JP2023537904A - 神経変性障害のための遺伝子療法 - Google Patents

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Abstract

本開示は、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）などの神経変性障害の治療のための組成物および方法に関する。本開示は、プログラニュリンまたはその一部をコードする導入遺伝子を含む発現構築物を、それを必要とする対象に投与することによって、ＦＴＤを治療する方法を提供する。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年８月１０日出願の米国仮特許出願第６３／０６３，８５２号の利益を主張し、当該仮出願の開示内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
電子的に提出されたテキストファイルの説明
ここで共に電子的に提出された以下のテキストファイルの内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される。配列表のコンピュータ可読形式のコピー（ファイル名：ＰＲＶＬ＿０１６＿０１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ．ｔｘｔ、記録日：２０２１年８月１０日、ファイルサイズ約６１２，８３４バイト）。
本開示は、遺伝子療法の分野およびそれを使用する方法に関する。
ゴーシェ病は、リソソーム酸β－グルコセレブロシダーゼ（Ｇｃａｓｅ、「ＧＢＡ」）の欠損によるスフィンゴ糖脂質代謝のまれな先天性異常である。患者は、肝脾腫、汎血球減少症につながる骨髄不全、肺障害および線維症、ならびに骨欠損を含む、非ＣＮＳ症状および所見に苦しむ。さらに、かなりの数の患者が、衝動性眼球運動および注視の欠陥、発作、認知障害、発達遅延、ならびにパーキンソン病を含む運動障害を含む神経症状に悩まされている。以下に記載の酵素補充療法、欠損Ｇｃａｓｅに結合して安定性を改善するシャペロン様小分子薬剤、およびゴーシェ病において蓄積して症状および所見をもたらす基質の産生を遮断する基質抑制療法を含む、造血骨髄および内臓における末梢疾患および主要な臨床症状に対処するいくつかの治療薬が存在する。しかしながら、ゴーシェ病の他の態様（特に骨格および脳に影響を及ぼすもの）は、治療に対して難治性であると考えられる。
プログラニュリン（ＰＧＲＮ）は、リソソーム機能に連結された追加のタンパク質である。ＰＧＲＮは、ＧＲＮ遺伝子によってコードされる。ヒトにおけるＧＲＮのハプロ不全は、前頭葉および側頭葉の萎縮を伴う、実行機能の障害、行動の変化、および言語困難を特徴とする神経変性疾患であるＦＴＤ－ＧＲＮ（ＧＲＮ変異を有する前頭側頭型認知症）を発症する約９０％のリスクをもたらす。ＦＴＤの患者には、疾患修飾療法は利用できない。
本明細書では、ＧＲＮ変異を有する前頭側頭型認知症を有するまたは有すると疑われる対象を治療する方法が提供され、方法は、対象に、
（ｉ）プログラニュリン（ＰＧＲＮ）タンパク質をコードする導入遺伝子挿入物に動作可能に連結されたプロモーターを含む発現構築物を含む核酸を含むｒＡＡＶベクターであって、導入遺伝子挿入物が、配列番号６８のヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶベクターと、
（ｉｉ）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）９キャプシドタンパク質と、を含む組替えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）と、以下のうちの一つまたは複数、
（Ａ）シロリムス、
（Ｂ）メチルプレドニゾロン、
（Ｃ）リツキシマブ、および
（Ｄ）プレドニゾン、と、を投与することを含む。
本明細書ではさらに、ＧＲＮ変異を有する前頭側頭型認知症を有するまたは有すると疑われる対象において免疫応答を抑制する方法が提供され、方法は、対象に、
（ｉ）プログラニュリン（ＰＧＲＮ）タンパク質をコードする導入遺伝子挿入物に動作可能に連結されたプロモーターを含む発現構築物を含む核酸を含むｒＡＡＶベクターであって、導入遺伝子挿入物が、配列番号６８のヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶベクターと、
（ｉｉ）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）９キャプシドタンパク質と、を含む組替えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）と、以下のうちの一つまたは複数、
（Ａ）シロリムス、
（Ｂ）メチルプレドニゾロン、
（Ｃ）リツキシマブ、および
（Ｄ）プレドニゾン、と、を投与することを含む。
本明細書に提供される方法の一部の実施形態では、プロモーターは、ニワトリベータアクチン（ＣＢＡ）プロモーターである。本明細書に提供される方法の一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーをさらに含む。本明細書に提供される方法の一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素（ＷＰＲＥ）をさらに含む。本明細書に提供される方法の一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、ウシ成長ホルモンポリＡシグナルテールをさらに含む。
本明細書に提供される方法の一部の実施形態では、核酸は、発現構築物に隣接する二つのアデノ随伴ウイルス逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を含む。本明細書に提供される方法の一部の実施形態では、各ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列である。
本明細書に提供される方法の一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、５’ＩＴＲと発現構築物との間にＴＲＹ領域をさらに含み、ＴＲＹ領域は配列番号２８を含む。
本明細書では、ＧＲＮ変異を有する前頭側頭型認知症を有するまたは有すると疑われる対象を治療する方法が提供され、方法は、対象に、
（ｉ）５’から３’の順序で、
（ａ）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）２ＩＴＲと、
（ｂ）サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーと、
（ｃ）ニワトリベータアクチン（ＣＢＡ）プロモーターと、
（ｄ）プログラニュリン（ＰＧＲＮ）タンパク質をコードする導入遺伝子挿入物であって、配列番号６８のヌクレオチド配列を含む、導入遺伝子挿入物と、
（ｅ）ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素（ＷＰＲＥ）と、
（ｆ）ウシ成長ホルモンポリＡシグナルテールと、
（ｇ）ＡＡＶ２逆位末端反復（ＩＴＲ）と、を含む核酸を含むｒＡＡＶベクターと、
（ｉｉ）ＡＡＶ９キャプシドタンパク質と、を含む組替えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）と、以下のうちの一つまたは複数：
（Ａ）シロリムス、
（Ｂ）メチルプレドニゾロン、
（Ｃ）リツキシマブ、および
（Ｄ）プレドニゾン、と、を投与することを含む。
本明細書ではさらに、ＧＲＮ変異を有する前頭側頭型認知症を有するまたは有すると疑われる対象において免疫応答を抑制する方法が提供され、方法は、対象に、
（ｉ）５’から３’の順序で、
（ａ）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）２ＩＴＲと、
（ｂ）サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーと、
（ｃ）ニワトリベータアクチン（ＣＢＡ）プロモーターと、
（ｄ）プログラニュリン（ＰＧＲＮ）タンパク質をコードする導入遺伝子挿入物であって、配列番号６８のヌクレオチド配列を含む、導入遺伝子挿入物と、
（ｅ）ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素（ＷＰＲＥ）と、
（ｆ）ウシ成長ホルモンポリＡシグナルテールと、
（ｇ）ＡＡＶ２逆位末端反復（ＩＴＲ）と、を含む核酸を含むｒＡＡＶベクターと、
（ｉｉ）ＡＡＶ９キャプシドタンパク質と、を含む組替えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）と、以下のうちの一つまたは複数：
（Ａ）シロリムス、
（Ｂ）メチルプレドニゾロン、
（Ｃ）リツキシマブ、および
（Ｄ）プレドニゾン、と、を投与することを含む。
本明細書に提供される方法の一部の実施形態では、ｒＡＡＶが、大槽内への注射を介して投与される。
本明細書に提供される方法の一部の実施形態では、ｒＡＡＶが、約１×１０１３ベクターゲノム（ｖｇ）～約７×１０１４ｖｇの範囲の用量で対象に投与される。本明細書に提供される方法の一部の実施形態では、ｒＡＡＶが、約３．５×１０１３ｖｇ、約７．０×１０１３ｖｇ、または約１．４×１０１４ｖｇの用量で対象に投与される。
本明細書に提供される方法の一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、約２０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、約１ｍＭのＭｇＣｌ２、約２００ｍＭのＮａＣｌ、および約０．００１％ ｗ／ｖポロクサマー１８８を含有する製剤で投与される。
本明細書に提供される方法の一部の実施形態では、メチルプレドニゾロンが、ｒＡＡＶの投与の前日または同日のいずれかに、約１０００ｍｇの用量で静脈内投与される。
本明細書に提供される方法の一部の実施形態では、プレドニゾンは、（Ａ）約１０００ｍｇのメチルプレドニゾロンの投与の翌日に開始する１４日間、約３０ｍｇ／日の用量で、 （Ｂ）（Ａ）の１４日間の期間の終了後の７日間の間に漸減されて、経口投与される。
本明細書に提供される方法の一部の実施形態では、リツキシマブは、ｒＡＡＶの投与の１４日前から１日前の任意の一日に、約１０００ｍｇの用量で静脈内投与される。
本明細書に提供される方法の一部の実施形態では、メチルプレドニゾロンは、リツキシマブが投与される前に投与される。本明細書に提供される方法の一部の実施形態では、メチルプレドニゾロンは、リツキシマブが投与される少なくとも約３０分前に投与される。本明細書に提供される方法の一部の実施形態では、メチルプレドニゾロンおよびリツキシマブの両方が、ｒＡＡＶの投与の前日に投与され、メチルプレドニゾロンは、リツキシマブが投与される少なくとも約３０分前に投与される。本明細書に提供される方法の一部の実施形態では、リツキシマブは、ｒＡＡＶの投与の１４日前から２日前の間の任意の一日に投与され、メチルプレドニゾロンは、リツキシマブが投与されるのと同じ日のリツキシマブが投与される少なくとも３０分前に約１００ｍｇの用量で、静脈内投与される。
本明細書に提供される方法の一部の実施形態では、シロリムスは、（Ａ）ｒＡＡＶの投与の三日、二日、または一日前に約６ｍｇの単回投与として、および（Ｂ）ｒＡＡＶの投与後約９０日間、約４ｎｇ／ｍｌ～約９ｎｇ／ｍＬの血清トラフレベルを維持するように約２ｍｇ／日の用量で、経口投与され、シロリムスの約２ｍｇ／日の第一の用量は、シロリムスの約６ｍｇの単回投与の翌日に投与される。本明細書に提供される方法の一部の実施形態では、シロリムスの投与が、ｒＡＡＶの投与後９０日間の期間の終了後１５日～３０日の間に漸減される。
本明細書に提供される方法の一部の実施形態では、方法は、
（ｉ）約１０００ｍｇの用量でメチルプレドニゾロンを静脈内投与することと、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）のメチルプレドニゾロン投与の約３０分後に、約１０００ｍｇの用量でリツキシマブを静脈内投与することと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉ）のメチルプレドニゾロン投与の翌日に、注射を介して大槽内にｒＡＡＶを投与することと、
（ｉｖ）ステップ（ｉ）のメチルプレドニゾロン投与の翌日から１４日間、約３０ｍｇ／日の用量でプレドニゾンを経口投与することと、
（ｖ）ステップ（ｉｖ）の１４日間の期間の終了後の７日間、プレドニゾンを漸減投与することと、
（ｖｉ）ステップ（ｉｉｉ）のｒＡＡＶ投与の三日前、二日前、または一日前に、シロリムスを約６ｍｇの単回投与として経口投与することと、
（ｖｉｉ）ステップ（ｉｉｉ）のｒＡＡＶ投与後の約９０日間、約４ｎｇ／ｍｌ～約９ｎｇ／ｍＬの血清トラフレベルを維持するようにシロリムスを約２ｍｇ／日の用量で経口投与することであって、シロリムスの約２ｍｇ／日の第一の用量は、シロリムスの約６ｍｇの単回投与の翌日に投与することと、
（ｖｉｉｉ）ステップ（ｖｉｉ）の９０日間の期間の終了後の１５日～３０日の間にシロリムスを漸減投与することと、を含む。
本明細書に提供される方法の一部の実施形態では、方法は、
（ｉ）ステップ（ｉｖ）のｒＡＡＶ投与の１４日前～２日前の間の任意の一日に、約１００ｍｇの用量でメチルプレドニゾロンを静脈内投与することと、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）のメチルプレドニゾロン投与の約３０分後に、約１０００ｍｇの用量でリツキシマブを静脈内投与することと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｖ）のｒＡＡＶ投与の一日前または同日のいずれかに、約１０００ｍｇの用量でメチルプレドニゾロンを静脈内投与することと、
（ｉｖ）注射を介してｒＡＡＶを大槽内に投与することと、
（ｖ）ステップ（ｉｉｉ）の前記メチルプレドニゾロン投与の翌日から１４日間、約３０ｍｇ／日の用量で前記プレドニゾンを経口投与することと、
（ｖｉ）ステップ（ｖ）の前記１４日間の期間の終了後の７日間、前記プレドニゾンを漸減投与することと、
（ｖｉｉ）ステップ（ｉｖ）のｒＡＡＶ投与の三日前、二日前、または一日前に、シロリムスを約６ｍｇの単回投与として経口投与することと、
（ｖｉｉｉ）ステップ（ｉｖ）のｒＡＡＶ投与後の約９０日間、約４ｎｇ／ｍｌ～約９ｎｇ／ｍＬの血清トラフレベルを維持するようにシロリムスを約２ｍｇ／日の用量で経口投与することであって、シロリムスの約２ｍｇ／日の第一の用量は、約６ｍｇのシロリムスの単回投与の翌日に投与することと、
（ｉｘ）ステップ（ｖｉｉｉ）の９０日間の期間の終了後の１５日～３０日の間にシロリムスを漸減投与することと、を含む。
本明細書に提供される方法の一部の実施形態では、免疫応答は、ｒＡＡＶに対する免疫応答である。本明細書に提供される方法の一部の実施形態では、免疫応答は、Ｔセル応答である。本明細書に提供される方法の一部の実施形態では、免疫応答は、Ｂセル応答である。本明細書に提供される方法の一部の実施形態では、免疫応答は、抗体応答である。本明細書に提供される方法の一部の実施形態では、免疫応答は、プレオサイトーシスである。本明細書に提供される方法の一部の実施形態では、プレオサイトーシスは、脳脊髄液（ＣＳＦ）プレオサイトーシスである。本明細書に提供される方法の一部の実施形態では、免疫応答は、ＣＳＦタンパク質の異常なレベルである。
本明細書に提供される方法の一部の実施形態では、シロリムス、メチルプレドニゾロン、リツキシマブ、またはプレドニゾンではない追加の免疫抑制剤が、対象にさらに投与される。
本明細書では、対象においてＧＲＮ変異を有する前頭側頭型認知症を治療する方法で使用する、
（ｉ）プログラニュリン（ＰＧＲＮ）タンパク質をコードする導入遺伝子挿入物に動作可能に連結されたプロモーターを含む発現構築物を含む核酸を含むｒＡＡＶベクターであって、導入遺伝子挿入物が、配列番号６８のヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶベクターと、
（ｉｉ）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）９キャプシドタンパク質と、を含む組替えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）と、以下のうちの一つまたは複数、
（Ａ）シロリムス、
（Ｂ）メチルプレドニゾロン、
（Ｃ）リツキシマブ、および
（Ｄ）プレドニゾン、と、
の、併用療法剤が提供される。
本明細書ではさらに、ＧＲＮ変異を有する前頭側頭型認知症を有するまたは有すると疑われる対象において免疫応答を抑制する方法で使用する、
（ｉ）プログラニュリン（ＰＧＲＮ）タンパク質をコードする導入遺伝子挿入物に動作可能に連結されたプロモーターを含む発現構築物を含む核酸を含むｒＡＡＶベクターであって、導入遺伝子挿入物が、配列番号６８のヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶベクターと、
（ｉｉ）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）９キャプシドタンパク質と、を含む組替えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）と、以下のうちの一つまたは複数、
（Ａ）シロリムス、
（Ｂ）メチルプレドニゾロン、
（Ｃ）リツキシマブ、および
（Ｄ）プレドニゾン、と、
の併用療法剤が提供される。
一部の実施形態では、本明細書の併用療法剤は、約１×１０１３ｖｇ～約７×１０１４ｖｇのｒＡＡＶを含む。一部の実施形態では、本明細書に提供される併用療法剤は、約３．５×１０１３ｖｇ、約７．０×１０１３ｖｇ、または約１．４×１０１４ｖｇのｒＡＡＶを含む。
図１は、Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部）をコードする発現構築物を含むベクターの一実施形態を描写する概略図である。
図２は、Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部）およびＬＩＭＰ２（ＳＣＡＲＢ２）またはその一部をコードする発現構築物を含むベクターの一実施形態を描写する概略図である。ＧｃａｓｅおよびＬＩＭＰ２のコード配列は、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）によって分離されている。
図３は、Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部）およびＬＩＭＰ２（ＳＣＡＲＢ２）またはその一部をコードする発現構築物を含むベクターの一実施形態を描写する概略図である。ＧｃａｓｅおよびＬＩＭＰ２のコード配列の発現はそれぞれ、別個のプロモーターによって駆動される。
図４は、Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部）、ＬＩＭＰ２（ＳＣＡＲＢ２）またはその一部、およびα－Ｓｙｎのための干渉ＲＮＡをコードする発現構築物を含むベクターの一実施形態を描写する概略図である。
図５は、Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部）、プロサポシン（例えば、ＰＳＡＰまたはその一部）、およびα－Ｓｙｎのための干渉ＲＮＡをコードする発現構築物を含むベクターの一実施形態を描写する概略図である。
図６は、Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部）およびプロサポシン（例えば、ＰＳＡＰまたはその一部）をコードする発現構築物を含むベクターの一実施形態を描写する概略図である。Ｇｃａｓｅおよびプロサポシンのコード配列は、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）によって分離されている。
図７は、Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部）をコードする発現構築物を含むベクターの一実施形態を描写する概略図である。この実施形態では、ベクターは、ヒトＧＢＡ１のコドン最適化コード配列を構成的に発現するための、ＣＭＶエンハンサー（ＣＭＶｅ）、ＣＢＡプロモーター（ＣＢＡｐ）、エクソン１、およびイントロン（ｉｎｔ）の四つの部分からなるＣＢＡプロモーターエレメント（ＣＢＡ）を含む。３’領域はまた、ＷＰＲＥ調節要素とそれに続くｂＧＨポリＡテールを含む。三つの転写制御活性化部位が、プロモーター領域の５’末端である ＴＡＴＡ、ＲＢＳ、およびＹＹ１、に含まれる。隣接ＩＴＲｓは、介在配列の正しいパッケージングを可能にする。５’ＩＴＲ配列（はめ込みボックス）の二つのバリアントを評価した。これらは、野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲの２０－ヌクレオチド「Ｄ」領域内にいくつかのヌクレオチド差を有する。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、上段に示される「Ｄ」ドメインヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、変異型「Ｄ」ドメイン（例えば、ヌクレオチド変化が下段に示される「Ｓ」ドメイン）を含む。
図８は、図６で示されたベクターの一実施形態を描写する概略図である。
図９は、パーキンソン病のＣＢＥマウスモデルにおけるＧｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部分）をコードする導入遺伝子を含むｒＡＡＶの送達のための代表的なデータを示す。Ｐ８で開始された、ＰＢＳビヒクル、２５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥ、３７．５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥ、または５０ｍｇ／ｋｇのＣＢＥ（左から右）の毎日のＩＰ送達。生存（左上）を一日二回、体重（右上）を毎日チェックした。すべての群は、ｎ＝８で開始した。行動は、Ｐ２３のオープンフィールド（左下）での移動総距離、およびＰ２４のロータロッドでの落下潜時（下中央）によって評価された。ＧＣａｓｅ基質のレベルは、ＣＢＥ離脱のある（３日目）およびなし（１日目）の両方で、ＰＢＳおよび２５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥ処置群のマウスの皮質中で分析された。凝集ＧｌｕＳｐｈおよびＧａｌＳｐｈレベル（右下）は、組織の湿重量ｍｇ当たりｐｍｏｌとして示される。平均値を提示する。エラーバーはＳＥＭである。線形回帰による処置群に対する名目上のｐ値、＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。 同上。
図１０は、ＣＢＥマウスモデルにおける最大ｒＡＡＶの用量のための試験デザインの一実施形態を描写する概略図である。手短に、ｒＡＡＶは、Ｐ３でＩＣＶ注射により送達され、Ｐ８で毎日のＣＢＥ処置が開始された。行動は、Ｐ２４～２５にオープンフィールドおよびロータロッドアッセイで評価され、基質レベルは、Ｐ３６およびＰ３８で測定された。
図１１は、ＣＢＥマウスモデルにおける最大ｒＡＡＶ用量の生存中の評価のための代表的なデータを示す。Ｐ３では、マウスをＩＣＶ送達を介して賦形剤または８．８ｅ９ｖｇ ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１のいずれかで処置した。ＰＢＳまたは２５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥのいずれかの毎日のＩＰ送達を、Ｐ８で開始した。試験終了時、マウスの半数が、Ｐ３６（１日目）での最後のＣＢＥ投与の一日後に犠牲となり、残りの半数はＰ３８（３日目）に犠牲となる前に３日間のＣＢＥ離脱を経た。すべての処置群（賦形剤＋ＰＢＳ ｎ＝８、ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１＋ＰＢＳ ｎ＝７、賦形剤＋ＣＢＥ ｎ＝８、およびバライアント＋ＣＢＥ ｎ＝９）を毎日計量し（左上）、およびＰ３６での重量を分析した（右上）。行動を、Ｐ２３でのオープンフィールドで移動した総距離（左下）およびＰ２４でのロータロッドでの落下潜時（右下）によって評価し、各動物について、３つの試験にわたる中央値として評価した。致死性のため、行動アッセイについては賦形剤＋ＣＢＥ群はｎ＝７、その他の群についてはｎ＝８である。動物にわたる平均を提示する。エラーバーはＳＥＭである。ＣＢＥ処置動物における線形回帰による処置群に対する名目上のｐ値、＊ｐ＜０．０５；＊＊＊ｐ＜０．００１。 同上。 同上。
図１２は、ＣＢＥマウスモデルにおける最大ｒＡＡＶ用量の生化学的評価のための代表的なデータを示す。全ての処置群の皮質（賦形剤＋ＰＢＳ ｎ＝８、バリアント＋ＰＢＳ ｎ＝７、賦形剤＋ＣＢＥ ｎ＝７、およびバリアント＋ＣＢＥ ｎ＝９）を使用して、ＧＣａｓｅ活性（左上）、ＧｌｕＳｐｈレベル（右上）、ＧｌｕＣｅｒレベル（左下）、およびベクターゲノム（右下）を、ＣＢＥ離脱の前（１日目）または後（３日目）に群内で測定した。生体内分布は、１μｇのゲノムＤＮＡ当たりのベクターゲノムとして示されている。平均値を提示する。エラーバーはＳＥＭである。ＣＢＥ処置動物における線形回帰による処置群に対する名目上のＰ値、（＊）Ｐ＜０．１；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１、収集日および性別は共変量として補正した。 同上。
図１３は、賦形剤＋ＰＢＳ、賦形剤＋ＣＢＥ、およびバリアント＋ＣＢＥ処置群の投与後のＣＢＥマウスモデルにおける行動学的および生化学的相関の代表的なデータを示す。処置群全体にわたり、ロータロッドでのパフォーマンスは、ＧｌｕＣｅｒ蓄積と負に相関し（Ａ、線形回帰によるｐ＝０．００１２）、ＧｌｕＳｐｈ蓄積は、ＧＣａｓｅ活性の増加と負に相関した（Ｂ、線形回帰によるｐ＝０．００８６）。
図１４は、ＣＢＥマウスモデルにおけるバリアントの生体内分布の代表的なデータを示す。ベクターゲノムの存在を、すべての処置群について肝臓、脾臓、腎臓、および性腺で評価した（賦形剤＋ＰＢＳ ｎ＝８、バリアント＋ＰＢＳ ｎ＝７、賦形剤＋ＣＢＥ ｎ＝７、およびバリアント＋ＣＢＥ ｎ＝９）。生体内分布は、１μｇのゲノムＤＮＡ当たりのベクターゲノムとして示されている。ベクターゲノムの存在は、ベクター参照標準曲線を使用して定量的ＰＣＲによって定量化され、ゲノムＤＮＡ濃度は、Ａ２６０光学密度測定によって評価された。平均値を提示する。エラーバーはＳＥＭである。採取日および性別は共変量として補正された、ＣＢＥ処置動物における線形回帰による処置群に対する名目上のｐ値、＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。 同上。
図１５は、ＣＢＥマウスモデルにおけるｒＡＡＶ用量範囲の生存中の評価のための代表的なデータを示す。マウスは、Ｐ３において、ＩＣＶ送達により賦形剤または、３．２ｅ９ｖｇ、１．０ｅ１０ｖｇ、または３．２ｅ１０ｖｇの三つの異なる用量のｒＡＡＶ－ＧＢＡ１の一つを受けた。Ｐ８で、２５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥの毎日のＩＰ処置が開始された。賦形剤およびＣＢＥまたは賦形剤およびＰＢＳを投与されたマウスが、対照としての役目を果たした。すべての処置群は、群当たりｎ＝１０（５Ｍ／５Ｆ）で開始した。すべてのマウスは、ＣＢＥ最終投与の一日後、犠牲となった（Ｐ３８～Ｐ４０）。すべての処置群を毎日計量し、およびそれらの重量をＰ３６で分析した。運動能力は、Ｐ２４のロータロッドでの落下潜時およびＰ３０でのテーパービームの横断潜時によって評価された。早期致死性のため、行動アッセイに参加したマウスの数は、賦形剤＋ＰＢＳ ｎ＝１０、賦形剤＋ＣＢＥ ｎ＝９、および３．２ｅ９ｖｇ ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１＋ ＣＢＥ ｎ＝６、１．０ｅ１０ｖｇ ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１＋ＣＢＥ ｎ＝１０、３．２ｅ１０ｖｇ ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１＋ＣＢＥ ｎ＝７であった。平均値を提示する。エラーバーはＳＥＭ、性別を共変量として補正された、ＣＢＥ処置群における線形回帰による名目Ｐ値は、＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１。 同上。
図１６は、ＣＢＥマウスモデルにおけるｒＡＡＶ用量範囲の生化学的評価のための代表的なデータを示す。全ての処置群の皮質（賦形剤＋ＰＢＳ ｎ＝１０、賦形剤＋ＣＢＥ ｎ＝９、および３．２ｅ９ｖｇ ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１＋ＣＢＥ ｎ＝６、１．０ｅ１０ｖｇ ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１＋ＣＢＥ ｎ＝１０、３．２ｅ１０ｖｇ ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１＋ＣＢＥ ｎ＝７）を使用して、ＧＣａｓｅ活性、ＧｌｕＳｐｈレベル、ＧｌｕＣｅｒレベル、およびベクターゲノムを測定した。ＧＣａｓｅ活性は、総タンパク質ｍｇ当たりのＧＣａｓｅのｎｇとして示されている。ＧｌｕＳｐｈおよびＧａｌＳｐｈレベルは、組織の湿重量ｍｇ当たりｐｍｏｌとして示される。生体内分布は、１μｇのゲノムＤＮＡ当たりのベクターゲノムとして示されている。ベクターゲノムの存在は、ベクター参照標準曲線を使用して定量的ＰＣＲによって定量化され、ゲノムＤＮＡ濃度は、Ａ２６０光学密度測定によって評価された。ベクターゲノムの存在も肝臓（Ｅ）で測定された。平均値を提示する。エラーバーはＳＥＭ。ＣＢＥ処置群における線形回帰による名目Ｐ値は、性別を共変量として補正して、＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。 同上。
図１７は、遺伝的マウスモデルでの最大用量ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１におけるテーパービーム分析のための代表的なデータを示す。処置群（ＷＴ＋賦形剤、ｎ＝５）、４Ｌ／ＰＳ－ＮＡ＋賦形剤（ｎ＝６）、および４Ｌ／ＰＳ－ＮＡ＋ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１（ｎ＝５））の運動能力を、ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１投与の４週間後、ビームウォークにより評価した。合計スリップおよび有効時間は、異なるビームでの５回の試行の合計として示されている。速度および速度当たりのスリップは、異なるビームでの５回の試行の平均として示されている。平均値を提示する。エラーバーはＳＥＭ。 同上。
図１８は、プログラニュリン（ＰＧＲＮ）タンパク質をコードするｒＡＡＶ構築物のインビトロ発現のための代表的なデータを示す。左のパネルは、プログラニュリン（ＰＧＲＮ）ＥＬＩＳＡアッセイの標準曲線を示す。下のパネルは、ｒＡＡＶで形質導入されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の細胞溶解物におけるＥＬＩＳＡアッセイによって測定されたＰＧＲＮ発現の用量反応を示す。ＭＯＩ＝感染の多重度（細胞当たりのベクターゲノム）。
図１９は、プロサポシン（ＰＳＡＰ）、ＳＣＡＲＢ２、および／または一つまたは複数の阻害性核酸と組み合わせたＧＢＡ１をコードするｒＡＡＶ構築物のインビトロ発現の代表的なデータを示す。データは、各構築物を用いたＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクションが、モックトランスフェクト細胞と比較して対象の導入遺伝子の過剰発現をもたらしたことを示す。 同上。 同上。
図２０は、ＩＴＲの「外側」（例えば、導入遺伝子挿入物または発現構築物と比較してＩＴＲの終端の近位）（上側）に位置する「Ｄ」領域と、ベクターの「内側」にＩＴＲｓを有する野生型ｒＡＡＶベクター（例えば、ベクターの導入遺伝子挿入物の近位）と、を含むｒＡＡＶベクターを描写する概略図である。
図２１は、ＧＢＡ２またはその一部、およびα－Ｓｙｎのための干渉ＲＮＡをコードする発現構築物を含むベクターの一実施形態を描写する概略図である。
図２２は、Ｇｃａｓｅ（ＧＢＡ１またはその一部）およびガラクトシルセラミターゼ（例えば、ＧＡＬＣまたはその一部）をコードする発現構築物を含むベクターの一実施形態を描写する概略図である。Ｇｃａｓｅおよびガラクトシルセラミターゼのコード配列の発現は、Ｔ２Ａ自己切断ペプチド配列によって分離される。
図２３は、Ｇｃａｓｅ（ＧＢＡ１またはその一部）およびガラクトシルセラミターゼ（例えば、ＧＡＬＣまたはその一部）をコードする発現構築物を含むベクターの一実施形態を描写する概略図である。Ｇｃａｓｅおよびガラクトシルセラミターゼのコード配列の発現は、Ｔ２Ａ自己切断ペプチド配列によって分離される。
図２４は、Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部）、カテプシンＢ（例えば、ＣＴＳＢまたはその一部）、およびα－Ｓｙｎのための干渉ＲＮＡをコードする発現構築物を含むベクターの一実施形態を描写する概略図である。ＧｃａｓｅおよびカテプシンＢのコード配列の発現は、Ｔ２Ａ自己切断ペプチド配列によって分離される。
図２５は、Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部）、スフィンゴミエリンホスホジエステラーゼ１（例えば、ＳＭＰＤ１またはその一部）、およびα－Ｓｙｎのための干渉ＲＮＡをコードする発現構築物を含むベクターの一実施形態を描写する概略図である。
図２６は、Ｇｃａｓｅ（ＧＢＡ１またはその一部）およびガラクトシルセラミターゼ（例えば、ＧＡＬＣまたはその一部）をコードする発現構築物を含むベクターの一実施形態を描写する概略図である。Ｇｃａｓｅおよびガラクトシルセラミターゼのコード配列は、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）によって分離されている。
図２７は、Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部）およびカテプシンＢ（例えば、ＣＴＳＢまたはその一部）をコードする発現構築物を含むベクターの一実施形態を描写する概略図である。ＧｃａｓｅおよびカテプシンＢのコード配列の発現はそれぞれ、別個のプロモーターによって駆動される。
図２８は、Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部）、ＧＣＨ１（例えば、ＧＣＨ１またはその一部）、およびα－Ｓｙｎのための干渉ＲＮＡをコードする発現構築物を含むベクターの一実施形態を描写する概略図である。ＧｃａｓｅおよびＧＣＨ１のコード配列は、Ｔ２Ａ自己切断ペプチド配列によって分離される。
図２９は、Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部）、ＲＡＢ７Ｌ１（例えば、ＲＡＢ７Ｌ１またはその一部）、およびα－Ｓｙｎのための干渉ＲＮＡをコードする発現構築物を含むベクターの一実施形態を描写する概略図である。ＧｃａｓｅおよびＲＡＢ７Ｌ１のコード配列は、Ｔ２Ａ自己切断ペプチド配列によって分離される。
図３０は、Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部）、ＧＣＨ１（例えば、ＧＣＨ１またはその一部）、およびα－Ｓｙｎのための干渉ＲＮＡをコードする発現構築物を含むベクターの一実施形態を描写する概略図である。ＧｃａｓｅおよびＧＣＨ１のコード配列の発現は、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）である。
図３１は、ＶＰＳ３５（例えば、ＶＰＳ３５またはその一部）およびα－ＳｙｎおよびＴＭＥＭ１０６Ｂのための干渉ＲＮＡｓをコードする発現構築物を含むベクターの一実施形態を描写する概略図である。
図３２は、Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部）、ＩＬ－３４（例えば、ＩＬ３４またはその一部）、およびα－Ｓｙｎのための干渉ＲＮＡをコードする発現構築物を含むベクターの一実施形態を描写する概略図である。ＧｃａｓｅおよびＩＬ－３４のコード配列は、Ｔ２Ａ自己切断ペプチド配列によって分離される。
図３３は、Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部）およびＩＬ－３４（例えば、ＩＬ３４またはその一部）をコードする発現構築物を含むベクターの一実施形態を描写する概略図である。ＧｃａｓｅおよびＩＬ－３４のコード配列は、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）によって分離されている。
図３４は、Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部）およびＴＲＥＭ２（例えば、ＴＲＥＭ２またはその一部）をコードする発現構築物を含むベクターの一実施形態を描写する概略図である。ＧｃａｓｅおよびＴＲＥＭ２のコード配列の発現はそれぞれ、別個のプロモーターによって駆動される。
図３５は、Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部）およびＩＬ－３４（例えば、ＩＬ３４またはその一部）をコードする発現構築物を含むベクターの一実施形態を描写する概略図である。ＧｃａｓｅおよびＩＬ－３４のコード配列の発現はそれぞれ、別個のプロモーターによって駆動される。
図３６Ａ～図３６Ｂは、ｑＰＣＲおよびＥＬＩＳＡによって測定された、対照形質導入細胞と比較しての、ＨＥＫ２９３細胞におけるＴＲＥＭ２およびＧＢＡ１の過剰発現に関する代表的なデータを示す。図３６Ａは、ＴＲＥＭ２の過剰発現のデータを示す。図３６Ｂは、同じ構築物からのＧＢＡ１の過剰発現のデータを示す。
図３７は、ＧＦＰレポーターアッセイ（上）およびα－Ｓｙｎアッセイ（下）による、インビトロでのＳＮＣＡのサイレンシングの成功を示す代表的なデータを示す。
図３８は、ＧＦＰレポーターアッセイ（上）およびα－Ｓｙｎアッセイ（下）による、インビトロでのＴＭＥＭ１０６Ｂのサイレンシングの成功を示す代表的なデータを示す。
図３９は、ＰＧＲＮをコードする発現構築物を含むベクターの一実施形態を描写する概略図である。
図４０は、「Ｄ」配列の野生型（円）または代替（例えば、「外側」、正方形）配置を有するＩＴＲｓを有するｒＡＡＶｓを使用するＨＥＫ２９３細胞の形質導入のデータを示す。「外側」に配置されたＩＴＲｓを有するｒＡＡＶｓは、野生型ＩＴＲｓを有するｒＡＡＶｓと同様に効率的に細胞を形質導入することができた。
図４１は、Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部）をコードする発現構築物を含むベクターの一実施形態を描写する概略図である。
図４２は、Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部）をコードする発現構築物を含むベクターの一実施形態を描写する概略図である。
図４３は、Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部）およびα－Ｓｙｎのための干渉ＲＮＡをコードする発現構築物を含むベクターの一実施形態を描写する概略図である。
図４４は、ＰＧＲＮをコードする発現構築物を含むベクターの一実施形態を描写する概略図である。
図４５は、ＰＧＲＮをコードする発現構築物を含むベクターの一実施形態を描写する概略図である。
図４６は、ＰＧＲＮをコードする発現構築物と、微小管関連タンパク質タウ（ＭＡＰＴ）の干渉ＲＮＡとを含むベクターの一実施形態を描写する概略図である。
図４７は、Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部）およびα－Ｓｙｎのための干渉ＲＮＡをコードする発現構築物を含むベクターの一実施形態を描写する概略図である。
図４８は、ＰＳＡＰをコードする発現構築物を含むベクターの一実施形態を描写する概略図である。
図４９は、Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部）をコードする発現構築物を含むベクターの一実施形態を描写する概略図である。
