JP2023529484A - コロナウイルス診断組成物、方法、及びその使用 - Google Patents

コロナウイルス診断組成物、方法、及びその使用 Download PDF

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Abstract

本開示は組換えペプチド及びタンパク質を開示し、コロナウイルスのウイルス抗原及び免疫原、例えばコロナウイルスＳタンパク質ペプチドを含み、中和抗体などの分析物を分析するのに有用である。いくつかの態様において、組換ペプチド及びタンパク質はコロナウイルスの可溶性ウイルス抗原を含む分泌された融合タンパク質を含む。可溶性ウイルス抗原は、自己三量体化することができるコラーゲンのＣ末端部分にインフレーム融合により接続され、ジスルフィド結合で連結した三量体融合タンパク質を形成することができる。診断方法及び関連キットも開示する。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０２０年６月１０日に出願された国際特許出願番号ＰＣＴ／ＣＮ２０２０／０９５３３２、及び２０２１年４月１３日に出願されたＰＣＴ／ＣＮ２０２１／０８７０５１の優先権及び利益を主張するものであり、この出願の開示はあらゆる目的でその全体が参照により本明細書に組み入れられたものとする。
ＡＳＣＩＩテキストファイルの配列表の提出
ＡＳＣＩＩテキストファイルによる以下の提出内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられたものとする：コンピュータ読み込み可能形式（ＣＲＦ）の配列表（ファイル名：１６５７６２０００５４２ＳＥＱＬＩＳＴ．ＴＸＴ、記録日：２０２１年６月９日、サイズ：５７５ＫＢ）。
本開示は、いくつかの態様において、例えばコロナウイルス感染を診断する目的のため、コロナウイルス感染を検出及び／又は分析するためのコロナウイルスのウイルス抗原及び免疫原、例えばコロナウイルスＳタンパク質ペプチドを含む組換ペプチド及びタンパク質に関する。
コロナウイルスはエンベロープを持つポジティブセンス一本鎖ＲＮＡウイルスである。公知のＲＮＡウイルスのうち最も大きなゲノム（２６～３２ｋｂ）を有し、系統的に４つの属（α、β、γ、δ）に分けられ、βコロナウイルスは更に４つの系統（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）に細分される。コロナウイルスは広範囲の鳥類及びヒトを含む哺乳類種に感染する。ヒトコロナウイルスは毎年ヒトに広まり、一般的に軽度の呼吸器疾患を引き起こし得るが、重症度は小児、高齢者、及び免疫無防備状態で高くなり得る。一方、中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２としても知られる最新の２０１９新型コロナウイルス（２０１９－ｎＣｏＶ）など特定の他のコロナウイルスは、高い病原性がある。これらのコロナウイルスの高病原性及び空気感染は、更なるコロナウイルスパンデミックの可能性に対する懸念をもたらしている。コロナウイルス感染を診断するための効果的な試験が緊急に必要である。該及び他の必要性を満たす方法、使用及び製品が提供される。
いくつかの態様において、サンプルを分析する方法が本明細書で提供され、この方法は、コロナウイルスのＳタンパク質ペプチド、又はその断片もしくはエピトープを含むタンパク質（例、本明細書で開示されるＳ三量体、ＮＴＤ／ＲＢＤ三量体、ＲＢＤ三量体、Ｓ１三量体又はＳ２三量体）とサンプルを接触させること、並びにこのタンパク質と、コロナウイルスのＳタンパク質ペプチド、又はその断片もしくはエピトープに特異的に結合することができる分析物との間の結合を検出することを含む。いくつかの実施形態において、分析物はＳタンパク質ペプチド、又はその断片もしくはエピトープを認識する抗体、受容体又は細胞である。いくつかの実施形態において、結合はサンプル中の分析物の存在、及び／又はサンプルを得た対象のコロナウイルスによる感染を示す。
いくつかの態様において、本明細書の方法はウイルス感染中及び／又は本明細書で開示されるタンパク質もしくはペプチドでワクチン接種後、Ｓタンパク質ペプチド、又はその断片もしくはエピトープに特異的に結合することができる分析物の高感度な検出を提供する。前述の実施形態のいずれかにおいて、分析物はＩｇＧ抗体、ＩｇＭ抗体又はＩｇＥ抗体、例えばＳタンパク質ペプチド、又はその断片もしくはエピトープに特異的なものとすることができる。前述の実施形態のいずれかにおいて、分析物はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２などのコロナウイルスに対する中和抗体とすることができる。前述の実施形態のいずれかにおいて、本方法はＥＬＩＳＡ又はラテラルフローアッセイとすることができる。
いくつかの態様において、本明細書で提供されるタンパク質と、タンパク質を含有もしくは固定した基板、パッド、又はバイアルとを含むキットが提供され、任意にこのキットはＥＬＩＳＡ又はラテラルフローアッセイキットである。
本明細書で開示される方法のいくつかの実施形態において、タンパク質は試験ストリップ上のクロマトグラフストリップの試験ゾーン内に固定される。
前述の実施形態のいずれかにおいて、クロマトグラフストリップはコントロールゾーンを更に含むことができ、コントロール捕捉剤はコントロールゾーン内に固定される。
前述の実施形態のいずれかにおいて、試験ストリップは結合パッドを含むサンプル結合ゾーンを更に含むことができ、結合パッドの一端はクロマトグラフストリップの一端と毛細管力で通じる。
前述の実施形態のいずれかにおいて、試験ストリップはサンプルパッドを含むサンプル添加ゾーンを更に含むことができ、サンプルパッドは結合パッド又はクロマトグラフストリップと毛細管力で通じることができる。
前述の実施形態のいずれかにおいて、分析物はコロナウイルスの表面抗原に対する中和抗体とすることができる。
前述の実施形態のいずれかにおいて、分析物はコロナウイルスの表面抗原に対する広域中和抗体とすることができる。
前述の実施形態のいずれかにおいて、分析物はＩｇＧ抗体、例えばＳタンパク質ペプチド、又はその断片もしくはエピトープに特異的なものとすることができる。
前述の実施形態のいずれかにおいて、分析物はＩｇＭ抗体、例えばＳタンパク質ペプチド、又はその断片もしくはエピトープに特異的なものとすることができる。
前述の実施形態のいずれかにおいて、分析物はＩｇＥ抗体、例えばＳタンパク質ペプチド、又はその断片もしくはエピトープに特異的なものとすることができる。
前述の実施形態のいずれかにおいて、分析物はＩｇＡ抗体、例えばＳタンパク質ペプチド、又はその断片もしくはエピトープに特異的なものとすることができる。
前述の実施形態のいずれかにおいて、分析物はＩｇＤ抗体、例えばＳタンパク質ペプチド、又はその断片もしくはエピトープに特異的なものとすることができる。
前述の実施形態のいずれかにおいて、分析物はヒト抗体、例えばＳタンパク質ペプチド、又はその断片もしくはエピトープに特異的なものとすることができる。
前述の実施形態のいずれかにおいて、サンプルはコロナウイルスに感染した対象から得ることができる。
前述の実施形態のいずれかにおいて、サンプルはコロナウイルスに感染し、回復している対象の血清とすることができる。
前述の実施形態のいずれかにおいて、サンプルはコロナウイルスの表面抗原受容体を更に含むことができる。
前述の実施形態のいずれかにおいて、サンプルはコロナウイルスの受容体及び表面抗原間の相互作用を遮断する中和抗体を含むことができる。
いくつかの実施形態において、複数の組換ポリペプチドを含むタンパク質が本明細書で開示され、コロナウイルスの表面抗原を含む各組換ポリペプチドはコラーゲンのＣ末端プロペプチドに連結しており、組換ポリペプチドのＣ末端プロペプチドはポリペプチド間ジスルフィド結合を形成する。
いくつかの実施形態において、コロナウイルスは重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、ＳＡＲＳコロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、ＳＡＲＳ様コロナウイルス、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）、ＭＥＲＳ様コロナウイルス、ＮＬ６３－ＣｏＶ、２２９Ｅ－ＣｏＶ、ＯＣ４３－ＣｏＶ、ＨＫＵ１－ＣｏＶ、ＷＩＶ１－ＣｏＶ、ＭＨＶ、ＨＫＵ９－ＣｏＶ、ＰＥＤＶ－ＣｏＶ又はＳＤＣＶである。
前述の実施形態のいずれかにおいて、表面抗原はコロナウイルススパイク（Ｓ）タンパク質、又はその断片もしくはエピトープを含むことができ、エピトープは任意に線状エピトープ又は配座エピトープであり、タンパク質は３つの組換ポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態において、コロナウイルスＳタンパク質融合ペプチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２などのコロナウイルスのＳタンパク質のエクトドメイン（例、膜貫通及び細胞質ドメインを有さない）又はその断片を含み、これはコラーゲンのＣプロペプチドにインフレーム融合され、ジスルフィド結合で連結したホモ三量体を形成することができる。Ｓ三量体など、結果として生じる組換タンパク質は発現し、トランスフェクト細胞から精製することができ、三量体型で天然様構造であると予測される。これは、膜貫通及び／又は細胞質ドメインを有さず、可溶型の組換ペプチド又はタンパク質として発現する場合に直面することが多いウイルス抗原のミスフォールディングの問題を解決する。このようなミスフォールドしたウイルス抗原は、天然のウイルス抗原の構造を正確に保存せず、ウイルスにより引き起こされる中和抗体により認識されないことが多い。
前述の実施形態のいずれかにおいて、表面抗原はシグナルペプチド、Ｓ１サブユニットペプチド、Ｓ２サブユニットペプチド又はその任意の組合せを含むことができる。
前述の実施形態のいずれかにおいて、表面抗原はシグナルペプチド、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）ペプチド、受容体結合モチーフ（ＲＢＭ）ペプチド、融合ペプチド（ＦＰ）、ヘプタッドリピート１（ＨＲ１）ペプチド、又はヘプタッドリピート２（ＨＲ２）ペプチド、或いはその任意の組合せを含むことができる。
前述の実施形態のいずれかにおいて、表面抗原はＳタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含むことができる。
前述の実施形態のいずれかにおいて、表面抗原はＳタンパク質のＳ１サブユニット及びＳ２サブユニットを含むことができる。
前述の実施形態のいずれかにおいて、表面抗原は膜貫通（ＴＭ）ドメインペプチド及び／又は細胞質（ＣＰ）ドメインペプチドを有さなくてよい。
前述の実施形態のいずれかにおいて、表面抗原はプロテアーゼ切断部位を含むことができ、プロテアーゼは任意にフーリン、トリプシン、第Ｘａ因子又はカテプシンＬである。
前述の実施形態のいずれかにおいて、表面抗原はプロテアーゼ切断部位を含まなくてよいか、又はプロテアーゼで切断されない変異したプロテアーゼ切断部位を含むことができ、プロテアーゼは任意にフーリン、トリプシン、第Ｘａ因子又はカテプシンＬである。
前述の実施形態のいずれかにおいて、表面抗原は可溶性でよいか、或いは膜又はウイルスエンベロープなどの脂質二重層に直接結合しない。
前述の実施形態のいずれかにおいて、表面抗原はタンパク質の組換ポリペプチド間で同じ又は異なってよい。
前述の実施形態のいずれかにおいて、表面抗原はＣ末端プロペプチドに直接融合することができるか、又はグリシン－Ｘ－Ｙ繰り返しを含むリンカーなどのリンカーによりＣ末端プロペプチドに連結することができる。Ｘ及びＹは独立して任意のアミノ酸であり、任意にプロリン又はヒドロキシプロリンである。
前述の実施形態のいずれかにおいて、タンパク質は可溶性でよいか、或いは膜又はウイルスエンベロープなどの脂質二重層に直接結合しない。
前述の実施形態のいずれかにおいて、タンパク質は対象の細胞表面受容体に結合することができ、対象は任意に霊長類などの哺乳類、例えばヒトである。
前述の実施形態のいずれかにおいて、細胞表面受容体はアンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）、ジペプチジルペプチダーゼ４（ＤＰＰ４）、樹状細胞特異的細胞間接着分子－３－結合ノンインテグリン（ＤＣ－ＳＩＧＮ）、又は肝臓／リンパ節－ＳＩＧＮ（Ｌ－ＳＩＧＮ）でよい。
前述の実施形態のいずれかにおいて、Ｃ末端プロペプチドはヒトコラーゲンのものでよい。
前述の実施形態のいずれかにおいて、Ｃ末端プロペプチドはｐｒｏα１（Ｉ）、ｐｒｏα１（ＩＩ）、ｐｒｏα１（ＩＩＩ）、ｐｒｏα１（Ｖ）、ｐｒｏα１（ＸＩ）、ｐｒｏα２（Ｉ）、ｐｒｏα２（Ｖ）、ｐｒｏα２（ＸＩ）、又はｐｒｏα３（ＸＩ）のＣ末端ポリペプチド、或いはその断片を含むことができる。
前述の実施形態のいずれかにおいて、Ｃ末端プロペプチドは組換ポリペプチド間で同じ又は異なってよい。
前述の実施形態のいずれかにおいて、Ｃ末端プロペプチドは、配列番号６７～８０のいずれか、又はこれと少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含むことができ、ポリペプチド間ジスルフィド結合を形成し、組換ポリペプチドを三量体化することができる。
前述の実施形態のいずれかにおいて、Ｃ末端プロペプチドはグリシン－Ｘ－Ｙ繰り返しを含む配列（例えば配列番号６７～８０のいずれかのＮ末端に連結する）、又はこれらと少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含むことができ、ポリペプチド間ジスルフィド結合を形成し、組換ポリペプチドを三量体化することができる。Ｘ及びＹは独立して任意のアミノ酸であり、任意にプロリン又はヒドロキシプロリンである。
前述の実施形態のいずれかにおいて、各組換ポリペプチドにおける表面抗原は融合前構造でよい。
前述の実施形態のいずれかにおいて、各組換ポリペプチドにおける表面抗原は融合後構造でよい。
前述の実施形態のいずれかにおいて、各組換ポリペプチドにおける表面抗原は、配列番号２７～６６のいずれか、又はこれと少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
前述の実施形態のいずれかにおいて、組換ポリペプチドは、配列番号１～２６のいずれか、又はこれと少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
図１は、例示的なＳ三量体の構造的特徴を示す。（Ａ）Ｓ三量体の構造ドメインの概略図及び（Ｂ）その三量体の共有結合的に連結した３次元構造。 図２は、ＥＬＩＳＡ形式の例示的なＳ三量体抗原に基づくＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体試験の結果を示す。 図３の出典はＰｏｓｔｈｕｍａ－Ｔｒｕｍｐｉｅら、Ａｎａｌ Ｂｉｏａｎａｌ Ｃｈｅｍ（２００９）３９３：５６９－５８２であり、サンドイッチ型の例示的なラテラルフローイムノアッセイ（ＬＦＩＡ）を示す。ナノ粒子標識分析物結合剤１をコンジュゲートリリースパッドで乾燥させる。分析物結合剤２を試験ライン（Ｔ）にスプレーし得る。コントロールをコントロールライン（Ｃ）にスプレーする。サンプルはサンプルパッドからコンジュゲートパッドに流れ、メンブレンに流入する。保護及びより簡単な取り扱いのためにストリップをデバイスに取り付ける。分析物結合剤１又は分析物結合剤２のどちらかは、ＣＯＶＩＤ－１９患者の血清におけるＳ反応性抗体に結合するＳ三量体であり得る。 図４の出典はＰｏｓｔｈｕｍａ－Ｔｒｕｍｐｉｅら、Ａｎａｌ Ｂｉｏａｎａｌ Ｃｈｅｍ（２００９）３９３：５６９－５８２であり、チューブ型の例示的なラテラルフロー（イムノ）アッセイを示し、コンジュゲートが試験チューブで脱水される。チューブ及びストリップは密封したアルミニウムパウチ及び乾燥剤に保管される。検査を行うために、サンプル（及びバッファ）を試験チューブにピペットで注入し、コンジュゲートを溶解し、ストリップを挿入する。試験ライン（Ｔ）での応答は分析物濃度に依存しており；コントロールライン（Ｃ）の反応は適切なメンブレンの流れを示す。 図５は、ＩｇＭ及びＩｇＧに関する例示的なＳ三量体抗原に基づくＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体試験の結果を示す。 図６は、ＩｇＧ及び中和抗体に関する例示的なＳ三量体抗原に基づくＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体試験の結果を示す。 図７は、抗原としてＳ三量体（図７、上パネル）又はＳ１三量体（図７、下パネル）を使用し、段階希釈した回復期患者の血清サンプルでラテラルフローアッセイを行った結果を示す。 図８は、抗原として原型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ三量体（図８、上パネル）又はＢ．１．３５１南アフリカ変異体Ｓ三量体（図８、下パネル）を使用し、多数の回復期血清サンプルでラテラルフローアッセイを行った結果を示す。
臨床現場即時アッセイは一般的に、分析物の構造的特徴に基づき、その分析物を検出するように設計される。このアッセイの一例は、ラテラルフローイムノアッセイである。ラテラルフローイムノアッセイは、ヘルスケア診断、疾病診断、環境試験、動物健康試験、及び食品飼料試験を含む複数の業種にわたって臨床現場即時検査として広く用いられる。多くのラテラルフローアッセイは、サンドイッチ型又は競合型を使用する（Ｄｚａｎｔｉｅｖら、ＴｒＡＣ Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５５，２０１４；Ｓａｊｉｄら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓａｕｄｉ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，１９，２０１５）。例示的なサンドイッチ型において、標的分析物に特異的な一次抗体が試験ラインに固定され、標的分析物に特異的な標識抗体は試験ライン上流の試験ストリップの一部分に添加される。分析物を含有するサンプルが試験ストリップに適用されると、分析物は標識抗体により捕捉され、試験ラインに向かって流れる。その後、試験ラインの固定された抗体は、分析物の標識抗体との複合体を捕捉し、これにより分析物と検出可能なサンドイッチを形成する。試験ストリップは固定した二次抗体を有するコントロールラインも含み得る。確実に試験ストリップの正確な操作を行うために、試験ラインを通過する標識抗体はコントロールラインで捕捉される。試験ラインの色の強度は、標的分析物の量と一致し、光学式ストリップ読み取り装置又は目視検査で測定することができる。競合型は、２つの抗体に同時に結合するには小さすぎる低分子量化合物を試験するのに使用することが多く、２つの一般的な配置を有する。１つ目の配置では、試験ストリップは、固定した分析物（検出されるものと同じ）を含む試験ライン、固定した二次抗体を含むコントロールライン、及び試験ライン上流の試験ストリップに添加される分析物に特異的な可動性の標識抗体を有する。分析物を含有するサンプルを試験ストリップに適用すると、可動性の標識抗体は分析物と複合体を形成する。複合体は試験ストリップを進み、分析物は試験ラインに結合せず、代わりに固定した二次抗体によりコントロールラインに結合する。分析物が存在しないとき、可動性の標識抗体は試験ラインにおいて固定された分析物と結合する。２つ目の配置では、試験ストリップは、固定した分析物に特異的な抗体を含む試験ライン、及び試験ライン上流の試験ストリップに添加した可動性の標識分析物（検出されるものと同じ）を有する。分析物を含有するサンプルを試験ストリップに適用すると、可動性の標識分析物は、試験ラインに固定された抗体との結合を分析物と争うため、試験ラインで結合する可動性の標識分析物は少ない。Ｌｉら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，８３，２０１１。
本開示において、抗体の代わりにコロナウイルスＳタンパク質融合ペプチド（例、Ｓ三量体、ＮＴＤ／ＲＢＤ三量体、Ｓ１三量体、Ｓ２三量体、ＲＢＤ三量体等）が使用され、例えばＳタンパク質融合ペプチド及び／又はウイルスに対する中和抗体（例、細胞受容体とのウイルス相互作用を遮断する抗体）を認識する抗原特異的抗体などの分析物を検出する。
本願で参照される特許資料、科学論文及びデータベースを含むすべての出版物は、各個々の出版物が参照により個別に組み入れられたのと同程度に、あらゆる目的のためにその全体が参照により組み入れられたものとする。本明細書に記載される定義が、参照により本明細書に組み入れられた特許、出願、公開出願及び他の出版物に記載される定義に反する又は矛盾する場合、参照により本明細書に組み入れられる定義より本明細書に示される定義を優先する。本明細書で用いられる項目の見出しは構成の目的のためにのみ記載し、記載される主題を限定するものとして解釈されるべきではない。
Ｉ．ウイルス抗原及び免疫原
本明細書で提供されるタンパク質は、コロナウイルスのウイルス抗原及び免疫原を含む。本明細書で検討されるコロナウイルスのウイルス抗原及び免疫原は、細胞性反応及び／又は液性反応を促進又は刺激することができる。いくつかの実施形態において、細胞性又は液性反応などの反応は、中和抗体などの抗体産生を含む。いくつかの実施形態において、コロナウイルスのウイルス抗原又は免疫原は、コロナウイルスＳタンパク質ペプチドである。
コロナウイルスは、重度呼吸器疾患を引き起こすことが知られるポジティブセンス一本鎖ＲＮＡウイルスのファミリーである。現在コロナウイルスファミリーにおいてヒトに感染することが知られたウイルスは、アルファコロナウイルス及びベータコロナウイルス属である。更に、ガンマコロナウイルス及びデルタコロナウイルス属は将来ヒトに感染し得ることが考えられる。ベータコロナウイルスの非限定例としては、中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、ヒトコロナウイルスＨＫＵ１（ＨＫＵ１－ＣｏＶ）、ヒトコロナウイルスＯＣ４３（ＯＣ４３－ＣｏＶ）、マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ－ＣｏＶ）、コウモリＳＡＲＳ様コロナウイルスＷＩＶ１（ＷＩＶ１－ＣｏＶ）、及びヒトコロナウイルスＨＫＵ９（ＨＫＵ９－ＣｏＶ）が挙げられる。アルファコロナウイルスの非限定例としては、ヒトコロナウイルス２２９Ｅ（２２９Ｅ－ＣｏＶ）、ヒトコロナウイルスＮＬ６３（ＮＬ６３－ＣｏＶ）、ブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）及び伝染性胃腸炎コロナウイルス（ＴＧＥＶ）が挙げられる。デルタコロナウイルスの非限定例としては、ブタデルタコロナウイルス（ＳＤＣＶ）である。
重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルスの一覧を本明細書に開示する。
・コウモリコロナウイルスＣｐ／Ｙｕｎｎａｎ２０１１
・コウモリコロナウイルスＲａＴＧ１３
・コウモリコロナウイルスＲｐ／Ｓｈａａｎｘｉ２０１１
○コウモリＳＡＲＳコロナウイルスＨＫＵ３
・コウモリＳＡＲＳコロナウイルスＨＫＵ３－１
・コウモリＳＡＲＳコロナウイルスＨＫＵ３－１０
・コウモリＳＡＲＳコロナウイルスＨＫＵ３－１１
・コウモリＳＡＲＳコロナウイルスＨＫＵ３－１２
・コウモリＳＡＲＳコロナウイルスＨＫＵ３－１３
・コウモリＳＡＲＳコロナウイルスＨＫＵ３－２
・コウモリＳＡＲＳコロナウイルスＨＫＵ３－３
・コウモリＳＡＲＳコロナウイルスＨＫＵ３－４
・コウモリＳＡＲＳコロナウイルスＨＫＵ３－５
・コウモリＳＡＲＳコロナウイルスＨＫＵ３－６
・コウモリＳＡＲＳコロナウイルスＨＫＵ３－７
・コウモリＳＡＲＳコロナウイルスＨＫＵ３－８
・コウモリＳＡＲＳコロナウイルスＨＫＵ３－９
・コウモリＳＡＲＳコロナウイルスＲｐ１
・コウモリＳＡＲＳコロナウイルスＲｐ２
○コウモリＳＡＲＳ ＣｏＶ Ｒｆ１／２００４
・コウモリＣｏＶ ２７３／２００５
○コウモリＳＡＲＳ ＣｏＶ Ｒｍ１／２００４
・コウモリＣｏＶ ２７９／２００５
・コウモリＳＡＲＳ ＣｏＶ Ｒｐ３／２００４
・コウモリＳＡＲＳ様コロナウイルス
・コウモリＳＡＲＳ様コロナウイルスＲｓ３３６７
・コウモリＳＡＲＳ様コロナウイルスＲｓＳＨＣ０１４
・コウモリＳＡＲＳ様コロナウイルスＷＩＶ１
・コウモリＳＡＲＳ様コロナウイルスＹＮＬＦ＿３１Ｃ
・コウモリＳＡＲＳ様コロナウイルスＹＮＬＦ＿３４Ｃ
・ＢｔＲｆ－ＢｅｔａＣｏＶ／ＨｅＢ２０１３
・ＢｔＲｆ－ＢｅｔａＣｏＶ／ＪＬ２０１２
・ＢｔＲｆ－ＢｅｔａＣｏＶ／ＳＸ２０１３
・ＢｔＲｓ－ＢｅｔａＣｏＶ／ＧＸ２０１３
・ＢｔＲｓ－ＢｅｔａＣｏＶ／ＨｕＢ２０１３
・ＢｔＲｓ－ＢｅｔａＣｏＶ／ＹＮ２０１３
・シベットＳＡＲＳ ＣｏＶ ００７／２００４
・シベットＳＡＲＳ ＣｏＶ ＳＺ１６／２００３
・シベットＳＡＲＳ ＣｏＶ ＳＺ３／２００３
○組換ＳＡＲＳｒ－ＣｏＶ
・ＳＡＲＳコロナウイルスＥｘｏＮ１
・ＳＡＲＳコロナウイルスＭＡ１５
・ＳＡＲＳコロナウイルスＭＡ１５ ＥｘｏＮ１
・ＳＡＲＳコロナウイルスｗｔｉｃ－ＭＢ
・ナカキクガシラコウモリコロナウイルス
・ＳＡＲＳコウモリコロナウイルス
・ＳＡＲＳコロナウイルスＡ００１
・ＳＡＲＳコロナウイルスＡ０１３
・ＳＡＲＳコロナウイルスＡ０２１
・ＳＡＲＳコロナウイルスＡ０２２
・ＳＡＲＳコロナウイルスＡ０３０
・ＳＡＲＳコロナウイルスＡ０３１
・ＳＡＲＳコロナウイルスＡＳ
・ＳＡＲＳコロナウイルスＢ０１２
・ＳＡＲＳコロナウイルスＢ０２４
・ＳＡＲＳコロナウイルスＢ０２９
・ＳＡＲＳコロナウイルスＢ０３３
・ＳＡＲＳコロナウイルスＢ０３９
・ＳＡＲＳコロナウイルスＢ０４０
・ＳＡＲＳコロナウイルスＢＪ０１
・ＳＡＲＳコロナウイルスＢＪ０２
・ＳＡＲＳコロナウイルスＢＪ０３
・ＳＡＲＳコロナウイルスＢＪ０４
・ＳＡＲＳコロナウイルスＢＪ１６２
・ＳＡＲＳコロナウイルスＢＪ１８２－１２
・ＳＡＲＳコロナウイルスＢＪ１８２－４
・ＳＡＲＳコロナウイルスＢＪ１８２－８
・ＳＡＲＳコロナウイルスＢＪ１８２ａ
・ＳＡＲＳコロナウイルスＢＪ１８２ｂ
・ＳＡＲＳコロナウイルスＢＪ２０２
・ＳＡＲＳコロナウイルスＢＪ２２３２
・ＳＡＲＳコロナウイルスＢＪ３０２
・ＳＡＲＳコロナウイルスＣ０１３
・ＳＡＲＳコロナウイルスＣ０１４
・ＳＡＲＳコロナウイルスＣ０１７
・ＳＡＲＳコロナウイルスＣ０１８
・ＳＡＲＳコロナウイルスＣ０１９
・ＳＡＲＳコロナウイルスＣ０２５
・ＳＡＲＳコロナウイルスＣ０２８
・ＳＡＲＳコロナウイルスＣ０２９
・ＳＡＲＳコロナウイルスＣＤＣ＃２００３０１１５７
・ＳＡＲＳコロナウイルスシベット０１０
・ＳＡＲＳコロナウイルスシベット０１４
・ＳＡＲＳコロナウイルスシベット０１９
・ＳＡＲＳコロナウイルスシベット０２０
・ＳＡＲＳコロナウイルスＣＳ２１
・ＳＡＲＳコロナウイルスＣＳ２４
・ＳＡＲＳコロナウイルスＣＵＨＫ－ＡＧ０１
・ＳＡＲＳコロナウイルスＣＵＨＫ－ＡＧ０２
・ＳＡＲＳコロナウイルスＣＵＨＫ－ＡＧ０３
・ＳＡＲＳコロナウイルスＣＵＨＫ－Ｌ２
・ＳＡＲＳコロナウイルスＣＵＨＫ－Ｓｕ１０
・ＳＡＲＳコロナウイルスＣＵＨＫ－Ｗ１
・ＳＡＲＳコロナウイルスｃｗ０３７
・ＳＡＲＳコロナウイルスｃｗ０４９
・ＳＡＲＳコロナウイルスＥＳ１９１
・ＳＡＲＳコロナウイルスＥＳ２６０
・ＳＡＲＳコロナウイルスＦＲＡ
○ＳＡＲＳコロナウイルスＦｒａｎｋｆｕｒｔ １
・ＳＡＲＳコロナウイルスＦｒａｎｋｆｕｒｔ１－ｖ０１
・ＳＡＲＳコロナウイルスＧＤ０１
・ＳＡＲＳコロナウイルスＧＤ０３Ｔ００１３
・ＳＡＲＳコロナウイルスＧＤ３２２
・ＳＡＲＳコロナウイルスＧＤ６９
・ＳＡＲＳコロナウイルスＧＤＨ－ＢＪＨ０１
・ＳＡＲＳコロナウイルスＧＺ－Ａ
・ＳＡＲＳコロナウイルスＧＺ－Ｂ
・ＳＡＲＳコロナウイルスＧＺ－Ｃ
・ＳＡＲＳコロナウイルスＧＺ－Ｄ
・ＳＡＲＳコロナウイルスＧＺ０２
・ＳＡＲＳコロナウイルスＧＺ０４０１
・ＳＡＲＳコロナウイルスＧＺ０４０２
・ＳＡＲＳコロナウイルスＧＺ０４０３
・ＳＡＲＳコロナウイルスＧＺ４３
・ＳＡＲＳコロナウイルスＧＺ５０
・ＳＡＲＳコロナウイルスＧＺ６０
・ＳＡＲＳコロナウイルスＨＢ
・ＳＡＲＳコロナウイルスＨＣ／ＳＺ／６１／０３
・ＳＡＲＳコロナウイルスＨＧＺ８Ｌ１－Ａ
・ＳＡＲＳコロナウイルスＨＧＺ８Ｌ１－Ｂ
・ＳＡＲＳコロナウイルスＨＧＺ８Ｌ２
・ＳＡＲＳコロナウイルスＨＨＳ－２００４
・ＳＡＲＳコロナウイルスＨＫＵ－３６８７１
・ＳＡＲＳコロナウイルスＨＫＵ－３９８４９
・ＳＡＲＳコロナウイルスＨＫＵ－６５８０６
・ＳＡＲＳコロナウイルスＨＫＵ－６６０７８
・ＳＡＲＳコロナウイルスＨｏｎｇ Ｋｏｎｇ／０３／２００３
・ＳＡＲＳコロナウイルスＨＰＺ－２００３
・ＳＡＲＳコロナウイルスＨＳＲ１
・ＳＡＲＳコロナウイルスＨＳＺ－Ａ
・ＳＡＲＳコロナウイルスＨＳＺ－Ｂｂ
・ＳＡＲＳコロナウイルスＨＳＺ－Ｂｃ
・ＳＡＲＳコロナウイルスＨＳＺ－Ｃｂ
・ＳＡＲＳコロナウイルスＨＳＺ－Ｃｃ
・ＳＡＲＳコロナウイルスＨＳＺ２－Ａ
・ＳＡＲＳコロナウイルスＨＺＳ２－Ｂｂ
・ＳＡＲＳコロナウイルスＨＺＳ２－Ｃ
・ＳＡＲＳコロナウイルスＨＺＳ２－Ｄ
・ＳＡＲＳコロナウイルスＨＺＳ２－Ｅ
・ＳＡＲＳコロナウイルスＨＺＳ２－Ｆｂ
・ＳＡＲＳコロナウイルスＨＺＳ２－Ｆｃ
・ＳＡＲＳコロナウイルスＪＭＤ
・ＳＡＲＳコロナウイルスＬＣ１
・ＳＡＲＳコロナウイルスＬＣ２
・ＳＡＲＳコロナウイルスＬＣ３
・ＳＡＲＳコロナウイルスＬＣ４
・ＳＡＲＳコロナウイルスＬＣ５
・ＳＡＲＳコロナウイルスＬＬＪ－２００４
・ＳＡＲＳコロナウイルスＮＳ－１
・ＳＡＲＳコロナウイルスＰ２
・ＳＡＲＳコロナウイルスＰＣ４－１１５
・ＳＡＲＳコロナウイルスＰＣ４－１２７
・ＳＡＲＳコロナウイルスＰＣ４－１３
・ＳＡＲＳコロナウイルスＰＣ４－１３６
・ＳＡＲＳコロナウイルスＰＣ４－１３７
・ＳＡＲＳコロナウイルスＰＣ４－１４５
・ＳＡＲＳコロナウイルスＰＣ４－１９９
・ＳＡＲＳコロナウイルスＰＣ４－２０５
・ＳＡＲＳコロナウイルスＰＣ４－２２７
・ＳＡＲＳコロナウイルスＰＣ４－２４１
・ＳＡＲＳコロナウイルスＰＵＭＣ０１
・ＳＡＲＳコロナウイルスＰＵＭＣ０２
・ＳＡＲＳコロナウイルスＰＵＭＣ０３
・ＳＡＲＳコロナウイルスＲｓ＿６７２／２００６
・ＳＡＲＳコロナウイルスｓｆ０９８
・ＳＡＲＳコロナウイルスｓｆ０９９
・ＳＡＲＳコロナウイルスＳｈａｎｇｈａｉＱＸＣ１
