JP2023528002A

JP2023528002A - Ｔ細胞を選択的に調節するための二重特異性分子

Info

Publication number: JP2023528002A
Application number: JP2022572706A
Authority: JP
Inventors: トルチア，ジェームズ; ジェイフリーマン，ゴードン
Original assignee: デイナファーバーキャンサーインスティチュート，インコーポレイテッド
Priority date: 2020-05-27
Filing date: 2021-05-27
Publication date: 2023-07-03
Also published as: US20230203157A1; WO2021243028A1; KR20230029611A; CA3177550A1; EP4157354A1; AU2021279028A1

Abstract

本発明は、部分的に、細胞特異的及び／又は組織特異的な様式でＴ細胞の活性化を阻害するための方法、並びにＰＤ－１に特異的に結合する第１の部分及びＴ細胞以外の標的細胞の表面抗原に特異的に結合する第２の部分を含む二重特異性分子に関する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年５月２７日に出願された米国仮特許出願第６３／０３０，７１４号の優先権の利益を主張し、当該出願の全内容は、その全体が、この参照により本明細書に組み込まれる。

政府権利の陳述
本発明は、米国国立衛生研究所により授与された助成金番号Ｐ０１ＡＩ０５６２９９に基づく政府支援を受けて行われた。政府は本発明において一定の権利を有する。

様々な免疫療法が著しく進歩したにもかかわらず、重篤な合併症が、様々な状況において現れ続けている。例えば、固形臓器移植を受けると、全身免疫抑制剤が使用され得るが、それらは、患者を、感染症、がん、及び薬物毒性のリスクにさらす。別の例として、自己免疫疾患もまた、ある程度、全身性免疫抑制剤で治療することもできるが、これらは再び、患者を、感染症、がん、及び薬物毒性のリスクにさらす。

いくつかの種類のがん、例えば、白血病の治療では、多くの場合、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）に直面する。骨髄移植後、ＧＶＨＤ及び移植片対白血病（ＧＶＬ）の両方が、同種リンパ球によって媒介される。ＧＶＨＤを抑制する薬剤はまた、ＧＶＬも抑制する。また、いくつかの種類のがんの治療において、チェックポイント阻害剤免疫関連副作用（ｉｒＡＥ）が観察される。高用量ステロイド又は他の免疫抑制剤を用いたｉｒＡＥの治療は、抗腫瘍免疫を減弱させることができる。再び、例えば、操作された免疫細胞療法を使用するいくつかの種類のがんの治療において、多くの場合、「オンターゲット、オフ腫瘍」毒性に直面する。

したがって、当該分野では、より高度な免疫療法並びに異なる免疫療法で観察される合併症を低減させる薬剤及び方法が必要とされる。

本発明は、可溶性ＰＤ－１抗体が、ＰＤ－１を活性化することはできないが、表面上のＰＤ－１に対する抗体が、アゴニストとして機能し得ること、及びＴＣＲ刺激とのＰＤ－１刺激の共局在化が、Ｔ細胞阻害に必要であることの発見に少なくとも部分的に基づいており、ＰＤ－１活性化には、クラスター化及び共局在化の２つの要件があることを示唆する。Ｔ細胞活性化を他の場所で可能にしながら、所望の細胞、細胞型、及び／又は組織との関連でＴ細胞活性化を選択的に阻害することができる薬剤を生成し、本明細書に記載した。

本明細書に開示される方法のいくつかの使用において、ＰＤ－１と、そのリガンドであるＰＤ－Ｌ１及び／又はＰＤ－Ｌ２との結合を遮断することは不都合である。このような方法において、「非遮断」抗ＰＤ－１クローンが好ましく、関連する実施形態において使用される。本明細書に開示される他の方法において、ＰＤ－１と、そのリガンドとの結合を遮断することが有益である。これらの方法において、「遮断」クローンが好ましい。

いくつかの実施形態では、開示される二重特異性分子は、アダプタとして機能し、表面抗原の存在を可能にして、ＰＤ－１クラスター化を規定する。したがって、より高い表面抗原密度は、ＰＤ－１アゴニズム及びＴ細胞活性阻害を媒介するためのより強力なＰＤ－１クラスター化をもたらす可能性が高いことになる。

いくつかの態様において、ＰＤ－１に特異的に結合する第１の部分、及びＴ細胞以外の標的細胞の表面抗原に特異的に結合する第２の部分を含む、二重特異性分子であって、任意選択で、二重特異性分子が、Ｔ細胞上のＰＤ－１に結合する、二重特異性分子が開示される。表面抗原及びＰＤ－１への二重特異性分子の同時結合は、（１）免疫学的シナプスに近接する等の、ＰＤ－１のクラスター化を促進し、（２）標的細胞に向けられたＴ細胞毒性を低減若しくは防止し、あるいは（３）免疫学的シナプスに近接する等の、ＰＤ－１のクラスター化を促進し、かつ／又はＴ細胞活性（例えば、細胞内インターフェロンガンマ産生、サイトカイン分泌、Ｔ細胞増殖等の阻害）、及び／若しくは標的細胞に向けられた毒性を低減若しくは防止することの両方であり、任意選択で、ｉ）二重特異性分子が、Ｔ細胞上のＰＤ－１に結合し、ｉｉ）Ｔ細胞活性が、サイトカイン産生及び／若しくはＴ細胞増殖であり、ｉｉｉ）少なくとも第１の部分若しくは第２の部分が、モノクローナル若しくはポリクローナル抗体、又はその抗原結合断片を含み、ｉｖ）二重特異性分子が、ＰＤ－１に対する単一結合部位を有し、かつ／あるいはｖ）二重特異性分子が、ＰＤ－１に対する単一結合部位及び表面抗原に対する単一結合部位を有する。

本発明のいずれかの態様に適用され得る、かつ／又は本明細書に記載される任意の他の実施形態と組み合わされ得る多数の実施形態が更に提供される。例えば、いくつかの実施形態では、ＰＤ－１への結合のＫ_ｄと、組織特異的表面抗原への結合のＫ_ｄとの差は、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、２０倍、２１倍、２２倍、２３倍、２４倍、２５倍、２６倍、２７倍、２８倍、２９倍、３０倍、３１倍、３２倍、３３倍、３４倍、３５倍、３６倍、３７倍、３８倍、３９倍、４０倍、４１倍、４２倍、４３倍、４４倍、４５倍、４６倍、４７倍、４８倍、４９倍、５０倍、５５倍、６０倍、６５倍、７０倍、７５倍、８０倍、８５倍、９０倍、９５倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍、４００倍、４５０倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１，０００倍、２，０００倍、３，０００倍、４，０００倍、５，０００倍、６，０００倍、７，０００倍、８，０００倍、９，０００倍、１０，０００倍、若しくはそれ以上、又はそれらの間の任意の範囲、例えば１５～５０倍を含み、任意選択で更に、ＰＤ－１への結合のＫ_ｄが、組織特異的表面抗原への結合のＫ_ｄ未満である。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１への結合時のオフレートと、組織特異的表面抗原への結合時のオフレートとの差は、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、２０倍、２１倍、２２倍、２３倍、２４倍、２５倍、２６倍、２７倍、２８倍、２９倍、３０倍、３１倍、３２倍、３３倍、３４倍、３５倍、３６倍、３７倍、３８倍、３９倍、４０倍、４１倍、４２倍、４３倍、４４倍、４５倍、４６倍、４７倍、４８倍、４９倍、５０倍、５５倍、６０倍、６５倍、７０倍、７５倍、８０倍、８５倍、９０倍、９５倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍、４００倍、４５０倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１，０００倍、２，０００倍、３，０００倍、４，０００倍、５，０００倍、６，０００倍、７，０００倍、８，０００倍、９，０００倍、１０，０００倍、若しくはそれ以上、又はそれらの間の任意の範囲、例えば１５～５０倍を含み、任意選択で更に、ＰＤ－１への結合のオフレートが、組織特異的表面抗原への結合のオフレートより遅い。いくつかの実施形態では、第１の部分は、ＰＤ－１のＰＤ－Ｌ１結合部位とは異なる部位でＰＤ－１に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第１の部分は、ＰＤ－１へのＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ２のいずれの結合も遮断しない。いくつかのこのような実施形態では、二重特異性分子は、表面抗原を発現する組織においてＰＤ－１のアゴニストとして作用するが、表面抗原を発現しない組織において作用しない。他の実施形態では、第１の部分は、ｉ）ＰＤ－１に特異的に結合し、ＰＤ－Ｌ１及び／若しくはＰＤ－Ｌ２とのＰＤ－１の結合を、（例えば、ＰＤ－１と結合し、ＰＤ－Ｌ１及び／又はＰＤ－Ｌ２の結合に立体障害を引き起こすこと等によって）遮断し、かつ／又はｉｉ）例えば、ＰＤ－Ｌ１及び／若しくはＰＤ－Ｌ２とのＰＤ－１の結合を遮断するように、ＰＤ－１のＰＤ－Ｌ１及び／若しくはＰＤ－Ｌ２結合部位においてＰＤ－１に特異的に結合する。いくつかのこのような実施形態では、二重特異性分子は、表面抗原を発現する組織においてＰＤ－１のアゴニストとして作用し、表面抗原を発現しない組織においてＰＤ－１のアンタゴニストとして作用する。例えば、このような二重特異性分子は、がんを治療するための免疫チェックポイント阻害剤として、並びに例えば、ｉｒＡＥのより低いリスクを担う免疫チェックポイント阻害剤としての第一選択状況における免疫関連有害事象（ｉｒＡＥ）に対する治療又は予防としての両方で使用され得る。本明細書に記載される任意の実施形態について、相同性パーセントの列挙は、任意の結合タンパク質、例えば、結合タンパク質の可変配列及び／又はそのＣＤＲ配列、例えば、それらの１つ、２つ、若しくは３つの軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、及び／又はＣＤＲ－Ｌ３）配列及び／又は１つ、２つ、若しくは３つの重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及び／又はＣＤＲ－Ｈ３）配列、例えば、本明細書の他の場所に記載される表４に列挙されたもの、又は他の当該技術分野において周知のものに適用されることが企図される。例えば、ある特定の実施形態では、第１の部分は、表１、表４Ａ、及び表４Ｂに列挙された配列からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、任意選択で、配列は、配列番号３０である。ある特定の実施形態では、第１の部分は、配列番号３１と、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第１の部分は、ＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ２の細胞外ドメインと、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、任意選択で、標的は、細胞外ドメインに対する受容体であり、かつ／又はＰＤ－Ｌ１の細胞外ドメインは、配列番号２４の配列を有する。いくつかの実施形態では、表面抗原は、表３Ａ、表３Ｂ、及び表３Ｃに列挙された表面抗原の群、又はＭＨＣクラスＩ対立遺伝子若しくはＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子から選択され、任意選択で、対立遺伝子は、ＨＬＡ対立遺伝子であるか、又はＭＨＣ対立遺伝子は、Ｈ－２Ｋｂである。ある特定の実施形態では、第２の部分は、配列番号２１と、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、第２の部分は、配列番号２２と、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、二重特異性分子は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、及び１４のうちのいずれか１つと、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも第１の部分又は第２の部分は、キメラ、ヒト化、複合、マウス、又はヒトモノクローナル若しくはポリクローナル抗体、あるいはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、少なくとも第１の部分又は第２の部分は、検出可能に標識され、エフェクタードメインを含み、Ｆｃドメインを含み、かつ／又はＦｖ、Ｆａｖ、Ｆ（ａｂ’）２）、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２、及びダイアボディ断片からなる群から選択される。

いくつかの態様では、本明細書に記載の二重特異性分子をコードする単離された核酸分子が開示される。単離された核酸分子は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、安定化されたｍＲＮＡ等の本明細書に更に記載されるいくつかの形態をとってもよく、任意選択で、異種配列をコードし、かつ／又は追加の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、ストリンジェントな条件下で、配列番号１～１４、２１～２６、２８、及び３０～３１の配列からなる群から選択されるポリペプチドをコードする核酸の相補体、又は配列番号１～１４、２１～２６、２８、及び３０～３１の配列からなる群から選択されるポリペプチドをコードする核酸と少なくとも約９５％の相同性を有する配列とハイブリダイズするものである。いくつかの態様では、このような単離された核酸を含む、ベクターが開示される。いくつかの態様では、このような単離された核酸、ベクターを含むか、又は本明細書に開示される二重特異性分子を発現する宿主細胞が開示され、任意選択で、宿主細胞は、ゲノム操作されており、かつ／又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）等の異種タンパク質を発現するＴ細胞である。いくつかの態様では、開示される少なくとも１つの二重特異性分子を含む、デバイス又はキットが開示され、当該デバイス又はキットは、任意選択で、少なくとも１つの二重特異性分子又は二重特異性分子を含む複合体を検出するための標識を含む。いくつかの態様では、少なくとも１つの二重特異性分子を産生する方法は、（ｉ）当該二重特異性分子の発現を可能にするのに好適な条件下で、開示される少なくとも１つの二重特異性分子をコードする配列を含む核酸によって形質転換された形質転換宿主細胞を培養することと、（ｉｉ）発現された二重特異性分子を回収することと、を含む。

ある特定の態様では、試料中で細胞特異的及び／又は組織特異的な様式でＴ細胞の活性化を阻害する方法であって、試料を、本明細書に記載される実施形態のいずれかの二重特異性分子と接触させることを含み、任意選択で、対象が、がんのリスクがあるか、がんを有する疑いがあるか、又はがんに罹患しており、したがって、がんを治療する、方法が開示される。このような方法のいくつかの実施形態では、二重特異性分子が、表面抗原及びＰＤ－１に同時に結合するときに、二重特異性分子が、標的細胞と相互作用するＴ細胞の活性化を阻害する。

いくつかの態様では、対象において細胞特異的及び／又は組織特異的な様式でＴ細胞の活性化を阻害する方法であって、対象に、本明細書に記載される実施形態のいずれかの二重特異性分子を投与することを含む、方法が開示される。このような方法のいくつかの実施形態では、二重特異性分子が、表面抗原及びＰＤ－１に同時に結合するときに、二重特異性分子が、標的細胞と相互作用するＴ細胞の活性化を阻害する。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、がん等の多種多様な状態の予防及び／又は治療に有用である。いくつかの実施形態では、遮断ＬｏＳＴＩＭは、がんの治療に有用であり、遮断ＬｏＳＴＩＭ及び非遮断ＬｏＳＴＩＭの両方は、チェックポイント阻害剤免疫関連有害事象（ｉｒＡＥ）の改善に有用である。いくつかの実施形態では、対象は、固形臓器移植を受けるように定められているか、又は受けており、その場合、表面抗原は、ミスマッチＭＨＣクラスＩ又はクラスＩＩであり得る。いくつかの実施形態では、対象は、自己免疫疾患のリスクがあるか、自己免疫疾患を有する疑いがあるか、又は自己免疫疾患に罹患しており、したがって、自己免疫疾患を治療し、その場合、表面抗原は、病理学的に炎症を起こした組織上で発現されているものであり得る。いくつかの実施形態では、対象は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）のリスクがあるか、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を有する疑いがあるか、又は移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）に罹患しており、したがって、ＧＶＨＤを治療し、その場合、表面抗原は、炎症組織上で発現されるが、がん性細胞上で発現されないものであり得る。例えば、対象は、同種骨髄移植を受けるように定められているか、又は受けている場合があり、その場合、表面抗原は、ＧＶＨＤによって一般的に影響を受ける組織上で発現されるものであり得る。いくつかの実施形態では、対象は、チェックポイント阻害剤免疫関連有害事象（ｉｒＡＥ）のリスクがあるか、チェックポイント阻害剤免疫関連有害事象（ｉｒＡＥ）を有する疑いがあるか、又はチェックポイント阻害剤免疫関連有害事象（ｉｒＡＥ）に罹患しており、したがって、ｉｒＡＥを治療し、その場合、表面抗原は、炎症組織上で発現されるが、がん性細胞上で発現されないものであり得る。例えば、本明細書に記載される組成物は、免疫関連の副作用に対する予防として使用され得、その場合、表面抗原は、免疫関連の副作用によって一般的に影響を受ける組織上で発現される。いくつかの実施形態では、対象は、操作された免疫細胞療法を受けるように定められているか、又は受けており、その場合、表面抗原は、免疫細胞療法によって標的化された腫瘍関連抗原も発現する正常組織において発現されるものであり得るが、がん性細胞上で発現されないものである。

特許又は出願ファイルには、カラーで描かれた少なくとも１つの図面が含まれている。カラー図面を有するこの特許又は特許出願刊行物のコピーは、申請及び必要な料金の支払い後、特許庁によって提供されることになる。

［図１Ａ～図１Ｃ］例示的なＬｏＳＴＩＭ（すなわち、本開示に記載され、使用される二重特異性分子）の概要を示す。図１Ａは、ＬｏＳＴＩＭの概略図を示す。ＬｏＳＴＩＭは、ＰＤ－１、並びにＴ細胞活性の阻害が望まれる場合、組織上で発現される任意の細胞特異的及び／又は組織特異的表面抗原に同時に結合することができる分子である。図１Ｂは、ＬｏＳＴＩＭの一実施形態が、Ｔ細胞上のＰＤ－１分子、並びに対向する体細胞の表面上の抗原の分子に同時に結合し、それによって、２つの細胞間の免疫学的シナプスに近接したＴ細胞表面上のＰＤ－１をクラスター化することを示す。ＰＤ－１のこのクラスター化及び共局在化は、Ｔ細胞活性化を阻害する。図１Ｃは、ＬｏＳＴＩＭの一実施形態が、Ｔ細胞上のＰＤ－１に結合するが、対向する体細胞表面上の抗原に結合しないことを示し、なぜなら、その同種抗原は、その細胞によって発現されないからである。ＬｏＳＴＩＭは、対向する細胞表面に結合することによって所定の位置に固定されないため、ＰＤ－１をクラスター化することも、Ｔ細胞表面上の免疫学的シナプスとＰＤ－１を共局在化することもできず、したがって、Ｔ細胞活性化を阻害しない。この状況では、ＬｏＳＴＩＭのＰＤ－１結合ドメインが、その天然リガンドによるＰＤ－１の係合を阻害する場合、ＬｏＳＴＩＭは、Ｔ細胞活性化の増強因子として機能する。いくつかの研究（例えば、実施例１のもの）において使用されるＬｏＳＴＩＭの代表的な概略図を示す。４つの一般化されたＬｏＳＴＩＭ設計を、その後の研究において評価した。（１）ｓｃＦｖが、Ｔ細胞阻害が所望される組織上に発現される細胞特異的及び／又は組織特異的表面抗原に結合する、ＰＤＬ１－ｓｃＦｖ融合タンパク質、（２）ｍＡｂが、Ｔ細胞阻害が所望される組織上に発現される細胞特異的及び／又は組織特異的表面抗原に対して向けられる、ＰＤＬ１－ｍＡｂ融合体、並びに（３）及び（４）、ＰＤ－１に対する、並びにＴ細胞阻害が所望される組織上に発現される細胞特異的及び／又は組織特異的表面抗原に対するアビディティーを有する、二重特異性モノクローナル抗体。ＬｏＳＴＩＭ１～４は、Ｔｈｙ１．２（ＣＤ９０．２）及びマウスＰＤ－１に対する二重特異性アビディティーを有する。抗Ｔｈｙ１．２結合ドメインは、抗Ｔｈｙ１．２クローンＡＦ６の可変領域であり、抗ＰＤ－１結合ドメインは、抗ＰＤ－１クローン２９Ｆ．１Ａ１２（１Ａ１２）の可変領域を介する。ＬｏＳＴＩＭ５～８は、Ｈ－２Ｋｂ（Ｃ５７Ｂ６クラスＩＭＨＣ対立遺伝子）及びマウスＰＤ－１に対する二重特異性アビディティーを有する。抗Ｈ－２Ｋｂ結合ドメインは、抗Ｈ－２ＫｂクローンＡＦ６－８８．５．３（ＡＦ６）の可変領域である。抗ＰＤ－１クローン１Ａ１２は、ＰＤ－１と、その天然リガンドとの相互作用を遮断し、ＰＤ－１アンタゴニストとして機能することが知られていることに留意されたい。抗体ＬｏＳＴＩＭのＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメインは、Ｃ１ｑ及びＦｃガンマ受容体結合を阻害することが知られているいくつかの点変異を含有し、したがって、これらのＦｃドメインを「不活性」にする。これらのＬｏＳＴＩＭの配列は、本明細の最後に付録として提示されている。［図３Ａ～図３Ｄ］ＬｏＳＴＩＭ結合結果を示す。図３Ａは、マウスＰＤ－１を過剰発現するトランスジェニックマウスプロＢ細胞である３００－ｍＰＤ－１細胞を、様々な濃度のＬｏＳＴＩＭ２～４及び６～８に曝露した実験結果を示す。結合は、抗ｍＩｇＧ２ａ－ＰＥコンジュゲートを介して検出された。図３Ｂは、相対ＰＤ－１アビディティーのより良い評価を可能にするように正規化された図３Ａからのデータを示す。図３Ｃは、ＧＭ－ＣＳＦと８日間培養したＣ５７Ｂ６骨髄細胞から生成した骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣＣ）を、様々な濃度のＬｏＳＴＩＭ６～８に曝露した実験結果を示す。結合は、抗ｍＩｇＧ２ａ－ＰＥコンジュゲートを介して検出された。図３Ｄは、ＢＭＤＤＣを、様々な濃度のＬｏＳＴＩＭ６～８に曝露した実験結果を示す。未結合ＬｏＳＴＩＭを最初に洗い流し、次いで、マウスＰＤ－１－ヒトＦｃ融合タンパク質の結合を検出することによって二重特異性結合を評価した。抗ヒトＩｇＧ－ＰＥコンジュゲートを、ディテクターとして使用した。これは、ＬｏＳＴＩＭが、Ｈ－２Ｋｂ及びＰＤ－１の両方を同時に結合することができることを実証した。ＳＩＩＮＦＥＫＬパルス骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＤＣ）によるＯＴ－ＩＴ細胞活性化が、ＬｏＳＴＩＭによって阻害されることを示す。Ｃ５７Ｂ６骨髄細胞をＧＭ－ＣＳＦで８日間培養し、ＢＭＤＤＣを得た。これらのＢＭＤＤＣを、１０マイクロモルのＳｅｒ－Ｉｌｅ－Ｉｌｅ－Ａｓｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ－Ｌｅｕ（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）ペプチドで６時間パルスし、洗浄し、次いで、Ｈ－２Ｋｂの関連でＳＩＩＮＦＥＫＬを認識する組換えＴＣＲを発現する、ＣＦＳＥ標識化ＯＴ－ＩＣＤ８ａ＋Ｔ細胞と共培養した。これらのＴ細胞は、ＯＴ－Ｉマウス脾細胞から負の磁気選別によって得られた。共培養物を、０．５マイクロモルの抗Ｈ－２Ｋｂ指向性ＬｏＳＴＩＭ５、６、７、又は８で処理した。細胞を７２時間共培養した。上に示されるヒストグラムは、ＣＤ８＋細胞上でゲーティングされた集団を表す。ＢＭＤＤＣを用いずに培養したＯＴ－ＩＴ細胞は、不活性であった（ＣＦＳＥ希釈によって１．４％の増殖）。ＢＭＤＤＣで刺激されたＯＴ－ＩＴ細胞は、活性化した（ＣＦＳＥ希釈によって８７．３％の増殖）。ＬｏＳＴＩＭ５は、ＢＭＤＤＣによる活性化ＯＴ－ＩＴ細胞に対してごくわずかな影響を及ぼした（ＣＦＳＥ希釈によって８４．３％の増殖）。ＬｏＳＴＩＭ６は、ＢＭＤＤＣによるＯＴ－ＩＴ細胞活性化を阻害した（ＣＦＳＥ希釈によって６２．４％の増殖）。ＬｏＳＴＩＭ７は、ＢＭＤＤＣによるＯＴ－ＩＴ細胞活性化を最も強力に阻害した（ＣＦＳＥ希釈によって４３．９％の増殖）。ＬｏＳＴＩＭ８は、ＯＴ－ＩＴ細胞活性化に対して影響を及ぼした（ＣＦＳＥ希釈によって７８．４％の増殖）。ＯＴ－ＩＴ細胞活性化のＬｏＳＴＩＭ媒介性阻害が、Ｈ－２Ｋｂ遮断に起因せず、ＰＤ－１に係合し得るＬｏＳＴＩＭを必要とすることを示す。ＳＩＩＮＦＥＫＬ－パルスＢＭＤＤＣによるＯＴ－Ｉ活性化の阻害が、ＬｏＳＴＩＭによるＨ－２Ｋｂ抗原提示の遮断に単に起因するかどうかに対処するために、ＣＦＳＥ標識化ＯＴ－ＩＣＤ８ａ＋Ｔ細胞を、０．５マイクロモルの抗Ｈ－２Ｋｂ、クローンＡＦ６の存在下でＢＭＤＤＣと共培養した。ＬｏＳＴＩＭ５～８のＨ－２Ｋｂ結合ドメインは、このクローンに由来するので、ＡＦ６は、ＬｏＳＴＩＭ５～８と同じＨ－２Ｋｂのエピトープに結合することが予想されることになる。共培養の５７時間後、ＯＴ－ＩＴ細胞活性化を、ＣＦＳＥ希釈及びＣＤ６９発現によって評価した。抗体処理の不在下でＢＭＤＤＣと共培養したＯＴ－Ｉ細胞は、活性化した（ＣＦＳＥ希釈によって６３．６％の増殖及び４２．６％のＣＤ６９発現）。このような共培養物に抗Ｈ－２ＫｂクローンＡＦ６を添加しても、Ｔ細胞活性化は阻害されなかった（ＣＦＳＥ希釈によって７３．４％の増殖及び６７．４％のＣＤ６９発現）。このような共培養物に等モル量の抗Ｈ－２ＫｂクローンＡＦ６及びＬｏＳＴＩＭ７を添加すると、Ｔ細胞活性化のいくらかの阻害が生じた（ＣＦＳＥ希釈によって４２．５％の増殖及び３８．８％のＣＤ６９発現）。同種異系Ｔ細胞活性化が、ＬｏＳＴＩＭ処理によって阻害されることを示す。ＬｏＳＴＩＭ分子が、同種異系細胞によるＴ細胞の活性化を阻害できるかどうかに対処するために、Ｃ５７Ｂ６ＢＭＤＤＣを、０．５マイクロモルでＬｏＳＴＩＭ５～８の存在下で８４時間、ＣＦＳＥ標識化ＢＡＬＢ／ｃＣＤ８Ｔ細胞と共培養した。Ｃ５７Ｂ６マウスに由来するＢＭＤＤＣと共培養したＢＡＬＢ／ｃＣＤ８Ｔ細胞は、強力に活性化した（ＣＦＳＥ希釈によって９１．８％の増殖）。ＬｏＳＴＩＭ５とのそのような共培養の処理は、Ｔ細胞活性化に対して最小限の阻害効果しか及ぼさなかった（ＣＦＳＥ希釈によって８５．５％の増殖）。ＬｏＳＴＩＭ６による処理は、Ｔ細胞活性化を阻害した（ＣＦＳＥ希釈によって７１．１％の増殖）。ＬｏＳＴＩＭ７による処理は、Ｔ細胞活性化の最も強力な阻害をもたらした（ＣＦＳＥ希釈によって６３．６％の増殖）。また、ＬｏＳＴＩＭ８による処理は、Ｔ細胞活性化の阻害をもたらした（ＣＦＳＥ希釈によって６９．１％の増殖）。［図７Ａ～図７Ｂ］ＬｏＳＴＩＭが、相互作用細胞の表面に結合して、Ｔ細胞活性化を阻害すること、及びＰＤ－１の、その天然リガンドへの結合を阻害するＬｏＳＴＩＭが、相互作用細胞の表面にも結合しない場合、Ｔ細胞活性化を増強することとなることを示す。対向する細胞の表面へのＬｏＳＴＩＭの結合が、Ｔ細胞活性化の阻害に必要であるかどうかを決定するために、ＣＦＳＥ標識化ＯＴ－ＩＣＤ８Ｔ細胞を、０．５マイクロモルでＬｏＳＴＩＭ１～４の存在下で５７時間、ＳＩＩＮＦＥＫＬパルスＢＭＤＤＣと共培養した（図７Ａ及び７Ｂ）。ＬｏＳＴＩＭ１～４は、Ｈ－２Ｋｂ結合ドメインの代わりにＴｈｙ１．２（ＣＤ９０．２）結合ドメインを有することを除いて、ＬｏＳＴＩＭ５～８と分子設計が同一である。ＢＭＤＤＣは、Ｔｈｙ１．２を発現しないため（上のパネルＢ）、ＬｏＳＴＩＭ１～４は、ＢＭＤＤＣの表面に結合しないことになる。これらのＬｏＳＴＩＭは、ＬｏＳＴＩＭ５～８と同じＰＤ－１結合ドメインを有するため、それらは、依然としてＴ細胞上のＰＤ－１に結合することになる。抗体処理の不在下でＢＭＤＤＣと共培養したＯＴ－Ｉ細胞は、活性化した（ＣＦＳＥ希釈によって６３．６％の増殖及び４２．６％のＣＤ６９発現）。ＬｏＳＴＩＭ１～４による処理は、これらの共培養においてＴ細胞活性化を阻害しなかった。実際に、ＬｏＳＴＩＭ１～４は、Ｔ細胞活性化を様々な程度まで増強した。ＬｏＳＴＩＭ１は、Ｔ細胞活性化に対して最小限の増強効果を及ぼした（６８．４％の増殖及び５６％のＣＤ６９発現）。ＬｏＳＴＩＭ２は、Ｔ細胞活性化を顕著に増強した（９８．６％の増殖及び７８．９％のＣＤ６９発現）。また、ＬｏＳＴＩＭ３は、Ｔ細胞活性化を増強した（９０．１％の増殖及び６１％のＣＤ６９発現）。また、ＬｏＳＴＩＭ４は、Ｔ細胞活性化を顕著に増強した（９６．１％の増殖及び７９％のＣＤ６９発現）。代表的な概念的概要を示す。Ｔ細胞上のＰＤ－１及び対向する標的細胞上の細胞表面抗原へのＬｏＳＴＩＭのトランス二重特異性結合は、Ｔ細胞表面上のＰＤ－１クラスター化及びこのクラスターと免疫学的シナプスとの共局在化をもたらし、それによってＰＤ－１を活性化し、Ｔ細胞活性を阻害する。ＰＤ－１は、Ｔ細胞表面上で横方向に自由に移動し、それは、免疫学的シナプスに近接してクラスター化されると活性化される。したがって、標的細胞上の表面抗原及びＴ細胞上のＰＤ－１へのＬｏＳＴＩＭのトランス二重特異性結合は、免疫学的シナプスが位置する細胞－細胞界面においてＰＤ－１を動員し、クラスター化することになる。これはＰＤ－１を活性化し、ＴＣＲシグナル伝達及びＴ細胞活性の阻害をもたらす。標的細胞表面上の抗原の係合が、ＬｏＳＴＩＭがＰＤ－１アゴニストとして機能するために必要である。単にＰＤ－１に結合するだけでは、ＰＤ－１をクラスター化せず、免疫学的シナプスに共局在化しないことになり、したがって、Ｔ細胞活性を阻害しないことになる。この特性により、ＬｏＳＴＩＭは選択的ＰＤ－１アゴニストとして機能し、表面抗原を発現する組織においてのみＴ細胞活性を阻害することができる。ＬｏＳＴＩＭは、その天然リガンドによるＰＤ－１の係合を遮断するように設計されてもよいか、又はされなくてもよい。それが、ＰＤ－１の、そのリガンドによる係合を遮断するように設計されている場合、それは、表面抗原を発現しない組織と相互作用するＴ細胞上のＰＤ－１のアンタゴニストとして機能し、一方、表面抗原を発現する組織と相互作用するＴ細胞上のＰＤ－１のアゴニストとして依然として機能する。したがって、この設計の単一のＬｏＳＴＩＭ分子は、組織の状況に応じて、Ｔ細胞活性の阻害剤又は増強因子のいずれかとして機能することになる。モデル表面抗原Ｈ－２Ｋ^ｂを発現する細胞への結合を示す。Ｈ－２Ｋ^ｂへの結合を、Ｈ－２Ｋ^ｂを発現することが知られている、Ｃ５７ＢＬ／６結腸直腸がん細胞株ＭＣ３８を使用したフローサイトメトリーによって評価した。特異性は、Ｈ－２Ｋｂを発現しないことが知られている、ＢＡＬＢ／ｃ結腸直腸がん細胞株であるＣＴ－２６細胞への結合を評価することによって実証された。ＬｏＳＴＩＭは、ＭＣ３８細胞に強く結合したが、ＣＴ－２６細胞には結合しなかった。別の実験では、Ｈ－２Ｋ^ｂを発現するＣ５７ＢＬ／６マウス由来のＢＭＤＤＣ、又はＨ－２Ｋ^ｂを発現しないＣ３Ｈマウス由来のＢＭＤＤＣを使用して、Ｈ－２Ｋ^ｂへの結合をフローサイトメトリーによって評価した。ＬｏＳＴＩＭは、Ｃ５７ＢＬ／６ＢＭＤＤＣ細胞に強く結合したが、Ｃ３ＨＢＭＤＤＣ細胞には結合しなかった。ＰＤ－１への結合並びにＰＤ－１及びＨ－２Ｋ^ｂへの二重特異性結合を示す。ＰＤ－１へのＬｏＳＴＩＭの結合を、マウスＰＤ－１を安定して発現するトランスジェニックマウスプロＢ細胞である３００－ｍＰＤ－１細胞を使用してフローサイトメトリーによって評価した。ＬｏＳＴＩＭは、３００－ｍＰＤ－１細胞に強く結合した。Ｈ－２Ｋ^ｂを発現するが、ＰＤ－１を発現しないＭＣ３８細胞、及びヒトＩｇＧ１Ｆｃドメインを有する可溶性マウスＰＤ－１－Ｆｃ融合体（ｍＰＤ－１－ｈＦｃ）を使用して、ＰＤ－１及びＨ－２Ｋ^ｂへの二重特異性結合を、フローサイトメトリーによって評価した。細胞をｍＰＤ－１－ｈＦｃ融合体に曝露する前に、未結合ＬｏＳＴＩＭを最初に洗い流した。フルオロフォアで標識化した抗ヒトＩｇＧ二次抗体により測定した、ＭＣ３８細胞へのｍＰＤ－１－ｈＦｃの結合により、ＬｏＳＴＩＭが、ＭＣ３８細胞上のＨ－２Ｋ^ｂ及びｍＰＤ－１－ｈＦｃの両方に同時に結合することができることが示された。これにより、ＰＤ－１結合の特異性も確認された。ＰＤ－１を発現するＴ細胞に結合するが、ＰＤ－１を発現しないＴ細胞には結合しないことを示す。ＰＤ－１結合特異性を更に確認するために、ＰＤ－１を発現する活性化初代Ｔ細胞へのＬｏＳＴＩＭの結合を、ＰＤ－１を発現しないナイーブ初代Ｔ細胞への結合と比較した。これらのＴ細胞は、Ｈ－２Ｋ^ｂを発現しないＢＡＬＢ／ｃＢｙＪマウスからのマウスから得たものであり、したがって、活性化されたＴ細胞への結合は、ＬｏＳＴＩＭがＰＤ－１に特異的に結合する場合にのみ生じるはずである。ＬｏＳＴＩＭは、活性化されたＢＡＬＢ／ｃＢｙＪＴ細胞に強く結合したが、ナイーブＢＡＬＢ／ｃＢｙＪＴ細胞には結合せず、ＰＤ－１結合の特異性が更に確認された。Ｔ細胞活性化の阻害を示す。Ｈ－２Ｋ^ｂモデル表面抗原を発現するＡＰＣによるＴ細胞活性化に対するＬｏＳＴＩＭの効果を評価するために、初代ＣＤ４＋ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪＴ細胞（Ｈ－２Ｋ^ｂ陰性）を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスから得られたＢ細胞（Ｈ－２Ｋ^ｂ陽性）と１：１の比で５日間共培養した。培養物を、５００ナノモルの、ＬｏＳＴＩＭ、親抗Ｈ－２Ｋ^ｂ抗体（ＡＦ６－８８．５．３）、親抗ＰＤ－１抗体（２９Ｆ．１Ａ１２）、又はビヒクル（ＰＢＳ）のいずれかで処理した。ＬｏＳＴＩＭは、ＣＦＳＥ希釈によって測定したように、Ｔ細胞のＡＰＣ誘導性増殖を完全に阻害した。ＡＦ６－８８．５．３、２９Ｆ．１Ａ１２、及びビヒクルのいずれも、Ｔ細胞増殖に影響を及ぼさなかった。これは、ＬｏＳＴＩＭが、ＬｏＳＴＩＭに結合する表面抗原を発現するＡＰＣによるＴ細胞活性化を阻害することを実証する。Ｔ細胞上のＰＤ－１及び標的細胞上の表面抗原へのＬｏＳＴＩＭの二重特異性結合は、モデル表面抗原Ｈ－２Ｋ^ｂに結合するＡＦ６－８８．５．３、又はＰＤ－１に結合する２９Ｆ．１Ａ１２のいずれかによるＴ細胞阻害の欠如によって実証されるように、この効果のために必要であった。同様の別の実験では、２つの濃度のＬｏＳＴＩＭを使用し、Ｔ細胞増殖の阻害が、用量依存的であることが見出された。ＴＣＲシグナル伝達の阻害を示す。ＴＣＲシグナル伝達への影響を評価するために、オボアルブミン抗原ＳＩＩＮＦＥＫＬを認識するトランスジェニックＴＣＲを発現するＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＯＴ－１マウスから精製し、プレート結合抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体によって活性化させ、静止させ、次いで、ＳＩＩＮＦＥＫＬ抗原を負荷したＣ５７ＢＬ／６細胞によって再刺激した。ＴＣＲ活性化を、リン酸化Ｚａｐ７０に特異的なフルオロフォア標識化抗体を使用して、ホスホフローサイトメトリーによって評価した。Ｚａｐ７０は、ＴＣＲ活性化時にリン酸化及び活性化され、ＴＣＲシグナル伝達に関与する膜近位キナーゼである。ＰＤ－１活性化は、ＴＣＲ媒介性のＺａｐ７０リン酸化を阻害することが知られている。ＬｏＳＴＩＭによる処理は、抗原誘導性のＺａｐ７０リン酸化を阻害した。Ｔ細胞活性化の細胞特異的及び／又は組織特異的阻害を示す。ＬｏＳＴＩＭの効果を、モデル細胞表面抗原Ｈ－２Ｋ^ｂを発現するＡＰＣとＴ細胞を共培養した場合、及びＨ－２Ｋ^ｂを発現しないＡＰＣとＴ細胞を共培養した場合と比較した。これを達成するために、精製されたＢＡＬＢ／ｃＢｙＪＣＤ８＋Ｔ細胞を、モデル細胞表面抗原Ｈ－２Ｋ^ｂを発現するＣ５７ＢＬ／６マウス由来のＢＭＤＤＣ、又はＨ－２Ｋ^ｂを発現しないＣ３Ｈマウス由来のＢＭＤＤＣのいずれかと共培養した。培養物を様々な濃度のＬｏＳＴＩＭで処理した。相対的Ｔ細胞増殖を、ビヒクル（ＰＢＳ）で処理した共培養物のＴ細胞増殖パーセンテージによってＴ細胞増殖パーセンテージを正規化することによって計算した。アロ刺激の強度はバックグラウンド間で変化し得るため、この計算は、Ｃ５７ＢＬ／６ＢＭＤＤＣ及びＣ３ＨＢＭＤＤＣによって刺激されたＢＡＬＢ／ｃＢｙＪＴ細胞について別々に実施した。Ｔ細胞活性化は、ＬｏＳＴＩＭが標的細胞に結合したときに阻害されたが、ＬｏＳＴＩＭが標的細胞に結合しなかったときには阻害されなかった。インビボでの同種拒絶（ａｌｌｏｒｅｊｅｃｔｉｏｎ）の阻害を示す。ＬｏＳＴＩＭに結合する抗原を発現する標的細胞に対してインビボで免疫活性を阻害するＬｏＳＴＩＭの能力を評価するために同種拒絶のモデルを使用した。（Ｃ５７ＢＬ／６起源の）ＭＣ３８細胞を、ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪマウスに皮下注射した。通常、ＭＣ３８腫瘍は、その異なるＭＨＣに対する同種応答（ａｌｌｏｒｅｓｐｏｎｓｅ）によって、ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪマウスにおいて拒絶されることになる。腫瘍成長の増加は、この同種応答が改善されることを示す。腫瘍体積は、ＰＢＳをビヒクル対照として与えられたマウスと比較して、ＬｏＳＴＩＭの腹腔内注射を与えられたマウスにおいて有意に大きかった（ｐ＝０．０２９７）。これは、標的細胞が、ＬｏＳＴＩＭが結合する抗原を発現する場合、ＬｏＳＴＩＭが、インビボで標的細胞に対する免疫活性を阻害することができることを実証する。この実験には、精製されたＬｏＳＴＩＭ単量体（以下の図１７で考察される）を使用したことに留意されたい。インビボでの同系腫瘍の処置を示す。同系腫瘍処置のモデルを使用して、ＬｏＳＴＩＭに結合する抗原を発現しない標的細胞に対する免疫活性に対するＬｏＳＴＩＭのインビボ効果を評価した。ＣＴ－２６細胞を、ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪマウスに皮下注射し、マウスを、ＬｏＳＴＩＭ、２９Ｆ．１Ａ１２（ＬｏＳＴＩＭの設計に使用した親抗ＰＤ－１抗体）、又はビヒクル対照としてＰＢＳのいずれかで処置した。ＬｏＳＴＩＭは、ＣＴ－２６細胞に対する免疫活性を阻害しなかった。代わりに、ＬｏＳＴＩＭは、ＣＴ－２６細胞に対する免疫活性を促進し、ＰＤ－１阻害剤２９Ｆ．１Ａ１２と同様に機能した。これは、ＬｏＳＴＩＭが、それが結合する抗原を発現しない標的細胞に対する免疫活性を阻害しないことになることを実証する。更に、ＰＤ－１の天然ライゲーションを遮断するＬｏＳＴＩＭが、これらの状況においてＰＤ－１阻害剤として機能することになり、腫瘍を処置することができることを実証する。この実験には、精製されたＬｏＳＴＩＭ単量体（以下の図１７で考察される）を使用したことに留意されたい。ＬｏＳＴＩＭ８のサイズ排除超高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ－ＵＰＬＣ）分析を示し、これは、図３、４、５、６、７、１０、１２、及び１４に提示した実験で使用された（左上パネル）。種の８９％は、２２０ｋＤａのサイズであり、ＬｏＳＴＩＭ８のおおよその予想される分子量であり、種の１１％は、ＬｏＳＴＩＭ（右パネル）の多量体（五量体及び三量体）を表す、より大きな分子量を有する。分取サイズ排除クロマトグラフィーを行った後、ＳＥ－ＵＰＬＣ分析により、多量体の８５％が除去され、残りの種の９８．４％がＬｏＳＴＩＭ単量体であることが確認された（左下パネル）。Ｔ細胞活性化に対する精製されたＬｏＳＴＩＭ単量体及び精製された多量体の効果を示す。Ｔ細胞活性化に対する各分子種の効果を評価するために、初代ＣＤ４＋ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪＴ細胞（Ｈ－２Ｋ^ｂ陰性）を、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｈ－２Ｋ^ｂ陽性）から得られたＢ細胞と１：１の比で５日間共培養した。培養物を、精製されなかった示された濃度のＬｏＳＴＩＭ又は分取サイズ排除クロマトグラフィーによって精製されたＬｏＳＴＩＭ単量体のいずれかで処理した。精製されていないＬｏＳＴＩＭは、２５０ｎＭ及び５００ｎＭでＴ細胞増殖を阻害したが、予想外に、精製されたＬｏＳＴＩＭ単量体は、これらの濃度でＴ細胞増殖を阻害しなかった。これは、これらの濃度でのＴ細胞阻害が多量体によるものであったことを示す。この兆候と一致して、精製された高分子量多量体（ＨＭＷ１又はＨＭＷ２）は、１１％の多量体から構成された２５０ｎＭの精製されていないＬｏＳＴＩＭ中に存在するほぼ同じ濃度（１８ｎＭ～３３ｎＭ）でＴ細胞の増殖を強力に阻害することができた。より大きなＨＭＷ１種が、ＨＭＷ２よりも強力にＴ細胞増殖を阻害するように見えたことも理解されるであろうが、これは、より強力なＰＤ－１クラスター化をもたらすＰＤ－１結合部位の数が多いことに起因し得る。精製されたＬｏＳＴＩＭ単量体によるＴ細胞活性化の組織特異的阻害を示す。ＣＦＳＥ標識化ＢＡＬＢ／ｃＣＤ８Ｔ細胞を、様々な濃度の精製されたＬｏＳＴＩＭ単量体の存在下で、Ｃ５７ＢＬ／６（Ｈ－２Ｋ^ｂ陽性）又はＣ３Ｈマウス（Ｈ－２Ｋ^ｂ陰性）のいずれかからのＢＭＤＣと培養した。ＬｏＳＴＩＭは、ＬｏＳＴＩＭに結合するＣ５７ＢＬ／６標的細胞によるＴ細胞活性化を強力に阻害したが（Ｈ－２Ｋ^ｂ陽性）、ＬｏＳＴＩＭに結合しないＣ３Ｈ標的細胞によるＴ細胞活性化を阻害しなかった（Ｈ－２Ｋ^ｂ陰性）。予想外に、ＬｏＳＴＩＭの阻害効果は、濃度が更に増加するにつれて減少が現れる前に、特定の濃度範囲内で最大に発生した。別のモデル系における精製されたＬｏＳＴＩＭ単量体によるＴ細胞活性化の阻害を示す。ＣＦＳＥ標識化ＯＴ－ＩＣＤ８＋Ｔ細胞を、様々な濃度の精製されたＬｏＳＴＩＭ単量体の存在下で、Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来のＳＩＩＮＦＥＫＬパルスＢＭＤＣと共培養した。ＣＦＳＥ平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、Ｔ細胞増殖及び活性化の測定基準として使用し、より低い値はより多くのＴ細胞増殖を示す。再び、ＬｏＳＴＩＭは、特定の濃度範囲内で最も強力にＴ細胞活性化を阻害し、濃度が増加するにつれて阻害効果がより顕著になり、次いでその後、顕著ではなくなってきた。驚くべきことに、ＬｏＳＴＩＭは、試験した最高濃度でＴ細胞活性化を阻害するのではなく、実際に増強した。ＬｏＳＴＩＭ媒介性Ｔ細胞阻害が、その同種抗原の両方への結合が飽和していない濃度で生じることを示す。以前の２つの図で実証され、この図の右側の２つのパネルで再現されるように、ＬｏＳＴＩＭは、両方のモデル系において０．４ｎＭ、４ｎＭ、及び４０ｎＭでＴ細胞活性化を阻害したが、４００ｎＭでは、その阻害効果は、同種異系Ｔ細胞活性化モデルにおいて減少し、モデル抗原（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）モデルにおいては存在しなかった。実際、ＳＩＩＮＦＥＫＬパルスＢＭＤＣによるＴ細胞活性化は、４００ｎＭの濃度で増強されたが、阻害されなかった。Ｈ－２Ｋｂ＋Ｃ５７ＢＬ／７ＢＭＤＣ及びＰＤ－１＋活性化Ｔ細胞への結合を別々に測定することによって生成した、この図の左側パネルにオーバーレイされたＬｏＳＴＩＭの同種抗原（ＰＤ－１及びＨ－２Ｋｂ）の各々についての結合曲線に対する比較を行うことができる。最低の親和性結合パートナーへの結合は、約１００ｎＭで飽和に近づき始め、約１０００ｎＭで飽和しているように見える。これは、両方のモデル系においてＬｏＳＴＩＭの阻害効果が失われる濃度範囲である。しかし、阻害効果が生じるためには、結合が依然として両方の結合パートナーに対して生じなければならず、したがって、２つの結合パートナーに対する結合親和性の差は有益であり、より広い差は、ＬｏＳＴＩＭがＴ細胞を阻害することができる、より広い範囲の濃度をもたらすはずである。したがって、その結合パートナー間の測定されたＫ_ｄの差がより大きいＬｏＳＴＩＭは、結合パートナーの各々についてのＫ_ｄがより類似しているＬｏＳＴＩＭよりも広範囲の濃度にわたってＴ細胞阻害を媒介することが予想されることになる。二重特異性結合と単一特異性結合との間の競合が許容される実験モデルにおいて、ＬｏＳＴＩＭ濃度が上昇するにつれて、二重特異性結合が、急激に減少する前に増加することを示す。ＭＣ３８細胞（Ｈ－２Ｋ^ｂ陽性、ＰＤ－１陰性）を、ヒトＰＤ－１（ｍＰＤ－１－ｈＦｃ）に融合した一定濃度の組換えマウスＰＤ－１細胞外ドメインの存在下で、様々な濃度のＬｏＳＴＩＭとインキュベートした。細胞に結合しなかった全てのタンパク質を完全に洗い流した後、細胞を抗ヒトＩｇＧ－ＰＥで染色して、二重特異性ＬｏＳＴＩＭ結合を介して細胞に結合したｍＰＤ－１－ｈＦｃを検出した。この実験は、各結合パートナーへの単一特異性結合と、両方の結合パートナーへの二重特異性結合との間の競合が同時に許容される場合、二重特異性結合が、限られた濃度範囲で生じることを実証した。ＬｏＳＴＩＭ媒介性Ｔ細胞阻害に対するこの結果は、図の右側の概略図に示される。ＬｏＳＴＩＭが、二重特異性結合が好ましい濃度（両方の結合パートナーが飽和していない濃度）で存在する場合、二重特異性結合は、標的細胞上の組織特異的表面抗原の存在を可能にし、その細胞と相互作用するＴ細胞上のＰＤ－１をクラスター化し、それによって、Ｔ細胞を阻害する。しかし、単一特異性結合はこれを許容せず、ＬｏＳＴＩＭが、各結合パートナーへの結合が飽和している濃度又はその濃度以上等、単一特異性結合が好ましい濃度で存在する場合、組織特異的表面抗原の存在は、ＰＤ－１クラスター化をもたらさないことになり、Ｔ細胞阻害は、ＬｏＳＴＩＭがその抗原に結合することができる場合でさえも生じないことになる。これは、以前の３つの図に提示された結果と一致する。二価の単一特異性抗ＰＤ－１抗体が、ＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ２によるＰＤ－１のライゲーションを遮断しない場合でさえ、腫瘍の免疫媒介性クリアランスを増強するように機能することができることを示す。二価の単一特異性抗体は、１つの結合パートナー／抗原決定基を有し、その結合パートナー／抗原決定基に対する２つの結合部位を有する。この例は、標準的なＩｇＧ抗体である。５Ｅ１２は、ＰＤ－１に結合するが、ＰＤ－１と、ＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ２との間の相互作用を遮断しない標準的なＩｇＧ抗体である。この図の左上のパネルは、５Ｅ１２が、３００－ｍＰＤ－１細胞に強く結合することを実証する。左の中央及び下部パネルは、５Ｅ１２の濃度の増加が、３００－ｍＰＤ－１細胞への組換えマウスＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ２Ｆｃ融合体（ｍＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ又はｍＰＤ－Ｌ２Ｆｃ）の結合を遮断しないことを実証することによって、これを確認する。右パネルは、図１５に提示されるインビボにおける免疫細胞活性を阻害するＬｏＳＴＩＭの能力を評価するために使用された腫瘍同種拒絶のモデルにおける腫瘍増殖に対する５Ｅ１２抗体の効果を評価する。（Ｃ５７ＢＬ／６起源の）ＭＣ３８細胞を、ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪマウスに皮下注射した。通常、ＭＣ３８腫瘍は、ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪマウスにおいて、その異なるＭＨＣに対する同種応答によって拒絶されることになるが、ＬｏＳＴＩＭによる処置は、著しく大きな腫瘍及び拒絶前の腫瘍のより長い平均持続期間をもたらす。この図には、２つの追加の実験条件が提示されている。（１）ＬｏＳＴＩＭ＋５Ｅ１２抗体での同時処置、及び（２）５Ｅ１２抗体単独での処置。ＬｏＳＴＩＭ及び５Ｅ１２での同時処置は、ＬｏＳＴＩＭの保護効果を低下させ、より少ない平均腫瘍体積及びより速い腫瘍拒絶をもたらした。５Ｅ１２単独での処置は、腫瘍増殖が測定できない程度まで、ビヒクル対照と比較して腫瘍クリアランスを有意に増強した。腫瘍クリアランスのこの増強は、ＰＤ－Ｌ１及び／又はＰＤ－Ｌ２によるＰＤ－１のライゲーションを遮断する抗ＰＤ－１抗体で予想され得るが、ＰＤ－１ライゲーションを遮断しない抗ＰＤ－１抗体では予想外である。５Ｅ１２抗体は、Ｔ細胞表面上の２つのＰＤ－１分子に結合し、それらの活性化に適合しないか、又はそれらの活性化を阻害する互いに対していくらかの方向又はいくらかの距離でこれらの分子を安定化することができると考えられる。一価の二重特異性ＬｏＳＴＩＭ等の、ＰＤ－１についての単一結合部位を有するＬｏＳＴＩＭは、二価形態で存在する場合、ＰＤ－１活性化と適合しない場合がある、５Ｅ１２等の抗ＰＤ－１クローンの使用を可能にすると考えられる。