図５０は、Ｇｃａｓｅ（ＧＢＡ１またはその一部）およびガラクトシルセラミターゼ（例えば、ＧＡＬＣまたはその一部）をコードする発現構築物を含むベクターの一実施形態を描写する概略図である。
図５１は、Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部）、プロサポシン（例えば、ＰＳＡＰまたはその一部）、およびα－Ｓｙｎのための干渉ＲＮＡをコードする発現構築物を含むｒＡＡＶベクターを含むプラスミドの一実施形態を描写する概略図である。
図５２Ａは、ＦＴＤ－ＧＲＮ変異を有する患者からのｉＰＳＣ由来神経幹細胞（ＮＳＣ）株が、健康な対照対象に由来するＮＳＣ株よりもプログラニュリンの分泌が少ないことを示す。対応のないｔ検定によって統計を決定した、＊＝ｐ＜０．０５，＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１。データは、平均±ＳＥＭとして表される。
図５２Ｂは、ＦＴＤ－ＧＲＮ変異担体神経培養における用量範囲ＰＲ００６Ａ遺伝子導入の結果を示す。ＮＳＣを等密度で播種し、ニューロンに分化させた。７日目に、ニューロンを賦形剤または指示量のＰＲ００６Ａで７２時間形質導入した。分泌プログラニュリン発現を、ＥＬＩＳＡにより細胞培地から測定し、体積（ｎ＝３～４；平均±ＳＥＭ）に対して正規化した。黒色の破線は、対照ニューロン（賦形剤処置）からの分泌プログラニュリンの内因性レベルを表す。分泌プログラニュリンは、賦形剤処置ＦＴＤ－ＧＲＮニューロンでは検出できなかった。統計をＡＮＯＶＡに続いてテューキー検定を用いて決定し、各条件の賦形剤処置対照ニューロンとの統計的比較をグラフ上に示す、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＊＝ｐ＜０．００１。ＬＬＯＱ＝定量下限、ＭＯＩ＝感染の多重度。
図５２Ｃは、ＰＲ００６による神経培養の処置により、ＦＴＤ－ＧＲＮ神経培養における重要なリソソームプロテアーゼであるカテプシンＤの成熟不良が救済されたことを示す。ＮＳＣを等濃度で播種し、ニューロンに分化させた。７日目に、５．３×１０５のＭＯＩで、賦形剤またはＰＲ００６Ａを用いてニューロンを７２時間形質導入した。ニューロンを溶解し、タンパク質シンプルウェスタンＪｅｓｓシステムで、抗カテプシンＤ（ＣＴＳＤ）一次抗体を用いて溶解物を分析した。成熟カテプシンＤ（ｍａｔＣＴＳＤ）およびプロカテプシンＤ（ｐｒｏＣＴＳＤ）の両方に対応するバンドを検出し、曲線下面積を各バンドに対して定量化し、内部総タンパク質正規化シグナルに正規化した。賦形剤またはＰＲ００６Ａ処置ＦＴＤ－ＧＲＮニューロンにおけるｍａｔＣＴＳＤ／ｐｒｏＣＴＳＤ比を決定した。ｙ軸は、賦形剤処置対照ニューロンの比率（ｎ＝３；平均±ＳＥＭ）のパーセントとしてのｍａｔＣＴＳＤ／ｐｒｏＣＴＳＤ比を示す。統計は、対応のあるｔ検定を使用して決定された、＊＝ｐ＜０．０５。
図５２Ｄおよび図５２Ｆは、ＰＲ００６Ａが、ＦＴＤ－ＧＲＮ神経培養においてＴＤＰ－４３病理を減少させることを示す。ＮＳＣを等濃度で播種し、ニューロンに分化させた。７日目に、５．３×１０５のＭＯＩで賦形剤またはＰＲ００６Ａを用いてニューロンを形質導入し、形質導入の２１日後に収集した。図５２Ｄ：ニューロンを溶解し、トリトン－Ｘ不溶性タンパク質画分を単離し、抗－ＴＤＰ－４３抗体（＃１２８９２－ＡＰ－１）を用いてタンパク質シンプルウェスタンＪｅｓｓシステムで分析した。ＴＤＰ－４３に対応するバンドを検出し、曲線下面積を各バンドに対して定量化し、不溶性画分の総タンパク質濃度に正規化した。ｙ軸は、各ＦＴＤ－ＧＲＮ細胞株（ｎ＝３、平均±ＳＥＭ）に対して別々に正規化された賦形剤処理レベルのパーセントとしての不溶性ＴＤＰ－４３の量を示す。図５２Ｄは、ＦＴＤ－ＧＲＮ神経培養における、ＦＴＤ－ＧＲＮ病理の特徴である不溶性ＴＤＰ－４３をＰＲ００６処置が減少させたことを示す。図５２Ｆ：ＰＲ００６Ａで処置されたｉＰＳＣ由来ニューロンの免疫蛍光画像からの核ＴＤＰ－４３シグナルの定量化。賦形剤またはＰＲ００６Ａで処置されたＦＴＤ－ＧＲＮニューロンにおける核当たりのＴＤＰ－４３シグナル強度を決定した。ｙ軸は、賦形剤で処置された対照ニューロンの核当たりのＴＤＰ－４３シグナル強度のパーセントとして、核当たりのＴＤＰ－４３シグナル強度を示す（ｎ＝１４５～３０６細胞、平均±ＳＥＭ）。ＴＤＰ－４３を抗－ＴＤＰ－４３抗体（＃１２８９２－ＡＰ－１）を使用して測定し、核領域をＤＡＰＩ染色によって決定した。図５２Ｆは、ＰＲ００６処置が、ＦＴＤ－ＧＲＮ神経培養における核ＴＤＰ－４３発現レベルを、ほぼ野生型対照レベルまで増加させたことを示す。対応のないｔ検定によって統計を決定した、＊＝ｐ＜０．０１，＊＊＝ｐ＜０．００１。
図５２Ｅは、ＦＴＤ－ＧＲＮ変異を有する患者からのｉＰＳＣ由来ＮＳＣ株は、健康な対照対象に由来するＮＳＣ株よりもプログラニュリンの分泌が少ないことを示す。対応のないｔ検定によって統計を決定した、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１。データは、平均±ＳＥＭとして表される。
図５２Ｇは、ヒトＦＴＤ－ＧＲＮおよびヒト対照細胞株からの神経幹細胞（ＮＳＣ）株が、神経培養に首尾よく分化されたことを示す一連の画像である。対照およびＦＴＤ－ＧＲＮのＮＳＣ株（ＦＴＤ－ＧＲＮ ＃１およびＦＴＤ－ＧＲＮ ＃２）は、細胞形態およびニューロンマーカーの免疫蛍光染色によって示されるように、７日後に、ニューロンに分化された（ＮｅｕＮ［赤］；左に標識されたＭＡＰ２またはＴａｕ［緑］）。ＤＡＰＩ（青色）を使用して核を染色した。
図５３Ａ～図５３Ｃは、成体用量範囲ＰＲ００６Ａ ＦＴＤ－ＧＲＮマウスモデル研究において、ＣＮＳにおける生体内分布およびプログラニュリン発現を分析する実験の結果を示す一連の棒グラフである。４か月齢のＧｒｎ ＫＯマウスに、ＩＣＶ投与によりＰＲ００６Ａまたは賦形剤を投与した。それらは、ＣＮＳの生化学的評価項目についての、賦形剤（赤色）、または１．１×１０９ｖｇ（２．７×１０９ｖｇ／ｇ脳）、１．１×１０１０ｖｇ（２．７×１０１０ｖｇ／ｇ脳）、または１．１×１０１１ｖｇ（２．７×１０１１ｖｇ／ｇ脳）（青色）の用量でのＰＲ００６Ａを用いた処置の３か月後に、犠牲となった。図５３Ａ：ベクターゲノムの存在を大脳皮質および脊髄で評価し、生体内分布を、対数スケール（ｎ＝８～１０／群、平均±ＳＥＭ）でｇＤＮＡ１μｇ当たりのベクターゲノムとして示す。ベクターゲノムの存在は、ベクター参照標準曲線を使用してｑＰＣＲによって定量化された。破線（５０ベクターゲノム／μｇ ｇＤＮＡ）は、陽性ベクターの存在に対する閾値を表す。図５３Ｂ：ＰＲ００６ＡがコードするＧＲＮ ＲＮＡ発現を、大脳皮質の定量的ＲＴ－ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）により評価した（ｎ＝８～１０／群、平均±ＳＥＭ）。ＧＲＮコピー数（我々のコドン最適化ＰＲ００６Ａ配列に特異的）は、総ＲＮＡの１μｇに正規化され、対数スケールで示されている。図５３Ｃ：プログラニュリンタンパク質レベルを、脳および脊髄中のヒト特異的プログラニュリンＥＬＩＳＡを使用して測定した（ｎ＝８～１０／群、平均±ＳＥＭ）。組織プログラニュリンレベルを、総タンパク質濃度に正規化した。定量下限（ＬＬＯＱ）は、灰色の破線で示される。組織ＥＬＩＳＡアッセイについては、アッセイＬＬＯＱ（ｎｇ／ｍＬ）を、全サンプルからの総タンパク質濃度平均で割ることによって、ＬＬＯＱ（ｎｇ／ｍｇ）値を決定する。エラーバーのないｘ軸上の処置群の凡例の色に対応する単純な線は、その群のすべての動物が０であったことを示す。統計解析を、ＡＮＯＶＡ、続いてダネット検定を用いて行い、その後、賦形剤処置理Ｇｒｎ ＫＯマウス群と比較した、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１。ｖｇ＝ベクターゲノム；ＬＬＯＱ＝定量下限；ＳＣ＝脊髄。
図５３Ｄ～図５３Ｅは、成体用量範囲ＰＲ００６Ａ ＦＴＤ－ＧＲＮマウスモデル試験において、末梢組織生体内分布およびプログラニュリン発現を分析する実験の結果を示す一連の棒グラフである。４か月齢のＧｒｎ ＫＯマウスに、ＩＣＶ投与によりＰＲ００６Ａまたは賦形剤を与えた。それらは、肝臓、心臓、肺、腎臓、脾臓、および性腺の生化学的評価項目についての、賦形剤（赤色）または１．１×１０９ｖｇ（２．７×１０９ｖｇ／ｇ脳）、１．１×１０１０ｖｇ（２．７×１０１０ｖｇ／ｇ脳）、または１．１×１０１１ｖｇ（２．７×１０１１ｖｇ／ｇ脳）の用量でのＰＲ００６Ａ（青色）を用いた処置の３か月後に、犠牲となった。図５３Ｄ：ベクターゲノムの存在を評価し、生体内分布を、ｇＤＮＡ１μｇ当たりのベクターゲノムとして対数スケールで示す（ｎ＝８～１０／群、平均±ＳＥＭ）。ベクターゲノムの存在は、ベクター参照標準曲線を使用してｑＰＣＲによって定量化された。破線（５０ベクターゲノム／μｇ ｇＤＮＡ）は、陽性ベクターの存在に対する閾値を表す。図５３Ｅ：プログラニュリンタンパク質レベルを、ＥＬＩＳＡを使用して測定した（ｎ＝８～１０／群、平均±ＳＥＭ）。組織プログラニュリンレベルを、総タンパク質濃度に正規化した。エラーバーのないｘ軸上の処置群の凡例の色に対応する単純な線は、その群のすべての動物が０であったことを示す。統計解析を、ＡＮＯＶＡ、続いてダネット検定を用いて行い、賦形剤処理したＧｒｎ ＫＯマウス群と比較した、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＊＝ｐ＜０．００１。ｖｇ＝ベクターゲノム。
図５３Ｆは、成体用量範囲ＰＲ００６Ａ ＦＴＤ－ＧＲＮマウスモデル試験において、血漿におけるプログラニュリンレベルを分析する実験の結果を示す棒グラフである。４か月齢のＧｒｎ ＫＯマウスに、ＩＣＶ投与によりＰＲ００６Ａまたは賦形剤を投与した。それらは、血漿の生化学的評価項目についての、賦形剤（赤色）または１．１×１０９ｖｇ（２．７×１０９ｖｇ／ｇ脳）、１．１×１０１０ｖｇ（２．７×１０１０ｖｇ／ｇ脳）、または１．１×１０１１ｖｇ（２．７×１０１１ｖｇ／ｇ脳）の用量でのＰＲ００６Ａ（青色）を用いた処置の３か月後に、犠牲となった。プログラニュリンタンパク質レベルを、血漿中のヒト特異的プログラニュリンＥＬＩＳＡを使用して測定した（ｎ＝８～１０／群、平均±ＳＥＭ）。血漿レベルは、対数スケールで示されている。定量下限（ＬＬＯＱ）は、灰色の破線で示される。統計解析を、ＡＮＯＶＡ、続いてダネット検定を用いて行い、賦形剤処置Ｇｒｎ ＫＯマウス群と比較した、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１。ＬＬＯＱ＝定量下限。ｖｇ＝ベクターゲノム。
図５３Ｇ～図５３Ｈは、成体用量範囲ＰＲ００６Ａ ＦＴＤ－ＧＲＮ成体マウスモデル研究において、リソソーム欠損および神経病理学的欠損の減少を示した実験の結果を示す一連の棒グラフである。４か月齢のＧｒｎ ＫＯマウスに、ＩＣＶ投与によりＰＲ００６Ａまたは賦形剤を投与した。それらは、賦形剤（赤色）または１．１×１０９ｖｇ（２．７×１０９ｖｇ／ｇ脳）、１．１×１０１０ｖｇ（２．７×１０１０ｖｇ／ｇ脳）、または１．１×１０１１ｖｇ（２．７×１０１１ｖｇ／ｇ脳）の用量でのＰＲ００６Ａ（青色）を用いた処置の３か月後に、分析のために犠牲となった。リポフスチン症は、（１）病理学者によるＨ＆Ｅ染色脳切片のスコアリング、および（２）ＩＨＣ切片からのリポフスチン自己蛍光の定量化という二つの独立した方法によって分析された。図５３Ｇ：リポフスチン蓄積（自己蛍光リポフスチン顆粒）は、以下の等級分類に従って、盲検化された委員会認定病理学者によって、異なる脳領域のＨ＆Ｅ染色切片で半定量的にスコア付けされた。０＝リポフスチンは観察されなかった。１＝領域全体に散在するリポフスチンの非常に小さな顆粒（＜２μｍ）、２＝小さな顆粒の蓄積密度の増加、および／またはより大きな顆粒（＞２－３ｕｍ）の発達；３＝低倍率対物レンズから視認できる高密度のリポフスチン顆粒を含む多焦点領域；４＝リポフシンの広範な蓄積。大脳皮質、海馬、および視床／視床下部脳領域のリポフスチン重症度スコアを示す（ｎ＝８～１０／群）。図５３Ｈ：ユビキチンのＩＨＣ分析を行い、大脳皮質、海馬、および視床で定量化した。閾値を超える免疫応答性物体のサイズ（免疫応答性物体サイズ［μｍ２］）は、ユビキチンについて示されている（ｎ＝８～１０／群、平均±ＳＥＭ）。統計は、ＡＮＯＶＡによって決定され、その後、ダネット検定により、賦形剤処置Ｇｒｎ ＫＯマウス群と比較した、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１。ｖｇ＝ベクターゲノム；ＷＴ＝野生型。
図５３Ｉ～図５３Ｋは、成体用量範囲ＰＲ００６Ａ ＦＴＤ－ＧＲＮマウスモデル研究において、神経炎症マーカーの減少を示した実験の結果を示す一連の棒グラフである。４か月齢のＧｒｎ ＫＯマウスに、ＩＣＶ投与によりＰＲ００６Ａまたは賦形剤を投与した。それらは、賦形剤（赤色）または１．１×１０９ｖｇ（２．７×１０９ｖｇ／ｇ脳）、１．１×１０１０ｖｇ（２．７×１０１０ｖｇ／ｇ脳）、または１．１×１０１１ｖｇ（２．７×１０１１ｖｇ／ｇ脳）の用量でのＰＲ００６Ａ（青色）を用いた処置の３か月後に、分析のために犠牲となった。図５３Ｉ：ＴｎｆおよびＣｄ６８の遺伝子発現（ｍＲＮＡレベル）を、体性感覚皮質のｑＲＴ－ＰＣＲによって測定した（平均±ＳＥＭ、ｎ＝８～１０／群）。遺伝子発現は、ハウスキーピング遺伝子であるＰｐｉｂに正規化された。図５３Ｊ～図５３Ｋ：Ｉｂａ１（図５３Ｊ）およびＧＦＡＰ（図５３Ｋ）のＩＨＣ分析を行い、大脳皮質、海馬、および視床の固定脳切片で定量化した。閾値を超える物体（免疫応答性領域［％］）によってカバーされる関心領域の割合を示す（平均±ＳＥＭ、ｎ＝８～１０／群）。統計は、ダネット調整を伴うＡＮＯＶＡによって決定され、各群を賦形剤処置Ｇｒｎ ＫＯマウス群と比較した、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＊＝ｐ＜０．００１。ｖｇ＝ベクターゲノム；ＷＴ＝野生型。
図５３Ｌ～図５３Ｎは、成体用量範囲ＰＲ００６Ａ ＦＴＤ－ＧＲＮマウスモデル試験において、リソソームおよび免疫経路の遺伝子発現の減少を示した実験の結果を示す一連の棒グラフである。４か月齢のＧｒｎ ＫＯマウスに、ＩＣＶ投与によりＰＲ００６Ａまたは賦形剤を与えた。それらは、賦形剤（赤色）または１．１×１０９ｖｇ（２．７×１０９ｖｇ／ｇ脳）、１．１×１０１０ｖｇ（２．７×１０１０ｖｇ／ｇ脳）、または１．１×１０１１ｖｇ（２．７×１０１１ｖｇ／ｇ脳）の用量でのＰＲ００６Ａ（青色）を用いた処置の３か月後に、分析のために犠牲となった。ＩＣＶ処置Ｇｒｎ ＫＯマウスおよび同年齢のＷＴ Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（グレー）からの大脳皮質サンプルにおいて、ＲＮＡシーケンシングを実施した。遺伝子セット変異解析（ＧＳＶＡ）法を使用して、賦形剤で処置されたＧｒｎ ＫＯマウスにおいて調節不良である以前に発行された遺伝子シグネチャのｍＲＮＡ発現レベルを、ＷＴマウスと比較した。示されるデータは、公表された二つの研究および一つのホールマーク（ＨＡＬＬＭＡＲＫ）経路からのキュレーションされた遺伝子セットのＧＳＶＡ活性スコアである。図５３Ｌ：細胞成分：空胞（ＧＯ：０００５７７３）、図５３Ｍ：リソソーム、および図５３Ｎ：補体系（ホールマーク（ＨＡＬＬＭＡＲＫ）経路）（中央値±範囲、ｎ＝８～１０／群）。統計解析を、ＡＮＯＶＡとそれに続くダネット検定を用いて行い、ファミリーワイズ（ｆａｍｉｌｙ－ｗｉｓｅ）Ｉ型エラー率、＊＊＊＝ｐ＜０．００１を制御しながら、賦形剤処置Ｇｒｎ ＫＯマウス群と比較した。ＧＳＶＡ＝遺伝子セット変異解析、ｖｇ＝ベクターゲノム、ＷＴ＝野生型。
図５４Ａは、ｑＰＣＲにより定量化されたＰＲ００６Ａ導入遺伝子の生体内分布を分析する実験の結果を示す一連の棒グラフである。賦形剤、低用量のＰＲ００６Ａ（６．５×１０９ｖｇ／ｇ脳）、または高用量のＰＲ００６Ａ（６．５×１０１０ｖｇ／ｇ脳）のいずれかのＩＣＭ注射の１８２日後に、ＮＨＰｓにおけるｑＰＣＲ方法を使用して導入遺伝子レベルを解析した。各バーは、群当たり３匹の平均±ＳＥＭを表し、黄色線は、５０ｖｇ／μｇのＤＮＡでの定量下限を示す。
図５４Ｂは、ヒトプログラニュリンに対する抗薬剤抗体のレベルを分析する実験の結果を示す一連の棒グラフである。賦形剤、低用量のＰＲ００６Ａ（６．５ｘ１０９ｖｇ／ｇ脳）、または高用量のＰＲ００６Ａ（６．５ｘ１０１０ｖｇ／ｇ脳）のいずれかを用いた投与後２９日目および１８２日目にＮＨＰ血清およびＣＳＦサンプル中のプログラニュリンに対する抗体。データは、平均±ＳＥＭを表す。
図５４Ｃは、ＰＲ００６Ａ導入遺伝子（ＧＲＮ）の発現を分析する実験の結果を示す一連の棒グラフである。ＧＲＮ発現レベルは、ＲＴ－ｑＰＣＲを使用して、１８３日目に収集されたＮＨＰ皮質、海馬、および腹側中脳で決定された。データは、平均±ＳＥＭとして表される。
図５４Ｄは、シンプルウェスタン（商標）（Ｊｅｓｓ）プラットフォームによって定量化されたＣＳＦ中のプログラニュリンレベルを分析する実験の結果を示す棒グラフである。シンプルウェスタン（商標）（Ｊｅｓｓ）分析によって決定された、１８３日目に採取されたＮＨＰ ＣＳＦサンプルで、プログラニュリンレベルを決定した。賦形剤、低用量のＰＲ００６Ａ（６．５×１０９ｖｇ／ｇ脳重量）、または高用量のＰＲ００６Ａ（６．５×１０１０ｖｇ／ｇ脳重量）で処置されたＮＨＰｓからのＣＳＦサンプル。提示されるデータは、平均±ＳＥＭ、ウィリアムの傾向検定を使用した一方向の用量依存性応答分析によるＰ値：＊ｐ＜０．０５。
図５５は、自動ウェスタンＪｅｓｓアッセイの選択性および特異性の結果を示すグラフである。ＦＴＤ患者のＣＳＦサンプル中のプログラニュリンタンパク質レベルは、Ｊｅｓｓによって５８ｋＤａで検出された。群（Ａ）：ヘテロ接合性ＦＴＤ患者、および群（Ｂ）および（Ｃ）：家族性非保因者または健常者。データは、平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表される。ＳＥＭ値は垂直エラーバーとして表示される。
図５６は、ＥＬＩＳＡにより検出されたＦＴＤ患者のＣＳＦサンプル中のプログラニュリンレベルを示すグラフである。群（Ａ）：ヘテロ接合性ＦＴＤ患者、および群（Ｂ）および（Ｃ）：家族性非保因者または健常者。データは、平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表される。ＳＥＭ値は垂直エラーバーとして表示される。
図５７は、Ｊｅｓｓ自動ウェスタンプラットフォーム上で二重で実行される各ＣＳＦサンプルのゲル画像である。サンプルを、一次抗体ＡｄｉｐｏｇｅｎＰＧ－３５９－７を使用して４倍希釈で分析した。第一のレーンは分子量標準であり、右側には、実施例１４で報告された免疫応答性を計算するために使用されるバンド識別がある。
図５８Ａ～図５８Ｂは、ヒトＰＧＲＮ発現レベルの測定を示す一連のプロットである。ヒトＰＧＲＮ発現レベルは、非ヒト霊長類ＣＳＦサンプルにおいて決定され、これは、１８０日目に、シンプルウェスタン（登録商標）（Ｊｅｓｓ）分析を用いて収集された。賦形剤で処置されたＮＨＰからのＣＳＦ（「賦形剤」）、低用量のＰＲ００６Ａ（６．５ｘ１０９ｖｇ／ｇ脳重量、「低」）、または高用量のＰＲ００６（６．５ｘ１０１０ｖｇ／ｇ脳重量、「高」）を分析した。データは、平均免疫応答性ピーク面積（図５８Ａ）、または賦形剤処置動物上の倍率変化（図５８Ｂ）として表される。各点は、一つのＮＨＰ（技術上の重複の平均）からの単一のＣＳＦサンプルを表し、箱は、三つの個々のＮＨＰの平均値±標準誤差を表す。
図５９Ａ～図５９Ｃは、ＰＲ００６Ａ処置後の高齢ＦＴＤ－ＧＲＮマウスモデルにおけるＣＮＳ中の生体内分布およびプログラニュリン発現を分析する実験の結果を示す一連の棒グラフである。ＩＣＶ賦形剤（赤色）または９．７×１０１０ｖｇ（２．４×１０１１ｖｇ／ｇ脳）ＰＲ００６Ａ（青色）を投与された２か月後に、１８か月齢のＧｒｎ ＫＯマウスから組織サンプルを採取した。図５９Ａ：ベクターゲノムの存在を大脳皮質および脊髄で評価した（平均±ＳＥＭ、ｎ＝４／群）。生体内分布は、ｇＤＮＡ１μｇの当たりのベクターゲノムを対数スケールで示されている。ベクターゲノムの存在は、ベクター参照標準曲線を使用してｑＰＣＲによって定量化された。破線（５０ベクターゲノム／μｇ ｇＤＮＡ）は、陽性ベクターの存在に対する閾値を表す。図５９Ｂ～図５９Ｃ：プログラニュリンタンパク質レベルが、ＣＮＳ組織（脳および脊髄（図５９Ｂ））、およびＣＳＦ（図５９Ｃ）中のＥＬＩＳＡを用いて測定された（平均±ＳＥＭ、ｎ＝４／群）。組織プログラニュリンレベルを総タンパク質濃度に正規化し、プログラニュリンのＣＳＦレベルを流体体積に正規化した。定量下限（ＬＬＯＱ）は、灰色の破線で示される。組織ＥＬＩＳＡアッセイについては、アッセイＬＬＯＱ（ｎｇ／ｍＬ）を、全サンプルからの総タンパク質濃度平均で割ることによって、ＬＬＯＱ（ｎｇ／ｍｇ）値を決定した。エラーバーのないｘ軸上の単純な赤い線は、その群のすべての動物が０であったことを示す。クラスカル・ウォリス検定を用いて統計解析を実施した；＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１。ｖｇ＝ベクターゲノム；ＬＬＯＱ＝定量下限；ＳＣ＝脊髄。
図５９Ｄ～図５９Ｅは、ＰＲ００６Ａ処置後の高齢ＦＴＤ－ＧＲＮマウスモデルにおけるリソソーム欠損および神経病理学的欠損の減少を示す実験の結果を示す一連の棒グラフおよび画像である。ＩＣＶ賦形剤（赤色）または９．７×１０１０ｖｇ（２．４×１０１１ｖｇ／ｇ脳）ＰＲ００６Ａ（青色）を投与された２か月後に、１８か月齢のＧｒｎ ＫＯマウスから組織サンプルを採取した。リポフスチン症は、病理学者によるＨ＆Ｅ染色脳切片のスコアリングによって分析された。図５９Ｄ：脳切片の視床／視床下部領域からの代表的なリポフスチン画像。白い矢印は、リポフスチン蓄積の例を示す。自己蛍光リポフスチン顆粒について評価された脳切片からのＨ＆Ｅ染色スライドの大脳皮質、海馬、および視床／視床のリポフスチン重症度スコアの概要が提供される。リポフスチン蓄積は、以下の等級分類に従って、盲検化された委員会認定病理学者によって、半定量的にスコア付けされた。０＝リポフスチンは観察されなかった。１＝領域全体に散在するリポフスチンの非常に小さな顆粒（＜２μｍ）、２＝小さな顆粒の蓄積密度の増加、および／またはより大きな顆粒（＞２－３ｕｍ）の発達；３＝低倍率対物レンズから視認できる高密度のリポフスチン顆粒を含む多焦点領域；４＝リポフシンの広範な蓄積。図５９Ｅ：ユビキチンのＩＨＣ分析（ｎ＝４／群）を行い、大脳皮質、海馬、および視床で定量化した。各領域に対する陽性細胞密度（細胞／ｍｍ２）を示す（平均±ＳＥＭ）。統計を、ｔ検定を使用して決定した、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１。ｖｇ＝ベクターゲノム。
図５９Ｆ～図５９Ｉは、ＰＲ００６Ａ処置後の高齢ＦＴＤ－ＧＲＮマウスモデルにおける神経炎症マーカーの減少を示す実験の結果を示す一連の棒グラフである。ＩＣＶ賦形剤（赤色）または９．７×１０１０ｖｇ（２．４×１０１１ｖｇ／ｇ脳）ＰＲ００６Ａ（青色）を投与された２か月後に、１８か月齢のＧｒｎ ＫＯマウスから組織サンプルを採取した。図５９Ｆ：ＴｎｆおよびＣｄ６８の遺伝子発現を、体性感覚皮質のｑＲＴ－ＰＣＲによって測定した（平均±ＳＥＭ、ｎ＝４／群）。遺伝子発現は、ハウスキーピング遺伝子であるＰｐｉｂに正規化された。（図５９Ｇ）炎症促進性サイトカインＴＮＦのタンパク質発現ＴＮＦαを、メソスケールディスカバリーマウス炎症促進性サイトカインアッセイ（平均±ＳＥＭ、ｎ＝４／群）を使用して大脳皮質で測定した。大脳皮質を均質化し、タンパク質発現レベルを組織溶解物の総タンパク質濃度に正規化した。図５９Ｈ～図５９Ｉ：Ｉｂａ１（図５９Ｈ）およびＧＦＡＰ（図５９Ｉ）のＩＨＣ分析を実施し、固定脳切片で定量化した。分析された三つの脳領域（大脳皮質、海馬、および視床）からの陽性細胞密度（細胞／ｍｍ２）の編集を示す（平均±ＳＥＭ、ｎ＝３～４／群）。統計解析を、ｔ検定を使用して実施した、＊＝ｐ＜０．０５。ｖｇ＝ベクターゲノム。 同上。
図６０は、ＰＲ００６Ａで形質導入されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の用量反応曲線を示すグラフである（ｎ＝２；平均±ＳＥＭ）。等数の細胞を、様々な量のＰＲ００６Ａで形質導入した。７２時間後、細胞培地中のプログラニュリンタンパク質レベルを、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して測定した。
図６１は、高齢ＦＴＤ－ＧＲＮマウスモデルにおける最大用量ＰＲ００６Ａの試験デザインの図である。１０μｌの賦形剤（対照）または９．７×１０１０ｖｇ（２．４×１０１１ｖｇ／ｇ脳）用量でのＰＲ００６Ａを、ＩＣＶ注射により、Ｇｒｎ ＫＯマウスの二つのコホートに送達した：（１）注射時に１６か月齢（ｎ＝４～５／群、ＰＲＶ－２０１８－０２７）および（２）注射時に１４か月齢（ｎ＝１／賦形剤処置群、ｎ＝３／ＰＲ００６Ａ処置群、ＰＲＶ－２０１９－００２）。動物を注射の二か月後に犠牲にした。ＣＮＳおよび末梢組織を収集し、ＰＲ００６Ａ生体内分布（ｑＰＣＲ）、プログラニュリンタンパク質発現（ＥＬＩＳＡ）、および病理組織（Ｈ＆Ｅ）を解析した。炎症促進性マーカーの発現、リポフスチンの蓄積、およびユビキチンの蓄積を脳内で評価した。
図６２Ａ～図６２Ｂは、ＰＲ００６Ａ処置後の高齢ＦＴＤ－ＧＲＮマウスモデルにおける末梢組織の生体内分布およびプログラニュリン発現の結果を示す棒グラフである。ＩＣＶ賦形剤（赤色）または９．７×１０１０ｖｇ（２．４×１０１１ｖｇ／ｇ脳）ＰＲ００６Ａ（青色）を投与された２か月後に、１８か月齢のＧｒｎ ＫＯマウスから組織サンプルを採取した。図６２Ａ：ベクターゲノムの存在を、肝臓、心臓、肺、腎臓、脾臓、および性腺で評価した（平均±ＳＥＭ、ｎ＝４／群）。生体内分布は、ｇＤＮＡ１μｇ当たりのベクターゲノムとして示されている。ベクターゲノムの存在は、ベクター参照標準を使用してｑＰＣＲによって定量化された。図６２Ｂ：プログラニュリンタンパク質レベルを、ＥＬＩＳＡを使用して測定した（平均±ＳＥＭ、ｎ＝４／群）。組織プログラニュリンレベルを、総タンパク質濃度に正規化した。エラーバーのないｘ軸上の単純な赤い線は、その群のすべての動物が０であったことを示す。統計解析を、クラスカル・ウォリス検定を使用して行った；＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１。ｖｇ＝ベクターゲノム。
図６３は、成体ＦＴＤ－ＧＲＮマウスモデルにおける用量範囲ＰＲ００６Ａの試験デザインの図である。１０μｌの賦形剤（対照）または１．１ｘ１０９ｖｇ（２．７ｘ１０９ｖｇ／ｇ脳）、１．１ｘ１０１０ｖｇ（２．７ｘ１０１０ｖｇ／ｇ脳）のＰＲ００６Ａ、または１．１ｘ１０１１ｖｇ（２．７ｘ１０１１ｖｇ／ｇ脳）のＰＲ００６Ａが、４か月齢のＧｒｎ ＫＯマウスにＩＣＶ注射で送達された（ｎ＝１０／群）。動物は、マウスが７か月齢の時の、注射の三か月後に犠牲となった。ＣＮＳおよび末梢組織を収集し、ＰＲ００６Ａ生体内分布（ｑＰＣＲ）、プログラニュリンタンパク質発現（ＥＬＩＳＡ）、および病理組織（Ｈ＆Ｅ）を解析した。炎症促進性マーカーの発現、リポフスチンの蓄積、およびユビキチンの蓄積、および広範囲な遺伝子発現の変化を脳内で評価した。
図６４は、ヒトプログラニュリンをコードする発現構築物を含む組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ＰＲ００６Ａ）の一実施形態を描写する概略図である。「ｂｐ」は「塩基対」を指す。「ｋａｎ」は、カナマイシンに対する耐性を付与する遺伝子を指す。「ＧＲＮ」は「プログラニュリン」を意味する。「ＩＴＲ」は、アデノ随伴ウイルス逆位末端反復配列を指す。「ＴＲＹ」は、三つの転写制御活性化部位を含む配列、ＴＡＴＡ、ＲＢＳ、およびＹＹ１、を指す。「ＣＢＡｐ」は、ニワトリβ－アクチンプロモーターを指す。「ＣＭＶｅ」は、サイトメガロウイルスエンハンサーを指す。「ＷＰＲＥ」は、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素を指す。「ｂＧＨ」は、ウシ成長ホルモンポリＡシグナルテールを指す。「ｉｎｔ」は、イントロンを指す。ＰＲ００６Ａの二本鎖のヌクレオチド配列は、配列番号９０および９１で提供されている。
本開示は、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）の遺伝子療法に関する。特に、本開示は、プログラニュリンをコードするＧＲＮ遺伝子の機能的コピーを送達する組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）と組み合わせて投与される免疫抑制レジメンに関する。遺伝子療法でされる対象において、免疫関連有害事象のリスクを減少させるために、免疫抑制レジメンが必要である。
本開示は、部分的には、対象における特定の遺伝子産物（例えば、ＣＮＳ疾患と関連する遺伝子産物）の組み合わせの発現のための組成物および方法に基づく。遺伝子産物は、タンパク質、タンパク質の断片（例えば、部分）、ＣＮＳ疾患関連遺伝子を阻害する干渉核酸などでありうる。一部の実施形態では、遺伝子産物は、ＣＮＳ疾患関連遺伝子によってコードされるタンパク質またはタンパク質断片である。一部の実施形態では、遺伝子産物は、ＣＮＳ疾患関連遺伝子を阻害する干渉核酸（例えば、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ａｍｉＲＮＡなど）である。
ＣＮＳ疾患関連遺伝子とは、ＦＴＤ、パーキンソン病（ＰＤ）などのＣＮＳ疾患と遺伝的、生化学的、または機能的に関連する遺伝子産物をコードする遺伝子を指す。例えば、ＧＲＮ遺伝子（タンパク質ＰＧＲＮ（プログラニュリン）をコードする）に病原性突然変異を有する個体は、ＧＲＮに突然変異を有しない個体と比較して、ＦＴＤを発症するリスクが増加することが観察された。同様に、ＧＢＡ１遺伝子（タンパク質Ｇｃａｓｅをコードする）に突然変異を有する個体は、ＧＢＡ１に突然変異を有しない個体と比較して、ＰＤを発症するリスクが増加することが観察された。別の例では、ＰＤは、α－シヌクレイン（α－Ｓｙｎ）タンパク質を含むタンパク質凝集体の蓄積と関連しており、それゆえ、ＳＮＣＡ（α－Ｓｙｎをコードする）はＰＤ関連遺伝子である。一部の実施形態では、本明細書に記載される発現カセットは、ＣＮＳ疾患関連遺伝子（またはそのコード配列）の野生型または非変異型をコードする。ＣＮＳ疾患関連遺伝子の例を表１に列挙する。
ゴーシェ病の患者（ＧＢＡ１遺伝子の両方の染色体対立遺伝子に変異を有する）に加えて、ＧＢＡ１の対立遺伝子の一つのみに変異を有する患者は、パーキンソン病（ＰＤ）のリスクが高い。歩行困難、安静時振戦、硬直、およびしばしばうつ病、睡眠困難、および認知機能低下を含むＰＤ症状の重症度は、酵素活性低下の程度と相関する。したがって、ゴーシェ病患者は最も重篤な経過を有するが、ＧＢＡ１の単一の軽度の変異を有する患者は通常、より良性の経過を有する。突然変異保因者は、実行機能障害、精神病、およびＰＤ様運動障害、ならびに多系統萎縮症を特徴とする、特徴的な運動障害および認知障害を伴うレビー小体認知症を含む、他のＰＤ関連障害のリスクが高い。これらの障害の容赦のない経過を変化させる治療法は存在しない。
Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１遺伝子の遺伝子産物）、ならびにリソソームの機能またはリソソームへの巨大分子の輸送に関与する多くの遺伝子の共通バリアント（例えば、リソソーム膜タンパク質１（ＬＩＭＰ）、ＳＣＡＲＢ２とも呼ばれる）などの酵素の欠損は、増加したＰＤのリスクおよび／またはゴーシェ病（例えば、２型ゴーシェ病または３型ゴーシェ病などの神経障害性ゴーシェ病、）のリスクと関連している。本開示は、部分的には、例えばゴーシェ病、ＰＤなどの中枢神経系（ＣＮＳ）と関連した、一つまたは複数の遺伝子、例えばＧｃａｓｅ、ＧＢＡ２、プロサポシン、プログラニュリン（ＰＧＲＮ）、ＬＩＭＰ２、ＧＡＬＣ、ＣＴＳＢ、ＳＭＰＤ、ＧＣＨ１、ＲＡＢ７、ＶＰＳ３５、ＩＬ－３４、ＴＲＥＭ２、ＴＭＥＭ１０６Ｂ、または前述のいずれかの組合せ（またはその一部）をコードする発現構築物（例えばベクター）に基づく。一部の実施形態では、本明細書に記載される遺伝子産物の組み合わせは、一緒に作用し（例えば、相乗的に）、対象において発現されたときに、ＣＮＳ疾患の一つまたは複数の兆候および症状を減少させる。
したがって、一部の態様では、本開示は、Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む単離核酸を提供する。一部の実施形態では、単離核酸は、コドン最適化されているＧｃａｓｅコード配列（例えば、哺乳類細胞、例えばヒト細胞における発現に最適化されたコドン）を含む。一部の実施形態では、Ｇｃａｓｅをコードする核酸配列は、配列番号１４（例えば、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０００１４８．２に記載される）に記載されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする。一部の実施形態では、単離核酸は、配列番号１５に記載される配列を含む。一部の実施形態では、発現構築物は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲｓ）、例えば、Ｇｃａｓｅタンパク質をコードする核酸配列に隣接するＡＡＶ ＩＴＲｓを含む。
一部の態様では、本開示は、プロサポシン（例えば、ＰＳＡＰ遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む単離核酸を提供する。一部の実施形態では、単離核酸は、コドン最適化されているプロサポシンコード配列（例えば、哺乳類細胞、例えばヒト細胞における発現に最適化されたコドン）を含む。一部の実施形態では、プロサポシンをコードする核酸配列は、配列番号１６（例えば、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００２７６９．１に記載される）に記載されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする。一部の実施形態では、単離核酸は、配列番号１７に記載される配列を含む。一部の実施形態では、発現構築物は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲｓ）、例えば、プロサポシンタンパク質をコードする核酸配列に隣接するＡＡＶ ＩＴＲｓを含む。
一部の態様では、本開示は、ＬＩＭＰ２／ＳＣＡＲＢ２（例えば、ＳＣＲＡＢ２遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む単離核酸を提供する。一部の実施形態では、単離核酸は、コドン最適化されているＳＣＲＡＢ２コード配列（例えば、哺乳類細胞、例えばヒト細胞における発現に最適化されたコドン）を含む。一部の実施形態では、ＬＩＭＰ２／ＳＣＡＲＢ２をコードする核酸配列は、配列番号１８（例えば、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００５４９７．１に記載される）に記載されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする。一部の実施形態では、単離核酸は、配列番号２９に記載される配列を含む。一部の実施形態では、発現構築物は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲｓ）、例えば、ＳＣＲＡＢ２タンパク質をコードする核酸配列に隣接するＡＡＶ ＩＴＲｓを含む。
一部の態様では、本開示は、ＧＢＡ２タンパク質（例えば、ＧＢＡ２遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む単離核酸を提供する。一部の実施形態では、単離核酸は、コドン最適化されているＧＢＡ２コード配列（例えば、哺乳類細胞、例えばヒト細胞における発現に最適化されたコドン）を含む。一部の実施形態では、ＧＢＡ２をコードする核酸配列は、配列番号３０（例えば、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０６５９９５．１に記載される）に記載されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする。一部の実施形態では、単離核酸は、配列番号３１に記載される配列を含む。一部の実施形態では、発現構築物は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲｓ）、例えば、ＧＢＡ２タンパク質をコードする核酸配列に隣接するＡＡＶ ＩＴＲｓを含む。
一部の態様では、本開示は、ＧＡＬＣタンパク質（例えば、ＧＡＬＣ遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む単離核酸を提供する。一部の実施形態では、単離核酸は、コドン最適化されているＧＡＬＣコード配列（例えば、哺乳類細胞、例えばヒト細胞における発現に最適化されたコドン）を含む。一部の実施形態では、ＧＡＬＣをコードする核酸配列は、配列番号３３（例えば、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０００１４４．２に記載される）に記載されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする。一部の実施形態では、単離核酸は、配列番号３４に記載される配列を含む。一部の実施形態では、発現構築物は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲｓ）、例えば、ＧＡＬＣタンパク質をコードする核酸配列に隣接するＡＡＶ ＩＴＲｓを含む。
一部の態様では、本開示は、ＣＴＳＢタンパク質（例えば、ＣＴＳＢ遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む単離核酸を提供する。一部の実施形態では、単離核酸は、コドン最適化されているＣＴＳＢコード配列（例えば、哺乳類細胞、例えばヒト細胞における発現に最適化されたコドン）を含む。一部の実施形態では、ＣＴＳＢをコードする核酸配列は、配列番号３５（例えば、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１８９９．１に記載される）に記載されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする。一部の実施形態では、単離核酸は、配列番号３６に記載される配列を含む。一部の実施形態では、発現構築物は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲｓ）、例えば、ＣＴＳＢタンパク質をコードする核酸配列に隣接するＡＡＶ ＩＴＲｓを含む。
一部の態様では、本開示は、ＳＭＰＤ１タンパク質（例えば、ＳＭＰＤ１遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む単離核酸を提供する。一部の実施形態では、単離核酸は、コドン最適化されているＳＭＰＤ１コード配列（例えば、哺乳類細胞、例えばヒト細胞における発現に最適化されたコドン）を含む。一部の実施形態では、ＳＭＰＤ１をコードする核酸配列は、配列番号３７（例えば、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０００５３４．３に記載される）に記載されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする。一部の実施形態では、単離核酸は、配列番号３８に記載される配列を含む。一部の実施形態では、発現構築物は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲｓ）、例えば、ＳＭＰＤ１タンパク質をコードする核酸配列に隣接するＡＡＶ ＩＴＲｓを含む。
一部の態様では、本開示は、ＧＣＨ１タンパク質（例えば、ＧＣＨ１遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む単離核酸を提供する。一部の実施形態では、単離核酸は、コドン最適化されているＧＣＨ１コード配列（例えば、哺乳類細胞、例えばヒト細胞における発現に最適化されたコドン）を含む。一部の実施形態では、ＧＣＨ１をコードする核酸配列は、配列番号４５（例えば、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０００５３４．３に記載される）に記載されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする。一部の実施形態では、単離核酸は、配列番号４６に記載される配列を含む。一部の実施形態では、発現構築物は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲｓ）、例えば、ＧＣＨ１タンパク質をコードする核酸配列に隣接するＡＡＶ ＩＴＲｓを含む。
