JP2023525204A - アデノ随伴ウイルスを検出するための方法およびキット - Google Patents

アデノ随伴ウイルスを検出するための方法およびキット Download PDF

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Abstract

本開示は、アデノ随伴ウイルスを検出するための方法およびキットを提供する。いくつかの実施形態では、アデノ随伴ウイルスは、Ａｎｃ８０である。検出方法は、ＨＰＬＣおよびＥＬＩＳＡベースの方法を含む。【選択図】図１

Description

本開示は、アデノ随伴ウイルスを検出するための方法およびキットを提供する。いくつかの実施形態では、アデノ随伴ウイルスは、Ａｎｃ８０である。検出方法は、ＨＰＬＣおよびＥＬＩＳＡベースの方法を含む。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、遺伝子治療のための重要なツールとして登場した。一般に、遺伝子治療のためのＡＡＶは、アセンブルされたウイルス粒子であり、これは、例えば、天然のウイルス遺伝子を欠き、目的の遺伝子（ＧＯＩ）などの目的の配列のみを含有し、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）をもたらす。次いで、目的の遺伝子は、ｒＡＡＶ粒子によって宿主細胞中に送達される。ｒＡＡＶ粒子を産生するための典型的なプロセスは、天然のＡＡＶゲノムにおいて見出される、逆位末端反復（ＩＴＲ）配列と隣接する目的の遺伝子を含有する第１のプラスミド（ＩＴＲ／ＧＯＩプラスミド）、ウイルスアセンブリのためにトランスで発現されるＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子を含有する第２のプラスミド（ｒｅｐ／ｃａｐプラスミド）、および、しばしば、アデノウイルスまたはヘルペスウイルスのいずれかからのヘルパー遺伝子を含有する第３のプラスミド（ヘルパープラスミド）の、少なくとも２つのプラスミドをプロデューサー細胞中に送達することを含む。次いで、プロデューサー細胞は、ＩＴＲ／ＧＯＩプラスミドを含有するアセンブルされたｒＡＡＶ粒子（すなわち、「パッケージングされた」ｒＡＡＶ）を産生し、パッケージングされたｒＡＡＶは、次いで、プロデューサー細胞から単離および精製され得る。
ｒＡＡＶの精製は、典型的には、プロデューサー細胞を回収すること、プロデューサー細胞を溶解すること、細胞溶解物を勾配精製（例えば、イオジキサノール勾配を使用する）および／または高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）（これは、イオン交換、サイズ排除、および／またはアフィニティベースのものであり得る）に供すること、ならびに、緩衝液交換および濃縮（例えば、タンジェンシャルフローフィルトレーションを使用する）を含む。精製後に、ｒＡＡＶ力価が、典型的には、測定される。組換えＡＡＶならびに産生および精製の方法は、例えば、Ｎａｓｏ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＤｒｕｇｓ ３１（４）：３１７－３３４（２０１７）およびＷＯ２０１８／１５０２６９にさらに記載されている。
プロデューサー細胞からのＡＡＶ、例えば、ｒＡＡＶの精製は、時間がかかる、労力集約的なプロセスであり得る。ウイルス力価測定は、典型的には、実質的に精製された試料が得られる後、例えば、精製工程の大部分またはすべての後まで行われないことから、低収率のバッチ（例えば、少ないウイルス粒子の数および／または低い完全／空キャプシドの比率）は、かなりの量の時間および試薬が費やされるまで検出されず、このことは、大いにコストを増加させ、産生効率を低減させる。
ＡＡＶ産生に関連するさらなる課題は、大規模で異なるウイルスベクターのための最適化されたプロセスを開発することである。上流および下流の両方のプロセスの反復性の最適化は、処理最中の（ｉｎ－ｐｒｏｃｅｓｓ）サンプルについてウイルス産物を特徴付けおよび定量化するための分析ツールを利用する。
ＷＯ２０１８／１５０２６９
Ｎａｓｏ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＤｒｕｇｓ ３１（４）：３１７－３３４（２０１７）
いくつかの実施形態では、本開示は、試料中のアデノ随伴ウイルス血清型Ａｎｃ８０を検出するための方法であって、（ａ）試料を、（ｉ）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶｘ）またはアデノ随伴ウイルス血清型８（ＡＡＶ８）に結合する捕捉試薬、および（ｉｉ）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶｘ）に結合する検出試薬と接触させることと、（ｂ）捕捉試薬、Ａｎｃ８０、および検出試薬を含む結合複合体を形成することと、（ｃ）結合複合体を検出し、それによって試料中のＡｎｃ８０を検出することと、を含む、方法を提供する。
追加の実施形態では、本開示は、キットであって、（ａ）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶｘ）に結合する捕捉試薬と、（ｂ）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶｘ）に結合する検出試薬と、を含む、キットを提供する。
さらなる実施形態では、本開示は、細胞懸濁液または細胞溶解物中のアデノ随伴ウイルスのキャプシド力価を決定する方法であって、方法は、（ａ）細胞懸濁液または細胞溶解物を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に供することであって、ＨＰＬＣは、アデノ随伴ウイルスのウイルス粒子（ＶＰ）に結合する樹脂を用いて行われる、供することと、（ｂ）細胞懸濁液または細胞溶解物中のＶＰを検出し、それによってアデノ随伴ウイルスのキャプシド力価を決定することと、を含む、方法を提供する。
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明の特定の態様の例示的な実施形態をさらに示すために含まれる。
本明細書における実施形態による例示的なＡＡＶ精製プロセスを示す。ＡＡＶプロデューサー細胞は、バイオリアクター中で増殖し、デプス濾過によって収集される。ＡＡＶは、単離され、クロマトグラフィーによって精製される。 実施例１に記載されるＨＰＬＣクロマトグラフィー実験の結果を示す。図２Ａ、２Ｂ、および２Ｃは、それぞれ、同じＨＰＬＣカラムを使用して、Ａｎｃ８０．ＣＭＶ．ｅＧＦＰ、ＡＡＶ２．ＣＭＶ．ｅＧＦＰ、およびＡＡＶ８．ＣＭＶ．ｅＧＦＰの試料から生成された標準曲線を示す。 実施例１に記載されるＨＰＬＣクロマトグラフィー実験の結果を示す。図２Ａ、２Ｂ、および２Ｃは、それぞれ、同じＨＰＬＣカラムを使用して、Ａｎｃ８０．ＣＭＶ．ｅＧＦＰ、ＡＡＶ２．ＣＭＶ．ｅＧＦＰ、およびＡＡＶ８．ＣＭＶ．ｅＧＦＰの試料から生成された標準曲線を示す。 実施例１に記載されるＨＰＬＣクロマトグラフィー実験の結果を示す。図２Ａ、２Ｂ、および２Ｃは、それぞれ、同じＨＰＬＣカラムを使用して、Ａｎｃ８０．ＣＭＶ．ｅＧＦＰ、ＡＡＶ２．ＣＭＶ．ｅＧＦＰ、およびＡＡＶ８．ＣＭＶ．ｅＧＦＰの試料から生成された標準曲線を示す。 実施例１に記載されるＨＰＬＣクロマトグラフィー実験の結果を示す。図３は、ＡＡＶ精製プロセスの様々な工程、すなわち、細胞懸濁液、細胞溶解物、溶解物の清澄化、タンジェンシャルフローフィルトレーション（ＴＦＦ）保持液、および最終濾過の間または後に得られた試料のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。 実施例１に記載されるＡＡＶ力価計算の結果を示す。ＨＰＬＣによって測定されたキャプシド力価（図３における結果から計算された）およびｄｄＰＣＲによって測定されたゲノム力価を使用して、完全／空キャプシド比率を測定した。 Ａｎｃ８０．ＣＭＶ．ｅＧＦＰの試料を用いて、実施例２に従って行ったＥＬＩＳＡの標準曲線を示す。 図５に示される標準曲線の曲線当てはめを決定するための４パラメータロジック回帰計算を示す。
本開示は、アデノ随伴ウイルスを検出するための方法およびキットに関する。
本明細書における別段の定義がない限り、本開示で使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般的に理解されている意味を有するものとする。
文脈による別段の要求がない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。本明細書で使用される場合、「ａ」または「ａｎ」は、１つ以上を意味し得る。本明細書で使用される場合、単語「ａ」または「ａｎ」は、単語「含む」と併せて使用される場合、１つまたは１つ超を意味し得る。本明細書で使用される場合、「別の」または「さらなる」は、少なくとも第２のまたはそれ以上を意味し得る。
本出願全体を通して、「約」という用語は、値が、その値を決定するために用いられる方法／デバイスについての固有の誤差の変動、または研究対象の間に存在する変動を含むことを示すために使用される。典型的には、「約」という用語は、状況に応じて、およそ１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、もしくは２０％、またはそれ以下を包含することを意味する。いくつかの実施形態では、当業者は、「約」という用語によって示される変動のレベルを、それが本明細書で使用される文脈によって理解するであろう。「約」という用語の使用が、具体的に列挙された値も含むこともまた理解されるべきである。
特許請求の範囲における「または」という用語の使用は、選択肢のみを指すことが明示的に示されるか、または選択肢が互いに排他的でない限り、「および／または」を意味するように使用されるが、本開示は、選択肢のみおよび「および／または」を指す定義を支持する。
本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」などのその任意の異形もしくは変化形）、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」（ならびに「有する（ｈａｖｅ）」および「有する（ｈａｓ）」などのその任意の異形もしくは変化形）、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（ならびに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」などのその任意の異形もしくは変化形）、または「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」（ならびに「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」などのその任意の異形または変化形）という用語は、包括的なまたは制限なしのものであり、追加の、列挙されていない要素または方法工程を排除しない。本明細書において考察される任意の実施形態は、本開示の任意の方法および／またはキットに関して実行され得ることが企図される。
「例えば（ｆｏｒ ｅｘａｍｐｌｅ）」という用語およびその対応する略語である「例えば（ｅ．ｇ．）」の使用は、別段の明示的な記述がない限り、列挙された特定の用語が、参照または引用された特定の例に限定されることは意図されない本開示の代表的な例および実施形態であることを意味する。
本明細書で使用される場合、「間（ｂｅｔｗｅｅｎ）」は、範囲の末端を含む範囲である。例えば、ｘとｙとの間の数には、ｘおよびｙの数、ならびにｘとｙとの範囲に入る任意の数が明示的に含まれる。
