JP2023524464A - 抗cd103抗体 - Google Patents
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Abstract
本発明は、抗CD103抗体、ならびに疾患の診断、予後、モニタリング、および治療におけるこれらの抗体の使用に関する。【選択図】なし
Description
関連出願
本出願は2020年4月30日出願の米国特許仮出願第62/704,258号に対する優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は2020年4月30日出願の米国特許仮出願第62/704,258号に対する優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
発明の分野
本発明は、抗CD103抗体、ならびに疾患の診断、予後、モニタリング、および治療におけるこれらの抗体の使用に関する。
本発明は、抗CD103抗体、ならびに疾患の診断、予後、モニタリング、および治療におけるこれらの抗体の使用に関する。
CD103(インテグリンαE)は、粘膜固有層T細胞、上皮樹状細胞、粘膜固有層由来樹状細胞の亜集団、および小さい末梢リンパ球サブセット上に発現するI型膜タンパク質である。Treg細胞は極めて高いレベルのCD103を発現する。成熟CD103タンパク質は、2つの鎖:150kD(C末端)鎖および25kD(N末端)鎖に切断され得、これらは、ジスルフィド結合により結合されたままである。β7インテグリンと組み合わせて、CD103は、αE/β7ヘテロダイマーを形成し、これは、ヒト粘膜リンパ球-1抗原として既知のE-カドヘリン結合インテグリンである。
免疫チェックポイントタンパク質および免疫応答におけるそれらの役割の特定と理解は、癌療法におけるブレークスルーとなる。この発見により、有効な抗腫瘍応答を得えられないことが明らかになった癌細胞に向けてT細胞を活性化するために、免疫チェックポイント経路の遮断に注力がなされた。CTLA-4に結合し、機能的に遮断する抗体であるイピリムマブは、転移性メラノーマの治療用として、2011年に米国食品医薬品局(FDA)により承認された。イピリムマブの直ぐ後に、プログラム細胞死-1(PD-1)受容体、および多くの癌細胞上で見つかったそのリガンドのプログラム細胞死リガンド1(PD-L1)を標的とする抗体も承認された。これらのチェックポイント阻害剤は、癌療法に革命をもたらした。
免疫チェックポイント経路を標的とする免疫療法であるとされる大きな臨床的有用性にも関わらず、大部分の癌患者は、チェックポイント阻害剤に対し応答しない。特に、研究は、チェックポイント阻害は、腫瘍環境中への限定的な機能性T細胞浸潤を示す患者では十分ではない可能性があることを示唆している。さらに、T細胞は、腫瘍塊の周囲の組織中に蓄積するが、それらは、腫瘍細胞それ自体とは相互作用しない可能性がある。
T細胞特異的ケモカインを産生し、共刺激または抑制シグナルと一緒に抗原を提示するそれらの能力により、腫瘍関連抗原提示細胞は、抗腫瘍エフェクター免疫を形成する最良の用意ができている。組織常在性樹状細胞は、2つの機能的に特殊化されたサブセット:細胞関連抗原のCD8+T細胞に対する刺激および交差提示に関与するCD103+-CD8+DC、およびCD4+ヘルパーT細胞応答の推進でより強力であるCD11b+DC、から構成される。CD103+-CD8+DC系統によるI型インターフェロン産生は、腫瘍抗原に対する自然発生的T細胞刺激を調節する。従って、腫瘍関連骨髄コンパートメントの組成物は、チェックポイント阻害に対する腫瘍応答において重要な役割を果たす可能性がある。
癌患者における改善された臨床転帰を有するCD103+腫瘍浸潤Tリンパ球関連報告は、癌特異的リンパ球の発現特性、および将来の免疫療法のためのそれらの意義の明確で包括的な理解を得る必要性を強調する。
第1の態様では、本発明は、以下で示す構造的および機能性特徴を含む抗CD103抗体およびそれらの抗原結合フラグメントを提供する。
種々の実施形態では、本発明は、下記を含むヒトCD103に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する:
a.配列番号1のアミノ酸配列または配列番号1とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1、
b.配列番号2のアミノ酸配列または配列番号2とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2、
c.配列番号3のアミノ酸配列または配列番号3とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3、
d.配列番号4のアミノ酸配列または配列番号4とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1、
e.配列番号5のアミノ酸配列または配列番号5とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2、
f.配列番号6のアミノ酸配列または配列番号6とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3、
または
g.配列番号9のアミノ酸配列または配列番号9とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1、
h.配列番号10のアミノ酸配列または配列番号10とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2、
i.配列番号11のアミノ酸配列または配列番号11とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3、
j.配列番号12のアミノ酸配列または配列番号12とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1、
k.配列番号13のアミノ酸配列または配列番号13とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2、および
l.配列番号14のアミノ酸配列または配列番号14とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3、
または
m.配列番号17のアミノ酸配列または配列番号17とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1、
n.配列番号18のアミノ酸配列または配列番号18とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2、
o.配列番号19のアミノ酸配列または配列番号19とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3、
p.配列番号20のアミノ酸配列または配列番号20とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1、
q.配列番号21のアミノ酸配列または配列番号21とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2、
r.配列番号22のアミノ酸配列または配列番号22とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3、
または
s.配列番号25のアミノ酸配列または配列番号25とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1、
t.配列番号26のアミノ酸配列または配列番号26とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2、
u.配列番号27のアミノ酸配列または配列番号27とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3、
v.配列番号28のアミノ酸配列または配列番号28とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1、
w.配列番号29のアミノ酸配列または配列番号29とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2、および
x.配列番号30のアミノ酸配列または配列番号30とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3、
または
y.配列番号33のアミノ酸配列または配列番号33とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1、
z.配列番号34のアミノ酸配列または配列番号34とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2、
aa.配列番号35のアミノ酸配列または配列番号35とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3、
bb.配列番号36のアミノ酸配列または配列番号36とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1、
cc.配列番号37のアミノ酸配列または配列番号37とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2、および
dd.配列番号38のアミノ酸配列または配列番号38とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3。
a.配列番号1のアミノ酸配列または配列番号1とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1、
b.配列番号2のアミノ酸配列または配列番号2とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2、
c.配列番号3のアミノ酸配列または配列番号3とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3、
d.配列番号4のアミノ酸配列または配列番号4とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1、
e.配列番号5のアミノ酸配列または配列番号5とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2、
f.配列番号6のアミノ酸配列または配列番号6とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3、
または
g.配列番号9のアミノ酸配列または配列番号9とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1、
h.配列番号10のアミノ酸配列または配列番号10とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2、
i.配列番号11のアミノ酸配列または配列番号11とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3、
j.配列番号12のアミノ酸配列または配列番号12とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1、
k.配列番号13のアミノ酸配列または配列番号13とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2、および
l.配列番号14のアミノ酸配列または配列番号14とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3、
または
m.配列番号17のアミノ酸配列または配列番号17とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1、
n.配列番号18のアミノ酸配列または配列番号18とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2、
o.配列番号19のアミノ酸配列または配列番号19とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3、
p.配列番号20のアミノ酸配列または配列番号20とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1、
q.配列番号21のアミノ酸配列または配列番号21とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2、
r.配列番号22のアミノ酸配列または配列番号22とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3、
または
s.配列番号25のアミノ酸配列または配列番号25とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1、
t.配列番号26のアミノ酸配列または配列番号26とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2、
u.配列番号27のアミノ酸配列または配列番号27とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3、
v.配列番号28のアミノ酸配列または配列番号28とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1、
w.配列番号29のアミノ酸配列または配列番号29とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2、および
x.配列番号30のアミノ酸配列または配列番号30とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3、
または
y.配列番号33のアミノ酸配列または配列番号33とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1、
z.配列番号34のアミノ酸配列または配列番号34とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2、
aa.配列番号35のアミノ酸配列または配列番号35とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3、
bb.配列番号36のアミノ酸配列または配列番号36とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1、
cc.配列番号37のアミノ酸配列または配列番号37とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2、および
dd.配列番号38のアミノ酸配列または配列番号38とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3。
一実施形態では、本発明は、下記を含むヒトCD103に結合する抗体を提供する:
a.配列番号1のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1、
b.配列番号2のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2、
c.配列番号3のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3、
d.配列番号4のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1、
e.配列番号5のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2、および
f.配列番号6のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3。
a.配列番号1のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1、
b.配列番号2のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2、
c.配列番号3のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3、
d.配列番号4のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1、
e.配列番号5のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2、および
f.配列番号6のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3。
一実施形態では、本発明は、下記を含むヒトCD103に結合する抗体を提供する:
a.配列番号9のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1、
b.配列番号10のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2、
c.配列番号11のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3、
d.配列番号12のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1、
e.配列番号13のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2、および
f.配列番号14のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3。
a.配列番号9のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1、
b.配列番号10のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2、
c.配列番号11のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3、
d.配列番号12のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1、
e.配列番号13のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2、および
f.配列番号14のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3。
一実施形態では、本発明は、下記を含むヒトCD103に結合する抗体を提供する:
a.配列番号17のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1、
b.配列番号18のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2、
c.配列番号19のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3、
d.配列番号20のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1、
e.配列番号21のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2、および
f.配列番号22のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3。
a.配列番号17のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1、
b.配列番号18のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2、
c.配列番号19のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3、
d.配列番号20のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1、
e.配列番号21のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2、および
f.配列番号22のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3。
一実施形態では、本発明は、下記を含むヒトCD103に結合する抗体を提供する:
a.配列番号25のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1、
b.配列番号26のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2、
c.配列番号27のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3、
d.配列番号28のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1、
e.配列番号29のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2、および
f.配列番号30のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3。
a.配列番号25のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1、
b.配列番号26のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2、
c.配列番号27のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3、
d.配列番号28のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1、
e.配列番号29のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2、および
f.配列番号30のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3。
一実施形態では、本発明は、下記を含むヒトCD103に結合する抗体を提供する:
a.配列番号33のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1、
b.配列番号34のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2、
c.配列番号35のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3、
d.配列番号36のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1、
e.配列番号37のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2、および
f.配列番号38のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3。
a.配列番号33のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1、
b.配列番号34のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2、
c.配列番号35のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3、
d.配列番号36のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1、
e.配列番号37のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2、および
f.配列番号38のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3。
一実施形態では、本発明は、下記を含むヒトCD103に結合する抗体を提供する:
a.配列番号1とは、1個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1、
b.配列番号2とは、1個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2、
c.配列番号3とは、1個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3、
d.配列番号4とは、1個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1、
e.配列番号5とは、1個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2、および
f.配列番号6とは、1個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3。
a.配列番号1とは、1個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1、
b.配列番号2とは、1個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2、
c.配列番号3とは、1個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3、
d.配列番号4とは、1個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1、
e.配列番号5とは、1個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2、および
f.配列番号6とは、1個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3。
一実施形態では、本発明は、下記を含むヒトCD103に結合する抗体を提供する:
a.配列番号9とは、1個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1、
b.配列番号10とは、1個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2、
c.配列番号11とは、1個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3、
d.配列番号12とは、1個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1、
e.配列番号13とは、1個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2、および
f.配列番号14とは、1個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3。
a.配列番号9とは、1個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1、
b.配列番号10とは、1個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2、
c.配列番号11とは、1個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3、
d.配列番号12とは、1個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1、
e.配列番号13とは、1個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2、および
f.配列番号14とは、1個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3。
一実施形態では、本発明は、下記を含むヒトCD103に結合する抗体を提供する:
a.配列番号17とは、1個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1、
b.配列番号18とは、1個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2、
c.配列番号19とは、1個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3、
d.配列番号20とは、1個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1、
e.配列番号21とは、1個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2、および
f.配列番号22とは、1個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3。
a.配列番号17とは、1個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1、
b.配列番号18とは、1個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2、
c.配列番号19とは、1個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3、
d.配列番号20とは、1個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1、
e.配列番号21とは、1個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2、および
f.配列番号22とは、1個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3。
一実施形態では、本発明は、下記を含むヒトCD103に結合する抗体を提供する:
a.配列番号25とは、1個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1、
b.配列番号26とは、1個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2、
c.配列番号27とは、1個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3、
d.配列番号28とは、1個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1、
e.配列番号29とは、1個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2、および
f.配列番号30とは、1個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3。
a.配列番号25とは、1個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1、
b.配列番号26とは、1個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2、
c.配列番号27とは、1個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3、
d.配列番号28とは、1個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1、
e.配列番号29とは、1個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2、および
f.配列番号30とは、1個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3。
一実施形態では、本発明は、下記を含むヒトCD103に結合する抗体を提供する:
a.配列番号33とは、1個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1、
b.配列番号34とは、1個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2、
c.配列番号35とは、1個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3、
d.配列番号36とは、1個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1、
e.配列番号37とは、1個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2、および
f.配列番号38とは、1個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3。
a.配列番号33とは、1個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1、
b.配列番号34とは、1個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2、
c.配列番号35とは、1個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3、
d.配列番号36とは、1個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1、
e.配列番号37とは、1個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2、および
f.配列番号38とは、1個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3。
一実施形態では、本発明は、下記を含むヒトCD103に結合する抗体を提供する:
a.配列番号1とは、2個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1、
b.配列番号2とは、2個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2、
c.配列番号3とは、2個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3、
d.配列番号4とは、2個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1、
e.配列番号5とは、2個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2、および
f.配列番号6とは、2個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3。
a.配列番号1とは、2個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1、
b.配列番号2とは、2個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2、
c.配列番号3とは、2個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3、
d.配列番号4とは、2個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1、
e.配列番号5とは、2個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2、および
f.配列番号6とは、2個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3。
一実施形態では、本発明は、下記を含むヒトCD103に結合する抗体を提供する:
a.配列番号9とは、2個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1、
b.配列番号10とは、2個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2、
c.配列番号11とは、2個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3、
d.配列番号12とは、2個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1、
e.配列番号13とは、2個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2、および
f.配列番号14とは、2個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3。
a.配列番号9とは、2個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1、
b.配列番号10とは、2個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2、
c.配列番号11とは、2個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3、
d.配列番号12とは、2個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1、
e.配列番号13とは、2個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2、および
f.配列番号14とは、2個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3。
一実施形態では、本発明は、下記を含むヒトCD103に結合する抗体を提供する:
a.配列番号17とは、2個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1、
b.配列番号18とは、2個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2、
c.配列番号19とは、2個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3、
d.配列番号20とは、2個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1、
e.配列番号21とは、2個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2、および
f.配列番号22とは、2個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3。
a.配列番号17とは、2個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1、
b.配列番号18とは、2個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2、
c.配列番号19とは、2個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3、
d.配列番号20とは、2個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1、
e.配列番号21とは、2個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2、および
f.配列番号22とは、2個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3。
一実施形態では、本発明は、下記を含むヒトCD103に結合する抗体を提供する:
a.配列番号25とは、2個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1、
b.配列番号26とは、2個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2、
c.配列番号27とは、2個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3、
d.配列番号28とは、2個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1、
e.配列番号29とは、2個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2、および
f.配列番号30とは、2個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3。
a.配列番号25とは、2個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1、
b.配列番号26とは、2個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2、
c.配列番号27とは、2個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3、
d.配列番号28とは、2個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1、
e.配列番号29とは、2個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2、および
f.配列番号30とは、2個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3。
一実施形態では、本発明は、下記を含むヒトCD103に結合する抗体を提供する:
a.配列番号33とは、2個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1、
b.配列番号34とは、2個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2、
c.配列番号35とは、2個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3、
d.配列番号36とは、2個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1、
e.配列番号37とは、2個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2、および
f.配列番号38とは、2個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3。
a.配列番号33とは、2個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1、
b.配列番号34とは、2個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2、
c.配列番号35とは、2個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3、
d.配列番号36とは、2個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1、
e.配列番号37とは、2個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2、および
f.配列番号38とは、2個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3。
一実施形態では、本発明は、下記を含むヒトCD103に結合する抗体を提供する:
a.配列番号1とは、3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1、
b.配列番号2とは、3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2、
c.配列番号3とは、3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3、
d.配列番号4とは、3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1、
e.配列番号5とは、3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2、および
f.配列番号6とは、3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3。
a.配列番号1とは、3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1、
b.配列番号2とは、3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2、
c.配列番号3とは、3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3、
d.配列番号4とは、3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1、
e.配列番号5とは、3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2、および
f.配列番号6とは、3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3。
一実施形態では、本発明は、下記を含むヒトCD103に結合する抗体を提供する:
a.配列番号9とは、3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1、
b.配列番号10とは、3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2、
c.配列番号11とは、3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3、
d.配列番号12とは、3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1、
e.配列番号13とは、3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2、および
f.配列番号14とは、3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3。
a.配列番号9とは、3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1、
b.配列番号10とは、3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2、
