JP2022526858A

JP2022526858A - アデノ随伴ウイルス（ａａｖ）のアセンブリを改善するための方法および組成物

Info

Publication number: JP2022526858A
Application number: JP2021560682A
Authority: JP
Inventors: マウラー，アンナ; ファンデンベルヘ，ルク・ハー
Original assignee: マサチューセッツ・アイ・アンド・イア・インファーマリー; ザスケペンスアイリサーチインスティテュート，インコーポレイテッド
Priority date: 2019-04-12
Filing date: 2020-04-13
Publication date: 2022-05-26
Also published as: EP3953478A1; EP3953478A4; US20220186193A1; CN114364804A; WO2020210839A1

Abstract

本明細書中において、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）のアセンブリを改善する目的で細胞を改変するための方法および組成物が記載される。

Description

関連出願の相互参照
本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に準拠して、２０１９年４月１２日に出願された米国出願第６２／８３３，５９５号に基づく優先権の利益を主張するものである。

技術分野
本開示は、概して、アデノ随伴ウイルスおよびアデノ随伴ウイルスを産生する方法に関する。

背景
遺伝子療法において使用するための組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）は、これまで、主に、たとえば２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＫＢ細胞、およびその他の哺乳類細胞株などの哺乳類細胞株において産生されている（たとえば、米国特許第６，１５６，３０３号、米国特許第５，３８７，４８４号、米国特許第５，７４１，６８３号、米国特許第５，６９１，１７６号、米国特許第５，６８８，６７６号、ＵＳ２００２００８１７２１号、ＷＯ００／４７７５７号、ＷＯ００／２４９１６号、およびＷＯ９６／１７９４７号を参照）。しかしながら、こうした哺乳類細胞培養系のほとんどにおいて、細胞１個あたり産生されるｒＡＡＶ粒子の数は１０Ｅ４個程度であり、これよりも大きなスケールでのｒＡＡＶの産生が、臨床研究において求められている。

ｒＡＡＶの産生を改善する方法が必要とされている。

概要
本開示は、培養細胞内で調節することにより組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の産生および／またはアセンブリを増大させ得る見込みのある複数の遺伝子およびタンパク質を提供する。本明細書中において記載される方法を用いることにより、遺伝子療法分野を含む臨床または実験用途に使用するための産生力価を最大限にすることができる。本明細書中において記載されるように、調節は、産生細胞株中での選択遺伝子のノックアウト、ノックダウン、もしくは過剰発現、培養基に添加される化学化合物による選択遺伝子の阻害／活性化、またはこれらの組み合わせを含み得る。

一態様において、細胞内でのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）のアセンブリを改善するための方法が提供される。このような方法は、典型的には、細胞内でのＨｓｃ／Ｈｓｐ７０もしくはその補因子、液胞特異的Ｈ＋ＡＴＰアーゼ、および／またはサイクリン依存性キナーゼ２の発現または活性を増大させることにより改変細胞を産生する工程と、改変細胞にＡＡＶベクターを感染させることにより感染改変細胞を産生する工程と、感染改変細胞を培養する工程と、アセンブリされたＡＡＶを集める工程とを含む。

いくつかの実施形態において、集めた上記アセンブリされたＡＡＶの量は、改変を有さない細胞をＡＡＶ感染させた後で集めた、アセンブリされたＡＡＶの量よりも多い。いくつかの実施形態において、当該方法の結果として、ＡＡＶの力価が著しく増加する。

別の一態様において、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）のアセンブリを改善するための方法が提供される。このような方法は、典型的には、改変細胞にＡＡＶを感染させる工程であって、細胞が、ＣＨＭＰ７、ＣＥＰ７２、ＣＮＯＴ６、ＳＬＣ９Ａ６、ＰＰＨＬＮ１、ＡＴＦ７ＩＰ、ＳＥＴＤＢ１、ＧＰＲ８９Ｂ、ＫＩＦ１６Ｂ、ＡＴＡＤ３Ａ、ＢＡＧ２、ＳＴＵＢ１、ＤＮＡＪＡ１、ＤＮＡＪＣ７、ＨＳＰＡ８、ＨＳＰＡ１Ａ、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＨＣＨＤ２、Ｃ１ＱＢＰ、ＤＰＹＳＬ５、ＦＸＲ１、ＦＸＲ２、ＩＰＯ５、ＬＢＲ、ＭＴＰＮ、ＮＰＭ３、ＮＰＭ１、ＰＰＬ、ＳＮＸ３、ＵＢＥ２Ｏ、ＳＡＥ１、ＣＣＤＣ１２４、ＧＮＢ１、ＲＡＢ１Ａ、ＧＮＢ４、ＲＰＬ２３、ＣＫＢ、ＳＲＰ９、ＵＣＨＬ１、およびＴＢＣＢから選択される１種もしくは複数種の遺伝子またはこれによりコードされるタンパク質の増加または減少を呈するように改変されている、工程と、アセンブリされたＡＡＶを集める工程とを含む。

いくつかの実施形態において、改変細胞は遺伝子操作細胞である。代表的な遺伝子操作細胞は、ノックアウト、ノックダウン、過剰発現、またはこれらの組み合わせを含む。

いくつかの実施形態において、改変細胞は、上記１種もしくは複数種の遺伝子またはこれによりコードされるタンパク質を増加または減少させる化学化合物を含む。代表的な化学化合物は、Ｃｄｋ１阻害剤ＩＶ、Ｃｄｋ２阻害剤ＩＩ、アポプタゾール（ａｐｏｐｔａｚｏｌｅ）、ＭＬ－７９２、ＢＭＬ２８２、ＮＳＣ３４８８８４、ＦＤＮＢ、およびバフィロマイシンＡ１を含むが、これらに限定されない。

さらに別の一態様において、アデノ随伴ウイルスをアセンブリするための無細胞培養系が提供される。このような系は、典型的には、培養基と、ＣＨＭＰ７、ＣＥＰ７２、ＣＮＯＴ６、ＳＬＣ９Ａ６、ＰＰＨＬＮ１、ＡＴＦ７ＩＰ、ＳＥＴＤＢ１、ＧＰＲ８９Ｂ、ＫＩＦ１６Ｂ、ＡＴＡＤ３Ａ、ＢＡＧ２、ＳＴＵＢ１、ＤＮＡＪＡ１、ＤＮＡＪＣ７、ＨＳＰＡ８、ＨＳＰＡ１Ａ、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＨＣＨＤ２、Ｃ１ＱＢＰ、ＤＰＹＳＬ５、ＦＸＲ１、ＦＸＲ２、ＩＰＯ５、ＬＢＲ、ＭＴＰＮ、ＮＰＭ３、ＮＰＭ１、ＰＰＬ、ＳＮＸ３、ＵＢＥ２Ｏ、ＳＡＥ１、ＣＣＤＣ１２４、ＧＮＢ１、ＲＡＢ１Ａ、ＧＮＢ４、ＲＰＬ２３、ＣＫＢ、ＳＲＰ９、ＵＣＨＬ１、およびＴＢＣＢから選択される少なくとも２種のタンパク質、またはこれら少なくとも２種のタンパク質をコードする核酸とを含む。いくつかの実施形態において、この物品は、少なくとも３種（たとえば、少なくとも４種、少なくとも５種など）のタンパク質、またはこれら少なくとも３種（たとえば、少なくとも４種、少なくとも５種など）のタンパク質をコードする核酸を含む。

また別の一態様において、細胞株が提供される。このような細胞株は、典型的には、Ｈｓｃ／Ｈｓｐ７０もしくはその補因子、液胞特異的Ｈ＋ＡＴＰアーゼ、および／もしくはサイクリン依存性キナーゼ２における１つもしくは複数の変異、ならびに／またはＨｓｃ／Ｈｓｐ７０もしくはその補因子、液胞特異的Ｈ＋ＡＴＰアーゼ、および／もしくはサイクリン依存性キナーゼ２を発現する１つもしくは複数の外因性コンストラクトを含む。

いくつかの実施形態において、変異はノックアウト変異を含む。いくつかの実施形態において、変異はノックダウン変異を含む。いくつかの実施形態において、１つまたは複数の外因性コンストラクトは、組換えコンストラクトを含む。

別の一態様において、細胞内でのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）のアセンブリを改善するための製品が提供される。このような製品は、典型的には、（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）のうちの少なくとも２通りの中からの少なくとも１つの要素を含む：（ａ）Ｈｓｃ／Ｈｓｐ７０もしくはその補因子、Ｈｓｃ／Ｈｓｐ７０もしくはその補因子をコードする核酸、またはＨｓｃ／Ｈｓｐ７０もしくはその補因子を調節する化合物；（ｂ）液胞特異的Ｈ＋ＡＴＰアーゼ、液胞特異的Ｈ＋ＡＴＰアーゼをコードする核酸、または液胞特異的Ｈ＋ＡＴＰアーゼを調節する化合物；および（ｃ）サイクリン依存性キナーゼ２、サイクリン依存性キナーゼ２をコードする核酸、またはサイクリン依存性キナーゼ２を調節する化合物。

いくつかの実施形態において、Ｈｓｃ／Ｈｓｐ７０またはその補因子を調節する化合物は、アポプタゾールである。いくつかの実施形態において、液胞特異的Ｈ＋ＡＴＰアーゼを調節する化合物は、バフィロマイシンＡ１である。いくつかの実施形態において、サイクリン依存性キナーゼ２を調節する化合物は、Ｃｄｋ２阻害剤ＩＩである。

一態様において、本開示は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）のアセンブリを改善するための方法を、特徴として有する。このような方法は、典型的には、遺伝子操作細胞にＡＡＶを感染させる工程であって、細胞が、ＣＨＭＰ７、ＣＥＰ７２、ＣＮＯＴ６、ＳＬＣ９Ａ６、ＰＰＨＬＮ１、ＡＴＦ７ＩＰ、ＳＥＴＤＢ１、ＧＰＲ８９Ｂ、ＫＩＦ１６Ｂ、ＡＴＡＤ３Ａ、ＢＡＧ２、ＳＴＵＢ１、ＤＮＡＪＡ１、ＤＮＡＪＣ７、ＨＳＰＡ８、ＨＳＰＡ１Ａ、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＨＣＨＤ２、Ｃ１ＱＢＰ、ＤＰＹＳＬ５、ＦＸＲ１、ＦＸＲ２、ＩＰＯ５、ＬＢＲ、ＭＴＰＮ、ＮＰＭ３、ＮＰＭ１、ＰＰＬ、ＳＮＸ３、ＵＢＥ２Ｏ、ＳＡＥ１、ＣＣＤＣ１２４、ＧＮＢ１、ＲＡＢ１Ａ、ＧＮＢ４、ＲＰＬ２３、ＣＫＢ、ＳＲＰ９、ＵＣＨＬ１、および／もしくはＴＢＣＢから選択される１種もしくは複数種の遺伝子またはこれによりコードされるタンパク質の増加または減少を呈するように遺伝子操作されている、工程と、アセンブリされたＡＡＶを集める工程とを含む。

別の一態様において、本開示は、細胞内でのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）のアセンブリを改善するための方法を、特徴として有する。このような方法は、典型的には、Ｈｓｃ／Ｈｓｐ７０もしくはその補因子、液胞特異的Ｈ＋ＡＴＰアーゼ、サイクリン依存性キナーゼ２、およびこれらの組み合わせから選択される１種または複数種の因子の存在下において、細胞にＡＡＶを感染させる工程と、アセンブリされたＡＡＶを集める工程とを含む。