本発明は、Ｔ細胞とは異なる標的細胞上のＰＤ－１及び表面抗原に結合する二重特異性分子が、細胞特異的及び／又は組織特異的な様式でＰＤ－１アゴニストとして機能することができるという発見に少なくとも部分的に基づく。

したがって、本発明は、様々な態様の中でも、所望の細胞、細胞型、及び／又は組織の状況におけるＰＤ－１アゴニストであり、それによって、そのような状況においてＴ細胞の活性化を阻害し、一方で、他の組織におけるＴ細胞のアゴニスト又はアンタゴニストではない、二重特異性分子を提供する。本発明はまた、様々な態様の中でも、いくつかの状況におけるＰＤ－１アゴニストであり、それによって、このような状況においてＴ細胞の活性化を阻害し、一方で、他の状況におけるＰＤ－１のアンタゴニストであり、それによって、これらの他の状況においてＴ細胞の活性化を増強する、二重特異性分子も提供する。

本発明はまた、様々な態様の中でも、細胞特異的及び／又は組織特異的な様式でＴ細胞の活性化を阻害することに関する方法も提供する。このような方法は、固形臓器移植片拒絶の予防、自己免疫疾患の治療、がんの治療、及び移植片対宿主病の治療において使用され得る。

様々な実施形態では、４つの広範な設計カテゴリーの二重特異性分子が開示される。第１のカテゴリーは、二重特異性抗体（ＩｇＧ、ＩｇＭ、及びＩｇＡモノクローナル抗体又はバリアントを含む）を含む。二重特異性抗体が使用される場合、Ｆｃドメインは、Ｆｃγ受容体への結合を減少させるための修飾を含有し得る。第２のカテゴリーは、Ｔ細胞活性の阻害が所望される体内の組織上の細胞上の表面抗原に対する抗体又はｓｃＦｖに融合したＰＤ－１のための天然リガンドを含む。リガンドが抗体に融合される場合、Ｆｃドメインは、Ｆｃγ受容体への結合を減少させるための修飾を含有し得る。第３のカテゴリーは、ＰＤ－１に対する抗体又はｓｃＦｖに融合した、Ｔ細胞活性の阻害が所望される（１つが存在する場合）体内の組織上の細胞上の表面抗原のための天然リガンドを含む。リガンドが抗体に融合される場合、Ｆｃドメインは、Ｆｃγ受容体への結合を減少させるための修飾を含有し得る。第４のカテゴリーは、Ｔ細胞活性の阻害が所望される体内の組織上の細胞上の表面抗原のための天然リガンドに融合したＰＤ－１のための天然リガンドを含む（直接融合又はＦｃ融合としてのいずれか）。Ｆｃ融合が使用される場合、Ｆｃドメインは、Ｆｃγ受容体への結合を減少させるための修飾を含有し得る。

これらのカテゴリーの各々について、二重特異性分子は、様々な特徴を有し得る。例えば、ＰＤ－１との相互作用は、天然リガンドによるそのライゲーションを遮断してもよいか、又はしなくてもよい。別の例として、各抗原決定基（ＰＤ－１又はＴ細胞活性の阻害が所望される体内の組織上の細胞上の表面抗原のいずれか）のための結合の価数（結合部位の数）は、以下のうちのいずれかであり得る。（１）所与の抗原決定基（ＰＤ－１又はＴ細胞活性の阻害が所望される体内の組織上の細胞上の表面抗原）について１つの抗原結合ドメイン（ＦＡＢ領域、ｓｃＦｖ、又は天然リガンドのいずれか）が存在する場合、一価、（２）所与の抗原決定基について２つの抗原結合ドメインが存在する場合、二価、及び（３）所与の抗原決定基について複数の抗原結合ドメインが存在する場合、多価。更に、ＰＤ－１の表面抗原結合に対する化学量論比は、変化してもよく、ＰＤ－１に対する結合ドメインの数は、表面抗原に対する結合ドメインの数に等しくてもよく、表面抗原結合ドメインよりも多くのＰＤ－１結合ドメインが存在してもよく（例えば、表面抗原結合ドメインよりも１、２、３、４、５、６、又はそれ以上多いＰＤ－１結合ドメイン）、又はＰＤ－１結合ドメインよりも多くの表面抗原結合ドメインが存在してもよい（例えば、ＰＤ－１結合ドメインよりも１、２、３、４、５、６、又はそれ以上多い表面抗原結合ドメイン）。

二重特異性分子は、様々な方法で使用される場合、多くの形態で治療的に投与され得る。例えば、それらは、治療用タンパク質として投与され得る。別の例として、それらは、治療用タンパク質（例えば、安定化されたｍＲＮＡ、適切なベクター内のＤＮＡ等）をコードする核酸として投与され得る。別の例として、それらは、治療用タンパク質を発現するように操作される細胞（例えば、治療用タンパク質をコードする核酸で形質転換されるＣＡＲ－Ｔ細胞）の形態にあり得る。

開示される二重特異性分子は、Ｔ細胞活性化を阻害することができる薬理学的ＰＤ－１アゴニストとして機能し得る。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、それらの設計の結果として、一部の組織上でＴ細胞活性を阻害するが、他の組織では阻害しない全身性薬理学的免疫抑制剤として機能し得る。いくつかの実施形態では、二重特異性分子は、それらの設計の結果として、異なる組織の状況においてＴ細胞活性を阻害又は増強の両方をすることができる薬理学的薬剤として機能し得る。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１の薬理学的アゴニストとしてＰＤ－１を阻害することが知られている抗体クローンのＰＤ－１結合ドメインの形成を可能にする。ＰＤ－１のそのような薬理学的アゴニストは、特定の組織の状況においてＴ細胞活性を阻害し得るが、他の組織の状況ではＴ細胞活性に対する活性又は増強効果のいずれも示さない。

開示される二重特異性分子は、特定の組織又は細胞型においてＴ細胞活性を阻害することができるが、同時に、他の組織においてＴ細胞活性を増強するか、又はそれに影響を及ぼさないことができる。様々な状態の治療のための、開示される二重特異性分子のいくつかの潜在的な応用は、本発明の使用及び方法と題された第ＶＩ節に更に記載されている。

Ｉ．定義
「ａ」及び「ａｎ」という冠詞は、冠詞の文法的目的語の１つ又は１つより多く（すなわち、少なくとも１つ）を指すために本明細書で使用される。一例として、「要素（ａｎｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの要素又は１つより多い要素を意味する。

マーカーの「変化した量」という用語は、対照試料中のマーカーのものと比較して、ある試料中のマーカーの増加若しくは減少したコピー数及び／又は特定のマーカー遺伝子（複数可）の増加若しくは減少した核酸レベルを指す。マーカーの「変化した量」という用語は、正常対照試料中のマーカーのタンパク質レベルと比較して、ある試料中のマーカーの増加又は減少したタンパク質レベルも含む。

マーカーの「変化した活性」という用語は、正常対照試料中のマーカーの活性と比較して、例えば生体試料中のある病状で増加又は減少するマーカーの活性を指す。マーカーの変化した活性は、例えば、マーカーの変化した発現、マーカーの変化したタンパク質レベル、マーカーの変化した構造、又は、例えば、マーカーと同じ若しくは異なる経路に関与する他のタンパク質との変化した相互作用、又は転写活性化因子若しくは阻害剤との変化した相互作用の結果であり得る。

マーカーの「変化した構造」という用語は、正常又は野生型遺伝子又はタンパク質と比較して、マーカー遺伝子又はマーカータンパク質中での変異又は対立遺伝子バリアント、例えば、マーカーの発現又は活性に影響を及ぼす突然変異の存在を指す。例えば、変異には、置換、欠失、又は付加変異が含まれるが、これらに限定されない。変異は、マーカーのコーディング領域又は非コーディング領域に存在し得る。

本明細書で別途特定されない限り、「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」及び「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」という用語は、抗体の天然に存在する形態（例えばＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ）及び組換え抗体、例えば、一本鎖抗体、キメラ及びヒト化抗体、並びに多重特異性抗体、並びに前述の全ての断片及び誘導体（これらの断片及び誘導体は少なくとも抗原結合部位を有する）を広範に包含する。抗体誘導体は、抗体にコンジュゲートされたタンパク質又は化学的部分を含み得る。「抗体」とは、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖、又はそれらの抗原結合部分を含む糖タンパク質を指す。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書でＶ_Ｈと略される）及び重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書でＶ_Ｌと略される）及び軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬからなる。Ｖ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存された領域が散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変領域に更に細分され得る。Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌは各々、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順でアミノ末端からカルボキシル末端に配置される３つのＣＤＲ及び４つのＦＲからなる。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。「不活性化抗体」は、補体系を誘導しない抗体を指す。

本明細書で使用される「抗体」という用語は、抗体の「抗原結合部分」（又は単に「抗体部分」）も含む。本明細書で使用される「抗原結合部分」という用語は、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上の断片を指す。抗体の抗原結合機能が全長抗体の断片によって果たされ得ることが示されている。抗体の「抗原結合部分」という用語の範囲内に包含される結合断片の例には、（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメイン、及びＣＨ１ドメインからなる一価断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片、（ｉｉｉ）ＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬドメイン及びＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄｅｔａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ３４１：５４４－５４６）、並びに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。更に、Ｆｖ断片の２つのドメインＶＬ及びＶＨが別個の遺伝子によってコードされるが、それらは、組換え法を使用して、それらがＶＬ領域及びＶＨ領域が対合して一価ポリペプチドを形成する単一タンパク質鎖として作製されることを可能にする合成リンカーによって連結され得る（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている、例えば、Ｂｉｒｄｅｔａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３－４２６、及びＨｕｓｔｏｎｅｔａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：５８７９－５８８３、及びＯｓｂｏｕｒｎｅｔａｌ．１９９８，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１６：７７８を参照のこと）。かかる一本鎖抗体は、抗体の「抗原結合部分」という用語の範囲内に包含されるようにも意図されている。特異的ｓｃＦｖの任意のＶＨ配列及びＶＬ配列は、完全ＩｇＧポリペプチド又は他のアイソタイプをコードする発現ベクターを生成するために、ヒト免疫グロブリン定常領域ｃＤＮＡ又はゲノム配列に連結され得る。ＶＨ及びＶＬは、タンパク質化学又は組換えＤＮＡ技術のいずれかを使用した免疫グロブリンのＦａｂ断片、Ｆｖ断片、又は他の断片の生成にも使用され得る。ダイアボディ等の一本鎖抗体の他の形態も包含される。ダイアボディは、ＶＨドメイン及びＶＬドメインが単一のポリペプチド鎖上に発現されるが、同じ鎖上の２つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカーを使用して発現され、それにより、これらのドメインを別の鎖の相補性ドメインと対合させ、２つの抗原結合部位を作製する、二価の二重特異性抗体である（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．，ｅｔａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：６４４４－６４４８、Ｐｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔａｌ．（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ２：１１２１－１１２３を参照のこと）。

なお更に、抗体又はその抗原結合部分は、抗体又は抗体部分と１つ以上の他のタンパク質又はペプチドとの共有結合的又は非共有結合的会合によって形成されるより大きい免疫接着ポリペプチドの一部であり得る。かかる免疫接着ポリペプチドの例には、四量体ｓｃＦｖポリペプチドを作製するためのストレプトアビジンコア領域の使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔａｌ．（１９９５）ＨｕｍａｎＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｎｄＨｙｂｒｉｄｏｍａｓ６：９３－１０１）、並びに二価のビオチン化ｓｃＦｖポリペプチドを作製するためのシステイン残基、マーカーペプチド、及びＣ末端ポリヒスチジンタグの使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔａｌ．（１９９４）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：１０４７－１０５８）が挙げられる。Ｆａｂ断片及びＦ（ａｂ’）２断片等の抗体部分は、それぞれ、全抗体のパパイン消化又はペプシン消化等の従来の技法を使用して、全抗体から調製され得る。更に、抗体、抗体部分、及び免疫接着ポリペプチドは、本明細書に記載の標準の組換えＤＮＡ技法を使用して得られ得る。

抗体は、ポリクローナル若しくはモノクローナル、異種、同種、若しくは同系、又はそれらの修飾形態（例えば、ヒト化、キメラ等）であり得る。抗体は、完全にヒトである場合もある。本明細書で使用される「モノクローナル抗体」及び「モノクローナル抗体組成物」という用語は、抗原の特定のエピトープと免疫反応することができる１種のみの抗原結合部位を含む抗体ポリペプチドの集団を指し、「ポリクローナル抗体」及び「ポリクローナル抗体組成物」という用語は、特定の抗原と相互作用することができる複数の種の抗原結合部位を含む抗体ポリペプチドの集団を指す。モノクローナル抗体組成物は、典型的には、それが免疫反応する特定の抗原に対する単一結合親和性を呈する。

「体液」という用語は、身体から排泄又は分泌される流体、並びに通常は身体から排泄又は分泌されない流体（例えば、羊水、房水、胆汁、血液及び血漿、脳脊髄液、耳垢（ｃｅｒｕｍｅｎ）及び耳垢（ｅａｒｗａｘ）、カウパー液又は前射精液、乳糜、糜粥、糞便、雌性射出液、間質液、細胞内液、リンパ液、月経、母乳、粘液、胸膜液、膿汁、唾液、皮脂、精液、血清、汗、滑液、涙、尿、腟粘滑液、硝子体液、嘔吐物）を指す。

「がん」又は「腫瘍」又は「過剰増殖性障害」という用語は、制御不能な増殖、不死性、転移能、速い成長及び増殖速度、並びにある特定の特有の形態学的特徴等のがんを引き起こす細胞に特有の特性を有する細胞の存在を指す。がん細胞は、多くの場合、腫瘍の形態にあるが、かかる細胞は、動物に単独で存在し得るか、又は白血病細胞等の非腫瘍形成性がん細胞であり得る。がんには、Ｂ細胞がん、例えば、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖病、例えば、アルファ鎖病、ガンマ鎖病、及びミュー鎖病等、良性単クローン性ガンマグロブリン血症、並びに免疫球性アミロイドーシス、黒色腫、乳がん、肺がん、気管支がん、結腸直腸がん、前立腺がん、膵臓がん、胃がん、卵巣がん、膀胱がん、脳又は中枢神経系がん、末梢神経系がん、食道がん、子宮頸がん、子宮又は子宮内膜がん、口腔又は咽頭がん、肝臓がん、腎臓がん、睾丸がん、胆道がん、小腸又は虫垂がん、唾液腺がん、甲状腺がん、副腎がん、骨肉腫、軟骨肉腫、血液学的組織がん等が含まれるが、これらに限定されない。本発明によって包含される方法に適用可能ながんのタイプの他の非限定的な例には、ヒト肉腫及びがん腫、例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑液腫瘍、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸がん、結腸直腸がん、膵臓がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、扁平上皮がん、基底細胞がん、腺がん、汗腺がん、脂腺がん、乳頭がん、乳頭腺がん、嚢胞腺がん、髄様がん、気管支がん、腎細胞がん、肝がん、胆管がん、肝臓がん、絨毛腫、精上皮腫、胎生期がん、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、骨がん、脳腫瘍、睾丸がん、肺がん、小細胞肺がん、膀胱がん、上皮がん、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、白血病、例えば、急性リンパ性白血病及び急性骨髄性白血病（骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、及び赤白血病）、慢性白血病（慢性骨髄性（顆粒球性）白血病及び慢性リンパ球性白血病）、及び真性赤血球増加症、リンパ腫（ホジキン病及び非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、及び重鎖病が挙げられる。いくつかの実施形態では、がんは、本来、上皮がんであり、がんには、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、結腸がん、婦人科がん、腎臓がん、喉頭がん、肺がん、口腔がん、頭頸部がん、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、又は皮膚がんが含まれるが、これらに限定されない。他の実施形態では、がんは、乳がん、前立腺がん、肺がん、又は結腸がんである。なお他の実施形態では、上皮がんは、非小細胞肺がん、非乳頭状腎細胞がん、子宮頸がん、卵巣がん（例えば、漿液性卵巣がん）、又は乳がんである。上皮がんは、漿液性、類内膜、粘液性、明細胞、ブレンナー、又は未分化を含むが、これらに限定されない様々な他の方法で特徴付けられ得る。

「ＣＤＲ」という用語及びその複数形「ＣＤＲｓ」は、３つが軽鎖可変領域の結合特性（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、及びＣＤＲ－Ｌ３）を構成し、３つが重鎖可変領域の結合特性（ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３）を構成する、相補性決定領域（ＣＤＲ）を指す。ＣＤＲは、抗体分子の機能的活性に寄与し、足場又はフレームワーク領域を含むアミノ酸配列によって分離される。正確な定義ＣＤＲ境界及び長さは、異なる分類及び番号付けシステムに付される。したがって、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、接触、又は任意の他の境界定義によって参照され得る。異なる境界にもかかわらず、これらのシステムは各々、可変配列内のいわゆる「超可変領域」を構成するものにある程度の重複を有する。したがって、これらのシステムに従うＣＤＲ定義は、隣接するフレームワーク領域に関して長さ及び境界領域の点で異なり得る。例えば、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、及び／又はＭａｃＣａｌｌｕｍｅｔａｌ．（各々参照により全体が組み込まれる、Ｋａｂａｔｅｔａｌ．，“ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ，”５^ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＨｅａｌｔｈａｎｄＨｕｍａｎＳｅｒｖｉｃｅｓ，１９９２、Ｃｈｏｔｈｉａｅｔａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６，９０１、及びＭａｃＣａｌｌｕｍｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９６）２６２，７３２）を参照されたい。

本明細書で使用される場合、「分類すること」という用語は、試料を病状と「関連付けること」又は試料を病状で「カテゴリー化すること」を含む。ある特定の例では、「分類すること」は、統計的証拠、実験的証拠、又は両方に基づいている。ある特定の実施形態では、分類する方法及びシステムは、いわゆる既知の病状を有する試料の訓練セットを使用する。確立された時点で、訓練データセットは、試料の未知の病状を分類するために、未知の試料の特徴が比較される基礎、モデル、又はテンプレートとしての機能を果たす。ある特定の例では、試料の分類は、試料の病状の診断に似ている。ある特定の他の例では、試料の分類は、試料の病状の別の病状との区別に似ている。

本明細書で使用される場合、「コーディング領域」という用語は、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含むヌクレオチド配列の領域を指し、「非コーディング領域」という用語は、アミノ酸に翻訳されないヌクレオチド配列の領域（例えば、５’及び３’非翻訳領域）を指す。

「［に対する］相補体」又は「相補的」とは、２つの核酸鎖の領域間又は同じ核酸鎖の２つの領域間の配列相補性の広範な概念を指す。第１の核酸領域のアデニン残基は、残基がチミン又はウラシルである場合に第１の領域に逆平行の第２の核酸領域の残基と特異的水素結合（「塩基対合」）を形成することができることが知られている。同様に、第１の核酸鎖のシトシン残基は、残基がグアニンである場合に第１の鎖に逆平行の第２の核酸鎖の残基と塩基対合することができることが知られている。核酸の第１の領域は、２つの領域が逆平行様式で配置されたときに、第１の領域の少なくとも１つのヌクレオチド残基が第２の領域の残基と塩基対合することができる場合、同じ又は異なる核酸の第２の領域に相補的である。一実施形態では、第１の領域が第１の部分を含み、第２の領域が第２の部分を含み、それにより、第１及び第２の部分が逆平行様式で配置されたときに、第１の部分のヌクレオチド残基の少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７５％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％が、第２の部分のヌクレオチド残基と塩基対合することができる。別の実施形態では、第１の部分の全てのヌクレオチド残基が、第２の部分のヌクレオチド残基と塩基対合することができる。

本明細書で使用される場合、「複合抗体」という用語は、２つ以上の非連関可変領域由来の生殖系列又は非生殖系列免疫グロブリン配列を含む可変領域を有する抗体を指す。加えて、「複合ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖系列又は非生殖系列免疫グロブリン配列に由来する定常領域及び２つ以上の非関連ヒト可変領域由来のヒト生殖系列又は非生殖系列配列を含む可変領域を有する抗体を指す。複合ヒト抗体は、ヒト体内の複合ヒト抗体の抗原性が低下するため、本発明による治療薬における有効な成分として有用である。

「対照」という用語は、試験試料中の発現産物との比較を提供するのに好適な任意の参照基準を指す。一実施形態では、対照は、発現産物レベルが、検出され、試験試料由来の発現産物レベルと比較される、「対照試料」を得ることを含む。かかる対照試料は、既知の転帰を有する対照がん患者由来の試料（保管された試料若しくは先行試料測定であり得る）、健常患者若しくはがん患者等の対象から単離された正常組織若しくは細胞、がん患者の同じ臓器若しくは身体位置から得られた正常細胞／組織に隣接する、健常対象若しくはがん患者等の対象から単離された培養初代細胞／組織、健常対象から単離された組織若しくは細胞試料、又は寄託所から得られた初代細胞／組織を含むが、これらに限定されない、任意の好適な試料を含み得る。別の好ましい実施形態では、対照は、ハウスキーピング遺伝子、正常組織（又は他の以前に分析された対照試料）由来の発現産物レベル範囲、ある特定の転帰（例えば、１、２、３、４年等の生存期間）を有するか、又はある特定の治療（例えば、標準治療がん療法）を受けている患者群又は一組の患者由来の試験試料中の以前に決定された発現産物レベル範囲を含むが、これらに限定されない、任意の好適な源由来の参照基準発現産物レベルを含み得る。当業者であれば、かかる対照試料及び参照基準発現産物レベルが対照として本発明の方法と組み合わせて使用され得ることを理解するであろう。一実施形態では、対照は、正常又は非がん性細胞／組織試料を含み得る。別の好ましい実施形態では、対照は、一組の患者、例えば、一組のがん患者の発現レベル、又はある特定の治療を受けている一組のがん患者発現レベル、又はある転帰に対して別の転帰を有する一組の患者の発現レベルを含み得る。前者の場合、各患者の特異的発現産物レベルは、発現のパーセンタイルレベルに割り当てられ得るか、又は参照基準発現レベルの平均値若しくは平均よりも高い若しくは低いのいずれかとして表され得る。別の好ましい実施形態では、対照は、正常細胞、併用化学療法で治療された患者由来の細胞、及び良性がんを有する患者由来の細胞を含み得る。別の実施形態では、対照は、測定値、例えば、ある集団におけるハウスキーピング遺伝子の発現レベルと比較した同じ集団における特定の遺伝子の平均発現レベルも含み得る。かかる集団は、健常対象、いずれの治療も受けていない（すなわち、未治療）がん患者、標準治療療法を受けているがん患者、又は良性がんを有する患者を含み得る。別の好ましい実施形態では、対照は、試験試料中の２つの遺伝子の発現産物レベルの比率を決定し、それを参照基準で同じ２つの遺伝子の任意の好適な比率と比較すること、試験試料中の２つ以上の遺伝子の発現産物レベルを決定し、任意の好適な対照中の発現産物レベルの差を決定すること、及び試験試料中の２つ以上の遺伝子の発現産物レベルを決定し、それらの発現を試験試料中のハウスキーピング遺伝子の発現に正規化し、任意の好適な対照と比較することを含むが、これらに限定されない、発現産物レベルの比率変換を含む。特に好ましい実施形態では、対照は、試験試料と同じ系統及び／又はタイプのものである対照試料を含む。別の実施形態では、対照は、がんを有する全ての患者等の一組の患者試料中のパーセンタイルとして又はそれに基づいて群分けされる発現産物レベルを含み得る。一実施形態では、対照発現産物レベルが確立され、例えば特定のパーセンタイルと比較してより高い又はより低い発現産物レベルが転帰を予測するための基礎として使用される。別の好ましい実施形態では、対照発現産物レベルが既知の転帰を有するがん対照患者由来の発現産物レベルを使用して確立され、試験試料由来の発現産物レベルが転帰を予測する基礎として対照発現産物レベルと比較される。以下のデータによって実証されるように、本発明の方法は、試験試料中の発現産物レベルを対照と比較する際の特定のカットポイントの使用に限定されない。

本明細書で使用される場合、「Ｆｃ領域」という用語は、天然配列Ｆｃ領域及びバリアントＦｃ領域を含む免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は異なり得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、Ｃｙｓ２２６位のアミノ酸残基から、又はＰｒｏ２３０から、そのカルボキシル末端まで及ぶと定義される。本発明の抗体における使用に好適な天然配列Ｆｃ領域には、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２（ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ）、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４が含まれる。

本明細書で使用される場合、「Ｆｃ受容体」又は「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を説明する。好ましいＦｃＲは、天然配列ヒトＦｃＲである。更に、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体に結合するもの（ガンマ受容体）であり、好ましいＦｃＲには、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体（これらの受容体の対立遺伝子バリアント及び代替的にスプライスされた形態を含む）が含まれ、ＦｃγＲＩＩ受容体には、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「阻害受容体」）が含まれ、これらは、主にその細胞質ドメインが異なる同様のアミノ酸配列を有する。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。阻害受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む（Ｍ．Ｄａｅｒｏｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２０３－２３４（１９９７）を参照のこと。ＦｃＲは、ＲａｖｅｔｃｈａｎｄＫｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７－９２（１９９１）、Ｃａｐｅｌｅｔａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ４：２５－３４（１９９４）、及びｄｅＨａａｓｅｔａｌ．，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０－４１（１９９５）に概説されている。今後特定されるものを含む他のＦｃＲも、本明細書における「ＦｃＲ」という用語によって包含される。

分子は、かなりの割合の分子が基質から解離することなく基質が流体（例えば標準のクエン酸生理食塩水、ｐＨ７．４）ですすがれ得るように、分子が基質に共有結合的又は非共有結合的に会合している場合、基質に「固定」又は「付着（ａｆｆｉｘ）」されている。

本明細書で使用される場合、「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基は、本明細書で定義されるＨＶＲ残基以外の可変ドメイン残基である。

「機能保存的バリアント」とは、タンパク質又は酵素中の所与のアミノ酸残基が、あるアミノ酸と同様の特性（例えば、極性、水素結合能、酸性、塩基性、疎水性、芳香族等）を有するアミノ酸との置換を含むが、これに限定されない、ポリペプチドの全体的な立体配座及び機能を改変することなく変化したものである。保存されたものとして示されるもの以外のアミノ酸は、同様の機能を有する任意の２つのタンパク質間のタンパク質又はアミノ酸配列類似性パーセントが変化し得るように、タンパク質中で異なり得、例えば、類似性がＭＥＧＡＬＩＧＮアルゴリズムに基づくクラスター法等のアライメントスキームに従って決定される、７０％～９９％であり得る。「機能保存的バリアント」は、ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡアルゴリズムによって決定される、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、なお好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有し、かつそれが比較される天然又は親タンパク質と同じ又は実質的に同様の特性又は機能を有するポリペプチドも含む。