一部の態様では、本開示は、ＲＡＢ７Ｌタンパク質（例えば、ＲＡＢ７Ｌ遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む単離核酸を提供する。一部の実施形態では、単離核酸は、コドン最適化されているＲＡＢ７Ｌコード配列（例えば、哺乳類細胞、例えばヒト細胞における発現に最適化されたコドン）を含む。一部の実施形態では、ＲＡＢ７Ｌをコードする核酸配列は、配列番号４７（例えば、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００３９２０．１に記載される）に記載されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする。一部の実施形態では、単離核酸は、配列番号４８に記載される配列を含む。一部の実施形態では、発現構築物は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲｓ）、例えば、ＲＡＢ７Ｌタンパク質をコードする核酸配列に隣接するＡＡＶ ＩＴＲｓを含む。
一部の態様では、本開示は、ＶＰＳ３５タンパク質（例えば、ＶＶＰＳ３５遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む単離核酸を提供する。一部の実施形態では、単離核酸は、コドン最適化されているＶＰＳ３５コード配列（例えば、哺乳類細胞、例えばヒト細胞における発現に最適化されたコドン）を含む。一部の実施形態では、ＶＰＳ３５をコードする核酸配列は、配列番号４９（例えば、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０６０６７６．２に記載される）に記載されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする。一部の実施形態では、単離核酸は、配列番号５０に記載される配列を含む。一部の実施形態では、発現構築物は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲｓ）、例えば、ＶＰＳ３５タンパク質をコードする核酸配列に隣接するＡＡＶ ＩＴＲｓを含む。
一部の態様では、本開示は、ＩＬ－３４タンパク質（例えば、ＩＬ３４遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む単離核酸を提供する。一部の実施形態では、単離核酸は、コドン最適化されているＩＬ－３４コード配列（例えば、哺乳類細胞、例えばヒト細胞における発現に最適化されたコドン）を含む。一部の実施形態では、ＩＬ－３４をコードする核酸配列は、配列番号５５（例えば、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿６８９６６９．２に記載される）に記載されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする。一部の実施形態では、単離核酸は、配列番号５６に記載される配列を含む。一部の実施形態では、発現構築物は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲｓ）、例えば、ＩＬ－３４タンパク質をコードする核酸配列に隣接するＡＡＶ ＩＴＲｓを含む。
一部の態様では、本開示は、ＴＲＥＭ２タンパク質（例えば、ＴＲＥＭ遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む単離核酸を提供する。一部の実施形態では、単離核酸は、コドン最適化されているＴＲＥＭ２コード配列（例えば、哺乳類細胞、例えばヒト細胞における発現に最適化されたコドン）を含む。一部の実施形態では、ＴＲＥＭ２をコードする核酸配列は、配列番号５７（例えば、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０６１８３８．１に記載される）に記載されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする。一部の実施形態では、単離核酸は、配列番号５８に記載される配列を含む。一部の実施形態では、発現構築物は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲｓ）、例えば、ＴＲＥＭ２タンパク質をコードする核酸配列に隣接するＡＡＶ ＩＴＲｓを含む。
一部の態様では、本開示は、ＴＭＥＭ１０６Ｂタンパク質（例えば、ＴＭＥＭ１０６Ｂ遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む単離核酸を提供する。一部の実施形態では、単離核酸は、コドン最適化されているＴＭＥＭ１０６Ｂコード配列（例えば、哺乳類細胞、例えばヒト細胞における発現に最適化されたコドン）を含む。一部の実施形態では、ＴＭＥＭ１０６Ｂをコードする核酸配列は、配列番号６３（例えば、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０６０８４４．２に記載される）に記載されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする。一部の実施形態では、単離核酸は、配列番号６４に記載される配列を含む。一部の実施形態では、発現構築物は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲｓ）、例えば、ＴＭＥＭ１０６Ｂタンパク質をコードする核酸配列に隣接するＡＡＶ ＩＴＲｓを含む。
一部の態様では、本開示は、プログラニュリン（例えば、ＰＧＲＮ遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む単離核酸を提供する。一部の実施形態では、単離核酸は、コドン最適化されているプロサポシンコード配列（例えば、哺乳類細胞、例えばヒト細胞における発現に最適化されたコドン）を含む。一部の実施形態では、プログラニュリン（ＰＧＲＮ）をコードする核酸配列は、配列番号６７（例えば、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００２０７８．１に記載される）に記載されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする。一部の実施形態では、単離核酸は、配列番号６８に記載される配列を含む。一部の実施形態では、発現構築物は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲｓ）、例えば、プロサポシンタンパク質をコードする核酸配列に隣接するＡＡＶ ＩＴＲｓを含む。
一部の態様では、本開示は、第一の遺伝子産物および第二の遺伝子産物をコードする発現構築物を含む単離核酸を提供し、各遺伝子産物は、表１に記載される遺伝子産物、またはその一部から独立して選択される。
一部の実施形態では、第一の遺伝子産物または第二の遺伝子産物は、Ｇｃａｓｅタンパク質、またはその一部である。一部の実施形態では、第一の遺伝子産物はＧｃａｓｅタンパク質であり、第二の遺伝子産物は、ＧＢＡ２、プロサポシン、プログラニュリン、ＬＩＭＰ２、ＧＡＬＣ、ＣＴＳＢ、ＳＭＰＤ１、ＧＣＨ１、ＲＡＢ７、ＶＰＳ３５、ＩＬ－３４、ＴＲＥＭ２、およびＴＭＥＭ１０６Ｂから選択される。
一部の実施形態では、発現構築物は、干渉核酸（例えば、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡなど）をコードする（例えば、単独で、または別の遺伝子産物に加えて）。一部の実施形態では、干渉核酸は、α－シヌクレイン（α－シヌクレイン）の発現を阻害する。一部の実施形態では、α－シヌクレインを標的とする干渉核酸は、配列番号２０～２５いずれか一つに記載される配列を含む。一部の実施形態では、α－シヌクレインを標的とする干渉核酸は、配列番号２０～２５いずれか一つに記載される配列と結合する（ハイブリダイズする）。
一部の実施形態では、干渉核酸は、ＴＭＥＭ１０６Ｂの発現を阻害する。一部の実施形態では、ＴＭＥＭ１０６Ｂを標的とする干渉核酸は、配列番号６４または６５に記載される配列を含む。一部の実施形態では、ＴＭＥＭ１０６Ｂを標的とする干渉核酸は、配列番号６４または６５に記載される配列と結合する（例えば、ハイブリダイズする）。
一部の実施形態では、発現構築物は、一つまたは複数のプロモーターをさらに含む。一部の実施形態では、プロモーターは、ニワトリ－ベータアクチン（ＣＢＡ）プロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＣＤ６８プロモーター、またはＪｅＴプロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩプロモーター（例えば、またはＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター（例えば、Ｕ６など）である。
一部の実施形態では、発現構築物は、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）をさらに含む。一部の実施形態では、ＩＲＥＳは、第一の遺伝子産物と第二の遺伝子産物の間に位置する。
一部の実施形態では、発現構築物は、自己切断ペプチドコード配列をさらに含む。一部の実施形態では、自己切断ペプチドは、Ｔ２Ａペプチドである。
一部の実施形態では、発現構築物は、二つのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を含む。一部の実施形態では、ＩＴＲ配列は、第一の遺伝子産物および第二の遺伝子産物に隣接する（例えば、５’末端から３’末端まで：ＩＴＲ－第一の遺伝子産物－第二の遺伝子産物－ＩＴＲの配置で）。一部の実施形態では、単離核酸のＩＴＲ配列のうちの一つは、機能性末端分離部位（ｔｒｓ）を欠く。例えば、一部の実施形態では、ＩＴＲｓの一つは、ΔＩＴＲである。
本開示は、一部の態様では、改変された「Ｄ」領域（例えば、野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲ、配列番号２９に対して改変されるＤ配列）を有するＩＴＲを含むｒＡＡＶベクターに関する。一部の実施形態では、改変Ｄ領域を有するＩＴＲは、ｒＡＡＶベクターの５’ＩＴＲである。一部の実施形態では、改変された「Ｄ」領域は、例えば配列番号２６に記載される「Ｓ」配列を含む。一部の実施形態では、改変された「Ｄ」領域を有するＩＴＲは、ｒＡＡＶベクターの３’ＩＴＲである。一部の実施形態では、改変された「Ｄ」領域は、３’ＩＴＲを含み、「Ｄ」領域は、ＩＴＲの３’末端（例えば、ベクターの導入遺伝子挿入物と比較して、ＩＴＲの外側または末端）に位置する。一部の実施形態では、改変された「Ｄ」領域は、配列番号２６または２７に記載される配列を含む。
一部の実施形態では、単離核酸（例えば、ｒＡＡＶベクター）は、ＴＲＹ領域を含む。一部の実施形態では、ＴＲＹ領域は、配列番号２８に記載される配列を含む。
一部の実施形態では、本開示に記載される単離核酸は、配列番号１～９１のいずれか一つに記載される配列を含むか、またはそれらからなる、またはそれを有するぺプチドをコードする。
一部の態様では、本開示は、本開示に記載される単離核酸を含むベクターを提供する。一部の実施形態では、ベクターは、プラスミドまたはウイルスベクターである。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターまたはバキュロウイルスベクターである。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、一本鎖（例えば、一本鎖ＤＮＡ）である。
一部の実施形態では、本開示は、本開示に記載される単離核酸を含む宿主細胞または本開示に記載されるベクターを提供する。
一部の実施形態では、本開示は、キャプシドタンパク質および単離核酸含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）または本開示に記載されるベクターを提供する
一部の実施形態では、キャプシドタンパク質は、血液脳関門、例えば、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質またはＡＡＶｒｈ．１０キャプシドタンパク質を横断することができる。一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、中枢神経系（ＣＮＳ）の神経細胞および非神経細胞を形質導入する。
一部の態様では、本開示は、中枢神経系（ＣＮＳ）疾患を有するまたは有すると疑われる対象を治療する方法を提供し、方法は、対象に、本開示に記載される組成物（例えば、単離核酸またはベクターまたはｒＡＡＶを含む組成物）を投与することを含む。一部の実施形態では、ＣＮＳ疾患は、表１２に列挙された神経変性疾患などの神経変性疾患である。一部の実施形態では、ＣＮＳ疾患は、表１３に列挙されたシヌクレイン病などのシヌクレイン病である。一部の実施形態では、ＣＮＳ疾患は、表１４に列挙されたタウオパチーなどのタウオパチーである。一部の実施形態では、ＣＮＳ疾患は、表１５に列挙されたリソソーム蓄積症などのリソソーム蓄積症である。一部の実施形態では、リソソーム蓄積症は、２型ゴーシェ病、または３型ゴーシェ病などの神経障害性ゴーシェ病である。
一部の実施形態では、本開示は、パーキンソン病を有するまたは有すると疑われる対象を治療する方法を提供し、方法は、本開示に記載される組成物（例えば、単離核酸またはベクターまたはｒＡＡＶを含む組成物）を対象に投与することを含む。
一部の実施形態では、本開示は、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、ＧＲＮ変異を有するＦＴＤ、タウ突然変異を伴うＦＴＤ、ＣＣ９ｏｒｆ７２変異を有するＦＴＤ、セロイドリポフスチン症、パーキンソン病、アルツハイマー病、大脳皮質基底核変性症、運動ニューロン疾患、またはゴーシェ病を有するまたは有すると疑われる対象を治療する方法を提供し、方法は、対象に、プログラニュリン（ＰＧＲＮ）をコードするｒＡＡＶを投与することを含み、ＰＧＲＮは、配列番号６８中の核酸配列によりコードされ、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ９血清型を有するキャプシドタンパク質を含む。
一部の実施形態では、本開示は、ＧＲＮ変異を有するＦＴＤを有するまたは有すると疑われる対象を治療する方法を提供し、方法は、プログラニュリン（ＰＧＲＮ）をコードするｒＡＡＶを対象に投与することを含み、ＰＧＲＮは配列番号６８中の核酸配列によりコードされ、ｒＡＡＶはＡＡＶ９血清型を有するキャプシドタンパク質を含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、約３．５×１０１３ベクターゲノム（ｖｇ）、約７．０×１０１３ｖｇ、または約１．４× １０１４ｖｇの用量で、対象に投与される。一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、大槽内への注射を介して投与される。
一部の実施形態では、組成物は、二つ以上の遺伝子産物（例えば、ＣＮＳ疾患関連遺伝子産物）、例えば、２、３、４、５、または本出願に記載されるそれ以上の遺伝子産物をコードする核酸（例えば、例えば、ＡＡＶキャプシドタンパク質によってキャプシド化されるＡＡＶゲノム）を含む。一部の実施形態では、組成物は、各々、一つまたは複数の異なる遺伝子産物をコードする、二種以上（例えば、２、３、４、５種以上）の異なる核酸（例えば、例えば、ＡＡＶキャプシドタンパク質によって別々にキャプシド化される、二種以上のｒＡＡＶゲノム）を含む。一部の実施形態では、二つ以上の異なる組成物が対象に投与され、各組成物は、異なる遺伝子産物をコードする一つまたは複数の核酸を含む。一部の実施形態では、異なる遺伝子産物は、同じプロモータータイプ（例えば、同じプロモーター）に動作可能に連結される。一部の実施形態では、異なる遺伝子産物は、異なるプロモーターに動作可能に連結される。
単離核酸およびベクター
単離核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよい。本開示は、一部の態様では、例えば、Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１遺伝子の遺伝子産物）またはその一部などの、一つまたは複数のＰＤ関連遺伝子をコードする発現構築物を含む単離核酸（例えば、ｒＡＡＶベクター）を提供する。β－グルコセレブロシダーゼまたはＧＢＡとも呼ばれるＧｃａｓｅは、糖脂質代謝の中間体である化学グルコセレブロシドのベータ－グルコシド結合を切断するリソソームタンパク質を指す。ヒトでは、Ｇｃａｓｅは１番染色体上にあるＧＢＡ１遺伝子によってコードされる。一部の実施形態では、ＧＢＡ１は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０００１４８．２（配列番号１４）によって表されるペプチドをコードする。一部の実施形態では、単離核酸は、配列番号１５に記載される配列などの、コドン最適化されているＧｃａｓｅコード配列（例えば、哺乳類細胞、例えばヒト細胞における発現に最適化されたコドン）を含む。
一部の態様では、本開示は、プロサポシン（例えば、ＰＳＡＰ遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む単離核酸を提供する。プロサポシンは、スフィンゴ脂質活性化タンパク質（サポシン）Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤの前駆体糖タンパク質であり、短いオリゴ糖基を有するスフィンゴ糖脂質の異化を促進する。ヒトでは、ＰＳＡＰ遺伝子は１０番染色体上に位置する。一部の実施形態では、ＰＳＡＰは、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００２７６９．１（配列番号１６）によって表されるペプチドをコードする。一部の実施形態では、単離核酸は、配列番号１７に記載される配列などの、コドン最適化されているプロサポシンコード配列（例えば、哺乳類細胞、例えばヒト細胞における発現に最適化されたコドン）を含む。
本開示の態様は、ＬＩＭＰ２／ＳＣＡＲＢ２（例えば、ＳＣＲＡＢ２遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む単離核酸と関連する。ＳＣＡＲＢ２は、細胞内のリソソームおよびエンドソームの輸送を調節する膜タンパク質を指す。ヒトでは、ＳＣＡＲＢ２遺伝子は４番染色体上に位置する。一部の実施形態では、ＳＣＲＡＢ２遺伝子は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００５４９７．１（配列番号１８）によって表されるペプチドをコードする。一部の実施形態では、単離核酸は、配列番号１９に記載される配列を含む。一部の実施形態では、単離核酸は、コドン最適化されたＳＣＡＲＢ２コード配列を含む。
本開示の態様は、ＧＢＡ２タンパク質（例えば、ＧＢＡ２遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む単離核酸に関連する。ＧＢＡ２タンパク質は、非リソソーム性グルコシルセラミダーゼを指す。ヒトでは、ＧＢＡ２遺伝子は９番染色体上に位置する。一部の実施形態では、ＧＢＡ２遺伝子は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０６５９９５．１（配列番号３０）によって表されるペプチドをコードする。一部の実施形態では、単離核酸は、配列番号３１に記載される配列を含む。一部の実施形態では、単離核酸は、コドン最適化されたＧＢＡ２コード配列を含む。
本開示の態様は、ＧＬＡＣタンパク質（例えば、ＧＬＡＣ遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む単離核酸に関連する。ＧＡＬＣタンパク質は、ガラクトセレブロシド、ガラクトシルスフィンゴシン、ラクトシルセラミド、およびモノガラクトシルジグリセリドのガラクトースエステル結合を加水分解する酵素であるガラクトシルセラミターゼ（または、ガラクトセレブロシダーゼ）を指す。ヒトでは、ＧＡＬＣ遺伝子は１４番染色体上に位置する。一部の実施形態では、ＧＡＬＣ遺伝子は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０００１４４．２（配列番号３３）によって表されるペプチドをコードする。一部の実施形態では、単離核酸は、配列番号３４に記載される配列を含む。一部の実施形態では、単離核酸は、コドン最適化されたＧＡＬＣコード配列を含む。
本開示の態様は、ＣＴＳＢタンパク質（例えば、ＣＴＳＢ遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む単離核酸に関連する。ＣＴＳＢタンパク質は、細胞内タンパク質分解において重要な役割を果たすリソソームシステインプロテアーゼであるカテプシンＢを指す。ヒトでは、ＣＴＳＢ遺伝子は８番染色体上に位置する。一部の実施形態では、ＣＴＳＢ遺伝子は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１８９９．１（配列番号３５）によって表されるペプチドをコードする。一部の実施形態では、単離核酸は、配列番号３６に記載される配列を含む。一部の実施形態では、単離核酸は、コドン最適化されたＣＴＳＢコード配列を含む。
本開示の態様は、ＳＭＰＤ１タンパク質（例えば、ＳＭＰＤ１遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む単離核酸に関連する。ＳＭＰＤ１タンパク質は、スフィンゴ脂質代謝に関与するヒドロラーゼ酵素であるスフィンゴミエリンホスホジエステラーゼ１を指す。ヒトでは、ＳＭＰＤ１遺伝子は１１番染色体上に位置する。一部の実施形態では、ＳＭＰＤ１遺伝子は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０００５３４．３（配列番号３７）によって表されるペプチドをコードする。一部の実施形態では、単離核酸は、配列番号３８に記載される配列を含む。一部の実施形態では、単離核酸は、コドン最適化されたＳＭＰＤ１コード配列を含む。
本開示の態様は、ＧＣＨ１タンパク質（例えば、ＧＣＨ１遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む単離核酸に関連する。ＧＣＨ１タンパク質は、葉酸およびバイオプテリン生合成経路の一部であるヒドロラーゼ酵素である、ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩを指す。ヒトでは、ＧＣＨ１遺伝子は１４番染色体上に位置する。一部の実施形態では、ＧＣＨ１遺伝子は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０００１５２．１（配列番号４５）によって表されるペプチドをコードする。一部の実施形態では、単離核酸は、配列番号４６に記載される配列を含む。一部の実施形態では、単離核酸は、コドン最適化されたＧＣＨ１コード配列を含む。
本開示の態様は、ＲＡＢ７Ｌタンパク質（例えば、ＲＡＢ７Ｌ遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む単離核酸に関連する。ＲＡＢ７Ｌタンパク質は、ＲＡＳオンコ遺伝子ファミリー様１のメンバーであるＲＡＢ７を指し、これはＧＴＰ結合タンパク質である。ヒトでは、ＲＡＢ７Ｌ遺伝子は１番染色体上に位置する。一部の実施形態では、ＲＡＢ７Ｌ遺伝子は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００３９２０．１（配列番号４７）によって表されるペプチドをコードする。一部の実施形態では、単離核酸は、配列番号４８に記載される配列を含む。一部の実施形態では、単離核酸は、コドン最適化されたＲＡＢ７Ｌコード配列を含む。
本開示の態様は、ＶＰＳ３５タンパク質（例えば、ＶＰＳ３５遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む単離核酸に関連する。ＶＰＳ３５タンパク質は、エンドソームからトランスゴルジネットワークへのタンパク質の逆行性輸送に関与するタンパク質複合体の一部である、液胞タンパク質ソーティング関連タンパク質３５を指す。ヒトでは、ＶＰＳ３５遺伝子は１６番染色体上に位置する。一部の実施形態では、ＶＰＳ３５遺伝子は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０６０６７６．２（配列番号４９）によって表されるペプチドをコードする。一部の実施形態では、単離核酸は、配列番号５０に記載される配列を含む。一部の実施形態では、単離核酸は、コドン最適化されたＶＰＳ３５コード配列を含む。
本開示の態様は、ＩＬ－３４タンパク質（例えば、ＩＬ３４遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む単離核酸に関連する。ＩＬ－３４タンパク質は、単球の成長および生存を増加させるサイトカインであるインターロイキン３４を指す。ヒトでは、ＩＬ３４遺伝子は１６番染色体上に位置する。一部の実施形態では、ＩＬ３４遺伝子は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿６８９６６９．２（配列番号５５）によって表されるペプチドをコードする。一部の実施形態では、単離核酸は、配列番号５６に記載される配列を含む。一部の実施形態では、単離核酸は、コドン最適化されたＩＬ－３４コード配列を含む。
本開示の態様は、ＴＲＥＭ２タンパク質（例えば、ＴＲＥＭ２遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む単離核酸に関連する。ＴＲＥＭ２タンパク質は、骨髄細胞２上で発現される、骨髄細胞上に存在する免疫グロブリンスーパーファミリー受容体である、トリガー受容体を指す。ヒトでは、ＴＲＥＭ２遺伝子は６番染色体上に位置する。一部の実施形態では、ＴＲＥＭ２遺伝子は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０６１８３８．１（配列番号５７）によって表されるペプチドをコードする。一部の実施形態では、単離核酸は、配列番号５８に記載される配列を含む。一部の実施形態では、単離核酸は、コドン最適化されたＴＲＥＭ２コード配列を含む。
本開示の態様は、ＴＭＥＭ１０６Ｂタンパク質（例えば、ＴＭＥＭ１０６Ｂ遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む単離核酸に関連する。ＴＭＥＭ１０６Ｂタンパク質は、樹状突起形態形成およびリソソーム輸送の制御に関与するタンパク質である膜貫通タンパク質１０６Ｂを指す。ヒトでは、ＴＭＥＭ１０６Ｂ遺伝子は７番染色体上に位置する。一部の実施形態では、ＴＭＥＭ１０６Ｂ遺伝子は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０６０８４４．２（配列番号６２）によって表されるペプチドをコードする。一部の実施形態では、単離核酸は、配列番号６３に記載される配列を含む。一部の実施形態では、単離核酸は、コドン最適化されたＴＭＥＭ１０６Ｂコード配列を含む。
本開示の態様は、プログラニュリンタンパク質（例えば、ＰＧＲＮ遺伝子の遺伝子産物）をコードする発現構築物を含む単離核酸に関連する。ＰＧＲＮタンパク質は、発生、炎症、細胞増殖、およびタンパク質恒常性に関与するタンパク質であるプログラニュリンを指す。ヒトでは、ＰＧＲＮ遺伝子は１７番染色体上に位置する。一部の実施形態では、ＰＧＲＮ遺伝子は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００２０７８．１（配列番号６７）によって表されるペプチドをコードする。一部の実施形態では、単離核酸は、配列番号６８に記載される配列を含む。一部の実施形態では、単離核酸は、コドン最適化されたＰＧＲＮコード配列を含む。一部の実施形態では、核酸は、ニワトリ－β－アクチン（ＣＢＡ）プロモーターおよびサイトメガロウイルスエンハンサー（ＣＭＶｅ）をさらに含む。
一部の態様では、本開示は、脳脊髄液（ＣＳＦ）サンプル中のＰＧＲＮタンパク質レベルを定量化するための、自動ウェスタンブロットイムノアッセイを提供する。一部の実施形態では、イムノアッセイは、キャピラリーベースの自動ウェスタンブロットイムノアッセイプラットフォームであり、タンパク質分離、イムノプロービング、洗浄、および化学発光による検出などのすべてのステップが、キャピラリーカートリッジ内で発生する。一部の実施形態では、ＣＳＦサンプルは、ヒトまたは非ヒト霊長類由来である。一部の態様では、イムノアッセイは、循環抗体の存在下でのＰＧＲＮタンパク質レベルの差異の検出を可能にする。一部の態様では、本開示は、ＣＳＦサンプル中のプログラニュリンタンパク質レベルを定量化する方法を提供し、方法は、（１）ＣＳＦサンプルを希釈すること（例えば、４倍希釈）と、（２）ＣＳＦサンプル、抗プログラニュリン抗体、抗プログラニュリン抗体を検出する二次抗体、ルミノール、および過酸化物をキャピラリーカートリッジのウェルに装填することと、（３）キャピラリーカートリッジを、自動ウェスタンブロットイムノアッセイ機器に装填することと、（４）自動ウェスタンブロットイムノアッセイ機器を使用して、シグナル強度、ピーク面積、シグナル対ノイズ比および総タンパク質正規化パラメータの一つまたは複数を計算することと、（５）抗プログラニュリン抗体に対する免疫応答のピーク面積として、ＣＳＦサンプル中のプログラニュリンタンパク質レベルを定量化することと、を含む。一部の実施形態では、ＣＳＦサンプルは、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）およびサンプル緩衝液を含むマスターミックスで希釈される。マスターミックスは、他の独自の構成要素をさらに含み得る。一部の態様では、抗プログラニュリン抗体は、ヒトプログラニュリンを検出する。一部の実施形態では、プログラニュリンタンパク質レベルは、自動ウェスタンブロットイムノアッセイ機器を制御するソフトウェアを使用して、計算されたパラメータから定量される。一部の実施形態では、ソフトウェアは、シンプルウェスタン（商標）向けＣｏｍｐａｓｓソフトウェア（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ、カリフォルニア州サンノゼ）である。
一部の実施形態では、本開示は、脳脊髄液（ＣＳＦ）サンプル中のプログラニュリンタンパク質レベルを定量化する方法を提供し、方法は、（１）ジチオスレイトール（ＤＴＴ）とサンプル緩衝液とを含むマスターミックス中のＣＳＦサンプルを希釈すること（例えば、４倍希釈）と、（２）希釈されたＣＳＦサンプル、抗プログラニュリン抗体、抗プログラニュリン抗体を検出する二次抗体、ルミノール、および過酸化物をキャピラリーカートリッジのウェルに装填することと、（３）キャピラリーカートリッジを、自動ウェスタンブロットイムノアッセイ機器に装填することと、（４）自動ウェスタンブロットイムノアッセイ機器を使用して、シグナル強度、ピーク面積、シグナル対ノイズ比を計算することと、（５）抗プログラニュリン抗体に対する免疫応答のピーク面積として、ＣＳＦサンプル中のプログラニュリンタンパク質レベルを定量化することと、を含む。
一部の態様では、本開示は、第一の遺伝子産物および第二の遺伝子産物をコードする発現構築物を含む単離核酸を提供し、各遺伝子産物は、表１に記載される遺伝子産物、またはその一部から独立して選択される。
一部の実施形態では、本開示に記載される単離核酸またはベクター（例えば、ｒＡＡＶベクター）は、配列番号１～９１のいずれか一つに記載される配列を含むまたはそれらからなる。一部の実施形態では、本開示に記載される単離核酸またはベクター（例えば、ｒＡＡＶベクター）は、配列番号１～９１のいずれか一つに記載される配列に相補的である（例えば、相補する）配列を含むまたはそれらからなる。一部の実施形態では、本開示に記載される単離核酸またはベクター（例えば、ｒＡＡＶベクター）は、配列番号１～９１のいずれか一つに記載される配列に逆相補的である配列を含むまたはそれらからなる。一部の実施形態では、本開示に記載される単離核酸またはベクター（例えば、ｒＡＡＶベクター）は、配列番号１～９１のいずれか一つに記載される配列の一部を含むまたはそれらからなる。一部は、配列番号１～９１のいずれか一つに記載される配列の少なくとも２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％を含みうる。一部の実施形態では、本開示によって記載される核酸配列は、核酸センス鎖（例えば、５’鎖～３’鎖）、またはウイルス配列の文脈において、プラス（＋）鎖である。一部の実施形態では、本開示によって記載される核酸配列は、核酸アンチセンス鎖（例えば、３’鎖～５’鎖）、またはウイルス配列の文脈において、マイナス（－）鎖である。
一部の実施形態では、遺伝子産物は、天然の遺伝子のコード部分（例えば、ｃＤＮＡ）によってコードされる。一部の実施形態では、第一の遺伝子産物は、ＧＢＡ１遺伝子によってコードされるタンパク質（またはその断片）である。一部の実施形態では、遺伝子産物は、例えば、ＳＣＡＲＢ２／ＬＩＭＰ２遺伝子またはＰＳＡＰ遺伝子などの表１に挙げられる他の遺伝子によってコードされるタンパク質（またはその断片）である。しかしながら、当業者は、第一の遺伝子産物（例えば、Ｇｃａｓｅ）および第二の遺伝子産物（例えば、ＬＩＭＰ２など）の発現順序が概して逆転しうることを認識している（例えば、ＬＩＭＰ２は第一の遺伝子産物であり、Ｇｃａｓｅは第二の遺伝子産物である）。一部の実施形態では、遺伝子産物は、表１に列挙された遺伝子の断片（例えば、一部）である。タンパク質断片は、表１に列挙された遺伝子によってコードされるタンパク質の約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約９９％を含んでもよい。一部の実施形態では、タンパク質断片は、表１に列挙された遺伝子によってコードされるタンパク質の５０％～９９．９％（例えば、５０％～９９．９％の間の任意の値）を含む。
一部の実施形態では、発現構築物はモノシストロン性である（例えば、発現構築物は、第一の遺伝子産物および第二の遺伝子産物を含む単一融合タンパク質をコードする）。一部の実施形態では、発現構築物は、ポリシストロン性である（例えば、発現構築物は、二つの異なる遺伝子産物、例えば、二つの異なるタンパク質またはタンパク質断片をコードする）。
ポリシストロン性発現ベクターは、一つまたは複数の（例えば、１、２、３、４、５、またはそれ以上）プロモーターを含んでもよい。任意の適切なプロモーター、例えば、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、内因性プロモーター、組織特異的プロモーター（例えば、ＣＮＳ特異的プロモーター）などを使用してもよい。一部の実施形態では、プロモーターは、ニワトリベータアクチンプロモーター（ＣＢＡプロモーター）、ＣＡＧプロモーター（例えば、Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｕ ｅｔ ａｌ．（２００８）ＢＭＣ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．９：２；ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７１－２１２１－９－２に記載される）、ＣＤ６８プロモーター、またはＪｅＴプロモーター（例えば、Ｔｏｒｎｏｅ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｇｅｎｅ ２９７（１－２）：２１－３２に記載される）である。一部の実施形態では、プロモーターは、第一の遺伝子産物、第二の遺伝子産物、または第一の遺伝子産物および第二の遺伝子産物をコードする核酸配列に動作可能に連結される。一部の実施形態では、発現カセットは、転写因子結合配列、イントロンスプライス部位、ポリ（Ａ）付加部位、エンハンサー配列、リプレッサー結合部位、または前述の任意の組み合わせを含むが、これらに限定されない、一つまたは複数の追加の調節配列を含む。
一部の実施形態では、第一の遺伝子産物をコードする核酸配列と、第二の遺伝子産物をコードする核酸配列は、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）をコードする核酸配列によって分離される。ＩＲＥＳ部位の例は、例えば、Ｍｏｋｒｅｊｓ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３４（データベース発行）：Ｄ１２５－３０によって記載される。一部の実施形態では、第一の遺伝子産物をコードする核酸配列と第二の遺伝子産物をコードする核酸配列は、自己切断ペプチドをコードする核酸配列によって分離される。自己切断ペプチドの例としては、以下に限定されないが、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、Ｆ２Ａ、ＢｍＣＰＶ ２Ａ、およびＢｍＩＦＶ ２Ａ、ならびにＬｉｕ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｓｃｉ Ｒｅｐ．７：２１９３．一部の実施形態では、自己切断ペプチドは、Ｔ２Ａペプチドである。
病理学的には、ＰＤおよびゴーシェ病などの障害は、主に、α－シヌクレイン（α－Ｓｙｎ）タンパク質から構成されるタンパク質凝集体の蓄積と関連している。したがって、一部の実施形態では、本明細書に記載される単離核酸は、α－Ｓｙｎタンパク質の発現を低減または防止する阻害性核酸を含む。阻害性核酸をコードする配列は、発現ベクターの非翻訳領域（例えば、イントロン、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲなど）内に配置されてもよい。
一部の実施形態では、阻害性核酸は、発現構築物のイントロン、例えば、第一の遺伝子産物をコードする配列のイントロン上流に位置付けられる。阻害性核酸は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、人工ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、またはＲＮＡアプタマーでありうる。概して、阻害性核酸は、標的ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の連続ヌクレオチド約６～約３０（例えば、６～３０の間の任意の整数）に結合する（例えば、ハイブリダイズする）。一部の実施形態では、阻害性核酸分子は、ｍｉＲＮＡまたはａｍｉＲＮＡであり、例えば、ＳＮＣＡ（α－Ｓｙｎタンパク質をコードする遺伝子）またはＴＭＥＭ１０６Ｂ（例えば、ＴＭＥＭ１０６Ｂタンパク質をコードする遺伝子）を標的とするｍｉＲＮＡである。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、それがハイブリダイズするＳＮＣＡ ｍＲＮＡの領域とのミスマッチを全く含まない（例えば、ｍｉＲＮＡは「完全である」）。一部の実施形態では、阻害性核酸はｓｈＲＮＡ（例えば、ＳＮＣＡまたはＴＭＥＭ１０６Ｂを標的とするｓｈＲＮＡ）である。一部の実施形態では、阻害性核酸は、ｍｉＲ－１５５足場およびＳＮＣＡまたはＴＭＥＭ１０６Ｂ標的化配列を含む人工ｍｉＲＮＡ（ａｍｉＲＮＡ）である。
当業者は、阻害性核酸（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ａｍｉＲＮＡなど）を含むまたはコードする核酸配列に言及する場合、本明細書に提供される配列中の任意の一つまたは複数のチミジン（Ｔ）ヌクレオチドまたはウリジン（Ｕ）ヌクレオチドは、アデノシンヌクレオチドとの塩基対形成（例えば、ワトソン－クリック塩基対を介して）に適した任意の他のヌクレオチドで置換されうることを認識する。例えば、ＴはＵで置換されてもよく、ＵはＴで置換されてもよい。
本明細書に記載される単離核酸は、それ自体、またはベクターの一部として存在しうる。概して、ベクターは、プラスミド、コスミド、ファージミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、またはウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レトロウイルスベクター、バキュロウイルスベクターなど）でありうる。一部の実施形態では、ベクターはプラスミド（例えば、本明細書に記載される単離核酸を含むプラスミド）である。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、一本鎖（例えば、一本鎖ＤＮＡ）である。一部の実施形態では、ベクターは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターである。一部の実施形態では、ベクターは、バキュロウイルスベクター（例えば、オートグラファカリフォーニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病（ＡｃＮＰＶ）ベクター）である。
