KR20230079181A - 다중 유전자의 발현을 억제하는 조성물 및 방법 - Google Patents

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KR20230079181A
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로렌 마리 비치
제시 제롬 스미스
라훌 카르니크
켄드릭 알란 고스
아담 월터 샤이데거
조디 미셸 케네디
제레미아 데일 파렐리
호우다 벨라그잘
라우라 안 응우옌
찰스 더블유. 오도넬
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플래그쉽 파이어니어링 이노베이션스 브이, 인크.
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Abstract

본 개시내용은 세포 내의 복수의 표적 유전자의 발현을 조절하기 위한, 예를 들어 감소시키기 위한 부위-특이적 파괴제에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 복수의 표적 유전자는 전염증성 유전자, 예를 들어 CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, 및 IL-8을 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 제1 앵커 서열을 표적화하는 제1 부위-특이적 파괴제 및 제2 앵커 서열을 파괴하는 제2 부위-특이적 파괴제를 사용하는 것을 포함한다.

Description

다중 유전자의 발현을 억제하는 조성물 및 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2020년 9월 29일에 출원된 미국 가출원 63/085,013 및 2021년 6월 29일에 출원된 미국 가출원 63/216,487의 이익을 주장한다. 상기 언급된 출원의 내용은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 서식으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하며, 이는 본 명세서에 전체적으로 참고로 포함된다. 2021년 9월 29일에 생성된 상기 ASCII 사본은 파일명이 O2057-7021WO_SL.txt이며, 크기가 666,818 바이트이다.
유전자 발현의 오조절(mis-regulation)은 (예를 들어, 포유동물, 예를 들어 인간에서) 많은 질환의 기저 원인이다. 많은 질환 및 병태는 복수의 관련 유전자와 연관되어 있다. 복수의 연관 유전자의 발현을 변경시키는, 예를 들어 감소시키는 신규 도구, 시스템, 및 방법에 대한 필요성이 있다.
본 개시내용은 특히 복수의 표적 유전자, 예를 들어 제1 앵커 서열 및 제2 앵커 서열을 포함하는 앵커 서열-매개 연접부(ASMC) 내에 있는 제1 유전자 및 제2 유전자의 발현을 조절하는 데, 예를 들어 감소시키는 데 사용될 수 있는 부위-특이적 파괴제 또는 부위-특이적 파괴제를 포함하는 시스템을 제공한다. 일 양태에서, 부위-특이적 파괴제는 ASMC에서 제1 앵커 서열에 또는 제1 앵커 서열의 근접부에 특이적으로 결합하는 표적화 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제의 결합은 복수의 표적 유전자, 예를 들어 제1 유전자 및 제2 유전자의 발현을 조절하는 데, 예를 들어 감소시키는 데 충분한 양으로 발생한다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 이펙터 모이어티를 추가로 포함한다. 일반적으로, 부위-특이적 파괴제에 의한 복수의 표적 유전자의 발현의 조절은 제1 앵커 서열에 또는 제1 앵커 서열의 근접부에 대한 부위-특이적 파괴제의 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 앵커 서열에 대한 부위-특이적 파괴제의 결합은 제1 앵커 서열에 대한 핵형성 폴리펩티드, 예를 들어 CTCF의 결합을 파괴할 수 있으며, 예를 들어 이에 의해 ASMC의 형성 및/또는 유지를 방해할 수 있고, 예를 들어 이에 의해 복수의 유전자의 발현을 조절할, 예를 들어 감소시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 앵커 서열 또는 제1 앵커 서열의 근접부에 대한 부위-특이적 파괴제의 결합은 제1 앵커 서열 및/또는 ASMC에 대한 이펙터 모이어티의 기능성을 국재화할 수 있고, 예를 들어 이에 의해 ASMC의 형성 및/또는 유지를 방해할 수 있고, 예를 들어 이에 의해 복수의 유전자의 발현을 조절할, 예를 들어 감소시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 앵커 서열 또는 제1 앵커 서열의 근접부에 대한 부위-특이적 파괴제의 결합은 제1 앵커 서열 및/또는 ASMC에 대한 이펙터 모이어티의 기능성을 국재화할 수 있고, 예를 들어 이에 의해 복수의 유전자의 발현을 조절할, 예를 들어 감소시킬 수 있다. 이론에 의해 구애되고자 함이 없이, 일부 구현예에서 동일한 ASMC 내에 있는 복수의 유전자를 표적화하는 것은 복수의 유전자의 발현을 더 효과적으로 조절할, 예를 들어 감소시킬 수 있고/있거나 복수의 유전자의 기능성과 관련한 치료 효과를 더 효과적으로 달성할 수 있는 것으로 생각된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 표적화된 복수의 유전자는 모두 전염증성 유전자일 수 있고; 본 명세서에 교시된 바와 같이 발현의 조절, 예를 들어 감소를 위해 복수의 전염증성 유전자를 표적화하는 것은 개별 유전자를 표적화하는 것보다 염증을 더 효과적으로 감소시킬 수 있다. (예를 들어, ASMC 또는 ASMC의 앵커 서열을 표적화함으로써) 동일한 게놈 복합체, 예를 들어 ASMC 내에 포함된 복수의 유전자를 표적화하는 것은 (예를 들어, 발현 조절 또는 조절의 안정성/기간과 관련하여) 복수의 개별 유전자를 표적화하는 효과보다 더 큰 상가적 또는 상승 효과를 가질 수 있다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 세포에서 제1 유전자 및 제2 유전자의 발현을 감소시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 세포를, 제1 및 제2 유전자의 발현을 감소시키기에 충분한 양으로 제1 앵커 서열 또는 제1 앵커 서열에 근접한 부위에 특이적으로 결합하는 표적화 모이어티를 포함하는 부위-특이적 파괴제와 접촉시키는 단계를 포함하고, 제1 및 제2 유전자는 제1 앵커 서열 및 제2 앵커 서열을 포함하는 앵커 서열-매개 연접부 내에 있다. 일부 구현예에서, 제1 유전자 및 제2 유전자는 전염증성 유전자이다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 부위-특이적 파괴제에 관한 것으로, 상기 부위-특이적 파괴제는 DNA-결합, 예를 들어 세포 내에서 제1 앵커 서열 또는 제1 앵커 서열의 근접부에 특이적으로 결합하는 표적화 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 앵커 서열은 제2 앵커 서열, 제1 유전자, 및 제2 유전자를 추가로 포함하는 앵커 서열-매개 연접부의 일부이다. 일부 구현예에서, 제1 유전자 및 제2 유전자는 전염증성 유전자이다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 부위-특이적 파괴제에 관한 것으로, 상기 부위-특이적 파괴제는 세포 내에서 제1 앵커 서열 또는 제1 앵커 서열의 근접부에 특이적으로 결합하는 표적화 모이어티를 포함하고, 여기서 제1 앵커 서열은 제2 앵커 서열, 제1 유전자, 및 제2 유전자를 추가로 포함하는 앵커 서열-매개 연접부의 일부이고, 제1 유전자 및 제2 유전자는 전염증성 유전자이다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 제1 표적화 모이어티 및 선택적으로 제1 이펙터 모이어티를 포함하는 제1 부위-특이적 파괴제(여기서, 제1 부위-특이적 파괴제는, 제1 유전자 및 제2 유전자를 포함하는 앵커 서열-매개 연접부(ASMC)의 제1 앵커 서열(또는 제1 앵커 서열의 근접부)에 특이적으로 결합함), 및 제2 표적화 모이어티 및 선택적으로 제2 이펙터 모이어티를 포함하는 제2 부위-특이적 파괴제(여기서, 제2 부위-특이적 파괴제는 ASMC의 제2 앵커 서열(또는 제2 앵커 서열의 근접부)에 결합함)를 포함하는 시스템을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 세포에서 제1 유전자 및 제2 유전자의 발현을 감소시키는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 세포를, 제1 및 제2 유전자의 발현을 감소시키기에 충분한 양으로 제1 앵커 서열 또는 제1 앵커 서열에 근접한 부위에 특이적으로 결합하는 표적화 모이어티를 포함하는 부위-특이적 파괴제와 접촉시키는 단계를 포함하고, 제1 및 제2 유전자는 제1 앵커 서열 및 제2 앵커 서열을 포함하는 앵커 서열-매개 연접부 내에 있고, 제1 유전자 및 제2 유전자는 전염증성 유전자이며; 이에 의해 제1 및 제2 유전자의 발현을 감소시킨다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 세포에서 제1 유전자 및 제2 유전자의 발현을 감소시키는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은
세포를, 제1 및 제2 유전자의 발현을 감소시키기에 충분한 양으로, 제1 앵커 서열 또는 제1 앵커 서열에 근접한 부위에 특이적으로 결합하는 제1 표적화 모이어티 및 선택적으로 제1 이펙터 모이어티를 포함하는 제1 부위-특이적 파괴제, 및 제2 표적화 모이어티 및 선택적으로 제2 이펙터 모이어티를 포함하는 제2 부위-특이적 파괴제(여기서, 제2 부위-특이적 파괴제는 ASMC의 제2 앵커 서열(또는 제2 앵커 서열의 근접부)에 결합함)를 포함하는 시스템과 접촉시키는 단계를 포함하며, 제1 및 제2 유전자는 ASMC 내에 있고, 제1 유전자 및 제2 유전자는 전염증성 유전자이다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 세포(예를 들어, 인간 세포, 예를 들어 1차 인간 세포) 및 본 명세서에 기재된 바와 같은 부위-특이적 파괴제 또는 시스템을 포함하는 반응 혼합물에 관한 것이다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 염증성 장애를 갖는 대상체를 치료하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 염증성 장애를 치료하기에 충분한 양으로 본 명세서에 기재된 바와 같은 부위-특이적 파괴제 또는 시스템을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 감염, 예를 들어 바이러스 감염, 예를 들어 COVID-19를 갖는 대상체에서, 염증, 예를 들어 국부 염증을 치료하는 방법에 관한 것으로, 염증을 치료하기에 충분한 양으로 본 명세서에 기재된 바와 같은 부위-특이적 파괴제 또는 시스템을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 제1 유전자 및 제2 유전자의 발현이 감소된 인간 세포에 관한 것으로, 여기서 제1 유전자 및 제2 유전자는 전염증성 유전자이고, 세포는 제1 및 제2 유전자를 포함하는 파괴된(예를 들어, 완전히 파괴된) 앵커 서열-매개 연접부를 포함한다. 일부 구현예에서, 인간 세포는 이전에 본 명세서에 기재된 부위-특이적 파괴제 또는 시스템과 접촉되었다. 일부 구현예에서, 인간 세포는 더 이상 본 명세서에 기재된 부위-특이적 파괴제 또는 시스템을 포함하지 않는다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 게놈 좌표 chr4:74595464-74595486, chr4:74595457-74595479, chr4:74595460-74595482, chr4:74595472-74595494, chr4:75000088-75000110, chr4:75000091-75000113, chr4:75000085-75000107, chr4:75000157-75000179, chr4:75000156-75000178, chr4:74595215-74595237, chr4:74595370-74595392, chr4:74595560-74595582, chr4:74595642-74595664, chr4:74595787-74595809, chr4:74528428-74528450, chr4:74528567-74528589, chr4:74528609-74528631, chr4:74789132-74789154, chr4:74789250-74789272, chr4:74789312-74789334, chr4:74964853-74964875, chr4:74964906-74964928, chr4:74965538-74965560, chr4:74965737-74965759, chr4:75000031-75000053, chr4:75000115-75000137, chr4:75000231-75000253, chr4:74975146-74975168, chr4:74975369-74975391, chr4:74976318-74976340, chr4:74570348-74570370, chr4:74570503-74570525, 또는 chr4:74570526-74570548에서, 또는 상기 영역의 5, 10, 15, 20, 30, 40, 또는 50개 뉴클레오티드 내에 돌연변이를 포함하는 인간 세포에 관한 것이다.
당업자는 단지 일상적인 실험을 사용하여, 본 명세서에서 기재된 본 개시내용의 구체적인 구현예에 대한 많은 균등물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다.
본 명세서에서 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 참고 문헌(예를 들어, 서열 데이터베이스 참조 번호)은 전체적으로 참고로 포함된다. 예를 들어, 본 명세서에 언급된, 예를 들어 본 명세서의 임의의 표에 있는 모든 GenBank, Unigene, 및 Entrez 서열은 참고로 포함된다. 달리 명시되지 않는 한, 본 명세서의 임의의 표에 있는 것을 포함한 본 명세서에 명시된 서열 수탁 번호는 2020년 9월 29일 현재 시점에서 최신의 데이터베이스 등록물을 지칭한다. 하나의 유전자 또는 단백질이 복수의 서열 수탁 번호를 참조할 때, 모든 서열 변이체가 포함된다.
정의
앵커 서열: 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "앵커 서열"은 앵커 서열-매개 연접부, 예를 들어 복합체를 형성하도록 충분히 결합하는 핵형성제(nucleating agent)에 의해 인식되는 핵산 서열을 지칭한다. 일부 구현예에서, 앵커 서열은 하나 이상의 CTCF 결합 모티프를 포함한다. 일부 구현예에서, 앵커 서열은 유전자 코딩 영역 내에 위치되어 있지 않다. 일부 구현예에서, 앵커 서열은 유전자간 영역 내에 위치되어 있다. 일부 구현예에서, 앵커 서열은 인핸서 또는 프로모터 중 어느 것에도 위치되어 있지 않다. 일부 구현예에서, 앵커 서열은 임의의 전사 개시 부위로부터 적어도 400 bp, 적어도 450 bp, 적어도 500 bp, 적어도 550 bp, 적어도 600 bp, 적어도 650 bp, 적어도 700 bp, 적어도 750 bp, 적어도 800 bp, 적어도 850 bp, 적어도 900 bp, 적어도 950 bp, 또는 적어도 1kb 떨어져 위치되어 있다. 일부 구현예에서, 앵커 서열은 게놈 각인, 단일대립유전자 발현, 및/또는 단일대립유전자 후성유전학적 마크와 연관되어 있지 않은 영역 내에 위치되어 있다. 일부 구현예에서, 앵커 서열은 내인성 핵형성 폴리펩티드(예를 들어, CTCF)에 결합하는 기능, 제2 앵커 서열과 상호작용하여 앵커 서열-매개 연접부를 형성하는 기능, 또는 앵커 서열-매개 연접부 외부에 있는 인핸서에 대해 절연하는 기능으로부터 선택되는 하나 이상의 기능을 갖는다. 본 개시내용의 일부 구현예에서, 기타 다른 앵커 서열(예를 들어, 상이한 상황에서 핵형성제(예를 들어, CTCF) 결합 모티프를 함유할 수 있는 서열)을 표적화하지 않고서, 특정 앵커 서열 또는 앵커 서열들을 특이적으로 표적화할 수 있는 기술이 제공되며; 그러한 표적화된 앵커 서열은 "표적 앵커 서열"로 지칭될 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 앵커 서열의 서열 및/또는 활성은 조절되는 반면, 표적화된 앵커 서열과 동일한 시스템 내에(예를 들어, 동일한 세포 내에 그리고/또는 일부 구현예에서는 동일한 핵산 분자(예를 들어, 동일한 염색체) 상에) 존재할 수 있는 하나 이상의 다른 앵커 서열의 서열 및/또는 활성은 조절되지 않는다. 일부 구현예에서, 앵커 서열은 핵형성 폴리펩티드 결합 모티프이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 앵커 서열은 핵형성 폴리펩티드 결합 모티프에 인접한다.
앵커 서열-매개 연접부: 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "앵커 서열-매개 연접부"는 DNA 내의 적어도 2개의 앵커 서열이, 이들 앵커 서열에 결합하여 앵커 서열들 사이의 공간적 근접 및 기능성 연결을 가능하게 하는 하나 이상의 폴리펩티드, 예컨대 핵형성 폴리펩티드, 또는 하나 이상의 단백질 및/또는 핵산 실체(entity)(예컨대, RNA 또는 DNA)에 의한, 이들 적어도 2개의 앵커 서열의 물리적 상호작용 또는 결합을 통해 일어나고/나거나 유지되는 DNA 구조, 일부 경우에는 복합체를 지칭한다(예를 들어, 도 1 참조).
~와 연관된: 2개의 사건 또는 실체는, 해당 용어가 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 하나의 존재, 수준, 형태 및/또는 기능이 나머지 다른 하나의 것과 상관 관계가 있다면, 서로 "연관되어" 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 특정 실체(예를 들어, 폴리펩티드, 유전자적 시그니처, 대사물, 미생물 등)는 그의 존재, 수준, 형태 및/또는 기능이 (예를 들어, 관련 집단에 걸쳐) 특정 질환, 장애, 또는 병태의 발병률 및/또는 감수성과 상관 관계가 있다면, 그러한 질환, 장애, 또는 병태과 연관되어 있는 것으로 여겨진다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 실체는, 그들이 직접적으로 또는 간접적으로 상호작용하여 서로 물리적 근접 상태에 있고/있거나 이 상태를 유지한다면, 서로 물리적으로 "연관되어" 있다. 일부 구현예에서, 서로 물리적으로 연관된 2개 이상의 실체는 서로 공유적으로 연결되어 있으며; 일부 구현예에서, 서로 물리적으로 연관된 2개 이상의 실체는 서로 공유적으로 연결되어 있지 않고, 예를 들어 수소 결합, 반데르발스 상호작용, 소수성 상호작용, 자기력(magnetism), 및 이들의 조합에 의해 비공유적으로 회합되어 있다. 일부 구현예에서, DNA 서열은, 핵산이 적어도 부분적으로 표적 게놈 또는 전사 복합체 내에 있고, DNA 서열 내의 유전자의 발현이 표적 게놈 또는 전사 복합체의 형성 또는 파괴에 의해 영향을 받을 때, 표적 게놈 또는 전사 복합체"와 연관되어" 있다.
부위-특이적 파괴제 : 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "부위-특이적 파괴제"는 게놈 복합체, 예를 들어 ASMC의 하나 이상의 성분을 특이적으로 억제하고/하거나, 분리하고/하거나, 분해하고/하거나, 변형시켜 본 명세서에 기재된 바와 같은 복수의 표적 유전자의 발현을 조절하는, 예를 들어 감소시키는 작용제 또는 실체를 지칭한다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 게놈 복합체의 하나 이상의 성분과 상호작용한다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 하나 이상의 게놈 복합체 성분에 (예를 들어, 직접적으로, 또는 일부 구현예에서는 간접적으로) 결합한다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 복수의 표적 유전자를 포함하는 ASMC의 일부일 수 있는 앵커 서열, 예를 들어 제1 및/또는 제2 앵커 서열에 결합한다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 복수의 표적 유전자를 포함하는 ASMC의 일부일 수 있는 앵커 서열, 예를 들어 제1 및/또는 제2 앵커 서열에 근접한 부위에 결합한다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 하나 이상의 게놈 복합체 성분을 변형시킨다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 항체(예를 들어, 단일특이적 또는 다중특이적 항체 작제물) 또는 항체 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 본 명세서에 기재된 바와 같이, 특정 게놈 위치 및/또는 표적화 모이어티에 의한 게놈 복합체로 지시된다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 게놈 복합체 성분 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 표적화 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 이펙터 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 복수의 이펙터 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 표적화 모이어티 및 하나 이상의 이펙터 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 게놈의 제2 부위보다(예를 들어, 게놈의 임의의 다른 부위에 비해) 더 높은 친화도로 게놈의 제1 부위에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 제2 게놈 복합체에 비해(예를 들어, 임의의 다른 게놈 복합체에 비해) 제1 게놈 복합체의 하나 이상의 성분을 우선적으로 억제하고/하거나, 분리하고/하거나, 분해하고/하거나, 변형시킨다.
도메인: 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "도메인"은 실체의 섹션 또는 일부분을 지칭한다. 일부 구현예에서, "도메인"은 실체의 특정 구조적 및/또는 기능적 특징과 연관되어 있으며, 따라서 도메인이 그의 모 실체의 나머지로부터 물리적으로 분리되어 있을 때, 도메인은 특정 구조적 및/또는 기능적 특징을 실질적으로 또는 전체적으로 유지한다. 대안적으로 또는 추가적으로, 일부 구현예에서, 도메인은, 그러한 (모) 실체로부터 분리되고 상이한 (수용자) 실체와 연결될 때, 모 실체에서 특징이 되게 한 하나 이상의 구조적 및/또는 기능적 특징을 수용자 실체 상에 실질적으로 유지하고/하거나 부여하는 실체의 일부분일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 도메인은 분자(예를 들어, 소분자, 탄수화물, 지질, 핵산, 폴리펩티드 등)의 섹션 또는 일부분이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 도메인은 폴리펩티드의 섹션이거나 이를 포함한다. 일부 그러한 구현예에서, 도메인은 특정 구조 요소(예를 들어, 특정 아미노산 서열 또는 서열 모티프, 알파-나선 특성, 베타-시트 특성, 코일드-코일(coiled-coil) 특성, 랜덤 코일 특성 등)에 의해, 그리고/또는 특정 기능적 특징(예를 들어, 결합 활성, 효소 활성, 접힘 활성, 신호전달 활성 등)에 의해 특성화된다.
이펙터 모이어티: 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "이펙터 모이어티"는 세포의 핵 내에 적절하게 국재화될 때 세포 내의 복수의 표적 유전자의 발현을 조절하는, 예를 들어 감소시키는 하나 이상의 기능성을 갖는 도메인을 지칭한다. 일부 구현예에서, 이펙터 모이어티는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 이펙터 모이어티는 폴리펩티드 및 핵산을 포함한다. 이펙터 모이어티와 연관된 기능성은, 예를 들어 유전자의 발현을 자극할 전사 인자의 동원(recruitment)을 차단하여, 복수의 표적 유전자의 발현에 직접적으로 영향을 줄 수 있다. 이펙터 모이어티와 연관된 기능성은, 예를 들어 복수의 표적 유전자의 발현을 억제하는 염색체 토폴로지의 변화를 유도하는 후성유전학적 변형을 도입하거나, 그러한 후성유전학적 변형을 도입시키는 기타 다른 인자를 동원하여, 복수의 표적 유전자의 발현에 간접적으로 영향을 줄 수 있다.
게놈 복합체 : 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "게놈 복합체"는 복수의 단백질 및/또는 기타 다른 성분(잠재적으로, 게놈 서열 요소를 포함함) 사이의 상호작용을 통해, 하나 이상의 염색체 상의 서로 이격된 2개의 게놈 서열 요소를 합친 복합체이다. 일부 구현예에서, 게놈 서열 요소는 복합체의 하나 이상의 단백질 성분이 결합하는 앵커 서열이다. 일부 구현예에서, 게놈 복합체는 앵커 서열-매개 연접부를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 게놈 서열 요소는 CTCF 결합 모티프, 프로모터 및/또는 인핸서일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 게놈 서열 요소는 프로모터 및/또는 조절 부위(예를 들어, 인핸서) 중 적어도 하나 또는 둘 모두를 포함한다. 일부 구현예에서, 복합체 형성은 게놈 서열 요소(들)에서 그리고/또는 게놈 서열 요소(들)에 대한 단백질 성분(들) 중 하나 이상의 결합에 의해 핵형성된다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 일부 구현예에서 복합체의 형성을 통한 게놈 부위들의 공동국재화(예를 들어, 연접)는 게놈 서열 요소(들)에서 또는 그 부근에서(일부 구현예에서는, 이들 사이를 포함함), DNA 토폴로지를 변경시킨다. 일부 구현예에서, 게놈 복합체는 하나 이상의 루프를 포함하는 앵커 서열-매개 연접부를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 게놈 복합체는 핵형성 폴리펩티드, 예컨대 CTCF 및/또는 코헤신(Cohesin)에 의해 핵형성된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 게놈 복합체는, 예를 들어 CTCF, 코헤신, 비-코딩 RNA(예를 들어, eRNA), 전사 기구 단백질(예를 들어, RNA 중합효소, 하나 이상의 전사 인자, 예를 들어 TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF, TFIIH 등으로 구성되는 군으로부터 선택된 것), 전사 조절인자(예를 들어, 메디에이터(Mediator), P300, 인핸서-결합 단백질, 리프레서-결합 단백질, 히스톤 변형제 등) 등 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 게놈 복합체는 하나 이상의 폴리펩티드 성분 및/또는 하나 이상의 핵산 성분(예를 들어, 하나 이상의 RNA 성분)을 포함하며, 이들은, 일부 구현예에서, 복합체가 형성되지 않을 때 채택하지 않는 토폴로지 형상(예를 들어, 루프) 내로의 게놈 DNA의 신장(stretch)을 구속하도록 서로 그리고/또는 하나 이상의 게놈 서열 요소(예를 들어, 앵커 서열, 프로모터 서열, 조절 서열(예를 들어, 인핸서 서열))와 상호작용할 수 있다.
핵산 : 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "핵산"은, 그의 가장 넓은 의미에서, 올리고뉴클레오티드 사슬 내로 도입되거나 도입될 수 있는 임의의 화합물 및/또는 물질을 지칭한다. 일부 구현예에서, 핵산은 포스포디에스테르 결합을 통해 올리고뉴클레오티드 사슬 내로 도입되거나 도입될 수 있는 화합물 및/또는 물질이다. 맥락으로부터 명백한 바와 같이, 일부 구현예에서 "핵산"은 개별 핵산 잔기(예를 들어, 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오시드)를 지칭하고; 일부 구현예에서, "핵산"은 개별 핵산 잔기들을 포함하는 올리고뉴클레오티드 사슬을 지칭한다. 일부 구현예에서, "핵산"은 RNA이거나 이를 포함하고; 일부 구현예에서, "핵산"은 DNA이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 하나 이상의 천연 핵산 잔기이거나, 이를 포함하거나, 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 핵산은 하나 이상의 핵산 유사체이거나, 이를 포함하거나, 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 핵산 유사체는 포스포디에스테르 백본을 이용하지 않는다는 점에서 핵산과 상이하다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 핵산은 하나 이상의 "펩티드 핵산"이거나, 이를 포함하거나, 이로 구성되는데, 펩티드 핵산은 당업계에 알려져 있고, 백본 내에 포스포디에스테르 결합 대신에 펩티드 결합을 가지며, 본 발명의 범주 내에 있는 것으로 여겨진다. 대안적으로 또는 추가적으로, 일부 구현예에서, 핵산은 포스포디에스테르 결합 대신에 하나 이상의 포스포로티오에이트 및/또는 5'-N-포스포르아미다이트 결합을 갖는다. 일부 구현예에서, 핵산은 하나 이상의 천연 뉴클레오시드(예를 들어, 아데노신, 티미딘, 구아노신, 시티딘, 우리딘, 데옥시아데노신, 데옥시티미딘, 데옥시 구아노신, 및 데옥시시티딘)이거나, 이를 포함하거나, 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 핵산은 하나 이상의 뉴클레오시드 유사체(예를 들어, 2-아미노아데노신, 2-티오티미딘, 이노신, 피롤로-피리미딘, 3-메틸 아데노신, 5-메틸시티딘, C-5 프로피닐-시티딘, C-5 프로피닐-우리딘, 2-아미노아데노신, C5-브로모우리딘, C5-플루오로우리딘, C5-요오도우리딘, C5-프로피닐-우리딘, C5-프로피닐-시티딘, C5-메틸시티딘, 2-아미노아데노신, 7-데아자아데노신, 7-데아자구아노신, 8-옥소아데노신, 8-옥소구아노신, 0(6)-메틸구아닌, 2-티오시티딘, 메틸화 염기, 삽입된 염기, 및 이들의 조합)이거나, 이를 포함하거나, 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 핵산은 천연 핵산 내의 것들과 비교할 때 하나 이상의 변형된 당(예를 들어, 2'-플루오로리보스, 리보스, 2'-데옥시리보스, 아라비노스, 및 헥소스)을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 기능성 유전자 산물, 예컨대 RNA 또는 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 핵산은 하나 이상의 인트론을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 천연 공급원로부터의 단리, 상보적 주형을 기반으로 한 중합에 의한 효소적 합성(생체내 또는 시험관내), 재조합 세포 또는 시스템에서의 재생산, 및 화학적 합성 중 하나 이상에 의해 제조된다. 일부 구현예에서, 핵산은 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 20, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000개 또는 그 이상의 잔기 길이이다. 일부 구현예에서, 핵산은 부분적으로 또는 전체적으로 단일 가닥이고; 일부 구현예에서, 핵산은 부분적으로 또는 전체적으로 이중 가닥이다. 일부 구현예에서, 핵산은, 폴리펩티드를 인코딩하는 서열의 상보체이거나 폴리펩티드를 인코딩하는 적어도 하나의 요소를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 핵산은 효소 활성을 갖는다.
작동가능하게 연결된 : 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 어구 "작동가능하게 연결된"은 기재된 성분들이 그들의 의도된 방식으로 기능할 수 있게 하는 관계에 있게 하는 병치(juxtaposition)를 지칭한다. 기능성 요소, 예를 들어 유전자에 "작동가능하게 연결된" 전사 제어 요소는 기능성 요소, 예를 들어 유전자의 발현 및/또는 활성이 전사 제어 요소와 양립가능한 조건 하에서 달성되도록 하는 방식으로 연관되어 있다. 일부 구현예에서, "작동가능하게 연결된" 전사 제어 요소는 관심 코딩 요소, 예를 들어 유전자와 연속적이며(예를 들어, 공유적으로 연결되어 있으며); 일부 구현예에서, 작동가능하게 연결된 전사 제어 요소는 관심 기능성 요소, 예를 들어 유전자에 대해 트랜스(trans)로 작용하거나 아니면 이로부터 떨어진 거리에서 작용한다. 일부 구현예에서, '작동가능하게 연결된'은 2개의 핵산 서열이 동일한 핵산 분자 상에 포함되어 있음을 의미한다. 추가의 구현예에서, '작동가능하게 연결된'은 2개의 핵산 서열이 동일한 핵산 분자 상에서, 예를 들어 1000, 500, 100, 50, 또는 10개의 서로의 염기쌍 이내에 서로 근접해 있거나 서로 직접 인접해 있음을 추가로 의미할 수 있다.
펩티드, 폴리펩티드, 단백질 : 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "펩티드", "폴리펩티드", 및 "단백질"은 펩티드 결합에 의해, 또는 펩티드 결합 이외의 수단에 의해 공유적으로 연결된 아미노산 잔기들로 구성된 화합물을 지칭한다. 단백질 또는 펩티드는 적어도 2개의 아미노산을 함유해야 하며, 단백질 또는 펩티드의 서열을 구성할 수 있는 아미노산의 최대수에 대한 제한은 없다. 폴리펩티드는 펩티드 결합에 의해 또는 펩티드 결합 이외의 수단에 의해 서로 연결된 2개 이상의 아미노산을 포함하는 임의의 펩티드 또는 단백질을 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 이 용어는 당업계에서, 예를 들어 펩티드, 올리고펩티드 및 올리고머로도 일반적으로 지칭되는 짧은 사슬, 및 당업계에서 단백질(이에는 많은 유형이 있음)로 일반적으로 지칭되는 더 긴 사슬 둘 모두를 지칭한다.
근접 : 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "근접"은 제1 부위에서 부위-특이적 파괴제의 결합 및/또는 부위-특이적 파괴제에 의한 제1 부위의 변형이 다른 한쪽 부위의 결합 및/또는 변형과 동일하거나 실질적으로 동일한 효과를 생성하도록 할 2개의 부위, 예를 들어 핵산 부위의 접근성을 지칭한다. 예를 들어, DNA-표적화 모이어티는 앵커 서열(제2 부위)에 근접한 제1 부위에 결합할 수 있고, 상기 DNA-표적화 모이어티와 연관된 이펙터 모이어티는, 내인성 핵형성 폴리펩티드에 대한 앵커 서열의 결합이 마치 제2 부위(앵커 서열)가 결합되고/되거나 변형된 것처럼 실질적으로 동일하게 변형되도록 제1 부위를 후성유전학적으로 변형시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 서로 근접한 부위는 서로 5000, 4000, 3000, 2000, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 50, 40, 30, 20, 10, 또는 5개 염기쌍 미만이다.
서열 표적화 폴리펩티드 : 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "서열 표적화 폴리펩티드"는 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 표적 핵산 서열을 인식하거나 이에 특이적으로 결합하는 단백질, 예컨대 효소, 예를 들어 Cas9 또는 TALEN을 지칭한다. 일부 구현예에서, 서열 표적화 폴리펩티드는 엔도뉴클레아제 활성이 결여된 촉매적으로 비활성인 단백질, 예컨대 dCas9, TAL 이펙터 분자, 또는 Zn 핑거 분자이다.
특이적 결합: 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "특이적 결합"은 결합이 일어나게 될 환경에서, 가능한 결합 파트너들 사이를 구별하는 능력을 지칭한다. 일부 구현예에서, 다른 잠재적인 표적들이 존재할 때 하나의 특정 표적과 상호작용하는 결합제는 그것이 상호작용하는 표적에 "특이적으로 결합한다"라고 지칭한다. 일부 구현예에서, 특이적 결합은 결합제와 이의 파트너 사이의 회합도(degree of association)를 검출하거나 결정함으로써 평가되고; 일부 구현예에서, 특이적 결합은 결합제-파트너 복합체의 해리도(degree of dissociation)를 검출하거나 결정함으로써 평가된다. 일부 구현예에서, 특이적 결합은 이의 파트너와 또 다른 실체 사이의 대체 상호작용과 경쟁할 수 있는 결합제의 능력을 검출하거나 결정함으로써 평가된다. 일부 구현예에서, 특이적 결합은 일정 범위의 농도에 걸쳐 그러한 검출 또는 결정을 수행함으로써 평가된다.
대상체 : 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "대상체" 또는 "시험 대상체"는, 예를 들어 실험, 진단, 예방, 및/또는 치료 목적을 위해, 본 개시내용에 따라 제공되는 화합물 또는 조성물이 투여되는 임의의 유기체를 지칭한다. 통상적인 대상체는 동물(예를 들어, 포유동물, 예컨대 마우스, 래트, 토끼, 비-인간 영장류, 및 인간; 곤충; 벌레 등) 및 식물을 포함한다. 일부 구현예에서, 대상체는 질환, 장애, 및/또는 병태를 앓고 있고/있거나 걸리기 쉬울 수 있다.
실질적으로 : 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "실질적으로"는 관심 특징 또는 특성의 전체적인 또는 거의 전체적인 범위 또는 정도를 나타내는 정성적인 조건을 지칭한다. 당업자는 생물학적 및 화학적 현상이, 설사 가능하다 하더라도, 거의 완료되지 않고/않거나 완료로 진행되지 않거나 절대적인 결과를 달성하거나 피하지 못한다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 용어 "실질적으로"는, 본 명세서의 일부 구현예에서, 많은 생물학적 및 화학적 현상에 내재되어 있는 완료의 잠재적인 결여를 포착하는 데 사용될 수 있다.
증상이 감소된다 : 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 어구 "증상이 감소된다"는 특정 질환, 장애 또는 병태의 하나 이상의 증상이 크기(예를 들어, 강도, 중증도 등) 및/또는 빈도가 감소될 때 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 특정 증상의 개시의 지연은 해당 증상의 빈도를 감소시키는 한 가지 형태인 것으로 여겨진다.
표적화 : 작용제 또는 실체는, 서로 접촉되게 한 조건 하에서 또 다른 표적화된 작용제 또는 실체에 특이적으로 결합한다면, 본 개시내용에 따라 그러한 또 다른 작용제 또는 실체를 "표적화"하는 것으로 여겨진다. 일부 구현예에서, 예를 들어, 항체(또는 이의 항원-결합 단편)는 그의 동종 에피토프 또는 항원을 표적화한다. 일부 구현예에서, 특정 서열을 갖는 핵산은 실질적으로 상보적인 서열의 핵산을 표적화한다. 일부 구현예에서, 앵커 서열에 특이적으로 결합하는 표적화 모이어티는 앵커 서열, 앵커 서열을 포함하는 ASMC, 및/또는 ASMC 내의 복수의 유전자를 표적화한다.
복수의 표적 유전자: 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "복수의 표적 유전자"는, 예를 들어 발현의 조절을 위해 표적화된 하나 초과의 유전자(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개, 또는 그 이상의 유전자)의 그룹을 의미한다. 일부 구현예에서, 복수의 표적 유전자는 표적화된 게놈 복합체의 일부이다. 일부 구현예에서, 복수의 표적 유전자의 각각의 유전자는, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 부위-특이적 파괴제에 의해 게놈 복합체가 표적화된 ASMC 내부에서 적어도 부분적으로, 표적 게놈 복합체의 일부로서 게놈 서열의 적어도 일부(예를 들어, 일부 또는 전부)를 갖는다. 일부 구현예에서, 조절은 복수의 표적 유전자의 발현의 억제를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 표적 유전자는, 복수의 표적 유전자, 또는 복수의 표적 유전자 중 하나 이상에 작동가능하게 연결된 전사 제어 요소를 본 명세서에 기재된 부위-특이적 파괴제와 접촉시킴으로써 조절된다. 일부 구현예에서, 복수의 표적 유전자 중 하나 이상은 세포, 예를 들어 대상체(예를 들어, 환자) 내의 세포에서 비정상적으로 발현된다(예를 들어, 과발현됨). 일부 구현예에서, 복수의 표적 유전자는 관련된 기능성을 갖는다. 예를 들어, 복수의 표적 유전자 중의 유전자는 전부 발현될 때 전염증 효과를 가질 수 있고; 그러한 복수의 표적 유전자 중의 유전자는 본 명세서에서 전염증성 유전자 또는 표적 전염증성 유전자로 지칭될 수 있다. 일부 구현예에서, 복수의 표적 유전자 중의 유전자는 단백질을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 복수의 표적 유전자 중의 유전자는 기능성 RNA를 인코딩한다.
표적화 모이어티 : 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "표적화 모이어티"는 성분 또는 성분들의 세트, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 게놈 복합체(예를 들어, 앵커 서열-매개 연접부)에 참여하는 성분 또는 성분들과 특이적으로 상호작용하는(예를 들어, 표적화하는) 작용제 또는 실체를 의미한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용에 따른 표적화 모이어티는 본 명세서에 기재된 바와 같은 게놈 복합체의 하나 이상의 표적 성분(들)을 표적화한다. 일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 게놈 서열 요소(예를 들어, 앵커 서열)를 포함하는 게놈 복합체 성분을 표적화한다. 일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 게놈 서열 요소 이외의 게놈 복합체 성분을 표적화한다. 일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 게놈 복합체 성분의 복수 또는 조합을 표적화하며, 일부 구현예에서 복수는 게놈 서열 요소를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 본 개시내용의 기여는, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 표적 유전자(예를 들어, 융합 유전자, 예를 들어 융합 종양유전자) 및/또는 중단점에 근접한 표적 앵커 서열을 포함하는, 하나 이상의 게놈 복합체의 억제, 분리, 분해, 및/또는 변형이 게놈 서열 요소(들)를 포함하여 게놈 복합체 요소(들)를 부위-특이적 파괴제로 표적화함으로써 달성될 수 있다는 통찰을 포함한다. 일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 게놈 복합체의 효과적인 억제, 분리, 분해, 및/또는 변형은 게놈 서열 요소(들)를 포함하는 복합체 성분(들)을 표적화함으로써 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용은 (예를 들어, 주어진 시스템에서 형성되거나 이에 존재할 수 있는 다른 게놈 복합체와 비교하여 특정 게놈 복합체에 대한 특이성 정도, [예를 들어, 집단에서 검출된 복합체의 수에 대한 영향 측면에서] 억제, 분리, 분해, 또는 변형의 유효성과 관련하여) 개선된 억제, 분리, 분해, 또는 변형은 게놈 서열 요소가 아닌 하나 이상의 복합체 성분을 표적화함으로써 달성될 수 있고, 선택적으로, 대안적으로 또는 추가적으로 게놈 서열 요소를 표적화하는 것을 포함할 수 있음을 고려하며, 여기서 개선된 억제, 분리, 분해, 또는 변형은 게놈 서열 요소(들) 단독의 표적화를 통해 통상적으로 달성되는 것에 대해 상대적인 것이다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 부위-특이적 파괴제는 표적 게놈 복합체의 억제, 분리, 분해, 또는 변형을 촉진한다. 예를 들어, 비제한적인 예로서, 일부 구현예에서 본 명세서에 기재된 바와 같은 부위-특이적 파괴제는 주어진 게놈 복합체(예를 들어, 앵커 서열-매개 연접부를 포함함)의 적어도 하나의 성분을 표적화함으로써 앵커 서열-매개 연접부를 억제하고/하거나, 분리하고/하거나, (예를 들어, 이의 성분을) 분해하고/하거나, (예를 들어, 이의 성분을) 변형시킨다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 부위-특이적 파괴제는 특정 게놈 복합체(즉, 표적 게놈 복합체)를 억제하고/하거나, 분리하고/하거나, (예를 들어, 이의 성분을) 분해하고/하거나, (예를 들어, 이의 성분을) 변형시키고, 예를 들어 다른 세포(예를 들어, 비표적 세포)에 존재할 수 있고/있거나 동일한 세포 내(즉, 표적 세포 내) 상이한 부위 부위에 존재할 수 있는 적어도 하나의 다른 특정 게놈 복합체(즉, 비표적 게놈 복합체)를 억제하고/하거나, 분리하고/하거나, (예를 들어, 이의 성분을) 분해하고/하거나, (예를 들어, 이의 성분을) 변형시키지 않는다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 부위-특이적 파괴제는 표적화 모이어티를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 또한 이펙터 모이어티(예를 들어, 파괴 모이어티)로서 작용하고; 그러한 일부 구현예에서 제공된 부위-특이적 파괴제에는 표적화 모이어티와 분리된(또는 의미있게 구별되는) 임의의 이펙터 모이어티(예를 들어, 파괴, 변형, 또는 기타 다른 이펙터 모이어티)가 결여될 수 있다.
치료적 유효량: 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "치료적 유효량"은 치료 투약계획(therapeutic regimen)의 일부로서 투여될 때 원하는 생물학적 반응을 이끌어내는 물질(예를 들어, 치료제, 조성물, 및/또는 제형)의 양을 의미한다. 일부 구현예에서, 물질의 치료적 유효량은 질환, 장애, 및/또는 병태를 앓거나 이에 취약한 대상체에게 투여될 때 그러한 질환, 장애, 및/또는 병태를 치료하고/하거나, 진단하고/하거나, 예방하고/하거나, 그의 발병을 지연시키기에 충분한 양이다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 물질의 유효량은 원하는 생물학적 종점(들), 전달하려는 물질, 표적 세포(들) 또는 조직(들) 등과 같은 인자들에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 질환, 장애, 및/또는 병태를 치료하기 위한 제형 내의 화합물의 유효량은 그러한 질환, 장애, 및/또는 병태를 경감시키고/시키거나, 호전시키고/시키거나, 완화하고/하거나, 억제하고/하거나, 예방하고/하거나, 이의 발병을 지연시키고/시키거나, 이의 중증도를 감소시키고/시키거나, 이의 하나 이상의 증상 또는 특징의 발생률을 감소시키는 양이다. 일부 구현예에서, 치료적 유효량은 단회 용량으로 투여되고; 일부 구현예에서는, 치료적 유효량을 전달하기 위해 다회 단위 용량이 요구된다.
전사 제어 서열 : 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "전사 제어 서열"은 유전자의 전사를 증가시키거나 감소시키는 핵산 서열을 지칭한다. "인핸싱 서열"은 유전자 전사의 가능성을 증가시킨다. "침묵 또는 리프레서 서열"은 유전자 전사의 가능성을 감소시킨다. 전사 제어 서열의 예는 프로모터 및 인핸서를 포함한다. 일부 구현예에서, ASMC는 전사 제어 서열을 포함한다. 그러한 전사 제어 서열은 내부 전사 제어 서열로 지칭된다(예를 들어, ASMC 내부에 포함되는 인핸싱 서열은 내부 인핸싱 서열로 지칭됨).
본 개시내용의 구현예에 대한 하기의 상세한 설명은 첨부 도면과 함께 읽을 때 더 잘 이해될 것이다. 본 개시내용을 설명할 목적으로, 도면에 현재 예시된 구현예가 나타나 있다. 그러나, 본 개시내용은 도면에 나타낸 구현예의 정밀한 배열 및 수단으로 한정되지 않음이 이해되어야 한다.
도 1은 앵커 서열에서 gRNA 서열의 예시적인 위치결정을 보여주는 다이어그램을 나타낸다. 도면은 보여지는 순서대로 각각 서열번호 244 내지 245를 개시한다.
도 2는 앵커 서열에서 gRNA 서열의 예시적인 위치결정 및 제한 부위 정보를 보여주는 다이어그램을 나타낸다. 도면은 보여지는 순서대로 각각 서열번호 246 내지 247을 개시한다.
도 3은 CRISPR/Cas 분자 및 제1 예시적인 gRNA를 포함하는 부위-특이적 파괴제로 처리한 TNF-처리 세포 및 상기 부위-특이적 파괴제로 처리하지 않은 TNF-처리 세포에서 다양한 케모카인의 발현(mRNA)의 그래프를 나타낸다.
도 4는 CRISPR/Cas 분자 및 제2 예시적인 gRNA를 포함하는 부위-특이적 파괴제로 처리한 TNF-처리 세포 및 상기 부위-특이적 파괴제로 처리하지 않은 TNF-처리 세포에서 다양한 케모카인의 발현(mRNA)의 그래프를 나타낸다.
도 5는 게놈 복합체, 예를 들어 ASMC의 다양한 유형, 예를 들어 루프, 및 내부에 포함된 유전자의 발현을 변경시키는 방법에 대한 모델을 도시하는 다이어그램을 나타낸다.
도 6은 CRISPR/Cas 분자 및 사이토카인-인코딩 유전자를 포함하는 게놈 복합체(예를 들어, ASMC)의 앵커 서열에 대해 표적화된 sgRNA를 포함하는 부위-특이적 파괴제로 처리한 THP-1 세포에서 CXCL1, CXCL2, CXCL3, 및 IL-8의 RNA 수준에 의해 측정된 사이토카인 발현의 그래프를 나타낸다.
도 7은 CRISPR/Cas 분자 및 사이토카인-인코딩 유전자를 포함하는 게놈 복합체(예를 들어, ASMC)의 앵커 서열에 대해 표적화된 상이한 sgRNA를 포함하는 부위-특이적 파괴제로 처리한 THP-1 세포의 사이토카인 분비(CXCL1 및 IL-8)의 그래프를 나타낸다.
도 8은 CRISPR/Cas 분자 및 사이토카인-인코딩 유전자를 포함하는 게놈 복합체(예를 들어, ASMC)의 앵커 서열에 대해 표적화된 sgRNA를 포함하는 부위-특이적 파괴제로 처리한 THP-1 세포에서 RNA 수준에 의해 측정된 사이토카인 발현(CXCL3)의 그래프(상단), 및 실험에서 세포가 처리되는 방법을 나타내는 순서도(하단)를 나타낸다.
도 9a는 CRISPR/Cas 분자 및 사이토카인-인코딩 유전자를 포함하는 게놈 복합체(예를 들어, ASMC)의 앵커 서열에 대해 표적화된 sgRNA를 포함하는 부위-특이적 파괴제로 처리하고 3주 후 THP-1 세포에서 RNA 수준에 의해 측정된 사이토카인 발현(CXCL1)의 그래프(상단), 및 실험에서 세포가 처리되는 방법을 나타내는 순서도(하단)를 나타낸다. 도 9b는 CRISPR/Cas 분자 및 사이토카인-인코딩 유전자를 포함하는 게놈 복합체(예를 들어, ASMC)의 앵커 서열에 대해 표적화된 sgRNA를 포함하는 부위-특이적 파괴제로 처리하고 3주 후 THP-1 세포에서 RNA 수준에 의해 측정된 사이토카인 발현(CXCL3)의 그래프를 나타낸다.
도 10은 촉매적으로 비활성인 CRISPR/Cas 분자와 전사 리프레서(KRAB) 및 사이토카인-인코딩 유전자를 포함하는 게놈 복합체(예를 들어, ASMC)의 앵커 서열에 대해 표적화된 sgRNA를 포함하는 부위-특이적 파괴제로 처리한 후 THP-1 세포에서 RNA 수준에 의해 측정된 사이토카인 발현(CXCL1)의 그래프를 나타낸다.
도 11은 촉매적으로 비활성인 CRISPR/Cas 분자와 히스톤 메틸트랜스퍼라제(EZH2) 및 사이토카인-인코딩 유전자를 포함하는 게놈 복합체(예를 들어, ASMC)의 앵커 서열에 대해 표적화된 sgRNA를 포함하는 부위-특이적 파괴제로 처리한 후 THP-1 세포에서 RNA 수준에 의해 측정된 사이토카인 발현(CXCL1)의 그래프를 나타낸다.
도 12는 촉매적으로 비활성인 CRISPR/Cas 분자와 DNA 메틸트랜스퍼라제(MQ1) 및 사이토카인-인코딩 유전자를 포함하는 게놈 복합체(예를 들어, ASMC)의 앵커 서열에 대해 표적화된 sgRNA를 포함하는 부위-특이적 파괴제로 처리한 후 THP-1 세포에서 RNA 수준에 의해 측정된 사이토카인 발현(CXCL1)의 그래프를 나타낸다.
도 13은 72시간, 3주, 또는 4주 동안 상이한 부위-특이적 파괴제로 처리한 후 THP-1 세포에서 RNA 수준에 의해 측정된 사이토카인 발현(CXCL1)의 그래프(상단), 및 실험에서 세포가 처리되는 방법을 나타내는 순서도(하단)를 나타낸다.
도 14는 사이토카인-인코딩 유전자를 포함하는 게놈 복합체(예를 들어, ASMC)의 앵커 서열에 대해 표적화된 sgRNA 및 상이한 부위-특이적 파괴제로 처리한 후 THP-1 세포에서 RNA 수준에 의해 측정된 사이토카인 발현(CXCL3)의 그래프(상단), 및 실험에서 세포가 처리되는 방법을 나타내는 순서도(하단)를 나타낸다.
도 15는 사이토카인-인코딩 유전자를 포함하는 게놈 복합체(예를 들어, ASMC)의 앵커 서열에 대해 표적화된 sgRNA 및 상이한 부위-특이적 파괴제로 처리한 후 THP-1 세포에서 RNA 수준에 의해 측정된 사이토카인 발현(CXCL1)의 그래프(상단)를 나타낸다.
도 16은 인간 CXCL IGD 및 유전자 클러스터 구성을 나타낸다. 도 16a는 CXLC1 내지 CXCL8 유전자 클러스터 내 2개의 루프를 설명하는 개략적인 절연 게놈 도메인(Insulated Genomic Domain; IGD)을 나타낸다. CXCL8, CXCL6, 및 CXCL 1 유전자는 IGD의 좌측 루프에 있다. CXCL2 내지 CXCL5 및 CXCL7 유전자는 IGD의 우측 루프에 있다. 상이한 세포주로부터의 IGD 데이터 조사는 중간 CTCF가 CXCL을 분비하는 세포(예를 들어, 림프구에는 아님)에만 존재함을 시사하였다.
도 16b는 좌측 CTCF-2, 좌측 CTCF, 중간 CTCF, 및 우측 CTCF의 4가지 상이한 CTCF 표적에 대해 가이드가 설계되었음을 나타낸다.
도 17은 dCas9-EZH2 가이드 30183이 TNF-알파로 처리한 인간 A549 폐암 상피 세포에서 CXCL1 내지 CXCL8 클러스터 내에 위치한 중간 CTCF 모티프를 표적화했을 때 CXCL1 내지 CXCL8 유전자가 하향조절되었음을 나타낸다. 대조군으로서 TNF 알파로 자극된 세포를 처리하였다.
도 18은 dCas9-EZH2 가이드 30183이 TNF-알파로 처리한 인간 IMR-90 정상 폐 섬유아세포에서 CXCL1 내지 CXCL8 클러스터 내에 위치한 중간 CTCF 모티프를 표적화했을 때 CXCL1, 2, 3, 8 유전자가 하향조절되었음을 나타낸다. 대조군으로서 TNF 알파로 자극된 세포를 처리하였다.
도 19는 컨트롤러(Controller) A가 TNF-알파로 처리한 인간 단핵구에서 CXCL1 내지 CXCL8 클러스터 내에 위치한 좌측 CTCF 모티프를 표적화했을 때 CXCL1, 2, 3, 8 유전자가 하향조절되었음을 나타낸다. 대조군으로서 TNF 알파로 자극된 세포를 처리하였다.
도 20은 마우스 CXCL IGD 및 유전자 클러스터 구성을 나타낸다. 도 20a는 CXCL 유전자 클러스터 내 2개의 루프를 설명하는 개략적인 절연 게놈 도메인(IGD)을 나타낸다. 도 20b는 CXLC1 내지 5, 7 및 15 유전자 클러스터 내 2개의 루프를 설명한다. CXCL4, CXCL5, 및 CXCL7 유전자는 IGD의 좌측 루프에 있다. CXCL1 내지 3 및 CXCL15 유전자는 좌측(L), 중간 1(M1), 중간 2(M2), 및 우측(R) CTCF의 4가지 상이한 CTCF 표적에 대해 설계된 IGD 가이드의 우측 루프에 있다.
도 21a는 IGD 가이드가 중간 1(M1), 중간 2(M2), 및 우측(R) CTCF의 4가지 상이한 CTCF 표적에 대해 설계되었음을 나타낸다.
도 21b는 dCas9-MQ1을 사용한 Hep 1.6에서 마우스 CXCML IGD의 시험관내 하향조절을 나타낸다. CXCL 유전자 클러스터에서 우측, 또는 2개의 중간 CTCF 모티프 중 하나를 표적화하는 가이드를 사용하여 dCas9-MQ1을 형질감염시켰으며, 이는 TNF 알파 자극 후 7개의 CXCL 유전자 중 어느 것에서도 하향조절하지 않는 것으로 나타났다(주황색). 중간 CTCF와 우측 둘 모두를 표적화하는 조합 가이드를 사용하여 dCas9-MQ1을 형질감염시켰을 때, 전체 유전자 클러스터가 하향조절되었다(파란색).
도 22의 A는 염증이 있는 폐에서 백혈구 여과 감소에 대한 dCas9-MQ1의 효과를 결정하기 위한 개략적인 실험 설계를 나타낸다. -2시간 시점에서 2개의 중간 및 우측 CTCF를 표적화하는 3 mg/kg의 dCas9-MQ1 또는 LNP 단독으로 각각의 마우스를 처리하였다. 0시간에 5 mg/kg LPS에 이어, +8시간 시점에 2개의 중간 및 우측 CTCF를 표적화하는 3 mg/kg의 dCas9-MQ1 또는 LNP 단독의 두 번째 투약으로 마우스를 시뮬레이션하였다. 0, 24, 및 48시간째에 10 mg/kg의 용량으로 덱사메타손을 복강내 투여하였다. 72시간째에 동물을 종료시키고 유동 염색을 위해 세기관지 세척액을 폐로부터 수집하였다.
도 22의 B는 dCas9-MQ1의 전신 투여가 염증이 있는 폐에서 백혈구 침윤을 감소시켰음을 나타낸다. dCas9-MQ1 처리 마우스로부터 수득한 세기관지 세척액에서 mL당 총 백혈구 수는 LPS + 질환 동물과 비교하여 현저한 차이를 나타내었다.
도 23a는 마우스의 염증이 있는 폐로부터 수득한 세기관지 세척액에서 확인된 침윤 세포의 조성을 나타낸다. 침윤 세포의 대부분을 구성하는 백혈구 세포 유형은 호중구이며, B 세포, T 세포, 대식세포 및 다른 유형의 조혈 세포가 그 뒤를 잇는다.
도 23b는 dCas9-MQ1이 +LPS 질환 그룹과 비교하여 현저한 차이로 폐에 침윤하는 호중구의 수를 감소시켰음을 나타낸다.
도 24는 BALF에서 백혈구 세포의 감소가 폐 특이적이며 말초 혈액에서 백혈구의 감소로 인한 것이 아님을 나타낸다. 이 그래프는 dCas9-MQ1로 처리한 BALF에서 백혈구 수의 감소 효과가 폐 특이적이고, 마우스 자체에서 백혈구 집단의 감소가 있기 때문이 아님을 설명하였다. 말초 혈액 중 조혈 세포 집단은 모든 그룹에 걸쳐 유사하였다.
도 25a 내지 25g는 CXCL1-5, CXCL7, 및 CXCL15 유전자 발현이 폐 조직에서 감소되었음을 나타낸다. 동물을 LNP 단독 또는 dCas9-MQ1로 처리한 후, 폐 조직을 처리하여 qPCR 방법에 의해 CXCL 유전자 발현을 확인하였다. 모든 CXCL 유전자는 dCA9-MQ1로 처리될 대 하향조절을 나타낸다. CXCL2 발현이 가장 많이 하향조절되었다.
도 26은 CXCL 발현 및 염증 부위로의 세포 동원의 감소가 다른 사이토카인의 존재를 감소시키는 유익한 하류 효과를 보였음을 나타낸다.
BALF에서 분비된 케모카인 단백질 수준은 CXCL 1 및 2 단백질 수준의 감소를 나타내었다. CXCL 발현 및 염증 부위로의 세포 동원의 감소는 GM-CSF(도 26c) 및 IL6(도 26d)의 존재를 감소시키는 유익한 하류 효과를 보였다.
본 개시내용은 부위-특이적 파괴제 또는 2가지 이상의 부위-특이적 파괴제를 포함하는 시스템의 사용을 통해 세포, 예를 들어 대상체 또는 환자의 세포 내의 복수의 표적 유전자의 발현을 조절하기 위한, 예를 들어 감소시키기 위한 기술을 제공한다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 표적화 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 표적화 모이어티 및 이펙터 모이어티를 포함한다. 이론에 의해 구애되고자 함이 없이, 다수의 질환 및 병태는 공통되는 게놈 복합체, 예를 들어 ASMC와 연관된 관련 기능성을 갖는 유전자 그룹과 연관된다. 복수의 표적 유전자를 (전체적으로 또는 부분적으로) 포함하는 게놈 복합체, 예를 들어 ASMC의 조절, 예를 들어 파괴는 개별 표적 유전자의 조절에 비해 (예를 들어, 변경의 개선된 효율, 효능, 및/또는 안정성과 관련하여) 복수의 표적 유전자의 발현을 변경시키는(예를 들어, 감소시키는) 것에 대한 개선된 접근법일 수 있다. 상기 개선은 복수의 표적 유전자와 연관된 질환 및 병태의 치료에서 상응하는 개선으로 해석될 수 있다. 예를 들어, 복수의 유전자는 전염증성 효과와 연관될 수 있고 부위-특이적 파괴제는 복수의 유전자를 (전체적으로 또는 부분적으로) 포함하는 게놈 복합체, 예를 들어 ASMC를 표적화하여 복수의 유전자의 발현을 조절할, 예를 들어 감소시킬 수 있으며, 이에 의해 항염 효과(예를 들어, 복수의 유전자를 개별적으로 표적화하는 것 대비 우수한 항염 효과)를 달성할 수 있다. 부위-특이적 파괴제, 표적화 모이어티, 이펙터 모이어티, 및 복수의 표적 유전자의 예가 본 명세서에서 제공된다.
부위-특이적 파괴제는 하나 이상의 양상에 의해 복수의 표적 유전자의 발현을 조절할, 예를 들어 감소시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 표적 부위, 예를 들어 앵커 서열에 결합하고, 다른 게놈 복합체 성분, 예를 들어 핵형성 폴리펩티드와 결합에 대해 물리적으로 또는 입체적으로 경쟁한다. 이론에 의해 구애되고자 함이 없이, 예를 들어 앵커 서열에 대한 게놈 복합체 성분(예를 들어, 핵형성 폴리펩티드)의 결합이 억제되도록(예를 들어, 방지되도록) 하는 앵커 서열의 물리적 또는 입체적 차단은 부위-특이적 파괴제가 복수의 표적 유전자의 발현을 조절할, 예를 들어 감소시킬 수 있는 하나의 메커니즘이다. 부위-특이적 파괴제는, 예를 들어 게놈 복합체 성분이 앵커 서열에 결합하는 친화도 및/또는 결합력을 변경(예를 들어, 감소)시킴으로써, 게놈 복합체 성분(예를 들어, 핵형성 폴리펩티드)과 앵커 서열의 상호작용을 불안정화시킬 수 있다. 앵커 서열에 대한 게놈 복합체 성분(예를 들어, 핵형성 폴리펩티드)의 결합을 차단 또는 불안정화시키는 것은, 앵커 서열 또는 이에 근접한 서열의 후성유전학적 변형, 앵커 서열 또는 이에 근접한 서열의 유전적 변형, 또는 앵커 서열 또는 이에 근접한 서열에 대한 부위-특이적 파괴제의 결합을 포함하는 하나 이상의 수단에 의해 달성될 수 있다. 앵커 서열에 대한 게놈 복합체 성분(예를 들어, 핵형성 폴리펩티드)의 결합을 억제(예를 들어, 방지)하는 것은 게놈 복합체, 예를 들어 ASMC를 억제(예를 들어, 이의 형성을 파괴 또는 방지)할 수 있다. 복수의 표적 유전자를 전체적으로 또는 부분적으로 포함하는 게놈 복합체, 예를 들어 ASMC의 억제는 복수의 표적 유전자의 유전자 발현을 조절할, 예를 들어 감소시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 표적화 모이어티, 제1 이펙터 모이어티, 및 제2 이펙터 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 이펙터 모이어티는 제2 이펙터 모이어티의 서열과 상이한 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 제1 이펙터 모이어티는 제2 이펙터 모이어티의 서열과 동일한 서열을 갖는다.
본 개시내용은 부분적으로 2개 이상의 부위-특이적 파괴제를 포함하는 시스템을 추가로 제공하며, 각각의 부위-특이적 파괴제는 표적화 모이어티 및 선택적으로 이펙터 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 2개 이상의 상이한 서열을 표적화한다(예를 들어, 각각의 부위-특이적 파괴제는 상이한 서열을 표적화할 수 있음). 일부 구현예에서, 제1 부위-특이적 파괴제는 복수의 표적 유전자, 예를 들어 인간 CXCL1 내지 CXCL8에 작동가능하게 연결된 전사 조절 요소(예를 들어, 프로모터 또는 전사 개시 부위(TSS))에 결합하고 제2 부위-특이적 파괴제는 복수의 표적 유전자, 예를 들어 인간 CXCL1 내지 CXCL8을 포함하는 앵커 서열-매개 연접부(ASMC)의 앵커 서열에 결합한다. 일부 구현예에서, 시스템에 의한 복수의 표적 유전자, 예를 들어 인간 CXCL1 내지 CXCL8의 발현 조절은 제1 및 제2 DNA 서열 각각에 대한 제1 부위-특이적 파괴제 및 제2 부위-특이적 파괴제의 결합을 포함한다. 제1 및 제2 DNA의 결합은 제1 및 제2 이펙터 모이어티의 기능성을 이들 부위로 국재화한다. 이론에 의해 구애되고자 함이 없이, 일부 구현예에서 제1 및 제2 부위-특이적 파괴제 이펙터 모이어티 둘 모두의 기능성을 사용하는 것은 제1 및/또는 제2 DNA 서열과 연관되거나 이를 포함하는 복수의 표적 유전자의 발현을 안정적으로 억제하며, 예를 들어 여기서 제1 및/또는 제2 DNA 서열은 복수의 표적 유전자 또는 하나 이상의 작동가능하게 연결된 전사 제어 요소의 서열이거나 이를 포함한다.
부위-특이적 파괴제
일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 표적화 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 DNA 서열, 예를 들어 앵커 서열에 특이적으로 결합하며, 이에 의해 상기 DNA 서열을 포함하는 게놈 복합체(예를 들어, ASMC)를 조절, 예를 들어 파괴한다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 표적화 모이어티 및 이펙터 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 DNA 서열에 특이적으로 결합하며, 이에 의해 이펙터 모이어티의 기능성을 DNA 서열로 국재화하고, 이에 의해 상기 DNA 서열을 포함하는 게놈 복합체(예를 들어, ASMC)를 조절, 예를 들어 파괴한다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 하나의 표적화 모이어티 및 하나의 이펙터 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 하나의 표적화 모이어티 및 하나 초과의 이펙터 모이어티, 예를 들어 2, 3, 4, 또는 5개의 이펙터 모이어티를 포함하며, 각 이펙터 모이어티는 하나 초과의 이펙터 모이어티 중 또 다른 것과 동일하거나 상이할 수 있다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 2개의 이펙터 모이어티를 포함할 수 있으며, 제1 이펙터 모이어티는 제2 이펙터 모이어티와 상이한 기능성을 포함한다. 예를 들어, 부위-특이적 파괴제는 2개의 이펙터 모이어티를 포함할 수 있으며, 제1 이펙터 모이어티는 DNA 메틸트랜스퍼라제 기능성을 포함하고(예를 들어, G9A 또는 EZH2 또는 이의 기능성 단편 또는 변이체를 포함함) 제2 이펙터 모이어티는 전사 리프레서 기능성을 포함한다(예를 들어, KRAB 또는 이의 기능성 단편 또는 변이체를 포함함). 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 복수의 표적 유전자의 발현의 감소에 대해 서로 상보적인 기능성을 갖는 이펙터 모이어티를 포함하며, 이들 기능성은 함께, 발현을 억제하고, 선택적으로, 개별적으로 존재할 때에는 발현을 억제하지 않거나 무시할 만한 정도로 억제한다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 복수의 이펙터 모이어티를 포함하며, 각 이펙터 모이어티는 기타 다른 이펙터 모이어티 각각과 상보적이고, 각 이펙터 모이어티는 복수의 표적 유전자의 발현을 감소시킨다.
일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 복수의 표적 유전자의 발현의 감소에 대해 서로 상승작용하는 기능성을 갖는 이펙터 모이어티의 조합을 포함한다. 이론에 의해 구애되고자 함이 없이, 일부 구현예에서, 다수의 전사 활성화 후성유전학적 마커(예를 들어, 다수의 상이한 유형의 후성유전학적 마커 및/또는 주어진 유형의 더 광범위한 마킹)가 개별적으로, 단독으로의 개별적인 변형보다 더 효과적으로 발현을 함께 억제한다는 점에서(예를 들어, 발현의 더 큰 감소의 생성 및/또는 발현의 더 오래 지속된 감소), 게놈 유전자좌에 대한 후성유전학적 변형은 누적된다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 복수의 이펙터 모이어티를 포함하며, 각 이펙터 모이어티는 기타 다른 이펙터 모이어티 각각과 상승작용하며, 예를 들어 각 이펙터 모이어티는 복수의 표적 유전자의 발현을 감소시킨다. 일부 구현예에서, (서로 상승작용하는 복수의 이펙터 모이어티를 포함하는) 부위-특이적 파괴제가 개별 이펙터 모이어티를 포함하는 부위-특이적 파괴제보다 복수의 표적 유전자의 발현을 억제하는 데 더 효과적이다. 일부 구현예에서, 상기 복수의 이펙터 모이어티를 포함하는 부위-특이적 파괴제는 개별 이펙터 모이어티를 포함하는 부위-특이적 파괴제보다 복수의 표적 유전자의 발현을 감소시키는 데 적어도 1.05×(즉, 1.05배), 1.1×, 1.15×, 1.2×, 1.25×, 1.3×, 1.35×, 1.4×, 1.45×, 1.5×, 1.55×, 1.6×, 1.65×, 1.7×, 1.75×, 1.8×, 1.85×, 1.9×, 1.95×, 2×, 3×, 4×, 5×, 6×, 7×, 8×, 9×, 10×, 20×, 30×, 40×, 50×, 60×, 70×, 80×, 90×, 또는 100× 효과적이다.
