JP2024515348A - コロナウイルスに対する治療用干渉粒子 - Google Patents
コロナウイルスに対する治療用干渉粒子 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2024515348A JP2024515348A JP2023564512A JP2023564512A JP2024515348A JP 2024515348 A JP2024515348 A JP 2024515348A JP 2023564512 A JP2023564512 A JP 2023564512A JP 2023564512 A JP2023564512 A JP 2023564512A JP 2024515348 A JP2024515348 A JP 2024515348A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cov
- sars
- construct
- sequence
- recombinant
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 title claims abstract description 86
- 239000002245 particle Substances 0.000 title claims description 93
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 title description 34
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 title description 7
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 claims abstract description 1117
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 222
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 221
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 claims abstract description 128
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 claims abstract description 118
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 claims abstract description 60
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 48
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims abstract description 31
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 154
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 119
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 102
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 65
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 62
- 208000025721 COVID-19 Diseases 0.000 claims description 45
- 208000037847 SARS-CoV-2-infection Diseases 0.000 claims description 39
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 37
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 37
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 34
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 claims description 32
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 claims description 31
- 201000003176 Severe Acute Respiratory Syndrome Diseases 0.000 claims description 30
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims description 21
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 21
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 19
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 17
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 claims description 17
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 claims description 16
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 16
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 15
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 15
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims description 14
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 13
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 12
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 claims description 10
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 claims description 9
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 claims description 7
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N adenyl group Chemical class N1=CN=C2N=CNC2=C1N GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 claims description 7
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 7
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 claims description 5
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 claims description 5
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 claims description 5
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 claims description 5
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 claims description 5
- 210000000133 brain stem Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 claims 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 claims 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 claims 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 abstract description 37
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 abstract description 3
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 abstract description 3
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 abstract description 2
- 230000010415 tropism Effects 0.000 abstract 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 199
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 160
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 148
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 127
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 127
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 79
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 70
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 47
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 44
- 101100313923 Arabidopsis thaliana TIP1-2 gene Proteins 0.000 description 42
- 101100099674 Oryza sativa subsp. japonica TIP2 gene Proteins 0.000 description 42
- 101100313935 Oryza sativa subsp. japonica TIP2-1 gene Proteins 0.000 description 42
- 101100489349 Arabidopsis thaliana PAT24 gene Proteins 0.000 description 41
- 101100315589 Homo sapiens TAX1BP3 gene Proteins 0.000 description 41
- 101100313925 Oryza sativa subsp. japonica TIP1-2 gene Proteins 0.000 description 41
- 101100313932 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) TIP20 gene Proteins 0.000 description 41
- 102100036221 Tax1-binding protein 3 Human genes 0.000 description 41
- 101100313921 Zea mays TIP1-1 gene Proteins 0.000 description 41
- 101150023068 tip1 gene Proteins 0.000 description 41
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 40
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 40
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 40
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 35
- 239000000047 product Substances 0.000 description 35
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 34
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 34
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 30
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 30
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 28
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 27
- 238000010453 CRISPR/Cas method Methods 0.000 description 25
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 24
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 24
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 24
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 24
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 23
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 23
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 22
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 21
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 20
- 108020004485 Nonsense Codon Proteins 0.000 description 20
- 108010020764 Transposases Proteins 0.000 description 20
- 102000008579 Transposases Human genes 0.000 description 20
- 231100000221 frame shift mutation induction Toxicity 0.000 description 20
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 20
- 230000037434 nonsense mutation Effects 0.000 description 20
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 19
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 19
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 19
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 18
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 18
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 16
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 16
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 15
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 description 15
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 15
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 15
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 15
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 14
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 13
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 13
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 13
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 13
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 13
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 13
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 12
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 12
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 12
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 12
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 12
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 12
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 12
- -1 Ccr1 Proteins 0.000 description 11
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 11
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 11
- 101710198474 Spike protein Proteins 0.000 description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 11
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 11
- 206010037423 Pulmonary oedema Diseases 0.000 description 10
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 10
- 210000002220 organoid Anatomy 0.000 description 10
- 238000003762 quantitative reverse transcription PCR Methods 0.000 description 10
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 9
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 9
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 9
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 9
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 9
- 101800000515 Non-structural protein 3 Proteins 0.000 description 8
- 101800002227 Papain-like protease nsp3 Proteins 0.000 description 8
- 101800001074 Papain-like proteinase Proteins 0.000 description 8
- 101710126859 Single-stranded DNA-binding protein Proteins 0.000 description 8
- 238000010459 TALEN Methods 0.000 description 8
- 108010043645 Transcription Activator-Like Effector Nucleases Proteins 0.000 description 8
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 8
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000006870 function Effects 0.000 description 8
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 8
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 8
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 8
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 8
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 8
- 101800001631 3C-like serine proteinase Proteins 0.000 description 7
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 7
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 7
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 7
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 7
- 241000699673 Mesocricetus auratus Species 0.000 description 7
- 101800004803 Papain-like protease Proteins 0.000 description 7
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 7
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 7
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 7
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 7
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 7
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 7
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 6
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 6
- 108010010677 Phosphodiesterase I Proteins 0.000 description 6
- 108010017070 Zinc Finger Nucleases Proteins 0.000 description 6
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 6
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 6
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 6
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 6
- 230000033458 reproduction Effects 0.000 description 6
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 6
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 6
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101000621943 Acholeplasma phage L2 Probable integrase/recombinase Proteins 0.000 description 5
- 101000618348 Allochromatium vinosum (strain ATCC 17899 / DSM 180 / NBRC 103801 / NCIMB 10441 / D) Uncharacterized protein Alvin_0065 Proteins 0.000 description 5
- 101000781117 Autographa californica nuclear polyhedrosis virus Uncharacterized 12.4 kDa protein in CTL-LEF2 intergenic region Proteins 0.000 description 5
- 101000708323 Azospirillum brasilense Uncharacterized 28.8 kDa protein in nifR3-like 5'region Proteins 0.000 description 5
- 101000770311 Azotobacter chroococcum mcd 1 Uncharacterized 19.8 kDa protein in nifW 5'region Proteins 0.000 description 5
- 101000748761 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized MFS-type transporter YcxA Proteins 0.000 description 5
- 101000765620 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YlxP Proteins 0.000 description 5
- 101000916134 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YqxJ Proteins 0.000 description 5
- 101000754349 Bordetella pertussis (strain Tohama I / ATCC BAA-589 / NCTC 13251) UPF0065 protein BP0148 Proteins 0.000 description 5
- 101000827633 Caldicellulosiruptor sp. (strain Rt8B.4) Uncharacterized 23.9 kDa protein in xynA 3'region Proteins 0.000 description 5
- 108091062157 Cis-regulatory element Proteins 0.000 description 5
- 101000947628 Claviceps purpurea Uncharacterized 11.8 kDa protein Proteins 0.000 description 5
- 101000686796 Clostridium perfringens Replication protein Proteins 0.000 description 5
- 101710139375 Corneodesmosin Proteins 0.000 description 5
- 101150013191 E gene Proteins 0.000 description 5
- 101000788129 Escherichia coli Uncharacterized protein in sul1 3'region Proteins 0.000 description 5
- 101000788370 Escherichia phage P2 Uncharacterized 12.9 kDa protein in GpA 3'region Proteins 0.000 description 5
- 101000787096 Geobacillus stearothermophilus Uncharacterized protein in gldA 3'region Proteins 0.000 description 5
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 101000976889 Haemophilus phage HP1 (strain HP1c1) Uncharacterized 19.2 kDa protein in cox-rep intergenic region Proteins 0.000 description 5
- 101000827627 Klebsiella pneumoniae Putative low molecular weight protein-tyrosine-phosphatase Proteins 0.000 description 5
- 101001130841 Middle East respiratory syndrome-related coronavirus (isolate United Kingdom/H123990006/2012) Non-structural protein ORF5 Proteins 0.000 description 5
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 5
- 102100040307 Protein FAM3B Human genes 0.000 description 5
- 101000974028 Rhizobium leguminosarum bv. viciae (strain 3841) Putative cystathionine beta-lyase Proteins 0.000 description 5
- 101000756519 Rhodobacter capsulatus (strain ATCC BAA-309 / NBRC 16581 / SB1003) Uncharacterized protein RCAP_rcc00048 Proteins 0.000 description 5
- 101000948219 Rhodococcus erythropolis Uncharacterized 11.5 kDa protein in thcD 3'region Proteins 0.000 description 5
- 101710176276 SSB protein Proteins 0.000 description 5
- 101000779242 Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 ORF3a protein Proteins 0.000 description 5
- 101000596353 Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 ORF7a protein Proteins 0.000 description 5
- 101000596375 Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 ORF7b protein Proteins 0.000 description 5
- 101000936711 Streptococcus gordonii Accessory secretory protein Asp4 Proteins 0.000 description 5
- 101000929863 Streptomyces cinnamonensis Monensin polyketide synthase putative ketoacyl reductase Proteins 0.000 description 5
- 101000788468 Streptomyces coelicolor Uncharacterized protein in mprR 3'region Proteins 0.000 description 5
- 101000845085 Streptomyces violaceoruber Granaticin polyketide synthase putative ketoacyl reductase 1 Proteins 0.000 description 5
- 101000711771 Thiocystis violacea Uncharacterized 76.5 kDa protein in phbC 3'region Proteins 0.000 description 5
- 101710134973 Uncharacterized 9.7 kDa protein in cox-rep intergenic region Proteins 0.000 description 5
- 101000711318 Vibrio alginolyticus Uncharacterized 11.6 kDa protein in scrR 3'region Proteins 0.000 description 5
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 5
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 5
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 5
- 108091007497 betacoronavirus-specific marker domains Proteins 0.000 description 5
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 5
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 5
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 5
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 5
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 5
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102100031673 Corneodesmosin Human genes 0.000 description 4
- 229940123611 Genome editing Drugs 0.000 description 4
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 4
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 4
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 4
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 4
- 101800000482 Non-structural protein 9 Proteins 0.000 description 4
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 description 4
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 description 4
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 4
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 4
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 4
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 4
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 4
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 239000006072 paste Substances 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 108010068698 spleen exonuclease Proteins 0.000 description 4
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 4
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 3
- 240000007472 Leucaena leucocephala Species 0.000 description 3
- 235000010643 Leucaena leucocephala Nutrition 0.000 description 3
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 3
- 101710118046 RNA-directed RNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 241000315672 SARS coronavirus Species 0.000 description 3
- 108091005774 SARS-CoV-2 proteins Proteins 0.000 description 3
- 108091007498 Transmembrane domain 2 Proteins 0.000 description 3
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 3
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 3
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 3
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 3
- 238000007490 hematoxylin and eosin (H&E) staining Methods 0.000 description 3
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 3
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 3
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 3
- 208000005333 pulmonary edema Diseases 0.000 description 3
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 3
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 3
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 3
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 3
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 3
- 238000004929 transmission Raman spectroscopy Methods 0.000 description 3
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 3
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 3
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 102100035765 Angiotensin-converting enzyme 2 Human genes 0.000 description 2
- 108090000975 Angiotensin-converting enzyme 2 Proteins 0.000 description 2
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 101150077124 CXCL10 gene Proteins 0.000 description 2
- 208000020446 Cardiac disease Diseases 0.000 description 2
- 101150009911 Ccl7 gene Proteins 0.000 description 2
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 2
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 2
- 101710085938 Matrix protein Proteins 0.000 description 2
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 101710127721 Membrane protein Proteins 0.000 description 2
- 241001024304 Mino Species 0.000 description 2
- 108010086093 Mung Bean Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 101150001779 ORF1a gene Proteins 0.000 description 2
- 240000007019 Oxalis corniculata Species 0.000 description 2
- ATUOYWHBWRKTHZ-UHFFFAOYSA-N Propane Chemical compound CCC ATUOYWHBWRKTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000018780 Replication Protein A Human genes 0.000 description 2
- 108010027643 Replication Protein A Proteins 0.000 description 2
- 101000667982 Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 Envelope small membrane protein Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 101150075071 TRS1 gene Proteins 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 108010012306 Tn5 transposase Proteins 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 2
- 210000001552 airway epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- XMQFTWRPUQYINF-UHFFFAOYSA-N bensulfuron-methyl Chemical compound COC(=O)C1=CC=CC=C1CS(=O)(=O)NC(=O)NC1=NC(OC)=CC(OC)=N1 XMQFTWRPUQYINF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 2
- 230000001010 compromised effect Effects 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000012350 deep sequencing Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 230000009274 differential gene expression Effects 0.000 description 2
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 2
- 238000002296 dynamic light scattering Methods 0.000 description 2
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- 238000011553 hamster model Methods 0.000 description 2
- 208000019622 heart disease Diseases 0.000 description 2
- 238000012165 high-throughput sequencing Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 2
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 2
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 2
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 2
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000034217 membrane fusion Effects 0.000 description 2
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 2
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 2
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 210000003928 nasal cavity Anatomy 0.000 description 2
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 238000001558 permutation test Methods 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 2
- 238000009097 single-agent therapy Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 2
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- RIFDKYBNWNPCQK-IOSLPCCCSA-N (2r,3s,4r,5r)-2-(hydroxymethyl)-5-(6-imino-3-methylpurin-9-yl)oxolane-3,4-diol Chemical compound C1=2N(C)C=NC(=N)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O RIFDKYBNWNPCQK-IOSLPCCCSA-N 0.000 description 1
- PTFYZDMJTFMPQW-UHFFFAOYSA-N 1,10-dihydropyrimido[5,4-b][1,4]benzoxazin-2-one Chemical compound O1C2=CC=CC=C2N=C2C1=CNC(=O)N2 PTFYZDMJTFMPQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RKSLVDIXBGWPIS-UAKXSSHOSA-N 1-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-iodopyrimidine-2,4-dione Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 RKSLVDIXBGWPIS-UAKXSSHOSA-N 0.000 description 1
- QLOCVMVCRJOTTM-TURQNECASA-N 1-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-prop-1-ynylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1NC(=O)C(C#CC)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 QLOCVMVCRJOTTM-TURQNECASA-N 0.000 description 1
- PISWNSOQFZRVJK-XLPZGREQSA-N 1-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methyl-2-sulfanylidenepyrimidin-4-one Chemical compound S=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 PISWNSOQFZRVJK-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- YKBGVTZYEHREMT-KVQBGUIXSA-N 2'-deoxyguanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O1 YKBGVTZYEHREMT-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- ZDTFMPXQUSBYRL-UUOKFMHZSA-N 2-Aminoadenosine Chemical compound C12=NC(N)=NC(N)=C2N=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O ZDTFMPXQUSBYRL-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 1
- JRYMOPZHXMVHTA-DAGMQNCNSA-N 2-amino-7-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-1h-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-one Chemical compound C1=CC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O JRYMOPZHXMVHTA-DAGMQNCNSA-N 0.000 description 1
- RHFUOMFWUGWKKO-XVFCMESISA-N 2-thiocytidine Chemical compound S=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 RHFUOMFWUGWKKO-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- XXSIICQLPUAUDF-TURQNECASA-N 4-amino-1-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-prop-1-ynylpyrimidin-2-one Chemical compound O=C1N=C(N)C(C#CC)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 XXSIICQLPUAUDF-TURQNECASA-N 0.000 description 1
- CKTSBUTUHBMZGZ-ULQXZJNLSA-N 4-amino-1-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-tritiopyrimidin-2-one Chemical compound O=C1N=C(N)C([3H])=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 CKTSBUTUHBMZGZ-ULQXZJNLSA-N 0.000 description 1
- AGFIRQJZCNVMCW-UAKXSSHOSA-N 5-bromouridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 AGFIRQJZCNVMCW-UAKXSSHOSA-N 0.000 description 1
- FHIDNBAQOFJWCA-UAKXSSHOSA-N 5-fluorouridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(F)=C1 FHIDNBAQOFJWCA-UAKXSSHOSA-N 0.000 description 1
- ZAYHVCMSTBRABG-JXOAFFINSA-N 5-methylcytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C(C)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 ZAYHVCMSTBRABG-JXOAFFINSA-N 0.000 description 1
- KDOPAZIWBAHVJB-UHFFFAOYSA-N 5h-pyrrolo[3,2-d]pyrimidine Chemical compound C1=NC=C2NC=CC2=N1 KDOPAZIWBAHVJB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BXJHWYVXLGLDMZ-UHFFFAOYSA-N 6-O-methylguanine Chemical compound COC1=NC(N)=NC2=C1NC=N2 BXJHWYVXLGLDMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KECVIQSGDHXMBS-UHFFFAOYSA-N 6-amino-5-hepta-1,5-diynyl-1H-pyrimidin-2-one Chemical compound CC#CCCC#CC1=CNC(=O)N=C1N KECVIQSGDHXMBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UEHOMUNTZPIBIL-UUOKFMHZSA-N 6-amino-9-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-7h-purin-8-one Chemical compound O=C1NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O UEHOMUNTZPIBIL-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 1
- QANYZFPLMHQWJO-UHFFFAOYSA-N 6-methyl-1,7-dihydropyrrolo[2,3-d]pyrimidin-2-one Chemical compound N1C(=O)NC2=NC(C)=CC2=C1 QANYZFPLMHQWJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VKKXEIQIGGPMHT-UHFFFAOYSA-N 7h-purine-2,8-diamine Chemical compound NC1=NC=C2NC(N)=NC2=N1 VKKXEIQIGGPMHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HCAJQHYUCKICQH-VPENINKCSA-N 8-Oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2NC(=O)N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HCAJQHYUCKICQH-VPENINKCSA-N 0.000 description 1
- HDZZVAMISRMYHH-UHFFFAOYSA-N 9beta-Ribofuranosyl-7-deazaadenin Natural products C1=CC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(CO)C(O)C1O HDZZVAMISRMYHH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SRNWOUGRCWSEMX-KEOHHSTQSA-N ADP-beta-D-ribose Chemical compound C([C@H]1O[C@H]([C@@H]([C@@H]1O)O)N1C=2N=CN=C(C=2N=C1)N)OP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SRNWOUGRCWSEMX-KEOHHSTQSA-N 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- SRNWOUGRCWSEMX-UHFFFAOYSA-N Adenosine diphosphate ribose Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C(C(C1O)O)OC1COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC1OC(O)C(O)C1O SRNWOUGRCWSEMX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100027211 Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102100021266 Alpha-(1,6)-fucosyltransferase Human genes 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 description 1
- 241000416162 Astragalus gummifer Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- YDNKGFDKKRUKPY-JHOUSYSJSA-N C16 ceramide Natural products CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)N[C@@H](CO)[C@H](O)C=CCCCCCCCCCCCCC YDNKGFDKKRUKPY-JHOUSYSJSA-N 0.000 description 1
- 101150052909 CCL2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 description 1
- 108700002856 Coronavirus Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229920002785 Croscarmellose sodium Polymers 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical class OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 241000408659 Darpa Species 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 239000004338 Dichlorodifluoromethane Substances 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 101150067056 Epsilon gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 108010046914 Exodeoxyribonuclease V Proteins 0.000 description 1