本明細書で使用される場合、「異種抗体」という用語は、かかる抗体を産生するトランスジェニック非ヒト生物との関連で定義される。この用語は、トランスジェニック非ヒト動物からなるものではなく、一般にトランスジェニック非ヒト動物種以外の種由来の生物に見られるものに対応するアミノ酸配列又はコード核酸配列を有する抗体を指す。

本明細書で使用される「相同」とは、同じ核酸鎖の２つの領域間又は２つの異なる核酸鎖の領域間のヌクレオチド配列類似性を指す。両領域におけるヌクレオチド残基位置が同じヌクレオチド残基によって占有されている場合、それらの領域は、その位置で相同である。第１の領域は、各領域の少なくとも１つのヌクレオチド残基位置が同じ残基によって占有されている場合、第２の領域と相同である。２つの領域間の相同性は、同じヌクレオチド残基によって占有されている２つの領域のヌクレオチド残基位置の割合で表される。一例として、ヌクレオチド配列５’－ＡＴＴＧＣＣ－３’を有する領域及びヌクレオチド配列５’－ＴＡＴＧＧＣ－３’を有する領域は、５０％の相同性を共有する。好ましくは、第１の領域が第１の部分を含み、第２の領域が第２の部分を含み、それにより、それらの部分の各々のヌクレオチド残基位置の少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７５％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％が同じヌクレオチド残基によって占有される。より好ましくは、それらの部分の各々の全てのヌクレオチド残基位置が同じヌクレオチド残基によって占有される。

本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、本発明の組換え発現ベクター等の本発明の核酸が導入される細胞を指すよう意図されている。「宿主細胞」及び「組換え宿主細胞」という用語は、本明細書で同義に使用される。かかる用語が特定の対象細胞のみならず、かかる細胞の子孫又は潜在的子孫も指すことを理解されたい。変異又は環境影響のいずれかによりある特定の修飾が後世で生じ得るため、かかる子孫は実際には親細胞と同一ではない場合があるが、依然として本明細書で使用される本用語の範囲内に含まれる。

本明細書で使用される「ヒト化抗体」という用語は、ヒト細胞によって作製されるであろう抗体により厳密に似るように改変された可変領域及び定常領域を有する非ヒト細胞によって作製された抗体を含むよう意図されている。例えば、非ヒト抗体アミノ酸配列を改変することにより、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に見られるアミノ酸を組み込む。ヒト化抗体は、例えば、ＣＤＲにおける、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列（例えば、インビトロでのランダム若しくは部位特異的変異誘発又はインビボでの体細胞変異によって導入される変異）によってコードされていないアミノ酸残基を含み得る。本明細書で使用される「ヒト化抗体」という用語は、マウス等の別の哺乳類種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列にグラフトされた抗体も含む。

本明細書で使用される場合、「超可変領域」、「ＨＶＲ」、又は「ＨＶ」という用語は、配列で超可変であり、かつ／又は構造的に定義されたループを形成する抗体可変ドメインの領域を指す。一般に、抗体は、６つのＨＶＲを含み、３つがＶＨにあり（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、３つがＶＬにある（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）。天然抗体では、Ｈ３及びＬ３が６つのＨＶＲのうちで最も多様性を呈し、特にＨ３が抗体への微細特異性の付与に特有の役割を果たすと考えられている。例えば、Ｘｕｅｔａｌ．（２０００）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ１３，３７－４５、ＪｏｈｎｓｏｎａｎｄＷｕｉｎＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ２４８，１－２５（Ｌｏ，ｅｄ．，ＨｕｍａｎＰｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３））を参照されたい。実際には、重鎖のみからなる天然に存在するラクダ類抗体は、軽鎖の不在下で機能的であり、安定している（例えば、Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎｅｔａｌ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ３６３：４４６－４４８（１９９３）及びＳｈｅｒｉｆｆｅｔａｌ．（１９９６）ＮａｔｕｒｅＳｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．３，７３３－７３６を参照されたい）。

本明細書で使用される場合、「免疫細胞」という用語は、免疫応答において役割を果たす細胞を指す。免疫細胞は造血起源のものであり、免疫細胞には、リンパ球、例えば、Ｂ細胞及びＴ細胞、ナチュラルキラー細胞、骨髄細胞、例えば、単球、マクロファージ、好酸球、マスト細胞、好塩基球、及び顆粒球が含まれる。

本明細書で使用される場合、「免疫障害」という用語には、がん、慢性炎症性疾患及び障害（例えば、クローン病、炎症性腸疾患、反応性関節炎、及びライム病等）、インスリン依存性糖尿病、臓器特異的自己免疫（例えば、多発性硬化症、橋本甲状腺炎、自己免疫性ブドウ膜炎、及びグレーブス病等）、接触性皮膚炎、乾癬、移植片拒絶、移植片対宿主病、サルコイドーシス、アトピー性状態（例えば、喘息及びアレルギー（アレルギー性鼻炎及び食品アレルギー等の消化管アレルギーを含むが、これらに限定されない）等）、好酸球増加症、結膜炎、糸球体腎炎、全身性紅斑性狼瘡、強皮症、蠕虫等のある特定の病原体易感染性（例えば、リーシュマニア症等）及びある特定のウイルス感染（例えば、ＨＩＶ及び細菌感染（結核及び癩腫癩等）等）、並びにマラリアを含むが、これらに限定されない免疫疾患、状態、及びそれらの素因が含まれる。

本明細書で使用される場合、「免疫応答」という用語は、Ｔ細胞媒介性及び／又はＢ細胞媒介性免疫応答を含む。例示の免疫応答には、Ｔ細胞応答、例えば、サイトカイン産生、及び細胞毒性が含まれる。加えて、免疫応答という用語には、Ｔ細胞活性化、例えば、抗体産生（体液性応答）及びサイトカイン応答性細胞、例えば、マクロファージの活性化によって間接的にもたらされる免疫応答が含まれる。

本明細書で使用される場合、「阻害すること」という用語及びその文法的等価物は、特定の作用、機能、又は相互作用の低減、制限、及び／又は遮断を指す。一実施形態では、この用語は、所与の出力又はパラメータのレベルを、対応する対照における量よりも少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又はそれ未満の量（例えば、背景染色、ＰＤ－１シグナル伝達、ＰＤ－１免疫阻害性機能等）に減少させることを指す。所与の出力又はパラメータのレベルの減少は、出力又はパラメータの絶対不在を意味し得るが、意味する必要はない。本発明は、出力又はパラメータを完全に排除する方法を必要とせず、それに限定されない。所与の出力又はパラメータは、本明細書及び実施例で考察される免疫組織化学的アッセイ、分子生物学的アッセイ、細胞生物学的アッセイ、臨床的アッセイ、及び生化学的アッセイを含むが、これらに限定されない当該技術分野で周知の方法を使用して決定され得る。「促進すること」、「増加させること」という反意用語、及びそれらの文法的等価物は、阻害又は低減について記載されたものと反対である所与の出力又はパラメータのレベルの増加を指す。

本明細書で使用される場合、「相互作用」という用語は、２つの分子間の相互作用を指すとき、分子のお互いとの物理的接触（例えば、結合）を指す。一般に、かかる相互作用は、当該分子の一方又は両方の活性をもたらす（それにより、生物学的効果がもたらされる）。活性は、それらの分子の一方又は両方の直接活性（例えば、シグナル伝達）であり得る。代替的に、相互作用における一方又は両方の分子は、それらのリガンドへの結合を阻止される場合があり、それ故に、リガンド結合活性（例えば、そのリガンドに結合し、免疫応答を誘発又は阻害する）に関して不活性で保持される。かかる相互作用を阻害することにより、相互作用に関与する１つ以上の分子の活性の破壊がもたらされる。かかる相互作用を増強することは、当該物理的接触を延長するか、又はその可能性を高めることであり、当該活性の可能性を延長するか、又はその可能性を高めることである。

本明細書で使用される場合、「単離された抗体」という用語は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体（例えば、ヒトＰＤ－１に特異的に結合し、ＰＤ－１に結合しない抗体を実質的に含まない単離された抗体）を指すよう意図されている。しかしながら、ヒトＰＤ－１に特異的に結合する単離された抗体は、それぞれ、異なる種由来の他のＰＤ－１タンパク質に対する交差反応性を有し得る。例えば、いくつかの実施形態では、この抗体は、少なくとも２つの種、例えば、ヒト及びマウス、又は他の哺乳動物若しくは非哺乳動物種に対して特異的結合親和性を維持する。しかしながら、いくつかの実施形態では、この抗体は、ヒトＰＤ－１に対してより高い又は実際に特異的な親和性及び選択性を維持する。加えて、単離された抗体は、典型的には、他の細胞物質及び／又は化学物質を実質的に含まない。本発明の一実施形態では、ヒトＰＤ－１に対する異なる特異性を有する「単離された」モノクローナル抗体の組み合わせが、明確に定義された組成物中で組み合わせられる。

本明細書で使用される場合、「単離されたタンパク質」とは、他のタンパク質、細胞物質、分離培地、及び培養培地（細胞から単離される場合又は組換えＤＮＡ技法によって産生される場合）、又は化学的前駆体若しくは他の化学物質（化学的に合成される場合）を実質的に含まないタンパク質を指す。「単離された」又は「精製された」タンパク質又はその生物学的に活性な部分は、抗体、ポリペプチド、ペプチド、若しくは融合タンパク質が由来する細胞若しくは組織源由来の細胞物質若しくは他の夾雑タンパク質を実質的に含まず、又は化学的前駆体若しくは他の化学物質（化学的に合成される場合）を実質的に含まない。「細胞物質を実質的に含まない」という言語は、タンパク質が、それが単離されるか、又は組換え的に産生される細胞の細胞成分から分離される標的ポリペプチド（例えば、免疫グロブリン）又はその断片の調製物を含む。一実施形態では、「細胞物質を実質的に含まない」という言語は、約３０％未満（乾燥重量で）の非標的タンパク質（本明細書で「夾雑タンパク質」とも称される）、より好ましくは約２０％未満の非標的タンパク質、なおより好ましくは約１０％未満の非標的タンパク質、最も好ましくは約５％未満の非標的タンパク質を有する標的タンパク質又はその断片の調製物を含む。抗体、ポリペプチド、ペプチド、若しくは融合タンパク質、又はそれらの断片、例えば、それらの生物学的に活性な断片が組換え的に産生される場合、これは、好ましくは、培養培地、すなわち、タンパク質調製物の体積の約２０％未満、より好ましくは約１０％未満、最も好ましくは約５％未満に相当する培養培地を実質的に含まない。

本明細書で使用される場合、「アイソタイプ」という用語は、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラス（例えば、ＩｇＭ又はＩｇＧ１）を指す。

本明細書で使用される場合、「Ｋ_Ｄ」という用語は、特定の抗体－抗原相互作用の解離平衡定数を指すよう意図されている。開示される本発明の抗体の結合親和性は、標準の抗体－抗原アッセイ、例えば、競合的アッセイ、飽和アッセイ、又はＥＬＩＳＡ若しくはＲＩＡ等の標準の免疫アッセイによって測定又は決定され得る。

本明細書で使用される場合、「キット」とは、本発明のマーカーの発現を特異的に検出又は調節するための少なくとも１つの試薬、例えば、プローブを含む任意の製品（例えば、パッケージ又は容器）である。キットは、本発明の方法を行うための装置として販売促進、流通、又は販売され得る。

本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、特定のエピトープに対して単一結合特異性及び親和性を呈する抗体を指す。したがって、「ヒトモノクローナル抗体」という用語は、単一結合特異性を呈し、かつヒト生殖系列又は非生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を有する抗体を指す。一実施形態では、ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞に融合したヒト重鎖トランス遺伝子及び軽鎖トランス遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物、例えば、トランスジェニックマウスから得られたＢ細胞を含むハイブリドーマによって産生される。

「マーカー」は、ある組織又は細胞での発現レベルの正常又は健常組織又は細胞におけるその発現レベルからの変化ががん等の病状に関連する遺伝子である。「マーカー核酸」は、本発明のマーカーによってコードされるか、又はそれに対応する核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ）である。かかるマーカー核酸には、配列表に記載の核酸配列のうちのいずれかの全配列若しくは部分配列、又はかかる配列の相補体を含むＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）が含まれる。マーカー核酸は、配列表に記載の核酸配列のうちのいずれかの全配列若しくは部分配列、又はかかる配列の相補体を含むＲＮＡも含み、全てのチミジン残基がウリジン残基で置換されている。「マーカータンパク質」は、本発明のマーカーによってコードされるか、又はそれに対応するタンパク質である。マーカータンパク質は、配列表に記載の配列のうちのいずれかの全配列又は部分配列を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１がマーカーとして使用される。「タンパク質」及び「ポリペプチド」という用語は同義に使用される。

本明細書で使用される場合、「調節する」という用語は、上方制御及び下方制御、例えば、応答の増強又は阻害を含む。

マーカーの「正常な」発現レベルは、異常なマーカーレベルに関連する疾患又は障害に罹患していない対象、例えば、ヒト患者の細胞中のマーカーの発現レベルである。マーカーの「過剰発現」又は「有意により高い発現レベル」とは、発現を評価するために用いられるアッセイの標準誤差を超え、かつ対照試料（例えば、マーカー関連疾患を有しない健常対象由来の試料）中のマーカーの発現レベル、好ましくは、いくつかの対照試料中のマーカーの平均発現レベルの好ましくは少なくとも２倍、より好ましくは３、４、５、又は１０倍である、試験試料における発現レベルを指す。マーカーの「有意により低い発現レベル」とは、対照試料（例えば、マーカー関連疾患を有しない健常対象由来の試料）中のマーカーの発現レベル、好ましくは、いくつかの対照試料中のマーカーの平均発現レベルよりも少なくとも２倍、より好ましくは３、４、５、又は１０倍低い、試験試料における発現レベルを指す。

本明細書で使用される場合、「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子を含むよう意図されている。核酸分子は、一本鎖又は二本鎖であり得るが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。本明細書で使用される場合、ＰＤ－１に結合する抗体又は抗体部分（例えば、Ｖ_Ｈ、Ｖ_Ｌ、ＣＤＲ３）をコードする核酸に関して「単離された核酸分子」という用語は、それらの抗体又は抗体部分をコードするヌクレオチド配列が、ＰＤ－１以外の抗原に結合する抗体又は抗体部分をコードする他のヌクレオチド配列を含まず、他の配列がヒトゲノムＤＮＡ中の核酸に天然に隣接し得る核酸分子を指すよう意図されている。

核酸は、別の核酸配列と機能的関係に置かれた場合、「作動可能に連結される」。例えば、プロモーター又はエンハンサーは、コーディング配列の転写に影響を及ぼした場合、その配列に作動可能に連結される。転写制御配列に関して、作動可能に連結されるとは、連結されているＤＮＡ配列が隣接しており、必要に応じて、２つのタンパク質コーディング領域を連結するために、隣接してリーディングフレーム内にあることを意味する。スイッチ配列の場合、作動可能に連結されるとは、それらの配列がスイッチ組換えをもたらすことができることを示す。

マーカーの「過剰発現」又は「有意により高い発現レベル」とは、発現を評価するために用いられるアッセイの標準誤差を超え、好ましくは対照試料（例えば、マーカー関連疾患を有しない健常対象由来の試料）中のマーカーの発現活性又はレベル、好ましくは、いくつかの対照試料中のマーカーの平均発現レベルよりも少なくとも２倍、より好ましくは２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０倍、又はそれ以上高い、試験試料中の発現レベルを指す。マーカーの「有意により低い発現レベル」とは、対照試料（例えば、マーカー関連疾患を有しない健常対象由来の試料）中のマーカーの発現レベル、好ましくは、いくつかの対照試料中のマーカーの平均発現レベルよりも少なくとも２倍、より好ましくは２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０倍、又はそれ以上低い、試験試料中の発現レベルを指す。

試料は、長期間にわたって個体から繰り返し収集され得る（例えば、約数日間、数週間、数ヶ月に１回以上、年１回、年２回等）。ある期間にわたって個体から多数の試料を得ることは、早期検出からの結果を検証し、かつ／又は生物学的パターンの変化を、例えば、疾患進行、薬物治療等の結果として特定するために使用され得る。例えば、対象試料は、１ヶ月に１回、２ヶ月に１回、又は本発明による１、２、若しくは３ヶ月間隔の組み合わせで採取及び監視され得る。加えて、経時的に得られた対象のバイオマーカー量及び／又は活性測定値は、監視期間中に、互いに、かつ正常対照のものと好都合に比較され、それにより、対象自身の値を長期監視のための内部対照又は個人的対照として提供することができる。

試料は、生細胞／組織、新鮮凍結細胞、新鮮組織、生検、固定細胞／組織、パラフィン等の培地中に包埋された細胞／組織、組織学的スライド、又はそれらの任意の組み合わせを含有し得る。

試料調製及び分離は、収集された試料のタイプ及び／又はバイオマーカー測定値の分析に応じて、手順のうちのいずれかを含み得る。かかる手順には、ほんの一例として、濃縮、希釈、ｐＨの調整、高濃度ポリペプチド（例えば、アルブミン、ガンマグロブリン、及びトランスフェリン等）の除去、保存料及び検量体の添加、プロテアーゼ阻害剤の添加、変性剤の添加、試料の脱塩、試料タンパク質の濃縮、脂質の抽出及び精製が含まれる。

試料調製は、非共有結合複合体中で他のタンパク質（例えば、担体タンパク質）に結合した分子を単離することもできる。このプロセスは、特定の担体タンパク質（例えば、アルブミン）に結合したこれらの分子を単離することができるか、又はタンパク質変性による、例えば、酸を使用した、全ての担体タンパク質からの結合した分子の放出、その後の担体タンパク質の除去等のより一般的なプロセスを使用することができる。

望ましくないタンパク質（例えば、高濃度の、無益な、又は検出不能なタンパク質）の試料からの除去は、高親和性試薬、高分子量フィルター、超遠心分離及び／又は電気透析を使用して達成され得る。高親和性試薬には、高濃度タンパク質に選択的に結合する抗体又は他の試薬（例えば、アプタマー）が含まれる。試料調製には、イオン交換クロマトグラフィー、金属イオン親和性クロマトグラフィー、ゲル濾過、疎水性クロマトグラフィー、クロマト分画、吸着クロマトグラフィー、等電点分画、及び関連技法も含まれ得る。分子量フィルターには、サイズ及び分子量に基づいて分子を分離する膜が含まれる。かかるフィルターは、逆浸透、ナノ濾過、限外濾過、及び精密濾過を更に用い得る。

「ポリペプチド断片」又は「断片」という用語は、参照ポリペプチドに関して使用される場合、アミノ酸残基が参照ポリペプチド自体と比較して欠失しているが、残りのアミノ酸配列が、通常、参照ポリペプチドにおける対応する位置と同一であるポリペプチドを指す。かかる欠失は、参照ポリペプチドのアミノ末端で内部的に、若しくはそのカルボキシル末端で、又は代替的に両方で生じ得る。断片は、典型的には、少なくとも５、６、８、若しくは１０アミノ酸長、少なくとも１４アミノ酸長、少なくとも２０、３０、４０、若しくは５０アミノ酸長、少なくとも７５アミノ酸長、又は少なくとも１００、１５０、２００、３００、５００、若しくはそれ以上のアミノ酸長である。それらは、例えば、それらが全長ポリペプチドの長さ未満である限り、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、４２０、４４０、４６０、４８０、５００、５２０、５４０、５６０、５８０、６００、６２０、６４０、６６０、６８０、７００、７２０、７４０、７６０、７８０、８００、８２０、８４０、８６０、８８０、９００、９２０、９４０、９６０、９８０、１０００、１０２０、１０４０、１０６０、１０８０、１１００、１１２０、１１４０、１１６０、１１８０、１２００、１２２０、１２４０、１２６０、１２８０、１３００、１３２０、１３４０、若しくはそれ以上の長さであり得、及び／又はそれを含み得る。代替的に、それらは、それらが全長ポリペプチドの長さ未満である限り、かかる範囲を超えず、かつ／又はかかる範囲を除外し得る。

「プローブ」という用語は、特異的に意図される標的分子、例えば、マーカーによってコードされるか、又はそれに対応するヌクレオチド転写物又はタンパク質に選択的に結合することができる任意の分子を指す。プローブは、当業者によって合成されるか、又は適切な生物学的調製物に由来するかのいずれかであり得る。標的分子の検出のために、プローブは、本明細書に記載されるように、標識されるように特異的に設計され得る。プローブとして利用され得る分子の例には、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、抗体、及び有機分子が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される場合、「再編成された」という用語は、Ｖセグメントが、それぞれ、完全Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌドメインを本質的にコードする立体配座におけるＤ－Ｊ又はＪセグメントに直接隣接して位置付けられている、重鎖又は軽鎖免疫グロブリン遺伝子座の立体配置を指す。再編成された免疫グロブリン遺伝子座は、生殖系列ＤＮＡとの比較によって特定され得、再編成された遺伝子座は、少なくとも１つの組換えられた七量体／九量体相同性要素を有する。

本明細書で使用される場合、「組換え宿主細胞」（又は単に「宿主細胞」）という用語は、組換え発現ベクターが導入された細胞を指すよう意図されている。かかる用語が、特定の対象細胞のみならず、かかる細胞の子孫も指すよう意図されていることを理解されたい。変異又は環境影響のいずれかによりある特定の修飾が後世で生じ得るため、かかる子孫は、実際には親細胞と同一ではない場合があるが、依然として本明細書で使用される「宿主細胞」という用語の範囲内に含まれる。

本明細書で使用される場合、「組換えヒト抗体」という用語は、組換え手段によって調製、発現、作製、又は単離された全てのヒト抗体、例えば、（ａ）ヒト免疫グロブリン遺伝子に対してトランスジェニック又はトランス染色体である動物（例えば、マウス）又はそれから調製されたハイブリドーマから単離された抗体（以下に更に記載される）、（ｂ）形質転換されて抗体を発現する宿主細胞から、例えば、トランスフェクトーマから単離された抗体、（ｃ）組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリから単離された抗体、及び（ｄ）ヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを伴う任意の他の手段によって調製、発現、作製、又は単離された抗体を含む。かかる組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列及び／又は非生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を有する。しかしながら、ある特定の実施形態では、かかる組換えヒト抗体は、インビトロ変異誘発（又は、ヒトＩｇ配列に対してトランスジェニックな動物が使用される場合、インビボ体細胞変異誘発）に供され得、それ故に、組換え抗体のＶ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列Ｖ_Ｈ配列及びＶ_Ｌ配列に由来し、かつそれに関連している一方で、インビボでヒト抗体生殖系列レパートリー中に天然に存在しない場合がある配列である。

本発明の「応答」は、概して、例えば、臨床的介入の経過、有効性、又は転帰への影響を決定することに関連している。いくつかの実施形態では、応答は、臨床的介入の開始後の腫瘍質量及び／又は体積の変化に直接関連する。例えば、過剰増殖性障害応答は、ＣＴ、ＰＥＴ、マンモグラム、超音波、又は触診によって測定される初期サイズ及び寸法と比較した、全身介入後の腫瘍のサイズに従って評価され得る。応答は、生検又は外科的切除後の腫瘍のキャリパー測定又は病理学的試験によっても評価され得る。応答は、腫瘍体積のパーセンテージ変化等の量的様式で、又は「病理学的完全寛解」（ｐＣＲ）、「臨床的完全寛解」（ｃＣＲ）、「臨床的部分寛解」（ｃＰＲ）、「臨床的安定疾患」（ｃＳＤ）、「臨床的進行性疾患」（ｃＰＤ）、若しくは他の質的基準等の質的様式で記録され得る。評価は、臨床的介入の開始後早期に、例えば、数時間後、数日後、数週間後、又は好ましくは数ヶ月後に行われ得る。応答評価の典型的なエンドポイントは、臨床的介入の終了時又は残留腫瘍細胞及び／若しくは腫瘍床の外科的除去時である。

本明細書で使用される場合、「特異的結合」という用語は、抗体の所定の抗原への結合を指す。典型的には、抗体は、ヒトＰＤ－１を分析物として、かつ抗体をリガンドとして使用したＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）アッセイ器具における表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術によって決定される場合、およそ１０^－７Ｍ未満、例えば、およそ１０^－８Ｍ、１０^－９Ｍ、若しくは１０^－１０Ｍ未満、又はそれよりも更に低い親和性（Ｋ_Ｄ）で結合し、所定の抗原以外の非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）又は密接に関連した抗原への結合に対するその親和性よりも少なくとも１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、若しくは１０．０倍、又はそれ以上高い親和性で所定の抗原に結合する。「抗原を認識する抗体」及び「抗原に特異的な抗体」という語句は、本明細書で「抗原に特異的に結合する抗体」という用語と同義に使用され得る。

本明細書で使用される場合、「対象」は、任意の健常動物、哺乳動物、若しくはヒト、又は異常なマーカーレベルに関連した疾患又は障害に罹患している任意の動物、哺乳動物、若しくはヒトを指す。「対象」という用語は、「患者」と同義である。「非ヒト動物」という用語には、全ての脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類等の哺乳動物及び非哺乳動物が含まれる。

「化学的前駆体又は他の化学物質を実質的に含まない」という言語は、タンパク質がタンパク質の合成に関与する化学的前駆体又は他の化学物質から分離された抗体、ポリペプチド、ペプチド、又は融合タンパク質の調製物を含む。一実施形態では、「化学的前駆体又は他の化学物質を実質的に含まない」という言語は、約３０％未満（乾燥重量で）の化学的前駆体又は非抗体、ポリペプチド、ペプチド、又は融合タンパク質化学物質、より好ましくは約２０％未満の化学的前駆体又は非抗体、ポリペプチド、ペプチド、又は融合タンパク質化学物質、なおより好ましくは約１０％未満の化学的前駆体又は非抗体、ポリペプチド、ペプチド、又は融合タンパク質化学物質、最も好ましくは約５％未満の化学的前駆体又は非抗体、ポリペプチド、ペプチド、又は融合タンパク質化学物質を有する抗体、ポリペプチド、ペプチド、又は融合タンパク質の調製物を含む。

本明細書で使用される場合、「生存期間」という用語には、死亡までの生存期間、別名、全生存期間（当該死亡は、原因を問わないか、又は腫瘍関連のいずれかであり得る）、「無再発生存期間」（再発という用語は、局所再発及び遠隔再発の両方を含むものとする）、無転移生存期間、無病生存期間（病という用語は、がん及びそれに関連する疾患を含むものとする）の全てが含まれる。当該生存期間の長さは、定義された開始点（例えば、診断時又は治療開始時）及び終点（例えば、死、再発、又は転移）を参照することによって計算され得る。加えて、治療有効性についての基準は、化学療法に対する応答、生存確率、所与の期間以内の転移確率、及び腫瘍再発確率を含むように拡大され得る。

「転写ポリヌクレオチド」又は「ヌクレオチド転写物」とは、本発明のマーカーの転写、ＲＮＡ転写物（存在する場合）の正常転写後プロセシング（例えば、スプライシング）、及びＲＮＡ転写物の逆転写によって作製される成熟ｍＲＮＡの全て又は一部に相補的な又はそれと相同のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｃＤＮＡ、又はかかるＲＮＡ若しくはｃＤＮＡの類似体）である。

本明細書で使用される場合、「Ｔ細胞」という用語は、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。Ｔ細胞という用語は、Ｔヘルパー１型Ｔ細胞及びＴヘルパー２型Ｔ細胞の両方も含む。「抗原提示細胞」という用語は、専門的抗原提示細胞（例えば、Ｂリンパ球、単球、樹状細胞、ランゲルハンス細胞）、並びに他の抗原提示細胞（例えば、ケラチノサイト、内皮細胞、アストロサイト、線維芽細胞、オリゴデンドロサイト）を含む。

本明細書で使用される場合、Ｖセグメントに関して「再編成されていない」又は「生殖系列立体配置」という用語は、ＶセグメントがＤセグメント又はＪセグメントに直接隣接するように組換えられていない立体配置を指す。

本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、連結されている別の核酸を輸送することができる核酸を指す。１つの種類のベクターは、追加のＤＮＡセグメントがライゲートされ得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す「プラスミド」である。別の種類のベクターは、追加のＤＮＡセグメントがウイルスゲノムにライゲーションされ得るウイルスベクターである。ある特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自己複製することができる（例えば、細菌性複製起源を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより、宿主ゲノムとともに複製される。更に、ある特定のベクターは、それらが作動可能に連結される遺伝子の発現を指示することができる。かかるベクターは、本明細書で「組換え発現ベクター」又は単に「発現ベクター」と称される。一般に、組換えＤＮＡ技法で有用な発現ベクターは、多くの場合、プラスミドの形態にある。本明細書では、「プラスミド」及び「ベクター」は、プラスミドがベクターの最も一般に使用されている形態であるため、同義に使用され得る。しかしながら、本発明は、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）等の同等の機能を果たす発現ベクターの他の形態を含むよう意図されている。

核酸について、「実質的相同性」という用語は、２つの核酸又はそれらの指定された配列が、最適にアライン及び比較されたときに、適切なヌクレオチド挿入又は欠失を伴って、ヌクレオチドの少なくとも約８０％、通常、ヌクレオチドの少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、又はそれ以上、より好ましくは、ヌクレオチドの少なくとも約９７％、９８％、９９％、又はそれ以上同一であることを示す。代替的に、実質的相同性は、セグメントが選択的ハイブリダイゼーション条件下でその鎖の相補体にハイブリダイズする場合に存在する。

２つの配列間の同一性パーセントは、それらの２つの配列の最適アライメントのために導入される必要のあるギャップの数及び各ギャップの長さを考慮して、それらの配列によって共有された同一の位置の数の関数（すなわち、同一性％＝同一の位置の数／位置の総数×１００）である。２つの配列間の配列の比較及び同一性パーセントの決定は、以下の非限定的な例に記載されるように、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。

２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＮＷＳｇａｐｄｎａを使用したＧＣＧソフトウェアパッケージ（ＧＣＧ社ウェブサイトのワールドワイドウェブ上で利用可能なもの）内のＧＡＰプログラムを使用して決定され得る。ＣＭＰ行列、及びギャップ重み４０、５０、６０、７０、又は８０、及び長さ重み１、２、３、４、５、又は６である。２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＰＡＭ１２０重み残基表、ギャップ長ペナルティ１２、及びギャップペナルティ４を使用した、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれたＥ．ＭｅｙｅｒｓａｎｄＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ、４：１１１７（１９８９））のアルゴリズムを使用して決定される場合もある。加えて、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、Ｂｌｏｓｕｍ６２行列又はＰＡＭ２５０行列のいずれか、及びギャップ重み１６、１４、１２、１０、８、６、又は４、及び長さ重み１、２、３、４、５、又は６を使用した、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ＧＣＧ社ウェブサイトのワールドワイドウェブ上で利用可能なもの）内のＧＡＰプログラムに組み込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎａｎｄＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（４８）：４４４４５３（１９７０））のアルゴリズムを使用して決定され得る。

本発明の核酸及びタンパク質配列は、例えば、関連配列を特定するために、公開データベースに対する検索を行うための「問い合わせ配列」として更に使用され得る。かかる検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３１０のＮＢＬＡＳＴプログラム及びＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して行われ得る。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本発明の核酸分子と相同のヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて行われ得る。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本発明のタンパク質分子と相同のアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて行われ得る。比較のためのギャップ付きアライメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．，（１９９７）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２５（１７）：３３８９３４０２に記載のギャップ付きＢＬＡＳＴが利用され得る。ＢＬＡＳＴプログラム及びギャップ付きＢＬＡＳＴプログラムを利用する際に、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータが使用され得る（ＮＣＢＩウェブサイトのワールドワイドウェブ上で利用可能である）。

核酸は、全細胞中に、細胞溶解物中に、又は部分的に精製された形態若しくは実質的に純粋な形態で存在し得る。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動、及び当該技術分野で周知の他の技法（Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔａｌ．，ｅｄ．ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＧｒｅｅｎｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇａｎｄＷｉｌｅｙＩｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８７）を参照のこと）を含む標準の技法によって、他の細胞成分又は他の夾雑物、例えば、他の細胞核酸又はタンパク質から精製されたときに、「単離される」又は「実質的に純粋にされる」。

ＩＩ．モノクローナル抗体、免疫グロブリン、及びポリペプチド
本発明は、部分的に、単離された二重特異性分子に関し、この単離された二重特異性分子は、ＰＤ－１に対して産生されるモノクローナル抗体又はその断片、及び隣接細胞の対向する表面上の抗原に対して産生されるモノクローナル抗体又はその断片を含み得る。

「ＰＤ－１」という用語は、既知のリガンドとしてＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２を有する共阻害性受容体として機能する免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーのメンバーを指す。ＰＤ－１は、ＴＣＲ誘導性活性化Ｔ細胞死中に上方制御された遺伝子を選択するためのクローニングベースの減算アプローチを使用して以前に特定された。ＰＤ－１は、ＰＤ－Ｌ１に結合するその能力に基づいた分子のＣＤ２８／ＣＴＬＡ－４ファミリーのメンバーである。ＣＴＬＡ－４と同様に、ＰＤ－１は、抗ＣＤ３に応答してＴ細胞の表面上で迅速に誘導される（Ａｇａｔａｅｔａｌ．２５（１９９６）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：７６５）。しかしながら、ＣＴＬＡ－４とは対照的に、ＰＤ－１はＢ細胞上でも誘導される（抗ＩｇＭに応答して）。ＰＤ－１は、胸腺細胞及び骨髄細胞のサブセット上でも発現される（Ａｇａｔａｅｔａｌ．（１９９６）（上記参照）、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａｅｔａｌ．（１９９６）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：７７３）。

代表的なヒトＰＤ－１バイオマーカーの核酸及びアミノ酸配列は、ＮＭ＿００５０１８．２及びＮＰ＿００５００９．２の下でＧｅｎＢａｎｋデータベースで一般に公開されており、表２に示されている（Ｉｓｈｉｄａｅｔａｌ．（１９９２）２０ＥＭＢＯＪ１１：３８８７、Ｓｈｉｎｏｈａｒａｅｔａｌ．（１９９４）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ２３：７０４、米国特許第５，６９８，５２０号も参照されたい）。ＰＤ－１は、免疫グロブリンスーパーファミリードメイン、膜貫通ドメインを含有する細胞外領域、並びに免疫受容体チロシンベースの阻害性モチーフ（ＩＴＩＭ）（Ｉｓｈｉｄａｅｔａｌ．（１９９２）ＥＭＢＯＪ．１１：３８８７、Ｓｈｉｎｏｈａｒａｅｔａｌ．（１９９４）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ２３：７０４、及び米国特許第５，６９８，５２０号）、及び免疫受容体チロシンベースのスイッチモチーフ（ＩＴＳＭ）を含む細胞内領域を有する。これらの特徴はまた、ｇｐ４９Ｂ、ＰＩＲ－Ｂ、及びキラー阻害性受容体（ＫＩＲ）（ＶｉｖｉｅｒａｎｄＤａｅｒｏｎ（１９９７）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ１８：２８６）も含む、免疫阻害性受容体と呼ばれる、ポリペプチドの大きなファミリーを定義する。これらの受容体のチロシルリン酸化ＩＴＩＭ及びＩＴＳＭモチーフは、阻害性シグナルをもたらす、ＳＨ２ドメイン含有ホスファターゼと相互作用すると仮定されることが多い。これらの免疫阻害性受容体のサブセットは、ＭＨＣポリペプチド、例えば、ＫＩＲに結合し、ＣＴＬＡ４は、Ｂ７－１及びＢ７－２に結合する。ＭＨＣ遺伝子とＢ７遺伝子との間に系統発生関係があることが提案されている（Ｈｅｎｒｙｅｔａｌ．（１９９９）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ２０（６）：２８５－８）。ヒト以外の生物中のＰＤ－１オルソログの核酸及びポリペプチド配列が周知であり、例えば、マウスＰＤ－１（ＮＭ＿００８７９８．２及びＮＰ＿０３２８２４．１）、ラットＰＤ－１（ＮＭ＿００１１０６９２７．１及びＮＰ＿００１１００３９７．１）、イヌＰＤ－１（ＸＭ＿５４３３３８．３及びＸＰ＿５４３３３８．３）、ウシＰＤ－１（ＮＭ＿００１０８３５０６．１及びＮＰ＿００１０７６９７５．１）、並びにニワトリＰＤ－１（ＸＭ＿４２２７２３．３及びＸＰ＿４２２７２３．２）が含まれる。

ＰＤ－１ポリペプチドは、阻害性シグナルを免疫細胞に伝達し、それによって、免疫細胞エフェクター機能を阻害することができる阻害性受容体であるか、又は例えば、可溶性単量体形態で存在するときに、免疫細胞の共刺激（例えば、競合阻害による）を促進することができる。好ましいＰＤ－１ファミリーメンバーは、ＰＤ－１と配列同一性を共有し、１つ以上のＢ７ファミリーメンバー、例えば、Ｂ７－１、Ｂ７－２、ＰＤ－１リガンド、及び／又は抗原提示細胞上の他のポリペプチドに結合する。

「ＰＤ－１活性」という用語は、例えば、抗原提示細胞上の天然ＰＤ－１リガンドを係合することによって、活性化免疫細胞における阻害性シグナルを調節するＰＤ－１ポリペプチドの能力を含む。免疫細胞における阻害性シグナルの調節により、免疫細胞の増殖及び／又は免疫細胞によるサイトカイン分泌の調節がもたらされる。したがって、「ＰＤ－１活性」という用語には、ＰＤ－１ポリペプチドのその天然リガンドに結合する能力、免疫細胞における共刺激又は阻害性シグナルを調節する能力、及び免疫応答を調節する能力が含まれる。

いくつかの実施形態では、がん等の状態は、ＰＤ－１遮断単独に対して応答性である。他の実施形態では、がん等の状態は、ＰＤ－１遮断単独に対して応答性であるが、ＰＤ－１遮断と別の療法との組み合わせで治療された場合、著しく又は相乗的により応答性である。ＰＤ－１遮断に対して単独で応答性である多くの状態は知られており、黒色腫（例えば、進行性又は転移性黒色腫）、肺がん（例えば、非小細胞肺がん及び小細胞肺がん）、乳がん（例えば、ＨＥＲ－２陰性乳がん、エストロゲン受容体陽性／ＨＥＲ－２陰性乳がん、及びトリプルネガティブ乳がん）、膵臓がん（例えば、膵臓腺がん）、及びホジキンリンパ腫、並びに膀胱がん、胃がん、頭頸部がん、腎臓がん、前立腺がん、婦人科がん、及び血液がんが含まれるが、これらに限定されない。

「ＰＤ－１リガンド」という用語は、ＰＤ－１受容体の結合パートナーを指し、ＰＤ－Ｌ１（Ｆｒｅｅｍａｎｅｔａｌ．（２０００）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２：１０２７）及びＰＤ－Ｌ２（Ｌａｔｃｈｍａｎｅｔａｌ．（２００１）Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：２６１）の両方を含む。少なくとも２つの種類のヒトＰＤ－１リガンドポリペプチドが存在する。ＰＤ－１リガンドタンパク質は、シグナル配列、並びにＩｇＶドメイン、ＩｇＣドメイン、膜貫通ドメイン、及び短い細胞質尾部を含む。ＰＤ－Ｌ１（配列データについては、Ｆｒｅｅｍａｎｅｔａｌ．（２０００）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２：１０２７を参照されたい）及びＰＤ－Ｌ２（配列データについては、Ｌａｔｃｈｍａｎｅｔａｌ．（２００１）Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：２６１を参照されたい）の両方は、ポリペプチドのＢ７ファミリーのメンバーである。ＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２の両方は、胎盤、脾臓、リンパ節、胸腺、及び心臓で発現される。ＰＤ－Ｌ２のみが、膵臓、肺、及び肝臓で発現され、一方、ＰＤ－Ｌ１のみが、胎児肝臓で発現される。ＰＤ－Ｌ１発現は広範であるが、ＰＤ－１リガンドの両方は、活性化された単球及び樹状細胞上で上方制御される。例えば、ＰＤ－Ｌ１は、マウス造血細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞（ＤＣ）、及び骨髄由来肥満細胞）、並びに非造血細胞（例えば、内皮細胞、上皮細胞、及び筋肉細胞）上で構成的に発現され、より高いレベルに上方制御されることが知られているが、ＰＤ－Ｌ２は、ＤＣ、マクロファージ、及び骨髄由来肥満細胞上で誘導的に発現される（Ｂｕｔｔｅｅｔａｌ．（２００７）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ２７：１１１を参照されたい）。