本明細書で言及される場合、「アデノ随伴ウイルス」または「ＡＡＶ」は、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ科およびＤｅｐｅｎｄｏｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ属の一本鎖ＤＮＡを含有する小さなサイズの複製欠損無エンベロープウイルスまたはウイルス粒子を指す。アデノ随伴ウイルスにはまた、祖先ＡＡＶ（Ａｎｃ ＡＡＶ）が含まれる。ＡＡＶ血清型の非限定的な例としては、Ａｎｃ８０、Ａｎｃ８０Ｌ２７、Ａｎｃ８０Ｌ６５、Ａｎｃ８０Ｌ１２１、ＡＡＶ１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ１．１、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ２Ｇ９、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ２－ＴＴ、ＡＡＶ２－ＴＴ－Ｓ３１２Ｎ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ３Ｂ－Ｓ３１２Ｎ、ＡＡＶ－ＬＫ３、ＡＡＶ６．１、ＡＡＶ６．３．１、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、ＡＡＶ．ＨＳＣ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３２、ＡＡＶ．ｒｈ３３、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ＲＨＭ１５－１、ＡＡＶ．ＲＨＭ１５－２、ＡＡＶ．ＲＨＭ１５－３、ＡＡＶ．ＲＨＭ１５－４、ＡＡＶ．ＲＨＭ１５－５、ＡＡＶ．ＲＨＭ１５－６、ＡＡＶ．ｃｙ１０、ＡＡＶ．ｄｊ、ＡＡＶ．ｐｏ４、ＡＡＶ．ｐｏ６、ＡＡＶ．ｈｕ２６、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、Ａｎｃ１２６、およびＡｎｃ１２７が挙げられる。これらの血清型に加えて、ＡＡＶ偽型が開発されている。ＡＡＶ偽型は、第１の血清型のキャプシドおよび第２の血清型のゲノムを含有する（例えば、偽型ＡＡＶ２／５は、血清型ＡＡＶ２のゲノムおよびＡＡＶ５のキャプシドを有するＡＡＶに対応する）。ＡＡＶの誘導体、改変、および／または偽型を産生する方法は、例えば、Ａｓｏｋａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０（４）：６９９－７０８（２０１２）に記載されている。
本明細書で使用される場合、「ｒｅｐ」遺伝子は、ウイルスゲノムを複製するために集合的に必要とされる、ＡＡＶの複製タンパク質をコードするＡＡＶゲノムの当該技術分野で認識されている領域を指す。Ｒｅｐはまた、これもまたＡＡＶ ＤＮＡ複製を媒介することが知られている、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ－６）ｒｅｐ遺伝子などの、ＡＡＶ遺伝子の機能的ホモログを指す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＡＡＶは、ｒｅｐコード領域をコードする。
本明細書で使用される場合、「ｃａｐ」遺伝子は、ＡＡＶのキャプシドタンパク質をコードするＡＡＶゲノムの当該技術分野で認識されている領域を指す。キャプシドタンパク質の例証的および非限定的な例は、ＡＡＶキャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３である。ＡＡＶキャプシドタンパク質は、相互作用して、ＡＡＶキャプシドを形成する。本開示で使用されるＣａｐ遺伝子は、任意のＡＡＶ血清型または血清型の組み合わせからのｃａｐ遺伝子を指し得る。
ＡＡＶの文脈で使用される場合、「組換え」という用語は、ＡＡＶが、天然に存在するＡＡＶとは違ったＡＡＶをもたらす１つ以上の手順の産物であることを意味する。組換えＡＡＶ、またはｒＡＡＶは、少なくとも１つのＡＡＶキャプシドタンパク質、および異種ポリヌクレオチド（すなわち、天然に存在するＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド（例えば、哺乳動物細胞などの細胞中に送達される導入遺伝子、または目的の遺伝子を含む））を含むキャプシド形成されたポリヌクレオチドｒＡＡＶベクターを含むウイルスまたはウイルス粒子を指す。ｒＡＡＶ粒子は、本明細書に記載される任意の血清型、偽型、または誘導体（例えば、Ａｎｃ８０、ＡＡＶ１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、またはそれらの誘導体、改変、および／もしくは偽型）であり得る。ｒＡＡＶ粒子にはまた、血清型の組み合わせが含まれ得る。
本明細書で使用される場合、「力価」または「ウイルス力価」という用語は、ウイルス、例えば、本明細書で提供されるＡＡＶの濃度を指す。ウイルス力価は、１ｍＬ当たりのウイルス粒子の数または感染単位の数として表現され得る。いくつかの実施形態では、ウイルス力価は、ウイルス成分、例えば、ウイルスキャプシドまたはゲノムの濃度を測定することによって決定される。
本明細書に記載されるように、ＡＡＶ、例えば、プロデューサー細胞からのｒＡＡＶの精製は、時間がかかる、労力集約的なプロセスであり得る。ｒＡＡＶの産生および精製のための例示的なプロセスを図１に示す。図１において、プロデューサー細胞は、所望される細胞密度までバイオリアクター中で増殖する。細胞は、デプス濾過によって収集され、クロマトグラフィーに供されて、精製ＡＡＶが得られる。ウイルス力価測定は、典型的には、実質的に精製された試料が得られる後、例えば、精製工程の大部分またはすべての後まで行われないことから、低収率のバッチ（例えば、少ないウイルス粒子の数および／または低い完全／空キャプシドの比率）は、かなりの量の時間および試薬が費やされるまで検出されず、このことは、大いにコストを増加させ、産生効率を低減させる。
いくつかの実施形態では、本開示は、プロデューサー細胞によって産生されたＡＡＶ力価を決定するための分析方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、ＡＡＶキャプシド力価を測定することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、ＡＡＶゲノム力価を測定することを含む。いくつかの実施形態では、同じ方法が、異なるＡＡＶ血清型を検出するために使用され、それによって、異なるプロトコルを有し得る、血清型特異的試薬を必要とする現在の方法を上回る効率的で簡略化された手順が提供される。例えば、異なる血清型のＡＡＶの製造者にとって、任意のＡＡＶ血清型を検出するための単一の合理化されたプロセスを利用できることは、機器の数およびそのメンテナンスを低減させ、機器がより効率的に利用されることを可能にし、試薬、処理、および労働コストを低下させ、人材育成を簡略化し、異なる認証の量を低減させ、製造可能性およびスケーリングを改善するなどをすることができる。
いくつかの実施形態では、方法は、本明細書に記載されるように、プロデューサー細胞からのＡＡＶ精製プロセスの間に、ＡＡＶ（例えば、Ａｎｃ８０）を検出および／または力価測定することができる。方法は、プロデューサー細胞タンパク質および細胞片などの干渉成分を含有し得る、粗未精製試料中であってさえも、ＡＡＶ（例えば、Ａｎｃ８０）の高感度で特異的な検出および／または力価測定を有利に行うことができ、それによって単純で効率的な処理最中のＡＡＶ試験を提供する。例えば、方法は、９０分以下、７５分以下、６０分以下、または４５分以下で行われ得る。いくつかの実施形態では、方法は、細胞溶解物中のＡＡＶ（例えば、Ａｎｃ８０）を検出および／または力価測定することができる。いくつかの実施形態では、方法は、部分精製細胞溶解物中のＡＡＶ（例えば、Ａｎｃ８０）を検出および／または力価測定することができる。「部分精製」細胞溶解物は、細胞溶解後の１つ以上の下流の精製プロセス工程、例えば、遠心分離、クロマトグラフィー、緩衝液交換、または濾過に供されている細胞溶解物を指す。いくつかの実施形態では、方法は、精製試料、例えば、本明細書に記載されるようにＡＡＶプロデューサー細胞から精製されている試料中のＡＡＶ（例えば、Ａｎｃ８０）を検出および／または力価測定することができる。いくつかの実施形態では、精製試料は、非ＡＡＶ粒子を含まないかまたは実質的に含まない。
クロマトグラフィー方法
いくつかの実施形態では、本開示は、プロデューサー細胞によって産生されたＡＡＶ力価を決定するための分析方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、産生プロセスの間の異なる時点で、例えば、プロデューサー細胞増殖の間、ならびに／または本明細書に記載されるＡＡＶの単離および精製プロセスの間の異なる時点でＡＡＶ力価を決定するために使用される。いくつかの実施形態では、方法は、プロデューサー細胞を溶解することなしにＡＡＶを検出および／または力価測定することができる。いくつかの実施形態では、方法は、ＡＡＶキャプシド力価を測定することを含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、細胞懸濁液または細胞溶解物中のアデノ随伴ウイルスのキャプシド力価を決定する方法であって、方法は、（ａ）細胞懸濁液または細胞溶解物を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に供することであって、ＨＰＬＣは、アデノ随伴ウイルスのウイルス粒子（ＶＰ）に結合する樹脂を用いて行われる、供することと、（ｂ）細胞懸濁液または細胞溶解物中のＶＰを検出し、それによってアデノ随伴ウイルスのキャプシド力価を決定することと、を含む、方法を提供する。
実施形態では、本明細書に記載される樹脂は、ウイルス粒子のキャプシドタンパク質に結合することができる。
例示的な実施形態では、ＶＰの検出は、分光光度的に（例えば、吸光度測定の使用によるものを含む）行われる。ＨＰＬＣ後の溶液の吸光度を測定するためのデバイスは、当該技術分野で周知であり、ＨＰＬＣ装置の一部として、またはＨＰＬＣカラムとは別に、のいずれかで使用するように容易に構成される。実施形態では、アデノ随伴ウイルスのＶＰの検出は、試料の吸光度を約２７０～２９０ｎｍで、より好適には約２８０ｎｍで、または特に２８０ｎｍで得ることによって行われる。次いで、この測定値を較正曲線と比較して（手動で、または機器測定の一部としてのいずれかで）、試料中のウイルスキャプシドの量の出力を提供し得る。
いくつかの実施形態では、細胞懸濁液は、増殖培地および／または緩衝液中に懸濁されたプロデューサー細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞溶解物は、未精製細胞溶解物、すなわち、細胞溶解後にいかなる下流の精製プロセスにも供されていない細胞溶解物である。他の実施形態では、細胞溶解物は、部分精製細胞溶解物、例えば、本明細書に記載されるように、細胞溶解後に１つ以上の下流の精製プロセス供されている細胞溶解物である。いくつかの実施形態では、細胞溶解物は、１つ以上の不純物を含み、これは、プロデューサー細胞のタンパク質、核酸、多糖、脂質、または他の細胞成分を含み得る。いくつかの実施形態では、不純物は、アセンブルされたＡＡＶ粒子の一部ではないウイルス成分を含む。いくつかの実施形態では、不純物は、部分的にアセンブルされたＡＡＶ粒子を含む。いくつかの実施形態では、不純物は、ミスフォールディングされたウイルスタンパク質または形成異常ウイルス粒子を含む。
