JP2023543056A - 複数遺伝子の発現を阻害するための組成物及び方法 - Google Patents

複数遺伝子の発現を阻害するための組成物及び方法 Download PDF

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ラフル カルニク，
ケンドリック アラン ゴス，
アダム ウォルター シャイデッガー，
ジョディ ミシェル ケネディ，
ジェレミア デイル ファレリ，
フーダ ベラグザル，
ローラ アン グエン，
チャールズ ダブリュー． オドネル，
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フラッグシップ パイオニアリング イノベーションズ ブイ， インコーポレイテッド
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Abstract

本開示は、細胞における標的複数遺伝子の発現を調節する、例えば、低減するための、部位特異的妨害剤に関する。一部の実施形態では、標的複数遺伝子は、炎症誘発性遺伝子、例えば、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、及びＩＬ－８を含む。一部の実施形態では、方法は、第１アンカー配列をターゲティングする第１部位特異的妨害剤、及び第２アンカー配列を妨害する第２部位特異的妨害剤を使用することを含む。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年９月２９日に出願された米国仮特許出願第６３／０８５，０１３号明細書及び２０２１年６月２９日に出願された米国仮特許出願第６３／２１６，４８７号明細書の利益を主張する。前述の出願の内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０２１年９月２９日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、Ｏ２０５７－７０２１ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔという名称で、サイズは６６６，８１８バイトである。
遺伝子発現の誤調節は、多くの疾患の根底にある原因である（例えば、哺乳動物、例えば、ヒトにおいて）。多数の疾患及び病状は、複数の関連遺伝子に関連している。複数の関連遺伝子の発現を変化させる、例えば低減するための新たなツール、システム、及び方法が必要とされている。
本開示は、とりわけ、第１アンカー配列及び第２アンカー配列を含むアンカー配列媒介接合部（ＡＳＭＣ）内にある複数の標的遺伝子、例えば第１遺伝子及び第２遺伝子の発現を調節、例えば低減するために使用することができる部位特異的妨害剤又は部位特異的妨害剤を含むシステムを提供する。一態様では、部位特異的妨害剤は、ＡＳＭＣの第１アンカー配列又は第１アンカー配列に近接した部位に、特異的に結合する、ターゲティング部分を含む。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤の結合は、複数の標的遺伝子、例えば、第１遺伝子及び第２遺伝子の発現を調節する、例えば低減するのに十分な量で起こる。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、エフェクター部分をさらに含む。概して、部位特異的妨害剤による標的複数遺伝子の発現の調節は、部位特異的妨害剤の、第１アンカー配列又はそれに近接した部位への結合を含む。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤の第１アンカー配列への結合は、核形成ポリペプチド、例えばＣＴＣＦの、第１アンカー配列への結合を妨害し、例えば、それにより、ＡＳＭＣの形成及び／又は維持を妨害し、例えば、それにより、複数の遺伝子の発現を調節、例えば低減する。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤の第１アンカー配列又はそれに近接した部位への結合は、エフェクター部分の機能性を第１アンカー配列及び／又はＡＳＭＣに局在化させ、例えば、それにより、ＡＳＭＣの形成及び／又は維持を妨害し、例えば、それにより、複数の遺伝子の発現を調節、例えば低減する。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤の第１アンカー配列又はそれに近接した部位への結合は、エフェクター部分の機能性を第１アンカー配列及び／又はＡＳＭＣに局在化させ、例えば、それにより、複数の遺伝子の発現を調節、例えば低減する。理論に束縛されることは望まないが、一部の実施形態では、同じＡＳＭＣ内にある複数の遺伝子をターゲティングすることは、複数の遺伝子の発現をより効率的に調節、例えば、低減し、且つ／又は複数の遺伝子の機能性に関する治療効果をより効率的に達成し得ると考えられる。例えば、一部の実施形態では、標的複数遺伝子は全て、炎症誘発性遺伝子であってもよく；本明細書で教示されるように、発現の調節、例えば、低減のために複数の炎症誘発性遺伝子をターゲティングすることは、個々の遺伝子をターゲティングするよりも効率的に炎症を低減し得る。同じゲノム複合体、例えば、ＡＳＭＣ内に含まれる、複数の遺伝子をターゲティングすること（例えば、ＡＳＭＣ又はＡＳＭＣのアンカー配列をターゲティングすることによる）は、（例えば、発現調節又は安定性／持続時間の調節に関して）複数の個々の遺伝子をターゲティングする効果よりも大きい相加的又は相乗的な効果を有し得る。
いくつかの態様では、本開示は、細胞における第１遺伝子及び第２遺伝子の発現を低減する方法であって、第１アンカー配列又は第１アンカー配列に近接した部位に特異的に結合する、ターゲティング部分を含む、部位特異的妨害剤に、第１及び第２遺伝子の発現を低減するのに十分な量で、細胞を接触させることを含み、第１及び第２遺伝子は、第１アンカー配列及び第２アンカー配列を含むアンカー配列媒介接合部内にある、方法を提供する。一部の実施形態では、第１遺伝子及び第２遺伝子は、炎症誘発性遺伝子である。
いくつかの態様では、本開示は、ＤＮＡ結合、例えば、細胞内の第１アンカー配列に特異的に、又はそれに近接して結合する、ターゲティング部分を含む部位特異的妨害剤を対象とする。一部の実施形態では、第１アンカー配列は、第２アンカー配列、第１遺伝子、及び第２遺伝子をさらに含む、アンカー配列媒介接合部の一部である。一部の実施形態では、第１遺伝子及び第２遺伝子は、炎症誘発性遺伝子である。
いくつかの態様では、本開示は、細胞内の第１アンカー配列に特異的に、又はそれに近接して結合する、ターゲティング部分を含む部位特異的妨害剤を対象とし、ここで、第１アンカー配列は、第２アンカー配列、第１遺伝子、及び第２遺伝子をさらに含む、アンカー配列媒介接合部の一部であり、第１遺伝子及び第２遺伝子は、炎症誘発性遺伝子である。
別の態様では、本開示は、第１ターゲティング部分と、任意選択的に第１エフェクター部分とを含む、第１部位特異的妨害剤を含むシステムを提供し、ここで、第１部位特異的妨害剤は、第１遺伝子及び第２遺伝子、並びに第２ターゲティング部分と、任意選択的に第２エフェクター部分とを含む、第２部位特異的妨害剤を含む、アンカー配列媒介接合部（ＡＳＭＣ）の第１アンカー配列（又は第１アンカー配列に近接した部位）に、特異的に結合し、第２部位特異的妨害剤は、ＡＳＭＣの第２アンカー配列（又は第２アンカー配列に近接した部位）に結合する。
別の態様では、本開示は、細胞における第１遺伝子及び第２遺伝子の発現を低減する方法であって、第１アンカー配列又は第１アンカー配列に近接した部位に特異的に結合する、ターゲティング部分を含む、部位特異的妨害剤に、第１及び第２遺伝子の発現を低減するのに十分な量で、細胞を接触させることを含み、第１及び第２遺伝子は、第１アンカー配列及び第２アンカー配列を含むアンカー配列媒介接合部内にある、方法を対象とし、ここで、第１遺伝子及び第２遺伝子は、炎症誘発性遺伝子であり；それにより、第１及び第２遺伝子の発現を低減する。
別の態様では、本開示は、細胞における第１遺伝子及び第２遺伝子の発現を低減する方法であって、第１ターゲティング部分と、任意選択的に第１アンカー配列又は第１アンカー配列に近接した部位に特異的に結合する第１エフェクター部分とを含む、第１部位特異的妨害剤、並びに第２ターゲティング部分と、任意選択的に第２エフェクター部分とを含む、第２部位特異的妨害剤を含むシステムと、細胞を接触させることを含む方法を対象とし、第２部位特異的妨害剤は、第１及び第２遺伝子の発現を低減するのに十分な量で、ＡＳＭＣの第２アンカー配列（又は第２アンカー配列に近接した部位）に結合し、第１及び第２遺伝子はＡＳＭＣ内にあり、第１遺伝子及び第２遺伝子は、炎症誘発性遺伝子である。
別の態様では、本開示は、細胞（例えば、ヒト細胞、例えば、初代ヒト細胞）と、本明細書に記載の部位特異的妨害剤又はシステムとを含む、反応混合物を対象とする。
別の態様では、本開示は、炎症性障害を有する対象を治療する方法であって、炎症性障害を治療するのに十分な量の本明細書に記載の部位特異的妨害剤又はシステムを対象に投与することを含む、方法を対象とする。
別の態様では、本開示は、感染、例えば、ウイルス感染、例えば、ＣＯＶＩＤ－１９を有する対象における炎症、例えば、局所炎症を治療する方法であって、炎症を治療するのに十分な量の本明細書に記載の部位特異的妨害剤又はシステムを対象に投与することを含む、方法を対象とする。
別の態様では、本開示は、低減された第１遺伝子及び第２遺伝子の発現を有するヒト細胞を対象とし、ここで、第１遺伝子及び第２遺伝子は、炎症誘発性遺伝子であり、細胞は、第１及び第２遺伝子を含む、妨害された（例えば、完全に妨害された）アンカー配列媒介接合部を含む。一部の実施形態では、ヒト細胞は、本明細書に記載の部位特異的妨害剤又はシステムと以前に接触されている。一部の実施形態では、ヒト細胞は、本明細書に記載の部位特異的妨害剤又はシステムをもはや含まない。
別の態様では、本開示は、ゲノム座標ｃｈｒ４：７４５９５４６４－７４５９５４８６、ｃｈｒ４：７４５９５４５７－７４５９５４７９、ｃｈｒ４：７４５９５４６０－７４５９５４８２、ｃｈｒ４：７４５９５４７２－７４５９５４９４、ｃｈｒ４：７５００００８８－７５０００１１０、ｃｈｒ４：７５００００９１－７５０００１１３、ｃｈｒ４：７５００００８５－７５０００１０７、ｃｈｒ４：７５０００１５７－７５０００１７９、ｃｈｒ４：７５０００１５６－７５０００１７８、ｃｈｒ４：７４５９５２１５－７４５９５２３７、ｃｈｒ４：７４５９５３７０－７４５９５３９２、ｃｈｒ４：７４５９５５６０－７４５９５５８２、ｃｈｒ４：７４５９５６４２－７４５９５６６４、ｃｈｒ４：７４５９５７８７－７４５９５８０９、ｃｈｒ４：７４５２８４２８－７４５２８４５０、ｃｈｒ４：７４５２８５６７－７４５２８５８９、ｃｈｒ４：７４５２８６０９－７４５２８６３１、ｃｈｒ４：７４７８９１３２－７４７８９１５４、ｃｈｒ４：７４７８９２５０－７４７８９２７２、ｃｈｒ４：７４７８９３１２－７４７８９３３４、ｃｈｒ４：７４９６４８５３－７４９６４８７５、ｃｈｒ４：７４９６４９０６－７４９６４９２８、ｃｈｒ４：７４９６５５３８－７４９６５５６０、ｃｈｒ４：７４９６５７３７－７４９６５７５９、ｃｈｒ４：７５００００３１－７５００００５３、ｃｈｒ４：７５０００１１５－７５０００１３７、ｃｈｒ４：７５０００２３１－７５０００２５３、ｃｈｒ４：７４９７５１４６－７４９７５１６８、ｃｈｒ４：７４９７５３６９－７４９７５３９１、ｃｈｒ４：７４９７６３１８－７４９７６３４０、ｃｈｒ４：７４５７０３４８－７４５７０３７０、ｃｈｒ４：７４５７０５０３－７４５７０５２５、若しくはｃｈｒ４：７４５７０５２６－７４５７０５４８、又は前記領域の５、１０、１５、２０、３０、４０、又は５０ヌクレオチド以内に突然変異を含むヒト細胞に関する。
当業者であれば、本明細書に記載される本開示の具体的な実施形態の多くの同等物を認識するか、又は常用的な実験を用いるだけでそれらを確認することができるだろう。
本明細書に挙げる全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献（例えば、配列データベース参照番号）は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。例えば、本明細書、例えば、本明細書のいずれかの表で参照される全てのＧｅｎＢａｎｋ、Ｕｎｉｇｅｎｅ、及びＥｎｔｒｅｚ配列は、参照により本明細書に組み込まれる。別に明示しない限り、本明細書の全ての表を含め、本明細書に記載される配列アクセッション番号は、２０２０年９月２９日現在のデータベースエントリーを指す。１つの遺伝子又はタンパク質が、複数の配列アクセッション番号を示す場合には、全ての配列変異体が包含される。
定義
アンカー配列：本明細書で用いられるとき、用語「アンカー配列」は、核形成薬剤により認識される核酸配列であって、十分に結合して、アンカー配列媒介接合部、例えば複合体を形成する核酸配列を指す。一部の実施形態では、アンカー配列は、１つ又は複数のＣＴＣＦ結合モチーフを含む。一部の実施形態では、アンカー配列は、遺伝子コーディング領域内に位置しない。一部の実施形態では、アンカー配列は、遺伝子間領域内に位置する。一部の実施形態では、アンカー配列は、エンハンサー又はプロモータ内のいずれにも位置しない。一部の実施形態では、アンカー配列は、任意の転写開始部位から少なくとも４００ｂｐ、少なくとも４５０ｂｐ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも５５０ｂｐ、少なくとも６００ｂｐ、少なくとも６５０ｂｐ、少なくとも７００ｂｐ、少なくとも７５０ｂｐ、少なくとも８００ｂｐ、少なくとも８５０ｂｐ、少なくとも９００ｂｐ、少なくとも９５０ｂｐ、又は少なくとも１ｋｂ離れて位置する。一部の実施形態では、アンカー配列は、ゲノム刷り込み、単一対立遺伝子の発現、及び／又は単一対立遺伝子のエピジェネティックマークと関連しない領域内に位置する。一部の実施形態では、アンカー配列は、内因性核形成ポリペプチド（例えば、ＣＴＣＦ）に結合すること、第２アンカー配列と相互作用してアンカー配列媒介接合部を形成すること、又はアンカー配列媒介接合部の外側にあるエンハンサーから隔離することから選択される１つ又は複数の機能を有する。本開示の一部の実施形態では、他のアンカー配列（例えば、別の状況での核形成薬剤（例えば、ＣＴＣＦ）結合モチーフを含有し得る配列）をターゲティングすることなく、特定の１つ又は複数のアンカー配列を特異的にターゲティングすることができる技術が提供され；こうした標的化アンカー配列は、「標的アンカー配列」と呼ばれることもある。一部の実施形態では、標的アンカー配列の配列及び／又は活性は調節されるが、標的化アンカー配列と同じシステム内（例えば、同じ細胞内及び／又は一部の実施形態では、同じ核酸分子、例えば、同じ染色体上）に存在し得る１つ若しくは複数の他のアンカー配列の配列及び／又は活性は調節されない。一部の実施形態では、アンカー配列は、核形成ポリペプチド結合モチーフを含むか、又は核形成ポリペプチド結合モチーフである。一部の実施形態では、アンカー配列は、核形成ポリペプチド結合モチーフに隣接している。
アンカー配列媒介接合部：本明細書で用いられるとき、用語「アンカー配列媒介接合部」は、核形成ポリペプチドなどの１つ若しくは複数のポリペプチド、又は１つ若しくは複数のタンパク質及び／又は核酸実体（例えば、ＲＮＡ若しくはＤＮＡなど）によるＤＮＡ内の少なくとも２つのアンカー配列の物理的相互作用若しくは結合によって起こる、及び／又はそれにより維持されるＤＮＡ構造、ある場合では複合体を指し、これは、アンカー配列と結合して、アンカー配列同士の空間的近接及び機能的連結を可能にする（例えば、図１を参照）。
と関連する：この用語が本明細書で用いられるとき、２つの事象又は実体は、その一方の存在、レベル、形態及び／又は機能が、他方のものと相関する場合に、互いに「関連する」。例えば、一部の実施形態では、特定の実体（例えば、ポリペプチド、遺伝子シグネチャー、代謝物、微生物など）は、その存在、レベル、形態及び／又は機能が、特定の疾患、障害、若しくは病状の発生率及び／又はそれに対する感受性と相関する場合に、その疾患、障害、又は病状と関連すると考えられる。一部の実施形態では、２つ以上の実体は、それらが直接又は間接的に相互作用して、互いに物理的に近接し、且つ／又は物理的に近接したままであれば、互いに物理的に「関連する」。一部の実施形態では、互いに物理的に関連する２つ以上の実体は、互いに共有結合しており；一部の実施形態では、互いに物理的に関連する２つ以上の実体は、互いに共有結合していないが、例えば、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、磁気、及びそれらの組合せにより、非共有結合している。一部の実施形態では、ＤＮＡ配列は、核酸が少なくとも部分的に標的ゲノム複合体又は転写複合体内にあり、ＤＮＡ配列中の遺伝子の発現が標的ゲノム複合体又は転写複合体の形成又は妨害によって影響を受ける場合に、標的ゲノム複合体又は転写複合体と「会合」している。
部位特異的妨害剤：本明細書で用いられるとき、用語「部位特異的妨害剤」は、ゲノム複合体、例えば、ＡＳＭＣの１つ又は複数の成分を特異的に阻害、解離、分解、及び／又は修飾し、それにより、本明細書に記載の標的複数遺伝子の発現を調節、例えば、低減する薬剤又は実体を指す。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、ゲノム複合体の１つ又は複数の成分と相互作用する。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、１つ又は複数のゲノム複合体成分に結合（例えば、直接的に、又は一部の実施形態では間接的に）する。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、標的複数遺伝子を含むＡＳＭＣの一部であってもよいアンカー配列、例えば、第１及び／又は第２アンカー配列に結合する。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、標的複数遺伝子を含むＡＳＭＣの一部であってもよいアンカー配列、例えば、第１及び／又は第２アンカー配列に近接した部位に結合する。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、１つ又は複数のゲノム複合体成分を修飾する。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、オリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、抗体（例えば、単一特異性又は多重特異性抗体構築物）又は抗体断片を含む。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、本明細書に記載されるように、ターゲティング部分により特定のゲノム位置及び／又はゲノム複合体に向けられる。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、ゲノム複合体成分又はその変異体を含む。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、ターゲティング部分を含む。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、エフェクター部分を含む。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、複数のエフェクター部分を含む。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、ターゲティング部分と１つ又は複数のエフェクター部分とを含む。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、ゲノムの第２部位よりも高い親和性でゲノムの第１部位に特異的に結合する（例えば、ゲノムの他の任意の部位と比較して）。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、第２ゲノム複合体と比較して（例えば、任意の他のゲノム複合体と比較して）、第１ゲノム複合体の１つ又は複数の成分を優先的に阻害、解離、分解、及び／又は修飾する。
ドメイン：本明細書で用いられるとき、用語「ドメイン」は、或る実体のセクション又は部分を指す。一部の実施形態では、「ドメイン」は、当該実体の特定の構造及び／又は機能的特徴と関連しており、ドメインがその親実体の残りから物理的に分離されたとき、それは、上記の特定の構造及び／又は機能的特徴を実質的に若しくは完全に保持する。これに代わり、又は加えて、一部の実施形態では、ドメインは、（親）実体から分離されて、別の（レシピエント）実体と連結されると、レシピエント実体に、親実体においてそれを特徴付けた１つ若しくは複数の構造及び／又は機能的特徴を実質的に保持し、且つ／又は付与する実体の１部分であるか、又はそれを含み得る。一部の実施形態では、ドメインは、或る分子（例えば、小分子、炭水化物、脂質、核酸、ポリペプチドなど）のセクション若しくは１部分であるか、又はそれを含む。一部の実施形態では、ドメインは、ポリペプチドのセクションであるか、又はそれを含む。いくつかのそうした実施形態では、ドメインは、特定の構造エレメント（例えば、特定のアミノ酸配列若しくは配列モチーフ、α－ヘリックス特徴、β－シート特徴、コイルドコイル特徴、ランダムコイル特徴など）、及び／又は特定の機能的特徴（例えば、結合活性、酵素活性、フォールディング活性、シグナル伝達活性など）を特徴とする。
エフェクター部分：本明細書で用いられるとき、用語「エフェクター部分」は、細胞の核に適切に局在化された場合に、細胞内の標的複数遺伝子の発現を調節する、例えば、低減する、１つ又は複数の機能性を有するドメインを指す。一部の実施形態では、エフェクター部分は、ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、エフェクター部分は、ポリペプチド及び核酸を含む。エフェクター部分に関連する機能性は、標的複数遺伝子の発現に直接影響を与え得る、例えば、遺伝子の発現を刺激し得る転写因子の動員を遮断し得る。エフェクター部分に関連する機能性は、標的複数遺伝子の発現に間接的に影響を与え得る、例えば、エピジェネティック修飾を導入するか、又は標的複数遺伝子の発現を阻害する染色体トポロジーの変化を誘発するエピジェネティック修飾を導入する他の因子を動員し得る。
ゲノム複合体：本明細書で用いられるとき、用語「ゲノム複合体」は、複数のタンパク質及び／又は他の成分（恐らく、ゲノム配列エレメントを含む）同士の相互作用によって、１つ若しくは複数の染色体上で互いに間隔をあけた２つのゲノム配列エレメントを一緒にする複合体である。一部の実施形態では、ゲノム配列エレメントは、複合体の１つ又は複数のタンパク質成分が結合するアンカー配列である。一部の実施形態では、ゲノム複合体は、アンカー配列媒介接合部を含んでもよい。一部の実施形態では、ゲノム配列エレメントは、ＣＴＣＦ結合モチーフ、プロモータ及び／又はエンハンサーであってもよいし、又はそれを含んでもよい。一部の実施形態では、ゲノム配列エレメントは、プロモータ及び／又は調節部位（例えば、エンハンサー）の少なくとも１つ又はその両方を含む。一部の実施形態では、複合体形成は、ゲノム配列エレメントにおいて、且つ／又はゲノム配列エレメントと１つ若しくは複数のタンパク質成分の結合により核形成される。当業者には理解されるように、一部の実施形態では、複合体の形成によるゲノム部位の共局在化（例えば、共役）によって、ゲノム配列エレメントにおける、又はその付近で（例えば、一部の実施形態では、配列間）のＤＮＡトポロジーが変更される。一部の実施形態では、ゲノム複合体は、１つ又は複数のループを含むアンカー配列媒介接合部を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載のゲノム複合体は、例えば、ＣＴＣＦ及び／又はコヒーシンなどの核形成ポリペプチドにより核形成される。一部の実施形態では、本明細書に記載のゲノム複合体は、例えば、以下：ＣＴＣＦ、コヒーシン、ノンコーディングＲＮＡ（例えば、ｅＲＮＡ）、転写機構タンパク質（例えば、ＲＮＡポリメラーゼ、例えば、ＴＦＩＩＡ、ＴＦＩＩＢ、ＴＦＩＩＤ、ＴＦＩＩＥ、ＴＦＩＩＦ、ＴＦＩＩＨなどからなる群から選択される１つ若しくは複数の転写因子）、転写調節因子（例えば、メディエータ（Ｍｅｄｉａｔｏｒ）、Ｐ３００、エンハンサー結合タンパク質、リプレッサー結合タンパク質、ヒストン修飾因子など）のうち１つ又は複数を含み得る。一部の実施形態では、本明細書に記載のゲノム複合体は、１つ若しくは複数のポリペプチド成分及び／又は１つ若しくは複数の核酸成分（例えば、１つ若しくは複数のＲＮＡ成分）を含み、それらは、一部の実施形態では、互いに及び／又は１つ若しくは複数のゲノム配列エレメント（例えば、アンカー配列、プロモータ配列、調節配列（例えば、エンハンサー配列）と相互作用することにより、ゲノムＤＮＡの１区間を、複合体が形成されなければ採用されないトポロジー立体配置（例えば、ループ）中に閉じ込め得る。
核酸：本明細書で用いられるとき、その最も広い意味では、用語「核酸」は、オリゴヌクレオチド鎖中に組み込まれているか、又は組み込まれ得る任意の化合物及び／又は物質を指す。一部の実施形態では、核酸は、リン酸ジエステル結合を介してオリゴヌクレオチド鎖中に組み込まれているか、又は組み込まれ得る化合物及び／若しくは物質である。文脈から明らかになるように、一部の実施形態では、「核酸」は、個別の核酸残基（例えば、ヌクレオチド及び／又はヌクレオシド）を指し；一部の実施形態では、「核酸」は、個別の核酸残基を含むオリゴヌクレオチド鎖を指す。一部の実施形態では、「核酸」は、ＲＮＡであるか、又はそれを含み；一部の実施形態では、「核酸」は、ＤＮＡであるか、又はそれを含む。一部の実施形態では、核酸は、１つ若しくは複数の天然の核酸残基であるか、それを含むか、又はそれから構成される。一部の実施形態では、核酸は、１つ若しくは複数の核酸アナログであるか、それを含むか、又はそれから構成される。一部の実施形態では、核酸アナログは、それがリン酸ジエステル骨格を利用しない点で、核酸とは異なる。例えば、一部の実施形態では、核酸は、１つ若しくは複数の「ペプチド核酸」であるか、それを含むか、又はそれから構成され、ペプチド核酸は、当技術分野で公知であり、骨格にリン酸ジエステル結合ではなくペプチド結合を有するものであり、これらは本発明の範囲に含まれるとみなされる。これに代わり、又は加えて、一部の実施形態では、核酸は、リン酸ジエステル結合ではなく、１つ若しくは複数のホスホロチオエート及び／又は５’－Ｎ－ホスホロアミダイト結合を有する。一部の実施形態では、核酸は、１つ若しくは複数の天然ヌクレオシド（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、及びデオキシシチジン）であるか、それを含むか、又はそれから構成される。一部の実施形態では、核酸は、１つ若しくは複数のヌクレオシドアナログ（例えば、２－アミノアデノシン、２－チオチミジン、イノシン、ピロロ－ピリミジン、３－メチルアデノシン、５－メチルシチジン、Ｃ－５プロピニル－シチジン、Ｃ－５プロピニル－ウリジン、２－アミノアデノシン、Ｃ５－ブロモウリジン、Ｃ５－フルオロウリジン、Ｃ５－ヨードウリジン、Ｃ５－プロピニル－ウリジン、Ｃ５－プロピニル－シチジン、Ｃ５－メチルシチジン、２－アミノアデノシン、７－デアザアデノシン、７－デアザグアノシン、８－オキソアデノシン、８－オキソグアノシン、０（６）－メチルグアニン、２－チオシチジン、メチル化塩基、介在塩基、及びそれらの組合せ）であるか、それを含むか、又はそれから構成される。一部の実施形態では、核酸は、天然の核酸に存在するものと比較して、１つ若しくは複数の修飾糖（例えば、２’－フルオロリボース、リボース、２’－デオキシリボース、アラビノース、及びヘキソース）を含む。一部の実施形態では、核酸は、ＲＮＡ又はタンパク質などの機能性遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を有する。一部の実施形態では、核酸は、１つ又は複数のイントロンを含む。一部の実施形態では、核酸は、天然の供給源からの単離、相補性鋳型に基づく重合による酵素合成（インビボ若しくはインビトロ）、組換え細胞若しくは系中での生殖、及び化学合成のうちの１つ又は複数により調製される。一部の実施形態では、核酸は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２０、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００残基長又はそれ以上である。一部の実施形態では、核酸は、一部が、又は完全に一本鎖であり；一部の実施形態では、核酸は、一部が、又は完全に二本鎖である。一部の実施形態では、核酸は、ポリペプチドをコードするか、又はポリペプチドをコードする配列の補体である少なくとも１つのエレメントを含むヌクレオチド配列を有する。一部の実施形態では、核酸は、酵素活性を有する。
作動可能に連結した：本明細書で用いられるとき、語句「作動可能に連結した」は、記載される成分が、その意図される様式でそれらを機能させることが可能な関係にある並置を指す。機能性エレメント、例えば、遺伝子と「作動可能に連結した」転写制御エレメントは、機能性エレメント、例えば、遺伝子の発現及び／又は活性が、転写制御エレメントと適合する条件下で達成されるように、結合されている。一部の実施形態では、「作動可能に連結した」転写制御エレメントは、目的のコーディングエレメント、例えば、遺伝子と連続的であり（例えば、共有している）；一部の実施形態では、作動可能に連結した転写制御エレメントは、目的の機能性エレメント、例えば、遺伝子に対してトランスで、或いはそうでなければそれから一定の距離の地点で作用する。一部の実施形態では、作動可能に連結したとは、２つの核酸配列が、同じ核酸分子上に含まれることを意味する。別の実施形態では、作動可能に連結したとは、さらに、２つの核酸配列が、同じ核酸分子上で互いに近接しており、例えば、互いに１０００、５００、１００、５０、若しくは１０塩基対内にあるか、又は互いに隣接していることを意味する場合もある。
ペプチド、ポリペプチド、タンパク質：本明細書で用いられるとき、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」は、ペプチド結合又はペプチド結合以外の手段によって共有結合されたアミノ酸残基から構成される化合物を指す。タンパク質又はペプチドには少なくとも２つのアミノ酸が含まれていなければならず、タンパク質又はペプチドの配列を構成できるアミノ酸の最大数に制限は設けられていない。ポリペプチドには、ペプチド結合又はペプチド結合以外の手段によって互いに連結された２つ以上のアミノ酸を含む任意のペプチド又はタンパク質が含まれる。本明細書で用いられるとき、この用語は、例えば、当技術分野で一般にペプチド、オリゴペプチド及びオリゴマーとも呼ばれる短鎖と、当技術分野で一般にタンパク質と呼ばれる長鎖の両方を指し、多くの種類がある。
近接：本明細書で用いられるとき、「近接（した）」とは、第１部位での部位特異的妨害剤の結合及び／又は部位特異的妨害剤による第１部位の修飾が、他方の部位の結合及び／又は修飾と同じ、若しくは実質的に同じ作用を生じるような、２つの部位、例えば、核酸部位の接近性を指す。例えば、ＤＮＡターゲティング部分は、アンカー配列（第２部位）と近接した第１部位に結合することができ、前記ＤＮＡターゲティング部分と結合したエフェクター部分は、あたかも第２部位（アンカー配列）が結合及び／又は修飾されたのと実質的に同様に、標的遺伝子の発現に対するアンカー配列の内因性核形成ポリペプチドへの結合が修飾されるように、第１部位をエピジェネティック的に修飾することができる。一部の実施形態では、互いに近接した部位は、互いから５０００、４０００、３０００、２０００、１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１００、５０、４０、３０、２０、１０、又は５塩基対未満である。
配列ターゲティングポリペプチド：本明細書で用いられるとき、用語「配列ターゲティングポリペプチド」は、本明細書で用いられるとき、標的核酸配列を認識するか、又はそれに特異的に結合する酵素、例えば、Ｃａｓ９又はＴＡＬＥＮなどの、タンパク質を指す。一部の実施形態では、配列ターゲティングポリペプチドは、エンドヌクレアーゼ活性を欠失した、ｄＣａｓ９、ＴＡＬエフェクター分子、又はＺｎフィンガー分子などの触媒として不活性のタンパク質である。
特異的結合：本明細書で用いられるとき、用語「特異的結合」は、結合が起こる環境において可能な結合パートナーを識別する能力を指す。一部の実施形態では、他の有望な標的が存在する場合に１つの特定の標的と相互作用する結合剤は、それが相互作用する標的に「特異的に結合する」と言われる。一部の実施形態では、特異的結合は、結合剤とそのパートナーとの間の会合の程度を検出又は決定することにより評価され；一部の実施形態では、特異的結合は、結合剤－パートナー複合体の解離の程度を検出又は決定することによって評価される。一部の実施形態では、特異的結合は、そのパートナーと別の実体との間の代替的相互作用と競合する結合剤の能力を検出又は決定することによって評価される。一部の実施形態では、特異的結合は、ある範囲の濃度にわたってそのような検出又は決定を実施することによって評価される。
対象：本明細書で用いられるとき、用語「対象」又は「試験対象」は、例えば、実験、診断、予防、及び／又は治療目的のために、提供された化合物又は組成物が本開示に従って投与される任意の生物を指す。典型的な対象には、動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、及びヒトなどの哺乳動物；昆虫；蠕虫など）及び植物が含まれる。一部の実施形態では、対象は、疾患、障害、及び／又は病状に罹患していてもよく、且つ／又は罹患しやすくてもよい。
実質的に：本明細書で用いられるとき、用語「実質的に」は、目的の特徴若しくは特性の全範囲若しくはほぼ全範囲又は程度を呈示する質的条件を指す。当業者には、生物学的及び化学的現象は、完了に到達する、且つ／又は完全性まで進行する、又は絶対的結果を達成若しくは回避することが、もしあるとしても、稀であるのは理解されよう。従って、用語「実質的に」は、本明細書のいくつかの実施形態において、多くの生物学的及び化学的現象に固有の完全性の欠如の可能性を捉えるために使用される場合もある。
症状が低減される：本明細書で用いられるとき、語句「症状が低減される」は、特定の疾患、障害又は病状の１つ又は複数の症状の大きさ（例えば、強度、重症度など）及び／又は頻度が低減される場合に使用され得る。一部の実施形態では、特定の症状の発症の遅延は、その症状の頻度を低減する一形態と考えられる。
標的：薬剤又は実体は、それらが互いに接触する条件下で、標的化薬剤又は実体と特異的に結合する場合、本開示に従って、別の薬剤又は実体を「ターゲティングする」とみなされる。一部の実施形態では、例えば、抗体（又はその抗原結合断片）は、そのコグネイトエピトープ若しくは抗原をターゲティングする。一部の実施形態では、特定の配列を有する核酸は、実質的に相補的な配列の核酸をターゲティングする。一部の実施形態では、アンカー配列に特異的に結合するターゲティング部分は、アンカー配列、アンカー配列を含むＡＳＭＣ、及び／又はＡＳＭＣ内の複数の遺伝子をターゲティングする。
標的複数遺伝子：本明細書で用いられるとき、用語「標的複数遺伝子」というは、調節、例えば、発現の調節につきターゲティングされる複数の遺伝子（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、又はそれ以上の遺伝子）の群を意味する。一部の実施形態では、標的複数遺伝子は、標的ゲノム複合体の一部である。一部の実施形態では、標的複数遺伝子の各遺伝子は、そのゲノム配列の少なくとも一部（例えば、一部又は全部）を、標的ゲノム複合体の一部として、例えば、ゲノム複合体が本明細書に記載の部位特異的妨害剤によりターゲティングされるＡＳＭＣ内に少なくとも部分的に有する。一部の実施形態では、調節は、標的複数遺伝子の発現の阻害を含む。一部の実施形態では、標的複数遺伝子、又は標的複数遺伝子のうちの１つ又は複数に作動可能に連結された転写制御エレメントを、本明細書に記載の部位特異的妨害剤と接触させることにより、標的複数遺伝子が調節される。一部の実施形態では、標的複数遺伝子のうちの１つ又は複数が、細胞、例えば、対象（例えば、患者）の細胞において異常に発現（例えば、過剰発現）される。一部の実施形態では、標的複数遺伝子は、関連する機能性を有する。例えば、標的複数遺伝子の遺伝子は全て、発現すると炎症誘発効果を有し得；そのような標的複数遺伝子の遺伝子は、本明細書において炎症誘発性遺伝子又は標的炎症誘発性遺伝子と呼ばれ得る。一部の実施形態では、標的複数遺伝子の遺伝子は、タンパク質をコードする。一部の実施形態では、標的複数遺伝子の遺伝子は、機能性ＲＮＡをコードする。
ターゲティング部分：本明細書で用いられるとき、用語「ターゲティング部分」は、成分又は成分のセット、例えば、本明細書に記載のゲノム複合体に参加する成分又は複数の成分（例えば、アンカー配列媒介接合部）と特異的に相互作用する（例えば、ターゲティングする）剤又は実体を意味する。一部の実施形態では、本開示に従うターゲティング部分は、本明細書に記載のゲノム複合体の１つ又は複数の標的成分をターゲティングする。一部の実施形態では、ターゲティング部分は、ゲノム配列エレメント（例えば、アンカー配列）を含むゲノム複合体成分をターゲティングする。一部の実施形態では、ターゲティング部分は、ゲノム配列エレメント以外のゲノム複合体成分をターゲティングする。一部の実施形態では、ターゲティング部分は、ゲノム複合体成分の複数又は組合せをターゲティングし、複数の一部の実施形態では、ゲノム配列エレメントを含み得る。いくつかの態様では、本開示の寄与には、本明細書に記載の、例えば、標的遺伝子（例えば、融合遺伝子、例えば、融合癌遺伝子）及び／又は切断点に近接した標的アンカー配列を含む、１つ又は複数のゲノム複合体の効果的な阻害、解離、分解、及び／又は修飾が、ゲノム配列エレメントを含む複合体成分を部位特異的妨害剤でターゲティングすることにより達成することができるという洞察が含まれる。いくつかの態様では、本明細書に記載の、１つ又は複数のゲノム複合体の効果的な阻害、解離、分解、及び／又は修飾は、ゲノム配列エレメントを含む複合体成分をターゲティングすることにより達成することができる。一部の実施形態では、本開示は、改善した（例えば、所与のシステム中で形成又は存在し得る他のゲノム複合体と比較した特定のゲノム複合体に対する特異性の程度、阻害、解離、分解、又は修飾の有効性に関して［例えば、集団内で検出される複合体の数に対する影響の観点から］）阻害、解離、分解、又は修飾は、ゲノム配列エレメントではない１つ又は複数の複合体成分をターゲティングすることによって達成することができ、任意選択的に、ゲノム配列エレメントをターゲティングすることを代替的又は追加的に含んでもよいことが考えられ、ここで、改善された阻害、解離、分解、又は修飾は、ゲノム配列エレメントのみをターゲティングすることによって典型的に達成されるものと比較される。一部の実施形態では、本明細書に記載の部位特異的妨害剤は、標的ゲノム複合体の阻害、解離、分解、又は修飾を促進する。例えば、非限定的な例として、一部の実施形態では、本明細書に記載の部位特異的妨害剤は、（例えば、アンカー配列媒介接合部を含む）所定のゲノム複合体の少なくとも１つの成分をターゲティングすることにより、アンカー配列媒介接合部を阻害、解離、分解（例えば、その成分を分解）、及び／又は修飾（例えば、その成分を修飾）する。一部の実施形態では、本明細書に記載の部位特異的妨害剤は、特定のゲノム複合体（すなわち、標的ゲノム複合体）を阻害、解離、分解（例えば、その成分を分解）、及び／又は改変（例えば、その成分を修飾）し、例えば、他の細胞（例えば、非標的細胞）に存在し得る、且つ／又は同じ細胞内（すなわち、標的細胞内）の異なる部位に存在し得る、少なくとも１つの他の特定のゲノム複合体（すなわち、非標的ゲノム複合体）を阻害、解離、分解（例えば、その成分を分解）及び／又は修飾（例えば、その成分を修飾）しない。本明細書に記載の部位特異的妨害剤は、ターゲティング部分を含み得る。一部の実施形態では、ターゲティング部分は、エフェクター部分（例えば、妨害部分）としても作用し；いくつかのそのような実施形態では、提供される部位特異的妨害剤は、ターゲティング部分とは別個の（又は有意に異なる）任意のエフェクター部分（例えば、妨害、修飾、又は他のエフェクター部分）を欠失し得る。
治療有効量：本明細書で用いられるとき、用語「治療有効量」は、治療レジメンの一環として投与されると、所望の生物学的応答を誘発する物質（例えば、治療薬、組成物、及び／又は製剤）の量を意味する。一部の実施形態では、或る物質の治療有効量は、疾患、障害、及び／又は病状に罹患しているか、若しくは罹患しやすい対象に投与されると、疾患、障害、及び／又は病状を治療、診断、予防する、且つ／又はその発症を遅延させるのに十分な量である。当業者には理解されるように、或る物質の有効量は、所望の生物学的エンドポイント、送達しようとする物質、標的細胞又は組織などの要因に応じて変動し得る。例えば、一部の実施形態では、疾患、障害、及び／又は病状を治療するための製剤中の化合物の有効量は、疾患、障害、及び／又は病状の１つ若しくは複数の症状又は特徴を改善、緩和、軽減、阻害、予防し、その発症を遅延させ、その重症度を低減させ、且つ／又はその発生率を低下させる量である。一部の実施形態では、治療有効量は、単一用量で投与され；一部の実施形態では、治療有効量を送達するために、複数回用量が必要とされる。
転写制御配列：本明細書で用いられるとき、用語「転写制御配列」は、遺伝子の転写を増大若しくは低減する核酸配列を指す。「増強配列」は、遺伝子転写の可能性を増大する。「サイレンシング又はリプレッサー配列」は、遺伝子転写の可能性を低減する。転写制御配列の例には、プロモータ及びエンハンサーが含まれる。一部の実施形態では、ＡＳＭＣは、転写制御配列を含む。そのような転写制御配列は、内部転写制御配列と呼ばれる（例えば、ＡＳＭＣ内に含まれる増強配列は、内部増強配列と呼ばれる）。
本開示の実施形態の以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むと、よりよく理解されるであろう。本開示を説明する目的で、現在例示されている実施形態が図面に示される。しかし、本開示は、図面に示される実施形態の正確な配置及び手段に限定されないことを理解されたい。
アンカー配列におけるｇＲＮＡ配列の例示的な配置を示す略図を示す。図は、出現順にそれぞれ配列番号２４４～２４５を開示する。 アンカー配列におけるｇＲＮＡ配列の例示的な配置及び制限部位情報を示す略図を示す。図は、出現順に配列番号２４６～２４７をそれぞれ開示する。 ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子及び第１例示的ｇＲＮＡを含む部位特異的妨害剤による処理を伴う及び伴わないＴＮＦ処理細胞における様々なケモカインの発現（ｍＲＮＡ）のグラフを示す。 ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子及び第２例示的ｇＲＮＡを含む部位特異的妨害剤による処理を伴う及び伴わないＴＮＦ処理細胞における様々なケモカインの発現（ｍＲＮＡ）のグラフを示す。 異なるタイプのゲノム複合体、例えば、ＡＳＭＣ、例えば、ループ、及びその中に含まれる遺伝子の発現を変更する方法のモデルを描写する略図である。 ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子を含む部位特異的妨害剤と、サイトカインをコードする遺伝子を含むゲノム複合体（例えば、ＡＳＭＣ）のアンカー配列をターゲティングするｓｇＲＮＡとで処理されたＴＨＰ－１細胞において、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、及びＩＬ－８のＲＮＡレベルにより測定されるサイトカイン発現のグラフを示す。 ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子を含む部位特異的妨害剤と、サイトカインをコードする遺伝子を含むゲノム複合体（例えば、ＡＳＭＣ）のアンカー配列をターゲティングする異なるｓｇＲＮＡとで処理されたＴＨＰ－１細胞のサイトカイン分泌（ＣＸＣＬ１及びＩＬ－８）のグラフを示す。 ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子を含む部位特異的妨害剤と、サイトカインをコードする遺伝子を含むゲノム複合体（例えば、ＡＳＭＣ）のアンカー配列をターゲティングするｓｇＲＮＡとで処理されたＴＨＰ－１細胞におけるＲＮＡレベルにより測定されるサイトカイン発現（ＣＸＣＬ３）のグラフ（上）、及び実験で細胞がどのようにプロセシングされたかを示すフローチャート（下）を示す。 ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子を含む部位特異的妨害剤と、サイトカインをコードする遺伝子を含むゲノム複合体（例えば、ＡＳＭＣ）のアンカー配列をターゲティングするｓｇＲＮＡとで処理された後３週間のＴＨＰ－１細胞におけるＲＮＡレベルにより測定されるサイトカイン発現（ＣＸＣＬ１）のグラフ（上）、及び実験で細胞がどのようにプロセシングされたかを示すフローチャート（下）を示す。 ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子を含む部位特異的妨害剤と、サイトカインをコードする遺伝子を含むゲノム複合体（例えば、ＡＳＭＣ）のアンカー配列をターゲティングするｓｇＲＮＡとで処理された後３週間のＴＨＰ－１細胞におけるＲＮＡレベルにより測定されるサイトカイン発現（ＣＸＣＬ３）のグラフを示す。 触媒として不活性のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子及び転写リプレッサー（ＫＲＡＢ）を含む部位特異的妨害剤と、サイトカインをコードする遺伝子を含むゲノム複合体（例えば、ＡＳＭＣ）のアンカー配列をターゲティングするｓｇＲＮＡとで処理された後のＴＨＰ－１細胞におけるＲＮＡレベルにより測定されるサイトカイン発現（ＣＸＣＬ１）のグラフを示す。 触媒として不活性のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子及びヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＥＺＨ２）を含む部位特異的妨害剤と、サイトカインをコードする遺伝子を含むゲノム複合体（例えば、ＡＳＭＣ）のアンカー配列をターゲティングするｓｇＲＮＡとで処理された後のＴＨＰ－１細胞におけるＲＮＡレベルにより測定されるサイトカイン発現（ＣＸＣＬ１）のグラフを示す。 触媒として不活性のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子及びＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＭＱ１）を含む部位特異的妨害剤と、サイトカインをコードする遺伝子を含むゲノム複合体（例えば、ＡＳＭＣ）のアンカー配列をターゲティングするｓｇＲＮＡとで処理された後のＴＨＰ－１細胞におけるＲＮＡレベルにより測定されるサイトカイン発現（ＣＸＣＬ１）のグラフを示す。 ７２時間、３週間、又は４週間にわたり、異なる部位特異的妨害剤で処理した後のＴＨＰ－１細胞におけるＲＮＡレベルにより測定されたサイトカイン発現（ＣＸＣＬ１）のグラフ（上）、及び実験で細胞がどのようにプロセシングされたかを示すフローチャート（下）を示す。 異なる部位特異的妨害剤と、サイトカインをコードする遺伝子を含むゲノム複合体（例えば、ＡＳＭＣ）のアンカー配列をターゲティングするｓｇＲＮＡとで処理された後のＴＨＰ－１細胞におけるＲＮＡレベルにより測定されるサイトカイン発現（ＣＸＣＬ３）のグラフ（上）、及び実験で細胞がどのようにプロセシングされたかを示すフローチャート（下）を示す。 異なる部位特異的妨害剤と、サイトカインをコードする遺伝子を含むゲノム複合体（例えば、ＡＳＭＣ）のアンカー配列をターゲティングするｓｇＲＮＡとで処理された後のＴＨＰ－１細胞におけるＲＮＡレベルにより測定されるサイトカイン発現（ＣＸＣＬ１）のグラフ（上）を示す。 ヒトＣＸＣＬ ＩＧＤ及び遺伝子クラスター構成を示す。図１６Ａは、ＣＸＬＣ１～８遺伝子クラスター内の２つのループを説明する、模式的な隔離されたゲノムドメイン（ＩＧＤ）を示す。ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ６、及びＣＸＣＬ１遺伝子は、ＩＧＤの左ループに存在する。ＣＸＣＬ２～５及びＣＸＣＬ７遺伝子は、ＩＧＤの右ループに存在する。異なる細胞株からのＩＧＤデータの調査により、中間ＣＴＣＦは、ＣＸＣＬを分泌する細胞にのみ存在する（例えば、リンパ球には存在しない）ことが示唆された。図１６Ｂは、ガイドが４つの異なるＣＴＣＦ標的：左ＣＴＣＦ－２、左ＣＴＣＦ、中央ＣＴＣＦ、及び右ＣＴＣＦに対して設計されたことを示す。 同上。 ｄＣａｓ９－ＥＺＨ２ガイド３０１８３が、ＴＮＦ－アルファ処理ヒトＡ５４９肺癌上皮細胞のＣＸＣＬ１～８クラスター内に位置する中間ＣＴＣＦモチーフをターゲティングした場合、ＣＸＣＬ１～８遺伝子が下方制御されたことを示す。ＴＮＦアルファで刺激された細胞は、対照として処理された。 ｄＣａｓ９－ＥＺＨ２ガイド３０１８３が、ＴＮＦ－アルファ処理ヒトＩＭＲ－９０正常肺線維芽細胞のＣＸＣＬ１～８クラスター内に位置する中間ＣＴＣＦモチーフをターゲティングした場合、ＣＸＣＬ１，２，３，８遺伝子が下方制御されたことを示す。ＴＮＦアルファで刺激された細胞は、対照として処理された。 コントローラＡが、ＴＮＦ－アルファ処理ヒト単球のＣＸＣＬ１～８クラスター内に位置する左ＣＴＣＦモチーフをターゲティングした場合、ＣＸＣＬ１、２、３、８遺伝子が下方制御されたことを示す。ＴＮＦアルファで刺激された細胞は、対照として処理された。 マウスＣＸＣＬ ＩＧＤ及び遺伝子クラスター構成を示す。図２０Ａは、ＣＸＣＬ遺伝子クラスター内の２つのループを説明する、模式的な隔離されたゲノムドメイン（ＩＧＤ）を示す。図２０Ｂは、ＣＸＬＣ１～５、７及び１５遺伝子クラスター内の２つのループを説明する。ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、及びＣＸＣＬ７遺伝子は、ＩＧＤの左ループに存在する。ＩＧＤガイドの右ループに存在するＣＸＣＬ１－３及びＣＸＣＬ１５遺伝子は、４つの異なるＣＴＣＦ標的：左（Ｌ）、中央１（Ｍ１）、中央２（Ｍ２）、及び右（Ｒ）ＣＴＣＦに対して設計された。 同上。 ＩＧＤガイドが４つの異なるＣＴＣＦ標的：中央１（Ｍ１）、中央２（Ｍ２）、右（Ｒ）ＣＴＣＦに対して設計されたことを示す。 ｄＣａｓ９－ＭＱ１を用いたＨｅｐ１．６におけるマウスＣＸＣＬ ＩＧＤのインビトロ下方制御を示す。ｄＣａｓ９－ＭＱ１は、ＣＸＣＬ遺伝子クラスターの右、又は２つの中央ＣＴＣＦモチーフのうちの１つをターゲティングするガイドを用いてトランスフェクトされ、これは、ＴＮＦアルファ刺激後７つのＣＸＣＬ遺伝子のいずれでも下方制御を示さなかった（橙色）。中央ＣＴＣＦ及び右ＣＴＣＦの両方をターゲティングする組合せガイドを用いてｄＣａｓ９－ＭＱ１をトランスフェクトすると、遺伝子クラスター全体が下方制御された（青色）。 （図２２Ａ）炎症を起こした肺における白血球濾過の低減に対するｄＣａｓ９－ＭＱ１の効果を決定するための模式的な実験設計を示す。各マウスは、ＬＮＰのみ、又は３ｍｇ／ｋｇのｄＣａｓ９－ＭＱ１で、－２時間の時点で２つの中央及び右のＣＴＣＦをターゲティングして処置された。マウスは、０時間で、５ｍｇ／ｋｇのＬＰＳでシミュレートされ、その後＋８時間の時点で、２つの中央及び右のＣＴＣＦをターゲティングする３ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ単独又はｄＣａｓ９－ＭＱ１の２回目の投与が続いた。デキサメタゾンは、０、２４、及び４８時間の時点で１０ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内投与した。動物を７２時間で処分し、フロー染色のために肺から気管支洗浄液を採取した。 （図２２Ｂ）ｄＣａｓ９－ＭＱ１の全身投与が、炎症を起こした肺における白血球浸潤を低減したことを示す。ｄＣａｓ９－ＭＱ１処置マウスから得られた気管支洗浄液中の総白血球数／ｍＬは、ＬＰＳ＋疾患動物と比較して、有意差を示した。 （図２３Ａ）炎症を起こしたマウスの肺から得られた気管支洗浄液中に見られる浸潤細胞の組成を示す。浸潤細胞の大部分を構成する白血球細胞型は好中球であり、続いてＢ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、及び他の型の造血細胞が続く。 （図２３Ｂ）ｄＣａｓ９－ＭＱ１が、＋ＬＰＳ疾患群と比較して、肺に浸潤する好中球の数を、有意差をもって低減することを示す。 ＢＡＬＦ中の白血球細胞の低減が肺特異的であり、末梢血中の白血球の低減によるものではないことを示す。このグラフは、ｄＣａｓ９－ＭＱ１処置によるＢＡＬＦ中の白血球数の低減の効果が肺特異的であり、マウス自体に白血球集団の低減があったためではないことを説明する。末梢血中の造血細胞集団は、全ての群で同様であった。 ＣＸＣＬ１～５、ＣＸＣＬ７、及びＣＸＣＬ１５遺伝子発現が肺組織で低減したことを示す。動物をＬＮＰ単独で又はｄＣａｓ９－ＭＱ１とともに処置した後、肺組織をプロセシングして、ｑＰＣＲ法によりＣＸＣＬ遺伝子発現をチェックした。ｄＣＡ９－ＭＱ１で処理した場合、全てのＣＸＣＬ遺伝子が下方制御を示す。ＣＸＣＬ２発現は最も下方制御された。 同上。 同上。 ＣＸＣＬ発現の低減及び炎症部位への細胞動員が、他のサイトカインの存在を低減する有益な下流効果を有していたことを示す。ＢＡＬＦで分泌されるケモカインタンパク質レベルは、ＣＸＣＬ１及び２タンパク質レベルの減少を示した。ＣＸＣＬ発現の低減及び炎症部位への細胞動員は、ＧＭ－ＣＳＦ（図２６Ｃ）及びＩＬ６（図２６Ｄ）の存在を低減する有益な下流効果を有していた。
本開示は、部位特異的妨害剤又は２つ以上の部位特異的妨害剤を含むシステムの使用によって、細胞、例えば、対象又は患者の細胞における、標的複数遺伝子の発現を調節する、例えば、低減するための技術を提供する。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、ターゲティング部分を含む。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、ターゲティング部分とエフェクター部分とを含む。理論に束縛されることは望まないが、多数の疾患及び病状は、共通のゲノム複合体、例えば、ＡＳＭＣに関連する、関連する機能性を有する遺伝子群に関連している。標的複数遺伝子を（全体的又は部分的に）含むゲノム複合体、例えば、ＡＳＭＣの調節、例えば、妨害は、（例えば、変更の改善された効率、有効性、及び／又は安定性に関して）個々の標的遺伝子の調節に対し、標的複数遺伝子の発現を変更する（例えば、低減する）ための改善されたアプローチとなり得る。前記改善は、標的複数遺伝子に関連する疾患及び病状の治療の対応する改善につながり得る。例えば、複数の遺伝子が炎症誘発効果に関連している可能性があり、部位特異的妨害剤は、複数の遺伝子を（全体的又は部分的に）含むゲノム複合体、例えば、ＡＳＭＣをターゲティングして、複数の遺伝子の発現を調節、例えば、低減し、それにより、抗炎症効果（例えば、複数の遺伝子を個別にターゲティングすることと比較して優れた抗炎症効果）を達成することができる。部位特異的妨害剤、ターゲティング部分、エフェクター部分、及び標的複数遺伝子の例を本明細書に提供する。
部位特異的妨害剤は、１つ又は複数のモダリティにより標的複数遺伝子の発現を調節、例えば低減することができる。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、標的部位、例えばアンカー配列に結合し、他のゲノム複合体成分、例えば、核形成ポリペプチドとの結合について、物理的又は立体的に競合する。理論に束縛されることは望まないが、例えば、アンカー配列へのゲノム複合体成分（例えば、核形成ポリペプチド）の結合が阻害される（例えば、防止される）ような、アンカー配列の物理的又は立体的な遮断は、部位特異的妨害剤が標的複数遺伝子の発現を調節、例えば低減することができる、一機構である。部位特異的妨害剤は、例えば、ゲノム複合体成分がアンカー配列に結合する親和性及び／又はアビディティーを変更する（例えば、低減する）ことにより、ゲノム複合体成分（例えば、核形成ポリペプチド）とアンカー配列との相互作用を不安定化し得る。アンカー配列へのゲノム複合体成分（例えば、核形成ポリペプチド）の結合の遮断又は不安定化は、アンカー配列又はそれに近接した配列のエピジェネティック修飾、アンカー配列又はそれに近接した配列の遺伝子修飾、又は部位特異的妨害剤のアンカー配列又はそれに近接した配列への結合を含む、１つ又は複数の手段によって達成され得る。ゲノム複合体成分（例えば、核形成ポリペプチド）のアンカー配列への結合を阻害（例えば、防止）することにより、ゲノム複合体、例えば、ＡＳＭＣを阻害（例えば、妨害又は形成を防止）し得る。標的複数遺伝子を全体的又は部分的に含むゲノム複合体、例えばＡＳＭＣの阻害は、標的複数遺伝子の遺伝子の発現を調節、例えば、低減し得る。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、ターゲティング部分と、第１エフェクター部分と、第２エフェクター部分とを含む。一部の実施形態では、第１エフェクター部分は、第２エフェクター部分の配列と異なる配列を有する。一部の実施形態では、第１エフェクター部分は、第２エフェクター部分の配列と同一の配列を有する。
本開示はさらに、部分的には、ターゲティング部分と、任意選択的にエフェクター部分とをそれぞれ含む、２つ以上の部位特異的妨害剤を含むシステムを提供する。一部の実施形態では、ターゲティング部分は、２つ以上の異なる配列をターゲティングする（例えば、各部位特異的妨害剤は、異なる配列をターゲティングし得る）。一部の実施形態では、第１部位特異的妨害剤は、標的複数遺伝子、例えば、ヒトＣＸＣＬ１～８に作動可能に連結された、転写調節エレメント（例えば、プロモータ又は転写開始部位（ＴＳＳ））に結合し、第２部位特異的妨害剤は、標的複数遺伝子、例えば、ヒトＣＸＣＬ１～８を含む、アンカー配列媒介接合部（ＡＳＭＣ）のアンカー配列に結合する。一部の実施形態では、システムによる標的複数遺伝子、例えばヒトＣＸＣＬ１～８の発現の調節は、第１部位特異的妨害剤及び第２部位特異的妨害剤の、それぞれ第１及び第２ＤＮＡ配列への結合を含む。第１及び第２ＤＮＡ配列の結合により、第１及び第２エフェクター部分の機能性がそれらの部位に局在化される。理論に束縛されることは望まないが、一部の実施形態では、第１及び第２部位特異的妨害剤エフェクター部分の両方の機能性を利用することにより、第１及び／又は第２ＤＮＡ配列に関連するか、又はそれらを含む、標的複数遺伝子の発現が安定的に抑制され、例えば、ここで、第１及び／又は第２ＤＮＡ配列は、標的複数遺伝子又は１つ又は複数の作動可能に連結された転写制御エレメントの配列であるか、又はそれを含む。
部位特異的妨害剤
