JP2023540388A - アゼチジン置換化合物の結晶形 - Google Patents

Abstract

式（Ｉ）に示すアゼチジン置換化合物の結晶形及びその調製方法であって、がん治療薬の調製における前記結晶形の使用をさらに含む。【化１】JPEG2023540388000032.jpg61170

Description

本願は次のような優先権を主張する：
ＣＮ２０２０１０９５２６９２．５号、出願日２０２０年０９月１１日。

本発明は、アゼチジン置換化合物の結晶形及びその調製方法に関し、前記結晶形の、がん治療薬の調製における使用をさらに含む。

１つ目のＲＡＳがん遺伝子は、ラット肉腫（ｒａｔ ｓａｒｃｏｍａ）から発見されたため、そのように命名された。ＲＡＳタンパク質はＲＡＳ遺伝子により発現される産物であり、密接に関連する、１８９個のアミノ酸からなる一種の単量体グロブリンを指し、分子量は２１ＫＤａである。このタンパク質は、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）又はグアノシン二リン酸（ＧＤＰ）と結合することができる。ＲＡＳタンパク質の活性状態は、細胞の成長、分化、細胞骨格、タンパク質の輸送及び分泌等に対して影響を有しており、その活性は、ＧＴＰ又はＧＤＰとの結合によって調節される。ＲＡＳタンパク質はＧＤＰと結合するときに休眠状態にあり、すなわち「不活性」状態にあり；上流の特定の細胞成長因子が刺激されたとき、ＲＡＳタンパク質は誘導されてＧＤＰを交換し、ＧＴＰと結合し、このとき、「活性化」状態と呼ばれる。ＧＴＰと結合したＲＡＳタンパク質は下流のタンパク質を活性化し、信号の伝達を行うことができる。ＧＴＰを加水分解する、弱い加水分解活性をＲＡＳタンパク質自体が有しており、ＧＴＰをＧＤＰに加水分解することができる。これにより、活性化状態から不活性状態への転換を実現することができる。この加水分解の過程において、ＧＡＰ（ＧＴＰａｓｅ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ、ＧＴＰ加水分解酵素活性化タンパク質）の関与もさらに必要である。ＧＡＰはＲＡＳタンパク質と作用し、ＧＴＰをＧＤＰに加水分解する能力を大幅に促進することができる。ＲＡＳタンパク質の変異はＧＡＰとの作用に影響し、すなわち、ＧＴＰをＧＤＰに加水分解する能力に影響しており、ＲＡＳタンパク質を活性化状態のままにする。活性化されたＲＡＳタンパク質は下流のタンパク質に成長信号を与え続け、最終的に、細胞が絶えず成長し分化するようになり、最終的に腫瘍が生じる。ＲＡＳ遺伝子ファミリーのメンバーは多く、そのうち各種がんと密接に関連するサブファミリーには主に、カーステン・ラット肉腫ウイルス発がん遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、ハーベイ・ラット肉腫ウイルス発がんホモログ（ＨＲＡＳ）、及び神経芽細胞腫ラット肉腫ウイルス発がん遺伝子ホモログ（ＮＲＡＳ）がある。約３０％のヒト腫瘍が、変異した、あるいくつかのＲＡＳ遺伝子を伴っており、そのうちＫＲＡＳの変異が最も顕著であり、すべてのＲＡＳ変異のうち８６％を占めることが判明している。ＫＲＡＳの変異については、最も一般的な変異は１２番目のグリシン（Ｇ１２）、１３番目のグリシン（Ｇ１３）、及び６１番目のグルタミン（Ｑ６１）の残基に出現し、そのうちＧ１２変異が８３％を占めている。

Ｇ１２Ｃ変異はＫＲＡＳ遺伝子の変異のうち比較的一般的な１つであり、１２番目のグリシンがシステインに変異したものを指す。ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ変異は肺がんにおいて最も一般的であり、文献（Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ ２０１４；１３：８２８－８５１）が報告するデータに基づいて推計すると、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ変異は、すべての肺がん患者の１０％前後を占めている。

ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ変異タンパク質は最先端の目標となっており、これまでの研究はまだ多くない。文献（Ｎａｔｕｒｅ．２０１３；５０３：５４８－５５１）は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ変異を標的とする一種の共有結合阻害剤を報告しているが、この種の化合物の酵素活性は高くなく、細胞レベルでも顕著な活性を発現していない。文献（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１６； ３５１：６０４－６０８，Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ ２０１６；６：３１６－２９）は、一種の化合物が細胞レベルでμＭクラスの細胞抗増殖活性を発現しているが、構造代謝安定性が低く、活性をさらに高めるのも困難である、と報告している。少数の文献報告以外では、Ａｒａｘｅｓ Ｐｈａｒｍａ ＬＬＣ社がＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ阻害剤に関する数件の特許を出願しており、例えば国際公開第２０１６１６４６７５号パンフレット及び国際公開第２０１６１６８５４０号パンフレットは、一種のキナゾリン誘導体が、高い酵素結合活性を有し、且つ、μＭクラスの細胞抗増殖活性を発現し、構造が安定しており、一定の選択性を有することを報告している。この種の化合物はいずれも、１つのアクリルアミドの断片を有しており、マイケル付加アクセプター及びＫＲＡＳタンパク質上のＧ１２Ｃ残基として作用して共有結合複合体を形成する。Ｌｉｕ Ｙｉらは２０１８年、Ｃｅｌｌ（Ｍａｔｔｈｅｗ Ｒ． Ｊａｎｅｓ，Ｙｉ Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２０１８，１７２，５７８－５８９．）においてＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ変異を標的とする共有結合阻害剤ＡＲＳ－１６２０を開示報告している。この化合物は優れた代謝安定性を有しており、細胞レベルでｎＭクラスの細胞抗増殖活性を発現しており、且つ、膵臓がんＭＩＡ－Ｐａｃａ２細胞皮下異種移植腫瘍モデルにおいて腫瘍の成長を効果的に抑制することができる。２０１８年の下半期に、Ａｍｇｅｎ社のＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ阻害剤ＡＭＧ ５１０に関する第一相臨床試験被験者募集（ＮＣＴ０３６００８８３）が開始されている。これは、初めて臨床研究に入った有機小分子ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ阻害剤である。２０１９年のＡＡＣＲ会議では、ＡＭＧ ５１０の構造式及び臨床試験前の一部の研究データが公開されている。２０１９年のＡＳＣＯ会議では、ＡＭＧ ５１０の早期の第一相臨床試験の結果が発表されており、ＡＭＧ ５１０の、化学療法を受けた後の疾患の進行に対する、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ変異を有する非小細胞肺がん患者の疾患制御率が９０％に達した。また、Ｍｉｒａｔｉ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓが研究開発したＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ阻害剤ＭＲＴＸ８４９についても、２０１９年１月に第一相臨床試験被験者募集（ＮＣＴ０３７８５２４９）が開始され、代表的な特許としては国際公開第２０１７２０１１６１号パンフレット及び国際公開第２０１９０９９５２４号パンフレットがある。

本発明は、Ｘ線粉末回折スペクトルが、角２θ：５．８９±０．２０°、８．８２±０．２０°、１７．７１±０．２０°に特徴的回折ピークを有する、式（Ｉ）の化合物の結晶形Ｃ
を提供する。

本発明のいくつかの解決策において、上記結晶形Ｃは、Ｘ線粉末回折スペクトルが、角２θ：５．８９±０．２０°、８．８２±０．２０°、１３．１９±０．２０°、１４．８１±０．２０°、１７．７１±０．２０°、１８．７２±０．２０°、２１．５８±０．２０°、２４．４７±０．２０°に特徴的回折ピークを有する。

本発明のいくつかの解決策において、上記結晶形Ｃは、Ｘ線粉末回折スペクトルが、角２θ：５．８９°、８．８２°、１１．５０°、１２．５８°、１３．１９°、１４．４２°、１４．８１°、１７．７１°、１８．７２°、２０．７０°、２１．５８°、２３．５１°、２４．４７°、２５．３６°、２６．５８°、２７．０９°、２９．０８°に特徴的回折ピークを有する。

本発明は、Ｘ線粉末回折スペクトルが、角２θ：５．８９±０．２０°、８．８２±０．２０°に特徴的回折ピークを有し、さらに、１７．７１±０．２０°、及び／又は１１．５０±０．２０°、及び／又は１２．５８±０．２０°、及び／又は１３．１９±０．２０°、及び／又は１４．４２±０．２０°、及び／又は１４．８１±０．２０°、及び／又は１８．７２±０．２０°、及び／又は２０．７０±０．２０°、及び／又は２１．５８±０．２０°、及び／又は２３．５１±０．２０°、及び／又は２４．４７±０．２０°、及び／又は２５．３６±０．２０°、及び／又は２６．５８±０．２０°、及び／又は２７．０９±０．２０°、及び／又は２９．０８±０．２０°に特徴的ピークを有する、式（Ｉ）の化合物の結晶形Ｃを提供する。

