JP2023525149A - 異常凝集の処置のための手段および方法 - Google Patents

異常凝集の処置のための手段および方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、細胞内のプロテアソーム分解経路を刺激する部分に融合された、アミロイド凝集を停止可能なペプチド部分を含む、非天然分子を提供する。本発明の非天然分子は、ヒトおよび獣医学の異常凝集障害を処置するのに有用である。

Description

発明の分野
本発明はタンパク質凝集の分野に関し、より具体的には、異常なタンパク質凝集、特に異常なアミロイドおよび非アミロイド凝集の分野に関する。さらにより具体的には、本発明は、例えばアミロイドβ、タウ、α－シヌクレイン、ＴＤＰ－４３、ｐ５３、ＦＵＳ等の凝集体などの、異常凝集の分野に属する。具体的には、本発明は、細胞内のタンパク質分解経路を刺激する部分に融合された、異常凝集を防止または停止可能なペプチド部分を含む、非天然分子を提供する。本発明の非天然分子は、ヒトおよび獣医学の異常凝集障害を処置または防止するのに有用である。
本発明の序論
異常凝集体は、複数の個々のペプチド単位が会合して大きなクラスターになることから生じる。かかる異常凝集体は一般に、ｉ）アミロイド線維およびアミロイドオリゴマーにさらに分類可能な、アミロイド構造、およびｉｉ）非アミロイド構造に分類される。アミロイド線維は主にβシートで構成され、クロスβＸ線回折パターンおよびコンゴレッド染料による特徴的な染色を含む、共通の特徴を共有する。これらの線維の形成は、一次元の結晶化に類似する。いくつかのアミロイドの形成に必要な５～１０残基の重要な配列を含有する短いペプチドが結晶化されて、これらはその後、関連するタンパク質からアミロイド形成をもたらすために使用される（Sawaya MR et al (2007) Nature 447, 453-457）。アミロイドオリゴマーは主に細胞内で会合し、アミロイド線維の前身と考えられ、また成熟したアミロイド線維より毒性が高いと考えられている。アミロイド構造および非アミロイド構造は、症状として、しかし主には疾患の原因として、いくつかの疾患に関連する。例えば、アミロイド疾患は、通常は可溶性のタンパク質が線維やオリゴマーなどのアミロイド構造に変換されることに関連する。興味深いことに、これまでに３７種類の異なるペプチドまたはタンパク質が、ヒトの病状においてアミロイドオリゴマーを形成するか、またはアミロイドの細胞内もしくは細胞外沈着物を形成することが見出されている（Chiti F and Dobson CM (2017) Annu. Rev. Biochem. 86: 27-68の表１を参照）。これらのアミロイドの多くは分泌され、沈着物が細胞外空間で得られるが、一方他のアミロイドはサイトゾルであり、アミロイド様の特徴を持つ細胞内封入体を形成する。アミロイドオリゴマーはアミロイド線維の前駆体であり、ほとんどの場合、細胞内に見出される。実際、最も研究されている細胞外アミロイド線維の２つであるアミロイドβとＩＡＰＰは、細胞内にも、例えばオリゴマーとして見出される。一般に、アミロイド構造を形成可能なポリペプチドはサイズが小さい。実際、それらの半分は１００残基未満のアミノ酸残基を有し、４つのみが４００残基を超え、７００残基を超えるものはないが、一方ヒトゲノムにコードされている３０，０００を超えるタンパク質の平均長は約５００残基である。アミロイド疾患に関連する既知のタンパク質のうち７つはオリゴマーを形成し、中枢神経系に沈着し、アルツハイマー病およびパーキンソン病などの神経変性状態を引き起こすが、残りはオリゴマーを形成し、他の組織（心臓、脾臓、肝臓および腎臓を含む）に沈着し、したがって結果として生じる疾患は非神経障害性である（Chiti F and Dobson CM (2017) Annu. Rev. Biochem. 86: 27-68の表１を参照）。アルツハイマー病においては、２種類の異なるミスフォールディング／凝集が発生する：ｉ）凝集したβシート様タンパク質（主にアミロイドβペプチドからなる）のプラーク、およびｉｉ）タウタンパク質、これは通常はチューブリンの凝集を促進してニューロン線維の天然の管状物質を形成するが、代わりに他の凝集体を形成し、その結果、ニューロンはニューロン線維を失い、したがってその機能を失う。トランスサイレチンは別の例であり、結果として生じるアミロイド疾患は一般に全身性であるか、末梢神経系または心臓に関係する。また現在までに、ヒト疾患において細胞内または細胞外の非アミロイド沈着物を形成可能な１９のペプチドまたはタンパク質が記載されている（Chiti F and Dobson CM (2017) Annu. Rev. Biochem. 86: 27-68の表２を参照）。
異常凝集体（例えば、アミロイドまたは非アミロイドの細胞外または細胞内沈着物によって集合的に形成されるもの）の、疾患との関連のために、異常凝集体形成を遅延させ防止するいくつかの試みがなされてきた。固有の配列だけでなく、明確に定義された凝集状態にも結合する抗体の能力は、異常凝集疾患の免疫療法を開発するためのかなりの努力につながっている（例えば、Briggs R et al (2016) Clin. Med. 16:247-53を参照）。残念ながら、異常凝集阻害剤を開発する試みはすべて、臨床試験の初期段階または後期段階で失敗している。失敗を調査すると、信頼性の高い様式で凝集反応を監視する方法の欠如、化合物の作用機序に関する知識の欠如、および疾患の初期での介入が不可能であることが、要因として示されている。他では、神経変性疾患を標的とする潜在的な阻害剤を特定するために、in vitroおよびin vivoでの化合物のスクリーニングに焦点を当てている。それにもかかわらず、標的ペプチドの凝集を阻害するペプチド構造（非天然アミノ酸および／またはＤ－アミノ酸を含む）を有する化合物は当技術分野で周知であり、かかるペプチドはキャッピングペプチドと呼ばれている。例は次の通りである：タウ凝集阻害剤についてはUS8,754,034B2、トランスサイレチン阻害剤についてはWO2018/005866、α－シヌクレイン阻害剤についてはUS2019/0241613。これらの特定のキャッピングペプチドは、特定の異常タンパク質の初期凝集体のさらなる成長を効率的に防止するが、しかしこれらのキャッピングペプチドは、確立された異常凝集体、または細胞内に存在する確立された異常オリゴマーを排除することはできない。異常なタウ凝集体をクリーンアップする取り組みは、WO2018/102067およびSilva MC et al 2019）eLIFE, 8, e45457）で開示されている。ただし、後者の方法では、二官能性化合物が使用され（一部はタウに結合し、別の部分はユビキチンリガーゼに結合する）、これらの化合物は、異常凝集形成の危険因子である過リン酸化（タウの単量体型）を分解する。
発明の概要
本発明は、標的タンパク質の異常凝集を防止または停止することができるキャッピングペプチドを含む新しいクラスの非天然分子を生成した；ここで該キャッピングペプチドは、細胞内タンパク質分解系の１つ以上のポリペプチド成分と相互作用する部分に、融合されている。これらの非天然分子は効率的に細胞に侵入でき、異常タンパク質のさらなる凝集を防止でき、重要なことには、前記タンパク質によって形成された異常凝集体を分解することもできることが、本発明において示される。驚くべきことに、我々の非天然分子は、タンパク質の異常凝集体の単量体形態を妨害しない（または分解しない）ため、これらの分子は異常凝集体（アミロイドおよび非アミロイド凝集体など）のみを分解することに特異的である。
したがって本発明は、一側面において、異常凝集体を形成可能な標的タンパク質の異常凝集体に特異的に結合する少なくとも１つのキャッピングペプチドを含む非天然分子を提供し、ここで前記少なくとも１つのキャッピングペプチドは、細胞内タンパク質分解系を標的とする少なくとも１つの部分に融合されている。
別の側面において、本発明の非天然分子は、異常凝集体を形成可能な標的タンパク質の異常なアミロイドまたは非アミロイド凝集体に特異的に結合する少なくとも２つのキャッピングペプチドを含む、非天然分子を提供し、ここで該少なくとも２つのキャッピングペプチドは、標的タンパク質の同一または異なる易凝集性領域に向けられ、およびここで該キャッピングペプチドは、細胞内タンパク質分解系を標的とする少なくとも１つの部分に融合されている。文言「～に向けられた」は、「～に結合する」と同等である。
さらに別の側面において、細胞内タンパク質分解系は、ユビキチンプロテアソーム分解系（ＵＰＳ）である。
さらに別の側面において、細胞内タンパク質分解系は、オートファジー分解系である。
さらに別の側面において、細胞内タンパク質分解系は、シャペロン介在性オートファジー（ＣＭＡ）系である。
特定の側面において、細胞内タンパク質分解系を標的とする部分は、小分子である。
さらに別の特定の側面において、細胞内タンパク質分解系を標的とする部分は、ペプチドであるか、またはペプチド様構造を有する。
ペプチド様構造とは、ペプチド配列の１個以上のアミノ酸がＤ－アミノ酸または人工アミノ酸に変化したペプチドである。
特定の側面において、非天然分子は、アミロイド線維もしくはアミロイドオリゴマーなどの細胞内異常凝集体、またはｐ５３、ＦＵＳもしくはＴＤＰ－４３などの非アミロイド凝集体を標的とする。
別の特定の側面において、非天然分子は、細胞外の異常凝集体を標的とする。
別の側面において、非天然分子は、例えばタウ、ＩＡＰＰアミロイドβ、α－シヌクレイン、ハンチンチン－１などの細胞内アミロイド形成タンパク質を標的とする。
別の側面において、非天然分子は、例えばアタキシン－１、ＦＵＳ、ＴＤＰ－４３およびｐ５３などの細胞内非アミロイド形成タンパク質を標的とする。
さらに別の側面において、非天然分子はさらに、半減期延長実体を含む。
さらに別の側面において、非天然分子はさらに、細胞透過性実体を含む。
さらに別の側面において、非天然分子はさらに、１つ以上の人工アミノ酸を含む。
さらに別の側面において、本発明の非天然分子は、医薬としての使用のために提供される。
図の説明
図１：候補キャッピングペプチドによって満たされるべき要件の概略図（詳細については例１を参照）。 図２：タウ由来のＡＰＲ（配列番号８に示す）に対する候補キャッピングペプチドの相互作用エネルギー。Ｘ軸は相互作用エネルギーを表し、Ｙ軸は伸長エネルギーを表す。適切なタウ候補キャッピングペプチドは、左上の角に位置する（凝集キャッピング）。 図３：タウバイオセンサーシーディングアッセイの図。細胞は、緩衝液（パネルＡおよびＢ）、非融合キャッピングペプチド（パネルＣおよびＤ）、または非天然分子（分解部分に結合したキャッピングペプチド（パネルＥおよびＦ））で前処理された、atto-633標識の事前形成タウ凝集体でトランスフェクトした。緑色スポットは誘導された内因性タウ凝集体（Ａ）を表し、赤色スポットは外因性の事前形成タウ凝集体（Ｂ）である。事前形成タウ凝集体のみに曝露された細胞は誘導されたタウ凝集を示し（パネルＡ）、これらは外因性の事前形成タウ凝集体に対して陽性である（Ｂ）。キャッピングペプチドで前処理した事前形成タウ凝集体に曝露された細胞は、減少したタウ凝集を示したが（パネルＣ）、外因性の事前形成タウ凝集体に対しては依然として陽性である（パネルＤ）。キャッピング－ディグレーダーペプチドで前処理した事前形成タウ凝集体に暴露された細胞は、減少したタウ凝集（パネルＥ）、および外因性の事前形成タウ凝集体の明らかな減少（パネルＦ）を示す。パネルＡ、Ｃ、およびＥは細胞の緑色スポットを表し、同じ細胞の赤色スポットはそれぞれＢ、Ｄ、およびＦに示す。
図４：タウバイオセンサーシーディングアッセイにおける減少したタウ凝集のスクリーニング。細胞は、緩衝液（ＣＴＲＬ）または特定のキャッピング（－ディグレーダー）ペプチドで前処理したatto-633標識事前形成タウ凝集体でトランスフェクトした。２つの独立した反復を、緑色スポット（誘導されたタウ凝集）を示す細胞の割合の±ＳＤで示す。 図５：タウバイオセンサーシーディングアッセイにおけるタウ凝集体分解のスクリーニング。細胞は、緩衝液（ＣＴＲＬ）または特定のキャッピング（－ディグレーダー）ペプチドで前処理したatto-633標識事前形成タウ凝集体でトランスフェクトした。２つの独立した反復を、赤色スポット（外因性タウ凝集体）を示す細胞の割合の±ＳＤで示す。 図６：ペプチドＣＡＰ１＿ＴＲおよび非天然分子（ディグレーダーバリアント）の濃度範囲の、誘導されたタウ凝集およびタウ凝集分解に対する効果。（Ａ）緑色スポット（誘導されたタウ凝集）を示す細胞の割合。少なくとも３回の独立した反復の平均値を±ＳＤで示す。（Ｂ）赤色スポット（外因性タウ凝集体）を示す細胞の割合。少なくとも３回の独立した反復の平均値を±ＳＤで示す。
図７：分解部分（ディグレーダーバリアント）を含むペプチドＨＥＴおよびそれに由来する非天然分子の濃度範囲の、誘導されたタウ凝集およびタウ凝集分解に対する効果。パネルＡは、緑色スポット（誘導されたタウ凝集）を有する細胞の割合を示す。少なくとも３回の独立した反復の平均値を±ＳＤで示す。パネルＢは、赤色スポット（外因性タウ凝集体）を有する細胞の割合を示す。少なくとも３回の独立した反復の平均値を±ＳＤで示す。 図８：異なるキャッピングペプチドおよびそれに由来する非天然分子の、事前形成タウ凝集体をシーディングしたタウバイオセンサー細胞に対する効果。事前形成タウ凝集体を、緩衝液（ＣＴＲＬ）またはキャッピングペプチド（ＣＡＰ１＿ＴＲおよびＨＥＴ）およびキャッピングペプチドを含む非天然分子（ＣＡＰ１＿ＴＲ－ＪＡＶおよびＨＥＴ－ＪＡＶ）と共に、細胞トランスフェクションの前に６時間インキュベートした。キャッピングペプチドおよび非天然分子の細胞上の最終ペプチド濃度は、３１２ｎＭであった。 図９：キャッピングペプチドＣＡＰ１＿ＴＲおよびそれに由来する非天然分子の、in vitroタウ凝集に対する効果。（Ａ）単量体タウ（９μＭ）は、キャッピングペプチドおよびそれに由来する非天然分子の添加なしで（灰色曲線）、または添加して（６μＭ、黒色曲線）凝集させた。Ｔｈ－Ｔは、凝集の監視のために加えた。少なくとも２回の独立した反復を表示する。（Ｂ）単量体タウ（９μＭ）は、事前形成タウ凝集体（灰色曲線）、またはキャッピングペプチドおよびそれに由来する非天然分子で前処理した事前形成タウ凝集体（６μＭ、黒色曲線）で凝集させた。Ｔｈ－Ｔは、凝集の監視のために加えた。少なくとも２回の独立した反復を表示する。
図１０：キャッピングペプチドＨＥＴおよびそれに由来する非天然分子の、in vitroタウ凝集に対する効果。（Ａ）単量体タウ（９μＭ）は、キャッピングペプチドおよびそれに由来する非天然分子の添加なしで（灰色曲線）、または添加して（６μＭ、黒色曲線）凝集させた。Ｔｈ－Ｔは、凝集の監視のために加えた。少なくとも２回の独立した反復を表示する。（Ｂ）単量体タウ（９μＭ）は、事前形成タウ凝集体（灰色曲線）、またはキャッピングペプチドおよびそれに由来する非天然分子で前処理した事前形成タウ凝集体（６μＭ、黒色曲線）で凝集させた。Ｔｈ－Ｔは、凝集の監視のために加えた。少なくとも２回の独立した反復を表示する。 図１１：ＣＡＰ１＿ＴＲ、ＨＥＴ、および特定の分解部分を含む非天然分子の、タウ単量体およびタウ凝集体（のシード）を用いたマイクロスケール熱泳動（ＭＳＴ）実験。キャッピングペプチドおよびそれに由来する非天然分子を、単量体タウ（灰色）または事前形成タウ凝集体（黒色）とインキュベートし、混合の約１５分後にＭＳＴ値を収集した。データは、９回の反復（３回の独立した）の正規化された平均値±ＳＤを表す。 図１２：ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における非天然分子の取り込み効率。細胞を、最終濃度５μＭの各非天然分子または緩衝液対照（ＣＴＲＬ）で処理し、２０時間インキュベートした。（Ａ）非天然分子ＣＡＰ１＿ＴＲ－ポマリドミドおよびＨＥＴ－ポマリドミドの取り込みの図。（Ｂ）ポマリドミド標識ペプチドについて陽性の細胞の割合の定量化。３回の独立した反復を±ＳＤで示す。
図１３：ＨＥＴおよびＣＡＰ１＿ＴＲおよび非天然分子（ディグレーダーバリアント）の、タウバイオセンサー細胞株における単量体タウレベルに対する効果。（Ａ）細胞を、最終濃度２．５μＭの各ペプチドでトランスフェクトし、細胞の固定およびイメージングの前に２０時間インキュベートした。（Ｂ－Ｃ）２．５μＭ（Ｂ）または３１３ｎＭ（Ｃ）のキャッピング（ディグレーダー）ペプチドによるトランスフェクション後、タウ－ＣＦＰ蛍光を測定し、緩衝液処理（ＣＴＲＬ）細胞に対して正規化することにより監視した、総タウレベル。３回の独立した反復の平均値を±ＳＤで示す。 図１４：ＨＥＴ、ＨＥＴ－ＪＡＶ、ＨＥＴ－ＣＭＡ１、およびＨＥＴ－ＣＭＡ２でそれぞれ前処理した事前形成タウ凝集体に暴露された細胞は、タウ凝集の減少（左パネル）および外因性の事前形成タウ凝集体の減少（右パネル）を示す。この実験の概要は例２に記載されている。 図１５：ヘテロ二量体タンデムキャッピングペプチドスクリーン。キャッピングペプチドをＤＭＳＯに溶解し、超音波処理した事前形成タウ凝集体またはＳｕｐ３５－ＮＭ凝集体と混合し、ＣＦＰおよびＹＦＰ標識タウリピートドメインを発現するタウバイオセンサー細胞株および、ＧＦＰ標識Ｓｕｐ３５－ＮＭを発現するＮＭバイオセンサー細胞株にトランスフェクトした。細胞上のキャッピングペプチドの最終濃度は６２５ｎＭ、凝集体（タウまたはＮＭ）の最終濃度は５０ｎＭであった。２４時間のインキュベーション後、誘導された凝集体を有する細胞の割合を決定し、正規化した。細胞をキャッピングペプチドなしで事前形成凝集体で処理した条件を１に設定し、細胞を事前形成凝集体で処理しなかった条件を０に設定した。結果は、３回の独立した反復（それぞれは３つの技術的反復からなる）の平均を示す。
図１６：アミロイドβキャッピングペプチドの設計。FoldXを使用して、対応するアミロイドβ ＡＰＲのすべての単一アミノ酸変異体と成長中の（野生型）アミロイド鎖との相互作用および伸長エネルギーを計算した。2okzおよび2onaは、タンパク質構造データベース（https://www.uniprot.org）に存在するＡＰＲ配列ＭＶＧＧＶＶ（配列番号５８）の識別番号であり、2onvはＡＰＲ配列ＧＧＶＶＩＡ（配列番号５９）の構造のエントリーであり、2y2aはＡＰＲ配列ＫＬＶＦＦＡ（配列番号６０）の構造のエントリーであり、2y29はＡＰＲ配列ＫＬＶＦＦＡ（配列番号６１）の構造のエントリーであり、および3ppzはＡＰＲ配列ＧＡＩＩＧＬ（配列番号６２）の構造のエントリーである。プロットは、負の相互作用エネルギーと正の伸長エネルギーを持つ単一の変異体のみを示し、後者は、アミロイドβ異常凝集体の凝集を阻害するための候補キャッピングペプチドである。 図１７：Ａβバイオセンサースクリーニングアッセイ。Ａβバイオセンサー細胞は可溶性Ａβ－mCherry（Ａβシードなし）を安定して発現し、Ａβ凝集は、事前形成Ａβ凝集体をこれらの細胞（１００ｎＭのＡβシード）にトランスフェクトすることによって誘導可能である。キャッピングペプチドをＡβシードへ加えると、Ａβシードのシーディング能力（seeding capacity）を減少させる（１００ｎＭのＡβシード＋キャッピングペプチド）。 図１８：ヘテロタンデムキャッピングペプチドの第１のバッチのＡβバイオセンサースクリーニングアッセイ。誘導されたＡβ凝集に対して陽性の細胞の相対数の定量化。データは、シードが添加されていない状態（０）および、キャッピングペプチドなしで１００ｎＭのＡβ凝集体が添加されている状態（１）に対して正規化されている。２回の独立した反復の平均を±ＳＤで示す。
図１９：ヘテロタンデムキャッピングペプチドの第２のバッチのＡβバイオセンサースクリーニングアッセイ。誘導されたＡβ凝集に対して陽性の細胞の相対数の定量化。データは、シードが添加されていない状態（０）および、キャッピングペプチドなしで１００ｎＭのＡβ凝集体が添加されている状態（１）に対して正規化されている。３回の独立した反復の平均を±ＳＤで示す。 図２０：ヘテロタンデムキャッピングペプチドの第２のバッチのＡβバイオセンサースクリーニングアッセイ。ＡｂＣａｐ４の、Ａβシードのシーディング能力に対する濃度依存効果の可視化。 図２１：ヘテロタンデムキャッピングペプチドの第２のバッチのＡβバイオセンサースクリーニングアッセイにおける、細胞の生存率。すべての濃度のキャッピングペプチドの相対的細胞生存率（未処理細胞と比較）。 図２２：主要な単一キャッピング配列を同定するためのヘテロキャッピング活性の分析。各グラフは、ヘテロキャッピングペプチドの１つの濃度のデータを表す。データは、誘導されたＡβ凝集に対して陽性の細胞の相対数の定量化を表す。データは、シードが添加されていない状態（０）および、キャッピングペプチドなしで１００ｎＭのＡβ凝集体が添加されている状態（１）に対して正規化されている。各データ点は、１つのペプチドの少なくとも３回の独立した反復の平均を表す。したがって、すべてのドットは１つのヘテロタンデムペプチドを表す。すべてのヘテロタンデムペプチドは２つの単一キャッピング配列から構成されるため、各ヘテロタンデムペプチドは２つのドットで表される。
図２３：Ａβ－６４７シードを用いたヒット検証アッセイの図。画像は、ヘテロキャッピングペプチドで前処理した５００ｎＭのＡβ－６４７シード（最終濃度＝６２５ｎＭ）と共に２０時間インキュベートした後の、細胞の状態を表す。赤色チャネル（各ＡｂＣａｐの例の上部パネル）はＡβ－６４７シードを示し、オレンジ色チャネル（各ＡｂＣａｐの例の中央パネル）は外因性Ａβ－mCherryを示す。各ＡｂＣａｐの例の下部パネルは、赤色チャネルとオレンジ色チャネルをマージした画像である。 図２４：Ａβ－６４７シードを用いたＡβバイオセンサースクリーニングアッセイ。誘導されたＡβ凝集に対して陽性の細胞数（オレンジ色ドット）とＡβ－６４７シードに対して陽性の細胞数（赤色ドット）の定量化。３回の独立した反復の平均を±ＳＤで示す。灰色と黒の点線は、非処理細胞（シードなし）について、それぞれ、誘導されたＡβ凝集およびＡβ－６４７シードに対して陽性の細胞の相対数を表す。 図２５：Ａβ－６４７シードを用いたＡβバイオセンサースクリーニングアッセイ（正規化されたデータ）。誘導されたＡβ凝集に対して陽性の細胞数（オレンジ色ドット）およびＡβ－６４７シードに対して陽性の細胞数（赤色ドット）の定量化。３回の独立した反復の平均を±ＳＤで示す。データは、シードが添加されていない状態（０）および、キャッピングペプチドなしで１００ｎＭのＡβ凝集体が添加されている状態（１）に対して、誘導されたＡβ凝集に対して陽性の細胞の相対数およびＡβ－６４７シードに対して陽性の細胞の相対数の両方について、正規化されている。
図２６：in vitroＡβシーディング凝集アッセイ。事前形成され超音波処理されたＡβ線維を、キャッピングペプチド（灰色ドット）または緩衝液（黒色の点）でプレインキュベートし、Ａβ凝集のシーディングのために使用した。薄い灰色ドットは、事前形成の超音波処理Ａβ線維を添加しない場合のＡβ凝集を表す。 図２７：単一濃度のキャッピングペプチドを使用した、標識されたＡβ線維およびタウ線維の最初のＭＳＴ実験。値は、各条件の生のFnormデータ点を示す。 図２８：濃度範囲のキャッピングペプチドを使用した、標識されたＡβ線維およびタウ線維のＭＳＴ実験。値はΔFnormデータ点を表す。Ｋｄ値はグラフに示す（該当する場合）。 図２９：ＴＴＲに存在する標的ＡＰＲ配列ＹＴＩＡＡＬＬＳＰＹＳ（配列番号９２）のアミロイドコア構造は、タンパク質構造データベース（www.rcsb.org）で2m5nとして入手可能である。例１で概説したように実施された、このアミロイドコア構造に基づく特定のキャッピングペプチドを生成する方法が、図に示されている。 図３０：キャッピングペプチドは、例１に記載のようにインスリンの異常凝集体を標的として設計した。インスリンに存在する標的ＡＰＲ配列ＬＹＱＬＥＮ（配列番号９６）のアミロイドコア構造は、タンパク質構造データベース（www.rcsb.org）に2ompとして見出される。
図３１：キャッピングペプチドは、例１に記載のようにインスリンの異常凝集体を標的として設計した。インスリンに存在する標的ＡＰＲ配列ＬＶＥＡＬＹＬ（配列番号９７）のアミロイドコア構造は、タンパク質構造データベース（www.rcsb.org）に3hydとして見出される。 図３２：キャッピングペプチドは、例１に記載のようにＩＡＰＰの異常凝集体を標的として設計した。ＩＡＰＰに存在するＡＰＲ配列ＡＩＬＳＳＴ（配列番号１０４）のアミロイドコア構造は、タンパク質構造データベース（www.rcsb.org）で3fodとして入手可能である。 図３３：キャッピングペプチドは、例１に記載のようにＩＡＰＰの異常凝集体を標的として設計した。ＩＡＰＰに存在するＡＰＲ配列ＮＶＧＳＮＴＹ（配列番号１０５）のアミロイドコア構造は、タンパク質構造データベース（www.rcsb.org）で3ftlとして入手可能である。 図３４：キャッピングペプチドは、例１に記載のようにＩＡＰＰの異常凝集体を標的として設計した。ＡＰＲ配列ＳＳＴＮＶＧ（配列番号１０６）のアミロイドコア構造は、タンパク質構造データベース（www.rcsb.org）で3ftrとして入手可能である。 図３５：キャッピングペプチドは、例１に記載のようにＩＡＰＰの異常凝集体を標的として設計した。ＡＰＲ配列ＮＦＧＡＩＬＳ（配列番号１０７）のアミロイドコア構造は、タンパク質構造データベース（www.rcsb.org）で5e5vとして入手可能である。
