JP2023530600A - 細胞外ベシクルの製造するための方法及びその使用 - Google Patents

細胞外ベシクルの製造するための方法及びその使用 Download PDF

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Abstract

本開示は、細胞外ベシクル（ＥＶ）を製造するための改善された方法及び組成物に関する。本開示はまた、新規のＥＶベースのＥＬＩＳＡアッセイ及びそのようなアッセイを実施するためのキット、並びに、膜結合抗原を含むＥＶを使用して特定の抗原に対する抗体を産生する方法にも関する。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、その全内容がここに参照することによって本願に援用される、２０２０年６月１日出願の米国仮特許出願第６３／０３３，０１４号に対する優先権の利益を主張する。
序文
本開示は、細胞外ベシクル（ＥＶ）を製造するための改善された方法及び組成物に関する。本開示はまた、新規のＥＶベースのＥＬＩＳＡアッセイ及びそのようなアッセイを実施するためのキット、並びに、対象の膜結合抗原を含むＥＶを使用して特定の抗原に対する抗体を産生する方法にも関する。
細胞外ベシクル（ＥＶ）は、脂質二重層に囲まれた細胞由来の膜構造の不均一な群である。ＥＶには、エキソソーム、微小胞、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、及びアポトーシス体（＞１μｍ）が含まれる（Thery et al., “Membrane vesicles as conveyors of immune responses,” Nat Rev Immunol. 2009;9(8):581-93; Andaloussi et al., “Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities,” Nat Rev Drug Discov. 2013;12(5):347-357）。ＥＶは、ＥＶ表面において膜タンパク質を天然立体配座で、高濃度で提示することができる。例えば、膜タンパク質は、細胞膜よりも１０倍から１００倍高い濃度でＥＶの表面に存在しうる。
堅牢なＥＶ生成プラットフォームの特性には、単一パス膜タンパク質と複数パス膜タンパク質の両方を再現可能に組み込む能力；十分なＥＶ収量の生成（例えば、ｍｇレベル）；妥当な規模（例えば、約１Ｌ）で容易にトランスフェクトされること；及び、種に一致したバックグラウンドを生成する能力のうちの１つ以上が含まれる。ＥＶを産生する従来の方法は、これらの要件のすべてを満たすことはできない。
本開示は、細胞外ベシクル（ＥＶ）を作製するための改善された方法及び組成物に関する。本開示はまた、新規のＥＶベースのＥＬＩＳＡアッセイ及びそのようなアッセイを実施するためのキット、並びに、対象の膜結合抗原を含むＥＶを使用して特定の抗原に対する抗体を産生する方法にも関する。
一態様では、本開示は、タンパク質に特異的に結合する抗体を産生するための方法を提供する。ある特定の実施態様では、該方法は、（ａ）（ｉ）ベシクル因子に曝露された細胞内で異種タンパク質を発現させること、（ｉｉ）細胞を培地で培養すること、及び（ｉｉｉ）異種タンパク質を含む複数のＥＶを培地から単離することによって、異種タンパク質を含む複数のＥＶを産生することであって、ベシクル因子がＡｃｙｌ．Ｈｒｓ、ＡＲＲＤＣ１、ＡＲＦ６、及びそれらの組合せからなる群より選択される、単離すること；（ｂ）動物に複数のＥＶを投与することによって動物を免疫化すること；及び、（ｃ）異種タンパク質に結合する抗体を動物から単離することを含む。
代替的及び／又は追加的に、タンパク質に特異的に結合する抗体を産生するための方法は、（ａ）（ｉ）細胞内で異種タンパク質を発現させること、（ｉｉ）細胞を培地で培養すること、及び（ｉｉｉ）タンパク質を含む複数のＥＶを培地から単離することによって、異種タンパク質を含む複数のＥＶを産生することであって、細胞が非接着細胞である、産生すること；（ｂ）動物に複数のＥＶを投与することによって動物を免疫化すること；及び、（ｃ）異種タンパク質に結合する抗体を動物から単離することを含みうる。ある特定の実施態様では、該方法は、細胞内でベシクル因子、例えば異種ベシクル因子、例えば、ＭＬＧａｇ、Ａｃｙｌ．Ｈｒｓ、ＡＲＲＤＣ１、ＡＲＦ６、又はそれらの組合せを発現させることをさらに含みうる。
ある特定の実施態様では、複数のＥＶは、超遠心分離によって培地から単離される。ある特定の実施態様では、複数のＥＶは、第０週、第２週、及び第４週に動物に投与される。ある特定の実施態様では、抗体を産生するための方法は、ＥＶと同時に例えばＲｉｂｉアジュバントなどのアジュバントを動物に投与することをさらに含む。ある特定の実施態様では、抗体を産生するための方法は、動物にブーストを投与してタンパク質に対する動物の免疫応答を高めることをさらに含む。ある特定の実施態様では、ブーストは、タンパク質、該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、又はそれらの組合せを含む。
本開示はさらに、本開示の方法によって産生される抗体を提供する。ある特定の実施態様では、抗体はモノクローナル抗体である。ある特定の実施態様では、抗体は、ヒト、ヒト化、又はキメラ抗体である。本開示はさらに、抗体又はその抗原結合部分と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物を提供する。ある特定の実施態様では、薬学的組成物は、追加の治療剤をさらに含む。ある特定の実施態様では、本開示の方法によって産生される抗体、又はその薬学的組成物は、医薬として使用することができ、疾患の治療に使用することができ、及び／又は医薬の製造に使用することができる。ある特定の実施態様では、本開示は、疾患を有する個体を治療する方法であって、本明細書に開示される単離された抗体若しくはその抗原結合部分、又はその薬学的組成物の有効量を個体に投与することを含む、方法を提供する。本開示はさらに、本明細書に開示される抗体又はその抗原結合部分をコードする単離された核酸、及び該核酸を含む宿主細胞を提供する。本開示はまた、抗体の発現に適した条件下で宿主細胞を培養すること、及び任意選択的に、該宿主細胞から抗体を単離することによって、抗体を産生する方法を提供する。
さらなる態様では、本開示は、複数のＥＶを産生するための方法を提供する。ある特定の実施態様では、該方法は、（ａ）細胞内で異種タンパク質を発現させること；（ｂ）細胞を培地で培養すること；及び、（ｃ）異種タンパク質を含む複数のＥＶを培地から単離することを含み、ここで、細胞は、Ａｃｙｌ．Ｈｒｓ、ＡＲＲＤＣ１、ＡＲＦ６、及びそれらの組合せからなる群より選択されるベシクル因子に曝露される、及び／又は細胞は非接着細胞である。
ある特定の実施態様では、異種タンパク質は、膜タンパク質、例えば、単一パス膜タンパク質又は複数パス膜タンパク質である。ある特定の実施態様では、膜タンパク質は、タンパク質複合体の成員である。ある特定の実施態様では、膜タンパク質は、膜貫通タンパク質ではなく、膜貫通タンパク質との複合体の成員である。ある特定の実施態様では、非接着細胞は、２９３Ｓ細胞又はＥｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞である。
別の態様では、本開示は、抗体を検出するための方法を提供する。例えば、限定するものではないが、該方法は、（ａ）試料を捕捉試薬と共にインキュベートすることであって、捕捉試薬が膜結合抗原を含む複数のＥＶを含み、抗体が膜結合抗原に特異的に結合する、インキュベートすること；及び、（ｂ）捕捉試薬に結合する抗体を検出可能な抗体と接触させて、結合された抗体を検出することであって、検出可能な抗体が、該抗体に特異的に結合する、検出することを含みうる。ある特定の実施態様では、複数のＥＶは、（ｉ）細胞内での膜結合抗原の発現、（ｉｉ）培地中、インビトロで細胞を培養して、膜結合抗原を提示する複数のＥＶを産生すること、及び（ｉｉｉ）膜結合抗原を提示する複数のＥＶを培地から単離することによって生成される。ある特定の実施態様では、細胞は、Ａｃｙｌ．Ｈｒｓ、ＡＲＲＤＣ１、ＡＲＦ６、及びそれらの組合せからなる群より選択されるベシクル因子に曝露される、及び／又は細胞は非接着細胞である。ある特定の実施態様では、方法は、（ｃ）（ｂ）で検出された抗体の量を測定することをさらに含むことができ、その量は、標準曲線を使用して定量化される。ある特定の実施態様では、試料は、血漿、血清、又は尿試料である。ある特定の実施態様では、捕捉抗体は、固体支持体、例えば、マイクロタイタープレート上に固定化されうる。ある特定の実施態様では、検出可能な抗体が蛍光標識される。ある特定の実施態様では、膜結合抗原は、膜タンパク質又はその断片である。
本開示は、試料中の抗体を検出するキットを提供する。ある特定の実施態様では、本開示のキットは、（ａ）膜結合抗原を含む複数のＥＶを含む捕捉試薬であって、検出される抗体が膜結合抗原に特異的に結合する、捕捉試薬と、（ｂ）検出される抗体に特異的に結合する検出可能な抗体とを含む。ある特定の実施態様では、複数のＥＶは、固体支持体上に固定化される。ある特定の実施態様では、固体支持体はマイクロタイタープレートである。ある特定の実施態様では、検出可能な抗体は蛍光標識される。ある特定の実施態様では、抗原は、膜タンパク質又はその断片である。
ある特定の実施態様では、本開示はさらに、抗体産生細胞を選別するための方法を提供する。ある特定の実施態様では、方法は、抗体産生細胞を複数のＥＶとともにインキュベートすることを含み、ここで、複数のＥＶは、（ｉ）膜結合抗原と第１の検出可能なマーカーとを含むＥＶの第１の集団であって、抗体産生細胞のサブセットが膜結合抗原に特異的に結合する、ＥＶの第１の集団；及び、（ｂ）膜結合抗原を欠いているが、第１のマーカーと区別可能な第２の検出可能なマーカーを含む、ＥＶの第２の集団を含む。ある特定の実施態様では、方法は、ＥＶの第１の集団に対する結合、又はＥＶの第１の集団とＥＶの第２の集団との組合せに対する結合に基づいて、抗体産生細胞を選別することをさらに含む。ある特定の実施態様では、ＥＶの第１の集団は、（ｉ）第１の細胞内での膜結合抗原及び第１の検出可能なマーカーの発現、（ｉｉ）培地中、インビトロで第１の細胞を培養して、膜結合抗原を提示する複数のＥＶを産生すること、及び（ｉｉｉ）膜結合抗原を提示する複数のＥＶを培地から単離することによって生成される。ある特定の実施態様では、ＥＶの第２の集団は、（ｉ）第２の細胞内での第２の検出可能なマーカーの発現、（ｉｉ）培地中、インビトロで第２の細胞を培養して、第２の検出可能なマーカーを含む複数のＥＶを産生すること、及び（ｉｉｉ）複数のＥＶを培地から単離することによって生成される。ある特定の実施態様では、細胞は、Ａｃｙｌ．Ｈｒｓ、ＡＲＲＤＣ１、ＡＲＦ６、及びそれらの組合せからなる群より選択されるベシクル因子に曝露される。ある特定の実施態様では、第１の細胞及び／又は第２の細胞は非接着細胞である。
細胞外ベシクル（ＥＶ）の形成を示す概略図。 ＥＶ形成のための設計原理。図２Ａは、一般的なＥＶ形成物質及びＡｃｙｌ．Ｈｒｓを所有するＥＶ設計を示している。 ＥＶ形成のための設計原理。図２Ｂは、ＭＬＧａｇ及びＡＲＲＤＣ１を所有するＥＶ設計を示している。 ＥＶ産生のワークフローを示す略図。 ウェスタンブロットを用いたＭＰ－Ｘを発現するＥＶを生成することができるベシクル因子の同定を示す図。 均一なベシクルサイズを示す動的光散乱（ＤＬＳ）を示す図。 ウェスタンブロットは、ベシクル因子であるＭＬＧａｇ、Ａｃｒｙｌ．Ｈｒｓ、及びマウスＡＲＲＤＣ１（ｍＡＲＲＤＣ１）が、マウス細胞においてＭＰ－Ｘ発現ＥＶ形成を誘導したことを示した。 ＥＶ産生の課題：図７Ａは、効率的なＥＶ精製を得るための課題を示している。 ＥＶ産生の課題：図７Ｂは、十分な収量を得るための課題を示している。 ＥＶの平均収量は、ベシクル因子としてＭＬＧａｇを有する、標的タンパク質を発現するＥＶを産生させるために使用したＥｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞及び２９３Ｓ細胞の収集日に測定した。 ＥＶの平均収量は、ベシクル因子としてＭＬＧａｇを有する、標的タンパク質を発現するＥＶを産生させるために使用したＥｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞及び２９３Ｓ細胞の収集日に測定した。 細胞生存率は、ベシクル因子としてＭＬＧａｇを有する、標的タンパク質を発現するＥＶを産生させるために使用したＥｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞及び２９３Ｓ細胞の収集日に測定した。 ＥＬＩＳＡを実施して、ＥＶを産生するＥｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞とＥＶを産生する２９３Ｓ細胞とのＭＰ－７の発現レベルを比較した。 ＥＬＩＳＡを実施して、ＥＶを産生するＥｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞とＥＶを産生する２９３Ｓ細胞とのＭＰ－８の発現レベルを比較した。 ＥＬＩＳＡを実施して、ＥＶを産生するＥｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞とＥＶを産生する２９３Ｓ細胞とのＭＰ－４の発現レベルを比較した。 明確に定義されたＥＶ粒子が生成された。 ＥＶベースのＥＬＩＳＡは、単一パス膜タンパク質に対するＦＡＣＳ＋抗体を検出することができる。 ＥＶベースのＥＬＩＳＡは、複数パス膜タンパク質に対するＦＡＣＳ＋抗体を検出することができる。 Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）ＥＶ免疫化ラット及びマウスのスクリーニング用に細胞株を同定した。略図は、動物の免疫プロトコールを示している。 Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）ＥＶ免疫化ラット及びマウスのスクリーニング用に細胞株を同定した。抗血清及び事前採血液の細胞への結合が、ＦＡＣＳによって示された。ラットのＥＶ免疫化からのｐＡｂは、２９３細胞には結合したが、ＲＢＡ細胞には結合しなかった。マウスのＥＶ免疫化からのｐＡｂは、ＲＢＡ細胞には結合したが、３Ｔ３細胞には結合しなかった。 Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）ＥＶ免疫化ラット及びマウスのスクリーニング用に細胞株を同定した。ｅＧＦＰを使用したＦＡＣＳは、両方のＲＢＡがトランスフェクト可能であることを示した。 Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）ＥＶ免疫化ラット及びマウスのスクリーニング用に細胞株を同定した。ｅＧＦＰを使用したＦＡＣＳは、３Ｔ３がトランスフェクト可能であることを示した。 Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）ＥＶ免疫化ウサギ及びラマ／ラクダのスクリーニング用に細胞株を同定した。略図は、動物の免疫プロトコールを示している。 Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）ＥＶ免疫化ウサギ及びラマ／ラクダのスクリーニング用に細胞株を同定した。抗血清及び事前採血液の細胞への結合がＦＡＣＳによって示された。ウサギのＥＶ免疫化からのｐＡｂは、ＲＫ１３細胞に結合しなかった。ラマのＥＶ免疫化からのｐＡｂは、３Ｔ３細胞には結合したが、Ｄｕｂｃａ細胞には結合しなかった。 Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）ＥＶ免疫化ウサギ及びラマ／ラクダのスクリーニング用に細胞株を同定した。ＦＡＣＳは、ＲＫ１３細胞（左）とＤｕｂｃａ細胞（右）の両方がトランスフェクト可能であることを示した。 ラットＲＢＡ細胞はＥＶを産生することができるが、２９３Ｓ細胞に比べて収率が低かった。 ウェスタンブロットにより、全細胞溶解物及びＥＶにおけるＭＰ－１の存在が確認された。 ウェスタンブロットにより、ＥＶ及び全細胞溶解物中にＭＰ－２が存在したことが確認された。 ウェスタンブロットにより、ＡＲＦ－６でトランスフェクトされた細胞から産生されたＥＶを有するＡＲＦ－６にはＭＰ－３が存在したが、ＭＬＧａｇには存在しなかったことが確認された。 Ｇａｇカプシドが、大きい細胞内ドメイン（ＩＣＤ）でのＭＰの取り込みを立体的にブロックすることを示す略図。 タンパク質ＥＬＩＳＡ、ＥＶベースのＥＬＩＳＡ、及びＦＡＣＳの作用機序を示す略図。 ＥＶベースのＥＬＩＳＡ力価（図１９Ａ）は、ＭＰ－４のＦＡＣＳ力価（図１９Ｂ）とよく相関した。 ＥＶベースのＥＬＩＳＡ力価（図１９Ａ）は、ＭＰ－４のＦＡＣＳ力価（図１９Ｂ）とよく相関した。 ＥＶベースのＥＬＩＳＡ（図１９Ｃ）力価は、タンパク質ＥＬＩＳＡ（図１９Ｄ）力価とよく相関しなかった。 ＥＶベースのＥＬＩＳＡ（図１９Ｃ）力価は、タンパク質ＥＬＩＳＡ（図１９Ｄ）力価とよく相関しなかった。 抗ＭＰ－５血清は、ＤＮＡ免疫化を使用してＭＰ－５で免疫化したマウスから採取した。図２０Ａには、ＥＶベースのＥＬＩＳＡの力価が示されている。 抗ＭＰ－５血清は、ＤＮＡ免疫化を使用してＭＰ－５で免疫化したマウスから採取した。図２０Ｂには、ＦＡＣＳの力価が示されている。 ＥＶベースのＥＬＩＳＡは、抗ＭＰ５抗体を検出するためのＦＡＣＳとよく相関していた。 ＭＰ－６ ＥＶの初期バッチの品質管理（ＱＣ）分析。ウェスタンブロットは、単離されたＥＶ内にＭＰ－６が存在することを示した。 ＭＰ－６ ＥＶの初期バッチの品質管理（ＱＣ）分析。ウェスタンブロットは、単離されたＥＶ内にベシクル因子が存在することを示した。 ＭＰ－６ ＥＶの初期バッチの品質管理（ＱＣ）分析。組換えタンパク質標準を使用した定量的ウェスタンブロットを使用して、単離されたＥＶ中のＭＰ－６を定量化した。 ＭＰ－６ ＥＶを使用した免疫化プロトコール。 ウェスタンブロットは、ＥＶで免疫化したラットから採取した抗血清中の抗ＭＰ－６及び抗Ｇａｇ抗体の存在を示した。 ＦＡＣＳは、トランスフェクション対照細胞への抗血清の有意な非特異的結合が存在しないことを示した。 ＦＡＣＳは、ＤＮＡ／タンパク質ブーストの前に採取した抗血清中のＭＰ－６発現細胞への結合を示した。 ＦＡＣＳは、ＤＮＡ／タンパク質ブースト後に採取した抗血清中のＭＰ－６発現細胞への結合を示した。 精製された一次抗体（図２５Ａ）と血清（図２５Ｂ）は同様のＦＡＣＳ結果を示した。 精製された一次抗体（図２５Ａ）と血清（図２５Ｂ）は同様のＦＡＣＳ結果を示した。 ＤＮＡブーストは、ＥＶ免疫化ラットの抗ＭＰ－６力価を選択的に増加させた。 マウス抗ＭＰ－７一次抗体は、ＭＰ－７を発現するＥＶで免疫化したノックアウトマウスから生成し、ＦＡＣＳによってスクリーニングした。前回のブースト前に採取した血清中に抗ＭＰ－７抗体が検出された。 マウス抗ＭＰ－７一次抗体は、ＭＰ－７を発現するＥＶで免疫化したノックアウトマウスから生成し、ＦＡＣＳによってスクリーニングした。前回のブースト後に採取した血清中に抗ＭＰ－７抗体が検出された。 マウス抗ＭＰ－７一次抗体は、ＭＰ－７を発現するＥＶで免疫化したノックアウトマウスから生成し、ＦＡＣＳによってスクリーニングした。血清は３Ｔ３対照細胞には結合しなかった。 マウス抗ＭＰ－７ハイブリドーマをＦＡＣＳでスクリーニングした。 マウス抗ＭＰ－７ハイブリドーマをＦＡＣＳでスクリーニングした。 初代細胞でのＦＡＣＳを使用したマウス抗ＭＰ－７ ｍＡｂのスクリーニング。 図３０－１と同じ。 図３０－１と同じ。 ラットを、膜に結合したＭＰ－１又はＭＰ－１ ＤＮＡを含むＥＶと、タンパク質又はＤＮＡブーストで免疫化した。ブースト前にラットから採取した抗血清をＦＡＣＳでスクリーニングした。 ラットを、膜に結合したＭＰ－１又はＭＰ－１ ＤＮＡを含むＥＶと、タンパク質又はＤＮＡブーストで免疫した。ブースト後にラットから採取した抗血清をＦＡＣＳでスクリーニングした。 ラット抗ＭＰ－１ハイブリドーマをＦＡＣＳでスクリーニングした。 ラットは、タンパク質、ＤＮＡ、又は膜結合ＭＰ－８を含むＥＶのみで免疫化した。各群から発見されたＥＬＩＳＡ陽性及びＦＡＣＳ陽性の抗体の数が示されている。 ラット及びウサギを、ＭＰ－９及びＭＰ－９ ＤＮＡを含むＥＶで免疫化した。ＧＦＰで標識化されたＭＰ－９ ＥＶ及びＲＦＰで標識化された空のＥＶによるラット及びウサギＩｇＧ＋Ｂ細胞の染色が示されている。 ラット及びウサギを、ＭＰ－１０又はＭＰ－１１を含むＥＶで免疫化した。ＲＦＰで標識化されたＭＰ ＥＶ及びＧＦＰで標識化された空のＥＶによるウサギＩｇＧ＋Ｂ細胞の染色が示されている。 表面発現には、ＭＰ－１４、ＭＰ－１５、ＭＰ－１６、及びＭＰ－１７（共受容体「Ｂ」）と、ＭＰ－１２及びＭＰ－１３（受容体「Ａ」）との共発現が必要である。 ＭＰ－１４、ＭＰ－１５、ＭＰ－１６、及びＭＰ－１７（共受容体「Ｂ」）と、ＭＰ－１２及びＭＰ－１３（受容体「Ａ」）との共発現により、ＥＶの取り込みが生じる。