- 102100037091 Exonuclease V Human genes 0.000 description 1
- 101800001768 Exoribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 1
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 101710114810 Glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 101800001704 Guanine-N7 methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000819490 Homo sapiens Alpha-(1,6)-fucosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 101150101999 IL6 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 208000002979 Influenza in Birds Diseases 0.000 description 1
- 241001138401 Kluyveromyces lactis Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 229920000168 Microcrystalline cellulose Polymers 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- CRJGESKKUOMBCT-VQTJNVASSA-N N-acetylsphinganine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCC[C@@H](O)[C@H](CO)NC(C)=O CRJGESKKUOMBCT-VQTJNVASSA-N 0.000 description 1
- XVYKKJFPXWHLPF-UHFFFAOYSA-N NCCCOCCOCCOCCCNC1=NC(NC=C1)=O Chemical compound NCCCOCCOCCOCCCNC1=NC(NC=C1)=O XVYKKJFPXWHLPF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102100026450 POU domain, class 3, transcription factor 4 Human genes 0.000 description 1
- 101710133389 POU domain, class 3, transcription factor 4 Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 239000004264 Petrolatum Substances 0.000 description 1
- 108050008598 Phosphoesterases Proteins 0.000 description 1
- 108010089430 Phosphoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007982 Phosphoproteins Human genes 0.000 description 1
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 1
- 102000029797 Prion Human genes 0.000 description 1
- 108091000054 Prion Proteins 0.000 description 1
- 101800001862 Proofreading exoribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 101800002929 Proofreading exoribonuclease nsp14 Proteins 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 101000933967 Pseudomonas phage KPP25 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 101710151619 Replicase polyprotein 1ab Proteins 0.000 description 1
- 241001068263 Replication competent viruses Species 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 108091007539 SARS-CoV-2 ORF1a Proteins 0.000 description 1
- 238000010818 SYBR green PCR Master Mix Methods 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 101100221606 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) COS7 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100240079 Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 N gene Proteins 0.000 description 1
- 101001024637 Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 101500025257 Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 RNA-directed RNA polymerase nsp12 Proteins 0.000 description 1
- 101000629318 Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 Spike glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710167605 Spike glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical group OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001615 Tragacanth Polymers 0.000 description 1
- 108010073062 Transcription Activator-Like Effectors Proteins 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- 101800000578 Uridylate-specific endoribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 229940123627 Viral replication inhibitor Drugs 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;sodium Chemical compound [Na].CC(O)=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011166 aliquoting Methods 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 230000001668 ameliorated effect Effects 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 1
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical class OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940090047 auto-injector Drugs 0.000 description 1
- 206010064097 avian influenza Diseases 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000010310 bacterial transformation Effects 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 239000000227 bioadhesive Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 description 1
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000011111 cardboard Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 229920006317 cationic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000034303 cell budding Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 229940106189 ceramide Drugs 0.000 description 1
- ZVEQCJWYRWKARO-UHFFFAOYSA-N ceramide Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)C(=O)NC(CO)C(O)C=CCCC=C(C)CCCCCCCCC ZVEQCJWYRWKARO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000011260 co-administration Methods 0.000 description 1
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 229940110456 cocoa butter Drugs 0.000 description 1
- 235000019868 cocoa butter Nutrition 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 229940075614 colloidal silicon dioxide Drugs 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 229960001681 croscarmellose sodium Drugs 0.000 description 1
- 235000010947 crosslinked sodium carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- PXBRQCKWGAHEHS-UHFFFAOYSA-N dichlorodifluoromethane Chemical compound FC(F)(Cl)Cl PXBRQCKWGAHEHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019404 dichlorodifluoromethane Nutrition 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 230000029117 egress of virus within host cell Effects 0.000 description 1
- 230000026502 entry into host cell Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 108010052305 exodeoxyribonuclease III Proteins 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 239000003205 fragrance Substances 0.000 description 1
- 235000015203 fruit juice Nutrition 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010055863 gene b exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013412 genome amplification Methods 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 229960005150 glycerol Drugs 0.000 description 1
- 150000002402 hexoses Chemical class 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 1
- 238000010324 immunological assay Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000010468 interferon response Effects 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000012669 liquid formulation Substances 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 239000007937 lozenge Substances 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229940016286 microcrystalline cellulose Drugs 0.000 description 1
- 235000019813 microcrystalline cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008108 microcrystalline cellulose Substances 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 238000002941 microtiter virus yield reduction assay Methods 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 229940042472 mineral oil Drugs 0.000 description 1
- 125000004573 morpholin-4-yl group Chemical group N1(CCOCC1)* 0.000 description 1
- 239000002324 mouth wash Substances 0.000 description 1
- 239000002539 nanocarrier Substances 0.000 description 1
- 239000006199 nebulizer Substances 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- VVGIYYKRAMHVLU-UHFFFAOYSA-N newbouldiamide Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)C(O)C(O)C(CO)NC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC VVGIYYKRAMHVLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000030147 nuclear export Effects 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 239000005022 packaging material Substances 0.000 description 1
- 239000011087 paperboard Substances 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 235000010603 pastilles Nutrition 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 229940066842 petrolatum Drugs 0.000 description 1
- 235000019271 petrolatum Nutrition 0.000 description 1
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 229920001592 potato starch Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000001294 propane Substances 0.000 description 1
- 239000003380 propellant Substances 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000012342 propidium iodide staining Methods 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 210000000664 rectum Anatomy 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 1
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 description 1
- RHFUOMFWUGWKKO-UHFFFAOYSA-N s2C Natural products S=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 RHFUOMFWUGWKKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-M salicylate Chemical compound OC1=CC=CC=C1C([O-])=O YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229960001860 salicylate Drugs 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000012222 talc Nutrition 0.000 description 1
- 230000004797 therapeutic response Effects 0.000 description 1
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 239000000196 tragacanth Substances 0.000 description 1
- 235000010487 tragacanth Nutrition 0.000 description 1
- 229940116362 tragacanth Drugs 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 238000004627 transmission electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- HDZZVAMISRMYHH-KCGFPETGSA-N tubercidin Chemical compound C1=CC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O HDZZVAMISRMYHH-KCGFPETGSA-N 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 210000001215 vagina Anatomy 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 230000007502 viral entry Effects 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
- C12N15/1131—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1058—Directional evolution of libraries, e.g. evolution of libraries is achieved by mutagenesis and screening or selection of mixed population of organisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1065—Preparation or screening of tagged libraries, e.g. tagged microorganisms by STM-mutagenesis, tagged polynucleotides, gene tags
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
- C40B40/02—Libraries contained in or displayed by microorganisms, e.g. bacteria or animal cells; Libraries contained in or displayed by vectors, e.g. plasmids; Libraries containing only microorganisms or vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/215—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/11—Antisense
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
- C12N2310/317—Chemical structure of the backbone with an inverted bond, e.g. a cap structure
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/20011—Coronaviridae
- C12N2770/20021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/20011—Coronaviridae
- C12N2770/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/20011—Coronaviridae
- C12N2770/20032—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/50—Vector systems having a special element relevant for transcription regulating RNA stability, not being an intron, e.g. poly A signal
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Virology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Ecology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
Abstract
本発明は、新規のキメラＡＡＶカプシドタンパク質、および組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を含むアデノウイルス随伴ウイルス（ＡＡＶ）におけるその使用、ならびにその組成物を提供する。キメラＡＡＶカプシドタンパク質は、親ＡＡＶカプシドとは異なる向性を含む有利な特性を有する。本出願の一態様は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２複製に干渉することができる組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物であって、（ａ）少なくとも１００ヌクレオチドのＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２ ５’ＵＴＲまたはそのバリアントを含む５’ＵＴＲ領域と、（ｂ）介在配列と、（ｃ）少なくとも１００ヌクレオチドのＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２ ３’ＵＴＲまたはそのバリアントを含む３’ＵＴＲ領域とを含む組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物を提供する。
Description
関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年４月２３日に出願された「Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ Ｃｏｒｏｎａ Ｖｉｒｕｓ」と題する国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ ２０２１／０２８８０９号の優先権利益を主張し、その内容はすべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年４月２３日に出願された「Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ Ｃｏｒｏｎａ Ｖｉｒｕｓ」と題する国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ ２０２１／０２８８０９号の優先権利益を主張し、その内容はすべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
政府支援
本発明は、国立衛生研究所によって配賦された１－ＤＰ２－ＯＤ００６６７７－０１およびＤＯＤ／ＤＡＲＰＡによって配賦されたＤ１７ＡＣ００００９の下、政府支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
配列記述
本発明は、国立衛生研究所によって配賦された１－ＤＰ２－ＯＤ００６６７７－０１およびＤＯＤ／ＤＡＲＰＡによって配賦されたＤ１７ＡＣ００００９の下、政府支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
配列記述
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの以下の提出物の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる：配列表（ファイル名：２１０２７２０００１４１ＳＥＱＬＩＳＴ．ＴＸＴ、記録日：２０２２年４月２４日、サイズ：１４５，７６９バイト）のコンピュータ可読形式（ＣＲＦ）。
発明の分野
発明の分野
本発明は、いくつかの態様では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされる感染症などのウイルス感染症を処置するための治療用干渉粒子に関する。
背景
世界保健機関は、ＣＯＶＩＤ－１９を世界的なパンデミックと宣言している。正式にはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と呼ばれる高い感染力のあるコロナウイルスは、Ｃｏｖｉｄ－１９疾患を引き起こす。最も効果的な封じ込め戦略を用いても、Ｃｏｖｉｄ－１９呼吸器疾患の拡散は減速しただけである。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の現在の株に対する有効なワクチンは存在するが、新しいバリアントおよび変異株が生じ続けている。したがって、感染にも干渉する処置、ならびに／または感染からの回復を促進し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のパンデミックを止めることができる新しいワクチンが必要とされている。
世界保健機関は、ＣＯＶＩＤ－１９を世界的なパンデミックと宣言している。正式にはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と呼ばれる高い感染力のあるコロナウイルスは、Ｃｏｖｉｄ－１９疾患を引き起こす。最も効果的な封じ込め戦略を用いても、Ｃｏｖｉｄ－１９呼吸器疾患の拡散は減速しただけである。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の現在の株に対する有効なワクチンは存在するが、新しいバリアントおよび変異株が生じ続けている。したがって、感染にも干渉する処置、ならびに／または感染からの回復を促進し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のパンデミックを止めることができる新しいワクチンが必要とされている。
簡潔な概要
非感染細胞の感染に干渉または感染を阻止することができる治療用干渉粒子（例えば、ＴＩＰ）などの組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物を含む組成物が提供される。組成物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の予防および処置に有用である。
非感染細胞の感染に干渉または感染を阻止することができる治療用干渉粒子（例えば、ＴＩＰ）などの組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物を含む組成物が提供される。組成物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の予防および処置に有用である。
本出願の一態様は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２複製に干渉することができる組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物であって、（ａ）少なくとも１００ヌクレオチドのＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２ ５’ＵＴＲまたはそのバリアントを含む５’ＵＴＲ領域と、（ｂ）介在配列と、（ｃ）少なくとも１００ヌクレオチドのＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２ ３’ＵＴＲまたはそのバリアントを含む３’ＵＴＲ領域とを含む組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物を提供し、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、それ自体で複製することができず、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の存在下で複製することができ、介在配列は、約１塩基対（ｂｐ）～約２９０００ｂｐである（例えば、約１ｂｐ～約５０００ｂｐ、約１ｂｐ～約５００ｂｐを含む）。
いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物中の５’ＵＴＲ領域、オプショナルの介在配列、および３’ＵＴＲ領域の全長は、約１０００ｂｐ～約１００００ｂｐである。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物中の５’ＵＴＲ領域、オプショナルの介在配列、および３’ＵＴＲ領域の全長は、約２０００ｂｐ～約３５００ｂｐである。
いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲ領域は、配列番号１のヌクレオチド１～２６５、またはそのバリアントを含む。いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲ領域は、５’ＵＴＲ配列の２またはそれを超えるコピーを含み、それぞれが少なくとも１００ヌクレオチドのＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２ ５’ＵＴＲまたはそのバリアントを含む。いくつかの実施形態では、３’ＵＴＲ領域は、配列番号１のヌクレオチド２９６７５～２９８７０、またはそのバリアントを含む。いくつかの実施形態では、３’ＵＴＲ領域は、配列番号１のヌクレオチド２９６７５～２９９０３、またはそのバリアントを含む。いくつかの実施形態では、３’ＵＴＲ領域は、３’ＵＴＲ配列の２またはそれを超えるコピーを含み、それぞれが少なくとも１００ヌクレオチドのＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２ ３’ＵＴＲまたはそのバリアントを含む。
いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ＳＡＲ－ＣｏＶ－２のパッケージングシグナルをさらに含む。いくつかの実施形態では、パッケージングシグナルは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ５’ＵＴＲ内のステムループ５を含む。
いくつかの実施形態では、介在配列は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列、異種配列、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、介在配列は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列を含む。いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列は、機能性ウイルスタンパク質をコードしない。
いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、配列番号１のヌクレオチド１～４５０、またはそのバリアントを含む。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲ－ＣｏＶ－２構築物は、配列番号１のヌクレオチド１～１５４０、またはそのバリアントを含む。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、配列番号１のヌクレオチド２９５４３～２９９０３、またはそのバリアントを含む。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、配列番号１のヌクレオチド２９５４３～２９８７０、またはそのバリアントを含む。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、配列番号１のヌクレオチド２９１９１～２９９０３、またはそのバリアントを含む。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、配列番号１のヌクレオチド２９１９１～２９８７０、またはそのバリアントを含む。
いくつかの実施形態では、介在配列は、異種配列を含む。いくつかの実施形態では、異種配列は、機能性タンパク質をコードしない。いくつかの実施形態では、異種配列は、１またはそれを超える機能性タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、異種配列は、レポータータンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、異種配列は、マーカー配列を含む。いくつかの実施形態では、マーカー配列は、バーコード配列である。
いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ｍＲＮＡである。
いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、３’改変を含む。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、３’伸長配列を含む。いくつかの実施形態では、３’伸長配列は、伸長ポリＡ配列である。いくつかの実施形態では、伸長ポリＡ配列は、少なくとも約１００個のアデニンヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、５’改変を含む。いくつかの実施形態では、５’改変は、５’キャップである。いくつかの実施形態では、５’キャップは、５’メチルキャップである。
いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ベクターである。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、５’ＵＴＲ領域の上流にプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは、Ｔ７プロモーターである。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、３’伸長ポリＡ配列またはポリＡ付加のためのシグナルを含む。
いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物ゲノムＲＮＡは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した宿主細胞中に存在する場合、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムＲＮＡよりも高い速度で産生され、その結果、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムＲＮＡに対する構築物ＳＡＲ－ＣｏＶ－２ゲノムＲＮＡの比は細胞中で１より大きい。
いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と比較して同じ伝播頻度を有する。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２よりも低い伝播頻度を有する。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２よりも高い伝播頻度を有する。
いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した宿主細胞中に存在する場合、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と同じまたはより高い効率でパッケージングされる。
いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、基本再生産比（Ｒ０）＞１を有する。
いくつかの態様では、本明細書に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物のうちいずれか１つとウイルスエンベロープタンパク質とを含むウイルス様粒子が本明細書で提供される。
いくつかの態様では、本明細書に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物のうちいずれか１つを含む単離された細胞が本明細書で提供される。
いくつかの態様では、本明細書に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物のうちいずれか１つと、薬学的に許容され得る賦形剤とを含む医薬組成物が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、送達ビヒクル中に存在する。いくつかの実施形態では、送達ビヒクルは、脂質ナノ粒子である。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、エアロゾル製剤である。
いくつかの態様では、個体におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を処置または予防する方法であって、有効量の前述の実施形態のうちいずれか１つの医薬組成物を前記個体に投与することを含む方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、個体がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染する前に投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、個体がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した後に投与される。いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、Ｂ．１．１．７、Ｂ．１．３５１、Ｐ．１、またはＢ．１．６１７．２から選択されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株に由来する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、単回用量として投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、複数回用量として投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、鼻腔内投与される。いくつかの実施形態では、個体は、医学的状態、既存の状態、または心臓、肺、脳もしくは免疫系の機能を低下させる状態を有する。いくつかの実施形態では、個体は免疫無防備状態である。いくつかの実施形態では、個体はヒトである。
いくつかの態様では、個体におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染症を処置するまたは処置もしくは予防するためのキットであって、前述の実施形態のうちいずれか１つに記載の医薬組成物および前述の実施形態のうちいずれか１つの方法を実施するための指示を含むキットが本明細書で提供される。
いくつかの態様では、ＴＲＳ１－Ｌ：５’－ｃｕａａａｃ－３’（配列番号３６）、ＴＲＳ２－Ｌ：５’－ａｃｇａａｃ－３’（配列番号３７）、ＴＲＳ３－Ｌ：５’－ｃｕａａａｃｇａａｃ－３’（配列番号３８）、またはそれらの組み合わせのうちの１またはそれを超えるものに結合することができるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２転写調節配列（ＴＲＳ）の阻害剤が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、阻害剤は、ＴＲＳ１－ＡＣＧＡＡＣＣＵＡＡＡＣＡＣＧＡＡＣＣＵＡＡＡＣ（配列番号２５）；ＴＲＳ２－ＡＣＧＡＡＣＡＣＧＡＡＣＡＣＧＡＡＣＡＣＧＡＡＣ（配列番号２６）；ＴＲＳ３－ＣＵＡＡＡＣＣＵＡＡＡＣＣＵＡＡＡＣＣＵＡＡＡＣ（配列番号２７）；またはそれらの組み合わせを含むか、またはそれから本質的になる配列を含む。
いくつかの態様では、前述の実施形態のうちいずれかの阻害剤および薬学的に許容され得る賦形剤を含む医薬組成物が本明細書で提供される。
いくつかの態様では、薬学的に許容され得る賦形剤と、（ａ）ＴＲＳｌ－Ｌ：５’－ｃｕａａａｃ－３’（配列番号３６）、ＴＲＳ２－Ｌ：５’－ａｃｇａａｃ－３’（配列番号３７）、ＴＲＳ３－Ｌ，５’－ｃｕａａａｃｇａａｃ－３’（配列番号３８）、またはそれらの組み合わせのうちの１またはそれを超えるもの（ｏｎｅ ｏｆ ｍｏｒｅ ｏｆ）に結合することができるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２転写調節配列（ＴＲＳ）の阻害剤と、（ｂ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）の少なくとも１００ヌクレオチド、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）の少なくとも１００ヌクレオチド、またはそれらの組み合わせを含む組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物とを含む医薬組成物が本明細書で提供される。
上記の組成物のうちいずれか１つおよび上記の方法のうちいずれか１つの指示を含むキットおよび製造品も提供される。
図面の簡単な説明
図面の簡単な説明
図面は、本開示の特徴および利点の特定の実施形態を示す。これらの実施形態は、いかなる方法でも添付の特許請求の範囲を限定することを意図するものではない。
詳細な説明
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２複製に干渉することができる組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物などの堅牢な治療用ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＩＰ（すなわち、治療用干渉粒子、ＴＩＰ）の組成物が本明細書に記載される。組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、それ自体で複製することはできないが、感染性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（例えば、複製能のあるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）の存在下で複製することができる。ＴＩＰは、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２と条件付きで複製し、基本再生産比（Ｒ０）＞１を示し、ウイルス複製を１０～１００倍阻害することが示されている。阻害はウイルス複製機構の競合を介して起こり、ＴＩＰ ＲＮＡの単回投与は、連続培養においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を持続的に阻害することが示された。ＴＩＰが中和耐性バリアント（例えば、Ｂ．１．３５１）に対する有効性を維持することが顕著に実証された。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染のハムスターモデルでは、脂質ナノ粒子中のＴＩＰの予防的および治療的鼻腔内投与の両方が、肺において持続的にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を１００倍抑制し、炎症誘発性サイトカイン発現を減少させ、重度の肺水腫を予防した。これらのデータは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対する本明細書に記載のＴＩＰの治療的および予防的使用の成功を実証している。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２複製に干渉することができる組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物などの堅牢な治療用ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＩＰ（すなわち、治療用干渉粒子、ＴＩＰ）の組成物が本明細書に記載される。組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、それ自体で複製することはできないが、感染性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（例えば、複製能のあるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）の存在下で複製することができる。ＴＩＰは、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２と条件付きで複製し、基本再生産比（Ｒ０）＞１を示し、ウイルス複製を１０～１００倍阻害することが示されている。阻害はウイルス複製機構の競合を介して起こり、ＴＩＰ ＲＮＡの単回投与は、連続培養においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を持続的に阻害することが示された。ＴＩＰが中和耐性バリアント（例えば、Ｂ．１．３５１）に対する有効性を維持することが顕著に実証された。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染のハムスターモデルでは、脂質ナノ粒子中のＴＩＰの予防的および治療的鼻腔内投与の両方が、肺において持続的にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を１００倍抑制し、炎症誘発性サイトカイン発現を減少させ、重度の肺水腫を予防した。これらのデータは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対する本明細書に記載のＴＩＰの治療的および予防的使用の成功を実証している。
したがって、本出願は、一態様では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２複製に干渉することができる組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＴＩＰ）を提供し、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、それ自体で複製することができず、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の存在下で複製することができる。そのような組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＴＩＰ）を含む脂質ナノ粒子などの送達ビヒクルがさらに提供される。そのような組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物を含むウイルス様粒子または細胞も提供される。
別の態様では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２複製に干渉することができる組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＴＩＰ）を含む医薬組成物であって、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物はそれ自体で複製することができず、組換え構築物はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の存在下で複製することができる、医薬組成物、ならびにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を処置および／または予防するためのその使用が提供される。
Ｉ．定義
「ウイルスの野生型株」は、本明細書に記載されているように、ヒトが作製した変異のいずれも含まない株であり、すなわち、野生型ウイルスは、自然から（例えば、ウイルスに感染したヒトから）単離され得る任意のウイルスである。野生型ウイルスは実験室で培養することができ、そしてなお、他のウイルスの非存在下で、自然から単離されたもののような子孫ゲノムまたはビリオンを産生することができる。
「ウイルスの野生型株」は、本明細書に記載されているように、ヒトが作製した変異のいずれも含まない株であり、すなわち、野生型ウイルスは、自然から（例えば、ウイルスに感染したヒトから）単離され得る任意のウイルスである。野生型ウイルスは実験室で培養することができ、そしてなお、他のウイルスの非存在下で、自然から単離されたもののような子孫ゲノムまたはビリオンを産生することができる。
本明細書で使用される場合、「処置」、「処置すること」などの用語は、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを指す。効果は、疾患またはその症候を完全にまたは部分的に予防するという点で予防的であり得、および／または疾患および／または疾患に起因する有害作用の部分的または完全な治癒という点で治療的であり得る。「処置」とは、本明細書で使用される場合、哺乳動物、特にヒトにおける疾患の任意の処置をカバーし、（ａ）疾患の素因を有する可能性があるが、それを有するとまだ診断されていない対象において疾患が発生することを予防すること、（ｂ）疾患を阻害すること、すなわち、その発症を停止させること、および（ｃ）疾患を軽減すること、すなわち、疾患の退行を引き起こすことを含む。
本明細書で互換的に使用される「個体」、「対象」、「宿主」、および「患者」という用語は、ネズミ科（ラット、マウス）、非ヒト霊長類、ヒト、イヌ、ネコ、有蹄動物（例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ）などを含む哺乳動物を指すが、これらに限定されない。
「治療有効量」または「効果のある量」は、疾患を処置するために哺乳動物（例えば、ヒト）または他の対象に投与された場合、疾患のそのような処置の効果をもたらすのに十分な薬剤（例えば、本明細書に記載の構築物、粒子など）の量を指す。「治療有効量」は、化合物または細胞、疾患およびその重症度、ならびに処置される対象の年齢、体重などに応じて変動し得る。
「共投与」および「と組み合わせて」という用語は、２種またはそれを超える治療剤を特定の時間制限なく、同時に、並行してまたは連続的にのいずれかでの投与を含む。一実施形態では、薬剤は、細胞中または対象の体内に同時に存在するか、またはそれらの生物学的または治療的効果を同時に発揮する。一実施形態では、治療剤は同じ組成物または単位剤形中にある。他の実施形態では、治療剤は別個の組成物または単位剤形中にある。ある特定の実施形態では、第１の薬剤は、第２の治療剤の投与の前に（例えば、分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、または１２週間前）、第２の治療剤の投与と併用して、または第２の治療剤の投与に続けて（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、または１２週間後）投与することができる。
本明細書で使用される場合、「医薬組成物」は、対象、例えば哺乳動物、例えばヒトへの投与に適した組成物を包含することを意味する。一般に、「医薬組成物」は無菌であり、対象内に望ましくない応答を誘発し得る汚染物質を含まない（例えば、医薬組成物中の化合物は、医薬品グレードである）。医薬組成物は、経口、口腔、直腸、非経口、腹腔内、皮内、気管内などを含むいくつかの異なる投与の経路を介して、それを必要とする対象または患者に投与するように設計することができる。
範囲を含むすべての数値指定、例えば、温度、時間、濃度、ウイルス負荷、および分子量は、必要に応じて、０．１または１．０の増分で（＋）または（－）に変動する近似値である。常に明示的に述べられているわけではないが、すべての数値指定の前に「約（ａｂｏｕｔ）」という用語が先行することを理解されたい。
また、常に明示的に述べられているわけではないが、本明細書に記載の試薬は単なる例示であり、いくつかの場合、当技術分野で均等物が利用可能であり得ることも理解されたい。
また、本明細書で使用される場合、「および／または」は、関連して列挙された項目の１つまたはそれを超えるありとあらゆる可能な組合せ、ならびに代替（「または」）で解釈される場合の組合せの欠如を指し、包含する。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明確にそうでないことを指示しない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「干渉粒子（ａｎ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ｐａｒｔｉｃｌｅ）」への言及は、複数のそのような粒子を含み、「シス作用性エレメント（ｔｈｅ ｃｉｓ－ａｃｔｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔ）」への言及は、当業者に公知な１つまたはそれを超えるシス作用性エレメントおよびその均等物への言及などを含む。特許請求の範囲は、任意の要素を除外するように起草され得ることにさらに留意されたい。したがって、この記述は、特許請求の範囲の要素の列挙または「否定的な」限定の使用に関連して、「単独で」、「のみ」などのような排他的な用語を使用するための先行基礎としての役割を果たすことを意図している。
値の範囲が提供される場合、その範囲の上限と下限との間の、文脈が明確にそうでないことを指示しない限り、下限の単位の１０分の１までの各介在値、およびその記載された範囲内の任意の他の記載値または介在値が、本発明内に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限および下限は、独立してより小さい範囲に含まれてもよく、記載された範囲内の任意の具体的に除外された限界を条件として、本発明内にも包含される。記載された範囲が限界の一方または両方を含む場合、それらの含まれる限界の一方または両方を除外した範囲も本発明に含まれる。
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同等の任意の方法および材料もまた、本発明の実践または試験で使用することができるが、ここでは好ましい方法および材料を説明する。本明細書で言及されるすべての刊行物は、刊行物が引用される関連する方法および／または材料を開示および説明するために参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、記載された特定の実施形態に限定されず、したがって当然のことながら変動し得ることを理解されたい。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定することを意図するものではないことも理解されたい。
以下の記述は、本明細書に記載される本発明の核酸および方法のいくつかの態様の概要を提供する。
ＩＩ．組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物
ＩＩ．組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物
本出願は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２複製に干渉することができる組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物、およびそのような構築物を含む脂質ナノ粒子などの送達ビヒクル（本明細書ではＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２治療用干渉粒子（ＴＩＰ）、ＴＩＰ構築物とも呼ばれる）を提供する。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＴＩＰは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２複製を１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００倍のうちいずれかよりも多く減少させることができる。組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＴＩＰは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムの５’および３’末端のセグメントを含み得る。例えば、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＴＩＰは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の５’－ＵＴＲおよび３’－ＵＴＲのセグメントを含み得る。介在配列（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列および／または異種配列、例えば検出可能なマーカータンパク質および／またはユニーク分子識別子（ＵＭＩ）配列）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムの５’セグメントと３’セグメントとの間に配置され得る。組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、それ自体で複製することはできないが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の存在下で複製することができる。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、またはそれらの組み合わせである。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２複製に干渉することができる組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物（例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＴＩＰ）であって、（ａ）少なくとも１００ヌクレオチドのＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２ ５’ＵＴＲまたはそのバリアントを含む５’ＵＴＲ領域と、（ｂ）オプショナルの介在配列と、（ｃ）少なくとも１００ヌクレオチドのＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２ ３’ＵＴＲまたはそのバリアントを含む３’ＵＴＲ領域とを含み、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物が、それ自体で複製することができず、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の存在下で複製することができる、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、介在配列は、約１塩基対（ｂｐ）～約２９０００ｂｐ（例えば、約１～２５０００、１～２００００、１～１５０００、１～１００００、１～９００、１～８００、１～７００、１～６００、１～５００、１～４００、１～３００、１～２００、または１～１００ｂｐのうちいずれかを含む）の長さを有する。いくつかの実施形態では、介在配列は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列、異種配列、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列は、機能性ウイルスタンパク質をコードしない。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ＳＡＲ－ＣｏＶ－２のパッケージングシグナルを含む。いくつかの実施形態では、パッケージングシグナルは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ５’ＵＴＲ内のステムループ５を含む。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、３’改変または３’伸長配列（ポリＡ配列またはシグナル伝達配列またはポリＡ付加など）を含む。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、５’改変（５’メチルキャップなど）を含む。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物ゲノムＲＮＡは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した宿主細胞中に存在する場合、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムＲＮＡよりも高い速度で産生され、その結果、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムＲＮＡに対する構築物ＳＡＲ－ＣｏＶ－２ゲノムＲＮＡの比は細胞中で１より大きい。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と同じまたはそれよりも低い伝播頻度を有する。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２よりも高い伝播頻度を有する。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した宿主細胞中に存在する場合、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と同じまたはより高い効率でパッケージングされる。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、基本再生産比（Ｒ０）＞１を有する。
いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２複製に干渉することができる組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＴＩＰ）であって、（ａ）配列番号１のヌクレオチド１～２６５またはそのバリアントを含む５’ＵＴＲ領域と、（ｂ）介在配列と、（ｃ）配列番号１のヌクレオチド２９６７５～２９８７０またはヌクレオチド２９６７５～２９９０３またはそのバリアントを含む３’ＵＴＲ領域とを含み、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物がそれ自体で複製することができず、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物が感染性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の存在下で複製することができ、介在配列が約１塩基対（ｂｐ）～約２９０００ｂｐである、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物中の５’ＵＴＲ領域、オプショナルの介在配列、および３’ＵＴＲ領域の全長は、約２０００ｂｐ～約３５００ｂｐ、例えば約２１００ｂｐである。いくつかの実施形態では、介在配列は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列、異種配列、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列は、機能性ウイルスタンパク質をコードしない。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ＳＡＲ－ＣｏＶ－２のパッケージングシグナルを含む。いくつかの実施形態では、パッケージングシグナルは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ５’ＵＴＲ内のステムループ５を含む。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、３’改変または３’伸長配列（ポリＡ配列またはシグナル伝達配列またはポリＡ付加など）を含む。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、５’改変（５’メチルキャップなど）を含む。
いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２複製に干渉することができる組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＴＩＰ）であって、（ｉ）配列番号１のヌクレオチド１～４５０またはそのバリアントと、（ｉｉ）配列番号１のヌクレオチド２９５４３～２９８７０またはヌクレオチド２９５４３～２９９０３またはそのバリアントとを含み、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物がそれ自体で複製することができず、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物が感染性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の存在下で複製することができる、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、配列番号１のヌクレオチド２４１にシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）への変異を含む。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物中の５’ＵＴＲ領域、オプショナルの介在配列、および３’ＵＴＲ領域の全長は、約２０００ｂｐ～約３５００ｂｐ、例えば約２１００ｂｐである。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ＳＡＲ－ＣｏＶ－２のパッケージングシグナルを含む。いくつかの実施形態では、パッケージングシグナルは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ５’ＵＴＲ内のステムループ５を含む。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、３’改変または３’伸長配列（ポリＡ配列またはシグナル伝達配列またはポリＡ付加など）を含む。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、５’改変（５’メチルキャップなど）を含む。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、配列番号２８のアミノ酸配列を含む５’ＵＴＲと、配列番号２９のアミノ酸配列を含む３’ＵＴＲとを含む。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、配列番号３２のアミノ酸配列を含む５’ＵＴＲと、配列番号２９のアミノ酸配列を含む３’ＵＴＲとを含む。
いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２複製に干渉することができる組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＴＩＰ）であって、（ｉ）配列番号１のヌクレオチド１～１５４０またはそのバリアントと、（ｉｉ）配列番号１のヌクレオチド２９１９１～２９８７０またはヌクレオチド２９１９１～２９９０３またはそのバリアントとを含み、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物がそれ自体で複製することができず、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物が感染性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の存在下で複製することができる、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、配列番号１のヌクレオチド２４１にＣからＴへの変異を含む。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物中の５’ＵＴＲ領域、オプショナルの介在配列、および３’ＵＴＲ領域の全長は、約２０００ｂｐ～約３５００ｂｐ、例えば約３５００ｂｐである。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ＳＡＲ－ＣｏＶ－２のパッケージングシグナルを含む。いくつかの実施形態では、パッケージングシグナルは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ５’ＵＴＲ内のステムループ５を含む。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、３’改変または３’伸長配列（ポリＡ配列またはシグナル伝達配列またはポリＡ付加など）を含む。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、５’改変（５’メチルキャップなど）を含む。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、配列番号３０のアミノ酸配列を含む５’ＵＴＲと、配列番号３１のアミノ酸配列を含む３’ＵＴＲとを含む。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、配列番号３３のアミノ酸配列を含む５’ＵＴＲと、配列番号３１のアミノ酸配列を含む３’ＵＴＲとを含む。
Ａ．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２
Ａ．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２
いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの核酸配列、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの核酸配列の断片、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのバリアントの核酸配列、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのバリアントの核酸配列の断片を含む。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスは、約９８６０アミノ酸をコードする約２９８９１ヌクレオチドの一本鎖ＲＮＡゲノムを有する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の選択されたＲＮＡゲノムは、逆転写およびｃＤＮＡの形成によってコピーされ、ＤＮＡにすることができる。線状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡを、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡ末端のライゲーションによって環状化できる。
本明細書中で使用される場合、「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノム」は、ＮＩＨ ＧｅｎＢａｎｋ Ｌｏｃｕｓ ＮＣ＿０４５５１２によって記載される２９９０３ヌクレオチド配列、鳥インフルエンザ・データ共有に関するグローバル・イニシアティブ（ＧＩＳＡＩＤ：Ｇｌｏｂａｌ Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ ｏｎ Ｓｈａｒｉｎｇ Ａｖｉａｎ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｄａｔａ）によって記載されるｈＣｏＶ－１９参照配列を示す。
コード領域を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムのＤＮＡ配列は、ＮＣＢＩウェブサイトからアクセッション番号ＮＣ＿０４５５１２．２として入手可能である（本明細書では配列番号１として提供される）。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、配列番号１、または配列番号１の配列と少なくとも約９０％の配列同一性（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性のうちいずれか）を含む配列を含む。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、配列番号１の１～２６５位に対応する５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ；リーダー配列またはリーダーＲＮＡとしても公知）を有し得る。そのような５’ＵＴＲは、開始コドンのすぐ上流にあるｍＲＮＡの領域を含み得る。５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲはまた、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のパッケージングを容易にし得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換えＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２構築物の５’ＵＴＲ領域は、配列番号１の１～２６５位に対応する少なくとも１００（例えば、少なくとも約１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０または２６０のうちいずれかを含む）ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換えＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２構築物の５’ＵＴＲ領域は、配列番号１の１～２６５位に対応する少なくとも１００（例えば、少なくとも約１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０または２６０を含む）ヌクレオチドのバリアントを含む。いくつかの実施形態では、バリアントのヌクレオチド配列は、配列番号１）の１～２６５位に対応する少なくとも１００（例えば、少なくとも約１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０または２６０を含む）ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列と少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相同である。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物の５’ＵＴＲ領域は、配列番号１の１～２６５位に対応するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物の５’ＵＴＲ領域は、配列番号１の１～２６５位に対応するヌクレオチド配列と少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相同なヌクレオチド配列を含む。
同様に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、２９６７５～２９８７０位に対応する３’ＵＴＲコア配列および２９７８１～２９９０３位に対応するポリＡ配列を含む、配列番号１の２９６７５～２９９０３位に対応する３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）を有することができる。プラス鎖ＲＮＡウイルスでは、マイナス鎖ＲＮＡ複製中間体の起源はゲノムの３’末端にあるので、３’－ＵＴＲはウイルスＲＮＡ複製において役割を果たすことができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換えＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２構築物の３’ＵＴＲ領域は、配列番号１の２９６７５～２９８７０（または２９６７５～２９９０３）位に対応する少なくとも１００（例えば、少なくとも約１２０、１４０、１６０、１８０、２００または２２０のうちいずれかを含む）ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換えＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２構築物の３’ＵＴＲ領域は、配列番号１の２９６７５～２９８７０（または２９６７５～２９９０３）位に対応する少なくとも１００（例えば、少なくとも約１２０、１４０、１６０、１８０、２００または２２０を含む）ヌクレオチドのバリアントを含む。いくつかの実施形態では、バリアントのヌクレオチド配列は、配列番号１）の２９６７５～２９８７０（または２９６７５～２９９０３）位に対応する少なくとも１００（例えば、少なくとも約１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０または２６０を含む）ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列と少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相同である。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物の３’ＵＴＲ領域は、配列番号１の２９６７５～２９８７０（または２９６７５～２９９０３）位に対応するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物の３’ＵＴＲ領域は、配列番号１の２９６７５～２９８７０（または２９６７５～２９９０３）位に対応するヌクレオチド配列と少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相同なヌクレオチド配列を含む。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムは、４つの主要な構造タンパク質：スパイク（Ｓ）タンパク質、ヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質、膜（Ｍ）タンパク質、およびエンベロープ（Ｅ）タンパク質をコードする。これらのタンパク質のいくつかは、配列番号１の配列の２６６～２１５５５位にある大きなポリプロテインの一部であり、このオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）はＯＲＦ１ａｂポリプロテインと称され、以下に示す配列番号２を有する。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ＯＲＦ１ａｂヌクレオチド配列のいずれの部分も含まない。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ＯＲＦ１ａｂヌクレオチド配列の一部（例えば、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、または５％のうちいずれか以下）を含む。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ＯＲＦ１ａｂヌクレオチド配列の全長または一部（例えば、少なくとも約９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、または５％のうちいずれか）を含み、ＯＲＦ１ａｂヌクレオチド配列の全長または一部は、フレームシフト変異、欠失、挿入、非センス変異、またはタンパク質の翻訳を全くもたらさないかもしくは機能性ウイルスタンパク質の翻訳をもたらさないミスセンス変異を含む。
ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列番号１の核酸の１３４４２～１３４６８位および１３４６８～１６２３６位にコードされている。このＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼには、ＮＣＢＩアクセッション番号ＹＰ＿００９７２５３０７が割り当てられており、以下の配列（配列番号３）を有する。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼヌクレオチド配列のいずれの部分も含まない。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼヌクレオチド配列の一部（例えば、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、または５％のうちいずれか以下）を含む。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼヌクレオチド配列の全長または一部（例えば、少なくとも約９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、または５％のうちいずれか）を含み、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼヌクレオチド配列の全長または一部は、フレームシフト変異、欠失、挿入、非センス変異、またはタンパク質の翻訳を全くもたらさないかもしくは機能性ウイルスタンパク質の翻訳をもたらさないミスセンス変異を含む。
ヘリカーゼは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列番号１の核酸の１６２３７～１８０３９位にコードされている。このヘリカーゼには、ＮＣＢＩアクセッション番号ＹＰ＿００９７２５３０８．１が割り当てられており、以下の配列（配列番号４）を有する。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ヘリカーゼヌクレオチド配列のいずれの部分も含まない。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ヘリカーゼヌクレオチド配列の一部（例えば、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、または５％のうちいずれか以下）を含む。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ヘリカーゼヌクレオチド配列の全長または一部（例えば、少なくとも約９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、または５％のうちいずれか）を含み、ヘリカーゼヌクレオチド配列の全長または一部は、フレームシフト変異、欠失、挿入、非センス変異、またはタンパク質の翻訳を全くもたらさないかもしくは機能性ウイルスタンパク質の翻訳をもたらさないミスセンス変異を含む。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ＧＵ２８０＿ｇｐ０２と称され得る、配列番号１の配列の２１５６３～２５３８４位にＯＲＦ（遺伝子Ｓ）を有し得、このＯＲＦは表面糖タンパク質またはスパイク糖タンパク質（以下に示す配列番号５）をコードする。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、遺伝子Ｓヌクレオチド配列のいずれの部分も含まない。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、遺伝子Ｓヌクレオチド配列の一部（例えば、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、または５％のうちいずれか以下）を含む。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、遺伝子Ｓヌクレオチド配列の全長または一部（例えば、少なくとも約９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、または５％のうちいずれか）を含み、遺伝子Ｓヌクレオチド配列の全長または一部は、フレームシフト変異、欠失、挿入、非センス変異、またはタンパク質の翻訳を全くもたらさないかもしくは機能性ウイルスタンパク質の翻訳をもたらさないミスセンス変異を含む。
Ｓまたはスパイクタンパク質は、細胞内へのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の進入を促進する役割を果たす。これは、短い細胞内尾部、膜貫通アンカー、ならびに受容体結合Ｓ１サブユニットおよび膜融合Ｓ２サブユニットからなる大きな外部ドメインから構成される。スパイク受容体結合ドメイン（「ＲＢＤドメイン」）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の配列番号５のスパイクタンパク質のアミノ酸３３０～５８３位に存在し得る（以下に示す配列番号６）。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、Ｓタンパク質ヌクレオチド配列のいずれの部分も含まない。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、Ｓタンパク質ヌクレオチド配列の一部（例えば、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、または５％のうちいずれか以下）を含む。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、Ｓタンパク質ヌクレオチド配列の全長または一部（例えば、少なくとも約９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、または５％のうちいずれか）を含み、Ｓタンパク質ヌクレオチド配列の全長または一部は、フレームシフト変異、欠失、挿入、非センス変異、またはタンパク質の翻訳を全くもたらさないかもしくは機能性ウイルスタンパク質の翻訳をもたらさないミスセンス変異を含む。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ＲＢＤドメインヌクレオチド配列のいずれの部分も含まない。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ＲＢＤドメインヌクレオチド配列の一部（例えば、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、または５％のうちいずれか以下）を含む。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ＲＢＤドメインヌクレオチド配列の全長または一部（例えば、少なくとも約９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、または５％のうちいずれか）を含み、ＲＢＤドメインヌクレオチド配列の全長または一部は、フレームシフト変異、欠失、挿入、非センス変異、またはタンパク質の翻訳を全くもたらさないかもしくは機能性ウイルスタンパク質ドメインの翻訳をもたらさないミスセンス変異を含む。
スパイクタンパク質におけるこの受容体結合モチーフ（ＲＢＭ）の分析は、受容体結合に必須のアミノ酸残基の大部分がＳＡＲＳ－ＣｏＶとＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２との間で保存されていたことを示し、このことは、両方のＣｏＶ株が宿主細胞への侵入のために同じ宿主受容体を使用することを示唆した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶによって利用される侵入の受容体は、アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ－２）である。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質膜融合Ｓ２ドメインは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の配列番号５のスパイクタンパク質の６６２～１２７０位にあり得る（以下に示す配列番号７）。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、Ｓ２ドメインヌクレオチド配列のいずれの部分も含まない。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、Ｓ２ドメインヌクレオチド配列の一部（例えば、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、または５％のうちいずれか以下）を含む。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、Ｓ２ドメインヌクレオチド配列の全長または一部（例えば、少なくとも約９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、または５％のうちいずれか）を含み、Ｓ２ドメインヌクレオチド配列の全長または一部は、フレームシフト変異、欠失、挿入、非センス変異、またはタンパク質の翻訳を全くもたらさないかもしくは機能性ウイルスタンパク質ドメインの翻訳をもたらさないミスセンス変異を含む。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ｎｓｐ３と称され得る、配列番号１の配列の２７２０～８５５４位にＯＲＦを有し得、これは膜貫通ドメイン１（ＴＭ１）を含む。膜貫通ドメイン１を有するこのｎｓｐ３ ＯＲＦは、ＮＣＢＩアクセッション番号ＹＰ＿００９７２５２９９．１を有し、配列番号８として以下に示される。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ｎｓｐ３ヌクレオチド配列のいずれの部分も含まない。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ｎｓｐ３ヌクレオチド配列の一部（例えば、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、または５％のうちいずれか以下）を含む。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ｎｓｐ３ヌクレオチド配列の全長または一部（例えば、少なくとも約９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、または５％のうちいずれか）を含み、ｎｓｐ３ヌクレオチド配列の全長または一部は、フレームシフト変異、欠失、挿入、非センス変異、またはタンパク質の翻訳を全くもたらさないかもしくは機能性ウイルスタンパク質の翻訳をもたらさないミスセンス変異を含む。
ｎｓｐ３タンパク質は、Ｎ末端酸性（Ａｃ）、予測ホスホエステラーゼ、パパイン様プロテイナーゼ、Ｙドメイン、膜貫通ドメイン１（ＴＭ１）、およびアデノシン二リン酸－リボース１’’－ホスファターゼ（ＡＤＲＰ）を含むさらなる保存ドメインを有する。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ｎｓｐ４Ｂ＿ＴＭと称され得る、配列番号１の配列の８５５５～１００５４位にＯＲＦを有し得、これは膜貫通ドメイン２（ＴＭ２）を含む。膜貫通ドメイン２を有するこのｎｓｐ４Ｂ＿ＴＭ ＯＲＦは、ＮＣＢＩアクセッション番号ＹＰ＿００９７２５３００を有し、配列番号９として以下に示される。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ｎｓｐ４Ｂ＿ＴＭヌクレオチド配列のいずれの部分も含まない。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ｎｓｐ４Ｂ＿ＴＭヌクレオチド配列の一部（例えば、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、または５％のうちいずれか以下）を含む。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ｎｓｐ４Ｂ＿ＴＭヌクレオチド配列の全長または一部（例えば、少なくとも約９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、または５％のうちいずれか）を含み、ｎｓｐ４Ｂ＿ＴＭヌクレオチド配列の全長または一部は、フレームシフト変異、欠失、挿入、非センス変異、またはタンパク質の翻訳を全くもたらさないかもしくは機能性ウイルスタンパク質の翻訳をもたらさないミスセンス変異を含む。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ＧＵ２８０＿ｇｐ０３と称され得る、配列番号１の配列の２５３９３～２６２２０位にＯＲＦ（ＯＲＦ３ａ）を有し得る（以下に示す配列番号１０）。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ＯＲＦ３ａヌクレオチド配列のいずれの部分も含まない。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ＯＲＦ３ａヌクレオチド配列の一部（例えば、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、または５％のうちいずれか以下）を含む。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ＯＲＦ３ａヌクレオチド配列の全長または一部（例えば、少なくとも約９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、または５％のうちいずれか）を含み、ＯＲＦ３ａヌクレオチド配列の全長または一部は、フレームシフト変異、欠失、挿入、非センス変異、またはタンパク質の翻訳を全くもたらさないかもしくは機能性ウイルスタンパク質の翻訳をもたらさないミスセンス変異を含む。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ＧＵ２８０＿ｇｐ０４と称され得る、配列番号１の配列の２６２４５～２６４７２位にＯＲＦ（遺伝子Ｅ）を有し得る（以下に示す配列番号１１）。
配列番号１１のタンパク質は、構造タンパク質、例えばエンベロープタンパク質である。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、遺伝子Ｅヌクレオチド配列のいずれの部分も含まない。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、遺伝子Ｅヌクレオチド配列の一部（例えば、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、または５％のうちいずれか以下）を含む。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、遺伝子Ｅヌクレオチド配列の全長または一部（例えば、少なくとも約９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、または５％のうちいずれか）を含み、遺伝子Ｅヌクレオチド配列の全長または一部は、フレームシフト変異、欠失、挿入、非センス変異、またはタンパク質の翻訳を全くもたらさないかもしくは機能性ウイルスタンパク質の翻訳をもたらさないミスセンス変異を含む。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ＧＵ２８０＿ｇｐ０５と称され得る、配列番号１の配列の２７２０２～２７１９１位にＯＲＦ（Ｍタンパク質遺伝子；ＯＲＦ５）を有し得る（以下に示す配列番号１２）。
配列番号１２のタンパク質は、構造タンパク質、例えば膜糖タンパク質である。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ＯＲＦ５ヌクレオチド配列のいずれの部分も含まない。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ＯＲＦ５ヌクレオチド配列の一部（例えば、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、または５％のうちいずれか以下）を含む。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ＯＲＦ５ヌクレオチド配列の全長または一部（例えば、少なくとも約９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、または５％のうちいずれか）を含み、ＯＲＦ５ヌクレオチド配列の全長または一部は、フレームシフト変異、欠失、挿入、非センス変異、またはタンパク質の翻訳を全くもたらさないかもしくは機能性ウイルスタンパク質の翻訳をもたらさないミスセンス変異を含む。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ＧＵ２８０＿ｇｐ０６と称され得る、配列番号１の配列の２７２０２～２７３８７位にＯＲＦ（ＯＲＦ６）を有し得る（以下に示す配列番号１３）。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ＯＲＦ６ヌクレオチド配列のいずれの部分も含まない。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ＯＲＦ６ヌクレオチド配列の一部（例えば、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、または５％のうちいずれか以下）を含む。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ＯＲＦ６ヌクレオチド配列の全長または一部（例えば、少なくとも約９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、または５％のうちいずれか）を含み、ＯＲＦ６ヌクレオチド配列の全長または一部は、フレームシフト変異、欠失、挿入、非センス変異、またはタンパク質の翻訳を全くもたらさないかもしくは機能性ウイルスタンパク質の翻訳をもたらさないミスセンス変異を含む。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ＧＵ２８０＿ｇｐ０７と称され得る、配列番号１の配列の２７３９４～２７７５９位にＯＲＦ（ＯＲＦ７ａ）を有し得る（以下に示す配列番号１４）。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ＯＲＦ７ａヌクレオチド配列のいずれの部分も含まない。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ＯＲＦ７ａヌクレオチド配列の一部（例えば、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、または５％のうちいずれか以下）を含む。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ＯＲＦ７ａヌクレオチド配列の全長または一部（例えば、少なくとも約９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、または５％のうちいずれか）を含み、ＯＲＦ７ａヌクレオチド配列の全長または一部は、フレームシフト変異、欠失、挿入、非センス変異、またはタンパク質の翻訳を全くもたらさないかもしくは機能性ウイルスタンパク質の翻訳をもたらさないミスセンス変異を含む。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ＧＵ２８０＿ｇｐ０８と称され得る、配列番号１の配列の２７７５６～２７８８７位にＯＲＦ（ＯＲＦ７ｂ）を有し得る（以下に示す配列番号１５）。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ＯＲＦ７ｂヌクレオチド配列のいずれの部分も含まない。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ＯＲＦ７ｂヌクレオチド配列の一部（例えば、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、または５％のうちいずれか以下）を含む。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ＯＲＦ７ｂヌクレオチド配列の全長または一部（例えば、少なくとも約９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、または５％のうちいずれか）を含み、ＯＲＦ７ｂヌクレオチド配列の全長または一部は、フレームシフト変異、欠失、挿入、非センス変異、またはタンパク質の翻訳を全くもたらさないかもしくは機能性ウイルスタンパク質の翻訳をもたらさないミスセンス変異を含む。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ＧＵ２８０＿ｇｐ０９と称され得る、配列番号１の配列の２７８９４～２８２５９位にＯＲＦ（ＯＲＦ８）を有し得る（以下に示す配列番号１６）。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ＯＲＦ８ヌクレオチド配列のいずれの部分も含まない。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ＯＲＦ８ヌクレオチド配列の一部（例えば、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、または５％のうちいずれか以下）を含む。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ＯＲＦ８ヌクレオチド配列の全長または一部（例えば、少なくとも約９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、または５％のうちいずれか）を含み、ＯＲＦ８ヌクレオチド配列の全長または一部は、フレームシフト変異、欠失、挿入、非センス変異、またはタンパク質の翻訳を全くもたらさないかもしくは機能性ウイルスタンパク質の翻訳をもたらさないミスセンス変異を含む。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ＧＵ２８０＿ｇｐ１０と称され得る、配列番号１の配列の２８２７４～２９５３３位にＯＲＦ（遺伝子Ｎ；ＯＲＦ９）を有し得る（以下に示す配列番号１７）。
配列番号１７のタンパク質は、構造タンパク質、例えばヌクレオカプシドホスホプロテインである。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ＯＲＦ９ヌクレオチド配列のいずれの部分も含まない。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ＯＲＦ９ヌクレオチド配列の一部（例えば、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、または５％のうちいずれか以下）を含む。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ＯＲＦ９ヌクレオチド配列の全長または一部（例えば、少なくとも約９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、または５％のうちいずれか）を含み、ＯＲＦ９ヌクレオチド配列の全長または一部は、フレームシフト変異、欠失、挿入、非センス変異、またはタンパク質の翻訳を全くもたらさないかもしくは機能性ウイルスタンパク質の翻訳をもたらさないミスセンス変異を含む。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ＧＵ２８０＿ｇｐ１１と称され得る、配列番号１の配列の２９５５８～２９６７４位にＯＲＦ（ＯＲＦ１０）を有し得る（以下に示す配列番号１９）。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ＯＲＦ１０ヌクレオチド配列のいずれの部分も含まない。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ＯＲＦ１０ヌクレオチド配列の一部（例えば、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、または５％のうちいずれか以下）を含む。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ＯＲＦ１０ヌクレオチド配列の全長または一部（例えば、少なくとも約９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、または５％のうちいずれか）を含み、ＯＲＦ１０ヌクレオチド配列の全長または一部は、フレームシフト変異、欠失、挿入、非センス変異、またはタンパク質の翻訳を全くもたらさないかもしくは機能性ウイルスタンパク質の翻訳をもたらさないミスセンス変異を含む。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、コードされたＧＵ２８０＿ｇｐ１１内にある、配列番号１の２９６０９～２９６４４位および２９６２９～２９６５７位にステムループを有し得る。例えば、配列番号１の２９６０９～２９６４４位でのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のステムループを配列番号２０として以下に示す。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、配列番号２０、または配列番号２０の配列と少なくとも約９０％の配列同一性（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性のうちいずれか）を含む配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、配列番号２０を含まない。
例えば、配列番号１の２９６２９～２９６５７位でのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のステムループを配列番号２１として以下に示す。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、配列番号２１、または配列番号２１の配列と少なくとも約９０％の配列同一性（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性のうちいずれか）を含む配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、配列番号２１を含まない。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＹＰ＿００９７２５３０５．１のｓｓＲＮＡ結合タンパク質をコードする配列番号１の配列の１２６８６～１３０２４位にＯＲＦ（ｎｓｐ９）を有し得、以下の配列（配列番号２２）を有する。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ｎｓｐ９ヌクレオチド配列のいずれの部分も含まない。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ｎｓｐ９ヌクレオチド配列の一部（例えば、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、または５％のうちいずれか以下）を含む。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ｎｓｐ９ヌクレオチド配列の全長または一部（例えば、少なくとも約９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、または５％のうちいずれか）を含み、ｎｓｐ９ヌクレオチド配列の全長または一部は、フレームシフト変異、欠失、挿入、非センス変異、またはタンパク質の翻訳を全くもたらさないかもしくは機能性ウイルスタンパク質の翻訳をもたらさないミスセンス変異を含む。
前述のヌクレオチド配列はＤＮＡ配列である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物に使用されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸は、ＤＮＡ配列である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物に使用されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸は、ＲＮＡ配列である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ＤＮＡ配列とＲＮＡ配列の両方（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡ配列およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ配列）を含む。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物がＲＮＡである場合、構築物のヌクレオチド配列は、本明細書に提供されるＤＮＡ配列に対応するＲＮＡ配列であると理解されるべきである。
さらに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムは、配列バリエーションの反映である構造バリエーションを自然に有し得る。したがって、本明細書に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物で使用されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、例えば、上で示されている配列と１つまたはそれを超えるヌクレオチドまたはアミノ酸の相違を有し得る。いくつかの場合、本明細書に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物で使用されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸は、例えば、上で示されている配列と２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０個、またはそれを超えるヌクレオチドまたはアミノ酸の相違を有し得る。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ＯＲＦ１ａｂ、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ヘリカーゼ、遺伝子Ｓ、Ｓタンパク質、ＲＢＤドメイン、Ｓ２ドメイン、ｎｓｐ３、ｎｓｐ４Ｂ、ＯＲＦ３ａ、遺伝子Ｅ、ＯＲＦ５、ＯＲＦ６、ＯＲＦ７ａ、ＯＲＦ７ｂ、ＯＲＦ８、ＯＲＦ９、ＯＲＦ１０、配列番号２０、配列番号２１、またはその一部について上に論じられるヌクレオチド配列と少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％相同である配列を含むことができる。
本明細書に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムの部分を有し得、ゲノムの欠失は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムの少なくとも１００、少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも１５００、少なくとも２０００、少なくとも２５００、少なくとも３０００、少なくとも４０００、少なくとも５０００、少なくとも６０００、少なくとも７０００、少なくとも８０００、少なくとも９０００、少なくとも１０，０００、少なくとも１１，０００、少なくとも１２，０００、少なくとも１３，０００、少なくとも１４，０００、少なくとも１５，０００、少なくとも１６，０００、少なくとも１７，０００、少なくとも１８，０００、少なくとも１９，０００、少なくとも２０，０００、少なくとも２１，０００、少なくとも２２，０００、少なくとも２３，０００、少なくとも２４，０００、少なくとも２５，０００、少なくとも２６，０００、少なくとも２７，０００、少なくとも２７５００、または少なくとも２８０００ヌクレオチドを含む。
本開示の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２の５’ＵＴＲまたはそのバリアントの５’ＵＴＲ領域と、オプショナルの介在配列と、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２の３’ＵＴＲまたはそのバリアントの３’ＵＴＲ領域を含む。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物中の５’ＵＴＲ領域、オプショナルの介在配列、および３’ＵＴＲ領域の全長は、約１，０００～約３０，０００ｂｐ、例えば約１，０００～約２０，０００、約１，０００～約１０，０００ｂｐ、約１，０００～約５，０００ｂｐ、約２，０００～約３，５００ｂｐ、約５，０００～約１５，０００ｂｐ、約１０，０００～約２０，０００ｂｐ、約１５，０００～約２５，０００ｂｐ、約２０，０００～約３０，０００ｂｐのうちいずれかである。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物中の５’ＵＴＲ領域、オプショナルの介在配列、および３’ＵＴＲ領域の全長は、約１，０００ｂｐ超、例えば約１，５００、２，０００、２，５００、３，０００、３，５００、４，０００、４，５００、５，０００、５，５００、６，０００、６，５００、７，０００、７，５００、８，０００、８，５００、９，０００、９，５００、１０，０００、１０，５００、１１，０００、１１，５００、１２，０００、１２，５００、１３，０００、１３，５００、１４，０００、１４，５００、１５，０００、１５，５００、１６，０００、１６，５００、１７，０００、１７，５００、１８，０００、１８，５００、１９，０００、１９，５００、２０，０００、２０，５００、２１，０００、２１，５００、２２，０００、２２，５００、２３，０００、２３，５００、２４，０００、２４，５００、２５，０００、２５，５００、２６，０００、２６，５００、２７，０００、２７，５００、２８，０００、２８，５００、２９，０００、２９，５００ｂｐ、３０，０００ｂｐのうちいずれかよりも長いか、または３０，０００ｂｐを超える長さよりも長い。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物中の５’ＵＴＲ領域、オプショナルの介在配列、および３’ＵＴＲ領域の全長は、約３０，０００ｂｐ未満、例えば、約２９，０００、２８，５００、２８，０００、２７，５００、２７，０００、２６，５００、２６，０００、２５，５００、２５，０００、２４，５００、２４，０００、２３，５００、２３，０００、２２，５００、２２，０００、２１，５００、２１，０００、１９，５００、１９，０００、１８，５００、１８，０００、１７，５００、１７，０００、１６，５００、１６，０００、１５，５００、１５，０００、１４，５００、１４，０００、１３，５００、１３，０００、１２，５００、１２，０００、１１，５００、１１，０００、１０，５００、１０，０００、９，５００、９，０００、８，５００、８，０００、７，５００、７，００、６，５００、６，０００、５，５００、５，０００、４，５００、４，０００、３，５００、３，０００、２，５００、２，０００、１，５００、１，０００ｂｐ、もしくは１，０００ｂｐ未満のうちいずれかの全長よりも短い。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物中の５’ＵＴＲ領域、オプショナルの介在配列、および３’ＵＴＲ領域の全長は、約２０００ｂｐ～約３５００ｂｐであり、約２０００ｂｐ、２１００ｂｐ、２２００ｂｐ、２３００ｂｐ、２４００ｂｐ、２５００ｂｐ、２６００ｂｐ、２７００ｂｐ、２８００ｂｐ、２９００ｂｐ、３０００ｂｐ、３１００ｂｐ、３２００ｂｐ、３３００ｂｐ、３４００ｂｐ、３５００ｂｐ、またはその間の任意の数のうちいずれかを含む。
いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物中の５’ＵＴＲ領域、オプショナルの介在配列、および３’ＵＴＲ領域の全長は、約１，０００～約１０，０００ｂｐである。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物中の５’ＵＴＲ領域、オプショナルの介在配列、および３’ＵＴＲ領域の全長は、約１，０００～約５，０００ｂｐである。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物中の５’ＵＴＲ領域、オプショナルの介在配列、および３’ＵＴＲ領域の全長は、約２，０００～約３，５００ｂｐである。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物中の５’ＵＴＲ領域、オプショナルの介在配列、および３’ＵＴＲ領域の全長は、約２，１００ｂｐである。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物中の５’ＵＴＲ領域、オプショナルの介在配列、および３’ＵＴＲ領域の全長は、約３，５００ｂｐである。
本開示は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体、例えば干渉性、条件付き複製性、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２欠失変異体、および関連構築物をまた提供する。例えば、本開示は、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列と比較して、１つまたはそれを超える欠失を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２欠失変異体を提供する。
したがって、本開示はまた、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体も提供する。そのようなＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２欠失変異体は、例えば配列番号１の任意の位置に１つまたはそれを超える欠失を有し得る。そのような欠失は、コードされたポリペプチドのいずれかの配列を短縮または排除し得る。例えば、そのような欠失は、配列番号２～１９または２２あるいは対応するコード配列によって特定される配列を短縮または欠失させ得る。例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸のそのような欠失は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸によってコードされるポリペプチドのいずれかの発現を低減または排除し得る。しかしながら、いくつかの場合、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムのある特定の領域（例えば、５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲの部分）は保持されるべきであり、欠失されるべきではない。
本開示は、干渉性、条件付き複製性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２欠失変異体および関連構築物を提供するために、保持されるべきＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムの特定の領域および欠失可能なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムの特定の領域を同定する。例えば、治療用干渉粒子（ＴＩＰ）として機能するために、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２欠失変異体は、例えば、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲなどのシス作用性エレメントを保持し得る。シス作用性エレメントを保持することに加えて、干渉性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２粒子は、いくつかの場合、Ｎタンパク質またはスパイク受容体結合Ｓ１サブユニット（例えば、配列番号６）などのいくつかのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質の一部分を保持し得る。