本明細書に記載されるように、実施形態では、ＡＡＶは、蛍光部分を含む。いくつかの実施形態では、蛍光部分は、蛍光色素である。いくつかの実施形態では、蛍光部分は、ＡＡＶ粒子中に組み込まれ、例えば、キャプシド中に組み込まれる。他の実施形態では、蛍光部分は、ＡＡＶ中の核酸中に組み込まれる。さらなる実施形態では、蛍光部分は、ＡＡＶ中のタンパク質またはポリペプチド中に組み込まれる。いくつかの実施形態では、蛍光部分は、蛍光タンパク質である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、蛍光タンパク質を発現する。いくつかの実施形態では、蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＡｐｐｌｅ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、ｍＶｅｎｕｓ、ｍＫＯ２、ｍＫａｔｅ２、またはそれらの任意のバリアントもしくは誘導体（例えば、ｅＧＦＰ）である。追加の蛍光部分およびタグは、当該技術分野で既知であり、例えば、ＴａｇＲＦＰ、ｍＫａｔｅ２、ｍＲｕｂｙ２、およびＦｕｓｉｏｎ Ｒｅｄなどの赤色蛍光タンパク質、ならびに、例えば、モノマー化（Ｖ２０６Ｋ）ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ ＧＦＰ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ３、高感度青色ＦＰ２（ＥＢＦＰ２）、ＴａｇＢＦＰ、ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ、およびモノマー化Ｖｅｎｕｓ（Ａ２０６Ｋ）などを含む他の蛍光タンパク質を含む。蛍光部分またはタグがアデノ随伴ウイルスと共に利用される実施形態では、検出は、好適には、蛍光検出を含む。そのような蛍光検出のためのデバイスは、当該技術分野で既知であり、ＨＰＬＣデバイスおよび装置と容易に組み合わされ得る。蛍光部分は、例えば、Ｊｅｎｓｅｎ，Ｔｈｅ Ａｎａｔｏｍｉｃａｌ Ｒｅｃｏｒｄ ２９５（１２）：２０３１－２０３６（２０１２）にさらに記載されている。いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、蛍光を使用して、例えば、ＨＰＬＣに取り付けられた蛍光検出器を介して検出される。蛍光検出（例えば、ＶＰの）は、２６０ｎｍおよび／または２８０ｎｍでの吸光度の検出と比較して、より高い感度を有する。蛍光検出はまた、比率計算を必要とするＡ２６０／Ａ２８０測定と比較して単純でわかりやすい出力を提供し得る。いくつかの実施形態では、蛍光検出または吸光度測定を利用する本明細書に記載される方法の検出限界は、約１０６、約１０７、約１０８、約１０９、または約１０１０ウイルス粒子である。
いくつかの実施形態では、ＨＰＬＣは、約０．１ｍＬ～約５．０ｍＬ、約０．１ｍＬ～約４．０ｍＬ、約０．１ｍＬ～約３．０ｍＬ、約０．１ｍＬ～約２．０ｍＬ、約０．１ｍＬ～約１．０ｍＬ、約０．１ｍＬ～約０．９ｍＬ、約０．２ｍＬ～約０．８ｍＬ、約０．３ｍＬ～約０．７ｍＬ、または約０．４ｍＬ～約０．６ｍＬの体積を有するカラム中に含有された樹脂を用いて行われる。いくつかの実施形態では、ＨＰＬＣは、約０．１ｍＬ、約０．２ｍＬ、約０．３ｍＬ、約０．４ｍＬ、約０．５ｍＬ、約０．６ｍＬ、約０．７ｍＬ、約０．８ｍＬ、約０．９ｍＬ、約１．０ｍＬ、約１．５ｍＬ、約２．０ｍＬ、約２．５ｍＬ、約３．０ｍＬ、約３．５ｍＬ、約４．０ｍＬ、約４．５ｍＬ、または約５．０ｍＬの体積を有するカラム中に含有された樹脂を用いて行われる。
いくつかの実施形態では、樹脂は、アフィニティ樹脂である。好適には、樹脂は、抗原／そのエピトープ結合部分、抗体断片もしくは誘導体、抗体アナログ、操作された抗体、または抗体と同様の方法で抗原に結合する物質を含む、抗体またはそのバリアントを含む。実施形態では、樹脂は、抗体の少なくとも１つの重鎖または軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。いくつかの実施形態では、樹脂は、１つ以上の抗体からの少なくとも２つのＣＤＲを含む。例示的な実施形態では、樹脂は、抗体またはその抗原結合断片を含む。
いくつかの実施形態では、樹脂は、任意の血清型または広範囲のＡＡＶ血清型のアデノ随伴ウイルスに結合する。本明細書に記載されるように、ＡＡＶｘは、そのような広範囲のＡＡＶ血清型を指す。いくつかの実施形態では、樹脂は、Ａｎｃ８０、Ａｎｃ８０Ｌ２７、Ａｎｃ８０Ｌ６５、Ａｎｃ８０Ｌ１２１、ＡＡＶ１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ１．１、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ２Ｇ９、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ２－ＴＴ、ＡＡＶ２－ＴＴ－Ｓ３１２Ｎ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ３Ｂ－Ｓ３１２Ｎ、ＡＡＶ－ＬＫ３、ＡＡＶ６．１、ＡＡＶ６．３．１、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、ＡＡＶ．ＨＳＣ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３２、ＡＡＶ．ｒｈ３３、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ＲＨＭ１５－１、ＡＡＶ．ＲＨＭ１５－２、ＡＡＶ．ＲＨＭ１５－３、ＡＡＶ．ＲＨＭ１５－４、ＡＡＶ．ＲＨＭ１５－５、ＡＡＶ．ＲＨＭ１５－６、ＡＡＶ．ｃｙ１０、ＡＡＶ．ｄｊ、ＡＡＶ．ｐｏ４、ＡＡＶ．ｐｏ６、ＡＡＶ．ｈｕ２６、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、Ａｎｃ１２６、およびＡｎｃ１２７のうちのいずれかに特異的に結合することができる。好適な実施形態では、ＡＡＶは、Ａｎｃ８０を含む。いくつかの実施形態では、樹脂は、ＡＡＶのウイルス粒子（ＶＰ）のキャプシドタンパク質に結合する。実施形態では、樹脂は、アセンブルされたＡＡＶ粒子に結合し、好適には、樹脂は、ＡＡＶキャプシド上の立体構造エピトープに結合する。
いくつかの実施形態では、ＡＡＶ力価（例えば、Ａｎｃ８０力価）は、ＨＰＬＣクロマトグラム上のピーク面積を測定することによって決定される。例示的な実施形態では、方法は、デジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）によってＡＡＶゲノム力価（例えば、Ａｎｃ８０力価）を測定することをさらに含む。ｄｄＰＣＲによるウイルス、例えば、ＡＡＶの力価測定は、Ｆｕｒｕｔａ－Ｈａｎａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ３０（４）：１２７－１３６（２０１９）に記載されている。いくつかの実施形態では、方法は、ＨＰＬＣおよびｄｄＰＣＲによって測定されたＡＡＶ力価の結果に基づいて、細胞懸濁液または細胞溶解物中の空キャプシドに対する完全キャプシドの比率を決定することをさらに含む。
本明細書に記載されるように、ＨＰＬＣ方法を利用して、キャプシド力価またはＡＡＶ血清型（Ａｎｃ８０を含む）を、細胞試料を最初に精製する必要なしに、小さな試料サイズ（例えば、１０ｓ～１００ｓのｍＬの試料）の使用で、決定し得ることが驚くべきことに見出された。これにより、処理の間の直接的なウイルス力価決定の迅速で単純な方法が可能になり、このことは、下流の処理に関する素早い決定を可能にする。
本明細書に記載されるＨＰＬＣ方法は、任意のバイオリアクター、ならびに任意の体積のバイオリアクタープロセスと組み合わせて利用され得る。例示的なリアクターとしては、撹拌タンク、エアリフト、ファイバー、マイクロファイバー、ホローファイバー、セラミックマトリックス、流動層、固定層、および／または噴流層バイオリアクターが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、「リアクター」は、発酵器もしくは発酵ユニット、または任意の他の反応容器を含むことができ、「リアクター」という用語は、「発酵器」と同義に使用される。発酵器または発酵という用語は、微生物培養物および哺乳動物培養物の両方を指す。例えば、いくつかの態様では、例示的なバイオリアクターユニットは、以下：栄養素および／もしくは炭素源の供給、好適な気体（例えば、酸素）の注入、発酵もしくは細胞培養培地の流入および流出、気相および液相の分離、温度の維持、酸素およびＣＯ２レベルの維持、ｐＨレベルの維持、かき混ぜ（例えば、撹拌）、ならびに／または洗浄／滅菌のうちの１つ以上、またはすべてを行い得る。発酵ユニット等の例示的なリアクターユニットは、ユニット内に複数のリアクターを含んでもよく、例えば、ユニットは、各ユニット内に１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、もしくは１００個、またはそれ以上のバイオリアクターを有してもよく、かつ／または施設は、施設内に単一または複数のリアクターを有する複数のユニットを含んでもよい。様々な実施形態では、バイオリアクターは、バッチ、半供給バッチ、供給バッチ、灌流、および／または連続発酵プロセスに好適であり得る。任意の好適な反応器直径が使用され得る。実施形態では、バイオリアクターは、約１００ｍＬ～約５０，０００Ｌの体積を有し得る。非限定的な例としては、１００ｍＬ、２５０ｍＬ、５００ｍＬ、７５０ｍＬ、１リットル、２リットル、３リットル、４リットル、５リットル、６リットル、７リットル、８リットル、９リットル、１０リットル、１５リットル、２０リットル、２５リットル、３０リットル、４０リットル、５０リットル、６０リットル、７０リットル、８０リットル、９０リットル、１００リットル、１５０リットル、２００リットル、２５０リットル、３００リットル、３５０リットル、４００リットル、４５０リットル、５００リットル、５５０リットル、６００リットル、６５０リットル、７００リットル、７５０リットル、８００リットル、８５０リットル、９００リットル、９５０リットル、１０００リットル、１５００リットル、２０００リットル、２５００リットル、３０００リットル、３５００リットル、４０００リットル、４５００リットル、５０００リットル、６０００リットル、７０００リットル、８０００リットル、９０００リットル、１０，０００リットル、１５，０００リットル、２０，０００リットル、および／または５０，０００リットルの体積が挙げられる。さらに、好適なリアクターは、マルチユーズ、シングルユーズ、ディスポーザブル、または非ディスポーザブルであり得、ステンレス鋼（例えば、３１６Ｌまたは任意の他の好適なステンレス鋼）ならびにインコネル（Ｉｎｃｏｎｅｌ）、プラスチック、および／またはガラスなどの金属合金を含む任意の好適な材料で形成することができる。
イムノアッセイ方法
いくつかの実施形態では、本開示は、試料中のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を検出および／または力価測定するためのイムノアッセイ方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、産生プロセスの間の異なる時点で、例えば、プロデューサー細胞増殖の間、ならびに／または本明細書に記載されるＡＡＶの単離および精製プロセスの間の異なる時点でＡＡＶ力価を決定するために使用される。いくつかの実施形態では、方法は、プロデューサー細胞を溶解することなしにＡＡＶを検出および／または力価測定することができる。いくつかの実施形態では、方法は、ＡＡＶキャプシド力価を測定することを含む。
いくつかの実施形態では、方法は、試料中のＡＡＶ（例えば、Ａｎｃ８０）を検出および／または力価測定するためのイムノアッセイ（例えば、酵素結合免疫吸着アッセイまたはＥＬＩＳＡ）である。イムノアッセイは、高い特異性および感度などの多くの利点を提供し、また、１つの実験において複数の試料を評価するために高スループット形式で実施され得る。いくつかの実施形態では、イムノアッセイは、同じ捕捉および／または検出試薬を使用して、複数のＡＡＶ血清型を検出および／または力価測定することができる。例えば、イムノアッセイは、マルチウェルプレートにおいて実施され得、各ウェル（または各ウェルの群）は、異なるＡＡＶ血清型に対応し得る。
