JP2023521384A - 活性化可能抗体を含む組成物 - Google Patents

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Abstract

本発明は、無損傷活性化可能抗体およびその切断異型体を含む組成物、無損傷活性化可能抗体から、無損傷活性化可能抗体の切断異型体を分離する方法、および組成物生産処理中に活性化可能抗体およびその切断異型体の相対％を判定またはモニターする方法を含む関連する方法を提供する。【選択図】図２Ａ

Description

関連する出願の相互参照
本出願は、２０２０年４月９日付けで出願された米国仮出願番号第６３／００７，７７６号に基づく優先権を主張する。その優先出願の開示内容全体が参照として本明細書に組み入れられる。
配列表の参照
本願は電子形式で提出の配列表を含む。配列表は、「ＣＹＴＸ－０５６－ＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と題するサイズ８８，０００バイトのファイルであり、２０２１年３月３１日付け作成のものである。この電子形式の配列表に含まれる情報は本願の一部を成し、その全内容が参照として本明細書に組み入れられる。
本開示は、無損傷活性化可能抗体およびその切断異型体に関連する組成物および方法に関するものであり、該組成物および方法は、組成物ならびに該組成物を作成、精製、測定、モニター、および利用する方法を含む。
モノクローナル抗体は、ますます増え続けている一群の治療用化合物であり、そのそれぞれは複数の臨床的適応のうちのいずれか一つに関与する標的抗原に結合するように設計される。これまでに、治験段階のもの、あるいは新規薬剤として承認されているもののいずれかである、モノクローナル抗体医薬品のリストは広範囲にわたる。この種類の医薬品の急激な増加は、それらの製造に用いる処理法に大きな進歩をもたらしたが、医薬品の凝集は依然として、各新規モノクローナル抗体薬剤の製造処理の開発中に対処せねばならない大きな問題である（Ｖａｒｓｈａら、ＢｉｏＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、第２６巻、３号）。医薬品の凝集は、薬剤産物の収率を低下させ、医薬品組成物から除去されなければ、安全性に関する潜在的問題となり得るため、望ましくない（同書）。例えば、凝集は、通常は露出していないエピトープを露出させ得るような肉眼視不可能な粒子の形成の原因となり、患者に投与した場合に、免疫原性の増加を潜在的に起こし得る（同書）。
このような凝集体は、細胞培養において産物発現中、あるいは下流処理における産物精製中、または保存中のいずれかに、不可逆的に形成される変性抗体分子の、典型的にはもつれた大型の塊である（同書）。様々な要因が、この凝集体の形成に寄与し得る。抗体治療薬の安全性および／または効力を改善する努力が成されてきたが、場合によっては、分子の構造を改変することによってそれが達成されることもあった。しかし、場合によっては、精製抗体治療薬の製造に関して、このような構造の変更が別の問題を引き起こすこともある。
したがって、抗体治療用化合物製造についての新規処理法が大変望まれている。
一局面において、本開示は、無損傷活性化可能抗体およびその切断異型体を含む組成物を含むが、ここで該切断異型体はその存在量が減少している。いくつかの局面においては、該切断異型体は、抗原結合ドメイン（ＡＢ）を含み、かつ開裂可能部分（ＣＭ）の少なくとも一部を含む。いくつかの局面においては、該切断異型体は少なくとも１つのプロドメインの隠蔽性部分（ＭＭ）を欠いている。
