JP2023530049A - コロナウイルスに対する治療用干渉粒子 - Google Patents

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Abstract

組成物 非感染細胞の感染に干渉または感染を阻止することができる欠陥ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物および粒子、ならびにそのような欠陥ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物および粒子を生成する方法が本明細書に記載されている。本明細書に記載の組成物および方法は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の処置に有用である。非感染細胞の感染に干渉または感染を阻止することができる、欠陥ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物および欠陥ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物を生成する方法が提供される。方法および組成物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の処置に有用である。

Description

優先権出願
本出願は、２０２０年４月２３日に出願された、米国仮出願第６３／０１４，３９４号に基づく優先権の利益を主張しており、その内容は、参考としてその全体が本明細書に詳細に援用される。
政府支援
本発明は、国立衛生研究所によって配賦された１－ＤＰ２－ＯＤ００６６７７－０１およびＤＯＤ／ＤＡＲＰＡによって配賦されたＤ１７ＡＣ００００９の下、政府支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
テキストファイルとして提供される配列表の参照による援用
配列表は、２０２１年４月２３日に作成された１４３，３６０バイトのサイズを有するテキストファイル「２１３５７９３．ｔｘｔ」として本明細書と共に提供される。テキストファイルの内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される。
背景
世界保健機関は、ＣＯＶＩＤ－１９を世界的なパンデミックと宣言している。正式にはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と呼ばれる高い感染力のあるコロナウイルスは、Ｃｏｖｉｄ－１９疾患を引き起こす。最も効果的な封じ込め戦略を用いても、Ｃｏｖｉｄ－１９呼吸器疾患の拡散は減速しただけである。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の現在の株に対する有効なワクチンは存在するが、新しいバリアントおよび変異株が生じ続けている。したがって、感染にも干渉する処置、ならびに／または感染からの回復を促進し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のパンデミックを止めることができる新しいワクチンが必要とされている。
概要
非感染細胞の感染に干渉または感染を阻止することができる、欠陥ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物および欠陥ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物を生成する方法が提供される。方法および組成物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の処置に有用である。
本明細書に記載の欠陥ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２組換え欠失変異体である。そのような組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２欠失変異体は、干渉性および／または条件付き複製性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２欠失変異体であり得る。非ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸がなくても、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、治療用干渉粒子または治療用干渉核酸であり得る。
これらの構築物は、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）、ポリＡテール、またはそれらの組合せを含むシス作用性エレメント、およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノム核酸セグメントを含み得る。典型的には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノム核酸セグメントは、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムと比較して、実質的な欠失を有する。したがって、治療用干渉ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸および粒子は、それら自体ではウイルスの複製および産生が不可能であり得、例えば、ヘルパーウイルスとして作用するために複製能を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を必要とし得る。
そのような治療用干渉粒子、欠陥ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物、および治療用干渉核酸の例としては、５’ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２短縮型配列のいずれか、例えば配列番号２８、３０、３２もしくは３３を有するもののいずれか、および／または３’ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２短縮型配列のいずれか、例えば配列番号３１もしくは３２を有するもののいずれかが挙げられ得る。３’ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列は、伸長されたポリＡ配列を含み得る。例えば、伸長されたポリＡ配列は、少なくとも１００アデニンヌクレオチド～２５０アデニンヌクレオチドを有し得る。そのような伸長されたポリＡ配列は、例えば、ｍＲＮＡの半減期を延長できる。
したがって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２治療用干渉粒子は、ＲＮＡ転写シグナル、翻訳開始部位、伸長されたポリＡテール、またはそれらの組合せを含み得る。さらに、欠失に対して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノム核酸セグメントは、野生型または天然型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムヌクレオチド配列と比較して、１つまたはそれを超えるヌクレオチド配列の変更を有し得る。
また、転写調節配列（ＴＲＳ）の１つまたはそれを超える阻害剤：ＴＲＳ１－Ｌ：５’－ｃｕａａａｃ－３’（配列番号３６）、ＴＲＳ２－Ｌ：５’－ａｃｇａａｃ－３’（配列番号３７）、およびＴＲＳ３－Ｌ、５’－ｃｕａａａｃｇａａｃ－３’（配列番号３８）、ならびにそれらの組成物も本明細書に記載されている。ＴＲＳ阻害剤は、単独で、または治療用干渉粒子ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物と併せて使用して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を阻害および／または感染に干渉することができる。
治療用干渉ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸および／またはＴＲＳ阻害剤は、例えば、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の細胞侵入を阻止するか、ウイルス粒子のアセンブリを媒介する構造タンパク質に対して競合するか、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の再生を低下させるか、ウイルス粒子のアセンブリを阻害するタンパク質を産生するか、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸の転写／複製を阻害するか、またはそれらの組合せであり得る。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２欠失ライブラリの作製および使用を含む方法も本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、主題の方法は、（ａ）配列特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼの標的配列を含むトランスポゾンカセットを環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの集団に挿入して、トランスポゾン挿入された環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの集団を生成すること、（ｂ）トランスポゾン挿入された環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの集団を配列特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼと接触させて、切断された線状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの集団を生成すること、（ｃ）切断された線状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの集団を１種またはそれを超えるエキソヌクレアーゼと接触させて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２欠失ＤＮＡの集団を生成すること、および（ｄ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２欠失ＤＮＡを環状化して、環状化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２欠失ＤＮＡのライブラリを生成することを含む。
いくつかの場合、トランスポゾンカセットは、トランスポゾンカセットの一端またはその付近に配置された第１の認識配列、およびトランスポゾンカセットの他端またはその付近に配置された第２の認識配列を含む。
いくつかのそのような場合、方法は、環状化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２欠失ＤＮＡのライブラリのメンバーを哺乳動物細胞に導入すること、およびウイルス感染性についてアッセイすることをさらに含む。例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２欠失ＤＮＡは、上皮細胞または肺胞細胞（例えば、ヒト肺胞ＩＩ型細胞）に導入され得る。いくつかの場合、方法は、環状化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２欠失ＤＮＡのライブラリのメンバーを配列決定して、欠陥ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２干渉粒子（ＤＩＰ）を同定することをさらに含む。
いくつかの場合、配列特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、またはＴＡＬＥＮから選択される。いくつかの場合、１種またはそれを超えるエキソヌクレアーゼは、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼを含む。いくつかの場合、１種またはそれを超えるエキソヌクレアーゼは、３’から５’へのエキソヌクレアーゼおよび５’から３’へのエキソヌクレアーゼを含む。いくつかの場合、１種またはそれを超えるエキソヌクレアーゼは、ＲｅｃＪを含む。いくつかの場合、主題の方法は、ステップ（ｄ）の前またはステップ（ｄ）と同時にバーコード配列を挿入することを含む。
いくつかの場合、切断された線状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの集団を１種またはそれを超えるエキソヌクレアーゼと接触させるステップは、一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）の存在下で行われる。
欠陥ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２干渉粒子（ＤＩＰ）を生成および同定する方法も提供される。いくつかの場合、方法は、（ａ）配列特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼのための標的配列を、各々がウイルスゲノムを含む環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＤＮＡの集団に挿入して、配列挿入されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＤＮＡの集団を生成すること、（ｂ）配列挿入されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＤＮＡの集団を配列特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼと接触させて、切断された線状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＤＮＡの集団を生成すること、（ｃ）切断された線状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＤＮＡの集団をエキソヌクレアーゼと接触させて、欠失ＤＮＡの集団を生成すること、（ｄ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２欠失ＤＮＡを環状化して、環状化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２欠失ウイルスＤＮＡのライブラリを生成すること、および（ｅ）環状化欠失ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＤＮＡのライブラリのメンバーを配列決定して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２欠失干渉粒子（ＤＩＰ）を同定することを含む。いくつかの場合、方法は、ステップ（ｄ）の前またはステップ（ｄ）と同時にバーコード配列を挿入することを含む。
いくつかの場合、方法は、生成された環状化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２欠失ＤＮＡのライブラリのメンバーを細胞、例えば、哺乳動物細胞に導入すること、およびウイルス感染性についてアッセイすることを含む。いくつかの場合、ステップ（ａ）の挿入することは、トランスポゾンカセットを環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＤＮＡの集団に挿入することを含み、トランスポゾンカセットは配列特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼの標的配列を含み、配列挿入されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＤＮＡの前記生成された集団はトランスポゾン挿入されたウイルスＤＮＡの集団である。いくつかの場合、方法は、ステップ（ｄ）の後に、細胞、例えば、培養中の哺乳動物細胞を環状化欠失ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＤＮＡのライブラリのメンバーに高感染多重度（ＭＯＩ）で感染させること、感染した細胞を１２時間～２日間の範囲の期間培養すること、ナイーブ細胞を培養物に添加すること、および培養中の細胞からウイルスを回収することを含む。いくつかの場合、方法は、ステップ（ｄ）の後に、細胞、例えば、培養中の哺乳動物細胞を環状化欠失ウイルスＤＮＡのライブラリのメンバーに低感染多重度（ＭＯＩ）で感染させること、感染した細胞をウイルス複製の阻害剤の存在下で１日～６日間の範囲の期間培養すること、培養した細胞を機能性ウイルスに高ＭＯＩで感染させること、感染した細胞を１２時間～４日間の範囲の期間培養すること、および培養した細胞からウイルスを回収することを含む。
図の説明
図１は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムおよびコードされたオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）の概略図を示す。
図２Ａ～図２Ｂは、野生型および欠陥ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による細胞の感染を図示する。図２Ａは、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムによる感染の概略図を示す。細胞ゲノム（左側のＤＮＡ）への組込み後、ウイルスカプシドを形成するパッケージングタンパク質を最終的に産生するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡが生成される。感染性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、それらの元の宿主細胞から逃れることができ、新しい細胞が必要な（機能的な野生型）表面認識タンパク質を有する場合、それらに感染することができる。図２Ｂは、欠陥ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２粒子（治療用干渉粒子、ＴＩＰと称される）が生存可能なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と共に存在する場合の感染の概略を示す。欠陥ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２粒子は、パッケージングシグナルを運ぶように操作されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムの切り詰められたバージョン、およびパッケージングに必要な他のウイルスのシスエレメントを有する。したがって、欠陥ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質も発現する細胞によってのみ作製され得る。欠陥ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２粒子は、二重に感染した細胞において野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２よりも欠陥ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノムＲＮＡコピーを実質的に多く産生するように操作される。野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノムＲＮＡよりも欠陥ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノムＲＮＡが不釣り合いに多いと、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２パッケージング材料は主に、欠陥ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノムＲＮＡを封入して浪費される。欠陥ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２粒子は、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のバーストサイズを低下させ、感染した細胞を野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の産生からほとんどを欠陥ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２粒子の産生に変換し、それによって野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス負荷を減少させる。 同上。
図３は、欠陥ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２粒子を作製するためのランダム化されたバーコード化欠失ライブラリを構築するための方法を概略的に図示する。分子クローンからバーコード化ＴＩＰ候補ライブラリを構築するための概略的なサイクル方法は、［１］環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２二本鎖ＤＮＡへのレトロトランスポゾンのインビトロ導入、［２］ランダムに挿入されたレトロトランスポゾンのエキソヌクレアーゼ媒介した切除、［３］環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に欠失（Δ）を作成するように酵素的チュウバック（ｃｈｅｗ ｂａｃｋ）、および［４］バーコード化ＴＩＰ候補ライブラリを生成するように、再ライゲーションの間に環状化およびバーコード化を含む（例えば、いずれも参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ＷｅｉｎｂｅｒｇｅｒらによるＷＯ２０１８１１２２５およびＷｅｉｎｂｅｒｇｅｒらによるＷＯ／２０１４／１５１７７１を参照）。
図４は、欠失ライブラリを生成する方法の一実施形態について、分子の詳細およびステップを図示する概略図である。ステップ（ａ）では、メガヌクレアーゼ（例えば、ｌ－Ｓｃｅｌまたはｌ－Ｃｅｕｌ）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２二本鎖ＤＮＡを切断する。ステップ（ｂ）では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの切断された末端をチュウバックする。ステップ（ｃ）では、チュウバックされた末端を修復する。したがって、欠失したギャップ（Δ）が末端間に存在する。ステップ（ｄ）では、５’リン酸がアルカリホスファターゼ（ＡＰ）によって除去され、ｄＡテールがクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）で生成される。ステップ（ｅ）では、末端をバーコードカセットにライゲーションし、それによって多数の環状バーコード化欠失ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体を生成する。
図５Ａ～図５Ｃは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２欠失変異体のランダム欠失ライブラリを生成および分析する方法を図示する。図５Ａは、３０ｋｂのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２分子クローンに対するランダム欠失ライブラリ（ＲＤＬ）の生成を概略的に図示する。ＲＤＬサブライブラリに使用された３つの１０ｋｂ断片が示されており、３つの断片はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムの異なるセグメントであった。３つの断片の末端をチュウバックし（例えば、図４で説明したように）、バーコード（網掛け円）を、欠失したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡ断片がライゲーションされる時に挿入した。したがって、バーコードは断片に従って異なる位置にあるだろう。バーコードはプライマー開始のための部位を含むので、配列決定により、様々なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２欠失変異体のどこに欠失が存在するかを容易に特定した。図５Ｂは、３つのランダム欠失サブライブラリにおけるバーコード位置のイルミナ・ディープ・シーケンシング・ランドスケープをグラフで図示する。このような配列決定は、サブライブラリが５８７，０００を超えるユニークなＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２欠失変異体を含むことを示した。図５Ｃは、約３０ｋｂのバンドおよびより低分子量のバンド（左側レーンにラダーがある；３つのさらなるレーンは三連である）が存在することを示す、ライゲーションしたＲＤＬライブラリからの電気泳動的に分離したＤＮＡのゲルを示す。 同上。 同上。
図６Ａ～図６Ｄは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２治療用干渉粒子（ＴＩＰ）を生成するために使用される「バイロリアクター（ｖｉｒｏｒｅａｃｔｏｒ）」戦略を図示する。図６Ａは、ビーズに固定化され、穏やかな撹拌下の懸濁液中で増殖され、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に指し示されたＭＯＩで感染したＶｅｒｏＥ６細胞を概略的に図示する。５０％の細胞および培地を１日おきに回収し、置き換えた。図６Ｂは、細胞死のマーカーであるヨウ化プロピジウムについて染色した、回収した細胞のフローサイトメトリーのプロットを示す。図６Ｃは、０．５のＭＯＩでのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染後の細胞生存率のパーセンテージをグラフで図示する。図６Ｄは、５．０のＭＯＩでのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染後の細胞生存率（％）をグラフで図示する。図６Ｃ～図６Ｄに示すように、生存可能な遊離細胞（円形記号）および生存可能な固定化細胞（三角形記号）のパーセンテージは、細胞生存率において初期低下を示すが、培養物は感染後１４日目までに回復する。 同上。 同上。
図７Ａ～図７Ｂは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＴＩＰ１およびＴＩＰ２の２つの治療用干渉粒子構築物の構造を概略的に図示する。図７Ａは、ＴＩＰ１構築物の構造の一例を示す。図７Ｂは、ＴＩＰ２構築物の構造の一例を示す。概略は、ＴＩＰ１およびＴＩＰ２がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の５’および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の部分をコードすることを示す。ＴＩＰ１は、４５０ｎｔの５’ＵＴＲおよび３３０ｎｔの３’ＵＴＲをコードする。ＴＩＰ２は、５’ＵＴＲ領域およびより大きな部分のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＯＲＦ１ａ（すなわち、ＴＩＰ２はＯＲＦ１ａの欠失をコードする）を含む。したがって、ＴＩＰ１およびＴＩＰ２はパッケージングシグナルを含むが、ウイルスＯＲＦ１ａ遺伝子の機能的コピーを発現することはできない。ＴＩＰ２によってコードされる３’ＵＴＲは、上流４１３ｎｔまでＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ Ｎ遺伝子内に伸長する一方、ＴＩＰ２はＮ遺伝子の機能的形態をコードしない（すなわち、それはＮ遺伝子の一部の欠失をコードする）。分析を容易にするために、カセットはまた、フローサイトメトリー分析のためのＩＲＥＳ－ｍＣｈｅｒｒｙレポーターも含む。 同上。
図８Ａ～図８Ｃは、４つの異なる種類の治療用干渉粒子（ＴＩＰ）がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の複製を５０分の１未満に減少させることをグラフで図示する。図８Ａは、様々な治療用干渉粒子（ＴＩＰ）が存在する場合でのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡの倍数変化をグラフで図示する。細胞をＴＩＰ１（Ｔ１）、ＴＩＰ１＊（Ｔ１＊）、ＴＩＰ２（Ｔ２）またはＴＩＰ２＊（Ｔ２＊）のｍＲＮＡでトランスフェクトし、細胞をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＭＯＩ＝０．００５）に感染させた。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２複製の収量減少を、感染の４８時間後にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｍＲＮＡ（Ｅ遺伝子）の減少倍数を測定することによって評価した。ＴＩＰ中に存在しない、Ｎ遺伝子の５’末端およびＥ遺伝子に特異的なプライマーを用いたＲＴ－ｑＰＣＲによってｍＲＮＡを定量した。Ｅ遺伝子プライマーによって検出されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｍＲＮＡの減少倍数を示す。ＴＩＰ２は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に最大の干渉を示す。図８Ｂは、ＴＩＰ１およびＴＩＰ２治療用干渉粒子をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムと共に約２４時間インキュベートした場合のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムの相対Ｌｏｇ１０量を、治療用干渉粒子を含まない対照と比較して、グラフで図示する。図８Ｃは、ＴＩＰ１およびＴＩＰ２治療用干渉粒子をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムと共に約４８時間インキュベートした場合のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムの相対Ｌｏｇ１０量を、治療用干渉粒子を含まない対照と比較して、グラフで図示する。