さらに別の一態様において、本開示は、細胞内でのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）のアセンブリを改善するための方法を、特徴として有する。このような方法は、典型的には、細胞内において１種または複数種の因子を調節する工程であって、因子が、Ｈｓｃ／Ｈｓｐ７０またはその補因子、液胞特異的Ｈ＋ＡＴＰアーゼ、およびサイクリン依存性キナーゼ２から選択される工程と、調節された細胞にＡＡＶを感染させる工程と、アセンブリされたＡＡＶを集める工程とを含む。

概して、本明細書中において記載される方法を用いた後には、集めた上記アセンブリされたＡＡＶの量は、遺伝子操作または調節をしていない細胞をＡＡＶ感染させた後で集めたＡＡＶの量よりも多い。概して、本明細書中において記載される方法は、ＡＡＶの力価の増加をもたらす。概して、本明細書中において記載される方法は、ＡＡＶベクター調製物の質および性能の増大をもたらす。

いくつかの実施形態において、遺伝子操作は、ノックアウト、ノックダウン、および／もしくは過剰発現のうちの１種もしくは複数種、またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、調節は、ノックアウト、ノックダウン、過剰発現、またはこれらの組み合わせを用いて行なわれる。いくつかの実施形態において、調節は、たとえば培養基への化学化合物の添加による、選択遺伝子の阻害および／または活性化を用いて行なわれる。

また別の一態様において、本開示は、細胞内でのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）のアセンブリを改善するための製品を提供する。このような製品は、典型的には、（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）のうちの少なくとも２通りの中からの少なくとも１つの要素を含む：（ａ）Ｈｓｃ／Ｈｓｐ７０もしくはその補因子、Ｈｓｃ／Ｈｓｐ７０もしくはその補因子をコードする核酸、および／またはＨｓｃ／Ｈｓｐ７０もしくはその補因子を調節する化合物；（ｂ）液胞特異的Ｈ＋ＡＴＰアーゼ、液胞特異的Ｈ＋ＡＴＰアーゼをコードする核酸、および／もしくは液胞特異的Ｈ＋ＡＴＰアーゼを調節する化合物；ならびに／または（ｃ）サイクリン依存性キナーゼ２、サイクリン依存性キナーゼ２をコードする核酸、および／もしくはサイクリン依存性キナーゼ２を調節する化合物。

別の一態様において、Ｈｓｃ／Ｈｓｐ７０もしくはその補因子、液胞特異的Ｈ＋ＡＴＰアーゼ、および／もしくはサイクリン依存性キナーゼ２における１つもしくは複数の変異（たとえば、ノックアウト、ノックダウン）；ならびに／または、Ｈｓｃ／Ｈｓｐ７０もしくはその補因子、液胞特異的Ｈ＋ＡＴＰアーゼ、および／もしくはサイクリン依存性キナーゼ２を発現する１つもしくは複数の外因性（たとえば組換え）のコンストラクト、を含む細胞株が提供される。

別の一態様において、本開示は、アデノ随伴ウイルスをアセンブリするための無細胞培養系を、特徴として有する。この系は、培養基と、ＣＨＭＰ７、ＣＥＰ７２、ＣＮＯＴ６、ＳＬＣ９Ａ６、ＰＰＨＬＮ１、ＡＴＦ７ＩＰ、ＳＥＴＤＢ１、ＧＰＲ８９Ｂ、ＫＩＦ１６Ｂ、ＡＴＡＤ３Ａ、ＢＡＧ２、ＳＴＵＢ１、ＤＮＡＪＡ１、ＤＮＡＪＣ７、ＨＳＰＡ８、ＨＳＰＡ１Ａ、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＨＣＨＤ２、Ｃ１ＱＢＰ、ＤＰＹＳＬ５、ＦＸＲ１、ＦＸＲ２、ＩＰＯ５、ＬＢＲ、ＭＴＰＮ、ＮＰＭ３、ＮＰＭ１、ＰＰＬ、ＳＮＸ３、ＵＢＥ２Ｏ、ＳＡＥ１、ＣＣＤＣ１２４、ＧＮＢ１、ＲＡＢ１Ａ、ＧＮＢ４、ＲＰＬ２３、ＣＫＢ、ＳＲＰ９、ＵＣＨＬ１、およびＴＢＣＢから選択される少なくとも２種（たとえば、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種など）のタンパク質、またはこれら少なくとも２種のタンパク質をコードする核酸とを含む。

特に定義がなければ、本明細書中において使用されるすべての科学技術用語は、本発明に係る方法および組成物が属する技術分野において通常の知識を有する者により一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書中に記載されるものと類似または同等の方法および材料を診療所または当該方法および組成物の試験において使用できるが、好適な方法および材料が以下に記載される。また、材料、方法、および例示は、例証することのみを目的とし、限定を意図しない。本明細書中において言及されるすべての出版物、特許出願、特許、およびその他の参考資料の全体を、引用により本明細書に援用する。

図面の説明

本明細書中において使用されるＣＲＩＳＰＲスクリーニングの手順の流れを示す概略図である。トランスフェクションの１８時間後におけるｓｇＲＮＡ存在量を示すプロットである。トランスフェクションの１８時間後におけるｓｇＲＮＡ存在量を示すプロットである。トランスフェクションの２４時間後におけるｓｇＲＮＡ存在量を示すプロットである。トランスフェクションの２４時間後におけるｓｇＲＮＡ存在量を示すプロットである。トランスフェクション法がベクター力価に及ぼす影響を示すグラフである。グラフは１回の実験を表わし、^＊は混入が確認されたことを示す。ベクター産生に及ぼすｓｉＲＮＡプレトランスフェクションおよびコトランスフェクションの影響を、ヒトゲノム中の配列を標的としないｓｉＲＮＡを使用する平行トランスフェクションに対する比率として示すグラフである。デュプリケート（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）で実施した実験の平均を表す。ベクター産生に及ぼすｓｉＲＮＡプレトランスフェクションおよびコトランスフェクションの影響を、平行偽トランスフェクションに対する比率として示すグラフである。デュプリケートで実施した実験の平均を表す。番号付き長円の中に示される発現コンストラクトでトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞の概略図である。２回行なった同じ実験（（レーンの上に）ＡおよびＢで示す）からの抗ＨＡ（ＶＰ餌（ｂａｉｔ））プルダウンおよび抗ＦＬＡＧ（ＡＡＰ餌）プルダウン（図６Ａ中に番号で示される）のために使用した溶解物からの免疫共沈降を示すゲルの画像である。図６ＢはＳＹＰＲＯＲｕｂｙで染色して総タンパク質を示し、図６ＣはウェスタンブロットによりＶＰおよびＡＡＰについて調べたものである。２回行なった同じ実験（（レーンの上に）ＡおよびＢで示す）からの抗ＨＡ（ＶＰ餌（ｂａｉｔ））プルダウンおよび抗ＦＬＡＧ（ＡＡＰ餌）プルダウン（図６Ａ中に番号で示される）のために使用した溶解物からの免疫共沈降を示すゲルの画像である。図６ＢはＳＹＰＲＯＲｕｂｙで染色して総タンパク質を示し、図６ＣはウェスタンブロットによりＶＰおよびＡＡＰについて調べたものである。図６Ａ中に示される通りに調製した等体積の溶解物に対して行なった免疫沈降を示すゲルである。各レーンに等体積の溶出液を載せて電気泳動し、ＳＹＰＲＯＲｕｂｙで染色して総タンパク質を示した（図６Ｄおよび図６Ｆ）、またはウェスタンブロットによりＶＰおよびＡＡＰについて調べた（図６Ｅおよび図６Ｇ）。図６Ａ中に示される通りに調製した等体積の溶解物に対して行なった免疫沈降を示すゲルである。各レーンに等体積の溶出液を載せて電気泳動し、ＳＹＰＲＯＲｕｂｙで染色して総タンパク質を示した（図６Ｄおよび図６Ｆ）、またはウェスタンブロットによりＶＰおよびＡＡＰについて調べた（図６Ｅおよび図６Ｇ）。図６Ａ中に示される通りに調製した等体積の溶解物に対して行なった免疫沈降を示すゲルである。各レーンに等体積の溶出液を載せて電気泳動し、ＳＹＰＲＯＲｕｂｙで染色して総タンパク質を示した（図６Ｄおよび図６Ｆ）、またはウェスタンブロットによりＶＰおよびＡＡＰについて調べた（図６Ｅおよび図６Ｇ）。図６Ａ中に示される通りに調製した等体積の溶解物に対して行なった免疫沈降を示すゲルである。各レーンに等体積の溶出液を載せて電気泳動し、ＳＹＰＲＯＲｕｂｙで染色して総タンパク質を示した（図６Ｄおよび図６Ｆ）、またはウェスタンブロットによりＶＰおよびＡＡＰについて調べた（図６Ｅおよび図６Ｇ）。共沈したタンパク質を質量分析により同定したものを示すヒートマップである。共沈したタンパク質を質量分析により同定したものを示すヒートマップである。トランスフェクション直前に添加した場合の、選択された宿主因子の薬理学的阻害がベクター産生に及ぼす影響を示す棒グラフである。トランスフェクションの４時間後に添加した場合の、選択された宿主因子の薬理学的阻害がベクター産生に及ぼす影響を示す棒グラフである。トランスフェクションの４時間後におけるサイクリン依存性キナーゼ１の阻害の影響を示す実験データ（下）に基づく棒グラフ（上）である。トランスフェクションの４時間後におけるサイクリン依存性キナーゼ２の阻害の影響を示す実験データ（下）に基づくグラフ（上）である。トランスフェクションの４時間後における熱ショックタンパク質７０の阻害の影響を示す実験データ（下）に基づくグラフ（上）である。トランスフェクションの４時間後におけるｓｕｍｏ活性化酵素１の阻害の影響を示す実験データ（下）に基づくグラフ（上）である。トランスフェクションの４時間後におけるユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼアイソザイムＬ１の阻害の影響を示す実験データ（下）に基づくグラフ（上）である。トランスフェクションの４時間後におけるヌクレオフォスミンの阻害の影響を示す実験データ（下）に基づくグラフ（上）である。トランスフェクションの４時間後におけるクレアチンキナーゼＢの阻害の影響を示す実験データ（下）に基づくグラフ（上）である。トランスフェクションの４時間後における液胞型Ｈ＋ＡＴＰアーゼの阻害の影響を示す実験データ（下）に基づくグラフ（上）である。ＡＡＶアセンブリの仮説モデルを示す概略図である。

詳細な説明
ゲノムおよびプロテオミクスのアプローチを使用して、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の産生および／またはアセンブリに関与する複数の宿主タンパク質を同定した。本明細書中において記載されるように、細胞内でのＡＡＶの産生および／またはアセンブリを増大させるために、このようなタンパク質の１種もしくは複数種、またはこのようなタンパク質の１種もしくは複数種をコードする核酸を改変することができる。同様に、ＡＡＶの産生および／またはアセンブリを増大させるために、このようなタンパク質の１種もしくは複数種、またはこのようなタンパク質の１種もしくは複数種をコードする核酸を、無細胞系に含めることができる。本明細書中において記載される方法を用いることにより、遺伝子療法分野を含む臨床または実験用途に使用するためのウイルスベクターの産生力価を最大限にすることができる。

本明細書中において記載されるように、細胞内でのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）のアセンブリを改善するための方法は、典型的には、細胞内でのＨｓｃ／Ｈｓｐ７０もしくはその補因子、液胞特異的Ｈ＋ＡＴＰアーゼ、および／またはサイクリン依存性キナーゼ２の発現または活性を増大させる工程を含む。細胞がこのように改変されていれば、この改変細胞にＡＡＶベクターを感染させて、続いて培養して、アセンブリされたＡＡＶを集めることができる。