本発明のいくつかの解決策において、上記結晶形Ｃは、ＸＲＰＤスペクトルが図３に示す通りである。

本発明のいくつかの解決策において、上記結晶形ＣのＸＲＰＤスペクトル解析データは表３に示す通りである。

本発明のいくつかの解決策において、上記結晶形Ｃは、示差走査熱量測定曲線が、２１４．７±５℃に吸熱ピークの始点を有する。

本発明のいくつかの解決策において、上記結晶形Ｃは、ＤＳＣスペクトルが図１１に示す通りである。

本発明のいくつかの解決策において、上記結晶形Ｃは、熱重量分析曲線の、１５０．０±３℃における重量減少が２．５２％に達する。

本発明のいくつかの解決策において、上記結晶形Ｃは、ＴＧＡスペクトルが図１０に示す通りである。

本発明は、ＸＲＰＤスペクトル解析データが表１に示す通りである、式（Ｉ）の化合物の結晶形Ａを提供する。

本発明は、ＸＲＰＤスペクトルが図１に示す通りである、式（Ｉ）の化合物の結晶形Ａを提供する。

本発明のいくつかの解決策において、上記結晶形Ａは、ＤＳＣスペクトルが図７に示す通りである。

本発明のいくつかの解決策において、上記結晶形Ａは、ＴＧＡスペクトルが図６に示す通りである。

本発明は、ＸＲＰＤスペクトル解析データが表２に示す通りである、式（Ｉ）の化合物の結晶形Ｂを提供する。

本発明は、ＸＲＰＤスペクトルが図２に示す通りである、式（Ｉ）の化合物の結晶形Ｂを提供する。

本発明のいくつかの解決策において、上記結晶形Ｂは、ＤＳＣスペクトルが図９に示す通りである。

本発明のいくつかの解決策において、上記結晶形Ｂは、ＴＧＡスペクトルが図８に示す通りである。

本発明は、ＸＲＰＤスペクトル解析データが表４に示す通りである、式（Ｉ）の化合物の結晶形Ｄを提供する。

本発明は、ＸＲＰＤスペクトルが図４に示す通りである、式（Ｉ）の化合物の結晶形Ｄを提供する。

本発明のいくつかの解決策において、上記結晶形Ｄは、ＤＳＣスペクトルが図１３に示す通りである。

本発明のいくつかの解決策において、上記結晶形Ｄは、ＴＧＡスペクトルが図１２に示す通りである。

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本発明は、ＸＲＰＤスペクトル解析データが表５に示す通りである、式（Ｉ）の化合物の結晶形Ｅを提供する。

本発明は、ＸＲＰＤスペクトルが図５に示す通りである、式（Ｉ）の化合物の結晶形Ｅを提供する。

本発明のいくつかの解決策において、上記結晶形Ｅは、ＤＳＣスペクトルが図１５に示す通りである。

本発明のいくつかの解決策において、上記結晶形Ｅは、ＴＧＡスペクトルが図１４に示す通りである。

本発明のいくつかの解決策において、上記結晶形の、がん治療薬の調製における使用。

本発明のいくつかの解決策において、上記がんは、肺がん、リンパ腫、食道がん、卵巣がん、膵臓がん、直腸がん、脳神経膠腫、子宮頸がん、尿路上皮がん、胃がん、子宮内膜がん、肝がん、胆管がん、乳腺がん、結腸がん、白血病、及びメラノーマを含む。

本発明の化合物は、優れた細胞活性及び選択性を有しており、結晶形が比較的安定しており、溶解性が高く、吸湿性が適当であり、良好な創薬可能性を備えている。

定義と説明
本発明は下記の略語を採用する：ＤＭＳＯはジメチルスルホキシドを表し；ＭｅＯＨはメタノールを表し；ＴＦＡはトリフルオロ酢酸を表し；ＮＣＳはＮ－クロロスクシンイミドを表し；ＰｙＢｒＯＰはブロモ－トリス－ピロリジノ－ホスホニウムヘキサフルオロホスファートを表し；ＬＣＭＳは高速液体クロマトグラフィー／質量分析を表し；ＸＲＰＤはＸ線粉末回折を表し；ＨＰＬＣは高速液体クロマトグラフィーを表し；ＡＣＮはアセトニトリルを表し；Ｈ_２Ｏは水を表す。

ＸＲＰＤ試験パラメータ

熱重量分析（ＴＧＡ）及び示差走査熱量測定（ＤＳＣ）
ＴＧＡ及びＤＳＣスペクトルはそれぞれ、熱重量分析計ＴＡ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＴＧＡ５５００／Ｑ５０００と示差走査熱量計ＴＡＱ２００／Ｑ２０００／Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＤＳＣ ２５００において収集され、表７は試験パラメータを列記している。