図３６：キャッピングペプチドは、例１に記載のようにＩＡＰＰの異常凝集体を標的として設計した。ＡＰＲ配列ＡＮＦＬＶＨ（配列番号１０８）のアミロイドコア構造は、タンパク質構造データベース（www.rcsb.org）で5e5xとして入手可能である。 図３７：キャッピングペプチドは、例１に記載のようにＩＡＰＰの異常凝集体を標的として設計した。ＡＰＲ配列ＬＶＨＳＳＮ（配列番号１０９）のアミロイドコア構造は、タンパク質構造データベース（www.rcsb.org）で5e5zとして入手可能である。 図３８：キャッピングペプチドは、例１に記載のようにβ２－ミクログロブリンの異常凝集体を標的として設計した。β２－ミクログロブリンに存在する標的ＡＰＲ配列ＬＳＦＳＫＤ（配列番号１２８）のアミロイドコア構造は、タンパク質構造データベース（www.rcsb.org）で3lozとして入手可能である。 図３９：キャッピングペプチドは、例１に記載のように前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）の異常凝集体を標的として設計した。ＰＡＰに存在する標的ＡＰＲ配列ＧＧＶＬＶＮ（配列番号１３２）のアミロイドコア構造は、タンパク質構造データベース（www.rcsb.org）で3ppdとして入手可能である。 図４０：キャッピングペプチドは、例１に記載のようにＳＯＤ１の異常凝集体を標的として設計した。ＳＯＤ１に存在する標的ＡＰＲ配列ＤＳＶＩＳＬＳ（配列番号１３６）のアミロイドコア構造は、タンパク質構造データベース（www.rcsb.org）で4ninとして入手可能である。
図４１：キャッピングペプチドは、例１に記載のようにＳＯＤ１の異常凝集体を標的として設計した。ＳＯＤ１に存在する標的ＡＰＲ配列ＧＶＩＧＩＡＱ（配列番号１３７）のアミロイドコア構造は、タンパク質構造データベース（www.rcsb.org）で4nipとして入手可能である。 図４２：キャッピングペプチドは、例１に記載のようにリゾチームの異常凝集体を標的として設計した。リゾチームに存在する標的ＡＰＲ配列ＩＦＱＩＮＳ（配列番号１４４）のアミロイドコア構造は、タンパク質構造データベース（www.rcsb.org）で4r0pとして入手可能である。 図４３：キャッピングペプチドは、例１に記載のようにα－シヌクレインの異常凝集体を標的として設計した。α－シヌクレインに存在する標的ＡＰＲ配列ＧＡＶＶＴＧＶＴＡＶＡ（配列番号１４８）のアミロイドコア構造は、タンパク質構造データベース（www.rcsb.org）で4rilとして入手可能である。 図４４：キャッピングペプチドは、例１に記載のようにｐ５３の異常凝集体を標的として設計した。ｐ５３に存在する標的ＡＰＲ配列ＬＴＩＩＴＬＥ（配列番号１５２）のアミロイドコア構造は、タンパク質構造データベース（www.rcsb.org）で4rp6として入手可能である。
図４５：キャッピングペプチドは、例１に記載のようにＰｒＰの異常凝集体を標的として設計した。ＰｒＰに存在する標的ＡＰＲ配列ＧＧＹＭＬＧＳ（配列番号１５６）のアミロイドコア構造は、タンパク質構造データベース（www.rcsb.org）で4w5mとして入手可能である。 図４６：キャッピングペプチドは、例１に記載のようにＰｒＰの異常凝集体を標的として設計した。ＰｒＰに存在する標的ＡＰＲ配列ＧＧＹＶＬＧＳ（配列番号１５７）のアミロイドコア構造は、タンパク質構造データベース（www.rcsb.org）で4w5pとして入手可能である。 図４７：キャッピングペプチドは、例１に記載のようにＰｒＰの異常凝集体を標的として設計した。ＰｒＰに存在する標的ＡＰＲ配列ＧＹＬＬＧＳＡ（配列番号１５８）のアミロイドコア構造は、タンパク質構造データベース（www.rcsb.org）で4w71として入手可能である。 図４８：キャッピングペプチドは、例１に記載のようにα－シヌクレイン（Ａ５３Ｔ変異型）の異常凝集体を標的として設計した。変異型α－シヌクレインに存在する標的ＡＰＲ配列ＧＶＶＨＧＶＴＴＶＡ（配列番号１６８）のアミロイドコア構造は、タンパク質構造データベース（www.rcsb.org）で4znnとして入手可能である。
図４９：キャッピングペプチドは、例１に記載のようにＩｇ軽鎖可変ドメインの異常凝集体を標的として設計した。軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列に存在する保存された標的ＡＰＲ配列ＹＴＦＧＱ（配列番号１７２)（Brumshtein B et al (2018) J. Biol. Chem. 293(51) 19659を参照）のアミロイドコア構造は、タンパク質構造データベース（www.rcsb.org）で6diyとして入手可能である。 図５０：キャッピングペプチドは、例１に記載のようにＴＤＰ－４３の異常凝集体を標的として設計した。ＴＤＰ－４３に存在する標的ＴＤＰ－４３配列ＧＮＮＳＹＳ（配列番号１７６）のアミロイドコア構造は、タンパク質構造データベース（www.rcsb.org）で5wiaとして入手可能である。 図５１：キャッピングペプチドは、例１に記載のようにＦＵＳの異常凝集体を標的として設計した。ＦＵＳに存在する標的ＡＰＲ配列ＳＹＳＳＹＧＱＳ（配列番号１８０）のアミロイドコア構造は、タンパク質構造データベース（www.rcsb.org）で6bxvとして入手可能である。
発明の詳細な説明
本発明は、特定の態様に関して、および特定の図面を参照して記載されるが、本発明は、それらに限定されるものではなく、請求の範囲によってのみ限定される。請求の範囲における任意の引用記号は、範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。無論、必ずしもすべての側面または利点が、本発明の任意の特定の態様のとおりに達成され得るものではないことが理解されるべきである。したがって、例えば、当業者は、本発明は、必ずしも本明細書において教示または示唆され得るような他の側面または利点を達成することなく、本明細書において教示されるような１つの利点または利点の群を達成または最適化する様式において具現または実行し得ることを理解するであろう。
本発明は、組織および操作の方法の両方について、それらの特色および利点と一緒に、以下の詳細な説明を、添付の図面と組み合わせて読み参照することにより最良に理解され得る。本発明の側面および利点は、本明細書において後に記載される態様（単数または複数）から明らかであるか、またはこれらを参照することにより解明されるであろう。本明細書全体にわたる「一態様（one embodiment）」または「一態様（an embodiment）」への言及は、当該態様に関連して記載された特定の特色、構造または特徴が、本発明の少なくとも１つの態様に含まれることを意味する。したがって、句「一態様において（in one embodiment）」または「一態様において（in an embodiment）」の出現は、本明細書全体にわたる多様な場所において、必ずしも全て同じ態様を指すものではないが、同じ態様を指す場合もある。同様に、本発明の例示的な態様の記載において、本発明の多様な特色は、ときに、多様な発明の側面のうちの１つ以上の開示の合理化および理解の補助を目的として、単一の態様、図面、またはその説明において、一緒にグループ化されることが、理解されるべきである。この開示の方法は、しかし、請求された発明が、各請求項において明示的に列記されるものより多くの特色を必要とするという意図を反映するものとして解釈されるべきではない。むしろ、以下の請求の範囲が反映するとおり、本発明の側面は、単一の前述の開示された態様の全ての特色よりも少ないものにおいて存在する。
エンドポイントによる数値範囲の列挙には、列挙されたエンドポイントだけでなく、それぞれの範囲内に含まれるすべての数値および分数が含まれる。これは数値範囲に適用され、それが「～から～まで」という表現で導入されるか、「～と～との間」という表現で導入されるか、または別の表現で導入されるかには関係しない。
本明細書で使用される「約」または「およそ」という用語は、パラメーター、量、持続時間などの測定可能な値に言及する場合、特定の値の変動および特定の値からの変動を包含することを意味し、これは、かかる変動が開示された発明において実行するのに適切である限り、例えば、指定された値の±１０％以下、好ましくは±５％以下、より好ましくは±１％以下、さらにより好ましくは±０．１％以下の変動である。修飾子「約」または「およそ」が指す値自体もまた、具体的に、および好ましくは、開示されていることを理解されたい。
「１つ以上の」または「少なくとも１つの」という用語、例えば、メンバーの群の１つ以上のメンバーまたは少なくとも１つのメンバー等は、さらなる例示によってそれ自体明らかであるが、この用語は、とりわけ、前記メンバーの任意の１つ、または前記メンバーの任意の２つ以上、例えば前記メンバーの任意の≧３、≧４、≧５、≧６または≧７など、および最大で前記メンバーのすべての参照を包含する。別の例では、「１つ以上」または「少なくとも１つ」は、１、２、３、４、５、６、７またはそれ以上を指し得る。
本明細書における本発明の背景の議論は、本発明の文脈を説明するために含まれている。これは、参照された資料のいずれかが、請求項のいずれかの優先日の時点で、いずれかの国で公開されていたか、知られていたか、または共通の一般知識の一部であったことを認めるものと見なされるべきではない。
この開示を通して、さまざまな刊行物、特許、および公開された特許明細書が特定の引用により参照されている。本明細書で引用されるすべての文書は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。特に、本明細書で具体的に言及されたかかる文書の教示またはセクションは、参照により組み込まれる。
別段の定義がない限り、技術用語および科学用語を含む、本発明の開示に使用されるすべての用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。さらなる手引きとして、用語の定義が、本発明の教示をよりよく理解するために含まれる。本発明の特定の側面または本発明の特定の態様に関連して特定の用語が定義される場合、かかる含意または意味は、本明細書全体にわたって、すなわち本発明の別の側面または態様の文脈においても、別の方法で定義されない限り適用されることを意味する。
以下の節では、本発明の異なる側面または態様がより詳細に定義される。そのように定義された各側面または態様は、逆が明確に示されない限り、任意の他の側面または態様と組み合わせることができる。特に、好ましいかまたは有利であると示された任意の特色は、好ましいかまたは有利であると示された任意の他の特色または複数の特色と組み合わせることができる。
本明細書全体にわたる「一態様（one embodiment）」または「一態様（an embodiment）」への言及は、当該態様に関連して記載された特定の特色、構造または特徴が、本発明の少なくとも１つの態様に含まれることを意味する。したがって、句「一態様において（in one embodiment）」または「一態様において（in an embodiment）」の出現は、本明細書全体にわたる多様な場所において、必ずしも全て同じ態様を指すものではないが、同じ態様を指す場合もある。さらに、本開示から当業者には明らかなように、１つ以上の態様において、特定の特色、構造、または特徴を任意の適切な様式で組み合わせることができる。さらに、本明細書に記載されるいくつかの態様は、他の態様に含まれるいくつかの特色は含むが他の特色を含まず、当業者によって理解されるように、異なる態様の特色の組み合わせは本発明の範囲内にあり、異なる態様を形成することが意図される。例えば、添付の特許請求の範囲において、請求された態様のいずれも、任意の組み合わせで使用することができる。
単数形の名詞を参照する際に、不定冠詞または定冠詞、例えば「a」または「an」、「the」が用いられる場合、これは、何か別段に特に記述されない限り、その名詞の複数形を含む。用語「含むこと（comprising）」が、本説明および請求の範囲において用いられる場合、それは、他の要素またはステップを除外しない。さらに、第１、第２、第３などの用語は、本説明および請求の範囲において、類似の要素の間を区別するために用いられ、必ずしも、連続的または経時的な順序を記載するためのものではない。そのように用いられる用語は、適切な状況下においては交換可能であり、本明細書において記載される本発明の態様は、本明細書において記載または説明されているもの以外の順序における操作が可能であることが、理解されるべきである。以下の用語または定義は、本発明の理解において補助するためにのみ提供される。本明細書において特に定義されない限り、本明細書において用いられる全ての用語は、本発明の分野における当業者にとって有するであろう意味と同じ意味を有する。実施者は、当該分野の定義および用語について、特にSambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第４版、Cold Spring Harbor Press, Plainsview, New York（2012）；およびAusubelら、Current Protocols in Molecular Biology（補遺114）、John Wiley & Sons, New York（2016）を教示される。本明細書において提供される定義は、当業者により理解されるものよりも狭い範囲を有するものと解釈されるべきではない。
用語「ポリペプチド」および「ペプチド」は、さらに本明細書において交換可能に用いられ、アミノ酸残基のポリマーおよびその合成アナログおよびバリアントを指す。したがって、これらの用語は、１つ以上のアミノ酸残基が合成の天然に存在しないアミノ酸、例えば対応する天然に存在するアミノ酸の化学的アナログであるアミノ酸ポリマーに当てはまるのみならず、天然に存在するアミノ酸ポリマーにも当てはまる。この用語はまた、グリコシル化、リン酸化、アミド化、酸化およびアセチル化などの、ポリペプチドの翻訳後修飾を含む。「組み換えポリペプチド」によってとは、組み換え技術を用いて、すなわち、組み換えまたは合成ポリヌクレオチドの発現を通して作成されたポリペプチドが意味される。用語「発現」または「遺伝子発現」とは、１つの特定の遺伝子または複数の特定の遺伝子または特定の遺伝子コンストラクトの転写を意味する。用語「発現」または「遺伝子発現」は、特定の意味において、１つの遺伝子または複数の遺伝子または遺伝子コンストラクトの、構造的ＲＮＡ（ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ）またはｍＲＮＡへの、その後の後者のタンパク質への翻訳を伴うかまたは伴わない、転写を意味する。プロセスは、ＤＮＡの転写および生じたｍＲＮＡ生成物のプロセッシングを含む。用語「組み換え宿主細胞」、「操作された細胞」、「発現宿主細胞」、「発現宿主系」、「発現系」または単に「宿主細胞」とは、本明細書において用いられる場合、組み換えベクターおよび／またはキメラ遺伝子コンストラクトが導入された細胞を指すことを意図される。かかる用語は、特定の対象細胞のみならず、かかる細胞の子孫をも指すことが意図されることが、理解されるべきである。特定の修飾は、変異または環境の影響に起因して、後に続く世代において起こり得るので、かかる子孫は、実際に、親細胞とは同一でない場合があるが、本明細書において用いられる場合は、用語「宿主細胞」の範囲内になお含まれる。用語「調節する（modulate）」、「調節する（modulates）」、または「調節（modulation）」とは、特定のレベルまたは活性の増強（例えば増加）または阻害（例えば減少）を指す。用語「増強する（enhance）」または「増加させる（increase）」とは、特定のパラメーターの、少なくとも約１．２５倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、８倍、１０倍、１２倍、または１５倍もの増加を指す。
用語「阻害する（inhibit）」または「低下させる（reduce）」またはこれらの文法的バリエーションは、本明細書において用いられる場合、特定のレベルまたは活性の少なくとも約１５％、２５％、３５％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、９０％、９５％またはそれより多くの減少または減弱を指す。特定の態様において、阻害または減少は、検出可能な活性を、ほとんどもたらさないか、または本質的にもたらさない（最大でも、顕著でない量、例えば、約１０％未満またはわずか５％）。
用語「天然に存在しない」とは、一般に、自然に形成されないか、または自然界に存在しない材料または実体を指す。かかる天然に存在しない材料または実体は、本明細書に記載の方法または当技術分野で知られている方法を使用して、人によって作られ、合成され、半合成され、修飾され、介入され、または操作され得る。一例として、ペプチドに関して使用される用語は、特に、同一アミノ酸配列のペプチドが自然界に見出されないこと、または同一アミノ酸配列のペプチドが自然界に存在する場合、天然に存在しないペプチドは、（天然に存在するペプチドに）含まれていない化学結合、修飾または部分などの１つ以上の追加の構造要素を含み、したがって天然に存在しないペプチドは、天然に存在する対応物から区別される。ある態様において、用語がペプチドに関して使用される場合、これは、天然に存在しないペプチドのアミノ酸配列が、天然に存在するペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質によって包含される連続アミノ酸のストレッチと同一ではないことを示し得る。誤解を避けるために、天然に存在しないペプチドは、ペプチド全体よりも短いアミノ酸ストレッチを完全に含有する場合があり、ここで特にその配列を含むアミノ酸ストレッチの構造は、天然に存在するペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質に見られる連続アミノ酸のストレッチと同一である。
用語「接触させる（contact）」またはその文法的バリエーションは、本発明の非天然分子および異常凝集体に関して用いられる場合、非天然分子と異常凝集体とを、一方が他方に対して生物学的効果を発揮するために十分近傍に互いを置くことを指す。「治療有効」量とは、本明細書において用いられる場合、対象に何らかの改善または利益を提供する量である。言い換えると、「治療有効」量とは、対象における少なくとも１つの臨床的症状の何らかの軽減、緩和または減少を提供するであろう量である。当業者は、対象に何らかの利益が提供される以上は、治療効果が完全または治癒的である必要はないことを理解するであろう。用語「処置する（treat）」、「処置すること（treating）」、または「～の処置（treatment of）」により、対象の状態の重篤度が、低下するか、または少なくとも部分的に改善または改変されること、および、少なくとも１つの臨床的症状の何らかの軽減、緩和または減少が達成されることが意図される。本明細書において用いられる場合、「機能的」ペプチドとは、そのペプチドに通常関連している少なくとも１つの生物学的活性（例えば、アミロイド線維またはアミロイドオリゴマーに結合してその形成を阻害すること）を実質的に保持するものである。特定の態様において、「機能的」ペプチドとは、未修飾のペプチドが有する活性の全てを実質的に保持する。生物学的活性を「実質的に保持する」により、ペプチドが、天然のポリペプチドの生物学的活性のうちの少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、またはそれより多くを保持すること（およびさらに天然のペプチドより高いレベルの活性を有し得ること）が意味される。オリゴマーまたは線維または非アミロイドの分解活性などの生物学的活性は、本明細書において記載されるアッセイおよび当該分野において周知の他のアッセイを用いて測定することができる。
本明細書において用いられる場合、用語「保存的アミノ酸置換」とは、ペプチド配列において通常存在するアミノ酸を、類似のサイズ、電荷または極性を有する異なるアミノ酸で置換することを意味する。保存的置換の例として、イソロイシン、バリンおよびロイシンなどの非極性（疎水性）残基の、別の非極性残基に対する置換が挙げられる。同様に、保存的置換の例として、１つの極性（親水性）残基の、別のものに対する、例えばアルギニンとリジンの間、グルタミンとアスパラギンの間、およびグリシンとセリンの間の置換が挙げられる。加えて、リジン、アルギニンもしくはヒスチジンなどの塩基性残基の、別のものに対する置換、または、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸などの１つの酸性残基の別の酸性残基に対する置換は、保存的置換のさらなる例である。非保存的置換の例として、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、メチオニンなどの非極性（疎水性）アミノ酸残基の、システイン、グルタミン、グルタミン酸またはリジンなどの極性（親水性）残基に対する、および／または極性残基の、非極性残基に対する置換が挙げられる。
用語「アミノ酸」は、天然に存在するアミノ酸、天然にコードされるアミノ酸、非天然にコードされるアミノ酸、非天然に存在するアミノ酸、アミノ酸類似体、および、天然に存在するアミノ酸と同様の様式で機能するアミノ酸模倣体であって、すべてのそれらのＤ－およびＬ－立体異性体を、それらの構造がかかる立体異性体形態を可能にする限りにおいて、包含する。アミノ酸は、本明細書では、それらの名称、一般に知られている三文字記号、またはIUPAC-IUB生化学命名委員会が推奨する一文字記号のいずれかによって言及される。「天然にコードされたアミノ酸」とは、２０の一般的なアミノ酸の１つであるアミノ酸、またはピロリジン、ピロリン－カルボキシ－リジンまたはセレノシステインを指す。２０の一般的なアミノ酸は以下である：アラニン（ＡまたはＡｌａ）、システイン（ＣまたはＣｙｓ）、アスパラギン酸（ＤまたはＡｓｐ）、グルタミン酸（ＥまたはＧｌｕ）、フェニルアラニン（ＦまたはＰｈｅ）、グリシン（ＧまたはＧｌｙ）、ヒスチジン（ＨまたはＨｉｓ）、イソロイシン（ＩまたはＩｌｅ）、リジン（ＫまたはＬｙｓ）、ロイシン（ＬまたはＬｅｕ）、メチオニン（ＭまたはＭｅｔ）、アスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）、プロリン（ＰまたはＰｒｏ）、グルタミン（ＱまたはＧｌｎ）、アルギニン（ＲまたはＡｒｇ）、セリン（ＳまたはＳｅｒ）、スレオニン（ＴまたはＴｈｒ）、バリン（ＶまたはＶａｌ）、トリプトファン（ＷまたはＴｒｐ）、およびチロシン（ＹまたはＴｙｒ）。
「人工アミノ酸」（または同等の用語である「非天然アミノ酸」）とは、２０の一般的なアミノ酸またはピロリジン、ピロリン－カルボキシ－リジンまたはセレノシステインのいずれでもないアミノ酸を指す。この用語は、限定はされないが、天然にコードされたアミノ酸の修飾（翻訳後修飾など）によって生じるが、それ自体は翻訳複合体によって成長中のポリペプチド鎖に自然に組み込まれないアミノ酸を含み、その例としては、限定はされないが以下である：Ｎ－アセチルグルコサミニル－Ｌ－セリン、Ｎ－アセチルグルコサミニル－Ｌ－スレオニン、およびＯ－ホスホチロシン。天然にコードされない、人工の、非天然の、または修飾されたアミノ酸のさらなる例としては、２－アミノアジピン酸、３－アミノアジピン酸、β－アラニン、β－アミノプロピオン酸、２－アミノ酪酸、４－アミノ酪酸、ピペリジン酸、６－アミノカプロン酸、２－アミノヘプタン酸、２－アミノイソ酪酸、３－アミノイソ酪酸、２－アミノピメリン酸、２，４－ジアミノ酪酸、デスモシン、２，２’－ジアミノピメリン酸、２，３－ジアミノプロピオン酸、Ｎ－エチルグリシン、Ｎ－エチルアスパラギン、ホモセリン、ホモシステイン、ヒドロキシリジン、アロ－ヒドロキシリジン、３－ヒドロキシプロリン、４－ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、アロ－イソロイシン、Ｎ－メチルグリシン、Ｎ－メチルイソロイシン、６－Ｎ－メチルリジン、Ｎ－メチルバリン、ノルバリン、ノルロイシン、またはオルニチンが挙げられる。さらに含まれるのは、１つ以上の個々の原子が、異なる原子、同じ原子の同位体、または異なる官能基で置換されているアミノ酸類似体である。さらに含まれるのは、Ellman et al. Methods Enzymol. 1991, vol. 202, 301-36に記載されている非天然アミノ酸およびアミノ酸類似体である。非天然アミノ酸の、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドへの組み込みは、多くの異なる方法で有利であり得る。例えば、Ｄ－アミノ酸含有タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドは、Ｌ－アミノ酸含有対応物と比較して、in vitroまたはin vivoでの安定性の増加を示す。より具体的には、Ｄ－アミノ酸含有タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドは、内因性ペプチダーゼおよびプロテアーゼに対してより耐性があり得て、それによって改善された分子の生物学的利用能および、延長されたin vivoの寿命が提供される。
タンパク質が、そのリボソームでの合成とタンパク質分解による最終的な分解までの間に、生体系内で多数の異なるコンフォメーション状態をとり得ることは、当技術分野でよく知られている。α－シヌクレイン、タウ、アミロイドβ、膵島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰ）を含む一連のタンパク質は、タンパク質沈着障害（または異常凝集体）の文脈で特に興味深いものであり、溶液中で大部分は構造化されておらず、しばしば自然に展開されているか、本質的に無秩序であると説明されている。興味深いことに、後者の異常凝集体は後者の本質的に無秩序な系であり、そうでなければ折り畳まれているより大きなタンパク質からのタンパク質分解後にも生成され得て、例えば、アミロイドβペプチド（Ａβ）およびゲルゾリンのアミロイド形成フラグメントなどである。タンパク質が採用するさまざまなコンフォメーション状態には、非常に複雑な一連の平衡が関与しており、正常に機能している生体系におけるその熱力学と動力学は、固有のアミノ酸配列によって決定されるだけでなく、分子シャペロンとの相互作用、分解プロセス、およびその他の高度な品質管理メカニズムによっても決定される。それらのアミノ酸配列とそれらが機能する生物学的環境は共進化し、ペプチドとタンパク質を可溶性状態に維持してきたが、状況によっては、非機能的かつ潜在的に損傷を与える異常タンパク質凝集体への変換も可能である。凝集中に最初に形成される異常種は、比較的少数の分子のクラスターであり、一般にそれらを生成した単量体状態の構造記憶を保持しているため、折り畳まれていない状態、部分的に折り畳まれた状態、または折り畳まれた単量体状態から発生した場合にそれぞれは、高度に無秩序な、部分的に構造化された、または天然様のオリゴマーを生じさせる。これらの初期の凝集体は、比較的弱い分子間相互作用のみが関与するため、一般的にかなり不安定であり、単に解離して可溶性種を再生し得る。しかし凝集が進むと、かかる凝集体は内部再編成を受けて、βシート構造を有するより安定した種を形成し得、これは多くの場合、コンパクト性およびサイズの増加を伴うプロセスである。これらのβ構造オリゴマーは、自己会合または単量体の付加によってさらに成長することができ、多くの場合、さらに時には劇的な構造再編成を伴って、クロスβ構造と高レベルの構造秩序を備えた明確な線維を形成する。アミロイド、無定形（amorphous）、または天然様のアセンブリを含むかかる大きな異常凝集体は、明確に定義された異常状態で蓄積するため、ヒトの疾患と関連付けられる。