以下の宿主タンパク質は、ＡＡＶのアセンブリに関与することが示されており、したがって、これらタンパク質のうちのいずれか１種、または２種以上の組み合わせ、または当該タンパク質をコードする核酸を、本明細書中において記載される通りに改変することによって、ＡＡＶの産生および／またはアセンブリを改善することができる：荷電多胞体タンパク質７（ｃｈａｒｇｅｄｍｕｌｔｉｖｅｓｉｃｕｌａｒｂｏｄｙｐｒｏｔｅｉｎ７；ＣＨＭＰ７）、中心体タンパク質７２ｋＤａ（ＣＥＰ７２）、ＣＣＲ４－ＮＯＴ転写複合体サブユニット６（ＣＮＯＴ６）、溶質キャリアファミリー９のメンバー６（ＳＬＣ９Ａ６）、ペリフィリン（ｐｅｒｉｐｈｙｌｌｉｎ）１（ＰＰＨＬＮ１）、活性化転写因子７相互作用タンパク質（ＡＴＦ７ＩＰ）、ｓｅｔドメインタンパク質バイファーケイテッド１（ｓｅｔｄｏｍａｉｎｐｒｏｔｅｉｎｂｉｆｕｒｃａｔｅｄ１；ＳＥＴＤＢ１）、Ｇタンパク質共役型受容体８９Ｂ（ＧＰＲ８９Ｂ）、キネシンファミリーメンバー１６Ｂ（ＫＩＦ１６Ｂ）、ＡＴＰアーゼファミリーＡＡＡドメイン含有タンパク質３Ａ（ＡＴＡＤ３Ａ）、ＢＡＧファミリー分子シャペロンレギュレーター２（ＢＡＧ２）、Ｅ３ユビキチン－タンパク質リガーゼＣＨＩＰ（ＳＴＵＢ１）、ＤｎａＪホモログサブファミリーＡメンバー１（ＤＮＡＪＡ１）、ＤｎａＪホモログサブファミリーＣメンバー７（ＤＮＡＪＣ７）、熱ショック７０ｋＤａタンパク質８（ＨＳＰＡ８）、熱ショック７０ｋＤａタンパク質１Ａ（ＨＳＰＡ１Ａ）、サイクリン依存性キナーゼ１（ＣＤＫ１）、サイクリン依存性キナーゼ２（ＣＤＫ２）、コイルドコイルヘリックスコイルドコイルヘリックスドメイン含有タンパク質２（ＣＨＣＨＤ２）、補体成分１Ｑサブコンポーネント結合タンパク質（ミトコンドリアの）（Ｃ１ＱＢＰ）、ジヒドロピリミジナーゼ関連タンパク質５（ＤＰＹＳＬ５）、脆弱Ｘ精神遅滞症候群関連タンパク質１（ＦＸＲ１）、脆弱Ｘ精神遅滞症候群関連タンパク質２（ＦＸＲ２）、インポーチン－５（ＩＰＯ５）、ラミン－Ｂ受容体（ＬＢＲ）、ミオトロフィン（ＭＴＰＮ）、ヌクレオプラスミン－３（ＮＰＭ３）、ヌクレオフォスミン（ＮＰＭ１）、ペリプラキン（ＰＰＬ）、ソーティングネキシン－３（ＳＮＸ３）、Ｅ３非依存性Ｅ２ユビキチン結合酵素（ＵＢＥ２Ｏ）、ＳＵＭＯ活性化酵素サブユニット１（ＳＡＥ１）、コイルドコイルドメイン含有タンパク質１２４（ＣＣＤＣ１２４）、グアニンヌクレオチド結合タンパク質Ｇ（Ｉ）／Ｇ（Ｓ）／Ｇ（Ｔ）サブユニットベータ－１（ＧＮＢ１）、Ｒａｓ関連タンパク質Ｒａｂ－１Ａ（ＲＡＢ１Ａ）、グアニンヌクレオチド結合タンパク質サブユニットベータ－４（ＧＮＢ４）、６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ２３（ＲＰＬ２３）、クレアチンキナーゼＢ型（ＣＫＢ）、シグナル認識粒子９ｋＤａタンパク質（ＳＲＰ９）、ユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼアイソザイムＬ１（ＵＣＨＬ１）、および／またはチューブリンフォールディングコファクターＢ（ＴＢＣＢ）。

本明細書中において記載されるように、宿主細胞を改変し、Ｈｓｃ／Ｈｓｐ７０、またはＶＰフォールディングに関係するＨｓｃ／Ｈｓｐ７０経路の補因子（たとえば、Ｂａｇ２、ＳＴＵＢ１、ＤｎａＪＣ７、またはＤｎａＪＡ１）、液胞特異的Ｈ＋ＡＴＰアーゼ、および／またはサイクリン依存性キナーゼ２の発現または活性を増大させることによって、その宿主細胞内でのＡＡＶの産生および／またはアセンブリを改善（または増大）できる。

本明細書中において記載されるように、用語「改変」または「改変される」は、本明細書中において記載される宿主タンパク質のうちの１種または複数種の発現または活性の増大または減少をもたらす、細胞に対する任意の種類の操作を含むものとして理解される。したがって、本明細書中において使用される場合、細胞の改変は、（たとえば変異誘発を用いて）内因性の核酸配列の発現をノックアウトもしくはノックダウンすること、または外因性の核酸配列（たとえば、組換え核酸分子を含有するコンストラクトまたはベクター）を過剰発現させることを含み得るが、これらに限定されない。また、細胞の改変は、１種または複数種の化学化合物に細胞を（たとえば培養基中において）曝露して本明細書中において記載される内因性の宿主タンパク質の１種または複数種の活性を直接的または間接的に増大または阻害することを含み得るが、これらに限定されない。

１種もしくは複数種の遺伝子またはこれによりコードされるタンパク質を増大または減少させるために使用できる代表的な化学化合物。代表的な化学化合物は、Ｃｄｋ１阻害剤ＩＶ、Ｃｄｋ２阻害剤ＩＩ、アポプタゾール、ＭＬ－７９２、ＢＭＬ２８２、ＮＳＣ３４８８８４、ＦＤＮＢ、およびバフィロマイシンＡ１を含むが、これらに限定されない。

タンパク質の発現または活性を増大させる方法が知られている。たとえば、タンパク質をコードする核酸を宿主細胞内で過剰発現させることができる。核酸を過剰発現させるための核酸コンストラクトが当技術分野において知られており、市販されている。また、化学化合物を使用してタンパク質の発現または活性を刺激できることも理解されており、このような活性を呈する化合物のスクリーニング方法が当技術分野において知られている。

タンパク質の発現または活性を減少させる方法が知られている。たとえば、タンパク質の発現または活性をノックアウトまたはノックダウンするために、このタンパク質をコードする核酸を変異させることができる。変異誘発方法が当技術分野において知られており、一般的に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して行なわれる。また、化学化合物を使用してタンパク質の発現または活性を阻害できることも理解されており、このような活性を呈する化合物のスクリーニング方法が当技術分野において知られている。

また、Ｈｓｃ／Ｈｓｐ７０もしくはその補因子、液胞特異的Ｈ＋ＡＴＰアーゼ、および／もしくはサイクリン依存性キナーゼ２における１つもしくは複数の変異；ならびに／または、Ｈｓｃ／Ｈｓｐ７０もしくはその補因子、液胞特異的Ｈ＋ＡＴＰアーゼ、および／もしくはサイクリン依存性キナーゼ２を発現する１つもしくは複数の外因性コンストラクト、を含む細胞株が提供される。

本明細書中において記載されるように細胞が改変されると、この改変細胞を使用して、適切な条件下で１つまたは複数のＡＡＶベクターを産生することができる。ＡＡＶベクター（たとえば、ＡＡＶ粒子の産生およびアセンブリに必要な最小限のウイルスタンパク質をコードするベクター）は、野生型ＡＡＶまたは組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）であり得る。ＡＡＶを産生する方法およびその哺乳類細胞を適切に培養する方法が当技術分野において知られており、必要なＡＡＶ成分をトランスフェクションする方法、ＡＡＶ産生成分を安定的に発現する細胞株の使用、および／または、Ｓａｎｄｏｖａｌら（2019, Viral Vectors for Gene Therapy）により記載されるように単純ヘルペスウイルスもしくはアデノウイルスなどの異種のウイルスベクター系を使用して細胞に感染させることによる細胞へのＡＡＶ成分の運搬を含む。

宿主タンパク質またはこのような宿主タンパク質をコードする核酸を改変することによって、ＡＡＶのアセンブリを改善できる。ＡＡＶのアセンブリの改善とは、改変なしでアセンブリされたＡＡＶと比較した場合の、アセンブリされたＡＡＶの数の増大、またはアセンブリの割合もしくは効率の増大を指す。本明細書中において記載される方法は、得られるＡＡＶの力価の増大（たとえば、著しい増大）をもたらす。いくつかの場合において、本明細書中において記載される方法は、改変なしで産生されたＡＡＶと比較して、ＡＡＶの質および性能を向上させる（たとえば、収量が増加する、生存率が増大する、および／または感染性が改善される）。

本明細書中において同定されるタンパク質、またはこのようなタンパク質をコードする核酸を、無細胞ＡＡＶ産生方法の開発において使用できる。たとえば、無細胞系を設計して、実際の細胞の非存在下でＡＡＶ粒子を産生するために使用できる。このような無細胞系は、たとえば、このようなタンパク質の１種もしくは複数種（たとえば、少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種）をコードする核酸、または当該タンパク質自体を含み得る。たとえば、以下のタンパク質の１種もしくは複数種、または１種もしくは複数種のタンパク質をコードする核酸を、無細胞系において提供できる：ＣＨＭＰ７、ＣＥＰ７２、ＣＮＯＴ６、ＳＬＣ９Ａ６、ＰＰＨＬＮ１、ＡＴＦ７ＩＰ、ＳＥＴＤＢ１、ＧＰＲ８９Ｂ、ＫＩＦ１６Ｂ、ＡＴＡＤ３Ａ、ＢＡＧ２、ＳＴＵＢ１、ＤＮＡＪＡ１、ＤＮＡＪＣ７、ＨＳＰＡ８、ＨＳＰＡ１Ａ、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＨＣＨＤ２、Ｃ１ＱＢＰ、ＤＰＹＳＬ５、ＦＸＲ１、ＦＸＲ２、ＩＰＯ５、ＬＢＲ、ＭＴＰＮ、ＮＰＭ３、ＮＰＭ１、ＰＰＬ、ＳＮＸ３、ＵＢＥ２Ｏ、ＳＡＥ１、ＣＣＤＣ１２４、ＧＮＢ１、ＲＡＢ１Ａ、ＧＮＢ４、ＲＰＬ２３、ＣＫＢ、ＳＲＰ９、ＵＣＨＬ１、および／またはＴＢＣＢ。

本明細書中において記載される方法の使用の後で集めた、アセンブリされたＡＡＶの量は、典型的には、改変を有さない細胞をＡＡＶ感染させた後で集めた、アセンブリされたＡＡＶの量よりも多い（たとえば、有意に多い）。いくつかの場合において、本明細書中において記載される方法は、ＡＡＶの力価の著しい増加をもたらす。

また、細胞内でのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）のアセンブリを改善するための製品も提供される。このような製品は、典型的には、（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）のうちの少なくとも２通りの中からの少なくとも１つの要素を含む：（ａ）Ｈｓｃ／Ｈｓｐ７０もしくはその補因子、Ｈｓｃ／Ｈｓｐ７０もしくはその補因子をコードする核酸、またはＨｓｃ／Ｈｓｐ７０もしくはその補因子を調節する化合物；（ｂ）液胞特異的Ｈ＋ＡＴＰアーゼ、液胞特異的Ｈ＋ＡＴＰアーゼをコードする核酸、または液胞特異的Ｈ＋ＡＴＰアーゼを調節する化合物；および（ｃ）サイクリン依存性キナーゼ２、サイクリン依存性キナーゼ２をコードする核酸、またはサイクリン依存性キナーゼ２を調節する化合物。

