JP2023522739A

JP2023522739A - がんワクチンとしてのシトルリン化ヌクレオホスミンペプチド

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Publication number: JP2023522739A
Application number: JP2022564145A
Authority: JP
Inventors: チョウドリー、ラフール; デュラン、リンダ・ジリアン
Original assignee: スキャンセルリミテッド
Priority date: 2020-04-21
Filing date: 2021-04-20
Publication date: 2023-05-31
Also published as: EP4139339A1; US20230173047A1; AU2021259214A1; CN115803337A; KR20230004666A; GB202005779D0; WO2021214022A1; CA3180133A1; BR112022021102A2

Abstract

本発明は、がん免疫療法に使用できる修飾ヌクレオホスミンペプチドに関する。改変ペプチドは、ワクチンとして、又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）及び養子Ｔ細胞移入療法の標的として使用できる。そのようなワクチン又は標的は、がんの治療に使用できる。

Description

本発明は、がんの免疫療法に使用できる修飾ヌクレオホスミンペプチドに関する。修飾ペプチドは、ワクチンとして、又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）及び養子Ｔ細胞移入療法の標的として使用できる。そのようなワクチン又は標的は、がんの治療に使用できる。

効果を発揮するためには、がんワクチンは、耐性を打ち破ることができ、免疫抑制性の腫瘍環境を克服できる強力な免疫応答を誘導する必要がある。最近、腫瘍破壊を媒介するＣＤ４Ｔ細胞の重要性が強調されているが、自己特異的なＣＤ４応答の誘導は困難であることが証明されている。これに対して、修飾された自己エピトープを認識するＣＤ４Ｔ細胞は、関節リウマチ（ＲＡ）、コラーゲンＩＩ誘発関節炎、サルコイドーシス、セリアック病及び乾癬などのいくつかの自己免疫疾患の病態生理学において役割を果たすことが示されている（Choy 2012；Grunewald and Eklund 2007；Coimbra et al. 2012；Holmdahl et al. 1985）。これらに共通する修飾の１つは、アルギニンのシトルリン化で、これには、アルギニンの正電荷のアルジミン基（＝ＮＨ）からシトルリンの中性電荷のケトン基（＝Ｏ）への変換が含まれる。シトルリン化は、さまざまな組織で見られるカルシウム依存性酵素であるペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）によって媒介される。Irelandら（Ireland and Unanue 2011）による最近の報告では、抗原提示細胞（ＡＰＣ）のシトルリン化Ｔ細胞エピトープの提示は、オートファジー及びＰＡＤ活性に依存することが実証されている。この工程は、プロフェッショナルＡＰＣや上皮細胞上のＭＨＣクラスＩＩ分子に提示するための内因性抗原の処理を可能にする効率的なメカニズムであることが実証されている（Munz 2012；Schmid, Pypaert, and Munz 2007）。オートファジーはＡＰＣでは構成的であるが、他の細胞ではストレスによってのみ誘導される（Green and Levine 2014）。シトルリン化エピトープを認識するＴ細胞は、シトルリン化ペプチドを発現しない正常な細胞を標的とはしない。オートファジーは、低酸素症や栄養飢餓といったストレスによって引き起こされ、アップレギュレートされて腫瘍の生存を促進する（Green and Levine 2014）。

核小体リンタンパク質Ｂ２３、Ｎｏ３８又はヌマトリンとしても公知のヌクレオホスミン（ＮＰＭ）は、最初に核小体の顆粒領域において高レベルで発現する核小体リンタンパク質として特定された（Kang, Olson, and Busch 1974；Kang et al. 1975；Grisendi et al. 2006）。ＮＰＭは至る所で発現し、細胞成長、増殖及び形質転換の調節において役割を果たし（Feuerstein, Chan, and Mond 1988）；その発現は有糸分裂刺激に応答して急速に増加し、高度に増殖している悪性細胞で多くのタンパク質が検出できる（Chan et al. 1989）。ＮＰＭは、多くの細胞活動に関与する多機能タンパク質であり、細胞内での増殖と成長抑制の役割に関係している。ＮＰＭ１遺伝子への関心（Liu and Chan 1993）の多くは、これがヒトでの腫瘍形成に関与しているためである。ＮＰＭの過剰発現は、制御されていない細胞増殖と細胞の形質転換と相関するが、ＮＰＭ発現の中断は、ゲノムの不安定性と中心体の増幅を引き起こし、細胞形質転換のリスクを高める。ＮＰＭは、さまざまな組織学的起源の固形腫瘍で頻繁に過剰発現し（Tanaka et al. 1992；Nozawa et al. 1996；Shields et al. 1997；Subong et al. 1999；Tsui et al. 2004；Skaar et al. 1998；Bernard et al. 2003）、ＮＰＭ１遺伝子座は染色体転座に関与するか、さまざまな種類の血液悪性腫瘍及び固形腫瘍で欠失している（Redner et al. 1996；Morris et al. 1994；Yoneda-Kato et al. 1996；Falini et al. 2005；Mendes-da-Silva et al. 2000）。ＮＰＭ１は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）で最も頻繁に変異する遺伝子の１つで、約３５％の患者で変異があり、白血病芽球の細胞質に異常に局在することが判明している。

ＮＰＭは高度に保存され、至る場所で発現する約３５ｋＤａのリンタンパク質で、主に核小体に局在するが、核と細胞質の間を移動できる（Borer et al. 1989；Yun et al. 2003）。ＮＰＭの移動活性とその適切な細胞内局在は、細胞の恒常性に重要な可能性がある。細胞コンパートメント間を移動することで、ＮＰＭはリボソーム前粒子の輸送、リボソーム生合成、小さな塩基性タンパク質の核小体への輸送の補助、ストレス刺激（紫外線照射及び低酸素）に対する応答、ゲノムの安定性の維持及びＤＮＡ転写の調節を含むさまざまな細胞の作用に関与する。（ＳＥＮＰ３及びＳＥＮＰ５による）ＳＵＭＯ（小さなユビキチン様修飾因子（small ubiquitin-like modifier））化での制御は、タンパク質の調節と細胞機能の別の側面である。ＮＰＭは、ｐ５３やＡＲＦといった重要な腫瘍抑制因子の活性と安定性の調節にも関与している。

ＮＰＭは、核小体リボ核タンパク質構造と関係しており、一本鎖及び二本鎖の核酸と結合できるが、Ｇ-四重鎖（グアニンリッチな配列の核酸で形成される二次構造）を形成する核酸に優先的に結合する。ＮＰＭは、タンパク質や核酸の分子シャペロンとしても機能する（Hingorani, Szebeni, and Olson 2000；Szebeni and Olson 1999；Okuwaki et al. 2001）。ＮＰＭは、ヌクレオホスミン（Ｎｐ）として知られるタンパク質の核シャペロンファミリーに属し、これらは全て保存されたＮ末端領域を共有している。さまざまなタンパク質の基質を使用したin vitro実験では、ＮＰＭが細胞環境でのタンパク質の凝集防止に有効で（Szebeni and Olson 1999）、ヒストンアセンブリ、ヌクレオソームアセンブリ及びアセチル化依存転写の増加が可能なヒストンシャペロンとして機能することが示されている（Okuwaki et al. 2001；Swaminathan et al. 2005）。

ＮＰＭの最も一般的な形態はＮＰＭ１．１（Ｂ２３．１とも呼ばれる）である。ＮＰＭ１．３（Ｂ２３．２とも呼ばれる）及びＮＰＭ１．２と称する２つの選択的スプライシングアイソフォームも存在する。ＮＰＭ１．２の機能は不明である。ＮＰＭ１．１は、全ての組織で最も一般的な形態である（Chang and Olson 1990；Wang, Umekawa, and Olson 1993）。天然の条件では、ＮＰＭはオリゴマーとして存在するが（Herrera et al. 1996）、５量体及び１０量体も形成できる（Namboodiri et al. 2004）。

ＮＰＭが関与する細胞活動の多様性により、それは潜在的ながん遺伝子及び潜在的な腫瘍抑制因子になる。ＮＰＭの発現及び／又は局在化の緩和は、さまざまなメカニズムで腫瘍形成に寄与する可能性がある。ＮＰＭタンパク質はさまざまな腫瘍で過剰発現しており、胃がん（Tanaka et al. 1992）、結腸がん（Nozawa et al. 1996）、卵巣がん（Shields et al. 1997）及び前立腺がん（Subong et al. 1999）のマーカーとして提案されている。場合によっては、ＮＰＭの発現量が腫瘍の進行ステージと相関している。例えば、ＮＰＭｍＲＮＡの過剰発現は、独立して、膀胱がんの再発及び疾患の次のステージへの進行に関連している（Tsui et al. 2004）。プロテオミクス解析により、ＮＰＭは、ヒト乳がん細胞における後天的エストロゲン非依存性に関連するエストロゲン調節タンパク質であることが確認され（Skaar et al. 1998）、ＮＰＭ発現の状態が特定の病態生理学的な特徴と相関する可能性があることが示唆された。

ＮＰＭは、核小体因子、転写因子、ヒストン、細胞増殖に関与するタンパク質を含む異なる細胞コンパートメント内の多くのパートナーと結合し、発がんストレスに応答できる。タンパク質の翻訳後修飾は、細胞ストレス下で生じ、そのような修飾の１つには、酵素ペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）によるアルギニン残基のシトルリンへの変換であるシトルリン化が含まれる。シトルリン化は、ストレスを受けた細胞で誘導される分解及びリサイクル工程（オートファジー）の結果として生じる（Ireland and Unanue 2011）。シトルリン化エピトープは、その後、ＣＤ４Ｔ細胞による認識のためＭＨＣクラスＩＩ分子上に提示される。シトルリン化タンパク質に応答して解き放たれた強力な免疫応答を利用して、がん細胞を破壊するように方向転換できる。この免疫応答は、大量のＩＦＮγを分泌するキラーＣＤ４Ｔ細胞によって媒介される。これは、ＭＨＣクラスＩＩの発現を増加させ、ＣＤ８Ｔ細胞の関与を必要とせずに、腫瘍細胞を直接殺す（Brentville et al. 2016；Durrant, Metheringham, and Brentville 2016）。腫瘍の認識は、シトルリン化及びオートファジーに依存する。多数のＩＦＮγを分泌するＣＤ４Ｔ細胞が、細胞骨格タンパク質であるビメンチンに由来する２つのシトルリン化ペプチドでマウスを免疫化した後に誘導されることが示されている。ex vivoで、これらのＣＤ４Ｔ細胞は、飢餓又はラパマイシンによってオートファジーが誘導された腫瘍細胞を認識する。腫瘍におけるビメンチンの機能と発現は、国際公開第2014/023957号に詳述されている。

ＮＰＭ１遺伝子の末端エクソンにおけるヘテロ接合変異の発見以降、ＮＰＭに多くの関心が向けられている。ＮＰＭ１遺伝子は染色体５ｑ３５にマッピングされ、選択的スプライシングにより３つのアイソフォームとして発現する。ＮＰＭ１．１（P06748-1）（２９４残基）が最も多く、核小体に局在している。アイソフォームＮＰＭ１．２（P06748-2）はフレーム内のエクソン（エクソン８）を欠くので、内部セグメント（残基１９５－２２３）が欠落しており、ＮＰＭ１．１より短いタンパク質である。ＮＰＭ１．３（P06748-3）は、３’末端で別のエクソンを使用するため、ＮＰＭ１．１の最後の３５アミノ酸を欠く短いタンパク質構築物となり（Wang, Umekawa, and Olson 1993）；このアイソフォームの発現は低レベルで、核質に局在している。最も多いＮＰＭ１．１アイソフォーム（ＮＰＭ１）は、全ての組織で発現している。

ＮＰＭ１遺伝子は、多くの腫瘍においてアップレギュレートされ、変異し、染色体転座しており；染色体異常は、非ホジキンリンパ腫、急性前骨髄球性白血病、骨髄異形成症候群及び急性骨髄性白血病の患者で発見されている（Falini et al. 2007）。ＮＰＭ変異の大部分は、最終的にアミノ酸数２９４のＮＰＭタンパク質の２８８位又は２９０位のトリプトファン残基に影響を与える（Duployez et al. 2018）。半数を超える変異は、正常な核型にも関連する（Duployez et al. 2018）。しかし、成人非ホジキンリンパ腫の２～８％を占める未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）とＡＭＬの数例では、ＮＰＭ遺伝子は他の遺伝子と共に転座する（Jairajpuri et al. 2014）。ＡＣＬでは、２番染色体のＡＬＫが５番染色体のＮＰＭと融合しており、また、ＡＭＬ転座の症例の１％未満で、３番染色体と５番染色体の融合のため、ＮＰＭＭＬＦ１（骨髄異形成／骨髄性白血病因子１）という名称のキメラ遺伝子が生成する（Falini et al. 2007）。これまで３例のみに影響を与えた急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）における非常にまれな転座は、ＮＰＭ１遺伝子とレチノイン酸受容体α遺伝子（ＲＡＲα）の融合が関与している（Falini et al. 2007）。ＮＰＭ１のヘテロ接合マウスは、腫瘍が発生しやすい。ＮＰＭは、異なる組織学的起源のさまざまな固形腫瘍（前立腺（Leotoing et al. 2008）、肝臓（Yun et al. 2007）、甲状腺（Pianta et al. 2010）、結腸（Nozawa et al. 1996）、胃（Tanaka et al. 1992）、すい臓（Zhu et al. 2015）、神経膠腫及び神経膠芽腫（Chen et al. 2015；Holmberg Olausson et al. 2015）、星状細胞腫（Kuo et al. 2015）等）でも頻繁に過剰発現しており、多くの場合、その過剰発現は有糸分裂指数及び転移と相関している。このように、ＮＰＭはさまざまな固形がん及び血液がんで発現するため、ワクチンの非常に魅力的な標的である。さらに、変異バージョンに対して特異的な抗体が存在するため、ＮＰＭ標的療法の恩恵を受ける可能性のある患者を特定するための診断が可能である。

ＮＰＭは、ＡＫＴ１（Lee et al. 2008）、ＢＡＲＤ１（Sato et al. 2004）、ＢＲＣＡ１（Sato et al. 2004）及びヌクレオリン（Li et al. 1996）と相互作用することが示され、複数の結合パートナー（Lindstrom 2011）がある。ＮＰＭ１の発現が低レベルの場合、ＮＰＭ１は中心体の複製を阻害することによって腫瘍成長を抑制できるものの、ＮＰＭ１は、腫瘍抑制因子ｐ５３／ＡＲＦ経路の不活性化により腫瘍成長を促進できると考えられている。

ＮＰＭは、血清飢餓又は抗がん剤による治療中に、リン酸化された核質に移行する可能性がある。ＮＰＭは、血液悪性腫瘍及び固形悪性腫瘍の治療の有望な標的である。過去１０年で、ＮＰＭ１を標的とする分子が発見され、その効果と治療の可能性が検討された。ＮＰＭ標的化合物をさまざまな化学療法剤と組み合わせて投与し、又はＮＰＭ標的化合物による治療と放射線療法と組み合わせると、多くの場合に顕著な相乗効果が観察され、これは、ＮＰＭを妨害するとがん細胞が敏感になる可能性があることを示唆している。NSC348884、Rev37-47、1A1 ＲＮＡアプタマー、CIGB-300、アブラインビラミド、全トランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）、YTR107及びNucAnt 6L（Ｎ６Ｌ）は、in vitro又は臨床で試験されたＮＰＭ結合化合物である（Di Matteo et al. 2016）。NSC348884や1A1 ＲＮＡアプタマーなどの一部の化合物はＮＰＭのオリゴマー化を妨げ、タンパク質を不安定にし（Qi et al. 2008；Jian et al. 2009）、Rev37-47及びアブラインビラミドとＮＰＭの直接結合はその機能を妨げる（Wulff, Siegrist, and Myers 2007；Szebeni, Herrera, and Olson 1995）。ＡＴＲＡはＡＰＬの主要な治療選択肢の１つであり（Lo-Coco et al. 2013）、in vitroの実験では、ＮＰＭの変異型はＡＴＲに結合後にプロテアソーム分解を受けることが示唆されている（Martelli et al. 2015；Di Matteo et al. 2016）。YTR107は、ＤＮＡ修復メカニズムを妨害することにより、ＮＰＭを介してがん細胞の放射線増感を誘導できる（Di Matteo et al. 2016；Sekhar et al. 2014）。メカニズムの経路は異なるが、これらの化合物とＮＰＭの結合の最終的な結果は、in vitroでのがん細胞のアポトーシスであった。これまで、２つの化合物（ＮＰＭリン酸化阻害剤であるCIGB-300、及びNucant N6L（リジン及びアルギニン残基に富む））の臨床試験が行われている。ＮＰＭを標的とするがん細胞アポトーシスの詳細なメカニズムはまだ解明されていないが、これまでの証拠は、ＮＰＭを標的とする化合物が、がん治療の有望な標的であることを示唆している。