図９Ａ～図９Ｂは、ＴＩＰ候補がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって動員され、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と一緒に伝播することを示す。図９Ａは、ＴＩＰ１およびＴＩＰ２粒子と共にインキュベートしたナイーブ非感染細胞からの上清を受けた対照細胞と比較して、ＴＩＰ１およびＴＩＰ２治療用干渉粒子と共にインキュベートしたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染細胞から移した上清を受けたＶｅｒｏ細胞によるｍＣｈｅｒｒｙ発現のフローサイトメトリー分析を示す。示されるように、ＴＩＰ１またはＴＩＰ２粒子が存在した場合、ｍＣｈｅｒｒｙを発現する細胞が検出されたが、対照細胞ではｍＣｈｅｒｒｙを発現する細胞は本質的に検出されなかった。図９Ｂは、ＴＩＰ１およびＴＩＰ２治療用干渉粒子を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した細胞と共に２４時間インキュベートした場合のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムのｌｏｇ１０量を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染していない対照と比較して、グラフで図示する。図９Ｃは、ＴＩＰ１およびＴＩＰ２治療用干渉粒子を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した細胞と共に４８時間インキュベートした場合のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムのｌｏｇ１０量を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染していない対照と比較して、グラフで図示する。 同上。
図１０は、アンチセンス転写調節配列（ＴＲＳ）を用いたトランスフェクションによってＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の転写を干渉するための方法を概略的に図示する。
図１１Ａ～図１１Ｃは、アンチセンス転写調節配列（ＴＲＳ）がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のプラーク形成単位（ｐｆｕ）を減少させ得ることをグラフで図示する。図１１Ａは、アンチセンスＴＲＳ１（ＡＣＧＡＡＣＣＵＡＡＡＣＡＣＧＡＡＣＣＵＡＡＡＣ（配列番号２５））でトランスフェクション後のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｐｆｕをグラフで図示する。図１１Ｂは、アンチセンスＴＲＳ２（ＡＣＧＡＡＣＡＣＧＡＡＣＡＣＧＡＡＣＡＣＧＡＡＣ（配列番号２６））でトランスフェクション後のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｐｆｕをグラフで図示する。図１１Ｃは、アンチセンスＴＲＳ３（ＣＵＡＡＡＣＣＵＡＡＡＣＣＵＡＡＡＣＣＵＡＡＡＣ（配列番号２７））でトランスフェクション後のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｐｆｕをグラフで図示する。 同上。
図１２は、ＴＲＳとＴＩＰ１またはＴＩＰ２のいずれかとの組合せが、ＴＲＳ単独と比較して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノム数を有意に減少させたことをグラフで図示する。
図１３Ａ～図１３Ｃは、ＴＩＰ１およびＴＩＰ２治療用干渉粒子が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の南アフリカおよびＵ．Ｋ．株を含む様々なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株の複製を有意に減少させることを図示する。図１３Ａは、ＴＩＰ１およびＴＩＰ２が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の南アフリカ５０１Ｙ．Ｖ２．ＨＶデルタバリアントの複製を有意に減少させることを図示する。図１３Ｂは、ＴＩＰ１およびＴＩＰ２が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の南アフリカ５０１Ｙ．Ｖ２．ＨＶバリアントの複製を有意に減少させることを図示する。図１３Ｃは、ＴＩＰ１およびＴＩＰ２が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＵ．Ｋ Ｂ．１．１．７バリアントの複製を有意に減少させることを図示する。
詳細な説明
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に干渉し得る欠陥ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２粒子（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２治療用干渉粒子）を作製する方法、およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を低減させるのに有用なそのような干渉性治療粒子の組成物が本明細書に記載されている。
本明細書に示されるように、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２治療用干渉粒子（ＴＩＰ）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の複製を５０分の１未満に減少させることができる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＴＩＰは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムの５’および３’末端のセグメントを含み得る。例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＴＩＰは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の５’－ＵＴＲおよび３’－ＵＴＲのセグメントを含み得る。いくつかの場合、検出可能なマーカーおよび／またはバーコードは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムの５’セグメントと３’セグメントとの間に存在し得る。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２治療用干渉粒子（ＴＩＰ）の例としては、本明細書に記載のＴＩＰ１、ＴＩＰ２、ＴＩＰ１＊、およびＴＩＰ２＊構築物が挙げられる。
ＴＩＰ１における５’ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列は以下に示す通りである（配列番号２８）。
Figure 2023530049000002
ＴＩＰ１における３’ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列を配列番号２９として以下に示す。
Figure 2023530049000003
ＴＩＰ２における５’ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列は以下に示す通りである（配列番号３０）。
Figure 2023530049000004
ＴＩＰ２における３’ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列は以下に示す通りである（配列番号３１）。
Figure 2023530049000005
Figure 2023530049000006
２つのさらなるＴＩＰバリアントはクローニングされたＴＩＰ１＊およびＴＩＰ２＊であり、これらは５’ＵＴＲ内に共通のＣ－２４１－Ｔ変異を含む。このＣ２４１Ｔ ＵＴＲ変異は、スパイクタンパク質Ｄ６１４Ｇ変異と一緒に集団間で共伝播する。
よって、ＴＩＰ１＊における５’ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列は以下に示す通りである（配列番号３２）。
Figure 2023530049000007
同様に、ＴＩＰ２＊における５’ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列は以下に示す通りである（配列番号３３）。
Figure 2023530049000008
Figure 2023530049000009
本明細書に記載の実験において使用されるＴＩＰ構築物は、５’ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸と３’ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸との間にコードされるマーカー（ｍＣｈｅｒｒｙ）を含んだ。そのようなマーカーの発現は、ＴＩＰ構築物でトランスフェクトした細胞においてＴＩＰ構築物の複製を検出することを可能にした。そのようなマーカーを含めることは、ＴＩＰをモニタリングするのに有用であるが、マーカーは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した患者または対象の処置として投与される治療用干渉粒子には必要ないか、または含まれなくてもよい。
一般に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２治療用干渉粒子を作製する方法は、環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの集団をＤＮＡ環の異なる位置で切断して、切断された（線状化された）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡのライブラリを生成することを含み、このライブラリのメンバーは異なる位置で切断されている。次いで、１種またはそれを超えるエキソヌクレアーゼを使用して切断部位の末端を「チュウバック」し、次いで「噛まれた末端（ｃｈｅｗｅｄ ｅｎｄｓ）」をライゲーションして環状ＤＮＡを再形成する。これにより、欠失ライブラリを生成する。ステップ（例えば、ライブラリのメンバーに対する異なる位置での切断ステップ）の各々を達成するために多くの方法があり、環状化（例えば、ライゲーション）ステップの前に行い得る任意のステップが存在する。以下でより詳細に論じられるように、２ラウンド以上のライブラリ生成を行うことができ、したがって、主題の方法を使用して、ライブラリのメンバーが２回以上の欠失を含む複雑な欠失ライブラリを生成することができる。
切断された（線状化された）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡのライブラリの生成
本明細書に記載の方法は、環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの集団から切断された（線状化された）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡのライブラリを生成することを含む。いくつかの場合、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡ集団の切断の位置はランダムである。例えば、トランスポゾンカセットをランダムな位置でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの集団に挿入することができ、トランスポゾンカセットは、配列特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼのための標的配列（認識配列）を含む。そのような場合、トランスポゾンカセットは、認識配列をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの集団に（ランダムな位置で）挿入するためのビヒクルとして使用されている。次いで、配列特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼ（認識配列を認識するもの）を使用してＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡを切断し、それによって切断された（線状化された）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡのライブラリを生成することができ、ライブラリのメンバーは異なる位置で切断されている。
「トランスポゾンカセット」という用語は、本明細書では、目的の配列をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡに挿入するためにトランスポゾンによって使用され得る配列によって挟まれた「目的の配列」を含む核酸分子を意味するために使用される。したがって、いくつかの場合、「目的の配列」は、トランスポゾン適合性逆方向末端反復（ＩＴＲ）、すなわち、トランスポゾンによって認識され、利用されるＩＴＲによって挟まれる。トランスポゾンカセットが１つまたはそれを超える標的配列（１種またはそれを超える配列特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼ用）をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡに挿入するためのビヒクルとして使用される場合、目的の配列は１つまたはそれを超える認識配列を含み得る。
いくつかの場合、目的の配列は、選択可能なマーカー遺伝子、例えば、薬物耐性、例えば抗生物質耐性をもたらすタンパク質をコードする遺伝子などの選択可能なマーカーをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの場合、目的の配列は、第１の配列特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼ（例えば、第１のメガヌクレアーゼ）のための認識配列の第１のコピーおよび第２のコピーを含む。いくつかの場合、目的の配列は、配列特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼ（例えば、メガヌクレアーゼ）のための第１および第２の認識配列によって挟まれる選択可能なマーカー遺伝子を含む。いくつかのそのような場合、第１の認識配列および第２の認識配列は同一であり、認識配列の第１のコピーおよび第２のコピーと見なすことができる。いくつかのそのような場合、第１の認識配列は第２の認識配列とは異なる。いくつかの場合、第１の認識配列および第２の認識配列（例えば、認識配列の第１および第２のコピー）は、選択可能なマーカー遺伝子、例えば抗生物質耐性タンパク質などの薬物耐性タンパク質をコードするものを挟む。いくつかの実施形態では、主題のトランスポゾンカセットは、第１のメガヌクレアーゼのための認識配列の第１のコピーおよび第２のコピー、ならびに第２のメガヌクレアーゼのための認識配列の第１のコピーおよび第２のコピーを含む。
上記のシナリオのいずれにおいても、いくつかの場合、第１および／または第２の認識配列は、ｌ－Ｓｃｅｌメガヌクレアーゼ（例えば、ａａｃｔａｔａａｃｇｇｔｃｃｔａａ＾ｇｇｔａｇｃｇａａ（配列番号３４））のための部位である。いくつかの場合、第１および／または第２の認識配列は、ｌ－Ｃｅｕｌメガヌクレアーゼ（例えば、ａａｃｔａｔａａｃｇｇｔｃｃｔａａ＾ｇｇｔａｇｃｇａａ（配列番号３５））のための部位である。図４を参照されたい。いくつかの場合、第１の認識配列はｌ－Ｓｃｅｌのための部位であり、第２の認識配列はｌ－Ｃｅｕｌのための部位である。いくつかの場合、第１および／または第２の認識配列は、例えば、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼ（ＬＭＮ）、ｌ－Ｓｃｅｌ、ｌ－Ｃｅｕｌ、ｌ－Ｃｒｅｌ、ｌ－Ｄｍｏｌ、ｌ－Ｃｈｕｌ、Ｉ－Ｄｉｒｌ、ｌ－Ｆｌｍｕｌ、ｌ－Ｆｌｍｕｌｌ、ｌ－Ａｎｉｌ、ｌ－ＳｃｅｌＶ、ｌ－Ｃｓｍｌ、ｌ－Ｐａｎｌ、ｌ－Ｐａｎｌｌ、ｌ－ＰａｎＭＩ、ｌ－Ｓｃｅｌｌ、ｌ－Ｐｐｏｌ、ｌ－Ｓｃｅｌｌｌ、Ｉ－Ｌｔｒｌ、ｌ－Ｇｐｉｌ、ｌ－ＧＺｅｌ、ｌ－Ｏｎｕｌ、ｌ－ＨｊｅＭＩ、ｌ－Ｍｓｏｌ、ｌ－Ｔｅｖｌ、ｌ－Ｔｅｖｌｌ、ｌ－Ｔｅｖｌｌｌ、Ｐｌ－Ｍｌｅｌ、Ｐｌ－Ｍｔｕｌ、Ｐｌ－Ｐｓｐｌ、Ｐｌ－Ｔｌｉ Ｉ、Ｐｌ－Ｔｌｉ ＩＩ、およびＰｌ－ＳｃｅＶから選択されるメガヌクレアーゼのための認識配列である。
上記のように、主題のトランスポゾンカセットは、トランスポザーゼ適合性逆方向末端反復（ＩＴＲ）によって挟まれる目的の配列を含む。ＩＴＲは、任意の所望のトランスポザーゼ、例えば、Ｔｎ３、Ｔｎ５、Ｔｎ７、Ｔｎ９、Ｔｎ１０、Ｔｎ９０３、Ｔｎ１６８１などの細菌トランスポザーゼ、および例えば、Ｔｃ１／ｍａｒｉｎｅｒスーパーファミリートランスポザーゼ、ｐｉｇｇｙＢａｃスーパーファミリートランスポザーゼ、ｈＡＴスーパーファミリートランスポザーゼ、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ、Ｆｒｏｇ Ｐｒｉｎｃｅ、Ｍｉｎｏｓ、Ｈｉｍａｒｌなどの真核生物トランスポザーゼと適合性であり得る。いくつかの場合、トランスポザーゼ適合性ＩＴＲは、Ｔｎ５トランスポザーゼと適合性である（すなわち、Ｔｎ５トランスポザーゼによって認識され、利用され得る）。本明細書で提供される方法のいくつかは、トランスポザーゼカセットをＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡに挿入するステップを含む。そのようなステップは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡおよびトランスポゾンカセットをトランスポザーゼと接触させることを含む。いくつかの場合、この接触は細菌細胞などの細胞の内部で起こり、いくつかの場合、この接触はインビトロで細胞の外部で起こる。上で列挙したトランスポザーゼ適合性ＩＴＲは、本明細書に開示される組成物および方法に適しているので、トランスポザーゼも同様である。したがって、適切なトランスポザーゼには、Ｔｎ３、Ｔｎ５、Ｔｎ７、Ｔｎ９、Ｔｎ１０、Ｔｎ９０３、Ｔｎ１６８１などの細菌トランスポザーゼ、および例えばＴｃ１／ｍａｒｉｎｅｒスーパーファミリートランスポザーゼ、ｐｉｇｇｙＢａｃスーパーファミリートランスポザーゼ、ｈＡＴスーパーファミリートランスポザーゼ、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ、Ｆｒｏｇ Ｐｒｉｎｃｅ、Ｍｉｎｏｓ、Ｈｉｍａｒｌなどの真核生物トランスポザーゼが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの場合、トランスポザーゼはＴｎ５トランスポザーゼである。
いくつかの実施形態では、主題の方法は、配列特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼ（例えば、１種またはそれを超える配列特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼ）のための標的配列（例えば、１つまたはそれを超える標的配列）を環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの集団に挿入し、それによって配列挿入された環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの集団を生成するステップを含む。いくつかの場合、挿入するステップは、標的配列（例えば、１つまたはそれを超える標的配列）を含むトランスポゾンカセットを挿入することによって行われ、それによってトランスポゾン挿入された環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの集団を生成する。いくつかの場合、トランスポゾンカセットは単一の認識配列（例えば、トランスポゾンカセットの中央または１つの末端付近にある）を含み、単一の認識配列をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの集団に導入するために使用され得る。いくつかの場合、トランスポゾンカセットは、２つ以上の認識配列（例えば、第１および第２の認識配列）を含む。いくつかのそのような場合、第１および第２の認識配列は、第１および第２の認識配列の切断がトランスポゾンカセット（またはトランスポゾンカセットの大部分）をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡから効果的に除去しながら、同時に線状化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡを生成し、よって、ライブラリのメンバーが異なる位置で切断されている、所望の切断された（線状化された）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡのライブラリを生成するように、第１および第２の認識配列はトランスポゾンカセットの末端またはその近く（例えば、末端の２０塩基、３０塩基、５０塩基、６０塩基、７５塩基、または１００塩基以内）に配置される。
トランスポゾンカセットが第１および第２の認識配列を含むいくつかの場合、第１および第２の認識配列は同じであり、したがって所与の認識配列の第１および第２のコピーである。いくつかのそのような場合、同じ配列特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼ（例えば、制限酵素、メガヌクレアーゼ、プログラム可能なゲノム編集ヌクレアーゼ）を使用して両方の部位で切断することができる。
いくつかの実施形態では、トランスポゾンカセットは、同じでない第１および第２の認識配列を含む。いくつかのそのような場合、異なる配列特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼ（例えば、制限酵素、メガヌクレアーゼ、プログラム可能なゲノム編集ヌクレアーゼ）を使用して２つの部位を切断する（例えば、トランスポゾン挿入されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡのライブラリを、２種の配列特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼと接触させ得る）。しかしながら、いくつかの場合、１種の配列特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼを依然として使用することができる。例えば、いくつかの場合、２つの異なるガイドＲＮＡを同じＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質と共に使用することができる。別の例として、いくつかの場合、所与の配列特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、両方の認識配列を認識することができる。
いくつかの場合、環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡ（例えば、プラスミド）の集団が宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌）などの細菌宿主細胞）の内部に存在し、トランスポゾンカセットを宿主細胞の内部に挿入するステップが行われる。例えば、方法は、トランスポザーゼおよび／もしくはトランスポザーゼをコードする核酸を選択された細胞に導入すること、または細胞内でのトランスポザーゼをコードする既存の発現カセットからのトランスポザーゼの発現などを含み得る。いくつかのそのような場合、主題の方法は、宿主細胞における選択／増殖ステップを含み得る。例えば、トランスポゾンカセットが薬物耐性マーカーを含む場合、宿主細胞を、トランスポゾン挿入された環状標的ＤＮＡを有する細胞を選択するために、薬物の存在下で増殖させることができる。
トランスポゾン挿入された環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの集団が生成されると（いくつかの場合、宿主細胞における選択／増殖ステップの後）、次のステップの前に（例えば、それらを配列特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼと接触させる前に）、集団を宿主細胞から単離／精製することができる。
環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡは小さい環状ＤＮＡ（例えば、５０ｋｂ未満）であり得るので、いくつかの場合、インビトロでのローリングサークル増幅（ＲＣＡ）の使用によって、細菌における選択および増殖ステップを回避することができる。例えば、転位後にニックの入った標的ＤＮＡの修復後、挿入されたトランスポゾンカセットに特異的なプライマーと共に、高度にプロセッシブで鎖置換性のポリメラーゼ（例えば、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ）を使用して、環状プラスミドのプールから挿入変異体を選択的に増幅することができる。換言すれば、そのようなステップは、細菌形質転換を介したＤＮＡの増幅を回避することができる。ＲＣＡの使用は、細菌の増殖／選択に必要な時間を短縮することができ、細菌の増殖を妨げないクローンに対してライブラリを偏らせることを回避することができる。
非ランダム切断
上記のように、いくつかの場合、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡ集団の切断の位置はランダムであるが、いくつかの場合、切断の位置はランダムではない。例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの集団を異なるベッセル（例えば、異なるチューブ、マルチウェルプレートの異なるウェルなど）に分配（例えば、アリコート）することができる。目的の特定の配列がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノム配列内で選択される場合、その目的の配列は環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡ内で切断され得る。環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの別々のアリコートを異なるベッセル（例えば、マルチウェルプレートのウェル）内に置くことができ、環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの異なるアリコートを、プログラム可能な配列特異的エンドヌクレアーゼを使用することによって異なる所定の位置で切断することができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１など）を使用する場合、ガイドＲＮＡは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノム内の任意の所望の配列を標的とするように（例えば、いくつかの場合、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列要件を考慮に入れながら）容易に設計することができる。例えば、ガイドＲＮＡは、環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡに沿って任意の所望の間隔（例えば、５ヌクレオチド（ｎｔ）ごと、１０ｎｔごと、２０ｎｔごと、５０ｎｔごと－重複、非重複など）でタイリングすることができる。各ベッセル（例えば、各ウェル）の環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡを、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼに加えてガイドＲＮＡの１つと接触させることができる。このようにして、切断されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡのライブラリを生成することができ、ライブラリのメンバーは別々のベッセル内にあるため互いに分離されている。当業者によって理解され得るように、いくつかの場合、ガイドＲＮＡを設計するときにＰＡＭ配列を考慮に入れることになり得、したがって、ガイドＲＮＡの標的部位間の間隔はＰＡＭ配列の制約の関数であり得、所与の標的配列にわたる一貫した間隔は、いくつかの場合、必ずしも可能ではないだろう。しかしながら、異なるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、異なる種から単離されたＣａｓ９などの同じタンパク質でさえも）は、異なるＰＡＭ要件を有し得、したがって、２種以上のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼの使用は、いくつかの場合、利用可能な標的部位に対するＰＡＭ要件によって課される少なくともいくつかの制約を緩和し得る。そして、方法のさらなるステップを別々に行うことができ（例えば、別々のベッセル内、マルチウェルプレートの別々のウェル内）、または任意のステップで、メンバーをプールし、１つのベッセルで一緒に処置することができる。
例示的であるが非限定的な例として、９６個の異なるガイドＲＮＡ（または３８４個の異なるガイドＲＮＡ）を使用して、９６ウェルプレートの９６個の異なるウェル（または３８４ウェルプレートの３８４個の異なるウェル）で環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡのアリコートを切断して、各メンバーが異なる部位で切断されている９６個のメンバー（または３８４個のメンバー）のライブラリを生成することができる。切断部位は、方法を開始する前にユーザによって設計され得る。次いで、エキソヌクレアーゼステップ（チュウバック）を別個のウェル（例えば、エキソヌクレアーゼを各ウェルにアリコートすることによって）で行い得るか、またはさらに２つのウェルをプールした後、エキソヌクレアーゼをプールに添加し得る。
環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡ
環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの集団の環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡは、任意の環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡであり得、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の任意の単離物から生成され得る。いくつかの場合、環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡはプラスミドＤＮＡである。例えば、いくつかの場合、環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡは複製起点（ＯＲＩ）を含む。いくつかの場合、環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡは、薬物耐性マーカー（例えば、薬物耐性をもたらすタンパク質をコードするヌクレオチド配列）を含む。いくつかの実施形態では、環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの集団は、線状ＤＮＡ分子の集団から（例えば、分子内ライゲーションを介して）生成される。例えば、主題の方法は、線状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡ分子の集団（例えば、ＰＣＲ産物の集団、線状ウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムの集団、制限消化物由来の産物の集団など）を環状化して、環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの集団を生成するステップを含み得る。いくつかの場合、そのような集団のメンバーは同一である（例えば、ＰＣＲ産物または制限消化物の多くのコピーを使用して、各環状ＤＮＡが同一であるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの集団を生成することができる）。いくつかの場合、そのような環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの集団のメンバーは互いに異なり得る。例えば、環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの集団は、２つまたはそれを超える異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２分離株から生成され得るか、または異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＰＣＲ産物から生成され得るか、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の異なる制限消化産物から生成され得る。
いくつかの場合、環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの集団自体が欠失ライブラリであり得る。例えば、環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの集団は、公知の欠失変異体（例えば、公知のウイルス欠失変異体）のライブラリであり得る。別の例として、主題の方法を２ラウンド行う場合、第２ラウンドのためのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの開始集団は、ライブラリのメンバーがライブラリの他のメンバーと比較して異なるＤＮＡセクションの欠失を含む欠失ライブラリ（例えば、第１ラウンドの欠失の間に生成される）であり得る。そのようなライブラリは、環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの集団として機能することができ、例えば、トランスポゾンカセットを依然として集団に導入することができる。したがって、この様式で第２ラウンドの欠失を行うことにより、複数の異なるエントリーポイントで欠失を有する構築物を生成することができる。例示的な例として、長さが約２９～３０ｋｂ（キロベース）のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの場合、第１ラウンドの欠失は、（生成されたライブラリの）１つのメンバーについて欠失塩基２０００から２６５０個を有し得、そのうち複数のコピーが存在する可能性があり得る。第２ラウンドの欠失は、２つの新しいメンバーを生成し得、それらは両方とも同じ欠失メンバーのコピーから生成される。このため、例えば、塩基３５００から３６５０個が（塩基２０００から２６５０個に加えて）欠失された状態で１つの新しいメンバーが生成され得る一方、塩基１５００から１５８０個が（塩基２０００から２６５０個に加えて）欠失された状態で第２の新しいメンバーが生成され得る。したがって、複数ラウンド（例えば、２、３、４、５など）の欠失により、複雑な欠失ライブラリを生産することができる。いくつかの場合、例えば上記のように、第２ラウンドがトランスポゾンカセットの挿入を含む、２ラウンド以上のライブラリ生成が行われる。
例えば、いくつかの場合、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼを使用して第１ラウンドの欠失を行い、環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡ）の集団内の予め選択された部位にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼを標的化することによって（例えば、目的の１つまたはそれを超えるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列を標的とするように、例えば予め選択された間隔でガイドＲＮＡを設計することによって）、切断された線状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡを生成する。環状化欠失ＤＮＡの第１のライブラリを生成するためのエキソヌクレアーゼ処置および環状化の後、環状化欠失ＤＮＡのライブラリは、第２ラウンドの欠失のために（環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの集団としての）入力として使用される。したがって、１種またはそれを超える配列特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼ（例えば、１種またはそれを超えるメガヌクレアーゼ）のための１つまたはそれを超える標的配列を環状化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２欠失ＤＮＡのライブラリに（例えば、トランスポゾンカセットを介してランダムな位置で）挿入して、トランスポゾン挿入された環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの集団を生成し、方法を継続する。いくつかのそのような場合、第１ラウンドの欠失は、欠失のために少数の目的の位置（１つの位置、例えば、１種のガイドＲＮＡのみを使用して特定の位置を標的化すること、または少数の位置、例えば、少数のガイドＲＮＡを使用して少数の位置を標的化すること）のみを標的とし得るが、第２ラウンドは、第１の欠失＋第２の欠失を含む欠失構築物を生成するために使用される。
いくつかの場合、環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡはウイルスゲノム全体を含む。他の場合、環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡは部分的なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスゲノムを含む。したがって、いくつかの場合、主題の方法は、ウイルス欠失変異体のライブラリを生成するために使用される。いくつかのそのような場合、生成されたウイルス欠失変異体のライブラリは、潜在的な欠陥干渉粒子（ＤＩＰ）のライブラリと見なすことができる。ＤＩＰは、同じ細胞内で複製する野生型ウイルスによって補完される場合を除いて複製することができないように、ゲノム欠失を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの変異バージョンである。ウイルスゲノムはシス作用性およびトランス作用性エレメントの両方をコードするので、欠陥干渉粒子（ＤＩＰ）は自然に生じ得る。トランス作用性エレメント（トランスエレメント）は、カプシドタンパク質または転写因子などの遺伝子産物をコードし、シス作用性エレメント（シスエレメント）は、ウイルスゲノム増幅、カプシド形成およびウイルス排出を含む生産的なウイルス複製を達成するためにトランスエレメント産物と相互作用するウイルスゲノムの領域である。換言すれば、欠損した（欠失した）トランスエレメントがトランスで提供される場合（例えば、ウイルスを共感染させることによって）、ＤＩＰのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスゲノムは依然としてコピーされ、ウイルス粒子にパッケージングされ得る。いくつかの場合、ＤＩＰは、例えば、利用可能なトランスエレメントに対して競合し、よって希釈することによって、共感染ウイルスのウイルス感染性を低下させるために治療的に使用することができる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＩＰが治療薬として（例えば、Ｃｏｖｉｄ－１９感染の処置として）使用され得るそのような場合、そのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＩＰは治療用干渉粒子（ＴＩＰ）と称され得る。
ＤＩＰは自然に発生し得るが、本開示の方法は、例えば、ウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムの欠失ライブラリを生成することによって、有用なタイプのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＩＰを生成するために使用することができる。そして、ライブラリメンバーを配列決定してＤＩＰであると予測されるものを同定することによって、そのような欠失ライブラリからＤＩＰを同定することができる。あるいは、またはさらに、生成された欠失ライブラリをスクリーニングすることができる。例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＩＰのライブラリを細胞に導入して、所望の機能を有するウイルスゲノムを有するメンバーを同定することができる。ＤＩＰおよびＴＩＰならびにそれらの使用のさらなる説明は、米国特許出願公開第２０１６００１５７５９号に提供されており、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
したがって、いくつかの場合、主題の方法は、生成されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２欠失構築物のライブラリのメンバーを標的細胞（例えば、ヒト細胞などの哺乳動物細胞などの真核細胞）に導入すること、および感染性についてアッセイすることを含む。いくつかのそのような場合、アッセイするステップはまた、共感染ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスによるライブラリメンバーの補完を含む。
そのような導入は、本明細書では、細胞への核酸の導入の任意の形態（例えば、エレクトロポレーション、トランスフェクション、リポフェクション、ナノ粒子送達、ウイルス送達など）を包含することを意味する。例えば、そのような「導入」は、培養中の哺乳動物細胞へ（例えば、環状化欠失ウイルスＤＮＡの生成されたライブラリのメンバーによってコードされるウイルスゲノムを含むウイルス粒子としてカプセル化することができる環状化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２欠失ウイルスＤＮＡの生成されたライブラリのメンバーを用いて）感染させることを包含する。
いくつかの場合、方法は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２欠失ＤＮＡのライブラリから、線状二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）産物、線状一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）産物、線状一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）産物、および線状二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）産物のうちの少なくとも１つを生成することを含む。したがって、いくつかのそのような場合、主題の方法は、そのような線状ｄｓＤＮＡ産物、線状ｓｓＤＮＡ産物、線状ｓｓＲＮＡ産物、および／または線状ｄｓＲＮＡ産物を哺乳動物細胞に（例えば、エレクトロポレーション、トランスフェクション、リポフェクション、ナノ粒子送達、ウイルス送達などを含むがこれらに限定されない、細胞に核酸を導入するための任意の好都合な方法を介して）導入することを含む。
そのような方法はまた、ウイルス感染性についてアッセイすることを含み得る。ウイルス感染性についてのアッセイは、任意の好都合な方法を使用して行うことができる。ウイルス感染性についてのアッセイは、環状化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２欠失ＤＮＡのライブラリのメンバー（および／または環状化欠失ＤＮＡのライブラリから生成される、線状二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）産物、線状一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）産物、線状一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）産物、および線状二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）産物のうちの少なくとも１つ）が導入される細胞に対して行うことができる。例えば、いくつかの場合、メンバーおよび／または産物は、カプセル化粒子として導入される。いくつかの場合、環状化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２欠失ＤＮＡのライブラリのメンバー（および／または環状化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２欠失ＤＮＡのライブラリから生成される、線状ｄｓＤＮＡ産物、線状ｓｓＤＮＡ産物、線状ｓｓＲＮＡ産物、および線状ｄｓＲＮＡ産物のうちの少なくとも１つ）を、ウイルス粒子を生成させるために第１の細胞の集団（例えば、哺乳動物細胞）に導入し、次いで、ウイルス粒子を使用して第２の細胞の集団（例えば、哺乳動物細胞）と接触させる。したがって、本明細書で使用される場合、特に明記しない限り、「ウイルス感染性についてのアッセイ」という語句は、上記のシナリオの両方を包含する（例えば、メンバーおよび／または産物が導入された細胞における感染性についてアッセイすることを包含し、上記のような第２の細胞の集団をアッセイすることも包含する）。
いくつかの実施形態では、主題の方法（例えば、ＤＩＰを生成および同定する方法）は、欠失ライブラリ（例えば、環状化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２欠失ＤＮＡのライブラリ）を生成した後、高感染多重度（ＭＯＩ）（例えば、＞２のＭＯＩを利用する）スクリーニングを含む。本明細書で使用される場合、「高ＭＯＩ」は、２またはそれを超える（例えば、２．５またはそれを超える、３またはそれを超える、５またはそれを超えるなど）のＭＯＩである。いくつかの場合、主題の方法は高ＭＯＩを使用する。したがって、いくつかの場合、主題の方法は、２もしくはそれを超える、３もしくはそれを超える、または５もしくはそれを超えるＭＯＩ（高ＭＯＩ）を使用する。いくつかの場合、主題の方法は、２～１５０（例えば、２～１００、２～８０、２～５０、２～３０、３～１５０、３～１００、３～８０、３～５０、３～３０、５～１５０、５～１００、５～８０、５～５０、または５～３０）の範囲のＭＯＩ（高ＭＯＩ）を使用する。いくつかの場合、主題の方法は、３～１００（例えば、５～１００）の範囲のＭＯＩ（高ＭＯＩ）を使用する。高ＭＯＩでは、多くの（すべてではないにしても）細胞が２つ以上のウイルスにより感染し、これにより、野生型カウンターパートによる欠陥ウイルスの補完が可能になる。高ＭＯＩでの欠失変異体ライブラリの反復継代は、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって効果的に動員され得る変異体を選択することができる。例えば、いくつかの場合、方法は、培養中の哺乳動物細胞を環状化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２欠失ウイルスＤＮＡのライブラリのメンバーに高感染多重度（ＭＯＩ）で感染させること、感染した細胞を１２時間～２日間（例えば、１２時間～３６時間または１２時間～２４時間）の範囲の期間培養すること、ナイーブ細胞を培養物に添加すること、および培養中の細胞からウイルスを回収することを含む。しかしながら、このスクリーニングステップは、いくつかの場合、野生型ウイルスによって効果的に動員され得るが、野生型共感染の非存在下では細胞変性であるＤＩＰ／ＴＩＰを選択する可能性がある。
したがって、いくつかの実施形態では、主題の方法（例えば、ＤＩＰを生成および同定する方法）は、よりストリンジェントなスクリーニング（本明細書では「低感染多重度（ＭＯＩ）スクリーニング」と称される）を含む。本明細書で使用される場合、「低ＭＯＩ」は、１未満（例えば、０．８未満、０．６未満など）のＭＯＩの使用を含む。いくつかの場合、主題の方法は低ＭＯＩを使用する。したがって、いくつかの場合、主題の方法は、１未満（例えば、０．８未満、０．６未満）のＭＯＩ（低ＭＯＩ）を使用する。いくつかの場合、主題の方法は、０．００１～０．８（例えば、０．００１～０．６、０．００１～０．５、０．００５～０．８、０．００５～０．６、０．０１～０．８、または０．０１～０．５）の範囲のＭＯＩ（低ＭＯＩ）を使用する。いくつかの場合、主題の方法は、０．０１～０．５の範囲のＭＯＩ（低ＭＯＩ）を使用する。例えば、欠失ライブラリによる標的細胞の低ＭＯＩ感染（例えば、＜１のＭＯＩを利用する）を、形質導入された集団の野生型ウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）による高ＭＯＩ感染と交互にして、ＤＩＰをナイーブ細胞に動員することができる。
いくつかの場合、１つもしくはそれを超えるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２または１つもしくはそれを超えるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２欠失ＤＮＡを有する細胞を、薬物の存在下で増殖させて、さらなるラウンドの複製が起こるかどうかを試験することができる。回復期間中、野生型ウイルスに感染した細胞（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した細胞）は死滅するだろうが、良好に挙動する変異体（細胞死滅トランス因子を産生しない）によって形質導入された細胞は維持されるだろう。この様式では、形質導入された宿主細胞を死滅させないが、野生型ウイルスの同時感染中に動員することができる変異体を選択することができる。したがって、いくつかの場合、主題の方法は、培養中の哺乳動物細胞を環状化欠失ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＤＮＡのライブラリのメンバーに低感染多重度（ＭＯＩ）で感染させること、感染した細胞をウイルス複製阻害剤の存在下で１日～６日間（例えば、１日～５日間、１日～４日間、１日～３日間、または１日～２日間）の範囲の期間培養すること、培養した細胞を機能性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに高ＭＯＩで感染させること、感染した細胞を１２時間～４日間（例えば、１２時間～７２時間、１２時間～４８時間、または１２時間～２４時間）の範囲の期間培養すること、および培養した細胞からウイルスを回収することを含む。
いくつかの実施形態では、主題の方法は、（ａ）配列特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼのための標的配列を環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＤＮＡの集団に挿入して、配列挿入されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの集団を生成すること、（ｂ）配列挿入されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの集団を配列特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼと接触させて、切断された線状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの集団を生成すること、（ｃ）切断された線状ウイルスＤＮＡの集団をエキソヌクレアーゼと接触させて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２欠失ＤＮＡの集団を生成すること、（ｄ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２欠失ＤＮＡを環状化して（例えば、ライゲーションを介して）、環状化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２欠失ＤＮＡのライブラリを生成すること、および（ｅ）環状化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２欠失ＤＮＡのライブラリのメンバーを配列決定して、欠失干渉粒子（ＤＩＰ）を同定することを含む。いくつかの場合、方法は、ステップ（ｄ）の前またはステップ（ｄ）と同時にバーコード配列を挿入することを含む。
いくつかの場合、ステップ（ａ）の挿入することは、トランスポゾンカセットを環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＤＮＡの集団に挿入することを含み、トランスポゾンカセットは配列特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼのための標的配列を含み、配列挿入されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの生成された集団はトランスポゾン挿入されたウイルスＤＮＡの集団である。いくつかの場合（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼを使用するいくつかの場合）、主題の方法はステップ（ａ）を含まず、代わりに、方法の第１のステップは、ライブラリのメンバーを互いに対して異なる位置で切断することであり、このステップの後にエキソヌクレアーゼステップが続き得る。
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標的配列および配列特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼ
いくつかの場合、配列特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼのための標的配列は、例えば、トランスポゾンカセットを使用してＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡに挿入される。「標的配列」は、本明細書では認識配列または認識部位とも称される。配列特異的エンドヌクレアーゼという用語は、本明細書では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの標的配列に結合および／またはそれを認識し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡを切断するＤＮＡエンドヌクレアーゼを指すために使用される。換言すれば、配列特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡ分子内の特定の配列（認識配列）を認識し、その認識に基づいて分子を切断する。いくつかの場合、配列特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、認識配列内のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡを切断し、いくつかの場合（例えば、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼの場合）、認識配列の外側を切断する。
配列特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼという用語は、例えば、制限酵素、メガヌクレアーゼ、およびプログラム可能なゲノム編集ヌクレアーゼを含み得る。配列特異的エンドヌクレアーゼの例としては、制限エンドヌクレアーゼ、例えば、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＢａｍＨＩなど；メガヌクレアーゼ、例えば、ＬＡＧＬＩ ＤＡＤＧメガヌクレアーゼ（ＬＭＮ）、ｌ－Ｓｃｅｌ、ｌ－Ｃｅｕｌ、ｌ－Ｃｒｅｌ、ｌ－Ｄｍｏｌ、ｌ－Ｃｈｕｌ、ｌ－Ｄｉｒｌ、ｌ－Ｆｌｍｕｌ、ｌ－Ｆｌｍｕｌｌ、ｌ－Ａｎｉｌ、１－ＳｃｅｌＶ、ｌ－Ｃｓｍｌ、ｌ－Ｐａｎｌ、Ｉ－Ｐａｎｌｌ、１－ＰａｎＭＩ、ｌ－Ｓｃｅｌｌ、ｌ－Ｐｐｏｌ、ｌ－Ｓｃｅｌｌｌ、ｌ－Ｌｔｒｌ、ｌ－Ｇｐｉｌ、ｌ－ＧＺｅｌ、ｌ－Ｏｎｕｌ、１－ＨｊｅＭＩ、ｌ－Ｍｓｏｌ、ｌ－Ｔｅｖｌ、Ｉ－Ｔｅｖｌｌ、ｌ－Ｔｅｖｌｌｌ、Ｐｌ－Ｍｌｅｌ、Ｐｌ－Ｍｔｕｌ、Ｐｌ－Ｐｓｐｌ、ＰＩ－ＴＩｉ Ｉ、ＰＩ－ＴＩｉ ｌｌ、Ｐｌ－ＳｃｅＶなど；ならびにプログラム可能な遺伝子編集エンドヌクレアーゼ、例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの場合、主題の組成物および／または方法の配列特異的エンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼおよびプログラム可能な遺伝子編集エンドヌクレアーゼから選択される。いくつかの場合、主題の組成物および／または方法の配列特異的エンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１など）から選択される。
いくつかの場合、主題の組成物および／または方法の配列特異的エンドヌクレアーゼはメガヌクレアーゼである。いくつかの場合、メガヌクレアーゼは、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼ（ＬＭＮ）、ｌ－Ｓｃｅｌ、ｌ－Ｃｅｕｌ、ｌ－Ｃｒｅｌ、ｌ－Ｄｍｏｌ、ｌ－Ｃｈｕｌ、ｌ－Ｄｉｒｌ、ｌ－Ｆｌｍｕｌ、ｌ－Ｆｌｍｕｌｌ、ｌ－Ａｎｉｌ、Ｉ－ＳｃｅｌＶ、ｌ－Ｃｓｍｌ、ｌ－Ｐａｎｌ、ｌ－Ｐａｎｌｌ、ｌ－ＰａｎＭＩ、ｌ－Ｓｃｅｌｌ、ｌ－Ｐｐｏｌ、ｌ－Ｓｃｅｌｌｌ、ｌ－Ｌｔｒｌ、ｌ－Ｇｐｉｌ、ｌ－ＧＺｅｌ、ｌ－Ｏｎｕｌ、ｌ－ＨｊｅＭＩ、ｌ－Ｍｓｏｌ、ｌ－Ｔｅｖｌ、ｌ－Ｔｅｖｌｌ、ｌ－Ｔｅｖｌｌｌ、Ｐｌ－Ｍｌｅｌ、Ｐｌ－Ｍｔｕｌ、Ｐｌ－Ｐｓｐｌ、ＰＩ－ＴＩｉ Ｉ、ＰＩ－ＴＩｉ ＩＩ，、およびＰｌ－ＳｃｅＶから選択される。いくつかの場合、メガヌクレアーゼｌ－Ｓｃｅｌが使用される。いくつかの場合、メガヌクレアーゼｌ－Ｃｅｕｌが使用される。いくつかの場合、メガヌクレアーゼｌ－Ｓｃｅｌおよびｌ－Ｃｅｕｌが使用される。
いくつかの場合、配列特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、プログラム可能なゲノム編集ヌクレアーゼである。「プログラム可能なゲノム編集ヌクレアーゼ」という用語は、本明細書では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡ内の異なる部位（認識配列）を標的とされ得るエンドヌクレアーゼを指すために使用される。適切なプログラム可能なゲノム編集ヌクレアーゼの例には、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬ－エフェクターＤＮＡ結合ドメイン－ヌクレアーゼ融合タンパク質（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ））、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、クラス２ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、例えばＩＩ型、Ｖ型またはＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ）が含まれるが、これらに限定されない。したがって、いくつかの実施形態では、プログラム可能なゲノム編集ヌクレアーゼは、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、クラス２ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、例えばＩＩ型、Ｖ型、またはＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ）から選択される。いくつかの場合、主題の組成物および／または方法の配列特異的エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１など）である。いくつかの場合、主題の組成物および／または方法の配列特異的エンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ、ＺＦＮ、およびＴＡＬＥＮから選択される。
クラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓエンドヌクレアーゼＣａｓ９タンパク質およびＣａｓ９ガイドＲＮＡ（ならびにそれらの送達方法）に関する情報（ならびにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸中に存在するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に関する要件についての情報）は、例えば、以下のＪｉｎｅｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１２年８月１７日；３３７（６０９６）：８１６－２１；Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉら、ＲＮＡ Ｂｉｏｌ．２０１３年５月；１０（５）：７２６－３７；Ｍａら、Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｓ Ｉｎｔ．２０１３；２０１３：２７０８０５；Ｈｏｕら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１３年９月２４日；１ １０（３９）：１５６４４－９；Ｊｉｎｅｋら、Ｅｌｉｆｅ．２０１３；２：ｅ００４７１；Ｐａｔｔａｎａｙａｋら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３年９月；３１（９）：８３９－４３；Ｑｉら、Ｃｅｌｌ．２０１３年２月２８日；１５２（５）：１１７３－８３；Ｗａｎｇら、Ｃｅｌｌ．２０１３年５月９日；１５３（４）：９１０－８；Ａｕｅｒら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２０１３年１０月３１日；Ｃｈｅｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１３年１１月１日；４１（２０）：ｅ１９；Ｃｈｅｎｇら、Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２０１３年１０月；２３（１０）：１ １６３－７１；Ｃｈｏら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．２０１３年１１月；１９５（３）：１ １７７－８０；ＤｉＣａｒｌｏら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１３年４月；４１（７）：４３３６－４３；Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎら、Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１３年１０月；１０（１０）：１０２８－３４；Ｅｂｉｎａら、Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１３；３：２５１０；Ｆｕｊｉｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１３年１１月１日；４１（２０）：ｅ１８７；Ｈｕら、Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２０１３年１１月；２３（１ １）：１３２２－５；Ｊｉａｎｇら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１３年１１月１日；４１（２０）：ｅ１８８；Ｌａｒｓｏｎら、Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２０１３年１１月；８（１ １）：２１８０－９６；Ｍａｌｉら、Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１３年１０月；１０（１０）：９５７－６３；Ｎａｋａｙａｍａら、Ｇｅｎｅｓｉｓ．２０１３年１２月；５１（１２）：８３５－４３；Ｒａｎら、Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２０１３年１１月；８（１ １）：２２８１－３０８；Ｒａｎら、Ｃｅｌｌ．２０１３年９月１２日；１５４（６）：１３８０－９；Ｕｐａｄｈｙａｙら、Ｇ３（Ｂｅｔｈｅｓｄａ）．２０１３年１２月９日；３（１２）：２２３３－８；Ｗａｌｓｈら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１３年９月２４日；１１０（３９）：１５５１４－５；Ｘｉｅら、Ｍｏｌ Ｐｌａｎｔ．２０１３年１０月９日；Ｙａｎｇら、Ｃｅｌｌ．２０１３年９月１２日；１５４（６）：１３７０－９；Ｂｒｉｎｅｒら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．２０１４年１０月２３日；５６（２）：３３３－９；ならびに米国特許および特許出願：第８，９０６，６１６号；第８，８９５，３０８号；第８，８８９，４１８号；第８，８８９，３５６号；第８，８７１，４４５号；第８，８６５，４０６号；第８，７９５，９６５号；第８，７７１，９４５号；第８，６９７，３５９号；第２０１４００６８７９７号；第２０１４０１７０７５３号；第２０１４０１７９００６号；第２０１４０１７９７７０号；第２０１４０１８６８４３号；第２０１４０１８６９１９号；第２０１４０１８６９５８号；第２０１４０１８９８９６号；第２０１４０２２７７８７号；第２０１４０２３４９７２号；第２０１４０２４２６６４号；第２０１４０２４２６９９号；第２０１４０２４２７００号；第２０１４０２４２７０２号；第２０１４０２４８７０２号；第２０１４０２５６０４６号；第２０１４０２７３０３７号；第２０１４０２７３２２６号；第２０１４０２７３２３０号；第２０１４０２７３２３１号；第２０１４０２７３２３２号；第２０１４０２７３２３３号；第２０１４０２７３２３４号；第２０１４０２７３２３５号；第２０１４０２８７９３８号；第２０１４０２９５５５６号；第２０１４０２９５５５７号；第２０１４０２９８５４７号；第２０１４０３０４８５３号；第２０１４０３０９４８７号；第２０１４０３１０８２８号；第２０１４０３１０８３０号；第２０１４０３１５９８５号；第２０１４０３３５０６３号；第２０１４０３３５６２０号；第２０１４０３４２４５６号；第２０１４０３４２４５７号；第２０１４０３４２４５８号；第２０１４０３４９４００号；第２０１４０３４９４０５号；第２０１４０３５６８６７号；第２０１４０３５６９５６号；第２０１４０３５６９５８号；第２０１４０３５６９５９号；第２０１４０３５７５２３号；第２０１４０３５７５３０号；第２０１４０３６４３３３号；および第２０１４０３７７８６８号において見出すことができ；これらのすべては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃｐｆ１）またはＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓエンドヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡに関連する例および指針（ならびにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸中に存在するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に関連する要件についての情報）は、当技術分野で見出すことができ、例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅら、Ｃｅｌｌ．２０１５年１０月２２日；１６３（３）：７５９－７１；Ｍａｋａｒｏｖａら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１５年１１月；１３（１１）：７２２－３６；およびＳｈｍａｋｏｖら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．２０１５年１１月５日；６０（３）：３８５－９７を参照されたい。
有用なデザイナージンクフィンガーモジュールには、様々なＧＮＮおよびＡＮＮトリプレットを認識するもの（Ｄｒｅｉｅｒら、（２００１）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７６：２９４６６－７８；Ｄｒｅｉｅｒら、（２０００）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３０３：４８９－５０２；Ｌｉｕら、（２００２）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７：３８５０－６）、ならびに様々なＣＮＮまたはＴＮＮトリプレットを認識するもの（Ｄｒｅｉｅｒら、（２００５）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８０：３５５８８－９７；Ｊａｍｉｅｓｏｎら、（２００３）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ ２：３６１－８）が含まれる。Ｄｕｒａｉら、（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３３：５９７８－９０；Ｓｅｇａｌ、（２００２）Ｍｅｔｈｏｄｓ ２６：７６－８３；ＰｏｒｔｅｕｓおよびＣａｒｒｏｌｌ、（２００５）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２３：９６７－７３；Ｐａｂｏら、（２００１）Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ７０：３１３－４０；Ｗｏｌｆｅら、（２０００）Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｔｒｕｃｔ ２９：１８３－２１２；ＳｅｇａｌおよびＢａｒｂａｓ、（２００１）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １２：６３２－７；Ｓｅｇａｌら、（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４２：２１３７－４８；ＢｅｅｒｌｉおよびＢａｒｂａｓ、（２００２）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
２０：１３５－４１；Ｃａｒｒｏｌｌら、（２００６）Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ １：１３２９；Ｏｒｄｉｚら、（２００２）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９９：１３２９０－５；Ｇｕａｎら、（２００２）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９９：１３２９６－３０１も参照されたい。
ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮ（およびそれらの送達方法）に関するさらなる情報については、Ｓａｎｊａｎａら、Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２０１２年１月５日；７（１）：１７１－９２ならびに国際特許出願ＷＯ２００２０９９０８４；ＷＯ００／４２２１９；ＷＯ０２／４２４５９；ＷＯ２００３０６２４５５；ＷＯ０３／０８０８０９；ＷＯ０５／０１４７９１；ＷＯ０５／０８４１９０；ＷＯ０８／０２１２０７；ＷＯ０９／０４２１８６；ＷＯ０９／０５４９８５；ＷＯ１０／０７９４３０；およびＷ０１０／０６５１２３；米国特許第８，６８５，７３７号；第６，１４０，４６６号；第６，５１１，８０８号；および第６，４５３，２４２号；ならびに米国特許出願第２０１１／０１４５９４０号、第２００３／００５９７６７号、および第２００３／０１０８８８０号を参照されたい；これらのすべては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの場合（例えば、制限酵素の場合）、認識配列は、所与のタンパク質に対して一定である（変化しない）（例えば、ＢａｍＨＩ制限酵素のための認識配列はＧ＾ＧＡＴＣＣである）。いくつかの場合、配列特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、所望の認識配列を認識するようにタンパク質（またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼの場合はその関連ＲＮＡ）を改変／操作することができるという意味で「プログラム可能」である。いくつかの場合（例えば、配列特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼがメガヌクレアーゼである場合および／または配列特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼである場合）、認識配列は、１４またはそれを超えるヌクレオチド（ｎｔ）（例えば、１５もしくはそれを超える、１６もしくはそれを超える、１７もしくはそれを超える、１８もしくはそれを超える、１９もしくはそれを超える、または２０もしくはそれを超えるｎｔ）の長さを有する。いくつかの場合、認識配列は、１４～４０ｎｔ（例えば、１４～３５、１４～３０、１４～２５、１５～４０、１５～３５、１５～３０、１５～２５、１６～４０、１６～３５、１６～３０、１６～２５、１７～４０、１７～３５、１７～３０、または１７～２５ｎｔ）の範囲の長さを有する。いくつかの場合、認識配列は、１４またはそれを超える塩基対（ｂｐ）（例えば、１５もしくはそれを超える、１６もしくはそれを超える、１７もしくはそれを超える、１８もしくはそれを超える、１９もしくはそれを超える、または２０もしくはそれを超えるｂｐ）の長さを有する。いくつかの場合、認識配列は、１４～４０ｂｐ（例えば、１４～３５、１４～３０、１４～２５、１５～４０、１５～３５、１５～３０、１５～２５、１６～４０、１６～３５、１６～３０、１６～２５、１７～４０、１７～３５、１７～３０、または１７～２５ｂｐ）の範囲の長さを有する。
上記で認識配列の長さに言及する場合、二本鎖ヘリックスおよび認識配列は塩基対（ｂｐ）を単位として考えることができるが、いくつかの場合（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼの場合）、認識配列は一本鎖形態（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓエンドヌクレアーゼのガイドＲＮＡは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡにハイブリダイズすることができる）で認識され、認識配列はヌクレオチド（ｎｔ）を単位として考えることができる。しかしながら、本明細書で認識配列に言及するときに「ｂｐ」または「ｎｔ」を使用する場合、この専門用語は限定を意図するものではない。一例として、本明細書に記載の特定の方法または組成物が両方のタイプの配列特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼ（「ｂｐ」を認識するものおよび「ｎｔ」を認識するもの）を包含する場合、「ｎｔ」または「ｂｐ」のいずれかは、配列特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼの範囲を限定することなく使用することができる。これは、当業者はどの用語（「ｎｔ」または「ｂｐ」）が適切に適用され、これはどのタンパク質が選択されるかに依存することを理解するであろうからである。認識配列の長さ制限の場合、当業者は、「ｎｔ」または「ｂｐ」という用語が使用されるかどうかにかかわらず、論じられている長さ制限が等しく適用されることを理解するであろう。
チュウバック（エキソヌクレアーゼ消化）
環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡが切断され、切断された線状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの集団が生成された後、線状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの開口端はエキソヌクレアーゼによって消化（チュウバック）される。多くの様々なエキソヌクレアーゼが当業者に公知であり、任意の好都合なエキソヌクレアーゼを使用することができる。いくつかの場合、５’から３’へのエキソヌクレアーゼが使用される。いくつかの場合、３’から５’へのエキソヌクレアーゼが使用される。いくつかの場合、５’から３’へのおよび３’から５’への両方のエキソヌクレアーゼ活性を有するエキソヌクレアーゼが使用される。いくつかの場合、２種以上のエキソヌクレアーゼ（例えば、２種のエキソヌクレアーゼ）が使用される。いくつかの場合、切断された線状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの集団を、５’から３’へのエキソヌクレアーゼおよび３’から５’へのエキソヌクレアーゼと接触（例えば、同時に、または一方が他方の前に）させる。
いくつかの場合、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼが３’から５’へのエキソヌクレアーゼ（ｄＮＴＰの非存在下、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼは３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性を有する）として使用される。いくつかの場合、ＲｅｃＪが５’から３’へのエキソヌクレアーゼとして使用される。いくつかの場合、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ（ｄＮＴＰの非存在下）およびＲｅｃＪが使用される。エキソヌクレアーゼの例には、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ）（ｄＮＴＰの非存在下）、ラムダエキソヌクレアーゼ（５’→３’）、Ｔ５エキソヌクレアーゼ（５’→３’）、エキソヌクレアーゼＩＩＩ（３’→５’）、エキソヌクレアーゼＶ（５’→３’および３’→５’）、Ｔ７エキソヌクレアーゼ（５’→３’）、エキソヌクレアーゼＴ、エキソヌクレアーゼＶＩＩ（短縮型）（５’→３’）、およびＲｅｃＪエキソヌクレアーゼ（５’→３’）が含まれるが、これらに限定されない。
ＤＮＡ消化（チュウバック）の速度は温度に敏感であり、したがって、所望の欠失のサイズは、エキソヌクレアーゼ消化中の温度を調節することによって制御することができる。例えば、以下の実施例のセクションでは、エキソヌクレアーゼとしてＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ（ｄＮＴＰの非存在下）およびＲｅｃＪを使用する場合、両末端消化速度（チュウバック速度）は、３７℃で５０ｂｐ／分の速度で、より低い温度（例えば、以下の実施例のセクションで論じられるように）では遅い速度で進行した。したがって、温度を低下または上昇させることができるか、および／または消化時間を短縮または延長させて、欠失のサイズ（すなわち、エキソヌクレアーゼ消化の量）を制御することができる。例えば、いくつかの場合、エキソヌクレアーゼ消化が所望のサイズ範囲の欠失を引き起こすように、温度および時間が調整される。例示的な例として、５００～１０００塩基対（ｂｐ）の範囲の欠失が望まれる場合、消化の時間および温度は、２５０～５００ヌクレオチドが線状化（切られた）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの各末端から除去されるように調整され得る、すなわち、欠失のサイズは、線状化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの各末端から除去されたヌクレオチドの数の合計である。いくつかの場合、エキソヌクレアーゼ消化が２０～１０００ｂｐ（例えば、２０～５０、４０～８０、２０～１００、４０～１００、２０～２００、４０～２００、６０～１００、６０～２００、８０～１５０、８０～２５０、１００～２５０、１５０～３５０、１００～５００、２００～５００、２００～７００、３００～８００、４００～８００、５００～１０００、７００～１０００、２０～８００、５０～１０００、１００～１０００、２５０～１０００、５０～１０００、５０～７５０、１００～１０００、または１００～７５０ｂｐ）の範囲のサイズを有する欠失を引き起こすように、温度および時間が調整される。
いくつかの場合、エキソヌクレアーゼ（１種またはそれを超えるエキソヌクレアーゼ）との接触は、室温（例えば、２５℃）～４０℃（例えば、２５～３７℃、３０～３７℃、３２～４０℃、または３０～４０℃）の範囲の温度で行われる。いくつかの場合、エキソヌクレアーゼとの接触は３７℃で行われる。いくつかの場合、エキソヌクレアーゼとの接触は３２℃で行われる。いくつかの場合、エキソヌクレアーゼとの接触は３０℃で行われる。いくつかの場合、エキソヌクレアーゼとの接触は２５℃で行われる。いくつかの場合、エキソヌクレアーゼとの接触は室温で行われる。
いくつかの場合、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡをエキソヌクレアーゼ（１種またはそれを超えるエキソヌクレアーゼ）と、１０秒～４０分（例えば、１０秒～３０分、１０秒～２０分、１０秒～１５分、１０秒～１０分、３０秒～３０分、３０秒～２０分、３０秒～１５分、３０秒～１２分、３０秒～１０分、１～４０分、１～３０分、１～２０分、１～１５分、１～１０分、３～４０分、３～３０分、３～２０分、３～１５分、３～１２分、または３～１０分）の範囲の期間接触させる。いくつかの場合、接触は、２０秒～１５分の範囲の期間である。
ＤＮＡ消化（チュウバック）後、残りのオーバーハングしたＤＮＡ末端は修復され得る（例えば、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ＋ｄＮＴＰを使用する）か、またはいくつかの場合、一本鎖オーバーハングは除去され得る（例えば、一本鎖ＤＮＡを切断するが二本鎖ＤＮＡを切断しないマングビーンヌクレアーゼなどのヌクレアーゼを使用する）。例えば、５’から３’へのまたは３’から５’へのエキソヌクレアーゼのみを使用する場合、一本鎖ＤＮＡに特異的なヌクレアーゼ（すなわち、二本鎖ＤＮＡを切らない）（例えば、マングビーンヌクレアーゼ）を使用してオーバーハングを除去することができる。
１種またはそれを超えるエキソヌクレアーゼと接触させるステップ（すなわち、チュウバック）は、一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢタンパク質）の存在下または非存在下で行うことができる。ＳＳＢは、露出した一本鎖ＤＮＡ末端に結合するタンパク質であり、（ｉ）ヌクレアーゼがＤＮＡにアクセスするのを防ぐことによってＤＮＡを安定化するのを助けること、および（ｉｉ）一本鎖ＤＮＡ内のヘアピン形成を防ぐことを含むがこれらに限定されないいくつかの結果を達成することができる。ＳＳＢタンパク質の例には、真核生物ＳＳＢタンパク質（例えば、複製タンパク質Ａ（ＲＰＡ））、細菌ＳＳＢタンパク質、およびウイルスＳＳＢタンパク質が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの場合、１種またはそれを超えるエキソヌクレアーゼと接触させるステップは、ＳＳＢの存在下で行われる。いくつかの場合、１種またはそれを超えるエキソヌクレアーゼと接触させるステップは、ＳＳＢの非存在下で行われる。
バーコード
いくつかの実施形態では、ライブラリのメンバーは、エキソヌクレアーゼ消化後（および残りのオーバーハングしているＤＮＡ末端が修復／除去された後）に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡにバーコードを付加することによって「タグ付け」される。バーコードの付加は、再環状化（ライゲーション）の前またはそれと同時に行うことができる。本明細書で使用される場合、「バーコード」という用語は、将来の同定のためにライブラリのメンバーを一意にタグ付けする配列を有するヌクレオチドのストレッチを意味するために使用される。例えば、いくつかの場合、（ランダムバーコードカセットのプールからの）バーコードカセットが付加され得、ライブラリを配列決定して、どのバーコード配列がどの特定のメンバーに関連付けられるか、すなわちどの特定の欠失に関連付けられるかを知ることができる（例えば、欠失ライブラリの各メンバが固有のバーコードを有するようにルックアップテーブルを作成することができる）。このようにして、欠失ライブラリのメンバーは、バーコードの存在によって（欠失の位置を決定することによってメンバーを同定しなければならない代わりに）追跡および把握することができる。任意の好都合なアッセイを使用して短いストレッチのヌクレオチドの存在を同定することは、容易に達成することができる。そのようなバーコードの使用は、ライブラリが所与の実験に使用されるたびに（欠失の位置を決定するために）個々のメンバーを単離し配列決定するよりも容易である。例えば、どのライブラリメンバーが実験前（例えば、ウイルス感染性についてアッセイするためにライブラリメンバーを細胞に導入する前）に存在するかを容易に判定し、これを、例えば、ハイスループット配列決定、マイクロアレイ、ＰＣＲ、ｑＰＣＲ、またはバーコード配列の存在／非存在を検出することができる任意の他の方法を使用して、実験前後のバーコードの存在について単純にアッセイすることによって、実験後にどのメンバーが存在するかと比較することができる。
いくつかの場合、バーコードはカセットとして付加される。バーコードカセットは、少なくとも１つの定常領域（カセットを受け入れるすべてのメンバーによって共有される領域）およびバーコード領域（すなわち、バーコード配列－バーコードがライブラリのメンバーを一意にマークするように、バーコードを受け入れるメンバーに対して固有の領域）を有するヌクレオチドのストレッチである。例えば、バーコードカセットは、（ｉ）使用されるバーコードカセット間で共通のプライマー部位である定常領域、および（ｉｉ）例えば、ランダム配列のストレッチであり得る固有のタグであるバーコード配列を含み得る。いくつかの場合、バーコードカセットは、２つの定常領域（例えば、２つの異なるプライマー部位）によって挟まれるバーコード領域を含む。例示的な例として、いくつかの場合、バーコードカセットは、２０ｂｐのプライマー結合部位によって挟まれる２０ｂｐのランダムバーコードを含む６０ｂｐのカセットである（例えば、図４を参照）。
バーコード配列は、任意の好都合な長さを有することができ、好ましくは、目的の所与のライブラリのメンバーを一意にマークするのに十分な長さである。いくつかの場合、バーコード配列は、１５ｂｐ～４０ｂｐ（例えば、１５～３５ｂｐ、１５～３０ｂｐ、１５～２５ｂｐ、１７～４０ｂｐ、１７～３５ｂｐ、１７～３０ｂｐ、または１７～２５ｂｐ）の長さを有する。いくつかの場合、バーコード配列は２０ｂｐの長さを有する。同様に、バーコードカセットは、任意の好都合な長さを有することができ、この長さは、バーコード配列の長さ＋定常領域の長さに依存する。いくつかの場合、バーコードカセットは、４０ｂｐ～１００ｂｐ（例えば、４０～８０ｂｐ、４５～１００ｂｐ、４５～８０ｂｐ、４５～７０ｂｐ、５０～１００ｂｐ、５０～８０ｂｐ、または５０～７０ｂｐ）の長さを有する。いくつかの場合、バーコードカセットは６０ｂｐの長さを有する。
バーコードまたはバーコードカセットは、任意の好都合な方法を使用して付加することができる。例えば、線状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡは、ランダムバーコードカセットのプールから引き出された３’－ｄＴ－テール付きバーコードカセットへのライゲーションによって再環状化することができる。次いで、ニックが入った半ライゲーション産物を封じ、宿主細胞、例えば細菌細胞に形質転換することができる。
産物の生成
いくつかの場合、主題の方法は、線状二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）産物（例えば、環状ＤＮＡの切断を介して、ＰＣＲを介してなど）、線状一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）産物（例えば、転写および逆転写を介して）、線状一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）産物（例えば、転写を介して）、および線状二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）産物のうちの少なくとも１つを（例えば、環状化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２欠失ＤＮＡの生成されたライブラリから）生成するステップを含む。必要に応じて、線状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２産物を、次いで細胞（例えば、哺乳動物細胞）に導入することができる。例えば、ＲＮＡウイルスに対する共通の技術は、ｄｓＤＮＡ鋳型（環状または線状）からインビトロ転写を行ってＲＮＡを作製し、次いでこのＲＮＡを細胞に（例えば、エレクトロポレーション、化学的方法などを介して）導入してウイルスのストックを生成することである。
また、キットも本開示の範囲内である。例えば、いくつかの場合、主題のキットは、（ｉ）本明細書に記載の環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの集団、（ｉｉ）本明細書に記載のトランスポゾンカセット、（ｉｉｉ）本明細書に記載の配列特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、（ｉｖ）本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼのための１つまたはそれを超えるガイドＲＮＡ、（ｖ）本明細書に記載のバーコードおよび／またはバーコードカセットの集団、ならびに（ｖｉ）本明細書に記載の、例えばライブラリの増幅、ウイルス感染性についてのアッセイなどのための宿主細胞の集団のうちの１つまたは複数を（任意の組合せで）含み得る。いくつかの場合、主題のキットは使用説明書を含むことができる。キットは、典型的には、キットの内容物の使用目的を指し示すラベルを含む。ラベルという用語は、キット上もしくはキットと共に供給されるか、またはそうでなければキットに付随する、任意の書面または記録された材料を含む。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスは、約９８６０アミノ酸をコードする約２９８９１ヌクレオチドの一本鎖ＲＮＡゲノムを有する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の選択されたＲＮＡゲノムは、逆転写およびｃＤＮＡの形成によってコピーされ、ＤＮＡにすることができる。線状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡを、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡ末端のライゲーションによって環状化できる。
コード領域を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムのＤＮＡ配列は、ＮＣＢＩウェブサイトからアクセッション番号ＮＣ＿０４５５１２．２として入手可能である（本明細書では配列番号１として提供される）。
Figure 2023530049000010
Figure 2023530049000011
Figure 2023530049000012
Figure 2023530049000013
Figure 2023530049000014
Figure 2023530049000015
Figure 2023530049000016
Figure 2023530049000017
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Figure 2023530049000019
Figure 2023530049000020
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Figure 2023530049000022
Figure 2023530049000023
Figure 2023530049000024
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、配列番号１の配列の１～２６５位に５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ；リーダー配列またはリーダーＲＮＡとしても公知）を有し得る。そのような５’ＵＴＲは、開始コドンのすぐ上流にあるｍＲＮＡの領域を含み得る。５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲはまた、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のパッケージングを容易にし得る。