典型的には、ｒＡＡＶベクター（例えば、ｒＡＡＶゲノム）は、二つのＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）配列に隣接した導入遺伝子（例えば、イントロン、エンハンサー配列、タンパク質コード配列、阻害性ＲＮＡコード配列、ポリＡテール配列などの、一つまたは複数の以上の各プロモーターを含む発現構築物）を含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターの導入遺伝子は、本開示に記載される単離核酸を含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターの二つのＩＴＲ配列の各々は、全長ＩＴＲ（例えば、約１４５ｂｐの長さで、機能的Ｒｅｐ結合部位（ＲＢＳ）および末端分離部位（ｔｒｓ）を含む）である。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターのＩＴＲｓの一つは切断される（例えば、短縮された、または完全長ではない）。一部の実施形態では、短縮型ＩＴＲは、機能的末端分離部位（ｔｒｓ）を欠き、自己相補的ＡＡＶベクター（ｓｃＡＡＶベクター）の作製に使用される。一部の実施形態では、短縮型ＩＴＲは、例えば、ＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１０（２６）：２１１２－８で記載されるように、ΔＩＴＲである。一部の実施形態では、二つのＩＴＲ配列の各々は、ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列である。
本開示の態様は、野生型ＡＡＶＩＴＲと比較して、例えば、野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲ（配列番号２９）と比較して、一つまたは複数の修飾（例えば、核酸付加、欠失、置換など）を有するＩＴＲを含む単離核酸（例えば、ｒＡＡＶベクター）に関する。野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲの構造を図２０に示す。概して、野生型ＩＴＲは、１２５ヌクレオチド領域を含み、この領域は、自己アニールして、二つのクロスアーム（それぞれＢ／Ｂ’およびＣ／Ｃ’と称される配列によって形成される）、より長いステム領域（配列Ａ／Ａ’によって形成される）、および「Ｄ」領域（図２０）と称される一本鎖末端領域からなる、回文二本鎖Ｔ字型、ヘアピン構造を形成する。一般的に、ＩＴＲの「Ｄ」領域は、Ａ／Ａ’配列によって形成されるステム領域と、ｒＡＡＶベクターの導入遺伝子を含む挿入物の間に配置される（例えば、ＩＴＲの終端に対して、またはｒＡＡＶベクターの導入遺伝子挿入物または発現構築物の近位で、ＩＴＲの「内側」に位置する）。一部の実施形態では、「Ｄ」領域は、配列番号２７に記載される配列を含む。「Ｄ」領域は、キャプシドタンパク質によるｒＡＡＶベクターのキャプシド形成において重要な役割を果たすと観察され、これは、例えばＬｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｊ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｄ ９（３）によって開示される。
本開示は、部分的には、ＩＴＲの「外側」（例えば、導入遺伝子挿入物または発現構築物と比較してＩＴＲの末端の近位）に位置する「Ｄ」領域を含むｒＡＡＶベクターが、改変されていない（例えば、野生型）ＩＴＲｓを有するＩＴＳｓを有するｒＡＡＶベクターよりも、ＡＡＶキャプシドタンパク質によって効率的にキャプシド化されるという驚くべき発見に基づいている。一部の実施形態では、改変されたた「Ｄ」配列（例えば、「外側」位置の「Ｄ」配列）を有するｒＡＡＶベクターは、野生型ＩＴＲ配列を有するｒＡＡＶベクターと比較して毒性が低減している。
一部の実施形態では、改変された「Ｄ」配列は、野生型「Ｄ」配列（例えば、配列番号２７）に対する少なくとも一つのヌクレオチド置換を含む。改変された「Ｄ」配列は、野生型「Ｄ」配列（例えば、配列番号２７）に対して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、または１０個を超えるヌクレオチド置換を有してもよい。一部の実施形態では、改変された「Ｄ」配列は、野生型「Ｄ」配列（例えば、配列番号２７）に対して、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９個の核酸置換を含む。一部の実施形態では、改変された「Ｄ」配列は、野生型「Ｄ」配列（例えば、配列番号２７）と約１０％～約９９％の間で同一である（例えば、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％）。一部の実施形態では、改変された「Ｄ」配列は、配列番号２６に記載される配列を含み、これは、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２５０（５）：５７３－８０に記載される「Ｓ」配列とも呼ばれる。
本開示に記載される単離核酸またはｒＡＡＶベクターは、例えば配列番号２８に記載される、またはＦｒａｎｃｏｉｓ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９（１７）：１１０８２－１１０９４により記載される「ＴＲＹ」配列をさらに含みうる。一部の実施形態では、ＴＲＹ配列は、ＩＴＲ（例えば、５’ＩＴＲ）および単離核酸またはｒＡＡＶベクターの発現構築物（例えば、導入遺伝子コード挿入物）との間に位置付けられる。
一部の態様では、本開示は、本開示に記載される単離核酸またはｒＡＡＶベクターを含むバキュロウイルスベクターに関する。一部の実施形態では、バキュロウイルスベクターは、例えば、Ｕｒａｂｅ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １３（１６）：１９３５－４３ および Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １７（１１）：１８８８－１８９６に記載されるオートグラファカリフォーニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病（ＡｃＮＰＶ）ベクターである。
一部の態様では、本開示は、本明細書に記載される単離核酸またはベクターを含む宿主細胞を提供する。宿主細胞は、原核細胞または真核細胞であり得る。例えば、宿主細胞は、哺乳類細胞、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞などでありうる。一部の実施形態では、宿主細胞は哺乳類細胞、例えばＨＥＫ２９３Ｔ細胞である。一部の実施形態では、宿主細胞は細菌細胞、例えば大腸菌細胞である。
ｒＡＡＶｓ
一部の態様では、本開示は、本明細書に記載の核酸をコードする導入遺伝子（例えば、本明細書に記載のｒＡＡＶベクター）を含む組換えＡＡＶｓ（ｒＡＡＶｓ）に関する。用語「ｒＡＡＶｓ」は概して、一つまたは複数のＡＡＶキャプシドタンパク質によってキャプシド形成されるｒＡＡＶベクターを含むウイルス粒子を指す。本開示に記載されるｒＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、およびＡＡＶ１０から選択される血清型を有するキャプシドタンパク質を含みうる。一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、非ヒト宿主由来のキャプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｒｈ．３９などのアカゲザルＡＡＶキャプシドタンパク質を含む。一部の実施形態では、本開示によって記載されるｒＡＡＶは、例えば、それが誘導される野生型ＡＡＶキャプシドタンパク質に対して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０（例えば、１５、２０ ２５、５０、１００など）を超えるアミノ酸置換（例えば、変異）を含むキャプシドタンパク質バリアントなどの、野生型キャプシドタンパク質のバリアントであるキャプシドタンパク質を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶキャプシドタンパク質バリアントは、例えば、Ａｌｂｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１８ Ｆｅｂ ７；２６（２）：５１０－５２３．に記載されるＡＡＶ１ＲＸキャプシドタンパク質である。一部の実施形態では、キャプシドタンパク質バリアントは、例えば、Ｒｏｓａｒｉｏ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ．２０１６；３：１６０２６に記載されるＡＡＶ ＴＭ６キャプシドタンパク質である。
一部の実施形態では、本開示に記載されるｒＡＡＶｓは、特にＣＳＦ腔内または脳実質内に直接導入された場合、ＣＮＳを通して容易に広がる。したがって、一部の実施形態では、本開示に記載されるｒＡＡＶｓは、血液脳関門（ＢＢＢ）を横断することができるキャプシドタンパク質を含む。例えば、一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ９またはＡＡＶｒｈ．１０の血清型を有するキャプシドタンパク質を含む。ｒＡＡＶｓの産生は、例えばＳａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｊ Ｖｉｒｏｌ．６３（９）：３８２２－８ ａｎｄ Ｗｒｉｇｈｔ（２００９）Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０（７）：６９８－７０６により記載される。一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、例えば、ミクログリア細胞などの骨髄細胞を、特異的にまたは優先的に標的にするキャプシドタンパク質を含む。
一部の実施形態では、本開示は、「ＰＲ００６Ａ」と呼ばれるｒＡＡＶを提供する。ＰＲ００６Ａは、機能性ヒトＧＲＮ遺伝子を送達し、機能性ヒトＰＧＲＮの発現の増加をもたらすｒＡＡＶである。ＰＲ００６Ａベクター挿入物は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー、ＣＢＡプロモーター、エクソン１、およびイントロン（ｉｎｔ）の４つの部分を含み、ヒトＧＲＮ（配列番号６８）のコドン最適化されたコード配列を構成的に発現する、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーター要素を含む。３’領域はまた、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素（ＷＰＲＥ）を含み、その後にウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルテールが続く。三つのよく記述された転写調節活性化
部位は、プロモーター領域の５’末端に含有される：ＴＡＴＡ、ＲＢＳ、およびＹＹ１（例えば、Ｆｒａｎｃｏｉｓ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９（１７）：１１０８２－１１０９４を参照）。隣接逆位末端反復（ＩＴＲｓ）は、介在配列の正しいパッケージングを可能にする。バックボーンには、カナマイシンに対する耐性を付与する遺伝子並びにリバースパッケージングを防止するためのスタッファー配列が含まれる。ｒＡＡＶベクターを示す概略図を図６４に示す。配列番号９０は、図６４に示されるＰＲ００６Ａベクターの第一の鎖（５’～３’の順で）のヌクレオチド配列を提供する。配列番号９１は、図６４に示されるＰＲ００６Ａベクターの第二の鎖（５’～３’の順で）のヌクレオチド配列を提供する。ＰＲ００６Ａは、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質を含む。
一部の実施形態では、本開示によって記載されるｒＡＡＶ（例えば、ｒＡＡＶキャプシド粒子を形成するためにＡＡＶキャプシドタンパク質によってキャプシド形成される組換えｒＡＡＶゲノムを含む）は、バキュロウイルスベクター発現系（ＢＥＶＳ）で生成される。ＢＥＶＳを使用したｒＡＡＶｓの産生は、例えば、Ｕｒａｂｅ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １３（１６）：１９３５－４３、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １７（１１）：１８８８－１８９６、米国特許第８，９４５，９１８号、米国特許第９，８７９，２８２号、および国際ＰＣＴ公開ＷＯ２０１７／１８４８７９号、によって記載される。しかしながら、ｒＡＡＶは、任意の適切な方法（例えば、組換えｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を使用して）を使用して作製することができる。一部の実施形態では、本明細書に開示されるｒＡＡＶは、ＨＥＫ２９３（ヒト胚性腎臓）細胞で産生される。
医薬組成物
一部の態様では、本開示は、本明細書に記載される単離核酸またはｒＡＡＶ、および薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容可能な」は、化合物の生物学的活性または特性を破壊しない担体または希釈剤などの材料を指し、例えば、望ましくない生物学的効果を引き起こすことなく、または含有される組成物の成分のいずれかと有害な様式で相互作用することなく、材料を個体に投与することができるなどの、比較的非毒性である。
本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容可能な担体」は、その意図された機能を実行しうるように、本発明内で患者内でまたは患者に対して有用な化合物を運搬または輸送することに関与する、液体または固体充填剤、安定剤、分散剤、懸濁剤、希釈剤、賦形剤、増粘剤、溶媒、または封入材料などの薬学的に許容可能な材料、組成物、または担体を意味する。本発明の実施において使用される医薬組成物に含まれうる追加の成分は、当技術分野で公知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｇｅｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，１９８５，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）に記載されており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載の組成物（例えば、医薬組成物）は、経腸（例えば、、経口）、非経口、 静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、くも膜下腔内、皮下、脳室内、経皮、皮内、直腸、膣内、腹腔内、局所的（粉末、軟膏、クリーム、および／または滴）、粘膜、鼻、頬内、舌下；気管内注入、気管支注入、および／または吸入；および／または経口スプレー、鼻腔スプレー、および／またはエアロゾルとして、を含む、任意の経路で投与することができる。具体的に企図される経路は、経口投与、静脈内投与（例えば、全身静脈内注射）、血液および／またはリンパ供給を介した局所投与、および／または罹患部位への直接投与である。一般に、投与の最も適切な経路は、薬剤の性質（例えば、胃腸管の環境におけるその安定性）、および／または対象の状態（例えば、対象が経口投与に耐えることができるかどうか）を含む様々な要因に依存する。特定の実施形態では、本明細書に記載の化合物または医薬組成物は、対象の眼への局所投与に適している。
一部の実施形態では、本開示は、水溶液中に提示される前述のＰＲ００６Ａ ｒＡＡＶを含むＰＲ００６Ａ最終医薬品を提供する。一部の実施形態では、最終製剤緩衝液は、約２０ｍＭのトリス［ｐＨ８．０］、約１ｍＭのＭｇＣｌ２、約２００ｍＭのＮａＣｌ、および約０．００１％［ｗ／ｖ］のポロクサマー１８８を含有する。一部の実施形態では、最終医薬品および最終製剤緩衝液は、大槽内（ＩＣＭ）注射に適している。
本明細書では、（Ａ）（ａ）ＰＧＲＮタンパク質をコードする導入遺伝子挿入物に動作可能に連結されたプロモーターを含む発現構築物を含む核酸を含むｒＡＡＶベクターであって、導入遺伝子挿入が配列番号６８のヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶベクターと、（ｂ）ＡＡＶ９キャプシドタンパク質と、を含むｒＡＡＶと、（Ｂ）対象においてＧＲＮ変異を有する前頭側頭型認知症を治療する方法に使用するシロリムスと、を含む併用療法剤が提供される。
本明細書では、（ｉ）プログラニュリン（ＰＧＲＮ）タンパク質をコードする導入遺伝子挿入物に動作可能に連結されたプロモーターを含む発現構築物を含む核酸を含むｒＡＡＶベクターであって、導入遺伝子挿入物が、配列番号６８のヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶベクターと、（ｉｉ）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）９キャプシドタンパク質と、を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）と、対象におけるＧＲＮ変異を有する前頭側頭型認知症を治療する方法に使用する一つまたは複数の免疫抑制剤と、の併用療法剤が提供される。本明細書では、（ｉ）プログラニュリン（ＰＧＲＮ）タンパク質をコードする導入遺伝子挿入物に動作可能に連結されたプロモーターを含む発現構築物を含む核酸を含むｒＡＡＶベクターであって、導入遺伝子挿入物が、配列番号６８のヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶベクターと、（ｉｉ）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）９キャプシドタンパク質と、を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）と、以下のうちの一つまたは複数と、の併用療法剤が提供される。対象においてＧＲＮ変異を有する前頭側頭型認知症を治療する方法で使用する（Ａ）シロリムス、（Ｂ）メチルプレドニゾロン、（Ｃ）リツキシマブ、および（Ｄ）プレドニゾン。
本明細書では、（ｉ）プログラニュリン（ＰＧＲＮ）タンパク質をコードする導入遺伝子挿入物に動作可能に連結されたプロモーターを含む発現構築物を含む核酸を含むｒＡＡＶベクターであって、導入遺伝子挿入物が、配列番号６８のヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶベクターと、（ｉｉ）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）９キャプシドタンパク質と、を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）と、以下のうちの一つまたは複数と、の併用療法剤が提供される。ＧＲＮ変異を有する前頭側頭型認知症を有するまたは有すると疑われる対象において免疫応答を抑制する方法に使用する（Ａ）シロリムス、（Ｂ）メチルプレドニゾロン、（Ｃ）リツキシマブ、および（Ｄ）プレドニゾン。
一部の実施形態では、併用療法剤は、約１×１０１３ｖｇ～約７×１０１４ｖｇのｒＡＡＶを含む。一部の実施形態では、併用療法剤は、約３．５×１０１３ｖｇ、約７．０×１０１３ｖｇ、または約１．４×１０１４ｖｇのｒＡＡＶを含む。
一部の実施形態では、併用療法剤は、シロリムス、メチルプレドニゾロン、リツキシマブ、またはプレドニゾンではない追加の免疫抑制剤を含む。
方法
本開示の態様は、部分的には、ＣＮＳ関連疾患を治療する対象における一つまたは複数のＣＮＳ疾患関連遺伝子産物の発現のための組成物に基づく。一つまたは複数のＣＮＳ疾患関連遺伝子産物は、一つまたは複数の単離核酸またはｒＡＡＶベクターによってコードされてもよい。一部の実施形態では、対象は、一つまたは複数の（１、２、３、４、５、またはそれ以上）遺伝子産物をコードする単一ベクター（例えば、単離核酸、ｒＡＡＶなど）を投与される。一部の実施形態では、対象は、複数の（例えば、２、３、４、５、またはそれ以上）ベクター（例えば、単離核酸、ｒＡＡＶｓなど）を投与され、各ベクターは、異なるＣＮＳ疾患関連遺伝子産物をコードする。
ＣＮＳ関連疾患は、神経変性疾患、シヌクレイン病、タウオパチー、またはリソソーム蓄積症であってもよい。神経変性疾患およびそれらの関連遺伝子の例を表１２に列挙する。
「シヌクレイン病」は、対象（例えば、健康な対象、例えば、シヌクレイン病を有していない対象と比較して）におけるアルファ－シヌクレイン（ＳＮＣＡの遺伝子産物）の蓄積によって特徴付けられる疾患または障害を指す。シヌクレイン病の例およびそれらの関連遺伝子を表１３に列挙する。
「タウオパチー」は、対象（例えば、タウオパチーを有していない健康な対象と比較して）における異常なタウタンパク質の蓄積を特徴とする疾患または障害を指す。タウオパチーの例およびそれらの関連遺伝子を表１４に列挙する。
「リソソーム蓄積症」は、対象のリソソーム中の毒性細胞産物の異常な蓄積により特徴付けられる疾患を指す。リソソーム蓄積症の例およびその関連遺伝子を表１５に列挙する。
本明細書で使用される場合、「治療する」または「治療すること」とは、（ａ）ＣＮＳ疾患の発症を予防または遅延すること、（ｂ）ＣＮＳ疾患の重症度を低減すること、（ｃ）ＣＮＳ疾患に特徴的な症状の発症を低減または防止すること、（ｄ）および／またはＣＮＳ疾患に特徴的な症状の悪化を防止することを指す。ＣＮＳ疾患の症状には、例えば、運動機能障害（例えば、揺れ、硬直、動きの鈍さ、歩行困難、麻痺）、認知機能障害（例えば、認知症、うつ病、不安、精神病）、記憶困難、情動的および行動機能障害が含まれうる。
本開示は、部分的には、パーキンソン病を治療するために一緒に作用する（例えば、相乗的に）対象におけるＰＤ関連遺伝子産物の組合せの発現のための組成物に基づく。
したがって、一部の態様では、本開示は、パーキンソン病を有するまたは有すると疑われる対象を治療する方法を提供し、方法は、本開示に記載される組成物（例えば、単離核酸またはベクターまたはｒＡＡＶを含む組成物）を対象に投与することを含む。
本開示は、部分的には、ゴーシェ病を治療する対象における一つまたは複数のＣＮＳ疾患関連遺伝子産物の発現のための組成物に基づく。一部の実施形態では、ゴーシェ病は、例えば、２型ゴーシェ病、または３型ゴーシェ病などの神経障害性ゴーシェ病である。一部の実施形態では、ゴーシェ病を有する対象は、ＰＤまたはＰＤの症状を有しない。
したがって、一部の態様では、本開示は、神経障害性ゴーシェ病を有するまたは有すると疑われる対象を治療する方法を提供し、方法は、本開示に記載される組成物（例えば、単離核酸またはベクターまたはｒＡＡＶを含む組成物）を対象に投与することを含む。
本開示は、部分的には、アルツハイマー病または前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）を治療する対象における一つまたは複数のＣＮＳ疾患関連遺伝子産物の発現のための組成物に基づく。一部の実施形態では、対象は、アルツハイマー病を有していない。一部の実施形態では、対象はＦＴＤを有し、アルツハイマー病を有していない。一部の実施形態では、対象は、ＧＲＮ（プログラニュリン）変異を有するＦＴＤを有する。一部の実施形態では、対象は、ＧＲＮ変異を有するＦＴＤを有し、対象は、ＧＲＮ変異（例えば、病原性ＧＲＮ変異）に対してヘテロ接合性である。一部の実施形態では、ＧＲＮ変異は、ヌル変異（例えば、ナンセンス、フレームシフト、またはスプライス部位変異、または完全もしくは部分的（エクソン）遺伝子欠失）である。一部の実施形態では、ＧＲＮ変異は、実証された機能的有害効果を有する病原性変異である。一部の実施形態では、ＧＲＮ変異は、ミスセンス病原性変異である。一部の実施形態では、ＧＲＮ変異は、Ｍｏｌｇｅｎ ＦＴＤデータベース（ｍｏｌｇｅｎ．ｕａ．ａｃ．ｂｅ）に列挙される。一部の実施形態では、ＧＲＮ変異は、対象において低血漿ＰＧＲＮレベル（＜７０ｎｇ／ｍＬ）を生成する。
一部の実施形態では、対象は、ＦＴＤ、ＧＲＮ変異を有するＦＴＤ、タウ変異を有するＦＴＤ、Ｃ９ｏｒｆ７２変異を有するＦＴＤ、神経セロイドリポフスチン症、パーキンソン病、アルツハイマー病、大脳皮質基底核変性症、運動ニューロン疾患、またはゴーシェ病を有する。
一部の実施形態では、対象は、症候性ＦＴＤ（例えば、行動バリアントＦＴＤ（ｂｖＦＴＤ）、原発性進行性失語症（ＰＰＡ）－ＦＴＤ、皮質基底核症候群を伴うＦＴＤ、または症候群の組み合わせ）を有する。
したがって、一部の態様では、本開示は、ＧＲＮ変異を有するＦＴＤを有するまたは有すると疑われる対象を治療する方法を提供し、方法は、本開示に記載される組成物（例えば、単離核酸またはベクターまたはｒＡＡＶを含む組成物）を対象に投与することを含む。
一部の実施形態では、アルツハイマー病またはＦＴＤ（例えば、ＧＲＮ変異を有するＦＴＤ）を有する対象は、プログラニュリン（ＰＧＲＮ）またはその一部をコードするｒＡＡＶを投与される。一部の実施形態では、アルツハイマー病またはＦＴＤ（例えば、ＧＲＮ変異を有するＦＴＤ）を有する対象は、ＰＧＲＮまたはその一部をコードするｒＡＡＶを投与され、ＰＧＲＮタンパク質は、コドン最適化された核酸配列または配列番号６８の核酸配列によってコードされる。一部の実施形態では、ＰＧＲＮタンパク質は、配列番号６７またはその一部分のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ９血清型を有するキャプシドタンパク質を含むＰＧＲＮをコードする。
一部の実施形態では、ＦＴＤ（例えば、ＧＲＮ変異を有するＦＴＤ）を治療するためのＰＧＲＮをコードするｒＡＡＶを含む組成物は、約１×１０１２ベクターゲノム（ｖｇ）～約１×１０１５ｖｇ、または約１×１０１３ｖｇ～約７×１０１４ｖｇ、または約１×１０１３ｖｇ～約５×１０１４ｖｇ、または約２×１０１３ｖｇ～約２×１０１４、または約３×１０１３～約２×１０１４ｖｇ、または約３．５×１０１３ｖｇ～約１．４×１０１４ｖｇの範囲の用量で、対象に投与される。一部の実施形態では、ＦＴＤ（例えば、ＧＲＮ変異を有するＦＴＤ）を治療するＰＧＲＮをコードするｒＡＡＶを含む組成物は、約２×１０１３ｖｇ、約３×１０１３ｖｇ、約４×１０１３ｖｇ、約５×１０１３ｖｇ、約６×１０１３ｖｇ、約７×１０１３ｖｇ、約８×１０１３ｖｇ、約９×１０１３ｖｇ、約１×１０１４ｖｇ、または約２×１０１４ｖｇの用量で、対象に投与される。
一部の態様では、本開示は、ＦＴＤ（例えば、ＧＲＮ変異を有するＦＴＤ）を有するまたはＦＴＤを有すると疑われる対象を治療する方法を提供し、方法は、ＰＧＲＮをコードするｒＡＡＶを含む組成物を対象に投与することを含み、組成物は、約３．５×１０１３ベクターゲノム（ｖｇ）、約７．０×１０１３ｖｇ、または約１．４×１０１４ｖｇの用量で投与される。
一部の態様では、本開示は、ＦＴＤ（例えば、ＧＲＮ変異を有するＦＴＤ）を有するまたはＦＴＤを有すると疑われる対象を治療する方法を提供し、方法は、ＰＧＲＮをコードするｒＡＡＶを含む組成物を対象に投与することを含み、組成物は、約１×１０１４ベクターゲノム（ｖｇ）、約２．０×１０１４ｖｇ、または約４．０×１０１４ｖｇの用量で投与される。
一部の実施形態では、対象にＦＴＤ（例えば、ＧＲＮ変異を有するＦＴＤ）を治療するＰＧＲＮをコードするｒＡＡＶを含む組成物は、単回投与され、その後、組成物は対象に投与されない。
一部の実施形態では、ｒＡＡＶを含む組成物は、大槽内に単一の後頭下注射を介して送達される。一部の実施形態では、大槽内への注射は、Ｘ線撮影誘導下で実施される。
一部の実施形態では、本開示は、ＧＲＮ変異を有するＦＴＤを有するまたは有すると疑われる対象の症状を治療する方法を提供し、方法は、機能的プログラニュリン（ＰＧＲＮ）タンパク質の配列をコードするｒＡＡＶを含む組成物を対象に投与することを含み、ＰＧＲＮタンパク質は、コドン最適化された核酸配列または配列番号６８の核酸配列によってコードされる。一部の実施形態では、ＧＲＮ変異を有するＦＴＤの症状は、人格変化、実行機能の障害、脱抑制、無関心、発話の遅れ、文法の誤用、多モード失認症、語義失語、または言葉の理解の障害であり得る。一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ９血清型を有するキャプシドタンパク質を含むＰＧＲＮをコードする。
一部の実施形態では、本開示は、ＧＲＮ変異を有するＦＴＤを有するまたは有すると疑われる対象の脳内のリポフスチンの蓄積を減少する方法を提供し、方法は、プログラニュリン（ＰＧＲＮ）をコードするｒＡＡＶを含む組成物を対象に投与することを含み、ＰＧＲＮタンパク質は、コドン最適化された核酸配列または配列番号６８の核酸配列によってコードされる。一部の態様では、本開示は、ＧＲＮ変異を有するＦＴＤを有するまたは有すると疑われる対象の脳内のユビキチンの蓄積を減少する方法を提供し、方法は、プログラニュリン（ＰＧＲＮ）をコードするｒＡＡＶを含む組成物を対象に投与することを含み、ＰＧＲＮタンパク質は、コドン最適化された核酸配列または配列番号６８の核酸配列によってコードされる。一部の態様では、本開示は、ＧＲＮ変異を有するＦＴＤを有するまたは有すると疑われる対象の脳内のＴＮＦαおよび／またはＣＤ６８の遺伝子発現および／またはタンパク質発現を減少する方法を提供し、方法は、プログラニュリン（ＰＧＲＮ）をコードするｒＡＡＶを含む組成物を対象に投与することを含み、ＰＧＲＮタンパク質は、コドン最適化された核酸配列または配列番号６８の核酸配列によってコードされる。一部の態様では、本開示は、ＧＲＮ変異を有するＦＴＤを有するまたは有すると疑われる対象の脳内のカテプシンＤの成熟を増加する方法を提供し、方法は、プログラニュリン（ＰＧＲＮ）をコードするｒＡＡＶを含む組成物を対象に投与することを含み、ＰＧＲＮタンパク質は、コドン最適化された核酸配列または配列番号６８の核酸配列によってコードされる。一部の態様では、本開示は、ＧＲＮ変異を有するＦＴＤを有するまたは有すると疑われる対象の脳内の核ＴＤＰ－４３（トランスアクティブ応答ＤＮＡ結合タンパク質４３ｋＤａ）タンパク質のレベルを増加する方法を提供し、方法は、プログラニュリン（ＰＧＲＮ）をコードするｒＡＡＶを含む組成物を対象に投与することを含み、ＰＧＲＮタンパク質は、コドン最適化された核酸配列または配列番号６８の核酸配列によってコードされる。一部の実施形態では、本開示は、ＧＲＮ変異を有するＦＴＤを有するまたは有すると疑われる対象の血液またはＣＳＦ中のニューロフィラメント軽鎖（ＮｆＬ）のレベルを減少する方法を提供し、方法は、プログラニュリン（ＰＧＲＮ）をコードするｒＡＡＶを含む組成物を対象に投与することを含み、ＰＧＲＮタンパク質は、コドン最適化された核酸配列または配列番号６８の核酸配列によってコードされる。一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ９血清型を有するキャプシドタンパク質を含むＰＧＲＮをコードする。
対象は、典型的には哺乳類であり、好ましくはヒトである。一部の実施形態では、対象は、１か月齢から１０歳齢の間である（例えば、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、１３か月、１４か月、１５か月、１６か月、１７か月、１８か月、１９か月、２０か月、２１か月、２２か月、２３か月、２４か月、３歳、４歳、５歳、６歳、７歳、８歳、９歳、１０歳、またはその間の任意の齢）。一部の実施形態では、対象は２～２０歳の間である。一部の実施形態では、対象は３０歳～１００歳である。一部の実施形態では、対象は５５歳以上である。
一部の実施形態では、組成物は、例えば、対象の脳および／または脊髄への直接注射によって、対象のＣＮＳに直接投与される。ＣＮＳ直接投与様式の例としては、以下に限定されないが、脳内注射、脳室内注射、槽内注射、実質内注射、くも膜下腔内注射、および前述の任意の組み合わせが挙げられる。一部の実施形態では、組成物は、大槽内（ＩＣＭ）注射により対象に投与される。一部の実施形態では、対象のＣＮＳへの直接注射は、対象の中脳、線条体および／または大脳皮質における導入遺伝子発現（例えば、第一の遺伝子産物、第二の遺伝子産物、および該当する場合には第三の遺伝子産物の発現）をもたらす。一部の実施形態では、ＣＮＳへの直接注射は、対象の脊髄および／またはＣＳＦにおける導入遺伝子発現（例えば、第一の遺伝子産物、第二の遺伝子産物、および該当する場合には第三の遺伝子産物の発現）をもたらす。
一部の実施形態では、対象のＣＮＳへの直接注射は、対流増加送達（ＣＥＤ）を含む。対流増加送達は、脳の外科的曝露および脳の標的領域への小径カテーテルの直接の配置を伴い、その後、治療剤（例えば、本明細書に記載される組成物またはｒＡＡＶ）を対象の脳に直接注入する治療戦略である。ＣＥＤは、例えば、Ｄｅｂｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｔｈｅｒ．９（１０）：１５１９－２７により記載される。
一部の実施形態では、組成物は、例えば、末梢注射によって対象に末梢的に投与される。末梢注射の例としては、皮下注射、静脈内注射、動脈内注射、腹腔内注射、または前述の任意の組み合わせが挙げられる。一部の実施形態では、末梢注射は、例えば対象の頸動脈への注射などの動脈内注射である。
一部の実施形態では、本開示に記載される組成物（例えば、単離核酸またはベクターまたはｒＡＡＶを含む組成物）は、対象のＣＮＳに末梢的および直接的の両方で投与される。例えば、一部の実施形態では、対象は、動脈内注射（例えば、頸動脈への注射）および実質内注射（例えば、ＣＥＤによる実質内注射）によって組成物を投与される。一部の実施形態では、ＣＮＳへの直接注射および末梢注射は同時である（例えば、同時に起こる）。一部の実施形態では、直接注射は、末梢注射の前に（例えば、１分および１週間、またはそれよりも前に）発生する。一部の実施形態では、直接注射は、末梢注射の後に（例えば、１分および１週間、またはそれよりも後に）発生する。
一部の実施形態では、対象は、免疫抑制剤を、本明細書に記載される組成物の前（例えば、１か月前から１分前）、または同時に投与される。一部の実施形態では、免疫抑制剤は、コルチコステロイド（例えば、プレドニゾン、ブデソニドなど）、ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、シロリムス、エベロリムスなど）、抗体（例えば、アダリムマブ、エタネルセプト、ナタリズマブなど）、またはメトトレキサートである。
一部の実施形態では、対象は、－１日目（ウィンドウ－３日目～－１日目）に、約６ｍｇのシロリムス経口負荷用量を投与される（０日目はｒＡＡＶの投与である）。例えば、シロリムス用量は、－３日目、－２日目、または－１日目に投与されてもよい。一部の実施形態では、２ｍｇのその後のシロリムス維持用量は、必要に応じて、約４ｎｇ／ｍＬ（約２ｎｇ／ｍＬ～約８ｎｇ／ｍＬの範囲）の血清トラフレベルを維持するために、３か月目まで投与および調整される。一部の実施形態では、２ｍｇのその後のシロリムス維持用量は、必要に応じて、約４ｎｇ／ｍＬ～約９ｎｇ／ｍＬの血清トラフレベルを維持するために、３か月目まで投与および調整される。一部の実施形態では、シロリムスは、その後１５日間～３０日間（３か月目の終了後）に実質的に漸減する。一部の実施形態では、トラフレベルは、シロリムス用量の投与前に収集される。
一部の実施形態では、対象は、約１ｇのメチルプレドニゾロン静脈内負荷用量を０日目（ウィンドウ－１日目～０日目）に投与され、その後、約３０ｍｇのプレドニゾンを、ｒＡＡＶ投与の翌日から１４日間経口投与される。一部の実施形態では、プレドニゾンは、その後の７日間の間漸減される。一部の実施形態では、プレドニゾンは、１日目から１４日目まで、併用薬として毎日０．５ｍｇ／ｋｇの用量で、そして毎日０．２５ｍｇ／ｋｇを４日間、経口投与され、続いて、４日間にわたって、０．１ｍｇ／ｋｇから０ｍｇ／ｋｇへ、毎日ゆっくりと漸減して、経口投与される。一部の実施形態では、メチルプレドニゾロンおよびプレドニゾンの投与は、上述のシロリムスの投与と組み合わされる。一部の実施形態では、プレドニゾンの高用量またはより長い漸減が使用されてもよい（例えば、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）／アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）の上昇の場合）。
一部の実施形態では、本明細書では、ＧＲＮ変異を有する前頭側頭型認知症を有するまたは有すると疑われる対象を治療する方法が提供され、方法は、対象に、（ｉ）５’～３’の順で、（ａ）ＡＡＶ２ ＩＴＲと、（ｂ）ＣＭＶエンハンサーと、（ｃ）ＣＢＡプロモーターと、（ｄ）ＰＧＲＮタンパク質をコードする導入遺伝子挿入物であって、配列番号６８のヌクレオチド配列を含む導入遺伝子挿入物と、（ｅ）ＷＰＲＥと、（ｆ）ウシ成長ホルモンポリＡシグナルテールと、（ｇ）ＡＡＶ２ ＩＴＲと、を含む核酸を含むｒＡＡＶベクターと、（ｉｉ）ＡＡＶ９キャプシドタンパク質と、を含む（Ａ）ｒＡＡＶと、（Ｂ）シロリムスであって、ｒＡＡＶの投与の１日～３日前の範囲で約６ｍｇの用量で経口投与され、ｒＡＡＶの投与後の約３か月間は約２ｎｇ／ｍＬ～約８ｎｇ／ｍＬの血清トラフレベルを維持するように約２ｍｇの用量が投与され、投与はｒＡＡＶの投与後の３か月の期間の終了後１５日～３０日の間に漸減されるシロリムスと、を投与することを含む。
本開示は、（１）野生型ＰＧＲＮをコードするＧＲＮ遺伝子の機能的コピーを送達するｒＡＡＶの投与と、（２）免疫抑制レジメンの投与と、を組み合わせた、ＦＴＤ－ＧＲＮを有するまたは有すると疑われる対象を治療する方法を提供する。一部の実施形態では、免疫抑制レジメンは、シロリムス、メチルプレドニゾロン、抗－ＣＤ２０抗体、およびプレドニゾンのうちの一つまたは複数の投与を含む。一部の実施形態では、免疫抑制レジメンは、シロリムス、メチルプレドニゾロン、抗－ＣＤ２０抗体、およびプレドニゾンの全ての投与を含む。一部の実施形態では、免疫抑制レジメンは、シロリムス、メチルプレドニゾロン、抗－ＣＤ２０抗体、およびプレドニゾンの全ての投与からなる。一部の実施形態では、抗－ＣＤ２０抗体はリツキシマブである。
一部の実施形態では、免疫抑制レジメンは、対象においてＡＡＶ関連および／または導入遺伝子タンパク質発現関連免疫応答を抑制する。一部の実施形態では、免疫抑制レジメンは、対象におけるＡＡＶ９キャプシド免疫応答を減少させる。一部の実施形態では、免疫抑制レジメンは、対象におけるＣＳＦ炎症反応を減少させる。
本明細書では、ＧＲＮ変異を有する前頭側頭型認知症を有するまたは有すると疑われる対象を治療する方法が提供され、方法は、対象に、（ｉ）プログラニュリン（ＰＧＲＮ）タンパク質をコードする導入遺伝子挿入物に動作可能に連結されたプロモーターを含む発現構築物を含む核酸を含むｒＡＡＶベクターであって、導入遺伝子挿入物が、配列番号６８のヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶベクターと、（ｉｉ）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）９キャプシドタンパク質と、を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）と、以下のうちの一つまたは複数と、を投与することを含む。（Ａ）シロリムス、（Ｂ）メチルプレドニゾロン、（Ｃ）リツキシマブ、および（Ｄ）プレドニゾン。
また、本明細書では、ＧＲＮ変異を有する前頭側頭型認知症を有するまたは有すると疑われる対象を治療する方法が提供され、方法は、対象に、（ｉ）５’から３’の順番で、（ａ）アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）２ＩＴＲと、（ｂ）サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーと、（ｃ）ニワトリベータアクチン（ＣＢＡ）プロモーターと、（ｄ）プログラニュリン（ＰＧＲＮ）タンパク質をコードする導入遺伝子挿入物であって、導入遺伝子挿入物が、配列番号６８の核酸配列を含む導入遺伝子挿入物と、（ｅ）ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節因子（ＷＰＲＥ）と、（ｆ）ウシ成長ホルモンポリＡシグナルテールと、（ｇ）ＡＡＶ２逆位末端反復（ＩＴＲ）と、を含む核酸を含むｒＡＡＶベクターと、（ｉｉ）ＡＡＶ９キャプシドタンパク質と、を含む組換えアデノ関連ウイルス（ｒＡＡＶ）と、以下のうちの一つまたは複数を投与することを含む。（Ａ）シロリムス、（Ｂ）メチルプレドニゾロン、（Ｃ）リツキシマブ、および（Ｄ）プレドニゾン。