いくつかの実施形態では、試料は、細胞懸濁液であり、すなわち、増殖培地および／または緩衝液中に懸濁されたプロデューサー細胞を含む。いくつかの実施形態では、試料は、未精製細胞溶解物、すなわち、細胞溶解後にいかなる精製プロセスにも供されていない細胞溶解物である。いくつかの実施形態では、試料は、部分精製細胞溶解物、例えば、本明細書に記載されるように、細胞溶解後に１つ以上の精製プロセスに供されている細胞溶解物である。いくつかの実施形態では、試料は、１つ以上の不純物を含む。いくつかの実施形態では、不純物は、プロデューサー細胞のタンパク質、核酸、多糖、脂質、または他の細胞成分を含む。実施形態では、不純物は、アセンブルされたＡＡＶ粒子の一部ではないウイルス成分を含む。他の実施形態では、不純物は、部分的にアセンブルされたＡＡＶ粒子を含む。いくつかの実施形態では、不純物は、ミスフォールディングされたウイルスタンパク質または形成異常ウイルス粒子を含む。
例示的な実施形態では、本開示は、試料中のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を検出するための方法であって、（ａ）試料を、（ｉ）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶｘ）に結合する捕捉試薬、および（ｉｉ）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶｘ）に結合する検出試薬と接触させることと、（ｂ）捕捉試薬、ＡＡＶ、および検出試薬を含む結合複合体を形成することと、（ｃ）結合複合体を検出し、それによって試料中のＡＡＶを検出することと、を含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、本明細書で提供される血清型のうちのいずれかである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、Ａｎｃ８０、Ａｎｃ８０Ｌ２７、Ａｎｃ８０Ｌ６５、Ａｎｃ８０Ｌ１２１、ＡＡＶ１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ１．１、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ２Ｇ９、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ２－ＴＴ、ＡＡＶ２－ＴＴ－Ｓ３１２Ｎ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ３Ｂ－Ｓ３１２Ｎ、ＡＡＶ－ＬＫ３、ＡＡＶ６．１、ＡＡＶ６．３．１、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、ＡＡＶ．ＨＳＣ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３２、ＡＡＶ．ｒｈ３３、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ＲＨＭ１５－１、ＡＡＶ．ＲＨＭ１５－２、ＡＡＶ．ＲＨＭ１５－３、ＡＡＶ．ＲＨＭ１５－４、ＡＡＶ．ＲＨＭ１５－５、ＡＡＶ．ＲＨＭ１５－６、ＡＡＶ．ｃｙ１０、ＡＡＶ．ｄｊ、ＡＡＶ．ｐｏ４、ＡＡＶ．ｐｏ６、ＡＡＶ．ｈｕ２６、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、Ａｎｃ１２６、Ａｎｃ１２７、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、Ａｎｃ８０である。
追加の実施形態では、本開示は、試料中のアデノ随伴ウイルス血清型Ａｎｃ８０を検出するための方法であって、（ａ）試料を、（ｉ）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶｘ）またはアデノ随伴ウイルス血清型８（ＡＡＶ８）に結合する捕捉試薬、および（ｉｉ）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶｘ）またはアデノ随伴ウイルス血清型８（ＡＡＶ８）に結合する検出試薬と接触させることと、（ｂ）捕捉試薬、Ａｎｃ８０、および検出試薬を含む結合複合体を形成することと、（ｃ）結合複合体を検出し、それによって試料中のＡｎｃ８０を検出することと、を含む、方法を提供する。
Ａｎｃ８０は、ＡＡＶ血清型１、２、８、および９の予測される祖先であり、強力な遺伝子治療ベクターとして、Ｚｉｎｎ ｅｔ ａｌ．によって再構築された（Ｚｉｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ １２：１０５６－１０６８（２０１５）、およびＬａｎｄｅｇｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３５：２８０－２８４（２０１７）を参照されたい）。Ａｎｃ８０クローンには、例えば、Ａｎｃ８０Ｌ２７、Ａｎｃ８０Ｌ６５、Ａｎｃ８０Ｌ１２１が含まれる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、Ａｎｃ８０Ｌ２７、Ａｎｃ８０Ｌ６５、およびＡｎｃ８０Ｌ１２１を検出することができる。
捕捉および検出試薬
いくつかの実施形態では、捕捉試薬は、抗原／そのエピトープ結合部分、抗体断片もしくは誘導体、抗体アナログ、操作された抗体、または抗体と同様の方法で抗原に結合する物質を含む、抗体またはそのバリアントである。いくつかの実施形態では、捕捉試薬は、抗体の少なくとも１つの重鎖または軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。いくつかの実施形態では、捕捉試薬は、１つ以上の抗体からの少なくとも２つのＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、捕捉試薬は、抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、捕捉試薬は、モノクローナル抗体である。
例示的な実施形態では、捕捉試薬は、表面上に固定化されている。好適な表面には、例えば、粒子（ビーズなど）（そのような粒子から調製されたカラムを含む）、ならびにマルチウェルプレートなどのプラスチック基材が含まれる。いくつかの実施形態では、表面は、マルチウェルプレートを含み、捕捉試薬は、マルチウェルプレートのウェル中に固定化されている。いくつかの実施形態では、表面は、粒子を含み、捕捉試薬は、粒子上に固定化されている。いくつかの実施形態では、捕捉試薬は、その対応するコンジュゲーションパートナーと表面上で反応することができるコンジュゲーション部分を含む。例示的なコンジュゲーション部分－コンジュゲーションパートナー対としては、受容体－リガンド対、相補的オリゴヌクレオチド、または交差反応性部分、例えば、チオールおよびマレイミドもしくはヨードアセトアミド、アルデヒドおよびヒドラジド、またはアジドおよびアルキンもしくはシクロアルキンなどが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、捕捉試薬は、ビオチンを含み、表面は、アビジンまたはストレプトアビジンを含む。
いくつかの実施形態では、捕捉試薬は、任意の血清型のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶｘ）に結合する。いくつかの実施形態では、捕捉試薬は、Ａｎｃ８０、Ａｎｃ８０Ｌ２７、Ａｎｃ８０Ｌ６５、Ａｎｃ８０Ｌ１２１、ＡＡＶ１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ１．１、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ２Ｇ９、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ２－ＴＴ、ＡＡＶ２－ＴＴ－Ｓ３１２Ｎ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ３Ｂ－Ｓ３１２Ｎ、ＡＡＶ－ＬＫ３、ＡＡＶ６．１、ＡＡＶ６．３．１、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、ＡＡＶ．ＨＳＣ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３２、ＡＡＶ．ｒｈ３３、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ＲＨＭ１５－１、ＡＡＶ．ＲＨＭ１５－２、ＡＡＶ．ＲＨＭ１５－３、ＡＡＶ．ＲＨＭ１５－４、ＡＡＶ．ＲＨＭ１５－５、ＡＡＶ．ＲＨＭ１５－６、ＡＡＶ．ｃｙ１０、ＡＡＶ．ｄｊ、ＡＡＶ．ｐｏ４、ＡＡＶ．ｐｏ６、ＡＡＶ．ｈｕ２６、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、Ａｎｃ１２６、およびＡｎｃ１２７のうちのいずれかに特異的に結合することができる。いくつかの実施形態では、捕捉試薬は、Ａｎｃ８０に結合する。実施形態では、捕捉試薬は、Ａｎｃ８０のキャプシドタンパク質（ＶＰ）に結合する。いくつかの実施形態では、捕捉試薬は、アセンブルされたＡＡＶ粒子に結合する。いくつかの実施形態では、捕捉試薬は、ＡＡＶキャプシド上の立体構造エピトープに結合する。
追加の実施形態では、捕捉試薬は、ＡＡＶ８に結合する。いくつかの実施形態では、捕捉試薬は、ＡＡＶ８およびＡｎｃ８０に結合することができる。
いくつかの実施形態では、捕捉試薬は、ＡＡＶ８のウイルス粒子（ＶＰ）のキャプシドタンパク質またはＡｎｃ８０のタンパク質に結合する。好適には、捕捉試薬は、ＡＡＶ８のＶＰ３タンパク質またはＶＰ３タンパク質Ａｎｃ８０に結合する。実施形態では、捕捉試薬は、ＡＡＶ８のＶＰ３またはＡｎｃ８０のＶＰ３タンパク質の残基５７５～６１０内、または残基５８０～６００内、または残基５８０～５９５内のエピトープに結合する。好適な実施形態では、捕捉試薬は、ＡＡＶ８ ＶＰ３タンパク質の残基５８６～５９１内のエピトープに結合する。他の実施形態では、捕捉試薬は、Ａｎｃ８０ ＶＰ３タンパク質の残基５８９～５９４内のエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、捕捉試薬は、配列ＬＱＳＡＮＴ（配列番号１）に結合する。他の実施形態では、捕捉試薬は、配列ＬＱＱＱＮＴ（配列番号２）に結合する。いくつかの実施形態では、捕捉試薬は、ＡＡＶ８抗体クローンＡＤＫ８である。
好適には、検出試薬は、抗原／そのエピトープ結合部分、抗体断片もしくは誘導体、抗体アナログ、操作された抗体、または抗体と同様の方法で抗原に結合する物質を含む、抗体またはそのバリアントである。いくつかの実施形態では、検出試薬は、抗体の少なくとも１つの重鎖または軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。いくつかの実施形態では、検出試薬は、１つ以上の抗体からの少なくとも２つのＣＤＲを含む。例示的な実施形態では、検出試薬は、抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、検出試薬は、モノクローナル抗体である。