同様に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、２９６７５～２９９０３位に３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）を有し得る。プラス鎖ＲＮＡウイルスでは、マイナス鎖ＲＮＡ複製中間体の起点はゲノムの３’末端にあるので、３’－ＵＴＲはウイルスＲＮＡ複製において役割を果たし得る。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムは、４つの主要な構造タンパク質：スパイク（Ｓ）タンパク質、ヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質、膜（Ｍ）タンパク質、およびエンベロープ（Ｅ）タンパク質をコードする。これらのタンパク質のいくつかは、配列番号１の配列の２６６～２１５５５位にある大きなポリプロテインの一部であり、このオープン・リーディング・フレームはＯＲＦ１ａｂポリプロテインと称され、以下に示す配列番号２を有する。
Figure 2023530049000025
Figure 2023530049000026
Figure 2023530049000027
いくつかの場合、本明細書に記載の構築物および治療用干渉粒子は、配列番号２をコードするゲノムの部分を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムの欠失を有し得る。そのような欠失は、配列番号２のタンパク質を不活性化し得る。
ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列番号１の核酸の１３４４２～１３４６８位および１３４６８～１６２３６位にコードされている。このＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼには、ＮＣＢＩアクセッション番号ＹＰ＿００９７２５３０７が割り当てられており、以下の配列（配列番号３）を有する。
Figure 2023530049000028
Figure 2023530049000029
いくつかの場合、本明細書に記載の構築物および治療用干渉粒子は、配列番号３をコードするゲノムの部分を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムの欠失を有し得る。そのような欠失は、配列番号３のタンパク質を不活性化し得る。
ヘリカーゼは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列番号１の核酸の１６２３７～１８０３９位にコードされている。このヘリカーゼには、ＮＣＢＩアクセッション番号ＹＰ＿００９７２５３０８．１が割り当てられており、以下の配列（配列番号４）を有する。
Figure 2023530049000030
いくつかの場合、本明細書に記載の構築物および治療用干渉粒子は、配列番号４をコードするゲノムの部分を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムの欠失を有し得る。そのような欠失は、配列番号４のタンパク質を不活性化し得る。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ＧＵ２８０＿ｇｐ０２と称され得る、配列番号１の配列の２１５６３～２５３８４位にオープン・リーディング・フレーム（遺伝子Ｓ）を有し得、このオープン・リーディング・フレームは表面糖タンパク質またはスパイク糖タンパク質（以下に示す配列番号５）をコードする。
Figure 2023530049000031
いくつかの場合、本明細書に記載の構築物および治療用干渉粒子は、配列番号５をコードするゲノムの部分を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムの欠失を有し得る。そのような欠失は、配列番号５のタンパク質を不活性化し得る。
Ｓまたはスパイクタンパク質は、細胞内へのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の進入を促進する役割を果たす。これは、短い細胞内尾部、膜貫通アンカー、ならびに受容体結合Ｓ１サブユニットおよび膜融合Ｓ２サブユニットからなる大きな外部ドメインから構成される。スパイク受容体結合ドメインは、配列番号５のスパイクタンパク質のアミノ酸３３０～５８３位（配列番号６として以下に示す）に存在し得る。
Figure 2023530049000032
Figure 2023530049000033
スパイクタンパク質におけるこの受容体結合モチーフ（ＲＢＭ）の分析は、受容体結合に必須のアミノ酸残基の大部分がＳＡＲＳ－ＣｏＶとＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２との間で保存されていたことを示し、このことは、２つのＣｏＶ株が細胞侵入のために同じ宿主受容体を使用することを示唆した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶによって利用される侵入の受容体は、アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ－２）である。
いくつかの場合、本明細書に記載の構築物および治療用干渉粒子は、配列番号６をコードするゲノムの部分を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムの欠失を有し得る。そのような欠失は、配列番号６のタンパク質を不活性化し得る。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の膜融合Ｓ２ドメインは、配列番号５のスパイクタンパク質の６６２～１２７０位（配列番号７として以下に示す）にあり得る。
Figure 2023530049000034
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ｎｓｐ３と称され得る、配列番号１の配列の２７２０～８５５４位にオープン・リーディング・フレームを有し得、これは膜貫通ドメイン１（ＴＭ１）を含む。膜貫通ドメイン１を有するこのｎｓｐ３オープン・リーディング・フレームは、ＮＣＢＩアクセッション番号ＹＰ＿００９７２５２９９．１を有し、配列番号８として以下に示される。
Figure 2023530049000035
ｎｓｐ３タンパク質は、Ｎ末端酸性（Ａｃ）、予測ホスホエステラーゼ、パパイン様プロテイナーゼ、Ｙドメイン、膜貫通ドメイン１（ＴＭ１）、およびアデノシン二リン酸－リボース１’’－ホスファターゼ（ＡＤＲＰ）を含むさらなる保存ドメインを有する。
いくつかの場合、本明細書に記載の構築物および治療用干渉粒子は、配列番号８をコードするゲノムの部分を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムの欠失を有し得る。そのような欠失は、配列番号８のタンパク質を不活性化し得る。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ｎｓｐ４Ｂ＿ＴＭと称され得る、配列番号１の配列の８５５５～１００５４位にオープン・リーディング・フレームを有し得、これは膜貫通ドメイン２（ＴＭ２）を含む。膜貫通ドメイン２を有するこのｎｓｐ４Ｂ＿ＴＭオープン・リーディング・フレームは、ＮＣＢＩアクセッション番号ＹＰ＿００９７２５３００を有し、配列番号９として以下に示される。
Figure 2023530049000036
いくつかの場合、本明細書に記載の構築物および治療用干渉粒子は、配列番号９をコードするゲノムの部分を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムの欠失を有し得る。そのような欠失は、配列番号９のタンパク質を不活性化し得る。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ＧＵ２８０＿ｇｐ０３と称され得る、配列番号１の配列の２５３９３～２６２２０位にオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ３ａ）を有し得る（以下に示す配列番号１０）。
Figure 2023530049000037
いくつかの場合、本明細書に記載の構築物および治療用干渉粒子は、配列番号１０をコードするゲノムの部分を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムの欠失を有し得る。そのような欠失は、配列番号１０のタンパク質を不活性化し得る。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ＧＵ２８０＿ｇｐ０４と称され得る、配列番号１の配列の２６２４５～２６４７２位にオープン・リーディング・フレーム（遺伝子Ｅ）を有し得る（以下に示す配列番号１１）。
Figure 2023530049000038
配列番号１１のタンパク質は、構造タンパク質、例えばエンベロープタンパク質である。いくつかの場合、本明細書に記載の構築物および治療用干渉粒子は、配列番号１１をコードするゲノムの部分を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムの欠失を有し得る。そのような欠失は、配列番号１１のタンパク質を不活性化し得る。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ＧＵ２８０＿ｇｐ０５と称され得る、配列番号１の配列の２７２０２～２７１９１位にオープン・リーディング・フレーム（Ｍタンパク質遺伝子；ＯＲＦ５）を有し得る（以下に示す配列番号１２）。
Figure 2023530049000039
配列番号１２のタンパク質は、構造タンパク質、例えば膜糖タンパク質である。いくつかの場合、本明細書に記載の構築物および治療用干渉粒子は、配列番号１２をコードするゲノムの部分を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムの欠失を有し得る。そのような欠失は、配列番号１２のタンパク質を不活性化し得る。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ＧＵ２８０＿ｇｐ０６と称され得る、配列番号１の配列の２７２０２～２７３８７位にオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ６）を有し得る（以下に示す配列番号１３）。
Figure 2023530049000040
いくつかの場合、本明細書に記載の構築物および治療用干渉粒子は、配列番号１３をコードするゲノムの部分を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムの欠失を有し得る。そのような欠失は、配列番号１３のタンパク質を不活性化し得る。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ＧＵ２８０＿ｇｐ０７と称され得る、配列番号１の配列の２７３９４～２７７５９位にオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ７ａ）を有し得る（以下に示す配列番号１４）。
Figure 2023530049000041
いくつかの場合、本明細書に記載の構築物および治療用干渉粒子は、配列番号１４をコードするゲノムの部分を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムの欠失を有し得る。そのような欠失は、配列番号１４のタンパク質を不活性化し得る。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ＧＵ２８０＿ｇｐ０８と称され得る、配列番号１の配列の２７７５６～２７８８７位にオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ７ｂ）を有し得る（以下に示す配列番号１５）。
Figure 2023530049000042
いくつかの場合、本明細書に記載の構築物および治療用干渉粒子は、配列番号１５をコードするゲノムの部分を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムの欠失を有し得る。そのような欠失は、配列番号１５のタンパク質を不活性化し得る。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ＧＵ２８０＿ｇｐ０９と称され得る、配列番号１の配列の２７８９４～２８２５９位にオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ８）を有し得る（以下に示す配列番号１６）。
Figure 2023530049000043
いくつかの場合、本明細書に記載の構築物および治療用干渉粒子は、配列番号１６をコードするゲノムの部分を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムの欠失を有し得る。そのような欠失は、配列番号１６のタンパク質を不活性化し得る。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ＧＵ２８０＿ｇｐ１０と称され得る、配列番号１の配列の２８２７４～２９５３３位にオープン・リーディング・フレーム（遺伝子Ｎ；ＯＲＦ９）を有し得る（以下に示す配列番号１７）。
Figure 2023530049000044
Figure 2023530049000045
配列番号１７のタンパク質は、構造タンパク質、例えばヌクレオカプシドホスホプロテインである。いくつかの場合、本明細書に記載の構築物および治療用干渉粒子は、配列番号１７をコードするゲノムの部分を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムの欠失を有し得る。そのような欠失は、配列番号１７のタンパク質を不活性化し得る。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ＧＵ２８０＿ｇｐ１１と称され得る、配列番号１の配列の２９５５８～２９６７４位にオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ１０）を有し得る（以下に示す配列番号１９）。
Figure 2023530049000046
いくつかの場合、本明細書に記載の構築物および治療用干渉粒子は、配列番号１９をコードするゲノムの部分を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムの欠失を有し得る。そのような欠失は、配列番号１９のタンパク質を不活性化し得る。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、コードされたＧＵ２８０＿ｇｐ１１内にある、２９６０９～２９６４４位および２９６２９～２９６５７位にステムループを有し得る。例えば、２９６０９～２９６４４位でのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のステムループを配列番号２０として以下に示す。
Figure 2023530049000047
例えば、２９６２９～２９６５７位でのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のステムループを配列番号２１として以下に示す。
Figure 2023530049000048
いくつかの場合、本明細書に記載の構築物および治療用干渉粒子は、配列番号２０および／または２１をコードするゲノムの部分を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムの欠失を有し得る。そのような欠失は、配列番号２０および／または２１のタンパク質を不活性化し得る。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＹＰ＿００９７２５３０５．１のｓｓＲＮＡ結合タンパク質をコードする配列番号１の配列の１２６８６～１３０２４位にオープン・リーディング・フレーム（ｎｓｐ９）を有し得、以下の配列（配列番号２２）を有する。
Figure 2023530049000049
いくつかの場合、本明細書に記載の構築物および治療用干渉粒子は、配列番号２２をコードするゲノムの部分を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムの欠失を有し得る。そのような欠失は、配列番号２２のタンパク質を不活性化し得る。
本明細書に記載の構築物および／または治療用干渉粒子は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムの部分を有し得、ゲノムの欠失は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムの少なくとも１００、少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも１５００、少なくとも２０００、少なくとも２５００、少なくとも３０００、少なくとも４０００、少なくとも５０００、少なくとも６０００、少なくとも７０００、少なくとも８０００、少なくとも９０００、少なくとも１０，０００、少なくとも１１，０００、少なくとも１２，０００、少なくとも１３，０００、少なくとも１４，０００、少なくとも１５，０００、少なくとも１６，０００、少なくとも１７，０００、少なくとも１８，０００、少なくとも１９，０００、少なくとも２０，０００、少なくとも２１，０００、少なくとも２２，０００、少なくとも２３，０００、少なくとも２４，０００、少なくとも２５，０００、少なくとも２６，０００、少なくとも２７，０００、少なくとも２７５００、または少なくとも２８０００ヌクレオチドを含む。
前述の配列はＤＮＡ配列である。本明細書に記載の組成物および方法で使用されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸は、そのような配列のＤＮＡまたはＲＮＡバージョンであり得る。３’ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸は、伸長されたポリＡ配列を含み得る。例えば、伸長されたポリＡ配列は、少なくとも１００アデニンヌクレオチド～２５０アデニンヌクレオチドを有し得る。そのような伸長されたポリＡ配列は、例えば、ｍＲＮＡの半減期を延長できる。
さらに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムは、配列バリエーションの反映である構造バリエーションを自然に有し得る。したがって、本明細書に記載の組成物および方法で使用されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、例えば、配列番号１～３５として示されている配列と１つまたはそれを超えるヌクレオチドまたはアミノ酸の相違を有し得る。いくつかの場合、本明細書に記載の組成物および方法で使用されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、例えば、配列番号１～３５として示されている配列と２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０個、またはそれを超えるヌクレオチドまたはアミノ酸の相違を有し得る。したがって、欠失の前に、本明細書に記載の方法および組成物で使用されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸のいずれかは、配列番号１～３５のいずれかに対して、少なくとも７０％、または少なくとも７５％、または少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％の配列同一性を有する、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２欠失変異体
本開示は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２欠失変異体、例えば干渉性、条件付き複製性、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２欠失変異体、および関連構築物を提供する。例えば、本開示は、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列と比較して、１つまたはそれを超える欠失を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２欠失変異体を提供する。
したがって、本開示はまた、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２欠失変異体も提供する。そのようなＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２欠失変異体は、例えば配列番号１の任意の位置に１つまたはそれを超える欠失を有し得る。そのような欠失は、コードされたポリペプチドのいずれかの配列を短縮または排除し得る。例えば、そのような欠失は、配列番号２～１９または２２によって特定されるアミノ酸配列を短縮または欠失させ得る。例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸のそのような欠失は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸によってコードされるポリペプチドのいずれかの発現を低減または排除し得る。しかしながら、いくつかの場合、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムのある特定の領域（例えば、５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲの部分）は保持されるべきであり、欠失されるべきではない。
本開示は、干渉性、条件付き複製性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２欠失変異体および関連構築物を提供するために、保持されるべきＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムの特定の領域および欠失可能なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムの特定の領域を同定する。例えば、治療用干渉粒子（ＴＩＰ）として機能するために、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２欠失変異体は、例えば、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲなどのシス作用性エレメントを保持し得る。シス作用性エレメントを保持することに加えて、干渉性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２粒子は、いくつかの場合、Ｎタンパク質またはスパイク受容体結合Ｓ１サブユニット（例えば、配列番号６）などのいくつかのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質の一部分を保持し得る。
野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２との干渉を示す干渉性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２粒子は、例えば、ウイルス粒子アセンブリを媒介する構造タンパク質に対して競合し得るか、またはウイルス粒子のアセンブリを阻害するタンパク質を産生し得る。例えば、干渉を示す干渉性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２粒子は、スパイクタンパク質の膜融合Ｓ２サブユニット（例えば、配列番号７）に欠失を有し得る。いくつかの場合、干渉を示す干渉性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２粒子は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、配列番号３）に１つまたはそれを超える欠失を有し得る。いくつかの場合、干渉を示す干渉性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２粒子は、Ｍタンパク質（膜糖タンパク質）（例えば、配列番号１２）に１つまたはそれを超える欠失を有し得る。いくつかの場合、干渉を示す干渉性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２粒子は、ｓｓＲＮＡ結合タンパク質（例えば、配列番号２２）に１つまたはそれを超える欠失を有し得る。
バリアントである干渉性、条件付き複製性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物を生成する方法も本明細書に記載されている。方法は一般に、ａ）上記のような干渉構築物を第１の宿主細胞集団または第１の個体に導入すること、ｂ）干渉構築物が第１の宿主細胞集団または第１の個体から（直接的に、または１つもしくはそれを超える介在細胞／個体を介して）伝播した第２の細胞集団または第２の個体から生物学的試料を得ること、ここで、第２の細胞集団または第２の個体中に存在する構築物は、第１の宿主細胞集団または第１の個体に導入された干渉構築物のバリアントである、およびｃ）バリアント構築物を第２の宿主細胞集団または第２の個体からクローニングすることを含む。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２欠失変異体および干渉性、条件付き複製性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物の欠失サイズは変動し得る。例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２欠失変異体および干渉性、条件付き複製性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、１つまたはそれを超える欠失を有し得、各欠失は、少なくとも１ｂｐ、少なくとも２ｂｐ、少なくとも３ｂｐ、少なくとも４ｂｐ、少なくとも５ｂｐ、少なくとも６ｂｐ、少なくとも７ｂｐ、少なくとも８ｂｐ、少なくとも９ｂｐ、少なくとも１０ｂｐ、少なくとも１２ｂｐ、少なくとも１５ｂｐ、少なくとも２０ｂｐ、少なくとも２５ｂｐ、少なくとも３０ｂｐ、少なくとも４０ｂｐの欠失を有する。
いくつかの場合、欠失サイズは、例えば、約１０ｂｐ～約５０００ｂｐ、約８００ｂｐ～約２５００ｂｐ、約９００ｂｐ～約２４００ｂｐ、約１０００ｂｐ～約２３００ｂｐ、約１１００ｂｐ～約２２００ｂｐ、約１２００ｂｐ～約２１００ｂｐ、約１３００ｂｐ～約２０００ｂｐ、約１４００ｂｐ～約１９００ｂｐ、約１５００ｂｐ～約１８００ｂｐ、または約１６００ｂｐ～約１７００ｂｐの範囲であり得る。
本開示は、干渉性、条件付き複製性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物を提供する。簡単にするために、干渉性、条件付き複製性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２「干渉構築物」または「ＴＩＰ」と称する。主題の干渉構築物は、条件付き複製性であり得る。例えば、主題の干渉構築物は、哺乳動物宿主中に存在する場合、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の非存在下では、それ自体のコピーを含む感染力のある粒子を形成することができない。主題の干渉構築物は、パッケージングに必要な適切なポリペプチドがもたらされる場合、実験室においてインビトロで（例えば、インビトロ細胞培養物中に）感染力のある粒子にパッケージングされ得る。感染力のある粒子は、干渉構築物を宿主細胞、例えばインビボ宿主細胞に送達することができる。インビボ宿主細胞（哺乳動物対象における宿主細胞）の内部に入ると、干渉構築物は宿主細胞のゲノムに組み込まれ得るか、または干渉構築物は細胞質性を維持し得る。干渉構築物は、いくつかの場合、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の存在下でのみインビボ宿主細胞において複製することができる。干渉構築物を有するインビボ宿主細胞が野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって感染すると、干渉構築物は複製することができる（例えば、転写され、パッケージングされる）。いくつかの場合、干渉構築物は、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２よりも実質的に効率的に複製をすることができ、それによって野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を打ち負かす。その結果、個体におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス負荷が実質的に減少する。
干渉構築物は、ＲＮＡ構築物またはＤＮＡ構築物（例えば、ＲＮＡのＤＮＡコピー）であり得る。
いくつかの場合、干渉構築物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に由来しないいかなる異種ヌクレオチド配列も含まない。「異種」とは、自然には野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中に通常存在しないヌクレオチド配列を指す。例えば、いくつかの場合、干渉構築物は、遺伝子産物をコードするいかなる異種ヌクレオチド配列も含み得ない。遺伝子産物には、ポリペプチドおよびＲＮＡが含まれる。
いくつかの場合、干渉構築物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に由来しない異種ヌクレオチド配列を含み得る。例えば、干渉構築物は、１つまたはそれを超えるバーコード配列、検出可能なマーカーをコードする１つまたはそれを超えるセグメント、１つまたはそれを超えるプロモーター、１つまたはそれを超えるＲＮＡ転写もしくは翻訳開始部位、１つまたはそれを超える終結シグナル、あるいはそれらの組合せを含み得る。構築物はまた、複製起点を含み得る。
干渉構築物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２シス作用性エレメントを含み得、変更により１つまたはそれを超えるコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２トランス作用性ポリペプチドが非機能性になるようなＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオチド配列の変更を含み得る。「非機能性」とは、例えば、コードされたポリペプチドの短縮もしくは内部欠失に起因して、またはポリペプチドが全く欠如していることに起因して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２トランス活性化ポリペプチドがその正常な機能を果たさないことを意味する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオチド配列の「変更」には、１つもしくはそれを超えるヌクレオチドの欠失および／または１つもしくはそれを超えるヌクレオチドの置換が含まれる。