本明細書ではさらに、ＧＲＮ変異を有する前頭側頭型認知症を有するまたは有すると疑われる対象の免疫応答を抑制する方法が提供され、方法は、対象に、（ｉ）プログラニュリン（ＰＧＲＮ）タンパク質をコードする導入遺伝子挿入物に動作可能に連結されたプロモーターを含む発現構築物を含む核酸を含むｒＡＡＶベクターであって、導入遺伝子挿入物が、配列番号６８のヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶベクターと、（ｉｉ）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）９キャプシドタンパク質と、を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）と、以下のうちの一つまたは複数と、を投与することを含む。（Ａ）シロリムス、（Ｂ）メチルプレドニゾロン、（Ｃ）リツキシマブ、および（Ｄ）プレドニゾン。
また、本明細書では、ＧＲＮ変異を有する前頭側頭型認知症を有するまたは有すると疑われる対象の免疫応答を抑制する方法が提供され、方法は、対象に、（ｉ）５’から３’の順番で、（ａ）アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）２ＩＴＲと、（ｂ）サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーと、（ｃ）ニワトリベータアクチン（ＣＢＡ）プロモーターと、（ｄ）プログラニュリン（ＰＧＲＮ）タンパク質をコードする導入遺伝子挿入物であって、導入遺伝子挿入物が、配列番号６８の核酸配列を含む導入遺伝子挿入物と、（ｅ）ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節因子（ＷＰＲＥ）と、（ｆ）ウシ成長ホルモンポリＡシグナルテールと、（ｇ）ＡＡＶ２逆位末端反復（ＩＴＲ）と、を含む核酸を含むｒＡＡＶベクターと、（ｉｉ）ＡＡＶ９キャプシドタンパク質と、を含む組換えアデノ関連ウイルス（ｒＡＡＶ）と、以下のうちの一つまたは複数を投与することを含む。（Ａ）シロリムス、（Ｂ）メチルプレドニゾロン、（Ｃ）リツキシマブ、および（Ｄ）プレドニゾン。
対象において免疫応答を抑制する本明細書に開示される方法では、免疫抑制剤は、遺伝子療法（例えば、ｒＡＡＶ）ではなく、免疫抑制剤（例えば、シロリムス、メチルプレドニゾロン、抗－ＣＤ２０抗体およびプレドニゾン）によって産生される。
一部の実施形態では、メチルプレドニゾロンは、ｒＡＡＶの投与の前日に約１０００ｍｇの用量で静脈内投与される。一部の実施形態では、メチルプレドニゾロンは、ｒＡＡＶの投与と同日に約１０００ｍｇの用量で静脈内投与される。
一部の実施形態では、プレドニゾンは、（Ａ）約１０００ｍｇのメチルプレドニゾロンの投与の翌日に開始する１４日間、約３０ｍｇ／日の用量で、および（Ｂ）（Ａ）の１４日間の期間の終了後の７日間で漸減して、経口投与される。一部の実施形態では、より長い期間でのプレドニゾンの漸減は、最初の１４日間の漸減の終了時にＡＬＴおよび／またはＡＳＴ＞３×正常上限（ＵＬＮ）を呈する対象で、さらに４週間にわたって使用される。
一部の実施形態では、抗－ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ）は、ｒＡＡＶの投与の１４日前から１日前の任意の一日に、約１０００ｍｇの用量で静脈内投与される。
一部の実施形態では、メチルプレドニゾロンは、抗－ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ）が投与される前に投与される。一部の実施形態では、メチルプレドニゾロンは、抗－ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ）が投与される少なくとも約３０分前に投与される。一部の実施形態では、メチルプレドニゾロンおよび抗－ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ）は、両方共、ｒＡＡＶの投与前の日に投与され、メチルプレドニゾロンは抗－ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ）が投与される少なくとも約３０分前に投与される。一部の実施形態では、抗－ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ）は、ｒＡＡＶの投与の１４日前から２日前の間の任意の一日に投与され、メチルプレドニゾロンは、抗－ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ）が投与されるのと同じ日に抗－ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ）が投与される少なくとも３０分前に約１００ｍｇの用量で静脈内投与される。
一部の実施形態では、シロリムスは、（Ａ）ｒＡＡＶの投与の三日、二日、または一日前に約６ｍｇの単回投与として、および（Ｂ）ｒＡＡＶの投与後約９０日間、約４ｎｇ／ｍｌ～約９ｎｇ／ｍＬの血清トラフレベルを維持するように約２ｍｇ／日の用量で、経口投与され、シロリムスの約２ｍｇ／日の第一の用量は、シロリムスの約６ｍｇの単回投与の翌日投与される。一部の実施形態では、シロリムスの投与が、ｒＡＡＶの投与後の９０日間の期間の終了後１５日～３０日の間に漸減される。
本明細書では、ＧＲＮ変異を有する前頭側頭型認知症を有するまたは有すると疑われる対象を治療する方法が提供され、方法は、対象に、
（ｉ）約１０００ｍｇの用量でメチルプレドニゾロンを静脈内投与することと、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）のメチルプレドニゾロン投与の約３０分後に、約１０００ｍｇの用量でリツキシマブを静脈内投与することと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉ）のメチルプレドニゾロン投与の翌日に、本明細書に開示されるｒＡＡＶを、大槽内への注射を介して投与することと、
（ｉｖ）ステップ（ｉ）のメチルプレドニゾロン投与の翌日から１４日間、約３０ｍｇ／日の用量でプレドニゾンを経口投与することと、
（ｖ）ステップ（ｉｖ）の１４日間の期間の終了後の７日間、プレドニゾンを漸減投与することと、
（ｖｉ）ステップ（ｉｉｉ）のｒＡＡＶ投与の三日前、二日前、または一日前に、シロリムスを約６ｍｇの単回投与として経口投与することと、
（ｖｉｉ）ステップ（ｉｉｉ）のｒＡＡＶ投与後の約９０日間、約４ｎｇ／ｍｌ～約９ｎｇ／ｍＬの血清トラフレベルを維持するようにシロリムスを約２ｍｇ／日の用量で経口投与することであって、シロリムスの約２ｍｇ／日の第一の用量は、シロリムスの約６ｍｇの単回投与の翌日に投与することと、
（ｖｉｉｉ）ステップ（ｖｉｉ）の９０日間の期間の終了後の１５日～３０日の間にシロリムスを漸減投与することと、を含む。
本明細書では、ＧＲＮ変異を有する前頭側頭型認知症を有する、または有すると疑われる対象において免疫応答を抑制する方法が提供され、方法は、対象に、
（ｉ）約１０００ｍｇの用量でメチルプレドニゾロンを静脈内投与することと、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）のメチルプレドニゾロン投与の約３０分後に、約１０００ｍｇの用量でリツキシマブを静脈内投与することと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉ）の前記メチルプレドニゾロン投与の翌日に、注射を介して大槽内に前記ｒＡＡＶを投与することと、
（ｉｖ）ステップ（ｉ）のメチルプレドニゾロン投与の翌日から１４日間、約３０ｍｇ／日の用量でプレドニゾンを経口投与することと、
（ｖ）ステップ（ｉｖ）の１４日間の期間の終了後の７日間、プレドニゾンを漸減投与することと、
（ｖｉ）ステップ（ｉｉｉ）のｒＡＡＶ投与の三日前、二日前、または一日前に、シロリムスを約６ｍｇの単回投与として経口投与することと、
（ｖｉｉ）ステップ（ｉｉｉ）のｒＡＡＶ投与後の約９０日間、約４ｎｇ／ｍｌ～約９ｎｇ／ｍＬの血清トラフレベルを維持するようにシロリムスを約２ｍｇ／日の用量で経口投与することであって、シロリムスの約２ｍｇ／日の第一の用量は、シロリムスの約６ｍｇの単回投与の翌日に投与することと、
（ｖｉｉｉ）ステップ（ｖｉｉ）の９０日間の期間の終了後の１５日～３０日の間にシロリムスを漸減投与することと、を含む。
本明細書では、ＧＲＮ変異を有する前頭側頭型認知症を有するまたは有すると疑われる対象を治療する方法が提供され、方法は、対象に、
（ｉ）ステップ（ｉｖ）のｒＡＡＶ投与の１４日前～２日前の間の任意の一日に、約１００ｍｇの用量でメチルプレドニゾロンを静脈内投与することと、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）のメチルプレドニゾロン投与の約３０分後に、約１０００ｍｇの用量でリツキシマブを静脈内投与することと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｖ）のｒＡＡＶ投与の一日前または同日のいずれかに、約１０００ｍｇの用量でメチルプレドニゾロンを静脈内投与することと、
（ｉｖ）注射を介して本明細書に記載されるｒＡＡＶを大槽内に投与することと、
（ｖ）ステップ（ｉｉｉ）の前記メチルプレドニゾロン投与の翌日から１４日間、約３０ｍｇ／日の用量で前記プレドニゾンを経口投与することと、
（ｖｉ）ステップ（ｖ）の前記１４日間の期間の終了後の７日間、前記プレドニゾンを漸減投与することと、
（ｖｉｉ）ステップ（ｉｖ）のｒＡＡＶ投与の三日前、二日前、または一日前に、シロリムスを約６ｍｇの単回投与として経口投与することと、
（ｖｉｉｉ）ステップ（ｉｖ）のｒＡＡＶ投与後の約９０日間、約４ｎｇ／ｍｌ～約９ｎｇ／ｍＬの血清トラフレベルを維持するようにシロリムスを約２ｍｇ／日の用量で経口投与することであって、シロリムスの約２ｍｇ／日の第一の用量は、約６ｍｇのシロリムスの単回投与の翌日に投与することと、
（ｉｘ）ステップ（ｖｉｉｉ）の９０日間の期間の終了後の１５日～３０日の間にシロリムスを漸減投与することと、を含む。
本明細書では、ＧＲＮ変異を有する前頭側頭型認知症を有する、または有すると疑われる対象において免疫応答を抑制する方法が提供され、方法は、対象に、
（ｉ）ステップ（ｉｖ）のｒＡＡＶ投与の１４日前～２日前の間の任意の一日に、約１００ｍｇの用量でメチルプレドニゾロンを静脈内投与することと、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）のメチルプレドニゾロン投与の約３０分後に、約１０００ｍｇの用量でリツキシマブを静脈内投与することと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｖ）のｒＡＡＶ投与の一日前または同日のいずれかに、約１０００ｍｇの用量でメチルプレドニゾロンを静脈内投与することと、
（ｉｖ）注射を介してｒＡＡＶを大槽内に投与することと、
（ｖ）ステップ（ｉｉｉ）の前記メチルプレドニゾロン投与の翌日から１４日間、約３０ｍｇ／日の用量で前記プレドニゾンを経口投与することと、
（ｖｉ）ステップ（ｖ）の前記１４日間の期間の終了後の７日間、前記プレドニゾンを漸減投与することと、
（ｖｉｉ）ステップ（ｉｖ）のｒＡＡＶ投与の三日前、二日前、または一日前に、シロリムスを約６ｍｇの単回投与として経口投与することと、
（ｖｉｉｉ）ステップ（ｉｖ）のｒＡＡＶ投与後の約９０日間、約４ｎｇ／ｍｌ～約９ｎｇ／ｍＬの血清トラフレベルを維持するようにシロリムスを約２ｍｇ／日の用量で経口投与することであって、シロリムスの約２ｍｇ／日の第一の用量は、約６ｍｇのシロリムスの単回投与の翌日に投与することと、
（ｉｘ）ステップ（ｖｉｉｉ）の９０日間の期間の終了後の１５日～３０日の間にシロリムスを漸減投与することと、を含む。
一部の実施形態では、対象の免疫応答は、ｒＡＡＶに対する免疫応答である。一部の実施形態では、免疫応答は、Ｔセル応答である。一部の実施形態では、免疫応答は、Ｂセル応答である。一部の実施形態では、免疫応答は、抗体応答である。一部の実施形態では、免疫応答は、プレオサイトーシスである。一部の実施形態では、プレオサイトーシスは、脳脊髄液（ＣＳＦ）プレオサイトーシスである。一部の実施形態では、免疫応答は、ＣＳＦタンパク質の異常なレベルのである。一部の実施形態では、ＣＳＦタンパク質の異常なレベルは、７０ｍｇ／ｄＬ超である。
一部の実施形態では、予防的ＩＶコルチコステロイド治療（Ｔ細胞およびＢ細胞の両方を標的とする）は、ｒＡＡＶでの治療の前日に開始し、経口治療は１４日間継続し、その後７日間にわたって漸減する。主にＴ細胞を標的とするシロリムス治療は、ｒＡＡＶによる治療の前日から開始し、９０日間続き、その後漸減する。主にＢ細胞を標的とするリツキシマブは、一回、好ましくはｒＡＡＶでの処置の前日に投与され、その活性は６カ月間持続すると予想される。
一部の実施形態では、対象は、コルチコステロイド、リツキシマブ、およびシロリムスからなる免疫抑制レジメンを受ける。対象は、－１日目にメチルプレドニゾロン１０００ｍｇのＩＶパルスの負荷用量を受ける（－１日目または０日目に許容される）。プレドニゾンを３０ｍｇ／日の用量で、１０００ｍｇのメチルプレドニゾロンのＩＶパルスの翌日（０日目または１日目）から１４日間、併用薬として経口投与し、その後の７日間にわたって漸減させる。対象は、－１４日目と－１日目の間の任意の一日に、１０００ｍｇのリツキシマブＩＶを１回投与される。リツキシマブに関連する注入関連反応（ＩＲＲ）のリスクと重症度を軽減するため、対象は、リツキシマブのＩＶ注入を受ける前にメチルプレドニゾロンのＩＶ投与を受ける。－１日目のリツキシマブの用量投与については、対象は、上述の１０００ｍｇのメチルプレドニゾロンのＩＶパルスの少なくとも３０分後にリツキシマブの注入を受ける。－１４日目と－２日目の間のリツキシマブの用量投与については、対象は、リツキシマブのＩＶ投与の約３０分前に１００ｍｇのメチルプレドニゾロンのＩＶ注入を受ける。対象は、－１日目に６ｍｇのシロリムス経口負荷用量を受ける（－３日目～－１日目のウィンドウ）。その後の２ｍｇ／日のシロリムス経口維持用量は、併用薬として０日目（またはシロリムス負荷用量の翌日、シロリムス負荷用量が－３日目または－２日目に投与される場合）に提供が開始され、６ｎｇ／ｍＬ（範囲４～９ｎｇ／ｍＬ）の血清トラフレベルを９０日間維持するために必要に応じて９０日間調整される。シロリムスはその後の１５～３０日間にわたって漸減される。高用量またはより長い漸減期間のコルチコステロイドおよびシロリムスが使用されうる。
一部の実施形態では、より長い漸減期間、または免疫抑制治療の再開始が使用されうる（例えば、ＡＳＴまたはＡＬＴの上昇、ＣＳＦにおける炎症性変化、または他の疑われる免疫系反応の場合）。
一部の実施形態では、シロリムス、メチルプレドニゾロン、リツキシマブ、またはプレドニゾンではない追加の免疫抑制剤がさらに対象に投与される。
一部の実施形態では、本明細書に開示される方法は、免疫抑制剤の用量の増加、長期の漸減レジメン、追加の薬剤の使用、または以下のなどの免疫応答に一致する兆候または症状に基づく治療の開始を含みうる。
・白血球数（ＷＢＣ）＞３０ｍｍ３および／または高脳脊髄液（ＣＳＦ）タンパク質（＞７０ｍｇ／ｄＬ）を伴う無症候性プレオサイトーシス
・臨床症状を伴うＣＳＦプレオサイトーシスおよび／またはタンパク質の増加（根底にあるＦＴＤ症状の代償不全を含む）
・神経学的検査および／または治療誘発性神経障害評価尺度（ＴＮＡＳ）に基づく感覚症状の出現
・肝炎の症状（例えば、黄斑、疲労）と併せて、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）および／またはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）上昇＞５×正常上限（ＵＬＮ）
・臨床症状の有無に関わらず、ＡＬＴおよび／またはＡＳＴ上昇が＞１０×ＵＬＮ。
対象に投与される本開示によって記載される組成物（例えば、単離核酸またはベクターまたはｒＡＡＶを含む組成物）の量は、投与方法に応じて変化する。例えば、一部の実施形態では、本明細書に記載されるｒＡＡＶは、約１０９個のゲノムコピー（ＧＣ）／ｋｇと約１０１４個のＧＣ／ｋｇ（例えば、約１０９個のＧＣ／ｋｇ、約１０１０個のＧＣ／ｋｇ、約１０１１個のＧＣ／ｋｇ、約１０１２個のＧＣ／ｋｇ、約１０１２個のＧＣ／ｋｇ、または約１０１４個のＧＣ／ｋｇ）との間の力価で対象に投与される。一部の実施形態では、対象は、ＣＳＦ腔への注射、または実質内注射により、高力価（例えば、＞１０１２ ゲノムコピー ＧＣ／ｋｇのｒＡＡＶ）を投与される。一部の実施形態では、本明細書に記載されるｒＡＡＶは、約１×１０１０ベクターゲノム（ｖｇ）から約１×１０１７ｖｇの範囲の用量で、静脈内注射により対象に投与される。一部の実施形態では、本明細書に記載されるｒＡＡＶは、約１×１０１０ベクターゲノム（ｖｇ）から約１×１０１６ｖｇの範囲の用量で、大槽内への注射により対象に投与される。
本開示に記載される組成物（例えば、単離核酸またはベクターまたはｒＡＡＶを含む組成物）は、一回または複数回（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、またはそれ以上）、対象に投与することができる。一部の実施形態では、組成物は、連続的に（例えば、慢性的に）、例えば、注入ポンプを介して対象に投与される。
実施例１：ｒＡＡＶベクター
ＡＡＶベクターは、三重プラスミドトランスフェクション用のＨＥＫ２９３細胞などの細胞を使用して産生される。ＩＴＲ配列は、対象の各導入遺伝子に対するプロモーター／エンハンサー要素、３’ポリＡシグナル、およびＷＰＲＥ要素などの翻訳後シグナルを含む発現構築物に隣接する。ＧＢＡ１およびＬＩＭＰ２および／またはプロサポシンなどの複数の遺伝子産物は、タンパク質配列の融合によって、またはペプチド結合の生成の防止のためにアミノ酸を添加した２つのペプチド断片を導くＴ２ＡもしくはＰ２Ａなどの２Ａペプチドリンカーを使用することによって、またはＩＲＥＳ要素を使用することによって、または２つの別個の発現カセットの発現によって、同時に発現することができる。発現された遺伝子の上流で効率的にスプライシングされる短いイントロン配列の存在は、発現レベルを向上させることができる。ｓｈＲＮＡおよび他の制御性ＲＮＡは、これらの配列内に潜在的に含まれ得る。本開示によって記載される発現構築物の例は、図１～８、２１～３５、３９、４１～５１および図６４、ならびに以下の表２に示されている。
実施例２：ＧＢＡ欠損症細胞内へのウイルス形質導入の細胞ベースアッセイ
ＧＢＡ１が欠損した細胞は、例えば、ＧＤ患者、単球、またはｈＥＳ細胞、または患者由来の誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）からの線維芽細胞として取得される。これらの細胞は、例えばグルコシルセラミドおよびグルコシルスフィンゴシン（ＧｌｃＣｅｒおよびＧｌｃＳｐｈ）などの基質を蓄積する。野生型または変異型培養細胞株のＣＢＥなどのＧｃａｓｅ阻害剤を用いた処理も、ＧＢＡ欠損症細胞を取得するために使用される。
このような細胞モデルを使用して、リソソーム欠損を、例えばこのタンパク質またはホスホ－αＳｙｎに対する抗体を有するα－シヌクレインなどの、タンパク質凝集体の蓄積に関して定量化し、続いて蛍光顕微鏡を使用して映像化する。ＬＡＭＰ１、ＬＡＭＰ２、ＬＩＭＰ１、ＬＩＭＰ２などのタンパク質マーカーのためのＩＣＣによる、またはＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒなどの染料の使用、または蛍光デキストランもしくは他のマーカーのエンドサイトーシス区画を通した取込みによるリソソーム異常の映像化が、実施される。ＬＣ３など、リソソームとの融合不良によるオートファジーマーカー蓄積のための映像化も実施することができる。ウェスタンブロッティングおよび／またはＥＬＩＳＡを使用して、これらのマーカーの異常な蓄積を定量化する。また、糖脂質基質およびＧＢＡ１の生成物の蓄積を、標準的なアプローチを用いて測定する。
治療的評価項目（例えば、ＰＤ関連病理の減少）は、ＡＡＶベクターの形質導入の発現との関連で測定され、活性および機能を確認および定量化する。Ｇｃａｓｅは、タンパク質ＥＬＩＳＡ法を用いて、または標準的なＧｃａｓｅ活性アッセイにより定量することもできる。
実施例３：変異型マウスを用いたインビボアッセイ
本実施例は、変異型マウスを使用したＡＡＶベクターのインビボアッセイを記載する。変異型マウスにおける上記のＡＡＶベクターのインビボ試験は、例えば、Ｌｉｏｕ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１（７）：４２４２－４２５３、Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．４６：２１０２－２１１３、およびＦａｒｆｅｌ－Ｂｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１１年）Ｄｉｓ．Ｍｏｄｅｌ Ｍｅｃｈ．４（６）：７４６－７５２によって記載されるアッセイを用いて、実施される。
ビヒクル対照およびＡＡＶベクター（例えば、２×１０１１ｖｇ／マウスの用量で）のくも膜下腔内または脳室内送達は、濃縮ＡＡＶストックを使用して、例えば、５～１０μＬの注射体積で実施される。対流増加送達による実質内送達が行われる。
治療は、症状の発症前または発症後に開始される。測定された評価項目は、ＣＮＳおよびＣＳＦ中の基質の蓄積、ＥＬＩＳＡによるＧｃａｓｅ酵素の蓄積および酵素活性の蓄積、運動および認知の評価項目、リソソーム機能不全、ならびにα－シヌクレイン単量体、前原線維または原線維の蓄積である。
実施例４：疾患の化学モデル
本実施例は、ゴーシェ病の化学的に誘導されたマウスモデル（例えば、ＣＢＥマウスモデル）を使用したＡＡＶベクターのインビボアッセイを記載する。これらのＡＡＶベクターのインビボ試験は、例えば、Ｖａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．２３９（４）：４９６－５０９によって記載される、ゴーシェ病の化学的に誘導されたマウスモデルにおいて、実施される。
ビヒクル対照およびＡＡＶベクター（例えば、２×１０１１ｖｇ／マウスの用量で）のくも膜下腔内または脳室内送達は、濃縮ＡＡＶストックを使用して、例えば、５～１０μＬの注射体積で実施される。対流増加送達による実質内送達が行われる。末梢送達は、尾静脈注射によって達成される。
治療は、症状の発症前または発症後に開始される。測定された評価項目は、ＣＮＳおよびＣＳＦ中の基質の蓄積、ＥＬＩＳＡによるＧｃａｓｅ酵素の蓄積および酵素活性の蓄積、運動および認知の評価項目、リソソーム機能不全、ならびにα－シヌクレイン単量体、前原線維または原線維の蓄積である。
実施例５：ＰＤ、ＬＢＤ、ゴーシェ病患者における臨床試験
一部の実施形態では、ゴーシェ病（例えば、ＧＤ１）の特定の形態を有する患者は、パーキンソン病（ＰＤ）またはレビー小体認知症（ＬＢＤ）を発症するリスクが増加する。本実施例は、ゴーシェ病、ＰＤおよび／またはＬＢＤを有する患者における、本開示によって記載されるｒＡＡＶｓの安全性および有効性を評価するための臨床試験について説明する。
ゴーシェ病、ＰＤおよび／またはＬＢＤの治療のためのかかるベクターの臨床試験は、Ｇｒａｂｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１２２（１）：３３－３９にて記載されるのと似通った試験デザインを用いて、実施された。
実施例６：末梢疾患の治療
一部の実施形態では、ゴーシェ病の特定の形態を有する患者は、例えばＢｉｅｇｓｔｒａａｔｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｂｒａｉｎ １３３（１０）：２９０９－２９１９に記載される、末梢神経障害の症状を示す。
本実施例は、ゴーシェ病（例えば、１型ゴーシェ病）に関連する末梢神経障害の治療のための、本明細書に記載されるＡＡＶベクターのインビボアッセイを記載する。簡潔に述べると、末梢神経障害の徴候または症状を有すると特定された１型ゴーシェ病患者は、本開示に記載されるように、ｒＡＡＶを投与される。一部の実施形態では、対象の末梢神経障害徴候および症状は、例えば、Ｂｉｅｇｓｔｒａａｔｅｎ ｅｔ ａｌ．に記載される方法を使用して、ｒＡＡＶの投与後に観察される。
患者の患者（例えば、患者の血清、末梢組織（例えば、肝組織、脾臓組織など）において）に存在する本開示に記載される形質導入遺伝子産物のレベルは、例えば、ウェスタンブロット分析、酵素機能アッセイ、または映像研究によってアッセイされる。
実施例７：ＣＮＳ型の治療
本実施例は、ゴーシェ病のＣＮＳ形態の治療のための本明細書に記載されるｒＡＡＶｓのインビボアッセイを記載する。簡潔に述べると、ゴーシェ病（例えば、２型または３型ゴーシェ病）のＣＮＳ型を有すると特定されたゴーシェ病患者は、本開示に記載されるように、ｒＡＡＶを投与される。患者のＣＮＳ（例えば、患者のＣＮＳの血清中、患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）中、患者のＣＮＳ組織中）に存在する本開示に記載される形質導入遺伝子産物のレベルは、例えば、ウェスタンブロット分析、酵素機能アッセイ、または映像研究によってアッセイされる。
実施例８：ＧＢＡ１に変異を有する対象におけるパーキンソン病の遺伝子療法
本実施例は、ＧＢＡ１をコードする組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を、ＧＢＡ１遺伝子の変異によって特徴付けられるパーキンソン病を有する対象に投与することを記載する。
このｒＡＡＶ－ＧＢＡ１ベクター挿入物は、ヒトＧＢＡ１（マルーン）のコドン最適化コード配列（ＣＤＳ）を構成的に発現するための、ＣＭＶエンハンサー（ＣＭＶｅ）、ＣＢＡプロモーター（ＣＢＡｐ）、エクソン１、およびイントロン（ｉｎｔ）の四つの部分からなるＣＢＡプロモーターエレメント（ＣＢＡ）を含む。３’領域はまた、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素（ＷＰＲＥ）転写後調節要素、続いてウシ成長ホルモンポリＡシグナル（ｂＧＨ ｐｏｌｙＡ）テールを含有する。隣接ＩＴＲｓは、介在配列の正しいパッケージングを可能にする。５’ＩＴＲ配列の二つのバリアント（図７、はめ込みボックス、底部配列）を評価した。これらのバリアントは、ＩＴＲの２０－ヌクレオチド「Ｄ」領域内にいくつかのヌクレオチド差があり、パッケージングおよび発現の効率に影響を与えると考えられる。ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１ベクター産物は、図７に示す「Ｄ」ドメインヌクレオチド配列（はめ込みボックス、上側配列）を含有する。バリアントベクターは、前臨床試験で同様に実施される、変異型の「Ｄ」ドメイン（本明細書では「Ｓ」領域と称され、影によりヌクレオチド変化が示される）を担持する。バックボーンには、カナマイシンに対する耐性を付与する遺伝子並びにリバースパッケージングを防止するためのスタッファー配列が含まれる。ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１ベクターを示す概略図を図８に示す。ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１ベクターは、ＡＡＶ９血清型カプシドタンパク質を使用してｒＡＡＶにパッケージングされる。
ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１は、蛍光透視誘導後頭下注射により、大槽（大槽内、ＩＣＭ）内に単回投与として対象に投与される。ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１投与レジメン試験の一実施形態は、以下の通りである。
ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１の単回用量が、非臨床薬理および毒性試験の結果に基づいて決定される二つの用量レベル（３ｅ１３ｖｇ（低用量）、１ｅ１４ｖｇ（高用量）など）のうちの一つで患者（Ｎ＝１２）に投与される。
初期試験は、ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１ベクターおよびｒＡＡＶ－ＧＢＡ１ Ｓ－バリアント構築物（以下に詳述）の有効性と安全性を評価するために、ＧＣａｓｅの阻害剤であるコンズリトール－ｂ－エポキシド（ＣＢＥ）の毎日の送達を含む化学マウスモデルで実施された。さらに、ホモ接合性ＧＢＡ１変異を担持し、部分的にサポシン（４Ｌ／ＰＳ－ＮＡ）が欠損している遺伝子マウスモデルにおいて、初期試験を実施した。マウスおよび非ヒト霊長類（ＮＨＰ）における追加の用量範囲試験を実施して、ベクターの安全性および有効性をさらに評価する。
ＡＡＶバックボーン中の５’逆位末端反復（ＩＴＲ）の二つのわずかに異なるバージョンを試験し、製造可能性および導入遺伝子発現を評価した（図７）。１４５ｂｐの５’ＩＴＲ内の２０ｂｐの「Ｄ」ドメインは、最適なウイルスベクター産生に必要であると考えられるが、場合により、「Ｄ」ドメイン内の変異は導入遺伝子発現を増加させるとも報告されている。したがって、完全な「Ｄ」ドメインを担持するウイルスベクターｒＡＡＶ－ＧＢＡ１に加えて、変異型「Ｄ」ドメイン（本明細書では「Ｓ」ドメインと呼ばれる）を有する第二のベクター形態も評価された。ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１およびバリアントの両方が、同じ導入遺伝子を発現する。両方のベクターは、以下に詳述するようにインビボで有効であったウイルスを産生したが、野生型の「Ｄ」ドメインを含有するｒＡＡＶ－ＧＢＡ１を、さらなる開発のために選択した。
ＧＣａｓｅ欠損症のＣＢＥモデルを確立するために、若年マウスにＧＣａｓｅの特異的阻害剤であるＣＢＥを投与した。マウスは、生後８日目（Ｐ８）から開始して、ＩＰ注射により毎日ＣＢＥを与えられた。三つの異なるＣＢＥ用量（２５ｍｇ／ｋｇ、３７．５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ）およびＰＢＳを試験し、行動表現型を示すモデルを確立した（図９）。高用量のＣＢＥは、用量依存的に致死性をもたらした。５０ｍｇ／ｋｇのＣＢＥで処置されたマウスはすべて、Ｐ２３までに死亡し、３７．５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥで処置された８匹のマウスのうち５匹は、Ｐ２７までに死亡した。２５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥで処置されたマウスに致死性はなかった。一方、ＣＢＥ注射マウスは、オープンフィールドアッセイ（ＰＢＳを与えられたマウスと同じ距離を同じ速度で移動する）において、一般的な運動障害を示さない一方、ＣＢＥ処置マウスは、ロータロッドアッセイにより測定される運動調整およびバランス欠陥を呈示した。
試験終了まで生存したマウスは、最後のＣＢＥ投与の翌日（Ｐ２７、「１日目」）または三日間のＣＢＥ離脱後（Ｐ２９、「３日目」）に犠牲となった。２５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥを投与されたマウスの皮質について脂質分析を行い、１日目および３日目のコホートの両方でＧＣａｓｅ基質の蓄積を評価した。ＧｌｕＳｐｈおよびＧａｌＳｐｈレベル（この例では凝集体で測定）は、ＰＢＳ処置対照と比較して、ＣＢＥ処置マウスに有意に蓄積され、ＧＣａｓｅの不足と一致した。
上述の研究に基づいて、２５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥ用量が、生存に影響を与えずに行動障害を生じたため、選択された。ＣＢＥ治療中に脳全体および導入遺伝子発現にわたって広範なＧＢＡ１分布を達成するために、ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１または賦形剤を、生後３日目（Ｐ３）に脳室内（ＩＣＶ）注射により送達し、その後Ｐ８で毎日のＩＰ ＣＢＥまたはＰＢＳ治療を開始した（図１０）。
ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１を投与されたＣＢＥ処置マウスは、賦形剤を投与されたマウスよりも、ロータロッドで統計的に有意に良好なパフォーマンスを示した（図１１）。バリアント処置群のマウスは、試験中に移動した総距離などの他の行動測定に関して賦形剤処置マウスと異なっていなかった（図１１Ｄ）。
生存試験の完了時に、マウスの半数を、生化学的解析のために、最後のＣＢＥ投与の翌日（Ｐ３６、「１日目」）またはＣＢＥ離脱後三日後（Ｐ３８、「３日目」）に犠牲にした（図１２）。生物学的三重複で実施された蛍光酵素アッセイを使用して、皮質におけるＧＣａｓｅ活性を評価した。ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１で処置されたマウスではＧＣａｓｅ活性が増加し、一方でＣＢＥ処置はＧＣａｓｅ活性を減少させた。さらに、ＣＢＥおよびｒＡＡＶ－ＧＢＡ１の両方を投与されたマウスは、ＰＢＳ処置群と類似したＧＣａｓｅ活性レベルを有し、これは、ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１の送達が、ＣＢＥ処置によって誘発されたＧＣａｓｅ活性の阻害を克服することができることを示す。マウスの運動皮質について脂質分析を行い、基質ＧｌｕＣｅｒおよびＧｌｕＳｐｈのレベルを調べた。ＣＢＥを投与されたマウスの脳に蓄積された脂質と、ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１処置の両方が、基質蓄積を有意に減少させた。
脂質レベルは、処置群全体にわたり、ＧＣａｓｅ活性およびロータロッドでのパフォーマンスの両方に負に相関した。ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１投与後のＧＣａｓｅ活性の増加は、基質の減少および運動機能の強化と関連していた（図１３）。図１４に示すように、ｑＰＣＲ（１μｇゲノムＤＮＡ当たり＞１００個のベクターゲノムを有することを陽性として定義）によって測定されるように、予備的生体内分布をベクターゲノムの存在によって評価した。ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１を投与されたマウスは、ＣＢＥありおよびなしで、皮質のｒＡＡＶ－ＧＢＡ１ベクターゲノムについて陽性であり、これは、ＩＣＶ送達が皮質へのｒＡＡＶ－ＧＢＡ１送達をもたらすことを示す。さらに、ベクターゲノムは肝臓で検出され、脾臓ではほとんど検出されず、心臓、腎臓または性腺では検出されなかった。すべての測定値について、１日目群と３日目群の間に統計的有意差はなかった。
ＣＢＥモデルにおけるより大きな研究では、ＣＢＥモデルにおけるｒＡＡＶ－ＧＢＡ１の有効用量がさらに探索された。２５ｍｇ／ｋｇのＣＢＥ用量モデルを使用して、賦形剤またはｒＡＡＶ－ＧＢＡ１をＰ３でＩＣＶを介して送達し、Ｐ８で開始されたＩＰ ＰＢＳまたはＣＢＥ処置を毎日行った。先術の研究で観察されたＣＢＥ離脱を有する群と有さない群の間の類似性を考慮して、すべてのマウスを、最終ＣＢＥ用量の１日後（Ｐ３８～４０）に犠牲にした。三つの異なるｒＡＡＶ－ＧＢＡ１用量の効果を評価した結果、群当たりマウス１０匹（５Ｍ／５Ｆ）とする、以下の五群となった。
賦形剤ＩＣＶ＋ＰＢＳ ＩＰ
賦形剤ＩＣＶ＋２５ｍｇ／ｋｇ ＣＢＥ ＩＰ
３．２ｅ９ｖｇ（２．１３ｅ１０ｖｇ／ｇ脳）ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１ ＩＣＶ＋２５ｍｇ／ｋｇ ＣＢＥ ＩＰ
１．０ｅ１０ｖｇ（６．６７ｅ１０ｖｇ／ｇ脳）ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１ ＩＣＶ＋２５ｍｇ／ｋｇ ＣＢＥ ＩＰ
３．２ｅ１０ｖｇ（２．１３ｅ１１ｖｇ／ｇ脳）ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１ ＩＣＶ＋２５ｍｇ／ｋｇ ＣＢＥ ＩＰ
最高用量のｒＡＡＶ－ＧＢＡ１は、ＣＢＥ処置に関連したＰ３７での体重増加の失敗を救済した。さらに、この用量は、賦形剤＋ＣＢＥ処置群と比較して、ロータロッドおよびテーパービームでのパフォーマンスにおいて統計的に有意な改善をもたらした（図１５）。賦形剤処置群およびｒＡＡＶ－ＧＢＡ１処置群（賦形剤＋ＰＢＳ：０、賦形剤＋２５ｍｇ／ｋｇ ＣＢＥ：１、３．２ｅ９ｖｇ ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１＋２５ｍｇ／ｋｇ ＣＢＥ：４、１．０ｅ１０ｖｇ ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１＋２５ｍｇ／ｋｇ ＣＢＥ：０、３．２ｅ１０ｖｇ ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１＋２５ｍｇ／ｋｇ ＣＢＥ ３）の両方を含むいくつかの群において、致死性が観察された。
生存試験の完了時に、生化学的分析のためにマウスを犠牲にした（図１６）。生物学的三重複で実施された蛍光分析により、皮質におけるＧＣａｓｅ活性を評価した。ＣＢＥ処置マウスは、ＧＣａｓｅ活性の減少を示し、一方で、高いｒＡＡＶ－ＧＢＡ１用量を投与されたマウスは、ＣＢＥ治療と比較して、ＧＣａｓｅ活性の統計的に有意な増加を示した。ＣＢＥ処置マウスはまた、ＧｌｕＣｅｒおよびＧｌｕＳｐｈの蓄積を有し、両方とも高用量のｒＡＡＶ－ＧＢＡ１を投与することによって救済された。
確立された化学ＣＢＥモデルに加えて、ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１は、Ｇｂａ１のＶ３９４Ｌ ＧＤ変異に対してホモ接合性であり、ＧＣａｓｅの局在化および活性に影響を及ぼすサポシンも部分的に欠損する４Ｌ／ＰＳ－ＮＡ遺伝子モデルでも評価される。これらのマウスは、ビームウォーク、ロータロッド、およびワイヤハングアッセイにおけるそれらのパフォーマンスによって示されるように、運動強度、協調、およびバランス欠損を呈する。典型的には、これらのマウスの寿命は２２週間未満である。当初の試験では、最大力価ウイルスの３μｌを、２．４ｅ１０ｖｇ（６．０ｅ１０ｖｇ／ｇ脳）の最終用量で、Ｐ２３でＩＣＶにより送達した。群当たり６匹のマウスで、処置群は以下のとおり。
ＷＴ＋賦形剤ＩＣＶ
４Ｌ／ＰＳ－ＮＡ＋賦形剤ＩＣＶ
４Ｌ／ＰＳ－ＮＡ＋２．４ｅ１０ｖｇ（６．０ｅ１０ｖｇ／ｇ脳）ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１ ＩＣＶ
ビーム歩行試験による運動能力を、ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１送達の４週間後に評価した。ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１を投与された変異型マウスの群は、賦形剤で処置された変異型マウスと比較して、スリップおよび速度当たりの総スリップが少ない傾向を示し、ＷＴレベルに近い運動機能を回復させた（図１７）。運動表現型は、これらのマウスが年齢を重ねるにつれてより重度になるので、この行動試験およびその他の行動試験におけるそれらのパフォーマンスは、後の時点で評価される。生存試験の完了時に、脂質レベル、ＧＣａｓｅ活性、および生体内分布がこれらのマウスで評価される。
現在、提案された第１相の高臨床用量の０．０３ｘ、０．１ｘ、および１ｘに相当するＣＢＥモデルを用いて、ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１の低用量を追加で試験している。各群は、群当たり１０匹（５Ｍ／５Ｆ）のマウスを含む。
賦形剤＋ＣＥＢ
賦形剤ＩＣＶ＋２５ｍｇ／ｋｇ ＣＢＥ ＩＰ
３．２ｅ８ｖｇ（２．１３ｅ９ｖｇ／ｇ脳）ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１ ＩＣＶ＋２５ｍｇ／ｋｇ ＣＢＥ ＩＰ
１．０ｅ９ｖｇ（６．６７ｅ９ｖｇ／ｇ脳）ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１ ＩＣＶ＋２５ｍｇ／ｋｇ ＣＢＥ ＩＰ
