样品并通过在室温下于黑暗中添加20mM的吲哚-3-乙酸(IAA)持续1小时来烷基化。将装置在4℃下以12,000xg离心10分钟并用50mM的碳酸氢铵洗涤一次。以1:50的比率向蛋白质溶液中加入100μL的50mM碳酸氢铵和0.25％的游离胰蛋白酶并将溶液于37℃温育过夜。最后，将装置在4℃下以12,000xg离心10分钟。向装置中加入100μL的50mM碳酸氢铵并离心，然后重复一次。然后将提取的肽冻干至接近干燥，并重悬于10μL的0.1％甲酸中进行液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)分析。柱和缓冲液。Nanocolumn捕集柱(PepMap C18,

100μm x 2cm,5um)和分析型xl柱(PepMap C18,

75μm x 50cm,2μm)。上样体积为1μg；流动相A：水中的0.1％甲酸；B：80％乙腈中的0.1％甲酸。总流速：250nL/min。LC线性梯度：在3分钟内2％至8％的缓冲液B，在50分钟内8％至20％的缓冲液B，在43分钟内20％至40％的缓冲液B，然后在4分钟内40％至90％的缓冲液B。

抗微生物效力

通过抑菌区(ZOI)试验测定效力。该试验证实含银微粒的膜通过从产品的银微粒洗脱低水平的银(Ag+)离子的抗菌功效。例如，对于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两者，25mg/cm²浓度的银加纤维蛋白应产生≤1.5mm的ZOI。

使用以下标准细菌菌株：金黄色葡萄球菌(耐甲氧西林,(mr)ATCC#43300)、金黄色葡萄球菌(甲氧西林敏感,(ms)ATCC#25923)、大肠杆菌(ATCC#35218)、铜绿假单胞菌(ATCC#27853)和表皮葡萄球菌(ATCC#35984)。对含有Luria-Bertani(LB)营养琼脂的皮氏培养皿(100mm×15mm)划线接种不同的细菌培养物。将三(3)个含银微粒的膜样品(1cm圆盘)置于营养琼脂上。庆大霉素处理(2μg/圆盘)和盐水处理(50μl)的滤纸(1-cm)圆盘分别用作阳性对照和阴性对照。将板于36℃下温育24小时以获得最佳细菌生长，然后拍照并使用ImageJ(美国国立卫生研究院[NIH])测量圆盘的ZOI直径。抗菌活性表示为ZOI直径的平均值(mm)减去圆盘的直径(±平均值的标准误差[SEM])。使用单因素方差分析(ANOVA)进行统计分析。

过程残留物

通过质谱和生物化学分析的组合测定来自血浆的过程残留物，如柠檬酸钠二水合物、磷酸二氢钠二水合物和甘氨酸。

实施例8：包含银微粒的血浆膜的机械性质和稳定性表征

材料和方法

膜如实施例6所述制备、包装和灭菌。简言之，将100mL的Octaplas血浆(Ocatapharma AG)置于模具中，用1.0ml的2M CaCl₂再钙化并允许其在37℃下凝结15分钟。15分钟后，将模具连接到真空泵并施加1.25mmHg至125mmHg之间的低真空达5分钟。将凝胶在5％的甘油中浸泡15分钟，然后涂覆浓度为25mg/cm²的银微粒，并干燥成膜。将膜包装在箔袋中，并在20kGy下进行γ灭菌和在室温下储存15个月。

爆裂压力

爆裂压力根据外科密封剂爆裂强度标准测试方法(ASTM-F 2392-04)测量。根据ASTM-F 2392-04将膜固定在夹具中，并将夹具连接至泵，在泵与爆裂压力夹具之间串联连接压力传感器。向系统中泵入流体增加压力直至膜爆裂。爆裂压力表示为[mmHg]。

折叠数和耐折性

还测定了含银微粒的膜的折叠数和耐折性。

折叠数是测定膜可被折叠的次数以确定膜柔韧性。这种测定通过如下实现：将膜的一半折叠在另一半的顶部上，将堆叠转动90°，然后再次将堆叠的一半折叠在另一半的顶部上并重复直至膜断裂或破裂。不触发膜破裂的每次折叠都将折叠数增加1。该测试对于评估基于血浆的膜在以紧密转角弯曲时保持其完整性的能力特别有用。

耐折性是测定膜可被折叠和展开的次数并且也是膜柔韧性的标志。这种测定通过重复地将膜的一半折叠在另一半的顶部上并展开到其原始位置来实现。耐折性由这样的折叠/展开重复的数目表示并提供用于耐磨损性估计的手段。

稳定性

制备多个涂覆银微粒的血浆膜。制备后测试五个膜的爆裂压力、折叠数、耐折数和膜厚度。在室温下储存464天(大约15个月)后，再次评价五个另外的膜的折叠数、耐折数和膜厚度。

磨蚀

称取5cm×5cm银涂覆膜的重量并使用2英寸宽的漆刷在膜的两面上刷擦100次。在100次刷擦序列后再次称取膜的重量。

结果

表2中示出了新合成的膜的机械性质。

表3中示出了在室温下储存15个月的膜的机械性质。

如表2和3中所示，膜在室温下储存15个月没有降低膜的柔韧性，如由相同的折叠数和耐折性度量指标所指示：新合成的膜和储存了15个月的膜两者的折叠数均为5，耐折性均为100。另外，膜的爆裂压力没有显著降低。事实上，平均爆裂压力仅降低5mmHg。储存了15个月的膜具有与新合成的膜99.5％相同的爆裂压力。

表4中示出了膜的耐磨性。

如表4中所示，含银微粒的膜在两面上刷擦100次后没有损失显著量的重量，因此包埋在膜中的银是耐磨的。

膜的银微粒的耐磨性是一种重要的特性。耐磨的膜没有银从膜脱落和与不意图用银/血浆膜治疗的组织接触。银耐磨膜还允许膜的精确剂量测定，并且在包装、灭菌或储存期间银微粒不会从膜脱落。通过喷涂向湿膜施加银防止在随后的干燥之后银从表面脱落。不希望受理论的束缚，通过喷涂向湿膜施加银微粒导致银微粒物理地截留到膜的纤维蛋白表面中而不会因接触、操作、灭菌或包装而磨擦掉。