일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 하나 이상의 표적화 모이어티, 예를 들어 Cas 도메인, TAL 이펙터 도메인, 또는 Zn 핑거 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, 시스템이 동일한 유형의 2개 이상의 표적화 모이어티, 예를 들어 2개 이상의 Cas 도메인을 포함할 때, 표적화 모이어티는 2개 이상의 상이한 서열에 특이적으로 결합한다. 예를 들어, 2개 이상의 Cas 도메인을 포함하는 부위-특이적 파괴제 시스템에서, 2개 이상의 Cas 도메인은 이들 도메인이 단지 이들의 표적 서열에 상응하는 gRNA에만 두드러지게 결합하도록(예를 들어, 또 다른 Cas9 도메인의 표적에 상응하는 gRNA에는 두드러지게 결합하지 않도록) 선택되거나 변경될 수 있다.
일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는, 예를 들어 펩티드 결합에 의해, 공유적으로 연결된 표적화 모이어티 및 이펙터 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화 모이어티 및 이펙터 모이어티는, 예를 들어 하나 이상의 펩티드 결합 및/또는 링커에 의해 연결되어, 동일한 폴리펩티드 사슬 상에 위치한다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는, 예를 들어 펩티드 결합 및/또는 링커에 의해 연결된 표적화 모이어티와 이펙터 모이어티를 포함하는, 융합 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 동일한 폴리펩티드 사슬 상의 이펙터 모이어티의 N-말단에 배치된 표적화 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 동일한 폴리펩티드 사슬 상의 이펙터 모이어티의 C-말단에 배치된 표적화 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 비-펩티드 결합에 의해 공유적으로 연결된 표적화 모이어티와 이펙터 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 비-펩티드 결합에 의해 이펙터 모이어티에 접합된다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 표적화 모이어티 및 복수의 이펙터 모이어티를 포함하며, 표적화 모이어티와 복수의 이펙터 모이어티는, 예를 들어 펩티드 결합에 의해, 공유적으로 연결된다(예를 들어, 표적화 모이어티와 복수의 이펙터 모이어티는 모두 일련의 공유 결합에 의해 연결되지만, 각 개별 모이어티는 기타 다른 모든 모이어티와 공유 결합을 공유할 수 없음).
다른 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 공유적으로 연결되지 않은, 예를 들어 서로 비공유적으로 회합된 표적화 모이어티와 이펙터 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 이펙터 모이어티에 비공유적으로 결합하는 표적화 모이어티를 포함하거나 그 반대로도 성립한다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 표적화 모이어티 및 복수의 이펙터 모이어티를 포함하며, 표적화 모이어티와 적어도 하나의 이펙터 모이어티는 공유적으로 연결되지 않으며, 예를 들어 서로 비공유적으로 회합되고, 표적화 모이어티와 적어도 하나의 기타 다른 이펙터 모이어티는, 예를 들어 펩티드 결합에 의해, 공유적으로 연결된다.
일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 G9A를 포함하는 제1 이펙터 모이어티 및 KRAB를 포함하는 제2 이펙터 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 G9A를 포함하는 제1 이펙터 모이어티 및 EZH2를 포함하는 제2 이펙터 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 EZH2를 포함하는 제1 이펙터 모이어티 및 KRAB를 포함하는 제2 이펙터 모이어티를 포함한다.
일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 표적화 모이어티 및 이펙터 모이어티를 포함하며, 이펙터 모이어티, 예를 들어 EZH2, 또는 G9A, 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편으로부터 선택되는 이펙터 모이어티의 C-말단 단부와 표적화 모이어티의 N-말단 단부는 공유적으로 연결된다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 표적화 모이어티 및 이펙터 모이어티를 포함하며, 이펙터 모이어티, 예를 들어 HDAC8, MQ1, DNMT3a/3L, KRAB, 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편으로부터 선택되는 이펙터 모이어티의 N-말단 단부와 표적화 모이어티의 C-말단 단부는 공유적으로 연결된다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 표적화 모이어티, 제1 이펙터 모이어티 및 제2 이펙터 모이어티를 포함하며, 제1 이펙터 모이어티, 예를 들어 EZH2, G9A, 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편으로부터 선택되는 이펙터 모이어티의 C-말단 단부와 표적화 모이어티의 N-말단 단부는 공유적으로 연결되고, 표적화 모이어티의 C-말단 단부와 제2 이펙터 모이어티, 예를 들어 HDAC8, MQ1, DNMT3a/3L, KRAB, 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편으로부터 선택되는 이펙터 모이어티의 N-말단 단부는 공유적으로 연결된다. 공유 연결은, 예를 들어 링커 서열을 통한 것일 수 있다.
일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 표적화 모이어티, 제1 이펙터 모이어티 및 제2 이펙터 모이어티를 포함하며, 제1 이펙터 모이어티는 EZH2 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편이고, 예를 들어 제1 이펙터 모이어티는 서열번호 17의 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 상기 서열에 대해 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 상이한 위치를 갖는 서열을 포함하며, 제1 이펙터 모이어티는 표적화 모이어티의 N-말단에 있고; 제2 이펙터 모이어티는 KRAB 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편이고, 예를 들어 제2 이펙터 모이어티는 서열번호 13의 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 상기 서열에 대해 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 상이한 위치를 갖는 서열을 포함하며, 제2 이펙터 모이어티는 표적화 모이어티의 C-말단에 있다.
일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 표적화 모이어티, 제1 이펙터 모이어티 및 제2 이펙터 모이어티를 포함하며, 제1 이펙터 모이어티는 EZH2 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편이고, 예를 들어 제1 이펙터 모이어티는 서열번호 17의 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 상기 서열에 대해 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 상이한 위치를 갖는 서열을 포함하며, 제1 이펙터 모이어티는 표적화 모이어티의 N-말단에 있고; 제2 이펙터 모이어티는 HDAC8 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편이고, 예를 들어 제2 이펙터 모이어티는 서열번호 19의 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 상기 서열에 대해 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 상이한 위치를 갖는 서열을 포함하며, 제2 이펙터 모이어티는 표적화 모이어티의 C-말단에 있다.
일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 표적화 모이어티, 제1 이펙터 모이어티 및 제2 이펙터 모이어티를 포함하며, 제1 이펙터 모이어티는 G9A 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편이고, 예를 들어 제1 이펙터 모이어티는 서열번호 67의 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 상기 서열에 대해 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 상이한 위치를 갖는 서열을 포함하며, 제1 이펙터 모이어티는 표적화 모이어티의 N-말단에 있고; 제2 이펙터 모이어티는 KRAB 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편이고, 예를 들어 제2 이펙터 모이어티는 서열번호 13의 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 상기 서열에 대해 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 상이한 위치를 갖는 서열을 포함하며, 제2 이펙터 모이어티는 표적화 모이어티의 C-말단에 있다.
일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 표적화 모이어티, 제1 이펙터 모이어티 및 제2 이펙터 모이어티를 포함하며, 제1 이펙터 모이어티는 G9A 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편이고, 예를 들어 제1 이펙터 모이어티는 서열번호 67의 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 상기 서열에 대해 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 상이한 위치를 갖는 서열을 포함하며, 제1 이펙터 모이어티는 표적화 모이어티의 N-말단에 있고; 제2 이펙터 모이어티는 EZH2 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편이고, 예를 들어 제2 이펙터 모이어티는 서열번호 17의 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 상기 서열에 대해 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 상이한 위치를 갖는 서열을 포함하며, 제2 이펙터 모이어티는 표적화 모이어티의 C-말단에 있다.
일부 구현예에서, 제1 이펙터 모이어티는 히스톤 메틸트랜스퍼라제 활성을 포함하고 제2 이펙터 모이어티는 상이한 히스톤 메틸트랜스퍼라제 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 이펙터 모이어티는 히스톤 메틸트랜스퍼라제 활성을 포함하고 제2 이펙터 모이어티는 동일한 히스톤 메틸트랜스퍼라제 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 이펙터 모이어티는 히스톤 데메틸라제 활성을 포함하고 제2 이펙터 모이어티는 히스톤 데아세틸라제 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 이펙터 모이어티는 히스톤 데메틸라제 활성을 포함하고 제2 이펙터 모이어티는 DNA 메틸트랜스퍼라제 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 이펙터 모이어티는 히스톤 데메틸라제 활성을 포함하고 제2 이펙터 모이어티는 DNA 데메틸라제 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 이펙터 모이어티는 히스톤 데메틸라제 활성을 포함하고 제2 이펙터 모이어티는 전사 리프레서 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 이펙터 모이어티는 히스톤 데메틸라제 활성을 포함하고 제2 이펙터 모이어티는 상이한 히스톤 데메틸라제 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 이펙터 모이어티는 히스톤 데메틸라제 활성을 포함하고 제2 이펙터 모이어티는 동일한 히스톤 데메틸라제 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 이펙터 모이어티는 히스톤 데아세틸라제 활성을 포함하고 제2 이펙터 모이어티는 DNA 메틸트랜스퍼라제 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 이펙터 모이어티는 히스톤 데아세틸라제 활성을 포함하고 제2 이펙터 모이어티는 DNA 데메틸라제 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 이펙터 모이어티는 히스톤 데아세틸라제 활성을 포함하고 제2 이펙터 모이어티는 전사 리프레서 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 이펙터 모이어티는 히스톤 데아세틸라제 활성을 포함하고 제2 이펙터 모이어티는 상이한 히스톤 데아세틸라제 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 이펙터 모이어티는 히스톤 데아세틸라제 활성을 포함하고 제2 이펙터 모이어티는 동일한 히스톤 데아세틸라제 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 이펙터 모이어티는 DNA 메틸트랜스퍼라제 활성을 포함하고 제2 이펙터 모이어티는 DNA 데메틸라제 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 이펙터 모이어티는 DNA 메틸트랜스퍼라제 활성을 포함하고 제2 이펙터 모이어티는 전사 리프레서 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 이펙터 모이어티는 DNA 메틸트랜스퍼라제 활성을 포함하고 제2 이펙터 모이어티는 상이한 DNA 메틸트랜스퍼라제 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 이펙터 모이어티는 DNA 메틸트랜스퍼라제 활성을 포함하고 제2 이펙터 모이어티는 동일한 DNA 메틸트랜스퍼라제 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 이펙터 모이어티는 DNA 데메틸라제 활성을 포함하고 제2 이펙터 모이어티는 전사 리프레서 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 이펙터 모이어티는 DNA 데메틸라제 활성을 포함하고 제2 이펙터 모이어티는 상이한 DNA 데메틸라제 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 이펙터 모이어티는 DNA 데메틸라제 활성을 포함하고 제2 이펙터 모이어티는 동일한 DNA 데메틸라제 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 이펙터 모이어티는 전사 리프레서 활성을 포함하고 제2 이펙터 모이어티는 상이한 전사 리프레서 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 이펙터 모이어티는 전사 리프레서 활성을 포함하고 제2 이펙터 모이어티는 동일한 전사 리프레서 활성을 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 이펙터 모이어티는 DNMT3a/3l, MQ1, KRAB, G9A, HDAC8, 또는 EZH2를 포함하고 제2 이펙터 모이어티는 DNMT3a/3l, MQ1, KRAB, G9A, HDAC8, 또는 EZH2를 포함한다.
링커
부위-특이적 파괴제는 하나 이상의 링커를 포함할 수 있다. 링커는 표적화 모이어티를 이펙터 모이어티에, 이펙터 모이어티를 또 다른 이펙터 모이어티에, 또는 표적화 모이어티를 또 다른 표적화 모이어티에 연결할 수 있다. 링커는 화학 결합, 예를 들어 하나 이상의 공유 결합 또는 비공유 결합일 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 공유적이다. 일부 구현예에서, 링커는 비공유적이다. 일부 구현예에서, 링커는 펩티드 링커이다. 그러한 링커는 2 내지 30개, 5 내지 30개, 10 내지 30개, 15 내지 30개, 20 내지 30개, 25 내지 30개, 2 내지 25개, 5 내지 25개, 10 내지 25개, 15 내지 25개, 20 내지 25개, 2 내지 20개, 5 내지 20개, 10 내지 20개, 15 내지 20개, 2 내지 15개, 5 내지 15개, 10 내지 15개, 2 내지 10개, 5 내지 10개, 또는 2 내지 5개의 아미노산 길이, 또는 2, 5, 10, 15, 20, 25, 또는 30개 이상의 아미노산 길이(및 선택적으로 최대 50, 40, 30, 25, 20, 15, 10, 또는 5개의 아미노산 길이)일 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 제1 모이어티를 제2 모이어티로부터, 예를 들어 표적화 모이어티를 이펙터 모이어티로부터 이격시키는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 예를 들어, 링커는, 예를 들어 2차 및 3차 구조의 분자 가요성을 제공하기 위하여, 표적화 모이어티와 이펙터 모이어티 사이에 위치될 수 있다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 제1 링커를 통해 표적화 모이어티에 연결된 제1 이펙터 모이어티 및 제2 링커를 통해 표적화 모이어티에 연결된 제2 이펙터 모이어티를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 링커는 제2 링커의 서열과 동일한 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 제1 링커는 제2 링커의 서열과 동일하지 않은 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 제1 이펙터 모이어티는 표적화 모이어티의 N-말단에 있다. 일부 구현예에서, 표적화 모이어티의 C-말단. 일부 구현예에서, 제1 이펙터 모이어티의 C-말단 단부는 제1 링커를 통해 표적화 모이어티의 N-말단 단부에 연결되고, 제2 이펙터 모이어티의 N-말단 단부는 제2 링커를 통해 표적화 모이어티의 C-말단 단부에 연결된다.
링커는 본 명세서에 기재된 가요성, 강성, 및/또는 절단성 링커를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 가요성을 제공하기 위하여 적어도 하나의 글리신, 알라닌, 및 세린 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 소수성 링커이며, 이에는, 예를 들어 음으로 하전된 설포네이트 기, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 기, 또는 피로포스페이트 디에스테르 기가 포함된다. 일부 구현예에서, 링커는 조절제로부터 모이어티(예를 들어, 폴리펩티드)를 선택적으로 방출하도록 절단 가능하지만, 조기 절단을 방지하기에 충분히 안정적이어야 한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 부위-특이적 파괴제의 하나 이상의 모이어티는 하나 이상의 링커와 연결된다.
당업자에 의해 알려진 바와 같이, 일반적으로 사용되는 가요성 링커는 Gly 및 Ser 잔기의 신장으로 주로 구성되는 서열을 갖는다("GS" 링커). 가요성 링커는 어느 정도의 이동 또는 상호작용을 필요로 하는 도메인/모이어티를 연결하는 데 유용할 수 있으며, 작은, 비극성(예를 들어, Gly) 또는 극성(예를 들어, Ser 또는 Thr) 아미노산을 포함할 수 있다. Ser 또는 Thr의 도입은 또한 물 분자와의 수소 결합을 형성함으로써 수용액 중에서의 링커의 안정성을 유지할 수 있으며, 이에 따라 링커와 모이어티/도메인 사이의 불리한 상호작용을 감소시킬 수 있다.
강성 링커는 도메인들/모이어티들 사이의 고정된 거리를 유지하는 데 그리고 그들의 독립적인 기능을 유지하는 데 유용하다. 강성 링커는 또한, 도메인들의 공간적 분리가 융합체 내의 하나 이상의 성분의 안정성 및 생물활성을 보존하는 데 중요할 때 유용할 수 있다. 강성 링커는 알파 나선-구조 또는 Pro-풍부 서열, (XP)n을 가질 수 있으며, 여기서 X는 임의의 아미노산, 바람직하게는 Ala, Lys, 또는 Glu를 지정한다.
절단성 링커는 생체내에서 유리 기능성 도메인/모이어티를 방출할 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 특정 조건 하에서, 예컨대 환원성 시약 또는 프로테아제의 존재 하에서 절단될 수 있다. 생체내 절단성 링커는 이황화물 결합의 가역적 성질을 이용할 수 있다. 한 예에는 2개의 Cys 잔기 사이의 트롬빈-감수성 서열(예를 들어, PRS)이 포함된다. CPRSC(서열번호 243)의 시험관내 트롬빈 처리는 트롬빈-감수성 서열의 절단을 초래하지만, 가역적 이황화물 결합은 온전하게 남아 있다. 그러한 링커는 알려져 있으며, 예를 들어 문헌[Chen et al. 2013. Fusion Protein Linkers: Property, Design and Functionality. Adv Drug Deliv Rev. 65(10): 1357-1369]에 기재되어 있다. 융합체 내의 링커의 생체내 절단은 또한, 특정 조건 하에 생체내에서, 특정 세포 또는 조직에서 발현되거나 특정 세포 구획 내에 구속된 프로테아제에 의해 수행될 수 있다. 많은 프로테아제의 특이성은 구속된 구획 내에서 링커의 더 느린 절단을 제공한다.
본 명세서에 기재된 링커에 사용하기에 적합한 분자의 예에는 음으로 하전된 설포네이트 기; 지질, 예컨대 폴리 (--CH2--) 탄화수소 사슬, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 기, 이의 불포화 변이체, 이의 하이드록실화 변이체, 이의 아미드화 또는 다른 방식으로의 N-함유 변이체; 비탄소 링커; 탄수화물 링커; 포스포디에스테르 링커, 또는 부위-특이적 파괴제의 2개 이상의 성분을 공유적으로 연결할 수 있는 기타 다른 분자가 포함된다. 비공유성 링커가 또한 포함되며, 이에는, 예를 들어 폴리펩티드가, 예를 들어, 류신, 이소류신, 발린, 또는 아마도 또한 알라닌, 페닐알라닌, 또는 심지어 티로신, 메티오닌, 글리신, 또는 기타 다른 소수성 잔기가 풍부한 일련의 잔기와 같은 폴리펩티드의 소수성 영역 또는 폴리펩티드의 소수성 확장을 통해 연결되는 소수성 지질 소구체가 있다. 부위-특이적 파괴제의 성분들은 전하-기반 화학을 사용하여 연결될 수 있으며, 이로써 부위-특이적 파괴제의 양으로 하전된 성분이 또 다른 성분의 음전하에 연결된다.
핵산
일 양태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 바와 같은 부위-특이적 파괴제, 시스템, 표적화 모이어티 및/또는 이펙터 모이어티를 인코딩하는 핵산 서열을 제공한다. 당업자는 RNA의 핵산 서열은, 통상적으로 티민(T)이 우라실(U)로 대체된 것을 제외하고는, 상응하는 DNA 서열과 동일함을 인식하고 있다. 뉴클레오티드 서열이 DNA 서열(예를 들어, A, T, G, C를 포함함)로 표현될 때, 본 개시내용은 또한 "U"가 "T"를 대체하는 상응하는 RNA 서열(예를 들어, A, U, G, C를 포함함)을 제공함이 이해될 것이다. 폴리뉴클레오티드 서열을 기재하기 위해 본 명세서에서는 통상적인 표기가 사용되며: 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 서열의 좌측단은 5'-단부이고, 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 서열의 우측 방향은 5'-방향으로 지칭된다.
유전자 코드의 축퇴로 인해, 본 명세서에 기재된 바와 같은 DNA-표적화 모이어티 및/또는 이펙터 모이어티를 포함하는 부위-특이적 파괴제를 인코딩하는 다수의 뉴클레오티드 서열이 생성될 수 있으며, 이들 중 일부는 본 명세서에 개시된 핵산 서열과 유사성, 예를 들어 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖는다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. 예를 들어, 코돈 AGA, AGG, CGA, CGC, CGG, 및 CGU 모두는 아미노산 아르기닌을 인코딩한다. 따라서, 아르기닌이 코돈에 의해 지정된 본 개시내용의 핵산 분자 내의 모든 위치에서, 그러한 코돈은 인코딩된 폴리펩티드를 변경시키지 않고서 상기에 기재된 상응하는 코돈 중 임의의 것으로 변경될 수 있다.
일부 구현예에서, 표적화 모이어티 및/또는 하나 이상의 이펙터 모이어티를 포함하는 부위-특이적 파괴제를 인코딩하는 핵산 서열은 포유동물, 예를 들어 인간에서 코돈 사용빈도에 따라 최적화된, 코돈-최적화된 코딩 영역의 일부 또는 전부일 수 있다. 일부 구현예에서, 표적화 모이어티 및/또는 하나 이상의 이펙터 모이어티를 인코딩하는 핵산 서열은 단백질 발현을 증가시키고/시키거나 단백질 발현의 지속시간을 증가시키기 위해 코돈 최적화된다. 일부 구현예에서, 코돈 최적화된 핵산 서열에 의해 생성되는 단백질은 코돈 최적화되지 않은 핵산 서열에 의해 인코딩될 때의 단백질의 수준과 비교하여 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 또는 적어도 50% 더 높다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 시스템, 또는 본 명세서에 기재된 방법은 하나 이상(예를 들어, 하나)의 DNA-표적화 모이어티 및 하나 이상의 이펙터 모이어티를 포함하는 폴리펩티드의 사용을 포함하며, 예를 들어 이펙터 모이어티는 MQ1, 예를 들어 박테리아 MQ1, 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, MQ1은 스피로플라스마 모노비아이(Spiroplasma monobiae) MQ1, 예를 들어 균주 ATCC 33825로부터 유래되고/되거나 Uniprot ID P15840에 상응하는 MQ1이다. 일부 구현예에서, MQ1 이펙터 모이어티는 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 뉴클레오티드 서열은 서열번호 10의 서열, 또는 상기 서열과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 상기 서열에 대해 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 상이한 위치를 갖는 서열을 포함한다.
MQ1
Figure pct00001
일부 구현예에서, MQ1은 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, MQ1은 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 이펙터 도메인은 서열번호 11 또는 12, 또는 상기 서열과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 상기 서열에 대해 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 상이한 위치를 갖는 서열을 포함한다.
MQ1
Figure pct00002
Figure pct00003
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 부위-특이적 파괴제에 사용하기 위한 MQ1은, 예를 들어 야생형 MQ1(예를 들어, 서열번호 11 또는 서열번호 12)과 대비하여 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 변이체이다. 일부 구현예에서, MQ1 변이체는 야생형 MQ1과 대비하여 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입을 포함한다. 일부 구현예에서, MQ1 변이체는 K297P 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, MQ1 변이체는 N299C 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, MQ1 변이체는 E301Y 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, MQ1 변이체는 Q147L 치환을 포함한다(예를 들어, 그리고 야생형 MQ1과 대비하여 감소된 DNA 메틸트랜스퍼라제 활성을 가짐). 일부 구현예에서, MQ1 변이체는 K297P, N299C, 및 E301Y 치환을 포함한다(예를 들어, 그리고 야생형 MQ1과 대비하여 감소된 DNA 결합 친화도를 가짐). 일부 구현예에서, MQ1 변이체는 Q147L, K297P, N299C, 및 E301Y 치환을 포함한다(예를 들어, 그리고 야생형 MQ1과 대비하여 감소된 DNA 메틸트랜스퍼라제 활성 및 DNA 결합 친화도를 가짐).
일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는, 예를 들어 모이어티/도메인을 또 다른 모이어티/도메인에 연결시키는, 본 명세서에 기재된 하나 이상의 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는, 예를 들어 CRISPR/Cas 단백질, 예를 들어 dCas9 단백질을 포함하는 CRISPR/Cas 분자이거나 이를 포함하는 표적화 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는, MQ1이거나 이를 포함하는 이펙터 모이어티, 및, 예를 들어 CRISPR/Cas 단백질, 예를 들어 dCas9 단백질; 예를 들어 dCas9m4를 포함하는 CRISPR/Cas 분자이거나 이를 포함하는 DNA-표적화 모이어티를 포함하는 융합 단백질이다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 본 명세서에 기재된 추가적인 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 표적 유전자 또는 복수의 표적 유전자(예를 들어, 본 명세서에 기재된 표적 유전자 또는 복수의 표적 유전자)의 발현을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 본 명세서에 기재된 유전자 발현을 조절하는, 예를 들어 감소시키는 방법, 병태를 치료하는 방법, 또는 표적 유전자 또는 전사 제어 요소를 후성유전학적으로 변형시키는 방법에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 시스템은 2개 이상의 부위-특이적 파괴제를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 시스템, 또는 본 명세서에 기재된 방법은 하나 이상(예를 들어, 하나)의 표적화 모이어티 및 하나 이상의 이펙터 모이어티를 포함하는 부위-특이적 파괴제 또는 폴리펩티드의 사용을 포함하며, 이펙터 모이어티는 징크 핑거 단백질 10의 크루펠-연관 박스(Krueppel-associated box, KRAB) 도메인, 예를 들어 NP_056209.2에 따른 것, 또는 NM_015394.5에 의해 인코딩된 단백질 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, KRAB는 합성 KRAB 작제물이다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 부위-특이적 파괴제에 사용하기 위한 KRAB는, 예를 들어 야생형 KRAB(예를 들어, NP_056209.2에 따른 것, 또는 NM_015394.5에 의해 인코딩된 단백질)와 대비하여 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 변이체이다. 일부 구현예에서, KRAB 변이체는 야생형 KRAB와 대비하여 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입을 포함한다. 일부 구현예에서, KRAB 변이체는 L37P 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, KRAB는 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함한다:
KRAB
Figure pct00004
일부 구현예에서, KRAB 이펙터 모이어티는 서열번호 14의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 뉴클레오티드 서열은 서열번호 14의 서열, 또는 상기 서열과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 상기 서열에 대해 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 상이한 위치를 갖는 서열을 포함한다.
KRAB
Figure pct00005
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 폴리펩티드 또는 부위-특이적 파괴제에 사용하기 위한 KRAB는, 예를 들어 서열번호 13의 KRAB 서열과 대비하여 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 변이체이다. 일부 구현예에서, KRAB 변이체는 서열번호 13과 대비하여 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입을 포함한다.
일부 구현예에서, 폴리펩티드 또는 부위-특이적 파괴제는, KRAB이거나 이를 포함하는 이펙터 모이어티 및 표적화 모이어티, 예를 들어 Crisper/Cas 단백질을 포함하는 융합 단백질이다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 또는 부위-특이적 파괴제는 본 명세서에 기재된 추가적인 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 또는 부위-특이적 파괴제는 표적 유전자 또는 복수의 표적 유전자의 발현을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 또는 부위-특이적 파괴제는 본 명세서에 기재된 유전자 발현을 조절하는, 예를 들어 감소시키는 방법, 병태를 치료하는 방법, 또는 표적 유전자 또는 복수의 표적 유전자, 예를 들어 전사 제어 요소를 후성유전학적으로 변형시키는 방법에 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 시스템, 또는 본 명세서에 기재된 방법은 하나 이상(예를 들어, 하나)의 표적화 모이어티 및 하나 이상의 이펙터 모이어티를 포함하는 부위-특이적 파괴제 또는 폴리펩티드의 사용을 포함하며, 이펙터 모이어티는 DNMT3a/3L 복합체, 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, DNMT3a/3L 복합체는 융합 작제물이다. 일부 구현예에서, DNMT3a/3L 복합체는 DNMT3A, 예를 들어 인간 DNMT3A, 예를 들어 NP_072046.2에 따른 것 또는 NM_022552.4에 의해 인코딩된 단백질, 또는 NM_022552.4에 의해 인코딩된 단백질 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편, 예를 들어 인간 DNMT3A, 예를 들어 NP_072046.2에 따른 것 또는 NM_022552.4에 의해 인코딩된 단백질의 aa 679 내지 912를 포함한다. 일부 구현예에서, DNMT3a/3L 복합체는 인간 DNMT3L 또는 이의 기능성 단편 또는 변이체(예를 들어, NP_787063.1에 따른 것 또는 NM_175867.3에 의해 인코딩된 단백질 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편, 예를 들어 인간 DNMT3L, 예를 들어 NP_787063.1 또는 NM_175867.3에 의해 인코딩된 단백질의 aa 274 내지 386)를 포함한다. 일부 구현예에서, DNMT3a/3L은 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 이펙터 모이어티는 서열번호 15, 또는 상기 서열과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 상기 서열에 대해 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 상이한 위치를 갖는 서열을 포함한다.
DNMT3A/3l(h)
Figure pct00006
일부 구현예에서, DNMT3a/3L은 서열번호 16의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 핵산은 서열번호 16의 서열, 또는 상기 서열과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 상기 서열에 대해 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 상이한 위치를 갖는 서열을 포함한다.
DNMT3A/3l(h)
Figure pct00007
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 시스템, 또는 본 명세서에 기재된 방법은 하나 이상(예를 들어, 하나)의 표적화 모이어티 및 하나 이상의 이펙터 모이어티를 포함하는 부위-특이적 파괴제 또는 폴리펩티드의 사용을 포함하며, 이펙터 모이어티는 EZH2, 예를 들어 NP-004447.2 또는 NP_001190176.1 2에 따른 것, 또는 NM_004456.5 또는 NM_001203247.2에 의해 인코딩된 단백질 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 부위-특이적 파괴제에 사용하기 위한 MQ1은, 예를 들어 EZH2, 예를 들어 NP-004447.2 또는 NP_001190176.1 2에 따른 것, 또는 NM_004456.5 또는 NM_001203247.2에 의해 인코딩된 단백질과 대비하여 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 변이체이다. 일부 구현예에서, EZH2 변이체는 야생형 EZH2와 대비하여 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입을 포함한다. 일부 구현예에서, EZH2는 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함한다:
EZH2
Figure pct00008
일부 구현예에서, EZH2 이펙터 모이어티는 서열번호 18의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 뉴클레오티드 서열은 서열번호 18의 서열, 또는 상기 서열과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 상기 서열에 대해 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 상이한 위치를 갖는 서열을 포함한다.
EZH2
Figure pct00009
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 폴리펩티드 또는 부위-특이적 파괴제에 사용하기 위한 EZH2는, 예를 들어 서열번호 17의 EZH2 서열과 대비하여 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 변이체이다. 일부 구현예에서, EZH2 변이체는 서열번호 17과 대비하여 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입을 포함한다.
일부 구현예에서, 폴리펩티드 또는 부위-특이적 파괴제는, EZH2이거나 이를 포함하는 이펙터 모이어티 및 표적화 모이어티를 포함하는 융합 단백질이다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 또는 부위-특이적 파괴제는 본 명세서에 기재된 추가적인 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 또는 부위-특이적 파괴제는 표적 유전자 또는 복수의 표적 유전자의 발현을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 또는 부위-특이적 파괴제는 본 명세서에 기재된 유전자 발현을 조절하는, 예를 들어 감소시키는 방법, 병태를 치료하는 방법, 또는 표적 유전자 또는 복수의 표적 유전자, 예를 들어 전사 제어 요소를 후성유전학적으로 변형시키는 방법에 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 시스템, 또는 본 명세서에 기재된 방법은 하나 이상(예를 들어, 하나)의 표적화 모이어티 및 하나 이상의 이펙터 모이어티를 포함하는 부위-특이적 파괴제 또는 폴리펩티드의 사용을 포함하며, 이펙터 모이어티는 HDAC8, 예를 들어 NP_001159890 또는 NP_060956.1에 따른 것, 또는 NM_001166418 또는 NM_018486.3에 의해 인코딩된 단백질 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, HDAC8은 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함한다:
HDAC8
Figure pct00010
일부 구현예에서, HDAC8 이펙터 모이어티는 서열번호 66의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 뉴클레오티드 서열은 서열번호 66의 서열, 또는 상기 서열과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 상기 서열에 대해 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 상이한 위치를 갖는 서열을 포함한다.
HDAC8
Figure pct00011
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 폴리펩티드 또는 부위-특이적 파괴제에 사용하기 위한 HDAC8은, 예를 들어 서열번호 19의 HDAC8 서열과 대비하여 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 변이체이다. 일부 구현예에서, HDAC8 변이체는 서열번호 19와 대비하여 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입을 포함한다.
일부 구현예에서, 폴리펩티드 또는 부위-특이적 파괴제는, HDAC8이거나 이를 포함하는 이펙터 모이어티 및 표적화 모이어티를 포함하는 융합 단백질이다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 또는 부위-특이적 파괴제는 본 명세서에 기재된 추가적인 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 또는 부위-특이적 파괴제는 표적 유전자 또는 복수의 표적 유전자의 발현을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 또는 부위-특이적 파괴제는 본 명세서에 기재된 유전자 발현을 조절하는, 예를 들어 감소시키는 방법, 병태를 치료하는 방법, 또는 표적 유전자 또는 복수의 표적 유전자, 예를 들어 전사 제어 요소를 후성유전학적으로 변형시키는 방법에 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 시스템, 또는 본 명세서에 기재된 방법은 하나 이상(예를 들어, 하나)의 표적화 모이어티 및 하나 이상의 이펙터 모이어티를 포함하는 부위-특이적 파괴제 또는 폴리펩티드의 사용을 포함하며, 이펙터 모이어티는 G9A, 예를 들어 NP_001350618.1에 따른 것, 또는 NM_001363689.1에 의해 인코딩된 단백질 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편, 예를 들어 G9A, 예를 들어 NP_001350618.1에 따른 것 또는 NM_001363689.1에 의해 인코딩된 단백질의 aa967 내지 1250이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, G9A는 서열번호 67의 아미노산 서열을 포함한다:
G9A
Figure pct00012
일부 구현예에서, G9A 이펙터 모이어티는 서열번호 68의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 뉴클레오티드 서열은 서열번호 68의 서열, 또는 상기 서열과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 상기 서열에 대해 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 상이한 위치를 갖는 서열을 포함한다.
G9A
Figure pct00013
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 폴리펩티드 또는 부위-특이적 파괴제에 사용하기 위한 G9A는, 예를 들어 서열번호 67의 G9A 서열과 대비하여 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 변이체이다. 일부 구현예에서, G9A 변이체는 서열번호 67과 대비하여 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입을 포함한다.
일부 구현예에서, 폴리펩티드 또는 부위-특이적 파괴제는, G9A이거나 이를 포함하는 이펙터 모이어티 및 표적화 모이어티를 포함하는 융합 단백질이다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 또는 부위-특이적 파괴제는 본 명세서에 기재된 추가적인 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 또는 부위-특이적 파괴제는 표적 유전자 또는 복수의 표적 유전자의 발현을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 또는 부위-특이적 파괴제는 본 명세서에 기재된 유전자 발현을 조절하는, 예를 들어 감소시키는 방법, 병태를 치료하는 방법, 또는 표적 유전자 또는 복수의 표적 유전자, 예를 들어 전사 제어 요소를 후성유전학적으로 변형시키는 방법에 사용될 수 있다.
시스템
본 개시내용의 시스템은 2개 이상의 부위-특이적 파괴제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제 시스템은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개, 또는 그 이상(그리고 선택적으로 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 또는 2개 이하)의 부위-특이적 파괴제를 포함한다. 일부 구현예에서, 시스템은 2개 이상의 상이한 서열(예를 들어, 1번째 및 2번째, 3번째, 4번째, 5번째, 6번째, 7번째, 8번째, 9번째, 10번째, 11번째, 12번째, 및/또는 그 이상의 DNA 서열, 및 선택적으로 20번째, 19번째, 18번째, 17번째, 16번째, 15번째, 14번째, 13번째, 12번째, 11번째, 10번째, 9번째, 8번째, 6번째, 5번째, 4번째, 3번째, 또는 2번째 이하의 DNA 서열)을 표적화한다. 일부 구현예에서, 시스템은 복수의 부위-특이적 파괴제를 포함하며, 복수의 부위-특이적 파괴제의 각 구성원은 복수의 부위-특이적 파괴제의 또 다른 구성원에 검출가능하게 결합하지 않으며, 예를 들어 그것에 결합하지 않는다. 일부 구현예에서, 시스템은 제1 부위-특이적 파괴제 및 제2 부위-특이적 파괴제를 포함하며, 제1 부위-특이적 파괴제는 제2 부위-특이적 파괴제에 검출가능하게 결합하지 않으며, 예를 들어 그것에 결합하지 않는다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 시스템은 2개 이상의 부위-특이적 파괴제를 포함하며, 부위-특이적 파괴제는 조성물, 약제학적 조성물, 또는 혼합물 형태로 함께 존재한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 시스템은 2개 이상의 부위-특이적 파괴제를 포함하며, 하나 이상의 부위-특이적 파괴제는 적어도 하나의 기타 다른 부위-특이적 파괴제와 혼합되지 않는다. 일부 구현예에서, 시스템은 제1 부위-특이적 파괴제 및 제2 부위-특이적 파괴제를 포함할 수 있으며, 세포의 핵 내의 제1 부위-특이적 파괴제의 존재는 동일한 세포의 핵 내의 제2 부위-특이적 파괴제의 존재와 중첩되지 않으며, 시스템은 제1 및 제2 부위-특이적 파괴제의 비중첩 존재를 통해 복수의 유전자의 발현 감소를 달성한다. 일부 구현예에서, 제1 부위-특이적 파괴제 및 제2 부위-특이적 파괴제는 동시에 또는 순차적으로 작용할 수 있다.
일부 구현예에서, 시스템의 부위-특이적 파괴제들은 각각 상이한 표적화 모이어티를 포함한다(예를 들어, 제1, 제2, 제3, 또는 추가의 부위-특이적 파괴제는 각각 서로 상이한 표적화 모이어티를 포함함). 예를 들어, 시스템은 제1 부위-특이적 파괴제 및 제2 부위-특이적 파괴제를 포함할 수 있으며, 제1 부위-특이적 파괴제는 제1 표적화 모이어티(예를 들어, Cas9 도메인, TAL 이펙터 도메인, 또는 Zn 핑거 도메인)를 포함하고, 제2 부위-특이적 파괴제는 제1 표적화 모이어티와 상이한 제2 표적화 모이어티(예를 들어, Cas9 도메인, TAL 이펙터 도메인, 또는 Zn 핑거 도메인)를 포함한다. 일부 구현예에서, '상이한'이란, 별개의 유형의 표적화 모이어티를 포함한다는 것을 의미할 수 있으며, 예를 들어 제1 표적화 모이어티는 Cas9 도메인을 포함하고, 제2 DNA-표적화 모이어티는 Zn 핑거 도메인을 포함한다. 다른 구현예에서, '상이한'이란, 동일한 유형의 표적화 모이어티의 별개의 변이체를 포함한다는 것을 의미할 수 있으며, 예를 들어 제1 표적화 모이어티는 (예를 들어, 제1 종으로부터의) 제1 Cas9 도메인을 포함하고, 제2 표적화 모이어티는 (예를 들어, 제2 종으로부터의) 제2 Cas9 도메인을 포함한다.
일 구현예에서, 시스템이 동일한 유형의 2개 이상의 표적화 모이어티, 예를 들어 2개 이상의 Cas9 또는 Zn 핑거 도메인을 포함할 때, 표적화 모이어티는 2개 이상의 상이한 서열에 특이적으로 결합한다. 예를 들어, 2개 이상의 Cas9 도메인을 포함하는 시스템에서, 2개 이상의 Cas9 도메인은 이들 도메인이 단지 이들의 표적 서열에 상응하는 gRNA에만 두드러지게 결합하도록(예를 들어, 또 다른 Cas9 도메인의 표적에 상응하는 gRNA에는 두드러지게 결합하지 않도록) 선택되거나 변경될 수 있다. 추가의 예에서, 2개 이상의 이펙터 모이어티를 포함하는 시스템에서, 2개 이상의 이펙터 모이어티는, 이들 모이어티가 단지 이들의 표적 서열에만 두드러지게 결합하도록(예를 들어, 또 다른 이펙터 모이어티의 표적 서열에는 두드러지게 결합하지 않도록) 선택되거나 변경될 수 있다.
일부 구현예에서, 시스템은 3개 이상의 부위-특이적 파괴제를 포함하며, 2개 이상의 부위-특이적 파괴제는 동일한 표적화 모이어티를 포함한다. 예를 들어, 시스템은 3개의 부위-특이적 파괴제를 포함할 수 있으며, 제1 및 제2 부위-특이적 파괴제 둘 모두는 제1 표적화 모이어티를 포함하고, 제3 부위-특이적 파괴제는 상이한 제2 표적화 모이어티를 포함한다. 추가로 예를 들어, 시스템은 4개의 부위-특이적 파괴제를 포함할 수 있으며, 제1 및 제2 부위-특이적 파괴제 둘 모두는 제1 표적화 모이어티를 포함하고, 제3 및 제4 부위-특이적 파괴제는 상이한 제2 표적화 모이어티를 포함한다. 추가로 예를 들어, 시스템은 5개의 부위-특이적 파괴제를 포함할 수 있으며, 제1 및 제2 부위-특이적 파괴제 둘 모두는 제1 표적화 모이어티를 포함하고, 제3 및 제4 부위-특이적 파괴제 둘 모두는 상이한 제2 표적화 모이어티를 포함하고, 제5 부위-특이적 파괴제는 상이한 제3 표적화 모이어티를 포함한다. 상기에 기재된 바와 같이, '상이한'이란, 상이한 유형의 표적화 모이어티를 포함한다는 것, 또는 동일한 유형의 표적화 모이어티의 별개의 변이체를 포함한다는 것을 의미할 수 있다.
일부 구현예에서, 시스템의 부위-특이적 파괴제들은 각각 상이한 DNA 서열에 결합한다(예를 들어, 제1, 제2, 제3, 또는 추가의 부위-특이적 파괴제는 각각 서로 상이한 DNA 서열에 결합함). 예를 들어, 시스템은 제1 부위-특이적 파괴제 및 제2 부위-특이적 파괴제를 포함할 수 있으며, 제1 부위-특이적 파괴제는 제1 DNA 서열에 결합하고, 제2 부위-특이적 파괴제는 제2 DNA 서열에 결합한다. 상이한 DNA 서열을 포함하는 일부 구현예에서, 하나의 부위-특이적 파괴제에 의해 결합된 DNA 서열과 또 다른 부위-특이적 파괴제에 의해 결합된 DNA 서열 사이에 동일하지 않은 적어도 하나의 위치가 있거나, 하나의 부위-특이적 파괴제에 의해 결합된 DNA 서열 내에 존재하지만 또 다른 부위-특이적 파괴제에 의해 결합된 DNA 서열 내에는 존재하지 않는 적어도 하나의 위치가 있다.
일부 구현예에서, 제1 DNA 서열은 제1 게놈 DNA 가닥 상에 위치할 수 있고, 제2 DNA 서열은 제2 게놈 DNA 가닥 상에 위치할 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 DNA 서열은 제2 DNA 서열과 동일한 게놈 DNA 가닥 상에 위치할 수 있다.
일부 구현예에서, 시스템은 3개 이상의 부위-특이적 파괴제를 포함하며, 2개 이상의 부위-특이적 파괴제는 동일한 DNA 서열에 결합한다. 예를 들어, 시스템은 3개의 부위-특이적 파괴제를 포함할 수 있으며, 제1 및 부위-특이적 파괴제 둘 모두는 제1 DNA 서열에 결합하고, 제3 부위-특이적 파괴제는 상이한 제2 DNA 서열에 결합한다. 추가로 예를 들어, 시스템은 4개의 부위-특이적 파괴제를 포함할 수 있으며, 제1 및 제2 부위-특이적 파괴제 둘 모두는 제1 DNA 서열에 결합하고, 제3 및 제4 부위-특이적 파괴제 둘 모두는 제2 DNA 서열에 결합한다. 추가로 예를 들어, 시스템은 5개의 부위-특이적 파괴제를 포함할 수 있으며, 제1 및 제2 부위-특이적 파괴제 둘 모두는 제1 DNA 서열에 결합하고, 제3 및 제4 부위-특이적 파괴제 둘 모두는 제2 DNA 서열에 결합하고, 제5 부위-특이적 파괴제는 제3 DNA 서열에 결합한다. 상기 기재된 바와 같이, '상이한'이란, 하나의 부위-특이적 파괴제에 의해 결합된 DNA 서열과 또 다른 부위-특이적 파괴제에 의해 결합된 DNA 서열 사이에 동일하지 않은 적어도 하나의 위치가 존재한다는 것, 또는 하나의 부위-특이적 파괴제에 의해 결합된 DNA 서열 내에 존재하는 적어도 하나의 위치가 또 다른 부위-특이적 파괴제에 의해 결합된 DNA 서열 내에는 존재하지 않는다는 것을 의미할 수 있다.
일부 구현예에서, 시스템은 2개 이상(예를 들어, 2개)의 부위-특이적 파괴제를 포함하며, 이들 부위-특이적 파괴제 중 복수개(예를 들어, 2개)는 상이한 DNA 서열에 결합하는 표적화 모이어티를 포함한다. 그러한 구현예에서, 제1 표적화 모이어티는 제1 DNA 서열에 결합할 수 있고, 제2 DNA-표적화 모이어티는 제2 DNA 서열에 결합할 수 있으며, 제1 및 제2 DNA 서열은 상이하고 중첩되지 않는다. 일부 그러한 구현예에서, 제1 DNA 서열은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100개의 염기쌍(그리고 선택적으로, 500, 400, 300, 200, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 또는 50개 이하의 염기쌍)으로 제2 DNA 서열로부터 분리되어 있다. 일부 그러한 구현예에서, 제1 DNA 서열은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100개 이하의 염기쌍(그리고 선택적으로, 0개의 염기쌍, 예를 들어 제1 서열과 제2 서열이 서로 직접 인접함)으로 제2 DNA 서열로부터 분리되어 있다.
일부 구현예에서, 시스템의 부위-특이적 파괴제들은 각각 상이한 이펙터 모이어티를 포함한다(예를 들어, 제1, 제2, 제3, 또는 추가의 부위-특이적 파괴제는 각각 서로 상이한 이펙터 모이어티를 포함함). 예를 들어, 시스템은 제1 부위-특이적 파괴제 및 제2 부위-특이적 파괴제를 포함할 수 있으며, 제1 부위-특이적 파괴제는 제1 이펙터 모이어티를 포함하고, 제2 부위-특이적 파괴제는 제1 이펙터 모이어티와 상이한 제2 이펙터 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 상이한 이펙터 모이어티는 별개의 유형의 이펙터 모이어티를 포함한다. 다른 구현예에서, 상이한 이펙터 모이어티는 동일한 유형의 이펙터 모이어티의 별개의 변이체를 포함한다.
표적화 모이어티
표적화 모이어티는 DNA 서열, 예를 들어 복수의 표적 유전자와 연관된 DNA 서열, 예를 들어 복수의 표적 유전자를 포함하는 ASMC의 앵커 서열에 특이적으로 결합할 수 있다. DNA 서열에 특이적으로 결합하는 임의의 분자 또는 화합물이 표적화 모이어티로서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 표적화 모이어티는, 예를 들어 앵커 서열, 예를 들어 복수의 표적 유전자를 포함하는 ASMC의 앵커 서열에 상보적인 서열을 포함하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 앵커 서열에 대한 게놈 복합체 성분(예를 들어, 핵형성 폴리펩티드, 예를 들어 CTCF)의 결합을 물리적/입체적으로 차단하는 올리고뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 핵산은, 예를 들어 CRISPR/Cas 분자와 호환가능한 가이드 RNA(gRNA)를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 CRISPR/Cas 분자, TAL 이펙터 분자, Zn 핑거 분자, tetR 도메인, 메가뉴클레아제, 펩티드 핵산(PNA) 또는 핵산 분자를 포함한다.
일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100, 50, 40, 30, 20, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 0.1, 0.09, 0.08, 0.07, 0.06, 0.05, 0.04, 0.03, 0.02, 0.01, 0.005, 0.002, 또는 0.001 nM 이하의 KD(그리고 선택적으로, 적어도 50, 40, 30, 20, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 0.1, 0.09, 0.08, 0.07, 0.06, 0.05, 0.04, 0.03, 0.02, 0.01, 0.005, 0.002, 또는 0.001 nM의 KD)로 그의 표적 서열에 결합한다. 일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 0.001 nM 내지 500 nM, 예를 들어 0.1 nM 내지 5 nM, 예를 들어 약 0.5 nM의 KD로 그의 표적 서열에 결합한다. 일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 적어도 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 5000, 10,000, 또는 100,000 nM의 KD로 비표적 서열에 결합한다(그리고 선택적으로, 비표적 서열에는 두드러지게 결합하지 않음). 일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 비표적 서열에 결합하지 않는다.
일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 표 7로부터 선택되는 서열, 또는 상기 서열과 적어도 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 동일성을 갖거나, 상기 서열에 대해 1, 2, 3, 4, 또는 5개 이하의 상이한 위치를 갖는 서열을 포함하는 핵산을 포함한다.
예시적인 서열
명칭 서열 서열번호
GD-28481 AGCCCCACCTTGTGGTCAGA 21
GD-28482 AGTGCTGCCTTCTGACCACA 22
GD-28483 GCTGCCTTCTGACCACAAGG 23
GD-28484 CCAGTATAAGCCCCACCTTG 24
GD-28485 CTGCCTGTCCCATAAGGAGG 25
GD-28486 GCACTGCCTGTCCCATAAGG 26
GD-28487 GGTCCTCCTCCTTATGGGAC 27
GD-28488 GCCTTGTTTTCGGCTCTAGA 28
GD-28489 GCCATCTAGAGCCGAAAACA 29
GD-29251 CCAATGAAGATGAAACTGGG 30
GD-29252 AACGTGCTTGCCTAAGATTC 31
GD-29253 AGCCCTTAATCATATCTAGT 32
GD-29254 CAGAGCTTAAGACCTGTACT 33
GD-29255 GCCCACCTTGACCTTCACAA 34
일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 표 6으로부터 선택되는 서열, 또는 상기 서열과 적어도 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 동일성을 갖거나, 상기 서열에 대해 1, 2, 3, 4, 또는 5개 이하의 상이한 위치를 갖는 서열을 포함하는 핵산을 포함한다.
예시적인 가이드 서열
가이드 서열 가닥 게놈 좌표
GD-30178 GTTACTGCGTAATTACCAGG
(서열번호 35)		 + GRCh37: chr4:74528428-74528450
GD-30179 TATTACATCCTACCTATAAG
(서열번호 36)		 + GRCh37: chr4:74528567-74528589
GD-30180 TGGGCTCTGGACTTAGATCG
(서열번호 37)		 + GRCh37: chr4:74528609-74528631
GD-30181 TAAGTGGGCTATGTATACAC
(서열번호 38)		 + GRCh37: chr4:74789132-74789154
GD-30182 TTTCTAAGTCTGTCACAAGG
(서열번호 39)		 - GRCh37: chr4:74789250-74789272
GD-30183 AAAGTAATATGATCTAGGAA
(서열번호 40)		 - GRCh37: chr4:74789312-74789334
GD-30184 GTTCGAGCGGCTGTGCGAGG
(서열번호 41)		 + GRCh37: chr4:74964853-74964875
GD-30185 GCTCTGTGGCTCTCCGAGAA
(서열번호 42)		 + GRCh37: chr4:74964906-74964928
GD-30186 GTGTGTGTGTTTCAACGTAG
(서열번호 43)		 + GRCh37: chr4:74965538-74965560
GD-30187 GGAAGTCACTGGGAGCTGCG
(서열번호 44)		 + GRCh37: chr4:74965737-74965759
GD-30200 GGCCACGGGTGTGTTCCCAG
(서열번호 45)		 - GRCh37: chr4:75000031-75000053
GD-30201 ATGGCCATTTGCAAAAGTCA
(서열번호 46)		 + GRCh37: chr4:75000115-75000137
GD-30202 CCAAACTAGACAGATAAAGC
(서열번호 47)		 + GRCh37: chr4:75000231-75000253
GD-30203 CCAGCATGACTCTAGCATGC
(서열번호 48)		 - GRCh37: chr4:74975146-74975168
GD-30204 TGGCCAAGGTCTGATATGCA
(서열번호 49)		 + GRCh37: chr4:74975369-74975391
GD-30205 TCATGAGTCCCAGAACATGT
(서열번호 50)		 - GRCh37: chr4:74976318-74976340
GD-30206 GCGAAAGAAGTAGTAGCTAA
(서열번호 51)		 - GRCh37: chr4:74570348-74570370
GD-30207 GACTAAGACTGGCAAATCTG
(서열번호 52)		 - GRCh37: chr4:74570503-74570525
GD-30208 GACTAAGAGGAGCCGACATG
(서열번호 53)		 + GRCh37: chr4:74570526-74570548
GD-30238 GAAAAACGGGTGTTGTGACG
(서열번호 54)		 + GRCm38: chr5:90661492-90661514
GD-30239 TTTGTGAACTAAGGATTCTG
(서열번호 55)		 - GRCm38: chr5:90661646-90661668
GD-30240 GTCCGTGTAGAGTTACCATG
(서열번호 56)		 + GRCm38: chr5:90661744-90661766
GD-30241 GATGTATTCACAAGAGGACT
(서열번호 57)		 + GRCm38: chr5:90785610-90785632
GD-30242 AATTACTACCTCATAGCTAG
(서열번호 58)		 - GRCm38: chr5:90909047-90909069
GD-30592 GAAGGTAGAAATCCGCCACT
(서열번호 59)		 GRCm38: chr5:90785724-90785746
GD-30593 GAAACGCCGAGGTAACTCAT
(서열번호 60)		 GRCm38: chr5:90788137-90788159
GD-30594 CAACTAAAATTTCTAGCCCT
(서열번호 61)		 GRCm38: chr5:90908926-90908948
GD-28044 GACTCCAGTCTTTCTAGAAGA
(서열번호: 62)		 GRCm38: chr6:113076028-113076047
일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 앵커 서열, 예를 들어 복수의 표적 유전자를 포함하거나, 서열에 대해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이하의 비상보적인 위치를 갖는 ASMC의 앵커 서열에 상보적인 서열을 포함하는 핵산을 포함한다.
일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 게놈 좌표 chr4:74595464-74595486, chr4:74595457-74595479, chr4:74595460-74595482, chr4:74595472-74595494, chr4:75000088-75000110, chr4:75000091-75000113, chr4:75000085-75000107, chr4:75000157-75000179, chr4:75000156-75000178, chr4:74595215-74595237, chr4:74595370-74595392, chr4:74595560-74595582, chr4:74595642-74595664, chr4:74595787-74595809, chr4:74528428-74528450, chr4:74528567-74528589, chr4:74528609-74528631, chr4:74789132-74789154, chr4:74789250-74789272, chr4:74789312-74789334, chr4:74964853-74964875, chr4:74964906-74964928, chr4:74965538-74965560, chr4:74965737-74965759, chr4:75000031-75000053, chr4:75000115-75000137, chr4:75000231-75000253, chr4:74975146-74975168, chr4:74975369-74975391, chr4:74976318-74976340, chr4:74570348-74570370, chr4:74570503-74570525, chr4:74570526-74570548, chr5:90785724-90785746, chr5:90788137-90788159, chr5:90908926-90908948, chr5:90661492-90661514, chr5:90661646-90661668, chr5:90661744-90661766, chr5:90785610-90785632, chr5:90909047-90909069, 또는 chr6:113076028-113076047을 갖는 영역과 적어도 부분적으로 중첩되는 서열, 또는 상기 영역의 5, 10, 15, 20, 30, 40, 또는 50개 뉴클레오티드 내에 있는 서열을 포함하는 핵산을 포함하거나, 상기 게놈 영역의 서열과 적어도 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 동일성을 갖거나, 상기 서열에 대해 1, 2, 3, 4, 또는 5개 이하의 상이한 위치를 갖는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 게놈 위치 chr4:74595464-74595486, chr4:74595457-74595479, chr4:74595460-74595482, chr4:74595472-74595494, chr4:75000088-75000110, chr4:75000091-75000113, chr4:75000085-75000107, chr4:75000157-75000179, chr4:75000156-75000178, chr4:74595215-74595237, chr4:74595370-74595392, chr4:74595560-74595582, chr4:74595642-74595664, chr4:74595787-74595809, chr4:74528428-74528450, chr4:74528567-74528589, chr4:74528609-74528631, chr4:74789132-74789154, chr4:74789250-74789272, chr4:74789312-74789334, chr4:74964853-74964875, chr4:74964906-74964928, chr4:74965538-74965560, chr4:74965737-74965759, chr4:75000031-75000053, chr4:75000115-75000137, chr4:75000231-75000253, chr4:74975146-74975168, chr4:74975369-74975391, chr4:74976318-74976340, chr4:74570348-74570370, chr4:74570503-74570525, chr4:74570526-74570548, chr5:90661492-90661514, chr5:90661646-90661668, chr5:90661744-90661766, chr5:90785610-90785632, chr5:90909047-90909069, chr5:90785724-90785746, chr5:90788137-90788159, chr5:90908926-90908948, 또는 chr6:113076028-113076047에서 서열에 결합한다.
일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 앵커 서열 또는 앵커 서열에 근접한 부위, 예를 들어 복수의 표적 유전자를 전체적으로 또는 부분적으로 포함하는 ASMC의 일부인 앵커 서열에 근접한 부위에 결합한다.
일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 CRISPR/Cas 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 이펙터 모이어티는 CRISPR/Cas 분자를 포함한다. CRISPR/Cas 분자는 클러스터화된 규칙적으로 사이 공간을 둔 짧은 회문성 반복(clustered regulatory interspaced short palindromic repeat; CRISPR) 시스템에 관여하는 단백질, 예를 들어 Cas 단백질, 및 선택적으로, 가이드 RNA, 예를 들어 단일 가이드 RNA(sgRNA)를 포함한다.
CRISPR 시스템은 원래 박테리아 및 고세균에서 발견된 적응 방어 시스템이다. CRISPR 시스템은 CRISPR-연관 또는 "Cas" 엔도뉴클레아제(예를 들어, Cas9 또는 Cpf1)로 지칭되는 RNA-유도 뉴클레아제를 사용하여 외래 DNA를 절단한다. 예를 들어, 통상적인 CRISPR/Cas 시스템에서, 엔도뉴클레아제는 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA 서열을 표적화하는 서열-특이적, 비-코딩 "가이드 RNA"에 의해 표적 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 서열-편집할 게놈 내의 부위)로 지시된다. CRISPR 시스템의 3가지 클래스(I 내지 III)가 확인되었다. 클래스 II CRISPR 시스템은 (다수의 Cas 단백질이 아닌) 단일 Cas 엔도뉴클레아제를 사용한다. 하나의 클래스 II CRISPR 시스템은 Cas9와 같은 II형 Cas 엔도뉴클레아제, CRISPR RNA("crRNA"), 및 트랜스-활성화 crRNA("tracrRNA")를 포함한다. crRNA는 통상적으로 표적 DNA 서열에 상응하는 약 20개 뉴클레오티드 RNA 서열인 "가이드 RNA"를 포함한다. crRNA는 또한 tracrRNA에 결합하여 RNase III에 의해 절단되는 부분적으로 이중 가닥인 구조를 형성하여 crRNA/tracrRNA 하이브리드를 생성하는 영역을 포함한다. 그 다음 crRNA/tracrRNA 하이브리드는 Cas9 엔도뉴클레아제가 표적 DNA 서열을 인식하고 절단하도록 지시한다. 표적 DNA 서열은 일반적으로 주어진 Cas 엔도뉴클레아제에 특이적인 "프로토스페이서 인접 모티프"(protospacer adjacent motif; "PAM")에 인접하여야 하지만; PAM 서열은 주어진 게놈 전체에 걸쳐 나타난다. 다양한 원핵생물 종으로부터 확인된 CRISPR 엔도뉴클레아제는 고유한 PAM 서열 요건을 가지며; PAM 서열의 예로는 5'-NGG(스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)), 5'-NNAGAA(스트렙토코커스 써모필루스(Streptococcus thermophilus) CRISPR1), 5'-NGGNG(스트렙토코커스 써모필루스 CRISPR3), 및 5'-NNNGATT(네이세리아 메닝지디티스(Neisseria meningiditis))가 포함된다. 일부 엔도뉴클레아제, 예를 들어 Cas9 엔도뉴클레아제는 G-풍부 PAM 부위, 예를 들어 5'-NGG(예를 들어, TGG, 예를 들어 CGG, 예를 들어 AGG)와 회합되며, PAM 부위로부터(이의 5'로부터) 3개 뉴클레오티드 상류의 위치에서 표적 DNA의 평활 말단(blunt-end) 절단을 수행한다. 또 다른 클래스 II CRISPR 시스템은, Cas9보다 작은 V형 엔도뉴클레아제 Cpf1를 포함하며, 예에는 AsCpf1((아시다미노코커스(Acidaminococcus) 종 유래) 및 LbCpf1((라크노스피라세(Lachnospiraceae) 종 유래)이 포함된다. Cpf1-연관 CRISPR 어레이는 tracrRNA의 필요 없이 성숙한 crRNA로 처리되며; 즉, Cpf1 시스템은 표적 DNA 서열을 절단하기 위해 Cpf1 뉴클레아제 및 crRNA만을 필요로 한다. Cpf1 엔도뉴클레아제는 T-풍부 PAM 부위, 예를 들어 5'-TTN과 회합된다. Cpf1은 또한 5'-CTA PAM 모티프를 인식할 수 있다. Cpf1은 4- 또는 5-뉴클레오티드 5' 오버행(overhang)을 갖는 오프셋 또는 엇갈린 이중 가닥 파손을 도입함으로써, 예를 들어 코딩 가닥 상에서 PAM 부위로부터(이의 3'로부터) 18개 뉴클레오티드 하류, 및 상보적 가닥 상에서 PAM 부위로부터 23개 뉴클레오티드 하류에 위치한 5-뉴클레오티드 오프셋 또는 엇갈린 절단물을 갖는 표적 DNA를 절단하며; 그러한 오프셋 절단으로 인한 5-뉴클레오티드 오버행은 평활 말단 절단된 DNA에서의 삽입에 의한 것보다는, 상동성 재조합에 의한 DNA 삽입에 의해 더 정확한 유전체 편집을 가능하게 한다. 예를 들어 문헌[Zetsche et al. (2015) Cell, 163:759 - 771]을 참조한다.
다양한 CRISPR 연관(Cas) 유전자 또는 단백질이 본 개시내용에 의해 제공되는 기술에 사용될 수 있으며, Cas 단백질의 선택은 본 방법의 특정 조건에 따라 달라질 것이다. Cas 단백질의 특정 예는 Cas1, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9, Cas10, Cpf1, C2C1, 또는 C2C3을 포함하는 클래스 II 시스템을 포함한다. 일부 구현예에서, Cas 단백질, 예를 들어 Cas9 단백질은 다양한 원핵생물 종들 중 임의의 것으로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 특정 Cas 단백질, 예를 들어 특정 Cas9 단백질은 특정 프로토스페이서-인접 모티프(PAM) 서열을 인식하도록 선택된다. 일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 서열 표적화 폴리펩티드, 예컨대 Cas 단백질, 예를 들어 Cas9를 포함한다. 특정 구현예에서, Cas 단백질, 예를 들어 Cas9 단백질은 박테리아 또는 고세균으로부터 수득되거나, 또는 알려진 방법을 사용하여 합성될 수 있다. 특정 구현예에서, Cas 단백질은 그람 양성 박테리아 또는 그람 음성 박테리아에서 유래할 수 있다. 특정 구현예에서, Cas 단백질은 스트렙토코커스(예를 들어, S. 피오게네스, 또는 S. 써모필루스), 프란시셀라(Francisella)(예를 들어, F. 노비시다(novicida)), 스타필로코커스(예를 들어, S. 아우레우스(aureus)), 아시다미노코커스(예를 들어, 아시다미노코커스 종 BV3L6), 네이세리아(예를 들어, N. 메닝지티디스), 크립토코커스, 코리네박테리움, 헤모필루스(Haemophilus), 유박테리움(Eubacterium), 파스퉤렐라(Pasteurella), 프레보텔라(Prevotella), 베일로넬라(Veillonella), 또는 마리노박터(Marinobacter)에서 유래할 수 있다.
일부 구현예에서, Cas 단백질은 Cas 단백질이 결합 및/또는 기능하기 위한 표적 DNA 서열에 존재하거나 이에 인접하기 위해 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)를 필요로 한다. 일부 구현예에서, PAM은 5'에서 3'으로 NGG, YG, NNGRRT, NNNRRT, NGA, TYCV, TATV, NTTN, 또는 NNNGATT이거나, 이를 포함하며, 여기서 N은 임의의 뉴클레오티드를 나타내고, Y는 C 또는 T를 나타내고, R은 A 또는 G를 나타내고, V는 A 또는 C 또는 G를 나타낸다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 표 1에 열거된 단백질이다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 그의 PAM을 변경하는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 E1369R, E1449H, 및 R1556A 돌연변이 또는 상기 위치에 상응하는 아미노산에 대한 유사한 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 E782K, N968K, 및 R1015H 돌연변이 또는 상기 위치에 상응하는 아미노산에 대한 유사한 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 D1135V, R1335Q, 및 T1337R 돌연변이 또는 상기 위치에 상응하는 아미노산에 대한 유사한 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 S542R 및 K607R 돌연변이 또는 상기 위치에 상응하는 아미노산에 대한 유사한 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 S542R, K548V, 및 N552R 돌연변이 또는 상기 위치에 상응하는 아미노산에 대한 유사한 치환을 포함한다.
명칭 효소 종 AA의 수 PAM PAM 인식을 변경시키기 위한 돌연변이 촉매적으로 사멸되게(catalytically dead) 하기 위한 돌연변이
FnCas9 Cas9 프란시셀라 노비시다 1629 5'-NGG-3' Wt D11A/H969A/N995A
FnCas9 RHA Cas9 프란시셀라 노비시다 1629 5'-YG-3' E1369R/E1449H/R1556A D11A/H969A/N995A
SaCas9 Cas9 스타필로코커스 아우레우스 1053 5'-NNGRRT-3' Wt D10A/H557A
SaCas9 KKH Cas9 스타필로코커스 아우레우스 1053 5'-NNNRRT-3' E782K/N968K/R1015H D10A/H557A
SpCas9 Cas9 스트렙토코커스 피오게네스 1368 5'-NGG-3' Wt D10A/D839A/H840A/N863A
SpCas9 VQR Cas9 스트렙토코커스 피오게네스 1368 5'-NGA-3' D1135V/R1335Q/T1337R D10A/D839A/H840A/N863A
AsCpf1 RR Cpf1 아시다미노코커스 종 BV3L6 1307 5'-TYCV-3' S542R/K607R E993A
AsCpf1 RVR Cpf1 아시다미노코커스 종 BV3L6 1307 5'-TATV-3' S542R/K548V/N552R E993A
FnCpf1 Cpf1 프란시셀라 노비시다 1300 5'-NTTN-3' Wt D917A/E1006A/D1255A
NmCas9 Cas9 네이세리아 메닝지디티스 1082 5'-NNNGATT-3' Wt D16A/D587A/H588A/N611A
일부 구현예에서, Cas 단백질은 촉매적으로 활성적이고, 표적 DNA 부위의 한 가닥 또는 두 가닥 모두를 절단한다. 일부 구현예에서, 표적 DNA 부위를 절단한 후, 예를 들어 세포 복구 기구에 의해 변경, 예를 들어 삽입 또는 결실이 형성된다.