本発明は、細胞内の異常凝集を防止するだけでなく、細胞内の異常凝集体を分解することもできる、非天然分子を提供する。
したがって本発明は、第１の態様において、以下の式（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）の構造を含む、非天然分子を提供する：
（Ａ）Ｚ０－Ｘ１－ＣＰ１－Ｘ２－Ｚ１－Ｍ１－Ｚ２
（Ｂ）Ｚ０－Ｘ１－ＣＰ１－Ｘ２－Ｚ１－Ｘ３－ＣＰ２－Ｘ４－Ｚ２－Ｍ１－Ｚ３
（Ｃ）Ｚ０－Ｘ１－ＣＰ１－Ｘ２－Ｚ１－Ｘ３－ＣＰ２－Ｘ４－Ｚ２－Ｘ５－ＣＰ３－Ｘ６－Ｚ３－Ｍ１－Ｚ４
ここで：
－Ｚ０はリンカーであるか、または不在であり
－ＣＰ１、ＣＰ２、およびＣＰ３は、同一または異なるキャッピングペプチドであり、
－Ｍ１は、細胞内タンパク質分解系を標的とする部分であり、
－Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５およびＸ６は、Ｒ、Ｋ、Ｅ、ＤまたはＰから選択される０、１または２個のアミノ酸から独立して選択されるゲートキーパーアミノ酸であり、
－分子（Ａ）において、Ｚ１はリンカーであり、およびＺ２はリンカーまたは不在から選択され、分子（Ｂ）において、Ｚ１およびＺ２は各々独立してリンカーであり、およびＺ３はリンカーまたは不在から選択され、分子（Ｃ）において、Ｚ１、Ｚ２およびＺ３は各々独立してリンカーであり、およびＺ４はリンカーまたは不在から選択される。
さらに別の態様において、本発明は、第１の態様において、以下の式（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）の構造からなる、非天然分子を提供する：
（Ａ）Ｚ０－Ｘ１－ＣＰ１－Ｘ２－Ｚ１－Ｍ１－Ｚ２
（Ｂ）Ｚ０－Ｘ１－ＣＰ１－Ｘ２－Ｚ１－Ｘ３－ＣＰ２－Ｘ４－Ｚ２－Ｍ１－Ｚ３
（Ｃ）Ｚ０－Ｘ１－ＣＰ１－Ｘ２－Ｚ１－Ｘ３－ＣＰ２－Ｘ４－Ｚ２－Ｘ５－ＣＰ３－Ｘ６－Ｚ３－Ｍ１－Ｚ４
ここで：
－Ｚ０はリンカーであるか、または不在であり
－ＣＰ１、ＣＰ２、およびＣＰ３は、同一または異なるキャッピングペプチドであり、
－Ｍ１は、細胞内タンパク質分解系を標的とする部分であり、
－Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５およびＸ６は、Ｒ、Ｋ、Ｅ、ＤまたはＰから選択される０、１または２個のアミノ酸から独立して選択されるゲートキーパーアミノ酸であり、
－分子（Ａ）において、Ｚ１はリンカーであり、およびＺ２はリンカーまたは不在から選択され、分子（Ｂ）において、Ｚ１およびＺ２は各々独立してリンカーであり、およびＺ３はリンカーまたは不在から選択され、分子（Ｃ）において、Ｚ１、Ｚ２およびＺ３は各々独立してリンカーであり、およびＺ４はリンカーまたは不在から選択される。
好ましい態様において、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５およびＸ６は、Ｒ、Ｋ、Ｅ、またはＰから選択される１または２個のアミノ酸から独立して選択されるゲートキーパーアミノ酸である。
別の好ましい態様において、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５およびＸ６は、ＲまたはＥから選択される１または２個のアミノ酸から独立して選択されるゲートキーパーアミノ酸である。
別の好ましい態様において、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５およびＸ６は、Ｒから選択される１または２個のアミノ酸からのゲートキーパーアミノ酸である。
さらなる態様において、本発明は、以下の式（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）の構造を含む、非天然分子を提供する：
（Ａ）Ｚ０－Ｘ１－ＣＰ１－Ｘ２－Ｚ１－Ｍ１－Ｚ２
（Ｂ）Ｚ０－Ｘ１－ＣＰ１－Ｘ２－Ｚ１－Ｘ３－ＣＰ２－Ｘ４－Ｚ２－Ｍ１－Ｚ３
（Ｃ）Ｚ０－Ｘ１－ＣＰ１－Ｘ２－Ｚ１－Ｘ３－ＣＰ２－Ｘ４－Ｚ２－Ｘ５－ＣＰ３－Ｘ６－Ｚ３－Ｍ１－Ｚ４
ここで：
－Ｚ０はリンカーであるか、または不在であり
－ＣＰ１、ＣＰ２およびＣＰ３は、同一または異なるキャッピングペプチドであり、ここでキャッピングペプチドは、以下のステップを含む方法に従って生成される：
ｏ異常凝集体を形成可能な標的タンパク質から、異常タンパク質凝集体の３次元構造またはアミロイドコアアミノ酸配列の３次元構造（このアミロイドコアアミノ酸配列は、標的タンパク質に存在する易凝集性領域（ＡＰＲ）に対応する）を取得すること、
ｏ前記アミロイドコアアミノ酸配列（またはＡＰＲ配列）のバリアントのin silicoリストを生成すること、ここで各バリアントは、アミロイドコアアミノ酸配列（またはＡＰＲ配列）と比較して、１または２または３個のアミノ酸の相違を有する、
ｏForcefieldアルゴリズムを使用して、ｉ）バリアント配列と３Ｄアミロイドコア構造、またはバリアント配列と異常タンパク質凝集体の３Ｄ構造との間の相互作用について、すべてのバリアント配列の熱力学的安定性を計算すること、この値は、相互作用のデルタギブスエネルギーとして指定しされ、およびｉｉ）バリアント配列とＡＰＲアミロイドコアの軸端にシーディングされたバリアント配列との間の相互作用について、すべてのバリアント配列の熱力学的安定性を計算すること、この値は、伸長のデルタギブスエネルギーとして指定される、
ｏ候補キャッピングペプチドのセットを生成すること、ここで候補は、相互作用について負のデルタＧ自由エネルギーおよび伸長について正のデルタＧ自由エネルギーを有する、
ｏ候補キャッピングペプチドのセットを実験的に試験し、１つ以上のキャッピングペプチドを生成すること。
－Ｍ１は、細胞内タンパク質分解系を標的とする部分であり、
－Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５およびＸ６は、Ｒ、Ｋ、Ｅ、ＤまたはＰから選択される０、１または２個のアミノ酸から独立して選択されるゲートキーパーアミノ酸であり、
－分子（Ａ）において、Ｚ１はリンカーであり、およびＺ２はリンカーまたは不在から選択され、分子（Ｂ）において、Ｚ１およびＺ２は各々独立してリンカーであり、およびＺ３はリンカーまたは不在から選択され、分子（Ｃ）において、Ｚ１、Ｚ２およびＺ３は各々独立してリンカーであり、およびＺ４はリンカーまたは不在から選択される。
特定の態様において、本発明は、以下の式（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）の構造を含む非天然分子を提供する：
（Ａ）Ｚ０－ＣＰ１－Ｚ１－Ｍ１－Ｚ２
（Ｂ）Ｚ０－ＣＰ１－Ｚ１－ＣＰ２－Ｚ２－Ｍ１－Ｚ３
（Ｃ）Ｚ０－ＣＰ１－Ｚ１－ＣＰ２－Ｚ２－ＣＰ３－Ｚ３－Ｍ１－Ｚ４
ここで：
－Ｚ０はリンカーであるか、または不在であり
－ＣＰ１、ＣＰ２、およびＣＰ３は、同一または異なるキャッピングペプチドであり、ここでキャッピングペプチドは、以下のステップを含む次の方法に従って生成される：
ｏ異常凝集体を形成可能な標的タンパク質から、異常タンパク質凝集体の３次元構造またはアミロイドコアアミノ酸配列の３次元構造（このアミロイドコアアミノ酸配列は、標的タンパク質に存在する易凝集性領域（ＡＰＲ）に対応する）を取得すること、
ｏ前記アミロイドコアアミノ酸配列（またはＡＰＲ配列）のバリアントのin silicoリストを生成すること、ここで各バリアントは、アミロイドコアアミノ酸配列（またはＡＰＲ配列）と比較して、１または２または３個のアミノ酸の相違を有する、
ｏForcefieldアルゴリズムを使用して、ｉ）バリアント配列と３次元（３Ｄ）アミロイドコア構造、またはバリアント配列と異常タンパク質凝集体の３Ｄ構造の間の相互作用について、すべてのバリアント配列の熱力学的安定性を計算すること、この値は、相互作用のデルタギブスエネルギーとして指定され、およびｉｉ）バリアント配列とその軸端で相互作用するバリアント配列を有する３次元アミロイドコア構造、またはバリアント配列とその軸端で相互作用するバリアント配列を有する異常凝集体の３次元構造の間の相互作用について、すべてのバリアント配列の熱力学的安定性を計算すること、この値は、伸長のデルタギブスエネルギーとして指定される、
ｏ候補キャッピングペプチドのセットを生成すること、ここで候補は、相互作用について負のデルタＧ自由エネルギーおよび伸長について正のデルタＧ自由エネルギーを有する、
ｏ候補キャッピングペプチドのセットを実験的に試験し、１つ以上のキャッピングペプチドを生成すること。
－Ｍ１は、細胞内タンパク質分解系を標的とする部分であり、
－分子（Ａ）において、Ｚ１はリンカーであり、およびＺ２はリンカーまたは不在から選択され、分子（Ｂ）において、Ｚ１およびＺ２は各々独立してリンカーであり、およびＺ３はリンカーまたは不在から選択され、分子（Ｃ）において、Ｚ１、Ｚ２およびＺ３は各々独立してリンカーであり、およびＺ４はリンカーまたは不在から選択される。
「ＡＰＲアミロイドコアの軸端にシーディングされたバリアント配列」とは、「バリアント配列によってすでに結合されている、ＡＰＲアミロイドコアの３Ｄ構造上のバリアント配列」を意味する。
キャッピングペプチドは、ＡＰＲ配列のバリアントを含むペプチドであり、このＡＰＲ配列は５～１０アミノ酸の長さを有し、異常凝集体を形成可能な標的タンパク質のアミノ酸配列に天然に存在し、ここでＡＰＲ配列のバリアントは、ＡＰＲ配列と比較して１、２、または３個のアミノ酸配列の相違を有し、任意に、ＡＰＲ配列の前記バリアントは、少なくとも１つのＤ－アミノ酸および／または少なくとも１つの人工アミノ酸を含有し、前記キャッピングペプチドは、前記ＡＰＲ配列から生成された（または形成された）線維の三次元構造との相互作用について負のデルタＧ自由エネルギー、および前記ＡＰＲ配列から生成された（または形成された）線維の三次元構造との伸長について正のデルタＧ自由エネルギーを有する。
特定の態様において、キャッピングペプチドは、ＡＰＲ配列のバリアントを含むペプチドであり、このＡＰＲ配列は５～１０アミノ酸の長さを有し、異常凝集体を形成可能な標的タンパク質のアミノ酸配列に天然に存在し、ここでＡＰＲ配列のバリアントは、ＡＰＲ配列と比較して、１、２、または３個のアミノ酸配列の相違を有し、任意に、ＡＰＲ配列の前記バリアントは、少なくとも１つのＤアミノ酸および／または少なくとも１つの人工アミノ酸を含有し、および：
ｉ）前記キャッピングペプチドは、前記ＡＰＲ配列から生成（または形成）された線維の三次元構造との相互作用について負のデルタＧ自由エネルギー、および前記ＡＰＲ配列から生成（または形成）された線維の三次元構造との伸長について正のデルタＧ自由エネルギーを有し、および／または
ｉｉ）前記キャッピングペプチドは、前記異常凝集体によって形成された線維の三次元構造との相互作用について負のデルタＧ自由エネルギー、および前記異常凝集体によって形成された線維の三次元構造との伸長について正のデルタＧ自由エネルギーを有する。
特定の態様において、キャッピングペプチドは、ＡＰＲ配列のバリアントからなるペプチドであり、このＡＰＲ配列は５～１０アミノ酸の長さを有し、異常凝集体を形成可能な標的タンパク質のアミノ酸配列に天然に存在し、ここでＡＰＲ配列のバリアントは、ＡＰＲ配列と比較して、１、２、または３個のアミノ酸配列の相違を有し、任意に、ＡＰＲ配列の前記バリアントは、少なくとも１つのＤアミノ酸および／または少なくとも１つの人工アミノ酸を含有し、および：
ｉ）前記キャッピングペプチドは、前記ＡＰＲ配列から生成（または形成）された線維の三次元構造との相互作用について負のデルタＧ自由エネルギー、および前記ＡＰＲ配列から生成（または形成）された線維の三次元構造との伸長について正のデルタＧ自由エネルギーを有し、および／または
ｉｉ）前記キャッピングペプチドは、前記異常凝集体によって形成された線維の三次元構造との相互作用について負のデルタＧ自由エネルギー、および前記異常凝集体によって形成された線維の三次元構造との伸長について正のデルタＧ自由エネルギーを有する。
伸長のデルタＧ自由エネルギーは、ＡＰＲ配列のバリアントと、ＡＰＲ配列のバリアントによって既に結合されているＡＰＲ配列の線維の三次元構造との間の相互作用を計算／決定することによって、計算／決定される。代替的に、伸長のデルタＧ自由エネルギーは、ＡＰＲ配列のバリアントと、ＡＰＲ配列のバリアントによって既に結合されている異常凝集体の線維の三次元構造との間の相互作用を計算／決定することによって、計算／決定される。
「ＡＰＲ配列によって形成される線維」という文言は、「アミロイドコア」の文言と同等であり、アミロイドコア配列はＡＰＲ配列である。
特定の態様において、キャッピングペプチドは、１、または２または３個のＤ－アミノ酸を含有する。
さらなる特定の態様において、キャッピングペプチドは、１、２または３個の人工アミノ酸を含有する。
別の特定の態様において、キャッピングペプチドは、１、２または３個のＤ－アミノ酸および１、２または３個の人工アミノ酸を含有する。
「キャッピングペプチド」という用語は、当技術分野で周知である。キャッピングペプチドは、標的タンパク質の異常凝集を阻害することができるポリペプチド（任意に非天然アミノ酸またはＤ－アミノ酸を含む）である。典型的には、キャッピングペプチドは、５～１０アミノ酸のアミノ酸長を有し、異常凝集体を形成可能な標的タンパク質に天然に存在する隣接易凝集性領域（ＡＰＲ）の、１、２または３個の異なるアミノ酸置換によって異なる。例に開示されたキャッピングペプチド以外の、本発明の文脈において使用することができるキャッピングペプチドの他の例は、US8,754,034B2（タウ凝集阻害剤）、WO2018/005866（トランスサイレチン阻害剤）、US2019/0241613（α－シヌクレイン阻害剤）、EP2719394B1およびPlumley J.A. et al (2014) J. Phys. Chem. B. 118, 3326に記載されている。キャッピングペプチドを生成する他の方法は、当技術分野で知られている。異常凝集体を形成するタンパク質のキャッピングペプチドを生成するさらなる非限定的な例は、US8754034B2、８ページ、３１～５４行に記載されている。当技術分野で開示されているほとんどのキャッピングペプチドは、構造に組み込まれた非天然アミノ酸またはＤ－アミノ酸を有する。驚くべきことに、本発明で定義されたキャッピングペプチドは、Ｄ－アミノ酸または非天然アミノ酸を組み込む必要なく、すでに効率的に作用している。さらに驚くべきことに、本発明のキャッピングペプチドは、二重キャッピングペプチド（本明細書の実施例のセクションで指定されるタンデムキャッピングペプチド（好ましくはヘテロタンデムキャッピングペプチド）、例１１を参照）または三重キャッピングペプチドの組み合わせとして設計された場合に、改善された作用を有する。タンデムキャッピングペプチドは、２つの異なるキャッピング配列としての２倍の同一キャッピングペプチド配列を有するものとして構築することができる。２つの異なるキャッピングペプチド配列（１つの分子に一緒に融合している）は、異常凝集体を形成可能な同一の標的タンパク質に存在する２つの異なるＡＰＲ配列に向けることができる。代替的に、２つの異なるキャッピングペプチド配列（１つの分子に一緒に融合している）は、異常凝集体を形成可能な２つの異なるタンパク質に向けることができる。
特定の態様において、本発明は、以下のステップを含む、異常凝集体を形成する標的タンパク質の候補キャッピングペプチドのセットを生成する方法を提供する：
ｏ標的タンパク質から異常凝集体の線維の３次元構造を取得すること、または異常凝集体を形成可能な標的タンパク質から単離されたアミロイドコアアミノ酸配列の３次元構造を取得すること（このアミロイドコアアミノ酸配列は、標的たんぱく質に天然に存在する易凝集性領域（ＡＰＲ）に対応する）、
ｏ前記アミロイドコアアミノ酸配列（または前記ＡＰＲ配列）のバリアントのin silicoリストを生成すること、ここで各バリアントは、アミロイドコアアミノ酸配列（または前記ＡＰＲ配列）と比較して、１、または２、または３個のアミノ酸の相違を有する、
ｏForcefieldアルゴリズムを使用して、次の間の相互作用についてすべてのバリアント配列の熱力学的安定性を計算すること：
□ｉ）バリアント配列とアミロイドコアの３－Ｄ構造、または、バリアント配列と前記タンパク質からの異常凝集体の線維の３－Ｄ構造；この値は相互作用のデルタギブスエネルギーとして指定され、
□ｉｉ）バリアント配列と、その軸端で相互作用するバリアント配列を有するアミロイドコアの３－Ｄ構造、または、バリアント配列と、その軸端で相互作用するバリアント配列を有する前記タンパク質からの異常凝集体の線維の３－Ｄ構造；この値は、伸長のデルタギブスエネルギーとして指定される、
ｏ候補キャッピングペプチドのセットを生成すること、ここで候補は、相互作用について負のデルタＧ自由エネルギーおよび伸長について正のデルタＧ自由エネルギーを有する。
「アミロイドコアアミノ酸配列の３－Ｄ構造を得ること」という文言は、「ＡＰＲ配列の線維の３－Ｄ構造を得ること」と同等である。
さらなる特定の態様において、方法は、候補キャッピングペプチドのセットを実験的に試験すること、および１つ以上のキャッピングペプチドを生成することを含む。
異常凝集体を形成可能なタンパク質のアミロイド形成配列（ＡＰＲ領域）の同定
１つ以上の易凝集性領域（ＡＰＲ）（凝集誘発性ストレッチとも呼ぶ）が、異常凝集体を形成可能なタンパク質のアミロイドまたは非アミロイド形成の原因であることは、よく知られている。換言すれば、異常タンパク質凝集体は、１つ以上の易凝集性領域を含む。易凝集性領域とは、本明細書では、アミロイドコア配列（典型的には５～１０アミノ酸の配列）であって、そこに当技術分野における三次元アミロイドコア配列が存在するか、これをCORDAX（下記参照）などの適切なアルゴリズムによって予測することができるか、または実験的に生成することさえ可能である、前記アミロイドコア配列と考えられている。
同定ステップにおいて、β凝集予測または凝集予測アルゴリズムが使用される。かかるアルゴリズムは当技術分野で周知である。典型的には、かかるアルゴリズムは、生物物理学的パラメーターを考慮に入れる。Tango、Waltz、およびZyggregatorは、かかるアルゴリズムの一般的な例であるが、さらに多くが当分野で記載されており、これには限定することなく、以下により記載されたものが含まれる：Bryan et al., PLoS Comput Biol. 5(3):e1000333, 2009；Caflish, Curr Opin Chem Biol. 10(5):437-44, 2006；Conchillo-Sole et al., BMC Bioinformatics 8:65, 2007；Galzitskaya et al., PLoS Comput Biol. 29;2(12):e177, 2006；Goldschmidt et al., PNAS 107(8):3487-92, 2010；Maurer-Stroh et al., Nat Methods 7(3):237-42, 2010；Rojas Quijano et al., Biochemistry 45(14):4638-52, 2006；Saiki et al., Biochem Biophys Res Commun 343(4):1262-71, 2006；Sanchez de Groot et al., BMC Struct Biol 5:18, 2005；Tartaglia et al., Protein Sci. 14(10):2723-34, 2005；Tartaglia et al., J Mol Biol. 380(2):425-36, 2008；Thompson et al., PNAS 103(11):4074-8, 2006；Trovato et al., Protein Eng Des Sel. 20(10):521-3, 2007；Yoon and Welsh, Protein Sci. 13(8):2149-60, 2004；Zibaee et al., Protein Sci. 16(5):906-18, 2007。特に興味深い機械学習アルゴリズムが最近記載され（Louros, N. et al (2020) Nature Communications 11:3314においてCORDAXと指定された）、これは、例えば球状タンパク質の表面露出パッチにおいてＡＰＲ配列を同定することができる。興味深いことにCORDAXは、同定されたアミロイドコア配列の３次元構造も予測可能である。ほとんどのアルゴリズムは、アミロイド凝集配列の同定に関与していることに注意されたい。無定形β凝集も発生し、両方の形態の凝集の配列空間が重複する可能性があり（Rousseau et al., Current Opinion in Structural Biology 16:118-126, 2006）、反応の動力学および条件が異常凝集体を形成可能な異常タンパク質の凝集に有利に働く限りにおいて、両方の形態の凝集がアプリケーションで想定されている。
用語「異常凝集体」は、アミロイド凝集体および非アミロイド凝集体を指す。アミロイド凝集体はさらに、アミロイド線維とアミロイドオリゴマーの間で区別することができる。好ましい態様において、異常凝集体は細胞内凝集体である。細胞外の異常凝集体を形成するものとしてカタログ化されている異常凝集体に関連する多くの疾患は、細胞内凝集体も形成することが知られている。実際、ＩＡＰＰとアミロイドβは、細胞内および細胞外凝集体を有する。異常凝集体（特にアミロイドオリゴマーおよびアミロイド線維）を形成するタンパク質および関連する病理学のさらなる例は、Chiti F and Dobson CM (2017) Annu. Rev. Biochem. 86: 27-68の３２、３３および３４ページの表１に概説されている。非アミロイド凝集体（または凝集体の別名である沈着物）の例は、Chiti F and Dobson CM (2017) Annu. Rev. Biochem. 86: 27-68の３５および３６ページの表２に示され、いくつかの非限定的な例は、ＴＤＰ－４３、ＦＵＳ、アタキシン－１およびｐ５３である。
細胞内タンパク質分解
細胞内タンパク質分解は、２つの主要なプロセス：ユビキチン－プロテアソーム系（ＵＰＳ）を介したプロテアソーム分解、および（エンド）リソソーム分解によって達成され得る。後者は一般に、細胞内基質に対するマイクロオートファジー、マクロオートファジー、およびシャペロン介在性オートファジー（ＣＭＡ）、ならびに細胞外基質に対するエンドサイトーシスとそれに続くリソソーム融合に分けられる。ＵＰＳによる分解には、分子シャペロンによるミスフォールド種の認識、これらの種をユビキチンで標識するＥ３ユビキチンリガーゼの動員が伴い、これらはその際にプロテアソームによる分解の標的とされる。ＣＭＡは、分子シャペロン、特にＨｓｃ７０によって操作され、Ｈｓｃ７０は特定のＫＦＥＲＱ様モチーフを介して基質を認識し、それらをリソソームに移行させ、そこで、基質が展開され、ＬＡＭＰ２Ａ複合体の作用によりリソソーム膜を横切って輸送される（Glick D et al (2010) J. Pathol. 221(1): 3-12およびUS20100016221を参照）。マクロオートファジーにおいて、基質（ユビキチン化されたタンパク質種だけでなく、他の細胞成分も）は、ｐ６２、ＮＢＲ１、ＴＡＸ１ＢＰ１、Ｏｐｔｎ、およびＴｏｌｌｉｐなどのいわゆるアダプタータンパク質によって認識され、これらはＬＣ３タンパク質に結合することにより、基質をファゴフォアに標的化し、最終的にリソソームと融合するオートファゴソームの形成をもたらす；オートファゴソームの内容物はそこで分解される。