一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、ターゲティング部分を含む。一部の実施形態では、ターゲティング部分は、ＤＮＡ配列、例えば、アンカー配列に特異的に結合し、それにより、前記ＤＮＡ配列を含むゲノム複合体（例えば、ＡＳＭＣ）を調節、例えば妨害する。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、ターゲティング部分とエフェクター部分とを含む。一部の実施形態では、ターゲティング部分は、ＤＮＡ配列に特異的に結合し、それにより、エフェクター部分の機能性をＤＮＡ配列に局在化し、それにより、前記ＤＮＡ配列を含むゲノム複合体（例えば、ＡＳＭＣ）を調節、例えば妨害する。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、１つのターゲティング部分と１つのエフェクター部分とを含む。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、１つのターゲティング部分と、複数のエフェクター部分、例えば、２つ、３つ、４つ、又は５つのエフェクター部分とを含み、それらはそれぞれ、複数のエフェクター部分の別のものと同じであってもよく、又は異なっていてもよい。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、第１エフェクター部分が第２エフェクター部分とは異なる機能性を含む、２つのエフェクター部分を含み得る。例えば、部位特異的妨害剤は、２つのエフェクター部分を含んでもよく、ここで、第１エフェクター部分は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ機能性を含み（例えば、Ｇ９Ａ若しくはＥＺＨ２又はその機能性断片若しくは変異体を含む）、第２エフェクター部分は、転写リプレッサー機能性を含む（例えば、ＫＲＡＢ又はその機能性断片若しくは変異体を含む）。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、その機能性が、標的複数遺伝子の発現低減に関して、互いに相補的であるエフェクター部分を含み、その場合、機能性は一緒になって発現を阻害し、且つ、任意選択的に、個別に存在するとき、発現を阻害しないか、又は無視できる程度にしか阻害しない。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、複数のエフェクター部分を含み、ここで、各エフェクター部分は、他方のエフェクター部分の各々と補い合い、各エフェクター部分は、標的複数遺伝子の発現を低減する。
一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、標的複数遺伝子の発現の低減に関して、その機能性が互いに相乗効果を与えるエフェクター部分の組合せを含む。理論に束縛されることは望まないが、一部の実施形態では、複数の転写活性化エピジェネティックマーカ（例えば、複数の異なるタイプのエピジェネティックマーカ及び／又は所与のタイプの大量生産）は各々が一緒になって、個別の修飾単独よりも効率的に発現を阻害する（例えば、より大きな発現低減及び／又はより長い発現低減）ことから、ゲノム遺伝子座に対するエピジェネティック修飾は、累積的である。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、複数のエフェクター部分を含み、ここで、各エフェクター部分は、他方のエフェクター部分の各々と相乗作用をもたらし、例えば、各エフェクター部分は、標的複数遺伝子の発現を低減する。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤（互いに相乗作用をもたらす複数のエフェクター部分を含む）は、標的複数遺伝子の発現の阻害に関して、個別のエフェクター部分を含む部位特異的妨害剤よりも有効である。一部の実施形態では、前記複数のエフェクター部分を含む部位特異的妨害剤は、標的複数遺伝子の発現の低減について、個別のエフェクター部分を含む部位特異的妨害剤より少なくとも１．０５×（すなわち、１．０５倍）、１．１×、１．１５×、１．２×、１．２５×、１．３×、１．３５×、１．４×、１．４５×、１．５×、１．５５×、１．６×、１．６５×、１．７×、１．７５×、１．８×、１．８５×、１．９×、１．９５×、２×、３×、４×、５×、６×、７×、８×、９×、１０×、２０×、３０×、４０×、５０×、６０×、７０×、８０×、９０×、又は１００×有効である。
一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、１つ又は複数のターゲティング部分、例えば、Ｃａｓドメイン、ＴＡＬエフェクタードメイン、又はＺｎフィンガードメインを含む。一実施形態では、システムが同じタイプの２つ以上のターゲティング部分、例えば、２つ以上のＣａｓドメインを含む場合、ターゲティング部分は、２つ以上の異なる配列に特異的に結合する。例えば、２つ以上のＣａｓドメインを含む部位特異的妨害剤システムにおいて、２つ以上のＣａｓドメインは、その標的配列に対応するｇＲＮＡのみに明らかに結合する（例えば、別のＣａｓドメインの標的に対応するｇＲＮＡには、明らかには結合しない）ように選択又は変更されてもよい。
一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、例えばペプチド結合により、共有結合した、ターゲティング部分とエフェクター部分とを含む。一部の実施形態では、ターゲティング部分及びエフェクター部分は、同じポリペプチド鎖上に位置し、例えば、１つ又は複数のペプチド結合及び／又はリンカーによって接続される。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、例えば、ペプチド結合及び／又はリンカーによって連結されたターゲティング部分及びエフェクター部分を含む、融合分子を含む。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、同じポリペプチド鎖上のエフェクター部分のＮ末端に配置されたターゲティング部分を含む。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、同じポリペプチド鎖上のエフェクター部分のＣ末端に配置されたターゲティング部分を含む。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、非ペプチド結合により共有結合した、ターゲティング部分とエフェクター部分とを含む。一部の実施形態では、ターゲティング部分は、非ペプチド結合によってエフェクター部分にコンジュゲートされる。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、ターゲティング部分と複数のエフェクター部分とを含み、ここで、ターゲティング部分及び複数のエフェクター部分は、例えばペプチド結合によって、共有結合している（例えば、ターゲティング部分及び複数のエフェクター部分は全て一連の共有結合により接続されているが、個々の部分は他の全ての部分と共有結合を共有していない可能性がある）。
他の実施形態では、部位特異的妨害剤は、共有結合していない、例えば、互いに非共有結合しているターゲティング部分及びエフェクター部分を含む。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、エフェクター部分に非共有結合するターゲティング部分、又はターゲティング部分に非共有結合するエフェクター部分を含む。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、ターゲティング部分と複数のエフェクター部分とを含み、ここで、ターゲティング部分及び少なくとも１つのエフェクター部分は、共有結合しておらず、例えば、互いに非共有結合していており、ターゲティング部分及び少なくとも１つの他の複数のエフェクター部分は、例えばペプチド結合によって、共有結合している。
一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、Ｇ９Ａを含む第１エフェクター部分と、ＫＲＡＢを含む第２エフェクター部分とを含む。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、Ｇ９Ａを含む第１エフェクター部分と、ＥＺＨ２を含む第２エフェクター部分とを含む。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、ＥＺＨ２を含む第１エフェクター部分と、ＫＲＡＢを含む第２エフェクター部分とを含む。
一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、ターゲティング部分とエフェクター部分とを含み、ここで、エフェクター部分、例えば、ＥＺＨ２若しくはＧ９Ａ又はその機能性変異体若しくは断片から選択されるエフェクター部分のＣ末端と、ターゲティング部分のＮ末端とは、共有結合している。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、ターゲティング部分とエフェクター部分とを含み、ここで、エフェクター部分、例えば、ＨＤＡＣ８、ＭＱ１、ＤＮＭＴ３ａ／３Ｌ、ＫＲＡＢ、又はその機能性変異体若しくは断片から選択されるエフェクター部分のＣ末端と、ターゲティング部分のＣ末端とは、共有結合している。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、ターゲティング部分と、第１エフェクター部分と、第２エフェクター部分とを含み、ここで、第１エフェクター部分、例えば、ＥＺＨ２、Ｇ９Ａ、又はその機能性変異体若しくは断片から選択されるエフェクター部分のＣ末端と、ターゲティング部分のＮ末端とは、共有結合しており、ターゲティング部分のＣ末端と、第２エフェクター部分、例えば、ＨＤＡＣ８、ＭＱ１、ＤＮＭＴ３ａ／３Ｌ、ＫＲＡＢ、又はその機能性変異体若しくは断片から選択されるエフェクター部分のＮ末端とは、共有結合している。共有結合は、例えば、リンカー配列を介したものであってもよい。
一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、ターゲティング部分と、第１エフェクター部分と、第２エフェクター部分とを含み、ここで、第１エフェクター部分は、ＥＺＨ２、又はその機能性変異体若しくは断片であり、例えば、第１エフェクター部分は、配列番号１７のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、若しくはそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の相違を有する配列を含み、第１エフェクター部分は、ターゲティング部分のＮ末端にあり；第２エフェクター部分は、ＫＲＡＢ、又はその機能性変異体若しくは断片であり、例えば、第２エフェクター部分は、配列番号１３のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、若しくはそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の相違を有する配列を含み、第２エフェクター部分は、ターゲティング部分のＣ末端にある。
一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、ターゲティング部分と、第１エフェクター部分と、第２エフェクター部分とを含み、ここで、第１エフェクター部分は、ＥＺＨ２、又はその機能性変異体若しくは断片であり、例えば、第１エフェクター部分は、配列番号１７のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、若しくはそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の相違を有する配列を含み、第１エフェクター部分は、ターゲティング部分のＮ末端にあり；第２エフェクター部分は、ＨＤＡＣ８、又はその機能性変異体若しくは断片であり、例えば、第２エフェクター部分は、配列番号１９のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、若しくはそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の相違を有する配列を含み、第２エフェクター部分は、ターゲティング部分のＣ末端にある。
一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、ターゲティング部分と、第１エフェクター部分と、第２エフェクター部分とを含み、ここで、第１エフェクター部分は、Ｇ９Ａ、又はその機能性変異体若しくは断片であり、例えば、第１エフェクター部分は、配列番号６７のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、若しくはそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の相違を有する配列を含み、第１エフェクター部分は、ターゲティング部分のＮ末端にあり；第２エフェクター部分は、ＫＲＡＢ、又はその機能性変異体若しくは断片であり、例えば、第２エフェクター部分は、配列番号１３のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、若しくはそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の相違を有する配列を含み、第２エフェクター部分は、ターゲティング部分のＣ末端にある。
一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、ターゲティング部分と、第１エフェクター部分と、第２エフェクター部分とを含み、ここで、第１エフェクター部分は、Ｇ９Ａ、又はその機能性変異体若しくは断片であり、例えば、第１エフェクター部分は、配列番号６７のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、若しくはそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の相違を有する配列を含み、第１エフェクター部分は、ターゲティング部分のＮ末端にあり；第２エフェクター部分は、ＥＺＨ２、又はその機能性変異体若しくは断片であり、例えば、第２エフェクター部分は、配列番号１７のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、若しくはそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の相違を有する配列を含み、第２エフェクター部分は、ターゲティング部分のＣ末端にある。
一部の実施形態では、第１エフェクター部分はヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を含み、第２エフェクター部分は異なるヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を含む。一部の実施形態では、第１エフェクター部分はヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を含み、第２エフェクター部分は同じヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を含む。一部の実施形態では、第１エフェクター部分はヒストンデメチラーゼ活性を含み、第２エフェクター部分はヒストンデアセチラーゼ活性を含む。一部の実施形態では、第１エフェクター部分はヒストンデメチラーゼ活性を含み、第２エフェクター部分はＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性を含む。一部の実施形態では、第１エフェクター部分はヒストンデメチラーゼ活性を含み、第２エフェクター部分はＤＮＡデメチラーゼ活性を含む。一部の実施形態では、第１エフェクター部分はヒストンデメチラーゼ活性を含み、第２エフェクター部分は転写抑制活性を含む。一部の実施形態では、第１エフェクター部分はヒストンデメチラーゼ活性を含み、第２エフェクター部分は異なるヒストンデメチラーゼ活性を含む。一部の実施形態では、第１エフェクター部分はヒストンデメチラーゼ活性を含み、第２エフェクター部分は同じヒストンデメチラーゼ活性を含む。一部の実施形態では、第１エフェクター部分はヒストンデアセチラーゼ活性を含み、第２エフェクター部分はＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性を含む。一部の実施形態では、第１エフェクター部分はヒストンデアセチラーゼ活性を含み、第２エフェクター部分はＤＮＡデメチラーゼ活性を含む。一部の実施形態では、第１エフェクター部分はヒストンデアセチラーゼ活性を含み、第２エフェクター部分は転写抑制活性を含む。一部の実施形態では、第１エフェクター部分はヒストンデアセチラーゼ活性を含み、第２エフェクター部分は異なるヒストンデアセチラーゼ活性を含む。一部の実施形態では、第１エフェクター部分はヒストンデアセチラーゼ活性を含み、第２エフェクター部分は同じヒストンデアセチラーゼ活性を含む。一部の実施形態では、第１エフェクター部分はＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性を含み、第２エフェクター部分はＤＮＡデメチラーゼ活性を含む。一部の実施形態では、第１エフェクター部分はＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性を含み、第２エフェクター部分は転写抑制活性を含む。一部の実施形態では、第１エフェクター部分はＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性を含み、第２エフェクター部分は異なるＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性を含む。一部の実施形態では、第１エフェクター部分はＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性を含み、第２エフェクター部分は同じＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性を含む。一部の実施形態では、第１エフェクター部分はＤＮＡデメチラーゼ活性を含み、第２エフェクター部分は転写抑制活性を含む。一部の実施形態では、第１エフェクター部分はＤＮＡデメチラーゼ活性を含み、第２エフェクター部分は異なるＤＮＡデメチラーゼ活性を含む。一部の実施形態では、第１エフェクター部分はＤＮＡデメチラーゼ活性を含み、第２エフェクター部分は同じＤＮＡデメチラーゼ活性を含む。一部の実施形態では、第１エフェクター部分は転写抑制活性を含み、第２エフェクター部分は異なる転写抑制活性を含む。一部の実施形態では、第１エフェクター部分は転写抑制活性を含み、第２エフェクター部分は同じ転写抑制活性を含む。
一部の実施形態では、第１エフェクター部分は、ＤＮＭＴ３ａ／３ｌ、ＭＱ１、ＫＲＡＢ、Ｇ９Ａ、ＨＤＡＣ８、又はＥＺＨ２を含み、第２エフェクター部分は、ＤＮＭＴ３ａ／３ｌ、ＭＱ１、ＫＲＡＢ、Ｇ９Ａ、ＨＤＡＣ８、又はＥＺＨ２を含む。
リンカー
部位特異的妨害剤は、１つ又は複数のリンカーを含み得る。リンカーは、ターゲティング部分をエフェクター部分に、エフェクター部分を別のエフェクター部分に、又はターゲティング部分を別のターゲティング部分に接続し得る。リンカーは、化学結合、例えば、１つ若しくは複数の共有結合又は非共有結合であってもよい。一部の実施形態では、リンカーは、共有結合である。一部の実施形態では、リンカーは、非共有結合である。一部の実施形態では、リンカーは、ペプチドリンカーである。こうしたリンカーは、２～３０、５～３０、１０～３０、１５～３０、２０～３０、２５～３０、２～２５、５～２５、１０～２５、１５～２５、２０～２５、２～２０、５～２０、１０～２０、１５～２０、２～１５、５～１５、１０～１５、２～１０、５～１０、若しくは２～５アミノ酸長、又は２、５、１０、１５、２０、２５、若しくは３０アミノ酸長以上（及び任意選択的に、最大５０、４０、３０、２５、２０、１５、１０、若しくは５アミノ酸長）であり得る。一部の実施形態では、リンカーを用いて、第１部分と第２部分の、例えば、ターゲティング部分とエフェクター部分の間に間隔をあけることができる。一部の実施形態では、例えば、二次及び三次構造の分子柔軟性を賦与するために、例えば、ターゲティング部分とエフェクター部分の間にリンカーを配置することができる。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、第１リンカーを介してターゲティング部分に連結された第１エフェクター部分と、第２リンカーを介してターゲティング部分に連結された第２エフェクター部分とを含み得る。一部の実施形態では、第１リンカーは、第２リンカーの配列と同一の配列を有する。一部の実施形態では、第１リンカーは、第２リンカーの配列と同一でない配列を有する。一部の実施形態では、第１エフェクター部分は、ターゲティング部分のＮ末端にある。一部の実施形態では、ターゲティング部分のＣ末端にある。一部の実施形態では、第１エフェクター部分のＣ末端は、第１リンカーを介してターゲティング部分のＮ末端に連結され、第２エフェクター部分のＮ末端は、第２リンカーを介してターゲティング部分のＣ末端に連結される。
リンカーは、本明細書に記載のフレキシブル、リジッド、及び／又は切断可能リンカーを含んでもよい。一部の実施形態では、柔軟性をもたらすため、リンカーは、少なくとも１つのグリシン、アラニン、及びセリンアミノ酸を含む。一部の実施形態では、リンカーは、例えば負に帯電したスルホン酸基、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基、又はピロリン酸ジエステル基を含む、疎水性リンカーである。一部の実施形態では、リンカーは、ある部分（例えばポリペプチド）を調節剤から選択的に放出するために切断可能であるが、未成熟切断を阻止するために十分に安定である。
一部の実施形態では、本明細書に記載の部位特異的妨害剤の１つ若しくは複数の部分は、１つ又は複数のリンカーと連結している。
当業者には公知であるように、一般に使用される柔軟なリンカーは、主としてＧｌｙ及びＳｅｒ残基の区間から構成される配列（「ＧＳ」リンカー）を有する。フレキシブルリンカーは、ある程度の運動又は相互作用を必要とするドメイン／部分を連結するのに有用であってもよく、小さい非極性（例えば、Ｇｌｙ）又は極性（例えば、Ｓｅｒ又はＴｈｒ）アミノ酸を含んでもよい。さらに、Ｓｅｒ又はＴｈｒを包含することで、水分子と水素結合を形成することにより、水溶液中でのリンカーの安定性が維持され得、ひいてはリンカーと部分／ドメインとの間の好ましくない相互作用が低減され得る。
リジッドリンカーは、ドメイン／部分間の固定距離を保持し、それらの独立した機能を維持するために有用である。リジッドリンカーはまた、融合における１つ又は複数の成分の安定性又は生物活性を保存するのにドメインの空間的分離がクリティカルであるとき、有用であってもよい。リジッドリンカーは、αヘリックス構造又はＰｒｏリッチ配列（ＸＰ）ｎ（ここでＸは、任意のアミノ酸、好ましくはＡｌａ、Ｌｙｓ、又はＧｌｕを指す）を有してもよい。
切断可能リンカーは、遊離機能ドメイン／部分をインビボで放出してもよい。一部の実施形態では、リンカーは、還元試薬又はプロテアーゼの存在などの特定条件下で切断されてもよい。インビボでの切断可能リンカーでは、ジスルフィド結合の可逆性が利用されてもよい。一例として、２つのＣｙｓ残基間のトロンビン感受性配列（例えばＰＲＳ）が挙げられる。ＣＰＲＳＣ（配列番号２４３）のインビトロでのトロンビン処理により、トロンビン感受性配列の切断がもたらされる一方で、可逆的ジスルフィド結合は、未変化のままである。かかるリンカーは、公知であり、例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．２０１３．Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｉｎｋｅｒｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｙ，Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ．Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．６５（１０）：１３５７－１３６９に記載されている。融合中でのリンカーのインビボ切断はまた、特定の細胞若しくは組織内、特定条件下、インビボで発現される、又は特定の細胞区画内に制限されるプロテアーゼにより実施されてもよい。多数のプロテアーゼの特異性により、制限された区画内でのリンカーのより緩徐な切断がもたらされる。
本明細書に記載されるリンカーに使用するのに好適な分子の例として、疎水性リンカー、例えば負に帯電したスルホン酸基；脂質、例えばポリ（－－ＣＨ２－－）炭化水素鎖、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基、その不飽和変異体、そのヒドロキシル化変異体、そのアミド化若しくはそれ以外のＮ含有変異体；非炭素リンカー；炭水化物リンカー；リン酸ジエステルリンカー、又は部位特異的妨害剤の２以上の成分に共有結合する能力がある他の分子が挙げられる。非共有結合リンカーも含まれ、例えばポリペプチドの疎水性領域又はポリペプチドの疎水性延長部、例えばロイシン、イソロイシン、バリン、又はおそらくはさらにアラニン、フェニルアラニン、又はさらにチロシン、メチオニン、グリシン、又は他の疎水性残基が豊富に存在する一連の残基を通じてポリペプチドが連結される疎水性脂質小球などが挙げられる。部位特異的妨害剤の成分は、部位特異的妨害剤の正に帯電した成分が負に帯電した別の成分に連結されるように、電荷に基づく化学を用いて連結されてもよい。
核酸
一態様では、本開示は、本明細書に記載の部位特異的妨害剤、システム、ターゲティング部分及び／又はエフェクター部分をコードする核酸配列を提供する。当業者は、ＲＮＡの核酸配列が、典型的にはチミン（Ｔ）がウラシル（Ｕ）に置換されていることを除き、対応するＤＮＡ配列と同一であることを認識している。ヌクレオチド配列がＤＮＡ配列（例えば、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃを含む）によって表される場合、本開示は、「Ｕ」が「Ｔ」に置換される対応するＲＮＡ配列（例えば、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃを含む）も提供することが理解されよう。本明細書では、従来の表記法を用いてポリヌクレオチド配列を説明する。一本鎖ポリヌクレオチド配列の左端は５’末端であり；二本鎖ポリヌクレオチド配列の左手方向は、５’方向と呼ばれる。
遺伝コードの縮重により、本明細書に記載のＤＮＡターゲティング部分及び／又はエフェクター部分を含む部位特異的妨害剤をコードする多数のヌクレオチド配列が生産され得、それらのうちの一部は、本明細書に開示される核酸配列に対する類似性、例えば、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有することが、当業者には理解されよう。例えば、コドンＡＧＡ、ＡＧＧ、ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、及びＣＧＵは全て、アミノ酸アルギニンをコードする。従って、アルギニンがコドンにより特定される本開示の核酸分子中の全ての位置で、コードされたポリペプチドを変更することなく、コドンを上記の対応するコドンのいずれかに変更することができる。
一部の実施形態では、ターゲティング部分及び／又は１つ又は複数のエフェクター部分を含む部位特異的妨害剤をコードする核酸配列は、哺乳動物、例えば、ヒトにおけるコドン使用頻度に従って最適化されたコドン最適化コード領域の一部又は全部であり得る。一部の実施形態では、ターゲティング部分及び／又は１つ又は複数のエフェクター部分をコードする核酸配列は、タンパク質発現を増大するため、及び／又はタンパク質発現の持続時間を増大するために最適化されたコドンである。一部の実施形態では、コドン最適化核酸配列によって生産されるタンパク質は、コドン最適化されていない核酸配列によりコードされる場合のタンパク質のレベルと比較して、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、又は少なくとも５０％高い。
一部の実施形態では、本明細書に記載のシステムは、１つ又は複数（例えば、１つ）のＤＮＡターゲティング部分及び１つ又は複数のエフェクター部分を含む、ポリペプチドを含み、又は本明細書に記載の方法は、その使用を含み、例えば、ここで、エフェクター部分は、ＭＱ１、例えば、細菌ＭＱ１、又はその機能性変異体又は断片であるか、それを含む。一部の実施形態では、ＭＱ１は、スピロプラズマ・モノビアエ（Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ ｍｏｎｏｂｉａｅ）ＭＱ１、例えば、ＡＴＣＣ３３８２５株由来及び／又はＵｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｐ１５８４０に対応するＭＱ１である。一部の実施形態では、ＭＱ１エフェクター部分は、配列番号１０のヌクレオチド配列によりコードされる。一部の実施形態では、本明細書に記載のヌクレオチド配列は、配列番号１０の配列、又はそれと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、若しくはそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の相違を有する配列を含む。
ＭＱ１
一部の実施形態では、ＭＱ１は、配列番号１１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＭＱ１は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載のエフェクタードメインは、配列番号１１若しくは１２、又はそれと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、若しくはそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の相違を有する配列を含む。
ＭＱ１
一部の実施形態では、本明細書に記載の部位特異的妨害剤に使用されるＭＱ１は、野生型ＭＱ１（例えば、配列番号１１又は配列番号１２）に比して、例えば、１つ又は複数の突然変異を含む変異体である。一部の実施形態では、ＭＱ１変異体は、野生型ＭＱ１に比して、１つ又は複数のアミノ酸置換、欠失、又は挿入を含む。一部の実施形態では、ＭＱ１変異体は、Ｋ２９７Ｐ置換を含む。一部の実施形態では、ＭＱ１変異体は、Ｎ２９９Ｃ置換を含む。一部の実施形態では、ＭＱ１変異体は、Ｅ３０１Ｙ置換を含む。一部の実施形態では、ＭＱ１変異体は、Ｑ１４７Ｌ置換を含む（例えば、野生型ＭＱ１に比して低減したＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性を有する）。一部の実施形態では、ＭＱ１変異体は、Ｋ２９７Ｐ、Ｎ２９９Ｃ、及びＥ３０１Ｙ置換を含む（例えば、野生型ＭＱ１に比して低減したＤＮＡ結合親和性を有する）。一部の実施形態では、ＭＱ１変異体は、Ｑ１４７Ｌ、Ｋ２９７Ｐ、Ｎ２９９Ｃ、及びＥ３０１Ｙ置換を含む（例えば、野生型ＭＱ１に比して低減したメチルトランスフェラーゼ活性及びＤＮＡ結合親和性を有する）。
一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、例えば、部分／ドメインを別の部分／ドメインに接続する、本明細書に記載の１つ又は複数のリンカーを含む。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質、例えば、ｄＣａｓ９タンパク質を含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子であるか、又はそれを含む、ターゲティング部分を含む。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、ＭＱ１である、又はそれを含む、エフェクター部分と、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子であるか、又はそれを含む、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質（例えば、ｄＣａｓ９タンパク質を含む、ＤＮＡターゲティング部分とを含む）、例えば、ｄＣａｓ９ｍ４を含む、融合タンパク質である。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、本明細書に記載の追加部分を含む。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、標的遺伝子又は標的複数遺伝子（例えば、本明細書に記載の標的遺伝子又は標的複数遺伝子）の発現を低減する。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、遺伝子発現を調節、例えば、低減する方法、病状を治療する方法、又は標的遺伝子若しくは本明細書に記載の転写制御エレメントをエピジェネティック的に修飾する方法で使用され得る。一部の実施形態では、システムは、２つ以上の部位特異的妨害剤を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載のシステムは、部位特異的妨害剤、又は１つ若しくは複数（例えば、１つ）のターゲティング部分及び１つ若しくは複数のエフェクター部分を含む、ポリペプチドを含み、又は本明細書に記載の方法は、その使用を含み、ここで、エフェクター部分は、ジンクフィンガータンパク質１０（例えば、ＮＰ＿０５６２０９．２に従う）のＫｒｕｅｐｐｅｌ会合ボックス（ＫＲＡＢ）ドメイン、又はＮＭ＿０１５３９４．５によりコードされるタンパク質、又はその機能性変異体若しくは断片であるか、又はそれを含む。一部の実施形態では、ＫＲＡＢは、合成ＫＲＡＢ構築物である。一部の実施形態では、本明細書に記載の部位特異的妨害剤に使用されるＫＲＡＢは、野生型ＫＲＡＢ（例えば、ＮＰ＿０５６２０９．２、又はＮＭ＿０１５３９４．５によりコードされるタンパク質に従う）に比して、例えば、１つ又は複数の突然変異を含む変異体である。一部の実施形態では、ＫＲＡＢ変異体は、野生型ＫＲＡＢに比して、１つ又は複数のアミノ酸置換、欠失、又は挿入を含む。一部の実施形態では、ＫＲＡＢ変異体は、Ｌ３７Ｐ置換を含む。一部の実施形態では、ＫＲＡＢは、配列番号１３のアミノ酸配列を含む。
ＫＲＡＢ
ＤＡＫＳＬＴＡＷＳＲＴＬＶＴＦＫＤＶＦＶＤＦＴＲＥＥＷＫＬＬＤＴＡＱＱＩＬＹＲＮＶＭＬＥＮＹＫＮＬＶＳＬＧＹＱＬＴＫＰＤＶＩＬＲＬＥＫＧＥＥＰＷＬＶＥＲＥＩＨＱＥＴＨＰＤＳＥＴＡＦＥＩＫＳＳＶ（配列番号１３）
一部の実施形態では、ＫＲＡＢエフェクター部分は、配列番号１４のヌクレオチド配列によりコードされる。一部の実施形態では、本明細書に記載のヌクレオチド配列は、配列番号１４の配列、又はそれと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、若しくはそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の相違を有する配列を含む。
ＫＲＡＢ
一部の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド又は部位特異的妨害剤に使用されるＫＲＡＢは、配列番号１３のＫＲＡＢ配列に比して、例えば、１つ又は複数の突然変異を含む変異体である。一部の実施形態では、ＫＲＡＢ変異体は、配列番号１３に比して、１つ又は複数のアミノ酸置換、欠失、又は挿入を含む。
一部の実施形態では、ポリペプチド又は部位特異的妨害剤は、ＫＲＡＢであるか又はＫＲＡＢを含むエフェクター部分とターゲティング部分とを含む、融合タンパク質、例えば、Ｃｒｉｓｐｅｒ／Ｃａｓタンパク質である。一部の実施形態では、ポリペプチド又は部位特異的妨害剤は、本明細書に記載の追加部分を含む。一部の実施形態では、ポリペプチド又は部位特異的妨害剤は、標的遺伝子又は標的複数遺伝子の発現を低減する。一部の実施形態では、ポリペプチド又は部位特異的妨害剤は、遺伝子発現を調節、例えば、低減する方法、病状を治療する方法、又は標的遺伝子若しくは複数の標的遺伝子、例えば、本明細書に記載の転写制御エレメントをエピジェネティック的に修飾する方法で使用され得る。
一部の実施形態では、本明細書に記載のシステムは、部位特異的妨害剤、又は１つ若しくは複数（例えば、１つ）のターゲティング部分及び１つ若しくは複数のエフェクター部分を含む、ポリペプチドを含み、又は本明細書に記載の方法は、その使用を含み、ここで、エフェクター部分は、ＤＮＭＴ３ａ／３Ｌ複合体、又はその機能性変異体又は断片であるか、それを含む。一部の実施形態では、ＤＮＭＴ３ａ／３Ｌ複合体は、融合構築物である。一部の実施形態では、ＤＮＭＴ３ａ／３Ｌ複合体は、ＤＮＭＴ３Ａ、例えば、ヒトＤＮＭＴ３Ａ（例えば、ＮＰ＿０７２０４６．２、又はＮＭ＿０２２５５２．４によりコードされるタンパク質に従う）又はＮＭ＿０２２５５２．４によりコードされるタンパク質又はその機能性変異体若しくは断片、例えば、ヒトＤＮＭＴ３Ａのａａ６７９～９１２（例えば、ＮＰ＿０７２０４６．２、又はＮＭ＿０２２５５２．４によりコードされるタンパク質に従う）を含む。一部の実施形態では、ＤＮＭＴ３ａ／３Ｌ複合体は、ヒトＤＮＭＴ３Ｌ又はその機能性断片若しくは変異体（例えば、ＮＰ＿７８７０６３．１、又はＮＭ＿１７５８６７．３によりコードされるタンパク質、若しくはその機能性変異体若しくは断片、例えば、ＮＰ＿７８７０６３．１又はＮＭ＿１７５８６７．３によりコードされるタンパク質に従うヒトＤＮＭＴ３Ｌのａａ２７４～３８６に従う）を含む。一部の実施形態では、ＤＮＭＴ３ａ／３Ｌは、配列番号１５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載のエフェクター部分は、配列番号１５、又はそれと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、若しくはそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の相違を有する配列を含む。
ＤＮＭＴ３Ａ／３ｌ（ｈ）
一部の実施形態では、ＤＮＭＴ３ａ／３Ｌは、配列番号１６のヌクレオチド配列によりコードされる。一部の実施形態では、本明細書に記載の核酸は、配列番号１６の配列、又はそれと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、若しくはそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の相違を有する配列を含む。
ＤＮＭＴ３Ａ／３ｌ（ｈ）
一部の実施形態では、本明細書に記載のシステムは、部位特異的妨害剤、又は１つ若しくは複数（例えば、１つ）のターゲティング部分及び１つ若しくは複数のエフェクター部分を含む、ポリペプチドを含み、又は本明細書に記載の方法は、その使用を含み、ここで、エフェクター部分は、ＥＺＨ２（例えば、ＮＰ－００４４４７．２若しくはＮＰ＿００１１９０１７６．１ ２、又はＮＭ＿００４４５６．５若しくはＮＭ＿００１２０３２４７．２によりコードされるタンパク質に従う）又はその機能性変異体若しくは断片であるか、又はそれを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の部位特異的妨害剤に使用されるＭＱ１は、ＥＺＨ２、例えば、ＮＰ－００４４４７．２若しくはＮＰ＿００１１９０１７６．１ ２、又はＮＭ＿００４４５６．５若しくはＮＭ＿００１２０３２４７．２によりコードされるタンパク質に従うＥＺＨ２に比して、例えば、１つ又は複数の突然変異を含む変異体である。一部の実施形態では、ＥＺＨ２変異体は、野生型ＥＺＨ２に比して、１つ又は複数のアミノ酸置換、欠失、又は挿入を含む。一部の実施形態では、ＥＺＨ２は、配列番号１７のアミノ酸配列を含む。
ＥＺＨ２
一部の実施形態では、ＥＺＨ２エフェクター部分は、配列番号１８のヌクレオチド配列によりコードされる。一部の実施形態では、本明細書に記載のヌクレオチド配列は、配列番号１８の配列、又はそれと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、若しくはそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の相違を有する配列を含む。
ＥＺＨ２
一部の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド又は部位特異的妨害剤に使用されるＥＺＨ２は、配列番号１７のＥＺＨ２配列に比して、例えば、１つ又は複数の突然変異を含む変異体である。一部の実施形態では、ＥＺＨ２変異体は、配列番号１７に比して、１つ又は複数のアミノ酸置換、欠失、又は挿入を含む。
一部の実施形態では、ポリペプチド又は部位特異的妨害剤は、ＥＺＨ２であるか又はＥＺＨ２を含むエフェクター部分とターゲティング部分とを含む、融合タンパク質である。一部の実施形態では、ポリペプチド又は部位特異的妨害剤は、本明細書に記載の追加部分を含む。一部の実施形態では、ポリペプチド又は部位特異的妨害剤は、標的遺伝子又は標的複数遺伝子の発現を低減する。一部の実施形態では、ポリペプチド又は部位特異的妨害剤は、遺伝子発現を調節、例えば、低減する方法、病状を治療する方法、又は標的遺伝子若しくは複数の標的遺伝子、例えば、本明細書に記載の転写制御エレメントをエピジェネティック的に修飾する方法で使用され得る。
一部の実施形態では、本明細書に記載のシステムは、部位特異的妨害剤、又は１つ若しくは複数（例えば、１つ）のターゲティング部分及び１つ若しくは複数のエフェクター部分を含む、ポリペプチドを含み、又は本明細書に記載の方法は、その使用を含み、ここで、エフェクター部分は、ＨＤＡＣ８（例えば、ＮＰ＿００１１５９８９０若しくはＮＰ＿０６０９５６．１、又はＮＭ＿００１１６６４１８若しくはＮＭ＿０１８４８６．３によりコードされるタンパク質に従う）又はその機能性変異体若しくは断片であるか、又はそれを含む。一部の実施形態では、ＨＤＡＣ８は、配列番号１９のアミノ酸配列を含む。
ＨＤＡＣ８
一部の実施形態では、ＨＤＡＣ８エフェクター部分は、配列番号６６のヌクレオチド配列によりコードされる。一部の実施形態では、本明細書に記載のヌクレオチド配列は、配列番号６６の配列、又はそれと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、若しくはそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の相違を有する配列を含む。
ＨＤＡＣ８
一部の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド又は部位特異的妨害剤に使用されるＨＤＡＣ８は、配列番号１９のＨＤＡＣ８配列に比して、例えば、１つ又は複数の突然変異を含む変異体である。一部の実施形態では、ＨＤＡＣ８変異体は、配列番号１９に比して、１つ又は複数のアミノ酸置換、欠失、又は挿入を含む。
一部の実施形態では、ポリペプチド又は部位特異的妨害剤は、ＨＤＡＣ８であるか又はＨＤＡＣ８を含むエフェクター部分とターゲティング部分とを含む、融合タンパク質である。一部の実施形態では、ポリペプチド又は部位特異的妨害剤は、本明細書に記載の追加部分を含む。一部の実施形態では、ポリペプチド又は部位特異的妨害剤は、標的遺伝子又は標的複数遺伝子の発現を低減する。一部の実施形態では、ポリペプチド又は部位特異的妨害剤は、遺伝子発現を調節、例えば、低減する方法、病状を治療する方法、又は標的遺伝子若しくは複数の標的遺伝子、例えば、本明細書に記載の転写制御エレメントをエピジェネティック的に修飾する方法で使用され得る。
一部の実施形態では、本明細書に記載のシステムは、部位特異的妨害剤、又は１つ若しくは複数（例えば、１つ）のターゲティング部分及び１つ若しくは複数のエフェクター部分を含む、ポリペプチドを含み、又は本明細書に記載の方法は、その使用を含み、ここで、エフェクター部分は、Ｇ９Ａ（例えば、ＮＰ＿００１３５０６１８．１、又はＮＭ＿００１３６３６８９．１によりコードされるタンパク質に従う）又はその機能性変異体若しくは断片、例えば、Ｇ９Ａ（例えば、ＮＰ＿００１３５０６１８．１、又はＮＭ＿００１３６３６８９．１によりコードされるタンパク質に従う）を含むａａ９６７～１２５０であるか、又はそれを含む。一部の実施形態では、Ｇ９Ａは、配列番号６７のアミノ酸配列を含む。
Ｇ９Ａ
一部の実施形態では、Ｇ９Ａエフェクター部分は、配列番号６８のヌクレオチド配列によりコードされる。一部の実施形態では、本明細書に記載のヌクレオチド配列は、配列番号６８の配列、又はそれと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、若しくはそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の相違を有する配列を含む。
Ｇ９Ａ
一部の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド又は部位特異的妨害剤に使用されるＧ９Ａは、配列番号６７のＧ９Ａ配列に比して、例えば、１つ又は複数の突然変異を含む変異体である。一部の実施形態では、Ｇ９Ａ変異体は、配列番号６７に比して、１つ又は複数のアミノ酸置換、欠失、又は挿入を含む。
一部の実施形態では、ポリペプチド又は部位特異的妨害剤は、Ｇ９Ａであるか又はＧ９Ａを含むエフェクター部分とターゲティング部分とを含む、融合タンパク質である。一部の実施形態では、ポリペプチド又は部位特異的妨害剤は、本明細書に記載の追加部分を含む。一部の実施形態では、ポリペプチド又は部位特異的妨害剤は、標的遺伝子又は標的複数遺伝子の発現を低減する。一部の実施形態では、ポリペプチド又は部位特異的妨害剤は、遺伝子発現を調節、例えば、低減する方法、病状を治療する方法、又は標的遺伝子若しくは複数の標的遺伝子、例えば、本明細書に記載の転写制御エレメントをエピジェネティック的に修飾する方法で使用され得る。
システム
本開示のシステムは、２つ以上の部位特異的妨害剤を含み得る。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤システムは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個、又はそれ以上（且つ任意選択的に、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、又は２個以下）の部位特異的妨害剤を含む。一部の実施形態では、システムは、２つ以上の異なる配列をターゲティングする（例えば、１番目と、２番目、３番目、４番目、５番目、６番目、７番目、８番目、９番目、１０番目、１１番目、１２番目、及び／又はさらなるＤＮＡ配列、及び任意選択的に、２０番目、１９番目、１８番目、１７番目、１６番目、１５番目、１４番目、１３番目、１２番目、１１番目、１０番目、９番目、８番目、６番目、５番目、４番目、３番目、又は２番目以下の配列）。一部の実施形態では、システムは、複数の部位特異的妨害剤を含み、ここで、複数の部位特異的妨害剤の各メンバーは、複数の部位特異的妨害剤の別のメンバーに検出可能に結合しない、例えば、結合しない。一部の実施形態では、システムは、第１部位特異的妨害剤及び第２部位特異的妨害剤を含み、ここで、第１部位特異的妨害剤は、第２部位特異的妨害剤に検出可能に結合しない、例えば、結合しない。
一部の実施形態では、本開示のシステムは、２つ以上の部位特異的妨害剤を含み、ここで、部位特異的妨害剤は、組成物、医薬組成物、又は混合物中に一緒に存在する。一部の実施形態では、本開示のシステムは、２つ以上の部位特異的妨害剤を含み、ここで、１つ又は複数の部位特異的妨害剤は、少なくとも１つの他の部位特異的妨害剤と混合されない。一部の実施形態では、システムは、第１部位特異的妨害剤及び第２部位特異的妨害剤を含んでもよく、ここで、細胞の核における第１部位特異的妨害剤の存在は、同じ細胞の核内の第２部位特異的妨害剤の存在と重複せず、システムは、第１及び第２部位特異的妨害剤の非重複的存在によって複数の遺伝子の発現の低減を達成する。一部の実施形態では、第１部位特異的妨害剤及び第２部位特異的妨害剤は、同時又は順次に作用し得る。
一部の実施形態では、システムの部位特異的妨害剤はそれぞれ、異なるターゲティング部分を含む（例えば、第１、第２、第３、又はさらなる部位特異的妨害剤はそれぞれ、互いに異なるターゲティング部分を含む）。例えば、システムは、第１部位特異的妨害剤及び第２部位特異的妨害剤を含んでもよく、ここで、第１部位特異的妨害剤は、第１ターゲティング部分（例えば、Ｃａｓ９ドメイン、ＴＡＬエフェクタードメイン、又はＺｎフィンガードメイン）を含み、第２部位特異的妨害剤は、第１ターゲティング部分とは異なる第２ターゲティング部分（例えば、Ｃａｓ９ドメイン、ＴＡＬエフェクタードメイン、又はＺｎフィンガードメイン）を含む。一部の実施形態では、異なるとは、異なるタイプのターゲティング部分を含むことを意味し、例えば、第１ターゲティング部分は、Ｃａｓ９ドメインを含み、第２のＤＮＡターゲティング部分は、Ｚｎフィンガードメインを含む。他の実施形態では、異なるとは、同じタイプのターゲティング部分の異なる変異体を含むことを意味し、例えば、第１ターゲティング部分は、第１Ｃａｓ９ドメイン（例えば、第１種から）を含み、第２ターゲティング部分は、第２Ｃａｓ９ドメイン（例えば、第２種から）を含む。
一実施形態では、システムが同じタイプの２つ以上のターゲティング部分、例えば、２つ以上のＣａｓ９又はＺｎフィンガードメインを含む場合、ターゲティング部分は、２つ以上の異なる配列に特異的に結合する。例えば、２つ以上のＣａｓ９ドメインを含むシステムにおいて、２つ以上のＣａｓ９ドメインは、その標的配列に対応するｇＲＮＡのみに明らかに結合する（例えば、別のＣａｓ９ドメインの標的に対応するｇＲＮＡには、明らかには結合しない）ように選択又は変更されてもよい。さらなる例において、２つ以上のエフェクター部分を含む系において、２つ以上のエフェクター部分は、それらがその標的配列のみに明らかに結合する（例えば、且つ別のエフェクター部分の標的配列には、明らかには結合しない）ように、選択又は変更され得る。
一部の実施形態では、システムは、３つ以上の部位特異的妨害剤を含み、２つ以上の部位特異的妨害剤は、同じターゲティング部分を含む。例えば、システムは、３つの部位特異的妨害剤を含んでもよく、ここで、第１及び第２部位特異的妨害剤は、いずれも第１ターゲティング部分を含み、第３部位特異的妨害剤は、第２の異なるターゲティング部分を含む。さらなる例として、システムは、４つの部位特異的妨害剤を含んでもよく、ここで、第１及び第２部位特異的妨害剤は、いずれも第１ターゲティング部分を含み、第３及び第４部位特異的妨害剤は、第２の異なるターゲティング部分を含む。さらなる例として、システムは、５つの部位特異的妨害剤を含んでもよく、ここで、第１及び第２部位特異的妨害剤は、いずれも第１ターゲティング部分を含み、第３及び第４部位特異的妨害剤は、いずれも第２の異なるターゲティング部分を含み、第５部位特異的妨害剤は、第３の異なるターゲティング部分を含む。上記のように、異なるとは、異なるタイプのターゲティング部分を含むこと、又は同じタイプのターゲティング部分の異なる変異体を含むことを意味し得る。
一部の実施形態では、システムの部位特異的妨害剤は、それぞれ異なるＤＮＡ配列に結合する（例えば、第１、第２、第３、又はさらなる部位特異的妨害剤はそれぞれ、互いに異なるＤＮＡ配列に結合する）。例えば、システムは、第１部位特異的妨害剤及び第２部位特異的妨害剤を含んでもよく、ここで、第１部位特異的妨害剤は第１ＤＮＡ配列に結合し、第２部位特異的妨害剤は第２ＤＮＡ配列に結合する。異なるＤＮＡ配列に関与する含む一部の実施形態では、ある部位特異的妨害剤が結合するＤＮＡ配列と別の部位特異的妨害剤が結合するＤＮＡ配列との間に同一でない少なくとも１つの位置があるか、又はある部位特異的妨害剤が結合するＤＮＡ配列には、別の部位特異的妨害剤が結合するＤＮＡ配列には存在しない少なくとも１つの位置がある。
一部の実施形態では、第１ＤＮＡ配列は、第１ゲノムＤＮＡ鎖上に位置し、第２ＤＮＡ配列は、第２ゲノムＤＮＡ鎖に位置し得る。一部の実施形態では、第１ＤＮＡ配列は、第２ＤＮＡ配列と同じゲノムＤＮＡ鎖上に位置し得る。
一部の実施形態では、システムは、３つ以上の部位特異的妨害剤を含み、２つ以上の部位特異的妨害剤は、同じＤＮＡ配列に結合する。例えば、システムは、３つの部位特異的妨害剤を含んでもよく、ここで、第１及び部位特異的妨害剤は、いずれも第１ＤＮＡ配列に結合し、第３部位特異的妨害剤は、第２の異なるＤＮＡ配列に結合する。さらなる例として、システムは、４つの部位特異的妨害剤を含んでもよく、ここで、第１及び第２部位特異的妨害剤は、いずれも第１ＤＮＡ配列に結合し、第３及び第４部位特異的妨害剤は、いずれも第２ＤＮＡ配列に結合する。さらなる例として、システムは、５つの部位特異的妨害剤を含んでもよく、ここで、第１及び第２部位特異的妨害剤は、いずれも第１ＤＮＡ配列に結合し、第３及び第４部位特異的妨害剤は、いずれも第２ＤＮＡ配列に結合し、第５部位特異的妨害剤は、第３ＤＮＡ配列に結合する。上記のように、異なるとは、ある部位特異的妨害剤が結合するＤＮＡ配列と別の部位特異的妨害剤が結合するＤＮＡ配列との間に同一でない少なくとも１つの位置があること、又はある部位特異的妨害剤が結合するＤＮＡ配列には、別の部位特異的妨害剤が結合するＤＮＡ配列には存在しない少なくとも１つの位置があることを意味し得る。
一部の実施形態では、システムは、２つ以上（例えば、２つ）の部位特異的妨害剤を含み、複数（例えば、２つ）の部位特異的妨害剤は、異なるＤＮＡ配列に結合するターゲティング部分を含む。そのような実施形態では、第１ターゲティング部分は第１ＤＮＡ配列に結合し得、第２ＤＮＡターゲティング部分は第２ＤＮＡ配列に結合し得、第１及び第２ＤＮＡ配列は異なり、重複しない。いくつかのそのような実施形態では、第１ＤＮＡ配列は、第２ＤＮＡ配列から少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、又は１００塩基対（及び任意選択的に、５００、４００、３００、２００、１００、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５、又は５０塩基対以下）の間隔を有するいくつかのそのような実施形態では、第１ＤＮＡ配列は、第２ＤＮＡ配列から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、又は１００塩基対以下（及び任意選択的に、０塩基対、例えば、第１配列と第２配列が互いに隣接している）の間隔を有する。
一部の実施形態では、システムの部位特異的妨害剤はそれぞれ、異なるエフェクター部分を含む（例えば、第１、第２、第３、又はさらなる部位特異的妨害剤はそれぞれ、互いに異なるエフェクター部分を含む）。例えば、システムは、第１部位特異的妨害剤及び第２部位特異的妨害剤を含んでもよく、ここで、第１部位特異的妨害剤は、第１エフェクター部分を含み、第２部位特異的妨害剤は、第１エフェクター部分とは異なる第２エフェクター部分を含む。一部の実施形態では、異なるエフェクター部分は、異なるタイプのエフェクター部分を含む。他の実施形態では、異なるエフェクター部分は、同じタイプのエフェクター部分の異なる変異体を含む。
ターゲティング部分
ターゲティング部分は、ＤＮＡ配列、例えば、標的複数遺伝子に関連するＤＮＡ配列、例えば、標的複数遺伝子を含むＡＳＭＣのアンカー配列に特異的に結合し得る。ＤＮＡ配列に特異的に結合する任意の分子又は化合物は、ターゲティング部分として使用され得る。一部の実施形態では、ターゲティング部分は、アンカー配列、例えば、標的複数遺伝子を含むＡＳＭＣのアンカー配列に相補的な配列を含む核酸を含む。一部の実施形態では、核酸は、アンカー配列へのゲノム複合体成分（例えば、核形成ポリペプチド、例えば、ＣＴＣＦ）の結合を物理的／立体的に遮断するオリゴヌクレオチドである。一部の実施形態では、核酸は、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子と適合する、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む。一部の実施形態では、ターゲティング部分は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子、ＴＡＬエフェクター分子、Ｚｎフィンガー分子、ｔｅｔＲドメイン、メガヌクレアーゼ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）又は核酸分子を含む。
一部の実施形態では、ターゲティング部分は、５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００、５０、４０、３０、２０、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１、０．０９、０．０８、０．０７、０．０６、０．０５、０．０４、０．０３、０．０２、０．０１、０．００５、０．００２、又は０．００１ｎＭ以下のＫＤ（且つ任意選択的に、少なくとも５０、４０、３０、２０、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１、０．０９、０．０８、０．０７、０．０６、０．０５、０．０４、０．０３、０．０２、０．０１、０．００５、０．００２、又は０．００１ｎＭのＫＤ）で、その標的配列に結合する。一部の実施形態では、ターゲティング部分は、０．００１ｎＭ～５００ｎＭ、例えば、０．１ｎＭ～５ｎＭ、例えば、約０．５ｎＭのＫＤでその標的配列に結合する。一部の実施形態では、ターゲティング部分は、少なくとも５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、５０００、１０，０００、又は１００，０００ｎＭのＫＤで非標的配列に結合する（且つ任意選択的に、明らかには非標的配列に結合しない）。一部の実施形態では、ターゲティング部分は、非標的配列に結合しない。
一部の実施形態では、ターゲティング部分は、表７から選択される配列、又はそれと少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％の同一性を有するか、若しくはそれと１、２、３、４、若しくは５つ以下の位置で異なる配列を含む核酸を含む。
一部の実施形態では、ターゲティング部分は、表６から選択される配列、又はそれと少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％の同一性を有するか、若しくはそれと１、２、３、４、若しくは５つ以下の位置で異なる配列を含む核酸を含む。
一部の実施形態では、ターゲティング部分は、アンカー配列、例えば、標的複数遺伝子を含むＡＳＭＣのアンカー配列の配列に相補的な配列を含むか、又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個以下のそれと非相補性の位置を有する、核酸を含む。
一部の実施形態では、ターゲティング部分は、ゲノムの座標ｃｈｒ４：７４５９５４６４－７４５９５４８６、ｃｈｒ４：７４５９５４５７－７４５９５４７９、ｃｈｒ４：７４５９５４６０－７４５９５４８２、ｃｈｒ４：７４５９５４７２－７４５９５４９４、ｃｈｒ４：７５００００８８－７５０００１１０、ｃｈｒ４：７５００００９１－７５０００１１３、ｃｈｒ４：７５００００８５－７５０００１０７、ｃｈｒ４：７５０００１５７－７５０００１７９、ｃｈｒ４：７５０００１５６－７５０００１７８、ｃｈｒ４：７４５９５２１５－７４５９５２３７、ｃｈｒ４：７４５９５３７０－７４５９５３９２、ｃｈｒ４：７４５９５５６０－７４５９５５８２、ｃｈｒ４：７４５９５６４２－７４５９５６６４、ｃｈｒ４：７４５９５７８７－７４５９５８０９、ｃｈｒ４：７４５２８４２８－７４５２８４５０、ｃｈｒ４：７４５２８５６７－７４５２８５８９、ｃｈｒ４：７４５２８６０９－７４５２８６３１、ｃｈｒ４：７４７８９１３２－７４７８９１５４、ｃｈｒ４：７４７８９２５０－７４７８９２７２、ｃｈｒ４：７４７８９３１２－７４７８９３３４、ｃｈｒ４：７４９６４８５３－７４９６４８７５、ｃｈｒ４：７４９６４９０６－７４９６４９２８、ｃｈｒ４：７４９６５５３８－７４９６５５６０、ｃｈｒ４：７４９６５７３７－７４９６５７５９、ｃｈｒ４：７５００００３１－７５００００５３、ｃｈｒ４：７５０００１１５－７５０００１３７、ｃｈｒ４：７５０００２３１－７５０００２５３、ｃｈｒ４：７４９７５１４６－７４９７５１６８、ｃｈｒ４：７４９７５３６９－７４９７５３９１、ｃｈｒ４：７４９７６３１８－７４９７６３４０、ｃｈｒ４：７４５７０３４８－７４５７０３７０、ｃｈｒ４：７４５７０５０３－７４５７０５２５、ｃｈｒ４：７４５７０５２６－７４５７０５４８、ｃｈｒ５：９０７８５７２４－９０７８５７４６、ｃｈｒ５：９０７８８１３７－９０７８８１５９、ｃｈｒ５：９０９０８９２６－９０９０８９４８、ｃｈｒ５：９０６６１４９２－９０６６１５１４、ｃｈｒ５：９０６６１６４６－９０６６１６６８、ｃｈｒ５：９０６６１７４４－９０６６１７６６、ｃｈｒ５：９０７８５６１０－９０７８５６３２、ｃｈｒ５：９０９０９０４７－９０９０９０６９、若しくはｃｈｒ６：１１３０７６０２８－１１３０７６０４７を有する領域と少なくとも部分的に重複する配列、又は前記領域の５、１０、１５、２０、３０、４０、若しくは５０ヌクレオチド以内である配列を含むか、又は前記ゲノム領域の配列に対して少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％の同一性を有するか、又はそれと１、２、３、４、又は５つ以下の位置で異なる配列を含む、核酸を含む。