c.配列番号11とは、3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3、
d.配列番号12とは、3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1、
e.配列番号13とは、3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2、および
f.配列番号14とは、3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3。
一実施形態では、本発明は、下記を含むヒトCD103に結合する抗体を提供する:
a.配列番号17とは、3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1、
b.配列番号18とは、3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2、
c.配列番号19とは、3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3、
d.配列番号20とは、3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1、
e.配列番号21とは、3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2、および
f.配列番号22とは、3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3。
a.配列番号17とは、3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1、
b.配列番号18とは、3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2、
c.配列番号19とは、3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3、
d.配列番号20とは、3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1、
e.配列番号21とは、3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2、および
f.配列番号22とは、3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3。
一実施形態では、本発明は、下記を含むヒトCD103に結合する抗体を提供する:
a.配列番号25とは、3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1、
b.配列番号26とは、3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2、
c.配列番号27とは、3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3、
d.配列番号28とは、3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1、
e.配列番号29とは、3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2、および
f.配列番号30とは、3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3。
a.配列番号25とは、3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1、
b.配列番号26とは、3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2、
c.配列番号27とは、3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3、
d.配列番号28とは、3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1、
e.配列番号29とは、3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2、および
f.配列番号30とは、3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3。
一実施形態では、本発明は、下記を含むヒトCD103に結合する抗体を提供する:
a.配列番号33とは、3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1、
b.配列番号34とは、3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2、
c.配列番号35とは、3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3、
d.配列番号36とは、3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1、
e.配列番号37とは、3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2、および
f.配列番号38とは、3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3。
a.配列番号33とは、3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1、
b.配列番号34とは、3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2、
c.配列番号35とは、3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3、
d.配列番号36とは、3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1、
e.配列番号37とは、3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2、および
f.配列番号38とは、3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3。
種々の他の実施形態では、本発明は:
a.配列番号7のアミノ酸配列を含む抗体または抗原結合フラグメントの重鎖および配列番号8のアミノ酸配列を含む抗体または抗原結合フラグメントの軽鎖;または
b.配列番号15のアミノ酸配列を含む抗体または抗原結合フラグメントの重鎖および配列番号16のアミノ酸配列を含む抗体または抗原結合フラグメントの軽鎖;または
c.配列番号23のアミノ酸配列を含む抗体または抗原結合フラグメントの重鎖および配列番号24のアミノ酸配列を含む抗体または抗原結合フラグメントの軽鎖;または
d.配列番号31のアミノ酸配列を含む抗体または抗原結合フラグメントの重鎖および配列番号32のアミノ酸配列を含む抗体または抗原結合フラグメントの軽鎖;または
e.配列番号39のアミノ酸配列を含む抗体または抗原結合フラグメントの重鎖および配列番号40のアミノ酸配列を含む抗体または抗原結合フラグメントの軽鎖;または
または、それぞれの場合で、所与の配列番号と少なくとも95%(およびより好ましくは97%または99%)の配列類似性または同一性を有するが、このような配列のいずれの差異も、その配列番号内のCDR配列の一部ではないアミノ酸に制限される配列、を含むヒトCD103に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
a.配列番号7のアミノ酸配列を含む抗体または抗原結合フラグメントの重鎖および配列番号8のアミノ酸配列を含む抗体または抗原結合フラグメントの軽鎖;または
b.配列番号15のアミノ酸配列を含む抗体または抗原結合フラグメントの重鎖および配列番号16のアミノ酸配列を含む抗体または抗原結合フラグメントの軽鎖;または
c.配列番号23のアミノ酸配列を含む抗体または抗原結合フラグメントの重鎖および配列番号24のアミノ酸配列を含む抗体または抗原結合フラグメントの軽鎖;または
d.配列番号31のアミノ酸配列を含む抗体または抗原結合フラグメントの重鎖および配列番号32のアミノ酸配列を含む抗体または抗原結合フラグメントの軽鎖;または
e.配列番号39のアミノ酸配列を含む抗体または抗原結合フラグメントの重鎖および配列番号40のアミノ酸配列を含む抗体または抗原結合フラグメントの軽鎖;または
または、それぞれの場合で、所与の配列番号と少なくとも95%(およびより好ましくは97%または99%)の配列類似性または同一性を有するが、このような配列のいずれの差異も、その配列番号内のCDR配列の一部ではないアミノ酸に制限される配列、を含むヒトCD103に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
一実施形態では、本発明は、配列番号7のアミノ酸配列を含む抗体の重鎖および配列番号8のアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖を含むヒトCD103に結合する抗体を提供する。
一実施形態では、本発明は、配列番号15のアミノ酸配列を含む抗体の重鎖および配列番号16のアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖を含むヒトCD103に結合する抗体を提供する。
一実施形態では、本発明は、配列番号23のアミノ酸配列を含む抗体の重鎖および配列番号24のアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖を含むヒトCD103に結合する抗体を提供する。
一実施形態では、本発明は、配列番号31のアミノ酸配列を含む抗体の重鎖および配列番号32のアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖を含むヒトCD103に結合する抗体を提供する。
一実施形態では、本発明は、配列番号39のアミノ酸配列を含む抗体の重鎖および配列番号40のアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖を含むヒトCD103に結合する抗体を提供する。
一実施形態では、本発明は、配列番号7と少なくとも95%(およびより好ましくは97%または最も好ましくは99%)の配列同一性を有するが、このような配列のいずれの差異も、配列番号7内のCDR配列の一部ではないアミノ酸に制限される、アミノ酸配列を含む抗体の重鎖および配列番号8と少なくとも95%(およびより好ましくは97%または最も好ましくは99%)の配列同一性を有するが、このような配列のいずれの差異も、配列番号8内のCDR配列の一部ではないアミノ酸に制限される、アミノ酸配列を含む抗体の軽鎖を含むヒトCD103に結合する抗体を提供する。
一実施形態では、本発明は、配列番号15と少なくとも95%(およびより好ましくは97%または最も好ましくは99%)の配列同一性を有するが、このような配列のいずれの差異も、配列番号15内のCDR配列の一部ではないアミノ酸に制限される、アミノ酸配列を含む抗体の重鎖および配列番号16と少なくとも95%(およびより好ましくは97%または最も好ましくは99%)の配列同一性を有するが、このような配列のいずれの差異も、配列番号16内のCDR配列の一部ではないアミノ酸に制限される、アミノ酸配列を含む抗体の軽鎖を含むヒトCD103に結合する抗体を提供する。
一実施形態では、本発明は、配列番号23と少なくとも95%(およびより好ましくは97%または最も好ましくは99%)の配列同一性を有するが、このような配列のいずれの差異も、配列番号23内のCDR配列の一部ではないアミノ酸に制限される、アミノ酸配列を含む抗体の重鎖および配列番号24と少なくとも95%(およびより好ましくは97%または最も好ましくは99%)の配列同一性を有するが、このような配列のいずれの差異も、配列番号24内のCDR配列の一部ではないアミノ酸に制限される、アミノ酸配列を含む抗体の軽鎖を含むヒトCD103に結合する抗体を提供する。
一実施形態では、本発明は、配列番号31と少なくとも95%(およびより好ましくは97%または最も好ましくは99%)の配列同一性を有するが、このような配列のいずれの差異も、配列番号31内のCDR配列の一部ではないアミノ酸に制限される、アミノ酸配列を含む抗体の重鎖および配列番号32と少なくとも95%(およびより好ましくは97%または最も好ましくは99%)の配列同一性を有するが、このような配列のいずれの差異も、配列番号32内のCDR配列の一部ではないアミノ酸に制限される、アミノ酸配列を含む抗体の軽鎖を含むヒトCD103に結合する抗体を提供する。
一実施形態では、本発明は、配列番号39と少なくとも95%(およびより好ましくは97%または最も好ましくは99%)の配列同一性を有するが、このような配列のいずれの差異も、配列番号39内のCDR配列の一部ではないアミノ酸に制限される、アミノ酸配列を含む抗体の重鎖および配列番号40と少なくとも95%(およびより好ましくは97%または最も好ましくは99%)の配列同一性を有するが、このような配列のいずれの差異も、配列番号40内のCDR配列の一部ではないアミノ酸に制限される、アミノ酸配列を含む抗体の軽鎖を含むヒトCD103に結合する抗体を提供する。
本文脈中、「配列類似性」は、保存的変化の程度と組み合わせた同一性の程度を基準にしている。「配列類似性」のパーセンテージは、同一性であるまたは保存的変化しているアミノ酸またはヌクレオチドのパーセンテージ、すなわち、「配列類似性」=配列同一性パーセント(+保存的変化パーセント)である。従って、本発明において、「保存的変化」および「同一性」は、上位概念「類似性」の一種であると見なされる。従って、用語の配列「類似性」が使われる場合は常に、それは、配列「同一性」および「保存的変化」を包含する。特定の実施形態では、保存的変化は無視され、パーセント配列類似性は、パーセント配列同一性を意味する。特定の実施形態では、参照されるパーセント配列同一性により許容される配列の変化は、全てまたはほぼ全てが保存的変化であり、すなわち、配列が90%同一である場合、残りの10%は、全てまたはほぼ全て保存的変化である。本文脈中の用語「ほぼ全て」は、許容される配列変化の少なくとも75%、より好ましくは少なくとも85%、さらにより好ましくは少なくとも90%、および最も好ましくは少なくとも95%が保存的変化であることを意味する。抗体重鎖および/または軽鎖の特定の実施形態では、許容される配列変化は、フレームワーク領域内にあり、CDR中にはない。
上記実施形態のいずれかで、抗体またはその抗原結合フラグメントは、その用語が本明細書で定義されるように、単離され得る。
上記実施形態のいずれかで、抗体またはその抗原結合フラグメントは、その用語が本明細書で定義されるように、組換え抗体である。
上記実施形態のいずれかで、抗体またはその抗原結合フラグメントは、その用語が本明細書で定義されるような、組換え抗体である。
本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、様々な種から得られ得る。例えば、本発明の抗体は、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、ニワトリ、ヤギ、ヒツジ、ロバ、ヒト、ラマまたはラクダ科動物配列、またはこのような配列の組み合わせ(いわゆるキメラ抗体)である免疫グロブリン配列を含み得る。最も好ましくは抗体または抗原結合フラグメントは、ヒト抗体または抗原結合フラグメントである。最も好ましくは抗体または抗原結合フラグメントは、ヒト化抗体または抗原結合フラグメントである。
用語の抗体には、抗原に結合する能力を保持する抗原結合部分、すなわち「抗原結合部位」(例えば、フラグメント、部分配列、相補性決定領域(CDR))を含み、これらには、(i)VL、VH、CLおよびCH1ドメインからなる一価のフラグメントであるFabフラグメント;(ii)ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって結合される2つのFabフラグメントを含む二価のフラグメントであるF(ab’)2フラグメント;(iii)VHおよびCH1ドメインからなるFdフラグメント;(iv)抗体の単一アームのVLおよびVHドメインからなるFvフラグメント;(v)VHドメインからなるdAbフラグメント(Ward et al.,(1989)Nature 341:544-546)ならびに(vi)単離された相補性決定領域(CDR)が含まれる。単鎖抗体も、用語の「抗体」への言及により含まれる。好ましい治療抗体は、完全IgG抗体である。本明細書で使用される場合、用語「完全抗体」は、認識された免疫グロブリンγ遺伝子により実質的にコードされる抗体のクラスに属するポリペプチドとして意図される。ヒトでは、このクラスは、IgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4を含む。マウスでは、このクラスは、IgG1、IgG2a、IgG2bおよびIgG3を含む。抗体のIgGクラスの既知のIgドメインは、VH、Cγ1、Cγ2、Cγ3、VL、およびCLである。
上記実施形態のいずれかで、抗体またはその抗原結合フラグメントは、2つの重鎖および2つの軽鎖を含むヒトまたはヒト化抗体である。一実施形態では、抗体はIgGである。好ましい実施形態では、抗体は、IgG1、IgG2、またはIgG4であり、好ましくはヒトIgG1、IgG2、またはIgG4である。
一実施形態では、本発明の抗CD103抗体は、上記の2つの軽鎖および2つの重鎖を有する完全長抗体構造を含み、各軽鎖は、ヒトカッパ軽鎖またはヒトラムダ軽鎖定常ドメインを含み、各重鎖は、ヒトIgG1定常領域を含む。
一実施形態では、本発明の抗CD103抗体は、上記の2つの軽鎖および2つの重鎖を有する完全長抗体構造を含み、各軽鎖は、ヒトカッパ軽鎖またはヒトラムダ軽鎖定常ドメインを含み、各重鎖は、ヒトIgG2定常領域を含む。
一実施形態では、本発明の抗CD103抗体は、上記の2つの軽鎖および2つの重鎖を有する完全長抗体構造を含み、各軽鎖は、ヒトカッパ軽鎖またはヒトラムダ軽鎖定常ドメインを含み、各重鎖は、ヒトIgG4定常領域を含む。
特定の実施形態では、本発明の抗CD103抗体は、インビボイメージング試験のために、少なくとも1種の診断標識にコンジュゲートされ得る。特定の実施形態では、本発明の抗CD103抗体の抗原結合フラグメントは、インビボイメージング試験のために、少なくとも1種の診断標識にコンジュゲートされ得る。特定の実施形態では、本発明の抗CD103抗体は、少なくとも1種の治療薬にコンジュゲートされ得る。特定の実施形態では、本発明の抗CD103抗体の抗原結合フラグメントは、少なくとも1種の治療薬にコンジュゲートされ得る。一実施形態では、治療薬は、第2抗体またはそのフラグメントである。一実施形態では、治療薬は、第2抗体である。一実施形態では、治療薬は、免疫調節剤である。一実施形態では、治療薬は、ホルモンである。一実施形態では、治療薬は、細胞傷害薬である。一実施形態では、治療薬は、酵素である。一実施形態では、治療薬は、放射性核種である。一実施形態では、治療薬は、少なくとも1種の免疫調節剤にコンジュゲートされた第2抗体である。一実施形態では、治療薬は、少なくとも1種の酵素にコンジュゲートされた第2抗体である。一実施形態では、治療薬は、少なくとも1種の放射性標識にコンジュゲートされた第2抗体である。一実施形態では、治療薬は、少なくとも1種のホルモンにコンジュゲートされた第2抗体である。一実施形態では、治療薬は、少なくとも1種のアンチセンスオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされた第2抗体である。一実施形態では、治療薬は、少なくとも1種の細胞傷害薬にコンジュゲートされた第2抗体である。一実施形態では、治療薬は、これらの組み合わせにコンジュゲートされた第2抗体である。一実施形態では、治療薬は、第2抗体またはそのフラグメント、免疫調節剤、ホルモン、細胞傷害薬、酵素、放射性核種、または免疫調節剤、酵素、放射性標識、ホルモン、アンチセンスオリゴヌクレオチド、または細胞傷害薬の少なくとも1種にコンジュゲートされた第2抗体のいずれか1種の組み合わせである。別の実施形態では、診断標識は、PETイメージングに適用できるものである。別の実施形態では、診断標識は、単一光子放射型コンピュータ断層撮影(SPECT)イメージングに適用できるものである。別の実施形態では、診断標識は、MRIに適用できるものである。別の実施形態では、診断標識は、光学イメージングに適用できるものである。別の実施形態では、診断標識は、11C、13N、15O、99mTc、61Cu、62Cu、64Cu、67Cu、18F、19F、66Ga、67Ga、68Ga、72Ga、123I、124I、111In、177Lu、44Sc、47Sc、86Y、88Y、90Y、45Ti、89Zr、インドシアニングリーン、IRDye 800CW、フルオレセイン(FITC)、磁気(例えば、酸化鉄)ナノ粒子などの(光)音響イメージングなどに適用できるものである。このリストは、限定することを意図したものではない。
本発明は、本発明の抗CD103抗体または抗原結合フラグメントのいずれか1つをコードする単離核酸も提供する。
本発明はまた、本発明の1種または複数の核酸を含む発現ベクターも提供する。発現ベクターは、宿主細胞中の標的核酸の転写に必要な調節エレメントを含むDNA分子である。典型的には、標的核酸は、構成的または誘導性プロモーター、組織特異的調節エレメント、およびエンハンサー配列を含む特定の調節エレメントの制御下に置かれる。このような標的核酸は、調節エレメントが遺伝子の発現を制御する場合、調節エレメントに「動作可能に連結された」と言われる。
これらの単離核酸およびそれらを含む発現ベクターは、組換え宿主細胞中で本発明の抗体またはそれらの抗原結合フラグメントを発現させるために使用され得る。従って、本発明はまた、本発明の発現ベクターを含む宿主細胞も提供する。
本発明はまた、本発明の抗CD103抗体または抗原結合フラグメントのいずれか1つを含む容器または注入装置も提供する。
本発明はまた、本発明の抗体の重鎖および/または軽鎖(またはその抗原結合フラグメント)をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を、ポリヌクレオチドの発現に好ましい条件下で培養すること、および任意選択で、宿主細胞および/または培地から抗体または抗原結合フラグメントを回収すること、を含む本発明の抗CD103抗体または抗原結合フラグメントの製造方法も提供する。一実施形態では、重鎖をコードするポリヌクレオチドおよび軽鎖をコードするポリヌクレオチドは、単一ベクター中に存在する。別の実施形態では、重鎖をコードするポリヌクレオチドおよび軽鎖をコードするポリヌクレオチドは、異なるベクター中に存在する。
別の態様では、本発明は、組織または他の生物検体のイメージング方法に関する。これらの方法は、生物検体を抗CD103抗体と接触させること、および生物検体中に存在するCD103に対する抗体の結合の存在または結合量を検出すること、を含む。従って、抗CD103抗体は、イメージング剤として使用される。
関連態様では、本発明は、抗CD103抗体および診断標識を含むイメージング剤の製造方法に関する。これらの方法は、抗CD103抗体と診断標識との間での共有結合の形成を含む。あるいは、これらの方法は、抗CD103抗体と診断標識との間での非共有結合の形成を含む。放射標識の場合には、同位体を、放射性金属の固定化のための第1の官能基および抗体への共有結合のための第2の官能基を含む二官能性キレート化剤を用いて、キレート化し得る。このようなキレート化剤の例には、限定されないが、DOTA、NOTA、TRITA、TETA、TACN、サイクレン、サイクラム、ホモシクレン、EDTA、DTPA、DOTP、およびNOTMPが挙げられる。キレート化剤の官能化バージョンは、保護または非保護スルフヒドリル部分、保護または非保護アミン部分、保護または非保護ヒドロキシル部分、一級アミン反応性部分、スルフヒドリル反応性部分、光反応性部分、カルボキシル反応性部分、アルギニン反応性部分、およびカルボニル反応性部分からなる群から選択され得る末端官能基をもたらすリンケージケミストリーを提供する。キレート化剤の官能化バージョンは、末端官能基(すなわち、保護スルフヒドリル部分)をもたらすリンケージケミストリーを提供する。キレート化剤の官能化バージョンは、末端官能基(すなわち、非保護スルフヒドリル部分)をもたらすリンケージケミストリーを提供する。キレート化剤の官能化バージョンは、末端官能基(すなわち、保護アミン部分)をもたらすリンケージケミストリーを提供する。キレート化剤の官能化バージョンは、末端官能基(すなわち、非保護アミン部分)をもたらすリンケージケミストリーを提供する。キレート化剤の官能化バージョンは、末端官能基(すなわち、保護ヒドロキシル部分)をもたらすリンケージケミストリーを提供する。キレート化剤の官能化バージョンは、末端官能基(すなわち、非保護ヒドロキシル部分)をもたらすリンケージケミストリーを提供する。キレート化剤の官能化バージョンは、末端官能基(すなわち、アミン反応性部分)をもたらすリンケージケミストリーを提供する。キレート化剤の官能化バージョンは、末端官能基(すなわち、スルフヒドリル反応性部分)をもたらすリンケージケミストリーを提供する。キレート化剤の官能化バージョンは、末端官能基(すなわち、光反応性部分)をもたらすリンケージケミストリーを提供する。キレート化剤の官能化バージョンは、末端官能基(すなわち、カルボキシル反応性部分)をもたらすリンケージケミストリーを提供する。キレート化剤の官能化バージョンは、末端官能基(すなわち、アルギニン反応性部分)をもたらすリンケージケミストリーを提供する。キレート化剤の官能化バージョンは、末端官能基(すなわち、カルボニル反応性部分)をもたらすリンケージケミストリーを提供する。還元剤がジスルフィド結合を放射標識に結合する遊離チオールに変換する直接ラベル表示手法も意図される。
種々の実施形態では、診断標識は、酵素、核酸、フルオロフォア、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、ジゴキシゲニン、マルトース、オリゴヒスチジン、2,4-ジニトロベンゼン、フェニルアルセネート、金属、ペプチドタグ、蛍光またはカラードマイクロスフェア、蛍光粒子、およびカラードラテックス粒子、からなる群から選択され得る。このリストは、限定することを意図したものではない。種々の実施形態では、診断標識は、酵素である。種々の実施形態では、診断標識は、核酸である。種々の実施形態では、診断標識は、フルオロフォアである。種々の実施形態では、診断標識は、ビオチンである。種々の実施形態では、診断標識は、アビジンである。種々の実施形態では、診断標識は、ストレプトアビジンである。種々の実施形態では、診断標識は、ジゴキシゲニンである。種々の実施形態では、診断標識は、マルトースである。種々の実施形態では、診断標識は、オリゴヒスチジンである。種々の実施形態では、診断標識は、2,4-ジニトロベンゼンである。種々の実施形態では、診断標識は、フェニルアルセネートである。種々の実施形態では、診断標識は、金属である。種々の実施形態では、診断標識は、ペプチドタグである。種々の実施形態では、診断標識は、蛍光マイクロスフェアである。種々の実施形態では、診断標識は、カラードマイクロスフェアである。種々の実施形態では、診断標識は、蛍光粒子である。種々の実施形態では、診断標識は、カラードラテックス粒子である。このような標識は、マレイミド、ハロゲン化アルキル、アリールハライド、αハロアシル、活性化アリール、ピリジルジスルフィド、カルボニル、カルボキシル、チオール、チオエステル、ジスルフィド、N-ヒドロキシスクシンイミド、または環状チオラクトン、などを含む架橋剤により抗体にコンジュゲートされ得る。
特定の実施形態では、生物検体は、生体内組織であり、方法はインビボイメージング法である。特定の実施形態では、生物検体は、生体内組織であり、方法はPETイメージングなどのインビボイメージング法である。特定の実施形態では、生物検体は、生体内組織であり、方法は単一光子放射型コンピュータ断層撮影(SPECT)イメージングによるインビボイメージング法である。特定の実施形態では、生物検体は、生体内組織であり、方法はMRIインビボイメージング法である。これらの方法では、抗CD103抗体は、用いられるイメージング方法の必要条件により検出可能なように標識される。好適な診断標識は本明細書で記載され、限定されないが、11C、13N、15O、99mTc、61Cu、62Cu、64Cu、67Cu、18F、19F、66Ga、67Ga、68Ga、72Ga、123I、124I、111In、177Lu、44Sc、47Sc、86Y、88Y、90Y、45Ti、89Zr、インドシアニングリーン、IRDye 800CW、フルオレセイン(FITC)、および磁気(例えば、酸化鉄)ナノ粒子などが挙げられる。
種々の実施形態では、イメージング剤として使用される抗CD103抗体は、CD103のその同族受容体E-カドヘリンへの結合を遮断する。種々の実施形態では、イメージング剤として使用される抗CD103抗体は、CD103のその同族受容体E-カドヘリンへの結合を遮断しない。種々の実施形態では、イメージング剤として使用される抗CD103抗体は、CD103のその同族受容体E-カドヘリンへの結合を部分的に遮断する。それぞれのこれらのタイプの抗CD103抗体は本明細書の以降で記載される。
種々の実施形態では、組織または他の生物検体のイメージング方法は、本発明の抗体をイメージング剤として利用する。
種々の実施形態では、組織または他の生物検体のイメージング方法は、本発明の抗体の抗原結合フラグメントをイメージング剤として利用する。
種々の実施形態では、組織または他の生物検体のイメージング方法は、以下を含む、抗体またはその抗原結合フラグメントをイメージング剤として利用する:
a.配列番号1のアミノ酸配列または配列番号1とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1、
b.配列番号2のアミノ酸配列または配列番号2とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2、
c.配列番号3のアミノ酸配列または配列番号3とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3、
d.配列番号4のアミノ酸配列または配列番号4とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1、
e.配列番号5のアミノ酸配列または配列番号5とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2、
f.配列番号6のアミノ酸配列または配列番号6とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3、
または
g.配列番号9のアミノ酸配列または配列番号9とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1、
h.配列番号10のアミノ酸配列または配列番号10とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2、
i.配列番号11のアミノ酸配列または配列番号11とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3、
j.配列番号12のアミノ酸配列または配列番号12とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1、
k.配列番号13のアミノ酸配列または配列番号13とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2、および
l.配列番号14のアミノ酸配列または配列番号14とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3、
または
m.配列番号17のアミノ酸配列または配列番号17とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1、
n.配列番号18のアミノ酸配列または配列番号18とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2、
o.配列番号19のアミノ酸配列または配列番号19とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3、
p.配列番号20のアミノ酸配列または配列番号20とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1、
q.配列番号21のアミノ酸配列または配列番号21とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2、
r.配列番号22のアミノ酸配列または配列番号22とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3、
または
s.配列番号25のアミノ酸配列または配列番号25とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1、
t.配列番号26のアミノ酸配列または配列番号26とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2、
u.配列番号27のアミノ酸配列または配列番号27とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3、
v.配列番号28のアミノ酸配列または配列番号28とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1、
w.配列番号29のアミノ酸配列または配列番号29とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2、および
x.配列番号30のアミノ酸配列または配列番号30とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3、
または
y.配列番号33のアミノ酸配列または配列番号33とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1、
z.配列番号34のアミノ酸配列または配列番号34とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2、
aa.配列番号35のアミノ酸配列または配列番号35とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3、
bb.配列番号36のアミノ酸配列または配列番号36とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1、
cc.配列番号37のアミノ酸配列または配列番号37とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2、および
dd.配列番号38のアミノ酸配列または配列番号38とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3。
a.配列番号1のアミノ酸配列または配列番号1とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1、
b.配列番号2のアミノ酸配列または配列番号2とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2、
c.配列番号3のアミノ酸配列または配列番号3とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3、
d.配列番号4のアミノ酸配列または配列番号4とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1、
e.配列番号5のアミノ酸配列または配列番号5とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2、
f.配列番号6のアミノ酸配列または配列番号6とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3、
または
g.配列番号9のアミノ酸配列または配列番号9とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1、
h.配列番号10のアミノ酸配列または配列番号10とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2、
i.配列番号11のアミノ酸配列または配列番号11とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3、
j.配列番号12のアミノ酸配列または配列番号12とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1、
k.配列番号13のアミノ酸配列または配列番号13とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2、および
l.配列番号14のアミノ酸配列または配列番号14とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3、
または
m.配列番号17のアミノ酸配列または配列番号17とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1、
n.配列番号18のアミノ酸配列または配列番号18とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2、
o.配列番号19のアミノ酸配列または配列番号19とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3、
p.配列番号20のアミノ酸配列または配列番号20とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1、
q.配列番号21のアミノ酸配列または配列番号21とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2、
r.配列番号22のアミノ酸配列または配列番号22とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3、
または
s.配列番号25のアミノ酸配列または配列番号25とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1、
t.配列番号26のアミノ酸配列または配列番号26とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2、
u.配列番号27のアミノ酸配列または配列番号27とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3、
v.配列番号28のアミノ酸配列または配列番号28とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1、
w.配列番号29のアミノ酸配列または配列番号29とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2、および
x.配列番号30のアミノ酸配列または配列番号30とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3、
または
y.配列番号33のアミノ酸配列または配列番号33とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1、
z.配列番号34のアミノ酸配列または配列番号34とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2、
aa.配列番号35のアミノ酸配列または配列番号35とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3、
bb.配列番号36のアミノ酸配列または配列番号36とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1、
cc.配列番号37のアミノ酸配列または配列番号37とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2、および
dd.配列番号38のアミノ酸配列または配列番号38とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3。
種々の他の実施形態では、組織または他の生物検体のイメージング方法は、
a.配列番号7のアミノ酸配列を含む抗体または抗原結合フラグメントの重鎖および配列番号8のアミノ酸配列を含む抗体または抗原結合フラグメントの軽鎖;または
b.配列番号15のアミノ酸配列を含む抗体または抗原結合フラグメントの重鎖および配列番号16のアミノ酸配列を含む抗体または抗原結合フラグメントの軽鎖;または
c.配列番号23のアミノ酸配列を含む抗体または抗原結合フラグメントの重鎖および配列番号24のアミノ酸配列を含む抗体または抗原結合フラグメントの軽鎖;または
d.配列番号31のアミノ酸配列を含む抗体または抗原結合フラグメントの重鎖および配列番号32のアミノ酸配列を含む抗体または抗原結合フラグメントの軽鎖;または
e.配列番号39のアミノ酸配列を含む抗体または抗原結合フラグメントの重鎖および配列番号40のアミノ酸配列を含む抗体または抗原結合フラグメントの軽鎖;または
または、それぞれの場合で、所与の配列番号と少なくとも95%(およびより好ましくは97%または99%)の配列類似性または同一性を有するが、このような配列のいずれの差異も、その配列番号内のCDR配列の一部ではないアミノ酸に制限される配列を含む、抗体またはその抗原結合フラグメントをイメージング剤として利用する。
a.配列番号7のアミノ酸配列を含む抗体または抗原結合フラグメントの重鎖および配列番号8のアミノ酸配列を含む抗体または抗原結合フラグメントの軽鎖;または
b.配列番号15のアミノ酸配列を含む抗体または抗原結合フラグメントの重鎖および配列番号16のアミノ酸配列を含む抗体または抗原結合フラグメントの軽鎖;または
c.配列番号23のアミノ酸配列を含む抗体または抗原結合フラグメントの重鎖および配列番号24のアミノ酸配列を含む抗体または抗原結合フラグメントの軽鎖;または
d.配列番号31のアミノ酸配列を含む抗体または抗原結合フラグメントの重鎖および配列番号32のアミノ酸配列を含む抗体または抗原結合フラグメントの軽鎖;または
e.配列番号39のアミノ酸配列を含む抗体または抗原結合フラグメントの重鎖および配列番号40のアミノ酸配列を含む抗体または抗原結合フラグメントの軽鎖;または
または、それぞれの場合で、所与の配列番号と少なくとも95%(およびより好ましくは97%または99%)の配列類似性または同一性を有するが、このような配列のいずれの差異も、その配列番号内のCDR配列の一部ではないアミノ酸に制限される配列を含む、抗体またはその抗原結合フラグメントをイメージング剤として利用する。
別の態様では、本発明は、本発明の抗CD103抗体の治療薬としての使用方法に関する。関連態様では、本発明は、本発明の抗CD103抗体の薬物の製造での使用に関する。別の関連する態様では、本発明は、CD103シグナル伝達を阻害するための本発明の抗CD103抗体の使用方法に関する。別の関連する態様では、本発明は、CD103のE-カドヘリンへの結合を遮断するための本発明の抗CD103抗体の使用方法に関する。
一実施形態では、方法は、CD103シグナル伝達媒介状態の治療を必要としている個体のその状態を治療するためのものであり、該方法は、本発明の有効量の抗CD103抗体を個体に投与することを含み、抗CD103抗体は、任意選択で、細胞傷害薬に結合される。
一実施形態では、方法は、CD103シグナル伝達媒介状態の治療を必要としている個体のその状態を治療するためのものであり、該方法は、本発明の有効量の抗CD103抗体の抗原結合フラグメントを個体に投与することを含み、抗CD103抗体は、任意選択で、細胞傷害薬に結合される。
一実施形態では、方法は、CD103シグナル伝達媒介状態の予防を必要としている個体のその状態を予防するためのものであり、該方法は、本発明の有効量の抗CD103抗体、またはその抗原結合フラグメントを個体に投与することを含み、抗CD103抗体は、任意選択で、細胞傷害薬に結合される。
一実施形態では、方法は、CD103シグナル伝達媒介状態の予防を必要としている個体のその状態を予防するためのものであり、該方法は、本発明の有効量の抗CD103抗体の抗原結合フラグメントを個体に投与することを含み、抗CD103抗体は、任意選択で、細胞傷害薬に結合される。
別の実施形態では、方法は、細胞におけるCD103シグナル伝達を阻害するためのものであり、方法は、細胞を本発明の抗CD103抗体、またはその抗原結合フラグメントと接触させることを含む。
別の実施形態では、方法は、細胞上に存在するE-カドヘリンに対するCD103の結合を阻害するためのものであり、方法は、細胞を本発明の抗CD103抗体、またはその抗原結合フラグメントと接触させることを含む。
さらに別の実施形態では、方法は、個体におけるCD103発現細胞を枯渇させるためのものであり、該方法は、本発明の有効量の抗CD103抗体、またはその抗原結合フラグメントを個体に投与することを含み、抗CD103抗体は、任意選択で、細胞傷害薬に結合される。
さらに別の実施形態では、方法は、毛様細胞性白血病、HCLv、腸および腸外リンパ腫、腸疾患関連T細胞性リンパ腫(EATL)、Tリンパ性白血病/リンパ腫(T-ALL)、T細胞性前リンパ球性白血病(T-PLL)、成体T細胞白血病/リンパ腫(ATLL)、菌状息肉腫(MF)、未分化大細胞リンパ腫ALCL、皮膚T細胞性リンパ腫(CTCL)、セザリー症候群(SS)、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、IgM多発性神経障害、重症筋無力症、アトピー性皮膚炎、アレルギー、喘息、全身性炎症反応症候群(SIRS)、敗血症、敗血性ショック、アテローム性動脈硬化症、セリアック病、皮膚筋炎、強皮症、間質性膀胱炎、移植拒絶反応、移植片対宿主病、アイカルディ・グティエール症候群、ハッチンソン・ギルフォード早老症候群、シングレトン・マートン症候群、プロテアソーム関連自己炎症症候群、SAVI(乳児発症STING関連血管炎)、CANDLE(脂肪異栄養症および発熱を伴う慢性非典型的好中球性皮膚疾患)症候群、エリテマトーデス、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、ウェゲナー疾患、炎症性腸疾患(例えば、潰瘍性大腸炎、クローン病)、特発性血小板減少性紫斑病特発性血小板減少性紫斑病、血栓性血小板減少性紫斑病、自己免疫性血小板減少症、多発性硬化症、乾癬、IgA腎症、IgM多発性神経障害、糸球体腎炎、自己免疫性心筋炎、重症筋無力症、血管炎、1型糖尿病、2型糖尿病、シェーグレン症候群、全身症状を伴うX連鎖色素性網状疾患、多発性筋炎、脊椎軟骨内異形成症、および加齢黄斑変性からなる群より選択される疾患の治療または予防を必要としている個体の疾患を治療または予防するためのものであり、該方法は、本発明の有効量の抗CD103抗体、またはその抗原結合フラグメントを個体に投与することを含み、抗CD103抗体は、任意選択で、細胞傷害薬に結合される。