进行另外的实验以评估含银微粒的新合成纤维蛋白膜的耐折性。根据所描述的耐折性测定法测试三个5cm×5cm膜的1000次折叠和展开重复的耐折性。测定在1000次折叠时暂停，但到那时膜尚未破裂失效，且测定可继续。因此，膜具有至少超过1000的耐折性。还从在相同的膜制备轮次中制得的5cm×cm膜测量爆裂压力并示于表5中。如表5中所示，耐折性测定没有显著降低含银微粒的纤维蛋白膜的爆裂压力。

实施例9：银微粒的体外电离

根据公布的方案(Sussman,Assessment of total silver and silvernanoparticle extraction from medical devices.Food Chem Toxicol2015；85:10-19)研究在各种液体媒介物中银离子从银微粒的洗脱。使用四种溶液载体：(1)蒸馏去离子水(图2A)，(2)生理(0.9％)盐水(图2C)、(3)人血浆(图2D)和(4)模拟体液(SBF)(图2B)。称取银微粒的重量至10mL的无菌媒介物中40mg/mL或250mg/mL的最终浓度，置于具有聚乙烯锥形盖插入物的20mL HDPE闪烁小瓶中，然后在温度受控的振荡器中于37℃搅动1小时、于37℃搅动24小时、于50℃搅动72小时和于37℃搅动7天。温育后，从小瓶中移除媒介物，置于15mL聚苯乙烯离心管中，等分试样在1.2N HCl中以1:100稀释，并通过电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)分析银含量。所有样品一式三份试验。

金属银微粒是几乎不溶性的，尤其是在水、SBF和盐水中，其中测得的可溶性银(Ag+)的最高浓度分别为大约0.2ppm、2.6ppm和5ppm(图2A-D)。在银离子与盐水和SBF中存在的盐之间达到平衡(图2C和2B)；该平衡在比当在去离子水中温育微粒时高十倍以上的Ag+浓度下达到(图2A)。银在血浆中更可溶，产生44ppm的最大浓度(图2D)。不希望受理论束缚，有机物如蛋白质会使可溶性银的平衡移动，因为Ag+与血浆白蛋白和巨球蛋白强烈结合。然而，即使在最佳洗脱条件下，温育的总银金属中的<0.02％溶解。此外，温育较高浓度的金属银不导致可溶性Ag+的可预测增加。虽然以250mg/mL温育银微粒通常产生比40mg/mL的浓度高的银离子浓度，但无论媒介物或温育条件如何，可溶性Ag+的相对增加为大约+50％至+75％，尽管银金属的起始浓度之间的差异>600％。

总之，金属银被广泛认为是生物惰性的，因此很难经由吸入、摄取或皮肤接触吸收到体内。前面的数据进一步强调了金属银的惰性、不溶性性质，并因此预测其在体内的全身吸收水平非常低。

实施例10：银的体内组织分布

尽管金属银是惰性的并因此比银盐如硝酸银(AgNO₃)和磺胺嘧啶银(SSD)毒性小，但在体液的存在下，它电离，从而释放对蛋白质、氨基酸和细胞膜的巯基基团和其他阴离子配体显示出强亲和力的生物活性Ag+。并且，尽管来自许多实验和临床研究的证据表明银没有保留在身体的任何器官中(除了罕有地在有银质沉着病情况的皮肤中之外)，但在皮下植入含有金属银微粒(15μm；Technic,Inc.)的纤维蛋白膜后，28天后评估在选定的大鼠器官和血浆中检测到的银的量。

方法

小鼠

根据GLP在相同数量的雄性和雌性大鼠(n＝12/性别/组)中制作切口疝并随机分配到治疗组(含2.5mg/cm²和25mg/cm²金属银微粒(15μm)的纤维蛋白膜)与对照组。在28天时，由独立的盲法兽医病理学家进行尸检。收集血浆和组织样品进行宏观和组织病理学、全血计数和临床化学测定以及经由ICP-MS的银含量测定。银的检测限范围为十亿分之0.003-0.018(ppb)，低于该水平的测量值记录为0.0。从禁食动物收集全血，与肝素混合以得到用于临床化学、血液学和凝血测定的血浆。

猪

还在切口疝预防的猪模型中表征施加含2.5mg/cm²和25mg/cm²金属银微粒(15μm)的纤维蛋白膜后银的分布。简言之，通过中线筋膜制作10cm全层剖腹术切口。对肠进行短暂操纵，然后用五根间断的可吸收2-0BIOSYN^TM缝线(Covidien,Mansfield,MA)闭合筋膜切口，缝线距离剖腹术切口的任一端0.5cm并间隔1.5cm。将总共6只动物(约克夏猪，雌性，90-105kg)随机分组以接受局部施加到缝合的肌筋膜切口的含2.5mg/cm²金属银微粒(15μ)的纤维蛋白膜、含25mg/cm²金属银微粒(15μ)的纤维蛋白膜或盐水，然后闭合皮肤。治疗的总表面积为10cm长筋膜切口周围的2cm面积。然后分两层闭合皮瓣。在加热灯下恢复30-60分钟后，将猪放回洁净的单独的围栏中。

在第28或90天，对选定的动物实施安乐死，进行尸检，并称取多个器官的重量，用盐水洗涤，并从胃、小肠、大肠、心脏、肝、肾、肺、骨骼肌、脾、胰腺、肾上腺、睾丸、脂肪组织、脑和皮肤采收多个1克的样品，置于冷冻管中并在液氮中冷冻以供后续分析。经由ICP-MS测量每个组织的银含量。

结果

小鼠

在小鼠模型中几乎没有或没有观察到生物化学器官损伤或宏观器官病理学的证据。用含2.5mg/cm²和25mg/cm²金属银微粒的纤维蛋白膜治疗的动物中的伤口部位伴随有巨噬细胞和多核巨细胞的浸润。在任何经治疗动物或对照动物中的植入部位处均未发现坏死。

几乎没有或没有观察到涉及肝脏、肌肉骨骼、肾脏或血液系统(即出血)的疾病的行为、临床、大体解剖学或组织病理学证据。

猪

在小肠、大肠、胰腺、肾上腺、睾丸、脂肪组织、肝或皮肤中未检测到银。在研究期间，动物表现出正常的生长和体重增加。在尸检时，没有涉及任何器官(包括肝、脾、肾或皮肤)的临床或组织病理学证据。