Ｈｓｃ／Ｈｓｐ７０またはその補因子を調節する代表的な化合物はアポプタゾールであり、液胞特異的Ｈ＋ＡＴＰアーゼを調節する代表的な化合物はバフィロマイシンＡ１であり、サイクリン依存性キナーゼ２を調節する代表的な化合物はＣｄｋ２阻害剤ＩＩである。

本発明においては、本分野の通常の知識の範囲内において、従来の分子生物学、微生物学、生化学、および組換えＤＮＡの技術が使用され得る。このような技術は、文献中において十分に説明されている。本発明が以下の実施例中でさらに説明されるが、これらは、請求項中に記載される方法および組成物の範囲を限定しない。

実施例１－最適なＡＡＶアセンブリに関連する因子のスクリーニング
簡潔には、ＡＡＶのアセンブリおよび／またはＤＮＡのパッケージングに関与するＨＥＫ２９３細胞中の因子を特定するために、２通りの異なるスクリーニングアプローチを実施した。これら２つの特性が組み合わさって製造が構成されるものであり、これらの因子のうちの１種または複数種を調節することによって、ＡＡＶの製造収量を増大させることができる。２通りのスクリーニングアプローチは、以下のように設計した。

免疫共沈降および質量分析
アセンブリに関与することが知られる様々なウイルスタンパク質にタンパク質タグを付け、ＨＥＫ２９３をトランスフェクションした後で、免疫共沈降を行なった。複合体でプルダウンされたタンパク質を、質量分析で分析した。これらのタンパク質について、これらと様々なウイルス成分との免疫共沈降、これらの生物学、およびこれらがバックグラウンドである可能性の低さ（たとえば、コントロールとコントロール質量分析データセットとに基づく）に基づいて、最も確実なヒットを記録した。この方法では、主に、タンパク質粒子のアセンブリ（たとえば、タンパク質粒子が集まること）の何らかの局面に関与するタンパク質と、これらのアセンブリタンパク質に関連する細胞補因子とをスクリーニングした。

試料の調製
以前（Maurer et al., 2019, J. Virol., 93:93(7): doi: 10.1128/JVI.02013-18）に記載された通りに試料を調製したが、ブロッキング工程と洗浄工程での界面活性剤とを割愛した、というのはこうした試薬はＬＣ－ＭＳ／ＭＳおよび下流の分析との相性が悪いためである。

ペプチドの消化
免疫沈降の後、ビーズに結合したタンパク質を、５０μＬの５０ｍＭＴｒｉｓ中において－８０℃にて凍結させた。試料を解凍し、尿素、ジチオトレイトール（ＤＴＴ、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、２０２９１）、トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｖ５１１Ｘ）、およびＴｒｉｓの溶液を添加することによって、２０個の試料の各々について、ビーズを、８０μＬの２Ｍ尿素、５０ｍＭＴｒｉｓＨＣＬ（ｐＨ８）、５μｇ／ｍＬトリプシン、および５ｍＭＤＴＴ中に懸濁した。試料を２５℃において振とうしながら１時間インキュベートした。上清を新しいチューブに移し、ビーズを６０μＬの５．３３Ｍ尿素、５０ｍＭＴｒｉｓＨＣＬ溶液で２回洗浄して、各試料について洗浄バッファーと上清とを合わせた。この溶液を５０００ｒｃｆで２分間遠心分離し、次いで新しいチューブに移した。タンパク質を４ｍＭＤＴＴで２５℃にて３０分間かけて還元し、次いで、１０ｍＭヨードアセトアミド（Ｓｉｇｍａ、Ａ３２２１）で４５分間、暗所において２５℃にてアルキル化した。その後、各試料に０．５μｇのトリプシンを添加し、その試料を一晩かけて２５℃にて振とうしながら消化した。１％ギ酸（ＦＡ；Ｆｌｕｋａ、５６３０２）で消化を停止させた。ＥｍｐｏｒｅＣ１８パンチ（３Ｍ，２３１５）を２つ含むステージチップ（ｓｔａｇｅｔｉｐ）を使用して、試料を脱塩した。スピンはいずれも、１，５００ｒｃｆにて２分間ずつ行なった。ステージチップは、１×５０μＬの５０％アセトニトリル（ＡＣＮ）／０．１％ＦＡと２×５０μＬの０．１％ＦＡとを用いて条件付けした。次いで、試料をステージチップにのせて、スピンさせた。その後、２×５０μＬの０．１％ＦＡで試料を洗浄して、１×５０μＬの５０％ＡＣＮ／０．１％ＦＡでステージチップから溶出させて、乾燥させた。

ＴＭＴ標識および強カチオン交換分画
ＴＭＴ標識のために、各試料を１００μＬの５０ｍＭＨＥＰＥＳ中で再構成した。次いで、４１μＬの１００％ＡＣＮ中の０．８ｍｇのＴＭＴ１０ＩｓｏｂａｒｉｃＭａｓｓＴａｇ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を各試料に添加した。試料を２５℃において１時間かけて標識した。標識効率をチェックして、適切かつ完全に標識されていることを確かめた。また、試料のＴＭＴ１０－ｐｌｅｘの各々について混合コントロールを行なうことによって、すべての試料が１：１で混合されていることを確めた。８μＬの５％ヒドロキシルアミンを用い、２５℃にて１５分間かけて、標識反応を停止させた。その後、各１０－ｐｌｅｘの試料を、すべての試料が互いに１：１の比率となる量にて混合し、乾燥させた。各１０－ｐｌｅｘ試料を１ｍＬの０．１％ＦＡ中に再懸濁し、Ｓｅｐ－ＰａｋＣ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ、１００ｍｇＷＡＴ０２３５９０）を使用して脱塩した。１×１ｍＬの１００％ＡＣＮ、１×１ｍＬの５０％ＡＣＮ／０．１％ＦＡ、および４×１ｍＬの０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いて、カラムを条件付けした。各試料をカラムに載せて、３×１ｍＬの０．１％ＴＦＡおよび１×１ｍＬの１％ＦＡで洗浄した。２×０．６ｍＬの５０％ＡＣＮ／０．１％ＦＡを用いてカラムからペプチドを溶出させて、乾燥させた。

試料を２００μＬの３％ＡＣＮ／０．１％ＦＡ中で再構成した。各試料の半分をとって乾燥させたものを、ＨＰＬＣ－ＨＣＤ－ＭＳ／ＭＳを用いて分析した。残りの半分を乾燥させて２５０μＬの０．５％酢酸（ＡｃＯＨ）中に再懸濁し、強カチオン交換を用いて分画した。下に３つのＳＣＸパンチ（３Ｍ、２２５１）を有し上に２つのＣ１８パンチを有するステージチップを使用して、試料を分画した。スピンはいずれも、３，５００ｒｃｆで２分間ずつ行なった。１×１００μＬのメタノール（ＭｅＯＨ）、１×１００μＬの８０％ＡＣＮ／０．５％ＡｃＯＨ、１×１００μＬの０．５％ＡｃＯＨ、１×１００μＬの２０％ＡＣＮ／０．５％ＡｃＯＨ／５００ｍＭＮＨ４ＡｃＯ、および１×０．５％ＡｃＯＨを用いて、ステージチップを条件付けした。試料を載せてスピンさせた。２×１００μＬの０．５％ＡｃＯＨでステージチップを洗浄した。１×１００μＬの８０％ＡＣＮ／０．５％ＡｃＯＨを用いて、Ｃ１８パンチからＳＣＸパンチへとペプチドを横断溶出させた。次いで、１×５０μＬの２０％ＡＣＮ／５０ｍＭＮＨ４ＡｃＯ（ｐＨ５．１５）、１×５０μＬの２０％ＡＣＮ／５０ｍＭＮＨ４ＨＣＯ_３（ｐＨ８．２５）、および１×５０μＬの２０％ＡＣＮ／０．１％ＮＨ４ＡｃＯ（ｐＨ１０．３）を用いて、ステージチップからペプチドを溶出させて、３つの画分とした。次いで、２００μＬの０．５％ＡｃＯＨを用いて各溶出画分を希釈し、２パンチＣ１８ステージチップを使用して脱塩した。１×１００μＬのＭｅＯＨ、１×１００μＬの８０％ＡＣＮ／０．５％ＡｃＯＨ、２×１００μＬの０．５％ＡｃＯＨを用いて、ステージチップを条件付けた。試料を載せてスピンさせた。その後、ステージチップを２×１００μＬの０．５％ＡｃＯＨで洗浄した。６０μＬの８０％ＡＣＮ／０．５％ＡｃＯＨを用いて、ステージチップから試料を溶出させた。各画分を乾燥させて、ＬＣ－ＭＳ－ＭＳ分析のために９μＬの３％ＡＣＮ／０．１％ＦＡ中に再懸濁した。分画していない半分の試料も、ＬＣ－ＭＳ－ＭＳ分析のために９μＬの３％ＡＣＮ／０．１％ＦＡ中に再懸濁した。

ＬＣ－ＭＳ／ＭＳおよびスペクトル分析
ＯｒｂｉｔｒａｐＦｕｓｉｏｎＬｕｍｏｓ質量分析計およびＥａｓｙ－ｎＬＣ１２００システムを備えたナノフローＨＰＬＣ－ＨＣＤ－ＭＳ／ＭＳを使用して、すべての試料を分析した。各試料４μＬずつを、１．９μｍのＣ－１８ビーズがセルフパックされたＰｉｃｏｆｒｉｔカラムを５０℃に加熱したものの上から、流量５００ｎｌ／分にて注入した。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳの勾配および流量は、以前に記載された通りとした（Mertins et al., 2016, Nature, 534:55-62）。スペクトルを１１０分間にわたって取得した。ＭＳ１走査を、解像度６０ｋ、走査範囲３５０～１８００ｍ／ｚ、最大注入時間５０ｍｓにて取得した。衝突エネルギー３８％でイオンをフラグメント化した。ＭＳ２走査を、解像度５０ｋ、最大注入時間１０５ｍｓ、０．７単離ウィンドウ（ｉｓｏｌａｔｉｏｎｗｉｎｄｏｗ）にて取得した。