細胞ストレスやＤＮＡ損傷の下では、Ｐ５３遺伝子が活性化される。Tanikawaらは、Ｐ５３によるＰＡＤ４のトランス活性化がＮＰＭシトルリン化につながることを示した（Tanikawa et al. 2009）。ＰＡＤ４及びＮＰＭはいずれも一般に核ベースであり、ＰＡＤ４をＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトすると、核小体から核質へのＮＰＭの局在化が生じ、このことは、核内でＰＡＤ４によるＮＰＭシトルリン化が生じることを示している（Tanikawa et al. 2009）。並行して、ＮＰＭを全細胞溶解物から免疫沈降させ、質量分析も行った。１９７位にシトルリンを含むＢ細胞エピトープが同定された。次に、これを使用して抗体を生成した（Tanikawa et al. 2009）。我々の結果は、残基１９７にシトルリンを含むペプチドはＴ細胞応答を誘導できなかったことを実証し、したがって、これがＢ細胞エピトープであることを確認している。対照的に、本発明では、新規なシトルリン化位置を含むＮＰＭペプチドは、抗腫瘍免疫をもたらす強力なＴ細胞応答を示す。

本発明の第一の側面によれば、
(i) アミノ酸配列ＡＫＦＩＮＹＶＫＮＣＦＲＭＴＤ（式中、アルギニン（Ｒ）残基はシトルリンに置換されている）、又は
(ii) アルギニン以外の位置で、１、２若しくは３個のアミノ酸が置換され、１、２若しくは３個のアミノ酸が挿入され、及び／又は、１、２若しくは３個のアミノ酸が欠失されているi) のアミノ酸配列、
を含む、から本質的になる、又は、からなる、シルトリン化Ｔ細胞抗原が提供される。

本発明者らは、腫瘍細胞上で発現し、アルギニンがシトルリンに置換されたＮＰＭに由来する抗原に対するＴ細胞応答を増強できることを、思いがけなく発見した。さらに、シトルリン含有ペプチドは、腫瘍ワクチン、並びにＴ細胞受容体（ＴＣＲ）及び養子Ｔ細胞移入療法を含むがこれらには限定されないＴ細胞ベースの治療法の開発を可能する。

本発明のＴ細胞抗原はＭＨＣクラスＩＩ抗原の可能性があり、すなわち、ＭＨＣクラスＩＩ分子と複合体を形成し、ＭＨＣクラスＩＩ分子上に提示される。当業者は、当該ポリペプチドの存在下でＭＨＣ分子がリフォールディングされ得るかどうかを確認することで、ポリペプチドがＭＨＣと複合体を形成するかどうかを決定できる。ポリペプチドがＭＨＣと複合体を形成しない場合、ＭＨＣは正しくリフォールディングされない。リフォールディングは、通常、折り畳まれた状態のＭＨＣのみを認識する抗体を使用して確認される。詳細は、Garboczi, Hung, and Wiley 1992に記載されている。

抗原中のアルギニン残基は全てシトルリンに変換されていてもよい。あるいは、抗原中のアルギニン残基の１、２、３又は４個がシトルリンに変換されていてもよく、残りは変換されない。したがって、本発明の抗原は、１、２、３又は４個のシトルリン残基を有していてもよい。本発明の抗原は、アミノ酸長が最大で２５であってもよい。それらのアミノ酸長は、少なくとも５であってもよく、１８、１９、２０、２１、２２、２３又は２４以下であってもよい。本発明のＴ細胞抗原は、腫瘍に関連していてもよく、腫瘍に対する免疫応答を刺激してもよい。

健常者及びＨＬＡトランスジェニックマウスでは、ＮＰＭペプチドによる刺激後に、シトルリン化ＮＰＭペプチドを認識したＴ細胞がＩＦＮγを産生し、検出されることを、本発明者らは示した。彼らは、特定のシトルリン化ＮＰＭペプチドがin vivoでＴ細胞応答を生み出し、そのため、がん治療のワクチンとして使用できることも示した。本発明者らは、B16F1cDP4PAD2KO担癌マウスでは抗腫瘍応答が消失したことを示した。これは、in vivoでの腫瘍細胞におけるアルギニン２７７のシトルリン化及び抗腫瘍効果に、ＰＡＤ２が重要であること実証する。これらの結果は、ＰＡＤ４はＮＰＭの発現を調節するために核内のさまざまな残基をシトルリン化するのに対し、主に細胞質で発現するＰＡＤ２はＭＨＣ－ＩＩ提示のためのＮＰＭのシトルリン化に関与することを示す。

本発明のＴ細胞抗原は、
i) 以下のアミノ酸配列：
ＡＫＦＩＮＹＶＫＮＣＦＲＭＴＤＱＥＡＩＱ
ＬＰＫＶＥＡＫＦＩＮＹＶＫＮＣＦＲＭＴＤ
（式中、アルギニン（Ｒ）残基はシトルリンに置換されている）
の１つ以上、又は
ii) アルギニン以外の位置で、１、２若しくは３個のアミノ酸が置換され、１、２若しくは３個のアミノ酸が挿入され、及び／又は、１、２若しくは３個のアミノ酸が欠失されているi) のアミノ酸配列の１つ以上、を含んでいてもよいか、から本質的になってもよいか、又は、からなってもよい。抗原は、非アルギニン位置での置換、挿入及び置換から選択される合計１、２、３、４又は５個のアミノ酸が修飾されていてもよい。ii) のＴ細胞抗原は、好ましくは、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、肺、結腸直腸、腎臓、乳房、卵巣及び肝臓の腫瘍を含むがこれらには限定されない腫瘍に対する免疫応答を増強できる。

本発明のＴ細胞抗原は、
i) 以下のアミノ酸配列：
ＡＫＦＩＮＹＶＫＮＣＦ－ｃｉｔ－ＭＴＤ（ＮＰＭ２６６－２８０）
ＡＫＦＩＮＹＶＫＮＣＦｃｉｔＭＴＤＱＥＡＩＱ（ＮＰＭ２６６－２８５）
ＬＰＫＶＥＡＫＦＩＮＹＶＫＮＣＦｃｉｔＭＴＤ（ＮＰＭ２６１－２８０）
（ｃｉｔはシトルリンを表す）、
の１つ以上、又は
ii) シトルリン以外の位置で、１、２若しくは３個のアミノ酸が置換され、１、２若しくは３個のアミノ酸が挿入され、及び／又は１、２若しくは３個のアミノ酸が欠失されているi) のアミノ酸配列、
を含む、から本質的になる、又はからなることが好ましい。

本発明者らは、予期せず、ＮＰＭ由来のシトルリン化ペプチドが、ＡＭＬ、肺、結腸直腸、腎臓、乳房、卵巣及び肝臓の腫瘍を含むがこれらに限定されない腫瘍に対する免疫応答を増強するために使用できることを見いだした。本発明者らは、
ＬＰＫＶＥＡＫＦＩＮＹＶＫＮＣＦｃｉｔＭＴＤ－２７７位がシトルリン化されたＮＰＭ２６１－２８０
ＡＫＦＩＮＹＶＫＮＣＦｃｉｔＭＴＤＱＥＡＩＱ－２７７位がシトルリン化されたＮＰＭ２６６－２８５
が、in vivoでシトルリン化ＮＰＭエピトープに対して抗腫瘍免疫応答を生み出したことを示した。これらの２つのペプチドはマウスと相同であることから、非自己として認識されない。

シトルリン化ペプチドは、共通のＨＬＡ－ＤＲ４モチーフを有する自己免疫患者で、Ｔ細胞応答を刺激することが知られている。これに対して、本発明者らは、２７７位がシトルリン化されたＮＰＭ２６６－２８５や２７７位がシトルリン化されたＮＰＭ２６１－２８０などのシトルリン化ＮＰＭペプチドが、ＨＬＡ－ＤＰ４及びＤＲ４トランスジェニックマウスで、Ｔ細胞応答を強力に刺激できることを初めて示した。２７７位がシトルリン化されたＮＰＭ２６６－２８５に対する応答を示す健常者は全て、ＨＬＡ－ＤＰ４を発現していた。さらに、ドナーのうちの２人はＨＬＡ－ＤＲ４も発現していた。このため、これは、広範な集団で、血液腫瘍及び固形腫瘍の治療に有望なワクチンとなる。２７７位がシトルリン化されたＮＰＭ２６６－２８５に対する応答は最も強力であり、未修飾の野生型配列に対する反応性は最小限であった。このシトルリン化ペプチド抗原を認識するＴ細胞は、腫瘍細胞を標的とし、in vivoで強力な抗腫瘍効果を引き出せるため、がん治療のワクチンとしてのシトルリン化ＮＰＭ２６６－２８５ｃｉｔを使用する最初の証拠を提供する。ＭＨＣ－ＩＩを発現する腫瘍に対し、２７７位がシトルリン化されたＮＰＭ２６１－２８０で強い抗腫瘍応答があったが、ＭＨＣ－ＩＩを発現できない腫瘍に対する応答は、はるかに弱かった。これは、ＭＨＣ－ＩＩ陰性腫瘍では、ＣＤ４Ｔ細胞はＣＤ８及び／又はＮＫ応答に対するバイスタンダー効果によって抗腫瘍応答を誘導できることを示唆するが、腫瘍がＭＨＣ－ＩＩを発現する場合の優れた抗腫瘍反応は、ＣＤ４Ｔ細胞が腫瘍を直接殺すこともできることを示唆する。

ＭＨＣクラスＩＩ抗原処理経路は、外因性抗原の細胞内移行とプロセッシング、各ＭＨＣクラスＩＩ分子のペプチド結合モチーフ、ＭＨＣクラスＩＩ：ペプチド複合体の輸送と安定性など、多くの要因の影響を受ける可能性がある。ＭＨＣクラスＩＩのペプチド結合溝は両端が開いており、ＭＨＣクラスＩ分子と比較して、ペプチドの長さによる制約が少ない。ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するペプチドのアミノ酸長は１３～２５で、通常、ＭＨＣ分子から突き出ている（Kim et al. 2014；Sette et al. 1989）。これらのペプチドには、コア領域と呼ばれる連続する９アミノ酸が含まれている。これらのアミノ酸のいくつかは、ペプチド結合溝と直接相互作用する（Andreatta et al. 2017）。コアペプチドの両側のアミノ酸は、ペプチド結合溝から突き出ており；これらはペプチドフランキング領域として知られている。それらは、ペプチド結合とその後のＴ細胞との相互作用に影響を与える可能性もある（Arnold et al. 2002；Carson et al. 1997；Godkin et al. 2001）。ＭＨＣクラスＩＩペプチドの長さにより、例えば１５～２０ｍｅｒの長いペプチドをスクリーニングに使用できるようになる。例えば、ＮＰＭでは、これには７１×１５ｍｅｒの重複ペプチドが必要で；これらは全２９４アミノ酸をカバーし、１１アミノ酸が重複している。（あるいは、１５個が重複する２０ｍｅｒを使用した場合、５６×２０ｍｅｒのペプチドが必要である。）これら７１のペプチドのうち、２８はアルギニン残基を含む。２８のペプチドをスクリーニングするために、これらを小さなペプチドプールと組み合わせて、in vitroでのアッセイに組み込むか、in vivoでのマウス免疫実験に使用できる。この種のスクリーニングは、何百ものペプチドをスクリーニングするためのネオエピトープ個別化ワクチンのデザインにおける標準である。例えば、Liuらは、上皮性卵巣がん患者のネオアンチゲンに対する応答を調査した（Liu et al. 2019）。彼らは７５のペプチドをスクリーニングし、Ｔ細胞応答を刺激する２７のペプチドを見いだした。Bobisseらは、７７６のペプチドをスクリーニングし、Ｔ細胞応答を刺激する１５（２％）のペプチドを見いだした（Bobisse et al. 2018）。

より長い２０ｍｅｒペプチドは、ネステッドＭＨＣＩ拘束エピトープも含めることができ、ＭＨＣクラスＩＩ及びＭＨＣクラスＩ拘束ＣＤ４Ｔ細胞及びＣＤ８Ｔ細胞応答の両者を識別するために使用されているので、この方法は、ＭＨＣクラスＩペプチドを識別する実行可能なアプローチでもある。個々のがん患者のがんワクチンネオアンチゲンを特定するためにこのような方法が使用されていることを考えると、この方法は、腫瘍がシトルリン化抗原を発現する広範ながん患者を治療するワクチンを開発するために、単一の抗原に対しても同様に実行可能で正当なアプローチである。これには、異なるＭＨＣクラスＩＩに結合するエピトープを確認するために、複数のドナーでの試験が必要で、ＭＨＣクラスＩ分子が識別される。同じ７１×１５ｍｅｒ又は５６×２０ｍｅｒの重複ペプチドが、個々に、又は各ドナーのプールで使用される。

ＭＨＣクラスＩＩ分子は高度に多形であり、ペプチド結合モチーフは、複数のＭＨＣクラスＩＩ分子に結合できることが確認されている多様なペプチドで非常に縮重している（Consogno et al. 2003）。ペプチド結合に重要なアミノ酸は、ＭＨＣクラスＩＩ：ペプチド複合体の結晶学研究で特定されている（Corper et al. 2000；Dessen et al. 1997；Fremont et al. 1996；Ghosh et al. 1995；Latek et al. 2000；Li et al. 2000；Lee, Wucherpfennig, and Wiley 2001；Brown et al. 1993；Smith et al. 1998；Stern et al. 1994；Scott et al. 1998；Fremont et al. 1998）。これらの研究は、Ｐ１、Ｐ４、Ｐ６及びＰ９は常にＭＨＣを向き、Ｐ－１、Ｐ２、Ｐ５、Ｐ８及びＰ１１は常にＴＣＲを向いていることを示す。ＨＬＡ－ＤＲ及びＨＬＡ－ＤＰアレルの頻度を表１に示す（Thomsen and Nielsen 2012；Gonzalez-Galarza et al. 2015）。

対照的に、ＭＨＣクラスＩ分子は、より拘束されたペプチド結合特性を示す。ＭＨＣクラスＩとの結合に重要なアミノ酸は、既知の天然結合ペプチドを分析する予測アルゴリズムでも特定されており（Jurtz et al. 2017）、（ＨＬＡ－Ｂ^＊０８０１を除き）Ｐ２及びＰ９は、結合アンカー残基として作用するＭＨＣに向いていることが示された。

ヌクレオホスミンの最も一般的な形態はＮＰＭ１．１である。ＮＰＭ１．３及びＮＰＭ１．２と呼ばれる２つの選択的スプライシングアイソフォームもあり、ＮＰＭ１．１は全ての組織で一般的な形態である。ペプチドＬＰＫＶＥＡＫＦＩＮＹＶＫＮＣＦＲＭＴＤ（２６１－２８０）及びＡＫＦＩＮＹＶＫＮＣＦＲＭＴＤＱＥＡＩＱ（２６６－２８５）は、ＮＰＭ１．１（Ｂ２３．１）及びＮＰＭ１．３（Ｂ２３．２）でのみ、見いだされている。したがって、２７７位がシトルリン化されたＮＰＭ２６１－２８０及び２６６－２８５、並びにそれらをコードする核酸は、ＮＰＭの最も一般的な形態（ＮＰＭ１．１）を標的とするために使用できる。ＮＰＭ１．３では、対応するペプチドは２３２－２５１及び２３７－２５６に位置し、２４８位でシトルリン化されている。

ＮＰＭは、遺伝子がクローン化された種（ニワトリ、マウス、イヌ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ブタ及びヒト）間で高度に保存されている。したがって、本発明の抗原は、場合によってはそのような抗原をコードする配列を含む核酸と組み合わせて、非ヒト哺乳動物のがんの治療に使用できる。

本発明は、その範囲内に、上記アミノ酸配列を有するペプチド、及びそれに対して実質的な同一性、例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９９％の同一性を有する配列、並びに医学における、特にがんの治療方法におけるそれらの使用も含む。このようなペプチドは、好ましくは、ＡＭＬ、肺、結腸直腸、腎臓、乳房、卵巣及び肝臓の腫瘍を含むがこれらには限定されない腫瘍に対する免疫応答を増強できる。２つのアミノ酸配列又は２つの核酸配列の同一性の割合は、一般に、最適な比較目的（例えば、第２の配列との最適なアラインメントのために第１の配列にギャップを導入できる）で配列をアラインメントさせ、対応する位置のアミノ酸残基又はヌクレオチド残基を比較することによって求められる。「最適なアラインメント」とは、最高の同一性の割合をもたらす２つの配列のアラインメントである。同一性の割合は、配列内の同一のアミノ酸残基又はヌクレオチド残基の数を比較する（すなわち、同一性の割合（％）＝同じ残基の位置の数／残基の総数 × １００）ことで求められる。