ＰＤ－１リガンドは、特定の保存された構造的及び機能的特徴を有するポリペプチドのファミリーを含む。「ファミリー」という用語は、タンパク質又は核酸分子を指すために使用される場合、本明細書で定義されるように、共通の構造ドメイン又はモチーフを有し、十分なアミノ酸又はヌクレオチド配列相同性を有する２つ以上のタンパク質又は核酸分子を意味するように意図される。そのようなファミリーメンバーは、天然に存在してもよく、又は天然に存在しなくてもよく、同じ又は異なる種のいずれかに由来し得る。例えば、ファミリーは、ヒト起源の第１のタンパク質、並びにヒト起源の他の別個のタンパク質を含有してもよく、又は代替的に、非ヒト起源のホモログを含有してもよい。ファミリーのメンバーはまた、共通の機能的特徴を有してもよい。ＰＤ－１リガンドは、ポリペプチドのＢ７ファミリーのメンバーである。本明細書で使用される「Ｂ７ファミリー」又は「Ｂ７ポリペプチド」という用語には、Ｂ７ポリペプチド、例えば、Ｂ７－１、Ｂ７－２、Ｂ７ｈ（Ｓｗａｌｌｏｗｅｔａｌ．（１９９９）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ１１：４２３）、及び／又はＰＤ－１リガンド（例えば、ＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ２）と配列相同性を共有する共刺激ポリペプチドが含まれる。例えば、ヒトＢ７－１及びＢ７－２は、デフォルトパラメータ（存在１１及び伸長１で設定されたギャップペナルティを有するＢｌｏｓｕｍ６２行列を用いてＮＣＢＩでＢＬＡＳＴプログラムを使用して比較した場合、約２６％のアミノ酸配列同一性を共有する（ＮＣＢＩウェブサイトを参照されたい）。Ｂ７ファミリーという用語はまた、免疫細胞機能を調節することができるこれらのポリペプチドのバリアントを含む。分子のＢ７ファミリーは、シグナルドメイン、ＩｇＶドメイン、及びＩｇＣドメインを含む、いくつかの保存領域を共有する。ＩｇＶドメイン及びＩｇＣドメインは、当該技術分野で認識されているＩｇスーパーファミリーメンバードメインである。これらのドメインは、Ｉｇフォールドと呼ばれる別個のフォールディングパターンを有する構造単位に対応する。Ｉｇフォールドは、２つのβシートのサンドイッチから構成され、各々が、２つのシート間の保存されたジスルフィド結合を有する５～１０個のアミノ酸の逆平行β鎖からなり、全てではないが、ほとんどにおいて、Ｉｇ、ＴＣＲ、及びＭＨＣ分子のＩｇＣドメインが、同一の種類の配列パターンを共有し、Ｉｇスーパーファミリー内でＣ１セットと呼ばれる。他のＩｇＣドメインは、他のセット内に入る。ＩｇＶドメインは配列パターンも共有し、Ｖセットドメインと呼ばれる。ＩｇＶドメインは、ＩｇＣドメインよりも長く、β鎖の追加の対を含有する。

好ましいＢ７ポリペプチドは、共刺激又は阻害性シグナルを免疫細胞に提供し、それにより、免疫細胞応答を促進又は阻害することができる。例えば、共刺激受容体に結合するＢ７ファミリーメンバーがＴ細胞活性化及び増殖を増加させる一方で、阻害性受容体に結合するＢ７ファミリーメンバーは共刺激を減少させる。更に、同じＢ７ファミリーメンバーがＴ細胞共刺激を増加させる場合も減少させる場合もある。例えば、共刺激受容体に結合すると、ＰＤ－１リガンドは、例えば、可溶性形態で存在する場合、免疫細胞の共刺激を誘導することができ、又は免疫細胞の共刺激を阻害することができる。阻害性受容体に結合すると、ＰＤ－１リガンドポリペプチドは、阻害性シグナルを免疫細胞に伝達することができる。好ましいＢ７ファミリーメンバーには、Ｂ７－１、Ｂ７－２、Ｂ７ｈ、ＰＤ－Ｌ１、又はＰＤ－Ｌ２、及びそれらの可溶性断片又は誘導体が含まれる。一実施形態では、免疫細胞上の１つ以上の受容体、例えば、ＣＴＬＡ４、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＰＤ－１、及び／又は他の受容体に結合するＢ７ファミリーメンバーは、受容体に応じて、阻害性シグナル又は共刺激シグナルを免疫細胞、好ましくは、Ｔ細胞に伝達する能力を有する。

共刺激シグナルの調節により、免疫細胞のエフェクター機能の調節がもたらされる。したがって、「ＰＤ－１リガンド活性」という用語には、ＰＤ－１リガンドポリペプチドのその天然受容体（例えばＰＤ－１又はＢ７－１）に結合する能力、免疫細胞における共刺激又は阻害性シグナルを調節する能力、及び免疫応答を調節する能力が含まれる。

様々な実施形態では、抗体又はそれらのバリアント（又はそれらをコードする核酸）は、実施例２又は実施例４で提供される配列を含み得る。これらの配列のいくつかが以下の表１にも提供される。

＊ＲＮＡ核酸分子（例えば、チミンがウリジンで置き換えられたもの）、コードされたタンパク質のオルソログをコードする核酸分子、並びに表１に列挙されるいずれかの配列番号の核酸配列若しくはバイオマーカー又はその一部と全長にわたって少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又はそれ以上の同一性を有する核酸配列を含むＤＮＡ又はＲＮＡ核酸配列が表１に含まれる。かかる核酸分子は、本明細書に更に記載される全長核酸の機能を有し得る。
＊タンパク質のオルソログ、並びに表１に列挙されるいずれかの配列番号のアミノ酸配列若しくはバイオマーカー又はその一部と全長にわたって少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又はそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド分子が表１に含まれる。かかるポリペプチドは、本明細書に更に記載される全長ポリペプチドの機能を有し得る。

抗体の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ３ドメインが、抗原のための抗体の結合特異性／親和性において特に重要な役割を果たすことが当該技術分野で周知であるため、上述のように調製された本発明の組換えモノクローナル抗体は、好ましくは、本発明の可変領域の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ３を含む。抗体は、本発明の可変領域のＣＤＲ２を更に含み得る。抗体は、本発明の可変領域のＣＤＲ１を更に含み得る。他の実施形態では、抗体は、これらのＣＤＲの任意の組み合わせを含み得る。これらのＣＤＲは、所与の定義（例えば、Ｋａｂａｔ）について、提供されるＶＨ／ＶＬ配列から決定され得る。

上述の操作された抗体のＣＤＲ１、２、及び／又は３領域は、本明細書に開示される本発明の可変領域と全く同じアミノ酸配列を含み得る。しかしながら、当業者であれば、ＰＤ－１に有効に結合する抗体の能力（例えば、保存的配列修飾）を依然として保持しながら、正確なＣＤＲ配列からのいくらかの逸脱が可能であり得ることを理解するであろう。したがって、別の実施形態では、操作された抗体は、本発明の１つ以上のＣＤＲに対して、例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は９９．５％同一である１つ以上のＣＤＲで構成されていてもよい。

本発明のモノクローナル抗体の重鎖可変ドメインは、表１に記載のｖＨアミノ酸配列を含み得るか、若しくはそれからなり得、かつ／又は本発明のモノクローナル抗体の軽鎖可変ドメインは、表１に記載のｖＬアミノ酸配列を含み得るか、若しくはそれからなり得る。

本発明のモノクローナル抗体は、当該技術分野で周知の任意の技法によって産生及び修飾され得る。同様に、かかるモノクローナル抗体は、キメラ抗体、好ましくはキメラマウス／ヒト抗体であり得る。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は、可変ドメインが、ヒトアクセプターフレームワーク領域、及び任意選択でヒト定常ドメイン（存在する場合）、並びに上で定義されるマウスＣＤＲ等の非ヒトドナーＣＤＲを含むようなヒト化抗体である。

本発明は、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２、及びダイアボディが含まれるが、これらに限定されない当該モノクローナル抗体の断片、並びに抗体断片から形成される多重特異性抗体を更に提供する。例えば、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ２、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４等のいくつかの免疫阻害性分子は、かかる分子の発現を効率的に特徴付けるために、二重特異的又は多重特異的様式で検出され得る。

本発明のモノクローナル抗体の他の断片も企図される。例えば、個別の免疫グロブリン重鎖及び／又は軽鎖が提供され、その可変ドメインは、表１に列挙される配列に提示される少なくとも１つのＣＤＲを含む。一実施形態では、免疫グロブリン重鎖は、表１に列挙される配列に提示される重鎖又は軽鎖可変ドメインＣＤＲの群から少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又は１００％同一の配列を有する少なくとも１つのＣＤＲを含む。別の実施形態では、免疫グロブリン軽鎖は、本明細書に記載の軽鎖又は重鎖可変ドメインＣＤＲの群から少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又は１００％同一である配列を有する少なくとも１つのＣＤＲを含む。

いくつかの実施形態では、免疫グロブリン重鎖及び／又は軽鎖は、本明細書に記載のＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、又はＣＤＲ－Ｈ３のうちの少なくとも１つを含む可変ドメインを含む。かかる免疫グロブリン重鎖は、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３のうちの少なくとも１つを含み得るか、又はそれからなり得る。かかる免疫グロブリン軽鎖は、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、及びＣＤＲ－Ｌ３のうちの少なくとも１つを含み得るか、又はそれからなり得る。

他の実施形態では、本発明による免疫グロブリン重鎖及び／又は軽鎖は、それぞれ、表１に提示されるｖＨ可変ドメイン配列又はｖＬ可変ドメイン配列を含むか、又はそれからなる。

本発明は、本明細書に記載のｖＨ可変ドメイン、ｖＬ可変ドメイン、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３配列からなる群から選択される配列を有するポリペプチドを更に提供する。

本発明の抗体、免疫グロブリン、及びポリペプチドは、単離された（例えば、精製された）形態で使用され得るか、又は膜若しくは脂質小胞（例えば、リポソーム）等のベクター中に含まれ得る。

いくつかの例示的なＰＤ－１配列は、以下の表２に提示される。

＊ＲＮＡ核酸分子（例えば、チミンがウリジンで置き換えられたもの）、コードされたタンパク質のオルソログをコードする核酸分子、並びに表２に列挙されるいずれかの配列番号の核酸配列若しくはバイオマーカー又はその一部と全長にわたって少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又はそれ以上の同一性を有する核酸配列を含むＤＮＡ又はＲＮＡ核酸配列が表２に含まれる。かかる核酸分子は、本明細書に更に記載される全長核酸の機能を有し得る。
＊タンパク質のオルソログ、並びに表２に列挙されるいずれかの配列番号のアミノ酸配列若しくはバイオマーカー又はその一部と全長にわたって少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又はそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド分子が表２に含まれる。かかるポリペプチドは、本明細書に更に記載される全長ポリペプチドの機能を有し得る。

ＩＩＩ．核酸、ベクター、及び組換え宿主細胞
本発明の更なる目的は、本発明の二重特異性分子、モノクローナル抗体及びその断片、免疫グロブリン、並びにポリペプチドをコードする核酸配列に関する。

特定の実施形態では、本発明は、本明細書に記載のｍＡｂのｖＨドメイン及び／又はｖＬドメインをコードする核酸配列、例えば、表１、実施例２、又は実施例４に開示されるものに関する。

典型的には、当該核酸は、プラスミド、コスミド、エピソーム、人工染色体、ファージ、又はウイルスベクター等の任意の好適なベクター中に含まれ得るＤＮＡ又はＲＮＡ分子である。

「ベクター」、「クローニングベクター」、及び「発現ベクター」という用語は、ＤＮＡ又はＲＮＡ配列（例えば、外来遺伝子）が宿主細胞に導入されて、宿主を形質転換し、導入された配列の発現（例えば、転写及び翻訳）を促進し得るビヒクルを意味する。したがって、本発明の更なる目的は、本発明の核酸を含むベクターに関する。

かかるベクターは、対象への投与時に当該ポリペプチドの発現を引き起こすか、又は指示するための制御要素、例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター等を含み得る。動物細胞の発現ベクターに使用され得るプロモーター及びエンハンサーの例には、ＳＶ４０の初期プロモーター及びエンハンサー（ＭｉｚｕｋａｍｉＴ．ｅｔａｌ．１９８７）、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲプロモーター及びエンハンサー（ＫｕｗａｎａＹｅｔａｌ．１９８７）、免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター（ＭａｓｏｎＪＯｅｔａｌ．１９８５）及びエンハンサー（ＧｉｌｌｉｅｓＳＤｅｔａｌ．１９８３）等が挙げられる。

動物細胞のいずれの発現ベクターも使用され得る。好適なベクターの例には、ｐＡＧＥ１０７（ＭｉｙａｊｉＨｅｔａｌ．１９９０）、ｐＡＧＥ１０３（ＭｉｚｕｋａｍｉＴｅｔａｌ．１９８７）、ｐＨＳＧ２７４（ＢｒａｄｙＧｅｔａｌ．１９８４）、ｐＫＣＲ（Ｏ’ＨａｒｅＫｅｔａｌ．１９８１）、ｐＳＧ１ベータｄ２－４－（ＭｉｙａｊｉＨｅｔａｌ．１９９０）等が挙げられる。プラスミドの他の代表的な例には、複製起点を含む複製プラスミド、又は組み込み型プラスミド、例えば、ｐＵＣ、ｐｃＤＮＡ、ｐＢＲ等が挙げられる。ウイルスベクターの代表的な例には、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、及びＡＡＶベクターが挙げられる。かかる組換えウイルスは、パッケージング細胞のトランスフェクション又はヘルパープラスミド若しくはウイルスでの過渡的トランスフェクション等の当該技術分野で既知の技法によって産生され得る。ウイルスパッケージング細胞の典型的な例には、ＰＡ３１７細胞、ＰｓｉＣＲＩＰ細胞、ＧＰｅｎｖ陽性細胞、２９３細胞等が挙げられる。かかる複製欠損組換えウイルスを産生するための詳細なプロトコルは、例えば、ＷＯ９５／１４７８５、ＷＯ９６／２２３７８、米国特許第５，８８２，８７７号、米国特許第６，０１３，５１６号、米国特許第４，８６１，７１９号、米国特許第５，２７８，０５６号、及びＷＯ９４／１９４７８で見つけることができる。

本発明の更なる目的は、本発明による核酸及び／又はベクターによってトランスフェクト、感染、又は形質転換された細胞に関する。「形質転換」という用語は、「外来」（すなわち、外因性又は細胞外）遺伝子、ＤＮＡ又はＲＮＡ配列の宿主細胞への導入を意味し、これにより、宿主細胞が導入された遺伝子又は配列を発現して、導入された遺伝子又は配列によってコードされる所望の物質、典型的には、タンパク質又は酵素を産生するようになる。導入されたＤＮＡ又はＲＮＡを受容及び発現する宿主細胞が「形質転換されている」。

本発明の核酸を使用して、好適な発現系において本発明の組換えポリペプチドを産生することができる。「発現系」という用語は、例えば、ベクターによって運搬されて宿主細胞に導入された外来ＤＮＡによってコードされたタンパク質の発現に好適な条件下での宿主細胞及び適合性ベクターを意味する。

一般的な発現系には、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞及びプラスミドベクター、昆虫宿主細胞及びバキュロウイルスベクター、並びに哺乳類宿主細胞及びベクターが含まれる。宿主細胞の他の例には、原核細胞（細菌等）及び真核細胞（酵母細胞、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞等）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の例としては、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、又はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ酵母、哺乳類細胞株（例えば、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＨＯ細胞、３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞等）、並びに初代又は樹立哺乳類細胞培養物（例えば、リンパ芽球、線維芽細胞、胚細胞、上皮細胞、神経細胞、脂肪細胞等から産生される）が挙げられる。例としては、マウスＳＰ２／０－Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１５８１）、マウスＰ３Ｘ６３－Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１５８０）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（以下、「ＤＨＦＲ遺伝子」と称される）が欠損しているＣＨＯ細胞（ＵｒｌａｕｂＧｅｔａｌ；１９８０）、ラットＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１６６２、以下、「ＹＢ２／０細胞」と称される）等も挙げられる。キメラ又はヒト化抗体のＡＤＣＣ活性がＹＢ２／０細胞で発現されたときに増強されるため、ＹＢ２／０細胞が好ましい。

本発明は、本発明による本発明の抗体又はポリペプチドを発現する組換え宿主細胞を産生する方法であって、（ｉ）上述の組換え核酸又はベクターをコンピテント宿主細胞にインビトロ又はエクスビボで導入するステップ、（ｉｉ）得られた組換え宿主細胞をインビトロ又はエクスビボで培養するステップ、並びに（ｉｉｉ）任意選択で、当該抗体又はポリペプチドを発現及び／又は分泌する細胞を選択するステップからなるステップを含む、方法にも関する。かかる組換え宿主細胞は、本発明の抗体及びポリペプチドの産生に使用され得る。

別の態様では、本発明は、選択的ハイブリダイゼーション条件下で本明細書に開示されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする単離された核酸を提供する。したがって、この実施形態のポリヌクレオチドは、かかるポリヌクレオチドを含む核酸の単離、検出、及び／又は定量化に使用され得る。例えば、本発明のポリヌクレオチドを使用して、寄託されたライブラリにおける部分長又は全長クローンを特定、単離、又は増幅することができる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ヒト若しくは哺乳類核酸ライブラリから単離されるか、又はさもなければヒト若しくは哺乳類核酸ライブラリ由来のｃＤＮＡと相補的なゲノム若しくはｃＤＮＡ配列である。好ましくは、ｃＤＮＡライブラリは、少なくとも８０％の全長配列、好ましくは、少なくとも８５％又は９０％の全長配列、より好ましくは、少なくとも９５％の全長配列を含む。ｃＤＮＡライブラリは、珍しい配列の提示を増加させるために正規化され得る。低又は中程度ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、排他的ではなく典型的に、相補的配列と比較して配列同一性が減少した配列に用いられる。中程度及び高ストリンジェンシー条件は、任意選択で、より高い同一性の配列に用いられ得る。低ストリンジェンシー条件は、約７０％の配列同一性を有する配列の選択的ハイブリダイゼーションを可能にし、オルソロガス又はパラロガス配列を特定するために用いられ得る。任意選択で、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に記載のポリヌクレオチドによってコードされる抗体の少なくとも一部をコードする。本発明のポリヌクレオチドは、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドへの選択的ハイブリダイゼーションのために用いられ得る核酸配列を包含する。例えば、各々参照により本明細書に全体的に組み込まれる、Ａｕｓｕｂｅｌ（上記参照）、Ｃｏｌｌｉｇａｎ（上記参照）を参照されたい。

ＩＶ．二重特異性分子及び抗体を産生する方法
本発明の二重特異性抗体、抗体及びその断片、免疫グロブリン、並びにポリペプチドは、単独で又は組み合わせでのいずれかでの任意の化学的、生物学的、遺伝的、又は酵素的技法等であるが、これらに限定されない当該技術分野で既知の任意の技法によって産生され得る。

所望の配列のアミノ酸配列を知ることにより、当業者であれば、ポリペプチドを産生するための標準技法によって当該抗体又はポリペプチドを容易に産生することができる。例えば、それらは、周知の固相法を使用して、好ましくは、製造業者の指示に従って市販のペプチド合成装置（例えば、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．製のもの）を使用して合成され得る。代替的に、本発明の抗体及び他のポリペプチドは、当該技術分野で周知の組換えＤＮＡ技法によって合成され得る。例えば、これらの断片は、所望の（ポリ）ペプチドをコードするＤＮＡ配列の発現ベクターへの組み込み及びかかるベクターの所望のポリペプチドを発現する好適な真核又は原核宿主への導入後にＤＮＡ発現産物として得られ得、所望のポリペプチドは、周知の技法を使用して後に単離され得る。

具体的には、本発明は更に、本発明の抗体又はポリペプチドを産生する方法であって、（ｉ）当該抗体又はポリペプチドの発現を可能にするのに好適な条件下で本発明による形質転換宿主細胞を培養するステップ、及び（ｉｉ）発現された抗体又はポリペプチドを回収するステップからなるステップを含む、方法に関する。

本発明の抗体及び他のポリペプチドは、例えば、タンパク質Ａ－セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、親和性クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、及びレクチンクロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン精製手順によって培養培地から好適に分離される。高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）も精製に用いられ得る。例えば、各々参照により本明細書に全体的に組み込まれる、Ｃｏｌｌｉｇａｎ，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、又はＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉｅｎｃｅ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ，Ｎ．Ｙ．，（１９９７－２００１）、例えば、第１、４、６、８、９、１０章を参照されたい。

本発明のキメラ抗体（例えば、マウス－ヒトキメラ）は、前述のようにＶＬ及びＶＨドメインをコードする核配列を得て、それらを、ヒト抗体ＣＨ及びヒト抗体ＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞の発現ベクターに挿入することによってヒトキメラ抗体発現ベクターを構築し、発現ベクターを動物細胞に導入することによってコーディング配列を発現することによって産生され得る。ヒトキメラ抗体のＣＨドメインは、ＩｇＧクラス又はそのサブクラス、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４等のヒト免疫グロブリンに属する任意の領域であり得る。同様に、ヒトキメラ抗体のＣＬは、カッパクラス又はラムダクラス等のＩｇに属する任意の領域であり得る。標準の組換えＤＮＡ技法を使用して作製され得るヒト部分及び非ヒト部分の両方を含むキメラ及びヒト化モノクローナル抗体は、本発明の範囲内である。かかるキメラ及びヒト化モノクローナル抗体は、当該技術分野で既知の組換えＤＮＡ技法によって、例えば、国際特許公開第ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９号（Ｒｏｂｉｎｓｏｎｅｔａｌ．）、欧州特許出願第１８４，１８７号（Ａｋｉｒａｅｔａｌ．）、欧州特許出願第１７１，４９６号（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｍ．）、欧州特許出願第１７３，４９４号（Ｍｏｒｒｉｓｏｎｅｔａｌ．）、ＰＣＴ出願第８６／０１５３３号（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒｅｔａｌ．）、米国特許第４，８１６，５６７号（Ｃａｂｉｌｌｙｅｔａｌ．）、欧州特許出願第１２５，０２３号（Ｃａｂｉｌｌｙｅｔａｌ．）、Ｂｅｔｔｅｒｅｔａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４０：１０４１－１０４３、Ｌｉｕｅｔａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：３４３９－３４４３、Ｌｉｕｅｔａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３５２１－３５２６、Ｓｕｎｅｔａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：２１４－２１８、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａｅｔａｌ．（１９８７）ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．４７：９９９－１００５、Ｗｏｏｄｅｔａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ３１４：４４６－４４９、Ｓｈａｗｅｔａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｎａｔｌ．ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ．８０：１５５３－１５５９）、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２２９：１２０２－１２０７、Ｏｉｅｔａｌ．（１９８６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ４：２１４、米国特許第５，２２５，５３９号（Ｗｉｎｔｅｒ）、Ｊｏｎｅｓｅｔａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ３２１：５５２－５２５、Ｖｅｒｈｏｅｙａｎｅｔａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２３９：１５３４、及びＢｅｉｄｌｅｒｅｔａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：４０５３－４０６０に記載の方法を使用して産生され得る。

加えて、ヒト化抗体は、米国特許第５，５６５，３３２号に開示されるプロトコル等の標準のプロトコルに従って作製され得る。別の実施形態では、抗体鎖又は特異的結合対メンバーは、当該技術分野で既知の技法、例えば、米国特許第５，５６５，３３２号、同第５，８７１，９０７号、又は同第５，７３３，７４３号に記載の技法を使用して、特異的結合対メンバーのポリペプチド鎖と複製可能なジェネリックディスプレイパッケージの構成成分との融合体をコードする核酸分子を含むベクターと、単一の結合対メンバーの第２のポリペプチド鎖をコードする核酸分子を含むベクターとの間の組換えによって産生され得る。本発明のヒト化抗体は、前述のようにＣＤＲドメインをコードする核酸配列を得て、それらを、（ｉ）ヒト抗体と同一の重鎖定常領域及び（ｉｉ）ヒト抗体と同一の軽鎖定常領域をコードする遺伝子を有する動物細胞の発現ベクターに挿入することによってヒト化抗体発現ベクターを構築し、発現ベクターを動物細胞に導入することによって遺伝子を発現することによって産生され得る。

ヒト化抗体発現ベクターは、抗体重鎖をコードする遺伝子及び抗体軽鎖をコードする遺伝子が別個のベクター上に存在するタイプのもの、又はこれらの両方の遺伝子が同じベクター上に存在するタイプ（タンデムタイプ）のもののいずれかであり得る。

従来の組換えＤＮＡ技法及び遺伝子トランスフェクション技法に基づいてヒト化抗体を産生するための方法は、当該技術分野で周知である（例えば、ＲｉｅｃｈｍａｎｎＬ．ｅｔａｌ．１９８８、ＮｅｕｂｅｒｇｅｒＭＳ．ｅｔａｌ．１９８５を参照のこと）。抗体は、例えば、ＣＤＲグラフティング（ＥＰ２３９，４００、ＰＣＴ公開第９１／０９９６７号、米国特許第５，２２５，５３９号、同第５，５３０，１０１号、及び同第５，５８５，０８９号）、ベニヤリング又はリサーフェシング（ＥＰ５９２，１０６、ＥＰ５１９，５９６、ＰａｄｌａｎＥＡ（１９９１）、ＳｔｕｄｎｉｃｋａＧＭｅｔａｌ．（１９９４）、ＲｏｇｕｓｋａＭＡ．ｅｔａｌ．（１９９４））、及び鎖シャッフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）を含む、当該技術分野で既知の様々な技法を使用してヒト化され得る。かかる抗体を調製するための一般的な組換えＤＮＡ技術も既知である（欧州特許出願第１２５０２３号及び国際特許出願第９６／０２５７６号を参照のこと）。

同様に、本明細書に記載の二重特異性又は多重特異性抗体は、標準の手順に従って作製され得る。例えば、トリオーマ及びハイブリッドハイブリドーマは、二重特異性又は多重特異性抗体を分泌することができる細胞株の２つの例である。ハイブリッドハイブリドーマ又はトリオーマによって産生される二重特異性及び多重特異性抗体の例は、米国特許第４，４７４，８９３号に開示されている。かかる抗体はまた、化学的手段（Ｓｔａｅｒｚｅｔａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ３１４：６２８、及びＰｅｒｅｚｅｔａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ３１６：３５４）、及びハイブリドーマ技術（ＳｔａｅｒｚａｎｄＢｅｖａｎ（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３：１４５３、及びＳｔａｅｒｚａｎｄＢｅｖａｎ（１９８６）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ７：２４１）によって構築され得る。代替的に、かかる抗体は、異なる抗体を作製するハイブリドーマ又は他の細胞を融合させることによってヘテロハイブリドーマを作製し、その後、所望の抗体を産生して共集合させるクローンを特定することによっても生成され得る。それらは、完全免疫グロブリン鎖又はＦａｂ及びＦｖ配列等のその一部の化学的又は遺伝的コンジュゲーションによっても生成され得る。抗体成分は、本明細書に記載の１つ以上の免疫阻害性バイオマーカーを含む、本発明の１つ以上のバイオマーカーのポリペプチド又はその断片に結合することができる。

加えて、抗体断片を産生するための方法が周知である。例えば、本発明のＦａｂ断片は、抗体をプロテアーゼ、パパインで処理することによって得られ得る。また、Ｆａｂは、抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを原核発現系又は真核発現系のベクターに挿入し、そのベクターを原核生物又は真核生物（適切な場合）に導入してＦａｂを発現させることによって産生され得る。

同様に、本発明のＦ（ａｂ’）２断片は、抗体をプロテアーゼ（ペプシン）で処理することによって得られ得る。また、Ｆ（ａｂ’）２断片は、チオエーテル結合又はジスルフィド結合により以下に記載のＦａｂ’に結合することによって産生され得る。

本発明のＦａｂ’断片は、Ｆ（ａｂ’）２を還元剤ジチオスレイトールで処理することによって得られ得る。また、Ｆａｂ’断片は、抗体のＦａｂ’断片をコードするＤＮＡを原核生物の発現ベクター又は真核生物の発現ベクターに挿入し、そのベクターを原核生物又は真核生物（適切な場合）に導入してそれを発現させることによって産生され得る。

加えて、本発明のｓｃＦｖは、前述のようにＶＨ及びＶＬドメインをコードするｃＤＮＡを得て、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、そのＤＮＡを原核生物の発現ベクター又は真核生物の発現ベクターに挿入し、その後、その発現ベクターを原核生物又は真核生物（適切な場合）に導入してｓｃＦｖを発現させることによって産生され得る。ヒト化ｓｃＦｖ断片を生成するために、ドナーｓｃＦｖ断片から相補性決定領域（ＣＤＲ）を選択することと、それらを、既知の三次元構造を有するヒトｓｃＦｖ断片フレームワークにグラフトすることとを含む、ＣＤＲグラフティングと呼ばれる周知の技術が使用され得る（例えば、ＷＯ９８／４５３２２、ＷＯ８７／０２６７１、米国特許第５，８５９，２０５号、米国特許第５，５８５，０８９号、米国特許第４，８１６，５６７号、ＥＰ０１７３４９４を参照のこと）。

Ｖ．二重特異性分子、抗体、免疫グロブリン、及びポリペプチドの修飾
本明細書に記載の二重特異性分子及び抗体のアミノ酸配列修飾が企図される。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望ましくあり得る。ヒト化抗体が非ヒト動物に由来する抗体のＶＨ及びＶＬ内のＣＤＲのみをヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲに単にグラフトすることによって産生された場合、抗原結合活性は、非ヒト動物に由来する元の抗体と比較して減少することが知られている。ＣＤＲ内のみならずＦＲ内の非ヒト抗体のＶＨ及びＶＬのいくつかのアミノ酸残基が抗原結合活性に直接又は間接的に関連するとみなされる。したがって、これらのアミノ酸残基の、ヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲに由来する異なるアミノ酸残基での置換により、結合活性が減少し、アミノ酸を、非ヒト動物に由来する元の抗体のアミノ酸残基で置き換えることによって補正され得る。

修飾及び変化が本発明の抗体の構造及びそれらをコードするＤＮＡ配列になされ得、望ましい特徴を有する抗体及びポリペプチドをコードする機能的分子を依然として得ることができる。例えば、ある特定のアミノ酸は、活性の認識可能な損失なしにタンパク質構造における他のアミノ酸によって置換され得る。タンパク質の相互作用的能力及び性質がタンパク質の生物学的機能的活性を定義するため、ある特定のアミノ酸置換が、タンパク質配列に、ひいては言うまでもなくそのＤＮＡコード配列になされ得、それにもかかわらず、同様の特性を有するタンパク質を得ることもできる。したがって、様々な変化が、それらの生物学的活性の認識可能な損失なしに、本発明の抗体配列又は当該ポリペプチドをコードする対応するＤＮＡ配列になされ得ることが企図される。

一実施形態では、アミノ酸変化は、ＤＮＡ配列内のコドンを変化させて、遺伝子コードの保存に基づいて保存的置換をコードすることによって達成され得る。具体的には、特定のタンパク質のアミノ酸配列と、遺伝子コード（以下に示される）によって定義されるタンパク質をコードし得るヌクレオチド配列との間に既知の明確な対応関係が存在する。同様に、特定の核酸のヌクレオチド配列と、遺伝子コードによって定義される核酸によってコードされるアミノ酸配列との間に既知の明確な対応関係が存在する。

遺伝子コードの重要な周知の特徴は、その冗長性であり、それにより、タンパク質を作製するために使用されるアミノ酸の大半には、１つより多くのコーディングヌクレオチドトリプレットが用いられ得る（上で例証される）。したがって、いくつかの異なるヌクレオチド配列が所与のアミノ酸配列をコードし得る。かかるヌクレオチド配列は、全ての生物における同じアミノ酸配列の産生をもたらすため（ある特定の生物はいくつかの配列を他の配列よりも効率的に翻訳し得るが）、機能的に同等であるとみなされる。更に、時折、プリン又はピリミジンのメチル化バリアントが所与のヌクレオチド配列に見られ得る。かかるメチル化は、トリヌクレオチドコドンと対応するアミノ酸との間のコーディング関係に影響を及ぼさない。

ポリペプチドのアミノ配列を変化させる際に、アミノ酸の疎水性親水性指標が考慮され得る。相互作用的生物学的機能をタンパク質に付与する際の疎水性親水性アミノ酸指数の重要性は、当該技術分野で一般に理解されている。アミノ酸の相対的疎水性親水性特性が、結果として生じたタンパク質の二次構造に寄与し、次いで、タンパク質と、他の分子、例えば、酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原等との相互作用を定義することが認められている。各アミノ酸には、それらの疎水性及び電荷特性に基づいて疎水性親水性指標が割り当てられており、それらは、イソロイシン（＋４．５）、バリン（＋４．２）、ロイシン（＋３．８）、フェニルアラニン（＋２．８）、システイン／シスチン（＋２．５）、メチオニン（＋１．９）、アラニン（＋１．８）、グリシン（－０．４）、トレオニン（－０．７）、セリン（－０．８）、トリプトファン（－０．９）、チロシン（－１．３）、プロリン（－１．６）、ヒスチジン（－３．２）、グルタミン酸（－３．５）、グルタミン（－３．５）、アスパラギン酸（＜ＲＴＩ３．５）、アスパラギン（－３．５）、リジン（－３．９）、及びアルギニン（－４．５）である。

ある特定のアミノ酸が同様の疎水性親水性指標又はスコアを有する他のアミノ酸によって置換されてもよく、同様の生物学的活性を有するタンパク質が依然としてもたらされる、すなわち、機能的に同等の生物学的タンパク質が依然として得られることが当該技術分野で既知である。

したがって、上で概説されるように、アミノ酸置換は、一般に、置換基のアミノ酸側鎖の相対的類似性、例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、サイズ等に基づいている。前述の様々な特性を考慮した例示の置換が当業者に周知であり、これらには、アルギニン及びリジン、グルタミン酸及びアスパラギン酸、セリン及びトレオニン、グルタミン及びアスパラギン、並びにバリン、ロイシン、及びイソロイシンが含まれる。

本発明の抗体のアミノ酸修飾の別のタイプが、例えば、安定性を増加させるための抗体の元のグリコシル化パターンを改変させる際に有用であり得る。「改変させる」とは、抗体に見られる１つ以上の炭水化物部分を欠失させること、及び／又は抗体に存在しない１つ以上のグリコシル化部位を付加することを意味する。抗体のグリコシル化は、典型的には、Ｎ結合であり得る。「Ｎ結合」とは、炭水化物部分のアスパラギン残基の側鎖への結合を指す。トリペプチド配列アスパラギン－Ｘ－セリン及びアスパラギン－Ｘ－トレオニン（ここで、Ｘは、プロリンを除く任意のアミノ酸である）は、炭水化物部分のアスパラギン側鎖への酵素結合の認識配列である。したがって、ポリペプチドにおけるこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在により、潜在的なグリコシル化部位が作製される。抗体へのグリコシル化部位の付加は、（Ｎ結合グリコシル化部位について）上に記載されるトリペプチド配列のうちの１つ以上を含むようにアミノ酸配列を改変することによって好都合に達成される。共有結合的修飾の別のタイプは、グリコシドを抗体に化学的又は酵素的にカップリングすることを含む。これらの手順は、Ｎ結合又はＯ結合グリコシル化のためのグリコシル化能力を有する宿主細胞における抗体の産生を必要としないという点で有利である。使用されるカップリング様式に応じて、糖が、（ａ）アルギニン及びヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）遊離スルフヒドリル基、例えば、システインの遊離スルフヒドリル基、（ｄ）遊離ヒドロキシル基、例えば、セリン、トレオニン、若しくはヒドロキシプロリンの遊離ヒドロキシル基、（ｅ）芳香族残基、例えば、フェニルアラニン、チロシン、若しくはトリプトファンの芳香族残基、又は（ｆ）グルタミンのアミド基に結合していてもよい。例えば、かかる方法は、ＷＯ８７／０５３３０に記載されている。

同様に、抗体上に存在するいずれの炭水化物部分の除去は、化学的又は酵素的に達成され得る。化学的脱グリコシル化は、化合物トリフルオロメタンスルホン酸又は同等の化合物への抗体の曝露を必要とする。この処理により、抗体をインタクトに保った状態で、結合糖（Ｎ－アセチルグルコサミン又はＮ－アセチルガラクトサミン）を除く大半又は全ての糖の切断がもたらされる。化学的脱グリコシル化は、ＳｏｊａｈｒＨ．ｅｔａｌ．（１９８７）及びＥｄｇｅ，ＡＳ．ｅｔａｌ．（１９８１）によって説明されている。抗体上の炭水化物部分の酵素的切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａ，ＮＲ．ｅｔａｌ．（１９８７）によって説明される様々なエンドグリコシダーゼ及びエキソグリコシダーゼの使用によって達成され得る。

他の修飾は、イムノコンジュゲートの形成を含み得る。例えば、１つのタイプの共有結合的修飾では、抗体又はタンパク質が、米国特許第４，６４０，８３５号、同第４，４９６，６８９号、同第４，３０１，１４４号、同第４，６７０，４１７号、同第４，７９１，１９２号、又は同第４，１７９，３３７号に記載の様式で、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレン等の様々な非タンパク質性ポリマーのうちの１つに共有結合的に連結される。

本発明の抗体又は他のタンパク質の異種薬剤とのコンジュゲーションは、Ｎ－スクシンイミジル（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（アジプイミド酸ジメチルＨＣＬ等）、活性エステル（スベリン酸ジスクシンイミジル等）、アルデヒド（グルタルアルデヒド等）、ビス－アジド化合物（ビス（ｐ－アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン等）、ビス－ジアゾニウム誘導体（ビス－（ｐ－ジアゾニウムベンゾイル）－エチレンジアミン等）、ジイソシアネート（トルエン２，６ジイソシアネート等）、及びビス－活性フッ素化合物（１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼン等）を含むが、これらに限定されない、様々な二官能性タンパク質カップリング剤を使用して行われ得る。例えば、炭素標識１－イソチオシアナトベンジルメチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ－ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体へのコンジュゲーションのための例示のキレート剤である（ＷＯ９４／１１０２６）。

別の態様では、本発明は、細胞毒素、薬物、及び／又は放射性同位体等の治療的部分にコンジュゲートされた抗体を特色とする。細胞毒素にコンジュゲートされると、これらの抗体コンジュゲートは、「免疫毒素」と称される。細胞毒素又は細胞毒性薬剤には、細胞に有害な（例えば、細胞を死滅させる）任意の薬剤が含まれる。例としては、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１－デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、及びピューロマイシン、並びにそれらの類似体又は相同体が挙げられる。治療薬には、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、６－メルカプトプリン、６－チオグアニン、シタラビン、５－フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）及びロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、並びにシス－ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前のダウノマイシン）及びドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前のアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、及びアントラマイシン（ＡＭＣ））、及び抗分裂剤（例えば、ビンクリスチン及びビンブラスチン）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の抗体は、放射性同位体、例えば、放射性ヨウ素にコンジュゲートされて、がん等の関連障害を治療するための細胞毒性放射性医薬品を生成することができる。

コンジュゲートされた抗体を使用して、臨床試験手順の一環として組織中のポリペプチドレベルを診断的又は予後的に監視して、例えば、所与の治療レジメンの有効性を決定するか、又は免疫療法に応答する可能性が最も高い患者を選択することができる。例えば、細胞がフローサイトメトリーアッセイで透過処理されて、抗体をそれらのエピトープに結合させ、コンジュゲートされた分子から発せられるシグナルを分析することによって結合の検出を可能にすることができる。検出は、抗体を検出可能な物質にカップリングする（すなわち、物理的に連結する）ことによって促進され得る。検出可能な物質の例には、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、及び放射性物質が挙げられる。好適な酵素の例には、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼが挙げられ、好適な補欠分子族複合体の例には、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンが挙げられ、好適な蛍光物質の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、又はフィコエリトリン（ＰＥ）が挙げられ、発光物質の例には、ルミノールが挙げられ、生物発光物質の例には、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリンが挙げられ、好適な放射性物質の例には、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^３５Ｓ、又は^３Ｈが挙げられる。［０１３４］本明細書で使用される場合、抗体に関して「標識される」という用語は、検出可能な物質、例えば、放射性薬剤又はフルオロフォア（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）又はフィコエリトリン（ＰＥ）又はインドシアニン（Ｃｙ５））を抗体にカップリングする（すなわち、物理的に連結する）ことによる抗体の直接的標識、並びに検出可能な物質との反応による抗体の間接的標識を包含するよう意図されている。