일부 구현예에서, Cas 단백질은 뉴클레아제, 예를 들어 뉴클레아제-결핍 Cas9를 탈활성화하도록 변형된다. 야생형 Cas9는 gRNA에 의해 표적화된 특이적인 DNA 서열에서 이중 가닥 파손(DSB)을 생성하는 반면, 변형된 기능기를 갖는 다수의 CRISPR 엔도뉴클레아제가 이용가능하며, 예를 들어, Cas9의 "닉카제" 형태는 단일 가닥 파손만을 생성하고; 촉매적으로 비활성인 Cas9("dCas9")는 표적 DNA를 절단하지 않는다. 일부 구현예에서, DNA 서열에 결합하는 dCas9는 입체 장애에 의해 해당 부위에서 전사를 방해할 수 있다. 일부 구현예에서, 앵커 서열에 대한 dCas9 결합은 게놈 복합체(예를 들어, ASMC) 형성 및/또는 유지를 방해할 수 있다(예를 들어, 감소시키거나 방지할 수 있음). 일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 촉매적으로 비활성인 Cas9, 예를 들어 dCas9, 예를 들어 Cas9m4를 포함한다. 많은 촉매적으로 비활성인 Cas9 단백질이 당업계에 알려져 있다. 일부 구현예에서, dCas9는 Cas 단백질의 각 엔도뉴클레아제 도메인 내의 돌연변이, 예를 들어 D10A 및 H840A 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 촉매적으로 비활성인 Cas9 단백질, 예를 들어 dCas9는 D11A 돌연변이 또는 상기 위치에 상응하는 아미노산에 대한 유사한 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 촉매적으로 비활성인 Cas9 단백질, 예를 들어 dCas9는 H969A 돌연변이 또는 상기 위치에 상응하는 아미노산에 대한 유사한 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 촉매적으로 비활성인 Cas9 단백질, 예를 들어 dCas9는 N995A 돌연변이 또는 상기 위치에 상응하는 아미노산에 대한 유사한 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 촉매적으로 비활성인 Cas9 단백질, 예를 들어 dCas9는 D11A, H969A, 및 N995A 돌연변이 또는 상기 위치에 상응하는 아미노산에 대한 유사한 치환을 포함한다.
일부 구현예에서, 촉매적으로 비활성인 Cas9 단백질, 예를 들어 dCas9는 D10A 돌연변이 또는 상기 위치에 상응하는 아미노산에 대한 유사한 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 촉매적으로 비활성인 Cas9 단백질, 예를 들어 dCas9는 H557A 돌연변이 또는 상기 위치에 상응하는 아미노산에 대한 유사한 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 촉매적으로 비활성인 Cas9 단백질, 예를 들어 dCas9는 D10A 및 H557A 돌연변이 또는 상기 위치에 상응하는 아미노산에 대한 유사한 치환을 포함한다.
일부 구현예에서, 촉매적으로 비활성인 Cas9 단백질, 예를 들어 dCas9는 D839A 돌연변이 또는 상기 위치에 상응하는 아미노산에 대한 유사한 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 촉매적으로 비활성인 Cas9 단백질, 예를 들어 dCas9는 H840A 돌연변이 또는 상기 위치에 상응하는 아미노산에 대한 유사한 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 촉매적으로 비활성인 Cas9 단백질, 예를 들어 dCas9는 N863A 돌연변이 또는 상기 위치에 상응하는 아미노산에 대한 유사한 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 촉매적으로 비활성인 Cas9 단백질, 예를 들어 dCas9는 D10A, D839A, H840A, 및 N863A 돌연변이 또는 상기 위치에 상응하는 아미노산에 대한 유사한 치환을 포함한다.
일부 구현예에서, 촉매적으로 비활성인 Cas9 단백질, 예를 들어 dCas9는 E993A 돌연변이 또는 상기 위치에 상응하는 아미노산에 대한 유사한 치환을 포함한다.
일부 구현예에서, 촉매적으로 비활성인 Cas9 단백질, 예를 들어 dCas9는 D917A 돌연변이 또는 상기 위치에 상응하는 아미노산에 대한 유사한 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 촉매적으로 비활성인 Cas9 단백질, 예를 들어 dCas9는 E1006A 돌연변이 또는 상기 위치에 상응하는 아미노산에 대한 유사한 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 촉매적으로 비활성인 Cas9 단백질, 예를 들어 dCas9는 D1255A 돌연변이 또는 상기 위치에 상응하는 아미노산에 대한 유사한 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 촉매적으로 비활성인 Cas9 단백질, 예를 들어 dCas9는 D917A, E1006A, 및 D1255A 돌연변이 또는 상기 위치에 상응하는 아미노산에 대한 유사한 치환을 포함한다.
일부 구현예에서, 촉매적으로 비활성인 Cas9 단백질, 예를 들어 dCas9는 D16A 돌연변이 또는 상기 위치에 상응하는 아미노산에 대한 유사한 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 촉매적으로 비활성인 Cas9 단백질, 예를 들어 dCas9는 D587A 돌연변이 또는 상기 위치에 상응하는 아미노산에 대한 유사한 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 촉매적으로 비활성인 Cas9 단백질, 예를 들어 dCas9는 H588A 돌연변이 또는 상기 위치에 상응하는 아미노산에 대한 유사한 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 촉매적으로 비활성인 Cas9 단백질, 예를 들어 dCas9는 N611A 돌연변이 또는 상기 위치에 상응하는 아미노산에 대한 유사한 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 촉매적으로 비활성인 Cas9 단백질, 예를 들어 dCas9는 D16A, D587A, H588A, 및 N611A 돌연변이 또는 상기 위치에 상응하는 아미노산에 대한 유사한 치환을 포함한다.
일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 시스템, 또는 본 명세서에 기재된 방법은 하나 이상(예를 들어, 하나)의 표적화 모이어티 및 하나 이상의 이펙터 모이어티(예를 들어, 1개 또는 2개의 이펙터 모이어티)를 포함하는 부위-특이적 파괴제 또는 폴리펩티드의 사용을 포함하며, 하나 이상의 표적화 모이어티는 Cas 단백질, 예를 들어 촉매적으로 비활성인 Cas9 단백질, 예를 들어 sadCas9, dCas9, 예를 들어 dCas9m4, 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편을 포함하는 CRISPR/Cas 분자이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, dCas9는 서열번호 5, 6, 또는 7의 아미노산 서열을 포함한다:
Cas9
Figure pct00014
dCas9(Cas9m4)
Figure pct00015
Sa-dCas9
Figure pct00016
일부 구현예에서, dCas9는 서열번호 8 또는 9의 핵산 서열에 의해 인코딩된다:
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
가이드 RNA(gRNA)
일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 gRNA를 포함하거나 이에 (예를 들어, 공유적으로) 연결된 Cas 분자를 포함할 수 있다. gRNA는 Cas-단백질 결합에 필요한 "스캐폴드" 서열, 및 게놈 표적을 위한 사용자-정의된 약 20개의 뉴클레오티드 표적화 서열로 구성되는 짧은 합성 RNA이다. 실제로, 가이드 RNA 서열은 17 내지 24개의 뉴클레오티드(예를 들어, 19, 20, 또는 21개의 뉴클레오티드) 길이를 갖고 표적화된 핵산 서열에 상보적이 되도록 일반적으로 설계된다. 일부 구현예에서 gRNA는 3 내지 6개의 측접 포스포로티오에이트(PS) 연결, 예를 들어 각 말단에 3개의 측접 PS 연결을 포함한다. 효과적인 가이드 RNA의 설계에 사용하기 위한 맞춤형 gRNA 생성기 및 알고리즘이 상업적으로 구매 가능하다. 키메라 "단일 가이드 RNA"("sgRNA")를 사용하여 유전자 편집이 또한 달성되었는데, 이는, 자연 발생 crRNA-tracrRNA 복합체를 모방하고, (뉴클레아제에 결합하기 위한) tracrRNA 및 (편집을 위해 뉴클레아제를 표적화된 서열로 가이드하기 위한) 적어도 하나의 crRNA 둘 모두를 함유하는 조작된(합성) 단일 RNA 분자이다. 화학적으로 변형된 sgRNA가 또한 Cas 단백질과 함께 사용하기에 효과적인 것으로 입증되었으며; 예를 들어, 문헌[Hendel et al. (2015) Nature Biotechnol., 985 - 991]을 참조한다.
일부 구현예에서, gRNA는 표적 유전자와 연관된 DNA 서열에 상보적인 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, DNA 서열은 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 발현 제어 요소이거나, 이를 포함하거나, 이와 중첩된다. 일부 구현예에서, gRNA는 표적 유전자와 연관된 DNA 서열에 적어도 90, 95, 99, 또는 100% 상보적인 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, Cas 분자를 포함하는 표적화 모이어티와 함께 사용하기 위한 gRNA는 sgRNA이다. 일부 구현예에서, gRNA는 표 4, 표 5, 표 6, 표 7로부터 선택되는 서열, 또는 상기 서열과 적어도 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 동일성을 갖거나, 상기 서열에 대해 1, 2, 3, 4, 또는 5개 이하의 상이한 위치를 갖는 서열을 포함하는 핵산 서열에 결합한다.
일부 구현예에서, CRISPR/Cas 분자와 함께 사용하기 위한 gRNA는 β-2-마이크로글로불린 발현과 연관된 표적 서열에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, CRISPR/Cas 분자와 함께 사용하기 위한 gRNA는 CXCL1 내지 CXCL8 유전자 발현 중 하나 이상과 연관된 표적 서열에 특이적으로 결합한다. 그러한 gRNA는 서열번호 20 내지 62로부터 선택되는 표적-결합 서열을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 TAL 이펙터 분자이거나 이를 포함한다. TAL 이펙터 분자, 예를 들어 DNA 서열에 특이적으로 결합하는 TAL 이펙터 분자는 복수의 TAL 이펙터 도메인 또는 이의 단편들을 포함하며, 선택적으로 자연 발생 TAL 이펙터들의 하나 이상의 추가적인 부분들(예를 들어, 복수의 TAL 이펙터 도메인들의 N- 및/또는 C-말단)을 포함한다. 많은 TAL 이펙터가 당업자에게 알려져 있으며, 예를 들어 Thermo Fisher Scientific으로부터 상업적으로 구매 가능하다.
TALE는 숙주 식물에서의 유전자 발현을 조절하고, 박테리아 콜로니화 및 생존을 용이하게 하는 식물 병원체 잔토모나스(Xanthomonas)를 포함하는 박테리아성 병원체의 다양한 종에 의해 분비되는 천연 이펙터 단백질이다. TAL 이펙터의 특이적 결합은 통상적으로 33 또는 34개의 아미노산의 나란히 정렬된 거의 동일한 반복부들의 중심 반복 도메인(반복부-가변 이(di)-잔기, RVD 도메인)을 기준으로 한다.
TAL 이펙터 패밀리의 구성원들은 그들의 반복부들의 수와 순서에서 주로 상이하다. 반복부들의 수는 1.5 내지 33.5개의 반복부 범위이며, C-말단 반복부는 보통 길이가 더 짧고(예를 들어, 약 20개 아미노산), 일반적으로 "절반-반복부"로서 지칭된다. TAL 이펙터의 각 반복부는 상이한 염기쌍 특이성을 나타내는 상이한 반복부 유형과 하나의 반복부-대-하나의 염기쌍 상관관계를 특징으로 한다(하나의 반복부는 표적 유전자 서열 상에서 하나의 염기쌍을 인식함). 일반적으로, 반복부의 수가 더 적을수록, 단백질-DNA 상호작용은 더 약해진다. 다수의 6.5개 반복부는 리포터 유전자의 전사를 활성화하기에 충분한 것으로 나타났다(Scholze et al., 2010).
반복부 대 반복부 변이는 아미노산 위치 12 및 13에서 주로 발생하며, 따라서 이는 "초가변"으로 지칭되고, 표적 DNA 프로모터 서열과의 상호작용의 특이성을 담당하며, 이는 예시적인 반복부 가변 이-잔기(RVD) 및 이들의 핵산 염기 표적에 대한 상동성을 열거한 표 2에 나타낸 바와 같다.
RVD 및 핵산 염기 특이성
표적 가능한 RVD 아미노산 조합
A NI NN CI HI KI
G NN GN SN VN LN DN QN EN HN RH NK AN FN
C HD RD KD ND AD
T NG HG VG IG EG MG YG AA EP VA QG KG RG
따라서, TAL 이펙터의 반복부를 표적 특이적 DAN 서열로 변형하는 것이 가능하다. 추가의 연구는, RVD NK가 G를 표적화할 수 있음을 나타내었다. TAL 이펙터의 표적 부위는 또한 제1 반복부에 의해 표적화되는 5' 염기에 측접하는 T를 포함하는 경향도 있지만, 이러한 인식의 정확한 기작은 알려져 있지 않다. 113개가 넘는 TAL 이펙터 서열이 오늘날까지 알려져 있다. 잔토모나스로부터의 TAL 이펙터의 비제한적 예는 Hax2, Hax3, Hax4, AvrXa7, AvrXa10 및 AvrBs3을 포함한다.
따라서, 본 개시내용의 TAL 이펙터 분자의 TAL 이펙터 도메인은 임의의 박테리아 종(예를 들어, 잔토모나스 종, 예컨대 아프리카 균주인, 잔토모나스 오리제 pv. 오리제(Xanthomonas oryzae　pv.　Oryzae)(Yu et al. 2011), 잔토모나스 캄페스트리스 pv. 라파니(Xanthomonas campestris　pv.　raphani) 균주 756C 및 잔토모나스 오리제 pv. 오리지콜라(Xanthomonas oryzae　pv.　oryzicola) 균주 BLS256(Bogdanove et al. 2011)으로부터의 TAL 이펙터로부터 유래될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 본 개시내용에 따른 TAL 이펙터 도메인은 RVD 도메인뿐만 아니라 자연 발생 TAL 이펙터로부터의 측접 서열(들)(RVD 도메인의 N-말단 및/또는 C-말단 측부 상에서의 서열)도 또한 포함한다. 이는 자연 발생 TAL 이펙터의 RVD보다 더 많거나 더 적은 반복부들을 포함할 수 있다. 본 개시내용의 TAL 이펙터 분자는 상기 코드를 기반으로 한 소정의 DNA 서열 및 당업계에 알려진 다른 것들을 표적화하도록 설계된다. TAL 이펙터 도메인의 수(예를 들어, 반복부(단량체 또는 모듈)) 및 그의 특이적 서열은 원하는 DNA 표적 서열을 기반으로 하여 선택된다. 예를 들어, TAL 이펙터 도메인, 예를 들어 반복부들은 특이적 표적 서열에 맞도록 제거 또는 부가될 수 있다. 일 구현예에서, 본 개시내용의 TAL 이펙터 분자는 6.5 내지 33.5개의 TAL 이펙터 도메인, 예를 들어 반복부를 포함한다. 일 구현예에서, 본 개시내용의 TAL 이펙터 분자는 8 내지 33.5개의 TAL 이펙터 도메인, 예를 들어 반복부, 예를 들어 10 내지 25개의 TAL 이펙터 도메인, 예를 들어 반복부, 예를 들어 10 내지 14개의 TAL 이펙터 도메인, 예를 들어 반복부를 포함한다.
일부 구현예에서, TAL 이펙터 분자는 DNA 표적 서열에 대한 완전한 매치에 상응하는 TAL 이펙터 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, DNA 표적 서열 상에서 반복부와 표적 염기쌍 사이의 미스매치는 TAL 이펙터 분자를 포함하는 부위-특이적 파괴제의 기능을 가능하게 하는 한 허용된다. 일반적으로, TALE 결합은 미스매치의 수와 역의 상관관계를 갖는다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 부위-특이적 파괴제의 TAL 이펙터 분자는 표적 DNA 서열과, 7개의 미스매치, 6개의 미스매치, 5개의 미스매치, 4개의 미스매치, 3개의 미스매치, 2개의 미스매치, 또는 1개의 미스매치 이하를 포함하고, 선택적으로는 미스매치가 없다. 이론에 의해 구애되고자 함이 없이, 일반적으로 TAL 이펙터 분자 내 TAL 이펙터 도메인의 수가 더 적을수록, 더 적은 수의 미스매치가 용인될 것이고, TAL 이펙터 분자를 포함하는 부위-특이적 파괴제의 기능을 여전히 허용할 것이다. 결합 친화도는 매칭되는 반복부-DNA 조합의 합에 따라 달라지는 것으로 생각된다. 예를 들어, 25개 이상의 TAL 이펙터 도메인을 갖는 TAL 이펙터 분자는 최대 7개의 미스매치를 용인할 수 있다.
TAL 이펙터 도메인에 추가적으로, 본 개시내용의 TAL 이펙터 분자는 자연 발생 TAL 이펙터로부터 유래된 추가적인 서열들을 포함할 수 있다. TAL 이펙터 분자의 TAL 이펙터 도메인 부분의 각각의 측면에 포함된 C-말단 및/또는 N-말단 서열(들)의 길이는 다양할 수 있으며, 예를 들어 문헌[Zhang et al. (2011)]의 연구를 기반으로 하여 당업자에 의해 선택될 수 있다. 상기 문헌[Zhang et al.]은 Hax3 유래된 TAL-이펙터를 기반으로 한 단백질에서 많은 C-말단 및 N-말단 절단 돌연변이체를 특성화하였으며, 표적 서열에 대한 최적 결합 및 이에 따라 전사 활성화에 기여하는 주요 요소를 확인하였다. 일반적으로, 전사 활성은 N-말단의 길이와 역의 상관관계에 있는 것으로 밝혀졌다. C-말단에 대하여, Hax 3 서열의 최초 68개 아미노산 내 DNA 결합 잔기에 중요한 요소가 확인되었다. 이에 따라 일부 구현예에서, 자연 발생 TAL 이펙터의 TAL 이펙터 도메인의 C-말단부 상에서 최초 68개 아미노산은 본 개시내용의 부위-특이적 파괴제의 TAL 이펙터 분자 내에 포함된다. 따라서, 일 구현예에서 본 개시내용의 TAL 이펙터 분자는 1) 자연 발생 TAL 이펙터로부터 유래된 하나 이상의 TAL 이펙터 도메인; 2) TAL 이펙터 도메인의 N-말단부에 대한 자연 발생 TAL 이펙터로부터 적어도 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 170, 180, 190, 200, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280개 또는 그 이상의 아미노산; 및/또는 3) TAL 이펙터 도메인의 C-말단부 상에서 자연 발생 TAL 이펙터로부터의 적어도 68, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 170, 180, 190, 200, 220, 230, 240, 250, 260개 또는 그 이상의 아미노산을 포함한다.
일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 Zn 핑거 분자이거나 이를 포함한다. Zn 핑거 분자는 Zn 핑거 단백질, 예를 들어, 자연 발생 Zn 핑거 단백질 또는 조작된 Zn 핑거 단백질, 또는 이의 단편을 포함한다. 많은 Zn 핑거 단백질이 당업자에게 알려져 있으며, 예를 들어 Sigma-Aldrich로부터 상업적으로 구매 가능하다.
일부 구현예에서, Zn 핑거 분자는, 선택된 표적 DNA 서열에 결합하도록 조작된, 비자연 발생 Zn 핑거 단백질을 포함한다. 예를 들어, 그 전체가 본 명세서에 참고로 포함된, 문헌[Beerli, et al. (2002) Nature Biotechnol. 20:135-141]; 문헌[Pabo, et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340]; 문헌[Isalan, et al. (2001) Nature Biotechnol. 19:656-660]; 문헌[Segal, et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637]; 문헌[Choo, et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416]; 미국 특허 6,453,242; 6,534,261; 6,599,692; 6,503,717; 6,689,558; 7,030,215; 6,794,136; 7,067,317; 7,262,054; 7,070,934; 7,361,635; 7,253,273; 및 미국 특허 공개 2005/0064474; 2007/0218528; 2005/0267061을 참조한다.
조작된 Zn 핑거 단백질은, 자연 발생 Zn 핑거 단백질과 비교하여, 새로운 결합 특이성을 가질 수 있다. 조작 방법은 합리적 설계(rational design) 및 다양한 유형의 선택을 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 합리적 설계는, 예를 들어 삼중자(또는 사중자) 뉴클레오티드 서열 및 개별적인 Zn 핑거 아미노산 서열을 포함하는 데이터베이스의 사용을 포함하며, 여기서 각각의 삼중자 또는 사중자 뉴클레오티드 서열은, 특정 삼중자 또는 사중자 서열에 결합하는 징크 핑거의 아미노산 서열 하나 이상과 회합된다. 예를 들어, 그 전체가 본 명세서에 참고로 포함된, 미국 특허 6,453,242 및 6,534,261을 참조한다.
파지 디스플레이 및 2-하이브리드 시스템을 포함하여 예시적인 선택 방법이 미국 특허 5,789,538; 5,925,523; 6,007,988; 6,013,453; 6,410,248; 6,140,466; 6,200,759; 및 6,242,568; 및 국제 특허 공개 WO 98/37186; WO 98/53057; WO 00/27878; 및 WO 01/88197 및 GB 2,338,237에 개시되어 있다. 추가적으로, 징크 핑거 단백질에 대한 결합 특이성의 향상은, 예를 들어 국제 특허 공개 WO 02/077227에 기재되어 있다.
추가적으로, 이들 및 기타 참고 문헌에 개시된 바와 같이, 징크 핑거 도메인 및/또는 다중-핑거의 징크 핑거 단백질은 임의의 적합한 링커 서열을 함께 사용하여 연결될 수 있으며, 이는 예를 들어 길이가 5개 이상의 아미노산인 링커를 포함한다. 또한, 길이가 6개 이상의 아미노산인 예시적인 링커 서열에 대해, 미국 특허 6,479,626; 6,903,185; 및 7,153,949를 참조한다. 본 명세서에 기재된 단백질은 단백질의 개별적인 징크 핑거들 간에 적합한 링커의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 추가적으로, 징크 핑거 결합 도메인에 대한 결합 특이성의 향상은, 예를 들어 공동 소유된 국제 특허 공개 WO 02/077227에 기재되어 있다.
Zn 핑거 단백질 및 융합 단백질의 설계 및 구축 방법(및 이를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드)는 당업자에게 알려져 있으며, 미국 특허 6,140,0815; 789,538; 6,453,242; 6,534,261; 5,925,523; 6,007,988; 6,013,453; 및 6,200,759; 국제 특허 공개 WO 95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/54311; WO 00/27878; WO 01/60970; WO 01/88197; WO 02/099084; WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536; 및 WO 03/016496에 상세하게 기재되어 있다.
추가적으로, 이들 및 기타 참고 문헌에 개시된 바와 같이, Zn 핑거 단백질 및/또는 다중-핑거 Zn 핑거 단백질은, 예를 들어 길이가 5개 이상의 아미노산인 링커를 포함하는, 임의의 적합한 링커 서열을 사용하여, 예를 들어 융합 단백질로서, 함께 연결될 수 있다. 또한, 길이가 6개 이상의 아미노산인 예시적인 링커 서열에 대해 미국 특허 6,479,626; 6,903,185; 및 7,153,949를 참조한다. 본 명세서에 기재된 Zn 핑거 분자는, 개별적인 징크 핑거 단백질 및/또는 Zn 핑거 분자의 다중-핑거 Zn 핑거 단백질 간에 적합한 링커의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 표적화 모이어티는 표적 DNA 서열에 (서열-특이적 방식으로) 결합하는 조작된 징크 핑거 단백질을 포함하는 Zn 핑거 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, Zn 핑거 분자는 하나의 Zn 핑거 단백질 또는 이의 단편을 포함한다. 다른 구현예에서, Zn 핑거 분자는 복수의 Zn 핑거 단백질(또는 이의 단편), 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6개 이상의 Zn 핑거 단백질(및 선택적으로 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 또는 2개 이하의 Zn 핑거 단백질)을 포함한다. 일부 구현예에서, Zn 핑거 분자는 적어도 3개의 Zn 핑거 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, Zn 핑거 분자는 4, 5, 또는 6개의 핑거를 포함한다. 일부 구현예에서, Zn 핑거 분자는 8, 9, 10, 11 또는 12개의 핑거를 포함한다. 일부 구현예에서, 3개의 Zn 핑거 단백질을 포함하는 Zn 핑거 분자는 9 또는 10개의 뉴클레오티드를 포함하는 표적 DNA 서열을 인식한다. 일부 구현예에서, 4개의 Zn 핑거 단백질을 포함하는 Zn 핑거 분자는 12 내지 14개의 뉴클레오티드를 포함하는 표적 DNA 서열을 인식한다. 일부 구현예에서, 6개의 Zn 핑거 단백질을 포함하는 Zn 핑거 분자는 18 내지 21개의 뉴클레오티드를 포함하는 표적 DNA 서열을 인식한다.
일부 구현예에서, Zn 핑거 분자는 양손(two-handed) Zn 핑거 단백질을 포함한다. 양손 징크 핑거 단백질은, 징크 핑거 단백질의 2개의 클러스터가 개재하는 아미노산들에 의해 분리되어, 2개의 징크 핑거 도메인이 2개의 불연속적인 표적 DNA 서열에 결합되도록 하는 단백질들이다. 징크 핑거 결합 단백질의 양손 유형의 예는 SIP1이며, 여기서 4개의 징크 핑거 단백질의 클러스터는 단백질의 아미노 말단에 위치되고, 3개의 징크 핑거 단백질의 클러스터는 카르복실 말단에 위치한다(문헌[Remade, et al. (1999) EMBO Journal 18(18):5073-5084] 참조). 이들 단백질의 징크 핑거의 각 클러스터는 독특한 표적 서열에 결합할 수 있고, 2개의 표적 서열 사이의 간격은 많은 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 뉴클레아제로부터의 DNA-결합 도메인이거나 이를 포함한다. 예를 들어, I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII 및 I-TevIII과 같은 호밍 엔도뉴클레아제 및 메가뉴클레아제의 인식 서열이 알려져 있다. 또한, 미국 특허 5,420,032; 6,833,252; 문헌[Belfort, et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388]; 문헌[Dujon, et al. (1989) Gene 82:115-118]; 문헌[Perler, et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:1125-1127]; 문헌[Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228]; 문헌[Gimble, et al. (1996) J. Mol. Biol. 263:163-180]; 문헌[Argast, et al. (1998) J. Mol. Biol. 280:345-353] 및 New England Biolabs 카탈로그를 참조한다. 추가적으로, 호밍 엔도뉴클레아제 및 메가뉴클레아제의 DNA-결합 특이성이 비천연 표적 부위에 결합하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Chevalier, et al. (2002) Molec. Cell 10:895-905]; 문헌[Epinat, et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:2952-2962]; 문헌[Ashworth, et al. (2006) Nature 441:656-659]; 문헌[Paques, et al. (2007) Current Gene Therapy 7:49-66]; 미국 특허 공개 2007/0117128을 참조한다.
일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화 모이어티 내에 포함될 수 있는 핵산은 DNA, RNA, 및/또는 인공 또는 합성 핵산 또는 핵산 유사체 또는 모방체이거나 이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 핵산은 게놈 DNA(gDNA), 상보적 DNA(cDNA), 펩티드 핵산(PNA), 펩티드- 올리고뉴클레오티드 접합체, 고정된 핵산(LNA), 가교 핵산(BNA), 폴리아미드, 삼중체-형성 올리고뉴클레오티드, 안티센스 올리고뉴클레오티드, tRNA, mRNA, rRNA, miRNA, gRNA, siRNA 또는 기타 다른 RNAi 분자(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 비코딩 RNA를 표적화하고/하거나 본 명세서에 기재된 바와 같은 표적화된 게놈 복합체와 연관된 특정 유전자의 발현 산물을 표적화하는 것들) 등 중 하나 이상이거나 이를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산은 자연 발생 DNA 또는 RNA 잔기가 아닌 하나 이상의 잔기를 포함할 수 있고/있거나, 포스포디에스테르 결합이 아닌(예를 들어, 이를 테면 포스포로티오에이트 결합 등일 수 있는) 하나 이상의 결합을 포함할 수 있고/있거나, 예를 들어 2'O 변형, 예컨대 2'-OMeP와 같은 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다. 합성 핵산을 제조하는 데 유용한 다양한 핵산 구조가 당업계에 알려져 있으며(예를 들어, WO2017/062862l 및 WO2014/012081 참조), 당업자는 이들이 본 개시내용에 따라 이용될 수 있음을 이해할 것이다.
부위-특이적 파괴제에, 예를 들어 표적화 모이어티에 사용하기에 적합한 핵산은 DNA, RNA, 변형된 올리고뉴클레오티드(예를 들어, 화학적 변형, 예컨대 백본 연결, 당 분자, 및/또는 핵산 염기를 변경시키는 변형), 및 인공 핵산을 포함할 수 있지만 이로 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 핵산은 게놈 DNA, cDNA, 펩티드 핵산(PNA) 또는 펩티드 올리고뉴클레오티드 접합체, 고정된 핵산(LNA), 가교 핵산(BNA), 폴리아미드, 삼중체 형성 올리고뉴클레오티드, 변형된 DNA, 안티센스 DNA 올리고뉴클레오티드, tRNA, mRNA, rRNA, 변형된 RNA, miRNA, gRNA, 및 siRNA 또는 기타 다른 RNA 또는 DNA 분자를 포함하지만 이로 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 약 15 내지 200개, 20 내지 200개, 30 내지 200개, 40 내지 200개, 50 내지 200개, 60 내지 200개, 70 내지 200개, 80 내지 200개, 90 내지 200개, 100 내지 200개, 110 내지 200개, 120 내지 200개, 130 내지 200개, 140 내지 200개, 150 내지 200개, 160 내지 200개, 170 내지 200개, 180 내지 200개, 190 내지 200개, 215 내지 190개, 20 내지 190개, 30 내지 190개, 40 내지 190개, 50 내지 190개, 60 내지 190개, 70 내지 190개, 80 내지 190개, 90 내지 190개, 100 내지 190개, 110 내지 190개, 120 내지 190개, 130 내지 190개, 140 내지 190개, 150 내지 190개, 160 내지 190개, 170 내지 190개, 180 내지 190개, 15 내지 180개, 20 내지 180개, 30 내지 180개, 40 내지 180개, 50 내지 180개, 60 내지 180개, 70 내지 180개, 80 내지 180개, 90 내지 180개, 100 내지 180개, 110 내지 180개, 120 내지 180개, 130 내지 180개, 140 내지 180개, 150 내지 180개, 160 내지 180개, 170 내지 180개, 15 내지 170개, 20 내지 170개, 30 내지 170개, 40 내지 170개, 50 내지 170개, 60 내지 170개, 70 내지 170개, 80 내지 170개, 90 내지 170개, 100 내지 170개, 110 내지 170개, 120 내지 170개, 130 내지 170개, 140 내지 170개, 150 내지 170개, 160 내지 170개, 15 내지 160개, 20 내지 160개, 30 내지 160개, 40 내지 160개, 50 내지 160개, 60 내지 160개, 70 내지 160개, 80 내지 160개, 90 내지 160개, 100 내지 160개, 110 내지 160개, 120 내지 160개, 130 내지 160개, 140 내지 160개, 150 내지 160개, 215 내지 150개, 20 내지 150개, 30 내지 150개, 40 내지 150개, 50 내지 150개, 60 내지 150개, 70 내지 150개, 80 내지 150개, 90 내지 150개, 100 내지 150개, 110 내지 150개, 120 내지 150개, 130 내지 150개, 140 내지 150개, 15 내지 140개, 20 내지 140개, 30 내지 140개, 40 내지 140개, 50 내지 140개, 60 내지 140개, 70 내지 140개, 80 내지 140개, 90 내지 140개, 100 내지 140개, 110 내지 140개, 120 내지 140개, 130 내지 140개, 15 내지 130개, 20 내지 130개, 30 내지 130개, 40 내지 130개, 50 내지 130개, 60 내지 130개, 70 내지 130개, 80 내지 130개, 90 내지 130개, 100 내지 130개, 110 내지 130개, 120 내지 130개, 215 내지 120개, 20 내지 120개, 30 내지 120개, 40 내지 120개, 50 내지 120개, 60 내지 120개, 70 내지 120개, 80 내지 120개, 90 내지 120개, 100 내지 120개, 110 내지 120개, 15 내지 110개, 20 내지 110개, 30 내지 110개, 40 내지 110개, 50 내지 110개, 60 내지 110개, 70 내지 110개, 80 내지 110개, 90 내지 110개, 100 내지 110개, 15 내지 100개, 20 내지 100개, 30 내지 100개, 40 내지 100개, 50 내지 100개, 60 내지 100개, 70 내지 100개, 80 내지 100개, 90 내지 100개, 15 내지 90개, 20 내지 90개, 30 내지 90개, 40 내지 90개, 50 내지 90개, 60 내지 90개, 70 내지 90개, 80 내지 90개, 15 내지 80개, 20 내지 80개, 30 내지 80개, 40 내지 80개, 50 내지 80개, 60 내지 80개, 70 내지 80개, 15 내지 70개, 20 내지 70개, 30 내지 70개, 40 내지 70개, 50 내지 70개, 60 내지 70개, 15 내지 60개, 20 내지 60개, 30 내지 60개, 40 내지 60개, 50 내지 60개, 15 내지 50개, 20 내지 50개, 30 내지 50개, 40 내지 50개, 15 내지 40개, 20 내지 40개, 30 내지 40개, 15 내지 30개, 20 내지 30개, 또는 15 내지 20개의 뉴클레오티드 길이, 또는 이들 사이의 임의의 범위의 뉴클레오티드 길이를 갖는 핵산을 포함한다.
이펙터 모이어티
본 개시내용의 부위-특이적 파괴제는 하나 이상의 이펙터 모이어티를 포함할 수 있다. 이펙터 모이어티는 본 명세서에 기재된 부위-특이적 파괴제의 일부로서 사용될 때 세포에서 복수의 표적 유전자의 발현을 조절하는, 예를 들어 감소시키는 하나 이상의 기능성을 갖는다. 일부 구현예에서, 이펙터 모이어티는, 예를 들어 앵커 서열에 대한 게놈 복합체 성분(예를 들어, 핵형성 폴리펩티드)의 결합이 억제되도록(예를 들어, 방지되도록) 앵커 서열을 물리적 또는 입체적으로 차단한다. 일부 구현예에서, 이펙터 모이어티는, 예를 들어 게놈 복합체 성분이 앵커 서열에 결합하는 친화도 및/또는 결합력을 변경(예를 들어, 감소)시킴으로써, 게놈 복합체 성분(예를 들어, 핵형성 폴리펩티드)과 앵커 서열의 상호작용을 불안정화시킨다. 예를 들어, 이펙터 모이어티는 게놈 복합체, 예를 들어 ASMC의 형성을 억제하거나 불안정화시키는 인자를 동원할 수 있거나, 게놈 복합체(예를 들어, ASMC)의 형성 또는 유지에 필요한 인자(예를 들어, 게놈 복합체 성분 또는 전사 인자)의 동원을 억제할 수 있다. 일부 구현예에서, 이펙터 모이어티는, 예를 들어 DNA 또는 이와 연관된 히스톤에 대한 하나 이상의 후성유전학적 변형의 적용 또는 제거를 촉진(예를 들어, 촉매화)함으로써, 앵커 서열 또는 앵커 서열에 근접한 서열의 후성유전학적 지형을 조절하여, 복수의 표적 유전자의 발현을 감소시킨다는 점에서 후성유전학적 변형 기능성을 갖는다. 일부 구현예에서, 이펙터 모이어티는 유전적 변형 기능성을 가지며, 예를 들어 이펙터 모이어티는 앵커 서열 또는 이에 근접한 서열에 변경(예를 들어, 삽입, 결실, 또는 치환)을 도입한다.
일부 구현예에서, 이펙터 모이어티는 CRISPR/Cas 분자, TAL 이펙터 분자, Zn 핑거 분자, tetR 도메인, 또는 메가뉴클레아제를 포함한다. 일부 구현예에서, 이펙터 모이어티는 유전적 변형 기능성, 예를 들어 본 명세서에 기재된 방법에서 유전적 변형을 할 수 있는 엔도뉴클레아제 활성을 갖는 CRISPR/Cas 분자, TAL 이펙터 분자, Zn 핑거 분자를 갖는다.
일부 구현예에서, 이펙터 모이어티는 히스톤 변형 기능성, 예를 들어 히스톤 메틸트랜스퍼라제, 히스톤 데메틸라제, 또는 히스톤 데아세틸라제 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 히스톤 메틸트랜스퍼라제 기능성은 H3K9 표적화 메틸트랜스퍼라제 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 히스톤 메틸트랜스퍼라제 기능성은 H3K56 표적화 메틸트랜스퍼라제 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 히스톤 메틸트랜스퍼라제 기능성은 H3K27 표적화 메틸트랜스퍼라제 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 히스톤 메틸트랜스퍼라제 또는 데메틸라제 기능성은 1개, 2개, 또는 3개의 메틸 기를 전달한다. 일부 구현예에서, 히스톤 데메틸라제 기능성은 H3K4 표적화 데메틸라제 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 이펙터 모이어티는 SETDB1, SETDB2, EHMT2(즉, G9A), EHMT1(즉, GLP), SUV39H1, EZH2, EZH1, SUV39H2, SETD8, SUV420H1, SUV420H2, 또는 이들 중 임의의 것의 기능성 변이체 또는 단편, 예를 들어 이들 중 임의의 것의 SET 도메인으로부터 선택되는 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 이펙터 모이어티는 KDM1A(즉, LSD1), KDM1B(즉, LSD2), KDM2A, KDM2B, KDM5A, KDM5B, KDM5C, KDM5D, KDM4B, NO66, 또는 이들 중 임의의 것의 기능성 변이체 또는 단편으로부터 선택되는 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 이펙터 모이어티는 HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC4, HDAC5, HDAC6, HDAC7, HDAC8, HDAC9, HDAC10, HDAC11, SIRT1, SIRT2, SIRT3, SIRT4, SIRT5, SIRT6, SIRT7, SIRT8, SIRT9, 또는 이들 중 임의의 것의 기능성 변이체 또는 단편으로부터 선택되는 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 이펙터 모이어티는 DNA 변형 기능성, 예를 들어 DNA 메틸트랜스퍼라제를 포함한다. 일부 구현예에서, 이펙터 모이어티는 MQ1, DNMT1, DNMT3A1, DNMT3A2, DNMT3B1, DNMT3B2, DNMT3B3, DNMT3B4, DNMT3B5, DNMT3B6, DNMT3L 또는 이들 중 임의의 것의 기능성 변이체 또는 단편으로부터 선택되는 단백질을 포함한다.
일부 구현예에서, 이펙터 모이어티는 전사 리프레서를 포함한다. 일부 구현예에서, 전사 리프레서는 전사, 예를 들어 표적 유전자의 전사를 자극하거나 촉진하는 인자의 동원을 차단한다. 일부 구현예에서, 전사 리프레서는 전사, 예를 들어 표적 유전자의 전사를 억제하는 인자를 동원한다. 일부 구현예에서, 이펙터 모이어티, 예를 들어 전사 리프레서는 KRAB, MeCP2, HP1, RBBP4, REST, FOG1, SUZ12, 또는 이들 중 임의의 것의 기능성 변이체 또는 단편으로부터 선택되는 단백질이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 이펙터 모이어티는 본 명세서에 기재된 기능성을 갖는 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 이펙터 모이어티는 하기로부터 선택되는 단백질을 포함한다:
KRAB(예를 들어, NP_056209.2에 따른 것 또는 NM_015394.5에 의해 인코딩된 단백질);
SET 도메인(예를 들어, 하기의 SET 도메인:
SETDB1(예를 들어, NP_001353347.1에 따른 것 또는 NM_001366418.1에 의해 인코딩된 단백질);
EZH2(예를 들어, NP-004447.2 또는 NP_001190176.1에 따른 것 또는 NM_004456.5 또는 NM_001203247.2에 의해 인코딩된 단백질);
G9A(예를 들어, NP_001350618.1에 따른 것 또는 NM_001363689.1에 의해 인코딩된 단백질); 또는
SUV39H1(예를 들어, NP_003164.1에 따른 것 또는 NM_003173.4에 의해 인코딩된 단백질));
히스톤 데메틸라제 LSD1(예를 들어, NP_055828.2에 따른 것 또는 NM_015013.4에 의해 인코딩된 단백질);
FOG1(예를 들어, FOG1의 N-말단 잔기)(예를 들어, NP_722520.2에 따른 것 또는 NM_153813.3에 의해 인코딩된 단백질); 또는
KAP1(예를 들어, NP_005753.1에 따른 것 또는 NM_005762.3에 의해 인코딩된 단백질);
이들 중 임의의 것의 기능성 단편 또는 변이체, 또는
상기 언급된 임의의 서열과 적어도 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 갖는 폴리펩티드. 일부 구현예에서, 이펙터 모이어티는 하기로부터 선택되는 단백질을 포함한다:
DNMT3A(예를 들어, 인간 DNMT3A)(예를 들어, NP_072046.2에 따른 것
또는 NM_022552.4에 의해 인코딩된 단백질);
DNMT3B(예를 들어, NP_008823.1에 따른 것
또는 NM_006892.4에 의해 인코딩된 단백질);
DNMT3L(예를 들어, NP_787063.1에 따른 것
또는 NM_175867.3에 의해 인코딩된 단백질);
DNMT3A/3L 복합체,
박테리아 MQ1(예를 들어, 균주 ATCC 33825로부터 얻은 CAA35058.1 또는 Uniprot ID P15840.3에 따른 것);
이들 중 임의의 것의 기능성 단편, 또는
상기 언급된 임의의 서열과 적어도 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 갖는 폴리펩티드. 일부 구현예에서, 이펙터 모이어티는 성숙한 박테리아 MQ1(예를 들어, 균주 ATCC 33825로부터 얻은 CAA35058.1 또는 Uniprot ID P15840.3에 따른 것)을 포함한다.
예시적인 이펙터 모이어티는 하기를 포함할 수 있지만 이로 한정되지 않는다: 유비퀴틴, 유비퀴틴 리가제 억제제로서의 바이사이클릭 펩티드, 전사 인자, DNA 및 단백질 변형 효소, 예컨대 토포이소머라제, 토포이소머라제 억제제, 예컨대 토포테칸, DNA 메틸트랜스퍼라제, 예컨대 DNMT 패밀리(예를 들어, DNMT3A, DNMT3B, DNMT3L), 단백질 메틸트랜스퍼라제(예를 들어, 바이러스 라이신 메틸트랜스퍼라제(vSET), 단백질-라이신 N-메틸트랜스퍼라제(SMYD2), 데아미나제(예를 들어, APOBEC, UG1), 히스톤 메틸트랜스퍼라제, 예컨대 제스트 인핸서 상동체 2(enhancer of zeste homolog 2, EZH2), PRMT1, 히스톤-라이신-N-메틸트랜스퍼라제(Setdb1), 히스톤 메틸트랜스퍼라제(SET2), 진정 염색질(euchromatic) 히스톤-라이신 N-메틸트랜스퍼라제 2(G9a), 히스톤-라이신 N-메틸트랜스퍼라제(SUV39H1), 및 G9a), 히스톤 데아세틸라제(예를 들어, HDAC1, HDAC2, HDAC3), DNA 탈메틸화에서 역할을 갖는 효소(예를 들어, TET 패밀리 효소는 5-메틸시토신의 5-하이드록시메틸시토신 및 더 고차의 산화적 유도체로의 산화를 촉매함), 단백질 데메틸라제, 예컨대 KDM1A 및 라이신-특이적 히스톤 데메틸라제 1(LSD1), 헬리카제, 예컨대 DHX9, 데아세틸라제(예를 들어, 시르투인(sirtuin) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7), 키나제, 포스파타제, DNA 삽입제, 예컨대 에티듐 브로마이드, SYBR 그린, 및 프로플라빈, 유출 펌프(efflux pump) 억제제, 예컨대 페닐알라닌 아르기닐 β-나프틸아미드 또는 퀴놀린 유도체와 같은 펩티드모방체, 핵 수용체 활성화제 및 억제제, 프로테아좀 억제제, 리소좀 저장 질환에 관여하는 것들과 같은 효소에 대한 경쟁적 억제제, 단백질 합성 억제제, 뉴클레아제(예를 들어, Cpf1, Cas9, 징크 핑거 뉴클레아제), 이들 중 하나 이상의 융합체(예를 들어, dCas9-DNMT, dCas9-APOBEC, dCas9-UG1), 및 단백질 유래 특정 도메인, 예컨대 KRAB 도메인.
일부 구현예에서, 당업자에게 알려진 방법에 의해 이펙터 모이어티로서 사용하기에 적합한 것으로 후보 도메인이 결정될 수 있다. 예를 들어, 후보 이펙터 모이어티가 세포의 핵 내에 존재하고, (예를 들어, 표적 유전자 또는 상기 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 전사 제어 요소에, 예를 들어 표적화 모이어티를 통해) 적절하게 국재화될 때, 후보 이펙터 모이어티가 세포 내의 표적 유전자의 발현을 감소시키는지, 예를 들어 표적 유전자에 의해 인코딩된 RNA 전사체의 수준을 감소시키는지(예를 들어, RNASeq 또는 노던 블롯(Northern blot)에 의해 측정되는 바와 같음), 또는 표적 유전자에 의해 인코딩된 단백질의 수준을 감소시키는지(예를 들어, ELISA에 의해 측정되는 바와 같음)의 여부를 검정함으로써 후보 이펙터 모이어티가 시험될 수 있다.
일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 이펙터 모이어티의 또 다른 카피에 결합하지 않는(예를 들어, 검출가능하게 결합하지 않는) 이펙터 모이어티를 포함하고, 예를 들어, 이펙터 모이어티는 단량체성이며 다량체로 회합하지 않는다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 이펙터 모이어티의 추가 카피와 다량체, 예를 들어 이량체, 삼량체, 사량체 또는 그 이상으로 회합하는 이펙터 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 복수의 이펙터 모이어티를 포함하며, 여기서 각 이펙터 모이어티는 또 다른 이펙터 모이어티에 검출가능하게 결합하지 않으며, 예를 들어 이에 결합하지 않는다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법에 사용하기 위한 이펙터 모이어티는 단량체성 상태, 예를 들어 비이량체성 상태에서 기능성이다.
일부 구현예에서, 이펙터 모이어티는 후성유전학적 변형 모이어티, 예를 들어 염색질의 2차원 구조를 조절하는(즉, 염색질의 2차원 표현을 변경시키는 방식으로 염색질의 구조를 조절하는) 후성유전학적 변형 모이어티를 포함한다.
본 개시내용의 방법 및 조성물에 유용한 후성유전학적 변형 모이어티는 후성유전학적 마커, 예를 들어 DNA 메틸화, 히스톤 메틸화, 히스톤 아세틸화, 히스톤 수모일화(sumoylation), 히스톤 인산화, 및 RNA-연관 침묵에 영향을 주는 작용제를 포함한다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 게놈 서열 요소에 표적화될 수 있는 예시적인 후성유전학적 효소는 DNA 메틸라제(예를 들어, DNMT3a, DNMT3b, DNMTL, MQ1), DNA 탈메틸화(예를 들어, TET 패밀리), 히스톤 메틸트랜스퍼라제, 히스톤 데아세틸라제(예를 들어, HDAC1, HDAC2, HDAC3), 시르투인 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7, 라이신-특이적 히스톤 데메틸라제 1(LSD1), 히스톤-라이신-N-메틸트랜스퍼라제(Setdb1), 진정 염색질 히스톤-라이신 N-메틸트랜스퍼라제 2(G9a), 히스톤-라이신 N-메틸트랜스퍼라제(SUV39H1), 제스트 인핸서 상동체 2(EZH2), 바이러스 라이신 메틸트랜스퍼라제(vSET), 히스톤 메틸트랜스퍼라제(SET2), 및 단백질-라이신 N-메틸트랜스퍼라제(SMYD2)를 포함한다. 그러한 후성유전학적 변형제의 예는, 예를 들어 문헌[de Groote et al. Nuc. Acids Res. (2012):1-18]에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제, 예를 들어 본 발명에 유용한 후성유전학적 변형 모이어티를 포함하는 부위-특이적 파괴제는, 본 명세서에 참고로 포함되는 문헌[Koferle et al. Genome Medicine 7.59 (2015):1-3]에 기재된 작제물이거나 이를 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 문헌[Koferle et al.]의 표 1에서 확인되는 작제물, 예를 들어 표 1에 기재된 히스톤 데아세틸라제, 히스톤 메틸트랜스퍼라제, DNA 탈메틸화, 또는 H3K4 및/또는 H3K9 히스톤 데메틸라제(예를 들어, dCas9-p300, TALE-TET1, ZF-DNMT3A, 또는 TALE-LSD1)이거나 이를 포함한다.
추가적인 모이어티
부위-특이적 파괴제는 (예를 들어, 하나 이상의 표적화 모이어티 및 하나 이상의 이펙터 모이어티에 추가하여) 하나 이상의 추가적인 모이어티를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 추가적인 모이어티는 태깅 또는 모니터링 모이어티, 절단성 모이어티(예를 들어, 표적화 모이어티와 이펙터 모이어티 사이에 위치하거나, 폴리펩티드의 N- 또는 C-말단 단부에 위치한 절단성 모이어티), 소분자, 막 전좌 폴리펩티드, 또는 약제 모이어티로부터 선택된다.
예시적인 부위-특이적 파괴제
하기의 예시적인 부위-특이적 파괴제는 단지 예시 목적으로 제시되며, 제한적인 것으로 의도되지 않는다.
일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 표적화 모이어티(예를 들어, dCas9, 예를 들어 S. 아우레우스 dCas9를 포함함), 및 MQ1, 예를 들어 박테리아 MQ1을 포함하는 이펙터 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 서열번호 201의 핵산 서열(예를 들어, 부위-특이적 파괴제를 인코딩하는 플라스미드), 및/또는 서열번호 202의 핵산 서열(예를 들어, 부위-특이적 파괴제를 인코딩하는 핵산(예를 들어, mRNA)), 부위-특이적 파괴제를 인코딩하는 핵산)에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 핵산은 서열번호 201 또는 202의 핵산 서열, 또는 상기 서열과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 상기 서열에 대해 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 상이한 위치를 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 서열번호 9의 핵산 서열에 의해 인코딩되고/되거나, 이펙터 모이어티는 서열번호 10의 핵산 서열에 의해 인코딩된다.
Sa-dCas9-MQ1(PL-27695) 플라스미드 DNA 서열:
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
Sa-dCas9-MQ1(MR-28126) 발현된 mRNA 서열:
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 표적화 모이어티(예를 들어, dCas9, 예를 들어 S. 피오게네스 dCas9 또는 이의 기능성 변이체 또는 돌연변이체; 예를 들어 Cas9m4를 포함함), 및 MQ1, 예를 들어 박테리아 MQ1을 포함하는 이펙터 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 서열번호 207의 핵산 서열(예를 들어, 부위-특이적 파괴제를 인코딩하는 핵산(예를 들어, mRNA))에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 핵산은 서열번호 207의 핵산 서열, 또는 상기 서열과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 상기 서열에 대해 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 상이한 위치를 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 서열번호 8의 핵산 서열에 의해 인코딩되고/되거나, 이펙터 모이어티는 서열번호 10의 핵산 서열에 의해 인코딩된다.
dCas9-MQ1 mRNA 서열(MR28125)
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
Figure pct00032
일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 서열번호 203, 208, 73 또는 74의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 부위-특이적 파괴제는 서열번호 203, 208, 73 또는 74의 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 상기 서열에 대해 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 상이한 위치를 갖는 서열을 포함한다.
Sa-dCas9-MQ1 단백질 서열:
Figure pct00033
dCas9-MQ1 단백질 서열(MR-28125에 상응함):
Figure pct00034
HA 태그를 갖지 않는 Sa-dCas9-MQ1
Figure pct00035
HA 태그를 갖지 않는 dCas9-MQ1
Figure pct00036
일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 표적화 모이어티(예를 들어, dCas9, 예를 들어 S. 피오게네스 dCas9를 포함함), 및 KRAB, 예를 들어 KRAB 도메인을 포함하는 이펙터 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 서열번호 204의 핵산 서열(예를 들어, 부위-특이적 파괴제를 인코딩하는 플라스미드), 및/또는 서열번호 205의 핵산 서열(예를 들어, 부위-특이적 파괴제를 인코딩하는 핵산(예를 들어, mRNA))에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 핵산은 서열번호 204 또는 205의 핵산 서열, 또는 상기 서열과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 상기 서열에 대해 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 상이한 위치를 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 서열번호 8의 핵산 서열에 의해 인코딩되고, 이펙터 모이어티는 서열번호 14의 핵산 서열에 의해 인코딩된다.
Sp-dCas9-KRAB(PL-27687) 플라스미드 DNA 서열:
Figure pct00037
Figure pct00038
Figure pct00039
Figure pct00040
Sp-dCas9-KRAB(MR-28122) 발현된 mRNA 서열:
Figure pct00041
Figure pct00042
Figure pct00043
일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 서열번호 206 또는 75의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 핵산은 서열번호 206 또는 75의 핵산 서열, 또는 상기 서열과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 상기 서열에 대해 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 상이한 위치를 갖는 서열을 포함한다.
Sp-dCas9-KRAB 단백질 서열:
Figure pct00044
HA 태그를 갖지 않는 Sp-dCas9-KRAB 단백질 서열:
Figure pct00045
일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 표적화 모이어티(예를 들어, dCas9, 예를 들어 S. 아우레우스 dCas9를 포함함), 및 EZH2를 포함하는 이펙터 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 dCas9, 예를 들어 S. 피오게네스 dCas9, 예를 들어 돌연변이체 S. 피오게네스 Cas9, 예를 들어 Cas9m4를 포함하는 표적화 모이어티 및 EZH2를 포함하는 이펙터 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 서열번호 209의 핵산 서열(예를 들어, 부위-특이적 파괴제를 인코딩하는 mRNA)에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 핵산은 서열번호 209의 핵산 서열, 또는 상기 서열과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 상기 서열에 대해 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 상이한 위치를 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 서열번호 8의 핵산 서열에 의해 인코딩되고/되거나, 이펙터 모이어티는 서열번호 18의 핵산 서열에 의해 인코딩된다.
EZH2-dCas9 mRNA(MR28938)
Figure pct00046
Figure pct00047
Figure pct00048
Figure pct00049
일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 서열번호 210 또는 76의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 핵산은 서열번호 210 또는 76의 핵산 서열, 또는 상기 서열과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 상기 서열에 대해 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 상이한 위치를 갖는 서열을 포함한다.
EZH2-dCas9 단백질 서열(MR-28938에 상응함)
Figure pct00050
HA 태그를 갖지 않는 EZH2-dCas9
Figure pct00051
일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 표적화 모이어티(예를 들어, dCas9, 예를 들어 S. 아우레우스 dCas9를 포함함), 및 DNMT3(예를 들어, DNMT3a/3L)을 포함하는 이펙터 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 dCas9, 예를 들어 S. 피오게네스 dCas9, 예를 들어 돌연변이체 S. 피오게네스 Cas9, 예를 들어 Cas9m4를 포함하는 표적화 모이어티 및 DNMT3(예를 들어, DNMT3a/3L)을 포함하는 이펙터 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 서열번호 211의 핵산 서열(예를 들어, 부위-특이적 파괴제를 인코딩하는 mRNA)에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 핵산은 서열번호 211의 핵산 서열, 또는 상기 서열과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 상기 서열에 대해 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 상이한 위치를 갖는 서열을 포함한다.
dCas9-DNMT3a/3L mRNA(MR-29414)
Figure pct00052
Figure pct00053
Figure pct00054
Figure pct00055
일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 서열번호 211 또는 77의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 작제물은 서열번호 211 또는 77의 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 상기 서열에 대해 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 상이한 위치를 갖는 서열을 포함한다.
dCas9-DNMT3a/3L 단백질 서열(MR-29414에 상응함)
Figure pct00056
HA 태그를 갖지 않는 dCas-DNMT3a/3L(h)
Figure pct00057
일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 표적화 모이어티(예를 들어, dCas9, 예를 들어 S. 아우레우스 dCas9를 포함함), 및 HDAC8, 예를 들어 HDAC8 도메인을 포함하는 이펙터 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 dCas9, 예를 들어 S. 피오게네스 dCas9, 예를 들어 돌연변이체 S. 피오게네스 Cas9, 예를 들어 Cas9m4를 포함하는 표적화 모이어티, 및 HDAC8, 예를 들어 HDAC8 도메인을 포함하는 이펙터 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 서열번호 213의 핵산 서열(예를 들어, 부위-특이적 파괴제를 인코딩하는 mRNA)에 의해 인코딩된다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 핵산은 서열번호 213의 핵산 서열, 또는 상기 서열과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 상기 서열에 대해 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 상이한 위치를 갖는 서열을 포함한다.
dCas9-HDAC8 mRNA(MR-29439)
Figure pct00058
Figure pct00059
Figure pct00060
일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 서열번호 214 또는 78의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 부위-특이적 파괴제는 서열번호 214 또는 78의 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 상기 서열에 대해 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 상이한 위치를 갖는 서열을 포함한다.
dCas9-HDAC8 단백질 서열(MR 29439에 상응함)
Figure pct00061
HA 태그를 갖지 않는 dCas9-HDAC8
Figure pct00062
일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 표적화 모이어티(예를 들어, dCas9, 예를 들어 S. 아우레우스 dCas9를 포함함), EZH2; 예를 들어 EZH2 도메인을 포함하는 제1 이펙터 모이어티, 및 HDAC8, 예를 들어 HDAC8 도메인을 포함하는 제2 이펙터 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 dCas9, 예를 들어 S. 피오게네스 dCas9, 예를 들어 돌연변이체 S. 피오게네스 Cas9, 예를 들어 Cas9m4를 포함하는 표적화 모이어티; EZH2, 예를 들어 EZH2 도메인을 포함하는 제1 이펙터 모이어티; 및 HDAC8, 예를 들어 HDAC8 도메인을 포함하는 제2 이펙터 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 서열번호 215의 핵산 서열(예를 들어, 부위-특이적 파괴제를 인코딩하는 mRNA)에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 핵산은 서열번호 215의 핵산 서열, 또는 상기 서열과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 상기 서열에 대해 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 상이한 위치를 갖는 서열을 포함한다.
EZH2-dCas9-HDAC8 mRNA(MR-29447)
Figure pct00063
Figure pct00064
Figure pct00065
Figure pct00066
Figure pct00067
일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 서열번호 216 또는 79의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 부위-특이적 파괴제는 서열번호 216 또는 79의 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 상기 서열에 대해 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 상이한 위치를 갖는 서열을 포함한다.
EZH2-dCas9-HDAC8 단백질 서열(MR-29447에 상응함)
Figure pct00068
Figure pct00069
EZH2-dCas9-HDAC8 단백질 서열(MR-29447에 상응함)
Figure pct00070
일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 표적화 모이어티(예를 들어, dCas9, 예를 들어 S. 아우레우스 dCas9를 포함함), G9A; 예를 들어 G9A 도메인을 포함하는 제1 이펙터 모이어티, 및 EZH2, 예를 들어 EZH2 도메인을 포함하는 제2 이펙터 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 dCas9, 예를 들어 S. 피오게네스 dCas9, 예를 들어 돌연변이체 S. 피오게네스 Cas9, 예를 들어 Cas9m4를 포함하는 표적화 모이어티; G9A, 예를 들어 G9A 도메인을 포함하는 제1 이펙터 모이어티; 및 EZH2, 예를 들어 EZH2 도메인을 포함하는 제2 이펙터 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 서열번호 69의 핵산 서열(예를 들어, 부위-특이적 파괴제를 인코딩하는 mRNA)에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 핵산은 서열번호 69의 핵산 서열, 또는 상기 서열과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 상기 서열에 대해 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 상이한 위치를 갖는 서열을 포함한다.
G9A-dCas9-EZH2(MR-29441) mRNA 서열
Figure pct00071
Figure pct00072
Figure pct00073
Figure pct00074
Figure pct00075
일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 서열번호 70 또는 80의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 부위-특이적 파괴제는 서열번호 70 또는 80의 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 상기 서열에 대해 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 상이한 위치를 갖는 서열을 포함한다.
G9A-dCas9-EZH2 단백질
Figure pct00076
Figure pct00077
HA 태그를 갖지 않는 G9A-dCas9-EZH2 단백질
Figure pct00078
일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 표적화 모이어티(예를 들어, dCas9, 예를 들어 S. 아우레우스 dCas9를 포함함), G9A; 예를 들어 G9A 도메인을 포함하는 제1 이펙터 모이어티, 및 KRAB, 예를 들어 KRAB 도메인을 포함하는 제2 이펙터 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 dCas9, 예를 들어 S. 피오게네스 dCas9, 예를 들어 돌연변이체 S. 피오게네스 Cas9, 예를 들어 Cas9m4를 포함하는 표적화 모이어티; G9A, 예를 들어 G9A 도메인을 포함하는 제1 이펙터 모이어티; 및 KRAB, 예를 들어 KRAB 도메인을 포함하는 제2 이펙터 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 서열번호 71의 핵산 서열(예를 들어, 부위-특이적 파괴제를 인코딩하는 mRNA)에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 핵산은 서열번호 71의 핵산 서열, 또는 상기 서열과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 상기 서열에 대해 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 상이한 위치를 갖는 서열을 포함한다.
G9A-dCas9-KRAB(MR-29942) mRNA 서열
Figure pct00079
Figure pct00080
Figure pct00081
Figure pct00082
일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 서열번호 72 또는 81의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 부위-특이적 파괴제는 서열번호 72 또는 81의 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 상기 서열에 대해 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 상이한 위치를 갖는 서열을 포함한다.
G9A-dCas9-KRAB 단백질
Figure pct00083
HA 태그를 갖지 않는 G9A-dCas9-KRAB 단백질
Figure pct00084
일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 표적화 모이어티(예를 들어, dCas9, 예를 들어 S. 아우레우스 dCas9를 포함함), EZH2; 예를 들어 EZH2 도메인을 포함하는 제1 이펙터 모이어티, 및 KRAB, 예를 들어 KRAB 도메인을 포함하는 제2 이펙터 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 dCas9, 예를 들어 S. 피오게네스 dCas9, 예를 들어 돌연변이체 S. 피오게네스 Cas9, 예를 들어 Cas9m4를 포함하는 표적화 모이어티; EZH2, 예를 들어 EZH2 도메인을 포함하는 제1 이펙터 모이어티; 및 KRAB, 예를 들어 KRAB 도메인을 포함하는 제2 이펙터 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 서열번호 85의 핵산 서열(예를 들어, 부위-특이적 파괴제를 인코딩하는 mRNA)에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 핵산은 서열번호 85의 핵산 서열, 또는 상기 서열과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 상기 서열에 대해 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 상이한 위치를 갖는 서열을 포함한다.
EZH2-dCas9-KRAB(MR-29948) mRNA 서열
Figure pct00085
Figure pct00086
Figure pct00087
Figure pct00088
일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 서열번호 86 또는 82의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 부위-특이적 파괴제는 서열번호 86 또는 82의 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 상기 서열에 대해 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 상이한 위치를 갖는 서열을 포함한다.
EZH2-dCas9-KRAB 단백질
Figure pct00089
HA 태그를 갖지 않는 EZH2 -dCas9-KRAB 단백질
Figure pct00090
일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 Cas9를 포함하는 CRISPR/Cas 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 서열번호 217의 핵산 서열(예를 들어, 부위-특이적 파괴제를 인코딩하는 mRNA)에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 핵산은 서열번호 217의 핵산 서열, 또는 상기 서열과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 상기 서열에 대해 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 상이한 위치를 갖는 서열을 포함한다.
Cas9 mRNA(MR-28127)
Figure pct00091
Figure pct00092
Figure pct00093
일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 서열번호 218 또는 84의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 부위-특이적 파괴제는 서열번호 218 또는 84의 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 상기 서열에 대해 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 상이한 위치를 갖는 서열을 포함한다.
Cas9 단백질 서열(MR-28127에 상응함)
Figure pct00094
HA 태그를 갖지 않는 Cas9 단백질 서열(MR-28127에 상응함)
Figure pct00095
일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 핵 국재화 서열(nuclear localization sequence; NLS)을 포함한다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 NLS, 예를 들어 N-말단에 있는 SV40 NLS를 포함한다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 NLS, 예를 들어 C-말단에 있는 SV40 NLS를 포함한다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 NLS, 예를 들어 C-말단에 있는 뉴클레오플라스민 NLS를 포함한다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 N-말단에 있는 제1 NLS 및 C-말단에 있는 제2 NLS를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 NLS와 제2 NLS는 동일한 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 제1 NLS와 제2 NLS는 상이한 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 N-말단에 있는 제1 NLS, C-말단에 있는 제2 NLS 및 제3 NLS를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 2개의 NLS는 동일한 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 제1 NLS와 제2 NLS는 동일한 서열을 갖고, 제3 NLS는 제1 NLS 및 제2 NLS와 상이한 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 SV40 NLS를 포함하며, 예를 들어 부위-특이적 파괴제는 PKKKRK(서열번호 63)에 따른 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 뉴클레오플라스민 NLS을 포함하며, 예를 들어 부위-특이적 파괴제는 KRPAATKKAGQAKKK(서열번호 64)의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 뉴클레오플라스민 핵 국재화 서열 및 HA-태그 중 하나 이상, 예를 들어 이들 중 어느 하나 또는 둘 모두를 포함하는 C-말단 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 에피토프 태그, 예를 들어 HA 태그: YPYDVPDYA(서열번호 65)를 포함한다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 에피토프 태그의 2개의 카피를 포함할 수 있다.
에피토프 태그가 많은 연구 상황에서 유용하지만, 치료적 상황에서는 에피토프 태그를 생략하는 것이 때때로 바람직하다. 따라서, 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 에피토프 태그가 결여되어 있다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 부위-특이적 파괴제는 본 명세서에 제공된 서열(또는 상기 서열과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 상기 서열에 대해 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 상이한 위치를 갖는 서열)을 포함하지만, 서열번호 65의 HA 태그가 결여되어 있다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 핵산은 본 명세서에 제공된 서열(또는 상기 서열과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 상기 서열에 대해 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 상이한 위치를 갖는 서열)을 포함하지만, 서열번호 65의 HA 태그를 인코딩하는 영역이 결여되어 있다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 NLS를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 에피토프 태그를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 HA 태그를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 서열번호 65에 따른 HA 태그를 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 Zn 핑거 분자를 포함하는 표적화 모이어티 및 EZH2 또는 이의 기능성 단편 또는 변이체를 포함하는 이펙터 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 서열번호 219, 220, 222, 223, 233, 또는 234의 핵산 서열, 또는 상기 서열과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 상기 서열에 대해 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 상이한 위치를 갖는 서열에 의해 인코딩된다.
일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 Zn 핑거 분자를 포함하는 표적화 모이어티 및 DNMT3(예를 들어, DNMT3a 또는 DNMT3L) 또는 이의 기능성 단편 또는 변이체를 포함하는 이펙터 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 서열번호 221, 231, 또는 236 내지 239의 핵산 서열, 또는 상기 서열과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 상기 서열에 대해 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 상이한 위치를 갖는 서열에 의해 인코딩된다.
일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 Zn 핑거 분자를 포함하는 표적화 모이어티 및 G9A 또는 이의 기능성 단편 또는 변이체를 포함하는 이펙터 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 서열번호 224, 225, 또는 227 내지 230의 핵산 서열, 또는 상기 서열과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 상기 서열에 대해 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 상이한 위치를 갖는 서열에 의해 인코딩된다.
일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 Zn 핑거 분자를 포함하는 표적화 모이어티 및 HDAC8 또는 이의 기능성 단편 또는 변이체를 포함하는 이펙터 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 서열번호 226, 232, 235, 또는 240 내지 242의 핵산 서열, 또는 상기 서열과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 상기 서열에 대해 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 상이한 위치를 갖는 서열에 의해 인코딩된다.