さらに別の実施形態では、方法は、毛様細胞性白血病、HCLv、腸および腸外リンパ腫、腸疾患関連T細胞性リンパ腫(EATL)、Tリンパ性白血病/リンパ腫(T-ALL)、T細胞性前リンパ球性白血病(T-PLL)、成体T細胞白血病/リンパ腫(ATLL)、菌状息肉腫(MF)、未分化大細胞リンパ腫ALCL、皮膚T細胞性リンパ腫(CTCL)、セザリー症候群(SS)、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、IgM多発性神経障害、重症筋無力症、アトピー性皮膚炎、アレルギー、喘息、全身性炎症反応症候群(SIRS)、敗血症、敗血性ショック、アテローム性動脈硬化症、セリアック病、皮膚筋炎、強皮症、間質性膀胱炎、移植拒絶反応、移植片対宿主病、アイカルディ・グティエール症候群、ハッチンソン・ギルフォード早老症候群、シングレトン・マートン症候群、プロテアソーム関連自己炎症症候群、SAVI(乳児発症STING関連血管炎)、CANDLE(脂肪異栄養症および発熱を伴う慢性非典型的好中球性皮膚疾患)症候群、エリテマトーデス、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、ウェゲナー疾患、炎症性腸疾患(例えば、潰瘍性大腸炎、クローン病)、特発性血小板減少性紫斑病特発性血小板減少性紫斑病、血栓性血小板減少性紫斑病、自己免疫性血小板減少症、多発性硬化症、乾癬、IgA腎症、IgM多発性神経障害、糸球体腎炎、自己免疫性心筋炎、重症筋無力症、血管炎、1型糖尿病、2型糖尿病、シェーグレン症候群、全身症状を伴うX連鎖色素性網状疾患、多発性筋炎、脊椎軟骨内異形成症、および加齢黄斑変性からなる群より選択される疾患の治療を必要としている個体の疾患を治療するためのものであり、該方法は、本発明の有効量の抗CD103抗体を個体に投与することを含み、抗CD103抗体は、任意選択で、細胞傷害薬に結合される。
さらに別の実施形態では、方法は、毛様細胞性白血病、HCLv、腸および腸外リンパ腫、腸疾患関連T細胞性リンパ腫(EATL)、Tリンパ性白血病/リンパ腫(T-ALL)、T細胞性前リンパ球性白血病(T-PLL)、成体T細胞白血病/リンパ腫(ATLL)、菌状息肉腫(MF)、未分化大細胞リンパ腫ALCL、皮膚T細胞性リンパ腫(CTCL)、セザリー症候群(SS)、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、IgM多発性神経障害、重症筋無力症、アトピー性皮膚炎、アレルギー、喘息、全身性炎症反応症候群(SIRS)、敗血症、敗血性ショック、アテローム性動脈硬化症、セリアック病、皮膚筋炎、強皮症、間質性膀胱炎、移植拒絶反応、移植片対宿主病、アイカルディ・グティエール症候群、ハッチンソン・ギルフォード早老症候群、シングレトン・マートン症候群、プロテアソーム関連自己炎症症候群、SAVI(乳児発症STING関連血管炎)、CANDLE(脂肪異栄養症および発熱を伴う慢性非典型的好中球性皮膚疾患)症候群、エリテマトーデス、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、ウェゲナー疾患、炎症性腸疾患(例えば、潰瘍性大腸炎、クローン病)、特発性血小板減少性紫斑病特発性血小板減少性紫斑病、血栓性血小板減少性紫斑病、自己免疫性血小板減少症、多発性硬化症、乾癬、IgA腎症、IgM多発性神経障害、糸球体腎炎、自己免疫性心筋炎、重症筋無力症、血管炎、1型糖尿病、2型糖尿病、シェーグレン症候群、全身症状を伴うX連鎖色素性網状疾患、多発性筋炎、脊椎軟骨内異形成症、および加齢黄斑変性からなる群より選択される疾患の予防を必要としている個体の疾患を予防するためのものであり、該方法は、本発明の有効量の抗CD103抗体を個体に投与することを含み、抗CD103抗体は、任意選択で、細胞傷害薬に結合される。
種々の実施形態では、これらの方法は、本発明の抗体を利用する。
種々の実施形態では、これらの方法は、本発明の抗体の抗原結合フラグメントを利用する。
種々の実施形態では、これらの方法は、下記を含む、抗体またはその抗原結合フラグメントを利用する:
a.配列番号1のアミノ酸配列または配列番号1とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1、
b.配列番号2のアミノ酸配列または配列番号2とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2、
c.配列番号3のアミノ酸配列または配列番号3とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3、
d.配列番号4のアミノ酸配列または配列番号4とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1、
e.配列番号5のアミノ酸配列または配列番号5とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2、
f.配列番号6のアミノ酸配列または配列番号6とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3、
または
g.配列番号9のアミノ酸配列または配列番号9とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1、
h.配列番号10のアミノ酸配列または配列番号10とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2、
i.配列番号11のアミノ酸配列または配列番号11とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3、
j.配列番号12のアミノ酸配列または配列番号12とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1、
k.配列番号13のアミノ酸配列または配列番号13とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2、および
l.配列番号14のアミノ酸配列または配列番号14とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3、
または
m.配列番号17のアミノ酸配列または配列番号17とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1、
n.配列番号18のアミノ酸配列または配列番号18とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2、
o.配列番号19のアミノ酸配列または配列番号19とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3、
p.配列番号20のアミノ酸配列または配列番号20とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1、
q.配列番号21のアミノ酸配列または配列番号21とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2、
r.配列番号22のアミノ酸配列または配列番号22とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3、
または
s.配列番号25のアミノ酸配列または配列番号25とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1、
t.配列番号26のアミノ酸配列または配列番号26とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2、
u.配列番号27のアミノ酸配列または配列番号27とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3、
v.配列番号28のアミノ酸配列または配列番号28とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1、
w.配列番号29のアミノ酸配列または配列番号29とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2、および
x.配列番号30のアミノ酸配列または配列番号30とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3、
または
y.配列番号33のアミノ酸配列または配列番号33とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1、
z.配列番号34のアミノ酸配列または配列番号34とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2、
aa.配列番号35のアミノ酸配列または配列番号35とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3、
bb.配列番号36のアミノ酸配列または配列番号36とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1、
cc.配列番号37のアミノ酸配列または配列番号37とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2、および
dd.配列番号38のアミノ酸配列または配列番号38とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3。
a.配列番号1のアミノ酸配列または配列番号1とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1、
b.配列番号2のアミノ酸配列または配列番号2とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2、
c.配列番号3のアミノ酸配列または配列番号3とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3、
d.配列番号4のアミノ酸配列または配列番号4とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1、
e.配列番号5のアミノ酸配列または配列番号5とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2、
f.配列番号6のアミノ酸配列または配列番号6とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3、
または
g.配列番号9のアミノ酸配列または配列番号9とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1、
h.配列番号10のアミノ酸配列または配列番号10とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2、
i.配列番号11のアミノ酸配列または配列番号11とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3、
j.配列番号12のアミノ酸配列または配列番号12とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1、
k.配列番号13のアミノ酸配列または配列番号13とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2、および
l.配列番号14のアミノ酸配列または配列番号14とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3、
または
m.配列番号17のアミノ酸配列または配列番号17とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1、
n.配列番号18のアミノ酸配列または配列番号18とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2、
o.配列番号19のアミノ酸配列または配列番号19とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3、
p.配列番号20のアミノ酸配列または配列番号20とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1、
q.配列番号21のアミノ酸配列または配列番号21とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2、
r.配列番号22のアミノ酸配列または配列番号22とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3、
または
s.配列番号25のアミノ酸配列または配列番号25とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1、
t.配列番号26のアミノ酸配列または配列番号26とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2、
u.配列番号27のアミノ酸配列または配列番号27とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3、
v.配列番号28のアミノ酸配列または配列番号28とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1、
w.配列番号29のアミノ酸配列または配列番号29とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2、および
x.配列番号30のアミノ酸配列または配列番号30とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3、
または
y.配列番号33のアミノ酸配列または配列番号33とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1、
z.配列番号34のアミノ酸配列または配列番号34とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2、
aa.配列番号35のアミノ酸配列または配列番号35とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3、
bb.配列番号36のアミノ酸配列または配列番号36とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1、
cc.配列番号37のアミノ酸配列または配列番号37とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2、および
dd.配列番号38のアミノ酸配列または配列番号38とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3。
本発明は、記載したものの他に複数の実施形態が可能であり、また、種々の方法で実施および実行できることを理解されたい。また、本明細書で使用される表現および用語、ならびに要約は、説明の目的のためであり、限定するものと見なされるべきではないことを理解されたい。従って、当業者なら、本発明のいくつかの目的を実行するための他の構成、方法およびシステムの設計用の基準として、本開示が拠り所としている概念を容易に利用し得る。従って、本発明の趣旨と範囲からから逸脱することのない限り、特許請求の範囲がこのような等価の構成を含むと見なされることは重要である。
全てでないにしても、ほとんどの癌免疫療法は、癌細胞中で優先的にまたは選択的に発現され、細胞表面上の主要組織適合性分子(MHC)を介して提示される抗原に対するT細胞ベース免疫応答の誘導に依存している。この作用モードは、おそらく、プログラム死-1(PD-1)またはそのリガンド(PD-L1)を遮断するモノクローナル抗体による治療に対する、高い腫瘍遺伝子変異量(TMB)を有する患者の絶妙な応答により最も良く例示されるであろう。免疫療法の将来性をより多くの患者に拡大するために、現在、2000を越える(組み合わせ)免疫療法試験が多数のタイプの癌に対し開始されている。この極めて多くの治療選択を考慮すると、薬物開発、医療判断をガイドでき、治療効果を評価できるバイオマーカーが緊急に必要とされている。
免疫療法の成功の証明は、腫瘍体積(腫瘍浸潤リンパ球;TIL)内のT細胞の活性および数の増大である。従って、腫瘍病変中のTIL「量」は、免疫療法に対する患者の選択およびモニタリングを支援する魅力的なバイオマーカーを表す。不幸にも、TILの広範なレパートリーがあり、腫瘍内の全てのT細胞が抗癌免疫応答に関与しているわけではない。近年、インテグリンサブユニットCD103が、食道、メラノーマ、肺、乳房、膀胱および全ての婦人科の癌を含む上皮悪性腫瘍に対する予後指標としての有用性のために、TILのマーカーとして出現した。重要なのは、CD103+TILは、腫瘍中の制癌作用に予め関連しているCD39+、PD-1+、およびCD137+TIL集団を含むことである。機構調査はまた、CD103の同族標的に対してT細胞の特異的活性化後にCD103が誘導され、CD103+細胞がメラノーマ、食道扁平上皮細胞癌および非小細胞肺癌患者における成功裡の抗PD-1治療中に顕著に増殖されることを実証した。最終的に、CD103は、腫瘍中の他の免疫細胞集団に非存在であり、従って、優秀細胞特異性を提供する。まとめると、腫瘍内CD103検出は、TIL量および免疫療法に対する応答を測定するための優れたバイオマーカーを提供し得る。
TIL量を評価する現在の標準的方法は、組織生検材料の免疫組織化学的検査(IHC)によるものである。しかし、患者の病変、量への不十分なアクセスの容易さ、病変内および病変間の腫瘍不均一性およびサンプリングエラーなどの生検ベース技術に関連するいくつかの既知の障害が存在する。また、現在の技術を用いた場合、腫瘍病変中のT細胞浸潤を経時的に追跡することが困難/不可能である。これらの障害を克服し、患者の全ての腫瘍病変および毒性感受性臓器中のTIL量に関する情報を得るために、非侵襲的全身イメージング技術を適用できる。陽電子放出断層撮影(PET)は、ホルモンおよび成長因子受容体の発現などの腫瘍特性の反復性非侵襲的臨床評価を可能にする分子イメージング技術である。PETは、高い空間分解能、感度、およびイメージングシグナルを定量化する可能性を特徴とする。PETは、好適な高感度放射性医薬品が入手できれば、腫瘍中のCD103+細胞の特異的モニタリングを可能にするであろう。従って、ここで、我々は、放射性医薬品として使用するために好適する種々の抗CD103特異的抗体の開発について記載する。
診断/予後の標的に加えて、CD103はまた、種々の疾患において治療標的を提示する。例えば、CD103は、T細胞、腸上皮内リンパ球および粘膜固有層リンパ球を含むいくつかのリンパ球サブセット中で発現される。CD103とE-カドヘリンとの間の相互作用は、リンパ球の上皮細胞への接着を生ずる。E-カドヘリンは上皮細胞中で構成的に発現されているが、CD103の発現は、インビトロ炎症性刺激時にT細胞中で誘導される。CD103の遮断は、CD8+およびTh9細胞の増殖を伴う障害、例えば、炎症性腸疾患および同種移植片拒絶に特に関連する。CD103はまた、樹状細胞により、これらの細胞の悪性型を含む種々のT細胞型上に発現される。さらに、腫瘍関連CD103+CD8 T細胞は、免疫寛容原性表現型を有することができ、CD103+DCは、免疫調節分子の発現を示し、IL-10、TGF-β、IL-35、およびインドールアミン 2,3-ジオキシゲナーゼ(IDO)などの免疫抑制因子を産生し、T細胞アネルギーおよびアポトーシスならびにTregの誘導をもたらす。
従って、CD103に結合し、そのCD103とE-カドヘリンとの間の相互作用を妨げる分子は、疾患のための薬物候補である。同様に、CD103に結合する分子は、例えば、治療目的のために、CD103発現細胞を枯渇させる抗体-薬物コンジュゲートの一部として使用し得る。
定義
本発明がさらに容易に理解され得るように、特定の技術的および科学的用語が以下で特に定義される。本明細書の別の場所で特に定義されない限り、本明細書で用いられるすべての他の技術的および科学的な用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。
本発明がさらに容易に理解され得るように、特定の技術的および科学的用語が以下で特に定義される。本明細書の別の場所で特に定義されない限り、本明細書で用いられるすべての他の技術的および科学的な用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。
添付の特許請求の範囲を含む、本明細書中で使用される場合、単語の単数形、例えば、「a」、「an」および「the」は、文脈によりそうでないことが明確に示されない限り、それらの対応する複数の参照物を包含する。
「投与」および「治療」は、動物、ヒト、実験対象、細胞、組織、器官、または生体液に適用される場合、外因性の医薬、治療薬、診断薬、または組成物の、動物、ヒト、対象、細胞、組織、器官、または生体液への接触を意味する。細胞の治療は、試薬の細胞への接触、ならびに試薬の体液への接触を包含し、この場合、体液は細胞と接触している。「投与」および「治療」はまた、例えば、細胞の、試薬、診断薬、結合化合物、または別の細胞によるインビトロおよびエクスビボ治療も意味する。
「治療する」または「治療すること」は、治療薬、例えば、本発明のいずれかの抗体または抗原結合フラグメントを含む組成物を、内部的にまたは外部的に、その薬剤が治療活性を有する1種または複数種の病徴を有する、または疾患を有すると疑われる対象または患者に投与することを意味する。通常、薬剤は、いずれかの臨床的に測定可能な程度に、このような症状(単一または複数)の退行を誘導するかまたは進行を抑制することにより、治療される対象または集団における1種または複数種の病徴を改善するのに効果的な量で投与される。いずれかの特定の病徴を改善するのに効果的な治療薬の量は、疾患状態、年齢、および患者の体重、ならびに対象の所望の応答を誘発する薬剤の能力などの因子に応じて変わってもよい。病徴が改善されたかどうかは、通常使われる任意の臨床的測定を使って、その症状の重症度または進行状態を評価する医師またはその他の熟練保健医療提供者により評価を受けることができる。
タンパク質の「組換え発現」は、宿主生物中の外来性の遺伝子の転写および翻訳がタンパク質を生成することを意味する。このタンパク質は、本明細書では、「組換えタンパク質」と呼ばれる。
本明細書で使用される場合、用語「陽電子放出断層撮影(PET)」は、疾患の診断を支援するために医用分野で使われる核イメージング技術を意味する。PETは、他のイメージング技術では得ることができない人体の多くの機能の画像を生成することにより、医師が一度に全患者を検査することを可能にする。この場合、PETは、単純にどのように見えるかではなく、どのように身体が働くか(生理的にまたは機能的に)の画像を示す。PETイメージングの用途には、腫瘍学、心臓病学、および神経学の分野のものが挙げられる。PETでは、短寿命ポジトロン放出同位体、本明細書では放射性医薬品と呼ばれる、が患者に注入される。これらの放射性薬物が患者に投与されると、それらは、それらの安定な対応物に関連する生理的経路に従って、身体内に分布する。
本明細書で使用される場合、用語「SPECT」は、「単一光子放射型コンピュータ断層撮影」を意味し、これは、ガンマ線を用いた核医学断層撮影イメージング技術である。それは、従来のγカメラを用いた核医学平面型イメージングに極めて類似し、真の3D情報を提供できる。この方法は通常、患者を通る断面切片として提示されるが、必要に応じて、自由に再フォーマットまたは操作できる。基本的技術は、γ放出放射性同位元素(放射性核種と呼ばれる)の、通常血流中への注入による患者中への送達を必要とする。
用語「検出可能標識」は、明細書または特許請求の範囲の目的に応じて、本開示による抗体またはその抗原結合フラグメントに間接的にまたは直接に結合する標識分子を意味し、標識分子は、そこに組み込まれている抗体の検出を促進する。従って、「検出可能標識」は、「標識分子」と同義に使用される。
本明細書で使用される場合、用語「イメージング剤」は、動物またはヒト対象の細胞もしくは組織、またはインビトロ条件下での細胞もしくは組織中の標識およびそれに対する接着物の位置を表示するために有用な標識部分を意味する。薬剤は、蛍光、発光、放射能、などの検出可能シグナルを提供するもの、またはMRIイメージングなどの方法により検出できるものを含み得るが、本開示で使用のプローブおよび方法の場合、用語「イメージング剤」は特に、PETまたはSPECTイメージング技術などにより検出可能な標識、例えば、限定されないが、64Cu、67Cu、89Zr、124I、86Y、90Y、111In、123/131I、177Lu、18F、99mTc、などを意味する。本開示の免疫複合体プローブの最も好ましい実施形態では、標識剤は、89-ジルコニウム(Zr)であるが、PET生成画像を提供し、グリピカン-3標的化抗体または抗体フラグメントに結合またはコンジュゲートし得る任意の金属同位体(または任意の他のPET適合性標識剤)を使用し得る。
用語「生物検体」は、生物(例えば、ヒト患者)由来のもしくはその中の、または生物の成分(例えば、細胞)由来の組織、体液、他の試料を意味する。試料は、任意の生体組織または体液であり得る。検体は、患者由来の試料である「臨床試料」であり得る。このような検体には、限定されないが、喀痰、血液、血液細胞(例えば、白血球)、羊水、血漿、骨髄、および組織または細針生検生検試料、尿、腹腔液、および胸水、またはそこからの細胞が挙げられる。生物検体はまた、組織学的目的のために採取される組織または組織の切片(例えば、凍結またはパラフィン包埋切片)を含み得る。生物検体はまた、「患者試料」とも呼ばれる。
特定の実施形態では、生物検体は、生物内の、またはそれから取り出した、腫瘍であってもよい。本明細書で使用される場合、「腫瘍」は、悪性または良性に関係なく、全ての新生細胞成長および増殖、ならびに全ての前癌および癌細胞および組織を意味する。用語の「癌」および「癌性の」は、通常、未制御細胞増殖により特徴付けられる哺乳動物の生理的状態を意味する、または言い表す。特に、本開示のプローブおよび組成物は、肝臓の癌細胞(肝細胞癌)、特にグリピカン-3膜結合型のタンパク質のエピトープ含有細胞の検出のために最も好都合である。
抗CD103抗体、およびその抗原結合フラグメント
本発明は、ヒトCD103に結合する抗体およびこのような抗体の使用を提供する。本発明は、ヒトCD103に結合する抗原結合フラグメントおよびこのようなフラグメントの使用を提供する。いくつかの実施形態では、抗CD103抗体は単離されている。
本発明は、ヒトCD103に結合する抗体およびこのような抗体の使用を提供する。本発明は、ヒトCD103に結合する抗原結合フラグメントおよびこのようなフラグメントの使用を提供する。いくつかの実施形態では、抗CD103抗体は単離されている。
抗体がポリペプチド配列(例えば、ヒトCD103)に特異的に結合するかどうかは、当該技術分野で既知の任意のアッセイを用いて判定できる。結合親和性を決定するために当該技術分野で既知のアッセイの例には、表面プラズモン共鳴法(例えば、BIACORE)または類似の技術(例えば、KinExaまたはOCTET)が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、所望生物活性を示す任意の形態の抗体を意味する。用語の抗体には、抗原に結合する能力を保持する抗原結合部分、すなわち「抗原結合部位」(例えば、フラグメント、部分配列、相補性決定領域(CDR))を含み、これらには、(i)VL、VH、CLおよびCH1ドメインからなる一価のフラグメントであるFabフラグメント;(ii)ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって結合される2つのFabフラグメントを含む二価のフラグメントであるF(ab’)2フラグメント;(iii)VHおよびCH1ドメインからなるFdフラグメント;(iv)抗体の単一アームのVLおよびVHドメインからなるFvフラグメント;(v)VHドメインからなるdAbフラグメント(Ward et al.,(1989)Nature 341:544-546)ならびに(vi)単離された相補性決定領域(CDR)が含まれる。単鎖抗体も、用語の「抗体」への言及により含まれる。好ましい治療抗体は、完全IgG抗体である。本明細書で使用される場合、用語「完全抗体」は、認識された免疫グロブリンγ遺伝子により実質的にコードされる抗体のクラスに属するポリペプチドとして意図される。ヒトでは、このクラスは、IgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4を含む。マウスでは、このクラスは、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3を含む。抗体のIgGクラスの既知のIgドメインは、VH、Cγ1、Cγ2、Cγ3、VL、およびCLである。
本発明は、抗CD103抗原結合フラグメントおよびこれらの使用方法を含む。
本明細書で使用される場合、「完全長抗体」は、IgGについて言えば、2つの重鎖および2つの軽鎖を含む二価の分子である。各重鎖は、VHドメイン、続けて、定常ドメイン(CH1)、ヒンジ領域、および更に2つの定常(CH2およびCH3)ドメインを含み、一方、各軽鎖は、1つのVLドメインおよび1つの定常(CL)ドメインを含む。完全長抗体は、IgMについて言えば、5または6個の結合免疫グロブリンを含む10価または12価の分子であり、その中で、各免疫グロブリンモノマーは、重鎖および軽鎖から形成される2つの結合部位を有する。
本明細書で使用される場合、別段の指示がない限り、「抗体フラグメント」または「抗原結合フラグメント」は、抗体の抗原結合フラグメント、すなわち、完全長抗体により結合された抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体フラグメント、例えば、1つまたは複数のCDR領域を保持するフラグメントを意味する。抗原結合フラグメントの例には、限定されないが、Fab、Fab’、F(ab’)2、およびFvフラグメント;ディアボディ;直鎖抗体;単鎖抗体分子、例えば、sc-Fv;ナノボディおよび抗体フラグメントから形成された多重特異的抗体が挙げられる。
本発明は、抗CD103 Fabフラグメントおよびこれらの使用方法を含む。「Fabフラグメント」は、1つの軽鎖およびCH1ならびに1つの重鎖の可変領域から構成される。Fab分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成できない。「Fabフラグメント」は、抗体のパパイン切断の産物であり得る。
本発明は、抗CD103抗体およびFc領域を含むその抗原結合フラグメントならびにそれらの使用を含む。「Fc」領域は、抗体のCH3およびCH2ドメインを含む2つの重鎖フラグメントを含む。2つの重鎖フラグメントは、2つ以上のジスルフィド結合により、およびCH3ドメインの疎水性相互作用により、一緒に保持される。
本発明は、抗CD103 Fab’フラグメントおよびこれらの使用方法を含む。「Fabフラグメント」は、1つの軽鎖およびVHドメインおよびCH1ドメインを含む1つの重鎖の一部またはフラグメントならびにCH1とCH2との間にも領域を含み、それにより、鎖間ジスルフィド結合が2つのFab’フラグメントの2つの重鎖間に形成されて、F(ab’)2分子を形成できる。
本発明は、抗CD103 F(ab’)2フラグメントおよびこれらの使用方法を含む。「F(ab’)2フラグメント」は、2つの軽鎖およびCH1とCH2ドメインとの間に定常領域の一部を含む2つの重鎖を含み、それにより、鎖間ジスルフィド結合が2つの重鎖間に形成される。F(ab’)2フラグメントは、従って、2つの重鎖間のジスルフィドにより一緒に保持される2つのFab’フラグメントから構成される。「F(ab’)2フラグメント」は、抗体のペプシン切断の産物であり得る。
本発明は、抗CD103 Fvフラグメントおよびこれらの使用方法を含む。「Fv領域」は、重鎖および軽鎖の両方由来の可変領域を含むが、定常領域を欠く。
本発明は、抗CD103 scFvフラグメントおよびこれらの使用方法を含む。用語「単鎖Fv」または「scFv」抗体は、抗体のVHおよびVLドメインを含む抗体フラグメントを意味し、これらのドメインはポリペプチド単鎖中に存在する。一般に、Fvポリペプチドは、VHおよびVLドメイン間にポリペプチドリンカーをさらに含み、これは、scFvが抗原結合のために所望の構造を形成することを可能とする。scFvの概説については、Pluckthun(1994)The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,Springer-Verlag,New York,pp.269-315を参照されたい。また、国際公開WO88/01649号および米国特許第4,946,778号および同5,260,203号も参照されたい。
本発明は、抗CD103ドメイン抗体およびこれらの使用方法を含む。「ドメイン抗体」は、重鎖の可変領域または軽鎖の可変領域のみを含む免疫学的機能性免疫グロブリンフラグメントである。いくつかの事例では、2つ以上のVH領域がペプチドリンカーによる共有結合で連結され、二価のドメイン抗体を生成する。二価のドメイン抗体の2つのVH領域は、同じまたは異なる抗原を標的にし得る。
本発明は、抗CD103二価抗体およびこれらの使用方法を含む。「二価抗体」は、2つの抗原結合部位を含む。いくつかの事例では、2つの結合部位は、同じ抗原特異性を有する。しかし、二価抗体は二重特異的であってもよい(下記参照)。
本発明は、抗CD103ディアボディおよびこれらの使用方法を含む。本明細書で使用される場合、「ディアボディ」という用語は、同じポリペプチド鎖(VH-VLまたはVL-VH)の軽鎖可変ドメイン(VL)に結合された重鎖可変ドメイン(VH)を含む、2つの抗原結合部位を有する小さな抗体フラグメントを意味する。同じ鎖の2つのドメイン間のペアリングを許可するには短すぎるリンカーを使用することにより、ドメインは別の鎖の相補的ドメインと対形成させられ、2つの抗原結合部位を形成する。ディアボディは、例えば、EP 404,097;国際公開WO93/11161;およびHolliger et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448により完全に記載されている。デュオボディは、Labrijn et al.,2013,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 110(13):5145-5150に記載されている。改変抗体バリアントの概説については、一般的には、Holliger and Hudson(2005)Nat.Biotechnol.23:1126-1136を参照されたい。
典型的には、いくつかの方法で改変されている本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、その活性がモル基準で表現される場合、少なくとも10%のその結合活性(親抗体と比較した場合)を保持する。好ましくは、本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、親抗体と比べて、少なくとも20%、50%、70%、80%、90%、95%または100%またはそれ超のCD103結合親和性を保持する。本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、その生物活性を実質的に変えない保存的または非保存的アミノ酸置換(抗体の「保存的バリアント」または「機能保存バリアント」と呼ばれる)を含み得る。
本発明は、単離抗CD103抗体およびその抗原結合フラグメントならびにそれらの使用を含む。本明細書では、用語「単離」は、このような生体分子の完全な非存在、または水、緩衝液、もしくは塩の非存在、または抗体またはフラグメントを含む医薬製剤の成分を意味することを意図していない。「単離」抗体、抗原結合フラグメント、核酸などは、その天然の環境の1種または複数の構成要素から特定され、分離および/または回収されている抗体である。好ましい実施形態では、抗体、抗原結合フラグメント、核酸などは、75重量%以上、より好ましくは90重量%以上、さらにより好ましくは95重量%以上、およびさらにより好ましくは98重量%以上まで精製される。従って、「単離」生体分子は、少なくとも部分的に、由来源である細胞または細胞培養物中の他の生体分子不含である。このような生体分子には、核酸、タンパク質、脂質、炭水化物、または壊死細胞片および成長培地などの他の物質が含まれる。単離抗体または抗原結合フラグメントはさらに、宿主細胞由来の、またはその成長培地のまたは生体分子などの発現系成分を少なくとも部分的に不含であり得る。
本発明は、抗CD103キメラ抗体(例えば、ヒト定常ドメイン/マウス可変ドメイン)およびこれらの使用方法を含む。本明細書で使用される場合、「キメラ抗体」は、第1の抗体由来の可変ドメインおよび第2抗体由来の定常ドメインを有する抗体であり、第1および第2の抗体は、異なる種由来である。(米国特許第4,816,567号;およびMorrison et al.,(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855)。典型的には、可変ドメインは、げっ歯類などの実験動物(「親抗体」)由来の抗体から得られ、および定常ドメイン配列は、ヒト抗体から得られ、それにより、得られるキメラ抗体は、親(例えば、マウス)抗体よりも、ヒト対象で有害免疫応答を誘発する可能性が少ない。
本発明は、抗CD103ヒト化抗体およびその抗原結合フラグメント(例えば、ヒト化されているラットまたはマウス抗体)およびこれらの使用方法を含む。本明細書で使用される場合、「ヒト化抗体」という用語は、ヒトおよび非ヒト(例えば、マウスまたはラット)抗体の両方由来の配列を含む抗体の形態を意味する。一般に、ヒト化抗体は、実質的に、少なくとも1つ、通常2つの可変ドメインを有し、全てもしくは実質的に全ての高頻度可変性ループが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、また、全てもしくは実質的に全てのフレームワーク(FR)領域がヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン定常領域(Fc)の少なくとも一部を任意に含んでもよい。ヒト化抗体に関するさらなる詳細については、例えば、Jones et al.,Nature,321:522-525(1986);Reichmann et al.,Nature,332:323-329(1988);Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593-596(1992);およびClark,Immunol.Today 21:397-402(2000)を参照されたい。
一般に、基本的な抗体構造単位は、四量体を含む。各四量体は、2つの同一のポリペプチド鎖の対を含み、各対は1つの「軽」鎖(約25kDa)および1つの「重」鎖(約50~70kDa)を有する。各鎖のアミノ末端部分は、抗原認識に主に関与する約100~110またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を含む。重鎖のカルボキシル末端部分は、エフェクター機能に主に関与する定常領域を定義し得る。典型的には、ヒト軽鎖は、カッパおよびラムダ軽鎖に分類される。さらに、ヒト重鎖は通常、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファ、またはイプシロンに分類され、抗体のアイソタイプをそれぞれ、IgM、IgD、IgG、IgA、およびIgEと定義する。軽鎖および重鎖内では、可変および定常領域は、約12個以上のアミノ酸の「J」領域により結合され、重鎖はまた、約10個以上のアミノ酸の「D」領域を含む。一般的には、Fundamental Immunology Ch.7(Paul,W.,ed.,2nd ed.Raven Press,N.Y.(1989)を参照されたい。
各軽鎖/重鎖対の可変領域は、抗体結合部位を形成する。従って、一般的に、完全な抗体は2つの結合部位を有する。二官能性または二重特異的抗体の場合を除いて、2つの結合部位は通常、同じである。
典型的には、重鎖および軽鎖両方の可変領域は、比較的保存されたフレームワーク領域(FR)内に位置する、相補性決定領域(CDR)とも呼ばれる、3つの高頻度可変領域を含む。CDRは通常、フレームワーク領域により整列され、特異的エピトープへの結合を可能にする。一般に、N末端からC末端へ、軽鎖および重鎖可変ドメインの両方は、FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3およびFR4を含む。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては通常、Sequences of Proteins of Immunological Interest,Kabat,et al.;National Institutes of Health,Bethesda,MD;5th ed.;NIH Publ.No.91-3242(1991);Kabat(1978)Adv.Prot.Chem.32:1-75;Kabat,et al.,(1977)J.Biol.Chem.252:6609-6616;Chothia,et al.,(1987)J Mol.Biol.196:901-917またはChothia,et al.,(1989)Nature 342:878-883の定義に従う。
本明細書で使用される場合、「超可変領域」という用語は、抗原結合に関与する、抗体またはその抗原結合フラグメントのアミノ酸残基を意味する。超可変領域は、「相補性決定領域」または「CDR」(すなわち、軽鎖可変ドメイン中のCDRL1、CDRL2およびCDRL3および重鎖可変ドメイン中のCDRH1、CDRH2およびCDRH3)からのアミノ酸残基を含む。Kabat et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(defining the CDR regions of an antibody by sequence)を参照されたい;また、Chothia and Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917(defining the CDR regions of an antibody by structure)も参照されたい。本明細書で使用される場合、「フレームワーク」または「FR」残基という用語は、本明細書でCDR残基と定義の高頻度可変領域以外の可変ドメイン残基を意味する。
「単離核酸分子」または「単離ポリヌクレオチド」は、ゲノム、mRNA、cDNA、または単離ポリヌクレオチドが天然で見出される、または天然では結合されないポリヌクレオチドに結合されているポリヌクレオチドの全てまたは一部に関連しない、合成起源、またはそれらのいくつかの組み合わせのDNAまたはRNAを意味する。 本開示では、特定のヌクレオチド配列「を含む核酸分子」は、完全な染色体を包含しないことを理解されたい。特定の核酸配列を「含む」単離核酸分子は、特定の配列に加えて、10個まであるいは20個以上までの他のタンパク質またはその部分もしくはフラグメントのためのコード配列を含み得る、または列挙された核酸配列のコード領域の発現を制御する、動作可能に連結された調節配列を含み得る、および/またはベクター配列を含み得る。
表現「制御配列」は、特定の宿主生物中で動作可能に連結されたコード配列の発現に必要なDNA配列を意味する。例えば、原核生物に好適する制御配列には、プロモーター、任意選択で、オペレーター配列、およびリボソーム結合部位が含まれる。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーを使用することが知られている。
核酸またはポリヌクレオチドは、それが、別の核酸配列と機能的関係を持つように配置される場合に、「動作可能に連結されている」。例えば、プレ配列または分泌リーダーのためのDNAは、それが、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、ポリペプチドのためのDNAに動作可能に連結されており;プロモーターまたはエンハンサーは、それが、その配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に動作可能に連結されており;またはリボソーム結合部位は、それが、翻訳を促進するように配置される場合、コード配列に動作可能に連結されている。一般的に、いつもとは限らないが、「作動可能に連結」は、結合されているDNA配列が近接しており、分泌リーダーの場合、隣接し、リーディングフレーム内にある。しかしながら、エンハンサーは隣接する必要はない。結合は、簡便な制限酵素部位におけるライゲーションによって達成される。このような部位が存在しない場合には、従来の慣行に従って合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを使用する。
本明細書で使用される場合、「細胞」、「細胞株」、および「細胞培養」という表現は、同じ意味で用いられ、全てのこのような呼称は、子孫を含む。従って、「形質転換体」および「形質転換細胞」という語句は、初代の対象の細胞および継代数に関係なくそれから誘導された培養物を含む。全ての子孫が、計画的または偶発性の変異により、DNA含有物が正確に同一であるとは限らないことも理解されよう。最初に形質転換された細胞でスクリーニングされたのと同じ機能または生物学的活性を有する変異子孫が含まれる。明確な呼称が意図される場合、それは、文脈から明らかであろう。
本明細書で使用される場合、「生殖系列配列」は、再配列されていない免疫グロブリンDNA配列の配列を意味する。再配列されていない免疫グロブリン配列の任意の好適な原料を使用し得る。ヒト生殖系列配列は、例えば、米国国立衛生研究所の国立関節炎、骨格筋、皮膚疾患研究所のウェブサイト上のJOINSOLVER生殖系列データベースから得られる。マウス生殖系列配列は、例えば、Giudicelli et al.(2005)Nucleic Acids Res.33:D256-D261に記載のように得られる。