本開示は、細胞外ベシクル（ＥＶ）を製造するための改善された方法及び組成物に関する。本開示はまた、新規のＥＶベースのＥＬＩＳＡアッセイ及びそのようなアッセイを実施するためのキット、並びに、対象の膜結合抗原、例えば、膜タンパク質を含むＥＶを使用して、特定の抗原に対する抗体を産生する方法に関する。本開示は、一部には、ある特定の精製ステップ、ベシクル因子、及び／又はＥＶ産生細胞株を採用することによって、ＥＶの迅速かつ高収量の生成を達成することが可能であるという発見に基づいている。また一部には、抗原提示ＥＶで動物を免疫化することにより、課題となる膜タンパク質抗原及び複合体に対する機能性抗体の開発が可能になるという発見にも基づいている。本開示の非限定的な実施態様が本明細書に開示される。
限定ではなく開示を明確にする目的で、この詳細な説明は次の小区分に分けられる：
Ｉ． 定義；
ＩＩ． ＥＶを作製する方法；
ＩＩＩ． ＥＶベースのＥＬＩＳＡアッセイ及びキット；
ＩＶ． ＥＶを使用して抗体を産生する方法；
Ｖ． 診断及び検出のための方法及び組成物；
ＶＩ． 薬学的組成物；
ＶＩＩ． 治療方法及び投与経路；
ＶＩＩＩ． 製造品；及び
ＩＸ． 例示的な実施態様。
Ｉ． 定義
本開示で用いられる用語は、概して、本開示の文脈内及び各用語が用いられる特定の文脈内で、当技術分野における通常の意味を有する。本開示の組成物及び方法並びにそれらを製造及び使用する方法を説明する際に、施術者に追加のガイダンスを提供するために、以下又は本明細書の他の箇所において、ある特定の用語が論じられる。
本明細書で用いられる場合には、特許請求の範囲及び／又は明細書で「含む」という用語と併せて用いられる単語「ａ」又は「ａｎ」の使用は、「１つ」を意味する場合もあるが、「１つ以上」、「少なくとも１つ」、及び「１つ又はそれより多く」と言う意味とも一致する。さらには、「有する」、「含む」、「含有する」、及び「包含する」という用語は交換可能であり、当業者はこれらの用語がオープンエンドの用語であることを認識している。
「約」又は「およそ」という用語は、当業者によって決定される特定の値の許容誤差範囲内であることを意味し、これは、一部には、値を測定又は決定する方法、すなわち、測定システムの制限に依存するものである。例えば、「約」は、当技術分野の慣行に従って、３以内又は３を超える標準偏差を意味しうる。あるいは、「約」は、所与の値の２０％まで、好ましくは１０％まで、さらに好ましくは５％まで、さらになお好ましくは１％までの範囲を意味しうる。あるいは、特に生物学的システム又はプロセスに関して、この用語は、値の１桁違い以内、好ましくは５倍以内、さらに好ましくは２倍以内を意味しうる。
本明細書における「個体」又は「対象」とは、ヒト又は非ヒト動物、例えば哺乳動物などの脊椎動物である。哺乳動物には、ヒト、非ヒト霊長類、家畜、競技用動物、げっ歯類、及びペットが含まれるが、これらに限定されない。非ヒト動物対象の非限定的な例には、マウス、ラット、ハムスター、及びモルモットなどのげっ歯類；ウサギ；イヌ；ネコ；ヒツジ；ブタ；ヤギ；ウシ；ウマ；並びに類人猿及びサルなどの非ヒト霊長類が含まれる。ある特定の実施態様では、個体又は対象はヒトである。
本明細書で用いられる場合、「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」という用語は、人工環境、及び人工環境内で起こるプロセス又は反応を指す。Ｉｎ ｖｉｔｒｏ環境は、試験管及び細胞培養を例示したが、これらに限定されない。
本明細書で用いられる場合、「ｉｎ ｖｉｖｏ」という用語は、自然環境（例えば、動物又は細胞）、及び胚発生、細胞分化、神経管形成などの自然環境内で起こるプロセス又は反応を指す。
本明細書で用いられる場合、「生物学的試料」という用語は、対象から得られた生体物質の試料を指し、体液、例えば、血液、血漿、血清、尿、痰、脊髄液、胸膜液、乳頭吸引液、リンパ液、呼吸器、腸、及び尿生殖器の液体、涙液、唾液、母乳、リンパ系からの液体、精液、脳脊髄液、臓器系内液、腹水、腫瘍嚢胞液、羊水、気管支肺胞液、胆液、及びそれらの組合せを含む。
「抗体」という用語は、本明細書では最も広い意味で用いられ、限定はしないが、それらが所望の抗原結合活性を呈する限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体断片を含めた、さまざまな抗体構造を包含する。
本明細書で用いられる場合、「抗体断片」という用語は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’ Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；直鎖状抗体；単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で用いられる場合、「キメラ抗体」という用語は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の供給源又は種に由来する一方で、重鎖及び／又は軽鎖の残りが異なる供給源又は種に由来する抗体を指す。
本明細書で用いられる「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指す。すなわち、集団を構成する個々の抗体は、例えば、天然に存在する突然変異を含む可能性のある変異体抗体、又はモノクローナル抗体調製物の産生中に生じる可能性のある変異体抗体を除き（このような変異体は概して微量で存在する）、同一であるか、及び／又は同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。したがって、修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集団から得られるという抗体の特徴を示しており、特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本開示によるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法を含むがこれらに限定されないさまざまな技術によって作製することができ、このような方法及びモノクローナル抗体を作製するための他の例示的な方法は、本明細書に記載されている。
「ネイキッド抗体」とは、異種部分（例えば、細胞毒性部分）又は放射性標識にコンジュゲートされていない抗体を指す。ネイキッド抗体は、薬学的組成物中に存在することができる。
抗体の「クラス」とは、その重鎖が有する定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。抗体には、５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭが存在し、これらの幾つかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２に分けることができる。ある特定の実施態様では、抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプのものである。ある特定の実施態様では、抗体は、Ｆｃ領域のエフェクター機能を低下させるためのＰ３２９Ｇ、Ｌ２３４Ａ、及びＬ２３５Ａ突然変異を有する、ＩｇＧ１アイソタイプのものである。他の実施態様では、抗体は、ＩｇＧ２アイソタイプのものである。ある特定の実施態様では、抗体は、ＩｇＧ４抗体の安定性を向上させるためにヒンジ領域にＳ２２８Ｐ突然変異を有する、ＩｇＧ４アイソタイプのものである。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つのタイプのいずれかに割り当てることができる。
本明細書で用いられる場合、「フレームワーク」又は「ＦＲ」という用語は、超可変領域（ＣＤＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、通常、次の４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４で構成される。したがって、ＣＤＲ及びＦＲ配列は、概して、ＶＨ（又はＶＬ）において次の配列に現れる：ＦＲ１－Ｈ１（Ｌ１）－ＦＲ２－Ｈ２（Ｌ２）－ＦＲ３－Ｈ３（Ｌ３）－ＦＲ４。
本明細書で用いられる場合、「完全長抗体」、「インタクトな抗体」、及び「全抗体」という用語は、本明細書では交換可能に用いられ、天然の抗体構造に実質的に類似した構造を有する抗体、又は本明細書で定義されるＦｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指す。
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から分離されている抗体である。ある特定の実施態様では、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動法（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）、又はクロマトグラフィー（例えば、イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）によって決定して、９５％又は９９％を超える純度まで精製される。抗体純度の評価するための方法のレビューについては、例えば、Flatman et al., J. Chromatogr.B 848:79-87 (2007)を参照されたい。
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選択において最も一般的に存在するアミノ酸残基を表すフレームワークである。概して、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループに由来するものである。概して、配列のサブグループは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3にあるようなサブグループである。ある特定の実施態様では、ＶＬについて、サブグループは、上記Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．にあるようなサブグループκＩである。ある特定の実施態様では、ＶＨについて、サブグループは、上記Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．にあるようなサブグループＩＩＩである。
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基とヒトＦＲ由来のアミノ酸残基とを含む、キメラ抗体を指す。ある特定の実施態様では、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、ここで、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）のすべて又は実質的にすべてが非ヒト抗体のものに対応し、ＦＲのすべて又は実質的にすべてがヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意選択的に、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含むことができる。抗体の「ヒト化形態」、例えば非ヒト抗体は、ヒト化を受けた抗体を指す。
本明細書で用いられる「超可変領域」という用語は、配列が超可変である（「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」）、及び／又は構造的に定義されたループを形成する（「超可変ループ」）、及び／又は抗原接触残基を含む（「抗原接触」）、抗体可変ドメインの領域の各々を指す。別途指示がない限り、ＣＤＲ残基及び可変ドメイン内の他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、本明細書では、上記Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．に従って番号付けされる。概して、抗体は、６つのＣＤＲを含む：ＶＨに３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、及びＶＬに３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）。本明細書における例示的なＣＤＲには、次のものが含まれる：
（ａ）アミノ酸残基２６－３２（Ｌ１）、５０－５２（Ｌ２）、９１－９６（Ｌ３）、２６－３２（Ｈ１）、５３－５５（Ｈ２）、及び９６－１０１（Ｈ３）に発生する超可変ループ（Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）；
（ｂ）アミノ酸残基２４－３４（Ｌ１）、５０－５６（Ｌ２）、８９－９７（Ｌ３）、３１－３５ｂ（Ｈ１）、５０－６５ （Ｈ２）、及び９５－１０２（Ｈ３）に発生するＣＤＲ（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed.Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)）；
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ－３６（Ｌ１）、４６－５５（Ｌ２）、８９－９６（Ｌ３）、３０－３５ｂ（Ｈ１）、４７－５８（Ｈ２）、及び９３－１０１（Ｈ３）発生する抗原接触（MacCallum et al. J. Mol. Biol.262:732-745 (1996)）；及び
（ｄ）ＣＤＲアミノ酸残基４６－５６（Ｌ２）、４７－５６（Ｌ２）、４８－５６（Ｌ２）、４９－５６（Ｌ２）、２６－３５（Ｈ１）、２６－３５ｂ（Ｈ１）、４９－６５（Ｈ２）、９３－１０２（Ｈ３）、及び９４－１０２（Ｈ３）を含む、（ａ）、（ｂ）、及び／又は（ｃ）の組合せ。
「イムノコンジュゲート」は、細胞障害剤を含むがこれに限定されない、１つ以上の異種分子にコンジュゲートした抗体である。
「核酸分子」又は「ポリヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドのポリマーを含む、任意の化合物及び／又は物質を含む。各ヌクレオチドは、塩基で構成されており、具体的には、プリン塩基又はピリミジン塩基（すなわち、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、又はウラシル（Ｕ））、糖（すなわち、デオキシリボース又はリボース）、及びリン酸基で構成されている。多くの場合、核酸分子は塩基配列によって記載され、それにより、塩基は、核酸分子の一次構造（線状構造）を表す。塩基の配列は、通常、５’から３’へと表される。本明細書において、核酸分子という用語は、例えば、相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）及びゲノムＤＮＡを含むデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、特にメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＤＮＡ又はＲＮＡの合成形態、並びにこれらの分子の２つ以上を含む混合ポリマーを包含する。核酸分子は直鎖状又は環状でありうる。加えて、核酸分子という用語は、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方、並びに一本鎖及び二本鎖の形態を含む。さらには、本明細書に記載される核酸分子は、天然に存在する又は天然に存在しないヌクレオチドを含むことができる。天然に存在しないヌクレオチドの例には、誘導体化された糖又はリン酸骨格結合又は化学的に修飾された残基を有する修飾されたヌクレオチド塩基が含まれる。核酸分子はまた、例えば宿主又は患者において、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏで本開示の抗体を直接発現させるためのベクターとして適切なＤＮＡ及びＲＮＡ分子も包含する。このようなＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）又はＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ベクターは、非修飾のものであっても、修飾されていてもよい。例えば、ｍＲＮＡを化学的に修飾して、ＲＮＡベクターの安定性及び／又はコード化された分子の発現を強化して、ｍＲＮＡを対象に注射してｉｎ ｖｉｖｏで抗体を生成できるようにすることができる（例えば、Stadler et al., Nature Medicine 2017, published online 12 June 2017, doi:10.1038/nm.4356、又は欧州特許第２１０１８２３号を参照）。
「単離された」核酸は、その自然環境の成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸は、通常核酸分子を含む細胞に含まれる核酸分子を含むが、核酸分子は染色体外に存在するか、又はその天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。
「抗体をコードする単離された核酸」とは、抗体の重鎖及び軽鎖（又はその断片）をコードする１つ以上の核酸分子を指し、単一のベクター又は別個のベクター内の（一又は複数の）核酸分子、及び宿主細胞内の１つ以上の位置に存在する（一又は複数の）核酸分子を含む。
本明細書で用いられる「ベクター」という用語は、それが連結された別の核酸を増殖させることができる核酸分子を指す。この用語には、自己複製核酸構造としてのベクター、並びにそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターが含まれる。ある特定のベクターは、作用可能に連結された核酸の発現を指示することができる。このようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と呼ばれる。
本明細書で用いられる場合、「抗原」及び「免疫原」という用語は、それを免疫された動物において免疫応答（好ましくは抗体応答）を誘導する分子又は物質を指すために、本明細書では交換可能に用いられる。抗原は、タンパク質、ペプチド、炭水化物、核酸、脂質、ハプテン、又は他の天然に存在する化合物若しくは合成化合物でありうる。ある特定の実施態様では、抗原はタンパク質である。ある特定の実施態様では、抗原は、膜タンパク質又はその断片である。ある特定の実施態様では、抗原は、単一パス若しくは複数パスの膜タンパク質、又はそれらの断片である。
本明細書で用いられる場合、「異種タンパク質」という用語は、異種タンパク質をコードするポリヌクレオチドを細胞に導入することによって細胞内で発現されるタンパク質を指す。ある特定の実施態様では、異種タンパク質は細胞にとって天然ではない。ある特定の実施態様では、異種タンパク質は、細胞にとって天然であるが、異種タンパク質をコードするポリヌクレオチドを細胞に導入したことによって過剰発現されるタンパク質である。
本明細書で交換可能に用いられる「膜結合抗原」及び「膜抗原」という用語は、膜に直接的又は間接的に結合する抗原を指す。
本明細書で交換可能に用いられる「膜結合タンパク質」及び「膜タンパク質」という用語は、膜に直接的又は間接的に結合するタンパク質を指す。膜結合タンパク質の非限定的な例には、内在性タンパク質、脂質アンカー型タンパク質、及び周辺タンパク質が含まれる。ある特定の実施態様では、膜タンパク質は、膜貫通タンパク質、例えば、単一パス若しくは複数パスの膜タンパク質、又はそれらの断片である。ある特定の実施態様では、膜タンパク質は、膜貫通タンパク質ではないが、膜貫通タンパク質との複合体の一部であるタンパク質（例えば、補助因子）である。本明細書の実施例で用いられる場合、頭字語「ＭＰ」は膜タンパク質を指す。
本明細書で用いられる場合、「膜貫通抗原」という用語は、膜を少なくとも１回横断する抗原を指す。膜貫通抗原の非限定的な例には、単一パス抗原、例えば、膜を１回横断する抗原、脂質アンカー型タンパク質、又は複数パス抗原、例えば、膜を少なくとも２回横断するタンパク質が含まれる。
本明細書で用いられる場合、「膜貫通タンパク質」という用語は、膜を少なくとも１回横断するタンパク質を指す。膜貫通タンパク質の非限定的な例には、単一パスタンパク質、例えば、膜を１回横断するタンパク質、脂質アンカー型タンパク質、又は複数パスタンパク質、例えば、膜を少なくとも２回横断するタンパク質が含まれる。ある特定の実施態様では、膜貫通タンパク質は、単一パス若しくは複数パスの膜貫通タンパク質、又はその断片である。ある特定の実施態様では、膜貫通タンパク質は、複数パス膜貫通タンパク質、又はその断片である。
本明細書で用いられる場合、「免疫化」という用語は、動物において抗体を産生することができるように動物に１つ以上の抗原を投与する、一又は複数のステップを指す。概して、免疫化は、動物に一又は複数の抗原を注射することを含む。免疫化は、一又は複数の抗原の１回以上の投与を包含しうる。ある特定の実施態様では、抗原は、該抗原を発現する複数のＥＶを介して動物に投与される。
本明細書で用いられる場合、「ポリクローナル抗体」又は「ポリクローナル抗血清」という用語は、一又は複数の抗原で免疫した動物の血液から調製することができる、１つ（一価又は特異的抗血清）又は複数（多価抗血清）の抗原に特異的な抗体の混合物を含む免疫血清を指す。