ウイルスタンパク質が後ろに記載されているＵｎｉｐｒｏｔヒトデータベースを使用して、ＳｐｅｃｔｒｕｍＭｉｌｌ（Ａｇｉｌｅｎｔ）でデータを検索した。フィックスド・モディフィケーション（ｆｉｘｅｄｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）であるシステインのカルバミドメチル化と、バリアブル・モディフィケーション（ｖａｒｉａｂｌｅｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）であるＮ末端タンパク質アセチル化、メチオニンの酸化、およびＴＭＴ１０ｐｌｅｘ標識とを検索した。酵素特異性（ｅｎｚｙｍｅｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）はＬｙｓＣ／トリプシンに設定し、ミス・クリーベージ（ｍｉｓｓｅｄｃｌｅａｖａｇｅ）は多くて３つとして、検索した。プレカーサーイオンの最大の荷電状態（ｍａｘｉｍｕｍｐｒｅｃｕｒｓｏｒｉｏｎｃｈａｒｇｅｓｔａｔｅ）は６に設定した。プレカーサーイオンおよびプロダクトイオンの質量の誤差範囲は２０ｐｐｍに設定した。ペプチドおよびタンパク質の誤同定率を計算したところ、１％未満であった。１つのペプチドスペクトルのみのマッチにより同定された非ヒトタンパク質およびヒトタンパク質は、いずれも、下流で実施する分析から除外した。モデレートＴ検定（ｍｏｄｅｒａｔｅｄＴ－ｔｅｓｔ）（ワールドワイドウェブのｓｏｆｔｗａｒｅ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｃａｎｃｅｒ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｇｅｎｅｐａｔｔｅｒｎ／を参照）を使用して、個々の各実験において統計学的に富化されているタンパク質を特定した。多重比較のための補正（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇの手順）の後、補正後のｐ値が０．０５未満である任意のタンパク質を、統計学的に富化されているとみなした。個々の実験の各々における餌タンパク質の量を基準とした富化タンパク質の標準化を、各富化タンパク質の値から餌のｌｏｇ２倍数富化値を差し引くことによって行なった。データをまとめ、ワールドワイドウェブのｓｏｆｔｗａｒｅ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｍｏｒｐｈｅｕｓ／を使用して、４通りの実験条件の全体にわたる平均の相対的富化を可視化した。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の使用
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を発現していて、かつ周知のすべてのヒト遺伝子のｇＲＮＡを含むｇＲＮＡライブラリでトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞において、ＡＡＶを産生させた。アセンブリしたカプシドタンパク質（すなわち、モノマーではない）のみを検出する抗ＡＡＶ抗体を使用するＦＡＣＳソーティングによって、ＡＡＶ産生細胞を選択した。選択された細胞中で富化されたｇＲＮＡは、このｇＲＮＡの標的がノックアウト時にＡＡＶ産生を改善したということを示す。（ａ）コントロールに対する富化の有意性、（ｂ）この作用を示す同じ遺伝子に対するｇＲＮＡの数（これらのライブラリは、１つの標的遺伝子について６つのｇＲＮＡを有する場合が多いという点で重複している）、および（ｃ）ＡＡＶアセンブリ／パッケージングとの関連があり得る遺伝子／タンパク質ヒットの生物学に基づいて、統計学的に最も有意なヒットを記録する。この方法は、アセンブリとパッケージング（たとえば、前もって形成された粒子中へのウイルスＤＮＡの侵入）との両方を調べるものである。

図１は、ＣＲＩＳＰＲスクリーニングパイプラインの概略図である。各タンパク質をコードする遺伝子を標的とするガイドを平均４つ有するレンチウイルスＣａｓ９＋ｓｇＲＮＡライブラリであるＢｒｕｎｅｌｌｏライブラリを用いて、ＭＯＩ＜１で、ＨＥＫ２９３細胞の形質導入を行なった。形質導入していない細胞を抗生物質選択により除去して、得られたノックアウト細胞ライブラリを培養して増殖させた。アデノウイルスヘルパー（ｄＦ６）およびｒｅｐ２－ｃａｐ８ＡＡＶ産生プラスミドで細胞をトランスフェクションした。３通りの時点（１２時間、１８時間、および２４時間）の各々において、約８億個の細胞を集めた。細胞を穏やかに固定して透過処理し（カプシド抗体が核に到達するように）、次いで、アセンブリしたカプシド中にのみ存在する構造的エピトープを認識するＡＤＫ８モノクローナル抗体で染色し、続いて蛍光二次抗体を添加した。染色された細胞をＦＡＣＳソーティングに供して、非生産細胞（ＮＥＧ）から生産細胞（ＰＯＳ、カプシドを含有する）を分けた。次いで、ゲノムＤＮＡを抽出し、組み込まれたガイド配列をＰＣＲで増幅してＩｌｌｕｍｉｎａでシーケンシングした。

次世代シーケンシングデータ分析
差次的に富化されたｓｇＲＮＡを、バージョン０．５．７のＭＡＧｅＣＫソフトウェアパッケージ（Li et al., 2014, Genome Biology, 15:554）を用いて確認した。簡潔には、ｓｇＲＮＡをシーケンシングし、マッピングして、定量した後（Sanson et al., 2018, Nat. Commun., 9:5416）、下記式に従って１００万あたりのリード数を基準として標準化した：ｓｇＲＮＡあたりのリード数／各条件での総リード数^＊１０^６。ｓｇＲＮＡ存在量に対するソーティングの影響を制御するために、陽性細胞由来のｓｇＲＮＡ存在量を、同じソートからの陰性細胞由来のものと比較した。次いで、遺伝子レベルでのｓｇＲＮＡの差次的富化を、ＭＡＧｅＣＫで構築されるＲｏｂｕｓｔＲａｎｋｉｎｇＡｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ（ＲＲＡ）によって確認した。

ＮＧＳ分析の可視化
ｓｇＲＮＡの差次的富化についての統計学的分析の結果を、Ｐｙｔｈｏｎで構築されるＭａｔｐｌｏｔｌｉｂ可視化ライブラリ（Hunter, 2007, Comp. Science & Eng., 9:90-95）によって可視化した。遺伝子同士の関連を可視化するために、遺伝子を、表１中に列記される遺伝子オントロジー用語（Ashburner et al., 2000, Nat. Genet., 25:25-29; The Gene Ontology C., 2017, Nuc. Acids Res., 45:D331-8; Carbon et al., 2009, Bioinform., 25:288-9）で分類した。上記遺伝子オントロジー用語に関連するヒト遺伝子の全リストに、２０１８年９月１３日にＡｍｉｇｏ２．５．２によってアクセスしてダウンロードした。

次いで、上位１０００個の遺伝子（ランク付けは富化の有意性による）を、ｙ軸上では、これらの多重検定の未補正ｐ値に従ってドットでプロットし、ｘ軸上では、そのカテゴリ内で無作為に分散させた。プロット中でのドットの大きさは、５×Ｎｅ３という式に従って異なっており、式中、Ｎは、上流の分析により差次的に富化されたと判断されたｓｇＲＮＡの数である。

実施例２－全ゲノムスクリーニングによるアセンブリおよび制限因子の同定
ベクターを産生する細胞の数、各細胞が産生したベクターの量、またはこれらの両方、のうちのいずれかを最大限にできる細胞株または培養条件を創製することを最終目的として、ゲノム全体における摂動を示す細胞がプールされたライブラリからの生産細胞を選択した。ＣＲＩＳＰＲａライブラリでスクリーニングを繰り返すことを意図して、最初のスクリーニングにＣＲＩＳＰＲノックアウトＢｒｕｎｅｌｌｏライブラリ（Doench et al., 2016, Nat. Biotechnol., 34:184-91）を選択した。ＡＡＶ２は、最もよく研究されている血清型であるが、他のユニークな表現型のなかで唯一、厳密な核小体のアセンブリを示す血清型である。新たな知見を得る機会を最大にする目的でＡＡＶ８を選択したが、さらには、ＡＡＶ８は多くの天然バリアントに系統学的にさらに近いため、多くの血清型の産生に向けて上記知見を広く応用できる可能性が高くなる。実験手順の流れが図１に示されるが、そこで、ガイド配列は、生産細胞と関連する遺伝子ノックアウトのためのリードアウトとしての役割を果たす。

実際には、カプシドに特異的な抗体で陽性染色される細胞は、トランスフェクションの１２時間後よりも前には観察されなかった。１２時間の時点で、カプシド陽性染色は集団の１％に満たなかった。１２時間での陽性集団の中には、未ソート集団との比較において、統計学的に富化された遺伝子はみられなかった。１８時間および２４時間の試料はそれぞれ６．２５％および６．２９％が陽性染色され、これらの試料中で富化または枯渇したガイド配列の分析が、図２および図３中に示される。

陰性集団との比較においてトランスフェクションの１８時間後（図２）および２４時間後（図３）に陽性選別された集団中で、富化または枯渇の有意性によってランク付けした上位１０００個の遺伝子を、ｙ軸上では、これらの多重検定の未補正ｐ値に従ってドットでプロットし、ｘ軸上では、これらの遺伝子オントロジーカテゴリ（プロットの下に色分けして列記）内で無作為に分散させた。プロット中でのドットの大きさは、５×Ｎｅ３という式に従って異なっており、式中、Ｎは、上流の分析により差次的に富化されたと判断されたｓｇＲＮＡの数である。

いくつかの統計学的に有意なガイドが１つの時点（１８時間または２４時間）のみに固有であったが、９つの統計学的に有意なガイドが両セットに重複していた（図２および図３中の太字）。ＡＴＦ７ＩＰおよびＳＥＴＤＢ１という２つの遺伝子が、両試料において特に高い有意性を示した。

これらの遺伝子についてさらに調べるために、ｓｉＲＮＡノックダウンを選択した、というのは、これによれば、ＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクションが容易であり、かつ、遺伝的摂動を有する安定な細胞株を作製するよりもｓｉＲＮＡの方が時間、労力、およびコストの点で有利であるためである。１８時間および２４時間の試料の両方において富化された上位９つの遺伝子からなるサブセットを選択した、というのは、両試料においてこれらが上位６５ヒット内に含まれ、このことが、機能上妥当である可能性が高いことを示唆しているためである（図２および図３中で太字）。

ｓｉＲＮＡトランスフェクションのための調製において、ＰＥＩおよび無血清ＤＭＥＭ以外のトランスフェクション試薬および培地について、ベクター産生に対するそれらの影響を調べた。トランスフェクション効率が高いことが知られており小さな核酸のトランスフェクションに一般的に使用されるリポフェクタミンおよびＯｐｔｉＭＥＭを、平行して、かつＰＥＩとＤＭＥＭのあらゆる順列にて、試験した（図４）。細胞を６ウェルプレート中においてＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中で増殖させて９０％コンフルエントとした後、トランスフェクションした。各条件においてプラスミドの量は同じとし、ｘ軸上に示されるようにＡＡＶ２／２もしくはＡＡＶ２／８ｒｅｐ／ｃａｐプラスミドまたは空のプラスミド（ＮＥＧ）を用いた。

すべての条件にわたり、（トランスフェクション試薬のμｇ）：（ＤＮＡのμｇ）の比率を１．３７５：１に維持した（ｘ軸、ＰＥＩＭａｘおよびリポフェクタミン）。トランスフェクション混合物を、１００μＬの無血清ＤＭＥＭ中（濃いバー）または１００μＬのＯｐｔｉＭＥＭ中（薄いバー）にて調製した。インキュベーション後、２通りの方法のうちの一方によってトランスフェクション混合物を細胞に添加した：（ａ）ウェルから培養基を吸引し、適切な培地１．９ｍＬをトランスフェクション混合物に添加し、混合して、ウェルに添加（無地のバー）、または（ｂ）ウェルから培養基を吸引し、適切な培地１．９ｍＬで置き換え、次いでトランスフェクション混合物を各ウェル中の培地の上に滴下（模様付きバー）。ＮＥＧ条件では、混合方法と共にＰＥＩＭａｘを使用した。４８時間後に粗ベクター調製物を回収して、ｑＰＣＲによってＤＲＰを定量した。試料の１つに混入があることが確認された（アスタリスクで示される）。

リポフェクタミンを用いると初期のトランスフェクション効率が非常に優れていたが（ＧＦＰ陽性細胞の数および強さの視覚評価による）、ＡＡＶ２およびＡＡＶ８ベクターの力価はリポフェクタミンを使用した場合の方が有意に低く、いくつかの場合においては１００分の１以下であった。ＰＥＩは、非常に低コストであるためにベクター産生で用いるのに好ましかったが、本明細書中において記載される知見によると、リポフェクタミンに基づくトランスフェクションは産生に対する阻害作用があることが示唆される。こうした不都合な作用を考慮に入れて、トランスフェクション効率の低いＰＥＩを、ｓｉＲＮＡ実験では使用した。