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일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 방법 또는 조성물에 사용하기 위한 핵산(예를 들어, 부위-특이적 파괴제를 인코딩하는 핵산)은 서열번호 69, 71, 85, 201, 202, 204, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 또는 219 내지 242 중 어느 하나의 핵산 서열, 또는 이들 중 임의의 것의 상보적 또는 역상보적 서열을 포함하거나, 이들 중 임의의 것과 적어도 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 방법 또는 조성물에 사용하기 위한 부위-특이적 파괴제는 서열번호 70, 72 내지 82, 84, 86, 203, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 또는 218 중 어느 하나의 핵산 서열을 포함하거나, 이들 중 임의의 것과 적어도 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 방법 또는 조성물에 사용하기 위한 부위-특이적 파괴제는 서열번호 69, 71, 85, 201, 202, 204, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 또는 219 내지 242 중 임의의 것에 의해 인코딩되는 아미노산 서열, 또는 이들 중 임의의 것과 적어도 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
기능적 특성
본 개시내용의 부위-특이적 파괴제 또는 시스템은 세포 내의 복수의 표적 유전자의 발현을 조절하는 데, 예를 들어 감소시키는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 발현의 조절은 복수의 표적 유전자의 각각에 의해 인코딩되는 RNA, 예를 들어 mRNA의 수준의 감소를 포함한다. 일부 구현예에서, 발현의 조절은 복수의 표적 유전자의 각각에 의해 인코딩되는 단백질의 수준의 감소를 포함한다. 일부 구현예에서, 발현의 조절은 복수의 표적 유전자의 각각에 의해 인코딩되는 mRNA 및 단백질의 수준 둘 모두의 감소를 포함한다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제에 의해 접촉되거나 이를 포함하는 세포 내의 복수의 표적 유전자 중 유전자의 발현은 부위-특이적 파괴제 또는 시스템에 의해 접촉되지 않거나 이를 포함하지 않는 세포 내의 유전자의 발현 수준보다 적어도 1.05×(즉, 1.05배), 1.1×, 1.15×, 1.2×, 1.25×, 1.3×, 1.35×, 1.4×, 1.45×, 1.5×, 1.55×, 1.6×, 1.65×, 1.7×, 1.75×, 1.8×, 1.85×, 1.9×, 1.95×, 2×, 3×, 4×, 5×, 6×, 7×, 8×, 9×, 10×, 20×, 30×, 40×, 50×, 60×, 70×, 80×, 90×, 또는 100× 더 낮다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제 또는 시스템에 의해 접촉되거나 이를 포함하는 세포 내의 복수의 표적 유전자의 각 유전자의 발현은 부위-특이적 파괴제 또는 시스템에 의해 접촉되지 않거나 이를 포함하지 않는 세포 내의 유전자의 발현 수준보다 적어도 1.05×(즉, 1.05배), 1.1×, 1.15×, 1.2×, 1.25×, 1.3×, 1.35×, 1.4×, 1.45×, 1.5×, 1.55×, 1.6×, 1.65×, 1.7×, 1.75×, 1.8×, 1.85×, 1.9×, 1.95×, 2×, 3×, 4×, 5×, 6×, 7×, 8×, 9×, 10×, 20×, 30×, 40×, 50×, 60×, 70×, 80×, 90×, 또는 100× 더 낮다. 유전자의 발현은 RT-PCR, ELISA, 웨스턴 블롯을 포함한 당업자에게 알려진 방법, 및 실시예 2 또는 4 내지 19의 방법에 의해 검정될 수 있다.
본 개시내용의 부위-특이적 파괴제 또는 시스템은 앵커 서열에 대한 핵형성 폴리펩티드, 예를 들어 CTCF의 결합을 감소시키는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포를 부위-특이적 파괴제 또는 시스템과 접촉시키는 것 또는 부위-특이적 파괴제 또는 시스템을 투여하는 것은 앵커 서열(예를 들어, 복수의 표적 유전자를 포함하는 ASMC의 앵커 서열)에 대한 핵형성 폴리펩티드, 예를 들어 CTCF의 결합의 감소를 초래한다. 일부 구현예에서, 세포를 부위-특이적 파괴제 또는 시스템과 접촉시키는 것 또는 부위-특이적 파괴제 또는 시스템을 투여하는 것은, 예를 들어 ChIP 및/또는 정량적 PCR에 의해 측정될 때, 부위-특이적 파괴제 또는 시스템으로 처리하기 전 또는 부위-특이적 파괴제 또는 시스템의 부재 하의 앵커 서열에 대한 핵형성 폴리펩티드(예를 들어, CTCF)의 결합과 대비하여 결합의 완전한 손실 또는 적어도 50, 60, 70, 80, 90, 95, 또는 99%의 감소를 초래한다.
본 개시내용의 부위-특이적 파괴제 또는 시스템은 복수의 표적 세포를 포함하는 게놈 복합체(예를 들어, ASMC)를 파괴하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포를 부위-특이적 파괴제 또는 시스템과 접촉시키는 것 또는 부위-특이적 파괴제 또는 시스템을 투여하는 것은 부위-특이적 파괴제 또는 시스템으로 처리하기 전 또는 부위-특이적 파괴제 또는 시스템의 부재 하의 복합체의 수준과 대비하여 복수의 표적 유전자를 포함하는 게놈 복합체(예를 들어, ASMC)의 수준의 감소를 초래한다. 일부 구현예에서, 세포를 부위-특이적 파괴제 또는 시스템과 접촉시키는 것 또는 부위-특이적 파괴제 또는 시스템을 투여하는 것은, 예를 들어 ChIA-PET, ELISA(예를 들어, 유전자 발현 변화를 평가하기 위함), CUT&RUN, ATAC-SEQ, ChIP 및/또는 정량적 PCR에 의해 측정될 때, 부위-특이적 파괴제 또는 시스템으로 처리하기 전 또는 부위-특이적 파괴제 또는 시스템의 부재 하의 복합체의 수준과 대비하여 게놈 복합체, 예를 들어 ASMC의 완전한 손실, 또는 적어도 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 또는 99%의 감소를 초래한다.
본 개시내용의 부위-특이적 파괴제 또는 시스템은 일정 기간 동안 세포 내의 복수의 표적 유전자의 발현을 조절하는 데, 예를 들어 감소시키는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제 또는 시스템에 의해 접촉되거나 이를 포함하는 세포 내의 복수의 표적 유전자 중 유전자의 발현은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24시간, 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 또는 14일, 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5주, 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개월, 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5년(예를 들어, 무기한으로) 동안 상당히 감소된다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제 또는 시스템에 의해 접촉되거나 이를 포함하는 세포 내의 복수의 표적 유전자의 각 유전자의 발현은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24시간, 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 또는 14일, 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5주, 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개월, 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5년(예를 들어, 무기한으로) 동안 상당히 감소된다. 선택적으로, 부위-특이적 파괴제 또는 시스템에 의해 접촉되거나 이를 포함하는 세포 내의 복수의 표적 유전자 중 유전자의 발현은 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1년 이하 동안 상당히 감소된다. 선택적으로, 부위-특이적 파괴제 또는 시스템에 의해 접촉되거나 이를 포함하는 세포 내의 복수의 표적 유전자의 각 유전자의 발현은 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1년 이하 동안 상당히 감소된다.
부위-특이적 파괴제 또는 시스템은 복수의 이펙터 모이어티를 포함할 수 있으며, 각 이펙터 모이어티는 서로 다른 이펙터 모이어티와 상이한 기능성을 갖는다. 예를 들어, 부위-특이적 파괴제 또는 시스템은 히스톤 데아세틸라제 기능성을 포함하는 제1 이펙터 모이어티 및 DNA 메틸트랜스퍼라제 기능성을 포함하는 제2 이펙터 모이어티를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 복수의 표적 유전자의 발현의 조절, 예를 들어 감소에 대해 서로 상보적인 기능성을 갖는 이펙터 모이어티의 조합을 포함하며, 예를 들어 이들 기능성은 함께 발현을 감소시키고, 선택적으로, 개별적으로 존재할 때에는 발현을 감소시키지 않거나 무시할 만한 정도로 감소시킨다.
일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제 또는 시스템은 복수의 표적 유전자의 발현의 조절, 예를 들어 감소에 대해 서로 상승작용하는 기능성을 갖는 이펙터 모이어티의 조합을 포함한다. 이론에 의해 구애되고자 함이 없이, 다수의 억제 후성유전학적 마커(예를 들어, 다수의 상이한 유형의 후성유전학적 마커 및/또는 주어진 유형의 더 광범위한 마킹)가 단독으로의 개별적인 변형보다 더 효과적으로 발현을 함께 감소시킨다는 점에서(예를 들어, 발현의 더 큰 감소의 생성 및/또는 발현의 더 오래 지속된 감소), 게놈 유전자좌에 대한 후성유전학적 변형은 누적되는 것으로 생각된다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제 또는 시스템은 서로 상승작용하는 복수의 이펙터 모이어티를 포함하며, 예를 들어 각 이펙터 모이어티는 표적 유전자의 발현을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 서로 상승작용하는 복수의 상이한 이펙터 모이어티를 포함하는 부위-특이적 파괴제는 복수의 상이한 이펙터 모이어티 중 단지 하나만 또는 이펙터 모이어티의 비-상승적 조합을 포함하는 부위-특이적 파괴제보다 복수의 표적 유전자의 발현을 조절하는 데, 예를 들어 감소시키는 데 더 효과적이다. 일부 구현예에서, 그러한 부위-특이적 파괴제는 복수의 상이한 이펙터 모이어티 중 단지 하나만 또는 이펙터 모이어티의 비-상승적 조합을 포함하는 부위-특이적 파괴제 또는 시스템보다 복수의 표적 유전자의 발현을 조절하는, 예를 들어 감소시키는 데 적어도 1.05×(즉, 1.05배), 1.1×, 1.15×, 1.2×, 1.25×, 1.3×, 1.35×, 1.4×, 1.45×, 1.5×, 1.55×, 1.6×, 1.65×, 1.7×, 1.75×, 1.8×, 1.85×, 1.9×, 1.95×, 2×, 3×, 4×, 5×, 6×, 7×, 8×, 9×, 10×, 20×, 30×, 40×, 50×, 60×, 70×, 80×, 90×, 또는 100× 효과적이다.
표적 부위
본 명세서에 개시된 부위-특이적 파괴제 또는 시스템은 세포, 예를 들어 대상체 또는 환자의 세포 내의 복수의 표적 유전자의 발현을 조절하는 데, 예를 들어 감소시키는 데 유용하다. 복수의 표적 유전자는 당업자에게 알려진 임의의 유전자를 포함할 수 있다. 복수의 표적 유전자는 적어도 2개의 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화된 복수의 유전자는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 유전자(및 선택적으로 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 또는 30개 이하의 유전자), 예를 들어 제1 유전자 및 제2 유전자, 그리고 선택적으로 제3 유전자, 제4 유전자, 제5 유전자, 제6 유전자, 제7 유전자, 제8 유전자, 제9 유전자, 제10 유전자, 제11 유전자, 제12 유전자, 제13 유전자, 제14 유전자, 제15 유전자, 제16 유전자, 제17 유전자, 제18 유전자, 제19 유전자, 및/또는 제20 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화된 복수의 유전자는 2 내지 20개, 2 내지 18개, 2 내지 16개, 2 내지 14개, 2 내지 12개, 2 내지 10개, 2 내지 9개, 2 내지 8개, 2 내지 7개, 2 내지 6개, 2 내지 5개, 2 내지 4개, 2 내지 3개, 3 내지 20개, 3 내지 18개, 3 내지 16개, 3 내지 14개, 3 내지 12개, 3 내지 10개, 3 내지 9개, 3 내지 8개, 3 내지 7개, 3 내지 6개, 3 내지 5개, 3 내지 4개, 4 내지 20개, 4 내지 18개, 4 내지 16개, 4 내지 14개, 4 내지 12개, 4 내지 10개, 4 내지 9개, 4 내지 8개, 4 내지 7개, 4 내지 6개, 4 내지 5개, 5 내지 20개, 5 내지 18개, 5 내지 16개, 5 내지 14개, 5 내지 12개, 5 내지 10개, 5 내지 9개, 5 내지 8개, 5 내지 7개, 5 내지 6개, 6 내지 20개, 6 내지 18개, 6 내지 16개, 6 내지 14개, 6 내지 12개, 6 내지 10개, 6 내지 9개, 6 내지 8개, 6 내지 7개, 7 내지 20개, 7 내지 18개, 7 내지 16개, 7 내지 14개, 7 내지 12개, 7 내지 10개, 7 내지 9개, 7 내지 8개, 8 내지 20개, 8 내지 18개, 8 내지 16개, 8 내지 14개, 8 내지 12개, 8 내지 10개, 8 내지 9개, 9 내지 20개, 9 내지 18개, 9 내지 16개, 9 내지 14개, 9 내지 12개, 9 내지 10개, 10 내지 20개, 10 내지 18개, 10 내지 16개, 10 내지 14개, 10 내지 12개, 12 내지 20개, 12 내지 18개, 12 내지 16개, 12 내지 14개, 14 내지 20개, 14 내지 18개, 14 내지 16개, 16 내지 20개, 16 내지 18개, 또는 18 내지 20개의 유전자를 포함한다.
일부 구현예에서, 복수의 표적 유전자 중 2개 이상(예를 들어, 모두)의 유전자는 대상체, 예를 들어 포유동물, 예를 들어 인간, 소, 말, 양, 닭, 래트, 마우스, 고양이, 또는 개에서 질환 또는 병태와 연관된다. 일부 구현예에서, 질환 또는 병태는 염증성 질환, 예를 들어 면역 매개 염증성 질환이다. 일부 구현예에서, 질환 또는 병태는 류마티스 관절염, 염증성 관절염, 통풍, 천식, 호중구 천식, 호중구 피부병, 발 부종, 급성 호흡기 질환 증후군(ARDS), COVID-19, 건선, 염증성 장 질환, 감염(예를 들어, 병원균, 예를 들어 박테리아, 바이러스, 또는 진균에 의한 감염), 외상(예를 들어, 찰과상 또는 이물질), 방사선 또는 화학적 손상의 영향, 골관절염, 골관절염 관절 통증, 관절 통증, 염증성 통증, 급성 통증, 만성 통증, 방광염, 기관지염, 피부염, 심혈관계 질환, 신경퇴행성 질환, 간 질환, 폐 질환, 신장 질환, 통증, 종창, 경직, 압통, 발적, 미열, 또는 질환 상태와 관련된 바이오마커(예를 들어, 사이토카인, 면역 수용체, 또는 염증성 마커)의 상승 중 하나 이상이다. 일부 구현예에서, 염증성 장애는, 예를 들어 바이러스, 예를 들어 Sars-Cov-2 바이러스에 의한 감염과 연관된다. 일부 구현예에서, 염증성 장애는 자가면역 장애이다. 일부 구현예에서, 염증성 장애는 저산소증과 연관된다. 일부 구현예에서, 염증성 장애는 ARDS, 저산소증, 및/또는 패혈증과 연관된다. 일부 구현예에서, 감염은, 예를 들어 하나 초과의 병원균, 예를 들어 제1 바이러스 또는 박테리아, 또는 진균, 및 제2 바이러스, 또는 박테리아, 또는 진균에 의해 유발되는 중복 감염이다. 일부 구현예에서, 염증성 장애는 폐 세포 조성, 예를 들어 감소된 AT2 세포 및/또는 증가된 수지상 세포, 대식세포, 호중구 세포, NK 세포, 섬유아세포, 백혈구, 림프 내피 세포 및/또는 혈관 내피 세포를 변화시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 장애는 하나 이상의 동반이환, 예를 들어 호흡기 감염, 비만, 위식도 역류 질환, 피부 병변, 및/또는 페쇄성 수면 무호흡증과 연관된다.
일부 구현예에서, 복수의 표적 유전자 중 2개 이상(예를 들어, 모두)의 유전자는 세포, 예를 들어 대상체, 예를 들어 인간 대상체 내의 세포에서 비정상적으로 발현되며, 예를 들어 과발현된다.
일부 구현예에서, 복수의 표적 유전자 중 2개 이상(예를 들어, 모두)의 유전자는 관련된 기능성을 갖는다. 이론에 의해 구애되고자 함이 없이, 관련된 기능성을 갖는 유전자는 종종 게놈에서 서로 근접하게 위치되며 또한 종종 (전체적으로 또는 부분적으로) 공통되는 게놈 복합체, 예를 들어 ASMC 내에서 발견되는 것으로 생각된다. 복수의 유전자 중 2개 이상(예를 들어, 모두)이 관련된 기능성을 갖는 복수의 표적 유전자의 발현을 조절하는, 예를 들어 감소시키는 것은 상기 상호관련된 유전자를 포함하는 게놈 복합체, 예를 들어 ASMC를 표적화함으로써 효율적으로 및 효과적으로 달성될 수 있다.
일부 구현예에서, 복수의 표적 유전자 중 1, 2, 3개, 또는 그 이상(예를 들어, 모두)은 사이토카인, 예를 들어 케모카인, 인터류킨, 전사 인자(예를 들어, 인터페론 조절 전사 인자), 세포간 접착 분자(ICAM), 또는 인터페론 수용체이다. 일부 구현예에서, 복수의 표적 유전자 중 2개 이상(예를 들어, 모두)은 사이토카인, 인터류킨, 전사 인자(예를 들어, 인터페론 조절 전사 인자), 세포간 접착 분자(ICAM), 또는 인터페론 수용체이다. 일부 구현예에서, 복수의 표적 유전자는 포유동물 유전자, 예를 들어 마우스 유전자, 인간 유전자이다.
일부 구현예에서, 복수의 표적 유전자 중 2개 이상(예를 들어, 모두)의 유전자는 전염증성 기능성을 갖는다. 일부 구현예에서, 복수의 표적 유전자 중 2개 이상(예를 들어, 모두)의 유전자는 면역 세포, 예를 들어 호중구에 대한 화학유인물질로서 작용할 수 있다. 예를 들어, 전염증성 기능성을 갖는 유전자(또한 본 명세서에서 전염증성 유전자로 지칭됨)는 CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, IL8, CXCL15, CCL2, CCL7, CCL9, IL1A, IL1B, CSF2, IRF1, ICAM1, ICAM4, ICAM5, IFNAR2, IL10RB, 또는 IFNGR2를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 표적 유전자는 CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, IL8, CXCL15, CCL2, CCL7, CCL9, IL1A, IL1B, CSF2, IRF1, ICAM1, ICAM4, ICAM5, IFNAR2, IL10RB, 또는 IFNGR2 중 2개 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 유전자는 하나 이상의 유전자 이상의 인간 CXCL 패밀리를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 표적 유전자는 CXCL1(예를 들어, NM_002089에 따른 RNA를 인코딩하는 핵산 서열 또는 P09341에 따른 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산, 또는 이의 돌연변이체), CXCL2(예를 들어, NM_001511에 따른 RNA를 인코딩하는 핵산 서열 또는 P19875에 따른 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산, 또는 이의 돌연변이체), CXCL3(예를 들어, NM_002090에 따른 RNA를 인코딩하는 핵산 서열 또는 P19876에 따른 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산, 또는 이의 돌연변이체), CXCL4(예를 들어, NM_002619 또는 NM_001363352에 따른 RNA를 인코딩하는 핵산 서열 또는 P02776에 따른 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산, 또는 이의 돌연변이체), CXCL5(예를 들어, NM_002994에 따른 RNA를 인코딩하는 핵산 서열 또는 P42830에 따른 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산, 또는 이의 돌연변이체), CXCL6(예를 들어, NM_002993에 따른 RNA를 인코딩하는 핵산 서열 또는 P80162에 따른 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산, 또는 이의 돌연변이체), CXCL7(예를 들어, NM_002704에 따른 RNA를 인코딩하는 핵산 서열 또는 P02775에 따른 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산, 또는 이의 돌연변이체), 및 IL8(예를 들어, NM_000584 또는 NM_001354840에 따른 RNA를 인코딩하는 핵산 서열, 또는 P10145에 따른 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산, 또는 이의 돌연변이체)을 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 유전자는 하나 이상의 유전자 이상의 마우스 CXCL 패밀리를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 표적 유전자는 CXCL1(예를 들어, NM_008176.3에 따른 RNA를 인코딩하는 핵산 서열 또는 P12850에 따른 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산, 또는 이의 돌연변이체), CXCL2(예를 들어, NM_009140.2에 따른 RNA를 인코딩하는 핵산 서열 또는 P10889에 따른 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산, 또는 이의 돌연변이체), CXCL3(예를 들어, NM_203320.3에 따른 RNA를 인코딩하는 핵산 서열 또는 Q6W5C0에 따른 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산, 또는 이의 돌연변이체), CXCL4(예를 들어, NM_019932에 따른 RNA를 인코딩하는 핵산 서열 또는 Q9Z126에 따른 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산, 또는 이의 돌연변이체), CXCL5(예를 들어, NM_009141.3에 따른 RNA를 인코딩하는 핵산 서열 또는 P50228에 따른 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산, 또는 이의 돌연변이체), CXCL7(예를 들어, NM_023785.3에 따른 RNA를 인코딩하는 핵산 서열 또는 Q9EQI5에 따른 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산, 또는 이의 돌연변이체), 및 CXCL15(예를 들어, NM_011339에 따른 RNA를 인코딩하는 핵산 서열 또는 Q9WVL7에 따른 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산, 또는 이의 돌연변이체)를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 표적 유전자는 CCL2, CCL7, CCL9, IL1A, 및 IL1B를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 표적 유전자는 CSF2, IRF1, ICAM1, ICAM4, 및 ICAM5를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 표적 유전자는 IFNAR2, IL10RB, 및 IFNGR2를 포함한다.
일부 구현예에서, 복수의 표적 유전자 중 2개 이상(예를 들어, 모두) 유전자의 발현 억제는 단백질, 예를 들어 사이토카인을 인코딩하는 다른 유전자의 발현을 조절할 수 있으며, 예를 들어 CXCL 발현 및 염증 부위로의 CXCL의 세포 동원을 감소시키는 것은 염증 부위에서 GM-CSF, 및/또는 IL-6의 존재를 감소시킨다.
일부 구현예에서, 복수의 표적 유전자는 게놈 복합체, 예를 들어 ASMC의 일부이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, '복수의 표적 유전자는 게놈 복합체, 예를 들어 ASMC의 일부이다'라고 지칭하는 것은, 복수의 유전자의 각각이 게놈 복합체, 예를 들어 ASMC 내에 적어도 부분적으로 포함된다는 것을 의미한다. '게놈 복합체, 예를 들어 ASMC의 일부인 복수의 표적 유전자'라고 지칭하는 것은 복수의 표적 유전자를 포함하는 게놈 복합체, 예를 들어 ASMC와 관련하여 호환 가능하게 사용된다. 예를 들어, 복수의 표적 유전자는 게놈에서 서로 인접하여 위치한 2개의 유전자로 구성될 수 있으며, 여기서 제1 앵커 서열은 제1 유전자 내에 배치되고 제2 앵커 서열은 제1 유전자에 대해 원위인 제2 유전자의 외부에 배치된다. 상기 제1 및 제2 앵커 서열의 회합에 의해 형성된 ASMC는 제2 유전자를 전체적으로 포함하고 제1 유전자를 부분적으로 포함할 것이며; 이들 2개의 유전자로 구성된 복수의 유전자는 이러한 ASMC의 일부가 될 것이다. 일부 구현예에서, 복수의 표적 유전자 중 각 유전자는 전체적으로 게놈 복합체, 예를 들어 ASMC 내에 있다(예를 들어, 유전자 서열을 인코딩하는 전사체의 어떤 부분도 게놈 복합체, 예를 들어 ASMC의 외부에 없음). 일부 구현예에서, 복수의 표적 유전자 중 각 유전자는 부분적으로 게놈 복합체, 예를 들어 ASMC 내에 있다(예를 들어, 유전자 서열을 인코딩하는 전사체의 일부 부분은 게놈 복합체, 예를 들어 ASMC의 외부에 있음). 일부 구현예에서, 복수의 표적 유전자 중 적어도 하나의 유전자는 전체적으로 게놈 복합체, 예를 들어 ASMC 내에 있고(예를 들어, 유전자 서열을 인코딩하는 전사체의 어떤 부분도 게놈 복합체, 예를 들어 ASMC의 외부에 없음), 복수의 표적 유전자 중 적어도 하나의 유전자는 부분적으로 게놈 복합체, 예를 들어 ASMC 내에 있다(예를 들어, 유전자 서열을 인코딩하는 전사체의 일부 부분은 게놈 복합체, 예를 들어 ASMC의 외부에 있음).
복수의 표적 유전자 중의 유전자는 코딩 서열, 예를 들어 엑손, 및/또는 비-코딩 서열, 예를 들어 인트론, 3'UTR, 또는 5'UTR을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 복수의 표적 유전자의 유전자는 전사 제어 요소에 작동가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 복수의 표적 유전자 중 유전자의 전사 제어 요소는 또한 게놈 복합체, 예를 들어 ASMC(유전자가 이의 일부임)의 일부이다. '게놈 복합체, 예를 들어 ASMC의 일부인 유전자에 작동가능하게 연결된 전사 제어 요소'를 지칭하는 것은 복수의 표적 유전자에 관하여 상기 기재된 바와 동일한 의미로 이해될 수 있다. 일부 구현예에서, 복수의 표적 유전자 중 유전자에 작동가능하게 연결된 각 전사 제어 요소는 전체적으로 게놈 복합체, 예를 들어 ASMC 내에 있다(예를 들어, 전사 제어 요소 서열의 어떤 부분도 게놈 복합체, 예를 들어 ASMC의 외부에 없음). 일부 구현예에서, 복수의 표적 유전자 중 각 전사 제어 요소는 부분적으로 게놈 복합체, 예를 들어 ASMC 내에 있다(예를 들어, 전사 제어 요소 서열의 일부 부분은 게놈 복합체, 예를 들어 ASMC의 외부에 있음). 일부 구현예에서, 복수의 표적 유전자 중 각 전사 제어 요소는 완전히 게놈 복합체, 예를 들어 ASMC의 외부에 있다(예를 들어, 각 전사 제어 요소 서열은 게놈 복합체, 예를 들어 ASMC의 외부에 있음). 일부 구현예에서, 복수의 표적 유전자 중 유전자에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 전사 제어 요소는 전체적으로 게놈 복합체, 예를 들어 ASMC 내에 있다(예를 들어, 전사 제어 요소 서열의 어떤 부분도 게놈 복합체, 예를 들어 ASMC의 외부에 없음). 일부 구현예에서, 복수의 표적 유전자 중 또 다른 유전자에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 전사 제어 요소는 부분적으로 게놈 복합체, 예를 들어 ASMC 내에 있다(예를 들어, 유전자 서열을 인코딩하는 전사체의 일부 부분은 게놈 복합체, 예를 들어 ASMC의 외부에 있음). 일부 구현예에서, 복수의 표적 유전자 중의 유전자에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 전사 제어 요소는 완전히 게놈 복합체, 예를 들어 ASMC의 외부에 있다.
일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제 또는 시스템은 앵커 서열, 예를 들어 복수의 표적 유전자를 포함하는 게놈 복합체(예를 들어, ASMC)의 일부인 앵커 서열에 대한 결합에 의해 복수의 표적 유전자를 표적화한다. 일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 앵커 서열에 결합한다. 일부 구현예에서, 앵커 서열에 대한 게놈 복합체 성분, 예를 들어 핵형성 폴리펩티드의 결합은 복합체 형성, 예를 들어 앵커 서열-매개 연접부 형성을 핵형성한다. 각 앵커 서열-매개 연접부는 하나 이상의 앵커 서열, 예를 들어 복수의 앵커 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 앵커 서열-매개 연접부는 복수의 표적 유전자의 발현을 변경시키도록, 예를 들어 억제하도록 파괴될 수 있다. 그러한 파괴는, 예를 들어 DNA의 토폴로지 구조를 변경시킴으로써, 예를 들어 전사 제어 요소(예를 들어, 인핸싱 및 침묵/억제 서열)와 상호작용할 수 있는 복수의 유전자의 능력을 조절함으로써, 유전자 발현을 조절할 수 있다.
부위-특이적 파괴제 또는 시스템에 사용하기에 적합한 표적화 모이어티는 앵커 서열, 예를 들어 복수의 표적 유전자를 포함하는 게놈 복합체(예를 들어, ASMC)의 일부인 앵커 서열에 근접한 부위에 결합할, 예를 들어 특이적으로 결합할 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, '근접'은 제1 부위에서 부위-특이적 파괴제 또는 시스템의 결합 및/또는 부위-특이적 파괴제에 의한 제1 부위의 변형이 다른 부위의 결합 및/또는 변형과 동일하거나 실질적으로 동일한 효과를 생성하도록 할 2개의 부위, 예를 들어 핵산 부위의 접근성을 지칭한다. 예를 들어, 표적화 모이어티는 복수의 표적 유전자(제2 부위)를 포함하는 게놈 복합체(예를 들어, ASMC)의 일부인 앵커 서열에 근접한 제1 부위에 결합할 수 있고, 상기 표적화 모이어티와 연관된 이펙터 모이어티는, 앵커 서열을 포함하는 게놈 복합체(예를 들어, ASMC)가 마치 제2 부위가 결합되고/되거나 변형된 것처럼 실질적으로 동일하게 변형되도록 제1 부위를 후성유전학적으로 변형시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 유전자(예를 들어, 표적 유전자 내의 엑손, 인트론, 또는 스플라이스 부위)에 근접한 부위, 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 전사 제어 요소에 근접한 부위, 또는 앵커 서열에 근접한 부위는 표적 유전자(예를 들어, 표적 유전자 내의 엑손, 인트론, 또는 스플라이스 부위), 전사 제어 요소, 또는 앵커 서열로부터 5000, 4000, 3000, 2000, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 50, 40, 30, 25, 20, 15, 10, 또는 5개의 염기쌍(그리고 선택적으로, 표적 유전자(예를 들어, 표적 유전자 내의 엑손, 인트론, 또는 스플라이스 부위), 전사 제어 요소, 또는 앵커 서열)로부터 적어도 적어도 5, 10, 20, 25, 50, 100, 200, 또는 300개의 염기쌍) 내에 있다. 일부 구현예에서, 앵커 서열에 근접한 부위는 앵커 서열로부터 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 50, 40, 30, 20, 10, 또는 5개 염기쌍 미만(그리고 선택적으로, 적어도 5, 10, 20, 25, 50, 100, 200, 또는 300개 염기쌍) 내에 있는 부위이다. 일부 구현예에서, 앵커 서열에 근접한 부위는 앵커 서열로부터 800, 700, 600, 500, 400, 500, 400, 또는 300개 염기쌍 미만(그리고 선택적으로, 적어도 5, 10, 20, 25, 50, 100, 200, 또는 300개 염기쌍) 내에 있는 부위이다.
본 명세서에 기재된 부위-특이적 파괴제 또는 시스템에 사용하기에 적합한 표적화 모이어티는 적어도 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개의 뉴클레오티드 또는 염기쌍(그리고 선택적으로, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 또는 10개 이하의 뉴클레오티드 또는 염기쌍)을 포함하는 부위에 결합할, 예를 들어 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개의 뉴클레오티드 또는 염기쌍을 포함하는 부위에 결합한다.
게놈 복합체
본 개시내용과 관련된 게놈 복합체는 복수의 폴리펩티드 및/또는 핵산(특히, 리보핵산) 성분을 포함하고 2개 이상의 게놈 서열 요소(예를 들어, 앵커 서열, 프로모터 및/또는 인핸서 요소)를 공동국재화하는 안정적인 구조를 포함한다. 일부 구현예에서, 관련 게놈 복합체는 앵커-서열-매개 연접부(예를 들어, 게놈 루프)를 포함한다. 일부 구현예에서, 게놈 복합체 내(즉, 3차원 공간 내)에 있는 게놈 서열 요소는 전사 프로모터 및/또는 조절(예를 들어, 인핸서 또는 리프레서) 서열을 포함한다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 일부 구현예에서, 게놈 복합체 내에 있는 게놈 서열 요소는 CTCF, YY1 등 중 하나 이상에 대한 결합 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, 게놈 복합체는 복수의 표적 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 표적 유전자 중 2개 이상(예를 들어, 모두)의 유전자는 ASMC의 단일 루프 내에 위치한다. 일부 구현예에서, 복수의 표적 유전자 중 2개 이상(예를 들어, 모두)의 유전자는 ASMC의 상이한 루프 내에 위치한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용에 따라 발생률이 감소한 게놈 복합체는 게놈 서열 요소(예를 들어, 일부 구현예에서 핵형성 성분에 의해 인식될 수 있는 앵커 서열, 예를 들어 CTCF 결합 모티프, YY1 결합 모티프 등), 하나 이상의 폴리펩티드 성분(예를 들어, 하나 이상의 핵형성 폴리펩티드, 하나 이상의 전사 기구 단백질, 및/또는 하나 이상의 전사 조절 단백질), 및/또는 하나 이상의 비-게놈 핵산 성분(예를 들어, 비-코딩 RNA 및/또는 mRNA, 예를 들어 게놈 복합체와 연관된 게놈으로부터 전사된 것) 중 하나 이상의 성분을 포함하거나, 이로 구성된다.
일부 구현예에서, 게놈 복합체 성분은 게놈 복합체의 일부이며, 여기서 게놈 복합체는, 예를 들어 복수의 단백질 및/또는 다른 성분 사이의 상호작용을 통해, 염색체 상의 서로 이격된 2개의 게놈 서열 요소를 합친 것이다.
일부 구현예에서, 게놈 서열 요소는 복합체의 하나 이상의 단백질 성분이 결합하는 앵커 서열이며; 따라서, 일부 구현예에서 게놈 복합체는 앵커-서열-매개 연접부를 포함한다. 일부 구현예에서, 게놈 서열 요소는 CTCF 결합 모티프, 프로모터 및/또는 인핸서를 포함한다. 일부 구현예에서, 게놈 서열 요소는 프로모터 및/또는 조절 부위(예를 들어, 인핸서) 중 적어도 하나 또는 둘 모두를 포함한다. 일부 구현예에서, 복합체 형성은 게놈 서열 요소(들)에서 그리고/또는 게놈 서열 요소(들)에 대한 단백질 성분(들) 중 하나 이상의 결합에 의해 핵형성된다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 게놈 복합체에 관련된 게놈 서열 요소는 서로 인접하지 않을 수 있다. 비인접 게놈 서열 요소(예를 들어, 앵커 서열, 프로모터, 및/또는 전사 조절 서열)를 갖는 일부 구현예에서, 제1 게놈 서열 요소(예를 들어, 앵커 서열, 프로모터, 또는 전사 조절 서열)는 제2 게놈 서열 요소(예를 들어, 앵커 서열, 프로모터, 또는 전사 조절 서열)로부터 약 500 bp 내지 약 500 Mb, 약 750 bp 내지 약 200 Mb, 약 1 kb 내지 약 100 Mb, 약 25 kb 내지 약 50 Mb, 약 50 kb 내지 약 1 Mb, 약 100 kb 내지 약 750 kb, 약 150 kb 내지 약 500 kb, 또는 약 175 kb 내지 약 500 kb 떨어져 있을 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 게놈 서열 요소(예를 들어, 앵커 서열, 프로모터, 또는 전사 조절 서열)는 제2 게놈 서열 요소(예를 들어, 앵커 서열, 프로모터, 또는 전사 조절 서열)로부터 약 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp, 1 kb, 5 kb, 10 kb, 15 kb, 20 kb, 25 kb, 30 kb, 35 kb, 40 kb, 45 kb, 50 kb, 55 kb, 60 kb, 65 kb, 70 kb, 75 kb, 80 kb, 85 kb, 90 kb, 95 kb, 100 kb, 125 kb, 150 kb, 175 kb, 200 kb, 225 kb, 250 kb, 275 kb, 300 kb, 350 kb, 400 kb, 500 kb, 600 kb, 700 kb, 800 kb, 900 kb, 1 Mb, 2 Mb, 3 Mb, 4 Mb, 5 Mb, 6 Mb, 7 Mb, 8 Mb, 9 Mb, 10 Mb, 15 Mb, 20 Mb, 25 Mb, 50 Mb, 75 Mb, 100 Mb, 200 Mb, 300 Mb, 400 Mb, 500 Mb, 또는 이 사이의 임의의 크기만큼 떨어져 있다.
앵커 서열-매개 연접부
일부 구현예에서, 본 개시내용과 관련된 게놈 복합체는 앵커 서열-매개 연접부(ASMC)이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵형성 폴리펩티드(들)가 게놈 내의 앵커 서열에 결합하고 이들 단백질, 및 선택적으로 하나 이상의 다른 성분 사이의 상호작용이 앵커 서열이 물리적으로 공동국재화된 연접부를 형성할 때 앵커-서열-매개 연접부가 형성된다. 본 명세서에 기재된 많은 구현예에서, 하나 이상의 유전자는 앵커-서열-매개 연접부와 연관되고; 그러한 구현예에서, 앵커 서열-매개 연접부는 통상적으로 하나 이상의 앵커 서열, 하나 이상의 유전자, 및 하나 이상의 전사 제어 서열, 예컨대 인핸싱 또는 침묵 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 전사 제어 서열은 앵커 서열-매개 연접부 내부에, 부분적으로 내부에, 또는 외부에 있다. 일부 구현예에서, ASMC는 내부 인핸싱 서열, 예를 들어 인핸서를 포함한다. 일부 구현예에서, ASMC는 복수의 표적 유전자를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 게놈 복합체(예를 들어, 앵커 서열-매개 연접부)는 게놈 루프, 예컨대 염색체내 루프이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 게놈 복합체(예를 들어, 앵커 서열-매개 연접부)는 복수의 게놈 루프를 포함한다. 하나 이상의 게놈 루프는 제1 앵커 서열, 핵산 서열, 전사 제어 서열, 및 제2 앵커 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 게놈 루프는 제1 앵커 서열, 전사 제어 서열, 및 제2 앵커 서열; 또는 제1 앵커 서열, 핵산 서열, 및 제2 앵커 서열을 순서대로 포함한다. 또 다른 일부 구현예에서, 핵산 서열 및 전사 제어 서열 중 하나 또는 둘 모두는 게놈 루프 내부에 위치한다. 또 다른 일부 구현예에서, 핵산 서열 및 전사 제어 서열 중 하나 또는 둘 모두는 게놈 루프 외부에 위치한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 게놈 루프는 전사 제어 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 게놈 복합체(예를 들어, 앵커 서열-매개 연접부)는 TATA 박스, CAAT 박스, GC 박스, 또는 CAP 부위를 포함한다.
일부 구현예에서, 앵커 서열-매개 연접부는 복수의 게놈 루프를 포함하고; 일부 그러한 구현예에서, 앵커 서열-매개 연접부는 하나 이상의 게놈 루프에 앵커 서열, 핵산 서열, 및 전사 제어 서열 중 적어도 하나를 포함한다.
루프 유형
일부 구현예에서, 게놈 루프는 하나 이상, 예를 들어 2, 3, 4, 5개, 또는 그 이상의 유전자, 예를 들어 복수의 표적 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 표적 유전자 중 2개 이상, 예를 들어 2, 3, 4, 5개, 또는 그 이상의 유전자는 동일한 방향으로 전사된다. 일부 구현예에서, 복수의 표적 유전자 중 모든 유전자는 동일한 방향으로 전사된다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 루프 내 복수의 표적 유전자의 발현을 조절하는(예를 들어, 감소시키는) 방법을 제공하며, 상기 방법은 (i) (예를 들어, 복수의 표적 유전자 중) 발현이 조절되는 유전자; 및/또는 (ii) 발현이 조절되는 유전자의 전사에 영향을 미치는 하나 이상의 연관된 전사 제어 서열의 외부에 있거나, 이의 일부가 아니거나, 이의 내부에 포함되는 게놈 서열의 공동국재화를 달성하는 게놈 복합체를 억제하고/하거나, 분리하고/하거나, 분해하고/하거나, 변형시키는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 복수의 표적 유전자의 전사를 조절하는(예를 들어, 감소시키는) 방법을 제공하며, 상기 방법은 (i) (예를 들어, 복수의 표적 유전자 중) 발현이 조절되는 유전자; 및/또는 (ii) 발현이 조절되는 유전자의 전사에 영향을 미치는 연관된 전사 제어 서열과 인접하지 않은 게놈 서열의 공동국재화를 달성하는 복합체의 형성을 억제하고/하거나 복합체를 불안정화시키는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 앵커 서열-매개 연접부는 하나 이상, 예를 들어 2, 3, 4, 5개, 또는 그 이상의 전사 제어 서열과 회합된다. 일부 구현예에서, 복수의 표적 유전자 중의 유전자(예를 들어, 복수의 표적 유전자 중 1, 2개, 또는 그 이상, 예를 들어 모두)는 하나 이상의 전사 제어 서열과 인접하지 않는다. 유전자가 전사 제어 서열(들)과 인접하지 않는 일부 구현예에서, 유전자는 하나 이상의 전사 제어 서열로부터 약 100 bp 내지 약 500 Mb, 약 500 bp 내지 약 200 Mb, 약 1 kb 내지 약 100 Mb, 약 25 kb 내지 약 50 Mb, 약 50 kb 내지 약 1 Mb, 약 100 kb 내지 약 750 kb, 약 150 kb 내지 약 500 kb, 또는 약 175 kb 내지 약 500 kb 떨어져 있을 수 있다. 일부 구현예에서, 유전자는 전사 제어 서열로부터 약 100 bp, 300 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp, 1 kb, 5 kb, 10 kb, 15 kb, 20 kb, 25 kb, 30 kb, 35 kb, 40 kb, 45 kb, 50 kb, 55 kb, 60 kb, 65 kb, 70 kb, 75 kb, 80 kb, 85 kb, 90 kb, 95 kb, 100 kb, 125 kb, 150 kb, 175 kb, 200 kb, 225 kb, 250 kb, 275 kb, 300 kb, 350 kb, 400 kb, 500 kb, 600 kb, 700 kb, 800 kb, 900 kb, 1 Mb, 2 Mb, 3 Mb, 4 Mb, 5 Mb, 6 Mb, 7 Mb, 8 Mb, 9 Mb, 10 Mb, 15 Mb, 20 Mb, 25 Mb, 50 Mb, 75 Mb, 100 Mb, 200 Mb, 300 Mb, 400 Mb, 500 Mb, 또는 이 사이의 임의의 크기만큼 떨어져 있다.
앵커 서열
일반적으로, 앵커 서열은 게놈 복합체 성분, 예를 들어 핵형성 폴리펩티드가 특이적으로 결합하는 게놈 서열 요소이다. 일부 구현예에서, 앵커 서열에 대한 게놈 복합체 성분의 결합은 복합체 형성을 핵형성한다.
각각의 앵커 서열-매개 연접부는 하나 이상, 예를 들어 복수의 앵커 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 앵커 서열은 자연 발생 루프를 형성 및/또는 안정화시키기 위해, 하나 이상의 새로운 루프를 형성하기 위해(예를 들어, 외인성 루프를 형성하기 위해 또는 외인성 또는 변경된 앵커 서열을 갖는 비자연 발행 루프를 형성하기 위해), 또는 자연 발생 또는 외인성 루프의 형성을 억제하거나 불안정화시키기 위해 조작되거나 변경될 수 있다. 그러한 변경은, 예를 들어 DNA의 토폴로지 구조를 변경시킴으로써, 예를 들어 이에 의해 유전자 조절 및 제어 요소(예를 들어, 인핸싱 및 침묵/억제 서열)와 상호작용할 수 있는 표적 유전자의 능력을 조절함으로써, 유전자 발현을 조절할 수 있다.
일부 구현예에서, 염색질 구조는 앵커 서열-매개 연접부 내에서 하나 이상의 뉴클레오티드를 치환하거나, 추가하거나 결실시킴으로써 변형된다. 일부 구현예에서, 염색질 구조는 앵커 서열-매개 연접부의 앵커 서열 내에서 하나 이상의 뉴클레오티드를 치환하거나, 추가하거나 결실시킴으로써 변형된다.
일부 구현예에서, 앵커 서열은 공통 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 다음과 같은 CTCF-결합 모티프를 포함한다: N(T/C/G)N(G/A/T)CC(A/T/G)(C/G)(C/T/A)AG(G/A)(G/T)GG(C/A/T)(G/A)(C/G)(C/T/A)(G/A/C)(서열번호 1)(여기서, N은 임의의 뉴클레오티드임).
A CTCF-결합 모티프는 또한 반대 배향일 수 있으며, 예를 들어 (G/A/C)(C/T/A)(C/G)(G/A)(C/A/T)GG(G/T)(G/A)GA(C/T/A)(C/G)(A/T/G)CC(G/A/T)N(T/C/G)N(서열번호 2)이다. 일부 구현예에서, 앵커 서열은 서열번호 1 또는 서열번호 2를 포함하거나, 서열번호 1 또는 서열번호 2 중 어느 하나와 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 앵커 서열은 CTCF 결합 모티프, USF1 결합 모티프, YY1 결합 모티프, TAF3 결합 모티프, 또는 ZNF143 결합 모티프를 포함한다. 일부 구현예에서, 앵커 서열은 핵형성 폴리펩티드 결합 모티프, 예를 들어 YY1-결합 모티프를 포함한다: CCGCCATNTT(서열번호 3)(여기서, N은 임의의 뉴클레오티드임). YY1-결합 모티프는 또한 반대 배향일 수 있으며, 예를 들어 AANATGGCGG(서열번호 4)(여기서, N은 임의의 뉴클레오티드임)이다. 일부 구현예에서, 앵커 서열은 서열번호 3 또는 서열번호 4를 포함하거나, 서열번호 3 또는 서열번호 4 중 어느 하나와 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 앵커 서열-매개 연접부는 제1 앵커 서열 및 제2 앵커 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 제1 앵커 서열 및 제2 앵커 서열은 각각 공통 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있으며, 예를 들어 각각은 CTCF 결합 모티프를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 앵커 서열 및 제2 앵커 서열은 각각 USF1 결합 모티프를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 앵커 서열 및 제2 앵커 서열은 각각 YY1 결합 모티프를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 앵커 서열 및 제2 앵커 서열은 각각 TAF3 결합 모티프를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 앵커 서열 및 제2 앵커 서열은 각각 ZNF143 결합 모티프를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 제1 앵커 서열 및 제2 앵커 서열은 상이한 서열을 포함하며, 예를 들어 제1 앵커 서열은 CTCF 결합 모티프를 포함하고, 제2 앵커 서열은 CTCF 결합 모티프 이외의 앵커 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 앵커 서열은 CTCF 결합 모티프, USF1 결합 모티프, YY1 결합 모티프, TAF3 결합 모티프, 또는 ZNF143 결합 모티프를 포함하고, 제2 앵커 서열은 CTCF 결합 모티프, USF1 결합 모티프, YY1 결합 모티프, TAF3 결합 모티프, 또는 ZNF143 결합 모티프를 포함하며, 여기서 제1 및 제2 앵커 서열은 둘 모두 CTCF 결합 모티프, USF1 결합 모티프, YY1 결합 모티프, TAF3 결합 모티프, 또는 ZNF143 결합 모티프를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 각 앵커 서열은 공통 뉴클레오티드 서열(예를 들어, CTCF 결합 모티프, USF1 결합 모티프, YY1 결합 모티프, TAF3 결합 모티프, 또는 ZNF143 결합 모티프)을 포함하고 공통 뉴클레오티드 서열의 한쪽 또는 양쪽에 하나 이상의 측접 뉴클레오티드를 포함한다.
연접부를 형성할 수 있는 2개의 앵커 서열(예를 들어, 각각은 CTCF 결합 모티프, USF1 결합 모티프, YY1 결합 모티프, TAF3 결합 모티프, 또는 ZNF143 결합 모티프를 포함함)은 임의의 배향으로, 예를 들어 5'-3'(좌측 탠덤) 또는 3'-5'(우측 탠덤) 중 어느 하나의 동일한 배향(탠덤)으로, 또는 하나의 앵커 서열은 5'-3'으로 배향되고 다른 하나는 3'-5'으로 배향되는 수렴 배향으로 게놈에 존재할 수 있다.
연접부를 형성할 수 있는 2개의 CTCF-결합 모티프(예를 들어, 연속 또는 비연속 CTCF 결합 모티프)는 임의의 배향으로, 예를 들어 5'-3'(좌측 탠덤, 예를 들어 서열번호 1을 포함하는 2개의 CTCF-결합 모티프) 또는 3'-5'(우측 탠덤, 예를 들어 서열번호 2를 포함하는 2개의 CTCF-결합 모티프) 중 어느 하나의 동일한 배향(탠덤)으로, 또는 하나의 CTCF-결합 모티프는 서열번호 1을 포함하고 또 다른 하나는 서열번호 2를 포함하는 수렴 배향으로 게놈에 존재할 수 있다. CTCFBSDB 2.0: Database For CTCF binding motifs And Genome Organization(월드와이드웹 insulatordb.uthsc.edu/)은 표적 유전자와 연관된 CTCF 결합 모티프를 확인하는 데 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 앵커 서열은 복수의 표적 유전자와 연관된 CTCF 결합 모티프를 포함하며, 여기서 복수의 표적 유전자는 질환, 장애 및/또는 병태와 연관된다. 일부 구현예에서, 앵커 서열은 복수의 표적 유전자와 연관된 CTCF 결합 모티프를 포함하며, 여기서 복수의 표적 유전자 중의 유전자는 관련된 기능성을 갖는다. 일부 구현예에서, 앵커 서열은 복수의 표적 유전자와 연관된 CTCF 결합 모티프를 포함하며, 여기서 복수의 표적 유전자(예를 들어, 복수 유전자 중 2개 이상, 예를 들어 모두)는 대상체의 세포에서 비정상적으로 발현된다.
일부 구현예에서, 염색질 구조는 적어도 하나의 앵커 서열, 예를 들어 핵형성 폴리펩티드 결합 모티프 내에서 하나 이상의 뉴클레오티드를 치환하거나, 추가하거나 결실시킴으로써 변형될 수 있다. 하나 이상의 뉴클레오티드는 앵커 서열, 예를 들어 핵형성 폴리펩티드 결합 모티프 내에서 치환, 추가 또는 결실을 위해 특이적으로 표적화될 수 있으며, 예를 들어 표적화된 변경일 수 있다.
일부 구현예에서, 앵커 서열-매개 연접부는 적어도 하나의 공통 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 핵형성 폴리펩티드 결합 모티프의 배향을 변화시킴으로써 변경될 수 있다. 일부 구현예에서, 앵커 서열은 핵형성 폴리펩티드 결합 모티프, 예를 들어 CTCF 결합 모티프를 포함하고, 표적화 모이어티는 적어도 하나의 핵형성 폴리펩티드 결합 모티프에 변경을 도입하여, 예를 들어 핵형성 폴리펩티드에 대한 결합 친화도를 변경시킨다.
일부 구현예에서, 앵커 서열-매개 연접부는 외인성 앵커 서열을 도입함으로써 변경될 수 있다. 일부 구현예에서, 예를 들어 비자연 발생 루프를 형성하도록 유도함으로써, 자연 발생 앵커 서열-매개 연접부의 형성을 불안정화시키거나 억제하기 위한 비자연 발생 또는 외인성 앵커 서열의 첨가는 핵산 서열의 전사를 변경시킨다(예를 들어, 감소시킴).
기타 구성
핵산 및 벡터
추가로 본 개시내용은, 부분적으로, 본 명세서에 기재된 부위-특이적 파괴제 또는 시스템을 인코딩하는 핵산에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제는 부위-특이적 파괴제, 예를 들어 부위-특이적 파괴제의 표적화 모이어티 및/또는 이펙터 모이어티를 인코딩하는 핵산을 포함하는 조성물을 통해 제공될 수 있으며, 핵산은 관심 시스템 내에서(예를 들어, 특정 세포, 조직, 유기체 등 내에서) 부위-특이적 파괴제의 발현을 달성하기에 충분한 기타 다른 서열과 연관되어 있다. 일부 구현예에서, 시스템은 제1 부위-특이적 파괴제, 예를 들어 제1 부위-특이적 파괴제의 제1 표적화 모이어티 및/또는 제1 이펙터 모이어티를 인코딩하는 제1 핵산, 및 제2 부위 특이적 파괴제, 예를 들어 제2 부위-특이적 파괴제의 제2 표적화 모이어티 및/또는 제2 이펙터 모이어티를 인코딩하는 제2 핵산을 포함하는 조성물을 통해 제공될 수 있으며, 제1 및/또는 제2 핵산은 관심 시스템 내에서(예를 들어, 특정 세포, 조직, 유기체 등 내에서) 부위-특이적 파괴제의 발현을 달성하기에 충분한 기타 다른 서열과 연관되어 있다.
일부 특정 구현예에서, 본 개시내용은 부위-특이적 파괴제를 인코딩하는 핵산 또는 이의 폴리펩티드 또는 핵산 부분(예를 들어, 폴리펩티드 및/또는 핵산을 포함하는 표적화 모이어티 및/또는 이펙터 모이어티)을 인코딩하는 핵산의 조성물을 제공한다. 일부 특정 구현예에서, 본 개시내용은 제1 부위-특이적 파괴제 및 제2 부위-특이적 파괴제를 인코딩하는 핵산, 또는 이의 폴리펩티드 또는 핵산 부분(예를 들어, 폴리펩티드 및/또는 핵산을 포함하는 표적화 모이어티 및/또는 이펙터 모이어티)의 조성물을 제공한다. 일부 그러한 구현예에서, 제공된 핵산은 DNA, RNA, 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 임의의 다른 핵산 모이어티 또는 실체를 포함할 수 있으며, 본 명세서에 기재된 임의의 기술 또는 당업계에서 달리 이용가능한 기술(예를 들어, 합성, 클로닝, 증폭, 시험관내 또는 생체내 전사 등)에 의해 제조될 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 부위-특이적 파괴제를 인코딩하는 제공된 핵산, 또는 이의 폴리펩티드 또는 핵산 부분은 관심 시스템에서(예를 들어, 특정 세포, 조직, 유기체 등에서) 제공된 핵산의 통합, 복제, 및/또는 발현을 달성하기에 적절한 및/또는 충분한 하나 이상의 복제, 통합, 및/또는 발현 신호와 작동적으로 연관될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 부위-특이적 파괴제 또는 시스템을 전달하기 위한 조성물은 부위-특이적 파괴제를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 또는 이의 폴리펩티드 또는 핵산 부분을 포함하는 벡터, 예를 들어 바이러스 벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 벡터는 제1 부위-특이적 파괴제를 인코딩하는 제1 핵산을 포함하고, 제2 벡터는 제2 부위-특이적 파괴제를 인코딩하는 제2 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 벡터는 제1 부위-특이적 파괴제를 인코딩하는 제1 핵산, 및 제2 부위-특이적 파괴제를 인코딩하는 제2 핵산을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 부위-특이적 파괴제 또는 시스템을 전달하기 위한 조성물은 부위-특이적 파괴제의 하나 이상의 성분을 인코딩하는 하나 이상의 핵산 또는 이의 폴리펩티드 또는 핵산 부분을 포함하는 RNA, 예를 들어 mRNA이거나 이를 포함한다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 핵산 또는 본 명세서에 기재된 단백질을 인코딩하는 핵산이 벡터 내로 도입될 수 있다. 레트로바이러스, 예컨대 렌티바이러스로부터 유래된 것들을 포함한 벡터가 장기간 유전자 전달을 달성하기에 적합한 도구인데, 그 이유는, 이들 벡터가 이식유전자의 장기간의 안정적인 통합 및 딸 세포에서의 그의 증식을 가능하게 하기 때문이다. 벡터의 예에는 발현 벡터, 복제 벡터, 프로브 생성 벡터 및 시퀀싱 벡터가 포함된다. 발현 벡터는 바이러스 벡터의 형태로 세포에 제공될 수 있다. 바이러스 벡터 기술은 당업계에 잘 알려져 있으며, 다양한 바이러스학 및 분자 생물학 매뉴얼에 기재되어 있다. 벡터로서 유용한 바이러스는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 헤르페스 바이러스, 및 렌티바이러스를 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 일반적으로, 적합한 벡터는 적어도 하나의 유기체에서 기능성인 복제 기점, 프로모터 서열, 편리한 제한 엔도뉴클레아제 부위, 및 하나 이상의 선택가능한 마커를 포함한다.
천연 또는 합성 핵산의 발현은 통상적으로 관심 유전자를 인코딩하는 핵산을 프로모터에 작동가능하게 연결하고 작제물을 발현 벡터 내로 도입함으로써 달성된다. 벡터는 진핵세포에서 복제 및 통합에 적합할 수 있다. 통상적인 클로닝 벡터는 전사 및 번역 종결자, 개시 서열, 및 원하는 핵산 서열의 발현에 유용한 프로모터를 포함한다.
추가적인 프로모터 요소, 예를 들어 인핸싱 서열은 전사 개시의 빈도를 조절할 수 있다. 통상적으로, 이들 서열은 전사 개시 부위의 30 내지 110 bp 상류 영역 내에 위치되지만, 다수의 프로모터가 마찬가지로 전사 개시 부위의 하류에 기능성 요소를 포함하는 것으로 최근에 밝혀졌다. 프로모터 요소간의 간격은 빈번하게 가요성이어서, 요소들이 서로에 대해 역전되거나 이동될 때 프로모터 기능이 보존된다. 티미딘 키나제(tk) 프로모터에서는, 활성의 감소가 시작되기 전에 프로모터 요소간의 간격이 증가되어 50 bp로 떨어질 수 있다. 프로모터에 따라, 개별 요소들이 전사를 활성화하도록 협동적으로 또는 독립적으로 기능할 수 있는 것으로 나타난다.
적합한 프로모터의 한 예는 전초기 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터 서열이다. 이러한 프로모터 서열은 강력한 구성적 프로모터 서열로서, 이것에 작동가능하게 연결된 임의의 폴리뉴클레오티드 서열의 고수준의 발현을 유도할 수 있다. 일부 구현예에서, 적합한 프로모터는 연장 성장 인자-1α(EF-1α)이다. 그러나, 다른 구성적 프로모터 서열이 또한 사용될 수 있으며, 이에는 유인원 바이러스 40(SV40) 초기 프로모터, 마우스 유선 종양 바이러스(MMTV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 긴 말단 반복부(LTR) 프로모터, MoMuLV 프로모터, 조류 백혈병 바이러스 프로모터, 엡스타인-바(Epstein-Barr) 바이러스 전초기 프로모터, 라우스 육종 바이러스 프로모터뿐만 아니라, 인간 유전자 프로모터, 예컨대 제한 없이, 액틴 프로모터, 미오신 프로모터, 헤모글로빈 프로모터, 및 크레아틴 키나제 프로모터가 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
본 개시내용은 임의의 특정 프로모터 또는 프로모터 카테고리(예를 들어, 구성적 프로모터)의 사용으로 제한되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 유도성 프로모터가 본 개시내용의 일부로서 고려된다. 일부 구현예에서, 유도성 프로모터의 사용은, 그것에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현이 요구될 때, 그러한 발현을 켤 수 있는 분자 스위치를 제공한다. 일부 구현예에서, 유도성 프로모터의 사용은, 발현이 요구되지 않을 때 발현을 끌 수 있는 분자 스위치를 제공한다. 유도성 프로모터의 예에는 메탈로티오닌(metallothionine) 프로모터, 글루코코르티코이드 프로모터, 프로게스테론 프로모터, 및 테트라사이클린 프로모터가 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, 도입하려는 발현 벡터는 또한 선택가능한 마커 유전자 또는 리포터 유전자 중 어느 하나 또는 둘 모두를 함유하여, 바이러스 벡터를 통해 형질감염시키거나 감염시키고자 하는 세포 집단으로부터의 발현 세포의 확인 및 선택을 용이하게 할 수 있다. 일부 양태에서, 선택가능한 마커는 별개의 DNA 조각 상에서 운반되어 공동형질감염 절차에 사용될 수 있다. 선택가능한 마커 및 리포터 유전자 둘 모두에는 숙주 세포에서의 발현을 가능하게 하기에 적절한 전사 제어 서열이 측접될 수 있다. 유용한 선택가능한 마커는, 예를 들어 항생제-저항성 유전자, 예컨대 neo 등을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 리포터 유전자는 잠재적으로 형질감염된 세포를 확인하는 데 그리고/또는 전사 제어 서열의 기능성을 평가하는 데 사용될 수 있다. 일반적으로, 리포터 유전자는, (리포터 유전자의) 수용자 공급원에 존재하지 않거나 그에 의해 발현되지 않고, 어떠한 용이하게 검출가능한 특성, 예를 들어 효소 활성 또는 시각화 가능한 형광에 의해 발현이 나타나는 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자이다. 리포터 유전자의 발현은 DNA가 수용자 세포 내로 도입된 후 적합한 시간에 검정된다. 적합한 리포터 유전자는 루시퍼라제, 베타-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제, 분비 알칼리성 포스파타제, 또는 녹색 형광 단백질 유전자를 인코딩하는 유전자를 포함할 수 있다(예를 들어, 문헌[Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479: 79-82]). 적합한 발현 시스템은 잘 알려져 있으며, 알려진 기법을 사용하여 제조되거나 상업적으로 입수될 수 있다. 일반적으로, 최고 수준의 리포터 유전자 발현을 나타내는 최소 5' 측접 영역을 갖는 작제물이 프로모터로서 확인된다. 그러한 프로모터 영역은 리포터 유전자에 연결되어, 프로모터-구동 전사를 조절하는 능력에 대하여 작용제를 평가하는 데 사용될 수 있다.　
세포
추가로 본 개시내용은, 부분적으로, 본 명세서에 기재된 부위-특이적 파괴제 또는 시스템을 포함하는 세포에 관한 것이다. 당업자에게 알려진 임의의 세포, 예를 들어 세포주, 예를 들어 재조합 폴리펩티드의 발현에 적합한 세포주가 본 명세서에 기재된 부위-특이적 파괴제를 포함하기에 적합하다. 일부 구현예에서, 세포, 예를 들어 세포주가 부위-특이적 파괴제, 하나 이상의 부위-특이적 작용제, 또는 이의 핵산 또는 폴리펩티드 부분을 포함하는 시스템을 발현하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포, 예를 들어 세포주가 부위-특이적 파괴제를 인코딩하는 핵산, 예를 들어 벡터를 발현하거나 증폭시키는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포, 예를 들어 세포주가 제1 부위-특이적 파괴제를 인코딩하는 핵산, 예를 들어 벡터 및 제2 부위-특이적 파괴제를 인코딩하는 벡터를 발현하거나 증폭시키는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 본 명세서에 기재된 부위-특이적 파괴제를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 본 명세서에 기재된 제1 부위-특이적 파괴제를 인코딩하는 제1 핵산, 및 제2 부위-특이적 파괴제를 인코딩하는 제2 핵산을 포함한다.
일부 구현예에서, 세포는 부위-특이적 파괴제를 인코딩하는 핵산 또는 이의 핵산 또는 폴리펩티드 부분을 포함하고, 핵산은 세포의 게놈 DNA 내로 통합된다. 일부 구현예에서, 세포는 부위-특이적 파괴제를 인코딩하는 핵산 또는 이의 핵산 또는 폴리펩티드 부분을 포함하고, 핵산은 벡터 상에 배치된다. 일부 구현예에서, 세포는 제1 부위-특이적 파괴제를 인코딩하는 제1 핵산 및 제2 부위-특이적 파괴제를 인코딩하는 제2 핵산 또는 이의 핵산 또는 폴리펩티드 부분을 포함하고, 제1 및 제2 핵산은 세포의 게놈 DNA 내로 통합된다. 일부 구현예에서, 세포는 제1 부위-특이적 파괴제를 인코딩하는 제1 핵산 및 제2 부위-특이적 파괴제를 인코딩하는 제2 핵산 또는 이의 핵산 또는 폴리펩티드 부분을 포함하고, 제1 및 제2 핵산은 벡터 상에 배치된다.
본 명세서의 부위-특이적 파괴제 또는 시스템을 포함하고/하거나 발현할 수 있는 세포의 예에는 간세포, 성상 세포, 쿠퍼 세포, 뉴런 세포, 내피 세포, 폐포 세포, 상피 세포, 근세포, 윤활층, 연골세포, 면역 세포, 및 림프구가 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
추가로 본 개시내용은, 부분적으로, 본 명세서에 기재된 방법 또는 공정에 의해 제조된 세포에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 부위-특이적 파괴제를 제공하는 단계, 세포를 제공하는 단계, 및 세포를 부위-특이적 파괴제(또는 부위-특이적 파괴제를 인코딩하는 핵산, 또는 상기 부위-특이적 파괴제 또는 핵산을 포함하는 조성물)과 접촉시키는 단계를 수행함으로써 생성되는 세포를 제공한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 시스템을 제공하는 단계, 세포를 제공하는 단계, 및 세포를 시스템(또는 제1 부위-특이적 파괴제를 인코딩하는 제1 핵산 및 제2 부위-특이적 파괴제를 인코딩하는 제2 핵산, 또는 상기 시스템 또는 핵산을 포함하는 조성물)과 접촉시키는 단계를 수행함으로써 생성되는 세포를 제공한다. 이론에 의해 구애되고자 함이 없이, 본 명세서에 기재된 부위-특이적 파괴제 또는 시스템과 접촉된 세포는 부위-특이적 파괴제에 의해 접촉되지 않은 유사한 세포와 비교하여, 복수의 표적 유전자의 발현의 감소; 복수의 표적 유전자, 복수의 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 전사 제어 요소, 또는 복수의 표적 유전자에 근접하거나 복수의 표적 유전자를 포함하는 앵커 서열-매개 연접부와 연관된 앵커 서열과 연관된 후성유전학적 마커의 변형; 복수의 표적 유전자 중 유전자, 복수의 표적 유전자에 작동 가능하게 연결된 전사 제어 요소, 또는 복수의 표적 유전자에 근접하거나 복수의 표적 유전자를 포함하는 앵커 서열-매개 연접부와 연관된 앵커 서열의 유전적 변형; 및/또는 복수의 표적 유전자를 포함하는 게놈 복합체, 예를 들어 ASMC의 수준의 감소(예를 들어, 이의 부재)를 나타낼 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 복수의 표적 유전자의 발현의 감소, 후성유전학적 마커의 변형, 및/또는 유전적 변형을 나타내는 세포는 부위-특이적 파괴제를 포함하지 않는다. 표적 유전자의 발현의 감소, 후성유전학적 마커의 변형, 및/또는 유전적 변형은, 예를 들어 부위-특이적 파괴제와의 접촉 후에 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24시간, 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 또는 14일, 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5주, 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개월, 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5년(예를 들어, 무기한으로) 동안 지속될 수 있다. 일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제에 의해 사전에 접촉된 세포는 부위-특이적 파괴제가 세포 내에 더 이상 존재하지 않게 된 후에 복수의 표적 유전자의 발현의 감소, 후성유전학적 마커의 변형, 및/또는 유전적 변형을 보유하며, 예를 들어 부위-특이적 파괴제가 세포 내에 더 이상 존재하지 않게 된 후에 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24시간, 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 또는 14일, 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5주, 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개월, 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5년(예를 들어, 무기한으로) 동안 보유한다. 일부 구현예에서, 세포는 포유동물 세포, 예를 들어 인간 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 체세포 및/또는 1차 세포이다.