本明細書で用いられる場合、「アジュバント」という用語は、免疫応答の非特異的刺激剤を指す。アジュバントは、次の成分のいずれか又は両方を含む組成物の形態でありうる：（ａ）急速な異化作用から（一又は複数の）抗原を保護する沈着物を形成するように設計された物質（例えば、鉱油、ミョウバン、水酸化アルミニウム、リポソーム、又は界面活性剤［例えば、プルロニックポリオール］）、及び（ｂ）免疫された宿主動物の免疫応答を（例えば、その中のリンホカインレベルを増加させることによって）非特異的に刺激する物質。リンホカインレベルを増加させるための分子の非限定的な例には、リポ多糖（ＬＰＳ）又はそのリピドＡ部分、百日咳菌、百日咳毒素、結核菌、及びムラミルジペプチド（ＭＤＰ）が含まれる。アジュバントの非限定的な例には、フロイントアジュバント（任意選択的に、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）を形成するために、死滅した結核菌を含む）、水酸化アルミニウムアジュバント、Ｒｉｂｉアジュバント、Ｔｉｔｅｒｍａｘアジュバント、スペコールアジュバント、アルミニウム塩アジュバント、及びモノホスホリルリピドＡ－合成トレハロースジコリノミルコレート（ＭＰＬ－ＴＤＭ）が含まれる。
本明細書で用いられる場合、「治療（treatment）」（及びその文法的な変化形、例えば、「治療する（treat）」又は「治療すること（treating）」とは、治療される個体において疾患の本来の経過を変える試みにおける臨床的介入のことを指し、予防のために、又は臨床病理の経過中に行うことができる。治療の所望の効果としては、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の軽減、疾患の任意の直接的又は間接的な病理学的結果の減弱、転移を予防すること、疾患の進行速度を低下させること、病状の寛解又は緩和、及び回復又は改善された予後が挙げられるが、これらに限られない。ある特定の実施態様では、本開示の抗体は、疾患の発症を遅らせるため、又は疾患の進行を遅らせるために用いられる。
「可変領域」又は「可変ドメイン」という用語は、抗体の抗原への結合に関与する抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれ、ＶＨ及びＶＬ）は、概して、同様の構造を有し、各ドメインは、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と、３つの超可変領域（ＣＤＲ）を含む（例えば、Kindt et al.Kuby Immunology, 6th ed., W.H.Freeman and Co., page 91 (2007)を参照）。抗原結合特異性を付与するためには、単一のＶＨ又はＶＬドメインで十分である。さらには、特定の抗原に結合する抗体は、抗原に結合する抗体からＶＨ又はＶＬを使用して単離して、それぞれ相補性のＶＬ又はＶＨドメインのライブラリーをスクリーニングすることができる。例えば、Portolano et al., J. Immunol.150:880-887 (1993);Clarkson et al.、Nature 352:624-628 (1991)を参照されたい。
本明細書で用いられる場合、「スクリーニング」という用語は、１つ以上のモノクローナル抗体（例えば、精製抗体及び／又は抗体を含むハイブリドーマ培養上清）を、抗体が目的の抗原に結合する能力を定性的及び／又は定量的に決定する１つ以上のアッセイに供することを指す。
本明細書で用いられる場合、「マーカー」は、直接的又は間接的な検出を可能にする組成物を指す。マーカーには、蛍光組成物、色素原標識、電子高密度標識、化学発光標識、及び放射性標識が含まれるが、これらに限定されない。例えば、限定するものではないが、特定のマーカーは、緑色蛍光タンパク質（「ＧＦＰ」）、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｄｔＴｏｍａｔｏ、又は当技術分野で知られている他の蛍光タンパク質である（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Shaner et al., A Guide to Choosing Fluorescent Proteins, Nature Methods 2(12) 905-909 (December 2005)、３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、及び１３１Ｉ、蛍光物質（希土類キレート又はルシファーイエロー及びその誘導体など）、ローダミン（rhodamine）及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ（ホタルルシフェラーゼ及び細菌蛍光プレーン酵素など）（米国特許第４，７３７，４５６号）、フルオレセイン、２，３－ジヒドロフタラジンジケトン、並びに検出可能なシグナルを生成する酵素、例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリ性リン酸サワー酵素（alkaline phosphorus sour enzyme）、βガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、炭水化物オキシダーゼ（グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）など）、及び複素環式オキシダーゼ（ウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼなど）。
本明細書で用いられる場合、「接着細胞」とは、増殖のために表面への付着を必要とする細胞を指す。
本明細書で用いられる場合、「非接着細胞」は、懸濁液中で培養される細胞を指す。ある特定の実施態様では、非接着細胞とは、増殖のために表面への付着を必要としない細胞である。
ＩＩ．ＥＶを製造する方法
一態様では、本開示は、ＥＶを作製する改善された方法に関する。これは、一部には、ある特定の精製ステップ、ベシクル因子、及び／又はＥＶ産生細胞株を採用することによって、ＥＶの迅速かつ高収量の生成を達成することが可能であるという発見に基づいている。
ある特定の非限定的な実施態様では、ＥＶを産生するための方法は、（ａ）目的のタンパク質、例えば、目的の異種タンパク質を、ベシクル因子に曝露された細胞内で発現させること；（ｂ）培地中、インビトロで細胞を培養して複数のＥＶを産生させること；及び、（ｃ）複数のＥＶを培地から単離することを含む。ある特定の実施態様では、細胞をベシクル因子に曝露することは、細胞内でベシクル因子を発現させることを含む。
ある特定の実施態様では、細胞内で目的のタンパク質を発現させることは、目的のタンパク質をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを細胞に導入することを含む。例えば、限定するものではないが、ＥＶを産生するための方法は、（ａ）目的のタンパク質、例えば目的の異種タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、ベシクル因子に曝露された細胞内に導入すること；（ｂ）培地中、インビトロで細胞を培養して複数のＥＶを産生させること；及び、（ｃ）複数のＥＶを培地から単離することを含む。ある特定の実施態様では、細胞にポリヌクレオチドをトランスフェクトして、細胞内で目的のタンパク質を発現させることができる。
ある特定の実施態様では、細胞をベシクル因子に曝露することは、細胞内、例えば、目的のタンパク質を発現する同じ細胞内でベシクル因子を発現させることを含むことができる。例えば、限定するものではないが、ベシクル因子をコードするポリヌクレオチドを細胞に導入することができる。ある特定の実施態様では、ベシクル因子は、目的のタンパク質をコードする同じポリヌクレオチドによってコードされうる。あるいは、目的のタンパク質及びベシクル因子は、２つの異なるポリヌクレオチドによってコードされうる。例えば、限定するものではないが、ベシクル因子に曝露された細胞内で目的の異種タンパク質を発現させることは、ベシクル因子をコードする第１のポリヌクレオチドと目的のタンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドとを細胞に導入することを含む。
ある特定の非限定的な実施態様では、ＥＶを産生するための方法は、（ａ）（ｉ）ベシクル因子及び目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び／又は（ｉｉ）ベシクル因子をコードする第１のポリヌクレオチド及び目的のタンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドを提供すること；（ｂ）（一又は複数の）ポリヌクレオチド、例えばポリヌクレオチド又は第１及び第２のポリヌクレオチドで細胞をトランスフェクトすること；（ｃ）培地中、インビトロで細胞を培養して複数のＥＶを産生させること；及び、（ｄ）複数のＥＶを培地から単離することを含む。ある特定の実施態様では、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドは、単一の核酸上に提供される。例示的なＥＶ生成ワークフローが図３に示されている。
ある特定の実施態様では、細胞をベシクル因子に曝露することは、目的のタンパク質を発現する細胞とは異なる細胞においてベシクル因子を発現させることを含みうる。例えば、限定するものではないが、ＥＶを産生する方法は、細胞、例えば第１の細胞内で目的のタンパク質を発現させることを含みうる。ある特定の実施態様では、目的のタンパク質は、該目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを細胞に導入することによって、細胞内で発現させることができる。ある特定の実施態様では、該方法は、目的のタンパク質を発現する細胞、例えば第１の細胞と共培養される異なる細胞内、例えば第２の細胞内でベシクル因子を発現させることをさらに含みうる。ある特定の実施態様では、該方法は、目的のタンパク質を発現する細胞、例えば第１の細胞を、他の細胞、例えば第２の細胞によって発現されるベシクル因子に曝露して、目的のタンパク質を提示するＥＶを産生することを含む。
ある特定の非限定的な実施態様では、ＥＶを産生するための方法は、ベシクル因子の非存在下、細胞内で目的のタンパク質を発現させることを含みうる。ある特定の実施態様では、該方法は、（ａ）細胞内で目的の異種タンパク質を発現させること；（ｂ）培地中、インビトロで細胞を培養して複数のＥＶを産生させること；及び、（ｃ）複数のＥＶを培地から単離すること、を含み、ここで、細胞は非接着細胞である。ある特定の非限定的な実施態様では、本開示の方法は、（ａ）目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供すること；（ｂ）細胞をポリヌクレオチドでトランスフェクトすること；（ｃ）培地中、インビトロで細胞を培養して複数のＥＶを産生させること；及び、（ｄ）複数のＥＶを培地から単離することを含む。
ある特定の実施態様では、ＥＶを産生する方法は、細胞内でタンパク質複合体を形成する２つ以上のタンパク質を発現させること、例えば、細胞内でタンパク質複合体を形成する２つ以上の異種タンパク質を発現させることを含みうる。例えば、限定するものではないが、本開示の方法は、タンパク質複合体の２つ以上のタンパク質、例えば、タンパク質複合体の３つ以上のタンパク質、４つ以上のタンパク質、５つ以上のタンパク質、６つ以上のタンパク質、７つ以上のタンパク質、８つ以上のタンパク質、又は９つ以上のタンパク質を、細胞内で発現させることを含みうる。ある特定の実施態様では、細胞内で発現されるタンパク質複合体の１つ以上のタンパク質は、膜貫通タンパク質でありうる。ある特定の実施態様では、細胞内で発現されるタンパク質複合体の１つ以上のタンパク質は、膜貫通タンパク質ではない。ある特定の実施態様では、細胞内で発現されるタンパク質複合体の１つ以上のタンパク質は、表在性膜タンパク質、例えば、膜貫通タンパク質に関連するタンパク質でありうる。ある特定の実施態様では、２つ以上のタンパク質は、タンパク質をコードするポリヌクレオチドを導入することによって、又はタンパク質をコードする２つ以上のポリヌクレオチドを導入することによって、細胞内で発現させることができる。ある特定の実施態様では、該方法は、例えば、細胞内でベシクル因子を発現させることによって、細胞をベシクル因子に曝露して、例えば、２つ以上のタンパク質の複合体を提示するＥＶを生成することをさらに含みうる。代替的及び／又は追加的に、目的の（一又は複数の）タンパク質は、ベシクル因子の非存在下、多数のＥＶを産生する細胞内、例えば非接着細胞内で発現させることができる。
ある特定の実施態様では、ベシクル因子は、天然のベシクル経路をブーストすることができる、又はベシクル形成を直接誘導することができる候補タンパク質である（図１）。非限定的な例示的なベシクル因子及びそれらの作用機序を表１に示す。ある特定の実施態様では、細胞は、本明細書に開示されるベシクル因子の１つ以上を発現するように遺伝子改変されうる。ある特定の実施態様では、ベシクル因子は、ＭＬＧａｇ、Ａｃｙｌ．Ｈｒｓ、ＡＲＲＤＣ１、ＲｈｏＡ、例えば、ＲｈｏＡ．Ｆ３０Ｌ、ＡＲＦ６、例えば、ＡＲＦ６．Ｑ６７Ｌ、及びそれらの組合せからなる群より選択される。ある特定の実施態様では、ベシクル因子は、ＭＬＧａｇ、Ａｃｙｌ．Ｈｒｓ、ＡＲＲＤＣ１、及びＡＲＦ６、例えばＡＲＦ６．Ｑ６７Ｌ、並びにそれらの組合せからなる群より選択される。ある特定の実施態様では、ベシクル因子は、Ａｃｙｌ．Ｈｒｓ、ＡＲＲＤＣ１及びＡＲＦ６、例えばＡＲＦ６．Ｑ６７Ｌ、並びにそれらの組合せからなる群より選択される。
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ある特定の実施態様では、ベシクル因子は、Ｇａｇタンパク質、例えばキメラＧａｇタンパク質である。ＨＩＶウイルスのＧａｇタンパク質は、Ｔｓｇ１０１／ＥＳＣＲＴ複合体に結合して膜に動員し、ウイルスの出芽を促進するペプチドを含む（Pornillos et al., “HIV Gag mimics the Tsg101-recruiting activity of the human Hrs protein,” J Cell Biol.2003;162(3): 425-434）。ＧａｇのみをコードするｃＤＮＡをヒト細胞に導入すると、ベシクルが生成されることが示されている（例えば、Qiu et al. J. Virol. 1999, 73(11):9145-9152；及び、Megede et al.J. Virol.2000、74(6):2628-2635を参照）。しかしながら、野生型ＨＩＶ Ｇａｇは、非ヒト細胞では効率的に発芽しない。キメラＧａｇタンパク質は、ヒト細胞とマウス細胞の両方でＥＶ産生を誘導できることが示されている（Hammarstedt et al., “Passive and active inclusion of host proteins in human immunodeficiency virus Type 1 Gag particles during budding at the plasma membrane,” J Virol.2004;78(11):5686-97；Chen et al., “Efficient assembly of an HIV-1/MLV Gag-chimeric virus in murine cells,” Proc Natl Acad Sci U S A. 2001;98(26):15239-44）。例示的なキメラＧａｇ（ＭＬＧａｇ）は、その全内容が本明細書に参照により援用される、Chen et al., “Efficient assembly of an HIV-1/MLV Gag-chimeric virus in murine cells,” Proc Natl Acad Sci U S A. 2001;98(26):15239-44に開示されている。ある特定の実施態様では、キメラＧａｇタンパク質は、ＨＩＶ Ｇａｇの一部と、異なるレトロウイルス由来のＧａｇの一部とを含む。例えば、限定するものではないが、キメラＧａｇは、ＨＩＶ Ｇａｇを含み、その局在を指示することが知られているＨＩＶ Ｇａｇの領域が、マウスレトロウイルスであるモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）由来の機能的に相同な領域で置換されている。ある特定の実施態様では、ＨＩＶ Ｇａｇの置換された領域は、本明細書ではＭＬＧａｇと呼ばれるキメラＧａｇを生成するマトリックスドメイン（ＭＡ）である。ある特定の実施態様では、キメラ及び完全長のＧａｇタンパク質は、任意の種に由来する内因性レトロウイルス（ＥＲＶ）配列から生成することができ、例えば、その全内容が本明細書に参照により援用される、Stocking et al. Cell Mol. Life Sci. 65(21):3383-3398 (2008)に記載されている。ある特定の実施態様では、ベシクル因子はＭＬＧａｇである。
ある特定の実施態様では、ベシクル因子は、アレスチンドメイン含有タンパク質１（ＡＲＲＤＣ１）である。ある特定の実施態様では、ベシクル因子はマウスＡＲＲＤＣ１（ｍＡＲＲＤＣ１）である。ある特定の実施態様では、ベシクル因子はヒトＡＲＲＤＣ１（ｈＡＲＲＤＣ１）である。ＡＲＲＤＣ１は、アクセサリータンパク質のテトラペプチドＰＳＡＰモチーフであり、ＥＶ形成を誘導する宿主タンパク質である。ＡＲＲＤＣ１の過剰発現により、微小胞（ＭＶ）形成が促進されることが示されている。このような効果は、ＰＳＡＰ／ＰＴＡＰペプチドを介したＴｓｇ１０１の動員によって媒介される。ＡＴＰアーゼＶＰＳ４ａの過剰発現は、ＭＶの形成をさらに促進する（Nabhan et al., “Formation and release of arrestin domain-containing protein 1-mediated microvesicles (ARMMs) at plasma membrane by recruitment of TSG101 protein,” Proc Natl Acad Sci U S A. 2012;109(11):4146-51）。
ある特定の実施態様では、ベシクル因子はＡＤＰリボシル化因子－６（ＡＲＦ６）である。ＡＲＦ６は、ＥＲＫ依存的に腫瘍細胞の微小胞形成を促進するＲｈｏ ＧＴＰアーゼであることが示されている（Muralidharan-Chari et al., “ARF6-regulated shedding of tumor cell-derived plasma membrane microvesicles,” Curr Biol.2009;19(22):1875-85）。ある特定の実施態様では、ベシクル因子は構成的に活性な形態のＡＲＦ６である。例えば、限定するものではないが、構成的に活性な形態のＡＲＦ６は、ＡＲＦ６．Ｑ６７Ｌである（例えば、その全内容が本明細書に参照により援用される、Peters et al.J. Cell Biol 128(6):1003-1017 (1995)を参照）。
ある特定の実施態様では、ベシクル因子は、腫瘍細胞における微小胞形成も促進することができる、突然変異型ＲｈｏＡ／ＲＯＣＫ１である（Li et al., “RhoA triggers a specific signaling pathway that generates transforming microvesicles in cancer cells,” Oncogene.2012;31(45):4740-9）。ある特定の実施態様では、ベシクル因子は、構成的に活性な形態のＲｈｏＡである。例えば、限定するものではないが、構成的に活性な形態のＲｈｏＡは、ＲｈｏＡ．Ｆ３０Ｌである（例えば、その全内容が本明細書に参照により援用される、Lin et al.JBC 274(33):23633-23641 (1999)を参照）。
ある特定の実施態様では、ベシクル因子は、原形質膜（ＰＭ）結合ドメイン、自己組織化ドメイン、及び輸送に必要なエンドソーム選別複合体（ＥＳＣＲＴ）動員ドメイン（図２Ａ）を含む。ＥＶ形成の設計原理は、ＥＶ因子／カーゴの迅速な生成を可能にすることである。ＰＭターゲティング及び高次オリゴマー化がＥＶの取り込みを促進することが示されている（Fang et al., “Higher-Order Oligomerization Targets Plasma Membrane Proteins and HIV Gag to Exosomes,” PLoS Biol.2007 Jun;5(6):e158）。ある特定の実施態様では、ベシクル因子は、アシル化タグのＰＭ結合ドメイン、及びコイルドコイルの自己組織化ドメインからなる肝細胞増殖因子調節チロシンキナーゼ基質（Ｈｒｓ）のＣ末端ドメイン、並びにＥＳＣＲＴ動員ドメインを含む、Ａｃｙｌ．Ｈｒｓである（図２Ａ）。ある特定の実施態様では、ベシクル因子は、マトリックスのＰＭ結合ドメイン、カプシドの自己組織化ドメイン、及びｐ６のＥＳＣＲＴ動員ドメインを含む、ＭＬＧａｇである（図２Ｂ）。ある特定の実施態様では、ベシクル因子は、自己組織化ドメインとＥＳＣＲＴ動員ドメインとを含む。ある特定の実施態様では、ベシクル因子は、アレスチンドメインの自己組織化ドメインとＥＳＣＲＴ動員ドメインとを含むＡＲＲＤＣ１である（図２Ｂ）。追加のベシクル因子は、当技術分野で知られている任意の方法によって特定することができる。例えば、限定するものではないが、すべてのタンパク質、例えばヒトタンパク質のｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングを実施して、ＥＶの産生を増加させる単一の遺伝子又は遺伝子の組合せを特定することができる。代替的又は追加的に、ＣＲＩＳＰＲ又はＲＮＡｉのスクリーニングを実施して、ＥＶの産生を阻害する単一の遺伝子又は遺伝子の組合せを特定することができる。