好適には、検出試薬は、任意の血清型のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶｘ）に結合する。いくつかの実施形態では、検出試薬は、Ａｎｃ８０、Ａｎｃ８０Ｌ２７、Ａｎｃ８０Ｌ６５、Ａｎｃ８０Ｌ１２１、ＡＡＶ１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ１．１、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ２Ｇ９、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ２－ＴＴ、ＡＡＶ２－ＴＴ－Ｓ３１２Ｎ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ３Ｂ－Ｓ３１２Ｎ、ＡＡＶ－ＬＫ３、ＡＡＶ６．１、ＡＡＶ６．３．１、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、ＡＡＶ．ＨＳＣ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３２、ＡＡＶ．ｒｈ３３、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ＲＨＭ１５－１、ＡＡＶ．ＲＨＭ１５－２、ＡＡＶ．ＲＨＭ１５－３、ＡＡＶ．ＲＨＭ１５－４、ＡＡＶ．ＲＨＭ１５－５、ＡＡＶ．ＲＨＭ１５－６、ＡＡＶ．ｃｙ１０、ＡＡＶ．ｄｊ、ＡＡＶ．ｐｏ４、ＡＡＶ．ｐｏ６、ＡＡＶ．ｈｕ２６、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、Ａｎｃ１２６、およびＡｎｃ１２７のうちのいずれかに結合することができる。いくつかの実施形態では、検出試薬は、Ａｎｃ８０に結合する。いくつかの実施形態では、検出試薬は、Ａｎｃ８０のＶＰのキャプシドタンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、検出試薬は、アセンブルされたＡＡＶ粒子に結合する。いくつかの実施形態では、検出試薬は、ＡＡＶキャプシド上の立体構造エピトープに結合する。
さらなる実施形態では、検出試薬は、ＡＡＶ８に結合する。いくつかの実施形態では、検出試薬は、ＡＡＶ８およびＡｎｃ８０に結合することができる。実施形態では、検出試薬は、ＡＡＶ８のウイルス粒子（ＶＰ）のキャプシドタンパク質またはＡｎｃ８０のタンパク質に結合し、好適には、検出試薬は、ＡＡＶ８のＶＰ３タンパク質またはＶＰ３タンパク質Ａｎｃ８０に結合する。いくつかの実施形態では、検出試薬は、ＡＡＶ８のＶＰ３またはＡｎｃ８０のＶＰ３タンパク質の残基５７５～６１０内、または残基５８０～６００内、または残基５８０～５９５内のエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、検出試薬は、ＡＡＶ８ ＶＰ３タンパク質の残基５８６～５９１内のエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、検出試薬は、Ａｎｃ８０ ＶＰ３タンパク質の残基５８９～５９４内のエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、検出試薬は、配列ＬＱＳＡＮＴ（配列番号１）に結合する。いくつかの実施形態では、検出試薬は、配列ＬＱＱＱＮＴ（配列番号２）に結合する。いくつかの実施形態では、検出試薬は、ＡＡＶ８抗体クローンＡＤＫ８である。
追加の実施形態では、捕捉試薬は、ＡＡＶ８に結合し、検出試薬は、ＡＡＶｘに結合する。いくつかの実施形態では、捕捉試薬は、ＡＡＶｘに結合し、検出試薬は、ＡＡＶ８に結合する。いくつかの実施形態では、捕捉試薬および検出試薬の両方は、ＡＡＶｘに結合する。例示的な実施形態では、捕捉試薬および検出試薬の両方は、Ａｎｃ８０、Ａｎｃ８０Ｌ２７、Ａｎｃ８０Ｌ６５、Ａｎｃ８０Ｌ１２１、ＡＡＶ１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ１．１、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ２Ｇ９、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ２－ＴＴ、ＡＡＶ２－ＴＴ－Ｓ３１２Ｎ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ３Ｂ－Ｓ３１２Ｎ、ＡＡＶ－ＬＫ３、ＡＡＶ６．１、ＡＡＶ６．３．１、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、ＡＡＶ．ＨＳＣ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３２、ＡＡＶ．ｒｈ３３、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ＲＨＭ１５－１、ＡＡＶ．ＲＨＭ１５－２、ＡＡＶ．ＲＨＭ１５－３、ＡＡＶ．ＲＨＭ１５－４、ＡＡＶ．ＲＨＭ１５－５、ＡＡＶ．ＲＨＭ１５－６、ＡＡＶ．ｃｙ１０、ＡＡＶ．ｄｊ、ＡＡＶ．ｐｏ４、ＡＡＶ．ｐｏ６、ＡＡＶ．ｈｕ２６、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、Ａｎｃ１２６、およびＡｎｃ１２７のうちのいずれかに結合することができる。
結合複合体形成
いくつかの実施形態では、捕捉試薬、ＡＡＶ（例えば、Ａｎｃ８０）、および検出試薬を含む結合複合体は、単一の工程で形成される。他の実施形態では、捕捉試薬、ＡＡＶ（例えば、Ａｎｃ８０）、および検出試薬を含む結合複合体は、１つ以上の工程で形成される。いくつかの実施形態では、結合複合体は、溶液中で形成され、次いで、表面に固定化される。いくつかの実施形態では、結合複合体は、ＡＡＶ（例えば、Ａｎｃ８０）を、表面上に固定化された捕捉試薬に結合させ、次いで、検出試薬をＡＡＶ（例えば、Ａｎｃ８０）に結合させて、表面上で結合複合体を形成することによって形成される。いくつかの実施形態では、結合複合体は、ＡＡＶ（例えば、Ａｎｃ８０）に、表面上に固定化された捕捉試薬に、かつ検出試薬に同時に結合することによって形成される。他の実施形態では、結合複合体は、ＡＡＶ（例えば、Ａｎｃ８０）を溶液中の検出試薬に結合させ、次いで、ＡＡＶ－検出試薬複合体を表面上の捕捉試薬に結合させることによって形成される。追加の実施形態では、結合複合体は、ＡＡＶ（例えば、Ａｎｃ８０）を溶液中の捕捉試薬および検出試薬に結合させ、次いで、本明細書に記載されるように捕捉試薬を表面に固定化することによって形成される。
検出
実施形態では、結合複合体は、検出可能な部分を介して検出される。例えば、検出可能な部分は、分光光度測定（色変化）、光散乱、光吸収、蛍光、化学発光、電気化学発光、生物発光、燐光、放射能、磁場、またはそれらの組み合わせによって測定される。実施形態では、ＡＡＶ力価（例えば、Ａｎｃ８０力価）は、検出可能な部分を測定することによって決定される。いくつかの実施形態では、検出可能な部分は、基質の存在下で検出可能である。好適には、検出可能な部分は、基質を切断する酵素であり、検出することは、切断された基質を検出することを含む。いくつかの実施形態では、検出可能な部分は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、グルコースオキシダーゼ（ＧＯ）、またはベータガラクトシダーゼ（ＢＧＡＬもしくはβ－ｇａｌ）を含む。ＨＲＰ基質の非限定的な例としては、例えば、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、３，３’－ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、２，２’－アジノ－ビス（３－エチルベンゾチアゾリン－６－スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、ｏ－フェニレンジアミン二塩酸塩（ＯＰＤ）、ＡＭＰＬＥＸ（登録商標）Ｒｅｄ、３－アミノ－９－エチルカルバゾール（ＡＥＣ）、ホモバニリン酸、ルミノール、ならびにＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒからのＳＵＰＥＲＳＩＧＮＡＬ（商標）ＥＬＩＳＡ、ＱＵＡＮＴＡＢＬＵ（商標）、およびＱＵＡＮＴＡＲＥＤ（商標）基質が挙げられる。ＡＰ基質の非限定的な例としては、例えば、ｐ－ニトロフェニルリン酸（ＰＮＰＰ）、ならびにＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒからのＣＤＰ－ＳＴＡＲ（商標）およびＤＹＮＡＬＩＧＨＴ（商標）基質が挙げられる。ＧＯ基質としては、例えば、グルコースが挙げられる。ＢＧＡＬ基質としては、例えば、ｏ－ニトロフェニル－β－Ｄ－ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、検出試薬は、検出可能な部分を含み、結合複合体を検出することは、検出試薬の検出可能な部分を測定することを含む。実施形態では、検出試薬は、検出可能な部分の結合パートナーを含み、結合複合体を検出することは、検出試薬を検出可能な部分と接触させることと、検出試薬に結合した検出可能な部分を測定することとを含む。追加の実施形態では、検出試薬および検出可能な部分は、各々、結合対における結合パートナーを含む。好適な結合対は、当該技術分野で既知であり、受容体－リガンド対、相補的オリゴヌクレオチド、または交差反応性部分、例えば、チオールおよびマレイミドもしくはヨードアセトアミド、アルデヒドおよびヒドラジド、またはアジドおよびアルキンもしくはシクロアルキンなどを含み得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、検出試薬は、ビオチンを含み、検出可能な部分は、アビジンまたはストレプトアビジンを含む。いくつかの実施形態では、検出試薬は、ビオチンを含み、検出可能な部分は、アビジンまたはストレプトアビジンにコンジュゲートされた西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を含む。好適には、結合複合体を検出することは、結合複合体をＨＲＰに結合させる（例えば、検出試薬およびＨＲＰ上のビオチン－アビジン／ストレプトアビジン相互作用を介して）ことと、ＨＲＰを発色性または化学発光性ＨＲＰ基質と接触させることと、色または化学発光シグナルの変化を検出することとを含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ力価（例えば、Ａｎｃ８０力価）は、色および／または化学発光シグナルの変化を測定することによって決定される。
キット
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載される方法を実施するためのキット、例えば、イムノアッセイキットを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を検出および／または力価測定するためのキットであって、（ａ）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶｘ）に結合する捕捉試薬と、（ｂ）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶｘ）に結合する検出試薬と、を含む、キットを提供する。本明細書に記載されるキットはまた、好適には、本明細書に記載される、ＥＬＩＳＡベースの方法を含む、様々な方法を実施するための説明書を含む。
いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載される任意のＡＡＶ血清型、例えば、Ａｎｃ８０、Ａｎｃ８０Ｌ２７、Ａｎｃ８０Ｌ６５、Ａｎｃ８０Ｌ１２１、ＡＡＶ１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ１．１、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ２Ｇ９、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ２－ＴＴ、ＡＡＶ２－ＴＴ－Ｓ３１２Ｎ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ３Ｂ－Ｓ３１２Ｎ、ＡＡＶ－ＬＫ３、ＡＡＶ６．１、ＡＡＶ６．３．１、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、ＡＡＶ．ＨＳＣ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３２、ＡＡＶ．ｒｈ３３、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ＲＨＭ１５－１、ＡＡＶ．ＲＨＭ１５－２、ＡＡＶ．ＲＨＭ１５－３、ＡＡＶ．ＲＨＭ１５－４、ＡＡＶ．ＲＨＭ１５－５、ＡＡＶ．ＲＨＭ１５－６、ＡＡＶ．ｃｙ１０、ＡＡＶ．ｄｊ、ＡＡＶ．ｐｏ４、ＡＡＶ．ｐｏ６、ＡＡＶ．ｈｕ２６、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、Ａｎｃ１２６、またはＡｎｃ１２７を検出および／または力価測定するために使用される。いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、Ａｎｃ８０である。Ａｎｃ８０は、本明細書においてさらに記載される。