結合親和性
例えば、限定するものではないが、本明細書で開示の抗体は、ヒトCD103に対し、表面プラズモン共鳴法(例えば、BIACORE)または類似の技術(例えば、KinExaまたはバイオレイヤー干渉法(OCTET))により測定して、10x10-9M以下のKD値で、二価として結合し得る。一実施形態では、本明細書で開示の抗体は、ヒトCD103に対し、約5~10x10-9MのKD値で、二価として結合し得る。KD値は、表面プラズモン共鳴法(例えば、BIACORE)により測定し得る。KD値は、類似の技術(例えば、KinExaまたはOCTET)により測定し得る。例えば、限定するものではないが、本明細書で開示の抗原結合フラグメントは、ヒトCD103に対し、表面プラズモン共鳴法(例えば、BIACORE)または類似の技術(例えば、KinExaまたはバイオレイヤー干渉法(OCTET))により測定して、10x10-9M以下のKD値で、二価として結合し得る。一実施形態では、本明細書で開示の抗原結合フラグメントは、ヒトCD103に対し、約5~10x10-9MのKD値で、二価として結合し得る。KD値は、類似の技術(例えば、KinExaまたはOCTET)により測定し得る。親和性は、KD=koff/kon(koffは解離速度定数であり、konは結合速度定数であり、KDは平衡定数である)として計算される。親和性は、様々な濃度(c)における標識リガンドの結合の割合(r)を測定することによって、平衡状態で決定することができる。データは、スキャッチャードの式:r/c=K(n-r)(式中、r=平衡状態における結合リガンドのモル/受容体のモル;c=平衡状態における遊離リガンド濃度;K=平衡結合定数;およびn=受容体分子当りのリガンド結合部位の数)を用いて、グラフ化される。グラフ解析により、r/cをY軸上にプロットするのに対して、rをX軸上にプロットし、このようにして、スキャッチャードプロットを作成する。スキャッチャード解析による抗体親和性測定法は、当該技術分野において周知である。例えば、van Erp et al.,J.Immunoassay 12:425-43,1991;Nelson and Griswold,Comput.Methods Programs Biomed.27:65-8,1988、を参照されたい。
例えば、限定するものではないが、本明細書で開示の抗体は、ヒトCD103に対し、表面プラズモン共鳴法(例えば、BIACORE)または類似の技術(例えば、KinExaまたはバイオレイヤー干渉法(OCTET))により測定して、10x10-9M以下のKD値で、二価として結合し得る。一実施形態では、本明細書で開示の抗体は、ヒトCD103に対し、約5~10x10-9MのKD値で、二価として結合し得る。KD値は、表面プラズモン共鳴法(例えば、BIACORE)により測定し得る。KD値は、類似の技術(例えば、KinExaまたはOCTET)により測定し得る。例えば、限定するものではないが、本明細書で開示の抗原結合フラグメントは、ヒトCD103に対し、表面プラズモン共鳴法(例えば、BIACORE)または類似の技術(例えば、KinExaまたはバイオレイヤー干渉法(OCTET))により測定して、10x10-9M以下のKD値で、二価として結合し得る。一実施形態では、本明細書で開示の抗原結合フラグメントは、ヒトCD103に対し、約5~10x10-9MのKD値で、二価として結合し得る。KD値は、類似の技術(例えば、KinExaまたはOCTET)により測定し得る。親和性は、KD=koff/kon(koffは解離速度定数であり、konは結合速度定数であり、KDは平衡定数である)として計算される。親和性は、様々な濃度(c)における標識リガンドの結合の割合(r)を測定することによって、平衡状態で決定することができる。データは、スキャッチャードの式:r/c=K(n-r)(式中、r=平衡状態における結合リガンドのモル/受容体のモル;c=平衡状態における遊離リガンド濃度;K=平衡結合定数;およびn=受容体分子当りのリガンド結合部位の数)を用いて、グラフ化される。グラフ解析により、r/cをY軸上にプロットするのに対して、rをX軸上にプロットし、このようにして、スキャッチャードプロットを作成する。スキャッチャード解析による抗体親和性測定法は、当該技術分野において周知である。例えば、van Erp et al.,J.Immunoassay 12:425-43,1991;Nelson and Griswold,Comput.Methods Programs Biomed.27:65-8,1988、を参照されたい。
抗体およびその抗原結合フラグメントの製造方法
従って、本発明は、本発明の抗CD103抗体またはその抗原結合フラグメントの製造方法を含み、該方法は、抗体またはフラグメントを発現するハイブリドーマ細胞をこのような発現に好ましい状態下で培養すること、および任意選択で、ハイブリドーマおよび/または成長培地(例えば、細胞培地)から抗体またはフラグメントを単離することを含む。
従って、本発明は、本発明の抗CD103抗体またはその抗原結合フラグメントの製造方法を含み、該方法は、抗体またはフラグメントを発現するハイブリドーマ細胞をこのような発現に好ましい状態下で培養すること、および任意選択で、ハイブリドーマおよび/または成長培地(例えば、細胞培地)から抗体またはフラグメントを単離することを含む。
本明細書で開示の抗CD103抗体はまた、組換えにより(例えば、E.coli/T7発現系、哺乳動物細胞発現系または下等真核生物発現系で)産生され得る。この実施形態では、本発明の抗体免疫グロブリン分子(例えば、VHまたはVL)をコードする核酸を、pETベースプラスミドに挿入し、E.coli/T7系中で発現させ得る。例えば、本発明は、抗体またはその抗原結合フラグメントまたはその免疫グロブリン鎖を宿主細胞(例えば、BL21またはBL21DE3などの大腸菌などの細菌宿主細胞)中で発現させる方法を含み、該方法は、T7 RNAポリメラーゼを、T7プロモーターに動作可能に連結された免疫グロブリン鎖をコードするポリヌクレオチドも含む細胞中で発現させることを含む。例えば、本発明のある実施形態では、E.coliなどの細菌宿主細胞は、ラックプロモーターに動作可能に連結されたT7 RNAポリメラーゼ遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含み、ポリメラーゼおよび鎖の発現は、宿主細胞のIPTG(イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド)を用いたインキュベーションより誘導される。
当技術分野において既知の組換え抗体を産生するいくつかの方法が存在する。抗体の組換え産生の方法の一例は、米国特許第4,816,567号で開示されている。
形質転換は、ポリヌクレオチドを宿主細胞中に導入するための任意の既知の方法によることができる。異種ポリヌクレオチドの哺乳動物細胞への導入方法は、当該技術分野において周知であり、デキストラン媒介遺伝子導入、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介遺伝子導入、原形質融合、電気穿孔、ポリヌクレオチドのリポソーム中への封入、DNAの核中への遺伝子銃注入および直接微量注入が挙げられる。加えて、核酸分子は、ウイルスベクターにより哺乳動物細胞中に導入され得る。細胞を形質転換する方法は、当該技術分野において周知である、例えば、米国特許第4,399,216号;同第4,912,040号;同第4,740,461号および、同第4,959,455号、も参照されたい。
従って、本発明は、本発明の抗CD103抗体またはその抗原結合フラグメントを製造するための組換え法を含み、該方法は、抗体またはフラグメントの1種または複数の免疫グロブリン鎖(例えば、重鎖および/または軽鎖免疫グロブリン鎖)をコードするポリヌクレオチドを導入すること;宿主細胞(例えば、CHOまたはピキアまたはピキア・パストリス(メタノール資化性酵母))をこのような発現に好ましい条件下で培養すること、および任意選択で、宿主細胞が増殖された宿主細胞および/または培地から抗体またはフラグメントまたは鎖を単離することを含む。
抗CD103抗体はまた、米国特許第6,331,415号で示されるいずれかの方法により合成できる。
本明細書で開示の抗体またはフラグメントまたは免疫グロブリン鎖の発現のための宿主としての哺乳動物細胞を含む真核生物および原核生物宿主細胞は、当該技術分野において周知であり、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関(ATCC)から入手可能な多くの不死化細胞株を含む。これらには、特に、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、NSO、SP2細胞、HeLa細胞、仔ハムスター腎臓(BHK)、サル腎培養細胞(COS)、ヒト肝細胞癌(例えば、Hep G2)、A549細胞、3T3細胞、HEK-293細胞、および多数の他の細胞株が挙げられる。哺乳動物宿主細胞としては、ヒト、マウス、ラット、イヌ、サル、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマおよびハムスター細胞が挙げられる。特に好まれる細胞株は、どの細胞株が高い発現レベルを有するかを特定することにより選択される。使用可能な他の細胞株は、Sf9細胞などの昆虫細胞株、両生類の細胞、細菌細胞、植物および真菌細胞である。真菌細胞には、例えば、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)、ピキア・フィンランディカ(Pichia finlandica)、ピキア・トレハロフィア(Pichia trehalophila)、ピキア・コクラメ(Pichia koclamae)、ピキア・メンブラナエファシエンス(Pichia membranaefaciens)、ピキア・ミニュータ(Pichia minuta)(オガタエア・ミニュータ(Ogataea minuta)、ピキア・リンドネリ(Pichia lindneri))、ピキア・オプティアエ(Pichia opuntiae)、ピキア・サーモトレランス(Pichia thermotolerans)、ピキア・サリクタリア(Pichia alictaria)、ピキア・ゲルカム(Pichia guercum)、ピキア・ピジュペリ(Pichia pijperi)、ピキア・スティプティス(Pichia stiptis)、ピキア・メタノリカ(Pichia methanolica)、ピキア属種、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、サッカロミセス属種、ハンセヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)、クリベロマイセス属種、クリベロマイセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、アスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)、トリコデルマ・リーセイ(Trichoderma reesei)、クリソスポリウム・ラクノウェンス(Chrysosporium lucknowense)、フザリウム属種、フザリウム・グラミネアラム(Fusariumu gramineum)、フザリウム・ベネナタム(Fusariumu venenatum)、フィスコミトレラ・パテンス(Physcomitrella patens)およびアカパンカビ(Neurospora crassa)、ピキア属種、いずれかのサッカロマイセス属種、ハンセヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)、いずれかのクリベロマイセス属種、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、アスペルギルス属種、トリコデルマ・リーセイ(Trichoderma reesei)、クリソスポリウム・ラクノウェンス(Chrysosporium lucknowense)、いずれかのフサリウム属種、ヤルロウィア・リポリチカ(Yarrowia lipolytica)、およびアカパンカビ(Neurospora crassa)を含む、酵母および繊維状真菌類細胞が挙げられる。重鎖またはその抗原結合部分またはフラグメント、および/または軽鎖またはその抗原結合フラグメントをコードする組換え発現ベクターは、哺乳動物宿主細胞に導入される場合、抗体は、宿主細胞を宿主細胞中の抗体またはフラグメントまたは鎖の発現を可能とする、または宿主細胞が増殖される培地中へのそれらの分泌を可能とするために十分な時間にわたり宿主細胞を培養することにより産生される。
抗体、およびその抗原結合フラグメントならびに免疫グロブリン鎖は、標準的なタンパク質精製方法を用いて培地から回収できる。さらに、抗体、およびその抗原結合フラグメントおよび本発明の免疫グロブリン鎖(またはそれ由来の他の部分)の産生細胞株からの発現は、いくつかの既知の技術を用いて高めることができる。例えば、グルタミンシンテターゼ発現系(GS系)は、特定の条件下で発現を高めるための一般的な手法である。GS系は、欧州特許第0216846号、同0256055号、ならびに同0323997号および同0338841号に関連して全体的に、または部分的に考察されている。従って、本発明のある実施形態では、哺乳動物宿主細胞(例えば、CHO)は、グルタミンシンテターゼ遺伝子を欠き、培地中のグルタミンの非存在下で増殖されるが、しかしながら、免疫グロブリン鎖をコードするポリヌクレオチドは、宿主細胞中の遺伝子の欠如を補完するグルタミンシンテターゼ遺伝子を含む。
本発明は、本発明の抗CD103抗体またはその抗原結合フラグメントを精製する方法を含み、該方法は、抗体またはフラグメントを含む試料を精製培地(例えば、カチオン交換培地、アニオン交換培地、疎水性交換培地、親和性精製培地(例えば、プロテインA、プロテインG、プロテインA/G、プロテインL))に導入し、精製された抗体またはフラグメントを培地に結合していない前記試料の通過画分から収集すること、または通過画分を廃棄し、培地から結合抗体またはフラグメントを溶出し、溶出液を収集することを含む。本発明のある実施形態では、培地は、試料が適用されるカラム中にある。本発明のある実施形態では、精製法は、宿主細胞中での抗体またはフラグメントの組換え発現後に行われ、例えば、宿主細胞が最初に溶解され、任意選択で、培地で精製の前に、溶解物が不溶性物質から精製される。
一般に、特定の細胞株または遺伝子導入動物中で産生された糖タンパク質は、細胞株または遺伝子導入動物中で産生された糖タンパク質に特徴的なグリコシル化パターンを有する。従って、抗体の特定のグリコシル化パターンは、抗体の産生に使用された特定の細胞株または遺伝子導入動物に依存する。しかし、本明細書で提供される核酸分子によりコードされている、または本明細書で提供されるアミノ酸配列を含む全ての抗体は、抗体が有し得るグリコシル化パターンに関係なく、本発明を含む。同様に、特定の実施形態では、非フコシル化N-グリカンのみを含むグリコシル化パターンを有する抗体は有利であり得る。その理由は、これらの抗体は、典型的には、それらのフコシル化対応物より強力は有効性を示すことが示されているためである(例えば、Shinkawa et al.,J.Biol.Chem.278:3466-3473(2003);米国特許第6,946,292号および同7,214,775号を参照されたい)。非フコシル化N-グリカンを有するこれらの抗体は、免疫原性である可能性がない。理由は、それらの炭水化物構造がヒト血清IgG中に存在する集団の正常な構成要素であるためである。
本発明は、本明細書で開示の抗CD103抗体の抗CD103抗原結合フラグメントをさらに含む。抗体フラグメントは、F(ab)2フラグメントを含み、これは、例えば、ペプシンによるIgGの酵素切断により産生され得る。Fabフラグメントは、例えば、F(ab)2のジチオトレイトールまたはメルカプトエチルアミンによる還元により産生され得る。
免疫グロブリンは、それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、異なるクラスに割り当て得る。いくつかの実施形態では、異なる定常ドメインは、本明細書で提供されるCDR由来のヒト化VLおよびVH領域に付加され得る。少なくとも5つの主要な免疫グロブリンクラス:IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMがあり、これらのいくつかは、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4;IgA1、およびIgA2などのサブクラス(アイソタイプ)にさらに分類され得る。本発明は、抗体のこれらのクラスまたはサブクラスのいずれかの抗体および抗原結合フラグメントを含む。
一実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは、重鎖定常領域、例えば、γ1、γ2、γ3、またはγ4ヒト重鎖定常領域またはそのバリアントなどのヒト定常領域を含む。別の実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは、軽鎖定常領域、例えば、ラムダまたはカッパヒト軽鎖領域またはそのバリアントなどのヒト軽鎖定常領域を含む。例えば、限定されるものではないが、ヒト重鎖定常領域は、γ4であり、ヒト軽鎖定常領域はカッパであり得る。代替的実施形態では、抗体のFc領域はSer228Pro変異を有するγ4である(Schuurman,J et.al.,Mol.Immunol.38:1-8,2001)。
一実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは、IgG1サブタイプの重鎖定常領域を含む。一実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは、IgG2サブタイプの重鎖定常領域を含む。一実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは、IgG4サブタイプの重鎖定常領域を含む。
抗体遺伝子改変
さらに含まれるのは、抗CD103抗体、およびその抗原結合フラグメントが、例えば、抗体またはフラグメントの特性を改善するために、抗体の可変ドメイン内のフレームワーク残基に改変を含む改変抗体である実施形態である。典型的には、このようなフレームワーク改変は、抗体またはフラグメントの免疫原性を低減するためになされる。これは通常、親(例えば、げっ歯類)抗体またはフラグメントの可変ドメイン中の非CDR残基(すなわち、フレームワーク残基)を、抗体が使用される予定の種、例えば、ヒト治療薬の場合にはヒト残基の免疫レパートリー由来の類似の残基で置換することにより達成される。このような抗体またはフラグメントは、「ヒト化」抗体またはフラグメントと呼ばれる。場合によっては、親和性を増大させること、または改変(例えば、ヒト化)抗体の特異性を変えることが望ましい。1つの手法は、1種または複数のフレームワーク残基を対応する生殖系列配列に変異させることである。より具体的には、体細胞変異を受ける抗体またはフラグメントは、抗体が由来する生殖系列配列とは異なるフレームワーク残基を含み得る。このような残基は、抗体またはフラグメントフレームワーク配列を、抗体またはフラグメントが由来する生殖系列配列と比較することにより特定できる。別の手法は、改変(例えば、ヒト化)抗体の1つまたは複数の位置で元の親(例えば、げっ歯類)残基に戻ること、例えば、フレームワーク残基を置換する過程で失われた結合親和性を回復することである。(例えば、米国特許第5,693,762号、同第5,585,089号および同第5,530,101号を参照されたい)。
さらに含まれるのは、抗CD103抗体、およびその抗原結合フラグメントが、例えば、抗体またはフラグメントの特性を改善するために、抗体の可変ドメイン内のフレームワーク残基に改変を含む改変抗体である実施形態である。典型的には、このようなフレームワーク改変は、抗体またはフラグメントの免疫原性を低減するためになされる。これは通常、親(例えば、げっ歯類)抗体またはフラグメントの可変ドメイン中の非CDR残基(すなわち、フレームワーク残基)を、抗体が使用される予定の種、例えば、ヒト治療薬の場合にはヒト残基の免疫レパートリー由来の類似の残基で置換することにより達成される。このような抗体またはフラグメントは、「ヒト化」抗体またはフラグメントと呼ばれる。場合によっては、親和性を増大させること、または改変(例えば、ヒト化)抗体の特異性を変えることが望ましい。1つの手法は、1種または複数のフレームワーク残基を対応する生殖系列配列に変異させることである。より具体的には、体細胞変異を受ける抗体またはフラグメントは、抗体が由来する生殖系列配列とは異なるフレームワーク残基を含み得る。このような残基は、抗体またはフラグメントフレームワーク配列を、抗体またはフラグメントが由来する生殖系列配列と比較することにより特定できる。別の手法は、改変(例えば、ヒト化)抗体の1つまたは複数の位置で元の親(例えば、げっ歯類)残基に戻ること、例えば、フレームワーク残基を置換する過程で失われた結合親和性を回復することである。(例えば、米国特許第5,693,762号、同第5,585,089号および同第5,530,101号を参照されたい)。
特定の実施形態では、抗CD103抗体、およびその抗原結合フラグメントは、改変(例えば、ヒト化)され、それらの性質を改善するために、フレームワークおよび/またはCDR中に改変を含む。このような改変による変化は、分子モデル化をベースにし得る。親(非ヒト)抗体配列に対する可変領域の分子モデルは、抗体の構造的特徴がわかるように構築でき、抗原と相互作用できる抗体上の潜在的領域を特定するために使用できる。従来のCDRは、免疫グロブリン配列の整列および可変領域の特定に基づいている。Kabat et al.,(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Kabat,et al.;National Institutes of Health,Bethesda,MD;5th ed.;NIH Publ.No.91-3242;Kabat(1978)Adv.Prot.Chem.32:1-75;Kabat,et al.,(1977)J.Biol.Chem.252:6609-6616。Chothiaと共同研究者は、抗体の結晶構造中のループの構造を注意深く調査し、高頻度可変性ループを提案した。Chothia,et al.,(1987)J Mol.Biol.196:901-917またはChothia,et al.,(1989)Nature 342:878-883。「CDR」および「高頻度可変性ループ」に分類される領域の間には、多様性が存在する。後の調査(Raghunathan et al,(2012)J.Mol Recog.25,3,103-113)は、いくつかの抗体-抗原結晶複合体を分析し、抗体中の抗原結合領域は、「CDR」残基または「高頻度可変性」ループに必ずしも厳密に適合するとは限らないことを観察した。非ヒト抗体の可変領域のための分子モデルを用いて、抗原に結合する可能性のある領域の選択を誘導するために使用できる。実際には、モデルに基づく潜在的抗原結合領域は、従来の「CDR」または「高頻度可変性」ループとは異なる。Discovery Studio(BIOVIA,Dassault Systems)などの市販の科学ソフトウェアを分子モデリングに使用できる。ヒトフレームワークは、フレームワークおよびCDR中の両方の非ヒト配列との最良一致に基づいて選択できる。ヒト生殖系列のVH、VJ領域中のFR4(フレームワーク4)の場合は、対応する非ヒト領域と比較される。ヒト生殖系列のVL、J-カッパおよびJ-ラムダ領域中のFR4(フレームワーク4)の場合は、配列は、対応する非ヒト領域と比較される。好適なヒトフレームワークが特定されると、CDRは選択ヒトフレームワーク中に移植される。場合によっては、VL-VH境界中の特定の残基は、非ヒト(親)配列におけるように、保持できる。分子モデルはまた、CDR構造、したがって抗原に対する結合を変える可能性がある残基を特定するために使用できる。場合によっては、これらの残基は、非ヒト(親)配列におけるように、保持できる。分子モデルはまた、グリコシル化、脱アミド化および酸化などの望ましくない効果をもたらす可能性のある溶媒曝露アミノ酸を特定するために使用できる。開発可能性フィルターを早い段階でデザインステージに導入して、これらの潜在的問題を除去/最小化できる。
別のタイプのフレームワーク改変は、T細胞エピトープを除去して、抗体の潜在的免疫原性を低減させるために、フレームワーク領域内の、さらには、1つまたは複数のCDR領域内の、1つまたは複数の残基の改変を含む。この手法は、「脱免疫化」とも呼ばれ、米国特許第7,125,689号に更に詳細に記載されている。
特定の実施形態では、脱アミド化または異性化を回避するように、最終抗体のより多くの化学的安定性を得るために、露出側鎖を含む特定のアミノ酸を別のアミノ酸残基に変更することが望ましい。アスパラギンの脱アミド化は、NG、DG、NG、NS、NA、NT、QGまたはQS配列で発生し、ポリペプチド鎖中にキンクを導入し、その安定性を低減するイソアスパラギン酸残基を生成し得る(イソアスパラギン酸効果)。異性化は、DG、DS、DAまたはDT配列で起こり得る。特定の実施形態では、本開示の抗体は、脱アミド化またはアスパラギン異性化部位を含まない。
例えば、アスパラギン(Asn)残基を、GlnまたはAlaに変更して、特にCDR内の、任意のAsn-Gly配列でイソアスパラギン酸の形成の可能性を低減し得る。類似の問題は、Asp-Gly配列でも起こり得る。Reissner and Aswad(2003)Cell.Mol.Life Sci.60:1281。イソアスパラギン酸形成は、抗体のその標的抗原に対する結合を弱める、または完全に抑止し得る。Presta(2005)J.Allergy Clin.Immunol.116:731 at 734を参照されたい。一実施形態では、アスパラギンは、グルタミン(Gln)に変更される。小さいアミノ酸がアスパラギンまたはグルタミンに隣接して生ずる場合に、より高率で起こる脱アミド化の可能性を低減するために、アスパラギン(Asn)またはグルタミン(Gln)残基に隣接したアミノ酸を変えることも望ましい場合がある。Bischoff & Kolbe(1994)J.Chromatog.662:261を参照されたい。加えて、CDR中の任意のメチオニン残基(典型的には、溶媒曝露Met)は、抗原結合親和性を低減し、最終抗体調製物中の分子不均一性の一因ともなり得る、メチオニン硫黄が酸化する可能性を低減するために、Lys、Leu、Ala、またはPheまたは他のアミノ酸に変更され得る。さらに、Asn-Proペプチド結合の切断の可能性を防止または最小化するために、CDR中で見つかる任意のAsn-Proの組み合わせをGln-Pro、Ala-Pro、またはAsn-Alaに変えることが望ましい場合がある。このような置換を有する抗体は、続けて、スクリーニングして、置換が抗体のCD103に対する親和性または特異性を、または他の望ましい生物活性を受け入れられないレベルまで低減させないことを確実にする。
別のタイプのフレームワーク改変は、凝集を防止するためのフレームワーク領域内の1つまたは複数の残基の変異を含む。抗体が凝集するリスクは、空間的凝集傾向を用いて評価できる-Chennamsetty,N et al(2010)J.Phys.Chem.114,6614-6624を参照されたい。方法は、各原子について、溶媒アクセス可能面積(Solvent Accessible Area)(SAA)の計算が必要である。次に、分子凝集スコアが全ての原子のスコアの合計として計算される。分子の所与の半径およびサイズに対して、これは、その全体的凝集傾向の近似的目安である。高い凝集スコアを有する残基は、より低いスコアを有する残基(例えば、より親水性のアミノ酸)により置換される。
抗体Fc領域の遺伝子改変
本明細書で開示の抗体(例えば、ヒト化抗体)およびその抗原結合フラグメントはまた、抗体の血清半減期、補体結合、Fc受容体結合、および/またはエフェクター機能(例えば、抗原依存性細胞傷害活性)などの1種または複数の特性を変えるために、典型的には、Fc領域内に、改変を含むように改変できる。さらに、本明細書で開示の抗体、およびその抗原結合フラグメントは、この場合も、抗体またはフラグメントの1つまたは複数の特性を変えるために、化学的に改変でき(例えば、1つまたは複数の化学的部分は、抗体に結合できる)、またはそのグリコシル化を変えるために改変できる。それぞれのこれらの実施形態は、以降で更に詳述される。Fc領域中の残基のナンバリングは、KabatのEUインデックスのナンバリングである。
本明細書で開示の抗体(例えば、ヒト化抗体)およびその抗原結合フラグメントはまた、抗体の血清半減期、補体結合、Fc受容体結合、および/またはエフェクター機能(例えば、抗原依存性細胞傷害活性)などの1種または複数の特性を変えるために、典型的には、Fc領域内に、改変を含むように改変できる。さらに、本明細書で開示の抗体、およびその抗原結合フラグメントは、この場合も、抗体またはフラグメントの1つまたは複数の特性を変えるために、化学的に改変でき(例えば、1つまたは複数の化学的部分は、抗体に結合できる)、またはそのグリコシル化を変えるために改変できる。それぞれのこれらの実施形態は、以降で更に詳述される。Fc領域中の残基のナンバリングは、KabatのEUインデックスのナンバリングである。
本明細書で開示の抗体、およびその抗原結合フラグメントはまた、改変(またはブロックされた)Fc領域を有する抗体およびフラグメントを含む。例えば、米国特許第5,624,821号;国際公開WO2003/086310;同WO2005/120571;同WO2006/0057702を参照されたい。このような改変を用いて、免疫系の種々の反応を強化または抑制でき、診断および療法において有益な効果が得られる可能性がある。Fc領域の変化には、アミノ酸変化(置換、欠失および挿入)、グリコシル化または脱グリコシル化、ならびに複数のFc領域の付加が含まれる。Fcに対する変化はまた、治療抗体中の抗体の半減期を変え、より少ない頻度の投与、従って、高められた利便性および物質の低減した使用を可能にする。Presta(2005)J.Allergy Clin.Immunol.116:731 at 734-35を参照されたい。
一実施形態では、本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、重鎖定常領域のヒンジ領域中の位置228に対応する位置でセリンからプロリンへの変異(S228P;EUインデックス;配列番号66)を含むIgG4アイソタイプ抗体またはフラグメントである。この変異は、ヒンジ領域中の重鎖間ジスルフィド架橋の不均一性を消滅させることが報告されている(Angal et al(1993).Mol.Immunol.30:105-108;位置241は、Kabatナンバリングシステムに基づく)。
本発明の一実施形態では、CH1のヒンジ領域は、ヒンジ領域中のシステイン残基の数が増大または減少するように改変される。この手法は、米国特許第5,677,425号に更に記載されている。CH1のヒンジ領域中のシステイン残基の数は、例えば、軽鎖および重鎖の構築を促進するように、または抗体の安定性を低減または増大させるように、変えられる。
別の実施形態では、本発明の抗体または抗原結合フラグメントのFcヒンジ領域は、抗体またはフラグメントの生物学的半減期を短縮させるように変異される。より具体的には、1つまたは複数のアミノ酸変異が、FcヒンジフラグメントのCH2-CH3ドメイン境界領域中に導入され、それにより、抗体またはフラグメントは、天然のFcヒンジドメインSpA結合に比べて、機能不全ブドウ球菌プロテインA(staphylococcal protein A)(SpA)結合を有する。この手法は、米国特許第6,165,745号に更に詳述されている。
別の実施形態では、本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、その生物学的半減期を延長させるように改変される。種々の手法が可能である。例えば、米国特許第6,277,375号に記載のように、1つまたは複数の次の変異を導入できる:T252L、T254S、T256F。あるいは、米国特許第5,869,046号および同第6,121,022号に記載のように、生物学的半減期を延長するために、抗体は、CH1またはCL領域内で改変して、IgGのFc領域のCH2ドメインの2つのループから得たサルベージ受容体結合エピトープを含めることができる。
さらに他の実施形態では、Fc領域は、少なくとも1種のアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基と置換することにより改変して、抗体または抗原結合フラグメントのエフェクター機能を変えられる。例えば、アミノ酸残基234、235、236、237、297、318、320および322から選択される1つまたは複数のアミノ酸を、抗体がエフェクターリガンドに対して変えられた親和性を有し、親抗体の抗原結合能力を保持するように、異なるアミノ酸残基と置換できる。親和性が変えられるエフェクターリガンドは、例えば、Fc受容体または補体のC1成分であり得る。この手法は、米国特許第5,624,821号および同第5,648,260号に更に詳述されている。
別の例では、アミノ酸残基329、331および322から選択される1つまたは複数のアミノ酸を、抗体が、変えられたC1q結合および/または低減されたまたは消滅した補体依存性細胞障害(CDC)を有するように、異なるアミノ酸残基と置換できる。この手法は、米国特許第6,194,551号に更に詳述されている。
別の例では、アミノ酸位置231および239内の1種または複数のアミノ酸残基が変更され、それにより、補体を修復する抗体の能力が変えられる。この手法は、PCT国際公開WO94/29351に更に記載されている。
本発明のタンパク質は、好ましくは抗体および最も好ましくはIgG抗体またはそれらのフラグメントであり、改変された(例えば、非改変抗体に比べて)FcγR結合特性(結合特性の例には、限定されないが、結合特異性、平衡解離定数(KD)、解離および結合速度(それぞれ、KoffおよびKon)が挙げられる)を有し、その特定の改変は、多かれ少なかれ望ましい。平衡解離定数(KD)は、Koff/konとして定義され、Kaは、KDの逆数であることは当該技術分野において既知である。
そのリガンドのFc領域の親和性および結合特性は、限定されないが、平衡法(例えば、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)またはラジオイムノアッセイ(RIA))または動力学(例えば、BIACORE(登録商標)、Octet(登録商標)、またはKinExa(登録商標)分析)を含むFc-FcγR相互作用、すなわち、Fc領域のFcγRに対する特異的結合を測定するために当該技術分野において既知の、種々のインビトロアッセイ法(生化学または免疫学ベースアッセイ))、および他の方法、例えば、間接的結合アッセイ、競合的阻害アッセイ、蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)、ゲル電気泳動法およびクロマトグラフィー(例えば、ゲル濾過)により測定され得る。これらのおよび他の方法は、調査される1種または複数の成分上の標識を利用および/または限定されないが、発色性、蛍光、発光、または同位体標識を含む種々の検出法を採用し得る。
特定の実施形態では、本発明のタンパク質は、1つまたは複数のヒトFcγRに結合する。特定の実施形態では、本発明のタンパク質は、FcγRI、FcγRIIB、FcγRIIC、FcγRIIIA-F158、およびFcγRIIIA-V158からなる群より選択される1つまたは複数のヒトFcγRに、野性型ヒトIgG1重鎖定常ドメイン(配列番号119)Fc領域を有する等価タンパク質より、少なくとも10倍、好ましくは少なくとも30倍、およびより好ましくは少なくとも100倍低い親和性で結合する。特定の実施形態では、本発明のタンパク質は、ヒトFcγRIに、野性型ヒトIgG1重鎖定常ドメイン(配列番号119)Fc領域を有する等価タンパク質より、少なくとも10倍、好ましくは少なくとも30倍、およびより好ましくは少なくとも100倍低い親和性で結合する。特定の実施形態では、本発明のタンパク質は、ヒトFcγRIIBに、野性型ヒトIgG1重鎖定常ドメイン(配列番号119)Fc領域を有する等価タンパク質より、少なくとも10倍、好ましくは少なくとも30倍、およびより好ましくは少なくとも100倍低い親和性で結合する。特定の実施形態では、本発明のタンパク質は、ヒトFcγRIICに、野性型ヒトIgG1重鎖定常ドメイン(配列番号119)Fc領域を有する等価タンパク質より、少なくとも10倍、好ましくは少なくとも30倍、およびより好ましくは少なくとも100倍低い親和性で結合する。特定の実施形態では、本発明のタンパク質は、ヒトFcγRIIIA-F158に、野性型ヒトIgG1重鎖定常ドメイン(配列番号119)Fc領域を有する等価タンパク質より、少なくとも10倍、好ましくは少なくとも30倍、およびより好ましくは少なくとも100倍低い親和性で結合する。特定の実施形態では、本発明のタンパク質は、ヒトFcγRIIIA-V158に、野性型ヒトIgG1重鎖定常ドメイン(配列番号119)Fc領域を有する等価タンパク質より、少なくとも10倍、好ましくは少なくとも30倍、およびより好ましくは少なくとも100倍低い親和性で結合する。特定の実施形態では、本発明のタンパク質は、FcγRI、FcγRIIB、FcγRIIC、FcγRIIIA-F158、およびFcγRIIIA-V158からなる群より選択される1つまたは複数のヒトFcγRに、野性型ヒトIgG4重鎖定常ドメイン(配列番号66)Fc領域を有する等価タンパク質より、少なくとも10倍、好ましくは少なくとも30倍、およびより好ましくは少なくとも100倍低い親和性で結合する。特定の実施形態では、本発明のタンパク質は、ヒトFcγRIに、野性型ヒトIgG4重鎖定常ドメイン(配列番号66)Fc領域を有する等価タンパク質より、少なくとも10倍、好ましくは少なくとも30倍、およびより好ましくは少なくとも100倍低い親和性で結合する。特定の実施形態では、本発明のタンパク質は、ヒトFcγRIIBに、野性型ヒトIgG4重鎖定常ドメイン(配列番号66)Fc領域を有する等価タンパク質より、少なくとも10倍、好ましくは少なくとも30倍、およびより好ましくは少なくとも100倍低い親和性で結合する。特定の実施形態では、本発明のタンパク質は、ヒトFcγRIICに、野性型ヒトIgG4重鎖定常ドメイン(配列番号66)Fc領域を有する等価タンパク質より、少なくとも10倍、好ましくは少なくとも30倍、およびより好ましくは少なくとも100倍低い親和性で結合する。特定の実施形態では、本発明のタンパク質は、ヒトFcγRIIIA-F158に、野性型ヒトIgG4重鎖定常ドメイン(配列番号66)Fc領域を有する等価タンパク質より、少なくとも10倍、好ましくは少なくとも30倍、およびより好ましくは少なくとも100倍低い親和性で結合する。特定の実施形態では、本発明のタンパク質は、ヒトFcγRIIIA-V158に、野性型ヒトIgG4重鎖定常ドメイン(配列番号66)Fc領域を有する等価タンパク質より、少なくとも10倍、好ましくは少なくとも30倍、およびより好ましくは少なくとも100倍少ない親和性で結合する。
種々の実施形態では、本発明のタンパク質は、免疫グロブリンC2領域および免疫グロブリンC3領域および免疫グロブリンヒンジ領域を含む免疫グロブリンFc領域を含む。例えば、免疫グロブリンFc領域は、IgG Fc領域、IgE Fc領域、またはIgA Fc領域であってもよい。種々の実施形態では、タンパク質は、2つの免疫グロブリンFc領域を含み、各免疫グロブリンFc領域は、免疫グロブリンC2領域および免疫グロブリンC3領域および免疫グロブリンヒンジ領域を含み、1つの免疫グロブリンFc領域のヒンジ領域は、他の免疫グロブリンFc領域のヒンジ領域に結合し、二量体Fc構造を形成する。最も好ましくは、このようなタンパク質は、ヒトまたはヒト化IgGタンパク質である。
特定の実施形態では、本発明のタンパク質は、変異IgG4 Fc領域を含み、好ましくは、タンパク質は、2つの変異IgG4 Fc領域を含み、二量体Fc構造を形成する。例えば、変異IgG4 Fc領域は、表3に記載の1つの変異、または変異の組み合わせを含み得る。この表で言及される定常領域のナンバリングシステムは、Kabatら(1991,NIH Publication 91-3242,National Technical Information Service,Springfield,VA)で示されるEUインデックスのナンバリングシステムである。この表では、1番目の文字および数字は非改変アミノ酸およびその位置を表し、2番目の文字は、前記位置で置換されたアミノ酸を表す。2種以上の変異の組み合わせを含む物質では、組み合わせ中の各変異は、「/」により分離されている。欠失は、「Δ」で示される。
特定の実施形態では、本発明のタンパク質は、変異IgG1 Fc領域を含み、好ましくは、タンパク質は、2つの変異IgG1 Fc領域を含み、二量体Fc構造を形成するIgGである。例えば、変異IgG1 Fc領域は、表4に記載の1つの変異を含み得る。この表で言及される定常領域のナンバリングシステムは、Kabatら(1991,NIH Publication 91-3242,National Technical Information Service,Springfield,VA)で示されるEUインデックスのナンバリングシステムである。この表では、1番目の文字および数字は非改変アミノ酸およびその位置を表し、2番目の文字は、前記位置で置換されたアミノ酸を表す。
特定の実施形態では、変異IgG1 Fc領域は、表5に記載の1つの変異の組み合わせを含み得る。この表で言及される定常領域のナンバリングシステムは、Kabatら(1991,NIH Publication 91-3242,National Technical Information Service,Springfield,VA)で示されるEUインデックスのナンバリングシステムである。この表では、1番目の文字および数字は非改変アミノ酸およびその位置を表し、2番目の文字は、前記位置で置換されたアミノ酸を表す。2つ以上の変異の組み合わせのそれぞれでは、組み合わせ中の各変異は、「/」により分離され、欠失は「Δ」により示される。
特定の実施形態では、本発明のタンパク質は、野生型または変異IgG2 Fc領域を含み、好ましくは、タンパク質は、2つの野生型または変異IgG2 Fc領域を含み、二量体Fc構造を形成するIgGである。変異IgG2 Fc領域は、表6に記載の1つの変異、または変異の組み合わせを含み得る。この表で言及される定常領域のナンバリングシステムは、Kabatら(1991,NIH Publication 91-3242,National Technical Information Service,Springfield,VA)で示されるEUインデックスのナンバリングシステムである。この表では、1番目の文字および数字は非改変アミノ酸およびその位置を表し、2番目の文字は、前記位置で置換されたアミノ酸を表す。2種以上の変異の組み合わせを含む物質では、組み合わせ中の各変異は、「/」により分離されている。
改変グリコシル化を有する抗体の産生
さらに別の実施形態では、本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、特定のグリコシル化パターンを含む。例えば、脱フコシル化または脱グリコシル化抗体(すなわち、それぞれ、フコースまたはグリコシル化を欠く抗体)またはフラグメントを作製できる。抗体またはフラグメントのグリコシル化パターンは、例えば、抗体またはフラグメントのCD103抗原に対する親和性または結合力を高めるように改変し得る。このような改変は、例えば、抗体またはフラグメント配列内の1つまたは複数のグリコシル化部位を変えることにより達成できる。例えば、1つまたは複数の可変領域フレームワークグリコシル化部位を除去し、それにより、その部位のグリコシル化を除去する1つまたは複数のアミノ酸置換を実施できる。このような脱グリコシル化は、抗原に対する抗体またはフラグメントのまたは結合力を高め得る。例えば、米国特許第5,714,350号および同第6,350,861号を参照されたい。
さらに別の実施形態では、本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、特定のグリコシル化パターンを含む。例えば、脱フコシル化または脱グリコシル化抗体(すなわち、それぞれ、フコースまたはグリコシル化を欠く抗体)またはフラグメントを作製できる。抗体またはフラグメントのグリコシル化パターンは、例えば、抗体またはフラグメントのCD103抗原に対する親和性または結合力を高めるように改変し得る。このような改変は、例えば、抗体またはフラグメント配列内の1つまたは複数のグリコシル化部位を変えることにより達成できる。例えば、1つまたは複数の可変領域フレームワークグリコシル化部位を除去し、それにより、その部位のグリコシル化を除去する1つまたは複数のアミノ酸置換を実施できる。このような脱グリコシル化は、抗原に対する抗体またはフラグメントのまたは結合力を高め得る。例えば、米国特許第5,714,350号および同第6,350,861号を参照されたい。
本明細書で開示の抗体および抗原結合フラグメントは、下等真核生物宿主細胞で産生されたものをさらに含み、特に、酵母および糸状菌などの真菌宿主細胞は、遺伝子改変されて、哺乳動物またはヒト様グリコシル化パターンを有する糖タンパク質を産生する(例えば、Choi et al,(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.100:5022-5027;Hamilton et al.,(2003)Science 301:1244-1246;Hamilton et al.,(2006)Science 313:1441-1443;Nett et al.,Yeast 28(3):237-52(2011);Hamilton et al.,Curr Opin Biotechnol.18(5):387-92(2007)を参照されたい)。これらの遺伝子改変宿主細胞の現在使用されている哺乳動物細胞株に対する特定の有意性は、特定のN-グリカン構造が多い糖タンパク質の組成物が産生できるように細胞中で産生される糖タンパク質のグリコシル化プロファイルを調節する能力である(例えば、米国特許第7,029,872号および同第7,449,308号を参照されたい)。これらの遺伝子改変宿主細胞は、主に特定のN-グリカン構造を有する抗体を産生するために使用されている(例えば、Li et al.,(2006)Nat.Biotechnol.24:210-215を参照されたい)。