ある特定の実施態様では、本明細書に開示される方法によって産生されるＥＶは、ベシクル因子及び／又は目的のタンパク質を含む。例えば、限定するものではないが、ベシクル因子は、ＥＶに組み込まれ、例えば、産生されたＥＶの内部に存在する。ある特定の実施態様では、目的のタンパク質は、ＥＶの表面に提示され、例えば、目的のタンパク質は、膜を１回以上横断するタンパク質であるか、又は膜を横断するタンパク質に関連するタンパク質である。ある特定の実施態様では、開示された方法によって産生されるＥＶは、ベシクル因子、例えば、ＭＬＧａｇ、Ａｃｙｌ．Ｈｒｓ、ＡＲＲＤＣ１、及び／又はＡＲＦ６、例えば、ＡＲＦ６．Ｑ６７Ｌと、目的のタンパク質とを含む。例えば、限定するものではないが、本明細書に開示される方法によって産生されるＥＶは、ＡＲＦ６、例えば、ＡＲＦ６．Ｑ６７Ｌと、目的のタンパク質とを含む。ある特定の実施態様では、本明細書に開示される方法によって産生されるＥＶは、ＭＬＧａｇと目的のタンパク質とを含む。ある特定の実施態様では、本明細書に開示される方法によって産生されるＥＶは、Ａｃｙｌ．Ｈｒｓと目的のタンパク質とを含む。ある特定の実施態様では、本明細書に開示される方法によって産生されるＥＶは、ＡＲＲＤＣ１と目的のタンパク質とを含む。
ある特定の実施態様では、ベシクル因子は、Ａｃｙｌ．Ｈｒｓ、ＡＲＲＤＣ１、及びＡＲＦ６のうちの１つ以上である。ある特定の実施態様では、ベシクル因子としてのＧａｇの使用は抗Ｇａｇ抗体の生成に関連していることから、Ａｃｙｌ．Ｈｒｓ、ＡＲＲＤＣ１、及びＡＲＦ６のうちの１つ以上の使用は有利である。抗Ｇａｇ抗体の産生は、目的のタンパク質に対する抗体を産生する免疫動物の免疫系の能力に影響を与える可能性があり、その結果、対象タンパク質に対する抗体の力価が低下する可能性がある。
表２に示されるように、Ａｃｙｌ．Ｈｒｓ、ＡＲＲＤＣ１、及びＡＲＦ６は、ＭＬＧａｇと同様の量のＥＶを産生した。表２に示される結果は、Ｇａｇが細胞表面からのウイルスの出芽の状況で進化し、したがってＥＶを効率的に産生することが期待される一方で、他のベシクル因子、例えば、Ａｃｙｌ．Ｈｒｓ、ＡＲＲＤＣ１、及びＡＲＦ６は、そのような状況では進化しなかったが、それでもなお、高収量のＥＶをもたらしたことから、驚くべきものである。
ある特定の実施態様では、ベシクル因子、例えば、Ａｃｙｌ．Ｈｒｓ、ＡＲＲＤＣ１、及び／又はＡＲＦ６は、ベシクル因子の発現によって産生されたＥＶで免疫される同じ種に由来しうる。ベシクル因子の発現によって産生されるＥＶで免疫される同じ種に由来するベシクル因子の使用は、免疫動物の目的のタンパク質ではなくベシクル因子に対する免疫応答のリスクを減らすことができるため、有利である。例えば、限定するものではないが、目的のタンパク質に対する抗体を生成するためにマウスを免疫化する場合、ベシクル因子、例えば、Ａｃｙｌ．Ｈｒｓ、ＡＲＲＤＣ１、及び／又はＡＲＦ６は、マウス由来、例えば、マウスＡｃｙｌ．Ｈｒｓ、マウスＡＲＲＤＣ１及び／又はマウスＡＲＦ６由来でありうる。ある特定の実施態様では、目的のタンパク質に対する抗体を生成するためにラットを免疫化する場合、ベシクル因子、例えば、Ａｃｙｌ．Ｈｒｓ、ＡＲＲＤＣ１、及び／又はＡＲＦ６は、ラット由来、例えば、ラットＡｃｙｌ．Ｈｒｓ、ラットＡＲＲＤＣ１、及び／又はラットＡＲＦ６由来でありうる。ある特定の実施態様では、目的のタンパク質に対する抗体を生成するためにウサギを免疫化する場合、ベシクル因子、例えば、Ａｃｙｌ．Ｈｒｓ、ＡＲＲＤＣ１、及び／又はＡＲＦ６は、ウサギ由来、例えば、ウサギＡｃｙｌ．Ｈｒｓ、ウサギＡＲＲＤＣ１、及び／又はウサギＡＲＦ６由来でありうる。ある特定の実施態様では、目的のタンパク質に対する抗体を生成するためにラマを免疫化する場合、ベシクル因子、例えば、Ａｃｙｌ．Ｈｒｓ、ＡＲＲＤＣ１、及び／又はＡＲＦ６は、ラマ由来、例えば、ラマＡｃｙｌ．Ｈｒｓ、ラマＡＲＲＤＣ１、及び／又はラマＡＲＦ６由来でありうる。ある特定の実施態様では、目的のタンパク質に対する抗体を生成するためにヒトを免疫化する場合、ベシクル因子、例えば、Ａｃｙｌ．Ｈｒｓ、ＡＲＲＤＣ１、及び／又はＡＲＦ６は、ヒト由来、例えば、ヒトＡｃｙｌ．Ｈｒｓ、ヒトＡＲＲＤＣ１、及び／又はヒトＡＲＦ６由来でありうる。
ある特定の実施態様では、細胞は、ベシクル因子を発現するように改変される。例えば、限定するものではないが、ベシクル因子をコードするポリヌクレオチドが細胞に導入されて、ベシクル因子を発現する。ある特定の実施態様では、細胞は、ベシクル因子をコードするポリヌクレオチドでトランスフェクトされて、細胞内でベシクル因子を発現する。
ある特定の実施態様では、細胞は、ベシクル因子の発現に適した条件下で培養される。ある特定の実施態様では、細胞は、ＥＶの産生に適した条件下で培養される。例えば、限定するものではないが、細胞は、ベシクル因子の発現及び／又はＥＶの産生のための細胞培養培地中で培養される。
ある特定の実施態様では、ベシクル因子を発現する細胞は、適切な時間インキュベートされて、ＥＶを産生する。ある特定の実施態様では、ベシクル因子を発現する細胞は、約１２時間から約７２時間インキュベートされて、ＥＶを産生する。ある特定の実施態様では、ベシクル因子を発現する細胞は、約２４時間から約６４時間インキュベートされて、ＥＶを産生する。ある特定の実施態様では、ベシクル因子を発現する細胞は、約４８時間インキュベートされて、ＥＶを産生する。
ある特定の実施態様では、ベシクル因子を発現する細胞のインキュベーションによって産生されたＥＶは、その後精製される。ある特定の実施態様では、ＥＶは、細胞培養培地から精製される。ある特定の実施態様では、ＥＶの精製は、完了するまでに約３０分から約２４時間かかる。ある特定の実施態様では、ＥＶの精製は、完了するまでに約３０分から約１２時間かかる。ある特定の実施態様では、ＥＶの精製は、完了するまでに約３０分から約５時間かかる。ある特定の実施態様では、ＥＶの精製は、完了するまでに約３０分から約４時間、例えば、完了するまでに約１時間から約４時間かかる。ある特定の実施態様では、ＥＶの精製は、完了するまでに約３時間かかる。ある特定の実施態様では、ＥＶは、超遠心分離を使用して細胞培養培地から単離される。
ある特定の実施態様では、ベシクル因子を使用してＥＶを産生するための本明細書に記載される方法は、約０．５ｍｇ以上、例えば、０．５－１．０ｍｇ；約１．０ｍｇ以上、例えば、１．０－１．５ｍｇ；約１．５ｍｇ以上、例えば、１．５－２．０ｍｇ；約２．０ｍｇ以上、例えば、２．０－３．０ｍｇ；約２．５ｍｇ以上、例えば、２．５－３．０ｍｇ；約３．０ｍｇ以上、例えば、３．０－４．０ｍｇ；約３．５ｍｇ以上、例えば、３．５－４．０ｍｇ；約４．０ｍｇ以上、例えば、４．０－５．０ｍｇ；約４．５ｍｇ以上、例えば、４．５－５．０ｍｇ；約５．０ｍｇ以上、例えば、５．０－６．０ｍｇ；又は約５．５ｍｇ以上、例えば、５．５－６．０ｍｇの精製ＥＶを産生することができる。ある特定の実施態様では、ベシクル因子を使用してＥＶを産生するための本明細書に記載される方法は、約３．０ｍｇ以上、例えば、３．０－５．０ｍｇの精製ＥＶを産生することができる。ある特定の実施態様では、ベシクル因子を使用してＥＶを産生するための本明細書に記載される方法は、異種タンパク質を発現する細胞を培養してからを培養してから約２４－７２時間以内に、前述の量のＥＶを産生することができる。ある特定の実施態様では、ベシクル因子を使用してＥＶを産生するための本明細書に記載される方法は、異種タンパク質を発現する細胞を培養してからを培養してから約２４－４８時間以内に、前述の量のＥＶを産生することができる。ある特定の実施態様では、ベシクル因子を使用してＥＶを産生するための本明細書に記載される方法は、異種タンパク質を発現する細胞を培養してからを培養してから約４８－７２時間以内に、前述の量のＥＶを産生することができる。
ある特定の実施態様では、ＥＶ産生のための本明細書に開示される方法で使用する細胞は、哺乳動物細胞である。ある特定の実施態様では、細胞はヒト細胞である。ある特定の実施態様では、細胞は、遺伝子改変されたヒト細胞である。ある特定の実施態様では、細胞は接着細胞である。例えば、限定するものではないが、細胞は、付着して増殖するＨＥＫ２９３細胞でありうる。ＨＥＫ２９３は、組織培養で増殖させたヒト胎児腎細胞に由来する細胞株である。ある特定の実施態様では、細胞はＣＨＯ細胞である。例えば、限定するものではないが、細胞は、ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）である。
ある特定の実施態様では、ＥＶ産生のための本明細書に開示される方法で用いられる細胞は、接着細胞ではない。ある特定の実施態様では、ＥＶ産生のための本明細書に開示される方法で用いられる細胞は、非接着細胞、例えば、懸濁液中で増殖する細胞である。ある特定の実施態様では、非接着細胞は、懸濁培養に適応したＨＥＫ２９３細胞である。例えば、限定するものではないが、細胞は、懸濁培養に適応したＨＥＫ２９３細胞である、２９３Ｓ細胞である。ある特定の実施態様では、細胞は、ＨＥＫ２９３細胞に由来し、懸濁培養で維持される、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）である。実施例２に示されるように、非接着細胞、例えば、２９３Ｓ細胞及びＥｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞は、接着細胞、例えばＨＥＫ２９３細胞と比較して、最も高収量のＥＶを産生した。
ＥＶ産生に接着細胞よりも非接着細胞を使用することには、多くの利点がある。例えば、非接着細胞を使用すると、同量の接着細胞を増殖させるために必要な多数の組織培養プレートと比較して、単一の振とうフラスコ内で非接着細胞を増殖させる方がはるかに簡単であることから、ＥＶの産生が簡素化される。非接着細胞は、接着細胞と比較して培養が容易で費用もかからず、必要な消耗品も少なく、培地からの分離も容易である。加えて、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞株などの非接着細胞株を使用すると、驚くべきことに、ベシクル因子の非存在下でも、高収量のベシクルが得られる。図７Ｂに示されるように、２９３Ｓ細胞株及びＥｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞株などの非接着細胞株を使用すると、驚くべきことに、接着ＨＥＫ２９３細胞株と比較して高収量のベシクルが得られた。
ある特定の実施態様では、非接着細胞は、目的のタンパク質を発現するように改変される。例えば、限定するものではないが、目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドが非接着細胞に導入されて、目的のタンパク質を発現する。ある特定の実施態様では、非接着細胞は、目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドでトランスフェクトされて、細胞内で目的のタンパク質を発現する。
ある特定の実施態様では、非接着細胞は、目的のタンパク質の発現に適した条件下で培養される。ある特定の実施態様では、非接着細胞は、ＥＶの産生に適した条件下で培養される。例えば、限定するものではないが、非接着細胞は、目的のタンパク質及び／又はＥＶの産生のための細胞培養培地中で培養される。
ある特定の実施態様では、目的のタンパク質を発現する非接着細胞は、適切な時間インキュベートされて、ＥＶを産生する。ある特定の実施態様では、目的のタンパク質を発現する非接着細胞は、約１２時間から約７２時間インキュベートされて、ＥＶを産生する。ある特定の実施態様では、目的のタンパク質を発現する非接着細胞は、約２４時間から約６４時間インキュベートされて、ＥＶを産生する。ある特定の実施態様では、目的のタンパク質を発現する非接着細胞は、約４８時間インキュベートされて、ＥＶを産生する。
ある特定の実施態様では、目的のタンパク質を発現する非接着細胞のインキュベーションによって産生されたＥＶは、その後精製される。ある特定の実施態様では、ＥＶは、細胞培養培地から精製される。ある特定の実施態様では、ＥＶの精製は、完了するまでに約３０分から約２４時間かかる。ある特定の実施態様では、ＥＶの精製は、完了するまでに約３０分から約１２時間かかる。ある特定の実施態様では、ＥＶの精製は、完了するまでに約３０分から約５時間かかる。ある特定の実施態様では、ＥＶの精製は、完了するまでに約３０分から約４時間、例えば、完了するまでに約１時間から約４時間かかる。ある特定の実施態様では、ＥＶの精製は、完了するまでに約３時間かかる。ある特定の実施態様では、ＥＶは、超遠心分離によって培地から単離される。
ある特定の実施態様では、例えばベシクル因子の非存在下で、非接着細胞株を使用してＥＶを産生するための本明細書に記載される方法は、約０．１ｍｇ以上、例えば、０．１－１．０ｍｇ、０．１－２．０ｍｇ、０．１－３．０ｍｇ、０．１－４．０ｍｇ、０．１－５．０ｍｇ、又は０．１－６．０ｍｇ；約０．２ｍｇ以上；約０．３ｍｇ以上；約０．４ｍｇ以上；約０．５ｍｇ以上；約０．６ｍｇ以上；約０．７ｍｇ以上；約０．８ｍｇ以上；約０．９ｍｇ以上；約１．０ｍｇ以上、例えば、１．０－２．０ｍｇ、１．０－３．０ｍｇ、１．０－４．０ｍｇ、１．０－５．０ｍｇ、又は１．０－６．０ｍｇ；約１．１ｍｇ以上；約１．２ｍｇ以上；約１．３ｍｇ以上；約１．４ｍｇ以上；約１．５ｍｇ以上；約１．６ｍｇ以上；約１．７ｍｇ以上；約１．８ｍｇ以上；約１．９ｍｇ以上；約２．０ｍｇ以上、例えば、２．０－３．０ｍｇ、２．０－４．０ｍｇ、２．０－５．０ｍｇ、又は２．０－６．０ｍｇ；約３．０ｍｇ以上、例えば、３．０－４．０ｍｇ、３．０－５．０ｍｇ、又は３．０－６．０ｍｇ；約４．０ｍｇ以上、例えば、４．０－５．０ｍｇ、又は４．０－６．０ｍｇ；又は約５．０ｍｇ以上の精製ＥＶ、例えば、５．０－６．０ｍｇを産生することができる。ある特定の実施態様では、非接着細胞株を使用してＥＶを産生するための本明細書に記載される方法は、約１．０ｍｇ以上、例えば１．０－６．０ｍｇの精製ＥＶを産生することができる。ある特定の実施態様では、非接着細胞株を使用してＥＶを産生するための本明細書に記載される方法は、非接着異種タンパク質を発現する細胞を培養してから約２４－７２時間以内に前述の量のＥＶを産生することができる。ある特定の実施態様では、非接着細胞を使用してＥＶを産生するための本明細書に記載される方法は、非接着異種タンパク質を発現する細胞を培養してから約２４－４８時間以内に前述の量のＥＶを産生することができる。ある特定の実施態様では、非接着細胞を使用してＥＶを産生するための本明細書に記載される方法は、非接着異種タンパク質を発現する細胞を培養してから約４８－７２時間以内に前述の量のＥＶを産生することができる。
ある特定の実施態様では、本明細書に開示される方法は、培地からＥＶ、例えば複数のＥＶを単離することをさらに含む。ある特定の実施態様では、ＥＶは、超遠心分離によって培地から単離される。ある特定の実施態様では、ＥＶは、ＰＥＧ沈殿を使用して培地から分離される。ある特定の実施態様では、ＥＶは、塩ベースの沈殿を使用して培地から分離される。例えば、限定するものではないが、ＥＶを産生させるための方法は、（ａ）例えば、細胞内でベシクル因子を発現させることによって、ベシクル因子に曝露された細胞内で目的の異種タンパク質を発現させること；（ｂ）培地中、インビトロで細胞を培養して複数のＥＶを産生させること；及び、（ｃ）超遠心分離、ＰＥＧ沈殿、及び／又は塩ベースの沈殿によって培地からＥＶを単離することを含む。ある特定の実施態様では、ＥＶを産生するための方法は、（ａ）例えば、細胞内でベシクル因子を発現させることによって、ベシクル因子に曝露された細胞内で目的の異種タンパク質を発現させること；（ｂ）培地中、インビトロで細胞を培養して複数のＥＶを産生させること；及び、（ｃ）超遠心分離によって培地からＥＶを単離することを含む。
ある特定の実施態様では、細胞は、ＥＶの単離前に、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも３６時間、又は少なくとも４８時間、培養される。ある特定の実施態様では、細胞は、ＥＶの単離前に、少なくとも２４時間、培養される。ある特定の実施態様では、細胞は、ＥＶの単離前に、少なくとも４８時間、培養される。例えば、限定するものではないが、ＥＶを産生させるための方法は、（ａ）例えば、細胞内でベシクル因子を発現させることによって、ベシクル因子に曝露された細胞内で目的の異種タンパク質を発現させること；（ｂ）培地中、インビトロで細胞を少なくとも約２４時間又は少なくとも約４８時間培養して複数のＥＶを産生させること；及び、（ｃ）超遠心分離、ＰＥＧ沈殿、及び／又は塩ベースの沈殿によって培地からＥＶを単離することを含む。
ある特定の実施態様では、目的のタンパク質又は膜結合抗原、例えば、膜タンパク質は、ポリペプチド又はペプチドを標的とするエキソソームに融合されない。ある特定の実施態様では、目的のタンパク質又は膜結合抗原、例えば、膜タンパク質は、ポリペプチド又はペプチドを標的とするエキソソームに架橋されない。
ある特定の実施態様では、ベシクル因子は、Ｇａｇタンパク質ではない。ある特定の実施態様では、ベシクル因子は、ＭＬＶ Ｇａｇタンパク質ではない。ある特定の実施態様では、ベシクル因子は、切断されていないＧａｇタンパク質ではない。ある特定の実施態様では、ベシクル因子は、非修飾のＧａｇタンパク質ではない。ある特定の実施態様では、ベシクル因子は、非キメラＧａｇタンパク質ではない。
ある特定の実施態様では、細胞培養物又は細胞懸濁液は、Ｇａｇタンパク質を含まない。非接着細胞を使用するある特定の実施態様では、細胞は、ベシクル因子の非存在下、例えばＧａｇタンパク質の非存在下で培養される。ある特定の実施態様では、ベシクル因子を発現するポリヌクレオチドを含まない非接着細胞が用いられる。ある特定の実施態様では、Ｇａｇタンパク質がＭＬＶ Ｇａｇタンパク質、切断されていないＧａｇタンパク質、非キメラＧａｇタンパク質、又は非修飾のＧａｇタンパク質であるかどうかにかかわらず、Ｇａｇタンパク質を発現するポリヌクレオチドを含まない、２９３Ｓ細胞又はＥｘｐｉ２９３細胞などの非接着が用いられる。
ＩＩＩ．ＥＶベースのＥＬＩＳＡアッセイ及びキット
本開示はまた、ＥＶベースの酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）アッセイを提供する。本開示のＥＶベースのＥＬＩＳＡアッセイは、ある特定の実施態様において、試料中の抗体のレベルを検出するという利点を有し、その抗体は、抗原の天然型に結合することができる。ある特定の実施態様では、本開示は、試料中の抗体を検出するための方法であって、（ａ）試料を捕捉試薬とともにインキュベートして、抗体を捕捉試薬に結合させることであって、捕捉試薬が複数の抗原発現ＥＶを含み、抗体が抗原に特異的に結合する、結合させること；及び、（ｂ）結合された抗体を検出可能な抗体と接触させることによって、捕捉試薬に結合する抗体を検出することであって、検出可能な抗体が該抗体に特異的に結合する、検出すること、を含む、方法を提供する。ある特定の実施態様では、該方法は、（ｃ）（ｂ）で検出された抗体の量を測定することをさらに含み、その量は、標準曲線を使用して定量化される。ある特定の実施態様では、捕捉試薬は、固体相に固定化されている。
ある特定の実施態様では、抗原は、膜タンパク質又はその断片である。ある特定の実施態様では、膜タンパク質は、単一パス膜タンパク質である。ある特定の実施態様では、膜タンパク質は、脂質アンカー型タンパク質である。ある特定の実施態様では、膜タンパク質は、複数パス膜タンパク質である。ＥＶを産生するための当技術分野で知られている任意の適切な方法は、本明細書に開示されているアッセイで使用することができる。ある特定の実施態様では、抗原提示ＥＶは、セクションＩＩに開示される方法に従って産生される。例えば、限定するものではないが、本明細書に開示されるＥＶベースのＥＬＩＳＡアッセイで使用するためのＥＶは、ベシクル因子、例えば、ＭＬＧａｇ、Ａｃｙｌ．Ｈｒｓ、ＡＲＲＤＣ１、及び／又はＡＲＦ６、例えば、ＡＲＦ６．Ｑ６７Ｌと、抗原とを含みうる。
ある特定の実施態様では、本明細書に開示される捕捉試薬は、アッセイの前に固体相上に固定化される。固定化は、アッセイ手順の前に捕捉試薬を不溶化するか、水不溶性マトリックス若しくは表面への吸着によって（米国特許第３，７２０，７６０号）、又は非共有結合若しくは共有結合によって達成することができる（例えば、米国特許第３，６４５，８５２号又はRotmans et al. J. Immunol. Methods 57:87-98 (1983)に記載されているように、例えば硝酸及び還元剤による支持体の事前活性化の有無にかかわらず、グルタルアルデヒド又はカルボジイミド架橋を使用する）。固定化は、例えば免疫沈降法による、アッセイ手順後に捕捉試薬を不溶化することによって、達成することができる。