いくつかの場合、干渉構築物は、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染している宿主細胞中（例えば、個体の宿主細胞中）に存在する場合、主題の干渉構築物を含まない同じタイプの宿主細胞における野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の複製の速度よりも、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、または１０倍超の高い速度で複製する。
いくつかの場合、干渉構築物は、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染している宿主細胞中（例えば、個体の宿主細胞中）に存在する場合、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染しているが主題の干渉構築物を含まない宿主細胞における野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２転写物の量と比較して、細胞における野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２転写物の量を少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％減少させる。
いくつかの場合、干渉構築物は、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染している宿主細胞中（例えば、個体の宿主細胞中）に存在する場合、宿主細胞の細胞質における干渉構築物にコードされたＲＮＡの野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２にコードされたＲＮＡに対する比（重量による、例えば、μｇ：μｇ）が１を超えるように、干渉構築物にコードされたＲＮＡの産生をもたらす。いくつかの場合、干渉構築物は、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染している宿主細胞中（例えば、個体の宿主細胞中）に存在する場合、宿主細胞の細胞質における干渉構築物にコードされたＲＮＡの野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２にコードされたＲＮＡに対する比（重量による、例えば、μｇ：μｇ）が少なくとも約１．５：１～少なくとも約１０２：１または１０２：１超、例えば約１．５：１～約２：１、約２：１～約５：１、約５：１～約１０：１、約１０：１～約２５：１、約２５：１～約５０：１、約５０：１～約７５：１、約７５：１～約１００：１、または１００：１超であるように、干渉構築物にコードされたＲＮＡの産生をもたらす。
いくつかの場合、干渉構築物は、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染している宿主細胞中（例えば、個体の宿主細胞中）に存在する場合、宿主細胞の細胞質における干渉構築物にコードされたＲＮＡの野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２にコードされたＲＮＡに対する比（例えば、モル比）が１を超えるように、干渉構築物にコードされたＲＮＡの産生をもたらす。いくつかの場合、干渉構築物は、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染している宿主細胞中（例えば、個体の宿主細胞中）に存在する場合、宿主細胞の細胞質における干渉構築物にコードされたＲＮＡの野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２にコードされたＲＮＡに対する比（例えば、モル比）が少なくとも約１．５：１～少なくとも約１０２：１または１０２：１超、例えば約１．５：１～約２：１、約２：１～約５：１、約５：１～約１０：１、約１０：１～約２５：１、約２５：１～約５０：１、約５０：１～約７５：１、約７５：１～約１００：１、または１００：１超であるように、干渉構築物にコードされたＲＮＡの産生をもたらす。
主題の干渉構築物は、１を超える基本再生産比（Ｒ０）（「基本再生産数」とも称される）を示し得る。Ｒ０は、１つの症例がその感染力のある期間にわたって平均して生じる症例の数である。Ｒ０が＞１である場合、感染は（細胞または個体の）集団に広がることができるであろう。したがって、主題の干渉構築物は、集団のある細胞から別の細胞へ、またはある個体から別の個体へ広がる能力を有する。いくつかの場合、主題の干渉構築物（または主題の干渉粒子）は、約２～約５、約５～約７、約７～約１０、約１０～約１５、または１５超のＲ０を有する。
宿主細胞の細胞質における干渉構築物にコードされたＲＮＡの野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２にコードされたＲＮＡに対する比を測定するために、任意の好都合な方法を使用することができる。適切な方法は、例えば、干渉構築物にコードされたＲＮＡおよび野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２にコードされたＲＮＡの両方のｑＲＴ－ＰＣＲ（例えば、シングルセルｑＲＴ－ＰＣＲ）によって転写物数を直接測定すること、干渉構築物にコードされたＲＮＡおよび野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２にコードされたＲＮＡによってコードされるタンパク質のレベルを測定すること（例えば、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、質量分析などによって）、ならびに干渉構築物にコードされたＲＮＡおよび野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２にコードされたＲＮＡに関連する検出可能な標識（例えば、ＲＮＡによってコードされ、ＲＮＡから翻訳されるタンパク質に融合される蛍光タンパク質の蛍光）のレベルを測定することを含み得る。そのような測定は、例えば、共トランスフェクション後に、任意の好都合な細胞型を使用して行うことができる。
いくつかの実施形態では、干渉構築物にコードされたＲＮＡはパッケージングされる。いくつかの実施形態では、干渉構築物にコードされたＲＮＡはパッケージングされない。いくつかの場合、干渉構築物にコードされたＲＮＡは、パッケージングされるＲＮＡとパッケージングされないＲＮＡの両方を含む。
処置
本開示は、個体におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス負荷を減少させる方法を提供する。方法は一般に、有効量の主題の干渉核酸構築物、主題の干渉核酸構築物を含む医薬製剤、主題の干渉粒子、または主題の干渉粒子を含む医薬製剤を個体に投与することを含む。
いくつかの場合、主題の方法は、有効量のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２干渉粒子、または主題の干渉粒子を含む医薬製剤を、それを必要とする個体に投与することを含む。いくつかの場合、主題の干渉粒子の有効量は、単独療法または併用療法において、１つまたはそれを超える用量で個体に投与される場合、干渉粒子による処置を受けていない個体のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス負荷と比較して、個体におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス負荷を少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または８０％超減少させるのに有効な量である。
いくつかの場合、主題の方法は、有効量の主題の干渉粒子を、それを必要とする個体に投与することを含む。いくつかの実施形態では、主題の干渉粒子の「有効量」は、単剤療法または併用療法において、１つまたはそれを超える用量で個体に投与される場合、干渉粒子による処置を受けていない個体と比較して、個体におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の症候を少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約２分の１、少なくとも約２．５分の１、少なくとも約３分の１、少なくとも約５分の１、少なくとも約１０分の１、または１０分の１未満に低下させるのに有効な量である。
様々な方法のいずれかを使用して、処置方法が有効であるかどうかを判定することができる。例えば、方法が有効であるかどうかを判定することは、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス負荷が減少しているかどうかを評価すること、感染した対象がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗体を産生しているかどうかを判定すること、感染した対象が助けを借りずに呼吸しているかどうかを判定すること、および／または感染した対象の体温が正常に戻っているかどうかを判定することを含み得る。ウイルス負荷を測定することは、例えば、プライマー特異的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ポリヌクレオチド配列を用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、生物学的試料のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の量を測定すること、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によってコードされるポリペプチドを検出および／または測定すること、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ポリペプチドに特異的な抗体を用いた酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）などの免疫学的測定法を使用すること、またはそれらの組合せによってであり得る。
製剤、投与量、および投与の経路
宿主に導入する前に、干渉構築物または干渉粒子を、治療的および予防的処置方法での使用のために様々な組成物に製剤化することができる。特に、干渉構築物または干渉粒子は、適切な薬学的に許容され得る担体または希釈剤と組み合わせることにより医薬組成物にすることができ、ヒトまたは獣医学用途のいずれかに適切になるように製剤化することができる。簡単にするために、主題の干渉構築物および主題の干渉粒子は、以下では集合的に「活性剤」または「活性成分」と称される。
したがって、主題の処置方法での使用のための組成物は、薬学的に許容され得る担体と組み合わせて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２干渉構築物またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２干渉粒子を含み得る。投与に適した様々な薬学的に許容され得る担体を使用することができる。担体の選択は、部分的には、特定のベクター、ならびに組成物を投与するために使用される特定の方法によって決定され得る。当業者はまた、組成物を投与する様々な経路が利用可能であり、２つ以上の経路を投与に使用することができるが、特定の経路が別の経路よりも迅速かつ効果的な反応をもたらすことができることを理解するであろう。したがって、主題の干渉構築物の組成物または主題の干渉粒子の組成物の多種多様な適切な製剤が存在する。
単独で、または他の抗ウイルス化合物と組み合わせて、組成物 主題の干渉構築物または主題の干渉粒子は、非経口投与に適した製剤にすることができる。そのような製剤は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、ならびに製剤を意図するレシピエントの血液と等張にする溶質、ならびに懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、および保存剤を含み得る、水性および非水性の滅菌懸濁液を含み得る。製剤は、単位用量または複数用量で、アンプルおよびバイアルなどの密封容器にて提供することができ、使用直前に、注射用の滅菌液体担体、例えば水の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存することができる。注射可能な溶液および懸濁液は、本明細書に記載されているように、滅菌粉末、顆粒、および錠剤から調製することができる。
吸入による投与に適したエアロゾル製剤も作製することができる。エアロゾル製剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などの加圧された許容され得る噴射剤に入れることができる。
経口投与に適した製剤は、例えば水、生理食塩水またはフルーツジュースなどの希釈剤に溶解した有効量の表題の干渉構築物または表題の干渉粒子などの液体溶液、各々が所定量の活性剤（主題の干渉構築物または主題の干渉粒子）を固体または顆粒として含む、カプセル剤、サシェ剤または錠剤、水性液体中の溶液または懸濁液、および水中油型エマルジョンまたは油中水型エマルジョンであり得る。錠剤形態は、ラクトース、マンニトール、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、微結晶セルロース、アカシア、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、および他の賦形剤、着色剤、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存剤、香味剤、および薬理学的に適合性のある担体のうちの１種または複数を含むことができる。
同様に、経口投与に適した製剤は、香味、通常スクロースおよびアカシアまたはトラガカントに活性成分を含むことができるロゼンジ形態、ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアカシアなどの不活性基剤に活性成分（主題の干渉構築物または主題の干渉粒子）を含むトローチ、ならびに適切な液体担体に活性剤を含むマウスウォッシュ、ならびに活性薬剤に加えて、当技術分野で入手可能な担体などを含有するクリーム、エマルジョン、ゲルなどを含み得る。
直腸投与のための製剤は、例えば、ココアバターまたはサリチラートを含む適切な基剤と共に坐剤として提供され得る。膣投与に適した製剤は、活性成分に加えて、適切であることが当技術分野で公知な担体を含有するペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォーム、またはスプレー製剤として提供され得る。同様に、有効成分は、コンドーム上のコーティングとして潤滑剤と組み合わされ得る。
本発明の文脈において、動物、特にヒトに投与される用量は、合理的な時間枠にわたり、感染した個体において治療応答をもたらすのに十分であるべきである。用量は、処置に用いられる特定の干渉構築物または干渉粒子の効力、疾患状態の重症度、ならびに感染した個体の体重および年齢によって決定されるだろう。用量のサイズはまた、用いられる特定の干渉構築物または干渉粒子の使用に付随する可能性がある有害な副作用の存在によって決定され得る。可能な限り、有害な副作用を最小限に抑えることが常に望ましい。
投与量は、錠剤、カプセル、液体製剤の単位体積などの単位剤形であり得る。本明細書で使用される「単位剤形」という用語は、ヒトおよび動物対象のための単位投与量として適した物理的に別個の単位を指し、各単位は、単独で、または他の抗ウイルス剤と組み合わせて、薬学的に許容され得る希釈剤、担体、またはビヒクルと組み合わせて所望の効果を生じるのに十分な量で計算された所定量の干渉構築物または干渉粒子を含有する。本開示の単位剤形の仕様は、用いられる特定の構築物または粒子および達成される効果、ならびに宿主中の各構築物または粒子に関連する薬力学に依存する。投与される用量は、個々の患者において「抗ウイルス有効量」または「有効レベル」を達成するのに必要な量であり得る。
一般に、１日あたり約５０ｍｇ／ｋｇ体重～約３００ｍｇ／ｋｇ体重の投与された構築物または粒子の組織濃度を達成するために十分な主題の干渉構築物または主題の干渉粒子の量、例えば、１日あたり約１００ｍｇ／ｋｇ体重～約２００ｍｇ／ｋｇ体重の量を投与することができる。ある特定の適用、例えば局所、眼または膣適用では、複数の１日用量を投与することができる。さらに、投与の数は、送達の手段および投与される特定の干渉構築物または干渉粒子に応じて変動し得る。
いくつかの実施形態では、主題の干渉構築物または干渉粒子（またはそれを含む組成物）は、１種またはそれを超えるさらなる治療剤との併用療法で投与される。適切なさらなる治療剤には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの１つまたはそれを超える機能を阻害する薬剤、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染の症候を処置または改善する薬剤、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染に続発して起こり得る感染を処置する薬剤などが含まれる。
キット、容器、デバイス、送達システム
活性剤（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２干渉粒子またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２欠失核酸）の単位用量を含むキットが本明細書に記載されている。単位用量は、経鼻、経口、経皮、または注射可能な（例えば、筋肉内、静脈内、または皮下注射用）投与のために製剤化することができる。そのようなキットでは、単位用量を収容する容器に加えて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を処置する際の薬物の使用および付随する利益を記載する情報添付文書があり得る。適切な活性剤（主題の干渉構築物または主題の干渉粒子）および単位用量は、本明細書の上記で記載されているものである。
多くの実施形態では、主題のキットは、主題の方法を実践するための説明書またはそれを得るための手段（例えば、説明書を提供するウェブページにユーザを導くウェブサイトＵＲＬ）をさらに含み得、これらの説明書は、典型的には基材上に印刷され、基材は、添付文書、包装、製剤容器などのうちの１つまたは複数であり得る。
いくつかの実施形態では、主題のキットは、患者のコンプライアンスを高める１つまたはそれを超える構成要素または特徴、例えば、患者が適切な時間または間隔で活性剤を摂取することを覚えておくのを助ける構成要素またはシステムを含む。そのような構成要素には、患者が適切な時間または間隔で活性剤を摂取することを覚えておくのを助けるためのカレンダーシステムが含まれるが、これに限定されない。
本発明は、活性剤を含む送達システムを提供する。いくつかの実施形態では、送達システムは、活性剤を含む製剤の皮下、静脈内、または筋肉内注射を実現する送達システムである。他の実施形態では、送達システムは、膣または直腸送達システムである。
いくつかの実施形態では、活性剤は、経口投与のために包装される。本発明は、活性剤の１日投与単位を含む包装単位を提供する。例えば、包装単位は、いくつかの実施形態では、従来のブリスターパック、または錠剤、丸剤などを含む任意の他の形態である。ブリスターパックは、適切な数の単位剤形を、厚紙、板紙、箔、またはプラスチックの裏打ち材を有する密封ブリスターパックに収容し、適切なカバーに封入する。各ブリスター容器は、例えば１日目から開始して、番号付けされてもよいし、他の方法でラベル付けされてもよい。
いくつかの実施形態では、主題の送達システムは注射デバイスを含む。例示的で非限定的な薬物送達デバイスには、ペン型インジェクターなどの注射デバイス、およびニードル／シリンジデバイスが含まれる。いくつかの実施形態では、本発明は、有効量の主題の活性剤を含む製剤が予め充填された注射送達デバイスを提供する。例えば、主題の送達デバイスは、単回用量の主題の活性剤が予め充填された注射デバイスを含む。主題の注射デバイスは、再使用可能または使い捨て可能であり得る。
ペン型インジェクターが利用可能である。本方法での使用に適合させることができる例示的なデバイスは、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎからの様々なペン型インジェクターのいずれか、例えば、ＢＤ（商標）Ｐｅｎ、ＢＤ（商標）Ｐｅｎ ＩＩ、ＢＤ（商標）Ａｕｔｏ－Ｉｎｊｅｃｔｏｒ；Ｉｎｎｏｖｊｅｃｔ，Ｉｎｃ．からのペン型インジェクター；米国特許第５，７２８，０７４号、第６，０９６，０１０号、第６，１４６，３６１号、第６，２４８，０９５号、第６，２７７，０９９号、および第６，２２１，０５３号などに論じられている医薬品送達ペン型デバイスのいずれかである。医薬品送達ペンは、使い捨て可能であってもよく、または再利用可能で再充填可能であってもよい。
いくつかの実施形態では、主題の送達システムは、鼻腔または肺に送達するためのデバイスを含む。例えば、本明細書に記載の組成物は、ネブライザー、吸入デバイスなどによる送達のために製剤化することができる。
生体接着性微粒子は、本開示の文脈での使用に適したさらに別の薬物送達システムを構成する。このシステムは、好ましくは鼻腔から滲出しない、多相液体または半固体調製物である。物質は、鼻壁に付着し、ある期間にわたって薬物を放出することができる。これらのシステムの多くは、経鼻使用のために設計された（例えば、米国特許第４，７５６，９０７号）。システムは、活性剤を含むミクロスフェア、および薬物の取込みを増強するための界面活性剤を含み得る。微粒子は、１０～１００μｍの直径を有し、デンプン、ゼラチン、アルブミン、コラーゲン、またはデキストランから調製することができる。
別のシステムは、アプリケータと共に使用するように適合された主題の製剤を含む容器（例えば、チューブ）である。活性剤は、アプリケータを使用して膣または直腸に適用することができる液体、クリーム、ローション、フォーム、ペースト、軟膏、およびゲルに組み込まれる。クリーム、ローション、フォーム、ペースト、軟膏およびゲル形式の医薬品を調製するためのプロセスは、文献全体に見られ得る。適切なシステムの例は、グリセロール、セラミド、鉱油、ペトロラタム、パラベン、フレグランスおよび水を含有する標準的なフレグランス不含ローション製剤であり、例えば商標ＪＥＲＧＥＮＳ（商標）（Ａｎｄｒｅｗ Ｊｅｒｇｅｎｓ Ｃｏ．、Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ、Ｏｈｉｏ）の下で販売されている製品である。本発明の組成物での使用に適した非毒性の薬学的に許容され得るシステムは、医薬製剤の当業者には明らかであり得、例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１９版、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、１９９５に記載されている。適切な担体の選択は、所望の特定の膣または直腸剤形の正確な性質、例えば活性成分がクリーム、ローション、フォーム、軟膏、ペースト、溶液、またはゲルに製剤化されるかどうか、ならびに活性成分の同一性に依存するだろう。他の適切な送達デバイスは、米国特許第６，４７６，０７９号に記載されているものである。
処置対象
本開示の方法は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を有すると疑われる個体、およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を有する個体、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を有すると診断された個体を処置するのに適している。本開示の方法はまた、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を有すると診断されておらず（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２について試験され、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２について陰性と試験された個体、および試験されていない個体）、かつ一般集団よりもＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に罹患する大きなリスクがあると考えられる個体（例えば、「リスクのある」個体）での使用にも適している。
本開示の方法は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を有すると疑われる個体、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を有する個体（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を有すると診断された個体）、および一般集団よりもＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に罹患する大きなリスクがあると考えられる個体を処置するのに適している。そのような個体には、健康でインタクトな免疫系を有するが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染するリスクがある個体（「リスクのある」個体）が含まれるが、これらに限定されない。さらに、そのような個体には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を有しているようには見えないが、低下した免疫応答、心疾患、低下した肺容量またはそれらの組合せを有し得る個体（「リスクのある」個体）が含まれるが、これらに限定されない。リスクのある個体には、一般集団よりもＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に感染する可能性が高い個体が含まれるが、これに限定されない。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染するリスクがある個体には、医療従事者、救急医療従事者、法執行官、救急ドライバー、および公共サービスドライバーなどの必須なサービス従事者が含まれるが、これらに限定されない。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染するリスクがある個体には、高齢な個体（例えば、６５歳を超える）、免疫無防備状態の個体、心疾患を有する個体、肥満の個体、および他のウイルスまたは細菌感染を有する個体が含まれるが、これらに限定されない。したがって、処置に適した個体には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２またはその任意のバリアントに感染しているか、または感染するリスクがある個体が含まれる。
定義
「ウイルスの野生型株」は、本明細書に記載されているように、ヒトが作製した変異のいずれも含まない株であり、すなわち、野生型ウイルスは、自然から（例えば、ウイルスに感染したヒトから）単離され得る任意のウイルスである。野生型ウイルスは実験室で培養することができ、そしてなお、他のウイルスの非存在下で、自然から単離されたもののような子孫ゲノムまたはビリオンを産生することができる。
本明細書で使用される場合、「処置」、「処置すること」などの用語は、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを指す。効果は、疾患またはその症候を完全にまたは部分的に予防するという点で予防的であり得、および／または疾患および／または疾患に起因する有害作用の部分的または完全な治癒という点で治療的であり得る。「処置」とは、本明細書で使用される場合、哺乳動物、特にヒトにおける疾患の任意の処置をカバーし、（ａ）疾患の素因を有する可能性があるが、それを有するとまだ診断されていない対象において疾患が発生することを予防すること、（ｂ）疾患を阻害すること、すなわち、その発症を停止させること、および（ｃ）疾患を軽減すること、すなわち、疾患の退行を引き起こすことを含む。
本明細書で互換的に使用される「個体」、「対象」、「宿主」、および「患者」という用語は、ネズミ科（ラット、マウス）、非ヒト霊長類、ヒト、イヌ、ネコ、有蹄動物（例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ）などを含む哺乳動物を指すが、これらに限定されない。
「治療有効量」または「効果のある量」は、疾患を処置するために哺乳動物（例えば、ヒト）または他の対象に投与された場合、疾患のそのような処置の効果をもたらすのに十分な薬剤（例えば、本明細書に記載の構築物、粒子など）の量を指す。「治療有効量」は、化合物または細胞、疾患およびその重症度、ならびに処置される対象の年齢、体重などに応じて変動し得る。
「共投与」および「と組み合わせて」という用語は、２種またはそれを超える治療剤を特定の時間制限なく、同時に、並行してまたは連続的にのいずれかでの投与を含む。一実施形態では、薬剤は、細胞中または対象の体内に同時に存在するか、またはそれらの生物学的または治療的効果を同時に発揮する。一実施形態では、治療剤は同じ組成物または単位剤形中にある。他の実施形態では、治療剤は別個の組成物または単位剤形中にある。ある特定の実施形態では、第１の薬剤は、第２の治療剤の投与の前に（例えば、分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、または１２週間前）、第２の治療剤の投与と併用して、または第２の治療剤の投与に続けて（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、または１２週間後）投与することができる。
本明細書で使用される場合、「医薬組成物」は、対象、例えば哺乳動物、例えばヒトへの投与に適した組成物を包含することを意味する。一般に、「医薬組成物」は無菌であり、対象内に望ましくない応答を誘発し得る汚染物質を含まない（例えば、医薬組成物中の化合物は、医薬品グレードである）。医薬組成物は、経口、口腔、直腸、非経口、腹腔内、皮内、気管内などを含むいくつかの異なる投与の経路を介して、それを必要とする対象または患者に投与するように設計することができる。
範囲を含むすべての数値指定、例えば、温度、時間、濃度、ウイルス負荷、および分子量は、必要に応じて、０．１または１．０の増分で（＋）または（－）に変動する近似値である。常に明示的に述べられているわけではないが、すべての数値指定の前に「約（ａｂｏｕｔ）」という用語が先行することを理解されたい。また、常に明示的に述べられているわけではないが、本明細書に記載の試薬は単なる例示であり、いくつかの場合、当技術分野で均等物が利用可能であり得ることも理解されたい。