いくつかの局面において、該組成物は、還元ＳＤＳ－ｃＧＥによって測定した場合に少なくとも約９０％の無損傷活性化可能抗体；還元ＳＤＳ－ｃＧＥによって測定した場合に約１０％未満の切断異型体；ＳＥ－ＨＰＬＣで測定した場合に約５％未満の高分子量分子種（ＨＭＷＳ）；および対応するＨＣＰ ＥＬＩＳＡで測定した場合に約１５０ｐｐｍ未満の宿主細胞蛋白質（ＨＣＰ）を含む。いくつかの局面においては、該組成物は、９５％超の無損傷活性化可能抗体および０．０５～５％の切断異型体を含む。いくつかの局面においては、該組成物は、９０％超の無損傷活性化可能抗体、０．０５～５％の切断異型体、１５０ｐｐｍ未満の宿主細胞蛋白質（ＨＣＰ）、および／または５％未満のＨＭＷＳを含む。いくつかの局面においては、該組成物は、９６％超の無損傷活性化可能抗体、０．０５～４％の切断異型体、１５０ｐｐｍ未満のＨＣＰおよび５％未満のＨＭＷＳを含む。いくつかの局面においては、該組成物は、９７％超の無損傷活性化可能抗体、０．０５～３％の切断異型体、１５０ｐｐｍ未満の宿主細胞蛋白（ＨＣＰ）および５％未満のＨＭＷＳを含む。いくつかの局面においては、該組成物は、９８％超の無損傷活性化可能抗体、０．０５～２％の切断異型体、１５０ｐｐｍ未満の宿主細胞蛋白（ＨＣＰ）および５％未満のＨＭＷＳを含む。いくつかの局面においては、該組成物は、９９％超の無損傷活性化可能抗体、０．０５～１％の切断異型体、１５０ｐｐｍ未満の宿主細胞蛋白（ＨＣＰ）および５％未満のＨＭＷＳを含む。いくつかの局面において、本開示は、容器、バイアル、注射筒、または該組成物の入った注入デバイスを含む。
一局面において、本開示は、組成物を生産する処理を含むが、ここで該組成物は以下の（Ａ）および（Ｂ）を含む：
（Ａ）ＭＭ、ＣＭ、およびＡＢを含む、９５％超の無損傷活性化可能抗体；
および
（Ｂ）その切断異型体であって、０．０５～５％の切断異型体；
ここで該処理は、クロマトグラフィーカラムに、水、（Ａ）、（Ｂ）、および第１の塩を含む水性原材料を載せる工程を含み、
ここで該クロマトグラフィーカラムは、支持マトリックスおよびそれに結合した疎水性リガンドを含む固定相を含み、
また該処理は、該組成物を取得する目的で、水および第２の塩を含む溶離液で該クロマトグラフィーカラムを溶出する工程をさらに含む。一局面において、該処理は、処理中において切断異型体の量を７５～９０％減らすことを含む。一局面において、該処理は、処理中においてＨＣＰの量を７５～９０％減らすことを含む。一局面において、該処理は、処理中においてＨＭＷＳの量を７５～９０％減らすことを含む。一局面において、該処理は、処理中に切断異型体、ＨＣＰ、およびＨＭＷＳの量を７０～９５％減らすことを含む。
一局面においては、本開示は、無損傷活性化可能抗体をその切断異型体から分離する方法を含むが、ここで該切断異型体は、該無損傷活性化可能抗体のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を示す切断異型体であり；
ここで該方法は：
（ｉ）水、該無損傷活性化可能抗体、その切断異型体、および第１の塩を含む水性原材料を、クロマトグラフィーカラムに載せる工程であって、
ここで該クロマトグラフィーカラムは、支持マトリックスおよびそれに結合した疎水性リガンドを含む固定相を含む、
クロマトグラフィーカラムに載せる工程；
および
（ｉｉ）組成物を取得する目的で、水および第２の塩を含む溶離液で、該クロマトグラフィーカラムを溶出する工程であって、
ここで処理中に該切断異型体の量を少なくとも７０％減少させる、
クロマトグラフィーカラムを溶出する工程、
を含む。いくつかの実施態様においては、処理中に該切断異型体の量を少なくとも７５％、８０％、８５％、または９０％減少させる。
一局面において、本開示は、組成物および組成物を作成するための処理を含むが、ここで該組成物は、重量で該組成物の総蛋白質のうちの少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が無損傷活性化可能抗体の形態であり、かつ重量で該組成物の総蛋白質のうちの０．１～１０％がその凝集した切断異型体の形態である。