固定化に用いられる固体相は、本質的に水不溶性であり、かつ免疫測定アッセイに有用な、任意の不活性支持体又は担体でありうる。不活性支持体は、例えば、表面、粒子、多孔性マトリックスなどの形態でありうる。支持体の非限定的な例には、小さいシート、セファデックス、ポリ塩化ビニル、プラスチックビーズ、及びアッセイプレート（例えば、９６ウェルマイクロタイタープレート）、又はポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレンなどから製造された試験管、並びに濾紙、アガロース、架橋デキストラン、及び他の多糖類などの粒子状物質が含まれる。加えて、臭化シアン活性化炭水化物及び米国特許第３，９６９，２８７号；同第３，６９１，０１６号；同第４，１９５，１２８号；同第４，２４７，６４２号；同第４，２２９，５３７号；及び、同第４，３３０，４４０号に記載される反応基質などの反応性水不溶性マトリックスは、捕捉試薬の固定化のために本開示とともに使用することができ、それらの内容全体が参照により援用される。ある特定の実施態様では、固定化された捕捉試薬は、マイクロタイタープレート上にコーティングされている。ある特定の実施態様では、固体相は、一度に幾つかの試料を分析するために使用することができるマルチウェルマイクロタイタープレートである。ある特定の実施態様では、固体相は、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートである。
ある特定の実施態様では、捕捉試薬は、コーティングされたプレートを形成するために、非共有結合性若しくは共有結合性相互作用によって、又は必要に応じて物理的結合によって、固体相上に結合される。接着のための適切な技法には、その内容全体が参照により援用される、米国特許第４，３７６，１１０号及びそこで引用された参考文献に記載された技法が含まれる。
ある特定の実施態様では、プレート又は他の固体相は、捕捉試薬を固体相に結合させるために捕捉試薬と一緒に架橋剤と共にインキュベートされる。架橋結合剤の非限定的な例には、例えば、１，１－ビス（ジアゾアセチル）－２－フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル類（例えば、４－アジドサリチル酸とのエステル）、３，３’－ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）などのジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル類、及びビス－Ｎ－マレイミド－１，８－オクタンなどの二官能マレイミドが含まれる。メチル－３－［（ｐ－アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデートなどの誘導体化剤は、光の存在下で架橋を形成することができる光活性化可能な中間体を生成する。
ある特定の実施態様では、次に、コーティングされたプレートを、結合部位に非特異的に結合して飽和させるブロッキング剤で処理して、プレートのウェル上の過剰な部位への遊離リガンドの望ましくない結合を防止する。適切なブロッキング剤の非限定的な例には、ゼラチン、ウシ血清アルブミン、卵アルブミン、カゼイン、及び脱脂乳が含まれる。
ある特定の実施態様では、試料を固定化された捕捉試薬とともにインキュベートした後、固定化された捕捉試薬を検出可能な抗体と接触させる。ある特定の実施態様では、検出可能な抗体はモノクローナル抗体である。ある特定の実施態様では、検出可能な抗体はポリクローナル抗体である。ある特定の実施態様では、検出可能な抗体は直接検出可能である。ある特定の実施態様では、検出可能な抗体は、蛍光標識又は比色標識を含む。ある特定の実施態様では、検出可能な抗体はビオチン化されており、検出手段はアビジン又はストレプトアビジン－β－ガラクトシダーゼ及びＭＵＧである。
本開示はまた、本明細書に開示されるＥＶベースのＥＬＩＳＡアッセイを実施するためのキットを提供する。ある特定の実施態様では、試料中の抗体のレベルを検出するためのキットは、（ａ）複数の抗原提示ＥＶを含む捕捉試薬であって、抗原が抗体に特異的に結合する、捕捉試薬；及び、（ｂ）捕捉された抗体に結合する検出可能な抗体を含む。
ある特定の実施態様では、キットは、捕捉試薬のための固体支持体をさらに含む。ある特定の実施態様では、固体支持体は別の要素として提供される。ある特定の実施態様では、提供された固体支持体は、捕捉試薬によってすでにコーティングされている。このように、キット内の膜結合抗原を含むＥＶは、すでに固体支持体に固定化することができ、あるいは、キットに含まれているか、又はキットとは別に提供されている支持体に固定化することができる。ある特定の実施態様では、捕捉試薬はマイクロタイタープレート上にコーティングされる。ある特定の実施態様では、検出可能な抗体は、直接検出することができる標識化抗体である。ある特定の実施態様では、検出可能な抗体は、異なる種で産生された検出可能な抗体に対する標識化抗体によって検出することができる、標識化されていない抗体である。ある特定の実施態様では、標識は酵素であり、キットは酵素に必要な基質及び補助因子をさらに含む。ある特定の実施態様では、標識はフルオロフォアであり、キットは検出可能な発色団を提供する色素前駆体をさらに含む。ある特定の実施態様では、検出可能な抗体は標識化されておらず、キットはさらに、好ましくは蛍光定量的検出フォーマットで、標識化されていない抗体に対する標識化抗体などの検出可能な抗体の検出手段を含む。
ある特定の実施態様では、キットは、アッセイを実施するための説明書、及び／又は抗体標準（例えば、精製抗体、好ましくは組換え産生抗体）、並びに安定剤、洗浄バッファー及びインキュベーションバッファーなどの他の添加剤をさらに含む。
ある特定の実施態様では、キットの成分は所定の比率で提供され、さまざまな試薬の相対量は、アッセイの所望の感受性を得るために適切に変更される。ある特定の実施態様では、試薬は乾燥粉末（例えば、凍結乾燥される）として提供される。
ＩＶ．ＥＶを使用して抗体を産生するための方法
別の態様では、本開示は、抗体産生のための方法を提供する。例えば、適切に折り畳まれた抗原を十分な量で産生することが難しいことから（これは、一部には、細胞毒性、低い発現収量、凝集、及びこのような抗原の不適切な折り畳みが原因である可能性がある）、膜結合抗原などのある特定の抗原に対する抗体は、製造が困難な場合がある。例えば、Katzen et al. Trends Biotech. 27(8):455-460 (2009)参照。例えば、ジスルフィドが豊富な（＞２ジスルフィド）タンパク質の発現は、凝集及びジスルフィドの誤対合の理由から、制限される可能性がある（例えば、Saez et al. Meth. Mol. Biol.1586:155-180 (2017)；Crook et al. Nat Comm. 8:2244 (2017)参照）。加えて、膜タンパク質複合体（例えば、ホモダイマー、ヘテロダイマー、及びホモトリマー複合体）の発現は、複合体内の１つ以上のタンパク質の膜貫通ドメインがしばしば高次複合体を安定化し、複合体のタンパク質間の相互作用が弱くなりうることから、困難な場合がある。さらには、このような膜タンパク質複合体の界面活性剤への可溶化は過酷になる場合があり、天然の複合体相互作用を破壊するか、又は脂質環境との重要な相互作用を除去する可能性がある（例えば、Birnbaum, et al.PNAS 111(49):17576-17581 (2014)；Henrich、et al. eLife 6:e20954 (2017)参照）。したがって、このような抗原をコードするＤＮＡ、このような抗原を発現する細胞、大腸菌によって産生される変性抗原、又はＣＨＯ細胞によって産生されるＦｃ融合抗原を用いたマウスの免疫化を含む、このような課題となる抗原に対する抗体を産生するために、さまざまな免疫化手法が試験されている。本開示の主題は、ある特定の実施形態では、課題となる抗原に対する望ましい結合特性を有する抗体の生成をもたらすことができる膜結合抗原、例えば複数パス膜タンパク質を含むＥＶで動物を免疫化することを対象とする。
ある特定の非限定的な実施態様では、本開示は、膜結合抗原を含む複数のＥＶを動物に投与して、抗原に特異的に結合する抗体を産生することを含む、動物を免疫化するための方法を提供する。
ある特定の実施態様では、抗原は、膜タンパク質又はその断片である。ある特定の実施態様では、抗原は、膜タンパク質の断片である。ある特定の実施態様では、膜タンパク質は、単一パス膜タンパク質、脂質アンカー型タンパク質。又は複数パス膜タンパク質である。本明細書に開示される方法と共に使用することができるタンパク質のクラスの非限定的な例には、受容体、例えば、Ｇ－タンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、ＧＰＩアンカータンパク質、イオンチャネル、多重膜貫通タンパク質、ジスルフィドが豊富な細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、不安定ＥＣＤ、多成分複合体、例えば、ホモ二量体タンパク質複合体、ヘテロ二量体タンパク質複合体、多タンパク質複合体などが含まれる。ある特定の実施態様では、抗原は、膜タンパク質に関連するタンパク質、例えば、多タンパク質複合体のタンパク質部分でありうる。例えば、限定するものではないが、膜タンパク質に関連するタンパク質は、補助因子でありうる。
ある特定の実施態様では、膜タンパク質は、複数パス膜タンパク質である。例えば、限定するものではないが、膜タンパク質は、膜を、少なくとも約２回、少なくとも約３回、少なくとも約４回、少なくとも約５回、少なくとも約６回、少なくとも約７回、少なくとも約８回、少なくとも約９回、少なくとも約１０回、少なくとも約１１回、又は少なくとも約１２回、横断する。ある特定の実施態様では、膜タンパク質は、膜、例えばＧＰＣＲを少なくとも７回、横断する。
ある特定の実施態様では、膜タンパク質は、７００以下のアミノ酸、６５０以下のアミノ酸、６００以下のアミノ酸、５５０以下のアミノ酸、５００以下のアミノ酸、４５０以下のアミノ酸、４００以下のアミノ酸、３５０以下のアミノ酸、３００以下のアミノ酸、２５０以下のアミノ酸、２００以下のアミノ酸、１５０以下のアミノ酸、１００以下のアミノ酸、９５以下のアミノ酸、９０以下のアミノ酸、８５以下のアミノ酸、８０以下のアミノ酸、７５以下のアミノ酸、７０以下のアミノ酸、６５以下のアミノ酸、６０以下のアミノ酸、５５以下のアミノ酸、５０以下のアミノ酸、４５以下のアミノ酸、４０以下のアミノ酸、３５以下のアミノ酸、３０以下のアミノ酸、２５以下のアミノ酸、２０以下のアミノ酸、１５以下のアミノ酸、１０以下のアミノ酸、又は５以下のアミノ酸を含む細胞内ドメインを有する。例えば、限定するものではないが、膜タンパク質は、４００以下のアミノ酸を含む細胞内ドメインを有する。ある特定の実施態様では、ベシクル因子であるＧａｇ、例えばＭＬＧａｇを使用して、目的の膜タンパク質、例えば、目的の膜タンパク質を表示するＥＶを生成する場合、膜タンパク質は、７００以下のアミノ酸、６００以下のアミノ酸、５００以下のアミノ酸、４００以下のアミノ酸、３００以下のアミノ酸、２００以下のアミノ酸、又は１００以下のアミノ酸を含む細胞内ドメインを有する。ある特定の実施態様では、Ｇａｇ、例えばＭＬＧａｇのベシクル因子を使用して、目的の膜タンパク質、例え、目的の膜タンパク質を提示するＥＶを産生する場合、膜タンパク質は、２００以下のアミノ酸を含む細胞内ドメインを有する。
ある特定の実施態様では、膜タンパク質はイオンチャネルである。ある特定の実施態様では、イオンチャネルはカチオンチャネルである。例えば、限定するものではないが、膜タンパク質は、カリウムイオンチャネル、ナトリウムイオンチャネル、又はカルシウムイオンチャネルである。ある特定の実施態様では、イオンチャネルはナトリウムイオンチャネルである。
ＥＶを製造するための当技術分野で知られている方法は、本明細書に開示される方法とともに使用することができる。例えば、限定するものではないが、抗原を含む目的のタンパク質を提示するＥＶを製造するための当技術分野で知られている方法は、本明細書に開示される抗体生成方法とともに使用することができる。ある特定の実施態様では、ＥＶは、本開示のセクションＩＩに開示される方法を使用して産生される。ある特定の実施態様では、抗原はＥＶの膜上に位置し、抗原の立体配座は、細胞膜上のその立体配座、例えば天然立体配座と実質的に類似している。
ある特定の非限定的な実施態様では、本開示は、目的のタンパク質に対する抗体を産生するための方法を提供する。ある特定の実施態様では、該方法は、抗原、例えば目的のタンパク質、例えば目的の膜タンパク質を含む複数のＥＶを動物に投与して、抗原に特異的に結合する抗体を産生させることによって、動物を免疫化することを含む。
ある特定の実施態様では、動物を免疫化することは、ＥＶを動物に注射することを含む。免疫化は、動物へのＥＶの１回以上の投与を包含しうる。ある特定の実施態様では、該方法は、動物へのＥＶの１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、又は１０回以上の投与を含む。ある特定の実施態様では、ＥＶは、約３から約６回、動物に投与される。ある特定の実施態様では、ＥＶは、第０週、第２週、及び第４週に動物に投与される。
ある特定の実施態様では、動物の免疫化は、生成されている標的特異的抗体のレベルを検出するためにＦＡＣＳによって監視することができる。適切な力価が検出される場合（例えば、１：１０００血清希釈でのＦＡＣＳ応答の検出によって）、モノクローナル抗体の生成は、本明細書に記載されるように、例えばＢ細胞クローニング又はハイブリドーマ生成によって開始することができる。
ある特定の実施態様では、該方法は、ＥＶ投与後の動物から抗血清を収集することをさらに含み、抗血清は、動物によって産生された抗体を含む。
ある特定の実施態様では、ＥＶは、アジュバントとともに動物に投与される。アジュバントの非限定的な例は、フロイントアジュバント（任意選択的に、マイコバクテリウム又はフロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）を形成するためのその成分を含む）、Ｒｉｂｉアジュバント、Ｔｉｔｅｒｍａｘアジュバント、スペコールアジュバント、及びアルミニウム塩アジュバントが含まれる。ある特定の実施態様では、アジュバントはＲｉｂｉアジュバントである。Ｒｉｂｉアジュバントは、抗原（例えば、抗原提示ＥＶ）がＴｗｅｅｎ８０を含む生理食塩水で乳化された代謝可能な油（スクアレン）と混合されている、水中油エマルションである。ある特定の実施態様では、Ｒｉｂｉアジュバントは、免疫刺激剤として作用する精製マイコバクテリア製品、及びグラム陰性菌製品モノホスホリルリピドＡも含む。ある特定の実施態様では、Ｒｉｂｉは、免疫細胞の膜と相互作用し、抗原の取り込み、処理、及び提示を高めるサイトカイン誘導をもたらす。ある特定の実施態様では、目的のタンパク質に対する抗体を産生するための方法は、目的のタンパク質を提示する複数のＥＶをアジュバントと組み合わせて動物に投与することを含む。
ある特定の実施態様では、該方法は、ブーストを動物に投与することをさらに含む。例えば、限定するものではないが、目的のタンパク質に対する抗体を産生するための方法は、目的のタンパク質を提示する複数のＥＶをブーストと組み合わせて動物に投与することを含む。ブーストは、動物の免疫応答を強化し、動物によって産生される抗体の量及び質を高めることができる。ある特定の実施態様では、ブーストは、抗原又は抗原の断片をコードするポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施態様では、ポリヌクレオチドはＤＮＡである。ある特定の実施態様では、ブーストは、抗原又はその断片を含むポリペプチド又はタンパク質を含む。ある特定の実施態様では、ブーストは、ＥＶと同時に投与される。ある特定の実施態様では、ブーストは、ＥＶが動物に投与されてから約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日、約１１日、約１２日、約１３日、約１４日、約１５日、約１６日、約１７日、約１８日、約１９日、約２０日、約２１日、約２２日、約２３日、約２４日、約２５日、約２６日、約２７日、約２８日、約２９日、及び／又は約３０日後に投与される。ある特定の実施態様では、ブーストは、ＥＶの最初の投与から約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日、約１１日、約１２日、約１３日、約１４日、約１５日、約１６日、約１７日、約１８日、約１９日、約２０日、約２１日、約２２日、約２３日、約２４日、約２５日、約２６日、約２７日、約２８日、約２９日、及び／又は約３０日後に、動物に投与される。例えば、限定するものではないが、ブーストは、ＥＶ（例えば、ＥＶの最初の用量）が動物に投与されてから約１４日後に投与される。ある特定の実施態様では、ブーストは、ＥＶ（例えば、ＥＶの最初の用量）が動物に投与されてから約２１日後に投与される。ある特定の実施態様では、ＥＶは、アジュバント及びブーストと組み合わせて動物に投与することができる。
免疫化及び抗体産生について当技術分野で知られている任意の動物を、本明細書に開示される方法とともに使用することができる。本明細書に開示される方法とともに使用することができる動物の非限定的な例には、旧世界ザル（例えば、アカゲザル及びカニクイザルを含む、ヒヒ又はマカク、米国特許第５，６５８，５７０号を参照）などの非ヒト霊長類、鳥類（例えば、ニワトリ）；ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ブタ、ロバ、ラマ、アルパカ、及びイヌが含まれる。ある特定の実施態様では、動物はげっ歯類である。「げっ歯類」とは、有胎盤哺乳動物のげっ歯目に属する動物である。本明細書で使用することができるげっ歯類の非限定的な例には、マウス、ラット、モルモット、リス、ハムスター、及びフェレットが含まれる。ある特定の実施態様では、免疫化するための動物はマウスである。
膜結合抗原を含むＥＶは、例えば、筋肉、皮膚、脳、肺、肝臓、脾臓、又は血液の細胞を含む、動物の体のさまざまな細胞に送達することができる。膜結合抗原を含むＥＶの投与は、特定の経路又は部位に限定されない。投与経路の非限定的な例には、筋肉内、皮内、表皮、耳介内、経口、膣、及び鼻腔が含まれる。ある特定の実施態様では、膜結合抗原を含むＥＶは、筋肉内、皮内、又は表皮において動物に投与される。ある特定の実施態様では、ＥＶは、筋肉、皮膚、又は粘膜の組織に送達される。
ある特定の実施態様では、本明細書に開示される方法は、免疫細胞がポリクローナル抗体を産生するか又は産生することができる、上に開示される免疫動物から免疫細胞を得ることをさらに含む。次いで、このような免疫細胞をポリエチレングリコール又はセンダイウイルスなどの適切な融合剤を使用して骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成することができる（Godmg, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103, Academic Press, 1986）。代替的又は追加的に、本明細書に開示される方法は、Ｂ細胞培養クローニング又は免疫ファージライブラリーの産生によって抗体を生成することを含みうる。例えば、その内容が参照により本明細書に援用される、Bazan et al. Hum. Vaccin. Immunother. 8(12):1817-1828 (2012)；Carbonetti et al. J. Immunol. Methods 448:66-73 (2017)を参照されたい。
このように、調製されたハイブリドーマ細胞は、未融合の親骨髄腫細胞の増殖又は生存を阻害する１つ以上の物質を含むことが好ましい適切な培地に播種し、増殖させることができる。例えば、親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアンメ（guanme）ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠いている場合、ハイブリドーマの培地には通常、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を防ぐ、ヒポキサンスム（hypoxanthme）、アンモプテルム（ammopterm）、及びチミド（thymide）（ＨＡＴ培地）が含まれる。骨髄腫細胞株の非限定的な例は、ＭＯＰＣ－２１及びＭＰＣ－１１マウス腫瘍に由来するものなどのマウス骨髄腫株、及びＰ３Ｘ６３ＡｇＵ．１、ＳＰ－２又はＸ６３－Ａｇ８－６５３細胞；ラット骨髄腫細胞株２１０－ＲＣＹ３．Ａｇｌ．２．３；並びに、ヒト骨髄腫及びマウス－ヒト異種骨髄腫細胞株である。
あるいは、ハイブリドーマ細胞株は、免疫動物の免疫細胞から他の方法で、例えば、目的のモノクローナル抗体を産生する不死化細胞株を産生するために免疫細胞をウイルス（例えば、エプスタイン・バーウイルス）又は癌遺伝子で不死化することによって、調製することができる。免疫動物の免疫細胞を使用してモノクローナル抗体を調製するさらに別の戦略のために、特異的抗体を産生する単一細胞から免疫グロブリンｃＤＮＡをクローニングすることによるモノクローナル抗体の産生に関する、Babcock et al. PNAS (USA), 93:7843-7848 (1996)も参照されたい。