特定の実施形態では、本明細書で開示の抗体およびその抗原結合フラグメントは、下等真核生物宿主細胞で産生されたものをさらに含み、これらは、限定されないが、GlcNAc(1-4)Man3GlcNAc2;Gal(1-4)GlcNAc(1-4)Man3GlcNAc2;NANA(1-4)Gal(1-4)GlcNAc(1-4)Man3GlcNAc2などのN-グリカンを含む二分岐および多分岐種を含むフコシル化および非フコシル化ハイブリッドならびに、複合体N-グリカンを含む。
特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体およびその抗原結合フラグメントは、GlcNAcMan5GlcNAc2;GalGlcNAcMan5GlcNAc2;およびNANAGalGlcNAcMan5GlcNAc2からなる群より選択される少なくとも1種のハイブリッドN-グリカンを有する抗体またはフラグメントを含み得る。特定の態様では、ハイブリッドN-グリカンは、組成物中でN-グリカン種が支配的である。
特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体およびその抗原結合フラグメントは、GlcNAcMan3GlcNAc2;GalGlcNAcMan3GlcNAc2;NANAGalGlcNAcMan3GlcNAc2;GlcNAc2Man3GlcNAc2;GalGlcNAc2Man3GlcNAc2;Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2;NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2;およびNANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2からなる群より選択される少なくとも1種の複合体N-グリカンを有する抗体またはフラグメントを含む。特定の態様では、複合体N-グリカンは、組成物中でN-グリカン種が支配的である。さらなる態様では、複合体N-グリカンは、組成物中に、約30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%、99%、または100%の複合体N-グリカンを含む特定のN-グリカン種である。一実施形態では、本明細書で提供される抗体およびその抗原結合フラグメントは、複合体N-グリカンを含み、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%、99%、または100%の複合体N-グリカンは、構造NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2を含み、このような構造は脱フコシル化されている。このような構造は、例えば、改変ピキア・パストリス宿主細胞中で産生できる。
特定の実施形態では、N-グリカンはフコシル化されている。一般に、フコースは、N-グリカンの還元末端でGlcNAcとα1,3結合、N-グリカンの還元末端でGlcNAcとα1,6結合、N-グリカンの非還元末端でGalとα1,2結合、N-グリカンの非還元末端でGlcNAcとα1,3結合、またはN-グリカンの非還元末端でGlcNAcとα1,4結合している。
従って、上記糖タンパク質組成物の特定の態様では、グリコフォームは、Man5GlcNAc2(Fuc)、GlcNAcMan5GlcNAc2(Fuc)、Man3GlcNAc2(Fuc)、GlcNAcMan3GlcNAc2(Fuc)、GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)、GalGlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)、Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)、NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)、およびNANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)からなる群より選択されるグリコフォームを産生するα1,3結合またはα1,6結合フコース;GlcNAc(Fuc)Man5GlcNAc2、GlcNAc(Fuc)Man3GlcNAc2、GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2、GalGlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2、Gal2GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2、NANAGal2GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2、およびNANA2Gal2GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2からなる群より選択されるグリコフォームを産生するα1,3結合またはα1,4結合フコース;またはGal(Fuc)GlcNAc2Man3GlcNAc2、Gal2(Fuc1-2)GlcNAc2Man3GlcNAc2、NANAGal2(Fuc1-2)GlcNAc2Man3GlcNAc2、およびNANA2Gal2(Fuc1-2)GlcNAc2Man3GlcNAc2からなる群より選択されるグリコフォームを産生するα1,2結合フコースである。
さらなる態様では、抗体(例えば、ヒト化抗体)またはその抗原結合フラグメントは、限定されないが、Man8GlcNAc2、Man7GlcNAc2、Man6GlcNAc2、Man5GlcNAc2、Man4GlcNAc2を含む高マンノースN-グリカン、またはMan3GlcNAc2 N-グリカン構造からなるN-グリカンを含む。
上記のさらなる態様では、複合体N-グリカンは、フコシル化および非フコシル化二分岐および多分岐種をさらに含む。
本明細書で使用される場合、「N-グリカン」および「グリコフォーム」という用語は、同じ意味で用いられ、N結合型オリゴ糖、例えば、ポリペプチドのアスパラギン残基に対するアスパラギン-N-アセチルグルコサミン結合により結合されるものを意味する。N結合型糖タンパク質は、タンパク質中のアスパラギン残基のアミド窒素に結合したN-アセチルグルコサミン残基を含む。糖タンパク質で認められる量の多いショ糖は、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、N-アセチルガラクトサミン(GalNAc)、N-アセチルグルコサミン(GlcNAc)およびシアル酸(例えば、N-アセチルノイラミン酸(NANA))である。糖基のプロセッシングは、ERの管腔中での同時翻訳で発生し、N結合型糖タンパク質のゴルジ装置中で翻訳後まで続く。
N-グリカンは、Man3GlcNAc2(「Man」はマンノースを意味し;「Glc」はグルコースを意味し;「NAc」はN-アセチルを意味し;GlcNAcはN-アセチルグルコサミンを意味する)の共通の五糖類コアを有する。通常、N-グリカン構造は、左側に非還元末端および右側に還元末端で示される。N-グリカンの還元末端は、タンパク質上にグリコシル化部位を含むAsn残基に結合された末端である。N-グリカンは、「トリマンノースコア」、「五糖類コア」または「パーシマンノースコア」とも呼ばれるMan3GlcNAc2(「Man3」)コア構造に追加される周辺ショ糖(例えば、GlcNAc、ガラクトース、フコースおよびシアル酸)を含む分岐(オリゴ糖の断片)の数が異なる。N-グリカンは、それらの分岐成分により分類される(例えば、高マンノース、複合体またはハイブリッド)。「高マンノース」型N-グリカンは、5個以上のマンノース残基を有する。「複合体」型N-グリカンは通常、「トリマンノース」コアの1,3マンノースアームに結合した少なくとも1つのGlcNAcおよび1,6マンノースアームに結合した少なくとも1種のGlcNAcを有する。複合体N-グリカンはまた、任意選択で、シアル酸または誘導体で修飾されたガラクトース(「Gal」)またはN-アセチルガラクトサミン(「GalNAc」)残基を有し得る(例えば、「NANA」または「NeuAc」、ここで、「Neu」はノイラミン酸を、「Ac」はアセチルを意味する)。複合体N-グリカンはまた、「二分岐」GlcNAcおよびコアフコース(「Fuc」)を含む鎖内置換を有し得る。複合体N-グリカンはまた、「トリマンノースコア」上に多分岐を有し、多くの場合、「多分岐グリカン」と呼ばれる。「ハイブリッド」N-グリカンは、トリマンノースコアの1,3-マンノースアームの末端上に少なくとも1種のGlcNAcおよびトリマンノースコアの1,6マンノースアーム上にゼロまたは1個以上のマンノースを有する。種々のN-グリカンは、「グリコフォーム」とも呼ばれる。
複合体N-グリカンに関して、用語「G-2」、「G-1」、「G0」、「G1」、「G2」、「A1」、および「A2」は、下記を意味する。「G-2」はMan3GlcNAc2として特徴付けることができるN-グリカン構造を意味し;用語「G-1」はGlcNAcMan3GlcNAc2として特徴付けることができるN-グリカン構造を意味し;用語「G0」はGlcNAc2Man3GlcNAc2として特徴付けることができるN-グリカン構造を意味し;用語「G1」はGalGlcNAc2Man3GlcNAc2として特徴付けることができるN-グリカン構造を意味し;用語「G2」はGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2として特徴付けることができるN-グリカン構造を意味し;用語「A1」はNANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2として特徴付けることができるN-グリカン構造を意味し;および、用語「A2」はNANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2として特徴付けることができるN-グリカン構造を意味する。特に指示がない限り、用語「G-2」、「G-1」、「G0」、「G1」、「G2」、「A1」、および「A2」は、N-グリカンの還元末端でGlcNAc残基に結合したフコースを欠くN-グリカン種を意味する。用語が「F」を含む場合、「F」は、N-グリカン種がN-グリカンの還元末端のGlcNAc残基上にフコース残基を含むことを示す。例えば、G0F、G1F、G2F、A1F、およびA2Fは全て、N-グリカンが、N-グリカンの還元末端でGlcNAc残基に結合したフコース残基をさらに含むことを示す。酵母および糸状菌などの下等真核生物は、フコースを産生するN-グリカンを通常、産生しない。
多分岐N-グリカンに関して、用語「多分岐N-グリカン」は、N-グリカンの1,6アームまたは1,3アームの非還元末端を含むマンノース残基上にGlcNAc残基またはN-グリカンの1,6アームおよび1,3アームの非還元末端を含むマンノース残基のそれぞれ上にGlcNAc残基をさらに含むN-グリカンを意味する。従って、多分岐N-グリカンは、式GlcNAc(2-4)Man3GlcNAc2、Gal(1-4)GlcNAc(2-4)Man3GlcNAc2、またはNANA(1-4)Gal(1-4)GlcNAc(2-4)Man3GlcNAc2を特徴とし得る。用語「1-4」は、1、2、3、または4残基を意味する。
二分岐N-グリカンに関して、用語「二分岐N-グリカン」は、GlcNAc残基がN-グリカンの還元末端でマンノース残基に結合しているN-グリカンを意味する。二分岐N-グリカンは、式GlcNAc3Man3GlcNAc2を特徴とし得、各マンノース残基はGlcNAc残基にその非還元末端で結合される。対照的に、多分岐N-グリカンがGlcNAc3Man3GlcNAc2を特徴とする場合、式は、2つのGlcNAc残基がN-グリカンの2つのアームの1つの非還元末端でマンノース残基に結合され、1つのGlcNAc残基がN-グリカンのもう一方のアームの非還元末端でマンノース残基に結合される。
特定の実施形態では、本発明のタンパク質は、脱グリコシル化Fc領域を含む。例えば、IgG1 Fc領域は、残基N297を欠失させるまたは置換することにより、脱グリコシル化され得る。
抗体物理的特性
本明細書で開示の抗体およびその抗原結合フラグメントは、軽鎖または重鎖免疫グロブリン可変領域中に1つまたは複数のグリコシル化部位をさらに含み得る。このようなグリコシル化部位は、改変された抗原結合に起因する抗体もしくはフラグメントの高められた免疫原性または抗体のpKの変化を生ずる(Marshall et al.(1972)Annu Rev Biochem 41:673-702;Gala and Morrison(2004)J Immunol 172:5489-94;Wallick et al(1988)J Exp Med 168:1099-109;Spiro(2002)Glycobiology 12:43R-56R;Parekh et al(1985)Nature 316:452-7;Mimura et al.(2000)Mol Immunol 37:697-706)。グリコシル化は、N-X-S/T配列を含むモチーフで起こることが知られている。
本明細書で開示の抗体およびその抗原結合フラグメントは、軽鎖または重鎖免疫グロブリン可変領域中に1つまたは複数のグリコシル化部位をさらに含み得る。このようなグリコシル化部位は、改変された抗原結合に起因する抗体もしくはフラグメントの高められた免疫原性または抗体のpKの変化を生ずる(Marshall et al.(1972)Annu Rev Biochem 41:673-702;Gala and Morrison(2004)J Immunol 172:5489-94;Wallick et al(1988)J Exp Med 168:1099-109;Spiro(2002)Glycobiology 12:43R-56R;Parekh et al(1985)Nature 316:452-7;Mimura et al.(2000)Mol Immunol 37:697-706)。グリコシル化は、N-X-S/T配列を含むモチーフで起こることが知られている。
各抗体または抗原結合フラグメントは、ユニークな等電点(pI)を有し、これは、一般に、6~9.5のpH範囲に入る。IgG1抗体のpIは通常、7~9.5のpH範囲内に入り、IgG4抗体のpIは通常、6~8のpH範囲内に入る。
各抗体または抗原結合フラグメントは、特徴的な融解温度を有し、より高い融解温度は、より高い全体的インビボ安定性を示す(Krishnamurthy R and Manning MC(2002)Curr Pharm Biotechnol 3:361-71)。一般に、TM1(初期アンフォールディング温度)は、60℃より高くても、65℃より高くても、または70℃より高くてもよい。抗体またはフラグメントの融点は、示差走査熱量測定法(Chen et al(2003)Pharm Res 20:1952-60;Ghirlando et al(1999)Immunol Lett 68:47-52)または円偏光二色性分光分析(Murray et al.(2002)J.Chromatogr Sci 40:343-9)を用いて測定できる。
さらなる実施形態では、急速に分解しない抗体およびその抗原結合フラグメントが選択される。抗体またはフラグメントの分解は、キャピラリー電気泳動法(CE)およびMALDI-MS(Alexander AJ and Hughes DE(1995)Anal Chem 67:3626-32)を用いて測定できる。
さらなる実施形態では、最小限の凝集効果を有する抗体およびその抗原結合フラグメントが選択される。凝集効果は、望ましくない免疫応答および/または改変されたまたは好ましくない薬物動態学的特性を生ずるきっかけとなる可能性がある。一般に、25%以下、20%以下、15%以下、10%以下または5%以下の凝集を有する抗体およびフラグメントが許容可能である。凝集は、サイズ排除カラム(SEC)、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、および光散乱を含むいくつかの技術により測定できる。
抗体コンジュゲート
本明細書で開示の抗CD103抗体はまた、化学的部分にコンジュゲートされ得る。本明細書で開示の抗CD103抗原結合フラグメントはまた、化学的部分にコンジュゲートされ得る。化学的部分は、特に高分子であり得る。化学的部分は、特に放射性ヌクレオチドであり得る。化学的部分は、特に細胞傷害性因子であり得る。特定の実施形態では、化学的部分は、対象の身体中の抗体またはフラグメントの半減期を延長する高分子である。好適な高分子には、限定されないが、親水性ポリマーが挙げられる。このような親水性ポリマーには、限定されないが、ポリエチレングリコール(PEG)(例えば、2kDa、5kDa、10kDa、12kDa、20kDa、30kDa、または40kDaの分子量を有するPEG)が挙げられ得る。このような親水性ポリマーには、限定されないが、デキストランが挙げられ得る。このような親水性ポリマーには、限定されないが、モノメトキシポリエチレングリコール(mPEG)が挙げられ得る。Lee,et al.,(1999)(Bioconj.Chem.10:973-981)は、PEGコンジュゲート単鎖抗体を開示している。Wen,et al.,(2001)(Bioconj.Chem.12:545-553)は、放射性金属キレート化剤(ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA))に結合したPEGとコンジュゲートされた抗体を開示している。
本明細書で開示の抗CD103抗体はまた、化学的部分にコンジュゲートされ得る。本明細書で開示の抗CD103抗原結合フラグメントはまた、化学的部分にコンジュゲートされ得る。化学的部分は、特に高分子であり得る。化学的部分は、特に放射性ヌクレオチドであり得る。化学的部分は、特に細胞傷害性因子であり得る。特定の実施形態では、化学的部分は、対象の身体中の抗体またはフラグメントの半減期を延長する高分子である。好適な高分子には、限定されないが、親水性ポリマーが挙げられる。このような親水性ポリマーには、限定されないが、ポリエチレングリコール(PEG)(例えば、2kDa、5kDa、10kDa、12kDa、20kDa、30kDa、または40kDaの分子量を有するPEG)が挙げられ得る。このような親水性ポリマーには、限定されないが、デキストランが挙げられ得る。このような親水性ポリマーには、限定されないが、モノメトキシポリエチレングリコール(mPEG)が挙げられ得る。Lee,et al.,(1999)(Bioconj.Chem.10:973-981)は、PEGコンジュゲート単鎖抗体を開示している。Wen,et al.,(2001)(Bioconj.Chem.12:545-553)は、放射性金属キレート化剤(ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA))に結合したPEGとコンジュゲートされた抗体を開示している。
本明細書で開示の抗体およびその抗原結合フラグメントはまた、99Tc、99mTc、86Y、88Y、90Y、111In、32P、14C、123I、124I、125I、3H、131I、11C、15O、13N、18F、19F、35S、51Cr、57To、226Ra、60Co、59Fe、57Se、152Eu、61Cu、62Cu、64Cu、67Cu、66Ga、67Ga、68Ga、72Ga、45Ti、89Zr、217Ci、211At、212Pb、177Lu、44Sc、47Sc、109Pd、234Th、40K、157Gd、55Mn、52Tr、および56Feなどの標識とコンジュゲートされ得る。
本明細書で開示の抗体はまた、ペグ化されて、例えば、その生物学的(例えば、血清)半減期を延長し得る。本明細書で開示の抗原結合フラグメントもペグ化され得る。抗体またはフラグメントをペグ化するために、抗体またはフラグメントは、通常、PEGの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体などの反応型のポリエチレングリコール(PEG)と、1つまたは複数のPEG基が抗体または抗体フラグメントに結合する条件下で、反応させられる。特定の実施形態では、ペグ化は、反応性PEG分子(または類似の反応性水溶性ポリマー)とのアシル化反応またはアルキル化反応を介して実施される。本明細書で使用される場合、「ポリエチレングリコール」という用語は、モノ(C1-C10)アルコキシ-またはアリールオキシ-ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール-マレイミドなどの他のタンパク質を誘導体化するのに使用されているPEGの全ての形態を包含することが意図される。特定の実施形態では、ペグ化される抗体またはフラグメントは、脱グリコシル化抗体またはフラグメントである。タンパク質をペグ化する方法は、当技術分野において既知であり、本発明の抗体に適用できる。例えば、EP0154316およびEP0401384を参照されたい。
本明細書で開示の抗体はまた、蛍光標識とコンジュゲートされ得る。本明細書で開示の抗体はまた、化学発光(chemiluminescent)標識とコンジュゲートされ得る。本明細書で開示の抗原結合フラグメントはまた、蛍光標識とコンジュゲートされ得る。本明細書で開示の抗原結合フラグメントはまた化学発光標識とコンジュゲートされ得る。これには、希土類元素キレート、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、イソチオシアネート、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、o-フタルアルデヒド、フルオレサミン、152Eu、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェリンなどのフルオロフォア、ルミナル標識、イソルミナル標識、芳香族アクリジニウムエステル標識、イミダゾール標識、アクリジニウム塩標識、シュウ酸エステル標識、エクオリン標識、2,3-ジヒドロフタラジンジオン、ビオチン/アビジン、スピン標識および安定なフリーラジカルが含まれる。
本発明の抗体はまた、細胞傷害薬にコンジュゲートされ得る。本発明の抗体の抗原結合フラグメントはまた、細胞傷害薬にコンジュゲートされ得る。本発明の抗体およびその抗原結合フラグメントはまた、オーリスタチンF、パクリタキセル、ドセタキセル、ビンクリスチン、CC-1065、SN-38、トポテカン、モルホリノドキソルビシン、リゾキシン(lysoxin)、シアノモルホリノドキソルビシン、ドラスタチン-10、エキノマイシン、コンブレタスタチン(combretatstatin)、カリケアミシン(chalicheamicin)、メイタンシン、DM-1、ネトロプシン、ジフテリア毒素、緑膿菌外毒素A鎖、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデシンA鎖、アルファサルシン、シナアブラギリタンパク質および化合物(例えば、脂肪酸)、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ(Phytolacca americana)タンパク質PAPI、PAPII、およびPAP-S;ニガウリ阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ阻害剤、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、およびエノマイシンなどの細胞傷害薬にコンジュゲートされ得る。このリストは、限定することを意図したものではない。本発明の抗体は、オーリスタチンFにコンジュゲートされ得る。本発明の抗体は、パクリタキセルにコンジュゲートされ得る。本発明の抗体は、ドセタキセルにコンジュゲートされ得る。本発明の抗体は、ビンクリスチンにコンジュゲートされ得る。本発明の抗体は、CC-1065にコンジュゲートされ得る。本発明の抗体は、SN-38にコンジュゲートされ得る。本発明の抗体は、トポテカンにコンジュゲートされ得る。本発明の抗体は、モルホリノドキソルビシンにコンジュゲートされ得る。本発明の抗体は、リゾキシンにコンジュゲートされ得る。本発明の抗体は、シアノモルホリノドキソルビシンにコンジュゲートされ得る。本発明の抗体は、ドラスタチン-10にコンジュゲートされ得る。本発明の抗体は、エキノマイシンにコンジュゲートされ得る。本発明の抗体は、コンブレタスタチン(combretastatin)にコンジュゲートされ得る。本発明の抗体は、カリケアミシンにコンジュゲートされ得る。本発明の抗体は、メイタンシンにコンジュゲートされ得る。本発明の抗体は、DM-1にコンジュゲートされ得る。本発明の抗体は、ネトロプシンにコンジュゲートされ得る。本発明の抗体は、ジフテリア毒素にコンジュゲートされ得る。本発明の抗体は、緑膿菌外毒素A鎖にコンジュゲートされ得る。本発明の抗体は、リシンA鎖にコンジュゲートされ得る。本発明の抗体は、アブリンA鎖にコンジュゲートされ得る。本発明の抗体は、モデシンA鎖にコンジュゲートされ得る。本発明の抗体は、アルファサルシンにコンジュゲートされ得る。本発明の抗体は、シナアブラギリタンパク質および化合物(例えば、脂肪酸)にコンジュゲートされ得る。本発明の抗体は、ジアンチンタンパク質にコンジュゲートされ得る。本発明の抗体は、ヨウシュヤマゴボウタンパク質PAPIにコンジュゲートされ得る。本発明の抗体は、ヨウシュヤマゴボウタンパク質PAPIIにコンジュゲートされ得る。本発明の抗体は、ヨウシュヤマゴボウタンパク質PAP-Sにコンジュゲートされ得る。本発明の抗体は、ニガウリ阻害剤にコンジュゲートされ得る。本発明の抗体は、クルシンにコンジュゲートされ得る。本発明の抗体は、クロチンにコンジュゲートされ得る。本発明の抗体は、サボンソウ阻害剤にコンジュゲートされ得る。本発明の抗体は、ミトゲリンにコンジュゲートされ得る。本発明の抗体は、レストリクトシンにコンジュゲートされ得る。本発明の抗体は、フェノマイシンにコンジュゲートされ得る。本発明の抗体は、エノマイシンにコンジュゲートされ得る。本発明の抗体の抗原結合フラグメントは、オーリスタチンFにコンジュゲートされ得る。本発明の抗体の抗原結合フラグメントは、パクリタキセルにコンジュゲートされ得る。本発明の抗体の抗原結合フラグメントは、ドセタキセルにコンジュゲートされ得る。本発明の抗体の抗原結合フラグメントは、ビンクリスチンにコンジュゲートされ得る。本発明の抗体の抗原結合フラグメントは、CC-1065にコンジュゲートされ得る。本発明の抗体の抗原結合フラグメントは、SN-38にコンジュゲートされ得る。本発明の抗体の抗原結合フラグメントは、トポテカンにコンジュゲートされ得る。本発明の抗体の抗原結合フラグメントは、モルホリノドキソルビシンにコンジュゲートされ得る。本発明の抗体は、リゾキシンにコンジュゲートされ得る。本発明の抗体の抗原結合フラグメントは、シアノモルホリノドキソルビシンにコンジュゲートされ得る。本発明の抗体の抗原結合フラグメントは、ドラスタチン-10にコンジュゲートされ得る。本発明の抗体の抗原結合フラグメントは、エキノマイシンにコンジュゲートされ得る。本発明の抗体の抗原結合フラグメントは、コンブレタスタチン(combretastatin)にコンジュゲートされ得る。本発明の抗体の抗原結合フラグメントは、カリケアミシン(chalicheamicin)にコンジュゲートされ得る。本発明の抗体の抗原結合フラグメントは、メイタンシンにコンジュゲートされ得る。本発明の抗体の抗原結合フラグメントは、DM-1にコンジュゲートされ得る。本発明の抗体の抗原結合フラグメントは、ネトロプシンにコンジュゲートされ得る。本発明の抗体の抗原結合フラグメントは、ジフテリア毒素にコンジュゲートされ得る。本発明の抗体の抗原結合フラグメントは、緑膿菌外毒素A鎖にコンジュゲートされ得る。本発明の抗体は、リシンA鎖にコンジュゲートされ得る。本発明の抗体の抗原結合フラグメントは、アブリンA鎖にコンジュゲートされ得る。本発明の抗体の抗原結合フラグメントは、モデシンA鎖にコンジュゲートされ得る。本発明の抗体の抗原結合フラグメントは、アルファサルシンにコンジュゲートされ得る。本発明の抗体の抗原結合フラグメントは、シナアブラギリタンパク質および化合物(例えば、脂肪酸)にコンジュゲートされ得る。本発明の抗体の抗原結合フラグメントは、ジアンチンタンパク質にコンジュゲートされ得る。本発明の抗体の抗原結合フラグメントは、ヨウシュヤマゴボウタンパク質PAPIにコンジュゲートされ得る。本発明の抗体の抗原結合フラグメントは、ヨウシュヤマゴボウタンパク質PAPIIにコンジュゲートされ得る。本発明の抗体の抗原結合フラグメントは、ヨウシュヤマゴボウタンパク質PAP-Sにコンジュゲートされ得る。本発明の抗体の抗原結合フラグメントは、ニガウリ阻害剤にコンジュゲートされ得る。本発明の抗体の抗原結合フラグメントは、クルシンにコンジュゲートされ得る。本発明の抗体の抗原結合フラグメントは、クロチンにコンジュゲートされ得る。本発明の抗体の抗原結合フラグメントは、サボンソウ阻害剤にコンジュゲートされ得る。本発明の抗体の抗原結合フラグメントは、ミトゲリンにコンジュゲートされ得る。本発明の抗体の抗原結合フラグメントは、レストリクトシンにコンジュゲートされ得る。本発明の抗体の抗原結合フラグメントは、フェノマイシンにコンジュゲートされ得る。本発明の抗体の抗原結合フラグメントは、エノマイシンにコンジュゲートされ得る。
本発明の抗体はまた、抗癌剤にコンジュゲートされ得る。本発明の抗体はまた、エルロチニブ(TARCEVA(登録商標)、Genentech/OSI Pharm.)、ドセタキセル(TAXOTERE(登録商標)、Sanofi-Aventis)、5-FU(フルオロウラシル、5-フルオロウラシル、CAS番号51-21-8)、ゲムシタビン(GEMZAR(登録商標)、Lilly)、PD-0325901(CAS番号391210-10-9、Pfizer)、シスプラチン(シス-ジアミン、ジクロロ白金(II)、CAS番号15663-27-1)、カルボプラチン(CAS番号41575-94-4)、パクリタキセル(TAXOL(登録商標)、Bristol-Myers Squibb Oncology、Princeton、N.J.)、トラスツズマブ(ハーセプチン(登録商標)、Genentech)、テモゾロミド(4-メチル-5-オキソ-2,3,4,6,8-ペンタザビシクロ[4.3.0]ノナ-2,7,9-トリエン-9-カルボキサミド、CAS番号85622-93-1、TEMODAR(登録商標)、TEMODAL(登録商標)、Schering Plough)、タモキシフェン((Z)-2-[4-(1,2-ジフェニルブタ-1-エニル)フェノキシ]-N,N-ジメチルエタンアミン、NOLVADEX(登録商標)、ISTUBAL(登録商標)、VALODEX(登録商標))、およびドキソルビシン(ADRIAMYCIN(登録商標))などの抗癌剤にコンジュゲートされ得る。追加の商業的にまたは臨床的に利用可能な抗癌剤は、オキサリプラチン(ELOXATIN(登録商標)、Sanofi)、ボルテゾミブ(VELCADE(登録商標)、Millennium Pharm.)、スーテント(SUNITINIB(登録商標)、SU11248、Pfizer)、レトロゾール(FEMARA(登録商標)、Novartis)、イマチニブメシレート(GLEEVEC(登録商標)、Novartis)、XL-518(Mek阻害剤、Exelixis、国際公開WO2007/044515)、ARRY-886(Mek阻害剤、AZD6244、Array BioPharma、Astra Zeneca)、SF-1126(PI3K阻害剤、Semafore Pharmaceuticals)、BEZ-235(PI3K阻害剤、Novartis)、XL-147(PI3K阻害剤、Exelixis)、PTK787/ZK222584(Novartis)、フルベストラント(FASLODEX(登録商標)、AstraZeneca)、ロイコボリン(フォリン酸)、ラパマイシン(シロリムス、RAPAMUNE(登録商標)、Wyeth)、ラパチニブ(TYKERB(登録商標)、GSK572016、Glaxo Smith Kline)、ロナファーニブ(SARASAR(商標)、SCH 66336、Schering Plough)、ソラフェニブ(NEXAVAR(登録商標)、BAY43-9006、Bayer Labs)、ゲフィチニブ(IRESSA(登録商標)、AstraZeneca)、イリノテカン(CAMPTOSAR(登録商標)、CPT-11、Pfizer)、ティピファニブ(ZARNESTRA(商標)、Johnson & Johnson)、ABRAXANE(商標)(クレモホール不含)、パクリタキセルのアルブミン遺伝子改変ナノ粒子製剤(American Pharmaceutical Partners、Schaumberg、Ill.)、バンデタニブ(rINN、ZD6474、ZACTIMA(登録商標)、AstraZeneca)、クロラムブシル、AG1478、AG1571(SU5271;Sugen)、テムシロリムス(TORISEL(登録商標)、Wyeth)、パゾパニブ(GlaxoSmithKline)、カンホスファミド(TELCYTA(登録商標)、Telik)、チオテパおよびシクロホスファミド(CYTOXAN(登録商標)、NEOSAR(登録商標));ビノレルビン(NAVELBINE(登録商標));カペシタビン(XELODA(登録商標)、Roche)、タモキシフェン(including NOLVADEX(登録商標);タモキシフェンクエン酸塩、FARESTON(登録商標)(トレミフェンクエン酸塩)MEGASE(登録商標)(酢酸メゲストロール)、AROMASIN(登録商標)(エキセメスタン;Pfizer)、ホルメスタイン(formestanie)、ファドロゾール、RIVISOR(登録商標)(ボロゾール)、FEMARA(登録商標)(レトロゾール;Novartis)、およびARIMIDEX(登録商標)(アナストロゾール;AstraZeneca)を含む。このリストは、限定することを意図したものではない。
本発明の抗体の抗原結合フラグメントはまた、抗癌剤にコンジュゲートされ得る。本発明の抗体の抗原結合フラグメントはまた、エルロチニブ(TARCEVA(登録商標)、Genentech/OSI Pharm.)、ドセタキセル(TAXOTERE(登録商標)、Sanofi-Aventis)、5-FU(フルオロウラシル、5-フルオロウラシル、CAS番号51-21-8)、ゲムシタビン(GEMZAR(登録商標)、Lilly)、PD-0325901(CAS番号391210-10-9、Pfizer)、シスプラチン(シス-ジアミン、ジクロロ白金(II)、CAS番号15663-27-1)、カルボプラチン(CAS番号41575-94-4)、パクリタキセル(TAXOL(登録商標)、Bristol-Myers Squibb Oncology、Princeton、N.J.)、トラスツズマブ(ハーセプチン(登録商標)、Genentech)、テモゾロミド(4-メチル-5-オキソ-2,3,4,6,8-ペンタザビシクロ[4.3.0]ノナ-2,7,9-トリエン-9-カルボキサミド、CAS番号85622-93-1、TEMODAR(登録商標)、TEMODAL(登録商標)、Schering Plough)、タモキシフェン((Z)-2-[4-(1,2-ジフェニルブタ-1-エニル)フェノキシ]-N,N-ジメチルエタンアミン、NOLVADEX(登録商標)、ISTUBAL(登録商標)、VALODEX(登録商標))、およびドキソルビシン(ADRIAMYCIN(登録商標))などの抗癌剤にコンジュゲートされ得る。追加の商業的にまたは臨床的に利用可能な抗癌剤は、オキサリプラチン(ELOXATIN(登録商標)、Sanofi)、ボルテゾミブ(VELCADE(登録商標)、Millennium Pharm.)、スーテント(SUNITINIB(登録商標)、SU11248、Pfizer)、レトロゾール(FEMARA(登録商標)、Novartis)、イマチニブメシレート(GLEEVEC(登録商標)、Novartis)、XL-518(Mek阻害剤、Exelixis、国際公開WO2007/044515)、ARRY-886(Mek阻害剤、AZD6244、Array BioPharma、Astra Zeneca)、SF-1126(PI3K阻害剤、Semafore Pharmaceuticals)、BEZ-235(PI3K阻害剤、Novartis)、XL-147(PI3K阻害剤、Exelixis)、PTK787/ZK222584(Novartis)、フルベストラント(FASLODEX(登録商標)、AstraZeneca)、ロイコボリン(フォリン酸)、ラパマイシン(シロリムス、RAPAMUNE(登録商標)、Wyeth)、ラパチニブ(TYKERB(登録商標)、GSK572016、Glaxo Smith Kline)、ロナファーニブ(SARASAR(商標)、SCH 66336、Schering Plough)、ソラフェニブ(NEXAVAR(登録商標)、BAY43-9006、Bayer Labs)、ゲフィチニブ(IRESSA(登録商標)、AstraZeneca)、イリノテカン(CAMPTOSAR(登録商標)、CPT-11、Pfizer)、ティピファニブ(ZARNESTRA(商標)、Johnson & Johnson)、ABRAXANE(商標)(クレモホール不含)、パクリタキセルのアルブミン遺伝子改変ナノ粒子製剤(American Pharmaceutical Partners、Schaumberg、Ill.)、バンデタニブ(rINN、ZD6474、ZACTIMA(登録商標)、AstraZeneca)、クロラムブシル、AG1478、AG1571(SU5271;Sugen)、テムシロリムス(TORISEL(登録商標)、Wyeth)、パゾパニブ(GlaxoSmithKline)、カンホスファミド(TELCYTA(登録商標)、Telik)、チオテパおよびシクロホスファミド(CYTOXAN(登録商標)、NEOSAR(登録商標));ビノレルビン(NAVELBINE(登録商標));カペシタビン(XELODA(登録商標)、Roche)、タモキシフェン(including NOLVADEX(登録商標);タモキシフェンクエン酸塩、FARESTON(登録商標)(トレミフェンクエン酸塩)MEGASE(登録商標)(酢酸メゲストロール)、AROMASIN(登録商標)(エキセメスタン;Pfizer)、ホルメスタイン(formestanie)、ファドロゾール、RIVISOR(登録商標)(ボロゾール)、FEMARA(登録商標)(レトロゾール;Novartis)、およびARIMIDEX(登録商標)(アナストロゾール;AstraZeneca)を含む。このリストは、限定することを意図したものではない。
本明細書では、抗体および抗原結合フラグメントは、常磁性キレート、微粒子、超常磁性粒子を用いて;超音波気泡、微粒子、マイクロスフェアなどへ取り込んで、検出可能なように標識し得る。
金属キレート剤は、常磁性金属に対するリガンド、および常磁性金属との複合体として機能する、1種または複数の極性基を有する分子である。好適なキレート化剤は当技術分野において既知であり、メチレンホスホン酸基、メチレンカルボヒドロキサミン酸基、カルボキシエチリデン基、またはカルボキシメチレン基を有する酸が含まれる。キレート化剤の例には、限定されないが、ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)、1,4,7,10-テトラアザシクロテトラデカン-1,4,7,10-四酢酸(DOTA)、1-置換1,4,7,-トリカルボキシメチル-1,4,7,10-テラアザシクロドデカン(DO3A)、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、および1,4,8,11-テトラアザシクロテトラデカン-1,4,8,11-四酢酸(TETA)が挙げられる。追加のキレート化リガンドは、エチレンビス-(2-ヒドロキシフェニルグリシン)(EHPG)、ならびに5-C1-EHPG、5Br-EHPG、5-Me-EHPG、5t-Bu-EHPG、および5sec-Bu-EHPGを含むその誘導体;ベンゾジエチレントリアミン五酢酸(ベンゾDTPA)およびベンゾDTPA、フェニルDTPA、ジフェニルDTPA、ベンジルDTPA、およびジベンジルDTPAを含むその誘導体;ビス-2(ヒドロキシベンジル)エチレンジアミン二酢酸(HBED)およびその誘導体;大環状化合物のクラスであって、少なくとも3個の炭素原子、より好ましくは少なくとも6個、および少なくとも2個のヘテロ原子(Oおよび/またはN)を含み、大環状化合物は、1つの環、またはヘテロ環元素で一緒に連結された2つもしくは3つの環からなる、例えば、ベンゾDOTA、ジベンゾDOTA、およびベンゾNOTAであってよく、NOTAは、1,4,7-トリアザシクロノナン N,N′,N″-三酢酸、ベンゾTETA、ベンゾDOTMAであり、DOTMAは、1,4,7,10-テトラアザシクロテトラデカン-1,4,7,10-テトラ(メチル四酢酸)およびベンゾTETMAであり、TETMAは、1,4,8,11-テトラアザシクロテトラデカン-1,4,8,11-(メチル四酢酸)である大環状化合物のクラス;1,3-プロピレンジアミン四酢酸(PDTA)およびトリエチレンテトラミン六酢酸(TTHA)の誘導体;1,5,10-N,N′,N″-トリス(2,3-ジヒドロキシベンゾイル)トリカテコレート(LICAM)の誘導体;および1,3,5-N,N′,N″-トリス(2,3-ジヒドロキシベンゾイル)アミノメチルベンゼン(MECAM)が挙げられる。本発明により意図される代表的キレート化剤およびキレート化基の例は、国際公開WO98/18496、同WO86/06605、同WO91/03200、同WO95/28179、同WO96/23526、同WO97/36619、国際出願PCT/US98/01473、同PCT/US98/20182、および米国特許第4,899,755号、同5,474,756号、同5,846,519号および同6,143,274号に記載されている。これらの全ては、参照により本明細書に組み込まれる。
Hunter,et al.,(1962)Nature 144:945;David,et al.,(1974)Biochemistry 13:1014;Pain,et al.,(1981)J.Immunol.Meth.40:219;and Nygren,J.,(1982)Histochem.and Cytochem.30:407に記載の方法を含む、本発明の抗体およびその抗原結合フラグメントを種々の部分にコンジュゲートするための当該技術分野において既知のいずれかの方法を採用し得る。抗体およびフラグメントをコンジュゲートする方法は、従来から存在し、当該技術分野において周知である。
化学的架橋剤は、下記を基準にして分類し得る:
1.官能基および化学的特異性;
2.架橋の長さおよび組成;
3.結合基が類似(ホモ二官能性)であるか、または異なる(ヘテロ二機能性)かどうか;
4.基が化学的にまたは光化学的に反応するかどうか;
5.試薬が切断可能であるかどうか;および
6.試薬が放射標識できるかまたは別の標識でタグ付けできるかどうか。
1.官能基および化学的特異性;
2.架橋の長さおよび組成;
3.結合基が類似(ホモ二官能性)であるか、または異なる(ヘテロ二機能性)かどうか;
4.基が化学的にまたは光化学的に反応するかどうか;
5.試薬が切断可能であるかどうか;および
6.試薬が放射標識できるかまたは別の標識でタグ付けできるかどうか。
架橋剤を用いて標的にされ得る抗体および標識上の反応基としては、1級アミン、カルボニル、およびカルボン酸が挙げられる。加えて、多くの反応性基が光反応性フェニルアジドなどの架橋剤を用いて非選択的に結合され得る。好適な試薬については、Pierce 2003-2004 Applications Handbookおよびカタログ番号1600926を参照されたい。この文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
最適架橋剤-対-標的モル比を決定するためには、多くの因子を考慮する必要がある。用途によっては、コンジュゲーションの程度は重要な因子である。例えば、免疫原コンジュゲートを調製する場合、高度のコンジュゲーションが抗原の免疫原性を高めるために通常望ましい。しかし、抗体または酵素にコンジュゲートする場合、低から中程度のコンジュゲーションがタンパク質の生物活性が保持されることを確実にするためには最適である。タンパク質の表面上の反応性基の数を考慮することも重要である。多数の標的基が存在する場合、より低い架橋剤-対-タンパク質比率を使用できる。限られた数の潜在的標的の場合には、より高い架橋剤-対-タンパク質比率が必要になり得る。これは、低分子量タンパク質に対して、グラム当りのより多い架橋剤になる。
相互作用の前後に、架橋試験を実施することにより、特定の相互作用に関連するタンパク質の立体構造変化も同様に解析され得る。異なるアーム長さの架橋剤を用い、コンジュゲーションの成功を解析することにより、比較を行える。立体障害を有するアミノ酸を架橋に利用可能になるようにタンパク質の立体構造を変化させる場合、異なる反応性基および/またはスペーサーアームを有する架橋剤の使用が望ましい場合がある。
反応性末端を連結する種々の長さのスペーサーアームまたは架橋を有する架橋剤を利用できる。架橋の最も明らかな属性は、結合される部分の立体的問題点に対処するその能力である。立体効果は、架橋のための潜在的反応部位間の距離を決定づけるので、異なる長さの架橋が相互作用のために考慮され得る。より短いスペーサーアームが、分子内の架橋試験で使用されることが多いが、分子間架橋は、より長いスペーサーアームを含む架橋剤が好ましい。
架橋剤中の高分子部分の含有(例えば、ポリエチレングリコール(「PEG」ホモポリマー、ポリプロピレングリコールホモポリマー、他のアルキル-ポリエチレンオキシド、ビス-ポリエチレンオキシドおよびポリ(アルキレンオキシド)のコポリマーまたはブロックコポリマー)は、特定の状況下では、好都合な場合がある。例えば、米国特許第5,643,575号、同5,672,662号、同5,705,153号、同5,730,990号、同5,902,588号、および同5,932,462号、ならびにTopchieva et al.,Bioconjug.Chem.6:380-8,1995を参照されたい。例えば、米国特許第5,672,662号は、PEG高分子部分および単一エステル結合を含む二官能性架橋剤を開示している。このような分子は、水中で約10~25分の半減期を与えるといわれている。
架橋剤の設計は、用いられる官能基の選択を必要とする。官能基の選択は、架橋されるべき種上の利用可能な標的部位に完全に依存する。いくつかの種(例えば、タンパク質)は、いくつかの標的化のために利用可能部位(例えば、リジンε-アミノ基、システインスルフヒドリル基、グルタミン酸カルボキシル基、など)を提示し得、特定の官能基の選択は、目的の生物学的特性(例えば、抗体の結合親和性、酵素の触媒活性、など)を最良に保存するために、経験的に実施し得る。
アミン基による結合