키트
추가로 본 개시내용은, 부분적으로, 본 명세서에 기재된 부위-특이적 파괴제, 시스템, 부위-특이적 파괴제를 인코딩하는 핵산, 또는 제1 부위-특이적 파괴제를 인코딩하는 제1 핵산 및 제2 부위-특이적 파괴제를 인코딩하는 제2 핵산을 포함하는 키트에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 키트는 부위-특이적 파괴제, 시스템, 또는 이를 인코딩하는 핵산, 및 상기 부위-특이적 파괴제 또는 시스템의 사용에 대한 설명서를 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 부위-특이적 파괴제 또는 이의 성분(예를 들어, 부위-특이적 파괴제의 폴리펩티드 또는 핵산 부분)을 인코딩하는 핵산, 및 상기 핵산 및/또는 부위-특이적 파괴제의 사용에 대한 설명서를 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 부위-특이적 파괴제 또는 이의 성분(예를 들어, 부위-특이적 파괴제의 폴리펩티드 또는 핵산 부분)을 인코딩하는 핵산을 포함하는 세포, 및 상기 세포, 핵산, 및/또는 상기 부위-특이적 파괴제의 사용에 대한 설명서를 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 제1 부위-특이적 파괴제를 인코딩하는 제1 핵산 및 제2 부위-특이적 파괴제를 인코딩하는 제2 핵산 또는 이의 성분(예를 들어, 제1 및 제2 부위-특이적 파괴제의 폴리펩티드 또는 핵산 부분), 및 상기 핵산 및/또는 상기 시스템의 사용에 대한 설명서를 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 제1 부위-특이적 파괴제를 인코딩하는 핵산 또는 이를 인코딩하는 제1 핵산 및 제2 부위-특이적 파괴제를 인코딩하는 제2 핵산 또는 이의 성분(예를 들어, 제1 및 제2 부위-특이적 파괴제의 폴리펩티드 또는 핵산 부분)을 포함하는 세포, 및 상기 세포, 핵산 및/또는 상기 시스템의 사용에 대한 설명서를 포함한다.
일부 구현예에서, 키트는 본 명세서에 기재된 부위-특이적 파괴제의 단위 투약량, 또는 부위-특이적 파괴제를 인코딩하는 핵산, 예를 들어 벡터의 단위 투약량을 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 본 명세서에 기재된 시스템의 단위 투약량, 또는 제1 부위-특이적 파괴제 및 제2 부위-특이적 파괴제를 인코딩하는 제1 및 제2 핵산, 예를 들어 벡터의 단위 투약량을 포함한다.
부위-특이적 파괴제를 제조하는 방법
일부 구현예에서, 부위-특이적 파괴제 또는 시스템은 하나 이상의 단백질을 포함하며, 따라서 단백질을 제조하는 방법에 의해 생성될 수 있다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, (본 명세서에 기재된 바와 같은 조절제 내에 포함될 수 있는) 단백질 또는 폴리펩티드의 제조 방법은 당업계에서 일상적이다. 일반적으로, 문헌[Smales & James (Eds.), Therapeutic Proteins: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology), Humana Press (2005)]; 및 [Crommelin, Sindelar & Meibohm (Eds.), Pharmaceutical Biotechnology: Fundamentals and Applications, Springer (2013)]을 참조한다.
본 개시내용의 조성물의 단백질 또는 폴리펩티드는 표준 고상(solid phase) 기법을 사용함으로써 생화학적으로 합성될 수 있다. 그러한 방법은 전체 고상 합성 방법, 부분 고상 합성 방법, 단편 축합, 고전적 용액 합성을 포함한다. 이들 방법은 펩티드가 비교적 짧을 때(예를 들어, 10 kDa) 그리고/또는 그것이 재조합 기법에 의해 생성될 수 없을 때(즉, 핵산 서열에 의해 인코딩되지 않을 때) 사용될 수 있으며, 이에 따라 상이한 화학을 수반한다.
고상 합성 절차는 당업계에 잘 알려져 있으며, 문헌[John Morrow Stewart and Janis Dillaha Young, Solid Phase Peptide Syntheses, 2nd Ed., Pierce Chemical Company, 1984]; 및 문헌[Coin, I., et al., Nature Protocols, 2:3247-3256, 2007]에 의해 추가로 기재되어 있다.
더 긴 펩티드의 경우, 재조합 방법이 사용될 수 있다. 재조합 치료용 폴리펩티드의 제조 방법은 당업계에서 일상적이다. 일반적으로, 문헌[Smales & James (Eds.), Therapeutic Proteins: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology), Humana Press (2005)]; 및 문헌[Crommelin, Sindelar & Meibohm (Eds.), Pharmaceutical Biotechnology: Fundamentals and Applications, Springer (2013)]을 참조한다.
재조합 단백질은 또한 곤충 세포, 효모, 박테리아 또는 기타 세포를 사용하여 적절한 프로모터 제어 하에 생산될 수도 있지만, 치료적 약학 단백질 또는 폴리펩티드를 생산하기 위한 예시적인 방법은 포유동물 세포에서의 발현을 포함한다. 포유동물 발현 벡터는 복제 기점, 적합한 프로모터, 및 기타 5' 또는 3' 측접하는 비-전사 서열과 같은 비-전사 요소들, 및 필요한 리보솜 결합 부위, 폴리아데닐화 부위, 스플라이스 공여체 및 수용체 부위, 및 종료 서열과 같은 5' 또는 3' 비번역 서열을 포함할 수 있다. SV40 바이러스 게놈, 예를 들어 SV40 기원으로부터 유래된 DNA 서열, 초기 프로모터, 스플라이스 및 폴리아데닐화 부위는 이종 DNA 서열의 발현에 필요한 기타 유전자 요소를 제공하는 데 사용될 수 있다. 박테리아, 진균, 효모, 및 포유동물 세포 숙주와의 사용을 위한 적절한 클로닝과 발현 벡터가 문헌[Green & Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition), Cold Spring Harbor Laboratory Press (2012)]에 기재되어 있다.
대량의 단백질 또는 폴리펩티드가 요구되는 경우, 그것은 문헌[Brian Bray, Nature Reviews Drug Discovery, 2:587-593, 2003]; 및 문헌[Weissbach & Weissbach, 1988, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Section VIII, pp 421-463]에 기재된 바와 같은 기법을 사용하여 생성될 수 있다.
다양한 포유동물 세포 배양 시스템이 재조합 단백질을 발현하고 제조하는 데 사용될 수 있다. 포유동물 발현 시스템의 예에는 CHO 세포, COS 세포, HeLA 및 BHK 세포주가 포함된다. 단백질 치료제의 생산을 위한 숙주 세포 배양의 과정은 문헌[Zhou and Kantardjieff (Eds.), Mammalian Cell Cultures for Biologics Manufacturing (Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology), Springer (2014)]에 기재되어 있다. 본 명세서에 기재된 조성물은 재조합 단백질을 인코딩하는, 벡터, 예컨대 바이러스 벡터, 예를 들어 렌티바이러스 벡터를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터, 예를 들어 바이러스 벡터는 재조합 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함할 수 있다.
단백질 치료제의 정제는 문헌[Franks, Protein Biotechnology: Isolation, Characterization, and Stabilization, Humana Press (2013)]; 및 문헌[Cutler, Protein Purification Protocols (Methods in Molecular Biology), Humana Press (2010)]에 기재되어 있다. 단백질 치료제의 제형은 문헌[Meyer (Ed.), Therapeutic Protein Drug Products: Practical Approaches to formulation in the Laboratory, Manufacturing, and the Clinic, Woodhead Publishing Series (2012)]에 기재되어 있다. 단백질은 하나 이상의 아미노산을 포함한다. 아미노산은, 예를 들어 하나 이상의 펩티드 결합의 형성을 통해 폴리펩티드 사슬 내로 도입될 수 있는 임의의 화합물 및/또는 물질을 포함한다. 일부 구현예에서, 아미노산은 일반 구조 H2N-C(H)(R)-COOH를 갖는다. 일부 구현예에서, 아미노산은 자연 발생 아미노산이다. 일부 구현예에서, 아미노산은 비천연 아미노산이고; 일부 구현예에서, 아미노산은 D-아미노산이며; 일부 구현예에서, 아미노산은 L-아미노산이다. "표준 아미노산"은 자연 발생 펩티드에서 일반적으로 발견되는 20개의 표준 L-아미노산 중 임의의 것을 지칭한다. "비표준 아미노산"은 그것이 합성에 의해 제조되는지 또는 천연 공급원으로부터 수득되는지의 여부에 관계 없이 표준 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 지칭한다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 내의 카르복시- 및/또는 아미노-말단 아미노산을 포함한 아미노산은 상기 일반적인 구조와 비교하여 구조적 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 아미노산은 일반적인 구조와 비교하여 메틸화, 아미드화, 아세틸화, PEG화, 글리코실화, 인산화, 및/또는 치환(예를 들어, 아미노 기, 카르복실산 기, 하나 이상의 양성자, 및/또는 하이드록실 기의 치환)에 의해 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 그러한 변형은, 예를 들어 달리 동일한 비변형된 아미노산을 함유하는 것과 비교하여, 변형된 아미노산을 함유하는 폴리펩티드의 순환 반감기를 변경시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 그러한 변형은, 달리 동일한 비변형된 아미노산을 함유하는 것과 비교하여, 변형된 아미노산을 함유하는 폴리펩티드의 관련 활성을 유의하게 변경시키지 않는다. 맥락으로부터 명백한 바와 같이, 일부 구현예에서, 용어 "아미노산"은 유리 아미노산을 지칭하는 데 사용될 수 있으며; 일부 구현예에서 그것은 폴리펩티드의 아미노산 잔기를 지칭하는 데 사용될 수 있다.
약제학적 조성물, 제형, 전달, 및 투여
추가로 본 개시내용은, 부분적으로, 본 명세서에 기재된 부위-특이적 파괴제를 포함하는 약제학적 조성물, 및 본 명세서에 기재된 부위-특이적 파괴제 또는 시스템을 인코딩하는 핵산을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "약제학적 조성물"은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체(예를 들어, 당업자에게 알려진 약제학적으로 허용되는 담체)와 함께 제형화된 활성제(예를 들어, 부위-특이적 파괴제, 시스템, 또는 이를 인코딩하는 핵산)를 지칭한다. 일부 구현예에서, 활성제는 관련 집단에 투여될 때 사전결정된 치료적 효과를 달성할 통계학적으로 유의한 확률을 나타내는 치료 투약계획에서 투여하기에 적절한 단위 용량으로 존재한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 본 개시내용의 부위-특이적 파괴제 또는 시스템을 포함한다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 고체 또는 액체 형태로의 투여를 위해 특수하게 제형화될 수 있으며, 이에는 하기에 맞게 구성된 것들이 포함된다: 경구 투여, 예를 들어 드렌치(drench)(수성 또는 비수성 용액 또는 현탁액), 정제, 예를 들어 협측, 설하, 및 전신 흡수를 목표로 한 것들, 볼루스, 분말, 과립, 혀에 적용하기 위한 페이스트; 비경구 투여, 예를 들어 피하, 근육내, 정맥내 또는 경막외 주사에 의한 투여, 예를 들어 멸균 용액 또는 현탁액, 또는 지속-방출 제형으로서의 주사; 국소 적용, 예를 들어 피부, 폐, 또는 구강에 적용되는 크림, 연고, 또는 제어-방출 패치 또는 스프레이로서의 적용; 질내 또는 직장내 투여, 예를 들어 페서리(pessary), 크림, 또는 폼(foam)으로서의 투여; 설하 투여; 안내 투여(ocularly); 경피 투여; 또는 비강, 폐, 및/또는 기타 다른 점막 표면 투여, 예를 들어 에어로졸, 수용액, 또는 현탁액. 일부 구현예에서, 조성물은 동결건조되거나 분무건조될 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물은 폐 투여 및/또는 정맥내 투여를 위해 제형화될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "약제학적으로 허용되는"은, 적절한 의학적 판단의 범주 내에서, 과도한 독성, 자극, 알러지 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합하고, 합리적인 이익/위험 비에 부합하는 화합물, 물질, 조성물, 및/또는 투약 형태를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "약제학적으로 허용되는 담체"는 대상 화합물을 하나의 기관, 또는 신체의 일부분을 또 다른 기관, 또는 신체의 일부분으로 운반 또는 수송하는 데 관여하는 약제학적으로 허용되는 물질, 조성물, 또는 비히클, 예컨대 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 또는 용매 캡슐화 물질을 의미한다. 각 담체는, 제형의 나머지 다른 성분들과 상용성이고 환자에게 해롭지 않다는 의미에서 "허용되어야" 한다. 일부 구현예에서, 예를 들어, 약제학적으로 허용되는 담체로서의 역할을 할 수 있는 물질은 하기를 포함한다: 당, 예컨대 락토스, 글루코스 및 수크로스; 전분, 예컨대 옥수수 전분 및 감자 전분; 셀룰로스, 및 이의 유도체, 예컨대 나트륨 카르복시메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트; 분말형 트래거캔스; 맥아; 젤라틴; 활석; 부형제, 예컨대 코코아 버터 및 좌제 왁스; 오일, 예컨대 땅콩유, 면실유, 홍화유, 참깨유, 올리브유, 옥수수유 및 대두유; 글리콜, 예컨대 프로필렌 글리콜; 폴리올, 예컨대 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜; 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트; 한천; 완충제, 예컨대 수산화마그네슘 및 수산화알루미늄; 알긴산; 무발열성 물(pyrogen-free water); 등장 식염수; 링거 용액; 에틸 알코올; pH 완충 용액; 폴리에스테르, 폴리카르보네이트 및/또는 폴리무수물; 및 약제학적 제형에 사용되는 기타 다른 무독성 상용성 물질.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "약제학적으로 허용되는 염"은 약제학적 맥락에서 사용하기에 적절한 그러한 화합물의 염, 즉, 적절한 의학적 판단의 범주 내에서, 과도한 독성, 자극, 알러지 반응 등 없이 인간 및 하등 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합하고, 합리적인 이익/위험 비에 부합하는 염을 지칭한다. 약제학적으로 허용되는 염은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, S. M. Berge 외 다수는 문헌[J. Pharmaceutical Sciences, 66: 1-19 (1977)]에서 약제학적으로 허용되는 염을 상세히 기재한다. 일부 구현예에서, 약제학적으로 허용되는 염은 비독성 산 부가 염을 포함하지만 이로 한정되지 않으며, 이때 비독성 산 부가 염은 무기 산, 예컨대 염산, 브롬화수소산, 인산, 황산 및 과염소산과 함께 또는 유기 산, 예컨대 아세트산, 말레산, 타르타르산, 시트르산, 석신산, 또는 말론산과 함께 형성되는 아미노 기의 염이거나, 당업계에서 사용되는 다른 방법, 예컨대 이온 교환을 사용함으로써 형성된 것이다. 일부 구현예에서, 약제학적으로 허용되는 염은 아디페이트, 알기네이트, 아스코르베이트, 아스파르테이트, 벤젠설포네이트, 벤조에이트, 바이셀페이트, 보레이트, 부티레이트, 캄퍼레이트, 캄퍼설포네이트, 시트레이트, 사이클로펜탄프로피오네이트, 디글루코네이트, 도데실설페이트, 에탄설포네이트, 포르메이트, 푸마레이트, 글루코헵토네이트, 글리세로포스페이트, 글루코네이트, 헤미설페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 하이드로요오다이드, 2-하이드록시-에탄설포네이트, 락토바이오네이트, 락테이트, 라우레이트, 라우릴 설페이트, 말레이트, 말레에이트, 말로네이트, 메탄설포네이트, 2-나프탈렌설포네이트, 니코티네이트, 니트레이트, 올레에이트, 옥살레이트, 팔미테이트, 파모에이트, 펙티네이트, 퍼설페이트, 3-페닐프로피오네이트, 포스페이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 스테아레이트, 석시네이트, 설페이트, 타르트레이트, 티오시아네이트, p-톨루엔설포네이트, 운데카노에이트, 발레레이트 염 등을 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 대표적인 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 나트륨, 리튬, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 등을 포함한다. 일부 구현예에서, 약제학적으로 허용되는 염은 적절한 경우, 비독성 암모늄, 4차 암모늄, 및 할라이드, 하이드록사이드, 카르복실레이트, 설페이트, 포스페이트, 니트레이트, 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알킬, 설포네이트, 및 아릴 설포네이트와 같은 반대이온을 사용하여 형성된 아민 양이온을 포함한다.
다양한 구현예에서, 본 개시내용은 약제학적으로 허용되는 부형제와 함께 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물을 제공한다. 약제학적으로 허용되는 부형제는, 일반적으로 안전하고, 비독성이고, 바람직한 약제학적 조성물을 제조하는 데 유용한 부형제를 포함하고, 인간의 약제학적 용도뿐만 아니라 수의용 용도에 허용되는 부형제를 포함한다. 그러한 부형제는 고체, 액체, 반고체이거나, 에어로졸 조성물의 경우에는 가스상일 수 있다.
약제학적 제제는, 정제 형태에 대해서는 필요에 따라 밀링, 혼합, 과립화, 및 압축을; 또는 경질 젤라틴 캡슐 형태에 대해서는 밀링, 혼합, 및 충전을 수반하는 통상적인 조제 기법에 따라 제조될 수 있다. 액체 담체가 사용될 때, 제제는 시럽, 엘릭서, 에멀젼 또는 수성 또는 비수성 용액 또는 현탁액의 형태일 수 있다. 그러한 액체 제형은 직접 os(경구) 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 임의의 투여 경로를 통한 세포 및/또는 대상체에 대한 전달을 위해 제형화될 수 있다. 대상체에 대한 투여 방식은 주사, 주입, 흡입, 비강내, 안내(intraocular), 국소 전달, 캐뉼러간(inter-cannular) 전달, 또는 섭취를 포함할 수 있다. 주사는, 제한 없이, 정맥내, 근육내, 동맥내, 수강내, 뇌실내, 관절낭내, 안와내, 심장내, 피내, 복막내, 경기관(transtracheal), 피하, 표피하, 관절내, 기관지, 피막하, 지주막하, 척수내, 뇌척수내, 및 흉골내 주사 및 주입을 포함한다. 일부 구현예에서, 투여는 에어로졸 흡입, 예를 들어 네뷸라이제이션에 의한 에어로졸 흡입을 포함한다. 일부 구현예에서, 투여는 전신(예를 들어, 경구, 직장, 비강, 설하, 협측, 또는 비경구), 장내(예를 들어, 전신에 미치는 효과를 갖지만, 위장관을 통해 전달됨), 또는 국부(예를 들어, 피부 상에의 국부 적용, 유리체강내 주사) 투여이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 조성물이 전신 투여된다. 일부 구현예에서, 투여는 비경구외(non-parenteral) 투여이고, 치료제는 비경구 치료제이다. 일부 구현예에서, 투여는 기관지(예를 들어, 기관지 점적주입에 의함), 협측, 진피(이는, 예를 들어 진피, 피내, 피간, 경피 등에 대한 국소 투여 중 하나 이상일 수 있거나 이를 포함할 수 있음), 장내, 동맥내, 피내, 위내, 수내, 근육내, 비강내, 복막내, 수강내, 정맥내, 뇌실내, 특정 기관 내(예를 들어, 간내), 점막, 비강, 경구, 직장, 피하, 설하, 국소, 기관(tracheal)(예를 들어, 기관내 점적주입에 의함), 질내, 유리체 투여 등일 수 있다. 일부 구현예에서, 투여는 단회 용량일 수 있다. 일부 구현예에서, 투여는 간헐적(예를 들어, 복수의 용량이 시간적으로 분리됨) 및/또는 주기적(예를 들어, 개별 용량이 공통된 기간에 의해 분리됨) 투약을 수반할 수 있다. 일부 구현예에서, 투여는 적어도 선택된 기간 동안 연속 투약(예를 들어, 관류)을 수반할 수 있다. 일부 구현예에서, 6, 8, 10, 12, 15 또는 20회, 또는 그 이상의 투여가 1회 치료 동안 또는 치료 투약계획으로서 일정 기간에 걸쳐 대상체에게 제공될 수 있다. 일부 구현예에서, 예를 들어 질환, 장애 또는 병태와 연관된 증상이 지속되는 한, 필요에 따라 투여가 제공될 수 있다. 일부 구현예에서, 반복 투여는 대상체의 남은 생애 동안 필요할 수 있다. 치료 기간은 다양할 수 있으며, 예를 들어 1일, 2일, 3일, 1주, 2주, 1개월, 2개월, 3개월, 6개월, 1년, 또는 그 이상일 수 있다.
일부 구현예에서, 투여는 호흡 전달 장치, 예를 들어 네뷸라이저, 예를 들어 정량 흡입기, 예를 들어 건조 분말 흡입기를 사용하여 제공된다. 상업적으로 구매 가능한 건조 분말 흡입기 중 일부는 Spinhaler(Fisons Pharmaceuticals, 미국 뉴욕주 로체스터 소재) 및 Rotahaler(GSK, 미국 노스캐롤라이나주 RTP 소재)를 포함한다. 일부 구현예에서, 네뷸라이저는 제트 네뷸라이저, 초음파 네뷸라이저, 및/또는 진동 메쉬 네뷸라이저를 포함할 수 있다.
투약
본 개시내용에 따른 약제학적 조성물은 치료적 유효량으로 전달될 수 있다. 정확한 치료적 유효량은 주어진 대상체에서 치료 효능의 관점에서 가장 효과적인 결과를 가져오게 될 조성물의 양이다. 이 양은 치료적 화합물의 특성(활성, 약동학적 특성, 약력학적 특성, 및 생체이용률을 포함함), 대상체의 생리학적 조건(연령, 성별, 질환 유형 및 병기, 전반적인 신체적 상태, 주어진 투약량에 대한 반응, 및 약제의 유형을 포함함), 제형에서의 약제학적으로 허용되는 담체 또는 담체들의 성질, 및/또는 투여 경로를 포함하지만 이로 한정되지 않는 다양한 인자에 따라 달라질 것이다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 치료제를 전달하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같은 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 게놈 복합체 조절제는 치료제이고/이거나 치료제의 전달은 치료제의 부재 하에서의 유전자 발현과 대비하여 유전자 발현의 변화를 야기한다.
본 명세서의 다양한 구현예에 제공된 바와 같은 방법이 본 명세서에 기재된 임의의 일부 양태에서 이용될 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 조성물은 특정 세포, 또는 하나 이상의 특정 조직에 표적화된다.
예를 들어, 일부 구현예에서 하나 이상의 조성물은 상피, 결합, 근육, 및/또는 신경 조직 또는 세포에 표적화된다. 일부 구현예에서, 조성물은, 예를 들어 다음과 같은 특정 기관계의 세포 또는 조직에 표적화된다: 호흡계(인두, 후두, 기관, 기관지, 폐, 횡격막); 심혈관계(심장, 혈관계); 소화계(식도, 위, 간, 담낭, 췌장, 장, 결장, 직장 및 항문); 내분비계(시상하부, 뇌하수체, 송과체 또는 송과선, 갑상선, 부갑상선, 부신); 배설계(신장, 요관, 방광); 림프계(림프, 림프절, 림프관, 편도선, 인두편도, 흉선, 비장); 외피계(피부, 모발, 손발톱); 근육계(예를 들어, 골격근); 신경계(뇌, 척수, 신경); 생식기계(난소, 자궁, 유선, 고환, 수정관, 정낭, 전립선); 골격계(뼈, 연골); 및/또는 이들의 조합. 일부 구현예에서, 조성물은 세포, 예를 들어 내피 세포, 폐포 세포, 상피 세포, 간세포, 성상 세포, 쿠퍼 세포, 윤활층, 연골세포, 섬유아세포, 관상피 세포, 상피 장세포, 배상세포, 기저 세포, 및/또는 면역 세포로 표적화된다. 일부 구현예에서, 조성물은 기관의 세포, 예를 들어 비강 세포, 폐 세포, 회장 세포, 심장 세포, 시각 세포, 간 세포, 방광 세포, 췌장 세포, 신장 세포, 뉴런 세포, 전립선 세포, 고환 세포로 표적화된다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 조성물은 혈액-뇌 장벽, 태반막, 또는 혈액-고환 장벽을 횡단한다. 일부 구현예에서, 조성물은 ACE-2 수용체를 발현하는 세포로 표적화된다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 제공된 바와 같은 약제학적 조성물은 전신 투여된다.
일부 구현예에서, 투여는 비경구외 투여이고, 치료제는 비경구 치료제이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 약제학적 조성물은 활성제 단독과 비교하여 개선된 PK/PD, 예를 들어 증가된 약동학적 특성 또는 약력학적 특성, 예컨대 개선된 표적화, 흡수, 또는 수송(예를 들어, 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 90% 개선되거나 그 이상임)을 갖는다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 치료제 단독과 비교하여 바람직하지 않은 효과의 감소, 예컨대 비표적 위치로의 확산, 탈표적(off-target) 활성, 또는 독성 대사의 감소를 갖는다(예를 들어, 활성제 단독과 대비하여 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 90% 또는 그 이상이 감소됨). 일부 구현예에서, 조성물은 활성제 단독과 비교하여 (예를 들어, 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 90% 또는 그 이상) 치료제의 효능을 증가시키고/시키거나 독성을 감소시킨다.
본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은, 예를 들어 담체, 예컨대 약제학적 담체 및/또는 중합체 담체, 예를 들어 리포좀 또는 소포를 포함하는 것으로 제형화되고, 알려진 방법에 의해 이를 필요로 하는 대상체(예를 들어, 인간 또는 비인간 농업용 동물 또는 가축 동물, 예를 들어 소, 개, 고양이, 말, 가금류)에게 전달될 수 있다. 그러한 방법은 형질감염(예를 들어, 지질-매개, 양이온성 중합체, 인산칼슘); 전기천공 또는 막 파괴(예를 들어, 뉴클레오펙션(nucleofection)) 및 바이러스 전달(예를 들어, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, AAV)의 기타 다른 방법을 포함한다. 전달 방법은 또한, 예를 들어 문헌[Gori et al., Delivery and Specificity of CRISPR/Cas9 Genome Editing Technologies for Human Gene Therapy. Human Gene Therapy. July 2015, 26(7): 443-451. doi:10.1089/hum.2015.074]; 및 문헌[Zuris et al. Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo. Nat Biotechnol. 2014 Oct 30;33(1):73-80]에 기재되어 있다.
지질 나노입자
본 명세서에 기재된 바와 같은 부위-특이적 파괴제는 입자를 포함한 임의의 생물학적 전달 시스템/제형, 예를 들어 나노입자 전달 시스템을 사용하여 전달될 수 있다. 나노입자는 치수(예를 들어, 직경)가 약 1 내지 약 1000 나노미터, 약 1 내지 약 500 나노미터 크기, 약 1 내지 약 100 nm, 약 30 nm 내지 약 200 nm, 약 50 nm 내지 약 300 nm, 약 75 nm 내지 약 200 nm, 약 100 nm 내지 약 200 nm, 및 이들 사이의 임의의 범위인 입자를 포함한다. 나노입자는 나노규모 치수들의 복합 구조를 갖는다. 일부 구현예에서, 나노입자는 통상적으로 구형이지만, 나노입자 조성에 따라 상이한 모폴로지가 가능하다. 나노입자의 외부 환경과 접촉해 있는 나노입자의 일부분은 일반적으로 나노입자의 표면으로서 확인된다. 일부 구현예에서, 나노입자는 최대 치수가 25 nm 내지 200 nm의 범위이다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 나노입자는 고체, 반고체, 에멀젼, 또는 콜로이드성 나노입자를 포함하지만 이로 한정되지 않는 임의의 형태로 제공될 수 있는 전달 시스템을 포함한다. 나노입자 전달 시스템은 지질-기반 시스템, 리포좀, 미셀, 마이크로소포, 엑소솜, 또는 유전자 총(gene gun)을 포함할 수 있지만 이로 한정되지 않는다. 일 구현예에서, 나노입자는 지질 나노입자(LNP)이다. 일부 구현예에서, LNP는 분자간력에 의해 서로 물리적으로 회합된 복수의 지질 분자를 포함하는 입자이다. 일부 구현예에서, LNP는 다수의 성분, 예를 들어 3개 또는 4개의 성분을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 부위-특이적 파괴제 또는 상기 부위-특이적 파괴제를 포함하는 약제학적 조성물(또는 상기 부위-특이적 파괴제를 인코딩하는 핵산, 또는 상기 부위-특이적 파괴제를 인코딩하는 핵산을 포함하는 약제학적 조성물)이 LNP 내에 캡슐화된다. 일 구현예에서, 시스템, 또는 상기 시스템을 포함하는 약제학적 조성물(또는 상기 시스템을 인코딩하는 핵산, 또는 상기 시스템을 인코딩하는 핵산을 포함하는 약제학적 조성물)이 LNP 내에 캡슐화된다. 일부 구현예에서, 제1 부위-특이적 파괴제를 인코딩하는 핵산과 제2 부위-특이적 파괴제를 인코딩하는 핵산은 동일한 LNP 내에 존재한다. 일부 구현예에서, 제1 부위-특이적 파괴제를 인코딩하는 핵산과 제2 부위-특이적 파괴제를 인코딩하는 핵산은 상이한 LNP 내에 존재한다. LNP의 제조 및 조절제 캡슐화가 사용될 수 있고/있거나 문헌[Rosin et al, Molecular Therapy, vol. 19, no. 12, pages 1286-2200, December 2011]으로부터 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 개시된 지질 나노입자 조성물은 mRNA에 의해 인코딩된 단백질의 발현에 유용하다. 일부 구현예에서, 핵산은, 지질 나노입자 내에 존재할 때, 수용액 중에서 뉴클레아제에 의한 분해에 저항한다.
일부 구현예에서, LNP 제형은 CCD 지질, 중성 지질, 및/또는 헬퍼 지질을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, LNP 제형은 이온화 가능한 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 이온화 가능한 지질은 양이온성 지질, 이온화 가능한 양이온성 지질, 또는 용이하게 양성자화될 수 있는 아민-함유 지질일 수 있다. 일부 구현예에서, 지질은 pH에 따라 양으로 하전된 형태 또는 중성 형태로 존재할 수 있는 양이온성 지질이다. 일부 구현예에서, 양이온성 지질은, 예를 들어 생리학적 조건 하에서 양으로 하전될 수 있는 지질이다. 일부 구현예에서, 지질 입자는 중성 지질, 이온화 가능한 아민-함유 지질, 생분해성 알킨 지질, 스테로이드, 인지질(다가불포화 지질을 포함함), 구조 지질(예를 들어, 스테롤), PEG, 콜레스테롤, 및 중합체 접합된 지질 중 하나 이상과 함께 제형 내에 양이온성 지질을 포함한다.
일부 구현예에서, LNP 제형(예를 들어, MC3 및/또는 SSOP)은 콜레스테롤, PEG, 및/또는 헬퍼 지질을 포함한다. LNP는, 예를 들어 미소구체, 예컨대 단층 및 다층 소포, 라멜라 상 지질 이중층일 수 있으며, 이는 일부 구현예에서 실질적으로 구형이다.
일부 구현예에서, LNP는 수성 코어, 예를 들어 본 명세서에 개시된 바와 같은 부위-특이적 파괴제 또는 시스템을 인코딩하는 핵산을 포함하는 수성 코어를 포함할 수 있다. 본 개시내용의 일부 구현예에서, LNP 제형을 위한 카고는 적어도 하나의 가이드 RNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 카고, 예를 들어 본 명세서에 개시된 바와 같은 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템을 인코딩하는 핵산은 LNP, 예를 들어 양이온성 지질을 포함하는 LNP의 표면에 흡착될 수 있다. 일부 구현예에서, 카고, 예를 들어 본 명세서에 개시된 바와 같은 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템을 인코딩하는 핵산은 LNP와 회합될 수 있다. 일부 구현예에서, 카고, 예를 들어 본 명세서에 개시된 바와 같은 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템을 인코딩하는 핵산은 LNP 내에 캡슐화되며, 예를 들어 완전 캡슐화 및/또는 부분 캡슐화될 수 있다.
일부 구현예에서, 카고를 포함하는 LNP는 전신 전달, 예를 들어 유기체 내에서 활성제의 폭넓은 노출을 초래할 수 있는 카고의 치료적 유효 용량의 전달을 위해 투여될 수 있다. 지질 나노입자의 전신 전달은, 예를 들어 정맥내, 폐, 기관지, 동맥내, 피하, 및 복막내 전달일 수 있다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자의 전신 전달은 정맥내 전달에 의해 수행된다. 일부 구현예에서, 카고를 포함하는 LNP는 국부 전달, 예를 들어 유기체 내의 표적 부위로의 활성제의 직접 전달을 위해 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, LNP는 질환 부위, 예를 들어 종양, 기타 다른 표적 부위, 예를 들어 염증 부위, 또는 표적 기관, 예를 들어 간, 폐, 위, 결장, 췌장, 자궁, 유방, 림프절 등으로 국부 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 LNP는 특정 세포, 예를 들어 간세포, 성상 세포, 쿠퍼 세포, 내피 세포, 폐포 세포, 및/또는 상피 세포로 국부 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 LNP는 특정 종양 부위, 예를 들어 피하, 동소(orthotopic) 부위로 국부 전달될 수 있다.
LNP는 에멀젼 중에 분산상으로서, 미셀로서, 또는 현탁액 중에 내부상으로서 제형화될 수 있다. 일부 구현예에서, LNP는 생분해성이다. 일부 구현예에서, LNP는 치료적 유효 용량에서 세포독성 수준으로 축적되지 않거나 생체내에서 독성을 야기하지 않는다. 일부 구현예에서, LNP는 치료적 유효 용량으로 반복 투여 후에 세포독성 수준으로 축적되지 않거나 생체내에서 독성을 야기하지 않는다. 일부 구현예에서, LNP는 치료적 유효 용량에서 실질적으로 유해한 효과로 이어지는 선천성 면역 반응을 야기하지 않는다.
일부 구현예에서, 사용되는 LNP는 화학식 (6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘트-6,9,28,31-테트라엔-19-일 4-(디메틸아미노) 부타노네이트 또는 ssPalmO-페닐-P4C2(ssPalmOPhe, SS-OP)를 포함한다. 일부 구현예에서, LNP 제형은 화학식 (6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘트-6,9,28,31-테트라엔-19-일 4-(디메틸아미노)부타노네이트(MC3), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC), 콜레스테롤, 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜-2000(PEG2k-DMG), 예를 들어 MC3 LNP 또는 ssPalmO-페닐-P4C2(ssPalmOPhe, SS-OP), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC), 콜레스테롤, 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜-2000(PEG2k-DMG), 예를 들어 SSOP-LNP를 포함한다.
리포좀은 내부 수성 구획을 둘러싸는 단층 또는 다층 지질 이중층 및 상대적으로 불투과성인 외측 친유성 인지질 이중층으로 구성된 구형의 소포 구조이다. 리포좀은 음이온성, 중성, 또는 양이온성일 수 있다. 리포좀은 생체적합성이고, 비독성이며, 친수성 및 친유성 약물 분자 둘 모두를 전달하고, 혈장 효소에 의한 분해로부터 그들의 카고(cargo)를 보호하고, 생물학적 막 및 혈액-뇌 장벽(BBB)을 가로질러 그들의 로드를 수송할 수 있다(예를 들어, 검토를 위해 문헌[Spuch and Navarro, Journal of Drug Delivery, vol. 2011, Article ID 469679, 12 pages, 2011. doi:10.1155/2011/469679] 참조).
소포는 몇몇 상이한 유형의 지질로부터 제조될 수 있지만, 약물 담체로서 리포좀을 생성하는 데 인지질이 가장 일반적으로 사용된다. 소포는, 제한 없이, DOTMA, DOTAP, DOTIM, DDAB를 단독으로 또는 콜레스테롤과 함께 포함하여 DOTMA와 콜레스테롤, DOTAP와 콜레스테롤, DOTIM과 콜레스테롤, 및 DDAB와 콜레스테롤을 생성할 수 있다. 다층 소포 지질의 제조 방법은 당업계에 알려져 있다(예를 들어, 미국 특허 6,693,086을 참조하며, 다층 소포 지질 제조에 관한 이의 교시내용은 본 명세서에 참고로 포함됨). 지질 필름이 수용액과 혼합될 때 소포 형성이 자발적일 수 있지만, 그것은 또한 균질기, 초음파처리기, 또는 압출 장치를 사용함으로써 전단 형태로 힘을 인가함으로써 촉진될 수 있다(예를 들어, 검토를 위해 문헌[Spuch and Navarro, Journal of Drug Delivery, vol. 2011, Article ID 469679, 12 pages, 2011. doi:10.1155/2011/469679] 참조). 문헌[Templeton et al., Nature Biotech, 15:647-652, 1997]에 기재된 바와 같이, 크기 감소 필터를 통해 압출함으로써 압출된 지질이 제조될 수 있으며, 압출된 지질 제조에 관한 이의 교시내용은 본 명세서에 참고로 포함된다.
본 명세서에 제공된 방법 및 조성물은 질환, 장애, 및/또는 병태의 증상을 경감시키는 충분한 투약계획에 의해 투여되는 약제학적 조성물을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 바와 같은 조성물을 투여함으로써 치료제를 전달하는 방법을 제공한다.
용도
본 개시내용은 추가로 본 명세서에 개시된 부위-특이적 파괴제 또는 시스템의 용도에 관한 것이다. 특히, 일부 구현예에서 그러한 제공된 기술은 복수의 표적 유전자 발현의 조절, 예를 들어 억제를 달성하는 데, 그리고 예를 들어, 이를 테면 세포 내에서의 복수의 표적 유전자 중 하나 이상 생성물의 활성, 전달, 및 침투의 제어를 가능하게 하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 포유동물 세포, 예를 들어 인간 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 체세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 1차 세포이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 세포는 포유동물 체세포이다. 일부 구현예에서, 포유동물 체세포는 1차 세포이다. 일부 구현예에서, 포유동물 체세포는 비배아 세포이다.
유전자 발현의 조절
추가로 본 개시내용은, 부분적으로, 복수의 표적 전자의 발현을 조절하는, 예를 들어 감소시키는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 본 명세서에 기재된 부위-특이적 파괴제 또는 시스템(또는 이를 인코딩하는 핵산, 또는 상기 부위-특이적 파괴제 또는 핵산을 포함하는 약제학적 조성물)을 제공하는 단계, 및 복수의 표적 유전자, 복수의 표적 유전자와 연관된 앵커 서열, 및/또는 복수의 표적 유전자를 포함하는 게놈 복합체(예를 들어, ASMC)를 부위-특이적 파괴제 또는 시스템과 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 표적 유전자의 발현을 조절하는, 예를 들어 감소시키는 것은 참조값, 예를 들어 부위-특이적 파괴제 또는 시스템의 부재 하에서의 유전자의 전사와 비교하여 복수의 표적 유전자 중 유전자의 전사의 조절을 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 표적 유전자의 발현을 조절하는, 예를 들어 감소시키는 방법은 생체외에서, 예를 들어 대상체, 예를 들어 포유동물 대상체, 예를 들어 인간 대상체 유래의 세포 상에서 사용된다. 일부 구현예에서, 세포는 포유동물 세포, 예를 들어 인간 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 체세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 1차 세포이다. 일부 구현예에서, 복수의 표적 유전자의 발현을 조절하는, 예를 들어 감소시키는 방법은 생체내에서, 예를 들어 포유동물 대상체, 예를 들어 인간 대상체에서 사용된다. 일부 구현예에서, 복수의 표적 유전자의 발현을 조절하는, 예를 들어 감소시키는 방법은 시험관내에서, 예를 들어 본 명세서에 기재된 세포 또는 세포주에서 사용된다.
이론에 의해 구애되고자 함이 없이, 일부 구현예에서 부위-특이적 파괴제 또는 시스템은 복수의 표적 유전자를 포함하는 게놈 복합체, 예를 들어 ASMC의 앵커 서열에 결합하고, 다음 효과 중 1, 2개, 또는 모두를 가짐으로써 복수의 표적 유전자의 발현을 조절할 수 있는 것으로 생각된다: 앵커 서열에 대한 게놈 복합체 성분(예를 들어, 핵형성 폴리펩티드)의 결합을 물리적 또는 입체적으로 차단함(예를 들어, 경쟁적으로 억제함); 복수의 표적 유전자, 복수의 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 전사 제어 요소, 또는 복수의 표적 유전자에 근접하거나 복수의 표적 유전자를 포함하는 앵커 서열-매개 연접부와 연관된 앵커 서열을 후성유전학적으로 변형시킴(예를 들어, 이에 의해 앵커 서열에 대한 게놈 복합체 성분, 예를 들어 핵형성 폴리펩티드의 결합을 감소시키고/시키거나 제거함); 또는 복수의 표적 유전자, 복수의 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 전사 제어 요소, 또는 복수의 표적 유전자에 근접하거나 복수의 표적 유전자를 포함하는 앵커 서열-매개 연접부와 연관된 앵커 서열을 유전적으로 변형시킴(예를 들어, 이에 의해 앵커 서열에 대한 게놈 복합체 성분, 예를 들어 핵형성 폴리펩티드의 결합을 감소시키고/시키거나 제거함).
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 방법은 복수의 표적 유전자 중 2개 이상 유전자의 발현을 조절하며, 예를 들어 감소시킨다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 방법은 복수의 표적 유전자 중 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개(및 선택적으로 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 또는 30개 이하)의 유전자의 발현을 조절하며, 예를 들어 감소시킨다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 방법은 복수의 표적 유전자 중 2 내지 20개, 2 내지 18개, 2 내지 16개, 2 내지 14개, 2 내지 12개, 2 내지 10개, 2 내지 9개, 2 내지 8개, 2 내지 7개, 2 내지 6개, 2 내지 5개, 2 내지 4개, 2 내지 3개, 3 내지 20개, 3 내지 18개, 3 내지 16개, 3 내지 14개, 3 내지 12개, 3 내지 10개, 3 내지 9개, 3 내지 8개, 3 내지 7개, 3 내지 6개, 3 내지 5개, 3 내지 4개, 4 내지 20개, 4 내지 18개, 4 내지 16개, 4 내지 14개, 4 내지 12개, 4 내지 10개, 4 내지 9개, 4 내지 8개, 4 내지 7개, 4 내지 6개, 4 내지 5개, 5 내지 20개, 5 내지 18개, 5 내지 16개, 5 내지 14개, 5 내지 12개, 5 내지 10개, 5 내지 9개, 5 내지 8개, 5 내지 7개, 5 내지 6개, 6 내지 20개, 6 내지 18개, 6 내지 16개, 6 내지 14개, 6 내지 12개, 6 내지 10개, 6 내지 9개, 6 내지 8개, 6 내지 7개, 7 내지 20개, 7 내지 18개, 7 내지 16개, 7 내지 14개, 7 내지 12개, 7 내지 10개, 7 내지 9개, 7 내지 8개, 8 내지 20개, 8 내지 18개, 8 내지 16개, 8 내지 14개, 8 내지 12개, 8 내지 10개, 8 내지 9개, 9 내지 20개, 9 내지 18개, 9 내지 16개, 9 내지 14개, 9 내지 12개, 9 내지 10개, 10 내지 20개, 10 내지 18개, 10 내지 16개, 10 내지 14개, 10 내지 12개, 12 내지 20개, 12 내지 18개, 12 내지 16개, 12 내지 14개, 14 내지 20개, 14 내지 18개, 14 내지 16개, 16 내지 20개, 16 내지 18개, 또는 18 내지 20개 유전자의 발현을 조절하며, 예를 들어 감소시킨다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 방법은 복수의 표적 유전자 중 각각의 유전자(예를 들어, 모든 유전자)의 발현을 조절하며, 예를 들어 감소시킨다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 방법은 복수의 표적 유전자 중 유전자의 발현을 조절하며, 예를 들어 감소시키고, 유전자 중 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상, 예를 들어 모두)은 사이토카인, 인터류킨, 전사 인자(예를 들어, 인터페론 조절 전사 인자), 세포간 접착 분자(ICAM), 또는 인터페론 수용체이다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 방법은 복수의 표적 유전자 중 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상, 예를 들어 모두)의 유전자로부터 생성된 RNA, 예를 들어 mRNA의 수준을 조절하며, 예를 들어 감소시킨다. 일부 구현예에서, 발현을 조절하는 것은 복수의 표적 유전자 중 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상, 예를 들어 모두)의 유전자로부터 생성된 단백질의 수준을 감소시키는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 발현을 조절하는 것은 복수의 표적 유전자 중 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상, 예를 들어 모두)의 유전자로부터 생성된 mRNA 및 단백질의 수준을 둘 모두 감소시키는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 감소는 처리 전 수준 또는 부위-특이적 파괴제의 부재 하의 수준과 비교하여 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%의 감소이다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 방법은, 예를 들어 실시예 2 또는 4 내지 11 중 임의의 것의 검정법을 사용하여, 예를 들어 세포를 TNF-알파로 자극 시, 인간 CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, 및 IL8 중 하나 이상(예를 들어, 이들 중 1, 2, 3개, 또는 모두)의 발현을 조절하며, 예를 들어 감소시킨다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 방법은, 예를 들어 실시예 14의 검정법을 사용하여, 예를 들어 세포를 TNF-알파로 자극 시, 마우스 CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL7, 및 CXCL15 중 하나 이상(예를 들어, 이들 중 1, 2, 3개, 또는 모두)의 발현을 조절하며, 예를 들어 감소시킨다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 방법은 앵커 서열에 대한 핵형성 폴리펩티드, 예를 들어 CTCF의 결합을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 세포를 부위-특이적 파괴제와 접촉시키는 것 또는 부위-특이적 파괴제를 투여하는 것은 앵커 서열(예를 들어, 복수의 표적 유전자를 포함하는 ASMC의 앵커 서열)에 대한 핵형성 폴리펩티드, 예를 들어 CTCF의 결합의 감소를 초래한다. 일부 구현예에서, 세포를 부위-특이적 파괴제와 접촉시키는 것 또는 부위-특이적 파괴제를 투여하는 것은, 예를 들어 ChIP 및/또는 정량적 PCR에 의해 측정될 때, 부위-특이적 파괴제 또는 시스템으로 처리하기 전 또는 부위-특이적 파괴제 또는 시스템의 부재 하의 앵커 서열에 대한 핵형성 폴리펩티드(예를 들어, CTCF)의 결합과 대비하여 결합의 완전한 손실 또는 적어도 50, 60, 70, 80, 90, 95, 또는 99%의 감소를 초래한다.
추가로 본 개시내용은, 부분적으로, 대상체에서 복수의 표적 유전자의 과발현과 연관된 병태를 치료하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 본 명세서에 기재된 부위-특이적 파괴제, 시스템, 핵산, 벡터, 세포, 또는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 특정 유전자의 과발현과 연관된 병태는 당업자에게 알려져 있다. 그러한 병태는 대사 장애, 신경근육 장애, 암(예를 들어, 고형 종양), 섬유증, 당뇨병, 우레아 장애, 면역 장애, 염증, 및 관절염을 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 장애는 자가면역 장애이다. 일부 구현예에서, 장애는 감염, 예를 들어 바이러스 감염, 예를 들어 SARS-Cov2 바이러스 감염과 연관되거나 이에 의해 유발된다.
추가로 본 개시내용은, 부분적으로, 대상체, 예를 들어 인간 대상체의 세포에서 복수의 표적 유전자의 발현을 조절하는, 예를 들어 감소시키는 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 대상체는 질환 또는 병태를 갖는다. 일부 구현예에서, 질환은 염증성 질환, 예를 들어 면역 매개 염증성 질환이다. 일부 구현예에서, 질환 또는 병태는 류마티스 관절염, 통풍, 천식, 호중구 천식, 호중구 피부병, 발 부종, 급성 호흡기 질환 증후군(ARDS), COVID-19, 건선, 염증성 장 질환, 감염(예를 들어, 병원균, 예를 들어 박테리아, 바이러스, 또는 진균에 의한 감염), 외상(예를 들어, 찰과상 또는 이물질), 방사선 또는 화학적 손상의 영향, 골관절염, 골관절염 관절 통증, 관절 통증, 염증성 통증, 급성 통증, 만성 통증, 방광염, 기관지염, 피부염, 심혈관계 질환, 신경퇴행성 질환, 간 질환, 폐 질환, 신장 질환, 통증, 종창, 경직, 압통, 발적, 미열, 또는 질환 상태와 관련된 바이오마커(예를 들어, 사이토카인, 면역 수용체, 또는 염증성 마커)의 상승 중 하나 이상이다. 일부 구현예에서, 염증성 장애는, 예를 들어 바이러스, 예를 들어 Sars-Cov-2 바이러스에 의한 감염과 연관된다. 일부 구현예에서, 염증성 장애는 자가면역 장애이다.
본 명세서에 제공된 바와 같은 방법 및 조성물은 복수의 표적 유전자의 전사를 안정하게 또는 일시적으로 변경시킴으로써(예를 들어, 감소시킴으로써) 복수의 표적 유전자의 과발현과 연관된 병태를 치료할 수 있다. 일부 구현예에서, 그러한 조절은 적어도 약 1시간 내지 약 30일, 또는 적어도 약 2시간, 6시간, 12시간, 18시간, 24시간, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일, 22일, 23일, 24일, 25일, 26일, 27일, 28일, 29일, 30일, 또는 더 긴 시간 동안 또는 이들 사이의 임의의 시간 동안 지속된다. 일부 구현예에서, 그러한 조절은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24시간, 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7일, 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5주, 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개월, 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5년(예를 들어, 무기한으로) 동안 지속된다. 선택적으로, 그러한 조절은 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1년 이하의 기간 동안 지속된다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 제공된 방법 또는 조성물은 상기 조성물에 의해 접촉되지 않거나 상기 방법으로 처리되지 않은 세포 내의 복수의 표적 유전자 중 유전자의 발현 대비 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100%(그리고 선택적으로, 최대 100%)만큼 세포 내의 복수의 표적 유전자 중 유전자의 발현을 감소시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 제공된 방법 또는 조성물은 상기 조성물에 의해 접촉되지 않거나 상기 방법으로 처리되지 않은 세포 내의 복수의 표적 유전자 중 각 유전자의 발현 대비 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100%(그리고 선택적으로, 최대 100%)만큼 세포 내의 복수의 표적 유전자 중 각 유전자의 발현을 감소시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 제공된 방법은 상기 복수의 표적 유전자를 포함하는 게놈 복합체, 예를 들어 앵커 서열-매개 연접부를 파괴함으로써 복수의 표적 유전자의 발현을 조절할, 예를 들어 감소시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 방법은 게놈 복합체(예를 들어, ASMC)를 파괴한다. 일부 구현예에서, 세포를 부위-특이적 파괴제와 접촉시키는 것 또는 부위-특이적 파괴제를 투여하는 것은 부위-특이적 파괴제 또는 시스템으로 처리하기 전 또는 부위-특이적 파괴제 또는 시스템의 부재 하의 복합체의 수준과 대비하여 복수의 표적 유전자를 포함하는 게놈 복합체(예를 들어, ASMC)의 수준의 감소를 초래한다. 일부 구현예에서, 세포를 부위-특이적 파괴제와 접촉시키는 것 또는 부위-특이적 파괴제를 투여하는 것은, 예를 들어 ChIA-PET, ELISA(예를 들어, 유전자 발현 변화를 평가하기 위함), CUT&RUN, ATAC-SEQ, ChIP 및/또는 정량적 PCR에 의해 측정될 때, 부위-특이적 파괴제 또는 시스템으로 처리하기 전 또는 부위-특이적 파괴제 또는 시스템의 부재 하의 복합체의 수준과 대비하여 게놈 복합체, 예를 들어 ASMC의 완전한 손실, 또는 적어도 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 또는 99%의 감소를 초래한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 제공된 바와 같은 방법 및 조성물은 염증 부위에서 사이토카인의 동원을 감소시킴으로써 염증 캐스케이드 또는 사이토카인 폭풍과 연관된 병태를 치료할 수 있다. 일부 구현예에서, 염증 캐스케이드 및/또는 사이토카인 폭풍은 염증성 장애, 예를 들어 바이러스 매개 염증성 장애, 예를 들어 COVID-19 감염과 연관된다. 일부 구현예에서, 염증성 장애는, 예를 들어 바이러스, 예를 들어 Sars-Cov-2 바이러스에 의한 감염과 연관된다. 일부 구현예에서, 염증성 장애는 자가면역 장애이다. 일부 구현예에서, 염증성 장애는 저산소증과 연관된다. 일부 구현예에서, 염증성 장애는 ARDS, 저산소증, 및/또는 패혈증과 연관된다. 일부 구현예에서, 감염은, 예를 들어 하나 초과의 병원균, 예를 들어 제1 바이러스 또는 박테리아, 또는 진균, 및 제2 바이러스, 또는 제2 박테리아, 또는 제2 진균에 의해 유발되는 중복 감염이다.
후성유전학적 변형
추가로 본 개시내용은, 부분적으로, 복수의 표적 유전자 중 하나 이상(예를 들어, 모두)의 유전자; 복수의 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 전사 제어 요소; 복수의 표적 유전자에 근접하거나 복수의 표적 유전자를 포함하는 앵커 서열-매개 연접부와 연관된 앵커 서열; 또는 상기 앵커 서열에 근접한 부위를 후성유전학적으로 변형시키는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 부위-특이적 파괴제, 시스템, 부위-특이적 파괴제를 인코딩하는 핵산, 시스템의 성분을 인코딩하는 핵산, 또는 상기 부위-특이적 파괴제, 시스템 또는 핵산을 포함하는 약제학적 조성물을 제공하는 단계; 및 복수의 표적 유전자 중 하나 이상(예를 들어, 모두)의 유전자, 복수의 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 전사 제어 요소, 복수의 표적 유전자에 근접하거나 복수의 표적 유전자를 포함하는 앵커 서열-매개 연접부와 연관된 앵커 서열, 또는 상기 앵커 서열에 근접한 부위를 부위-특이적 파괴제 또는 시스템과 접촉시키는 단계를 포함하며, 이에 의해 복수의 표적 유전자, 복수의 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 전사 제어 요소, 복수의 표적 유전자에 근접하거나 복수의 표적 유전자를 포함하는 앵커 서열-매개 연접부와 연관된 앵커 서열, 또는 상기 앵커 서열에 근접한 부위를 후성유전학적으로 변형시킨다.
일부 구현예에서, 복수의 표적 유전자, 복수의 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 전사 제어 요소, 복수의 표적 유전자에 근접하거나 복수의 표적 유전자를 포함하는 앵커 서열-매개 연접부와 연관된 앵커 서열, 또는 상기 앵커 서열에 근접한 부위를 후성유전학적으로 변형시키는 방법은 복수의 표적 유전자, 복수의 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 전사 제어 요소, 복수의 표적 유전자에 근접하거나 복수의 표적 유전자를 포함하는 앵커 서열-매개 연접부와 연관된 앵커 서열, 또는 상기 앵커 서열에 근접한 부위의 DNA 메틸화를 증가시키거나 감소시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 표적 유전자, 복수의 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 전사 제어 요소, 복수의 표적 유전자에 근접하거나 복수의 표적 유전자를 포함하는 앵커 서열-매개 연접부와 연관된 앵커 서열, 또는 상기 앵커 서열에 근접한 부위를 후성유전학적으로 변형시키는 방법은 복수의 표적 유전자, 복수의 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 전사 제어 요소, 복수의 표적 유전자에 근접하거나 복수의 표적 유전자를 포함하는 앵커 서열-매개 연접부와 연관된 앵커 서열, 또는 상기 앵커 서열에 근접한 부위와 연관된 히스톤의 히스톤 메틸화를 증가시키거나 감소시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 표적 유전자, 복수의 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 전사 제어 요소, 복수의 표적 유전자에 근접하거나 복수의 표적 유전자를 포함하는 앵커 서열-매개 연접부와 연관된 앵커 서열, 또는 상기 앵커 서열에 근접한 부위를 후성유전학적으로 변형시키는 방법은 복수의 표적 유전자, 복수의 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 전사 제어 요소, 복수의 표적 유전자에 근접하거나 복수의 표적 유전자를 포함하는 앵커 서열-매개 연접부와 연관된 앵커 서열, 또는 상기 앵커 서열에 근접한 부위와 연관된 히스톤의 히스톤 아세틸화를 감소시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 표적 유전자, 복수의 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 전사 제어 요소, 복수의 표적 유전자에 근접하거나 복수의 표적 유전자를 포함하는 앵커 서열-매개 연접부와 연관된 앵커 서열, 또는 상기 앵커 서열에 근접한 부위를 후성유전학적으로 변형시키는 방법은 복수의 표적 유전자, 복수의 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 전사 제어 요소, 복수의 표적 유전자에 근접하거나 복수의 표적 유전자를 포함하는 앵커 서열-매개 연접부와 연관된 앵커 서열, 또는 상기 앵커 서열에 근접한 부위와 연관된 히스톤의 히스톤 수모일화를 증가시키거나 감소시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 표적 유전자, 복수의 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 전사 제어 요소, 복수의 표적 유전자에 근접하거나 복수의 표적 유전자를 포함하는 앵커 서열-매개 연접부와 연관된 앵커 서열, 또는 상기 앵커 서열에 근접한 부위를 후성유전학적으로 변형시키는 방법은 복수의 표적 유전자, 복수의 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 전사 제어 요소, 복수의 표적 유전자에 근접하거나 복수의 표적 유전자를 포함하는 앵커 서열-매개 연접부와 연관된 앵커 서열, 또는 상기 앵커 서열에 근접한 부위와 연관된 히스톤의 히스톤 인산화를 증가시키거나 감소시키는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 복수의 표적 유전자, 복수의 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 전사 제어 요소, 복수의 표적 유전자에 근접하거나 복수의 표적 유전자를 포함하는 앵커 서열-매개 연접부와 연관된 앵커 서열, 또는 상기 앵커 서열에 근접한 부위를 후성유전학적으로 변형시키는 방법은 상기 조성물에 의해 접촉되지 않거나 상기 방법으로 처리되지 않은 세포 내의 그러한 부위에서의 후성유전학적 변형의 수준 대비 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100%(그리고 선택적으로, 최대 100%)만큼 후성유전학적 변형의 수준을 감소시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 복수의 표적 유전자, 복수의 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 전사 제어 요소, 복수의 표적 유전자에 근접하거나 복수의 표적 유전자를 포함하는 앵커 서열-매개 연접부와 연관된 앵커 서열, 또는 상기 앵커 서열에 근접한 부위를 후성유전학적으로 변형시키는 방법은 상기 조성물에 의해 접촉되지 않거나 상기 방법으로 처리되지 않은 세포 내의 그러한 부위에서의 후성유전학적 변형의 수준 대비 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000%(그리고 선택적으로, 최대 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 또는 2000%)만큼 후성유전학적 변형의 수준을 증가시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 복수의 표적 유전자, 복수의 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 전사 제어 요소, 복수의 표적 유전자에 근접하거나 복수의 표적 유전자를 포함하는 앵커 서열-매개 연접부와 연관된 앵커 서열, 또는 상기 앵커 서열에 근접한 부위의 후성유전학적 변형은, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은, 복수의 표적 유전자의 발현 수준을 변형시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 방법에 의해 생성된 후성유전학적 변형은 적어도 약 1시간 내지 약 30일, 또는 적어도 약 2시간, 6시간, 12시간, 18시간, 24시간, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일, 22일, 23일, 24일, 25일, 26일, 27일, 28일, 29일, 30일, 또는 더 긴 시간 동안 또는 이들 사이의 임의의 시간 동안 지속된다. 일부 구현예에서, 그러한 조절은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24시간, 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7일, 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5주, 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개월, 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5년(예를 들어, 무기한으로) 동안 지속된다. 선택적으로, 그러한 조절은 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1년 이하의 기간 동안 지속된다.
일부 구현예에서, 복수의 표적 유전자, 복수의 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 전사 제어 요소, 복수의 표적 유전자에 근접하거나 복수의 표적 유전자를 포함하는 앵커 서열-매개 연접부와 연관된 앵커 서열, 또는 상기 앵커 서열에 근접한 부위를 후성유전학적으로 변형시키는 방법에서 사용하기 위한 부위-특이적 파괴제 또는 시스템은 후성유전학적 변형 모이어티를 포함하는 이펙터 모이어티를 포함한다. 예를 들어, 이펙터 모이어티는 DNA 메틸트랜스퍼라제 활성을 갖는 후성유전학적 변형 모이어티를 포함할 수 있으며, 내인성 또는 자연 발생 표적 서열(예를 들어, 복수의 표적 유전자 중의 유전자, 복수의 표적 유전자에 작동 가능하게 연결된 전사 제어 요소, 복수의 표적 유전자에 근접하거나 복수의 표적 유전자를 포함하는 앵커 서열-매개 연접부와 연관된 앵커 서열, 또는 상기 앵커 서열에 근접한 부위)이 그의 메틸화를 증가시키도록(예를 들어, 전사 인자와 복수의 표적 유전자 중의 유전자 또는 전사 제어 요소의 일부분과의 상호작용을 감소시키도록, 앵커 서열에 대한 핵형성 단백질의 결합을 감소시키도록, 그리고/또는 앵커 서열-매개 연접부를 파괴하거나 방해하도록) 변경될 수 있거나, 그의 메틸화를 감소시키도록(예를 들어, 전사 인자와 복수의 표적 유전자 중의 유전자 또는 전사 제어 요소의 일부분의 상호작용을 증가시키도록, 앵커 서열에 대한 핵형성 단백질의 결합을 증가시키도록, 그리고/또는 앵커 서열-매개 연접부의 강도를 촉진하거나 증가시키도록) 변경될 수 있다.
유전적 변형
추가로 본 개시내용은, 부분적으로, 복수의 표적 유전자 중 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3개, 또는 모두)의 유전자, 복수의 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 전사 제어 요소, 또는 복수의 표적 유전자에 근접하거나 복수의 표적 유전자를 포함하는 앵커 서열-매개 연접부와 연관된 앵커 서열을 유전적으로 변형시키는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 부위-특이적 파괴제 또는 시스템 또는 이를 인코딩하는 핵산, 또는 상기 부위-특이적 파괴제, 시스템 또는 핵산을 포함하는 약제학적 조성물을 제공하는 단계; 및 복수의 표적 유전자 중 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3개, 또는 모두)의 유전자, 복수의 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 전사 제어 요소, 또는 복수의 표적 유전자에 근접하거나 복수의 표적 유전자를 포함하는 앵커 서열-매개 연접부와 연관된 앵커 서열을 부위-특이적 파괴제와 접촉시키는 단계를 포함하며, 이에 의해 복수의 표적 유전자, 복수의 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 전사 제어 요소, 또는 복수의 표적 유전자에 근접하거나 복수의 표적 유전자를 포함하는 앵커 서열-매개 연접부와 연관된 앵커 서열을 유전적으로 변형시킨다.
유전적 변형은 삽입, 결실, 또는 치환 중 하나 이상을 복수의 표적 유전자 중의 유전자, 복수의 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 전사 제어 요소, 또는 복수의 표적 유전자에 근접하거나 복수의 표적 유전자를 포함하는 앵커 서열-매개 연접부와 연관된 앵커 서열에 도입하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 삽입은 적어도 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800, 또는 2000개의 뉴클레오티드(및 선택적으로 3000, 2500, 2000, 1500, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 또는 200개 이하의 뉴클레오티드)의 추가를 포함한다. 일부 구현예에서, 삽입은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100개의 뉴클레오티드(및 선택적으로 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 뉴클레오티드)의 추가를 포함한다. 일부 구현예에서, 삽입은 1 내지 10개, 1 내지 9개, 1 내지 8개, 1 내지 7개, 1 내지 6개, 1 내지 5개, 1 내지 4개, 1 내지 3개, 또는 1 내지 2개 뉴클레오티드의 추가를 포함한다. 일부 구현예에서, 결실은 적어도 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800, 또는 2000개의 뉴클레오티드(및 선택적으로 3000, 2500, 2000, 1500, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 또는 200개 이하의 뉴클레오티드)의 제거를 포함한다. 일부 구현예에서, 결실은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100개의 뉴클레오티드(및 선택적으로 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 뉴클레오티드)의 제거를 포함한다. 일부 구현예에서, 결실은 1 내지 10개, 1 내지 9개, 1 내지 8개, 1 내지 7개, 1 내지 6개, 1 내지 5개, 1 내지 4개, 1 내지 3개, 또는 1 내지 2개 뉴클레오티드의 제거를 포함한다. 일부 구현예에서, 치환은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100개의 뉴클레오티드(및 선택적으로 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 뉴클레오티드)의 변경을 포함한다. 일부 구현예에서, 치환은 1 내지 10개, 1 내지 9개, 1 내지 8개, 1 내지 7개, 1 내지 6개, 1 내지 5개, 1 내지 4개, 1 내지 3개, 또는 1 내지 2개 뉴클레오티드의 변경을 포함한다.
일부 구현예에서, 유전적 변형은, 예를 들어 복수의 표적 유전자를 포함하는 ASMC와 연관된 앵커 서열에 대한 삽입, 결실, 또는 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 유전적 변형은 앵커 서열에 대한 게놈 복합체 성분, 예를 들어 핵형성 폴리펩티드의 결합을 변경시킨다(예를 들어, 감소시키거나 증가시킴). 일부 구현예에서, 유전적 변형은 전체적으로 또는 부분적으로 앵커 서열을 (예를 들어, 삽입, 결실, 또는 치환을 통해) 무효화시키며, 이에 의해 예를 들어 앵커 서열에 대한 핵형성 폴리펩티드의 결합을 감소시키거나 제거하고, 예를 들어 상기 앵커 서열을 포함하는 ASMC의 존재를 감소시키거나 상기 ASMC를 제거한다. 이론에 의해 구애되고자 함이 없이, 본 개시내용은 삽입, 결실, 또는 치환을 앵커 서열에 도입하여 복수의 표적 유전자를 포함하는 게놈 복합체, 예를 들어 ASMC에서 앵커 서열의 참여를 감소시키거나 제거하기 위한 유전적 변형 기능성을 갖는 부위-특이적 파괴제의 사용을 고려한다. 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같이, 그러한 변경은 게놈 복합체, 예를 들어 ASMC를 파괴하는 것으로 예상되며, 복수의 표적 유전자의 발현을 감소시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 유전적 변형은 앵커 서열을 포함하는 서열의 삽입을 포함한다. 이론에 의해 구애되고자 함이 없이, 본 개시내용은 외인성 앵커 서열을 복수의 표적 유전자 중의 유전자, 복수의 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 전사 제어 요소, 또는 복수의 표적 유전자에 근접하거나 복수의 표적 유전자를 포함하는 앵커 서열-매개 연접부와 연관된 앵커 서열에 도입하기 위한 유전적 변형 기능성을 갖는 부위-특이적 파괴제 또는 시스템의 사용을 고려한다. 새로운 앵커 서열의 존재는 복수의 표적 유전자를 포함하는 게놈 복합체, 예를 들어 ASMC의 형성 및/또는 유지를 파괴하며, 이에 의해 복수의 표적 유전자의 발현을 조절할, 예를 들어 감소시킬 수 있다고 생각된다.
하기 실시예는 본 개시내용의 일부 구현예를 추가로 설명하기 위해 제공되지만, 본 개시내용의 범주를 제한하고자 하지 않으며; 그들의 예시적인 성질로 인해 당업자에게 알려진 기타 다른 절차, 방법, 또는 기법이 대안적으로 사용될 수 있음이 이해될 것이다.
실시예
실시예 1: 예시적인 복수의 유전자의 발현 감소
이 실시예는 부분적으로, CRISPR/Cas 분자 및 주어진 가이드 서열을 포함하는 가이드 RNA를 포함하는 부위-특이적 파괴제를 사용하여 CXCL1, CXCL2, CXCL3, 및 IL8을 포함하는 복수의 표적 유전자의 발현 감소를 입증하는 실험을 기재한다.
CRISPR/Cas 분자(Cas9)를 인코딩하는 mRNA 및 sgRNA Cas9/가이드 RNP 복합체를 포함하는 부위-특이적 파괴제를 포함하는 RNP의 형질감염을 THP-1 세포로의 전기천공에 의해 수행하였다. RPMI + 10% FBS에서 세포를 배양하였다. 또한 비교를 위해 부모 계통(parental line)도 분석하였다.