高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
サンプルの純度及び溶解度は、高速液体クロマトグラフィーＡｇｉｌｅｎｔ １２６０ ＨＰＬＣによって収集して測定する。

打錠（Ｈｙｄｒａｕｌｉｃ Ｐｒｅｓｓ）
打錠実験はＳＹＰ－５ＢＳ手動打錠機において遂行され、サンプルが受ける圧力は約３５０ＭＰａである。

結晶形ＡのＸＲＰＤスペクトルである。 結晶形ＢのＸＲＰＤスペクトルである。 結晶形ＣのＸＲＰＤスペクトルである。 結晶形ＤのＸＲＰＤスペクトルである。 結晶形ＥのＸＲＰＤスペクトルである。 結晶形ＡのＴＧＡスペクトルである。 結晶形ＡのＤＳＣスペクトルである。 結晶形ＢのＴＧＡスペクトルである。 結晶形ＢのＤＳＣスペクトルである。 結晶形ＣのＴＧＡスペクトルである。 結晶形ＣのＤＳＣスペクトルである。 結晶形ＤのＴＧＡスペクトルである。 結晶形ＤのＤＳＣスペクトルである。 結晶形ＥのＴＧＡスペクトルである。 結晶形ＥのＤＳＣスペクトルである。 結晶形Ｃの立体楕円球図である。

以下、実施例を通じて本発明について詳しく記述するが、本発明に対するいかなる不利な限定も意味しない。本発明の化合物は、以下に列挙する具体的な実施形態と、他の化学合成方法との結合により形成される実施形態と、当業者に周知の均等物置換方式とを含む、当業者に周知の種々の合成方法によって調製することができ、好ましい実施形態は本発明の実施例を含むが、これらのみに限定されない。当業者にとっては、本発明の趣旨及び範囲を逸脱しない状況で、本発明の具体的な実施形態に対して種々の変更や改良を行うことは自明である。

実施例１ 式（Ｉ）の化合物の調製
ステップ１：化合物２の合成
化合物１（１５００ｇ、４．４９ｍｏｌ）のエタノール（１０．５Ｌ）と水（４．５Ｌ）溶液に炭酸カリウム（１．２４ｋｇ、８．９７ｍｏｌ）を添加した後、５０℃まで昇温し、温度を５０～７０℃に制御して過酸化水素水（１．７８ｋｇ、１５．７１ｍｏｌ、３０％純度）を直接ゆっくりと滴加し、滴加完了後に７０℃で１時間攪拌し続けた。３０℃まで降温し、亜硫酸ナトリウム水溶液（３．０Ｌ）を添加した後、３０℃で１時間攪拌し、水道水（３０Ｌ）を添加し、２０℃で１時間攪拌し、固体を濾過し乾燥させて化合物２を得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：３３１．０（Ｍ＋１）。

ステップ２：化合物３の合成
化合物２（３００ｇ、０．８４ｍｏｌ）のアセトニトリル（３．０Ｌ）溶液に水酸化カリウム（１８９．９８ｇ、３．３９ｍｏｌ）及び二硫化炭素（１９３．３５ｇ、２．５４ｍｏｌ）を添加し、反応液を２５℃で２時間攪拌した。水道水（７．５Ｌ）を添加した後、２Ｍの塩酸（１．８Ｌ）でｐＨを１に調節し、析出固体を濾過し、水ですすぎ、乾燥させて化合物３を得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：３７３．０（Ｍ＋１）。

ステップ３：化合物４の合成
化合物３（１０００ｇ、２．６９ｍｏｌ）の炭酸ジメチル（１０．０Ｌ）溶液に炭酸カリウム（８１６．６９ｇ、５．９１ｍｏｌ）及び臭化テトラブチルアンモニウム（８６．５９ｇ、２６８．６０ｍｍｏｌ）を添加し、反応液を内温８５～９０℃で１６時間攪拌し、３０℃まで降温し、固体を濾過した後、濾過ケーキを１４Ｌの水で希釈し、１０℃で３時間攪拌し、さらに、６Ｍの塩酸でｐＨを２に調節し、濾過し、乾燥させて粗生成物（１０８５ｇ）を得た。粗生成物を酢酸エチル（３２５４ｍＬ）と石油エーテル（４８８１ｍＬ）との混合溶媒を用いて２０℃で１０時間攪拌し、濾過し、乾燥させて化合物４を得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：３８７．０（Ｍ＋１）。