いくつかの実施形態では、本開示は、キットであって、（ａ）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶｘ）またはアデノ随伴ウイルス血清型８（ＡＡＶ８）に結合する捕捉試薬と、（ｂ）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶｘ）またはアデノ随伴ウイルス血清型８（ＡＡＶ８）に結合する検出試薬と、を含む、キットを提供する。
捕捉試薬および検出試薬は、本明細書においてさらに記載される。いくつかの実施形態では、捕捉試薬は、抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、検出試薬は、抗体またはその抗原結合断片である。
いくつかの実施形態では、キットは、捕捉表面を含む。捕捉表面は、本明細書に記載される表面のうちのいずれかであり得る。いくつかの実施形態では、捕捉表面は、粒子を含む。いくつかの実施形態では、捕捉表面は、マルチウェルプレートなどのプラスチック基材を含む。いくつかの実施形態では、捕捉試薬は、捕捉表面上に固定化されている。いくつかの実施形態では、捕捉表面は、マルチウェルプレートであり、捕捉試薬は、マルチウェルプレートのウェル上に固定化されている。
いくつかの実施形態では、捕捉試薬および捕捉表面は、別々に提供され、キットは、捕捉試薬を捕捉表面に固定化するための試薬をさらに含む。いくつかの実施形態では、捕捉試薬は、コンジュゲーション部分を含み、捕捉表面は、そのコンジュゲーションパートナーを含む。例示的なコンジュゲーション部分－コンジュゲーションパートナー対としては、受容体－リガンド対、相補的オリゴヌクレオチド、または交差反応性部分、例えば、チオールおよびマレイミドもしくはヨードアセトアミド、アルデヒドおよびヒドラジド、またはアジドおよびアルキンもしくはシクロアルキンなどが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、捕捉試薬は、ビオチンを含み、捕捉表面は、それに付着されたアビジンまたはストレプトアビジンを含む。
いくつかの実施形態では、捕捉試薬は、任意の血清型のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶｘ）に結合する。いくつかの実施形態では、捕捉試薬は、Ａｎｃ８０、Ａｎｃ８０Ｌ２７、Ａｎｃ８０Ｌ６５、Ａｎｃ８０Ｌ１２１、ＡＡＶ１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ１．１、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ２Ｇ９、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ２－ＴＴ、ＡＡＶ２－ＴＴ－Ｓ３１２Ｎ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ３Ｂ－Ｓ３１２Ｎ、ＡＡＶ－ＬＫ３、ＡＡＶ６．１、ＡＡＶ６．３．１、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、ＡＡＶ．ＨＳＣ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３２、ＡＡＶ．ｒｈ３３、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ＲＨＭ１５－１、ＡＡＶ．ＲＨＭ１５－２、ＡＡＶ．ＲＨＭ１５－３、ＡＡＶ．ＲＨＭ１５－４、ＡＡＶ．ＲＨＭ１５－５、ＡＡＶ．ＲＨＭ１５－６、ＡＡＶ．ｃｙ１０、ＡＡＶ．ｄｊ、ＡＡＶ．ｐｏ４、ＡＡＶ．ｐｏ６、ＡＡＶ．ｈｕ２６、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、Ａｎｃ１２６、およびＡｎｃ１２７のうちのいずれかに特異的に結合することができる。いくつかの実施形態では、捕捉試薬は、Ａｎｃ８０に結合する。いくつかの実施形態では、捕捉試薬は、Ａｎｃ８０のキャプシドタンパク質（ＶＰ）に結合する。いくつかの実施形態では、捕捉試薬は、アセンブルされたＡＡＶ粒子に結合する。いくつかの実施形態では、捕捉試薬は、ＡＡＶキャプシド上の立体構造エピトープに結合する。
いくつかの実施形態では、捕捉試薬は、ＡＡＶ８に結合する。いくつかの実施形態では、捕捉試薬は、ＡＡＶ８およびＡｎｃ８０に結合することができる。いくつかの実施形態では、捕捉試薬は、ＡＡＶ８のウイルス粒子（ＶＰ）のキャプシドタンパク質またはＡｎｃ８０のキャプシドタンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、捕捉試薬は、ＡＡＶ８のＶＰ３タンパク質またはＶＰ３タンパク質Ａｎｃ８０に結合する。いくつかの実施形態では、捕捉試薬は、ＡＡＶ８のＶＰ３またはＡｎｃ８０のＶＰ３タンパク質の残基５７５～６１０内、または残基５８０～６００内、または残基５８０～５９５内のエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、捕捉試薬は、ＡＡＶ８ ＶＰ３タンパク質の残基５８６～５９１内のエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、捕捉試薬は、Ａｎｃ８０ ＶＰ３タンパク質の残基５８９～５９４内のエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、捕捉試薬は、配列ＬＱＳＡＮＴ（配列番号１）に結合する。いくつかの実施形態では、捕捉試薬は、配列ＬＱＱＱＮＴ（配列番号２）に結合する。いくつかの実施形態では、捕捉試薬は、ＡＡＶ８抗体クローンＡＤＫ８である。
いくつかの実施形態では、検出試薬は、任意の血清型のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶｘ）に結合する。いくつかの実施形態では、検出試薬は、Ａｎｃ８０、Ａｎｃ８０Ｌ２７、Ａｎｃ８０Ｌ６５、Ａｎｃ８０Ｌ１２１、ＡＡＶ１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ１．１、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ２Ｇ９、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ２－ＴＴ、ＡＡＶ２－ＴＴ－Ｓ３１２Ｎ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ３Ｂ－Ｓ３１２Ｎ、ＡＡＶ－ＬＫ３、ＡＡＶ６．１、ＡＡＶ６．３．１、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、ＡＡＶ．ＨＳＣ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３２、ＡＡＶ．ｒｈ３３、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ＲＨＭ１５－１、ＡＡＶ．ＲＨＭ１５－２、ＡＡＶ．ＲＨＭ１５－３、ＡＡＶ．ＲＨＭ１５－４、ＡＡＶ．ＲＨＭ１５－５、ＡＡＶ．ＲＨＭ１５－６、ＡＡＶ．ｃｙ１０、ＡＡＶ．ｄｊ、ＡＡＶ．ｐｏ４、ＡＡＶ．ｐｏ６、ＡＡＶ．ｈｕ２６、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、Ａｎｃ１２６、およびＡｎｃ１２７のうちのいずれかに結合することができる。いくつかの実施形態では、検出試薬は、Ａｎｃ８０に結合する。いくつかの実施形態では、検出試薬は、Ａｎｃ８０のキャプシドタンパク質（ＶＰ）に結合する。いくつかの実施形態では、検出試薬は、アセンブルされたＡＡＶ粒子に結合する。いくつかの実施形態では、検出試薬は、ＡＡＶキャプシド上の立体構造エピトープに結合する。
いくつかの実施形態では、検出試薬は、ＡＡＶ８に結合する。いくつかの実施形態では、検出試薬は、ＡＡＶ８およびＡｎｃ８０に結合することができる。いくつかの実施形態では、検出試薬は、ＡＡＶ８のウイルス粒子（ＶＰ）のキャプシドタンパク質またはＡｎｃ８０のキャプシドタンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、検出試薬は、ＡＡＶ８のＶＰ３タンパク質またはＶＰ３タンパク質Ａｎｃ８０に結合する。いくつかの実施形態では、検出試薬は、ＡＡＶ８のＶＰ３またはＡｎｃ８０のＶＰ３タンパク質の残基５７５～６１０内、または残基５８０～６００内、または残基５８０～５９５内のエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、検出試薬は、ＡＡＶ８ ＶＰ３タンパク質の残基５８６～５９１内のエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、検出試薬は、Ａｎｃ８０ ＶＰ３タンパク質の残基５８９～５９４内のエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、検出試薬は、配列ＬＱＳＡＮＴ（配列番号１）に結合する。いくつかの実施形態では、検出試薬は、配列ＬＱＱＱＮＴ（配列番号２）に結合する。いくつかの実施形態では、検出試薬は、ＡＡＶ８抗体クローンＡＤＫ８である。
いくつかの実施形態では、捕捉試薬は、ＡＡＶ８に結合し、検出試薬は、ＡＡＶｘに結合する。いくつかの実施形態では、捕捉試薬は、ＡＡＶｘに結合し、検出試薬は、ＡＡＶ８に結合する。いくつかの実施形態では、捕捉試薬および検出試薬の両方は、ＡＡＶｘに結合する。いくつかの実施形態では、捕捉試薬および検出試薬の両方は、Ａｎｃ８０、Ａｎｃ８０Ｌ２７、Ａｎｃ８０Ｌ６５、Ａｎｃ８０Ｌ１２１、ＡＡＶ１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ１．１、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ２Ｇ９、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ２－ＴＴ、ＡＡＶ２－ＴＴ－Ｓ３１２Ｎ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ３Ｂ－Ｓ３１２Ｎ、ＡＡＶ－ＬＫ３、ＡＡＶ６．１、ＡＡＶ６．３．１、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、ＡＡＶ．ＨＳＣ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３２、ＡＡＶ．ｒｈ３３、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ＲＨＭ１５－１、ＡＡＶ．ＲＨＭ１５－２、ＡＡＶ．ＲＨＭ１５－３、ＡＡＶ．ＲＨＭ１５－４、ＡＡＶ．ＲＨＭ１５－５、ＡＡＶ．ＲＨＭ１５－６、ＡＡＶ．ｃｙ１０、ＡＡＶ．ｄｊ、ＡＡＶ．ｐｏ４、ＡＡＶ．ｐｏ６、ＡＡＶ．ｈｕ２６、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、Ａｎｃ１２６、およびＡｎｃ１２７のうちのいずれかに結合することができる。