野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２との干渉を示す干渉性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２粒子（すなわち、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物を含む粒子）は、例えば、ウイルス粒子アセンブリを媒介する構造タンパク質に対して競合し得るか、またはウイルス粒子のアセンブリを阻害するタンパク質を産生し得る。例えば、干渉を示す干渉性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２粒子は、スパイクタンパク質の膜融合Ｓ２サブユニット（例えば、配列番号７）に欠失を有し得る。いくつかの場合、干渉を示す干渉性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２粒子は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、配列番号３）に１つまたはそれを超える欠失を有し得る。いくつかの場合、干渉を示す干渉性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２粒子は、Ｍタンパク質（膜糖タンパク質）（例えば、配列番号１２）に１つまたはそれを超える欠失を有し得る。いくつかの場合、干渉を示す干渉性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２粒子は、ｓｓＲＮＡ結合タンパク質（例えば、配列番号２２）に１つまたはそれを超える欠失を有し得る。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２欠失変異体および干渉性、条件付き複製性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物の欠失サイズは変動し得る。例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２欠失変異体および干渉性、条件付き複製性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、１つまたはそれを超える欠失を有し得、各欠失は、少なくとも１ｂｐ、少なくとも２ｂｐ、少なくとも３ｂｐ、少なくとも４ｂｐ、少なくとも５ｂｐ、少なくとも６ｂｐ、少なくとも７ｂｐ、少なくとも８ｂｐ、少なくとも９ｂｐ、少なくとも１０ｂｐ、少なくとも１２ｂｐ、少なくとも１５ｂｐ、少なくとも２０ｂｐ、少なくとも２５ｂｐ、少なくとも３０ｂｐ、少なくとも４０ｂｐの欠失を有する。
いくつかの場合、欠失サイズは、例えば、約１０ｂｐ～約５０００ｂｐ、約８００ｂｐ～約２５００ｂｐ、約９００ｂｐ～約２４００ｂｐ、約１０００ｂｐ～約２３００ｂｐ、約１１００ｂｐ～約２２００ｂｐ、約１２００ｂｐ～約２１００ｂｐ、約１３００ｂｐ～約２０００ｂｐ、約１４００ｂｐ～約１９００ｂｐ、約１５００ｂｐ～約１８００ｂｐ、または約１６００ｂｐ～約１７００ｂｐの範囲であり得る。
いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスゲノムに由来する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ＷＩＶ４、すなわちｈＣｏＶ－１９／ＷＩＶ０４／２０１９もしくはＢｅｔａＣｏＶ／ＷＩＶ０４／２０１９、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＷＩＶ４と実質的に同じゲノム配列（例えば、２００、１００、５０、２０、１０、５、４、３、２または１個のうちいずれか１つよりも少ない変異）および表現型を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスである。
いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントである。これらのバリアントに関連する例示的なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントおよびスパイクタンパク質変異を以下の表１に示す。本明細書に記載されるＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２バリアントは、世界保健機関（ＷＨＯ）によって、または指定された世界大流行の系統発生学的研究課題（Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ Ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ Ｎａｍｅｄ Ｇｌｏｂａｌ Ｏｕｔｂｒｅａｋ）（ＰＡＮＧＯ）系統ソフトウェアに従って命名される。当技術分野における異なる命名システムおよびアルゴリズムを使用して、同じバリアントが参照され得ることが理解される。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントの分類および定義、ならびに既知のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントのリストは、ワールドワイドウェブｃｄｃ．ｇｏｖ／ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ／２０１９－ｎｃｏｖ／ｖａｒｉａｎｔｓ／ ｖａｒｉａｎｔ－ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ．ｈｔｍｌで見ることができる。いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントは、上記の配列のうちいずれかと少なくとも約８０％の配列相同性を有する任意の配列であり得、これは時々出現し得る。本出願は例示的なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノム配列として配列番号１を提供するが、本出願は他のウイルス（本明細書に記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントなど）に由来する組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物も企図していることを理解されたい。したがって、本明細書に記載の配列番号１（またはその一部、例えば配列番号（ＳＥＤ ＩＤ ＮＯ）１の５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲ配列）のバリアントは、他のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス（本明細書に記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントなど）における対応する配列（対応する５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲ配列など）を包含する。
表１．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント。
表１．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント。
いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントは、アルファ（すなわち、Ｂ．１．１．７およびＱ）バリアント、ベータ（すなわち、Ｂ．１．３５１）バリアント、ガンマ（すなわち、Ｂ．１．１．２８．１としても知られるＰ．１）バリアント、イプシロン（すなわち、Ｂ．１．４２７またはＢ．１．４２９）バリアント、エータ（すなわち、Ｂ．１．５２５）バリアント、イオタ（すなわち、Ｂ．１．５２６）バリアント、カッパ（すなわち、Ｂ．１．６１７．１）バリアント、Ｂ．１．６１７．３バリアント、ゼータ（すなわち、Ｐ．２）バリアント、ミュー（すなわち、Ｂ．１．６２１またはＢ．１．６２１．１）バリアント、デルタ（すなわち、Ｂ．１．６１７．２またはＡＹ）バリアント、およびオミクロン（すなわち、Ｂ．１．１．５２９またはＢＡ）バリアントからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントは、Ｂ．１．６１７．２バリアントなどのデルタバリアント、またはＡＹバリアントである。いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントは、Ｂ．１．５２９バリアントまたはＢＡバリアントなどのオミクロンバリアントである。いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントは、Ｂ．１．１．７、Ｂ．１．３５１、Ｐ．１、およびＢ．１．６１７．２からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントは、スパイクタンパク質に１またはそれを超える変異（例えば、挿入、欠失および／または置換）を有する。いくつかの実施形態では、スパイクタンパク質中の１またはそれを超える変異は、ウイルス適合性、例えば伝播性、病毒性、および／または薬物耐性（例えば、中和抗体に対する耐性および／またはワクチンに対する耐性）に影響を及ぼし得る。いくつかの実施形態では、スパイクタンパク質中の１またはそれを超える変異は、ウイルス適合性を実質的に変化させない。いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントは、スパイクタンパク質に変異を有しない。
Ｂ．５’ＵＴＲ領域および３’ＵＴＲ領域
Ｂ．５’ＵＴＲ領域および３’ＵＴＲ領域
本明細書に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲにそれぞれ由来する５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲ領域を含む。
いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲ領域は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のステムループ５を含む。
いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物の５’ＵＴＲ領域は、約１００～約５００ｂｐの全長、例えば約１００～約２００ｂｐ、約１５０～約２５０ｂｐ、約２００～約３００ｂｐ、約２５０～約３５０ｂｐ、約３００～約４００ｂｐ、約３５０～約４５０ｂｐ、または約４００～約５００ｂｐの全長を含む。いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲ領域は、約１００ ｂｐ超の全長、例えば約１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００ｂｐ、もしくは５００ｂｐ超のうちいずれかを超える全長を含む。いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲ領域は、約５００ｂｐ未満の全長、例えば約４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００ｂｐ、もしくは１００ｂｐ未満うちのいずれか未満の全長を含む。いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲ領域は、約２６５ｂｐの全長を含む。
いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物の５’ＵＴＲ領域は、配列番号１の断片またはそのバリアントを含む。いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲ領域は、配列番号１のヌクレオチド１～２６５またはそのバリアントと少なくとも約３０％の配列相同性（例えば、少なくとも約３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列相同性のうちいずれか）を含む。いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲ領域は、配列番号１のヌクレオチド１～２６５、またはそのバリアントを含む。いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲ領域は、配列番号１のヌクレオチド１～２６５を含む。
いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ５’ＵＴＲ配列またはそのバリアントの１よりも多くのコピーを含む５’ＵＴＲ領域を含む。例えば、いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ５’ＵＴＲ配列またはそのバリアントの約２、３、４、５、６、７、８、９、１０個もしくは１０個超のコピーのいずれかを含む。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物の５’ＵＴＲ領域の各５’ＵＴＲ配列は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ５’ＵＴＲ配列またはそのバリアントの少なくとも約１００ヌクレオチドのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ５’ＵＴＲ配列またはそのバリアント、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ５’ＵＴＲ配列またはそのバリアントの少なくとも約１５０、２００、２５０、３００個、またはそれを超えるヌクレオチドのうちいずれかを含む。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物の５’ＵＴＲ領域の各５’ＵＴＲ配列は、約３００ヌクレオチド未満のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ５’ＵＴＲ配列またはそのバリアント、例えば約２５０、２００、１５０、１００もしくは１００未満のヌクレオチドのいずれか未満のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ５’ＵＴＲ配列またはそのバリアントを含む。いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲ領域の各５’ＵＴＲ配列は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ５’ＵＴＲ配列またはそのバリアントの同じ配列を含む。いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲ領域の各５’ＵＴＲ配列は、異なる長さのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ５’ＵＴＲ配列またはそのバリアントの配列を含む。
いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物の３’ＵＴＲ領域は、約１００～約５００ｂｐの全長、例えば約１００～約２００ｂｐ、約１５０～約２５０ｂｐ、約２００～約３００ｂｐ、約２５０～約３５０ｂｐ、約３００～約４００ｂｐ、約３５０～約４５０ｂｐ、または約４００～約５００ｂｐの全長を含む。いくつかの実施形態では、３’ＵＴＲ領域は、約１００ ｂｐ超の全長、例えば約１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００ｂｐ、もしくは５００ｂｐ超のうちいずれかを超える全長を含む。いくつかの実施形態では、３’ＵＴＲ領域は、約５００ｂｐ未満の全長、例えば約４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００ｂｐ、もしくは１００ｂｐ未満うちのいずれか未満の全長を含む。いくつかの実施形態では、３’ＵＴＲ領域は、約２２８ｂｐの全長を含む。いくつかの実施形態では、３’ＵＴＲ領域は、約１９６ｂｐの全長を含む。
いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物の３’ＵＴＲ領域は、配列番号１の断片またはそのバリアントを含む。いくつかの実施形態では、３’ＵＴＲ領域は、配列番号１のヌクレオチド２９６７５～２９８７０またはそのバリアントと少なくとも約３０％の配列相同性（例えば、少なくとも約３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列相同性のうちいずれか）を含む。いくつかの実施形態では、３’ＵＴＲ領域は、配列番号１のヌクレオチド２９６７５～２９８７０、またはそのバリアントを含む。いくつかの実施形態では、３’ＵＴＲ領域は、配列番号１のヌクレオチド２９６７５～２９９０３を含む。いくつかの実施形態では、３’ＵＴＲ領域は、配列番号１のヌクレオチド２９６７５～２９９０３またはそのバリアントと少なくとも約３０％の配列相同性（例えば、少なくとも約３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列相同性のうちいずれか）を含む。いくつかの実施形態では、３’ＵＴＲ領域は、配列番号１のヌクレオチド２９６７５～２９９０３、またはそのバリアントを含む。いくつかの実施形態では、３’ＵＴＲ領域は、配列番号１のヌクレオチド２９６７５～２９９０３を含む。
いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ３’ＵＴＲ配列またはそのバリアントの１よりも多くのコピーを含む３’ＵＴＲ領域を含む。例えば、いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ３’ＵＴＲ配列またはそのバリアントの約２、３、４、５、６、７、８、９、１０個もしくは１０個超のコピーのいずれかを含む。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物の３’ＵＴＲ領域の各３’ＵＴＲ配列は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ３’ＵＴＲ配列またはそのバリアントの少なくとも約１００ヌクレオチドのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ３’ＵＴＲ配列またはそのバリアント、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ３’ＵＴＲ配列またはそのバリアントの少なくとも約１５０、２００、２５０、３００個、またはそれを超えるヌクレオチドのうちいずれかを含む。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物の３’ＵＴＲ領域の各３’ＵＴＲ配列は、約３００ヌクレオチド未満のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ３’ＵＴＲ配列またはそのバリアント、例えば約２５０、２００、１５０、１００もしくは１００未満のヌクレオチドのいずれか未満のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ３’ＵＴＲ配列またはそのバリアントを含む。いくつかの実施形態では、３’ＵＴＲ領域の各３’ＵＴＲ配列は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ３’ＵＴＲ配列またはそのバリアントの同じ配列を含む。いくつかの実施形態では、３’ＵＴＲ領域の各３’ＵＴＲ配列は、異なる長さのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ３’ＵＴＲ配列またはそのバリアントの配列を含む。
Ｃ．介在配列
Ｃ．介在配列
いくつかの態様では、本明細書に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は介在配列を含む。いくつかの実施形態では、介在配列は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列、異種配列、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、介在配列を含まない。
介在配列は、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物中の５’ＵＴＲ領域と３’ＵＴＲ領域との間に配置される。
組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、全長が約１ｂｐ～約２９，０００ｂｐである介在配列を含み得る。いくつかの実施形態では、介在配列は、約１ｂｐ～約２９，０００ｂｐ、例えば、約１～約１００ｂｐ、約５０～約２５０ｂｐ、約２００～約５００ｂｐ、約２５０～約７５０ｂｐ、約５００～約１，０００ｂｐ、約１，０００～約１０，０００ｂｐ、約１，０００～約５，０００ｂｐ、約２，０００～約３，５００ｂｐ、約５，０００～約１５，０００ｂｐ、約１０，０００～約２０，０００ｂｐ、約１５，０００～約２５，０００ｂｐ、約２０，０００～約２９，０００ｂｐのうちいずれかである。いくつかの実施形態では、介在配列は、全長が約１ｂｐ超、例えば全長が約１０、５０、１００、１５０、２００、２５０、５００、１，５００、２，０００、２，５００、３，０００、３，５００、４，０００、４，５００、５，０００、５，５００、６，０００、６，５００、７，０００、７，５００、８，０００、８，５００、９，０００、９，５００、１０，０００、１０，５００、１１，０００、１１，５００、１２，０００、１２，５００、１３，０００、１３，５００、１４，０００、１４，５００、１５，０００、１５，５００、１６，０００、１６，５００、１７，０００、１７，５００、１８，０００、１８，５００、１９，０００、１９，５００、２０，０００、２０，５００、２１，０００、２１，５００、２２，０００、２２，５００、２３，０００、２３，５００、２４，０００、２４，５００、２５，０００、２５，５００、２６，０００、２６，５００、２７，０００、２７，５００、２８，０００、２８，５００、２９，０００もしくは２９，０００超のうちいずれかよりも長い長さを含む。いくつかの実施形態では、介在配列は、全長が約２９，０００ｂｐ未満、例えば全長が約２８，５００、２８，０００、２７，５００、２７，０００、２６，５００、２６，０００、２５，５００、２５，０００、２４，５００、２４，０００、２３，５００、２３，０００、２２，５００、２２，０００、２１，５００、２１，０００、１９，５００、１９，０００、１８，５００、１８，０００、１７，５００、１７，０００、１６，５００、１６，０００、１５，５００、１５，０００、１４，５００、１４，０００、１３，５００、１３，０００、１２，５００、１２，０００、１１，５００、１１，０００、１０，５００、１０，０００、９，５００、９，０００、８，５００、８，０００、７，５００、７，００、６，５００、６，０００、５，５００、５，０００、４，５００、４，０００、３，５００、３，０００、２，５００、２，０００、１，５００、１，０００、５００、２５０、２００、１５０、１００、５０、１０ｂｐもしくは１０ｂｐ未満のうちいずれか未満の長さを含む。
（ｉ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列
（ｉ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列
いくつかの態様では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列またはそのバリアントを含む介在配列を含む。本明細書で使用される場合、「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列」という用語は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスゲノムまたはそのバリアントに由来する任意の配列を含む。いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスゲノムは、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株に由来する。いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスゲノムは、Ｂ．１．１．７（アルファバリアント）、Ｂ．１．３５１（ベータバリアント）、Ｐ．１（ガンマバリアント）、またはＢ．１．６１７．２（デルタバリアント）から選択されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株由来のものである。本開示の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、任意の既知のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列もしくはそのバリアント、または任意の現在未知の、将来のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列もしくはそのバリアントを含む介在配列を含んでもよく、そのような組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は本開示の範囲内であることを理解されたい。
いくつかの実施形態では、介在配列中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列は遺伝子産物をコードしない。いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列は、機能性ウイルスタンパク質をコードしない。いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列は、機能性ウイルスＲＮＡをコードしない。組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２シス作用性配列エレメントを含み得、変更により１つまたはそれを超えるコードされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２トランス作用性ポリペプチドが非機能性になるようなＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列の変更を含み得る。「非機能性」とは、例えば、コードされたポリペプチドの短縮もしくは内部欠失に起因して、またはポリペプチドが全く欠如していることに起因して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２トランス活性化ポリペプチドがその正常な機能を果たさないことを意味する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列の「変更」には、１つもしくはそれを超えるヌクレオチドの欠失および／または１つもしくはそれを超えるヌクレオチドの置換が含まれる。
いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスゲノムからのＯＲＦの一部を含む。いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスゲノムからの完全なＯＲＦと、ＯＲＦに散在する１またはそれを超える終止コドンとを含み、ＯＲＦの翻訳をもたらさないかまたは非機能性ウイルスタンパク質をもたらす。いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列は、ＯＲＦの翻訳をもたらさないＯＲＦ内の変異を含む。いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列は、非機能性翻訳ウイルスタンパク質をもたらすＯＲＦ内の変異を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列は、ＯＲＦの翻訳をもたらさない、または非機能性ウイルスタンパク質をもたらす、フレームシフト変異、欠失、挿入、ナンセンス変異、またはミスセンス変異を含む。
いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスゲノムまたはそのバリアントに由来しない介在配列を含まない。いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列は、配列番号１～２２または対応するコード配列のうちいずれか１つに由来する。いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列は、ポリプロテインＯＲＦ１ａｂの配列（配列番号２）またはその一部を含む。いくつかの実施形態では、ポリプロテインＯＲＦ１ａｂの一部（配列番号２）は、機能性ウイルスタンパク質をコードしない。
いくつかの態様では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、配列番号１のヌクレオチド１～４５０、またはそのバリアントを含む。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、配列番号１のヌクレオチド２９５４３～２９９０３、またはそのバリアントを含む。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、配列番号１のヌクレオチド２９５４３～２９８７０、またはそのバリアントを含む。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、配列番号１のヌクレオチド１～４５０およびヌクレオチド２９５４３～２９９０３、またはそのバリアントを含む。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、配列番号１のヌクレオチド１～４５０およびヌクレオチド２９５４３～２９８７０、またはそのバリアントを含む。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、配列番号２８の配列、または配列番号２８の配列と少なくとも約９０％の配列同一性（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性のうちいずれか）を含む配列を含む５’ＵＴＲ領域を含む。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、配列番号２９の配列、または配列番号２９の配列と少なくとも約９０％の配列同一性（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性のうちいずれか）を含む配列を含む３’ＵＴＲ領域を含む。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、配列番号２８の配列、または配列番号２８の配列と少なくとも約９０％の配列同一性（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性のうちいずれか）を含む配列を含む５’ＵＴＲ領域、および配列番号２９の配列、または配列番号２９の配列と少なくとも約９０％の配列同一性（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性のうちいずれか）を含む配列を含む３’ＵＴＲ領域を含む。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物中の５’ＵＴＲ領域、オプショナルの介在配列、および３’ＵＴＲ領域の全長は、約２０００ｂｐ～約３５００ｂｐ、例えば約２１００ｂｐである。
いくつかの態様では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、配列番号１のヌクレオチド１～４５０、またはそのバリアントを含み、ヌクレオチド２４１はシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）に変異している（例えば、５’ＵＴＲ内のＣ－２４１－Ｔ変異）。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、配列番号１のヌクレオチド２９５４３～２９９０３、またはそのバリアントを含む。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、配列番号１のヌクレオチド２９５４３～２９８７０、またはそのバリアントを含む。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、配列番号１のヌクレオチド１～４５０およびヌクレオチド２９５４３～２９９０３、またはそのバリアントを含み、ヌクレオチド２４１はＣからＴに変異している。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、配列番号１のヌクレオチド１～４５０およびヌクレオチド２９５４３～２９８７０、またはそのバリアントを含み、ヌクレオチド２４１はＣからＴに変異している。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、配列番号３２の配列、または配列番号３２の配列と少なくとも約９０％の配列同一性（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性のうちいずれか）を含む配列を含む５’ＵＴＲ領域を含む。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、配列番号２９の配列、または配列番号２９の配列と少なくとも約９０％の配列同一性（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性のうちいずれか）を含む配列を含む３’ＵＴＲ領域を含む。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、配列番号３２の配列、または配列番号３２の配列と少なくとも約９０％の配列同一性（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性のうちいずれか）を含む配列を含む５’ＵＴＲ領域、および配列番号２９の配列、または配列番号２９の配列と少なくとも約９０％の配列同一性（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性のうちいずれか）を含む配列を含む３’ＵＴＲ領域を含む。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物中の５’ＵＴＲ領域、オプショナルの介在配列、および３’ＵＴＲ領域の全長は、約２０００ｂｐ～約３５００ｂｐ、例えば約２１００ｂｐである。
いくつかの態様では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、配列番号１のヌクレオチド１～１５４０、またはそのバリアントを含む。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、配列番号１のヌクレオチド２９１９１～２９９０３、またはそのバリアントを含む。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、配列番号１のヌクレオチド２９１９１～２９８７０、またはそのバリアントを含む。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲ－ＣｏＶ－２構築物は、配列番号１のヌクレオチド１～１５４０およびヌクレオチド２９１９１～２９９０３、またはそのバリアントを含む。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲ－ＣｏＶ－２構築物は、配列番号１のヌクレオチド１～１５４０およびヌクレオチド２９１９１～２９８７０、またはそのバリアントを含む。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、配列番号３０の配列、または配列番号３０の配列と少なくとも約９０％の配列同一性（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性のうちいずれか）を含む配列を含む５’ＵＴＲ領域を含む。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、配列番号３１の配列、または配列番号３１の配列と少なくとも約９０％の配列同一性（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性のうちいずれか）を含む配列を含む３’ＵＴＲ領域を含む。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、配列番号３０の配列、または配列番号３０の配列と少なくとも約９０％の配列同一性（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性のうちいずれか）を含む配列を含む５’ＵＴＲ領域、および配列番号３１の配列、または配列番号３１の配列と少なくとも約９０％の配列同一性（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性のうちいずれか）を含む配列を含む３’ＵＴＲ領域を含む。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物中の５’ＵＴＲ領域、オプショナルの介在配列、および３’ＵＴＲ領域の全長は、約２０００ｂｐ～約３５００ｂｐ、例えば約３５００ｂｐである。
いくつかの態様では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、配列番号１のヌクレオチド１～１５４０、またはそのバリアントを含み、ヌクレオチド２４１はＣからＴに変異している（例えば、５’ＵＴＲ内のＣ－２４１－Ｔ変異）。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲ－ＣｏＶ－２構築物は、配列番号１のヌクレオチド２９１９１～２９９０３、またはそのバリアントを含む。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、配列番号１のヌクレオチド２９１９１～２９８７０、またはそのバリアントを含む。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲ－ＣｏＶ－２構築物は、配列番号１のヌクレオチド１～１５４０およびヌクレオチド２９１９１～２９９０３、またはそのバリアントを含み、ヌクレオチド２４１はＣからＴに変異している。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲ－ＣｏＶ－２構築物は、配列番号１のヌクレオチド１～１５４０およびヌクレオチド２９１９１～２９８７０、またはそのバリアントを含み、ヌクレオチド２４１はＣからＴに変異している。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、配列番号３３の配列、または配列番号３３の配列と少なくとも約９０％の配列同一性（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性のうちいずれか）を含む配列を含む５’ＵＴＲ領域を含む。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、配列番号３１の配列、または配列番号３１の配列と少なくとも約９０％の配列同一性（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性のうちいずれか）を含む配列を含む３’ＵＴＲ領域を含む。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、配列番号３３の配列、または配列番号３３の配列と少なくとも約９０％の配列同一性（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性のうちいずれか）を含む配列を含む５’ＵＴＲ領域、および配列番号３１の配列、または配列番号３１の配列と少なくとも約９０％の配列同一性（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性のうちいずれか）を含む配列を含む３’ＵＴＲ領域を含む。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物中の５’ＵＴＲ領域、オプショナルの介在配列、および３’ＵＴＲ領域の全長は、約２０００ｂｐ～約３５００ｂｐ、例えば約２１００ｂｐである。
（ｉｉ）異種配列
（ｉｉ）異種配列
いくつかの態様では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、異種配列を含む介在配列を含む。いくつかの実施形態では、異種配列は異種ヌクレオチド配列である。「異種」とは、自然界では野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムまたはそのバリアントに通常存在しない配列を指す。例えば、いくつかの場合、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、遺伝子産物をコードする異種配列を含まない。いくつかの実施形態では、異種配列は、機能性タンパク質をコードしない。いくつかの実施形態では、異種配列は、機能性ＲＮＡをコードしない。
いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列に由来しない異種配列を含む。いくつかの実施形態では、異種配列は、１またはそれを超える機能性タンパク質または配列をコードする。例えば、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、１またはそれを超えるマーカー配列（バーコード配列またはユニーク分子識別子配列（ＵＭＩ）など）、検出可能なマーカーをコードする１またはそれを超える核酸、レポータータンパク質、１またはそれを超えるプロモーター、１またはそれを超えるＲＮＡ転写もしくは翻訳開始部位、１またはそれを超える終結シグナル、またはそれらの組み合わせを含み得る。構築物はまた、複製起点を含むことができる。
いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、例えばＰＣＲまたは核酸シーケンシングによって、組換えＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２構築物の有無（または同一性）を決定することを可能にするマーカー配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ＵＭＩ配列などのバーコード配列を含む。本明細書で使用される場合、「バーコード」および「ＵＭＩ」という用語は互換的に使用され、将来の識別のために組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物を一意にタグ付けする配列を有するヌクレオチドのストレッチを指す。例えば、いくつかの場合において、（ランダムバーコードカセットのプールからの）バーコードカセットを組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物に付加し、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物をシーケンシングすることにより、どのバーコード配列がどの特定の構築物に関連するかを知ることができる。このようにして、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物を追跡し、バーコードの存在によって説明することができる。任意の好都合なアッセイを使用して短いストレッチのヌクレオチドの存在を特定することは、容易に達成することができる。そのようなバーコードの使用は、例えば、ハイスループットシーケンシング、マイクロアレイ、ＰＣＲ、ｑＰＣＲ、またはバーコード配列の存在／非存在を検出することができる任意の他の方法を使用して、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物を単離およびシーケンシングするよりも容易である。
場合によっては、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物にバーコードがカセットとして付加される。バーコードカセットは、少なくとも１つの定常領域（カセットを受け入れるすべてのメンバーによって共有される領域）およびバーコード領域（すなわち、バーコード配列：バーコードがライブラリーのメンバーを一意にマークするように、バーコードを受け取るメンバーに一意の領域）を有するヌクレオチドのストレッチである。例えば、バーコードカセットは、（ｉ）使用されるバーコードカセット間で共通のプライマー部位である定常領域と、（ｉｉ）例えばランダム配列のストレッチであり得るユニークタグであるバーコード配列とを含むことができる。場合によっては、バーコードカセットは、２つの定常領域（例えば、２つの異なるプライマー部位）に挟まれたバーコード領域を含む。実例として、いくつかの場合において、バーコードカセットは、２０ｂｐプライマー結合部位に挟まれた２０ｂｐランダムバーコードを含む６０ｂｐカセットである（例えば、図４を参照されたい）。
バーコード配列は、任意の好都合な長さを有することができ、好ましくは、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物を一意にマークするのに十分な長さである。場合によっては、バーコード配列は、１５ｂｐ～４０ｂｐの長さを有する（例えば、１５～３５ｂｐ、１５～３０ｂｐ、１５～２５ｂｐ、１７～４０ｂｐ、１７～３５ｂｐ、１７～３０ｂｐ、または１７～２５ｂｐ）。場合によっては、バーコード配列は２０ｂｐの長さを有する。同様に、バーコードカセットは、任意の好都合な長さを有することができ、この長さは、バーコード配列の長さ＋定常領域（複数可）の長さに依存する。場合によっては、バーコードカセットは、４０ｂｐ～１００ ｂｐ（例えば、４０～８０ｂｐ、４５～１００ｂｐ、４５～８０ｂｐ、４５～７０ｂｐ、５０～１００ｂｐ、５０～８０ｂｐ、または５０～７０ｂｐから）の長さを有する。場合によっては、バーコードカセットは６０ｂｐの長さを有する。
Ｄ．追加の構築物特徴
Ｄ．追加の構築物特徴
いくつかの態様では、本明細書に提供される組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２複製に干渉するのに有用であり得る追加の特徴を含む。例えば、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、構築物の安定性、ウイルス充填能などを高める配列を含んでもよい。
いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ＳＡＲ－ＣｏＶ－２またはそのバリアントのパッケージングシグナルを含む。ウイルスの組み立て中、ウイルスＲＮＡセグメントは選択的にビリオン（ｖｉｒｏｎ）に組み込まれる。各ウイルスＲＮＡセグメントは、ビリオン（ｖｉｒｏｎ）へのＲＮａのパッケージングを媒介する特異的構造を含む。パッケージングシグナルは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのウイルス複製、ゲノム組込みおよび遺伝子再集合の決定において重要な役割を果たす。いくつかの実施形態では、パッケージングシグナルは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ５’ＵＴＲ内のステムループ５を含む。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ５’ＵＴＲのステムループ５は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＲＮＡのパッケージングのための予測パッケージング信号（Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｏｌｓｔｈｏｏｒｎ，２０１０；Ｒａｎｇａｎ ｅｔ ａｌ．，２０２０）をコードする。
本明細書に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物（例えば、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ構築物）は、構築物を保護する改変を含んでもよい。例えば、いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は３’改変（例えば、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物のヌクレオチド配列の３’末端に付加された改変）または５’改変（例えば、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物のヌクレオチド配列の５’末端に付加された改変）を含む。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、３’改変と５’改変の両方を含む。本明細書に記載の３’および／または５’改変は、ｍＲＮＡ組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物またはＤＮＡ組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物のプロセシングを促進し得る。
いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物（組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ構築物など）は、構築物中の任意の位置、例えば構築物の中央に改変を含む。そのような改変は、５’または３’ヒドロキシル（－ＯＨ）基が反応するのを阻止し、３’エキソヌクレアーゼ活性に対する耐性（例えば、ヌクレアーゼ耐性）を付与し、構築物を安定化し、および／またはアミンもしくはチオール基を使用したさらなる共有結合改変を可能にし得る。いくつかの実施形態では、改変は、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物の転写後に、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物に加えられる（例えば、転写後修飾）。いくつかの実施形態では、改変は、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物の転写前に、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物に加えられる。いくつかの実施形態では、改変は、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物の翻訳前に、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物に加えられる。
いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物（組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ構築物など）は、３’改変を含む。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、３’伸長配列を含む。いくつかの実施形態では、３’伸長配列は組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物の３’末端を保護する。いくつかの実施形態では、３’伸長配列は、伸長ポリＡ配列である。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、伸長ポリＡ配列を付加するためのシグナル伝達配列を含む。いくつかの実施形態では、３’伸長配列は、伸長ポリＡ配列を付加するためのシグナル伝達配列を含む。いくつかの実施形態では、伸長ポリＡ配列は、少なくとも約１００個のアデニンヌクレオチド、例えば少なくとも約１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００個、またはそれを超えるアデニンヌクレオチドのうちいずれかを含む。伸長ポリＡ配列は、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物を安定化し、および／または構築物が核から放出され、細胞質内のリボソームによってタンパク質に翻訳されることを可能にし得る。
いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物（組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ構築物など）は、５’改変を含む。いくつかの実施形態では、５’改変は、５’キャップである。５’キャップは、安定なｍＲＮＡ組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物の作製を可能にし、そのような構築物の翻訳を可能にし得る。いくつかの実施形態では、５’キャップは組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物の核外輸送を調節し、エキソヌクレアーゼによる組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物の分解を防ぎ、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物の翻訳を促進し、および／または５’近位イントロン切除を促進する。いくつかの実施形態では、５’キャップは、５’メチルキャップである。いくつかの実施形態では、５’メチルキャップは、７－メチルグアニレートキャップである。
いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、構築物の３’または５’末端にない改変を含む。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物中のヌクレオチドのうちいずれかが改変され得る。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドは、合成および／または改変核酸分子（例えば、ＬＮＡ、ＰＮＡ、モルホリノなどのような改変ヌクレオチドを含む）、タンパク質性分子、例えばペプチド、ポリペプチド、タンパク質もしくはプリオン、またはタンパク質もしくはポリペプチド成分などを含む任意の分子、またはその断片、または脂質もしくは炭水化物分子、または脂質もしくは炭水化物成分を含む任意の分子であり得る。本発明の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物での使用に適したヌクレオチドには、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）およびチミン（Ｔ）を含むＤＮＡ（デオキシリボ核酸）の天然ヌクレオチド、ならびにＲＮＡ（リボ核酸）の天然ヌクレオチド、アデニン（Ａ）、ウラシル（Ｕ）、グアニン（Ｇ）およびシトシン（Ｃ）が含まれる。さらなる塩基としては、天然塩基、例えばデオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、デオキシシチジン、イノシン、ジアミノプリン；塩基類似体、例えば２－アミノアデノシン、２－チオチミジン、イノシン、ピロロ－ピリミジン、３－メチルアデノシン、Ｃ５－プロピニルシチジン、Ｃ５－プロピニルウリジン、Ｃ５－ブロモウリジン、Ｃ５－フルオロウリジン、Ｃ５－ヨードウリジン、Ｃ５－メチルシチジン、７－デアザアデノシン、７－デアザグアノシン、８－オキソアデノシン、８－オキソグアノシン、Ｏ（６）－メチルグアニン、４－（（３－（２－（２－（３－アミノプロポキシ）エトキシ）エトキシ）プロピル）アミノ）ピリミジン－２（１Ｈ）－オン、４－アミノ－５－（ヘプタ－１，５－ジイン－１－イル）ピリミジン－２（１Ｈ）－オン、６－メチル－３，７－ジヒドロ－２Ｈ－ピロロ［２，３－ｄ］ピリミジン－２－オン、３Ｈ－ベンゾ［ｂ］ピリミド［４，５－ｅ］［１，４］オキサジン－２（１０Ｈ）－オン、および２－チオシチジン；２’－Ｏ－メチル化塩基および２’－フルオロ塩基を含む２’置換ヌクレオチドなどの改変ヌクレオチド；および改変された糖、例えば、２’－フルオロリボース、リボース、２’－デオキシリボース、アラビノースおよびヘキソース；および／またはホスホロチオエートおよび５’－Ｎ－ホスホロアミダイト結合などの改変リン酸基が挙げられる。
いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、ＤＮＡベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは、５’ＵＴＲ領域の上流にある。いくつかの実施形態では、プロモーターは、Ｔ７プロモーターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、３’伸長ポリＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、ポリＡ付加のための３’シグナルを含む。
Ｅ．構築物の特性
Ｅ．構築物の特性
本開示は、干渉性の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物を提供する。干渉性の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物が脂質ナノ粒子またはウイルス様粒子などの送達に適したビヒクルに含まれる場合などに、「ＴＩＰ」と呼ばれることがある。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とは異なり、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物はそれ自体では複製能がないが、複製能ウイルスであるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の存在下で複製することができる。例えば、主題の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、哺乳動物宿主に存在する場合、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（すなわち、複製能のあるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）の非存在下では、それ自体のコピーを含む感染性粒子を形成することができない。対象の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、パッケージングに必要な適切なポリペプチドが提供される場合、宿主細胞内の感染性粒子にパッケージングすることができる。次いで、感染性粒子は他の細胞に感染することができる。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２よりも効率的に複製することができ、それによってＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を打ち負かす。その結果、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染している個体においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルス量を減少させることができる。
組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ＲＮＡ構築物、ｍＲＮＡ構築物、またはＤＮＡ構築物（例えば、ＲＮＡのＤＮＡコピー）であり得る。
いくつかの場合、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＴＩＰは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染している宿主細胞中（例えば、個体の宿主細胞中）に存在する場合、主題の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＴＩＰを含まない同じタイプの宿主細胞における野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の複製の速度よりも、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、または１０倍超（例えば、２０倍、３０倍、４０倍または５０倍）の高い速度で複製する。
いくつかの場合、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＴＩＰは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染している宿主細胞中（例えば、個体の宿主細胞中）に存在する場合、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染しているが主題の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＴＩＰを含まない宿主細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２転写物の量と比較して、細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２転写物の量を少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％減少させる。
いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物ゲノムＲＮＡは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した宿主細胞中に存在する場合、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムＲＮＡ（例えば、宿主細胞に感染した複製能のあるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来のＲＮＡ）よりも高い速度で産生され、その結果、細胞中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムＲＮＡに対する組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムＲＮＡの比は１より大きい。いくつかの場合において、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染している宿主細胞中（例えば、個体の宿主細胞中）に存在する場合、宿主細胞の細胞質中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コードゲノムＲＮＡに対する組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物コードＲＮＡの比（重量による、例えば、μｇ：μｇ）が少なくとも約１．５：１～少なくとも約２：１または２：１超、例えば約１．５：１～約２：１、約２：１～約５：１、約５：１～約１０：１、約１０：１～約２５：１、約２５：１～約５０：１、約５０：１～約７５：１、約７５：１～約１００：１、または１００：１超であるように、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物コードＲＮＡの産生をもたらす。