一部の実施形態では、ターゲティング部分は、ゲノム位置ｃｈｒ４：７４５９５４６４－７４５９５４８６、ｃｈｒ４：７４５９５４５７－７４５９５４７９、ｃｈｒ４：７４５９５４６０－７４５９５４８２、ｃｈｒ４：７４５９５４７２－７４５９５４９４、ｃｈｒ４：７５００００８８－７５０００１１０、ｃｈｒ４：７５００００９１－７５０００１１３、ｃｈｒ４：７５００００８５－７５０００１０７、ｃｈｒ４：７５０００１５７－７５０００１７９、ｃｈｒ４：７５０００１５６－７５０００１７８、ｃｈｒ４：７４５９５２１５－７４５９５２３７、ｃｈｒ４：７４５９５３７０－７４５９５３９２、ｃｈｒ４：７４５９５５６０－７４５９５５８２、ｃｈｒ４：７４５９５６４２－７４５９５６６４、ｃｈｒ４：７４５９５７８７－７４５９５８０９、ｃｈｒ４：７４５２８４２８－７４５２８４５０、ｃｈｒ４：７４５２８５６７－７４５２８５８９、ｃｈｒ４：７４５２８６０９－７４５２８６３１、ｃｈｒ４：７４７８９１３２－７４７８９１５４、ｃｈｒ４：７４７８９２５０－７４７８９２７２、ｃｈｒ４：７４７８９３１２－７４７８９３３４、ｃｈｒ４：７４９６４８５３－７４９６４８７５、ｃｈｒ４：７４９６４９０６－７４９６４９２８、ｃｈｒ４：７４９６５５３８－７４９６５５６０、ｃｈｒ４：７４９６５７３７－７４９６５７５９、ｃｈｒ４：７５００００３１－７５００００５３、ｃｈｒ４：７５０００１１５－７５０００１３７、ｃｈｒ４：７５０００２３１－７５０００２５３、ｃｈｒ４：７４９７５１４６－７４９７５１６８、ｃｈｒ４：７４９７５３６９－７４９７５３９１、ｃｈｒ４：７４９７６３１８－７４９７６３４０、ｃｈｒ４：７４５７０３４８－７４５７０３７０、ｃｈｒ４：７４５７０５０３－７４５７０５２５、ｃｈｒ４：７４５７０５２６－７４５７０５４８、ｃｈｒ５：９０６６１４９２－９０６６１５１４、ｃｈｒ５：９０６６１６４６－９０６６１６６８、ｃｈｒ５：９０６６１７４４－９０６６１７６６、ｃｈｒ５：９０７８５６１０－９０７８５６３２、ｃｈｒ５：９０９０９０４７－９０９０９０６９、ｃｈｒ５：９０７８５７２４－９０７８５７４６、ｃｈｒ５：９０７８８１３７－９０７８８１５９、ｃｈｒ５：９０９０８９２６－９０９０８９４８、又はｃｈｒ６：１１３０７６０２８－１１３０７６０４７で配列に結合する。
一部の実施形態では、ターゲティング部分は、アンカー配列又はアンカー配列に近接する部位、例えば、標的複数遺伝子を完全に又は部分的に含むＡＳＭＣの一部であるアンカー配列に結合する。
一部の実施形態では、ターゲティング部分は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子を含む。一部の実施形態では、エフェクター部分は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子を含む。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子は、クラスター化した規則的な間隔の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）システムに関与するタンパク質、例えば、Ｃａｓタンパク質、及び任意選択的にガイドＲＮＡ、例えば、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含む。
ＣＲＩＳＰＲシステムは、細菌及び古細菌中に最初に発見された適応型防御システムである。ＣＲＩＳＰＲシステムは、ＣＲＩＳＰＲ関連又は「Ｃａｓ」エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９若しくはＣｐｆ１）と呼ばれるＲＮＡ誘導ヌクレアーゼを用いて、外来ＤＮＡを切断する。例えば、典型的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムでは、エンドヌクレアーゼは、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ配列をターゲティングする配列特異的、ノンコーディング「ガイドＲＮＡ」により標的ヌクレアーゼ配列（例えば、配列編集しようとするゲノム内の部位）に向けられる。３つのクラス（Ｉ～ＩＩＩ）のＣＲＩＳＰＲシステムが同定されている。クラスＩＩ ＣＲＩＳＰＲシステムは、単一のＣａｓエンドヌクレアーゼ（複数のＣａｓタンパク質ではなく）を使用する。１クラスのＩＩ ＣＲＩＳＰＲシステムは、ＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（「ｃｒＲＮＡ」）、及びトランス作用性ｃｒＲＮＡ（「ｔｒａｃｒＲＮＡ」）を含む。ｃｒＲＮＡは、「ガイドＲＮＡ」を含み、これは、典型的には約２０ヌクレオチドＲＮＡ配列であり、標的ＤＮＡ配列に対応する。ｃｒＲＮＡはまた、ｔｒａｃｒＲＮＡに結合して、部分的二本鎖構造を形成する領域を含み、この構造が、ＲＮａｓｅＩＩＩにより切断されて、ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドが得られる。次に、ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを指令して、標的ＤＮＡ配列を認識させ、これを切断させる。標的ＤＮＡ配列は、概して、所与のＣａｓエンドヌクレアーゼに特異的な「プロトスペーサ隣接モチーフ」（「ＰＡＭ」）と隣接していなければならないが；ＰＡＭ配列は、所与のゲノム全体にわたって出現する。多様な原核生物種から同定されたＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは、ユニークなＰＡＭ配列要件を有し；ＰＡＭ配列の例としては、５’－ＮＧＧ（化膿性レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、５’－ＮＮＡＧＡＡ（ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ１）、５’－ＮＧＧＮＧ（ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ３）、及び５’－ＮＮＮＧＡＴＴ（髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｄｉｔｉｓ））が挙げられる。いくつかのエンドグルカナーゼ、例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、Ｇ－リッチＰＡＭ部位、例えば、５’－ＮＧＧ（例えば、ＴＧＧ、例えば、ＣＧＧ、例えば、ＡＧＧ）と結合し、ＰＡＭ部位から（その５’側）３ヌクレオチド上流の位置で標的ＤＮＡの平滑末端切断を実施する。別のクラスＩＩ ＣＲＩＳＰＲシステムは、Ｃａｓ９より小さいＶ型エンドヌクレアーゼＣｐｆ１を含み；例として、ＡｓＣｐｆ１（アシダミノコッカス属種（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）由来）及びＬｂＣｐｆ１（ラクノスピラ科種（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｓｐ．）由来）が挙げられる。Ｃｐｆ１関連ＣＲＩＳＰＲアレイは、ｔｒａｃｒＲＮＡを必要とせずに成熟ｃｒＲＮＡにプロセシングされ；言い換えれば、Ｃｐｆ１システムは、標的ＤＮＡ配列を切断するために、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼとｃｒＲＮＡしか必要としない。Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼは、Ｔ－リッチＰＡＭ部位、例えば、５‘－ＴＴＮと結合する。Ｃｐｆ１はまた、５’－ＣＴＡ ＰＡＭモチーフも認識する。Ｃｐｆ１は、４－若しくは５－ヌクレオチド５’オーバーハングを有するオフセット又はスタッガード二本鎖切断を導入する、例えば、コーディング鎖上のＰＡＭから（その３’側）１８ヌクレオチド下流及び相補鎖上のＰＡＭから２３ヌクレオチド下流に位置する５－ヌクレオチドオフセット又はスタッガード切断を用いて標的ＤＮＡを切断することにより、標的ＤＮＡを切断し；こうしたオフセット切断によって生じる５－ヌクレオチドオーバーハングは、平滑末端切断ＤＮＡでの挿入によるものと比較して、相同組換えによるＤＮＡ挿入によってさらに正確なゲノム編集を可能にする。例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｃｅｌｌ，１６３：７５９－７７１を参照されたい。
多種多様なＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子又はタンパク質を、本開示に提供される技術で使用することができ、Ｃａｓタンパク質の選択は、本方法の特定の条件に応じて変化し得る。Ｃａｓタンパク質の具体的な例として、クラスＩＩシステムが挙げられ、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃｐｆ１、Ｃ２Ｃ１、又はＣ２Ｃ３を含む。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９タンパク質は、多様な原核生物種のいずれに由来するものでもよい。一部の実施形態では、特定のＣａｓタンパク質、例えば、特定のＣａｓ９タンパク質は、特定のプロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を認識するように選択される。一部の実施形態では、ターゲティング部分として、配列ターゲティングポリペプチド、例えば、Ｃａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９が挙げられる。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９タンパク質は、細菌若しくは古細菌から取得するか、又は公知の方法を用いて合成してもよい。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、グラム陽性菌又はグラム陰性菌に由来するものであってもよい。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、レンサ球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、化膿性レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、若しくはＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））、フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）（例えば、Ｆ．ノビシダ（Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ））、スタフィロコッカッス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ））、アシダミノコッカス属（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、アシダミノコッカス属種（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）ＢＶ３Ｌ６）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）（例えば、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ））、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヘモフィラス属（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ユーバクテリウム属（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、パスツレラ属（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、ベイロネラ属（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ）、又はマリノバクター属（Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ）に由来するものであってよい。
一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓタンパク質が結合及び／又は機能するために、プロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）が標的ＤＮＡ配列中に存在するか、若しくはそれと隣接する必要がある。一部の実施形態では、ＰＡＭは、５’から３’に、ＮＧＧ、ＹＧ、ＮＮＧＲＲＴ、ＮＮＮＲＲＴ、ＮＧＡ、ＴＹＣＶ、ＴＡＴＶ、ＮＴＴＮ、又はＮＮＮＧＡＴＴであるか、又はそれを含み、ここで、Ｎは、任意のヌクレオチドを表し、Ｙは、Ｃ又はＴを表し、Ｒは、Ａ又はＧを表し、Ｖは、Ａ又はＣ又はＧを表す。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、表１に挙げるタンパク質である。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、そのＰＡＭを変更する１つ又は複数の突然変異を含む。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｅ１３６９Ｒ、Ｅ１４４９Ｈ、及びＲ１５５６Ａ突然変異、又は前記位置に対応するアミノ酸への類似の置換を含む。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｅ７８２Ｋ、Ｎ９６８Ｋ、及びＲ１０１５Ｈ突然変異、又は前記位置に対応するアミノ酸への類似の置換を含む。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｄ１１３５Ｖ、Ｒ１３３５Ｑ、及びＴ１３３７Ｒ突然変異、又は前記位置に対応するアミノ酸への類似の置換を含む。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｓ５４２Ｒ及びＫ６０７Ｒ突然変異、又は前記位置に対応するアミノ酸への類似の置換を含む。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｓ５４２Ｒ、Ｋ５４８Ｖ、及びＮ５５２Ｒ突然変異、又は前記位置に対応するアミノ酸への類似の置換を含む。
一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、触媒的に活性であり、標的ＤＮＡ部位の一方又は両方の鎖を切断する。一部の実施形態では、標的ＤＮＡ部位の切断の後に、例えば、細胞修復機構による、変更、例えば、挿入又は欠失の形成が続く。
一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質を修飾して、ヌクレアーゼを不活性化する（例えば、ヌクレアーゼ欠失Ｃａｓ９）。野生型Ｃａｓ９は、ｇＲＮＡがターゲティングする特定のＤＮＡ配列に二本鎖切断（ＤＳＢ）を生成するのに対し、修飾された機能性を有するいくつかのＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼが入手可能であり、例えば：Ｃａｓ９の「ニッカーゼ」バージョンは、一本鎖切断のみを生成し；触媒として不活性のＣａｓ９（「ｄＣａｓ９」）は、標的ＤＮＡを切断しない。一部の実施形態では、ＤＮＡ配列とｄＣａｓ９の結合は、立体障害により当該部位の転写に干渉する。一部の実施形態では、アンカー配列へのｄＣａｓ９の結合は、ゲノム複合体（例えば、ＡＳＭＣ）の形成及び／又は維持に干渉（例えば、低減又は防止）し得る。一部の実施形態では、ターゲティング部分は、触媒として不活性のＣａｓ９、例えば、ｄＣａｓ９、例えば、Ｃａｓ９ｍ４を含む。触媒として不活性の多くのＣａｓ９タンパク質が当技術分野で知られている。一部の実施形態では、ｄＣａｓ９は、Ｃａｓタンパク質の各エンドヌクレアーゼドメインに突然変異、例えば、Ｄ１０Ａ及びＨ８４０Ａ突然変異を含む。
一部の実施形態では、触媒として不活性のＣａｓ９タンパク質、例えば、ｄＣａｓ９は、Ｄ１１Ａ突然変異、又は前記位置に対応するアミノ酸への類似の置換を含む。一部の実施形態では、触媒として不活性のＣａｓ９タンパク質、例えば、ｄＣａｓ９は、Ｈ９６９Ａ突然変異、又は前記位置に対応するアミノ酸への類似の置換を含む。一部の実施形態では、触媒として不活性のＣａｓ９タンパク質、例えば、ｄＣａｓ９は、Ｎ９９５Ａ突然変異、又は前記位置に対応するアミノ酸への類似の置換を含む。一部の実施形態では、触媒として不活性のＣａｓ９タンパク質、例えば、ｄＣａｓ９は、Ｄ１１Ａ、Ｈ９６９Ａ、及びＮ９９５Ａ突然変異、又は前記位置に対応するアミノ酸への類似の置換を含む。
一部の実施形態では、触媒として不活性のＣａｓ９タンパク質、例えば、ｄＣａｓ９は、Ｄ１０Ａ突然変異、又は前記位置に対応するアミノ酸への類似の置換を含む。一部の実施形態では、触媒として不活性のＣａｓ９タンパク質、例えば、ｄＣａｓ９は、Ｈ５５７Ａ突然変異、又は前記位置に対応するアミノ酸への類似の置換を含む。一部の実施形態では、触媒として不活性のＣａｓ９タンパク質、例えば、ｄＣａｓ９は、Ｄ１０Ａ及びＨ５５７Ａ突然変異、又は前記位置に対応するアミノ酸への類似の置換を含む。
一部の実施形態では、触媒として不活性のＣａｓ９タンパク質、例えば、ｄＣａｓ９は、Ｄ８３９Ａ突然変異、又は前記位置に対応するアミノ酸への類似の置換を含む。一部の実施形態では、触媒として不活性のＣａｓ９タンパク質、例えば、ｄＣａｓ９は、Ｈ８４０Ａ突然変異、又は前記位置に対応するアミノ酸への類似の置換を含む。一部の実施形態では、触媒として不活性のＣａｓ９タンパク質、例えば、ｄＣａｓ９は、Ｎ８６３Ａ突然変異、又は前記位置に対応するアミノ酸への類似の置換を含む。一部の実施形態では、触媒として不活性のＣａｓ９タンパク質、例えば、ｄＣａｓ９は、Ｄ１０Ａ、Ｄ８３９Ａ、Ｈ８４０Ａ、及びＮ８６３Ａ突然変異、又は前記位置に対応するアミノ酸への類似の置換を含む。
一部の実施形態では、触媒として不活性のＣａｓ９タンパク質、例えば、ｄＣａｓ９は、Ｅ９９３Ａ突然変異、又は前記位置に対応するアミノ酸への類似の置換を含む。
一部の実施形態では、触媒として不活性のＣａｓ９タンパク質、例えば、ｄＣａｓ９は、Ｄ９１７Ａ突然変異、又は前記位置に対応するアミノ酸への類似の置換を含む。一部の実施形態では、触媒として不活性のＣａｓ９タンパク質、例えば、ｄＣａｓ９は、Ｅ１００６Ａ突然変異、又は前記位置に対応するアミノ酸への類似の置換を含む。一部の実施形態では、触媒として不活性のＣａｓ９タンパク質、例えば、ｄＣａｓ９は、Ｄ１２５５Ａ突然変異、又は前記位置に対応するアミノ酸への類似の置換を含む。一部の実施形態では、触媒として不活性のＣａｓ９タンパク質、例えば、ｄＣａｓ９は、Ｄ９１７Ａ、Ｅ１００６Ａ、及びＤ１２５５Ａ突然変異、又は前記位置に対応するアミノ酸への類似の置換を含む。
一部の実施形態では、触媒として不活性のＣａｓ９タンパク質、例えば、ｄＣａｓ９は、Ｄ１６Ａ突然変異、又は前記位置に対応するアミノ酸への類似の置換を含む。一部の実施形態では、触媒として不活性のＣａｓ９タンパク質、例えば、ｄＣａｓ９は、Ｄ５８７Ａ突然変異、又は前記位置に対応するアミノ酸への類似の置換を含む。一部の実施形態では、触媒として不活性のＣａｓ９タンパク質、例えば、ｄＣａｓ９は、Ｈ５８８Ａ突然変異、又は前記位置に対応するアミノ酸への類似の置換を含む。一部の実施形態では、触媒として不活性のＣａｓ９タンパク質、例えば、ｄＣａｓ９は、Ｎ６１１Ａ突然変異、又は前記位置に対応するアミノ酸への類似の置換を含む。一部の実施形態では、触媒として不活性のＣａｓ９タンパク質、例えば、ｄＣａｓ９は、Ｄ１６Ａ、Ｄ５８７Ａ、Ｈ５８８Ａ、及びＮ６１１Ａ突然変異、又は前記位置に対応するアミノ酸への類似の置換を含む。
いくつかの態様では、本明細書に記載のシステムは、部位特異的妨害剤、又は１つ若しくは複数（例えば、１つ）のターゲティング部分及び１つ若しくは複数のエフェクター部分（例えば、１つ又は２つのエフェクター部分）を含む、ポリペプチドを含み、又は本明細書に記載の方法は、その使用を含み、ここで、１つ又は複数のターゲティング部分は、Ｃａｓタンパク質、例えば、触媒として不活性のＣａｓ９タンパク質、例えば、ｓａｄＣａｓ９、ｄＣａｓ９、例えば、ｄＣａｓ９ｍ４、又はその機能性変異体若しくは断片を含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子であるか、又はそれを含む。一部の実施形態では、ｄＣａｓ９は、配列番号５、６、又は７のアミノ酸配列を含む。
Ｃａｓ９
ｄＣａｓ９（Ｃａｓ９ｍ４）
Ｓａ－ｄＣａｓ９
一部の実施形態では、ｄＣａｓ９は、配列番号８又は９の核酸配列によりコードされる。
ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）
一部の実施形態では、ターゲティング部分は、ｇＲＮＡを含むか、又はそれと（例えば、共有）結合したＣａｓ分子を含み得る。ｇＲＮＡは、Ｃａｓ－タンパク質結合に必要な「スカフォールド」配列と、ゲノム標的のためのユーザ定義の約２０ヌクレオチドターゲティング配列から構成される短い合成ＲＮＡである。実際には、ガイドＲＮＡ配列は、概して１７～２４ヌクレオチド（例えば、１９、２０、又は２１ヌクレオチド）の間の長さを有するように設計され、且つ標的化核酸配列に対して相補的である。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、３～６個の隣接するホスホロチオエート（ＰＳ）結合、例えば、各末端に３個の隣接するＰＳ結合を含む。カスタムｇＲＮＡジェネレータ及びアルゴリズムは、有効なガイドＲＮＡの設計に使用する目的で市販されている。遺伝子編集はまた、キメラ「単一ガイドＲＮＡ」（「ｓｇＲＮＡ」）、操作（合成）単一ＲＮＡ分子を用いても達成されており、これは、天然に存在するｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体を模倣し、ｔｒａｃｒＲＮＡ（ヌクレアーゼとの結合用）と、少なくとも１つのｃｒＲＮＡ（編集のためにターゲティングされる配列にヌクレアーゼを誘導する）の両方を含有する。キメラ編集ｓｇＲＮＡはまた、Ｃａｓタンパク質と一緒に使用する上で有効であることが実証されている；例えば、Ｈｅｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，９８５－９９１を参照されたい。
一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、標的遺伝子に関連するＤＮＡ配列と相補的な核酸配列を含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ配列は、標的遺伝子と作動可能に連結した発現制御エレメントであるか、それを含むか、又はそれと重複する。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、標的遺伝子に関連するＤＮＡ配列と少なくとも９０、９５、９９、又は１００％相補的な核酸配列を含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ分子を含むターゲティング部分と一緒に使用されるｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡである。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、表４、表５、表６、表７から選択される配列、又はそれと少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％の同一性を有するか、若しくはそれと１、２、３、４、若しくは５つ以下の位置で異なる配列を含む核酸配列と結合する。
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子と一緒に使用されるｇＲＮＡは、β－２－ミクログロブリン発現に関連する標的配列に特異的に結合する。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子と一緒に使用されるｇＲＮＡは、１つ又は複数のＣＸＣＬ１～８遺伝子発現に関連する標的配列に特異的に結合する。そのようなｇＲＮＡは、配列番号２０～６２から選択される標的結合配列を含み得る。
一部の実施形態では、ターゲティング部分は、ＴＡＬエフェクター分子であるか、又はそれを含む。ＴＡＬエフェクター分子、例えば、ＤＮＡ配列に特異的に結合するＴＡＬエフェクター分子は、複数のエフェクタードメイン又はその断片と、任意選択的に天然に存在するＴＡＬエフェクター（例えば、複数のＴＡＬエフェクタードメインのＮ－及び／又はＣ－末端）の１つ若しくは複数の別の部分を含む。多くのＴＡＬエフェクターが当業者に公知であり、例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから市販されている。
ＴＡＬＥは、宿主植物における遺伝子発現を調節して、細菌のコロニー形成及び生存を促進する植物病原菌キサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）などの多くの病原菌種により分泌される天然のタンパク質である。ＴＡＬエフェクターの特異的な結合は、典型的には３３又は３４アミノ酸のタンデムに配列されたほぼ同一の反復配列から成る中央リピートドメイン（リピート可変二残基、ＲＶＤドメイン）に基づく。
ＴＡＬエフェクターファミリーのメンバーは、主にそれらのリピートの数及び順序が異なる。反復配列の数は、１．５～３３．５リピートの範囲であり、Ｃ－末端リピートは、通常、長さが短く（例えば、約２０アミノ酸）、一般に「ハーフリピート」と呼ばれる。ＴＡＬエフェクターの各リピートは、異なる塩基対特異性を呈示する異なるリピートタイプとの１リピート対１塩基対相関を特徴とする（１リピートが、標的遺伝子配列上の１塩基対を認識する）。概して、リピートの数が少ないほど、タンパク質－ＤＮＡ相互作用が弱くなる。６．５リピートの数は、リポータ遺伝子の転写を活性化する上で十分であることが判明している（Ｓｃｈｏｌｚｅ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。
リピート対リピートの変化は、主としてアミノ酸位置１２及び１３で起こり、そのため、これらは、「超可変」と呼ばれており、また、これは、例示的なリピート可変二残基（ＲＶＤ）及び核酸塩基標的とのそれらの対応を列記する表２に示すように、標的ＤＮＡプロモータ配列との相互作用の特異性の原因となる。
従って、特定のＤＮＡ配列をターゲティングするように、ＴＡＬエフェクターのリピートを修飾することが可能である。さらなる研究から、ＲＶＤ ＮＫがＧをターゲティングすることができることが明らかにされている。ＴＡＬエフェクターの標的部位は、最初のリピートがターゲティングする５’塩基とフランキングするＴを含む傾向もあるが、この認識の厳密な機構は不明である。現在までに１１３を超えるＴＡＬエフェクター配列がわかっている。キサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）からのＴＡＬエフェクターの非限定的な例として、Ｈａｘ２、Ｈａｘ３、Ｈａｘ４、ＡｖｒＸａ７、ＡｖｒＸａ１０及びＡｖｒＢｓ３が挙げられる。
従って、本開示のＴＡＬエフェクター分子のＴＡＬエフェクタードメインは、任意の細菌種（例えば、キサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）種、例えば、白葉枯病菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ．Ｏｒｙｚａｅ）のアフリカ株（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．２０１１）、アブラナ科野菜斑点細菌病菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｒａｐｈａｎｉ）株７５６Ｃ及びイネ白葉枯病菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ．ｏｒｙｚｉｃｏｌａ）株ＢＬＳ２５６（Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ ｅｔ ａｌ．２０１１）由来のＴＡＬエフェクターから得ることができる。本明細書で使用される場合、本開示に従うＴＡＬエフェクタードメインは、ＲＶＤドメイン、並びにやはり天然に存在するＴＡＬエフェクター由来のフランキング配列（ＲＶＤドメインのＮ－末端及び／又はＣ－末端上の配列）を含む。これは、天然に存在するＴＡＬエフェクターのＲＶＤより多いか、又は少ないリピートを含み得る。本開示のＴＡＬエフェクター分子は、前述のコード及び当技術分野で既知の他のコードに基づく所与のＤＮＡ配列をターゲティングするように設計される。ＴＡＬエフェクタードメイン（例えば、リピート（モノマー又はモジュール）の数及びそれらの配列は、所望のＤＮＡ標的配列に基づいて選択される。例えば、特定の標的配列に合わせるために、ＴＡＬエフェクタードメイン、例えば、リピートを除去又は付加してもよい。一実施形態では、本開示のＴＡＬエフェクター分子は、６．５～３３．５のＴＡＬエフェクタードメイン、例えば、リピートを含む。一実施形態では、本開示のＴＡＬエフェクター分子は、８～３３．５のＴＡＬエフェクタードメイン、例えば、リピート、例えば、１０～２５のＴＡＬエフェクタードメイン、例えば、リピート、例えば、１０～１４のＴＡＬエフェクタードメイン、例えば、リピートを含む。
一部の実施形態では、ＴＡＬエフェクター分子は、ＤＮＡ標的配列との完全なマッチに対応するＴＡＬエフェクタードメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ標的配列上のリピートと標的塩基対との間のミスマッチは、それが、ＴＡＬエフェクター分子を含む部位特異的妨害剤の機能を可能にする場合に限って許容される。一般に、ＴＡＬＥ結合は、ミスマッチの数と逆相関する。一部の実施形態では、本開示の部位特異的妨害剤のＴＡＬエフェクター分子は、標的ＤＮＡ配列に対して、７つ、６つ、５つ、４つ、３つ、２つ、又は１つ以下のミスマッチ、また任意選択的にゼロのミスマッチを含む。理論に束縛されることは望まないが、一般に、ＴＡＬエフェクター分子中のＴＡＬエフェクタードメインの数が少ないほど、より少数のミスマッチが許容され、これは、ＴＡＬエフェクター分子を含む部位特異的妨害剤の機能を依然として可能にする。結合親和性は、マッチするリピート－ＤＮＡ組合せの合計に依存すると考えられる。例えば、２５以上のＴＡＬエフェクタードメインを有するＴＡＬエフェクター分子は、最大７つのミスマッチを許容することができる。
ＴＡＬエフェクタードメインに加えて、本開示のＴＡＬエフェクター分子は、天然に存在するＴＡＬエフェクターに由来する追加の配列を含んでもよい。ＴＡＬエフェクター分子のＴＡＬエフェクタードメイン部分の両側に含まれるＣ－末端及び／又はＮ－末端配列の長さは、変動し得、例えば、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１１）の研究に基づいて、当業者により選択することができる。Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．は、Ｈａｘ３由来のＴＡＬエフェクターベースのタンパク質中のいくつかのＣ－末端及びＮ－末端切断変異体を特性決定し、標的配列との最適な結合、従って転写の活性化に寄与する重要なエレメントを同定した。概して、転写活性は、Ｎ－末端の長さと逆相関することが判明した。Ｃ－末端に関しては、Ｈａｘ３配列の最初の６８アミノ酸内のＤＮＡ結合残基に重要なエレメントが同定された。従って、一部の実施形態では、天然に存在するＴＡＬエフェクターのＴＡＬエフェクタードメインのＣ－末端側の最初の６８アミノ酸は、本開示の部位特異的妨害剤のＴＡＬエフェクター分子に含まれる。従って、一実施形態では、本開示のＴＡＬエフェクター分子は、以下：１）天然に存在するＴＡＬエフェクター由来の１つ若しくは複数のＴＡＬエフェクタードメイン；２）ＴＡＬエフェクタードメインのＮ－末端側の天然に存在するＴＡＬエフェクター由来の少なくとも７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１７０、１８０、１９０、２００、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０以上のアミノ酸；及び／又は３）ＴＡＬエフェクタードメインのＣ－末端側の少なくとも６８、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１７０、１８０、１９０、２００、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０以上のアミノ酸を含む。
一部の実施形態では、ターゲティング部分は、Ｚｎフィンガー分子であるか、又はそれを含む。Ｚｎフィンガー分子は、Ｚｎフィンガータンパク質、例えば、天然に存在するＺｎフィンガータンパク質若しくは操作Ｚｎフィンガータンパク質、又はその断片を含む。多くのＺｎフィンガータンパク質が当業者に公知であり、例えば、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから、市販されている。
一部の実施形態では、Ｚｎフィンガー分子は、選択した標的ＤＮＡ配列に結合するように操作された非天然のＺｎフィンガータンパク質を含む。例えば、以下を参照されたい：Ｂｅｅｒｌｉ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１３５－１４１；Ｐａｂｏ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：３１３－３４０；Ｉｓａｌａｎ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６５６－６６０；Ｓｅｇａｌ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：６３２－６３７；Ｃｈｏｏ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：４１１－４１６；米国特許第６，４５３，２４２号明細書；同第６，５３４，２６１号明細書；同第６，５９９，６９２号明細書；同第６，５０３，７１７号明細書；同第６，６８９，５５８号明細書；同第７，０３０，２１５号明細書；同第６，７９４，１３６号明細書；同第７，０６７，３１７号明細書；同第７，２６２，０５４号明細書；同第７，０７０，９３４号明細書；同第７，３６１，６３５号明細書；同第７，２５３，２７３号明細書；及び米国特許出願公開第２００５／００６４４７４号明細書；同第２００７／０２１８５２８号明細書；同第２００５／０２６７０６１号明細書（全て、それらの全体が、参照により本明細書に組み込まれる）。
操作Ｚｎフィンガータンパク質は、天然に存在するＺｎフィンガータンパク質と比較して、新たな結合特異性を有し得る。操作方法として、限定されないが、合理的設計及び様々なタイプの選択が挙げられる。合理的設計は、例えば、トリプレット（クアドルプレット）ヌクレオチド配列と個別のＺｎフィンガーアミノ酸配列の使用を含み、ここで、トリプレット又はクアドルプレットヌクレオチド配列は各々、上記の特定のトリプレット又はクアドルプレット配列に結合するジンクフィンガーの１つ若しくは複数のアミノ酸配列と結合している。例えば、米国特許第６，４５３，２４２号明細書及び同第６，５３４，２６１号明細書（それらの全体が、参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
ファージディスプレイ及びツーハイブリッドシステムを含む例示的な選択方法が、以下：米国特許第５，７８９，５３８号明細書；同第５，９２５，５２３号明細書；同第６，００７，９８８号明細書；同第６，０１３，４５３号明細書；同第６，４１０，２４８号明細書；同第６，１４０，４６６号明細書；同第６，２００，７５９号明細書；及び同第６，２４２，５６８号明細書；並びに国際公開第９８／３７１８６号パンフレット；同第９８／５３０５７号パンフレット；同第００／２７８７８号パンフレット；及び同第０１／８８１９７号パンフレット並びに英国特許第２，３３８，２３７号明細書に開示されている。加えて、ジンクフィンガータンパク質に対する結合特異性の増強が、例えば、国際公開第０２／０７７２２７号パンフレットに記載されている。
さらに、上記の参照文献及びその他の参照文献に開示されているように、ジンクフィンガードメイン及び／又はマルチフィンガージンクフィンガータンパク質は、任意の好適なリンカー配列を用いて互いに連結されていてもよく、そうしたリンカーとして例えば、長さが５アミノ酸以上のリンカーが挙げられる。また、長さが６アミノ酸以上の例示的なリンカー配列については、米国特許第６，４７９，６２６号明細書；同第６，９０３，１８５号明細書；及び同第７，１５３，９４９号明細書を参照されたい。本明細書に記載されるタンパク質は、当該タンパク質の個々のジンクフィンガー間に好適なリンカーの任意の組合せを含んでもよい。加えて、ジンクフィンガー結合ドメインに対する結合特異性の増強については、例えば、共同所有国際公開第０２／０７７２２７号パンフレットに記載されている。
融合タンパク質（及びそれをコードするポリヌクレオチド）の設計及び構築のためのＺｎフィンガータンパク質及び方法は、当業者には周知であり、以下に詳しく記載されている：米国特許第６，１４０，０８１５号明細書；同第７８９，５３８号明細書；同第６，４５３，２４２号明細書；同第６，５３４，２６１号明細書；同第５，９２５，５２３号明細書；同第６，００７，９８８号明細書；同第６，０１３，４５３号明細書；及び同第６，２００，７５９号明細書；国際公開第９５／１９４３１号パンフレット；同第９６／０６１６６号パンフレット；同第９８／５３０５７号パンフレット；同第９８／５４３１１号パンフレット；同第００／２７８７８号パンフレット；同第０１／６０９７０号パンフレット；同第０１／８８１９７号パンフレット；同第０２／０９９０８４号パンフレット；同第９８／５３０５８号パンフレット；同第９８／５３０５９号パンフレット；同第９８／５３０６０号パンフレット；同第０２／０１６５３６号パンフレット；及び同第０３／０１６４９６号パンフレット。
さらに、上記の、及びその他の参照文献に開示されているように、ジンクフィンガータンパク質及び／又はマルチフィンガーＺｎフィンガータンパク質は、例えば、融合タンパク質と同様に、任意の好適なリンカー配列を用いて互いに連結されていてもよく、そうしたリンカーとして例えば、長さが５アミノ酸以上のリンカーが挙げられる。また、長さが６アミノ酸以上の例示的なリンカー配列については、米国特許第６，４７９，６２６号明細書；同第６，９０３，１８５号明細書；及び同第７，１５３，９４９号明細書を参照されたい。本明細書に記載されるＺｎフィンガー分子は、当該Ｚｎフィンガー分子の個々のジンクフィンガータンパク質及び／又はマルチフィンガーＺｎフィンガータンパク質の間に好適なリンカーの任意の組合せを含んでもよい。
特定の実施形態では、ターゲティング部分は、標的ＤＮＡ配列に（配列特異的に）結合する操作ジンクフィンガータンパク質を含むＺｎフィンガー分子を含む。一部の実施形態では、Ｚｎフィンガー分子は、１つのＺｎフィンガータンパク質又はその断片を含む。別の実施形態では、Ｚｎフィンガー分子は、複数のＺｎフィンガータンパク質（又はその断片）、例えば、２、３、４、５、６以上のＺｎフィンガータンパク質（及び任意選択的に、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、若しくは２以下のフィンガータンパク質）を含む。一部の実施形態では、Ｚｎフィンガー分子は、少なくとも３つのＺｎフィンガータンパク質を含む。一部の実施形態では、Ｚｎフィンガー分子は、４、５、又は６つのフィンガーを含む。一部の実施形態では、Ｚｎフィンガー分子は、８、９、１０、１１、又は１２のフィンガーを含む。一部の実施形態では、３つのＺｎフィンガータンパク質を含むＺｎフィンガー分子は、９又は１０ヌクレオチドを含む標的ＤＮＡ配列を認識する。一部の実施形態では、４つのＺｎフィンガータンパク質を含むＺｎフィンガー分子は、１２～１４ヌクレオチドを含む標的ＤＮＡ配列を認識する。一部の実施形態では、６つのＺｎフィンガータンパク質を含むＺｎフィンガー分子は、１８～２１ヌクレオチドを含む標的ＤＮＡ配列を認識する。
一部の実施形態では、Ｚｎフィンガー分子は、２枝型（ｔｗｏ ｈａｎｄｅｄ）Ｚｎフィンガータンパク質を含む。２枝型Ｚｎフィンガータンパク質は、２つのジンクフィンガードメインが２つの不連続標的部位に結合するように、ジンクフィンガータンパク質の２つのクラスターが、アミノ酸を介在することにより隔てられている、タンパク質である。２枝型のジンクフィンガー結合タンパク質の例は、ＳＩＰ１であり、この場合、４個のジンクフィンガータンパク質のクラスターが、タンパク質のアミノ末端に位置し、３個のＺｎフィンガータンパク質のクラスターが、カルボキシル末端に位置する（Ｒｅｍａｄｅ，ｅｔ ａｌ．（１９９９）ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ、１８（１８）：５０７３－５０８４を参照）。これらのタンパク質中のジンクフィンガーの各クラスターは、ユニークな標的配列に結合することができ、２つの標的配列間のスペーシングは、多くのヌクレオチドを含むことができる。
一部の実施形態では、ターゲティング部分は、ヌクレアーゼに由来するＤＮＡ結合ドメインであるか、又はそれを含む。例えば、Ｉ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＣｅｕＩ、ＰＩ－ＰｓｐＩ、ＰＩ－Ｓｃｅ、Ｉ－ＳｃｅＩＶ、Ｉ－ＣｓｍＩ、Ｉ－ＰａｎＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩ、Ｉ－ＰｐｏＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＴｅｖＩ、Ｉ－ＴｅｖＩＩ、及びＩ－ＴｅｖＩＩＩなどのホーミングエンドヌクレアーゼ及びメガヌクレアーゼの認識配列が知られている。米国特許第５，４２０，０３２号明細書；同第６，８３３，２５２号明細書；Ｂｅｌｆｏｒｔ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５：３３７９－３３８８；Ｄｕｊｏｎ，ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｇｅｎｅ ８２：１１５－１１８；Ｐｅｒｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９９４），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：１１２５－１１２７；Ｊａｓｉｎ（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１２：２２４－２２８；Ｇｉｍｂｌｅ，ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：１６３－１８０；Ａｒｇａｓｔ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８０：３４５－３５３及びＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓのカタログも参照されたい。加えて、ホーミングエンドヌクレアーゼ及びメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合特異性を操作して、非天然の標的部位を結合することができる。例えば、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ １０：８９５－９０５；Ｅｐｉｎａｔ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：２９５２－２９６２；Ａｓｈｗｏｒｔｈ，ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｎａｔｕｒｅ ４４１：６５６－６５９；Ｐａｑｕｅｓ，ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７：４９－６６；米国特許出願公開第２００７／０１１７１２８号明細書を参照されたい。
一部の実施形態では、ターゲティング部分は、核酸を含む。一部の実施形態では、ターゲティング部分に含まれ得る核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及び／又は人工若しくは合成核酸又は核酸アナログ若しくは模倣物であってもよいし、或いはそれを含有してもよい。例えば、一部の実施形態では、核酸は、以下：ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ペプチド－オリゴヌクレオチドコンジュゲート、ロック核酸（ＬＮＡ）、架橋核酸（ＢＮＡ）、ポリアミド、トリプレックス形成オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｇＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ若しくは他のＲＮＡｉ分子（例えば、本明細書に記載されるノンコーディングＲＮＡをターゲティングするもの、及び／又は本明細書に記載される標的化ゲノム複合体に関連する特定の遺伝子の発現産物をターゲティングするもの）などのうちの１つ若しくは複数であるか、又はそれを含み得る。一部の実施形態では、核酸は、天然に存在するＤＮＡ又はＲＮＡ残基ではない１つ若しくは複数の残基を含んでもよく、リン酸ジエステル結合ではない１つ若しくは複数の連結（例えば、ホスホロチオエート結合などであり得る）を含んでもよく、且つ／又は例えば、２’－ＯＭｅＰといった２’Ｏ修飾などの１つ若しくは複数の修飾を含んでもよい。合成核酸を調製するのに有用な種々の核酸構造は当技術分野で公知であり（例えば、国際公開第２０１７／０６２８６２ｌ号パンフレット及び同第２０１４／０１２０８１号パンフレットを参照）、当業者は、これらが、本開示に従って使用され得ることを理解されよう。
部位特異的妨害剤、例えば、ターゲティング部分に使用するのに好適な核酸配列として、限定されないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾オリゴヌクレオチド（例えば、化学修飾、例えば、骨格連結、糖分子、及び／又は核酸塩基を変更する修飾など）、並びに人工核酸を挙げることができる。一部の実施形態では、核酸として、限定されないが、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）若しくはペプチドオリゴヌクレオチドコンジュゲート、ロック核酸（ＬＮＡ）、架橋核酸（ＢＮＡ）、ポリアミド、トリプレックス形成オリゴヌクレオチド、修飾ＤＮＡ、アンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチド、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、修飾ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｇＲＮＡ、及びｓｉＲＮＡ又は他のＲＮＡ若しくはＤＮＡ分子が挙げられる。
一部の実施形態では、ターゲティング部分は、約１５～２００、２０～２００、３０～２００、４０～２００、５０～２００、６０～２００、７０～２００、８０～２００、９０～２００、１００～２００、１１０～２００、１２０～２００、１３０～２００、１４０～２００、１５０～２００、１６０～２００、１７０～２００、１８０～２００、１９０～２００、２１５～１９０、２０～１９０、３０～１９０、４０～１９０、５０～１９０、６０～１９０、７０～１９０、８０～１９０、９０～１９０、１００～１９０、１１０～１９０、１２０～１９０、１３０～１９０、１４０～１９０、１５０～１９０、１６０～１９０、１７０～１９０、１８０～１９０、１５～１８０、２０～１８０、３０～１８０、４０～１８０、５０～１８０、６０～１８０、７０～１８０、８０～１８０、９０～１８０、１００～１８０、１１０～１８０、１２０～１８０、１３０～１８０、１４０～１８０、１５０～１８０、１６０～１８０、１７０～１８０、１５～１７０、２０～１７０、３０～１７０、４０～１７０、５０～１７０、６０～１７０、７０～１７０、８０～１７０、９０～１７０、１００～１７０、１１０～１７０、１２０～１７０、１３０～１７０、１４０～１７０、１５０～１７０、１６０～１７０、１５～１６０、２０～１６０、３０～１６０、４０～１６０、５０～１６０、６０～１６０、７０～１６０、８０～１６０、９０～１６０、１００～１６０、１１０～１６０、１２０～１６０、１３０～１６０、１４０～１６０、１５０～１６０、２１５～１５０、２０～１５０、３０～１５０、４０～１５０、５０～１５０、６０～１５０、７０～１５０、８０～１５０、９０～１５０、１００～１５０、１１０～１５０、１２０～１５０、１３０～１５０、１４０～１５０、１５～１４０、２０～１４０、３０～１４０、４０～１４０、５０～１４０、６０～１４０、７０～１４０、８０～１４０、９０～１４０、１００～１４０、１１０～１４０、１２０～１４０、１３０～１４０、１５～１３０、２０～１３０、３０～１３０、４０～１３０、５０～１３０、６０～１３０、７０～１３０、８０～１３０、９０～１３０、１００～１３０、１１０～１３０、１２０～１３０、２１５～１２０、２０～１２０、３０～１２０、４０～１２０、５０～１２０、６０～１２０、７０～１２０、８０～１２０、９０～１２０、１００～１２０、１１０～１２０、１５～１１０、２０～１１０、３０～１１０、４０～１１０、５０～１１０、６０～１１０、７０～１１０、８０～１１０、９０～１１０、１００～１１０、１５～１００、２０～１００、３０～１００、４０～１００、５０～１００、６０～１００、７０～１００、８０～１００、９０～１００、１５～９０、２０～９０、３０～９０、４０～９０、５０～９０、６０～９０、７０～９０、８０～９０、１５～８０、２０～８０、３０～８０、４０～８０、５０～８０、６０～８０、７０～８０、１５～７０、２０～７０、３０～７０、４０～７０、５０～７０、６０～７０、１５～６０、２０～６０、３０～６０、４０～６０、５０～６０、１５～５０、２０～５０、３０～５０、４０～５０、１５～４０、２０～４０、３０～４０、１５～３０、２０～３０、若しくは１５～２０ヌクレオチド、又はそれらの間の任意の範囲の長さを有する核酸を含む。
エフェクター部分
本開示の部位特異的妨害剤は、１つ又は複数のエフェクター部分を含み得る。エフェクター部分は、本明細書に記載の部位特異的妨害剤の一部として使用される場合、細胞内の標的複数遺伝子の発現を調節、例えば、低減する、１つ又は複数の機能性を有する。一部の実施形態では、エフェクター部分は、例えば、アンカー配列へのゲノム複合体成分（例えば、核形成ポリペプチド）の結合が阻害される（例えば、防止される）ように、アンカー配列を物理的又は立体的に遮断する。一部の実施形態では、エフェクター部分は、例えば、ゲノム複合体成分がアンカー配列に結合する親和性及び／又はアビディティーを変更する（例えば、低減する）ことにより、ゲノム複合体成分（例えば、核形成ポリペプチド）とアンカー配列との相互作用を不安定化する。例えば、エフェクター部分は、ゲノム複合体、例えば、ＡＳＭＣの形成を阻害するか、若しくは不安定化させる因子を動員し得るか、又はゲノム複合体（例えば、ＡＳＭＣ）の形成又は維持に必要な因子（例えば、ゲノム複合体成分又は転写因子）の動員を阻害し得る。一部の実施形態では、エフェクター部分は、標的複数遺伝子の発現を低減するために、例えば、ＤＮＡ又はそれに関連するヒストンへの１つ又は複数のエピジェネティック修飾の適用又は除去を促進する（例えば、触媒する）ことによって、アンカー配列又はアンカー配列に近接した配列のエピジェネティックランドスケープを調節するという点で、エピジェネティック修飾機能性を有する。一部の実施形態では、エフェクター部分は、遺伝子修飾機能性を有し、例えば、アンカー配列又はそれに近接した配列に変更（例えば、挿入、欠失、又は置換）を導入する。
一部の実施形態では、エフェクター部分は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子、ＴＡＬエフェクター分子、Ｚｎフィンガー分子、ｔｅｔＲドメイン、又はメガヌクレアーゼを含む。一部の実施形態では、エフェクター部分は、遺伝子修飾機能性、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子、ＴＡＬエフェクター分子、本明細書に記載の方法において遺伝子修飾を行うことができるエンドヌクレアーゼ活性を有するＺｎフィンガー分子を有する。
一部の実施形態では、エフェクター部分は、ヒストン修飾機能性、例えば、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ヒストンデメチラーゼ、又はヒストンデアセチラーゼ活性を含む。一部の実施形態では、ヒストンメチルトランスフェラーゼ機能性は、メチルトランスフェラーゼ活性をターゲティングするＨ３Ｋ９を含む。一部の実施形態では、ヒストンメチルトランスフェラーゼ機能性は、メチルトランスフェラーゼ活性をターゲティングするＨ３Ｋ５６を含む。一部の実施形態では、ヒストンメチルトランスフェラーゼ機能性は、メチルトランスフェラーゼ活性をターゲティングするＨ３Ｋ２７を含む。一部の実施形態では、ヒストンメチルトランスフェラーゼ又はデメチラーゼ機能性は、１つ、２つ、又は３つのメチル基を転移する。一部の実施形態では、ヒストンデメチラーゼ機能性は、Ｈ３Ｋ４ターゲティングデメチラーゼ活性を含む。一部の実施形態では、エフェクター部分は、ＳＥＴＤＢ１、ＳＥＴＤＢ２、ＥＨＭＴ２（すなわち、Ｇ９Ａ）、ＥＨＭＴ１（すなわち、ＧＬＰ）、ＳＵＶ３９Ｈ１、ＥＺＨ２、ＥＺＨ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＳＥＴＤ８、ＳＵＶ４２０Ｈ１、ＳＵＶ４２０Ｈ２、又はその機能性変異体若しくは断片、例えば、それらのいずれかのＳＥＴドメインから選択されるタンパク質を含む。一部の実施形態では、エフェクター部分は、ＫＤＭ１Ａ（すなわち、ＬＳＤ１）、ＫＤＭ１Ｂ（すなわち、ＬＳＤ２）、ＫＤＭ２Ａ、ＫＤＭ２Ｂ、ＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、ＫＤＭ５Ｄ、ＫＤＭ４Ｂ、ＮＯ６６、又はそれらいずれかの機能性変異体若しくは断片から選択されるタンパク質を含む。一部の実施形態では、エフェクター部分は、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ９、ＨＤＡＣ１０、ＨＤＡＣ１１、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、ＳＩＲＴ７、ＳＩＲＴ８、ＳＩＲＴ９、又はそれらいずれかの機能性変異体若しくは断片から選択されるタンパク質を含む。
一部の実施形態では、エフェクター部分は、ＤＮＡ修飾機能性、例えばＤＮＡメチルトランスフェラーゼを含む。一部の実施形態では、エフェクター部分は、ＭＱ１、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ１、ＤＮＭＴ３Ａ２、ＤＮＭＴ３Ｂ１、ＤＮＭＴ３Ｂ２、ＤＮＭＴ３Ｂ３、ＤＮＭＴ３Ｂ４、ＤＮＭＴ３Ｂ５、ＤＮＭＴ３Ｂ６、ＤＮＭＴ３Ｌ、又はそれらいずれかの機能性変異体若しくは断片から選択されるタンパク質を含む。
一部の実施形態では、エフェクター部分は、転写抑制因子を含む。一部の実施形態では、転写抑制因子は、転写、例えば、標的遺伝子の転写を、刺激又は促進する因子の動員を遮断する。一部の実施形態では、転写抑制因子は、転写、例えば、標的遺伝子の転写を阻害する因子を動員する。一部の実施形態では、エフェクター部分、例えば、転写リプレッサーは、ＫＲＡＢ、ＭｅＣＰ２、ＨＰ１、ＲＢＢＰ４、ＲＥＳＴ、ＦＯＧ１、ＳＵＺ１２、又はそれらいずれかの機能性変異体若しくは断片から選択されるタンパク質であるか、又はそれを含む。
一部の実施形態では、エフェクター部分は、本明細書に記載の機能性を有するタンパク質を含む。一部の実施形態では、エフェクター部分は、以下から選択されるタンパク質を含む：
ＫＲＡＢ（例えば、ＮＰ＿０５６２０９．２、又はＮＭ＿０１５３９４．５によりコードされるタンパク質に従う）；
ＳＥＴドメイン（例えば、以下のＳＥＴドメイン：
ＳＥＴＤＢ１（例えば、ＮＰ＿００１３５３３４７．１、又はＮＭ＿００１３６６４１８．１によりコードされるタンパク質に従う）；
ＥＺＨ２（例えば、ＮＰ－００４４４７．２若しくはＮＰ＿００１１９０１７６．１、又はＮＭ＿００４４５６．５若しくはＮＭ＿００１２０３２４７．２によりコードされるタンパク質に従う）；
Ｇ９Ａ（例えば、ＮＰ＿００１３５０６１８．１、又はＮＭ＿００１３６３６８９．１によりコードされるタンパク質に従う）；又は
ＳＵＶ３９Ｈ１（例えば、ＮＰ＿００３１６４．１、又はＮＭ＿００３１７３．４によりコードされるタンパク質に従う））；
ヒストンデメチラーゼＬＳＤ１（例えば、ＮＰ＿０５５８２８．２又はＮＭ＿０１５０１３．４によりコードされるタンパク質に従う）；
ＦＯＧ１（例えば、ＦＯＧ１のＮ末端残基）（例えば、ＮＰ＿７２２５２０．２又はＮＭ＿１５３８１３．３によりコードされるタンパク質に従う）；また
ＫＡＰ１（例えば、ＮＰ＿００５７５３．１、又はＮＭ＿００５７６２．３によりコードされるタンパク質に従う）；
そのいずれかの機能性断片若しくは変異体、又は
上記配列のいずれかに対して少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の同一性を有する配列を有するポリペプチド。一部の実施形態では、エフェクター部分は、以下から選択されるタンパク質を含む：
ＤＮＭＴ３Ａ（例えば、ヒトＤＮＭＴ３Ａ）（例えば、ＮＰ＿０７２０４６．２
又はＮＭ＿０２２５５２．４によりコードされるタンパク質に従う）；
ＤＮＭＴ３Ｂ（例えば、ＮＰ＿００８８２３．１
又はＮＭ＿００６８９２．４によりコードされるタンパク質に従う）；
ＤＮＭＴ３Ｌ（例えば、ＮＰ＿７８７０６３．１
又はＮＭ＿１７５８６７．３によりコードされるタンパク質に従う）；
ＤＮＭＴ３Ａ／３Ｌ複合体、
細菌ＭＱ１（例えば、株ＡＴＣＣ３３８２５又はＵｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｐ１５８４０．３から得られるＣＡＡ３５０５８．１に従う）；
そのいずれかの機能性断片、又は
上記配列のいずれかに対して少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の同一性を有する配列を有するポリペプチド。一部の実施形態では、エフェクター部分は、成熟細菌ＭＱ１（例えば、株ＡＴＣＣ３３８２５又はＵｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｐ１５８４０．３から得られるＣＡＡ３５０５８．１に従う）を含む。