实施例11：用含银微粒的血浆膜进行体内伤口治疗

纤维蛋白是组织修复的核心，因为它在伤口中形成的聚合物网络不仅充当止血屏障，而且还充当支持迁移的免疫细胞并隔离可溶性信号传导分子的蛋白质支架。然而，纤维蛋白的生理性质是复杂的并且它们与纤维蛋白的大分子结构的关系是不完全清楚的。参见例如Litvinov RI,Weisel JW.Fibrin mechanical properties and their structuralorigins.Matrix Biol 2017；60-61:110-23。因此，评估了当纤维蛋白的来源为液体组织密封剂相比(versus)干燥的平面血浆膜时银微粒加纤维蛋白对糖尿病小鼠中伤口愈合的功效。

材料和方法

动物。所有程序均在LabCore的机构动物护理和使用委员会的事先批准下进行。遗传性糖尿病C57BL/KsJ-db/db(雄性,14-16周)小鼠获自Jackson Laboratories(BarHarbor,ME)。在进行手术之前，使动物适应实验室条件至少2天，并且所有动物都可随意获得水和标准大鼠饲料。这些瘦素受体缺陷型动物是被广泛接受的2型糖尿病模型，其允许比较有和没有治疗的伤口愈合的变化。参见例如Kleinert M,Clemmensen C,Hofmann SM等人,Animal models of obesity and diabetes mellitus.Nat Rev Endocrinol 2018；14:140-62

切除性创伤。为了检查银加液体纤维蛋白密封剂或掺入干血浆膜中时对糖尿病伤口愈合的影响，将小鼠置于异氟醚麻醉下并用电推子对其背部剃毛。皮下注射一百微升(100μl)的1/30稀释的0.3mg/ml丁丙诺啡，然后背部用必妥碘杀菌液和酒精准备。使用模版和剪刀在每只小鼠的背上制作直径为2cm的圆形切除性伤口，包括除去肉膜层。然后将动物随机分配至使用具有银的液体纤维蛋白密封剂或具有银的干血浆膜治疗相比盐水对照。向对照小鼠的开放性伤口施加250μl的盐水，而实验小鼠用液体纤维蛋白密封剂[300μl的液体纤维蛋白密封剂(TISSEEL Baxter Healthcare Corp,Hayward,CA)加6mg/cm²银微粒(15μm,Technic,Inc.,Woonsocket,RI)]或具有银的干血浆膜(含10或25mg/cm²银微粒的2cm血浆膜圆盘)进行治疗。随后用闭塞性敷料(Tegaderm^TM,3M,St.Paul,MN)覆盖伤口，该敷料用缝线固定以防止动物去除敷料，从而保持伤口清洁和湿润。此外，这类似于患者中糖尿病溃疡的管理。然后将小鼠放回单独的笼子中，并允许其醒来并恢复正常活动。从第0天开始，每周检查小鼠并拍摄背部伤口的照片。治疗后二十八(28)天，对小鼠实施安乐死。使用标准成像程序Image J(NIH)分析系列伤口照片。

伤口愈合评价。测量每只动物的每周伤口照片并比较系列照片以测定伤口闭合率[(基线面积-检测面积)/基线面积×100％]。使用梯形法则测定每条伤口愈合曲线下面积(AUC)。

统计学。进行统计学分析，使用学生t-检验比较对照组和实验组的平均AUC值，显著性为P<0.05。

结果

在28天结束时，无论是何种治疗，大多数背部伤口已愈合(图3A和3B)。然而，用液体纤维蛋白密封剂和银微粒或具有银微粒的干血浆膜治疗的小鼠比盐水治疗的对照组更迅速地愈合其伤口，如由较小的伤口愈合曲线下面积所证明(分别为182±29对271±37，p<0.001和205±28对287±74，p＝0.04)。

与单独盐水相比，用银加纤维蛋白治疗的伤口愈合更快，在28天内完全再上皮化。图3A示出了在用含银微粒的膜治疗后的伤口面积。图3B示出了在用银微粒+液体纤维蛋白治疗后的伤口面积。对用含银的膜和银+液体纤维蛋白治疗的伤口确定伤口愈合时间的平均曲线下面积(AUC)。表6示出了含银微粒的膜的AUC，表6示出了银微粒+液体纤维蛋白的AUC。

表6：用含银微粒的膜治疗的伤口的AUC

表7：用银微粒和液体纤维蛋白治疗的伤口的AUC

数据为平均值±标准偏差(SD)

由于糖尿病小鼠模型，银治疗未使伤口愈合恢复至正常。然而，与盐水相比，含银微粒的两种膜(10mg/cm²和25mg/cm²)都导致增加的愈合时间(含银膜平均AUC为205和209，与盐水的244相比)。出人意料的是，含银微粒的干燥膜在伤口愈合方面也与液体纤维蛋白加银一样有效(平均AUC为182)。值得注意的是，比较这两种测试制剂，在治疗的动物中观察到的加速伤口愈合的程度实际上是相同的。血浆膜中的干平面纤维蛋白与液体纤维蛋白相比同样有效。这是出乎意料的发现，因为在与液体形式的纤维蛋白的结构相比时，血浆膜中纤维蛋白的水合状态和三级结构由于制备期间的干燥和压缩而被显著改变。没有预期复杂的纤维性蛋白如纤维蛋白在这样的生理化学变化之后保持其生物效力和对伤口愈合的作用。参见例如Weisel JW,Litvinov RI.Fibrin Formation,Structure andProperties.Subcell Biochem 2017；82:405-56。

用干燥膜和银观察到的改善水平与由各种药物、生长因子和干细胞疗法所展现的水平相当。参见例如Brown RL,Breeden MP,GreenhalghDG.PDGF and TGF-alpha actsynergistically to improve wound healing in the genetically diabetic mouse.JSurg Res 1994；56:562-70；Sun Y,Song L,Zhang Y,Wang H,Dong X.Adipose stem cellsfrom type 2diabetic mice exhibit therapeutic potential in wound healing.StemCell Res Ther2020；11:298；和Wang F,Zhang C,Dai L等人,Bafilomycin A1Accelerates Chronic Refractory Wound Healing in db/db Mice.Biomed ResInt2020；2020:6265701。值得注意地，银治疗的动物中的加速愈合在治疗后的前14天内最明显。这一观察结果与巨噬细胞的激活一致，因为这些细胞在伤口愈合的早期阶段至关重要。