１．０ｅ１０ｖｇ（６．６７ｅ１０ｖｇ／ｇ脳）ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１ ＩＣＶ＋２５ｍｇ／ｋｇ ＣＢＥ ＩＰ
運動表現型に加えて、脂質レベルおよびＧＣａｓｅ活性が皮質で評価される。治療および分析の時間経過も実施される。
有効性および安全性データを評価するために、より大きな用量範囲試験が開始された。１０匹の４Ｌ／ＰＳ－ＮＡマウス（群当たり５Ｍ／５Ｆ）に、１０μｌのｒＡＡＶ－ＧＢＡ１を注射した。アロメトリック脳重量計算を使用して、用量は、提案された第１相高臨床用量の０．１５ｘ、１．５ｘ、４．４ｘ、および１４．５ｘに相関する。注射群は以下からなる。
ＷＴ＋賦形剤ＩＣＶ
４Ｌ／ＰＳ－ＮＡ＋賦形剤ＩＣＶ
４Ｌ／ＰＳ－ＮＡ＋４．３ｅ９ｖｇ（１．１ｅ１０ｖｇ／ｇ脳）ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１ ＩＣＶ
４Ｌ／ＰＳ－ＮＡ＋４．３ｅ１０ｖｇ（１．１ｅ１１ｖｇ／ｇ／脳）ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１ ＩＣＶ
４Ｌ／ＰＳ－ＮＡ＋１．３ｅ１１ｖｇ（３．２ｅ１１ｖｇ／ｇ脳）ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１ ＩＣＶ
４Ｌ／ＰＳ－ＮＡ＋４．３ｅ１１ｖｇ（１．１ｅ１２ｖｇ／ｇ脳）ｒＡＡＶ－ＧＢＡ１ ＩＣＶ
実施例９：ｒＡＡＶベクターのインビトロ分析
ｒＡＡＶ構築物を、インビトロおよびインビボで試験した。図１８は、プログラニュリン（ＰＧＲＮ）タンパク質をコードするｒＡＡＶ構築物のインビトロ発現のための代表的なデータを示す。左のパネルは、プログラニュリン（ＰＧＲＮ）ＥＬＩＳＡアッセイの標準曲線を示す。下のパネルは、ｒＡＡＶで形質導入されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の細胞溶解物におけるＥＬＩＳＡアッセイによって測定されたＰＧＲＮ発現の用量反応を示す。ＭＯＩ＝感染の多重度（細胞当たりのベクターゲノム）。
単独で、またはＧＢＡ１および／または一つまたは複数の阻害性ＲＮＡと組み合わせて、プロサポシン（ＰＳＡＰ）およびＳＣＡＲＢ２をコードするｒＡＡＶベクターのインビトロ活性を評価するパイロット試験を実施した。ＰＳＡＰおよびプログラニュリン（ＰＧＲＮ）をコードする一つの構築物も試験した。試験されたベクターは、表３に示されるものを含む。「Ｏｐｔ」は、哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞）における発現に最適化された核酸配列コドンを指す。図１９は、構築物の各々を用いたＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクションが、模擬トランスフェクト細胞と比較して、対応する遺伝子産物の過剰発現をもたらしたことを示す代表的なデータを示す。
単独で、または一つまたは複数の阻害性ＲＮＡと組み合わせて、ＴＲＥＭ２をコードするｒＡＡＶベクターのインビトロ活性を評価するパイロット試験を実施した。試験されたベクターは、表３に示されるものを含む。「Ｏｐｔ」は、哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞）における発現に最適化された核酸配列コドンを指す。図３６Ａ～３６Ｂは、構築物の各々を用いたＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクションが、模擬トランスフェクト細胞と比較して、対応する遺伝子産物の過剰発現をもたらしたことを示す代表的なデータを示す。
実施例１０：ＳＮＣＡおよびＴＭＥＭ１０６Ｂ ｓｈＲＮＡ構築物の試験
ＨＥＫ２９３細胞
ヒト胚性腎臓２９３細胞株（ＨＥＫ２９３）を、本試験で使用した（＃８５１２０６０２、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）。ＨＥＫ２９３細胞を、培養培地（１００単位／ｍｌのペニシリンおよび１００ μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（＃１５１４０１２２、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含む、１０％のウシ胎仔血清［ＦＢＳ］［＃１００８２１４７、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ］を補充したＤ－ＭＥＭ［＃１１９９５０６５、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ］）中で維持した。
プラスミドトランスフェクション
プラスミドトランスフェクションは、製造者の指示に従って、リポフェクタミン２０００トランスフェクション試薬（＃１１６６８０１９、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して実施された。簡潔には、ＨＥＫ２９３細胞（＃１２０２２００１、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を、抗生物質を含まない培養培地中で、３×１０５細胞／ｍｌの密度で播種した。翌日、プラスミドとリポフェクタミン２０００試薬をＯｐｔｉ－ＭＥＭ溶液（＃３１９８５０６２、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で組み合わせた。５分後、混合物をＨＥＫ２９３培養物に添加した。７２時間後、ＲＮＡまたはタンパク質抽出のために、細胞を採取するか、または画像分析に供した。画像分析のために、プレートを０．０１％ポリ－Ｌ－リジン溶液（Ｐ８９２０、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で予め被覆してから、細胞の播種を行った。
定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）による遺伝子発現解析
製造者の指示に従って、Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｃｅｌｌｓ－ｔｏ－ＣＴキット（＃４４０２９５５、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）により相対遺伝子発現レベルを決定した。候補プラスミドを、リポフェクタミン２０００トランスフェクション試薬（５０μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ溶液中の０．５μｇプラスミドおよび１．５μｌの試薬）を使用して、４８ウェルプレート（７．５×１０４細胞／ウェル）上に播種したＨＥＫ２９３細胞に一過性にトランスフェクトした。７２時間後、細胞からＲＮＡを抽出し、製造者の指示に従ってｃＤＮＡを合成するための逆転写に使用した。定量ＰＣＲ分析のために、２～５μｌのｃＤＮＡ産物を、Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ マスターミックス（＃４３６７６５９、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた、遺伝子特異的プライマー対（２５０ｎＭ最終濃度）を用いて重複増幅した。ＳＮＣＡ、ＴＭＥＭ１０６Ｂ、およびＧＡＰＤＨ遺伝子のプライマー配列は、以下のとおりである。５’－ＡＡＧ ＡＧＧ ＧＴＧ ＴＴＣ ＴＣＴ ＡＴＧ ＴＡＧ ＧＣ －３’（配列番号ＮＯ：７１）、ＳＮＣＡ向け５’－ＧＣＴ ＣＣＴ ＣＣＡ ＡＣＡ ＴＴＴ ＧＴＣ ＡＣＴ Ｔ－３’（配列番号：７２）、５’－ＡＣＡ ＣＡＧ ＴＡＣ ＣＴＡ ＣＣＧ ＴＴＡ ＴＡＧ ＣＡ－３’（配列番号：７３）、ＴＭＥＭ１０６Ｂ向け５’－ＴＧＴ ＴＧＴ ＣＡＣ ＡＧＴ ＡＡＣ ＴＴＧ ＣＡＴ ＣＡ－３’（配列番号：７４）、および５’－ＣＴＧ ＧＧＣ ＴＡＣ ＡＣＴ ＧＡＧ ＣＡＣ Ｃ －３’（配列番号：７５）、ＧＡＰＤＨ向け５’－ＡＡＧ ＴＧＧ ＴＣＧ ＴＴＧ ＡＧＧ ＧＣＡ ＡＴＧ －３’（配列番号：７６）定量ＰＣＲを、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ３ リアルタイムＰＣＲシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で実施した。発現レベルは、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨによって正規化され、比較ＣＴ法を使用して計算された。
蛍光イメージング分析
ＥＧＦＰコード領域の下流にヒトＳＮＣＡ遺伝子の３’－ＵＴＲを含有するＥＧＦＰレポータープラスミドを、ＳＮＣＡおよびＴＭＥＭ１０６Ｂノックダウンプラスミドの検証に使用した。ＥＧＦＰレポータープラスミドおよび候補ノックダウンプラスミドを、リポフェクタミン２０００トランスフェクション試薬（０．０４ μｇレポータープラスミド、０．０６ μｇノックダウンプラスミド、および１０ μｌ Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ溶液中の０．３μｌ試薬）を使用して、ポリ－Ｌ－リジン被覆９６ウェルプレート（３．０ ｘ １０４細胞／ウェル）上に播種したＨＥＫ２９３細胞に同時にトランスフェクトした。７２時間後、ＥＧＦＰシグナルの蛍光強度を、Ｖａｒｉｏｓｋａｎ ＬＵＸマルチモードリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用して、励起４８８ｎｍ／発光５１２ｎｍで測定した。細胞を、４％のＰＦＡでＲＴで１０分間固定し、４０μｇ／ｍｌの７－アミノアクチノマイシンＤ（７－ＡＡＤ）を含有するＤ－ＰＢＳでＲＴで３０分間インキュベートした。Ｄ－ＰＢＳで洗浄した後、Ｖａｒｉｏｓｋａｎリーダーを使用して、励起５４６ｎｍ／発光６４７ｎｍで７－ＡＡＤシグナルの蛍光強度を測定し、細胞数を定量化した。７－ＡＡＤシグナルレベル当たりの正規化ＥＧＦＰシグナルを、対照ノックダウンサンプルと比較した。
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
ヒトＳＮＣＡ遺伝子の３’－ＵＴＲまたはＳＮＣＡコード領域の下流のＴＭＥＭ１０６Ｂ遺伝子を含有するα－シヌクレインレポータープラスミドを、タンパク質レベルでのノックダウンプラスミドの検証に使用した。ＨＥＫ２９３細胞から抽出された溶解物を使用して、α－シヌクレインタンパク質のレベルをＥＬＩＳＡ（＃ＫＨＢ００６１、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により決定した。候補プラスミドを、リポフェクタミン２０００トランスフェクション試薬（２５μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ溶液中の０．１μｇレポータープラスミド、０．１５μｇノックダウンプラスミド、および０．７５μｌの試薬）を使用して、４８ウェルプレート（７．５×１０４細胞／ウェル）上に播種したＨＥＫ２９３細胞に一過性にトランスフェクトした。７２時間後、プロテアーゼ阻害剤カクテル（＃Ｐ８３４０、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充した放射性免疫沈降アッセイ（ＲＩＰＡ）緩衝液（＃８９９００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で細胞を溶解し、数秒間超音波処理した。氷上で３０分間インキュベーションした後、溶解物を２０，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離し、上清を収集した。タンパク質レベルを定量化した。プレートを４５０ｎｍでバリオスカンプレートリーダーで読み、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ ５ソフトウェアを使用して濃度を計算した。測定されたタンパク質濃度を、ビシンコニン酸アッセイ（＃２３２２５、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて決定した総タンパク質濃度に正規化した。
図３７および表４は、ＧＦＰレポーターアッセイ（上）およびα－Ｓｙｎアッセイ（下）によるインビトロでのＳＮＣＡのサイレンシングの成功を示す代表的なデータを示す。図３８および表５は、ＧＦＰレポーターアッセイ（上）およびα－Ｓｙｎアッセイ（下）によるインビトロでのＴＭＥＭ１０６Ｂのサイレンシングの成功を示す代表的なデータを示す。
実施例１１：ＩＴＲ「Ｄ」配列配置および細胞形質導入
ｒＡＡＶベクターの細胞形質導入に対するＩＴＲ 「Ｄ」配列の配置の効果を調査した。ＨＥＫ２９３細胞は、図２０に示す通り、１）野生型ＩＴＲｓ（例えば、導入遺伝子挿入物の近位で、ＩＴＲの終端の遠位にある「Ｄ」配列）、または２）ベクターの「外側」に位置する「Ｄ」配列を有するＩＴＲｓ（例えば、ＩＴＲの終端の近位に、かつ導入遺伝子挿入物の遠位に位置する「Ｄ」配列）を有するＧｃａｓｅコードｒＡＡＶｓで形質導入された。驚くべきことに、データは、「外側」位置に位置する「Ｄ」配列を有するｒＡＡＶｓは、効率的にパッケージングされ、細胞を形質導入する能力を保持することを示す（図４０）。
実施例１２：プログラニュリンｒＡＡＶｓのインビトロ試験
図３９は、ＰＧＲＮをコードする発現構築物を含むベクターの一実施形態を描写する概略図である。プログラニュリンは、ＰＧＲＮ（例えば、コドン最適化ＰＧＲＮ）をコードするｒＡＡＶベクターの注射によって、例えば大槽内などへの実質内またはくも膜下腔内注射によって、ＧＲＮ欠失に対してヘテロ接合性またはホモ接合性ののいずれかであるＧＲＮ欠損げっ歯類のＣＮＳで過剰発現される。
マウスは、生後２か月または６か月で注射され、６か月または１２か月齢で、以下のうちの一つまたは複数について分析される：ＲＮＡおよびタンパク質レベルでのＧＲＮの発現レベル、行動アッセイ（例えば、動きの改善）、生存アッセイ（例えば、生存の改善）、ミクログリアおよび炎症性マーカー、グリオーシス、ニューロンの欠損、リポフスチン症、および／または例えばＬＡＭＰ１などのソソームマーカーの蓄積。ＰＧＲＮ欠損マウスに対するアッセイは、例えば、Ａｒｒａｎｔ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｂｒａｉｎ １４０：１４７７－１４６５；Ａｒｒａｎｔ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ３８（９）：２３４１－２３５８；およびＡｍａｄｏ ｅｔ ａｌ．（２０１８）ｄｏｉ：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／３０８６９；に記載され、これは本明細書に参照によって組み込まれる。
実施例１３：プログラニュリンｒＡＡＶのインビトロおよびインビボ試験
インビトロおよびインビボアッセイを実施して、プログラニュリン（ＰＧＲＮ）タンパク質をコードするｒＡＡＶ構築物（ＰＲ００６（ＰＲ００６Ａとも呼ばれる）、図６４を参照）の効果を分析した。ＰＲ００６は、ＡＡＶ９血清型を有するキャプシドを含む。
インビトロ非臨床試験
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＰＲ００６Ａに由来するプログラニュリン発現
ＰＲＰＲ００６Ａの、細胞状況でのプログラニュリンタンパク質産生を誘導する能力が調査された。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、２．１×１０５～３．３×１０６ベクターゲノム（ｖｇ）／細胞の範囲の感染の多重度（ＭＯＩ）の範囲にわたってＰＲ００６Ａで形質導入した。ＰＲ００６Ａ形質導入は、細胞培地へのプログラニュリンタンパク質の発現および分泌の、頑健な用量依存性の増加をもたらした（図６０）。内因性ヒトＧＲＮ遺伝子に由来する発現を反映して、実質的に低いプログラニュリンタンパク質レベルが、賦形剤（意図された臨床ビヒクル）のみで治療された陰性対照群で検出された。
ＦＴＤ－ＧＲＮ ｉＰＳＣ由来ニューロンにおける有効性
ヒトＦＴＤ－ＧＲＮ（ＧＲＮ変異を伴う前頭側頭型認知症）神経培養におけるインビトロでのｒＡＡＶ構築物の有効性を分析するためにアッセイを実施した。細胞株は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ および Ｓｔｒｏｋｅ（ＮＩＮＤＳ）Ｈｕｍａｎ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｄａｔａ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ（ＮＨＣＤＲ）から入手した。材料ＮＤ５００１５（ＦＴＤ－ＧＲＮ、Ｍ１Ｌ）、ＮＤ５００６０（ＦＴＤ－ＧＲＮ、Ｒ４９３Ｘ）およびＮＤ３８５５５（対照、野生型）（表６を参照）。
ＦＴＤ－ＧＲＮに病理学的に関連する細胞モデルを確立するために、各株からのｉＰＳＣを、２ステッププロトコルを使用して神経細胞に分化させた。最初のステップでは、ｉＰＳＣを増殖性神経幹細胞（ＮＳＣ）系統に分化させ、これは免疫蛍光標識によって検出されるように、多能性マーカー（すなわち、Ｏｃｔ４およびＳＳＥＡ１）の発現を欠き、神経幹細胞マーカー（すなわち、ＳＯＸ２、ネスチン、ＳＯＸ１、およびＰＡＸ６）の発現を得た。
対照およびＦＴＤ－ＧＲＮのＮＳＣ株を等密度で播種し、４８時間後、細胞溶解物（細胞内プログラニュリン）（図５２Ｅ）および細胞培地（分泌プログラニュリン）（図５２Ａ）中で、プログラニュリン発現を酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって測定した。プログラニュリン発現は、細胞数の差異（ｎ＝３、平均±ＳＥＭ）を説明するために、総タンパク質濃度に正規化された。ヘテロ接合性ＧＲＮ変異を有するＮＳＣ株は、対照ＮＳＣと比較して、細胞内および分泌プログラニュリンレベルが有意に低く、ＦＴＤ－ＧＲＮ ＮＳＣは内因性プログラニュリンレベルの約２５～５０％を発現する。これは、このＦＴＤ－ＧＲＮ細胞モデルが、ＦＴＤ－ＧＲＮ患者に観察される臨床的プログラニュリン欠損症を再現することを示唆するものであり、この患者は、正常なプログラニュリンレベルの三分の一から二分の一を血漿に発現する（Ｆｉｎｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｉｎ １３２，５８３－５９１（２００９）；Ｇｈｉｄｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ７１，１２３５－１２３９，（２００８）；Ｓｌｅｅｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ ６５，６０３－６０９（２００９））。
すべての細胞株からのＮＳＣを、神経培養に分化させた。ｉＰＳＣ由来ＮＳＣがプログラニュリン発現の減少を示すことを確立した後、株をニューロンに分化させて、ＰＲ００６Ａの非臨床有効性試験のための臨床的に代表的な細胞型を生成した。ＮＳＣを神経分化媒体に播種し、７日間の期間で有糸分裂後ニューロンに最終的に分化させ、次いで免疫蛍光法によって神経マーカー（すなわち、ＭＡＰ２、ＮｅｕＮ、Ｔａｕ、Ｔｕｊ１、ＮＦ－Ｈ）の発現について評価した（図５２Ｇ）。このプロトコルを使用して、対照およびＦＴＤ－ＧＲＮ ｉＰＳＣ由来ＮＳＣ株の両方を、効率的にニューロンに分化させた。
ＦＴＤ－ＧＲＮ ｉＰＳＣ由来神経培養物を使用して、インビトロでのＰＲ００６Ａの有効性を評価した。ＦＴＤ－ＧＲＮニューロンを、２．７ ｘ １０５、５．３ ｘ １０５、または１．１ ｘ １０６ｖｇ／細胞のＭＯＩで賦形剤またはＰＲ００６Ａで処置した。ＰＲ００６形質導入は、ＥＬＩＳＡによって測定されるように、すべての細胞株において分泌プログラニュリンの、頑健な用量依存性の発現をもたらした（図５２Ｂ）。賦形剤処置対照およびＦＴＤ－ＧＲＮニューロンを、内因性プログラニュリンレベルについて評価した。対照ニューロンは内因性分泌プログラニュリンを発現し、ＦＴＤ－ＧＲＮニューロンでは分泌プログラニュリンは検出されなかった（図５２Ｂ）。線形回帰分析により、両方のＦＴＤ－ＧＲＮ細胞株にわたってＰＲ００６Ａ用量とプログラニュリンレベルとの間に有意な相関が確認された（ｐ＝３．５×１０－１３）。これらの結果は、ＰＲ００６Ａを用いた治療が、ＦＴＤ－ＧＲＮニューロンモデルにおけるプログラニュリンの分泌上昇をもたらすことを示す。
プログラニュリンは、リソソームプロテアーゼカテプシンＤ（ＣＴＳＤ）の成熟を刺激することが知られているが、その機能喪失はリソソーム蓄積障害および神経変性にも関与している。ＣＴＳＤは、酵素的に活性な成熟プロテアーゼ（ｍａｔＣＴＳＤ）へのタンパク質分解プロセシングを受ける不活性全長プロタンパク質（ｐｒｏＣＴＳＤ）として発現される。プログラニュリンは、ｐｒｏＣＴＳＤに結合してｍａｔＣＴＳＤプロテアーゼへの成熟を強化する分子シャペロンとして作用することが報告されている。ＦＴＤ－ＧＲＮ神経培養では、ＰＲ００６形質導入により、カテプシンＤの成熟不良が救済された（図５２Ｃ）。対照、ＦＴＤ－ＧＲＮ ＃１、およびＦＴＤ－ＧＲＮ ＃２ニューロンをＰＲ００６Ａまたは賦形剤で形質導入した。５．３ ｘ １０５ ＰＲ００６ＡのＭＯＩを、対照細胞の少なくとも２倍にプログラニュリンレベルを回復させたため、有効性実験に使用した（図５２Ｂ）。有効性を評価するために、ｐｒｏＣＴＳＤおよびｍａｔＣＴＳＤ発現レベルを、細胞溶解物中で、自動シンプルウェスタン（商標）（Ｊｅｓｓ）プラットフォームで評価した（図５２Ｃ）。賦形剤処置ＦＴＤ－ＧＲＮニューロンは、賦形剤処置対照ニューロンと比較して、ｍａｔＣＴＳＤ対ｐｒｏＣＴＳＤの比率が低かった。ＰＲ００６Ａ治療は、両方のＦＴＤ－ＧＲＮニューロン株における比率を有意に増加させた（図５２Ｃ）。対照ニューロンでは、ＰＲ００６Ａ処置によって、ｍａｔＣＴＳＤのｐｒｏＣＴＳＤに対する比率が有意に変化しなかった。これらの所見は、ＰＲ００６Ａが、ＦＴＤ－ＧＲＮニューロンにおけるリソソーム機能関連表現型を回復させることを示す。
正常なニューロンでは、ＴＤＰ－４３（トランスアクティブ応答ＤＮＡ結合タンパク質４３ ｋＤａ）タンパク質が核内に局在している。ＦＴＤ－ＧＲＮ患者の死後脳では、ニューロンの細胞質におけるＴＤＰ－４３の凝集が観察され、ＴＤＰ－４３の核蓄積が低減される。ＦＴＤニューロンは核ＴＤＰ－４３を減少させ、ニューロンの凝集および下流毒性をもたらす。Ｇｒｎ ＫＯマウスはこのＴＤＰ－４３病理を完全に再現しないため、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来ニューロンは、ＴＤＰ－４３の生物学を研究するための貴重なＦＴＤ－ＧＲＮモデルである。ＧＲＮ変異を担持しない対照ニューロンと比べて、核におけるＴＤＰ－４３の蓄積の減少および不溶性ＴＤＰ－４３の蓄積の増加が、ＦＴＤ－ＧＲＮを有する患者からのｉＰＳＣ由来ニューロンにおいて報告されており、これはＶａｌｄｅｚ ｅｔ ａｌ．（Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２６、４８６１－４８７２（２０１７））に記載されている。両方のＦＴＤ－ＧＲＮ変異担体株からの神経培養物のＰＲ００６Ａ形質導入は、ＴＤＰ－４３異常を逆転させ、不溶性ＴＤＰ－４３の減少（シンプルウェスタン（登録商標）（Ｊｅｓｓ）プラットフォームを用いて測定（図５２Ｄ））、およびＴＤＰ－４３の核局在化の増加（免疫蛍光を用いて測定（図５２Ｆ））をもたらす。
まとめると、ＰＲ００６形質導入は、リソソーム酵素、カテプシンＤにおける欠陥のある成熟を回復し、ＦＴＤ－ＧＲＮニューロンにおける異常なＴＤＰ－４３病理を改善した。
インビボ非臨床試験
高齢のＧｒｎノックアウトマウスにおける有効性および生体内分布
インビボおよび最大用量ＰＲ００６ＡでのＰＲ００６Ａの有効性を、Ｇｒｎノックアウト（ＫＯ）マウスモデルで評価した。これらの研究（Ｂ６（Ｃｇ）－Ｇｒｎ ｔｍ１．１Ａｉｄｉ／Ｊ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）で使用されたＧｒｎ ＫＯマウスモデルでは、エクソン１～４が、標的プログラニュリン（Ｇｒｎ）遺伝子（Ｙｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２０７，１１７－１２８（２０１０））から除去される。これらの動物は、プログラニュリンの完全な喪失を有し、リソソーム変化、神経リポフスチン蓄積、ユビキチン蓄積、小膠細胞症、および神経炎症を含む年齢依存性表現型を示し、したがってＦＴＤ－ＧＲＮをモデル化するために広く使用されている。すべての試みは、試験からのバイアスを排除するために行われた。マウスは、性別および体重のバランスがとれた処置群に割り当てられ、実験評価項目の盲検化評価が、資格を有する人員によって実施された。
当初の試験では、ＰＲ００６Ａは、９．７×１０１０ｖｇ（２．４×１０１１ｖｇ／ｇ脳）の用量で、高齢のＧｒｎ ＫＯマウスに送達された。これは、試験に使用されたウイルスロットの注射体積の制約および物理的力価のため、試験の時点で達成可能な最高用量であった。ＣＮＳ炎症および小膠細胞症を含むＦＴＤ－ＧＲＮ関連表現型の多くは、年齢依存的に発生し、１２～２４か月齢の間に最も顕著な表現型の発現が起こるため、高齢マウスを使用した。
高齢のＧｒｎ ＫＯマウスを用いた試験では、ＰＲ００６Ａは、単回脳室内（ＩＣＶ）注射によって投与された。１０μｌ賦形剤（意図された臨床ビヒクル、２０ｍＭのトリスｐＨ８．０、２００ｍＭのＮａＣｌ、および１ｍＭ ＭｇＣｌ２＋０．００１％プルロニックＦ６８）または９．７ｘ１０１０ｖｇ ＰＲ００６Ａ（２．４ｘ１０１１ｖｇ／ｇ脳〔成体マウスの脳重量４００ｍｇに基づく〕）を、ＩＣＶ注射により、二つのコホートの高齢Ｇｒｎ ＫＯマウスに送達した：（１）注射時に１６か月齢（ｎ＝４／群、ＰＲＶ－２０１８－０２７；図６１）、および（２）注射時に１４か月齢（計画ｎ＝３／群、ＰＲＶ－２０１９－００２、図６１）。動物を注射の二か月後に犠牲にした。
試験ＰＲＶ－２０１８－０２７では、ＰＲ００６Ａの単回投与を、以下の処置群で１６か月齢のマウスに送達した。
予想外の試験の逸脱（遺伝子型決定のエラーおよび動物の早期喪失）のため、ＰＲＶ－２０１９－００２試験（１４か月齢コホート）は、計画ｎ＝３ではなく１匹のみを賦形剤処置群に登録した。サンプル数が少ないため統計解析は不可能であり、この試験はさらなる考察から除外される。しかし、この試験の所見は、ＰＲＶ－２０１８－０２７試験のものと同等であった。
生体内分布およびプログラニュリン発現：生体内分布を、ＰＣＲ感受性に対する現在の米国食品医薬品局生物製剤評価研究センター（ＣＢＥＲ）／組織・先進治療局（ＯＴＡＴ）標準を満たすｑＰＣＲアッセイを使用して、ベクターゲノムの存在を測定することによって決定した（１μｇゲノムＤＮＡ当たり＞５０個のベクターゲノムを陽性として定義）。ＰＲ００６Ａを投与されたすべてのマウスは、大脳皮質および脊髄のベクターゲノムが陽性であり、ＩＣＶ投与が成功裏に脳およびＣＮＳのＰＲ００６Ａ形質導入をもたらすことを示した（図５９Ａ）。ＩＣＶ ＰＲ００６Ａは、Ｇｒｎ ＫＯマウスのＣＮＳ（脳、脊髄）において有意なレベルのヒトプログラニュリンタンパク質をもたらしたが、予想通り、賦形剤を投与されたマウスではヒトプログラニュリンは検出不能であった（図５９Ｂ）。プログラニュリンは主に分泌タンパク質であるため、ＣＳＦ中の発現は脳内でのタンパク質産生の代用とみなされ、ＣＳＦプログラニュリンレベルが低下したＦＴＤ－ＧＲＮ患者の潜在的な翻訳エンドポイントを表す。我々は、ＰＲ００６Ａ処置マウスのＣＳＦ中のヒトプログラニュリンを検出できたが、サンプル量が少ないこと、およびマウスにおいて十分な量のＣＳＦを得ることの技術的限界により、ＣＳＦプログラニュリンレベルの測定は、アッセイの定量下限（ＬＬＯＱ）未満であった（図５９Ｃ）。
ＩＣＶ投与はまた、肝臓、心臓、肺、腎臓、脾臓、および性腺を含む末梢組織において、広範なベクターゲノムの存在およびプログラニュリンタンパク質レベルをもたらした（図６２Ａ～図６２Ｂ）。さらに、ＰＲ００６Ａ処置Ｇｒｎ ＫＯマウスの血漿において、有意なレベルのヒトプログラニュリンが検出可能であった。予想通り、ヒトプログラニュリンは、賦形剤処理したＧｒｎ ＫＯマウスでは検出されなかった。
リポフスチン蓄積：ニューロンリポフスチンの蓄積、有糸分裂後細胞のリソソームに経時的に漸進的に蓄積する電子密度の高い自己蛍光物質は、リソソーム機能不全の指標であり、Ｇｒｎ ＫＯマウスの特徴的な年齢依存性表現型である。リポフスチンの蓄積は、隣接する脳切片において二つの独立した方法を使用して評価された。（１）より臨床的なアプローチでは、脳におけるリポフスチンの蓄積は、０（リポフスチンは観察されなかった）から４（広範囲のリポフスチン蓄積）のスケールで、盲検化された病理学者によってスコア付けされ、（２）より定量的なアプローチでは、リポフスチン自己蛍光は、免疫組織化学（ＩＨＣ）によって検出され、自動的に定量化された。Ｇｒｎ ＫＯマウスは、脳全体にわたって実質的にリポフスチン症を示し、ＩＣＶ ＰＲ００６Ａ治療は、大脳皮質、海馬、および視床におけるリポフスチンスコアの重症度を減少させた（図５９Ｄ）。ＩＨＣ画像からのリポフスチン蓄積の定量化はまた、三つの脳領域すべてにおいてＰＲ００６Ａ治療によるリポフスチン症の減少を検出した。ユビキチン陽性の含有物は、Ｇｒｎ ＫＯマウスモデルにも年齢依存的に蓄積するＦＴＤ－ＧＲＮ患者の決定的な病理学的特徴であるため、ＩＨＣを実施して、関心脳領域（大脳皮質、海馬、視床）で定量化し、ユビキチン蓄積を評価した。ＰＲ００６Ａ治療は、Ｇｒｎ ＫＯマウスにおけるユビキチン蓄積を有意に減少させた（図５９Ｅ）。これらの所見は、ＰＲ００６ＡがＦＴＤ－ＧＲＮのＧｒｎ ＫＯマウスモデルにおいてリソソーム機能障害を改善することを示唆している。
神経炎症：慢性ＣＮＳ炎症は、ＦＴＤ－ＧＲＮ患者の脳における病理学的特徴であり、Ｇｒｎ ＫＯマウスにおいて、年齢依存的に再現される。プログラニュリンは、ＦＴＤ－ＧＲＮのマウスモデルにおいて抗炎症効果を有し、プログラニュリンの喪失は、ＴＮＦａを含む炎症促進性サイトカインの上方制御につながる。この研究では、ＰＲ００６Ａを用いた治療は、高齢のＧｒｎ ＫＯマウスにおける炎症マーカーレベルを抑制した。ＩＣＶ ＰＲ００６Ａは、大脳皮質における炎症促進性サイトカインＴｎｆ（ＴＮＦａ）およびミクログリアのマーカーであるＣｄ６８（ＣＤ６８）の遺伝子発現を減少させた（図５９Ｆ）。また、ＴＮＦαタンパク質レベルが、メソスケールディスカバリーマウス炎症促進性サイトカインアッセイを用いたＰＲ００６Ａ処置Ｇｒｎ ＫＯマウスからの大脳皮質サンプルにおいて減少した（図５９Ｇ）。神経炎症をさらに評価するために、小膠細胞症のマーカーであるＩｂａ１、および星状細胞増加症のマーカーであるＧＦＡＰについて免疫組織化学（ＩＨＣ）を行い、関心脳領域（大脳皮質、海馬、視床）で定量化した。ＰＲ００６Ａ治療は、Ｇｒｎ ＫＯマウスの小膠細胞症（Ｉｂａ１）の減少傾向をもたらしたが、星状細胞増加症（ＧＦＡＰ）には影響しなかった（図５９Ｈ、図５９Ｉ）。まとめると、これらの結果は、ＰＲ００６Ａ治療が、ＦＴＤ－ＧＲＮの高齢Ｇｒｎ ＫＯマウスモデルにおける神経炎症を減少させることを示す。
病理組織学：これらの研究の全マウスの脳、胸部脊髄、肝臓、心臓、脾臓、肺、および腎臓のヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色の盲検化された委員会認定病理学者による徹底的な病理組織解析からは、ＰＲ００６Ａ治療に関連する有害事象は示されなかった。ＰＲ００６ＡのＧｒｎ ＫＯマウスへの投与は、髄質および橋における神経壊死の頻度および／または重症度スコアの減少を含む、モデルの特徴である所見の発生率および／または重症度の減少をもたらした。さらに、ＰＲ００６Ａ治療により、胸部脊髄における軸索変性の発生率および重症度の両方の減少があった。これらの所見については、以下の毒性のセクションで詳しく説明される。
結論：ＩＣＶ ＰＲ００６Ａを９．７×１０１０ｖｇ（２．４×１０１１ｖｇ／ｇ脳）の用量で投与することにより、高齢Ｇｒｎ ＫＯマウスの脳および末梢組織全体にわたって広範なベクターゲノムの存在がもたらされた。ＰＲ００６Ａ治療は、広範なプログラニュリン発現を増加させた。さらに、ＰＲ００６Ａは、Ｇｒｎ ＫＯマウスモデルおよびＦＴＤ－ＧＲＮの患者の両方において起こると知られている病理である、脳内のリポフスチンおよびユビキチンの蓄積を減少させた。ＰＲ００６Ａはまた、慢性ＣＮＳ炎症を示す表現型である大脳皮質における炎症促進性サイトカインおよび免疫細胞活性化の発現を減少させた。
成体Ｇｒｎノックアウトマウスにおける用量範囲の有効性
ＰＲ００６Ａの有効用量をさらに評価するために、成体Ｇｒｎ ＫＯマウスにおけるより大きな用量範囲試験を実施した。ＰＲＶ－２０１９－００４では、１０μｌの賦形剤（意図された臨床ビヒクル；２０ｍＭのトリスｐＨ８．０、２００ｍＭのＮａＣｌ、および１ｍＭのＭｇＣｌ２＋０．００１％プルロニックＦ６８）またはＰＲ００６Ａを、ＩＣＶを介して４か月齢の動物に送達した。これらの成体マウスは、高齢なＧｒｎ ＫＯマウスの代わりに使用された。その理由は、後者は用量範囲試験を実施するのに十分な数が入手できなかったためである。成体Ｇｒｎ ＫＯマウスは、高齢マウスよりも軽度の表現型を有するが、それでもリソソーム欠損および神経炎症性変化を呈し、したがってＰＲ００６Ａの有効用量範囲の評価に適している。広範囲のウイルス用量にわたるＰＲ００６Ａの有効性を評価するために、ＰＲ００６Ａは、試験の時点での注射体積の制約および試験に使用されるウイルスロットの物理的力価試験により達成可能な最高用量である１．１×１０１１ｖｇ（２．７×１０１１ｖｇ／ｇ脳）、中間用量である１．１×１０１０ｖｇ（２．７×１０１０ｖｇ／ｇ脳）、または低用量である１．１×１０９ｖｇ（２．７×１０９ｖｇ／脳）で、投与された。実験設計の詳細は、図６３に示される。
ＰＲ００６Ａの三つの用量が、群当たり１０匹のマウス（４Ｍ／６Ｆ）で評価された。
野生型（ＷＴ）Ｇｒｎ対立遺伝子を有するＧｒｎ ＫＯマウス（７か月齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ）と同じバックグラウンド系統の年齢適合マウスを、本試験において、選択的有効性評価項目の対照として使用した。
生体内分布およびプログラニュリン発現：生体内分布を、ＰＣＲ感度に関する現在の米国食品医薬品局のＣＢＥＲ／ＯＴＡＴ基準を満たすｑＰＣＲアッセイを使用して、ベクターゲノムの存在を測定することによって決定した（１μｇゲノムＤＮＡ当たり＞５０個のベクターゲノムを陽性として定義）。ＰＲ００６Ａを投与されたマウスは、大脳皮質および脊髄のベクターゲノムが用量依存的に陽性であり、ＩＣＶ投与が、ＣＮＳにおいてＰＲ００６Ａ形質導入を成功裏にもたらすことを示した（図５３Ａ）。ＰＲ００６ＡでコードされたＧＲＮのｑＲＴ－ＰＣＲ解析は、ＰＲ００６ＡのＩＣＶ投与が大脳皮質におけるヒトＧＲＮ ｍＲＮＡ発現の用量依存的な誘導をもたらしたことを明らかにした（図５３Ｂ）。ＰＲ００６Ａ治療は、脳および脊髄におけるヒトプログラニュリンタンパク質のレベルを増加させた（図５３Ｃ）。脳組織では、ヒトプログラニュリンレベルが、最も高いＰＲ００６Ａ用量で検出され、および定量化された。低い用量では、プログラニュリンレベルは、脳のバックグラウンドが高いため、アッセイ検出限界未満であった。しかしながら、用量間の対数倍の差に基づいて、より低い用量での予想プログラニュリンレベルの比例推定は、脳組織におけるアッセイの定量下限（ＬＬＯＱ）を十分下回るであろう。内因性マウスプログラニュリンのレベルが、野生型（ＷＴ）Ｇｒｎ対立遺伝子を有する年齢および系統一致マウスにおいて測定された。大脳皮質および脊髄の両方で、ＰＲ００６Ａ処置Ｇｒｎ ＫＯマウスにおけるヒトプログラニュリンのレベルは、任意の用量でＷＴマウスにおける内因性プログラニュリンのレベルを超えなかった。非種交差反応性抗プログラニュリン抗体を用いた異なる検出アッセイを使用して、ヒトおよびマウスプログラニュリンを測定するため、絶対数を精度と比較することはできない。
ＰＲ００６Ａ投与はまた、肝臓、心臓、肺、腎臓、脾臓、および性腺を含む末梢組織において、広範なベクターゲノムの存在およびプログラニュリンタンパク質レベルをもたらした（図５３Ｄ；図５３Ｅ）。
血漿では、ＰＲＰＲ００６Ａ処置Ｇｒｎ ＫＯマウスにおいて、すべての用量レベルで、有意なレベルのヒトプログラニュリンが検出された（図５３Ｆ）。期待に沿って、ヒトプログラニュリンは、賦形剤で治療されたＧｒｎ ＫＯマウスでは検出されなかった。ＰＲＰＲ００６Ａの中間用量で治療された動物におけるヒトプログラニュリンのレベルは、ＷＴ Ｇｒｎ対立遺伝子を有するマウスで測定されたマウスプログラニュリンのレベルと同じ範囲内であった。非種交差反応性抗プログラニュリン抗体を用いる異なる検出アッセイを使用してヒトおよびマウスのプログラニュリンを測定するため、絶対数は精度と比較することはできない。
リポフスチン蓄積：リポフスチン蓄積は、隣接する脳切片において二つの独立した方法を用いて評価された。（１）より臨床的なアプローチでは、脳におけるリポフスチン蓄積は、０（リポフスチンは観察されなかった）から４（広範囲のリポフスチン蓄積）のスケールで、盲検化された病理学者によってスコア付けされ、（２）より定量的なアプローチでは、リポフスチン自己蛍光は、ＩＨＣによって検出され、自動的に定量化された。Ｇｒｎ ＫＯマウスは、脳全体にわたってリポフスチン症を呈したが、ＷＴマウスは、脳内で検出可能なリポフスチンを有しなかった（図５３Ｇ）。ＰＲ００６ＡのＩＣＶ投与は、Ｇｒｎ ＫＯマウスの脳における細胞内リポフスチン蓄積の重症度スコアの用量依存性の減少をもたらした（図５３Ｇ）。リポフスチン症の減少に関するＰＲ００６Ａの有効性は、海馬および視床を含むＦＴＤ－ＧＲＮのＧｒｎ ＫＯマウスモデルにおいて最も頑健なリポフスチン症表現型を示す脳領域において最も容易に定量化され得る。病理学者によるリポフスチンのスコアリングに加えて、対象脳領域（すなわち、大脳皮質、海馬、視床）においてリポフスチン症を定量的に評価するために実施されたＩＨＣにより、中間および高ＰＲ００６Ａ用量での有意な減少の発生を伴う、大脳皮質および視床脳領域でのリポフスチン蓄積量の用量依存的な減少が検出された。ＩＨＣは、脳内でのユビキチン蓄積を評価するためにも実施された。これは、Ｇｒｎ ＫＯマウスで発生する追加のＦＴＤ－ＧＲＮ関連病理である。ＷＴマウスと比較して、Ｇｒｎ ＫＯマウスは、脳全体にわたってユビキチンの増加を示した（図５３Ｈ）。ＰＲ００６Ａは、三回の投与すべてで、ユビキチン免疫応答性物体サイズをほぼＷＴレベルまで有意に減少させた（図５３Ｈ）。
神経炎症：ＰＲ００６Ａを用いた治療は、成体Ｇｒｎ ＫＯマウスの脳における炎症マーカーレベルを抑制した。ＩＣＶ ＰＲ００６Ａは、２．７ｘ１０９ｖｇ／ｇの脳～２．７ｘ１０１１ｖｇ／ｇ脳の範囲の用量にわたって、皮質におけるミクログリアのマーカーである炎症促進性サイトカインＴｎｆ（ＴＮＦα）およびＣｄ６８（ＣＤ６８）の遺伝子発現を減少させた（図５３Ｉ）。公表されたデータに沿って、我々は、野生型Ｇｒｎ対立遺伝子を有する年齢が合致したマウスと比較して、賦形剤処置Ｇｒｎ ＫＯマウスにおけるこれらの神経炎症性マーカーの遺伝子発現の増加を観察した（図５３Ｉ）。ＰＲＶ－２０１８－０２７からの１８か月齢のＧｒｎ ＫＯマウスにおける観察結果、および文献におけるＴＮＦａ異常の報告とは対照的に、７か月齢の成体賦形剤処置Ｇｒｎ ＫＯマウスにおいて大脳皮質ＴＮＦαタンパク質レベルの頑健な増加は見られず、さらに、Ｇｒｎ ＫＯマウスにおいてＰＲ００６Ａでの有意な変化は観察されなかった。これらの所見は、１２～２４か月齢までは、Ｇｒｎ ＫＯマウスモデルでは頑健な神経炎症性表現型は発生しないという、以前に公表された所見と一致している。免疫組織化学（ＩＨＣ）を実施し、対象脳領域（大脳皮質、海馬、および視床）で定量化して、小膠細胞症のマーカーであるＩｂａ１、および星状細胞増加症のマーカーであるＧＦＡＰの染色によりニューロンの炎症をさらに評価した。Ｇｒｎ ＫＯマウスでは、ＷＴマウスと比較して、脳全体にわたって小膠細胞症（Ｉｂａ１）および星状細胞増加症（ＧＦＡＰ）の有意な増加があった（図５３Ｊ～図５３Ｋ）。ＰＲ００６Ａ治療は、三回の投与すべてで小膠細胞症（Ｉｂａ１）を有意に減少させた（図５３Ｊ）。中間ＰＲ００６Ａ用量で星状細胞増加症（ＧＦＡＰ）減少の傾向が観察され、視床脳領域での高ＰＲ００６Ａ用量で星状細胞増加症（ＧＦＡＰ）の有意な減少が観察された（図５３Ｋ）。