ある特定の実施態様では、本明細書に開示される方法は、各抗原に結合することができる１つ以上のモノクローナル抗体を同定するためのスクリーニングステップをさらに含む。ある特定の実施態様では、該方法は、動物が免疫化された抗原に結合する抗体をスクリーニングすることをさらに含む。ある特定の実施態様では、スクリーニングは、培養上清及び／又はクローン化されたハイブリドーマ細胞由来の精製抗体を使用して行うことができる。ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、例えば免疫アッセイで決定することができる。免疫アッセイの非限定的な例には、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、及びＦＡＣＳアッセイが含まれる。ある特定の実施態様では、本明細書に開示されるＥＶベースのＥＬＩＳＡは、抗体スクリーニングに使用することができる。
ある特定の実施態様では、本明細書に開示される方法は、抗体産生細胞の選別を可能にする。例えば、抗体産生細胞は、ある特定の実施態様では、複数のＥＶとともにインキュベートすることができ、複数のＥＶは、（１）膜結合抗原と第１の検出可能なマーカーとを含むＥＶの第１の集団であって、抗体産生細胞のサブセットが膜結合抗原に特異的に結合する、ＥＶの第１の集団；及び、（２）ＥＶの第１の集団の膜結合抗原を欠いているが、第１のマーカーと区別可能な第２の検出可能なマーカーを含む、ＥＶの第２の集団、を含む。ある特定の実施態様では、次に、抗体産生細胞は、第１のマーカーを含むＥＶの第１の集団、又は第１のマーカーを含むＥＶの第１の集団と第２のマーカーを含むＥＶの第２の集団との組合せのいずれかとの結合に基づいて、分類することができる。ある特定の実施態様では、第１及び第２の検出可能なマーカーは、蛍光マーカーである。ある特定の実施態様では、第１及び第２の蛍光マーカーは蛍光タンパク質である。ある特定の実施態様では、選別はＦＡＣＳによって実施される。ある特定の実施態様では、抗体産生細胞はＢ細胞である。ある特定の実施態様では、抗体産生細胞はハイブリドーマ細胞である。
Ｖ．診断及び検出のための方法及び組成物
ある特定の実施態様では、本明細書に開示される抗体、例えば、本明細書に開示される方法によって生成される抗体は、生物学的試料中の抗原の存在を検出するために有用でありうる。本明細書で用いられる「検出」という用語は、定量的又は定性的検出を包含する。
ある特定の実施態様では、診断又は検出の方法において使用するための抗体、例えば、本明細書に開示される方法を使用して生成される抗体が提供される。さらなる態様では、生物学的試料中の抗原の存在を検出する方法が提供される。ある特定の実施態様では、該方法は、生物学的試料を、本明細書に記載される抗体と、その対応する抗原への抗体の結合を許容する条件下で接触させること、及び複合体が抗体と関連する抗原との間で形成されるかどうかを検出することを含む。このような方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏの方法であっても、ｉｎ ｖｉｖｏの方法であってもよい。ある特定の実施態様では、抗体は、例えば抗原が患者が選択するためのバイオマーカーである場合に、抗体による治療に適格な対象を選択するために用いられる。
ある特定の実施態様では、標識化抗体が提供される。標識には、直接検出される標識又は部分（蛍光、発色団、電子密度、化学発光、及び放射性標識など）、並びに、例えば酵素反応又は分子相互作用を介して間接的に検出される酵素又はリガンドなどの部分が含まれるが、これらに限定されない。例示的な標識には、放射性同位体３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、及び１３１Ｉ、希土類キレート又はフルオレセイン及びその誘導体などのフルオロフォア、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ、例えばホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ（米国特許第４７３７４５６号）などのルセリフェラーゼ類（luceriferases）、ルシフェリン、２，３－ジヒドロフタラジンジオン類、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼなどの糖オキシダーゼ、過酸化水素を使用して、例えばＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼ、又はマイクロペルオキシダーゼなどの色素前駆体を酸化するために過酸化水素を利用する酵素と結合した、例えばウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼなどの複素環式オキシダーゼ、ビオチン／アビジン、スピン標識、バクテリオファージ標識、安定フリーラジカルなどが含まれるが、これらに限定されない。
ＶＩ．薬学的組成物
さらなる態様では、本開示は、例えば、下記治療方法のいずれかに使用するための、本明細書に開示される抗体のいずれかを含む薬学的組成物を提供する。例えば、限定するものではないが、抗体は、本明細書に開示される方法を使用して生成される。一態様では、薬学的組成物は、本明細書に提供される抗体のいずれか及び薬学的に許容される担体を含む。別の態様では、薬学的組成物は、本明細書に提供される抗体のいずれかと、例えば以下に記載されるような少なくとも１つの追加の治療剤とを含む。
本明細書に記載される抗体の薬学的組成物は、凍結乾燥された組成物又は水溶液の形態で、所望の純度を有するそのような抗体を１つ以上の任意選択的な薬学的に許容される担体と混合することによって調製される（Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)）。薬学的に許容される担体は、一般に、用いられる投与量及び濃度でレシピエントに対して無毒であり、次のものが含まれるが、これらに限定されない：ヒスチジン、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、及び他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；ヘキサメトニウムクロリド；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及び、ｍ－クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む、単糖、二糖、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、又はソルビトールなどの糖類；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質複合体）；及び／又は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤。本明細書における例示的な薬学的に許容される担体には、可溶性中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｈａｌｏｚｙｍｅ，Ｉｎｃ．）などのヒト可溶性ＰＨ－２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質など、間質性薬物分散剤がさらに含まれる。ｒＨｕＰＨ２０を含めた、ある特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰｓ及び使用方法が、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号及び同第２００６／０１０４９６８号に記載されている。一態様では、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼなどの１つ以上の追加のグリコサミノグリカナーゼ類と併用される。
例示的な凍結乾燥された抗体組成物は、米国特許第６，２６７，９５８号に記載されている。水性抗体組成物は、米国特許第６，１７１，５８６号及び国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されているものを含み、後者の組成物はヒスチジン酢酸バッファーを含む。
本明細書の薬学的組成物はまた、治療されている特定の症状に必要とされる複数の有効成分、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない補完的な活性を有するものも含みうる。このような有効成分は、意図された目的にとって有効な量で組み合わせて適切に存在する。
有効成分は、例えば、コアセルベーション技法によって、又は界面重合、例えば、コロイド状薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）又はマクロエマルジョンにおいて、それぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン－マイクロカプセル及びポリ－（メチルメタシレート）マイクロカプセルによって調製されたマイクロカプセル内に封入することができる。このような技法は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示されている。
徐放性の薬学的組成物を調製することができる。徐放性調製物の適切な例には、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれ、このマトリックスは、成形品、例えば、膜又はマイクロカプセルの形態をしている。
ｉｎ ｖｉｖｏでの投与に用いられる薬学的組成物は、一般に滅菌されている。滅菌は、例えば滅菌濾過膜による濾過によって、容易に達成することができる。
ＶＩＩ．治療方法及び投与経路
本明細書に提供される抗体のいずれかを治療方法に使用することができる。例えば、限定するものではないが、本開示は、治療方法において使用するための本開示の方法によって生成された抗体を提供する。
一態様では、医薬として使用するための、本明細書に開示される抗体、例えば、本開示の方法によって生成された抗体が提供される。さらなる態様では、疾患の治療に使用するための、本明細書に開示される抗体、例えば、本開示の方法によって生成された抗体が提供される。ある特定の実施態様では、治療方法で使用するための本明細書に開示される抗体が提供される。
ある特定の実施態様では、本開示は、疾患を有する個体を治療する方法において使用するための、本明細書に開示される抗体、例えば、本開示の方法によって生成された抗体を提供する。ある特定の実施態様では、該方法は、本明細書に開示される抗体の有効量を個体に投与することを含む。ある特定の実施態様では、該方法は、少なくとも１つの追加の治療剤（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つの追加の治療剤）の有効量を個体に投与することをさらに含む。
さらなる態様では、本開示は、医薬品の製造又は調製における、本明細書に開示される抗体、例えば、本開示の方法によって生成された抗体の使用を提供する。ある特定の実施態様では、医薬は疾患の治療用である。ある特定の実施態様では、医薬は、疾患を有する個体に有効量の医薬を投与することを含む、疾患を治療する方法において使用するためのものである。ある特定の実施態様では、該方法は、少なくとも１つの追加の治療剤の有効量を個体に投与することをさらに含む。
さらなる態様では、本開示は、疾患を治療するための方法を提供する。ある特定の実施態様では、該方法は、このような疾患を有する個体に本明細書に開示される抗体の有効量を投与することを含む。ある特定の実施態様では、該方法は、少なくとも１つの追加の治療剤の有効量を個体に投与することをさらに含む。
上記実施態様のいずれかによる「個体」は、ヒトでありうる。
さらなる態様では、本開示は、例えば、上記治療方法のいずれかに使用するための、本明細書に提供される抗体のいずれかを含む薬学的組成物を提供する。ある特定の実施態様では、薬学的組成物は、本明細書に提供される抗体のいずれかと、薬学的に許容される担体とを含む。ある特定の実施態様では、薬学的組成物は、本明細書に提供される抗体のいずれかと、例えば以下に記載されるような少なくとも１つの追加の治療剤とを含む。
本開示の抗体は、単独で、又は治療において他の薬剤と組み合わせて使用することができる。例えば、本開示の抗体は、少なくとも１つの追加の治療剤と共投与することができる。
上記の併用療法は、併用投与（２つ以上の治療剤が同じ又は別個の薬学的組成物に含まれる場合）、及び別個の投与を包含しており、この場合、本開示の抗体の投与は、一又は複数の追加の治療剤の投与前、投与と同時、及び／又は投与後に行うことができる。ある特定の実施態様では、本明細書に記載される抗体の投与、及び追加の治療剤の投与は、互いに約１ヶ月以内、又は約１、２、若しくは３週間以内、又は約１、２、３、４、５、若しくは６日以内に行われる。ある特定の実施態様では、本明細書に記載される抗体及び追加の治療剤は、治療１日目に患者に投与される。本開示の抗体は、放射線療法と組み合わせて使用することもできる。
本開示の抗体（及び任意の追加の治療剤）は、非経口、肺内、及び鼻腔内、並びに局所治療が望まれる場合には病巣内投与を含む、任意の適切な手段によって投与することができる。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与が含まれる。投与は、一部には、その投与が短期間であるか又は長期であるかに応じて、任意の適切な経路、例えば、静脈内注射又は皮下注射などの注射によるものでありうる。本明細書では、さまざまな時点にわたる単回又は複数回投与、ボーラス投与、及びパルス注入を含むがこれらに限定されないさまざまな投与スケジュールが想定されている。
本開示の抗体は、医学行動規範と一致する様式で処方され、投薬され、投与されよう。これに関連して考慮すべき要因としては、治療される特定の疾患、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、疾患の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、及び医療従事者に既知である他の要因が挙げられる。抗体は、必ずしもそうである必要はないが、任意選択的に、問題の障害を予防又は治療するために現在使用されている１つ以上の薬剤とともに処方される。このような他の薬剤の有効量は、薬学的組成物中に存在する抗体の量、疾患又は治療法の種類、及び上述した他の要因に依存する。これらは、概して、本明細書に記載されるものと同じ投薬量及び投与経路で、又は本明細書に記載される投薬量の約１から９９％で、又は経験的／臨床的に適切であると決定される任意の投薬量及び任意の経路で用いられる。
疾患の予防又は治療について、本開示の抗体の適切な投薬量は（単独で、又は１つ以上の他の追加の治療剤と組み合わせて用いられる場合）、治療される疾患の種類、抗体の種類、疾患の重症度及び経過、その抗体が予防目的又は治療目的で投与されるかどうか、以前の療法、患者の病歴及びその抗体に対する応答、並びに主治医の裁量に依存するであろう。抗体は、好適には、患者に一度に又は一連の治療にわたって投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば、１回以上の別個の投与によるか、又は連続注入によるかにかかわらず、約１μｇ／ｋｇから１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ－１０ｍｇ／ｋｇ）の抗体が、患者に投与するための初回候補投薬量でありうる。１つの典型的な１日投薬量は、上で言及した因子に応じて、約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲になる可能性がある。数日間又はそれ以上にわたる反復投与では、状態に応じて、治療は、概して、疾患の症状の所望の抑制が生じるまで続けられる。抗体の１つの例示的な投薬量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、又は１０ｍｇ／ｋｇのうちの１つ以上の用量（又はそれらの任意の組合せ）を患者に投与することができる。このような用量は、断続的に、例えば毎週又は３週間毎（例えば、患者が約２回から約２０回、又は例えば約６回の用量の抗体を受容するように）投与することができる。高い初回負荷用量に続いて、１回以上のより少ない用量を投与することができる。例示的な投薬レジメンは、投与することを含む。しかしながら、他の投薬レジメンも有用でありうる。この療法の進行は、従来の技術及びアッセイによって容易に監視される。
ＶＩＩＩ．製造品
本開示の別の態様では、上述の障害の治療、予防、及び／又は診断に有用な材料を含む製造品が提供される。製造品は、容器と、該容器の上又は容器に関連付けられたラベル又は添付文書とを含む。適切な容器には、例えば、ボトル、バイアル、注射器、ＩＶ溶液バッグなどが含まれる。容器は、ガラス又はプラスチックなどのさまざまな材料で形成することができる。容器は、組成物単独、又は状態の治療、予防、及び／又は診断に有効な別の組成物と組み合わせた組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有していてもよい（例えば、容器は、静注バッグ、又は皮下注射針が貫通可能なストッパーを有するバイアルでありうる）。
組成物中の少なくとも１つの活性剤は、本開示の抗体、例えば、本開示の方法によって生成された抗体である。ラベル又は添付文書は、組成物が、選択した状態を治療するために使用されることを示す。さらには、製造品は、（ａ）組成物がその中に含まれる第１の容器であって、該組成物が本開示の抗体（例えば、本開示の方法によって生成された抗体）を含む、第１の容器；及び、（ｂ）組成物がその中に含まれる第２の容器であって、該組成物がさらなる細胞毒性又は他の治療剤を含む、第２の容器を含みうる。本開示のこの実施態様の製造品は、組成物を特定の状態を治療するために使用することができることを示す添付文書をさらに含むことができる。あるいは、又は加えて、製造品は、注射用の静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、及びデキストロース溶液などの薬学的に許容されるバッファーを含む第２（又は第３）の容器をさらに含みうる。他のバッファー、希釈剤、フィルタ、針、注射器などを含めた、商業的観点及びユーザの観点から望ましい他の材料がさらに含まれる場合がある。
ＩＸ．例示的な実施態様
Ａ．ある特定の非限定的な実施態様では、本明細書に開示される主題は、タンパク質に特異的に結合する抗体を産生するための方法であって、
（ａ）（ｉ）ベシクル因子に曝露された細胞内で異種タンパク質を発現させること、（ｉｉ）細胞を培地で培養すること、及び（ｉｉｉ）異種タンパク質を含む複数のＥＶを培地から単離することによって異種タンパク質を含む複数の細胞外ベシクル（ＥＶ）を産生することであって、ベシクル因子が、Ａｃｙｌ．Ｈｒｓ、ＡＲＲＤＣ１、ＡＲＦ６、及びそれらの組合せからなる群より選択される、産生すること；
（ｂ）動物に複数のＥＶを投与することによって動物を免疫化すること；及び
（ｃ）タンパク質に結合する抗体を動物から単離すること
を含む、方法を提供する。
Ａ１．細胞が非接着細胞である、前述のＡに記載の方法。
Ａ２．細胞内でベシクル因子及びタンパク質を発現させることが、ベシクル因子及びタンパク質をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを細胞に導入することを含む、前述のＡ及びＡ１に記載の方法。
Ａ３．ベシクル因子及びタンパク質が、単一のポリヌクレオチドによってコードされる、前述のＡ２に記載の方法。
Ａ４．ベシクル因子が第１のポリヌクレオチドによってコードされ、タンパク質が第２のポリヌクレオチドによってコードされる、前述のＡ２に記載の方法。
Ｂ．ある特定の非限定的な実施態様では、本明細書に開示される主題は、タンパク質に特異的に結合する抗体を産生するための方法であって、（ａ）（ｉ）細胞内で異種タンパク質を発現させること、（ｉｉ）細胞を培地で培養すること、及び（ｉｉｉ）異種タンパク質を含む複数のＥＶを培地から単離することによって、異種タンパク質を含む複数の細胞外ベシクル（ＥＶ）を産生することであって、細胞が非接着細胞である、産生すること；（ｂ）動物に複数のＥＶを投与することによって動物を免疫化すること；及び、（ｃ）異種タンパク質に結合する抗体を動物から単離すること、を含む、方法を提供する。
Ｂ１．複数のＥＶを産生することが、細胞内で異種ベシクル因子を発現させることをさらに含む、前述のＢに記載の方法。
Ｂ２．ベシクル因子が、ＭＬＧａｇ、Ａｃｙｌ．Ｈｒｓ、ＡＲＲＤＣ１、ＡＲＦ６、及びそれらの組合せからなる群より選択される、前述のＢ１に記載の方法。
Ｂ３．異種タンパク質が膜タンパク質である、前述のＡからＢ２のいずれかに記載の方法。
Ｂ４．膜タンパク質が単一パス膜タンパク質である、前述のＢ３に記載の方法。
Ｂ５．膜タンパク質が複数パス膜タンパク質である、前述のＢ３に記載の方法。
Ｂ６．膜タンパク質がタンパク質複合体の成員である、前述のＢ３に記載の方法。
Ｂ７．膜タンパク質が膜貫通タンパク質ではなく、タンパク質複合体の成員である、前述のＢ３に記載の方法。
Ｂ８．非接着細胞が、２９３Ｓ細胞又はＥｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞である、前述のＡ１からＢ７のいずれかに記載の方法。
Ｂ９．ＥＶが、超遠心分離によって培地から単離される、前述のＡからＢ８のいずれかに記載の方法。
Ｂ１０．複数のＥＶが、第０週、第２週、及び第４週に動物に投与される、前述のＡからＢ９のいずれかに記載の方法。