２つの配列間の同一性の割合は、当業者に公知の数学的アルゴリズムを使用して実行できる。２つの配列を比較する数学的アルゴリズムの例は、KarlinとAltschulのアルゴリズム（Karlin and Altschul 1993）である。AltschulらのＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラムには、このようなアルゴリズムが組み込まれている（Altschul et al. 1990）。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラム（スコア＝１００、文字列長＝１２）を用いて実行し、本発明の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム（スコア＝５０、文字列長＝３）を用いて実行し、本発明のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較のためにギャップのあるアラインメントを取得するには、ＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴがAltschul et al. 1997に記載されているように利用できる。あるいは、ＰＳＩ－Ｂｌａｓｔを利用して、分子間の遠い関係を検出する反復検索を実行できる。ＢＬＡＳＴ、ＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴ及びＰＳＩ－Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例．ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータが使用できる。http://www.ncbi.nlm.nih.govを参照。配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの別の例は、MyersとMillerのアルゴリズム（Myers and Miller 1989）である。ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）には、このようなアルゴリズムが組み込まれている。当技術分野で知られている配列分析のための他のアルゴリズムには、Torelli and Robotti 1994に記載のＡＤＶＡＮＣＥとＡＤＡＭ、及びPearson and Lipman 1988に記載のＦＡＳＴＡが含まれる。ＦＡＳＴＡでは、ｋｔｕｐは検索の感度と速度を設定する制御オプションである。

アミノ酸置換とは、アミノ酸残基が同じ位置で置換アミノ酸残基に置換されることを意味する。挿入されたアミノ酸残基は、任意の位置に挿入されてもよく、挿入されたアミノ酸残基の一部又は全部が互いに直接隣接するように挿入されてもよいか、又は、挿入されたアミノ酸残基のいずれも別の挿入されたアミノ酸残基に直接隣接しないように挿入されてもよい。

本発明の抗原は、そのＣ末端及び／又はＮ末端に１つ、２つ又は３つの追加のアミノ酸を含んでいてもよい。本発明の抗原は、１つのアミノ酸の置換及び１つのアミノ酸の挿入、１つのアミノ酸の置換及び１つのアミノ酸の欠失、又は、１つのアミノ酸の挿入及び１つのアミノ酸の欠失を除く、上述したアミノ酸配列を含んでいてもよい。本発明の抗原は、１つのアミノ酸の置換、１つのアミノ酸の挿入及び１つのアミノ酸の欠失を除く、上述したアミノ酸配列を含んでいてもよい。

挿入アミノ酸及び置換アミノ酸は、天然に存在するアミノ酸であっても、天然に存在しないアミノ酸であってもよく、例えば天然に存在しない側鎖を含んでいてもよい。このような変更されたペプチドリガンドは、Douat-Casassus et al. 2007；Hoppes et al. 2014及びそれらの参考文献で更に説明されている。２つ以上のアミノ酸残基が置換され、及び／又は挿入される場合、置換／挿入されるアミノ酸残基は互いに同じであっても異なっていてもよい。各置換アミノ酸は、置換されるアミノ酸とは異なる側鎖を有していてもよい。

好ましくは、本発明の抗原は、ＭＨＣ分子のペプチド結合溝でＭＨＣに結合する。一般に、上述したアミノ酸の修飾は、ペプチドがＭＨＣに結合する能力を損なわない。好ましい態様では、アミノ酸の修飾は、ペプチドがＭＨＣに結合する能力を改善する。例えば、ペプチドをＭＨＣに固定する位置で変異させることができる。そのような位置及びこれらの位置での好ましい残基は、当技術分野で公知である。

本発明の抗原は、免疫応答を誘発するために使用されてもよい。このような場合は、「オフターゲット」免疫応答に関連する可能性のある望ましくない副作用の危険性を回避するために、免疫応答は意図した標的に対して特異的であることが重要である。したがって、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列は、他のタンパク質、特に他のヒトタンパク質に由来するペプチドのアミノ酸配列と一致しないことが好ましい。当業者は、既知のタンパク質配列のデータベースを検索して、本発明による抗原が別のタンパク質に存在するかどうかを確認する方法を理解している。

本発明の抗原は、固相合成法としても知られるメリフィールド合成法、又は他のペプチド合成法で容易く合成できる。ＧＭＰグレードのポリペプチドは、Multiple Peptide Systems, San Diego, CAによる固相合成技術で製造する。あるいは、ペプチドは、必要に応じて、当技術分野で公知の方法で組換えにより製造してもよい。このような方法は、通常、発現されるポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクターを使用して、ポリペプチドを、例えば、細菌、酵母、昆虫又は哺乳類の細胞中のin vivoで発現させることを含む。あるいは、in vitro無細胞系を使用してもよい。このような系は当技術分野において公知で、例えばLife Technologies、Paisley、英国から市販されている。抗原は、単離されてもよく、及び／又は実質的に純粋な形態で提供されてもよい。例えば、それらは、他のポリペプチド又はタンパク質を実質的に含まない形態で提供されてもよい。本発明のペプチドは、Ｆｍｏｃ化学又は当業者に公知の他の標準技術を使用して合成してもよい。

第二の側面では、本発明は、第一の側面の抗原とＭＨＣ分子の複合体を提供する。好ましくは、抗原は、ＭＨＣ分子のペプチド結合溝に結合する。ＭＨＣ分子はＭＨＣクラスＩＩであってもよい。ＭＨＣクラスＩＩ分子は、ＨＬＡ－ＤＲ４、ＤＲ１、ＤＰ４、ＤＰ２、ＤＰ５、ＤＱ２、ＤＱ３、ＤＱ５及びＤＱ６などの、ＤＰ、ＤＲ又はＤＱアレルであってもよい。

本発明の抗原及び複合体は、単離された形態、及び／又は実質的に純粋な形態であってもよい。例えば、抗原及び複合体は、他のポリペプチド又はタンパク質を実質的に含まない形態で提供されてもよい。本発明の文脈において、用語「ＭＨＣ分子」は、ペプチド結合が保持されるという条件で、組換えＭＨＣ分子、天然に存在しないＭＨＣ分子、及びその誘導体又は多様体を含むＭＨＣの機能的に等価な断片を含むことに留意されたい。例えば、ＭＨＣ分子は、固体支持体に結合した、可溶性の形態の、及び／又は多量体の形態の、治療部分に融合されていてもよい。

本発明の抗原が複合体を形成できる可溶性の組換えＭＨＣ分子の製造方法は、当該技術分野で公知である。適切な方法には、大腸菌細胞又は昆虫細胞による発現及び精製が含まれるが、これらには限定されない。あるいは、ＭＨＣ分子は、合成により、又は無細胞系を使用して生成されてもよい。

本発明の抗原及び／又は抗原－ＭＨＣ複合体は、治療効果を引き出すことができる部分と結合してもよい。そのような部分は、免疫原性であることが知られているキャリアタンパク質であってもよい。ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）は、ワクチン組成物に使用される適切なキャリアタンパク質の例である。あるいは、本発明の抗原及び／又は抗原－ＭＨＣ複合体は、融合パートナーと結合してもよい。融合パートナーは、検出目的で、前記抗原若しくはＭＨＣを固体支持体に結合させるために、又はＭＨＣオリゴマー化のために使用してもよい。ＭＨＣ複合体は、例えばＢｉｒＡ酵素を使用してビオチンを付加できるビオチン化部位を組み込んでもよい。他の適切な融合パートナーには、蛍光若しくは発光標識、放射性標識、核酸プローブ及びコントラスト試薬、抗体又は検出可能な産物を産生する酵素が含まれるが、これらには限定されない。検出方法には、フローサイトメトリー、顕微鏡検査、電気泳動又はシンチレーション計数が含まれてもよい。

本発明の抗原－ＭＨＣ複合体は、可溶性の形態で提供されてもよいし、適切な固体支持体との結合で固定化されてもよい。固体支持体の例には、ビーズ、膜、セファロース、磁気ビーズ、プレート、チューブ、カラムが含まれるが、これらには限定されない。抗原－ＭＨＣ複合体は、ＥＬＩＳＡプレート、磁気ビーズ又は表面プラズモン共鳴バイオセンサーチップに結合させることができる。抗原－ＭＨＣ複合体を固体支持体に結合させる方法は、当業者に公知で、例えば、親和性結合対（例．ビオチンとストレプトアビジン又は抗体と抗原）を使用することを含む。好ましい態様では、抗原－ＭＨＣ複合体は、ビオチンで標識され、ストレプトアビジンで被覆された表面に結合している。

本発明の抗原－ＭＨＣ複合体は、多量体の形態、例えば、二量体、四量体、五量体、八量体又はそれ以上であってもよい。多量体ペプチドＭＨＣ複合体の製造に適した方法の例は、Greten and Schneck 2002とその参考文献に記載されている。一般に、抗原－ＭＨＣ多量体は、ビオチン残基でタグ付けされた抗原－ＭＨＣを使用して製造され、蛍光標識されたストレプトアビジンと複合体を形成してもよい。あるいは、免疫グロブリンを分子足場として、多量体の抗原－ＭＨＣ複合体を形成してもよい。この系では、ＭＨＣ分子の細胞外ドメインが、短いアミノ酸リンカーで分離された免疫グロブリン重鎖の定常領域と融合する。ＭＨＣ多量体は、デキストランなどのキャリア分子を使用しても製造されている（国際公開第02/072631号）。多量体の抗原－ＭＨＣ複合体は、アビディティ効果により、前記複合体に結合するＴ細胞受容体などの結合部分の検出を改善するのに有用である。

本発明の抗原は、ＭＨＣと複合体を形成して細胞の表面に提示されてもよい。したがって、本発明は、本発明の複合体をその表面に提示する細胞も提供する。そのような細胞は、哺乳動物細胞、好ましくは免疫系の細胞、特に樹状細胞やＢ細胞といった特殊化された抗原提示細胞であってもよい。他の好ましい細胞には、Ｔ２細胞が含まれる（Hosken and Bevan 1990）。本発明の抗原又は複合体を提示する細胞は、好ましくは集団の形態で単離されていてもよく、又は実質的に純粋な形態で提供されてもよい。前記細胞は、天然では本発明の複合体を提示しないかもしれないし、あるいは、前記細胞は天然よりも高いレベルで複合体を提示するかもしれない。そのような細胞は、本発明の抗原で前記細胞をパルスすることにより得てもよい。パルスは、通常、１０^－５～１０^－１２Ｍのポリペプチドを使用して、細胞を抗原とともに数時間インキュベートすることを含む。細胞は、組換えにより産生されてもよい。本発明の抗原を提示する細胞は、以下で詳細に説明するように、当該細胞で活性化される又は当該細胞と結合するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）とＴ細胞を単離するため使用してもよい。

本発明のペプチドは、Ｆｍｏｃ化学又は当業者に公知の他の標準技術で合成してもよい。

本発明によりペプチドを製造する別の便利な方法は、発現系で核酸を使用することにより、ペプチドをコードする核酸を発現させることである。そのような核酸は、本発明の別の側面を形成する。

当業者は、本発明のペプチドを提供するような核酸への置換、欠失及び／又は付加を究明できる。核酸は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、又はクローニングによって得られるか若しくは化学合成によって製造されるｍＲＮＡなどのＲＮＡであるかもしれない。治療的使用のために、核酸は、好ましくは、治療される被験体で発現されることが可能な形態である。本発明のペプチド又は本発明の核酸は、単離された及び／若しくは精製された形態の単離物として提供されてもよく、又は、天然に関連する物質を含まないか、実質的に含まずに提供されてもよい。核酸の場合、恐らく発現のための１つ以上の調節配列が含まれる場合を除いて、ヒトゲノム中の遺伝子に隣接する核酸を含まないか、実質的に含まなくてもよい。核酸は、完全に又は部分的に合成されたものであってもよく、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ又はＲＮＡを含んでいてもよい。本発明の核酸がＲＮＡを含む場合、示された配列は、Ｔの代わりにＵを用いたＲＮＡ同等物として解釈されるべきである。

本発明のペプチドをコードする核酸配列は、利用可能な核酸配列及びクローンが与えられれば、例えば、本明細書に記載の情報及び参考文献、並びに当該技術分野において公知の技術（例えば、Sambrook 1989；Ausubel 1992を参照）により、当業者が容易く製造できる。これらの技術には、(i) 例えばゲノム源からの、そのような核酸の試料を増幅するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用、(ii) 化学合成、又は (iii) ｃＤＮＡ配列の製造、が含まれる。ポリペプチドをコードするＤＮＡは、コード化ＤＮＡを取得し、発現される部分のいずれかの側の適切な制限酵素認識部位を特定し、その部分をＤＮＡから切り出すことを含む、当業者に公知の適切な方法で製造し、使用してもよい。次いで、この部分を、標準的な市販の発現系で適切なプロモーターに作動可能に連結してもよい。別の組換え法は、適切なＰＣＲプライマーでＤＮＡの関連部分を増幅することである。配列の修飾を、例えば部位特異的変異誘発で行い、修飾ペプチドを発現させるか、核酸の発現に使用される宿主細胞におけるコドン選択を考慮に入れることができる。

本発明は、上述した核酸を少なくとも１つ含む、プラスミド、ベクター、転写又は発現カセットの形態の構築物も提供する。本発明は、上述した構築物を１つ以上含む組換え宿主細胞も提供する。前述のように、本発明のペプチドをコードする核酸は、当該核酸からの発現を含む方法であって、組成物を製造する方法と同様に、本発明の側面を形成する。発現は、当該核酸を含む組換え宿主細胞を適切な条件下で培養することで都合よく行ってもよい。発現による産生に続き、適切な技術で組成物を単離及び／又は精製してもよく、その後、必要に応じて使用してもよい。

さまざまな宿主細胞でのポリペプチドのクローニング及び発現系は周知である。適切な宿主細胞には、細菌、哺乳動物細胞、酵母及びバキュロウイルス系が含まれる。異種ポリペプチドの発現のために当該技術分野で利用できる哺乳動物細胞株には、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎細胞、ＮＳＯマウスメラノーマ細胞及び他の多くの細胞が含まれる。一般的で好ましい細菌宿主は大腸菌である。大腸菌などの原核細胞における抗体及び抗体断片の発現は、当該技術分野において十分に確立している。真核細胞の培養における発現も、特異的な結合メンバーの産生の選択肢として当業者に利用可能であり、最近のレビューについては、例えば、Reff 1993；Trill, Shatzman, and Ganguly 1995を参照されたい。レビューについては、例えばPluckthun 1991を参照。真核細胞の培養における発現も、特異的な結合メンバーの産生の選択肢として当業者に利用可能であり、最近のレビューについては、例えば、Reff 1993；Trill, Shatzman, and Ganguly 1995を参照されたい。

プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子及び必要に応じて他の配列を含む適切な調節配列を含む適切なベクターを選択又は構築できる。ベクターは、必要に応じて、ファージ又はファージミドなどのウイルス性プラスミドであってもよい。詳細については、例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual（Sambrook 1989）を参照。例えば、核酸構築物の調製、変異誘発、配列決定、細胞へのＤＮＡの導入と遺伝子発現、及びタンパク質の分析における、核酸操作の多くの公知の技術及びプロトコルは、Short Protocols in Molecular Biology（Ausubel 1992）に詳細に記載されている。

したがって、本発明の別の側面は、明細書に開示された核酸を含有する、単離されてもよい宿主細胞を提供する。更に別の側面は、そのような核酸の宿主細胞への導入を含む方法も提供する。導入には、利用可能な技術を使用してもよい。真核細胞の場合、適切な技術には、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン、エレクトロポレーション、レトロウイルス又は他のウイルス（例．ワクシニアウイルス）を使用したリポソーム媒介トランスフェクション及び形質導入が含まれてもよく、又は昆虫細胞の場合、バキュロウイルスを使用した形質導入が含まれてもよい。細菌細胞の場合、適切な技術には、塩化カルシウム形質転換、エレクトロポレーション及びバクテリオファージを使用したトランスフェクションが含まれてもよい。導入に続いて、例えば遺伝子発現条件下で宿主細胞を培養することにより、核酸からの発現を引き起こしてもよく、可能にしてもよい。

ある態様では、本発明の核酸は宿主細胞のゲノム（例．染色体）に組み込まれる。標準的な技術に従い、ゲノムとの組換えを促進する配列を含めることによって、組み込みを促進してもよい。

本発明は、上述したポリペプチドを発現させるために、発現系で上記構築物を使用することを含む方法も提供する。

本発明のポリペプチドは、本発明のポリペプチドに特異的に結合する結合部分を特定し、及び／又は単離するために使用できる。そのような結合部分は、免疫療法試薬として使用してもよく、抗体を含んでいてもよい。したがって、別の側面では、本発明は、本発明のポリペプチドに結合する結合部分を提供する。

本発明の抗原及び複合体は、前記本発明の抗原及び／又は複合体に特異的に結合する結合部分を特定し、及び／又は単離するために使用できる。そのような結合部分は、免疫療法試薬として使用してもよく、抗体及びＴＣＲを含んでいてもよい。

第三の側面では、本発明は、本発明の抗原に結合する結合部分を提供する。好ましくは、結合部分は、前記ポリペプチドがＭＨＣと複合体を形成している場合に抗原に結合する。後者の場合、結合部分は抗原にも結合するという条件で、部分的にＭＨＣに結合してもよい。結合部分は抗原のみに結合してもよく、その結合は特異的であってもよい。結合部分は、抗原－ＭＨＣ複合体のみに結合してもよく、その結合は特異的であってもよい。