总之，银微粒与干燥纤维蛋白(血浆膜)组合出乎意料地加速了遗传性糖尿病小鼠中的伤口愈合。

图4示出了用含银微粒的干燥纤维蛋白膜治疗的糖尿病小鼠(C57BL/KsJ-db/db)中愈合切除性皮肤伤口的代表性组织学样本。可以在银微粒周围(黑色箭头)和在组织处理期间银微粒的脱落导致的空气空间周围(白色箭头)看到若干多核巨细胞。40倍放大。不希望受理论束缚，据信多核异物巨细胞对于伤口愈合是重要的。

实施例12：含银微粒的膜的体内降解

材料

切口

将Sprague-Dawley大鼠(雄性,250-300g,Charles River,Cambridge,MA)置于异氟醚麻醉下；用电推子对腹侧腹壁剃毛，并且手术野用70％的酒精准备。通过无血管筋膜前平面掀起在腹侧中线横向2cm处的6cm×3cm矩形全层皮瓣，从而将皮肤切口与下面的筋膜伤口愈合环境分开。保持1:2的皮瓣长度与宽度比以防止皮瓣缺血。形成5cm中线剖腹术切口，操作肠，然后用两条间断的5-0普通肠线(可快速吸收)缝线闭合肌筋膜切口，缝线分别距离切开的肌筋膜边缘5mm并在距中线剖腹术切口的头端和尾端的三分之一距离处，然后用连续的4-0vicryl缝线闭合皮瓣以防止肠脱出。手术后立即在腹部切口周围皮下输注0.4mL的布比卡因0.25％，每2分钟观察大鼠，直至其醒来并恢复正常活动。其后，将大鼠放回单独的笼中并每天监测两次。在术后12和18小时，皮下注射0.05mg/kg的丁丙诺啡。

施加含银微粒的膜

将总共82只大鼠随机分到三个对照组(单独的盐水、单独的干纤维蛋白膜和具有银微粒的液体纤维蛋白密封剂，如WO2013138238中所述)和两个实验组(含2.5mg/cm²和25mg/cm²银微粒(15μ)的干燥纤维蛋白膜)中。在皮肤闭合之前，对动物的其缝合的肌筋膜切口施加选定的治疗。在第21天和第28天，检查所有动物是否存在明显的腹部突出(临床疝)并照此记录。然后对动物实施安乐死，切下它们的腹壁，将覆盖的皮肤小心地与肌筋膜表面和疝囊(如果存在的话)分开。仔细检查每个样本，并测量直肌之间的任何间隙。如果发现间隙直径大于2mm，则将其归类为解剖学疝。肌筋膜缺损的总面积也通过测量最大横向和头尾向尺寸来确定，并然后使用椭圆方程(πx r₁ x r₂；r₁＝1/2横向直径，并且r₂＝1/2头尾向直径)来计算。在21天和/或28天后评估切口疝发生率和尺寸、拉伸强度和组织组织学。经由苏木精-伊红和天狼星红染色评估腹壁肌肉和周围胶原的组织学。另外，根据Hansen等人,Am J Pathol2003；163:2421-2431中描述的方法对载片进行巨细胞、纤维化、纤维化密度和血管生成评分。根据Mace等人,Wound Repair Regen 2007；15:636-645中描述的方法通过计数常见炎性细胞的数目来评价炎症。

拉伸强度测定

在大鼠中进行进一步的研究以确定正常愈合的腹部切口的拉伸强度不受使用含银微粒的膜治疗的影响。使用已确立的创建切口疝的实验方案(Dubay,Ann Surg 2004；240:179-186)，不同的是使用连续缝合的4-0vicryl缝线而不是2根间断的5-0普通肠线缝线闭合5cm中线剖腹术切口。使用缓慢溶解的缝线材料而不是快速溶解缝线材料进行连续闭合允许肌筋膜伤口有足够的时间正常愈合(类似于患者中的标准治疗)并因此避免切口疝的形成。将动物随机分到两个对照组(单独的盐水和单独的纤维蛋白膜)和两个实验组(含2.5mg/cm²与25mg/cm²银微粒的纤维蛋白膜)中。在第21天或第28天，对所有动物实施安乐死，切除整个腹侧腹壁并收集两条肌肉进行机械测试。在尸检的6小时内进行腹壁肌肉条的张力测量分析。使用拉伸载荷以便于使用Instron张力计(型号

)进行筋膜-筋膜界面的机械表征。经由计算机同时记录力和组织变形数据并使用

软件进行数据分析。试样的失效定义为屈服点，而不是最终组织破裂点。

结果

在第21天或第28天在用含2.5mg/cm²和25mg/cm²银微粒的干燥纤维蛋白膜治疗的小鼠中没有观察到间隙。

在盐水对照组与用含银微粒的纤维蛋白膜治疗的小鼠之间观察到切口疝发生率和疝尺寸两者都降低。如与盐水对照相比，组织学样本显示治疗动物中新纤维化的增加。在21天或28天之后，无论治疗组，肌筋膜切口的拉伸强度相同。

实施例13：糖尿病足溃疡(DFU)的人试验

糖尿病足溃疡是糖尿病的常见、复杂且严重的并发症，其与显著发病率、死亡率和医疗费用相关。DFU每年影响全世界约2600万人(Armstrong,N Engl J Med 2017；376:2367-2375)，仅在美国就花费超过130亿美元(Rice,Diabetes Care 2014；37:651-658)，并且五年死亡率等同于食管癌、肝癌和肺癌(Singh,JAMA 2005；293:217-228)。但是，患上DFU的最令人恐惧的后果也许是截肢的风险。2016年，糖尿病患者下肢截肢超过13万例，相当于每4分钟就有一例截肢(CDC,National Diabetes Statistics Report,2020)。85％的这些截肢之前有溃疡(Singh,JAMA 2005；293:217-228；Driver,J Am Podiatr Med Assoc2010；100:335-341)。不幸的是，目前对DFU的治疗具有一个首要的限制。治疗或者减少细菌生长(其阻碍细胞再生)，或者增强细胞生长但具有有限的抗菌活性。目前没有可用的治疗有效地增强细胞生长同时抑制细菌。由于DFU通常具有增加的微生物负荷(生物负荷)，同时缺乏足够的再生性细胞和生长因子反应(不充分愈合)，故最佳治疗必须同时解决伤口生物负荷而同时还以安全和非毒性的方式恢复伤口的再生能力。含银微粒的纤维蛋白膜利用银的医疗特性显著地增强伤口愈合，同时控制局部生物负荷。