각 편집된 세포주 및 부모 대조군에 대해 4중으로 24웰 플레이트에 350k개 세포를 도말하였다. 1시간 후 각 세포주에 대해 2개 웰에 10 ng/ml의 TNF 알파(Sigma Cat# 654205)를 첨가하였다. 나머지 2개 웰은 대조군으로서 비처리되었다.
편집된 세포와 부모 세포를 TNF 알파와 함께 24시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 제조업체의 프로토콜에 따라 AllPrep DNA/RNA Kit(Qiagen)를 사용하여 DNA와 RNA를 분리하였다. LunaScript® RT SuperMix Kit(New England Biolabs)를 사용하여 RNA 샘플을 cDNA로 역전사시키고 TaqMan® Fast Advanced Master Mix(Thermo Fisher Scientific)와 함께 개별 CXCL1, CXCL2, CXCL3 및 IL8 특이적 TaqMan 프라이머/프로브 세트를 사용하여 정량적 PCR에 의해 분석하였다.
ΔΔCt 방법을 사용하여 인간 GAPDH 참조 유전자에 대비하여 CXCL1 내지 CXCL3 및 IL7 유전자 발현을 정량화하였다. 직접적으로 TNF 알파를 처리한 후 유전자 발현의 배수 증가를 측정함으로써 비처리 세포에서의 유전자 발현 수준과 비교하여 유전자 발현 변화를 추가로 정량화하였다.
절연 게놈 도메인(IGD)의 양쪽 경계에 있는 CTCF 앵커를 ChIP-seq 데이터를 사용하여 위치를 파악하고, CTCF 앵커 서열을 알려진 CTCF 위치 가중치 매트릭스(JASPAR)를 사용하여 컴퓨터로 확인하였다. CTCF 앵커 서열을 표적화하도록 CRISPR(Sp Cas9) 가이드를 선택하였다.
가이드 서열은 하기 표에 열거되어 있다.
Figure pct00136
실시예 2: 72시간째 THP-1 세포에서의 사이토카인 발현 감소
이 실시예는 부분적으로, CRISPR/Cas 분자 및 복수의 표적 유전자를 포함하는 ASMC의 앵커 서열로 표적화된 가이드 RNA를 포함하는 부위-특이적 파괴제를 사용하여 CXCL1, CXCL2, CXCL3, 및 IL8을 포함하는 복수의 표적 유전자의 발현 감소를 입증하는 실험을 기재한다.
sgRNA 및 Cas9 RNP를 인코딩하는 mRNA를 THP-1 세포로 전기천공하였다. CXCL1, CXCL2, CXCL3, 및 IL8을 포함하는 ASMC의 CTCF 부위 중 하나를 표적화하도록 sgRNA 서열(실시예 1의 것)을 선택하였다. 형질감염된 세포를 10 ng/ml의 TNF 알파와 함께 24시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 제조업체의 프로토콜에 따라 AllPrep DNA/RNA Kit(Qiagen)를 사용하여 DNA와 RNA를 분리하였다. LunaScript® RT SuperMix Kit(New England Biolabs)를 사용하여 RNA 샘플을 cDNA로 역전사시키고 TaqMan® Fast Advanced Master Mix(Thermo Fisher Scientific)와 함께 개별 CXCL1, CXCL2, CXCL3 및 IL8 특이적 TaqMan 프라이머/프로브 세트를 사용하여 정량적 PCR에 의해 분석하였다.
ΔΔCt 방법을 사용하여 인간 GAPDH 참조 유전자에 대비하여 CXCL1 내지 3 및 IL8 유전자 발현을 정량화하였다. 직접적으로 TNF 알파를 처리한 후 유전자 발현의 배수 증가를 측정함으로써 비처리 세포에서의 유전자 발현 수준과 비교하여 유전자 발현 변화를 추가로 정량화하였다. 도 6의 결과는 CRISPR/Cas 분자와 sgRNA를 포함하는 부위-특이적 파괴제가 THP-1 세포에서 CXCL1, CXCL2, CXCL3, 및 IL8 발현을 감소시키는 데 사용될 수 있으며 처리 72시간 후에 발현이 감소됨을 나타낸다. 결과는 또한 상기 부위-특이적 파괴제의 LNP 전달이 유효량의 작용제를 표적 세포에 전달하는 데 사용될 수 있음을 나타낸다.
CXCL1, CXCL2, CXCL3, 및 IL8을 포함하는 ASMC의 다른 CTCF 부위를 표적화하는 sgRNA를 사용하여 실험을 반복했을 때 유사한 결과가 관찰되었다(데이터는 나타내지 않음).
실시예 3: 부위-특이적 조절제에 의해 감소된 THP-1 세포의 사이토카인 단백질 분비
이 실시예는 부분적으로, CRISPR/Cas 분자 및 복수의 표적 유전자를 포함하는 ASMC의 앵커 서열로 표적화된 가이드 RNA를 포함하는 부위-특이적 파괴제를 사용하여 세포를 처리함으로써, 복수의 표적 유전자 중 2개의 유전자인 CXCL1과 IL-8의 분비 감소를 입증하는 실험을 기재한다.
이전 실시예에서와 같이 예시적인 CRISPR/Cas 분자(Cas9)를 포함하는 부위-특이적 파괴제를 인코딩하는 mRNA 및 sgRNA를 포함하는 RNP로 THP-1 세포를 전기천공하였다. CXCL1 및 IL-8을 포함하는 ASMC의 CTCF 부위 중 하나로 sgRNA(실시예 1의 것)를 표적화하였다. 세포를 10 ng/ml의 TNF 알파로 24시간 동안 자극하였다. 그 후, 세포 상청액을 수집하고 -80℃에서 동결시켰다. CRISPR/Cas 분자를 인코딩하는 mRNA에 추가적으로, 4가지 상이한 sgRNA와 접촉한 세포로부터의 상청액, 및 형질감염되지 않은 양성 대조군을 Myriad Genetics Inc.의 사이토카인 패널에서 CXCL1 및 IL-8 단백질 수준에 대해 스크리닝하였다. 도 7은 sgRNA 및 CRISPR/Cas 분자 RNP로 처리한 세포로부터 수득한 각 상청액에 대해 CXCL1 및 IL-8의 수준 감소가 관찰되었음을 나타내며, 이는 (예를 들어, 앵커 서열의 파괴 및 폴리펩티드 상호작용의 핵형성, 예를 들어 CTCF 결합의 파괴에 의해) ASMC 파괴에 대한 표현형 반응을 입증한다. 이 데이터는 실시예 2의 qPCR에 의해 관찰된 mRNA 발현 감소와 일치한다.
CXCL1 및 IL8을 포함하는 ASMC의 다른 CTCF 부위를 표적화하는 sgRNA를 사용하여 실험을 반복했을 때 유사한 결과가 관찰되었다(데이터는 나타내지 않음).
실시예 4: qPCR에 의해 측정된 CXCL3 발현 감소
이 실시예는 부분적으로, CRISPR/Cas 분자 및 복수의 표적 유전자를 포함하는 ASMC의 앵커 서열로 표적화된 다양한 가이드 RNA를 포함하는 부위-특이적 파괴제를 사용하여 THP-1 세포를 처리함으로써 CXCL3의 발현 감소를 입증하는 실험을 기재한다.
RPMI + 10% FBS에서 THP-1 세포를 성장시켰다. CRISPR/Cas 분자(Cas9)를 인코딩하는 mRNA 및 복수의 표적 유전자를 포함하는 ASMC의 CTCF 부위 중 어느 하나로 표적화된 sgRNA로 LNP를 사용하여 세포를 형질감염시켰다. 도 9a에 표시된 바와 같이 사용된 sgRNA(실시예 1의 것)은 좌측 또는 우측 CTCF 부위를 표적으로 한다. Precision NanoSystems Inc.의 NanoAssemblr® SparkTM를 사용함으로써 SSOP 지질 혼합물을 사용한 지질 나노입자(LNP) 제형화를 수행하였다. 실험 조건의 경우, 각 형질감염된 조건 및 부모 대조군에 대해 LNP 형질감염 72시간 후 24웰 플레이트에 웰당 350k개 세포를 도말하였다(도 8의 순서도 참조). 1시간 후 각 웰에 대해 10 ng/ml의 TNF 알파(Sigma Cat# 654205)를 첨가하였다. 비처리 부모 세포를 10 ng/ml의 TNF 알파와 함께 또는 이것 없이 도말하였다.
형질감염된 세포를 TNF 알파와 함께 24시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 제조업체의 프로토콜에 따라 AllPrep DNA/RNA Kit(Qiagen)를 사용하여 DNA와 RNA를 분리하였다. LunaScript® RT SuperMix Kit(New England Biolabs)를 사용하여 RNA 샘플을 cDNA로 역전사시키고 TaqMan® Fast Advanced Master Mix(Thermo Fisher Scientific)와 함께 개별 CXCL3 TaqMan 프라이머/프로브 세트를 사용하여 정량적 PCR에 의해 분석하였다.
ΔΔCt 방법을 사용하여 인간 GAPDH 참조 유전자에 대비하여 CXCL3 유전자 발현을 정량화하였다. 직접적으로 TNF 알파를 처리한 후 유전자 발현의 배수 증가를 측정함으로써 비처리 세포에서의 유전자 발현 수준과 비교하여 유전자 발현 변화를 추가로 정량화하였다. 결과는 CRISPR/Cas 분자 및 여러 가지 상이한 sgRNA를 포함하는 부위-특이적 파괴제가 THP-1 세포에서 CXCL3 발현을 감소시키는 데 사용될 수 있음을 나타낸다(도 8 그래프). 결과는 또한 상기 부위-특이적 파괴제의 LNP 전달이 유효량의 작용제를 표적 세포에 전달하는 데 사용될 수 있음을 나타낸다. 결과는 또한 복수의 표적 유전자를 포함하는 ASMC의 어느 한 쪽에 있는 앵커 서열을 표적화하는 것이 복수의 표적 유전자의 발현을 감소시킬 수 있음을 입증한다.
CXCL1, CXCL2, CXCL3, 및 IL8을 포함하는 ASMC의 다른 CTCF 부위를 표적화하는 sgRNA를 사용하여 실험을 반복했을 때 유사한 결과가 관찰되었다(데이터는 나타내지 않음).
실시예 5: CXCL1 및 CXCL3 발현은 형질감염 3주 후 감소된다
이 실시예는 부분적으로, CRISPR/Cas 분자 및 복수의 표적 유전자를 포함하는 ASMC의 앵커 서열로 표적화된 다양한 가이드 RNA를 포함하는 부위-특이적 파괴제를 사용하여 형질감염 3주 후 THP-1 세포에서 CXCL1 및 CXCL3의 안정적인 발현 감소를 입증하는 실험을 기재한다.
TNF 알파 자극 전에 형질감염된 세포를 3주 동안 인큐베이션한 것을 제외하고는, 실시예 4에서와 같이 세포와 LNP를 준비하고, 샘플을 분석하였다(도 9a 순서도 참조).
결과는 CRISPR/Cas 분자 및 여러 가지 상이한 sgRNA를 포함하는 부위-특이적 파괴제가 작용제(들)를 포함하는 LNP로 처리하고 최대 3주(3주를 포함함) 후 THP-1 세포에서 CXCL1 및 CXCL3 발현을 안정적으로 감소시키는 데 사용될 수 있음을 나타낸다(도 9a 및 9b). 결과는 또한 복수의 표적 유전자를 포함하는 ASMC의 어느 한 쪽에 있는 앵커 서열을 표적화하는 것이 복수의 표적 유전자의 발현을 안정적으로 감소시킬 수 있음을 입증한다.
실시예 6: KRAB 이펙터 모이어티를 포함하는 작용제는 CXCL1 발현을 감소시킨다
이 실시예는 부분적으로, 전사 리프레서에 융합된 CRISPR/Cas 분자 및 복수의 표적 유전자를 포함하는 ASMC의 앵커 서열로 표적화된 다양한 가이드 RNA를 포함하는 부위-특이적 파괴제를 사용하여 형질감염 후 THP-1 세포에서 CXCL1의 발현 감소를 입증하는 실험을 기재한다.
RPMI + 10% FBS에서 THP-1 세포를 성장시켰다. 전사 리프레서에 융합된 CRISPR/Cas 분자인 dCas9-KRAB를 인코딩하는 mRNA 및 복수의 표적 유전자를 포함하는 ASMC의 CTCF 부위 중 어느 하나로 표적화된 sgRNA(실시예 1의 것)로 LNP를 사용하여 세포를 형질감염시켰다. Precision NanoSystems Inc.의 NanoAssemblr® SparkTM를 사용함으로써 SSOP 지질 혼합물을 사용한 지질 나노입자(LNP) 제형화를 수행하였다. 실험 조건의 경우, 각 형질감염된 조건 및 부모 대조군에 대해 LNP 형질감염 72시간 후 24웰 플레이트에 웰당 350k개 세포를 도말하였다. 1시간 후 각 웰에 대해 10 ng/ml의 TNF 알파(Sigma Cat# 654205)를 첨가하였다. 비처리 부모 세포를 10 ng/ml의 TNF 알파와 함께 또는 이것 없이 도말하였다. CRISPR/Cas 분자(Cas9)를 인코딩하는 mRNA 및 sgRNA를 사용한 형질감염(실시예 2, 4 및 5에 따름)을 양성 대조군으로 수행하였다.
형질감염된 세포를 TNF 알파와 함께 24시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 제조업체의 프로토콜에 따라 AllPrep DNA/RNA Kit(Qiagen)를 사용하여 DNA와 RNA를 분리하였다. LunaScript® RT SuperMix Kit(New England Biolabs)를 사용하여 RNA 샘플을 cDNA로 역전사시키고 TaqMan® Fast Advanced Master Mix(Thermo Fisher Scientific)와 함께 개별 CXCL1 특이적 TaqMan 프라이머/프로브 세트를 사용하여 정량적 PCR에 의해 분석하였다.
ΔΔCt 방법을 사용하여 인간 GAPDH 참조 유전자에 대비하여 CXCL1 유전자 발현을 정량화하였다. 직접적으로 TNF 알파를 처리한 후 유전자 발현의 배수 증가를 측정함으로써 비처리 세포에서의 유전자 발현 수준과 비교하여 유전자 발현 변화를 추가로 정량화하였다. 결과는 전사 리프레서인 KRAB에 융합된 촉매적으로 비활성인 CRISPR/Cas 분자를 포함하고, 다양한 sgRNA에 의해 CTCF 부위로 표적화된 부위-특이적 파괴제가 THP-1 세포에서 CXCL1 발현을 감소시키는 데 사용될 수 있음을 나타낸다(도 10). 형질감염 72시간 후에 발현 감소가 관찰되었다.
실시예 7: EZH2 이펙터 모이어티를 포함하는 작용제는 CXCL1 발현을 감소시킨다
이 실시예는 부분적으로, 히스톤 메틸트랜스퍼라제(EZH2)에 융합된 CRISPR/Cas 분자 및 복수의 표적 유전자를 포함하는 ASMC의 앵커 서열로 표적화된 다양한 가이드 RNA를 포함하는 부위-특이적 파괴제를 사용하여 형질감염 후 THP-1 세포에서 CXCL1의 발현 감소를 입증하는 실험을 기재한다.
RPMI + 10% FBS에서 THP-1 세포를 성장시켰다. 히스톤 데아세틸라제에 융합된 촉매적으로 비활성인 CRISPR/Cas 분자(dCas9)인 dCas9-EZH2를 인코딩하는 mRNA, 및 복수의 표적 유전자를 포함하는 ASMC의 CTCF 부위 중 어느 하나로 표적화된 sgRNA(실시예 1의 것)로 LNP를 사용하여 세포를 형질감염시켰다. Precision NanoSystems Inc.의 NanoAssemblr® SparkTM를 사용함으로써 SSOP 지질 혼합물을 사용한 지질 나노입자(LNP) 제형화를 수행하였다. 실험 조건의 경우, 각 형질감염된 조건 및 부모 대조군에 대해 LNP 형질감염 72시간 후 24웰 플레이트에 웰당 350k개 세포를 도말하였다. 1시간 후 각 웰에 대해 10 ng/ml의 TNF 알파(Sigma Cat# 654205)를 첨가하였다. 비처리 부모 세포를 10 ng/ml의 TNF 알파와 함께 또는 이것 없이 도말하였다.
형질감염된 세포를 TNF 알파와 함께 24시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 제조업체의 프로토콜에 따라 AllPrep DNA/RNA Kit(Qiagen)를 사용하여 DNA와 RNA를 분리하였다. LunaScript® RT SuperMix Kit(New England Biolabs)를 사용하여 RNA 샘플을 cDNA로 역전사시키고 TaqMan® Fast Advanced Master Mix(Thermo Fisher Scientific)와 함께 개별 CXCL1 특이적 TaqMan 프라이머/프로브 세트를 사용하여 정량적 PCR에 의해 분석하였다.
ΔΔCt 방법을 사용하여 인간 GAPDH 참조 유전자에 대비하여 CXCL1 유전자 발현을 정량화하였다. 직접적으로 TNF 알파를 처리한 후 유전자 발현의 배수 증가를 측정함으로써 비처리 세포에서의 유전자 발현 수준과 비교하여 유전자 발현 변화를 추가로 정량화하였다. 결과는 히스톤 메틸트랜스퍼라제(EZH2)에 융합된 촉매적으로 비활성인 CRISPR/Cas 분자를 포함하고, 다양한 sgRNA에 의해 CTCF 부위로 표적화된 부위-특이적 파괴제가 THP-1 세포에서 CXCL1 발현을 감소시키는 데 사용될 수 있음을 나타낸다(도 11). 형질감염 72시간 후에 발현 감소가 관찰되었다.
실시예 8: MQ1이펙터 모이어티를 포함하는 작용제는 CXCL1 발현을 감소시킨다
이 실시예는 부분적으로, DNA 메틸트랜스퍼라제(MQ1)에 융합된 CRISPR/Cas 분자 및 복수의 표적 유전자를 포함하는 ASMC의 앵커 서열로 표적화된 다양한 가이드 RNA를 포함하는 부위-특이적 파괴제를 사용하여 형질감염 후 THP-1 세포에서 CXCL1의 발현 감소를 입증하는 실험을 기재한다.
RPMI + 10% FBS에서 THP-1 세포를 성장시켰다. MQ1에 융합된 촉매적으로 비활성인 CRISPR/Cas 분자(dCas9)인 dCas9-MQ1을 인코딩하는 mRNA, 및 복수의 표적 유전자를 포함하는 ASMC의 CTCF 부위 중 어느 하나로 표적화된 sgRNA(실시예 1의 것)로 LNP를 사용하여 세포를 형질감염시켰다. Precision NanoSystems Inc.의 NanoAssemblr® SparkTM를 사용함으로써 SSOP 지질 혼합물을 사용한 지질 나노입자(LNP) 제형화를 수행하였다. 실험 조건의 경우, 각 형질감염된 조건 및 부모 대조군에 대해 LNP 형질감염 72시간 후 24웰 플레이트에 웰당 350k개 세포를 도말하였다. 1시간 후 각 웰에 대해 10 ng/ml의 TNF 알파(Sigma Cat# 654205)를 첨가하였다. 비처리 부모 세포를 10 ng/ml의 TNF 알파와 함께 또는 이것 없이 도말하였다.
형질감염된 세포를 TNF 알파와 함께 24시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 제조업체의 프로토콜에 따라 AllPrep DNA/RNA Kit(Qiagen)를 사용하여 DNA와 RNA를 분리하였다. LunaScript® RT SuperMix Kit(New England Biolabs)를 사용하여 RNA 샘플을 cDNA로 역전사시키고 TaqMan® Fast Advanced Master Mix(Thermo Fisher Scientific)와 함께 개별 CXCL1 및 CXCL3 특이적 TaqMan 프라이머/프로브 세트를 사용하여 정량적 PCR에 의해 분석하였다.
ΔΔCt 방법을 사용하여 인간 GAPDH 참조 유전자에 대비하여 CXCL1 및 3 유전자 발현을 정량화하였다. 직접적으로 TNF 알파를 처리한 후 유전자 발현의 배수 증가를 측정함으로써 비처리 세포에서의 유전자 발현 수준과 비교하여 유전자 발현 변화를 추가로 정량화하였다. 결과는 DNA 메틸트랜스퍼라제(MQ1)에 융합된 촉매적으로 비활성인 CRISPR/Cas 분자를 포함하고, 다양한 sgRNA에 의해 CTCF 부위로 표적화된 부위-특이적 파괴제가 THP-1 세포에서 CXCL1 발현을 감소시키는 데 사용될 수 있음을 나타낸다(도 12). 형질감염 72시간 후에 발현 감소가 관찰되었다. CXCL3 발현을 측정하여 유사한 결과가 관찰되었다(데이터는 나타내지 않음).
실시예 9: Cas9 또는 dCas9-EZH2 처리 후 지속적인 CXCL1 발현 감소
이 실시예는 부분적으로, CRISPR/Cas 분자 또는 히스톤 데아세틸라제(EZH2)에 융합된 촉매적으로 비활성인 CRISPR/Cas 분자 중 어느 하나 및 CXCL1을 포함하는 복수의 표적 유전자를 포함하는 ASMC의 앵커 서열로 표적화된 sgRNA를 포함하는 부위-특이적 파괴제를 사용하여 형질감염 후 최대 4주까지 THP-1 세포에서 CXCL1의 안정적인 발현 감소를 입증하는 실험을 기재한다.
ATxTM Scalable Transfection System(MaxCyte)을 사용하여, 어느 하나의 부위-특이적 파괴제(Cas9 또는 dCas9-EZH2)를 인코딩하는 mRNA 및 sgRNA(실시예 1의 것)를 사용하여 어셈플리 처리에 있어서 조건당 5백만개의 세포로 RPMI + 10% FBS에서 성장시킨 THP-1 세포를 전기천공하였다. 형질감염된 세포의 샘플을 수확하고 TNF 알파와 함께 24시간 동안 인큐베이션하였다. 이를 매주 반복하여 4주까지 수행하였다. 그 후, 제조업체의 프로토콜에 따라 AllPrep DNA/RNA Kit(Qiagen)를 사용하여 DNA와 RNA를 분리하였다. LunaScript® RT SuperMix Kit(New England Biolabs)를 사용하여 RNA 샘플을 cDNA로 역전사시키고 TaqMan® Fast Advanced Master Mix(Thermo Fisher Scientific)와 함께 개별 CXCL1, CXCL2, CXCL3 및 IL8 특이적 TaqMan 프라이머/프로브 세트를 사용하여 정량적 PCR에 의해 분석하였다.
ΔΔCt 방법을 사용하여 인간 GAPDH 참조 유전자에 대비하여 CXCL1 유전자 발현을 정량화하였다. 직접적으로 TNF 알파를 처리한 후 유전자 발현의 배수 증가를 측정함으로써 비처리 세포에서의 유전자 발현 수준과 비교하여 유전자 발현 변화를 추가로 정량화하였다. 결과는 CRISPR/Cas 분자, 또는 히스톤 메틸트랜스퍼라제(EZH2)에 융합된 촉매적으로 비활성인 CRISPR/Cas 분자를 포함하고, sgRNA에 의해 CTCF 부위로 표적화된 부위-특이적 파괴제가 THP-1 세포에서 CXCL 발현을 감소시키는 데 사용될 수 있음을 나타낸다(도 13). 발현 감소는 적어도 4주까지 지속되며, 또한 형질감염 후 72시간 및 3주째에도 관찰된다.
실시예 10: EZH2-dCas9-KRAB 및 sgRNA로 처리 시의 CXCL3 발현 감소
이 실시예는 부분적으로, 히스톤 메틸트랜스퍼라제(EZH2) 및 전사 리프레서(KRAB)에 융합된 촉매적으로 비활성인 CRISPR/Cas 분자, 및 복수의 표적 유전자를 포함하는 ASMC의 앵커 서열로 표적화된 다양한 가이드 RNA를 포함하는 부위-특이적 파괴제를 사용하여 형질감염 후 THP-1 세포에서 CXCL3의 발현 감소를 입증하는 실험을 기재한다.
RPMI + 10% FBS에서 THP-1 세포를 성장시켰다. 여러 가지 상이한 부위-특이적 파괴제를 다음과 같이 시험하였다: G9A-dCas9-EZH2(G9A가 dCas9에 융합되고 이것이 EZH2에 융합됨), G9A-dCas9-KRAB, 및 EZH2-dCas9-KRAB. 부위-특이적 파괴제를 인코딩하는 mRNA, 및 복수의 표적 유전자를 포함하는 ASMC의 CTCF 부위로 표적화된 sgRNA로 LNP를 사용하여 세포를 형질감염시켰다. 좌측 CTCF에 근접하지만 좌측 CTCF 부위로부터 약간의 거리가 있는(예를 들어, CTCF 부위로부터 80, 160, 235, 또는 300개 뉴클레오티드) 게놈 DNA 부위를 표적화하도록 sgRNA를 선택하였다. 좌측 CTCF에 근접하지만 좌측 CTCF 부위로부터 약간의 거리가 있는 게놈 DNA 부위를 표적화하는 예시적인 가이드 서열이 표 5에 제공되어 있다.
가이드 가이드 서열 게놈 좌표 서열번호
GD-29251 CCAATGAAGATGAAACTGGG chr4:74595215-74595237 30
GD-29252 AACGTGCTTGCCTAAGATTC chr4:74595370-74595392 31
GD-29253 AGCCCTTAATCATATCTAGT chr4:74595560-74595582 32
GD-29254 CAGAGCTTAAGACCTGTACT chr4:74595642-74595664 33
GD-29255 GCCCACCTTGACCTTCACAA chr4:74595787-74595809 34
Precision NanoSystems Inc.의 NanoAssemblr® SparkTM를 사용함으로써 SSOP 지질 혼합물을 사용한 지질 나노입자(LNP) 제형화를 수행하였다. 실험 조건의 경우, 각 형질감염된 조건 및 부모 대조군에 대해 LNP 형질감염 72시간 후 24웰 플레이트에 웰당 350k개 세포를 도말하였다. 1시간 후 각 웰에 대해 10 ng/ml의 TNF 알파(Sigma Cat# 654205)를 첨가하였다. 비처리 부모 세포를 10 ng/ml의 TNF 알파와 함께 또는 이것 없이 도말하였다.
형질감염된 세포를 TNF 알파와 함께 24시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 제조업체의 프로토콜에 따라 AllPrep DNA/RNA Kit(Qiagen)를 사용하여 DNA와 RNA를 분리하였다. LunaScript® RT SuperMix Kit(New England Biolabs)를 사용하여 RNA 샘플을 cDNA로 역전사시키고 TaqMan® Fast Advanced Master Mix(Thermo Fisher Scientific)와 함께 개별 CXCL1 및 CXCL3 특이적 TaqMan 프라이머/프로브 세트를 사용하여 정량적 PCR에 의해 분석하였다.
ΔΔCt 방법을 사용하여 인간 GAPDH 참조 유전자에 대비하여 CXCL1 및 3 유전자 발현을 정량화하였다. 직접적으로 TNF 알파를 처리한 후 유전자 발현의 배수 증가를 측정함으로써 비처리 세포에서의 유전자 발현 수준과 비교하여 유전자 발현 변화를 추가로 정량화하였다. 결과는 히스톤 메틸트랜스퍼라제(EZH2) 및 전사 리프레서(KRAB)에 융합된 촉매적으로 비활성인 CRISPR/Cas 분자를 포함하고, sgRNA에 의해 CTCF에 근접한 부위로 표적화된 부위-특이적 파괴제가 THP-1 세포에서 CXCL3 발현을 감소시키는 데 사용될 수 있음을 나타낸다(도 14). CXCL1 발현을 측정하여 유사한 결과가 관찰되었다(데이터는 나타내지 않음).
실시예 11: 부위-특이적 파괴제 및 sgRNA로 처리 시의 CXCL1 발현 감소
이 실시예는 부분적으로, DNA 메틸트랜스퍼라제(DNMT33a/3l)에 융합된 촉매적으로 비활성인 CRISPR/Cas 분자; 히스톤 데아세틸라제(HDAC8)에 융합된 촉매적으로 비활성인 CRISPR/Cas 분자; 또는 히스톤 데아세틸라제(HDAC8) 및 히스톤 메틸트랜스퍼라제(EZH2)에 융합된 촉매적으로 비활성인 CRISPR/Cas 분자, 및 복수의 표적 유전자를 포함하는 ASMC의 앵커 서열로 표적화된 다양한 가이드 RNA를 포함하는 다양한 예시적인 부위-특이적 파괴제를 사용하여 형질감염 후 THP-1 세포에서 CXCL1의 발현 감소를 입증하는 실험을 기재한다.
RPMI + 10% FBS에서 THP-1 세포를 성장시켰다. 여러 가지 상이한 부위-특이적 파괴제를 다음과 같이 시험하였다: dCas9-DNMT3a/3l(dCas9에 융합된 DNMT3a/3l), dCas9-HDAC8, 및 EZH2-dCas9-HDAC8. 부위-특이적 파괴제를 인코딩하는 mRNA, 및 복수의 표적 유전자를 포함하는 ASMC의 어느 하나의 CTCF 부위로 표적화된 sgRNA(실시예 1의 것)로 LNP를 사용하여 세포를 형질감염시켰다. Precision NanoSystems Inc.의 NanoAssemblr® SparkTM를 사용함으로써 SSOP 지질 혼합물을 사용한 지질 나노입자(LNP) 제형화를 수행하였다. 실험 조건의 경우, 각 형질감염된 조건 및 부모 대조군에 대해 LNP 형질감염 72시간 후 24웰 플레이트에 웰당 350k개 세포를 도말하였다. 1시간 후 각 웰에 대해 10 ng/ml의 TNF 알파(Sigma Cat# 654205)를 첨가하였다. 비처리 부모 세포를 10 ng/ml의 TNF 알파와 함께 또는 이것 없이 도말하였다.
형질감염된 세포를 TNF 알파와 함께 24시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 제조업체의 프로토콜에 따라 AllPrep DNA/RNA Kit(Qiagen)를 사용하여 DNA와 RNA를 분리하였다. LunaScript® RT SuperMix Kit(New England Biolabs)를 사용하여 RNA 샘플을 cDNA로 역전사시키고 TaqMan® Fast Advanced Master Mix(Thermo Fisher Scientific)와 함께 개별 CXCL1 특이적 TaqMan 프라이머/프로브 세트를 사용하여 정량적 PCR에 의해 분석하였다.
ΔΔCt 방법을 사용하여 인간 GAPDH 참조 유전자에 대비하여 CXCL1 유전자 발현을 정량화하였다. 직접적으로 TNF 알파를 처리한 후 유전자 발현의 배수 증가를 측정함으로써 비처리 세포에서의 유전자 발현 수준과 비교하여 유전자 발현 변화를 추가로 정량화하였다. 결과는 dCas9-DNMT3a/3l, dCas9-HDAC8, 또는 EZH2-dCas9-HDAC8을 포함한 부위-특이적 파괴제가 THP-1 세포에서 CXCL1 발현을 감소시키는 데 사용될 수 있고 이들 작용제가 여러 가지 상이한 sgRNA에 의해 CTCF 부위로 표적화될 때 사이토카인 발현을 감소시키는 데 효과적이었음을 나타낸다(도 15).
실시예 12: 인간 A549 폐암 상피 세포 및 IMR-90 세포에서 dCas9-EZH2 및 가이드 30183으로 처리 시의 CXCL 유전자 클러스터 발현 감소
이 실시예는 dCas9-EZH2 및 가이드 30183(컨트롤러 1)으로 처리 시의 인간 A549 폐암 상피 세포 및 IMR-90 세포에서의 CXCL 유전자 클러스터 발현 감소를 입증한다.
인간 A549 세포(ATCC® CCL-185) 및 IMR-90 세포(ATCC®-CCL-186)를 100 μl의 배지에서 평평한 바닥 세포 배양 처리 플레이트에 웰당 15,000개 세포로 도말하였다. A549 세포에는 F12/K ATCC®-30-2004 배지를 제공하고 IMR-90 세포에는 EMEM ATCC®-30-2003 배지를 제공하였다. 완전 배지는 둘 다 10% FBS(VWR cat# 97068-085)를 포함하여 제조되었다. 플레이트에 부착하고 24시간 후, 가이드 30183 및 EZH2-dCas9 컨트롤러를 함유한 LNP를 2 μg/ml SSOP 지질 믹스의 최종 농도로 배지에 첨가하였다. 6시간 후, 배지를 100 μl의 적절한 배지로 교체하고 세포를 72시간 동안 인큐베이션하였다. 72시간 인큐베이션의 완료 후, TNF 알파(Sigma Cat# 654205)를 10 ng/ml의 최종 농도로 지정된 웰에 첨가하고 24시간 동안 인큐베이션하였다. 24시간 후, 제조업체의 프로토콜에 따라 NucleoSpin® 96 RNA Core Kit(Macherey-Nagel Inc, cat# 740466.4)를 사용하여 RNA를 분리하였다. LunaScript® RT SuperMix Kit(New England Biolabs)를 사용하여 RNA 샘플을 cDNA로 역전사시키고 TaqMan® Fast Advanced Master Mix(Thermo Fisher Scientific)와 함께 개별 특이적 TaqMan 프라이머/프로브 세트를 사용하여 정량적 PCR에 의해 분석하였다. ΔΔCt 방법을 사용하여 인간 ABL1 참조 유전자에 대비하여 유전자 발현을 정량화하였다. 직접적으로 TNF 알파를 처리한 후 유전자 발현의 배수 증가를 측정함으로써 비처리 세포에서의 유전자 발현 수준과 비교하여 유전자 발현 변화를 추가로 정량화하였다.
데이터는 dCas9-EZH2로 처리될 때 인간 A549 폐암 상피 세포에서 CXCL 유전자 클러스터의 유전자(구체적으로, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, 및 IL-8) 발현 수준이 40 내지 70%로 감소했음을 나타내었다(도 17). 중간 CTCF가 dCas9-EZH2 및 GD-30183로 표적화될 때 IMR-90 세포에서 CXCL 유전자 클러스터의 유전자(구체적으로, CXCL1, CXCL2, CXCL3, 및 IL-8)의 유전자 발현이 약 50% 감소하였다(도 18).
실시예 13: 인간 단핵구에서 dCas9-EZH2 및 가이드 GD-28481로 처리 시의 CXCL 유전자 클러스터 발현 감소
이 실시예는 dCas 기반 이펙터(컨트롤러 A)로 처리 시의 인간 단핵구 세포에서의 CXCL 유전자 클러스터 발현 감소를 입증한다.
Synthego에 의해 THP-1 세포(ATCC-TIB-202)로 전기천공함으로써 Cas9/가이드 RNP 복합체의 형질감염을 수행하였다.
편집된 세포주를 받은 후, 바이알을 해동하고, 세포를 RPMI + 10% FBS(VWR cat# 97068-085)에서 1주일 동안 배양하여 세포가 동결 및 해동으로부터 회복되도록 하였다. 또한 비교를 위해 부모 비편집 THP1 세포주도 분석하였다.
편집된 세포주 및 부모 대조군에 대해 4중으로 24웰 플레이트에 350,000개 세포를 도말하였다. 1시간 후 10 ng/ml의 TNF 알파(Sigma Cat# 654205)를 첨가하였다. 또한 비처리 대조군 웰을 사용하여 케모카인 발현의 증가 배수를 비교하였다.
편집된 세포와 부모 세포를 TNF 알파와 함께 24시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 제조업체의 프로토콜에 따라 DNA/RNA All Prep Kit(Qiagen)를 사용하여 DNA와 RNA를 분리하였다. LunaScript® RT SuperMix Kit(New England Biolabs)를 사용하여 RNA 샘플을 cDNA로 역전사시키고 TaqMan® Fast Advanced Master Mix(Thermo Fisher Scientific)와 함께 개별 CXCL1, CXCL2, CXCL3 및 IL8 특이적 TaqMan 프라이머/프로브 세트를 사용하여 정량적 PCR에 의해 분석하였다.
ΔΔCt 방법을 사용하여 인간 GAPDH 참조 유전자에 대비하여 CXCL1 내지 3 및 IL8 유전자 발현을 정량화하였다. 직접적으로 TNF 알파를 처리한 후 유전자 발현의 배수 증가를 측정함으로써 비처리 세포에서의 유전자 발현 수준과 비교하여 유전자 발현 변화를 추가로 정량화하였다.
데이터는 투약 후 24시간째에 CXCL1, CXCL2, CXCL3, 및 IL-8의 유전자 발현이 비처리 단핵구에서 CXCL1, CXCL2, CXCL3, 및 IL-8 유전자 발현과 비교하여 컨트롤러 A로 처리한 단핵구에서 각각 65%, 55%, 88%, 및 52% 감소하였음을 나타내었다(도 19).
실시예 14: Hep 1.6 세포에서 3개의 앵커 서열을 표적화하는 sgRNA 및 dCas9-MQ1로 처리 시의 마우스 CXCL 유전자 클러스터 발현 감소
이 실시예는 Hep 1.6 세포에서 3개의 앵커 서열을 표적화하는 sgRNA 및 dCas9-MQ1로 처리할 때 마우스 CXCL 유전자 클러스터 발현이 하향조절됨을 입증한다.
마우스 세포 HEPA 1.6(ATCC® CRL-1830)을 100 μl의 배지(DMEM Gibco Cat# 11995-065, 10% FBS VWR cat# 97068-085)에서 평평한 바닥 세포 배양 처리 플레이트에 웰당 10k개 세포로 도말하였다. 플레이트에 부착시키고 24시간 후, 배양액을 4개의 처리군과 3개의 대조군으로 나누었다. (i) 우측 CTCF를 표적화하는 가이드 GD-30594 및 dCas9-MQ1 컨트롤러, (ii) 중간 CTCF 1을 표적화하는 dCas9-MQ1 이펙터가 있는 가이드 GD-30592, (iii) 중간 CTCF를 표적화하는 dCas9-MQ1 이펙터가 있는 가이드 GD-30593 및 (iv) 중간 및 우측 CTCF를 둘 다 표적화하는 dCas9-MQ1과 GD-30594, GD-30592 및 GD-30593의 조합을 함유하는 LNP를 2 μg/mL SSOP 지질 믹스의 최종 농도로 처리군에 따른 세포 배양액에 첨가하였다. 비처리 세포, LNP로 처리한 세포, 및 형질감염 대조군 가이드를 함유한 LNP 및 TNF로 처리한 세포를 대조군으로 사용하였다. 6시간 후, 배지를 100 μl의 DMEM로 교체하고 세포를 72시간 동안 인큐베이션하였다. 72시간 인큐베이션의 완료 후, TNF 알파(Sigma Cat# 654245)를 10 ng/ml의 최종 농도로 지정된 웰에 첨가하고 24시간 동안 인큐베이션한다. 24시간 후, 제조업체의 프로토콜에 따라 NucleoSpin® 96 RNA Core Kit(Macherey-Nagel, cat# 740466.4)를 사용하여 RNA를 분리하였다. LunaScript® RT SuperMix Kit(New England Biolabs)를 사용하여 RNA 샘플을 cDNA로 역전사시키고 TaqMan® Fast Advanced Master Mix(Thermo Fisher Scientific)와 함께 개별 특이적 TaqMan 프라이머/프로브 세트를 사용하여 정량적 PCR에 의해 분석하였다. ΔΔCt 방법을 사용하여 마우스 HPRT 참조 유전자에 대비하여 유전자 발현을 정량화하였다. 직접적으로 TNF 알파를 처리한 후 유전자 발현의 배수 증가를 측정함으로써 비처리 세포에서의 유전자 발현 수준과 비교하여 유전자 발현 변화를 추가로 정량화하였다.
데이터는 CXCL 유전자 클러스터에서 우측, 또는 2개의 중간 CTCF 모티프 중 하나를 표적화하는 가이드를 사용하여 형질감염된 dCas9-MQ1로 처리한 세포가 TNF 알파 자극 후 7개의 CXCL 유전자 모두에서 약간의 하향조절을 보임을 입증하였다(도 21b). 그러나, 중간과 우측 CTCF를 둘 모두 표적화하는 가이드의 조합을 사용하여 형질감염된 dCas9-MQ1로 세포를 처리했을 때 전체 CXCL 유전자 클러스터는 현저하게 더 하향조절되었다.
실시예 15: dCas9-MQ1의 전신 투여는 염증이 있는 폐에서 백혈구 침윤의 현저한 감소를 입증한다
이 실시예는 dCas9-MQ1의 전신 투여가 마우스 폐에서 생체내 백혈구 침윤을 감소시킴을 입증한다.
뮤린 지질다당류(LPS) 폐 염증 모델을 사용하여 폐에서의 급성 염증을 연구하였다. DOTAP 1% PEG 짧은 ncRNA를 포함하는 LNP를 대조군으로 사용하였다. 각 마우스는 정맥내 투여 지점을 통해 -2시간째에 3 mg/kg 용량의 LNP-DOTAP 또는 dCas9-MQ1을 받았다. 마우스를 0시간째에 경구 흡입을 통해 5 mg/kg의 LPS로 자극하였다. 3 mg/kg으로 LNP-DOTAP 또는 dCas9-MQ1의 제2 용량을 +8시간 시점에 투여하였다. 0, 24, 및 48시간째에 10 mg/kg의 용량으로 덱사메타손을 복강내 투여하였다. 72시간째에 동물을 종료시키고 유동 염색을 위해 세기관지 세척액을 폐로부터 수집하였다. BALF에서의 호중구 침윤 감소를 염증성 반응의 중증도를 이해하기 위한 척도로 사용하였다.
dCas9-MQ1 처리 동물의 폐로부터 수집한 세기관지 세척액은 약 5.0 × 105개 백혈구 수/mL를 나타내었다. 허위 그룹, 즉 처리를 받지 않은 건강한 마우스에는 세기관지 세척액에서(BALF) 백혈구가 유의하게 존재하지 않았다. LPS 처리 마우스, 덱사메타손 처리 마우스, 및 LNP-DOTAP 처리 마우스는 세기관지 세척액에서 각각 약 8.0 × 105개 백혈구 수/mL, 약 7.2 × 105개 백혈구 수/mL, 및 약 6.0 × 105개 백혈구 수/mL를 나타내었다(도 22의 B). 또한 질환 대조군과 비교하여 dCas9-MQ1 처리 72시간 후 마우스에서 기관지-폐포 세척액(BALF)에서 호중구 침윤의 56% 감소가 관찰되었다.
실시예 16: dCas9-MQ1의 전신 투여는 BALF에서 호중구 침윤의 현저한 감소를 입증한다
이 실시예는 세포 집단을 평가하기 위해 실시예 15에서 얻은 BALF를 분석한다.
하기 염색 패널을 사용한 유세포 측정 분석을 사용하여 실시예 15에서 얻은 BALF의 세포 집단을 평가하고 종결 시점에 BALF에 존재하는 세포의 백분율을 기록하였다(도 23a). 또한 BALF 중 호중구 수를 하기 항체 염색 패널을 사용하여 그래프로 표시하였다.
폐포 대식세포: CD45+, Siglec F+, CD11b-, CD11c+
호중구: CD45+, Siglec F-, CD11b+, CD11c-, Ly-6G+
T 세포: CD45+, Siglec F-, CD11c-, CD3+
B 세포: CD45+, Siglec F--, CD11c-, B220+(도 23b)
분석은, 침윤 세포의 대부분을 구성하는 백혈구 세포 유형은 호중구이며, B 세포, T 세포, 대식세포 및 다른 유형의 조혈 세포가 그 뒤를 잇는다는 것을 나타내었다(도 23a). 컨트롤러는 +LPS 질환 그룹과 비교하여 현저한 차이로 폐에 침윤하는 호중구의 수를 감소시켰다(도 23b).
실시예 17: BALF에서 백혈구 세포의 감소는 폐 특이적이다
이 실시예는 BALF에서 백혈구 세포의 감소가 폐 특이적임을 입증하며, 이러한 감소가 dCas9-MQ1 처리로 인한 것임을 시사한다.
뮤린 지질다당류(LPS) 폐 염증 모델을 사용하여 폐에서의 급성 염증을 연구하였다. DOTAP 1% PEG 짧은 ncRNA를 포함하는 LNP를 대조군으로 사용하였다. 각 마우스는 정맥내 투여 지점을 통해 -2시간째에 3 mg/kg 용량의 LNP-DOTAP 또는 dCas9-MQ1을 받았다. 마우스를 0시간째에 경구 흡입을 통해 5 mg/kg의 LPS로 자극하였다. 3 mg/kg으로 LNP-DOTAP 또는 dCas9-MQ1의 제2 용량을 +8시간 시점에 투여하였다. 0, 24, 및 48시간째에 10 mg/kg의 용량으로 덱사메타손을 복강내 투여하였다. 72시간째에 동물을 종료시키고 유동 염색을 위해 세기관지 세척액을 폐로부터 수집하였다. 말초 혈액을 72시간 종료 시점에 수집하였다. CD45+ 항체 염색을 사용한 유세포 측정을 사용하여 각 그룹의 말초 혈액에서 백혈구 집단을 결정하였다. 각 군에 대해 얻은 백혈구 수를 그래프에 플롯팅하였다.
그래프는 컨트롤러로 처리한 BALF에서 백혈구 수의 감소 효과가 폐 특이적인 것을 나타내었는데, 이는 백혈구 수의 감소가 마우스 자체에서, 말초 혈액에서도 더 낮은 백혈구 수를 보였을 것인 백혈구 집단의 감소가 있기 때문이 아니라 dCas9-MQ1 처리에 기인한 것임을 시사한다. 말초 혈액 중 조혈 세포 집단은 모든 그룹에 걸쳐 유사한 것으로 밝혀졌다(도 24).
실시예 18: dCas9-MQ1의 전신 투여는 CXCL 유전자 발현이 폐 조직에서 감소됨을 입증한다
이 실시예는 CXCL 유전자 클러스터 발현이 dCas9-MQ1의 전신 투여 시 폐 조직에서 하향조절됨을 입증한다.
BALF를 실시예 15에 기재된 방법을 사용하여 수집하였다. BALF 수집 후, 좌측 폐엽의 절반을 취해 동결하여 qPCR 분석을 위해 보관하였다. 폐 조직을 균질화하고, qPCR 분석을 위해 RNA를 추출하여 구체적으로 CXCL1 내지 7 및 CXCL15에 대해 정량화하였다. ΔΔCt 방법을 사용하여 마우스 GAPDH 참조 유전자에 대비하여 유전자 발현을 정량화하였다.
데이터는 CXCL 유전자 클러스터 발현이 dCas9-MQ1로 처리되지 않은 마우스에서 얻은 폐 조직 샘플에서의 CXCL 유전자 클러스터 발현과 비교하여 dCas9-MQ1로 처리된 마우스로부터 얻은 폐 조직 샘플에서 다양한 정도로 하향조절되었음을 나타내었다(도 25).
실시예 19: CXCL 발현 감소는 염증 부위에 대한 다른 사이토카인의 존재 및 세포 동원 감소의 유익한 하류 효과를 나타낸다
CXCL 유전자 클러스터의 과발현은 호중구를 유인하는 케모카인을 생성한다. 염증성 세포를 폐로 동원하는 케모카인은 국부 염증을 촉진하여, 심각한 병의 발생을 야기한다. 이 실시예는 CXCL 발현의 하향조절이 세포 동원을 감소시키는 유익한 하류 효과를 나타내어 염증 부위에서 다른 사이토카인의 존재의 감소를 야기함을 입증하며, 이는 CXCL 발현의 하향 조절이 염증 발병의 중증도를 감소시키는 유망한 방법임을 시사한다.
BALF를 실시예 15에 기재된 방법을 사용하여 수집하였다. BALF 수집 후, 좌측 폐엽의 절반을 취해 동결하여 qPCR 분석을 위해 보관하였다. 폐 조직을 균질화하고, qPCR 분석을 위해 RNA를 추출하여 멀티플렉싱 Luminex® 기기를 사용하여 구체적으로 BALF 중 CXCL1, CXCL2, GM-CSF, 및 IL-6 단백질의 총 수에 대해 정량화하였다.
데이터는 dCas9-MQ1로 처리한 마우스로부터 얻은 폐 조직이 dCas9-MQ1로 처리하지 않은 마우스로부터 얻은 폐 조직에서 확인된 CXCL1, CXCL2, GM-CSF, 및 IL-6 발현과 비교하여 CXCL1, CXCL2, GM-CSF, 및 IL-6의 더 낮은 발현을 보임을 입증하였다.
균등물
본 발명이 이의 상세한 설명과 함께 기재되었지만, 전술한 설명은 예시하고자 하는 것이고, 첨부된 청구범위의 범주에 의해 규정되는 본 발명의 범주를 제한하고자 하는 것이 아님이 이해되어야 한다. 일부 양태, 이점, 및 변형이 하기 청구범위의 범주 내에 있다.