Ｇｒｎ ＫＯマウスモデル表現型の多くは後期に発現するが、研究によると、Ｇｒｎ ＫＯマウスは、リソソームおよび免疫関連経路の変化を含む、早ければ生後４か月時点での広範な遺伝子発現の変化を早くも呈することが報告されている。したがって、上述の標的ｑＲＴ－ＰＣＲ解析に加えて、高感度のハイスループット技術（ＲＮＡシーケンシング）を用いて広範囲に評価することができ、かつ最小限のサンプル材料しか必要としない、ｍＲＮＡレベルの変化を評価するトランスクリプトミクスアプローチが採用された。大脳皮質のＲＮＡシーケンシングを行い、遺伝子セット変異解析（ＧＳＶＡ）（Ｈａｎｚｅｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １４，７（２０１３））を使用して、同系統の年齢が合致したＷＴマウスと比較して、７か月齢の賦形剤処置Ｇｒｎ ＫＯマウスのどの遺伝子発現経路が変化するかを決定した。我々は、以前に公表された研究で報告されているように、Ｇｒｎを欠くマウスにおいてリソソームおよび免疫関連経路の欠損を確認した。有意な変化が、ＧＯ ＴＥＲＭ（ＧＯ：０００５７７３）「空胞」遺伝子（Ｌｕｉ ｅｔ ａｌ（Ｃｅｌｌ １６５，９２１－９３５（２０１６））によって記載されるＧｒｎ ＫＯマウスにおいて調節不全と報告される４つの遺伝子を含む）のサブセット、「リソソーム遺伝子」セット（Ｅｖｅｒｓ ｅｔ ａｌ（Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２０，２５６５－２５７４（２０１７））によって記載されるＧｒｎ ＫＯマウスにおいて調節不全と示される２５のリソソーム関連遺伝子のサブセット）、および遺伝子セットエンリッチメント解析ホールマーク（ＨＡＬＬＭＡＲＫ）データベース（自然免疫系の一部である相補系の構成要素をコードする遺伝子を含む）による「相補」遺伝セット、で報告された。次に、これらの遺伝子セットの活性レベルをＰＲ００６Ａ治療で測定し、比較した（図５３Ｌ ～図５３Ｎ）。ＰＲ００６Ａを用いた治療は、用量依存的に、Ｇｒｎ ＫＯマウスで観察された遺伝子セットの欠損を逆転させた。
病理組織：これらの研究の全てのマウスの、脳、胸部脊髄、肝臓、心臓、脾臓、肺、腎臓、および性腺のヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色について、盲検化された委員会認定病理学者が行った徹底的な病理組織解析では、ＰＲ００６Ａ治療に関連する毒性の証拠は見出されなかった。毒性解析の詳細は、以下のセクションに提供されている。
結論：ＩＣＶ ＰＲ００６Ａは、２．７ｘ１０９ｖｇ／ｇ脳～２．７ｘ１０１１ｖｇ／ｇ脳に及ぶ用量で、脳および末梢組織全体にわたって用量依存的に広範なベクターゲノムの存在をもたらした。ＰＲ００６Ａ治療は、ＣＮＳにおけるプログラニュリンｍＲＮＡおよびタンパク質の産生にもつながった。複数の脳領域にわたって、リソソーム機能不全の読み出しである、ＰＲ００６Ａとリポフスチン症の減少との間に明らかな用量応答の関係が観察された。ＰＲＰＲ００６Ａの中間および最高用量レベルで、頑健かつ統計的に有意なリポフスチン症の減少が観察された。すべてのＰＲ００６Ａ用量は、脳内のユビキチン蓄積を減少させた。最低用量の２．７ｘ１０９ｖｇ／ｇ脳から開始して、ＰＲ００６Ａは、ＲＮＡおよびタンパク質レベルで脳内の炎症促進性マーカーの発現を減少させた。
発明の概要：インビボの非臨床試験
ＰＲ００６Ａは、Ｇｒｎ ＫＯマウスを効果的に形質導入し、その結果、ＣＮＳにおける導入遺伝子の頑健な用量依存性の生体内分布およびプログラニュリンｍＲＮＡおよびタンパク質の産生をもたらした。ＰＲ００６Ａは、リソソームおよび神経炎症性経路における遺伝子発現異常を用量依存的に逆転させた。ＰＲ００６Ａは、リポフスチン症、ユビキチン蓄積、および小膠細胞症を含む、このＦＴＤ－ＧＲＮマウスモデルの脳で発生する表現型の多くを減少させた。用量範囲試験では、２．７ｘ１０９ｖｇ／ｇ脳ＰＲ００６Ａの最低用量は、大脳皮質における炎症マーカーの発現を有意に抑制した。２．７×１０１０ｖｇ／ｇ脳ＰＲ００６Ａの中間用量は、リソソーム欠損（例えば、リポフスチン症）および神経炎症の両方を、頑健かつ統計的に有意に改善した。２．７×１０１１ｖｇ／ｇ脳ＰＲ００６Ａの高用量は、毒性の証拠なしに、プログラニュリン発現をさらに増加させた。
安全性薬理学
これらの試験を通して、被験物質に起因すると考えられる有害事象は認められなかった。
ＰＲＶ－２０１８－０２７、ＰＲＶ－２０１９－００２、およびＰＲＶ－２０１９－００４における動物の生存および病理組織学的解析からの安全性所見
については、以下のセクションで説明する。
単回投与毒性
ＰＲ００６Ａを用いた一連の非臨床試験が、マウスおよびサルにおける安全性評価項目が調査されながら、実施された。Ｇｒｎ ＫＯマウスモデルで三つの試験が実施され、評価項目は神経病理学的評価項目を含み、保護活性ならびにＰＲ００６Ａの脳室内（ＩＣＶ）注射による投与から生じる潜在的毒性の両方を評価した。ＩＣＭの投与はマウスではより技術的に困難である。これらのマウスモデルは、患者がＧＲＮ遺伝子に突然変異を有し、その結果、プログラニュリンレベルが低下するＦＴＤ－ＧＲＮの代表的なものである。カニクイザルでは、ＰＲ００６Ａを大槽内（ＩＣＭ）に注射するパイロット試験の一環として、神経病理学も実施された。ＰＲＰＲ００６ＡがＩＣＭに送達されたカニクイザルにおいてＧＬＰ試験が実施され、サルは７日目、３０日目、または１８３日目に犠牲となった。ＧＬＰ試験では、組織の完全なリスト上の解剖学的病理評価項目に加えて、臨床評価項目の包括的なリストが組み込まれた。診療所における単回投与を支援するため、以下の単回投与試験を実施した。
高齢ＦＴＤ－ＧＲＮマウスモデルにおける最大用量ＰＲ００６Ａ（ＰＲＶ－２０１８－０２７およびＰＲＶ－２０１９－００２）
Ｇｒｎ ＫＯマウスにおけるこれらの有効性試験の一部として、賦形剤またはＰＲ００６ＡのいずれかでＩＣＶ処置されたマウスにおいて、神経病理学的評価を実施した。Ｇｒｎ ＫＯマウスは、プログラニュリンの完全な喪失を有し、リソソーム変化、神経リポフスチン蓄積、小膠細胞症、および神経炎症を含む、それらの年齢依存性表現型のためにＦＴＤ－ＧＲＮのモデルとして広く使用されている。試験の薬理学的部分の態様は、上記のセクションに要約されているのに対し、本試験で評価された毒性学関連の評価項目は以下に要約されている。ＰＲ００６Ａの二つの研究を、高齢Ｇｒｎ ＫＯマウスモデルで実施した。最初の試験（ＰＲＶ－２０１８－０２７）では、１６か月齢の９つの混合性別Ｇｒｎ ＫＯマウスにＰＲ００６Ａまたは賦形剤のいずれかをＩＣＶ投与した。動物は、投与後９週間で犠牲となった。単一のＰＲ００６Ａ用量群を、この研究に含めた：１０μｌの非希釈ウイルス、総用量９．７×１０１０ｖｇ（２．４×１０１１ｖｇ／ｇ脳）、対照群は１０μｌの賦形剤で治療した。
生体内分布、リソソーム変化、および炎症マーカーなどの様々な死後評価項目を、この試験のプロトコルの一部として評価した（上のセクションを参照）。動物を二回／日、生存についてもチェックし、体重を一回／日測定した。治療後２カ月での安楽死後、標的組織を採取し、冷却された４％のパラホルムアルデヒド中に滴下固定して、４℃で保存した。試験を完了した８匹の動物の組織をトリミングし、処理し、パラフィンブロックに埋め込んだ。次いで、約５μｍの切片にし、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色し、委員会認定の獣医病理学者によって調べさせた。
この試験中、処置群から１匹のマウスが早期死亡し、剖検中に死亡した動物に異常は記録されなかったため、既知の死因はなかった。その他の死亡または異常は観察されなかった。すべての処置群は、体重に関して同様に追跡し、有意差は示さなかった。
病理組織学的検査では、ＰＲ００６Ａ関連の有害な所見はなかった。脳内には広範なリポフスチンの蓄積があり、これはＧｒｎ ＫＯマウスに予想される所見と一致していた。ＰＲ００６Ａ処置動物では、脳のすべての領域におけるリポフスチン蓄積のスコア重症度の減少があった。形態学的変化はまた、ＰＲＰＲ００６Ａ治療で、特に髄質および橋の神経壊死に関して、頻度および／または重症度スコアのわずかな減少を示すように思われた。しかしながら、形態学的変化におけるこれらの傾向は、リポフスチンスコアのそれほど一貫していなかった。
胸部脊髄では、軸索の変性があり、非常にまれに（各群４匹中１匹）、最小のニューロン壊死が観察されました。ＰＲ００６Ａで処置された動物において、軸索変性の発生率および重症度の両方にわずかな減少があった。
おそらくはＧｒｎホモ接合性ノックアウトマウスに関連すると考えられる以下の所見は、ＰＲ００６Ａで治療された動物において、頻度および／または重症度が低下したように見えた：腎臓の髄質における拡張した細管、腎臓における糸球体症、および肺における異物（直線状、無細胞性、暗いピンク色の構造として特徴付けられ、通常は気道内であり、外来巨細胞および／またはマクロファージと頻繁に関連する）。より大きな動物のコホートが、より決定的な結論を得るには必要である。
観察されたその他すべての病理組織学的所見は、偶発的および／または偶発的に類似するとみなされ、賦形剤および被験物質処置動物における重症度は、したがって、ＰＲ００６Ａの投与とは関連がないとみなされた。
第二の試験（ＰＲＶ－２０１９－００２）では、１４か月齢の５つの混合性別Ｇｒｎ ＫＯマウスにＰＲ００６Ａまたは賦形剤のいずれかをＩＣＶ投与した。動物は、投与後８週間で犠牲となった。単一のＰＲ００６Ａ用量群を、この研究に含めた：１０μｌの非希釈ウイルス、総用量９．７×１０１０ｖｇ（２．４×１０１１ｖｇ／ｇ脳）、対照群は１０μｌの賦形剤で治療した。
動物は、ＰＲＶ－２０１８－０２７試験と同じ方法で分析された。動物を二回／日、生存についてチェックし、体重を一回／日測定した。処置後２カ月での安楽死後、標的組織を採取し、冷却された４％のパラホルムアルデヒド中で滴下固定し、評価まで４℃で保存した。
ＣＮＳでは、Ｇｒｎ ＫＯマウスで以前に観察された所見と一致する所見が脳で観察された（Ｙｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２０７（１）：１１７－１２８（２０１０））。具体的には、脳全体でリポフスチンの蓄積が広範に増加した。まれに、最小限のニューロン壊死も観察された（未処置の早期死亡動物１匹および賦形剤動物１匹において）。
サンプル数が少ないため、治療に関連する所見の一貫した傾向を示すことができなかった。被験物質（ＰＲ００６Ａ）と賦形剤の間には、一貫した応答の差はなかった。
非ＣＮＳ組織については、Ｇｒｎ ＫＯマウスの表現型と一致すると考えられる所見が、腎臓（単核炎症細胞の管状拡張および浸潤）および肝臓（クッパー細胞／シノイド内層細胞およびクッパー細胞微小肉芽腫の空胞化）において観察された（Ｙｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２０７（１）：１１７－１２８（２０１０））。
手術を受け、試験に登録されたすべての動物に、「糸球体症」の所見が観察された。この所見について、標準的でチャレンジされていないＧｒｎノックアウトマウスに関連する変化として公表された報告は見つからなかったが、一件の研究は、高ホモシステイン血症、糸球体基底膜の肥厚、および有足細胞足突起消失を誘発する食事で処置されたプログラニュリン欠損マウスを立証した（Ｆｕ ｅｔ ａｌ．，Ｈｙｐｅｒｔｕｌａｔｉｏｎ ６９（２）：２５９－２６６（２０１７））。
その他の全ての所見は、実験マウスで一般的に観察された所見と一致していた。サンプル数が少ないため、治療に関連する決定的な差は示されなかった。
成体ＦＴＤ－ＧＲＮマウスモデルにおける用量範囲ＰＲ００６Ａ（ＰＲＶ－２０１９－００４）
ＰＲ００６Ａの安全性をさらに評価するために、成体Ｇｒｎ ＫＯマウスにおけるより大きな用量範囲試験を実施した。合計で４０匹の混合性別マウスを４つの群に分け、脳の左半球に単回の一方的ＩＣＶ注射により、賦形剤またはＰＲ００６Ａの三つの用量のうちの一つのいずれかを投与した。処置群にかかわらず、すべての動物は、１０μｌの総用量体積を受けた。マウスは生後４か月で治療され、治療後３か月で安楽死させた。約７か月まで成長した未処置のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（同じバックグラウンド系統）を含む追加の野生型（ＷＴ）対照群も安楽死させ、同様の剖検の対象とした。
試験は、以下の試験デザインに従って実施された。
試験中、動物を一日二回生存確認し、週に一回計量した。処置の３か月後にマウスを安楽死させ、ＰＲ００６Ａの有効性を評価するために様々な死後評価を実施した（上記のセクションを参照）。さらに、脳、胸部脊髄、肝臓、心臓、脾臓、肺、腎臓、および性腺からのＨ＆Ｅで染色された切片を、委員会認定病理学者によって評価した。
病理組織学的検査では、処置群にかかわらず、マウスのいずれにも有害なＰＲ００６Ａ関連所見はなかった。
脳の様々な領域：大脳皮質、大脳核、海馬、視床／視床下部、小脳、および脳幹（特に橋および髄質）における細胞内リポフスチンの蓄積など、Ｇｒｎ ＫＯマウスモデル表現型と一致する所見があった。Ｈ＆Ｅ染色切片（ニューロンおよびグリオーシスの空胞化）に形態学的変化の明確な証拠は観察されなかった。リポフスチン色素の蓄積は、簡単に検出可能な形態学的変化に先行することができ、したがって、有効性の適切なバイオマーカーとしての役割を果たす。すべてのＧｒｎホモ接合性ＫＯ群はリポフスチンの蓄積を示したが、この所見の重症度には処置群間で差があった。リポフスチン蓄積のスコアが高い頻度は、賦形剤で処置された動物の群において最大であった（第１群）。ＰＲ００６Ａで処置された動物のうち、より高いスコアの頻度が第４群（低用量ＰＲ００６Ａ；２．７×１０９ｖｇ／ｇ脳）で観察され、続いて第３群（中用量ＰＲ００６Ａ；２．７×１０１０ｖｇ／ｇ脳）で観察された。最低の重症度スコアは、第２群（高用量ＰＲ００６Ａ；２．７×１０１１ｖｇ／ｇ脳）で観察された。これらの所見は、Ｇｒｎホモ接合性ノックアウトマウスの脳における細胞内リポフスチン蓄積の重症度スコアの用量依存性の減少を示す。その他すべての病理組織学的所見は、偶発的および／または偶発的に類似するとみなされ、賦形剤および被験物質処置動物における重症度は、したがって、ＰＲ００６Ａの投与とは関連がないとみなされた。
サルにおけるＧＬＰ単回投与試験（ＰＲＶ－２０１８－０２８）
試験デザイン
このＧＬＰ試験の目的は、６、２９、または１８２日間の投与後観察期間を設けて、カニクイザルにＩＣＭ注射を介して一回投与された場合の被験物質ＰＲ００６Ａの毒性および生体内分布を評価することであった。動物は、７日目、３０日目、１８３日目に犠牲となった。本試験は、２つの用量レベルを評価するために設計された。最大用量は、希釈されていないＰＲ００６Ａの１．２ｍＬの体積（投与の経験のある最も大きな体積）を有する達成可能な最大実行可能用量で、低用量は、大容量よりも１ログ単位低い用量相当である。用量は、脳重量推定７４ｇの本試験で用いた非ヒト霊長類であるカニクイザルにおいて、４．８×１０１１ｖｇの低用量および４．８×１０１２ｖｇの高用量と同じであった。これは、およそ６．５×１０９ｖｇ／ｇ脳および６．５×１０１０ｖｇ／ｇ脳に相当する。試験にはまた、動物が１．２ｍｌ（２０ｍＭのトリスｐＨ８．０、２００ｍＭのＮａＣｌ、および１ｍＭのＭｇＣｌ２＋０．００１％［ｗ／ｖ］のプルロニックＦ６８）の賦形剤のみを受ける対照群が含まれた。この研究は、カニクイザルマカクのオスとメスの両方を利用した。７日目群は、最高用量でのメス１匹を含み、早期毒性のための歩哨として設計され、残りの二つの時点（３０日目および１８３日目）は、各用量でオス２匹およびメス１匹を含んだ。複数の脳領域からのサンプルに加えて、ｑＰＣＲ分析のために末梢組織サンプルを採取した。ｑＰＣＲで陽性であったすべてのサンプルを、導入遺伝子発現について分析した。この研究デザインの表集計概要を表１１に示す。
カニクイザルＮＨＰは、複数の生存中観察および測定によって評価された。これには、死亡／病的状態（毎日）、臨床観察（毎日）、体重（ベースラインおよびその後毎週）、食物消費量の目視検査（毎日）、神経学的観察（ベースラインおよび２週目および２６週目）、間接眼底検査（ベースラインおよび２週目および２６週目）、ならびに心電図（ＥＣＧ）測定（ベースラインおよび２週目および２６週目）が含まれる。
ＡＡＶ９キャプシドに対する中和抗体（ｎＡｂ）の分析は、ベースラインおよび７、３０、または１８３日目の犠牲時に行った。血液学、凝固、臨床化学、および尿検査からなる臨床病理を、ベースライン（血液検査、尿検査で一回）で二回、および投与期の１週目および１３週目に一回行った。
動物を安楽死させ、組織を７日目、３０日目、または１８３日目に採取した。存在する場合に、表１１で概要を述べた組織は、すべての動物から収集され、計量され（該当する場合）、複数の複製に分割された。一つの複製を、１０％の中性緩衝ホルマリン（最適な固定のために特別な固定剤が必要な場合を除く）中で、病理組織学的評価のために保存した（全動物）。ｑＰＣＲおよび導入遺伝子発現解析のために追加の複製を収集した。
安全性および毒物学
予定外の死亡はなく、全ての動物は予定された剖検まで生存した。有害なＰＲ００６Ａ関連臨床所見、体重変化、眼での観察、または身体検査または神経学的検査所見はなかったが、剖検での全般的な肉眼検査では、いずれのコホートでも薬剤に関連した異常は示されなかった。さらに、６．５×１０９または６．５×１０１０ｖｇ／ｇ脳を投与された男性または組み合わせた性別において、ＰＲ間隔、ＱＲＳ持続時間、ＱＴ間隔、補正ＱＴ（ＱＴｃ）間隔におけるＰＲＰＲ００６Ａ関連の変化、または心拍数の変化は観察されなかった。ＥＣＧの定性的評価中に異常なＥＣＧ波形または不整脈は観察されなかった。
生体内分布
ＰＲ００６Ａ導入遺伝子の生体内分布解析を、ｑＰＣＲベースのアッセイを使用して実施した。高用量群（６．５×１０１０ｖｇ／ｇ脳）の１８３日目に、ＣＮＳおよび周辺全体にわたって広範な形質導入があり、ｑＰＣＲアッセイの定量下限である５０ｖｇ／μｇＤＮＡのカットオフで、すべての組織でベクター存在が陽性であった。１８３日目からの選択された代表的な領域からのデータを図５４Ａに示すが、３０日目のデータは示されない。高用量群（６．５×１０１０ｖｇ／ｇ脳）の３０日目に、検査したＣＮＳ組織はすべて、被殻を除いて形質導入陽性であった。低用量（６．５×１０９ｖｇ／ｇ脳）で処置した動物からの組織は、１８３日目にＣＮＳで陽性であったが、末梢組織からは脾臓および肝臓のみが陽性であった。さらに、高用量のＰＲ００６Ａで処置された一匹のメスＮＨＰは、７日目に卵巣で陽性であり、高用量で処置されたオスは、３０日目および１８３日目に精巣で陽性であった。ＰＲ００６Ａ遺伝子導入は、肝臓および神経系組織において最も頑健であり、検査した他の末梢器官においては一貫して低かった。脳では、３０日目と比較して１８３日目にベクター遺伝子導入が安定し、導入遺伝子の頑健で持続的な遺伝子導入が実証された。
ＰＲ００６ＡのＩＣＭ投与を受けるＮＨＰでは、処置後３０日目および１８３日目に採取された血清およびＣＳＦサンプルで検出された抗プログラニュリン抗体とともに、導入遺伝子産物であるプログラニュリンに対する有意な同種免疫応答があった。免疫応答は、ヒトプログラニュリンタンパク質がＮＨＰで発現したことを示す。抗薬物抗体（ＡＤＡ）レベルを、確立された免疫アッセイ技術を使用して決定した。データを図５４Ｂン示す。
ＰＲ００６Ａ（ＧＲＮ）の発現を、ＲＴ－ｑＰＣＲベースのアッセイを使用してｍＲＮＡレベルで、およびシンプルウェスタン（商標）（Ｊｅｓｓ）分析を使用してタンパク質レベルで測定した。ＰＲ００６Ａ形質導入のレベルと同時に、導入遺伝子の発現は、１８３日目に採取された、選択された脳領域（図５４Ｃ）、肝臓、性腺、脊髄、およびＤＲＧにおいてＲＴ－ｑＰＣＲを使用するｍＲＮＡ測定によって観察された。
導入遺伝子の発現は、ＰＲ００６Ａの両方の用量で脳および肝臓で測定可能であり、発現レベルは、用量依存性および持続性の両方であった。性腺では、高用量のオスでのみ発現が測定可能であった。メスの両用量で、発現は７日目および３０日目で測定可能であったが、１８３日目えは測定可能ではなかった。
ヒトプログラニュリンが処置されたＮＨＰで産生されたことを確認するために、Ｊシンプルウェスタン（商標）ＪｅｓｓプラットフォームでＣＳＦ中のタンパク質レベルを評価した。方法の詳細は、実施例１４に提供される。この方法は、ＦＴＤ－ＧＲＮ患者由来のＣＳＦサンプル中のプログラニュリンレベルを測定し、それらが健康なヒト対照およびＧＲＮ変異のないＦＴＤ患者由来のＣＳＦサンプル中のおよそ半分のレベルであることを確立することによって、適格となった。ＣＳＦからの結果は、ＰＲ００６Ａの低用量および高用量の両方で処置された動物において、用量依存的にプログラニュリンのレベルが上昇することを示す（図５４Ｄ）。これらの結果は、ＩＣＭ投与後のＮＨＰにおけるＰＲ００６Ａの効果的かつ広範な形質導入が、プログラニュリンレベルの増加につながることを示している。
シンプルウェスタン（商標）（Ｊｅｓｓ）アッセイは、高レベルの非特異的バックグラウンドバンドにより、脳組織内のプログラニュリンレベルを測定するには適していないため、プログラニュリンタンパク質測定はＣＳＦに焦点を当てた。現在利用可能なアッセイは、高レベルの非特異的バックグラウンドのため、ＮＨＰ組織における導入遺伝子由来ヒトプログラニュリンのレベルを確実には測定しない。ＣＳＦレベルは一般に、関連する脳濃度を反映すると考えられ、それらは臨床試験への翻訳バイオマーカーとして特に価値がある。
発明の概要
ＮＨＰにおける小規模な非ＧＬＰ試験、および１８３日目までのＮＨＰにおけるＧＬＰ試験を含む、非臨床試験のいずれにおいても、臨床試験の開始を妨げる有害な安全性所見または毒性の懸念は存在しない。ＧＬＰ試験の病理所見は重症度において一貫して最小であり、両方の用量群にわたって罹患細胞の数が少なかった。その他の、生存中または死後ＰＲ００６Ａ関連の有害な所見はなかった。
ＦＴＤ－ＧＲＮを有するヒト対象における第１／２相試験
ヒト対象（ｎ＝１５）は、ＰＲ００６組替えＡＡＶの非盲検試験に登録される。被験者包括基準は、３０～８０歳（含んだ）、病原性ＧＲＮ変異を有する、症候性疾患の段階にある、治験薬の投与前にバックグラウンド薬を安定的に使用している、を含む。各対象は、単回のＩＣＭ（大槽内）注射として治験薬を受ける。この試験には、３か月のバイオマーカーのリードアウト、１２か月の臨床リードアウト、５年間の安全性および臨床フォローアップを含む。試験は、（１）安全性および耐容性：（２）プログラニュリン、ＮｆＬ（神経フィラメント軽鎖）、および体積ＭＲＩ（磁気共鳴画像法）を含む主要なバイオマーカー、および（３）有効性：ＣＤＲ＋ＮＡＣＣ ＦＴＬＤ（臨床認知症評価＋国立アルツハイマー病調整センター前頭側頭葉認知症）、行動尺度、認知尺度、言語尺度、機能尺度、およびＱｏＬ（生活の質）を分析する。
実施例１４：脳脊髄液中のプログラニュリン検出のための自動ウェスタンアッセイ
この実験の目的は、プロテインシンプル（カリフォルニア州サンノゼ）の自動ウェスタンプラットフォームＪｅｓｓを使用して、脳脊髄液（ＣＳＦ）中のプログラニュリン（ＰＧＲＮ）のタンパク質レベルを定量化することであった。この試験方法は、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）ＣＳＦサンプルを分析するために使用されうる。ヒトプログラニュリンタンパク質の発現レベルを決定するため、非ヒト霊長類対象からのＣＳＦサンプルであるＰＲ００６Ａの導入遺伝子産物を、ヒトプログラニュリンタンパク質を特異的に検出する抗体を使用して、シンプルウェスタン（商標）（Ｊｅｓｓ）プラットフォーム上で分析した。シンプルウェスタン（商標）プラットフォームは、キャピラリーベースの自動ウェスタンブロットイムノアッセイプラットフォームであり、タンパク質分離、免疫プローブ、洗浄、および化学発光による検出を含むすべてのステップが、キャピラリーカートリッジ内で発生する。ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅによって製造された二次抗体およびすべての緩衝液に加えて、ヒトプログラニュリン（Ａｄｉｐｏｇｅｎ ＰＧ－３５９－７、１０倍希釈）に対するサンプル（４倍希釈）および一次抗体を、Ｊｅｓｓプラットフォーム上で実行されたカスタマイズされたカートリッジに装填した。半定量的データ解析は、各ランが完了した後に自動的に発生し、ここで、Ｊｅｓｓ機器を使用して、シグナル強度、ピーク面積、およびシグナル対ノイズ比などのパラメータが計算された。各個々のサンプルについて、プログラニュリンのレベルが、抗体に対する免疫応答性のピーク面積として測定された。すべての分析を、盲検化されたサンプルを用いて実施した。
本明細書に記述されたアッセイを、非ヒト霊長類動物試験からのＣＳＦサンプル上で実施した。プログラニュリン（ＰＧＲＮ）タンパク質をコードするｒＡＡＶ構築物（ＰＲ００６、図６４を参照）使用して、遺伝子療法の有効性を試験するために、ＣＳＦサンプルをプログラニュリンタンパク質の存在およびレベルについて試験した。本試験では、賦形剤またはＰＲ００６のいずれかを、低用量のＰＲ００６（１．８×１０１０ｖｇ／ｇ脳重量）または高用量のＰＲ００６（１．８×１０１１ｖｇ／ｇ脳重量）で、大槽内（ＩＣＭ）注射によりＮＨＰ動物に送達した。各群は３匹の動物から構成された。感染後１８０日目に九匹のＮＨＰ動物を犠牲にし（表１６）、Ｊｅｓｓベースのアッセイを使用してＣＳＦサンプルを分析した。
この方法を実施するにあたり、以下の手順に従った。
ストック溶液の調製
１．分離モジュールＥＺ標準パックの管を透明にするために、４０μＬの水を加えて、４００ｍＭのＤＴＴ溶液を調製する。穏やかに混合する。
２．マスターミックスを調製するには、２０マイクロリットルの１０Ｘサンプル緩衝液と２０マイクロリットルの４００ｍＭ ＤＴＴをＥＺピンク色のマスターミックスチューブに加える。穏やかに混合する。
３．ビオチン化ラダーを調製するには、ピペットで２０μＬの水をＥＺクリアビオチン化ラダーチューブにピンクペレットで分注する。穏やかに混合する。
４．それぞれ等量を加えることにより、ルミノールおよび過酸化物混合物を調製する。一回の実行については、２００μＬのルミノールに２００μＬの過酸化物を加える。
５．一次抗体の希釈（１０倍希釈）を、一次抗体の２５μＬと抗体希釈剤２の２２５μＬを混合して調製する。
サンプルの調製：
１．サンプルは、０．１ｘサンプル緩衝液中で希釈される。１０μＬの１０ｘサンプル緩衝液を９９０μＬの水に添加することによって、０．１ｘサンプル緩衝液を調製する。
２．必要に応じてサンプルを希釈する。例えば、ＮＨＰ ＣＳＦサンプルを、マスターミックスを加える前に４倍希釈した。１５μＬの０．１ｘサンプル緩衝液に５μＬのＮＨＰ ＣＳＦを加えた。
３．１Ｘのマスターミックスを４Ｘのサンプルに加えて、サンプルを調製する。技術上の重複を実施するには、サンプル当たり合計１５μＬのサンプルとマスターミックスを調製する。例えば、３μＬのマスターミックスを１２μＬの希釈サンプルに加える。穏やかに混合する。
４．サンプルを９５℃で５分間煮沸する。
５．デスクトップのミニ遠心分離を使用して、手短にサンプルをスピンダウンする。サンプルを装填する前にボルテックスする。
試薬とサンプルをカートリッジに装填する：
１．カートリッジマップに従って、すべてのサンプルをピペットで分注する。
ａ．レーンＥの各ウェルに１５μＬのルミノール＋過酸化物の混合物をピペットで分注する。
ｂ．レーンＤの最初のウェルに１０μＬのストレプトアビジンを分注する。
ｃ．レーンＤの残りの２４ウェルに１０μＬの二次抗体をピペットで分注する。
ｄ．レーンＣ内の最初のウェルに１０μＬの抗体希釈を分注する。
ｅ．レーンＣの残りの２４ウェルに１０μＬの二次抗体希釈をピペットで分注する。
ｆ．レーンＢの全てのウェルに１０μＬの抗体希釈を分注する。
ｇ．レーンＡの最初のウェルに１０μＬの調製されたＥＺラダーをピペット注入する。
ｈ．レーンＡの複製レーンにする５μＬのサンプルおよびマスターミックス溶液を分注する。
２．カートリッジを室温で２５００ＲＰＭで５分間スピンする。
キャピラリーとカートリッジを機器に装填する：
１．キャピラリーをスロットに装填する。ランプが青色に点灯することを確認する。
２．スピンしたカートリッジを機器に装填する。
３．機器の青色のランプが点滅を停止した後に、開始ボタンを押す。
アッセイシステムの適合性は、重複に対するＣＶ（分散係数）割合が３０％以下である場合に、許容可能であるとみなされた。
アッセイを使用してＮＨＰ ＣＳＦサンプル中のプログラニュリンを検出する前に、アッセイを以下のように試験した。Ｊｅｓｓアッセイの適格性には、希釈の線形性、選択性および特異性の評価が含まれた。ＢｉｏＩＶＴからの正常なＣＳＦサンプルを使用して、Ｊｅｓｓアッセイの希釈線形性を決定した。ＰＧＲＮ変異を有する前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）の患者からのＣＳＦサンプル（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｒａｌｉｚｅｄ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ ｆｏｒ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｄｅｍｅｎｔｉａｓ（ＮＣＲＡＤ；インディアナ州インディアナポリス）から取得）を使用して、Ｊｅｓｓアッセイの選択性および特異性を決定した。
結果と考察
希釈線形性
Ｊｅｓｓによって検出されたＰＧＲＮタンパク質の希釈線形性を、市販（ＢｉｏＩＶＴ）の一般的個体からのＣＳＦサンプルで試験した。ＣＳＦサンプル中のＰＧＲＮの内因性レベルを測定し、希釈線形性を決定した。二個体を、２～６４倍希釈の範囲の２倍連続希釈で試験した。
表１９は、Ｊｅｓｓによって検出された５８ｋＤａのＰＧＲＮタンパク質のピーク面積、および１６倍希釈からの各希釈の％差を報告した。線形範囲内の結果は、太字（１００±３０％の差以内）で示される。希釈線形性は、４～１６倍希釈以内であるように確立された。
要約すると、試験したすべてのマトリックスは、０±３０％である％の差異の許容基準に合格した許容可能な線形範囲を有したが、その範囲のサイズおよび希釈量はマトリクス間で変動した。サンプル線形性ＭＲＤは、４倍希釈となるように確立された。希釈線形性は、４～１６倍希釈以内であるように確立された。ＣＳＦの許容基準を通過するＭＲＤおよび線形希釈範囲の概要を表２０に示す。
選択性と特異性
Ｊｅｓｓによって検出されたＰＧＲＮタンパク質の選択性および特異性を、ＮＣＲＡＤからのＰＲ００６ ＦＴＤ患者サンプルからのＣＳＦサンプルで試験した。ＣＳＦサンプルの三群（グループＡ、Ｂ、およびＣ）を、ヘテロ接合性ＦＴＤ患者（グループＡ）、家族性非保因者（グループＢまたはＣ）、および正常な個人（グループＢまたはＣ）から収集した。各群について六つのサンプルを分析した。サンプル群を表１６ ＦＴＤ患者ＣＳＦサンプル情報に列挙する。
ＣＳＦサンプルを、ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅによって提供される０．１Ｘサンプル緩衝液中で４倍希釈し、技術的な重複で試験した。２０％超の結果％ＣＶを有するサンプルの重複を再分析した。２０％未満の％ＣＶを有する結果が表２２に報告された。表２２は、Ｊｅｓｓと重複間の％ＣＶによって検出された５８ｋＤａのＰＧＲＮタンパク質のピーク面積を報告した。結果は、グループＡと比較して、グループＢおよびＣにおいて約二倍高いＰＧＲＮレベルを示し、これは、ＣＳＦサンプルのＰＧＲＮレベルの決定においてＪｅｓｓアッセイの選択性および特異性を示す（図５５）。
ＦＴＤ患者試験（表２１）からのＣＳＦサンプルも、ヒトＰＧＲＮ ＥＬＩＳＡキット（Ａｄｉｐｏｇｅｎ、ＡＧ－４５Ａ－００１８ＹＥＫ－ＫＩ０１）を用いて分析した。ＥＬＩＳＡ（図５６）からの結果は、群間でＪｅｓｓとしてＰＧＲＮレベルの同様の傾向を示し、ＪｅｓｓアッセイがＣＳＦサンプルにおけるＰＧＲＮレベルの評価に適切であることを示した。
結論として、このＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ自動ウェスタンＪｅｓｓアッセイは、ＮＨＰ ＣＳＦサンプルにおけるＰＧＲＮレベルの評価に適切であると決定された。
ＮＨＰ ＣＳＦサンプルのＪｅｓｓデータを表２３に示す。各サンプルは、二つの技術的複製にわたる平均を表す。サンプルレーン内の５８ｋＤバンドのピーク面積が報告される。データは、技術的複製および調整された希釈倍率の平均ピーク面積として提示される。
このアッセイの目標は、ＮＨＰ試験の対象組織領域におけるＰＲ００６の形質導入後のプログラニュリン（ＰＧＲＮ）タンパク質発現レベルを確認することであった。これは、プログラニュリンタンパク質がモノクローナル抗体を使用して検出された、自動ウェスタンプラットフォームを使用して行われた。プログラニュリン発現は、対照およびＰＲ００６処置ＮＨＰの両方でＣＳＦ中で測定可能であった。アッセイは、内因性プログラニュリンタンパク質とＰＲ００６Ａ誘導プログラニュリンタンパク質とを区別しない。
実施例１５：ＦＴＤ－ＧＲＮを有する患者におけるＰＲ００６Ａおよび免疫抑制プロトコルのプログラニュリンレベルに対する安全性および効果を評価する１／２相試験
ＰＲ００６Ａは、ＡＡＶ９ウイルスベクターを利用して、野生型ＧＲＮをコードするＤＮＡ、すなわちＰＧＲＮをコードする遺伝子を患者の細胞に送達する、治験遺伝子療法である（図６４参照）。十五人の患者に、医師による大槽内への後頭下注射により、ＰＲ００６Ａの単回投与が投与される。三つの漸増用量コホートが計画されている（３．５×１０１３ｖｇ、約７．０×１０１３ｖｇまたは約１．４×１０１４ｖｇのＰＲ００６Ａ）。ｒＡＡＶ（ＰＲ００６Ａ）の単回投与は、各レジメンの０日目に対象に投与される。
登録された各患者は、医療従事者の評価（ｂｖＦＴＤ、ＰＰＡ－ＦＴＤ、皮質基底核症候群を伴うＦＴＤ、または症候群の組み合わせは登録可能）に従って症候性ＦＴＤを有する必要がある。登録された各患者は、ＣＤＲ＋ＮＡＣＣ ＦＴＬＤ ＳＢ（臨床認知症評価ステージング機器＋Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｎｇ Ｃｅｎｔｅｒの前頭側頭変性ドメイン）で≧１および≦１５をスコアしなければならない。登録された各患者は、病原性ＧＲＮ変異の保因者でなければならない。病原性変異には、ナンセンス、フレームシフト、スプライス部位変異、および完全または部分（エクソン）遺伝子欠失を含むすべてのヌル変異を含む。
・機能的悪影響が証明されている、以前に公表されたすべての病原性変異（選択されたミスセンス変異は、病原性であることが分かっている場合に含まれ得る）
・Ｍｏｌｇｅｎ ＦＴＤデータベースに記載されているすべての病原性変異
・中央検査機関での測定に基づく、血漿ＰＧＲＮレベルが低い（＜７０ｎｇ／ｍＬ）全ての新しい変異。
免疫抑制剤の投与
コルチコステロイドの投与：患者は、－１日目に、メチルプレドニゾロン（ＭＰＳ）１０００ｍｇ ＩＶパルスの負荷用量を受ける（試験場のセットアップに応じて、－１日目または０日目に許容される）。リツキシマブ（ＲＴＸ）投与前の－１４日目から－２日目の間のメチルプレドニゾロンの１００ｍｇ ＩＶ投与の可能性については、以下のセクションを参照のこと。３０ｍｇ／日の用量でのプレドニゾンは、１０００ｍｇのメチルプレドニゾロンのＩＶパルスの翌日（０日目または１日目）から１４日間、併用薬として経口投与され、その後７日間にわたって漸減される。より高い用量またはより長い漸減期間のコルチコステロイドは、医療従事者の裁量で使用されうる。
リツキシマブの投与：患者は、－１４日目と－１日目の間の任意の一日に、リツキシマブＩＶ１０００ｍｇを１回投与される。リツキシマブに関連する注入関連反応（ＩＲＲ）のリスクおよび重症度を軽減するために、患者は、リツキシマブのＩＶ注入を受ける前にメチルプレドニゾロンのＩＶ投与を受ける。－１日目のリツキシマブの用量投与については、患者は、上述の１０００ｍｇのＩＶメチルプレドニゾロンパルスの少なくとも３０分後にリツキシマブの注入を受ける。－１４日目～－２日目のリツキシマブの用量投与については、患者は、リツキシマブのＩＶ投与の約３０分前に１００ｍｇのメチルプレドニゾロンＩＶ注入を受ける。
現地の慣行および／または医療従事者の裁量により、ＩＲＲ予防のために、アセトアミノフェンおよび／またはジフェンヒドラミンを追加で提供してもよい。
シロリムスの投与：患者は、－１日目に６ｍｇのシロリムス経口負荷用量を投与される（－３日目～－１日目のウィンドウ）。２ｍｇ／日のその後のシロリムス経口維持用量は、０日目（またはシロリムス負荷用量の翌日、シロリムス負荷用量が－３日目または－２日目に投与される場合）に開始され、必要に応じて、６ｎｇ／ｍＬ（範囲４～９ｎｇ／ｍＬ）の血清トラフレベルを９０日間維持するように調整される併用薬として提供される。その後、シロリムスは、その後１５～３０日間にわたって漸減される。シロリムスのトラフレベルは、各訪問に対するシロリムスの投与前に収集される。より高い用量またはより長い漸減期間のシロリムスは、医療従事者の裁量で使用されうる。
免疫抑制モニタリング基準：シロリムストラフレベルの監視に加えて、各患者の臨床状態、臨床検査所見、および潜在的な有害事象が評価される。
また、免疫抑制剤の用量を増やす、漸減レジメンを延長する、追加の薬剤を追加する、または以下を含む免疫応答と一致する臨床徴候もしくは症状に基づいて治療を再開する必要性を考慮するべきである。
・白血球数（ＷＢＣ）＞３０ｍｍ３および／または高脳脊髄液（ＣＳＦ）タンパク質（＞７０ｍｇ／ｄＬ）を伴う無症候性プレオサイトーシス
・臨床症状を伴うＣＳＦプレオサイトーシスおよび／またはタンパク質の増加（根底にあるＦＴＤ症状の代償不全を含む）
・神経学的検査および／または治療誘発性神経障害評価尺度（ＴＮＡＳ）に基づく感覚症状の出現
・肝炎の症状（例えば、黄斑、疲労）と併せて、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）および／またはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）上昇＞５×正常上限（ＵＬＮ）
・臨床症状の有無に関わらず、ＡＬＴおよび／またはＡＳＴ上昇＞１０×ＵＬＮ
医療従事者は、最初の１４日間の漸減終了時に、ＡＬＴおよび／またはＡＳＴ＞３×ＵＬＮを呈する患者に、追加で４週間にわたるより長いプレドニゾンの漸減を実施することを考慮すべきである。プレドニゾン治療に難治性のＡＳＴ／ＡＬＴ上昇の場合、医療従事者は肝臓専門医に専門家の助言を求めるべきである。救済的免疫抑制を必要とするＣＳＦ炎症性変化の場合、免疫抑制剤の再開／増量／追加の免疫抑制剤の導入から１～２か月後に予定されていない腰部穿刺を実施するべきである。
脳槽内穿刺前の手順
患者は、麻酔専門医の診察を含む、脳槽穿刺のための標準治療医学的評価を受ける。医師および麻酔専門医は、スクリーニング臨床検査分析（記録された陰性妊娠検査を含む）、脳および頸椎（医師が要請する場合）のＭＲＩおよびＭＲＡ、ならびに局所ＥＣＧの結果をレビューする。既往歴、現在処方されている薬および市販の薬は、最近の変更に関してレビューされる。麻酔専門医の裁量により、追加の臨床評価を実施することができる（付随する病状に特有の）。
槽内注射
０日目に、ＰＲ００６Ａは、医師によって大槽内への後頭下注射を介して単回投与として投与される。注射の前に、ＰＲ００６Ａ投与体積と同等の体積の槽内流体が除去される。手続きは、全身麻酔下または深鎮静下で、撮像ガイダンスを使用して実施される。患者は、ＰＲ００６Ａ投与後２４時間（一晩の入院）観察下に留まる。
試験デザイン
これは５年間の治験である。一年目に、患者は、安全性、耐容性、免疫原性、バイオマーカー、および有効性に対するＰＲ００６Ａの効果について評価される。患者は、安全性、選択されたバイオマーカー、および有効性パラメータを引き続きモニタリングするため、さらに４年間追跡する。
有効性評価
主要目的は、大槽内への後頭部注射を介して投与されるＰＲ００６Ａの三用量レベルの安全性、耐容性、および免疫原性を評価し、血液およびＣＳＦ中のＰＧＲＮレベルを定量化することである。
副次的な目的は、ＰＲ００６Ａが以下に与える影響を評価することである。ＣＤＲ＋ＮＡＣＣ ＦＴＬＤおよびＮｆＬ（神経フィラメント軽鎖）、血液およびＣＳＦのレベル。
探索的な目的は、ＰＲ００６Ａの以下への効果を評価することである：認知、行動、言語、および日常生活の尺度、ウイルス脱落、ｖＭＲＩおよび白質病変の定量化に基づく撮像パターン、ならびにＣＳＦ、血液、および尿における神経炎症、アストログリアの病変、およびリソソーム機能（例えば、グリア細胞線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、ＹＫＬ－４０、ビス（モノアシルグリセロ）リン酸（ＢＭＰ））の選択されたバイオマーカー。