また、本明細書で使用される場合、「および／または」は、関連して列挙された項目の１つまたはそれを超えるありとあらゆる可能な組合せ、ならびに代替（「または」）で解釈される場合の組合せの欠如を指し、包含する。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明確にそうでないことを指示しない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「干渉粒子（ａｎ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ｐａｒｔｉｃｌｅ）」への言及は、複数のそのような粒子を含み、「シス作用性エレメント（ｔｈｅ ｃｉｓ－ａｃｔｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔ）」への言及は、当業者に公知な１つまたはそれを超えるシス作用性エレメントおよびその均等物への言及などを含む。特許請求の範囲は、任意の要素を除外するように起草され得ることにさらに留意されたい。したがって、この記述は、特許請求の範囲の要素の列挙または「否定的な」限定の使用に関連して、「単独で」、「のみ」などのような排他的な用語を使用するための先行基礎としての役割を果たすことを意図している。
値の範囲が提供される場合、その範囲の上限と下限との間の、文脈が明確にそうでないことを指示しない限り、下限の単位の１０分の１までの各介在値、およびその記載された範囲内の任意の他の記載値または介在値が、本発明内に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限および下限は、独立してより小さい範囲に含まれてもよく、記載された範囲内の任意の具体的に除外された限界を条件として、本発明内にも包含される。記載された範囲が限界の一方または両方を含む場合、それらの含まれる限界の一方または両方を除外した範囲も本発明に含まれる。
以下の例は、本発明の開発において行われた実験的作業のいくつかを示す。
実施例１：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ランダム欠失ライブラリ（ＲＤＬ）の生成
効率的な動員に必要なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の領域を系統的に同定するために、ＨＩＶ ＮＬ４－３のランダム欠失ライブラリを作成しインデックス付けしたＷｅｉｎｂｅｒｇｅｒおよびＮｏｔｔｏｎ（２０１７）によって記載されたものと同様のランダム化欠失スクリーニングを利用した。
簡潔には、プラスミドＤＮＡをトランスポゾン媒介のランダム挿入に供し、続いてトランスポゾンの切除、露出した末端のエキソヌクレアーゼ媒介の消化により、ランダムな遺伝的位置を中心とする各々が可変サイズの欠失を作成した。次いで、プラスミドを、２０ヌクレオチドのランダムＤＮＡバーコードを含むカセットと一緒に再ライゲーションして、欠失を「インデックス付け」した。インデックス付けにより、欠失した領域を（ゲノム配列とバーコードとの連結によって）容易に同定し、ディープシーケンシングによって追跡／定量することが可能になる。このプロセスは、図１～図４に概略的に図示されている。図５Ａは、このプロセスをさらに図示する。
ライブラリのメンバーの欠失部位を配列決定した。図５Ｂに示される欠失深度プロットは、サブライブラリが５８７，０００個を超える欠失を含んだことを示す。サブライブラリをライゲーションして全長ライブラリを形成し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２インサートをＲＮＡにインビトロで転写し、ＲＮＡをＶｅｒｏＥ６細胞にトランスフェクトした。次いで、トランスフェクトした細胞を野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに感染させて、欠失変異体の動員を試験した。３回のウイルス継代の後、ＲＮＡを細胞から抽出し、欠失バーコードの存在を分析した。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ バイロリアクター
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２欠失変異体に感染され得る、懸濁液中のシリコーンビーズ上で増殖するＶｅｒｏＥ６細胞を使用して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バイロリアクターを設定し、それによって感染および最終的にはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２治療用干渉粒子（ＴＩＰ）の進化を改善するための動的システムを創出した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バイロリアクターに使用される条件は、ＨＩＶ ＴＩＰを単離するために使用されるプロトコル（ＷｅｉｎｂｅｒｇｅｒおよびＮｏｔｔｏｎ（２０１７）によって記載されている）から適合させた。
図６Ａに図示されるように、ＶｅｒｏＥ６細胞が定常状態の密度に達したとき、穏やかな撹拌下、０．５または５のＭＯＩでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２欠失変異体に感染させた。培養物の半分を毎日リアクターから取り出し、新鮮な細胞および培地で置き換えた。リアクターから取り出した試料を遠心分離し、後の分析のために上清を凍結し、ヨウ化プロピジウム染色プロトコルを使用したフローサイトメトリーによって細胞生存率を測定した（図６Ｂ）。細胞生存率は、感染の２日後（ｄｐｉ）では低かった（３５～６０％）（図６Ｃ～図６Ｄ）が、感染の４日後（ｄｐｉ）すぐに回復し始め、１２ｄｐｉまで安定したまま（６０～８０５）であった。１３日目に、培養物は９０％超の細胞生存率まで回復した。
実施例２：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２治療用干渉粒子（ＴＩＰ）
図７Ａ～図７Ｂに示される構造を有する最小ＴＩＰ構築物、ＴＩＰ１およびＴＩＰ２を設計し、クローニングした。ＴＩＰ１およびＴＩＰ２構築物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の５’および３’ＵＴＲの様々な部分をコードし、ＩＲＥＳから駆動されるｍＣｈｅｒｒｙレポータータンパク質を発現する。プラスミド構築物を配列検証した。
ＴＩＰ１における５’ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列は以下に示す通りである（配列番号２８）。
Figure 2023530049000050
ＴＩＰ１における３’ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列を配列番号２９として以下に示す。
Figure 2023530049000051
Figure 2023530049000052
ＴＩＰ２における５’ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列は以下に示す通りである（配列番号３０）。
Figure 2023530049000053
Figure 2023530049000054
ＴＩＰ２における３’ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列は以下に示す通りである（配列番号３１）。
Figure 2023530049000055
２つのさらなるＴＩＰバリアントはクローニングされたＴＩＰ１＊およびＴＩＰ２＊であり、これらは５’ＵＴＲ内に共通のＣ－２４１－Ｔ変異を含む。このＣ２４１Ｔ ＵＴＲ変異は、スパイクタンパク質Ｄ６１４Ｇ変異と一緒に集団間で共伝播する。
よって、ＴＩＰ１＊における５’ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列は以下に示す通りである（配列番号３２）。
Figure 2023530049000056
同様に、ＴＩＰ２＊におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列は以下の通りである（配列番号３３）。
Figure 2023530049000057
Figure 2023530049000058
ＴＩＰ構築物がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の複製を減少させることができるかどうかを試験するために、４つのＴＩＰ構築物からのｍＲＮＡを、各プラスミドにおいてＴＩＰの上流に作動可能に連結されたＴ７プロモーターからのインビトロ転写によって生成した。インビトロで転写されたＴＩＰ ｍＲＮＡの異なる調製物をＶｅｒｏ Ｅ６細胞（ＴＩＰ１、ＴＩＰ１＊、ＴＩＰ２、またはＴＩＰ２＊）にトランスフェクトし、細胞をＭＯＩ＝０．００５でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＷＡ株）に感染させた。感染後４８時間で試料を回収し、収量減少アッセイを行った（図８を参照）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｅ（エンベロープ）遺伝子がＴＩＰ配列に存在しないため、感染後４８時間でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｍＲＮＡ（Ｅ遺伝子）の減少倍数によって収量減少アッセイを測定した。
図８に示すように、ＴＩＰ構築物はすべてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス複製を減少させた一方、ＴＩＰ２構築物はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する最大の干渉を示した。
実施例３：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＴＩＰはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって動員され、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と一緒に伝播する
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって動員され、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と一緒に伝播される候補ＴＩＰの能力を試験するために、上清移行実験を行った。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染したＶｅｒｏ Ｅ６細胞を、図７Ａ～図７Ｂに示される構造を有する様々なＴＩＰ候補でトランスフェクトした。したがって、ｍＣｈｅｒｒｙ発現の分析をＴＩＰ複製の尺度として使用することができる。感染の９６時間後に、この第１の細胞集団から上清を収集し、上清を新鮮なＶｅｒｏ細胞の第２の集団に移した。第１の対照として、上清をナイーブ非感染細胞からＶｅｒｏ細胞に移し、第２の対照として、上清をＴＩＰでトランスフェクトされていないＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した細胞から移した。フローサイトメトリーを実施して、上清移行の４８時間後に第２の細胞集団のｍＣｈｅｒｒｙ発現を分析した。
図９に示すように、第１および第２の対照はｍＣｈｅｒｒｙ発現を示さなかった（図９Ａ～図９Ｂ）。しかしながら、ＴＩＰ候補ｍＲＮＡでトランスフェクトし、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染させた細胞からの上清はｍＣｈｅｒｒｙ産生細胞を生成し、機能性ウイルス様粒子（ＶＬＰ）がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヘルパーウイルスによって生成されていることを示した（図９Ｃ～図９Ｉ）。概して、本発明者らは、ｍＲＮＡトランスフェクション（図９Ｇ～図９Ｈ）がＤＮＡトランスフェクション（図９Ｃ～図９Ｆ）よりも良好な動員をもたらすことを見出した。これは、ｍＲＮＡトランスフェクションがまた、ＤＮＡトランスフェクションよりも良好なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２干渉をもたらしたＲＴ－ｑＰＣＲによる収量減少アッセイの結果と一致していた（図示せず）。
実施例４：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗ウイルス介入のための転写調節配列（ＴＲＳ）
この実施例は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に介入または干渉するためのアンチセンスＲＮＡの使用を記載する。
転写開始は、いくつかのタイプのコンセンサス転写調節配列（ＴＲＳ）：ＴＲＳ１－Ｌ：５’－ｃｕａａａｃ－３’（配列番号３６）、ＴＲＳ２－Ｌ：５’－ａｃｇａａｃ－３’（配列番号３７）、およびＴＲＳ３－Ｌ、５’－ｃｕａａａｃｇａａｃ－３’（配列番号３８）によってコロナウイルスにおいて調節される。
転写がこれらの転写開始部位から阻害され得るかどうかを評価するために、以下のアンチセンスＴＲＳ ＲＮＡを開発した：
ＴＲＳ１－ＡＣＧＡＡＣＣＵＡＡＡＣＡＣＧＡＡＣＣＵＡＡＡＣ（配列番号２５）、
ＴＲＳ２－（ＡＣＧＡＡＣＡＣＧＡＡＣＡＣＧＡＡＣＡＣＧＡＡＣ（配列番号２６）、および
ＴＲＳ３－ＣＵＡＡＡＣＣＵＡＡＡＣＣＵＡＡＡＣＣＵＡＡＡＣ（配列番号２７）。
Ｖｅｒｏ細胞をアンチセンスＴＲＳ ＲＮＡでトランスフェクトし、次いで、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＭＯＩ ０．０１または０．０５）に感染させた。対照として、細胞をスクランブルＲＮＡ（ＴＲＳ ＲＮＡの代わりに）でトランスフェクトし、次いで、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＭＯＩ ０．０１または０．０５）に感染させた。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の力価を定量的ＰＣＲによって決定し、ウエスタンブロットを２４、４８および７２時間で調製した。
図１１Ａ～図１１Ｃに示すように、ＴＲＳ２アンチセンスの使用は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の力価を最大限に低下させた（図１１Ｂ）。
次いで、Ｖｅｒｏ細胞をＴＲＳ２アンチセンスとＴＩＰ１またはＴＩＰ２のいずれかとの組合せと共にインキュベートし、次いで細胞をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染させた。次いで、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノム数の倍数変化を決定した。
図１２に示すように、ＴＲＳ２アンチセンスとＴＩＰ１またはＴＩＰ２のいずれかとの組合せは、ＴＲＳ単独と比較して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノム数を有意に減少させた。
実施例５：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＴＩＰは様々なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株の複製を減少させる
この実施例は、様々なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株に介入または干渉するための治療用干渉粒子（ＴＩＰ１およびＴＩＰ２）の使用を記載する。
Ｖｅｒｏ細胞を、治療用干渉粒子（０．３ｎｇ／μｌまたは０．００３ｎｇ／μｌのＴＩＰ１またはＴＩＰ２）または対照ＲＮＡをカプセル化する脂質ナノ粒子で前処置した。処置の２時間後、細胞を以下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株のうちの１つに感染させた（ＭＯＩ ０．００５）：
・ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の５０１Ｙ．Ｖ２．ＨＶバリアント、口語的に南アフリカバリアントとして公知；
・ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の５０１Ｙ．Ｖ２．ＨＶデルタバリアント、口語的に南アフリカバリアントとして公知；および
・Ｂ．１．１．７バリアント、口語的にＵ．Ｋ．バリアントとして公知。
感染後４８時間に、上清を感染した培養物から回収し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス力価を定量した。
図１３Ａ～図１３Ｃは、ＴＩＰ１およびＴＩＰ２が用量依存的にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の複製を有意に減少させることを示す。
以下の記述は、本明細書に記載の本発明の核酸および方法のいくつかの態様の概要を提供する。
記述：
１．少なくとも１００ヌクレオチドのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、少なくとも１００ヌクレオチドの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）、またはそれらの組合せを含むシス作用性エレメントを含む、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
２．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の複製に干渉する、記述１に記載の構築物。
３．複製できない、記述１または２に記載の構築物。
４．感染性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の存在下で複製する、記述１～３のいずれか１つに記載の構築物。
５．ウイルスの複製および産生をそれ自体ではできず、ヘルパーウイルスとして作用するための複製能を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を必要とする、記述１～４のいずれか１つに記載の構築物。
６．感染性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の存在下、細胞間で伝播され得る、記述１～５のいずれか１つに記載の構築物。
７．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のためのパッケージングシグナルを含む、記述１～６のいずれか１つに記載の構築物。
８．配列番号１～２２のいずれかの部分をコードするＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムの部分の欠失を含む、記述１～７のいずれか１つに記載の構築物。
９．ゲノムから欠失された部分が、少なくとも１０～少なくとも２７，０００ヌクレオチドを含む、記述８に記載の構築物。
１０．ゲノムから欠失された部分が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムの少なくとも１００、少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも１５００、少なくとも２０００、少なくとも２５００、少なくとも３０００、少なくとも４０００、少なくとも５０００、少なくとも６０００、少なくとも７０００、少なくとも８０００、少なくとも９０００、少なくとも１０，０００、少なくとも１１，０００、少なくとも１２，０００、少なくとも１３，０００、少なくとも１４，０００、少なくとも１５，０００、少なくとも１６，０００、少なくとも１７，０００、少なくとも１８，０００、少なくとも１９，０００、少なくとも２０，０００、少なくとも２１，０００、少なくとも２２，０００、少なくとも２３，０００、少なくとも２４，０００、少なくとも２５，０００、少なくとも２６，０００、少なくとも２７，０００、少なくとも２７５００、少なくとも２８０００ヌクレオチドを含む、記述８または９に記載の構築物。
１１．記述１～１０のいずれか１つに記載の構築物であって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物が野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の細胞侵入を阻止するか、ウイルス粒子アセンブリを媒介する構造タンパク質に対して競合するか、インビボでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物の再生低下を示すか、ウイルス粒子のアセンブリを阻害するタンパク質を産生するか、またはそれらの組合せである、構築物。
１２．野生型または天然型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムヌクレオチド配列と比較して、１つまたはそれを超えるヌクレオチド配列の変更を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノム核酸、記述１１に記載の構築物。
１３．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物ゲノム核酸の、スパイクタンパク質膜融合Ｓ２サブユニット、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、Ｍタンパク質（膜糖タンパク質）、ｓｓＲＮＡ結合タンパク質、またはそれらの組合せにおいて１つまたはそれを超えるヌクレオチド配列の変更を含む、記述１１または１２に記載の構築物。
１４．記述１～１３のいずれかに記載の構築物であって、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した宿主細胞中に存在する場合、構築物ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノムＲＮＡの、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノムＲＮＡに対する比が細胞において１を超えるように、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物のゲノムＲＮＡが野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノムＲＮＡよりも高い速度で産生される、構築物。
１５．野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２よりも高い伝播頻度を有する、記述１～１４のいずれかに記載の構築物。
１６．基本再生産比（Ｒ０）＞１を有する、記述１～１５のいずれかに記載の構築物。
１７．野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した宿主細胞中に存在する場合、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と同じまたはより高い効率でパッケージングされる、記述１～１６のいずれかに記載の構築物。
１８．１～２６５、２６６～８０５、８０６～２７１９、２７２０～８５５４、８５５５～１００５４、１００５５～１０９７２、１０９７３～１１８４２、１１８４３～１２０９１、１２０９２～１２６８５、１２６８６～１３０２４、１３０２５～１３４４１、１３４４２～１３４６８、１３４６８～１６２３６、１６２３７～１８０３９、１８０４０～１９６２０、１９６２１～２０６５８、２０６５９～２１５５２、２１５６３～２５３８４、２６６～１３４８３位、またはそれらの組合せ内に少なくとも１～２０ヌクレオチドの欠失を含む（ここで、位置番号は配列番号１の参照ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列に対するものである）、記述１～１７のいずれかに記載の構築物。
１９．スパイク糖タンパク質のコード領域の２１５６３～２５３８４位内、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのコード領域の１３４４２～１６２３６の番号が付けられた位置内、Ｍタンパク質（膜糖タンパク質）のコード領域の２６５２３～２７１９１位、ｓｓＲＮＡ結合タンパク質のコード領域の１２６８６～１３０２４位、またはそれらの組合せ内に少なくとも１～２０ヌクレオチドの欠失を含む（ここで、位置番号は配列番号１の参照ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列に対するものである）、記述１～１８のいずれかに記載の構築物。
２０．少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９．１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０ １７０、１８０、１９０、２００、２２５、２５０、３００、３５０、４００、４５０または５００ヌクレオチドの欠失を含む、記述１～１９のいずれかに記載の構築物。
２１．配列番号２８、３０、３２または３３のいずれかを有する５’ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２短縮型配列を含む、記述１～２０のいずれかに記載の構築物。
２２．３’ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２短縮型配列、例えば、配列番号３１または３２を有するもののいずれかを含む、記述１～２１のいずれかに記載の構築物。
２３．伸長されたポリＡ配列を含む、記述１～２２のいずれかに記載の構築物。
２４．伸長されたポリＡ配列がｍＲＮＡの半減期を延長する、記述２３に記載の構築物。
２５．伸長されたポリＡ配列が、少なくとも１００アデニンヌクレオチド、少なくとも１２０アデニンヌクレオチド、少なくとも１４０アデニンヌクレオチド、少なくとも１５０アデニンヌクレオチド、少なくとも１７０アデニンヌクレオチド、少なくとも１８０アデニンヌクレオチド、少なくとも２００アデニンヌクレオチド、少なくとも２２５アデニンヌクレオチド、または少なくとも２５０アデニンヌクレオチドを含む、記述２３または２４のいずれかに記載の構築物。
２６．検出可能なマーカーをコードするセグメントを含む、記述１～２５のいずれかに記載の構築物。
２７．記述１～２６のいずれか１つに記載の構築物およびウイルスエンベロープタンパク質を含む粒子。
２８．記述１～２６のいずれかに記載の構築物または記述２７に記載の粒子、および薬学的に許容され得る賦形剤を含む、医薬組成物。
２９．ＴＲＳ１－Ｌ：５’－ｃｕａａａｃ－３’（配列番号３６）、ＴＲＳ２－Ｌ：５’－ａｃｇａａｃ－３’（配列番号３７）、ＴＲＳ３－Ｌ、５’－ｃｕａａａｃｇａａｃ－３’（配列番号３８）、またはそれらの組合せのうちの複数のうちの１つに結合し得るＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２転写調節配列（ＴＲＳ）の阻害剤。
３０．以下を含むか、または以下から本質的になる配列：
ＴＲＳ１－ＡＣＧＡＡＣＣＵＡＡＡＣＡＣＧＡＡＣＣＵＡＡＡＣ（配列番号２５）、
ＴＲＳ２－ＡＣＧＡＡＣＡＣＧＡＡＣＡＣＧＡＡＣＡＣＧＡＡＣ（配列番号２６）、
ＴＲＳ３－ＣＵＡＡＡＣＣＵＡＡＡＣＣＵＡＡＡＣＣＵＡＡＡＣ（配列番号２７）、または
それらの組合せ
を含む、記述２９に記載の阻害剤。
３１．記述２９または３０に記載の阻害剤、および薬学的に許容され得る賦形剤を含む、医薬組成物。
３２．薬学的に許容され得る賦形剤、および記述２９もしくは３０に記載の阻害剤、記述１～２６のいずれかに記載の構築物、記述２７に記載の粒子、またはそれらの組合せを含む、医薬組成物。
３３．記述２８、３１、または３２に記載の組成物を対象に投与することを含む方法。
３４．対象が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した実験動物である、記述３３に記載の方法。
３５．対象がヒトである、記述３３に記載の方法。
３６．対象が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染している疑いがあるヒトであり、対象が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２について陽性と試験されたヒトである、記述３３または３５に記載の方法。
３７．対象が、医学的症状、既存の症状、または心臓、肺、脳もしくは免疫系の機能を低下させる症状を有する、記述３３～３６のいずれか１つに記載の方法。
３８．記述１～２６のいずれかに記載の構築物または記述２７の粒子を含む単離された細胞。
３９．（ａ）配列特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼのための標的配列を含むトランスポゾンカセットを環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの集団に挿入して、トランスポゾン挿入された環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの集団を生成すること、
（ｂ）トランスポゾン挿入された環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの集団を配列特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼと接触させて、切断された線状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの集団を生成すること、
（ｃ）切断された線状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの集団を１種またはそれを超えるエキソヌクレアーゼと接触させて、欠失ＤＮＡの集団を生成すること、および
（ｄ）欠失ＤＮＡを環状化して、環状化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２欠失ＤＮＡのライブラリを生成すること
を含む、欠失ライブラリを生成する方法。
４０．環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムを含むプラスミドである、記述３９に記載の方法。
４１．環状化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２欠失ＤＮＡのライブラリのメンバーを哺乳動物細胞に導入すること、およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染性についてアッセイすることをさらに含む、記述３９または４０に記載の方法。
４２．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２欠陥干渉粒子（ＤＩＰ）を同定するために、環状化欠失ＤＮＡのライブラリのメンバーを配列決定することをさらに含む、記述３９～４１のいずれか１つに記載の方法。