上位遺伝子のいくつかを重複して標的とするｓｉＲＮＡを、ベクター産生プラスミドでのトランスフェクションよりも２４時間前にトランスフェクションすることによって、産生の開始前にノックダウンを生じさせた。次いで、産生プラスミドおよびｓｉＲＮＡを一緒にトランスフェクションして、２回目のトランスフェクションの４８時間後に粗調製物を回収して滴定した（図５）。簡潔には、ｘ軸上に示される遺伝子を標的とするＳｍａｒｔＰＯＯＬｓｉＲＮＡを、ドリップ法（ｄｒｉｐｍｅｔｈｏｄ）とＤＭＥＭ＋５％ＦＢＳとを使用することによって、ＨＥＫ２９３細胞中にトランスフェクションした。２４時間後、細胞をｓｉＲＮＡで再度トランスフェクションして、ヘルパー、ｒｅｐ－ｃａｐ、およびＩＴＲ．ｃｍｖ．ＥＧＦＰ．Ｔ２Ａ．ルシフェラーゼ．ＩＴＲプラスミドを添加した。４８時間後に、粗ベクター調製物を回収した。

ＤＲＰをｑＰＣＲによって定量し、以下の２通りの様式で記録した、すなわち、ヒトゲノム中の配列を標的としないｓｉＲＮＡを使用する平行トランスフェクションに対する比率として（図５Ａ）、および平行偽トランスフェクションに対する比率として（図５Ｂ）。コントロールとしては、ｓｉＲＮＡプレトランスフェクションおよびコトランスフェクションの影響に対するコントロールとして１つのウェルを標的のないｓｉＲＮＡで平行してトランスフェクションし、もう１つのウェルについては、ｓｉＲＮＡでのトランスフェクションを行なわなかった（すなわち、産生プラスミドのみ）。

ＡＡＶ２およびＡＡＶ８の粗調製物の力価を、標的のないｓｉＲＮＡコントロールの力価に対する比率として記録したところ（図５Ａ）、対象とした遺伝子のいずれをノックダウンした際にも、ベクター力価の著しい増大は観察されなかった。しかしながら、ｓｉＲＮＡなしのコントロール（図５Ｂ）に対する比率として記録した場合には、ＡＡＶ２は著しい力価の増大を示し、ＣＮＯＴ６ノックダウンでは６．５倍も増大したが、ＡＡＶ８はこれを示さなかった。おそらく、最も興味深い観察は、標的のないｓｉＲＮＡでさえもベクター力価を少し増大させたということであり、このことは、ＲＮＡｉ経路の活性化によりどういうわけか産生が増大したことを示唆している。

実施例３－アセンブリの文脈におけるウイルスと宿主タンパク質とのタンパク質相互作用
アセンブリプロセスと、直接関与している機構とについて、そのメカニズムを理解するために、二十面体へのアセンブリ前およびアセンブリ中にＡＡＰおよびカプシドモノマーと物理的に相互に作用する宿主因子を同定した。以前の報告によると、ＨＡタグＶＰ１を餌として用いたＶＰ－ＶＰ－ＡＡＰ複合体の免疫沈降では、完全にアセンブリしたカプシドは沈降しない（Maurer et al., 2018, Cell Resp., 23:1817-30）。また、ＡＡＰは、アセンブリしたカプシドの一部だとは考えられていないが、しかし、もしそうであれば、内部にある可能性があり、よって、抗体に到達して共沈する可能性はないと考えられる。よって、ＦＬＡＧ－ＡＡＰまたはＨＡ－ＶＰ１によって共沈したタンパク質は、カプシドのアセンブリ前およびアセンブリ中に生じる相互作用を象徴していると推察された。こうして考えられたメカニズムについての洞察を最大とする目的で、多くの異なる相互作用をプローブするためにプルダウンを設計した（図６）。

簡潔には、図６Ａ中に示される発現コンストラクトでＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクションした。細胞溶解物を調製し、総タンパク質をＢＣＡによって測定し、次いで、全試料中での総タンパク質濃度が等しくなるように希釈した。枠は、抗ＨＡ（ＶＰ餌）プルダウン（図６Ｂ）および抗ＦＬＡＧ（ＡＡＰ餌）プルダウン（図６Ｃ）に使用した溶解物を示す。２回行なった同じ実験（レーンの上に「Ａ」および「Ｂ」で示す）でインプットした各溶解物（図６Ａ中に番号をつけてある）の２％を電気泳動し、ＳＹＰＲＯＲｕｂｙで染色することにより総タンパク質を示した（図６Ｂ）、またはウェスタンブロットによりＶＰおよびＡＡＰについて調べた（図６Ｃ）。次いで、等体積の溶解物について免疫沈降を行なった（図６Ａ中に記載）。溶出液を等体積ずつ各レーンに載せて電気泳動し、ＳＹＰＲＯＲｕｂｙで染色することにより総タンパク質を示した（図６Ｄおよび図６Ｆ）、またはウェスタンブロットによりＶＰおよびＡＡＰについて調べた（図６Ｅおよび図６Ｇ）。

これらの実験により、ＶＰモノマーに結合する細胞タンパク質（試料２）、ＡＡＰに結合するもの（試料６）、およびＶＰ－ＡＡＰ複合体またはＶＰオリゴマーに結合するもの（試料３）を調べることができた。また、これらの実験によって、ＶＰの相互作用の相手がＡＡＰの存在下または非存在下においてどのように変わるのかについて、そしてその逆の場合についても調べることができた（試料２または試料６と試料３との比較）。

ＡＡＰのＮ末端から３分の１（ＡＡＰＮ）は、疎水性領域と、保存されているコアとを含んでおり、また、ＡＡＰとＶＰとが一緒に機能するために重要であることが示されており（Maurer et al., 2018, 上述; Tse et al., 2018, J. Virol., 92(14):doi:10.,1128/JVI.00393-18）、また、ＡＡＰのＣ末端部分（ＡＡＰＣ）は核小体シグナルおよび核移行シグナルを含む（Earley et al., 2015, J. Virol., 89:3038-48）。よって、ＡＡＰ、さらにはＶＰの核移行を担う細胞タンパク質がＡＡＰＣと結合し、主にＡＡＰＮがＶＰとの直接的な結合を担っているのではないかと推察した。この点について調べるために、切断型ＡＡＰ（ＡＡＰＮおよびＡＡＰＣ）にＦＬＡＧタグをつけたものをトランスフェクションおよびプルダウンに含めた（図６、それぞれ試料４および試料５）。ＨＡ－ＶＰ１またはＦＬＡＧ－ＡＡＰを餌として用いて免疫共沈降を両方向にて行ない、また、タグを付けていないＶＰおよびＡＡＰをコントロール試料中で発現させたものについて抗ＨＡおよび抗ＦＬＡＧのプルダウンを行なって非特異的結合タンパク質を評価し（試料１および試料７）、これをバックグラウンドとして、その他の試料から差し引くこととした。

これらの実験において、ＡＡＶ８のＶＰ１を使用した、というのは、ＣＲＩＳＰＲスクリーニングにおいてＡＡＶ８を使用しており、両方法において可能性のあるヒットを比較できたためである（たとえば、２種の異なる血清型を比較することは適切でないと考えられる）。ＡＡＰ２を使用したが、その理由は、これがＡＡＶ８産生をロバストにトランスコンプリメンテーション（ｔｒａｎｓ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）するためであり（Maurer et al., 2018, 上述; Earley et al, 2017, J. Virol., 91(3):doi: 10.1128/JVI.01980-16; Grosse et al., 2017, J. Virol., 91(20):doi: 10.1128/JVI.01198-17; Sonntag et al., 2011, J. Virol., 85:12686-97）、かつ、過去にはどの血清型からもＡＡＰの細胞結合相手が特定されていないことからＡＡＰ２を非常に詳細に研究したので、ＡＡＰと細胞タンパク質との相互作用についての結論および仮説を報告するのがよいと考えたためである。

生物学的デュプリケート（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｄｕｐｌｉｃａｔｅｓ）でトランスフェクションおよび免疫沈降の各々（図６）を行なったところ、複数のプルダウン同士の間に差次的なバンド形成を観察でき（図６Ｄおよび図６Ｆ）、このことは、各条件において固有の細胞タンパク質が存在していることを示す。溶出物に対してＬＣ－ＭＳ／ＭＳを行ない、各条件下で統計学的に有意に富化されたタンパク質を餌タンパク質を基準として標準化したものを、ヒートマップとして、図７Ａ中（ＨＡ－ＶＰ１についてプルダウンされたタンパク質、よって、ＶＰ１の結合相手を示す）、および図７Ｂ中（ＦＬＡＧ－ＡＡＰ２についてプルダウンされたタンパク質、よってＡＡＰ２の結合相手を示す）にまとめた。図７Ａおよび図７Ｂ中の行の名称は、Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号、遺伝子記号、タンパク質名称、およびその遺伝子産物に対して特定された固有のペプチドの数を含む。図７Ａおよび図７Ｂ中のカラムの識別名は、各条件（図６中に記載される）において発現したタグ付き餌タンパク質およびその他のウイルスタンパク質を含む。

特定された複数の結合相手は、ベクター調製物において以前に特定されたもののうちの、固有の複数のタンパク質である。また、ＶＰにより共沈したタンパク質は、ＡＡＰプルダウンにおけるものとは異なっており、この一連の組は、ウイルスタンパク質の共発現に依存して変わる。たとえば、全長ＡＡＰまたはＡＡＰＮが共発現している場合を除いて、ＶＰ１はＢａｇ２、ＳＴＵＢ１、およびＤｎａＪＣ７と共沈する。逆に、ＶＰ１が共発現している場合にのみ、ＡＡＰはＤｎａＪＡ１と共沈し、このことは、ＤｎａＪＡ１とＶＰ１との結合がＡＡＰに依存することを示す。これらの４種のタンパク質は、タンパク質の折りたたみを直接触媒する必須のシャペロンタンパク質である、広範囲に発現している熱ショック類似７０（ｈｅａｔｓｈｏｃｋｃｏｇｎａｔｅ７０）および熱ショックタンパク質７０（Ｈｓｃ／Ｈｓｐ７０）の補因子である。Ｈｓｐ７０がプルダウンにおいて検出されたが、特異的プルダウンにおける真の富化は判定が困難である、というのは、ＨＥＫ２９３細胞中でのＨｓｐ７０の発現レベルが非常に高く、バックグランドレベルを押し上げて非特異的結合事象をさらに頻繁に引き起こすためである。

また、タンパク質とＶＰまたはＡＡＰとの相互作用が互いの存在にそれほど影響されないタンパク質もある。完全なカプシドと相互作用すること（Dong et al., 2014, PLoS One, 9:e86453）および感染中における核／核小体への移行にとって必要であること（Bevington et al., 2007, Virology, 357:102-13; Johnson and Samulski, 2009, J. Virol., 83:2632-44）が示されている、核小体が富化されたタンパク質ヌクレオフォスミンを、ＶＰ１の存在下および非存在下、全長ＡＡＰ２によって、より具体的にはＡＡＰＮによってではなくＡＡＰＣによって、共沈させた。核膜孔複合体を介して移行に介在するインポーチン－ベータファミリーに属するインポーチン－５が、ＶＰが存在していてもＡＡＰ（およびＡＡＰＣ、ＡＡＰＮではなく）に結合するという、ヌクレオフォスミンに類似するパターンを示した。インポーチン－ベータは、入ってくるＡＡＶ２粒子と共存することが示されているが、このファミリーに属する特定のメンバーについては調ベられていない（Nicolson and Samulski, 2014, J. Virol., 88:4132-44）。これらの結果は、核小体におけるアセンブリのためのＡＡＰの核／核小体輸送およびＶＰタンパク質の共輸送にＡＡＰのＣ末端配列が介在していることを示唆する。実際、ＡＡＰ２について記載される核および核小体の局在シグナルはＣ末端部分にある（Earley et al., 2014, J. Virol., doi:10.1128/jvi.03125-14）。クレアチンキナーゼＢおよびミオトロフィンなどの、ＡＡＰにより共沈する別のクラスのタンパク質は、ＶＰ１が共発現している場合を除いて、プルダウンされなかった。本明細書中において記載されるＭＳアプローチによって同定したこれらのおよびその他の多くのタンパク質は、これまで、ＡＡＶの複製サイクルとの関連が明らかにされていなかった。同定した結合相手のうちいくつかは、ＦＸＲ１およびＦＸＲ２などの、十分に特徴付けされていない遺伝子／タンパク質である。