例示的なエフェクター部分として、限定されないが、以下：ユビキチン、ユビキチンリガーゼ阻害剤などの二環式ペプチド、転写因子、トポイソメラーゼなどのＤＮＡ及びタンパク質修飾酵素、トポテカンなどのトポイソメラーゼ阻害剤、ＤＮＭＴファミリー（例えば、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＤＮＭＴ３Ｌ）などのＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、タンパク質メチルトランスフェラーゼ（例えば、ウイルスリシンメチルトランスフェラーゼ（ｖＳＥＴ）、タンパク質－リシンＮ－メチルトランスフェラーゼ（ＳＭＹＤ２）、デアミナーゼ（例えば、ＡＰＯＢＥＣ、ＵＧ１）、ｚｅｓｔｅホモログ２のエンハンサー（ＥＺＨ２）、ＰＲＭＴ１、ヒストン－リシンＮ－メチルトランスフェラーゼ（Ｓｅｔｄｂ１）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＳＥＴ２）、ユークロマチンヒストン－リシンＮ－メチルトランスフェラーゼ２（Ｇ９ａ）、ヒストン－リシンＮ－メチルトランスフェラーゼ（ＳＵＶ３９Ｈ１）、及びＧ９ａなどのヒストンメチルトランスフェラーゼ）、ヒストンデアセチラーゼ（例えば、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２，ＨＤＡＣ３）、ＤＮＡ脱メチル化に役割を有する酵素（例えば、ＴＥＴファミリー酵素は、５－メチルシトシンから５－ヒドロキシルメチルシトシン及びより高度の酸化誘導体への酸化を触媒する）、ＫＤＭ１Ａ及びリシン特異的ヒストンデメチラーゼ１（ＬＳＤ１）などのタンパク質デメチラーゼ、ＤＨＸ９などのヘリカーゼ、デアセチラーゼ（例えば、サーチュイン１、２、３、４、５、６、又は７）、キナーゼ、ホスファターゼ、臭化エチジウム、ＳＹＢＲグリーン及びプロフラビンなどのＤＮＡ挿入剤、フェニルアラニンアルギニルβ－ナフチルアミド若しくはキノリン誘導体のようなペプチド模倣物などの排出ポンプ阻害剤、核受容体活性化因子及び阻害剤、プロテアソーム阻害剤、酵素に関する競合阻害剤（例えば、リソソーム蓄積症に関与するものなど）、タンパク質合成阻害剤、ヌクレアーゼ（例えば、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ９、ジンクフィンガーヌクレアーゼ）、それらの１つ若しくは複数の融合物（例えば、ｄＣａｓ９－ＤＮＭＴ、ｄＣａｓ９－ＡＰＯＢＥＣ、ｄＣａｓ９－ＵＧ１）、並びにタンパク質からの特定のドメイン（例えば、ＫＲＡＢドメイン）を挙げることができる。
一部の実施形態では、候補ドメインは、当業者に公知の方法によって、エフェクター部分としての使用に好適であることが決定され得る。例えば、候補エフェクター部分は、候補エフェクター部分が細胞の核内に存在し、（例えば、標的遺伝子又は前記標的遺伝子に作動可能に連結された転写制御エレメントに、例えば、ターゲティング部分を介して）適切に局在化している場合、候補エフェクター部分が、細胞内の標的遺伝子の発現を低減するか、例えば、標的遺伝子によりコードされるＲＮＡ転写物のレベルを低減するか（例えば、ＲＮＡＳｅｑ又はノーザンブロットにより測定される）、又は標的遺伝子によりコードされるタンパク質のレベルを低減するか（例えば、ＥＬＩＳＡにより測定される）をアッセイすることにより試験され得る。
一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、エフェクター部分の別のコピーに結合しない（例えば、検出可能に結合しない）エフェクター部分を含み、例えば、エフェクター部分は単量体であり、多量体に会合しない。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、エフェクター部分のさらなるコピーと会合して多量体、例えば、二量体、三量体、四量体、又はそれ以上になるエフェクター部分を含む。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、複数のエフェクター部分を含み、各エフェクター部分は、別のエフェクター部分に検出可能に結合しない、例えば、結合しない。一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法に使用されるエフェクター部分は、単量体、例えば、非二量体状態で機能する。
一部の実施形態では、エフェクター部分は、例えば、クロマチンの二次元構造を調節する（すなわち、クロマチンの構造をその二次元表現を変更し得る方法で調節する）エピジェネティック修飾部分を含む。
本開示の方法及び組成物で有用なエピジェネティック修飾部分は、エピジェネティックマーカ、例えば、ＤＮＡメチル化、ヒストンメチル化、ヒストンアセチル化、ヒストンＳＵＭＯ化、ヒストンリン酸化、及びＲＮＡ関連サイレンシングに影響を与える物質を含む。本明細書に記載のゲノム配列エレメントをターゲティングさせることができる例示的なエピジェネティック酵素として、ＤＮＡメチラーゼ（例えば、ＤＮＭＴ３ａ、ＤＮＭＴ３ｂ、ＤＮＭＴＬ、ＭＱ１）、ＤＮＡ脱メチル化（例えば、ＴＥＴファミリー）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ（例えば、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２，ＨＤＡＣ３）、サーチュイン１、２、３、４、５、６、又は７、リシン特異的ヒストンデメチラーゼ１（ＬＳＤ１）、ヒストン－リシン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ（Ｓｅｔｄｂ１）、ユークロマチンヒストン－リシン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ２（Ｇ９ａ）、ヒストン－リシンＮ－メチルトランスフェラーゼ（ＳＵＶ３９Ｈ１）、ｚｅｓｔｅホモログ２のエンハンサー（ＥＺＨ２）、ウイルスリシンメチルトランスフェラーゼ（ｖＳＥＴ）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＳＥＴ２）、及びタンパク質－リシンＮ－メチルトランスフェラーゼ（ＳＭＹＤ２）などが挙げられる。こうしたエピジェネティック修飾剤の例は、例えば、ｄｅ Ｇｒｏｏｔｅ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２０１２）：１－１８に記載されている。
一部の実施形態では、本明細書において有用な、例えばエピジェネティック修飾部分を含む、部位特異的妨害剤は、Ｋｏｆｅｒｌｅ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ７．５９（２０１５）：１－３（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている構築物を含むか、又はそうした構築物である。例えば、一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、Ｋｏｆｅｒｌｅ ｅｔ ａｌ．の表１に見出される構築物、例えば、表１に記載のヒストンデアセチラーゼ、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡ脱メチル化、又はＨ３Ｋ４及び／若しくはＨ３Ｋ９ヒストンデメチラーゼ（例えば、ｄＣａｓ９－ｐ３００、ＴＡＬＥ－ＴＥＴ１、ＺＦ－ＤＮＭＴ３Ａ、又はＴＡＬＥ－ＬＳＤ１）を含むか、又はそうした構築物である。
追加部分
部位特異的妨害剤は、（例えば、１つ又は複数のターゲティング部分及び１つ又は複数のエフェクター部分に加えて）１つ又は複数の追加部分をさらに含んでもよい。一部の実施形態では、追加部分は、タギング若しくはモニタリング部分、切断可能部分（例えば、ターゲティング部分とエフェクター部分との間、又はポリペプチドのＮ若しくはＣ末端に位置する、切断可能部分）、小分子、膜移行ポリペプチド、又は薬剤部分から選択される。
例示的な部位特異的妨害剤
以下の例示的な部位特異的妨害剤は、説明のみを目的として提示され、限定を意図するものではない。
一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、ターゲティング部分（例えば、ｄＣａｓ９、例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｄＣａｓ９を含む）と、ＭＱ１、例えば、細菌ＭＱ１を含む、エフェクター部分とを含む。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、配列番号２０１（例えば、部位特異的妨害剤をコードするプラスミド）及び／又は２０２（例えば、部位特異的妨害剤をコードする部位特異的妨害剤をコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ））の核酸配列によりコードされる。一部の実施形態では、本明細書に記載の核酸は、配列番号２０１若しくは２０２の核酸配列、又はそれと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、若しくはそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の相違を有する配列を含む。一部の実施形態では、ターゲティング部分は、配列番号９の核酸配列によりコードされ、且つ／又はエフェクター部分は、配列番号１０の核酸配列によりコードされる。
Ｓａ－ｄＣａｓ９－ＭＱ１（ＰＬ－２７６９５）プラスミドＤＮＡ配列：
Ｓａ－ｄＣａｓ９－ＭＱ１（ＭＲ－２８１２６）発現ｍＲＮＡ配列：
一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、ターゲティング部分（例えば、ｄＣａｓ９、例えば、化膿性レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｄＣａｓ９又はその機能性変異体若しくは突然変異体；例えば、Ｃａｓ９ｍ４を含む）と、ＭＱ１、例えば、細菌ＭＱ１を含む、エフェクター部分とを含む。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、配列番号２０７の核酸配列（例えば、部位特異的妨害剤をコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ））によりコードされる。一部の実施形態では、本明細書に記載の核酸は、配列番号２０７の核酸配列、又はそれと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、若しくはそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の相違を有する配列を含む。一部の実施形態では、ターゲティング部分は、配列番号８の核酸配列によりコードされ、且つ／又はエフェクター部分は、配列番号１０の核酸配列によりコードされる。
ｄＣａｓ９－ＭＱ１ ｍＲＮＡ配列（ＭＲ２８１２５）
一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、配列番号２０３、２０８、７３又は７４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の部位特異的妨害剤は、配列番号２０３、２０８、７３若しくは７４のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、若しくはそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の相違を有する配列を含む。
Ｓａ－ｄＣａｓ９－ＭＱ１タンパク質配列：
ｄＣａｓ９－ＭＱ１タンパク質配列（ＭＲ－２８１２５に対応）：
Ｓａ－ｄＣａｓ９－ＭＱ１、ＨＡタグなし
ｄＣａｓ９－ＭＱ１、ＨＡタグなし
一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、ターゲティング部分（例えば、ｄＣａｓ９、例えば、化膿性レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｄＣａｓ９を含む）と、ＫＲＡＢ、例えば、ＫＲＡＢドメインを含む、エフェクター部分とを含む。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、配列番号２０４（例えば、部位特異的妨害剤をコードするプラスミド）及び／又は２０５（例えば、部位特異的妨害剤をコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ））の核酸配列によりコードされる。一部の実施形態では、本明細書に記載の核酸は、配列番号２０４若しくは２０５の核酸配列、又はそれと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、若しくはそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の相違を有する配列を含む。一部の実施形態では、ターゲティング部分は、配列番号８の核酸配列によりコードされ、且つエフェクター部分は、配列番号１４の核酸配列によりコードされる。
Ｓｐ－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ（ＰＬ－２７６８７）プラスミドＤＮＡ配列：
Ｓｐ－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ（ＭＲ－２８１２２）発現ｍＲＮＡ配列：
一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、配列番号２０６又は７５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の核酸は、配列番号２０６若しくは７５の核酸配列、又はそれと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、若しくはそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の相違を有する配列を含む。
Ｓｐ－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢタンパク質配列：
Ｓｐ－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢタンパク質配列、ＨＡタグなし：
一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、ターゲティング部分（例えば、ｄＣａｓ９、例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｄＣａｓ９を含む）と、ＥＺＨ２を含む、エフェクター部分とを含む。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、ｄＣａｓ９、例えば、化膿性レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｄＣａｓ９、例えば、変異化膿性レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９、例えば、Ｃａｓ９ｍ４を含む、ターゲティング部分と、ＥＺＨ２を含む、エフェクター部分とを含む。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、配列番号２０９の核酸配列（例えば、部位特異的妨害剤をコードするｍＲＮＡ）によりコードされる。一部の実施形態では、本明細書に記載の核酸は、配列番号２０９の核酸配列、又はそれと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、若しくはそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の相違を有する配列を含む。一部の実施形態では、ターゲティング部分は、配列番号８の核酸配列によりコードされ、且つ／又はエフェクター部分は、配列番号１８の核酸配列によりコードされる。
ＥＺＨ２－ｄＣａｓ９ｍＲＮＡ（ＭＲ２８９３８）
一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、配列番号２１０又は７６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の核酸は、配列番号２１０若しくは７６の核酸配列、又はそれと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、若しくはそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の相違を有する配列を含む。
ＥＺＨ２－ｄＣａｓ９タンパク質配列（ＭＲ－２８９３８に対応）
ＥＺＨ２－ｄＣａｓ９、ＨＡタグなし
一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、ターゲティング部分（例えば、ｄＣａｓ９、例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｄＣａｓ９を含む）と、ＤＮＭＴ３（例えば、ＤＮＭＴ３ａ／３Ｌ）を含む、エフェクター部分とを含む。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、ｄＣａｓ９、例えば、化膿性レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｄＣａｓ９、例えば、変異化膿性レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９、例えば、Ｃａｓ９ｍ４を含む、ターゲティング部分と、ＤＮＭＴ３（例えば、ＤＮＭＴ３ａ／３Ｌ）を含む、エフェクター部分とを含む。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、配列番号２１１の核酸配列によりコードされる（例えば、部位特異的妨害剤をコードするｍＲＮＡ）。一部の実施形態では、本明細書に記載の核酸は、配列番号２１１の核酸配列、又はそれと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、若しくはそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の相違を有する配列を含む。
ｄＣａｓ９－ＤＮＭＴ３ａ／３ＬｍＲＮＡ（ＭＲ－２９４１４）
一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、配列番号２１１又は７７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の構築物は、配列番号２１１若しくは７７のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、若しくはそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の相違を有する配列を含む。
ｄＣａｓ９－ＤＮＭＴ３ａ／３Ｌタンパク質配列（ＭＲ－２９４１４に対応）
ｄＣａｓ－ＤＮＭＴ３ａ／３Ｌ（ｈ）、ＨＡタグなし
一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、ターゲティング部分（例えば、ｄＣａｓ９、例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｄＣａｓ９を含む）と、ＨＤＡＣ８、例えば、ＨＤＡＣ８ドメインを含む、エフェクター部分とを含む。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、ｄＣａｓ９、例えば、化膿性レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｄＣａｓ９、例えば、変異化膿性レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９、例えば、Ｃａｓ９ｍ４を含む、ターゲティング部分と、ＨＤＡＣ８、例えば、ＨＤＡＣ８ドメインを含む、エフェクター部分とを含む。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、配列番号２１３の核酸配列（例えば、部位特異的妨害剤をコードするｍＲＮＡ）によりコードされる。
一部の実施形態では、本明細書に記載の核酸は、配列番号２１３の核酸配列、又はそれと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、若しくはそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の相違を有する配列を含む。
ｄＣａｓ９－ＨＤＡＣ８ｍＲＮＡ（ＭＲ－２９４３９）
一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、配列番号２１４又は７８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の部位特異的妨害剤は、配列番号２１４若しくは７８のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、若しくはそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の相違を有する配列を含む。
ｄＣａｓ９－ＨＤＡＣ８タンパク質配列（ＭＲ ２９４３９に対応）
ｄＣａｓ９－ＨＤＡＣ８、ＨＡタグなし
一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、ターゲティング部分（例えば、ｄＣａｓ９、例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｄＣａｓ９を含む）と、ＥＺＨ２；例えば、ＥＺＨ２ドメインを含む、第１エフェクター部分と、ＨＤＡＣ８、例えば、ＨＤＡＣ８ドメインを含む、第２エフェクター部分とを含む。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、ｄＣａｓ９、例えば、化膿性レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｄＣａｓ９、例えば、変異化膿性レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９、例えば、Ｃａｓ９ｍ４を含む、ターゲティング部分と；ＥＺＨ２、例えば、ＥＺＨ２ドメインを含む、第１エフェクター部分と；ＨＤＡＣ８、例えば、ＨＤＡＣ８ドメインを含む、第２エフェクター部分とを含む。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、配列番号２１５の核酸配列（例えば、部位特異的妨害剤をコードするｍＲＮＡ）によりコードされる。一部の実施形態では、本明細書に記載の核酸は、配列番号２１５の核酸配列、又はそれと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、若しくはそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の相違を有する配列を含む。
ＥＺＨ２－ｄＣａｓ９－ＨＤＡＣ８ ｍＲＮＡ（ＭＲ－２９４４７）
一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、配列番号２１６又は７９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の部位特異的妨害剤は、配列番号２１６若しくは７９のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、若しくはそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の相違を有する配列を含む。
ＥＺＨ２－ｄＣａｓ９－ＨＤＡＣ８タンパク質配列（ＭＲ－２９４４７に対応）
ＥＺＨ２－ｄＣａｓ９－ＨＤＡＣ８タンパク質配列（ＭＲ－２９４４７に対応）
一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、ターゲティング部分（例えば、ｄＣａｓ９、例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｄＣａｓ９を含む）と、Ｇ９Ａ；例えば、Ｇ９Ａドメインを含む、第１エフェクター部分と、ＥＺＨ２、例えば、ＥＺＨ２ドメインを含む、第２エフェクター部分とを含む。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、ｄＣａｓ９、例えば、化膿性レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｄＣａｓ９、例えば、変異化膿性レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９、例えば、Ｃａｓ９ｍ４を含む、ターゲティング部分と；Ｇ９Ａ、例えば、Ｇ９Ａドメインを含む、第１エフェクター部分と；ＥＺＨ２、例えば、ＥＺＨ２ドメインを含む、第２エフェクター部分とを含む。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、配列番号６９の核酸配列（例えば、部位特異的妨害剤をコードするｍＲＮＡ）によりコードされる。一部の実施形態では、本明細書に記載の核酸は、配列番号６９の核酸配列、又はそれと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、若しくはそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の相違を有する配列を含む。
Ｇ９Ａ－ｄＣａｓ９－ＥＺＨ２（ＭＲ－２９４４１）ｍＲＮＡ配列
一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、配列番号７０又は８０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の部位特異的妨害剤は、配列番号７０若しくは８０のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、若しくはそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の相違を有する配列を含む。
Ｇ９Ａ－ｄＣａｓ９－ＥＺＨ２タンパク質
Ｇ９Ａ－ｄＣａｓ９－ＥＺＨ２タンパク質、ＨＡタグなし
一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、ターゲティング部分（例えば、ｄＣａｓ９、例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｄＣａｓ９を含む）と、Ｇ９Ａ；例えば、Ｇ９Ａドメインを含む、第１エフェクター部分と、ＫＲＡＢ、例えば、ＫＲＡＢドメインを含む、第２エフェクター部分とを含む。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、ｄＣａｓ９、例えば、化膿性レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｄＣａｓ９、例えば、変異化膿性レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９、例えば、Ｃａｓ９ｍ４を含む、ターゲティング部分と；Ｇ９Ａ、例えば、Ｇ９Ａドメインを含む、第１エフェクター部分と；ＫＲＡＢ、例えば、ＫＲＡＢドメインを含む、第２エフェクター部分とを含む。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、配列番号７１の核酸配列（例えば、部位特異的妨害剤をコードするｍＲＮＡ）によりコードされる。一部の実施形態では、本明細書に記載の核酸は、配列番号７１の核酸配列、又はそれと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、若しくはそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の相違を有する配列を含む。
Ｇ９Ａ－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ（ＭＲ－２９９４２）ｍＲＮＡ配列
一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、配列番号７２又は８１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の部位特異的妨害剤は、配列番号７２若しくは８１のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、若しくはそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の相違を有する配列を含む。
Ｇ９Ａ－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢタンパク質
Ｇ９Ａ－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢタンパク質、ＨＡタグなし
一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、ターゲティング部分（例えば、ｄＣａｓ９、例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ｄＣａｓ９を含む）と、ＥＺＨ２；例えば、ＥＺＨ２ドメインを含む、第１エフェクター部分と、ＫＲＡＢ、例えば、ＫＲＡＢドメインを含む、第２エフェクター部分とを含む。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、ｄＣａｓ９、例えば、化膿性レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｄＣａｓ９、例えば、変異化膿性レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９、例えば、Ｃａｓ９ｍ４を含む、ターゲティング部分と；ＥＺＨ２、例えば、ＥＺＨ２ドメインを含む、第１エフェクター部分と；ＫＲＡＢ、例えば、ＫＲＡＢドメインを含む、第２エフェクター部分とを含む。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、配列番号８５の核酸配列（例えば、部位特異的妨害剤をコードするｍＲＮＡ）によりコードされる。一部の実施形態では、本明細書に記載の核酸は、配列番号８５の核酸配列、又はそれと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、若しくはそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の相違を有する配列を含む。
ＥＺＨ２－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ（ＭＲ－２９９４８）ｍＲＮＡ配列
一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、配列番号８６又は８２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の部位特異的妨害剤は、配列番号８６若しくは８２のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、若しくはそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の相違を有する配列を含む。
ＥＺＨ２－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢタンパク質
ＥＺＨ２－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢタンパク質、ＨＡタグなし
一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、Ｃａｓ９を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子を含む。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、配列番号２１７の核酸配列（例えば、部位特異的妨害剤をコードするｍＲＮＡ）によりコードされる。一部の実施形態では、本明細書に記載の核酸は、配列番号２１７の核酸配列、又はそれと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、若しくはそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の相違を有する配列を含む。
Ｃａｓ９ｍＲＮＡ（ＭＲ－２８１２７）
一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、配列番号２１８又は８４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の部位特異的妨害剤は、配列番号２１８若しくは８４のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、若しくはそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の相違を有する配列を含む。
Ｃａｓ９タンパク質配列（ＭＲ－２８１２７に対応）
Ｃａｓ９タンパク質配列（ＭＲ－２８１２７に対応）、ＨＡタグなし
一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、核局在化配列（ＮＬＳ）を含む。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、Ｎ末端にＮＬＳ、例えばＳＶ４０ ＮＬＳを含む。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、Ｃ末端にＮＬＳ、例えばＳＶ４０ ＮＬＳを含む。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、Ｃ末端にＮＬＳ、例えばヌクレオプラスミンＮＬＳを含む。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、Ｎ末端に第１ＮＬＳを含み、Ｃ末端に第２ＮＬＳを含む。一部の実施形態では、第１及び第２ＮＬＳは、同じ配列を有する。一部の実施形態では、第１及び第２ＮＬＳは、異なる配列を有する。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、Ｎ末端に第１ＮＬＳ、第２ＮＬＳ、及びＣ末端に第３ＮＬＳを含む。一部の実施形態では、少なくとも２つのＮＬＳは、同じ配列を有する。一部の実施形態では、第１及び第２ＮＬＳは、同じ配列を有し、第３ＮＬＳは、第１及び第２ＮＬＳと異なる配列を有する。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、ＳＶ４０ ＮＬＳを含み、例えば、部位特異的妨害剤は、ＰＫＫＫＲＫ（配列番号６３）に従う配列を含む。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、ヌクレオプラスミンＮＬＳを含み、例えば、部位特異的妨害剤は、ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫ（配列番号６４）の配列を含む。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、例えば、ヌクレオプラスミン核局在化配列及びＨＡタグの１つ又は複数、例えば、いずれか又は両方を含む、Ｃ末端配列を含む。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、エピトープタグ、例えば、ＨＡタグ：ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ（配列番号６５）を含む。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、エピトープタグの２つのコピーを含み得る。
エピトープタグは、多くの研究状況で有用であるが、治療状況ではエピトープタグを省略することが望ましい場合がある。従って、一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、エピトープタグを欠失している。一部の実施形態では、本明細書に記載の部位特異的妨害剤は、本明細書に提供される配列（又はそれと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、若しくはそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の相違を有する配列）を含むが、配列番号６５のＨＡタグを欠失している。一部の実施形態では、本明細書に記載の核酸は、本明細書に提供される配列（又はそれと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、若しくはそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の相違を有する配列）を含むが、配列番号６５のＨＡタグをコードする領域を欠失している。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、ＮＬＳを含まない。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、エピトープタグを含まない。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、ＨＡタグを含まない。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、配列番号６５に従うＨＡタグ配列を含まない。
一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、Ｚｎフィンガー分子を含むターゲティング部分と、ＥＺＨ２又はその機能性断片若しくは変異体を有するエフェクター部分と、を含む。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、配列番号２１９、２２０、２２２、２２３、２３３、若しくは２３４の核酸配列、又はそれと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、若しくはそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の相違を有する配列によりコードされる。
一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、Ｚｎフィンガー分子を含むターゲティング部分と、ＤＮＭＴ３（例えば、ＤＮＭＴ３ａ又はＤＮＭＴ３Ｌ）又はその機能性断片若しくは変異体を有するエフェクター部分と、を含む。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、配列番号２２１、２３１、若しくは２３６～２３９の核酸配列、又はそれと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、若しくはそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の相違を有する配列によりコードされる。
一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、Ｚｎフィンガー分子を含むターゲティング部分と、Ｇ９Ａ又はその機能性断片若しくは変異体を有するエフェクター部分と、を含む。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、配列番号２２４、２２５、若しくは２２７～２３０の核酸配列、又はそれと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、若しくはそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の相違を有する配列によりコードされる。
一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、Ｚｎフィンガー分子を含むターゲティング部分と、ＨＤＡＣ８又はその機能性断片若しくは変異体を有するエフェクター部分と、を含む。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、配列番号２２６、２３２、２３５、若しくは２４０～２４２の核酸配列、又はそれと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、若しくはそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の相違を有する配列によりコードされる。
一部の実施形態では、本明細書に記載の方法又は組成物に使用される核酸（例えば、部位特異的妨害剤をコードする核酸）は、配列番号６９、７１、８５、２０１、２０２、２０４、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、若しくは２１９～２４２のいずれか１つの核酸配列、そのいずれかの相補的又は逆相補的な配列を含むか、又はそのいずれかに対して少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法又は組成物に使用される部位特異的妨害剤は、配列番号７０、７２～８２、８４、８６、２０３、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、若しくは２１８のいずれか１つのアミノ酸配列を含むか、又はそのいずれかに対して少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法又は組成物に使用される部位特異的妨害剤は、配列番号６９、７１、８５、２０１、２０２、２０４、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、又は２１９～２４２のいずれか１つによりコードされるアミノ酸配列、又はそのいずれかに対して少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
機能的特徴
本開示の部位特異的妨害剤又はシステムを使用して、細胞内の標的複数遺伝子の発現を調節、例えば、低減することができる。一部の実施形態では、発現の調節は、標的複数遺伝子の各々によりコードされるＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡのレベルを低減することを含む。一部の実施形態では、発現の調節は、標的複数遺伝子の各々によりコードされるタンパク質のレベルを低減することを含む。一部の実施形態では、発現の調節は、標的複数遺伝子の各々によりコードされるｍＲＮＡ及びタンパク質のレベルをいずれも低減することを含む。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤と接触させた、又は部位特異的妨害剤を含む細胞における標的複数遺伝子の遺伝子の発現は、部位特異的妨害剤と接触させていないか、又は部位特異的妨害剤を含まない細胞における遺伝子の発現のレベルより少なくとも１．０５×（すなわち、１．０５倍）、１．１×、１．１５×、１．２×、１．２５×、１．３×、１．３５×、１．４×、１．４５×、１．５×、１．５５×、１．６×、１．６５×、１．７×、１．７５×、１．８×、１．８５×、１．９×、１．９５×、２×、３×、４×、５×、６×、７×、８×、９×、１０×、２０×、３０×、４０×、５０×、６０×、７０×、８０×、９０×、又は１００×低い。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤若しくはシステムと接触させた、又は部位特異的妨害剤若しくはシステムを含む細胞における標的複数遺伝子の各遺伝子の発現は、部位特異的妨害剤と接触させていないか、又は部位特異的妨害剤を含まない細胞における遺伝子の発現のレベルより少なくとも１．０５×（すなわち、１．０５倍）、１．１×、１．１５×、１．２×、１．２５×、１．３×、１．３５×、１．４×、１．４５×、１．５×、１．５５×、１．６×、１．６５×、１．７×、１．７５×、１．８×、１．８５×、１．９×、１．９５×、２×、３×、４×、５×、６×、７×、８×、９×、１０×、２０×、３０×、４０×、５０×、６０×、７０×、８０×、９０×、又は１００×低い。遺伝子の発現は、当業者には公知の方法によりアッセイすることができ、そうした方法として、ＲＴ－ＰＣＲ、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、及び実施例２又は４～１９の方法が挙げられる。
本開示の部位特異的妨害剤又はシステムを使用して、核形成ポリペプチド、例えば、ＣＴＣＦの、アンカー配列への結合を低減することができる。一部の実施形態では、細胞を接触させること、又は部位特異的妨害剤若しくはシステムを投与することは、核形成ポリペプチド、例えば、ＣＴＣＦの、アンカー配列（例えば、標的複数遺伝子を含むＡＳＭＣのアンカー配列）への結合の低減をもたらす。一部の実施形態では、細胞を接触させること、又は部位特異的妨害剤若しくはシステムを投与することは、部位特異的妨害剤若しくはシステムで処理する前、又は部位特異的妨害剤若しくはシステムの非存在下での、アンカー配列への核形成ポリペプチド（例えば、ＣＴＣＦ）の結合と比較して、結合の完全な喪失、又は少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５若しくは９９％の低減をもたらす（例えば、ＣｈＩＰ及び／又は定量的ＰＣＲにより測定される）。
本開示の部位特異的妨害剤又はシステムを使用して、標的複数細胞を含むゲノム複合体（例えば、ＡＳＭＣ）を妨害することができる。一部の実施形態では、細胞を接触させること、又は部位特異的妨害剤若しくはシステムを投与することは、部位特異的妨害剤若しくはシステムで処理する前、又は部位特異的妨害剤若しくはシステムの非存在下での、複合体のレベルと比較して、標的複数遺伝子を含むゲノム複合体（例えば、ＡＳＭＣ）のレベルの低減をもたらす。一部の実施形態では、細胞を接触させること、又は部位特異的妨害剤若しくはシステムを投与することは、部位特異的妨害剤若しくはシステムで処理する前、又は部位特異的妨害剤若しくはシステムの非存在下での、複合体のレベルと比較して、ゲノム複合体、例えば、ＡＳＭＣの完全な喪失、又は少なくとも２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、９５、又は９９％の低減（例えば、ＣｈＩＡ－ＰＥＴ、ＥＬＩＳＡ（例えば、遺伝子発現の変化を評価するため）、ＣＵＴ＆ＲＵＮ、ＡＴＡＣ－ＳＥＱ、ＣｈＩＰ及び／又は定量的ＰＣＲにより測定される）をもたらす。
本開示の部位特異的妨害剤又はシステムを使用して、一定期間にわたり、細胞内の標的複数遺伝子の発現を調節、例えば、低減することができる。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤若しくはシステムと接触させた、又は部位特異的妨害剤若しくはシステムを含む細胞における標的複数遺伝子の遺伝子の発現は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、若しくは２４時間、又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、１０、若しくは１４日、又は少なくとも１、２、３、４、若しくは５週間、又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２ヶ月、又は少なくとも１、２、３、４、若しくは５年にわたって（例えば、無期限に）明らかに低減される。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤若しくはシステムと接触させた、又は部位特異的妨害剤若しくはシステムを含む細胞における標的複数遺伝子の各遺伝子の発現は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、若しくは２４時間、又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、１０、若しくは１４日、又は少なくとも１、２、３、４、若しくは５週間、又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２ヶ月、又は少なくとも１、２、３、４、若しくは５年にわたって（例えば、無期限に）明らかに低減される。任意選択的に、部位特異的妨害剤若しくはシステムと接触させた、又はそれを含む、細胞における標的複数遺伝子の遺伝子の発現は、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１年以下にわたって明らかに低減する。任意選択的に、部位特異的妨害剤若しくはシステムと接触させた、又はそれを含む、細胞における標的複数遺伝子の各遺伝子の発現は、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１年以下にわたって明らかに低減する。
部位特異的妨害剤又はシステムは、複数のエフェクター部分を含んでもよく、ここで、各エフェクター部分は、他の各エフェクター部分とは異なる機能性を有する。例えば、部位特異的妨害剤又はシステムは、ヒストンデアセチラーゼ機能性を含む第１のエフェクター部分と、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ機能性を含む第２のエフェクター部分とを含み得る。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、その機能性が、標的複数遺伝子の発現の調節、例えば、低減に関して、互いに相補的であるエフェクター部分の組合せを含み、例えば、その場合、機能性は一緒になって発現を低減し、且つ、任意選択的に、個別に存在するとき、発現を低減しないか、又は無視できる程度にしか低減しない。
一部の実施形態では、部位特異的妨害剤又はシステムは、標的複数遺伝子の発現の調節、例えば、低減に関して、その機能性が互いに相乗効果を与えるエフェクター部分の組合せを含む。理論に束縛されることは望まないが、複数の抑制性エピジェネティックマーカ（例えば、複数の異なるタイプのエピジェネティックマーカ及び／又は所与のタイプの大量生産）は一緒になって、個別の修飾単独よりも効率的に発現を低減する（例えば、より大きな発現低減及び／又はより長い発現低減）ことから、ゲノム遺伝子座に対するエピジェネティック修飾は、累積的であると考えられる。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤又はシステムは、互いに相乗作用する複数のエフェクター部分を含み、例えば、各エフェクター部分は、標的遺伝子の発現を低減する。一部の実施形態では、互いに相乗作用をもたらす複数の異なるエフェクター部分を含む部位特異的妨害剤は、標的複数遺伝子の発現の調節、例えば、低減に関して、複数の異なるエフェクター部分のうちの１つのみ、又はエフェクター部分の非相乗的な組合せを含む部位特異的妨害剤よりも有効である。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、標的複数遺伝子の発現の調節、例えば、低減について、複数の異なるエフェクター部分のうちの１つのみ、又はエフェクター部分の非相乗的な組合せを含む、部位特異的妨害剤又はシステムより少なくとも１．０５×（すなわち、１．０５倍）、１．１×、１．１５×、１．２×、１．２５×、１．３×、１．３５×、１．４×、１．４５×、１．５×、１．５５×、１．６×、１．６５×、１．７×、１．７５×、１．８×、１．８５×、１．９×、１．９５×、２×、３×、４×、５×、６×、７×、８×、９×、１０×、２０×、３０×、４０×、５０×、６０×、７０×、８０×、９０×、又は１００×有効である。
標的部位
本明細書に開示される部位特異的妨害剤又はシステムは、細胞内、例えば、対象又は患者の細胞内の、標的複数遺伝子の発現を調節する、例えば、低減するのに有用である。標的複数遺伝子は、当業者に公知の任意の遺伝子を含み得る。標的複数遺伝子は、少なくとも２つの遺伝子を含む。一部の実施形態では、標的複数遺伝子は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個の遺伝子（且つ任意選択的に、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又は３０個以下の遺伝子）、例えば、第１遺伝子及び第２遺伝子、並びに任意選択的に、第３遺伝子、第４遺伝子、第５遺伝子、第６遺伝子、第７遺伝子、第８遺伝子、第９遺伝子、第１０遺伝子、第１１遺伝子、第１２遺伝子、第１３遺伝子、第１４遺伝子、第１５遺伝子、第１６遺伝子、第１７遺伝子、第１８遺伝子、第１９遺伝子、及び／又は第２０遺伝子を含む。一部の実施形態では、標的複数遺伝子は、２～２０、２～１８、２～１６、２～１４、２～１２、２～１０、２～９、２～８、２～７、２～６、２～５、２～４、２～３、３～２０、３～１８、３～１６、３～１４、３～１２、３～１０、３～９、３～８、３～７、３～６、３～５、３～４、４～２０、４～１８、４～１６、４～１４、４～１２、４～１０、４～９、４～８、４～７、４～６、４～５、５～２０、５～１８、５～１６、５～１４、５～１２、５～１０、５～９、５～８、５～７、５～６、６～２０、６～１８、６～１６、６～１４、６～１２、６～１０、６～９、６～８、６～７、７～２０、７～１８、７～１６、７～１４、７～１２、７～１０、７～９、７～８、８～２０、８～１８、８～１６、８～１４、８～１２、８～１０、８～９、９～２０、９～１８、９～１６、９～１４、９～１２、９～１０、１０～２０、１０～１８、１０～１６、１０～１４、１０～１２、１２～２０、１２～１８、１２～１６、１２～１４、１４～２０、１４～１８、１４～１６、１６～２０、１６～１８、又は１８～２０個の遺伝子を含む。
一部の実施形態では、標的複数遺伝子の２つ以上（例えば、全て）の遺伝子は、対象、例えば、哺乳動物、例えば、ヒト、ウシ、ウマ、ヒツジ、ニワトリ、ラット、マウス、ネコ、又はイヌに疾患又は病状と関連する。一部の実施形態では、疾患又は病状は、炎症性疾患、例えば、免疫介在性炎症性疾患である。一部の実施形態では、疾患又は病状は、関節リウマチ、炎症、関節炎、痛風、喘息、好中球性喘息、好中球性皮膚症、足浮腫、急性呼吸器疾患症候群（ＡＲＤＳ）、ＣＯＶＩＤ－１９、乾癬、炎症性腸疾患、感染（例えば、病原体、例えば、細菌、ウイルス、又は真菌による）、外的損傷（例えば、擦傷又は異物）、放射線又は化学的損傷の影響、変形性関節症、変形性関節症の関節痛、関節痛、炎症性疼痛、急性痛、慢性痛、膀胱炎（ｃｙｓｔｉｓｉｓ）、気管支炎、皮膚炎、心血管疾患、神経変性疾患、肝臓疾患、肺疾患、腎臓疾患、痛み、腫れ、こわばり、圧痛、発赤、熱、又は疾患状態に関連するバイオマーカの上昇（例えば、サイトカイン、免疫受容体、又は炎症マーカ）のうちの１つ又は複数である。一部の実施形態では、炎症性障害は、例えば、ウイルス、例えば、Ｓａｒｓ－Ｃｏｖ－２ウイルスによる感染に関連する。一部の実施形態では、炎症性障害は、自己免疫障害である。一部の実施形態では、炎症性障害は、低酸素症に関連する。一部の実施形態では、炎症性障害は、ＡＲＤＳ、低酸素症、及び／又は敗血症に関連する。一部の実施形態では、感染は、例えば、複数の病原体、例えば、第１ウイルス又は細菌又は真菌、及び第２ウイルス又は細菌又は真菌によって引き起こされる、重複感染である。一部の実施形態では、炎症性障害は、肺細胞組成を変化させ、例えば、ＡＴ２細胞の減少及び／又は樹状細胞、マクロファージ、好中球、ＮＫ細胞、線維芽細胞、白血球、リンパ管内皮細胞及び／又は血管内皮細胞の増加をもたらし得る。一部の実施形態では、障害は、１つ又は複数の併存疾患、例えば、呼吸器感染症、肥満、胃食道逆流症、皮膚病変、及び／又は閉塞性睡眠時無呼吸に関連する。
一部の実施形態では、標的複数遺伝子の２つ以上（例えば、全て）の遺伝子が、細胞、例えば対象、例えばヒト対象の細胞において、異常に発現、例えば、過剰発現される。
一部の実施形態では、標的複数遺伝子のうちの２つ以上（例えば、全て）の遺伝子が、関連する機能性を有する。理論に束縛されることは望まないが、関連する機能性を有する遺伝子は、ゲノム内で互いに近接して配置されることが多く、一般的なゲノム複合体、例えば、ＡＳＭＣ内に（全体的又は部分的に）頻繁に見られると考えられる。複数の遺伝子のうちの２つ以上（例えば、全て）が関連する機能性を有する標的複数遺伝子の発現を調節する、例えば、低減することは、前記相互に関連する遺伝子を含むゲノム複合体、例えば、ＡＳＭＣをターゲティングすることにより、効果的且つ効率的に達成され得る。
一部の実施形態では、標的複数遺伝子の１つ、２つ、３つ、又はそれ以上（例えば、全て）の遺伝子は、サイトカイン、例えば、ケモカイン、インターロイキン、転写因子（例えば、インターフェロン調節転写因子）、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）、又はインターフェロン受容体である。一部の実施形態では、標的複数遺伝子の２つ以上（例えば、全て）の遺伝子は、サイトカイン、インターロイキン、転写因子（例えば、インターフェロン調節転写因子）、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）、又はインターフェロン受容体である。一部の実施形態では、標的複数遺伝子は、哺乳動物遺伝子、例えばマウス遺伝子、ヒト遺伝子である。
一部の実施形態では、標的複数遺伝子のうちの２つ以上（例えば、全て）の遺伝子が、炎症誘発性機能性を有する。一部の実施形態では、標的複数遺伝子の２つ以上（例えば、全て）の遺伝子は、免疫細胞、例えば、好中球に対する化学誘引物質として作用し得る。例えば、炎症誘発性機能性を有する遺伝子（本明細書において炎症誘発性遺伝子とも呼ばれる）には、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＩＬ８、ＣＸＣＬ１５、ＣＣＬ２、ＣＣＬ７、ＣＣＬ９、ＩＬ１Ａ、ＩＬ１Ｂ、ＣＳＦ２、ＩＲＦ１、ＩＣＡＭ１、ＩＣＡＭ４、ＩＣＡＭ５、ＩＦＮＡＲ２、ＩＬ１０ＲＢ、又はＩＦＮＧＲ２が含まれる。一部の実施形態では、標的複数遺伝子は、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＩＬ８、ＣＸＣＬ１５、ＣＣＬ２、ＣＣＬ７、ＣＣＬ９、ＩＬ１Ａ、ＩＬ１Ｂ、ＣＳＦ２、ＩＲＦ１、ＩＣＡＭ１、ＩＣＡＭ４、ＩＣＡＭ５、ＩＦＮＡＲ２、ＩＬ１０ＲＢ、又はＩＦＮＧＲ２の２つ以上を含む。一部の実施形態では、複数の遺伝子は、ヒトＣＸＣＬファミリーの１つ又は複数の遺伝子を含む。一部の実施形態では、標的複数遺伝子は、ＣＸＣＬ１（例えば、ＮＭ＿００２０８９に従うＲＮＡをコードする核酸配列、又はＰ０９３４１に従うポリペプチドをコードする核酸、又はその変異体）、ＣＸＣＬ２（例えば、ＮＭ＿００１５１１に従うＲＮＡをコードする核酸配列、又はＰ１９８７５に従うポリペプチドをコードする核酸、又はその変異体）、ＣＸＣＬ３（例えば、ＮＭ＿００２０９０に従うＲＮＡをコードする核酸配列、又はＰ１９８７６に従うポリペプチドをコードする核酸、又はその変異体）、ＣＸＣＬ４（例えば、ＮＭ＿００２６１９若しくはＮＭ＿００１３６３３５２に従うＲＮＡをコードする核酸配列、又はＰ０２７７６に従うポリペプチドをコードする核酸、又はその変異体）、ＣＸＣＬ５（例えば、ＮＭ＿００２９９４に従うＲＮＡをコードする核酸配列、又はＰ４２８３０に従うポリペプチドをコードする核酸、又はその変異体）、ＣＸＣＬ６（例えば、ＮＭ＿００２９９３に従うＲＮＡをコードする核酸配列、又はＰ８０１６２に従うポリペプチドをコードする核酸、又はその変異体）、ＣＸＣＬ７（例えば、ＮＭ＿００２７０４に従うＲＮＡをコードする核酸配列、又はＰ０２７７５に従うポリペプチドをコードする核酸、又はその変異体）、及びＩＬ８（例えば、ＮＭ＿０００５８４若しくはＮＭ＿００１３５４８４０に従うＲＮＡをコードする核酸配列、又はＰ１０１４５に従うポリペプチドをコードする核酸、又はその変異体）を含む。一部の実施形態では、複数の遺伝子は、マウスＣＸＣＬファミリーの１つ又は複数の遺伝子を含む。一部の実施形態では、標的複数遺伝子は、ＣＸＣＬ１（例えば、ＮＭ＿００８１７６．３に従うＲＮＡをコードする核酸配列、又はＰ１２８５０に従うポリペプチドをコードする核酸、又はその変異体）、ＣＸＣＬ２（例えば、ＮＭ＿００９１４０．２に従うＲＮＡをコードする核酸配列、又はＰ１０８８９に従うポリペプチドをコードする核酸、又はその変異体）、ＣＸＣＬ３（例えば、ＮＭ＿２０３３２０．３に従うＲＮＡをコードする核酸配列、又はＱ６Ｗ５Ｃ０に従うポリペプチドをコードする核酸、又はその変異体）、ＣＸＣＬ４（例えば、ＮＭ＿０１９９３２に従うＲＮＡをコードする核酸配列、又はＱ９Ｚ１２６に従うポリペプチドをコードする核酸、又はその変異体）、ＣＸＣＬ５（例えば、ＮＭ＿００９１４１．３に従うＲＮＡをコードする核酸配列、又はＰ５０２２８に従うポリペプチドをコードする核酸、又はその変異体）、ＣＸＣＬ７（例えば、ＮＭ＿０２３７８５．３に従うＲＮＡをコードする核酸配列、又はＱ９ＥＱＩ５に従うポリペプチドをコードする核酸、又はその変異体）、及びＣＸＣＬ１５（例えば、ＮＭ＿０１１３３９に従うＲＮＡをコードする核酸配列、又はＱ９ＷＶＬ７に従うポリペプチドをコードする核酸、又はその変異体）を含む。一部の実施形態では、標的複数遺伝子は、ＣＣＬ２、ＣＣＬ７、ＣＣＬ９、ＩＬ１Ａ、及びＩＬ１Ｂを含む。一部の実施形態では、標的複数遺伝子は、ＣＳＦ２、ＩＲＦ１、ＩＣＡＭ１、ＩＣＡＭ４、及びＩＣＡＭ５を含む。一部の実施形態では、標的複数遺伝子は、ＩＦＮＡＲ２、ＩＬ１０ＲＢ、及びＩＦＮＧＲ２を含む。