研究设计

三十(30)名正接受糖尿病足溃疡治疗的成年患者的多中心、平行组、标准疗法对照的、1期研究。参与者同等地被随机分配到研究组。治疗涉及每周施加含银微粒的膜(15μm颗粒,2.5-25mg/cm²膜)直至伤口愈合，与标准治疗相比，不超过连续12周。在基线访视(第1天)时，对所有伤口进行检查、清创和/或清洁，然后局部施加含银微粒的膜以覆盖伤口的整个表面积，然后放置敷料7±2天。除了在第3天(±1天)更换敷料以检查潜在的过敏反应并由研究者酌情决定处理过多的伤口渗出液外，仅在每周访视时取下敷料。在随后的临床访视时进行额外的清创以去除研究者认为有必要去除的任何坏死或不需要的组织。每周监测患者的糖尿病足溃疡，包括测量尺寸和深度以及评估溃疡恶化、疼痛或感染迹象。

持续时间

从入组到研究结束，研究持续时间总共长达26周。这包括两周的活动磨合，随后是长达12周的随机治疗，参与者伤口完全闭合后2周的随访访视，加上最后一次治疗后12周的最终随访访视。

功效评估

临床试验的主要终点是在不愈合性糖尿病足溃疡患者中局部施加含金属银微粒的血浆膜的安全性。

次要终点包括：

·在治疗后第1周至第12周愈合的研究伤口百分数

·完全伤口闭合的时间

·治疗后第1周至第12周的面积(cm²)减少百分数

·治疗后3个月的溃疡复发率

·研究过程期间的伤口感染率

·疼痛(VAS)

·生活质量(伤口-QoL,SF-36)和

·治疗费用

安全性评估

安全性评估包括不良事件(AE)、严重不良事件(SAE)、身体检查、生命体征测量、临床实验室评价和由于毒性而中断治疗的原因。

研究人群

糖尿病足溃疡位于踝远端、糖尿病受到控制且动脉循环无明显受损的成年患者。

入组标准

1.18-75岁的男性或女性。

2.受试者能够并且愿意遵守研究程序并获得知情同意。

3.起源于糖尿病、位于足上(定义为从踝关节以下开始)并且在筛选当天之前持续时间>30天，对常规伤口愈合治疗没有充分反应的不愈合性溃疡。

4.清创后目标溃疡表面积在1-10cm²之间，无活动性感染。在随机分组之前进行锐器清创(sharp debridement)。在进行锐器清创之前必须获得受试者参与本研究的知情同意。

5.1型或2型糖尿病患者(美国糖尿病协会的糖尿病诊断标准)。

6.可能存在其他伤口但不在目标溃疡的3cm内。

7.在过去90天内，患者患肢动脉灌注充足，如由以下情况中的任一所证实：脚趾压力(体积描记术)>50mm/Hg，或收缩压ABI结果≥0.70并≤1.2，或来自足部的TcPO2≥30mmHg，或多普勒动脉波形与足中的充足流量一致(患腿踝关节处的双相或三相波形)。

8.目标溃疡涉及全厚度皮肤缺损，但无肌腱、肌肉或骨暴露(已存在≥4周)。

9.在随机分组之前90天内HbA1c<12％。

10.过去6个月内血清肌酐<3.0mg/dL。

11.愿意并能够(受试者或负责的照料者)保持所需的卸载(off-loading)(如适用于溃疡位置)。

12.妊娠试验阴性

13.在可能怀孕妇女接触治疗产品期间，使用可靠的避孕和/或禁欲方法。

排除标准

1.疑似或确认的伤口感染体征/症状(在入组前可以治疗感染，并重新考虑受试者是否参与研究)。

2.表现为探及骨的溃疡的患者(德克萨斯大学IIIA-D级)。当用无菌眼科探针可以感觉到骨或关节时确认骨探及(probe-to-bone)阳性。

3.对银过敏。

4.对FFP或对包括任何血浆蛋白的血浆来源产品过敏。

5.受试者以前参加过本研究或在入组30天内参与过任何研究药物或医疗器械研究。

6.目前正在接受在研究者认为已知干扰伤口愈合的治疗方案或药物治疗(例如：癌症化疗或等效免疫抑制剂、全身性类固醇治疗>10天、细胞抑制药物、某些过敏药物、COX-2抑制剂或放射疗法)。

7.在研究者看来会干扰伤口愈合的过度淋巴水肿。

8.任何干扰受试者遵守治疗方案的能力的病症。

9.在研究者看来会抑制伤口愈合的活动性Charcot足或具有骨性突出的Charcot畸形。

10.继发于血管炎、肿瘤或血液病症的伤口。服用抗凝药物的患者将如在任何外科手术中，根据入组中心采用的方案进行监测。

11.除糖尿病外，在研究者看来会损害受试者安全或数据质量或严重负面干扰伤口愈合过程的正常参数的病症。

12.进行透析的受试者。

13.足部放射史。

14.溃疡存在>18个月。

15.酒精或药物使用障碍的临床相关病史。

16.患有不受控制的自身免疫结缔组织疾病的患者。

17.怀孕或哺乳期患者。

18.患有不受控制的贫血的患者(女性Hb<10g/dL；男性<12g/dL)。

19.严重营养不良(血清白蛋白<2.0，CRP正常)。

20.在放置含银微粒的膜高级伤口护理产品或标准护理敷料时，受试者具有：

i.伤口感染的明显迹象，如由例如脓、红斑、蜂窝织炎、溃疡中/周围的过高温度、非典型气味和/或溃疡中/周围的过度疼痛所证实(可以治疗感染并重新考虑受试者是否参与研究)。

ii.骨髓炎，有软骨坏死(如果在研究者看来需要额外诊断确认，则进行x-射线检查)