「細胞内タンパク質分解系を標的とする部分」とは、細胞内タンパク質分解系の成分と相互作用する（または同等の文言である「に結合する（binds to）」または「と結合する（binds with）」）小分子またはペプチド（またはペプチド様）構造を指す。さらに言い換えると、「細胞内タンパク質分解系を標的とする部分」とは、細胞内タンパク質分解系に関与するタンパク質に結合する（または相互作用する）小分子またはペプチドである。「細胞内タンパク質分解系において」という文言は、「細胞内タンパク質分解において（in intracellular proteolysis）」、「細胞内分解において」、「細胞分解において」、「細胞内タンパク質分解において（in intracellular protein degradation）」、「細胞タンパク質分解において」と同等である。細胞内タンパク質分解系に関与するタンパク質の例は、当技術分野で知られているいくつかのユビキチンＥ３リガーゼ、またはオートファゴソームタンパク質ＬＣ３、またはオートファジーアダプタータンパク質ｐ６２、またはオートファゴソームタンパク質ＴＡＸ１ＢＰ１、ＮＢＲ１、ＯｐｔｎおよびＴｏｌｌｉｐ、または分子シャペロンＨｓｃ７０である。この「細胞内タンパク質分解系」は、ユビキチンＥ３リガーゼ系またはオートファジー系を指す。過去数十年にわたり、目的のタンパク質を選択的に分解するための、これらの細胞分解経路をハイジャックする技術が登場した。タンパク質分解を標的とするキメラ分子（ＰＲＯＴＡＣ）は、治療介入のために現在多くの注目を集めている新しい技術である。このメカニズムは、タンパク質分解のためにユビキチンＥ３リガーゼをハイジャックすることによる、タンパク質機能の阻害に基づく。ＰＲＯＴＡＣ分子は、Ｅ３リガーゼリガンド（したがって、ユビキチンＥ３リガーゼタンパク質に結合する）で構成され、柔軟なリンカーを介して目的の特定のタンパク質の標的化部分（ペプチドまたは小分子）に融合される。細胞内タンパク質分解系に関与するタンパク質を標的化することは、ペプチドリガンドまたは小分子リガンドなどの部分（または同等の文言であるリガンド）を使用することによって簡便に行うことができる。表１に、例の非限定的なリストを示す。ＰＲＯＴＡＣは、ユビキチン－プロテアソーム系の通常の生理学的基質に限定されない、転写因子や非酵素タンパク質などの「手に負えない」タンパク質標的を排除する可能性がある。したがって、本発明の非天然分子がユビキチンＥ３リガーゼ標的化部分を含む特定の態様において、これらの非天然分子は、ヘテロ二機能性ＰＲＯＴＡＣ分子と見なすことができる。細胞内プロテアソーム分解の別の例は、オートファジー系、特にマイクロオートファジー、マクロオートファジー、またはシャペロン介在性オートファジー（ＣＭＡ）による、細胞内タンパク質のクリーンアップである。
本発明において特に興味深いのは、いわゆるＬＣ３相互作用領域（ＬＩＲ）を介してオートファゴソームタンパク質ＬＣ３を標的とする部分、またはオートファジーアダプタータンパク質ｐ６２（ＬＣ３依存性オートファジーの古典的受容体）を標的とする部分、またはオートファジーアダプタータンパク質ＮＢＲ１を標的とする部分（ＮＢＲ１はユビキチン陽性タンパク質凝集体へと動員され、これらをＬＣ３依存性オートファジーに誘導する）、またはオートファジーアダプタータンパク質ＴＡＸ１ＢＰ１を標的とする部分、または分子シャペロンＨｓｃ７０を標的とする部分である。ＬＣ３相互作用領域（ＬＩＲ）、特にＬＩＲモチーフの概要は、Birgisdottir AB et al (2013) J. of Cell Science 126, 3237-3247によって作成されている。さらに、ＬＩＲデータベースとして指定されている利用可能なデータベース：http://repeat.biol.ucy.ac.cy/iLIR/があり、このデータベースは、すべての既知のＬＣ３相互作用領域配列を示している。これらの後者のＬＣ３相互作用配列は、本発明の非天然分子の設計において便利に使用することができ、ここでこれらの配列は、オートファジーに関与する特定のタンパク質と相互作用する部分である。オートファジー細胞系に関与するタンパク質と相互作用可能な小分子およびペプチドのいくつかの例を、表１に示し（ＡＵＴＡＣとして示されている）、Ｅ３ユビキチンリガーゼタンパク質と相互作用可能な小分子およびペプチドのいくつかの例を、表１に示す（ＰＲＯＴＡＣと表記）。
「～と相互作用する」という文言は、「～と結合する」と同等である。
Figure 2023525149000001
Figure 2023525149000002
Figure 2023525149000003
表１：ＰＲＯＴＡＣ部分およびＡＵＴＡＣ部分の例
特定の態様によれば、本明細書に記載の非天然分子の全長は、６０、５５、または５０アミノ酸を超えない。より具体的には、長さは、４０アミノ酸、３０アミノ酸、２５アミノ酸、または２０アミノ酸を超えない。
さらに別の態様において、本発明の非天然分子はさらに、細胞内タンパク質分解系を標的とする第２部分（Ｍ２）を含み、前記第２部分（Ｍ２）は、以前に異なる態様で示した構造（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）において、Ｍ１部分に隣接して融合することができる。Ｍ２部分の融合は、Ｍ１とＭ２の間のリンカー配列によって中断されることが好ましい。
さらに別の態様において、本発明の非天然分子はさらに、細胞内タンパク質分解系を標的とする第２部分（Ｍ２）を含み、前記第２部分（Ｍ２）は、以前に異なる態様で示した構造（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）において、Ｚ０リンカーに隣接して融合される。
本明細書に記載の非天然分子におけるさらに別の態様において、分子（Ｂ）および（Ｃ）中のキャッピングペプチドは、異常凝集形成標的タンパク質の同一または異なる易凝集性領域に向けられる。
本明細書に記載の非天然分子におけるさらに別の態様において、分子（Ｂ）および（Ｃ）中のキャッピングペプチドは、異なる異常凝集形成標的タンパク質の易凝集性領域に向けられる。
別の態様において、本発明はまた、同位体標識非天然分子を含み、これらは、本明細書で定義されたものと、１つ以上の原子が自然界で通常見られる原子質量または質量数とは異なる原子質量または質量数を有する原子によって置き換えられているという事実を除き、同一である。本発明の非天然分子に（例えば、ペプチド部分に）組み込むことができる同位体の例には、水素、炭素、窒素、酸素、リン、硫黄、フッ素、および塩素の同位体、例えば、それぞれ、２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１１Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ、１７Ｏ、３１Ｐ、３２Ｐ、３５Ｓ、１８Ｆ、および３６ＣＩが含まれる。本発明の非天然分子および前記ペプチドの薬学的に許容し得る塩、または前述の同位体および／または他の原子の他の同位体を含有するものは、本発明の範囲内である。本発明の特定の同位体標識非天然分子、例えば３Ｈおよび１４Ｃなどの放射性同位体が組み込まれているものは、薬物および／または基質組織分布アッセイにおいて有用である。トリチウム化、すなわち３Ｈ、および炭素１４、すなわち１４Ｃ同位体は、調製の容易さおよび検出性から特に好ましい。さらに、重水素、すなわち２Ｈなどのより重い同位体による置換は、より大きな代謝安定性から生じる特定の治療上の利点、例えばin vivo半減期の増加または必要な投与量の減少をもたらす可能性があり、したがって状況によっては好ましい場合があり、本発明の同位体標識非天然分子は、一般に、以下の例に開示される手順を実施することによって、非同位体標識試薬を容易に入手可能な同位体標識試薬に置き換えることにより、調製することができる。
さらに別の態様において、本発明の非天然分子はさらに、少なくとも１つのＤ－アラニンを、前記ペプチドのアミノ末端および／またはカルボキシ末端に含む。
さらに別の態様において、本発明は、医薬として使用するための本発明の非天然分子を提供する。
さらに別の態様において、本発明は、タンパク質が異常凝集体を形成する疾患を処置するために使用する本発明の非天然分子を提供する。例１３は、異なる異常凝集体によって引き起こされる疾患のリストを示す。
いくつかの態様において、本発明の非天然分子は、アミノ末端および／またはカルボキシル末端に１つ以上の追加の残基を含み得る。いくつかの態様において、１つ以上の追加の残基は、Ｄ－アラニンである。例えば非天然分子は、１つまたは２つのＤ－アラニンを、アミノ末端および／またはカルボキシル末端に含み得る。
特定の態様において、本発明の非天然分子は、アミノ末端および／またはカルボキシル末端にブロッキング剤を付加することによりin vivoでの使用のために修飾して、関連する非天然分子のin vivoでの生存を促進することができる。これは、ペプチド末端が、細胞による取り込みの前にプロテアーゼにより分解される傾向がある状況において、有用であり得る。かかるブロッキング剤は、限定することなく、さらなる関係するまたは無関係のペプチド配列を含んでもよく、これは、投与されるべきペプチドのアミノおよび／またはカルボキシル末端残基に結合していてもよい。これは、ペプチドの合成の間に化学的に、または組み換えＤＮＡ技術により、任意の好適な方法により、行うことができる。例えば、１つ以上の天然に存在しないアミノ酸、例えばＤ－アラニンなどを、末端に付加させてもよい。あるいは、ピログルタミン酸または当該分野において公知の他の分子などのブロッキング剤を、アミノおよび／またはカルボキシル末端残基に結合させてもよく、または、アミノ末端におけるアミノ基もしくはカルボキシル末端におけるカルボキシル基を、異なる部分で置き換えてもよい。加えて、ペプチド末端を、例えばＮ末端のアセチル化および／またはＣ末端のアミド化により修飾してもよい。同様に、ペプチドを、投与の前に、薬学的に許容し得る「キャリア」タンパク質に、共有結合により、または非共有結合的に、カップリングしてもよい。
別の特定の態様において、本発明の非天然分子は、人工アミノ酸を、キャッピングペプチド部分および／または細胞内タンパク質分解系を標的とする部分（部分がペプチドである場合）に含むことができる。
リンカー
上記の式（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）で概説したように、本明細書に記載の非天然分子は、任意にリンカー部分Ｚ０、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３およびＺ４も含有することができる。特定の態様によれば、非天然分子、特にペプチド構造からなる非天然分子は、内部リンカーのみを含有し、ＮまたはＣ末端リンカーを含有しない。したがって、式（Ａ）において：Ｚ０およびＺ２は不在であり、式（Ｂ）において：Ｚ０およびＺ３は不在であり、式（Ｃ）において：Ｚ０およびＺ４は不在である。他の特定の態様において、本明細書に記載の非天然分子は、リンカー部分Ｚ０、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３およびＺ４を有さない。さらに別の特定の態様において、非天然分子は、内部リンカー部分を有さない。
リンカー部分の性質は本発明にとって重要ではなく、ただし、長い柔軟なリンカーは通常使用されない。特定の態様によれば、各リンカー（Ｚ）は、０～２０個の同一または非同一単位のストレッチから独立して選択され、ここで単位はアミノ酸、単糖、ヌクレオチドまたは単量体である。同一でない単位は、同じ性質の同一でない単位であり得る（例えば、異なるアミノ酸、またはいくつかのコポリマー）。それらは、異なる性質の同一ではない単位である場合もあり、例えばアミノ酸およびヌクレオチド単位を有するリンカー、または２つ以上の異なる単量体種を含むヘテロポリマー（コポリマー）である。特定の態様によれば、少なくとも１つのＺ、特に各Ｚの長さは、少なくとも１単位である。他の特定の態様によれば、Ｚは０単位である。特定の態様によれば、すべてのＺリンカーは同一である。
アミノ酸、単糖、ヌクレオチド、および単量体は、当該技術分野におけるものと同じ意味を有する。単量体の特定の例には、天然単量体の模倣体、例えば非タンパク質構成アミノ酸または非天然アミノ酸（例えば、カルニチン、ＧＡＢＡ、およびＬ－ＤＯＰＡ、ヒドロキシプロリンおよびセレノメチオニン）、ペプチド核酸単量体などが含まれることに留意されたい。他の適切な単量体の例としては、限定はされないが、エチレンオキシド、塩化ビニル、イソプレン、乳酸、オレフィン類例えばエチレン、プロピレン等、ポリマー中に存在するアミド（例えば、アクリルアミド）、アクリロニトリル－ブタジエン－スチレン単量体、エチレンビニルアセテート、およびポリマー形成が可能な他の有機分子が挙げられる。
代替的な態様によれば、リンカー単位は化学リンカー、例えばカルボジイミドカップリングによって生成されるものなどである。適切なカルボジイミドの例には、限定はされないが、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、およびジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）が含まれる。別の特に想定される化学リンカーは、４，７，１０－トリオキサトリデカン－コハク酸（４，７，１０－トリオキサトリデカン－スクシンアミド酸とも呼ばれる）またはＴｔｄｓである。
特定の態様によれば、少なくとも１つ、特にすべてのＺリンカーは、同じ性質の０～１０単位の間、特に同じ性質の０～５単位の間である。リンカーが柔軟な場合、短いリンカーを使用することが特に想定される。短いリンカーの使用は、同じ非天然分子の２つのＣＰストレッチがそれ自体で折り返されるのを防ぐことができ、これにより、目的のアミロイドタンパク質を標的にすることが難しくなる。また、１つの分子の異なるＣＰストレッチが互いに相互作用できないようにすることで、分子の溶解度が増加する。特定の態様によれば、リンカーは非常に短いため、ＣＰストレッチを逆平行に折り畳むことができない。例えばアミノ酸の場合、完全なターンを作るには少なくとも３つまたは４つのアミノ酸が必要であるため、４つ以下または３つ以下のアミノ酸のリンカーが特に想定される。これはアミノ酸の性質にも依存するため、特定の構造的傾向またはねじれ構造の傾向、例えばＧ、Ｓ、およびＰなどを持たないアミノ酸の使用が特に想定される。特定の態様によれば、少なくとも１つのＺ部分は、ペプチドまたはポリペプチドリンカーである。かかるリンカーの特に想定される配列には、ＰＰＰ、ＰＰまたはＧＳが含まれるが、これらに限定されない。アミノ酸で構成されているＺ部分の場合、一次構造を考慮することができる（例えば、リンカーの配列には、特定の構造に対する傾向のない多くのアミノ酸が含まれる）だけでなく、二次構造または三次構造も考慮に入れることができる。例えば、特定の二次構造を形成しないアミノ酸、または（線状の）αへリックスを形成するアミノ酸を選択できる。または、アミノ酸は、安定した三次構造を形成しないように選択することができる；これは、ＣＰ部分がアクセスできなくなる可能性があるためである。アミノ酸リンカーは、ランダムコイルを形成し得る。別の特に想定されるリンカーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、すなわち単量体エチレンオキシド基のオリゴマーまたはポリマーである。ＰＥＧオリゴマーは、多くの場合、単量体単位の数を示して略称され、例えばＰＥＧ２、ＰＥＧ３または（ＰＥＧ）４である。特定の態様によれば、少なくとも１つのＺ部分はＰＥＧオリゴマー（略してＰＥＧ）である。さらなる特定の態様によれば、すべてのＺ部分がＰＥＧ部分である。
他のリンカーよりも長いリンカーが好まれる特定の例の１つは、同じ生物の少なくとも２つの異なるアミロイドタンパク質が標的とされている場合である（すなわち、ＣＰ１およびＣＰ２および／またはＣＰ３部分は、１より多くのアミロイド形成タンパク質の凝集誘導領域に対応する）。分子が１より多くのアミロイド形成タンパク質と（例えば同時に）相互作用できることを確実にするには、異なる標的化ＣＰ部分間の距離を大きくすることが有益な場合があり、これにより相互作用は、立体障害によっては妨げられない。これらの例では、Ｚリンカーは、０～１００個の同一または非同一単位のストレッチであってもよく、ここで単位はアミノ酸、単糖、ヌクレオチド、または単量体であり；または０～９０、０～８０、０～７０、０～６０、０～５０、０～４０、０～３０、または０～２０の間である。特に、Ｚリンカーの最小長は、少なくとも１単位、少なくとも２単位、少なくとも３単位、少なくとも４単位、または少なくとも５単位である。
より長いリンカーが使用される場合、それらは、少なくとも１つのＣＰ領域が由来するタンパク質の配列と同一でないことが好ましい。特に特定の態様によれば、２０単位を超えるリンカーはペプチドリンカーではない、すなわち、単位はアミノ酸ではない。代替的態様によれば、より長いリンカーはペプチドリンカーであり得るが、ただし反復モチーフを含有するペプチドリンカー（例えば、ＧＳ、ＧＧＳ、ＰＰリンカー、またはモノ、ジ、もしくはトリアミノ酸反復を含有する他のリンカー）である。特にリンカーは、例えばαヘリックスまたはβシートのストレッチなどの二次ポリペプチド構造を、本質的に含まない。ポリペプチド二次構造のモチーフに対するポリペプチドリンカーの素因は、リンカーの末端が享受する空間的自由度を必然的に限定するであろう。
その他の部分
非天然分子は、さらに他の部分を含むことができる（または他の部分にさらに融合もしくは結合することができる）。すべての部分について、部分および非天然分子がそれらの特定の機能を発揮できる限り、融合またはリンカーの性質は本発明にとって重要ではない。特定の態様によれば、非天然分子に融合された部分は、切断され得る（例えば、プロテアーゼ認識部位を有するリンカー部分を使用することによって）。このようにして、部分および分子の機能を分離することができ、これは、より大きな部分について、または特定の時点の後に部分が不要となる態様（例えば、タグを使用した分離ステップの後に切断されるタグ）について、特に興味深い。
分子がさらに検出可能な標識を含むことが、特に想定される。検出可能な標識は、Ｎ末端またはＣ末端で、または内部的に、分子に融合され得る（例えば、リンカーを介して、またはリンカーは、検出可能な標識として使用可能である）。代替的に、検出可能な標識は、分子のＣＰ－Ｍ－Ｘ－Ｚ部分の１つ以上における１つ以上の標識アミノ酸（例えば、蛍光または放射性標識アミノ酸）の使用を指すことができる。
Ｚ０が非天然分子中に存在する（または式（Ａ）でＺ２が存在する、または式（Ｂ）でＺ３が存在する、または式（Ｃ）でＺ４が存在する）態様については、検出可能な標識は、Ｚ０（またはＺ２またはＺ３またはＺ４）リンカー部分に融合させることができる。分子にタグを追加するために使用されるリンカーは、長くかつ柔軟であり得る。しかし、検出可能な標識が分子に付着される実際の方法は、本発明にとって重要ではなく、典型的には、使用される標識の性質および／または標識の目的（必要とされる近接性を決定し得る）に依存するだろう。原則として、標識が検出可能である限り、タンパク質性の分子の任意の既知の標識を使用できることに留意されたい。特に想定される標識には、限定はされないが、タグ、蛍光標識、酵素基質、酵素、量子ドット、（常）磁性であり得るナノ粒子、放射性標識、光学標識などが含まれる。
他の部分と同様に、分子は２つの末端を有するため、分子はそのＮ末端とＣ末端の両方で別の部分（例えば標識）に融合されることが想定される。これらの２つの標識は、同一（より強いシグナルを生成する）または異なる（異なる検出目的のため）であり得る。標識などの部分は、Ｚ０および／またはＺ２またはＺ３またはＺ４リンカーを介して、またはより長いリンカーを介して融合することができる。
特定の態様によれば、検出可能な標識はＧＦＰまたはビオチンではない。他の特定の態様によれば、ビオチンまたはＧＦＰが検出可能な標識であり得る。
他の特定の態様によれば、非天然分子は、他の部分に融合して、例えばin vivoでの半減期を延長することができる。安定性を高めることとは別に、かかる部分は、それらが融合している分子の溶解度も増加させ得る。ゲートキーパー（それぞれ式（Ａ）、（Ｂ）、および（Ｃ）で番号付けされたＸ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４部分）の存在は、原則として、非天然分子を溶液中に保持することを防ぐのに役立つが、多くの場合において、我々はＸ部分が省略可能であることを見出した。特定の態様において、溶解度を増加させる部分のさらなる添加は、分子のより容易な取り扱いをもたらし得、特に、安定性および有効期間を改善し得る。かかる部分の周知の例は、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）である。この部分は、リンカーとしてのみならず、可溶化部分としても用いられ得るので、特に想起される。他の例として、ペプチドおよびタンパク質またはタンパク質ドメイン、またはさらに完全なタンパク質（例えばＧＦＰ）が挙げられる。このことに関して、ＰＥＧのように、１つの部分が様々な機能または効果を有し得ることに注意すべきである。例えば、ｆｌａｇタグ（配列ＤＹＫＤＤＤＤＫ）は、標識として用いられ得るペプチド部分であるが、その電荷密度に起因して、それはまた、可溶化を増強するであろう。ＰＥＧ化は、生物製剤の溶解度を増加させることが、既にしばしば示されている（例えば、Veronese and Mero, BioDrugs. 2008; 22(5):315-29）。ペプチド、ポリペプチド、タンパク質またはタンパク質ドメインタグを目的の分子に付加することは、当該分野において広範に記載されている。例として、これらに限定されないが、シヌクレインに由来するペプチド（例えば、Park et al., Protein Eng. Des. Sel. 2004; 17:251-260）、ＳＥＴ（溶解度増強タグ、Zhang et al., Protein Expr Purif 2004; 36:207-216）、チオレドキシン（ＴＲＸ）、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、N-Utilization substance（ＮｕｓＡ）、低分子ユビキチン様修飾因子（ＳＵＭＯ）、ユビキチン（Ｕｂ）、ジスルフィド結合Ｃ（disulfide bond C：ＤｓｂＣ）、Seventeen kilodalton protein（Ｓｋｐ）、ファージＴ７タンパク質キナーゼフラグメント（Ｔ７ＰＫ）、タンパク質Ｇ Ｂ１ドメイン、タンパク質Ａ ＩｇＧ ＺＺリピートドメイン、および細菌免疫グロブリン結合ドメイン（Hutt et al., J Biol Chem.; 287(7):4462-9, 2012）が挙げられる。タグの性質は、当業者により決定され得る適用に依存するであろう。
半減期を延長することの他に、非天然分子は、他のまたはさらなる薬物動態学的および薬力学的特性を改変する部分に融合させてもよい。例えば、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）、アルブミン結合ドメインまたは合成アルブミン結合ペプチドへの融合は、様々な治療用タンパク質の薬物動態学および薬力学を改善することが知られている（Langenheim and Chen, Endocrinol.; 203(3):375-87, 2009）。しばしば用いられる別の部分は、抗体のフラグメント結晶化可能領域（fragment crystallizable region：Ｆｃ）である。これらの部分の性質は、本発明のためには極めて重要ではなく、適用に依存して当業者により決定されてよい。
本明細書に記載の非天然分子との組み合わせも想定される他の部分は、標的化部分（targeting moieties）である。例えば分子は、例えば所与の標的に対する特異性を有する抗体、ペプチドまたは小分子に融合することができ、非天然分子は、標的アミロイドタンパク質を含む細胞におけるアミロイド形成を阻害するが、これは、非天然分子に存在する標的化部分が、非天然分子を、アミロイドタンパク質を含む細胞へと誘導するためである。
ただし、標的化部分は必要ではないことに留意されたい；なぜならば、分子自体が特定の配列認識によってそれらの標的を見つけることができるからである。したがって、代替的な態様によれば、分子は標的化部分として効果的に使用され、薬物または小分子などの他の部分にさらに融合され得る。分子を特定のタンパク質（例えば、特定の細胞型または細胞コンパートメントでのみ発生するタンパク質）に標的化することにより、これらの化合物を特定の細胞型／コンパートメントに標的化することができる。したがって、例えば薬物を、アミロイド標的タンパク質を含む細胞に選択的に送達することができる。
さらに他の態様によれば、分子はさらに、細胞透過（または細胞移動）を媒介する配列を含むことができる、すなわち分子は、細胞透過配列の組換えまたは合成付着によってさらに修飾される。しかしながら、本発明の非天然分子は、細胞透過配列なしで効率的に細胞に侵入することに留意されたい。非天然分子（例えば、ポリペプチドとして）は、融合タンパク質または化学結合タンパク質の真核細胞への形質導入を促進する配列に、さらに融合または化学結合され得る。細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）またはタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）配列は当技術分野で周知であり、ＨＩＶ ＴＡＴタンパク質、ポリアルギニン配列、ペネトラチンおよびｐｅｐ－１を含むがこれらに限定されない。さらに他の一般的に使用される細胞透過性ペプチド（天然および人工ペプチドの両方）が、例えば以下に開示されている：Sawant and Torchilin, Mol Biosyst. 6(4):628-40, 2010；Noguchi et al., Cell Transplant. 19(6):649-54, 2010およびLindgren and Langel, Methods Mol Biol. 683:3-19, 2011。
ＣＰＰの典型はそれらの電荷であるため、本明細書に記載の一部の荷電分子は、細胞に入るのにＣＰＰを必要としないことも可能である。実際、例で示されるように、シグナルペプチドまたは細胞内領域を標的とすることが可能であり、これは分子が細胞に取り込まれることを必要とし、ＣＰＰへの融合なしで起こる。
他の部分が分子に融合している場合、特定の態様において、これらの部分を分子から除去できることが想定される。典型的には、これは、特定のプロテアーゼ切断部位を組み込むことによるか、または同等のアプローチで実施される。これは、部分が大きなタンパク質である場合に特に当てはまり、かかる場合、本明細書に記載の方法のいずれかで分子を使用する前に（例えば、分子の精製中に）、部分を切断してもよい。切断部位は、別個に組み込まれてもよく、または外部Ｚリンカーの不可欠な部分であってもよい（例えば、部分は非天然分子のＮ末端またはＣ末端である）。非常に具体的な態様によれば、この部分は、内部Ｚリンカーの一部であってもよいし、Ｚリンカー全体であってもよい。例として、ＣＰ＝２の分子は次の構造を有することができる：Ｘ１－ＣＰ１－Ｘ２－Ｚ１－Ｘ３－ＣＰ２－Ｘ４－Ｍ、ここでＺ１（一部または全体）はヘキサヒスチジン配列である；これは次にリンカーと検出配列の両方である。かかる場合には通常、切断部位は、可能ではあるが、分子自体の切断につながるために、組み込まれない。追加の部分が内部で融合される態様によれば、非タンパク質性（例えば、ＰＥＧ）または制限された長さ（３０、２０または１０未満のアミノ酸、上記参照）を有するペプチド配列のみが、可溶化部分として想定されることに留意されたい。そうでなければ、タンパク質ドメインがアミロイド凝集の防止を妨げる可能性がある。