イミドエステルおよびN-ヒドロキシスクシンイミジル(「NHS」)エステルは通常、アミン特異的官能基として採用される。NHSエステルは、一級または二級アミンと反応時に安定な生成物をもたらす。結合は、生理学的pHで効率的であり、NHSエステル架橋剤は、それらのイミデート対応物よりも溶液中で安定である。ホモ二官能性NHSエステルコンジュゲーションは、アミン含有タンパク質を1段階または2段階反応で架橋するためによく使用される。一級アミンは、NHSエステルに対する基本的標的である。タンパク質のN末端に存在する利用可能なα-アミン基は、NHSエステルと反応し、アミドを形成する。しかし、タンパク質上のα-アミンは、必ずしも利用できるとは限らないために、アミノ酸の側鎖との反応が重要になる。5種のアミノ酸は、側鎖に窒素を有するが、リジンのε-アミノ基のみが、NHSエステルと顕著に反応する。共有結合アミド結合は、NHSエステル架橋剤が一級アミンと反応する際に形成され、N-ヒドロキシスクシンイミドを放出する。
イミドエステルおよびN-ヒドロキシスクシンイミジル(「NHS」)エステルは通常、アミン特異的官能基として採用される。NHSエステルは、一級または二級アミンと反応時に安定な生成物をもたらす。結合は、生理学的pHで効率的であり、NHSエステル架橋剤は、それらのイミデート対応物よりも溶液中で安定である。ホモ二官能性NHSエステルコンジュゲーションは、アミン含有タンパク質を1段階または2段階反応で架橋するためによく使用される。一級アミンは、NHSエステルに対する基本的標的である。タンパク質のN末端に存在する利用可能なα-アミン基は、NHSエステルと反応し、アミドを形成する。しかし、タンパク質上のα-アミンは、必ずしも利用できるとは限らないために、アミノ酸の側鎖との反応が重要になる。5種のアミノ酸は、側鎖に窒素を有するが、リジンのε-アミノ基のみが、NHSエステルと顕著に反応する。共有結合アミド結合は、NHSエステル架橋剤が一級アミンと反応する際に形成され、N-ヒドロキシスクシンイミドを放出する。
スルフヒドリル基による結合
マレイミド、アルキルおよびアリールハロゲン化物、α-ハロアシル、およびピリジルジスルフィドは、典型的には、スルフヒドリル特異的官能基として用いられる。反応混合物のpHがpH6.5~7.5の間に保持される場合、マレイミド基は、スルフヒドリル基に対し特異的である。pH7では、マレイミドとスルフヒドリルの反応は、アミンとの反応よりも1000倍速い。マレイミドは、チロシン、ヒスチジンまたはメチオニンとは反応しない。遊離スルフヒドリルが十分な量で存在しない場合、それらは、利用可能なジスルフィド結合の還元により生成できる場合が多い。
マレイミド、アルキルおよびアリールハロゲン化物、α-ハロアシル、およびピリジルジスルフィドは、典型的には、スルフヒドリル特異的官能基として用いられる。反応混合物のpHがpH6.5~7.5の間に保持される場合、マレイミド基は、スルフヒドリル基に対し特異的である。pH7では、マレイミドとスルフヒドリルの反応は、アミンとの反応よりも1000倍速い。マレイミドは、チロシン、ヒスチジンまたはメチオニンとは反応しない。遊離スルフヒドリルが十分な量で存在しない場合、それらは、利用可能なジスルフィド結合の還元により生成できる場合が多い。
カルボキシル基による結合
カルボジイミドは、カルボキシルを一級アミンまたはヒドラジドに結合させ、アミドまたはヒドラゾン結合が形成される。カルボジイミドは、カルボジイミドと結合される分子との間で架橋が形成されないという点で他のコンジュゲーション反応と異なり;むしろ、利用可能なカルボキシル基と利用可能なアミン基との間でペプチド結合が形成される。タンパク質のカルボキシ末端は、グルタミン酸およびアスパラギン酸側鎖と同様に、標的化できる。過剰架橋剤の存在下では、タンパク質がカルボキシルおよびアミンの両方を含むために、重合が起こる。架橋は形成されず、アミド結合はペプチド結合と同じであり、そのため、架橋の逆転は、タンパク質の破壊なしには不可能である。
カルボジイミドは、カルボキシルを一級アミンまたはヒドラジドに結合させ、アミドまたはヒドラゾン結合が形成される。カルボジイミドは、カルボジイミドと結合される分子との間で架橋が形成されないという点で他のコンジュゲーション反応と異なり;むしろ、利用可能なカルボキシル基と利用可能なアミン基との間でペプチド結合が形成される。タンパク質のカルボキシ末端は、グルタミン酸およびアスパラギン酸側鎖と同様に、標的化できる。過剰架橋剤の存在下では、タンパク質がカルボキシルおよびアミンの両方を含むために、重合が起こる。架橋は形成されず、アミド結合はペプチド結合と同じであり、そのため、架橋の逆転は、タンパク質の破壊なしには不可能である。
非選択的標識
光親和性試薬は、化学的に不活性であるが紫外線または可視光に曝露されると反応性になる化合物である。アリールアジドは、250~460nmの波長で光分解されて、反応性アリールニトレンを形成する光親和性試薬である。アリールニトレンは、非選択的に反応して共有結合を形成する。還元剤は、アジド基を還元できるので、これらは、注意して使用する必要がある。
光親和性試薬は、化学的に不活性であるが紫外線または可視光に曝露されると反応性になる化合物である。アリールアジドは、250~460nmの波長で光分解されて、反応性アリールニトレンを形成する光親和性試薬である。アリールニトレンは、非選択的に反応して共有結合を形成する。還元剤は、アジド基を還元できるので、これらは、注意して使用する必要がある。
カルボニル特異的架橋剤
カルボニル(アルデヒドおよびケトン)は、pH5~7でアミンおよびヒドラジドと反応する。ヒドラジドとの反応は、アミンとの反応より速く、これを、部位特異的架橋のために有用にしている。カルボニルは、タンパク質中には、簡単に存在するものではないが、しかし、メタ過ヨウ素酸ナトリウムを用いた糖部分の軽度の酸化により隣接ヒドロキシルがアルデヒドまたはケトンに変換される。
カルボニル(アルデヒドおよびケトン)は、pH5~7でアミンおよびヒドラジドと反応する。ヒドラジドとの反応は、アミンとの反応より速く、これを、部位特異的架橋のために有用にしている。カルボニルは、タンパク質中には、簡単に存在するものではないが、しかし、メタ過ヨウ素酸ナトリウムを用いた糖部分の軽度の酸化により隣接ヒドロキシルがアルデヒドまたはケトンに変換される。
実験および診断での使用
本明細書で開示の抗CD103抗体は、親和性精製剤として使用され得る。本明細書で開示の抗CD103抗原結合フラグメントは、親和性精製剤として使用され得る。この方法では、抗CD103抗体およびその抗原結合フラグメントは、当該技術分野において周知の方法を用いて、セファデックス、ガラスまたはアガロース樹脂または濾紙などの固相上に固定される。固定化抗体またはフラグメントは、精製されるCD103タンパク質(またはそのフラグメント)を含む試料と接触され、その後、支持体は、固定化抗体またはフラグメントに結合されているCD103タンパク質を除く試料中の実質的に全ての物質を除去する好適な溶媒で洗浄される。最後に、支持体は、結合CD103を溶出する溶媒(例えば、プロテインA)で洗浄される。このような固定化抗体およびフラグメントは、本発明の一部を形成する。
本明細書で開示の抗CD103抗体は、親和性精製剤として使用され得る。本明細書で開示の抗CD103抗原結合フラグメントは、親和性精製剤として使用され得る。この方法では、抗CD103抗体およびその抗原結合フラグメントは、当該技術分野において周知の方法を用いて、セファデックス、ガラスまたはアガロース樹脂または濾紙などの固相上に固定される。固定化抗体またはフラグメントは、精製されるCD103タンパク質(またはそのフラグメント)を含む試料と接触され、その後、支持体は、固定化抗体またはフラグメントに結合されているCD103タンパク質を除く試料中の実質的に全ての物質を除去する好適な溶媒で洗浄される。最後に、支持体は、結合CD103を溶出する溶媒(例えば、プロテインA)で洗浄される。このような固定化抗体およびフラグメントは、本発明の一部を形成する。
さらに提供されるのは、例えば、本明細書で考察されるウェスタンブロットおよび他のイムノアッセイの実施のために有用な二次抗体を生成するための抗原である。
抗CD103抗体(例えば、ヒト化抗体)およびその抗原結合フラグメントは、CD103タンパク質のための診断アッセイ、例えば、特定細胞、組織、または血清、例えば、単球、マクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、および樹状細胞などの骨髄細胞中のその発現の検出にも有用であり得る。このような診断法は、種々の疾患診断に有用である。
本発明は、本明細書で開示の抗CD103抗体またはその抗原結合フラグメントの使用を組み入れたELISAアッセイ(酵素結合免疫吸着アッセイ)を含む。
例えば、このような方法は、下記のステップを含む:
(a)基材(例えば、マイクロタイタープレートウェル、例えば、プラスチックプレートの表面)を抗CD103抗体またはその抗原結合フラグメントでコートするステップ;
(b)CD103の存在を試験する試料を基材に適用するステップ;
(c)プレートを洗浄し、試料中の非結合物質を除去するステップ;
(d)検出可能なように標識されたCD103抗原に同様に特異的な抗体(例えば、酵素結合抗体)を適用するステップ;
(e)基材を洗浄し、非結合標識抗体を除去するステップ;
(f)標識抗体が酵素結合である場合、酵素により蛍光シグナルに変換される薬品を適用するステップ;
(g)標識抗体の存在を検出するステップ。
(a)基材(例えば、マイクロタイタープレートウェル、例えば、プラスチックプレートの表面)を抗CD103抗体またはその抗原結合フラグメントでコートするステップ;
(b)CD103の存在を試験する試料を基材に適用するステップ;
(c)プレートを洗浄し、試料中の非結合物質を除去するステップ;
(d)検出可能なように標識されたCD103抗原に同様に特異的な抗体(例えば、酵素結合抗体)を適用するステップ;
(e)基材を洗浄し、非結合標識抗体を除去するステップ;
(f)標識抗体が酵素結合である場合、酵素により蛍光シグナルに変換される薬品を適用するステップ;
(g)標識抗体の存在を検出するステップ。
基材に結合した標識の検出は、CD103タンパク質の存在を示す。
さらなる実施形態では、標識抗体またはその抗原結合フラグメントは、ABTS(例えば、2,2’-アジノ-ビス(3-エチルベンズチアゾリン-6-スルホン酸))または3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジンと反応して、検出可能な色変化を生じるペルオキシダーゼで標識される。あるいは、標識抗体またはフラグメントは、シンチラントの存在下でシンチレーションカウンターにより検出できる検出可能な放射性同位元素(例えば、3H)で標識される。
本発明の抗CD103抗体またはその抗原結合フラグメントをウェスタンブロットまたは免疫-タンパク質ブロット法で使用し得る。このような手順は、本発明の一部を形成し、例えば、下記を包含する:
(1)任意選択で、CD103の存在に関し試験される試料から(例えば、試料中のタンパク質のPAGEまたはSDS-PAGE電気泳動による分離から)タンパク質を当該技術分野において既知の方法(例えば、セミドライブロッティングまたはタンクブロッティング)を用いて膜または他の固体基材上に転写すること;CD103またはそのフラグメントの存在に関し試験される膜または他の固体基材を本発明の抗CD103抗体またはその抗原結合フラグメントと接触させること;
(2)膜を1回または複数回洗浄して、非結合抗CD103抗体またはフラグメントおよび他の非結合物質を除去すること;および
(3)結合抗CD103抗体またはフラグメントを検出すること。
(1)任意選択で、CD103の存在に関し試験される試料から(例えば、試料中のタンパク質のPAGEまたはSDS-PAGE電気泳動による分離から)タンパク質を当該技術分野において既知の方法(例えば、セミドライブロッティングまたはタンクブロッティング)を用いて膜または他の固体基材上に転写すること;CD103またはそのフラグメントの存在に関し試験される膜または他の固体基材を本発明の抗CD103抗体またはその抗原結合フラグメントと接触させること;
(2)膜を1回または複数回洗浄して、非結合抗CD103抗体またはフラグメントおよび他の非結合物質を除去すること;および
(3)結合抗CD103抗体またはフラグメントを検出すること。
このような膜は、ニトロセルロースまたはビニル系(例えば、ポリフッ化ビニリデン(PVDF))膜の形態を取ってよく、非変性PAGE(ポリアクリルアミドゲル電気泳動)ゲルまたはSDS-PAGE(ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動)ゲル中でCD103の存在に関し試験されるタンパク質が転写されている膜である。膜を抗CD103抗体またはフラグメントと接触させる前に、膜は任意選択で、膜上の非特異的タンパク質結合部位に結合するように、例えば、脱脂粉ミルクなどでブロッキングされる。
結合抗体またはフラグメントの検出は、CD103タンパク質が膜または基材上に、および試料中に存在することを示す。結合抗体またはフラグメントの検出は、抗体またはフラグメントと、検出可能なように標識されている二次抗体(抗免疫グロブリン抗体)とを結合させ、その後、二次抗体の存在を検出することにより行われ得る。
本明細書で開示の抗CD103抗体およびその抗原結合フラグメントは、免疫組織化学的検査のためにも使用され得る。このような方法は、本発明の一部を形成し、例えば、下記を含む:
(1)CD103タンパク質の存在に関し試験される細胞(例えば、単球、マクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、および樹状細胞などの骨髄細胞を含む試料)を本発明の抗CD103抗体またはその抗原結合フラグメントと接触させること;および
(2)細胞上のまたは細胞中の抗体またはフラグメントを検出すること。
(1)CD103タンパク質の存在に関し試験される細胞(例えば、単球、マクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、および樹状細胞などの骨髄細胞を含む試料)を本発明の抗CD103抗体またはその抗原結合フラグメントと接触させること;および
(2)細胞上のまたは細胞中の抗体またはフラグメントを検出すること。
抗体またはフラグメントそれ自体が検出可能なように標識される場合、それは直接的に検出できる。あるいは、抗体またはフラグメントは、検出可能なように標識された検出される二次抗体により結合され得る。
本明細書で開示の特定の抗CD103抗体およびその抗原結合フラグメントは、インビボ腫瘍イメージングのためにも使用され得る。このような方法は、放射標識抗CD103抗体またはその抗原結合フラグメントを、CD103発現に関連する腫瘍(例えば、腫瘍細胞上に、例えば、CD103を発現する腫瘍)の存在に関し試験される患者の身体中へ注入し、続けて、患者の身体の核イメージングを行って、例えば、腫瘍に結合している高濃度の抗体またはフラグメントを含む位置で、標識抗体またはフラグメントの存在を検出することを含み得る。位置の検出は、CD103+腫瘍および腫瘍細胞の存在を示す。
イメージング技術には、SPECTイメージング(単一光子放射型コンピュータ断層撮影)またはpETイメージング(陽電子放出断層撮影)が挙げられる。標識には、例えば、SPECTイメージングと組み合わせたヨウ素-123(123I)およびテクネチウム-99(99mTc)、または例えば、PETイメージングと組み合わせた11C、13N、15Oまたは18F、またはインジウム-111(例えば、Gordon et al.,(2005)International Rev.Neurobiol.67:385-440を参照されたい)が挙げられる。
医薬組成物および投与および治療的使用
本発明の抗体は、CD103シグナル伝達を抑制し、従って、本発明の一態様では、本明細書で開示の特定の抗体は、特定の状態および疾患の治療または予防のための候補である。本発明は、状態および疾患の治療方法を提供し、状態または疾患の経過は、CD103シグナル伝達により影響を受け得る。前記方法は、本発明の治療有効量の抗体を、このような治療を必要とする対象に投与することを含む。
本発明の抗体は、CD103シグナル伝達を抑制し、従って、本発明の一態様では、本明細書で開示の特定の抗体は、特定の状態および疾患の治療または予防のための候補である。本発明は、状態および疾患の治療方法を提供し、状態または疾患の経過は、CD103シグナル伝達により影響を受け得る。前記方法は、本発明の治療有効量の抗体を、このような治療を必要とする対象に投与することを含む。
インテグリンファミリーヘテロダイマーは、T細胞活性化、ホーミング、およびエフェクター機能の送達において多様で極めて豊富な役割を果たす。CD103インテグリンヘテロダイマーは、最初は脊椎動物腸粘膜中のT細胞上のその発現により特定された。それは、腸上皮内リンパ球(iIEL)の95%超で、および約40%の粘膜固有層リンパ球で、高レベルで発現される。CD103は、上皮細胞細胞特異的リガンド、E-カドヘリンを認識する。正常マウスおよびヒトでは、腸上皮内に存在するCD8+T細胞は高レベルのCD103を発現し、上皮内リンパ球、腫瘍浸潤リンパ球および特定の樹状細胞中で広範に発現されている。以前の調査は、腫瘍特異的浸潤性リンパ球に起因する細胞溶解においてCD103が腫瘍細胞上のそのリガンド、E-カドヘリンとの溶解性顆粒分極およびエキソサイトーシスを引き起こす相互作用を介して、重要な役割を果たすことを実証した。さらに、CD103およびE-カドヘリンのライゲーションは、T細胞の腫瘍細胞への接着を促進し、活性化細胞傷害性T細胞の共刺激を誘導する。これらの知見は、CD103が腫瘍免疫を高めるための標的である可能性があることを示唆する。
種々の実施形態では、本発明の抗体は、E-カドヘリンへの結合を遮断し、CD103+細胞、CD103+CD8+エフェクター細胞を枯渇させるために使用され、および/または組織常在性メモリーT細胞(TRM)を枯渇させるために使用される。
本発明はまた、CD103シグナル伝達媒介状態を治療する方法を提供し、該方法は、有効量の1種または複数の本発明の抗体を、それを必要としている患者に投与することを含む。いくつかの実施形態では、CD103シグナル伝達媒介状態は、自己免疫性、炎症性、または神経変性状態または癌である(Rayburn,E.R.et al.,Mol Cell Pharmacol.2009;1(1):29-43 and Urbanska,A.M.et al.,Cell Biochem Biophys.2015 Jul;72(3):757-69を参照されたい)。
同種移植片拒絶におけるCD103
移植腎摘出検体のFACS分析により、拒絶エピソードを起こしている同種移植片に浸潤したCD8エフェクターの主要サブセットが高レベルのCD103を発現したことが明らかになった。興味深いことに、CD103+CD8+エフェクターは、慢性移植腎障害の場合に、拒絶エピソードを起こしている腎移植で最も豊富である。重要なのは、CD103+CD8+エフェクターが周辺リンパ性コンパートメント(すなわち、末梢血リンパ球)中には存在せず、従って、従来の免疫モニタリング手法により検出できないことである。しかし、CD103 mRNAは、臨床拒絶と同時に腎移植レシピエントの尿から単離される細胞により発現され、拒絶エピソード中のCD103+CD8+エフェクターの尿細管内局在化と一致する。上記の臨床観察は、CD8エフェクター集団による移植片上皮コンパートメントの破壊促進におけるCD103の重要な役割と一致し、移植片上皮要素のCD8媒介破壊にはCD103の発現が必要であるという仮設を裏付ける。本明細書に記載される本発明の抗体は、同種移植片拒絶の治療に使用できる。本明細書に記載される本発明の抗体は、同種移植片拒絶の予防に使用できる。本明細書に記載される本発明の抗原結合フラグメントは、同種移植片拒絶の治療に使用できる。本明細書に記載される本発明の抗原結合フラグメントは、同種移植片拒絶の予防に使用できる。
移植腎摘出検体のFACS分析により、拒絶エピソードを起こしている同種移植片に浸潤したCD8エフェクターの主要サブセットが高レベルのCD103を発現したことが明らかになった。興味深いことに、CD103+CD8+エフェクターは、慢性移植腎障害の場合に、拒絶エピソードを起こしている腎移植で最も豊富である。重要なのは、CD103+CD8+エフェクターが周辺リンパ性コンパートメント(すなわち、末梢血リンパ球)中には存在せず、従って、従来の免疫モニタリング手法により検出できないことである。しかし、CD103 mRNAは、臨床拒絶と同時に腎移植レシピエントの尿から単離される細胞により発現され、拒絶エピソード中のCD103+CD8+エフェクターの尿細管内局在化と一致する。上記の臨床観察は、CD8エフェクター集団による移植片上皮コンパートメントの破壊促進におけるCD103の重要な役割と一致し、移植片上皮要素のCD8媒介破壊にはCD103の発現が必要であるという仮設を裏付ける。本明細書に記載される本発明の抗体は、同種移植片拒絶の治療に使用できる。本明細書に記載される本発明の抗体は、同種移植片拒絶の予防に使用できる。本明細書に記載される本発明の抗原結合フラグメントは、同種移植片拒絶の治療に使用できる。本明細書に記載される本発明の抗原結合フラグメントは、同種移植片拒絶の予防に使用できる。
組織常在性メモリーT細胞
皮膚慢性炎症、特に乾癬およびFDEの再発は、以前の患部で高頻度に発生することは古くから知られてきた。従って、免疫記憶が炎症性疾患の反応性および慢性化の再発に関与することが提案された。TRM細胞(末梢組織中での長期生存および低い遊走)の際だった特性に対して、皮膚TRM細胞は、炎症性皮膚障害の再発に積極的に関与し得ることが示唆された。
皮膚慢性炎症、特に乾癬およびFDEの再発は、以前の患部で高頻度に発生することは古くから知られてきた。従って、免疫記憶が炎症性疾患の反応性および慢性化の再発に関与することが提案された。TRM細胞(末梢組織中での長期生存および低い遊走)の際だった特性に対して、皮膚TRM細胞は、炎症性皮膚障害の再発に積極的に関与し得ることが示唆された。
乾癬病変の一次発症は、その後続けて既往の部位で再発が起こる場合が多く、その発生および再発に局所常在性メモリーT細胞が関与することが示唆されてきた。乾癬病変中のCD8+T細胞は、高度に活性化され、大量のCD69およびCD103を発現する。対照的に、若干のT細胞は、これらのタンパク質を末梢血中で構成的に発現し、さらに、TEM細胞が血管アドレシンE-セレクチンと相互作用し、感染または攻撃の間に皮膚に輸送される。より重要なことに、最近の調査は、TCRαβ+常在性T細胞は、正常に見える皮膚でも、乾癬の既往部位に蓄積すること、およびそれらは、IL-17およびIFNγを産生して、乾癬状応答を引き起こすことができることを示した。これらの知見は、乾癬発生における病変常在性T細胞の重要な役割を裏付ける。本明細書に記載される本発明の抗体は、乾癬の治療に使用できる。本明細書に記載される本発明の抗体は、乾癬の予防に使用できる。本明細書に記載される本発明の抗原結合フラグメントは、乾癬の治療に使用できる。本明細書に記載される本発明の抗原結合フラグメントは、乾癬の予防に使用できる。
炎症性腸疾患およびCD103
重要な病理過程は腸炎症を推進するとして次第に認識され、自己免疫は、調節性T細胞(Treg)プール中の定性的または定量的欠損に続発する免疫恒常性の喪失である。Tregは、それらの発生的起源に応じて、2つのグループ:胸腺Treg(tTreg)または末梢誘導性Treg(pTreg)に大きく分割できる。T細胞は、形質転換増殖因子β(TGFβ)の存在下でのT細胞受容体(TCR)共刺激によりFoxp3発現CD4+CD25+Tregに変換され得る。腸関連リンパ組織(GALT)中でのpTreg変換は、TGFβ、IL-2およびレチノイン酸(RA)の存在下で未感作CD4+T細胞が抗原に遭遇すると、強化された。これは、腸微小環境により前処置されたCD103+DCにより促進されて、TGFβを産生または活性化し、RAを提供する。CD103発現の非存在下では、DCは、Treg発生を誘導できず、炎症促進性のサイトカインを産生する。UCの患者では、結腸CD4+T細胞上のCD103発現は、炎症促進性Th1、Th17、およびTh1/Th17サイトカインの産生の増大と関連し、UC患者のCD103+DCは、Th1/Th2/Th17細胞応答を促進する能力を有することが報告された。従って、標的化インテグリンの有効性は、腸炎惹起性CD103+樹状細胞の除去およびリンパ球動員の遮断により説明し得る。本明細書に記載される本発明の抗体は、炎症性腸疾患の治療に使用できる。本明細書に記載される本発明の抗体は、炎症性腸疾患の予防に使用できる。本明細書に記載される本発明の抗原結合フラグメントは、炎症性腸疾患の治療に使用できる。本明細書に記載される本発明の抗原結合フラグメントは、炎症性腸疾患の予防に使用できる。
重要な病理過程は腸炎症を推進するとして次第に認識され、自己免疫は、調節性T細胞(Treg)プール中の定性的または定量的欠損に続発する免疫恒常性の喪失である。Tregは、それらの発生的起源に応じて、2つのグループ:胸腺Treg(tTreg)または末梢誘導性Treg(pTreg)に大きく分割できる。T細胞は、形質転換増殖因子β(TGFβ)の存在下でのT細胞受容体(TCR)共刺激によりFoxp3発現CD4+CD25+Tregに変換され得る。腸関連リンパ組織(GALT)中でのpTreg変換は、TGFβ、IL-2およびレチノイン酸(RA)の存在下で未感作CD4+T細胞が抗原に遭遇すると、強化された。これは、腸微小環境により前処置されたCD103+DCにより促進されて、TGFβを産生または活性化し、RAを提供する。CD103発現の非存在下では、DCは、Treg発生を誘導できず、炎症促進性のサイトカインを産生する。UCの患者では、結腸CD4+T細胞上のCD103発現は、炎症促進性Th1、Th17、およびTh1/Th17サイトカインの産生の増大と関連し、UC患者のCD103+DCは、Th1/Th2/Th17細胞応答を促進する能力を有することが報告された。従って、標的化インテグリンの有効性は、腸炎惹起性CD103+樹状細胞の除去およびリンパ球動員の遮断により説明し得る。本明細書に記載される本発明の抗体は、炎症性腸疾患の治療に使用できる。本明細書に記載される本発明の抗体は、炎症性腸疾患の予防に使用できる。本明細書に記載される本発明の抗原結合フラグメントは、炎症性腸疾患の治療に使用できる。本明細書に記載される本発明の抗原結合フラグメントは、炎症性腸疾患の予防に使用できる。
CD103+リンパ増殖症候群
フローサイトメトリー免疫表現型検査は、B細胞慢性リンパ性白血病(CLL)、マントル細胞リンパ腫(MCL)、および毛様細胞性白血病(HCL)を含むB細胞リンパ増殖症候群(BC-LPD)の診断に重要である。低悪性度のB細胞リンパ増殖性過程の診断評価では、CD103陽性が毛様細胞性白血病(HCL)またはその異形HCLvの診断の指標となる。
フローサイトメトリー免疫表現型検査は、B細胞慢性リンパ性白血病(CLL)、マントル細胞リンパ腫(MCL)、および毛様細胞性白血病(HCL)を含むB細胞リンパ増殖症候群(BC-LPD)の診断に重要である。低悪性度のB細胞リンパ増殖性過程の診断評価では、CD103陽性が毛様細胞性白血病(HCL)またはその異形HCLvの診断の指標となる。
これらのB細胞障害に加えて、CD103陽性はまた、T細胞新生物サブセットにおける特徴でもある。現在のT細胞新生物の世界保健機関分類中のほとんどのエンティティに相当する184症例の一研究では、46%の胃腸リンパ腫、40%の成人T細胞白血病/リンパ腫、および6.9%の他の新生物がCD103陽性を示した。同様に、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍(BPDCN)は、CD103を発現する。
本明細書に記載される本発明の抗体は、リンパ増殖性疾患の治療に使用できる。本明細書に記載される本発明の抗原結合フラグメントは、リンパ増殖性疾患の治療に使用できる。本発明の抗体を用いて治療し得るCD103を発現しているリンパ増殖性疾患としては、限定されないが、毛様細胞性白血病、HCLv、腸および腸外リンパ腫、腸疾患関連T細胞性リンパ腫(EATL)、T-リンパ性白血病/リンパ腫(T-ALL)、T細胞性前リンパ球性白血病(T-PLL)、成人T細胞白血病/リンパ腫(ATLL)、菌状息肉腫(MF)、未分化大細胞リンパ腫(ALCL)、皮膚T細胞性リンパ腫(CTCL)、および芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍が挙げられる。
腫瘍形成におけるCD103
腫瘍関連CD103+CD8 T細胞は、CTLA-4およびIL-10の増大した発現およびIFNγ、TNF-α、およびグランザイムの低減した発現を伴う免疫寛容原性表現型を有することが報告された。さらに、CD103は、CD4+調節細胞のマーカーとして記載されており、免疫寛容原性DC上に存在する。マウスにおけるCD103+CD8 T細胞を低減する抗CD103抗体によるCD103の直接標的化は、B16メラノーマおよびMC38モデルで治療効果をもたらすことが報告されている。本明細書に記載される本発明の抗体は、腫瘍形成の治療に使用できる。本明細書に記載される本発明の抗体は、腫瘍形成の予防に使用できる。本明細書に記載される本発明の抗原結合フラグメントは、腫瘍形成の治療に使用できる。本明細書に記載される本発明の抗原結合フラグメントは、腫瘍形成の予防に使用できる。本明細書に記載される本発明の抗体は、腫瘍形成の進行の軽減に使用できる。
腫瘍関連CD103+CD8 T細胞は、CTLA-4およびIL-10の増大した発現およびIFNγ、TNF-α、およびグランザイムの低減した発現を伴う免疫寛容原性表現型を有することが報告された。さらに、CD103は、CD4+調節細胞のマーカーとして記載されており、免疫寛容原性DC上に存在する。マウスにおけるCD103+CD8 T細胞を低減する抗CD103抗体によるCD103の直接標的化は、B16メラノーマおよびMC38モデルで治療効果をもたらすことが報告されている。本明細書に記載される本発明の抗体は、腫瘍形成の治療に使用できる。本明細書に記載される本発明の抗体は、腫瘍形成の予防に使用できる。本明細書に記載される本発明の抗原結合フラグメントは、腫瘍形成の治療に使用できる。本明細書に記載される本発明の抗原結合フラグメントは、腫瘍形成の予防に使用できる。本明細書に記載される本発明の抗体は、腫瘍形成の進行の軽減に使用できる。
本発明のCD103抗体の治療適用
本発明は、細胞中のCD103シグナル伝達を抑制するための本発明の1種または複数の抗体の使用を提供する。
本発明は、細胞中のCD103シグナル伝達を抑制するための本発明の1種または複数の抗体の使用を提供する。
本発明は、E-カドヘリンおよびE-カドヘリン発現細胞に対するCD103結合を抑制するための本発明の1種または複数の抗体の使用を提供する。
本発明は、CD103媒介状態の治療のための本発明の1種または複数の抗体の使用をさらに提供する。
本発明は、CD103発現細胞を枯渇させるための本発明の1種または複数の抗体の使用を提供する。
本発明は、前述の使用の内の1つのための薬物の製造における本発明の1種または複数の抗体の使用をさらに提供する。
本明細書で記載の本発明の抗体は、種々の疾患の治療に有用であり得、CD103シグナル伝達の調節が治療効果をもたらす。いくつかの態様では、本発明の化合物はCD103シグナル伝達を抑制し、アトピー性皮膚炎、アレルギー、喘息、全身性炎症反応症候群(SIRS)、敗血症、敗血性ショック、アテローム性動脈硬化症、セリアック病、皮膚筋炎、強皮症、間質性膀胱炎、移植拒絶反応、移植片対宿主病、アイカルディ・グティエール症候群、ハッチンソン・ギルフォード早老症候群、シングレトン・マートン症候群、プロテアソーム関連自己炎症症候群、SAVI(乳児発症STING関連血管炎)、CANDLE(脂肪異栄養症および発熱を伴う慢性非典型的好中球性皮膚疾患)症候群、エリテマトーデス、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、ウェゲナー疾患、炎症性腸疾患(例えば、潰瘍性大腸炎、クローン病)、特発性血小板減少性紫斑病特発性血小板減少性紫斑病、血栓性血小板減少性紫斑病、自己免疫性血小板減少症、多発性硬化症、乾癬、IgA腎症、IgM多発性神経障害、糸球体腎炎、自己免疫性心筋炎、重症筋無力症、血管炎、1型糖尿病、2型糖尿病、シェーグレン症候群、全身症状を伴うX連鎖色素性網状疾患、多発性筋炎、脊椎軟骨内異形成症、加齢黄斑変性、アルツハイマー病およびパーキンソン病からなる群より選択される疾患の治療に有用であり得る。いくつかの実施形態では、本発明の化合物は、アイカルディ・グティエール症候群、X連鎖色素性網状疾患、皮膚筋炎、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、多発性硬化症、またはI型またはII型糖尿病の治療に有用である。本明細書に記載される本発明の抗体は、炎症性腸疾患の治療に使用されるのが好ましい。本明細書に記載される本発明の抗体は、乾癬の治療に使用されるのが好ましい。
本発明は、対象の自己免疫疾患を治療する方法を提供し、該方法は、治療有効量の1種または複数の本発明の抗体を、それを必要としている患者に投与することを含む。いくつかの実施形態では、自己免疫疾患は、I型インターフェロン症(例えば、アイカルディ・グティエール症候群、シェーグレン症候群、シングレトン・マートン症候群、プロテアソーム関連自己炎症症候群、SAVI(乳児発症STING関連血管炎)、CANDLE症候群、凍傷狼瘡エリテマトーデス、全身性エリテマトーデス、脊椎軟骨内異形成症)、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫心筋炎、血栓性血小板減少性紫斑病、自己免疫性血小板減少症、乾癬、1型糖尿病または2型糖尿病であり得る。
本発明は、対象の炎症性疾患を治療する方法を提供し、該方法は、治療有効量の1種または複数の本発明の抗体を、それを必要としている患者に投与することを含む。例えば、炎症性疾患は、アトピー性皮膚炎、アレルギー、喘息、全身性炎症反応症候群(SIRS)、敗血症、敗血性ショック、アテローム性動脈硬化症、セリアック病、皮膚筋炎、強皮症、間質性膀胱炎、移植拒絶反応、移植片対宿主病、アイカルディ・グティエール症候群、ハッチンソン・ギルフォード早老症候群、シングレトン・マートン症候群、プロテアソーム関連自己炎症症候群、SAVI(乳児発症STING関連血管炎)、CANDLE(脂肪異栄養症および発熱を伴う慢性非典型的好中球性皮膚疾患)症候群、エリテマトーデス、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、ウェゲナー疾患、炎症性腸疾患(例えば、潰瘍性大腸炎、クローン病)、特発性血小板減少性紫斑病特発性血小板減少性紫斑病、血栓性血小板減少性紫斑病、自己免疫性血小板減少症、多発性硬化症、乾癬、IgA腎症、IgM多発性神経障害、糸球体腎炎、自己免疫性心筋炎、重症筋無力症、血管炎、1型糖尿病、2型糖尿病、シェーグレン症候群、全身症状を伴うX連鎖色素性網状疾患、多発性筋炎、脊椎軟骨内異形成症、加齢黄斑変性、アルツハイマー病およびパーキンソン病からなる群より選択できる。いくつかの実施形態では、本発明の化合物は、アイカルディ・グティエール症候群、X連鎖色素性網状疾患、皮膚筋炎、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、多発性硬化症、またはI型またはII型糖尿病の治療に有用である。
本発明は、対象の神経変性疾患を治療する方法を更に提供し、該方法は、治療有効量の1種または複数の本発明の抗体を、それを必要としている患者に投与することを含む。例えば、神経変性疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、IgM多発性神経障害、または重症筋無力症であり得る。
本発明は、CD103を発現している悪性腫瘍を治療する方法を更に提供する。例えば、悪性腫瘍は、TおよびB細胞リンパ腫、および特に毛様細胞性白血病、HClv、腸および腸外リンパ腫、腸疾患関連T細胞性リンパ腫(EATL)、T-リンパ性白血病/リンパ腫(T-ALL)、T細胞性前リンパ球性白血病(T-PLL)、成人T細胞白血病/リンパ腫(ATLL)、菌状息肉腫(MF)、未分化大細胞リンパ腫(ALCL)、皮膚T細胞性リンパ腫(CTCL)、セザリー症候群(SS)であり得る。
本発明の抗CD103抗体および抗原結合フラグメントの医薬または無菌組成物を調製するために、抗体またはその抗原結合フラグメントを薬学的に許容可能な担体または賦形剤と混合する。例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciencesおよび米国薬局方:国民医薬品集、Mack Publishing Company,Easton,PA(1984)を参照されたい。
治療薬および診断薬の製剤は、例えば、凍結乾燥粉末、スラリー、水溶液または懸濁液の形態の許容可能な担体、賦形剤または安定剤と混合することにより調製され得る(例えば、Hardman,et al.(2001)Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics,McGraw-Hill,New York,NY;Gennaro(2000)Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Lippincott,Williams,and Wilkins,New York,NY;Avis,et al.(eds.)(1993)Pharmaceutical Dosage Forms:Parenteral Medications,Marcel Dekker,NY;Lieberman,et al.(eds.)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets,Marcel Dekker,NY;Lieberman,et al.(eds.)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms:Disperse Systems,Marcel Dekker,NY;Weiner and Kotkoskie(2000)Excipient Toxicity and Safety,Marcel Dekker,Inc.,New York,NYを参照されたい)。
単独でまたは別の治療薬と組み合わせて投与される、本発明の抗体の毒性および治療効力は、細胞培養または実験動物によりLD50(集団の50%致死用量)およびED50(集団の50%に対する治療的有効量)を測定するための標準的医薬手法により決定できる。毒性と治療効果との間の用量比率は、治療指数(LD50/ED50)である。これらの細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータを、ヒトでの使用に対する一定の範囲の投与量の処方に使用できる。このような化合物の投与量は、毒性がほとんどないか、全くない場合のED50を含む一定の範囲の循環濃度範囲内にあるのが好ましい。投与量は、採用される剤形および投与経路に応じて、この範囲内で変わってもよい。
さらなる実施形態では、米医薬品便覧2003(Thomson Healthcare;57th edition(2002年11月1日))に基づいてさらなる治療薬が、本発明の抗CD103抗体またはその抗原結合フラグメントと共に対象に投与される。
投与方法は変わってもよい。投与経路には、経口、直腸、経粘膜、腸、非経口;筋肉内、皮下、皮内、髄内、髄腔内、直接脳室内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、眼内、吸入、吹送、局所、皮膚性、経皮、または動脈内経路が挙げられる。
特定の実施形態では、本発明の抗CD103抗体またはその抗原結合フラグメントは、注入によるなどの侵襲的経路により投与できる。本発明のさらなる実施形態では、抗CD103抗体またはその抗原結合フラグメント、またはその医薬組成物は、静脈内に、皮下に、筋肉内に、動脈内に、腫瘍内に、または吸入、エアロゾル送達で投与される。非侵襲的経路(例えば、経口;例えば、丸薬、カプセルまたはタブレットで)による投与も、本発明の範囲内にある。
本発明は、抗体またはその抗原結合フラグメントまたはその医薬組成物のいずれかを含む容器(例えば、キャップまたはクロマトグラフィーカラム、中空針または注射器のシリンダと共に、プラスチックまたはガラスバイアル)を提供する。本発明はまた、本発明の抗体または抗原結合フラグメントまたはその医薬組成物のいずれかを含む注入装置を提供する。注入装置は、患者の身体中に物質を非経口の経路、例えば、筋肉内、皮下または静脈内を経由して導入する装置である。例えば、注入装置は、例えば、注入される流体(例えば、抗体またはフラグメントまたはその医薬組成物)を保持するシリンダまたはバレル、皮膚および/または流体の注入のために血管に孔を開ける針;およびシリンダから流体を押し出し、針内径に通すためのプランジャを含む注射器(例えば、医薬組成物をプレフィルした)であり得る。本発明のある実施形態では、本発明の抗体または抗原結合フラグメントまたはその医薬組成物を含む注入装置は、静脈内(IV)注入装置である。このような装置は、抗体またはフラグメントまたはその医薬組成物をカニューレまたは外套針/針中に含み、これは、カニューレまたは外套針/針を通して患者の身体に導入される流体(例えば、生理食塩水;またはNaCl、乳酸ナトリウム、KCl、CaCl2を含み、任意選択で、グルコースを含む乳酸リンゲル溶液)を保持するためのバッグまたはリザーバーに取り付け得るチューブに取り付け得る。抗体またはフラグメントまたはその医薬組成物は、本発明のある実施形態では、装置中に導入され、外套針およびカニューレが対象の静脈中に挿入されると、外套針は挿入されたカニューレから取り外される。例えば、IV装置は、末梢静脈(手または腕の);上大静脈または下大静脈、または心臓の右心房(例えば、中心静脈)内に;または鎖骨下、内頚、または大腿静脈に、および例えば、上大静脈または右心房に達するまで心臓に方向に進み(例えば、中心静脈ライン)、挿入され得る。本発明のある実施形態では、注入装置は、自動注入装置;噴射式注射器または外部注入ポンプである。噴射式注射器は、抗体またはフラグメントまたはその医薬組成物を患者の身体に導入するために表皮に侵入する高圧の細い液体噴射口を使用する。外部注入ポンプは、抗体またはフラグメントまたはその医薬組成物を制御された量で患者の身体中に送達する医療装置である。外部注入ポンプは、電気でまたは機械的に動力を供給され得る。種々のポンプが様々な方法で機能する。例えば、シリンジポンプは、注射器のリザーバー中に流体を保持し、移動可能なピストンが流体送達を制御する、またはエラストマーポンプは、伸縮性バルーンリザーバー中に流体を保持し、バルーンの弾性壁からの圧力が流体送達を推進する。蠕動ポンプでは、一連のローラーがフレキシブルチューブを挟み込み、液体を前方に押し出す。多重チャネルポンプでは、流体を、複数の速度で複数のリザーバーから送達できる。
本明細書で開示の医薬組成物はまた、米国特許第6,620,135号;同6,096,002号;同5,399,163号;同5,383,851号;同5,312,335号;同5,064,413号;同4,941,880号;同4,790,824号または同4,596,556号で記載の装置などの無針皮下組織注入装置で投与し得る。医薬組成物を含むこのような無針装置も本発明の一部である。本明細書で開示の医薬組成物も注入により投与され得る。医薬組成物を投与するためのよく知られたインプラントおよびモジュールの例としては、制御された速度で薬物を分注するための埋め込み型マイクロ注入ポンプを開示する米国特許第4,487,603号、正確な注入速度で薬物を送達するための薬物注入ポンプを開示する米国特許第4,447,233号、連続的な薬物送達のための可変流埋め込み型注入装置を開示する米国特許第4,447,224号、複数チャンバーコンパートメントを備える浸透圧薬物送達システムを開示する米国特許第4,439,196号で開示のものが挙げられる。多くの他のこのようなインプラント、送達系、およびモジュールが当業者に周知であり、本発明の医薬組成物を含むこれらは、本発明の範囲内にある。
あるいは、例えば、抗体またはフラグメントの腫瘍中への直接的注入により、全身的ではなく局所的に本発明の抗CD103抗体または抗原結合フラグメントを投与し得る。さらに、標的化薬物送達システムで、例えば、組織特異的抗体でコーティングしたリポソームに入れて、例えば、腫瘍を標的として、抗体またはフラグメントを投与し得る。リポソームは、罹患組織を標的にする、およびそれにより選択的に取り込まれる。このような方法およびリポソームは、本発明の一部である。
投与計画は、治療抗体または抗原結合フラグメントの血清または組織代謝回転率、症状のレベル、治療抗体の免疫原性、および生物学的マトリックス中の標的細胞のアクセスし易さ、を含むいくつかの因子に依存する。投与計画は、標的病状の改善をもたらすのに十分な治療抗体またはフラグメントを送達すると同時に、望ましくない副作用を最少化するのが好ましい。従って、送達される生物製剤の量は、一部は、特定の治療抗体および治療される状態の重症度に依存する。治療抗体またはフラグメントの適切な投与量のガイダンスを利用可能である(例えば、Wawrzynczak(1996)Antibody Therapy,Bios Scientific Pub.Ltd,Oxfordshire,UK;Kresina(ed.)(1991)Monoclonal Antibodies,Cytokines and Arthritis,Marcel Dekker,New York,NY;Bach(ed.)(1993)Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases,Marcel Dekker,New York,NY;Baert,et al.(2003)New Engl.J.Med.348:601-608;Milgrom et al.(1999)New Engl.J.Med.341:1966-1973;Slamon et al.(2001)New Engl.J.Med.344:783-792;Beniaminovitz et al.(2000)New Engl.J.Med.342:613-619;Ghosh et al.(2003)New Engl.J.Med.348:24-32;Lipsky et al.(2000)New Engl.J.Med.343:1594-1602を参照されたい)。
適切な投与量の決定は、臨床医により、例えば、既知の、または当該技術分野で治療に影響すると考えられているパラメーターまたは因子を用いて、実施される。一般に、投与量は、最適投与量より幾分少ない量で開始し、その後、何らかのマイナスの副作用と比較して、所望または最適効果が達成されるまで小さい増分で増やされる。重要な診断尺度には、例えば、炎症症状の尺度、または産生された炎症性サイトカインのレベルの尺度が含まれる。一般に、使用される生物製剤は、治療標的化動物と同じ種由来であり、それにより、試薬に対するどのような免疫応答も最小化することが望ましい例えば、ヒト対象の場合では、ヒト化および完全にヒト抗体が望ましい場合がある。