一部の実施形態では、標的複数遺伝子の２つ以上（例えば、全て）の遺伝子の発現の阻害は、タンパク質、例えば、サイトカインをコードする他の遺伝子の発現を調節し得、例えば、ＣＸＣＬ発現の低減及び炎症部位へのＣＸＣＬの細胞動員は、炎症部位におけるＧＭ－ＣＳＦ及び／又はＩＬ－６の存在を低減する。
一部の実施形態では、標的複数遺伝子は、ゲノム複合体、例えば、ＡＳＭＣの一部である。本明細書で用いられるとき、ゲノム複合体、例えば、ＡＳＭＣの一部である、標的複数遺伝子への言及は、複数の遺伝子の各々がゲノム複合体、例えばＡＳＭＣ内に少なくとも部分的に含まれることを意味する。ゲノム複合体、例えばＡＳＭＣの一部としての標的複数遺伝子への言及は、標的複数遺伝子を含むゲノム複合体、例えばＡＳＭＣへの言及と交換可能に使用される。例えば、標的複数遺伝子は、ゲノム内で互いに隣接して位置する２つの遺伝子から構成されてもよく、ここで、第１アンカー配列は、第１の遺伝子内に配置され、第２アンカー配列は、第１遺伝子の遠位の第２の遺伝子の外側に配置される。前記第１及び第２アンカー配列の会合によって形成されるＡＳＭＣは、第２の遺伝子を完全に含み、第１の遺伝子を部分的に含み得；これら２つの遺伝子からなる複数の遺伝子は、このＡＳＭＣの一部であり得る。一部の実施形態では、標的複数遺伝子の各遺伝子は、完全に、ゲノム複合体、例えばＡＳＭＣ内にある（例えば、遺伝子配列をコードする転写物のどの部分も、ゲノム複合体、例えばＡＳＭＣの外にない）。一部の実施形態では、標的複数遺伝子の各遺伝子は、部分的に、ゲノム複合体、例えばＡＳＭＣ内にある（例えば、遺伝子配列をコードする転写物の一部分は、ゲノム複合体、例えばＡＳＭＣの外にある）。一部の実施形態では、標的複数遺伝子の少なくとも１つの遺伝子は、完全に、ゲノム複合体、例えばＡＳＭＣ内にあり（例えば、遺伝子配列をコードする転写物のどの部分も、ゲノム複合体、例えばＡＳＭＣの外にない）、標的複数遺伝子の少なくとも１つの遺伝子は、部分的に、ゲノム複合体、例えばＡＳＭＣ内にある（例えば、遺伝子配列をコードする転写物の一部分は、ゲノム複合体、例えばＡＳＭＣの外にある）。
標的複数遺伝子の遺伝子は、コード配列、例えば、エキソン、及び／又は非コード配列、例えば、イントロン、３’ＵＴＲ、又は５’ＵＴＲを含み得る。一部の実施形態では、標的複数遺伝子の遺伝子は、転写制御エレメントに作動可能に連結される。一部の実施形態では、標的複数遺伝子の遺伝子の転写制御エレメントはまた、遺伝子がその一部であるゲノム複合体、例えば、ＡＳＭＣの一部である。ゲノム複合体、例えば、ＡＳＭＣの一部として、遺伝子に作動可能に連結された転写制御エレメントについて言及することは、標的複数遺伝子に関して上述したのと同じ意味で理解することができる。一部の実施形態では、標的複数遺伝子の遺伝子に作動可能に連結された各転写制御エレメントは、完全に、ゲノム複合体、例えば、ＡＳＭＣ内にある（例えば、転写制御エレメント配列は、どの部分も、ゲノム複合体、例えば、ＡＳＭＣの外側にない）。一部の実施形態では、標的複数遺伝子の各転写制御エレメントは、部分的に、ゲノム複合体、例えば、ＡＳＭＣ内にある（例えば、転写制御エレメント配列の一部は、ゲノム複合体、例えば、ＡＳＭＣの外側にある）。一部の実施形態では、標的複数遺伝子の各転写制御エレメントは、ゲノム複合体、例えば、ＡＳＭＣの完全に外側にある（例えば、各転写制御エレメント配列は、ゲノム複合体、例えば、ＡＳＭＣの外側にある）。一部の実施形態では、標的複数遺伝子の遺伝子に作動可能に連結された少なくとも１つの転写制御エレメントは、完全に、ゲノム複合体、例えば、ＡＳＭＣ内にある（例えば、転写制御エレメント配列は、どの部分も、ゲノム複合体、例えば、ＡＳＭＣの外側にない）。一部の実施形態では、標的複数遺伝子の別の遺伝子に作動可能に連結された少なくとも１つの転写制御エレメントは、部分的に、ゲノム複合体、例えば、ＡＳＭＣ内にある（例えば、遺伝子配列をコードする転写物の一部は、ゲノム複合体、例えば、ＡＳＭＣの外側にある）。一部の実施形態では、標的複数遺伝子の遺伝子に作動可能に連結された少なくとも１つの転写制御エレメントは、ゲノム複合体、例えば、ＡＳＭＣの完全に外側にある。
一部の実施形態では、部位特異的妨害剤又はシステムは、アンカー配列、例えば、標的複数遺伝子を含むゲノム複合体（例えば、ＡＳＭＣ）の一部であるアンカー配列に結合することにより、標的複数遺伝子をターゲティングする。一部の実施形態では、ターゲティング部分は、アンカー配列に結合する。一部の実施形態では、ゲノム複合体成分、例えば、核形成ポリペプチドのアンカー配列への結合が、複合体形成、例えば、アンカー配列媒介接合部形成の中心となる。各アンカー配列媒介接合部は、１つ又は複数のアンカー配列、例えば、複数のアンカー配列を含む。一部の実施形態では、アンカー配列媒介接合部を妨害して、標的複数遺伝子の発現を変更、例えば、阻害することができる。こうした妨害は、例えば、ＤＮＡのトポロジー構造を変化させることにより、例えば、複数の遺伝子が転写制御エレメント（例えば、増強及びサイレンシング／抑制性配列）と相互作用する能力を調節することにより、遺伝子発現を調節し得る。
部位特異的妨害剤又はシステムに使用するのに好適なターゲティング部分は、アンカー配列、例えば、標的複数遺伝子を含むゲノム複合体（例えば、ＡＳＭＣ）の一部であるアンカー配列に近接した部位に結合、例えば、特異的に結合し得る。本明細書で用いられるとき、「近接（した）」とは、第１部位での部位特異的妨害剤若しくはシステムの結合及び／又は部位特異的妨害剤による第１部位の修飾が、他方の部位の結合及び／又は修飾と同じ、若しくは実質的に同じ作用を生じるような、２つの部位、例えば、核酸部位の接近性を指す。例えば、ターゲティング部分は、標的複数遺伝子を含むゲノム複合体（例えば、ＡＳＭＣ）の一部であるアンカー配列（第２部位）に近接した第１部位に結合することができ、前記ターゲティング部分に関連するエフェクター部分は、あたかも第２部位が結合及び／又は修飾されたのと実質的に同様に、アンカー配列を含むゲノム複合体（例えば、ＡＳＭＣ）が修飾されるように、第１部位をエピジェネティック的に修飾することができる。一部の実施形態では、標的遺伝子（例えば、標的遺伝子内のエキソン、イントロン、若しくはスプライス部位）に近接した、標的遺伝子と作動可能に連結した転写制御エレメントに近接した、又はアンカー配列に近接した部位は、標的遺伝子（例えば、標的遺伝子内のエキソン、イントロン、若しくはスプライス部位）、転写制御エレメント、又はアンカー配列から５０００、４０００、３０００、２０００、１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１００、５０、４０、３０、２５、２０、１５、１０、又は５塩基対内（及び任意選択的に、標的遺伝子（例えば、標的遺伝子内のエキソン、イントロン、若しくはスプライス部位）、転写制御エレメント、又はアンカー配列から少なくとも５、１０、２０、２５、５０、１００、２００、若しくは３００塩基対の地点）にある。一部の実施形態では、アンカー配列に近接した部位は、アンカー配列から１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１００、５０、４０、３０、２０、１０、又は５塩基対未満（及び任意選択的に、少なくとも５、１０、２０、２５、５０、１００、２００、又は３００塩基対）の部位である。一部の実施形態では、アンカー配列に近接した部位は、アンカー配列から８００、７００、６００、５００、４００、又は３００塩基対未満（及び任意選択的に、少なくとも５、１０、２０、２５、５０、１００、２００、又は３００塩基対）の部位である。
本明細書に記載の部位特異的妨害剤又はシステムに使用するのに好適なターゲティング部分は、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０ヌクレオチド又は塩基対（且つ任意選択的に、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、又は１０ヌクレオチド又は塩基対以下）を含む部位に結合、例えば、特異的に結合し得る。一部の実施形態では、ターゲティング部分は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０ヌクレオチド又は塩基対を含む部位に結合する。
ゲノム複合体
本開示に関連するゲノム複合体は、複数のポリペプチド及び／又は核酸（特に、リボ核酸）成分を含み、２つ以上のゲノム配列エレメント（例えば、アンカー配列、プロモータ及び／又はエンハンサーエレメント）を共局在化する、安定な構造を含む。一部の実施形態では、関連するゲノム複合体は、アンカー配列媒介接合部（例えば、ゲノムループ）を含む。一部の実施形態では、ゲノム複合体内（すなわち、三次元空間内）のゲノム配列エレメントには、転写プロモータ及び／又は調節（例えば、エンハンサー又はリプレッサー）配列が含まれる。これに代わり、又は加えて、一部の実施形態では、ゲノム複合体中のゲノム配列エレメントは、ＣＴＣＦ、ＹＹ１などのうちの１つ又は複数に対する結合部位を含む。一部の実施形態では、ゲノム複合体は、標的複数遺伝子を含む。一部の実施形態では、標的複数遺伝子の２つ以上（例えば、全て）の遺伝子が、ＡＳＭＣの単一ループに位置する。一部の実施形態では、標的複数遺伝子の２つ以上（例えば、全て）の遺伝子が、ＡＳＭＣの異なるループに位置する。
一部の実施形態では、本開示に従って発生率が低減するゲノム複合体は、ゲノム配列エレメント（例えば、一部の実施形態では、核形成成分によって認識され得る、アンカー配列、例えば、ＣＴＣＦ結合モチーフ、ＹＹ１結合モチーフなど）、１つ又は複数のポリペプチド成分（例えば、１つ又は複数の核形成ポリペプチド、１つ又は複数の転写機構タンパク質、及び／又は１つ又は複数の転写調節タンパク質）、及び／又は１つ又は複数の非ゲノム核酸成分（例えば、例えばゲノム複合体に関連する遺伝子から転写された、非コードＲＮＡ及び／又はｍＲＮＡ）から選択される１つ又は複数の成分を含むか、又はそれからなる。
一部の実施形態では、ゲノム複合体成分は、ゲノム複合体の一部であり、ここで、ゲノム複合体は、例えば、複数のタンパク質及び／又は他の成分同士の相互作用によって、染色体上で互いに間隔をあけた２つのゲノム配列エレメントを一緒にする。
一部の実施形態では、ゲノム配列エレメントは、複合体の１つ又は複数のタンパク質成分が結合するアンカー配列であり；従って、一部の実施形態では、ゲノム複合体は、アンカー配列媒介接合部を含む。一部の実施形態では、ゲノム配列エレメントは、ＣＴＣＦ結合モチーフ、プロモータ及び／又はエンハンサーを含む。一部の実施形態では、ゲノム配列エレメントは、プロモータ及び／又は調節部位（例えば、エンハンサー）の少なくとも１つ又はその両方を含む。一部の実施形態では、複合体形成は、ゲノム配列エレメントにおいて、且つ／又はゲノム配列エレメントと１つ若しくは複数のタンパク質成分の結合により核形成される。
本明細書に記載のゲノム複合体に関与するゲノム配列エレメントは、互いに非連続的であってもよい。非隣接ゲノム配列エレメント（例えば、アンカー配列、プロモータ、及び／又は転写調節配列）を有する一部の実施形態では、第１ゲノム配列エレメント（例えば、アンカー配列、プロモータ、又は転写調節配列）は、第２ゲノム配列エレメント（例えば、アンカー配列、プロモータ、又は転写調節配列）から約５００ｂｐ～約５００Ｍｂ、約７５０ｂｐ～約２００Ｍｂ、約１ｋｂ～約１００Ｍｂ、約２５ｋｂ～約５０Ｍｂ、約５０ｋｂ～約１Ｍｂ、約１００ｋｂ～約７５０ｋｂ、約１５０ｋｂ～約５００ｋｂ、又は約１７５ｋｂ～約５００ｋｂの間隔を有し得る。一部の実施形態では、第１ゲノム配列エレメント（例えば、アンカー配列、プロモータ、又は転写調節配列）は、第２ゲノム配列エレメント（例えば、アンカー配列、プロモータ、又は転写調節配列）から約５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１ｋｂ、５ｋｂ、１０ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂ、３０ｋｂ、３５ｋｂ、４０ｋｂ、４５ｋｂ、５０ｋｂ、５５ｋｂ、６０ｋｂ、６５ｋｂ、７０ｋｂ、７５ｋｂ、８０ｋｂ、８５ｋｂ、９０ｋｂ、９５ｋｂ、１００ｋｂ、１２５ｋｂ、１５０ｋｂ、１７５ｋｂ、２００ｋｂ、２２５ｋｂ、２５０ｋｂ、２７５ｋｂ、３００ｋｂ、３５０ｋｂ、４００ｋｂ、５００ｋｂ、６００ｋｂ、７００ｋｂ、８００ｋｂ、９００ｋｂ、１Ｍｂ、２Ｍｂ、３Ｍｂ、４Ｍｂ、５Ｍｂ、６Ｍｂ、７Ｍｂ、８Ｍｂ、９Ｍｂ、１０Ｍｂ、１５Ｍｂ、２０Ｍｂ、２５Ｍｂ、５０Ｍｂ、７５Ｍｂ、１００Ｍｂ、２００Ｍｂ、３００Ｍｂ、４００Ｍｂ、５００Ｍｂ、又はそれらの間の任意のサイズの間隔を有する。
アンカー配列媒介接合部
一部の実施形態では、本開示に関連するゲノム複合体は、アンカー配列媒介接合部（ＡＳＭＣ）であるか、又はそれを含む。一部の実施形態では、アンカー配列媒介接合部は、核形成ポリペプチドが、ゲノム内のアンカー配列に結合すると形成され、これらのタンパク質、並びに任意選択的に、１つ若しくは複数の他の成分同士及びそれらの間の相互作用によって、接合部が形成され、そこにアンカー配列が物理的に共局在化される。本明細書に記載の多くの実施形態では、１つ又は複数の遺伝子がアンカー配列媒介接合部と結合しており；そのような実施形態では、アンカー配列媒介接合部は、典型的には、１つ若しくは複数のアンカー配列、１つ若しくは複数の遺伝子、及び１つ若しくは複数の転写制御配列、例えば、増強若しくはサイレンシング配列を含む。一部の実施形態では、転写制御配列は、アンカー配列媒介接合部内部にあるか、一部が内部にあるか、又はその外部にある。一部の実施形態では、ＡＳＭＣは、内部増強配列、例えば、エンハンサーを含む。一部の実施形態では、ＡＳＭＣは、標的複数遺伝子を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載のゲノム複合体（例えば、アンカー配列媒介接合部）は、染色体内ループなどのゲノムループであるか、又はそれを含む。特定の実施形態では、本明細書に記載のゲノム複合体（例えば、アンカー配列媒介接合部）は、複数のゲノムループを含む。１つ又は複数のゲノムループは、第１アンカー配列、核酸配列、転写制御配列、及び第２アンカー配列を含み得る。一部の実施形態では、少なくとも１つのゲノムループは、順に、第１アンカー配列、転写制御配列、及び第２アンカー配列；又は第１アンカー配列、核酸配列、及び第２アンカー配列を含む。さらに一部の実施形態では、核酸配列及び転写制御配列の一方又は両方がゲノムループ内に位置する。さらに一部の実施形態では、核酸配列及び転写制御配列の一方又は両方がゲノムループの外側に位置する。一部の実施形態では、１つ又は複数のゲノムループは、転写制御配列を含む。一部の実施形態では、ゲノム複合体（例えば、アンカー配列媒介接合部）は、ＴＡＴＡボックス、ＣＡＡＴボックス、ＧＣボックス、又はＣＡＰ部位を含む。
一部の実施形態では、アンカー配列媒介接合部は、複数のゲノムループを含み；一部のそのような実施形態では、アンカー配列媒介接合部は、アンカー配列、核酸配列、及び転写制御配列のうちの少なくとも１つを、１つ又は複数のゲノムループに含む。
ループの種類
一部の実施形態では、ゲノムループは、１つ又は複数、例えば、２、３、４、５、若しくはそれ以上の遺伝子、例えば、標的複数遺伝子を含む。一部の実施形態では、標的複数遺伝子の２つ以上、例えば、２、３、４、５、又はそれ以上の遺伝子が同じ方向に転写される。一部の実施形態では、標的複数遺伝子の全ての遺伝子が同じ方向に転写される。
一部の実施形態では、本開示は、（ｉ）発現が調節される（例えば、標的複数遺伝子の）遺伝子；及び／又は（ｉｉ）発現が調節される遺伝子の転写に影響を与える、１つ又は複数の関連転写制御配列の外側にあるか、その一部ではないか、又はその中に含まれる、ゲノム配列の共局在化を実現する、ゲノム複合体を阻害、解離、分解、及び／又は修飾することを含む、ループ内の標的複数遺伝子の発現を調節する（例えば、低減する）方法を提供する。
一部の実施形態では、本開示は、（ｉ）発現が調節される（例えば、標的複数遺伝子の）遺伝子；及び／又は（ｉｉ）発現が調節される遺伝子の転写に影響を与える関連転写制御配列と非連続的であるゲノム配列の共局在化を実現する、複合体の形成を阻害すること、及び／又は複合体を不安定化することを含む、標的複数遺伝子の転写を調節する（例えば、低減する）方法を提供する。
一部の実施形態では、アンカー配列媒介接合部は、１つ又は複数、例えば、２、３、４、５、又はそれ以上の転写制御配列と関連している。一部の実施形態では、標的複数遺伝子の遺伝子（例えば、１つ、２つ、又はそれ以上、例えば、全ての標的複数遺伝子）は、１つ又は複数の転写制御配列と非連続的である。遺伝子が、その転写制御配列と不連続である一部の実施形態では、遺伝子は、１つ若しくは複数の転写制御配列から約１００ｂｐ～約５００Ｍｂ、約５００ｂｐ～約２００Ｍｂ、約１ｋｂ～約１００Ｍｂ、約２５ｋｂ～約５０Ｍｂ、約５０ｋｂ～約１Ｍｂ、約１００ｋｂ～約７５０ｋｂ、約１５０ｋｂ～約５００ｋｂ、又は約１７５ｋｂ～約５００ｋｂの間隔を有し得る。一部の実施形態では、遺伝子は、転写制御配列から約１００ｂｐ、３００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１ｋｂ、５ｋｂ、１０ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂ、３０ｋｂ、３５ｋｂ、４０ｋｂ、４５ｋｂ、５０ｋｂ、５５ｋｂ、６０ｋｂ、６５ｋｂ、７０ｋｂ、７５ｋｂ、８０ｋｂ、８５ｋｂ、９０ｋｂ、９５ｋｂ、１００ｋｂ、１２５ｋｂ、１５０ｋｂ、１７５ｋｂ、２００ｋｂ、２２５ｋｂ、２５０ｋｂ、２７５ｋｂ、３００ｋｂ、３５０ｋｂ、４００ｋｂ、５００ｋｂ、６００ｋｂ、７００ｋｂ、８００ｋｂ、９００ｋｂ、１Ｍｂ、２Ｍｂ、３Ｍｂ、４Ｍｂ、５Ｍｂ、６Ｍｂ、７Ｍｂ、８Ｍｂ、９Ｍｂ、１０Ｍｂ、１５Ｍｂ、２０Ｍｂ、２５Ｍｂ、５０Ｍｂ、７５Ｍｂ、１００Ｍｂ、２００Ｍｂ、３００Ｍｂ、４００Ｍｂ、５００Ｍｂ、又はそれらの間の任意のサイズの間隔を有する。
アンカー配列
一般に、アンカー配列は、ゲノム複合体成分、例えば、核形成ポリペプチドが特異的に結合するゲノム配列エレメントである。一部の実施形態では、ゲノム複合体成分のアンカー配列との結合が、複合体形成の中心となる。
各アンカー配列媒介接合部は、１つ又は複数のアンカー配列、例えば、複数のアンカー配列を含む。一部の実施形態では、アンカー配列を操作又は変更して、天然に存在するループを形成及び／又は安定化し、１つ若しくは複数の新しいループを形成し（例えば、外性ループを形成するか、又は外性若しくは変更されたアンカー配列を有する天然に存在しないループを形成する）、又は天然若しくは外性ループを不安定化するか、若しくはその形成を阻害できる。こうした変更は、例えば、ＤＮＡのトポロジー構造を変化させ、例えば、それにより、標的遺伝子が、遺伝子調節及び制御因子（例えば、増強及びサイレンシング／リプレッサー配列）と相互作用する能力を調節することによって遺伝子発現を調節することができる。
一部の実施形態では、アンカー配列媒介接合部内の１つ若しくは複数のヌクレオチドを置換、付加するか、又は欠失させることにより、クロマチン構造を修飾する。一部の実施形態では、アンカー配列媒介接合部のアンカー配列内の１つ若しくは複数のヌクレオチドを置換、付加するか、又は欠失させることにより、クロマチン構造を修飾する。
一部の実施形態では、アンカー配列は、共通のヌクレオチド配列、例えば、ＣＴＣＦ－結合モチーフ：Ｎ（Ｔ／Ｃ／Ｇ）Ｎ（Ｇ／Ａ／Ｔ）ＣＣ（Ａ／Ｔ／Ｇ）（Ｃ／Ｇ）（Ｃ／Ｔ／Ａ）ＡＧ（Ｇ／Ａ）（Ｇ／Ｔ）ＧＧ（Ｃ／Ａ／Ｔ）（Ｇ／Ａ）（Ｃ／Ｇ）（Ｃ／Ｔ／Ａ）（Ｇ／Ａ／Ｃ）（配列番号１）（Ｎは、任意のヌクレオチドである）を含む。
ＣＴＣＦ－結合モチーフはまた、逆配向、例えば、（Ｇ／Ａ／Ｃ）（Ｃ／Ｔ／Ａ）（Ｃ／Ｇ）（Ｇ／Ａ）（Ｃ／Ａ／Ｔ）ＧＧ（Ｇ／Ｔ）（Ｇ／Ａ）ＧＡ（Ｃ／Ｔ／Ａ）（Ｃ／Ｇ）（Ａ／Ｔ／Ｇ）ＣＣ（Ｇ／Ａ／Ｔ）Ｎ（Ｔ／Ｃ／Ｇ）Ｎ（配列番号２）であってもよい。一部の実施形態では、アンカー配列は、配列番号１若しくは配列番号２又は配列番号１若しくは配列番号２のいずれかに対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一の配列を含む。
一部の実施形態では、アンカー配列は、ＣＴＣＦ結合モチーフ、ＵＳＦ１結合モチーフ、ＹＹ１結合モチーフ、ＴＡＦ３結合モチーフ、又はＺＮＦ１４３結合モチーフを含む。一部の実施形態では、アンカー配列は、核形成ポリペプチド結合モチーフ、例えば、ＹＹ１結合モチーフ：ＣＣＧＣＣＡＴＮＴＴ（配列番号３）（Ｎは、任意のヌクレオチドである）を含む。ＹＹ１結合モチーフはまた、逆配向、例えば、ＡＡＮＡＴＧＧＣＧＧ（配列番号４）（Ｎは、任意のヌクレオチドである）であってもよい。一部の実施形態では、アンカー配列は、配列番号３若しくは配列番号４又は配列番号３若しくは配列番号４のいずれかに対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一の配列を含む。
一部の実施形態では、アンカー配列媒介接合部は、少なくとも１つの第１アンカー配列と少なくとも１つの第２アンカー配列を含む。例えば、一部の実施形態では、第１アンカー配列及び第２アンカー配列は各々、共通のヌクレオチド配列を含んでもよく、例えば、各々がＣＴＣＦ結合モチーフを含む。一部の実施形態では、第１アンカー配列及び第２アンカー配列は各々、ＵＳＦ１結合モチーフを含んでもよい。一部の実施形態では、第１アンカー配列及び第２アンカー配列は各々、ＹＹ１結合モチーフを含んでもよい。一部の実施形態では、第１アンカー配列及び第２アンカー配列は各々、ＴＡＦ３結合モチーフを含んでもよい。一部の実施形態では、第１アンカー配列及び第２アンカー配列は各々、ＺＮＦ１４３結合モチーフを含んでもよい。
一部の実施形態では、第１アンカー配列及び第２アンカー配列は、異なる配列を含み、例えば、第１アンカー配列は、ＣＴＣＦ結合モチーフを含み、第２アンカー配列は、ＣＴＣＦ結合モチーフ以外のアンカー配列を含む。一部の実施形態では、第１アンカー配列は、ＣＴＣＦ結合モチーフ、ＵＳＦ１結合モチーフ、ＹＹ１結合モチーフ、ＴＡＦ３結合モチーフ、又はＺＮＦ１４３結合モチーフを含み、第２アンカー配列は、ＣＴＣＦ結合モチーフ、ＵＳＦ１結合モチーフ、ＹＹ１結合モチーフ、ＴＡＦ３結合モチーフ、又はＺＮＦ１４３結合モチーフを含み、ここで、第１及び第２アンカー配列は、両方とも、ＣＴＣＦ結合モチーフ、ＵＳＦ１結合モチーフ、ＹＹ１結合モチーフ、ＴＡＦ３結合モチーフ、又はＺＮＦ１４３結合モチーフを含むわけではない。一部の実施形態では、各アンカー配列は、共通のヌクレオチド配列（例えば、ＣＴＣＦ結合モチーフ、ＵＳＦ１結合モチーフ、ＹＹ１結合モチーフ、ＴＡＦ３結合モチーフ、又はＺＮＦ１４３結合モチーフ）を含み、共通のヌクレオチド配列の片側又は両側に１つ又は複数のフランキングヌクレオチドを含む。
接合部を形成することができる２つのアンカー配列（例えば、それぞれＣＴＣＦ結合モチーフ、ＵＳＦ１結合モチーフ、ＹＹ１結合モチーフ、ＴＡＦ３結合モチーフ、又はＺＮＦ１４３結合モチーフを含む）は、ゲノム内に任意の配向で存在することができ、例えば、同じ配向（タンデム）では、５’－３’（左タンデム、又は３’－５’（右タンデム）、又は収束配向で、一方のアンカー配列は５’－３’に配向され、もう一方のアンカー配列は５’－３’に配向されている。
接合部を形成することができる２つのＣＴＣＦ結合モチーフ（例えば、連続的若しくは非連続的ＣＴＣＦ結合モチーフ）は、任意の配向で、例えば、同じ配向（タンデム）で５’－３’（左タンデム、例えば、配列番号１を含む２つのＣＴＣＦ結合モチーフ）又は３’－５’（右タンデム、例えば、配列番号２を含む２つのＣＴＣＦ結合モチーフ）のいずれか、或いは、一方のＣＴＣＦ結合モチーフが配列番号１を含み、他方が配列番号２を含む収斂配向で、ゲノム内に存在し得る。ＣＴＣＦＢＳＤＢ ２．０：Ｄａｔａｂａｓｅ Ｆｏｒ ＣＴＣＦ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｔｉｆｓ Ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ（ワールドワイドウェブ上のｉｎｓｕｌａｔｏｒｄｂ．ｕｔｈｓｃ．ｅｄｕ／）を用いて、標的遺伝子に関連するＣＴＣＦ結合モチーフを同定することができる。
一部の実施形態では、アンカー配列は、標的複数遺伝子に関連するＣＴＣＦ結合モチーフを含み、この場合、上記標的複数遺伝子は、疾患、障害及び／又は病状に関連する。一部の実施形態では、アンカー配列は、標的複数遺伝子に関連するＣＴＣＦ結合モチーフを含み、この場合、標的複数遺伝子の遺伝子は、関連する機能性を有する。一部の実施形態では、アンカー配列は、標的複数遺伝子に関連するＣＴＣＦ結合モチーフを含み、ここで、標的複数遺伝子（例えば、複数のうちの２つ以上、例えば、全て）は、対象の細胞において異常に発現される。
一部の実施形態では、少なくとも１つのアンカー配列、例えば、核形成ポリペプチド結合モチーフ内の、１つ又は複数のヌクレオチドを置換、付加するか、又は欠失させることにより、クロマチン構造を修飾する。アンカー配列、例えば、核形成ポリペプチド結合モチーフ内での置換、付加又は欠失のために、１つ若しくは複数のヌクレオチドを特異的にターゲティングする、例えば、標的化変更することもできる。
一部の実施形態では、アンカー配列媒介接合部は、少なくとも１つの共通のヌクレオチド配列、例えば、核形成ポリペプチド結合モチーフの配向を変えることによって変更され得る。一部の実施形態では、アンカー配列は、核形成ポリペプチド結合モチーフ、例えば、ＣＴＣＦ結合モチーフを含み、ターゲティング部分は、少なくとも１つの核形成ポリペプチド結合モチーフに変更を導入して、例えば、核形成ポリペプチドに対する結合親和性を変更する。
一部の実施形態では、外性アンカー配列を導入することによって、アンカー配列媒介接合部を変更することができる。一部の実施形態では、例えば、天然に存在しないループの形成を誘導することにより、天然に存在するアンカー配列媒介接合部の形成を不安定化又は阻害するための、天然に存在しないか又は外性のアンカー配列の付加は、核酸配列の転写を変更する（例えば、低減する）。
その他の構成
核酸及びベクター
本開示は、部分的に、本明細書に部位特異的妨害剤又は記載のシステムをコードする核酸をさらに対象とする。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤は、部位特異的妨害剤をコードする核酸、例えば、部位特異的妨害剤のターゲティング部分及び／又はエフェクター部分を含む組成物を介して提供され得、ここで、核酸は、目的のシステムにおいて（例えば、特定の細胞、組織、生物などにおいて）部位特異的妨害剤の発現を達成するのに十分な他の配列と会合している。一部の実施形態では、システムは、第１部位特異的妨害剤、例えば、第１部位特異的妨害剤の第１ターゲティング部分及び／又は第１エフェクター部分をコードする、第１核酸、及び第２部位特異的妨害剤、例えば、第２部位特異的妨害剤の第２ターゲティング部分及び／又は第２エフェクター部分をコードする、第２核酸を含む組成物によって提供され得、ここで、第１及び／又は第２核酸は、目的のシステムにおいて（例えば、特定の細胞、組織、生物などにおいて）部位特異的妨害剤の発現を達成するのに十分な他の配列と会合している。
いくつかの特定の実施形態では、本開示は、部位特異的妨害剤若しくはポリペプチドをコードする核酸又はその核酸部分（例えば、ポリペプチド及び／又は核酸を含むターゲティング部分及び／又はエフェクター部分）の組成物を提供する。いくつかの特定の実施形態では、本開示は、第１部位特異的妨害剤及び第２部位特異的妨害剤若しくはポリペプチドをコードする核酸又はその核酸部分（例えば、ポリペプチド及び／又は核酸を含むターゲティング部分及び／又はエフェクター部分）の組成物を提供する。いくつかのそうした実施形態では、提供される核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は本明細書に記載されるいずれか他の核酸部分若しくは実体を含んでよく、本明細書に記載されるか、又はそうでなければ、当技術分野で利用可能な任意の技術（例えば、合成、クローニング、増幅、インビトロ若しくはインビボ転写など）により調製され得る。一部の実施形態では、１つ又は複数の部位特異的妨害剤、又はそのポリペプチド若しくは核酸部分をコードする、提供される核酸は、目的のシステム、例えば、特定の細胞、組織、生物など）において提供される核酸の組込み、複製、及び／又は発現を達成するのに適した及び／又は十分な１つ若しくは複数の複製、組込み、及び／又は発現シグナルと作動可能に結合されていてもよい。
一部の実施形態では、本明細書に記載の部位特異的妨害剤又はシステムを送達するための組成物は、部位特異的妨害剤若しくはポリペプチドをコードする１つ又は複数の核酸又はその核酸部分を含むベクター、例えば、ウイルスベクターを含む。一部の実施形態では、第１ベクターは、第１部位特異的妨害剤をコードする第１核酸を含み、第２ベクターは、第２部位特異的妨害剤をコードする第２核酸を含む。一部の実施形態では、単一のベクターは、第１部位特異的妨害剤をコードする第１核酸と、第２部位特異的妨害剤をコードする第２核酸とを含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載の部位特異的妨害剤又はシステムを送達するための組成物は、部位特異的妨害剤若しくはポリペプチドの１つ又は複数の成分をコードする１つ又は複数の核酸又はその核酸部分を含むＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡであるか、それを含む。
本明細書に記載のような核酸又は本明細書に記載のタンパク質をコードする核酸は、ベクター中に組み込まれてもよい。ベクター、例えばレンチウイルスなどのレトロウイルス由来のものは、導入遺伝子の長期の安定な組込み及び娘細胞におけるその増殖を可能にすることから、長期遺伝子導入を達成するために好適なツールである。ベクターの例として、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、及び配列決定ベクターが挙げられる。発現ベクターは、ウイルスベクターの形態で細胞に提供されてもよい。ウイルスベクター技術は、当該技術分野で周知であり、種々のウイルス学及び分子生物学のマニュアルに説明されている。ベクターとして有用であるウイルスとして、限定はされないが、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、及びレンチウイルスが挙げられる。一般に、好適なベクターは、少なくとも１つの生物において機能的な複製起点、プロモータ配列、便宜的な制限エンドヌクレアーゼ部位、及び１以上の選択可能マーカを有する。
天然又は合成核酸の発現は、典型的には目的の遺伝子をコードする核酸をプロモータに作動可能に連結し、構築物を発現ベクターに組み込むことにより達成される。ベクターは、真核生物における複製及び組み込みに適し得る。典型的なクローニングベクターは、所望される核酸配列の発現にとって有用な転写及び翻訳ターミネーター、開始配列、並びにプロモータを有する。
追加的なプロモータ領域、例えば増強配列は、転写開始の頻度を調節してもよい。典型的には、これらの配列は転写開始部位の３０～１１０ｂｐ上流の領域内に位置するが、近年、いくつかのプロモータが同様に転写開始部位の下流に機能的要素を有することが示されている。プロモータ領域間のスペーシングはフレキシブルであることが多いことから、プロモータ機能は、領域が互いに対して反転又は移動されるとき、保存される。チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモータでは、プロモータ領域間のスペーシングは、活性が低下し始める前に５０ｂｐ離れるまで増加し得る。プロモータに応じて、転写を活性化するため、各領域が協同的又は非依存的に機能し得るように思われる。
好適なプロモータの一例が、最初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ配列である。このプロモータ配列は、それに作動可能に連結された任意のポリヌクレオチド配列の発現を高レベルで駆動する能力がある強力な構成的プロモータ配列である。いくつかの実施形態では、好適なプロモータが伸長成長因子－１α（ＥＦ－１α）である。しかし、他の構成的プロモータ配列、例えば限定はされないが、サルウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモータ、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）長末端リピート（ＬＴＲ）プロモータ、ＭｏＭｕＬＶプロモータ、トリ白血病ウイルスプロモータ、エプスタイン・バーウイルス最初期プロモータ、ラウス肉腫ウイルスプロモータ、並びにヒト遺伝子プロモータ、例えば限定はされないが、アクチンプロモータ、ミオシンプロモータ、ヘモグロビンプロモータ、及びクレアチンキナーゼプロモータも使用されてもよい。
本開示は、任意の特定のプロモータ又はプロモータのカテゴリー（例えば構成的プロモータ）の使用に限定されるように解釈されるべきではない。例えば、いくつかの実施形態では、誘導性プロモータが本開示の一部として検討される。いくつかの実施形態では、誘導性プロモータの使用により、それが作動可能に連結される対象のポリヌクレオチド配列の発現を、かかる発現が所望されるときに活性化する能力がある分子スイッチが提供される。いくつかの実施形態では、誘導性プロモータの使用により、発現を、所望されないときに不活性化する能力がある分子スイッチが提供される。誘導性プロモータの例として、限定はされないが、メタロチオニンプロモータ、グルココルチコイドプロモータ、プロゲステロンプロモータ、及びテトラサイクリンプロモータが挙げられる。
いくつかの実施形態では、導入されるべき発現ベクターはまた、ウイルスベクターを介してトランスフェクト又は感染されることが探求された細胞の集団から細胞を発現する同定及び選択を促進するため、選択可能マーカ遺伝子若しくはレポーター遺伝子のいずれか又は双方を有し得る。いくつかの態様では、選択可能マーカは、ＤＮＡの分離片に対して実施され、同時トランスフェクション法において使用されてもよい。宿主細胞内での発現を可能にするため、選択可能マーカとレポーター遺伝子の双方は、適切な転写調節配列と隣接されてもよい。有用な選択可能マーカは、例えば抗生物質耐性遺伝子、例えばｎｅｏなどを含んでもよい。
いくつかの実施形態では、潜在的にトランスフェクトされた細胞を同定するため、且つ／又は転写調節配列の機能性を評価するため、レポーター遺伝子が使用されてもよい。一般に、レポーター遺伝子は、（レポーター遺伝子の）レシピエント供給源中に存在しないか又はそれによって発現され、且ついくつかの容易に検出可能な特性、例えば酵素活性又は可視化可能な蛍光により発現が明らかにされるようなポリペプチドをコードする遺伝子である。レポーター遺伝子の発現は、ＤＮＡがレシピエント細胞に導入されてからの好適な時点でアッセイされる。好適なレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌されたアルカリホスファターゼをコードする遺伝子、又は緑色蛍光タンパク質遺伝子（例えば、Ｕｉ－Ｔｅｉ ｅｔ ａｌ．，２０００ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４７９：７９－８２）を含んでもよい。好適な発現系は、周知であり、公知の技術を用いて調製されるか又は商業的に得られてもよい。一般に、レポーター遺伝子の最高レベルでの発現を示す最小の５’隣接領域を有する構築物は、プロモータとして同定される。かかるプロモータ領域は、レポーター遺伝子に連結され、薬剤のプロモータ駆動転写を調節する能力について評価するため、使用されてもよい。
細胞
本開示は、部分的に、本明細書に記載の部位特異的妨害剤又はシステムを含む細胞をさらに対象とする。当業者に公知の任意の細胞、例えば、細胞株、例えば、組換えポリペプチドの発現に適した細胞株は、本明細書に記載の部位特異的妨害剤を含むのに好適である。一部の実施形態では、細胞、例えば、細胞株を使用して、部位特異的妨害剤、１つ若しくは複数の部位特異的薬剤を含むシステム、又はその核酸若しくはポリペプチド部分を発現することができる。一部の実施形態では、細胞、例えば細胞株を使用して、部位特異的妨害剤をコードする核酸、例えばベクターを発現又は増幅することができる。一部の実施形態では、細胞、例えば細胞株を使用して、１つ又は複数の核酸、例えば、第１部位特異的妨害剤をコードするベクター及び第２部位特異的妨害剤をコードするベクターを発現又は増幅することができる。一部の実施形態では、細胞は、本明細書に記載の部位特異的妨害剤をコードする核酸を含む。一部の実施形態では、細胞は、本明細書に記載の第１部位特異的妨害剤をコードする第１核酸と、第２部位特異的妨害剤をコードする第２核酸とを含む。
一部の実施形態では、細胞は、部位特異的妨害剤又はその核酸若しくはポリペプチド部分をコードする核酸を含み、核酸は、細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれる。一部の実施形態では、細胞は、部位特異的妨害剤又はその核酸若しくはポリペプチド部分をコードする核酸を含み、核酸は、ベクター上に配置される。一部の実施形態では、細胞は、第１部位特異的妨害剤をコードする第１核酸、及び第２部位特異的妨害剤をコードする第２核酸、又はその核酸若しくはポリペプチド部分を含み、第１及び第２核酸は、細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれる。一部の実施形態では、細胞は、第１部位特異的妨害剤をコードする第１核酸、及び第２部位特異的妨害剤をコードする第２核酸、又はその核酸若しくはポリペプチド部分を含み、第１及び第２核酸は、ベクター上に配置される。
本明細書の部位特異的妨害剤又はシステムを含み得る及び／又は発現し得る細胞の例として、限定されないが、肝細胞、星状細胞、クッパー細胞、神経細胞、内皮細胞、肺胞細胞、上皮細胞、筋細胞、滑膜層、軟骨細胞、免疫細胞、及びリンパ球が挙げられる。
本開示はさらに、部分的に、本明細書に記載の方法又はプロセスによって作製された細胞を対象とする。一部の実施形態では、本開示は、本明細書に記載の部位特異的妨害剤を提供すること、細胞を提供すること、及び細胞を部位特異的妨害剤（又は部位特異的妨害剤をコードする核酸、又は前記部位特異的妨害剤若しくは核酸を含む組成物）と接触させることにより生産される細胞を提供する。一部の実施形態では、本開示は、本明細書に記載のシステムを提供すること、細胞を提供すること、及び細胞をシステム（又は第１部位特異的妨害剤をコードする第１核酸及び第２部位特異的妨害剤をコードする第２核酸、又は前記システム若しくは核酸を含む組成物）と接触させることにより生産される細胞を提供する。理論に束縛されることは望まないが、本明細書に記載の部位特異的妨害剤又はシステムと接触した細胞は、部位特異的妨害剤と接触していない同様の細胞と比較して、標的複数遺伝子の発現の低減；標的複数遺伝子、標的複数遺伝子に作動可能に連結された転写制御エレメント、又は標的複数遺伝子に近接した、若しくは標的複数遺伝子を含むアンカー配列媒介接合部と会合した、アンカー配列に関連するエピジェネティックマーカの修飾；標的複数遺伝子、標的複数遺伝子に作動可能に連結された転写制御エレメント、又は標的複数遺伝子に近接した、若しくは標的複数遺伝子を含むアンカー配列媒介接合部と会合した、アンカー配列の遺伝子の遺伝子修飾；及び／又は標的複数遺伝子を含むゲノム複合体、例えば、ＡＳＭＣのレベルの低減（例えば、不存在）を示し得る。一部の実施形態では、標的複数遺伝子の発現の低減、エピジェネティックマーカの修飾、及び／又は遺伝子修飾を示す細胞は、部位特異的妨害剤を含まない。標的複数遺伝子の発現の低減、エピジェネティックマーカの修飾、及び／又は遺伝子修飾は、部位特異的妨害剤との接触後、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、若しくは２４時間、又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、１０、若しくは１４日、又は少なくとも１、２、３、４、若しくは５週間、又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、若しくは１２ヶ月、又は少なくとも１、２、３、４、若しくは５年にわたって（例えば、無期限に）持続し得る。一部の実施形態では、部位特異的妨害剤によって以前に接触された細胞は、部位特異的妨害剤が細胞内にもはや存在しなくなった後、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、若しくは２４時間、又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、１０、若しくは１４日、又は少なくとも１、２、３、４、若しくは５週間、又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、若しくは１２ヶ月、又は少なくとも１、２、３、４、若しくは５年にわたって（例えば、無期限に）標的複数遺伝子の発現の低減、エピジェネティックマーカの修飾、及び／又は遺伝子修飾を保持する。一部の実施形態では、細胞は、哺乳動物、例えば、ヒト細胞である。一部の実施形態では、細胞は、体細胞及び／又は初代細胞である。
キット
本開示はさらに、部分的に、部位特異的妨害剤、システム、部位特異的妨害剤をコードする核酸、又は本明細書に記載の第１部位特異的妨害剤をコードする第１核酸及び第２部位特異的妨害剤をコードする第２核酸を含むキットを対象とする。一部の実施形態では、キットは、部位特異的妨害剤、システム、又はそれをコードする核酸、及び前記部位特異的妨害剤又はシステムの使用説明書を含む。一部の実施形態では、キットは、部位特異的妨害剤をコードする核酸又はその成分（例えば、部位特異的妨害剤のポリペプチド又は核酸部分）と、前記核酸及び／又は前記部位特異的妨害剤の使用説明書とを含む。一部の実施形態では、キットは、部位特異的妨害剤をコードする核酸又はその成分（例えば、部位特異的妨害剤のポリペプチド又は核酸部分）を含む細胞と、前記細胞、核酸及び／又は前記部位特異的妨害剤の使用説明書とを含む。一部の実施形態では、キットは、第１部位特異的妨害剤をコードする第１核酸及び第２部位特異的妨害剤をコードする第２核酸又はその成分（例えば、第１及び第２部位特異的妨害剤のポリペプチド又は核酸部分）と、前記核酸及び／又は前記システムの使用説明書とを含む。一部の実施形態では、キットは、コードする核酸を含む細胞又は第１部位特異的妨害剤をコードする核酸を含む第１核酸及び第２部位特異的妨害剤をコードする第２核酸又はその成分（例えば、第１及び第２部位特異的妨害剤のポリペプチド又は核酸部分）と、前記細胞、核酸及び／又は前記システムの使用説明書とを含む。
一部の実施形態では、キットは、部位特異的妨害剤の単位用量、又は本明細書に記載の部位特異的妨害剤をコードする核酸、例えばベクターの単位用量を含む。一部の実施形態では、キットは、システムの単位用量、又は本明細書に記載の第１部位特異的妨害剤及び第２部位特異的妨害剤をコードする第１及び第２核酸、例えば、ベクターの単位用量を含む。
部位特異的妨害剤の作製方法
一部の実施形態では、部位特異的妨害剤又はシステムは、１つ又は複数のタンパク質を含み、従って、タンパク質を作製する方法によって生産され得る。当業者には理解されるように、タンパク質又はポリペプチド（本明細書に記載の調節剤に含有され得る）を作製する方法は、当技術分野で常用的である。概要については、以下：Ｓｍａｌｅｓ ＆ Ｊａｍｅｓ（Ｅｄｓ．），Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（２００５）；及びＣｒｏｍｍｅｌｉｎ，Ｓｉｎｄｅｌａｒ ＆ Ｍｅｉｂｏｈｍ（Ｅｄｓ．），Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（２０１３）を参照されたい。
本開示の組成物のタンパク質又はポリペプチドは、標準的な固相技術を用いて生化学的に合成することができる。こうした方法としては、排他的固相合成、部分的固相合成方法、フラグメント凝縮、古典的溶液合成が挙げられる。これらの方法は、ペプチドが比較的短い（例えば、１０ｋＤａ）場合、且つ／又はそれを組換え技術により生産することができない（すなわち、核酸配列によりコードされない）ため、別の化学を必要とする場合に使用することができる。
固相合成法は、当技術分野で公知であり、Ｊｏｈｎ Ｍｏｒｒｏｗ Ｓｔｅｗａｒｔ ａｎｄ Ｊａｎｉｓ Ｄｉｌｌａｈａ Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９８４；及びＣｏｉｎ，Ｉ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２：３２４７－３２５６，２００７により詳しく記載されている。
より長いペプチドの場合、組換え法を使用することができる。組換え治療用ポリペプチドを作製する方法は、当技術分野において常用的である。概要については、以下：Ｓｍａｌｅｓ ＆ Ｊａｍｅｓ（Ｅｄｓ．），Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（２００５）；及びＣｒｏｍｍｅｌｉｎ，Ｓｉｎｄｅｌａｒ ＆ Ｍｅｉｂｏｈｍ（Ｅｄｓ．），Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（２０１３）を参照されたい。
治療薬用タンパク質又はポリペプチドを生産する例示的な方法は、哺乳動物細胞における発現を含むが、適切なプロモータの制御下で、昆虫細胞、酵母、細菌、又は他の細胞を用いて組換えタンパク質を生産することもできる。哺乳動物発現ベクターは、非転写エレメント、例えば、複製起点、好適なプロモータ、並びに他の５’又は３’フランキング非転写配列、及び５’又は３’非翻訳配列、例えば、必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー及びアクセプター部位、並びに終結配列を含み得る。異種ＤＮＡ配列の発現に必要な他の遺伝子エレメントを取得するために、ＳＶ４０ウイルスゲノム由来のＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０起点、初期プロモータ、スプライス、及びポリアデニル化部位を用いてもよい。細菌、真菌、酵母、及び哺乳動物細胞宿主と共に使用するのに適したクローニング及び発現ベクターは、以下：Ｇｒｅｅｎ ＆ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２０１２）に記載されている。多量のタンパク質又はポリペプチドが要望される場合には、以下：Ｂｒｉａｎ Ｂｒａｙ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，２：５８７－５９３，２００３；及びＷｅｉｓｓｂａｃｈ ＆ Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ，１９８８，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，Ｓｅｃｔｉｏｎ ＶＩＩＩ，ｐｐ ４２１－４６３に記載されるような技術を用いて、それを生成することができる。
様々な哺乳動物細胞培養システムを使用して、組換えタンパク質を発現させ、製造することができる。哺乳動物発現システムの例として、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬＡ及びＢＨＫ細胞株が挙げられる。タンパク質治療薬生産のための宿主細胞培養のプロセスは、Ｚｈｏｕ ａｎｄ Ｋａｎｔａｒｄｊｉｅｆｆ（Ｅｄｓ．），Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（２０１４）に記載されている。本明細書に記載される組成物は、組換えタンパク質をコードするベクター、例えば、ウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクターを含有してもよい。一部の実施形態では、ベクター、例えば、ウイルスベクターは、組換えタンパク質をコードする核酸を含み得る。タンパク質治療薬の精製については、以下：Ｆｒａｎｋｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（２０１３）；及びＣｕｔｌｅｒ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（２０１０）に記載されている。タンパク質治療薬の製剤化については、以下：Ｍｅｙｅｒ（Ｅｄ．），Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ：Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，ａｎｄ ｔｈｅ Ｃｌｉｎｉｃ，Ｗｏｏｄｈｅａｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｓｅｒｉｅｓ（２０１２）に記載されている。タンパク質は、１つ又は複数のアミノ酸を含む。アミノ酸は、例えば、１つ又は複数のペプチド結合を介して、ポリペプチド鎖に組み込むことができる任意の化合物及び／又は物質を含む。一部の実施形態では、アミノ酸は、一般的な構造：Ｈ２Ｎ－Ｃ（Ｈ）（Ｒ）－ＣＯＯＨを有する。一部の実施形態では、アミノ酸は、天然に存在するアミノ酸である。一部の実施形態では、アミノ酸は、非天然アミノ酸であり；一部の実施形態では、アミノ酸は、Ｄ－アミノ酸であり；一部の実施形態では、アミノ酸は、Ｌ－アミノ酸である。「標準アミノ酸」とは、天然に存在するペプチドに共通して存在する２０の標準Ｌ－アミノ酸のいずれかを指す。「非標準アミノ酸」とは、それが合成により調製されたか、又は天然供給源から得られたかにかかわらず、標準アミノ酸以外のあらゆるアミノ酸を指す。一部の実施形態では、ポリペプチド中のカルボキシ－及び／又はアミノ－末端アミノ酸を含め、アミノ酸は、上の一般的な構造と比較して、構造修飾を含んでもよい。例えば、一部の実施形態では、アミノ酸は、一般的な構造と比較して、（例えば、アミノ基、カルボン酸基、１つ若しくは複数のプロトン、及び／又はヒドロキシル基の）メチル化、アミド化、アセチル化、ペグ化、グリコシル化、リン酸化、及び／又は置換により修飾されていてもよい。一部の実施形態では、こうした修飾は、例えば、そうでなければ同じ非修飾アミノ酸を含有するものと比較して、修飾アミノ酸を含有するポリペプチドの循環半減期を変更し得る。一部の実施形態では、こうした修飾は、そうでなければ同じ非修飾アミノ酸を含有するものと比較して、修飾アミノ酸を含有するポリペプチドの関連活性を有意に変更しない。文脈から明らかになるように、一部の実施形態では、用語「アミノ酸」は、遊離アミノ酸を示すために使用される場合もあり；一部の実施形態では、ポリペプチドのアミノ酸残基を示すために使用される場合もある。
医薬組成物、製剤、送達、及び投与
本開示はさらに、部分的に、本明細書に記載の部位特異的妨害剤を含む医薬組成物、及び本明細書に記載の部位特異的妨害剤又はシステムをコードする核酸を含む医薬組成物を対象とする。
本明細書で用いられるとき、用語「医薬組成物」は、１つ若しくは複数の薬学的に許容できる担体（例えば、当業者には公知の薬学的に許容できる担体）と一緒に製剤化される活性薬剤（例えば、部位特異的妨害剤若しくはシステム、又はそれをコードする核酸）を指す。一部の実施形態では、活性薬剤は、関連集団に投与すると、予定された治療効果を達成する統計的に有意な確率を示す治療レジメンでの投与に適した単位用量で存在する。一部の実施形態では、医薬組成物は、本開示の部位特異的妨害剤又はシステムを含む。
一部の実施形態では、医薬組成物は、固体又は液体形態での投与のために特別に製剤化してもよく、そうしたものとして、以下：経口投与、例えば、飲薬（水性若しくは非水性溶液又は懸濁液）、錠剤、例えば、口腔、舌下、及び全身吸収を目的とするもの、ボーラス、粉末剤、顆粒剤、舌への適用のためのペースト剤；非経口投与、例えば、皮下、筋肉内、静脈内若しくは硬膜外注射（例えば、滅菌溶液若しくは懸濁液など）、又は持続放出製剤；例えば、クリーム、軟膏などの局所適用、又は皮膚、肺、若しくは口腔に適用される制御放出パッチ若しくはスプレー；例えば、ペッサリー、クリーム、若しくはフォームとしての膣内若しくは直腸内；舌下；眼内；経皮；或いは例えば、エアロゾル、水溶液、又は懸濁液としての鼻、肺、及び／又は他の粘膜表面のために設計されたものが挙げられる。一部の実施形態では、組成物を凍結乾燥又は噴霧乾燥してもよい。一部の実施形態では、組成物は、肺投与及び／又は静脈内投与のために製剤化され得る。
本明細書で用いられるとき、用語「薬学的に許容できる」は、信頼できる医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、又は他の障害若しくは合併症を起こすことなく、ヒト及び動物の組織と接触した使用に適しており、妥当なベネフィット／リスト比に見合う化合物、材料、組成物、及び／又は剤形を指す。
本明細書で用いられるとき、用語「薬学的に許容できる担体」とは、主題の組成物を１つの器官、若しくは身体の部分から、別の器官、若しくは身体の部分に運搬又は輸送するのに関与する液体若しくは固体充填剤、希釈剤、賦形剤、若しくは溶媒カプセル化材料などの薬学的に許容できる材料、組成物又はビヒクルを意味する。各担体は、製剤の他の成分と適合性であり、且つ患者に対して有害ではないという意味で「許容される」ものでなければならない。一部の実施形態では、例えば、薬学的に許容できる担体として役立ち得る材料として、以下：ラクトース、グルコース及びスクロースなどの糖；トウモロコシデンプン及びジャガイモデンプンなどのデンプン；セルロース、及びその誘導体、例えば、ナトリウムカルボキシルメチルセルロース、エチルセルロース及び酢酸セルロース；粉末トラガカント；麦芽；ゼラチン；タルク；ココアバター及び坐剤用ワックスなどの賦形剤；ピーナッツ油、ココナッツ油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油及びダイズ油などの油；プロピレングリコールなどのグリコール；グリセリン、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコールなどのポリオール；オレイン酸エチル及びラウリン酸エチルなどのエステル；寒天；水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；エチルアルコール；アルギン酸；発熱性物質除去蒸留水；等張食塩水；リンガー液；エチルアルコール；ｐＨ緩衝液；ポリエステル、ポリカーボネート、及び／又はポリ無水物；並びに医薬製剤に使用されている他の非毒性適合性物質が挙げられる。
本明細書で用いられるとき、用語「薬学的に許容できる塩」は、医薬関連での使用に適した化合物の塩、すなわち、信頼できる医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応などを起こすことなく、ヒト及び下等動物の組織と接触した使用に適しており、且つ妥当なベネフィット／リスト比に見合う塩を指す。薬学的に許容できる塩は、当技術分野で公知である。例えば、Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅ，ｅｔ ａｌ．は、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，６６：１－１９（１９７７）に薬学的に許容できる塩を記載している。一部の実施形態では、薬学的に許容できる塩として、限定されないが、非毒性酸付加塩が挙げられ、これは、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸及び過塩素酸などの無機酸、又は酢酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸、若しくはマロン酸などの有機酸と共に形成されるか、或いはイオン交換などの当技術分野で使用される他の方法を用いることにより形成されるアミノ基の塩である。一部の実施形態では、薬学的に許容できる塩として、限定されないが、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、ショウノウ酸塩、カンファースルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、グルコン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヨウ化水素酸塩、２－ヒドロキシ－エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３－フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアネート、ｐ－トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などが挙げられる。代表的なアルカリ又はアルカリ土類金属塩として、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどが挙げられる。一部の実施形態では、薬学的に許容できる塩として、適切であれば、非毒性アンモニウム、第四級アンモニウム、並びにハロゲン化物、水酸化物、カルボン酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、１～６個の炭素原子を有するアルキル、スルホン酸塩及びアリールスルホン酸塩などの対イオンを用いて形成されるアミンカチオンが挙げられる。
様々な実施形態では、本開示は、薬学的に許容できる賦形剤と共に、本明細書に記載の医薬組成物を提供する。薬学的に許容できる賦形剤は、一般に安全、非毒性で望ましい医薬組成物を調製するのに有用な賦形剤を含み、且つ動物使用と共にヒト医薬品使用にとって許容できる賦形剤を含む。こうした賦形剤は、固体、液体、半固体であってもよいし、又はエアロゾル組成物の場合には、気体であってよい。