ステップ４：化合物５の合成
Ｎ，Ｎ－ジエチルアゼチジン－３－アミン（１５９．７０ｇ、１．２５ｍｏｌ）のｎ－ブタノール（３５１０ｍＬ）溶液に化合物４（３９０ｇ、０．９６ｍｏｌ）を添加し、反応液を１２０℃まで加熱し、１５時間攪拌した。反応液を３０℃まで冷却し、水（４．０Ｌ）を添加し、層化し、水相を酢酸エチル（１Ｌ＊２）で２回抽出し、有機相を合わせて減圧濃縮した。濃縮して得られた残余物に酢酸エチル（４Ｌ）及び水（３．０Ｌ）を添加し、６Ｍの塩酸でｐＨ＝２に調節し、有機相を分離させて捨て、水相を炭酸カリウム（２５０ｇ）でｐＨ＝８に調節した後、酢酸エチル（２．５Ｌ＊３）で３回抽出し、無水硫酸ナトリウム乾燥し、濾過濃縮乾燥して化合物５を得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：４６７．１（Ｍ＋１）。

ステップ５：化合物６の合成
化合物５（８３０ｇ、１．６９ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（２．５２Ｌ）溶液にＴＦＡ（７７１．０２ｇ、６．７６ｍｍｏｌ）及びＮＣＳ（１４５１．４７ｇ、３．３８ｍｍｏｌ）を添加し、反応液を６０℃まで昇温し、２時間攪拌した。飽和した亜硫酸ナトリウム水溶液（１．６Ｌ）を添加してクエンチした後、１Ｍの水酸化ナトリウム溶液（７Ｌ）を滴加し、酢酸エチル（４Ｌ＊３）で３回抽出し、飽和食塩水（１Ｌ）で１回洗浄し、乾燥、濾過、濃縮して化合物６を得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：５３５．０（Ｍ＋１）。

ステップ６：化合物７の合成
化合物６（４００ｇ、０．６９ｍｏｌ）のＮ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（３．２Ｌ）溶液にＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（１３５．０５ｇ、１．０４ｍｏｌ）、化合物６－１（１４２．７２ｇ、０．７６ｍｏｌ）及びＰｙＢｒＯＰ（３５７．２３ｇ、０．７６ｍｍｏｌ）を添加し、反応液を２０℃で３時間攪拌した。反応液に純水（９．６Ｌ）を添加した後、濾過し、濾過ケーキを乾燥させて化合物７を得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：７０３．１（Ｍ＋１）。

ステップ７：化合物８の合成
化合物７（６００ｇ、０．８５ｍｏｌ）の酢酸エチル（１．８Ｌ）溶液に４Ｍの塩酸メタノール（１．８Ｌ、７．２０ｍｏｌ）溶液を添加し、反応液を１５℃で１２時間攪拌した。反応液を濾過し、濾過ケーキを、酢酸エチル（２Ｌ）を用いて１５℃で２時間叩解した。濾過し、濾過ケーキを乾燥させて化合物８を得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：６０３．１（Ｍ＋１）。

ステップ８：式（Ｉ）の化合物の合成
化合物８（３６０ｇ、０．５３ｍｍｏｌ）の２－メチルテトラヒドロフラン（３．６Ｌ）溶液に水（７．２Ｌ）及び炭酸カリウム（１４６．７０ｇ、１．０６ｍｏｌ）を添加し、反応液を１５℃まで冷却した後、化合物８－１（５７．６４ｇ、０．６４ｍｏｌ）を滴加し、反応液を１５℃で１５分攪拌した。反応液を２－メチルテトラヒドロフラン（０．５Ｌ＊２）で２回抽出した。有機相を合わせ、飽和食塩水（０．５Ｌ）で１回洗浄し、無水硫酸ナトリウム乾燥し、濾過し、濾液を減圧濃縮して粗生成物を得た。粗生成物を、メタノール／水＝１／２（２．８Ｌ）の混合溶媒を用いて４０℃で１２時間攪拌した後、濾過し、濾過ケーキを加熱乾燥してからイソプロピルアルコール（１．５Ｌ）を添加して懸濁液を形成し、８０℃まで加熱し、８０℃で２時間攪拌した。続いてｎ－ヘプタン（１．０Ｌ）を添加し、反応液を８０℃で１２時間攪拌した。反応液を２５℃まで冷却し、２５℃で１２時間攪拌し続けた。続いて濾過し、濾過ケーキ乾燥させて式（Ｉ）の化合物を得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：６５６．９（Ｍ＋１）；¹HNMR(400MHz、DMSO-d₆)δ7.68(d、J=7.58Hz、1H)7.00(s、1H)6.82(dd、J=16.69、10.45Hz、1H)6.10-6.22(m、3H)5.69-5.77(m、1H)4.09-4.22(m、2H)3.85-3.94(m、2H)3.79(brs、2H)3.71(brs、6H)3.60-3.65(m、1H)2.51-2.57(m、4H)0.91-0.99(m、6H)。