Ｂ１１．ＥＶと同時に動物にアジュバントを投与することをさらに含む、前述のＡからＢ１０のいずれかに記載の方法。
Ｂ１２．アジュバントがＲｉｂｉアジュバントである、前述のＢ１１に記載の方法。
Ｂ１３．動物にブーストを投与してタンパク質に対する動物の免疫応答を高めることをさらに含む、前述のＡからＢ１２のいずれかに記載の方法。
Ｂ１４．ブーストが、タンパク質、該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、又はそれらの組合せを含む、前述のＢ１３に記載の方法。
Ｂ１５．ブーストがタンパク質を含む、前述のＢ１４に記載の方法。
Ｂ１６．ブーストが、タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、前述のＢ１４に記載の方法。
Ｂ１７．抗体がモノクローナル抗体である、前述のＡからＢ１６のいずれかに記載の方法。
Ｂ１８．抗体が、ヒト、ヒト化、又はキメラ抗体である、前述のＡからＢ１７のいずれかに記載の方法。
Ｃ．ある特定の非限定的な実施態様では、本明細書に開示される主題は、ＡからＢ１８のいずれかに記載の方法によって産生された、単離された抗体又はその抗原結合部分を提供する。
Ｄ．ある特定の非限定的な実施態様では、本明細書に開示される主題は、Ｃに記載の抗体又はその抗原結合部分をコードする単離された核酸を提供する。
Ｅ．ある特定の非限定的な実施態様では、本明細書に開示される主題は、Ｄに記載の核酸を含む宿主細胞を提供する。
Ｆ．ある特定の非限定的な実施態様では、本明細書に開示される主題は、抗体又はその抗原結合部分を産生する方法であって、抗体の発現に適した条件下でＥに記載の宿主細胞を培養することを含む、方法を提供する。
Ｆ１．宿主細胞から抗体を回収することをさらに含む、前述のＦに記載の方法。
Ｇ．ある特定の非限定的な実施態様では、本明細書に開示される主題は、Ｃに記載の単離された抗体又はその抗原結合部分と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物を提供する。
Ｇ１．追加の治療剤をさらに含む、前述のＧに記載の薬学的組成物。
Ｈ．医薬として使用するための、前述のＣに記載の単離された抗体又はその抗原結合部分。
Ｉ．疾患の治療に使用するための、前述のＣに記載の単離された抗体又はその抗原結合部分。
Ｊ．ある特定の非限定的な実施態様では、本明細書に開示される主題は、医薬の製造における、Ｃに記載の単離された抗体又はその抗原結合部分の使用を提供する。
Ｋ．ある特定の非限定的な実施態様では、本明細書に開示される主題は、疾患を有する個体を治療する方法であって、Ｃに記載の単離された抗体又はその抗原結合部分の有効量を個体に投与することを含む、方法を提供する。
Ｋ１．追加の治療剤を個体に投与することをさらに含む、前述のＫに記載の方法。
Ｌ．ある特定の非限定的な実施態様では、本明細書に開示される主題は、Ｇ又はＧ１に記載の薬学的組成物を個体に投与することを含む、疾患を有する個体を治療する方法を提供する。
Ｍ．ある特定の非限定的な実施態様では、本明細書に開示される主題は、試料中の抗体を検出するための方法であって、
（ａ）試料を捕捉試薬と共にインキュベートすることであって、捕捉試薬が膜結合抗原を含む複数のＥＶを含み、抗体が膜結合抗原に特異的に結合する、インキュベートすること；及び
（ｂ）捕捉試薬に結合している抗体を検出可能な抗体と接触させて、結合した抗体を検出することであって、検出可能な抗体が該抗体に特異的に結合する、検出すること
を含み、
複数のＥＶが、（ｉ）細胞内での膜結合抗原の発現、（ｉｉ）培地中、インビトロで細胞を培養して、膜結合抗原を提示する複数のＥＶを産生すること、及び（ｉｉｉ）膜結合抗原を提示する複数のＥＶを培地から単離することによって生成され、かつ
細胞が、Ａｃｙｌ．Ｈｒｓ、ＡＲＲＤＣ１、ＡＲＦ６、及びそれらの組合せからなる群より選択されるベシクル因子に曝露される、及び／又は細胞が非接着細胞である、
方法を提供する。
Ｍ１．（ｃ）（ｂ）で検出された抗体の量を測定することをさらに含み、その量が標準曲線を使用して定量化される、前述のＭに記載の方法。
Ｍ２．試料が、血漿、血清、又は尿試料である、前述のＭ又はＭ１に記載の方法。
Ｍ３．捕捉試薬が固体支持体上に固定化される、前述のＭからＭ２のいずれかに記載の方法。
Ｍ４．固体支持体がマイクロタイタープレートである、前述のＭ３に記載の方法。
Ｍ５．検出可能な抗体が蛍光標識される、前述のＭからＭ４のいずれかに記載の方法。
Ｍ６．膜結合抗原が、膜タンパク質又はその断片である、前述のＭからＭ５のいずれかに記載の方法。
Ｎ．ある特定の非限定的な実施態様では、本明細書に開示される主題は、抗体産生細胞を選別するための方法であって、
（ａ）抗体産生細胞を複数のＥＶとともにインキュベートすることであって、複数のＥＶが、ｉ． 膜結合抗原と第１の検出可能なマーカーとを含むＥＶの第１の集団であって、抗体産生細胞のサブセットが膜結合抗原に特異的に結合する、ＥＶの第１の集団と、ｉｉ． 膜結合抗原を欠いているが、第１のマーカーと区別可能な第２の検出可能なマーカーを含む、ＥＶの第２の集団とを含む、インキュベートすること；及び
（ｂ）ＥＶの第１の集団に対する結合、又はＥＶの第１の集団とＥＶの第２の集団との組合せに対する結合に基づいて、抗体産生細胞を選別すること
を含み、
ＥＶの第１の集団が、（ｉ）第１の細胞内での膜結合抗原及び第１の検出可能なマーカーの発現、（ｉｉ）培地中、インビトロで第１の細胞を培養して、膜結合抗原を提示する複数のＥＶを産生すること、及び（ｉｉｉ）膜結合抗原を提示する複数のＥＶを培地から単離することによって生成され、
ＥＶの第２の集団が、（ｉ）第２の細胞内での第２の検出可能なマーカーの発現、（ｉｉ）培地中、インビトロで第２の細胞を培養して、第２の検出可能なマーカーを含む複数のＥＶを産生すること、及び（ｉｉｉ）第２の検出可能なマーカーを提示する複数のＥＶを培地から単離することによって生成され、かつ
（ｉ）第１の細胞及び／又は第２の細胞が、Ａｃｙｌ．Ｈｒｓ、ＡＲＲＤＣ１、ＡＲＦ６、及びそれらの組合せからなる群より選択されるベシクル因子と接触する、及び／又は（ｉｉ）第１の及び／又は第２の細胞が非接着細胞である、
方法を提供する。
Ｎ１．第１及び第２の検出可能なマーカーが蛍光マーカーである、前述のＮに記載の方法。
Ｎ２．第１及び第２の蛍光マーカーが蛍光タンパク質である、前述のＮ１に記載の方法。
Ｎ３．選別が蛍光活性化セルソーティングによって実施される、前述のＮからＮ２のいずれかに記載の方法。
Ｎ４．抗体産生細胞がＢ細胞である、前述のＮからＮ３のいずれかに記載の方法。
Ｎ５．抗体産生細胞がハイブリドーマ細胞である、前述のＮからＮ４のいずれかに記載の方法。
Ｏ．ある特定の非限定的な実施態様では、本明細書に開示される主題は、異種タンパク質を提示する複数の細胞外ベシクル（ＥＶ）を産生するための方法であって、
（ａ）細胞内で異種タンパク質を発現させること；
（ｂ）細胞を培地で培養すること；及び
（ｃ）異種タンパク質を含む複数のＥＶを培地から単離すること
を含み、
細胞が、Ａｃｙｌ．Ｈｒｓ、ＡＲＲＤＣ１、ＡＲＦ６、及びそれらの組合せからなる群より選択されるベシクル因子に曝露される、及び／又は細胞が非接着細胞である、
方法を提供する。
Ｏ１．異種タンパク質が膜タンパク質である、前述のＯに記載の方法。
Ｏ２．膜タンパク質が単一パス膜タンパク質である、前述のＯ１に記載の方法。
Ｏ３．膜タンパク質が複数パス膜タンパク質である、前述のＯ１に記載の方法。
Ｏ４．膜タンパク質がタンパク質複合体の成員である、前述のＯ１からＯ３のいずれかに記載の方法。
Ｏ５．非接着細胞が、２９３Ｓ細胞又はＥｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞である、前述のＭからＯ４のいずれかに記載の方法。
Ｏ６．複数のＥＶが、超遠心分離によって培地から単離される、前述のＭからＯ５のいずれかに記載の方法。
Ｐ．ある特定の非限定的な実施態様では、本明細書に開示される主題は、試料中の抗体を検出するキットであって、
（ａ）膜結合抗原を含む複数のＥＶを含む捕捉試薬であって、検出される抗体が抗原に特異的に結合する、捕捉試薬；及び
（ｂ）検出される抗体に特異的に結合する、検出可能な抗体
を含み、
複数のＥＶが、（ｉ）細胞内での膜結合抗原の発現、（ｉｉ）培地中、インビトロで細胞を培養して、膜結合抗原を提示する複数のＥＶを産生すること、及び（ｉｉｉ）膜結合抗原を提示する複数のＥＶを培地から単離することによって生成され、かつ
細胞が、Ａｃｙｌ．Ｈｒｓ、ＡＲＲＤＣ１、ＡＲＦ６、及びそれらの組合せからなる群より選択されるベシクル因子に曝露される、及び／又は細胞が非接着細胞である、
方法を提供する。
Ｐ１．複数のＥＶが固体支持体上に固定化される、前述のＰに記載のキット。
Ｐ２．固体支持体がマイクロタイタープレートである、前述のＰ又はＰ１に記載のキット。
Ｐ３．検出可能な抗体が蛍光標識される、前述のＰからＰ２のいずれかに記載のキット。
Ｐ４．膜結合抗原が、膜タンパク質又はその断片である、前述のＰからＰ３のいずれかに記載のキット。
本明細書に開示される主題は、限定としてではなく、本明細書に開示される主題の例示として提供される以下の実施例を参照することによって、より良く理解されよう。
実施例１：ＭＰ－Ｘによるベシクルを生成するベシクル因子の同定
２９３Ｔ細胞に、標的タンパク質であるヒトＧ－タンパク質共役受容体（膜タンパク質（ＭＰ）－Ｘ）と、ｈＡＲＲＤＣ１、Ａｃｙｌ－Ｈｒｓ、ＡＲＦ６．Ｑ６７Ｌ、ＲｈｏＡ．Ｆ３０Ｌ、構成的活性型のＲＯＣＫ、ＭｅｍＰｒｏ、及びＭＬＧａｇから選択されたベシクル因子とを同時トランスフェクトした。ＥＶは、図３に示されるように生成した。標的タンパク質及びベシクル因子の発現を試験するために、細胞溶解物を収集した。培地を収集し、処理した。ＥＶは、超遠心分離によって培地から収集した。精製したＥＶは、抗ＦＬＡＧ抗体（１：１０００希釈Ｍ２ Ｓｉｇｍａ Ｆ３１６５）を使用したウェスタンブロットによって分析した。
図４に示されるように、ＭＰ－Ｘは、ベシクル因子ｈＡＲＲＤＣ１、Ａｃｙｌ．Ｈｒｓ、ＡＲＦ６．Ｑ６７Ｌ、又はＭＬＧａｇをトランスフェクトされた細胞から産生されたＥＶにおいて発現されたが、ベシクル因子ＲｈｏＡ．Ｆ３０Ｌ、構成的活性型のＲＯＣＫ、及びＭｅｍＰｒｏをトランスフェクトされた細胞から産生されたＥＶでは発現しなかった。加えて、動的光散乱（ＤＬＳ）は、ｈＡＲＲＤＣ１、Ａｃｙｌ．Ｈｒｓ、又はＭＬＧａｇをトランスフェクトされた細胞から産生されたＥＶが、均一なベシクルサイズを有していることを示した（図５）。
次に、ＥＶの誘導におけるこれらのベシクル因子の有効性を、マウス細胞で試験した。マウス結腸がん細胞ＭＣ３８及びマウス筋芽細胞Ｃ２Ｃ１２に、ＭＰ－Ｘと、ＭＬＧａｇ、Ａｃｙｌ．Ｈｒｓ、及びｍＡＲＲＤＣ１から選択されたベシクル因子とを同時トランスフェクトして、ＥＶを産生させた。超遠心分離によって培地からＥＶを精製した後、ウェスタンブロット（抗ＦＬＡＧ一次抗体、１：１０００希釈 Ｍ２ Ｓｉｇｍａ Ｆ３１６５）で分析して、ＭＰ－Ｘの存在を検出した。図６は、ベシクル因子ＭＬＧａｇ、Ａｃｙｌ．Ｈｒｓ、又はｍＡＲＲＤＣ１をトランスフェクトされた細胞から産生されたＥＶにおけるＭＰ－Ｘレベルが高かったことを示した。ＭＰ－Ｘは、ベシクル因子をトランスフェクトされていない細胞から産生されたＥＶでは検出されなかった。
実施例２：高収率で迅速なＥＶ産生を可能にするための改善された方法
ＥＶ産生における課題の１つは、ＥＶを培地から効率的に精製することである（図７Ａ）。ＰＥＧ沈殿法では、回収が非常に乏しく、明らかなペレットが生成されず、一晩のステップを必要とした。塩ベースの沈殿には１時間しか必要としなかったが、不溶性のペレットが生成された。本研究では、超遠心分離による精製が３つの方法すべての中で最も効率的な精製であり、３時間しか必要としなかったことがわかった。
ＥＶ産生におけるもう１つの課題は、十分な収量を有する細胞株を選択することである。多数の細胞株の収量を比較した後、本研究では、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）及び２９３Ｓ細胞が、４つの細胞株すべての中で最高の収量を産生したことがわかった（図７Ｂ）。トランスフェクション法としてＪｅｔＰＥＩを用いた。
本研究では、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞株と２９３Ｓ細胞株の間のＥＶ収量及び標的タンパク質（すなわち、目的のタンパク質）の発現も比較した。図８Ａ－８Ｂは、ＭＬＧａｇをベシクル因子として使用した場合に、Ｅｘｐｉ２９３細胞株が２９３Ｓ細胞株よりも高い平均収量を有していたことを示した。図８Ｃは、２９３Ｓ細胞株よりもＥｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞株の方が細胞の生存率が良好であることを示した。
Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞株及び２９３Ｓ細胞株の倍加時間は、約２４時間で、非常に類似していた。トランスフェクション後の細胞増殖は、両方の細胞株で減少した。２９３Ｓ細胞株は生産段階において１回の倍加を有しうるが、一方、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞株は生産段階において数回の倍加を有していた。
さらに、ＥＶ内の各標的タンパク質の存在は、ＥＬＩＳＡを使用して測定した。図９Ａ－９Ｃは、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞株由来のＥＶが、２９３Ｓ細胞株のＥＶよりも高い標的タンパク質濃度を有していたことを示した。
本研究では、ラットＲＢＡ細胞をＥＶ生産に使用することができるかどうかについても試験した。ＲＢＡ細胞株は、ＳＤラットに由来する乳腺腺癌細胞株である。ＲＢＡ細胞がＥＶを産生することができることがわかったが、２９３Ｓ細胞株と比較すると、収量は非常に低かった（図１３）。
実施例３：ＥＶは、複雑な膜タンパク質に対するＦＡＣＳ＋抗体のＥＬＩＳＡベースの検出を可能にした
本研究では、ベシクル因子ＭＬＧａｇ、Ａｃｙｌ．Ｈｒｓ、ＡＲＲＤＣ１、及びＡＲＦ６が、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞株を使用して、明確に定義された粒子（直径１８４±４０ｎｍ）を生成するのに役立ったことがわかった（図１０Ａ）。さらに、ＥＶは、ＥＶによって組み込まれたタンパク質に対するＦＡＣＳ＋抗体を使用して、単一パス膜タンパク質及び複数パス膜タンパク質のＥＬＩＳＡベースの検出を可能にした（図１０Ｂ－１０Ｃ）。
実施例４：Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）ＥＶ免疫化ラット、ウサギ、ラマ、及びマウスに由来する抗体をスクリーニングするための細胞株の同定
本研究では、ウサギ、ラマ／ラクダ、ラット、及びマウス細胞株のトランスフェクション効率、並びにＥＶ免疫化ラット又はマウス抗血清への結合能についてスクリーニングした。ＳＤラット、ウサギ、及びラマ、並びにマウスを、第０週、第２週、及び第４週にＥｘｐｉ２９３Ｆ（商標）産生ＥＶで免疫化した。血清試料は、免疫前（事前採血試料）及び免疫化後（抗血清試料）に動物から採取した（図１１Ａ、図１２Ａ）。Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞株、ＲＫ１３細胞株、Ｄｕｂｃａ細胞株、ＲＢＡ細胞株、及び３Ｔ３細胞株を含むさまざまな細胞株に対する収集された事前採血試料及び抗血清試料の結合を、ＦＡＣＳで測定した。採取したラット抗血清は、２９３細胞株には高度に結合したが、ＳＤラット由来の乳腺腺癌細胞株であるＲＢＡ細胞株には結合しなかった。採取したマウス抗血清は、ＲＢＡ細胞株に高度に結合したが、Ｂａｌｂ／ｃマウス由来の胚線維芽細胞株である３Ｔ３細胞株には結合しなかった（図１１Ｂ）。ＲＢＡ細胞は高度にトランスフェクト可能であり（図１１Ｃ）、３Ｔ３細胞も適度にトランスフェクト可能であった（図１１Ｄ）。採取したウサギ抗血清はＲＫ１３細胞に結合せず、採取したラマ抗血清はＤｕｂｃａ細胞には結合しなかったが、３Ｔ３細胞には結合した（図１２Ｂ）。ＲＫ１３細胞及びＤｕｂｃａ細胞もトランスフェクト可能であった（図１２Ｃ）。このように、ＲＢＡ細胞株及び３Ｔ３細胞株は、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）ＥＶ免疫化ＳＤラット及びマウス由来の抗体のスクリーニングに使用することができ、ＲＫ１３細胞株及びＤｕｂｃａ細胞株はＥｘｐｉ２９３Ｆ（商標）ＥＶ免疫化ウサギ及びラマ由来の抗体のスクリーニングに使用することができる。
実施例５：ＥＶ抗原を用いた課題となる膜タンパク質に対する機能的モノクローナル抗体の開発
Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞株にベシクル因子ＭＬＧａｇ及び膜タンパク質－１（ＭＰ－１、複数パス膜タンパク質）コンストラクトを４日間同時トランスフェクトし、培地からＥＶを収集した。ウェスタンブロットにより、ＥＶ及び全細胞溶解物中にＭＰ－１が存在したことが確認された（図１４）。
Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞株には、ベシクル因子ＭＬＧａｇ又はＡＲＦ６、及び膜タンパク質－２（ＭＰ－２、１１０を超えるアミノ酸を含む細胞内ドメインを有しない複数パス膜タンパク質）コンストラクトも４日間同時トランスフェクトした。ウェスタンブロットにより、ＥＶ及び全細胞溶解物中にＭＰ－２が存在したことが確認された（図１５）。
Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞株には、ベシクル因子ＭＬＧａｇ又はＡＲＦ６、及び膜タンパク質－３（Ｍｐ－３、７００を超えるアミノ酸を含む細胞内ドメインを有する複数パス膜タンパク質）コンストラクトも４日間同時トランスフェクトした。ウェスタンブロットにより、ＡＲＦ６でトランスフェクトされた細胞から産生されたＥＶを有するＡＲＦ６にはＭＰ－３が存在したが、ＭＬＧａｇには存在しなかったことが確認された（図１６）。特定の理論に限定されるものではないが、このような結果の理由は、Ｇａｇカプシドが、大きい細胞内ドメインでのＭＰの取り込みを立体的にブロックするためでありうる（図１７）。
実施例６：ネイティブ形態の抗原に対する一次抗体をスクリーニングするためのＥＶベースのＥＬＩＳＡ
本研究では、ＥＶベースのＥＬＩＳＡを細胞ベースのＦＡＣＳとともに使用して、ネイティブな形態の膜タンパク質に対する一次抗体をスクリーニングする方法を比較した。タンパク質のＥＬＩＳＡ、ＥＶベースのＥＬＩＳＡ、及びＦＡＣＳの作用機序を図１８に示した。
２つの膜タンパク質ＭＰ－４及びＭＰ－５を、本研究のための結合抗原として使用した。ＭＰ－４は単一パス膜タンパク質であり、ＭＰ－５は複数パス膜タンパク質である。
抗ＭＰ－４ハイブリドーマは、タンパク質の免疫化を使用してＭＰ－４で免疫したマウスから生成した。膜結合ＭＰ－４を含むＥＶは、ＥＶベースのＥＬＩＳＡ用にＭＬＧａｇを使用して生成した。図１９Ａ－１９Ｄは、ＥＶベースのＥＬＩＳＡ力価がＭＰ－４のＦＡＣＳ力価とよく相関し、ＥＶベースのＥＬＩＳＡの結果がＦＡＣＳの結果と一致したことを示した。対照的に、タンパク質ベースのＥＬＩＳＡとＥＶベースのＥＬＩＳＡ又はＦＡＣＳとの相関関係は、非常に乏しいものであった。
抗ＭＰ－５血清及びハイブリドーマは、ＤＮＡ免疫化を使用してＭＰ－５で免疫化したマウスから生成した。同様に、ＥＶベースのＥＬＩＳＡはＦＡＣＳとよく相関していた（図２０Ａ－２０Ｂ、図２１）。
したがって、本研究により、ＥＶが複雑な膜タンパク質に対する抗体のＥＬＩＳＡベースの検出を可能にし、ＥＶベースのＥＬＩＳＡを使用してネイティブな形態の抗原に対する一次抗体をスクリーニングすることができることが示された。
実施例７：課題となる抗原ＭＰ－６に対するモノクローナル抗体発見のためのＥＶを発現する抗原の使用。
ＭＰ－６は、複数のがんに対する高価値の抗体薬物複合体（ＡＤＣ）標的であり、抗ＭＰ－６抗体を開発するための課題となる標的である。膜結合ＭＰ－６を含むＥＶは、２９３Ｓ細胞に、ＭＬＧａｇ、Ａｃｙｌ．Ｈｒｓ、ＡＲＦ６、又はＡＲＲＤＣ１のベシクル因子、及びＭＰ－６コンストラクトを同時トランスフェクトすることによって生成した。ＥＶは、超遠心分離によって単離した。ＥＶの収量を表２に示す。ＭＰ－６の相対レベルはウェスタンブロットで測定した。
Figure 2023530600000003
ＭＰ－６ ＥＶの最初のバッチの分析は、ＭＰ－６が単離されたＥＶにおいて発現されたことを示した（図２２Ａ）。加えて、ウェスタンブロット分析により、各ベシクル因子もベシクルに組み込まれたことが確認された（図２２Ｂ）。組換えタンパク質標準を用いた定量的ウェスタンブロットを使用して、ベシクルに取り込まれたＭＰ－６の絶対量を測定した（図２２Ｃ）。
ＳＤラットは、生成されたＥＶとＤＮＡ又はタンパク質ブーストで免疫化した。免疫化のためのＥＶは、ＰＢＳ又Ｒｉｂｉ（アジュバント）中で調製した。免疫化プロトコールを図２３に示した。ＤＮＡ又はタンパク質のブーストの前又は後に、ラットから抗血清を採取した。収集した抗血清から抗体を精製し、最終濃度は２５０、５０、１０、又は２μｇ／ｍｌであった。精製された抗体中の抗ＭＰ－６抗体のレベルは、ＦＡＣＳ又はウェスタンブロットで測定した。ＲＢＡ細胞は、ＭＰ－６発現コンストラクトの有無にかかわらず、リポフェクタミン３０００（リポフェクタミン：ＤＮＡ＝３：１）を２日間使用して、トランスフェクトした。これらのＲＢＡ細胞をＦＡＣＳ分析に使用した。