いくつかの実施形態では、検出試薬は、例えば、分光光度測定（色変化）、光散乱、光吸収、蛍光、化学発光、電気化学発光、生物発光、燐光、放射能、磁場、またはそれらの組み合わせによって測定されることができる、検出可能な部分を含む。いくつかの実施形態では、検出試薬は、検出可能な部分の結合パートナーを含む。いくつかの実施形態では、検出試薬および検出可能な部分は、各々、結合対における結合パートナー、例えば、受容体－リガンド対、相補的オリゴヌクレオチド、または交差反応性部分、例えば、チオールおよびマレイミドもしくはヨードアセトアミド、アルデヒドおよびヒドラジド、またはアジドおよびアルキンもしくはシクロアルキンなどを含む。いくつかの実施形態では、検出試薬は、ビオチンを含み、検出可能な部分は、アビジンまたはストレプトアビジンを含む。いくつかの実施形態では、検出可能な部分は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、グルコースオキシダーゼ（ＧＯ）、またはベータガラクトシダーゼ（ＢＧＡＬもしくはβ－ｇａｌ）を含む。いくつかの実施形態では、検出試薬は、ビオチンを含み、検出可能な部分は、アビジンまたはストレプトアビジンにコンジュゲートされたＨＲＰを含む。
いくつかの実施形態では、捕捉試薬は、凍結乾燥されている。いくつかの実施形態では、捕捉試薬は、溶液中で提供される。いくつかの実施形態では、検出試薬は、凍結乾燥されている。いくつかの実施形態では、検出試薬は、溶液中で提供される。捕捉および／または検出試薬が凍結乾燥されている実施形態では、キットは、好適には、凍結乾燥された試薬を再構成または再懸濁するための緩衝液をさらに含む。いくつかの実施形態では、捕捉および／または検出試薬は、例えば、それらの最適な運送および／または貯蔵温度に従って、キットの他の成分とは別に提供される。
いくつかの実施形態では、キットは、緩衝液、アッセイ停止溶液、較正試薬、検出試薬に結合することができる検出可能な部分、および検出可能な基質のうちの１つ以上をさらに含む。
いくつかの実施形態では、キットは、アッセイ緩衝液、ブロッキング緩衝液、コーティング緩衝液、洗浄緩衝液、再構成または再懸濁緩衝液、および貯蔵緩衝液のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、アッセイ緩衝液は、リン酸緩衝生理食塩水、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、Ｔｒｉｓ、ＮａＣｌ、ＴＷＥＥＮ、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、キットは、アッセイ停止溶液を含む。いくつかの実施形態では、アッセイ停止溶液は、硫酸を含む。
いくつかの実施形態では、キットは、較正試薬を含む。いくつかの実施形態では、較正試薬は、既知の量のＡＡＶ（例えば、Ａｎｃ８０）を含む。いくつかの実施形態では、キットは、一定範囲の濃度のＡＡＶ（例えば、Ａｎｃ８０）を含む複数の較正試薬を含む。いくつかの実施形態では、複数の較正試薬は、キットを使用して行われる方法についての定量化の上限および下限付近の濃度のＡＡＶ（例えば、Ａｎｃ８０）を含む。いくつかの実施形態では、較正試薬の複数の較正濃度は、方法のダイナミックレンジ全体に及ぶ。いくつかの実施形態では、複数の較正試薬は、例えば、異なるＡＡＶ血清型を検出するための方法を較正するために、複数のＡＡＶ血清型を含む。いくつかの実施形態では、較正試薬は、陽性対照試薬である。いくつかの実施形態では、較正試薬は、陰性対照試薬である。いくつかの実施形態では、較正試薬は、凍結乾燥されている。いくつかの実施形態では、較正試薬は、溶液中で提供される。
いくつかの実施形態では、キットは、検出試薬に結合することができる検出可能な部分を含む。検出可能な部分は、本明細書においてさらに記載される。いくつかの実施形態では、検出可能な部分は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、グルコースオキシダーゼ（ＧＯ）、またはベータガラクトシダーゼ（ＢＧＡＬもしくβ－ｇａｌ）を含む。いくつかの実施形態では、キットは、検出可能な部分のための基質をさらに含む。検出可能な部分のための例示的な基質は、本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、基質は、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、３，３’－ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、２，２’－アジノ－ビス（３－エチルベンゾチアゾリン－６－スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、ｏ－フェニレンジアミン二塩酸塩（ＯＰＤ）、ＡＭＰＬＥＸ（登録商標）Ｒｅｄ、３－アミノ－９－エチルカルバゾール（ＡＥＣ）、ホモバニリン酸、ルミノール、ならびにＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒからのＳＵＰＥＲＳＩＧＮＡＬ（商標）ＥＬＩＳＡ、ＱＵＡＮＴＡＢＬＵ（商標）、およびＱＵＡＮＴＡＲＥＤ（商標）基質である。いくつかの実施形態では、基質は、ｐ－ニトロフェニルリン酸（ＰＮＰＰ）、ならびにＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒからのＣＤＰ－ＳＴＡＲ（商標）およびＤＹＮＡＬＩＧＨＴ（商標）基質である。いくつかの実施形態では、基質は、グルコースである。いくつかの実施形態では、基質は、ｏ－ニトロフェニル－β－Ｄ－ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）である。
いくつかの実施形態では、キットは、アッセイ消耗品、例えば、アッセイモジュール、バイアル、チューブ、液体取り扱いおよび移送デバイス、例えば、ピペットチップ、カバーおよびシール、ラック、ならびにラベルのうちの１つ以上をさらに含む。いくつかの実施形態では、キットは、ＡＡＶ（例えば、Ａｎｃ８０）を検出および／または力価測定するためのイムノアッセイを行うための説明書をさらに含む。いくつかの実施形態では、イムノアッセイは、本明細書に記載される方法を含む。
例示的な実施形態
実施形態１は、試料中のアデノ随伴ウイルス血清型Ａｎｃ８０を検出するための方法であって、試料を、（ｉ）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶｘ）またはアデノ随伴ウイルス血清型８（ＡＡＶ８）に結合する捕捉試薬、および（ｉｉ）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶｘ）に結合する検出試薬と接触させることと、捕捉試薬、Ａｎｃ８０、および検出試薬を含む結合複合体を形成することと、結合複合体を検出し、それによって試料中のＡｎｃ８０を検出することと、を含む、方法である。
実施形態２は、捕捉試薬および／または検出試薬が、抗体またはその抗原結合断片である、実施形態１の方法を含む。
実施形態３は、捕捉試薬が、表面上に固定化されている、実施形態１または２の方法を含む。
実施形態４は、捕捉試薬が、ビオチンを含み、表面が、アビジンまたはストレプトアビジンを含む、実施形態３の方法を含む。
実施形態５は、表面が、マルチウェルプレートであり、捕捉試薬が、マルチウェルプレートのウェル中に固定化されている、実施形態３または４の方法を含む。
実施形態６は、捕捉試薬が、ＡＡＶｘに結合する、実施形態１～５のいずれかの方法を含む。
実施形態７は、捕捉試薬が、ＡＡＶ８に結合する、実施形態１～５のいずれかの方法を含む。
実施形態８は、捕捉試薬が、Ａｎｃ８０のウイルス粒子（ＶＰ）に結合する、実施形態１～７のいずれかの方法を含む。
実施形態９は、捕捉試薬が、ＶＰ３に結合する、実施形態７の方法を含む。
実施形態１０は、捕捉試薬が、ＶＰ３の残基５８０～６００内のエピトープに結合する、実施形態９の方法を含む。
実施形態１１は、捕捉試薬が、ＬＱＳＡＮＴ（配列番号１）に結合する、実施形態１０の方法を含む。
実施形態１２は、検出試薬が、ＡＡＶｘに結合する、実施形態１～１１のいずれかの方法を含む。
実施形態１３は、検出試薬が、ＡＡＶ８に結合する、実施形態１～１１のいずれかの方法を含む。
実施形態１４は、検出試薬が、Ａｎｃ８０のウイルスタンパク質（ＶＰ）に結合する、実施形態１～１３のいずれかの方法を含む。
実施形態１５は、検出試薬が、検出可能な部分の結合パートナーを含む、実施形態１～１４のいずれかの方法を含む。
実施形態１６は、検出試薬が、ビオチンを含み、検出可能な部分が、アビジンまたはストレプトアビジンにコンジュゲートされた西洋ワサビペルオキシダーゼを含む、実施形態１５の方法を含む。
実施形態１７は、捕捉試薬が、ＡＡＶ８に結合し、検出試薬が、ＡＡＶｘに結合する、実施形態１の方法を含む。
実施形態１８は、キットであって、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶｘ）またはアデノ随伴ウイルス血清型８（ＡＡＶ８）に結合する捕捉試薬と、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶｘ）に結合する検出試薬と、を含む、キットである。
実施形態１９は、捕捉試薬および／または検出試薬が、抗体またはその抗原結合断片である、実施形態１８のキットを含む。
実施形態２０は、捕捉表面をさらに含む、実施形態１８または１９のキットを含む。
実施形態２１は、捕捉試薬が、ビオチンを含み、捕捉表面が、それに付着されたアビジンまたはストレプトアビジンを含む、実施形態２０のキットを含む。
実施形態２２は、捕捉表面が、マルチウェルプレートであり、捕捉試薬が、マルチウェルプレートのウェル上に固定化されている、実施形態２０または２１のキットを含む。
実施形態２３は、捕捉試薬が、ＡＡＶｘに結合する、実施形態１８～２２のいずれかのキットを含む。
実施形態２４は、捕捉試薬が、ＡＡＶ８に結合する、実施形態１８～２２のいずれかのキットを含む。
実施形態２５は、捕捉試薬が、Ａｎｃ８０のウイルスタンパク質（ＶＰ）に結合する、実施形態１８～２４のいずれかのキットを含む。
実施形態２６は、捕捉試薬が、ＶＰ３に結合する、実施形態２４のキットを含む。
実施形態２７は、捕捉試薬が、ＶＰ３の残基５８０～６００内のエピトープに結合する、実施形態２６のキットを含む。
実施形態２８は、捕捉試薬が、ＬＱＳＡＮＴ（配列番号１）に結合する、実施形態２７のキットを含む。
実施形態２９は、検出試薬が、ＡＡＶｘに結合する、実施形態１８～２８のいずれかのキットを含む。
実施形態３０は、検出試薬が、ＡＡＶ８に結合する、実施形態１８～２８のいずれかのキットを含む。
実施形態３１は、検出試薬が、Ａｎｃ８０のキャプシドタンパク質（ＶＰ）に結合する、実施形態１８～３０のいずれかのキットを含む。
実施形態３２は、検出可能な部分をさらに含み、検出試薬が、検出可能な部分の結合パートナーを含む、実施形態１８～３１のいずれかのキットを含む。
実施形態３３は、検出試薬が、ビオチンを含み、検出可能な部分が、アビジンまたはストレプトアビジンにコンジュゲートされた西洋ワサビペルオキシダーゼを含む、実施形態３２のキットを含む。
実施形態３４は、捕捉試薬、検出試薬、またはその両方が、凍結乾燥されている、実施形態１８～３３のいずれかのキットを含む。
実施形態３５は、捕捉試薬、検出試薬、またはその両方が、溶液中で提供される、実施形態１８～３３のいずれかのキットを含む。
実施形態３６は、緩衝液、アッセイ停止溶液、較正試薬、検出試薬に結合することができる検出可能な部分、および検出可能な基質のうちの１つ以上をさらに含む、実施形態１８～３５のいずれかのキットを含む。
実施形態３７は、捕捉試薬が、ＡＡＶ８に結合し、検出試薬が、ＡＡＶｘに結合する、実施形態１８のキットを含む。
実施形態３８は、細胞懸濁液または細胞溶解物中のアデノ随伴ウイルスのキャプシド力価を決定する方法であって、方法は、細胞懸濁液または細胞溶解物を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に供することであって、ＨＰＬＣは、アデノ随伴ウイルスのウイルスタンパク質（ＶＰ）に結合する樹脂を用いて行われる、供することと、細胞懸濁液または細胞溶解物中のＶＰを検出し、それによってアデノ随伴ウイルスのキャプシド力価を決定することと、を含む、方法である。