実施例２ 式（Ｉ）の化合物結晶形の調製
式（Ｉ）の化合物結晶形Ａの調製：
式（Ｉ）の化合物（１０ｇ）を１３０ｍｌのイソプロピルアルコールに溶解させ、１００℃まで昇温し、１００℃で１時間攪拌した後、１０℃まで自然冷却し、１０℃下で９時間攪拌し、濾過し、結晶形Ａを得た。

式（Ｉ）の化合物結晶形Ｂの調製：
式（Ｉ）の化合物（１９．０ｍｇ）を１．０ｍｌのテトラヒドロフランに溶解させ、それに３．６ｍｌの逆溶媒の水を１滴ずつ添加し、結晶形Ｂを得た。

式（Ｉ）の化合物結晶形Ｃの調製：
式（Ｉ）の化合物（１９．７ｍｇ）を１．０ｍｌのアセトニトリルに溶解させ、それに３．７ｍｌの逆溶媒の水を１滴ずつ添加し、結晶形Ｃを得た。

式（Ｉ）の化合物結晶形Ｄの調製：
式（Ｉ）の化合物（１４．７ｍｇ）を１．０ｍｌの酢酸エチルに溶解させ、それに５．８ｍｌの逆溶媒のｎ－ヘプタンを１滴ずつ添加し、結晶形Ｄを得た。

式（Ｉ）の化合物（２２．０ｍｇ）を０．６ｍｌの酢酸イソプロピル／ｍ－キシレン（体積比１：３）に加え、懸濁液を得、５０℃で２時間平衡化させてから濾過し、０．１℃／ｍｉｎの速度で５℃まで降温した後、室温で約１カ月揮発させ、結晶形Ｄを得た。

式（Ｉ）の化合物（３２．２ｍｇ）を０．５ｍｌのアセトニトリル／ｍ－キシレン（体積比１：５）に加え、懸濁液を得、５０℃で２時間平衡化させてから、０．１℃／ｍｉｎの速度で５℃まで降温した後、０．１℃／ｍｉｎの速度で５０℃まで昇温し、さらに、０．１℃／ｍｉｎの速度で５℃まで降温し、室温で約１カ月揮発させた後、結晶形Ｄを得た。

式（Ｉ）の化合物結晶形Ｅの調製：
式（Ｉ）の化合物（１５．７ｍｇ）を１．０ｍｌの２－メチルテトラヒドロフランに溶解させ、それに３．８ｍｌの逆溶媒のｎ－ヘプタンを１滴ずつ添加し、結晶形Ｅを得た。

実施例３ 式（Ｉ）の化合物結晶形Ｃの圧力安定性
式（Ｉ）の化合物結晶形Ｃを円形金型（直径６ｍｍ）に入れ、サンプルが受ける圧力が３５０ＭＰａ前後に達するまで加圧し、シート状サンプルの小片を取ってＸＲＰＤを直接検査した結果、結晶形Ｃは打錠（圧力約３５０ＭＰａ）を経た後に結晶形が変わっていないことが示された。

結論：式（Ｉ）の化合物結晶形Ｃは、優れた圧力安定性を有する。

実施例４ 式（Ｉ）の化合物結晶形Ｃの固体安定性実験
式（Ｉ）の化合物結晶形Ｃの固体安定性を評価するため、式（Ｉ）の化合物結晶形Ｃについて、影響要因（高温、高湿及び光照射）と、６０℃／７５％ＲＨ及び４０℃／７５％ＲＨの条件の安定性との考察を行った。結晶形Ｃを、高温（６０℃、閉鎖）、高湿（９２．５％ＲＨ、シールフィルムで包んで小穴を５つ開ける）の条件で１週間、２週間それぞれ放置し、ＩＣＨ条件（可視光線照度が１．２Ｅ＋０６Ｌｕｘ・ｈｒｓに達し、紫外線照度が２００Ｗ・ｈｒｓ／ｍ２に達する）により可視光線及び紫外線の下（遮光対照群のサンプルを同時に放置し、アルミ箔で包む）で閉鎖放置すると同時に、６０℃／７５％ＲＨの条件で１、２カ月放置し（シールフィルムで包んで小穴を５つ開ける）、４０℃／７５％ＲＨの条件で１、２、３カ月放置した（シールフィルムで包んで小穴を５つ開ける）。すべての安定性サンプルについてＸＲＰＤ試験を行うことで、結晶形の変化を検出し、すべての安定性サンプルについてＨＰＬＣ試験を行った。