実施例４－選択されたヒットについての、化学的阻害による機能評価
ベクター産生に及ぼす結合相手の影響を実証するための第１段階として、対応する化学的阻害剤が市販されているすべてのヒットについて試験した。また、バフィロマイシンＡ１についても試験し、バフィロマイシンＡ１は液胞特異的Ｈ＋ＡＴＰアーゼ（これの５つのサブユニットがＣＲＩＳＰＲスクリーニングにおいて大幅に枯渇していることを確かめた（図２および図３））を阻害する。また、バフィロマイシンＡ１は、ＡＡＰの非存在下においてＶＰタンパク質をレスキューすることも示されている（Maurer et al., 2018, 上述）。

阻害剤を、培養細胞用途で製造元が推奨する添加量を中心とした濃度範囲にて、培地中に段階希釈した。阻害剤を含有する培地をウェルに添加し、ＡＡＶ２（薄いバー）またはＡＡＶ８（濃いバー）産生プラスミドのいずれかを含有するトランスフェクション混合物を上に滴下して、４８時間後にベクターを回収した（図８Ａ）。最も多い添加量でのＨｓｃ／Ｈｓｐ７０、ヌクレオフォスミン、およびクレアチンキナーゼＢの阻害、ならびにすべての添加量でのバフィロマイシンＡ１の阻害によって、ベクター産生がバックグランドレベルにまで低下した。これらのうちで、カプシドアセンブリの直接的な阻害のためではなく不良なトランスフェクション効率の結果として生じたものがあるか否かを調べるために、上流ではあるがベクター産生にとって重要な因子について、トランスフェクション混合物の添加によりトランスフェクション工程を開始させた４時間後に、阻害剤を添加して、実験を繰り返した（図８Ｂ）。

Ｘ軸は、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中における阻害剤の濃度（μＭ）を示す。アッセイのバックグラウンド（ＮＥＧ）を評価するために、ポジティブコントロールトランスフェクションにはｃａｐ遺伝子の代わりにＤＭＳＯのみを与え（ＤＭＳＯ）、ネガティブコントロールにはＤＭＳＯおよび空のプラスミドを与えた。トランスフェクションして４８時間後に粗ベクター調製物を回収して、ｑＰＣＲによってＤＲＰを定量した。４８時間においてＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏｗキットを用いて生細胞をアッセイし、値を、同じプレート中に２倍希釈で播種した細胞の検量線を用いてプロットした。総トランスフェクション効率をＥＧＦＰ陽性細胞のイメージングによって視覚的に評価し（ＥＧＦＰは、導入遺伝子がＩＴＲ間に挟まれているプラスミドの中に存在）、細胞の健康状態を、明視野イメージングによって視覚的に、かつ薬剤処理ウェル中でのＡＴＰレベルによって定量的に、評価した（薄い陰影付き、図８Ｂ）。さらに、いくつかの阻害剤濃度については、１回目の実験で有効でなかったために調整を加えたが、これらの濃度のうちのいくつかは、標的酵素の特異性を保証する濃度よりも高かった可能性がある。

２回行なった実験のうち２回目の実験の結果を、各阻害剤のそれぞれについて、生細胞数を基準として標準化して、対応する顕微鏡画像と共に、図９～図１６中に示す。これらの実験において、産生プラスミドをＨＥＫ２９３細胞中にトランスフェクションし、適切な阻害剤を段階希釈して、４時間後にｘ軸上に示される濃度で添加した。阻害剤は、平行して実施したプレートに同濃度で添加し、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ（登録商標）を用いてＡＴＰレベルを定量することによって、４８時間のインキュベーション後の細胞生存率を評価した。ウェルからベクターを回収する直前に、４８時間の時点で、顕微鏡法によって、総トランスフェクション効率（ＥＧＦＰ；導入遺伝子がＩＴＲ間に挟まれているプラスミドにおいて存在）および細胞形態（明視野）を、ｘ軸上に示される濃度にて評価した。ＡＡＶ２（薄いバー）およびＡＡＶ８（濃いバー）ベクターの力価を、ＤＲＰに対するｑＰＣＲによって定量した。各調製物中のゲノムのコピー数（ＧＣ）を、各条件について調べた生細胞の数を基準として標準化して、生細胞１個あたりのＧＣを、阻害剤を与えていないポジティブコントロールトランスフェクション（ＤＭＳＯ）に対する比率として記録した。これらの実験についての標準化前のデータが、図９Ｂ中に示される。

Ｃｄｋ１阻害剤ＩＶによるＣｄｋ１の阻害はベクター力価に影響を及ぼしたが、これに付随して、細胞の健康状態とトランスフェクション効率との両方が低下した（図９）。よって、Ｃｄｋ１がベクター産生に関与している可能性は、これらの実験からは、確認も否認もできない。細胞生存率への影響を伴わないＡＡＶ８力価の著しい低下は、トランスフェクションの４時間後に阻害剤を添加した場合にのみ、ＡＡＶ８について６．２５μＭでみられたが、この濃度ではＡＡＶ２産生への影響はなかった。ＡＡＶ８のＶＰ１を餌として用いた際にＣｄｋ１が有力な結合相手として特定されたことを考慮すると、これは、血清型特異的に、ＡＡＶ２とよりもＡＡＶ８と優先的に相互作用することを示唆し得る。

Ｃｄｋ２阻害剤ＩＩによるＣｄｋ２の阻害が、細胞生存率（ＡＴＰによりアッセイ）または総トランスフェクション効率（ＥＧＦＰ可視化により）に影響を及ぼさずに、ＡＡＶ２の産生およびＡＡＶ８の産生の両方に対して、高濃度にて、特に９０～２７０μＭにて、添加量依存性の影響を示した（図１０）。細胞形態は添加量２７０μＭにて影響を受け、外見からして生きているＧＦＰ＋細胞が各ウェルの中央へと凝集した。ＡＡＶ８の力価が１０分の１近くまで低下したことから、Ｃｄｋ２が産生に関与していることが示唆されるが、こうした高い薬剤濃度での非特異的な影響を完全に除外するためにはさらなる実験が必要である。

Ｂａｇ２、ＳＴＵＢ１、ＤｎａＪＣ７、またはＤｎａＪＡ１に対する阻害剤は市販品がないが、しかしながら、アポプタゾールはシャペロンであるＨｓｃ７０およびＨｓｐ７０を阻害し、これによって上記４種のコシャペロンのすべてが機能していることが記録される。アポプタゾールによるＨｓｃ／Ｈｓｐ７０の阻害は、添加量に大いに依存するベクター産生の低下（ＡＡＶ８で５％に低下）を示し、明らかなトランスフェクション効率の低下はみられなかったが、細胞形態は劇的に変化した（図１１）。３００μＭにおいて、細胞がウェルの中央へと集まったが、それでもＥＧＦＰのロバストな発現を示し、ＡＴＰの存在量によってアッセイしたところ著しい細胞死は示さなかった。言うまでもなく、細胞タンパク質の大部分の折りたたみにとって重要であるこのシャペロンの阻害は、産生に必要なその他のメカニズムに対して、間接的に影響を及ぼしている可能性がある。ＶＰの折りたたみにおけるＨｓｃ／Ｈｓｐ７０の直接的な関与を確かめるためにはさらなる研究が必要であるが、これらの結果から、Ｈｓｃ／Ｈｓｐ７０に関連する機能が産生にとって重要だということが明らかとなった。

ＭＬ－７９２によるＳＡＥ１の阻害（図１２）、またはＢＭＬ２８２によるＵＣＨＬ１の阻害（図１３）は、ベクター力価に対して著しい影響を及ぼしたが、これに付随して、ＥＧＦＰの発現が劇的に低下した。よって、力価に対するこの影響は不良なトランスフェクションの結果として生じた可能性がある。

ヌクレオフォスミン（ＮＰＭ１）は、特にリボソームの新生の文脈において、折りたたみおよび核／核小体輸送のシャペロンとしての役割を有する。ＮＰＭ１はＲｅｐタンパク質およびアセンブリしたカプシドと相互作用することが以前に示されているが、これらの研究の実験設計はＡＡＰ－ＮＰＭ１の相互作用に対処していなかったと考えられる（Dong et al., 2014, PLoS One, 9:e86453; Bevington et al., 2007, Virology, 357:102-13）。トランスフェクション直前にＮＳＣ３４８８８４によりＮＰＭ１を薬理学的に阻害するとベクター力価が大きな影響を受けたが（図８Ａ）、この影響は、トランスフェクションの４時間後に添加した場合にはみられなかった（図８Ｂおよび図１４）。このことは、ＮＰＭ１に対しての役割が非常に初期のものであることを示唆している。

クレアチンキナーゼＢ（ＣＫＢ）は、代謝において、特に、細胞ＡＴＰが急速に消費される部位でこれをｉｎｓｉｔｕにて再生するという重要な役割を果たしている。ＦＤＮＢによるＣＫＢの阻害は細胞のベクター産生に依って増大するようであるが（図１５）、これは、生細胞の定量をＡＴＰレベルの測定により間接的に行なったことと関連する可能性がある、つまり、ＡＴＰ再生の阻害により生細胞数が人為的に小さくなり、そのために生細胞１個あたりのゲノムコピー数が多くなった可能性がある。

液胞特異的Ｈ＋ＡＴＰアーゼ（Ｖ－ＡＴＰアーゼ）は複数のサブユニットからなる酵素複合体であり、細胞内区画の膜を越えるプロトンの移行を触媒して内部ｐＨに影響を及ぼす。Ｖ－ＡＴＰアーゼは、リソソーム、エンドソーム、およびオートファゴソームの酸性化にとって重要であり、バフィロマイシンＡ１によりＶ－ＡＴＰアーゼを阻害するとＡＡＶ感染が阻害される（Bartlett et al., 2000, J. Virol., 74:2777-85; Sonntag et al., 2006, J. Virol., 80:11040-54）。また、バフィロマイシンＡ１は、ＰＥＩが介在するプラスミドＤＮＡのトランスフェクションをも阻害し（You and Auguste, 2010, Biomater., 31:6859-66）、このことから、トランスフェクション直前にＶ－ＡＴＰアーゼを阻害した際にみられたベクター産生の停止（図８Ａ）と、全ゲノムＣＲＩＳＰＲノックアウトスクリーニングからのサブユニットの枯渇（図２および図３）とが説明される。トランスフェクションの４時間後にバフィロマイシンＡ１を少量添加した場合にはベクター力価の１０分の１への低下が観察され、トランスフェクション効率への著しい影響は視覚的には認められなかった（図１６）。バフィロマイシンＡ１での処理は、ＡＡＰの非存在下においていくつかの血清型のＶＰタンパク質の分解をレスキューするが（Maurer et al., 2018, 上述）、このことは、消化小器官の酸性化がＡＡＶ産生に対する拮抗作用を有することを示唆している。しかしながら、（Sonntag et al., 2011, J. Virol., 85:12686-97）などにおけるように、ＡＡＰの存在下では、この酸性化も産生にとって重要であるようである。これらの結果は、エンドソーム、リソソーム、および／またはオートファゴソームの区画が、ＡＡＶ複製サイクルの全局面と組換えベクター産生の場とおいて複雑な役割を有していることを示唆する。