本発明の抗体コンジュゲートを使用して、所与の生物学的応答を修飾することができる。治療的部分が古典的な化学的治療薬に限定されると解釈されるべきではない。例えば、薬物部分は、所望の生物学的活性を有するタンパク質又はポリペプチドであり得る。かかるタンパク質には、例えば、酵素的に活性な毒素又はその活性断片（アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素、又はジフテリア毒素等）、タンパク質（腫瘍壊死因子又はインターフェロン－ガンマ等）、又は生物学的応答修飾因子（例えば、リンフォカイン、インターロイキン－１（「ＩＬ－１」）、インターロイキン－２（「ＩＬ－２」）、インターロイキン－６（「ＩＬ－６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ－ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ－ＣＳＦ」）、又は他のサイトカイン若しくは成長因子等）が含まれ得る。

かかる治療的部分を抗体にコンジュゲートするための技法が周知であり、例えば、Ａｒｎｏｎｅｔａｌ．，“ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓＦｏｒＩｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇＯｆＤｒｕｇｓＩｎＣａｎｃｅｒＴｈｅｒａｐｙ”，ｉｎＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓＡｎｄＣａｎｃｅｒＴｈｅｒａｐｙ，Ｒｅｉｓｆｅｌｄｅｔａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．２４３５６（ＡｌａｎＲ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８５）、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍｅｔａｌ．，“ＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓＦｏｒＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙ”，ｉｎＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙ（２ｎｄＥｄ．），Ｒｏｂｉｎｓｏｎｅｔａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．６２３５３（ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９８７）、Ｔｈｏｒｐｅ，“ＡｎｔｉｂｏｄｙＣａｒｒｉｅｒｓＯｆＣｙｔｏｔｏｘｉｃＡｇｅｎｔｓＩｎＣａｎｃｅｒＴｈｅｒａｐｙ：ＡＲｅｖｉｅｗ”，ｉｎＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ’８４：ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＡｎｄＣｌｉｎｉｃａｌＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐｉｎｃｈｅｒａｅｔａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．４７５５０６（１９８５）、“Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，ＡｎｄＦｕｔｕｒｅＰｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅＯｆＴｈｅＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＵｓｅＯｆＲａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄＡｎｔｉｂｏｄｙＩｎＣａｎｃｅｒＴｈｅｒａｐｙ”，ｉｎＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓＦｏｒＣａｎｃｅｒＤｅｔｅｃｔｉｏｎＡｎｄＴｈｅｒａｐｙ，Ｂａｌｄｗｉｎｅｔａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．３０３１６（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ１９８５）、及びＴｈｏｒｐｅｅｔａｌ．，“ＴｈｅＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎＡｎｄＣｙｔｏｔｏｘｉｃＰｒｏｐｅｒｔｉｅｓＯｆＡｎｔｉｂｏｄｙ－ＴｏｘｉｎＣｏｎｊｕｇａｔｅｓ”，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，６２：１１９５８（１９８２）を参照されたい。

いくつかの実施形態では、コンジュゲーションは、細胞における細胞毒性薬剤又は成長阻害剤の放出を促進する「切断可能なリンカー」を使用して行われ得る。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、感光性リンカー、ジメチルリンカー、又はジスルフィド含有リンカー（例えば、米国特許第５，２０８，０２０号を参照のこと）が使用され得る。代替的に、抗体及び細胞毒性薬剤又は成長阻害剤を含む融合タンパク質が組換え技法又はペプチド合成によって作製され得る。ＤＮＡの長さは、互いに隣接しているか、又はコンジュゲートの所望の特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域によって分離されているかのいずれかのコンジュゲートの２つの部分をコードするそれぞれの領域を含み得る。

ＶＩ．本発明の使用及び方法
本明細書に記載される本発明の抗体、免疫グロブリン、ポリペプチド、及び核酸は、以下に更に記載されるように、多数の状態の治療に使用され得る。

ａ．固形臓器移植
薬理学的免疫抑制剤は、固形臓器同種移植片の拒絶を防止するために使用される。これらの薬剤は、同種移植片の部位だけでなく全身でＴ細胞活性を阻害し、その結果、移植レシピエントは感染及びがんのリスクが増加する。既存の免疫抑制剤はまた、累積毒性をもたらし、臓器機能を損なう可能性があり、これは投薬を制限する可能性がある。既存の薬剤での治療にもかかわらず、臓器拒絶が依然として生じる可能性がある。

レシピエントが、ＭＨＣクラスＩ又はＭＨＣクラスＩＩのいずれかの少なくとも１つのミスマッチ対立遺伝子を有する移植された臓器移植片を受け取るとき、その移植片中の細胞は、レシピエントの体内の任意の他の組織上に存在しない表面抗原を発現する。そのミスマッチＭＨＣ対立遺伝子のタンパク質産物に特異的なアビディティーを有するＬｏＳＴＩＭ（すなわち、本開示で使用されるような二重特異性分子）は、同種移植片の細胞に対してＴ細胞活性を阻害するが、レシピエントの体内の他の場所においてＴ細胞の活性は阻害しない。したがって、ＬｏＳＴＩＭが、同種移植片の外側のレシピエントの身体の一部における感染又はがんのリスクを増加させることは予想されないことになる。ＬｏＳＴＩＭは、既存の免疫抑制剤の置き換えとして、又は補助剤としてのいずれかとして機能し得、既存の免疫抑制剤を、低減された毒性を伴う、より低い用量で使用することを可能にする。

ｂ．自己免疫疾患
一般に、自己免疫疾患は、体内の全ての組織に関与するのではなく、組織型のサブセットの病理学的炎症をもたらす。このいくつかの例には、関節リウマチ、大腸炎、クローン病、自己免疫性肝炎、狼瘡、及びＩ型糖尿病が含まれる。しかしながら、自己免疫疾患を治療するために使用される現在の薬理学的免疫抑制剤は、全身の免疫細胞活性を阻害する。この全身性免疫抑制は、患者を感染及びがんのリスクの増加にさらし、現在の薬剤は、自己免疫を適切に抑制することができないことがある。

病理学的に炎症を起こした組織の表面上に発現される抗原に特異的なアビディティーを有するＬｏＳＴＩＭは、その位置ではＴ細胞活性を阻害するが、体内の他の場所では阻害しないことになる。したがって、ＬｏＳＴＩＭは、Ｔ細胞によって媒介される自己免疫状態を治療するが、ＬｏＳＴＩＭによって免疫抑制の標的化されていない身体部分における感染又はがんのリスクを増加させることは予測されないことになる。

ｃ．がんの治療：チェックポイント阻害剤免疫関連副作用
免疫関連副作用（ｉｒＡＥ）は、ＰＤ－１／ＰＤＬ１シグナル伝達軸を阻害する免疫療法を受ける患者のかなりの割合で生じ、時には、これらの副作用は重篤であり得る。最も一般的なｉｒＡＥには、肺炎、大腸炎、肝炎、皮膚炎、甲状腺炎、及び関節炎が含まれるが、自己免疫は、ほぼ全ての組織において誘導され得る。管理は、典型的には、免疫療法の中止及びステロイドによる治療を伴う。一部の患者は、ステロイドを次第に減らすことはできず、ほとんどの患者は、療法に対する応答を享受していたとしても、再発性ｉｒＡＥの懸念から、免疫療法で再チャレンジできない。加えて、ステロイドを使用してｉｒＡＥに対処することは、他の方法でＰＤ－１遮断に対する継続的な応答を示す可能性のある患者における抗腫瘍効果を実際に減衰させ得る可能性がある。

ｉｒＡＥに感受性のある組織上に発現される表面抗原に対して指向されるＬｏＳＴＩＭ又はＬｏＳＴＩＭのパネルは、それらの組織上のＴ細胞活性を阻害すると同時に、生産的Ｔ細胞活性が他の場所、最も重要なことには腫瘍部位で持続することを可能にすることになる。もちろん、これは、腫瘍がＬｏＳＴＩＭに結合する抗原を発現しないことが条件である。更に、ＰＤ－１とその天然リガンドとの相互作用を阻害するＬｏＳＴＩＭは、同時に、腫瘍部位を含む他の組織上でＰＤ－１アンタゴニストとして機能することになる。したがって、適切に設計されたＬｏＳＴＩＭは、がんの治療を提供し続けながら、ｉｒＡＥを治療又は予防することができる。このようなＬｏＳＴＩＭ又はＬｏＳＴＩＭのパネルは、ｉｒＡＥのリスクがある患者又は全ての患者における既存のＰＤ－１／ＰＤＬ１阻害剤の先行の代替としても使用することもできる。

ｄ．がんの治療：操作された免疫細胞療法
キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）の形態の操作された免疫細胞療法は、Ｂ細胞リンパ腫、急性リンパ性白血病、及び多発性骨髄腫を含む血液悪性腫瘍の治療の装備に対する最近の追加である。しかしながら、この技術を固形悪性腫瘍に変換するには、進展が遅かった。固形がんに対するＣＡＲ－Ｔの使用の主な障壁の１つは、いわゆる「オンターゲット、オフ腫瘍」効果であり、それによって、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＡＲによって標的とされる腫瘍関連抗原を発現する正常組織を攻撃する。

ＣＡＲによって腫瘍関連抗原標的を発現する正常な組織は、それらの組織上の表面抗原に対して指向されたＬｏＳＴＩＭ又はＬｏＳＴＩＭのパネルによって保護され得る。ＬｏＳＴＩＭが結合する抗原が、がん上に発現されない限り、腫瘍に対するＣＡＲ－Ｔの活性が維持される。ＬｏＳＴＩＭは、薬剤として外因的に投与され得るか、又はＣＡＲ－Ｔ細胞自体によって発現され得る。更に、ＰＤ－１遮断が、がんに対するＣＡＲ－Ｔ細胞の活性を増強し得ることが示されている。したがって、ＰＤ－１とその天然リガンドとの相互作用を遮断するＬｏＳＴＩＭは、ＣＡＲ－Ｔ細胞のがんに対する効果を増強するために使用することができる。

ｅ．がんの治療：移植片対宿主病及び骨髄移植
移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）は、急性及び慢性の両方の状況において、同種骨髄移植の合併症である。移植されたＴ細胞による主要及び軽微なアロ抗原の認識は、この現象を媒介するが、それはまた、これらのリンパ球が残存白血病細胞を攻撃する、いわゆる「移植片対白血病」（ＧＶＬ）効果を媒介し、したがって、同種移植の長期生存利益の大部分を提供する。ＧＶＨＤを同時に減衰させながらＧＶＬ効果を増強する薬剤又は方法を開発するためのかなりの努力がなされてきたが、これらの効果は同じリンパ球によって媒介される可能性が高いため、これは依然としてこの分野にとって継続的な課題である。

ＧＶＨＤに感受性のある正常組織上で発現する表面抗原に対して指向されるＬｏＳＴＩＭ又はＬｏＳＴＩＭのパネルは、ＧＶＨＤを治療又は予防することができる。重要なことに、既存の免疫抑制剤とは対照的に、ＬｏＳＴＩＭが、がん性細胞上の抗原に結合しない限り、ＬｏＳＴＩＭは、ＧＶＬ効果を維持する。実際に、ＰＤ－１とその天然リガンドとの相互作用を遮断するＬｏＳＴＩＭは、同時に、ＧＶＨＤから正常な組織を保護しながらＧＶＬ効果を強化し得る。

ＶＩＩ．本発明の更なる使用及び方法
本明細書に記載の本発明の抗体、免疫グロブリン、ポリペプチド、及び核酸は、多数の予測的医薬アッセイ（例えば、診断アッセイ、予後アッセイ、及び臨床試験の監視）で使用され得、いくつかの実施形態では、単独で、又は毒性化合物若しくは他の治療薬にコンジュゲートされたときに、治療目的（例えば、治療的及び予防的）に有用であり得る。本明細書で使用される「検出」という用語は、対照の参照を伴う又は伴わない質的及び／又は量的検出（レベルの測定）を含む。本明細書に記載されるように、本発明のいくつかの抗体又はその断片は、以下の活性：１）ＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ２等のその天然結合パートナーに結合し、かつ又はその活性を調節すること、２）共免疫阻害性シグナル伝達等の細胞内又は細胞間シグナル伝達を調節すること、３）リンパ球の活性化及び／又は増殖を調節すること、４）生物、例えば、マウス又はヒト等の哺乳類生物の免疫応答を調節すること、並びに５）免疫細胞アネルギーを調節することのうちの１つ以上を有する。

したがって、本発明の一態様は、生体試料（例えば、血液、血清、細胞、又は組織）との関連でポリペプチドレベルを決定し、それにより、試料中のポリペプチドレベルを決定し、個体が障害に罹患しているかを決定し、かつ／又はかかるレベルによって示されるかかる障害の状態を決定するための診断アッセイに関する。

本発明は、個体がかかる障害を発症する危険性があるかを決定するための予後（又は予測的）アッセイも提供する。本発明の別の態様は、臨床試験における検出されたポリペプチドの発現又は活性への薬剤（例えば、薬物、化合物）の影響の監視に関する。

本発明は、ＰＤ－１シグナルを伝達する薬剤を特定するための手段としてＰＤ－１の検出も提供する。ＰＤ－１シグナルを伝達する薬剤は、免疫応答を減弱させ、自己免疫疾患、喘息、及び耐性の確立に有用であり得る。

本明細書に記載のいずれの方法においても、ＰＤ－１は、単独で、又は他の免疫チェックポイント及び／若しくは共刺激分子等の他の分子の発現と組み合わせて検出され得る。いくつかの分子のコンビナトリアル検出（例えば、順次又は同時）は、治療的介入の相乗作用及び／又は障害亜型の個別化された高分解能診断に関する有用な情報を提供し得る。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１は、もう１つのマーカーでコンビナトリアル的に検出される。

ａ．診断アッセイ
本発明は、部分的に、ポリペプチドのレベルを検出するための方法、システム、及びコードを提供する。

ポリペプチドのレベルを検出するための例示的な方法は、生体試料を試験対象から得ることと、生体試料中でポリペプチドのレベルが検出されるように、生体試料を、ポリペプチドを検出することができる本発明の抗体又はその抗原結合断片と接触させることと、を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの抗体又はその抗原結合断片が使用され、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上のかかる抗体又は抗体断片が組み合わせで（例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡで）又は順次に使用され得る。ある特定の例では、統計的アルゴリズムは、単一の学習統計的分類子システムである。例えば、単一の学習統計的分類子システムは、予測値又は確率値及びＰＤ－１の存在又はレベルに基づいて試料をＰＤ－１試料として分類するために使用され得る。単一の学習統計的分類子システムの使用により、典型的には、試料が、少なくとも約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の感受性、特異性、陽性予測値、陰性予測値、及び／又は全体精度を有するＰＤ－１試料として分類される。

他の好適な統計的アルゴリズムが当業者に周知である。例えば、学習統計的分類子システムは、複雑なデータセット（例えば、目的とするマーカーのパネル）に適合し、かかるデータセットに基づいて決定することができる機械学習アルゴリズム技法を含む。いくつかの実施形態では、分類ツリー（例えば、ランダムフォレスト）等の単一の学習統計的分類子システムが使用される。他の実施形態では、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれ以上の学習統計的分類子システムの組み合わせが、好ましくは直列で使用される。学習統計的分類子システムの例には、帰納的学習（例えば、ランダムフォレスト、分類及び回帰ツリー（Ｃ＆ＲＴ）、ブーストツリー等の決定／分類ツリー）、確率的に近似的に正しい（ＰＡＣ）学習、コネクショニスト学習（例えば、ニューラルネットワーク（ＮＮ）、人工ニューラルネットワーク（ＡＮＮ）、ニューロファジーネットワーク（ＮＦＮ）、ネットワーク構造、多層パーセプトロン等のパーセプトロン、多層フィードフォワードネットワーク、ニューラルネットワークの適用、信念ネットワークにおけるベイズ学習等）、強化学習（例えば、ナイーブ学習、適応動的学習、及び時間差学習等の既知の環境における受動的学習、未知の環境における受動的学習、未知の環境における能動的学習、学習行動値関数、強化学習の適用等）、並びに遺伝的アルゴリズム及び進化的プログラミングを使用したものが挙げられるが、これらに限定されない。他の学習統計的分類子システムは、サポートベクトルマシン（例えば、カーネル法）、多変量適応型回帰スプライン（ＭＡＲＳ）、レーベンバーグ・マーカートアルゴリズム、ガウス・ニュートンアルゴリズム、ガウスの混合（ｍｉｘｔｕｒｅｓｏｆＧａｕｓｓｉａｎｓ）、勾配降下アルゴリズム、及び学習ベクトル量子化（ＬＶＱ）を含む。ある特定の実施形態では、本発明の方法は、ＰＤ－１試料分類結果を臨床医、例えば、組織病理学者又は腫瘍学者に送信することを更に含む。

別の実施形態では、本発明の方法は、個体が異常なＰＤ－１に関連する状態又は障害を有する確率の形態で診断を更に提供する。例えば、個体は、約０％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又はそれ以上のその状態又は障害を有する確率を有し得る。更に別の実施形態では、本発明の方法は、個体における状態又は障害の予後を更に提供する。いくつかの例では、試料をＰＤ－１試料として分類する方法は、試料が得られる個体の症状（例えば、臨床的因子）に更に基づいている。症状又は症状の群は、例えば、リンパ球数、白血球数、赤血球沈降速度、下痢、腹痛、痙攣、発熱、貧血、体重減少、不安、うつ、及びそれらの組み合わせであり得る。いくつかの実施形態では、異常なＰＤ－１に関連する状態又は障害を有する個体の診断に続いて、個体に、その状態又は障害に関連する１つ以上の症状の治療に有用な薬物（例えば、化学療法剤）の治療有効量が投与される。

一実施形態では、本方法は、対照生体試料（例えば、状態又は障害を有しない対象由来の生体試料）、状態又は障害の寛解中又はそれを発症する前の対象由来の生体試料、又は状態又は障害を発症する治療中の対象由来の生体試料を得ることを更に含む。

ポリペプチド又はその断片の存在又は不在を検出するための例示の方法は、ポリペプチドに結合することができる本発明の抗体又はその断片、好ましくは検出可能な標識を有する抗体である。抗体は、ポリクローナルであり得るか、又はより好ましくは、モノクローナルであり得る。かかる薬剤が標識され得る。抗体に関して「標識される」という用語は、検出可能な物質をプローブ又は抗体にカップリングする（すなわち、物理的に連結する）ことによるプローブ又は抗体の直接標識、並びに直接標識される別の試薬との反応によるプローブ又は抗体の間接的標識を包含するよう意図されている。間接的標識の例には、蛍光標識された二次抗体を使用した一次抗体の検出が挙げられる。「生体試料」という用語は、対象から単離された組織、細胞、及び血清等の生体液、並びに対象に存在する組織、細胞、及び体液を含むよう意図されている。すなわち、本発明の検出方法を使用して、生体試料中のポリペプチド又はその断片をインビトロで、かつインビボで検出することができる。ポリペプチドの検出のためのインビトロ技法には、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット、免疫沈降、免疫組織化学（ＩＨＣ）、細胞内フローサイトメトリー及び関連技法、並びに免疫蛍光が含まれる。更に、ポリペプチド又はその断片の検出のためのインビボ技法には、対象に標識された抗ポリペプチド抗体を導入することが含まれる。例えば、抗体は、放射性、発光、蛍光、又は他の同様のマーカーで標識され得、対象におけるその存在及び位置が、標準の画像技法によって単独で、又は細胞型マーカー（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞マーカー）等の他の分子の画像法と組み合わせてのいずれかで検出され得る。

一実施形態では、生体試料は、試験対象由来のポリペプチド分子を含有する。好ましい生体試料は、従来の手段によって対象から単離される血清、腫瘍微小環境、腫瘍周辺、又は腫瘍内である。

別の実施形態では、本方法は、対照対象から対照生体試料を得ることと、ポリペプチド若しくはその断片の存在が生体試料中で検出されるように、対照試料を、化合物又はポリペプチド若しくはその断片を検出することができる薬剤と接触させることと、対照試料中のポリペプチド若しくはその断片の存在を、試験試料中のポリペプチド若しくはその断片の存在と比較することとを更に含む。

なお他の実施形態では、抗体は、ＥＬＩＳＡ又はＲＩＡにおける抗体の使用のための構成要素又はデバイスと関連付けられ得る。非限定的な例には、これらのアッセイで使用するために固体表面上に固定化された（例えば、上述のように光又は放射線放出に基づいて検出可能な標識に連結及び／又はコンジュゲートされた）抗体が挙げられる。他の実施形態では、抗体は、免疫クロマトグラフィーアッセイ又は免疫化学的アッセイ、例えば、「サンドイッチ」又は競合的アッセイ、免疫組織化学、免疫蛍光顕微鏡法等の使用によるＰＤ－１の検出のためのデバイス又は条片と関連付けられる。かかるデバイス又は条片の追加の例は、自宅での検査又は迅速な臨床現場即時検査用に設計されたものである。更なる例には、単一試料中の複数の分析物の同時分析用に設計されたものが挙げられる。例えば、本発明の非標識抗体は、生体試料中の「捕捉」ＰＤ－１ポリペプチドに適用され得、捕捉された（又は固定化された）ＰＤ－１ポリペプチドは、検出のために本発明の抗ＰＤ－１抗体の標識形態に結合し得る。例えば、免疫拡散、免疫電気泳動、免疫組織病理学、免疫組織化学、及び組織病理学に基づくアッセイを含む免疫アッセイの他の標準の実施形態が当業者に周知である。

ｂ．予後アッセイ
更に、本明細書に記載の診断法は、障害を有するか、又はそれを発症するリスクのある対象を特定するために利用され得る。異常な発現又は活性には、増加又は減少した発現又は活性、並びに野生型発現発生パターン又は細胞内発現パターンに従わない発現又は活性が含まれる。例えば、異常なＰＤ－１レベルは、ＰＤ－１遺伝子若しくは制御配列における変異又はその染色体ＰＤ－１遺伝子の増幅により、ＰＤ－１遺伝子が過少発現又は過剰発現される場合、及びかかる変異により、非機能性ＰＤ－１ポリペプチド又は野生型では機能しないポリペプチド、例えば、細胞内ドメインを欠損しているためＰＤ－１結合又はシグナルパートナーと相互作用できないポリペプチドがもたらされる状況を含むように意図されている。本明細書で使用される場合、「望ましくない」という用語は、免疫細胞活性化等の生物学的応答に関与する望ましくない現象を含む。例えば、望ましくないという用語は、対象において望ましくないＰＤ－１バリアントを含む。

本開示の残りで更に説明されるように、異常なＰＤ－１に関連する多くの障害が当業者に既知である。ＰＤ－１は、選択リンパ性悪性疾患、ウイルス誘導性がん、及び多くの固形腫瘍を含む複数の腫瘍タイプによって発現される。しかしながら、いくつかの障害、例えば、自己免疫疾患、炎症性疾患等を治療する際に免疫応答を下方制御するために免疫阻害が所望される。

前述の診断アッセイ又は以下のアッセイ等の本明細書に記載のアッセイを利用して、ＰＤ－１活性化の誤制御に関連する障害を有するか、又はそれを発症するリスクのある対象を特定することができる。したがって、本発明は、異常な又は望ましくないＰＤ－１活性化に関連する障害を特定するための方法を提供し、本方法において、試験試料が対象から得られ、ＰＤ－１レベルが検出され、異常な又は望ましくないＰＤ－１ポリペプチドの存在が、異常な又は望ましくないＰＤ－１活性に関連する障害を有するか、又はそれを発症するリスクのある対象の診断に用いられる。本明細書で使用される場合、「試験試料」は、目的とする対象から得られた生体試料を指す。例えば、試験試料は、生体液（例えば、脳脊髄液又は血清）、細胞試料、又は組織、例えば、腫瘍微小環境、腫瘍周辺領域、及び／又は腫瘍内領域の組織病理学的スライドであり得る。

更に、本明細書に記載の予後アッセイを使用して、薬剤（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣薬、ポリペプチド、ペプチド、核酸、小分子、又は他の薬物候補）が対象に投与されて、異常な又は望ましくないＰＤ－１活性に関連するかかる障害を治療することができるかを決定することができる。例えば、かかる方法を使用して、対象が１つの薬剤又は薬剤の組み合わせで有効に治療され得るかを決定することができる。したがって、本開示は、対象が、異常な又は望ましくないＰＤ－１活性に関連する障害を治療するための１つ以上の薬剤で有効に治療され得るかを決定するための方法を提供する。

本明細書に記載の方法は、例えば、ＰＤ－１を伴う疾患又は疾病の症状又は家族歴を呈する患者を診断するための臨床状況において好都合に使用され得る、例えば、本明細書に記載の少なくとも１つの抗体試薬を含む予めパッケージングされた診断キットを利用することによって行われ得る。

更に、ＰＤ－１が発現される任意の細胞型又は組織が本明細書に記載の予後アッセイで利用され得る。

本発明の別の態様は、異常なＰＤ－１活性化に関連する障害を有する個体由来の生体試料中のＰＤ－１が分析され、その情報が好ましくは同様の年齢及び人種の対照（例えば、その障害を有しない個体であり、対照は、「健常」若しくは「正常」個体と称され得るか、又は所与の経時的研究における初期の時点のもの）と比較される、関連及び／又は層別化分析のための本明細書に記載の組成物及び方法の使用を含む。患者及び対照の適切な選択は、関連及び／又は層別化研究の成功に重要である。したがって、十分に特徴付けられた表現型を有する個体のプールが非常に望ましい。疾患診断、疾患素因スクリーニング、疾患予後、薬物応答性決定（薬理ゲノミクス）、薬物毒性スクリーニング等の基準が本明細書に記載される。

遺伝的関連及び／又は層別化研究のための異なる研究設計が使用され得る（ＭｏｄｅｒｎＥｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ，ＬｉｐｐｉｎｃｏｔｔＷｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ（１９９８），６０９ー６２２）。患者の応答が干渉されない観察的研究が最も頻繁に行われている。観察的研究の第１のタイプは、疾患の疑わしい原因が存在するヒトの試料及び疑わしい原因が存在しないヒトの別の試料を特定し、その後、２つの試料における疾患の発症頻度が比較される。これらの試料採取された集団はコホートと呼ばれ、この研究は前向き研究である。観察的研究の他のタイプは、症例対照研究又は後向き研究である。典型的な症例対照研究では、試料は、疾患のある特定の兆候等の目的とする表現型を有する個体（症例）及び結論が導き出される集団（標的集団）におけるその表現型を有しない個体（対照）から収集される。その後、疾患の考えられる原因が後向きに調査される。症例対照研究における試料収集時間及び費用が前向き研究よりも大幅に下回るため、症例対照研究は、少なくとも探査及び発見段階中の遺伝的関連研究におけるより一般に使用されている研究設計である。

全ての関連表現型及び／又は遺伝子型情報が得られた後、個体の表現型特性を有する対立遺伝子又は遺伝子型の存在間に有意な相関関係が存在するかを決定するための統計的分析が行われる。好ましくは、データの検査及び整理が最初に行われ、その後、遺伝的関連のための統計的検定が行われる。試料の疫学的及び臨床データが当該技術分野で周知の表及びグラフを用いて記述統計学によって要約され得る。好ましくは、データ完成、一貫性のないエントリ、及び外れ値を確認するためのデータ検証が行われる。その後、それぞれ、離散変数及び連続変数について症例と対照との間の有意差を確認するためのカイ二乗検定及びｔ－検定（分布が正規分布ではない場合、ウィルコクソンの順位和検定）が使用され得る。

遺伝的関連検定を行う際の重要な決定は、有意レベルの決定であり、それらの検定のｐ値がそのレベルに達したときに有意な関連が断言され得る。陽性ヒットがその後の確証検定で追跡される予備的分析では、例えば、０．２（寛大な有意レベル）未満の未調整ｐ値が、ＰＤ－１レベルの疾患のある特定の表現型特性との有意な関連のための仮説を生み出すために使用され得る。０．０５（当該技術分野で伝統的に使用されている有意レベル）未満のｐ値が疾患との関連を有するとみなされるようにそのレベルが達成されることが好ましい。ヒットが同じ源由来のより多くの試料又は異なる源由来の異なる試料における確証的分析で追跡されるとき、複数の検定の調整が、実験ワイズエラー率を０．０５で維持しながら過剰なヒット数を回避するように行われる。複数の検定を調整して異なる種類のエラー率を制御するための異なる方法が存在する一方で、一般に使用されているが、むしろ保守的な方法は、実験ワイズ又はファミリーワイズエラー率を制御するためのボンフェローニ補正である（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓａｎｄｍｕｌｔｉｐｌｅｔｅｓｔｓ，Ｗｅｓｔｆａｌｌｅｔａｌ，ＳＡＳＩｎｓｔｉｔｕｔｅ（１９９９））。偽発見率（ＦＤＲ）を制御するための並べ替え検定がより有力であり得る（ＢｅｎｊａｍｉｎｉａｎｄＨｏｃｈｂｅｒｇ，ＪｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅＲｏｙａｌＳｔａｔｉｓｔｉｃａｌＳｏｃｉｅｔｙ，ＳｅｒｉｅｓＢ５７，１２８９－１３００，１９９５、Ｒｅｓａｍｐｌｉｎｇ－ｂａｓｅｄＭｕｌｔｉｐｌｅＴｅｓｔｉｎｇ，ＷｅｓｔｆａｌｌａｎｄＹｏｕｎｇ，Ｗｉｌｅｙ（１９９３））。これらの検定が依存的であり、実験ワイズエラー率の制御とは対照的に偽発見率の制御が十分である場合に、多重度を制御するためのかかる方法が好ましいであろう。

個々の遺伝的又は非遺伝的危険因子が疾患の素因になることが見出されると、分類／予測スキームが設定されて、個体の表現型及び／又は遺伝子型並びに他の非遺伝的危険因子に応じて個体が属するカテゴリー（例えば、疾患又は非疾患）を予測することができる。離散形質のロジスティック回帰及び連続形質の線形回帰が、かかる課題のための標準の技法である（ＡｐｐｌｉｅｄＲｅｇｒｅｓｓｉｏｎＡｎａｌｙｓｉｓ，ＤｒａｐｅｒａｎｄＳｍｉｔｈ，Ｗｉｌｅｙ（１９９８））。更に、他の技法も分類を設定するために使用され得る。かかる技法には、ＭＡＲＴ、ＣＡＲＴ、ニューラルネットワーク、及び異なる方法の性能の比較における使用に好適な判別分析が含まれるが、これらに限定されない（ＴｈｅＥｌｅｍｅｎｔｓｏｆＳｔａｔｉｓｔｉｃａｌＬｅａｒｎｉｎｇ，Ｈａｓｔｉｅ，Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ＆Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（２００２））。

ｃ．臨床試験中の効果の監視
薬剤（例えば、化合物、薬物、又は小分子）のＰＤ－１ポリペプチド又はその断片のレベルへの影響（例えば、細胞増殖及び／又は遊走の調節）の監視は、基本的な薬物スクリーニングのみならず、臨床試験でも適用され得る。例えば、ＰＤ－１遺伝子発現を減少させるか、ポリペプチドレベルを減少させるか、又はＰＤ－１活性を下方制御するための本明細書に記載のスクリーニングアッセイによって決定される薬剤の有効性は、減少したＰＤ－１遺伝子発現、減少したポリペプチドレベル、又は下方制御されたＰＤ－１活性を呈する対象の臨床試験で監視され得るか、又は本明細書に記載の抗ＰＤ－１抗体又は断片によって検出可能な減少したＰＤ－１レベル発現を呈する対象の臨床試験で監視され得る。かかる臨床試験では、ＰＤ－１遺伝子の発現若しくは活性及び／又は目的とする障害の症状若しくはマーカーが、特定の細胞、組織、又は系の表現型の「読み出し」又はマーカーとして使用され得る。同様に、ＰＤ－１遺伝子発現を増加させるか、ポリペプチドレベルを増加させるか、又はＰＤ－１活性を増加させるための本明細書に記載のスクリーニングアッセイによって決定される薬剤の有効性は、増加したＰＤ－１遺伝子発現、増加したポリペプチドレベル、又は増加したＰＤ－１活性を呈する対象の臨床試験で監視され得る。かかる臨床試験では、ＰＤ－１遺伝子の発現若しくは活性及び／又は目的とする障害の症状若しくはマーカーが、自己免疫障害等の特定の細胞、組織、又は系の表現型の「読み出し」又はマーカーとして使用され得る。

例えば、限定するものではなく、ＰＤ－１活性（例えば、本明細書に記載のスクリーニングアッセイで特定された）を調節する薬剤（例えば、化合物、薬物、又は小分子）での処理によって細胞内で調節されるＰＤ－１を含む遺伝子が特定され得る。したがって、例えば、臨床試験において、異常なＰＤ－１活性化に関連する障害への薬剤の効果を研究するために、細胞が単離され、核酸及び／又はタンパク質が調製され、異常なＰＤ－１活性化に関連する障害に関与するＰＤ－１及び／又は他の遺伝子のレベルについて分析され得る。遺伝子発現レベル（例えば、遺伝子発現パターン）は、産生されるポリペプチドの量を測定することによって、本明細書に記載の方法のうちの１つによって、又はＰＤ－１又は他の遺伝子のレベルを測定することによって分析される。この方法で、遺伝子発現パターンは、薬剤に対する細胞の生理学的応答を示すマーカーとしての機能を果たし得る。したがって、この応答状態は、薬剤での個体の治療前及びその治療中の様々な時点で決定され得る。

好ましい実施形態では、本発明は、薬剤（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣薬、ポリペプチド、ペプチド、核酸、小分子、又は本明細書に記載のスクリーニングアッセイによって特定される他の薬物候補）での対象の治療の有効性を監視するための方法であって、（ｉ）薬剤の投与前に対象から投与前試料を得るステップと、（ｉｉ）投与前試料中のＰＤ－１ポリペプチド又はその断片のレベルを検出するステップと、（ｉｉｉ）対象から１つ以上の投与後試料を得るステップと、（ｉｖ）投与後試料中のＰＤ－１ポリペプチド又はその断片のレベルを検出するステップと、（ｖ）投与前試料中のＰＤ－１ポリペプチド又はその断片のレベルを、投与後試料（複数可）中のＰＤ－１ポリペプチドと比較するステップと、（ｖｉ）対象への薬剤の投与を適宜に変更するステップとを含む、方法を提供する。例えば、薬剤の増加した投与は、ＰＤ－１を検出されたレベルよりも低いレベルに低下させる、すなわち、薬剤の有効性を高めるのに望ましくあり得る。かかる実施形態に従って、ＰＤ－１レベルは、観察可能な表現型応答の不在下でさえも薬剤の有効性の指標として使用され得る。同様に、免疫組織化学（ＩＨＣ）等によるＰＤ－１レベル分析を使用して、１つ以上の免疫チェックポイントを阻害するためのＰＤ－１及び／若しくはＰＤ－１免疫療法、又は免疫療法を受ける患者を選択することもできる。本明細書に記載されるように、腫瘍がＰＤ－１活性化を有する患者は、ＰＤ－１又はＰＤ－１ｍＡｂ免疫療法に応答する可能性が高い。この免疫療法により、免疫活性化が最初にもたらされ、活性化Ｔ細胞がＩＦＮ－ガンマを発現し、次いで、ＰＤ－１活性化を上方制御する。通常、これにより、ＰＤ－１の係合及び免疫応答の下方制御がもたらされる。

ｄ．治療的方法及び使用
いくつかの実施形態では、本発明の抗体、断片、又はイムノコンジュゲート（例えば、抗ＰＤ－１抗体のみ、又は治療的部分にコンジュゲートされたもの）は、異常な又は望ましくないＰＤ－１活性化に関連する任意の障害（例えば、がん）の治療に有用である。ある特定の実施形態では、治療は、ヒト等の哺乳動物のものである。本発明のかかる抗体は、目的とする障害を治療するために、単独で、又は任意の好適な薬剤若しくは適切な療法と組み合わせて使用され得る。

治療用モノクローナル抗体が、その抗体によって特異的に認識される抗原を細胞外に有する細胞の枯渇をもたらし得ることが周知である。この枯渇は、少なくとも３つの機構：抗体媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）、補体依存性溶解、及び抗体によって標的とされる抗原を介して伝達されるシグナルによる腫瘍成長の直接抗腫瘍阻害によって媒介され得る。

「補体依存性細胞毒性」又は「ＣＤＣ」とは、補体の存在下での標的細胞の溶解を指す。古典的な補体経路の活性化は、補体系の第１の成分の、それらの同族抗原に結合している抗体への結合によって開始される。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイ、例えば、Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏｅｔａｌ．（１９９７）に記載のＣＤＣアッセイが行われ得る。

「抗体依存性細胞媒介性細胞毒性」又は「ＡＤＣＣ」とは、ある特定の細胞毒性細胞（例えばナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ）上に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合した分泌抗体により、これらの細胞毒性エフェクター細胞が抗原を有する標的細胞に特異的に結合し、その後、標的細胞を死滅させることが可能になる細胞毒性の形態を指す。目的とする分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、インビトロＡＤＣＣアッセイ、例えば、米国特許第５，５００，３６２号又は同第５，８２１，３３７号に記載のインビトロＡＤＣＣアッセイが行われ得る。当該技術分野で周知のように、Ｆｃ部分は、Ｆｃ受容体との所望の相互作用を達成するか、又はそれを欠くように操作され得る。

細胞内標的の抗体媒介性結合、中和、及び／又は調節のために、ある特定の修飾がなされなければならない。本明細書に記載されるように、ｓＦｖ及びＦａｂ等のある特定の抗体型式が、抗体様分子の細胞内発現に適している。特定の経路で抗原又は分子に対抗する、核、ＥＲ、細胞質、ゴルジ、原形質膜、ミトコンドリアを含む細胞の異なるコンパートメントにおける発現を標的とするためのかかる適合抗体様分子を作製及び使用するための方法が周知である（少なくとも、米国特許公開第２００８／０２３３１１０号及び同第２００３／０１０４４０２号、Ｍａｒａｓｃｏｅｔａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：７８８９－７８９３、Ｃｈｅｎｅｔａｌ．（１９９４）ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ５：５９５－６０１、Ｃｈｅｎｅｔａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：５９３２－５９３６、Ｍｈａｓｈｉｌｋａｒｅｔａｌ．（１９９５）ＥＭＢＯＪ．１４：１５４２－１５５１、Ｍａｒａｓｃｏｅｔａｌ．（１９９７）ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ４：１１－１５、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎｅｔａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：３１３７－３１４１、及びＤｕａｎｅｔａｌ．（１９９４）ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ５：１３１５－１３２４を参照のこと）。