実験結果：表９を参照のこと。

結論：式（Ｉ）の化合物晶Ｃ型は、優れた固体安定性を有する。

実施例５ 式（Ｉ）の化合物立体配置の確認
式（Ｉ）の化合物の結晶調製：式（Ｉ）の化合物の結晶は、エタノール条件下で、溶媒揮発法を用い、室温で１０日間の培養を経て得られる。式（Ｉ）の化合物の立体構造楕円球図について図１６を参照すると、Ｓ配置である。式（Ｉ）の化合物結晶の構造データ及びパラメータについては、表１０－１、１０－２、１０－３、１０－４、１０－５、及び１０－６を参照のこと。

実験例１：細胞実験
実験の目的
ＮＣＩ－Ｈ３５８、ＭＩＡ－ＰＡ－ＣＡ－２、Ａ３７５、ＳＷ１４６３、Ａ４２７細胞において、細胞増殖に対する化合物の影響を検出する。

式（Ｉ）の化合物はＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ選択性阻害剤であり、ＧＤＰと結合するＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃタンパク質が共有結合し、ＫＲＡＳタンパク質のＧＤＰ／ＧＴＰの交換をブロックし、ＫＲＡＳタンパク質に、ＧＤＰと結合する形式における不活性状態を維持させることにより、細胞及び腫瘍の成長を抑制することができると実証した研究が既にある。

実験方法
細胞培養条件
Ｈ３５８細胞系培地：８９％培地ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ウシ胎児血清＋１％Ｐ／Ｓ
ＭＩＡ－ＰＡ－ＣＡ－２細胞系培地：８６．５％培地ＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎児血清＋２．５％ウマ血清＋１％Ｐ／Ｓ
Ａ３７５細胞系培地：８９％培地ＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎児血清＋１％Ｐ／Ｓ
ＳＷ１４６３細胞系培地：８９％培地Ｌｅｉｂｏｖｉｔ２ ｓＬ－１５＋１０％ウシ胎児血清＋１％Ｐ／Ｓ
Ａ４２７細胞系培地：８９％培地ＥＭＥＭ＋１０％ウシ胎児血清＋１％Ｐ／Ｓ

細胞播種
１、細胞の継代過程で用いられる培地とパンクレアチンを３７℃の水槽に入れて予熱した。

２、パンクレアチンで細胞をリンスし、パンクレアチンで細胞を脱落状態まで消化し、培養液を加えて混和し、消化を終了した。

３、細胞を１５ｍＬ遠心管に吸い取り、０．０１ｍＬ細胞懸濁液を吸い取って計数板に添加して計数した。

４、すべての細胞について、下表中の細胞密度により、それぞれ適量の細胞量を取って１５ｍＬ遠心管に加え、相応の細胞培養液を用いて体積９ｍＬまで補った。

５、細胞については、添付するマイクロプレート配置図に従い、９６ウェルマイクロプレートの周縁横列のウェルに１５０μＬの無菌水を添加し、その他のウェルに８０μＬの細胞懸濁液をそれぞれ添加した後、細胞培養プレートをインキュベーターに入れて培養した。

化合物の準備
ＤＭＳＯを用いて式（Ｉ）の化合物を１０ｍＭから２ｍＭまで希釈し、続いて、３倍に連続して希釈し、計９つの濃度勾配を希釈した。

調製された２μＬの化合物を濃度勾配毎に吸い取り、対応する細胞の７８μＬの培地に添加して均一に混合し、化合物投薬溶液とした。

３、添付するマイクロプレート配置図に従い、２０μＬの化合物投薬溶液を吸い取り、各細胞培養プレートにそれぞれ添加する。終濃度は１０μＭ～０．００１５μＭであり、ＤＭＳＯ終濃度は０．５％である。２．５％のＤＭＳＯを含む２０μＬの細胞培地を対照群に添加した後、細胞培養プレートをインキュベーター中に戻し入れて培養した。