本明細書で開示の抗体またはその抗原結合フラグメントは、 持続注入により投与され得る、または投与される用量で、例えば、毎日、週当たり1~7回、毎週、隔週、月1回、3ヶ月毎、半年毎、毎年に投与され得る。投与量は、例えば、静脈内に、皮下に、局所に、経口で、経鼻的に、直腸内に、筋肉内に、大脳内に、脊髄内に、または吸入により投与され得る。総毎週投与量は通常、少なくとも0.05μg/kg体重、より一般的には少なくとも0.2μg/kg、0.5μg/kg、1μg/kg、10μg/kg、100μg/kg、0.25mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg、5.0mg/kg、10mg/kg、25mg/kg、50mg/kgまたはそれ超である(例えば、Yang,et al.(2003)New Engl.J.Med.349:427-434;Herold,et al.(2002)New Engl.J.Med.346:1692-1698;Liu,et al.(1999)J.Neurol.Neurosurg.Psych.67:451-456;Portielji,et al.(20003)Cancer Immunol.Immunother.52:151-144を参照されたい)。投与量はまた、抗CD103抗体の対象の血清中の所定標的濃度、例えば、0.1、0.3、1、3、10、30、100、300 μg/mLまたはそれ超を達成するように投与され得る。他の実施形態では、本発明の抗CD103抗体は、例えば、皮下にまたは静脈内に、毎週、2週に1回、「4週毎」、毎月、各月、または3か月に1回基準で、10、20、50、80、100、200、500、1000または2500mg/対象を投与される。
本明細書で使用される場合、「有効量」という用語は、単独でまたは追加の治療薬と組み合わせて、細胞、組織、または対象に投与される場合に、1種または複数の疾患の症状、例えば、癌または癌の進行の測定可能な改善をもたらすのに効果的な本発明の抗CD103またはその抗原結合フラグメントの量を意味する。有効量は、抗体またはフラグメントの少なくとも部分的に症状の改善、例えば、腫瘍縮小または除去、腫瘍増殖のないこと、延長された生存時間を生ずるのに十分な量をさらに意味する。単独で投与される個別の有効成分に適用する場合、有効量はその成分単独を意味する。組み合わせて適用される場合、有効量は、順次または同時に投与されたかにかかわらず、治療効果を生ずる有効成分の合わせた量を意味する。治療薬の有効量は、少なくとも10%;通常少なくとも20%;好ましくは少なくとも30%;より好ましくは少なくとも40%、および最も好ましくは少なくとも50%の診断尺度またはパラメーターの改善を生じる。主観的な尺度が疾患重症度を評価するために使用される場合、有効量はまた、主観的な尺度での改善を生じ得る。
キット
更に提供されるのは、本明細書で考察した薬学的に許容可能な担体および/または治療薬を含む1種または複数の追加の成分と組み合わせて、限定されないが、本明細書で考察した抗CD103抗体または抗原結合フラグメントを含む1種または複数の成分を含むキットである。抗体またはフラグメントおよび/または治療薬は、純粋な組成物として、または医薬組成物中で、薬学的に許容可能な担体と組み合わせて処方できる。
更に提供されるのは、本明細書で考察した薬学的に許容可能な担体および/または治療薬を含む1種または複数の追加の成分と組み合わせて、限定されないが、本明細書で考察した抗CD103抗体または抗原結合フラグメントを含む1種または複数の成分を含むキットである。抗体またはフラグメントおよび/または治療薬は、純粋な組成物として、または医薬組成物中で、薬学的に許容可能な担体と組み合わせて処方できる。
一実施形態では、キットは、本発明の抗CD103抗体またはその抗原結合フラグメントまたはその医薬組成物を1つの容器(例えば、無菌ガラスまたはプラスチックバイアル中)および/または治療薬およびその医薬組成物を別の容器(例えば、無菌ガラスまたはプラスチックバイアル中)に含む。
別の実施形態では、キットは、本発明の抗CD103抗体またはその抗原結合フラグメントを、薬学的に許容可能な担体、任意選択の一緒に処方される1種または複数の治療薬と組み合わせて、任意選択で、単一の共通の容器中に医薬組成物として含む、本発明の組み合わせを含む。
キットが対象への非経口的投与のための医薬組成物を含む場合、キットは、このような投与を実施するための装置を含めることができる。例えば、キットは、上記で考察の1種または複数の皮下注射針または他の注入装置を含めることができる。
キットは、医薬組成物および剤形に関する情報を含む添付文書をキット中に含めることができる。一般に、このような情報は、同封の医薬組成物および剤形を効果的におよび安全に使用する際に、患者および医師を支援する。例えば、本発明の組み合わせに関する次の情報は、添付文書で提供され得る:薬物動態学、薬力学、臨床試験、有効性パラメーター、効能・効果、禁忌、警告、予防策、有害反応、過量投与、適切な用量および投与、剤形、適切な保管条件、参考文献、製造業者/流通業者情報および特許情報。
検出キット
更に提供されるのは、診断または検出薬および、例えば、ELISA(サンドイッチタイプまたは競合フォーマット)などのイムノアッセイを含む、種々の検出アッセイで使用するための1種または複数のこのような試薬を含むキットである。キットの成分は、固体支持体に予め取り付けられていてもよく、またはキットが使用されるときに固体支持体の表面に適用されてもよい。本発明のいくつかの実施形態では、シグナル生成手段は、本発明の抗体またはフラグメントに予め結合されていてもよく、または1つまたは複数の成分、例えば、緩衝液、抗体-酵素コンジュゲート、酵素基質などと、使用前に結合させる必要があり得る。キットはまた、追加の試薬、例えば、固相表面への非特異的結合を減らすためのブロッキング試薬、洗浄試薬、酵素基質なども含み得る。固相表面は、チューブ、ビード、マイクロタイタープレート、マイクロスフェア、またはタンパク質、ペプチドまたはポリペプチドを固定化するために好適する他の物質の形態であり得る。特定の態様では、化学発光または発色生成物の形成または化学発光または発色基質の還元を触媒する酵素は、シグナル生成手段の成分である。このような酵素は当該技術分野で公知である。キットは、本明細書で記載のいずれかの捕捉剤および検出薬を含み得る。任意選択で、キットはまた、本発明の方法を実施するための説明書も含み得る。
更に提供されるのは、診断または検出薬および、例えば、ELISA(サンドイッチタイプまたは競合フォーマット)などのイムノアッセイを含む、種々の検出アッセイで使用するための1種または複数のこのような試薬を含むキットである。キットの成分は、固体支持体に予め取り付けられていてもよく、またはキットが使用されるときに固体支持体の表面に適用されてもよい。本発明のいくつかの実施形態では、シグナル生成手段は、本発明の抗体またはフラグメントに予め結合されていてもよく、または1つまたは複数の成分、例えば、緩衝液、抗体-酵素コンジュゲート、酵素基質などと、使用前に結合させる必要があり得る。キットはまた、追加の試薬、例えば、固相表面への非特異的結合を減らすためのブロッキング試薬、洗浄試薬、酵素基質なども含み得る。固相表面は、チューブ、ビード、マイクロタイタープレート、マイクロスフェア、またはタンパク質、ペプチドまたはポリペプチドを固定化するために好適する他の物質の形態であり得る。特定の態様では、化学発光または発色生成物の形成または化学発光または発色基質の還元を触媒する酵素は、シグナル生成手段の成分である。このような酵素は当該技術分野で公知である。キットは、本明細書で記載のいずれかの捕捉剤および検出薬を含み得る。任意選択で、キットはまた、本発明の方法を実施するための説明書も含み得る。
本明細書で開示の抗体、ペプチド、抗原結合フラグメント、またはポリヌクレオチドおよび検出薬として組成物を使用するための説明書の少なくとも1つを含む、本明細書で開示の検出キットも作製され得る。このようなキットで使用するための容器は通常、少なくとも1つのバイアル、試験チューブ、フラスコ、ボトル、注射器または、1種または複数の検出組成物を入れ、好ましくは適宜分注され得る他の好適な容器を含み得る。本明細書で開示のキットはまた、通常、商用販売のために密に詰め込まれた状態のバイアルを包含するための手段、例えば、所望バイアルをその中に保持する射出またはブロー成形プラスチック容器を含む。放射標識、発色、蛍光発生、または他のタイプの検出可能標識または検出手段をキット中に含める場合、標識剤は、検出または治療用組成物それ自体と同じ容器中に提供され得るか、あるいは、この第2の組成物が置かれ、好適に分注され得る第2の別の容器手段中に配置され得る。あるいは、検出薬および標識は、1個の容器手段として作製され得、ほとんどの場合には、キットはまた、通常、商用販売および/または簡便梱包および配送のために密に詰め込まれた状態のバイアルを包含するための手段を含む。
一般法
分子生物学における標準的な方法は、Sambrook,Fritsch and Maniatis(1982 & 1989 2nd Edition,2001 3rd Edition)Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY;Sambrook and Russell(2001)Molecular Cloning,3rd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY;Wu(1993)Recombinant DNA,Vol.217,Academic Press,San Diego,CAに記載されている。標準的な方法はまた、Ausbel,et al.(2001)Current Protocols in Molecular Biology,Vols.1-4,John Wiley and Sons,Inc.New York,NYにも認められ、これは、細菌細胞中のクローニングおよびDNA変異誘発(Vol.1)、哺乳動物細胞および酵母中のクローニング(Vol.2)、複合多糖およびタンパク質発現(Vol.3)、ならびに生物情報学(Vol.4)について記載している。
分子生物学における標準的な方法は、Sambrook,Fritsch and Maniatis(1982 & 1989 2nd Edition,2001 3rd Edition)Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY;Sambrook and Russell(2001)Molecular Cloning,3rd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY;Wu(1993)Recombinant DNA,Vol.217,Academic Press,San Diego,CAに記載されている。標準的な方法はまた、Ausbel,et al.(2001)Current Protocols in Molecular Biology,Vols.1-4,John Wiley and Sons,Inc.New York,NYにも認められ、これは、細菌細胞中のクローニングおよびDNA変異誘発(Vol.1)、哺乳動物細胞および酵母中のクローニング(Vol.2)、複合多糖およびタンパク質発現(Vol.3)、ならびに生物情報学(Vol.4)について記載している。
免疫沈降、クロマトグラフィー、電気泳動、遠心分離、および結晶化を含むタンパク質精製方法が記載されている(Coligan,et al.(2000)Current Protocols in Protein Science,Vol.1,John Wiley and Sons,Inc.,New York)。化学的分析、化学修飾、翻訳後修飾、融合タンパク質の産生、タンパク質のグリコシル化が記載されている(例えば、Coligan,et al.(2000)Current Protocols in Protein Science,Vol.2,John Wiley and Sons,Inc.,New York;Ausubel,et al.(2001)Current Protocols in Molecular Biology,Vol.3,John Wiley and Sons,Inc.,NY,NY,pp.16.0.5-16.22.17;Sigma-Aldrich,Co.(2001)Products for Life Science Research,St.Louis,MO;pp.45-89;Amersham Pharmacia Biotech(2001)BioDirectory,Piscataway,N.J.,pp.384-391を参照されたい)。 ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の産生、精製、およびフラグメント化が記載されている(Coligan,et al.(2001)Current Protcols in Immunology,Vol.1,John Wiley and Sons,Inc.,New York;Harlow and Lane(1999)Using Antibodies,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY;Harlow and Lane、前出)。リガンド/受容体相互作用を特徴付けるための標準的な技術を利用可能である(例えば、Coligan,et al.(2001)Current Protocols in Immunology,Vol.4,John Wiley,Inc.,New Yorkを参照されたい)。
モノクローナル、ポリクローナル、およびヒト化抗体を調製できる(例えば、Sheperd and Dean(eds.)(2000)Monoclonal Antibodies,Oxford Univ.Press,New York,NY;Kontermann and Dubel(eds.)(2001)Antibody Engineering,Springer-Verlag,New York;Harlow and Lane(1988)Antibodies A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,pp.139-243;Carpenter,et al.(2000)J.Immunol.165:6205;He,et al.(1998)J.Immunol.160:1029;Tang et al.(1999)J.Biol.Chem.274:27371-27378;Baca et al.(1997)J.Biol.Chem.272:10678-10684;Chothia et al.(1989)Nature 342:877-883;Foote and Winter(1992)J.Mol.Biol.224:487-499;米国特許第6,329,511号を参照されたい)。
ヒト化に変わるものは、ファージ上に提示されたヒト抗体ライブラリーまたは遺伝子導入マウスのヒト抗体ライブラリーを使用することである(Vaughan et al.(1996)Nature Biotechnol.14:309-314;Barbas(1995)Nature Medicine 1:837-839;Mendez et al.(1997)Nature Genetics 15:146-156;Hoogenboom and Chames(2000)Immunol.Today 21:371-377;Barbas et al.(2001)Phage Display:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York;Kay et al.(1996)Phage Display of Peptides and Proteins:A Laboratory Manual,Academic Press,San Diego,CA;de Bruin et al.(1999)Nature Biotechnol.17:397-399)。
単鎖抗体およびディアボディが記載されている(例えば、Malecki et al.(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99:213-218;Conrath et al.(2001)J.Biol.Chem.276:7346-7350;Desmyter et al.(2001)J.Biol.Chem.276:26285-26290;Hudson and Kortt(1999)J.Immunol.Methods 231:177-189;および米国特許第4,946,778号を参照されたい)。二官能性抗体が提供される(例えば、Mack,et al.(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:7021-7025;Carter(2001)J.Immunol.Methods 248:7-15;Volkel,et al.(2001)Protein Engineering 14:815-823;Segal,et al.(2001)J.Immunol.Methods 248:1-6;Brennan,et al.(1985)Science 229:81-83;Raso,et al.(1997)J.Biol.Chem.272:27623;Morrison(1985)Science 229:1202-1207;Traunecker,et al.(1991)EMBO J.10:3655-3659;ならびに米国特許第5,932,448号、同5,532,210号、および同6,129,914号を参照されたい)。
二重特異的抗体もまた、提供される(例えば、Azzoni et al.(1998)J.Immunol.161:3493;Kita et al.(1999)J.Immunol.162:6901;Merchant et al.(2000)J.Biol.Chem.74:9115;Pandey et al.(2000)J.Biol.Chem.275:38633;Zheng et al.(2001)J.Biol Chem.276:12999;Propst et al.(2000)J.Immunol.165:2214;Long(1999)Ann.Rev.Immunol.17:875を参照されたい)。
抗原の精製は、抗体の生成に必須ではない。動物は、目的の抗原を有する細胞で免疫化できる。その後、脾細胞が免疫化動物から単離でき、脾細胞は骨髄腫細胞株と融合されて、ハイブリドーマを産生できる(例えば、Meyaard et al.(1997)Immunity 7:283-290;Wright et al.(2000)Immunity 13:233-242;Preston et al.,supra;Kaithamana et al.(1999)J.Immunol.163:5157-5164を参照されたい)。
抗体は、低分子薬物分子、酵素、リポソーム、ポリエチレングリコール(PEG)にコンジュゲートできる。抗体は、治療、診断、キットまたは他の目的に有用であり、例えば、色素、放射性同位元素、酵素、または金属、例えば、コロイド状金に結合した抗体を含む(例えば、Le Doussal et al.(1991)J.Immunol.146:169-175;Gibellini et al.(1998)J.Immunol.160:3891-3898;Hsing and Bishop(1999)J.Immunol.162:2804-2811;Everts et al.(2002)J.Immunol.168:883-889を参照されたい)。
蛍光活性化細胞分取(FACS)を含むフローサイトメトリー法を利用できる(例えば、Owens,et al.(1994)Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory Practice,John Wiley and Sons,Hoboken,NJ;Givan(2001)Flow Cytometry,2nd ed.;Wiley-Liss,Hoboken,NJ;Shapiro(2003)Practical Flow Cytometry,John Wiley and Sons,Hoboken,NJを参照されたい)。核酸プライマーおよびプローブ、ポリペプチドを含む、核酸の修飾に好適する蛍光試薬、および、例えば、診断薬として使用するための抗体を利用可能である(Molecular Probes(2003)Catalogue,Molecular Probes,Inc.,Eugene,OR;Sigma-Aldrich(2003)Catalogue,St.Louis,MO)。
免疫系の組織学の標準的方法が記載されている(例えば、Muller-Harmelink(ed.)(1986)Human Thymus:Histopathology and Pathology,Springer Verlag,New York,NY;Hiatt,et al.(2000)Color Atlas of Histology,Lippincott,Williams,and Wilkins,Phila,PA;Louis,et al.(2002)Basic Histology:Text and Atlas,McGraw-Hill,New York,NYを参照されたい)。
例えば、抗原フラグメント、リーダー配列、タンパク質フォールディング、機能的ドメイン、グリコシル化部位、および配列アラインメントの決定のためのソフトウェアパッケージおよびデータベースを利用可能である(例えば、GenBank,Vector NTI(登録商標)Suite(Informax,Inc,Bethesda,MD);GCG Wisconsin Package(Accelrys,Inc.,San Diego,CA);DeCypher(登録商標)(TimeLogic Corp.,Crystal Bay,Nevada);Menne,et al.(2000)Bioinformatics 16:741-742;Menne,et al.(2000)Bioinformatics Applications Note 16:741-742;Wren,et al.(2002)Comput.Methods Programs Biomed.68:177-181;von Heijne(1983)Eur.J.Biochem.133:17-21;von Heijne(1986)Nucleic Acids Res.14:4683-4690を参照されたい)。
実施例2:原材料および細胞株
チャイニーズハムスター卵巣(CHO)-K1細胞およびヒト腺癌細胞株MCF7をアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関(ATCC)から入手した。細胞は、微生物の混入およびマイコプラズマのスクリーニングが実施され、陰性であることが証明されるまで隔離された。CHO-K1細胞をDMEM/F12(Gibco)、1%PenStrep(Gibco)、5%のNCBS(Biowest)中で増殖させ、5%CO2の加湿雰囲気中、37℃でインキュベートした。MCF7細胞をEMEM(ATCC)、1%のPenStrep(Gibco)、10%のFBS(Gibco)中で増殖させ、5%CO2の加湿雰囲気中、37℃でインキュベートした。CHO-K1細胞をヒトインテグリンAlphaE(ユニプロットP38570)およびヒトインテグリンBeta7(ユニプロットP26010)の完全長オープンリーディングフレームをそれぞれコードするpCI-neoおよびpcDNA3.1(+)-hygroベクターで遺伝子導入することにより、CHO-K1.hCD103/hBeta7細胞株を生成した。安定なクローンを、ジェネテシン(50ug/mL、Gibco)およびヒグロマイシンB(50ug/mL、Invitrogen)を補充したCHO培地中で限界希釈法により得た。CHO-K1.hAlpha4/hBeta7発現細胞を、ヒトインテグリンAlpha4(ユニプロットP13612)およびヒトインテグリンBeta7の完全長オープンリーディングフレームをそれぞれコードするpCI-neoおよびpcDNA3.1(+)-hygroベクターでのCHO-K1細胞の一過性遺伝子導入により生成した。CHO-K1.rhCD103/rhBeta7発現細胞を、アカゲザルインテグリンAlphaE(ユニプロットH9Z8N2)およびアカゲザルインテグリンBeta7(NCBI XP_015007317.1)の完全長オープンリーディングフレームをそれぞれコードするpCI-neoおよびpcDNA3.1(+)-hygroベクターでのCHO-K1細胞の一過性遺伝子導入により生成した。
チャイニーズハムスター卵巣(CHO)-K1細胞およびヒト腺癌細胞株MCF7をアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関(ATCC)から入手した。細胞は、微生物の混入およびマイコプラズマのスクリーニングが実施され、陰性であることが証明されるまで隔離された。CHO-K1細胞をDMEM/F12(Gibco)、1%PenStrep(Gibco)、5%のNCBS(Biowest)中で増殖させ、5%CO2の加湿雰囲気中、37℃でインキュベートした。MCF7細胞をEMEM(ATCC)、1%のPenStrep(Gibco)、10%のFBS(Gibco)中で増殖させ、5%CO2の加湿雰囲気中、37℃でインキュベートした。CHO-K1細胞をヒトインテグリンAlphaE(ユニプロットP38570)およびヒトインテグリンBeta7(ユニプロットP26010)の完全長オープンリーディングフレームをそれぞれコードするpCI-neoおよびpcDNA3.1(+)-hygroベクターで遺伝子導入することにより、CHO-K1.hCD103/hBeta7細胞株を生成した。安定なクローンを、ジェネテシン(50ug/mL、Gibco)およびヒグロマイシンB(50ug/mL、Invitrogen)を補充したCHO培地中で限界希釈法により得た。CHO-K1.hAlpha4/hBeta7発現細胞を、ヒトインテグリンAlpha4(ユニプロットP13612)およびヒトインテグリンBeta7の完全長オープンリーディングフレームをそれぞれコードするpCI-neoおよびpcDNA3.1(+)-hygroベクターでのCHO-K1細胞の一過性遺伝子導入により生成した。CHO-K1.rhCD103/rhBeta7発現細胞を、アカゲザルインテグリンAlphaE(ユニプロットH9Z8N2)およびアカゲザルインテグリンBeta7(NCBI XP_015007317.1)の完全長オープンリーディングフレームをそれぞれコードするpCI-neoおよびpcDNA3.1(+)-hygroベクターでのCHO-K1細胞の一過性遺伝子導入により生成した。
ヒト非小細胞肺癌細胞株A549をアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関(ATCC)から入手した。細胞は、微生物の混入およびマイコプラズマのスクリーニングが実施され、陰性であることが証明されるまで隔離された。細胞をDMEM/F12、GlutaMAX(商標)サプリメント+CHO-K1用の5%のFCS+25mMのHEPESおよびA549用のRPMI+10%FCS中で増殖させ、5%CO2の加湿雰囲気中、37℃でインキュベートした。A549細胞株に、ガイドRNA、完全機能性CAS9カセットおよびGFP(プラスミドpSpCas9(BB)-2A-GFP(PX458)(Ran et al.Nature Protocols 8:2281-2308(2013))(Addgene plasmid # 48138;n2t.net/addgene:48138;RRID:Addgene_48138))をコードするプラスミドを用いて、非リポソーム型遺伝子導入(Fugene)によりCDH1(E-カドヘリン)のノックアウトを実施した。GFP陽性単細胞クローンを、Moflo Astrios sorter(Beckman Coulter)を用いて単離した。サンガー塩基配列決定法でインデルの追跡により破壊を確認した。
CD103陽性T細胞を以下のように生成した。ヒト末梢血単核球(PBMC)を、Ficoll-Paque密度勾配遠心分離(Ficoll-Paque PLUS,GE Healthcare Life Sciences,Marlborough,MA,USA)のバフィーコートを介して健全なボランティアからインフォームドコンセント(Sanquin)後に単離した。次に、MagniSort(商標)ヒトCD8 T細胞濃縮キットを用い、標準プロトコル(Thermo Fisher Scientific)に従って、CD8陽性T細胞を陰性選択した。続けて、細胞を10μg/mLのPHA、6000U/mLのIL-2および10ng/mLの組換えTGFβで刺激し、10%のFCSおよびペニシリン/ストレプトマイシン(100U/mL)で補充したRPMI中で培養した。80%超のCD103陽性CD8細胞を得るために、細胞を少なくとも10日間培養した。
新鮮な腫瘍物質の細胞減少性手術を受けている卵巣癌患者から得た。メスを用いて、約1mm3の腫瘍片を切り出し、酵素消化(1mg/mlのコラゲナーゼIV型(Life Technologies)、31U/mlのrhDNase(Pulmozyme,Genentech,California,USA)および10%のFCSを補充したRPMI)に37℃で30分間または室温で一晩、供した。続けて、残りの腫瘍片を含む消化培地を70μmセルストレーナー(Corning,Amsterdam,The Netherlands)で濾過した。フローサイトメトリー分析のために、細胞をペレット化し、洗浄し、以降で使用するまで凍結保存した。
免疫コンピテントBalb/cおよびC57/BL6マウス由来の脾臓、およびBalb/cマウス由来の胸腺を採取し、続けて、70μmのストレーナー上でプランジャを用いてミンチにした。赤血球リシスバッファー(BioLegend)を用いて赤血球を除去した。細胞をペレット化し、洗浄し、以降で使用するまで凍結保存した。
実施例3:モノクローナル抗体生成
ヒトCD103抗体を生成するために、マウスをヒトCD103(インテグリンalpha-E)およびヒトインテグリンbeta-7の完全長オープンリーディングフレームをコードするcDNAプラスミド構築物で免疫化した。pCI-neoおよびpcDNA3.1(+)をカスタムベースで合成し、GeneArt/ThermoFisher(Regensburg,Germany)から得た。マウスをHelios遺伝子銃(BioRad、Hercules,CA,USA)およびDNAコート金弾丸(BioRad)を用いて、製造業者の説明書に従ってEnvigo(Horst,The Netherlands)で遺伝子銃免疫化により免疫した。手短に説明すると、1μmの金粒子をpCI-neo-hCD103およびpcDNA3.1(+)-hBeta7 cDNAならびにマウスFlt3LおよびマウスGM-CSF(両方ともAldevronから)のための市販の発現ベクターを、1:1:1:1比率でコートした。合計50μgのプラスミドDNAを用いて、25mgの金粒子をコートした。具体的には、7~8週齢の雌BALB/cマウス(Harlan)の耳中に遺伝子銃を、両耳に3回の投与サイクルで受けて、免疫した。
ヒトCD103抗体を生成するために、マウスをヒトCD103(インテグリンalpha-E)およびヒトインテグリンbeta-7の完全長オープンリーディングフレームをコードするcDNAプラスミド構築物で免疫化した。pCI-neoおよびpcDNA3.1(+)をカスタムベースで合成し、GeneArt/ThermoFisher(Regensburg,Germany)から得た。マウスをHelios遺伝子銃(BioRad、Hercules,CA,USA)およびDNAコート金弾丸(BioRad)を用いて、製造業者の説明書に従ってEnvigo(Horst,The Netherlands)で遺伝子銃免疫化により免疫した。手短に説明すると、1μmの金粒子をpCI-neo-hCD103およびpcDNA3.1(+)-hBeta7 cDNAならびにマウスFlt3LおよびマウスGM-CSF(両方ともAldevronから)のための市販の発現ベクターを、1:1:1:1比率でコートした。合計50μgのプラスミドDNAを用いて、25mgの金粒子をコートした。具体的には、7~8週齢の雌BALB/cマウス(Harlan)の耳中に遺伝子銃を、両耳に3回の投与サイクルで受けて、免疫した。
CHO-K1.hCD103/hBeta7安定細胞株を用いて、抗体力価を細胞ELISA(「CELISA」)により評価した。細胞を96ウェル平底組織培養プレートに8x104細胞/ウェルで播種し、5%CO2および95%湿度下、37℃で、細胞層が集密的になるまで培養した。細胞を各試料の希釈したマウス血清と共に、5%CO2および95%湿度下、37℃で1時間インキュベートした。次に、細胞をリン酸緩衝食塩水(PBS)/0.05%ツイーン-20(PBS-T)で洗浄し、ヤギ抗マウスIgG抗マウスIgG-HRPコンジュゲート(Southern Biotech)と共に、5%CO2および95%湿度下、37℃で1時間インキュベートした。続けて、細胞をPBS-Tで3回洗浄し、抗hCD103/hBeta7免疫反応性をTMB安定化色素原(Invitrogen)で可視化した。反応を0.5MのH2SO4で停止し、吸光度を450および610nmで読み取った。抗hCD103/hBeta7力価は、2種のDNA免疫化後に検出して、各個別マウス血清試料で1:2500より高かった。全てのマウスを最後の3回目の免疫化を行い、4日後に屠殺した。赤血球枯渇脾臓およびリンパ節細胞集団を報告されたプロトコルに従って調製した。
抗hCD103抗体産生B細胞を選択するために、hCD103に特異的に結合し、好ましくはサルCD103と交差反応性を有する抗体発現B細胞に選択的に結合する選択戦略を設計し、開発した。カニクイザルCD103配列は既知ではないので、交差反応性試験を、アカゲザルCD103を用いて実施した。hCD103/hBeta7免疫化マウス由来の脾細胞およびリンパ球を、T25培養フラスコ中で播種され、30グレイで照射された、hCD103陰性MCF-7とインキュベートした。1時間後、フラスコを前後に動かすことにより、非結合細胞を静かに取り除いた。次に、非結合細胞含有培地を、照射したCHO-K1.hAlpha4/hBeta7細胞(一過性遺伝子導入)を含む新しいT25フラスコに移した。hBeta7反応性B細胞を陰性選択するために、この手順を氷上でもう1回繰り返した。次に、非結合B細胞を含む培地を、30Gyで照射したCHO-K1.hCD103/hBeta7細胞と共にインキュベートした。氷上で1.5時間のインキュベーション後に、培地を用いた複数の洗浄ステップにより非結合細胞を除去した。続けて、結合リンパ球を有するCHO-K1.hCD103/hBeta7細胞を含むT25フラスコをトリプシン-EDTA(Sigma)で回収した。選択B細胞を10%(v/v)T細胞上清および50,000個の照射した(25Gy)EL-4 B5フィーダー細胞と、96ウェル平底組織培養プレート中の200μlの培地の最終体積中で、混合した。4日目に、細胞培地をリフレッシュした。8日目に上清を細胞ELISAにより、下記のようにhCD103/hBeta7反応性に関しスクリーニングした。CHO-K1.hCD103/hBeta7、CHO.K1.rhCD103/rhBeta7(一過性遺伝子導入)およびCHO-K1.hAlpha4/hBeta7(一過性遺伝子導入)を96ウェル平底組織培養プレート中の培地(10%ウシ胎仔血清(Hyclone)および80U Pen/Strep(Gibco)で補充したDMEM-F12(Gibco))に播種し、5%CO2および95%湿度下、37℃で、それらが集密的になるまで培養した。続けて、培地を除去し、細胞をB細胞培養物由来の上清と共に、5%CO2および95%湿度下、37℃で1時間インキュベートした。次に、細胞をPBS-Tで洗浄し、ヤギ抗マウスIgG抗マウスIgG-HRPコンジュゲート(Southern Biotech)と共に、5%CO2および95%湿度下、37℃で1時間インキュベートした。続けて、細胞をPBS-Tで3回洗浄し、抗hCD103/hBeta7免疫反応性および抗hAlpha4/hBeta7をTMB安定化色素原(Invitrogen)で可視化した。反応を0.5MのH2SO4で停止し、吸光度を450および610nmで読み取った。
hAlpha4/hBeta7に対し反応性ではないか、または最小限の反応性であった、hCD103/hBeta7反応性上清由来のB細胞クローンを、報告された手順(Steenbakkers et al.(1992)Mol.Biol.Rep.19:125)をわずかに変更して、ミニ電気融合により不死化した。手短に説明すると、B細胞を106個のSp2/0-Ag14マウス骨髄腫細胞(ATCC CRL-1581)をElectrofusion Isomolar Buffer(Eppendorf)中で混合した。15s、1MHz、23Vrms ACの交番電界とそれに続く、10as、180ボルトDCの強電界DC方形波および再度の15s、1MHz、23Vrms AC交流電界により電気融合を50μLの融合体チャンバー中で実施したチャンバーの内容物をハイブリドーマ選択培地に移し、限界希釈法条件下で96ウェルプレートに播種した。電気融合の8日後に、ハイブリドーマ上清を細胞ELISAにより、上記のようにhCD103/hBeta7、rhCD103/rhBeta7、およびhAlpha4/hBeta7結合活性に関しスクリーニングした。上清中に抗体を分泌した、CD103に特異的に結合したハイブリドーマを-180℃で凍結し(-1バッチ)、限界希釈によりサブクローニングし、それらの健全性および安定性を保護した。安定ハイブリドーマを、細胞層が集密的になるまで-180℃で凍結した(-LD1バッチ)。
選択した安定なハイブリドーマを無血清培地中で7日間培養し、上清を回収し、抗体をMabSelect SureプロテインA樹脂を用いて、製造業者の説明書(GE Healthcare)に従って精製した。抗体濃度を、分光測光法を用いて定量化した。抗体の単量体性(monomericity)をSEC-HPLCにより評価した。ハイブリドーマ培養物の上清を用いて、ハイブリドーマのアイソタイピングを行った。手短に言えば、それぞれのコモンマウスのアイソタイプおよび軽鎖に対する固定化ヤギ抗マウス抗体バンドを有する尿試験紙に基づくマウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット(BioRad)を用いて、アイソタイピングを行った。回収された抗体は全て、マウスIgG1と特定された。ハイブリドーマ細胞の全RNAを抽出することにより、cDNA合成を可能にし、下記の方法を用いて、LakePharma(CA,USA)で実施した、抗マウスIgG1ハイブリドーマ物質の可変領域の塩基配列決定により抗体配列を明らかにした。cDNA端の塩基配列を明らかにする実験法(RACE)を実施し、TOPO(Thermo Fisher Scientific)ベクター中で陽性フラグメントのクローニングを可能にした。TOPOクローンの塩基配列を決定し、VBASE2を用いて配列にアノテーションをつけた。
mAb発見作戦により、インテグリンヘテロダイマーhCD103/hBeta7のヒトCD103(インテグリンアルファ-E)ドメインへの特異的結合を示す6種の異なるmAb候補を得た。6種の選択した候補をハイブリドーマから産生し、精製した。図1は、精製された抗hCD103 mAbのCHO.K1-hCD103/hBeta7、CHO.K1-rhCD103/rhBeta7、およびCHO.K1-hAlpha4/hBeta7に対する細胞結合データを示す。遺伝子導入CHO-K1細胞株によるインテグリンヘテロダイマーの発現が、インテグリンヒトCD103、インテグリンヒトAlpha-4、およびインテグリンヒトBeta-7に対する市販のmAbにより確認された。選択されたハイブリドーマの配列を決定し、Discovery Studioを用いて系統樹を構築し(図2)、VHおよびVL配列が種々の程度の類似性を有する点でユニークであることを示す。図からわかるように、抗体は、hCD103に対し結合を示すが、hBeta7に対しては、結合を示さない。アカゲザルCD103/rhBeta7に対する結合は、種々の候補で異なる。
実施例4:抗hCD103Fabフラグメントの生成
抗hCD103Fab候補は、ImmunoPrecise(Oss,the Netherlands)により産生された。候補hCD103.01A、hCD103.05A、およびhCD103.06AのVHおよびVLドメインのDNA配列をコードする合成ベクターを合成し、その後、ImmunoPreciseのヒトIgG1-Fab-Kベクターおよびヒトカッパ軽鎖ベクターにそれぞれ挿入し、続けて、HEK293細胞の遺伝子導入を実施した。回収した上清由来のFab フラグメントを、CaptureSelect IgG-CH1親和性マトリックスを用いてエンドトキシン不含精製により精製した。Fab濃度を、分光測光法を用いて定量化し、Fab純度をSDS-PAGEおよびHP-SECにより評価した。エンドトキシンレベルをLALアッセイにより測定した。
抗hCD103Fab候補は、ImmunoPrecise(Oss,the Netherlands)により産生された。候補hCD103.01A、hCD103.05A、およびhCD103.06AのVHおよびVLドメインのDNA配列をコードする合成ベクターを合成し、その後、ImmunoPreciseのヒトIgG1-Fab-Kベクターおよびヒトカッパ軽鎖ベクターにそれぞれ挿入し、続けて、HEK293細胞の遺伝子導入を実施した。回収した上清由来のFab フラグメントを、CaptureSelect IgG-CH1親和性マトリックスを用いてエンドトキシン不含精製により精製した。Fab濃度を、分光測光法を用いて定量化し、Fab純度をSDS-PAGEおよびHP-SECにより評価した。エンドトキシンレベルをLALアッセイにより測定した。
実施例5:mAbおよびFabの蛍光標識
FabおよびmAbを6xモル過剰のAlexa Fluor647-NHS(Thermo Scientific)でコンジュゲートした。手短に言えば、Zeba 7K MWCOスピンカラムを用いて、mAb/Fabを0.2Mの重炭酸ナトリウム pH8.3に再緩衝した。6倍モル過剰のAlexa Fluor647-NHS(10mg/mLのDMSO中ストックから)を加えた。反応を室温下の暗所で1時間可能とした。未反応Alexa Fluor-NHSをZeba 7K MWCOスピンカラムを用いて除去した。抗体およびAF647濃度を、分光測光法を用いて280nmおよび650nmでそれぞれ測定した。残留未反応AF647の量を、デュアル検出器システム(280nmおよび650nm)を用いて、HP-SECにより測定した。mAb当り+/-4色素およびFab当り+/-2~3色素の標識収率が観察された。
FabおよびmAbを6xモル過剰のAlexa Fluor647-NHS(Thermo Scientific)でコンジュゲートした。手短に言えば、Zeba 7K MWCOスピンカラムを用いて、mAb/Fabを0.2Mの重炭酸ナトリウム pH8.3に再緩衝した。6倍モル過剰のAlexa Fluor647-NHS(10mg/mLのDMSO中ストックから)を加えた。反応を室温下の暗所で1時間可能とした。未反応Alexa Fluor-NHSをZeba 7K MWCOスピンカラムを用いて除去した。抗体およびAF647濃度を、分光測光法を用いて280nmおよび650nmでそれぞれ測定した。残留未反応AF647の量を、デュアル検出器システム(280nmおよび650nm)を用いて、HP-SECにより測定した。mAb当り+/-4色素およびFab当り+/-2~3色素の標識収率が観察された。
実施例6:ヒトCD103/Beta7発現CHO細胞に対する免疫反応性
非標識mAbおよびFabのCHO.K1-hCD103/hBeta7に対する細胞結合をCELISAにより前述のように分析した。次に、フローサイトメトリーを用いて細胞結合実験を同様に実施し、CHO.K1-hCD103/hBeta7およびCHO.K1上のAF647標識mAb/Fabの結合プロファイルを測定した。1x105個の剥離細胞をmAb/Fabと共に4℃で30分間インキュベートした。洗浄後、細胞を1%BSA/DPBS/1xDAPI中に再懸濁し、FACS-CantoII(BD Biosciences)で分析した。
非標識mAbおよびFabのCHO.K1-hCD103/hBeta7に対する細胞結合をCELISAにより前述のように分析した。次に、フローサイトメトリーを用いて細胞結合実験を同様に実施し、CHO.K1-hCD103/hBeta7およびCHO.K1上のAF647標識mAb/Fabの結合プロファイルを測定した。1x105個の剥離細胞をmAb/Fabと共に4℃で30分間インキュベートした。洗浄後、細胞を1%BSA/DPBS/1xDAPI中に再懸濁し、FACS-CantoII(BD Biosciences)で分析した。
図3は、細胞ELISAでの種々の非標識mAb/Fabの結合データを示す。hCD103.01mAb/FabおよびhCD103.05mAbのCHO.K1.hCD103/beta7および組換えhCD103/Beta7の両方に対する強力な結合、hCD103.05FabのCHO.K1.hCD103/beta7および組換えhCD103/beta7の両方に対する幾分低下した結合ならびにhCD103.06mAb/Fabの組換えhCD103/Beta7(ACRO biosystem)に対する弱い/最小限の結合、一方で、hCD103.06mAbのCHO.K1.hCD103/hBeta7に対する強い結合、を示す。
図4は、フローサイトメトリーでの種々のAF647-標識mAb/Fabの結合データを示す。非遺伝子導入CHO.K1に対するmAbおよびFab試薬の用量依存性結合は観察されなかった(データは示さず)。
実施例7:組換えヒトCD103/Beta7に対する免疫反応性
ヒトCD103/Beta7に対する免疫反応性を組換えhCD103/hBeta7 Fcタンパク質(Acro-Biosystems)コート96ウェルMaxisorp平底プレートを用いて、ELISAにより評価した。タンパク質コート96ウェルプレートをタンパク質不含ブロッキング緩衝液(Pierce)中、37℃で1.5時間ブロッキングした。プレートを洗浄し、PBS中の0.1%ツイーン20中で、mAb/Fabと共に、室温で1時間インキュベートした。次に、プレートをPBS-Tで洗浄し、mAb用のヤギ抗マウスIgG-HRPコンジュゲート(Southern Biotech)、およびFabフラグメント用のヤギ抗ヒトFab-HRPコンジュゲート(Jackson Immuno Research)と共に、PBS中の0.1%ツイーン20中で、室温下、1時間インキュベートした。続けて、細胞をPBS-Tで3回洗浄し、抗hCD103免疫反応性をTMB安定化色素原(Invitrogen)で可視化した。反応を0.5MのH2SO4で停止し、吸光度を450および610nmで読み取った。