本発明の複合体に結合する結合部分について述べる場合、「特異的」とは、本明細書では、一般に、結合部分が、本発明の抗原－ＭＨＣ複合体以外の１つ以上の別の抗原－ＭＨＣ複合体に対して著しい結合を示さない状況を指す。

結合部分は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）であってもよい。ＴＣＲは、International Immunogenetics（ＩＭＧＴ）のＴＣＲ命名法で記述されており、ＴＣＲ配列のＩＭＧＴデータベースにリンクしている。ＩＭＧＴ命名法によって定義された独自の配列は周知で、ＴＣＲの分野の当業者に利用可能である。例えば、それらは、“T cell Receptor Factsbook”, (2001) LeFranc and LeFranc, Academic Press, ISBN 0-12-441352-8；Lefranc, (2011), Cold Spring Harb Protoc 2011(6): 595-603；Lefranc, (2001), Curr Protoc Immunol Appendix 1: Appendix 10;（Lefranc 2003）及びＩＭＧＴウエブサイト（www.IMGT.org）に記載されている。簡潔に説明すると、αβＴＣＲは２つのジスルフィド鎖で構成されている。各鎖（α鎖とβ鎖）は一般に、可変ドメインと定常ドメインの２つのドメインを有していると見なされる。短い結合領域は、可変ドメイン及び定常ドメインを接続し、通常、α可変領域の一部と考えられる。さらに、β鎖は、通常、結合領域の隣に短い多様性領域を含み、通常、β可変領域の一部と考えられる。

ＴＣＲは、当業者に知られている形式であってもよい。例えば、ＴＣＲはαβヘテロ二量体であってもよく、一本鎖（国際公開第99/18129号に記載のものなど）であってもよい。一本鎖ＴＣＲには、αβＴＣＲポリペプチドの形式：Ｖα－Ｌ－Ｖβ、Ｖβ－Ｌ－Ｖα、Ｖα－Ｃα－Ｌ－Ｖβ、Ｖα－Ｌ－Ｖβ－Ｃβ又はＶα－Ｃα－Ｌ－Ｖβ－Ｃβ、場合によってはこれらの逆方向が含まれ、ここで、Ｖα及びＶβは、それぞれＴＣＲα及びβの可変領域であり、Ｃα及びＣβは、それぞれＴＣＲα及びβの定常領域であり、Ｌはリンカー配列である。ＴＣＲは可溶型（すなわち、膜貫通ドメイン又は細胞質ドメインを有さない）であってもく、又は完全長のα及びβ鎖を含んでいてもよい。ＴＣＲは、Ｔ細胞などの細胞の表面に提供されてもよい。細胞は、ヒト細胞などの哺乳動物細胞であってもよい。

細胞は、医学、特にがんの治療に使用してもよい。がんは、固形腫瘍又は血液腫瘍であってもよい。がんは、肺、結腸直腸、腎臓、乳房、卵巣及び肝臓がん、急性骨髄性白血病であってもよい。細胞は、治療対象の自己に由来するものであってもよく、自己に由来しないものであってもよい。

ＴＣＲのα及び／又はβ鎖の定常ドメインは、天然の／天然に存在するＴＲＡＣ／ＴＲＢＣ配列の短縮型であってもよい。また、ＴＲＡＣ／ＴＲＢＣは修飾を含んでいてもよい。例えば、α鎖の細胞外配列は、天然の／天然に存在するＴＲＡＣに関連する修飾を含んでいてもよく、ＩＭＧＴナンバリングで、ＴＲＡＣのアミノ酸Ｔ４８がＣ４８に置換される。同様に、β鎖の細胞外配列は、天然の／天然に存在するＴＲＢＣ１又はＴＲＢＣ２に関連する修飾を含んでいてもよく、ＩＭＧＴナンバリングで、ＴＲＢＣ１又はＴＲＢＣ２のＳ５７がＣ５７に置換される。天然のα及びβ鎖の細胞外配列に対するこれらのシステイン置換は、リフォールディングされた可溶性ＴＣＲ、すなわち細胞外のα及びβ鎖のリフォールディングで形成されるＴＣＲを安定化する非天然の鎖間ジスルフィド結合の形成を可能にする（国際公開第03/020763号）。この非天然のジスルフィド結合は、正しく折り畳まれたＴＣＲのファージ上での表示を容易くする（Li et al. 2005）。さらに、安定したジスルフィド結合可溶性ＴＣＲの使用により、結合親和性及び結合半減期の評価が便利になる。非天然のジスルフィド結合を形成する別の位置は、国際公開第03/020763号に記載されている。

各鎖の可変ドメインはＮ末端に位置し、フレームワーク配列（ＦＲ）中に３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。ＣＤＲは、ペプチド－ＭＨＣ結合の認識部位を含む。α鎖可変領域（Ｖα）をコードするいくつかの遺伝子とβ鎖可変領域（Ｖβ）をコードするいくつかの遺伝子があり、それらは、そのフレームワーク、ＣＤＲ１及びＣＤＲ２配列により、並びに部分的に明らかにされたＣＤＲ３配列により、区切られる。Ｖα及びＶβ遺伝子は、ＩＭＧＴ命名法では、それぞれ接頭辞ＴＲＡＶ及びＴＲＢＶで呼ばれる（Folch et al. 2000；Lefranc 2001）“T cell Receptor Factsbook”, Academic Press）。同様に、α鎖及びβ鎖には、それぞれＴＲＡＪ又はＴＲＢＪと呼ばれるいくつかの結合遺伝子又はＪ遺伝子があり、β鎖にはＴＲＢＤと呼ばれる多様性遺伝子又はＤ遺伝子がある（Folch et al. 2000；Lefranc 2001）“T cell Receptor Factsbook”, Academic Press）。Ｔ細胞受容体鎖の莫大な多様性は、さまざまなＶ、Ｊ及びＤ遺伝子（アレル多様体を含む）間の組合せによる再編成と接合部の多様性による（Arstila et al. 1999；Robins et al. 2009）。ＴＣＲα及びβ鎖の定常領域又はＣ領域は、それぞれＴＲＡＣ及びＴＲＢＣと呼ばれる（Lefranc, (2001), Curr Protoc Immunol Appendix 1: Appendix 10）。本発明のＴＣＲは、変異を含むように改変されていてもよい。ファージディスプレイや部位特異的変異誘発といった変異した高親和性のＴＣＲ多様体の調製方法は、当業者に知られている（例えば、国際公開第04/044004号及びLiら（Li et al. 2005）を参照）。

ＴＣＲは、画像化化合物（例．診断目的に適した標識）で標識されていてもよい。そのような標識された高親和性ＴＣＲは、ＣＤ１－抗原複合体、細菌スーパー抗原及びＭＨＣ－ペプチド／スーパー抗原複合体から選択されるＴＣＲリガンドの検出に有用であり、この方法は、ＴＣＲリガンドを、ＴＣＲリガンドに特異的な高親和性ＴＣＲ（又は高親和性ＴＣＲ複合体の多量体）と接触させることを含み；ＴＣＲリガンドとの結合を検出する。Zhuら（Zhu et al. 2006）が説明するものなどの親和性ＴＣＲ複合体の多量体では、（例えば、ビオチン化ヘテロ二量体を使用して形成される）蛍光ストレプトアビジン（市販）を使用して、検出可能な標識を提供できる。蛍光標識された多量体は、例えば高親和性ＴＣＲに特異的であるペプチドを有する抗原提示細胞を検出するＦＡＣＳ分析での使用に適している。

本発明によれば、シトルリンを含む本発明のＮＰＭペプチドは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を介したがん免疫療法の標的として使用できる。ＴＣＲは、ＭＨＣ分子と複合体を形成してＡＰＣの表面に提示される短いペプチド抗原を認識するように設計されている（Davis et al. 1998）。特定のシトルリン含有ペプチドの同定は、新規な免疫療法の開発に都合がよい。このような治療用のＴＣＲは、例えば、細胞傷害剤又は免疫エフェクター剤を腫瘍に送達する目的で可溶性標的剤として使用でき（Boulter et al. 2003；Liddy et al. 2012；McCormack et al. 2013）、あるいは養子療法用のＴ細胞を改変するために使用できる（June et al. 2014）。

本発明のＴＣＲ（又はその多価複合体）は、代わりに又は追加で、例えば、細胞殺傷に使用する毒性部分、又はインターロイキンやサイトカインといった免疫刺激剤であってもよい治療剤と（例えば、共有結合又は別の方法で）結合してもよい。本発明の多価で高親和性のＴＣＲ複合体は、野生型又は高親和性の多量体ではないＴ細胞受容体ヘテロ二量体と比較して、ＴＣＲリガンドに対する結合能力が増強されていてもよい。したがって、本発明の多価で高親和性のＴＣＲ複合体は、in vitro又はin vivoで特定の抗原を提示する細胞を追跡又は標的化するのに特に有用であり、そのような用途の多価で高親和性の別のＴＣＲ複合体の製造中間体としても有用である。したがって、高親和性ＴＣＲ又は多価で高親和性のＴＣＲ複合体は、in vivoで使用する薬学的に許容される製剤として提供されてもよい。

高親和性ＴＣＲは、可溶性二重特異性試薬の製造に使用してもよい。好ましい態様は、リンカーを介して抗ＣＤ３特異的抗体断片と融合した可溶性ＴＣＲを含む試薬である。そのような試薬の製造方法を含む詳細は、国際公開第10/133828号に記載されている。本発明のＴＣＲは、治療試薬として使用してもよい。この場合、ＴＣＲは可溶型であってもよく、好ましくは免疫エフェクターと融合していてもよい。適切な免疫エフェクターには、ＩＬ－２やＩＦＮ－αなどのサイトカイン；スーパー抗原及びその変異体；ＩＬ－８、血小板因子４、メラノーマ増殖刺激タンパク質などのケモカイン；Ｔ細胞又はＮＫ細胞といった免疫細胞上の抗原に結合する抗体、その断片、誘導体及び多様体（例．抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ１６）；補体活性化剤が含まれるが、これらには限定されない。

本発明の結合部分は抗体であってもよい。用語「抗体」は、本明細書では、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、天然物であるか、部分的又は完全に合成されたかにかかわらず、抗原に特異的に結合する抗原結合部位を含む分子を指す。用語「抗体」は、天然物であるか、部分的又は完全に合成されたかにかかわらず、免疫グロブリン結合ドメインを有するポリペプチド、並びに、抗体結合ドメインであるか、それと相同な結合ドメインを有するポリペプチドを含む、抗体断片、誘導体、抗体の機能的等価物及び同族体、ヒト化抗体を含む。したがって、別のポリペプチドと融合した、免疫グロブリン結合ドメイン又はその同等物を含むキメラ分子が含まれる。キメラ抗体のクローニング及び発現は、欧州特許出願公開第120694号及び第125023号に記載されている。ヒト化抗体は、非ヒト（例．マウス）抗体の可変領域及びヒト抗体の定常領域を有する改変抗体であってもよい。ヒト化抗体の製造方法は、例えば、米国特許第5225539号に記載されている。抗体の例は、免疫グロブリンアイソタイプ（例．ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ及びＩｇＡ）及びそれらのアイソタイプサブクラス；Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄなどの抗原結合ドメインを含む断片；及びダイアボディである。抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、本明細書では「ｍａｂ」と呼ばれる場合がある。

抗体、例えばモノクローナル抗体を取得し、組換えＤＮＡ技術を使用して、元の抗体の特異性を保持する抗体又はキメラ分子を製造できる。そのような技術は、免疫グロブリンの可変領域又は相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするＤＮＡを、異なる免疫グロブリンの定常領域又は定常領域とフレームワーク領域に導入することを含んでいてもよい（例えば、欧州特許出願公開第184187号、英国特許出願公開第2188638号又は欧州特許出願公開第239400号を参照）。ハイブリドーマ（又は抗体を産生する他の細胞）は、産生される抗体の結合特異性を変化させる可能性がある、遺伝子変異又はその他の変更がされていてもよい。

抗体の断片が抗原に結合する機能を実行できることが示されている。結合断片の例は、(i) ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなるＦａｂ断片；(ii) ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；(iii) １つの抗体のＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片；(iv) ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ward et al. 1989）；(v) 単離されたＣＤＲ領域；(vi) ２つの連結されたＦａｂ断片を含む二価の断片であるＦ（ａｂ’）_２断片；(vii) ＶＨドメイン及びＶＬドメインがペプチドリンカーによって連結し、これらの２つのドメインが会合して抗原結合部位を形成する単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）（Bird et al. 1988；Huston et al. 1988）；(viii) 二重特異性単鎖Ｆｖ二量体（PCT/US92/09965）；並びに、(ix) 遺伝子融合によって構築された多価又は多重特異性フラグメントである「ダイアボディ」（国際公開第94/13804号；Holliger and Winter 1993）、である。ダイアボディは、免疫グロブリン軽鎖の結合領域を含む第１のドメイン及び免疫グロブリン重鎖の結合領域を含む第２のドメインを含み、これらのドメインは（例えば、ペプチドリンカーによって）連結しているが、互いに会合して抗原結合部位を形成できないポリペプチドの多量体であり、抗原結合部位は、多量体内のあるポリペプチドの第１のドメインと、多量体内の別のポリペプチドの第２のドメインとの会合によって形成される（国際公開第94/13804号）。二重特異性抗体は、例えば化学的に、又はハイブリッドハイブリドーマから製造するなど、さまざまな方法で製造できる従来の二重特異性抗体であってもよく（Holliger and Winter 1993）、このような二重特異性抗体の断片であってもよい。抗体全体よりも、ｓｃＦｖの二量体又はダイアボディを使用する方が好ましい場合がある。ダイアボディ及びｓｃＦｖは、可変ドメインのみを使用しＦｃ領域なしで構築でき、潜在的に抗イディオタイプ反応の影響を低減する。二重特異性抗体の他の形態には、Traunecke, Lanzavecchia, and Karjalainen 1991に記載の単鎖「Janusins」が含まれる。二重特異性抗体とは対照的に、二重特異性ダイアボディも有用であるかもしれない。なぜなら、それらは容易く構築でき、大腸菌で発現できるためである。適切な結合特異性のダイアボディ（及び抗体断片などの多くのポリペプチド）が、ライブラリーからのファージディスプレイ（国際公開第94/13804号）を使用して容易に選択できる。例えば、抗原Ｘに対するダイアボディの一方のアームの特異性を維持し、もう一方のアームを変化させたライブラリーを作成し、適切な特異性の抗体を選択できる。「抗原結合ドメイン」は、抗原の一部分又は全体に特異的に結合し、相補的である領域を含む抗体の一部分である。抗原が大きい場合、抗体は抗原の特定の部分にのみ結合してもよく、その部分はエピトープと呼ばれる。抗原結合ドメインは、１つ以上の抗体可変ドメインによって提供されてもよい。抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含んでいてもよい。

また、改変されたタンパク質足場に基づく結合部分も本発明に包含される。タンパク質足場は、目的の標的分子の結合部位を提供するように修飾された、安定で可溶性の天然のタンパク質の構造に由来する。改変されたタンパク質足場の例には、その２つのαヘリックスが結合界面を提供するブドウ球菌プロテインＡのＺドメインに基づくアフィボディ（Nygren 2008）；ベータバレルフォールドの開放端に小さなリガンドの結合部位が組み込まれているリポカリン由来のアンチカリン（Skerra 2008）、ナノボディ及びＤＡＲＰｉｎが含まれるが、これらには限定されない。改変されたタンパク質足場は、通常、抗体と同じ抗原タンパク質に結合することを目的としており、潜在的な治療薬である。それらは、阻害剤若しくはアンタゴニストとして、又は、in vivoで毒素などの分子を特定の組織に標的化する送達ビヒクルとして作用してもよい（Gebauer and Skerra 2009）。短いペプチドを使用して、標的タンパク質に結合させてもよい。フィロマー（Phylomers）は、細菌のゲノムに由来する天然の構造化ペプチドである。このようなペプチドは、タンパク質構造の折り畳みの多様なアレイを示し、in vivoでタンパク質間相互作用を阻害／破壊するために使用できる（Watt 2006）。

上述したように、本発明者らは、特定の修飾されたＮＰＭ抗原が腫瘍に関連し、シトルリン化ペプチドが腫瘍に対する免疫応答を増強するのに使用できるＴ細胞応答を刺激することを見いだした。本発明は、医学で使用する、第１の側面の抗原、第２の側面の複合体及び／又は第３の側面の結合部分を提供する。第１の側面の抗原、第２の側面の複合体及び／又は第３の側面の結合部分は、がんの治療方法で使用できる。がんを治療する医薬の製造及びがんの治療方法における、第１の側面の抗原、第２の側面の複合体及び／又は第３の側面の結合部分も提供され、本発明の第１の側面の抗原、第２の側面の複合体及び／又は第３の側面の結合部分を、そのような治療を必要とする対象に投与することを含む。本発明の抗原は、単独で、又はプールとして組み合わせて使用してもよい。さらに、これらは、チェックポイント阻害剤（イピリムマブ、ペムブロリズマブ及びニボルマブなど）を含むがこれには限定されない抗癌剤などの他の治療薬と組み合わせて使用できる。