・ＳＡＲＳコロナウイルスＳｈａｎｇｈａｉＱＸＣ２
・ＳＡＲＳコロナウイルスＳｈａｎｈｇａｉ ＬＹ
・ＳＡＲＳコロナウイルスＳｉｎ０４０９
・ＳＡＲＳコロナウイルスＳｉｎ２５００
・ＳＡＲＳコロナウイルスＳｉｎ２６７７
・ＳＡＲＳコロナウイルスＳｉｎ２６７９
・ＳＡＲＳコロナウイルスＳｉｎ２７４８
・ＳＡＲＳコロナウイルスＳｉｎ２７７４
・ＳＡＲＳコロナウイルスＳｉｎ３４０８
・ＳＡＲＳコロナウイルスＳｉｎ３４０８Ｌ
・ＳＡＲＳコロナウイルスＳｉｎ３７２５Ｖ
・ＳＡＲＳコロナウイルスＳｉｎ３７６５Ｖ
・ＳＡＲＳコロナウイルスＳｉｎ８４２
・ＳＡＲＳコロナウイルスＳｉｎ８４５
・ＳＡＲＳコロナウイルスＳｉｎ８４６
・ＳＡＲＳコロナウイルスＳｉｎ８４７
・ＳＡＲＳコロナウイルスＳｉｎ８４８
・ＳＡＲＳコロナウイルスＳｉｎ８４９
・ＳＡＲＳコロナウイルスＳｉｎ８５０
・ＳＡＲＳコロナウイルスＳｉｎ８５２
・ＳＡＲＳコロナウイルスＳｉｎ＿ＷＮＶ
・ＳＡＲＳコロナウイルスＳｉｎｏ１－１１
・ＳＡＲＳコロナウイルスＳｉｎｏ３－１１
・ＳＡＲＳコロナウイルスＳｉｎＰ１
・ＳＡＲＳコロナウイルスＳｉｎＰ２
・ＳＡＲＳコロナウイルスＳｉｎＰ３
・ＳＡＲＳコロナウイルスＳｉｎＰ４
・ＳＡＲＳコロナウイルスＳｉｎＰ５
・ＳＡＲＳコロナウイルスＳｏＤ
・ＳＡＲＳコロナウイルスＳＺ１
・ＳＡＲＳコロナウイルスＳＺ１３
・ＳＡＲＳコロナウイルスＴａｉｗａｎ
・ＳＡＲＳコロナウイルスＴａｉｗａｎ ＪＣ－２００３
・ＳＡＲＳコロナウイルスＴａｉｗａｎ ＴＣ１
・ＳＡＲＳコロナウイルスＴａｉｗａｎ ＴＣ２
・ＳＡＲＳコロナウイルスＴａｉｗａｎ ＴＣ３
・ＳＡＲＳコロナウイルスＴＪ０１
・ＳＡＲＳコロナウイルスＴＪＦ
・ＳＡＲＳコロナウイルスＴｏｒ２
○ＳＡＲＳコロナウイルスＴＷ
・ＳＡＲＳコロナウイルスＴＷ－ＧＤ１
・ＳＡＲＳコロナウイルスＴＷ－ＧＤ２
・ＳＡＲＳコロナウイルスＴＷ－ＧＤ３
・ＳＡＲＳコロナウイルスＴＷ－ＧＤ４
・ＳＡＲＳコロナウイルスＴＷ－ＧＤ５
・ＳＡＲＳコロナウイルスＴＷ－ＨＰ１
・ＳＡＲＳコロナウイルスＴＷ－ＨＰ２
・ＳＡＲＳコロナウイルスＴＷ－ＨＰ３
・ＳＡＲＳコロナウイルスＴＷ－ＨＰ４
・ＳＡＲＳコロナウイルスＴＷ－ＪＣ２
・ＳＡＲＳコロナウイルスＴＷ－ＫＣ１
・ＳＡＲＳコロナウイルスＴＷ－ＫＣ３
・ＳＡＲＳコロナウイルスＴＷ－ＰＨ１
・ＳＡＲＳコロナウイルスＴＷ－ＰＨ２
・ＳＡＲＳコロナウイルスＴＷ－ＹＭ１
・ＳＡＲＳコロナウイルスＴＷ－ＹＭ２
・ＳＡＲＳコロナウイルスＴＷ－ＹＭ３
・ＳＡＲＳコロナウイルスＴＷ－ＹＭ４
・ＳＡＲＳコロナウイルスＴＷ１
・ＳＡＲＳコロナウイルスＴＷ１０
・ＳＡＲＳコロナウイルスＴＷ１１
・ＳＡＲＳコロナウイルスＴＷ２
・ＳＡＲＳコロナウイルスＴＷ３
・ＳＡＲＳコロナウイルスＴＷ４
・ＳＡＲＳコロナウイルスＴＷ５
・ＳＡＲＳコロナウイルスＴＷ６
・ＳＡＲＳコロナウイルスＴＷ７
・ＳＡＲＳコロナウイルスＴＷ８
・ＳＡＲＳコロナウイルスＴＷ９
・ＳＡＲＳコロナウイルスＴＷＣ
・ＳＡＲＳコロナウイルスＴＷＣ２
・ＳＡＲＳコロナウイルスＴＷＣ３
・ＳＡＲＳコロナウイルスＴＷＨ
・ＳＡＲＳコロナウイルスＴＷＪ
・ＳＡＲＳコロナウイルスＴＷＫ
・ＳＡＲＳコロナウイルスＴＷＳ
・ＳＡＲＳコロナウイルスＴＷＹ
・ＳＡＲＳコロナウイルスＵｒｂａｎｉ
・ＳＡＲＳコロナウイルスＶｉｅｔｎａｍ
・ＳＡＲＳコロナウイルスＷＦ１８８
・ＳＡＲＳコロナウイルスＷＨ２０
・ＳＡＲＳコロナウイルスＷＨＵ
・ＳＡＲＳコロナウイルスｘｗ００２
・ＳＡＲＳコロナウイルスＺＪ０１
・ＳＡＲＳコロナウイルスＺＪ０２
・ＳＡＲＳコロナウイルスＺＪ０３０１
・ＳＡＲＳコロナウイルスＺＭＹ １
・ＳＡＲＳコロナウイルスＺＳ－Ａ
・ＳＡＲＳコロナウイルスＺＳ－Ｂ
・ＳＡＲＳコロナウイルスＺＳ－Ｃ
・ＳＡＲＳ関連コウモリコロナウイルスＲｓＳＨＣ０１４
・ＳＡＲＳ関連ベータコロナウイルスＲｐ３／２００４
・重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２
例示的なＳＡＲＳ ＣｏＶ－２株を以下の表に示す。
Figure 2023529484000001
コロナウイルスのウイルスゲノムはキャッピングされ、ポリアデニル化され、ヌクレオカプシドタンパク質で被覆される。コロナウイルスビリオンは、スパイク（Ｓ）タンパク質と呼ばれるＩ型融合糖タンパク質を含有するウイルスエンベロープ含む。多くのコロナウイルスは、共通のゲノム機構を有し、ゲノムの５’領域に含まれるレプリカーゼ遺伝子、及びゲノムの３’領域に含まれる構造遺伝子を有する。
コロナウイルスのスパイク（Ｓ）タンパク質は、前駆体タンパク質として最初に合成されるクラスＩ融合糖タンパク質である。個々の前駆体Ｓポリペプチドはホモ三量体を形成し、ゴルジ体内でグリコシル化され、プロセシングを受けてシグナルペプチドが除去され、細胞プロテアーゼの切断により別々のＳ１及びＳ２ポリペプチド鎖が生成される。これらはホモ三量体内で依然としてＳ１／Ｓ２プロトマーとして会合し、従ってヘテロ二量体の三量体である。Ｓ１サブユニットはウイルス膜より遠く、宿主受容体へのウイルス結合を介在する受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含有する。Ｓ２サブユニットは融合タンパク質機構、例えば融合ペプチド、融合糖タンパク質に特有の２つのヘプタッドリピート配列（ＨＲ１及びＨＲ２）及び中央ヘリックス、膜貫通ドメイン、並びにサイトゾル側末端ドメインを含有する。
いくつかの例では、コロナウイルスのウイルス抗原又は免疫原は、融合前構造のコロナウイルスＳタンパク質ペプチドである。これは分泌系で成熟コロナウイルスＳタンパク質へのプロセシング後、コロナウイルスＳから融合後構造に移行する融合事象の誘発前に、コロナウイルスＳタンパク質のエクトドメインにより採られる構造形態である。融合前構造の例示的なコロナウイルスＳタンパク質（ＨＫＵ１－ＣｏＶ）の３次元構造は、Ｋｉｒｃｈｄｏｅｒｆｅｒら、「Ｐｒｅ－ｆｕｓｉｏｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｓｐｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ」，Ｎａｔｕｒｅ，５３１：１１８－１２１，２０１６に示される。
いくつかの例では、コロナウイルスのウイルス抗原又は免疫原は、天然のコロナウイルスＳ配列と比較して、１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は挿入を含む。これは、該当する天然のコロナウイルスＳ配列から形成されるコロナウイルスＳエクトドメイン三量体と比較して、融合前構造がより保持される。１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は挿入による融合前構造の「安定化」は、例えばエネルギー安定化（例、融合後開構造に対して融合前構造のエネルギーを低下させる）及び／又は動的安定化（例、融合前構造から融合後構造への移行率を低下させる）とすることができる。更に、該当する天然のコロナウイルスＳ配列と比較して、融合前構造のコロナウイルスＳエクトドメイン三量体の安定化は、変性に対する抵抗性を増すことができる。コロナウイルスＳエクトドメイン三量体が融合前構造であるかどうかを決定する方法を本明細書で提供し、（限定されないが）融合前構造特異的抗体を使用するネガティブ染色電子顕微鏡法及び抗体結合アッセイを含む。
いくつかの例では、コロナウイルスのウイルス抗原又は免疫原はＳタンパク質ペプチドの断片である。いくつかの実施形態において、抗原又は免疫原はＳタンパク質ペプチドのエピトープである。エピトープは分子上の抗原決定化学基又はペプチド配列を含み、これらは抗原性であるため、特異的な免疫応答を引き起こす。例えばエピトープはＢ及び／又はＴ細胞が応答する抗原の領域である。抗体は、コロナウイルスＳエクトドメイン上のエピトープなど、特定の抗原エピトープに結合することができる。エピトープは、連続アミノ酸、又はタンパク質の３次フォールディングにより並置される不連続アミノ酸のどちらからも形成することができる。いくつかの実施形態において、コロナウイルスエピトープは線状エピトープである。いくつかの実施形態において、コロナウイルスエピトープは配座エピトープである。いくつかの実施形態において、コロナウイルスエピトープは中和エピトープ部位である。いくつかの実施形態において、コロナウイルスＳタンパク質ペプチド又はその断片のすべての中和エピトープは、抗原又は免疫原として存在する。
いくつかの例では、例えばウイルス抗原又は免疫原がＳタンパク質ペプチドの断片であるとき、Ｓタンパク質ペプチドの１つのサブユニットのみが存在し、Ｓタンパク質ペプチドのその１つのサブユニットが三量体化される。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原はシグナルペプチド、Ｓ１サブユニットペプチド、Ｓ２サブユニットペプチド又はその任意の組合せを含む。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原はシグナルペプチド、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）ペプチド、受容体結合モチーフ（ＲＢＭ）ペプチド、融合ペプチド（ＦＰ）、ヘプタッドリピート１（ＨＲ１）ペプチド、又はヘプタッドリピート２（ＨＲ２）ペプチド、或いはその任意の組合せを含む。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原はＳタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含む。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原はＳタンパク質のＳ１サブユニット及びＳ２サブユニットを含む。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原はＳタンパク質のＳ１サブユニットを含むが、Ｓ２サブユニットを含まない。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原はＳタンパク質のＳ２サブユニットを含むが、Ｓ１サブユニットを含まない。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は、膜貫通（ＴＭ）ドメインペプチド及び／又は細胞質（ＣＰ）ドメインペプチドを有さない。
いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原はプロテアーゼ切断部位を含み、プロテアーゼは任意にフーリン、トリプシン、第Ｘａ因子又はカテプシンＬである。
いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原はプロテアーゼ切断部位を有さないか、或いはプロテアーゼにより切断されない変異したプロテアーゼ切断部位を含み、プロテアーゼは任意にフーリン、トリプシン、第Ｘａ因子又はカテプシンＬである。
いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は、少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質又はその断片を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原である。いくつかの実施形態において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２反応性抗体及び／又はＴ細胞により認識される。いくつかの実施形態において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原は不活化全ウイルスである。いくつかの実施形態において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原はウイルスのサブユニットを含む。いくつかの実施形態において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又はその断片の構造タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の構造タンパク質はスパイク（Ｓ）タンパク質、膜（Ｍ）タンパク質、ヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質、及びエンベロープ（Ｅ）タンパク質からなる群の１つ又は複数を含む。いくつかの実施形態において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の非構造タンパク質又はその断片を含むか、又は更に含む。代表的なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２分離株（Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１）のヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＭＮ９０８９４７．３（Ｗｕら、Ｎａｔｕｒｅ，５７９：２６５－２６９，２０２０）に記載される。
いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は配列番号５５に示す配列を含む。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は、以下に示す配列番号５５の配列（下線の配列は太字のＴｈｒ３３３－Ｇｌｙ５２６の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）内の受容体結合モチーフ（ＲＢＭ）を示す）と少なくとも或いは約８０％、８５％、９０％、９２％、９５％又は９７％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原はＲＢＤ三量体、例えば配列番号６７～８０のいずれかに連結するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＲＢＤ配列を含む。
Figure 2023529484000002
いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は、最初のＷｕｈａｎ－Ｈｕ－１コロナウイルスのスパイク糖タンパク質（例、ＮＣ＿０４５５１２）の配列を含む。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原はＢ．１．５２６系統ウイルスのスパイク糖タンパク質の配列を含む。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原はＣｌｕｓｔｅｒ５（ΔＦＶＩスパイク）ウイルスのスパイク糖タンパク質の配列を含む。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原はＢ．１．１．７ 系統ウイルスのスパイク糖タンパク質の配列を含む。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原はＢ．１．１．２０７系統ウイルスのスパイク糖タンパク質の配列を含む。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原はＢ．１．１．３１７系統ウイルスのスパイク糖タンパク質の配列を含む。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原はＢ．１．１．３１８系統ウイルスのスパイク糖タンパク質の配列を含む。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原はＰ．１系統ウイルスのスパイク糖タンパク質の配列を含む。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原はＢ．１．３５１系統ウイルスのスパイク糖タンパク質の配列を含む。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原はＢ．１．４２９／ＣＡＬ．２０Ｃ系統ウイルスのスパイク糖タンパク質の配列を含む。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原はＢ．１．５２５系統ウイルスのスパイク糖タンパク質の配列を含む。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原はＢ．１．５２６系統ウイルスのスパイク糖タンパク質の配列を含む。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原はＢ．１．６１７系統ウイルスのスパイク糖タンパク質の配列を含む。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原はＢ．１．６１７．２系統ウイルスのスパイク糖タンパク質の配列を含む。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原はＢ．１．６１８系統ウイルスのスパイク糖タンパク質の配列を含む。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原はＢ．１．６２０系統ウイルスのスパイク糖タンパク質の配列を含む。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原はＰ．２系統ウイルスのスパイク糖タンパク質の配列を含む。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原はＰ．３系統ウイルスのスパイク糖タンパク質の配列を含む。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原はＢ．１．１．１４３系統ウイルスのスパイク糖タンパク質の配列を含む。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原はＡ．２３．１系統ウイルスのスパイク糖タンパク質の配列を含む。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原はＢ．１．６１７系統ウイルスのスパイク糖タンパク質の配列を含む。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は、Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１、Ｂ．１．５２６系統ウイルス、Ｂ．１．１．７系統ウイルス、Ｐ．１系統ウイルス、Ｂ．１．３５１系統ウイルス、Ｐ．２系統ウイルス、Ｂ．１．１．１４３系統ウイルス、Ａ．２３．１系統ウイルス、及びＢ．１．６１７系統ウイルスからなる群から選択される任意の２つ以上であるウイルスのスパイク糖タンパク質に由来する配列を任意の好適な組合せで含む。
いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は、例えばＢ．１．５２６変異体などにＥ４８４Ｋ及び／又はＳ４７７Ｎを含む。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は、例えばＣｌｕｓｔｅｒ５（ΔＦＶＩスパイク）変異体などにΔ４００－４０２（ΔＦＶＩ）を含む。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は、例えばＢ．１．１．７変異体などにΔ６９－７０（ΔＨＶ）、Δ１４４（ΔＹ）、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２Ａ及び／又はＤ１１１８Ｈを含む。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は、例えばＢ．１．１．２０７変異体などにＰ６８１Ｈを含む。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は、例えばＰ．１変異体などにＬ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Ｄ１３８Ｙ、Ｒ１９０Ｓ、Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｔ１０２７Ｉ及び／又はＶ１１７６Ｆを含む。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は、例えばＰ．２変異体などにＥ４８４Ｋを含む。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は、例えばＰ．３変異体などにＥ４８４Ｋ及び／又はＮ５０１Ｙを含む。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は、例えばＢ．１．３５１変異体などにＬ１８Ｆ、Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２－２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ｄ６１４Ｇ及び／又はＡ７０１Ｖを含む。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は、例えばＢ．１．４２９／ＣＡＬ．２０Ｃ変異体などにＳ１３Ｉ、Ｗ１５２Ｃ及び／又はＬ４５２Ｒを含む。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は、例えばＢ．１．５２５変異体などにΔ６９－７０（ΔＨＶ）、Ｅ４８４Ｋ及び／又はＦ８８８Ｌを含む。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は、例えばＢ．１．６１７変異体などにＧ１４２Ｄ、Ｌ４５２Ｒ、Ｅ４８４Ｑ及び／又はＰ６８１Ｒを含む。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は、例えばＢ．１．６１７．２変異体などにＧ１４２Ｄ、Ｌ４５２Ｒ及び／又はＰ６８１Ｒを含む。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は、例えばＢ．１．６１８変異体などにＥ４８４Ｋを含む。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は、任意の好適な組合せで任意の１つ又は複数の上記突然変異を含む融合ポリペプチド（プロトマー）を含み得る。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は３つの融合ポリペプチドの三量体を含み得る。３つのプロトマー融合ポリペプチドのいずれかは任意の好適な組合せで任意の１つ又は複数の上記突然変異を含み得る。いくつかの実施形態において、三量体を形成する３つのプロトマー融合ポリペプチドのうちの２つ又は３つすべては、各プロトマーに異なる突然変異及び／又は異なる突然変異の組合せを含み得る。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は三量体の混合物を含み得る。各三量体は異なる突然変異及び／又は異なる突然変異の組合せを含み得る。
いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は、配列番号５５のアミノ酸位置１３、１８、２０、２６、６９、７０、８０、１３８、１４２、１４４、１５２、１９０、２１５、２４２、２４３、２４４、２４６、４００、４０１、４０２、４１７、４４０、４５２、４７７、４８４、５０１、５７０、６１４、６５５、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、７０１、７１６、８８８、９８２、１０２７、１１１８及び１１７６の突然変異（例、置換、欠失及び／又は挿入）からなる群から選択される任意の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上の突然変異を含む。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は、アミノ酸位置４４０、４５２、４７７、４８４、５０１、６１４、６５５、６８１及び７０１の突然変異（例、置換、欠失及び／又は挿入）からなる群から選択される任意の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ又はすべての突然変異を含む。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は異なるウイルス由来の配列を含むキメラポリペプチドを含み、例えばコロナウイルスの第１の変異体に由来する１つ又は複数の突然変異、及び第１の変異体とは異なるコロナウイルスの第２の変異体に由来する１つ又は複数の突然変異などである。いくつかの実施形態において、このようなキメラウイルス抗原又は免疫原（或いはキメラウイルス抗原又は免疫原の組合せ）は、コロナウイルスの第１及び第２の変異体両方に対する広い免疫応答を引き起こすのに使用し得る。いくつかの実施形態において、このようなキメラウイルス抗原又は免疫原（或いはキメラウイルス抗原又は免疫原の組合せ）は、例えばＥＬＩＳＡ又はラテラルフローアッセイにおいてウイルス抗原又は免疫原に結合する分析物（例、ウイルスを中和するＩｇＧ、ＩｇＭ及び／又はＩｇＥなどのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体）を高感度に検出するための抗原として使用し得る。
いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原はＳ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９－７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２－２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００－４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ及びＶ１１７６Ｆからなる群から選択される任意の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上の突然変異を含む。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原はＮ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｇ、Ｓ４７７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ及びＡ７０１Ｖからなる群から選択される任意の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上の突然変異を含む。
いくつかの実施形態において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原は、全長Ｓタンパク質のシグナルペプチドを欠く短縮型Ｓタンパク質、膜貫通及び細胞質ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原は組換タンパク質であるが、他の実施形態において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原はビリオンから精製される。いくつかの好ましい実施形態において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原は単離された抗原である。
いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は配列番号２７に示す配列を含む。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は、配列番号２７の配列と少なくとも或いは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、例えば１３、１８、２０、２６、６９、７０、８０、１３８、１４２、１４４、１５２、１９０、２１５、２４２、２４３、２４４、２４６、４００、４０１、４０２、４１７、４４０、４５２、４７７、４８４、５０１、５７０、６１４、６５５、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、７０１、７１６、８８８、９８２、１０２７、１１１８及び１１７６（配列番号５５のアミノ酸位置）からなる群から選択される１つ又は複数のアミノ酸位置に置換、欠失及び／又は挿入を含む配列である。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は配列番号２７の変異体を含み、この変異体はＳ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９－７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２－２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００－４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ及びＶ１１７６Ｆからなる群から選択される任意の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上の突然変異を含む。
いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は配列番号２８に示す配列を含む。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は、配列番号２８の配列と少なくとも或いは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、例えば１３、１８、２０、２６、６９、７０、８０、１３８、１４２、１４４、１５２、１９０、２１５、２４２、２４３、２４４、２４６、４００、４０１、４０２、４１７、４４０、４５２、４７７、４８４、５０１、５７０、６１４、６５５、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、７０１、７１６、８８８、９８２、１０２７、１１１８及び１１７６（配列番号５５のアミノ酸位置）からなる群から選択される１つ又は複数のアミノ酸位置に置換、欠失及び／又は挿入を含む配列である。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は配列番号２８の変異体を含み、この変異体はＳ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９－７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２－２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００－４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ及びＶ１１７６Ｆからなる群から選択される任意の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上の突然変異を含む。
いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は配列番号２９に示す配列を含む。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は、配列番号２９の配列と少なくとも或いは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、例えば１３、１８、２０、２６、６９、７０、８０、１３８、１４２、１４４、１５２、１９０、２１５、２４２、２４３、２４４、２４６、４００、４０１、４０２、４１７、４４０、４５２、４７７、４８４、５０１、５７０、６１４、６５５、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、７０１、７１６、８８８、９８２、１０２７、１１１８及び１１７６（配列番号５５のアミノ酸位置）からなる群から選択される１つ又は複数のアミノ酸位置に置換、欠失及び／又は挿入を含む配列である。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は配列番号２９の変異体を含み、この変異体はＳ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９－７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２－２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００－４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ及びＶ１１７６Ｆからなる群から選択される任意の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上の突然変異を含む。
いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は配列番号３０に示す配列を含む。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は、配列番号３０の配列と少なくとも或いは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、例えば１３、１８、２０、２６、６９、７０、８０、１３８、１４２、１４４、１５２、１９０、２１５、２４２、２４３、２４４、２４６、４００、４０１、４０２、４１７、４４０、４５２、４７７、４８４、５０１、５７０、６１４、６５５、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、７０１、７１６、８８８、９８２、１０２７、１１１８及び１１７６（配列番号５５のアミノ酸位置）からなる群から選択される１つ又は複数のアミノ酸位置に置換、欠失及び／又は挿入を含む配列である。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は配列番号３０の変異体を含み、この変異体はＳ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９－７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２－２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００－４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ及びＶ１１７６Ｆからなる群から選択される任意の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上の突然変異を含む。
いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は配列番号３１に示す配列を含む。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は、配列番号３１の配列と少なくとも或いは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、例えば１３、１８、２０、２６、６９、７０、８０、１３８、１４２、１４４、１５２、１９０、２１５、２４２、２４３、２４４、２４６、４００、４０１、４０２、４１７、４４０、４５２、４７７、４８４、５０１、５７０、６１４、６５５、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、７０１、７１６、８８８、９８２、１０２７、１１１８及び１１７６（配列番号５５のアミノ酸位置）からなる群から選択される１つ又は複数のアミノ酸位置に置換、欠失及び／又は挿入を含む配列である。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は配列番号３１の変異体を含み、この変異体はＳ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９－７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２－２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００－４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ及びＶ１１７６Ｆからなる群から選択される任意の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上の突然変異を含む。
いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は配列番号３２に示す配列を含む。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は、配列番号３２の配列と少なくとも或いは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、例えば１３、１８、２０、２６、６９、７０、８０、１３８、１４２、１４４、１５２、１９０、２１５、２４２、２４３、２４４、２４６、４００、４０１、４０２、４１７、４４０、４５２、４７７、４８４、５０１、５７０、６１４、６５５、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、７０１、７１６、８８８、９８２、１０２７、１１１８及び１１７６（配列番号５５のアミノ酸位置）からなる群から選択される１つ又は複数のアミノ酸位置に置換、欠失及び／又は挿入を含む配列である。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は配列番号３２の変異体を含み、この変異体はＳ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９－７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２－２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００－４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ及びＶ１１７６Ｆからなる群から選択される任意の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上の突然変異を含む。
いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は配列番号３３に示す配列を含む。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は、配列番号３３の配列と少なくとも或いは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、例えば１３、１８、２０、２６、６９、７０、８０、１３８、１４２、１４４、１５２、１９０、２１５、２４２、２４３、２４４、２４６、４００、４０１、４０２、４１７、４４０、４５２、４７７、４８４、５０１、５７０、６１４、６５５、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、７０１、７１６、８８８、９８２、１０２７、１１１８及び１１７６（配列番号５５のアミノ酸位置）からなる群から選択される１つ又は複数のアミノ酸位置に置換、欠失及び／又は挿入を含む配列である。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は配列番号３３の変異体を含み、この変異体はＳ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９－７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２－２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００－４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ及びＶ１１７６Ｆからなる群から選択される任意の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上の突然変異を含む。
いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は配列番号３４に示す配列を含む。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は、配列番号３４の配列と少なくとも或いは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、例えば１３、１８、２０、２６、６９、７０、８０、１３８、１４２、１４４、１５２、１９０、２１５、２４２、２４３、２４４、２４６、４００、４０１、４０２、４１７、４４０、４５２、４７７、４８４、５０１、５７０、６１４、６５５、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、７０１、７１６、８８８、９８２、１０２７、１１１８及び１１７６（配列番号５５のアミノ酸位置）からなる群から選択される１つ又は複数のアミノ酸位置に置換、欠失及び／又は挿入を含む配列である。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は配列番号３４の変異体を含み、この変異体はＳ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９－７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２－２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００－４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ及びＶ１１７６Ｆからなる群から選択される任意の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上の突然変異を含む。
いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は配列番号３５に示す配列を含む。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は、配列番号３５の配列と少なくとも或いは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、１３、１８、２０、２６、６９、７０、８０、１３８、１４２、１４４、１５２、１９０、２１５、２４２、２４３、２４４、２４６、４００、４０１、４０２、４１７、４４０、４５２、４７７、４８４、５０１、５７０、６１４、６５５、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、７０１、７１６、８８８、９８２、１０２７、１１１８及び１１７６（配列番号５５のアミノ酸位置）からなる群から選択される１つ又は複数のアミノ酸位置に置換、欠失及び／又は挿入を含む配列などである。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は配列番号３５の変異体を含み、この変異体はＳ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９－７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２－２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００－４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ及びＶ１１７６Ｆからなる群から選択される任意の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上の突然変異を含む。
いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は配列番号３６に示す配列を含む。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は、配列番号３６の配列と少なくとも或いは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、例えば１３、１８、２０、２６、６９、７０、８０、１３８、１４２、１４４、１５２、１９０、２１５、２４２、２４３、２４４、２４６、４００、４０１、４０２、４１７、４４０、４５２、４７７、４８４、５０１、５７０、６１４、６５５、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、７０１、７１６、８８８、９８２、１０２７、１１１８及び１１７６（配列番号５５のアミノ酸位置）からなる群から選択される１つ又は複数のアミノ酸位置に置換、欠失及び／又は挿入を含む配列である。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は配列番号３６の変異体を含み、この変異体はＳ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９－７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２－２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００－４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ及びＶ１１７６Ｆからなる群から選択される任意の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上の突然変異を含む。
いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は配列番号３７に示す配列を含む。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は、配列番号３７の配列と少なくとも或いは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、例えば１３、１８、２０、２６、６９、７０、８０、１３８、１４２、１４４、１５２、１９０、２１５、２４２、２４３、２４４、２４６、４００、４０１、４０２、４１７、４４０、４５２、４７７、４８４、５０１、５７０、６１４、６５５、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、７０１、７１６、８８８、９８２、１０２７、１１１８及び１１７６（配列番号５５のアミノ酸位置）からなる群から選択される１つ又は複数のアミノ酸位置に置換、欠失及び／又は挿入を含む配列である。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は配列番号３７の変異体を含み、この変異体はＳ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９－７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２－２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００－４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ及びＶ１１７６Ｆからなる群から選択される任意の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上の突然変異を含む。
いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は配列番号３８に示す配列を含む。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は、配列番号３８の配列と少なくとも或いは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、例えば１３、１８、２０、２６、６９、７０、８０、１３８、１４２、１４４、１５２、１９０、２１５、２４２、２４３、２４４、２４６、４００、４０１、４０２、４１７、４４０、４５２、４７７、４８４、５０１、５７０、６１４、６５５、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、７０１、７１６、８８８、９８２、１０２７、１１１８及び１１７６（配列番号５５のアミノ酸位置）からなる群から選択される１つ又は複数のアミノ酸位置に置換、欠失及び／又は挿入を含む配列である。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は配列番号３８の変異体を含み、この変異体はＳ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９－７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２－２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００－４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ及びＶ１１７６Ｆからなる群から選択される任意の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上の突然変異を含む。
いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は配列番号３９に示す配列を含む。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は、配列番号３９の配列と少なくとも或いは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、例えば１３、１８、２０、２６、６９、７０、８０、１３８、１４２、１４４、１５２、１９０、２１５、２４２、２４３、２４４、２４６、４００、４０１、４０２、４１７、４４０、４５２、４７７、４８４、５０１、５７０、６１４、６５５、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、７０１、７１６、８８８、９８２、１０２７、１１１８及び１１７６（配列番号５５のアミノ酸位置）からなる群から選択される１つ又は複数のアミノ酸位置に置換、欠失及び／又は挿入を含む配列である。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は配列番号３９の変異体を含み、この変異体はＳ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９－７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２－２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００－４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ及びＶ１１７６Ｆからなる群から選択される任意の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上の突然変異を含む。
いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は配列番号４０に示す配列を含む。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は、配列番号４０の配列と少なくとも或いは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、例えば１３、１８、２０、２６、６９、７０、８０、１３８、１４２、１４４、１５２、１９０、２１５、２４２、２４３、２４４、２４６、４００、４０１、４０２、４１７、４４０、４５２、４７７、４８４、５０１、５７０、６１４、６５５、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、７０１、７１６、８８８、９８２、１０２７、１１１８及び１１７６（配列番号５５のアミノ酸位置）からなる群から選択される１つ又は複数のアミノ酸位置に置換、欠失及び／又は挿入を含む配列である。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は配列番号４０の変異体を含み、この変異体はＳ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９－７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２－２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００－４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ及びＶ１１７６Ｆからなる群から選択される任意の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上の突然変異を含む。
いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は配列番号４１に示す配列を含む。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は、配列番号４１の配列と少なくとも或いは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、例えば１３、１８、２０、２６、６９、７０、８０、１３８、１４２、１４４、１５２、１９０、２１５、２４２、２４３、２４４、２４６、４００、４０１、４０２、４１７、４４０、４５２、４７７、４８４、５０１、５７０、６１４、６５５、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、７０１、７１６、８８８、９８２、１０２７、１１１８及び１１７６（配列番号５５のアミノ酸位置）からなる群から選択される１つ又は複数のアミノ酸位置に置換、欠失及び／又は挿入を含む配列である。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は配列番号４１の変異体を含み、この変異体はＳ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９－７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２－２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００－４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ及びＶ１１７６Ｆからなる群から選択される任意の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上の突然変異を含む。
いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は配列番号４２に示す配列を含む。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は、配列番号４２の配列と少なくとも或いは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、例えば１３、１８、２０、２６、６９、７０、８０、１３８、１４２、１４４、１５２、１９０、２１５、２４２、２４３、２４４、２４６、４００、４０１、４０２、４１７、４４０、４５２、４７７、４８４、５０１、５７０、６１４、６５５、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、７０１、７１６、８８８、９８２、１０２７、１１１８及び１１７６（配列番号５５のアミノ酸位置）からなる群から選択される１つ又は複数のアミノ酸位置に置換、欠失及び／又は挿入を含む配列である。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は配列番号４２の変異体を含み、この変異体はＳ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９－７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２－２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００－４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ及びＶ１１７６Ｆからなる群から選択される任意の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上の突然変異を含む。
いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は配列番号４３に示す配列を含む。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は、配列番号４３の配列と少なくとも或いは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、例えば１３、１８、２０、２６、６９、７０、８０、１３８、１４２、１４４、１５２、１９０、２１５、２４２、２４３、２４４、２４６、４００、４０１、４０２、４１７、４４０、４５２、４７７、４８４、５０１、５７０、６１４、６５５、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、７０１、７１６、８８８、９８２、１０２７、１１１８及び１１７６（配列番号５５のアミノ酸位置）からなる群から選択される１つ又は複数のアミノ酸位置に置換、欠失及び／又は挿入を含む配列である。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は配列番号４３の変異体を含み、この変異体はＳ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９－７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２－２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００－４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ及びＶ１１７６Ｆからなる群から選択される任意の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上の突然変異を含む。
いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は配列番号４４に示す配列を含む。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は、配列番号４４の配列と少なくとも或いは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、例えば１３、１８、２０、２６、６９、７０、８０、１３８、１４２、１４４、１５２、１９０、２１５、２４２、２４３、２４４、２４６、４００、４０１、４０２、４１７、４４０、４５２、４７７、４８４、５０１、５７０、６１４、６５５、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、７０１、７１６、８８８、９８２、１０２７、１１１８及び１１７６（配列番号５５のアミノ酸位置）からなる群から選択される１つ又は複数のアミノ酸位置に置換、欠失及び／又は挿入を含む配列である。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は配列番号４４の変異体を含み、この変異体はＳ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９－７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２－２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００－４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ及びＶ１１７６Ｆからなる群から選択される任意の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上の突然変異を含む。
いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は配列番号４５に示す配列を含む。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は、配列番号４５の配列と少なくとも或いは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、例えば１３、１８、２０、２６、６９、７０、８０、１３８、１４２、１４４、１５２、１９０、２１５、２４２、２４３、２４４、２４６、４００、４０１、４０２、４１７、４４０、４５２、４７７、４８４、５０１、５７０、６１４、６５５、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、７０１、７１６、８８８、９８２、１０２７、１１１８及び１１７６（配列番号５５のアミノ酸位置）からなる群から選択される１つ又は複数のアミノ酸位置に置換、欠失及び／又は挿入を含む配列である。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は配列番号４５の変異体を含み、この変異体はＳ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９－７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２－２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００－４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ及びＶ１１７６Ｆからなる群から選択される任意の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上の突然変異を含む。
いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は配列番号４６に示す配列を含む。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は、配列番号４６の配列と少なくとも或いは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、例えば１３、１８、２０、２６、６９、７０、８０、１３８、１４２、１４４、１５２、１９０、２１５、２４２、２４３、２４４、２４６、４００、４０１、４０２、４１７、４４０、４５２、４７７、４８４、５０１、５７０、６１４、６５５、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、７０１、７１６、８８８、９８２、１０２７、１１１８及び１１７６（配列番号５５のアミノ酸位置）からなる群から選択される１つ又は複数のアミノ酸位置に置換、欠失及び／又は挿入を含む配列である。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は配列番号４６の変異体を含み、この変異体はＳ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９－７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２－２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００－４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ及びＶ１１７６Ｆからなる群から選択される任意の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上の突然変異を含む。
いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は配列番号４７に示す配列を含む。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は、配列番号４７の配列と少なくとも或いは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、例えば１３、１８、２０、２６、６９、７０、８０、１３８、１４２、１４４、１５２、１９０、２１５、２４２、２４３、２４４、２４６、４００、４０１、４０２、４１７、４４０、４５２、４７７、４８４、５０１、５７０、６１４、６５５、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、７０１、７１６、８８８、９８２、１０２７、１１１８及び１１７６（配列番号５５のアミノ酸位置）からなる群から選択される１つ又は複数のアミノ酸位置に置換、欠失及び／又は挿入を含む配列である。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は配列番号４７の変異体を含み、この変異体はＳ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９－７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２－２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００－４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ及びＶ１１７６Ｆからなる群から選択される任意の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上の突然変異を含む。
いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は配列番号４８に示す配列を含む。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は、配列番号４８の配列と少なくとも或いは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、例えば１３、１８、２０、２６、６９、７０、８０、１３８、１４２、１４４、１５２、１９０、２１５、２４２、２４３、２４４、２４６、４００、４０１、４０２、４１７、４４０、４５２、４７７、４８４、５０１、５７０、６１４、６５５、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、７０１、７１６、８８８、９８２、１０２７、１１１８及び１１７６（配列番号５５のアミノ酸位置）からなる群から選択される１つ又は複数のアミノ酸位置に置換、欠失及び／又は挿入を含む配列である。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は配列番号４８の変異体を含み、この変異体はＳ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９－７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２－２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００－４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ及びＶ１１７６Ｆからなる群から選択される任意の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上の突然変異を含む。
いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は配列番号４９に示す配列を含む。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は、配列番号４９の配列と少なくとも或いは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、例えば１３、１８、２０、２６、６９、７０、８０、１３８、１４２、１４４、１５２、１９０、２１５、２４２、２４３、２４４、２４６、４００、４０１、４０２、４１７、４４０、４５２、４７７、４８４、５０１、５７０、６１４、６５５、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、７０１、７１６、８８８、９８２、１０２７、１１１８及び１１７６（配列番号５５のアミノ酸位置）からなる群から選択される１つ又は複数のアミノ酸位置に置換、欠失及び／又は挿入を含む配列である。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は配列番号４９の変異体を含み、この変異体はＳ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９－７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２－２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００－４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ及びＶ１１７６Ｆからなる群から選択される任意の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上の突然変異を含む。
いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は配列番号５０に示す配列を含む。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は、配列番号５０の配列と少なくとも或いは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、例えば１３、１８、２０、２６、６９、７０、８０、１３８、１４２、１４４、１５２、１９０、２１５、２４２、２４３、２４４、２４６、４００、４０１、４０２、４１７、４４０、４５２、４７７、４８４、５０１、５７０、６１４、６５５、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、７０１、７１６、８８８、９８２、１０２７、１１１８及び１１７６（配列番号５５のアミノ酸位置）からなる群から選択される１つ又は複数のアミノ酸位置に置換、欠失及び／又は挿入を含む配列である。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は配列番号５０の変異体を含み、この変異体はＳ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９－７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２－２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００－４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ及びＶ１１７６Ｆからなる群から選択される任意の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上の突然変異を含む。
いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は配列番号５１に示す配列を含む。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は、配列番号５１の配列と少なくとも或いは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、例えば１３、１８、２０、２６、６９、７０、８０、１３８、１４２、１４４、１５２、１９０、２１５、２４２、２４３、２４４、２４６、４００、４０１、４０２、４１７、４４０、４５２、４７７、４８４、５０１、５７０、６１４、６５５、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、７０１、７１６、８８８、９８２、１０２７、１１１８及び１１７６（配列番号５５のアミノ酸位置）からなる群から選択される１つ又は複数のアミノ酸位置に置換、欠失及び／又は挿入を含む配列である。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は配列番号５１の変異体を含み、この変異体はＳ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９－７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２－２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００－４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ及びＶ１１７６Ｆからなる群から選択される任意の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上の突然変異を含む。
いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は配列番号５２に示す配列を含む。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は、配列番号５２の配列と少なくとも或いは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原はシグナルペプチドを含む。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は配列番号５３に示す配列を含む。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は、配列番号５３の配列と少なくとも或いは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は配列番号５４に示す配列を含む。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は、配列番号５４の配列と少なくとも或いは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は配列番号５５に示す配列を含む。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は、配列番号５５の配列と少なくとも或いは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、例えば１３、１８、２０、２６、６９、７０、８０、１３８、１４２、１４４、１５２、１９０、２１５、２４２、２４３、２４４、２４６、４００、４０１、４０２、４１７、４４０、４５２、４７７、４８４、５０１、５７０、６１４、６５５、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、７０１、７１６、８８８、９８２、１０２７、１１１８及び１１７６からなる群から選択される１つ又は複数のアミノ酸位置に置換、欠失及び／又は挿入を含む配列である。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は配列番号５５の変異体を含み、この変異体はＳ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９－７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２－２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００－４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ及び１１７６Ｆからなる群から選択される任意の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上の突然変異を含む。
いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は配列番号５６に示す配列を含む。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は、配列番号５６の配列と少なくとも或いは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、例えば１３、１８、２０、２６、６９、７０、８０、１３８、１４２、１４４、１５２、１９０、２１５、２４２、２４３、２４４、２４６、４００、４０１、４０２、４１７、４４０、４５２、４７７、４８４、５０１、５７０、６１４、６５５、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、７０１、７１６、８８８、９８２、１０２７、１１１８及び１１７６（配列番号５５のアミノ酸位置）からなる群から選択される１つ又は複数のアミノ酸位置に置換、欠失及び／又は挿入を含む配列である。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は配列番号５６の変異体を含み、この変異体はＳ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９－７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２－２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００－４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ及びＶ１１７６Ｆからなる群から選択される任意の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上の突然変異を含む。
いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は配列番号５７に示す配列を含む。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は、配列番号５７の配列と少なくとも或いは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、例えば配列番号５７の１つ又は複数のアミノ酸位置に置換、欠失及び／又は挿入を含む配列である。
いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は配列番号５８に示す配列を含む。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は、配列番号５８の配列と少なくとも或いは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、例えば配列番号５８の１つ又は複数のアミノ酸位置に置換、欠失及び／又は挿入を含む配列である。
いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は配列番号５９に示す配列を含む。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は、配列番号５９の１つ又は複数のアミノ酸位置に置換、欠失及び／又は挿入を含むアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は配列番号６０に示す配列を含む。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は、配列番号６０の１つ又は複数のアミノ酸位置に置換、欠失及び／又は挿入を含むアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は配列番号６１に示す配列を含む。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は、配列番号６１の配列と少なくとも或いは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、例えば配列番号６１の１つ又は複数のアミノ酸位置に置換、欠失及び／又は挿入を含む配列である。
いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は配列番号６２に示す配列を含む。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は、配列番号６２の配列と少なくとも或いは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、例えば配列番号６２の１つ又は複数のアミノ酸位置に置換、欠失及び／又は挿入を含む配列である。
いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は配列番号６３に示す配列を含む。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は、配列番号６３の配列と少なくとも或いは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、例えば配列番号６３の１つ又は複数のアミノ酸位置に置換、欠失及び／又は挿入を含む配列である。
いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は配列番号６４に示す配列を含む。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は、配列番号６４の配列と少なくとも或いは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、例えば配列番号６４の１つ又は複数のアミノ酸位置に置換、欠失及び／又は挿入を含む配列である。
いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は配列番号６５に示す配列を含む。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は、配列番号６５の配列と少なくとも或いは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、例えば配列番号６５の１つ又は複数のアミノ酸位置に置換、欠失及び／又は挿入を含む配列である。
いくつかの実施形態において、ウイルス抗原又は免疫原は、配列番号６６などの膜貫通ドメイン又はその一部を含まない。いくつかの実施形態において、コロナウイルスのウイルス抗原又は免疫原は可溶性Ｓタンパク質ペプチドを含む。いくつかの実施形態において、可溶性Ｓタンパク質ペプチドはＴＭドメインペプチド及びＣＰドメインペプチドを有さない。いくつかの実施形態において、可溶性Ｓタンパク質ペプチドは、膜又はウイルスエンベロープなどの脂質二重層に結合しない。
いくつかの実施形態において、Ｓタンパク質ペプチドはコドン最適化された核酸配列から産生される。いくつかの実施形態において、Ｓタンパク質ペプチドはコドン最適化されていない核酸配列から産生される。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載するように、ウイルス抗原又は免疫原は、該ウイルス抗原又は免疫原を含む組換ポリペプチド又は融合ペプチドを含むことができる。ウイルス抗原又は免疫原という用語は、コロナウイルスのウイルス抗原又は免疫原を含むタンパク質を指すのに使用し得る。特定の例において、コロナウイルスのウイルス抗原又は免疫原は本明細書で提供されるようなコロナウイルスタンパク質ペプチドである。
ＩＩ．組換ペプチド及びタンパク質
本明細書で提供されるコロナウイルスのウイルス抗原及び免疫原、例えばＳタンパク質ペプチド（セクションＩを参照）は、他のタンパク質又はペプチドと連結するなど、結合することができ、融合ペプチドを含む組換ポリペプチドを形成することが予想される。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される個別の組換ポリペプチド（例、単量体）は会合して組換ポリペプチドの多量体、例えば三量体を形成する。いくつかの実施形態において、個別の組換ポリペプチドの単量体の会合は共有結合性相互作用により起こる。いくつかの実施形態において、個別の組換ポリペプチド単量体の会合は非共有結合性相互作用により起こる。いくつかの実施形態において、共有結合又は非共有結合などの相互作用は、コロナウイルスのウイルス抗原又は免疫原、例えばＳタンパク質ペプチドが連結するタンパク質又はペプチドの影響を受ける。いくつかの実施形態において、例えばコロナウイルスのウイルス抗原又は免疫原が本明細書に記載するようにＳタンパク質ペプチドであるとき、これが連結するであろうタンパク質又はペプチドは、糖タンパク質の天然のホモ三量体構造が保存されるように選択することができる。これは、Ｓタンパク質ペプチドに対する強力で効果的な免疫原性応答を引き起こすのに有利であり得る。例えば、コロナウイルスのウイルス抗原又は免疫原（例、Ｓタンパク質ペプチド）の天然の構造の保存及び／又は維持は、免疫応答を生成することができる抗原部位への到達を改善又は可能にし得る。いくつかの例では、本明細書に記載されるＳタンパク質ペプチドを含む組換ポリペプチド（例えばセクションＩを参照）は、本明細書において組換Ｓ抗原、組換Ｓ免疫原、又は組換Ｓタンパク質と呼ばれる。
いくつかの例では、組換ポリペプチド又はその多量体化した組換ポリペプチドは、凝集するか、又は凝集させて複数のコロナウイルスのウイルス抗原及び／又は免疫原である組換ポリペプチドを含むタンパク質又は複合体を形成することができることが更に予想される。このようなタンパク質の形成は、コロナウイルスのウイルス抗原及び／又は免疫原に対する強力で効果的な免疫原性応答を生成するのに有利であり得る。例えば、複数の組換ポリペプチド含むタンパク質を形成し、これにより例えばコロナウイルスＳタンパク質ペプチドなど、複数のコロナウイルスのウイルス抗原を形成し、ウイルス抗原の三次及び／又は四次構造を保存し得、天然構造に対する免疫応答を引き起こさせる。いくつかの例では、凝集はコロナウイルスのウイルス抗原又は免疫原の構造安定性を与え得、次に免疫応答を促進することができる潜在的な抗原性部位に達することができる。
いくつかの実施形態において、コロナウイルスのウイルス抗原又は免疫原は、三量体化ドメインにＣ末端で連結することができ（Ｃ末端結合）、単量体の三量体化を促進する。いくつかの実施形態において、三量体化は三量体構造によりコロナウイルスのウイルス抗原又は免疫原、例えばコロナウイルスＳタンパク質ペプチドの膜近位側を安定させる。
可溶性組換タンパク質の安定した三量体を促進する外因性多量体化ドメインの非限定例としては、ＧＣＮ４ロイシンジッパー（Ｈａｒｂｕｒｙら、１９９３年、Ｓｃｉｅｎｃｅ２６２：１４０１－１４０７）、肺サーファクタントタンパク質由来の三量体化モチーフ（Ｈｏｐｐｅら、１９９４年、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ３４４：１９１－１９５）、コラーゲン（ＭｃＡｌｉｎｄｅｎら、２００３年、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ２７８：４２２００－４２２０７）、及びファージＴ４フィブリチンフォルドン（Ｍｉｒｏｓｈｎｉｋｏｖら、１９９８年、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ１１：３２９－４１４）が挙げられ、そのいずれかは本明細書に記載されるコロナウイルスのウイルス抗原又は免疫原に連結することができ（例、ＳペプチドがＣ末端に連結することにより）、組換ウイルス抗原又は免疫原の三量体化を促進する。米国特許第７，２６８，１１６号明細書、第７，６６６，８３７号明細書、第７，６９１，８１５号明細書、第１０，６１８，９４９号明細書、第１０，９０６，９４４号明細書、及び第１０，９６０，０７０号明細書、並びに米国特許出願公開第２０２０／０００９２４４号明細書も参照のこと。あらゆる目的のためその全体が参照により本明細書に組み入れられたものとする。
いくつかの実施形態において、１つ又は複数のペプチドリンカー（ｇｌｙ－ｓｅｒリンカー、例えば１０アミノ酸のグリシン－セリンペプチドリンカーなど）は、多量体化ドメインに組換ウイルス抗原又は免疫原を結合するのに使用することができる。三量体は、組換ウイルス抗原又は免疫原の三量体が所望の性質（例、融合前構造）を保ちさえすれば、本明細書で提供した安定させる突然変異（又はその組合せ）のいずれかを含むことができる。
治療的に実行可能であるように、生物学的製剤設計に所望の三量体タンパク質部分は以下の基準を満たすべきである。理想的に、免疫グロブリンＦｃのような天然の分泌タンパク質の一部であるべきであり、これは循環血液中に豊富であり（無毒）、ヒト起源であり（免疫原性の欠如）、比較的安定し（長半減期）、効率的な自己三量体化が可能であり、この自己三量体化は鎖間共有結合性ジスルフィド結合により強化される。従って、三量体化されたコロナウイルスのウイルス抗原又は免疫原は構造的に安定である。