検出・読み取り
１、化合物処理の当日、０日目の試験プレートをインキュベーターから取り出し、５０μＬのＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏを添加し、１０００ｒｐｍで１０秒間遠心し、室温で１０分間振盪した後、再び１０００ｒｐｍで１０秒間遠心し、Ｅｎｖｉｓｉｏｎで読み取った。

２、細胞を７２時間にわたり化合物インキュベーションした後、ＭＩＡ－ＰＡ－ＣＡ－２、Ａ３７５、Ａ４２７細胞の試験プレートをインキュベーターから取り出し、９６ウェルマイクロプレートの各ウェルに５０μＬのＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏを添加し、１０００ｒｐｍで１０秒間遠心し、室温で１０分間振盪した後、再び１０００ｒｐｍで１０秒間遠心し、Ｅｎｖｉｓｉｏｎで読み取った。

３、細胞を１２０時間にわたり化合物インキュベーションした後、ＮＣＩ－Ｈ３５８細胞の試験プレートをインキュベーターから取り出し、９６ウェルマイクロプレートの各ウェルに５０μＬのＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏを添加し、１０００ｒｐｍで１０秒間遠心し、室温で１０分間振盪した後、再び１０００ｒｐｍで１０秒間遠心し、Ｅｎｖｉｓｉｏｎで読み取った。

４、細胞を１４４時間にわたり化合物インキュベーションした後、ＳＷ１４６３細胞の試験プレートをインキュベーターから取り出し、９６ウェルマイクロプレートの各ウェルに５０μＬのＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏを添加し、１０００ｒｐｍで１０秒間遠心し、室温で１０分間振盪した後、再び１０００ｒｐｍで１０秒間遠心し、Ｅｎｖｉｓｉｏｎで読み取った。

実験結果と検討
式（Ｉ）の化合物は、ヒト非小細胞肺がんのＮＣＩ－Ｈ３５８細胞、膵臓がんＭＩＡ－ＰＡ－ＣＡ－２、ヒト直腸腺がん細胞ＳＷ１４６３に対する増殖阻害活性が優れていることを、本実験の試験結果が示している。同時に、式（Ｉ）の化合物は、メラノーマＡ３７５細胞、ヒト肺がん細胞Ａ４２７に対する活性が弱く、このことは、野生型ＫＲＡＳ及びＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｄ）タンパク質に対する阻害活性が低く、オフターゲットのリスクが低いことを示している。詳細なＩＣ_５０データについては下表１１を参照

Claims (10)

1. Ｘ線粉末回折スペクトルが、角２θ：５．８９±０．２０°、８．８２±０．２０°、１７．７１±０．２０°に特徴的回折ピークを有する、式（Ｉ）の化合物の結晶形Ｃ。
   
2. Ｘ線粉末回折スペクトルが、角２θ：５．８９±０．２０°、８．８２±０．２０°、１３．１９±０．２０°、１４．８１±０．２０°、１７．７１±０．２０°、１８．７２±０．２０°、２１．５８±０．２０°、２４．４７±０．２０°に特徴的回折ピークを有する、請求項１に記載の結晶形Ｃ。
3. Ｘ線粉末回折スペクトルが、角２θ：５．８９°、８．８２°、１１．５０°、１２．５８°、１３．１９°、１４．４２°、１４．８１°、１７．７１°、１８．７２°、２０．７０°、２１．５８°、２３．５１°、２４．４７°、２５．３６°、２６．５８°、２７．０９°、２９．０８°に特徴的回折ピークを有する、請求項２に記載の結晶形Ｃ。
4. ＸＲＰＤスペクトルが図３に示す通りである、請求項２又は３に記載の結晶形Ｃ。
5. 示差走査熱量測定曲線が、２１４．７±５℃に吸熱ピークの始点を有する、請求項１～４のいずれか一項に記載の結晶形Ｃ。
6. ＤＳＣスペクトルが図１１に示す通りである、請求項５に記載の結晶形Ｃ。
7. 熱重量分析曲線の、１５０．０±３℃における重量減少が２．５２％に達する、請求項１～４のいずれか一項に記載の結晶形Ｃ。
8. ＴＧＡスペクトルが図１０に示す通りである、請求項７に記載の結晶形Ｃ。
9. 請求項１～８のいずれか一項に記載の結晶形の、がん治療薬の調製における使用。
10. 前記がんが、肺がん、リンパ腫、食道がん、卵巣がん、膵臓がん、直腸がん、脳神経膠腫、子宮頸がん、尿路上皮がん、胃がん、子宮内膜がん、肝がん、胆管がん、乳腺がん、結腸がん、白血病、及びメラノーマを含む、請求項９に記載の使用。