いくつかの場合、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染している宿主細胞中（例えば、個体の宿主細胞中）に存在する場合、宿主細胞の細胞質における組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物にコードされたＲＮＡのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２にコードされたゲノムＲＮＡに対する比（例えば、モル比）が１を超えるように、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物にコードされたＲＮＡの産生をもたらす。いくつかの場合、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染している宿主細胞中（例えば、個体の宿主細胞中）に存在する場合、宿主細胞の細胞質における組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物にコードされたＲＮＡのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２にコードされたゲノムＲＮＡに対する比（例えば、モル比）が少なくとも約１．５：１～少なくとも約２：１または２：１超、例えば約１．５：１～約２：１、約２：１～約５：１、約５：１～約１０：１、約１０：１～約２５：１、約２５：１～約５０：１、約５０：１～約７５：１、約７５：１～約１００：１、または１００：１超であるように、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物にコードされたＲＮＡの産生をもたらす。
主題の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、１を超える基本再生産比（Ｒ０）（「基本再生産数」とも称される）を示し得る。Ｒ０は、１つの感染した親細胞から生じる娘細胞の数（例えば、１つの症例がその感染力のある期間にわたって平均して生じる症例の数）であり、統計的に有意な数の反復実験の平均により通常特徴付けられる。Ｒ０が＞１である場合、感染は（細胞または個体の）集団に広がることができるであろう。したがって、主題の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、集団のある細胞から別の細胞へ、またはある個体から別の個体へ広がる能力を有する。いくつかの場合、主題の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物（または主題の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２粒子）は、約２～約５、約５～約７、約７～約１０、約１０～約１５、または１５超のＲ０を有する。
宿主細胞の細胞質における組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物にコードされたＲＮＡのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２にコードされたゲノムＲＮＡに対する比を測定するために、任意の好都合な方法を使用することができる。適切な方法は、例えば、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物にコードされたＲＮＡおよび野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２にコードされたＲＮＡの両方のｑＲＴ－ＰＣＲ（例えば、シングルセルｑＲＴ－ＰＣＲ）によって転写物数を直接測定すること、干渉構築物にコードされたＲＮＡおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２にコードされたゲノムＲＮＡによってコードされるタンパク質のレベルを測定すること（例えば、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、質量分析などによって）、ならびに組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物にコードされたＲＮＡおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２にコードされたゲノムＲＮＡに関連する検出可能な標識（例えば、ＲＮＡによってコードされ、ＲＮＡから翻訳されるタンパク質に融合される蛍光タンパク質の蛍光）のレベルを測定することを含み得る。そのような測定は、例えば、共トランスフェクション後に、任意の好都合な細胞型を使用して行うことができる。
送達ビヒクル（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＴＩＰ）に含まれる組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物などの本明細書に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（例えば、複製能のあるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２などの感染性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）と比較して異なる伝播頻度を有し得る。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、感染性呼吸器液への曝露によって伝染する。人々がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染する主なモードは、感染性ウイルスを保有する呼吸器液への曝露によるものである。本明細書で使用される「伝播頻度」という用語は、インビトロでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染が細胞から細胞に伝わる頻度、またはインビボでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染がある人から別の人またはある動物から別の動物に伝わる頻度を指す。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と同じ伝播頻度を有する。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２よりも低い（例えば、少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍または１０倍低い）伝播頻度を有する。
いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２よりも高い伝播頻度を有する。
いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物コードＲＮＡは、パッケージングされる。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物コードＲＮＡは、パッケージングされていない。いくつかの場合において、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物コードＲＮＡは、パッケージングされたＲＮＡとパッケージングされていないＲＮＡの両方を含む。
いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物にコードされたＲＮＡはパッケージングされる。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物にコードされたＲＮＡはパッケージングされない。いくつかの場合、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物にコードされたＲＮＡは、パッケージングされるＲＮＡとパッケージングされないＲＮＡの両方を含む。
ＩＩＩ．転写調節配列（ＴＲＳ）の阻害剤
ＩＩＩ．転写調節配列（ＴＲＳ）の阻害剤
いくつかの態様では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２転写調節配列（ＴＲＳ）の阻害剤が本明細書で提供される。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＴＲＳの阻害剤はアンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＴＲＳの阻害剤はアンチセンスＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＴＲＳの阻害剤は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に介入または干渉する。いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＴＲＳの阻害剤は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の進行を予防する。
転写開始は、いくつかのタイプのコンセンサスＴＲＳによって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２などのコロナウイルスにおいて調節される。これらのＴＲＳは、転写の開始に関与するウイルス内の特定の遺伝子の発現を増加または減少させることができる核酸配列を含んでもよい。したがって、そのようなＴＲＳの阻害は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が転写される能力を損なう可能性があり、それによってＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に介入または干渉する。
いくつかの実施形態では、ＴＲＳは、配列番号３６～３８のうちいずれか１つの配列、または配列番号３６～３８のうちいずれか１つの配列と少なくとも約９０％の配列同一性（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性のうちいずれか）を含むそのバリアントを含む。いくつかの実施形態では、ＴＲＳは、ＴＲＳ１－Ｌ：５’－ｃｕａａａｃ－３’（配列番号３６）の配列、または配列番号３６の配列と少なくとも約９０％の配列同一性（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性のうちいずれか）を含むそのバリアントを含む。いくつかの実施形態では、ＴＲＳは、ＴＲＳ２－Ｌ：５’－ａｃｇａａｃ－３’（配列番号３７）の配列、または配列番号３７の配列と少なくとも約９０％の配列同一性（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性のうちいずれか）を含むそのバリアントを含む。いくつかの実施形態では、ＴＲＳは、ＴＲＳ３－Ｌ，５’－ｃｕａａａｃｇａａｃ－３’（配列番号３８）の配列、または配列番号３８の配列と少なくとも約９０％の配列同一性（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性のうちいずれか）を含むそのバリアントを含む。
いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＴＲＳの阻害剤は、配列番号３６～３８のうちいずれか１つ、またはそれらの組み合わせに結合することができる。いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＴＲＳの阻害剤は、配列番号３６の配列、または配列番号３６の配列と少なくとも約９０％の配列同一性（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性のうちいずれか）を含むそのバリアントに結合することができる。いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＴＲＳの阻害剤は、配列番号３７の配列、または配列番号３７の配列と少なくとも約９０％の配列同一性（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性のうちいずれか）を含むそのバリアントに結合することができる。いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＴＲＳの阻害剤は、配列番号３８の配列、または配列番号３８の配列と少なくとも約９０％の配列同一性（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性のうちいずれか）を含むそのバリアントに結合することができる。いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＴＲＳの阻害剤は、配列番号３６および３７の両方の配列に結合することができる。いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＴＲＳの阻害剤は、配列番号３６および３８の両方の配列に結合することができる。いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＴＲＳの阻害剤は、配列番号３８および３７の両方の配列に結合することができる。いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＴＲＳの阻害剤は、配列番号３６～３８の配列のそれぞれに結合することができる。
いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＴＲＳの阻害剤は、ＡＣＧＡＡＣＣＵＡＡＡＣＡＣＧＡＡＣＣＵＡＡＡＣ（ＴＲＳ１；配列番号２５）もしくは配列番号２５と少なくとも約９０％の配列同一性（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性のうちいずれか）を含むそのバリアント、ＡＣＧＡＡＣＡＣＧＡＡＣＡＣＧＡＡＣＡＣＧＡＡＣ（ＴＲＳ２；配列番号２６）もしくは配列番号２６と少なくとも約９０％の配列同一性（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性のうちいずれか）を含むそのバリアント、ＣＵＡＡＡＣＣＵＡＡＡＣＣＵＡＡＡＣＣＵＡＡＡＣ（ＴＲＳ３；配列番号２７）もしくは配列番号２７と少なくとも約９０％の配列同一性（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性のうちいずれか）を含むそのバリアント、またはそれらの組み合わせを含む配列を含む。いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＴＲＳの阻害剤は、配列番号２５～２７のうちいずれかから本質的になる配列、または配列番号２５～２７のうちいずれかと少なくとも約９０％の配列同一性（例えば、少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性のうちいずれか）を含むそのバリアント、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＴＲＳの阻害剤は、配列番号２５～２７のそれぞれを含む。いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＴＲＳの阻害剤は、配列番号２５～２７から本質的になる。
ＩＶ．パッケージングされたウイルス様粒子、ベクターおよび細胞
ＩＶ．パッケージングされたウイルス様粒子、ベクターおよび細胞
本出願はまた、本明細書に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物およびウイルスエンベロープタンパク質を含むウイルス様粒子を提供する。これらのウイルス様粒子は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶの存在下で生成され、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の助けを借りてパッケージングされ、それによってＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＴＩＰをもたらす。
ウイルスエンベロープタンパク質は、組み立て、出芽、エンベロープ形成、および病原性を含むウイルスのいくつかの態様を媒介する小さな内在性膜タンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、ウイルスエンベロープタンパク質は、コロナウイルスエンベロープタンパク質である。いくつかの実施形態では、ウイルスエンベロープタンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エンベロープタンパク質である。
本明細書に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物を含むベクターも提供される。いくつかの実施形態では、ベクターは、本明細書に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物の核酸配列を含む。そのようなベクターとしては、限定されないが、ＤＮＡベクター、ファージベクター、ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどが挙げられる。
本明細書に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＴＩＰを含む細胞（単離された細胞など）も企図される。いくつかの態様では、本明細書で提供される組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＴＩＰのうちいずれかを含む単離された細胞が本明細書で提供される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、細菌細胞などの原核細胞に含まれ得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は、真核細胞、例えば真菌細胞（酵母細胞など）、植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞に含まれ得る。例示的な真核細胞には、ＣＯＳ７細胞を含むＣＯＳ細胞；２９３－６Ｅ細胞を含む２９３細胞；ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ－Ｓ、ＤＧ４４．Ｌｅｃ１３ ＣＨＯ細胞、およびＦＵＴ８ ＣＨＯ細胞を含む）；ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞（Ｃｒｕｃｅｌｌ）；およびＮＳＯ細胞が含まれるが、これらに限定されない。
所望の宿主細胞への１またはそれを超える核酸の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染などを含むがこれらに限定されない任意の方法によって達成され得る。非限定的な例示的方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２００１）に記載されている。核酸は、任意の適切な方法に従って、所望の宿主細胞に一過性または安定にトランスフェクトされ得る。
本発明はまた、本明細書に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＴＩＰ、ＶＬＰまたはベクターのうちいずれかを含む宿主細胞（単離された細胞など）を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＴＩＰを含む細胞（単離された細胞など）が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＴＩＰのうちいずれかの核酸配列を含む細胞（単離された細胞など）が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＴＩＰのうちいずれかの核酸配列を含むベクターを含む細胞が本明細書で提供される。哺乳動物宿主細胞の非限定的な例には、ＣＯＳ、ＨｅＬａおよびＣＨＯ細胞が含まれるが、これらに限定されない。適切な非哺乳動物宿主細胞には、原核生物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）および酵母（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓａｅ、Ｓ．ｐｏｍｂｅ；またはＫ．ｌａｃｔｉｓ）が含まれる。
Ｖ．処置方法
Ｖ．処置方法
本開示は、個体におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス量を減少させる方法を提供する。この方法は一般に、有効量の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物、適切な送達ビヒクル（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＴＩＰ）に含まれる組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物、および／または適切な送達ビヒクル（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＴＩＰ）に含まれる組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物もしくは組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物を含む医薬製剤（本明細書では 「医薬組成物」とも呼ばれる）を個体に投与することを含む。「組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物」および「ＴＩＰ」という用語は、本明細書では互換的に使用され得、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に干渉することのできる干渉性の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物を指す。
いくつかの態様では、個体におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を処置または予防する方法であって、有効量の医薬組成物、例えば本明細書に記載の任意の医薬組成物を個体に投与することを含む方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、個体がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染する前（例えば、少なくとも約１、２、３、４、５、または６日前）に投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、個体がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した後（例えば、少なくとも約１、２、３、４、５、または６日後）に投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、個体がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に陽性と試験される前（例えば、少なくとも約１、２、３、４、５、または６日前）に投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、個体がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に陽性と試験された後（例えば、少なくとも約１、２、３、４、５、または６日後）に投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、個体がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に陽性と試験された人と密接に接触する前（例えば、少なくとも約１、２、３、４、５、または６日前）に投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、個体がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に陽性と試験された人と密接に接触した後（例えば、少なくとも約１、２、３、４、５、または６日後）に投与される。いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、Ｂ．１．１．７、Ｂ．１．３５１、Ｐ．１、またはＢ．１．６１７．２から選択されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株に由来する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、単回用量として投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、複数回用量として投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、鼻腔内投与される。
いくつかの場合、主題の方法は、有効量の主題の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物または主題のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２干渉粒子（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＴＩＰ）、または主題の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物または主題のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２干渉粒子（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＴＩＰ）を含む医薬製剤を、それを必要とする個体に投与することを含む。いくつかの場合、主題の干渉粒子の有効量は、単独療法または併用療法において、１つまたはそれを超える用量で個体に投与される場合、干渉粒子による処置を受けていない個体のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス負荷と比較して、個体におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス負荷を少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または８０％超減少させるのに有効な量である。
いくつかの場合、主題の方法は、有効量の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２干渉粒子（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＴＩＰ）を、それを必要とする個体に投与することを含む。いくつかの実施形態では、主題の干渉粒子の「有効量」は、単剤療法または併用療法において、１つまたはそれを超える用量で個体に投与される場合、干渉粒子による処置を受けていない個体と比較して、個体におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の症候を少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約２分の１、少なくとも約２．５分の１、少なくとも約３分の１、少なくとも約５分の１、少なくとも約１０分の１、または１０分の１未満に低下させるのに有効な量である。
様々な方法のいずれかを使用して、処置方法が有効であるかどうかを判定することができる。例えば、方法が有効であるかどうかを判定することは、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス負荷が減少しているかどうかを評価すること、感染した対象がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗体を産生しているかどうかを判定すること、感染した対象が助けを借りずに呼吸しているかどうかを判定すること、および／または感染した対象の体温が正常に戻っているかどうかを判定することを含み得る。ウイルス負荷を測定することは、例えば、プライマー特異的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ポリヌクレオチド配列を用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、生物学的試料のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の量を測定すること、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によってコードされるポリペプチドを検出および／または測定すること、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ポリペプチドに特異的な抗体を用いた酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）などの免疫学的測定法を使用すること、またはそれらの組合せによってであり得る。
Ａ．処置対象
本開示の方法は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を有すると疑われる個体、およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を有する個体、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を有すると診断された個体を処置するのに適している。本開示の方法はまた、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を有すると診断されておらず（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２について試験され、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２について陰性と試験された個体、および試験されていない個体）、かつ一般集団よりもＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に罹患する大きなリスクがあると考えられる個体（例えば、「リスクのある」個体）での使用にも適している。
本開示の方法は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を有すると疑われる個体、およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を有する個体、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を有すると診断された個体を処置するのに適している。本開示の方法はまた、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を有すると診断されておらず（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２について試験され、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２について陰性と試験された個体、および試験されていない個体）、かつ一般集団よりもＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に罹患する大きなリスクがあると考えられる個体（例えば、「リスクのある」個体）での使用にも適している。
本開示の方法は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を有すると疑われる個体、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を有する個体（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を有すると診断された個体）、および一般集団よりもＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に罹患する大きなリスクがあると考えられる個体を処置するのに適している。そのような個体には、健康でインタクトな免疫系を有するが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染するリスクがある個体（「リスクのある」個体）が含まれるが、これらに限定されない。さらに、そのような個体には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を有しているようには見えないが、低下した免疫応答、心疾患、低下した肺容量またはそれらの組合せを有し得る個体（「リスクのある」個体）が含まれるが、これらに限定されない。リスクのある個体には、一般集団よりもＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に感染する可能性が高い個体が含まれるが、これに限定されない。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染するリスクがある個体には、医療従事者、救急医療従事者、法執行官、救急ドライバー、および公共サービスドライバーなどの必須なサービス従事者が含まれるが、これらに限定されない。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染するリスクがある個体には、高齢な個体（例えば、６５歳を超える）、免疫無防備状態の個体、心疾患を有する個体、肥満の個体、および他のウイルスまたは細菌感染を有する個体が含まれるが、これらに限定されない。したがって、処置に適した個体には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２またはその任意のバリアントに感染しているか、または感染するリスクがある個体が含まれる。
いくつかの実施形態では、個体は、医学的状態、既存の状態、または心臓、肺、脳もしくは免疫系の機能を低下させる状態を有する。いくつかの実施形態では、個体は免疫無防備状態である。いくつかの実施形態では、個体はヒトである。
ＶＩ．製剤、投与量、および投与の経路
宿主に導入する前に、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物または干渉粒子（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＴＩＰ）を、治療的および予防的処置方法での使用のために様々な組成物に製剤化することができる。特に、干渉構築物または干渉粒子は、適切な薬学的に許容され得る担体または希釈剤と組み合わせることにより医薬組成物にすることができ、ヒトまたは獣医学用途のいずれかに適切になるように製剤化することができる。簡単にするために、主題の干渉構築物および主題の干渉粒子は、以下では集合的に「活性剤」または「活性成分」と称される。
宿主に導入する前に、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物または干渉粒子（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＴＩＰ）を、治療的および予防的処置方法での使用のために様々な組成物に製剤化することができる。特に、干渉構築物または干渉粒子は、適切な薬学的に許容され得る担体または希釈剤と組み合わせることにより医薬組成物にすることができ、ヒトまたは獣医学用途のいずれかに適切になるように製剤化することができる。簡単にするために、主題の干渉構築物および主題の干渉粒子は、以下では集合的に「活性剤」または「活性成分」と称される。
いくつかの態様では、本明細書に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物のうちいずれかと、薬学的に許容され得る賦形剤とを含む医薬組成物が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物は送達ビヒクル（本明細書では「薬学的に許容され得る担体」とも呼ばれる）中に存在し、それによりＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＴＩＰを形成する。本明細書で使用される場合、「送達ビヒクル」は、限定されないが賦形剤（複数可）、結合剤（複数可）、希釈剤（複数可）、溶媒（複数可）、充填剤（複数可）、および／または安定剤（複数可）を含む１またはそれを超える成分を有し得る、薬物送達のプロセスで使用される薬学的に許容され得る基材、組成物、またはビヒクルを指す。本開示による送達ビヒクルは、ポリマーベースの送達ビヒクル、脂質ナノ粒子、ナノ粒子、リポソーム、ウイルスベクター（本明細書に記載のウイルスベクターのうちいずれかなど）、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含み得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、送達ビヒクルは、脂質ナノ粒子である。
主題の処置方法での使用のための組成物は、薬学的に許容され得る担体と組み合わせて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２干渉構築物（例えば、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物）またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２干渉粒子（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＴＩＰ）を含み得る。投与に適した様々な薬学的に許容され得る担体を使用することができる。担体の選択は、部分的には、特定のベクター、ならびに組成物を投与するために使用される特定の方法によって決定され得る。当業者はまた、組成物を投与する様々な経路が利用可能であり、２つ以上の経路を投与に使用することができるが、特定の経路が別の経路よりも迅速かつ効果的な反応をもたらすことができることを理解するであろう。したがって、主題の干渉構築物の組成物または主題の干渉粒子の組成物の多種多様な適切な製剤が存在する。
単独で、または他の抗ウイルス化合物と組み合わせて、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物または主題の干渉粒子（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＴＩＰ）を含む組成物は、非経口投与に適した製剤にすることができる。そのような製剤は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、ならびに製剤を意図するレシピエントの血液と等張にする溶質、ならびに懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、および保存剤を含み得る、水性および非水性の滅菌懸濁液を含み得る。製剤は、単位用量または複数用量で、アンプルおよびバイアルなどの密封容器にて提供することができ、使用直前に、注射用の滅菌液体担体、例えば水の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存することができる。注射可能な溶液および懸濁液は、本明細書に記載されているように、滅菌粉末、顆粒、および錠剤から調製することができる。
吸入による投与に適したエアロゾル製剤も作製することができる。エアロゾル製剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などの加圧された許容され得る噴射剤に入れることができる。
経口投与に適した製剤は、例えば水、生理食塩水またはフルーツジュースなどの希釈剤に溶解した有効量の表題の干渉構築物または表題の干渉粒子などの液体溶液、各々が所定量の活性剤（主題の干渉構築物または主題の干渉粒子）を固体または顆粒として含む、カプセル剤、サシェ剤または錠剤、水性液体中の溶液または懸濁液、および水中油型エマルジョンまたは油中水型エマルジョンであり得る。錠剤形態は、ラクトース、マンニトール、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、微結晶セルロース、アカシア、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、および他の賦形剤、着色剤、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存剤、香味剤、および薬理学的に適合性のある担体のうちの１種または複数を含むことができる。
同様に、経口投与に適した製剤は、香味、通常スクロースおよびアカシアまたはトラガカントに活性成分を含むことができるロゼンジ形態、ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアカシアなどの不活性基剤に活性成分（主題の干渉構築物または主題の干渉粒子）を含むトローチ、ならびに適切な液体担体に活性剤を含むマウスウォッシュ、ならびに活性薬剤に加えて、当技術分野で入手可能な担体などを含有するクリーム、エマルジョン、ゲルなどを含み得る。
直腸投与のための製剤は、例えば、ココアバターまたはサリチラートを含む適切な基剤と共に坐剤として提供され得る。膣投与に適した製剤は、活性成分に加えて、適切であることが当技術分野で公知な担体を含有するペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォーム、またはスプレー製剤として提供され得る。同様に、有効成分は、コンドーム上のコーティングとして潤滑剤と組み合わされ得る。
本発明の文脈において、動物、特にヒトに投与される用量は、合理的な時間枠にわたり、感染した個体において治療応答をもたらすのに十分であるべきである。用量は、処置に用いられる特定の干渉構築物または干渉粒子の効力、疾患状態の重症度、ならびに感染した個体の体重および年齢によって決定されるだろう。用量のサイズはまた、用いられる特定の干渉構築物または干渉粒子の使用に付随する可能性がある有害な副作用の存在によって決定され得る。可能な限り、有害な副作用を最小限に抑えることが常に望ましい。
投与量は、錠剤、カプセル、液体製剤の単位体積などの単位剤形であり得る。本明細書で使用される「単位剤形」という用語は、ヒトおよび動物対象のための単位投与量として適した物理的に別個の単位を指し、各単位は、単独で、または他の抗ウイルス剤と組み合わせて、薬学的に許容され得る希釈剤、担体、またはビヒクルと組み合わせて所望の効果を生じるのに十分な量で計算された所定量の干渉構築物または干渉粒子を含有する。本開示の単位剤形の仕様は、用いられる特定の構築物または粒子および達成される効果、ならびに宿主中の各構築物または粒子に関連する薬力学に依存する。投与される用量は、個々の患者において「抗ウイルス有効量」または「有効レベル」を達成するのに必要な量であり得る。
一般に、１日あたり約５０ｍｇ／ｋｇ体重～約３００ｍｇ／ｋｇ体重の投与された構築物または粒子の組織濃度を達成するために十分な主題の干渉構築物（例えば、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物）または主題の干渉粒子（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＴＩＰ）の量、例えば、１日あたり約１００ｍｇ／ｋｇ体重～約２００ｍｇ／ｋｇ体重の量を投与することができる。ある特定の適用、例えば局所、眼または膣適用では、複数の１日用量を投与することができる。さらに、投与の数は、送達の手段および投与される特定の干渉構築物または干渉粒子に応じて変動し得る。
いくつかの実施形態では、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物または干渉粒子（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＴＩＰ）（またはそれを含む組成物）は、１種またはそれを超えるさらなる治療剤との併用療法で投与される。適切なさらなる治療剤には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの１つまたはそれを超える機能を阻害する薬剤、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染の症候を処置または改善する薬剤、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染に続発して起こり得る感染を処置する薬剤などが含まれる。
いくつかの態様では、本明細書に記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＴＲＳの阻害剤のうちいずれかなどのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２転写調節配列（ＴＲＳ）の阻害剤と、薬学的に許容され得る賦形剤とを含む医薬組成物が本明細書で提供される。
他の態様では、薬学的に許容され得る賦形剤と、（ａ）配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、またはそれらの組み合わせのうちの１またはそれを超えるもの（ｏｎｅ ｏｆ ｍｏｒｅ ｏｆ）に結合することができるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＴＲＳの阻害剤と、（ｂ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ５’ＵＴＲの少なくとも１００ヌクレオチド、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ３’ＵＴＲの少なくとも１００ヌクレオチド、またはそれらの組み合わせを含む組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物とを含む医薬組成物が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、薬学的に許容され得る賦形剤、（ａ）配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、もしくはそれらの組み合わせを含むかまたはそれらから本質的になるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＴＲＳの阻害剤、またはそれらの組み合わせ；（ｂ）組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物であって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ５’ＵＴＲの少なくとも１００ヌクレオチド、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ３’ＵＴＲの少なくとも１００ヌクレオチド、またはそれらの組み合わせを含む構築物、を含む医薬組成物が本明細書で提供される。
ＶＩＩ．キット、容器、デバイス、送達システム
活性剤（干渉組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物、例えば、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＴＩＰ）の単位用量を含むキットが本明細書に記載されている。単位用量は、経鼻、経口、経皮、または注射可能な（例えば、筋肉内、静脈内、または皮下注射用）投与のために製剤化することができる。そのようなキットでは、単位用量を収容する容器に加えて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を処置する際の薬物の使用および付随する利益を記載する情報添付文書があり得る。適切な活性剤（主題の干渉構築物または主題の干渉粒子）および単位用量は、本明細書の上記で記載されているものである。
活性剤（干渉組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物、例えば、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＴＩＰ）の単位用量を含むキットが本明細書に記載されている。単位用量は、経鼻、経口、経皮、または注射可能な（例えば、筋肉内、静脈内、または皮下注射用）投与のために製剤化することができる。そのようなキットでは、単位用量を収容する容器に加えて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を処置する際の薬物の使用および付随する利益を記載する情報添付文書があり得る。適切な活性剤（主題の干渉構築物または主題の干渉粒子）および単位用量は、本明細書の上記で記載されているものである。
いくつかの態様では、個体におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染症を処置または処置もしくは予防するためのキットであって、本明細書に記載の医薬組成物のうちいずれかと、本明細書に記載の個体におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を処置または予防する方法のうちいずれかを実施するための指示とを含むキットが本明細書で提供される。
多くの実施形態では、主題のキットは、主題の方法を実践するための説明書またはそれを得るための手段（例えば、説明書を提供するウェブページにユーザを導くウェブサイトＵＲＬ）をさらに含み得、これらの説明書は、典型的には基材上に印刷され、基材は、添付文書、包装、製剤容器などのうちの１つまたは複数であり得る。
いくつかの実施形態では、主題のキットは、患者のコンプライアンスを高める１つまたはそれを超える構成要素または特徴、例えば、患者が適切な時間または間隔で活性剤を摂取することを覚えておくのを助ける構成要素またはシステムを含む。そのような構成要素には、患者が適切な時間または間隔で活性剤を摂取することを覚えておくのを助けるためのカレンダーシステムが含まれるが、これに限定されない。
本発明は、活性剤を含む送達システムを提供する。いくつかの実施形態では、送達システムは、活性剤を含む製剤の皮下、静脈内、または筋肉内注射を実現する送達システムである。他の実施形態では、送達システムは、膣または直腸送達システムである。
いくつかの実施形態では、活性剤は、経口投与のために包装される。本発明は、活性剤の１日投与単位を含む包装単位を提供する。例えば、包装単位は、いくつかの実施形態では、従来のブリスターパック、または錠剤、丸剤などを含む任意の他の形態である。ブリスターパックは、適切な数の単位剤形を、厚紙、板紙、箔、またはプラスチックの裏打ち材を有する密封ブリスターパックに収容し、適切なカバーに封入する。各ブリスター容器は、例えば１日目から開始して、番号付けされてもよいし、他の方法でラベル付けされてもよい。
いくつかの実施形態では、主題の送達システムは注射デバイスを含む。例示的で非限定的な薬物送達デバイスには、ペン型インジェクターなどの注射デバイス、およびニードル／シリンジデバイスが含まれる。いくつかの実施形態では、本発明は、有効量の主題の活性剤を含む製剤が予め充填された注射送達デバイスを提供する。例えば、主題の送達デバイスは、単回用量の主題の活性剤が予め充填された注射デバイスを含む。主題の注射デバイスは、再使用可能または使い捨て可能であり得る。
ペン型インジェクターが利用可能である。本方法での使用に適合させることができる例示的なデバイスは、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎからの様々なペン型インジェクターのいずれか、例えば、ＢＤ（商標）Ｐｅｎ、ＢＤ（商標）Ｐｅｎ ＩＩ、ＢＤ（商標）Ａｕｔｏ－Ｉｎｊｅｃｔｏｒ；Ｉｎｎｏｖｊｅｃｔ，Ｉｎｃ．からのペン型インジェクター；米国特許第５，７２８，０７４号、第６，０９６，０１０号、第６，１４６，３６１号、第６，２４８，０９５号、第６，２７７，０９９号、および第６，２２１，０５３号などに論じられている医薬品送達ペン型デバイスのいずれかである。医薬品送達ペンは、使い捨て可能であってもよく、または再利用可能で再充填可能であってもよい。
いくつかの実施形態では、主題の送達システムは、鼻腔または肺に送達するためのデバイスを含む。例えば、本明細書に記載の組成物は、ネブライザー、吸入デバイスなどによる送達のために製剤化することができる。
生体接着性微粒子は、本開示の文脈での使用に適したさらに別の薬物送達システムを構成する。このシステムは、好ましくは鼻腔から滲出しない、多相液体または半固体調製物である。物質は、鼻壁に付着し、ある期間にわたって薬物を放出することができる。これらのシステムの多くは、経鼻使用のために設計された（例えば、米国特許第４，７５６，９０７号）。システムは、活性剤を含むミクロスフェア、および薬物の取込みを増強するための界面活性剤を含み得る。微粒子は、１０～１００μｍの直径を有し、デンプン、ゼラチン、アルブミン、コラーゲン、またはデキストランから調製することができる。
別のシステムは、アプリケータと共に使用するように適合された主題の製剤を含む容器（例えば、チューブ）である。活性剤は、アプリケータを使用して膣または直腸に適用することができる液体、クリーム、ローション、フォーム、ペースト、軟膏、およびゲルに組み込まれる。クリーム、ローション、フォーム、ペースト、軟膏およびゲル形式の医薬品を調製するためのプロセスは、文献全体に見られ得る。適切なシステムの例は、グリセロール、セラミド、鉱油、ペトロラタム、パラベン、フレグランスおよび水を含有する標準的なフレグランス不含ローション製剤であり、例えば商標ＪＥＲＧＥＮＳ（商標）（Ａｎｄｒｅｗ Ｊｅｒｇｅｎｓ Ｃｏ．、Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ、Ｏｈｉｏ）の下で販売されている製品である。本発明の組成物での使用に適した非毒性の薬学的に許容され得るシステムは、医薬製剤の当業者には明らかであり得、例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１９版、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、１９９５に記載されている。適切な担体の選択は、所望の特定の膣または直腸剤形の正確な性質、例えば活性成分がクリーム、ローション、フォーム、軟膏、ペースト、溶液、またはゲルに製剤化されるかどうか、ならびに活性成分の同一性に依存するだろう。他の適切な送達デバイスは、米国特許第６，４７６，０７９号に記載されているものである。
ＶＩＩＩ．組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物を生成する方法
ＶＩＩＩ．組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物を生成する方法
本明細書に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＴＩＰ）は、当技術分野で公知の分子クローニング法によって生成することができる。非限定的で例示的な方法が本明細書に記載される。
Ａ．切断された（線状化された）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡのライブラリの生成
本明細書に記載の方法は、環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの集団から切断された（線状化された）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡのライブラリを生成することを含む。いくつかの場合、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡ集団の切断の位置はランダムである。例えば、トランスポゾンカセットをランダムな位置でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの集団に挿入することができ、トランスポゾンカセットは、配列特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼのための標的配列（認識配列）を含む。そのような場合、トランスポゾンカセットは、認識配列をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの集団に（ランダムな位置で）挿入するためのビヒクルとして使用されている。次いで、配列特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼ（認識配列を認識するもの）を使用してＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡを切断し、それによって切断された（線状化された）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡのライブラリを生成することができ、ライブラリのメンバーは異なる位置で切断されている。
本明細書に記載の方法は、環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの集団から切断された（線状化された）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡのライブラリを生成することを含む。いくつかの場合、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡ集団の切断の位置はランダムである。例えば、トランスポゾンカセットをランダムな位置でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの集団に挿入することができ、トランスポゾンカセットは、配列特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼのための標的配列（認識配列）を含む。そのような場合、トランスポゾンカセットは、認識配列をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの集団に（ランダムな位置で）挿入するためのビヒクルとして使用されている。次いで、配列特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼ（認識配列を認識するもの）を使用してＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡを切断し、それによって切断された（線状化された）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡのライブラリを生成することができ、ライブラリのメンバーは異なる位置で切断されている。
「トランスポゾンカセット」という用語は、本明細書では、目的の配列をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡに挿入するためにトランスポゾンによって使用され得る配列によって挟まれた「目的の配列」を含む核酸分子を意味するために使用される。したがって、いくつかの場合、「目的の配列」は、トランスポゾン適合性逆方向末端反復（ＩＴＲ）、すなわち、トランスポゾンによって認識され、利用されるＩＴＲによって挟まれる。トランスポゾンカセットが１つまたはそれを超える標的配列（１種またはそれを超える配列特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼ用）をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡに挿入するためのビヒクルとして使用される場合、目的の配列は１つまたはそれを超える認識配列を含み得る。
いくつかの場合、目的の配列は、選択可能なマーカー遺伝子、例えば、薬物耐性、例えば抗生物質耐性をもたらすタンパク質をコードする遺伝子などの選択可能なマーカーをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの場合、目的の配列は、第１の配列特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼ（例えば、第１のメガヌクレアーゼ）のための認識配列の第１のコピーおよび第２のコピーを含む。いくつかの場合、目的の配列は、配列特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼ（例えば、メガヌクレアーゼ）のための第１および第２の認識配列によって挟まれる選択可能なマーカー遺伝子を含む。いくつかのそのような場合、第１の認識配列および第２の認識配列は同一であり、認識配列の第１のコピーおよび第２のコピーと見なすことができる。いくつかのそのような場合、第１の認識配列は第２の認識配列とは異なる。いくつかの場合、第１の認識配列および第２の認識配列（例えば、認識配列の第１および第２のコピー）は、選択可能なマーカー遺伝子、例えば抗生物質耐性タンパク質などの薬物耐性タンパク質をコードするものを挟む。いくつかの実施形態では、主題のトランスポゾンカセットは、第１のメガヌクレアーゼのための認識配列の第１のコピーおよび第２のコピー、ならびに第２のメガヌクレアーゼのための認識配列の第１のコピーおよび第２のコピーを含む。
上記のように、主題のトランスポゾンカセットは、トランスポザーゼ適合性逆方向末端反復（ＩＴＲ）によって挟まれる目的の配列を含む。ＩＴＲは、任意の所望のトランスポザーゼ、例えば、Ｔｎ３、Ｔｎ５、Ｔｎ７、Ｔｎ９、Ｔｎ１０、Ｔｎ９０３、Ｔｎ１６８１などの細菌トランスポザーゼ、および例えば、Ｔｃ１／ｍａｒｉｎｅｒスーパーファミリートランスポザーゼ、ｐｉｇｇｙＢａｃスーパーファミリートランスポザーゼ、ｈＡＴスーパーファミリートランスポザーゼ、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ、Ｆｒｏｇ Ｐｒｉｎｃｅ、Ｍｉｎｏｓ、Ｈｉｍａｒｌなどの真核生物トランスポザーゼと適合性であり得る。いくつかの場合、トランスポザーゼ適合性ＩＴＲは、Ｔｎ５トランスポザーゼと適合性である（すなわち、Ｔｎ５トランスポザーゼによって認識され、利用され得る）。本明細書で提供される方法のいくつかは、トランスポザーゼカセットをＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡに挿入するステップを含む。そのようなステップは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡおよびトランスポゾンカセットをトランスポザーゼと接触させることを含む。いくつかの場合、この接触は細菌細胞などの細胞の内部で起こり、いくつかの場合、この接触はインビトロで細胞の外部で起こる。上で列挙したトランスポザーゼ適合性ＩＴＲは、本明細書に開示される組成物および方法に適しているので、トランスポザーゼも同様である。したがって、適切なトランスポザーゼには、Ｔｎ３、Ｔｎ５、Ｔｎ７、Ｔｎ９、Ｔｎ１０、Ｔｎ９０３、Ｔｎ１６８１などの細菌トランスポザーゼ、および例えばＴｃ１／ｍａｒｉｎｅｒスーパーファミリートランスポザーゼ、ｐｉｇｇｙＢａｃスーパーファミリートランスポザーゼ、ｈＡＴスーパーファミリートランスポザーゼ、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ、Ｆｒｏｇ Ｐｒｉｎｃｅ、Ｍｉｎｏｓ、Ｈｉｍａｒｌなどの真核生物トランスポザーゼが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの場合、トランスポザーゼはＴｎ５トランスポザーゼである。