ヒトCD103/Beta7に対する免疫反応性を組換えhCD103/hBeta7 Fcタンパク質(Acro-Biosystems)コート96ウェルMaxisorp平底プレートを用いて、ELISAにより評価した。タンパク質コート96ウェルプレートをタンパク質不含ブロッキング緩衝液(Pierce)中、37℃で1.5時間ブロッキングした。プレートを洗浄し、PBS中の0.1%ツイーン20中で、mAb/Fabと共に、室温で1時間インキュベートした。次に、プレートをPBS-Tで洗浄し、mAb用のヤギ抗マウスIgG-HRPコンジュゲート(Southern Biotech)、およびFabフラグメント用のヤギ抗ヒトFab-HRPコンジュゲート(Jackson Immuno Research)と共に、PBS中の0.1%ツイーン20中で、室温下、1時間インキュベートした。続けて、細胞をPBS-Tで3回洗浄し、抗hCD103免疫反応性をTMB安定化色素原(Invitrogen)で可視化した。反応を0.5MのH2SO4で停止し、吸光度を450および610nmで読み取った。
実施例8:フローサイトメトリー分析
腫瘍消化物中の抗CD103mAbおよびFabフラグメントの結合アッセイのために、試料を複数の分取量に分割し、生死マーカーおよびヒトCD3、CD8α、CD33およびCD103に対する市販の抗体、またはCD3、CD8α、CD33および二次検出薬を有する我々の抗CD103mAbもしくはFabに対する市販の抗体を用いて染色した。抗CD103とマウスCD103陽性T細胞との結合アッセイのために、脾臓および胸腺単一細胞懸濁液を複数の分取量に分割し、生死マーカーおよびマウスCD8およびCD103に対する市販の抗体を用いて染色した。追加の分取量を関連アイソタイプ対照で、または蛍光マイナス1対照(「FMO」=蛍光マイナス1対照は、全てのフルオロフォアマイナス1フルオロフォアで染色される細胞である;関連アイソタイプ対照は直接に標識した非特異的アイソタイプ抗体または二次検出試薬と組み合わせた非特異的アイソタイプ抗体を含む)として染色した。フローサイトメトリーを用いて、蛍光標識mAbのパーセンテージ結合を決定した。最大結合は、100%に設定した。測定は、BD FACSVerse(BD Biosciences)で実施した。FlowJo v10(Tree Star)を用いてデータ分析を実施し、表面受容体レベルを平均蛍光強度(MFI)として表した。
腫瘍消化物中の抗CD103mAbおよびFabフラグメントの結合アッセイのために、試料を複数の分取量に分割し、生死マーカーおよびヒトCD3、CD8α、CD33およびCD103に対する市販の抗体、またはCD3、CD8α、CD33および二次検出薬を有する我々の抗CD103mAbもしくはFabに対する市販の抗体を用いて染色した。抗CD103とマウスCD103陽性T細胞との結合アッセイのために、脾臓および胸腺単一細胞懸濁液を複数の分取量に分割し、生死マーカーおよびマウスCD8およびCD103に対する市販の抗体を用いて染色した。追加の分取量を関連アイソタイプ対照で、または蛍光マイナス1対照(「FMO」=蛍光マイナス1対照は、全てのフルオロフォアマイナス1フルオロフォアで染色される細胞である;関連アイソタイプ対照は直接に標識した非特異的アイソタイプ抗体または二次検出試薬と組み合わせた非特異的アイソタイプ抗体を含む)として染色した。フローサイトメトリーを用いて、蛍光標識mAbのパーセンテージ結合を決定した。最大結合は、100%に設定した。測定は、BD FACSVerse(BD Biosciences)で実施した。FlowJo v10(Tree Star)を用いてデータ分析を実施し、表面受容体レベルを平均蛍光強度(MFI)として表した。
エクスビボヒト腫瘍消化物を用いて、CD3+CD8+T細胞にゲートを設定し、フローサイトメトリーで、日常的にベンチマークとして使用される市販の抗CD103mAb(BD Bioscience)対して抗CD103mAbを評価した。抗CD103mAbは、市販の抗CD103mAbに対し観察されたものと同一の発生頻度で、CD103+CD8+T細胞亜集団を容易に特定した(図5)。CD4+T細胞またはCD33+(骨髄)細胞に対する非結合をこれらの消化物中で検出した10人の別々の患者中のCD103+CD8+T細胞亜集団に対するmAb結合は、クローン01Aに対し最も高かったが、一方、クローン03Aは、最も低い結合を示した(図6)さらに、抗体クローン01A、05Aおよび06A由来の組換えFabフラグメントは、ヒト腫瘍消化物中で、それぞれ、Fab.hCD103.01.C1のCD103+CD8+T細胞亜集団に対する最強の結合を示したが、一方、Fab.hCD103.06.C1は、最も低い結合を示し(図7)、mAb結合データと一致した。
mAb間の親和性および競合における差異を評価するために、CD103+CD8+T細胞を我々の抗CD103mAbまたは市販の抗CD103mAbと共にFACS培地中、4℃で1時間プレインキュベートし、続けて、それらの蛍光標識対応物と共に4℃で1時間インキュベートした。フローサイトメトリーを用いて、蛍光標識mAbのパーセンテージ結合を決定した。最大結合は、100%に設定した。
フローサイトメトリーを用いて、CD103mAbクローンがマウスCD103+T細胞と交差反応するかどうかを判定した。マウス脾臓および胸腺のCD103の発現を市販の抗マウスCD103mAbを用いて調査した。およそ半分のCD8細胞がCD103陽性であった。しかし、抗ヒトCD103mAbクローンは、マウスCD103に対し特定結合を示さなかった(データは示さず)。競合アッセイにより、我々のパネル中のほとんどのmAbの結合は、クローン03Aおよび06Aを除いて、市販のCD103mAbの結合を阻害し、逆もまた同じであることが明らかになり、CD103上の同じ領域に結合することを示す(図8)。それにもかかわらず、結合特性の差異が観察された。クローン01Aおよび02Aは、競合アッセイで、ほとんどの他のmAbクローンの結合を遮断したが、一方、クローン03A、05A、06Aおよび07Aは、そうではなく、別々の結合エピトープを示唆する。さらに、蛍光標識05A、06Aおよび07Aは、同じクローンで飽和後に結合を示し、より低い結合親和性を示す。
抗CD103mAbおよびFabフラグメントの内部移行および解離、ならびにCD103の膜代謝回転を以前に記載されたプロトコルを用いて測定した。手短に説明すると、CHO.K1-hCD103/hBeta7細胞またはCD103陽性T細胞を氷上で抗CD103mAbおよびFabフラグメント(20μg/mL最終濃度)で染色した。染色後、1)細胞を氷冷FACS緩衝液で洗浄し、FACS培地中で1:50に希釈した二次抗体と共に、4℃で1時間インキュベートして、表面発現を測定した。2)細胞を氷冷FACS緩衝液で洗浄し、培地中、37℃で4時間インキュベートし、その後、二次抗体のみが表面結合CD103mAbまたはFabフラグメントに結合するので、二次抗体と共に4℃で1時間インキュベートして、非内部移行CD103抗体複合体抗体複合体を測定した。3)細胞を氷冷FACS緩衝液で洗浄し、培地中、37℃で4時間インキュベートし、その後、CD103mAbまたはFabフラグメントと共に、続けて、二次抗体と共に再インキュベートし、非内部移行した再出現受容体および受容体のデノボ合成の可能性を測定した。重複実験試料を各処理条件について測定し、バックグラウンド蛍光および二次抗体の非特異的結合を補正した。測定は、BD FACSVerseまたはBD Accuri C6(BD Biosciences)で実施した。FlowJo v10(Tree Star)を用いてデータ分析を実施し、表面受容体発現を平均蛍光強度(MFI)として表した。37℃で4時間のインキュベーションは、細胞表面に種々の量の残存mAbおよびFabフラグメント結合を生じた。減少は、内部移行mAbおよびFabフラグメントを示すのであろう。しかし、同じ実験を直接に標識したmAbおよびFabフラグメントを用いて実施すると、細胞表面の残存mAbまたはFabフラグメントの減少は解離によるものであることを示した。注目すべきことに、CD103表面発現レベルは、mAbまたはFabフラグメントとのインキュベーションによりごくわずかに変化したにすぎなかった。
実施例9:CD103+T細胞接着アッセイ
CD103+T細胞接着アッセイを以下のように実施した。実験の1日前に、96ウェルプレートを、1mMのCa2+およびMg2+を含むダルベッコPBS(DPBS)中の2μg/mLの濃度の100μLの組換えE-カドヘリンを用いて、4℃で一晩コートした。次に、ウェルをDPBS中の1%ウシ血清アルブミン(BSA)を用いて少なくとも1時間ブロッキングした。CD103+T細胞をCFSE(Thermo Fisher Scientific)で前述(3)に記載のように標識し、RPMI+10%FCS+1mMのMn2+に再懸濁した。CFSE標識細胞を10μg/mLの抗体またはFabフラグメントと共に氷上で30分間プレインキュベーションし、続けて、E-カドヘリンコーティングされたウェル(50,000個の細胞/ウェル)中、37℃で30分間のインキュベーションを実施、または細胞をE-カドヘリンコーティングウェルに37℃で30分間直接移し、続けて、10μg/mLの抗体またはFabフラグメント処理を37℃で30分間実施した。
CD103+T細胞接着アッセイを以下のように実施した。実験の1日前に、96ウェルプレートを、1mMのCa2+およびMg2+を含むダルベッコPBS(DPBS)中の2μg/mLの濃度の100μLの組換えE-カドヘリンを用いて、4℃で一晩コートした。次に、ウェルをDPBS中の1%ウシ血清アルブミン(BSA)を用いて少なくとも1時間ブロッキングした。CD103+T細胞をCFSE(Thermo Fisher Scientific)で前述(3)に記載のように標識し、RPMI+10%FCS+1mMのMn2+に再懸濁した。CFSE標識細胞を10μg/mLの抗体またはFabフラグメントと共に氷上で30分間プレインキュベーションし、続けて、E-カドヘリンコーティングされたウェル(50,000個の細胞/ウェル)中、37℃で30分間のインキュベーションを実施、または細胞をE-カドヘリンコーティングウェルに37℃で30分間直接移し、続けて、10μg/mLの抗体またはFabフラグメント処理を37℃で30分間実施した。
A549野性型およびE-カドヘリンノックアウト細胞を用いた接着アッセイのために、実験の1日前に、腫瘍細胞(30,000個の細胞/ウェル)を96ウェルプレート中に播種した。次に、CFSE標識CD103+T細胞を10μg/mLの抗体と共に氷上で30分間プレインキュベーションし、続けて、腫瘍細胞播種ウェル中、37℃で60分間インキュベーションした。
インキュベーション後、非結合細胞をプレートを反転させて除去し、DPBSで洗浄した。最後に、細胞をDPBS中の3.7%ホルマリンを用いて固定した。従来の螢光顕微鏡(Invitrogen(商標)EVOS(商標)FLイメージングシステムを用いて画像を取得した。結合T細胞をImage Jソフトウェア分析(1.50v)を用いて定量化した。
図9に示すように、CD103mAbクローン01A、02A、03Aおよび07Aは、最強の細胞結合阻害を示すが、一方、06Aは、E-カドヘリンに対する結合を部分的に阻害する。クローン05Aは、CD103媒介T細胞接着を妨げない唯一のクローンであった。類似の効果は、Fab.hCD103.01.C1、Fab.hCD103.05.C1、およびFab.hCD103.06.C1に対しても観察された(データは示さず)。A549腫瘍細胞のCDH1(E-カドヘリン)のCRISPRノックアウトは、低減されたCD103+T細胞接着を生じたが、我々のCD103mAbの明確な効果は、E-カドヘリンおよびE-カドヘリンノックアウト細胞で観察されなかった。
実施例10:細胞ベースELISA
手順の一日前に、CD103/β7トランスフェクトCHO細胞(30,000個の細胞/ウェル)を96ウェルプレートに播種した。その後、段階希釈のCD103mAb、Fabフラグメントおよびアイソタイプ対照を各ウェルの96ウェルプレートに加え、37℃で1時間インキュベートした。ウェルをPBSで洗浄し、ウサギ抗マウス/IgG-HRP(1:4000;Dako)またはFab特異的ヤギ抗ヒト/IgG-HRP(1:4000;Sigma Aldrich)と共に、37℃で1時間インキュベートした。次に、ウェルをPBSで洗浄し、TMB基質(KPL)を加えた。呈色反応を1MのHCl溶液を加えて停止し、吸光度をマイクロプレート(Thermo Scientific)により測定した。
手順の一日前に、CD103/β7トランスフェクトCHO細胞(30,000個の細胞/ウェル)を96ウェルプレートに播種した。その後、段階希釈のCD103mAb、Fabフラグメントおよびアイソタイプ対照を各ウェルの96ウェルプレートに加え、37℃で1時間インキュベートした。ウェルをPBSで洗浄し、ウサギ抗マウス/IgG-HRP(1:4000;Dako)またはFab特異的ヤギ抗ヒト/IgG-HRP(1:4000;Sigma Aldrich)と共に、37℃で1時間インキュベートした。次に、ウェルをPBSで洗浄し、TMB基質(KPL)を加えた。呈色反応を1MのHCl溶液を加えて停止し、吸光度をマイクロプレート(Thermo Scientific)により測定した。
実施例11:89Zr-hCD103.01A、89Zr-hCD103.05A、89Zr-Fab.hCD103.01.C1および89Zr-hCD103.05.C1トレーサー開発および品質管理
hCD103.01A、hCD103.05A、Fab.hCD103.01.C1およびFab.hCD103.05.C1を、3または4倍モル過剰のTFP-N-Suc-デスフェラール-Fe(Df,ABX GmbH,Hamburg,Germany)と共にインキュベートし、続けて、89Zr-標識を、臨床グレード89Zr(Perkin Elmer,Groningen,The Netherlands)を用いて実施した。最大達成可能比活性を、250~1000MBq/mgの範囲のmg当りの89Zrの可変量の抗体またはFabフラグメントを用いて測定した。放射化学純度(RCP)をトリクロロ酢酸(TCA)沈降試験により評価した。89Zr-Fab.hCD103.01.C1およびFab.hCD103.05.C1の放射化学純度は、試験した3種の89Zrレベル(250、500,および750MBqの89Zr)に対し、>96%であった。Df-mAbおよび-Fabコンジュゲートの凝集およびフラグメント化をサイズ排除超高速液体クロマトグラフィー(SE-UPLC)により検査した。Waters SE-UPLCシステムは、二重波長吸光度検出器、インライン放射能検出器およびTSK-GEL G3000SWXLカラム(JSB,Eindhoven,The Netherlands)を装備している。
hCD103.01A、hCD103.05A、Fab.hCD103.01.C1およびFab.hCD103.05.C1を、3または4倍モル過剰のTFP-N-Suc-デスフェラール-Fe(Df,ABX GmbH,Hamburg,Germany)と共にインキュベートし、続けて、89Zr-標識を、臨床グレード89Zr(Perkin Elmer,Groningen,The Netherlands)を用いて実施した。最大達成可能比活性を、250~1000MBq/mgの範囲のmg当りの89Zrの可変量の抗体またはFabフラグメントを用いて測定した。放射化学純度(RCP)をトリクロロ酢酸(TCA)沈降試験により評価した。89Zr-Fab.hCD103.01.C1およびFab.hCD103.05.C1の放射化学純度は、試験した3種の89Zrレベル(250、500,および750MBqの89Zr)に対し、>96%であった。Df-mAbおよび-Fabコンジュゲートの凝集およびフラグメント化をサイズ排除超高速液体クロマトグラフィー(SE-UPLC)により検査した。Waters SE-UPLCシステムは、二重波長吸光度検出器、インライン放射能検出器およびTSK-GEL G3000SWXLカラム(JSB,Eindhoven,The Netherlands)を装備している。
2種のDf-コンジュゲートCD103mAbおよびFabフラグメントのCD103結合親和性は、それらの非修飾対応物と類似であった(図10)。加えて、Df-コンジュゲートmAbおよびFabフラグメントの両方は、さらに精製することなく、>95%の放射化学純度で500MBq 89Zr/mgの比活性を達成した(図11)。従って、これらのトレーサーは、体内分布試験に使用する場合、10μg(PETイメージング)あるいはそれ未満の低い量でのPETイメージングに好適する。インビトロで、hCD103.01AおよびhCD103.05Aは、CD103遺伝子導入CHO-K1モデル細胞株(CHO.K1-hCD103/hBeta7)に対する特異的結合を示したが、CHO-K1野生型細胞(CHO.WT)に対してはそうではなかった(図12)。
実施例12:動物試験
図13Aは、89Zr-hCD103.01Aおよび89Zr-hCD103.05Aの例示的PETイメージングプロトコルを示す。雄ヌードマウス(BALB/c OlaHsd-Foxn1nu,Envigo,The Netherlands)の皮下(sc)にCHO.K1またはCHO.CD103(300μLの1:1のPBSおよび高成長因子マトリゲル(BD Biosciences,Breda,The Netherlands)中の5x106個)を接種した。異種移植片を少なくとも200mm3に成長させた。mAbによるマイクロPETイメージングのために、異種移植片含有マウス(n=3匹/群)の静脈内(iv)に陰茎静脈経由で8.7±0.48μgの89Zr-CD103.01Aまたは8.76±0.42μgの89Zr-CD103.05Aを注入した。Focus 220PETスキャナー(CTI Siemens)を用いて、注入後(pi)1、3および6日目にマイクロPETスキャンを行い、続けて、最終スキャン後にエクスビボ体内分布分析を実施した。Fabフラグメントによる体内分布実験のために、異種移植片含有マウス(n=2または3匹/群)の静脈内(iv)に陰茎静脈経由で約10μgの89Zr-Fab.hCD103.01.C1または89Zr-Fab.hCD103.05.C1を注入し、続けて、24時間後にエクスビボ体内分布分析を行った。
図13Aは、89Zr-hCD103.01Aおよび89Zr-hCD103.05Aの例示的PETイメージングプロトコルを示す。雄ヌードマウス(BALB/c OlaHsd-Foxn1nu,Envigo,The Netherlands)の皮下(sc)にCHO.K1またはCHO.CD103(300μLの1:1のPBSおよび高成長因子マトリゲル(BD Biosciences,Breda,The Netherlands)中の5x106個)を接種した。異種移植片を少なくとも200mm3に成長させた。mAbによるマイクロPETイメージングのために、異種移植片含有マウス(n=3匹/群)の静脈内(iv)に陰茎静脈経由で8.7±0.48μgの89Zr-CD103.01Aまたは8.76±0.42μgの89Zr-CD103.05Aを注入した。Focus 220PETスキャナー(CTI Siemens)を用いて、注入後(pi)1、3および6日目にマイクロPETスキャンを行い、続けて、最終スキャン後にエクスビボ体内分布分析を実施した。Fabフラグメントによる体内分布実験のために、異種移植片含有マウス(n=2または3匹/群)の静脈内(iv)に陰茎静脈経由で約10μgの89Zr-Fab.hCD103.01.C1または89Zr-Fab.hCD103.05.C1を注入し、続けて、24時間後にエクスビボ体内分布分析を行った。
スキャンを再構成し、インビボ定量化をAMIDE(v1.0.4、Stanford University,Stanford,CA,USA)を用いて実施した。マイクロPETデータは平均標準化取り込み値で表される(SUVmean)。1g/mlの組織密度を仮定して、エクスビボ重量に基づいて、目的の領域(ROI)を描画した。血液プール測定のために、心臓の中央に固定サイズの球体を描画し、肝臓および脾臓は、臓器の代表的な部分に、固定サイズの楕円ROIを描画した。最終スキャン後に、マウスを屠殺し、目的の臓器を体内分布試験のために収集した。注入トレーサーの臓器および基準を較正ウェル型LKB-1282-Compu-gammaシステム(LKB WALLAC)でカウントし、秤量した。減衰補正後、エクスビボ組織活性をグラム組織当りの注入投与量のパーセンテージ(%ID/g)として表した。
CHO.K1-hCD103/hBeta7中のCD103膜発現は、TIL中のCD103発現と同等である(データは示さず)。CHO.K1-hCD103/hBeta7担癌マウスのpETスキャンは、89Zr-hCD103.01Aおよび89Zr-hCD103.05A腫瘍取り込みは、時間と共に増大し(図13B)、最大の腫瘍取り込みおよび最小のバックグラウンド臓器取り込みは注入の6日後に観察された(89Zr-hCD103.01Aでは、中央値平均標準化取り込み値(SUVmean)腫瘍:2.7、中央値SUVmean血液:0.9、および89Zr-hCD103.05Aでは、中央値SUVmean腫瘍:3.0、中央値SUVmean血液:0.9;図13C、DおよびE)。89Zr-hCD103.01Aは、CHO.K1 WT異種移植片中に蓄積を示さなかった(SUVmean腫瘍:1.5;SUVmean血液:1.4)、これは、非特異的対照群として使用された。同様に、6日目のエクスビボ体内分布分析は、高CD103特異的89Zr-hCD103.01Aおよび89Zr-hCD103.05A腫瘍取り込みを示し(CHO.K1-hCD103/hBeta7では、グラム組織当りの注入投与量の、それぞれ17.0および32.8パーセンテージ(%ID/g)に対し、CHO.K1 WTでは7.8%ID/g)、大きなシンク器官は存在しない(図14)。Fabフラグメントでは、注入の24時間後のエクスビボ体内分布分析は、CD103特異的89Zr-Fab.hCD103.01.C1および89Zr-Fab.hCD103.05.C1腫瘍取り込みを示した(CHO.K1-hCD103/hBeta7では、それぞれ、2.44および1.27%ID/gで、これに対し、CHO.K1 WTでは0.64%ID/gである)(図15)。
実施例13:治療をモニターするためのCD103標的化放射性医薬品の使用
(免疫)療法の開始前に、「CD103 PET」スキャンが単独で、または低用量CTスキャンと組み合わせて、実施される。CD103放射性医薬品の取り込みが定量される。CD103 PET-CTスキャンが反復され、(免疫)療法中に周期的に定量され得る。ベースライン取り込み、治療中取り込み、または取り込み中のベースラインからの治療誘導変化が臨床判断をガイドするために使用される。これには、限定されないが、療法の延長、療法の休止または投与量調節が含まれ得る。
(免疫)療法の開始前に、「CD103 PET」スキャンが単独で、または低用量CTスキャンと組み合わせて、実施される。CD103放射性医薬品の取り込みが定量される。CD103 PET-CTスキャンが反復され、(免疫)療法中に周期的に定量され得る。ベースライン取り込み、治療中取り込み、または取り込み中のベースラインからの治療誘導変化が臨床判断をガイドするために使用される。これには、限定されないが、療法の延長、療法の休止または投与量調節が含まれ得る。
実施例15:参考文献
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本明細書で引用された全ての文献は、あたかもそれぞれの出版物、データベースエントリ(例えば、ジェンバンク配列またはGeneIDエントリ)、特許出願、または特許が、具体的および個別に、参照により組み込まれることが示されるのと同程度に参照により本明細書に組み込まれる。この参照による組み込みの記載は、出願者により、37C.F.R.§1.57(b)(1)に基づき、それぞれのおよび全ての個別の出版物、データベースエントリ(例えば、ジェンバンク配列またはGeneIDエントリ)、特許出願、または特許に関連することが意図され、このような引用が参照による組み込みの特定の目的のための記載に直接隣接していない場合でも、これらのそれぞれは、37C.F.R.§1.57(b)(2)にしたがって、明確に識別される。参照によるくみこみの特定の目的のための記載の包含が明細書内に、たとえあったにしても、これは決してこの参照による組み込みの一般的記載を弱めるものではない。本明細書による文献の引用は、この文献が先行技術に関連するという承認を意図するものではなく、また、これらの出版物または文書の内容または日付に関しなんらかの承認を与えるものでもない。参考文献が、本明細書で提供される定義と矛盾する請求された用語の定義を提供する場合には、本明細書で提供される定義が請求発明の解釈に使用されるものとする。
当業者が本発明を行い、かつ使用するために、本発明を十分に詳細に記載し、実証してきたが、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、様々な代替方法、変更、および改良が行われることは明らかである。本明細書で提供した実施例は、好ましい実施形態を代表するものであり、例示的であり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。当業者なら、その中での変更および他の使用を思いつくであろう。これらの変更は、本発明の趣旨に包含され、特許請求の範囲により規定される。
本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく、本明細書で開示される本発明に対して、様々な代替および変更をなし得ることを当業者は容易に理解するであろう。
本明細書で言及した全ての特許出願、特許、刊行物および他の文献は、本発明が属する技術分野の当業者のレベルを示すものであり、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる。本明細書において引用された参考文献は、本請求発明に対する先行技術であることを承認するものではない。
別に定めのない限り、全ての技術および化学的用語は、本発明が属する当業者に通常理解されているものと同じ意味を有する。矛盾がある場合には、定義を含めて本明細書が優先することになる。
記述がおよび特許請求の範囲の両方における冠詞「a」、「an」および「the」の使用は、本明細書で別段の指示がない限り、または文脈上明らかに矛盾するということがない限り、単数および複数の両方を包含すると解釈されるべきである。用語「含む(comprising)」、「有する(having)」、「化学式である(being of formura)」、「含む(including)」、および「含む(containing)」は、特に断らない限り、オープンターム(すなわち「含むがこれに限定されない」という意味)として解釈されるものとする。さらに、ある実施形態において「含む(comprising)」または別の開放型用語が使用されている場合は常に、同じ実施形態は、中間的用語「から基本的になる(consisting essentially of)」または閉鎖型用語「からなる(consisting of)」を使用してより狭く請求できると理解されるべきである。
数値に関連して使用される「約(about)」、「およそ(approximately)」、「近似の(approximate)」という用語は、数値の集まりまたは範囲が含まれることを意味する。例えば、「約X」には、Xの±20%、±10%、±5%、±2%、±1%、±0.5%、±0.2%、または±0.1%の範囲の数値(Xは数値)が含まれる。一実施形態では、「約(about)」という用語は、指定値より10%多いまたは少ない値の範囲を意味する。別の実施形態では、「約(about)」という用語は、指定値より5%多いまたは少ない値の範囲を意味する。別の実施形態では、「約(about)」という用語は、指定値より1%多いまたは少ない値の範囲を意味する。
値の範囲の列挙は、本明細書で別段の指示がない限り、その範囲内に入る個別の各値を個々に表すことの簡略法として用いることを単に意図したものであり、個別の各値は、それが本明細書に個々に列挙されているかのうように本明細書に組み込まれる。本明細書で使われる範囲は、別段の指定がない限り、範囲の2つの限界値を含む。例えば、「XとYの間」、「XからYの範囲」という用語は、XとYおよびその間の整数を含む。他方では、本開示において一連の個別値について言及する場合、2つの個別値のいずれかを2つの端点として含む任意の範囲も本開示において想定される。例えば、「約100mg、200mg、または400mgの用量」という表現は、「100~200mgの範囲の用量」、「200~400mgの範囲の用量」、または「100~400mgの範囲の用量」を意味することもできる。
本明細書で適切に、例示的に記載した本発明は、本明細書で具体的に開示されない任意の(単一または複数の)要素、(単一または複数の)制限がない状態で実行され得る。したがって、例えば、本明細書の各事例において、「含む(comprising)」、「基本的に~からなる(consisting essentially of)」および「からなる(consisting of)」という用語のいずれも、他の2つの用語のいずれかと置き換え得る。使用された用語および表現は、説明の用語として、制限なく使用される。示され、記載される特徴の全ての等価物またはその一部を排除するそのような用語および表現の使用は意図しないが、本発明の特許請求の範囲の中で、様々な変更が可能であることは理解される。したがって、本発明は、好ましい実施形態および任意の特徴によって具体的に開示されているが、当業者は、本明細書に開示される概念の変更および変形を行うことが可能であり、このような変更および変形は、添付の特許請求の範囲によって定められるように、本発明の範囲に入ると見なされることを理解されたい。
Claims (42)
- ヒトCD103に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記抗体または抗原結合フラグメントは、
a.配列番号1のアミノ酸配列または配列番号1とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1、
b.配列番号2のアミノ酸配列または配列番号2とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2、
c.配列番号3のアミノ酸配列または配列番号3とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3、
d.配列番号4のアミノ酸配列または配列番号4とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1、
e.配列番号5のアミノ酸配列または配列番号5とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2、
f.配列番号6のアミノ酸配列または配列番号6とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3、の1種または複数、および任意選択でこれらのそれぞれ、を含む、抗体またはその抗原結合フラグメント。 - ヒトCD103に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記抗体または抗原結合フラグメントは、
a.配列番号9のアミノ酸配列または配列番号9とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1、
b.配列番号10のアミノ酸配列または配列番号10とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2、
c.配列番号11のアミノ酸配列または配列番号11とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3、
d.配列番号12のアミノ酸配列または配列番号12とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1、
e.配列番号13のアミノ酸配列または配列番号13とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2、
f.配列番号14のアミノ酸配列または配列番号14とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3、の1種または複数、および任意選択でこれらのそれぞれ、を含む、抗体またはその抗原結合フラグメント。 - ヒトCD103に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記抗体または抗原結合フラグメントは、
a.配列番号17のアミノ酸配列または配列番号17とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1、
b.配列番号18のアミノ酸配列または配列番号18とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2、
c.配列番号19のアミノ酸配列または配列番号19とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3、
d.配列番号20のアミノ酸配列または配列番号20とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1、
e.配列番号21のアミノ酸配列または配列番号21とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2、
f.配列番号22のアミノ酸配列または配列番号22とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3、の1種または複数、および任意選択でこれらのそれぞれ、を含む、抗体またはその抗原結合フラグメント。 - ヒトCD103に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記抗体または抗原結合フラグメントは、
a.配列番号25のアミノ酸配列または配列番号25とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1、
b.配列番号26のアミノ酸配列または配列番号26とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2、
c.配列番号27のアミノ酸配列または配列番号27とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3、
d.配列番号28のアミノ酸配列または配列番号28とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1、
e.配列番号29のアミノ酸配列または配列番号29とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2、
f.配列番号30のアミノ酸配列または配列番号30とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3、の1種または複数、および任意選択でこれらのそれぞれ、を含む、抗体またはその抗原結合フラグメント。 - ヒトCD103に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記抗体または抗原結合フラグメントは、
a.配列番号33のアミノ酸配列または配列番号33とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1、
b.配列番号34のアミノ酸配列または配列番号34とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2、
c.配列番号35のアミノ酸配列または配列番号35とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3、
d.配列番号36のアミノ酸配列または配列番号36とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1、
e.配列番号37のアミノ酸配列または配列番号37とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2、
f.配列番号38のアミノ酸配列または配列番号38とは、1、2、または3個の保存的置換だけ異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3、の1種または複数、および任意選択でこれらのそれぞれ、を含む、抗体またはその抗原結合フラグメント。 - ヒトCD103に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記抗体の重鎖または抗原結合フラグメントが、配列番号7のアミノ酸配列を含み、前記抗体の軽鎖または抗原結合フラグメントが、配列番号8のアミノ酸配列を含む、抗体またはその抗原結合フラグメント。
- ヒトCD103に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記抗体の重鎖または抗原結合フラグメントが、配列番号15のアミノ酸配列を含み、前記抗体の軽鎖または抗原結合フラグメントが、配列番号16のアミノ酸配列を含む、抗体またはその抗原結合フラグメント。
- ヒトCD103に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記抗体の重鎖または抗原結合フラグメントが、配列番号23のアミノ酸配列を含み、前記抗体の軽鎖または抗原結合フラグメントが、配列番号24のアミノ酸配列を含む、抗体またはその抗原結合フラグメント。
- ヒトCD103に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記抗体の重鎖または抗原結合フラグメントが、配列番号31のアミノ酸配列を含み、前記抗体の軽鎖または抗原結合フラグメントが、配列番号32のアミノ酸配列を含む、抗体またはその抗原結合フラグメント。
- ヒトCD103に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記抗体の重鎖または抗原結合フラグメントが、配列番号39のアミノ酸配列を含み、前記抗体の軽鎖または抗原結合フラグメントが、配列番号40のアミノ酸配列を含む、抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 前記抗体が、完全IgGである、請求項1~10の1項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
- 前記抗体が、scFv、FabまたはF(ab’)2である、請求項1~10の1項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
- 前記抗体が、野性型または変異IgG2 Fc領域を含む、請求項1~10の1項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
- 前記抗体が、変異IgG1 Fc領域を含む、請求項1~10の1項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
- 前記抗体が、変異IgG4 Fc領域を含む、請求項1~10の1項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。
- 請求項1~10の1項に記載の抗体と同じヒトCD103のエピトープに結合する、抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 前記抗体または抗原結合フラグメントが、ヒト化されている、請求項1~10のいずれかに記載の抗体または抗原結合フラグメント。
- 請求項1~17の1項に記載の抗体をコードする1種または複数の核酸。
- 請求項1~17の1項に記載の抗体をコードする1種または複数の核酸およびそれに動作可能に連結された調節配列を含む、前記抗体を宿主細胞中で発現するように構成された発現系。
- 請求項19に記載の発現系を含む宿主細胞。
- 細菌細胞、ヒト細胞、哺乳動物細胞、ピキア細胞、植物細胞、HEK293細胞、またはチャイニーズハムスター卵巣細胞である、請求項20に記載の宿主細胞。
- 請求項1~17のいずれか1項に記載の抗体または抗原結合フラグメントおよび薬学的に許容可能な担体または希釈剤を含む、組成物。
- 抗体または抗原結合フラグメントの製造方法であって、
請求項1~17に記載の前記抗体または抗原結合フラグメントのいずれか1つの前記重鎖および/または前記軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞をポリヌクレオチドの発現に好ましい条件下で培養するステップ、および任意選択で、前記宿主細胞および/または培地から前記抗体または抗原結合フラグメントを回収するステップ、を含む、方法。 - 生物検体中のCD103の存在を検出するための方法であって、前記検体を請求項1~17のいずれか1項に記載の抗CD103抗体またはその抗原結合フラグメントと接触させるステップ、および
前記生物検体中に存在するCD103との複合体中の前記抗体または抗原結合フラグメントの結合の存在または量を検出するステップ、を含み、前記複合体の検出が前記生物検体中に存在するCD103の存在または量を示す、方法。 - 前記抗体または抗原結合フラグメントが、診断標識を含む、請求項24に記載の方法。
- 前記検出ステップが、PETイメージング、単一光子放射型コンピュータ断層撮影(SPECT)イメージング、MRI、光学イメージング、または(光)音響イメージングを含む、請求項25に記載の方法。
- 前記診断標識が、11C、13N、15O、99mTc、61Cu、62Cu、64Cu、67Cu、18F、19F、66Ga、67Ga、68Ga、72Ga、123I、124I、111In、177Lu、44Sc、47Sc、86Y、88Y、90Y、45Ti、89Zr、インドシアニングリーン、IRDye 800CW、フルオレセイン(FITC)、および磁気(例えば、酸化鉄)ナノ粒子からなる群より選択される、請求項26に記載の方法。
- 前記抗体または抗原結合フラグメントが、E-カドヘリンに対するCD103結合を遮断しない、請求項23~27の1項に記載の方法。
- 前記抗体または抗原結合フラグメントが、E-カドヘリンに対するCD103結合を少なくとも部分的に遮断する、請求項23~27の1項に記載の方法。
- 前記抗体または抗原結合フラグメントが、請求項1~17のいずれか1項に記載の抗体または抗原結合フラグメントである、請求項23~27の1項に記載の方法。
- 前記体検出ステップが、前記複合体を検出するためのインビボイメージング法を含む、請求項23~30の1項に記載の方法。
- 前記体検出ステップが、腫瘍中の前記複合体を検出するためのインビボイメージング法を含む、請求項31に記載の方法。
- イメージング剤であって、
検出可能標に識抗された抗CD103抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、イメージング剤。 - 前記抗体または抗原結合フラグメントが、E-カドヘリンに対するCD103結合を遮断しない、請求項33に記載のイメージング剤。
- 前記抗体または抗原結合フラグメントが、E-カドヘリンに対するCD103結合を少なくとも部分的に遮断する、請求項33に記載のイメージング剤。
- 前記抗体または抗原結合フラグメントが、請求項1~17のいずれか1項に記載の抗体または抗原結合フラグメントである、請求項33に記載のイメージング剤。
- 前記抗体または抗原結合フラグメントが、11C、13N、15O、99mTc、61Cu、62Cu、64Cu、67Cu、18F、19F、66Ga、67Ga、68Ga、72Ga、123I、124I、111In、177Lu、44Sc、47Sc、86Y、88Y、90Y、45Ti、89Zr、インドシアニングリーン、IRDye 800CW、フルオレセイン(FITC)、および磁気(例えば、酸化鉄)ナノ粒子からなる群より選択される標識により検出可能に標識される、請求項33~36の1項に記載のイメージング剤。
- CD103シグナル伝達媒介状態の治療または予防を必要としている個体でそれを行う方法であって、
請求項1~17のいずれか1項に記載の抗CD103抗体またはその抗原結合フラグメントの有効量を前記個体に投与するステップであって、前記抗CD103抗体が、任意選択で、細胞傷害薬に結合されている、ステップを含む、方法。 - 細胞中のCD103シグナル伝達を阻害するための方法であって、
前記細胞を請求項1~17のいずれか1項に記載の抗CD103抗体またはその抗原結合フラグメントと接触させるステップ、を含む、方法。 - 細胞上に存在するE-カドヘリンに対するCD103結合を阻害する方法であって、
前記細胞を請求項1~17のいずれか1項に記載の抗CD103抗体またはその抗原結合フラグメントと接触させるステップ、を含む、方法。 - 個体のCD103発現細胞を枯渇させる方法であって、
請求項1~17のいずれか1項に記載の抗CD103抗体またはその抗原結合フラグメントの有効量を前記個体に投与するステップであって、前記抗CD103抗体が、任意選択で、細胞傷害薬に結合されている、ステップを含む、方法。 - 毛様細胞性白血病、HCLv、腸および腸外リンパ腫、腸疾患関連T細胞性リンパ腫(EATL)、Tリンパ性白血病/リンパ腫(T-ALL)、T細胞性前リンパ球性白血病(T-PLL)、成体T細胞白血病/リンパ腫(ATLL)、菌状息肉腫(MF)、未分化大細胞リンパ腫ALCL、皮膚T細胞性リンパ腫(CTCL)、セザリー症候群(SS)、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、IgM多発性神経障害、重症筋無力症、アトピー性皮膚炎、アレルギー、喘息、全身性炎症反応症候群(SIRS)、敗血症、敗血性ショック、アテローム性動脈硬化症、セリアック病、皮膚筋炎、強皮症、間質性膀胱炎、移植拒絶反応、移植片対宿主病、アイカルディ・グティエール症候群、ハッチンソン・ギルフォード早老症候群、シングレトン・マートン症候群、プロテアソーム関連自己炎症症候群、SAVI(乳児発症STING関連血管炎)、CANDLE(脂肪異栄養症および発熱を伴う慢性非典型的好中球性皮膚疾患)症候群、エリテマトーデス、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、ウェゲナー疾患、炎症性腸疾患(例えば、潰瘍性大腸炎、クローン病)、特発性血小板減少性紫斑病特発性血小板減少性紫斑病、血栓性血小板減少性紫斑病、自己免疫性血小板減少症、多発性硬化症、乾癬、IgA腎症、IgM多発性神経障害、糸球体腎炎、自己免疫性心筋炎、重症筋無力症、血管炎、1型糖尿病、2型糖尿病、シェーグレン症候群、全身症状を伴うX連鎖色素性網状疾患、多発性筋炎、脊椎軟骨内異形成症、および加齢黄斑変性、からなる群より選択される疾患の治療または予防を必要としている個体においてそれを実施する方法であって、
請求項1~17のいずれか1項に記載の抗CD103抗体またはその抗原結合フラグメントの有効量を前記個体に投与するステップであって、前記抗CD103抗体が、任意選択で、細胞傷害薬に結合されている、ステップを含む、方法。
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