特定の態様によれば、本明細書に記載の非天然分子の全長は、５０アミノ酸を超えない。より具体的には、長さは、４０アミノ酸、３０アミノ酸、２５アミノ酸、または２０アミノ酸を超えない。分子がさらなる部分に融合されるさらなる特定の態様によれば、長さの制限は、分子全体のＸ１－ＣＰ１－Ｘ２－Ｚ１－Ｘ３－ＣＰ２－Ｘ４－Ｍ１またはＸ１－ＣＰ１－Ｘ２－Ｚ１－Ｘ３－ＣＰ２－Ｘ４－Ｚ２－ＣＰ３－Ｘ５－Ｚ３－Ｍ１の部分のみに適用される（したがって、例えば標識までは含まれない）。したがって、切断部位が分子内に構築されている場合、長さの制限は通常、切断後の長さに適用される。
ゲートキーパーアミノ酸
本明細書に記載の非天然分子において、キャッピングペプチド配列は、任意に両側で、低いβ凝集能を有する０、１または２個の特定のアミノ酸（式（Ａ）のＸ１およびＸ２部分、式（Ｂ）のＸ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４部分、および式（Ｃ）のＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５およびＸ６部分）に隣接している。これらはゲートキーパー残基と呼ばれることもあり（Pedersen et al., J Mol Biol 341: 575-588, 2004）、非天然分子のキャッピングペプチドを自己凝集から守るためのオプションである。ゲートキーパー残基を本発明の非天然分子に使用して、溶解度を増加することができる。これらの例において、好ましいゲートキーパー残基は、ＲおよびＥなどの正に荷電したゲートキーパー残基である。しかしながら別の好ましい態様においては、ゲートキーパーアミノ酸は非天然分子のキャッピングペプチド配列に隣接していないと言うべきである。
タンパク質の天然状態において、凝集はしばしば、自然に発生する荷電残基によって、また例えば凝集配列セグメントの側面にあるプロリンおよびグリシンによっても、阻止または妨害される。これらはゲートキーパー残基として効果的に機能する；すなわち残基は、必ずしも天然状態を安定化するわけではないが、例えば立体的または静電的衝突などによって、望ましくないミスフォールド状態または凝集状態の形成をブロックする。
これらのゲートキーパー残基は、Ｒ、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ｎ、Ｓ、Ｈ、ＧおよびＱ残基から特に選択される。さらにより具体的には、ゲートキーパー残基は、Ｒ、Ｋ、Ｐ、ＤまたはＥから選択される。さらにより具体的には、ゲートキーパー残基は、ＲおよびＥから選択される。
非天然分子の組換え産生
非天然分子が完全に天然アミノ酸からなる特定の態様において、特定の非天然分子の組換え産生が想定され得る。しかしながら、細胞内タンパク質分解系と相互作用する部分が組換え発現に用いられる宿主細胞によって認識されないよう、注意しなければならない。したがって、好ましい側面において、宿主細胞によって発現されるべき非天然分子は、宿主細胞にとって外因性であり、組換え宿主細胞の細胞内タンパク質分解系と相互作用しない。例えば、大腸菌などの原核宿主における非天然分子の異種発現は、通常、発現に問題を引き起こさないだろう。組換えベクターは、下方制御されるべきタンパク質が発現されるところの細胞内に目的の核酸配列を運び、かつ前記細胞内で核酸の発現を駆動するためのビヒクルとして、理想的に適している。組換えベクターは、細胞内で別個の実体として（例えば、プラスミドまたはウイルスもしくは非ウイルス性キャリアとして）存続するか、または細胞のゲノムに組み込まれ得る。
したがって、適切な組換え細胞が本明細書で提供され、これらは、本明細書に記載の分子をコードする（またはコードする配列を有する）核酸分子を含むか、またはかかる非天然分子をコードする核酸分子を含有する組換えベクターを含む。細胞は、原核細胞または真核細胞であり得る。後者の場合、それは好ましくは、酵母、藻類または植物、または動物細胞（例えば、昆虫、哺乳動物またはヒト細胞）でさえあり得る。特定の態様によれば、細胞は細胞株として提供される。
組換え非天然分子は、細菌細胞、酵母細胞、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、またはトランスジェニック動物もしくは植物を含む、適切な発現系を使用して製造することができる。組換え非天然分子は、任意の従来のタンパク質またはペプチド精製手順によって、均質近くに精製され得、および／または添加物と混合され得る。さらに別の態様において、前記非天然分子は、発現され、精製されて、および化学的に修飾されたポリペプチド中にさらに修飾される。化学合成は、他の小分子の抱合または設計による非天然アミノ酸の組み込みを可能にする。非天然アミノ酸のペプチドへの組み込みは、高親和性、高特異性の分子認識を開発するための小分子医化学アプローチに類似した、より大きな化学的多様性の可能性を開く。非天然アミノ酸はまた、ペプチドをプロテアーゼ（例えば、血清または胃）に認識させないようにすることによって、ペプチド非天然分子の急速な分解も防ぐことができる。さらに別の態様において、本発明の非天然分子は、Ｄ－アミノ酸または化学修飾アミノ酸などの修飾アミノ酸を含む。さらに別の態様において、前記非天然分子は、天然アミノ酸と非天然アミノ酸の混合物からなる。さらに別の態様において、非天然分子の半減期は、グリコシル化（Haubner R. et al (2001) J. Nucl. Med. 42, 326-336）、ポリエチレングリコールとの抱合（ＰＥＧ化）などの修飾によって延長することができる（Koehler MF et al (2002) Bioorg. Med. Chem. Lett. 12, 2883-2886を参照）。
ウイルスの形質導入／遺伝子治療
ある態様において、非天然分子が完全に（天然）アミノ酸からなる場合、これらの非天然分子はトランスジーンとして（すなわち分子をコードする核酸として）投与することができる。これらの態様による非天然分子は完全にポリペプチドの性質のものであり、なぜならばこれらはコードされる必要があるためであり、すなわち、非天然分子に存在するすべての番号付けされたＺ、ＣＰ、（必要に応じてＸ）、およびＭ部分は、ポリペプチドの性質のものである。トランスジェニック送達が想定される医療用途には、遺伝子治療法（例えば、レンチウイルスを使用）または幹細胞用途が含まれるが、これらに限定されない。
特定の態様において、本発明の非天然分子の投与は、これが本来ペプチドである場合、遺伝子治療法によって実施することができる。したがって、本発明の非天然分子（これらの非天然分子が純粋にアミノ酸からなる場合）は核酸によってコードすることができ、かかる核酸はベクターで提供される。かかる非天然分子は、遺伝子治療によって投与できることが特に想定される。本明細書で使用される「遺伝子治療」は、対象への、発現されたまたは発現可能な核酸の投与によって行われる治療を指す。かかる用途のために、本明細書に記載の核酸分子またはベクターは、細胞内での非天然分子の産生を可能にする。遺伝子治療のための多くの方法が当技術分野で利用可能であり、例えば、（アデノ随伴）ウイルス媒介遺伝子サイレンシング、またはウイルス媒介遺伝子治療が含まれる（例えば、US 20040023390；Mendell et al 2017, N Eng J Med 377:1713-1722）。多くの送達方法が当業者に周知であり、限定はされないが、ウイルス送達システム、ＤＮＡプラスミドのマイクロインジェクション、裸の核酸の微粒子銃、リポソームの使用が含まれる。個々の患者への投与によるin vivo送達は、典型的には全身投与（例えば、静脈内、腹腔内注入または脳注射；例えば、Mendell et al 2017, N Eng J Med 377:1713-1722）によって行われる。前記非天然分子が核酸またはベクターとして提供される場合、かかる非天然分子は、ナノ粒子または人工エキソソームなどの脂質ベースの送達システムを含む送達方法およびビヒクルを通じて投与されることも、より具体的に想定され、これらもまた細胞特異的であり、非天然分子の送達に適し得る。
非天然分子の合成
特定の態様において、本発明の非天然分子（または少なくともそのペプチド部分）は、当該分野において公知のいくつかのペプチド合成方法に従って産生することができる。ペプチド合成方法は、例えば、固相合成プロセスおよび液相合成プロセスのうちのいずれかであってよい。すなわち、目的の非天然分子は、化合物（Ｉ）を構成することができる部分的なペプチドまたはアミノ酸と、残りの部分（これは、２つ以上のアミノ酸により構成することができる）の縮合を、所望される配列に従って繰り返すことにより、産生することができる。望ましい配列を有する生成物が保護基を有する場合、目的のペプチドは、保護基を除去することにより生成することができる。知られるべき縮合方法および保護基を除去する方法の例は、以下の（１）～（５）において記載される方法を含む。（１）M. Bodanszky and M. A. Ondetti: Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York (1966)、（２）Schroeder and Luebke: The Peptide, Academic Press, New York (1965)、（３）Nobuo Izumiya, et al.: Peptide Gosei-no-Kiso to Jikken (Basics and experiments of peptide synthesis), published by Maruzen Co. (1975)、（４）Haruaki Yajima and Shunpei Sakakibara: Seikagaku Jikken Koza (Biochemical Ex-periment) 1, Tanpakushitsu no Kagaku (Chemistry of Proteins) IV, 205 (1977)、および（５）Haruaki Yajima, ed.: Zoku Iyakuhin no Kaihatsu (A sequel to Development of Pharmaceuticals), Vol. 14, Peptide Synthesis, published by Hirokawa Shoten。反応後にペプチドは、例えば溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、再結晶化等、およびそれらの組み合わせなどの、従来の精製の方法を用いて精製および単離することができる。上述の方法により得られたペプチドが、遊離の形態である場合、それは、既知の方法により好適な塩に変換することができる；逆に、ペプチドが塩の形態で得られる場合、当該塩は、既知の方法により遊離の形態または他の塩に変換することができる。出発化合物もまた、塩であってもよい。かかる塩の例として、以下に記述されるペプチドの塩として例示されるものが挙げられる。保護されたアミノ酸またはペプチドの縮合のために、ペプチド合成のために使用可能な多様な活性化試薬を用いることができ、これらは、特に好ましくは、トリスホスホニウム（trisphosphonium）塩、テトラメチルウロニウム塩、カルボジイミドなどである。トリスホスホニウム塩の例として、ベンゾトリアゾール－１－イルオキシトリス（ピロリジノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）、ブロモトリス（ピロリジノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢｒｏＰ）、７－アザベンゾトリアゾール－１－イルオキシトリス（ピロリジノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＡＯＰ）が挙げられ、テトラメチルウロニウム塩の例として、２－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－ヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、２－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－ヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）、２－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）、２－（５－ノルボルナン－２，３－ジカルボキシイミド）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＮＴＵ）、Ｏ－（Ｎ－スクシンイミジル（succimidyl））－１，１，３，３－テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＳＴＵ）が挙げられ、カルボジイミドの例として、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＤＩ）、Ｎ－エチル－Ｎ’－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣＩ．ＨＣｌ）などが挙げられる。これらを用いる縮合のために、ラセミ化阻害剤（例えば、ＨＯＮＢ、ＨＯＢｔ、ＨＯＡｔ、ＨＯＯＢｔなど）の添加を用いることができる。縮合のために用いられるべき溶媒は、ペプチド縮合反応のために使用可能であることが知られるものから適切に選択される。例えば、酸アミド、例えば無水または含水性のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセタミド、Ｎ－メチルピロリドンなど、ハロゲン化炭化水素、例えば塩化メチレン、クロロホルムなど、アルコール、例えばトリフルオロエタノール、フェノールなど、スルホキシド、例えばジメチル－スルホキシドなど、三級アミン、例えばピリジンなど、エーテル、例えばジオキサン、テトラヒドロフランなど、ニトリル、例えばアセトニトリル、プロピオンニトリルなど、エステル、例えば酢酸メチル、酢酸エチルなど、これらの適切な混合物などを用いることができる。反応温度は、ペプチド結合反応のために使用可能であることが知られている範囲から適切に選択され、通常、約－２０℃（「℃」は、「摂氏」を表す）～５０℃の範囲から選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は、通常、１．５～６倍の過剰量において用いられる。相合成において、ニンヒドリン反応を用いる試験により縮合が不十分であることが明らかとなる場合、十分な縮合は、限定することなく、保護基の除去なしで縮合反応を繰り返すことにより行うことができる。反応を繰り返した後で縮合がまだ不十分である場合、その後の反応に対する影響を回避することができるように未反応のアミノ酸を、無水酢酸、アセチルイミダゾールなどによりアシル化することができる。出発アミノ酸のアミノ基のための保護基の例として、Ｚ、Ｂｏｃ、ｔｅｒｔ－ペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４－メトキシベンジルオキシカルボニル、Ｃｌ－－Ｚ、Ｂｒ－－Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２－ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃ、トリチルなどが挙げられる。出発アミノ酸のためのカルボキシル保護基の例として、上述のＣ１－６アルキル基、Ｃ３－１０シクロアルキル基、Ｃ７－１４アラルキル基に加えて、アリル、２－アダマンチル、４－ニトロベンジル、４－メトキシベンジル、４－クロロベンジル、フェナシルおよびベンジルオキシカルボニルヒドラジド、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルヒドラジド、トリチルヒドラジドなどが挙げられる。セリンまたはスレオニンのヒドロキシル基は、例えば、エステル化またはエーテル化により保護することができる。エステル化のために好適な基の例として、低級（Ｃ２－４）アルカノイル基、例えばアセチル基など、アロイル基、例えばベンゾイル基など、および有機酸から誘導される基などが挙げられる。加えて、エーテル化のために好適な基の例として、ベンジル、テトラヒドロピラニル、ｔｅｒｔ－ブチル（Ｂｕ．ｓｕｐ．ｔ）、トリチル（Ｔｒｔ）などが挙げられる。チロシンのフェノールのヒドロキシル基のための保護基の例として、Ｂｚｌ、２，６－ジクロロベンジル、２－ニトロベンジル、Ｂｒ－－Ｚ、ｔｅｒｔ－ブチルなどが挙げられる。ヒスチジンのイミダゾールのための保護基の例として、Ｔｏｓ、４－メトキシ－２，３，６－トリメチルベンゼンスルホニル（Ｍｔｒ）、ＤＮＰ、Ｂｏｍ、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなどが挙げられる。
アルギニンのグアニジノ基のための保護基の例として、Ｔｏｓ、Ｚ、４－メトキシ－２，３，６－トリメチルベンゼンスルホニル（Ｍｔｒ）、ｐ－メトキシベンゼンスルホニル（ＭＢＳ）、２，２，５，７，８－ペンタメチルクロマン－６－スルホニル（Ｐｍｃ）、メシチレン－２－スルホニル（Ｍｔｓ）、２，２，４，６，７－ペンタメチルジヒドロベンゾフラン－５－スルホニル（Ｐｂｆ）、Ｂｏｃ、Ｚ、ＮＯ２などが挙げられる。リジンの側鎖アミノ基の保護基の例として、Ｚ、Ｃｌ－－Ｚ、トリフルオロアセチル、Ｂｏｃ、Ｆｍｏｃ、Ｔｒｔ、Ｍｔｒ、４，４－ジメチル－２，６－ジオキソシクロヘキシリデニル（Ｄｄｅ）などが挙げられる。トリプトファンのインドリルのための保護基の例として、ホルミル（Ｆｏｒ）、Ｚ、Ｂｏｃ、Ｍｔｓ、Ｍｔｒなどが挙げられる。アスパラギンおよびグルタミンのための保護基の例として、Ｔｒｔ、キサンチル（Ｘａｎ）、４，４’－ジメトキシベンズヒドリル（Ｍｂｈ）、２，４，６－トリメトキシベンジル（Ｔｍｏｂ）などが挙げられる。出発物質中の活性化カルボキシル基の例として、対応する酸無水物、アジド、活性エステル［アルコールとのエステル（例えば、ペンタクロロフェノール、２，４，５－トリクロロフェノール、２，４－ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（hydroxysuccimide）、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、１－ヒドロキシ－７－アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ））］などが挙げられる。出発材料中の活性化アミノ基の例として、対応する亜リン酸アミドが挙げられる。保護基を取り除く（除去する）ための方法の例として、Ｐｄ－ブラックまたはＰｄ－カーボンなどの触媒の存在下における水素流中での触媒による還元；無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸、トリメチルシリルブロミド（ＴＭＳＢｒ）、トリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネート、テトラフルオロホウ酸、トリス（トリフルオロ）ホウ酸、三臭化ホウ素、またはこれらの混合溶液を用いる酸処置；ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどを用いる塩基処置；および液体アンモニア中のナトリウムによる還元などが挙げられる。上記の酸処置による除去反応は、一般に、－２０℃～４０℃の温度において行われる；酸処置は、アニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾールおよびパラクレゾールなどのカチオンスカベンジャー；ジメチルスルフィド、１，４－ブタンジチオール、１，２－エタンジチオールなどを添加することにより、効率的に行われる。また、ヒスチジンのイミダゾールの保護基として用いられる２，４－ジニトロフェニル基は、チオフェノール処置により取り除かれる；トリプトファンのインドールの保護基として用いられるホルミル基は、１，２－エタンジチオール、１，４－ブタンジチオールなどの存在下における酸処置による、ならびに希釈水酸化ナトリウム、希釈アンモニアなどによるアルカリ処置による脱保護により取り除かれる。
さらに、本発明の非天然分子は、溶媒和物（例えば水和物）または非溶媒和物（例えば非水和物）であり得る。非天然分子は、同位体（例えば３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、１２５Ｉ）などで標識され得る。さらに、非天然分子は、１Ｈが２Ｈ（Ｄ）に変換される重水素変換形態であってもよい。同位体で標識または置換されたペプチドは、例えば、陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）用のトレーサー（ＰＥＴトレーサー）として用いることができ、医学的診断などの分野において有用である。
本明細書において記述される非天然分子（純粋にペプチドからなる場合）について、従来のペプチドのマーキングに従って、左末端はＮ末端（アミノ末端）であり、右末端はＣ末端（カルボキシル末端）である。ペプチドのＣ末端は、アミド（－ＣＯＮＨ２）、カルボキシル基（－ＣＯＯＨ）、カルボン酸（－ＣＯＯ－）、アルキルアミド（－ＣＯＮＨＲ）、およびエステル（－ＣＯＯＲ）のうちのいずれかであってよい。特に、アミド（－ＣＯＮＨ２）が好ましい。非天然分子は、塩の形態であってもよい。かかる塩の例として、金属塩、アンモニウム塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などが挙げられる。
ある態様において、非天然分子はまた、プロドラッグ形態であってもよい。プロドラッグとは、生体内の生理学的条件下において、酵素、胃酸などに起因する反応により本発明の機能的ペプチドに変換される化合物、すなわち、酵素による酸化、還元、加水分解などにより、本発明のペプチドに変換される化合物；胃酸などに起因する加水分解などにより本発明の非天然分子に変換される化合物を意味する。本発明のペプチドのプロドラッグの例として、ペプチドのアミノが、アシル化、アルキル化またはリン酸化されている化合物（例えば、ペプチドのアミノが、エイコサノイル化、アラニル化、ペンチルアミノカルボニル化、（５－メチル－２－オキソ－１，３－ジオキソレン－４－イル）メトキシカルボニル化、テトラヒドロフラニル化、ピロリジルメチル化、ピバロイルオキシメチル化またはｔｅｒｔ－ブチル化されている化合物など）；ペプチドのヒドロキシが、アシル化、アルキル化、リン酸化またはホウ酸化されている化合物（例えば、ペプチドのヒドロキシが、アセチル化、パルミトイル化、プロパノイル化、ピバロイル化、スクシニル化、フマリル化、アラニル化またはジメチルアミノメチルカルボニル化されている化合物）；ペプチドのカルボキシが、エステル化またはアミド化されている化合物（例えば、ペプチドのカルボキシが、Ｃ１－６アルキルエステル化、フェニルエステル化、カルボキシメチルエステル化、ジメチルアミノメチルエステル化、ピバロイルオキシメチルエステル化、エトキシカルボニルオキシエチルエステル化、フタリジルエステル化、（５－メチル－２－オキソ－１，３－ジオキソレン－４－イル）メチルエステル化、シクロヘキシルオキシカルボニルエチルエステル化またはメチルアミド化されている化合物）などが挙げられる。他のものの中でも、化合物（Ｉ）のカルボキシが、メチル、エチル、ｔｅｒｔ－ブチルなどのＣ１－６アルキルによりエステル化されている化合物が、好ましくは用いられる。これらの化合物は、それ自体公知の方法により、ペプチドから産生することができる。本発明のペプチドのプロドラッグはまた、IYAKUHIN no KAIHATSU（Development of Pharmaceuticals）、第７巻、Design of Molecules、p. 163-198、Published by HIROKAWA SHOTEN（1990年）において記載されるものなどの、生理学的条件下において本発明のペプチドに変換されるものであってよい。本明細書において、プロドラッグは、塩を形成してもよい。かかる塩の例として、本発明のペプチドの塩として例示されるものが挙げられる。本発明のペプチドは、結晶を形成してもよい。単一の結晶形態または複数の結晶形態の混合物を有する結晶もまた、本発明のペプチドにおいて含まれる。結晶は、それ自体公知の結晶化方法に従って本発明のペプチドを結晶化することにより生成することができる。加えて、本発明のペプチドは、薬学的に許容し得る共結晶または共結晶の塩であってもよい。ここで、共結晶または共結晶の塩とは、室温で固体であって、各々が異なる物理学的特性（例えば、構造、融点、融解熱、吸湿性、溶解度、安定性など）を有する２つ以上の特定の物質からなる、結晶性物質を意味する。共結晶および共結晶の塩は、それ自体公知の共結晶化により生成することができる。本発明のペプチドの結晶は、物理化学的特性（例えば、融点、溶解度、安定性）および生物学的特性（例えば、薬物動態（吸収、分布、代謝、排出）、効率の表出）において優れ、したがって、医薬として極めて有用である。
本発明の非天然分子の投与－本発明の非天然分子を含む医薬組成物