本発明者らは、シトルリン化ＮＰＭペプチドが強力なＴ細胞応答を刺激できることを初めて示した。本発明は、対象の腫瘍組織に対する免疫応答の局所刺激のための適切な手段を提供する。これらのＮＰＭｃｉｔペプチドに特異的なＴ細胞は、腫瘍細胞を標的としてin vivoで強力な抗腫瘍効果を誘発でき、したがって、がん治療のワクチンとしてＮＰＭｃｉｔエピトープを使用する最初の証拠を提供する。ワクチンに対する免疫応答の刺激には、患者の自然免疫応答と、腫瘍に対する免疫応答の誘導を目的とした免疫療法（例．チェックポイント阻害剤、腫瘍抗原に対するＣＡＲ－Ｔ及び他の腫瘍免疫療法）が含まれる。このような免疫応答の支援又は誘導は、免疫応答を開始及び維持し、この活性化をしばしばブロックする腫瘍媒介性免疫抑制を回避するために、さまざまな臨床で有益であるかもしれない。これらの応答は、自己免疫疾患の治療のために許容されてもよい。

いくつかの態様では、細胞性免疫応答は、ストレスによって誘発される翻訳後に修飾されたペプチドに特異的であり、免疫応答には、ＴＣＲαβ又はγδを発現するＴ細胞の活性化が含まれる。本発明は、ＴＣＲ、個々のＴＣＲサブユニット（単独又は組合せ）及びそれらのサブドメイン、可溶性ＴＣＲ（ｓＴＣＲ）、例えば、天然のＴＣＲには存在しない定常ドメイン残基間に少なくとも１つのジスルフィド鎖間結合を有する可溶性αβ二量体ＴＣＲ、並びに、自己又は同種異系のＴ細胞又はＴ細胞前駆細胞に組み込まれたクローン化されたＴＣＲ、並びにそれらの調製方法、前記ＴＣＲを有する他の細胞にも関する。

がんは、エストロゲン受容体陰性乳がんを含む乳がん、結腸直腸がん、肺がん、卵巣がん、腎がん、肝臓がん及びＡＭＬであってもよい。

本発明は、アジュバント又は他の薬学的に許容されるワクチン成分と共に処方される、本発明の抗原、複合体及び／又は結合部分を含む医薬組成物を提供する。特定の態様では、アジュバントは、ＣｐＧ（ＴＬＲ９）、ＭＰＬＡ（ＴＬＲ４）、イミキモド（ＴＬＲ７）、ポリＩ：Ｃ（ＴＬＲ３）、アンプリバントＴＬＲ１／２リガンド、ＧＭＣＳＦ、オイルエマルジョン、バクテリア産物又は不活化バクテリア全体などのＴＬＲリガンドである。

抗原は、Ｔ細胞抗原又はＢ細胞抗原であってもよい。本発明のペプチドは、単独で、又は組み合わせて使用してもよい。さらに、これらは、チェックポイント阻害剤（イピリムマブなど）を含むがこれには限定されない抗癌剤などの他の治療薬と組み合わせて使用できる。

本発明の抗原は、ペプチドとして、場合によっては国際公開第02/058728号に開示されたペプチドの形態で、in vivoで送達されてもよい。本発明者らは、驚くべきことに、本発明の抗原をペプチドとして投与した場合、強力な免疫応答を引き起こすことを見いだした。そのようなペプチドは、ペプチドの配列そのものとして、抗原を含むポリペプチドとして、又は完全長のタンパク質としてさえも投与してもよい。あるいは、本発明の抗原は、抗原をコードする核酸、抗原を含むポリペプチドをコードする核酸、又は完全長タンパク質をもコードする核酸としてin vivoで投与してもよい。そのような核酸は、ミニ遺伝子の形態、すなわち、リーダー配列及び抗原、又はリーダー配列及び全長タンパク質をコードする形態であってもよい。

用語「治療」は、本明細書では、ヒト又はヒト以外の動物に利益をもたらすことができるあらゆる方法が含まれる。抗原、核酸、複合体及び／又は結合部分は、薬学的に許容される担体又は複数の担体と組み合わせて使用して、医薬組成物を形成してもよい。そのような担体には、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、リポソーム、水、グリセロール、エタノール及びそれらの組合せが含まれていてもよいが、これらに限定されるものではない。

本発明の組成物の治療的投与の主要な経路は注射と想定されるが、カテーテル又は他の外科用チューブによる送達を行ってもよい。いくつかの適切な投与経路には、静脈内、皮下、皮内、腹腔内及び筋肉内投与が含まれる。液体製剤は、粉末製剤から再構成した後に利用してもよい。

静脈内注射又は患部への注射の場合、活性成分は、発熱物質を含まず、ｐＨが適切で、等張であり、安定性を維持する、非経口的に許容される水溶液の形態である。当業者は、例えば、塩化ナトリウム注射、リンゲル注射又は乳酸リンゲル注射といった等張ビヒクルを使用して、適切な溶液を調製できる。必要に応じて、保存剤、安定剤、緩衝剤、酸化防止剤、及び／又は他の添加剤を加えてもよい。

経口投与用の医薬組成物は、錠剤、カプセル剤、散剤又は液剤であってもよい。錠剤は、ゼラチン又はアジュバントなどの固体担体を含んでいてもよい。液体医薬組成物は、一般に、水、石油、動物油、植物油、鉱物油又は合成油といった液体担体を含む。生理食塩水、デキストロース、他の糖類溶液、又はエチレングリコール、プロピレングリコール若しくはポリエチレングリコールといったグリコールが含まれていてもよい。製剤が液剤の場合、例えば、ｐＨ６．８～７．６の非リン酸緩衝液を含む生理食塩水であってもよく、又は凍結乾燥粉末であってもよい。

組成物は、腫瘍部位若しくは他の所望の部位に局所的に投与してよく、又は腫瘍若しくは他の細胞を標的とする方法で送達してもよい。いくつかの態様では、抗原は、ＴＣＲαβ又はγδを発現するＴ細胞の活性化を含む細胞性免疫応答のためのアジュバントなしで投与される。

組成物は、好ましくは「治療有効量」で個体に投与され、これは個体に利益をもたらすに十分な量である。実際の投与量、及び投与速度と経時変化は、治療対象の性質と重症度で異なる。治療の処方、例えば投与量の決定などは、一般開業医及び他の医師の責任の範囲内であり、通常、治療する障害、個々の患者の状態、送達部位、投与方法及び開業医に知られている他の要因を考慮する。本発明の組成物は、がんの治療に特に関連し、最初の治療又は手術後の再発の予防に特に関連する。これまでに述べた技術及びプロトコルの例は、Remington's Pharmaceutical Sciences（Remington 1980）に記載されている。組成物は、単独で、又は、治療される状態に応じて同時若しくは順次、他の治療と組み合わせて投与してもよい。他のがん治療には、他のモノクローナル抗体、他の化学療法剤、他の放射線療法技術、又は当該技術分野において公知の他の免疫療法が含まれる。本発明の組成物の１つの適用法は、手術の補助として、すなわち、腫瘍除去後におけるがん再発の危険性の低減に役立つことである。本発明の組成物は、全体又は部分的に、化学合成で製造してもよい。組成物は、十分に確立された標準的な液体又は好ましくは固相ペプチド合成法に従って容易く調製でき、その一般的な説明は広く利用可能（例えば、in Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd edition (Stewart 1984), in The Practice of Peptide Synthesis (Bodanzsky 1984)及びApplied Biosystems 430A User’s Manual, ABI Inc.を参照）であるか、それらは、液相法によって、又は、固相、液相及び溶液化学の組合せによって、例えば、最初にそれぞれのペプチド部分を完成させ、次に、必要に応じて、存在する保護基を除去した後、それぞれの炭酸、スルホン酸又はその反応性誘導体の反応による残基Ｘの導入により、溶液中で調製してもよい。

本発明の抗原、複合体、核酸分子、ベクター、細胞及び結合部分は、非天然であるか、精製されているか、改変されているか、組み換えられているか、単離されているか、及び／又は合成されていてもよい。

この発明は、本発明の複合体に結合する結合部分を特定する方法であって、前記方法は、候補となる結合部分を複合体と接触させ、候補となる結合部分が複合体に結合するかどうかを決定することを含む方法も提供する。

本発明の各側面の好ましい特徴は、必要な変更を加え、他の側面と同様である。この明細書に記載されている先行技術文献は、法律で許可されている最大限の範囲で組み込まれる。

ヒトヌクレオホスミンのスプライシングバリアントの配列アラインメントヒトヌクレオホスミンＮＰＭ１．１と選択的にスプライシングされた２つのアイソフォーム（ＮＰＭ１．２及びＮＰＭ１．３）のアラインメント。薄い灰色は非相同領域を表す。シトルリン化ヌクレオホスミンペプチドのプールに対するＩＦＮγ応答のスクリーニングＨＨＤＩＩ／ＤＰ４を発現するトランスジェニックマウス系統を使用して、ペプチドに対するＩＦＮγ応答をスクリーニングした。マウスは、４～５種の重複しないＮＰＭペプチドのプールで３週間免疫化した。最初の投与から２１日後に脾細胞を採取した。ヒトＮＰＭペプチドによる刺激に対するex vivo応答を、ＩＦＮγELISpotで検討した。溶媒のみの応答を、陰性対照とした。各プールについて、マウスはｎ＝３である。ペプチド応答の統計的有意性を、各プールの溶媒のみの応答と比較し、Dunnettの事後検定を伴うＡＮＯＶＡで決定した。* p<0.5、** p<0.01、*** p<0.001、**** p<0.0001。シトルリン化ヌクレオホスミンペプチドのプールに対するＩＦＮγ応答のスクリーニングヒトＨＬＡ－ＤＲ４を発現するトランスジェニックマウス系統を使用して、ペプチドに対するＩＦＮγ応答をスクリーニングした。以下、図２Ａの説明に同じ。強力なＩＦＮγ応答を誘導するＮＰＭコアエピトープの定義ＨＬＡ－ＤＰ４トランスジェニックマウスを、ＮＰＭ２６１－２８０ｃｉｔペプチドで、毎週、３週間にわたり３回免疫した。３回目の投与の７日後に脾細胞を採取した。ＮＰＭ２６１－２８０ｃｉｔペプチド、ＮＰＭ２６６－２８５ｃｉｔペプチド及びＮＰＭ２６６－２８０ｃｉｔペプチドに対する応答を決定するために、ex vivo ＩＦＮγELISpotを行った。ＮＰＭ２６６－２８０ｃｉｔに対するペプチド応答の統計的有意性を、Dunnettの事後検定を伴うＡＮＯＶＡで、溶媒のみ、ＮＰＭ２６０－２８０ｃｉｔ、及びＮＰＭ２６６－２８５ｃｉｔに対する応答と比較した。* p<0.5、** p<0.01、*** p<0.001、**** p<0.0001。強力なＩＦＮγ応答を誘導するＮＰＭコアエピトープの定義ＨＬＡ－ＤＰ４トランスジェニックマウスを、ＮＰＭ２６６－２８５ｃｉｔペプチドで、毎週、３週間にわたり３回免疫した。以下、図３Ａの説明に同じ。強力なＩＦＮγ応答を誘導するＮＰＭコアエピトープの定義ＨＬＡ－ＤＲ４トランスジェニックマウスを、ＮＰＭ２６１－２８０ｃｉｔペプチドとＮＰＭ２６６－２８５ｃｉｔペプチドの組合せで、毎週、３週間にわたり３回免疫した。以下、図３Ａの説明に同じ。ヒトヌクレオホスミン２６６－２８５は強力なＩＦＮγ及びグランザイムＢ応答を誘導するトランスジェニックマウスを、ＮＰＭ２６６－２８５ｃｉｔペプチドで、毎週、３週間にわたり３回免疫した。最初の投与から２１日後に脾細胞を採取した。ＮＰＭ２６６－２８５ｃｉｔ及びＮＰＭ２６６－２８５ｗｔに対する応答を決定するために、ex vivo ＩＦＮγELISpotを行った。応答がＣＤ４Ｔ細胞又はＣＤ８Ｔ細胞によって媒介されたかどうかを判断するために、抗ＣＤ４又はＣＤ８ブロッキング抗体の存在下でex vivo ELISpotを行った。ペプチド応答の統計的有意性を、通常の一元配置ＡＮＯＶＡ比較で比較した。* p<0.5、** p<0.01、*** p<0.001、**** p<0.0001。ELISpotスポット数が１０００スポットを超えた場合、グラフの値は１０００とした。ヒトヌクレオホスミン２６６－２８５は強力なＩＦＮγ及びグランザイムＢ応答を誘導するトランスジェニックマウスを、ＮＰＭ２６６－２８５ｗｔペプチドで、毎週、３週間にわたり３回免疫した。以下、図４Ａの説明に同じ。がん細胞株におけるＮＰＭの発現ヌクレオホスミン（ＮＰＭ）及びβアクチンをプローブしたラダーに対する、ＨｅＬａ（レーン１）、ラダー（レーン２）、ＰＹ８１１９（レーン３）、ＰＹ２３０（レーン４）、ｐａｎ０２（レーン５）、ＬＬＣ２（レーン６）、ＴＲＡＭＰ（レーン７）、ＩＤ８（レーン８）、Ｂ１６Ｆ１（レーン９）、ラダー（レーン１０）、組換えＮＰＭ（レーン１１）細胞株のライセートの免疫ブロット（Ａ）。バンドは、ＮＰＭ（３５ｋＤａ）及びβ-アクチン（４２ｋＤａ）の予想サイズに対応する。ＮＰＭのin vitroシトルリン化は、ＰＡＤ２又はＰＡＤ４の存在下で行い、次いで、シトルリン化の部位が特定のために質量分析（Ｂ）を行った。 in vitroシトルリン化後のＮＰＭ２６６－２８５ｃｉｔの検出ＮＰＭのin vitroシトルリン化を、ＰＡＤ２の存在下で行い、次いで、シトルリン化部位の特定のために質量分析を行った。 in vitroシトルリン化後のＮＰＭ２６６－２８５ｃｉｔの検出ＮＰＭのin vitroシトルリン化を、ＰＡＤ４の存在下で行い、次いで、シトルリン化部位の特定のために質量分析を行った。ヒトヌクレオホスミン２６６－２８５ｃｉｔペプチドは、抗腫瘍実験でin vivoでの生存優位性を提供するＨＨＤＩＩ／ＤＰ４マウスに、ＩＦＮγ誘導ＤＰ４を有するＢ１６腫瘍をチャレンジし、４日後にＮＰＭ２６６－２８５ｃｉｔペプチド又はＮＰＭ２６６－２８５ｗｔペプチドで免疫化した。対照マウス（ＣｐＧ／ＭＰＬＡのみ）及びＮＰＭ２６６－２８５ｃｉｔペプチド又はＮＰＭ２６６－２８５ｗｔペプチドで免疫したマウスについて（ＣｐＧ／ＭＰＬＡ対照群はｎ＝１０、免疫化群はｎ＝２０）、腫瘍移植後２４日目の全生存率を示た。結果は２つの独立した実験による。免疫マウスと対照マウスの間の統計的差異は、Mantel-Cox検定で決定し、ｐ値を示す。腫瘍体積の中央値とｐ値は、Mann Whitney U検定で決定したものを示す。ヒトヌクレオホスミン２６６－２８５ｃｉｔペプチドは、抗腫瘍実験でin vivoでの生存優位性を提供するＨＨＤＩＩ／ＤＰ４マウスに、ＩＦＮγ誘導ＤＰ４を有するＢ１６腫瘍をチャレンジし、４日後にＮＰＭ２６６－２８５ｃｉｔペプチド又はＮＰＭ２６６－２８５ｗｔペプチドで免疫化した。対照マウス（ＣｐＧ／ＭＰＬＡのみ）及びＮＰＭ２６６－２８５ｃｉｔペプチド又はＮＰＭ２６６－２８５ｗｔペプチドで免疫したマウスについて（ＣｐＧ／ＭＰＬＡ対照群はｎ＝１０、免疫化群はｎ＝２０）、腫瘍移植後２４日目の腫瘍体積を示た。以下、図６Ａの説明に同じ。ヒトヌクレオホスミン２６６－２８５ｃｉｔペプチドは、ヒトＰＢＭＣで応答を誘導する１０人の健康なドナーからＰＢＭＣを分離し、各ドナーでＨＬＡタイピングを行い、９人のＨＬＡ－ＤＰ４陽性ドナー（２人はＨＬＡ－ＤＲ４も発現）及び１人のＨＬＡ－ＤＰ４陰性ドナーのＰＢＭＣを使用した。各ドナーから単離したＰＢＭＣは、培地又はヒトＮＰＭ２６６－２８５ｃｉｔペプチドと共に培養した。ＮＰＭ２６６－２８５ｃｉｔペプチドで刺激する前に、ＰＭＢＣをＣＳＦＥで標識した；代表的なフローサイトメトリープロットを示す。ヒトヌクレオホスミン２６６－２８５ｃｉｔペプチドは、ヒトＰＢＭＣで応答を誘導する１０人の健康なドナーからＰＢＭＣを分離し、各ドナーでＨＬＡタイピングを行い、９人のＨＬＡ－ＤＰ４陽性ドナー（２人はＨＬＡ－ＤＲ４も発現）及び１人のＨＬＡ－ＤＰ４陰性ドナーのＰＢＭＣを使用した。各ドナーから単離したＰＢＭＣは、培地又はヒトＮＰＭ２６６－２８５ｃｉｔペプチドと共に培養した。ＮＰＭ２６６－２８５ｃｉｔペプチドで刺激する前に、ＰＭＢＣをＣＳＦＥで標識した；ＣＳＦＥ標識細胞集団内のＣＤ４集団の増殖応答を、７日目及び１０日目にフローサイトメトリーで検討した。ヒトヌクレオホスミン２６６－２８５ｃｉｔペプチドは、ヒトＰＢＭＣで応答を誘導する１０人の健康なドナーからＰＢＭＣを分離し、各ドナーでＨＬＡタイピングを行い、９人のＨＬＡ－ＤＰ４陽性ドナー（２人はＨＬＡ－ＤＲ４も発現）及び１人のＨＬＡ－ＤＰ４陰性ドナーのＰＢＭＣを使用した。各ドナーから単離したＰＢＭＣは、培地又はヒトＮＰＭ２６６－２８５ｃｉｔペプチドと共に培養した。ＮＰＭ２６６－２８５ｃｉｔペプチドで刺激する前に、ＰＭＢＣをＣＳＦＥで標識した；増殖中又は増殖していないＣＤ４細胞のＩＦＮγを発現する能力を、７日目と１０日目に検討し、１０日目の応答を示す。ヒトヌクレオホスミン２６６－２８５ｃｉｔペプチドは、ヒトＰＢＭＣで応答を誘導する１０人の健康なドナーからＰＢＭＣを分離し、各ドナーでＨＬＡタイピングを行い、９人のＨＬＡ－ＤＰ４陽性ドナー（２人はＨＬＡ－ＤＲ４も発現）及び１人のＨＬＡ－ＤＰ４陰性ドナーのＰＢＭＣを使用した。各ドナーから単離したＰＢＭＣは、培地又はヒトＮＰＭ２６６－２８５ｃｉｔペプチドと共に培養した。ＮＰＭ２６６－２８５ｃｉｔペプチドで刺激する前に、ＰＭＢＣをＣＳＦＥで標識した；増殖中又は増殖していないＣＤ４細胞のグランザイムＢを発現する能力を、７日目と１０日目に検討し、１０日目の応答を示す。ヒトヌクレオホスミン２６６－２８５ｃｉｔペプチドは、ヒトＰＢＭＣで応答を誘導する１０人の健康なドナーからＰＢＭＣを分離し、各ドナーでＨＬＡタイピングを行い、９人のＨＬＡ－ＤＰ４陽性ドナー（２人はＨＬＡ－ＤＲ４も発現）及び１人のＨＬＡ－ＤＰ４陰性ドナーのＰＢＭＣを使用した。各ドナーから単離したＰＢＭＣは、培地又はヒトＮＰＭ２６６－２８５ｃｉｔペプチドと共に培養した。ＮＰＭ２６６－２８５ｃｉｔペプチドで刺激する前に、ＰＭＢＣをＣＳＦＥで標識した；増殖中又は増殖していないＣＤ４細胞のＣＤ１３４を発現する能力を、７日目と１０日目に検討し、１０日目の応答を示す。ヒトヌクレオホスミン２６６－２８５ｃｉｔペプチドは、ヒトＰＢＭＣで応答を誘導する１０人の健康なドナーからＰＢＭＣを分離し、各ドナーでＨＬＡタイピングを行い、９人のＨＬＡ－ＤＰ４陽性ドナー（２人はＨＬＡ－ＤＲ４も発現）及び１人のＨＬＡ－ＤＰ４陰性ドナーのＰＢＭＣを使用した。各ドナーから単離したＰＢＭＣは、培地又はヒトＮＰＭ２６６－２８５ｃｉｔペプチドと共に培養した。ＮＰＭ２６６－２８５ｃｉｔペプチドで刺激する前に、ＰＭＢＣをＣＳＦＥで標識した。ヒトヌクレオホスミン２６６－２８５ｃｉｔペプチドに対する免疫応答はナイーブＴ細胞によって媒介される健康なドナーから分離したＰＢＭＣは、ＣＤ４５ＲＯが枯渇しているか、枯渇していない状態で、培地又はヒトＮＰＭ２６６－２８５ｃｉｔペプチドと培養した。ＮＰＭ２６６－２８５ｃｉｔペプチドで刺激する前に、ＰＭＢＣをＣＳＦＥで標識した。ＣＳＦＥ標識細胞集団内のＣＤ４集団の増殖応答を、１１日目にフローサイトメトリーで検討した。Ｔ細胞応答を、枯渇していないＣＤ４５ＲＯ培養物と比較した。ヌクレオホスミン配列の比較他の種（マウス、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、イヌ）からの同等の配列を有するヒトＮＰＭのアラインメント。ＰＡＤ２はin vivoでのＮＰＭのシトルリン化に関与するＰＡＤ２がＮＰＭのシトルリン化に重要かどうかを検討するために、ＨＬＡ－ＤＰ４マウスを、ＰＡＤ２酵素を欠く誘導ＤＰ４腫瘍細胞を発現するＢ１６Ｆ１腫瘍細胞で攻撃し、その後、４、１１及び１８日目に免疫化した。１群につき１０匹のマウスで、腫瘍成長及び生存を監視した。全生存期間を示す。免疫マウスと対照マウスとの間の統計的差異を、マンテル－コックス検定で決定し、ｐ値を示す。腫瘍体積の中央値及びｐ値は、マンホイットニーのＵ検定で決定したものを示す。ＰＡＤ２はin vivoでのＮＰＭのシトルリン化に関与するＰＡＤ２がＮＰＭのシトルリン化に重要かどうかを検討するために、ＨＬＡ－ＤＰ４マウスを、ＰＡＤ２酵素を欠く誘導ＤＰ４腫瘍細胞を発現するＢ１６Ｆ１腫瘍細胞で攻撃し、その後、４、１１及び１８日目に免疫化した。１群につき１０匹のマウスで、腫瘍成長及び生存を監視した。２８日目の腫瘍体積を示す。以下、図１０Ａの説明に同じ。ＮＰＭ２６６－２８５ｃｉｔによる生存優位性は、ＭＨＣＩＩを介して達成されるＭＨＣＩＩが存在しない場合でも、ＮＰＭ２６６－２８５ｃｉｔが有効かどうかを検討するために、ＨＬＡ－ＤＰ４マウスを、ＨＨＤＩＩを発現するＤＰ４の発現を欠くＢ１６Ｆ１腫瘍細胞で攻撃し、その後、４、１１及び１８日目に免疫化した。１群１０匹のマウスについて、腫瘍成長及び生存率を監視した。全生存期間を示す。免疫マウスと対照マウスとの間の統計的差異を、マンテル－コックス検定で決定し、ｐ値を示す。腫瘍体積の中央値及びｐ値は、マンホイットニーのＵ検定で決定したものを示す。ＮＰＭ２６６－２８５ｃｉｔによる生存優位性は、ＭＨＣＩＩを介して達成されるＭＨＣＩＩが存在しない場合でも、ＮＰＭ２６６－２８５ｃｉｔが有効かどうかを検討するために、ＨＬＡ－ＤＰ４マウスを、ＨＨＤＩＩを発現するＤＰ４の発現を欠くＢ１６Ｆ１腫瘍細胞で攻撃し、その後、４、１１及び１８日目に免疫化した。１群１０匹のマウスについて、腫瘍成長及び生存率を監視した。２８日目の腫瘍体積を示す。以下、図１１Ａの説明に同じ。