一局面において、本開示は、無損傷活性化可能抗体および５％未満のその切断異型体、５％未満のその凝集体、１５０ｐｐｍ未満のＨＣＰ、またはそれらの組み合わせを含む医薬品組成物を生産する方法を含むが、ここで該方法は、水、（Ａ）、（Ｂ）、および第１の塩を含む水性原材料を、クロマトグラフィーカラムに載せる工程を含み、ここで該クロマトグラフィーカラムは、支持マトリックスおよびそれに結合した疎水性リガンドを含む固定相を含み、また該方法は、水および第２の塩を含む溶離液でクロマトグラフィーカラムの溶出を行い、該組成物を取得する工程を含む。
いくつかの局面において、本開示は、本明細書に開示される組成物を、それを必要とする対象、例えば、癌、炎症性疾患、自己免疫疾患、またはそれらの組み合わせに罹患している患者に投与することを含む。いくつかの局面において、本開示は、活性化可能抗体の切断異型体を毒性量よりも低い量で、および疾病微小環境において活性化する活性化可能抗体をある用量で含む本明細書に開示される組成物を、投与することを含む。いくつかの局面において、本開示は、本開示の組成物を投与することによって、対象を治療する治療的濃度域を拡大することを含む。
一局面において、本発明は、無損傷活性化可能抗体の精製組成物を生産するための処理法を提供するが、ここで該処理法は以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む：
（ａ）水、無損傷活性化可能抗体、切断不純物、および第１の塩を含む水性原材料を、クロマトグラフィーカラムに載せる工程であって、
ここで該クロマトグラフィーカラムが、支持マトリックスおよびそこに結合したリガンドを含む固定相を含み、
ここで該リガンドは、疎水性置換基を含み、
かつ、
ここで該無損傷活性化可能抗体は、
（ｉ）第１の生物学的標的に特異的な結合親和性を有する少なくとも第１の抗原結合ドメイン（ＡＢ）、
および
（ｉｉ）第１のプロドメイン、
を含み、
ここで該少なくとも第１のＡＢは、第１の抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および第１の抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含み、
ここで該第１のプロドメインは、第１の隠蔽部分（ＭＭ）および第１の開裂可能部分（ＣＭ）を含み、
かつ
ここで該第１のＡＢは、該第１のプロドメインに共役（結合）している、
クロマトグラフィーカラムに載せる工程；
および
（ｂ）無損傷活性化可能抗体を含む精製組成物を含む溶出液を生成させる目的で、水および第２の塩を含む溶離液で該クロマトグラフィーカラムを溶出する工程であって、
ここで該溶出液において、該切断不純物が実質的に除去されている、
クロマトグラフィーカラムを溶出する工程。
別の局面において、該水性原材料は、その他の不純物（例えば、宿主細胞蛋白質（ＨＣＰ）および／または高分子量分子種（ＨＭＷＳ）など）をさらに含むが、ここで該溶出液においては、その他の不純物の量が実質的に減少している。
さらなる一局面において、本発明は、精製した無損傷活性化可能抗体組成物であって、切断不純物の残留量が全くゼロであるか、あるいは非常に低い組成物を提供する。
またさらなる一局面において、本発明は、精製した無損傷活性化可能抗体組成物であって、切断不純物、宿主細胞蛋白質（ＨＣＰ）、および高分子量分子種（ＨＭＷＳ）の残留量が全くゼロであるか、あるいは非常に低い組成物を提供する。
別の局面において、本開示は、組成物生産処理中に活性化可能抗体およびその切断異型体の相対量を判定またはモニターする方法を含むが、ここで該判定またはモニターは、以下の工程によって成される：
活性化可能抗体の集団およびその切断異型体の集団を含む試料組成物を、ゲルキャピラリー電気泳動に供する工程；
該ゲルキャピラリー電気泳動において、該活性化可能抗体の集団を、その切断異型体の集団から分離する工程；
および
無損傷のプロドメインをコードするポリペプチドに対応するピーク面積およびその切断プロドメインをコードするポリペプチドに対応するピーク面積を測定することによって、該活性化可能抗体の集団およびその切断異型体の集団の相対量を定量する工程。