医薬調製物は、錠剤の場合、粉砕、混合、顆粒化、及び必要に応じて圧縮；硬質ゼラチンカプセル剤形の場合、粉砕、混合、及び充填を含む従来の製剤技術に従って製造することができる。液体担体を用いる場合、調製物は、シロップ、エレキシル、エマルジョン又は水性若しくは非水性溶液又は懸濁液の形態であってよい。こうした液体製剤は、直接経口投与され得る。
一部の実施形態では、医薬組成物は、任意の投与経路を介して、細胞及び／又は対象に送達するために、製剤化され得る。対象への投与方法としては、注射、注入、吸入、鼻内、眼内、局所送達、カニューレ内送達、又は摂取を挙げることができる。注射としては、限定しないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、血管内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、気管支、被膜下、くも膜下、脊髄内、脳脊髄内、並びに胸骨内注射及び注入が挙げられる。一部の実施形態では、投与は、例えば、噴霧法を用いたエアロゾル吸入を含む。一部の実施形態では、投与は、全身（例えば、経口、直腸、鼻内、舌下、口腔、若しくは非経口）、経腸（例えば、全身作用だが、消化管を介して送達される）、又は局所（例えば、皮膚への局所適用、硝子体内注射）である。一部の実施形態では、１つ若しくは複数の組成物は、全身投与される。一部の実施形態では、投与は注射ではなく、且つ、治療薬は非経口治療薬である。いくつかの実施形態では、投与は、気管支（例えば、気管支内点滴による）、口腔、皮膚（例えば、真皮、皮内、皮内、経皮などに対する局所の１つ若しくは複数であるか、又はそれを含み得る）、経腸、動脈内、皮内、胃内、髄内、筋肉内、鼻内、腹腔内、髄腔内、静脈内、心室内、特定の器官内（例えば、肝臓内）、粘膜、鼻内、経口、皮下、舌下、局所、気管（例えば、気管内点滴により）、膣内、硝子体などであってよい。一部の実施形態では、投与は、単回用量であり得る。一部の実施形態では、投与は、間欠的（例えば、時間間隔をあけた複数回用量）及び／又は定期的（例えば、共通の時間間隔を開けた個別の用量）な投薬を含み得る。一部の実施形態では、投与は、少なくとも選択された期間にわたり連続した投薬（例えば、灌流）を含み得る。一部の実施形態では、１回の治療中に、又は治療レジメンとして一定期間にわたって、対象に６回、８回、１０回、１２回、１５回、又は２０回、又はそれ以上の投与が行われ得る。一部の実施形態では、投与は、必要に応じて、例えば、疾患、障害又は病状に関連する症状が持続する限り行われ得る。一部の実施形態では、反復投与は、対象の残りの生涯にわたって指示され得る。治療期間は変動し得、例えば、１日、２日、３日、１週間、２週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、１年、又はそれ以上であり得る。
一部の実施形態では、投与は、呼吸送達装置、例えば、噴霧器、例えば、定量吸入器、例えば、乾燥粉末吸入器を用いて提供される。市販の乾燥粉末吸入器には、Ｓｐｉｎｈａｌｅｒ（Ｆｉｓｏｎｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）及びＲｏｔａｈａｌｅｒ（ＧＳＫ，ＲＴＰ，ＮＣ）が含まれる。一部の実施形態では、噴霧器は、ジェット噴霧器、超音波噴霧器、及び／又は振動メッシュ噴霧器を含み得る。
投与量
本開示に従う医薬組成物は、治療有効量で投与され得る。正確な治療有効量は、所与の対象の治療の効力に関して最も有効な結果をもたらすと考えられる組成物の量である。この量は、様々な要因に応じて変動するが、そうした要因として、限定されないが、治療化合物の特徴（活性、薬物動態、薬力学、及び生体利用可能性など）、対象の生理学的状態（年齢、性別、疾患の種類及びステージ、健康状態全般、所与の用量に対する応答性、並びに薬剤の種類など）、製剤中の薬学的に許容できる１つ若しくは複数の担体、及び／又は投与経路が挙げられる。
いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載の組成物を対象に投与することを含む、治療薬の送達方法を提供し、ここで、ゲノム複合体調節剤が治療薬であり、且つ／又は治療薬の送達は、治療薬の非存在下での遺伝子発現に比して、遺伝子発現の変化を引き起こす。
本明細書の様々な実施形態で提供される方法を、本明細書に描写されるいくつかの態様のいずれに使用してもよい。一部の実施形態では、１つ若しくは複数の組成物を特定の細胞、又は１つ若しくは複数の特定の組織に対してターゲティングさせる。
例えば、一部の実施形態では、１つ若しくは複数の組成物を、上皮、結合、筋肉、及び／又は神経組織若しくは細胞に対してターゲティングさせる。一部の実施形態では、組成物を、特定の器官系、例えば、呼吸系（咽頭、喉頭、気管、気管支、肺、横隔膜）、心血管系（心臓、血管）；消化系（食道、胃、肝臓、膀胱、膵臓、腸、結腸、直腸及び肛門）；内分泌系（視床下部、下垂体、松果体若しくは松果腺、甲状腺、副甲状腺、副腎）；排出系（腎臓、尿管、膀胱）；リンパ系（リンパ、リンパ節、リンパ管、扁桃腺、アデノイド、胸腺、脾臓）；外皮系（皮膚、毛髪、爪）；筋肉系（例えば、骨格筋）；神経系（脳、脊髄、神経）；生殖系（卵巣、子宮、乳腺、精巣、精管、精嚢、前立腺）；骨格系（骨、軟骨）；及び／又はそれらの組合せの細胞又は組織にターゲティングさせる。一部の実施形態では、組成物は、細胞、例えば、内皮、肺胞、上皮、肝細胞、星状細胞、クッパー細胞、滑膜層、軟骨細胞、線維芽細胞、管上皮細胞、上皮腸細胞、杯細胞、基底細胞、及び／又は免疫細胞に対してターゲティングさせる。一部の実施形態では、組成物は、器官の細胞、例えば、鼻細胞、肺細胞、回腸細胞、心臓細胞、視細胞、肝臓細胞、膀胱細胞、膵臓細胞、腎臓細胞、神経細胞、前立腺細胞、精巣細胞に対してターゲティングさせる。一部の実施形態では、本開示の組成物は、血液脳関門、胎盤膜、又は血液精巣関門を通過する。一部の実施形態では、組成物は、ＡＣＥ－２受容体を発現する細胞をターゲティングする。
一部の実施形態では、本明細書に提供される医薬組成物は、全身投与される。
一部の実施形態では、投与は注射によるものではなく、且つ治療薬は非経口治療薬である。
一部の実施形態では、本開示の医薬組成物は、活性薬剤単独と比較して、ＰＫ／ＰＤの改善、例えば、増加した薬物動態又は薬物力学、例えば、ターゲティング、吸収、若しくは輸送の改善（例えば、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、９０％、若しくはそれ以上の改善）を有する。一部の実施形態では、医薬組成物は、活性薬剤単独と比較して、低減した望ましくない作用、例えば、低減した非標的位置への拡散、オフターゲット活性、又は毒性代謝産物（例えば、治療薬単独と比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、９０％、若しくはそれ以上の低減）を有する。一部の実施形態では、組成物は、活性薬剤単独と比較して、治療薬の効力を増大し、且つ／又は治療薬の毒性を低減する（例えば、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、９０％、若しくはそれ以上）。
本明細書に記載される医薬組成物は、例えば、製剤用担体及び／又はポリマー担体、例えば、リポソーム若しくは小胞体などの担体を含め、製剤化して、公知の方法により、それを必要とする対象（例えば、ヒト又はヒト以外の農場若しくは家畜動物、例えば、畜牛、イヌ、ネコ、ウマ、家禽）に送達される。こうした方法としては、トランスフェクション（例えば、脂質媒介性、カチオンポリマー、リン酸カルシウム）；エレクトロポレーション又は他の膜破壊（例えば、ヌクレオフェクション）及びウイルス送達（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶ）が挙げられる。さらに送達方法は、例えば、以下：Ｇｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｊｕｌｙ ２０１５，２６（７）：４４３－４５１．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｕｍ．２０１５．０７４；及びＺｕｒｉｓ ｅｔ ａｌ．にも記載されている。タンパク質のカチオン脂質媒介送達は、インビトロ及びインビボで効率的なタンパク質ベースのゲノム編集を可能にする。Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４ Ｏｃｔ ３０；３３（１）：７３－８０。
脂質ナノ粒子
本明細書に記載の部位特異的妨害剤は、粒子を含む任意の生物学的送達システム／製剤、例えばナノ粒子送達システムを用いて送達することができる。ナノ粒子は、約１～約１０００ナノメートル、約１～約５００ナノメートルの大きさ、約１～約１００ｎｍ、約３０ｎｍ～約２００ｎｍ、約５０ｎｍ～約３００ｎｍ、約７５ｎｍ～約２００ｎｍ、約１００ｎｍ～約２００ｎｍ、及びそれらの間の任意の範囲の寸法（例えば、直径）を有する粒子を含む。ナノ粒子は、ナノスケールの複合構造を有する。一部の実施形態では、ナノ粒子は、典型的には球状であるが、ナノ粒子の組成に応じて異なる形態が可能である。ナノ粒子の外部環境と接触するナノ粒子の部分は、概して、ナノ粒子の表面として識別される。一部の実施形態では、ナノ粒子は、２５ｎｍ～２００ｎｍの範囲の最大寸法を有する。本明細書に記載のナノ粒子は、固体、半固体、エマルジョン、又はコロイドナノ粒子を含むがこれらに限定されない任意の形態で提供され得る送達システムを含む。ナノ粒子送達システムとして、限定されないが、脂質ベースのシステム、リポソーム、ミセル、微小胞、エキソソーム、又は遺伝子銃が挙げられる。一実施形態では、ナノ粒子は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）である。一部の実施形態では、ＬＮＰは、分子間力によって互いに物理的に会合した複数の脂質分子を含む粒子である。一部の実施形態では、ＬＮＰは、複数の成分、例えば、３～４個の成分を含み得る。一実施形態では、部位特異的妨害剤又は前記部位特異的妨害剤を含む医薬組成物（又はそれをコードする核酸、又は前記部位特異的妨害剤をコードする核酸を含む医薬組成物）は、ＬＮＰ内に封入される。一実施形態では、システム又は前記システムを含む医薬組成物（又はそれをコードする核酸、又は前記システムをコードする核酸を含む医薬組成物）は、ＬＮＰ内に封入される。一部の実施形態では、第１部位特異的妨害剤をコードする核酸と第２部位特異的妨害剤をコードする核酸は、同じＬＮＰ中に存在する。一部の実施形態では、第１部位特異的妨害剤をコードする核酸と第２部位特異的妨害剤をコードする核酸は、異なるＬＮＰ中に存在する。ＬＮＰの調製及び調節剤のカプセル化は、Ｒｏｓｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．１９，ｎｏ．１２，ｐａｇｅｓ １２８６－２２００，２０１１年１２月）から使用され得るか、且つ／又はそれから適合され得る。一部の実施形態では、本明細書に開示される脂質ナノ粒子組成物は、ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質の発現に有用である。一部の実施形態では、核酸は、脂質ナノ粒子中に存在する場合、ヌクレアーゼによる分解に対し、水溶液中で耐性がある。
一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤は、ＣＣＤ脂質、中性脂質、及び／又はヘルパー脂質を含み得る。一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤は、イオン化可能な脂質を含む。一部の実施形態では、イオン化可能な脂質は、カチオン性脂質、イオン化可能なカチオン性脂質、又は容易にプロトン化できるアミン含有脂質であってもよい。一部の実施形態では、脂質は、ｐＨに応じて正に帯電した形態又は中性の形態で存在することができるカチオン性脂質である。一部の実施形態では、カチオン性脂質は、例えば生理学的条件下で、正に荷電することができる脂質である。一部の実施形態では、脂質粒子は、中性脂質、イオン化可能なアミン含有脂質、生分解性アルキン脂質、ステロイド、多価不飽和脂質を含むリン脂質、構造脂質（例えば、ステロール）、ＰＥＧ、コレステロール及びポリマー共役脂質のうちの１つ又は複数を配合したカチオン性脂質を含む。
一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤（例えば、ＭＣ３及び／又はＳＳＯＰ）は、コレステロール、ＰＥＧ、及び／又はヘルパー脂質を含む。ＬＮＰは、例えば、ミクロスフェア（一部の実施形態では、実質的に球状である、単層及び多層ベシクル、ラメラ相脂質二重層を含む）であってもよい。
一部の実施形態では、ＬＮＰは、例えば、本明細書に開示される部位特異的妨害剤又はシステムをコードする核酸を含む、水性コアを含み得る。本開示の一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤のカーゴは、少なくとも１つのガイドＲＮＡを含む。一部の実施形態では、カーゴ、例えば、部位特異的妨害剤をコードする核酸、又は本明細書に開示されるシステムは、ＬＮＰ、例えば、カチオン性脂質を含むＬＮＰの表面に吸着され得る。一部の実施形態では、カーゴ、例えば、部位特異的妨害剤をコードする核酸、又は本明細書に開示されるシステムは、ＬＮＰと会合し得る。一部の実施形態では、カーゴ、例えば、部位特異的妨害剤をコードする核酸、又は本明細書に開示されるシステムは、ＬＮＰ内に封入、例えば、完全に封入及び／又は部分的に封入され得る。
一部の実施形態では、カーゴを含むＬＮＰは、全身送達、例えば、生物内の活性薬剤の広範な曝露をもたらすことができるカーゴの治療有効用量の送達のために投与され得る。脂質ナノ粒子の全身送達は、例えば、静脈内、肺、気管支、動脈内、皮下、及び腹腔内送達であってもよい。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子の全身送達は、静脈内送達による。一部の実施形態では、カーゴを含むＬＮＰは、局所送達、例えば、生物内の標的部位への活性薬剤の直接送達のために投与され得る。一部の実施形態では、ＬＮＰは、疾患部位、例えば、腫瘍、他の標的部位、例えば、炎症部位、又は標的臓器、例えば、肝臓、肺、胃、結腸、膵臓、子宮、乳房、リンパ節などに局所的に送達され得る。一部の実施形態では、本明細書に開示されるＬＮＰは、特定の細胞、例えば、肝細胞、星状細胞、クッパー細胞、内皮、肺胞、及び／又は上皮細胞に局所的に送達され得る。一部の実施形態では、本明細書に開示されるＬＮＰは、特定の腫瘍部位、例えば、皮下に、同所性に局所的に送達され得る。
ＬＮＰは、エマルジョン中の分散相、ミセル、又は懸濁液中の内相として製剤化され得る。一部の実施形態では、ＬＮＰは、生分解性である。一部の実施形態では、ＬＮＰは、細胞毒性レベルまで蓄積せず、治療有効用量で、インビボで毒性を引き起こさない。一部の実施形態では、ＬＮＰは、細胞毒性レベルまで蓄積せず、治療有効用量での反復投与後にインビボで毒性を引き起こさない。一部の実施形態では、ＬＮＰは、治療有効用量で実質的に有害作用をもたらす自然免疫応答を引き起こさない。
一部の実施形態では、使用されるＬＮＰは、式（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコン－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート又はｓｓＰａｌｍＯ－フェニル－Ｐ４Ｃ２（ｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈｅ、ＳＳ－ＯＰ）を含む。一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤は、式、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコン－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタン酸（ＭＣ３）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、コレステロール、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧ）、例えば、ＭＣ３ ＬＮＰ又はｓｓＰａｌｍＯ－フェニル－Ｐ４Ｃ２（ｓｓＰａｌｍＯ－Ｐｈｅ、ＳＳ－ＯＰ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、コレステロール、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧ）、例えば、ＳＳＯＰ－ＬＮＰを含む。
リポソームは、内部水性区画を囲む単層又は多重層の脂質二重層並びに比較的不透過性の外部親油性リン脂質二重層から構成された球状小胞構造である。リポソームは、アニオン性、中性又はカチオン性であってもよい。リポソームは、生体適合性、非毒性であり、親水性及び親油性薬剤分子の双方を送達し、それらのカーゴを血漿酵素により分解から保護し、それらの負荷を生物学的膜及び血液脳関門（ＢＢＢ）を通じて輸送し得る（例えば、レビューとして、Ｓｐｕｃｈ ａｎｄ Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ４６９６７９，１２ ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９を参照）。
小胞は、いくつかの異なるタイプの脂質から作成され得るが、薬物担体としてのリポソームを作成するため、リン脂質が最も一般的に使用される。小胞は、限定はされないが、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＩＭ、ＤＤＡＢを単独で含むか、又はコレステロールと一緒に含み、ＤＯＴＭＡ及びコレステロール、ＤＯＴＡＰ及びコレステロール、ＤＯＴＩＭ及びコレステロール、並びにＤＤＡＢ及びコレステロールを生成してもよい。多重膜小胞脂質を調製するための方法は、当該技術分野で公知である（例えば、米国特許第６，６９３，０８６号明細書を参照、多重膜小胞脂質製剤に関するその教示内容は、参照により本明細書中に援用される）。脂質膜が水溶液と混合されるとき、小胞形成は自発的であり得るが、それはまた、ホモジナイザー、ソニケーター、又は押出成形装置に使用により振盪の形態で力を加えることにより促進され得る（例えば、レビューとして、Ｓｐｕｃｈ ａｎｄ Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ４６９６７９，１２ ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９を参照）。押し出された脂質は、サイズを低減するフィルターを介して押し出すことにより調製可能であり、それはＴｅｍｐｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ，１５：６４７－６５２，１９９７に記載の通りである（押し出された脂質製剤に関するその教示内容は、参照により本明細書中に援用される）。
本明細書に記載される方法及び組成物は、疾患、障害及び／又は病状の症状を緩和するのに十分なレジメンにより投与される医薬組成物を含み得る。いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載の組成物を投与することにより、治療薬を送達する方法を提供する。
使用
本開示は、さらに、本明細書に開示される部位特異的妨害剤又はシステムの使用にも関する。とりわけ、一部の実施形態では、そのような提供される技術を使用して、標的複数遺伝子の発現の調節、例えば、抑制を達成し、例えば、標的複数遺伝子（例えば、細胞中）の１つ又は複数の生成物の活性、送達、及び浸透の制御を可能にすることができる。一部の実施形態では、細胞は、哺乳動物、例えば、ヒト細胞である。一部の実施形態では、細胞は、体細胞である。一部の実施形態では、細胞は、初代細胞である。例えば、一部の実施形態では、細胞は、哺乳動物の体細胞である。一部の実施形態では、哺乳動物体細胞は、初代細胞である。一部の実施形態では、哺乳動物体細胞は、非胚性細胞である。
遺伝子発現の調節
本開示はさらに、部分的には、本明細書に記載の部位特異的妨害剤又はシステム（又はそれをコードする核酸、又は前記部位特異的妨害剤若しくは核酸を含む医薬組成物）を提供すること、及び標的複数遺伝子、標的複数遺伝子に関連するアンカー配列、及び／又は標的複数遺伝子を含むゲノム複合体（例えば、ＡＳＭＣ）を、部位特異的妨害剤又はシステムと接触させることを含む、標的複数遺伝子の発現を調節する、例えば、低減する方法を対象とする。一部の実施形態では、標的複数遺伝子の発現を調節、例えば、低減することは、参照値と比較した、標的複数遺伝子の遺伝子の転写、例えば、部位特異的妨害剤又はシステムの存在下での遺伝子の転写の調節を含む。一部の実施形態では、標的複数遺伝子の発現を調節、例えば、低減する方法は、例えば、対象、例えば、哺乳動物対象、例えば、ヒト対象由来の細胞に対して、エクスビボで使用される。一部の実施形態では、細胞は、哺乳動物、例えば、ヒト細胞である。一部の実施形態では、細胞は、体細胞である。一部の実施形態では、細胞は、初代細胞である。一部の実施形態では、標的複数遺伝子の発現を調節、例えば、低減する方法は、例えば、哺乳動物対象、例えば、ヒト対象に対して、インビボで使用される。一部の実施形態では、標的複数遺伝子の発現を調節、例えば、低減する方法は、例えば、本明細書に記載される細胞又は細胞株に対して、インビトロで使用される。
理論に束縛されることは望まないが、一部の実施形態では、部位特異的妨害剤又はシステムは、標的複数遺伝子を含むゲノム複合体、例えば、ＡＳＭＣのアンカー配列に結合すること、及び次の効果：ゲノム複合体成分（例えば、核形成ポリペプチド）のアンカー配列への結合を物理的又は立体的に遮断する（例えば、競合的に阻害する）；標的複数遺伝子、標的複数遺伝子に作動可能に連結された転写制御エレメント、又は標的複数遺伝子に近接した、若しくは標的複数遺伝子を含むアンカー配列媒介接合部と会合した、アンカー配列をエピジェネティック的に修飾する（例えば、それにより、ゲノム複合体成分、例えば、核形成ポリペプチドの、アンカー配列への結合を低減／及び又は排除する）；又は標的複数遺伝子、標的複数遺伝子に作動可能に連結された転写制御エレメント、又は標的複数遺伝子に近接した、若しくは標的複数遺伝子を含むアンカー配列媒介接合部と会合した、アンカー配列を遺伝子修飾する（例えば、それにより、ゲノム複合体成分、例えば、核形成ポリペプチドの、アンカー配列への結合を低減／及び又は排除する）、の１つ、２つ、又は全てを有することにより標的複数遺伝子の発現を調節し得ると考えられる。
一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、標的複数遺伝子のうちの２つ以上の遺伝子の発現を調節、例えば低減する。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、標的複数遺伝子のうちの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個（且つ任意選択的に、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又は３０個以下）の遺伝子の発現を調節、例えば低減する。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、標的複数遺伝子のうちの２～２０、２～１８、２～１６、２～１４、２～１２、２～１０、２～９、２～８、２～７、２～６、２～５、２～４、２～３、３～２０、３～１８、３～１６、３～１４、３～１２、３～１０、３～９、３～８、３～７、３～６、３～５、３～４、４～２０、４～１８、４～１６、４～１４、４～１２、４～１０、４～９、４～８、４～７、４～６、４～５、５～２０、５～１８、５～１６、５～１４、５～１２、５～１０、５～９、５～８、５～７、５～６、６～２０、６～１８、６～１６、６～１４、６～１２、６～１０、６～９、６～８、６～７、７～２０、７～１８、７～１６、７～１４、７～１２、７～１０、７～９、７～８、８～２０、８～１８、８～１６、８～１４、８～１２、８～１０、８～９、９～２０、９～１８、９～１６、９～１４、９～１２、９～１０、１０～２０、１０～１８、１０～１６、１０～１４、１０～１２、１２～２０、１２～１８、１２～１６、１２～１４、１４～２０、１４～１８、１４～１６、１６～２０、１６～１８、又は１８～２０個の遺伝子の発現を調節、例えば低減する。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、標的複数遺伝子のうちの各遺伝子（例えば、全ての遺伝子）の発現を調節、例えば低減する。
一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、標的複数遺伝子の遺伝子の発現を調節、例えば低減し、ここで、遺伝子のうちの１つ又は複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上、例えば、全て）は、サイトカイン、インターロイキン、転写因子（例えば、インターフェロン調節転写因子）、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）、又はインターフェロン受容体である。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、標的複数遺伝子の１つ又は複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上、例えば、全て）の遺伝子から生産されるＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡのレベルを調節、例えば、低減する。一部の実施形態では、発現を調節することは、標的複数遺伝子の１つ又は複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれ以上、例えば、全て）の遺伝子から生産されるタンパク質のレベルを低減することを含む。一部の実施形態では、発現を調節することは、標的複数遺伝子の１つ又は複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれ以上、例えば、全て）の遺伝子から生産されるｍＲＮＡ及びタンパク質のレベルの両方を低減することを含む。一部の実施形態では、低減は、治療前のレベル又は部位特異的妨害剤の非存在下でのレベルと比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％の低減である。
一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、例えば、実施例２又は４～１１のいずれかのアッセイを用いた、例えば、ＴＮＦ－アルファによる細胞の刺激時に、ヒトＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、及びＩＬ８のうちの１つ又は複数（例えば、１つ、２つ、３つ、又は全て）の発現を調節、例えば、低減する。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、例えば、実施例１４のアッセイを用いた、例えば、ＴＮＦ－アルファによる細胞の刺激時に、マウスＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ７、及びＣＸＣＬ１５のうちの１つ又は複数（例えば、１つ、２つ、３つ、又は全て）の発現を調節、例えば、低減する。
一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、核形成ポリペプチド、例えばＣＴＣＦの、アンカー配列への結合を低減する。一部の実施形態では、細胞を接触させること、又は部位特異的妨害剤を投与することは、核形成ポリペプチド、例えば、ＣＴＣＦの、アンカー配列（例えば、標的複数遺伝子を含むＡＳＭＣのアンカー配列）への結合の低減をもたらす。一部の実施形態では、細胞を接触させること、又は部位特異的妨害剤を投与することは、部位特異的妨害剤若しくはシステムで処理する前、又は部位特異的妨害剤若しくはシステムの非存在下での、アンカー配列への核形成ポリペプチド（例えば、ＣＴＣＦ）の結合と比較して、結合の完全な喪失、又は少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５若しくは９９％の低減をもたらす（例えば、ＣｈＩＰ及び／又は定量的ＰＣＲにより測定される）。
本開示は、部分的に、対象における標的複数遺伝子の過剰発現に関連する病状を治療する方法であって、本明細書に記載の部位特異的妨害剤、システム、核酸、ベクター、細胞、又は医薬組成物を対象に投与することを含む、方法をさらに対象とする。特定の遺伝子の過剰発現に関連する病状は、当業者には公知である。こうした病状として、限定されないが、代謝障害、神経筋障害、癌（例えば、固形腫瘍）、繊維症、糖尿病、尿素障害、免疫障害、炎症、及び関節炎が挙げられる。一部の実施形態では、障害は、自己免疫障害である。一部の実施形態では、障害は、感染、例えば、ウイルス感染、例えば、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ２ウイルス感染に関連するか、又はそれによって引き起こされる。
本開示はさらに、部分的には、対象、例えばヒト対象の細胞における、標的複数遺伝子の発現を調節する、例えば、低減する方法を対象とする。一部の実施形態では、対象は、疾患又は病状を有する。一部の実施形態では、疾患は、炎症性疾患、例えば、免疫介在性炎症性疾患である。一部の実施形態では、疾患又は病状は、関節リウマチ、痛風、喘息、好中球性喘息、好中球性皮膚症、足浮腫、急性呼吸器疾患症候群（ＡＲＤＳ）、ＣＯＶＩＤ－１９、乾癬、炎症性腸疾患、感染（例えば、病原体、例えば、細菌、ウイルス、又は真菌による）、外的損傷（例えば、擦傷又は異物）、放射線又は化学的損傷の影響、変形性関節症、変形性関節症の関節痛、関節痛、炎症性疼痛、急性痛、慢性痛、膀胱炎（ｃｙｓｔｉｓｉｓ）、気管支炎、皮膚炎、心血管疾患、神経変性疾患、肝臓疾患、肺疾患、腎臓疾患、痛み、腫れ、こわばり、圧痛、発赤、熱、又は疾患状態に関連するバイオマーカの上昇（例えば、サイトカイン、免疫受容体、又は炎症マーカ）のうちの１つ又は複数である。一部の実施形態では、炎症性障害は、例えば、ウイルス、例えば、Ｓａｒｓ－Ｃｏｖ－２ウイルスによる感染に関連する。一部の実施形態では、炎症性障害は、自己免疫障害である。
本明細書で提供される方法及び組成物は、複数標的遺伝子の転写を安定的又は一時的に変更する（例えば、低減する）ことにより、標的複数遺伝子の過剰発現に関連する病状を治療し得る。一部の実施形態では、こうした調節は、少なくとも約１時間～約３０日、又は少なくとも約２時間、６時間、１２時間、１８時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、若しくはそれ以上又はそれらの間の任意の時間持続する。一部の実施形態では、こうした調節は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、若しくは２４時間、又は少なくとも１、２、３、４、５、６、若しくは７日、又は少なくとも１、２、３、４、若しくは５週間、又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、若しくは１２ヶ月、又は少なくとも１、２、３、４、若しくは５年にわたって（例えば、無期限に）持続する。任意選択的に、こうした調節は、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１年以下にわたって持続する。
一部の実施形態では、本明細書で提供される方法又は組成物は、細胞内の標的複数遺伝子の遺伝子の発現を、組成物と接触していない細胞又は本方法で処理されていない細胞における標的複数遺伝子の遺伝子の発現と比較して、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００％（及び任意選択的に、最大１００％まで）低減し得る。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法又は組成物は、細胞内の標的複数遺伝子の各遺伝子の発現を、組成物と接触していない細胞又は本方法で処理されていない細胞における標的複数遺伝子の各遺伝子の発現と比較して、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００％（及び任意選択的に、最大１００％まで）低減し得る。
一部の実施形態では、本明細書に提供される方法は、前記標的複数遺伝子を含むゲノム複合体、例えば、アンカー配列媒介接合部を妨害することにより、標的複数遺伝子の発現を調節、例えば、低減し得る。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、ゲノム複合体（例えば、ＡＳＭＣ）を妨害する。一部の実施形態では、細胞を接触させること、又は部位特異的妨害剤を投与することは、部位特異的妨害剤若しくはシステムで処理する前、又は部位特異的妨害剤若しくはシステムの非存在下での、複合体のレベルと比較して、標的複数遺伝子を含むゲノム複合体（例えば、ＡＳＭＣ）のレベルの低減をもたらす。一部の実施形態では、細胞を接触させること、又は部位特異的妨害剤を投与することは、部位特異的妨害剤若しくはシステムで処理する前、又は部位特異的妨害剤若しくはシステムの非存在下での、複合体のレベルと比較して、ゲノム複合体、例えば、ＡＳＭＣの完全な喪失、又は少なくとも２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、９５、又は９９％の低減（例えば、ＣｈＩＡ－ＰＥＴ、ＥＬＩＳＡ（例えば、遺伝子発現の変化を評価するため）、ＣＵＴ＆ＲＵＮ、ＡＴＡＣ－ＳＥＱ、ＣｈＩＰ及び／又は定量的ＰＣＲにより測定される）をもたらす。
一部の実施形態では、本明細書で提供される方法及び組成物は、炎症部位におけるサイトカインの動員を低減することによって、炎症又はサイトカインストームのカスケードに関連する病状を治療することができる。一部の実施形態では、炎症及び／又はサイトカインストームのカスケードは、炎症性障害、例えば、ウイルス媒介性炎症性障害、例えば、ＣＯＶＩＤ－１９感染に関連する。一部の実施形態では、炎症性障害は、例えば、ウイルス、例えば、Ｓａｒｓ－Ｃｏｖ－２ウイルスによる感染に関連する。一部の実施形態では、炎症性障害は、自己免疫障害である。一部の実施形態では、炎症性障害は、低酸素症に関連する。一部の実施形態では、炎症性障害は、ＡＲＤＳ、低酸素症、及び／又は敗血症に関連する。一部の実施形態では、感染は、例えば、複数の病原体、例えば、第１ウイルス又は細菌又は真菌、及び第２ウイルス又は第２細菌又は第２真菌によって引き起こされる、重複感染である。
エピジェネティック修飾
本開示はさらに、部分的に、標的複数遺伝子の遺伝子のうち１つ又は複数（例えば、全て）；標的複数遺伝子に作動可能に連結された転写制御エレメント；標的複数遺伝子に近接した、若しくは標的複数遺伝子を含むアンカー配列媒介接合部と会合した、アンカー配列；又は前記アンカー配列に近接した部位を、エピジェネティック的に修飾する方法を対象とし、方法は、部位特異的妨害剤、システム、部位特異的妨害剤をコードする核酸、システムの成分をコードする核酸、又は前記部位特異的妨害剤、システム若しくは核酸を含む医薬組成物を提供すること；及び標的複数遺伝子の遺伝子のうち１つ又は複数（例えば、全て）、標的複数遺伝子に作動可能に連結された転写制御エレメント、標的複数遺伝子に近接した、若しくは標的複数遺伝子を含むアンカー配列媒介接合部と会合した、アンカー配列、又は前記アンカー配列に近接した部位を、部位特異的妨害剤又はシステムと接触させることを含み、それにより、標的複数遺伝子、標的複数遺伝子に作動可能に連結された転写制御エレメント、標的複数遺伝子に近接した、若しくは標的複数遺伝子を含むアンカー配列媒介接合部と会合した、アンカー配列、又は前記アンカー配列に近接した部位をエピジェネティック的に修飾する。
一部の実施形態では、エピジェネティック的に標的複数遺伝子、標的複数遺伝子に作動可能に連結された転写制御エレメント、標的複数遺伝子に近接した、若しくは標的複数遺伝子を含むアンカー配列媒介接合部と会合した、アンカー配列、又は前記アンカー配列に近接した部位の方法は、標的複数遺伝子、標的複数遺伝子に作動可能に連結された転写制御エレメント、標的複数遺伝子に近接した、若しくは標的複数遺伝子を含むアンカー配列媒介接合部と会合した、アンカー配列、又は前記アンカー配列に近接した部位のＤＮＡメチル化を増大又は低減することを含む。一部の実施形態では、標的複数遺伝子、標的複数遺伝子に作動可能に連結された転写制御エレメント、標的複数遺伝子に近接した、若しくは標的複数遺伝子を含むアンカー配列媒介接合部と会合した、アンカー配列、又は前記アンカー配列に近接した部位をエピジェネティック的に修飾する方法は、標的複数遺伝子、標的複数遺伝子に作動可能に連結された転写制御エレメント、標的複数遺伝子に近接した、若しくは標的複数遺伝子を含むアンカー配列媒介接合部と会合した、アンカー配列、又は前記アンカー配列に近接した部位、と会合したヒストンのヒストンメチル化を増大又は低減することを含む。一部の実施形態では、標的複数遺伝子、標的複数遺伝子に作動可能に連結された転写制御エレメント、標的複数遺伝子に近接した、若しくは標的複数遺伝子を含むアンカー配列媒介接合部と会合した、アンカー配列、又は前記アンカー配列に近接した部位をエピジェネティック的に修飾する方法は、標的複数遺伝子、標的複数遺伝子に作動可能に連結された転写制御エレメント、標的複数遺伝子に近接した、若しくは標的複数遺伝子を含むアンカー配列媒介接合部と会合した、アンカー配列、又は前記アンカー配列に近接した部位、と会合したヒストンのヒストンアセチル化を低減することを含む。一部の実施形態では、標的複数遺伝子、標的複数遺伝子に作動可能に連結された転写制御エレメント、標的複数遺伝子に近接した、若しくは標的複数遺伝子を含むアンカー配列媒介接合部と会合した、アンカー配列、又は前記アンカー配列に近接した部位をエピジェネティック的に修飾する方法は、標的複数遺伝子、標的複数遺伝子に作動可能に連結された転写制御エレメント、標的複数遺伝子に近接した、若しくは標的複数遺伝子を含むアンカー配列媒介接合部と会合した、アンカー配列、又は前記アンカー配列に近接した部位、と会合したヒストンのヒストンＳＵＭＯ化を増大又は低減することを含む。一部の実施形態では、標的複数遺伝子、標的複数遺伝子に作動可能に連結された転写制御エレメント、標的複数遺伝子に近接した、若しくは標的複数遺伝子を含むアンカー配列媒介接合部と会合した、アンカー配列、又は前記アンカー配列に近接した部位をエピジェネティック的に修飾する方法は、標的複数遺伝子、標的複数遺伝子に作動可能に連結された転写制御エレメント、標的複数遺伝子に近接した、若しくは標的複数遺伝子を含むアンカー配列媒介接合部と会合した、アンカー配列、又は前記アンカー配列に近接した部位、と会合したヒストンのヒストンリン酸化を増大又は低減することを含む。
一部の実施形態では、標的複数遺伝子、標的複数遺伝子に作動可能に連結された転写制御エレメント、標的複数遺伝子に近接した、若しくは標的複数遺伝子を含むアンカー配列媒介接合部と会合した、アンカー配列、又は前記アンカー配列に近接した部位をエピジェネティック的に修飾する方法は、エピジェネティック修飾のレベルを、上記組成物と接触させていないか、又は上記方法で処理されていない細胞における当該部位でのエピジェネティック修飾のレベルに比して、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００％（及び任意選択的に、最大１００％）低減し得る。一部の実施形態では、標的複数遺伝子、標的複数遺伝子に作動可能に連結された転写制御エレメント、標的複数遺伝子に近接した、若しくは標的複数遺伝子を含むアンカー配列媒介接合部と会合した、アンカー配列、又は前記アンカー配列に近接した部位をエピジェネティック的に修飾する方法は、エピジェネティック修飾のレベルを、上記組成物と接触させていないか、又は上記方法で処理されていない細胞における当該部位でのエピジェネティック修飾のレベルに比して、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、又は１０００％（及び任意選択的に、最大２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、又は２０００％）増大し得る。一部の実施形態では、標的複数遺伝子、標的複数遺伝子に作動可能に連結された転写制御エレメント、標的複数遺伝子に近接した、若しくは標的複数遺伝子を含むアンカー配列媒介接合部と会合した、アンカー配列、又は前記アンカー配列に近接した部位のエピジェネティック修飾は、標的複数遺伝子、例えば、本明細書に記載の標的複数遺伝子の発現のレベルを改変し得る。
一部の実施形態では、本明細書に記載の方法により達成されるエピジェネティック修飾は、少なくとも約１時間～約３０日、又は少なくとも約２時間、６時間、１２時間、１８時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、若しくはそれ以上、又はそれらの間の任意の時間持続する。一部の実施形態では、こうした調節は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、若しくは２４時間、又は少なくとも１、２、３、４、５、６、若しくは７日、又は少なくとも１、２、３、４、若しくは５週間、又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、若しくは１２ヶ月、又は少なくとも１、２、３、４、若しくは５年にわたって（例えば、無期限に）持続する。任意選択的に、こうした調節は、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１年以下にわたって持続する。
一部の実施形態では、標的複数遺伝子、標的複数遺伝子に作動可能に連結された転写制御エレメント、標的複数遺伝子に近接した、若しくは標的複数遺伝子を含むアンカー配列媒介接合部と会合した、アンカー配列、又は前記アンカー配列に近接した部位をエピジェネティック的に修飾する方法に使用される部位特異的妨害剤又はシステムは、エピジェネティック修飾部分を含むエフェクター部分を含む。例えば、エフェクター部分は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性を有するエピジェネティック修飾部分を含んでもよく、内因性又は天然に存在する標的配列（例えば、標的複数遺伝子の全ての遺伝子、標的複数遺伝子に作動可能に連結された転写制御エレメント、標的複数遺伝子に近接した、若しくは標的複数遺伝子を含むアンカー配列媒介接合部と会合した、アンカー配列、又は前記アンカー配列に近接した部位）は、そのメチル化を増大するように変更してもよく（例えば、転写因子と、標的複数遺伝子又は転写制御エレメントの遺伝子の一部との相互作用を低減する、核形成タンパク質のアンカー配列への結合を低減する、及び／又はアンカー配列媒介接合部を妨害又は防止する）、又はそのメチル化を低減するように変更してもよい（例えば、転写因子と、標的複数遺伝子又は転写制御エレメントの遺伝子の一部との相互作用を増大する、核形成タンパク質のアンカー配列への結合を増大する、及び／又はアンカー配列媒介接合部を促進又はその強度を増大する）。
遺伝子修飾
本開示はさらに、部分的に、標的複数遺伝子の遺伝子のうち１つ又は複数（例えば、１つ、２つ、３つ、又は全て）、標的複数遺伝子に作動可能に連結された転写制御エレメント、又は標的複数遺伝子に近接した、若しくは標的複数遺伝子を含むアンカー配列媒介接合部と会合した、アンカー配列を、遺伝子修飾する方法を対象とし、方法は、部位特異的妨害剤又はシステム若しくはそれをコードする核酸、又は前記部位特異的妨害剤、システム若しくは核酸を含む医薬組成物を提供すること；及び標的複数遺伝子の遺伝子のうち１つ又は複数（例えば、１つ、２つ、３つ、又は全て）、標的複数遺伝子に作動可能に連結された転写制御エレメント、又は標的複数遺伝子に近接した、若しくは標的複数遺伝子を含むアンカー配列媒介接合部と会合した、アンカー配列を、部位特異的妨害剤と接触させることを含み、それにより、標的複数遺伝子、標的複数遺伝子に作動可能に連結された転写制御エレメント、又は標的複数遺伝子に近接した、若しくは標的複数遺伝子を含むアンカー配列媒介接合部と会合した、アンカー配列を遺伝子修飾する。
遺伝子改変は、挿入、欠失、又は置換のうちの１つ又は複数を、標的複数遺伝子の遺伝子、標的複数遺伝子に作動可能に連結された転写制御エレメント、又は標的複数遺伝子に近接した、若しくは標的複数遺伝子を含むアンカー配列媒介接合部と会合した、アンカー配列に導入することを含み得る。一部の実施形態では、挿入は、少なくとも１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１２００、１４００、１６００、１８００、又は２０００個のヌクレオチド（且つ任意選択的に、３０００、２５００、２０００、１５００、１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、又は２００個以下のヌクレオチド）の付加を含む。一部の実施形態では、挿入は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００個のヌクレオチド（且つ任意選択的に、２００、１５０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個以下のヌクレオチド）の付加を含む。一部の実施形態では、挿入は、１～１０、１～９、１～８、１～７、１～６、１～５、１～４、１～３、又は１～２個のヌクレオチドの付加を含む。一部の実施形態では、欠失は、少なくとも１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１２００、１４００、１６００、１８００、又は２０００個のヌクレオチド（且つ任意選択的に、３０００、２５００、２０００、１５００、１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、又は２００個以下のヌクレオチド）の除去を含む。一部の実施形態では、欠失は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００個のヌクレオチド（且つ任意選択的に、２００、１５０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個以下のヌクレオチド）の除去を含む。一部の実施形態では、欠失は、１～１０、１～９、１～８、１～７、１～６、１～５、１～４、１～３、又は１～２個のヌクレオチドの除去を含む。一部の実施形態では、置換は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００個のヌクレオチド（且つ任意選択的に、２００、１５０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個以下のヌクレオチド）の変更を含む。一部の実施形態では、置換は、１～１０、１～９、１～８、１～７、１～６、１～５、１～４、１～３、又は１～２個のヌクレオチドの変更を含む。
一部の実施形態では、遺伝子修飾は、例えば、標的複数遺伝子を含むＡＳＭＣに関連する、アンカー配列に対する挿入、欠失、又は置換を含む。一部の実施形態では、遺伝子修飾は、アンカー配列へのゲノム複合体成分、例えば、核形成ポリペプチドの結合を変化させる（例えば、低減又は増大する）。一部の実施形態では、遺伝子修飾は、（例えば、挿入、欠失、又は置換によって）アンカー配列を完全に又は部分的に抑止し、それにより、核形成ポリペプチドのアンカー配列への結合を低減又は消滅させ、例えば、前記アンカー配列を含むＡＳＭＣの存在を低減又はそれを消滅させる。理論に束縛されることは望まないが、本開示は、アンカー配列に挿入、欠失、又は置換を導入して、標的複数遺伝子を含むゲノム複合体、例えば、ＡＳＭＣへのアンカー配列の参加を低減又は排除する、遺伝子修飾機能性を有する部位特異的妨害剤の使用が考えられる。本明細書の他所に記載されるように、そのような変更は、ゲノム複合体、例えば、ＡＳＭＣを妨害すると予想され、標的複数遺伝子の発現を低減し得る。
一部の実施形態では、遺伝子修飾は、アンカー配列を含む配列の挿入を含む。理論に束縛されることは望まないが、本開示は、標的複数遺伝子の遺伝子、標的複数遺伝子に作動可能に連結された転写制御エレメント、又は標的複数遺伝子に近接した、若しくは標的複数遺伝子を含むアンカー配列媒介接合部と会合した、アンカー配列に、外性アンカー配列を導入する遺伝子修飾機能性を有する部位特異的妨害剤の使用が考えられる。新しいアンカー配列の存在は、標的複数遺伝子を含むゲノム複合体、例えば、ＡＳＭＣの形成及び／又は維持を妨害し得、それにより、標的複数遺伝子の発現を調節、例えば低減すると考えられる。
以下の実施例は、本開示の一部の実施形態をさらに説明するために提供されるが、本開示の範囲の限定を意図するものではなく；それらの例示的な性質から、当業者には周知の他の手順、方法、又は技術が代替的に使用され得ることは理解されよう。
実施例１：例示的な複数遺伝子の発現の低減
この例は、部分的に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子を含む部位特異的妨害剤と、所与のガイド配列を含むガイドＲＮＡとを用いて、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、及びＩＬ８を含む標的複数遺伝子の発現を低減すること実証する実験を説明する。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子（Ｃａｓ９）をコードするｍＲＮＡを含む部位特異的妨害剤と、ｓｇＲＮＡ Ｃａｓ９／ガイドＲＮＰ複合体とを含む、ＲＮＰのトランスフェクションは、ＴＨＰ－１細胞へのエレクトロポレーションにより行った。細胞は、ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳで培養した。親株も比較のために分析した。
３５０ｋ細胞は、各編集細胞株及び親対照について４つずつ２４ウェルプレートにプレーティングした。１時間後、１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦアルファ（Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ＃６５４２０５）を各細胞株につき２つのウェルに添加した。残りの２つのウェルは、対照として未処理である。
編集された親細胞をＴＮＦアルファと共に２４時間インキュベートした。その後、製造者のプロトコルに従って、ＡｌｌＰｒｅｐ ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、ＤＮＡ及びＲＮＡを単離した。ＬｕｎａＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲＴ ＳｕｐｅｒＭｉｘ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて、ｃＤＮＡにＲＮＡサンプルを逆転写し、ＴａｑＭａｎ Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた個別のＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３＆ＩＬ８特異的ＴａｑＭａｎプライマー／プローブセットを使用する定量ＰＣＲにより解析した。
ΔΔＣｔ法を用いたヒトＧＡＰＤＨ参照遺伝子と比較して、ＣＸＣＬ１－３＆ＩＬ７遺伝子発現を定量した。遺伝子発現の変化は、未処理細胞における遺伝子発現のレベルと直接比較して、ＴＮＦアルファ処理後の遺伝子発現の倍率増加を測定することによって、さらに定量した。
隔離されたゲノムドメイン（ＩＧＤ）の両方の境界にあるＣＴＣＦアンカーは、ＣｈＩＰ－ｓｅｑデータを用いて検索され、ＣＴＣＦアンカー配列は、既知のＣＴＣＦ位置重みマトリックス（ＪＡＳＰＡＲ）を用いて計算で特定された。ＣＲＩＳＰＲ（ＳｐＣａｓ９）ガイドは、ＣＴＣＦアンカー配列をターゲティングするように選択された。
ガイド配列を以下の表に示す。
実施例２：７２時間でのＴＨＰ－１細胞におけるサイトカイン発現の低減
この例は、部分的に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子を含む部位特異的妨害剤と、標的複数遺伝子を含むＡＳＭＣのアンカー配列をターゲティングするガイドＲＮＡとを用いて、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、及びＩＬ８を含む標的複数遺伝子の発現を低減することを実証する実験を説明する。
Ｃａｓ９ ＲＮＰをコードするｓｇＲＮＡ及びｍＲＮＡをＴＨＰ－１細胞にエレクトロポレーションした。ｓｇＲＮＡ配列（実施例１から）は、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、及びＩＬ８を含むＡＳＭＣのＣＴＣＦ部位のうちの１つをターゲティングするように選択された。トランスフェクトされた細胞を１０ｎｇ／ｍｌ ＴＮＦアルファと共に２４時間インキュベートした。その後、製造者のプロトコルに従って、ＡｌｌＰｒｅｐ ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、ＤＮＡ及びＲＮＡを単離した。ＬｕｎａＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲＴ ＳｕｐｅｒＭｉｘ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて、ｃＤＮＡにＲＮＡサンプルを逆転写し、ＴａｑＭａｎ（登録商標） Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた個別のＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３＆ＩＬ８特異的ＴａｑＭａｎプライマー／プローブセットを使用する定量ＰＣＲにより解析した。
ΔΔＣｔ法を用いたヒトＧＡＰＤＨ参照遺伝子と比較して、ＣＸＣＬ１－３＆ＩＬ８遺伝子発現を定量した。遺伝子発現の変化は、未処理細胞における遺伝子発現のレベルと直接比較して、ＴＮＦアルファ処理後の遺伝子発現の倍率増加を測定することによって、さらに定量した。図６の結果は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子を含む部位特異的妨害剤とｓｇＲＮＡとを使用して、ＴＨＰ－１細胞におけるＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、及びＩＬ８発現を低減できること、及びその発現が処理後７２時間で低減することを示す。結果はまた、前記部位特異的妨害剤のＬＮＰ送達を使用して、有効量の薬剤を標的細胞に送達できることを示している。
ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、及びＩＬ８を含むＡＳＭＣの他のＣＴＣＦ部位をターゲティングするｓｇＲＮＡを用いて実験を繰り返した場合にも、同様の結果が見られた（データは示さず）。
実施例３：部位特異的調節剤により低減されたＴＨＰ－１細胞のサイトカインタンパク質分泌
この例は、部分的に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子を含む部位特異的妨害剤と、標的複数遺伝子を含むＡＳＭＣのアンカー配列をターゲティングするガイドＲＮＡとを用いて、細胞を処理することにより、ＣＸＣＬ１及びＩＬ－８、標的複数遺伝子の２つの遺伝子の分泌を低減することを実証する実験を説明する。
ＴＨＰ－１細胞は、先の実施例のように、ｓｇＲＮＡと、例示的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子（Ｃａｓ９）を含む部位特異的妨害剤をコードするｍＲＮＡとを含むＲＮＰでエレクトロポレーションした。ｓｇＲＮＡ（実施例１から）は、ＣＸＣＬ１とＩＬ－８とを含むＡＳＭＣのＣＴＣＦ部位のうちの１つをターゲティングした。細胞を１０ｎｇ／ｍｌ ＴＮＦアルファと共に２４時間刺激した。その後、細胞上清を採取し、－８０℃で凍結した。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子をコードするｍＲＮＡに加えて、４つの異なるｓｇＲＮＡと接触させた細胞の上清、及びトランスフェクトしていない陽性対照を、Ｍｙｒｉａｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｃ．のサイトカインパネルでＣＸＣＬ１及びＩＬ－８タンパク質レベルについてスクリーニングした。図７は、ｓｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子ＲＮＰで処理した細胞から得られた各上清でＣＸＣＬ１及びＩＬ８のレベルの低下が見られたことを示し、（例えば、アンカー配列及び核形成ポリペプチド相互作用を妨害する、例えば、ＣＴＣＦ結合を妨害することによる）ＡＳＭＣ妨害に対する表現型応答を実証する。このデータは、実施例２のｑＰＣＲで見られるｍＲＮＡ発現の低減と一致している。
ＣＸＣＬ１及びＩＬ８を含むＡＳＭＣの他のＣＴＣＦ部位をターゲティングするｓｇＲＮＡを用いて実験を繰り返した場合にも、同様の結果が見られた（データは示さず）。
実施例４：ｑＰＣＲにより測定されるＣＸＣＬ３発現の低減
この例は、部分的に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子を含む部位特異的妨害剤と、標的複数遺伝子を含むＡＳＭＣのアンカー配列をターゲティングする様々なガイドＲＮＡとを用いて、ＴＨＰ－１細胞を処理することにより、ＣＸＣＬ３の発現を低減することを実証する実験を説明する。
ＴＨＰ－１細胞は、ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳで増殖させた。細胞を、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子（Ｃａｓ９）をコードするｍＲＮＡと、ＬＮＰを用いて標的複数遺伝子を含むＡＳＭＣのＣＴＣＦ部位のいずれかをターゲティングするｓｇＲＮＡとでトランスフェクトした。ｓｇＲＮＡ（実施例１から）は、図９Ａに示されるように左又は右のＣＴＣＦ部位の標的を使用した。ＳＳＯＰ脂質混合物を使用した脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の製剤化は、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．のＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（登録商標）Ｓｐａｒｋ（商標）を使用して実行した。実験条件について、３５０ｋ細胞／ウェルを、ＬＮＰトランスフェクションの７２時間後に、各トランスフェクト条件及び親対照を２４ウェルプレートにプレーティングした（図８のフローチャートを参照）。１時間後、１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦアルファ（Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ＃６５４２０５）を各ウェルに添加した。未処理の親細胞を１０ｎｇ／ｍｌ ＴＮＦアルファあり及びなしで平板培養した。
トランスフェクトされた細胞をＴＮＦアルファと共に２４時間インキュベートした。その後、製造者のプロトコルに従って、ＡｌｌＰｒｅｐ ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、ＤＮＡ及びＲＮＡを単離した。ＬｕｎａＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲＴ ＳｕｐｅｒＭｉｘ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて、ｃＤＮＡにＲＮＡサンプルを逆転写し、ＴａｑＭａｎ（登録商標） Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた個別のＣＸＣＬ３ ＴａｑＭａｎプライマー／プローブセットを使用する定量ＰＣＲにより解析した。