以下の実施例及び図面を参照して、本発明を更に説明する。

方法
1.1 市販のｍＡｂ
抗ＩＦＮγ抗体（クローンＸＭＧ１．２）、抗マウスＣＤ４（クローンＧＫ１．５）、抗マウスＣＤ８（クローン２．４３）及び抗ヒトＣＤ４（クローンＯＫＴ－４）は、Bio X Cell（米国）から購入した。抗ヒトＣＤ１３４（クローンＲＥＡ６２１）及び抗ヒトＣＤ８（クローンＲＥＡ７３４）は、Miltenyi（ドイツ）から購入した。抗ヒトＣＤ４（クローンＲＰＡ－Ｔ４）、抗ヒトグランザイムＢ（クローンＧＢ１１）は、Thermo Fisher Scientific（米国）から購入し、抗ヒトＩＦＮγ（クローンＥ７８０）は、eBioscience（米国）から購入した。

1.2 細胞株
機能的なＭＨＣクラスＩＩＤＲ４（ＤＲＢ１^＊０４０１；Ｔ２ＤＲ４）を安定的にトランスフェクトしたＴ細胞／Ｂ細胞ハイブリッド細胞株Ｔ２は、以前に説明されている（Kovats et al. 1997）。マウスメラノーマＢ１６Ｆ１、マウスすい臓ｐａｎ０２細胞株は、American Tissue Culture Collection（ＡＴＣＣ）から入手し、特に説明しない場合は、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）及びＬ－グルタミン（２ｍＭ）を添加し、重炭酸ナトリウムで緩衝化したＲＰＭＩ培地１６４０（GIBCO/BRL）中で培養した。マウストランスジェニックＴＲＡＭＰ細胞はＡＴＣＣから入手し、０．００５ｍｇ／ｍｌのウシインスリン及び１０ｎＭのデヒドロイソアンドロステロン９０％、ウシ胎児血清５％、Nu-Serum IV５％が添加され、重炭酸ナトリウムを１．５ｇ／Ｌ、グルコースを４．５ｇ／Ｌ含むように調整された４ｍＭのL-グルタミンを含むダルベッコ改変イーグル培地中で培養した。マウス乳腺がん細胞株ＰＹ８１１９及びＰＹ２３０はＡＴＣＣから入手し、ハムのＦ１２のKaighn改変培地、５％ＦＢＳ中で培養し、ＰＹ２３０細胞株は、０．１％ MITO＋Serum Extender（Corning）の存在下でも培養した。ヒト細胞株ＨｅＬａ及びマウス細胞株ＬＬＣ２はＡＴＣＣから入手し、１０％のウシ胎児血清を添加したイーグルの最小必須培地中で培養した。ＩＤ８細胞株は、KUMC University of Kansas（米国）のK. Roby博士に提供してもらい、１０％ＦＣＳを添加したＤＭＥＭ中で培養した。

1.3 免疫原
1.3.1 ペプチド
純度が９０％を超えるペプチドは、Peptide Synthetics（Fareham、英国）が合成し、０．２ｍｇのアリコート中、－８０℃で凍結乾燥し、保存した。使用日に、それらを１０％ジメチルホルムアミド中で適切な濃度に再構成した。

1.4 プラスミド及びトランスフェクション
pVitro 2キメラ及び誘導ＨＬＡ－ＤＲ４プラスミドの構築は、以前に説明されている（Brentville et al. 2016；Metheringham et al. 2009）。ＨＨＤＩＩプラスミドを調製するために、ＥＬ４－ＨＨＤ細胞から単離した全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。これは、フォワード及びリバースプライマーを使用してＨＨＤを増幅するテンプレートとして用いられ、pCR2.1にサブクローニングした。次いで、ヒトＨＬＡ－Ａ２リーダー配列、ヒトＨＬＡ－Ａ^＊０２０１ＭＨＣクラスＩ分子のα１及びα２ドメイン並びにマウスＨ－２ＤｂクラスＩ分子のα３膜貫通及び細胞質ドメインにグリシンセリンリンカーを介して共有結合したヒトβ２－ミクログロブリン（β２Ｍ）分子を含む、ＨＨＤ鎖を、Invitrogenから入手した哺乳動物発現ベクターpCDNA3.1のＥｃｏＲＶ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入した。

エンドトキシンを含まないプラスミドＤＮＡを、エンドフリーのQiagen maxiprepキット（Qiagen、Crawley）を使用して調製した。

リポフェクタミントランスフェクション試薬（Invitrogen）を用い、以前に説明したプロトコル（Brentville et al. 2016）で細胞株をトランスフェクトした。Ｂ１６Ｆ１細胞は、ＺＦＮ技術（Sigma）を用いてマウスＭＨＣ－Ｉ及び／又はＭＨＣ－ＩＩをノックアウトし、pVitro 2キメラプラスミドを使用して構成的ＨＬＡ－ＤＰ４をトランスフェクトした。以前に説明（Xue et al. 2016）したように、関連する場合、細胞を、ヒトＨＬＡ－Ａ２リーダー配列、ヒトＨＬＡ－０２０１ＭＨＣクラス１分子のα１及びα２ドメイン並びにマウスＨ－２ＤｂクラスＩ分子のα３膜貫通及び細胞質ドメインにグリシンセリンリンカーを介して共有結合したヒトβ2-ミクログロブリン（β２Ｍ）分子を含む、ＨＨＤＩＩプラスミドでもトランスフェクトした。pVITRO2ヒトＨＬＡ－ＤＰ４プラスミド及びＩＦＮγ誘導プラスミドpDCGASヒトＨＬＡ－ＤＰ４でトランスフェクトされたＢ１６Ｆ１ＨＨＤＩＩ細胞も以前に説明されている（Brentville et al. 2019）。

1.6 ウエスタンブロット
プロテアーゼ阻害剤カクテル（Sigma）を含むＲＩＰＡバッファー中で細胞溶解物を調製し、４～１２％NuPAGE Bis-Trisゲル（Invitrogen）でタンパク質を分離した後、ＰＶＤＦ膜に転写した。３％ＢＳＡで１時間、膜をブロックした後、１０００分の１のヒトＮＰＭに対する抗体（クローンFC82291、Abcam）及び１５０００分の１のβアクチンに対する抗体（クローンAC-15、Sigma）をプローブとして使用した。蛍光二次抗体IRDye 800RDye及び（βアクチンに対する）二次抗マウス抗体IRDye 680RDを使用してタンパク質を可視化した。Licor Odysseyスキャナーにより膜を画像化した。ＮＰＭタンパク質（ab114194、Abcam）を陽性対照として使用した。

1.7 In vitroシトルシン化
ＮＰＭのシトルリン化は、０．１ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５、Fisher）、１０ｍＭのＣａＣｌ_２（Sigma）及び５ｍＭのＤＴＴ（Sigma）中で行った。溶液の最終濃度は、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌｐＨ７．５が３７６ｍＭ、ＣａＣｌ_２が３．７６ｍＭ、ＤＴＴが１．８８ｍＭであった。試料をＰＡＤ酵素と共に３７℃で２時間インキュベートし、－８０℃で一晩又は使用するまで保存した。ＰＡＤ２酵素は最終濃度１４８ｍＵで使用し、ＰＡＤ４は最終濃度１５２ｍＵで使用した。ＰＡＤ酵素は、３７ｍＵ／μｌｈＰＡＤ２及び３８ｍＵ／μｌｈＰＡＤ４のものをModiquestから購入した。

1.8 質量分析
試料は、トリプシンとタンパク質の比率を１：５０とし、３７℃で一晩、トリプシン消化を行い、調製した。次いで、真空で試料を乾燥し、ＭＳ分析の前に、ＬＣＭＳグレードの水中の０．１％ギ酸／５％アセトニトリルに再懸濁した。ＭＳ分析では、試料は、３５℃のカラムオーブン内のYMC Triart C18カラム（内径３００ｕｍ、粒子サイズ３μｍ、１５ｃｍ）に、２分間の洗浄トラップ／溶出構成のオートサンプラー（１～１０μｌ／分のポンプモジュールを５μｌ／分で動作させるEksigent Ekspert nanoLC 425 LCシステム）により注入した。試料は、５０μｍ電極を備えたDuospray（TurboV）ソースを介し、質量分析計のSCIEX 6600 TripleTに８７分かけて勾配溶出した。SCIEX 6600は、１サイクルフラグメンテーションあたり３０イオンのＩＤＡモード（Independent Data Acquisition／Data Dependent Acquisition）、総サイクル時間は１．８秒、ＴＯＦＭＳスキャンは累積２５０ミリ秒、プロダクトイオンスキャンごとに５０ミリ秒に設定した。