コラーゲンは細胞外マトリックスの主な構成要素である線維性タンパク質のファミリーである。哺乳類で最も豊富なタンパク質であり、身体の総タンパク質のほぼ２５％を構成する。コラーゲンは、骨、腱、皮膚、角膜、軟骨、血管及び歯の形成における主要な構造的役割を担う。コラーゲンＩ、ＩＩ、ＩＩＩ，ＩＶ、Ｖ及びＸＩのフィブリル型はすべてプロコラーゲンと呼ばれるより大きな三量体前駆体として合成される。数百の「Ｇ－Ｘ－Ｙ」繰り返し（又はグリシンの繰り返し）からなる中央の連続した三重らせんドメインの側面に、非コラーゲンドメイン（ＮＣ）、Ｎプロペプチド及びＣプロペプチドが配置される。Ｃ及びＮ末端伸長のどちらもプロコラーゲンが分泌されると、タンパク質分解的にプロセシングされる。この事象により成熟タンパク質がコラーゲンフィブリルに集合し、不溶性細胞基質の形成を引き起こす。ＢＭＰ－１は、グリシン繰り返し及びコラーゲンのＣプロドメイン間の接続付近にあるプロコラーゲンの特異的ペプチド配列を認識し、プロペプチドの除去を担うプロテアーゼである。Ｉ型コラーゲンのシェディングされた三量体Ｃプロペプチドは、健常成人のヒト血清に５０～３００ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度で存在することが見出され、子供でははるかに高いレベルを有し、活性な骨形成を示す。Ｉ型コラーゲンのＣプロペプチドの家族性高血清濃度を有する人々において、そのレベルは１～６μｇ／ｍＬに達し、明らかな異常はない。これは、Ｃプロペプチドが毒性を有さないことを示唆する。コラーゲンの三量体Ｃプロペプチドの構造的研究により、三葉構造であり、３つすべてのサブユニットがＮ末端付近の接続領域で凝集し、プロコラーゲン分子の残部に連結することが示唆された。この突出するタンパク質の幾何形状は一方向に融合され、Ｆｃ二量体と類似している。
Ｉ、ＩＶ、Ｖ及びＸＩ型コラーゲンは、主に２つのα１鎖及び１つのα２鎖（Ｉ、ＩＶ、Ｖ型に関して）、又は３つの異なるａ鎖（ＸＩ型に関して）からなるヘテロ三量体形態に集合し、これらの配列は高度に一致する。ＩＩ及びＩＩＩ型コラーゲンはどちらもα１鎖のホモ三量体である。コラーゲンの最も豊富な形態であるＩ型コラーゲンに関し、安定したα（Ｉ）ホモ三量体も形成され、異なる組織で様々なレベルで存在する。これらのコラーゲンＣプロペプチド鎖の多くは、細胞で単独で過剰発現すると、ホモ三量体に自己集合することができる。Ｎプロペプチドドメインがまず合成されるが、三量体コラーゲンへの分子集合は、Ｃプロペプチドの重ね合わせによる会合から始まる。Ｃプロペプチド複合体は鎖間ジスルフィド結合の形成により安定するが、適当な鎖の重ね合わせのためにジスルフィド結合を形成する必要性は不明であると考えられる。その後、グリシンの三重らせんの繰り返しは、ジッパー方式で関連するＣ末端からＮ末端まで伝搬される。組換ＤＮＡ技術を使用し、異なるコラーゲン鎖のＣプロペプチドを交換することにより、非天然型のコラーゲンマトリックスを作り出している。サイトカイン及び成長因子などの非コラーゲンタンパク質は、プロコラーゲン又は成熟コラーゲンのＮ末端とも融合され、新規のコラーゲンマトリックスを形成し、これは細胞基質から非コラーゲンタンパク質をゆっくりと放出させることを目的とする。しかし、どちらの状況下でも、Ｃプロペプチドは組換コラーゲンフィブリルが集合して不溶性細胞基質になる前に切断される必要がある。
他のタンパク質三量体化ドメイン、例えばバクテリオファージＴ４酵母フィブリチンのＧＣＮ４及び大腸菌のアスパラギン酸カルバモイル転移酵素由来のものは、異種タンパク質を三量体化させることがすでに記載されているが、これらの三量体タンパク質のいずれも性質上ヒトではなく、天然に分泌されるタンパク質でもない。このように、任意の三量体融合タンパク質は細胞内で作製されなければならず、これにより可溶性受容体などの天然の分泌タンパク質についてミスフォールディングを引き起こし得るだけでなく、何千もの他の細胞内タンパク質からこのような融合タンパク質の精製を難しくし得る。更に、三量体の生物学的製剤設計について、このような非ヒトタンパク質の三量体化ドメイン（例、酵母、バクテリオファージ及び細菌由来）を使用する致命的な欠点は、人体における仮定される免疫原性であり、これによりこのような融合タンパク質は、人体に注入後直ちに、その効果が失われることである。
このように、本明細書に記載されるような組換ポリペプチドにおけるコラーゲンの使用は多くの利点を有する。（１）コラーゲンは哺乳類の身体で分泌される最も豊富なタンパク質であり、身体における総タンパク質のほぼ２５％を構成する；（２）コラーゲンの主な形態は三量体らせんで天然に存在し、これらの球状Ｃプロペプチドは三量体化を開始するのを担う；（３）成熟コラーゲンからタンパク質分解により放出されるコラーゲンの三量体Ｃプロペプチドは、哺乳類の血液でサブマイクログラム／ｍＬレベルで天然に見出され、身体に有毒でないと思われる；（４）コラーゲンの線状三重らせん領域は、各残基の間隔が２．９Åであることが予測されるリンカーとして含まれることができ、又は融合タンパク質の一部として排除されることができ、従って三量体化されるタンパク質及びコラーゲンのＣプロペプチド間の距離を正確に調節することができ、最適な生物活性を達成する；（５）プロコラーゲンからＣプロペプチドを切断するＢＭＰ１の認識部位は、突然変異させるか、又は除去することができ、三量体融合タンパク質の破壊を防止する；（６）Ｃプロペプチドドメインはジスルフィド結合によりそれ自体で三量体を形成し、一般的なアフィニティタグを提供し、生成した任意の分泌型の融合タンパク質の精製にこれを使用することができる。いくつかの実施形態において、コロナウイルスのウイルス抗原及び免疫原、例えばＳタンパク質ペプチドに連結するコラーゲンのＣプロペプチドは、可溶性で共有結合的に連結したホモ三量体融合タンパク質の組換え産生を行うことができる。
いくつかの実施形態において、コロナウイルスのウイルス抗原又は免疫原は、コラーゲンのＣ末端プロペプチドに連結して組換ポリペプチドを形成する。いくつかの実施形態において、組換ポリペプチドのＣ末端プロペプチドはポリペプチド間ジスルフィド結合を形成する。いくつかの実施形態において、組換タンパク質は三量体を形成する。いくつかの実施形態において、コロナウイルスのウイルス抗原又は免疫原はセクションＩに記載されるようなＳタンパク質ペプチドである。
例えば、ポリペプチド間ジスルフィド結合により、配列番号１に示す融合ポリペプチドのＮ末端にシグナルペプチドＭＦＶＦＬＶＬＬＰＬＶＳＳ（配列番号５４）を含む融合ポリペプチドが作製され、三量体を形成し得る（ポリペプチド間ジスルフィド結合を形成し得るＣｙｓ残基は太字である）。
Figure 2023529484000003
いくつかの実施形態において、ポリペプチド間ジスルフィド結合はＣｙｓ１５－１３６、Ｃｙｓ１３１－１６６、Ｃｙｓ２９１－３０１、Ｃｙｓ３７９－４３２、Ｃｙｓ３３６－３６１、Ｃｙｓ３９１－５２５、Ｃｙｓ４８０－４８８、Ｃｙｓ５３８－５９０、Ｃｙｓ６１７－６４９、Ｃｙｓ６６２－６７１、Ｃｙｓ７４３－７４９、Ｃｙｓ７３８－７６０、Ｃｙｓ８４０－８５１、Ｃｙｓ１０３２－１０４３及びＣｙｓ１０８２－１１２６の１つ又は複数又は全てを任意の好適な組合せで含み得る。いくつかの実施形態において、三量体における融合ポリペプチドは、例えば１７、６１、１２２、１４９、１６５、２３４、２８２、３３１、３４３、６０３、６１６、６５７、７０９、７１７、８０１、１０７４、１０９８及び１１３４の１つ又は複数又は全てのＡｓｎ残基に１つ又は複数のグルコシル化部位（例、Ａｓｎ結合型）を任意の好適な組合せで含み得る。
いくつかの実施形態において、Ｃ末端プロペプチドはヒトコラーゲンのものである。いくつかの実施形態において、Ｃ末端プロペプチドはｐｒｏα１（Ｉ）、ｐｒｏα１（ＩＩ）、ｐｒｏα１（ＩＩＩ）、ｐｒｏα１（Ｖ）、ｐｒｏα１（ＸＩ）、ｐｒｏα２（Ｉ）、ｐｒｏα２（Ｖ）、ｐｒｏα２（ＸＩ）又はｐｒｏα３（ＸＩ）のＣ末端ポリペプチド、或いはその断片を含む。いくつかの実施形態において、Ｃ末端プロペプチドはｐｒｏα１（Ｉ）のＣ末端ポリペプチドであるか、又はこれを含む。
いくつかの実施形態において、Ｃ末端プロペプチドは配列番号６７～８０のいずれかに示すアミノ酸配列であるか、又はこれを含む。いくつかの実施形態において、Ｃ末端プロペプチドは配列番号６７～８０のいずれかと少なくとも或いは約８５％、９０％、９２％、９５％又は９７％の配列相同性を有するアミノ酸配列である。
いくつかの実施形態において、Ｃ末端プロペプチドはコラーゲン三量体化ドメイン（例、ヒトα１（Ｉ）コラーゲンのＣプロペプチド）のアミノ酸配列であるか、又はこれを含み、ＢＭＰ－１部位でアスパラギン酸（Ｄ）がアスパラギン（Ｎ）に置換されており、例えば配列番号６８に示すように、ＲＡＤがＲＡＮに突然変異している。いくつかの実施形態において、Ｃ末端プロペプチドはコラーゲン三量体化ドメイン（例、ヒトα１（Ｉ）コラーゲンのＣプロペプチド）のアミノ酸配列であるか、又はこれを含み、ＢＭＰ－１部位でアラニン（Ａ）がアスパラギン（Ｎ）に置換されており、例えば配列番号６９に示すように、ＲＡＤがＲＮＤに突然変異されている。いくつかの実施形態において、本明細書のＣ末端プロペプチドは、ＤＤＡＮではなく、ＲＳＡＮなどの突然変異したＢＭＰ－１部位を含み得る。いくつかの実施形態において、本明細書のＣ末端プロペプチドはＢＭＰ－１部位を含み得、例えばＲＡＮ（例、ＲＡＮＤＡＮ）又はＲＮＤ（例、ＲＮＤＤＡＮ）の代わりにＲＡＤ（例、ＲＡＤＤＡＮ）配列を含む（配列番号６８又は６９などの）配列を本明細書で開示される融合ポリペプチドにおいて使用し得る。例えば、配列番号２７（下線付き）又はその断片、変異体もしくは突然変異体は、配列番号６７（イタリック体）又はその断片、変異体もしくは突然変異体に直接又は間接的に連結し得て、例えば以下の融合タンパク質を形成する。
Figure 2023529484000004
いくつかの実施形態において、Ｃ末端プロペプチドは、配列番号６７～８０のいずれかの断片のアミノ酸配列であるか、又はこれを含む。
いくつかの実施形態において、Ｃ末端プロペプチドはグリシン－Ｘ－Ｙ繰り返しを含む配列、或いはこれと少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％又は９７％の相同性を有するアミノ酸配列を含むことができ、ポリペプチド間ジスルフィド結合を形成し、組換ポリペプチドを三量体化することができる。Ｘ及びＹは独立して任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態において、Ｘ及びＹは独立してプロリン又はヒドロキシプロリンである。
Ｓタンパク質ペプチドがＣ末端プロペプチドに連結して組換ポリペプチドを形成するいくつかの例では、組換ポリペプチドはＳタンパク質ペプチドのホモ三量体となる三量体を形成する。いくつかの実施形態において、三量体化した組換ポリペプチドのＳタンパク質ペプチドは融合前構造である。いくつかの実施形態において、三量体化した組換ポリペプチドのＳタンパク質ペプチドは融合後構造である。いくつかの実施形態において、この構造状態はＳタンパク質ペプチドの異なる抗原部位に達することができる。いくつかの実施形態において、抗原部位は線状エピトープ又は配座エピトープなどのエピトープである。記載するように、三量体化した組換ポリペプチドを有する利点は、様々な潜在的で異なる抗原部位に対して免疫応答を行うことができることである。
いくつかの実施形態において、三量体化した組換ポリペプチドは同じウイルス抗原又は免疫原を含む個別の組換ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、三量体化した組換ポリペプチドは個別の組換ポリペプチドを含み、それぞれが他の組換ポリペプチドと異なるウイルス抗原又は免疫原を含む。いくつかの実施形態において、三量体化した組換ポリペプチドは個別の組換ポリペプチドを含み、個別の組換ポリペプチドの１つは他の組換ポリペプチドと異なるウイルス抗原又は免疫原を含む。いくつかの実施形態において、三量体化した組換ポリペプチドは個別の組換ポリペプチドを含み、個別の組換ポリペプチドの２つは同じウイルス抗原又は免疫原を含み、このウイルス抗原又は免疫原は残りの組換ポリペプチドに含まれるウイルス抗原又は免疫原と異なる。
いくつかの実施形態において、組換ポリペプチドはセクションＩに記載される任意のコロナウイルスのウイルス抗原又は免疫原を含む。いくつかの実施形態において、組換ポリペプチドは、セクションＩに記載される任意のコロナウイルスのウイルス抗原又は免疫原を含み、本明細書に記載されるようなコラーゲンのＣ末端プロペプチドに、本明細書に記載されるように連結する。
いくつかの実施形態において、免疫原はプロトマーを含む組換ＳＡＲＳ－ＣｏＶ又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓエクトドメイン三量体を含み、これはＨＲ１ドメイン及び中央ヘリックスドメイン間の境界に、又は境界付近に１つ又は複数の（２など、例えば連続する２つ）プロリン置換を含み、融合前構造のＳエクトドメイン三量体を安定させる。いくつかのこのような実施形態において、融合前構造のＳエクトドメインを安定させる１つ又は複数の（２など、例えば連続する２つ）プロリン置換は、ＨＲ１のＣ末端残基における１５位のアミノ酸のＮ末端と、中央ヘリックスのＮ末端残基における５位のアミノ酸のＣ末端との間に位置する。
いくつかの実施形態において、１つ又は複数の（２など、例えば連続する２つ）プロリン置換は、融合前構造のコロナウイルス（例、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）Ｓエクトドメイン三量体を安定させる。いくつかの実施形態において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質ペプチドは、９８６Ｋ／９８７Ｖから９８６Ｐ／９８７Ｐへの突然変異を含む。
いくつかの実施形態において、融合前構造で安定化された組換コロナウイルス（例、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）Ｓエクトドメイン三量体は、Ｓ１／Ｓ２及び／又はＳ２’プロテアーゼ切断部位の突然変異を含む一本鎖Ｓエクトドメインプロトマーを含み、これらの部位のプロテアーゼ切断を防止する。いくつかの実施形態において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質ペプチドは６８５Ｒから６８５Ａの突然変異を含む。様々なウイルスの例示的なプロテアーゼ切断部位を以下に示す。
Figure 2023529484000005
いくつかの実施形態において、１つ又は複数のプロリン置換（９８６Ｐ／９８７Ｐ置換など）により融合前構造で安定化された組換コロナウイルス（例、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）Ｓエクトドメイン三量体のプロトマーは、プロテアーゼ切断部位の突然変異によりプロテアーゼ切断を防止するなど、融合前構造の安定化のために更なる修飾を含む。
配列番号５５として挙げられるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質配列に関し、エクトドメインは細胞プロセシング中に除去されるシグナルペプチド（ＳＰ）；Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）；受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）；１つ又は複数のＳ１／Ｓ２切断部位；融合ペプチド（ＦＰ）；内部融合ペプチド（ＩＦＰ）；ヘプタッドリピート１／２（ＨＲ１／２）及び膜貫通ドメイン（ＴＭ）を含む。例示的な配列は、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／ＭＮ９０８９４７．３、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／ＭＮ９０８９４７、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／ＭＮ９０８９４７．２に見出すことができる。更なる配列は肺炎ウイルスの分離株であるＷｕｈａｎ－Ｈｕ－１の全ゲノムを含むｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｂａｎｋ／ｓａｒｓ－ｃｏｖ－２－ｓｅｑｓ／に見出すことができる。
いくつかの実施形態において、融合前に安定化したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓエクトドメイン三量体のプロトマーは、ＮＴＤ、ＲＢＤ、（Ｓ１／Ｓ２サイト１又はＳ１／Ｓ２サイト２の）Ｓ１、ＦＰ、ＩＦＰ、ＨＲ１、ＨＲ２又はエクトドメインのＣ末端残基のＣ末端残基（例えば、三量体化ドメイン又は膜貫通ドメインに連結することができる）を有することができる。Ｓタンパク質の位置ナンバリングはＳＡＲＳ－ＣｏＶ株間で変わり得るが、配列を調節して関連する構造ドメイン及び切断部位を決定することができる。免疫原としてＳエクトドメイン三量体の有用性を減少させることなく、開示された免疫原において、いずれかのエクトドメイン断片のＮ及びＣ末端の数残基（１０までなど）を低減又は修飾することができることを理解されたい。
いくつかの実施形態において、組換ポリペプチドはＳＡＲＳ－ＣｏＶ又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質のＮＴＤペプチドであるか、又はこれを含む。いくつかの実施形態において、組換ポリペプチドはＳＡＲＳ－ＣｏＶ又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質のＲＢＤペプチドであるか、又はこれを含む。いくつかの実施形態において、組換ポリペプチドはＳＡＲＳ－ＣｏＶ又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質のＮＴＤペプチド及びＲＢＤペプチドであるか、又はこれらを含む。いくつかの実施形態において、組換ポリペプチドはＳＡＲＳ－ＣｏＶ又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質のＳ１ドメインペプチドであるか、又はこれを含む。いくつかの実施形態において、組換ポリペプチドはＳＡＲＳ－ＣｏＶ又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質のＳ２ドメインペプチドであるか、又はこれを含む。
いくつかの実施形態において、組換ポリペプチド又は融合タンパク質は配列番号２７～６６のいずれかに示す第１の配列を含み、配列番号６７～８０のいずれかに示す第２の配列に連結する。第１の配列のＣ末端は第２の配列のＮ末端に直接又は間接的に連結する。
シグナルペプチドを有さない例示的なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１Ｓ組換ポリペプチドを配列番号２６（１４９１ａａ）に示す。
Figure 2023529484000006
上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１Ｓ組換ポリペプチドは配列番号５３に示すＮ末端シグナルペプチドを含み得る。
シグナルペプチドを有さない例示的なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓ組換ポリペプチドを配列番号１（１５０９ａａ）に示す。
Figure 2023529484000007
上記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓ組換ポリペプチドは配列番号５４に示すＮ末端シグナルペプチドを含み得る。
いくつかの実施形態において、組換ポリペプチドは配列番号１に示す配列であるか、又はこれを含む。いくつかの実施形態において、組換ポリペプチドは配列番号１と少なくとも或いは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列であるか、又はこれを含み、例えば１３、１８、２０、２６、６９、７０、８０、１３８、１４２、１４４、１５２、１９０、２１５、２４２、２４３、２４４、２４６、４００、４０１、４０２、４１７、４４０、４５２、４７７、４８４、５０１、５７０、６１４、６５５、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、７０１、７１６、８８８、９８２、１０２７、１１１８及び／又は１１７６（配列番号５５のアミノ酸位置）、或いはその任意の組合せなどの１つ又は複数のアミノ酸位置に置換、欠失及び／又は挿入を含む配列である。いくつかの実施形態において、組換ポリペプチドは配列番号１の変異体であるか、又はこれを含み、この変異体はＳ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９－７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２－２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００－４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ及びＶ１１７６Ｆ、又はその任意の組合せからなる群から選択される任意の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上の突然変異を含む。
いくつかの実施形態において、組換ポリペプチドは配列番号２に示す配列であるか、又はこれを含む。いくつかの実施形態において、組換ポリペプチドは配列番号２と少なくとも或いは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列であるか、又はこれを含み、例えば１３、１８、２０、２６、６９、７０、８０、１３８、１４２、１４４、１５２、１９０、２１５、２４２、２４３、２４４、２４６、４００、４０１、４０２、４１７、４４０、４５２、４７７、４８４、５０１、５７０、６１４、６５５、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、７０１、７１６、８８８、９８２、１０２７、１１１８及び／又は１１７６（配列番号５５のアミノ酸位置）、或いはその任意の組合せなどの１つ又は複数のアミノ酸位置に置換、欠失及び／又は挿入を含む配列である。いくつかの実施形態において、組換ポリペプチドは配列番号２の変異体であるか、又はこれを含み、この変異体はＳ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９－７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２－２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００－４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ及びＶ１１７６Ｆ、又はその任意の組合せからなる群から選択される任意の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上の突然変異を含む。
いくつかの実施形態において、組換ポリペプチドは配列番号３に示す配列であるか、又はこれを含む。いくつかの実施形態において、組換ポリペプチドは配列番号３と少なくとも或いは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列であるか、又はこれを含み、例えば１３、１８、２０、２６、６９、７０、８０、１３８、１４２、１４４、１５２、１９０、２１５、２４２、２４３、２４４、２４６、４００、４０１、４０２、４１７、４４０、４５２、４７７、４８４、５０１、５７０、６１４、６５５、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、７０１、７１６、８８８、９８２、１０２７、１１１８及び／又は１１７６（配列番号５５のアミノ酸位置）、或いはその任意の組合せなどの１つ又は複数のアミノ酸位置に置換、欠失及び／又は挿入を含む配列である。いくつかの実施形態において、組換ポリペプチドは配列番号３の変異体であるか、又はこれを含み、この変異体はＳ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９－７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２－２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００－４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ及びＶ１１７６Ｆ、又はその任意の組合せからなる群から選択される任意の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上の突然変異を含む。
いくつかの実施形態において、組換ポリペプチドは配列番号４に示す配列であるか、又はこれを含む。いくつかの実施形態において、組換ポリペプチドは配列番号４と少なくとも或いは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列であるか、又はこれを含み、例えば１３、１８、２０、２６、６９、７０、８０、１３８、１４２、１４４、１５２、１９０、２１５、２４２、２４３、２４４、２４６、４００、４０１、４０２、４１７、４４０、４５２、４７７、４８４、５０１、５７０、６１４、６５５、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、７０１、７１６、８８８、９８２、１０２７、１１１８及び／又は１１７６（配列番号５５のアミノ酸位置）、或いはその任意の組合せなどの１つ又は複数のアミノ酸位置に置換、欠失及び／又は挿入を含む配列である。いくつかの実施形態において、組換ポリペプチドは配列番号４の変異体であるか、又はこれを含み、この変異体はＳ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９－７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２－２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００－４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ及びＶ１１７６Ｆ、又はその任意の組合せからなる群から選択される任意の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上の突然変異を含む。
いくつかの実施形態において、組換ポリペプチドは配列番号５に示す配列であるか、又はこれを含む。いくつかの実施形態において、組換ポリペプチドは配列番号５と少なくとも或いは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列であるか、又はこれを含み、例えば１３、１８、２０、２６、６９、７０、８０、１３８、１４２、１４４、１５２、１９０、２１５、２４２、２４３、２４４、２４６、４００、４０１、４０２、４１７、４４０、４５２、４７７、４８４、５０１、５７０、６１４、６５５、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、７０１、７１６、８８８、９８２、１０２７、１１１８及び／又は１１７６（配列番号５５のアミノ酸位置）、或いはその任意の組合せなどの１つ又は複数のアミノ酸位置に置換、欠失及び／又は挿入を含む配列である。いくつかの実施形態において、組換ポリペプチドは配列番号５の変異体であるか、又はこれを含み、この変異体はＳ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９－７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２－２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００－４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ及びＶ１１７６Ｆ、又はその任意の組合せからなる群から選択される任意の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上の突然変異を含む。
いくつかの実施形態において、組換ポリペプチドは配列番号６に示す配列であるか、又はこれを含む。いくつかの実施形態において、組換ポリペプチドは配列番号６と少なくとも或いは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列であるか、又はこれを含み、例えば１３、１８、２０、２６、６９、７０、８０、１３８、１４２、１４４、１５２、１９０、２１５、２４２、２４３、２４４、２４６、４００、４０１、４０２、４１７、４４０、４５２、４７７、４８４、５０１、５７０、６１４、６５５、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、７０１、７１６、８８８、９８２、１０２７、１１１８及び／又は１１７６（配列番号５５のアミノ酸位置）、或いはその任意の組合せなどの１つ又は複数のアミノ酸位置に置換、欠失及び／又は挿入を含む配列である。いくつかの実施形態において、組換ポリペプチドは配列番号６の変異体であるか、又はこれを含み、この変異体はＳ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９－７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２－２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００－４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ及びＶ１１７６Ｆ、又はその任意の組合せからなる群から選択される任意の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上の突然変異を含む。
いくつかの実施形態において、組換ポリペプチドは配列番号７に示す配列であるか、又はこれを含む。いくつかの実施形態において、組換ポリペプチドは配列番号７と少なくとも或いは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列であるか、又はこれを含み、例えば１３、１８、２０、２６、６９、７０、８０、１３８、１４２、１４４、１５２、１９０、２１５、２４２、２４３、２４４、２４６、４００、４０１、４０２、４１７、４４０、４５２、４７７、４８４、５０１、５７０、６１４、６５５、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、７０１、７１６、８８８、９８２、１０２７、１１１８及び／又は１１７６（配列番号５５のアミノ酸位置）、或いはその任意の組合せなどの１つ又は複数のアミノ酸位置に置換、欠失及び／又は挿入を含む配列である。いくつかの実施形態において、組換ポリペプチドは配列番号７の変異体であるか、又はこれを含み、この変異体はＳ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９－７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２－２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００－４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ及びＶ１１７６Ｆ、又はその任意の組合せからなる群から選択される任意の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上の突然変異を含む。