ΔΔＣｔ法を用いたヒトＧＡＰＤＨ参照遺伝子と比較して、ＣＸＣＬ３遺伝子発現を定量した。遺伝子発現の変化は、未処理細胞における遺伝子発現のレベルと直接比較して、ＴＮＦアルファ処理後の遺伝子発現の倍率増加を測定することによって、さらに定量した。結果は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子といくつかの異なるｓｇＲＮＡとを含む部位特異的妨害剤を使用して、ＴＨＰ－１細胞におけるＣＸＣＬ３発現を低減できることを示す（図８のグラフ）。結果はまた、前記部位特異的妨害剤のＬＮＰ送達を使用して、有効量の薬剤を標的細胞に送達できることを示している。この結果はまた、標的複数遺伝子を含むＡＳＭＣのいずれかの側でアンカー配列をターゲティングすることが、標的複数遺伝子の発現を低減できることを実証する。
ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、及びＩＬ８を含むＡＳＭＣの他のＣＴＣＦ部位をターゲティングするｓｇＲＮＡを用いて実験を繰り返した場合にも、同様の結果が見られた（データは示さず）。
実施例５：ＣＸＣＬ１及びＣＸＣＬ３の発現は、トランスフェクション後３週間で低減した
この例は、部分的に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子を含む部位特異的妨害剤と、標的複数遺伝子を含むＡＳＭＣのアンカー配列をターゲティングする様々なガイドＲＮＡとによるトランスフェクションの３週間後のＴＨＰ－１細胞におけるＣＸＣＬ１及びＣＸＣＬ３の発現の安定した低減を実証する実験を説明する。
細胞及びＬＮＰを調製し、トランスフェクトされた細胞をＴＮＦアルファ刺激の前に３週間インキュベートしたことを除いて、サンプルを実施例４のように分析した（図９Ａのフローチャートを参照）。
結果は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子といくつかの異なるｓｇＲＮＡとを含む部位特異的妨害剤を使用して、薬剤を含むＬＮＰによる処理後３週間（３週間を含む）まで、ＴＨＰ－１細胞におけるＣＸＣＬ１及びＣＸＣＬ３発現を安定的に低減できることを示す（図９Ａ及び９Ｂ）。この結果はまた、標的複数遺伝子を含むＡＳＭＣのいずれかの側でアンカー配列をターゲティングすることが、標的複数遺伝子の発現を安定的に低減できることを実証する。
実施例６：ＫＲＡＢエフェクター部分を含む薬剤は、ＣＸＣＬ１発現を低減する
この例は、部分的に、転写リプレッサーに融合されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子を含む部位特異的妨害剤と、標的複数遺伝子を含むＡＳＭＣのアンカー配列をターゲティングする様々なガイドＲＮＡとによるトランスフェクション後のＴＨＰ－１細胞におけるＣＸＣＬ１の発現の低減を実証する実験を説明する。
ＴＨＰ－１細胞は、ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳで増殖させた。細胞は、転写リプレッサーに融合したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子、ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢをコードするｍＲＮＡと、ＬＮＰを用いて標的複数遺伝子を含むＡＳＭＣのいずれかのＣＴＣＦ部位をターゲティングするｓｇＲＮＡ（実施例１から）とでトランスフェクトした。ＳＳＯＰ脂質混合物を使用した脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の製剤化は、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．のＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（登録商標）Ｓｐａｒｋ（商標）を使用して実行した。実験条件について、３５０ｋ細胞／ウェルを、ＬＮＰトランスフェクションの７２時間後に、各トランスフェクト条件及び親対照を２４ウェルプレートにプレーティングした。１時間後、１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦアルファ（Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ＃６５４２０５）を各ウェルに添加した。未処理の親細胞を１０ｎｇ／ｍｌ ＴＮＦアルファあり及びなしで平板培養した。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子（Ｃａｓ９）及びｓｇＲＮＡ（実施例２、４、及び５による）をコードするｍＲＮＡでのトランスフェクションを陽性対照として実施した。
トランスフェクトされた細胞をＴＮＦアルファと共に２４時間インキュベートした。その後、製造者のプロトコルに従って、ＡｌｌＰｒｅｐ ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、ＤＮＡ及びＲＮＡを単離した。ＬｕｎａＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲＴ ＳｕｐｅｒＭｉｘ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて、ｃＤＮＡにＲＮＡサンプルを逆転写し、ＴａｑＭａｎ（登録商標） Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた個別のＣＸＣＬ１特異的ＴａｑＭａｎプライマー／プローブセットを使用する定量ＰＣＲにより解析した。
ΔΔＣｔ法を用いたヒトＧＡＰＤＨ参照遺伝子と比較して、ＣＸＣＬ１遺伝子発現を定量した。遺伝子発現の変化は、未処理細胞における遺伝子発現のレベルと直接比較して、ＴＮＦアルファ処理後の遺伝子発現の倍率増加を測定することによって、さらに定量した。この結果は、転写リプレッサー、ＫＲＡＢに融合し、異なるｓｇＲＮＡによりＣＴＣＦ部位にターゲティングされた触媒として不活性のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子を含む部位特異的妨害剤を使用して、ＴＨＰ－１細胞におけるＣＸＣＬ１発現を低減することができることを示す（図１０）。発現の減少は、トランスフェクションの７２時間後に見られた。
実施例７：ＥＺＨ２エフェクター部分を含む薬剤は、ＣＸＣＬ１発現を低減する
この例は、部分的に、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＥＺＨ２）に融合したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子を含む部位特異的妨害剤と、標的複数遺伝子を含むＡＳＭＣのアンカー配列をターゲティングする様々なガイドＲＮＡとによるトランスフェクション後のＴＨＰ－１細胞におけるＣＸＣＬ１の発現の低減を実証する実験を説明する。
ＴＨＰ－１細胞は、ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳで増殖させた。細胞は、ヒストンデアセチラーゼに融合した触媒として不活性のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子（ｄＣａｓ９）、ｄＣａｓ９－ＥＺＨ２をコードするｍＲＮＡと、ＬＮＰを用いて標的複数遺伝子を含むＡＳＭＣのいずれかのＣＴＣＦ部位をターゲティングするｓｇＲＮＡ（実施例１から）とでトランスフェクトした。ＳＳＯＰ脂質混合物を使用した脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の製剤化は、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．のＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（登録商標）Ｓｐａｒｋ（商標）を使用して実行した。実験条件について、３５０ｋ細胞／ウェルを、ＬＮＰトランスフェクションの７２時間後に、各トランスフェクト条件及び親対照を２４ウェルプレートにプレーティングした。１時間後、１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦアルファ（Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ＃６５４２０５）を各ウェルに添加した。未処理の親細胞を１０ｎｇ／ｍｌ ＴＮＦアルファあり及びなしで平板培養した。
トランスフェクトされた細胞をＴＮＦアルファと共に２４時間インキュベートした。その後、製造者のプロトコルに従って、ＡｌｌＰｒｅｐ ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、ＤＮＡ及びＲＮＡを単離した。ＬｕｎａＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲＴ ＳｕｐｅｒＭｉｘ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて、ｃＤＮＡにＲＮＡサンプルを逆転写し、ＴａｑＭａｎ（登録商標） Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた個別のＣＸＣＬ１特異的ＴａｑＭａｎプライマー／プローブセットを使用する定量ＰＣＲにより解析した。
ΔΔＣｔ法を用いたヒトＧＡＰＤＨ参照遺伝子と比較して、ＣＸＣＬ１遺伝子発現を定量した。遺伝子発現の変化は、未処理細胞における遺伝子発現のレベルと直接比較して、ＴＮＦアルファ処理後の遺伝子発現の倍率増加を測定することによって、さらに定量した。この結果は、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＥＺＨ２）に融合し、異なるｓｇＲＮＡによりＣＴＣＦ部位にターゲティングされた触媒として不活性のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子を含む部位特異的妨害剤を使用して、ＴＨＰ－１細胞におけるＣＸＣＬ１発現を低減することができることを示す（図１１）。発現の減少は、トランスフェクションの７２時間後に見られた。
実施例８：ＭＱ１エフェクター部分を含む薬剤は、ＣＸＣＬ１発現を低減する
この例は、部分的に、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＭＱ１）に融合したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子を含む部位特異的妨害剤と、標的複数遺伝子を含むＡＳＭＣのアンカー配列をターゲティングする様々なガイドＲＮＡとによるトランスフェクション後のＴＨＰ－１細胞におけるＣＸＣＬ１の発現の低減を実証する実験を説明する。
ＴＨＰ－１細胞は、ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳで増殖させた。細胞は、ＭＱ１に融合された触媒として不活性のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子（ｄＣａｓ９）（ｄＣａｓ９－ＭＱ１）をコードするｍＲＮＡと、ＬＮＰを用いて標的複数遺伝子を含むＡＳＭＣのいずれかのＣＴＣＦ部位をターゲティングするｓｇＲＮＡ（実施例１から）とでトランスフェクトした。ＳＳＯＰ脂質混合物を使用した脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の製剤化は、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．のＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（登録商標）Ｓｐａｒｋ（商標）を使用して実行した。実験条件について、３５０ｋ細胞／ウェルを、ＬＮＰトランスフェクションの７２時間後に、各トランスフェクト条件及び親対照を２４ウェルプレートにプレーティングした。１時間後、１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦアルファ（Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ＃６５４２０５）を各ウェルに添加した。未処理の親細胞を１０ｎｇ／ｍｌ ＴＮＦアルファあり及びなしで平板培養した。
トランスフェクトされた細胞をＴＮＦアルファと共に２４時間インキュベートした。その後、製造者のプロトコルに従って、ＡｌｌＰｒｅｐ ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、ＤＮＡ及びＲＮＡを単離した。ＬｕｎａＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲＴ ＳｕｐｅｒＭｉｘ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて、ｃＤＮＡにＲＮＡサンプルを逆転写し、ＴａｑＭａｎ（登録商標） Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた個別のＣＸＣＬ１及びＣＸＣＬ３特異的ＴａｑＭａｎプライマー／プローブセットを使用する定量ＰＣＲにより解析した。
ΔΔＣｔ法を用いたヒトＧＡＰＤＨ参照遺伝子と比較して、ＣＸＣＬ１及び３遺伝子発現を定量した。遺伝子発現の変化は、未処理細胞における遺伝子発現のレベルと直接比較して、ＴＮＦアルファ処理後の遺伝子発現の倍率増加を測定することによって、さらに定量した。この結果は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＭＱ１）に融合し、異なるｓｇＲＮＡによりＣＴＣＦ部位にターゲティングされた触媒として不活性のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子を含む部位特異的妨害剤を使用して、ＴＨＰ－１細胞におけるＣＸＣＬ１発現を低減することができることを示す（図１２）。発現の減少は、トランスフェクションの７２時間後に見られた。ＣＸＣＬ３発現を測定して同様の結果が見られた（データは示さず）。
実施例９：Ｃａｓ９又はｄＣａｓ９－ＥＺＨ２処理後の持続的なＣＸＣＬ１の発現低減
この例は、部分的に、ヒストンデアセチラーゼ（ＥＺＨ２）に融合したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子又は触媒として不活性のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子のいずれかを含む部位特異的妨害剤と、ＣＸＣＬ１を含む標的複数遺伝子を含むＡＳＭＣのアンカー配列をターゲティングする様々なｓｇＲＮＡとによるトランスフェクション後４週間までの、ＴＨＰ－１細胞におけるＣＸＣＬ１の発現の安定した低減を実証する実験を説明する。
ＡＴｘ（商標）Ｓｃａｌａｂｌｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＭａｘＣｙｔｅ）を使用して、ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳで増殖したＴＨＰ－１細胞は、いずれかの部位特異的妨害剤（Ｃａｓ９又はｄＣａｓ９－ＥＺＨ２）をコードするｍＲＮＡと、ｓｇＲＮＡ（実施例１から）とで、アセンブリを処理する条件ごとに５００万個の細胞でエレクトロポレーションした。トランスフェクトされた細胞のサンプルを回収し、ＴＮＦアルファと共に２４時間インキュベートした。これを毎週反復して４週間行った。その後、製造者のプロトコルに従って、ＡｌｌＰｒｅｐ ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、ＤＮＡ及びＲＮＡを単離した。ＬｕｎａＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲＴ ＳｕｐｅｒＭｉｘ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて、ｃＤＮＡにＲＮＡサンプルを逆転写し、ＴａｑＭａｎ（登録商標） Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた個別のＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３＆ＩＬ８特異的ＴａｑＭａｎプライマー／プローブセットを使用する定量ＰＣＲにより解析した。
ΔΔＣｔ法を用いたヒトＧＡＰＤＨ参照遺伝子と比較して、ＣＸＣＬ１遺伝子発現を定量した。遺伝子発現の変化は、未処理細胞における遺伝子発現のレベルと直接比較して、ＴＮＦアルファ処理後の遺伝子発現の倍率増加を測定することによって、さらに定量した。この結果は、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＥＺＨ２）に融合し、ｓｇＲＮＡによりＣＴＣＦ部位にターゲティングされたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子、又は触媒として不活性のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子を含む部位特異的妨害剤を使用して、ＴＨＰ－１細胞におけるＣＸＣＬ１発現を低減することができることを示す（図１３）。発現の低減は、少なくとも４週間まで持続し、トランスフェクション後７２時間及び３週間でも観察される。
実施例１０：ＣＸＣＬ３発現は、ＥＺＨ２－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ及びｓｇＲＮＡで処理すると低減される
この例は、部分的に、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＥＺＨ２）及び転写リプレッサー（ＫＲＡＢ）に融合した触媒として不活性のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子を含む部位特異的妨害剤と、標的複数遺伝子を含むＡＳＭＣのアンカー配列をターゲティングする様々なガイドＲＮＡとによるトランスフェクション後のＴＨＰ－１細胞におけるＣＸＣＬ３の発現の低減を実証する実験を説明する。
ＴＨＰ－１細胞は、ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳで増殖させた。いくつかの異なる部位特異的妨害剤を調べた：Ｇ９Ａ－ｄＣａｓ９－ＥＺＨ２（ＥＺＨ２に融合したｄＣａｓ９に融合したＧ９Ａ）、Ｇ９Ａ－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ、及びＥＺＨ２－ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ。細胞を、部位特異的妨害剤をコードするｍＲＮＡと、ＬＮＰを用いて標的複数遺伝子を含むＡＳＭＣのＣＴＣＦ部位をターゲティングするｓｇＲＮＡとでトランスフェクトした。ｓｇＲＮＡは、左ＣＴＣＦ部位に近接しているが、左ＣＴＣＦ部位からいくらか距離のある（例えば、ＣＴＣＦ部位から８０、１６０、２３５、又は３００ヌクレオチド）ゲノムＤＮＡ部位をターゲティングするように選択された。左ＣＴＣＦ部位に近接しているが、左ＣＴＣＦ部位からいくらか距離のあるゲノムＤＮＡ部位をターゲティングする例示的なガイド配列を表５に示す。
ＳＳＯＰ脂質混合物を使用した脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の製剤化は、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．のＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（登録商標）Ｓｐａｒｋ（商標）を使用して実行した。実験条件について、３５０ｋ細胞／ウェルを、ＬＮＰトランスフェクションの７２時間後に、各トランスフェクト条件及び親対照を２４ウェルプレートにプレーティングした。１時間後、１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦアルファ（Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ＃６５４２０５）を各ウェルに添加した。未処理の親細胞を１０ｎｇ／ｍｌ ＴＮＦアルファあり及びなしで平板培養した。
トランスフェクトされた細胞をＴＮＦアルファと共に２４時間インキュベートした。その後、製造者のプロトコルに従って、ＡｌｌＰｒｅｐ ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、ＤＮＡ及びＲＮＡを単離した。ＬｕｎａＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲＴ ＳｕｐｅｒＭｉｘ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて、ｃＤＮＡにＲＮＡサンプルを逆転写し、ＴａｑＭａｎ（登録商標） Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた個別のＣＸＣＬ１及びＣＸＣＬ３特異的ＴａｑＭａｎプライマー／プローブセットを使用する定量ＰＣＲにより解析した。
ΔΔＣｔ法を用いたヒトＧＡＰＤＨ参照遺伝子と比較して、ＣＸＣＬ１及び３遺伝子発現を定量した。遺伝子発現の変化は、未処理細胞における遺伝子発現のレベルと直接比較して、ＴＮＦアルファ処理後の遺伝子発現の倍率増加を測定することによって、さらに定量した。この結果は、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＥＺＨ２）及び転写リプレッサー（ＫＲＡＢ）に融合し、ＣＴＣＦに近接した部位ｓｇＲＮＡにターゲティングされた触媒として不活性のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子を含む部位特異的妨害剤を使用して、ＴＨＰ－１細胞におけるＣＸＣＬ３発現を低減することができることを示す（図１４）。ＣＸＣＬ１発現を測定して同様の結果が見られた（データは示さず）。
実施例１１：ＣＸＣＬ１発現は、部位特異的妨害剤及びｓｇＲＮＡで処理すると低減される
この例は、部分的に、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ３３ａ／３ｌ）に融合した触媒として不活性のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子；ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ８）に融合した触媒として不活性のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子；又はヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ８）及びヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＥＺＨ２）に融合した触媒として不活性のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子を含む、様々な例示的な部位特異的妨害剤と、標的複数遺伝子を含むＡＳＭＣのアンカー配列をターゲティングする様々なガイドＲＮＡとによるトランスフェクション後のＴＨＰ－１細胞におけるＣＸＣＬ１の発現の低減を実証する実験を説明する。
ＴＨＰ－１細胞は、ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳで増殖させた。いくつかの異なる部位特異的妨害剤を調べた：ｄＣａｓ９－ＤＮＭＴ３ａ／３ｌ（ｄＣａｓ９に融合したＤＮＭＴ３ａ／３ｌ）、ｄＣａｓ９－ＨＤＡＣ８、及びＥＺＨ２－ｄＣａｓ９－ＨＤＡＣ８。細胞を、部位特異的妨害剤をコードするｍＲＮＡと、ＬＮＰを用いて標的複数遺伝子を含むＡＳＭＣのいずれかのＣＴＣＦ部位をターゲティングするｓｇＲＮＡ（実施例１から）とでトランスフェクトした。ＳＳＯＰ脂質混合物を使用した脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の製剤化は、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．のＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（登録商標）Ｓｐａｒｋ（商標）を使用して実行した。実験条件について、３５０ｋ細胞／ウェルを、ＬＮＰトランスフェクションの７２時間後に、各トランスフェクト条件及び親対照を２４ウェルプレートにプレーティングした。１時間後、１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦアルファ（Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ＃６５４２０５）を各ウェルに添加した。未処理の親細胞を１０ｎｇ／ｍｌ ＴＮＦアルファあり及びなしで平板培養した。
トランスフェクトされた細胞をＴＮＦアルファと共に２４時間インキュベートした。その後、製造者のプロトコルに従って、ＡｌｌＰｒｅｐ ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、ＤＮＡ及びＲＮＡを単離した。ＬｕｎａＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲＴ ＳｕｐｅｒＭｉｘ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて、ｃＤＮＡにＲＮＡサンプルを逆転写し、ＴａｑＭａｎ（登録商標） Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた個別のＣＸＣＬ１特異的ＴａｑＭａｎプライマー／プローブセットを使用する定量ＰＣＲにより解析した。
ΔΔＣｔ法を用いたヒトＧＡＰＤＨ参照遺伝子と比較して、ＣＸＣＬ１遺伝子発現を定量した。遺伝子発現の変化は、未処理細胞における遺伝子発現のレベルと直接比較して、ＴＮＦアルファ処理後の遺伝子発現の倍率増加を測定することによって、さらに定量した。結果は、ｄＣａｓ９－ＤＮＭＴ３ａ／３ｌ、ｄＣａｓ９－ＨＤＡＣ８、又はＥＺＨ２－ｄＣａｓ９－ＨＤＡＣ８を含む部位特異的妨害剤を使用して、ＴＨＰ－１細胞におけるＣＸＣＬ１発現を低減することができ、これらの薬剤がいくつかの異なるｓｇＲＮＡによりＣＴＣＦ部位にターゲティングされると、サイトカイン発現が低減したことを示す（図１５）。
実施例１２：ＣＸＣＬ遺伝子クラスター発現は、ヒトＡ５４９肺癌上皮細胞及びＩＭＲ－９０細胞においてｄＣａｓ９－ＥＺＨ２及びガイド３０１８３で処理すると低減される
この例は、ｄＣａｓ９－ＥＺＨ２及びガイド３０１８３（コントローラ１）で処理した場合、ＣＸＣＬ遺伝子クラスターの発現は、ヒトＡ５４９肺癌上皮細胞及びＩＭＲ－９０細胞において低減することを実証する。
ヒトＡ５４９細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－１８５）及びＩＭＲ－９０細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）－ＣＣＬ－１８６）を、１００μｌの培地中、平底細胞培養処理プレートに、ウェルあたり１５，０００細胞でプレーティングした。Ａ５４９細胞にはＦ１２／Ｋ ＡＴＣＣ（登録商標）－３０－２００４培地が、ＩＭＲ－９０細胞にはＥＭＥＭ ＡＴＣＣ（登録商標）－３０－２００３培地が与えられた。完全培地は両方１０％ＦＢＳ（ＶＷＲ ｃａｔ＃９７０６８－０８５）で作製された。プレートに２４時間接着した後、ガイド３０１８３及びＥＺＨ２－ｄＣａｓ９コントローラを含むＬＮＰを、２μｇ／ｍｌのＳＳＯＰ脂質混合物の最終濃度で培地に添加した。６時間後、培地を１００μｌの適切な培地に交換し、細胞を７２時間インキュベートした。７２時間のインキュベーションの完了後、ＴＮＦアルファ（Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ＃６５４２０５）を１０ｎｇ／ｍｌの最終濃度で指定されたウェルに添加し、２４時間インキュベートした。２４時間後、製造者のプロトコルに従って、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）９６ ＲＮＡ Ｃｏｒｅ Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ Ｉｎｃ，ｃａｔ＃７４０４６６．４）を用いてＲＮＡを単離した。ＬｕｎａＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲＴ ＳｕｐｅｒＭｉｘ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて、ｃＤＮＡにＲＮＡサンプルを逆転写し、ＴａｑＭａｎ（登録商標） Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた個別の特異的ＴａｑＭａｎプライマー／プローブセットを使用する定量ＰＣＲにより解析した。ΔΔＣｔ法を用いたヒトＡＢＬ１参照遺伝子と比較して、遺伝子発現を定量した。遺伝子発現の変化は、未処理細胞における遺伝子発現のレベルと直接比較して、ＴＮＦアルファ処理後の遺伝子発現の倍率増加を測定することによって、さらに定量した。
データは、ｄＣａｓ９－ＥＺＨ２で処理した場合、ＣＸＣＬ遺伝子クラスター（具体的には、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、及びＩＬ－８）の遺伝子の発現レベルが、ヒトＡ５４９肺癌上皮細胞で４０～７０％低減されたことを示した。（図１７）。中央ＣＴＣＦがｄＣａｓ９－ＥＺＨ２及びＧＤ－３０１８３による標的であった場合、ＣＸＣＬ遺伝子クラスター（具体的には、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、及びＩＬ－８）の遺伝子の発現レベルは、ＩＭＲ－９０細胞で約５０％低下した（図１８）。
実施例１３：ＣＸＣＬ遺伝子クラスター発現は、ヒト単球においてｄＣａｓ９－ＥＺＨ２及びガイドＧＤ－２８４８１で処理すると低減される
この例は、ｄＣａｓベースのエフェクター（コントローラＡ）で処理した場合、ヒト単球細胞におけるＣＸＣＬ遺伝子クラスター発現が低減されることを実証する。
Ｃａｓ９／ガイドＲＮＰ複合体のトランスフェクションは、ＳｙｎｔｈｅｇｏによるＴＨＰ－１細胞（ＡＴＣＣ－ＴＩＢ－２０２）へのエレクトロポレーションにより実施された。
編集された細胞株の受領後、バイアルを解凍し、細胞をＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ（ＶＷＲ ｃａｔ＃９７０６８－０８５）中で１週間培養して、凍結及び解凍から細胞を回復させた。未編集の親ＴＨＰ１細胞株も比較のために分析した。
３５０，０００細胞は、編集細胞株及び親対照について４つずつ２４ウェルプレートにプレーティングした。１時間後、１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦアルファ（Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ＃６５４２０５）を添加した。ケモカイン発現の倍率増加を比較するために、未処理の対照ウェルも使用された。
編集された親細胞をＴＮＦアルファと共に２４時間インキュベートした。その後、製造者のプロトコルに従って、ＤＮＡ／ＲＮＡ ＡｌｌＰｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、ＤＮＡ及びＲＮＡを単離した。ＬｕｎａＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲＴ ＳｕｐｅｒＭｉｘ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて、ｃＤＮＡにＲＮＡサンプルを逆転写し、ＴａｑＭａｎ（登録商標） Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた個別のＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３＆ＩＬ８特異的ＴａｑＭａｎプライマー／プローブセットを使用する定量ＰＣＲにより解析した。
ΔΔＣｔ法を用いたヒトＧＡＰＤＨ参照遺伝子と比較して、ＣＸＣＬ１－３＆ＩＬ８遺伝子発現を定量した。遺伝子発現の変化は、未処理細胞における遺伝子発現のレベルと直接比較して、ＴＮＦアルファ処理後の遺伝子発現の倍率増加を測定することによって、さらに定量した。
データは、投与後２４時間のＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、及びＩＬ－８の遺伝子発現が、未処理の単球におけるＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、及びＩＬ－８遺伝子発現とそれぞれ比較して、コントローラＡで処理された単球で６５％、５５％、８８％、及び５２％減少したことを示した（図１９）。
実施例１４：マウスＣＸＣＬ遺伝子クラスター発現は、ｄＣａｓ９－ＭＱ１とＨｅｐ１．６細胞の３つのアンカー配列をターゲティングするｓｇＲＮＡとで処理すると低減される
この例は、マウスＣＸＣＬ遺伝子クラスター発現が、ｄＣａｓ９－ＭＱ１とＨｅｐ１．６細胞の３つのアンカーシーケンスをターゲティングするｓｇＲＮＡとで処理すると、下方制御されることを実証する。
マウス細胞ＨＥＰＡ１．６（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１８３０）を、１００μｌの培地（ＤＭＥＭ Ｇｉｂｃｏ Ｃａｔ＃１１９９５－０６５、１０％ＦＢＳ ＶＷＲ ｃａｔ＃９７０６８－０８５）で処理した平底細胞培養プレートに、ウェルあたり１０ｋ細胞でプレーティングした。プレートに付着してから２４時間後、培養物を４つの処理群及び３つの対照群に分けた。（ｉ）ガイドＧＤ－３０５９４と、右ＣＴＣＦをターゲティングするｄＣａｓ９－ＭＱ１コントローラ、（ｉｉ）ガイドＧＤ－３０５９２と、中央ＣＴＣＦ１をターゲティングするｄＣａｓ９－ＭＱ１エフェクター、（ｉｉｉ）ガイドＧＤ－３０５９３と、中央ＣＴＣＦをターゲティングするｄＣａｓ９－ＭＱ１エフェクター、及び（ｉｖ）ＧＤ－３０５９４、ＧＤ－３０５９２及びＧＤ－３０５９３の組合せと、中央及び右ＣＴＣＦの両方をターゲティングするｄＣａｓ９－ＭＱ１、を含むＬＮＰを、処理群の細胞培養物に、最終濃度２μｇ／ｍＬのＳＳＯＰ脂質混合物で添加した。未処理細胞、ＬＮＰで処理した細胞、並びにＴＮＦ、及びトランスフェクション制御ガイドを含有するＬＮＰで処理した細胞を、対照として使用した。６時間後、培地を１００μｌのＤＭＥＭに交換し、細胞を７２時間インキュベートした。７２時間のインキュベーションの完了後、ＴＮＦアルファ（Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ＃６５４２４５）を１０ｎｇ／ｍｌの最終濃度で指定されたウェルに添加し、２４時間インキュベートする。２４時間後、製造者のプロトコルに従って、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）９６ ＲＮＡ Ｃｏｒｅ Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ，ｃａｔ＃７４０４６６．４）を用いてＲＮＡを単離した。ＬｕｎａＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲＴ ＳｕｐｅｒＭｉｘ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて、ｃＤＮＡにＲＮＡサンプルを逆転写し、ＴａｑＭａｎ（登録商標） Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた個別の特異的ＴａｑＭａｎプライマー／プローブセットを使用する定量ＰＣＲにより解析した。ΔΔＣｔ法を用いたマウスＨＰＲＴ参照遺伝子と比較して、遺伝子発現を定量した。遺伝子発現の変化は、未処理細胞における遺伝子発現のレベルと直接比較して、ＴＮＦアルファ処理後の遺伝子発現の倍率増加を測定することによって、さらに定量した。
データは、ＣＸＣＬ遺伝子クラスターの右、又は２つの中央ＣＴＣＦモチーフのうちの１つをターゲティングするガイドを用いてトランスフェクトされたｄＣａｓ９－ＭＱ１で処理した細胞が、ＴＮＦアルファ刺激後７つのＣＸＣＬ遺伝子の全てがいくらかの下方制御を示したことを実証した（図２１Ｂ）。しかし、中央及び右のＣＴＣＦの両方をターゲティングするガイドの組合せを用いてトランスフェクトされたｄＣａｓ９－ＭＱ１で細胞を処理した場合、ＣＸＣＬ遺伝子クラスター全体が有意により下方制御された（図２１Ｂ）。
実施例１５：ｄＣａｓ９－ＭＱ１の全身投与は、炎症を起こした肺における白血球浸潤の有意な低減を実証する
この例は、ｄＣａｓ９－ＭＱ１の全身投与がマウス肺におけるインビボでの白血球浸潤を低減することを実証する。
マウスのリポ多糖（ＬＰＳ）肺炎症モデルを使用して、肺の急性炎症を研究した。ＤＯＴＡＰ １％ＰＥＧ短ｎｃＲＮＡを含むＬＮＰを対照として使用した。各マウスに、静脈内投与ポイントを介して－２時間で３ｍｇ／ｋｇ用量のＬＮＰ－ＤＯＴＡＰ又はｄＣａｓ９－ＭＱ１を投与した。マウスは、０時間で経口吸引によって５ｍｇ／ｋｇのＬＰＳで刺激した。３ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ－ＤＯＴＡＰ又はｄＣａｓ９－ＭＱ１の第２用量を＋８時間の時点で投与した。デキサメタゾンは、０、２４、及び４８時間の時点で１０ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内投与した。動物を７２時間で処分し、フロー染色のために肺から気管支洗浄液を採取した。ＢＡＬＦ中の好中球浸潤の低減は、炎症反応の重症度を理解するための手段として使用された。
ｄＣａｓ９－ＭＱ１処置動物の肺から採取された気管支洗浄液は、約５．０×１０５個の白血球数／ｍＬを示した。偽群、すなわち、処置を受けていない健康なマウスは、気管支洗浄液（ＢＡＬＦ）中に有意な白血球の存在を有しなかった。ＬＰＳ処置マウス、デキサメタゾン処置マウス、及びＬＮＰ－ＤＯＴＡＰ処置マウスは、気管支洗浄液中、それぞれ、約８．０×１０５個／ｍＬの白血球数、約７．２×１０５個／ｍＬの白血球数、及び約６．０×１０５個／ｍＬの白血球数を示した（図２２Ｂ）。気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）中の好中球浸潤の５６％の低減も、疾患対照と比較して、ｄＣａｓ９－ＭＱ１による処置の７２時間後にマウスで観察された。
実施例１６：ｄＣａｓ９－ＭＱ１の全身投与は、ＢＡＬＦ中の好中球浸潤の有意な低減を実証する
この実施例は、細胞集団を評価するために実施例１５で得られたＢＡＬＦを分析する。
以下の染色パネルを用いたフローサイトメトリー分析を使用して、実施例１５で得られたＢＡＬＦ中の細胞集団を評価し、終了時にＢＡＬＦ中に存在する細胞のパーセンテージを記録した（図２３Ａ）。ＢＡＬＦ中の好中球数も、下の抗体染色パネルを用いてグラフ化した。
肺胞マクロファージ：ＣＤ４５＋、Ｓｉｇｌｅｃ Ｆ＋、ＣＤ１１ｂ－、ＣＤ１１ｃ＋
好中球：ＣＤ４５＋、Ｓｉｇｌｅｃ Ｆ－、ＣＤ１１ｂ＋、ＣＤ１１ｃ－、Ｌｙ－６Ｇ＋
Ｔ細胞：ＣＤ４５＋、Ｓｉｇｌｅｃ Ｆ－、ＣＤ１１ｃ－、ＣＤ３＋
Ｂ細胞：ＣＤ４５＋、Ｓｉｇｌｅｃ Ｆ－－、ＣＤ１１ｃ－、Ｂ２２０＋（図２３Ｂ）
分析により、浸潤細胞の大部分を構成する白血球細胞型は好中球であり、続いてＢ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、及び他の型の造血細胞が続くことが示された（図２３Ａ）。コントローラは、＋ＬＰＳ疾患群と比較して、肺に浸潤する好中球の数を、有意差をもって低減する（図２３Ｂ）。
実施例１７：ＢＡＬＦ中の白血球細胞の低減は肺特異的である
この例は、ＢＡＬＦ中の白血球細胞の低減が肺に特異的であることを実証し、低減がｄＣａｓ９－ＭＱ１処置の結果であったことを示唆している。
マウスのリポ多糖（ＬＰＳ）肺炎症モデルを使用して、肺の急性炎症を研究した。ＤＯＴＡＰ １％ＰＥＧ短ｎｃＲＮＡを含むＬＮＰを対照として使用した。各マウスに、静脈内投与ポイントを介して－２時間で３ｍｇ／ｋｇ用量のＬＮＰ－ＤＯＴＡＰ又はｄＣａｓ９－ＭＱ１を投与した。マウスは、０時間で経口吸引によって５ｍｇ／ｋｇのＬＰＳで刺激した。３ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ－ＤＯＴＡＰ又はｄＣａｓ９－ＭＱ１の第２用量を＋８時間の時点で投与した。デキサメタゾンは、０、２４、及び４８時間の時点で１０ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内投与した。動物を７２時間で処分し、フロー染色のために肺から気管支洗浄液を採取した。７２時間の終了時に末梢血を採取した。ＣＤ４５＋抗体染色を用いたフロー分析を使用して、各群の末梢血中の白血球集団を決定した。各群で得られた白血球数をグラフにプロットした。
グラフは、コントローラ処理によるＢＡＬＦ中の白血球数の低減の効果が肺特異的であることを説明しており、これは、白血球数の低減が、マウス自体の白血球数の低減（この場合、末梢血中の白血球数の低下も示されたと考えられる）ではなく、ｄＣａｓ９－ＭＱ１処理によるものであることを示唆している。末梢血中の造血細胞集団は、全ての群で同様であることがわかった（図２４）。
実施例１８：ｄＣａｓ９－ＭＱ１の全身投与は、ＣＸＣＬ遺伝子発現が肺組織で低減されることを実証する
この例は、ｄＣａｓ９－ＭＱ１の全身投与時に肺組織でＣＸＣＬ遺伝子クラスター発現が下方制御されることを実証する。
実施例１５に記載の方法を用いてＢＡＬＦを採取した。ＢＡＬＦ採取後、左肺葉の半分を瞬間凍結してｑＰＣＲ分析用に保存した。肺組織をホモジナイズし、ＣＸＣＬ１－７及びＣＸＣＬ１５を特異的に定量するｑＰＣＲ分析のためにＲＮＡを抽出した。ΔΔＣｔ法を用いたマウスＧＡＰＤＨ参照遺伝子と比較して、遺伝子発現を定量した。
データは、ｄＣａｓ９－ＭＱ１で処理されていないマウスから得られた肺組織サンプルにおけるＣＸＣＬ遺伝子クラスター発現と比較して、ｄＣａｓ９－ＭＱ１で処理されたマウスから得られた肺組織サンプルにおいて、ＣＸＣＬ遺伝子クラスター発現が異なる程度で下方制御されたことを示した（図２５）。
実施例１９：ＣＸＣＬ発現の低減は、細胞動員の低減及び炎症部位への他のサイトカインの存在の低減という有益な下流効果を有する
ＣＸＣＬ遺伝子クラスターの過剰発現は、好中球を誘引するケモカインを生産する。炎症細胞を肺に動員するケモカインは、局所炎症を促進し、重度の病変形成を引き起こす。この例は、ＣＸＣＬ発現の下方制御が、炎症部位における他のサイトカインの存在の低減につながる細胞動員を低減するという有益な下流効果を有することを実証し、ＣＸＣＬ発現の下方制御が炎症病変の重症度を低減する有望な方法であることを示唆している。
実施例１５に記載の方法を用いてＢＡＬＦを採取した。ＢＡＬＦ採取後、左肺葉の半分を瞬間凍結してｑＰＣＲ分析用に保存した。肺組織をホモジナイズし、多重化Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）装置を使用してＢＡＬＦ中のＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＧＭ－ＣＳＦ、及びＩＬ－６タンパク質の総数を特異的に定量するｑＰＣＲ分析のためにＲＮＡを抽出した。
データは、ｄＣａｓ９－ＭＱ１で処理したマウスから得られた肺組織が、ｄＣａｓ９－ＭＱ１で処理されていないマウスから得られた肺組織で見られたＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＧＭ－ＣＳＦ、及びＩＬ－６の発現と比較して、より低いＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＧＭ－ＣＳＦ、及びＩＬ－６の発現を示したことを実証した。
同等物
本発明をその詳細な説明と併せて説明してきたが、前述の説明は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を例示するものであり、限定するものではないことを理解されたい。いくつかの態様、利点、及び改変は、以下の特許請求の範囲内にある。

Claims (232)

  1. 細胞における第１遺伝子及び第２遺伝子の発現を低減する方法であって、
    第１アンカー配列又は第１アンカー配列に近接した部位に特異的に結合する、ターゲティング部分を含む、部位特異的妨害剤に、前記第１及び第２遺伝子の発現を低減するのに十分な量で、前記細胞を接触させることを含み、
    前記第１及び第２遺伝子が、前記第１アンカー配列及び第２アンカー配列を含むアンカー配列媒介接合部内にあり、
    任意選択的に、前記第１遺伝子及び第２遺伝子が、炎症誘発性遺伝子であり；
    それにより、前記第１及び第２遺伝子の発現を低減する、方法。
  2. ＤＮＡ結合、例えば、細胞内の第１アンカー配列に特異的に、又はそれに近接して結合する、ターゲティング部分を含み、
    前記第１アンカー配列が、第２アンカー配列、第１遺伝子、及び第２遺伝子をさらに含む、アンカー配列媒介接合部の一部であり、
    任意選択的に、前記第１遺伝子及び前記第２遺伝子が、炎症誘発性遺伝子である、部位特異的妨害剤。
  3. 前記第１又は第２アンカー配列が、ＩＬ－８とＲＡＳＳＦ６の間；ＩＬ－８エンハンサーとＲＡＳＳＦ６の間；ＣＸＣＬ１とＣＸＣＬ４の間；ＣＸＣＬ２とＥＰＧＮの間；又はＥ２エンハンサーとＥＰＧＮの間に位置する、請求項２に記載の部位特異的妨害剤。
  4. 前記部位特異的妨害剤が、エフェクター部分をさらに含む、請求項２又は３に記載の部位特異的妨害剤。
  5. 前記ターゲティング部分が、ＴＡＬエフェクター分子、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子（例えば、触媒として不活性のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質）、ジンクフィンガードメイン、ｔｅｔＲドメイン、メガヌクレアーゼ、又はオリゴヌクレオチドを含む、請求項２～４のいずれか一項に記載の部位特異的妨害剤。
  6. 前記エフェクター部分が、本明細書に記載のエフェクター、例えば、ＭＱ１、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ１、ＤＮＭＴ３Ａ２、ＤＮＭＴ３Ｂ１、ＤＮＭＴ３Ｂ２、ＤＮＭＴ３Ｂ３、ＤＮＭＴ３Ｂ４、ＤＮＭＴ３Ｂ５、ＤＮＭＴ３Ｂ６、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＥＺＨ２、ＨＤＡＣ８、ＫＲＡＢ、ＭｅＣＰ２、ＨＰ１、ＲＢＢＰ４、ＲＥＳＴ、ＦＯＧ１、ＳＵＺ１２、ＳＥＴＤＢ１、ＳＥＴＤＢ２、ＥＨＭＴ２（すなわち、Ｇ９Ａ）、ＥＨＭＴ１（すなわち、ＧＬＰ）、ＳＵＶ３９Ｈ１、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ９、ＨＤＡＣ１０、ＨＤＡＣ１１、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、ＳＩＲＴ７、ＳＩＲＴ８、ＳＩＲＴ９、ＥＺＨ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＳＥＴＤ８、ＳＵＶ４２０Ｈ１、ＳＵＶ４２０Ｈ２若しくはＤＮＭＴ３、又はそれらいずれかの機能性変異体若しくは断片を含む、請求項２～５のいずれか一項に記載の部位特異的妨害剤。
  7. 前記エフェクター部分が、リンカーを介して前記ターゲティング部分に連結されている、請求項２～６のいずれか一項に記載の部位特異的妨害剤。
  8. 前記エフェクター部分が、前記ターゲティング部分のＣ末端である、請求項２～７のいずれか一項に記載の部位特異的妨害剤。
  9. 前記エフェクター部分が、前記ターゲティング部分のＮ末端である、請求項２～７のいずれか一項に記載の部位特異的妨害剤。
  10. 前記エフェクター部分が、配列番号１０、１４、１６、１８、６６、６８のいずれか、又はそれと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、若しくはそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の相違を有する配列から選択されるヌクレオチド配列によりコードされる、請求項２～９のいずれか一項に記載の部位特異的妨害剤。
  11. 前記エフェクター部分が、配列番号１１、１２、１３、１５、１７、１９、６７のいずれか、又はそれと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、若しくはそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の相違を有する配列に従うアミノ酸配列を含む、請求項２～１０のいずれか一項に記載の部位特異的妨害剤。
  12. 前記エフェクター部分が、ＭＱ１、又はその機能性変異体若しくは断片であり、例えば、前記エフェクター部分が、配列番号１１若しくは１２のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、若しくはそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の相違を有する配列を含み、任意選択的に、前記エフェクター部分が、前記ターゲティング部分のＣ末端にある、請求項２～１１のいずれか一項に記載の部位特異的妨害剤。
  13. 前記エフェクター部分が、ＫＲＡＢ、又はその機能性変異体若しくは断片であり、例えば、前記エフェクター部分が、配列番号１３のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、若しくはそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の相違を有する配列を含み、任意選択的に、前記エフェクター部分が、前記ターゲティング部分のＣ末端にある、請求項２～１１のいずれか一項に記載の部位特異的妨害剤。
  14. 前記エフェクター部分が、ＤＮＭＴ３ａ／３Ｌ、又はその機能性変異体若しくは断片であり、例えば、前記エフェクター部分が、配列番号１５のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、若しくはそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の相違を有する配列を含み、任意選択的に、前記エフェクター部分が、前記ターゲティング部分のＣ末端にある、請求項２～１１のいずれか一項に記載の部位特異的妨害剤。
  15. 前記エフェクター部分が、ＥＺＨ２、又はその機能性変異体若しくは断片であり、例えば、前記エフェクター部分が、配列番号１７のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、若しくはそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の相違を有する配列を含む、請求項２～１１のいずれか一項に記載の部位特異的妨害剤。
  16. 前記エフェクター部分が、ＨＤＡＣ８、又はその機能性変異体若しくは断片であり、例えば、前記エフェクター部分が、配列番号１９のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、若しくはそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の相違を有する配列を含み、任意選択的に、前記エフェクター部分が、前記ターゲティング部分のＣ末端にある、請求項２～１１のいずれか一項に記載の部位特異的妨害剤。
  17. 前記エフェクター部分が、Ｇ９Ａ、又はその機能性変異体若しくは断片であり、例えば、前記エフェクター部分が、配列番号６７のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、若しくは１００％の同一性を有するか、若しくはそれと２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下の位置の相違を有する配列を含み、任意選択的に、前記エフェクター部分が、前記ターゲティング部分のＮ末端にある、請求項２～１１のいずれか一項に記載の部位特異的妨害剤。
  18. 第２エフェクター部分をさらに含む、請求項２～１７のいずれか一項に記載の部位特異的妨害剤。
  19. 前記ターゲティング部分が、前記第１エフェクター部分と前記第２エフェクター部分との間に位置する、請求項１８に記載の部位特異的妨害剤。
  20. 前記エフェクター部分が、ポリマー、例えば、オリゴヌクレオチド；例えば、ｇＲＮＡを含む、請求項２～１９のいずれか一項に記載の部位特異的妨害剤。
  21. 前記オリゴヌクレオチドが、前記アンカー配列の相補体、又は前記アンカー配列に近接した配列に対する相補体を含む配列を有する、請求項２０に記載の部位特異的妨害剤。
  22. 前記ターゲティング部分が、ｇＲＮＡ、例えば、配列番号２０～６２のいずれかの配列の少なくとも１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０ヌクレオチドを含むゲノム遺伝子座に結合するｇＲＮＡをさらに含み、例えば、前記ｇＲＮＡが、配列番号２０～６２のいずれかの配列の少なくとも１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０ヌクレオチドを含む配列を含む、請求項２～２１のいずれか一項に記載の部位特異的妨害剤。
  23. 前記ターゲティングドメインが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子、例えば、触媒として不活性のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質と、ｇＲＮＡ、例えば、配列番号２０～６２のいずれかの配列の少なくとも１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０ヌクレオチドを含むゲノム遺伝子座に結合するｇＲＮＡとを含み、例えば、前記ｇＲＮＡが、配列番号２０～６２のいずれかの配列の少なくとも１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０ヌクレオチドを含む配列を含み、前記エフェクター部分が、ＤＮＭＴ３ａ／３ｌ、ＭＱ１、ＫＲＡＢ、Ｇ９Ａ、ＨＤＡＣ８、又はＥＺＨ２から選択されるエフェクターを含む、請求項２～２２のいずれか一項に記載の部位特異的妨害剤。
  24. 前記ターゲティングドメインが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子、例えば、触媒として不活性のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質と、ｇＲＮＡ、例えば、配列番号２０～６２のいずれかの配列の少なくとも１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０ヌクレオチドを含むゲノム遺伝子座に結合するｇＲＮＡとを含み、例えば、前記ｇＲＮＡが、配列番号２０～６２のいずれかの配列の少なくとも１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０ヌクレオチドを含む配列を含み、前記第１エフェクター部分が、ＤＮＭＴ３ａ／３ｌ、ＭＱ１、ＫＲＡＢ、Ｇ９Ａ、ＨＤＡＣ８、又はＥＺＨ２から選択されるエフェクターを含み、前記第２エフェクター部分が、ＤＮＭＴ３ａ／３ｌ、ＭＱ１、ＫＲＡＢ、Ｇ９Ａ、ＨＤＡＣ８、又はＥＺＨ２から選択されるエフェクターを含む、請求項２３に記載の部位特異的妨害剤。
  25. 前記ターゲティングドメインが、配列番号２０～６２のいずれかの配列の少なくとも１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０ヌクレオチドを含むゲノム遺伝子座に結合する、請求項２～２４のいずれか一項に記載の部位特異的妨害剤。
  26. 前記ターゲティングドメインが、配列番号２０～６２のいずれかの配列の５０ヌクレオチド以内（例えば、上流又は下流）のゲノム遺伝子座に結合する、請求項２～２５のいずれか一項に記載の部位特異的妨害剤。
  27. 前記ターゲティングドメインが、配列番号２０～６２のいずれかの配列の１００ヌクレオチド以内（例えば、上流又は下流）のゲノム遺伝子座に結合する、請求項２～２６のいずれか一項に記載の部位特異的妨害剤。
  28. 前記ターゲティングドメインが、配列番号２０～６２のいずれかの配列の２００ヌクレオチド以内（例えば、上流又は下流）のゲノム遺伝子座に結合する、請求項２～２７のいずれか一項に記載の部位特異的妨害剤。
  29. 前記ターゲティングドメインが、配列番号２０～６２のいずれかの配列の３００ヌクレオチド以内（例えば、上流又は下流）のゲノム遺伝子座に結合する、請求項２～２８のいずれか一項に記載の部位特異的妨害剤。
  30. （ｉ）１つ又は複数の核局在化シグナル配列（ＮＬＳ）を含むか、又は（ｉｉ）ＮＬＳを含まず、任意選択的に、前記ＮＬＳは、配列番号６３及び／又は６４のアミノ酸配列を含む、請求項２～２９のいずれか一項に記載の部位特異的妨害剤。
  31. 前記第１及び／又は第２エフェクター部分が、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、ヒストンデメチラーゼ、又はヒストン修飾複合体のリクルータを含む、請求項１８～３０のいずれか一項に記載の部位特異的妨害剤。
  32. 前記ＡＳＭＣが、２つのループを含む、請求項２～３１のいずれか一項に記載の部位特異的妨害剤。
  33. 前記第１遺伝子が、前記ＡＳＭＣの第１ループ内にあり、前記第２遺伝子が、前記ＡＳＭＣの第２ループ内にある、請求項２～３２のいずれか一項に記載の部位特異的妨害剤又は請求項１に記載の方法。
  34. 前記第１アンカー配列が、前記第１ループと前記第２ループの間に位置する、請求項３３に記載の部位特異的妨害剤又は方法。
  35. 請求項２～３４のいずれか一項に記載の部位特異的妨害剤をコードする、核酸。
  36. 前記アンカー配列媒介接合部が、第３遺伝子をさらに含み、任意選択的に、前記方法が、前記第３遺伝子の発現の低減をもたらす、請求項１に記載の方法又は請求項２～３６のいずれか一項に記載の部位特異的妨害剤。
  37. 前記アンカー配列媒介接合部が、第４遺伝子をさらに含み、任意選択的に、前記方法が、前記第４遺伝子の発現の低減をもたらす、請求項３６に記載の方法又は部位特異的妨害剤。
  38. 前記アンカー配列媒介接合部が、第５遺伝子をさらに含み、任意選択的に、前記方法が、前記第５遺伝子の発現の低減をもたらす、請求項３７に記載の方法又は部位特異的妨害剤。
  39. 前記アンカー配列媒介接合部が、第６遺伝子をさらに含み、任意選択的に、前記方法が、前記第６遺伝子の発現の低減をもたらす、請求項３８に記載の方法又は部位特異的妨害剤。
  40. 前記アンカー配列媒介接合部が、第７遺伝子をさらに含み、任意選択的に、前記方法が、前記第７遺伝子の発現の低減をもたらす、請求項３９に記載の方法又は部位特異的妨害剤。
  41. 前記アンカー配列媒介接合部が、第８遺伝子をさらに含み、任意選択的に、前記方法が、前記第８遺伝子の発現の低減をもたらす、請求項４０に記載の方法又は部位特異的妨害剤。
  42. 低減された第１遺伝子及び第２遺伝子の発現を有するヒト細胞であって、
    前記第１遺伝子及び前記第２遺伝子が、炎症誘発性遺伝子であり、