iii.在为期2周的活动磨合期内伤口愈合面积>20％

iv.在30天内使用高压氧和包含生长因子、工程化组织或皮肤替代品(例如，Regranex、Dermagraft、Apligraf等)的活性敷料。

21.锐器清创后伤口表面积>10cm2或深度>5mm。

22.临床怀疑溃疡位置处或附近有皮肤癌，活检未排除。

排除的既往或伴随用药

1.在研究入组前90天内高剂量的皮质类固醇(即，剂量≥1.5mg/kg/天的泼尼松或等效物)。

2.在研究入组前90天内的化疗或放疗。

3.在研究入组前90天内施用免疫球蛋白或粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。

治疗

每周施加含银微粒的膜进行治疗。在基线访视时，使用锋利的刀片、剪刀、刮匙或Versajet系统通过清创移除坏死组织。然后局部施加含银微粒的膜以覆盖伤口的整个表面积，随后放置敷料7±2天。在每周(±2天)研究访视时进行定期安排的敷料更换(即，受试者或照料者不在家更换敷料)，到第12周，例外是第一次安排的敷料更换在第2天(±1天)进行。第12周之后，敷料材料、敷料更换频率和在家更换敷料由研究者针对未愈合的溃疡酌情决定。每周监测患者的糖尿病足溃疡，包括测量尺寸和体积以及评估溃疡恶化、疼痛或感染迹象。在随后的临床访视时进行额外的伤口清创以根据研究者的判断移除任何坏死组织或不需要的组织。

安全性评价

第2±1天：在第一次施加的2-3天内评价患者以经由增加的局部疼痛、水肿、红斑、引流、气味或过敏迹象(例如，皮炎)来评估局部耐受性。

第1-12周：研究者寻找糖尿病足溃疡中感染的证据。不良结果包括发红、肿胀、疼痛、气味或引流的增加。研究者了解感染的体征和症状。如果存在感染的临床的迹象，则在侵袭性锐器清创后经由溃疡基底刮除获得伤口培养物。给予适当的全身抗生素治疗直至感染消退。记录微生物学确认和抗生素治疗的选择。

第1-12周：研究者监测溃疡的任何恶化，例如疼痛或引流的增加或尺寸的增加。如果有溃疡恶化的证据，则终止含银微粒的膜的治疗，患者接受标准护理治疗并在研究期间跟踪。每周获得未愈合伤口的拭子培养物并测定含有银抗性基因的细菌的存在。

第13-24周：在终止含银微粒的膜的治疗后12(±2)周评价患者以确定DFU的愈合状态和任何长期安全性问题的存在。

虽然已结合优选实施方案和各种替代实施方案具体示出和描述了本发明，但相关领域技术人员应理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下可在其中作形式和细节上的各种改变。

统计方法

通过Mann-Whitney U检验比较疼痛、生活质量和溃疡尺寸的连续终点。使用Kaplan-Meier生存分析来测定愈合时间，并使用对数秩χ2检验来测定愈合率。使用描述性统计，包括平均值、中值、标准偏差、频率和百分数，来描述数值数据。在研究组之间比较人口统计学变量、糖尿病类型、伤口尺寸、愈合的伤口的完全愈合时间和未愈合的溃疡的伤口尺寸从基线到最近随访评价的变化。使用Pearson卡方分析比较分类性信息。对于正态分布的连续变量，使用单因素方差分析来确定统计学显著性。利用伤口愈合时间作为生存事件，使用Kaplan–Meier生存分析(乘积限图)评估治疗组之间的伤口愈合。如果伤口未能在12周终点时或在最后可用的临床评估时愈合或如果患者退出研究，则删掉该伤口。使用在最后随访评价时获得的伤口测量结果进行分析。使用对数秩检验来确定生存曲线之间的显著差异。进行Cox比例风险模型分析以确定伤口愈合与以下协变量之间的关系：呈现时的溃疡尺寸；指数溃疡持续时间；患者年龄；体重指数；营养状态的受试者总体评估(SGA)；部位、缺血、神经病变、细菌感染、面积和深度(SINBAD)DFU分类评分；和糖尿病类型。另外，进行风险比估计以评价伤口愈合时间与显著协变量之间的相关性。当P<0.05且功效为至少0.80时，认为统计学差异是显著的。在整个统计分析中使用百分之九十的置信区间。

数据与安全性监测计划

安全性信息审查。Vitruvian和ERC将持续审查安全性数据。ERC由糖尿病专家(Robert Rushakoff,MD,教授,UCSF)、血管外科专家(Joseph H.Rapp,MD,荣誉教授,UCSF)和足病医学专家(Chia-Ding(JD)Shih,DPM,MPH,MA,California School of PodiatricMedicine)组成。ERC将准备研究数据报告供Vitruvian审查并纳入最终研究报告中。

研究停止规则。如果任何ERC审查得出结论认为存在重大安全性问题，则可以在任何时间暂停研究治疗的入组和启动。如果试验暂停，则任何新研究受试者的所有筛选、入组和启动将停止，等待Vitruvian的审查。

基于以下SAE的发生暂停试验：死亡或严重感染(定义为≥3级(如下定义)的任何感染)。Vitruvian应评价任何非预期的不良反应并在计划的安全性数据审查会议期间每3个月一次通知ERC审查安全性数据。用于计划的安全性审查的数据将至少包括所有报告的AE和SAE的列表。另外，可能会要求ERC进行特别审查。Vitruvian将及时(在5个工作日内)进行。

不良反应由Vitruvian分级并且归因将最终由ERC确定。

不良事件的分级、报告和归因。分级标准。研究中心将根据国家癌症研究所针对除感染外的所有AE的不良事件通用术语标准(NCICTCAE-4.0版)中规定的标准对研究受试者经历的AE的严重程度分级。该文件提供了一种通用语言来描述所有AE的严重度、分析和解释数据并阐明临床意义。

根据NCI-CTCAE手册中的以下标准将不良事件按1至5的评分分级：

·1级＝轻度不良事件。

·2级＝中度不良事件。

·3级＝严重和不期望的不良事件。

·4级＝危及生命或致残的不良事件。

·5级＝死亡。

在本研究的适当AE病例报告表上记录2级或更高等级的事件。

对于感染的任何AE，对研究参与者使用以下分级系统：

·1级感染＝无症状；仅临床或诊断观察；仅使用口服抗微生物剂进行干预；无需侵入性干预

·2级感染＝有症状；静脉内抗微生物剂干预；可能需要侵入性干预

·3级感染＝伴有血流动力学损害的任何感染，需要血管加压药，需要重症监护室水平的护理或涉及软组织坏死性的感染

·4级感染＝危及生命的感染

·5级感染＝感染导致的死亡

不良事件报告。研究者将在发现事件后24小时内向Vitruvian和IRB报告所有SAE，无论相关性或预期如何，并将所有IND安全性报告提交给FDA。对于SAE，提供AE/SAE表上的所有要求的信息。