いくつかの実施形態では、主題の方法は、配列特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼ（例えば、１種またはそれを超える配列特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼ）のための標的配列（例えば、１つまたはそれを超える標的配列）を環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの集団に挿入し、それによって配列挿入された環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの集団を生成するステップを含む。いくつかの場合、挿入するステップは、標的配列（例えば、１つまたはそれを超える標的配列）を含むトランスポゾンカセットを挿入することによって行われ、それによってトランスポゾン挿入された環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの集団を生成する。いくつかの場合、トランスポゾンカセットは単一の認識配列（例えば、トランスポゾンカセットの中央または１つの末端付近にある）を含み、単一の認識配列をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの集団に導入するために使用され得る。いくつかの場合、トランスポゾンカセットは、２つ以上の認識配列（例えば、第１および第２の認識配列）を含む。いくつかのそのような場合、第１および第２の認識配列は、第１および第２の認識配列の切断がトランスポゾンカセット（またはトランスポゾンカセットの大部分）をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡから効果的に除去しながら、同時に線状化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡを生成し、よって、ライブラリのメンバーが異なる位置で切断されている、所望の切断された（線状化された）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡのライブラリを生成するように、第１および第２の認識配列はトランスポゾンカセットの末端またはその近く（例えば、末端の２０塩基、３０塩基、５０塩基、６０塩基、７５塩基、または１００塩基以内）に配置される。トランスポゾンカセットが第１および第２の認識配列を含むいくつかの場合、第１および第２の認識配列は同じであり、したがって所与の認識配列の第１および第２のコピーである。いくつかのそのような場合、同じ配列特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼ（例えば、制限酵素、メガヌクレアーゼ、プログラム可能なゲノム編集ヌクレアーゼ）を使用して両方の部位で切断することができる。
いくつかの実施形態では、トランスポゾンカセットは、同じでない第１および第２の認識配列を含む。いくつかのそのような場合、異なる配列特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼ（例えば、制限酵素、メガヌクレアーゼ、プログラム可能なゲノム編集ヌクレアーゼ）を使用して２つの部位を切断する（例えば、トランスポゾン挿入されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡのライブラリを、２種の配列特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼと接触させ得る）。しかしながら、いくつかの場合、１種の配列特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼを依然として使用することができる。例えば、いくつかの場合、２つの異なるガイドＲＮＡを同じＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質と共に使用することができる。別の例として、いくつかの場合、所与の配列特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、両方の認識配列を認識することができる。
いくつかの場合、環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡ（例えば、プラスミド）の集団が宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌）などの細菌宿主細胞）の内部に存在し、トランスポゾンカセットを宿主細胞の内部に挿入するステップが行われる。例えば、方法は、トランスポザーゼおよび／もしくはトランスポザーゼをコードする核酸を選択された細胞に導入すること、または細胞内でのトランスポザーゼをコードする既存の発現カセットからのトランスポザーゼの発現などを含み得る。いくつかのそのような場合、主題の方法は、宿主細胞における選択／増殖ステップを含み得る。例えば、トランスポゾンカセットが薬物耐性マーカーを含む場合、宿主細胞を、トランスポゾン挿入された環状標的ＤＮＡを有する細胞を選択するために、薬物の存在下で増殖させることができる。
トランスポゾン挿入された環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの集団が生成されると（いくつかの場合、宿主細胞における選択／増殖ステップの後）、次のステップの前に（例えば、それらを配列特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼと接触させる前に）、集団を宿主細胞から単離／精製することができる。
環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡは小さい環状ＤＮＡ（例えば、５０ｋｂ未満）であり得るので、いくつかの場合、インビトロでのローリングサークル増幅（ＲＣＡ）の使用によって、細菌における選択および増殖ステップを回避することができる。例えば、転位後にニックの入った標的ＤＮＡの修復後、挿入されたトランスポゾンカセットに特異的なプライマーと共に、高度にプロセッシブで鎖置換性のポリメラーゼ（例えば、ｐｈｉ２９
ＤＮＡポリメラーゼ）を使用して、環状プラスミドのプールから挿入変異体を選択的に増幅することができる。換言すれば、そのようなステップは、細菌形質転換を介したＤＮＡの増幅を回避することができる。ＲＣＡの使用は、細菌の増殖／選択に必要な時間を短縮することができ、細菌の増殖を妨げないクローンに対してライブラリを偏らせることを回避することができる。
ＤＮＡポリメラーゼ）を使用して、環状プラスミドのプールから挿入変異体を選択的に増幅することができる。換言すれば、そのようなステップは、細菌形質転換を介したＤＮＡの増幅を回避することができる。ＲＣＡの使用は、細菌の増殖／選択に必要な時間を短縮することができ、細菌の増殖を妨げないクローンに対してライブラリを偏らせることを回避することができる。
非ランダム切断
上記のように、いくつかの場合、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡ集団の切断の位置はランダムであるが、いくつかの場合、切断の位置はランダムではない。例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの集団を異なるベッセル（例えば、異なるチューブ、マルチウェルプレートの異なるウェルなど）に分配（例えば、アリコート）することができる。目的の特定の配列がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノム配列内で選択される場合、その目的の配列は環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡ内で切断され得る。環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの別々のアリコートを異なるベッセル（例えば、マルチウェルプレートのウェル）内に置くことができ、環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの異なるアリコートを、プログラム可能な配列特異的エンドヌクレアーゼを使用することによって異なる所定の位置で切断することができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１など）を使用する場合、ガイドＲＮＡは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノム内の任意の所望の配列を標的とするように（例えば、いくつかの場合、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列要件を考慮に入れながら）容易に設計することができる。例えば、ガイドＲＮＡは、環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡに沿って任意の所望の間隔（例えば、５ヌクレオチド（ｎｔ）ごと、１０ｎｔごと、２０ｎｔごと、５０ｎｔごと－重複、非重複など）でタイリングすることができる。各ベッセル（例えば、各ウェル）の環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡを、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼに加えてガイドＲＮＡの１つと接触させることができる。このようにして、切断されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２
ＤＮＡのライブラリを生成することができ、ライブラリのメンバーは別々のベッセル内にあるため互いに分離されている。当業者によって理解され得るように、いくつかの場合、ガイドＲＮＡを設計するときにＰＡＭ配列を考慮に入れることになり得、したがって、ガイドＲＮＡの標的部位間の間隔はＰＡＭ配列の制約の関数であり得、所与の標的配列にわたる一貫した間隔は、いくつかの場合、必ずしも可能ではないだろう。しかしながら、異なるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、異なる種から単離されたＣａｓ９などの同じタンパク質でさえも）は、異なるＰＡＭ要件を有し得、したがって、２種以上のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼの使用は、いくつかの場合、利用可能な標的部位に対するＰＡＭ要件によって課される少なくともいくつかの制約を緩和し得る。そして、方法のさらなるステップを別々に行うことができ（例えば、別々のベッセル内、マルチウェルプレートの別々のウェル内）、または任意のステップで、メンバーをプールし、１つのベッセルで一緒に処置することができる。例示的であるが非限定的な例として、９６個の異なるガイドＲＮＡ（または３８４個の異なるガイドＲＮＡ）を使用して、９６ウェルプレートの９６個の異なるウェル（または３８４ウェルプレートの３８４個の異なるウェル）で環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡのアリコートを切断して、各メンバーが異なる部位で切断されている９６個のメンバー（または３８４個のメンバー）のライブラリを生成することができる。切断部位は、方法を開始する前にユーザによって設計され得る。次いで、エキソヌクレアーゼステップ（チュウバック）を別個のウェル（例えば、エキソヌクレアーゼを各ウェルにアリコートすることによって）で行い得るか、またはさらに２つのウェルをプールした後、エキソヌクレアーゼをプールに添加し得る。
上記のように、いくつかの場合、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡ集団の切断の位置はランダムであるが、いくつかの場合、切断の位置はランダムではない。例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの集団を異なるベッセル（例えば、異なるチューブ、マルチウェルプレートの異なるウェルなど）に分配（例えば、アリコート）することができる。目的の特定の配列がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノム配列内で選択される場合、その目的の配列は環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡ内で切断され得る。環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの別々のアリコートを異なるベッセル（例えば、マルチウェルプレートのウェル）内に置くことができ、環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの異なるアリコートを、プログラム可能な配列特異的エンドヌクレアーゼを使用することによって異なる所定の位置で切断することができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１など）を使用する場合、ガイドＲＮＡは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノム内の任意の所望の配列を標的とするように（例えば、いくつかの場合、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列要件を考慮に入れながら）容易に設計することができる。例えば、ガイドＲＮＡは、環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡに沿って任意の所望の間隔（例えば、５ヌクレオチド（ｎｔ）ごと、１０ｎｔごと、２０ｎｔごと、５０ｎｔごと－重複、非重複など）でタイリングすることができる。各ベッセル（例えば、各ウェル）の環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡを、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼに加えてガイドＲＮＡの１つと接触させることができる。このようにして、切断されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２
ＤＮＡのライブラリを生成することができ、ライブラリのメンバーは別々のベッセル内にあるため互いに分離されている。当業者によって理解され得るように、いくつかの場合、ガイドＲＮＡを設計するときにＰＡＭ配列を考慮に入れることになり得、したがって、ガイドＲＮＡの標的部位間の間隔はＰＡＭ配列の制約の関数であり得、所与の標的配列にわたる一貫した間隔は、いくつかの場合、必ずしも可能ではないだろう。しかしながら、異なるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、異なる種から単離されたＣａｓ９などの同じタンパク質でさえも）は、異なるＰＡＭ要件を有し得、したがって、２種以上のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼの使用は、いくつかの場合、利用可能な標的部位に対するＰＡＭ要件によって課される少なくともいくつかの制約を緩和し得る。そして、方法のさらなるステップを別々に行うことができ（例えば、別々のベッセル内、マルチウェルプレートの別々のウェル内）、または任意のステップで、メンバーをプールし、１つのベッセルで一緒に処置することができる。例示的であるが非限定的な例として、９６個の異なるガイドＲＮＡ（または３８４個の異なるガイドＲＮＡ）を使用して、９６ウェルプレートの９６個の異なるウェル（または３８４ウェルプレートの３８４個の異なるウェル）で環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡのアリコートを切断して、各メンバーが異なる部位で切断されている９６個のメンバー（または３８４個のメンバー）のライブラリを生成することができる。切断部位は、方法を開始する前にユーザによって設計され得る。次いで、エキソヌクレアーゼステップ（チュウバック）を別個のウェル（例えば、エキソヌクレアーゼを各ウェルにアリコートすることによって）で行い得るか、またはさらに２つのウェルをプールした後、エキソヌクレアーゼをプールに添加し得る。
環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡ
環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの集団の環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡは、任意の環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡであり得、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の任意の単離物から生成され得る。いくつかの場合、環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡはプラスミドＤＮＡである。
環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの集団の環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡは、任意の環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡであり得、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の任意の単離物から生成され得る。いくつかの場合、環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡはプラスミドＤＮＡである。
例えば、いくつかの場合、環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡは複製起点（ＯＲＩ）を含む。いくつかの場合、環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡは、薬物耐性マーカー（例えば、薬物耐性をもたらすタンパク質をコードするヌクレオチド配列）を含む。いくつかの実施形態では、環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの集団は、線状ＤＮＡ分子の集団から（例えば、分子内ライゲーションを介して）生成される。例えば、主題の方法は、線状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡ分子の集団（例えば、ＰＣＲ産物の集団、線状ウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムの集団、制限消化物由来の産物の集団など）を環状化して、環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの集団を生成するステップを含み得る。いくつかの場合、そのような集団のメンバーは同一である（例えば、ＰＣＲ産物または制限消化物の多くのコピーを使用して、各環状ＤＮＡが同一であるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの集団を生成することができる）。いくつかの場合、そのような環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの集団のメンバーは互いに異なり得る。例えば、環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの集団は、２つまたはそれを超える異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２分離株から生成され得るか、または異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＰＣＲ産物から生成され得るか、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の異なる制限消化産物から生成され得る。
いくつかの場合、環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの集団自体が欠失ライブラリであり得る。例えば、環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの集団は、公知の欠失変異体（例えば、公知のウイルス欠失変異体）のライブラリであり得る。別の例として、主題の方法を２ラウンド行う場合、第２ラウンドのためのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの開始集団は、ライブラリのメンバーがライブラリの他のメンバーと比較して異なるＤＮＡセクションの欠失を含む欠失ライブラリ（例えば、第１ラウンドの欠失の間に生成される）であり得る。そのようなライブラリは、環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの集団として機能することができ、例えば、トランスポゾンカセットを依然として集団に導入することができる。したがって、この様式で第２ラウンドの欠失を行うことにより、複数の異なるエントリーポイントで欠失を有する構築物を生成することができる。例示的な例として、長さが約２９～３０ｋｂ（キロベース）のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの場合、第１ラウンドの欠失は、（生成されたライブラリの）１つのメンバーについて欠失塩基２０００から２６５０個を有し得、そのうち複数のコピーが存在する可能性があり得る。第２ラウンドの欠失は、２つの新しいメンバーを生成し得、それらは両方とも同じ欠失メンバーのコピーから生成される。このため、例えば、塩基３５００から３６５０個が（塩基２０００から２６５０個に加えて）欠失された状態で１つの新しいメンバーが生成され得る一方、塩基１５００から１５８０個が（塩基２０００から２６５０個に加えて）欠失された状態で第２の新しいメンバーが生成され得る。したがって、複数ラウンド（例えば、２、３、４、５など）の欠失により、複雑な欠失ライブラリを生産することができる。いくつかの場合、例えば上記のように、第２ラウンドがトランスポゾンカセットの挿入を含む、２ラウンド以上のライブラリ生成が行われる。
例えば、いくつかの場合、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼを使用して第１ラウンドの欠失を行い、環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡ）の集団内の予め選択された部位にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼを標的化することによって（例えば、目的の１つまたはそれを超えるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列を標的とするように、例えば予め選択された間隔でガイドＲＮＡを設計することによって）、切断された線状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡを生成する。環状化欠失ＤＮＡの第１のライブラリを生成するためのエキソヌクレアーゼ処置および環状化の後、環状化欠失ＤＮＡのライブラリは、第２ラウンドの欠失のために（環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの集団としての）入力として使用される。したがって、１種またはそれを超える配列特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼ（例えば、１種またはそれを超えるメガヌクレアーゼ）のための１つまたはそれを超える標的配列を環状化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２欠失ＤＮＡのライブラリに（例えば、トランスポゾンカセットを介してランダムな位置で）挿入して、トランスポゾン挿入された環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの集団を生成し、方法を継続する。いくつかのそのような場合、第１ラウンドの欠失は、欠失のために少数の目的の位置（１つの位置、例えば、１種のガイドＲＮＡのみを使用して特定の位置を標的化すること、または少数の位置、例えば、少数のガイドＲＮＡを使用して少数の位置を標的化すること）のみを標的とし得るが、第２ラウンドは、第１の欠失＋第２の欠失を含む欠失構築物を生成するために使用される。
いくつかの場合、環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡはウイルスゲノム全体を含む。他の場合、環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡは部分的なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスゲノムを含む。したがって、いくつかの場合、主題の方法は、ウイルス欠失変異体のライブラリを生成するために使用される。いくつかのそのような場合、生成されたウイルス欠失変異体のライブラリは、潜在的な欠陥干渉粒子（ＤＩＰ）のライブラリと見なすことができる。ＤＩＰは、同じ細胞内で複製する野生型ウイルスによって補完される場合を除いて複製することができないように、ゲノム欠失を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの変異バージョンである。ウイルスゲノムはシス作用性およびトランス作用性エレメントの両方をコードするので、欠陥干渉粒子（ＤＩＰ）は自然に生じ得る。トランス作用性エレメント（トランスエレメント）は、カプシドタンパク質または転写因子などの遺伝子産物をコードし、シス作用性エレメント（シスエレメント）は、ウイルスゲノム増幅、カプシド形成およびウイルス排出を含む生産的なウイルス複製を達成するためにトランスエレメント産物と相互作用するウイルスゲノムの領域である。換言すれば、欠損した（欠失した）トランスエレメントがトランスで提供される場合（例えば、ウイルスを共感染させることによって）、ＤＩＰのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスゲノムは依然としてコピーされ、ウイルス粒子にパッケージングされ得る。いくつかの場合、ＤＩＰは、例えば、利用可能なトランスエレメントに対して競合し、よって希釈することによって、共感染ウイルスのウイルス感染性を低下させるために治療的に使用することができる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＩＰが治療薬として（例えば、Ｃｏｖｉｄ－１９感染の処置として）使用され得るそのような場合、そのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＩＰは治療用干渉粒子（ＴＩＰ）と称され得る。
ＤＩＰは自然に発生し得るが、本開示の方法は、例えば、ウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムの欠失ライブラリを生成することによって、有用なタイプのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＩＰを生成するために使用することができる。そして、ライブラリメンバーを配列決定してＤＩＰであると予測されるものを同定することによって、そのような欠失ライブラリからＤＩＰを同定することができる。あるいは、またはさらに、生成された欠失ライブラリをスクリーニングすることができる。例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＩＰのライブラリを細胞に導入して、所望の機能を有するウイルスゲノムを有するメンバーを同定することができる。ＤＩＰおよびＴＩＰならびにそれらの使用のさらなる説明は、米国特許出願公開第２０１６００１５７５９号に提供されており、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
したがって、いくつかの場合、主題の方法は、生成されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２欠失構築物のライブラリのメンバーを標的細胞（例えば、ヒト細胞などの哺乳動物細胞などの真核細胞）に導入すること、および感染性についてアッセイすることを含む。いくつかのそのような場合、アッセイするステップはまた、共感染ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスによるライブラリメンバーの補完を含む。
そのような導入は、本明細書では、細胞への核酸の導入の任意の形態（例えば、エレクトロポレーション、トランスフェクション、リポフェクション、ナノ粒子送達、ウイルス送達など）を包含することを意味する。例えば、そのような「導入」は、培養中の哺乳動物細胞へ（例えば、環状化欠失ウイルスＤＮＡの生成されたライブラリのメンバーによってコードされるウイルスゲノムを含むウイルス粒子としてカプセル化することができる環状化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２欠失ウイルスＤＮＡの生成されたライブラリのメンバーを用いて）感染させることを包含する。
いくつかの場合、方法は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２欠失ＤＮＡのライブラリから、線状二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）産物、線状一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）産物、線状一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）産物、および線状二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）産物のうちの少なくとも１つを生成することを含む。したがって、いくつかのそのような場合、主題の方法は、そのような線状ｄｓＤＮＡ産物、線状ｓｓＤＮＡ産物、線状ｓｓＲＮＡ産物、および／または線状ｄｓＲＮＡ産物を哺乳動物細胞に（例えば、エレクトロポレーション、トランスフェクション、リポフェクション、ナノ粒子送達、ウイルス送達などを含むがこれらに限定されない、細胞に核酸を導入するための任意の好都合な方法を介して）導入することを含む。
そのような方法はまた、ウイルス感染性についてアッセイすることを含み得る。ウイルス感染性についてのアッセイは、任意の好都合な方法を使用して行うことができる。ウイルス感染性についてのアッセイは、環状化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２欠失ＤＮＡのライブラリのメンバー（および／または環状化欠失ＤＮＡのライブラリから生成される、線状二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）産物、線状一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）産物、線状一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）産物、および線状二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）産物のうちの少なくとも１つ）が導入される細胞に対して行うことができる。例えば、いくつかの場合、メンバーおよび／または産物は、カプセル化粒子として導入される。いくつかの場合、環状化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２欠失ＤＮＡのライブラリのメンバー（および／または環状化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２欠失ＤＮＡのライブラリから生成される、線状ｄｓＤＮＡ産物、線状ｓｓＤＮＡ産物、線状ｓｓＲＮＡ産物、および線状ｄｓＲＮＡ産物のうちの少なくとも１つ）を、ウイルス粒子を生成させるために第１の細胞の集団（例えば、哺乳動物細胞）に導入し、次いで、ウイルス粒子を使用して第２の細胞の集団（例えば、哺乳動物細胞）と接触させる。したがって、本明細書で使用される場合、特に明記しない限り、「ウイルス感染性についてのアッセイ」という語句は、上記のシナリオの両方を包含する（例えば、メンバーおよび／または産物が導入された細胞における感染性についてアッセイすることを包含し、上記のような第２の細胞の集団をアッセイすることも包含する）。
いくつかの実施形態では、主題の方法（例えば、ＤＩＰを生成および同定する方法）は、欠失ライブラリ（例えば、環状化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２欠失ＤＮＡのライブラリ）を生成した後、高感染多重度（ＭＯＩ）（例えば、＞２のＭＯＩを利用する）スクリーニングを含む。本明細書で使用される場合、「高ＭＯＩ」は、２またはそれを超える（例えば、２．５またはそれを超える、３またはそれを超える、５またはそれを超えるなど）のＭＯＩである。いくつかの場合、主題の方法は高ＭＯＩを使用する。したがって、いくつかの場合、主題の方法は、２もしくはそれを超える、３もしくはそれを超える、または５もしくはそれを超えるＭＯＩ（高ＭＯＩ）を使用する。いくつかの場合、主題の方法は、２～１５０（例えば、２～１００、２～８０、２～５０、２～３０、３～１５０、３～１００、３～８０、３～５０、３～３０、５～１５０、５～１００、５～８０、５～５０、または５～３０）の範囲のＭＯＩ（高ＭＯＩ）を使用する。いくつかの場合、主題の方法は、３～１００（例えば、５～１００）の範囲のＭＯＩ（高ＭＯＩ）を使用する。高ＭＯＩでは、多くの（すべてではないにしても）細胞が２つ以上のウイルスにより感染し、これにより、野生型カウンターパートによる欠陥ウイルスの補完が可能になる。高ＭＯＩでの欠失変異体ライブラリの反復継代は、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって効果的に動員され得る変異体を選択することができる。例えば、いくつかの場合、方法は、培養中の哺乳動物細胞を環状化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２欠失ウイルスＤＮＡのライブラリのメンバーに高感染多重度（ＭＯＩ）で感染させること、感染した細胞を１２時間～２日間（例えば、１２時間～３６時間または１２時間～２４時間）の範囲の期間培養すること、ナイーブ細胞を培養物に添加すること、および培養中の細胞からウイルスを回収することを含む。しかしながら、このスクリーニングステップは、いくつかの場合、野生型ウイルスによって効果的に動員され得るが、野生型共感染の非存在下では細胞変性であるＤＩＰ／ＴＩＰを選択する可能性がある。
したがって、いくつかの実施形態では、主題の方法（例えば、ＤＩＰを生成および同定する方法）は、よりストリンジェントなスクリーニング（本明細書では「低感染多重度（ＭＯＩ）スクリーニング」と称される）を含む。本明細書で使用される場合、「低ＭＯＩ」は、１未満（例えば、０．８未満、０．６未満など）のＭＯＩの使用を含む。いくつかの場合、主題の方法は低ＭＯＩを使用する。したがって、いくつかの場合、主題の方法は、１未満（例えば、０．８未満、０．６未満）のＭＯＩ（低ＭＯＩ）を使用する。いくつかの場合、主題の方法は、０．００１～０．８（例えば、０．００１～０．６、０．００１～０．５、０．００５～０．８、０．００５～０．６、０．０１～０．８、または０．０１～０．５）の範囲のＭＯＩ（低ＭＯＩ）を使用する。いくつかの場合、主題の方法は、０．０１～０．５の範囲のＭＯＩ（低ＭＯＩ）を使用する。例えば、欠失ライブラリによる標的細胞の低ＭＯＩ感染（例えば、＜１のＭＯＩを利用する）を、形質導入された集団の野生型ウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）による高ＭＯＩ感染と交互にして、ＤＩＰをナイーブ細胞に動員することができる。
いくつかの場合、１つもしくはそれを超えるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２または１つもしくはそれを超えるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２欠失ＤＮＡを有する細胞を、薬物の存在下で増殖させて、さらなるラウンドの複製が起こるかどうかを試験することができる。回復期間中、野生型ウイルスに感染した細胞（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した細胞）は死滅するだろうが、良好に挙動する変異体（細胞死滅トランス因子を産生しない）によって形質導入された細胞は維持されるだろう。この様式では、形質導入された宿主細胞を死滅させないが、野生型ウイルスの同時感染中に動員することができる変異体を選択することができる。したがって、いくつかの場合、主題の方法は、培養中の哺乳動物細胞を環状化欠失ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＤＮＡのライブラリのメンバーに低感染多重度（ＭＯＩ）で感染させること、感染した細胞をウイルス複製阻害剤の存在下で１日～６日間（例えば、１日～５日間、１日～４日間、１日～３日間、または１日～２日間）の範囲の期間培養すること、培養した細胞を機能性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに高ＭＯＩで感染させること、感染した細胞を１２時間～４日間（例えば、１２時間～７２時間、１２時間～４８時間、または１２時間～２４時間）の範囲の期間培養すること、および培養した細胞からウイルスを回収することを含む。
いくつかの実施形態では、主題の方法は、（ａ）配列特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼのための標的配列を環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＤＮＡの集団に挿入して、配列挿入されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの集団を生成すること、（ｂ）配列挿入されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの集団を配列特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼと接触させて、切断された線状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの集団を生成すること、（ｃ）切断された線状ウイルスＤＮＡの集団をエキソヌクレアーゼと接触させて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２欠失ＤＮＡの集団を生成すること、（ｄ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２欠失ＤＮＡを環状化して（例えば、ライゲーションを介して）、環状化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２欠失ＤＮＡのライブラリを生成すること、および（ｅ）環状化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２欠失ＤＮＡのライブラリのメンバーを配列決定して、欠失干渉粒子（ＤＩＰ）を同定することを含む。いくつかの場合、方法は、ステップ（ｄ）の前またはステップ（ｄ）と同時にバーコード配列を挿入することを含む。いくつかの場合、ステップ（ａ）の挿入することは、トランスポゾンカセットを環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＤＮＡの集団に挿入することを含み、トランスポゾンカセットは配列特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼのための標的配列を含み、配列挿入されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの生成された集団はトランスポゾン挿入されたウイルスＤＮＡの集団である。いくつかの場合（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼを使用するいくつかの場合）、主題の方法はステップ（ａ）を含まず、代わりに、方法の第１のステップは、ライブラリのメンバーを互いに対して異なる位置で切断することであり、このステップの後にエキソヌクレアーゼステップが続き得る。
Ｂ．標的配列および配列特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼ
いくつかの場合、配列特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼのための標的配列は、例えば、トランスポゾンカセットを使用してＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡに挿入される。「標的配列」は、本明細書では認識配列または認識部位とも称される。配列特異的エンドヌクレアーゼという用語は、本明細書では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの標的配列に結合および／またはそれを認識し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡを切断するＤＮＡエンドヌクレアーゼを指すために使用される。換言すれば、配列特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡ分子内の特定の配列（認識配列）を認識し、その認識に基づいて分子を切断する。いくつかの場合、配列特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、認識配列内のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡを切断し、いくつかの場合（例えば、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼの場合）、認識配列の外側を切断する。
いくつかの場合、配列特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼのための標的配列は、例えば、トランスポゾンカセットを使用してＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡに挿入される。「標的配列」は、本明細書では認識配列または認識部位とも称される。配列特異的エンドヌクレアーゼという用語は、本明細書では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの標的配列に結合および／またはそれを認識し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡを切断するＤＮＡエンドヌクレアーゼを指すために使用される。換言すれば、配列特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡ分子内の特定の配列（認識配列）を認識し、その認識に基づいて分子を切断する。いくつかの場合、配列特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、認識配列内のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡを切断し、いくつかの場合（例えば、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼの場合）、認識配列の外側を切断する。
配列特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼという用語は、例えば、制限酵素、メガヌクレアーゼ、およびプログラム可能なゲノム編集ヌクレアーゼを含み得る。配列特異的エンドヌクレアーゼの例としては、制限エンドヌクレアーゼ、例えば、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＢａｍＨＩなど；メガヌクレアーゼ、例えば、ＬＡＧＬＩ ＤＡＤＧメガヌクレアーゼ（ＬＭＮ）、１－Ｓｃｅｌ、１－Ｃｅｕｌ、１－Ｃｒｅｌ、１－Ｄｍｏｌ、１－Ｃｈｕｌ、１－Ｄｉｒｌ、１－Ｆｌｍｕｌ、１－Ｆｌｍｕｌｌ、１－Ａｎｉｌ、１－ＳｃｅｌＶ、１－Ｃｓｍｌ、１－Ｐａｎｌ、Ｉ－Ｐａｎｌｌ、１－ＰａｎＭＩ、１－Ｓｃｅｌｌ、１－Ｐｐｏｌ、１－Ｓｃｅｌｌｌ、１－Ｌｔｒｌ、１－Ｇｐｉｌ、１－ＧＺｅｌ、１－Ｏｎｕｌ、１－ＨｊｅＭＩ、１－Ｍｓｏｌ、１－Ｔｅｖｌ、Ｉ－Ｔｅｖｌｌ、１－Ｔｅｖｌｌｌ、Ｐ１－Ｍｌｅｌ、Ｐ１－Ｍｔｕｌ、Ｐ１－Ｐｓｐｌ、ＰＩ－ＴＤ Ｉ、ＰＩ－ＴＤ ｌｌ、Ｐ１－ＳｃｅＶなど；ならびにプログラム可能な遺伝子編集エンドヌクレアーゼ、例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの場合、主題の組成物および／または方法の配列特異的エンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼおよびプログラム可能な遺伝子編集エンドヌクレアーゼから選択される。いくつかの場合、主題の組成物および／または方法の配列特異的エンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１など）から選択される。
いくつかの場合、主題の組成物および／または方法の配列特異的エンドヌクレアーゼはメガヌクレアーゼである。いくつかの場合、メガヌクレアーゼは、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼ（ＬＭＮ）、１－Ｓｃｅｌ、１－Ｃｅｕｌ、１－Ｃｒｅｌ、１－Ｄｍｏｌ、１－Ｃｈｕｌ、１－Ｄｉｒｌ、１－Ｆｌｍｕｌ、１－Ｆｌｍｕｌｌ、１－Ａｎｉｌ、Ｉ－ＳｃｅｌＶ、１－Ｃｓｍｌ、１－Ｐａｎｌ、１－Ｐａｎｌｌ、１－ＰａｎＭＩ、１－Ｓｃｅｌｌ、１－Ｐｐｏｌ、１－Ｓｃｅｌｌｌ、１－Ｌｔｒｌ、１－Ｇｐｉｌ、１－ＧＺｅｌ、１－Ｏｎｕｌ、１－ＨｊｅＭＩ、１－Ｍｓｏｌ、１－Ｔｅｖｌ、１－Ｔｅｖｌｌ、１－Ｔｅｖｌｌｌ、Ｐ１－Ｍｌｅｌ、Ｐ１－Ｍｔｕｌ、Ｐ１－Ｐｓｐｌ、ＰＩ－Ｔｌｉ Ｉ、ＰＩ－Ｔｌｉ ＩＩ、およびＰ１－ＳｃｅＶから選択される。いくつかの場合、メガヌクレアーゼ１－Ｓｃｅｌが使用される。いくつかの場合、メガヌクレアーゼ１－Ｃｅｕｌが使用される。いくつかの場合、メガヌクレアーゼ１－Ｓｃｅｌおよび１－Ｃｅｕｌが使用される。
いくつかの場合、配列特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、プログラム可能なゲノム編集ヌクレアーゼである。「プログラム可能なゲノム編集ヌクレアーゼ」という用語は、本明細書では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡ内の異なる部位（認識配列）を標的とされ得るエンドヌクレアーゼを指すために使用される。適切なプログラム可能なゲノム編集ヌクレアーゼの例には、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬ－エフェクターＤＮＡ結合ドメイン－ヌクレアーゼ融合タンパク質（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ））、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、クラス２ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、例えばＩＩ型、Ｖ型またはＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ）が含まれるが、これらに限定されない。したがって、いくつかの実施形態では、プログラム可能なゲノム編集ヌクレアーゼは、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、クラス２ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、例えばＩＩ型、Ｖ型、またはＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ）から選択される。いくつかの場合、主題の組成物および／または方法の配列特異的エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１など）である。いくつかの場合、主題の組成物および／または方法の配列特異的エンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ、ＺＦＮ、およびＴＡＬＥＮから選択される。
クラス２ ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓエンドヌクレアーゼＣａｓ９タンパク質およびＣａｓ９ガイドＲＮＡ（ならびにそれらの送達方法）に関する情報（ならびにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸中に存在するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に関する要件についての情報）は、例えば、以下のＪｉｎｅｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１２年８月１７日；３３７（６０９６）：８１６－２１；Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉら、ＲＮＡ Ｂｉｏｌ．２０１３年５月；１０（５）：７２６－３７；Ｍａら、Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｓ Ｉｎｔ．２０１３；２０１３：２７０８０５；Ｈｏｕら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１３年９月２４日；１ １０（３９）：１５６４４－９；Ｊｉｎｅｋら、Ｅｌｉｆｅ．２０１３；２：ｅ００４７１；Ｐａｔｔａｎａｙａｋら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３年９月；３１（９）：８３９－４３；Ｑｉら、Ｃｅｌｌ．２０１３年２月２８日；１５２（５）：１１７３－８３；Ｗａｎｇら、Ｃｅｌｌ．２０１３年５月９日；１５３（４）：９１０－８；Ａｕｅｒら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２０１３年１０月３１日；Ｃｈｅｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１３年１１月１日；４１（２０）：ｅ１９；Ｃｈｅｎｇら、Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２０１３年１０月；２３（１０）：１ １６３－７１；Ｃｈｏら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．２０１３年１１月；１９５（３）：１ １７７－８０；ＤｉＣａｒｌｏら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１３年４月；４１（７）：４３３６－４３；Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎら、Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１３年１０月；１０（１０）：１０２８－３４；Ｅｂｉｎａら、Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１３；３：２５１０；Ｆｕｊｉｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１３年１１月１日；４１（２０）：ｅ１８７；Ｈｕら、Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２０１３年１１月；２３（１ １）：１３２２－５；Ｊｉａｎｇら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１３年１１月１日；４１（２０）：ｅ１８８；Ｌａｒｓｏｎら、Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２０１３年１１月；８（１ １）：２１８０－９６；Ｍａｌｉら、Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１３年１０月；１０（１０）：９５７－６３；Ｎａｋａｙａｍａら、Ｇｅｎｅｓｉｓ．２０１３年１２月；５１（１２）：８３５－４３；Ｒａｎら、Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２０１３年１１月；８（１ １）：２２８１－３０８；Ｒａｎら、Ｃｅｌｌ．２０１３年９月１２日；１５４（６）：１３８０－９；Ｕｐａｄｈｙａｙら、Ｇ３（Ｂｅｔｈｅｓｄａ）．２０１３年１２月９日；３（１２）：２２３３－８；Ｗａｌｓｈら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１３年９月２４日；１１０（３９）：１５５１４－５；Ｘｉｅら、Ｍｏｌ Ｐｌａｎｔ．２０１３年１０月９日；Ｙａｎｇら、Ｃｅｌｌ．２０１３年９月１２日；１５４（６）：１３７０－９；Ｂｒｉｎｅｒら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．２０１４年１０月２３日；５６（２）：３３３－９；ならびに米国特許および特許出願：第８，９０６，６１６号；第８，８９５，３０８号；第８，８８９，４１８号；第８，８８９，３５６号；第８，８７１，４４５号；第８，８６５，４０６号；第８，７９５，９６５号；第８，７７１，９４５号；第８，６９７，３５９号；第２０１４００６８７９７号；第２０１４０１７０７５３号；第２０１４０１７９００６号；第２０１４０１７９７７０号；第２０１４０１８６８４３号；第２０１４０１８６９１９号；第２０１４０１８６９５８号；第２０１４０１８９８９６号；第２０１４０２２７７８７号；第２０１４０２３４９７２号；第２０１４０２４２６６４号；第２０１４０２４２６９９号；第２０１４０２４２７００号；第２０１４０２４２７０２号；第２０１４０２４８７０２号；第２０１４０２５６０４６号；第２０１４０２７３０３７号；第２０１４０２７３２２６号；第２０１４０２７３２３０号；第２０１４０２７３２３１号；第２０１４０２７３２３２号；第２０１４０２７３２３３号；第２０１４０２７３２３４号；第２０１４０２７３２３５号；第２０１４０２８７９３８号；第２０１４０２９５５５６号；第２０１４０２９５５５７号；第２０１４０２９８５４７号；第２０１４０３０４８５３号；第２０１４０３０９４８７号；第２０１４０３１０８２８号；第２０１４０３１０８３０号；第２０１４０３１５９８５号；第２０１４０３３５０６３号；第２０１４０３３５６２０号；第２０１４０３４２４５６号；第２０１４０３４２４５７号；第２０１４０３４２４５８号；第２０１４０３４９４００号；第２０１４０３４９４０５号；第２０１４０３５６８６７号；第２０１４０３５６９５６号；第２０１４０３５６９５８号；第２０１４０３５６９５９号；第２０１４０３５７５２３号；第２０１４０３５７５３０号；第２０１４０３６４３３３号；および第２０１４０３７７８６８号において見出すことができ；これらのすべては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃｐｆ１）またはＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓエンドヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡに関連する例および指針（ならびにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸中に存在するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に関連する要件についての情報）は、当技術分野で見出すことができ、例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅら、Ｃｅｌｌ．２０１５年１０月２２日；１６３（３）：７５９－７１；Ｍａｋａｒｏｖａら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１５年１１月；１３（１１）：７２２－３６；およびＳｈｍａｋｏｖら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．２０１５年１１月５日；６０（３）：３８５－９７を参照されたい。有用なデザイナージンクフィンガーモジュールには、様々なＧＮＮおよびＡＮＮトリプレットを認識するもの（Ｄｒｅｉｅｒら、（２００１）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７６：２９４６６－７８；Ｄｒｅｉｅｒら、（２０００）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３０３：４８９－５０２；Ｌｉｕら、（２００２）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７：３８５０－６）、ならびに様々なＣＮＮまたはＴＮＮトリプレットを認識するもの（Ｄｒｅｉｅｒら、（２００５）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８０：３５５８８－９７；Ｊａｍｉｅｓｏｎら、（２００３）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ ２：３６１－８）が含まれる。Ｄｕｒａｉら、（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３３：５９７８－９０；Ｓｅｇａｌ、（２００２）Ｍｅｔｈｏｄｓ ２６：７６－８３；ＰｏｒｔｅｕｓおよびＣａｒｒｏｌｌ、（２００５）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２３：９６７－７３；Ｐａｂｏら、（２００１）Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ７０：３１３－４０；Ｗｏｌｆｅら、（２０００）Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｔｒｕｃｔ ２９：１８３－２１２；ＳｅｇａｌおよびＢａｒｂａｓ、（２００１）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １２：６３２－７；Ｓｅｇａｌら、（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４２：２１３７－４８；ＢｅｅｒｉｉおよびＢａｒｂａｓ、（２００２）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０：１３５－４１；Ｃａｒｒｏｌｌら、（２００６）Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ １：１３２９；Ｏｒｄｉｚら、（２００２）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９９：１３２９０－５；Ｇｕａｎら、（２００２）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９９：１３２９６－３０１も参照されたい。
ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮ（およびそれらの送達方法）に関するさらなる情報については、Ｓａｎｊａｎａら、Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２０１２年１月５日；７（１）：１７１－９２ならびに国際特許出願ＷＯ２００２０９９０８４；ＷＯ００／４２２１９；ＷＯ０２／４２４５９；ＷＯ２００３０６２４５５；ＷＯ０３／０８０８０９；ＷＯ０５／０１４７９１；ＷＯ０５／０８４１９０；ＷＯ０８／０２１２０７；ＷＯ０９／０４２１８６；ＷＯ０９／０５４９８５；ＷＯ１０／０７９４３０；およびＷＯ１０／０６５１２３；米国特許第８，６８５，７３７号；第６，１４０，４６６号；第６，５１１，８０８号；および第６，４５３，２４２号；ならびに米国特許出願第２０１１／０１４５９４０号、第２００３／００５９７６７号、および第２００３／０１０８８８０号を参照されたい；これらのすべては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの場合（例えば、制限酵素の場合）、認識配列は、所与のタンパク質に対して一定である（変化しない）（例えば、ＢａｍＨＩ制限酵素のための認識配列はそれである）。いくつかの場合、配列特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、所望の認識配列を認識するようにタンパク質（またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼの場合はその関連ＲＮＡ）を改変／操作することができるという意味で「プログラム可能」である。いくつかの場合（例えば、配列特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼがメガヌクレアーゼである場合および／または配列特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼである場合）、認識配列は、１４またはそれを超えるヌクレオチド（ｎｔ）（例えば、１５もしくはそれを超える、１６もしくはそれを超える、１７もしくはそれを超える、１８もしくはそれを超える、１９もしくはそれを超える、または２０もしくはそれを超えるｎｔ）の長さを有する。いくつかの場合、認識配列は、１４～４０ｎｔ（例えば、１４～３５、１４～３０、１４～２５、１５～４０、１５～３５、１５～３０、１５～２５、１６～４０、１６～３５、１６～３０、１６～２５、１７～４０、１７～３５、１７～３０、または１７～２５ｎｔ）の範囲の長さを有する。いくつかの場合、認識配列は、１４またはそれを超える塩基対（ｂｐ）（例えば、１５もしくはそれを超える、１６もしくはそれを超える、１７もしくはそれを超える、１８もしくはそれを超える、１９もしくはそれを超える、または２０もしくはそれを超えるｂｐ）の長さを有する。いくつかの場合、認識配列は、１４～４０ｂｐ（例えば、１４～３５、１４～３０、１４～２５、１５～４０、１５～３５、１５～３０、１５～２５、１６～４０、１６～３５、１６～３０、１６～２５、１７～４０、１７～３５、１７～３０、または１７～２５ｂｐ）の範囲の長さを有する。