いくつかの実施形態において、組換ポリペプチドは配列番号８に示す配列であるか、又はこれを含む。いくつかの実施形態において、組換ポリペプチドは配列番号８と少なくとも或いは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列であるか、又はこれを含み、例えば１３、１８、２０、２６、６９、７０、８０、１３８、１４２、１４４、１５２、１９０、２１５、２４２、２４３、２４４、２４６、４００、４０１、４０２、４１７、４４０、４５２、４７７、４８４、５０１、５７０、６１４、６５５、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、７０１、７１６、８８８、９８２、１０２７、１１１８及び／又は１１７６（配列番号５５のアミノ酸位置）、或いはその任意の組合せなどの１つ又は複数のアミノ酸位置に置換、欠失及び／又は挿入を含む配列である。いくつかの実施形態において、組換ポリペプチドは配列番号８の変異体であるか、又はこれを含み、この変異体はＳ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９－７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２－２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００－４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ及びＶ１１７６Ｆ、又はその任意の組合せからなる群から選択される任意の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上の突然変異を含む。
いくつかの実施形態において、組換ポリペプチドは配列番号９に示す配列であるか、又はこれを含む。いくつかの実施形態において、組換ポリペプチドは配列番号９と少なくとも或いは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列であるか、又はこれを含み、例えば１３、１８、２０、２６、６９、７０、８０、１３８、１４２、１４４、１５２、１９０、２１５、２４２、２４３、２４４、２４６、４００、４０１、４０２、４１７、４４０、４５２、４７７、４８４、５０１、５７０、６１４、６５５、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、７０１、７１６、８８８、９８２、１０２７、１１１８及び／又は１１７６（配列番号５５のアミノ酸位置）、或いはその任意の組合せなどの１つ又は複数のアミノ酸位置に置換、欠失及び／又は挿入を含む配列である。いくつかの実施形態において、組換ポリペプチドは配列番号９の変異体であるか、又はこれを含み、この変異体はＳ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９－７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２－２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００－４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ及びＶ１１７６Ｆ、又はその任意の組合せからなる群から選択される任意の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上の突然変異を含む。
いくつかの実施形態において、組換ポリペプチドは配列番号１０に示す配列であるか、又はこれを含む。いくつかの実施形態において、組換ポリペプチドは配列番号１０と少なくとも或いは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列であるか、又はこれを含み、例えば１３、１８、２０、２６、６９、７０、８０、１３８、１４２、１４４、１５２、１９０、２１５、２４２、２４３、２４４、２４６、４００、４０１、４０２、４１７、４４０、４５２、４７７、４８４、５０１、５７０、６１４、６５５、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、７０１、７１６、８８８、９８２、１０２７、１１１８及び／又は１１７６（配列番号５５のアミノ酸位置）、或いはその任意の組合せなどの１つ又は複数のアミノ酸位置に置換、欠失及び／又は挿入を含む配列である。いくつかの実施形態において、組換ポリペプチドは配列番号１０の変異体であるか、又はこれを含み、この変異体はＳ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９－７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２－２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００－４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ及びＶ１１７６Ｆ、又はその任意の組合せからなる群から選択される任意の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上の突然変異を含む。
いくつかの実施形態において、組換ポリペプチドは配列番号１１に示す配列であるか、又はこれを含む。いくつかの実施形態において、組換ポリペプチドは配列番号１１と少なくとも或いは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列であるか、又はこれを含み、例えば１３、１８、２０、２６、６９、７０、８０、１３８、１４２、１４４、１５２、１９０、２１５、２４２、２４３、２４４、２４６、４００、４０１、４０２、４１７、４４０、４５２、４７７、４８４、５０１、５７０、６１４、６５５、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、７０１、７１６、８８８、９８２、１０２７、１１１８及び／又は１１７６（配列番号５５のアミノ酸位置）、或いはその任意の組合せなどの１つ又は複数のアミノ酸位置に置換、欠失及び／又は挿入を含む配列である。いくつかの実施形態において、組換ポリペプチドは配列番号１１の変異体であるか、又はこれを含み、この変異体はＳ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９－７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２－２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００－４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ及びＶ１１７６Ｆ、又はその任意の組合せからなる群から選択される任意の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上の突然変異を含む。
いくつかの実施形態において、組換ポリペプチドは配列番号１２に示す配列であるか、又はこれを含む。いくつかの実施形態において、組換ポリペプチドは配列番号１２と少なくとも或いは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列であるか、又はこれを含み、例えば１３、１８、２０、２６、６９、７０、８０、１３８、１４２、１４４、１５２、１９０、２１５、２４２、２４３、２４４、２４６、４００、４０１、４０２、４１７、４４０、４５２、４７７、４８４、５０１、５７０、６１４、６５５、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、７０１、７１６、８８８、９８２、１０２７、１１１８及び／又は１１７６（配列番号５５のアミノ酸位置）、或いはその任意の組合せなどの１つ又は複数のアミノ酸位置に置換、欠失及び／又は挿入を含む配列である。いくつかの実施形態において、組換ポリペプチドは配列番号１２の変異体であるか、又はこれを含み、この変異体はＳ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９－７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２－２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００－４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ及びＶ１１７６Ｆ、又はその任意の組合せからなる群から選択される任意の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上の突然変異を含む。
いくつかの実施形態において、組換ポリペプチドは配列番号１３に示す配列であるか、又はこれを含む。いくつかの実施形態において、組換ポリペプチドは配列番号１３と少なくとも或いは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列であるか、又はこれを含み、例えば１３、１８、２０、２６、６９、７０、８０、１３８、１４２、１４４、１５２、１９０、２１５、２４２、２４３、２４４、２４６、４００、４０１、４０２、４１７、４４０、４５２、４７７、４８４、５０１、５７０、６１４、６５５、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、７０１、７１６、８８８、９８２、１０２７、１１１８及び／又は１１７６（配列番号５５のアミノ酸位置）、或いはその任意の組合せなどの１つ又は複数のアミノ酸位置に置換、欠失及び／又は挿入を含む配列である。いくつかの実施形態において、組換ポリペプチドは配列番号１３の変異体であるか、又はこれを含み、この変異体はＳ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９－７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２－２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００－４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ及びＶ１１７６Ｆ、又はその任意の組合せからなる群から選択される任意の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上の突然変異を含む。
いくつかの実施形態において、組換ポリペプチドは配列番号１４に示す配列であるか、又はこれを含む。いくつかの実施形態において、組換ポリペプチドは配列番号１４と少なくとも或いは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列であるか、又はこれを含み、例えば１３、１８、２０、２６、６９、７０、８０、１３８、１４２、１４４、１５２、１９０、２１５、２４２、２４３、２４４、２４６、４００、４０１、４０２、４１７、４４０、４５２、４７７、４８４、５０１、５７０、６１４、６５５、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、７０１、７１６、８８８、９８２、１０２７、１１１８及び／又は１１７６（配列番号５５のアミノ酸位置）、或いはその任意の組合せなどの１つ又は複数のアミノ酸位置に置換、欠失及び／又は挿入を含む配列である。いくつかの実施形態において、組換ポリペプチドは配列番号１４の変異体であるか、又はこれを含み、この変異体はＳ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９－７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２－２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００－４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ及びＶ１１７６Ｆ、又はその任意の組合せからなる群から選択される任意の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上の突然変異を含む。
いくつかの実施形態において、組換ポリペプチドは配列番号１５に示す配列であるか、又はこれを含む。いくつかの実施形態において、組換ポリペプチドは配列番号１５と少なくとも或いは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列であるか、又はこれを含み、例えば１３、１８、２０、２６、６９、７０、８０、１３８、１４２、１４４、１５２、１９０、２１５、２４２、２４３、２４４、２４６、４００、４０１、４０２、４１７、４４０、４５２、４７７、４８４、５０１、５７０、６１４、６５５、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、７０１、７１６、８８８、９８２、１０２７、１１１８及び／又は１１７６（配列番号５５のアミノ酸位置）、或いはその任意の組合せなどの１つ又は複数のアミノ酸位置に置換、欠失及び／又は挿入を含む配列である。いくつかの実施形態において、組換ポリペプチドは配列番号１５の変異体であるか、又はこれを含み、この変異体はＳ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９－７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２－２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００－４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ及びＶ１１７６Ｆ、又はその任意の組合せからなる群から選択される任意の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上の突然変異を含む。
いくつかの実施形態において、組換ポリペプチドは配列番号１６に示す配列であるか、又はこれを含む。いくつかの実施形態において、組換ポリペプチドは配列番号１６と少なくとも或いは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列であるか、又はこれを含み、例えば１３、１８、２０、２６、６９、７０、８０、１３８、１４２、１４４、１５２、１９０、２１５、２４２、２４３、２４４、２４６、４００、４０１、４０２、４１７、４４０、４５２、４７７、４８４、５０１、５７０、６１４、６５５、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、７０１、７１６、８８８、９８２、１０２７、１１１８及び／又は１１７６（配列番号５５のアミノ酸位置）、或いはその任意の組合せなどの１つ又は複数のアミノ酸位置に置換、欠失及び／又は挿入を含む配列である。いくつかの実施形態において、組換ポリペプチドは配列番号１６の変異体であるか、又はこれを含み、この変異体はＳ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９－７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２－２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００－４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ及びＶ１１７６Ｆ、又はその任意の組合せからなる群から選択される任意の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上の突然変異を含む。
いくつかの実施形態において、組換ポリペプチドは配列番号１７に示す配列であるか、又はこれを含む。いくつかの実施形態において、組換ポリペプチドは配列番号１７と少なくとも或いは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列であるか、又はこれを含み、例えば１３、１８、２０、２６、６９、７０、８０、１３８、１４２、１４４、１５２、１９０、２１５、２４２、２４３、２４４、２４６、４００、４０１、４０２、４１７、４４０、４５２、４７７、４８４、５０１、５７０、６１４、６５５、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、７０１、７１６、８８８、９８２、１０２７、１１１８及び／又は１１７６（配列番号５５のアミノ酸位置）、或いはその任意の組合せなどの１つ又は複数のアミノ酸位置に置換、欠失及び／又は挿入を含む配列である。いくつかの実施形態において、組換ポリペプチドは配列番号１７の変異体であるか、又はこれを含み、この変異体はＳ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９－７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２－２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００－４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ及びＶ１１７６Ｆ、又はその任意の組合せからなる群から選択される任意の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上の突然変異を含む。
いくつかの実施形態において、組換ポリペプチドは配列番号１８に示す配列であるか、又はこれを含む。いくつかの実施形態において、組換ポリペプチドは配列番号１８と少なくとも或いは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列であるか、又はこれを含み、例えば１３、１８、２０、２６、６９、７０、８０、１３８、１４２、１４４、１５２、１９０、２１５、２４２、２４３、２４４、２４６、４００、４０１、４０２、４１７、４４０、４５２、４７７、４８４、５０１、５７０、６１４、６５５、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、７０１、７１６、８８８、９８２、１０２７、１１１８及び／又は１１７６（配列番号５５のアミノ酸位置）、或いはその任意の組合せなどの１つ又は複数のアミノ酸位置に置換、欠失及び／又は挿入を含む配列である。いくつかの実施形態において、組換ポリペプチドは配列番号１８の変異体であるか、又はこれを含み、この変異体はＳ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９－７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２－２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００－４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ及びＶ１１７６Ｆ、又はその任意の組合せからなる群から選択される任意の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上の突然変異を含む。
いくつかの実施形態において、組換ポリペプチドは配列番号１９に示す配列であるか、又はこれを含む。いくつかの実施形態において、組換ポリペプチドは配列番号１９と少なくとも或いは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列であるか、又はこれを含み、例えば１３、１８、２０、２６、６９、７０、８０、１３８、１４２、１４４、１５２、１９０、２１５、２４２、２４３、２４４、２４６、４００、４０１、４０２、４１７、４４０、４５２、４７７、４８４、５０１、５７０、６１４、６５５、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、７０１、７１６、８８８、９８２、１０２７、１１１８及び／又は１１７６（配列番号５５のアミノ酸位置）、或いはその任意の組合せなどの１つ又は複数のアミノ酸位置に置換、欠失及び／又は挿入を含む配列である。いくつかの実施形態において、組換ポリペプチドは配列番号１９の変異体であるか、又はこれを含み、この変異体はＳ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９－７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２－２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００－４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ及びＶ１１７６Ｆ、又はその任意の組合せからなる群から選択される任意の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上の突然変異を含む。
いくつかの実施形態において、組換ポリペプチドは配列番号２０に示す配列であるか、又はこれを含む。いくつかの実施形態において、組換ポリペプチドは配列番号２０と少なくとも或いは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列であるか、又はこれを含み、例えば１３、１８、２０、２６、６９、７０、８０、１３８、１４２、１４４、１５２、１９０、２１５、２４２、２４３、２４４、２４６、４００、４０１、４０２、４１７、４４０、４５２、４７７、４８４、５０１、５７０、６１４、６５５、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、７０１、７１６、８８８、９８２、１０２７、１１１８及び／又は１１７６（配列番号５５のアミノ酸位置）、或いはその任意の組合せなどの１つ又は複数のアミノ酸位置に置換、欠失及び／又は挿入を含む配列である。いくつかの実施形態において、組換ポリペプチドは配列番号２０の変異体であるか、又はこれを含み、この変異体はＳ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９－７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２－２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００－４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ及びＶ１１７６Ｆ、又はその任意の組合せからなる群から選択される任意の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上の突然変異を含む。
いくつかの実施形態において、組換ポリペプチドは配列番号２１に示す配列であるか、又はこれを含む。いくつかの実施形態において、組換ポリペプチドは配列番号２１と少なくとも或いは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列であるか、又はこれを含み、例えば１３、１８、２０、２６、６９、７０、８０、１３８、１４２、１４４、１５２、１９０、２１５、２４２、２４３、２４４、２４６、４００、４０１、４０２、４１７、４４０、４５２、４７７、４８４、５０１、５７０、６１４、６５５、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、７０１、７１６、８８８、９８２、１０２７、１１１８及び／又は１１７６（配列番号５５のアミノ酸位置）、或いはその任意の組合せなどの１つ又は複数のアミノ酸位置に置換、欠失及び／又は挿入を含む配列である。いくつかの実施形態において、組換ポリペプチドは配列番号２１の変異体であるか、又はこれを含み、この変異体はＳ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９－７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２－２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００－４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ及びＶ１１７６Ｆ、又はその任意の組合せからなる群から選択される任意の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上の突然変異を含む。
いくつかの実施形態において、組換ポリペプチドは配列番号２２に示す配列であるか、又はこれを含む。いくつかの実施形態において、組換ポリペプチドは配列番号２２と少なくとも或いは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列であるか、又はこれを含み、例えば１３、１８、２０、２６、６９、７０、８０、１３８、１４２、１４４、１５２、１９０、２１５、２４２、２４３、２４４、２４６、４００、４０１、４０２、４１７、４４０、４５２、４７７、４８４、５０１、５７０、６１４、６５５、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、７０１、７１６、８８８、９８２、１０２７、１１１８及び／又は１１７６（配列番号５５のアミノ酸位置）、或いはその任意の組合せなどの１つ又は複数のアミノ酸位置に置換、欠失及び／又は挿入を含む配列である。いくつかの実施形態において、組換ポリペプチドは配列番号２２の変異体であるか、又はこれを含み、この変異体はＳ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９－７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２－２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００－４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ及びＶ１１７６Ｆ、又はその任意の組合せからなる群から選択される任意の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上の突然変異を含む。
いくつかの実施形態において、組換ポリペプチドは配列番号２３に示す配列であるか、又はこれを含む。いくつかの実施形態において、組換ポリペプチドは配列番号２３と少なくとも或いは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列であるか、又はこれを含み、例えば１３、１８、２０、２６、６９、７０、８０、１３８、１４２、１４４、１５２、１９０、２１５、２４２、２４３、２４４、２４６、４００、４０１、４０２、４１７、４４０、４５２、４７７、４８４、５０１、５７０、６１４、６５５、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、７０１、７１６、８８８、９８２、１０２７、１１１８及び／又は１１７６（配列番号５５のアミノ酸位置）、或いはその任意の組合せなどの１つ又は複数のアミノ酸位置に置換、欠失及び／又は挿入を含む配列である。いくつかの実施形態において、組換ポリペプチドは配列番号２３の変異体であるか、又はこれを含み、この変異体はＳ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９－７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２－２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００－４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ及びＶ１１７６Ｆ、又はその任意の組合せからなる群から選択される任意の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上の突然変異を含む。
いくつかの実施形態において、組換ポリペプチドは配列番号２４に示す配列であるか、又はこれを含む。いくつかの実施形態において、組換ポリペプチドは配列番号２４と少なくとも或いは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列であるか、又はこれを含み、例えば１３、１８、２０、２６、６９、７０、８０、１３８、１４２、１４４、１５２、１９０、２１５、２４２、２４３、２４４、２４６、４００、４０１、４０２、４１７、４４０、４５２、４７７、４８４、５０１、５７０、６１４、６５５、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、７０１、７１６、８８８、９８２、１０２７、１１１８及び／又は１１７６（配列番号５５のアミノ酸位置）、或いはその任意の組合せなどの１つ又は複数のアミノ酸位置に置換、欠失及び／又は挿入を含む配列である。いくつかの実施形態において、組換ポリペプチドは配列番号２４の変異体であるか、又はこれを含み、この変異体はＳ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９－７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２－２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００－４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ及びＶ１１７６Ｆ、又はその任意の組合せからなる群から選択される任意の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上の突然変異を含む。