图5提供了拟定临床试验的事件的时间表。

归因定义。AE与研究方案的关系或归因最初由研究者确定并记录在适当的AE/SAE表上。安全性报告的归因的最终确定由Vitruvian和ERC确定。AE与研究的关系经由NCI-CTCAE定义确定为不相关、可能或确定。

本说明书的正文中引用的所有参考文献、已授权专利和专利申请均出于所有目的通过引用整体并入本文。

Claims (92)

1.一种干燥膜，所述干燥膜包含：纤维蛋白、纤维蛋白原或其组合以及银微粒，其中所述膜含有约0.01国际单位(IU)或更少的凝血酶/cm²膜；并且其中所述膜在室温下稳定至少18个月。

2.根据权利要求1所述的干燥膜，其中所述银微粒以1-50mg银/cm²膜的浓度存在。

3.根据权利要求2所述的干燥膜，其中所述银微粒以2.5-25mg银微粒/cm²膜的浓度存在。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的干燥膜，其中所述银微粒具有约2μm至1,000μm的范围内的平均直径。

5.根据权利要求4所述的干燥膜，其中所述银微粒具有约15μm的平均直径。

6.根据上述权利要求中任一项所述的干燥膜，其中所述纤维蛋白或纤维蛋白原以全血或全血浆的组分存在。

7.根据上述权利要求中任一项所述的干燥膜，其中所述纤维蛋白、纤维蛋白原或其组合以0.5至20.0mg/cm²膜的量存在。

8.根据权利要求7所述的干燥膜，其中所述纤维蛋白原以2.5至4.0mg/cm²膜的量存在。

9.根据上述权利要求中任一项所述的干燥膜，其中所述膜不含凝血酶。

10.根据上述权利要求中任一项所述的干燥膜，其中所述膜在施用于受试者时释放0.02至5.0ppm的银离子。

11.根据上述权利要求中任一项所述的干燥膜，其中所述膜具有约0.5至2.0mg/cm²的水分含量。

12.根据权利要求11所述的干燥膜，其中所述膜具有约0.9mg/cm²的水分含量。

13.根据上述权利要求中任一项所述的干燥膜，其中所述膜在所述膜的表面上包含银微粒。

14.根据上述权利要求中任一项所述的干燥膜，其中所述膜的所述表面上的所述银微粒是耐磨的。

15.根据权利要求14所述的干燥膜，其中所述耐磨性通过刷擦来测定。

16.根据权利要求14或15所述的干燥膜，其中所述膜的所述表面上的所述银微粒对于至少100次刷擦测定重复是耐磨的。

17.根据上述权利要求中任一项所述的干燥膜，其中所述膜具有至少2、至少3、至少4或至少5的折叠数。

18.根据权利要求17所述的干燥膜，其中所述折叠数通过折叠所述膜直至所述膜断裂或破裂来测定。

19.根据上述权利要求中任一项所述的干燥膜，其中所述膜具有至少5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、500或1000的耐折性。

20.根据权利要求19所述的干燥膜，其中所述耐折性通过在同一折线上折叠和展开所述膜直至所述膜断裂或破裂来测定。

21.根据上述权利要求中任一项所述的干燥膜，其中所述膜具有约50至1000mm的爆裂压力。

22.根据权利要求21所述的干燥膜，其中所述膜具有至少800mmHg的爆裂压力。

23.根据上述权利要求中任一项所述的干燥膜，其中所述膜在室温下稳定至少15个月。

24.根据权利要求23所述的干燥膜，其中所述稳定性通过爆裂压力和耐折性测定。

25.根据权利要求23或24所述的干燥膜，其中所述膜在室温下储存15个月后具有至少5的折叠数。

26.根据权利要求23或24所述的干燥膜，其中所述膜在室温下储存15个月后具有至少100的耐折性。

27.根据权利要求23或24所述的干燥膜，其中所述膜在室温下储存15个月后具有至少800的爆裂压力。

28.根据上述权利要求中任一项所述的干燥膜，所述干燥膜还包含粘合剂涂层。

29.根据权利要求28所述的干燥膜，其中所述粘合剂涂层为氧化再生纤维素。

30.根据权利要求28或29所述的干燥膜，其中所述粘合剂涂层以膜的5重量％-25重量％的量存在于所述膜上。

31.根据上述权利要求中任一项所述的干燥膜，其中所述膜是无菌的。

32.根据权利要求31所述的干燥膜，其中所述膜通过γ辐照来灭菌。

33.根据上述权利要求中任一项所述的干燥膜，所述干燥膜还包含钙。

34.根据权利要求33所述的干燥膜，其中所述钙以0.00005-0.20mg/cm²膜的浓度存在于所述膜中。

35.根据上述权利要求中任一项所述的干燥膜，其中所述膜的厚度在0.1mm至1mm之间。

36.根据权利要求35所述的干燥膜，其中所述膜的厚度为约100μm、150μm或200μm。

37.一种处理受试者中的伤口的方法，所述方法包括向所述伤口施用有效量的根据权利要求1-36中任一项所述的干燥膜。

38.根据权利要求37所述的方法，其中在打开包含所述干燥膜的储存容器后不到15分钟将所述干燥膜施用于所述伤口。

39.根据权利要求37所述的方法，其中在打开包含所述干燥膜的储存容器后1至15分钟之间将所述干燥膜施用于所述伤口。

40.根据权利要求37-39中任一项所述的方法，其中所述伤口为急性伤口、慢性伤口、不愈合性伤口、糖尿病足溃疡、下肢静脉溃疡、压力性溃疡、手术伤口、动脉伤口、外伤性伤口或由ICD-9代码定义的皮肤病症。