本明細書で使用される場合、「細胞内免疫グロブリン分子」という用語は、天然に存在する分泌免疫グロブリンと同じであるが、合成後に細胞内に残存する完全免疫グロブリンである。「細胞内免疫グロブリン断片」とは、細胞内免疫グロブリン分子の一本鎖断片を含む任意の断片を指す。したがって、細胞内免疫グロブリン分子又はその断片は、細胞の外面で分泌又は発現されない。一本鎖細胞内免疫グロブリン断片は、本明細書で「一本鎖免疫グロブリン」と称される。本明細書で使用される場合、「細胞内免疫グロブリン分子又はその断片」という用語は、「細胞内免疫グロブリン」、「一本鎖細胞内免疫グロブリン」（又はその断片）、「細胞内免疫グロブリン断片」、「細胞内抗体」（又はその断片）、及び「イントラボディ」（又はその断片）を包含すると理解される。したがって、「細胞内免疫グロブリン」、「細胞内Ｉｇ」、「細胞内抗体」、及び「イントラボディ」という用語は、本明細書で同義に使用され得、全て「細胞内免疫グロブリン分子又はその断片」の一般的定義によって包含される。本発明の細胞内免疫グロブリン分子又はその断片は、いくつかの実施形態では、２つ以上のサブユニットポリペプチド、例えば、「第１の細胞内免疫グロブリンサブユニットポリペプチド」及び「第２の細胞内免疫グロブリンサブユニットポリペプチド」を含み得る。しかしながら、他の実施形態では、細胞内免疫グロブリンは、単一のポリペプチドのみを含む「一本鎖細胞内免疫グロブリン」であり得る。本明細書で使用される場合、「一本鎖細胞内免疫グロブリン」は、所望の活性、例えば、抗原への細胞内結合を有する任意の単位断片として定義される。したがって、一本鎖細胞内免疫グロブリンは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の両方を含むもの、並びに抗原に結合する単一の可変領域、例えば、本明細書に記載の「ラクダ化」重鎖可変領域のみを有する一本鎖細胞内免疫グロブリンを包含する。細胞内免疫グロブリン又はＩｇ断片は、細胞内の実質的に任意の場所で、例えば、細胞質内、細胞膜の内面上、又は核、ゴルジ、小胞体、エンドソーム、ミトコンドリア等の細胞内コンパートメント（細胞サブコンパートメント又は細胞コンパートメントとも称される）で発現され得る。更なる細胞サブコンパートメントには、本明細書に記載され、かつ当該技術分野で周知のものが含まれる。

かかる細胞内免疫グロブリンは、標的とされる抗原を含むレシピエント細胞又は宿主細胞で発現される。本発明の宿主細胞は、好ましくは、真核細胞若しくは細胞株、好ましくは、植物、動物、脊椎動物、哺乳類、齧歯類、マウス、霊長類、又はヒト細胞若しくは細胞株である。ＰＤ－１シグナル伝達を調節する効果は当該技術分野で周知である（例えば、ＰＣＴ公開第２００１／０１４５５７号を参照のこと）。

いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、前述の成長阻害剤、細胞毒性薬剤、又はプロドラッグ活性化酵素等の治療的部分にコンジュゲートされ得る。本発明の抗体は、当該成長阻害剤、細胞毒性薬剤、又はプロドラッグの、所望のＰＤ－１量を過小又は過剰発現する細胞への標的に有用であり得る。

したがって、本発明の目的は、異常なＰＤ－１活性化に関連する障害を治療するための方法であって、それを必要とする対象に、本発明の抗体、断片、又はイムノコンジュゲートの治療有効量を投与することを含む、方法に関する。

代替的に、いくつかの実施形態では、本発明の抗体又は抗原結合断片は、免疫応答の上方制御に関する診断、予後、及び予防用途に加えて、治療的用途に有用である。免疫応答の上方制御は、既存の免疫応答を増強する形態又は初期免疫応答を誘発する形態にあり得る。例えば、主題の組成物及び方法を使用した免疫応答の増強は、がん及び微生物（例えば、細菌、ウイルス、又は寄生虫）感染に対する免疫学的防御を改善する場合に有用である。例えば、本明細書に記載の免疫応答機能の上方制御又は増強は、腫瘍免疫の誘導に有用である。

別の実施形態では、免疫応答は、既存の耐性、クローン欠失、及び／又は疲弊（例えば、Ｔ細胞疲弊）が克服されるように、本明細書に記載の方法によって刺激され得る。例えば、対象が有意な免疫応答を開始することができない抗原、例えば、腫瘍特異的抗原等の自己抗原に対する免疫応答は、免疫応答を上方制御する本明細書に記載の適切な薬剤を投与することによって誘導され得る。一実施形態では、腫瘍特異的抗原等の自己抗原が同時投与され得る。別の実施形態では、免疫応答は、神経学的障害を治療するための抗原（例えば、自己抗原）に対して刺激され得る。別の実施形態では、主題の薬剤は、能動免疫化の過程で外来抗原に対する応答を高めるためのアジュバントとして使用され得る。

ある特定の例では、免疫応答を更に増強するために、免疫応答を上方制御する他の薬剤、例えば、共刺激受容体を介してシグナルを伝達する他のＢ７ファミリーメンバーの形態を更に投与することが望ましくあり得る。また、免疫応答を上方制御する薬剤が様々なポリペプチド（例えば、病原体に由来するポリペプチド）に対するワクチンにおいて予防的に使用され得る。病原体（例えば、ウイルス）に対する免疫は、適切なアジュバントにおいて免疫応答を上方制御する薬剤とともにウイルスタンパク質をワクチン接種することによって誘導され得る。

代替的に、いくつかの実施形態では、本発明の抗体及び抗原結合断片は、診断、予後、及び予防用途に加えて、免疫反応を上方制御する疾患、例えば、喘息、自己免疫疾患（糸球体腎炎、関節炎、拡張型心筋症様疾患、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、クローン病、全身性紅斑性狼瘡、慢性リウマチ性関節炎、多発性硬化症、乾癬、アレルギー性接触皮膚炎、多発性筋炎、強皮症、結節性動脈周囲炎、リウマチ熱、尋常性白斑、インスリン依存性糖尿病、ベーチェット病、橋本病、アジソン病、皮膚筋炎、重症筋無力症、ライター症候群、グレーブス病、悪性貧血、グッドパスチャー症候群、不妊症、慢性活動性肝炎、天疱瘡、自己免疫性血小板減少性紫斑病、及び自己免疫性溶血性貧血、活動性慢性肝炎、アジソン病、抗リン脂質症候群、アトピー性アレルギー、自己免疫性萎縮性胃炎、自己免疫無塩酸症（ａｃｈｌｏｒｈｙｄｒａａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ）、セリアック病、クッシング症候群、皮膚筋炎、円板状紅斑性狼瘡、グッドパスチャー症候群、橋本甲状腺炎、特発性副腎萎縮、特発性血小板減少症、インスリン依存性糖尿病、ランバート・イートン症候群、ルポイド肝炎、いくつかのリンパ球減少症例、混合結合組織病、類天疱瘡、尋常性天疱瘡、悪性貧血、水晶体起因性ブドウ膜炎、結節性多発性動脈炎、多腺性自己免疫症候群、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、レイノー症候群、再発性多発性軟骨炎、シュミット症候群、限局性強皮症（又はクレスト症候群）、交感性眼炎、全身性紅斑性狼瘡、高安動脈炎、側頭動脈炎、甲状腺機能亢進症、Ｂ型インスリン抵抗性、潰瘍性大腸炎、及びヴェグナー肉芽腫症）を抑制するための治療的用途（疾患の治療及びその発症又は進行の遅延等）に有用である。

同様に、本発明の抗体及び抗原結合断片は、診断、予後、及び予防用途に加えて、持続する感染性疾患（例えば、ＨＰＶ、ＨＢＶ、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、レトロウイルス、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ－１及びＨＩＶ－２）、ヘルペスウイルス、例えば、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ＨＳＶ－１及びＨＳＶ－２、並びにインフルエンザウイルスを含むウイルス感染性疾患のための治療的用途（疾患の治療及びその発症又は進行の遅延等）に有用である。本明細書に記載されるように使用され得る病原体に関連する他の抗原は、マラリア、好ましくはＮＡＮＰの反復に基づくマラリアペプチドを含む、様々な寄生虫の抗原である。加えて、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｂｒｕｇｉａ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ、Ｃｏｃｃｉｄｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ、Ｇｏｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、Ｐａｒａｍｅｃｉｕｍ、Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ、Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ、及びＶｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅ等の細菌性、真菌性、及び他の病原性疾患が含まれる。例示の種には、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｇｏｎｏｒｒｈｅａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓｖａｇｉｎａｌｉｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｖａｇｉｎａｌｉｓ、Ｂ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ菌種、Ｍｉｃｒｏｐｌａｓｍａｈｏｍｉｎｉｓ、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓｄｕｃｒｅｙｉ、Ｇｒａｎｕｌｏｍａｉｎｇｕｉｎａｌｅ、Ｌｙｍｐｈｏｐａｔｈｉａｖｅｎｅｒｅｕｍ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｐａｌｌｉｄｕｍ、Ｂｒｕｃｅｌｌａａｂｏｒｔｕｓ．Ｂｒｕｃｅｌｌａｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａｓｕｉｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａｃａｎｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｆｅｔｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｆｅｔｕｓｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｐｏｍｏｎａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａｏｖｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａｐｓｉｔｔａｃｉ、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓｆｏｅｔｕｓ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａｇｏｎｄｉｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓｅｑｕｕｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａａｂｏｒｔｕｓｏｖｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａａｂｏｒｔｕｓｅｑｕｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｅｑｕｉ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｃｉｌｕｓｓｅｍｉｎｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｂｏｖｉｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ａｂｓｉｄｉａｒａｍｏｓａ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａｅｑｕｉｐｅｒｄｕｍ、Ｂａｂｅｓｉａｃａｂａｌｌｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｔｅｔａｎｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、又は真菌、例えば、Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ等、又は他の病原体、例えば、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｆａｌｃｉｐａｒｕｍが含まれる。国立アレルギー感染病研究所（ＮＩＡＩＤ）優先病原体も含まれる。これらには、カテゴリーＡ薬剤、例えば、大痘瘡（天然痘）、Ｂａｃｉｌｌｕｓａｎｔｈｒａｃｉｓ（炭疽）、Ｙｅｒｓｉｎｉａｐｅｓｔｉｓ（ペスト）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｂｏｔｕｌｉｎｕｍ毒素（ボツリヌス中毒症）、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ（野兎病）、フィロウイルス（エボラ出血熱、マールブルグ出血熱）、アレナウイルス（ラッサ（ラッサ熱）、フニンウイルス（アルゼンチン出血熱）、及び関連ウイルス）、カテゴリーＢ薬剤、例えば、Ｃｏｘｉｅｌｌａｂｕｒｎｅｔｔｉ（Ｑ熱）、Ｂｒｕｃｅｌｌａ種（ブルセラ症）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｍａｌｌｅｉ（鼻疽）、アルファウイルス（ベネズエラ脳脊髄炎、東部及び西部ウマ脳脊髄炎）、Ｒｉｃｉｎｕｓｃｏｍｍｕｎｉｓ（ヒマシ実）由来のリシン毒素、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓのイプシロン毒素、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓエンテロトキシンＢ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ種、Ｓｈｉｇｅｌｌａｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ菌株Ｏ１５７：Ｈ７、Ｖｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍｐａｒｖｕｍ、カテゴリーＣ薬剤、例えば、ニパウイルス、ハンタウイルス、ダニ媒介性出血熱ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、黄熱、及び多剤耐性結核菌、蠕虫、例えば、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ及びＴａｅｎｉａ、並びに原虫、例えば、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ（例えば、Ｌ．ｍｅｘｉｃａｎａ）及びＰｌａｓｍｏｄｉｕｍが含まれる。

なお別の実施形態では、本発明の抗体又は抗原結合断片は、診断、予後、及び予防用途に加えて、免疫学的耐性、臓器移植片拒絶、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、アレルギー性疾患、及びＰＤ－１によって媒介された免疫反応の減弱によって引き起こされる疾患の誘導に関して治療的用途に有用である。

本発明との関連で、本明細書で使用される「治療すること」又は「治療」という用語は、かかる用語が適用される障害若しくは状態、又はかかる障害若しくは状態の１つ以上の症状を逆転させるか、軽減するか、その進行を抑制するか、又は予防することを意味する。本明細書で使用される「がんを治療する」という用語は、がんの細胞の成長及び／又は増殖の抑制を意味する。好ましくは、かかる治療は、腫瘍成長の退縮（すなわち、測定可能な腫瘍のサイズの減少）ももたらす。最も好ましくは、かかる治療は、腫瘍の完全退縮をもたらす。

いくつかの実施形態では、「患者」又は「それを必要とする患者」という用語は、異常なＰＤ－１活性化に関連するがんに罹患しているか、又は罹患する可能性の高いヒト又は非ヒト哺乳動物を対象とする。

本発明のポリペプチドの「治療有効量」とは、いずれの医学的治療にも適用可能な合理的なベネフィット／リスク比でがん等の目的とする障害を治療するのに十分な抗体の量を意味する。しかしながら、本発明の抗体及び組成物の総１日使用量は、正しい医学的判断の範囲内で主治医によって決定されることが理解されるであろう。任意の特定の患者の特定の治療有効用量レベルは、治療される障害及び障害の重症度；用いられる特定の抗体の活性；用いられる特定の組成物、患者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別、及び食生活；用いられる特定の抗体の投与時間、投与経路、及び排泄速度；治療期間；用いられる特定のポリペプチドと組み合わせて又はそれと同時に使用される薬物；並びに医学技術分野で周知の同様の因子を含む様々な因子に依存するであろう。例えば、所望の治療効果を達成するのに必要なレベル未満のレベルで化合物の投与を開始し、所望の効果が達成されるまで投薬量を徐々に増加させることが当業者に周知である。

本発明の抗体を１つ以上含む治療用製剤は、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で、所望の純度を有する抗体を、任意選択の生理学的に許容される担体、賦形剤、又は安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ１６ｔｈｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））と混合することによって保管用に調製される。抗体組成物は、良好な医療行為と一致する様式で製剤化、投薬、及び投与される。この関連での考慮すべき因子には、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤送達部位、投与方法、投与のスケジュール、及び医師に既知の他の因子が含まれる。

治療用量は、少なくとも約０．０１μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約０．０５μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約０．１μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約０．５μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約１μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約２．５μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約５μｇ／ｋｇ体重、及び約１００μｇ／ｋｇ体重以下であり得る。当業者であれば、かかるガイドラインが、例えば、抗体断片の使用時又は抗体コンジュゲートの使用時に、活性薬剤の分子量に応じて調整されることを理解するであろう。投薬量は、局所投与、例えば、経鼻、吸入等、又は全身投与、例えば、筋肉内、腹腔内、静脈内等によっても変化し得る。

本組成物は、活性を増強するか、又は別様に治療効果を高める１つ以上の薬剤を必要としないが、任意選択でそれと製剤化される。これらは、一般に、本明細書で使用される同じ投薬量及び投与経路で、又はこれまでに用いられた投薬量の約１～９９％で使用される。

許容される担体、賦形剤、又は安定剤は、用いられる投薬量及び濃度でレシピエントに非毒性であり、これらには、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸等の緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；保存料（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル、又はベンジルアルコール；メチルパラベン又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾール等）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖、二糖、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、又はソルビトール等の糖；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体（例えば、亜鉛－タンパク質錯体）、及び／又はＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤が含まれる。インビボ投与に使用される製剤は、滅菌でなければならない。これは、無菌濾過膜を通した濾過によって容易に達成される。

これらの活性成分は、例えば、液滴形成技法又は界面重合によって調製されたマイクロカプセルに、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ－（メチルメタクリレート）マイクロカプセルに、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）に、又はマクロエマルジョンに封入される場合もある。かかる技法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ１６ｔｈｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。

本明細書に記載の組成物は、非経口、皮下、腹腔内、肺内、及び鼻内を含む任意の好適な手段によって投与され得る。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与が含まれる。加えて、本組成物は、特に抗体の用量の減少に伴うパルス注入によって好適に投与され得る。

疾患の予防又は治療のために、抗体の適切な投薬量は、上で定義される治療される疾患のタイプ、疾患の重症度及び経過、抗体が予防のために投与されるか、以前の療法、患者の臨床歴及び抗体に対する応答、及び主治医の判断に依存するであろう。抗体は、１回又は一連の治療にわたって患者に好適に投与される。

ｅ．アッセイ及びスクリーニング法
本発明の別の態様は、非細胞ベースのアッセイ及び異種移植片動物モデルアッセイを含むスクリーニングアッセイに関する。一実施形態では、これらのアッセイは、ＰＤ－１シグナル伝達を減少させ、それにより、免疫応答を増加させる薬剤を特定し、かつ／又はＰＤ－１シグナル伝達を増加させ、それにより、免疫応答を減少させる薬剤を特定するために、ヒト又は動物モデルアッセイ等においてＰＤ－１シグナル伝達を調節する薬剤を特定するための方法を提供する。

一実施形態では、本発明は、ＰＤ－１等の、本明細書（例えば、表、図、実施例、又は本明細書の他の箇所）に記載の少なくとも１つのバイオマーカーに結合するか、又はその生物学的活性を調節する試験薬剤をスクリーニングするためのアッセイに関する。一実施形態では、かかる薬剤を特定するための方法は、本明細書に記載の少なくとも１つのバイオマーカーを調節する、例えば、阻害する薬剤の能力の決定を伴う。

一実施形態では、アッセイは、本明細書に記載の少なくとも１つのバイオマーカーを試験薬剤と接触させることと、以下に記載されるように基質の直接結合を測定すること又は間接的パラメータを測定すること等によって、バイオマーカーの酵素活性を調節する（例えば、阻害する）試験薬剤の能力を決定することとを含む、無細胞アッセイ又は細胞ベースのアッセイである。

例えば、直接結合アッセイでは、結合が複合体中の標識タンパク質又は分子を検出することによって決定され得るように、バイオマーカータンパク質（又はそれらのそれぞれの標的ポリペプチド又は分子）が放射性同位体又は酵素標識にカップリングされ得る。例えば、標的は、直接的又は間接的のいずれかで、^１２５Ｉ、^３５Ｓ、^１４Ｃ、又は^３Ｈで標識され得、放射性同位体が放射線放出の直接計数又はシンチレーション計数によって検出され得る。代替的に、標的は、例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、又はルシフェラーゼで酵素的に標識され得、酵素標識が適切な基質の産物への変換の決定によって検出され得る。バイオマーカーと基質との間の相互作用の決定が標準の結合又は酵素分析アッセイを使用して達成される場合もある。上述のアッセイ方法の１つ以上の実施形態では、ポリペプチド又は分子を固定化して、タンパク質又は分子の一方又は両方の複合体形成されていない形態からの複合体形成された形態の分離を促進し、かつアッセイの自動化を適応させることが望ましくあり得る。

試験薬剤の標的への結合は、反応物を収容するのに好適な任意の容器内で達成され得る。かかる容器の非限定的な例には、マイクロタイタープレート、試験管、及び微小遠心管が挙げられる。本明細書に記載の抗体の固定化された形態は、多孔性、微孔性（約１ミクロン未満の平均細孔径を有する）又はマクロ多孔性（約１０ミクロン超の平均細孔径を有する）材料、例えば、膜、セルロース、ニトロセルロース、若しくはガラス繊維；ビーズ、例えば、アガロース若しくはポリアクリルアミド若しくはラテックス製のもの；又は皿、プレート、若しくはウェルの表面、例えば、ポリスチレン製のもの等の固相に結合した抗体も含み得る。

代替の実施形態では、バイオマーカーと基質又はバイオマーカーとその天然結合パートナーとの間の相互作用を調節する薬剤の能力決定は、シグナル伝達経路（例えば、フィードバックループ）内のその位置の下流又は上流で機能するポリペプチド又は他の産物の活性を調節する試験薬剤の能力を決定することによって達成され得る。かかるフィードバックループは当該技術分野で周知である（例えば、ＣｈｅｎａｎｄＧｕｉｌｌｅｍｉｎ（２００９）Ｉｎｔ．Ｊ．ＴｒｙｐｔｏｐｈａｎＲｅｓ．２：１－１９を参照のこと）。

本発明は更に、上述のスクリーニングアッセイによって特定された新規の薬剤に関する。したがって、本明細書に記載されるように特定された薬剤を適切な動物モデル等に更に使用することは本発明の範囲内である。例えば、本明細書に記載されるように特定された薬剤が動物モデルに使用されて、かかる薬剤での治療の有効性、毒性、又は副作用を決定することができる。代替的に、本明細書に記載されるように特定された抗体が動物モデルに使用されて、かかる薬剤の作用機構を決定することができる。

ＶＩＩＩ．キット
加えて、本発明は、生体試料中のＰＤ－１ポリペプチド又はその断片の存在を検出するためのキットも包含する。例えば、キットは、生体試料中のＰＤ－１ポリペプチド又はその断片を検出することができる標識化合物又は薬剤、試料中のＰＤ－１ポリペプチド又はその断片の量を決定するための手段、及び試料中のＰＤ－１ポリペプチド又はその断片の量を標準と比較するための手段を含み得る。化合物又は薬剤は、好適な容器に包装することができる。例えば、本発明は、本明細書に記載の少なくとも１つの抗体を含むキットを提供する。本発明の抗体を含むキットは、ＰＤ－１の検出又は治療若しくは診断アッセイで使用され得る。本発明のキットは、固体支持体、例えば、組織培養プレート又はビーズ（例えば、セファロースビーズ）に結合した抗体を含み得る。

キットは、キットが設計される特定の用途を容易にするための追加の成分を含み得る。例えば、インビトロでの、例えば、ＥＬＩＳＡ又はウエスタンブロットでのＰＤ－１の検出及び定量化のための抗体を含むキットが提供され得る。キットが含み得る追加の例示の薬剤には、標識を検出する手段（例えば、酵素標識のための酵素基質、蛍光標識を検出するためのフィルターセット、ヒツジ抗マウス－ＨＲＰ等の適切な二次標識等）及び対照に必要な試薬（例えば、対照生体試料又はＰＤ－１タンパク質標準）が挙げられる。キットは、開示される本発明の方法での使用が認められている緩衝液及び他の試薬を更に含み得る。非限定的な例には、担体タンパク質又は洗剤等の非特異的結合を減少させる薬剤が挙げられる。本発明のキットは、本明細書に提供される開示される本発明の方法における開示される本発明のキット又は抗体の使用を開示又は記載する教材も含み得る。

本発明は、以下の実施例によって更に例証され、これらは、限定するものと解釈されるべきではない。本明細書を通じて引用される全ての参考文献、特許、及び公開された特許出願の内容、並びに図面は、参照により本明細書に組み込まれる。

実施例１：ＰＤ－１に係合し、アゴニスト又はアンタゴニストのいずれかとして機能する二重特異性分子を使用したＴ細胞活性の選択的調節
ＰＤ－１アゴニストとして機能する二重特異性分子を使用してＴ細胞活性を阻害する方法が開示される。これらの分子は、Ｔ細胞表面上のＰＤ－１に結合し、また、隣接する細胞の対向する表面上の抗原にも結合する。この二重特異性相互作用により、それらはＴ細胞表面上にＰＤ－１をクラスター化し、このクラスターを免疫学的シナプスに共局在化させ、それによってＰＤ－１を活性化し、Ｔ細胞活性を阻害する。これらの分子がＰＤ－１アゴニストとして機能するためには、標的細胞表面上の抗原の係合が必要であり、この特性を利用して、いくつかの組織上のＴ細胞活性を阻害するが、他の組織上のＴ細胞活性を阻害しない選択的ＰＤ－１アゴニストとして機能する分子を作製することができる。分子のこのカテゴリーは、本明細書では、位置特異的Ｔ細胞阻害分子（ＬｏＳＴＩＭ）と称される。ＬｏＳＴＩＭはまた、その天然リガンドによるＰＤ－１の係合を遮断するように設計されてもよく、その場合、それは、ＬｏＳＴＩＭに結合しない組織と相互作用するＴ細胞上のＰＤ－１のアンタゴニストとして機能することになり、一方、ＬｏＳＴＩＭに結合する組織と相互作用するＴ細胞上のＰＤ－１のアゴニストとして依然として機能する。したがって、その設計の単一のＬｏＳＴＩＭ分子は、組織の状況に応じて、Ｔ細胞機能の増強因子又は阻害剤のいずれかとして機能することになる。対照的に、その天然リガンドによるＰＤ－１の係合を遮断しないＬｏＳＴＩＭは、Ｔ細胞機能の細胞特異的及び／又は組織特異的阻害剤としてのみ機能することになる。

例示的なＬｏＳＴＩＭの概要を図１Ａ～図１Ｃに示す。図１Ａは、ＬｏＳＴＩＭの概略図を示す。ＬｏＳＴＩＭは、ＰＤ－１、並びにＴ細胞活性の阻害が望まれる場合、組織上で発現される任意の細胞特異的及び／又は組織特異的表面抗原に同時に結合することができる分子である。図１Ｂは、ＬｏＳＴＩＭの一実施形態が、Ｔ細胞上のＰＤ－１分子、並びに対向する体細胞の表面上の抗原の分子に同時に結合し、それによって、２つの細胞間の免疫学的シナプスに近接したＴ細胞表面上のＰＤ－１をクラスター化することを示す。ＰＤ－１のこのクラスター化及び共局在化は、Ｔ細胞活性化を阻害する。図１Ｃは、ＬｏＳＴＩＭの一実施形態が、Ｔ細胞上のＰＤ－１に結合するが、対向する体細胞表面上の抗原に結合しないことを示し、なぜなら、その同種抗原は、その細胞によって発現されないからである。ＬｏＳＴＩＭは、対向する細胞表面に結合することによって所定の位置に固定されないため、ＰＤ－１をクラスター化することも、Ｔ細胞表面上の免疫学的シナプスとＰＤ－１を共局在化することもできず、したがって、Ｔ細胞活性化を阻害しない。この状況では、ＬｏＳＴＩＭのＰＤ－１結合ドメインが、その天然リガンドによるＰＤ－１の係合を阻害する場合、ＬｏＳＴＩＭは、Ｔ細胞活性化の増強因子として機能する。

４つの一般化されたＬｏＳＴＩＭ設計を、その後の研究において評価した。（１）ｓｃＦｖが、Ｔ細胞阻害が所望される組織上に発現される細胞特異的及び／又は組織特異的表面抗原に結合する、ＰＤＬ１－ｓｃＦｖ融合タンパク質、（２）ｍＡｂが、Ｔ細胞阻害が所望される組織上に発現される細胞特異的及び／又は組織特異的表面抗原に対して向けられる、ＰＤＬ１－ｍＡｂ融合体、並びに（３）及び（４）、ＰＤ－１に対する、並びにＴ細胞阻害が所望される組織上に発現される細胞特異的及び／又は組織特異的表面抗原に対するアビディティーを有する、二重特異性モノクローナル抗体。図２は、これらの研究で使用されたＬｏＳＴＩＭの概略図を示す。ＬｏＳＴＩＭ１～４は、Ｔｈｙ１．２（ＣＤ９０．２）及びマウスＰＤ－１に対する二重特異性アビディティーを有する。抗Ｔｈｙ１．２結合ドメインは、抗Ｔｈｙ１．２クローンＡＦ６の可変領域であり、抗ＰＤ－１結合ドメインは、抗ＰＤ－１クローン１Ａ１２の可変領域を介する。ＬｏＳＴＩＭ５～８は、Ｈ－２Ｋｂ（Ｃ５７Ｂ６クラスＩＭＨＣ対立遺伝子）及びマウスＰＤ－１に対する二重特異性アビディティーを有する。抗Ｈ－２Ｋｂ結合ドメインは、抗Ｈ－２ＫｂクローンＡＦ６の可変領域である。抗ＰＤ－１クローン１Ａ１２は、ＰＤ－１と、その天然リガンドとの相互作用を遮断し、ＰＤ－１アンタゴニストとして機能することが知られていることに留意されたい。抗体ＬｏＳＴＩＭのＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメインは、Ｃ１ｑ及びＦｃガンマ受容体結合を阻害することが知られているいくつかの点変異を含有し、したがって、これらのＦｃドメインを「不活性」にする。

これらのＬｏＳＴＩＭの配列を実施例２に示す。

これらの構築物を使用したＬｏＳＴＩＭ結合を調査し、いくつかの結果を図３Ａ～図３Ｄに示す。図３Ａに示すように、マウスＰＤ－１を過剰発現するトランスジェニックマウスプロＢ細胞である３００－ｍＰＤ－１細胞を、様々な濃度のＬｏＳＴＩＭ２～４及び６～８に曝露した。結合は、抗ｍＩｇＧ２ａ－ＰＥコンジュゲートを介して検出された。図３Ｂは、相対ＰＤ－１アビディティーのより良い評価を可能にするように正規化されたパネルＡからのデータを示す。図３Ｃに示すように、ＧＭ－ＣＳＦと８日間培養したＣ５７Ｂ６骨髄細胞から生成した骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣＣ）を、様々な濃度のＬｏＳＴＩＭ６～８に曝露した。結合は、抗ｍＩｇＧ２ａ－ＰＥコンジュゲートを介して検出された。図３Ｄに示すように、ＢＭＤＤＣを、様々な濃度のＬｏＳＴＩＭ６～８に曝露した。マウスＰＤ－１－ヒトＦｃ融合タンパク質の結合を検出することによって二重特異性結合を評価した。抗ヒトＩｇＧ－ＰＥコンジュゲートを、ディテクターとして使用した。

更なる結果を図４に提供し、その図は、ＳＩＩＮＦＥＫＬパルス骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＤＣ）によるＯＴ－ＩＴ細胞活性化が、ＬｏＳＴＩＭによって阻害されることを示す。Ｃ５７Ｂ６骨髄細胞をＧＭ－ＣＳＦで８日間培養し、ＢＭＤＤＣを得た。これらのＢＭＤＤＣを、１０マイクロモルのＳｅｒ－Ｉｌｅ－Ｉｌｅ－Ａｓｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ－Ｌｅｕ（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）ペプチドで６時間パルスし、洗浄し、次いで、Ｈ－２Ｋｂの関連でＳＩＩＮＦＥＫＬを認識する組換えＴＣＲを発現する、ＣＦＳＥ標識化ＯＴ－ＩＣＤ８ａ＋Ｔ細胞と共培養した。これらのＴ細胞は、ＯＴ－Ｉマウス脾細胞から負の磁気選別によって得られた。共培養物を、０．５マイクロモルの抗Ｈ－２Ｋｂ指向性ＬｏＳＴＩＭ５、６、７、又は８で処理した。細胞を７２時間共培養した。上に示されるヒストグラムは、ゲーティングされたＣＤ８＋細胞を表す。

ＢＭＤＤＣを用いずに培養したＯＴ－ＩＴ細胞は、不活性であった（ＣＦＳＥ希釈によって１．４％の増殖）。ＢＭＤＤＣで刺激されたＯＴ－ＩＴ細胞は、活性化した（ＣＦＳＥ希釈によって８７．３％の増殖）。ＬｏＳＴＩＭ５は、ＢＭＤＤＣによる活性化ＯＴ－ＩＴ細胞に対してごくわずかな影響を及ぼした（ＣＦＳＥ希釈によって８４．３％の増殖）。ＬｏＳＴＩＭ６は、ＢＭＤＤＣによるＯＴ－ＩＴ細胞活性化を阻害した（ＣＦＳＥ希釈によって６２．４％の増殖）。ＬｏＳＴＩＭ７は、ＢＭＤＤＣによるＯＴ－ＩＴ細胞活性化を最も強力に阻害した（ＣＦＳＥ希釈によって４３．９％の増殖）。ＬｏＳＴＩＭ８は、ＯＴ－ＩＴ細胞活性化に対して中程度の影響を及ぼした（ＣＦＳＥ希釈によって７８．４％の増殖）。

この実験は、様々な分子設計のＬｏＳＴＩＭ分子によるＴ細胞活性の阻害を実証する。これらの分子は全て、Ｔ細胞上のＰＤ－１、及びＴ細胞と相互作用する細胞の表面上の抗原を同時に結合することができる。

図５に示されるように、ＯＴ－ＩＴ細胞活性化のＬｏＳＴＩＭ媒介性阻害が、Ｈ－２Ｋｂ遮断によるものではなく、ＰＤ－１を係合するＬｏＳＴＩＭを必要とすることも見出されている。ＳＩＩＮＦＥＫＬ－パルスＢＭＤＤＣによるＯＴ－Ｉ活性化の阻害が、ＬｏＳＴＩＭによるＨ－２Ｋｂ抗原提示の遮断に単に起因するかどうかに対処するために、ＣＦＳＥ標識化ＯＴ－ＩＣＤ８ａ＋Ｔ細胞を、０．５マイクロモルの抗Ｈ－２Ｋｂ、クローンＡＦ６の存在下でＢＭＤＤＣと共培養した。ＬｏＳＴＩＭ５～８のＨ－２Ｋｂ結合ドメインは、このクローンに由来するので、ＡＦ６は、ＬｏＳＴＩＭ５～８と同じＨ－２Ｋｂのエピトープに結合することが予想されることになる。共培養の５７時間後、ＯＴ－ＩＴ細胞活性化を、ＣＦＳＥ希釈及びＣＤ６９発現によって評価した。

抗体処理の不在下でＢＭＤＤＣと共培養したＯＴ－Ｉ細胞は、活性化した（ＣＦＳＥ希釈によって６３．６％の増殖及び４２．６％のＣＤ６９発現）。このような共培養物に抗Ｈ－２ＫｂクローンＡＦ６を添加しても、Ｔ細胞活性化は阻害されなかった（ＣＦＳＥ希釈によって７３．４％の増殖及び６７．４％のＣＤ６９発現）。このような共培養物に等モル量の抗Ｈ－２ＫｂクローンＡＦ６及びＬｏＳＴＩＭ７を添加すると、Ｔ細胞活性化のいくらかの阻害が生じた（ＣＦＳＥ希釈によって４２．５％の増殖及び３８．８％のＣＤ６９発現）。

要約すると、抗Ｈ－２ＫｂクローンＡＦ６での処理は、Ｔ細胞活性化を阻害するのに十分ではなかった。したがって、Ｔ細胞活性化のＬｏＳＴＩＭ媒介性阻害は、単にＨ－２Ｋｂ抗原提示の遮断によるものではなかった。更に、ＬｏＳＴＩＭ７及び抗Ｈ－２ＫｂクローンＡＦ６の等モル混合物は、Ｔ細胞活性化にいくらかの阻害を及ぼすことができた。ＬｏＳＴＩＭ７及びクローンＡＦ６が、同じＨ－２Ｋｂ結合ドメインを有するため、表面Ｈ－２Ｋｂ上の２種の平衡化が予想されることになる。この種の１：１混合物を含有した共培養において、Ｔ細胞活性化が阻害されたため、Ｈ－２Ｋｂ及びＰＤ－１の両方に結合するＬｏＳＴＩＭ分子の存在が、Ｔ細胞阻害に必要であることが実証された。

図６に示される実験結果が実証するように、同種異系Ｔ細胞活性化は、ＬｏＳＴＩＭ処理によって阻害される。ＬｏＳＴＩＭ分子が、同種異系細胞によるＴ細胞の活性化を阻害できるかどうかに対処するために、Ｃ５７Ｂ６ＢＭＤＤＣを、０．５マイクロモルでＬｏＳＴＩＭ５～８の存在下で８４時間、ＣＦＳＥ標識化ＢＡＬＢ／ｃＣＤ８Ｔ細胞と共培養した。

Ｃ５７Ｂ６マウスに由来するＢＭＤＤＣと共培養したＢＡＬＢ／ｃＣＤ８Ｔ細胞は、強力に活性化した（ＣＦＳＥ希釈によって９１．８％の増殖）。ＬｏＳＴＩＭ５とのそのような共培養の処理は、Ｔ細胞活性化に対して最小限の阻害効果しか及ぼさなかった（ＣＦＳＥ希釈によって８５．５％の増殖）。ＬｏＳＴＩＭ６による処理は、Ｔ細胞活性化を阻害した（ＣＦＳＥ希釈によって７１．１％の増殖）。ＬｏＳＴＩＭ７による処理は、Ｔ細胞活性化の最も強力な阻害をもたらした（ＣＦＳＥ希釈によって６３．６％の増殖）。また、ＬｏＳＴＩＭ８による処理は、Ｔ細胞活性化の阻害をもたらした（ＣＦＳＥ希釈によって６９．１％の増殖）。

要約すると、様々な分子設計のＬｏＳＴＩＭ分子は、Ｔ細胞の同種異系活性化を阻害することができる。

図７に示される実験結果は、ＬｏＳＴＩＭが、相互作用細胞の表面に結合して、Ｔ細胞活性化を阻害すること、及びＰＤ－１の、その天然リガンドへの結合を阻害するＬｏＳＴＩＭが、相互作用細胞の表面にも結合しない場合、Ｔ細胞活性化を増強することとなることを示す。対向する細胞の表面へのＬｏＳＴＩＭの結合が、Ｔ細胞活性化の阻害に必要であるかどうかを決定するために、ＣＦＳＥ標識化ＯＴ－ＩＣＤ８Ｔ細胞を、０．５マイクロモルでＬｏＳＴＩＭ１～４の存在下で５７時間、ＳＩＩＮＦＥＫＬパルスＢＭＤＤＣと共培養した。ＬｏＳＴＩＭ１～４は、Ｈ－２Ｋｂ結合ドメインの代わりにＴｈｙ１．２（ＣＤ９０．２）結合ドメインを有することを除いて、ＬｏＳＴＩＭ５～８と分子設計が同一である。ＢＭＤＤＣは、Ｔｈｙ１．２を発現しないため（上のパネルＢ）、ＬｏＳＴＩＭ１～４は、ＢＭＤＤＣの表面に結合しないことになる。これらのＬｏＳＴＩＭは、ＬｏＳＴＩＭ５～８と同じＰＤ－１結合ドメインを有するため、それらは、依然としてＴ細胞上のＰＤ－１に結合することになる。

抗体処理の不在下でＢＭＤＤＣと共培養したＯＴ－Ｉ細胞は、活性化した（ＣＦＳＥ希釈によって６３．６％の増殖及び４２．６％のＣＤ６９発現）。ＬｏＳＴＩＭ１～４による処理は、これらの共培養においてＴ細胞活性化を阻害しなかった。実際に、ＬｏＳＴＩＭ１～４は、Ｔ細胞活性化を様々な程度まで増強した。ＬｏＳＴＩＭ１は、Ｔ細胞活性化に対して最小限の増強効果を及ぼした（６８．４％の増殖及び５６％のＣＤ６９発現）。ＬｏＳＴＩＭ２は、Ｔ細胞活性化を顕著に増強した（９８．６％の増殖及び７８．９％のＣＤ６９発現）。また、ＬｏＳＴＩＭ３は、Ｔ細胞活性化を増強した（９０．１％の増殖及び６１％のＣＤ６９発現）。また、ＬｏＳＴＩＭ４は、Ｔ細胞活性化を顕著に増強した（９６．１％の増殖及び７９％のＣＤ６９発現）。

これらのデータは、Ｔ細胞上のＰＤ－１への結合自体が、ＬｏＳＴＩＭが、Ｔ細胞阻害を媒介するには不十分であることを実証している。ＬｏＳＴＩＭは、対向する細胞の表面上の抗原にトランスで結合する。ＰＤ－１及びＴ細胞表面上の別の抗原へのシス結合は、Ｔ細胞阻害を媒介するのに不十分であり、これは、図７及び図４のデータによって実証される。なぜなら、両方の場合において、ＯＴ－ＩＴ細胞は、使用されるＬｏＳＴＩＭに対する同種結合抗原の両方を発現するからである。最後に、図７のデータは、ＰＤ－１とその天然リガンドとの相互作用を遮断するＬｏＳＴＩＭが、対向する細胞の表面にも結合しない場合、Ｔ細胞活性を阻害するのではなく、強化することになることを実証する。