４３．配列特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼが、メガヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、またはＴＡＬＥＮから選択される、記述３９～４２のいずれか１つに記載の方法。
４４．ステップ（ｄ）の前にまたはステップ（ｄ）と同時にバーコード配列を挿入することを含む、記述３９～４３のいずれか１つに記載の方法。
４５．１種またはそれを超えるエキソヌクレアーゼがＴ４ ＤＮＡポリメラーゼを含む、記述３９～４４のいずれか１つに記載の方法。
４６．１種またはそれを超えるエキソヌクレアーゼが、３’から５’へのエキソヌクレアーゼおよび５’から３’へのエキソヌクレアーゼを含む、記述３９～４５のいずれか１つに記載の方法。
４７．切断された線状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの集団を１種またはそれを超えるエキソヌクレアーゼと接触させるステップが、一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）の存在下で行われる、記述３９～４６のいずれか１つに記載の方法。
４８．トランスポゾンカセットが、トランスポゾンカセットの一端またはその付近に配置された第１の認識配列、およびトランスポゾンカセットの他端またはその付近に配置された第２の認識配列を含む、記述３９～４７のいずれか１つに記載の方法。
４９．ステップ（ａ）の前に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２線状ＤＮＡ分子の集団を環状化して前記環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの集団を生成することをさらに含む、記述３９～４８のいずれか１つに記載の方法。
５０．線状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡ分子の集団が、１種もしくはそれを超えるＰＣＲ産物、１種もしくはそれを超える線状ウイルスゲノム、および／または１種もしくはそれを超える制限消化産物を含む、記述４９に記載の方法。
５１．環状化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２欠失ＤＮＡのライブラリのメンバーを哺乳動物細胞に導入することをさらに含む、記述３９～５０のいずれか１つに記載の方法。
５２．環状化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２欠失ＤＮＡのライブラリから、線状二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）産物、線状一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）産物、線状一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）産物、および線状二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）産物のうちの少なくとも１つを生成することをさらに含む、記述３９～５１のいずれか１つに記載の方法。
５３．前記線状ｄｓＤＮＡ産物、線状ｓｓＤＮＡ産物、線状ｓｓＲＮＡ産物、および／または線状ｄｓＲＮＡ産物を哺乳動物細胞に導入することをさらに含む、記述５２に記載の方法。
５４．（ａ）配列特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼのための標的配列を、各々のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＤＮＡがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスゲノムを含む環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＤＮＡの集団に挿入して、配列挿入されたウイルスＤＮＡの集団を生成すること、
（ｂ）配列挿入されたウイルスＤＮＡの集団を配列特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼと接触させて、切断された線状ウイルスＤＮＡの集団を生成すること、
（ｃ）切断された線状ウイルスＤＮＡの集団をエキソヌクレアーゼと接触させて、欠失ＤＮＡの集団を生成すること、
（ｄ）欠失ＤＮＡを環状化して、環状化欠失ウイルスＤＮＡのライブラリを生成すること、および
（ｅ）環状化欠失ウイルスＤＮＡのライブラリのメンバーを配列決定して、欠失干渉粒子（ＤＩＰ）を同定すること
を含む、欠陥干渉粒子（ＤＩＰ）を生成および同定する方法。
５５．ステップ（ａ）の前に、線状ＤＮＡ分子の集団を環状化して前記環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＤＮＡの集団を生成することを含む、記述５４に記載の方法。
５６．線状ＤＮＡ分子の集団が、１種もしくはそれを超えるＰＣＲ産物、１種もしくはそれを超える線状ウイルスゲノム、および／または１種もしくはそれを超える制限消化産物を含む、記述５４または５５に記載の方法。
５７．ステップ（ｄ）の前にまたはステップ（ｄ）と同時にバーコード配列を挿入することを含む、記述５４～５６のいずれか１つに記載の方法。
５８．（ｉ）環状化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２欠失ウイルスＤＮＡのライブラリのメンバーを哺乳動物細胞に導入すること、および（ｉｉ）ウイルス感染性についてアッセイすることをさらに含む、記述５４～５７のいずれか１つに記載の方法。
５９．環状化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２欠失ウイルスＤＮＡのライブラリから、線状二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）産物、線状一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）産物、線状一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）産物、および線状二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）産物のうちの少なくとも１つを生成すること
をさらに含む、記述５４～５８のいずれか１つに記載の方法。
６０．前記線状ｄｓＤＮＡ産物、線状ｓｓＤＮＡ産物、線状ｓｓＲＮＡ産物、および／または線状ｄｓＲＮＡ産物を哺乳動物細胞に導入すること、ならびに
ウイルス感染性についてアッセイすること
をさらに含む、記述５９に記載の方法。
６１．ステップ（ａ）の挿入することが、トランスポゾンカセットを環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＤＮＡの集団に挿入することを含み、トランスポゾンカセットが配列特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼのための標的配列を含み、前記配列挿入されたウイルスＤＮＡの生成された集団がトランスポゾン挿入されたウイルスＤＮＡの集団である、記述３９～６０のいずれかに記載の方法。
６２．ステップ（ｄ）の後に、培養中の哺乳動物細胞を環状化欠失ウイルスＤＮＡのライブラリのメンバーに高感染多重度（ＭＯＩ）で感染させること、感染した細胞を１２時間～２日間の範囲の期間培養すること、ナイーブ細胞を培養物に添加すること、および培養中の細胞からウイルスを回収することを含む、記述３９～６１のいずれか１つに記載の方法。
６３．ステップ（ｄ）の後に、培養中の哺乳動物細胞を環状化欠失ウイルスＤＮＡのライブラリのメンバーに低感染多重度（ＭＯＩ）で感染させること、感染した細胞をウイルス複製の阻害剤の存在下で１日～６日間の範囲の期間培養すること、培養した細胞を機能性ウイルスに高ＭＯＩで感染させること、感染した細胞を１２時間～４日間の範囲の期間培養すること、培養した細胞からウイルスを回収することを含む、記述３９～６２のいずれか１つに記載の方法。
６４．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに感染している疑いがある個体を処置する方法であって、治療有効量の記述１～２６のいずれかに記載の構築物、記述２７に記載の粒子、または記述２８に記載の医薬組成物を個体に投与することを含む、方法。
６５．治療有効量の記述３１または３２に記載の組成物を個体に投与することをさらに含む、記述６４に記載の方法。
６６．個体におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス負荷を減少させる、記述６４または６５に記載の方法。
６７．個体が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染と診断されているか、または一般集団よりもＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染する高いリスクがあると考えられる、記述６４～６６のいずれか１つに記載の方法。
６８．個体に対する、記述１～２６のいずれかに記載の構築物、記述２７に記載の粒子、記述２８に記載の医薬組成物、または記述３１もしくは３２の組成物を含む容器を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスによる感染を処置するためのキット。
６９．容器が、肺または鼻腔への投与のためのシリンジまたはデバイスである、記述６８に記載のキット。
７０．記述１～２６のうちの１つに記載の構築物を含む単離された生体液。
７１．生体液が血液または血漿である、記述６５に記載の単離された生体液。
７２．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに感染した細胞を、記述１～２６のいずれかに記載の構築物でトランスフェクトすること、および構築物を粒子にパッケージングするのに適した条件下で細胞をインキュベートすることを含む、粒子を生成する方法。
本発明を上記の実施形態と併せて説明してきたが、前述の説明および例は例示を意図しており、本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。本発明の範囲内の他の態様、利点および修正は、本発明が関係する当業者には明らかであろう。
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同等の任意の方法および材料もまた、本発明の実践または試験で使用することができるが、ここでは好ましい方法および材料を説明する。本明細書で言及されるすべての刊行物は、刊行物が引用される関連する方法および／または材料を開示および説明するために参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、記載された特定の実施形態に限定されず、したがって当然のことながら変動し得ることを理解されたい。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定することを意図するものではないことも理解されたい。いかなる状況下においても、本特許は、いかなる審査官または特許商標庁の他の職員もしくは従業員によってなされた陳述によっても限定されると解釈されてはならない。ただし、そのような記述が具体的、かつ、出願人による応答の書面において明示的に採用された制限または留保がない場合を除く。
さらに、本発明の特徴または態様がマーカッシュ群の観点から記載されている場合、当業者は、本発明がそれによってマーカッシュ群の任意の個々のメンバーまたはサブグループメンバーに関しても記載されることを認識するであろう。

Claims (39)

  1. 少なくとも１００ヌクレオチドのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、少なくとも１００ヌクレオチドの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）、またはそれらの組合せを含むシス作用性エレメントを含む、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
  2. ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の複製に干渉する、請求項１に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
  3. 細胞内で複製できない、請求項１に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
  4. 感染性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の存在下で複製する、請求項１に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
  5. 感染性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の存在下、細胞間で伝播され得る、請求項１に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
  6. ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のためのパッケージングシグナルを含む、請求項１に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
  7. 配列番号１～２２のいずれかの部分をコードするＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムの部分の欠失を含む、請求項１に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
  8. 前記ゲノムから欠失された部分が、少なくとも１０～少なくとも２７，０００ヌクレオチドを含む、請求項７に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
  9. 請求項１に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物であって、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の細胞侵入を阻止するか、ウイルス粒子アセンブリを媒介する構造タンパク質に対して競合するか、インビボで前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物の再生低下を示すか、ウイルス粒子のアセンブリを阻害するタンパク質を産生するか、またはそれらの組合せである、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
  10. 請求項１に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物であって、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した宿主細胞中に存在する場合、構築物ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノムＲＮＡの、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノムＲＮＡに対する比が前記細胞において１を超えるように、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物のゲノムＲＮＡが前記野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノムＲＮＡよりも高い速度で産生される、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
  11. 前記野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２よりも高い伝播頻度を有する、請求項１に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
  12. 基本再生産比（Ｒ０）＞１を有する、請求項１に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
  13. 野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した宿主細胞中に存在する場合、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と同じまたはより高い効率でパッケージングされる、請求項１に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
  14. 配列番号２８、３０、３２または３３のいずれかを有する５’ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２短縮型配列を含む、請求項１に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
  15. 配列番号３１または３２を有するもののいずれかなどの３’ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２短縮型配列を含む、請求項１４に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
  16. 伸長されたポリＡ配列を含む、請求項１に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
  17. 前記伸長されたポリＡ配列が少なくとも１００アデニンヌクレオチドを含む、請求項１６に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
  18. 検出可能なマーカーをコードするセグメントを含む、請求項１に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
  19. 請求項１に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物、および薬学的に許容され得る賦形剤を含む、医薬組成物。
  20. ＴＲＳ１－Ｌ：５’－ｃｕａａａｃ－３’（配列番号３６）、ＴＲＳ２－Ｌ：５’－ａｃｇａａｃ－３’（配列番号３７）、ＴＲＳ３－Ｌ、５’－ｃｕａａａｃｇａａｃ－３’（配列番号３８）、またはそれらの組合せのうちの複数のうちの１つに結合し得る、１つまたはそれを超えるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２転写調節配列（ＴＲＳ）の阻害剤。
  21. 以下を含むか、または以下から本質的になる配列：
    ＴＲＳ１－ＡＣＧＡＡＣＣＵＡＡＡＣＡＣＧＡＡＣＣＵＡＡＡＣ（配列番号２５）、
    ＴＲＳ２－ＡＣＧＡＡＣＡＣＧＡＡＣＡＣＧＡＡＣＡＣＧＡＡＣ（配列番号２６）、
    ＴＲＳ３－ＣＵＡＡＡＣＣＵＡＡＡＣＣＵＡＡＡＣＣＵＡＡＡＣ（配列番号２７）、または
    それらの組合せ
    を含む、請求項２０に記載の阻害剤。
  22. 請求項２０に記載の阻害剤、および薬学的に許容され得る賦形剤を含む、医薬組成物。
  23. 薬学的に許容され得る賦形剤、（ａ）ＴＲＳ１－Ｌ：５’－ｃｕａａａｃ－３’（配列番号３６）、ＴＲＳ２－Ｌ：５’－ａｃｇａａｃ－３’（配列番号３７）、ＴＲＳ３－Ｌ、５’－ｃｕａａａｃｇａａｃ－３’（配列番号３８）、またはそれらの組合せのうちの複数のうちの１つに結合し得るＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２転写調節配列（ＴＲＳ）の阻害剤、および（ｂ）少なくとも１００ヌクレオチドのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、少なくとも１００ヌクレオチドの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）、またはそれらの組合せを含むシス作用性エレメントを含む組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物を含む、医薬組成物。
  24. （ａ）配列特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼのための標的配列を、各々のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＤＮＡがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスゲノムまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスゲノムの一部分を含む環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＤＮＡの集団に挿入して、配列挿入されたウイルスＤＮＡの集団を生成すること、
    （ｂ）前記配列挿入されたウイルスＤＮＡの集団を前記配列特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼと接触させて、切断された線状ウイルスＤＮＡの集団を生成すること、
    （ｃ）前記切断された線状ウイルスＤＮＡの集団をエキソヌクレアーゼと接触させて、欠失ＤＮＡの集団を生成すること、
    （ｄ）前記欠失ＤＮＡを環状化して、環状化欠失ウイルスＤＮＡのライブラリを生成すること、および
    （ｅ）前記環状化欠失ウイルスＤＮＡのライブラリのメンバーを配列決定して、欠陥干渉粒子（ＤＩＰ）を同定すること
    を含む、１種またはそれを超える欠陥干渉粒子（ＤＩＰ）を生成するための方法。
  25. ステップ（ａ）の前に、線状ＤＮＡ分子の集団を環状化して、前記環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＤＮＡの集団を生成することを含む、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記挿入するステップ（ａ）が、トランスポゾンカセットを前記環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＤＮＡの集団に挿入することを含み、前記トランスポゾンカセットが前記配列特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼのための前記標的配列を含み、前記配列挿入されたウイルスＤＮＡの生成された集団がトランスポゾン挿入されたウイルスＤＮＡの集団である、請求項２４に記載の方法。
  27. ステップ（ｄ）の前にまたはステップ（ｄ）と同時に、バーコード配列、マーカーをコードする発現カセット、またはそれらの組合せを挿入することを含む、請求項２４に記載の方法。
  28. 環状化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２欠失ウイルスＤＮＡのライブラリのメンバーまたは１種もしくはそれを超える種類の欠陥干渉粒子（ＤＩＰ）を培養した哺乳動物細胞に導入すること、およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染性についてアッセイすることをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
  29. 哺乳動物細胞を、前記環状化欠失ウイルスＤＮＡのライブラリのメンバーで、または１種もしくはそれを超える種類の欠陥干渉粒子（ＤＩＰ）でトランスフェクトすること、
    前記哺乳動物細胞をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染させて、アッセイ混合物を生成すること、
    前記アッセイ混合物を培養すること、および
    ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染性について前記アッセイ混合物をアッセイし、前記環状化欠失ウイルスＤＮＡもしくは前記欠陥干渉粒子（ＤＩＰ）、またはそれらの組合せを定量すること
    をさらに含む、請求項２４に記載の方法。
  30. 哺乳動物細胞を、前記環状化欠失ウイルスＤＮＡのライブラリのメンバーで、または１種もしくはそれを超える種類の欠陥干渉粒子（ＤＩＰ）でトランスフェクトすること、
    前記哺乳動物細胞をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染させて、アッセイ混合物を生成すること、
    前記アッセイ混合物を培養すること、
    前記培養した哺乳動物細胞から上清を取り出すこと、
    前記上清をナイーブ細胞の培養物に添加すること、および
    前記感染性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、前記環状化欠失ウイルスＤＮＡ、前記欠陥干渉粒子（ＤＩＰ）、またはそれらの組合せを定量すること
    をさらに含む、請求項２４に記載の方法。
  31. ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに感染した細胞を、請求項１に記載の構築物でトランスフェクトすること、および前記構築物を粒子にパッケージングするのに適した条件下で前記細胞をインキュベートすることを含む、粒子を生成する方法。
  32. 薬学的に許容され得る賦形剤、および治療有効量の少なくとも１つの、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）、もしくはそれらの組合せを含むシス作用性エレメントを含む干渉性組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物、または前記干渉性組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物を含む粒子を含む医薬組成物を、対象に投与することを含む方法。
  33. ＴＲＳ１－Ｌ：５’－ｃｕａａａｃ－３’（配列番号３６）、ＴＲＳ２－Ｌ：５’－ａｃｇａａｃ－３’（配列番号３７）、ＴＲＳ３－Ｌ、５’－ｃｕａａａｃｇａａｃ－３’（配列番号３８）、それらの組合せのうちの複数のうちの１つに結合し得るＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２転写調節配列（ＴＲＳ）の阻害剤、またはその組成物を対象に投与することをさらに含む、請求項３２に記載の方法。
  34. ２～２１日後にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス負荷を測定することをさらに含む、請求項３２に記載の方法。
  35. 前記対象が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２について陽性と試験された個体もしくは患者であるか、または前記対象がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染している疑いがある、請求項３２に記載の方法。
  36. 前記対象が、一般集団よりもＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染する高いリスクがあると考えられるか、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染と診断された、個体または患者である、請求項３２に記載の方法。
  37. ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の処置もしくは予防における、治療有効量の少なくとも１つの、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）、もしくはそれらの組合せを含むシス作用性エレメントを含む干渉性組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物、もしくは前記干渉性組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物を含む粒子、および薬学的に許容され得る賦形剤、
    治療有効量の少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２転写調節配列（ＴＲＳ）の阻害剤であって、ＴＲＳ１－Ｌ：５’－ｃｕａａａｃ－３’（配列番号３６）、ＴＲＳ２－Ｌ：５’－ａｃｇａａｃ－３’（配列番号３７）、ＴＲＳ３－Ｌ、５’－ｃｕａａａｃｇａａｃ－３’（配列番号３８）のうちの複数のうちの１つに結合し得る、阻害剤、
    またはそれらの組合せ
    を含む医薬組成物の、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の処置または阻害における、使用。
  38. ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスによる感染を処置するためのキットであって、
    治療有効量の少なくとも１つの、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）、それらの組合せを含むシス作用性エレメントを含む組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物、またはその医薬組成物を含む容器、
    前記組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物を含む粒子を含む組成物を含む容器、
    ＴＲＳ１－Ｌ：５’－ｃｕａａａｃ－３’（配列番号３６）、ＴＲＳ２－Ｌ：５’－ａｃｇａａｃ－３’（配列番号３７）、ＴＲＳ３－Ｌ、５’－ｃｕａａａｃｇａａｃ－３’（配列番号３８）、またはそれらの組合せのうちの複数のうちの１つに結合し得る、少なくとも１種のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２転写調節配列（ＴＲＳ）の阻害剤を含む容器、
    前記少なくとも１種のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２転写調節配列の阻害剤を含む組成物を含む容器、ならびに
    前記組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物、前記少なくとも１種のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２転写調節配列の阻害剤、およびその組成物を使用するための説明書
    を含む、キット。
  39. 前記容器が、肺または鼻腔への投与のためのシリンジまたはデバイスである、請求項３８に記載のキット。
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