本出願は、参照により、以下の文書の全内容が組み込まれる。米国特許出願公開第２０２０／０３３２２６５号、国際ＰＣＴ出願公開ＷＯ２０１９／０７０８９３号、国際ＰＣＴ出願公開ＷＯ２０１９／０７０８９１号、米国仮出願シリアル番号６２／５６７，２９６、２０１７年１０月３日出願、標題「ＧＥＮＥ ＴＨＥＲＡＰＩＥＳ ＦＯＲ ＬＹＳＯＳＯＭＡＬ ＤＩＳＯＲＤＥＲＳ」、米国仮出願シリアル番号６２／５６７，３１１、２０１７年１０月３日出願、標題「ＧＥＮＥ ＴＨＥＲＡＰＩＥＳ ＦＯＲ ＬＹＳＯＳＯＭＡＬ ＤＩＳＯＲＤＥＲＳ」、６２／５６７，３１９、２０１７年１０月３日出願表題「ＧＥＮＥ ＴＨＥＲＡＰＩＥＳ ＦＯＲ ＬＹＳＯＳＯＭＡＬ ＤＩＳＯＲＤＥＲＳ」、６２／５６７，３０１、２０１８年１０月３日出願表題「ＧＥＮＥ ＴＨＥＲＡＰＩＥＳ ＦＯＲ ＬＹＳＯＳＯＭＡＬ ＤＩＳＯＲＤＥＲＳ」、６２／５６７，３１０、２０１７年１０月３日出願、表題「ＧＥＮＥ ＴＨＥＲＡＰＩＥＳ ＦＯＲ ＬＹＳＯＳＯＭＡＬ ＤＩＳＯＲＤＥＲＳ」、６２／５６７，３０３、２０１７年１０月３日出願、表題「ＧＥＮＥ ＴＨＥＲＡＰＩＥＳ ＦＯＲ ＬＹＳＯＳＯＭＡＬ ＤＩＳＯＲＤＥＲＳ」、および６２／５６７，３０５、２０１７年１０月３日出願、表題「ＧＥＮＥ ＴＨＥＲＡＰＩＥＳ ＦＯＲ ＬＹＳＯＳＯＭＡＬ ＤＩＳＯＲＤＥＲＳ」。
このように、本発明の少なくとも一つの実施形態のいくつかの態様を記述したが、様々な変更、修正、および改善が当業者に容易に生じることが理解されるべきである。かかる変更、修正、および改善は、本開示の一部となることが意図され、本発明の趣旨および範囲内であることが意図される。したがって、前述の説明および図面は、一例としてのみである。
本発明のいくつかの実施形態が本明細書で説明され例証されてきたが、当業者は、本明細書に記載する機能を実行し、ならびに／または結果および／もしくは利点のうちの一つまたは複数を得るための、様々な他の手段および／または構造を容易に想到するであろうし、こうした変形および／または修正は各々、本発明の実施形態の範囲内であるとみなされる。より一般に、本明細書に記載するすべてのパラメータ、寸法、材料、および構成が、例示的であることを意図していることと、実際のパラメータ、寸法、材料、および／または構成が、本発明の教示が使用される、特定の適用に依存するであろうことを、当業者は、容易に理解するだろう。当業者は、日常的な実験のみを用いて、本明細書に記載する本発明の特定の実施形態に対する、多数の同等なものを認識するまたは確認できるだろう。そのため、前述の実施形態は例としてのみ提示され、添付の特許請求の範囲およびその同等物の範囲内において、本発明は、具体的に記載し特許請求の範囲に記載する以外の、別の方法で実施されてもよいことは理解されるものとする。本発明は、本明細書に記載する各個別の特徴、システム、物品、材料、および／または方法を対象とする。加えて、こうした特徴、システム、物品、材料、および／または方法が互いに矛盾したものでない場合、二つ以上のこうした特徴、システム、物品、材料、および／または方法の任意の組み合わせが、本発明の範囲内に含まれる。
本明細書において使用する、明細書中および特許請求の範囲中の「一つの（ａおよびａｎ）」という不定冠詞は、明確にそれと反対であると示されない限り、「少なくとも一つの」を意味するものと理解すべきである。
本明細書において、および特許請求の範囲において使用される「および／または」という言葉は、接続された要素の「いずれかまたは両方」を意味する（すなわち、要素が場合によっては接続的に存在し、他の場合では離接的に存在する）と理解されるべきである。「および／または」の節によって具体的に特定された要素以外の他の要素は、それらの具体的に特定された要素に関連しているかどうかにかかわらず、明確にそうではないと示された場合を除いて、随意に存在してもよい。それ故に、非限定的な例として、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの制約のない語とともに使用する場合の「Ａおよび／またはＢ」への言及は、一実施形態においてＢを有さないＡ（随意にＢ以外の要素を含む）を指し、別の実施形態においてＡを有さないＢ（随意にＡ以外の要素を含む）を指し、また別の実施形態においてＡとＢの両方（随意に他の要素を含む）を指すなどの可能性がある。
明細書中および特許請求の範囲中の本明細書に使用するように、「または」は、上で定義した「および／または」と同じ意味を有するように理解すべきである。例えば、リスト中の分離的項目「または」または「および／または」は、包括的であると解釈すべきであり、すなわち、いくつかの要素または要素のリストのうちの少なくとも一つだが、また二つ以上も、そして任意選択でリストされていないさらなる項目も含むよう解釈すべきである。それとは反対であると明確に示す用語のみ、例えば、「～のうちの一つのみ」もしくは「～のうちのちょうど一つ」、または特許請求の範囲で使用される「～から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」が、いくつかの要素または要素のリストのうちのちょうど一つの要素の含むことを指す。概して、本明細書で使用する「または」という用語は、「いずれか」、「～のうちの一つ」、「～のうちの一つのみ」、または「～のうちのちょうど一つ」など、排他的な用語が先行する場合、排他的な代替物（すなわち、「一つまたは他方だが両方ではない」）を示すとのみ解釈すべきである。
明細書中および特許請求の範囲中の本明細書に使用するように、一つまたは複数の要素のリストに関する「少なくとも一つ」という表現は、要素のリストの中の要素のうちの任意の一つまたは複数から選択される、少なくとも一つの要素を意味するものと理解すべきであるが、必ずしも、要素のリスト内に具体的に挙げられたあらゆる要素のうちの少なくとも一つを含むとは限らず、また要素のリストの中の要素の任意の組合せを排除しない。また、当該定義は、「少なくとも一つ」という表現が指す要素のリスト内で、具体的に特定された要素以外の他の要素が、具体的に特定された要素に関連するしないにかかわらず、任意選択で存在し得ることも可能にする。従って、非限定的な例として、「ＡおよびＢのうちの少なくとも一つ」（または同等のものとして「ＡまたはＢのうちの少なくとも一つ」、もしくは同等のものとして「Ａおよび／またはＢのうちの少なくとも一つ」）は、ある実施形態では、少なくとも一つの（任意選択で二つ以上を含む）Ａ、ただしＢは存在しない（任意選択でＢ以外の要素を含む）ことを指し、別の実施形態では、少なくとも一つの（任意選択で二つ以上を含む）Ｂ、ただしＡは存在しない（任意選択でＡ以外の要素を含む）ことを指し、また別の実施形態では、少なくとも一つの（任意選択で二つ以上を含む）Ａ、および少なくとも一つの（任意選択で二つ以上を含む）Ｂ（任意選択で他の要素を含む）を指す、などの可能性がある。
請求項の要素を修正するための請求項における、第一、第二、第三などの順序を示す用語の使用は、それ自体は、ある請求項の要素の他の請求項にたいするいかなる優先順位、順位、または順序または方法の行為が実施される時間的順序を意味するものではなく、特定の名称を有する一つの請求項の要素を、同じ名称を有する別の要素（順序を示す用語の使用を除いて）と区別するための標識としてのみ使用される。
それとは反対であると明確に示されない限り、本明細書に請求される、二つ以上のステップまたは作用を含む任意の方法において、方法のステップまたは作用の順序は、必ずしも、方法のステップまたは作用が列挙される順序に限定されないことも理解されるべきである。
本明細書において言及される各米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許公表文献はすべて、参照により、その全文が本明細書に組み込まれる。
配列
一部の実施形態では、一つまたは複数の遺伝子産物（例えば、第一、第二、および／または第三の遺伝子産物）をコードする発現カセットは、配列番号１～９１のいずれか一つに記載される配列を含む、またはからなる。一部の実施形態では、一つまたは複数の遺伝子産物をコードする発現カセットは、配列番号１～９１のいずれか一つに記載される配列を相補的（相補する）配列を含む、またはからなる。一部の実施形態では、一つまたは複数の遺伝子産物をコードする発現カセットは、配列番号１～９１のいずれか一つに記載される配列を逆相補的（逆相補する）配列を含む、またはからなる。一部の実施形態では、遺伝子産物は、配列番号１～９１のいずれか一つの一部（例えば、断片）によりコードされる。一部の実施形態では、核酸配列は、核酸センス鎖（例えば、５’から３’鎖）であるか、またはウイルス配列の文脈において、プラス鎖（＋）である。一部の実施形態では、核酸配列は、核酸アンチセンス鎖（例えば、３’～５’鎖）であるか、またはウイルス配列の文脈において、マイナス（－）鎖である。
番号付けされた実施形態
添付の特許請求の範囲にかかわらず、本開示は、以下の番号付けされた実施形態を規定する。
１．ＧＲＮ変異を有する前頭側頭型認知症を有するまたは有すると疑われる対象を治療する方法であって、対象に、
（ｉ）プログラニュリン（ＰＧＲＮ）タンパク質をコードする導入遺伝子挿入物に動作可能に連結されたプロモーターを含む発現構築物を含む核酸を含むｒＡＡＶベクターであって、導入遺伝子挿入物が、配列番号６８のヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶベクターと、
（ｉｉ）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）９キャプシドタンパク質と、を含む組替えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）と、以下のうちの一つまたは複数、
（Ａ）シロリムス、
（Ｂ）メチルプレドニゾロン、
（Ｃ）リツキシマブ、および
（Ｄ）プレドニゾン、と、を投与することを含む、方法。
２．ＧＲＮ変異を有する前頭側頭型認知症を有するまたは有すると疑われる対象において免疫応答を抑制する方法であって、対象に、
（ｉ）プログラニュリン（ＰＧＲＮ）タンパク質をコードする導入遺伝子挿入物に動作可能に連結されたプロモーターを含む発現構築物を含む核酸を含むｒＡＡＶベクターであって、導入遺伝子挿入物が、配列番号６８のヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶベクターと、
（ｉｉ）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）９キャプシドタンパク質と、を含む組替えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）と、以下のうちの一つまたは複数、
（Ａ）シロリムス、
（Ｂ）メチルプレドニゾロン、
（Ｃ）リツキシマブ、および
（Ｄ）プレドニゾン、と、を投与することを含む、方法。
３．ｒＡＡＶが、約１×１０１３ベクターゲノム（ｖｇ）～約７×１０１４ｖｇの範囲の用量で対象に投与される、実施形態１または２に記載の方法。
４．ｒＡＡＶが、約３．５×１０１３ｖｇ、約７．０×１０１３ｖｇまたは約１．４×１０１４ｖｇの用量で対象に投与される、実施形態１または２に記載の方法。
５．ｒＡＡＶが、大槽内への注射を介して投与される、実施形態１～４のいずれか一項に記載の方法。
６．プロモーターが、ニワトリベータアクチン（ＣＢＡ）プロモーターである、実施形態１～５のいずれか一項に記載の方法。
７．ｒＡＡＶベクターが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーをさらに含む、実施形態１～６のいずれか一項に記載の方法。
８．ｒＡＡＶベクターが、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素（ＷＰＲＥ）をさらに含む、実施形態１～７のいずれか一項に記載の方法。
９．ｒＡＡＶベクターが、ウシ成長ホルモンポリＡシグナルテールをさらに含む、実施形態１～８のいずれか一項に記載の方法。
１０．核酸が、前記発現構築物に隣接する二つのアデノ随伴ウイルス逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を含む、実施形態１～９のいずれか一項に記載の方法。
１１．各ＩＴＲ配列が、ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列である、実施形態１０に記載の方法。
１２．ｒＡＡＶベクターが、５’ＩＴＲと発現構築物との間にＴＲＹ領域をさらに含み、ＴＲＹ領域が配列番号２８を含む、実施形態１０または１１に記載の方法。
１３．ＧＲＮ変異を有する前頭側頭型認知症を有するまたは有すると疑われる対象を治療する方法であって、対象に、
（ｉ）５’から３’の順序で、
（ａ）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）２ＩＴＲと、
（ｂ）サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーと、
（ｃ）ニワトリベータアクチン（ＣＢＡ）プロモーターと、
（ｄ）プログラニュリン（ＰＧＲＮ）タンパク質をコードする導入遺伝子挿入物であって、配列番号６８のヌクレオチド配列を含む、導入遺伝子挿入物と、
（ｅ）ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素（ＷＰＲＥ）と、
（ｆ）ウシ成長ホルモンポリＡシグナルテールと、
（ｇ）ＡＡＶ２逆位末端反復（ＩＴＲ）と、を含む核酸を含むｒＡＡＶベクターと、
（ｉｉ）ＡＡＶ９キャプシドタンパク質と、を含む組替えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）と、以下のうちの一つまたは複数：
（Ａ）シロリムス、
（Ｂ）メチルプレドニゾロン、
（Ｃ）リツキシマブ、および
（Ｄ）プレドニゾン、と、を投与することを含む、方法。
１４．ＧＲＮ変異を有する前頭側頭型認知症を有するまたは有すると疑われる対象において免疫応答を抑制する方法であって、対象に、
（ｉ）５’から３’の順序で、
（ａ）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）２ＩＴＲと、
（ｂ）サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーと、
（ｃ）ニワトリベータアクチン（ＣＢＡ）プロモーターと、
（ｄ）プログラニュリン（ＰＧＲＮ）タンパク質をコードする導入遺伝子挿入物であって、配列番号６８のヌクレオチド配列を含む、導入遺伝子挿入物と、
（ｅ）ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素（ＷＰＲＥ）と、
（ｆ）ウシ成長ホルモンポリＡシグナルテールと、
（ｇ）ＡＡＶ２逆位末端反復（ＩＴＲ）と、を含む核酸を含むｒＡＡＶベクターと、
（ｉｉ）ＡＡＶ９キャプシドタンパク質と、を含む組替えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）と、以下のうちの一つまたは複数：
（Ａ）シロリムス、
（Ｂ）メチルプレドニゾロン、
（Ｃ）リツキシマブ、および
（Ｄ）プレドニゾン、と、を投与することを含む、方法。
１５．ｒＡＡＶが、約１×１０１３ｖｇ～約７×１０１４ｖｇの範囲の用量で前記対象に投与される、実施形態１３または１４に記載の方法。
１６．ｒＡＡＶが、約３．５×１０１３ｖｇ、約７．０×１０１３ｖｇまたは約１．４×１０１４ｖｇの用量で対象に投与される、実施形態１３または１４に記載の方法。
１７．ｒＡＡＶが、大槽内への注射を介して投与される、実施形態１３～１６のいずれか一項に記載の方法。
１８．ｒＡＡＶが、約２０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、約１ｍＭのＭｇＣｌ２、約２００ｍＭのＮａＣｌ、および約０．００１％ ｗ／ｖポロクサマー１８８を含有する製剤で投与される、実施形態１～１７のいずれか一項に記載の方法。
１９．一部の実施形態では、メチルプレドニゾロンが、ｒＡＡＶの投与の前日または同日のいずれかに約１０００ｍｇの用量で静脈内投与される、実施形態１～１８のいずれか一項に記載の方法。
２０．プレドニゾンが、
（Ａ）約１０００ｍｇの前記メチルプレドニゾロンの投与の翌日から始まる１４日間、約３０ｍｇ／日の用量で、および
（Ｂ）（Ａ）の１４日間の期間の終了後の７日間の間に漸減されて、経口投与される、実施形態１～１９のいずれか一項に記載の方法。
２１．リツキシマブが、ｒＡＡＶの投与の１４日前から１日前の任意の一日に、約１０００ｍｇの用量で静脈内投与される、実施形態１～２０のいずれか一項に記載の方法。
２２．メチルプレドニゾロンが、リツキシマブが投与される前に投与される、実施形態２１に記載の方法。
２３．メチルプレドニゾロンが、リツキシマブが投与される少なくとも約３０分前に投与される、実施形態２２に記載の方法。
２４．メチルプレドニゾロンおよびリツキシマブの両方が、ｒＡＡＶの投与の前日に投与され、メチルプレドニゾロンは、リツキシマブが投与される少なくとも約３０分前に投与される、実施形態２１に記載の方法。
２５．リツキシマブが、ｒＡＡＶの投与の１４日前から２日前の間の任意の一日に投与され、メチルプレドニゾロンは、リツキシマブが投与されるのと同じ日にリツキシマブが投与される少なくとも３０分前に約１００ｍｇの用量で、静脈内投与される、実施形態２１に記載の方法。
２６．シロリムスが、
（Ａ）ｒＡＡＶの投与の三日前、二日前、または一日前に、約６ｍｇの単回投与として、および
（Ｂ）ｒＡＡＶの投与後の約９０日間、約４ｎｇ／ｍＬ～約９ｎｇ／ｍＬの血清トラフレベルを維持するように約２ｍｇ／日の用量で、経口投与され、
シロリムスの約２ｍｇ／日の前記第一の用量は、シロリムスの約６ｍｇの前記単回投与の翌日に投与される、実施形態１～２５のいずれか一項に記載の方法。
２７．シロリムスの投与が、ｒＡＡＶの投与後の９０日の期間の終了後１５日～３０日の間に漸減される、実施形態２６に記載の方法。
２８．
（ｉ）約１０００ｍｇの用量でメチルプレドニゾロンを静脈内投与することと、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）のメチルプレドニゾロン投与の約３０分後に、約１０００ｍｇの用量でリツキシマブを静脈内投与することと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉ）のメチルプレドニゾロン投与の翌日に、注射を介して大槽内にｒＡＡＶを投与することと、
（ｉｖ）ステップ（ｉ）のメチルプレドニゾロン投与の翌日から１４日間、約３０ｍｇ／日の用量でプレドニゾンを経口投与することと、
（ｖ）ステップ（ｉｖ）の１４日間の期間の終了後の７日間、プレドニゾンを漸減投与することと、
（ｖｉ）ステップ（ｉｉｉ）のｒＡＡＶ投与の三日前、二日前、または一日前に、シロリムスを約６ｍｇの単回投与として経口投与することと、
（ｖｉｉ）ステップ（ｉｉｉ）のｒＡＡＶ投与後の約９０日間、約４ｎｇ／ｍｌ～約９ｎｇ／ｍＬの血清トラフレベルを維持するようにシロリムスを約２ｍｇ／日の用量で経口投与することであって、シロリムスの約２ｍｇ／日の第一の用量は、シロリムスの約６ｍｇの単回投与の翌日に投与することと、
（ｖｉｉｉ）ステップ（ｖｉｉ）の９０日間の期間の終了後の１５日～３０日の間にシロリムスを漸減投与することと、を含む、実施形態１～２７のいずれか一項に記載の方法。
２９．
（ｉ）ステップ（ｉｖ）のｒＡＡＶ投与の１４日前～２日前の間の任意の一日に、約１００ｍｇの用量でメチルプレドニゾロンを静脈内投与することと、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）のメチルプレドニゾロン投与の約３０分後に、約１０００ｍｇの用量でリツキシマブを静脈内投与することと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｖ）のｒＡＡＶ投与の一日前または同日のいずれかに、約１０００ｍｇの用量でメチルプレドニゾロンを静脈内投与することと、
（ｉｖ）注射を介してｒＡＡＶを大槽内に投与することと、
（ｖ）ステップ（ｉｉｉ）の前記メチルプレドニゾロン投与の翌日から１４日間、約３０ｍｇ／日の用量で前記プレドニゾンを経口投与することと、
（ｖｉ）ステップ（ｖ）の前記１４日間の期間の終了後の７日間、前記プレドニゾンを漸減投与することと、
（ｖｉｉ）ステップ（ｉｖ）のｒＡＡＶ投与の三日前、二日前、または一日前に、シロリムスを約６ｍｇの単回投与として経口投与することと、
（ｖｉｉｉ）ステップ（ｉｖ）のｒＡＡＶ投与後の約９０日間、約４ｎｇ／ｍｌ～約９ｎｇ／ｍＬの血清トラフレベルを維持するようにシロリムスを約２ｍｇ／日の用量で経口投与することであって、シロリムスの約２ｍｇ／日の第一の用量は、約６ｍｇのシロリムスの単回投与の翌日に投与することと、
（ｉｘ）ステップ（ｖｉｉｉ）の９０日間の期間の終了後の１５日～３０日の間にシロリムスを漸減投与することと、を含む、実施形態１～２７のいずれか一項に記載の方法。
３０．免疫応答が、ｒＡＡＶに対する免疫応答である、実施形態２または１４に記載の方法。
３１．免疫応答が、Ｔセル反応である、実施形態２、１４および３０のいずれか一項に記載の方法。
３２．免疫応答が、Ｂセル反応である、実施形態２、１４および３０のいずれか一項に記載の方法。
３３．免疫応答が、抗体反応である、実施形態２、１４および３０のいずれか一項に記載の方法。
３４．免疫応答が、プレオサイトーシスである、実施形態２、１４および３０のいずれか一項に記載の方法。
３５．プレオサイトーシスが、脳脊髄液（ＣＳＦ）プレオサイトーシスである、実施形態３４に記載の方法。
３６．免疫応答が、ＣＳＦタンパク質の異常なレベルである、実施形態２、１４および３０のいずれか一項に記載の方法。
３７．シロリムス、メチルプレドニゾロン、リツキシマブ、またはプレドニゾンではない追加の免疫抑制剤がさらに対象に投与される、実施形態１～３６のいずれか一項に記載の方法。
３８．対象においてＧＲＮ変異を有する前頭側頭型認知症を治療する方法に使用する、
（ｉ）プログラニュリン（ＰＧＲＮ）タンパク質をコードする導入遺伝子挿入物に動作可能に連結されたプロモーターを含む発現構築物を含む核酸を含むｒＡＡＶベクターであって、導入遺伝子挿入物が、配列番号６８のヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶベクターと、
（ｉｉ）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）９キャプシドタンパク質と、を含む組替えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）と、以下のうちの一つまたは複数、
（Ａ）シロリムス、
（Ｂ）メチルプレドニゾロン、
（Ｃ）リツキシマブ、および
（Ｄ）プレドニゾン、と、
の、併用療法剤。
３９．ＧＲＮ変異を有する前頭側頭型認知症を有するまたは有すると疑われる対象において免疫応答を抑制する方法に使用する、
（ｉ）プログラニュリン（ＰＧＲＮ）タンパク質をコードする導入遺伝子挿入物に動作可能に連結されたプロモーターを含む発現構築物を含む核酸を含むｒＡＡＶベクターであって、導入遺伝子挿入物が、配列番号６８のヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶベクターと、
（ｉｉ）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）９キャプシドタンパク質と、を含む組替えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）と、以下のうちの一つまたは複数、
（Ａ）シロリムス、
（Ｂ）メチルプレドニゾロン、
（Ｃ）リツキシマブ、および
（Ｄ）プレドニゾン、と、
の併用療法剤。
４０．組み合わせが、約１×１０１３ｖｇ～約７×１０１４ｖｇのｒＡＡＶを含む、実施形態３９に記載の使用のための併用療法剤。
４１．組み合わせが、約３．５×１０１３ｖｇ、約７．０×１０１３ｖｇまたは約１．４×１０１４ｖｇのｒＡＡＶを含む、実施形態３９に記載の使用のための併用療法剤。

Claims (41)

  1. ＧＲＮ変異を有する前頭側頭型認知症を有するまたは有すると疑われる対象を治療する方法であって、前記対象に、
    （ｉ）プログラニュリン（ＰＧＲＮ）タンパク質をコードする導入遺伝子挿入物に動作可能に連結されたプロモーターを含む発現構築物を含む核酸を含むｒＡＡＶベクターであって、前記導入遺伝子挿入物が、配列番号６８のヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶベクターと、
    （ｉｉ）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）９キャプシドタンパク質と、を含む組替えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）と、以下のうちの一つまたは複数、
    （Ａ）シロリムス、
    （Ｂ）メチルプレドニゾロン、
    （Ｃ）リツキシマブ、および
    （Ｄ）プレドニゾン、と、を投与することを含む、方法。
  2. ＧＲＮ変異を有する前頭側頭型認知症を有するまたは有すると疑われる対象において免疫応答を抑制する方法であって、前記対象に、
    （ｉ）プログラニュリン（ＰＧＲＮ）タンパク質をコードする導入遺伝子挿入物に動作可能に連結されたプロモーターを含む発現構築物を含む核酸を含むｒＡＡＶベクターであって、前記導入遺伝子挿入物が、配列番号６８のヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶベクターと、
    （ｉｉ）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）９キャプシドタンパク質と、を含む組替えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）と、以下のうちの一つまたは複数、
    （Ａ）シロリムス、
    （Ｂ）メチルプレドニゾロン、
    （Ｃ）リツキシマブ、および
    （Ｄ）プレドニゾン、と、を投与することを含む、方法。
  3. 前記ｒＡＡＶが、約１×１０１３ベクターゲノム（ｖｇ）～約７×１０１４ｖｇの範囲の用量で前記対象に投与される、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記ｒＡＡＶが、約３．５×１０１３ｖｇ、約７．０×１０１３ｖｇまたは約１．４×１０１４ｖｇの用量で前記対象に投与される、請求項１または２に記載の方法。
  5. 前記ｒＡＡＶが、大槽内への注射を介して投与される、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記プロモーターが、ニワトリベータアクチン（ＣＢＡ）プロモーターである、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記ｒＡＡＶベクターが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーをさらに含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記ｒＡＡＶベクターが、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素（ＷＰＲＥ）をさらに含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記ｒＡＡＶベクターが、ウシ成長ホルモンポリＡシグナルテールをさらに含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記核酸が、前記発現構築物に隣接する二つのアデノ随伴ウイルス逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 各ＩＴＲ配列が、ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列である、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記ｒＡＡＶベクターが、５’ＩＴＲと前記発現構築物との間にＴＲＹ領域をさらに含み、前記ＴＲＹ領域が配列番号２８を含む、請求項１０または１１に記載の方法。
  13. ＧＲＮ変異を有する前頭側頭型認知症を有するまたは有すると疑われる対象を治療する方法であって、前記対象に、
    （ｉ）５’から３’の順序で、
    （ａ）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）２ＩＴＲと、
    （ｂ）サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーと、
    （ｃ）ニワトリベータアクチン（ＣＢＡ）プロモーターと、
    （ｄ）プログラニュリン（ＰＧＲＮ）タンパク質をコードする導入遺伝子挿入物であって、配列番号６８のヌクレオチド配列を含む、導入遺伝子挿入物と、
    （ｅ）ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素（ＷＰＲＥ）と、
    （ｆ）ウシ成長ホルモンポリＡシグナルテールと、
    （ｇ）ＡＡＶ２逆位末端反復（ＩＴＲ）と、を含む核酸を含むｒＡＡＶベクターと、
    （ｉｉ）ＡＡＶ９キャプシドタンパク質と、を含む組替えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）と、以下のうちの一つまたは複数：
    （Ａ）シロリムス、
    （Ｂ）メチルプレドニゾロン、
    （Ｃ）リツキシマブ、および
    （Ｄ）プレドニゾン、と、を投与することを含む、方法。
  14. ＧＲＮ変異を有する前頭側頭型認知症を有するまたは有すると疑われる対象において免疫応答を抑制する方法であって、前記対象に、
    （ｉ）５’から３’の順序で、
    （ａ）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）２ＩＴＲと、
    （ｂ）サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーと、
    （ｃ）ニワトリベータアクチン（ＣＢＡ）プロモーターと、
    （ｄ）プログラニュリン（ＰＧＲＮ）タンパク質をコードする導入遺伝子挿入物であって、配列番号６８のヌクレオチド配列を含む、導入遺伝子挿入物と、
    （ｅ）ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素（ＷＰＲＥ）と、
    （ｆ）ウシ成長ホルモンポリＡシグナルテールと、
    （ｇ）ＡＡＶ２逆位末端反復（ＩＴＲ）と、を含む核酸を含むｒＡＡＶベクターと、
    （ｉｉ）ＡＡＶ９キャプシドタンパク質と、を含む組替えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）と、以下のうちの一つまたは複数：
    （Ａ）シロリムス、
    （Ｂ）メチルプレドニゾロン、
    （Ｃ）リツキシマブ、および
    （Ｄ）プレドニゾン、と、を投与することを含む、方法。
  15. 前記ｒＡＡＶが、約１×１０１３ｖｇ～約７×１０１４ｖｇの範囲の用量で前記対象に投与される、請求項１３または１４に記載の方法。
  16. 前記ｒＡＡＶが、約３．５×１０１３ｖｇ、約７．０×１０１３ｖｇまたは約１．４×１０１４ｖｇの用量で前記対象に投与される、請求項１３または１４に記載の方法。
  17. 前記ｒＡＡＶが、大槽内への注射を介して投与される、請求項１３～１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記ｒＡＡＶが、約２０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、約１ｍＭのＭｇＣｌ２、約２００ｍＭのＮａＣｌ、および約０．００１％ｗ／ｖのポロクサマー１８８を含む製剤で投与される、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記メチルプレドニゾロンが、前記ｒＡＡＶの投与の一日前または同日のいずれかに、約１０００ｍｇの用量で静脈内投与される、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記プレドニゾンが、
    （Ａ）約１０００ｍｇの前記メチルプレドニゾロンの投与の翌日から始まる１４日間、約３０ｍｇ／日の用量で、および
    （Ｂ）（Ａ）の前記１４日間の期間の終了後の７日間の間に漸減されて、経口投与される、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記リツキシマブが、前記ｒＡＡＶの投与の１４日前から１日前の間の任意の一日に、約１０００ｍｇの用量で静脈内投与される、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記メチルプレドニゾロンが、前記リツキシマブが投与される前に投与される、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記メチルプレドニゾロンが、前記リツキシマブが投与される少なくとも約３０分前に投与される、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記メチルプレドニゾロンおよび前記リツキシマブの両方が、前記ｒＡＡＶの投与の前日に投与され、前記メチルプレドニゾロンは、前記リツキシマブが投与される少なくとも約３０分前に投与される、請求項２１に記載の方法。
  25. 前記リツキシマブが、前記ｒＡＡＶの投与の１４日前から２日前の間の任意の一日に投与され、前記メチルプレドニゾロンは、前記リツキシマブが投与されるのと同じ日に前記リツキシマブが投与される少なくとも３０分前に約１００ｍｇの用量で、静脈内投与される、請求項２１に記載の方法。
  26. 前記シロリムスが、
    （Ａ）前記ｒＡＡＶの投与の三日前、二日前、または一日前に、約６ｍｇの単回投与として、および
    （Ｂ）前記ｒＡＡＶの投与後の約９０日間、約４ｎｇ／ｍＬ～約９ｎｇ／ｍＬの血清トラフレベルを維持するように約２ｍｇ／日の用量で、経口投与され、
    前記シロリムスの約２ｍｇ／日の第一の用量は、前記シロリムスの約６ｍｇの前記単回投与の翌日に投与される、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記シロリムスの投与が、前記ｒＡＡＶの投与後の前記約９０日間の期間の終了後１５日～３０日の間に漸減される、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記方法が、
    （ｉ）約１０００ｍｇの用量で前記メチルプレドニゾロンを静脈内投与することと、
    （ｉｉ）ステップ（ｉ）の前記メチルプレドニゾロン投与の約３０分後に、約１０００ｍｇの用量で前記リツキシマブを静脈内投与することと、
    （ｉｉｉ）ステップ（ｉ）の前記メチルプレドニゾロン投与の翌日に、注射を介して大槽内に前記ｒＡＡＶを投与することと、
    （ｉｖ）ステップ（ｉ）の前記メチルプレドニゾロン投与の翌日から１４日間、約３０ｍｇ／日の用量で前記プレドニゾンを経口投与することと、
    （ｖ）ステップ（ｉｖ）の前記１４日間の期間の終了後の７日間、前記プレドニゾンを漸減投与することと、
    （ｖｉ）ステップ（ｉｉｉ）の前記ｒＡＡＶ投与の三日前、二日前、または一日前に、前記シロリムスを約６ｍｇの単回投与として経口投与することと、
    （ｖｉｉ）ステップ（ｉｉｉ）の前記ｒＡＡＶ投与の後の約９０日間、約４ｎｇ／ｍｌ～約９ｎｇ／ｍＬの血清トラフレベルを維持するように前記シロリムスを約２ｍｇ／日の用量で経口投与することであって、
    前記シロリムスの約２ｍｇ／日の前記第一の用量は、前記シロリムスの約６ｍｇの前記単回投与の翌日に投与される、経口投与することと、
    （ｖｉｉｉ）ステップ（ｖｉｉ）の前記９０日間の期間の終了後の１５日～３０日の間に前記シロリムスを漸減投与することと、を含む、請求項１～２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 前記方法が、
    （ｉ）ステップ（ｉｖ）の前記ｒＡＡＶ投与の１４日前～２日前の間の任意の一日に、約１００ｍｇの用量で前記メチルプレドニゾロンを静脈内投与することと、
    （ｉｉ）ステップ（ｉ）の前記メチルプレドニゾロン投与の約３０分後に、約１０００ｍｇの用量で前記リツキシマブを静脈内投与することと、
    （ｉｉｉ）ステップ（ｉｖ）の前記ｒＡＡＶ投与の一日前または同日のいずれかに、約１０００ｍｇの用量で前記メチルプレドニゾロンを静脈内投与することと、
    （ｉｖ）注射を介して前記ｒＡＡＶを大槽内に投与することと、
    （ｖ）ステップ（ｉｉｉ）の前記メチルプレドニゾロン投与の翌日から１４日間、約３０ｍｇ／日の用量で前記プレドニゾンを経口投与することと、
    （ｖｉ）ステップ（ｖ）の前記１４日間の期間の終了後の７日間、前記プレドニゾンを漸減投与することと、
    （ｖｉｉ）ステップ（ｉｖ）の前記ｒＡＡＶ投与の三日前、二日前、または一日前に、前記シロリムスを約６ｍｇの単回投与として経口投与することと、
    （ｖｉｉｉ）ステップ（ｉｖ）の前記ｒＡＡＶ投与の後の約９０日間、約４ｎｇ／ｍｌ～約９ｎｇ／ｍＬの血清トラフレベルを維持するように前記シロリムスを約２ｍｇ／日の用量で経口投与することであって、
    前記シロリムスの約２ｍｇ／日の前記第一の用量は、前記シロリムスの約６ｍｇの前記単回投与の翌日に投与される、経口投与することと、
    （ｉｘ）ステップ（ｖｉｉｉ）の前記９０日間の期間の終了後の１５日～３０日の間に前記シロリムスを漸減投与することと、を含む、請求項１～２７のいずれか一項に記載の方法。
  30. 前記免疫応答が、前記ｒＡＡＶに対する免疫応答である、請求項２または１４に記載の方法。
  31. 前記免疫応答が、Ｔセル反応である、請求項２、１４、および３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 前記免疫応答が、Ｂセル反応である、請求項２、１４、および３０のいずれか一項に記載の方法。
  33. 前記免疫応答が、抗体反応である、請求項２、１４、および３０のいずれか一項に記載の方法。
  34. 前記免疫応答が、プレオサイトーシスである、請求項２、１４、および３０のいずれか一項に記載の方法。
  35. 前記プレオサイトーシスが、脳脊髄液（ＣＳＦ）プレオサイトーシスである、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記免疫応答が、ＣＳＦタンパク質の異常なレベルである、請求項２、１４、および３０のいずれか一項に記載の方法。
  37. シロリムス、メチルプレドニゾロン、リツキシマブ、またはプレドニゾンではない追加の免疫抑制剤が、前記対象にさらに投与される、請求項１～３６のいずれか一項に記載の方法。
  38. 対象においてＧＲＮ変異を有する前頭側頭型認知症を治療する方法に使用する、
    （ｉ）プログラニュリン（ＰＧＲＮ）タンパク質をコードする導入遺伝子挿入物に動作可能に連結されたプロモーターを含む発現構築物を含む核酸を含むｒＡＡＶベクターであって、前記導入遺伝子挿入物が、配列番号６８のヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶベクターと、
    （ｉｉ）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）９キャプシドタンパク質と、を含む組替えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）と、以下のうちの一つまたは複数、
    （Ａ）シロリムス、
    （Ｂ）メチルプレドニゾロン、
    （Ｃ）リツキシマブ、および
    （Ｄ）プレドニゾン、との、併用療法剤。
  39. ＧＲＮ変異を有する前頭側頭型認知症を有するまたは有すると疑われる対象において免疫応答を抑制する方法に使用する、
    （ｉ）プログラニュリン（ＰＧＲＮ）タンパク質をコードする導入遺伝子挿入物に動作可能に連結されたプロモーターを含む発現構築物を含む核酸を含むｒＡＡＶベクターであって、前記導入遺伝子挿入物が、配列番号６８のヌクレオチド配列を含むｒＡＡＶベクターと、
    （ｉｉ）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）９キャプシドタンパク質と、を含む組替えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）と、以下のうちの一つまたは複数、
    （Ａ）シロリムス、
    （Ｂ）メチルプレドニゾロン、
    （Ｃ）リツキシマブ、および
    （Ｄ）プレドニゾン、と、の併用療法剤。
  40. 前記組み合せが、約１×１０１３ｖｇ～約７×１０１４ｖｇの前記ｒＡＡＶを含む、請求項３９に記載の使用のための併用療法剤。
  41. 前記組み合わせが、約３．５×１０１３ｖｇ、約７．０×１０１３ｖｇまたは約１．４×１０１４ｖｇの前記ｒＡＡＶを含む、請求項３９に記載の使用のための併用療法剤。
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