41.根据权利要求40所述的方法，其中所述伤口为不愈合性伤口。

42.根据权利要求41所述的方法，其中所述伤口选自减少的原发性术后粘连形成、减少的术后粘连再形成、来自细胞和组织移植的伤口、和烧伤伤口。

43.根据权利要求37-42中任一项所述的方法，其中所述干燥膜在向所述受试者的所述伤口施用所述膜后不到28天降解。

44.一种制造用于治疗受试者中的伤口的干燥膜的方法，所述方法包括：

获得人血浆；

将所述血浆置于模具中；

通过向所述血浆中添加聚合剂来聚合所述血浆以形成凝胶；

向所述凝胶中添加银微粒以生成含银微粒的血浆凝胶；

从所述聚合的凝胶移除流体以生成膜；

干燥所述膜；和

对所述膜进行γ灭菌。

45.根据权利要求44所述的方法，其中通过在约1.25托至125托的压力下向所述凝胶施加真空压力来进行流体的移除。

46.根据权利要求44-45中任一项所述的方法，其中所述聚合剂为CaCl₂或凝血酶。

47.根据权利要求46所述的方法，其中所述聚合剂为CaCl₂。

48.根据权利要求46或47所述的方法，其中向所述血浆中添加0.5-1mg/ml的CaCl₂。

49.根据权利要求48所述的方法，其中向所述血浆中添加约0.86mg/ml的CaCl₂。

50.根据权利要求44-49中任一项所述的方法，所述方法还包括在干燥所述膜之前用甘油溶液温育所述膜。

51.根据权利要求50所述的方法，其中所述甘油溶液包含2％的甘油。

52.根据权利要求44-51中任一项所述的方法，其中将所述银微粒添加到所述血浆中。

53.根据权利要求44-51中任一项所述的方法，其中在所述凝胶的聚合之前添加所述银微粒。

54.根据权利要求44-53中任一项所述的方法，其中通过将所述银微粒与所述血浆混合来添加所述银微粒。

55.根据权利要求44-51中任一项所述的方法，其中在所述凝胶的聚合之后添加所述银微粒。

56.根据权利要求44-51中任一项所述的方法，其中在从所述凝胶移除所述流体之前添加所述银微粒。

57.根据权利要求44-51中任一项所述的方法，其中在从所述凝胶移除所述流体之后添加所述银微粒。

58.根据权利要求44-51中任一项所述的方法，其中在所述甘油溶液温育之后添加所述银微粒。

59.根据权利要求44-51和55-58中任一项所述的方法，其中通过在所述聚合的凝胶上施加包含银微粒的喷涂层来添加所述银微粒。

60.根据权利要求44-59中任一项所述的方法，其中所述银微粒以1-50mg银/cm²膜的浓度存在。

61.根据权利要求60所述的方法，其中所述银微粒以2.5-25mg银/cm²膜的浓度存在。

62.根据权利要求44-61中任一项所述的方法，其中所述银微粒具有2μm至1,000μm的范围内的平均直径。

63.根据权利要求62所述的方法，其中所述银微粒具有约15μm的平均直径。

64.根据权利要求44-63中任一项所述的方法，其中所述膜还包含磷脂。

65.根据权利要求64所述的方法，其中所述磷脂为磷脂酰丝氨酸或磷脂酰胆碱。

66.根据权利要求44-65中任一项所述的方法，其中所述钙以0.00005-0.20mg/cm²膜的浓度存在于所述膜中。

67.根据权利要求44-66中任一项所述的方法，其中所述膜包含小于约0.0999IU凝血酶/cm²膜。

68.根据权利要求44-62中任一项所述的方法，所述方法还包括在将所述血浆置于所述模具中之后于37℃温育所述血浆。

69.根据权利要求69所述的方法，其中将所述血浆于37℃温育5至30分钟。

70.根据权利要求69所述的方法，其中将所述血浆于37℃温育15分钟。

71.根据权利要求44-62中任一项所述的方法，所述方法还包括在用所述甘油溶液温育之后于37℃温育所述凝胶。

72.根据权利要求71所述的方法，其中将所述凝胶于37℃温育5至60分钟。

73.根据权利要求71所述的方法，其中将所述凝胶于37℃温育5分钟。

74.根据权利要求44-73中任一项所述的方法，其中将所述膜在42℃至50℃的温度下干燥。

75.根据权利要求44-74中任一项所述的方法，其中将所述膜干燥30分钟至120分钟。

76.根据权利要求44-75中任一项所述的方法，其中将所述膜在对流烘箱中干燥。

77.根据权利要求44-76中任一项所述的方法，其中所述膜具有约0.5至2.0mg/cm²的水分含量。

78.根据权利要求77所述的方法，其中所述膜具有约0.9mg/cm²的水分含量。

79.根据权利要求44-78中任一项所述的方法，所述方法还包括向所述膜添加粘合剂涂层。

80.根据权利要求79所述的方法，其中所述粘合剂涂层为氧化再生纤维素。

81.根据权利要求79或80中的一项所述的干燥膜，其中所述粘合剂涂层以5重量％-25重量％的量存在于所述膜上。

82.根据权利要求44-81中任一项所述的方法，所述方法还包括对所述人血浆进行病毒灭活。

83.根据权利要求82所述的方法，其中所述病毒灭活包括溶剂/去污剂和/或纳滤。

84.根据权利要求83所述的方法，其中所述溶剂/去污剂为Triton X-100。

85.根据权利要求44-84中任一项所述的方法，其中所述膜的厚度为约0.1mm至1mm。

86.一种在受试者中预防伤口的方法，所述方法包括向所述受试者中易于形成伤口的区域施用有效量的根据权利要求1-36中任一项所述的干燥膜。

87.根据权利要求86所述的方法，其中在打开包含所述干燥膜的储存容器后不到15分钟将所述干燥膜施用于所述易于形成伤口的区域。

88.根据权利要求87所述的方法，其中在打开包含所述干燥膜的所述储存容器后1至15分钟之间将所述干燥膜施用于所述易于形成伤口的区域。

89.根据权利要求86-88中任一项所述的方法，其中所述伤口为急性伤口、慢性伤口、不愈合性伤口、糖尿病足溃疡、下肢静脉溃疡、压力性溃疡、手术伤口、动脉伤口、外伤性伤口或由ICD-9代码定义的皮肤病症。

90.根据权利要求89所述的方法，其中所述伤口为不愈合性伤口。

91.根据权利要求86-88中任一项所述的方法，其中所述伤口为疝。

92.根据权利要求86-91中任一项所述的方法，其中所述干燥膜在向所述受试者中所述易于形成伤口的区域施用所述膜后不到28天降解。

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