実施例２：実施例１で使用されるＬｏＳＴＩＭの代表的な配列

実施例３：ＬｏＳＴＩＭの様々な代表的な使用
ＬｏＳＴＩＭの概念的概要を図８に示す。Ｔ細胞上のＰＤ－１及び対向する標的細胞上の細胞表面抗原へのＬｏＳＴＩＭのトランス二重特異性結合は、Ｔ細胞表面上のＰＤ－１クラスター化及びこのクラスターと免疫学的シナプスとの共局在化をもたらし、それによってＰＤ－１を活性化し、Ｔ細胞活性を阻害する。ＰＤ－１は、Ｔ細胞表面上で横方向に自由に移動し、それは、免疫学的シナプスに近接してクラスター化されると活性化される。したがって、標的細胞上の表面抗原及びＴ細胞上のＰＤ－１へのＬｏＳＴＩＭのトランス二重特異性結合は、免疫学的シナプスが位置する細胞－細胞界面においてＰＤ－１を動員し、クラスター化することになる。これはＰＤ－１を活性化し、ＴＣＲシグナル伝達及びＴ細胞活性の阻害をもたらす。標的細胞表面上の抗原の係合が、ＬｏＳＴＩＭがＰＤ－１アゴニストとして機能するために必要である。単にＰＤ－１に結合するだけでは、ＰＤ－１をクラスター化せず、免疫学的シナプスに共局在化しないことになり、したがって、Ｔ細胞活性を阻害しないことになる。この特性により、ＬｏＳＴＩＭは選択的ＰＤ－１アゴニストとして機能し、表面抗原を発現する組織においてのみＴ細胞活性を阻害することができる。ＬｏＳＴＩＭは、その天然リガンドによるＰＤ－１の係合を遮断するように設計されてもよいか、又はされなくてもよい。それが、ＰＤ－１の、そのリガンドによる係合を遮断するように設計されている場合、それは、表面抗原を発現しない組織と相互作用するＴ細胞上のＰＤ－１のアンタゴニストとして機能し、一方、表面抗原を発現する組織と相互作用するＴ細胞上のＰＤ－１のアゴニストとして依然として機能する。したがって、この設計の単一のＬｏＳＴＩＭ分子は、組織の状況に応じて、Ｔ細胞活性の阻害剤又は増強因子のいずれかとして機能することになる。

モデル表面抗原Ｈ－２Ｋ^ｂを発現する細胞への結合を図９に示す。Ｈ－２Ｋ^ｂへの結合は、Ｈ－２Ｋ^ｂを発現することが知られている、Ｃ５７ＢＬ／６結腸直腸がん細胞株ＭＣ３８を使用したフローサイトメトリーによって評価した。特異性は、Ｈ－２Ｋｂを発現しないことが知られている、ＣＴ－２６細胞への結合を評価することによって実証された。ＬｏＳＴＩＭは、ＭＣ３８細胞に強く結合したが、ＣＴ－２６細胞には結合しなかった。別の実験では、Ｈ－２Ｋ^ｂを発現するＣ５７ＢＬ／６マウス由来のＢＭＤＤＣ、又はＨ－２Ｋ^ｂを発現しないＣ３Ｈマウス由来のＢＭＤＤＣを使用して、Ｈ－２Ｋ^ｂへの結合をフローサイトメトリーによって評価した。ＬｏＳＴＩＭは、Ｃ５７ＢＬ／６ＢＭＤＤＣ細胞に強く結合したが、Ｃ３ＨＢＭＤＤＣ細胞には結合しなかった。

ＰＤ－１への結合並びにＰＤ－１及びＨ－２Ｋ^ｂへの二重特異性結合を図１０に示す。ＰＤ－１へのＬｏＳＴＩＭの結合を、マウスＰＤ－１を安定して発現するトランスジェニックマウスプロＢ細胞である３００－ｍＰＤ－１細胞を使用してフローサイトメトリーによって評価した。ＬｏＳＴＩＭは、３００－ｍＰＤ－１細胞に強く結合した。Ｈ－２Ｋ^ｂを発現するが、ＰＤ－１を発現しないＭＣ３８細胞、及びヒトＩｇＧ１Ｆｃドメインを有する可溶性マウスＰＤ－１－Ｆｃ融合体（ｍＰＤ－１－ｈＦｃ）を使用して、ＰＤ－１及びＨ－２Ｋ^ｂへの同時二重特異性結合を、フローサイトメトリーによって評価した。フルオロフォアで標識化した抗ヒトＩｇＧ二次抗体により測定した、ｍＰＤ－１－ｈＦｃのＭＣ３８細胞への結合は、ＭＣ３８細胞上のＨ－２Ｋ^ｂ及びｍＰＤ－１－ｈＦｃへのＬｏＳＴＩＭの二重特異性結合を示した。これにより、ＰＤ－１結合の特異性も確認された。

更なる実験では、図１１に示されるように、ＬｏＳＴＩＭは、ＰＤ－１を発現するＴ細胞に結合するが、ＰＤ－１を発現しないＴ細胞には結合しないことが示された。ＰＤ－１結合特異性を更に確認するために、ＰＤ－１を発現する活性化初代Ｔ細胞へのＬｏＳＴＩＭの結合を、ＰＤ－１を発現しないナイーブ初代Ｔ細胞への結合と比較した。これらのＴ細胞は、Ｈ－２Ｋ^ｂを発現しないＢＡＬＢ／ｃＢｙＪマウスからのマウスから得たものであり、したがって、活性化されたＴ細胞への結合は、ＬｏＳＴＩＭがＰＤ－１に特異的に結合する場合にのみ生じるはずである。ＬｏＳＴＩＭは、活性化されたＢＡＬＢ／ｃＢｙＪＴ細胞に強く結合したが、ナイーブＢＡＬＢ／ｃＢｙＪＴ細胞には結合せず、ＰＤ－１結合の特異性が更に確認された。

Ｔ細胞活性化の阻害を、図１２に示すように調査した。Ｈ－２Ｋ^ｂモデル表面抗原を発現するＡＰＣによるＴ細胞活性化に対するＬｏＳＴＩＭの効果を評価するために、初代ＣＤ４＋ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪＴ細胞（Ｈ－２Ｋ^ｂ陰性）を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスから得られたＢ細胞（Ｈ－２Ｋ^ｂ陽性）と１：１の比で５日間共培養した。培養物を、５００ナノモルの、ＬｏＳＴＩＭ、親抗Ｈ－２Ｋ^ｂ抗体（ＡＦ６－８８．５．３）、親抗ＰＤ－１抗体（２９Ｆ．１Ａ１２）、又はビヒクル（ＰＢＳ）のいずれかで処理した。ＬｏＳＴＩＭは、ＣＦＳＥ希釈によって測定したように、Ｔ細胞のＡＰＣ誘導性増殖を完全に阻害した。ＡＦ６－８８．５．３、２９Ｆ．１Ａ１２、及びビヒクルのいずれも、Ｔ細胞増殖に影響を及ぼさなかった。これは、ＬｏＳＴＩＭが、ＬｏＳＴＩＭに結合する表面抗原を発現するＡＰＣによるＴ細胞活性化を阻害することを実証する。Ｔ細胞上のＰＤ－１及び標的細胞上の表面抗原へのＬｏＳＴＩＭの二重特異性結合は、モデル表面抗原Ｈ－２Ｋ^ｂに結合するＡＦ６－８８．５．３、又はＰＤ－１に結合する２９Ｆ．１Ａ１２のいずれかによるＴ細胞阻害の欠如によって実証されるように、この効果のために必要であった。同様の別の実験では、２つの濃度のＬｏＳＴＩＭを使用し、Ｔ細胞増殖の阻害が、用量依存的であることが見出された。

ＴＣＲシグナル伝達の阻害を、図１３に示されるように調査した。ＴＣＲシグナル伝達への影響を評価するために、オボアルブミン抗原ＳＩＩＮＦＥＫＬを認識するトランスジェニックＴＣＲを発現するＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＯＴ－１マウスから精製し、プレート結合抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体によって活性化させ、静止させ、次いで、ＳＩＩＮＦＥＫＬ抗原を負荷したＣ５７ＢＬ／６細胞によって再刺激した。ＴＣＲ活性化を、リン酸化Ｚａｐ７０に特異的なフルオロフォア標識化抗体を使用して、ホスホフローサイトメトリーによって評価した。Ｚａｐ７０は、ＴＣＲ活性化時にリン酸化及び活性化され、ＴＣＲシグナル伝達に関与する膜近位キナーゼである。ＰＤ－１活性化は、ＴＣＲ媒介性のＺａｐ７０リン酸化を阻害することが知られている。ＬｏＳＴＩＭによる処理は、抗原誘導性のＺａｐ７０リン酸化を阻害した。

Ｔ細胞活性化の細胞特異的及び／又は組織特異的阻害を、図１４に示すように調査した。ＬｏＳＴＩＭの効果を、モデル細胞表面抗原Ｈ－２Ｋ^ｂを発現するＡＰＣとＴ細胞を共培養した場合、及びＨ－２Ｋ^ｂを発現しないＡＰＣとＴ細胞を共培養した場合と比較した。これを達成するために、精製されたＢＡＬＢ／ｃＢｙＪＣＤ８＋Ｔ細胞を、モデル細胞表面抗原Ｈ－２Ｋ^ｂを発現するＣ５７ＢＬ／６マウス由来のＢＭＤＤＣ、又はＨ－２Ｋ^ｂを発現しないＣ３Ｈマウス由来のＢＭＤＤＣのいずれかと共培養した。培養物を様々な濃度のＬｏＳＴＩＭで処理した。相対的Ｔ細胞増殖を、ビヒクル（ＰＢＳ）で処理した共培養物のＴ細胞増殖パーセンテージによってＴ細胞増殖パーセンテージを正規化することによって計算した。アロ刺激の強度はバックグラウンド間で変化し得るため、この計算は、Ｃ５７ＢＬ／６ＢＭＤＤＣ及びＣ３ＨＢＭＤＤＣによって刺激されたＢＡＬＢ／ｃＢｙＪＴ細胞について別々に実施した。Ｔ細胞活性化は、ＬｏＳＴＩＭが標的細胞に結合したときに阻害されたが、ＬｏＳＴＩＭが標的細胞に結合しなかったときには阻害されなかった。

インビボでの同種拒絶の阻害を、図１５に示されるように調査した。ＬｏＳＴＩＭに結合する抗原を発現する標的細胞に対してインビボで免疫活性を阻害するＬｏＳＴＩＭの能力を評価するために同種拒絶のモデルを使用した。（Ｃ５７ＢＬ／６起源の）ＭＣ３８細胞を、ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪマウスに皮下注射した。腫瘍体積は、ＰＢＳをビヒクル対照として与えられたマウスと比較して、ＬｏＳＴＩＭの腹腔内注射を与えられたマウスにおいて有意に大きかった（ｐ＝０．０２９７）。これは、標的細胞が、ＬｏＳＴＩＭが結合する抗原を発現する場合、ＬｏＳＴＩＭが、インビボで標的細胞に対する免疫活性を阻害することができることを実証する。

インビボでのシンジニク（ｓｙｎｇｅｎｉｃ）腫瘍の処置を、図１６に示されるように調査した。同系腫瘍処置のモデルを使用して、ＬｏＳＴＩＭに結合する抗原を発現しない標的細胞に対する免疫活性に対するＬｏＳＴＩＭのインビボ効果を評価した。ＣＴ－２６細胞を、ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪマウスに皮下注射し、マウスを、ＬｏＳＴＩＭ、２９Ｆ．１Ａ１２（ＬｏＳＴＩＭの設計に使用した親抗ＰＤ－１抗体）、又はビヒクル対照としてＰＢＳのいずれかで処置した。ＬｏＳＴＩＭは、ＣＴ－２６細胞に対する免疫活性を阻害しなかった。代わりに、ＬｏＳＴＩＭは、ＣＴ－２６細胞に対する免疫活性を促進し、ＰＤ－１阻害剤２９Ｆ．１Ａ１２と同様に機能した。これは、ＬｏＳＴＩＭが、それが結合する抗原を発現しない標的細胞に対する免疫活性を阻害しないことになることを実証する。更に、ＰＤ－１の天然ライゲーションを遮断するＬｏＳＴＩＭが、これらの状況においてＰＤ－１阻害剤として機能することになることを実証する。

更に、ＬｏＳＴＩＭが、その結合パートナー（ＰＤ－１及び組織抗原）の両方への結合が飽和していない濃度で存在する場合に、Ｔ細胞阻害が生じることを実証する実験を実施し（図１９～２１）、それによって、ＬｏＳＴＩＭが、ＰＤ－１及び組織抗原の両方についての結合曲線が最大結合を予測する濃度未満でＰＤ－１アゴニストとして機能することを確認した（図２１）。理論に拘束されないが、単一のＬｏＳＴＩＭ分子が、対向するＴ細胞表面上の組織抗原及びＰＤ－１に同時に結合し、これが非飽和濃度で有利であると考えられる。反対に、各結合パートナーへの結合が最大である濃度（飽和濃度）では、各結合パートナーへの単一特異性結合が有利であり、これはＰＤ－１クラスター化をもたらさない。例えば、図２１は、濃度が最低親和性結合パートナーの飽和濃度に近づくにつれて減少する前に、濃度が増加するにつれて真の二重特異性結合が増加することを示す。最終結果は、２つの結合パートナーに対する親和性の間のより広い差異を有するＬｏＳＴＩＭは、ＰＤ－１アゴニストとして機能し、したがって、より広い治療濃度域を有する、より広い範囲の濃度を有すると考えられる。反対に、２つの結合パートナーに対してより類似した結合親和性を有するＰＤ－１二重特異性は、ＰＤ－１アゴニズムを促進する真の二重特異性結合を示す、より狭い範囲の濃度を有するであろう。この結果は、抗ＰＤ－１／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体が、ＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１阻害剤（二重チェックポイント阻害剤）の両方として機能することができるが、そのような抗体が、結合パートナーの各々に対して類似の親和性を有すると考えられているため、顕著なＰＤ－１クラスター化及びアゴニズムをもたらさない理由を説明し、このため、ＰＤ－１クラスター化することができる顕著な濃度域はほとんどないであろう。これは、遮断及び非遮断ＬｏＳＴＩＭの両方に適用される。

概して、局所的に（例えば、がん治療のための）ＰＤ－１アゴニストとしても機能する一方で、全身的にＰＤ－１阻害剤として機能することが意図されるＬｏＳＴＩＭは、組織特異的表面抗原に対してより高いＰＤ－１に対する親和性を有することから恩恵を受けるべきである。上で考察したように、ＰＤ－１への結合は、理想的には、腫瘍部位でのＰＤ－Ｌ１の遮断を確実にするために飽和又はそれに近い状態でなければならないが、ＰＤ－１及び表面抗原の両方への結合は、ＬｏＳＴＩＭが表面抗原発現組織上でＰＤ－１アゴニストとして機能するために両方が飽和してはならない。

いくつかの実施形態では、追加のＬｏＳＴＩＭ設計特性が有用であり得、企図される。例えば、ＰＤ－１に対してより高い親和性を有するＬｏＳＴＩＭでは、いくつかの実施形態では、それが一価二重特異性である（各結合パートナーに対して、特にＰＤ－１に対して、２つの結合部位ではなく１つの結合部位を有する）ことが有利であると考えられる。理論に拘束されないが、ＰＤ－１結合のために飽和する濃度で溶液中に存在する場合、二価のＬｏＳＴＩＭは、Ｔ細胞表面上のＰＤ－１の２つ以上のコピーに同時に結合することができ、そうすることによって、ＰＤ－１のこれらの２つのコピーを、それらの活性化と不適合である距離又は配向で架橋することができると考えられる。本明細書に記載されるデータは、二価の単一特異性抗ＰＤ－１抗体（例えば、ｍＡｂ５Ｅ１２）が、その活性化と不適合である距離又は配向でＰＤ－１を架橋することができることを示す（図２３）。ｍＡｂ５Ｅ１２は、ＰＤ－Ｌ１によるＰＤ－１のライゲーションを遮断しない抗ＰＤ－１抗体であるので、チェックポイント阻害剤として機能することは予測されないことになる。しかしながら、それでも腫瘍のクリアランスを促進するように見える（例えば、腫瘍同種移植片は、ビヒクルで処置されたマウスよりも、５Ｅ１２で処置されたマウスにおいてはるかに速く拒絶される）。ｍＡｂ５Ｅ１２はＰＤ－１に結合するが、ＰＤ－Ｌ１結合を遮断しないため、本明細書で提供されるデータは、それが異なる機構を使用してＰＤ－１の機能を妨害することを示し、これは、二量体中で安定化されたＰＤ－１が、何らかの形で活性化と不適合であり、単一のＰＤ－１結合部位の利点を有する二重特異性分子としてのＬｏＳＴＩＭが予想外であるという判定であると考えられる。任意の抗ＰＤ－１クローンは、ＰＤ－１及び表面抗原に対する結合親和性の差、並びに／又はｉｉ）上記のように、局所的にＰＤ－１アゴニストとしても機能しながらチェックポイント阻害剤として全身的に機能するＬｏＳＴＩＭにおける表面抗原よりも高いＰＤ－１に対する結合親和性を有する限り、一価二重特異性ＬｏＳＴＩＭにおいて使用することができるはずである。

いくつかの実施形態では、ＬｏＳＴＩＭは、Ｆｃ－ガンマ受容体（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ１、ＦｃγＲＩＩＢ２、ＦｃγＲＩＩＩＡ、及び／又はＦｃγＲＩＩＩＢ）のようなＩｇＧ抗体受容体へのＦｃの結合を減弱させるような、操作されたＦｃドメインを有し得る。これは、Ｆｃ－ガンマ受容体結合が、Ｆｃ－ガンマ受容体を発現するプロフェッショナル抗原提示細胞の表面にＬｏＳＴＩＭを結合させ、したがって、新たなＴ細胞応答のプライミングを阻害又は部分的に阻害し得るため、いくつかの実施形態では有用である。

本明細書に記載されるように、ＬｏＳＴＩＭ標的化のための表面抗原選択は、保護のために所望の組織上の任意のレベルでの表面抗原の発現があり、がん又は目的の他の組織上での発現がない限り、特に限定されない。しかしながら、いくつかの実施形態では、特定の表面抗原は、特定の臨床用途に特に有用であり得る。例えば、本明細書に記載されるように、免疫関連有害事象（ｉｒＡＥ）に対しても治療又は予防しながら、固形悪性腫瘍を治療することができるＬｏＳＴＩＭについて、表面抗原は、免疫寛容が所望される組織（ｉｒＡＥに影響を受けるか、又は影響を受けるリスクのある組織）上で発現されなければならないが、がん細胞上で発現されてはならない。異なるがん及び異なる末梢組織によって発現される抗原は同一ではない場合があるため、異なる抗原は、目的の所与のがんの種類についての治療との関連でｉｒＡＥのリスクがある特定の組織を保護するのに適切である。いくつかの表面抗原はＬｏＳＴＩＭに適切であり、複数の臨床シナリオにわたって有用である。したがって、ＬｏＳＴＩＭ中のＰＤ－１結合部分及び表面抗原部分の適合性のための生物物理学的基準に加えて、臨床用途の状況で特定の表面抗原を選択するための特定の基準は、以下のうちの１つ以上を含み得る。１）細胞の原形質膜上での存在、２）上皮組織を含む細胞における原形質膜の側底面上での存在、並びに３）免疫細胞と接触し得る細胞表面の部分（例えば、上皮組織を含む細胞の側底面）上での表面抗原発現レベル及び／又は表面密度。

周知のバイオインフォマティクス分析は、目的の表面抗原を特定するために、公開されている周知の遺伝子発現及びタンパク質発現データソースを分析するために適用され得る。例えば、ＨｕｍａｎＰｒｏｔｅｉｎＡｔｌａｓデータセット（バージョン２０．１）を、ｐｒｏｔｅｉｎａｔｌａｓ．ｏｒｇ／ａｂｏｕｔ／ｄｏｗｎｌｏａｄにおいてＷｏｒｌｄＷｉｄｅＷｅｂからダウンロードした。このデータセットは、免疫組織化学を使用した抗体ベースのタンパク質プロファイリングに由来する４４の正常ヒト組織型からのタンパク質発現データを含む。１７形態のヒトがん由来のタンパク質発現プロファイルも、このソース（バージョン２０．１）からダウンロードした。ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇにおいてＷｏｒｌｄＷｉｄｅＷｅｂで入手可能なＴｈｅＵｎｉｖｅｒｓａｌＰｒｏｔｅｉｎＲｅｓｏｕｒｃｅ（Ｕｎｉｐｒｏｔ）から、膜タンパク質（膜内及び膜関連）のリストをダウンロードした（以下の検索用語を使用した：位置：（位置：「膜［ＳＬ－０１６２］」）、及びレビュー：あり及び生物：「Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ（Ｈｕｍａｎ）［９６０６］」）。次に、Ｍａｔｌａｂコンピュータ言語で記述された一連のカスタムコンピュータプログラムを使用して、これらのデータセットを単一のデータベースに統合し、その中で、正常な組織発現プロファイル及びがん組織発現プロファイルが、データベース内の各タンパク質に対して連結される。Ｕｎｉｐｒｏｔから得られたリストに膜タンパク質として記載されていないあらゆるタンパク質を除去するためにデータベースをフィルタリングした後、データベースを、各臨床用途に適切な基準を満たすタンパク質について検索した。ｉｒＡＥ又はＧＶＨＤの治療等のがんの治療を伴う用途では、表面抗原は、免疫寛容が所望される組織上で発現されるが、治療されるがんでは発現されない場合、適切であった。特定の臨床用途における有利な使用のための表面抗原の代表的な非限定的な例には、以下の表が含まれる。

ＰＤ－１結合部分及び表面抗原結合部分対についての生物物理学的及び発現基準の説明に基づいて、以下が代表的であり、非限定的で追加のＬｏＳＴＩＭ構築物の追加の例が、以下の表４Ｂに提供される。

これらのＬｏＳＴＩＭ構築物の各々は、当該技術分野において、及び本明細書に記載される標準的かつ周知の方法を使用して更に操作され得、ヒト化、目的の抗体フォーマット、操作されたＦｃドメイン、リンカー等を含むが、これらに限定されない、本明細書に記載される目的の配列を更に含むことを理解されたい。

本明細書に記載される二重特異性抗体を産生するための多数の設計及び戦略が企図され、任意の組み合わせで任意の実施形態に適用され得る。例えば、いくつかの実施形態は、Ｆｃドメインを含み、他の実施形態は含まないが、これは、薬物動態及び薬物分布の観点からの利点及び欠点をもたらす。いくつかの実施形態は、多価であり、すなわち、各抗原に対して複数の結合部位を有し、いくつかは一価であり、すなわち、各抗原に対して単一の結合部位を有する。いくつかの実施形態は、１つの抗原に対して単一の結合部位及び他の抗原に対して複数の結合部位を有する。いくつかの実施形態は、「ノブインホール（ｋｎｏｂ－ｉｎ－ｈｏｌｅ）」又は静電ステアリング技術を使用する重鎖の非対称ペアリングを伴い、他の実施形態は、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を重鎖又は軽鎖のアミノ末端又はカルボキシ末端に連結することを伴う。多様な人工リンカーを使用して、ｓｃＦｖを、グリシン－セリン及びグリシン－アラニンリンカー等の重鎖又は軽鎖に接続することができる。２つの結合パートナーのための可変領域はまた、人工リンカーによって様々な配向でＦｃドメインなしで互いに接続されてもよく、ダイアボディ及び「二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー」等の設計をもたらす。多量の二重特異性設計は、既知の二重特異性抗体設計のより包括的な一覧を含む、いくつかの総説論文の対象である（例えば、ＢｒｉｎｋｍａｎｎａｎｄＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ（２０１７）ＭＡＢＳ９（２）：１８２－２１２を参照のこと）。

いくつかの実施形態では、細胞型特異的マーカーは、ＭＨＣクラスＩＩである。ＭＨＣクラスＩＩは、プロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）に対する細胞型特異的マーカーである。他の細胞型又は組織型は、このマーカーを発現しない。したがって、クラスＩＩＭＨＣ特異的ＬｏＳＴＩＭは、これらの細胞によるＴ細胞活性化を選択的に防止し、これは、プロフェッショナルＡＰＣによるＴ細胞活性化を防止又は阻害し、Ｔ細胞プライミングの阻害、及びこれらのＡＰＣによって提示されている抗原に対するＴ細胞応答の阻害をもたらす。別の結果は、Ｂ細胞がＭＨＣクラスＩＩを発現するプロフェッショナルＡＰＣであり、これらのプロセスにはＴ細胞との直接的な相互作用を必要とするＴ細胞の支援が必要であるため、Ｂ細胞クラススイッチング及び親和性成熟の阻害である。したがって、ＭＨＣクラスＩＩ特異的ＬｏＳＴＩＭは、抗原に対するＴ細胞（細胞媒介性）及びＢ細胞（体液性）寛容を生じさせるための免疫抑制剤として使用され得る。これらは、自己免疫疾患又は望ましくない同種異系免疫応答の間、例えば臓器移植において体によって自然に提示される抗原であり得る。同様に、抗原は、ＭＨＣクラスＩＩ特異的ＬｏＳＴＩＭと同時に外因的に投与されて、それらの抗原に対する免疫学的寛容をもたらし得る。

実施例４：ＬｏＳＴＩＭ剤は、臨床適応症を治療するために使用され得る
ＬｏＳＴＩＭ剤は、本明細書に記載され、当該技術分野において周知の日常的な手順を使用して、がん、自己免疫疾患、ＧＶＨＤ、ｉｒＡＥ等の本明細書に記載されるような、ＬｏＳＴＩＭの設計に応じて、様々な臨床適応症のリスクがあるか、それを有すると疑われるか、又はそれに罹患している対象を治療するために使用され得る。

例えば、大腸炎は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１阻害後の一般的なｉｒＡＥである（Ａｌｅｓｓａｎｄｒｉｎｏｅｔａｌ．（２０１９）Ａｂｄｏｍ．Ｒａｄｉｏｌ．（ＮＹ）４４（５）：１９１７－１９２７）。実験的自己免疫性大腸炎モデルのバリアントは、ＣＤ８Ｔ細胞活性に依存する（Ｐｕｎｉｔｅｔａｌ．（２０１５）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１４９（４）：９９３－１００５、Ｔａｊｉｍａｅｔａｌ．（２００８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０５：１０１９－１０２７）。ＣＤ８^＋Ｃ４４^低ＣＤ６２Ｌ^＋細胞を、フローサイトメトリー選別によってＣ５７ＢＬ／６末梢リンパ節から精製し、Ｐｕｎｉｔｅｔａｌ．（２０１５）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１４９（４）：９９３－１００５に以前に記載されているように免疫不全Ｃ５７ＢＬ／６Ｒａｇ２－／－レシピエントに養子導入する。大腸炎の発症は、典型的には、養子導入の４～５週間後に発生する。発症前（予防研究）又は発症後（治療研究）のいずれかで、処置を、Ｈ－２Ｋｂ特異的ＬｏＳＴＩＭ、ＡＦ６－８８．５．３（親抗Ｈ－２Ｋｂ）、２９Ｆ．１Ａ１２（親抗ＰＤ１）、又はＰＢＳで開始する。この実験は、親抗ＥｐＣＡＭ単一特異性抗体及び親抗ＰＤ１単一特異性抗体、並びにビヒクル対照としてのＰＢＳを含む適切な対照とともに、ＥｐＣＡＭ特異的ＬｏＳＴＩＭで別々に実施される。Ｃ５７ＢＬ／６組織はＨ－２Ｋ^ｂを発現し、ＥｐＣＡＭも発現するため、前述のＬｏＳＴＩＭは、それらの表面に結合することになり、このモデルではＴ細胞活性を阻害し、免疫媒介性大腸炎を改善することが予想される。

実施例５：材料及び方法
ＬｏＳＴＩＭの設計及び生産
概念実証ＬｏＳＴＩＭは、二重特異性抗体フォーマットで作製した。そのために、まず、マウスＩｇＧ２ａカッパ抗Ｈ－２Ｋ^ｂモノクローナル抗体を発現する、ＡＦ６－８８．５．３ハイブリドーマの重鎖（Ｖ_Ｈ）及び軽鎖（Ｖ_Ｌ）の可変領域の配列を決定した。ＡＦ６－８８．５．３ハイブリドーマは、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手した。Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌを含有するｃＤＮＡは、ｃＤＮＡ末端の急速増幅（ＲＡＣＥ）によって調製した。得られた抗体可変領域ｃＤＮＡ断片を、ＴＯＰＯベクター（ＬａｋｅＰｈａｒｍａ，Ｉｎｃ）にクローニングした。合計１４個のクローンをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅し、ゲル電気泳動及び回収によって精製した。各増幅及び精製クローンを、Ｓａｎｇｅｒ配列決定に供し、単一のＶ_Ｈ及び単一のＶ_Ｌコンセンサス配列を得た。

以下のようにＬｏＳＴＩＭ二重特異性抗体タンパク質配列を設計した。ＡＦ６－８８．５．３Ｖ_Ｈ配列のアミノ酸翻訳を、マウスＩｇＧ２ａＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、及びＦｃドメインのアミノ酸配列のアミノ酸末端に付加した。Ｆｃドメインは、Ｆｃγ受容体結合及びＣ１ｑ結合を減少させることが知られている点置換を含む：Ｌ２３５Ｅ、Ｅ３１８Ａ、Ｋ３２０Ａ、及びＫ３２２Ａ（Ｄｕｎｃａｎｅｔａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ３３２（６１６４）：５６３－４、ＤｕｎｃａｎａｎｄＷｉｎｔｅｒ（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ３３２（６１６６）：７３８－４０、Ｓｔｅｕｒｅｒｅｔａｌ．（１９９５）ＪＩｍｍｕｎｏｌ．１５５（３）：１１６５－７４）。Ｈ－２Ｋ^ｂ及びＰＤ－１の両方に結合可能なＬｏＳＴＩＭを作製するために、抗ＰＤ－１モノクローナル抗体２９Ｆ．１Ａ１２の可変領域のアミノ酸配列を含有する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）配列を構築し、可撓性リンカー配列ＧＧＧＧＡＧＧＧＧ（配列番号１６）によって分離された２つの配列とともに、Ｆｃドメインのカルボキシ末端に付加した。２９Ｆ．１Ａ１２のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ配列は、前述の段落に記載の方法により以前に得られていた。ｓｃＦｖ配列を作製するために、２９Ｆ．１Ａ１２Ｖ_Ｌ配列を、２９Ｆ．１Ａ１２Ｖ_Ｈ配列のアミノ末端に付加し、２つの配列を、可撓性リンカー配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１７）によって分離した。軽鎖アミノ酸配列を作製するために、ＡＦ６－８８．５．３Ｖ_Ｌを、マウスカッパ鎖定常領域のアミノ末端に直接付加した。ＬｏＳＴＩＭの重鎖及び軽鎖をコードするヌクレオチド配列は、コンピュータによる逆転写及びコドン最適化によって得た。シグナルペプチドＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ（配列番号１８）をコードするヌクレオチド配列を、重鎖ヌクレオチド配列及び軽鎖ヌクレオチド配列の両方にすぐ隣接する５’に付加した。

ＡＦ６－８８．５．３Ｖ_Ｈヌクレオチド配列（配列番号１９）
ＧＡＴＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＡＧＴＧＣＡＧＣＣＴＧＧＡＧＧＧＴＣＣＣＧＧＡＡＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＣＴＴＴＣＡＧＴＡＧＣＴＴＴＧＧＡＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＴＣＧＴＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＡＧＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＣＧＣＡＴＡＣＡＴＴＡＧＴＡＧＴＧＧＣＡＧＴＡＡＴＡＣＣＡＴＣＴＡＣＴＡＴＧＣＡＧＡＣＡＣＡＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＴＣＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＣＣＴＧＴＴＣＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＣＣＡＧＴＣＴＡＡＧＧＴＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＡＴＧＴＡＴＴＡＴＴＧＴＧＣＡＣＴＴＡＣＧＡＣＧＧＧＧＴＣＣＴＧＧＴＴＴＧＣＴＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＴＣＴＧＧＴＣＡＣＴＧＴＣＴＣＴＧＣＡ
ＡＦ６－８８．５．３Ｖ_Ｌヌクレオチド配列（配列番号２０）
ＧＡＣＡＴＣＴＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＣＡＴＣＣＴＧＴＣＴＧＴＧＣＧＴＣＣＡＧＧＡＧＡＡＡＧＡＧＴＣＡＧＴＴＴＣＴＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＴＣＡＧＡＧＣＣＴＴＧＧＣＡＣＡＡＧＣＡＴＡＣＡＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＡＡＧＡＡＣＡＧＡＴＧＧＴＴＣＴＣＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＣＡＴＡＡＡＡＴＡＴＧＣＴＴＣＴＧＡＧＴＣＴＡＴＣＴＣＴＧＧＧＡＴＣＣＣＴＴＣＣＡＧＧＴＴＴＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＡＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＴＡＣＴＣＴＴＡＧＣＡＴＣＡＡＣＡＧＴＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＡＡＧＡＴＡＴＴＧＣＡＧＡＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＡＣＡＡＡＧＴＡＡＴＡＧＣＴＧＧＣＣＡＡＴＣＡＣＧＴＴＣＧＧＴＧＣＴＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＡＡ
ＡＦ６－８８．５．３Ｖ_Ｈアミノ酸配列（配列番号２１）
ＤＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＲＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＦＧＭＨＷＶＲＱＡＰＥＫＧＬＥＷＶＡＹＩＳＳＧＳＮＴＩＹＹＡＤＴＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＰＫＮＴＬＦＬＱＭＴＳＬＲＳＥＤＴＡＭＹＹＣＡＬＴＴＧＳＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ
ＡＦ６－８８．５．３Ｖ_Ｌアミノ酸配列（配列番号２２）
ＤＩＬＬＴＱＳＰＡＩＬＳＶＲＰＧＥＲＶＳＦＳＣＲＡＳＱＳＬＧＴＳＩＨＷＹＱＱＲＴＤＧＳＰＲＬＬＩＫＹＡＳＥＳＩＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＳＩＮＳＶＥＳＥＤＩＡＤＹＹＣＱＱＳＮＳＷＰＩＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ
Ｌ２３５Ｅ、Ｅ３１８Ａ、Ｋ３２０Ａ、及びＫ３２２Ａ置換（配列番号２３）を含む、ｍＩｇＧ２ａＣＨ１、ヒンジ領域、及びＦｃドメイン