データは、PEAKS Studio 8.0（Bioinformatic Solutions Inc.、Waterloo、カナダ）を使用して、SwissProtヒト（Uniprotを手動でアノテート／キュレート）データベースを検索し、２５ｐｐｍの親質量誤差許容値、０．１Ｄａフラグメント質量誤差許容値で、シトルリン化（Ｒ）、脱アミド化（ＮＱＲ）、酸化（Ｍ）の修飾を検索して分析した。サイトは、最小イオン強度が５％の信頼できる修飾サイトとして識別した。

1.7 免疫化
1.7.1. 免疫化プロトコル
８～１２週齢の、ＨＬＡ－ＤＲ４マウス（Taconic、米国）及び国際公開第2013/017545号（EMMA repository、仏国）に記載のマウスのＨＨＤＩＩ／ＨＬＡ－ＤＰ４トランスジェニック系統を使用し、Nottingham Trent大学のスタッフが世話をした。全ての作業は、Home Officeのプロジェクト認可の下で行った。ペプチドを１０％ジメチルホルムアミドに溶解して濃度１ｍｇ／ｍＬとし、アジュバントであるＣｐＧ及びＭＰＬＡ（Invivogen、英国）をそれぞれ１マウスあたり６μｇ使用して、（一連の希釈物として）乳化した。ペプチド（２５μｇ／マウス）を尾の付け根に皮下注射した。

腫瘍攻撃実験では、（他に説明しない限り）一次免疫の３日前にマウスの右側脇腹に、１×１０^５のB16 HHDII/iDP4、B16F1 HHDIIMHCIIKO又はB16 HHDII/PAD2KOcDP4細胞を皮下投与し、次いで、上述のとおり免疫した。腫瘍の成長を３～４日間隔で監視し、腫瘍の直径が１０ｍｍ以上となったら、マウスを人道的に安楽死させた。

1.8 免疫応答の分析
1.8.1 動物組織の単離と分析
脾臓をばらばらにし、赤血球溶解緩衝液で２分間処理した。腫瘍を採取し、機械的に分解した。

1.8.2 末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の単離
静脈穿刺の直後に末梢血試料をリチウムヘパリンチューブ（Becton Dickinson）に採取し、処理した。ＰＢＭＣは、Ficoll-Hypaqueを用いた密度勾配遠心分離で単離した。単離直後にＰＢＭＣの増殖及び培養ELISpotアッセイを行った。

1.8.3 ex vivo ELISpotアッセイ
ELISpotアッセイは、製造元（Mabtech、スエーデン）の指示に従い、マウスＩＦＮγ捕捉・検出試薬を使用した。簡単に説明すると、９６ウェルImmobilin-Pプレートのウェルに抗ＩＦＮγ抗体をコーティングした。（さまざまな濃度の）合成ペプチドと１ウェルあたり５×１０^５個の脾細胞をウェルに加えた。５μｇ／ｍＬのＬＰＳを陽性対照として使用した。ペプチドでパルスした標的細胞を、必要に応じて１ウェルあたり５×１０^４で加え、プレートを３７℃で４０時間インキュベートした。インキュベーション後、捕捉されたＩＦＮγをビオチン化抗ＩＦＮγ抗体で検出し、ストレプトアビジンアルカリホスファターゼ及び発色基質で発色させた。この実験は３回行った。リポ多糖（ＬＰＳ；５μｇ／ｍＬ）を陽性対照として使用した。ブロッキング実験では、Bio X Cellの抗ＣＤ４ブロッキング抗体（ＲＰＡ－Ｔ４）及び抗ＣＤ８ブロッキング抗体（２．４３）を２０μｇ／ｍＬで使用した。自動プレートリーダー（Cellular Technologies Ltd）を使用してスポットを分析し、計数した。

1.9 増殖アッセイ
末梢血試料（約５０ｍＬ）をリチウムヘパリンチューブ（Becton Dickinson）に採取した。試料を室温で維持し、静脈穿刺の直後に処理した。ＰＢＭＣは、Ficoll-Hypaqueを用いた密度勾配遠心分離で単離した。ＰＢＭＣの単離直後に増殖アッセイを行った。健康なドナーの試料からルーチンで得られるＰＢＭＣの中央値は、全血１ｍｌあたり１．０４×１０^６（範囲：０．６×１０^６～１．４８×１０^６／ｍＬ）であった。トリパンブルー排除で検討した生存率の中央値は９３％（範囲９０～９５％）であった。

新たに単離したＰＢＭＣにカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）（ThermoFisher）を添加した。簡単に説明すると、暖かいＰＢＳ中の５０μＭのストック溶液を、ＤＭＳＯ中の５ｍＭのマスター溶液から調製した。最終濃度を５μＭとするために、ＣＦＳＥをＰＢＭＣ（５×１０^６細胞／ｍＬのローディングバッファー（５v/v％の熱不活性化ＦＣＳを含むＰＢＳ））に急速に追加した。ＰＢＭＣを、室温暗所で５分間インキュベートした後、細胞に取り込まれなかったＣＦＳＥを過剰（×１０v/v容積）のローディングバッファー（３００ｇ×１０分）で２回洗浄して除去した。細胞を完全培地で１．５×１０^６／ｍＬとし、上述したように、ビヒクル（陰性対照）、ＰＨＡ（陽性対照、最終濃度１０μｇ／ｍＬ）又はペプチド（１０μｇ／ｍＬ）を含む培地にプレーティングし、刺激した。

７～１１日目に、培養液から５００μＬの細胞を取り出し、ＰＢＳで洗浄し、１：５０希釈の抗ＣＤ４（ＰＥ－Ｃｙ５、クローンＲＰＡ－Ｔ４、ThermoFisher）、抗ＣＤ８ｅｆｌｕｏｒ４５０、クローンＲＰＡ－Ｔ８、ThermoFisher）及び抗ＣＤ１３４（ＰＥ－Ｃｙ７、クローンＲＥＡ６２１、Miltenyi）で染色した。製造元の指示に従い、細胞内固定／透過化バッファー（ThermoFisher）を使用して、細胞を洗浄、固定、透過化した。サイトカインの細胞内染色は、１：５０希釈の抗ＩＦＮγ（クローン４Ｓ．Ｂ３、ThermoFisher)又は抗グランザイムＢ（ＰＥ、クローンＧＢ１１、Thermofisher)を使用した。適切なゲートを決定するために染色しビヒクル刺激対照を使用して、MACSQuantソフトウェアバージョン2.8.168.16380を備えたMACSQuant 10フローサイトメーターで、染色した試料を分析した。

1.10 ＦＡＣＳセルソート
１０日目に、ウェルの内容物を穏やかに混合し、（ペプチド刺激に基づいて）プールし、ＰＢＳで洗浄した（３００ｇ×１０分）。ペレットを、１０μｌの抗ＣＤ４ｅＦｌｕｏ４５０（クローンＲＰＡ－Ｔ４、ThermoFisher、カタログ番号48-0049-42）及び１０μＬの抗ＣＤ８ＡＰＣ（クローンＲＰＡ－Ｔ８、ThermoFisher、カタログ番号17-0088-41）を含有する５００μＬのＰＢＳに穏やかに再懸濁した。細胞を４℃で３０分間染色した後、１．０ｍｌのＰＢＳで洗浄（５分×３００ｇ）し、３００μｌのＦＡＣＳソーティングバッファー（１ｍＭのＥＤＴＡ、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ及び１v/v％のＨＩＦＣＳを添加したＰＢＳ）に再懸濁した。各染色試料から試料を１０μｌ取り出し、ＦＡＣＳソーティングバッファーを９０μｌ加えた。MACSQuant Analyzer 10フローサイトメーターで１０，０００イベント収集し、増殖を決定した。残りの細胞は、バルクＦＡＣＳソーティングに使用した。

MoFlo XDP High Speed Cell Sorterを使用し、滅菌条件で細胞をソートする。全ての試料は、CD4+ve/CFSEhighの集団とCD4+ve/CFSElowの集団を分離する１．０ｍｌのＲＮＡプロテクト（Protect（Qiagen）５部：ＦＡＣＳソーティングバッファー（Sigma）１部）にソートされる。ソートされた細胞（バルク）を－８０℃で保存する。

シトルリンを含むＮＰＭペプチドを認識するＴＣＲのα鎖とβ鎖のペアの決定。ＲＮＡプロテクト中のCD4+ve/CFSEhigh集団及びCD4+ve/CFSElow集団からソートされた細胞（バルク）は、ＴＣＲＡ鎖及びＴＣＲＢ鎖のＮＧＳシーケンシングのためにiRepertoire Inc（Huntsville、AL、米国）に送り、非増殖性CD4+ve/CFSEhigh集団とは対照的な、CD4+ve/CFSElow細胞でのＴＣＲの増殖を確認する。簡単に説明すると、ソートした細胞からＲＮＡを精製し、ＲＴ－ＰＣＲを行い、次いで、ｃＤＮＡをヒトＴＣＲα及びβ ２５０ＰＥＲプライマー（iRepertoire Inc、Huntsville、AL、米国）を用て、Amplicon rescued multiplex ＰＣＲ（ＡＲＭ－ＰＣＲ）にかける。プライマーに関する情報は、米国特許第7,999,092号及び第9,012,148号に記載されている。ＰＣＲ／ＤＮＡ試料の評価後、１０個の試料ライブラリーをプールし、Illumina MiSeqプラットフォーム（Illumina、San Diego、CA、米国）を使用してシーケンシングを行った。生のデータは、IRwebソフトウェア（iRepertoire）を使用して分析した。Ｖ、Ｄ及びＪ遺伝子の使用とＣＤＲ３の配列が特定され、割り当てられ、iRwebツールを使用してツリーマップが作成された。ツリーマップは、各固有のＣＤＲ３を色付きの四角形として示し、四角形のサイズは、レパートリー内の各ＣＤＲ３の存在量に対応し、位置はＶ領域の使用によって決定される。

ＴＣＲα鎖及びＴＣＲβ鎖の同族ペアと配列を解明するために、IRepertoireはそのiPair（登録商標）技術を使用し、CD4+ve/CFSElow細胞集団（一括でソートし、同時に一括してシーケンシングした）を、iCapture 96ウェルプレートに１ウェルあたり１細胞で播種する。ＲＴ－ＰＣＲを行い、Amplicon rescued multiplex ＰＣＲ（ＡＲＭ－ＰＣＲ）で、単一細胞からＴＣＲα鎖及びβ鎖を増幅できる。iPair（登録商標）ソフトウェアを利用して、バルクデータと比較した、特定の鎖のペアリングの頻度及びランク付けされた配列について、データを分析できる。

1.11 ＰＡＤ２のノックアウト
Ｂ１６Ｆ１細胞のＰＡＤ２ノックアウトは、Sigma-Aldrich Cell Design Studio（登録商標）で行った。CompoZrジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）技術を、配列NM008812-r649a1：ＣＴＧＣＡＧＣＣＧＣＡＣＧＧＴＣＣＧＴＴＣＣＣＧＣＡＧＣ及びNM008812-656a1：ＴＧＧＧＡＧＣＣＧＣＧＴＧＧＡＧＧＣＧＧＴＧＴＡＣＧＴＧを有するＮＰＭエクソン１の標的化に使用した。数回の再標的化の後、８９％の切断が達成され、次いで、単一細胞のクローニングが行われ、安定したクローンが確立された。Sigma-Aldrich Cell Design Studio（登録商標）のｄｄＰＣＲ及びフローサイトメトリー（ab50257及びab150063、Abcam）を使用して、クローンのＰＡＤ２のノックアウトを検討した。ｄｄＰＣＲに使用したプライマー及びプローブは、Thermo fisher独自のもの（Mm00447012_m1及びMm00447020_m1）であった。

1.12 統計学的手法
データを脾細胞１００万個あたりのスポット数として表した。平均値と標準偏差（ＳＤ）は、４回の測定値から計算した。各群３匹のマウスについて、平均値とＳＤも計算した。必要に応じて、GraphPad Prism 6ソフトウェアを使用してＡｎｏｖａ分析を行った。

実施例１ヌクレオホスミンの配列アラインメントと相同性
哺乳動物では、ＮＰＭの最も一般的な形態はＮＰＭ１．１で、２つの選択的にスプライシングされたアイソフォーム（ＮＰＭ１．２及びＮＰＭ１．３）が存在し、これらはＮＰＭの短いバージョンであるが、高度に相同である（図１）。

実施例２ＨＨＤＩＩ／ＤＰ４及びＨＨＤＩＩ／ＤＲ４マウスのヌクレオホスミンエピトープに対するＴ細胞応答
腫瘍関連エピトープに対するＴ細胞応答は、免疫寛容及び胸腺内のＴ細胞の欠失のために、しばしば弱いか存在しない。ＨＬＡ－ＤＲ４及びＨＨＤＩＩ／ＤＰ４トランスジェニックマウスにおけるシトルリン化ＮＰＭペプチドを、ＩＦＮγ応答を刺激する能力についてスクリーニングした。アルギニンを有する全てのペプチドを選択し、アルギニン残基をシトルリン（ｃｉｔ）に置換した。選択したペプチドを表２にまとめる。

ヌクレオホスミンペプチド応答のスクリーニング
マウスで免疫応答を生み出すことが可能なシトルリン化ＮＰＭエピトープを特定するためにスクリーニングを行った。マウスを、４～６種のヒトシトルリン化ペプチドのプールで免疫化した。交差反応の影響を減らすために、重複するアミノ酸配列を含まないように各プール内のペプチドを選択した。各プールを、週に１回、３週間の単回免疫として皮下投与した。各ペプチドプールには、アジュバントとしてＣｐＧ／ＭＰＬＡと組み合わせた２５μｇの各ペプチドが含まれていた。３回目の免疫の７日後にマウスを選別し、免疫プール内の各ペプチドに対する免疫応答をex vivo ＩＦＮγELISpotで検討した（図２）。我々は、シトルリン化ペプチドがトランスジェニックＤＲ４マウス系統で応答を誘導できることを以前に示している。マウス系統が異なれば、ＭＨＣレパートリーが異なることを考え、スクリーニングには、２つの異なるトランスジェニック系統（ＤＲ４及びＤＰ４）を使用した。

ＨＨＤＩＩ／ＤＰ４及びＨＬＡ－ＤＲ４トランスジェニックマウスにおいて、ヒトＮＰＭシトルリン化ペプチドに対する有意なＩＦＮγ応答を検出した（図２）。ＨＨＤＩＩ／ＤＰ４マウス（Ａ）では、ＮＰＭシトルリン化ペプチド２６１－２８０及び２６６－２８５が有意な免疫応答を誘発した（それぞれp=<0.0001及びp=<0.0001）。対照的に、ペプチド１８６－２０５及び１９１－２１０に含まれるアミノ酸１９７（Ｂ細胞エピトープ）の既知のシトルリン化部位は、免疫応答を誘導できなかった。ＨＬＡ－ＤＲ４マウスでは、有意なＩＦＮγ応答（Ｂ）は、ＮＰＭシトルリン化ペプチド２６６－２８５のみで検出され（p=<0.0001）、他のＮＰＭペプチドに対して他の応答は検出されなかった。また、１９７位にシトルリン化残基を含むＢ細胞エピトープに対して生じた検出可能な免疫応答はなかった（Tanikawa et al. 2009）。

２６１－２８０ｃｉｔ及び２６６－２８５ｃｉｔの２つのペプチドは１５アミノ酸エピトープを共有し、これらのペプチドは、ＨＨＤＩＩ／ＤＰ４及びＨＬＡ－ＤＲ４マウスにおいて高頻度でＩＦＮγ応答を生み出した（図２Ａ及び図２Ｂ）。
アラインメントすると
（２６１－２８０）ＬＰＫＶＥＡＫＦＩＮＹＶＫＮＣＦ－ｃｉｔ－ＭＴＤ
（２６６－２８５）ＡＫＦＩＮＹＶＫＮＣＦ－ｃｉｔ－ＭＴＤＱＥＡＩＱ
となる。ＨＬＡ－ＤＲ４及びＨＨＤＩＩ／ＤＰ４マウスでの応答のコアとなるエピトープが、配列：
（２６６－２８０）ＡＫＦＩＮＹＶＫＮＣＦ－ｃｉｔ－ＭＴＤ
内に存在する必要がある。