実施形態３９は、検出することが、２８０ｎｍでキャプシドタンパク質を分光光度的に検出することを含む、実施形態３８の方法を含む。
実施形態４０は、アデノ随伴ウイルスが、蛍光部分を含み、検出することが、蛍光検出を含む、実施形態３８の方法を含む。
実施形態４１は、細胞溶解物が、未精製細胞溶解物または部分精製細胞溶解物である、実施形態３８～４０のいずれかの方法を含む。
実施形態４２は、ＨＰＬＣが、約０．１～約１．０ｍＬの体積を有するカラム中に含有された樹脂を用いて行われる、実施形態３８～４１のいずれかの方法を含む。
実施形態４３は、樹脂が、抗体またはその抗原結合断片を含む、実施形態３８～４２のいずれかの方法を含む。
実施形態４４は、アデノ随伴ウイルスが、Ａｎｃ８０を含む、実施形態３８～４３のいずれかの方法を含む。
実施例１．ＨＰＬＣアッセイ
広域スペクトルＡＡＶ（ＡＡＶＸ）アフィニティカラムは、ＰＯＲＯＳ（商標）ＣＡＰＴＵＲＥＳＥＬＥＣＴ（商標）ＡＡＶＸ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｓｉｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を５０×４．６ｍｍ ＨＰＬＣカラム中に充填することによって、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ｉｎｃ．により調製された。Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒを備えたＡｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ Ｂｉｏ－Ｉｎｅｒｔ ＬＣ Ｓｙｓｔｅｍを使用して、Ａｎｃ８０．ＣＭＶ．ｅＧＦＰ、ＡＡＶ２．ＣＭＶ．ｅＧＦＰ、およびＡＡＶ８．ＣＭＶ．ｅＧＦＰを含む様々なＡＡＶ血清型試料を用いてＡＡＶＸアフィニティカラムを評価した。それぞれＡｎｃ８０．ＣＭＶ．ｅＧＦＰ、ＡＡＶ２．ＣＭＶ．ｅＧＦＰ、およびＡＡＶ８．ＣＭＶ．ｅＧＦＰについて生成された標準曲線を示す図２Ａ～２Ｃに示されるように、応答線形性Ｒ２＞０．９９は、３つすべてのＡＡＶ血清型について観察され、検出の下限は、およそ６×１０８の総ウイルス粒子であった。
ＨＰＬＣ方法を、Ａｎｃ８０の処理最中のサンプルを用いてさらに試験した。Ａｎｃ８０．ＣＭＶ．ｅＧＦＰを産生する５０Ｌのバイオリアクターを、精製プロセスの様々な工程の間にＨＰＬＣ方法を使用して試験した。図３に示されるように、Ａｎｃ８０．ＣＭＶ．ｅＧＦＰキャプシドピークは、細胞懸濁液、細胞溶解物、溶解物清澄化後、タンジェンシャルフローフィルトレーション（ＴＦＦ）後、および最終濾過工程後の、試験したすべての工程において首尾よく検出された。
処理最中のＡｎｃ８０試料の力価を、線形回帰分析に基づいて決定した。力価をまた、ｄｄＰＣＲを使用して決定し、処理最中の試料の完全／空キャプシド比率を、図４に示されるように計算した。
実施例２．イムノアッセイ
Ａｎｃ８０のためのＥＬＩＳＡアッセイを、抗ＡＡＶ８捕捉抗体、および検出抗体としてのＣＡＰＴＵＲＥＳＥＬＥＣＴ（商標）Ｂｉｏｔｉｎ Ａｎｔｉ－ＡＡＶＸ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して開発した。Ａｎｃ８０．ＣＭＶ．ｅＧＦＰについての標準曲線を、４パラメータロジスティック回帰を使用してＲ２＞０．９９で生成した（図５、標準曲線、および図６、回帰計算を参照されたい）。
ＥＬＩＳＡアッセイをまた、Ａｎｃ８０．ＣＭＶ．ｅＧＦＰを産生する５０Ｌのバイオリアクターからの処理最中の試料に適用した。処理最中の試料の力価を測定し、結果は、他の方法によって測定された力価に匹敵する。
特許、特許出願、論文、教科書などを含む、本明細書で引用されるすべての参考文献、ならびにそれらにおいて引用される参考文献は、それらが既に引用されていない程度まで、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (44)

  1. 試料中のアデノ随伴ウイルス血清型Ａｎｃ８０を検出するための方法であって、
    （ａ）前記試料を、（ｉ）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶｘ）またはアデノ随伴ウイルス血清型８（ＡＡＶ８）に結合する捕捉試薬、および（ｉｉ）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶｘ）に結合する検出試薬と接触させることと、
    （ｂ）前記捕捉試薬、前記Ａｎｃ８０、および前記検出試薬を含む結合複合体を形成することと、
    （ｃ）前記結合複合体を検出し、それによって前記試料中の前記Ａｎｃ８０を検出することと、を含む、方法。
  2. 前記捕捉試薬および／または前記検出試薬が、抗体またはその抗原結合断片である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記捕捉試薬が、表面上に固定化されている、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記捕捉試薬が、ビオチンを含み、前記表面が、アビジンまたはストレプトアビジンを含む、請求項３に記載の方法。
  5. 前記表面が、マルチウェルプレートであり、前記捕捉試薬が、前記マルチウェルプレートのウェル中に固定化されている、請求項３または４に記載の方法。
  6. 前記捕捉試薬が、ＡＡＶｘに結合する、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記捕捉試薬が、ＡＡＶ８に結合する、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記捕捉試薬が、前記Ａｎｃ８０のウイルス粒子に結合する、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記捕捉試薬が、ＶＰ３に結合する、請求項７に記載の方法。
  10. 前記捕捉試薬が、ＶＰ３の残基５８０～６００内のエピトープに結合する、請求項９に記載の方法。
  11. 前記捕捉試薬が、ＬＱＳＡＮＴ（配列番号１）に結合する、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記検出試薬が、ＡＡＶｘに結合する、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記検出試薬が、ＡＡＶ８に結合する、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記検出試薬が、前記Ａｎｃ８０のウイルス粒子に結合する、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記検出試薬が、検出可能な部分の結合パートナーを含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記検出試薬が、ビオチンを含み、前記検出可能な部分が、アビジンまたはストレプトアビジンにコンジュゲートされた西洋ワサビペルオキシダーゼを含む、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記捕捉試薬が、ＡＡＶ８に結合し、前記検出試薬が、ＡＡＶｘに結合する、請求項１に記載の方法。
  18. キットであって、
    （ａ）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶｘ）またはアデノ随伴ウイルス血清型８（ＡＡＶ８）に結合する捕捉試薬と、
    （ｂ）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶｘ）に結合する検出試薬と、を含む、キット。
  19. 前記捕捉試薬および／または前記検出試薬が、抗体またはその抗原結合断片である、請求項１８に記載のキット。
  20. 捕捉表面をさらに含む、請求項１８または１９に記載のキット。
  21. 前記捕捉試薬が、ビオチンを含み、前記捕捉表面が、それに付着されたアビジンまたはストレプトアビジンを含む、請求項２０に記載のキット。
  22. 前記捕捉表面が、マルチウェルプレートであり、前記捕捉試薬が、前記マルチウェルプレートのウェル上に固定化されている、請求項２０または２１に記載のキット。
  23. 前記捕捉試薬が、ＡＡＶｘに結合する、請求項１８～２２のいずれか一項に記載のキット。
  24. 前記捕捉試薬が、ＡＡＶ８に結合する、請求項１８～２２のいずれか一項に記載のキット。
  25. 前記捕捉試薬が、前記Ａｎｃ８０のキャプシドタンパク質（ＶＰ）に結合する、請求項１８～２４のいずれか一項に記載のキット。
  26. 前記捕捉試薬が、ＶＰ３に結合する、請求項２４に記載のキット。
  27. 前記捕捉試薬が、ＶＰ３の残基５８０～６００内のエピトープに結合する、請求項２６に記載のキット。
  28. 前記捕捉試薬が、ＬＱＳＡＮＴ（配列番号１）に結合する、請求項２７に記載のキット。
  29. 前記検出試薬が、ＡＡＶｘに結合する、請求項１８～２８のいずれか一項に記載のキット。
  30. 前記検出試薬が、ＡＡＶ８に結合する、請求項１８～２８のいずれか一項に記載のキット。
  31. 前記検出試薬が、前記Ａｎｃ８０のウイルス粒子に結合する、請求項１８～３０のいずれか一項に記載のキット。
  32. 検出可能な部分をさらに含み、前記検出試薬が、前記検出可能な部分の結合パートナーを含む、請求項１８～３１のいずれか一項に記載のキット。
  33. 前記検出試薬が、ビオチンを含み、前記検出可能な部分が、アビジンまたはストレプトアビジンにコンジュゲートされた西洋ワサビペルオキシダーゼを含む、請求項３２に記載のキット。
  34. 前記捕捉試薬、前記検出試薬、またはその両方が、凍結乾燥されている、請求項１８～３３のいずれか一項に記載のキット。
  35. 前記捕捉試薬、前記検出試薬、またはその両方が、溶液中で提供される、請求項１８～３３のいずれか一項に記載のキット。
  36. 緩衝液、アッセイ停止溶液、較正試薬、前記検出試薬に結合することができる検出可能な部分、および検出可能な基質のうちの１つ以上をさらに含む、請求項１８～３５のいずれか一項に記載のキット。
  37. 前記捕捉試薬が、ＡＡＶ８に結合し、前記検出試薬が、ＡＡＶｘに結合する、請求項１８に記載のキット。
  38. 細胞懸濁液または細胞溶解物中のアデノ随伴ウイルスのキャプシド力価を決定する方法であって、前記方法は、
    （ａ）前記細胞懸濁液または細胞溶解物を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に供することであって、前記ＨＰＬＣは、前記アデノ随伴ウイルスのウイルス粒子（ＶＰ）に結合する樹脂を用いて行われる、供することと、
    （ｂ）前記細胞懸濁液または細胞溶解物中のＶＰを検出し、それによって前記アデノ随伴ウイルスのキャプシド力価を決定することと、を含む、方法。
  39. 前記検出することが、２８０ｎｍでキャプシドタンパク質を分光光度的に検出することを含む、請求項３８に記載の方法。
  40. 前記アデノ随伴ウイルスが、蛍光部分を含み、前記検出することが、蛍光検出を含む、請求項３８に記載の方法。
  41. 前記細胞溶解物が、未精製細胞溶解物または部分精製細胞溶解物である、請求項３８～４０のいずれか一項に記載の方法。
  42. 前記ＨＰＬＣが、約０．１～約１．０ｍＬの体積を有するカラム中に含有された前記樹脂を用いて行われる、請求項３８～４１のいずれか一項に記載の方法。
  43. 前記樹脂が、抗体またはその抗原結合断片を含む、請求項３８～４２のいずれか一項に記載の方法。
  44. 前記アデノ随伴ウイルスが、Ａｎｃ８０を含む、請求項３８～４３のいずれか一項に記載の方法。

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