一態様において、本発明の非天然分子は、対象に直接投与される。一般に本発明の化合物は、薬学的に許容し得るキャリア（例えば、生理食塩水）中に懸濁させて、経口で、または静脈内注入により投与されるか、または、皮下で、筋肉内で、髄腔内、腹腔内で、直腸内で、膣内で、鼻内で、胃内で、気管内で、大脳内でもしくは肺内で投与されるであろう。別の態様において、大脳内または気管内送達は、投与ポンプを用いて達成することができる。必要とされる投与量は、投与の経路の選択肢；処方物の性質；患者の疾病の性質；対象のサイズ、重量、表面積、年齢および性別；投与されている他の薬物；ならびに主治医の判断に依存する。好適な投与量は、０．０１～１００ｍｇ／ｋｇの範囲である。多様な非天然分子および可能なバリアント、ならびに多様な投与経路の異なる効率を考慮して、必要とされる投与量の広範なバリエーションが予測される。例えば、経口投与は、ｉ．ｖ．注射による投与よりも高い投与量を必要とすることが予測されるであろう。これらの投与レベルのバリエーションは、当該分野においてよく理解されているような最適化のための標準的な実験ルーチンを用いて調整することができる。投与は、単一であっても複数であってもよい（例えば、２倍、３倍、４倍、６倍、８倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、１５０倍、またはそれより多く）。
ある態様において、本発明の非天然分子は、例えば非天然分子を分解に対して保護するために、少なくとも１つの修飾された末端を含む。いくつかの態様において、Ｎ末端をアセチル化するか、および／またはＣ末端をアミド化する。ある態様において、本発明の非天然分子は、少なくとも１つの非天然のアミノ酸（例えば１つ、２つ、３つもしくはそれより多く）、または少なくとも１つの末端修飾（例えば１つもしくは２つ）を含む。いくつかの態様において、非天然分子は、少なくとも１つの非天然のアミノ酸および少なくとも１つの末端修飾を含む。
本発明の非天然分子は、任意に、他の治療剤と組み合わせて送達してもよい。さらなる治療剤を、本発明の非天然分子と同時に送達してもよい。本明細書において用いられる場合、「同時に（concurrently）」という語は、組み合わせ効果を生成するために十分に時間的に近いことを意味する（すなわち、同時に（concurrently）とは、同時に（simultaneously）であってもよく、または、それは、２つ以上のイベントが、互いの前後の短期間のうちに起こることであってもよい）。キットは、方法を実施するためのさらなる剤（例えば、緩衝液、容器、さらなる治療剤）、ならびに説明をさらに含んでもよい。さらなる側面として、本発明は、上で議論される治療効果のうちのいずれかを達成するために、医薬処方物およびこれを投与する方法を提供する。医薬処方物は、上で議論される試薬のうちのいずれかを、薬学的に許容し得るキャリア、例えば天然に存在しないペプチドまたはそのバリアント中に含んでもよい。「薬学的に許容し得る」により、生物学的にまたは別段に望ましくないわけではない材料を意味し、すなわち材料は、毒性などの任意の望ましくない生物学的効果を引き起こすことなく対象に投与することができる。本発明の処方物は、任意に、薬用剤、医薬剤、キャリア、アジュバント、分散剤、希釈剤などを含んでもよい。本発明の非天然分子は、既知の技術に従って、医薬用キャリア中で投与のために処方することができる。例えば、Remington, The Science And Practice of Pharmacy（Ed. 2014）を参照。本発明による医薬処方物の製造において、非天然分子（その生理学的に許容し得る塩を含む）は、典型的には、特に、許容し得るキャリアと混合される。キャリアは、固体または液体、または両方であってよく、好ましくは、ペプチドの重量により０．０１または０．５％～９５％または９９％を含んでもよい単位用量処方物、例えば錠剤として、ペプチドと共に処方される。１つ以上の非天然分子を、本発明の処方物中に組み込むことができ、これは、周知の製薬の技術のうちのいずれかにより調製することができる。本発明のさらなる側面は、対象をin vivoで処置する方法であって、該方法は、本発明の非天然分子を薬学的に許容し得るキャリア中に含む医薬組成物を対象に投与することを含み、ここで、医薬組成物は、治療有効量において投与される。本発明の非天然分子の、それを必要とするヒト対象または動物への投与は、化合物を投与するための当該分野において公知の任意の手段によるものであってよい。本発明の処方物は、経口、直腸、局所、頬側（例えば舌下）、膣、非経口（例えば、皮下、骨格筋、心筋、横隔膜の筋肉および平滑筋を含む筋肉内、皮内、静脈内、腹腔内）、局所（すなわち、気道表面を含む皮膚および粘膜の両方の表面）、鼻内、経皮、関節内、気管内、大脳内および吸入投与、門脈内送達による肝臓への投与、ならびに直接的な臓器注射（例えば、肝臓内へ、中枢神経系への送達のために脳内へ、膵臓内へ、または腫瘍もしくは腫瘍の周囲の組織中へ）のために好適なものを含む。任意の所与の場合における最も好適な経路は、処置されている状態の性質および重篤度に、ならびに、用いられている特定の非天然分子の性質に依存するであろう。
注射のために、キャリアは、典型的には、滅菌のパイロジェンフリー水、滅菌の生理食塩水、高張食塩水、パイロジェンフリーリン酸緩衝生理食塩水などの液体であろう。投与の他の方法のために、キャリアは、固体または液体のいずれであってもよい。経口投与のために、非天然分子は、カプセル、錠剤および粉末などの固体剤形において、またはエリキシル剤、シロップおよび懸濁液などの液体剤形において、投与することができる。非天然分子は、不活性成分および粉末化されたキャリア、例えばグルコース、ラクトース、スクロース、マンニトール、デンプン、セルロースまたはセルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、サッカリンナトリウム、滑石、炭酸マグネシウムなどと一緒に、ゼラチンカプセル中に封入してもよい。望ましい色、味、安定性、緩衝化能力、分散度または他の公知の望ましい特色を提供するために添加することができるさらなる不活性成分の例は、赤色酸化鉄、シリカゲル、ラウリル硫酸ナトリウム、二酸化チタン、食用白色インクなどである。類似の希釈剤は、圧縮錠剤を製造するために用いることができる。錠剤およびカプセルはいずれも、数時間の期間にわたり薬品の連続的な放出をもたらすために、持続放出用製品として製造することができる。圧縮錠剤は、任意の不快な味を遮蔽して、錠剤を雰囲気から保護するために、糖コーティングまたはフィルムコーティングされていても、または胃腸管における選択的崩壊のために、腸溶性コーティングされていてもよい。経口投与のための液体剤形は、患者のアクセプタンスを増大するために、着色剤および香味剤を含んでもよい。頬側（舌下）投与のために好適な処方物として、香味付けされた基剤（通常はスクロースおよびアラビアゴムまたはトラガカント）中に非天然分子を含むロゼンジ；ゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアラビアゴムなどの不活性な基剤中に非天然分子を含むトローチが挙げられる。非経口投与のために好適な本発明の処方物は、滅菌の水性および非水性の非天然分子の注射溶液を含み、この調製物は、好ましくは、意図されるレシピエントの血液と等張である。これらの調製物は、抗酸化剤、バッファー、静菌剤、および処方物を意図されるレシピエントの血液と等張にする溶質を含んでもよい。水性および非水性の滅菌の懸濁液は、懸濁剤および濃縮剤を含んでもよい。処方物は、単位／用量または複数用量の容器、例えば密封されたアンプルおよびバイアル中に存在してもよく、凍結乾燥（freeze-dry／lyophilize）状態において貯蔵してもよく、これは、使用の直前に、滅菌の液体キャリア、例えば食塩水または注射用水の添加のみを必要とする。
即時注射溶液および懸濁液は、先に記載される種類の滅菌の粉末、顆粒および錠剤から調製することができる。例えば、本発明の一側面において、密封された容器中の単位剤形における、本発明の非天然分子を含む、注射可能な、安定な滅菌組成物が提供される。非天然分子または塩は、好適な薬学的に許容し得るキャリアにより再構成して、対象中へのその注射のために好適な液体組成物を形成することができる、凍結乾燥物の形態において提供される。単位剤形は、典型的には、約１ｍｇ～約１０グラムの非天然分子または塩を含む。非天然分子または塩が、実質的に非水溶性である場合、十分量の薬学的に許容し得る乳化剤を、当該非天然分子または塩を水性キャリア中で乳化するために十分な量で使用することができる。１つのかかる有用な乳化剤は、ホスファチジルコリンである。直腸投与のために好適な処方物は、好ましくは、単位用量の坐剤として提示される。これらは、非天然分子を、１つ以上の従来の固体キャリア、例えばカカオバターと混合して、次いで、生じた混合物を成形することにより、調製することができる。皮膚への局所適用のために好適な処方物は、好ましくは、軟膏、クリーム、ローション、ペースト、ゲル、スプレー、エアロゾルまたはオイルの形態をとる。用いることができるキャリアとして、ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、アルコール、皮膚浸透増強剤（transdermal enhancer）、およびこれらの２つ以上の組み合わせが挙げられる。経皮投与のために好適な処方物は、レシピエントの表皮との密接な接触を長期間にわたり保持するように適応させた個別のパッチとして提示してもよい。経皮投与のために好適な処方物はまた、イオン泳動により送達することができ（例えばTyle, Pharm. Res. 3:318 (1986)を参照）、典型的には、任意に、緩衝化されたペプチドの水溶液の形態をとってよい。好適な処方物は、クエン酸またはビス／トリスバッファー（ｐＨ６）またはエタノール／水を含み、０．１～０．２Ｍの化合物を含む。非天然分子は、代替的に、鼻内投与のために処方してもよく、別段に、任意の好適な手段により、対象の肺に投与しても、例えば、対象が吸入する非天然分子含有呼吸用粒子のエアロゾル懸濁液により投与してもよい。呼吸用粒子は、液体であっても固体であってもよい。用語「エアロゾル」は、細気管支または鼻孔中に吸入されることができる任意の気体媒介性の懸濁相を含む。特に、エアロゾルは、気体媒介性の液滴の懸濁液を含み、これは、定量噴霧式吸入器またはネブライザーにおいて、またはミストスプレー器において、生成することができる。エアロゾルはまた、空気または他のキャリアガス中に懸濁された乾燥粉末組成物を含み、これは、例えば吸入デバイスからガス注入により送達することができる。非天然分子を含む液体粒子のエアロゾルは、当業者に公知であるとおりの任意の好適な手段により、例えば圧力駆動式エアロゾルネブライザーまたは超音波式ネブライザーにより、生成することができる。非天然分子を含む固体粒子のエアロゾルは、同様に、製薬の分野において公知の技術により、任意の固体粒子医薬用エアロゾル発生器により生成することができる。あるいは、全身性の様式ではなくむしろ局所性の様式において、例えばデポーまたは持続放出処方物において、非天然分子を投与してもよい。
さらに、本発明は、本明細書において開示される非天然分子およびその塩のリポソーム処方物を提供する。リポソーム懸濁液を形成するための技術は、当該分野において周知である。非天然分子またはその塩が水溶性の塩である場合、従来のリポソーム技術を用いて、前記非天然分子またはその塩を、脂質小胞中に組み込むことができる。かかる場合において、非天然分子またはその塩の水溶性に起因して、当該非天然分子またはその塩は、実質的に、リポソームの親水性の中心またはコア内に搭載されるであろう。使用される脂質層は、任意の従来の組成のものであってよく、コレステロールを含むものであっても、コレステロールフリーであってもよい。目的の非天然分子またはその塩が非水溶性である場合、やはり、従来のリポソーム形成技術を使用して、当該塩を、実質的に、リポソームの構造を形成する疎水性脂質二重層中に搭載することができる。いずれの場合においても、生成されるリポソームは、標準的な超音波処理および均質化技術の使用を通して、サイズを縮小してもよい。本明細書において開示されるペプチドまたはその塩を含むリポソーム処方物を、凍結乾燥して、凍結乾燥物を生成してもよく、これは、水などの薬学的に許容し得るキャリアにより再構成して、リポソーム懸濁液を再生することができる。非水溶性非天然分子の場合、医薬組成物は、非水溶性ペプチドを、例えば水性基剤などのエマルジョン中で含んで調製してもよい。かかる場合において、組成物は、所望される量の非天然分子を乳化するために十分な量の薬学的に許容し得る乳化剤を含むであろう。特に有用な乳化剤として、ホスファチジルコリンおよびレシチンが挙げられる。特定の態様において、非天然分子は、その用語が上で定義されるとおり、治療有効量において対象に投与される。薬学的に活性な非天然分子の投与量は、当該分野において公知の方法により決定することができる。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciencesを参照。任意の特定の非天然分子の治療有効投与量は非天然分子ごと、および患者ごとに変化し、患者の状態および送達の経路に依存するであろう。一般的な提案として、投与される活性成分の総量は、一般に、１日当たり約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約２００ｍｇ／体重１ｋｇ、好ましくは１日当たり約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／体重１ｋｇの範囲である。臨床的に有用な投与スケジュールは、１日１～３回の投与から４週間に１回の投与の範囲である。さらに、患者が一定期間薬物を服用しない「休薬期間」は、薬理効果と耐容性の全体的なバランスに有益であり得る。単位投与量は、約０．５ｍｇ～約１５００ｍｇの活性成分を含有してよく、１日１回以上または１日１回未満投与することができる。静脈内、筋肉内、皮下および非経口注射を含む注射による投与、ならびに注入技法の使用のための平均１日投与量は、好ましくは、０．０１～２００ｍｇ／ｋｇ総体重である。平均１日直腸投薬レジメンは、好ましくは０．０１～２００ｍｇ／ｋｇ総体重である。平均１日経膣投薬レジメンは、好ましくは、０．０１～２００ｍｇ／ｋｇ総体重である。平均１日局所投薬レジメンは、好ましくは、１日１回～４回の間で投与される０．１ｍｇ～２００ｍｇである。経皮濃度は好ましくは、１日用量０．０１～２００ｍｇ／ｋｇを維持するのに必要な濃度である。平均１日吸入投薬レジメンは、好ましくは、０．０１～１００ｍｇ／ｋｇ総体重である。好ましくは、吸入用組成物は、単独で、またはラクトースなどの不活性キャリアと組み合わせて、嗅剤またはエアロゾルまたは噴霧器用の溶液として、または吹送用の極微粉末として、気道に投与するために提供される。かかる場合、活性な非天然分子の粒子は、適切には、直径が５０ミクロン未満、好ましくは１０ミクロン未満、例えば１～５ミクロン、例えば２～５ミクロンである。代替的に、粒径が３０～５００ｎｍのコーティングされたナノ粒子を使用することができる。好ましい吸入用量は、０．０５～２ｍｇ、例えば、０．０５～０．５ｍｇ、０．１～１ｍｇ、または０．５～２ｍｇの範囲である。
当業者にとって、各患者に対する特定の初期および継続的投薬レジメンは、担当の診断医によって決定される状態の性質および重症度、使用される特定の非天然分子の活性、患者の年齢および全身状態、投与時間、投与経路、薬物の排泄速度、薬物の組み合わせなどによって変化するだろう。本発明の非天然分子またはその薬学的に許容し得る塩もしくはエステルもしくは組成物の所望の処置様式および投与回数は、従来の処置試験を用いて当業者によって確認することができる。
一般的慣例として、組成物には通常、関係する医療処置において使用するための書面または印刷された指示書が添付される。
本発明は、獣医学および医学的適用において用途を見出す。好適な対象として、鳥類および哺乳動物の両方が挙げられ、哺乳動物が好ましい。用語「鳥類」は、本明細書において用いられる場合、これらに限定されないが、ニワトリ、カモ、アヒル、ウズラ、シチメンチョウ、およびキジを含む。用語「哺乳動物」は、本明細書において用いられる場合、これらに限定されないが、ヒト、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ネコ、イヌ、ウサギ類などを含む。ヒトの対象は、新生児、幼児、青少年および成人を含む。
併用療法
特定の態様において、本発明の非天然分子は、単独の医薬品として、またはその組み合わせが許容し得ない副作用を引き起こさないような１つ以上の他の医薬品と組み合わせて、投与することができる。本発明は、かかる組み合わせにも関する。例えば、本発明の非天然分子は、異常凝集を減少させる既知の薬剤、ならびにそれらの混合物および組み合わせ、または細胞内タンパク質分解系、特にオートファジー系を誘導する既知の薬剤と組み合わせることができる。オートファジー誘導因子のよく知られた例はRusso M and Russo GL (2018), Biochem. Pharmacol. 153,51-56に記載されており、表１を参照されたい；いくつかの例は、ＢＨ－３ミメティクス（－）ゴシポール、ＡＢＴ－７３７、メシル酸オバトクラックス、および、メトホルミン、ラパマイシン、ラパログなどの承認済み薬剤、およびトレハロース、レスベラトロール、クルクミン、ケルセチンなどの天然化合物である。
本明細書を通して述べられている「処置すること」または「処置」という用語は慣用的に用いられ、アミロイド障害などの疾患または障害の状態等と、闘う、緩和する、縮小する、軽減する、改善する等の目的での、例えば対象の管理またはケアとして使用される。
特定の態様、特定の構成、ならびに材料および／または分子が、本発明による操作されたペプチドおよび方法に関して本明細書で論じられてきたが、形態および詳細における様々な変更または改変が、本発明の範囲および精神から逸脱することなくなされ得ることが理解されるべきである。以下の例は、特定の態様をよりよく説明するために提供されるものであり、本出願を限定すると考えるべきではない。本出願は請求項によってのみ限定される。
１．キャッピングペプチドの設計
本発明において、キャッピングペプチド配列の構造に基づく設計のための方法論を開発した；キャッピングペプチド配列は、哺乳動物において異常凝集体を形成可能なタンパク質の凝集を停止（または低減）することができる。方法は、異常凝集体を形成可能なタンパク質の、異常凝集体（異常凝集体は、異常凝集体を形成可能な全長タンパク質の３Ｄ構造、またはアミロイドコアの３Ｄ構造のいずれか）の３Ｄ構造の利用可能性に依存する。異常凝集体を形成するタンパク質は、文献ではアミロイド線維または非アミロイド線維を形成可能なタンパク質として分類されているが（Chiti F and Dobson CM (2017) Annu. Rev. Biochem. 86: 27-68の表１および表２を参照）、非アミロイド線維を形成すると記載されているタンパク質（例えば、ＦＵＳ、ｐ５３、およびＴＤＰ－４３など）も短い凝集タンパク質領域を有し、分離されるとアミロイド線維を形成し、これらのアミロイド線維からアミロイドコアの３－Ｄ構造（さらに簡単に言えば、アミロイドコア構造）が利用可能であると言われている。異常凝集体の３次元構造または異常凝集体を形成可能なタンパク質のアミロイドコア構造から開始する我々のこの方法においては、forcefieldアルゴリズムを使用して、候補キャッピングペプチドのリスト（詳細を参照）とアミロイドコア構造（または異常凝集体の３－Ｄ構造）の間の相互作用エネルギーを計算する。この例では、FoldX力場を使用して、推定される相互作用の熱力学的安定性を計算した。特定のアミロイドコア構造のテンプレート３Ｄ構造は、例えば、オンラインのProtein Data Bank（ＰＤＢデータベース、（www.rcsb.org））から取得可能である。
方法論の最初のステップは、アミロイドコアのアミノ酸配列のバリアントのin silicoリストを生成することから始まる。アミロイドコアのアミノ酸配列は、異常凝集体を形成可能なタンパク質に存在する５～１０アミノ酸のペプチドである、易凝集性領域（ＡＰＲ領域）として知られている。ＡＰＲ配列は、アミロイドコアの一次アミノ酸配列（３Ｄ構造が入手可能である）であるか、またはかかるＡＰＲ配列は、異常凝集体を形成可能なタンパク質において、本明細書で前述した適切なＡＰＲ同定アルゴリズムを使用して同定することができる（３Ｄ構造を生成または予測することができる）。したがって、ＡＰＲ配列から開始して、このＡＰＲ配列の１、２、または３個のアミノ酸をすべての可能な１９の異なるアミノ酸に置換したバリアントのin silicoリストを生成する（図１では、かかるバリアントは「エッジバリアント」として示される）。次のステップでは、候補ペプチド（ＡＰＲバリアントのin silicoリストからなる）を、以下の方法論に従ってさらに使用する。
我々は、この方法を構築する際に次のように推論した：すなわち、候補ペプチドがキャッピングペプチドとしての資格を得るには、成長しているアミロイドコアの軸端に強く結合する必要があるが、同時にペプチドは、線維軸に沿ったさらなる伸長を妨げる十分な構造破壊を導入する必要がある。後者は、野生型（または通常の）伸長／核形成配列とは対照的である。以下の方法は、野生型ＡＰＲ領域の配列と比較して、１つのアミノ酸の違いを有するバリアントを用いて示す。
この要件は、２つの相互作用エネルギー間の組み合わせ結果に分解できる（図１ａおよび１ｂを参照）：
ΔΔＧ相互作用＝ΔＧエッジバリアント－ΔＧエッジＡＰＲ （１）
ΔΔＧ伸長＝ΔＧエッジ伸長バリアント－ΔＧエッジＡＰＲ （２）
ここで、ΔＧエッジバリアントは、ＡＰＲアミロイドコアにドッキングされた単一のバリアント鎖の間の相互作用エネルギーであり（図１ａ）、ΔＧエッジ伸長バリアントは、バリアントがシーディングされたＡＰＲアミロイドコアの軸端にドッキングされた単一のバリアント鎖の間の相互作用の自由エネルギーであり（図１ｂ）、およびΔＧエッジＡＰＲは、同じアミロイドコアに対する単一のＡＰＲ鎖の間の相互作用エネルギーに対応する（図１ａ、ＡＰＲ自己凝集経路）。
配列が、ＡＰＲ凝集コアとのクロストークに関与するのに適合すると見なされるためには、（１）から好ましい相互作用が必要である。２番目の関数（２）によって与えられる同じバリアントの伸長エネルギーが、同時の好ましい相互作用に対応する場合、バリアントはアミロイドのヘテロタイプの成長を促進することができ、したがって共凝集経路につながる（図１、ヘテロタイプ凝集を参照）。一方、線維のエッジに立体障害を導入する配列は、先端でのさらなる成長の阻害をもたらし、したがって凝集阻害剤として機能する（図１、凝集キャッピングを参照）。
相互作用ポテンシャルは、線維の同じ端での相加的ＡＰＲイベントの凝集ポテンシャルに関連して計算される。この比較の背後にある論拠は３つである：（ｉ）これが、計算されたエネルギーポテンシャルの、実験的に決定された結晶構造に由来する熱力学的に安定した相互作用セグメントとの直接比較を提供すること、（ｉｉ）代替ＡＰＲアミロイドコア間のクロストークポテンシャルの比較を可能にすること、なぜならば、前記比較はアミロイド構造の開始安定性に無関心だからであり、および（ｉｉｉ）エネルギーがFoldXアルゴリズムを使用して計算されること、ここでこのアルゴリズムは、最初に構築され、かつ変異の、タンパク質またはペプチド安定性に対する安定化効果の予測に優れている。
（１）によって計算された相互作用ポテンシャルをｘ軸にプロットし、（２）からのポテンシャルをｙ軸にプロットすると、すべてのバリアント配列の二次プロファイルが得られる（図２を参照）。図２は、タウタンパク質で同定されたＡＰＲである配列番号８のアミノ酸配列バリアントを示す。左上の象限は、同定されたＡＰＲテンプレート構造に対して潜在的なキャッピングペプチドとして作用すると予測される配列バリアントに対応する。有利なバリアント配列（左上象限）は、ＡＰＲコアの三次元構造との相互作用について負のデルタＧ自由エネルギーおよび、バリアント配列が軸端に結合されているＡＰＲコアの三次元構造との伸長について正のデルタＧ自由エネルギーを有する。
２．タウアミロイドを特異的に分解可能な非天然分子の設計
表２は、タウアミロイドを特異的に分解する非天然分子を生成するための要素を示す。第１列は、キャッピングペプチド分子のＩＤ名を示す。第２列（キャッピングペプチドと題されている）は、単一キャッピングペプチドとタンデムキャッピングペプチドを示す。タンデムキャッピングペプチドにおいて、２つの同一または２つの異なるキャッピングペプチドを使用することができる。キャッピングペプチドは、タウ凝集体の形成を停止するように設計されている。表２に示されるすべてのキャッピングペプチドは、タウタンパク質で同定された２つのＡＰＲに基づいている：６２３ＶＱＩＶＹＫ６２８（配列番号７）および５９２ＶＱＩＩＩＮＫ５９７（配列番号８）。キャッピングペプチド（第２列に示されている）は異常タウアミロイドを分解しないため、キャッピングペプチドは細胞内タンパク質分解系を標的とする部分に融合される。ＶＨＬタグへの融合（第３列、ＡＬＡＯＹＩＰペプチド配列（配列番号１）、「Ｏ」はアミノ酸ヒドロキシプロリン）またはジャベリンタグへの融合（第３列、ＮＬＬＲＬＴＧＷペプチド配列（配列番号６））またはセレブロン（ＣＲＢＮ）を標的とする小分子（ポマリドミド）への融合。表２に示されるキャッピングペプチド（第１列の１１の異なるペプチド配列）とそれぞれ３つの異なる標的部分（第３、第４および第５列にそれぞれに示される部分）との間の組み合わせは、３３の異なる非天然分子の組み合わせをもたらす。タンデムキャッピングペプチド（同一または異なるキャッピングペプチド間）および（タンデム）キャッピングペプチドとＶＨＬまたはジャベリンタグの間に、柔軟なＧＳリンカーが挿入される。
Figure 2023525149000004
 表２：異なるキャッピングペプチド（キャッピングペプチド配列は第２列で下線が引かれている）および３つの異なる部分（第３、第４および第５列）との組み合わせの概略図であり、これは、実験で使用される、本発明の３３の異なる非天然分子をもたらす。残基ＲおよびＤはゲートキーパーアミノ酸であり、残基Ｏは人工アミノ酸ヒドロキシプロリンである。ＧＳおよびＧＳＧＳはリンカー配列である。