実施例５－提案されるモデル
図１７は、対象とする複数のタンパク質を組み込んだＡＡＶアセンブリの仮説モデルを示す概略図である。新生ＶＰタンパク質（最も左）が、細胞質中において翻訳されて、ＡＡＰの非存在下においてプロテアソームによって分解される。ＡＡＰが存在する場合には、ＶＰがオリゴマー化してアセンブリ中間体となり、核内に輸送されて完全なカプシドアセンブリとなる。ＡＡＰがＶＰをモノマーまたはオリゴマーのどちらとして共輸送するのはわかっていない。図中に示される他のタンパク質はいずれも一連のプルダウンで特定され、ここで、試料中にこれらが存在するか存在しないかに基づき（たとえば、図７）、かつ文献から周知されるこれらの機能に基づき、仮説的な機序においてアセンブリされた。

全ゲノムＣＲＩＳＰＲノックアウトスクリーニングにより、１８時間の試料および２４時間の試料の両方において、少なくとも２つのヒット（ＡＴＦ７ＩＰおよびＳＥＴＤＢ１）が得られ、統計学的有意性が非常に高かった。これらのタンパク質は、Ｈ３Ｋ９をトリメチル化して活性座を転写的にサイレンシングする抑制性クロマチン調節因子であるＨＵＳＨ複合体の中で一緒に存在しており、これらのタンパク質は機能的に共依存の関係にある（２４）。ＨＵＳＨ複合体がトランスフェクションされたプラスミドからのウイルスタンパク質の発現をサイレンシングするモデルが考えられ得る、または、ＨＵＳＨがカプシドアセンブリを促進するその他の因子の発現をサイレンシングしている可能性もある。

こうしたプロテオミクス研究によって、ＣＲＩＳＰＲスクリーニングよりも多くのヒット（統計学的有意性あり）が得られ、また、ウイルスタンパク質に差次的に結合するいくつかのヒットは、ＤｎａＪＡ１、ＤｎａＪＣ７、ＢＡＧ２、およびＳＴＵＢ１などの同じ経路の異なる支流に供給されるという役割を有する。Ｈｓｃ／Ｈｓｐ７０の活性は、Ｈｓｃ／Ｈｓｐ７０によるＡＴＰ加水分解を刺激して基質結合親和性を増大させるＪ－タンパク質などのコシャペロンと、ヌクレオチド交換因子として機能するＢＡＧファミリーのタンパク質とに依存する。また、Ｊ－タンパク質はその基質に直接結合するが、このことはＤｎａＪタンパク質がＨｓｐ７０基質選択性に関与していることを示す。これらのコシャペロンとＨｓｃ／Ｈｓｐ７０とは、一緒に、基質の折りたたみを駆動できるが、また、基質の分解にも関与している可能性がある。ＳＴＵＢ１は、不完全または不適切に折りたたまれたＨｓｃ／Ｈｓｐ７０基質をユビキチン化してプロテアソーム分解の標的とすることによってタンパク質安定性の負の制御因子として働く、Ｅ３リガーゼである。ＢＡＧ２は、ＤｎａＪタンパク質と共にＨｓｐ７０のＡＴＰアーゼ活性を刺激し、ＳＴＵＢ１のユビキチン化活性を阻害する。ＤＮＡＪＣ７は、プロテアソームによる基質の分解を阻害することにより安定化するという役割を有することが示唆されており、不適切に折りたたまれた基質を折りたたみ経路の初期段階に戻すことによる再利用シャペロンとしての働きが提案されている。ＶＰ１がＡＡＰの存在下および非存在下においてＤＮＡＪＡ１、ＢＡＧ２、およびＳＴＵＢ１と差次的に結合することは、コシャペロンとＨｓｃ／Ｈｓｐ７０との選択性、相互作用、および機能性に対してＡＡＰが直接関与していることを示唆する。さらに、このことは、ＡＡＰが上流で作用してプロテアソームによるＶＰタンパク質の分解を阻害するという機能的ネットワークを提案する。

その他の実施形態
方法および組成物が、複数の異なる態様と共に本明細書中において記載されているが、これら様々な態様について上述される記載は例証を意図しており当該方法および組成物の範囲の限定を意図しないということが理解される。その他の態様、利点、および改変は、特許請求の範囲に含まれる。

開示されるのは、開示される方法および組成物の産物の調製のために使用できる、もしくはこの調製と併用して使用できる、もしくはこの調製において使用できる方法および組成物、またはこうした産物である。これらのおよびその他のものが本明細書中において開示されており、これらの方法および組成物の組み合わせ、サブセット、相互作用、グループなどが開示されていることが理解される。すなわち、これらの組成物および方法の個々についての、またはこれらの様々な集合的な組み合わせおよび並び替えについての、具体的な言及が明白に開示されていない場合があるかもしれないが、これらの各々は具体的に意図されており、本明細書中において記載されている。たとえば、特定の組成物または特定の方法が開示および議論され複数の組成物または方法が議論されている場合、これら組成物および方法の組み合わせおよび並び替えのひとつひとつが、そうではないと具体的に示されている場合を除いて、具体的に意図されている。同様に、これらの任意のサブセットまたは組み合わせも具体的に意図および開示されている。

Claims

細胞内でのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）のアセンブリを改善するための方法であって、
細胞内でのＨｓｃ／Ｈｓｐ７０もしくはその補因子、液胞特異的Ｈ＋ＡＴＰアーゼ、および／またはサイクリン依存性キナーゼ２の発現または活性を増大させることにより改変細胞を産生する工程と、
前記改変細胞にＡＡＶベクターを感染させることにより感染改変細胞を産生する工程と、
前記感染改変細胞を培養する工程と、
アセンブリされたＡＡＶを集める工程とを含む、方法。
集めた前記アセンブリされたＡＡＶの量は、前記改変を有さない細胞をＡＡＶ感染させた後で集めた、アセンブリされたＡＡＶの量よりも多い、請求項１に記載の方法。
前記方法の結果として、ＡＡＶの力価が著しく増加する、請求項１または２に記載の方法。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）のアセンブリを改善するための方法であって、
ＡＡＶを有する改変細胞から前記ＡＡＶを産生する工程であって、前記細胞が、ＣＨＭＰ７、ＣＥＰ７２、ＣＮＯＴ６、ＳＬＣ９Ａ６、ＰＰＨＬＮ１、ＡＴＦ７ＩＰ、ＳＥＴＤＢ１、ＧＰＲ８９Ｂ、ＫＩＦ１６Ｂ、ＡＴＡＤ３Ａ、ＢＡＧ２、ＳＴＵＢ１、ＤＮＡＪＡ１、ＤＮＡＪＣ７、ＨＳＰＡ８、ＨＳＰＡ１Ａ、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＨＣＨＤ２、Ｃ１ＱＢＰ、ＤＰＹＳＬ５、ＦＸＲ１、ＦＸＲ２、ＩＰＯ５、ＬＢＲ、ＭＴＰＮ、ＮＰＭ３、ＮＰＭ１、ＰＰＬ、ＳＮＸ３、ＵＢＥ２Ｏ、ＳＡＥ１、ＣＣＤＣ１２４、ＧＮＢ１、ＲＡＢ１Ａ、ＧＮＢ４、ＲＰＬ２３、ＣＫＢ、ＳＲＰ９、ＵＣＨＬ１、およびＴＢＣＢから選択される１種もしくは複数種の遺伝子またはこれによりコードされるタンパク質の増加または減少を呈するように改変されている、工程と、
アセンブリされた前記ＡＡＶを集める工程と、を含む、方法。
前記改変細胞は遺伝子操作細胞である、請求項４に記載の方法。
前記遺伝子操作細胞は、ノックアウト、ノックダウン、過剰発現、またはこれらの組み合わせを含む、請求項５に記載の方法。
前記改変細胞は、前記１種もしくは複数種の遺伝子またはこれによりコードされるタンパク質を増加または減少させる化学化合物を含む、請求項４に記載の方法。
前記化学化合物は、Ｃｄｋ１阻害剤ＩＶ、Ｃｄｋ２阻害剤ＩＩ、アポプタゾール、ＭＬ－７９２、ＢＭＬ２８２、ＮＳＣ３４８８８４、ＦＤＮＢ、およびバフィロマイシンＡ１からなる群より選択される、請求項７に記載の方法。
アデノ随伴ウイルスをアセンブリするための無細胞培養系であって、
培養基と、
ＣＨＭＰ７、ＣＥＰ７２、ＣＮＯＴ６、ＳＬＣ９Ａ６、ＰＰＨＬＮ１、ＡＴＦ７ＩＰ、ＳＥＴＤＢ１、ＧＰＲ８９Ｂ、ＫＩＦ１６Ｂ、ＡＴＡＤ３Ａ、ＢＡＧ２、ＳＴＵＢ１、ＤＮＡＪＡ１、ＤＮＡＪＣ７、ＨＳＰＡ８、ＨＳＰＡ１Ａ、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＨＣＨＤ２、Ｃ１ＱＢＰ、ＤＰＹＳＬ５、ＦＸＲ１、ＦＸＲ２、ＩＰＯ５、ＬＢＲ、ＭＴＰＮ、ＮＰＭ３、ＮＰＭ１、ＰＰＬ、ＳＮＸ３、ＵＢＥ２Ｏ、ＳＡＥ１、ＣＣＤＣ１２４、ＧＮＢ１、ＲＡＢ１Ａ、ＧＮＢ４、ＲＰＬ２３、ＣＫＢ、ＳＲＰ９、ＵＣＨＬ１、およびＴＢＣＢから選択される少なくとも２種のタンパク質、または前記少なくとも２種のタンパク質をコードする核酸と、を含む、無細胞培養系。
少なくとも３種（たとえば、少なくとも４種、少なくとも５種など）のタンパク質、または前記少なくとも３種のタンパク質をコードする核酸を含む、請求項９に記載の無細胞培養系。
Ｈｓｃ／Ｈｓｐ７０もしくはその補因子、液胞特異的Ｈ＋ＡＴＰアーゼ、および／もしくはサイクリン依存性キナーゼ２における１つもしくは複数の変異、ならびに／または
Ｈｓｃ／Ｈｓｐ７０もしくはその補因子、液胞特異的Ｈ＋ＡＴＰアーゼ、および／もしくはサイクリン依存性キナーゼ２を発現する１つもしくは複数の外因性コンストラクト
を含む細胞株。
前記変異はノックアウト変異を含む、請求項１１に記載の細胞株。
前記変異はノックダウン変異を含む、請求項１１に記載の細胞株。
前記１つまたは複数の外因性コンストラクトは組換えコンストラクトである、請求項１１に記載の細胞株。
細胞内でのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）のアセンブリを改善するための製品であって、（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）のうちの少なくとも２通りの中からの少なくとも１つの要素を含む、製品：
（ａ）Ｈｓｃ／Ｈｓｐ７０もしくはその補因子、Ｈｓｃ／Ｈｓｐ７０もしくはその補因子をコードする核酸、またはＨｓｃ／Ｈｓｐ７０もしくはその補因子を調節する化合物；
（ｂ）液胞特異的Ｈ＋ＡＴＰアーゼ、液胞特異的Ｈ＋ＡＴＰアーゼをコードする核酸、または液胞特異的Ｈ＋ＡＴＰアーゼを調節する化合物；および
（ｃ）サイクリン依存性キナーゼ２、サイクリン依存性キナーゼ２をコードする核酸、またはサイクリン依存性キナーゼ２を調節する化合物。
前記Ｈｓｃ／Ｈｓｐ７０またはその補因子を調節する化合物は、アポプタゾールである、請求項１５に記載の製品。
前記液胞特異的Ｈ＋ＡＴＰアーゼを調節する化合物は、バフィロマイシンＡ１である、請求項１５に記載の製品。
前記サイクリン依存性キナーゼ２を調節する化合物は、Ｃｄｋ２阻害剤ＩＩである、請求項１５に記載の製品。