上記で認識配列の長さに言及する場合、二本鎖ヘリックスおよび認識配列は塩基対（ｂｐ）を単位として考えることができるが、いくつかの場合（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼの場合）、認識配列は一本鎖形態（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓエンドヌクレアーゼのガイドＲＮＡは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡにハイブリダイズすることができる）で認識され、認識配列はヌクレオチド（ｎｔ）を単位として考えることができる。しかしながら、本明細書で認識配列に言及するときに「ｂｐ」または「ｎｔ」を使用する場合、この専門用語は限定を意図するものではない。一例として、本明細書に記載の特定の方法または組成物が両方のタイプの配列特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼ（「ｂｐ」を認識するものおよび「ｎｔ」を認識するもの）を包含する場合、「ｎｔ」または「ｂｐ」のいずれかは、配列特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼの範囲を限定することなく使用することができる。これは、当業者はどの用語（「ｎｔ」または「ｂｐ」）が適切に適用され、これはどのタンパク質が選択されるかに依存することを理解するであろうからである。認識配列の長さ制限の場合、当業者は、「ｎｔ」または「ｂｐ」という用語が使用されるかどうかにかかわらず、論じられている長さ制限が等しく適用されることを理解するであろう。
Ｃ．チュウバック（エキソヌクレアーゼ消化）
環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡが切断され、切断された線状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２
ＤＮＡの集団が生成された後、線状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの開口端はエキソヌクレアーゼによって消化（チュウバック）される。多くの様々なエキソヌクレアーゼが当業者に公知であり、任意の好都合なエキソヌクレアーゼを使用することができる。いくつかの場合、５’から３’へのエキソヌクレアーゼが使用される。いくつかの場合、３’から５’へのエキソヌクレアーゼが使用される。いくつかの場合、５’から３’へのおよび３’から５’への両方のエキソヌクレアーゼ活性を有するエキソヌクレアーゼが使用される。いくつかの場合、２種以上のエキソヌクレアーゼ（例えば、２種のエキソヌクレアーゼ）が使用される。いくつかの場合、切断された線状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの集団を、５’から３’へのエキソヌクレアーゼおよび３’から５’へのエキソヌクレアーゼと接触（例えば、同時に、または一方が他方の前に）させる。
環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡが切断され、切断された線状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２
ＤＮＡの集団が生成された後、線状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの開口端はエキソヌクレアーゼによって消化（チュウバック）される。多くの様々なエキソヌクレアーゼが当業者に公知であり、任意の好都合なエキソヌクレアーゼを使用することができる。いくつかの場合、５’から３’へのエキソヌクレアーゼが使用される。いくつかの場合、３’から５’へのエキソヌクレアーゼが使用される。いくつかの場合、５’から３’へのおよび３’から５’への両方のエキソヌクレアーゼ活性を有するエキソヌクレアーゼが使用される。いくつかの場合、２種以上のエキソヌクレアーゼ（例えば、２種のエキソヌクレアーゼ）が使用される。いくつかの場合、切断された線状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの集団を、５’から３’へのエキソヌクレアーゼおよび３’から５’へのエキソヌクレアーゼと接触（例えば、同時に、または一方が他方の前に）させる。
いくつかの場合、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼが３’から５’へのエキソヌクレアーゼ（ｄＮＴＰの非存在下、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼは３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性を有する）として使用される。いくつかの場合、ＲｅｃＪが５’から３’へのエキソヌクレアーゼとして使用される。いくつかの場合、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ（ｄＮＴＰの非存在下）およびＲｅｃＪが使用される。エキソヌクレアーゼの例には、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ）（ｄＮＴＰの非存在下）、ラムダエキソヌクレアーゼ（５’→３’）、Ｔ５エキソヌクレアーゼ（５’→３’）、エキソヌクレアーゼＩＩＩ（３’→５’）、エキソヌクレアーゼＶ（５’→３’および３’→５’）、Ｔ７エキソヌクレアーゼ（５’→３’）、エキソヌクレアーゼＴ、エキソヌクレアーゼＶＩＩ（短縮型）（５’→３’）、およびＲｅｃＪエキソヌクレアーゼ（５’→３’）が含まれるが、これらに限定されない。
ＤＮＡ消化（チュウバック）の速度は温度に敏感であり、したがって、所望の欠失のサイズは、エキソヌクレアーゼ消化中の温度を調節することによって制御することができる。例えば、以下の実施例のセクションでは、エキソヌクレアーゼとしてＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ（ｄＮＴＰの非存在下）およびＲｅｃＪを使用する場合、両末端消化速度（チュウバック速度）は、３７℃で５０ｂｐ／分の速度で、より低い温度（例えば、以下の実施例のセクションで論じられるように）では遅い速度で進行した。したがって、温度を低下または上昇させることができるか、および／または消化時間を短縮または延長させて、欠失のサイズ（すなわち、エキソヌクレアーゼ消化の量）を制御することができる。例えば、いくつかの場合、エキソヌクレアーゼ消化が所望のサイズ範囲の欠失を引き起こすように、温度および時間が調整される。例示的な例として、５００～１０００塩基対（ｂｐ）の範囲の欠失が望まれる場合、消化の時間および温度は、２５０～５００ヌクレオチドが線状化（切られた）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの各末端から除去されるように調整され得る、すなわち、欠失のサイズは、線状化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの各末端から除去されたヌクレオチドの数の合計である。いくつかの場合、エキソヌクレアーゼ消化が２０～１０００ｂｐ（例えば、２０～５０、４０～８０、２０～１００、４０～１００、２０～２００、４０～２００、６０～１００、６０～２００、８０～１５０、８０～２５０、１００～２５０、１５０～３５０、１００～５００、２００～５００、２００～７００、３００～８００、４００～８００、５００～１０００、７００～１０００、２０～８００、５０～１０００、１００～１０００、２５０～１０００、５０～１０００、５０～７５０、１００～１０００、または１００～７５０ｂｐ）の範囲のサイズを有する欠失を引き起こすように、温度および時間が調整される。
いくつかの場合、エキソヌクレアーゼ（１種またはそれを超えるエキソヌクレアーゼ）との接触は、室温（例えば、２５℃）～４０℃（例えば、２５～３７℃、３０～３７℃、３２～４０℃、または３０～４０℃）の範囲の温度で行われる。いくつかの場合、エキソヌクレアーゼとの接触は３７℃で行われる。いくつかの場合、エキソヌクレアーゼとの接触は３２℃で行われる。いくつかの場合、エキソヌクレアーゼとの接触は３０℃で行われる。いくつかの場合、エキソヌクレアーゼとの接触は２５℃で行われる。いくつかの場合、エキソヌクレアーゼとの接触は室温で行われる。いくつかの場合、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡをエキソヌクレアーゼ（１種またはそれを超えるエキソヌクレアーゼ）と、１０秒～４０分（例えば、１０秒～３０分、１０秒～２０分、１０秒～１５分、１０秒～１０分、３０秒～３０分、３０秒～２０分、３０秒～１５分、３０秒～１２分、３０秒～１０分、１～４０分、１～３０分、１～２０分、１～１５分、１～１０分、３～４０分、３～３０分、３～２０分、３～１５分、３～１２分、または３～１０分）の範囲の期間接触させる。いくつかの場合、接触は、２０秒～１５分の範囲の期間である。
ＤＮＡ消化（チュウバック）後、残りのオーバーハングしたＤＮＡ末端は修復され得る（例えば、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ＋ｄＮＴＰを使用する）か、またはいくつかの場合、一本鎖オーバーハングは除去され得る（例えば、一本鎖ＤＮＡを切断するが二本鎖ＤＮＡを切断しないマングビーンヌクレアーゼなどのヌクレアーゼを使用する）。例えば、５’から３’へのまたは３’から５’へのエキソヌクレアーゼのみを使用する場合、一本鎖ＤＮＡに特異的なヌクレアーゼ（すなわち、二本鎖ＤＮＡを切らない）（例えば、マングビーンヌクレアーゼ）を使用してオーバーハングを除去することができる。
１種またはそれを超えるエキソヌクレアーゼと接触させるステップ（すなわち、チュウバック）は、一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢタンパク質）の存在下または非存在下で行うことができる。ＳＳＢは、露出した一本鎖ＤＮＡ末端に結合するタンパク質であり、（ｉ）ヌクレアーゼがＤＮＡにアクセスするのを防ぐことによってＤＮＡを安定化するのを助けること、および（ｉｉ）一本鎖ＤＮＡ内のヘアピン形成を防ぐことを含むがこれらに限定されないいくつかの結果を達成することができる。ＳＳＢタンパク質の例には、真核生物ＳＳＢタンパク質（例えば、複製タンパク質Ａ（ＲＰＡ））、細菌ＳＳＢタンパク質、およびウイルスＳＳＢタンパク質が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの場合、１種またはそれを超えるエキソヌクレアーゼと接触させるステップは、ＳＳＢの存在下で行われる。いくつかの場合、１種またはそれを超えるエキソヌクレアーゼと接触させるステップは、ＳＳＢの非存在下で行われる。
Ｄ．バーコード
いくつかの実施形態では、ライブラリのメンバーは、エキソヌクレアーゼ消化後（および残りのオーバーハングしているＤＮＡ末端が修復／除去された後）に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡにバーコードを付加することによって「タグ付け」される。バーコードの付加は、再環状化（ライゲーション）の前またはそれと同時に行うことができる。本明細書で使用される場合、「バーコード」という用語は、将来の同定のためにライブラリのメンバーを一意にタグ付けする配列を有するヌクレオチドのストレッチを意味するために使用される。例えば、いくつかの場合、（ランダムバーコードカセットのプールからの）バーコードカセットが付加され得、ライブラリを配列決定して、どのバーコード配列がどの特定のメンバーに関連付けられるか、すなわちどの特定の欠失に関連付けられるかを知ることができる（例えば、欠失ライブラリの各メンバが固有のバーコードを有するようにルックアップテーブルを作成することができる）。このようにして、欠失ライブラリのメンバーは、バーコードの存在によって（欠失の位置を決定することによってメンバーを同定しなければならない代わりに）追跡および把握することができる。任意の好都合なアッセイを使用して短いストレッチのヌクレオチドの存在を同定することは、容易に達成することができる。そのようなバーコードの使用は、ライブラリが所与の実験に使用されるたびに（欠失の位置を決定するために）個々のメンバーを単離し配列決定するよりも容易である。例えば、どのライブラリメンバーが実験前（例えば、ウイルス感染性についてアッセイするためにライブラリメンバーを細胞に導入する前）に存在するかを容易に判定し、これを、例えば、ハイスループット配列決定、マイクロアレイ、ＰＣＲ、ｑＰＣＲ、またはバーコード配列の存在／非存在を検出することができる任意の他の方法を使用して、実験前後のバーコードの存在について単純にアッセイすることによって、実験後にどのメンバーが存在するかと比較することができる。
いくつかの実施形態では、ライブラリのメンバーは、エキソヌクレアーゼ消化後（および残りのオーバーハングしているＤＮＡ末端が修復／除去された後）に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡにバーコードを付加することによって「タグ付け」される。バーコードの付加は、再環状化（ライゲーション）の前またはそれと同時に行うことができる。本明細書で使用される場合、「バーコード」という用語は、将来の同定のためにライブラリのメンバーを一意にタグ付けする配列を有するヌクレオチドのストレッチを意味するために使用される。例えば、いくつかの場合、（ランダムバーコードカセットのプールからの）バーコードカセットが付加され得、ライブラリを配列決定して、どのバーコード配列がどの特定のメンバーに関連付けられるか、すなわちどの特定の欠失に関連付けられるかを知ることができる（例えば、欠失ライブラリの各メンバが固有のバーコードを有するようにルックアップテーブルを作成することができる）。このようにして、欠失ライブラリのメンバーは、バーコードの存在によって（欠失の位置を決定することによってメンバーを同定しなければならない代わりに）追跡および把握することができる。任意の好都合なアッセイを使用して短いストレッチのヌクレオチドの存在を同定することは、容易に達成することができる。そのようなバーコードの使用は、ライブラリが所与の実験に使用されるたびに（欠失の位置を決定するために）個々のメンバーを単離し配列決定するよりも容易である。例えば、どのライブラリメンバーが実験前（例えば、ウイルス感染性についてアッセイするためにライブラリメンバーを細胞に導入する前）に存在するかを容易に判定し、これを、例えば、ハイスループット配列決定、マイクロアレイ、ＰＣＲ、ｑＰＣＲ、またはバーコード配列の存在／非存在を検出することができる任意の他の方法を使用して、実験前後のバーコードの存在について単純にアッセイすることによって、実験後にどのメンバーが存在するかと比較することができる。
いくつかの場合、バーコードはカセットとして付加される。バーコードカセットは、少なくとも１つの定常領域（カセットを受け入れるすべてのメンバーによって共有される領域）およびバーコード領域（すなわち、バーコード配列－バーコードがライブラリのメンバーを一意にマークするように、バーコードを受け入れるメンバーに対して固有の領域）を有するヌクレオチドのストレッチである。例えば、バーコードカセットは、（ｉ）使用されるバーコードカセット間で共通のプライマー部位である定常領域、および（ｉｉ）例えば、ランダム配列のストレッチであり得る固有のタグであるバーコード配列を含み得る。いくつかの場合、バーコードカセットは、２つの定常領域（例えば、２つの異なるプライマー部位）によって挟まれるバーコード領域を含む。例示的な例として、いくつかの場合、バーコードカセットは、２０ｂｐのプライマー結合部位によって挟まれる２０ｂｐのランダムバーコードを含む６０ｂｐのカセットである（例えば、図４を参照）。
バーコード配列は、任意の好都合な長さを有することができ、好ましくは、目的の所与のライブラリのメンバーを一意にマークするのに十分な長さである。いくつかの場合、バーコード配列は、１５ｂｐ～４０ｂｐ（例えば、１５～３５ｂｐ、１５～３０ｂｐ、１５～２５ｂｐ、１７～４０ｂｐ、１７～３５ｂｐ、１７～３０ｂｐ、または１７～２５ｂｐ）の長さを有する。いくつかの場合、バーコード配列は２０ｂｐの長さを有する。同様に、バーコードカセットは、任意の好都合な長さを有することができ、この長さは、バーコード配列の長さ＋定常領域の長さに依存する。いくつかの場合、バーコードカセットは、４０ｂｐ～１００ｂｐ（例えば、４０～８０ｂｐ、４５～１００ｂｐ、４５～８０ｂｐ、４５～７０ｂｐ、５０～１００ｂｐ、５０～８０ｂｐ、または５０～７０ｂｐ）の長さを有する。いくつかの場合、バーコードカセットは６０ｂｐの長さを有する。
バーコードまたはバーコードカセットは、任意の好都合な方法を使用して付加することができる。例えば、線状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡは、ランダムバーコードカセットのプールから引き出された３’－ｄＴ－テール付きバーコードカセットへのライゲーションによって再環状化することができる。次いで、ニックが入った半ライゲーション産物を封じ、宿主細胞、例えば細菌細胞に形質転換することができる。
Ｅ．産物の生成
いくつかの場合、主題の方法は、線状二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）産物（例えば、環状ＤＮＡの切断を介して、ＰＣＲを介してなど）、線状一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）産物（例えば、転写および逆転写を介して）、線状一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）産物（例えば、転写を介して）、および線状二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）産物のうちの少なくとも１つを（例えば、環状化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２欠失ＤＮＡの生成されたライブラリから）生成するステップを含む。必要に応じて、線状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２産物を、次いで細胞（例えば、哺乳動物細胞）に導入することができる。例えば、ＲＮＡウイルスに対する共通の技術は、ｄｓＤＮＡ鋳型（環状または線状）からインビトロ転写を行ってＲＮＡを作製し、次いでこのＲＮＡを細胞に（例えば、エレクトロポレーション、化学的方法などを介して）導入してウイルスのストックを生成することである。
いくつかの場合、主題の方法は、線状二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）産物（例えば、環状ＤＮＡの切断を介して、ＰＣＲを介してなど）、線状一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）産物（例えば、転写および逆転写を介して）、線状一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）産物（例えば、転写を介して）、および線状二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）産物のうちの少なくとも１つを（例えば、環状化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２欠失ＤＮＡの生成されたライブラリから）生成するステップを含む。必要に応じて、線状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２産物を、次いで細胞（例えば、哺乳動物細胞）に導入することができる。例えば、ＲＮＡウイルスに対する共通の技術は、ｄｓＤＮＡ鋳型（環状または線状）からインビトロ転写を行ってＲＮＡを作製し、次いでこのＲＮＡを細胞に（例えば、エレクトロポレーション、化学的方法などを介して）導入してウイルスのストックを生成することである。
また、キットも本開示の範囲内である。例えば、いくつかの場合、主題のキットは、（ｉ）本明細書に記載の環状ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡの集団、（ｉｉ）本明細書に記載のトランスポゾンカセット、（ｉｉｉ）本明細書に記載の配列特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、（ｉｖ）本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼのための１つまたはそれを超えるガイドＲＮＡ、（ｖ）本明細書に記載のバーコードおよび／またはバーコードカセットの集団、ならびに（ｖｉ）本明細書に記載の、例えばライブラリの増幅、ウイルス感染性についてのアッセイなどのための宿主細胞の集団のうちの１つまたは複数を（任意の組合せで）含み得る。いくつかの場合、主題のキットは使用説明書を含むことができる。キットは、典型的には、キットの内容物の使用目的を指し示すラベルを含む。ラベルという用語は、キット上もしくはキットと共に供給されるか、またはそうでなければキットに付随する、任意の書面または記録された材料を含む。
Ｆ．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＴＩＰの最適化とさらなる開発
Ｆ．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＴＩＰの最適化とさらなる開発
いくつかの実施形態では、ＴＩＰ伝播（ρ）および干渉（ψ）パラメータを最適化するように操作することによって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＴＩＰのウイルス量低減を強化することができる。パラメータ「ρ」は、組織内のより多くの細胞にＴＩＰを拡散させることによってウイルス量を減少させるのに役立つ。ＴＩＰは野生型ウイルスが動員されることを必要とするので、ψが大きすぎる（阻害が大きすぎる）場合、ＴＩＰを動員するために利用可能なウイルスは少なくなる。したがって、ρおよびψは、組織規模全体で一種の相乗効果を生じる。
いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＴＩＰは、ρおよびψの値に基づいて治療有効性について評価される。いくつかの実施形態では、数学的にモデル化されたρおよびψの値を使用して、候補ＴＩＰがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とうまく競合するかどうかを判定する。いくつかの実施形態では、ＴＩＰはρを増強することによって最適化される。いくつかの実施形態では、ρは、ウイルスパッケージングシグナルの付加によって増強される。いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＴＩＰはψを増強することによって最適化される。
実施例
本発明は、以下の実施例を参照することによってより完全に理解されるであろう。しかしながら、それらは本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書に記載された実施例および実施形態は例示のみを目的としており、それに照らして様々な改変または変更が当業者に示唆され、本出願の精神および範囲ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれるべきであることが理解される。
本発明は、以下の実施例を参照することによってより完全に理解されるであろう。しかしながら、それらは本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書に記載された実施例および実施形態は例示のみを目的としており、それに照らして様々な改変または変更が当業者に示唆され、本出願の精神および範囲ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれるべきであることが理解される。
実施例１：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ランダム欠失ライブラリ（ＲＤＬ）の生成
効率的な動員に必要なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の領域を系統的に同定するために、ＨＩＶ ＮＬ４－３のランダム欠失ライブラリを作成しインデックス付けしたＷｅｉｎｂｅｒｇｅｒおよびＮｏｔｔｏｎ（２０１７）によって記載されたものと同様のランダム化欠失スクリーニングを利用した。
効率的な動員に必要なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の領域を系統的に同定するために、ＨＩＶ ＮＬ４－３のランダム欠失ライブラリを作成しインデックス付けしたＷｅｉｎｂｅｒｇｅｒおよびＮｏｔｔｏｎ（２０１７）によって記載されたものと同様のランダム化欠失スクリーニングを利用した。
簡潔には、プラスミドＤＮＡをトランスポゾン媒介のランダム挿入に供し、続いてトランスポゾンの切除、露出した末端のエキソヌクレアーゼ媒介の消化により、ランダムな遺伝的位置を中心とする各々が可変サイズの欠失を作成した。次いで、プラスミドを、２０ヌクレオチドのランダムＤＮＡバーコードを含むカセットと一緒に再ライゲーションして、欠失を「インデックス付け」した。インデックス付けにより、欠失した領域を（ゲノム配列とバーコードとの連結によって）容易に同定し、ディープシーケンシングによって追跡／定量することが可能になる。このプロセスは、図１～図４に概略的に図示されている。図５Ａは、このプロセスをさらに図示する。
ライブラリのメンバーの欠失部位を配列決定した。図５Ｂに示される欠失深度プロットは、サブライブラリが５８７，０００個を超える欠失を含んだことを示す。サブライブラリをライゲーションして全長ライブラリを形成し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２インサートをＲＮＡにインビトロで転写し、ＲＮＡをＶｅｒｏＥ６細胞にトランスフェクトした。次いで、トランスフェクトした細胞を野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに感染させて、欠失変異体の動員を試験した。３回のウイルス継代の後、ＲＮＡを細胞から抽出し、欠失バーコードの存在を分析した。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バイロリアクター
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２欠失変異体に感染され得る、懸濁液中のシリコーンビーズ上で増殖するＶｅｒｏＥ６細胞を使用して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バイロリアクターを設定し、それによって感染および最終的にはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２治療用干渉粒子（ＴＩＰ）の進化を改善するための動的システムを創出した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バイロリアクターに使用される条件は、ＨＩＶ ＴＩＰを単離するために使用されるプロトコル（ＷｅｉｎｂｅｒｇｅｒおよびＮｏｔｔｏｎ（２０１７）によって記載されている）から適合させた。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２欠失変異体に感染され得る、懸濁液中のシリコーンビーズ上で増殖するＶｅｒｏＥ６細胞を使用して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バイロリアクターを設定し、それによって感染および最終的にはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２治療用干渉粒子（ＴＩＰ）の進化を改善するための動的システムを創出した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バイロリアクターに使用される条件は、ＨＩＶ ＴＩＰを単離するために使用されるプロトコル（ＷｅｉｎｂｅｒｇｅｒおよびＮｏｔｔｏｎ（２０１７）によって記載されている）から適合させた。
図６Ａに図示されるように、ＶｅｒｏＥ６細胞が定常状態の密度に達したとき、穏やかな撹拌下、０．５または５のＭＯＩでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２欠失変異体に感染させた。培養物の半分を毎日リアクターから取り出し、新鮮な細胞および培地で置き換えた。リアクターから取り出した試料を遠心分離し、後の分析のために上清を凍結し、ヨウ化プロピジウム染色プロトコルを使用したフローサイトメトリーによって細胞生存率を測定した（図６Ｂ）。細胞生存率は、感染の２日後（ｄｐｉ）では低かった（３５～６０％）（図６Ｃ～図６Ｄ）が、感染の４日後（ｄｐｉ）すぐに回復し始め、１２ｄｐｉまで安定したまま（６０～８０５）であった。１３日目に、培養物は９０％超の細胞生存率まで回復した。
実施例２：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２治療用干渉粒子（ＴＩＰ）
図７Ａ～図７Ｂに示される構造を有する最小ＴＩＰサブゲノム合成構築物、ＴＩＰ１およびＴＩＰ２を設計し、クローニングした。ＴＩＰ１およびＴＩＰ２構築物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の５’および３’ＵＴＲの様々な部分をコードし、ＩＲＥＳから駆動されるｍＣｈｅｒｒｙレポータータンパク質を発現する。プラスミド構築物を配列検証した。
図７Ａ～図７Ｂに示される構造を有する最小ＴＩＰサブゲノム合成構築物、ＴＩＰ１およびＴＩＰ２を設計し、クローニングした。ＴＩＰ１およびＴＩＰ２構築物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の５’および３’ＵＴＲの様々な部分をコードし、ＩＲＥＳから駆動されるｍＣｈｅｒｒｙレポータータンパク質を発現する。プラスミド構築物を配列検証した。
より具体的には、ＴＩＰは、予測パッケージングシグナルをコードする５’ＵＴＲ内のステムループ５、ならびに蛍光レポータータンパク質（ｍＣｈｅｒｒｙ）の発現を駆動する内部リボソーム進入配列（ＩＲＥＳ）をコードする３’ＵＴＲおよび１２８０ヌクレオチド（ｎｔ）レポーターカセットの全体を包含する。ＴＩＰ１（約２．１ｋｂ）は、５’ＵＴＲ＋ポリプロテインＯＲＦ１ａｂの部分の最初の４５０ｎｔおよび３’ＵＴＲ＋レポーターカセットの最後の３２８ｎｔをコードし、一方、ＴＩＰ２（約３．５ｋｂ）は、５’ＵＴＲおよびＯＲＦ１ａｂの部分を包含する１５４０ｎｔ、ならびにＮタンパク質の部分、ＯＲＦ１０および３’ＵＴＲを含むゲノムの最後の７１３ｎｔをレポーターカセットと共にコードする。すべてのＴＩＰ ｍＲＮＡおよび対照ｍＲＮＡをインビトロ転写し、５’メチルキャップおよび約１００ｎｔの３’ポリＡテールをインビトロ転写後に付加した。
ＴＩＰ１における５’ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列は以下に示す通りである（配列番号２８）。
ＴＩＰ１における３’ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列を配列番号２９として以下に示す。
ＴＩＰ２における５’ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列は以下に示す通りである（配列番号３０）。
ＴＩＰ２における３’ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列は以下に示す通りである（配列番号３１）。
２つのさらなるＴＩＰバリアントはクローニングされたＴＩＰ１＊およびＴＩＰ２＊であり、これらは５’ＵＴＲ内に共通のＣ－２４１－Ｔ変異を含む。このＣ２４１Ｔ ＵＴＲ変異は、スパイクタンパク質Ｄ６１４Ｇ変異と一緒に集団間で共伝播する。
よって、ＴＩＰ１＊における５’ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列は以下に示す通りである（配列番号３２）。
同様に、ＴＩＰ２＊における５’ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列は以下の通りである（配列番号３３）。
ＴＩＰ構築物がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の複製を減少させることができるかどうかを試験するために、４つのＴＩＰ構築物からのｍＲＮＡを、各プラスミドにおいてＴＩＰの上流に作動可能に連結されたＴ７プロモーターからのインビトロ転写によって生成した。インビトロで転写されたＴＩＰ ｍＲＮＡの異なる調製物をＶｅｒｏ Ｅ６細胞（ＴＩＰ１、ＴＩＰ１＊、ＴＩＰ２、またはＴＩＰ２＊）にトランスフェクトし、細胞をＭＯＩ＝０．００５でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＷＡ株）に感染させた。感染後４８時間で試料を回収し、収量減少アッセイを行った（図８を参照）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｅ（エンベロープ）遺伝子がＴＩＰ配列に存在しないため、感染後４８時間でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｍＲＮＡ（Ｅ遺伝子）の減少倍数によって収量減少アッセイを測定した。図８に示すように、ＴＩＰ構築物はすべてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス複製を減少させた一方、ＴＩＰ２構築物はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する最大の干渉を示した。
実施例３：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＴＩＰはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって動員され、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と一緒に伝播する ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって動員され、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と一緒に伝播される候補ＴＩＰの能力を試験するために、上清移行実験を行った。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染したＶｅｒｏ Ｅ６細胞を、図７Ａ～図７Ｂに示される構造を有する様々なＴＩＰ候補でトランスフェクトした。したがって、ｍＣｈｅｒｒｙ発現の分析をＴＩＰ複製の尺度として使用することができる。感染の９６時間後に、この第１の細胞集団から上清を収集し、上清を新鮮なＶｅｒｏ細胞の第２の集団に移した。第１の対照として、上清をナイーブ非感染細胞からＶｅｒｏ細胞に移し、第２の対照として、上清をＴＩＰでトランスフェクトされていないＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した細胞から移した。フローサイトメトリーを実施して、上清移行の４８時間後に第２の細胞集団のｍＣｈｅｒｒｙ発現を分析した。
図９に示すように、第１および第２の対照はｍＣｈｅｒｒｙ発現を示さなかった（図９Ａ～図９Ｂ）。しかしながら、ＴＩＰ候補ｍＲＮＡでトランスフェクトし、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染させた細胞からの上清はｍＣｈｅｒｒｙ産生細胞を生成し、機能性ウイルス様粒子（ＶＬＰ）がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヘルパーウイルスによって生成されていることを示した（図９Ｃ～図９Ｉ）。概して、本発明者らは、ｍＲＮＡトランスフェクション（図９Ｇ～図９Ｈ）がＤＮＡトランスフェクション（図９Ｃ～図９Ｆ）よりも良好な動員をもたらすことを見出した。これは、ｍＲＮＡトランスフェクションがまた、ＤＮＡトランスフェクションよりも良好なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２干渉をもたらしたＲＴ－ｑＰＣＲによる収量減少アッセイの結果と一致していた（図示せず）。
実施例４：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する抗ウイルス介入のための転写調節配列（ＴＲＳ）
この実施例は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に介入または干渉するためのアンチセンスＲＮＡの使用を記載する。
この実施例は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に介入または干渉するためのアンチセンスＲＮＡの使用を記載する。
転写開始は、いくつかのタイプのコンセンサス転写調節配列（ＴＲＳ）：ＴＲＳ１－Ｌ：５’－ｃｕａａａｃ－３’（配列番号３６）、ＴＲＳ２－Ｌ：５’－ａｃｇａａｃ－３’（配列番号３７）、およびＴＲＳ３－Ｌ、５’－ｃｕａａａｃｇａａｃ－３’（配列番号３８）によってコロナウイルスにおいて調節される。
転写がこれらの転写開始部位から阻害され得るかどうかを評価するために、以下のアンチセンスＴＲＳ ＲＮＡを開発した：
ＴＲＳ１－ＡＣＧＡＡＣＣＵＡＡＡＣＡＣＧＡＡＣＣＵＡＡＡＣ（配列番号２５）、
ＴＲＳ２－（ＡＣＧＡＡＣＡＣＧＡＡＣＡＣＧＡＡＣＡＣＧＡＡＣ（配列番号２６）、および
ＴＲＳ３－ＣＵＡＡＡＣＣＵＡＡＡＣＣＵＡＡＡＣＣＵＡＡＡＣ（配列番号２７）。
ＴＲＳ１－ＡＣＧＡＡＣＣＵＡＡＡＣＡＣＧＡＡＣＣＵＡＡＡＣ（配列番号２５）、
ＴＲＳ２－（ＡＣＧＡＡＣＡＣＧＡＡＣＡＣＧＡＡＣＡＣＧＡＡＣ（配列番号２６）、および
ＴＲＳ３－ＣＵＡＡＡＣＣＵＡＡＡＣＣＵＡＡＡＣＣＵＡＡＡＣ（配列番号２７）。
Ｖｅｒｏ細胞をアンチセンスＴＲＳ ＲＮＡでトランスフェクトし、次いで、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＭＯＩ ０．０１または０．０５）に感染させた。対照として、細胞をスクランブルＲＮＡ（ＴＲＳ ＲＮＡの代わりに）でトランスフェクトし、次いで、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＭＯＩ ０．０１または０．０５）に感染させた。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の力価を定量的ＰＣＲによって決定し、ウエスタンブロットを２４、４８および７２時間で調製した。
図１１Ａ～図１１Ｃに示すように、ＴＲＳ２アンチセンスの使用は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の力価を最大限に低下させた（図１１Ｂ）。
次いで、Ｖｅｒｏ細胞をＴＲＳ２アンチセンスとＴＩＰ１またはＴＩＰ２のいずれかとの組合せと共にインキュベートし、次いで細胞をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染させた。次いで、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノム数の倍数変化を決定した。
図１２に示すように、ＴＲＳ２アンチセンスとＴＩＰ１またはＴＩＰ２のいずれかとの組合せは、ＴＲＳ単独と比較して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノム数を有意に減少させた。
実施例５：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＴＩＰは様々なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株の複製を減少させる
この実施例は、様々なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株に介入または干渉するための治療用干渉粒子（ＴＩＰ１およびＴＩＰ２）の使用を記載する。
この実施例は、様々なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株に介入または干渉するための治療用干渉粒子（ＴＩＰ１およびＴＩＰ２）の使用を記載する。
Ｖｅｒｏ細胞を、治療用干渉粒子（０．３ｎｇ／μＬまたは０．００３ｎｇ／μＬのＴＩＰ１またはＴＩＰ２）または対照ＲＮＡをカプセル化する脂質ナノ粒子で前処置した。処置の２時間後、細胞を以下のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株のうちの１つに感染させた（ＭＯＩ ０．００５）：
・ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の５０１Ｙ．Ｖ２．ＨＶバリアント、口語的に南アフリカバリアントとして公知；
・ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の５０１Ｙ．Ｖ２．ＨＶデルタバリアント、口語的に南アフリカバリアントとして公知；および
・Ｂ．１．１．７バリアント、口語的にＵ．Ｋ．バリアントとして公知。
・ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の５０１Ｙ．Ｖ２．ＨＶバリアント、口語的に南アフリカバリアントとして公知；
・ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の５０１Ｙ．Ｖ２．ＨＶデルタバリアント、口語的に南アフリカバリアントとして公知；および
・Ｂ．１．１．７バリアント、口語的にＵ．Ｋ．バリアントとして公知。
感染後４８時間に、上清を感染した培養物から回収し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス力価を定量した。
図１３Ａ～図１３Ｃは、ＴＩＰ１およびＴＩＰ２が用量依存的にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の複製を有意に減少させることを示す。
実施例６：初代ヒト肺オルガノイドにおいて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＴＩＰはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を阻害する
実施例６：初代ヒト肺オルガノイドにおいて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＴＩＰはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を阻害する
ＴＩＰがより生理学的な状況でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に干渉するかどうかを試験するために、図１４Ａに示すようなヒト肺オルガノイドモデルを使用した。オルガノイドを、３人のドナーから得た初代ヒト小気道上皮細胞（図１４Ｂ）を使用して確立し、特徴付けた。オルガノイドにＴＩＰ１、ＴＩＰ２またはＲＮＡ対照のうちいずれかをトランスフェクトし、次いでＭＯＩ＝０．５で２４時間後にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに感染させた。
肺オルガノイド中のウイルス力価を感染２４時間後にＲＴ－ｑＰＣＲによってアッセイした。簡潔には、示された時点で、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染細胞をＴＲＩｚｏｌ ＬＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）溶液に溶解した。Ｄｉｒｅｃｔ－ｚｏｌ（商標）ＲＮＡ抽出キット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．）を用いてＲＮＡを抽出し、ＤＮａｓｅで処理した。各逆転写酵素反応に１μｇのＲＮＡを使用し、ＳＹＢＲグリーンＰＣＲマスターミックス（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と配列特異的プライマーを用いた定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ－ＰＣＲ）分析によりｃＤＮＡを分析した。すべてのｑＲＴ－ＰＣＲ測定値をＧＡＰＤＨまたはβ－アクチンに対して正規化した。
肺オルガノイドのウイルス力価をプラーク形成単位（ＰＦＵ）分析によってさらにアッセイした。簡潔には、プラークアッセイを行う２４時間前にコンフルエントな単層としてプレーティングすることによって細胞を調製した。プラークアッセイの日に、培地を吸引し、細胞をＰＢＳで洗浄し、改変ＤＭＥＭ培地（ＤＭＥＭ、２％ＦＢＳ、Ｌ－ｇｌｕｔ、Ｐ／Ｓ）中の希釈ウイルス２５０μＬをコンフルエントな単層に添加し、続いて１５分ごとに穏やかに揺らしながら３７℃で１時間インキュベートした。１時間のインキュベーション後、２ｍＬの重層培地（１×ＭＥＭ中１．２％ Ａｖｉｃｅｌ）を各ウェルに添加した。感染後７２時間で、重層培地を吸引し、単層をＰＢＳで洗浄し、１０％ホルマリンで１時間固定した。プラークを０．１％クリスタルバイオレットで１０ｍｓ染色し、細胞培養グレードの水で３回洗浄した後、ＩｍａｇｅＪを使用してプラークを計数し、ウイルス価をｐｆｕ／ｍＬに算出した。
ＲＴ－ｑＰＣＲ（図１４Ｃ）およびＰＦＵ分析（図１４Ｄ）の両方により、ＴＩＰがＣｔｒｌ ＲＮＡと比較してＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を約１－Ｌｏｇ減少させることが確認された。
実施例７：ＴＩＰはウイルス様粒子（ＶＬＰ）を生成し、ウイルストランスエレメントについて競合し、Ｒ０＞１で動員する
実施例７：ＴＩＰはウイルス様粒子（ＶＬＰ）を生成し、ウイルストランスエレメントについて競合し、Ｒ０＞１で動員する
ＴＩＰ ＲＮＡがＶＬＰにパッケージングされているかどうかを決定するために、再構成アッセイを行った（図１５Ａ）。細胞に、ＴＩＰ ＲＮＡ、Ｃｔｒｌ ＲＮＡとともに、またはＲＮＡなしで、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のマトリックス（Ｍ）、エンベロープ（Ｅ）、スパイク（Ｓ）、またはヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質のｃＤＮＡをそれぞれコードする発現ベクターを共トランスフェクトした。上清を濃縮し（超遠心分離し）、透過型電子顕微鏡法（ＥＭ）によってＶＬＰの存在について画像化し、並行して、ナイーブ細胞の機能的ＶＬＰ形質導入について分析した。ＥＭ分析は、豊富な直径約１００ｎｍのＶＬＰの存在を示した。ｍＣｈｅｒｒｙのＲＴ－ｑＰＣＲは、Ｃｔｒｌ ＲＮＡではなくＴＩＰ ＲＮＡを使用して再構成したＶＬＰでは、ナイーブ細胞の実質的なＴＩＰ形質導入を示した（図１５Ａ）。
ＴＩＰ ｍＲＮＡが直接結合し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスタンパク質と競合するかどうかを試験するために、電気移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）をＴＩＰ ｍＲＮＡおよびウイルスタンパク質に対して行った。精製ＴＩＰ１またはＴＩＰ２ ＲＮＡとインキュベートした、ＲｄＲｐ複合体またはＮタンパク質のうちいずれかを発現する細胞抽出物のＥＭＳＡ分析は、ＴＩＰ ＲＮＡはＲｄＲｐ複合体とＮタンパク質の両方に結合するが、Ｃｔｒｌ ＲＮＡはこれらのタンパク質のいずれにも結合しないことを示した（図１５Ｂ）。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の状況におけるＴＩＰのＲ０を定量するために、上清移入アッセイ（ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ－ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｓｓａｙ）を「第１ラウンド上清移入アッセイ」に改変した。ＴＩＰトランスフェクト細胞を低ＭＯＩ（ＭＯＩ＝０．０５）で感染させ、洗浄してウイルスを除去し、感染の２時間後にＧＦＰ＋レポーター細胞を培養物に導入した（全細胞の約２０％）。レポーター細胞へのＴＩＰ動員を、感染１２時間後のＧＦＰ＋集団内のｍＣｈｅｒｒｙ＋細胞のパーセンテージを用いて定量した。感染依存性動員を、すべてのＲＮＡについて非感染試料と比較することによって確認し（図１５Ｃ～１５Ｄ）、対照ＲＮＡは、推定パッケージングシグナルを有する５’ＵＴＲを除いて、ウイルスの非存在下または存在下のいずれにおいても動員しなかった。ＴＩＰ＋細胞の割合（約８％）をバックグラウンド自己蛍光について補正して、６．３％のＴＩＰ＋細胞を得て（ＭＯＩ＝０．０５での元のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染についての約５％の感染細胞と比較）、これは、アッセイで２０％のＧＦＰ＋細胞の添加を考慮した後、４％の感染細胞に変換された。４％の細胞の最初の野生型感染から６．３％の新しい細胞に伝播するＴＩＰは、およそ５０％の増加またはおよそＲ０＝１．５７に相当する；比較のために、Ｒ０＝２は、ｍＣｈｅｒｒｙ＋である細胞の４％から８％への倍加を必要とする。ＴＩＰについてのこのＲ０＞１の発見は、連続継代アプローチ（図１６Ａ～１６Ｄを参照）を使用して以下の実施例でさらに検証される。
ＴＩＰ ＲＮＡがビリオンに高レベルでパッケージングされたことを検証するために、上清から単離したビリオンにおいてＴＩＰ ＲＮＡ対ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムＲＮＡの相対割合をＲＴ－ｑＰＣＲによって定量した（図１５Ｅ）。分析は、ＴＩＰ ＲＮＡがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスゲノムと比較して有意に富化されている（１．５～２倍）ことを示した。
全体として、これらのデータは、ＴＩＰがウイルス侵入または早期ウイルス発現を制限しないこと（すなわち、細胞応答の誘導を介して）、ＴＩＰ ＲＮＡがＭ、Ｎ、ＥおよびＳの存在下で機能的ＴＩＰ ＶＬＰを生成すること、ＴＩＰ ＲＮＡが細胞内のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質に結合し、それについて競合し得ること、ならびにパッケージングおよび複製リソースについての競合が、測定されたＴＩＰ媒介性収量減少を定量的に説明するのに十分であることを示している。
実施例８：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＴＩＰは、抵抗の発生に対する高い障壁を示す
実施例８：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＴＩＰは、抵抗の発生に対する高い障壁を示す
ウイルス上清を新しいナイーブ細胞に継続的に連続継代して高レベルのウイルス感染を維持する長期ウイルス培養物を確立し、ウイルスエスケープ変異体について選択した（図１６Ａ）。Ｃｔｒｌ ＲＮＡまたはＴＩＰ１ ＲＮＡのうちいずれかをトランスフェクトした細胞を使用して連続ウイルス培養を開始し、次いで、細胞を感染させ、ウイルス上清をナイーブ非トランスフェクト細胞上に４８時間ごとに約３週間連続継代し、各継代でウイルスを滴定した。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２複製適合性は、Ｃｔｒｌ ＲＮＡ連続培養で３週間にわたって約１－Ｌｏｇまで強化された（図１６Ｂ）。対照的に、ＴＩＰ ＲＮＡの存在下で開始された連続培養は、ＰＦＵによるウイルス力価の即時の約２ Ｌｏｇ減少を示し（図１６Ｂ）、単一ラウンドの収量減少データと一致した（図１４Ａ～１４Ｅ）。このウイルス力価の減少は、２０日間の培養の経過にわたって持続した。
連続培養におけるこのウイルス量減少が、細胞特異性ではなくＴＩＰ干渉によるものであることを検証するために、２０日後の並行対照培養からの上清を使用して、ＴＩＰ ＲＮＡの存在下で細胞を感染させ、ウイルス力価の２－Ｌｏｇ減少を再現した（図１６Ｃ）。培養上清のＲＴ－ｑＰＣＲ分析は、ＴＩＰ ＲＮＡが２０日目にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡと比較して４倍の増加を示すことを示した（図１６Ｄ）。ＴＩＰ ＲＮＡは感染培養物に１回だけ添加されたので（すなわち、０日目の単回投与）、これらの連続培養データは、ＴＩＰの条件付きの増幅および持続的伝播、すなわちＲ０＞１を示している。
実施例９：鼻腔内ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＴＩＰ送達はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を阻害し、炎症誘発性サイトカインを減少させ、ハムスターの肺水腫を予防する
実施例９：鼻腔内ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＴＩＰ送達はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を阻害し、炎症誘発性サイトカインを減少させ、ハムスターの肺水腫を予防する
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染のシリアンゴールデンハムスターモデル（Ｓｉａ ｅｔ ａｌ．，２０２０）を使用して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＴＩＰのインビボ有効性をアッセイした。
様々なＲＮＡ送達アプローチの鼻腔内投与を、げっ歯類の気道にＲＮＡを効率的に送達する能力について試験した。インビトロ転写ルシフェラーゼ発現ＲＮＡを使用して、精製ＲＮＡ単独（「裸のＲＮＡ」）、カチオン性ポリマーナノキャリア（すなわち、ポリエチレンイミン）に封入されたＲＮＡ、および脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）に封入されたＲＮＡを試験した。ＬＮＰは、鼻腔内投与後に肺への効率的なインビボＲＮＡ送達を示した（図１７Ａ）。ＴＩＰ１ ＲＮＡまたはＣｔｒｌ ＲＮＡのうちいずれかを含有するＬＮＰを生成し、特徴づけた。ＬＮＰ封入ＴＩＰ ＲＮＡは、Ｖｅｒｏ細胞における収量減少アッセイを使用して抗ウイルス効果を保持した（図１７Ｂ）。
次に、ＴＩＰまたはＣｔｒｌ ＲＮＡ ＬＮＰをシリアンゴールデンハムスターの鼻腔内に投与し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（１０６ ＰＦＵ）でチャレンジした（図１７Ｃ）。対照処置ハムスターは感染後に体重減少を示したが、これはＴＩＰ処置によって有意に改善された（図１７Ｄ）。ハムスターから５日目に採取した肺組織における感染性ウイルスの分析により、ＴＩＰ処置動物におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス量の有意な約２ Ｌｏｇ減少が確認された（図１７Ｅ）。１匹の動物はウイルス量の減少を示さなかったが、これはＴＩＰの非効率的投与／送達と一致し得る。肺におけるウイルス転写物のＲＴ－ｑＰＣＲ分析は、ＴＩＰ処置動物のウイルス量における相関するがより少ない１－Ｌｏｇ減少を示した（図１７Ｆ）。
ＴＩＰの条件付き伝播がインビボでのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２阻害と相関するかどうかを決定するために、ＴＩＰ発現をＲＴ－ｑＰＣＲによって５日目に肺で分析した。高レベルのＴＩＰ ＲＮＡが観察されたが（図１８Ａ）、５日目のＣｔｒｌ ＲＮＡは実質的に低いレベルで存在した（図１８Ｂ）。さらに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の存在がＴＩＰの条件付き伝播に必須であることを確認するために、ハムスター肺における５日目のウイルスの存在下と非存在下でのＴＩＰまたはＣｔｒｌ ＲＮＡの量を決定した。肺におけるＣｔｒｌ ＲＮＡレベルは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の存在下で４ Ｌｏｇまで有意に増幅されたＴＩＰ ＲＮＡとは対照的に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染によって影響されなかった（図１８Ｃ）。ＴＩＰ処置動物におけるルシフェラーゼおよび対照動物におけるｍＣｈｅｒｒｙについてのＲＴ－ｑＰＣＲ閾値サイクル（Ｃｔ）値はすべて＞３０であり、無視できる非特異的増幅を示した。
感染動物の肺におけるサイトカインおよびインターフェロン応答を、ＲＮＡシーケンシング（ＲＮＡｓｅｑ）を行うことによって分析した。ハムスター肺試料の分析は、２０６個の上方調節遺伝子および２３３個の下方調節遺伝子によってＴＩＰ処置動物を対照処置動物から明確に区別することができることを示した（図１９Ａ）。これらの差次的発現遺伝子（ＤＥＧ）は、非感染ハムスター肺試料と共に分析した場合、４つのクラスターを形成する（図１９Ａ）。ＴＩＰ処置動物における下方調節された遺伝子の大部分は、インターフェロン刺激遺伝子（ＩＳＧ）（２３３個のうち１５７個；図１９Ｂ）、特にクラスターＩＩＩ内の遺伝子（１２１個のうち９７個；図１９Ｂ）であった。遺伝子オントロジー（ＧＯ）分析は、ＴＩＰ処置が、クラスターＩＩＩにおいて有意に富化されている炎症誘発性免疫応答経路を有意に下方調節することを示した（図１９Ｃ）。ＴＩＰ処置試料（図１９Ｄ）におけるクラスターＩＩＩ遺伝子の発現減少は、免疫応答の軽減を示唆した。具体的には、Ｉｌ６、Ｃｃｌ２、Ｃｃｌ７、Ｃｘｃｌ１０、Ｃｃｒ１を含む、ＣＯＶＩＤ－１９患者において上方調節されることが以前に報告された炎症誘発性サイトカインおよび受容体の発現レベルが、ＴＩＰ処置動物において有意に減少した（図１９Ｅおよび図１９Ｆ）。重要なことに、感染動物においてＴＩＰ処置とＣｔｒｌ処置とを区別することができるＤＥＧは、非感染動物においてＴＩＰを対照から分離することができず（図１９Ａ対図１９Ｇ）、緩和された炎症誘発性免疫応答が感染依存的であり、ＴＩＰ ＲＮＡだけによるものではないことを示している。
５日目のハムスター肺組織試料の組織学的分析を行った。重度の肺水腫の徴候を示す対照動物は、ＴＩＰ処置動物には存在しない（図２０Ａ）。具体的には、すべての動物が感染と一致して炎症のいくつかの徴候を示すにもかかわらず、対照動物は、顕著な肺胞浮腫および肺胞腔の目立った細胞浸潤（図２０Ａ）を示し、血管漏出を示した。ＴＩＰ処置動物の肺は、実質的に少ない浮腫および細胞浸潤を示した。画像の組織病理学的スコアリング（図２０Ｂ）は、ＴＩＰ処置ハムスターにおける肺胞浮腫および細胞浸潤の有意な減少を示した（図２０Ｃ）。ＴＩＰまたはＣｔｒｌ ＲＮＡ ＬＮＰで処置した非感染ハムスターを対照として使用し、肺胞浮腫および浸潤物の有意差はなく、重度の血管漏出がウイルス感染に起因することが確認された（図２０Ｄ）。
曝露後の治療状況におけるＴＩＰの有効性を試験するために、ハムスターにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（１０６ ＰＦＵ）を接種し、次いで、感染後１２時間でＬＮＰ ＴＩＰまたはＬＮＰ Ｃｔｒｌ ＲＮＡを単回鼻腔内投与した（図２１Ａ）。上記の結果と一致して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス量の有意な減少（図２１Ｂ）ならびに５日目の動物の肺における病理発生の減少（図２１Ｃ～２１Ｅ）が観察された。
上記の組成物のうちいずれか１つおよび上記の方法のうちいずれか１つの指示を含むキットおよび製造品も提供される。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２複製に干渉することができる組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物であって、
（ａ）少なくとも１００ヌクレオチドのＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２ ５’ＵＴＲまたはそのバリアントを含む５’ＵＴＲ領域と、
（ｂ）介在配列と、
（ｃ）少なくとも１００ヌクレオチドのＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２ ３’ＵＴＲまたはそのバリアントを含む３’ＵＴＲ領域とを含み、
前記組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物が、それ自体で複製することができず、
前記組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の存在下で複製することができ、
前記介在配列が、約１ｂｐ～約２９０００ｂｐである、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
（項目２）
前記組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物中の前記５’ＵＴＲ領域、オプショナルの前記介在配列、および前記３’ＵＴＲ領域の全長が、約１０００ｂｐ～約１００００ｂｐである、項目１に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
（項目３）
前記組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物中の前記５’ＵＴＲ領域、オプショナルの前記介在配列、および前記３’ＵＴＲ領域の全長が、約２０００ｂｐ～約３５００ｂｐである、項目２に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
（項目４）
前記５’ＵＴＲ領域が、配列番号１のヌクレオチド１～２６５またはそのバリアントを含む、項目１～３のうちいずれか一項に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
（項目５）
前記５’ＵＴＲ領域が、５’ＵＴＲ配列の２またはそれを超えるコピーを含み、それぞれが少なくとも１００ヌクレオチドのＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２ ５’ＵＴＲまたはそのバリアントを含む、項目１～４のうちいずれか一項に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
（項目６）
前記３’ＵＴＲ領域が、配列番号１のヌクレオチド２９６７５～２９８７０またはそのバリアントを含む、項目１～５のうちいずれか一項に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