３．非天然分子の細胞スクリーニングアッセイ
３３種類の非天然分子（最終濃度１０μＭ）を、事前形成された（超音波処理された）タウ凝集体（最終濃度４μＭ）と混合した。事前形成されたタウ凝集体は、遠赤色のatto-633色素で標識され、細胞での取り込みと分解の効率を監視する。６時間のインキュベーション後、得られた非天然分子とタウ凝集体の混合物を、タウバイオセンサー細胞にトランスフェクトした（Holmes et al (2014) Proc Natl Acad Sci U S A. 111(41): E4376-E4385に記載）。タウバイオセンサー細胞株は、蛍光タンパク質ＣＦＰに融合したタウリピートドメイン（ＲＤ）と蛍光タンパク質ＹＦＰに融合したタウリピートタンパク質の両方を安定して発現する、モノクローナルＦＲＥＴバイオセンサーＨＥＫ２９３Ｔ細胞株である。事前形成されたタウシードを添加しなくても、バイオセンサー細胞はびまん性タウ（可溶性）を安定して発現する。ただし、外因性の事前形成タウ凝集体への曝露は、タウ凝集を誘導し、ＣＦＰ－ＹＦＰペアのＦＲＥＴシグナルを生成し、タウ封入体の蛍光シグナルを増強する。ＦＲＥＴシグナルにより、タウ凝集体形成を単量体バックグラウンドから区別することができる。外因性タウ凝集体のトランスフェクションにリン脂質（リポフェクタミンなど－供給源：Thermofisher）を使用すると、凝集体誘導能が最大化される。
細胞に適用される非天然分子の最終ペプチド濃度は５００ｎＭであり、事前形成タウ凝集体の最終濃度は２００ｎＭである。トランスフェクションの２０時間後に細胞を固定し、２つの読み取り値を使用して非天然分子の活性を定量化した：
－緑色スポットを有する細胞の割合の決定：これらは、タウ凝集を誘導した細胞である。
－赤色スポットを有する細胞の割合の決定：これらは、事前形成タウ凝集体に対して陽性の細胞である。
このスクリーニングは、非天然分子の活性を比較するのには理想的ではない１つの非天然分子濃度（５００ｎＭ）でのみ実行されることに、注意することが重要である。実際、分解誘導分子の濃度が高すぎると、その活性に悪影響を与える可能性がある（二相性の挙動）。したがってこのアッセイは、本発明で定義される活性（または不活性）非天然分子を同定するための、最初のフィルターとして機能する。
図３は、ビヒクル対照、キャッピングペプチド（第２列参照）、および非天然分子（分解部分に融合したキャッピングペプチド）で処理されたタウバイオセンサー細胞の、一般的原理を示す。
次のステップにおいて、表２に示すすべての非天然分子（第２列のペプチドと第３、４、および５列に示すそれぞれの部分の組み合わせ）を、タウバイオセンサーシーディングアッセイでスクリーニングした（図４および５を参照）。データ分析は、緑色（内因性タウ凝集体）を含有する細胞の割合の定量化－図４を参照、または赤色（外因性タウ凝集体）スポットを含有する細胞の割合の定量化－図５を参照、に基づく。
フォローアップ実験で非天然分子をさらに生成するために、２つのキャッピングペプチドを選択した：ＣＡＰ１＿ＴＲおよびＨＥＴ（表２の第１列のＩＤ番号を参照）。後者のキャッピングペプチドはタンデムペプチドであるが、「単一」ペプチドＣＡＰ１の配列に基づく非天然分子も、キャッピング活性（ＪＡＶ部分に融合したキャッピングペプチド、図２を参照）および分解活性（ＪＡＶ部分に融合したキャッピングペプチド、図５を参照）を示す。
４．細胞アッセイ－濃度範囲の最適化
この例において、本発明の非天然分子は、キャッピングペプチドＣＡＰ１＿ＴＲおよびＨＥＴの配列（表２の第２列に示される配列）に基づいて生成した。タウバイオセンサーシーディングアッセイは、ペプチドの濃度範囲で実行した。したがって、アッセイは例２で説明したものと同じであるが、ただしキャッピングペプチドおよびキャッピングペプチドを含む非天然分子の濃度範囲を使用して、事前形成タウ凝集体とインキュベートした。図６および７は、細胞に適用されたペプチドおよび誘導された非天然分子の最終濃度を示す（図６および７を参照）。
図６は、ＣＡＰ１＿ＴＲペプチドを含む非天然分子のそれぞれが、誘導されたタウ凝集を濃度依存的に減少させることを示す（図４Ａの曲線を参照）。さらに、ＶＨＬ部分を含む非天然分子は、最高濃度でタウ凝集体の分解を誘導する（図４Ｂの曲線を参照）。裸のキャッピングペプチドＣＡＰ１＿ＴＲ（言い換えると、分解部分に融合されていない）も、最高濃度で赤色スポット陽性の細胞のわずかな減少を示すことが観察される。これは分解によるものではなく、取り込みの減少によるものである（赤いタウ凝集体が細胞の外側に固着している）。これは技術的人工物であるが、この人工物によってもなお、ＶＨＬ部分を含む非天然分子がタウ凝集体陽性の細胞の割合をさらに減少させることは明らかである。
図７は、ＨＥＴペプチドおよび分解部分を含む非天然分子のそれぞれが、誘導されたタウ凝集を濃度依存的に減少させることを示す（図７Ａの緑色曲線）。さらに、ＶＨＬ部分およびＪＡＶ部分を含む非天然分子は、最高濃度でタウ凝集体の分解を誘導する（図７Ｂの赤色曲線）。ＶＨＬ部分を含む非天然分子は二相曲線を示し、この非天然分子の濃度が高くなると、細胞分解系が過負荷になることを示す。ＪＡＶ部分を含む非天然分子は、明確な濃度依存性の、タウ凝集体の分解を示す。さらなる例として、図８は、ペプチドおよびそれに由来する非天然分子ＣＡＰ１＿ＴＲ、ＣＡＰ１＿ＴＲ－ＪＡＶ、ＨＥＴ、およびＨＥＴ－ＪＡＶ（３１２ｎＭにて）が、事前形成されたタウ凝集体をシーディングしたタウバイオセンサー細胞に及ぼす影響を示す。
一見したところ、非天然分子ＣＡＰ１＿ＴＲ－ＪＡＶは、上記の定量化によると、タウ凝集体の分解に（適用された濃度で）明確な影響を示さないことに注意されたい（図６Ｂ、３番目のパネルを参照）；これは我々の観察によれば、対照と比較して、同じ数の細胞がatto-633タウ凝集体を含んでいるからである。それにもかかわらず、図８（３番目のパネル）は、細胞内のatto-633タウ凝集体サイズへの影響を明確に示している（細胞は非常に小さな赤色封入体のみを含有する）。考えられる説明の１つは、タウの分解は実際に進行中であるが、まだ最終段階には達していないということである。
５．in vitroタウ凝集アッセイ
キャッピングペプチドおよびそれに由来する非天然分子もまたin vitroでタウ凝集を減少させるかどうかを検証するために、Ｔｈ－Ｔ凝集アッセイを実施した（Xue et al (2017) R Soc Open Sci. 4(1):160696）。キャッピングペプチド（最終濃度６μＭ）を全長単量体タウタンパク質（最終濃度９μＭ）と混合し、Ｔｈ－Ｔ蛍光を経時的に監視した。これは、事前形成タウ凝集体の添加なし（「シーディングなし」）、および事前形成タウ凝集体の添加あり（「シーディングあり」）で実行した。後者の場合、事前形成タウ凝集体は、キャッピングペプチドおよびそれに由来する非天然分子と共に、アッセイ開始前に２時間プレインキュベートした。データを図９および１０に示す。
６．本発明の非天然分子の親和性計算
キャッピングペプチドおよびそれに由来する非天然分子の親和性を全長タウで測定するために、マイクロスケール熱泳動（MST, Monolith NT. Automated）実験を実施した。簡単に言えば、atto-633標識タウ単量体またはatto-633標識事前形成タウ凝集体を、濃度範囲のキャッピングペプチドおよびそれに由来する非天然分子と混合し、ＭＳＴ測定を行った。
ＣＡＰ１＿ＴＲキャッピングペプチドを含むすべての非天然分子のデータは非常に明確である（図１１、上のパネルを参照）。実際、ナノモルの親和性がタウ凝集体に対して得られるが、タウ単量体への結合は観察されない。ＨＥＴキャッピングペプチドおよびそれに由来する非天然分子も、タウ単量体と比較してタウ凝集体に対して高い親和性を示すが（図１１、下のパネルを参照）、しかし測定された親和性はＣＡＰ１＿ＴＲバリアントと比較して有意に高い。これは、ペプチド結合の、タウ凝集体の動きに対する実際の効果に依存した、ＭＳＴ測定の性質による可能性がある。親和性データは、Biolayer Interferometry（ＢＬＩ）を使用して測定することもできる。後者の技術により、正確なＫｏｎおよびＫｏｆｆレートの計算が可能である。
７．本発明の非天然分子の取り込み効率
本発明の非天然分子の細胞取り込みを（リポフェクタミンを使用することなく）監視するために、蛍光標識バリアントを使用した。ポマリドミドは固有の緑色蛍光（励起＝４４０ｎｍ；発光＝５１０ｎｍ）を示すため、ポマリドミドを含む非天然分子を使用した。通常のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を最終濃度５μＭの各非天然分子で処理し、２０時間のインキュベーション後、非天然分子の取り込みを、細胞内のポマリドミド蛍光を追跡することにより監視した（図１２を参照）。
大きな違いはあるものの、ほとんどの非天然分子は細胞に効率的に取り込まれていると、我々は結論付けている。タンデムキャッピングペプチドを含む非天然分子は改善された細胞取り込みを示し、またゲートキーパーを含まない非天然分子もゲートキーパーを含む非天然分子と同様の取り込み効率を有することが観察された。驚くべきことに、アミノ酸Ｄからなるゲートキーパーを含む非天然分子は、細胞に取り込まれる効率が低い。
８．アミロイド形態に対する非天然分子の特異性
この実験において、我々は、本発明の非天然分子がタウの単量体形態を分解しないことを証明する。これについて、例２で概説したバイオセンサー細胞株を使用する。キャッピングペプチドおよび、キャッピングペプチドとディグレーダー部分を含む非天然分子は、事前形成されたタウシードの添加なしで、タウバイオセンサー細胞株にトランスフェクトする。２０時間のインキュベーション後、細胞を固定し、固有のタウ－ＣＦＰ強度レベルをチェックする。図１３は、単量体タウが分解されないため、キャッピング（ディグレーダー）ペプチドのいずれもが、ペプチドでの処理時に蛍光の変化を示さないことを示す。
９．ＣＭＡ誘導部分を含む非天然分子
次のステップでは、異なる非天然分子を、配列番号１９に示すキャッピングペプチドに基づいて試験した（表２、ＨＥＴ－ペプチドを参照）。１つの非天然分子（ＨＥＴ＿ＪＡＶ、配列番号２２）は、ジャベリン部分との融合に基づいており、第２および第３の非天然分子は、それぞれの部分：ＣＭＡ１（配列
番号２３）およびＣＭＡ２（配列番号２４）に基づいていた。

HET
WQIVYKGSVWMINK (配列番号19)


HET_JAV
WQIVYKGSVWMINKGSGSNLLRLTGW (配列番号22)


HET_CMA1
WQIVYKGSVWMINKGSGSKFERQKILDQRFFE (配列番号23)


HET_CMA2
WQIVYKGSVWMINKGSGSVKKDQGSKFERQ (配列番号24)

これらの非天然分子の細胞スクリーニングは、例３に従って行った。図１４は、緑色スポットを有する細胞の割合（左パネル）および赤色スポットを有する細胞の割合（右パネル）を示す。
１０．タウ－ＡＰＲ配列に２つのアミノ酸変異を有するタウキャッピングペプチドの設計
本例では、異常タウ凝集体に対する特異性を有するキャッピングペプチドを設計し、ここで該キャッピングペプチドは、選択されたＡＰＲ配列と比較して２つのアミノ酸変異を有する。これについて、配列番号７および配列番号８におけるすべての可能な２アミノ酸置換のリストを生成した。この二重変異体リストからのキャッピングペプチドの選択は、例１に記載の方法に基づいた。このアプローチで得られたキャッピングペプチドの配列を表３に示す。
Figure 2023525149000005
 表３：２つのアミノ酸変異を有するタウ異常凝集体に対して特異性を有するキャッピングペプチド配列を、それぞれ配列番号７および配列番号８と比較したもの。
１１．タウ異常凝集体に向けられたタンデムキャッピングペプチド
本例では、タウ特異性に最適なヘテロ二量体タンデムキャッピングペプチドを同定する目的で、スクリーニングを行った。ヘテロ二量体タンデムキャッピングペプチドは、それぞれが異なるタウＡＰＲ配列を標的とする２つの単一キャッピングペプチドからなる。
タウを標的とする２３の異なるヘテロ二量体タンデムキャッピングペプチドを合成し、その配列を表４に示す。これらのキャッピング ペプチドをＤＭＳＯに溶解し、超音波処理および事前形成されたタウ凝集体またはＳｕｐ３５－ＮＭ凝集体と混合し、それぞれを、ＣＦＰおよびＹＦＰ標識タウ反復ドメインを発現するタウバイオセンサー細胞株、およびＧＦＰ標識Ｓｕｐ３５－ＮＭを発現するＮＭバイオセンサー細胞株にトランスフェクトした。Ｓｕｐ３５－ＮＭはバイオセンサー系統であり、ヘテロタンデムキャッピングペプチドのα特異的効果を検出するための細胞系統として使用した。実際、Saccharomyces cerevisiae翻訳終結因子Ｓｕｐ３５のプリオン決定領域（ＮＭ）は、アミロイド様線維に集合する（Hess S. et al (2007) EMBO reports 8, 12, 1196を参照）。細胞上のキャッピングペプチドの最終濃度は６２５ｎＭであり、シード凝集体（タウまたはＮＭシード）の最終濃度は５０ｎＭであった。２４時間のインキュベーション後、誘導された凝集体を有する細胞の割合を決定し、正規化した。細胞がキャッピングペプチドなしで事前形成凝集体で処理された条件を１に設定し、細胞が事前形成凝集体で処理されなかった条件を０に設定した。図１５の結果は、３回の独立した反復（各々は３回の技術的反復からなる）の平均を示す。データは、ＣＡＰ＿１Ａ、ＣＡＰ＿１Ｅ、およびＣＡＰ＿４Ｄが最もパフォーマンスの高いペプチドであり、タウ凝集の阻害にも特異的であることを示す。
Figure 2023525149000006
 表４：ヘテロ二量体タンデムタウキャッピングペプチドの配列
１２．アミロイドβに向けられたキャッピングペプチドの設計
キャッピングペプチドは、すべてのＡβ ＡＰＲ配列に対して利用可能な異なるアミロイド構造に基づいて設計した（図１６を参照）。最も不利な伸長エネルギーと最も有利な相互作用エネルギーを持つ単一変異体を、キャッピングペプチド設計のために選択し、これらは、図１６で太字の大きなフォントサイズで強調表示されている。
図１６のin silicoで予測されたキャッピングペプチド配列に基づいて、ヘテロタンデムキャッピングペプチドを設計した。すべてのヘテロタンデムは、それぞれが異なるＡβ ＡＰＲを標的とする２つの単一キャッピングペプチド配列からなる。これらのヘテロタンデムキャッピングペプチドから得られた配列を、表５に示す。
Figure 2023525149000007
Figure 2023525149000008
表５：本発明で使用するＡβヘテロタンデムキャッピングペプチドの配列
１２．１ Ａβバイオセンサースクリーニングアッセイ
表５に示すヘテロタンデムキャッピングペプチドをＤＭＳＯに溶解し、ろ過し、事前形成および超音波処理されたＡβ凝集体（２μＭ）と混合した。この混合物を約４時間インキュベートし、Ａβバイオセンサー細胞にトランスフェクトした。Ａβバイオセンサー細胞は、可溶性Ａβ－mCherryを安定して発現し、Ａβ凝集は、事前形成されたＡβ凝集体をこれらの細胞にトランスフェクトすることによって誘導できる（図１７）。細胞上のＡβ凝集体の最終濃度は１００ｎＭであり、キャッピングペプチドの濃度範囲を使用した。
すべての代表的な画像を表示する代わりに、図１８はスポットを含む細胞の相対数を示す。すなわち、シードの添加なしの状態を０、１００ｎＭのＡβ凝集体を加えた状態（キャッピングペプチドなし）を１として示す。
図１８は、ヘテロタンデムキャッピングペプチドＡｂＣａｐ２５が、Ａβのシーディング能力に対して濃度依存効果を有し、ＩＣ５０が１．４２μＭであることを示している。注目に値することには、ヘテロタンデムキャッピングペプチドＡｂＣａｐ１１およびＡｂＣａｐ１４も、最高濃度で効果を有する。
次のステップにおいて、ヘテロタンデムキャッピングペプチドの第２のバッチをスクリーニングし、データを図１９に示す。
１つのヘテロタンデムキャッピング（ＡｂＣａｐ４）の効果の例を図２０に示す。さらに、図２１は、すべての処理細胞の相対的な細胞生存率を示す。データは、未処理の細胞（シードの添加なし）に対して正規化されている。
さらに、すべてのタンデムキャッピングペプチドの活性について分析を行い、すべてのタンデムの特定の単一キャッピングペプチドが、キャッピング活性の増加を一貫して示すかどうかを確認した。この分析を図２２に示す。
この実験から、ＫＬＷＦＦＡ（配列番号９０）およびＭＶＷＧＶＶ（配列番号９１）の２つの単一キャッピングペプチドが最高濃度で良好なスコアを示すことが注目される。
１２．２ Ａβバイオセンサーアッセイ――Ａβ－６４７シード
図１８、１９、および２０に示した結果に基づき、最も有望なキャッピングペプチドヒットを選択した。これらのヒットの配列を表６に示す。
Figure 2023525149000009
 表６：セクション１２．１で特定された最適キャッピングペプチドの配列
表６のヘテロタンデムキャッピングペプチドをＤＭＳＯに溶解し、ろ過し、事前形成および超音波処理されたＡβ－６４７凝集体（１０μＭ）と混合した。この混合物を約１６時間インキュベートし、Ａβバイオセンサー細胞にトランスフェクトした。細胞上のＡβ－６４７凝集体の最終濃度は５００ｎＭであり、キャッピングペプチドの濃度範囲を使用した。データを、図２３、２４、および２５に示す。
１２．３ in vitroＡβシーディング凝集アッセイ
表６のキャッピングペプチドを、ＤＭＳＯ（ストック濃度１ｍＭ）に新たに溶解し、アッセイの前にろ過した。１μＬのペプチドキャッピング溶液を、１９μＬの事前形成および超音波処理されたＡβ線維（ストック濃度１０μＭ）と混合した。そのためこの混合物は、１０μＭのＡβ線維と５０μＭのキャッピングペプチドを含有し、これを約４時間インキュベートした。次に、新たに溶解した単量体Ａβを、カラムで分離することにより調製した。この単量体Ａβ（最終濃度１０μＭ）を１０％のＡβ線維－ペプチド混合物と混合し、Ｔｈ－Ｔを加えて凝集を監視した。データの結果を図２６に示す。
我々は、キャッピングペプチドＡｂＣＡＰ＿２、ＡｂＣＡＰ３、ＡｂＣＡＰ４、およびＡｂＣＡＰ１９は、事前形成および超音波処理されたＡβ線維のシーディング能力に明確な影響を与えると結論付けている。
１２．４ in vitro親和性アッセイ
表６のキャッピングペプチドを、ＤＭＳＯ（ストック濃度１ｍＭ）に新たに溶解し、アッセイの前にろ過した。１μＬのペプチドキャッピング溶液を、１９μＬの事前形成および超音波処理されたＡβ－６４７線維（ストック濃度５００ｎＭ）または超音波処理されたタウ－６３３線維（２５０ｎＭ）と混合した。この混合物のＭＳＴ測定値を直ちに監視した。図２７はFnorm値を表す；簡潔に言うと、超音波処理された線維のみと、キャッピングペプチドと混合した超音波処理された線維との間のFnorm値の違いは、結合イベントを示す。
３つの最も有望なキャッピングペプチド（ＡｂＣａｐ３、４、および１９）について、上記と同じ実験を、超音波処理Ａβ－６４７線維および超音波処理タウ－６３３線維の両方に対するキャッピングペプチドの濃度範囲を使用して、実施した。データを図２８に示す。
１３．異常凝集体を形成可能な追加のタンパク質に対するキャッピングペプチドの設計
１３．１ トランスサイレチンの異常凝集体に向けられたキャッピングペプチド
トランスサイレチン（ＴＴＲ）は、異常凝集体を形成可能なタンパク質である。ＴＴＲの異常凝集体は、老人性全身性アミロイドーシス、家族性アミロイドポリニューロパチー、家族性アミロイド心筋症、および軟膜アミロイドーシスに関連する（Chiti F and Dobson CM (2017) Annu. Rev. Biochem. 86: 27-68）。キャッピングペプチドは、例１に記載のように、ＴＴＲの異常凝集体を標的として設計した。ＴＴＲのアミノ酸配列は、UniProtアクセッション番号（https://www.uniprot.org）P02766として入手可能である。ＴＴＲに存在する標的ＡＰＲ配列ＹＴＩＡＡＬＬＳＰＹＳ（配列番号９２）のアミロイドコア構造は、タンパク質構造データベース（www.rcsb.org）で2m5nとして入手可能である。例１で概説したように実施したこのアミロイドコア構造に基づく分析を、図２９に示す。
分析から同定された３つの予測されたキャッピングペプチドは、ＹＴＩＹＡＬＬＳＰＹＳ（配列番号９３）、ＹＴＩＡＰＬＬＳＰＹＳ（配列番号９４）およびＹＴＩＡＡＬＦＳＰＹＳ（（配列番号９５）である。
したがって、細胞内タンパク質分解系を標的とする部分に連結されたＴＴＲの異常凝集体を標的とするキャッピングペプチドを含む非天然分子は、老人性全身性アミロイドーシス、家族性アミロイドポリニューロパチー、家族性アミロイド心筋症、および軟膜アミロイドーシスを処置するための使用に提供される。
１３．２ インスリンの異常凝集体に向けられたキャッピングペプチド
インスリンは、異常凝集体を形成可能なポリペプチドである。インスリンの異常凝集体は、注射限局性アミロイドーシスに関連する（Chiti F and Dobson CM (2017) Annu. Rev. Biochem. 86: 27-68）。キャッピングペプチドは、例１に記載のように、インスリンの異常凝集体を標的として設計した。インスリンのアミノ酸配列は、UniProtアクセッション番号（https://www.uniprot.org）A6XGL2として入手可能である。インスリンに存在する標的ＡＰＲ配列ＬＹＱＬＥＮ（配列番号９６）およびＬＶＥＡＬＹＬ（配列番号９７）の２つのアミロイドコア構造は、タンパク質構造データベース（www.rcsb.org）でそれぞれ2ompおよび3hydとして入手可能である。これらのアミロイドコア構造に基づく分析を例１で概説したように実施し、図３０および３１に示す。
コア構造2ompの分析から同定された３つの予測されたキャッピングペプチドは、ＬＹＹＬＥＮ（配列番号９８）、ＬＹＷＬＥＮ（配列番号９９）およびＳＹＱＬＥＮ（配列番号１００）である。
コア構造3hydの分析から同定された３つの予測されたキャッピングペプチドは、ＬＶＥＡＳＹＬ（配列番号１０１）、ＬＶＹＡＬＹＬ（配列番号１０２）およびＬＶＥＡＬＹＬ（配列番号１０３）である。
したがって、細胞内タンパク質分解系を標的とする部分に連結されたインスリンの異常凝集体を標的とするキャッピングペプチドを含む非天然分子は、注射限局性アミロイドーシスを処置するための使用に提供される。
１３．３ 膵島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰ）の異常凝集体に向けられたキャッピングペプチド
膵島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰ）は、異常凝集体を形成可能なポリペプチドである。ＩＡＰＰの異常凝集体は、ＩＩ型糖尿病およびインスリノーマに関連する（Chiti F and Dobson CM (2017) Annu. Rev. Biochem. 86: 27-68）。キャッピングペプチドは、例１に記載のように、ＩＡＰＰの異常凝集体を標的として設計した。ＩＡＰＰのアミノ酸配列は、UniProtアクセッション番号（https://www.uniprot.org）P10997として入手可能である。ＩＡＰＰに存在する異なるＡＰＲ配列のいくつかのアミロイドコア構造は、タンパク質構造データベース（www.rcsb.org）で3fod（ＡＩＬＳＳＴ（配列番号１０４）の場合）、3ftl（ＮＶＧＳＮＴＹ（配列番号１０５）の場合）、3ftr（ＳＳＴＮＶＧ（配列番号１０６）の場合）、5e5v（ＮＦＧＡＩＬＳ（配列番号１０７）の場合）、5e5x（ＡＮＦＬＶＨ（配列番号１０８）の場合）および5e5z（ＬＶＨＳＳＮ（配列番号１０９）の場合）として利用可能である。これらのアミロイドコア構造に基づく分析を例１で概説したように実施し、図３２～３７に示す。
アミロイドコア3fodに基づく分析から同定された３つの予測されたキャッピングペプチドは、ＡＩＰＳＳＴ（配列番号１１０）、ＡＩＬＳＳＦ（配列番号１１１）およびＡＩＬＳＰＴ（配列番号１１２）である。
アミロイドコア3ft1に基づく分析から同定された３つの予測されたキャッピングペプチドは、ＮＶＧＳＬＴＹ（配列番号１１３）、ＥＶＧＳＮＴＹ（配列番号１１４）およびＮＶＧＳＮＧＹ（配列番号１１５）である。
アミロイドコア3ftrに基づく分析から同定された３つの予測されたキャッピングペプチドは、ＳＫＴＮＶＧ（配列番号１１６）、ＳＳＴＮＶＥ（配列番号１１７）およびＳＳＴＮＶＷ（配列番号１１８）である。
アミロイドコア5e5vに基づく分析から同定された３つの予測されたキャッピングペプチドは、ＮＦＧＦＩＬＳ（配列番号１１９）、ＮＦＧＲＩＬＳ（配列番号１２０）およびＮＦＧＥＩＬＳ（配列番号１２１）である。
アミロイドコア5e5xに基づく分析から同定された３つの予測されたキャッピングペプチドは、ＷＮＦＬＶＨ（配列番号１２２）、ＡＮＷＬＶＨ（配列番号１２３）およびＡＮＦＬＲＨ（配列番号１２４）である。
アミロイドコア5e5zに基づく分析から同定された３つの予測されたキャッピングペプチドは、ＬＶＰＳＳＮ（配列番号１２５）、ＷＶＨＳＳＮ（配列番号１２６）およびＬＶＨＧＳＮ（配列番号１２７）である。
したがって、細胞内タンパク質分解系を標的とする部分に連結されたＩＡＰＰの異常凝集体を標的とするキャッピングペプチドを含む非天然分子は、ＩＩ型糖尿病およびインスリノーマを処置するための使用に提供される。
１３．４ β２－ミクログロブリンの異常凝集体に向けられたキャッピングペプチド
β２－ミクログロブリンは、異常凝集体を形成可能なタンパク質である。β２－ミクログロブリンの異常凝集体は、透析関連アミロイドーシスおよび遺伝性内臓アミロイドーシス（hereditary visceral amyloidosis）に関連する（Chiti F and Dobson CM (2017) Annu. Rev. Biochem. 86: 27-68）。キャッピングペプチドは、例１に記載のように、β２ミクログロブリンの異常凝集体を標的として設計した。β２ミクログロブリンのアミノ酸配列は、UniProtsアクセッション番号（https://www.uniprot.org）P61769として入手可能である。β２－ミクログロブリンに存在する標的ＡＰＲ配列ＬＳＦＳＫＤ（配列番号１２８）のアミロイドコア構造は、タンパク質構造データベース（www.rcsb.org）で3lozとして入手可能である。例１で概説したように実施したこのアミロイドコア構造に基づく分析を、図３８に示す。