いくつかの実施形態において、組換ポリペプチドは配列番号２５に示す配列であるか、又はこれを含む。いくつかの実施形態において、組換ポリペプチドは配列番号２５と少なくとも或いは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列であるか、又はこれを含み、例えば１３、１８、２０、２６、６９、７０、８０、１３８、１４２、１４４、１５２、１９０、２１５、２４２、２４３、２４４、２４６、４００、４０１、４０２、４１７、４４０、４５２、４７７、４８４、５０１、５７０、６１４、６５５、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、７０１、７１６、８８８、９８２、１０２７、１１１８及び／又は１１７６（配列番号５５のアミノ酸位置）、或いはその任意の組合せなどの１つ又は複数のアミノ酸位置に置換、欠失及び／又は挿入を含む配列である。いくつかの実施形態において、組換ポリペプチドは配列番号２５の変異体であるか、又はこれを含み、この変異体はＳ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９－７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２－２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００－４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ及びＶ１１７６Ｆ、又はその任意の組合せからなる群から選択される任意の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上の突然変異を含む。
いくつかの実施形態において、組換ポリペプチドは配列番号２６に示す配列であるか、又はこれを含む。いくつかの実施形態において、組換ポリペプチドは配列番号２６と少なくとも或いは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列であるか、又はこれを含み、例えば配列番号２６の１つ又は複数のアミノ酸位置に置換、欠失及び／又は挿入を含む配列である。
上記のように、いくつかの実施形態において、本明細書で提供される組換ポリペプチドは会合して三量体を形成するだけでなく、凝集するか、又は凝集させて複数の組換ポリペプチドを含むタンパク質を生成することができる。いくつかの実施形態において、形成されるタンパク質はマクロ構造を有する。いくつかの例では、マクロ構造は、コロナウイルスのウイルス抗原又は免疫原の組換ポリペプチドにおける構造安定性を付与し得、次に免疫応答を促進することができる潜在的な抗原性部位に達することができる。
いくつかの実施形態において、三量体化した組換ポリペプチドは凝集して、複数の三量体化した組換ポリペプチドを含有するタンパク質を形成する。いくつかの実施形態において、複数の三量体化した組換ポリペプチドはマクロ構造を有するタンパク質を形成する。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される複数の組換ポリペプチドを含むタンパク質は免疫原である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される複数の組換ポリペプチドを含むタンパク質はナノ粒子に含まれる。例えば、いくつかの実施形態において、タンパク質はタンパク質ナノ粒子などのナノ粒子に直接連結する。いくつかの実施形態において、タンパク質はナノ粒子に間接的に連結する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される複数の組換ポリペプチドを含むタンパク質はウイルス様粒子（ＶＬＰ）に含まれる。
いくつかの実施形態において、配列番号１～２６からなる群から選択される組換ポリペプチド、又はその断片、変異体もしくは突然変異体を任意の好適な組合せで含む複合体を本明細書で提供する。いくつかの実施形態において、配列番号１～２６からなる群から選択される組換ポリペプチド、又はその断片、変異体もしくは突然変異体の三量体を含む複合体を本明細書で提供し、組換ポリペプチドはポリペプチド間ジスルフィド結合により三量体化して三量体を形成する。
いくつかの実施形態において、複数の組換ポリペプチドを含む融合タンパク質を本明細書で提供し、各組換ポリペプチドはアミノからカルボキシ末端まで：ａ）非キメラ型コロナウイルスのスパイクタンパク質に位置するように、コロナウイルススパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）より前に位置するコロナウイルススパイクタンパク質エクトドメインの一部を含む、第１のコロナウイルスの第１の領域；ｂ）第１のコロナウイルスとは異なる第２のコロナウイルスのコロナウイルススパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含む第２の領域；並びにｃ）組換ポリペプチドのＣ末端プロペプチドがポリペプチド間ジスルフィド結合を形成するコラーゲンのＣ末端プロペプチド、を含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は第２の領域及びコラーゲンのＣ末端プロペプチド間に第３の領域を更に含む。いくつかの実施形態において、第３の領域は第３のコロナウイルスのＳ１ドメインを含み、第３のコロナウイルスは第１のコロナウイルス又は第２のコロナウイルスと同じ又は異なる。いくつかの実施形態において、第３の領域は第４のコロナウイルスのＳ２ドメインを含み、第４のコロナウイルスは第１、第２又は第４のコロナウイルスと同じ又は異なる。いくつかの実施形態において、第１の領域は第１のコロナウイルスのＮ末端ドメイン（ＮＴＤ）を含む。いくつかの実施形態において、第１の領域は第２のコロナウイルスにおける該当するアミノ酸残基と異なる１つ又は複数のアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態において、第２の領域は第１のコロナウイルスにおける該当するアミノ酸残基と異なる１つ又は複数のアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態において、第１及び第２のコロナウイルスは同じコロナウイルスの異なる変異体又は株である。いくつかの実施形態において、第１の領域は第１のコロナウイルスのＮＴＤを含み、第２の領域は第２のコロナウイルスのＲＢＤを含み、第１及び第２のコロナウイルスはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の異なる変異体である。いくつかの実施形態において、第１のコロナウイルス及び第２のコロナウイルスは独立してＢ．１．５２６、Ｂ．１．１．１４３、Ｐ．２、Ｂ．１．３５１、Ｐ．１、Ｂ．１．１．７、Ｂ．１．６１７及びＡ．２３．１系統のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、３つの組換ポリペプチドを含む三量体の融合タンパク質を本明細書で提供し、各組換ポリペプチドはアミノからカルボキシ末端まで：ａ）Ｂ．１．５２６系統ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のコロナウイルススパイクタンパク質Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）を含む第１の領域；ｂ）Ｂ．１．３５１系統ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のコロナウイルススパイクタンパク質受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含む第２の領域；並びにｃ）組換ポリペプチドのＣ末端プロペプチドがポリペプチド間ジスルフィド結合を形成するコラーゲンのＣ末端プロペプチド、を含む。
いくつかの実施形態において、哺乳類におけるコロナウイルスによる感染を防止する方法を本明細書で提供し、この方法は有効量の本明細書に開示される融合タンパク質で哺乳類に免疫を与えることを含む。いくつかの実施形態において、第１及び第２のコロナウイルスに対する中和抗体は哺乳類で生成される。いくつかの実施形態において、第１及び第２のコロナウイルスはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の異なる変異体であり、哺乳類で生成される中和抗体はＢ．１．５２６、Ｂ．１．１．１４３、Ｐ．２、Ｂ．１．３５１、Ｐ．１、Ｂ．１．１．７、Ｂ．１．６１７及びＡ．２３．１系統の２つ以上のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを中和する。いくつかの実施形態において、哺乳類で生成される中和抗体はＢ．１．５２６、Ｂ．１．１．１４３、Ｐ．２、Ｂ．１．３５１、Ｐ．１、Ｂ．１．１．７、Ｂ．１．６１７及びＡ．２３．１系統の３つ以上のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを中和する。いくつかの実施形態において、本方法は融合タンパク質で２回以上哺乳類に免疫を与えることを含む。いくつかの実施形態において、同じＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異体由来のＮＴＤ及びＲＢＤを有するスパイクタンパク質ペプチドを含む免疫原を１回又は複数回投与後、融合タンパク質はブースタ回として投与される。
いくつかの実施形態において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含むコロナウイルスのスパイク（Ｓ）糖タンパク質に由来する、又はこれを修飾した遺伝子組み換え融合ポリペプチドを本明細書で提供する。いくつかの実施形態において、コロナウイルスの野生型Ｓタンパク質配列と比較して、本明細書で開示する融合ポリペプチドを融合前構造で安定させることができる。いくつかの実施形態において、三量体化ドメインとの融合は、融合タンパク質におけるＳタンパク質ペプチドが直鎖らせんを形成することを防止し得る（例、膜融合プロセス中に起こるものと類似する）。例えば、Ｓ三量体サブユニットワクチン候補のクライオＥＭ構造は、洗剤の存在下、融合前及び融合後状態のどちらも形成する野生型全長スパイクタンパク質とは異なり、緊密に閉じた融合前状態を主に採ることを示す。Ｍａら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ（２０２１）ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＶＩ．００１９４－２１。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は変化した可溶性Ｓ配列を含み得る。これはＳ１／Ｓ２切断部位を不活化する修飾；ヘプタッドリピート１（ＨＲ１）領域及び中央ヘリックス（ＣＨ）領域間のターン領域における、ＨＲ１及びＣＨが直鎖らせんを形成することを防止する突然変異；並びに／或いは安定させる突然変異に加えて、ヘプタッドリピート２領域（ＨＲ２）のトランケーションを有する。いくつかの実施形態において、本明細書の融合タンパク質は、融合前状態でスパイクタンパク質を安定させると考えられるＫ９８６Ｇ／Ｖ９８７Ｇ、Ｋ９８６Ｐ／Ｖ９８７Ｐ、Ｋ９８６Ｇ／Ｖ９８７Ｐ又はＫ９８６Ｐ／Ｖ９８７Ｇなど、１つ又は複数の突然変異を含み得るが、含む必要はない。いくつかの実施形態において、Ｋ９８６Ｇ／Ｖ９８７Ｇ、Ｋ９８６Ｐ／Ｖ９８７Ｐ、Ｋ９８６Ｇ／Ｖ９８７Ｐ又はＫ９８６Ｐ／Ｖ９８７Ｇなどの突然変異は、Ｔｒｉｍｅｒ－Ｔａｇ（登録商標）三量体化ドメインを含む本明細書で開示される融合ポリペプチドを安定させるのに必要ではない。
これらの実施形態の一部において、Ｓ１／Ｓ２切断部位を不活化する突然変異は、ＧＳＡＧ（配列番号６０）を用いてＲＲＡＲ（配列番号５５の６８２－６８５）を置換することを含むことができ、ターン領域における突然変異は二重突然変異のＫ９８６Ｇ／Ｖ９８７Ｇ、Ｋ９８６Ｐ／Ｖ９８７Ｐ、Ｋ９８６Ｇ／Ｖ９８７Ｐ又はＫ９８６Ｐ／Ｖ９８７Ｇを含むことができる。いくつかの実施形態において、ＨＲ２のトランケーションは、野生型可溶性Ｓ配列のＣ末端で配列番号６５に示す１つ又は複数の残基の欠失を必然的に伴う。いくつかの実施形態において、免疫原ポリペプチドは、ＨＲ２と相互作用するＨＲ１の領域に（ａ）１つ又は複数のプロリン又はグリシンの置換、及び／或いは（ｂ）１つ又は複数のアミノ酸残基の挿入を更に含むことができる。これらの実施形態の一部において、免疫原ポリペプチドはＡ９４２Ｐ、Ｓ９４３Ｐ、Ａ９４４Ｐ、Ａ９４２Ｇ、Ｓ９４３Ｇ及びＡ９４４Ｇから選択される１つ又は複数の置換を有することができる。これらの実施形態の一部において、挿入はＡ９４２－Ａ９４４における任意の残基間のＧ又はＧＳの挿入であり得る。
いくつかの実施形態において、本明細書で開示した免疫原により誘導される中和免疫応答は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２などのコロナウイルスに対する中和抗体を生成する。いくつかの実施形態において、本明細書の中和抗体はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２などのコロナウイルス又はその成分の細胞受容体又は共受容体に結合する。いくつかの実施形態において、ウイルス受容体又は共受容体はコロナウイルス受容体又は共受容体、好ましくは肺炎ウイルス受容体又は共受容体、より好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２受容体又は共受容体などのヒトコロナウイルス受容体である。いくつかの実施形態において、本明細書の中和抗体は、インビトロ、インサイチュ及び／又はインビボで、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２などの少なくとも１つのコロナウイルスの活性又は結合、或いはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２などのコロナウイルスの受容体活性又は結合、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２放出、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２受容体シグナル伝達、膜ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２切断、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２活性、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２産生及び／又は合成を調節、減少、拮抗、軽減、遮断、阻害、排除及び／又は干渉する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示した免疫原はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する中和抗体を誘導し、これはアンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）、ジペプチジルペプチダーゼ４（ＤＰＰ４）、樹状細胞特異的細胞間接着分子－３－結合ノンインテグリン（ＤＣ－ＳＩＧＮ）、及び／又は肝臓／リンパ節－ＳＩＧＮ（Ｌ－ＳＩＧＮ）など、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２受容体又は共受容体に結合するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を調節、減少、拮抗、軽減、遮断、阻害、排除及び／又は干渉する。
ＩＩＩ．検出及び診断方法
ラテラルフローイムノアッセイは多くの様々な分析化学及び医学分野、例えば臨床診断で広く使用され、体液などサンプルにおける目的とする分析物の存在を決定する。ラテラルフローイムノアッセイの以前の研究は、米国特許及び特許出願公開：米国特許第５，６０２，０４０号明細書；第５，６２２，８７１号明細書；第５，６５６，５０３号明細書；第６，１８７，５９８号明細書；第６，２２８，６６０号明細書；第６，８１８，４５５号明細書；米国特許出願公開第２００１／０００８７７４号明細書；第２００５／０２４４９８６号明細書；米国特許第６，３５２，８６２号明細書；米国特許出願公開第２００３／０２０７４６５号明細書；第２００３／０１４３７５５号明細書；第２００３／０２１９９０８号明細書；米国特許第５，７１４，３８９号明細書；第５，９８９，９２１号明細書；第６，４８５，９８２号明細書；米国特許仮出願第１１／０３５，０４７号；米国特許第５，６５６，４４８号明細書；第５，５５９，０４１号明細書；第５，２５２，４９６号明細書；第５，７２８，５８７号明細書；第６，０２７，９４３号明細書；第６，５０６，６１２号明細書；第６，５４１，２７７号明細書；第６，７３７，２７７号明細書；第５，０７３，４８４号明細書；第５，６５４，１６２号明細書；第６，０２０，１４７号明細書；第４，９５６，３０２号明細書；第５，１２０，６４３号明細書；第６，５３４，３２０号明細書；第４，９４２，５２２号明細書；第４，７０３，０１７号明細書；第４，７４３，５６０号明細書；第５，５９１，６４５号明細書；及び米国再発行特許第ＲＥ３８，４３０（Ｅ）号明細書により例示される。
本明細書に記載される試験ストリップは、分析物の機能的属性、例えば相互作用遮断特性を検出することができる。いくつかの実施形態において、分析物は中和（又は遮断）抗体、例えば宿主におけるウイルスタンパク質及び細胞表面タンパク質など、２つ以上の分子成分の相互作用を妨げる抗体である。いくつかの実施形態において、中和抗体は抗コロナウイルス中和抗体である。いくつかの実施形態において、中和抗体は抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体である。いくつかの実施形態において、中和抗体は抗ＲＢＤ中和抗体であり、ＲＢＤはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又はＳＡＲ－ＣｏＶなどのコロナウイルス由来である。
本明細書に記載されるデバイスは、１つ又は複数の試験ゾーン、及び任意に１つ又は複数のコントロールゾーンを含むクロマトグラフストリップを含む。いくつかの実施形態において、クロマトグラフストリップはメンブレンである。いくつかの実施形態において、クロマトグラフストリップは多孔質メンブレンである。クロマトグラフストリップの細孔サイズは広く異なり得る。いくつかの実施形態において、クロマトグラフストリップは約１μｍ～約１０μｍ、約５μｍ～約１５μｍ又は約１０μｍ～約２０μｍのいずれかなど、約１μｍ～約２０μｍの細孔を含む。いくつかの実施形態において、クロマトグラフストリップは吸湿性材料を含む。いくつかの実施形態において、クロマトグラフストリップは非吸湿性材料を含む。いくつかの実施形態において、クロマトグラフストリップは、セルロース、セルロースブレンド、ニトロセルロース、セルロースエステル、混合ニトロセルロースエステル、ポリエステル、アクリロニトリル共重合体、レーヨン、ガラス繊維、ポリエチレンテレフタラート繊維、ポリプロピレン、及びその組合せからなる群から選択される材料を含む。いくつかの実施形態において、メンブレンはニトロセルロースメンブレンである。
いくつかの実施形態において、クロマトグラフストリップ又はその一部は、例えば任意の結合相互作用の特異性を増加させるためにブロッカーで処理される。いくつかの実施形態において、ブロッカーはカゼイン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、メチル化ＢＳＡ、動物全血清、脱脂粉乳、又はその組合せを含む。クロマトグラフストリップが遮断されると、ニトロセルロースなどのクロマトグラフストリップの電荷が中和され、従って更なるタンパク質又はその成分は遮断されたクロマトグラフストリップに結合することができない。更に、クロマトグラフストリップのクロマトグラフ構造は変更され、フローは従来のクロマトグラフィのフローではなく、むしろグライディング又はスライドフローであり得る。いくつかの実施形態において、クロマトグラフストリップは支持される。
本明細書に記載する試験ストリップの特定の成分は検出剤を含み、試験ストリップの特定のゾーン（例えば、試験ゾーン、コントロールゾーン）における上記成分の同定（定性及び／又は定量）を容易にする。いくつかの実施形態において、分子結合系の分子成分は検出剤で標識される。いくつかの実施形態において、サンプル結合ゾーンなどにおける他の成分（例、抗体又は抗原結合断片）は検出剤で標識される。いくつかの実施形態において、試験ストリップの２つ以上の成分は検出剤で標識され、各成分は試験ストリップの他の検出剤とは区別することができる（例、色に基づき）特有の検出剤で標識される。
いくつかの実施形態において、検出剤は酵素を含む。いくつかの実施形態において、検出剤は複数の酵素を含むポリマー酵素を含む。いくつかの実施形態において、酵素はベータ－Ｄ－ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ－ラクタマーゼ、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、ウリカーゼ、スーパーオキシドディスムターゼ、ルシフェラーゼ、ピルビン酸キナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、エンテロキナーゼ、チロシナーゼ及びキサンチンオキシダーゼからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、検出剤は検出粒子を含む。いくつかの実施形態において、検出粒子は酵素粒子（ナノ粒子など）、ポリスチレン粒子（マイクロスフェアなど）、ラテックス粒子、金を含む粒子（ナノ金粒子など）、コロイド金粒子、金属粒子（酸化鉄ナノ粒子など）、磁性粒子、蛍光検出可能な粒子又は半導体粒子（ナノ結晶など）を含む。
いくつかの実施形態において、試験ストリップは吸収ゾーンを更に含む。一般的に、吸収ゾーンは、例えばクロマトグラフストリップから過剰な流体を可逆的又は非可逆的に除去するように構成される。いくつかの実施形態において、吸収ゾーンは可逆的な乾燥剤（吸収ゾーンから液体を逆流させる）であるように構成される。いくつかの実施形態において、吸収ゾーンは非可逆的な乾燥剤であるように構成される。いくつかの実施形態において、吸収ゾーンはウィッキングパッドを含む。いくつかの実施形態において、ウィッキングパッドは吸湿性材料を含む。いくつかの実施形態において、ウィッキングパッドはろ紙、ガラス繊維ろ紙などを含む。
いくつかの実施形態において、吸収ゾーンはクロマトグラフストリップの下流に位置する。いくつかの実施形態において、吸収ゾーンはクロマトグラフストリップと毛細管力で通じる。
いくつかの実施形態において、試験ストリップはサンプルパッドを含むサンプル追加ゾーンを更に含む。いくつかの実施形態において、サンプルパッドは試験ストリップの１つ又は複数の下流要素、例えば結合パッド又はクロマトグラフストリップと毛細管力で通じる。
いくつかの実施形態において、サンプルパッドを含むサンプル追加ゾーンはサンプルを受けるように構成される。いくつかの実施形態において、サンプルは体液を含む。いくつかの実施形態において、サンプルは全血サンプルである。いくつかの実施形態において、サンプルは血液サンプルである。いくつかの実施形態において、サンプルは身体の分泌物のサンプルである。いくつかの実施形態において、サンプルは気管支肺胞洗浄液サンプルである。
いくつかの実施形態において、複数の組換ポリペプチドを含むタンパク質とサンプルを接触させることを含む、サンプルを分析する方法を本明細書で開示する。コロナウイルスの表面抗原を含む各組換ポリペプチドはコラーゲンのＣ末端プロペプチドに連結しており、組換ポリペプチドのＣ末端プロペプチドがポリペプチド間ジスルフィド結合を形成する。タンパク質と、コロナウイルスの表面抗原に特異的に結合することができる分析物との結合が検出される。いくつかの実施形態において、分析物は表面抗原を認識する抗体、受容体又は細胞であり、サンプルは限定されないが、分析物を含有する血清又は血漿などの体液である。
前述の実施形態のいずれかにおいて、結合はサンプル中の分析物の存在、及び／又はサンプルを得た対象のコロナウイルスによる感染を示すことができる。
前述の実施形態のいずれかにおいて、本方法はラテラルフロー法又はＥＬＩＳＡでよい。前述の実施形態のいずれかにおいて、タンパク質をコロイド金粒子で標識し、試験ストリップ上のコンジュゲートパッド内で乾燥させることができる。タンパク質を含むクロマトグラフストリップを含む試験ストリップも開示し、タンパク質は複数の組換ポリペプチドを含み、コロナウイルスの表面抗原を含む各組換ポリペプチドはコラーゲンのＣ末端プロペプチドに連結しており、組換ポリペプチドのＣ末端プロペプチドはポリペプチド間ジスルフィド結合を形成する。いくつかの実施形態において、タンパク質はコロイド金粒子で標識され、試験ストリップ上のコンジュゲートパッド内で乾燥される。
前述の実施形態のいずれかにおいて、分析物に特異的な二次抗体を試験ストリップ上のクロマトグラフメンブレンの試験ゾーン内に固定することができる。前述の実施形態のいずれかにおいて、二次抗体は抗ＩｇＧ抗体又は抗ＩｇＭ抗体でよい。前述の実施形態のいずれかにおいて、試験ストリップはコントロールゾーンを更に含むことができ、コラーゲンのＣ末端プロペプチドに特異的な抗体が固定される。前述の実施形態のいずれかにおいて、試験ストリップは、試験ストリップの一端に分析のために分析物を添加するサンプルパッド、及び反対端にサンプルパッドと毛細管力で通じる吸収パッドを更に含むことができる。いくつかの実施形態において、クロマトグラフストリップはコントロールゾーンを更に含み、コントロール捕捉剤はコントロールゾーン内に固定される。
前述の実施形態のいずれかにおいて、試験ストリップはタンパク質を含む結合パッドを含むサンプル結合ゾーンを更に含むことができ、結合パッドの一端はクロマトグラフストリップの一端と毛細管力で通じる。
前述の実施形態のいずれかにおいて、試験ストリップはサンプルパッドを含むサンプル追加ゾーンを更に含むことができ、サンプルパッドは結合パッド又はクロマトグラフストリップと毛細管力で通じる。
前述の実施形態のいずれかにおいて、分析物はコロナウイルスの表面抗原に対する中和抗体を含むことができる。
前述の実施形態のいずれかにおいて、分析物はコロナウイルスの表面抗原に対する広域中和抗体を含むことができる。
前述の実施形態のいずれかにおいて、分析物はＩｇＧ抗体を含むことができる。
前述の実施形態のいずれかにおいて、分析物はＩｇＭ抗体を含むことができる。
前述の実施形態のいずれかにおいて、分析物はヒト抗体を含むことができる。
前述の実施形態のいずれかにおいて、サンプルはコロナウイルスに感染した対象に由来してよい。
前述の実施形態のいずれかにおいて、サンプルはコロナウイルスに感染した対象及び回復した対象の血清又は血漿でよい。
前述の実施形態のいずれかにおいて、サンプルはコロナウイルスワクチンで免疫性が与えられた対象に由来してよい。
前述の実施形態のいずれかにおいて、コロナウイルスの表面抗原受容体、任意にＡＣＥ２－Ｆｃなどの受容体－Ｆｃである受容体は、試験ストリップ上のクロマトグラフメンブレンにおける第２の試験ゾーン内に固定することができる。
前述の実施形態のいずれかにおいて、分析物を有さない溶媒コントロールと比較して、分析物を添加するとすぐに、第２の試験ゾーンにおいて抗原標識コロイド金粒子の保持が低下し、これにより中和抗体、又は受容体及びコロナウイルスの表面抗原間の相互作用を遮断することができる抗体の陽性検出を示すことができる。
前述の実施形態のいずれかにおいて、コロナウイルスは重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、ＳＡＲＳコロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、ＳＡＲＳ様コロナウイルス、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）、ＭＥＲＳ様コロナウイルス、ＮＬ６３－ＣｏＶ、２２９Ｅ－ＣｏＶ、ＯＣ４３－ＣｏＶ、ＨＫＵ１－ＣｏＶ、ＷＩＶ１－ＣｏＶ、ＭＨＶ、ＨＫＵ９－ＣｏＶ、ＰＥＤＶ－ＣｏＶ又はＳＤＣＶでよい。
前述の実施形態のいずれかにおいて、表面抗原はコロナウイルスのスパイク（Ｓ）タンパク質、又はその断片もしくはエピトープを含むことができ、エピトープは任意に線状エピトープ又は配座エピトープであり、タンパク質はコラーゲンのＣ末端プロペプチドにより連結される３つの組換抗原ポリペプチドを含む。
前述の実施形態のいずれかにおいて、表面抗原はシグナルペプチド、Ｓ１サブユニットペプチド、Ｓ２サブユニットペプチド又はその任意の組合せを含むことができる。
前述の実施形態のいずれかにおいて、表面抗原はシグナルペプチド、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）ペプチド、受容体結合モチーフ（ＲＢＭ）ペプチド、融合ペプチド（ＦＰ）、ヘプタッドリピート１（ＨＲ１）ペプチド、又はヘプタッドリピート２（ＨＲ２）ペプチド、或いはその任意の組合せを含むことができる。
前述の実施形態のいずれかにおいて、表面抗原はＳタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含むことができる。
前述の実施形態のいずれかにおいて、表面抗原はＳタンパク質のＳ１サブユニット及びＳ２サブユニットを含むことができる。
前述の実施形態のいずれかにおいて、表面抗原は膜貫通（ＴＭ）ドメインペプチド及び／又は細胞質（ＣＰ）ドメインペプチドを欠いてよい。
前述の実施形態のいずれかにおいて、表面抗原はプロテアーゼ切断部位を含むことができ、このプロテアーゼは任意にフーリン、トリプシン、第Ｘａ因子又はカテプシンＬである。
前述の実施形態のいずれかにおいて、表面抗原はプロテアーゼ切断部位を欠いてよく、プロテアーゼは任意にフーリン、トリプシン、第Ｘａ因子又はカテプシンＬである。