コアエピトープを、２５μｇのＮＰＭ２６１－２８０ｃｉｔ又は２６６－２８５ｃｉｔペプチドでマウスを週１回３週間免疫することにより確認した。ＨＨＤＩＩ／ＤＰ４マウスは個々のペプチドで免疫し、ＨＬＡ－ＤＲ４マウスはＮＰＭ２６１－２８０ｃｉｔ及び２６６－２８５ｃｉｔの組合せで免疫し、全てＣｐＧ／ＭＰＬＡも投与した。３回目の免疫の７日後にマウスを選別した。ＮＰＭ２６１－２８０ｃｉｔ及びＮＰＭ２６６－２８５ｃｉｔに対する免疫応答を、提案されたコアエピトープであるＮＰＭ２６６－２８０ｃｉｔに対する応答と共に、ex vivo ＩＦＮγELISpotで検討した（図３）。ＨＨＤＩＩ／ＤＰ４ではヒトＮＰＭ２６１－２８０ｃｉｔ及びＮＰＭ２６６－２８５ｃｉｔペプチドに対し、またＨＬＡ－ＤＲ４トランスジェニックマウスではＮＰＭ２６６－２８５ｃｉｔペプチドに対し、有意なＩＦＮγ応答が検出された。ＨＨＤＩＩ／ＤＰ４トランスジェニックマウスでは、コアペプチドＮＰＭ２６６－２８０ｃｉｔと、ＮＰＭ２６１－２８０ｃｉｔ又はＮＰＭ２６６－２８５ｃｉｔに対する応答の間に有意差はなかった。ＨＬＡ－ＤＲ４トランスジェニックマウスでは、ＮＰＭ２６６－２８０ｃｉｔとＮＰＭ２６６－２８５ｃｉｔに対する応答に有意差があり、ＨＬＡ－ＤＲ４マウスではコアペプチドが異なり、恐らくアミノ酸ＱＥＡＩＱ（位置２８１－２８５）を含むことを示す。

ＨＬＡ－ＤＲ４及びＨＨＤＩＩ／ＤＰ４マウスにおいて、２６６－２８５ｃｉｔペプチドは最も強力な免疫応答を発生させた（図２Ａ及び図２Ｂ）。その後の実験では、このペプチドに焦点を当てた。

ＮＰＭ２６６－２８５ペプチドに対する免疫応答が野生型（ｗｔ）ではなくシトルリン化ペプチドに特異的であることを判断するために、マウスをＮＰＭ２６６－２８５ｃｉｔ又はＮＰＭ２６６－２８５ｗｔペプチドで免疫した。ＨＨＤＩＩ／ＤＰ４マウスの皮下に、２５μｇのペプチド（ＮＰＭ２６６－２８５ｃｉｔ又はＮＰＭ２６６－２８５ｗｔ）を週１回、３週間投与した。３回目の免疫の７日後にマウスを選別し、各ペプチドに対する免疫応答をex vivo ELISpotで検討した（図４Ａ及び図４Ｂ）。ＮＰＭ２６６－２８５ｗｔで免疫したマウスでは低から中程度のＩＦＮγ応答が認められ、その応答はシトルリン化ペプチドと交差反応し（図４Ｂ）、ＮＰＭ２６６－２８５ｃｉｔペプチドで細胞を刺激した場合に同様の応答が見られたので、これらの応答はＮＰＭ２６６－２８５ｗｔペプチドに特異的ではなかった。対照的に、ＮＰＭ２６６－２８５ｃｉｔで免疫したマウスでは強力なＩＦＮγ応答が認められ、これらの応答は、ＮＰＭ２６６－２８５ｗｔペプチド（p=0.0002）及び対照（p=<0.0001）に対する応答と比較して有意であった。これにより、ＨＨＤＩＩ／ＤＰ４マウスで生じた免疫応答は、ＮＰＭ２６６－２８５ペプチドのシトルリン化に応答することが確認された。

実施例３腫瘍細胞が提示したｃｉｔヌクレオホスミンペプチドは腫瘍治療の標的とすることができる
本発明者らは、メラノーマＢ１６Ｆ１細胞株がＮＰＭを構成的に発現し、ＮＰＭのin vitroシトルリン化が２７７位でシトルリンを生じることをウエスタンブロットにより既に確立している（図５Ａ及び図５Ｂ）。次に、ＮＰＭ２６６－２８５ｃｉｔペプチドによる免疫の抗腫瘍効果をin vivoで検討した。ＩＦＮγ誘導ヒトＤＰ４（ｉＤＰ４）でトランスフェクトされたマウスＢ１６メラノーマ細胞株の増殖に対するＮＰＭ２６６－２８５（ｃｉｔ及びｗｔ）による免疫化の効果を検討した。ＮＰＭ２６６－２８５ｗｔ又はＮＰＭ２６６－２８５ｃｉｔによる免疫化の３日前に、マウスにＢ１６ＨＨＤＩＩ／ｉＤＰ４腫瘍細胞をチャレンジした。ＮＰＭ２６６－２８５ｃｉｔペプチドで免疫化されたマウスは、ＣｐＧ／ＭＰＬＡのみで免疫化された対照マウスに対し有意な生存優位性を示した（図６Ａ）。対照マウスの生存率は５０日で０％であったのに対して、ＮＰＭ２６６－２８５ｃｉｔで免疫したマウスの生存率は６５％（p=<0.0001）、ＮＰＭ２６６－２８５ｗｔで免疫したマウスの生存率も有意な３０％（p=0.0018）であり、野生型ペプチドで刺激されたＴ細胞がシトルリン化エピトープと交差反応し、腫瘍を認識できることを再度示唆する。関連する毒性はなかった。腫瘍移植後２４日目の腫瘍体積も、ＮＰＭ２６６－２８５ｃｉｔ免疫マウス（図６Ｂ、中央値：０ｍｍ^３）では、対照群（中央値：１４２５ｍｍ^３）と比較して有意に低かった（p=<0.0001）。また、対照群（中央値：１４２５ｍｍ^３）と比較して、ＮＰＭ２６６－２８５ｗｔ免疫化マウスの腫瘍体積（中央値：３４ｍｍ^３）も有意に低かった（p=0.0152）。

実施例４健康なヒトドナー及びがん患者のＮＰＭへの応答
ＨＨＤＩＩ／ｉＤＰ４マウスでは、免疫の２日後に、ＮＰＭ２６６－２８５ｃｉｔペプチドに対する応答は検出できなかったが、１２日後には検出できた。このことは、これがナイーブな応答で、このマウスには既存の免疫が存在しないことを示唆する。このことは、ヒトはＮＰＭ２６６－２８５ｃｉｔペプチドに対する免疫応答を有するか、又は発生できるかという問題を提起した。これを調査するために、１０人の健康なドナーからＰＢＭＣを分離し、ＮＰＭ２６６－２８５ｃｉｔペプチドの存在下で培養した。９人のドナーはＨＬＡ－ＤＰ４が陽性で、そのうち２人はＨＬＡ－ＤＲ４も陽性であり、追加のドナー（ドナー１０）はＨＬＡ－ＤＰ４及びＨＬＡ－ＤＲ４が陰性（陰性対照）であった。

in vitroでの培養の前に、１０人の健康なドナーのＰＢＭＣを、ＮＰＭ２６６－２８５ｃｉｔペプチドの存在下、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識した。７日目と１０日目に、細胞を抗ＣＤ４及び抗ＣＤ８蛍光色素結合抗体で染色し、増殖をフローサイトメトリーで検討した（図７Ａ）。７日目に、１０人中４人で、ＣＤ４ＮＰＭ２６６－２８５特異的増殖（ＣＦＳＥ^ｌｏｗ）の集団が検出され、これは１０日目には増加し、１０人のドナー（９人はＨＬＡ－ＤＰ４陽性ドナー）中７人が特定の応答を示した（図７Ｂ）。１０日目に、良好なＣＤ４ＮＰＭ２６６－２８５特異的増殖応答を示した７人のドナーの機能分析を行った。全てのドナーで、ＩＦＮγ、グランザイムＢ及びＣＤ１３４の発現を、増殖中のＣＤ４Ｔ細胞と増殖していないＣＤ４Ｔ細胞を比較しながら、決定した（図７Ｃ、図７Ｄ及び図７Ｅ）。７人のドナー全員の増殖中のＣＤ４ＮＰＭ２６６－２８５特異的Ｔ細胞は、グランザイムＢを発現した。さらに、７人中６人は、ＩＦＮγ及びＣＤ１３４も発現していたが、この発現は大多数のドナー（７人中６人）で増殖中のＴ細胞のみに関するものであった。

in vitroでの培養の前に、１１人のがん患者及び９人の卵巣がん患者のＰＢＭＣを、ＮＰＭ２６６－２８５ｃｉｔペプチドの存在下、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識した。７日目と１０日目に、細胞を抗ＣＤ４及び抗ＣＤ８蛍光色素結合抗体で染色し、増殖をフローサイトメトリーで検討した（図７Ｆ）。７日目に、１１人の肺がん患者中４人で、ＣＤ４ＮＰＭ２６６－２８５ｃｉｔ特異的増殖（ＣＦＳＥ^ｌｏｗ）の集団が検出された。これは１０日目には減少し、１１人の患者中３人だけが特異的応答を示した（図７Ｆ）。７日目に、９人の卵巣がん患者中１人で、ＣＤ４ＮＰＭ２６６－２８５ｃｉｔ特異的増殖（ＣＦＳＥ^ｌｏｗ）の集団が検出された。これは１０日目も変化せず、２６６－２８５ＮＰＭｃｉｔペプチドに対する特異的な応答を示したのは１人の患者のみであった。

これらの結果は、健康なドナーの大多数が、細胞毒性活性に関する機能マーカーのアップレギュレーションにも関連するＮＰＭ２６６－２８５ｃｉｔペプチドに対するＣＤ４増殖応答を発生できることを示唆する。一部のがん患者のＰＢＭＣは、ＮＰＭ２６６－２８５ｃｉｔペプチドに対するＣＤ４応答を起こすことができるが、これは健康なドナーで応答する人数よりも少ない。この頻度の低下は、これらの患者における薬物療法又はある程度の腫瘍媒介性免疫抑制による可能性がある。

実施例５健康なヒトドナーでは、ナイーブＴ細胞集団はＮＰＭｃｉｔペプチドに応答する
２人の健康なドナーからＰＢＭＣを分離し、２つの画分に分割し、第１の画分はＣＤ４５ＲＯ細胞を枯渇させ、第２の画分は枯渇させなかった。in vitroでの培養の前に、ＰＢＭＣを、ＮＰＭ２６６－２８５ｃｉｔペプチドの存在下、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識した。１１日目に、細胞を抗ＣＤ４及び抗ＣＤ８蛍光色素結合抗体で染色し、増殖をフローサイトメトリーで検討した（図８）。１１日目に、ＣＤ４５ＲＯ枯渇及び非枯渇集団の両者で、ＣＤ４ＮＰＭ２６６－２８５特異的増殖（ＣＦＳＥ^ｌｏｗ）の集団が検出された。増殖中のＣＤ４Ｔ細胞の割合は、ＣＤ４５ＲＯ枯渇集団で高く（２３．６％）、このことは、ナイーブＴ細胞がＮＰＭｃｉｔペプチドに応答していることを示す。

実施例６さまざまな種の間のヌクレオホスミンの相同性
ヌクレオホスミンは、マウス、イヌ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ブタ及びヒトの間で高度に保存されている（図９）。ワクチンはヒト及びマウスでＴ細胞応答を誘導し、マウスで抗腫瘍応答を誘導するため、他の種でも同様の応答が見られると想定できる。

実施例７ＰＡＤ２はin vivoでの腫瘍におけるアルギニン２７７のシトルリン化に関与する
ＰＡＤ２又はＰＡＤ４酵素がin vivoでのシトルリン化に関与するかどうかを判断するために、ＰＡＤ２を欠くＢ１６腫瘍細胞株（B16F1cDP4PAD2KO）を調製した。ＰＡＤ４のノックアウト後に細胞は成長できず、ＰＡＤ４酵素のノックアウトは失敗した。ＰＡＤ２酵素を欠くB16F1cDP4PADKO腫瘍細胞を、トランスジェニックＨＬＡ－ＤＰ４マウスに移植した。ＣＰＧ／ＭＰＬＡと組み合わせたＮＰＭ２６６－２８５ｃｉｔによる免疫化後に腫瘍成長を検討し、ＣＰＧ／ＭＰＬＡ対照群における腫瘍成長と比較した（図１０）。全体として、非免疫のＣＰＧ／ＭＰＬＡ対照群と比較した場合、ＮＰＭ２６６ｃｉｔで免疫したB16F1cDP4PADKO担癌マウスで、有意な生存優位性はなかった（p=0.6826、図１０Ａ）。腫瘍体積を２８日目に計算した（図１０Ｂ）。ＣｐＧ／ＭＰＬＡ対照マウス（中央値：１９０．５ｍｍ^３）とＮＰＭ２６６－２８５ｃｉｔ免疫マウス（中央値：６９６．６ｍｍ^３）の間に有意差はなかった（p=0.2050）。B16F1cDP4PADKO担癌マウスでは抗腫瘍応答が消失し、このことは、ＰＡＤ２がin vivoでの腫瘍細胞におけるアルギニン２７７のシトルリン化及び抗腫瘍効果に重要であることを実証している。

実施例８ＭＨＣクラスＩＩは、ＮＰＭ２６６－２８５ｃｉｔによる免疫後の抗腫瘍反応に必須である
ＭＨＣクラスＩＩが、ＮＰＭ２６６－２８５ｃｉｔによる免疫化後に担癌マウスで観察される抗腫瘍応答に必須であるかどうかを判断するために、Ｂ１６細胞株を、ＭＨＣ－ＩＩがノックアウトするよう改変した（B16F1HHDIIMHCIIKO）。トランスジェニックＨＨＤＩＩマウスに、ＭＨＣ－ＩＩを欠くB16F1HHDIIMHCIIKO腫瘍細胞を移植した。ＣＰＧ／ＭＰＬＡと組み合わせたＮＰＭ２６６－２８５ｃｉｔによる免疫化後に腫瘍成長を検討し、ＣＰＧ／ＭＰＬＡ対照群と比較した（図１１）。全体として、ＣＰＧ／ＭＰＬＡ対照群と比較した場合、ＮＰＭ２６６－２８５ｃｉｔで免疫したB16F1HHDIIMHCIIKO担癌マウスでは全生存率が１０％改善した（p=0.0144、図１１Ａ）。腫瘍体積を２８日目に計算した（図１１Ｂ）。ＣｐＧ／ＭＰＬＡ対照マウス（中央値：１０２７ｍｍ^３）とＮＰＭ２６６－２８５ｃｉｔ免疫マウス（中央値：９０４．３ｍｍ^３）の間に有意差はなかった（p=0.2050）。ＭＨＣ－ＩＩＫＯ腫瘍における生存率のわずかな改善は、ＣＤ４Ｔ細胞が、ＣＤ８及び／又はＮＫ応答の改善によるバイスタンダー効果で抗腫瘍応答を誘導できることを示唆するが、腫瘍がＭＨＣ－ＩＩを発現する場合の優れた抗腫瘍応答は、ＣＤ４Ｔ細胞が腫瘍を直接殺すこともできることを示唆する。

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Claims

i) アミノ酸配列ＡＫＦＩＮＹＶＫＮＣＦＲＭＴＤ（式中、アルギニン（Ｒ）残基はシトルリンに置換されている）、又は
ii) アルギニン以外の位置で、１、２若しくは３個のアミノ酸が置換され、１、２若しくは３個のアミノ酸が挿入され、及び／又は、１、２若しくは３個のアミノ酸が欠失されているi) のアミノ酸配列、
を含む、から本質的になる、又は、からなる、シルトリン化Ｔ細胞抗原。
i) 以下のアミノ酸配列：
ＡＫＦＩＮＹＶＫＮＣＦＲＭＴＤＱＥＡＩＱ
ＬＰＫＶＥＡＫＦＩＮＹＶＫＮＣＦＲＭＴＤ
（式中、アルギニン（Ｒ）残基はシトルリンに置換されている）
の１つ以上、又は
ii) シトルリン以外の位置で、１、２若しくは３個のアミノ酸が置換され、１、２若しくは３個のアミノ酸が挿入され、及び／又は、１、２若しくは３個のアミノ酸が欠失されているi) のアミノ酸配列の１つ以上、
を含む、から本質的になる、又は、からなる、請求項１に記載の抗原。
請求項１又は２に記載の抗原とＭＨＣ分子との複合体であって、場合によっては、前記ＭＨＣ分子は、任意にＨＬＡ－ＤＲ４及びＤＰ４から選択される、ＭＨＣクラスＩＩである、複合体。
請求項１又は２に記載のポリペプチドに結合する結合部分。
ＭＨＣと複合体を形成する場合、前記ポリペプチドに結合する、請求項４に記載の結合部分。
前記結合部分はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）又は抗体である、請求項４又は５に記載の結合部分。
前記ＴＣＲは細胞の表面に存在する、請求項６に記載の結合部分。
医薬として使用するための、請求項１若しくは２に記載の抗原、請求項３に記載の複合体、又は請求項４～７のいずれか一項に記載の結合部分。
がんの治療又は予防に使用するための、請求項８に記載の抗原、複合体及び／又は結合部分。
前記がんが、ＡＭＬ、肺、結腸直腸、腎臓、乳房、卵巣及び肝臓の腫瘍である、請求項９に記載の抗原、複合体及び／又は結合部分。
請求項１若しくは２に記載の抗原、請求項３に記載の複合体、及び／又は請求項４～７のいずれか一項に記載の結合部分、並びに薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
請求項３に記載の複合体に結合する結合部分を特定する方法であって、前記方法は、候補となる結合部分を前記複合体と接触させ、前記候補となる結合部分が前記複合体に結合するかどうかを決定することを含む、方法。