    前記細胞が、前記第１及び第２遺伝子を含む、妨害された（例えば、完全に妨害された）アンカー配列媒介接合部を含む、ヒト細胞。
  43. 前記アンカー配列媒介接合部により構成されるアンカー配列へのＣＴＣＦ結合が低減した、例えば、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００％低減した、請求項４２に記載のヒト細胞。
  44. 前記ヒト細胞は、第３炎症誘発性遺伝子の発現が低減した、請求項４２又は４３のいずれか一項に記載のヒト細胞。
  45. 前記ヒト細胞は、第４炎症誘発性遺伝子の発現が低減した、請求項４４に記載のヒト細胞。
  46. 前記ヒト細胞は、第５炎症誘発性遺伝子の発現が低減した、請求項４５に記載のヒト細胞。
  47. 前記ヒト細胞は、第６炎症誘発性遺伝子の発現が低減した、請求項４６に記載のヒト細胞。
  48. 前記ヒト細胞は、第７炎症誘発性遺伝子の発現が低減した、請求項４７に記載のヒト細胞。
  49. 前記ヒト細胞は、第８炎症誘発性遺伝子の発現が低減した、請求項４８に記載のヒト細胞。
  50. 前記ヒト細胞が、ｃｈｒ４：７４５９５４６４－７４５９５４８６、ｃｈｒ４：７４５９５４５７－７４５９５４７９、ｃｈｒ４：７４５９５４６０－７４５９５４８２、ｃｈｒ４：７４５９５４７２－７４５９５４９４、ｃｈｒ４：７５００００８８－７５０００１１０、ｃｈｒ４：７５００００９１－７５０００１１３、ｃｈｒ４：７５００００８５－７５０００１０７、ｃｈｒ４：７５０００１５７－７５０００１７９、ｃｈｒ４：７５０００１５６－７５０００１７８、ｃｈｒ４：７４５９５２１５－７４５９５２３７、ｃｈｒ４：７４５９５３７０－７４５９５３９２、ｃｈｒ４：７４５９５５６０－７４５９５５８２、ｃｈｒ４：７４５９５６４２－７４５９５６６４、ｃｈｒ４：７４５９５７８７－７４５９５８０９、ｃｈｒ４：７４５２８４２８－７４５２８４５０、ｃｈｒ４：７４５２８５６７－７４５２８５８９、ｃｈｒ４：７４５２８６０９－７４５２８６３１、ｃｈｒ４：７４７８９１３２－７４７８９１５４、ｃｈｒ４：７４７８９２５０－７４７８９２７２、ｃｈｒ４：７４７８９３１２－７４７８９３３４、ｃｈｒ４：７４９６４８５３－７４９６４８７５、ｃｈｒ４：７４９６４９０６－７４９６４９２８、ｃｈｒ４：７４９６５５３８－７４９６５５６０、ｃｈｒ４：７４９６５７３７－７４９６５７５９、ｃｈｒ４：７５００００３１－７５００００５３、ｃｈｒ４：７５０００１１５－７５０００１３７、ｃｈｒ４：７５０００２３１－７５０００２５３、ｃｈｒ４：７４９７５１４６－７４９７５１６８、ｃｈｒ４：７４９７５３６９－７４９７５３９１、ｃｈｒ４：７４９７６３１８－７４９７６３４０、ｃｈｒ４：７４５７０３４８－７４５７０３７０、ｃｈｒ４：７４５７０５０３－７４５７０５２５、若しくはｃｈｒ４：７４５７０５２６－７４５７０５４８、又は前記領域の５、１０、１５、２０、３０、４０、又は５０ヌクレオチド以内に突然変異を含む、請求項４２～４９のいずれか一項に記載のヒト細胞。
  51. ｃｈｒ４：７４５９５４６４－７４５９５４８６、ｃｈｒ４：７４５９５４５７－７４５９５４７９、ｃｈｒ４：７４５９５４６０－７４５９５４８２、ｃｈｒ４：７４５９５４７２－７４５９５４９４、ｃｈｒ４：７５００００８８－７５０００１１０、ｃｈｒ４：７５００００９１－７５０００１１３、ｃｈｒ４：７５００００８５－７５０００１０７、ｃｈｒ４：７５０００１５７－７５０００１７９、ｃｈｒ４：７５０００１５６－７５０００１７８、ｃｈｒ４：７４５９５２１５－７４５９５２３７、ｃｈｒ４：７４５９５３７０－７４５９５３９２、ｃｈｒ４：７４５９５５６０－７４５９５５８２、ｃｈｒ４：７４５９５６４２－７４５９５６６４、ｃｈｒ４：７４５９５７８７－７４５９５８０９、ｃｈｒ４：７４５２８４２８－７４５２８４５０、ｃｈｒ４：７４５２８５６７－７４５２８５８９、ｃｈｒ４：７４５２８６０９－７４５２８６３１、ｃｈｒ４：７４７８９１３２－７４７８９１５４、ｃｈｒ４：７４７８９２５０－７４７８９２７２、ｃｈｒ４：７４７８９３１２－７４７８９３３４、ｃｈｒ４：７４９６４８５３－７４９６４８７５、ｃｈｒ４：７４９６４９０６－７４９６４９２８、ｃｈｒ４：７４９６５５３８－７４９６５５６０、ｃｈｒ４：７４９６５７３７－７４９６５７５９、ｃｈｒ４：７５００００３１－７５００００５３、ｃｈｒ４：７５０００１１５－７５０００１３７、ｃｈｒ４：７５０００２３１－７５０００２５３、ｃｈｒ４：７４９７５１４６－７４９７５１６８、ｃｈｒ４：７４９７５３６９－７４９７５３９１、ｃｈｒ４：７４９７６３１８－７４９７６３４０、ｃｈｒ４：７４５７０３４８－７４５７０３７０、ｃｈｒ４：７４５７０５０３－７４５７０５２５、若しくはｃｈｒ４：７４５７０５２６－７４５７０５４８、又は前記領域の５、１０、１５、２０、３０、４０、又は５０ヌクレオチド以内に突然変異を含む、ヒト細胞。
  52. 前記突然変異が、（例えば、１～１０、１～９、１～８、１～７、１～６、１～５、１～４、１～３、又は１～２ヌクレオチドの）欠失、置換、又は挿入を含む、請求項２７又は２８のいずれか一項に記載のヒト細胞。
  53. 妨害されていないＡＳＭＣを有するヒト細胞と比較して、前記突然変異へのＣＴＣＦ結合が低減された、例えば、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００％低減された、請求項５０～５２のいずれか一項に記載のヒト細胞。
  54. 前記第１及び第２遺伝子の発現が、妨害されていないＡＳＭＣを有するヒト細胞と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％低減された、請求項４２～５３のいずれか一項に記載のヒト細胞。
  55. 第１ターゲティング部分と、任意選択的に第１エフェクター部分とを含む、第１部位特異的妨害剤であって、前記第１部位特異的妨害剤が、アンカー配列媒介接合部（ＡＳＭＣ）の第１アンカー配列に特異的に結合し、前記ＡＳＭＣが、第１遺伝子及び第２遺伝子を含む、第１部位特異的妨害剤、及び
    第２ターゲティング部分と、任意選択的に第２エフェクター部分とを含む、第２部位特異的妨害剤であって、前記第２部位特異的妨害剤が、前記ＡＳＭＣの第２アンカー配列に結合する、第２部位特異的妨害剤を含む、システム。
  56. 前記第１アンカー配列が、ＩＬ－８とＲＡＳＳＦ６の間；ＩＬ－８エンハンサーとＲＡＳＳＦ６の間；ＣＸＣＬ１とＣＸＣＬ４の間；ＣＸＣＬ２とＥＰＧＮの間；又はＥ２エンハンサーとＥＰＧＮの間にある、請求項５５に記載のシステム。
  57. 前記第２アンカー配列が、ＩＬ－８とＲＡＳＳＦ６の間；ＩＬ－８エンハンサーとＲＡＳＳＦ６の間；ＣＸＣＬ１とＣＸＣＬ４の間；ＣＸＣＬ２とＥＰＧＮの間；又はＥ２エンハンサーとＥＰＧＮの間にある、請求項５５又は５６に記載のシステム。
  58. 前記第１アンカー配列が、ＩＬ－８エンハンサーとＲＡＳＳＦ６の間にあり、前記第２アンカー配列が、ＣＸＣＬ１とＣＸＣＬ４の間にある、請求項５５～５７のいずれか一項に記載のシステム。
  59. 前記第１アンカー配列が、ＩＬ－８エンハンサーとＲＡＳＳＦ６の間にあり、前記第２アンカー配列が、Ｅ２エンハンサーとＥＰＧＮの間にある、請求項５５～５８のいずれか一項に記載のシステム。
  60. 前記第１アンカー配列が、ＣＸＣＬ１とＣＸＣＬ４の間にあり、前記第２アンカー配列が、Ｅ２エンハンサーとＥＰＧＮの間にある、請求項５５～５９のいずれか一項に記載のシステム。
  61. 前記第１部位特異的妨害剤が、本明細書に記載の部位特異的妨害剤、例えば、請求項２～９のいずれか一項に記載の部位特異的妨害剤である、請求項５５～６０のいずれか一項に記載のシステム。
  62. 前記第２部位特異的妨害剤が、本明細書に記載の部位特異的妨害剤、例えば、請求項２～９のいずれか一項に記載の部位特異的妨害剤である、請求項５５～６１のいずれか一項に記載のシステム。
  63. 前記第１ターゲティング部分及び前記第２ターゲティング部分が、それぞれ独立して、ＴＡＬエフェクター分子、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子、ジンクフィンガードメイン、ｔｅｔＲドメイン、メガヌクレアーゼ、又はオリゴヌクレオチドを含む、請求項５５～６２のいずれか一項に記載のシステム。
  64. 前記第１エフェクター部分及び前記第２エフェクター部分が、それぞれ独立して、本明細書に記載のエフェクター、例えば、ＭＱ１、ＥＺＨ２、ＨＤＡＣ８、ＫＲＡＢ、Ｇ９Ａ、若しくはＤＮＭＴ３ａ／３ｌ、又はそれらいずれかの機能性変異体若しくは断片を含む、請求項５５～６３のいずれか一項に記載のシステム。
  65. 前記第１エフェクター部分及び前記第２エフェクター部分が、それぞれ独立して、ＳＥＴＤＢ１、ＳＥＴＤＢ２、ＥＨＭＴ２（すなわち、Ｇ９Ａ）、ＥＨＭＴ１（すなわち、ＧＬＰ）、ＳＵＶ３９Ｈ１、ＥＺＨ２、ＥＺＨ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＳＥＴＤ８、ＳＵＶ４２０Ｈ１、ＳＵＶ４２０Ｈ２、又はその機能性変異体若しくは断片から選択されるタンパク質を含む、請求項５５～６２のいずれか一項に記載のシステム。
  66. 前記第１エフェクター部分及び前記第２エフェクター部分が、それぞれ独立して、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ９、ＨＤＡＣ１０、ＨＤＡＣ１１、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、ＳＩＲＴ７、ＳＩＲＴ８、ＳＩＲＴ９、又はそれらいずれかの機能性変異体若しくは断片から選択されるタンパク質を含む、請求項５５～６５のいずれか一項に記載のシステム。
  67. 前記第１エフェクター部分及び前記第２エフェクター部分が、それぞれ独立して、ＭＱ１、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ１、ＤＮＭＴ３Ａ２、ＤＮＭＴ３Ｂ１、ＤＮＭＴ３Ｂ２、ＤＮＭＴ３Ｂ３、ＤＮＭＴ３Ｂ４、ＤＮＭＴ３Ｂ５、ＤＮＭＴ３Ｂ６、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＤＮＭＴ３ａ／３ｌ、又はそれらいずれかの機能性変異体若しくは断片から選択されるタンパク質を含む、請求項５５～４３のいずれか一項に記載のシステム。
  68. 前記第１エフェクター部分及び前記第２エフェクター部分が、それぞれ独立して、ＫＲＡＢ、ＭｅＣＰ２、ＨＰ１、ＲＢＢＰ４、ＲＥＳＴ、ＦＯＧ１、ＳＵＺ１２、又はそれらいずれかの機能性変異体若しくは断片から選択されるタンパク質を含む、請求項５５～６７のいずれか一項に記載のシステム。
  69. 前記第１エフェクター部分及び前記第２エフェクター部分が、それぞれ独立して、ポリマー、例えば、オリゴヌクレオチドを含む、請求項５５～６８のいずれか一項に記載のシステム。
  70. 前記第１オリゴヌクレオチドと前記第２オリゴヌクレオチドが同一である、請求項５５～６９のいずれか一項に記載のシステム。
  71. 前記第１オリゴヌクレオチドと前記第２オリゴヌクレオチドが異なっている、請求項５５～７０のいずれか一項に記載のシステム。
  72. 前記第１オリゴヌクレオチドが、前記第１アンカー配列の相補体、又は前記第１アンカー配列に近接した配列に対する相補体を含む配列を有し、前記第２オリゴヌクレオチドが、前記第２アンカー配列の相補体、又は前記第２アンカー配列に近接した配列に対する相補体を含む配列を有する、請求項５５～７１のいずれか一項に記載のシステム。
  73. 前記アンカー配列媒介接合部が、第３遺伝子をさらに含む、請求項５５～７２のいずれか一項に記載のシステム。
  74. 前記アンカー配列媒介接合部が、第４遺伝子をさらに含む、請求項５５～７３のいずれか一項に記載のシステム。
  75. 前記アンカー配列媒介接合部が、第５遺伝子をさらに含む、請求項５５～７４のいずれか一項に記載のシステム。
  76. 前記アンカー配列媒介接合部が、第６遺伝子をさらに含む、請求項５５～７５のいずれか一項に記載のシステム。
  77. 前記アンカー配列媒介接合部が、第７遺伝子をさらに含む、請求項５５～７６のいずれか一項に記載のシステム。
  78. 前記アンカー配列媒介接合部が、第８遺伝子をさらに含む、請求項５５～７７のいずれか一項に記載のシステム。
  79. 前記ＡＳＭＣが、２つのループを含む、請求項５５～７８のいずれか一項に記載のシステム。
  80. 請求項５５～７９のいずれか一項に記載のシステムをコードする、核酸組成物。
  81. 単一の核酸が、前記第１部位特異的妨害剤及び前記第２部位特異的妨害剤の両方をコードする、請求項８０に記載の核酸。
  82. 第１核酸が、前記第１部位特異的妨害剤をコードし、第２核酸が、前記第２部位特異的妨害剤をコードする、請求項８１に記載の核酸。
  83. 細胞における第１遺伝子及び第２遺伝子の発現を低減する方法であって、前記細胞を、請求項８０～８２のいずれか一項に記載の核酸組成物の請求項５５～７９のいずれか一項に記載のシステムと接触させることを含む、方法。
  84. 前記細胞が、前記第１部位特異的妨害剤及び前記第２部位特異的妨害剤に、同時に接触される、請求項８３に記載の方法。
  85. 前記細胞が、前記第１部位特異的妨害剤及び前記第２部位特異的妨害剤に、順次に接触される、請求項８３に記載の方法。
  86. 前記第１遺伝子がＣＸＣＬ１であり、前記第２遺伝子がＣＸＣＬ２である、請求項１～８５のいずれか一項に記載の方法、ヒト細胞、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  87. 前記第１遺伝子がＣＸＣＬ１であり、前記第２遺伝子がＣＸＣＬ３である、請求項１～８５のいずれか一項に記載の方法、ヒト細胞、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  88. 前記第１遺伝子がＣＸＣＬ１であり、前記第２遺伝子がＩＬ－８である、請求項１～８５のいずれか一項に記載の方法、ヒト細胞、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  89. 前記第１遺伝子がＣＸＣＬ１であり、前記第２遺伝子がＣＸＣＬ４である、請求項１～８５のいずれか一項に記載の方法、ヒト細胞、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  90. 前記第１遺伝子がＣＸＣＬ１であり、前記第２遺伝子がＣＸＣＬ５である、請求項１～８５のいずれか一項に記載の方法、ヒト細胞、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  91. 前記第１遺伝子がＣＸＣＬ１であり、前記第２遺伝子がＣＸＣＬ６である、請求項１～８５のいずれか一項に記載の方法、ヒト細胞、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  92. 前記第１遺伝子がＣＸＣＬ１であり、前記第２遺伝子がＣＸＣＬ７である、請求項１～８５のいずれか一項に記載の方法、ヒト細胞、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  93. 前記第１遺伝子がＣＸＣＬ２であり、前記第２遺伝子がＣＸＣＬ３である、請求項１～８５のいずれか一項に記載の方法、ヒト細胞、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  94. 前記第１遺伝子がＣＸＣＬ２であり、前記第２遺伝子がＩＬ－８である、請求項１～８５のいずれか一項に記載の方法、ヒト細胞、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  95. 前記第１遺伝子がＣＸＣＬ２であり、前記第２遺伝子がＣＸＣＬ４である、請求項１～８５のいずれか一項に記載の方法、ヒト細胞、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  96. 前記第１遺伝子がＣＸＣＬ２であり、前記第２遺伝子がＣＸＣＬ４である、請求項１～８５のいずれか一項に記載の方法、ヒト細胞、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  97. 前記第１遺伝子がＣＸＣＬ２であり、前記第２遺伝子がＣＸＣＬ５である、請求項１～８５のいずれか一項に記載の方法、ヒト細胞、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  98. 前記第１遺伝子がＣＸＣＬ２であり、前記第２遺伝子がＣＸＣＬ６である、請求項１～８５のいずれか一項に記載の方法、ヒト細胞、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  99. 前記第１遺伝子がＣＸＣＬ２であり、前記第２遺伝子がＣＸＣＬ７である、請求項１～８５のいずれか一項に記載の方法、ヒト細胞、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  100. 前記第１遺伝子がＣＸＣＬ３であり、前記第２遺伝子がＩＬ－８である、請求項１～８５のいずれか一項に記載の方法、ヒト細胞、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  101. 前記第１遺伝子がＣＸＣＬ３であり、前記第２遺伝子がＣＸＣＬ４である、請求項１～８５のいずれか一項に記載の方法、ヒト細胞、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  102. 前記第１遺伝子がＣＸＣＬ３であり、前記第２遺伝子がＣＸＣＬ５である、請求項１～８５のいずれか一項に記載の方法、ヒト細胞、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  103. 前記第１遺伝子がＣＸＣＬ３であり、前記第２遺伝子がＣＸＣＬ６である、請求項１～８５のいずれか一項に記載の方法、ヒト細胞、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  104. 前記第１遺伝子がＣＸＣＬ３であり、前記第２遺伝子がＣＸＣＬ７である、請求項１～８５のいずれか一項に記載の方法、ヒト細胞、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  105. 前記第１遺伝子がＣＸＣＬ４であり、前記第２遺伝子がＣＸＣＬ５である、請求項１～８５のいずれか一項に記載の方法、ヒト細胞、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  106. 前記第１遺伝子がＣＸＣＬ４であり、前記第２遺伝子がＣＸＣＬ６である、請求項１～８５のいずれか一項に記載の方法、ヒト細胞、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  107. 前記第１遺伝子がＣＸＣＬ４であり、前記第２遺伝子がＣＸＣＬ７である、請求項１～８５のいずれか一項に記載の方法、ヒト細胞、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  108. 前記第１遺伝子がＣＸＣＬ４であり、前記第２遺伝子がＩＬ－８である、請求項１～８５のいずれか一項に記載の方法、ヒト細胞、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  109. 前記第１遺伝子がＣＸＣＬ５であり、前記第２遺伝子がＣＸＣＬ６である、請求項１～８５のいずれか一項に記載の方法、ヒト細胞、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  110. 前記第１遺伝子がＣＸＣＬ５であり、前記第２遺伝子がＣＸＣＬ７である、請求項１～８５のいずれか一項に記載の方法、ヒト細胞、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  111. 前記第１遺伝子がＣＸＣＬ５であり、前記第２遺伝子がＩＬ－８である、請求項１～８５のいずれか一項に記載の方法、ヒト細胞、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  112. 前記第１遺伝子がＣＸＣＬ６であり、前記第２遺伝子がＣＸＣＬ７である、請求項１～８５のいずれか一項に記載の方法、ヒト細胞、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  113. 前記第１遺伝子がＣＸＣＬ６であり、前記第２遺伝子がＩＬ－８である、請求項１～８５のいずれか一項に記載の方法、ヒト細胞、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  114. 前記第１遺伝子がＣＸＣＬ７であり、前記第２遺伝子がＩＬ－８である、請求項１～８５のいずれか一項に記載の方法、ヒト細胞、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  115. 前記第１遺伝子がＣＸＣＬ１であり、前記第２遺伝子がＣＸＣＬ２であり、前記第３遺伝子がＣＸＣＬ３である、請求項３６～８５のいずれか一項に記載の方法、ヒト細胞、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  116. 前記第１、第２、及び第３遺伝子が、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、又はＩＬ－８から選択される、請求項３６～８５のいずれか一項に記載の方法、ヒト細胞、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  117. 前記第１、第２、第３、及び第４遺伝子が、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、又はＩＬ－８から選択される、請求項３６～８５のいずれか一項に記載の方法、ヒト細胞、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  118. 前記第１、第２、第３、第４、及び第５遺伝子が、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、又はＩＬ－８から選択される、請求項３６～８５のいずれか一項に記載の方法、ヒト細胞、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  119. 前記第１、第２、第３、第４、第５、及び第６遺伝子が、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、又はＩＬ－８から選択される、請求項３６～８５のいずれか一項に記載の方法、ヒト細胞、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  120. 前記第１、第２、第３、第４、第５、第６、及び第７遺伝子が、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、又はＩＬ－８から選択される、請求項３６～８５のいずれか一項に記載の方法、ヒト細胞、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  121. 前記第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、及び第８遺伝子が、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、又はＩＬ－８である、請求項３６～８５のいずれか一項に記載の方法、ヒト細胞、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  122. 前記第１遺伝子がサイトカインである、請求項１～１２１のいずれか一項に記載の方法、ヒト細胞、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  123. 前記第２遺伝子がサイトカインである、請求項１～１２２のいずれか一項に記載の方法、ヒト細胞、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  124. 前記第３遺伝子がサイトカインである、請求項１～１２３のいずれか一項に記載の方法、ヒト細胞、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  125. 前記第４遺伝子がサイトカインである、請求項１～１２４のいずれか一項に記載の方法、ヒト細胞、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  126. 前記第５遺伝子がサイトカインである、請求項１～１２５のいずれか一項に記載の方法、ヒト細胞、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  127. 前記第６遺伝子がサイトカインである、請求項１～１２６のいずれか一項に記載の方法、ヒト細胞、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  128. 前記第７遺伝子がサイトカインである、請求項１～１２７のいずれか一項に記載の方法、ヒト細胞、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  129. 前記第８遺伝子がサイトカインである、請求項１～１２８のいずれか一項に記載の方法、ヒト細胞、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  130. 前記アンカー配列媒介接合部が、３つ、４つ、又は５つの炎症誘発性遺伝子を含む、請求項１～１２９のいずれか一項に記載の方法、ヒト細胞、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  131. 前記部位特異的妨害剤が、配列番号２０～６２、又はそれと少なくとも９０％、９５％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するか、若しくはそれと１、２、３、４、若しくは５つ以下の位置で異なる配列から選択されるヌクレオチド配列を含む、核酸（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）を含む、請求項１～１３０のいずれか一項に記載の方法、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  132. 前記部位特異的妨害剤が、配列番号２１、２２、２４、４０、又はそれと少なくとも９０％、９５％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するか、若しくはそれと１、２、３、４、若しくは５つ以下の位置で異なる配列から選択されるヌクレオチド配列を含む、核酸（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）を含む、請求項１～１３１のいずれか一項に記載の方法、部位特異的妨害剤。
  133. 前記部位特異的妨害剤が、表４、５、６、７から選択されるゲノム座標を有する領域と少なくとも部分的に重複する配列、又は前記領域の５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、又は１０００ヌクレオチド以内の配列に結合する、請求項１～１３２のいずれか一項に記載の方法又は部位特異的妨害剤。
  134. 例えば、ＴＮＦ－アルファによる細胞の刺激時に、サイトカイン、例えば、ケモカインのレベルの低減（例えば、実施例２～１１に記載されるように測定される）をもたらす、請求項１～１３３のいずれか一項に記載の方法。
  135. 例えば、ＴＮＦ－アルファによる細胞の刺激時に、サイトカイン（例えば、ケモカイン）のレベルが低減される（例えば、実施例２～１１に記載されるように測定される）、請求項１～１３４のいずれか一項に記載の方法又はヒト細胞。
  136. 例えば、ＴＮＦ－アルファによる細胞の刺激時に、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、及びＩＬ８のうちの１つ又は複数（例えば、２つ、３つ、又は全て）の転写レベルが低減される（例えば、実施例２又は４～１１に記載されるように測定される）、請求項１～１３５のいずれか一項に記載の方法又はヒト細胞。
  137. 例えば、ＴＮＦ－アルファによる細胞の刺激時に、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、及びＩＬ８のうちの１つ又は複数（例えば、２つ、３つ、又は全て）の転写レベルが低減される、請求項１～１３６のいずれか一項に記載の方法又はヒト細胞。
  138. 前記低減が、処理前レベル又は妨害されていないＡＳＭＣを有するヒト細胞と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％の低減である、請求項１３２～１３７のいずれか一項に記載の方法又はヒト細胞。
  139. 例えば、ＴＮＦ－アルファによる細胞の刺激時に、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、及びＩＬ８のうちの１つ又は複数（例えば、２つ、３つ、又は全て）のタンパク質レベル（例えば、分泌タンパク質レベル）が低減される（例えば、実施例３に記載されるように測定される）、請求項１～１３８のいずれか一項に記載の方法又はヒト細胞。
  140. 例えば、ＴＮＦ－アルファによる細胞の刺激時に、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、及びＩＬ８のうちの１つ又は複数（例えば、２つ、３つ、又は全て）のタンパク質レベル（例えば、分泌タンパク質レベル）が低減される、請求項１～１３９のいずれか一項に記載の方法又はヒト細胞。
  141. 前記低減が、処理前レベル又は妨害されていないＡＳＭＣを有するヒト細胞と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％の低減である、請求項１４０に記載の方法又はヒト細胞。
  142. 前記第１アンカー配列へのＣＴＣＦの結合の低減、例えば、ＣｈＩＰ及び定量的ＰＣＲにより測定される、例えば、結合の完全な喪失、又は妨害されていないＡＳＭＣを有するヒト細胞と比較して、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００％の喪失をもたらす、請求項１～１４１のいずれか一項に記載の方法。
  143. 前記アンカー配列媒介接合部の妨害をもたらす、請求項１～１４２のいずれか一項に記載の方法。
  144. 前記細胞の集団が、前記部位特異的妨害剤と接触され、前記第１アンカー配列が、前記集団中の細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％で編集される、請求項１～１４３のいずれか一項に記載の方法。
  145. 効果（例えば、サイトカインレベルの前記低減）が、前記第１遺伝子又は前記第２遺伝子を個別に阻害する前記効果と比較して、相加的又は相乗的である、請求項１～１４４のいずれか一項に記載の方法。
  146. 発現が、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、１０、若しくは１４日間、又は少なくとも１、２、３、４、若しくは５週間低減する、請求項１～１４５のいずれか一項に記載の方法。
  147. 前記細胞が、炎症性疾患、例えば、免疫介在性炎症性疾患を有する対象の細胞である、請求項１～１４６のいずれか一項に記載の方法、ヒト細胞、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  148. 前記炎症性疾患が、自己免疫障害、例えば、関節リウマチである、請求項１～１４７のいずれか一項に記載の方法、ヒト細胞、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  149. 前記炎症性疾患が、病原性感染、例えば、ウイルス感染、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２感染に関連している、請求項１～１４８のいずれか一項に記載の方法、ヒト細胞、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  150. 前記炎症性疾患が、重複感染、例えば、２つ以上の病原体、例えば、ウイルス及び細菌（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２及び肺炎レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉ））により、例えば、ウイルス及び真菌（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２及びムコール症）により引き起こされる感染と関連している、請求項１～１４９のいずれか一項に記載の方法、ヒト細胞、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  151. 前記細胞が、関節リウマチ、炎症、関節炎、痛風、喘息、好中球性喘息、好中球性皮膚症、足浮腫、急性呼吸器疾患症候群（ＡＲＤＳ）、ＣＯＶＩＤ－１９、乾癬、炎症性腸疾患、感染（例えば、病原体、例えば、細菌、ウイルス、又は真菌による）、外的損傷（例えば、擦傷又は異物）、放射線又は化学的損傷の影響、変形性関節症、変形性関節症の関節痛、関節痛、炎症性疼痛、急性痛、慢性痛、膀胱炎、気管支炎、皮膚炎、皮膚症、心血管疾患、神経変性疾患、肝臓疾患、肺疾患、腎臓疾患、痛み、腫れ、こわばり、圧痛、発赤、熱、又は疾患状態に関連するバイオマーカの上昇（例えば、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、免疫受容体、感染マーカ、又は炎症マーカ）を有する対象の細胞である、請求項１～１５０のいずれか一項に記載の方法、ヒト細胞、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  152. 前記細胞が、関節リウマチ、乾癬、又は炎症性腸疾患を有する対象の細胞である、請求項１～１５１のいずれか一項に記載の方法、ヒト細胞、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  153. 前記細胞が、関節リウマチ、痛風、好中球性喘息、好中球性皮膚症、急性呼吸器疾患症候群（ＡＲＤＳ）、又はＣＯＶＩＤ－１９を有する対象の細胞である、請求項１～１５２のいずれか一項に記載の方法、ヒト細胞、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  154. 前記アンカー配列媒介接合部が、内部増強配列を含む、請求項１～１５３のいずれか一項に記載の方法、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  155. 前記第２遺伝子（及び任意選択的に、前記第３、第４、第５、第６、第７、又は第８遺伝子）が、前記第１遺伝子と同じ方向に転写される、請求項１～１５４のいずれか一項に記載の方法、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  156. 前記第１アンカー配列が、ＣＴＣＦ結合モチーフ、ＵＳＦ１結合モチーフ、ＹＹ１結合モチーフ、ＴＡＦ３結合モチーフ、又はＺＮＦ１４３結合モチーフから選択される結合モチーフを含む、請求項１～１５５のいずれか一項に記載の方法、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  157. 前記第１アンカー配列が、ＣＴＣＦ結合モチーフを含む、請求項１～１５６のいずれか一項に記載の方法、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  158. 前記部位特異的妨害剤が、前記細胞内の内因性核形成ポリペプチド（例えば、ＣＴＣＦ、ＵＳＦ１、ＹＹ１、ＴＡＦ３、又はＺＮＦ１４３）の結合と競合する十分な親和性で前記第１アンカー配列に特異的に、又はそれに近接して結合する、請求項１～１５７のいずれか一項に記載の方法、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  159. 前記部位特異的妨害剤が、前記第１アンカー配列内の又はそれに近接した１つ又は複数のヌクレオチドを付加、欠失、又は置換する、請求項１～１５８のいずれか一項に記載の方法、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  160. 前記部位特異的妨害剤が、第１ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質と第１ガイドＲＮＡとを含む、第１ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子を含む、ターゲティング部分又はエフェクター部分を含む、請求項１～１５９のいずれか一項に記載の方法又は部位特異的妨害剤。
  161. 前記第１部位特異的妨害剤が、第１ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質と第１ガイドＲＮＡとを含む、第１ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子を含む、第１ターゲティング部分又は第１エフェクター部分を含み、前記第２部位特異的妨害剤が、第２ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質と第２ガイドＲＮＡとを含む、第２ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子を含む、第２ターゲティング部分又は第２エフェクター部分を含む、請求項１～１６０のいずれか一項に記載の方法又はシステム。
  162. 前記部位特異的妨害剤が、ＴＡＬエフェクター分子、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子、ジンクフィンガードメイン、ｔｅｔＲドメイン、メガヌクレアーゼ、又はオリゴヌクレオチドを含む、ターゲティング部分又はエフェクター部分を含む、請求項１～１６１のいずれか一項に記載の方法又は部位特異的妨害剤。
  163. 前記第１部位特異的妨害剤が、ＴＡＬエフェクター分子、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子、ジンクフィンガードメイン、ｔｅｔＲドメイン、メガヌクレアーゼ、又はオリゴヌクレオチドを含む、第１ターゲティング部分又は第１エフェクター部分を含み、前記第２部位特異的妨害剤が、ＴＡＬエフェクター分子、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子、ジンクフィンガードメイン、ｔｅｔＲドメイン、メガヌクレアーゼ、又はオリゴヌクレオチドを含む、第２ターゲティング部分又は第２エフェクター部分を含む、請求項１～１６２のいずれか一項に記載の方法又はシステム。
  164. 前記部位特異的妨害剤が、ヒストン修飾機能性、例えば、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ヒストンデメチラーゼ、又はヒストンデアセチラーゼ活性を含む、エフェクター部分を含む、請求項１～１６３のいずれか一項に記載の方法又は部位特異的妨害剤。
  165. 前記第１及び／又は第２部位特異的妨害剤が、ヒストン修飾機能性、例えば、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ヒストンデメチラーゼ、又はヒストンデアセチラーゼ活性を含む、エフェクター部分を含む、請求項１～１６４のいずれか一項に記載の方法又はシステム。
  166. 前記エフェクター部分が、ＳＥＴＤＢ１、ＳＥＴＤＢ２、ＥＨＭＴ２（すなわち、Ｇ９Ａ）、ＥＨＭＴ１（すなわち、ＧＬＰ）、ＳＵＶ３９Ｈ１、ＥＺＨ２、ＥＺＨ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＳＥＴＤ８、ＳＵＶ４２０Ｈ１、ＳＵＶ４２０Ｈ２、又はその機能性変異体若しくは断片から選択されるタンパク質を含む、請求項１６４又は１６５のいずれか一項に記載の方法、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  167. 前記エフェクター部分が、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ９、ＨＤＡＣ１０、ＨＤＡＣ１１、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、ＳＩＲＴ７、ＳＩＲＴ８、ＳＩＲＴ９、又はそれらいずれかの機能性変異体若しくは断片から選択されるタンパク質を含む、請求項１６４又は１６５のいずれか一項に記載の方法、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  168. 前記エフェクター部分が、ＥＺＨ２又はそれらいずれかの機能性変異体若しくは断片を含む、請求項１６４又は１６５のいずれか一項に記載の方法、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  169. 前記エフェクター部分が、ＨＤＡＣ８又はそれらいずれかの機能性変異体若しくは断片を含む、請求項１６４又は１６５のいずれか一項に記載の方法、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  170. 前記部位特異的妨害剤が、ＤＮＡ修飾機能性、例えば、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼを含む、エフェクター部分を含む、請求項１～１６９のいずれか一項に記載の方法又は部位特異的妨害剤。
  171. 前記第１及び／又は第２部位特異的妨害剤が、ＤＮＡ修飾機能性、例えば、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼを含む、エフェクター部分を含む、請求項１～１７０のいずれか一項に記載の方法又はシステム。
  172. 前記エフェクター部分が、ＭＱ１、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ１、ＤＮＭＴ３Ａ２、ＤＮＭＴ３Ｂ１、ＤＮＭＴ３Ｂ２、ＤＮＭＴ３Ｂ３、ＤＮＭＴ３Ｂ４、ＤＮＭＴ３Ｂ５、ＤＮＭＴ３Ｂ６、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＤＮＭＴ３ａ／３ｌ、又はそれらいずれかの機能性変異体若しくは断片から選択されるタンパク質を含む、請求項１７０又は１７１に記載の方法、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  173. 前記エフェクター部分が、ＭＱ１又はそれらいずれかの機能性変異体若しくは断片を含む、請求項１７０又は１７１に記載の方法、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  174. 前記エフェクター部分が、ＤＮＭＴ３（例えば、ＤＮＭＴ３ａ、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＤＮＭＴ３ａ／３ｌ、ＤＮＭＴ３Ｂ１、ＤＮＭＴ３Ｂ２、ＤＮＭＴ３Ｂ３、ＤＮＭＴ３Ｂ４、ＤＮＭＴ３Ｂ５、又はＤＮＭＴ３Ｂ６）又はそれらいずれかの機能性変異体若しくは断片を含む、請求項１７０又は１７１に記載の方法、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  175. 前記部位特異的妨害剤が、転写リプレッサーを含むエフェクター部分を含む、請求項１～１７４のいずれか一項に記載の方法又は部位特異的妨害剤。
  176. 前記第１及び／又は第２部位特異的妨害剤が、転写リプレッサーを含むエフェクター部分を含む、請求項１～１７５のいずれか一項に記載の方法又は部位特異的妨害剤。
  177. 前記エフェクター部分が、ＫＲＡＢ、ＭｅＣＰ２、ＨＰ１、ＲＢＢＰ４、ＲＥＳＴ、ＦＯＧ１、ＳＵＺ１２から選択されるタンパク質又はそれらいずれかの機能性変異体若しくは断片を含む、請求項１７５又は１７６に記載の方法、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  178. 前記エフェクター部分が、ＫＲＡＢ又はそれらいずれかの機能性変異体若しくは断片を含む、請求項１７７に記載の方法、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  179. 前記部位特異的妨害剤が、ポリマーを含む、請求項１～１７８のいずれか一項に記載の方法又は部位特異的妨害剤。
  180. 前記第１及び／又は第２部位特異的妨害剤が、ポリマーを含む、請求項１～１７９のいずれか一項に記載の方法又はシステム。
  181. 前記ポリマーが、ポリアミドを含む、請求項１７９又は１８０に記載の方法、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  182. 前記ポリマーがオリゴヌクレオチドである、請求項１７９又は１８０に記載の方法、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  183. 前記オリゴヌクレオチドが、前記第１アンカー配列の相補体、又は前記第１アンカー配列に近接した配列に対する相補体を含む配列を有する、請求項１８２に記載の方法、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  184. 前記オリゴヌクレオチドが、前記第２アンカー配列の相補体、又は前記第２アンカー配列に近接した配列に対する相補体を含む配列を有する、請求項１８２に記載の方法、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  185. 前記オリゴヌクレオチドが、化学修飾を含む、請求項１８２～１８４のいずれか一項に記載の方法、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  186. 前記ポリマーがペプチド核酸である、請求項１７９又は１８０に記載の方法又は部位特異的妨害剤、又はシステム。
  187. 前記部位特異的妨害剤が、ペプチド－核酸ミックスマーを含む、請求項１～１８６のいずれか一項に記載の方法、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  188. 前記部位特異的妨害剤（例えば、前記部位特異的妨害剤のターゲティング部分又はエフェクター部分）が、ペプチド又はポリペプチドを含む、請求項１～１８７のいずれか一項に記載の方法、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  189. 前記ポリペプチドがジンクフィンガーポリペプチドである、請求項１８８に記載の方法、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  190. 前記ポリペプチドが、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）ポリペプチドであるか、又はそれを含む、請求項１８８に記載の方法、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  191. 前記部位特異的妨害剤が、小分子を含む、請求項１～１９０のいずれか一項に記載の方法又は部位特異的妨害剤。
  192. 前記第１及び／又は第２部位特異的妨害剤が、小分子を含む、請求項１～１９１のいずれか一項に記載の方法又はシステム。
  193. 前記部位特異的妨害剤が、エフェクター部分、例えば、エピジェネティック修飾剤、例えば、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、又はヒストンメチルトランスフェラーゼをさらに含む、請求項１～１９２のいずれか一項に記載の方法又は部位特異的妨害剤。
  194. 前記第１及び／又は第２部位特異的妨害剤が、エフェクター部分、例えば、エピジェネティック修飾剤、例えば、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、又はヒストンメチルトランスフェラーゼをさらに含む、請求項１～１９３のいずれか一項に記載の方法又はシステム。
  195. 前記部位特異的妨害剤が、融合分子を含む、請求項１～１９４のいずれか一項に記載の方法又は部位特異的妨害剤。
  196. 前記第１及び／又は第２部位特異的妨害剤が、融合分子を含む、請求項１～１９５のいずれか一項に記載の方法又はシステム。
  197. 前記部位特異的妨害剤が、例えば融合分子として、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子を含むターゲティング部分と、転写リプレッサーを含むエフェクター部分とを含む、請求項１～１９６のいずれか一項に記載の方法又は部位特異的妨害剤。
  198. 前記第１及び／又は第２部位特異的妨害剤が、例えば融合分子として、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子を含むターゲティング部分と、転写リプレッサーを含むエフェクター部分とを含む、請求項１～１９７のいずれか一項に記載の方法又はシステム。
  199. 前記ターゲティング部分が、ｄＣａｓ９及び前記エフェクター部分ＫＲＡＢ又はその機能性変異体若しくは部分を含む、請求項１９８に記載の方法又は部位特異的妨害剤。
  200. 前記第１及び／又は第２ターゲティング部分が、ｄＣａｓ９及び前記エフェクター部分ＫＲＡＢ又はその機能性変異体若しくは部分を含む、請求項１～１９９のいずれか一項に記載の方法又はシステム。
  201. 前記部位特異的妨害剤が、例えば融合分子として、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子を含むターゲティング部分と、ヒストンメチルトランスフェラーゼを含むエフェクター部分とを含む、請求項１～１７７のいずれか一項に記載の方法又は部位特異的妨害剤。
  202. 前記第１及び／又は第２部位特異的妨害剤が、例えば融合分子として、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子を含むターゲティング部分と、ヒストンメチルトランスフェラーゼを含むエフェクター部分とを含む、請求項１～２０１のいずれか一項に記載の方法又はシステム。
  203. 前記ターゲティング部分が、ｄＣａｓ９を含み、前記エフェクター部分が、ＥＺＨ２又はその機能性変異体若しくは部分を含む、請求項２０１に記載の方法、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  204. 前記部位特異的妨害剤が、例えば融合分子として、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子を含むターゲティング部分と、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼを含むエフェクター部分とを含む、請求項１～１９６のいずれか一項に記載の方法、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  205. 前記ターゲティング部分が、ｄＣａｓ９を含み、前記エフェクター部分が、ＭＱ１又はその機能性変異体若しくは部分を含む、請求項２０４に記載の方法、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  206. 前記ターゲティング部分が、ｄＣａｓ９を含み、前記エフェクター部分が、ＤＮＭＴ３、例えば、ＤＮＭＴ３ａ／３ｌ又はその機能性変異体若しくは部分を含む、請求項２０３に記載の方法、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  207. 前記部位特異的妨害剤が、例えば融合分子として、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子を含むターゲティング部分と、ヒストンメチルトランスフェラーゼを含む第１エフェクター部分と、転写リプレッサーを含む第２エフェクター部分とを含む、請求項１～２０６のいずれか一項に記載の方法、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  208. 前記ターゲティング部分が、ｄＣａｓ９を含み、前記第１エフェクター部分が、ＥＺＨ２又はその機能性変異体若しくは部分を含み、前記第２エフェクター部分が、ＫＲＡＢ又はその機能性変異体若しくは部分を含む、請求項２０７に記載の方法、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  209. 前記部位特異的妨害剤が、例えば融合分子として、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子を含むターゲティング部分と、ヒストンデアセチラーゼを含むエフェクター部分とを含む、請求項１～２０８のいずれか一項に記載の方法、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  210. 前記ターゲティング部分が、ｄＣａｓ９を含み、前記エフェクター部分が、ＨＤＡＣ８又はその機能性変異体若しくは部分を含む、請求項２０９に記載の方法、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  211. 前記部位特異的妨害剤が、例えば融合分子として、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子を含むターゲティング部分と、ヒストンメチルトランスフェラーゼを含む第１エフェクター部分と、ヒストンデアセチラーゼを含む第２エフェクター部分とを含む、請求項１～２１０のいずれか一項に記載の方法、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  212. 前記ターゲティング部分が、ｄＣａｓ９を含み、前記第１エフェクター部分が、ＥＺＨ２又はその機能性変異体若しくは部分を含み、前記第２エフェクター部分が、ＨＤＡＣ８又はその機能性変異体若しくは部分を含む、請求項２１１に記載の方法、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  213. 前記部位特異的妨害剤が、配列番号６９、７１、８５、２０１、２０２、２０４、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、又は２１９～２４２、そのいずれかの相補的又は逆相補的な配列から選択される核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含むか、又はそのいずれかに対して少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の同一性を有する配列を含む、請求項１９５～２１２のいずれか一項に記載の方法、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  214. 前記部位特異的妨害剤が、配列番号７０、７２、８２、８４、８６、２０３、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、又は２１８のいずれか１つから選択されるか、若しくは配列番号２１９～２４２のいずれか１つから選択される配列によりコードされるアミノ酸配列を含むか、又はそのいずれかに対して少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の同一性を有する配列を含む、請求項１９５～２１３のいずれか一項に記載の方法、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  215. 前記細胞が、対象内にある、請求項１～２１４のいずれか一項に記載の方法、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  216. 前記細胞が、エクスビボである、請求項１～２１５のいずれか一項に記載の方法、部位特異的妨害剤。
  217. 前記細胞が、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞である、請求項１～２１６のいずれか一項に記載の方法又は部位特異的妨害剤、又はシステム。
  218. 前記細胞が、体細胞である、請求項１～２１７のいずれか一項に記載の方法、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  219. 前記細胞が、初代細胞である、請求項１～２１８のいずれか一項に記載の方法、部位特異的妨害剤、又はシステム。
  220. 前記接触させるステップがエクスビボで実施される、請求項１～２１９のいずれか一項に記載の方法。
  221. 前記接触させるステップの前に、対象から前記細胞（例えば、哺乳動物細胞）を除去するステップをさらに含む、請求項２２０に記載の方法。
  222. 前記接触させるステップの後に、（ｂ）前記細胞（例えば、哺乳動物細胞）を対象に投与するステップをさらに含む、請求項２２０又は２２１のいずれか一項に記載の方法。
  223. 前記接触させるステップが、前記部位特異的妨害剤を含む組成物を対象に投与することを含む、請求項１～２２２のいずれか一項に記載の方法。
  224. 部位特異的妨害剤が、単剤療法として投与される、請求項２２３に記載の方法。
  225. 前記部位特異的妨害剤が、第２治療剤と組み合わせて投与される、請求項２２３に記載の方法。
  226. 細胞（例えば、ヒト細胞、例えば、初代ヒト細胞）と、請求項１～２２５のいずれか一項に記載の部位特異的妨害剤又はシステムとを含む、反応混合物。
  227. 炎症性障害を有する対象を治療する方法であって、
    前記炎症性障害を治療するのに十分な量の、請求項１～２２６のいずれか一項に記載の部位特異的妨害剤、システム又は反応混合物を、前記対象に投与すること、
    それにより、前記炎症性障害を治療すること
    を含む、方法。
  228. 前記炎症性障害が、関節リウマチ、乾癬、又は炎症性腸疾患である、請求項２２７に記載の方法。
  229. 前記炎症性障害が、関節リウマチ、痛風、好中球性喘息、好中球性皮膚症、急性呼吸器疾患症候群（ＡＲＤＳ）、又はＣＯＶＩＤ－１９である、請求項２２７又は２２８に記載の方法。
  230. 前記炎症性障害が、自己免疫障害、例えば、関節リウマチである、請求項２２７～２２９のいずれか一項に記載の方法。
  231. 前記炎症性疾患が、病原性感染、例えば、ウイルス感染、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２感染に関連している、請求項２２７～２２９のいずれか一項に記載の方法。
  232. 前記炎症性疾患が、重複感染、例えば、２つ以上の病原体、例えば、ウイルス及び細菌（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２及び肺炎レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉ））により、例えば、ウイルス及び真菌（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２及びムコール症）により引き起こされる感染と関連している、請求項２２７～２２９のいずれか一項に記載の方法。
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