分析から同定された３つの予測されたキャッピングペプチドは、ＬＳＦＰＫＤ（配列番号１２９）、ＭＳＦＳＫＤ（配列番号１３０）およびＬＳＦＳＥＤ（配列番号１３１）である。
したがって、細胞内タンパク質分解系を標的とする部分に連結されたβ２－ミクログロブリンの異常凝集体を標的とするキャッピングペプチドを含む非天然分子は、透析関連アミロイドーシスおよび遺伝性内臓アミロイドーシスを処置するための使用に提供される。
１３．５ 前立腺酸性ホスファターゼの異常凝集体に向けられたキャッピングペプチド
前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）は、そのフラグメントが異常凝集体を形成可能なタンパク質である。ＰＡＰの異常凝集体は、ＨＩＶ感染の増強に関連する（Arnold F et al (2012) J. Virol. 86(2):1244-1249）。キャッピングペプチドは、例１に記載のように、ＰＡＰの異常凝集体を標的として設計した。ＰＡＰのアミノ酸配列は、UniProtアクセッション番号（https://www.uniprot.org）P15309として入手可能である。ＰＡＰに存在する標的ＡＰＲ配列ＧＧＶＬＶＮ（配列番号１３２）のアミロイドコア構造は、タンパク質構造データベース（www.rcsb.org）で3ppdとして入手可能である。例１で概説したように実施したこのアミロイドコア構造に基づく分析を、図３９に示す。
分析から同定された３つの予測されたキャッピングペプチドは、ＧＲＶＬＶＮ（配列番号１３３）、ＧＷＶＬＶＮ（配列番号１３４）およびＧＫＶＬＶＮ（配列番号１３５）である。
したがって、細胞内タンパク質分解系を標的とする部分に連結されたＰＡＰの異常凝集体を標的とするキャッピングペプチドを含む非天然分子は、ＨＩＶ疾患を処置するための使用に提供される。
１３．６ スーパーオキシドジスムターゼ１の異常凝集体に向けられたキャッピングペプチド
スーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）は、異常凝集体を形成可能なタンパク質である。ＳＯＤ１の異常凝集体は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）と関連する（Chiti F and Dobson CM (2017) Annu. Rev. Biochem. 86: 27-68）。キャッピングペプチドは、例１に記載のように、ＳＯＤ１の異常凝集体を標的として設計した。ＳＯＤ１のアミノ酸配列は、UniProtアクセッション番号（https://www.uniprot.org）P00441として入手可能である。ＳＯＤ１に存在する標的ＡＰＲ配列ＤＳＶＩＳＬＳ（配列番号１３６）およびＧＶＩＧＩＡＱ（配列番号１３７）のアミロイドコア構造は、タンパク質構造データベース（www.rcsb.org）でそれぞれ4ninおよび4nipとして入手可能である。例１で概説したように実施したこのアミロイドコア構造に基づく分析を、図４０および４１に示す。
アミロイドコア4ninに基づく分析から同定された３つの予測されたキャッピングペプチドは、ＤＳＲＩＳＬＳ（配列番号１３８）、ＤＳＶＩＳＬＰ（配列番号１３９）およびＱＳＶＩＳＬＳ（配列番号１４０）である。
アミロイドコア4nipに基づく分析から同定された３つの予測されたキャッピングペプチドは、ＧＶＩＷＩＡＱ（配列番号１４１）、ＧＶＩＧＩＰＱ（配列番号１４２）およびＧＶＩＹＩＡＱ（配列番号１４３）である。
したがって、細胞内タンパク質分解系を標的とする部分に連結されたＳＯＤ１の異常凝集体を標的とするキャッピングペプチドを含む非天然分子は、ＡＬＳへの使用に提供される。
１３．７ リゾチームの異常凝集体に向けられたキャッピングペプチド
リゾチームは、異常凝集体を形成可能なタンパク質である。リゾチームの異常凝集体は、リゾチームアミロイドーシス（主に内臓の）に関連する（Chiti F and Dobson CM (2017) Annu. Rev. Biochem. 86: 27-68）。キャッピングペプチドは、例１に記載のように、リゾチームの異常凝集体を標的として設計した。リゾチームのアミノ酸配列は、UniProtアクセッション番号（https://www.uniprot.org）H0YDZ2として入手可能である。リゾチームに存在する標的ＡＰＲ配列ＩＦＱＩＮＳ（配列番号１４４）のアミロイドコア構造は、タンパク質構造データベース（www.rcsb.org）で4r0pとして入手可能である。例１で概説したように実施したこのアミロイドコア構造に基づく分析を、図４２に示す。
分析から同定された３つの予測されたキャッピングペプチドは、ＩＦＱＩＥＳ（配列番号１４５）、ＩＦＱＩＤＳ（配列番号１４６）およびＩＦＱＩＦＳ（配列番号１４７）である。
したがって、細胞内タンパク質分解系を標的とする部分に連結されたリゾチームの異常凝集体を標的とするキャッピングペプチドを含む非天然分子は、リゾチームアミロイドーシスを処置するための使用に提供される。
１３．８ α－シヌクレインの異常凝集体に向けられたキャッピングペプチド
α－シヌクレインは、異常凝集体を形成可能なポリペプチドである。α－シヌクレインの異常凝集体は、パーキンソン病、認知症を伴うパーキンソン病、レビー小体型認知症および多系統萎縮症に関連する（Chiti F and Dobson CM (2017) Annu. Rev. Biochem. 86: 27-68）。キャッピングペプチドは、例１に記載のように、α－シヌクレインの異常凝集体を標的として設計した。α－シヌクレインのアミノ酸配列は、UniProtアクセッション番号（https://www.uniprot.org）P37840として入手可能である。α－シヌクレインに存在する標的ＡＰＲ配列ＧＡＶＶＴＧＶＴＡＶＡ（配列番号１４８）のアミロイドコア構造は、タンパク質構造データベース（www.rcsb.org）で4rilとして入手可能である。このアミロイドコア構造に基づく分析を例１で概説したように実施し、図４３に示す。
コア構造4ri1の分析から同定された３つの予測されたキャッピングペプチドは、ＧＡＶＶＴＧＶＴＡＶＦ（配列番号１４９）、ＧＡＶＶＴＧＶＴＡＶＡ（配列番号１５０）およびＧＡＶＶＴＧＶＴＡＶＡ（配列番号１５１）である。
したがって、細胞内タンパク質分解系を標的とする部分に連結されたα－シヌクレイン凝集体の異常凝集体を標的とするキャッピングペプチドを含む非天然分子は、パーキンソン病、認知症を伴うパーキンソン病、レビー小体型認知症および多系統萎縮症を処置するための使用に提供される。
１３．９ ｐ５３の異常凝集体に向けられたキャッピングペプチド
タンパク質ｐ５３は、異常凝集体を形成可能なポリペプチドである。ｐ５３の異常凝集体は、がんに関連する（Chiti F and Dobson CM (2017) Annu. Rev. Biochem. 86: 27-68）。キャッピングペプチドは、例１に記載のように、ｐ５３の異常凝集体を標的として設計した。ｐ５３のアミノ酸配列は、UniProtアクセッション番号（https://www.uniprot.org）P04637として入手可能である。Ｐ５３に存在する標的ＡＰＲ配列ＬＴＩＩＴＬＥ（配列番号１５２）のアミロイドコア構造は、タンパク質構造データベース（www.rcsb.org）で4rp6として入手可能である。このアミロイドコア構造に基づく分析を例１で概説したように実施し、図４４に示す。
コア構造4rp6の分析から同定された３つの予測されたキャッピングペプチドは、ＬＴＩＩＴＥ（配列番号１５３）、ＬＴＩＩＴＬＥ（配列番号１５４）およびＬＰＩＩＴＬＥ（配列番号１５５）である。
したがって、細胞内タンパク質分解系を標的とする部分に連結されたｐ５３凝集体を標的とするキャッピングペプチドを含む非天然分子は、がんを処置するための使用に提供される。
１３．１０ プリオンタンパク質の異常凝集体に向けられたキャッピングペプチド
プリオンタンパク質（ＰｒＰ）は、異常凝集体を形成可能なポリペプチドである。ＰｒＰの異常凝集体は、クロイツフェルト・ヤコブ病、致死性不眠症、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、ハンチントン病様１、神経精神医学的特徴を伴う海綿状脳症、変異型クロイツフェルト・ヤコブ病、クールー病（Kuru）および遺伝性感覚性自律神経性ニューロパチーに関連する（Chiti F and Dobson CM (2017) Annu. Rev. Biochem. 86: 27-68）。キャッピングペプチドは、例１に記載のように、ＰｒＰの異常凝集体を標的として設計した。ＰｒＰのアミノ酸配列は、UniProtアクセッション番号（https://www.uniprot.org）P04156として入手可能である。ＰｒＰに存在する標的ＡＰＲ配列ＧＧＹＭＬＧＳ（配列番号１５６）、ＧＧＹＶＬＧＳ（配列番号１５７）およびＧＹＬＬＧＳＡ（配列番号１５８）のアミロイドコア構造は、タンパク質構造データベース（www.rcsb.org）でそれぞれ4w5m、4w5p、および4w71として入手可能である。これらのアミロイドコア構造に基づく分析を例１で概説したように実施し、図４５、４６および４７に示す。
コア構造4w5mの分析から同定された３つの予測されたキャッピングペプチドは、ＬＧＹＭＬＧＳ（配列番号１５９）、ＧＧＹＭＬＶＳ（配列番号１６０）およびＫＧＹＭＬＧＳ（配列番号１６１）である。
コア構造4w5pの分析から同定された３つの予測されたキャッピングペプチドは、ＧＧＹＶＹＧＳ（配列番号１６２）、ＧＧＹＲＬＧＳ（配列番号１６３）およびＧＧＹＶＦＧＳ（配列番号１６４）である。
コア構造4w71の分析から同定された３つの予測されたキャッピングペプチドは、ＧＹＬＬＨＳＡ（配列番号１６５）、ＧＹＬＬＹＳＡ（配列番号１６６）およびＧＹＬＬＦＳＡ（配列番号１６７）である。
したがって、細胞内タンパク質分解系を標的とする部分に連結されたＰｒＰの異常凝集体を標的とするキャッピングペプチドを含む非天然分子は、クロイツフェルト・ヤコブ病、致死性不眠症、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、ハンチントン病様１、神経精神医学的特徴を伴う海綿状脳症、変異型クロイツフェルト・ヤコブ病、クールー病および遺伝性感覚性自律神経性ニューロパチーを処置するための使用に提供される。
１３．１１ 変異型α－シヌクレイン（Ａ５３Ｔ変異）の異常凝集体に向けられたキャッピングペプチド
α－シヌクレインの変異型（Ａ５３Ｔ変異）は、異常凝集体を形成可能なポリペプチドである。α－シヌクレインの異常凝集体は、パーキンソン病、認知症を伴うパーキンソン病、レビー小体型認知症および多系統萎縮症に関連する（Chiti F and Dobson CM (2017) Annu. Rev. Biochem. 86: 27-68）。キャッピングペプチドは、例１に記載のように、変異型α－シヌクレイン（Ａ５３Ｔ変異）の異常凝集体を標的として設計した。α－シヌクレインのアミノ酸配列は、UniProtアクセッション番号（https://www.uniprot.org）P37840として入手可能である。変異型α－シヌクレインに存在する標的ＡＰＲ配列ＧＶＶＨＧＶＴＴＶＡ（配列番号１６８）のアミロイドコア構造は、タンパク質構造データベース（www.rcsb.org）で4znnとして入手可能である。このアミロイドコア構造に基づく分析を例１で概説したように実施し、図４８に示す。
コア構造4znnの分析から同定された３つの予測されたキャッピングペプチドは、ＧＶＶＨＧＶＴＴＲＡ（配列番号１６９）、ＧＶＶＨＧＶＥＴＶＡ（配列番号１７０）およびＧＶＶＨＭＶＴＴＶＡ（配列番号１７１）である。
したがって、細胞内タンパク質分解系を標的とする部分に連結された変異型α－シヌクレイン凝集体を標的とするキャッピングペプチドを含む非天然分子は、パーキンソン病、認知症を伴うパーキンソン病、レビー小体型認知症、および多系統萎縮症を処置するための使用に提供される。
１３．１２ 免疫グロブリン軽鎖可変ドメインの異常凝集体に向けられたキャッピングペプチド
軽鎖免疫グロブリン可変ドメインは、異常凝集体を形成可能なポリペプチドの属である（実際、異なる患者は軽鎖可変ドメインの異なる配列を有する)。軽鎖免疫グロブリン可変ドメインの異常凝集体は、収縮期駆出率が保持された心不全、ネフローゼ症候群、肝機能障害、末梢／自律神経性ニューロパチー、および非定型くすぶり型骨髄腫または単クローン性免疫グロブリン血症に関連する（Gertz MA (2020) Am. J. Hematol. 95(7): 848）。キャッピングペプチドは、例１に記載のように、軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列の異常凝集体を標的として設計した。このアミロイドコア構造に基づく分析を例１に概説されたように実施し、図４９に示す。
コア構造6diyの分析から同定された３つの予測されたキャッピングペプチドは、ＹＰＦＧＱ（配列番号１７３）、ＹＬＦＧＱ（配列番号１７４）およびＮＴＦＧＱ（配列番号１７５）である。
したがって、細胞内タンパク質分解系を標的とする部分に連結された軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン凝集体を標的とするキャッピングペプチドを含む非天然分子は、収縮期駆出率が保持された心不全、ネフローゼ症候群、肝機能障害、末梢／自律神経性ニューロパチー、および非定型くすぶり型骨髄腫または単クローン性免疫グロブリン血症を処置するための使用に提供される。
１３．１３ ＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質４３の異常凝集体に向けられたキャッピングペプチド
ＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質４３（ＴＤＰ－４３）は、異常凝集体を形成可能なタンパク質である。ＴＤＰ－４３の異常凝集体は、ユビキチン陽性封入体を伴う前頭側頭葉変性症および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）に関連する（Chiti F and Dobson CM (2017) Annu. Rev. Biochem. 86: 27-68）。キャッピングペプチドを、例１に記載のように、ＴＤＰ－４３の異常凝集体を標的として設計した。ＴＤＰ－４３のアミノ酸配列は、UniProtアクセッション番号（https://www.uniprot.org）Q13148として入手可能である。ＴＤＰ－４３に存在する標的ＴＤＰ－４３配列ＧＮＮＳＹＳ（配列番号１７６）のアミロイドコア構造は、タンパク質構造データベース（www.rcsb.org）で5wiaとして入手可能である。例１で概説したように実施したこのアミロイドコア構造に基づく分析を、図５０に示す。
分析から同定された３つの予測されたキャッピングペプチドは、ＧＮＮＳＹＹ（配列番号１７７）、ＧＮＮＨＹＳ（配列番号１７８）およびＧＮＮＳＹＦ（配列番号１７９）である。
したがって、細胞内タンパク質分解系を標的とする部分に連結されたＴＤＰ－４３の異常凝集体を標的とするキャッピングペプチドを含む非天然分子は、ユビキチン陽性封入体を伴う前頭側頭葉変性症および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を処置するための使用に提供される。
１３．１４ ＲＮＡ結合タンパク質ＦＵＳの異常凝集体に向けられたキャッピングペプチド
ＲＮＡ結合タンパク質ＦＵＳ（ＦＵＳ）は、異常凝集体を形成可能なタンパク質である。ＦＵＳの異常凝集体は、ユビキチン陰性封入体を伴う前頭側頭葉変性症および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）に関連する（Chiti F and Dobson CM (2017) Annu. Rev. Biochem. 86: 27-68）。キャッピングペプチドは、例１に記載のように、ＦＵＳの異常凝集体を標的として設計した。ＦＵＳのアミノ酸配列は、UniProtアクセッション番号（https://www.uniprot.org）P35637として入手可能である。ＦＵＳに存在する標的ＡＰＲ配列ＳＹＳＳＹＧＱＳ（配列番号１８０）のアミロイドコア構造は、タンパク質構造データベース（www.rcsb.org）で6bxvとして入手可能である。例１で概説したように実施したこのアミロイドコア構造に基づく分析を、図５１に示す。
分析から同定された３つの予測されたキャッピングペプチドは、ＳＹＳＳＹＷＱＳ（配列番号１８１）、ＳＹＳＳＹＹＱＳ（配列番号１８２）およびＳＹＳＳＹＩＱＳ（配列番号１８３）である。
したがって、細胞内タンパク質分解系を標的とする部分に連結されたＦＵＳの異常凝集体を標的とするキャッピングペプチドを含む非天然分子は、ユビキチン陰性封入体を伴う前頭側頭葉変性症および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を処置するための使用に提供される。
表７は、例１３で実施した分析の概要を表す。
Figure 2023525149000010
 表７：異常凝集体を形成可能な追加のタンパク質のキャッピングペプチド同定の概要
１４．非天然分子の、マウスにおけるタウ病状(tau pathology)のシーディングおよび拡散に対する効果
次のステップでは、タウ凝集体を標的とする本発明の非天然分子を、in vivoのマウス野生型モデルにおいて使用する。
これに対し、異なる種類のタウシードを調製する：
－組換えタウ凝集体（または同義語であるタウシード）（組換え精製タウ（１０μＭ）をヘパリン（５μＭ）と共に少なくとも２週間インキュベートして調製）
－ヒト脳抽出タウシード（サルコシル抽出を適用して脳から不溶性タウ凝集体を精製、Ren Y and Sahara N. (2013) Front. Neurol. 4: 102による）
－ＰＳ１９マウス脳抽出タウシード（ＰＳ１９マウスモデルは、ヒトＰ３０１Ｓ変異をコードする１つのＮ末端インサートと４つの微小管結合反復（１Ｎ４Ｒ）を持つ微小管関連タンパク質タウのＴ３４アイソフォームを保有し、これらはすべてマウスプリオンタンパク質プロモーターによって駆動される。これらのマウスは、神経線維変化、神経変性タウオパチーおよびアルツハイマー病の研究に有用である）もまた、サルコシル抽出法で抽出した。
これら３つの異なるタウ凝集体のそれぞれを、緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１００ｍＭのＮａＣｌ）と混合し、本発明の非天然分子（ＨＥＴ－ＪＡＶ：ＷＱＩＶＹＫＧＳＶＷＭＩＮＫＧＳＧＳＮＬＬＲＬＴＧＷ、配列番号２２）を１～１０μＭの濃度範囲でこの緩衝液に溶解した。
野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６ｊａｘ）を、イソフルランで鎮静する。鎮静されたマウスを固定し、２μＬのタウシード（緩衝液のみと混合するか、または非天然分子と混合）を、海馬への注入の特定の定位座標で注入する（Ｘ＝内側／外側＋１．６、Ｙ＝前方／後方－２．２、およびＺ＝背側／腹側－１．５）。
次のステップでは、注入後のさまざまな時点（２時間、１２時間、２４時間）でマウスを犠牲にし、灌流し、脳試料を染色およびイメージングのために収集する。
組換えシードは蛍光色素（atto-633）で標識されており、染色なしで容易に検出および定量可能である。脳から抽出されたタウシードを検出するには、タウ抗体（供給源：Alzforum, Cat# MAB361）による染色でシードを検出して定量化する必要がある。
タウシードが本発明の非天然分子で前処理された条件において、非天然分子で前処理されていないタウシードの条件と比較して、海馬におけるタウシードの量の有意な減少を観察する。
代替的なトランスジェニックマウスモデルにおいて、事前形成されたタウ凝集体を非天然分子（配列番号２２）で前処理し、６時間のインキュベーション後、この事前形成された混合物を、まだタウ病状を発症していない若いｈＴａｕ［Ｐ３０１Ｌ］マウスの海馬に注射する（Kent BA et al (2017) Brain Behav. 8(1) e00896を参照）。注射の９週間後、マウスを犠牲にする。ＡＴ８陽性封入体の免疫組織化学的（ＩＨＣ）定量化を、同側（注射部位）および反対側の海馬（反対部位）で実施する。緩衝液で前処理された事前形成タウ凝集体は、対照ビヒクルとして機能する。我々は、対側海馬に広がるタウ病状のレベルが、配列番号２２に示す非天然分子が適用された場合に、ビヒクルと比較して減少することを観察する。

Claims (12)

  1. 以下の構造（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）を含む、非天然分子：
    （Ａ）Ｚ０－ＣＰ１－Ｚ１－Ｍ１－Ｚ２
    （Ｂ）Ｚ０－ＣＰ１－Ｚ１－ＣＰ２－Ｚ２－Ｍ１－Ｚ３
    （Ｃ）Ｚ０－ＣＰ１－Ｚ１－ＣＰ２－Ｚ２－ＣＰ３－Ｚ３－Ｍ１－Ｚ４
    ここで：
    －Ｚ０はリンカーであるか、または不在であり
    －ＣＰ１、ＣＰ２、およびＣＰ３は、同一または異なるキャッピングペプチドであり、ここでキャッピングペプチドは、易凝集性領域配列（ＡＰＲ配列）のバリアントを含むペプチドであり、このＡＰＲ配列は５～１０アミノ酸の長さを有し、かつ異常凝集体を形成可能な標的タンパク質のアミノ酸配列中に天然に存在し、ここで該ＡＰＲ配列のバリアントは、標的タンパク質に存在する天然のＡＰＲ配列と比較して、１、２、または３個のアミノ酸配列の相違を有し、任意に、前記ＡＰＲ配列のバリアントは、少なくとも１つのＤ－アミノ酸および／または少なくとも１つの人工アミノ酸を含有し、前記キャッピングペプチドは、前記ＡＰＲ配列によって形成されるアミロイド線維の三次元構造との相互作用について負のデルタＧ自由エネルギーおよび、前記ＡＰＲ配列によって形成されるアミロイド線維の三次元構造との伸長について正のデルタＧ自由エネルギーを有し、
    －Ｍ１は、細胞内タンパク質分解に関与するタンパク質に結合する小分子またはペプチドのいずれかからなる部分であり、
    －分子（Ａ）において、Ｚ１はリンカーであり、およびＺ２はリンカーまたは不在から選択され、分子（Ｂ）において、Ｚ１およびＺ２は各々独立してリンカーであり、およびＺ３はリンカーまたは不在から選択され、分子（Ｃ）において、Ｚ１、Ｚ２およびＺ３は各々独立してリンカーであり、およびＺ４はリンカーまたは不在から選択される。
  2. 細胞内分解に関与するタンパク質に結合する第２部分（Ｍ２）が、構造（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）においてＭ１部分に隣接して融合している、請求項１に記載の非天然分子。
  3. 分子（Ｂ）および（Ｃ）において、キャッピングペプチドが、異常凝集形成標的タンパク質の同一または異なる易凝集性領域に向けられる、請求項１または２に記載の非天然分子。
  4. 分子（Ｂ）および（Ｃ）において、キャッピングペプチドが、異なる異常凝集形成標的タンパク質の易凝集性領域に向けられる、請求項１または２に記載の非天然分子。
  5. 異常凝集が、アミロイド凝集または非アミロイド凝集である、請求項１～４のいずれか一項に記載の非天然分子。
  6. 細胞内分解に関与するタンパク質が、ユビキチンプロテアソーム分解系（ＵＰＳ）に属する、請求項１～５のいずれか一項に記載の非天然分子。
  7. 細胞内分解に関与するタンパク質が、オートファジー系に属する、請求項１～５のいずれか一項に記載の非天然分子。
  8. 異常凝集形成標的タンパク質がアミロイド形成標的タンパク質であり、タウ、ＩＡＰＰ、アミロイドβ、ハンチンチン－１およびα－シヌクレインからなるリストから選択される、請求項１～７のいずれか一項に記載の非天然分子。
  9. 異常凝集形成標的タンパク質が非アミロイド形成標的タンパク質であり、ＦＵＳ、ＴＤＰ－４３、アタキシン－１およびｐ５３からなるリストから選択される、請求項１～７のいずれか一項記載の非天然分子。
  10. 医薬として使用するための、請求項１～９のいずれか一項に記載の非天然分子。
  11. 以下のステップを含む、異常凝集体を形成する標的タンパク質に結合する候補キャッピングペプチドのセットを得る方法：
    ａ．異常凝集体を形成可能な標的タンパク質から単離された易凝集性領域（ＡＰＲ）アミノ酸配列によって生成される線維の３次元（３－Ｄ）構造を取得すること、
    ｂ．各バリアントが天然のＡＰＲアミノ酸配列と比較して１、または２、または３個のアミノ酸の相違を有する、前記ＡＰＲアミノ酸配列のバリアントのin silicoリストを生成すること、
    ｃ．Forcefieldアルゴリズムによって、ｉ）バリアント配列と、ＡＰＲ配列によって生成された線維の３－Ｄ構造との間の相互作用の、すべてのバリアント配列の熱力学的安定性を計算すること、この値は、相互作用のデルタギブスエネルギーとして指定され、および、ｉｉ）バリアント配列と、その軸端で相互作用するバリアント配列を有するＡＰＲ配列によって生成された線維の３－Ｄ構造との間の相互作用の、すべてのバリアント配列の熱力学的安定性を計算すること、この値は、伸長のデルタギブスエネルギーとして指定される、
    ｄ．候補キャッピングペプチドのセットを取得すること、ここで候補は、相互作用について負のデルタＧ自由エネルギー、および伸長について正のデルタＧ自由エネルギーを有する。
  12. 候補キャッピングペプチドのセットを実験的に試験すること、および１つ以上のキャッピングペプチドを生成することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
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