２９Ｆ．１Ａ１２ｓｃＦｖ配列（配列番号２４）
ＤＶＡＬＴＱＴＰＶＡＱＰＶＴＬＧＤＱＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＲＴＹＬＥＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＩＧＳＧＳＧＳＤＦＴＬＴＩＳＲＶＥＰＥＤＬＧＶＹＹＣＦＱＡＴＨＤＰＮＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＶＫＰＧＳＳＶＫＩＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＨＦＩＨＷＩＫＱＱＰＧＮＧＬＥＷＩＧＧＩＹＰＧＤＧＤＴＥＹＮＱＱＦＮＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＳＴＡＹＭＲＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＦＣＡＴＲＶＰＳＹＷＦＦＤＦＷＧＰＧＴＭＶＴＶＳＳ
リーダー配列（配列番号２５）を含む、ＬｏＳＴＩＭ重鎖の全重鎖アミノ酸配列
ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳＤＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＲＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＦＧＭＨＷＶＲＱＡＰＥＫＧＬＥＷＶＡＹＩＳＳＧＳＮＴＩＹＹＡＤＴＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＰＫＮＴＬＦＬＱＭＴＳＬＲＳＥＤＴＡＭＹＹＣＡＬＴＴＧＳＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡＡＫＴＴＡＰＳＶＹＰＬＡＰＶＣＧＤＴＴＧＳＳＶＴＬＧＣＬＶＫＧＹＦＰＥＰＶＴＬＴＷＮＳＧＳＬＳＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＤＬＹＴＬＳＳＳＶＴＶＴＳＳＴＷＰＳＱＳＩＴＣＮＶＡＨＰＡＳＳＴＫＶＤＫＫＩＥＰＲＧＰＴＩＫＰＣＰＰＣＫＣＰＡＰＮＬＥＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＩＫＤＶＬＭＩＳＬＳＰＩＶＴＣＶＶＶＤＶＳＥＤＤＰＤＶＱＩＳＷＦＶＮＮＶＥＶＨＴＡＱＴＱＴＨＲＥＤＹＮＳＴＬＲＶＶＳＡＬＰＩＱＨＱＤＷＭＳＧＫＡＦＡＣＡＶＮＮＫＤＬＰＡＰＩＥＲＴＩＳＫＰＫＧＳＶＲＡＰＱＶＹＶＬＰＰＰＥＥＥＭＴＫＫＱＶＴＬＴＣＭＶＴＤＦＭＰＥＤＩＹＶＥＷＴＮＮＧＫＴＥＬＮＹＫＮＴＥＰＶＬＤＳＤＧＳＹＦＭＹＳＫＬＲＶＥＫＫＮＷＶＥＲＮＳＹＳＣＳＶＶＨＥＧＬＨＮＨＨＴＴＫＳＦＳＲＴＰＧＫＧＧＧＧＡＧＧＧＧＤＶＡＬＴＱＴＰＶＡＱＰＶＴＬＧＤＱＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＲＴＹＬＥＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＩＧＳＧＳＧＳＤＦＴＬＴＩＳＲＶＥＰＥＤＬＧＶＹＹＣＦＱＡＴＨＤＰＮＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＶＫＰＧＳＳＶＫＩＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＨＦＩＨＷＩＫＱＱＰＧＮＧＬＥＷＩＧＧＩＹＰＧＤＧＤＴＥＹＮＱＱＦＮＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＳＴＡＹＭＲＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＦＣＡＴＲＶＰＳＹＷＦＦＤＦＷＧＰＧＴＭＶＴＶＳＳ
リーダー配列（配列番号２６）を含む、ＬｏＳＴＩＭの全軽鎖アミノ酸配列
ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳＤＩＬＬＴＱＳＰＡＩＬＳＶＲＰＧＥＲＶＳＦＳＣＲＡＳＱＳＬＧＴＳＩＨＷＹＱＱＲＴＤＧＳＰＲＬＬＩＫＹＡＳＥＳＩＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＳＩＮＳＶＥＳＥＤＩＡＤＹＹＣＱＱＳＮＳＷＰＩＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＲＡＤＡＡＰＴＶＳＩＦＰＰＳＳＥＱＬＴＳＧＧＡＳＶＶＣＦＬＮＮＦＹＰＫＤＩＮＶＫＷＫＩＤＧＳＥＲＱＮＧＶＬＮＳＷＴＤＱＤＳＫＤＳＴＹＳＭＳＳＴＬＴＬＴＫＤＥＹＥＲＨＮＳＹＴＣＥＡＴＨＫＴＳＴＳＰＩＶＫＳＦＮＲＮＥＣ
リーダー配列（配列番号２７）を含む、ＬｏＳＴＩＭ重鎖の全ヌクレオチド配列
ＡＴＧＧＡＡＴＧＧＡＧＣＴＧＧＧＴＣＴＴＴＣＴＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＣＡＧＴＡＡＣＧＡＣＴＧＧＴＧＴＣＣＡＣＴＣＣＧＡＣＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＡＧＣＧＧＣＧＧＴＧＧＣＣＴＧＧＴＧＣＡＧＣＣＣＧＧＡＧＧＴＡＧＣＡＧＧＡＡＧＣＴＧＡＧＣＴＧＣＧＣＣＧＣＡＡＧＣＧＧＣＴＴＣＡＣＣＴＴＴＡＧＣＡＧＣＴＴＣＧＧＣＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＧＡＧＧＣＡＡＧＣＣＣＣＣＧＡＧＡＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＧＧＣＡＴＡＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＴＣＴＡＣＴＡＣＧＣＣＧＡＣＡＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＡＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＴＡＧＣＡＧＧＧＡＣＡＡＣＣＣＣＡＡＡＡＡＣＡＣＣＣＴＧＴＴＣＣＴＧＣＡＧＡＴＧＡＣＣＡＧＣＣＴＧＡＧＧＡＧＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＡＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＣＣＧＧＣＴＣＴＴＧＧＴＴＴＧＣＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＡＧＣＧＣＣＧＣＴＡＡＡＡＣＡＡＣＡＧＣＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＡＴＣＣＡＣＴＧＧＣＣＣＣＴＧＴＧＴＧＴＧＧＡＧＡＴＡＣＡＡＣＴＧＧＣＴＣＣＴＣＧＧＴＧＡＣＴＣＴＡＧＧＡＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＧＴＴＡＴＴＴＣＣＣＴＧＡＧＣＣＡＧＴＧＡＣＣＴＴＧＡＣＣＴＧＧＡＡＣＴＣＴＧＧＴＴＣＣＣＴＧＴＣＣＡＧＴＧＧＴＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＡＧＣＴＧＴＣＣＴＧＣＡＧＴＣＴＧＡＣＣＴＣＴＡＣＡＣＣＣＴＣＡＧＣＴＣＡＡＧＣＧＴＧＡＣＴＧＴＡＡＣＣＡＧＣＴＣＧＡＣＣＴＧＧＣＣＣＡＧＣＣＡＧＴＣＣＡＴＣＡＣＣＴＧＣＡＡＴＧＴＧＧＣＣＣＡＣＣＣＧＧＣＡＡＧＣＡＧＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＡＡＡＴＴＧＡＧＣＣＣＡＧＡＧＧＧＣＣＣＡＣＡＡＴＣＡＡＧＣＣＣＴＧＴＣＣＴＣＣＡＴＧＣＡＡＡＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＴＡＡＣＣＴＣＧＡＧＧＧＴＧＧＡＣＣＡＴＣＣＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＴＣＣＡＡＡＧＡＴＣＡＡＧＧＡＴＧＴＡＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＴＧＡＧＣＣＣＣＡＴＡＧＴＣＡＣＡＴＧＴＧＴＡＧＴＣＧＴＴＧＡＴＧＴＧＡＧＣＧＡＧＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＴＧＴＣＣＡＧＡＴＣＡＧＣＴＧＧＴＴＴＧＴＧＡＡＣＡＡＣＧＴＧＧＡＡＧＴＧＣＡＣＡＣＴＧＣＴＣＡＧＡＣＡＣＡＧＡＣＧＣＡＴＡＧＡＧＡＧＧＡＴＴＡＣＡＡＣＡＧＴＡＣＴＣＴＣＣＧＧＧＴＴＧＴＣＡＧＴＧＣＣＣＴＣＣＣＣＡＴＣＣＡＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＡＴＧＡＧＴＧＧＣＡＡＧＧＣＣＴＴＣＧＣＡＴＧＣＧＣＴＧＴＣＡＡＣＡＡＣＡＡＡＧＡＣＣＴＣＣＣＡＧＣＧＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＧＡＡＣＣＡＴＣＴＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＡＧＧＧＴＣＡＧＴＡＡＧＡＧＣＴＣＣＡＣＡＧＧＴＡＴＡＴＧＴＣＴＴＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＧＡＡＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＴＡＡＧＡＡＡＣＡＧＧＴＣＡＣＴＣＴＧＡＣＣＴＧＣＡＴＧＧＴＣＡＣＡＧＡＣＴＴＣＡＴＧＣＣＴＧＡＡＧＡＣＡＴＴＴＡＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＡＣＣＡＡＣＡＡＣＧＧＧＡＡＡＡＣＡＧＡＧＣＴＡＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＡＣＡＣＴＧＡＡＣＣＡＧＴＣＣＴＧＧＡＣＴＣＴＧＡＴＧＧＴＴＣＴＴＡＣＴＴＣＡＴＧＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＧＡＧＡＧＴＧＧＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＣＴＧＧＧＴＧＧＡＧＡＧＡＡＡＴＡＧＣＴＡＣＴＣＣＴＧＴＴＣＡＧＴＧＧＴＣＣＡＣＧＡＧＧＧＴＣＴＧＣＡＣＡＡＴＣＡＣＣＡＣＡＣＧＡＣＴＡＡＧＡＧＣＴＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＴＣＣＧＧＧＴＡＡＧＧＧＣＧＧＡＧＧＴＧＧＴＧＣＡＧＧＡＧＧＣＧＧＴＧＧＡＧＡＣＧＴＴＧＣＣＣＴＧＡＣＡＣＡＧＡＣＣＣＣＣＧＴＧＧＣＣＣＡＧＣＣＣＧＴＧＡＣＣＣＴＧＧＧＣＧＡＣＣＡＧＧＣＣＡＧＣＡＴＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＣＡＧＣＣＡＧＡＧＣＴＴＧＧＴＴＣＡＣＡＧＣＡＡＣＧＧＣＡＧＧＡＣＣＴＡＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＴＡＣＣＴＧＣＡＧＡＡＧＣＣＧＧＧＡＣＡＧＡＧＣＣＣＣＣＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＡＡＧＧＴＧＡＧＣＡＡＴＡＧＧＴＴＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＣＣＧＡＣＡＧＧＴＴＣＡＴＡＧＧＣＡＧＴＧＧＡＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＡＴＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＴＡＧＣＡＧＧＧＴＧＧＡＧＣＣＣＧＡＧＧＡＣＣＴＧＧＧＡＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＴＴＣＣＡＧＧＣＡＡＣＣＣＡＣＧＡＣＣＣＣＡＡＣＡＣＣＴＴＣＧＧＣＧＣＴＧＧＡＡＣＴＡＡＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＡＧＧＧＴＧＧＣＧＧＡＧＧＡＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧＣＧＧＴＡＧＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＡＴＣＴＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＣＣＡＧＣＡＧＡＧＣＧＧＴＧＣＣＧＡＧＣＴＧＧＴＴＡＡＧＣＣＣＧＧＴＡＧＣＡＧＣＧＴＧＡＡＧＡＴＣＡＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＡＧＣＧＧＣＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＡＧＣＣＡＣＴＴＣＡＴＣＣＡＣＴＧＧＡＴＣＡＡＡＣＡＧＣＡＧＣＣＣＧＧＣＡＡＣＧＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＣＧＧＣＧＧＣＡＴＣＴＡＣＣＣＣＧＧＡＧＡＣＧＧＣＧＡＣＡＣＣＧＡＧＴＡＣＡＡＴＣＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＧＧＡＡＡＧＧＣＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＧＣＣＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＧＣＣＴＡＣＡＴＧＡＧＧＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＡＧＧＡＣＡＧＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＴＣＴＧＣＧＣＣＡＣＣＡＧＧＧＴＧＣＣＣＡＧＣＴＡＣＴＧＧＴＴＣＴＴＣＧＡＣＴＴＣＴＧＧＧＧＣＣＣＴＧＧＣＡＣＧＡＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＧＴＣＴＴＣＴＴＡＡ
リーダー配列（配列番号２８）を含む、ＬｏＳＴＩＭの全軽鎖ヌクレオチド配列
ＡＴＧＧＡＡＴＧＧＡＧＣＴＧＧＧＴＣＴＴＴＣＴＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＣＡＧＴＡＡＣＧＡＣＴＧＧＴＧＴＣＣＡＣＴＣＣＧＡＣＡＴＣＣＴＧＣＴＧＡＣＣＣＡＡＡＧＣＣＣＧＧＣＡＡＴＣＣＴＧＡＧＣＧＴＧＡＧＧＣＣＣＧＧＴＧＡＧＡＧＧＧＴＧＡＧＣＴＴＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＣＣＡＧＴＣＣＣＴＧＧＧＣＡＣＣＡＧＣＡＴＣＣＡＣＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＡＡＡＧＧＡＣＣＧＡＣＧＧＣＡＧＣＣＣＣＡＧＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＡＡＧＴＡＣＧＣＣＡＧＣＧＡＧＡＧＣＡＴＴＡＧＣＧＧＣＡＴＣＣＣＣＡＧＣＡＧＧＴＴＣＡＧＣＧＧＧＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＣＣＧＡＣＴＴＣＡＣＴＣＴＧＡＧＣＡＴＣＡＡＣＡＧＣＧＴＧＧＡＧＡＧＣＧＡＧＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＡＣＴＡＣＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＣＴＧＧＣＣＡＡＴＣＡＣＣＴＴＣＧＧＣＧＣＡＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＡＡＣＧＧＧＣＡＧＡＴＧＣＴＧＣＡＣＣＡＡＣＴＧＴＡＴＣＣＡＴＣＴＴＣＣＣＡＣＣＡＴＣＣＡＧＴＧＡＧＣＡＧＴＴＡＡＣＡＴＣＴＧＧＡＧＧＴＧＣＣＴＣＡＧＴＣＧＴＧＴＧＣＴＴＣＴＴＧＡＡＣＡＡＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＡＡＧＡＣＡＴＣＡＡＴＧＴＣＡＡＧＴＧＧＡＡＧＡＴＴＧＡＴＧＧＣＡＧＴＧＡＡＣＧＡＣＡＡＡＡＴＧＧＣＧＴＣＣＴＧＡＡＣＡＧＴＴＧＧＡＣＴＧＡＴＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＡＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＡＴＧＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＣＡＣＧＴＴＧＡＣＣＡＡＧＧＡＣＧＡＧＴＡＴＧＡＡＣＧＡＣＡＴＡＡＣＡＧＣＴＡＴＡＣＣＴＧＴＧＡＧＧＣＣＡＣＴＣＡＣＡＡＧＡＣＡＴＣＡＡＣＴＴＣＡＣＣＣＡＴＴＧＴＣＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＧＧＡＡＴＧＡＧＴＧＴＴＧＡＴＡＡ

重鎖及び軽鎖ヌクレオチド配列を合成し、ｐＬＥＶ１２３発現ベクター（ＬａｋｅＰｈａｒｍａ，Ｉｎｃ）にクローニングし、配列をＰＣＲ増幅、続いてＳａｎｇｅｒ配列決定によって確認した。次いで、ベクターをＰＣＲによって増幅し、増幅したＤＮＡを、品質評価のためにアガロースゲル上に流し、その配列を、トランスフェクションに進める前に、Ｓａｎｇｅｒ配列決定によって再び確認した。タンパク質の生成及び精製は、ＬａｋｅＰｈａｒｍａの標準操作手順によって行った。簡潔に述べると、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を、振とうフラスコ内の懸濁液中に播種し、無血清の化学的に定義された培地を使用して拡大した。トランスフェクションの日に、拡大した細胞を、新鮮な培地を有する新しいフラスコ内に播種した。発現ベクターを、ＣＨＯ細胞内に一過性にトランスフェクトした。細胞を、フェドバッチ（ｂａｔｃｈ－ｆｅｄ）培養として１４日間維持した。一時的な生成工程からの馴化培地を回収し、遠心分離及び濾過によって清澄化した。上清を、結合緩衝液で予め平衡化したプロテインＡカラム上に充填した。ＯＤ２８０値（ＮａｎｏＤｒｏｐ、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をゼロに測定するまで、洗浄緩衝液をカラムに通した。標的タンパク質を低ｐＨ緩衝液で溶出し、画分を収集し、各画分のＯＤ２８０値を記録した。標的タンパク質を含有する画分をプールし、０．２μｍの膜フィルターを通して濾過した。タンパク質濃度は、ＯＤ２８０値及び計算された吸光係数から計算した。標的タンパク質のキャピラリー電気泳動（ＣＥ－ＳＤＳ）分析は、ＬａｂＣｈｉｐＧＸＩＩ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して行った。低エンドトキシンレベルを確認するために、発色性ＬｉｍｕｌｕｓＡｍｅｂｏｃｙｔｅＬｙｓａｔｅ法（Ｅｎｄｏｓａｆｅ－ＭＣＳ、ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して、精製生成物の複製試料を定量した。

結合アッセイ
ＰＤ－１へのＬｏＳＴＩＭの結合を、ＰＤ－１を発現する細胞を使用してフローサイトメトリーによって評価した。マウスＰＤ－１を安定的に発現するトランスジェニックマウスプロＢ細胞である３００－ｍＰＤ－１細胞を、０．５％ウシ血清アルブミン（ＰＢＳ－ＢＳＡ）を有するリン酸緩衝生理食塩水中のＬｏＳＴＩＭの連続希釈物に室温で１５分間曝露した。次いで、それらをＰＢＳ－ＢＳＡで３回洗浄し、フィコエリトリン（抗マウスＩｇＧ２ａ－ＰＥ）（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）にコンジュゲートした二次抗体、抗マウスＩｇＧ２ａと４℃で１０分間インキュベートした。次に、細胞をＰＢＳ－ＢＳＡで３回洗浄した。次いで、ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（ＢｅｃｋｔｏｎＤｉｃｋｅｎｓｏｎ）を使用してフローサイトメトリーによって細胞を分析し、ＰＥの平均蛍光強度をＬｏＳＴＩＭ結合の測定基準として使用した。

結合特異性を確認するために、ＰＤ－１を発現する活性化初代Ｔ細胞への結合を、ＰＤ－１を発現しないナイーブ初代Ｔ細胞への結合と比較した。これらのＴ細胞は、Ｈ－２Ｋ^ｂ、ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪを発現しないバックグラウンドから得た。これらのマウスを、ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＢａｒＨａｒｂｏｒ、Ｍａｉｎｅ）から入手し、屠殺し、剖検を行ってそれらの脾臓を除去した。脾臓を、以下で完全培地と称する、１０％のウシ胎仔血清、ペニシリン、及びストレプトマイシンを含む滅菌ＲＰＭＩ－１６４０培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で洗浄し、次いで完全培地中で機械的に脱凝集させて脾細胞を放出し、４０ミクロンの滅菌フィルターを使用して濾過した。赤血球を、ＲｅｄＨｙｂｒｉ－ＭａｘＢｌｏｏｄＣｅｌｌＬｙｓｉｎｇＢｕｆｆｅｒ（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）中で５分間インキュベートすることによって溶解し、続いて希釈し、完全培地中で洗浄した。赤血球溶解手順を、細胞ペレットが白くなるまで１～２回繰り返し、完全な赤血球溶解を示した。次いで、脾細胞をカウントし、ＣＤ４Ｔ細胞を、そのプロトコルに従ってＣＤ４＋ＴＣｅｌｌＩｓｏｌａｔｉｏｎＫｉｔ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃｈ）を使用した負の磁気選別によって精製した。脾細胞採取及びＴ細胞精製の前日に、１０ｃｍの組織培養処理プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を抗ＣＤ３クローン１７Ａ２（ＢｉｏＸＣｅｌｌ）でコーティングし、プレートを４℃で一晩インキュベートし、次いでＰＢＳで２回洗浄した。Ｔ細胞精製後、精製したＴ細胞の半分を、可溶性抗ＣＤ２８クローン３７．５１（ＢｉｏＸＣｅｌｌ）の存在下で抗ＣＤ３抗体コーティングプレート内でのインキュベーションによって活性化し、他のＴ細胞を、抗体でコーティングされていないプレート内でインキュベートした。３日間のインキュベーションの後、活性化及び休止したナイーブＴ細胞の両方をＰＢＳ－ＢＳＡで洗浄し、ＰＢＳ－ＢＳＡ中の様々な濃度のＬｏＳＴＩＭに１５分間曝露した。次いで、細胞をＰＢＳ－ＢＳＡで３回洗浄し、抗マウス－ＩｇＧ２ａ－ＰＥと４℃で１０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳ－ＢＳＡ中で３回洗浄し、次いでＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターを使用してフローサイトメトリーによって分析した。

Ｈ－２Ｋｂへの結合を、Ｈ－２Ｋｂを発現することが知られている、Ｃ５７ＢＬ／６結腸直腸がん細胞株ＭＣ－３８を使用したフローサイトメトリーによって評価し、Ｈ－２Ｋｂを発現しないことが知られているＣＴ－２６細胞への結合と比較した。ＭＣ－３８細胞もＣＴ－２６細胞もＰＤ－１を発現しない。細胞をＰＢＳ－ＢＳＡで洗浄し、ＰＢＳ－ＢＳＡ中の様々な濃度のＬｏＳＴＩＭに１５分間曝露した。次いで、細胞をＰＢＳ－ＢＳＡで３回洗浄し、抗マウス－ＩｇＧ２ａ－ＰＥと４℃で１０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳ－ＢＳＡ中で３回洗浄し、次いでＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターを使用してフローサイトメトリーによって分析した。

ＰＤ－１及びＨ－２Ｋ^ｂへの同時二重特異性結合は、Ｈ－２Ｋ^ｂを発現するが、ＰＤ－１を発現しないＭＣ－３８細胞を使用したフローサイトメトリーによって評価した。ＭＣ－３８細胞をＰＢＳ－ＢＳＡで洗浄し、ＰＢＳ－ＢＳＡ中の様々な濃度のＬｏＳＴＩＭに１５分間曝露した。次に、細胞をＰＢＳ－ＢＳＡで３回洗浄し、ヒトＩｇＧ１Ｆｃドメインを有する組換えマウスＰＤ－１Ｆｃキメラタンパク質（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）とインキュベートした。細胞をＰＢＳ－ＢＳＡで３回洗浄し、次に、４℃で１０分間、マウスＩｇＧ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）に対して吸着させた抗ヒト－ＩｇＧ１－ＰＥとインキュベートした。細胞をＰＢＳ－ＢＳＡ中で３回洗浄し、次いでＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターを使用してフローサイトメトリーによって分析した。別の実験では、ＰＤ－１及びＨ－２Ｋ^ｂへの同時二重特異性結合を、単一特異性結合と二重特異性結合との間の競合が可能である実験的設定で調べた。この実験では、ＭＣ－３８細胞を同様に、ＰＢＳ－ＢＳＡ中の様々な濃度のＬｏＳＴＩＭとインキュベートしたが、組換えマウスＰＤ－１Ｆｃキメラタンパク質を添加し、ＰＢＳ－ＢＳＡで細胞を洗浄する前に、ＬｏＳＴＩＭと同時にインキュベートした。マウス吸着抗ヒト－ＩｇＧ－ＰＥで同様に検出を行い、ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターを使用して細胞を分析した。

Ｔ細胞活性化アッセイ
抗原提示細胞（ＡＰＣ）として使用した骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＤＣ）を以下のように調製した。ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙから得たＣ５７ＢＬ／６又はＣ３Ｈマウスを屠殺し、剖検を行った。大腿骨及び脛骨を単離し、７０％エタノール中で洗浄した。骨を乾燥させた後、外科用メスを使用して骨の端部を除去し、細い針を備えた注射器を使用して完全培地を骨に流して骨髄を除去した。次いで注射器での繰り返しの吸引によって骨髄を機械的に脱凝集させ、次いで４０ミクロンの滅菌フィルターを使用して濾過した。赤血球を、ＲｅｄＨｙｂｒｉ－ＭａｘＢｌｏｏｄＣｅｌｌＬｙｓｉｎｇＢｕｆｆｅｒ中で５分間インキュベートすることによって溶解し、続いて希釈し、完全培地中で洗浄した。赤血球溶解手順を、細胞ペレットが白くなるまで１～２回繰り返し、完全な赤血球溶解を示した。骨髄細胞を計数し、２０ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を含有する完全培地中に再懸濁し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。３日後、２０ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦを有する等体積の完全培地を添加した。３日後、培養体積の半分を除去し、遠心分離し、２０ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦを含有する新鮮な完全培地中に再懸濁し、培養物に戻し、更に２日間インキュベートした。懸濁液及び軽く付着したＢＭＤＤＣ細胞の混合物を、ピペット（ｐｉｐｐｅｔｅ）を使用した反復吸引によって得た。

精製したＢ細胞を、いくつかの実験においてＡＰＣとして使用し、以下のように調製した。Ｃ５７ＢＬ／６又はＣ３Ｈマウスを、ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙから入手し、屠殺し、剖検を行って、それらの脾臓を除去した。脾臓を完全培地で洗浄し、次いで完全培地中で機械的に脱凝集させて、脾細胞を放出し、４０ミクロンの滅菌フィルターを使用して濾過した。赤血球を、ＲｅｄＨｙｂｒｉ－ＭａｘＢｌｏｏｄＣｅｌｌＬｙｓｉｎｇＢｕｆｆｅｒ中で５分間インキュベートすることによって溶解し、続いて希釈し、完全培地中で洗浄した。赤血球溶解手順を、細胞ペレットが白くなるまで１～２回繰り返し、完全な赤血球溶解を示した。次いで、脾細胞をカウントし、Ｂ細胞を、そのプロトコルに従ってＰａｎＢＣｅｌｌＩｓｏｌａｔｉｏｎＫｉｔＩＩ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃｈ）を使用した負の磁気選別によって精製した。

ナイーブＴ細胞を得るために、ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪマウスを屠殺し、剖検を行って、それらの脾臓を除去した。脾臓を、完全培地を含む滅菌ＲＰＭＩ－１６４０培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で洗浄し、次いで完全培地中で機械的に脱凝集させて、脾細胞を放出した。赤血球を、ＲｅｄＨｙｂｒｉ－ＭａｘＢｌｏｏｄＣｅｌｌＬｙｓｉｎｇＢｕｆｆｅｒ中で５分間インキュベートすることによって溶解し、続いて希釈し、完全培地中で洗浄した。赤血球溶解手順を、細胞ペレットが白くなるまで１～２回繰り返し、完全な赤血球溶解を示した。次いで、脾細胞をカウントし、ＣＤ８＋ＴＣｅｌｌＩｓｏｌａｔｉｏｎＫｉｔ又はＣＤ４＋ＴＣｅｌｌＩｓｏｌａｔｉｏｎＫｉｔ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃｈ）のいずれかを使用して、それらのそれぞれのプロトコルに従って、負の磁気選別によってＣＤ８Ｔ細胞を精製した。

ＡＰＣによるナイーブＴ細胞活性化に対するＬｏＳＴＩＭの効果を評価するために、ナイーブＢＡＬＢ／ｃＢｙＪＴ細胞を、ＢＭＤＤＣ又はＢ細胞ＡＰＣのいずれかと１：１の比で５日間共培養した。Ｈ－２Ｋｂを発現し、したがってＬｏＳＴＩＭに結合する、Ｃ５７ＢＬ／６マウスから得られたＡＰＣによってプライミングされたＴ細胞に対するＬｏＳＴＩＭの効果を、Ｈ－２Ｋｂを発現せず、したがってＬｏＳＴＩＭに結合しない、Ｃ３Ｈマウスから得られたＡＰＣによってプライミングされたＴ細胞に対するその効果と比較した。詳細な方法は以下のとおりであった。上記のようにナイーブＢＡＬＢ／ｃＢｙＪＴ細胞を取得し、そのプロトコルに従ってＣｅｌｌＴｒａｃｅＣＦＳＥＣｅｌｌＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎＫｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識した。上記のようにＣ５７ＢＬ／６又はＣ３Ｈマウスのいずれかから得られたＢＭＤＤＣ又はＢ細胞を取得し、そのプロトコルに従ってＣｅｌｌＴｒａｃｅＶｉｏｌｅｔＣｅｌｌＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎＫｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してＣｅｌｌＴｒａｃｅＶｉｏｌｅｔ色素で標識した。次いで、１×１０^５のＴ細胞及び１×１０^５のＡＰＣを、９６ウェル組織培養プレート中の２００マイクロリットルの完全培地中で共培養した。各条件について、少なくとも４つの複製培養物を含めた。処理条件は、様々な濃度のＬｏＳＴＩＭ（５０ナノモル濃度～５００ナノモル濃度）、陰性対照としての親抗ＰＤ－１クローン１Ａ１２モノクローナル抗体、陰性対照としての親抗Ｈ－２Ｋ^ｂクローンＡＦ６－８８．５．３モノクローナル抗体、又はビヒクル対照としてのＰＢＳを含んだ。１０ｕｇ／ｍＬの精製したラット抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２クローン２．４Ｇ２を各培養物に添加して、ＡＰＣに対するＬｏＳＴＩＭ又は対照抗体のいずれかの結合が、Ｈ－２Ｋ^ｂ特異的結合のみを反映し、Ｆｃγ受容体結合を反映しないことを確実にした。５％ＣＯ２の雰囲気下で、３７℃で５日間のインキュベーション後、ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターを使用してフローサイトメトリーによって細胞を分析した。細胞分裂を受けたＴ細胞の割合は、ＣＦＳＥ希釈によるＣｅｌｌＴｒａｃｅＶｉｏｌｅｔ陰性細胞の割合を計算することによって決定し、これをＴ細胞活性化の測定基準として使用した。

シグナル伝達アッセイ
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナル伝達に対する効果を評価するために、オボアルブミン抗原ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号２９）を認識するトランスジェニックＴＣＲを発現するＣＤ８＋Ｔ細胞をＯＴ－１マウスから精製し、活性化し、次いで、ＬｏＳＴＩＭの存在下又は不存在下で、ＳＩＩＮＦＥＫＬ抗原を装填したＣ５７ＢＬ／６Ｂ細胞によって再刺激した。ＴＣＲ活性化を、ホスホフローサイトメトリーによって評価した。詳細な方法は以下のとおりであった。ＯＴ－１マウスを、ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＢａｒＨａｒｂｏｒ、Ｍａｉｎｅ）から入手し、屠殺した。剖検を行って、それらの脾臓を除去した。脾臓を完全培地で洗浄し、次いで完全培地中で機械的に脱凝集させて、脾細胞を放出した。赤血球を、ＲｅｄＨｙｂｒｉ－ＭａｘＢｌｏｏｄＣｅｌｌＬｙｓｉｎｇＢｕｆｆｅｒ中で５分間インキュベートすることによって溶解し、続いて希釈し、完全培地中で洗浄した。赤血球溶解手順を、細胞ペレットが白くなるまで１～２回繰り返し、完全な赤血球溶解を示した。次いで、脾細胞をカウントし、ＣＤ８Ｔ細胞を、そのプロトコルに従ってＣＤ８＋ＴＣｅｌｌＩｓｏｌａｔｉｏｎＫｉｔ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃｈ）を使用した負の磁気選別によって精製した。脾細胞採取及びＴ細胞精製の前日に、１０ｃｍの組織培養処理プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を抗ＣＤ３クローン１７Ａ２（ＢｉｏＸＣｅｌｌ）でコーティングし、プレートを４℃で一晩インキュベートし、次いでＰＢＳで２回洗浄した。可溶性抗ＣＤ２８クローン３７．５１の存在下で、３７℃で３日間、抗ＣＤ３抗体コーティングプレート中でのインキュベーションによって、精製したＴ細胞を活性化した。次いで、活性化したＴ細胞をプレートから除去し、完全培地中で洗浄し、次いで、抗体刺激なしで６時間、組織培養プレート中で静置した。同時に、上記のように精製した新鮮なＣ５７ＢＬ／６Ｂ細胞を、１０マイクロモルのＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドで６時間パルスし、３回洗浄し、次いで、９６ウェル丸底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中で静止したＴ細胞と共培養した。インキュベーションの前に、プレートを１２５０ｒｐｍで１分間遠心分離して、Ｔ細胞及びＢ細胞を近接させた。共培養物を３７℃及び５％ＣＯ２でインキュベートした。細胞を固定し、公開されたキットプロトコルに従って、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ細胞内固定及び透過緩衝液セットを使用して透過処理した。ＰＥ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にコンジュゲートした抗ホスホ－ＺＡＰ７０（クローンｎ３ｋｏｂｕ５）、及びＡＰＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）にコンジュゲートした抗マウスＣＤ８（クローン５３－６．７）を用いて、キットプロトコルにおける適切な点で細胞を染色した。ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターを使用して、細胞をフローサイトメトリーによって分析し、ＣＤ８陽性集団内のＰＥの平均蛍光強度をＴＣＲ活性化の測定基準として使用した。

同種拒絶のインビボ阻害
１×１０^６個の（Ｃ５７ＢＬ／６由来の）ＭＣ３８細胞を、１０匹のＢＡＬＢ／ｃＢｙＪマウスの脇腹に、０日目に皮下注射し、マウスを、ＬｏＳＴＩＭを受ける５匹のマウスの処置群、及びビヒクル対照（ＰＢＳ）を受ける５匹のマウスの対照群の２つの群に分けた。０日目から開始して、各群のマウスに、２００μＬのＰＢＳ中の２００μｇのＬｏＳＴＩＭ又は２００μＬのＰＢＳ単独のいずれかを腹腔内に注射した。これらの腹腔内注射は３日ごとに継続した。腫瘍サイズは、三次元でキャリパーを用いて３日ごとに測定した。

同系腫瘍のインビボでの処置
２×１０^５個のＣＴ－２６細胞を、０日目にＢＡＬＢ／ｃＢｙＪマウスの腹部に皮下注射した。６日目に腫瘍サイズを測定し、測定可能な腫瘍を有するマウスを、ＬｏＳＴＩＭを受ける５匹のマウスの処置群、抗ＰＤ－１親抗体２９Ｆ．１Ａ１２を受ける５匹のマウスの対照群、及びビヒクル対照（ＰＢＳ）を受ける４匹のマウスの群の３つの群に分けた。６日目から開始して、２００μＬのＰＢＳ中の２００μｇのＬｏＳＴＩＭ、２００μＬのＰＢＳ中の２００μｇの２９Ｆ．１Ａ１２、又は２００μＬのＰＢＳ単独を腹腔内に注入した。これらの腹腔内注射は３日ごとに継続した。腫瘍サイズが、ＩＡＣＵＣ承認プロトコルによって設定された所定の限界に達したとき、又は腫瘍が潰瘍化したとき、マウスを屠殺した。最初のマウスが屠殺されるまで、３日ごとに三次元でキャリパーを用いて腫瘍サイズを測定した。

ＳＥ－ＵＰＬＣ分析及び分取サイズ排除クロマトグラフィー
サイズ排除超高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ－ＵＰＬＣ）分析のために、２マイクロリットルの試料を、０．３ｍＬ／分の流量で、１．７マイクロメートル、４．６×１５０ｍｍのカラムを用いて１０分間、ＡＣＱＵＩＴＹＵＰＬＣタンパク質ＢＥＨＳＥＣ２００に注入した。ｐＨ６．２で５０ｍＭのリン酸ナトリウム及び５００ｍＭの塩化ナトリウムの移動相を使用した。

分取サイズ排除クロマトグラフィーのために、材料を、ＨｉＬｏａｄ２６／６００Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムに充填し、これを、ｐＨ７．４でリン酸緩衝生理食塩水の移動相で実行した。タンパク質の溶出は、２８０ｎｍで紫外線の吸光度を測定することによって検出した。ＳＥ－ＵＰＬＣ分析によって特定された３つの分子種を表す３つのピークを検出した。これらのピークに対応する溶出画分を収集し、適切にプールして、３つの分子種のうちの１つに各々対応する、３つの別々の調製物を得た。

参照による組み込み
本明細書で言及される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、個々の刊行物、特許、又は特許出願が各々参照により組み込まれると具体的かつ個別に示されるかのように、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。矛盾する場合には、本明細書のいずれの定義も含む本出願が支配する。

等価物
当業者であれば、通常範囲を超えない実験を使用して、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、又は確定することができるであろう。かかる等価物は、以下の特許請求の範囲によって包含されるよう意図されている。

Claims

ＰＤ－１に特異的に結合する第１の部分と、Ｔ細胞以外の標的細胞の表面抗原に特異的に結合する第２の部分と、を含む、二重特異性分子であって、前記表面抗原及びＰＤ－１への前記二重特異性分子の同時結合が、免疫学的シナプスに近接したＰＤ－１のクラスター化を促進し、かつ／又は前記表面抗原及びＰＤ－１への前記二重特異性分子の同時結合が、前記標的細胞に向けられたＴ細胞活性及び／若しくは毒性を低減若しくは防止し、任意選択で、
ｉ）前記二重特異性分子が、Ｔ細胞上のＰＤ－１に結合し、
ｉｉ）Ｔ細胞活性が、サイトカイン産生及び／又はＴ細胞増殖であり、
ｉｉｉ）少なくとも前記第１の部分若しくは前記第２の部分が、モノクローナル若しくはポリクローナル抗体、又はその抗原結合断片を含み、
ｉｖ）前記二重特異性分子が、ＰＤ－１に対する単一結合部位を有し、かつ／あるいは
ｖ）前記二重特異性分子が、ＰＤ－１に対する単一結合部位及び前記表面抗原に対する単一結合部位を有する、二重特異性分子。
ｉ）ＰＤ－１への結合のＫ_ｄと、組織特異的表面抗原への結合のＫ_ｄとの差が、少なくとも１０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１，０００倍、５，０００倍、若しくは１０，０００倍であり、任意選択で更に、ＰＤ－１への結合の前記Ｋ_ｄが、前記組織特異的表面抗原への結合の前記Ｋ_ｄ未満であり、かつ／又はｉｉ）ＰＤ－１への結合時のオフレートと、前記組織特異的表面抗原への結合時の前記オフレートとの差が、少なくとも１０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１，０００倍、５，０００倍、若しくは１０，０００倍であり、任意選択で更に、ＰＤ－１への結合の前記オフレートが、前記組織特異的表面抗原への結合の前記オフレートよりも遅い、請求項１に記載の二重特異性分子。
前記第１の部分が、ＰＤ－１のＰＤ－Ｌ１結合部位とは異なる部位でＰＤ－１に特異的に結合する、請求項１又は２に記載の二重特異性分子。
前記第１の部分が、ＰＤ－１へのＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ２のいずれの結合も遮断しない、請求項１～３のいずれか一項に記載の二重特異性分子。
前記二重特異性分子が、前記表面抗原を発現する細胞又は組織においてＰＤ－１のアゴニストとして作用するが、前記表面抗原を発現しない細胞又は組織において作用しない、請求項３又は４に記載の二重特異性分子。
前記第１の部分が、ｉ）ＰＤ－１に特異的に結合し、ＰＤ－Ｌ１若しくはＰＤ－Ｌ２とのＰＤ－１の前記結合を遮断し、かつ／又はｉｉ）ＰＤ－１の前記ＰＤ－Ｌ１及び／若しくはＰＤ－Ｌ２結合部位においてＰＤ－１に特異的に結合する、請求項１又は２に記載の二重特異性分子。
前記二重特異性分子が、前記表面抗原を発現する細胞又は組織においてＰＤ－１のアゴニストとして作用し、前記表面抗原を発現しない細胞又は組織においてＰＤ－１のアンタゴニストとして作用する、請求項５又は６に記載の二重特異性分子。
前記第１の部分が、表１、表４Ａ、及び表４Ｂに列挙された配列からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、任意選択で、前記配列が、配列番号３０である、請求項１又は２に記載の二重特異性分子。
前記第１の部分が、配列番号３１と、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１、２、又は８に記載の二重特異性分子。
前記第１の部分が、ＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ２の細胞外ドメインと、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、任意選択で、前記標的が、前記細胞外ドメインに対する受容体であり、かつ／又はＰＤ－Ｌ１の前記細胞外ドメインが、配列番号２４の配列を有する、請求項１又は２に記載の二重特異性分子。
前記表面抗原が、表３Ａ、表３Ｂ、及び表３Ｃに列挙された表面抗原の群、又はＭＨＣクラスＩ対立遺伝子及び／若しくはＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子から選択され、任意選択で、前記対立遺伝子が、ＨＬＡ対立遺伝子であるか、又は前記ＭＨＣ対立遺伝子が、Ｈ－２Ｋｂである、請求項１又は２に記載の二重特異性分子。
前記第２の部分が、配列番号２１と、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の二重特異性分子。
前記第２の部分が、配列番号２２と、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１１又は１２に記載の二重特異性分子。
前記二重特異性分子が、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、及び１４のうちのいずれか１つと、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載の二重特異性分子。
少なくとも前記第１の部分又は前記第２の部分が、キメラ、ヒト化、複合、マウス、又はヒトモノクローナル若しくはポリクローナル抗体、あるいはその抗原結合断片である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の二重特異性分子。
少なくとも前記第１の部分又は前記第２の部分が、検出可能に標識され、エフェクタードメインを含み、Ｆｃドメインを含み、かつ／又はＦｖ、Ｆａｖ、Ｆ（ａｂ’）２）、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２、及びダイアボディ断片からなる群から選択され、任意選択で、前記Ｆｃドメインが、Ｆｃガンマ受容体への結合を減少させるように修飾される、請求項１～１５のいずれか一項に記載の二重特異性分子。
請求項１～１６のいずれか一項に記載の二重特異性分子をコードする単離された核酸分子であって、任意選択で、前記単離された核酸分子が、ストリンジェントな条件下で、配列番号１～１４、２１～２６、２８、及び３０～３１の配列からなる群から選択されるポリペプチドをコードする核酸の相補体、又は配列番号１～１４、２１～２６、２８、及び３０～３１の配列からなる群から選択されるポリペプチドをコードする核酸と少なくとも約９５％の相同性を有する配列とハイブリダイズし、任意選択で、前記単離された核酸分子が安定化されたｍＲＮＡである、単離された核酸分子。
請求項１７に記載の単離された核酸を含む、ベクター。
請求項１７に記載の単離された核酸を含むか、請求項１８に記載のベクターを含むか、又は請求項１～１６のいずれか一項に記載の二重特異性分子を発現する、宿主細胞であって、任意選択で、前記宿主細胞が、ゲノム操作されており、かつ／又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）等の異種タンパク質を発現するＴ細胞である、宿主細胞。
請求項１～１６のいずれか一項に記載の少なくとも１つの二重特異性分子を含むデバイス又はキットであって、前記デバイス又はキットが、任意選択で、前記少なくとも１つの二重特異性分子又は前記二重特異性分子を含む複合体を検出するための標識を含む、デバイス又はキット。
請求項１～１６のいずれか一項に記載の少なくとも１つの二重特異性分子を産生する方法であって、前記方法が、（ｉ）前記二重特異性分子の発現を可能にするのに好適な条件下で、請求項１～１６のいずれか一項に記載の少なくとも１つの二重特異性分子をコードする配列を含む核酸によって形質転換された形質転換宿主細胞を培養するステップと、（ｉｉ）発現された二重特異性分子を回収するステップと、を含む、方法。
試料中で細胞特異的及び／又は組織特異的な様式でＴ細胞の活性化を阻害する方法であって、前記試料を、請求項１～１６のいずれか一項に記載の二重特異性分子と接触させることを含む、方法。
前記二重特異性分子が、前記表面抗原及びＰＤ－１に同時に結合するときに、前記二重特異性分子が、前記標的細胞と相互作用するＴ細胞の活性化を阻害する、請求項２２に記載の方法。
対象において細胞特異的及び／又は組織特異的な様式でＴ細胞の活性化を阻害する方法であって、前記対象に、請求項１～１６のいずれか一項に記載の二重特異性分子を投与することを含み、任意選択で、前記対象が、がんのリスクがあるか、がんを有する疑いがあるか、又はがんに罹患している、方法。
前記二重特異性分子が、前記表面抗原及びＰＤ－１に同時に結合するときに、前記二重特異性分子が、前記標的細胞と相互作用するＴ細胞の活性化を阻害する、請求項２４に記載の方法。
前記対象が、固形臓器移植を受けるように定められているか、又は受けている、請求項２５に記載の方法。
前記表面抗原が、ミスマッチＭＨＣクラスＩ又はクラスＩＩである、請求項２６に記載の方法。
前記対象が、自己免疫疾患のリスクがあるか、自己免疫疾患を有する疑いがあるか、又は自己免疫疾患に罹患しており、したがって、前記自己免疫疾患を治療する、請求項２５に記載の方法。
前記表面抗原が、病理学的に炎症を起こした組織上で発現されるものである、請求項２８に記載の方法。
前記対象が、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）のリスクがあるか、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を有する疑いがあるか、又は移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）に罹患しており、したがって、前記ＧＶＨＤを治療する、請求項２５に記載の方法。
前記表面抗原が、炎症組織上で発現されるが、がん性細胞上で発現されないものであり、かつ／又は前記対象が、同種骨髄移植を受けるように定められているか、若しくは受けている、請求項３０に記載の方法。
前記対象が、チェックポイント阻害剤免疫関連有害事象（ｉｒＡＥ）のリスクがあるか、チェックポイント阻害剤免疫関連有害事象（ｉｒＡＥ）を有する疑いがあるか、又はチェックポイント阻害剤免疫関連有害事象（ｉｒＡＥ）に罹患しており、したがって、前記ｉｒＡＥを治療する、請求項２５に記載の方法。
前記表面抗原が、炎症組織上で発現されるが、がん性細胞上で発現されないものである、請求項３２に記載の方法。
前記対象が、操作された免疫細胞療法を受けるように定められているか、又は受けている、請求項２５に記載の方法。
前記表面抗原が、前記免疫細胞療法によって標的化された腫瘍関連抗原も発現する正常組織において発現されるものであるが、がん性細胞上で発現されないものである、請求項３４に記載の方法。