（項目７）
前記３’ＵＴＲ領域が、配列番号１のヌクレオチド２９６７５～２９９０３またはそのバリアントを含む、項目６に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
（項目８）
前記３’ＵＴＲ領域が、３’ＵＴＲ配列の２またはそれを超えるコピーを含み、それぞれが少なくとも１００ヌクレオチドのＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２ ３’ＵＴＲまたはそのバリアントを含む、項目１～７のうちいずれか一項に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
（項目９）
ＳＡＲ－ＣｏＶ－２についてのパッケージングシグナルをさらに含む、項目１～８のうちいずれか一項に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
（項目１０）
前記パッケージングシグナルが、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ５’ＵＴＲ内のステムループ５を含む、項目９に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
（項目１１）
前記介在配列が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列、異種配列、またはそれらの組み合わせを含む、項目１～８のうちいずれか一項に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
（項目１２）
前記介在配列がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列を含む、項目１１に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
（項目１３）
前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列が機能性ウイルスタンパク質をコードしない、項目１２に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
（項目１４）
配列番号１のヌクレオチド１～４５０またはそのバリアントを含む、項目１～１３のうちいずれか一項に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
（項目１５）
配列番号１のヌクレオチド１～１５４０またはそのバリアントを含む、項目１～１４のうちいずれか一項に記載の組換えＳＡＲ－ＣｏＶ－２構築物。
（項目１６）
配列番号１のヌクレオチド２９５４３～２９９０３またはそのバリアントを含む、項目１～１５のうちいずれか一項に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
（項目１７）
配列番号１のヌクレオチド２９１９１～２９９０３またはそのバリアントを含む、項目１～１６のうちいずれか一項に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
（項目１８）
前記介在配列が異種配列を含む、項目１～１７のうちいずれか一項に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
（項目１９）
前記異種配列が機能性タンパク質をコードしない、項目１８に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
（項目２０）
前記異種配列が、１またはそれを超える機能性タンパク質をコードする、項目１８に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
（項目２１）
前記異種配列がレポータータンパク質をコードする、項目２０に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
（項目２２）
前記異種配列がマーカー配列を含む、項目１８～２１のうちいずれか一項に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
（項目２３）
前記マーカー配列がバーコード配列である、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２。
（項目２４）
ｍＲＮＡである、項目１～２３のうちいずれかに記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
（項目２５）
３’改変または３’伸長配列をさらに含む、項目２４に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
（項目２６）
前記３’伸長配列が伸長ポリＡ配列である、項目２５に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
（項目２７）
前記伸長ポリＡ配列が少なくとも約１００個のアデニンヌクレオチドを含む、項目２６に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
（項目２８）
５’改変をさらに含む、項目２４～２７のうちいずれか一項に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
（項目２９）
前記５’改変が５’キャップである、項目２８に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
（項目３０）
前記５’キャップが５’メチルキャップである、項目２９に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
（項目３１）
ＤＮＡである、項目１～２３のうちいずれか一項に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
（項目３２）
ベクターである、項目３１に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
（項目３３）
前記５’ＵＴＲ領域の上流にプロモーターをさらに含む、項目３２に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
（項目３４）
前記プロモーターがＴ７プロモーターである、項目３３に記載の組換えＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２構築物。
（項目３５）
３’伸長ポリＡ配列またはポリＡ付加のためのシグナルをさらに含む、項目３１～３４のうちいずれかに記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
（項目３６）
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した宿主細胞中に存在する場合、前記構築物ＳＡＲ－ＣｏＶ－２のゲノムＲＮＡの、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノムＲＮＡに対する比が前記細胞において１を超えるように、前記組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物のゲノムＲＮＡが前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノムＲＮＡよりも高い速度で産生される、項目１～３５のいずれか一項に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
（項目３７）
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と同じまたはより低い伝播頻度を有する、項目１～３６のうちいずれか一項に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
（項目３８）
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２よりも高い伝播頻度を有する、項目１～３６のうちいずれか一項に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
（項目３９）
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した宿主細胞中に存在する場合、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と同じまたはより高い効率でパッケージングされる、項目１～３８のうちいずれか一項に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
（項目４０）
基本再生産比（Ｒ ０ ）＞１を有する、項目１～３９のうちいずれか一項に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
（項目４１）
項目１～４０のうちいずれか一項に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物とウイルスエンベロープタンパク質とを含むウイルス様粒子。
（項目４２）
項目１～４０のうちいずれか一項に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物を含む単離された細胞。
（項目４３）
項目１～４０のうちいずれか一項に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物と、薬学的に許容され得る賦形剤とを含む医薬組成物。
（項目４４）
前記組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物が送達ビヒクル中に存在する、項目３５に記載の医薬組成物。
（項目４５）
前記送達ビヒクルが脂質ナノ粒子である、項目４４に記載の医薬組成物。
（項目４６）
前記医薬組成物がエアロゾル製剤である、項目４３～４５のうちいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目４７）
個体におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を処置または予防する方法であって、有効量の項目４３～４６のうちいずれか一項に記載の医薬組成物を前記個体に投与することを含む方法。
（項目４８）
前記医薬組成物が、前記個体がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染する前に投与される、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
前記医薬組成物が、前記個体がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した後に投与される、項目４７に記載の方法。
（項目５０）
前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が、Ｂ．１．１．７、Ｂ．１．３５１、Ｐ．１、またはＢ．１．６１７．２から選択されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株に由来する、項目４７～４９のうちいずれか一項に記載の方法。
（項目５１）
前記医薬組成物が単回用量として投与される、項目４７～５０のうちいずれか一項に記載の方法。
（項目５２）
前記医薬組成物が複数回用量として投与される、項目４７～５０のうちいずれか一項に記載の方法。
（項目５３）
前記医薬組成物が鼻腔内投与される、項目４７～５２のうちいずれか一項に記載の方法。
（項目５４）
前記個体が、医学的状態、既存の状態、または心臓、肺、脳もしくは免疫系の機能を低下させる状態を有する、項目４７～５３のうちいずれか一項に記載の方法。
（項目５５）
前記個体が免疫無防備状態である、項目４７～５４のうちいずれか一項に記載の方法。
（項目５６）
前記個体がヒトである、項目４７～５５のうちいずれか一項に記載の方法。
（項目５７）
個体におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染症を処置するまたは処置もしくは予防するためのキットであって、項目２４～２８のうちいずれか一項に記載の医薬組成物および項目４０～４９のうちいずれか一項に記載の方法を実施するための指示を含むキット。
（項目５８）
ＴＲＳ１－Ｌ：５’－ｃｕａａａｃ－３’（配列番号３６）、ＴＲＳ２－Ｌ：５’－ａｃｇａａｃ－３’（配列番号３７）、ＴＲＳ３－Ｌ、５’－ｃｕａａａｃｇａａｃ－３’（配列番号３８）、またはそれらの組合せのうちの複数のうちの１つに結合し得る、１つまたはそれを超えるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２転写調節配列（ＴＲＳ）の阻害剤。
（項目５９）
以下を含むか、または以下から本質的になる配列：
ＴＲＳ１－ＡＣＧＡＡＣＣＵＡＡＡＣＡＣＧＡＡＣＣＵＡＡＡＣ（配列番号２５）、
ＴＲＳ２－ＡＣＧＡＡＣＡＣＧＡＡＣＡＣＧＡＡＣＡＣＧＡＡＣ（配列番号２６）、
ＴＲＳ３－ＣＵＡＡＡＣＣＵＡＡＡＣＣＵＡＡＡＣＣＵＡＡＡＣ（配列番号２７）、または
それらの組合せ
を含む、項目５８に記載の阻害剤。
（項目６０）
項目５８または５９に記載の阻害剤、および薬学的に許容され得る賦形剤を含む、医薬組成物。
（項目６１）
薬学的に許容され得る賦形剤、（ａ）ＴＲＳ１－Ｌ：５’－ｃｕａａａｃ－３’（配列番号３６）、ＴＲＳ２－Ｌ：５’－ａｃｇａａｃ－３’（配列番号３７）、ＴＲＳ３－Ｌ、５’－ｃｕａａａｃｇａａｃ－３’（配列番号３８）、またはそれらの組合せのうちの複数のうちの１つに結合し得るＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２転写調節配列（ＴＲＳ）の阻害剤、および（ｂ）少なくとも１００ヌクレオチドのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、少なくとも１００ヌクレオチドのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）、またはそれらの組合せを含む組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物を含む、医薬組成物。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２複製に干渉することができる組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物であって、
（ａ）少なくとも１００ヌクレオチドのＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２ ５’ＵＴＲまたはそのバリアントを含む５’ＵＴＲ領域と、
（ｂ）介在配列と、
（ｃ）少なくとも１００ヌクレオチドのＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２ ３’ＵＴＲまたはそのバリアントを含む３’ＵＴＲ領域とを含み、
前記組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物が、それ自体で複製することができず、
前記組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の存在下で複製することができ、
前記介在配列が、約１ｂｐ～約２９０００ｂｐである、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
（項目２）
前記組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物中の前記５’ＵＴＲ領域、オプショナルの前記介在配列、および前記３’ＵＴＲ領域の全長が、約１０００ｂｐ～約１００００ｂｐである、項目１に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
（項目３）
前記組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物中の前記５’ＵＴＲ領域、オプショナルの前記介在配列、および前記３’ＵＴＲ領域の全長が、約２０００ｂｐ～約３５００ｂｐである、項目２に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
（項目４）
前記５’ＵＴＲ領域が、配列番号１のヌクレオチド１～２６５またはそのバリアントを含む、項目１～３のうちいずれか一項に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
（項目５）
前記５’ＵＴＲ領域が、５’ＵＴＲ配列の２またはそれを超えるコピーを含み、それぞれが少なくとも１００ヌクレオチドのＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２ ５’ＵＴＲまたはそのバリアントを含む、項目１～４のうちいずれか一項に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
（項目６）
前記３’ＵＴＲ領域が、配列番号１のヌクレオチド２９６７５～２９８７０またはそのバリアントを含む、項目１～５のうちいずれか一項に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
（項目７）
前記３’ＵＴＲ領域が、配列番号１のヌクレオチド２９６７５～２９９０３またはそのバリアントを含む、項目６に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
（項目８）
前記３’ＵＴＲ領域が、３’ＵＴＲ配列の２またはそれを超えるコピーを含み、それぞれが少なくとも１００ヌクレオチドのＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２ ３’ＵＴＲまたはそのバリアントを含む、項目１～７のうちいずれか一項に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
（項目９）
ＳＡＲ－ＣｏＶ－２についてのパッケージングシグナルをさらに含む、項目１～８のうちいずれか一項に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
（項目１０）
前記パッケージングシグナルが、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ５’ＵＴＲ内のステムループ５を含む、項目９に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
（項目１１）
前記介在配列が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列、異種配列、またはそれらの組み合わせを含む、項目１～８のうちいずれか一項に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
（項目１２）
前記介在配列がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列を含む、項目１１に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
（項目１３）
前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列が機能性ウイルスタンパク質をコードしない、項目１２に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
（項目１４）
配列番号１のヌクレオチド１～４５０またはそのバリアントを含む、項目１～１３のうちいずれか一項に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
（項目１５）
配列番号１のヌクレオチド１～１５４０またはそのバリアントを含む、項目１～１４のうちいずれか一項に記載の組換えＳＡＲ－ＣｏＶ－２構築物。
（項目１６）
配列番号１のヌクレオチド２９５４３～２９９０３またはそのバリアントを含む、項目１～１５のうちいずれか一項に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
（項目１７）
配列番号１のヌクレオチド２９１９１～２９９０３またはそのバリアントを含む、項目１～１６のうちいずれか一項に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
（項目１８）
前記介在配列が異種配列を含む、項目１～１７のうちいずれか一項に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
（項目１９）
前記異種配列が機能性タンパク質をコードしない、項目１８に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
（項目２０）
前記異種配列が、１またはそれを超える機能性タンパク質をコードする、項目１８に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
（項目２１）
前記異種配列がレポータータンパク質をコードする、項目２０に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
（項目２２）
前記異種配列がマーカー配列を含む、項目１８～２１のうちいずれか一項に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
（項目２３）
前記マーカー配列がバーコード配列である、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２。
（項目２４）
ｍＲＮＡである、項目１～２３のうちいずれかに記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
（項目２５）
３’改変または３’伸長配列をさらに含む、項目２４に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
（項目２６）
前記３’伸長配列が伸長ポリＡ配列である、項目２５に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
（項目２７）
前記伸長ポリＡ配列が少なくとも約１００個のアデニンヌクレオチドを含む、項目２６に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
（項目２８）
５’改変をさらに含む、項目２４～２７のうちいずれか一項に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
（項目２９）
前記５’改変が５’キャップである、項目２８に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
（項目３０）
前記５’キャップが５’メチルキャップである、項目２９に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
（項目３１）
ＤＮＡである、項目１～２３のうちいずれか一項に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
（項目３２）
ベクターである、項目３１に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
（項目３３）
前記５’ＵＴＲ領域の上流にプロモーターをさらに含む、項目３２に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
（項目３４）
前記プロモーターがＴ７プロモーターである、項目３３に記載の組換えＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２構築物。
（項目３５）
３’伸長ポリＡ配列またはポリＡ付加のためのシグナルをさらに含む、項目３１～３４のうちいずれかに記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
（項目３６）
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した宿主細胞中に存在する場合、前記構築物ＳＡＲ－ＣｏＶ－２のゲノムＲＮＡの、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノムＲＮＡに対する比が前記細胞において１を超えるように、前記組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物のゲノムＲＮＡが前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノムＲＮＡよりも高い速度で産生される、項目１～３５のいずれか一項に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
（項目３７）
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と同じまたはより低い伝播頻度を有する、項目１～３６のうちいずれか一項に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
（項目３８）
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２よりも高い伝播頻度を有する、項目１～３６のうちいずれか一項に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
（項目３９）
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した宿主細胞中に存在する場合、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と同じまたはより高い効率でパッケージングされる、項目１～３８のうちいずれか一項に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
（項目４０）
基本再生産比（Ｒ ０ ）＞１を有する、項目１～３９のうちいずれか一項に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
（項目４１）
項目１～４０のうちいずれか一項に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物とウイルスエンベロープタンパク質とを含むウイルス様粒子。
（項目４２）
項目１～４０のうちいずれか一項に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物を含む単離された細胞。
（項目４３）
項目１～４０のうちいずれか一項に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物と、薬学的に許容され得る賦形剤とを含む医薬組成物。
（項目４４）
前記組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物が送達ビヒクル中に存在する、項目３５に記載の医薬組成物。
（項目４５）
前記送達ビヒクルが脂質ナノ粒子である、項目４４に記載の医薬組成物。
（項目４６）
前記医薬組成物がエアロゾル製剤である、項目４３～４５のうちいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目４７）
個体におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を処置または予防する方法であって、有効量の項目４３～４６のうちいずれか一項に記載の医薬組成物を前記個体に投与することを含む方法。
（項目４８）
前記医薬組成物が、前記個体がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染する前に投与される、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
前記医薬組成物が、前記個体がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した後に投与される、項目４７に記載の方法。
（項目５０）
前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が、Ｂ．１．１．７、Ｂ．１．３５１、Ｐ．１、またはＢ．１．６１７．２から選択されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株に由来する、項目４７～４９のうちいずれか一項に記載の方法。
（項目５１）
前記医薬組成物が単回用量として投与される、項目４７～５０のうちいずれか一項に記載の方法。
（項目５２）
前記医薬組成物が複数回用量として投与される、項目４７～５０のうちいずれか一項に記載の方法。
（項目５３）
前記医薬組成物が鼻腔内投与される、項目４７～５２のうちいずれか一項に記載の方法。
（項目５４）
前記個体が、医学的状態、既存の状態、または心臓、肺、脳もしくは免疫系の機能を低下させる状態を有する、項目４７～５３のうちいずれか一項に記載の方法。
（項目５５）
前記個体が免疫無防備状態である、項目４７～５４のうちいずれか一項に記載の方法。
（項目５６）
前記個体がヒトである、項目４７～５５のうちいずれか一項に記載の方法。
（項目５７）
個体におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染症を処置するまたは処置もしくは予防するためのキットであって、項目２４～２８のうちいずれか一項に記載の医薬組成物および項目４０～４９のうちいずれか一項に記載の方法を実施するための指示を含むキット。
（項目５８）
ＴＲＳ１－Ｌ：５’－ｃｕａａａｃ－３’（配列番号３６）、ＴＲＳ２－Ｌ：５’－ａｃｇａａｃ－３’（配列番号３７）、ＴＲＳ３－Ｌ、５’－ｃｕａａａｃｇａａｃ－３’（配列番号３８）、またはそれらの組合せのうちの複数のうちの１つに結合し得る、１つまたはそれを超えるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２転写調節配列（ＴＲＳ）の阻害剤。
（項目５９）
以下を含むか、または以下から本質的になる配列：
ＴＲＳ１－ＡＣＧＡＡＣＣＵＡＡＡＣＡＣＧＡＡＣＣＵＡＡＡＣ（配列番号２５）、
ＴＲＳ２－ＡＣＧＡＡＣＡＣＧＡＡＣＡＣＧＡＡＣＡＣＧＡＡＣ（配列番号２６）、
ＴＲＳ３－ＣＵＡＡＡＣＣＵＡＡＡＣＣＵＡＡＡＣＣＵＡＡＡＣ（配列番号２７）、または
それらの組合せ
を含む、項目５８に記載の阻害剤。
（項目６０）
項目５８または５９に記載の阻害剤、および薬学的に許容され得る賦形剤を含む、医薬組成物。
（項目６１）
薬学的に許容され得る賦形剤、（ａ）ＴＲＳ１－Ｌ：５’－ｃｕａａａｃ－３’（配列番号３６）、ＴＲＳ２－Ｌ：５’－ａｃｇａａｃ－３’（配列番号３７）、ＴＲＳ３－Ｌ、５’－ｃｕａａａｃｇａａｃ－３’（配列番号３８）、またはそれらの組合せのうちの複数のうちの１つに結合し得るＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２転写調節配列（ＴＲＳ）の阻害剤、および（ｂ）少なくとも１００ヌクレオチドのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、少なくとも１００ヌクレオチドのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）、またはそれらの組合せを含む組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物を含む、医薬組成物。
Claims (61)
- ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２複製に干渉することができる組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物であって、
（ａ）少なくとも１００ヌクレオチドのＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２ ５’ＵＴＲまたはそのバリアントを含む５’ＵＴＲ領域と、
（ｂ）介在配列と、
（ｃ）少なくとも１００ヌクレオチドのＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２ ３’ＵＴＲまたはそのバリアントを含む３’ＵＴＲ領域とを含み、
前記組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物が、それ自体で複製することができず、
前記組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の存在下で複製することができ、
前記介在配列が、約１ｂｐ～約２９０００ｂｐである、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。 - 前記組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物中の前記５’ＵＴＲ領域、オプショナルの前記介在配列、および前記３’ＵＴＲ領域の全長が、約１０００ｂｐ～約１００００ｂｐである、請求項１に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
- 前記組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物中の前記５’ＵＴＲ領域、オプショナルの前記介在配列、および前記３’ＵＴＲ領域の全長が、約２０００ｂｐ～約３５００ｂｐである、請求項２に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
- 前記５’ＵＴＲ領域が、配列番号１のヌクレオチド１～２６５またはそのバリアントを含む、請求項１～３のうちいずれか一項に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
- 前記５’ＵＴＲ領域が、５’ＵＴＲ配列の２またはそれを超えるコピーを含み、それぞれが少なくとも１００ヌクレオチドのＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２ ５’ＵＴＲまたはそのバリアントを含む、請求項１～４のうちいずれか一項に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
- 前記３’ＵＴＲ領域が、配列番号１のヌクレオチド２９６７５～２９８７０またはそのバリアントを含む、請求項１～５のうちいずれか一項に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
- 前記３’ＵＴＲ領域が、配列番号１のヌクレオチド２９６７５～２９９０３またはそのバリアントを含む、請求項６に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
- 前記３’ＵＴＲ領域が、３’ＵＴＲ配列の２またはそれを超えるコピーを含み、それぞれが少なくとも１００ヌクレオチドのＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２ ３’ＵＴＲまたはそのバリアントを含む、請求項１～７のうちいずれか一項に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
- ＳＡＲ－ＣｏＶ－２についてのパッケージングシグナルをさらに含む、請求項１～８のうちいずれか一項に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
- 前記パッケージングシグナルが、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ５’ＵＴＲ内のステムループ５を含む、請求項９に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
- 前記介在配列が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列、異種配列、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１～８のうちいずれか一項に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
- 前記介在配列がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列を含む、請求項１１に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
- 前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列が機能性ウイルスタンパク質をコードしない、請求項１２に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
- 配列番号１のヌクレオチド１～４５０またはそのバリアントを含む、請求項１～１３のうちいずれか一項に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
- 配列番号１のヌクレオチド１～１５４０またはそのバリアントを含む、請求項１～１４のうちいずれか一項に記載の組換えＳＡＲ－ＣｏＶ－２構築物。
- 配列番号１のヌクレオチド２９５４３～２９９０３またはそのバリアントを含む、請求項１～１５のうちいずれか一項に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
- 配列番号１のヌクレオチド２９１９１～２９９０３またはそのバリアントを含む、請求項１～１６のうちいずれか一項に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
- 前記介在配列が異種配列を含む、請求項１～１７のうちいずれか一項に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
- 前記異種配列が機能性タンパク質をコードしない、請求項１８に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
- 前記異種配列が、１またはそれを超える機能性タンパク質をコードする、請求項１８に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
- 前記異種配列がレポータータンパク質をコードする、請求項２０に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
- 前記異種配列がマーカー配列を含む、請求項１８～２１のうちいずれか一項に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
- 前記マーカー配列がバーコード配列である、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２。
- ｍＲＮＡである、請求項１～２３のうちいずれかに記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
- ３’改変または３’伸長配列をさらに含む、請求項２４に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
- 前記３’伸長配列が伸長ポリＡ配列である、請求項２５に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
- 前記伸長ポリＡ配列が少なくとも約１００個のアデニンヌクレオチドを含む、請求項２６に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
- ５’改変をさらに含む、請求項２４～２７のうちいずれか一項に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
- 前記５’改変が５’キャップである、請求項２８に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
- 前記５’キャップが５’メチルキャップである、請求項２９に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
- ＤＮＡである、請求項１～２３のうちいずれか一項に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
- ベクターである、請求項３１に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
- 前記５’ＵＴＲ領域の上流にプロモーターをさらに含む、請求項３２に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
- 前記プロモーターがＴ７プロモーターである、請求項３３に記載の組換えＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２構築物。
- ３’伸長ポリＡ配列またはポリＡ付加のためのシグナルをさらに含む、請求項３１～３４のうちいずれかに記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
- ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した宿主細胞中に存在する場合、前記構築物ＳＡＲ－ＣｏＶ－２のゲノムＲＮＡの、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノムＲＮＡに対する比が前記細胞において１を超えるように、前記組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物のゲノムＲＮＡが前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノムＲＮＡよりも高い速度で産生される、請求項１～３５のいずれか一項に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
- ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と同じまたはより低い伝播頻度を有する、請求項１～３６のうちいずれか一項に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
- ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２よりも高い伝播頻度を有する、請求項１～３６のうちいずれか一項に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
- ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した宿主細胞中に存在する場合、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と同じまたはより高い効率でパッケージングされる、請求項１～３８のうちいずれか一項に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
- 基本再生産比（Ｒ０）＞１を有する、請求項１～３９のうちいずれか一項に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物。
- 請求項１～４０のうちいずれか一項に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物とウイルスエンベロープタンパク質とを含むウイルス様粒子。
- 請求項１～４０のうちいずれか一項に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物を含む単離された細胞。
- 請求項１～４０のうちいずれか一項に記載の組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物と、薬学的に許容され得る賦形剤とを含む医薬組成物。
- 前記組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物が送達ビヒクル中に存在する、請求項３５に記載の医薬組成物。
- 前記送達ビヒクルが脂質ナノ粒子である、請求項４４に記載の医薬組成物。
- 前記医薬組成物がエアロゾル製剤である、請求項４３～４５のうちいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 個体におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を処置または予防する方法であって、有効量の請求項４３～４６のうちいずれか一項に記載の医薬組成物を前記個体に投与することを含む方法。
- 前記医薬組成物が、前記個体がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染する前に投与される、請求項４７に記載の方法。
- 前記医薬組成物が、前記個体がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した後に投与される、請求項４７に記載の方法。
- 前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が、Ｂ．１．１．７、Ｂ．１．３５１、Ｐ．１、またはＢ．１．６１７．２から選択されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株に由来する、請求項４７～４９のうちいずれか一項に記載の方法。
- 前記医薬組成物が単回用量として投与される、請求項４７～５０のうちいずれか一項に記載の方法。
- 前記医薬組成物が複数回用量として投与される、請求項４７～５０のうちいずれか一項に記載の方法。
- 前記医薬組成物が鼻腔内投与される、請求項４７～５２のうちいずれか一項に記載の方法。
- 前記個体が、医学的状態、既存の状態、または心臓、肺、脳もしくは免疫系の機能を低下させる状態を有する、請求項４７～５３のうちいずれか一項に記載の方法。
- 前記個体が免疫無防備状態である、請求項４７～５４のうちいずれか一項に記載の方法。
- 前記個体がヒトである、請求項４７～５５のうちいずれか一項に記載の方法。
- 個体におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染症を処置するまたは処置もしくは予防するためのキットであって、請求項２４～２８のうちいずれか一項に記載の医薬組成物および請求項４０～４９のうちいずれか一項に記載の方法を実施するための指示を含むキット。
- ＴＲＳ１－Ｌ：５’－ｃｕａａａｃ－３’（配列番号３６）、ＴＲＳ２－Ｌ：５’－ａｃｇａａｃ－３’（配列番号３７）、ＴＲＳ３－Ｌ、５’－ｃｕａａａｃｇａａｃ－３’（配列番号３８）、またはそれらの組合せのうちの複数のうちの１つに結合し得る、１つまたはそれを超えるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２転写調節配列（ＴＲＳ）の阻害剤。
- 以下を含むか、または以下から本質的になる配列：
ＴＲＳ１－ＡＣＧＡＡＣＣＵＡＡＡＣＡＣＧＡＡＣＣＵＡＡＡＣ（配列番号２５）、
ＴＲＳ２－ＡＣＧＡＡＣＡＣＧＡＡＣＡＣＧＡＡＣＡＣＧＡＡＣ（配列番号２６）、
ＴＲＳ３－ＣＵＡＡＡＣＣＵＡＡＡＣＣＵＡＡＡＣＣＵＡＡＡＣ（配列番号２７）、または
それらの組合せ
を含む、請求項５８に記載の阻害剤。 - 請求項５８または５９に記載の阻害剤、および薬学的に許容され得る賦形剤を含む、医薬組成物。
- 薬学的に許容され得る賦形剤、（ａ）ＴＲＳ１－Ｌ：５’－ｃｕａａａｃ－３’（配列番号３６）、ＴＲＳ２－Ｌ：５’－ａｃｇａａｃ－３’（配列番号３７）、ＴＲＳ３－Ｌ、５’－ｃｕａａａｃｇａａｃ－３’（配列番号３８）、またはそれらの組合せのうちの複数のうちの１つに結合し得るＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２転写調節配列（ＴＲＳ）の阻害剤、および（ｂ）少なくとも１００ヌクレオチドのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、少なくとも１００ヌクレオチドのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）、またはそれらの組合せを含む組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構築物を含む、医薬組成物。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US202063014394P | 2020-04-23 | 2020-04-23 | |
| USPCT/US2021/028809 | 2021-04-23 | ||
| PCT/US2021/028809 WO2021216979A2 (en) | 2020-04-23 | 2021-04-23 | Therapeutic interfering particles for corona virus |
| PCT/US2022/026223 WO2022226423A2 (en) | 2020-04-23 | 2022-04-25 | Therapeutic interfering particles for corona virus |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2024515348A true JP2024515348A (ja) | 2024-04-09 |
Family
ID=78270205
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2022564795A Pending JP2023530049A (ja) | 2020-04-23 | 2021-04-23 | コロナウイルスに対する治療用干渉粒子 |
| JP2023564512A Pending JP2024515348A (ja) | 2020-04-23 | 2022-04-25 | コロナウイルスに対する治療用干渉粒子 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2022564795A Pending JP2023530049A (ja) | 2020-04-23 | 2021-04-23 | コロナウイルスに対する治療用干渉粒子 |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20230151367A1 (ja) |
| EP (2) | EP4153201A4 (ja) |
| JP (2) | JP2023530049A (ja) |
| KR (2) | KR20230028240A (ja) |
| CN (2) | CN116472345A (ja) |
| AU (2) | AU2021259847A1 (ja) |
| BR (2) | BR112022021562A2 (ja) |
| CA (2) | CA3181803A1 (ja) |
| IL (1) | IL297547A (ja) |
| MX (1) | MX2022013387A (ja) |
| WO (2) | WO2021216979A2 (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2021259847A1 (en) * | 2020-04-23 | 2022-12-15 | The J. David Gladstone Institutes | Therapeutic interfering particles for corona virus |
| WO2023015231A1 (en) * | 2021-08-04 | 2023-02-09 | The Regents Of The University Of California | Sars-cov-2 virus-like particles |
| WO2023108299A1 (en) * | 2021-12-17 | 2023-06-22 | The Royal Institution For The Advancement Of Learning/Mcgill University | Polypeptides capable of limiting the replication of a coronavirus |
| WO2023183794A2 (en) * | 2022-03-24 | 2023-09-28 | Mercury Bio, Inc. | Direct production of sirnas in saccharomyces boulardii and packaging in extracellular vesicles (evs) for targeted gene silencing |
| WO2024175707A1 (en) | 2023-02-22 | 2024-08-29 | Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung GmbH | A synthetic oligonucleotide for treating nidovirales infections |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005005596A2 (en) * | 2003-06-18 | 2005-01-20 | Chinese National Human Genome Center At Shanghai | Characterization of the earliest stages of the severe acute respiratory syndrome (sars) virus and uses thereof |
| US20050171044A1 (en) * | 2003-12-24 | 2005-08-04 | Stein David A. | Oligonucleotide compound and method for treating nidovirus infections |
| WO2014151771A1 (en) * | 2013-03-14 | 2014-09-25 | The J. David Gladstone Institutes | Compositions and methods for treating an immunodeficiency virus infection |
| US11141493B2 (en) * | 2014-03-10 | 2021-10-12 | Editas Medicine, Inc. | Compositions and methods for treating CEP290-associated disease |
| AU2021259847A1 (en) * | 2020-04-23 | 2022-12-15 | The J. David Gladstone Institutes | Therapeutic interfering particles for corona virus |
| RU2733361C1 (ru) * | 2020-07-14 | 2020-10-01 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр "Институт иммунологии" Федерального медико-биологического агентства России (ФГБУ "ГНЦ Институт иммунологии" ФМБА России) | Средство для ингибирования репликации вируса SARS-CoV-2, опосредованного РНК-интерференцией |
| CN112029781B (zh) * | 2020-08-14 | 2023-01-03 | 中山大学 | 一种新型冠状病毒SARS-CoV-2的安全型复制子系统及其应用 |
-
2021
- 2021-04-23 AU AU2021259847A patent/AU2021259847A1/en active Pending
- 2021-04-23 BR BR112022021562A patent/BR112022021562A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2021-04-23 EP EP21791727.7A patent/EP4153201A4/en active Pending
- 2021-04-23 WO PCT/US2021/028809 patent/WO2021216979A2/en active Application Filing
- 2021-04-23 KR KR1020227040803A patent/KR20230028240A/ko unknown
- 2021-04-23 CA CA3181803A patent/CA3181803A1/en active Pending
- 2021-04-23 US US17/920,682 patent/US20230151367A1/en active Pending
- 2021-04-23 JP JP2022564795A patent/JP2023530049A/ja active Pending
- 2021-04-23 IL IL297547A patent/IL297547A/en unknown
- 2021-04-23 CN CN202180037788.1A patent/CN116472345A/zh active Pending
- 2021-04-23 MX MX2022013387A patent/MX2022013387A/es unknown
-
2022
- 2022-04-25 AU AU2022262662A patent/AU2022262662A1/en active Pending
- 2022-04-25 CA CA3216708A patent/CA3216708A1/en active Pending
- 2022-04-25 CN CN202280030465.4A patent/CN117413063A/zh active Pending
- 2022-04-25 EP EP22792655.7A patent/EP4326398A2/en active Pending
- 2022-04-25 BR BR112023021422A patent/BR112023021422A2/pt unknown
- 2022-04-25 WO PCT/US2022/026223 patent/WO2022226423A2/en active Application Filing
- 2022-04-25 JP JP2023564512A patent/JP2024515348A/ja active Pending
- 2022-04-25 KR KR1020237039760A patent/KR20240004551A/ko unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP4153201A4 (en) | 2024-06-12 |
| AU2021259847A1 (en) | 2022-12-15 |
| BR112022021562A2 (pt) | 2023-02-07 |
| WO2022226423A3 (en) | 2022-12-15 |
| JP2023530049A (ja) | 2023-07-13 |
| CA3181803A1 (en) | 2021-10-28 |
| MX2022013387A (es) | 2023-05-17 |
| CA3216708A1 (en) | 2022-10-27 |
| EP4153201A2 (en) | 2023-03-29 |
| WO2021216979A3 (en) | 2021-11-25 |
| CN117413063A (zh) | 2024-01-16 |
| WO2021216979A2 (en) | 2021-10-28 |
| US20230151367A1 (en) | 2023-05-18 |
| KR20230028240A (ko) | 2023-02-28 |
| IL297547A (en) | 2022-12-01 |
| EP4326398A2 (en) | 2024-02-28 |
| BR112023021422A2 (pt) | 2024-01-30 |
| KR20240004551A (ko) | 2024-01-11 |
| CN116472345A (zh) | 2023-07-21 |
| AU2022262662A9 (en) | 2023-10-26 |
| AU2022262662A1 (en) | 2023-10-19 |
| WO2022226423A2 (en) | 2022-10-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2024515348A (ja) | コロナウイルスに対する治療用干渉粒子 | |
| US20240299525A1 (en) | Rsv rna vaccines | |
| US11497807B2 (en) | Zoonotic disease RNA vaccines | |
| Cheng et al. | D614G substitution of SARS-CoV-2 spike protein increases syncytium formation and virus titer via enhanced furin-mediated spike cleavage | |
| US11963975B2 (en) | Therapeutic targets for facioscapulohumeral muscular dystrophy | |
| Ma et al. | mRNA cap methylation influences pathogenesis of vesicular stomatitis virus in vivo | |
| US10662464B2 (en) | Methods of analyzing virus-derived therapeutics | |
| JP2021522178A (ja) | 病態治療のためのＲＮＡエディターのｍＲＮＡ駆動型発現 | |
| Avena | Characterizing Sudan Virus Evolution: Insights into Population Diversity and Inter-Genomic Relationships | |
| WO2023133418A2 (en) | Circular rna derived from rna viruses and related compositions and methods |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20231221 |