ウェスタンブロットにより、ＤＮＡ又はタンパク質のブースト後にラットから採取した抗血清中の抗ＭＰ－６抗体及び抗Ｇａｇ抗体のレベルを示した（図２４Ａ）。ＤＮＡ又はタンパク質のブースト後にラットから採取した抗血清は、ＲＢＡ細胞に対して有意な結合を有していなかったことがわかった（図２４Ｂ）。本研究では、ＲＢＡベースのＦＡＣＳを使用して、採取した抗血清中の抗体レベルも測定した。ＦＡＣＳの結果はウェスタンブロットのデータとよく相関していた（図２４Ｃ及び２４Ｄ）。このように、免疫化された一次抗体はＲＢＡ細胞へのバックグラウンド結合を示さず、ナイーブなＳＤラットのＩｇＧはＭＰ－６でトランスフェクトされたＲＢＡに結合しなかったことが示された。ＭＰ－６を発現するＥＶで免疫化したラットから採取した抗体のみが、ＭＰ－６でトランスフェクトされたＲＢＡへの結合を示した。したがって、ＲＢＡベースのＦＡＣＳは、ＥＶ免疫化ラットによって産生されるＭＰ－６抗体のスクリーニングに使用することができる。
本研究により、タンパク質ブーストではなくＤＮＡブーストが、ＭＰ－６発現ＥＶで免疫化されたラットにおいて抗ＭＰ－６抗体力価を増加させることがわかった（図２４Ａ－２４Ｄ、図２６）。加えて、免疫化プロセスへのアジュバント（Ｒｉｂｉ）の組み込みも、抗ＭＰ－６抗体力価を増加させた（図２４Ａ－２４Ｄ、図２５Ａ－２５Ｂ）。
本研究は、アジュバントとしてのＲｉｂｉが抗体力価を増加させ、Ａｃｙｌ．Ｈｒｓ ＥＶがＭＬＧａｇ ＥＶよりも弱い抗体応答を生成したことを示した（図２５Ａ）。図２５Ｂは、血清がＦＡＣＳによる抗体力価チェックに適切であり、ＩｇＧの精製が必要ないことを示した。
実施例８：ＭＰ－７に対するモノクローナル抗体発見のためのＥＶを発現する抗原の使用。
本研究は、実施例７で開発された免疫化方法を使用して、膜タンパク質ＭＰ－７（複数パス膜タンパク質）に対するモノクローナル抗体を発見及び生成した。マウス抗ＭＰ－７一次抗体は、ＭＰ－７を含むＥＶで免疫化したノックアウトマウスから生成し、ＦＡＣＳによってスクリーニングした。抗ＭＰ－７ハイブリドーマは、抗血清がＦＡＣＳでＭＰ－７発現細胞への有意な結合を示したマウスから選択した（図２７Ａ－２７Ｃ）。ハイブリドーマをＦＡＣＳによってさらにスクリーニングして、ＣＯＳ７安定細胞及び内因性細胞においてＭＰ－７への強い結合を示した抗ＭＰ－７抗体クローンを選択した（図２８－３０）。
実施例９：ＭＰ－１に対するモノクローナル抗体発見のための抗原を含むＥＶの使用。
本研究は、実施例７で開発された免疫化方法を使用して、膜タンパク質ＭＰ－１に対するモノクローナル抗体を産生した。ラットは、タンパク質又はＤＮＡブーストを用いて、膜に結合したＭＰ－１又はＭＰ－１ ＤＮＡを含むＥＶで免疫化した。ＭＰ－１が破傷風トキソイド（ＭＰ－８ ＴＣＥ４）からのユニバーサルＴ細胞エピトープの４つの繰り返しに融合された、追加のＥＶを生成した（Demotz et al.J Immunol 1989; 142）。ＥＶは、ベシクル因子としてのＭＬＧａｇの発現によって生成した。
ラットから採取した抗血清をＦＡＣＳでスクリーニングした（図３１Ａ－３１Ｂ）。抗体力価の増加において、ＤＮＡブーストは全体的にタンパク質ブーストよりも効果的であり、Ｔ細胞エピトープの添加は効果がなかったことが示された。タンパク質ブーストは、ＤＮＡ免疫化ラットにおけるＦＡＣＳ力価を増加させ、タンパク質ブーストと細胞表面ＭＰ－１との間のエピトープの一部の重複が示唆された。ラット抗ＭＰ－１ハイブリドーマをＦＡＣＳでスクリーニングした（図３２）。ＲＢＡ細胞にＭＰ－１ ＤＮＡをリポフェクタミン ３０００とともに１日間トランスフェクトし、ラット抗ＭＰ－１ハイブリドーマ上清で染色した後、ＡＦ６４７－抗ラットＩｇＧで染色した。
実施例１０：ＭＰ－８に対するモノクローナル抗体発見のための膜結合抗原を含むＥＶの使用。
本研究は、実施例７で開発された免疫化方法を使用して、膜タンパク質ＭＰ－８（単一パス膜タンパク質）に対するモノクローナル抗体を発見及び生成した。ラットを、タンパク質、ＭＰ－８をコードするＤＮＡ、又は膜結合ＭＰ－８を含むＥＶ（ベシクル因子としてＭＬＧａｇを使用して生成した）のみで免疫化した。ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳの結果を図３３に示した。結果は、ＥＶ免疫化はタンパク質免疫化と比較してＥＬＩＳＡ＋クローンが少なくなる一方で、ＥＶ免疫化はタンパク質免疫化と比較してより高いパーセンテージのＦＡＣＳ＋抗体を生成できることを示している。
実施例１１：免疫動物からのＢ細胞の選別のための膜結合抗原を含む蛍光ＥＶの使用。
本研究は、実施例７で開発された免疫化方法を使用して、膜タンパク質ＭＰ－９（複数パス膜タンパク質）に対するモノクローナル抗体を発見及び生成した。ラット及びウサギを、ＭＰ－９及びＭＰ－９ ＤＮＡを含むＥＶで免疫化した。ＥＶは、ベシクル因子としてのＭＬＧａｇの発現によって生成した。
ＰＢＭＣは、ラット及びウサギの両方から取得し、ＧＦＰ標識化ＭＰ－９を含むＥＶ及びＭＰ－９を含まないＲＦＰ標識化ＥＶで染色した。ＩｇＧ＋Ｂ細胞の染色が図３４に示されている。結果は、ＥＶで染色したＢ細胞の２つの集団を示している。ＧＦＰ／ＲＦＰ＋の集団は、ＥＶにおいて非ＭＰ－９タンパク質を検出するＢ細胞を表している。ボックス内に示されているＧＦＰのみで標識された集団は、ＭＰ－９を特異的に検出するＢ細胞を表している。他の２つのＭＰ（ＭＰ－１０及びＭＰ－１１）を使用して、ＲＦＰで標識されたＭＰ ＥＶ及びＧＦＰで標識された空のＥＶでウサギＩｇＧ＋Ｂ細胞を染色することができることが示された（図３５）。いずれの場合も、ＭＰを特異的に検出するＲＦＰのみで標識されたＢ細胞の明確な集団が存在している。
実施例１２：タンパク質複合体の膜タンパク質に対するモノクローナル抗体を生成するためのＥＶの使用。
本研究は、実施例７で開発された免疫化方法を使用して、タンパク質複合体内の膜タンパク質に対するモノクローナル抗体を発見及び生成した。タンパク質複合体は、６つの異なる膜タンパク質（ＭＰ－１２、ＭＰ－１３、ＭＰ－１４の２つのコピー、ＭＰ－１５、ＭＰ－１６、及びＭＰ－１７の２つのコピー）を含む。ＭＰ－１２及びＭＰ－１３は二量体化して受容体（本明細書では図３６Ａ－Ｂにおいて受容体「Ａ」と呼ばれる）を形成し、ＭＰ－１４、ＭＰ－１５、ＭＰ－１６、及びＭＰ－１７は、ＭＰ－１２及びＭＰ－１３によって形成される受容体の共受容体として機能する複合体（本明細書では図３６Ａ－Ｂにおいて共受容体「Ｂ」と呼ばれる）を形成する。ＭＰ－１２とＭＰ－１３の両方、又はＭＰ－１４、ＭＰ－１５、ＭＰ－１６、及びＭＰ－１７の４つすべてをコードする、２つの多シストロン性発現ベクターが生成された。細胞表面での複合体の形成を確認するために、Ｅｘｐｉ２９３細胞に、（ｉ）ＭＰ－１２及びＭＰ－１３をコードするｃＤＮＡ、（ｉｉ）ＭＰ－１４、ＭＰ－１５、ＭＰ－１６及びＭＰ－１７をコードするｃＤＮＡ、又は（ｉ）と（ｉｉ）の両方を一時的にトランスフェクトした。ＭＰ－１４、ＭＰ－１５、ＭＰ－１６及びＭＰ－１７の発現、並びにＭＰ－１２及びＭＰ－１３の発現は、すべてのタンパク質が共発現されたときにフローサイトメトリーによって検出し、完全な複合体のアセンブリが確認された（図３６Ａ）。完全なタンパク質複合体を含むＥＶを生成し、ＥＬＩＳＡによって取り込みを確認した（図３６Ｂ）。ＥＶは、ＭＬＧａｇの発現によって生成した。
ラットは、６つの膜タンパク質（ＭＰ－１２、ＭＰ－１３、ＭＰ－１４、ＭＰ－１５、ＭＰ－１６、及びＭＰ－１７）の複合体を含むＥＶで免疫化した。ラット由来のモノクローナル抗体のその後の特徴付けでは、例えば、ＭＰ－１２／ＭＰ－１３、ＭＰ－１４、ＭＰ－１４／ＭＰ－１６、又はＭＰ－１４／ＭＰ－１５のいずれかなど、複合体内のタンパク質に結合するＦＡＣＳ＋抗体の発見に成功したことが示された（表３）。これらのデータは、ＥＶを使用して、タンパク質複合体内に存在する膜タンパク質に対する抗体を生成することができることを示している。
Figure 2023530600000004
本明細書に開示される主題及びその利点を詳細に説明してきたが、本開示の精神及び範囲から逸脱することなく、本明細書にさまざまな変更、置換、及び修正を行うことができるものと理解されたい。さらには、本出願の範囲は、本明細書に記載されるプロセス、機械、製造、及び物質の組成、手段、方法、及びステップの特定の実施態様に制限されることは意図されていない。本開示の主題、プロセス、機械、製造、物質の組成、手段、方法、又はステップの発明から当業者が容易に認識するように、本明細書に記載される対応する実施態様と実質的に同じ機能を実行するか又は実質的に同じ結果を達成する、既存のもの又は今後開発されるものは、本開示の主題に従って利用することができる。したがって、添付の特許請求の範囲は、そのようなプロセス、機械、製造、物質の組成、手段、方法、又はステップをその範囲内に含むことを意図している。
さまざまな特許、特許出願、刊行物、製品説明、プロトコール、及び配列寄託番号が本出願全体を通して引用されており、その発明全体があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (59)

  1. タンパク質に特異的に結合する抗体を産生するための方法であって、
    （ａ）（ｉ）ベシクル因子に曝露された細胞内で異種タンパク質を発現させること、（ｉｉ）細胞を培地で培養すること、及び（ｉｉｉ）異種タンパク質を含む複数の細胞外ベシクル（ＥＶ）を培地から単離することによって、異種タンパク質を含む複数のＥＶを産生することであって、ベシクル因子が、Ａｃｙｌ．Ｈｒｓ、ＡＲＲＤＣ１、ＡＲＦ６、及びそれらの組合せからなる群より選択される、複数のＥＶを産生すること；
    （ｂ）動物に複数のＥＶを投与することによって動物を免疫化すること；並びに
    （ｃ）異種タンパク質に結合する抗体を動物から単離すること
    を含む、方法。
  2. 細胞が非接着細胞である、請求項１に記載の方法。
  3. タンパク質に特異的に結合する抗体を産生するための方法であって、
    （ａ）（ｉ）細胞内で異種タンパク質を発現させること、（ｉｉ）細胞を培地で培養すること、及び（ｉｉｉ）異種タンパク質を含む複数の細胞外ベシクル（ＥＶ）を培地から単離することによって、異種タンパク質を含む複数のＥＶを産生することであって、細胞が非接着細胞である、複数のＥＶを産生すること；
    （ｂ）動物に複数のＥＶを投与することによって動物を免疫化すること；並びに
    （ｃ）異種タンパク質に結合する抗体を動物から単離すること
    を含む、方法。
  4. 複数のＥＶを産生することが、細胞内でベシクル因子を発現させることをさらに含む、請求項３に記載の方法。
  5. ベシクル因子が、ＭＬＧａｇ、Ａｃｙｌ．Ｈｒｓ、ＡＲＲＤＣ１、ＡＲＦ６、及びそれらの組合せからなる群より選択される、請求項４に記載の方法。
  6. 異種タンパク質が膜タンパク質である、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 膜タンパク質が単一パス膜タンパク質である、請求項６に記載の方法。
  8. 膜タンパク質が複数パス膜タンパク質である、請求項６に記載の方法。
  9. 膜タンパク質がタンパク質複合体の成員である、請求項６から８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 膜タンパク質が、膜貫通タンパク質ではなく、膜貫通タンパク質との複合体の一部であるタンパク質である、請求項６に記載の方法。
  11. 非接着細胞が、２９３Ｓ細胞又はＥｘｐｉ２９３ＦＴＭ細胞である、請求項２から１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. ＥＶが、超遠心分離によって培地から単離される、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 複数のＥＶが、第０週、第２週、及び第４週に動物に投与される、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. ＥＶと同時に動物にアジュバントを投与することをさらに含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. アジュバントがＲｉｂｉアジュバントである、請求項１４に記載の方法。
  16. 動物にブーストを投与してタンパク質に対する動物の免疫応答を高めることをさらに含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. ブーストが、タンパク質、該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、又はそれらの組合せを含む、請求項１６に記載の方法。
  18. ブーストがタンパク質を含む、請求項１７に記載の方法。
  19. ブーストが、タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１７に記載の方法。
  20. 抗体がモノクローナル抗体である、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 抗体が、ヒト、ヒト化、又はキメラ抗体である、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法によって産生された、単離された抗体又はその抗原結合部分。
  23. 請求項２２に記載の抗体又はその抗原結合部分をコードする、単離された核酸。
  24. 請求項２３に記載の核酸を含む、宿主細胞。
  25. 抗体の発現に適した条件下で請求項２４に記載の宿主細胞を培養することを含む、抗体又はその抗原結合部分を産生する方法。
  26. 宿主細胞から抗体を回収することをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
  27. 請求項２２に記載の単離された抗体又はその抗原結合部分と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
  28. 追加の治療剤をさらに含む、請求項２７に記載の薬学的組成物。
  29. 医薬として使用するための、請求項２２に記載の単離された抗体又はその抗原結合部分。
  30. 疾患の治療に使用するための、請求項２２に記載の単離された抗体又はその抗原結合部分。
  31. 医薬の製造における、請求項２２に記載の単離された抗体又はその抗原結合部分の使用。
  32. 有効量の請求項２２に記載の単離された抗体又はその抗原結合部分を個体に投与することを含む、疾患を有する個体を治療する方法。
  33. 追加の治療剤を個体に投与することをさらに含む、請求項３２に記載の方法。
  34. 請求項２７又は２８に記載の薬学的組成物を個体に投与することを含む、疾患を有する個体を治療する方法。
  35. 試料中の抗体を検出するための方法であって、
    （ａ）試料を捕捉試薬とともにインキュベートすることであって、捕捉試薬が膜結合抗原を含む複数のＥＶを含み、抗体が膜結合抗原に特異的に結合する、試料を捕捉試薬とともにインキュベートすること；及び
    （ｂ）捕捉試薬に結合している抗体を検出可能な抗体と接触させて、結合した抗体を検出することであって、検出可能な抗体が該抗体に特異的に結合する、結合した抗体を検出すること
    を含み、
    複数のＥＶが、（ｉ）細胞内での膜結合抗原の発現、（ｉｉ）培地中、インビトロで細胞を培養して、膜結合抗原を提示する複数のＥＶを産生すること、及び（ｉｉｉ）膜結合抗原を提示する複数のＥＶを培地から単離することによって生成され、かつ
    細胞が、Ａｃｙｌ．Ｈｒｓ、ＡＲＲＤＣ１、ＡＲＦ６、及びそれらの組合せからなる群より選択されるベシクル因子に曝露される、及び／又は細胞が非接着細胞である、
    方法。
  36. （ｃ）（ｂ）で検出された抗体の量を測定することをさらに含み、その量が標準曲線を使用して定量化される、請求項３５に記載の方法。
  37. 試料が、血漿、血清、又は尿試料である、請求項３５又は３６に記載の方法。
  38. 捕捉試薬が固体支持体上に固定化される、請求項３５から３７のいずれか一項に記載の方法。
  39. 固体支持体がマイクロタイタープレートである、請求項３８に記載の方法。
  40. 検出可能な抗体が蛍光標識される、請求項３５から３９のいずれか一項に記載の方法。
  41. 膜結合抗原が、膜タンパク質又はその断片である、請求項３５から４０のいずれか一項に記載の方法。
  42. 抗体産生細胞を選別するための方法であって、
    （ａ）抗体産生細胞を複数のＥＶとともにインキュベートすることであって、該複数のＥＶが、
    ｉ． 膜結合抗原と第１の検出可能なマーカーとを含むＥＶの第１の集団であって、抗体産生細胞のサブセットが膜結合抗原に特異的に結合する、ＥＶの第１の集団；及び
    ｉｉ． 膜結合抗原を欠いているが、第１のマーカーと区別可能な第２の検出可能なマーカーを含む、ＥＶの第２の集団
    を含む、抗体産生細胞を複数のＥＶとともにインキュベートすること；並びに
    （ｂ）ＥＶの第１の集団に対する結合、又はＥＶの第１の集団とＥＶの第２の集団との組合せに対する結合に基づいて、抗体産生細胞を選別すること
    を含み、
    ＥＶの第１の集団が、（ｉ）第１の細胞内での膜結合抗原及び第１の検出可能なマーカーの発現、（ｉｉ）培地中、インビトロで第１の細胞を培養して、膜結合抗原を提示する複数のＥＶを産生すること、及び（ｉｉｉ）膜結合抗原を提示する複数のＥＶを培地から単離することによって生成され、
    ＥＶの第２の集団が、（ｉ）第２の細胞内での第２の検出可能なマーカーの発現、（ｉｉ）培地中、インビトロで第２の細胞を培養して、第２の検出可能なマーカーを含む複数のＥＶを産生すること、及び（ｉｉｉ）第２の検出可能なマーカーを提示する複数のＥＶを培地から単離することによって生成され、かつ
    （ｉ）第１の細胞及び／又は第２の細胞が、Ａｃｙｌ．Ｈｒｓ、ＡＲＲＤＣ１、ＡＲＦ６、及びそれらの組合せからなる群より選択されるベシクル因子に曝露される、及び／又は（ｉｉ）第１の細胞及び／又は第２の細胞が非接着細胞である、
    方法。
  43. 第１の検出可能なマーカー及び第２の検出可能なマーカーが蛍光マーカーである、請求項４２に記載の方法。
  44. 第１の蛍光マーカー及び第２の蛍光マーカーが蛍光タンパク質である、請求項４３に記載の方法。
  45. 選別が蛍光活性化セルソーティングによって実施される、請求項４２から４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. 抗体産生細胞がＢ細胞である、請求項４２から４５のいずれか一項に記載の方法。
  47. 抗体産生細胞がハイブリドーマ細胞である、請求項４２から４５のいずれか一項に記載の方法。
  48. タンパク質を提示する複数の細胞外ベシクル（ＥＶ）を産生するための方法であって、
    （ａ）細胞内で異種タンパク質を発現させること；
    （ｂ）細胞を培地中で培養すること；及び
    （ｃ）異種タンパク質を含む複数のＥＶを培地から単離すること
    を含み、
    細胞が、Ａｃｙｌ．Ｈｒｓ、ＡＲＲＤＣ１、ＡＲＦ６、及びそれらの組合せからなる群より選択されるベシクル因子に曝露される、及び／又は細胞が非接着細胞である、
    方法。
  49. 異種タンパク質が膜タンパク質である、請求項４８に記載の方法。
  50. 膜タンパク質が単一パス膜タンパク質である、請求項４９に記載の方法。
  51. 膜タンパク質が複数パス膜タンパク質である、請求項４９に記載の方法。
  52. 膜タンパク質がタンパク質複合体の成員である、請求項４９から５１のいずれか一項に記載の方法。
  53. 非接着細胞が、２９３Ｓ細胞又はＥｘｐｉ２９３ＦＴＭ細胞である、請求項３５から５２のいずれか一項に記載の方法。
  54. 複数のＥＶが、超遠心分離によって培地から単離される、請求項３５から５３のいずれか一項に記載の方法。
  55. 試料中の抗体を検出するためのキットであって、
    （ａ）膜結合抗原を含む複数のＥＶを含む捕捉試薬であって、検出される抗体が抗原に特異的に結合する、捕捉試薬；及び
    （ｂ）検出される抗体に特異的に結合する、検出可能な抗体
    を含み、
    複数のＥＶが、（ｉ）細胞内での膜結合抗原の発現、（ｉｉ）培地中、インビトロで細胞を培養して、膜結合抗原を提示する複数のＥＶを産生すること、及び（ｉｉｉ）膜結合抗原を提示する複数のＥＶを培地から単離することによって生成され、かつ
    細胞が、Ａｃｙｌ．Ｈｒｓ、ＡＲＲＤＣ１、ＡＲＦ６、及びそれらの組合せからなる群より選択されるベシクル因子に曝露される、及び／又は細胞が非接着細胞である、
    方法。
  56. 複数のＥＶが固体支持体上に固定化される、請求項５５に記載のキット。
  57. 固体支持体がマイクロタイタープレートである、請求項５５又は５６に記載のキット。
  58. 検出可能な抗体が蛍光標識されている、請求項５５から５７のいずれか一項に記載のキット。
  59. 膜結合抗原が、膜タンパク質又はその断片である、請求項５５から５８のいずれか一項に記載のキット。
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