SEQUENCE LISTING <110> FLAGSHIP PIONEERING INNOVATIONS V, INC. <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR INHIBITING THE EXPRESSION OF MULTIPLE GENES <130> O2057-7021WO <140> <141> <150> 63/216,487 <151> 2021-06-29 <150> 63/085,013 <151> 2020-09-29 <160> 247 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 1 nbndccdsha grkgghrshv 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 2 vhsrhggkrg ahsdccdnbn 20 <210> 3 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial 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tctggagatg 1380 gaacccgtga caatccccga cgtgcatggc ggctctctgc agaacgccgt gagagtgtgg 1440 tccaacatcc ccgccattag aagcagacac tgggctctgg tgagcgagga ggaactgtct 1500 ctgctggccc agaataagca gtcctccaag ctggccgcca agtggcccac caagctggtg 1560 aagaactgct ttctgcctct gagggagtat ttcaagtatt tcagcaccga actgaccagc 1620 agcctg 1626 <210> 17 <211> 745 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Gly Gln Thr Gly Lys Lys Ser Glu Lys Gly Pro Val Cys Trp Arg Lys 1 5 10 15 Arg Val Lys Ser Glu Tyr Met Arg Leu Arg Gln Leu Lys Arg Phe Arg 20 25 30 Arg Ala Asp Glu Val Lys Ser Met Phe Ser Ser Asn Arg Gln Lys Ile 35 40 45 Leu Glu Arg Thr Glu Ile Leu Asn Gln Glu Trp Lys Gln Arg Arg Ile 50 55 60 Gln Pro Val His Ile Leu Thr Ser Val Ser Ser Leu Arg Gly Thr Arg 65 70 75 80 Glu Cys Ser Val Thr Ser Asp Leu Asp Phe Pro Thr Gln Val Ile Pro 85 90 95 Leu Lys Thr Leu Asn Ala Val Ala Ser Val Pro Ile Met Tyr Ser Trp 100 105 110 Ser Pro Leu Gln Gln Asn Phe Met Val Glu Asp Glu Thr Val Leu His 115 120 125 Asn Ile Pro Tyr Met Gly Asp Glu Val 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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 29 gccatctaga gccgaaaaca 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 30 ccaatgaaga tgaaactggg 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 31 aacgtgcttg cctaagattc 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 32 agcccttaat catatctagt 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 33 cagagcttaa gacctgtact 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 34 gcccaccttg accttcacaa 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 35 gttactgcgt aattaccagg 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 36 tattacatcc tacctataag 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 37 tgggctctgg acttagatcg 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 38 taagtgggct atgtatacac 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 39 tttctaagtc tgtcacaagg 20 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 40 aaagtaatat gatctaggaa 20 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 41 gttcgagcgg ctgtgcgagg 20 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 42 gctctgtggc tctccgagaa 20 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 43 gtgtgtgtgt ttcaacgtag 20 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 44 ggaagtcact gggagctgcg 20 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 45 ggccacgggt gtgttcccag 20 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 46 atggccattt gcaaaagtca 20 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 47 ccaaactaga cagataaagc 20 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 48 ccagcatgac tctagcatgc 20 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 49 tggccaaggt ctgatatgca 20 <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 50 tcatgagtcc cagaacatgt 20 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 51 gcgaaagaag tagtagctaa 20 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 52 gactaagact ggcaaatctg 20 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 53 gactaagagg 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tcttcgacta tagatactcc caagccgacg ctctgaagta cgtgggcatc gagagagaga 7680 tggaaatccc cggaggtggc ggatcgggaa agcggcccgc cgccaccaag aaggccggtc 7740 aggccaagaa gaagaagggc agctacccct acgacgtgcc cgactacgcc tgagcggccg 7800 cttaattaag ctgccttctg cggggcttgc cttctggcca tgcccttctt ctctcccttg 7860 cacctgtacc tcttggtctt tgaataaagc ctgagtagga agtctagaaa aaaaaaaaaa 7920 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 7980 aaaaaaa 7987 <210> 70 <211> 2581 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 70 Met Ala Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Ile His Gly Val Pro Ala 1 5 10 15 Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser Ala Ala Ile Ala Glu Val Leu 20 25 30 Leu Asn Ala Arg Cys Asp Leu His Ala Val Asn Tyr His Gly Asp Thr 35 40 45 Pro Leu His Ile Ala Ala Arg Glu Ser Tyr His Asp Cys Val Leu Leu 50 55 60 Phe Leu Ser Arg Gly Ala Asn Pro Glu Leu Arg Asn Lys Glu Gly Asp 65 70 75 80 Thr Ala Trp Asp Leu Thr Pro Glu Arg Ser Asp Val Trp Phe 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acaaggtgcc cagcaagaag ttcaaggtgc 1380 tgggcaacac cgaccggcac agcatcaaga agaacctgat cggcgccctg ctgttcgaca 1440 gcggcgagac cgccgaggcc acccggctga agcggaccgc ccggcggcgg tacacccggc 1500 ggaagaaccg gatctgctac ctgcaggaga tcttcagcaa cgagatggcc aaggtggacg 1560 acagcttctt ccaccggctg gaggagagct tcctggtgga ggaggacaag aagcacgagc 1620 ggcaccccat cttcggcaac atcgtggacg aggtggccta ccacgagaag taccccacca 1680 tctaccacct gcggaagaag ctggtggaca gcaccgacaa ggccgacctg cggctgatct 1740 acctggccct ggcccacatg atcaagttcc ggggccactt cctgatcgag ggcgacctga 1800 accccgacaa cagcgacgtg gacaagctgt tcatccagct ggtgcagacc tacaaccagc 1860 tgttcgagga gaaccccatc aacgccagcg gcgtggacgc caaggccatc ctgagcgccc 1920 ggctgagcaa gagccggcgg ctggagaacc tgatcgccca gctgcccggc gagaagaaga 1980 acggcctgtt cggcaacctg atcgccctga gcctgggcct gacccccaac ttcaagagca 2040 acttcgacct ggccgaggac gccaagctgc agctgagcaa ggacacctac gacgacgacc 2100 tggacaacct gctggcccag atcggcgacc agtacgccga cctgttcctg gccgccaaga 2160 acctgagcga cgccatcctg ctgagcgaca tcctgcgggt gaacaccgag atcaccaagg 2220 cccccctgag cgccagcatg atcaagcggt acgacgagca ccaccaggac ctgaccctgc 2280 tgaaggccct ggtgcggcag cagctgcccg agaagtacaa ggagatcttc ttcgaccaga 2340 gcaagaacgg ctacgccggc tacatcgacg gcggcgccag ccaggaggag ttctacaagt 2400 tcatcaagcc catcctggag aagatggacg gcaccgagga gctgctggtg aagctgaacc 2460 gggaggacct gctgcggaag cagcggacct tcgacaacgg cagcatcccc caccagatcc 2520 acctgggcga gctgcacgcc atcctgcggc ggcaggagga cttctacccc ttcctgaagg 2580 acaaccggga gaagatcgag aagatcctga ccttccggat cccctactac gtgggccccc 2640 tggcccgggg caacagccgg ttcgcctgga tgacccggaa atccgaggag accatcaccc 2700 cctggaactt cgaggaggtg gtggacaagg gcgccagcgc ccagagcttc atcgagcgga 2760 tgaccaactt cgacaagaac ctgcccaacg agaaggtgct gcccaagcac agcctgctgt 2820 acgagtactt caccgtgtac aacgagctga ccaaggtgaa gtacgtgacc gagggcatgc 2880 ggaagcccgc cttcctgagc ggcgagcaga agaaggccat cgtggacctg ctgttcaaga 2940 ccaaccggaa ggtgaccgtg aagcagctga aggaggacta cttcaagaag atcgagtgct 3000 tcgacagcgt ggagatcagc ggcgtggagg accggttcaa cgccagcctg ggcacctacc 3060 acgacctgct gaagatcatc aaggacaagg acttcctgga caacgaggag aacgaggaca 3120 tcctggagga catcgtgctg accctgaccc tgttcgagga ccgggagatg atcgaggagc 3180 ggctgaaaac ctacgcccac ctgttcgacg acaaggtgat gaagcagctg aagcggcggc 3240 ggtacaccgg ctggggccgg ctgagccgga agctgatcaa cggcatccgg gacaagcaga 3300 gcggcaagac catcctggac ttcctgaaat ccgacggctt cgccaaccgg aacttcatgc 3360 agctgatcca cgacgacagc ctgaccttca aggaggacat ccagaaggcc caggtgagcg 3420 gccagggcga cagcctgcac gagcacatcg ccaacctggc cggcagcccc gccatcaaga 3480 agggcatcct gcagaccgtg aaggtggtgg acgagctggt gaaggtgatg ggccggcaca 3540 agcccgagaa catcgtgatc gagatggccc gggagaacca gaccacccag aagggccaga 3600 agaacagccg ggagcggatg aagcggatcg aggagggcat caaggagctg ggcagccaga 3660 tcctgaagga gcaccccgtg gagaacaccc agctgcagaa cgagaagctg tacctgtact 3720 acctgcagaa cggccgggac atgtacgtgg accaggagct ggacatcaac cggctgagcg 3780 actacgacgt ggccgccatc gtgccccaga gcttcctgaa ggacgacagc atcgacaaca 3840 aggtgctgac ccggagcgac aaggcccggg 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cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120 ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180 accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240 attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300 tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360 tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt gacgcgtatt gggatggtac 420 ctaatacgac tcactataag gaaataagag agaaaagaag agtaagaaga aatataagag 480 ccaccatggc ccccaagaag aagcggaagg tgggcatcca cggcgtgccc gccgccgcca 540 agcggaacta catcctgggc ctggccatcg gcatcaccag cgtgggctac ggcatcatcg 600 actacgagac ccgggacgtg atcgacgccg gcgtgcggct gttcaaggag gccaacgtgg 660 agaacaacga gggccggcgg agcaagcggg gcgcccggcg gctgaagcgg cggcggcggc 720 accggatcca gcgggtgaag aagctgctgt tcgactacaa cctgctgacc gaccacagcg 780 agctgagcgg catcaacccc tacgaggccc gggtgaaggg cctgagccag aagctgagcg 840 aggaggagtt cagcgccgcc ctgctgcacc tggccaagcg gcggggcgtg cacaacgtga 900 acgaggtgga ggaggacacc ggcaacgagc tgagcaccaa ggagcagatc agccggaaca 960 gcaaggccct ggaggagaag tacgtggccg agctgcagct ggagcggctg aagaaggacg 1020 gcgaggtgcg gggcagcatc aaccggttca agaccagcga ctacgtgaag gaggccaagc 1080 agctgctgaa ggtgcagaag gcctaccacc agctggacca gagcttcatc gacacctaca 1140 tcgacctgct ggagacccgg cggacctact acgagggccc cggcgagggc agccccttcg 1200 gctggaagga catcaaggag tggtacgaga tgctgatggg ccactgcacc tacttccccg 1260 aggagctgcg gagcgtgaag tacgcctaca acgccgacct gtacaacgcc ctgaacgacc 1320 tgaacaacct ggtgatcacc cgggacgaga acgagaagct ggagtactac gagaagttcc 1380 agatcatcga gaacgtgttc aagcagaaga agaagcccac cctgaagcag atcgccaagg 1440 agatcctggt gaacgaggag gacatcaagg gctaccgggt gaccagcacc ggcaagcccg 1500 agttcaccaa cctgaaggtg taccacgaca tcaaggacat caccgcccgg aaggagatca 1560 tcgagaacgc cgagctgctg gaccagatcg ccaagatcct gaccatctac cagagcagcg 1620 aggacatcca ggaggagctg accaacctga acagcgagct gacccaggag gagatcgagc 1680 agatcagcaa cctgaagggc tacaccggca cccacaacct gagcctgaag gccatcaacc 1740 tgatcctgga cgagctgtgg cacaccaacg acaaccagat cgccatcttc aaccggctga 1800 agctggtgcc caagaaggtg gacctgagcc agcagaagga gatccccacc accctggtgg 1860 acgacttcat cctgagcccc gtggtgaagc ggagcttcat ccagagcatc aaggtgatca 1920 acgccatcat caagaagtac ggcctgccca acgacatcat catcgagctg gcccgggaga 1980 agaacagcaa ggacgcccag aagatgatca acgagatgca gaagcggaac cggcagacca 2040 acgagcggat cgaggagatc atccggacca ccggcaagga gaacgccaag tacctgatcg 2100 agaagatcaa gctgcacgac atgcaggagg gcaagtgcct gtacagcctg gaggccatcc 2160 ccctggagga cctgctgaac aaccccttca actacgaggt ggacgccatc atcccccgga 2220 gcgtgagctt cgacaacagc ttcaacaaca aggtgctggt gaagcaggag gagaacagca 2280 agaagggcaa ccggaccccc ttccagtacc tgagcagcag cgacagcaag atcagctacg 2340 agaccttcaa gaagcacatc ctgaacctgg ccaagggcaa gggccggatc agcaagacca 2400 agaaggagta cctgctggag gagcgggaca tcaaccggtt cagcgtgcag aaggacttca 2460 tcaaccggaa cctggtggac acccggtacg ccacccgggg cctgatgaac ctgctgcgga 2520 gctacttccg ggtgaacaac ctggacgtga aggtgaaatc catcaacggc ggcttcacca 2580 gcttcctgcg gcggaagtgg aagttcaaga aggagcggaa caagggctac aagcaccacg 2640 ccgaggacgc cctgatcatc gccaacgccg acttcatctt caaggagtgg aagaagctgg 2700 acaaggccaa gaaggtgatg gagaaccaga tgttcgagga gaagcaggcc gagagcatgc 2760 ccgagatcga gaccgagcag gagtacaagg agatcttcat caccccccac cagatcaagc 2820 acatcaagga cttcaaggac tacaagtaca gccaccgggt ggacaagaag cccaaccgga 2880 agctgatcaa cgacaccctg tacagcaccc ggaaggacga caagggcaac accctgatcg 2940 tgaacaacct gaacggcctg tacgacaagg acaacgacaa gctgaagaag ctgatcaaca 3000 agagccccga gaagctgctg atgtaccacc acgaccccca gacctaccag aagctgaagc 3060 tgatcatgga gcagtacggc gacgagaaga accccctgta caagtactac gaggagaccg 3120 gcaactacct gaccaagtac agcaagaagg acaacggccc cgtgatcaag aagatcaagt 3180 actacggcaa caagctgaac gcccacctgg acatcaccga cgactacccc aacagccgga 3240 acaaggtggt gaagctgagc ctgaagccct accggttcga cgtgtacctg gacaacggcg 3300 tgtacaagtt cgtgaccgtg aagaacctgg acgtgatcaa gaaggagaac tactacgagg 3360 tgaacagcaa gtgctacgag gaggccaaga agctgaagaa gatcagcaac caggccgagt 3420 tcatcgccag cttctacaag aacgacctga tcaagatcaa cggcgagctg taccgggtga 3480 tcggcgtgaa caacgacctg ctgaaccgga tcgaggtgaa catgatcgac atcacctacc 3540 gggagtacct ggagaacatg aacgacaagc ggccccccca catcatcaag accatcgcca 3600 gcaagaccca gagcatcaag aagtacagca ccgacatcct gggcaacctg tacgaggtga 3660 aatccaagaa gcacccccag atcatcaaga agggcaagcg gcccgccgcc accaagaagg 3720 ccggccaggc caagaagaag aaggcccggg acagcaaggt ggagaacaag accaagaagc 3780 tgcgggtgtt cgaggccttc gccggcatcg gcgcccagcg gaaggccctg gagaaggtgc 3840 ggaaggacga gtacgagatc gtgggcctgg ccgagtggta cgtgcccgcc atcgtgatgt 3900 accaggccat ccacaacaac ttccacacca agctggagta caagagcgtg agccgggagg 3960 agatgatcga ctacctggag aacaagaccc tgagctggaa cagcaagaac cccgtgagca 4020 acggctactg gaagcggaag aaggacgacg agctgaagat catctacaac gccatcaagc 4080 tgagcgagaa ggagggcaac atcttcgaca tccgggacct gtacaagcgg accctgaaga 4140 acatcgacct gctgacctac agcttcccct gccaggacct gagccagcag ggcatccaga 4200 agggcatgaa gcggggcagc ggcacccgga gcggcctgct gtgggagatc gagcgggccc 4260 tggacagcac cgagaagaac gacctgccca agtacctgct gatggagaac gtgggcgccc 4320 tgctgcacaa gaagaacgag gaggagctga accagtggaa gcagaagctg gagagcctgg 4380 gctaccagaa cagcatcgag gtgctgaacg ccgccgactt cggcagcagc caggcccggc 4440 ggcgggtgtt catgatcagc accctgaacg agttcgtgga gctgcccaag ggcgacaaga 4500 agcccaagag catcaagaag gtgctgaaca agatcgtgag cgagaaggac atcctgaaca 4560 acctgctgaa gtacaacctg accgagttca agaaaaccaa gagcaacatc aacaaggcca 4620 gcctgatcgg ctacagcaag ttcaacagcg agggctacgt gtacgacccc gagttcaccg 4680 gccccaccct gaccgccagc ggcgccaaca gccggatcaa gatcaaggac ggcagcaaca 4740 tccggaagat gaacagcgac gagaccttcc tgtacatcgg cttcgacagc caggacggca 4800 agcgggtgaa cgagatcgag ttcctgaccg agaaccagaa gatcttcgtg tgcggcaaca 4860 gcatcagcgt ggaggtgctg gaggccatca tcgacaagat cggcggcccc agcagcggcg 4920 gcaagcggcc cgccgccacc aagaaggccg gccaggccaa gaagaagaag ggcagctacc 4980 cctacgacgt gcccgactac gcctgagcgg ccgcttaatt aagctgcctt ctgcggggct 5040 tgccttctgg ccatgccctt cttctctccc ttgcacctgt acctcttggt ctttgaataa 5100 agcctgagta ggaagtctag aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 5160 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa ttgtcttctt catcgcctgc 5220 agatcccaat ggcgcgccga gcttggctcg agcatggtca tagctgtttc ctgtgtgaaa 5280 ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt gtaaagcctg 5340 gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc ccgctttcca 5400 gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg 5460 tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg 5520 gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg 5580 ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa 5640 ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg 5700 acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc 5760 tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc 5820 ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc 5880 ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg 5940 ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc 6000 actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga 6060 gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaaga acagtatttg gtatctgcgc 6120 tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac 6180 caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg 6240 atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc 6300 acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa 6360 ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt ctgacagtta 6420 gaaaaactca tcgagcatca aatgaaactg caatttattc atatcaggat tatcaatacc 6480 atatttttga aaaagccgtt tctgtaatga aggagaaaac tcaccgaggc agttccatag 6540 gatggcaaga tcctggtatc ggtctgcgat tccgactcgt ccaacatcaa tacaacctat 6600 taatttcccc tcgtcaaaaa taaggttatc aagtgagaaa tcaccatgag tgacgactga 6660 atccggtgag aatggcaaaa gtttatgcat ttctttccag acttgttcaa caggccagcc 6720 attacgctcg tcatcaaaat cactcgcatc aaccaaaccg ttattcattc gtgattgcgc 6780 ctgagcgaga 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cacggcgtgc ccgccgccgc caagcggaac tacatcctgg 120 gcctggccat cggcatcacc agcgtgggct acggcatcat cgactacgag acccgggacg 180 tgatcgacgc cggcgtgcgg ctgttcaagg aggccaacgt ggagaacaac gagggccggc 240 ggagcaagcg gggcgcccgg cggctgaagc ggcggcggcg gcaccggatc cagcgggtga 300 agaagctgct gttcgactac aacctgctga ccgaccacag cgagctgagc ggcatcaacc 360 cctacgaggc ccgggtgaag ggcctgagcc agaagctgag cgaggaggag ttcagcgccg 420 ccctgctgca cctggccaag cggcggggcg tgcacaacgt gaacgaggtg gaggaggaca 480 ccggcaacga gctgagcacc aaggagcaga tcagccggaa cagcaaggcc ctggaggaga 540 agtacgtggc cgagctgcag ctggagcggc tgaagaagga cggcgaggtg cggggcagca 600 tcaaccggtt caagaccagc gactacgtga aggaggccaa gcagctgctg aaggtgcaga 660 aggcctacca ccagctggac cagagcttca tcgacaccta catcgacctg ctggagaccc 720 ggcggaccta ctacgagggc cccggcgagg gcagcccctt cggctggaag gacatcaagg 780 agtggtacga gatgctgatg ggccactgca cctacttccc cgaggagctg cggagcgtga 840 agtacgccta caacgccgac ctgtacaacg ccctgaacga cctgaacaac ctggtgatca 900 cccgggacga gaacgagaag ctggagtact acgagaagtt ccagatcatc gagaacgtgt 960 tcaagcagaa gaagaagccc accctgaagc agatcgccaa ggagatcctg gtgaacgagg 1020 aggacatcaa gggctaccgg gtgaccagca ccggcaagcc cgagttcacc aacctgaagg 1080 tgtaccacga catcaaggac atcaccgccc ggaaggagat catcgagaac gccgagctgc 1140 tggaccagat cgccaagatc ctgaccatct accagagcag cgaggacatc caggaggagc 1200 tgaccaacct gaacagcgag ctgacccagg aggagatcga gcagatcagc aacctgaagg 1260 gctacaccgg cacccacaac ctgagcctga aggccatcaa cctgatcctg gacgagctgt 1320 ggcacaccaa cgacaaccag atcgccatct tcaaccggct gaagctggtg cccaagaagg 1380 tggacctgag ccagcagaag gagatcccca ccaccctggt ggacgacttc atcctgagcc 1440 ccgtggtgaa gcggagcttc atccagagca tcaaggtgat caacgccatc atcaagaagt 1500 acggcctgcc caacgacatc atcatcgagc tggcccggga gaagaacagc aaggacgccc 1560 agaagatgat caacgagatg cagaagcgga accggcagac caacgagcgg atcgaggaga 1620 tcatccggac caccggcaag gagaacgcca agtacctgat cgagaagatc aagctgcacg 1680 acatgcagga gggcaagtgc ctgtacagcc tggaggccat ccccctggag gacctgctga 1740 acaacccctt caactacgag gtggacgcca tcatcccccg gagcgtgagc ttcgacaaca 1800 gcttcaacaa caaggtgctg gtgaagcagg aggagaacag caagaagggc aaccggaccc 1860 ccttccagta cctgagcagc agcgacagca agatcagcta cgagaccttc aagaagcaca 1920 tcctgaacct ggccaagggc aagggccgga tcagcaagac caagaaggag tacctgctgg 1980 aggagcggga catcaaccgg ttcagcgtgc agaaggactt catcaaccgg aacctggtgg 2040 acacccggta cgccacccgg ggcctgatga acctgctgcg gagctacttc cgggtgaaca 2100 acctggacgt gaaggtgaaa tccatcaacg gcggcttcac cagcttcctg cggcggaagt 2160 ggaagttcaa gaaggagcgg aacaagggct acaagcacca cgccgaggac gccctgatca 2220 tcgccaacgc cgacttcatc ttcaaggagt ggaagaagct ggacaaggcc aagaaggtga 2280 tggagaacca gatgttcgag gagaagcagg ccgagagcat gcccgagatc gagaccgagc 2340 aggagtacaa ggagatcttc atcacccccc accagatcaa gcacatcaag gacttcaagg 2400 actacaagta cagccaccgg gtggacaaga agcccaaccg gaagctgatc aacgacaccc 2460 tgtacagcac ccggaaggac gacaagggca acaccctgat cgtgaacaac ctgaacggcc 2520 tgtacgacaa ggacaacgac aagctgaaga agctgatcaa caagagcccc gagaagctgc 2580 tgatgtacca ccacgacccc cagacctacc agaagctgaa gctgatcatg gagcagtacg 2640 gcgacgagaa gaaccccctg tacaagtact acgaggagac cggcaactac ctgaccaagt 2700 acagcaagaa ggacaacggc cccgtgatca agaagatcaa gtactacggc aacaagctga 2760 acgcccacct ggacatcacc gacgactacc ccaacagccg gaacaaggtg gtgaagctga 2820 gcctgaagcc ctaccggttc gacgtgtacc tggacaacgg cgtgtacaag ttcgtgaccg 2880 tgaagaacct ggacgtgatc aagaaggaga actactacga ggtgaacagc aagtgctacg 2940 aggaggccaa gaagctgaag aagatcagca accaggccga gttcatcgcc agcttctaca 3000 agaacgacct gatcaagatc aacggcgagc tgtaccgggt gatcggcgtg aacaacgacc 3060 tgctgaaccg gatcgaggtg aacatgatcg acatcaccta ccgggagtac ctggagaaca 3120 tgaacgacaa gcggcccccc cacatcatca agaccatcgc cagcaagacc cagagcatca 3180 agaagtacag caccgacatc ctgggcaacc tgtacgaggt gaaatccaag aagcaccccc 3240 agatcatcaa gaagggcaag cggcccgccg ccaccaagaa ggccggccag gccaagaaga 3300 agaaggcccg ggacagcaag gtggagaaca agaccaagaa gctgcgggtg ttcgaggcct 3360 tcgccggcat cggcgcccag cggaaggccc tggagaaggt gcggaaggac gagtacgaga 3420 tcgtgggcct ggccgagtgg tacgtgcccg 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acggcagcaa catccggaag atgaacagcg 4320 acgagacctt cctgtacatc ggcttcgaca gccaggacgg caagcgggtg aacgagatcg 4380 agttcctgac cgagaaccag aagatcttcg tgtgcggcaa cagcatcagc gtggaggtgc 4440 tggaggccat catcgacaag atcggcggcc ccagcagcgg cggcaagcgg cccgccgcca 4500 ccaagaaggc cggccaggcc aagaagaaga agggcagcta cccctacgac gtgcccgact 4560 acgcctgagc ggccgcttaa ttaagctgcc ttctgcgggg cttgccttct ggccatgccc 4620 ttcttctctc ccttgcacct gtacctcttg gtctttgaat aaagcctgag taggaagtct 4680 agaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4740 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 4762 <210> 203 <211> 1506 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 203 Met Ala Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Ile His Gly Val Pro Ala 1 5 10 15 Ala Ala Lys Arg Asn Tyr Ile Leu Gly Leu Ala Ile Gly Ile Thr Ser 20 25 30 Val Gly Tyr Gly Ile Ile Asp Tyr Glu Thr Arg Asp Val Ile Asp Ala 35 40 45 Gly Val Arg Leu Phe Lys Glu Ala Asn Val Glu Asn Asn Glu Gly Arg 50 55 60 Arg 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ggagacccac cccgacagcg agaccgcctt cgagatcaag agcagcgtga 4980 gcggcggcaa gcggcccgcc gccaccaaga aggccggcca ggccaagaag aagaagggca 5040 gctaccccta cgacgtgccc gactacgcct gagcggccgc ttaattaagc tgccttctgc 5100 ggggcttgcc ttctggccat gcccttcttc tctcccttgc acctgtacct cttggtcttt 5160 gaataaagcc tgagtaggaa gtctagaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 5220 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaattgt cttcttcatc 5280 gcctgcagat cccaatggcg cgccgagctt ggctcgagca tggtcatagc tgtttcctgt 5340 gtgaaattgt tatccgctca caattccaca caacatacga gccggaagca taaagtgtaa 5400 agcctggggt gcctaatgag tgagctaact cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc 5460 tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag 5520 aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt 5580 cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga 5640 atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg 5700 taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa 5760 aaatcgacgc 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atcatgacat taacctataa aaataggcgt atcacgaggc cctttcgtc 7499 <210> 205 <211> 4828 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 205 aggaaataag agagaaaaga agagtaagaa gaaatataag agccaccatg gcccccaaga 60 agaagcggaa ggtgggcatc cacggcgtgc ccgccgccga caagaagtac agcatcggcc 120 tggccatcgg caccaacagc gtgggctggg ccgtgatcac cgacgagtac aaggtgccca 180 gcaagaagtt caaggtgctg ggcaacaccg accggcacag catcaagaag aacctgatcg 240 gcgccctgct gttcgacagc ggcgagaccg ccgaggccac ccggctgaag cggaccgccc 300 ggcggcggta cacccggcgg aagaaccgga tctgctacct gcaggagatc ttcagcaacg 360 agatggccaa ggtggacgac agcttcttcc accggctgga ggagagcttc ctggtggagg 420 aggacaagaa gcacgagcgg caccccatct tcggcaacat cgtggacgag gtggcctacc 480 acgagaagta ccccaccatc taccacctgc ggaagaagct ggtggacagc accgacaagg 540 ccgacctgcg gctgatctac ctggccctgg cccacatgat caagttccgg ggccacttcc 600 tgatcgaggg cgacctgaac cccgacaaca gcgacgtgga caagctgttc atccagctgg 660 tgcagaccta caaccagctg ttcgaggaga 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Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 206 Met Ala Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Ile His Gly Val Pro Ala 1 5 10 15 Ala Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Ala Ile Gly Thr Asn Ser Val 20 25 30 Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe 35 40 45 Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile 50 55 60 Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu 65 70 75 80 Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys 85 90 95 Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser 100 105 110 Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys 115 120 125 His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr 130 135 140 His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp 145 150 155 160 Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His 165 170 175 Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro 180 185 190 Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln 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aucugcuacc ugcaggagau cuucagcaac 360 gagauggcca agguggacga cagcuucuuc caccggcugg aggagagcuu ccugguggag 420 gaggacaaga agcacgagcg gcaccccauc uucggcaaca ucguggacga gguggccuac 480 cacgagaagu accccaccau cuaccaccug cggaagaagc ugguggacag caccgacaag 540 gccgaccugc ggcugaucua ccuggcccug gcccacauga ucaaguuccg gggccacuuc 600 cugaucgagg gcgaccugaa ccccgacaac agcgacgugg acaagcuguu cauccagcug 660 gugcagaccu acaaccagcu guucgaggag aaccccauca acgccagcgg cguggacgcc 720 aaggccaucc ugagcgcccg gcugagcaag agccggcggc uggagaaccu gaucgcccag 780 cugcccggcg agaagaagaa cggccuguuc ggcaaccuga ucgcccugag ccugggccug 840 acccccaacu ucaagagcaa cuucgaccug gccgaggacg ccaagcugca gcugagcaag 900 gacaccuacg acgacgaccu ggacaaccug cuggcccaga ucggcgacca guacgccgac 960 cuguuccugg ccgccaagaa ccugagcgac gccauccugc ugagcgacau ccugcgggug 1020 aacaccgaga ucaccaaggc cccccugagc gccagcauga ucaagcggua cgacgagcac 1080 caccaggacc ugacccugcu gaaggcccug gugcggcagc agcugcccga gaaguacaag 1140 gagaucuucu ucgaccagag caagaacggc uacgccggcu acaucgacgg cggcgccagc 1200 caggaggagu ucuacaaguu caucaagccc auccuggaga agauggacgg caccgaggag 1260 cugcugguga agcugaaccg ggaggaccug cugcggaagc agcggaccuu cgacaacggc 1320 agcauccccc accagaucca ccugggcgag cugcacgcca uccugcggcg gcaggaggac 1380 uucuaccccu uccugaagga caaccgggag aagaucgaga agauccugac cuuccggauc 1440 cccuacuacg ugggcccccu ggcccggggc aacagccggu ucgccuggau gacccggaaa 1500 uccgaggaga ccaucacccc cuggaacuuc gaggaggugg uggacaaggg cgccagcgcc 1560 cagagcuuca ucgagcggau gaccaacuuc gacaagaacc ugcccaacga gaaggugcug 1620 cccaagcaca gccugcugua cgaguacuuc accguguaca acgagcugac caaggugaag 1680 uacgugaccg agggcaugcg gaagcccgcc uuccugagcg gcgagcagaa gaaggccauc 1740 guggaccugc uguucaagac caaccggaag gugaccguga agcagcugaa ggaggacuac 1800 uucaagaaga ucgagugcuu cgacagcgug gagaucagcg gcguggagga ccgguucaac 1860 gccagccugg gcaccuacca cgaccugcug aagaucauca aggacaagga cuuccuggac 1920 aacgaggaga acgaggacau ccuggaggac aucgugcuga cccugacccu guucgaggac 1980 cgggagauga ucgaggagcg gcugaaaacc uacgcccacc 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uggagacccg gcagaucacc 2880 aagcacgugg cccagauccu ggacagccgg augaacacca aguacgacga gaacgacaag 2940 cugauccggg aggugaaggu gaucacccug aaauccaagc uggugagcga cuuccggaag 3000 gacuuccagu ucuacaaggu gcgggagauc aacaacuacc accacgccca cgacgccuac 3060 cugaacgccg uggugggcac cgcccugauc aagaaguacc ccaagcugga gagcgaguuc 3120 guguacggcg acuacaaggu guacgacgug cggaagauga ucgccaagag cgagcaggag 3180 aucggcaagg ccaccgccaa guacuucuuc uacagcaaca ucaugaacuu cuucaagacc 3240 gagaucaccc uggccaacgg cgagauccgg aagcggcccc ugaucgagac caacggcgag 3300 accggcgaga ucguguggga caagggccgg gacuucgcca ccgugcggaa ggugcugagc 3360 augccccagg ugaacaucgu gaagaaaacc gaggugcaga ccggcggcuu cagcaaggag 3420 agcauccugc ccaagcggaa cagcgacaag cugaucgccc ggaagaagga cugggacccc 3480 aagaaguacg gcggcuucga cagccccacc guggccuaca gcgugcuggu gguggccaag 3540 guggagaagg gcaagagcaa gaagcugaaa uccgugaagg agcugcuggg caucaccauc 3600 auggagcgga gcagcuucga gaagaacccc aucgacuucc uggaggccaa gggcuacaag 3660 gaggugaaga aggaccugau caucaagcug cccaaguaca 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acgacgugcg gaagaugauc gccaagagcg 5460 agcaggagau cggcaaggcc accgccaagu acuucuucua cagcaacauc augaacuucu 5520 ucaagaccga gaucacccug gccaacggcg agauccggaa gcggccccug aucgagacca 5580 acggcgagac cggcgagauc gugugggaca agggccggga cuucgccacc gugcggaagg 5640 ugcugagcau gccccaggug aacaucguga agaaaaccga ggugcagacc ggcggcuuca 5700 gcaaggagag cauccugccc aagcggaaca gcgacaagcu gaucgcccgg aagaaggacu 5760 gggaccccaa gaaguacggc ggcuucgaca gccccaccgu ggccuacagc gugcuggugg 5820 uggccaaggu ggagaagggc aagagcaaga agcugaaauc cgugaaggag cugcugggca 5880 ucaccaucau ggagcggagc agcuucgaga agaaccccau cgacuuccug gaggccaagg 5940 gcuacaagga ggugaagaag gaccugauca ucaagcugcc caaguacagc cuguucgagc 6000 uggagaacgg ccggaagcgg augcuggcca gcgccggcga gcugcagaag ggcaacgagc 6060 uggcccugcc cagcaaguac gugaacuucc uguaccuggc cagccacuac gagaagcuga 6120 agggcagccc cgaggacaac gagcagaagc agcuguucgu ggagcagcac aagcacuacc 6180 uggacgagau caucgagcag aucagcgagu ucagcaagcg ggugauccug gccgacgcca 6240 accuggacaa ggugcugagc gccuacaaca 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ggggccggcu gagccggaag cugaucaacg 2100 gcauccggga caagcagagc ggcaagacca uccuggacuu ccugaaaucc gacggcuucg 2160 ccaaccggaa cuucaugcag cugauccacg acgacagccu gaccuucaag gaggacaucc 2220 agaaggccca ggugagcggc cagggcgaca gccugcacga gcacaucgcc aaccuggccg 2280 gcagccccgc caucaagaag ggcauccugc agaccgugaa ggugguggac gagcugguga 2340 aggugauggg ccggcacaag cccgagaaca ucgugaucga gauggcccgg gagaaccaga 2400 ccacccagaa gggccagaag aacagccggg agcggaugaa gcggaucgag gagggcauca 2460 aggagcuggg cagccagauc cugaaggagc accccgugga gaacacccag cugcagaacg 2520 agaagcugua ccuguacuac cugcagaacg gccgggacau guacguggac caggagcugg 2580 acaucaaccg gcugagcgac uacgacgugg ccgccaucgu gccccagagc uuccugaagg 2640 acgacagcau cgacaacaag gugcugaccc ggagcgacaa ggcccggggc aagagcgaca 2700 acgugcccag cgaggaggug gugaagaaga ugaagaacua cuggcggcag cugcugaacg 2760 ccaagcugau cacccagcgg aaguucgaca accugaccaa ggccgagcgg ggcggccuga 2820 gcgagcugga caaggccggc uucaucaagc ggcagcuggu ggagacccgg cagaucacca 2880 agcacguggc ccagauccug gacagccgga ugaacaccaa guacgacgag aacgacaagc 2940 ugauccggga ggugaaggug aucacccuga aauccaagcu ggugagcgac uuccggaagg 3000 acuuccaguu cuacaaggug cgggagauca acaacuacca ccacgcccac gacgccuacc 3060 ugaacgccgu ggugggcacc gcccugauca agaaguaccc caagcuggag agcgaguucg 3120 uguacggcga cuacaaggug uacgacgugc ggaagaugau cgccaagagc gagcaggaga 3180 ucggcaaggc caccgccaag uacuucuucu acagcaacau caugaacuuc uucaagaccg 3240 agaucacccu ggccaacggc gagauccgga agcggccccu gaucgagacc aacggcgaga 3300 ccggcgagau cgugugggac aagggccggg acuucgccac cgugcggaag gugcugagca 3360 ugccccaggu gaacaucgug aagaaaaccg aggugcagac cggcggcuuc agcaaggaga 3420 gcauccugcc caagcggaac agcgacaagc ugaucgcccg gaagaaggac ugggacccca 3480 agaaguacgg cggcuucgac agccccaccg uggccuacag cgugcuggug guggccaagg 3540 uggagaaggg caagagcaag aagcugaaau ccgugaagga gcugcugggc aucaccauca 3600 uggagcggag cagcuucgag aagaacccca ucgacuuccu ggaggccaag ggcuacaagg 3660 aggugaagaa ggaccugauc aucaagcugc ccaaguacag ccuguucgag cuggagaacg 3720 gccggaagcg gaugcuggcc agcgccggcg agcugcagaa gggcaacgag cuggcccugc 3780 ccagcaagua cgugaacuuc cuguaccugg ccagccacua cgagaagcug aagggcagcc 3840 ccgaggacaa cgagcagaag cagcuguucg uggagcagca caagcacuac cuggacgaga 3900 ucaucgagca gaucagcgag uucagcaagc gggugauccu ggccgacgcc aaccuggaca 3960 aggugcugag cgccuacaac aagcaccggg acaagcccau ccgggagcag gccgagaaca 4020 ucauccaccu guucacccug accaaccugg gcgcccccgc cgccuucaag uacuucgaca 4080 ccaccaucga ccggaagcgg uacaccagca ccaaggaggu gcuggacgcc acccugaucc 4140 accagagcau caccggccug uacgagaccc ggaucgaccu gagccagcug ggcggcgaca 4200 gcgccggcgg cggcggcagc ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc ggccccaaga 4260 agaagcggaa gguggccgcc gccggcagca accacgacca ggaguucgac ccccccaagg 4320 uguacccccc cgugcccgcc gagaagcgga agcccauccg ggugcugagc cuguucgacg 4380 gcaucgccac cggccugcug gugcugaagg accugggcau ccagguggac cgguacaucg 4440 ccagcgaggu gugcgaggac agcaucaccg ugggcauggu gcggcaccag ggcaagauca 4500 uguacguggg cgacgugcgg agcgugaccc agaagcacau ccaggagugg ggccccuucg 4560 accuggugau cggcggcagc cccugcaacg 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gacaaccugc uggcccagau cggcgaccag uacgccgacc 960 uguuccuggc cgccaagaac cugagcgacg ccauccugcu gagcgacauc cugcggguga 1020 acaccgagau caccaaggcc ccccugagcg ccagcaugau caagcgguac gacgagcacc 1080 accaggaccu gacccugcug aaggcccugg ugcggcagca gcugcccgag aaguacaagg 1140 agaucuucuu cgaccagagc aagaacggcu acgccggcua caucgacggc ggcgccagcc 1200 aggaggaguu cuacaaguuc aucaagccca uccuggagaa gauggacggc accgaggagc 1260 ugcuggugaa gcugaaccgg gaggaccugc ugcggaagca gcggaccuuc gacaacggca 1320 gcauccccca ccagauccac cugggcgagc ugcacgccau ccugcggcgg caggaggacu 1380 ucuaccccuu ccugaaggac aaccgggaga agaucgagaa gauccugacc uuccggaucc 1440 ccuacuacgu gggcccccug gcccggggca acagccgguu cgccuggaug acccggaaau 1500 ccgaggagac caucaccccc uggaacuucg aggagguggu ggacaagggc gccagcgccc 1560 agagcuucau cgagcggaug accaacuucg acaagaaccu gcccaacgag aaggugcugc 1620 ccaagcacag ccugcuguac gaguacuuca ccguguacaa cgagcugacc aaggugaagu 1680 acgugaccga gggcaugcgg aagcccgccu uccugagcgg cgagcagaag aaggccaucg 1740 uggaccugcu guucaagacc aaccggaagg ugaccgugaa gcagcugaag gaggacuacu 1800 ucaagaagau cgagugcuuc gacagcgugg agaucagcgg cguggaggac cgguucaacg 1860 ccagccuggg caccuaccac gaccugcuga agaucaucaa ggacaaggac uuccuggaca 1920 acgaggagaa cgaggacauc cuggaggaca ucgugcugac ccugacccug uucgaggacc 1980 gggagaugau cgaggagcgg cugaaaaccu acgcccaccu guucgacgac aaggugauga 2040 agcagcugaa gcggcggcgg uacaccggcu ggggccggcu gagccggaag cugaucaacg 2100 gcauccggga caagcagagc ggcaagacca uccuggacuu ccugaaaucc gacggcuucg 2160 ccaaccggaa cuucaugcag cugauccacg acgacagccu gaccuucaag gaggacaucc 2220 agaaggccca ggugagcggc cagggcgaca gccugcacga gcacaucgcc aaccuggccg 2280 gcagccccgc caucaagaag ggcauccugc agaccgugaa ggugguggac gagcugguga 2340 aggugauggg ccggcacaag cccgagaaca ucgugaucga gauggcccgg gagaaccaga 2400 ccacccagaa gggccagaag aacagccggg agcggaugaa gcggaucgag gagggcauca 2460 aggagcuggg cagccagauc cugaaggagc accccgugga gaacacccag cugcagaacg 2520 agaagcugua ccuguacuac cugcagaacg gccgggacau guacguggac caggagcugg 2580 acaucaaccg gcugagcgac uacgacgugg ccgccaucgu gccccagagc uuccugaagg 2640 acgacagcau cgacaacaag gugcugaccc ggagcgacaa ggcccggggc aagagcgaca 2700 acgugcccag cgaggaggug gugaagaaga ugaagaacua cuggcggcag cugcugaacg 2760 ccaagcugau cacccagcgg aaguucgaca accugaccaa ggccgagcgg ggcggccuga 2820 gcgagcugga caaggccggc uucaucaagc ggcagcuggu ggagacccgg cagaucacca 2880 agcacguggc ccagauccug gacagccgga ugaacaccaa guacgacgag aacgacaagc 2940 ugauccggga ggugaaggug aucacccuga aauccaagcu ggugagcgac uuccggaagg 3000 acuuccaguu cuacaaggug cgggagauca acaacuacca ccacgcccac gacgccuacc 3060 ugaacgccgu ggugggcacc gcccugauca agaaguaccc caagcuggag agcgaguucg 3120 uguacggcga cuacaaggug uacgacgugc ggaagaugau cgccaagagc gagcaggaga 3180 ucggcaaggc caccgccaag uacuucuucu acagcaacau caugaacuuc uucaagaccg 3240 agaucacccu ggccaacggc gagauccgga agcggccccu gaucgagacc aacggcgaga 3300 ccggcgagau cgugugggac aagggccggg acuucgccac cgugcggaag gugcugagca 3360 ugccccaggu gaacaucgug aagaaaaccg aggugcagac cggcggcuuc agcaaggaga 3420 gcauccugcc caagcggaac agcgacaagc ugaucgcccg gaagaaggac ugggacccca 3480 agaaguacgg cggcuucgac agccccaccg uggccuacag cgugcuggug guggccaagg 3540 uggagaaggg caagagcaag aagcugaaau ccgugaagga gcugcugggc aucaccauca 3600 uggagcggag cagcuucgag aagaacccca ucgacuuccu ggaggccaag ggcuacaagg 3660 aggugaagaa ggaccugauc aucaagcugc ccaaguacag ccuguucgag cuggagaacg 3720 gccggaagcg gaugcuggcc agcgccggcg agcugcagaa gggcaacgag cuggcccugc 3780 ccagcaagua cgugaacuuc cuguaccugg ccagccacua cgagaagcug aagggcagcc 3840 ccgaggacaa cgagcagaag cagcuguucg uggagcagca caagcacuac cuggacgaga 3900 ucaucgagca gaucagcgag uucagcaagc gggugauccu ggccgacgcc aaccuggaca 3960 aggugcugag cgccuacaac aagcaccggg acaagcccau ccgggagcag gccgagaaca 4020 ucauccaccu guucacccug accaaccugg gcgcccccgc cgccuucaag uacuucgaca 4080 ccaccaucga ccggaagcgg uacaccagca ccaaggaggu gcuggacgcc acccugaucc 4140 accagagcau caccggccug uacgagaccc ggaucgaccu gagccagcug ggcggcgaca 4200 gcggcggcaa gcggcccgcc gccaccaaga aggccggcca ggccaagaag aagaagucgg 4260 gcgggggugg cucagaggag cccgaggagc ccgccgauag cggacaaucu cuggugcccg 4320 ucuacaucua cagccccgaa uaugugagca ugugugauuc ccucgccaag aucccuaaga 4380 gagccagcau ggugcauucu cugaucgagg ccuacgcucu gcauaagcaa augaggaucg 4440 ugaagcccaa ggucgccagc auggaagaga uggccaccuu ucacaccgau gccuaccucc 4500 aacaucucca gaaggugucc caagagggcg acgacgacca ccccgacucc auugaguacg 4560 gacugggcua ugauugcccc gccaccgagg gcaucuuuga cuaugccgcc gcuaucggcg 4620 gagcuaccau cacagccgcc cagugucuga uugauggcau gugcaagguc gccaucaacu 4680 gguccggagg cuggcaucau gccaagaagg augaggccuc cggcuucugu uaucugaaug 4740 acgccgugcu gggcauucug agacugagga ggaaauucga gaggauucug uacguggauc 4800 uggaucugca ucacggagau ggagucgaag augccuucag cuucaccagc aaggugauga 4860 cagucucucu gcacaaguuc ucccccggcu ucuuucccgg aaccggcgac guguccgacg 4920 ugggacuggg caagggaagg uacuacagcg ugaacgugcc cauucaagac ggcauccaag 4980 acgagaagua cuaccagauc ugcgaguccg ugcucaagga ggucuaccaa gccuucaauc 5040 cuaaggcugu cgugcuccaa cugggagcug auaccauugc uggcgauccc augugcagcu 5100 ucaauaugac acccgucgga aucggcaagu gccucaagua cauccuccag uggcagcucg 5160 ccacccucau ucucggagga ggcggauaca aucuggcuaa uaccgccaga ugcuggaccu 5220 aucugaccgg cgugauucug ggcaaaacac ugagcagcga aauccccgac cacgaguuuu 5280 ucaccgcuua cggccccgac uacgugcugg agaucacccc cagcugcaga cccgauagaa 5340 acgaacccca uagaauccag caaauucuga acuauaucaa gggcaaccuc aagcacgucg 5400 ugggaggugg cggaucggga aagcggcccg ccgccaccaa gaaggccggu caggccaaga 5460 agaagaaggg cagcuacccc uacgacgugc ccgacuacgc cugagcggcc gcuuaauuaa 5520 gcugccuucu gcggggcuug ccuucuggcc augcccuucu ucucucccuu gcaccuguac 5580 cucuuggucu uugaauaaag ccugaguagg aagucuagaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 5640 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 5698 <210> 214 <211> 1818 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 214 Met Ala Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Ile His Gly Val Pro Ala 1 5 10 15 Ala Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Ala Ile Gly Thr Asn Ser Val 20 25 30 Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp 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guggacgaca gcuucuucca ccggcuggag gagagcuucc 2700 ugguggagga ggacaagaag cacgagcggc accccaucuu cggcaacauc guggacgagg 2760 uggccuacca cgagaaguac cccaccaucu accaccugcg gaagaagcug guggacagca 2820 ccgacaaggc cgaccugcgg cugaucuacc uggcccuggc ccacaugauc aaguuccggg 2880 gccacuuccu gaucgagggc gaccugaacc ccgacaacag cgacguggac aagcuguuca 2940 uccagcuggu gcagaccuac aaccagcugu ucgaggagaa ccccaucaac gccagcggcg 3000 uggacgccaa ggccauccug agcgcccggc ugagcaagag ccggcggcug gagaaccuga 3060 ucgcccagcu gcccggcgag aagaagaacg gccuguucgg caaccugauc gcccugagcc 3120 ugggccugac ccccaacuuc aagagcaacu ucgaccuggc cgaggacgcc aagcugcagc 3180 ugagcaagga caccuacgac gacgaccugg acaaccugcu ggcccagauc ggcgaccagu 3240 acgccgaccu guuccuggcc gccaagaacc ugagcgacgc cauccugcug agcgacaucc 3300 ugcgggugaa caccgagauc accaaggccc cccugagcgc cagcaugauc aagcgguacg 3360 acgagcacca ccaggaccug acccugcuga aggcccuggu gcggcagcag cugcccgaga 3420 aguacaagga gaucuucuuc gaccagagca agaacggcua cgccggcuac aucgacggcg 3480 gcgccagcca ggaggaguuc uacaaguuca ucaagcccau ccuggagaag auggacggca 3540 ccgaggagcu gcuggugaag cugaaccggg aggaccugcu gcggaagcag cggaccuucg 3600 acaacggcag caucccccac cagauccacc ugggcgagcu gcacgccauc cugcggcggc 3660 aggaggacuu cuaccccuuc cugaaggaca accgggagaa gaucgagaag auccugaccu 3720 uccggauccc cuacuacgug ggcccccugg cccggggcaa cagccgguuc gccuggauga 3780 cccggaaauc cgaggagacc aucacccccu ggaacuucga ggagguggug gacaagggcg 3840 ccagcgccca gagcuucauc gagcggauga ccaacuucga caagaaccug cccaacgaga 3900 aggugcugcc caagcacagc cugcuguacg aguacuucac cguguacaac gagcugacca 3960 aggugaagua cgugaccgag ggcaugcgga agcccgccuu ccugagcggc gagcagaaga 4020 aggccaucgu ggaccugcug uucaagacca accggaaggu gaccgugaag cagcugaagg 4080 aggacuacuu caagaagauc gagugcuucg acagcgugga gaucagcggc guggaggacc 4140 gguucaacgc cagccugggc accuaccacg accugcugaa gaucaucaag gacaaggacu 4200 uccuggacaa cgaggagaac gaggacaucc uggaggacau cgugcugacc cugacccugu 4260 ucgaggaccg ggagaugauc gaggagcggc ugaaaaccua cgcccaccug uucgacgaca 4320 aggugaugaa gcagcugaag 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cagauccugg acagccggau gaacaccaag uacgacgaga 5220 acgacaagcu gauccgggag gugaagguga ucacccugaa auccaagcug gugagcgacu 5280 uccggaagga cuuccaguuc uacaaggugc gggagaucaa caacuaccac cacgcccacg 5340 acgccuaccu gaacgccgug gugggcaccg cccugaucaa gaaguacccc aagcuggaga 5400 gcgaguucgu guacggcgac uacaaggugu acgacgugcg gaagaugauc gccaagagcg 5460 agcaggagau cggcaaggcc accgccaagu acuucuucua cagcaacauc augaacuucu 5520 ucaagaccga gaucacccug gccaacggcg agauccggaa gcggccccug aucgagacca 5580 acggcgagac cggcgagauc gugugggaca agggccggga cuucgccacc gugcggaagg 5640 ugcugagcau gccccaggug aacaucguga agaaaaccga ggugcagacc ggcggcuuca 5700 gcaaggagag cauccugccc aagcggaaca gcgacaagcu gaucgcccgg aagaaggacu 5760 gggaccccaa gaaguacggc ggcuucgaca gccccaccgu ggccuacagc gugcuggugg 5820 uggccaaggu ggagaagggc aagagcaaga agcugaaauc cgugaaggag cugcugggca 5880 ucaccaucau ggagcggagc agcuucgaga agaaccccau cgacuuccug gaggccaagg 5940 gcuacaagga ggugaagaag gaccugauca ucaagcugcc caaguacagc cuguucgagc 6000 uggagaacgg ccggaagcgg 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cagcatccag cggggcagca 1920 agaagcacct gctgctggcc cccagcgacg tggccggctg gggcatcttc atcaaggacc 1980 ccgtgcagaa gaacgagttc atcagcgagt actgcggcga gatcatcagc caggacgagg 2040 ccgaccggcg gggcaaggtg tacgacaagt acatgtgcag cttcctgttc aacctgaaca 2100 acgacttcgt ggtggacgcc acccggaagg gcaacaagat ccggttcgcc aaccacagcg 2160 tgaaccccaa ctgctacgcc aaggtgatga tggtgaacgg cgaccaccgg atcggcatct 2220 tcgccaagcg ggccatccag accggcgagg agctgttctt cgactaccgg tacagccagg 2280 ccgacgccct gaagtacgtg ggcatcgagc gggagatgga gatccccggc agcagcggat 2340 ccctggagcc cggcgaaaag ccttacaagt gtcccgagtg cggaaagagc ttcagcagag 2400 ccgataatct gaccgagcac caaaggaccc acaccggaga gaagccttat aagtgtcccg 2460 aatgcggcaa aagcttttct agaagcgatc atctgaccaa ccaccagagg acacacaccg 2520 gagaaaaacc ttacaaatgc cccgagtgcg gcaaaagctt ctcccagagc agcaatctgg 2580 tgagacacca aaggacccac accggcgaaa aaccctataa atgccccgaa tgtggcaaga 2640 gctttagcac atccggcgag ctggtgaggc atcaaagaac acataccggc gagaagccct 2700 acaagtgccc cgagtgtgga aaaagcttca gcacccacct 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<220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 223 aggaaataag agagaaaaga agagtaagaa gaaatataag agccaccatg gcccccaaga 60 agaagcggaa ggtgggcggc agcggcggca gcggccagac cggcaagaag agcgagaagg 120 gccccgtgtg ctggcggaag cgggtgaaga gcgagtacat gcggctgcgg cagctgaagc 180 ggttccggcg ggccgacgag gtgaagagca tgttcagcag caaccggcag aagatcctgg 240 agcggaccga gatcctgaac caggagtgga agcagcggcg aatccagccc gtgcacatcc 300 tgaccagcgt gagcagcctg cggggcaccc gggagtgcag cgtgaccagc gacctggact 360 tccccaccca ggtgatcccc ctaaagaccc tgaacgccgt ggccagcgtg cccatcatgt 420 acagctggag ccccctgcag cagaacttca tggtggagga cgagaccgtg ctgcacaaca 480 tcccctacat gggcgacgag gtgctggacc aggacggcac cttcatcgag gagctgatca 540 agaactacga cggcaaggtg cacggcgacc gggagtgcgg cttcatcaac gacgagatct 600 tcgtggagct ggtgaacgcc ctgggccagt acaacgacga cgacgacgac gacgacggcg 660 acgaccccga ggagcgggag gagaagcaga aggacctgga ggaccaccgg gacgacaagg 720 agagccggcc cccccggaag ttccccagcg acaagatctt cgaggccatc agcagcatgt 780 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Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 224 aggaaataag agagaaaaga agagtaagaa gaaatataag agccaccatg gcccccaaga 60 agaagcggaa ggtgggcatc cacggcgtgc ccgccgcctc gggcgggggt ggctcaggaa 120 atagggctat cagaaccgag aagatcatct gtagggacgt ggctagaggc tacgagaacg 180 tgcccattcc ttgcgtgaat ggcgtggatg gcgaaccttg ccccgaggac tacaaataca 240 tctccgagaa ctgcgaaacc agcacaatga acatcgacag aaacatcacc cacctccagc 300 actgcacatg tgtggatgac tgctcctcca gcaactgtct gtgcggccag ctctccatca 360 gatgctggta cgacaaggac ggcagactgc tgcaagagtt caacaagatc gaaccccctc 420 tcatcttcga gtgtaaccaa gcttgcagct gctggagaaa ctgcaagaat agagtggtcc 480 agagcggcat caaggtgaga ctgcaactgt acagaaccgc caagatggga tggggagtga 540 gggctctgca aaccattccc caaggcacct tcatctgcga atacgtgggc gaactgatct 600 ccgacgccga agctgacgtg agagaggacg acagctatct cttcgatctg gacaataagg 660 acggcgaggt gtactgcatc gacgctagat attacggcaa catctctaga ttcatcaacc 720 acctctgcga tcccaacatc attcccgtga gggtgttcat gctgcaccaa gatctgaggt 780 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agcggcccgc cgccaccaag aaggccggcc aggccaagaa gaagaagggc agctacccct 1680 acgacgtgcc cgactacgcc tgagcggccg cttaattaag ctgccttctg cggggcttgc 1740 cttctggcca tgcccttctt ctctcccttg cacctgtacc tcttggtctt tgaataaagc 1800 ctgagtagga agtctagaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1860 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 1897 <210> 225 <211> 1897 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 225 aggaaataag agagaaaaga agagtaagaa gaaatataag agccaccatg gcccccaaga 60 agaagcggaa ggtgggcatc cacggcgtgc ccgccgcctc gggcgggggt ggctcaggaa 120 atagggctat cagaaccgag aagatcatct gtagggacgt ggctagaggc tacgagaacg 180 tgcccattcc ttgcgtgaat ggcgtggatg gcgaaccttg ccccgaggac tacaaataca 240 tctccgagaa ctgcgaaacc agcacaatga acatcgacag aaacatcacc cacctccagc 300 actgcacatg tgtggatgac tgctcctcca gcaactgtct gtgcggccag ctctccatca 360 gatgctggta cgacaaggac ggcagactgc tgcaagagtt caacaagatc gaaccccctc 420 tcatcttcga gtgtaaccaa gcttgcagct 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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 231 aggaaataag agagaaaaga agagtaagaa gaaatataag agccaccatg gcccccaaga 60 agaagcggaa ggtgggcatc cacggcgtgc ccgccgccgg cagcagcgga tccctggagc 120 ccggcgaaaa accctataag tgccccgagt gcggcaagag ctttagcgat cccggccatc 180 tggtgaggca tcagaggacc cacaccggcg aaaagcctta caaatgcccc gagtgtggaa 240 aaagcttcag cagaagcgat catctgacca cccatcagag gacacatacc ggcgagaagc 300 cttataaatg ccccgaatgt ggaaagagct tctccagaag cgaccatctg accaaccacc 360 agaggaccca taccggagaa aaaccttaca aatgccccga gtgtggaaag tccttcagct 420 cccccgccga tctgacaaga catcagagaa cccacaccgg cgaaaaacct tataaatgtc 480 ccgagtgtgg caaaagcttc tccgacaaga aggatctgac aagacaccaa aggacccaca 540 ccggcgagaa accttataaa tgtcccgaat gcggaaaaag ctttagcaga aacgacgctc 600 tgaccgaaca ccagagaaca cataccggag agaaacccta taaatgtccc gagtgcggaa 660 aatccttcag caccaccggc gctctgacag agcatcagag gacacacacc ggcaaaaaga 720 cctccgctag cggcagcggc ggcggcagcg gcggcaacca cgaccaggag ttcgaccccc 780 ccaaggtgta cccccccgtg cccgccgaga agcggaagcc catccgggtg ctgagcctgt 840 tcgacggcat cgccaccggc ctgctggtgc tgaaggacct gggcatccag gtggaccggt 900 acatcgccag cgaggtgtgc gaggacagca tcaccgtggg catggtgcgg caccagggca 960 agatcatgta cgtgggcgac gtgcggagcg tgacccagaa gcacatccag gagtggggcc 1020 ccttcgacct ggtgatcggc ggcagcccct gcaacgacct gagcatcgtg aaccccgccc 1080 ggaagggcct gtacgagggc accggccggc tgttcttcga gttctaccgg ctgctgcacg 1140 acgcccggcc caaggagggc gacgaccggc ccttcttctg gctgttcgag aacgtggtgg 1200 ccatgggcgt gagcgacaag cgggacatca gccggttcct ggagagcaac cccgtgatga 1260 tcgacgccaa ggaggtgagc gccgcccacc gggcccggta cttctggggc aacctgcccg 1320 gcatgaaccg gcccctggcc agcaccgtga acgacaagct ggagctgcag gagtgcctgg 1380 agcacggccg gatcgccaag ttcagcaagg tgcggaccat caccacccgg agcaacagca 1440 tcaagcaggg caaggaccag cacttccccg tgttcatgaa cgagaaggag gacatcctgt 1500 ggtgcaccga gatggagcgg gtgttcggct tccccgtgca ctacaccgac gtgagcaaca 1560 tgagccggct ggcccggcag cggctgctgg gccggagctg gagcgtgccc gtgatccggc 1620 acctgttcgc 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1380 gaaccggcga cgtgtccgac gtgggactgg gcaagggaag gtactacagc gtgaacgtgc 1440 ccattcaaga cggcatccaa gacgagaagt actaccagat ctgcgagtcc gtgctcaagg 1500 aggtctacca agccttcaat cctaaggctg tcgtgctcca actgggagct gataccattg 1560 ctggcgatcc catgtgcagc ttcaatatga cacccgtcgg aatcggcaag tgcctcaagt 1620 acatcctcca gtggcagctc gccaccctca ttctcggagg aggcggatac aatctggcta 1680 ataccgccag atgctggacc tatctgaccg gcgtgattct gggcaaaaca ctgagcagcg 1740 aaatccccga ccacgagttt ttcaccgctt acggccccga ctacgtgctg gagatcaccc 1800 ccagctgcag acccgataga aacgaacccc atagaatcca gcaaattctg aactatatca 1860 agggcaacct caagcacgtc gtgggaggtg gcggatcggg aaagcggccc gccgccacca 1920 agaaggccgg tcaggccaag aagaagaagg gcagctaccc ctacgacgtg cccgactacg 1980 cctgagcggc cgcttaatta agctgccttc tgcggggctt gccttctggc catgcccttc 2040 ttctctccct tgcacctgta cctcttggtc tttgaataaa gcctgagtag gaagtctaga 2100 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2160 aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 2179 <210> 233 <211> 3262 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 233 aggaaataag agagaaaaga agagtaagaa gaaatataag agccaccatg gcccccaaga 60 agaagcggaa ggtgggcggc agcggcggca gcggccagac cggcaagaag agcgagaagg 120 gccccgtgtg ctggcggaag cgggtgaaga gcgagtacat gcggctgcgg cagctgaagc 180 ggttccggcg ggccgacgag gtgaagagca tgttcagcag caaccggcag aagatcctgg 240 agcggaccga gatcctgaac caggagtgga agcagcggcg aatccagccc gtgcacatcc 300 tgaccagcgt gagcagcctg cggggcaccc gggagtgcag cgtgaccagc gacctggact 360 tccccaccca ggtgatcccc ctaaagaccc tgaacgccgt ggccagcgtg cccatcatgt 420 acagctggag ccccctgcag cagaacttca tggtggagga cgagaccgtg ctgcacaaca 480 tcccctacat gggcgacgag gtgctggacc aggacggcac cttcatcgag gagctgatca 540 agaactacga cggcaaggtg cacggcgacc gggagtgcgg cttcatcaac gacgagatct 600 tcgtggagct ggtgaacgcc ctgggccagt acaacgacga cgacgacgac gacgacggcg 660 acgaccccga ggagcgggag gagaagcaga aggacctgga ggaccaccgg gacgacaagg 720 agagccggcc cccccggaag ttccccagcg acaagatctt cgaggccatc 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Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 234 aggaaataag agagaaaaga agagtaagaa gaaatataag agccaccatg gcccccaaga 60 agaagcggaa ggtgggcggc agcggcggca gcggccagac cggcaagaag agcgagaagg 120 gccccgtgtg ctggcggaag cgggtgaaga gcgagtacat gcggctgcgg cagctgaagc 180 ggttccggcg ggccgacgag gtgaagagca tgttcagcag caaccggcag aagatcctgg 240 agcggaccga gatcctgaac caggagtgga agcagcggcg aatccagccc gtgcacatcc 300 tgaccagcgt gagcagcctg cggggcaccc gggagtgcag cgtgaccagc gacctggact 360 tccccaccca ggtgatcccc ctaaagaccc tgaacgccgt ggccagcgtg cccatcatgt 420 acagctggag ccccctgcag cagaacttca tggtggagga cgagaccgtg ctgcacaaca 480 tcccctacat gggcgacgag gtgctggacc aggacggcac cttcatcgag gagctgatca 540 agaactacga cggcaaggtg cacggcgacc gggagtgcgg cttcatcaac gacgagatct 600 tcgtggagct ggtgaacgcc ctgggccagt acaacgacga cgacgacgac gacgacggcg 660 acgaccccga ggagcgggag gagaagcaga aggacctgga ggaccaccgg gacgacaagg 720 agagccggcc cccccggaag ttccccagcg acaagatctt cgaggccatc agcagcatgt 780 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Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 235 aggaaataag agagaaaaga agagtaagaa gaaatataag agccaccatg gcccccaaga 60 agaagcggaa ggtgggcatc cacggcgtgc ccgccgccgg cagcagcgga tccctggagc 120 ccggcgaaaa accctataaa tgccccgagt gtggcaagag cttttccgac cccggacacc 180 tcgtgaggca tcagagaaca cataccggcg agaaacccta caagtgcccc gaatgcggca 240 aatccttctc tagaaaggac aatctgaaaa accatcaaag aacccatacc ggcgagaagc 300 cctataaatg tcccgagtgt ggaaagagct tcagccacaa gaacgctctg cagaaccatc 360 agaggaccca taccggcgaa aagccttata agtgccccga gtgcggaaaa tccttttcta 420 gaagggacga gctgaatgtg caccaaagga cacataccgg agagaaaccc tacaaatgcc 480 ccgagtgcgg caagtccttc agcacctccg gcaatctggt gaggcaccaa aggacacaca 540 ccggcgaaaa accttacaag tgtcccgagt gcggaaaaag cttttcccag aacagcacac 600 tgaccgaaca ccaaaggacc cacaccggag agaaacctta taaatgtccc gagtgtggaa 660 agtcctttag ccagtccggc aatctgacag agcatcaaag aacccacacc ggcaaaaaga 720 cctccgctag cggcagcggc ggcggcagcg gcggcgagga gcccgaggag cccgccgata 780 gcggacaatc tctggtgccc gtctacatct acagccccga atatgtgagc atgtgtgatt 840 ccctcgccaa gatccctaag agagccagca tggtgcattc tctgatcgag gcctacgctc 900 tgcataagca aatgaggatc gtgaagccca aggtcgccag catggaagag atggccacct 960 ttcacaccga tgcctacctc caacatctcc agaaggtgtc ccaagagggc gacgacgacc 1020 accccgactc cattgagtac ggactgggct atgattgccc cgccaccgag ggcatctttg 1080 actatgccgc cgctatcggc ggagctacca tcacagccgc ccagtgtctg attgatggca 1140 tgtgcaaggt cgccatcaac tggtccggag gctggcatca tgccaagaag gatgaggcct 1200 ccggcttctg ttatctgaat gacgccgtgc tgggcattct gagactgagg aggaaattcg 1260 agaggattct gtacgtggat ctggatctgc atcacggaga tggagtcgaa gatgccttca 1320 gcttcaccag caaggtgatg acagtctctc tgcacaagtt ctcccccggc ttctttcccg 1380 gaaccggcga cgtgtccgac gtgggactgg gcaagggaag gtactacagc gtgaacgtgc 1440 ccattcaaga cggcatccaa gacgagaagt actaccagat ctgcgagtcc gtgctcaagg 1500 aggtctacca agccttcaat cctaaggctg tcgtgctcca actgggagct gataccattg 1560 ctggcgatcc catgtgcagc ttcaatatga cacccgtcgg aatcggcaag tgcctcaagt 1620 acatcctcca gtggcagctc gccaccctca ttctcggagg aggcggatac aatctggcta 1680 ataccgccag atgctggacc tatctgaccg gcgtgattct gggcaaaaca ctgagcagcg 1740 aaatccccga ccacgagttt ttcaccgctt acggccccga ctacgtgctg gagatcaccc 1800 ccagctgcag acccgataga aacgaacccc atagaatcca gcaaattctg aactatatca 1860 agggcaacct caagcacgtc gtgggaggtg gcggatcggg aaagcggccc gccgccacca 1920 agaaggccgg tcaggccaag aagaagaagg gcagctaccc ctacgacgtg cccgactacg 1980 cctgagcggc cgcttaatta agctgccttc tgcggggctt gccttctggc catgcccttc 2040 ttctctccct tgcacctgta cctcttggtc tttgaataaa gcctgagtag gaagtctaga 2100 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2160 aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 2179 <210> 236 <211> 2668 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 236 aggaaataag agagaaaaga agagtaagaa gaaatataag agccaccatg gcccccaaga 60 agaagcggaa ggtgggcatc cacggcgtgc ccgccgccgg cagcagcgga tccctggagc 120 ccggcgaaaa gccttacaag tgtcccgagt gcggaaagag cttcagcaga gccgataatc 180 tgaccgagca ccaaaggacc cacaccggag agaagcctta taagtgtccc gaatgcggca 240 aaagcttttc tagaagcgat catctgacca accaccagag gacacacacc ggagaaaaac 300 cttacaaatg ccccgagtgc ggcaaaagct tctcccagag cagcaatctg gtgagacacc 360 aaaggaccca caccggcgaa aaaccctata aatgccccga atgtggcaag agctttagca 420 catccggcga gctggtgagg catcaaagaa cacataccgg cgagaagccc tacaagtgcc 480 ccgagtgtgg aaaaagcttc agcacccacc tcgatctgat cagacaccag aggacccata 540 ccggagagaa accctacaaa tgtcccgagt gcggaaagtc ctttagccag ctggcccatc 600 tgagagctca tcaaaggaca cacaccggcg agaagcctta caagtgtccc gagtgcggaa 660 aatccttctc ccaactggcc catctgaggg cccaccagag aacccacacc ggcaaaaaga 720 cctccgctag cggcagcggc ggcggcagcg gcggcaacca cgaccaggag ttcgaccccc 780 ccaaggtgta cccccccgtg cccgccgaga agcggaagcc catccgggtg ctgagcctgt 840 tcgacggcat cgccaccggc ctgctggtgc tgaaggacct gggcatccag gtggaccggt 900 acatcgccag cgaggtgtgc gaggacagca tcaccgtggg catggtgcgg caccagggca 960 agatcatgta cgtgggcgac gtgcggagcg tgacccagaa gcacatccag gagtggggcc 1020 ccttcgacct ggtgatcggc ggcagcccct gcaacgacct gagcatcgtg aaccccgccc 1080 ggaagggcct gtacgagggc accggccggc tgttcttcga gttctaccgg ctgctgcacg 1140 acgcccggcc caaggagggc gacgaccggc ccttcttctg gctgttcgag aacgtggtgg 1200 ccatgggcgt gagcgacaag cgggacatca gccggttcct ggagagcaac cccgtgatga 1260 tcgacgccaa ggaggtgagc gccgcccacc gggcccggta cttctggggc aacctgcccg 1320 gcatgaaccg gcccctggcc agcaccgtga acgacaagct ggagctgcag gagtgcctgg 1380 agcacggccg gatcgccaag ttcagcaagg tgcggaccat caccacccgg agcaacagca 1440 tcaagcaggg caaggaccag cacttccccg tgttcatgaa cgagaaggag gacatcctgt 1500 ggtgcaccga gatggagcgg gtgttcggct tccccgtgca ctacaccgac gtgagcaaca 1560 tgagccggct ggcccggcag cggctgctgg gccggagctg gagcgtgccc gtgatccggc 1620 acctgttcgc ccccctgaag gagtacttcg cctgcgtgag cagcggcaac agcaacgcca 1680 acagccgggg ccccagcttc agcagcggcc tggtgcccct gagcctgcgg ggcagccaca 1740 tgaatcctct ggagatgttc gagacagtgc ccgtgtggag aaggcaaccc gtgagggtgc 1800 tgagcctctt cgaggacatt aagaaggagc tgacctctct gggctttctg gaatccggca 1860 gcgaccccgg ccagctgaaa cacgtggtgg acgtgaccga cacagtgagg aaggacgtgg 1920 aagagtgggg cccctttgac ctcgtgtatg gagccacacc tcctctcggc cacacatgcg 1980 ataggcctcc cagctggtat ctcttccagt tccacagact gctccagtac gccagaccta 2040 agcccggcag ccccagaccc ttcttctgga tgttcgtgga caatctggtg ctgaacaagg 2100 aggatctgga tgtggccagc agatttctgg agatggaacc cgtgacaatc cccgacgtgc 2160 atggcggctc tctgcagaac gccgtgagag tgtggtccaa catccccgcc attagaagca 2220 gacactgggc tctggtgagc gaggaggaac tgtctctgct ggcccagaat aagcagtcct 2280 ccaagctggc cgccaagtgg cccaccaagc tggtgaagaa ctgctttctg cctctgaggg 2340 agtatttcaa gtatttcagc accgaactga ccagcagcct gagcggcggc aagcggcccg 2400 ccgccaccaa gaaggccggc caggccaaga agaagaaggg cagctacccc tacgacgtgc 2460 ccgactacgc ctgagcggcc gcttaattaa gctgccttct gcggggcttg ccttctggcc 2520 atgcccttct tctctccctt gcacctgtac ctcttggtct ttgaataaag cctgagtagg 2580 aagtctagaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2640 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 2668 <210> 237 <211> 2668 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 237 aggaaataag agagaaaaga agagtaagaa gaaatataag agccaccatg gcccccaaga 60 agaagcggaa ggtgggcatc cacggcgtgc ccgccgccgg cagcagcgga tccctggagc 120 ccggagaaaa gccttacaaa tgccccgagt gcggcaagtc cttcagccag ctggctcatc 180 tgagagctca tcaaaggacc cacaccggcg agaagcccta taagtgcccc gagtgcggaa 240 aatccttctc ccagagcagc aatctcgtca gacaccagag gacccacacc ggcgagaaac 300 cttacaagtg tcccgaatgt ggaaagtcct tctcccaaaa gagctctctg atcgcccatc 360 agagaacaca taccggcgaa aaaccctaca agtgccccga gtgtggcaaa agcttttcca 420 ccaccggcaa tctgaccgtg catcaaagaa cccacaccgg cgaaaaaccc tacaaatgcc 480 ccgagtgtgg caaatccttc tccgaccccg gccatctggt gaggcaccag aggacacaca 540 ccggcgagaa accttataaa tgtcccgaat gcggcaagtc ctttagcacc agcggctctc 600 tggtgagaca tcagaggaca cataccggcg aaaagcctta caagtgtccc gagtgtggca 660 aaagcttcag ccagaacagc acactgacag agcatcagag aacccatacc ggcaaaaaga 720 ccagcgctag cggcagcggc ggcggcagcg gcggcaacca cgaccaggag ttcgaccccc 780 ccaaggtgta cccccccgtg cccgccgaga agcggaagcc catccgggtg ctgagcctgt 840 tcgacggcat cgccaccggc ctgctggtgc tgaaggacct gggcatccag gtggaccggt 900 acatcgccag cgaggtgtgc gaggacagca tcaccgtggg catggtgcgg caccagggca 960 agatcatgta cgtgggcgac gtgcggagcg tgacccagaa gcacatccag gagtggggcc 1020 ccttcgacct ggtgatcggc ggcagcccct gcaacgacct gagcatcgtg aaccccgccc 1080 ggaagggcct gtacgagggc accggccggc tgttcttcga gttctaccgg ctgctgcacg 1140 acgcccggcc caaggagggc gacgaccggc ccttcttctg gctgttcgag aacgtggtgg 1200 ccatgggcgt gagcgacaag cgggacatca gccggttcct ggagagcaac cccgtgatga 1260 tcgacgccaa ggaggtgagc gccgcccacc gggcccggta cttctggggc aacctgcccg 1320 gcatgaaccg gcccctggcc agcaccgtga acgacaagct ggagctgcag gagtgcctgg 1380 agcacggccg gatcgccaag ttcagcaagg tgcggaccat caccacccgg agcaacagca 1440 tcaagcaggg caaggaccag cacttccccg tgttcatgaa cgagaaggag gacatcctgt 1500 ggtgcaccga gatggagcgg gtgttcggct tccccgtgca ctacaccgac gtgagcaaca 1560 tgagccggct ggcccggcag cggctgctgg gccggagctg gagcgtgccc gtgatccggc 1620 acctgttcgc ccccctgaag gagtacttcg cctgcgtgag cagcggcaac agcaacgcca 1680 acagccgggg ccccagcttc agcagcggcc tggtgcccct gagcctgcgg ggcagccaca 1740 tgaatcctct ggagatgttc gagacagtgc ccgtgtggag aaggcaaccc gtgagggtgc 1800 tgagcctctt cgaggacatt aagaaggagc tgacctctct gggctttctg gaatccggca 1860 gcgaccccgg ccagctgaaa cacgtggtgg acgtgaccga cacagtgagg aaggacgtgg 1920 aagagtgggg cccctttgac ctcgtgtatg gagccacacc tcctctcggc cacacatgcg 1980 ataggcctcc cagctggtat ctcttccagt tccacagact gctccagtac gccagaccta 2040 agcccggcag ccccagaccc ttcttctgga tgttcgtgga caatctggtg ctgaacaagg 2100 aggatctgga tgtggccagc agatttctgg agatggaacc cgtgacaatc cccgacgtgc 2160 atggcggctc tctgcagaac gccgtgagag tgtggtccaa catccccgcc attagaagca 2220 gacactgggc tctggtgagc gaggaggaac tgtctctgct ggcccagaat aagcagtcct 2280 ccaagctggc cgccaagtgg cccaccaagc tggtgaagaa ctgctttctg cctctgaggg 2340 agtatttcaa gtatttcagc accgaactga ccagcagcct gagcggcggc aagcggcccg 2400 ccgccaccaa gaaggccggc caggccaaga agaagaaggg cagctacccc tacgacgtgc 2460 ccgactacgc ctgagcggcc gcttaattaa gctgccttct gcggggcttg ccttctggcc 2520 atgcccttct tctctccctt gcacctgtac ctcttggtct ttgaataaag cctgagtagg 2580 aagtctagaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2640 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 2668 <210> 238 <211> 2668 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 238 aggaaataag agagaaaaga agagtaagaa gaaatataag agccaccatg gcccccaaga 60 agaagcggaa ggtgggcatc cacggcgtgc ccgccgccgg cagcagcgga tccctggagc 120 ccggcgaaaa accctataaa tgccccgagt gtggcaagag cttttccgac cccggacacc 180 tcgtgaggca tcagagaaca cataccggcg agaaacccta caagtgcccc gaatgcggca 240 aatccttctc tagaaaggac aatctgaaaa accatcaaag aacccatacc ggcgagaagc 300 cctataaatg tcccgagtgt ggaaagagct tcagccacaa gaacgctctg cagaaccatc 360 agaggaccca taccggcgaa aagccttata agtgccccga gtgcggaaaa tccttttcta 420 gaagggacga gctgaatgtg caccaaagga cacataccgg agagaaaccc tacaaatgcc 480 ccgagtgcgg caagtccttc agcacctccg gcaatctggt gaggcaccaa aggacacaca 540 ccggcgaaaa accttacaag tgtcccgagt gcggaaaaag cttttcccag aacagcacac 600 tgaccgaaca ccaaaggacc cacaccggag agaaacctta taaatgtccc gagtgtggaa 660 agtcctttag ccagtccggc aatctgacag agcatcaaag aacccacacc ggcaaaaaga 720 cctccgctag cggcagcggc ggcggcagcg gcggcaacca cgaccaggag ttcgaccccc 780 ccaaggtgta cccccccgtg cccgccgaga agcggaagcc catccgggtg ctgagcctgt 840 tcgacggcat cgccaccggc ctgctggtgc tgaaggacct gggcatccag gtggaccggt 900 acatcgccag cgaggtgtgc gaggacagca tcaccgtggg catggtgcgg caccagggca 960 agatcatgta cgtgggcgac gtgcggagcg tgacccagaa gcacatccag gagtggggcc 1020 ccttcgacct ggtgatcggc ggcagcccct gcaacgacct gagcatcgtg aaccccgccc 1080 ggaagggcct gtacgagggc accggccggc tgttcttcga gttctaccgg ctgctgcacg 1140 acgcccggcc caaggagggc gacgaccggc ccttcttctg gctgttcgag aacgtggtgg 1200 ccatgggcgt gagcgacaag cgggacatca gccggttcct ggagagcaac cccgtgatga 1260 tcgacgccaa ggaggtgagc gccgcccacc gggcccggta cttctggggc aacctgcccg 1320 gcatgaaccg gcccctggcc agcaccgtga acgacaagct ggagctgcag gagtgcctgg 1380 agcacggccg gatcgccaag ttcagcaagg tgcggaccat caccacccgg agcaacagca 1440 tcaagcaggg caaggaccag cacttccccg tgttcatgaa cgagaaggag gacatcctgt 1500 ggtgcaccga gatggagcgg gtgttcggct tccccgtgca ctacaccgac gtgagcaaca 1560 tgagccggct ggcccggcag cggctgctgg gccggagctg gagcgtgccc gtgatccggc 1620 acctgttcgc ccccctgaag gagtacttcg cctgcgtgag cagcggcaac agcaacgcca 1680 acagccgggg ccccagcttc agcagcggcc tggtgcccct gagcctgcgg ggcagccaca 1740 tgaatcctct ggagatgttc gagacagtgc ccgtgtggag aaggcaaccc gtgagggtgc 1800 tgagcctctt cgaggacatt aagaaggagc tgacctctct gggctttctg gaatccggca 1860 gcgaccccgg ccagctgaaa cacgtggtgg acgtgaccga cacagtgagg aaggacgtgg 1920 aagagtgggg cccctttgac ctcgtgtatg gagccacacc tcctctcggc cacacatgcg 1980 ataggcctcc cagctggtat ctcttccagt tccacagact gctccagtac gccagaccta 2040 agcccggcag ccccagaccc ttcttctgga tgttcgtgga caatctggtg ctgaacaagg 2100 aggatctgga tgtggccagc agatttctgg agatggaacc cgtgacaatc cccgacgtgc 2160 atggcggctc tctgcagaac gccgtgagag tgtggtccaa catccccgcc attagaagca 2220 gacactgggc tctggtgagc gaggaggaac tgtctctgct ggcccagaat aagcagtcct 2280 ccaagctggc cgccaagtgg cccaccaagc tggtgaagaa ctgctttctg cctctgaggg 2340 agtatttcaa gtatttcagc accgaactga ccagcagcct gagcggcggc aagcggcccg 2400 ccgccaccaa gaaggccggc caggccaaga agaagaaggg cagctacccc tacgacgtgc 2460 ccgactacgc ctgagcggcc gcttaattaa gctgccttct gcggggcttg ccttctggcc 2520 atgcccttct tctctccctt gcacctgtac ctcttggtct ttgaataaag cctgagtagg 2580 aagtctagaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2640 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 2668 <210> 239 <211> 2668 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 239 aggaaataag agagaaaaga agagtaagaa gaaatataag agccaccatg gcccccaaga 60 agaagcggaa ggtgggcatc cacggcgtgc ccgccgccgg cagcagcgga tccctggagc 120 ccggcgaaaa gccttacaaa tgtcccgaat gcggaaagag cttcagcaga gccgacaatc 180 tgaccgaaca tcagagaacc cataccggag aaaaacctta caaatgtccc gagtgcggca 240 aaagcttctc ccaagccgga catctggcca 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gttctaccgg ctgctgcacg 1140 acgcccggcc caaggagggc gacgaccggc ccttcttctg gctgttcgag aacgtggtgg 1200 ccatgggcgt gagcgacaag cgggacatca gccggttcct ggagagcaac cccgtgatga 1260 tcgacgccaa ggaggtgagc gccgcccacc gggcccggta cttctggggc aacctgcccg 1320 gcatgaaccg gcccctggcc agcaccgtga acgacaagct ggagctgcag gagtgcctgg 1380 agcacggccg gatcgccaag ttcagcaagg tgcggaccat caccacccgg agcaacagca 1440 tcaagcaggg caaggaccag cacttccccg tgttcatgaa cgagaaggag gacatcctgt 1500 ggtgcaccga gatggagcgg gtgttcggct tccccgtgca ctacaccgac gtgagcaaca 1560 tgagccggct ggcccggcag cggctgctgg gccggagctg gagcgtgccc gtgatccggc 1620 acctgttcgc ccccctgaag gagtacttcg cctgcgtgag cagcggcaac agcaacgcca 1680 acagccgggg ccccagcttc agcagcggcc tggtgcccct gagcctgcgg ggcagccaca 1740 tgaatcctct ggagatgttc gagacagtgc ccgtgtggag aaggcaaccc gtgagggtgc 1800 tgagcctctt cgaggacatt aagaaggagc tgacctctct gggctttctg gaatccggca 1860 gcgaccccgg ccagctgaaa cacgtggtgg acgtgaccga cacagtgagg aaggacgtgg 1920 aagagtgggg cccctttgac ctcgtgtatg gagccacacc tcctctcggc cacacatgcg 1980 ataggcctcc cagctggtat ctcttccagt tccacagact gctccagtac gccagaccta 2040 agcccggcag ccccagaccc ttcttctgga tgttcgtgga caatctggtg ctgaacaagg 2100 aggatctgga tgtggccagc agatttctgg agatggaacc cgtgacaatc cccgacgtgc 2160 atggcggctc tctgcagaac gccgtgagag tgtggtccaa catccccgcc attagaagca 2220 gacactgggc tctggtgagc gaggaggaac tgtctctgct ggcccagaat aagcagtcct 2280 ccaagctggc cgccaagtgg cccaccaagc tggtgaagaa ctgctttctg cctctgaggg 2340 agtatttcaa gtatttcagc accgaactga ccagcagcct gagcggcggc aagcggcccg 2400 ccgccaccaa gaaggccggc caggccaaga agaagaaggg cagctacccc tacgacgtgc 2460 ccgactacgc ctgagcggcc gcttaattaa gctgccttct gcggggcttg ccttctggcc 2520 atgcccttct tctctccctt gcacctgtac ctcttggtct ttgaataaag cctgagtagg 2580 aagtctagaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2640 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 2668 <210> 240 <211> 2179 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 240 aggaaataag agagaaaaga agagtaagaa gaaatataag agccaccatg gcccccaaga 60 agaagcggaa ggtgggcatc cacggcgtgc ccgccgccgg cagcagcgga tccctggagc 120 ccggcgaaaa gccttacaag tgccccgagt gtggcaaatc ctttagcacc accggaaatc 180 tgaccgtcca ccagagaaca cataccggcg agaaacccta caagtgtccc gagtgcggca 240 aatccttcag ccagctggcc catctgagag cccatcaaag gacccatacc ggcgagaaac 300 cttacaagtg tcccgaatgt ggaaagtcct ttagcagccc cgccgatctg acaagacatc 360 aaagaaccca caccggcgag aagccctata aatgtcccga gtgtggaaag tccttcagcc 420 agagcggcaa tctgaccgag catcaaagaa cccataccgg cgaaaagccc tataagtgcc 480 ccgaatgcgg aaaaagcttc tccacaagcg gcgagctggt gagacaccaa aggacacata 540 ccggcgaaaa gccttataaa tgccccgagt gcggcaagag cttctctaga aaggacaatc 600 tgaagaacca ccaaagaaca cacaccggcg agaagcccta caaatgcccc gagtgcggca 660 agagctttag ccagtccagc aacctcgtga gacatcagag gacacatacc ggaaaaaaga 720 ccagcgctag cggcagcggc ggcggcagcg gcggcgagga gcccgaggag cccgccgata 780 gcggacaatc tctggtgccc gtctacatct acagccccga atatgtgagc atgtgtgatt 840 ccctcgccaa gatccctaag agagccagca tggtgcattc tctgatcgag gcctacgctc 900 tgcataagca aatgaggatc gtgaagccca aggtcgccag catggaagag atggccacct 960 ttcacaccga tgcctacctc caacatctcc agaaggtgtc ccaagagggc gacgacgacc 1020 accccgactc cattgagtac ggactgggct atgattgccc cgccaccgag ggcatctttg 1080 actatgccgc cgctatcggc ggagctacca tcacagccgc ccagtgtctg attgatggca 1140 tgtgcaaggt cgccatcaac tggtccggag gctggcatca tgccaagaag gatgaggcct 1200 ccggcttctg ttatctgaat gacgccgtgc tgggcattct gagactgagg aggaaattcg 1260 agaggattct gtacgtggat ctggatctgc atcacggaga tggagtcgaa gatgccttca 1320 gcttcaccag caaggtgatg acagtctctc tgcacaagtt ctcccccggc ttctttcccg 1380 gaaccggcga cgtgtccgac gtgggactgg gcaagggaag gtactacagc gtgaacgtgc 1440 ccattcaaga cggcatccaa gacgagaagt actaccagat ctgcgagtcc gtgctcaagg 1500 aggtctacca agccttcaat cctaaggctg tcgtgctcca actgggagct gataccattg 1560 ctggcgatcc catgtgcagc ttcaatatga cacccgtcgg aatcggcaag tgcctcaagt 1620 acatcctcca gtggcagctc gccaccctca ttctcggagg aggcggatac aatctggcta 1680 ataccgccag atgctggacc tatctgaccg gcgtgattct gggcaaaaca ctgagcagcg 1740 aaatccccga ccacgagttt ttcaccgctt acggccccga ctacgtgctg gagatcaccc 1800 ccagctgcag acccgataga aacgaacccc atagaatcca gcaaattctg aactatatca 1860 agggcaacct caagcacgtc gtgggaggtg gcggatcggg aaagcggccc gccgccacca 1920 agaaggccgg tcaggccaag aagaagaagg gcagctaccc ctacgacgtg cccgactacg 1980 cctgagcggc cgcttaatta agctgccttc tgcggggctt gccttctggc catgcccttc 2040 ttctctccct tgcacctgta cctcttggtc tttgaataaa gcctgagtag gaagtctaga 2100 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2160 aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 2179 <210> 241 <211> 2179 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 241 aggaaataag agagaaaaga agagtaagaa gaaatataag agccaccatg gcccccaaga 60 agaagcggaa ggtgggcatc cacggcgtgc ccgccgccgg cagcagcgga tccctggagc 120 ccggcgaaaa accctataag tgccccgagt gcggcaagag ctttagcgat cccggccatc 180 tggtgaggca tcagaggacc cacaccggcg aaaagcctta caaatgcccc gagtgtggaa 240 aaagcttcag cagaagcgat catctgacca cccatcagag gacacatacc ggcgagaagc 300 cttataaatg ccccgaatgt ggaaagagct tctccagaag cgaccatctg accaaccacc 360 agaggaccca taccggagaa aaaccttaca aatgccccga gtgtggaaag tccttcagct 420 cccccgccga tctgacaaga catcagagaa cccacaccgg cgaaaaacct tataaatgtc 480 ccgagtgtgg caaaagcttc tccgacaaga aggatctgac aagacaccaa aggacccaca 540 ccggcgagaa accttataaa tgtcccgaat gcggaaaaag ctttagcaga aacgacgctc 600 tgaccgaaca ccagagaaca cataccggag agaaacccta taaatgtccc gagtgcggaa 660 aatccttcag caccaccggc gctctgacag agcatcagag gacacacacc ggcaaaaaga 720 cctccgctag cggcagcggc ggcggcagcg gcggcgagga gcccgaggag cccgccgata 780 gcggacaatc tctggtgccc gtctacatct acagccccga atatgtgagc atgtgtgatt 840 ccctcgccaa gatccctaag agagccagca tggtgcattc tctgatcgag gcctacgctc 900 tgcataagca aatgaggatc gtgaagccca aggtcgccag catggaagag atggccacct 960 ttcacaccga tgcctacctc caacatctcc agaaggtgtc ccaagagggc gacgacgacc 1020 accccgactc cattgagtac ggactgggct atgattgccc cgccaccgag ggcatctttg 1080 actatgccgc cgctatcggc ggagctacca tcacagccgc ccagtgtctg attgatggca 1140 tgtgcaaggt cgccatcaac tggtccggag gctggcatca tgccaagaag gatgaggcct 1200 ccggcttctg ttatctgaat gacgccgtgc tgggcattct gagactgagg aggaaattcg 1260 agaggattct gtacgtggat ctggatctgc atcacggaga tggagtcgaa gatgccttca 1320 gcttcaccag caaggtgatg acagtctctc tgcacaagtt ctcccccggc ttctttcccg 1380 gaaccggcga cgtgtccgac gtgggactgg gcaagggaag gtactacagc gtgaacgtgc 1440 ccattcaaga cggcatccaa gacgagaagt actaccagat ctgcgagtcc gtgctcaagg 1500 aggtctacca agccttcaat cctaaggctg tcgtgctcca actgggagct gataccattg 1560 ctggcgatcc catgtgcagc ttcaatatga cacccgtcgg aatcggcaag tgcctcaagt 1620 acatcctcca gtggcagctc gccaccctca ttctcggagg aggcggatac aatctggcta 1680 ataccgccag atgctggacc tatctgaccg gcgtgattct gggcaaaaca ctgagcagcg 1740 aaatccccga ccacgagttt ttcaccgctt acggccccga ctacgtgctg gagatcaccc 1800 ccagctgcag acccgataga aacgaacccc atagaatcca gcaaattctg aactatatca 1860 agggcaacct caagcacgtc gtgggaggtg gcggatcggg aaagcggccc gccgccacca 1920 agaaggccgg tcaggccaag aagaagaagg gcagctaccc ctacgacgtg cccgactacg 1980 cctgagcggc cgcttaatta agctgccttc tgcggggctt gccttctggc catgcccttc 2040 ttctctccct tgcacctgta cctcttggtc tttgaataaa gcctgagtag gaagtctaga 2100 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2160 aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 2179 <210> 242 <211> 2179 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 242 aggaaataag agagaaaaga agagtaagaa gaaatataag agccaccatg gcccccaaga 60 agaagcggaa ggtgggcatc cacggcgtgc ccgccgccgg cagcagcgga tccctggagc 120 ccggcgaaaa gccttacaaa tgtcccgaat gcggaaagag cttcagcaga gccgacaatc 180 tgaccgaaca tcagagaacc cataccggag aaaaacctta caaatgtccc gagtgcggca 240 aaagcttctc ccaagccgga catctggcca gccaccaaag gacacatacc ggcgagaaac 300 cctacaagtg ccccgagtgc ggcaagtcct tctctagatc cgatgagctg gtcagacatc 360 agagaaccca taccggcgag aagccttata agtgccccga atgtggcaag tccttcagcc 420 agagagctca tctggagagg catcaaagaa cacacaccgg agagaaacct tacaagtgtc 480 ccgagtgtgg aaagagcttc tccagaaggg acgagctgaa cgtccaccaa agaacccata 540 ccggcgaaaa gccctataaa tgccccgagt gtggaaaatc cttttctaga tccgaccatc 600 tgacaaccca ccagaggacc cataccggag agaagcccta caaatgcccc gagtgtggaa 660 aaagcttctc tagaaacgat gctctgacag agcaccaaag gacccacacc ggcaaaaaga 720 ccagcgctag cggcagcggc ggcggcagcg gcggcgagga gcccgaggag cccgccgata 780 gcggacaatc tctggtgccc gtctacatct acagccccga atatgtgagc atgtgtgatt 840 ccctcgccaa gatccctaag agagccagca tggtgcattc tctgatcgag gcctacgctc 900 tgcataagca aatgaggatc gtgaagccca aggtcgccag catggaagag atggccacct 960 ttcacaccga tgcctacctc caacatctcc agaaggtgtc ccaagagggc gacgacgacc 1020 accccgactc cattgagtac ggactgggct atgattgccc cgccaccgag ggcatctttg 1080 actatgccgc cgctatcggc ggagctacca tcacagccgc ccagtgtctg attgatggca 1140 tgtgcaaggt cgccatcaac tggtccggag gctggcatca tgccaagaag gatgaggcct 1200 ccggcttctg ttatctgaat gacgccgtgc tgggcattct gagactgagg aggaaattcg 1260 agaggattct gtacgtggat ctggatctgc atcacggaga tggagtcgaa gatgccttca 1320 gcttcaccag caaggtgatg acagtctctc tgcacaagtt ctcccccggc ttctttcccg 1380 gaaccggcga cgtgtccgac gtgggactgg gcaagggaag gtactacagc gtgaacgtgc 1440 ccattcaaga cggcatccaa gacgagaagt actaccagat ctgcgagtcc gtgctcaagg 1500 aggtctacca agccttcaat cctaaggctg tcgtgctcca actgggagct gataccattg 1560 ctggcgatcc catgtgcagc ttcaatatga cacccgtcgg aatcggcaag tgcctcaagt 1620 acatcctcca gtggcagctc gccaccctca ttctcggagg aggcggatac aatctggcta 1680 ataccgccag atgctggacc tatctgaccg gcgtgattct gggcaaaaca ctgagcagcg 1740 aaatccccga ccacgagttt ttcaccgctt acggccccga ctacgtgctg gagatcaccc 1800 ccagctgcag acccgataga aacgaacccc atagaatcca gcaaattctg aactatatca 1860 agggcaacct caagcacgtc gtgggaggtg gcggatcggg aaagcggccc gccgccacca 1920 agaaggccgg tcaggccaag aagaagaagg gcagctaccc ctacgacgtg cccgactacg 1980 cctgagcggc cgcttaatta agctgccttc tgcggggctt gccttctggc catgcccttc 2040 ttctctccct tgcacctgta cctcttggtc tttgaataaa gcctgagtag gaagtctaga 2100 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2160 aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 2179 <210> 243 <211> 5 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Thrombin-sensitive sequence <400> 243 Cys Pro Arg Ser Cys 1 5 <210> 244 <211> 51 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Anchor sequence <400> 244 tggatgggag tgtgacagtg ctgccttctg accacaaggt ggggcttata c 51 <210> 245 <211> 51 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Anchor sequence <400> 245 gtataagccc caccttgtgg tcagaaggca gcactgtcac actcccatcc a 51 <210> 246 <211> 102 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Anchor sequence <400> 246 ttgttttcgg ctctagatgg cgccataagc ctatgtttac cttgactttt gcaaatggcc 60 atggcactgc ctgtcccata aggaggagga ccaaagggat ta 102 <210> 247 <211> 51 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Anchor sequence <400> 247 caaaagtcaa ggtaaacata ggcttatggc gccatctaga gccgaaaaca a 51

Claims (232)

  1. 세포에서 제1 유전자 및 제2 유전자의 발현을 감소시키는 방법으로서,
    세포를, 제1 유전자 및 제2 유전자의 발현을 감소시키기에 충분한 양으로 제1 앵커 서열 또는 제1 앵커 서열에 근접한 부위에 특이적으로 결합하는 표적화 모이어티를 포함하는 부위-특이적 파괴제와 접촉시키는 단계
    를 포함하며,
    제1 및 제2 유전자는 제1 앵커 서열 및 제2 앵커 서열을 포함하는 앵커 서열-매개 연접부 내에 있고,
    선택적으로 제1 유전자 및 제2 유전자는 전염증성 유전자이며,
    이에 의해 제1 유전자 및 제2 유전자의 발현을 감소시키는, 방법.