前述の実施形態のいずれかにおいて、表面抗原は可溶性でよいか、或いは膜又はウイルスエンベロープなどの脂質二重層に直接結合しない。
前述の実施形態のいずれかにおいて、表面抗原はタンパク質の組換ポリペプチド間で同じ又は異なってよい。
前述の実施形態のいずれかにおいて、表面抗原はＣ末端プロペプチドに直接融合することができるか、又はグリシン－Ｘ－Ｙ繰り返しを含むリンカーなどのリンカーを介してＣ末端プロペプチドに連結することができ、Ｘ及びＹは独立して任意のアミノ酸であり、任意にプロリン又はヒドロキシプロリンである。
前述の実施形態のいずれかにおいて、タンパク質は対象の細胞表面受容体に結合することができ、対象は任意に霊長類、例えばヒトなどの哺乳類である。
前述の実施形態のいずれかにおいて、細胞表面受容体はアンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）、ジペプチジルペプチダーゼ４（ＤＰＰ４）、樹状細胞特異的細胞間接着分子－３－結合ノンインテグリン（ＤＣ－ＳＩＧＮ）又は肝臓／リンパ節－ＳＩＧＮ（Ｌ－ＳＩＧＮ）でよい。
前述の実施形態のいずれかにおいて、Ｃ末端プロペプチドはヒトコラーゲンのものでよい。
前述の実施形態のいずれかにおいて、Ｃ末端プロペプチドはｐｒｏα１（Ｉ）、ｐｒｏα１（ＩＩ）、ｐｒｏα１（ＩＩＩ）、ｐｒｏα１（Ｖ）、ｐｒｏα１（ＸＩ）、ｐｒｏα２（Ｉ）、ｐｒｏα２（Ｖ）、ｐｒｏα２（ＸＩ）もしくはｐｒｏα３（ＸＩ）のＣ末端ポリペプチド、又はその断片を含むことができる。
前述の実施形態のいずれかにおいて、組換ポリペプチド間のＣ末端プロペプチドは同じ又は異なってよい。
前述の実施形態のいずれかにおいて、Ｃ末端プロペプチドは配列番号６７～８０のいずれか、又はこれと少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含むことができ、ポリペプチド間ジスルフィド結合を形成し、組換ポリペプチドを三量体化することができる。
前述の実施形態のいずれかにおいて、Ｃ末端プロペプチドは、配列番号６７～８０のいずれかのＮ末端に連結したグリシン－Ｘ－Ｙ繰り返しを含む配列、又はこれと少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含むことができ、ポリペプチド間ジスルフィド結合を形成し、組換ポリペプチドを三量体化することができる。Ｘ及びＹは独立して任意のアミノ酸であり、任意にプロリン又はヒドロキシプロリンである。
前述の実施形態のいずれかにおいて、各組換ポリペプチドにおける表面抗原は融合前構造又は融合後構造でよい。
前述の実施形態のいずれかにおいて、各組換ポリペプチドにおける表面抗原は配列番号２７～６６のいずれか、又はこれと少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
前述の実施形態のいずれかにおいて、組換ポリペプチドは配列番号１～２６のいずれか、又はこれと少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
ＩＶ．製品又はキット
提供された組換ポリペプチド、タンパク質及び免疫原性組成物を含有する製品又はキットも提供する。製品は容器、及び容器上又は容器と関連するラベル又は添付文書を含み得る。好適な容器としては例えば瓶、バイアル、シリンジ、試験管、ＩＶ溶液バッグなどが挙げられる。容器はガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。いくつかの実施形態において、容器は滅菌入口部を有する。例示的な容器は、静注液バッグ、バイアルが挙げられ、注射用針により穿孔することができる栓を有するものを含む。製品又はキットは、組成物が本明細書に記載される状態など、特定の状態（例えば、コロナウイルス感染）を治療するのに使用することができることを示す添付文書を更に含み得る。或いは又は更に、製品又はキットは薬学的に許容可能なバッファを含む別の又は同じ容器を更に含み得る。他のバッファ、希釈剤、ろ紙、針及び／又はシリンジなどの他の材料を更に含み得る。
ラベル又は添付文書は、個体におけるコロナウイルス感染を治療するのに組成物を使用することを示し得る。容器上又は容器に関連したラベル又は添付文書は、製剤の再構成及び／又は使用の説明を示し得る。ラベル又は添付文書は、この製剤が個体におけるコロナウイルス感染を治療又は予防するために皮下、静脈内又は他の投与形態に有用であるか、又は対象とすることを更に示し得る。
いくつかの実施形態における容器は組成物を保持し、この組成物は単独であるか、或いは状態を治療、予防及び／又は診断するのに有効な別の組成物との組合せである。製品又はキットは（ａ）免疫原性組成物又はタンパク質もしくはその組換ポリペプチドを含む組成物（つまり、第１の薬剤）を有する第１の容器；並びに（ｂ）アジュバント又は治療剤などの更なる薬剤を含む組成物（つまり、第２の薬剤）を有する第２の容器を含み得る。この物品又はキットは、有効量の第２の薬剤で対象を治療するための取扱い説明書をラベル又は添付文書に更に含む。
定義
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての専門用語、表記、並びに他の技術及び科学用語又は学術用語は、クレームされた主題が関係する当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有することが意図される。いくつかの例では、明瞭さ及び／又は容易な参照のために、一般的に理解された意味を有する用語が本明細書で定義され、本明細書に含まれるこのような定義は、必ずしも当技術分野で通常に理解されるものと実質的な差異を表すように解釈されるべきではない。
「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すのに交換可能に使用され、最小の長さに限定されない。提供された受容体及び他のポリペプチド、例えばリンカー又はペプチドを含むポリペプチドは、天然及び／又は非天然のアミノ酸残基を含むアミノ酸残基を含み得る。これらの用語は、ポリペプチドの発現後修飾、例えばグリコシル化、シアル化、アセチル化及びリン酸化も含む。いくつかの態様において、タンパク質が所望の活性を維持しさえすれば、ポリペプチドは天然又は自然の配列に対する修飾を含み得る。これらの修飾は、部位特異的変異導入のように意図的なものでも、タンパク質を産生する宿主の突然変異又はＰＣＲ増幅によるエラーなどによる偶発的なものでもあり得る。
本明細書で用いられるとき、「対象」はヒト又は他の動物などの哺乳類であり、典型的にはヒトである。いくつかの実施形態において、薬剤又は複数の薬剤、細胞、細胞集団、或いは組成物が投与される患者などの対象は哺乳類であり、典型的にはヒトなどの霊長類である。いくつかの実施形態において、霊長類はサル又は類人猿である。対象はオスでもメスでもよく、幼児、年少者、青年、成人及び老人の対象など任意の好適な年齢でよい。いくつかの実施形態において、対象は齧歯動物などの非霊長類の哺乳類である。
本明細書で用いられるとき「疾患の発症を遅延させる」は疾患（癌など）の発症を先送りする、妨害する、遅くする、阻止する、安定させる、抑制する及び／又は延ばすことを意味する。病歴及び／又は治療を受ける個体に応じて時間の長さは様々でよい。いくつかの実施形態において、十分な又は著しい遅延は、実質的に予防を包含することができ、個体が疾患を発症しない。例えば、転移癌の発症などの末期癌は遅延させ得る。
本明細書で用いられるとき「約」という用語は、当業者に容易に知られた各値の通常の誤差範囲を指す。本明細書における「約」値又はパラメータの参照は、その値又はパラメータ自体を対象とする実施形態を含む（及び記載する）。
本明細書で用いられるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈から明らかでない限り複数の指示対象を含む。例えば「ａ」又は「ａｎ」は「少なくとも１つの」又は「１つ又は複数」を意味する。
この開示を通して、クレームされた主題の様々な態様は範囲形式で提示される。範囲形式の記載は単に便宜上、簡潔にするためのものであり、クレームされた主題の範囲を柔軟性なく限定するものとして解釈されるべきでないことを理解するべきである。従って、範囲の記載は、具体的に開示されたすべての可能性のある小範囲、並びにその範囲内の個別の数値を有すると考えられるべきである。例えば、値の範囲が挙げられる場合、その範囲の上限及び下限間に介在する各値、並びにその記載された範囲における任意の他の記載された値又は介在する値はクレームされた主題内に包含されることが理解される。これらのより小さな範囲の上限及び下限は、独立してより小さな範囲に含まれ得、また記載された範囲内の任意の具体的に除外された限度を考慮して、クレームされた主題内に包含される。記載された範囲が上下限の１つ又はどちらも含む場合、含まれる限度のどちらか又は両方を含まない範囲もクレームされた主題に含まれる。これは範囲の幅に関わらず適用される。
本明細書で用いられるとき、組成物は細胞を含む２つ以上の生成物、物質又は化合物の任意の混合物を指す。溶液、懸濁液、液体、粉末、ペースト、水性、非水性又はその任意の組合せであり得る。
本明細書で用いられるとき、「ベクター」という用語は核酸分子を指し、これと連結する別の核酸を増殖させることができる。この用語は自己複製核酸構造としてのベクター、並びにベクターが導入されている宿主細胞のゲノムに組み込まれるベクターを含む。特定のベクターは、これらが動作可能に連結した核酸の発現を誘導することができる。このようなベクターは本明細書では「発現ベクター」と呼ばれる。
以下の実施例は説明の目的のためにのみ示され、本発明の範囲を限定する意図はない。
実施例１：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質ペプチドを含む組換ポリペプチドの生成
シグナルペプチド（ＳＰ）、Ｓ１及びＳ２ドメインを含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ２に由来する天然スパイクタンパク質（Ｓ）の完全なエクトドメインは、α１コラーゲンのヒトＣプロペプチドをコードした哺乳類発現ベクターにＣ末端でインフレーム融合され、例えば図１に示すように、分泌された三量体のＳ三量体融合抗原を発現することができた。
Ｓ三量体融合タンパク質の高レベルでの発現を達成した。１０Ｌバイオリアクタで行ったフェッドバッチ無血清ＣＨＯ細胞培養のＳ三量体発現について８％ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した。６日目から１１日目に１０μＬの無細胞条件培地を還元条件下で分析し、その後クマシーブルー染色を行った。高度に精製したＳ三量体を標準品（Ｓｔｄ）としてゲルに添加した。全長Ｓ三量体及びＳ１／Ｓ２フーリン部位で部分的に切断された形態は示した通りであった。
その後、共有結合的に連結したＳ三量体を精製し、特徴づけた。プロテインＡ（ＰＡ）アフィニティクロマトグラフィ及び陰イオン交換カラム（Ｑ）、その後限外ろ過及び透析ろ過（ＵＦ／ＤＦ）により、取り除いた細胞培養培地からＳ三量体を精製して、原薬（ＤＳ）を得た。４μｇの精製タンパク質を８％還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより開始時の細胞培養培地に対して分析し、クマシーブルーで染色した。Ｓ三量体をＳ１／Ｓ２フーリン切断部位で部分的に切断するが、切断したＳ１サブユニットは、Ｓ三量体と共精製されるため、Ｓ三量体に結合するようであった。Ｓ三量体はジスルフィド結合で連結した三量体である。４μｇの高度に精製した天然様Ｓ三量体を記載のように非還元及び還元条件下で６％ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分析し、クマシーブルーで染色した。ＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析により判断されるように、Ｓ三量体をほぼ均一まで精製し、一部の切断したＳ１をサイズ排除クロマトグラフィ中に分離した。Ｓ三量体の分子量は６６０Ｋｄａと推定された。プロテインＡセンサを用い、Ｆｏｒｔｅｂｉｏの生体層干渉測定により、Ｓ三量体のＡＣＥ２－Ｆｃへの受容体結合反応速度を評価した。
Ｓ三量体をＮ結合型グリカンで高度にグリコシル化した。エンドグリカナーゼＦ（ＰＮＧａｓｅＦ）単独、又はＰＮＧａｓｅＦ及びエンド－Ｏ－グリコシダーゼを使用し、消化前後の高度に精製されたＳ三量体からＮ及びＯ結合型グリカンを除去し、８％還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分析し、クマシーブルーで染色して、脱グルコシル化前後の全長Ｓ三量体、Ｓ２三量体及び切断したＳ１を示した。ＦＥＩ Ｔｅｃｎａｉ ｓｐｉｒｉｔ電子顕微鏡を用い、ネガティブＥＭにより高度に精製したＳ三量体を可視化した。
実施例２：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質ペプチドを含む組換ポリペプチドを用いて分析物を検出する方法
ＥＬＩＳＡを設計し、実施例１に記載したように生成した例示的な組換ポリペプチドを使用し、Ｓ三量体抗原に基づくＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体検査を行った。具体的に、Ｓタンパク質を認識する患者及び正常コントロールの血清におけるＩｇＧ抗体を検出するために、プレートを組換Ｓ三量体でコーティングした。ヤギ抗ヒトＩｇＧ－ＨＲＰにより検出を行い、サンプル希釈に基づきＥＣ５０として抗体価を計算した。図２はＥＬＩＳＡアッセイの結果を示し、Ｓ三量体がＣＯＶＩＤ－１９患者の血清におけるＳ反応性ＩｇＧ抗体を特異的に検出することができることを明示する。
ラテラルフローアッセイを使用し、最近ＣＯＶＩＤ－１９から回復した多数の患者の血清もＳ三量体を用いて分析した（図５及び図６）。ＩｇＭ及びＩｇＧに関するＳ三量体抗原に基づくＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体検査において、患者８人のサンプルのうち４つが認識できるＳ特異的ＩｇＭの陽性信号を示し（図５、Ｐ１～Ｐ４）、一方８つのうちの７つが認識できるＳ特異的ＩｇＧの陽性信号を示した（図５、Ｐ１～Ｐ７）。
Ｓ三量体抗原に基づくＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体ＩｇＧ及び中和抗体検査において、患者３人のサンプルのうちの３つが認識できるＳ特異的ＩｇＧの陽性信号を示し、同様にＡＣＥ２結合バンドは薄いか、又は無かった（図６、Ｐ１～Ｐ３）。正常サンプル及びＰＢＳコントロールのすべてにおいて、認識できるＡＣＥ２結合バンドがあり、Ｓ特異的ＩｇＧ結合は無かった（図６、Ｎ１～Ｎ４及びＰＢＳ）。Ｓ三量体をコロイド金粒子で標識し、試験ストリップ上のコンジュゲートパッド内で乾燥させた。分析物に特異的な二次抗体（例、Ｓ反応性ＩｇＧ抗体を認識する抗ＩｇＧ抗体）を試験ストリップ上のクロマトグラフメンブレンの試験ゾーン内に固定した。また、ＡＣＥ２－Ｆｃなど、Ｓタンパク質の受容体を試験ストリップ上のクロマトグラフメンブレンの第２の試験ゾーン内に固定した。これらの結果は、Ｓ三量体がＣＯＶＩＤ－１９患者血清中のＳ反応性ＩｇＧ抗体だけでなく、細胞表面受容体ＡＣＥ２へのＳタンパク質の結合を妨害又は低減することができる患者血清中の中和抗体も特異的に検出することができたことをまとめて示す。
回復期血清サンプルを連続的に希釈し、抗原としてＳ三量体（図７、上パネル）及びＳ１三量体（図７、下パネル）を用いてラテラルフローアッセイにより分析した。認識できるＳ特異的ＩｇＧの陽性信号が１：２０４８０から１：４０９６０の段階希釈で検出され、一方で認識できるＳ１特異的ＩｇＧの陽性信号が１：１０２０から１：２０４８０の段階希釈で検出された。これらの結果は、Ｓ三量体及びＳ１三量体に基づくアッセイが極端に感度がよいことを示す。
野生型Ｓ三量体（原型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ三量体）及びＢ．１．３５１南アフリカ変異体ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ三量体（図８）を使用し、Ｓ反応性抗体についてラテラルフローアッセイで回復期血清の多数のサンプルを試験した。認識できるＳ特異的ＩｇＧ抗体の陽性信号が、野生型Ｓ三量体又はＢ．１．３５１のＳ三量体を用いた多数のサンプルで観察された。
本発明は特定の開示した実施形態の範囲に限定されることを意図せず、例えば本発明の様々な態様を説明するために示される。記載される組成物及び方法の様々な変更は、本明細書の説明及び教示から明らかになるであろう。このような変化は、本開示の真の範囲及び趣旨から逸脱することなく行うことができ、本開示の範囲に含まれることが意図される。
配列
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Claims (52)

  1. 複数の組換ポリペプチドを含む抗原とサンプルを接触させることを含む、サンプルの分析方法であって、
    コロナウイルスの表面スパイクタンパク質を含む各組換ポリペプチドがコラーゲンのＣ末端プロペプチドに連結しており、前記Ｃ末端プロペプチドがポリペプチド間ジスルフィド結合を形成し、
    前記サンプルが前記コロナウイルスの前記スパイクタンパク質に特異的に結合することができる分析物を含有しているか、又は含有すると思われ、前記抗原及び前記分析物間の結合が検出される、方法。
  2. 前記分析物が前記抗原を認識する抗体、受容体、細胞であり、及び／或いは前記サンプルが限定されないが前記分析物を含有する血清又は血漿などの体液である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記結合が前記サンプル中の前記分析物の存在、及び／又は前記サンプルを得た対象の前記コロナウイルスによる感染を示す、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記方法がラテラルフロー法である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記抗原がコロイド金粒子で標識され、試験ストリップ上のコンジュゲートパッド内で乾燥される、請求項４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記分析物に特異的な二次抗体が、前記試験ストリップ上のクロマトグラフメンブレンの試験ゾーン内に固定される、請求項４又は５に記載の方法。
  7. 前記試験ストリップがコントロールゾーンを更に含み、コラーゲンのＣ末端プロペプチドに特異的な抗体が固定される、請求項６に記載の方法。
  8. 前記試験ストリップが、前記試験ストリップの一端に分析のために前記分析物を添加するサンプルパッド、及び反対端に前記サンプルパッドと毛細管力で通じる吸収パッドを更に含む、請求項５～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 毛細管力により前記吸収パッドに向かって前記クロマトグラフメンブレン上で移動するため、前記サンプルパッドに前記分析物を添加し、前記試験ゾーンで抗原標識コロイド金粒子の任意の良好な保持があると、前記分析物の陽性検出が示され、一方コントロールゾーンでのみ任意の前記抗原標識コロイド金粒子の保持があると、前記分析物の陰性の読み出しを示す、請求項４～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記分析物が前記コロナウイルスの表面抗原に対する抗体である、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記分析物が前記コロナウイルスの前記表面抗原に対する中和抗体である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記分析物がＩｇＧ抗体である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記分析物がＩｇＭ抗体である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記分析物がヒト抗体である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記分析物が前記コロナウイルスに感染した対象から得られる、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記分析物が、前記コロナウイルスに感染し、回復している対象の血清である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記分析物が、コロナウイルスワクチンで免疫性が与えられた対象から得られる、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記コロナウイルスの前記表面抗原の受容体、任意のＡＣＥ２－Ｆｃなどの受容体－Ｆｃが、前記試験ストリップ上の前記クロマトグラフメンブレンにおける第２の試験ゾーン内に固定される、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記分析物を有さない溶媒コントロールと比較して、前記分析物を添加すると、前記第２の試験ゾーンにおける前記抗原標識コロイド金粒子の保持が任意に低下し、これにより中和抗体、又はコロナウイルスの前記受容体及び前記表面抗原間の相互作用を遮断することができる抗体の陽性検出を示す、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記コロナウイルスが重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、ＳＡＲＳコロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、ＳＡＲＳ様コロナウイルス、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）、ＭＥＲＳ様コロナウイルス、ＮＬ６３－ＣｏＶ、２２９Ｅ－ＣｏＶ、ＯＣ４３－ＣｏＶ、ＨＫＵ１－ＣｏＶ、ＷＩＶ１－ＣｏＶ、ＭＨＶ、ＨＫＵ９－ＣｏＶ、ＰＥＤＶ－ＣｏＶ、又はＳＤＣＶである、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記抗原がコロナウイルススパイク（Ｓ）タンパク質、又はその断片もしくはエピトープを含み、前記エピトープが任意に線状エピトープ又は配座エピトープであり、前記抗原が前記コラーゲンのＣ末端プロペプチドにより連結される３つの組換抗原ポリペプチドを含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記抗原がシグナルペプチド、Ｓ１サブユニットペプチド又はＳ２サブユニットペプチド、或いはその任意の組合せを含む、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記抗原がシグナルペプチド、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）ペプチド、受容体結合モチーフ（ＲＢＭ）ペプチド、融合ペプチド（ＦＰ）、ヘプタッドリピート１（ＨＲ１）ペプチド、又はヘプタッドリピート２（ＨＲ２）ペプチド、或いはその任意の組合せを含む、請求項２１に記載の方法。
  24. 前記抗原が前記Ｓタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含む、請求項２１のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記抗原が前記Ｓタンパク質のＳ１サブユニット及びＳ２サブユニットを含む、請求項２１のいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記抗原が膜貫通（ＴＭ）ドメインペプチド及び／又は細胞質（ＣＰ）ドメインペプチドを含まない、請求項２１～２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記抗原がプロテアーゼ切断部位を含み、前記プロテアーゼが任意にフーリン、トリプシン、第Ｘａ因子、トロンビン又はカテプシンＬである、請求項２１～２５のいずれか一項に記載の方法。
  28. 前記抗原が任意のプロテアーゼ切断部位を含まない、請求項２１～２５のいずれか一項に記載の方法。
  29. 前記抗原が可溶性であるか、或いは膜又はウイルスエンベロープなどの脂質二重層に直接結合しない、請求項１～２８のいずれか一項に記載の方法。
  30. 前記抗原が前記タンパク質の前記組換ポリペプチド間で同じ又は異なる、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法。
  31. 前記抗原が前記Ｃ末端プロペプチドに直接融合するか、又はグリシン－Ｘ－Ｙ繰り返しを含むリンカーなどのリンカーにより前記Ｃ末端プロペプチドに連結し、Ｘ及びＹが独立して任意のアミノ酸であり、任意にプロリン又はヒドロキシプロリンである、請求項１～３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 前記Ｃ末端プロペプチドがヒトコラーゲンのものである、請求項１～３１のいずれか一項に記載の方法。
  33. 前記Ｃ末端プロペプチドがｐｒｏα１（Ｉ）、ｐｒｏα１（ＩＩ）、ｐｒｏα１（ＩＩＩ）、ｐｒｏα１（Ｖ）、ｐｒｏα１（ＸＩ）、ｐｒｏα２（Ｉ）、ｐｒｏα２（Ｖ）、ｐｒｏα２（ＸＩ）、又はｐｒｏα３（ＸＩ）のＣ末端ポリペプチド、或いはその断片を含む、請求項１～３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. 前記Ｃ末端プロペプチドが配列番号６７～８０のいずれか、又はこれと少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、ポリペプチド間ジスルフィド結合を形成し、前記組換ポリペプチドを三量体化することができる、請求項１～３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. 各前記組換ポリペプチドにおける前記抗原が融合前構造又は融合後構造である、請求項１～３４のいずれか一項に記載の方法。
  36. 各前記組換ポリペプチドにおける前記抗原が、配列番号２７～６６のいずれか、又はこれと少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～３５のいずれか一項に記載の方法。
  37. 前記組換ポリペプチドが、配列番号１～２６のいずれか、又はこれと少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～３６のいずれか一項に記載の方法。
  38. サンプルを分析する方法であって、
    複数の組換ポリペプチドを含む抗原で基板を被覆することであって、コロナウイルスの表面スパイクタンパク質を含む各組換ポリペプチドがコラーゲンのＣ末端プロペプチドに連結しており、前記Ｃ末端プロペプチドがポリペプチド間ジスルフィド結合を形成する、被覆と；
    前記被覆した基板をサンプルと接触させることであって、前記サンプルが前記コロナウイルスの前記スパイクタンパク質に特異的に結合することができる分析物を含有するか、又は含有すると思われる、接触と；
    前記抗原及び前記分析物間に形成される複合体を前記分析物に特異的に結合する検出剤と接触させることと、を含み、
    シグナルが前記検出剤で検出され、前記サンプル中の前記分析物の存在／非存在、量、又は活性を示す、方法。
  39. 前記分析物が前記抗原を認識する抗体、受容体、細胞であり、及び／或いは前記サンプルが限定されないが前記分析物を含有する血清又は血漿などの体液である、請求項３８に記載の方法。
  40. 前記シグナルが、前記サンプルを得た対象の前記コロナウイルスによる感染を示す、請求項３８又は３９に記載の方法。
  41. 前記方法がＥＬＩＳＡアッセイである、請求項３８～４０のいずれか一項に記載の方法。
  42. 前記検出剤が化学発光、蛍光、又はその組合せを放出することができる成分、例えばＨＲＰなどの酵素を含む、請求項３８～４１のいずれか一項に記載の方法。
  43. 前記分析物が、前記コロナウイルスの前記表面抗原に対する中和抗体である、請求項３８～４２のいずれか一項に記載の方法。
  44. 前記分析物がＩｇＧ抗体であり、前記検出剤が抗ＩｇＧ抗体を含む、請求項３８～４３のいずれか一項に記載の方法。
  45. 前記分析物がＩｇＭ抗体であり、前記検出剤が抗ＩｇＭ抗体を含む、請求項３８～４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記分析物が、前記コロナウイルスに感染した対象、前記コロナウイルスに感染し、回復している対象、又はコロナウイルスワクチンで免疫性が与えられた対象から得られる、請求項３８～４５のいずれか一項に記載の方法。
  47. 前記接触工程の１つ又は両方が、前記コロナウイルスの前記表面抗原受容体の存在下で実施され、前記受容体が任意にＡＣＥ２－Ｆｃなどの受容体－Ｆｃである、請求項３８～４６のいずれか一項に記載の方法。
  48. 前記分析物及び前記受容体が、前記コロナウイルスの前記スパイクタンパク質に結合することを争う、請求項４７に記載の方法。
  49. 前記Ｃ末端プロペプチドが、配列番号６７～８０のいずれか、又はこれと少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、ポリペプチド間ジスルフィド結合を形成し、前記組換ポリペプチドを三量体化することができる、請求項３８～４８のいずれか一項に記載の方法。
  50. 各前記組換ポリペプチドにおける前記抗原が融合前構造又は融合後構造である、請求項３８～４９のいずれか一項に記載の方法。
  51. 各前記組換ポリペプチドにおける前記抗原が、配列番号２７～６６のいずれか、又はこれと少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３８～５０のいずれか一項に記載の方法。
  52. 前記組換ポリペプチドが、配列番号１～２６のいずれか、又はこれと少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３８～５１のいずれか一項に記載の方法。
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