  2. 부위-특이적 파괴제로서,
    DNA-결합, 예를 들어 세포 내에서 제1 앵커 서열 또는 제1 앵커 서열의 근접부에 특이적으로 결합하는 표적화 모이어티
    를 포함하며,
    제1 앵커 서열은 제2 앵커 서열, 제1 유전자, 및 제2 유전자를 추가로 포함하는 앵커 서열-매개 연접부의 일부이고,
    선택적으로 제1 유전자 및 제2 유전자는 전염증성 유전자인, 부위-특이적 파괴제.
  3. 제2항에 있어서, 상기 제1 또는 제2 앵커 서열은 IL-8과 RASSF6 사이; IL-8 인핸서와 RASSF6 사이; CXCL1과 CXCL4 사이; CXCL2와 EPGN 사이; 또는 E2 인핸서와 EPGN 사이에 위치하는, 부위-특이적 파괴제.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 부위-특이적 파괴제는 이펙터 모이어티를 추가로 포함하는, 부위-특이적 파괴제.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적화 모이어티는 TAL 이펙터 분자, CRISPR/Cas 분자(예를 들어, 촉매적으로 비활성인 CRISPR/Cas 단백질), 징크 핑거 도메인, tetR 도메인, 메가뉴클레아제, 또는 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 부위-특이적 파괴제.
  6. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이펙터 모이어티는 본 명세서에 기재된 이펙터, 예를 들어 MQ1, DNMT1, DNMT3A1, DNMT3A2, DNMT3B1, DNMT3B2, DNMT3B3, DNMT3B4, DNMT3B5, DNMT3B6, DNMT3L, EZH2, HDAC8, KRAB, MeCP2, HP1, RBBP4, REST, FOG1, SUZ12, SETDB1, SETDB2, EHMT2(즉, G9A), EHMT1(즉, GLP), SUV39H1, HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC4, HDAC5, HDAC6, HDAC7, HDAC8, HDAC9, HDAC10, HDAC11, SIRT1, SIRT2, SIRT3, SIRT4, SIRT5, SIRT6, SIRT7, SIRT8, SIRT9, EZH1, SUV39H2, SETD8, SUV420H1, SUV420H2 또는 DNMT3, 또는 이들 중 임의의 것의 기능성 변이체 또는 단편을 포함하는, 부위-특이적 파괴제.
  7. 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이펙터 모이어티는 링커를 통해 표적화 모이어티에 연결된, 부위-특이적 파괴제.
  8. 제2항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이펙터 모이어티는 표적화 모이어티의 C-말단에 있는, 부위-특이적 파괴제.
  9. 제2항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이펙터 모이어티는 표적화 모이어티의 N-말단에 있는, 부위-특이적 파괴제.
  10. 제2항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이펙터 모이어티는 서열번호 10, 14, 16, 18, 66, 68 중 어느 하나로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열, 또는 상기 서열과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 상기 서열에 대해 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 상이한 위치를 갖는 서열에 의해 인코딩되는, 부위-특이적 파괴제.
  11. 제2항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이펙터 모이어티는 서열번호 11, 12, 13, 15, 17, 19, 67 중 어느 하나에 따른 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 상기 서열에 대해 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 상이한 위치를 갖는 서열을 포함하는, 부위-특이적 파괴제.
  12. 제2항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이펙터 모이어티는 MQ1 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편이며, 예를 들어 이펙터 모이어티는 서열번호 11 또는 12의 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 상기 서열에 대해 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 상이한 위치를 갖는 서열을 포함하고, 선택적으로 이펙터 모이어티는 표적화 모이어티의 C-말단에 있는, 부위-특이적 파괴제.
  13. 제2항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이펙터 모이어티는 KRAB 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편이며, 예를 들어 이펙터 모이어티는 서열번호 13의 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 상기 서열에 대해 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 상이한 위치를 갖는 서열을 포함하고, 선택적으로 이펙터 모이어티는 표적화 모이어티의 C-말단에 있는, 부위-특이적 파괴제.
  14. 제2항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이펙터 모이어티는 DNMT3a/3L 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편이며, 예를 들어 이펙터 모이어티는 서열번호 15의 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 상기 서열에 대해 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 상이한 위치를 갖는 서열을 포함하고, 선택적으로 이펙터 모이어티는 표적화 모이어티의 C-말단에 있는, 부위-특이적 파괴제.
  15. 제2항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이펙터 모이어티는 EZH2 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편이며, 예를 들어 이펙터 모이어티는 서열번호 17의 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 상기 서열에 대해 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 상이한 위치를 갖는 서열을 포함하는, 부위-특이적 파괴제.
  16. 제2항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이펙터 모이어티는 HDAC8 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편이며, 예를 들어 이펙터 모이어티는 서열번호 19의 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 상기 서열에 대해 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 상이한 위치를 갖는 서열을 포함하고, 선택적으로 이펙터 모이어티는 표적화 모이어티의 C-말단에 있는, 부위-특이적 파괴제.
  17. 제2항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이펙터 모이어티는 G9A 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편이며, 예를 들어 이펙터 모이어티는 서열번호 67의 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 적어도 80, 85, 90, 95, 99, 또는 100% 동일성을 갖거나, 상기 서열에 대해 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 상이한 위치를 갖는 서열을 포함하고, 선택적으로 이펙터 모이어티는 표적화 모이어티의 N-말단에 있는, 부위-특이적 파괴제.
  18. 제2항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 이펙터 모이어티를 추가로 포함하는, 부위-특이적 파괴제.
  19. 제18항에 있어서, 상기 표적화 모이어티는 제1 이펙터 모이어티와 제2 이펙터 모이어티 사이에 위치하는, 부위-특이적 파괴제.
  20. 제2항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이펙터 모이어티는 중합체, 예를 들어 올리고뉴클레오티드; 예를 들어 gRNA를 포함하는, 부위-특이적 파괴제.
  21. 제20항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 앵커 서열의 보체 또는 앵커 서열에 근접한 서열에 대한 보체를 포함하는 서열을 갖는, 부위-특이적 파괴제.
  22. 제2항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적화 모이어티는 gRNA, 예를 들어 서열번호 20 내지 62 중 임의의 서열의 적어도 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 뉴클레오티드를 포함하는 게놈 유전자좌에 결합하는 gRNA를 추가로 포함하며, gRNA는 서열번호 20 내지 62 중 임의의 서열의 적어도 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 뉴클레오티드를 포함하는 서열을 포함하는, 부위-특이적 파괴제.
  23. 제2항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적화 도메인은 CRISPR/Cas 분자, 예를 들어 촉매적으로 비활성인 CRISPR/Cas 단백질, 및 gRNA, 예를 들어 서열번호 20 내지 62 중 임의의 서열의 적어도 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 뉴클레오티드를 포함하는 게놈 유전자좌에 결합하는 gRNA를 포함하며, 예를 들어 gRNA는 서열번호 20 내지 62 중 임의의 서열의 적어도 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 뉴클레오티드를 포함하는 서열을 포함하고, 이펙터 모이어티는 DNMT3a/3l, MQ1, KRAB, G9A, HDAC8, 또는 EZH2로부터 선택되는 이펙터를 포함하는, 부위-특이적 파괴제.
  24. 제23항에 있어서, 상기 표적화 도메인은 CRISPR/Cas 분자, 예를 들어 촉매적으로 비활성인 CRISPR/Cas 단백질, 및 gRNA, 예를 들어 서열번호 20 내지 62 중 임의의 서열의 적어도 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 뉴클레오티드를 포함하는 게놈 유전자좌에 결합하는 gRNA를 포함하며, 예를 들어 gRNA는 서열번호 20 내지 62 중 임의의 서열의 적어도 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 뉴클레오티드를 포함하는 서열을 포함하고, 제1 이펙터 모이어티는 DNMT3a/3l, MQ1, KRAB, G9A, HDAC8, 또는 EZH2로부터 선택되는 이펙터를 포함하고, 제2 이펙터 모이어티는 DNMT3a/3l, MQ1, KRAB, G9A, HDAC8, 또는 EZH2로부터 선택되는 이펙터를 포함하는, 부위-특이적 파괴제.
  25. 제2항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적화 도메인은 서열번호 20 내지 62 중 임의의 서열의 적어도 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 뉴클레오티드를 포함하는 게놈 유전자좌에 결합하는, 부위-특이적 파괴제.
  26. 제2항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적화 도메인은 서열번호 20 내지 62 중 임의의 서열의 (예를 들어, 상류 또는 하류의) 50개 뉴클레오티드 내에 있는 게놈 유전자좌에 결합하는, 부위-특이적 파괴제.
  27. 제2항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적화 도메인은 서열번호 20 내지 62 중 임의의 서열의 (예를 들어, 상류 또는 하류의) 100개 뉴클레오티드 내에 있는 게놈 유전자좌에 결합하는, 부위-특이적 파괴제.
  28. 제2항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적화 도메인은 서열번호 20 내지 62 중 임의의 서열의 (예를 들어, 상류 또는 하류의) 200개 뉴클레오티드 내에 있는 게놈 유전자좌에 결합하는, 부위-특이적 파괴제.
  29. 제2항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적화 도메인은 서열번호 20 내지 62 중 임의의 서열의 (예를 들어, 상류 또는 하류의) 300개 뉴클레오티드 내에 있는 게놈 유전자좌에 결합하는, 부위-특이적 파괴제.
  30. 제2항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, (i) 하나 이상의 핵 국재화 신호 서열(NLS)을 포함하거나, (ii) NLS를 포함하지 않고, 선택적으로 NLS는 서열번호 63 및/또는 64의 아미노산 서열을 포함하는, 부위-특이적 파괴제.
  31. 제18항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및/또는 제2 이펙터 모이어티는 DNA 메틸트랜스퍼라제, 히스톤 메틸트랜스퍼라제, 히스톤 데아세틸라제, 히스톤 데메틸라제, 또는 히스톤 변형 복합체의 동원인자(recruiter)를 포함하는, 부위-특이적 파괴제.
  32. 제2항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ASMC는 2개의 루프를 포함하는, 부위-특이적 파괴제.
  33. 제2항 내지 제32항 중 어느 한 항의 부위-특이적 파괴제 또는 제1항의 방법에 있어서, 상기 제1 유전자는 ASMC의 제1 루프에 위치하고, 제2 유전자는 ASMC의 제2 루프에 위치하는, 부위-특이적 파괴제 또는 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 제1 앵커 서열은 제1 루프와 제2 루프 사이에 위치하는, 부위-특이적 파괴제 또는 방법.
  35. 제2항 내지 제34항 중 어느 한 항의 부위-특이적 파괴제를 인코딩하는 핵산.
  36. 제1항의 방법 또는 제2항 내지 제36항 중 어느 한 항의 부위-특이적 파괴제에 있어서, 상기 앵커 서열-매개 연접부는 제3 유전자를 추가로 포함하고, 선택적으로 상기 방법은 제3 유전자의 발현 감소를 초래하는, 방법 또는 부위-특이적 파괴제.
  37. 제36항에 있어서, 상기 앵커 서열-매개 연접부는 제4 유전자를 추가로 포함하고, 선택적으로 상기 방법은 제4 유전자의 발현 감소를 초래하는, 방법 또는 부위-특이적 파괴제.
  38. 제37항에 있어서, 상기 앵커 서열-매개 연접부는 제5 유전자를 추가로 포함하고, 선택적으로 상기 방법은 제5 유전자의 발현 감소를 초래하는, 방법 또는 부위-특이적 파괴제.
  39. 제38항에 있어서, 상기 앵커 서열-매개 연접부는 제6 유전자를 추가로 포함하고, 선택적으로 상기 방법은 제6 유전자의 발현 감소를 초래하는, 방법 또는 부위-특이적 파괴제.
  40. 제39항에 있어서, 상기 앵커 서열-매개 연접부는 제7 유전자를 추가로 포함하고, 선택적으로 상기 방법은 제7 유전자의 발현 감소를 초래하는, 방법 또는 부위-특이적 파괴제.
  41. 제40항에 있어서, 상기 앵커 서열-매개 연접부는 제8 유전자를 추가로 포함하고, 선택적으로 상기 방법은 제8 유전자의 발현 감소를 초래하는, 방법 또는 부위-특이적 파괴제.
  42. 제1 유전자 및 제2 유전자의 발현이 감소된 인간 세포로서,
    제1 유전자 및 제2 유전자는 전염증성 유전자이고,
    세포는 제1 유전자 및 제2 유전자를 포함하는 파괴된(예를 들어, 완전히 파괴된) 앵커 서열-매개 연접부를 포함하는, 인간 세포.
  43. 제42항에 있어서, 앵커 서열-매개 연접부에 포함되어 있는 앵커 서열에 대한 CTCF 결합이 감소된, 예를 들어 적어도 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100% 감소된, 인간 세포.
  44. 제42항 또는 제43항에 있어서, 제3 전염증성 유전자의 발현이 감소된, 인간 세포.
  45. 제44항에 있어서, 제4 전염증성 유전자의 발현이 감소된, 인간 세포.
  46. 제45항에 있어서, 제5 전염증성 유전자의 발현이 감소된, 인간 세포.
  47. 제46항에 있어서, 제6 전염증성 유전자의 발현이 감소된, 인간 세포.
  48. 제47항에 있어서, 제7 전염증성 유전자의 발현이 감소된, 인간 세포.
  49. 제48항에 있어서, 제8 전염증성 유전자의 발현이 감소된, 인간 세포.
  50. 제42항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, chr4:74595464-74595486, chr4:74595457-74595479, chr4:74595460-74595482, chr4:74595472-74595494, chr4:75000088-75000110, chr4:75000091-75000113, chr4:75000085-75000107, chr4:75000157-75000179, chr4:75000156-75000178, chr4:74595215-74595237, chr4:74595370-74595392, chr4:74595560-74595582, chr4:74595642-74595664, chr4:74595787-74595809, chr4:74528428-74528450, chr4:74528567-74528589, chr4:74528609-74528631, chr4:74789132-74789154, chr4:74789250-74789272, chr4:74789312-74789334, chr4:74964853-74964875, chr4:74964906-74964928, chr4:74965538-74965560, chr4:74965737-74965759, chr4:75000031-75000053, chr4:75000115-75000137, chr4:75000231-75000253, chr4:74975146-74975168, chr4:74975369-74975391, chr4:74976318-74976340, chr4:74570348-74570370, chr4:74570503-74570525, 또는 chr4:74570526-74570548에, 또는 상기 영역의 5, 10, 15, 20, 30, 40, 또는 50개 뉴클레오티드 내에 돌연변이를 포함하는, 인간 세포.
  51. 인간 세포로서, chr4:74595464-74595486, chr4:74595457-74595479, chr4:74595460-74595482, chr4:74595472-74595494, chr4:75000088-75000110, chr4:75000091-75000113, chr4:75000085-75000107, chr4:75000157-75000179, chr4:75000156-75000178, chr4:74595215-74595237, chr4:74595370-74595392, chr4:74595560-74595582, chr4:74595642-74595664, chr4:74595787-74595809, chr4:74528428-74528450, chr4:74528567-74528589, chr4:74528609-74528631, chr4:74789132-74789154, chr4:74789250-74789272, chr4:74789312-74789334, chr4:74964853-74964875, chr4:74964906-74964928, chr4:74965538-74965560, chr4:74965737-74965759, chr4:75000031-75000053, chr4:75000115-75000137, chr4:75000231-75000253, chr4:74975146-74975168, chr4:74975369-74975391, chr4:74976318-74976340, chr4:74570348-74570370, chr4:74570503-74570525, 또는 chr4:74570526-74570548에, 또는 상기 영역의 5, 10, 15, 20, 30, 40, 또는 50개 뉴클레오티드 내에 돌연변이를 포함하는 인간 세포.
  52. 제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 돌연변이는 (예를 들어, 1 내지 10개, 1 내지 9개, 1 내지 8개, 1 내지 7개, 1 내지 6개, 1 내지 5개, 1 내지 4개, 1 내지 3개, 또는 1 내지 2개의 뉴클레오티드의) 결실, 치환, 또는 삽입을 포함하는, 인간 세포.
  53. 제50항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이에 대한 CTCF 결합이 감소된, 예를 들어 파괴되지 않은 ASMC를 갖는 인간 세포와 비교하여 적어도 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100% 감소된, 인간 세포.
  54. 제42항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 유전자 및 제2 유전자의 발현은 파괴되지 않은 ASMC를 갖는 인간 세포와 비교하여 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 감소된, 인간 세포.
  55. 시스템으로서,
    제1 표적화 모이어티 및 선택적으로 제1 이펙터 모이어티를 포함하며, 앵커 서열-매개 연접부(ASMC)의 제1 앵커 서열에 특이적으로 결합하고, ASMC는 제1 유전자 및 제2 유전자를 포함하는, 제1 부위-특이적 파괴제, 및
    제2 표적화 모이어티 및 선택적으로 제2 이펙터 모이어티를 포함하며, ASMC의 제2 앵커 서열에 결합하는, 제2 부위-특이적 파괴제;
    를 포함하는 시스템.
  56. 제55항에 있어서, 상기 제1 앵커 서열은 IL-8과 RASSF6 사이; IL-8 인핸서와 RASSF6 사이; CXCL1과 CXCL4 사이; CXCL2와 EPGN 사이; 또는 E2 인핸서와 EPGN 사이에 있는, 시스템.
  57. 제55항 또는 제56항에 있어서, 상기 제2 앵커 서열은 IL-8과 RASSF6 사이; IL-8 인핸서와 RASSF6 사이; CXCL1과 CXCL4 사이; CXCL2와 EPGN 사이; 또는 E2 인핸서와 EPGN 사이에 있는, 시스템.
  58. 제55항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 앵커 서열은 IL-8 인핸서와 RASSF6 사이에 있고 제2 앵커 서열은 CXCL1과 CXCL4 사이에 있는, 시스템.
  59. 제55항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 앵커 서열은 IL-8 인핸서와 RASSF6 사이에 있고 제2 앵커 서열은 E2 인핸서와 EPGN 사이에 있는, 시스템.
  60. 제55항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 앵커 서열은 CXCL1과 CXCL4 사이에 있고 제2 앵커 서열은 E2 인핸서와 EPGN 사이에 있는, 시스템.
  61. 제55항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 부위-특이적 파괴제는 본 명세서에 기재된 부위-특이적 파괴제, 예를 들어 제2항 내지 제9항 중 어느 한 항의 부위-특이적 파괴제인, 시스템.
  62. 제55항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 부위-특이적 파괴제는 본 명세서에 기재된 부위-특이적 파괴제, 예를 들어 제2항 내지 제9항 중 어느 한 항의 부위-특이적 파괴제인, 시스템.
  63. 제55항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 표적화 모이어티 및 제2 표적화 모이어티는 각각 독립적으로 TAL 이펙터 분자, CRISPR/Cas 분자, 징크 핑거 도메인, tetR 도메인, 메가뉴클레아제, 또는 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 시스템.
  64. 제55항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 이펙터 및 제2 이펙터는 각각 독립적으로 본 명세서에 기재된 이펙터, 예를 들어 MQ1, EZH2, HDAC8, KRAB, G9A, 또는 DNMT3a/3l, 또는 이들 중 임의의 것의 기능성 변이체 또는 단편을 포함하는, 시스템.
  65. 제55항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 이펙터 및 제2 이펙터는 각각 독립적으로 SETDB1, SETDB2, EHMT2(즉, G9A), EHMT1(즉, GLP), SUV39H1, EZH2, EZH1, SUV39H2, SETD8, SUV420H1, SUV420H2, 또는 이들 중 임의의 것의 기능성 변이체 또는 단편으로부터 선택되는 단백질을 포함하는, 시스템.
  66. 제55항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 이펙터 및 제2 이펙터는 각각 독립적으로 HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC4, HDAC5, HDAC6, HDAC7, HDAC8, HDAC9, HDAC10, HDAC11, SIRT1, SIRT2, SIRT3, SIRT4, SIRT5, SIRT6, SIRT7, SIRT8, SIRT9, 또는 이들 중 임의의 것의 기능성 변이체 또는 단편으로부터 선택되는 단백질을 포함하는, 시스템.
  67. 제55항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 이펙터 및 제2 이펙터는 각각 독립적으로 MQ1, DNMT1, DNMT3A1, DNMT3A2, DNMT3B1, DNMT3B2, DNMT3B3, DNMT3B4, DNMT3B5, DNMT3B6, DNMT3L, DNMT3a/3l, 또는 이들 중 임의의 것의 기능성 변이체 또는 단편으로부터 선택되는 단백질을 포함하는, 시스템.
  68. 제55항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 이펙터 및 제2 이펙터는 각각 독립적으로 KRAB, MeCP2, HP1, RBBP4, REST, FOG1, SUZ12, 또는 이들 중 임의의 것의 기능성 변이체 또는 단편으로부터 선택되는 단백질을 포함하는, 시스템.
  69. 제55항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 이펙터 및 제2 이펙터는 각각 독립적으로 중합체, 예를 들어 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 시스템.
  70. 제55항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 올리고뉴클레오티드 및 제2 올리고뉴클레오티드는 동일한, 시스템.
  71. 제55항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 올리고뉴클레오티드 및 제2 올리고뉴클레오티드는 상이한, 시스템.
  72. 제55항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 올리고뉴클레오티드는 제1 앵커 서열의 보체 또는 제1 앵커 서열에 근접한 서열에 대한 보체를 포함하는 서열을 갖고, 제2 올리고뉴클레오티드는 제2 앵커 서열의 보체 또는 제2 앵커 서열에 근접한 서열에 대한 보체를 포함하는 서열을 갖는, 시스템.
  73. 제55항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 앵커 서열-매개 연접부는 제3 유전자를 추가로 포함하는, 시스템.
  74. 제55항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 앵커 서열-매개 연접부는 제4 유전자를 추가로 포함하는, 시스템.
  75. 제55항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 앵커 서열-매개 연접부는 제5 유전자를 추가로 포함하는, 시스템.
  76. 제55항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 앵커 서열-매개 연접부는 제6 유전자를 추가로 포함하는, 시스템.
  77. 제55항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 앵커 서열-매개 연접부는 제7 유전자를 추가로 포함하는, 시스템.
  78. 제55항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 앵커 서열-매개 연접부는 제8 유전자를 추가로 포함하는, 시스템.
  79. 제55항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ASMC는 2개의 루프를 포함하는, 시스템.
  80. 제55항 내지 제79항 중 어느 한 항의 시스템을 인코딩하는 핵산 조성물.
  81. 제80항에 있어서, 단일 핵산이 제1 부위-특이적 파괴제 및 제2 부위-특이적 파괴제를 둘 모두 인코딩하는, 핵산.
  82. 제81항에 있어서, 제1 핵산은 제1 부위-특이적 파괴제를 인코딩하고 제2 핵산은 제2 부위-특이적 파괴제를 인코딩하는, 핵산.
  83. 세포에서 제1 유전자 및 제2 유전자의 발현을 감소시키는 방법으로서, 세포를, 제80항 내지 제82항 중 어느 한 항에 따른 핵산 조성물의 제55항 내지 제79항 중 어느 한 항에 따른 시스템과 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  84. 제83항에 있어서, 상기 세포는 제1 부위-특이적 파괴제 및 제2 부위-특이적 파괴제와 동시에 접촉되는, 방법.
  85. 제83항에 있어서, 상기 세포는 제1 부위-특이적 파괴제 및 제2 부위-특이적 파괴제와 순차적으로 접촉되는, 방법.
  86. 제1항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 유전자는 CXCL1이고 제2 유전자는 CXCL2인, 방법, 인간 세포, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  87. 제1항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 유전자는 CXCL1이고 제2 유전자는 CXCL3인, 방법, 인간 세포, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  88. 제1항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 유전자는 CXCL1이고 제2 유전자는 IL-8인, 방법, 인간 세포, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  89. 제1항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 유전자는 CXCL1이고 제2 유전자는 CXCL4인, 방법, 인간 세포, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  90. 제1항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 유전자는 CXCL1이고 제2 유전자는 CXCL5인, 방법, 인간 세포, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  91. 제1항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 유전자는 CXCL1이고 제2 유전자는 CXCL6인, 방법, 인간 세포, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  92. 제1항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 유전자는 CXCL1이고 제2 유전자는 CXCL7인, 방법, 인간 세포, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  93. 제1항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 유전자는 CXCL2이고 제2 유전자는 CXCL3인, 방법, 인간 세포, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  94. 제1항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 유전자는 CXCL2이고 제2 유전자는 IL-8인, 방법, 인간 세포, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  95. 제1항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 유전자는 CXCL2이고 제2 유전자는 CXCL4인, 방법, 인간 세포, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  96. 제1항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 유전자는 CXCL2이고 제2 유전자는 CXCL4인, 방법, 인간 세포, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  97. 제1항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 유전자는 CXCL2이고 제2 유전자는 CXCL5인, 방법, 인간 세포, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  98. 제1항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 유전자는 CXCL2이고 제2 유전자는 CXCL6인, 방법, 인간 세포, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  99. 제1항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 유전자는 CXCL2이고 제2 유전자는 CXCL7인, 방법, 인간 세포, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  100. 제1항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 유전자는 CXCL3이고 제2 유전자는 IL-8인, 방법, 인간 세포, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  101. 제1항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 유전자는 CXCL3이고 제2 유전자는 CXCL4인, 방법, 인간 세포, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  102. 제1항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 유전자는 CXCL3이고 제2 유전자는 CXCL5인, 방법, 인간 세포, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  103. 제1항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 유전자는 CXCL3이고 제2 유전자는 CXCL6인, 방법, 인간 세포, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  104. 제1항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 유전자는 CXCL3이고 제2 유전자는 CXCL7인, 방법, 인간 세포, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  105. 제1항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 유전자는 CXCL4이고 제2 유전자는 CXCL5인, 방법, 인간 세포, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  106. 제1항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 유전자는 CXCL4이고 제2 유전자는 CXCL6인, 방법, 인간 세포, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  107. 제1항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 유전자는 CXCL4이고 제2 유전자는 CXCL7인, 방법, 인간 세포, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  108. 제1항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 유전자는 CXCL4이고 제2 유전자는 IL-8인, 방법, 인간 세포, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  109. 제1항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 유전자는 CXCL5이고 제2 유전자는 CXCL6인, 방법, 인간 세포, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  110. 제1항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 유전자는 CXCL5이고 제2 유전자는 CXCL7인, 방법, 인간 세포, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  111. 제1항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 유전자는 CXCL5이고 제2 유전자는 IL-8인, 방법, 인간 세포, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  112. 제1항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 유전자는 CXCL6이고 제2 유전자는 CXCL7인, 방법, 인간 세포, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  113. 제1항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 유전자는 CXCL6이고 제2 유전자는 IL-8인, 방법, 인간 세포, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  114. 제1항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 유전자는 CXCL7이고 제2 유전자는 IL-8인, 방법, 인간 세포, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  115. 제36항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 유전자는 CXCL1이고, 제2 유전자는 CXCL2이며, 제3 유전자는 CXCL3인, 방법, 인간 세포, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  116. 제36항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1, 제2, 및 제3 유전자는 CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, 또는 IL-8로부터 선택되는, 방법, 인간 세포, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  117. 제36항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1, 제2, 제3, 및 제4 유전자는 CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, 또는 IL-8로부터 선택되는, 방법, 인간 세포, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  118. 제36항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1, 제2, 제3, 제4, 및 제5 유전자는 CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, 또는 IL-8로부터 선택되는, 방법, 인간 세포, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  119. 제36항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 및 제6 유전자는 CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, 또는 IL-8로부터 선택되는, 방법, 인간 세포, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  120. 제36항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 및 제7 유전자는 CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, 또는 IL-8로부터 선택되는, 방법, 인간 세포, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  121. 제36항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 및 제8 유전자는 CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, 또는 IL-8인, 방법, 인간 세포, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  122. 제1항 내지 제121항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 유전자는 사이토카인인, 방법, 인간 세포, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  123. 제1항 내지 제122항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 유전자는 사이토카인인, 방법, 인간 세포, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  124. 제1항 내지 제123항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제3 유전자는 사이토카인인, 방법, 인간 세포, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  125. 제1항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제4 유전자는 사이토카인인, 방법, 인간 세포, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  126. 제1항 내지 제125항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제5 유전자는 사이토카인인, 방법, 인간 세포, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  127. 제1항 내지 제126항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제6 유전자는 사이토카인인, 방법, 인간 세포, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  128. 제1항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제7 유전자는 사이토카인인, 방법, 인간 세포, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  129. 제1항 내지 제128항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제8 유전자는 사이토카인인, 방법, 인간 세포, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  130. 제1항 내지 제129항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 앵커 서열-매개 연접부는 3, 4, 또는 5개의 전염증성 유전자를 포함하는, 방법, 인간 세포, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  131. 제1항 내지 제130항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 부위-특이적 파괴제는 서열번호 20 내지 62로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열, 또는 상기 서열과 적어도 90%, 95%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖거나, 상기 서열에 대해 1, 2, 3, 4, 또는 5개 이하의 상이한 위치를 갖는 서열을 포함하는 핵산(예를 들어, DNA 또는 RNA)을 포함하는, 방법, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  132. 제1항 내지 제131항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 부위-특이적 파괴제는 서열번호 21, 22, 24, 40으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열, 또는 상기 서열과 적어도 90%, 95%, 98%, 또는 99% 동일성을 갖거나, 상기 서열에 대해 1, 2, 3, 4, 또는 5개 이하의 상이한 위치를 갖는 서열을 포함하는 핵산(예를 들어, DNA 또는 RNA)을 포함하는, 방법, 부위-특이적 파괴제.
  133. 제1항 내지 제132항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 부위-특이적 파괴제는 표 4, 5, 6, 7로부터 선택되는 게놈 좌표를 갖는 영역과 적어도 부분적으로 중첩되는 서열, 또는 상기 영역의 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000개 뉴클레오티드 내에 있는 서열에 결합하는, 방법 또는 부위-특이적 파괴제.
  134. 제1항 내지 제133항 중 어느 한 항에 있어서, 예를 들어 실시예 2 내지 11에 기재된 바와 같이 측정될 때, 예를 들어 세포를 TNF-알파로 자극 시, 사이토카인, 예를 들어 케모카인의 수준의 감소를 초래하는, 방법.
  135. 제1항 내지 제134항 중 어느 한 항에 있어서, 예를 들어 실시예 2 내지 11에 기재된 바와 같이 측정될 때, 예를 들어 세포를 TNF-알파로 자극 시, 사이토카인(예를 들어, 케모카인)의 수준이 감소되는, 방법 또는 인간 세포.
  136. 제1항 내지 제135항 중 어느 한 항에 있어서, 예를 들어 실시예 2 또는 4 내지 11에 기재된 바와 같이 측정될 때, 예를 들어 세포를 TNF-알파로 자극 시, CXCL1, CXCL2, CXCL3, 및 IL8 중 하나 이상(예를 들어, 이들 중 2, 3개, 또는 모두)의 전사체 수준이 감소되는, 방법 또는 인간 세포.
  137. 제1항 내지 제136항 중 어느 한 항에 있어서, 예를 들어 세포를 TNF-알파로 자극 시, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, 및 IL8 중 하나 이상(예를 들어, 이들 중 2, 3개, 또는 모두)의 전사체 수준이 감소되는, 방법 또는 인간 세포.
  138. 제132항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 감소는 처리 전 수준 또는 파괴되지 않은 ASMC를 갖는 인간 세포와 비교하여 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%의 감소인, 방법 또는 인간 세포.
  139. 제1항 내지 제138항 중 어느 한 항에 있어서, 예를 들어 실시예 3에 기재된 바와 같이 측정될 때, 예를 들어 세포를 TNF-알파로 자극 시, CXCL1, CXCL2, CXCL3, 및 IL8 중 하나 이상(예를 들어, 이들 중 2, 3개, 또는 모두)의 단백질 수준(예를 들어, 분비된 단백질 수준)이 감소되는, 방법 또는 인간 세포.
  140. 제1항 내지 제139항 중 어느 한 항에 있어서, 예를 들어 세포를 TNF-알파로 자극 시, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, 및 IL8 중 하나 이상(예를 들어, 이들 중 2, 3개, 또는 모두)의 단백질 수준(예를 들어, 분비된 단백질 수준)이 감소되는, 방법 또는 인간 세포.
  141. 제140항에 있어서, 상기 감소는 처리 전 수준 또는 파괴되지 않은 ASMC를 갖는 인간 세포와 비교하여 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%의 감소인, 방법 또는 인간 세포.
  142. 제1항 내지 제141항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 앵커 서열에 대한 CTCF의 결합의 감소, 예를 들어 ChIP 및 정량적 PCR에 의해 측정될 때, 파괴되지 않은 ASMC를 갖는 인간 세포와 비교하여 결합의 완전한 손실 또는 적어도 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100%의 손실을 초래하는, 방법.
  143. 제1항 내지 제142항 중 어느 한 항에 있어서, 앵커 서열-매개 연접부의 파괴를 초래하는, 방법.
  144. 제1항 내지 제143항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포의 집단은 부위-특이적 파괴제와 접촉되고, 제1 앵커 서열은 집단에서 세포의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%에서 편집되는, 방법.
  145. 제1항 내지 제144항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효과(예를 들어, 사이토카인 수준의 감소)는 제1 유전자 또는 제2 유전자를 개별적으로 억제하는 효과와 비교하여 상가적 또는 상승적인, 방법.
  146. 제1항 내지 제145항 중 어느 한 항에 있어서, 발현은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 또는 14일, 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5주 동안 감소되는, 방법.
  147. 제1항 내지 제146항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 염증성 질환, 예를 들어 면역 매개 염증성 질환을 갖는 대상체의 세포인, 방법, 인간 세포, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  148. 제1항 내지 제147항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염증성 질환은 자가면역 장애, 예를 들어 류마티스 관절염인, 방법, 인간 세포, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  149. 제1항 내지 제148항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염증성 질환은 병원성 감염, 예를 들어 바이러스 감염, 예를 들어 SARS-CoV2 감염과 연관되는, 방법, 인간 세포, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  150. 제1항 내지 제149항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염증성 질환은 중복 감염, 예를 들어 2개 이상의 병원체에 의해, 예를 들어 바이러스 및 박테리아에 의해(예를 들어, SARS-CoV2 및 연쇄상구균폐렴에 의해), 예를 들어 바이러스 및 진균에 의해(예를 들어, SARS-CoV2 및 털곰팡이(mucormycosis)에 의해) 유발되는 감염과 연관된, 방법, 인간 세포, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  151. 제1항 내지 제150항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 류마티스 관절염, 염증성 관절염, 통풍, 천식, 호중구 천식, 호중구 피부병, 발 부종, 급성 호흡기 질환 증후군(ARDS), COVID-19, 건선, 염증성 장 질환, 감염(예를 들어, 병원균, 예를 들어 박테리아, 바이러스, 또는 진균에 의한 감염), 외상(예를 들어, 찰과상 또는 이물질), 방사선 또는 화학적 손상의 영향, 골관절염, 골관절염 관절 통증, 관절 통증, 염증성 통증, 급성 통증, 만성 통증, 방광염, 기관지염, 피부염, 피부병, 심혈관계 질환, 신경퇴행성 질환, 간 질환, 폐 질환, 신장 질환, 통증, 종창, 경직, 압통, 발적, 미열, 또는 질환 상태와 관련된 바이오마커(예를 들어, 사이토카인, 케모카인, 성장 인자, 면역 수용체, 감염 마커, 또는 염증성 마커)의 상승을 갖는 대상체의 세포인, 방법, 인간 세포, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  152. 제1항 내지 제151항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 류마티스 관절염, 건선, 또는 염증성 장 질환을 갖는 대상체의 세포인, 방법, 인간 세포, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  153. 제1항 내지 제152항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 류마티스 관절염, 통풍, 호중구 천식, 호중구 피부병, 급성 호흡기 질환 증후군(ARDS), 또는 COVID-19를 갖는 대상체의 세포인, 방법, 인간 세포, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  154. 제1항 내지 제153항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 앵커 서열-매개 연접부는 내부 인핸싱 서열을 포함하는, 방법, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  155. 제1항 내지 제154항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 유전자(및 선택적으로 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 또는 제8 유전자)는 제1 유전자와 동일한 방향으로 전사되는, 방법, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  156. 제1항 내지 제155항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 앵커 서열은 CTCF 결합 모티프, USF1 결합 모티프, YY1 결합 모티프, TAF3 결합 모티프, 또는 ZNF143 결합 모티프로부터 선택되는 결합 모티프를 포함하는, 방법, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  157. 제1항 내지 제156항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 앵커 서열은 CTCF 결합 모티프를 포함하는, 방법, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  158. 제1항 내지 제157항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 부위-특이적 파괴제는 세포 내에서 내인성 핵형성 폴리펩티드(예를 들어, CTCF, USF1, YY1, TAF3, 또는 ZNF143)의 결합과 경쟁하기에 충분한 친화도로 제1 앵커 서열 또는 이의 근접부에 특이적으로 결합하는, 방법, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  159. 제1항 내지 제158항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 부위-특이적 파괴제는 제1 앵커 서열 내의 또는 이에 근접한 하나 이상의 뉴클레오티드를 추가하거나, 결실시키거나, 치환하는, 방법, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  160. 제1항 내지 제159항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 부위-특이적 파괴제는 제1 CRISPR/Cas 단백질 및 제1 가이드 RNA를 포함하는 제1 CRISPR/Cas 분자를 포함하는 표적화 모이어티 또는 이펙터 모이어티를 포함하는, 방법 또는 부위-특이적 파괴제.
  161. 제1항 내지 제160항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 부위-특이적 파괴제는 제1 CRISPR/Cas 단백질 및 제1 가이드 RNA를 포함하는 제1 CRISPR/Cas 분자를 포함하는 제1 표적화 모이어티 또는 제1 이펙터 모이어티를 포함하고, 제2 부위-특이적 파괴제는 제2 CRISPR/Cas 단백질 및 제2 가이드 RNA를 포함하는 제2 CRISPR/Cas 분자를 포함하는 제2 표적화 모이어티 또는 제2 이펙터 모이어티를 포함하는, 방법 또는 시스템.
  162. 제1항 내지 제161항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 부위-특이적 파괴제는 TAL 이펙터 분자, CRISPR/Cas 분자, 징크 핑거 도메인, tetR 도메인, 메가뉴클레아제, 또는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 표적화 모이어티 또는 이펙터 모이어티를 포함하는, 방법 또는 부위-특이적 파괴제.
  163. 제1항 내지 제162항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 부위-특이적 파괴제는 TAL 이펙터 분자, CRISPR/Cas 분자, 징크 핑거 도메인, tetR 도메인, 메가뉴클레아제, 또는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제1 표적화 모이어티 또는 제1 이펙터 모이어티를 포함하고, 제2 부위-특이적 파괴제는 TAL 이펙터 분자, CRISPR/Cas 분자, 징크 핑거 도메인, tetR 도메인, 메가뉴클레아제, 또는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제2 표적화 모이어티 또는 제2 이펙터 모이어티를 포함하는, 방법 또는 시스템.
  164. 제1항 내지 제163항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 부위-특이적 파괴제는 히스톤 변형 기능성, 예를 들어 히스톤 메틸트랜스퍼라제, 히스톤 데메틸라제, 또는 히스톤 데아세틸라제 활성을 포함하는 이펙터 모이어티를 포함하는, 방법 또는 부위-특이적 파괴제.
  165. 제1항 내지 제164항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및/또는 제2 부위-특이적 파괴제는 히스톤 변형 기능성, 예를 들어 히스톤 메틸트랜스퍼라제, 히스톤 데메틸라제, 또는 히스톤 데아세틸라제 활성을 포함하는 이펙터 모이어티를 포함하는, 방법 또는 시스템.
  166. 제164항 또는 제165항에 있어서, 상기 이펙터 모이어티는 SETDB1, SETDB2, EHMT2(즉, G9A), EHMT1(즉, GLP), SUV39H1, EZH2, EZH1, SUV39H2, SETD8, SUV420H1, SUV420H2, 또는 이들 중 임의의 것의 기능성 변이체 또는 단편으로부터 선택되는 단백질을 포함하는, 방법, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  167. 제164항 또는 제165항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이펙터 모이어티는 HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC4, HDAC5, HDAC6, HDAC7, HDAC8, HDAC9, HDAC10, HDAC11, SIRT1, SIRT2, SIRT3, SIRT4, SIRT5, SIRT6, SIRT7, SIRT8, SIRT9, 또는 이들 중 임의의 것의 기능성 변이체 또는 단편으로부터 선택되는 단백질을 포함하는, 방법, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  168. 제164항 또는 제165항에 있어서, 상기 이펙터 모이어티는 EZH2 또는 이 중 임의의 것의 기능성 변이체 또는 단편을 포함하는, 방법, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  169. 제164항 또는 제165항에 있어서, 상기 이펙터 모이어티는 HDAC8 또는 이 중 임의의 것의 기능성 변이체 또는 단편을 포함하는, 방법, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  170. 제1항 내지 제169항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 부위-특이적 파괴제는 DNA 변형 기능성, 예를 들어 DNA 메틸트랜스퍼라제를 포함하는 이펙터 모이어티를 포함하는, 방법 또는 부위-특이적 파괴제.
  171. 제1항 내지 제170항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및/또는 제2 부위-특이적 파괴제는 DNA 변형 기능성, 예를 들어 DNA 메틸트랜스퍼라제를 포함하는 이펙터 모이어티를 포함하는, 방법 또는 시스템.
  172. 제170항 또는 제171항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이펙터 모이어티는 MQ1, DNMT1, DNMT3A1, DNMT3A2, DNMT3B1, DNMT3B2, DNMT3B3, DNMT3B4, DNMT3B5, DNMT3B6, DNMT3L, DNMT3a/3l, 또는 이들 중 임의의 것의 기능성 변이체 또는 단편으로부터 선택되는 단백질을 포함하는, 방법, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  173. 제170항 또는 제171항에 있어서, 상기 이펙터 모이어티는 MQ1 또는 이 중 임의의 것의 기능성 변이체 또는 단편을 포함하는, 방법, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  174. 제170항 또는 제171항에 있어서, 상기 이펙터 모이어티는 DNMT3(예를 들어, DNMT3a, DNMT3L, DNMT3a/3l, DNMT3B1, DNMT3B2, DNMT3B3, DNMT3B4, DNMT3B5, 또는 DNMT3B6) 또는 이들 중 임의의 것의 기능성 변이체 또는 단편을 포함하는, 방법, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  175. 제1항 내지 제174항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 부위-특이적 파괴제는 전사 리프레서를 포함하는 이펙터 모이어티를 포함하는, 방법 또는 부위-특이적 파괴제.
  176. 제1항 내지 제175항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및/또는 제2 부위-특이적 파괴제는 전사 리프레서를 포함하는 이펙터 모이어티를 포함하는, 방법 또는 부위-특이적 파괴제.
  177. 제175항 또는 제176항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이펙터 모이어티는 KRAB, MeCP2, HP1, RBBP4, REST, FOG1, SUZ12, 또는 이들 중 임의의 것의 기능성 변이체 또는 단편으로부터 선택되는 단백질을 포함하는, 방법, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  178. 제177항에 있어서, 상기 이펙터 모이어티는 KRAB 또는 이 중 임의의 것의 기능성 변이체 또는 단편을 포함하는, 방법, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  179. 제1항 내지 제178항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 부위-특이적 파괴제는 중합체를 포함하는, 방법 또는 부위-특이적 파괴제.
  180. 제1항 내지 제179항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및/또는 제2 부위-특이적 파괴제는 중합체를 포함하는, 방법 또는 시스템.
  181. 제179항 또는 제180항에 있어서, 상기 중합체는 폴리아미드를 포함하는, 방법, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  182. 제179항 또는 제180항에 있어서, 상기 중합체는 올리고뉴클레오티드인, 방법, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  183. 제182항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 제1 앵커 서열의 보체 또는 제1 앵커 서열에 근접한 서열에 대한 보체를 포함하는 서열을 갖는, 방법, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  184. 제182항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 제2 앵커 서열의 보체 또는 제2 앵커 서열에 근접한 서열에 대한 보체를 포함하는 서열을 갖는, 방법, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  185. 제182항 내지 제184항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 화학적 변형을 포함하는, 방법, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  186. 제179항 또는 제180항에 있어서, 상기 중합체는 펩티드 핵산인, 방법 또는 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  187. 제1항 내지 제186항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 부위-특이적 파괴제는 펩티드-핵산 믹스머(mixmer)를 포함하는, 방법, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  188. 제1항 내지 제187항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 부위-특이적 파괴제(예를 들어, 부위-특이적 파괴제의 표적화 모이어티 또는 이펙터 모이어티)는 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함하는, 방법, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  189. 제188항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 징크 핑거 폴리펩티드인, 방법, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  190. 제188항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN) 폴리펩티드이거나 이를 포함하는, 방법, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  191. 제1항 내지 제190항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 부위-특이적 파괴제는 소분자를 포함하는, 방법 또는 부위-특이적 파괴제.
  192. 제1항 내지 제191항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및/또는 제2 부위-특이적 파괴제는 소분자를 포함하는, 방법 또는 시스템.
  193. 제1항 내지 제192항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 부위-특이적 파괴제는 이펙터 모이어티, 예를 들어 후성유전학적 변형제, 예를 들어 DNA 메틸트랜스퍼라제, 히스톤 데아세틸라제, 또는 히스톤 메틸트랜스퍼라제를 추가로 포함하는, 방법 또는 부위-특이적 파괴제.
  194. 제1항 내지 제193항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및/또는 제2 부위-특이적 파괴제는 이펙터 모이어티, 예를 들어 후성유전학적 변형제, 예를 들어 DNA 메틸트랜스퍼라제, 히스톤 데아세틸라제, 또는 히스톤 메틸트랜스퍼라제를 추가로 포함하는, 방법 또는 시스템.
  195. 제1항 내지 제194항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 부위-특이적 파괴제는 융합 분자를 포함하는, 방법 또는 부위-특이적 파괴제.
  196. 제1항 내지 제195항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및/또는 제2 부위-특이적 파괴제는 융합 분자를 포함하는, 방법 또는 시스템.
  197. 제1항 내지 제196항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 부위-특이적 파괴제는, 예를 들어 융합 분자로서, CRISPR/Cas 분자를 포함하는 표적화 모이어티, 및 전사 리프레서를 포함하는 이펙터 모이어티를 포함하는, 방법 또는 부위-특이적 파괴제.
  198. 제1항 내지 제197항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및/또는 제2 부위-특이적 파괴제는, 예를 들어 융합 분자로서, CRISPR/Cas 분자를 포함하는 표적화 모이어티, 및 전사 리프레서를 포함하는 이펙터 모이어티를 포함하는, 방법 또는 시스템.
  199. 제198항에 있어서, 상기 표적화 모이어티는 dCas9를 포함하고 이펙터 모이어티는 KRAB 또는 이의 기능성 변이체 또는 부분을 포함하는, 방법 또는 부위-특이적 파괴제.
  200. 제1항 내지 제199항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및/또는 제2 표적화 모이어티는 dCas9를 포함하고 이펙터 모이어티는 KRAB 또는 이의 기능성 변이체 또는 부분을 포함하는, 방법 또는 시스템.
  201. 제1항 내지 제177항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 부위-특이적 파괴제는, 예를 들어 융합 분자로서, CRISPR/Cas 분자를 포함하는 표적화 모이어티, 및 히스톤 메틸트랜스퍼라제를 포함하는 이펙터 모이어티를 포함하는, 방법 또는 부위-특이적 파괴제.
  202. 제1항 내지 제201항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및/또는 제2 부위-특이적 파괴제는, 예를 들어 융합 분자로서, CRISPR/Cas 분자를 포함하는 표적화 모이어티, 및 히스톤 메틸트랜스퍼라제를 포함하는 이펙터 모이어티를 포함하는, 방법 또는 시스템.
  203. 제201항에 있어서, 상기 표적화 모이어티는 dCas9를 포함하고 이펙터 모이어티는 EZH2 또는 이의 기능성 변이체 또는 부분을 포함하는, 방법, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  204. 제1항 내지 제196항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 부위-특이적 파괴제는, 예를 들어 융합 분자로서, CRISPR/Cas 분자를 포함하는 표적화 모이어티, 및 DNA 메틸트랜스퍼라제를 포함하는 이펙터 모이어티를 포함하는, 방법, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  205. 제204항에 있어서, 상기 표적화 모이어티는 dCas9를 포함하고 이펙터 모이어티는 MQ1 또는 이의 기능성 변이체 또는 부분을 포함하는, 방법, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  206. 제203항에 있어서, 상기 표적화 모이어티는 dCas9를 포함하고 이펙터 모이어티는 DNMT3, 예를 들어 DNMT3a/3l 또는 이의 기능성 변이체 또는 부분을 포함하는, 방법, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  207. 제1항 내지 제206항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 부위-특이적 파괴제는, 예를 들어 융합 분자로서, CRISPR/Cas 분자를 포함하는 표적화 모이어티, 히스톤 메틸트랜스퍼라제를 포함하는 제1 이펙터 모이어티, 및 전사 리프레서를 포함하는 제2 이펙터 모이어티를 포함하는, 방법, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  208. 제207항에 있어서, 상기 표적화 모이어티는 dCas9를 포함하고, 제1 이펙터 모이어티는 EZH2 또는 이의 기능성 변이체 또는 부분을 포함하며, 제2 이펙터 모이어티는 KRAB 또는 이의 기능성 변이체 또는 부분을 포함하는, 방법, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  209. 제1항 내지 제208항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 부위-특이적 파괴제는, 예를 들어 융합 분자로서, CRISPR/Cas 분자를 포함하는 표적화 모이어티, 및 히스톤 데아세틸라제를 포함하는 이펙터 모이어티를 포함하는, 방법, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  210. 제209항에 있어서, 상기 표적화 모이어티는 dCas9를 포함하고 이펙터 모이어티는 HDAC8 또는 이의 기능성 변이체 또는 부분을 포함하는, 방법, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  211. 제1항 내지 제210항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 부위-특이적 파괴제는, 예를 들어 융합 분자로서, CRISPR/Cas 분자를 포함하는 표적화 모이어티, 히스톤 메틸트랜스퍼라제를 포함하는 제1 이펙터 모이어티, 및 히스톤 데아세틸라제를 포함하는 제2 이펙터 모이어티를 포함하는, 방법, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  212. 제211항에 있어서, 상기 표적화 모이어티는 dCas9를 포함하고, 제1 이펙터 모이어티는 EZH2 또는 이의 기능성 변이체 또는 부분을 포함하며, 제2 이펙터 모이어티는 HDAC8 또는 이의 기능성 변이체 또는 부분을 포함하는, 방법, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  213. 제195항 내지 제212항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 부위-특이적 파괴제는 서열번호 69, 71, 85, 201, 202, 204, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 또는 219 내지 242로부터 선택되는 핵산 서열, 이들 중 임의의 것의 상보적 또는 역상보적 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하거나, 이들 중 임의의 것과 적어도 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 방법, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  214. 제195항 내지 제213항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 부위-특이적 파괴제는 서열번호 70, 72, 82, 84, 86, 203, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 또는 218 중 어느 하나로부터 선택되거나, 서열번호 219 내지 242 중 어느 하나로부터 선택되는 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함하거나, 이들 중 임의의 것과 적어도 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 방법, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  215. 제1항 내지 제214항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 대상체 내에 위치한, 방법, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  216. 제1항 내지 제215항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 생체외에 있는, 방법, 부위-특이적 파괴제.
  217. 제1항 내지 제216항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 포유동물 세포, 예를 들어 인간 세포인, 방법 또는 부위-특이적 파괴제.
  218. 제1항 내지 제217항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 체세포인, 방법, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  219. 제1항 내지 제218항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 1차 세포인, 방법, 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템.
  220. 제1항 내지 제219항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접촉시키는 단계는 생체외에서 수행되는, 방법.
  221. 제220항에 있어서, 상기 접촉시키는 단계 전에, 대상체로부터 세포(예를 들어, 포유동물 세포)를 제거하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  222. 제220항 또는 제221항에 있어서, 상기 접촉시키는 단계 후에, (b) 세포(예를 들어, 포유동물 세포)를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  223. 제1항 내지 제222항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접촉시키는 단계는 부위-특이적 파괴제를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  224. 제223항에 있어서, 상기 부위-특이적 파괴제는 단일요법으로 투여되는, 방법.
  225. 제223항에 있어서, 상기 부위-특이적 파괴제는 제2 치료제와 조합하여 투여되는, 방법.
  226. 제1항 내지 제225항 중 어느 한 항의 세포(예를 들어, 인간 세포, 예를 들어 1차 인간 세포), 및 부위-특이적 파괴제, 또는 시스템을 포함하는 반응 혼합물.
  227. 염증성 장애를 갖는 대상체를 치료하는 방법으로서,
    염증성 장애를 치료하기에 충분한 양으로 제1항 내지 제226항 중 어느 한 항의 부위-특이적 파괴제, 시스템 또는 반응 혼합물을 대상체에게 투여하는 단계
    를 포함하며,
    이에 의해 염증성 장애를 치료하는, 방법.
  228. 제227항에 있어서, 상기 염증성 장애는 류마티스 관절염, 건선, 또는 염증성 장 질환인, 방법.
  229. 제227항 또는 제228항에 있어서, 상기 염증성 장애는 류마티스 관절염, 통풍, 호중구 천식, 호중구 피부병, 급성 호흡기 질환 증후군(ARDS), 또는 COVID-19인, 방법.
  230. 제227항 내지 제229항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염증성 장애는 자가면역 장애, 예를 들어 류마티스 관절염인, 방법.
  231. 제227항 내지 제229항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염증성 질환은 병원성 감염, 예를 들어 바이러스 감염, 예를 들어 SARS-CoV2 감염과 연관되는, 방법.
  232. 제227항 내지 제229항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염증성 질환은 중복 감염, 예를 들어 2개 이상의 병원체에 의해, 예를 들어 바이러스 및 박테리아에 의해(예를 들어, SARS-CoV2 및 연쇄상구균폐렴에 의해), 예를 들어 바이러스 및 진균에 의해(예를 들어, SARS-CoV2 및 털곰팡이에 의해) 유발되는 감염과 연관된, 방법.
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