活性化可能抗ＰＤＬ１抗体の生物学的回収によって取得した試料について質量分光分析を行った結果を示している。この結果は、対応する単一アーム切断不純物の予想分子量に対応する単一ピークを示している。完全切断不純物の予想分子量の位置には全くピークが見られない。 活性化可能抗ＰＤ１抗体の生物学的回収によって取得した試料について質量分光分析を行った結果を示している。この結果は、対応する単一アーム切断不純物の予想分子量に対応する単一ピークを示している。完全切断不純物の予想分子量の位置には全くピークが見られない。 活性化可能抗ＣＤ１６６抗体の生物学的回収によって取得した試料について質量分光分析を行った結果を示している。この結果は、対応する単一アーム切断不純物の予想分子量に対応する単一ピークを示している。完全切断不純物の予想分子量の位置には全くピークが見られない。 無損傷活性化可能抗体およびその切断異型体の構造を模式的に示す。 無損傷活性化可能抗体およびその切断異型体の混合物を模式的に示すが、これら切断異型体は、本開示の方法で処理する前には、組成物中に存在している可能性がある。 以下を模式的に示している：（１）対象の細胞への図２Ｂの混合物の投与；（２）上記投与後の対象の細胞への無損傷活性化可能抗体およびその切断異型体の結合；（３）該組成物由来の切断異型体の健常組織ヘの結合；および（４）罹患（例えば、腫瘍）組織の環境における、無損傷活性化可能抗体の活性化、およびその部位への活性化抗体の結合。 以下を模式的に示している：（１）対象への投与時における、本開示の方法で処置した後の組成物に存在する無損傷活性化可能抗体の結合；（２）投与した無損傷活性化可能抗体の、健常組織への結合の欠如；および（３）罹患（例えば、腫瘍）組織のみの環境における、無損傷活性化可能抗体の活性化、およびその部位への活性化抗体の結合。 プロテインＡクロマトグラフィーによる精製後の活性化可能抗ＣＤ１６６抗体を含む試料について実施した還元ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）キャピラリーゲル電気泳動（ＳＤＳ－ｃＧＥ）の結果を表している。 活性化可能抗ＣＤ１６６抗体を含む試料の陰イオン交換クロマトグラフィー（陰イオンＩＥＸ）後の溶出液の試料について実施した還元ＳＤＳ－ｃＧＥの結果を表している。陰イオンＩＥＸ工程の水性原材料は、プロテインＡクロマトグラフィー工程（その分析は図４Ａに示される）の溶出液を含むものであった。 疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）による精製後の活性化可能抗ＣＤ１６６抗体を含む試料について実施した還元ＳＤＳキャピラリーゲル電気泳動（ＳＤＳ－ｃＧＥ）の結果を表している。ＨＩＣ工程の水性原材料は、陰イオンＩＥＸ工程（その分析は図４Ｂに示される）の溶出液を含むものであった。 実施例２に記載のような無損傷活性化可能抗ＣＤ１６６抗体および対応する切断不純物を含む水性原材料を精製する陽イオン交換クロマトグラフィーの評価を示す。カラムは、第１の緩衝液（２５ｍＭ ＮａＯＡｃ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５．０（８０カラム容積勾配））を第２の緩衝液（２５ｍＭ ＮａＯＡｃ、２５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５．０）に混合することによるＮａＣｌ勾配で溶出した。曲線「Ａ」は２８０ｎｍの吸光度を示し；曲線「Ｂ」は２５４ｎｍの吸光度を示し；曲線「Ｃ」は伝導度（ｍＳ／ｃｍ）を示し；曲線「Ｄ」は、第２の緩衝液に混合した第１の緩衝液の％を示している。左のｙ軸は吸光度（ｍＡＵ）を表し；右のｙ軸は伝導度（ｍＳ／ｃｍ）を表し；ｘ軸は画分（ｍＬ）を表す。
広範な標的発現に起因する毒性が、モノクローナル抗体治療薬の治療有効性を制限してきた。この問題に対処するために、組換え法によって作成される活性化可能抗体であって、抗原結合ドメイン（ＡＢ）、開裂可能部分（ＣＭ）、およびＡＢのその標的に対する特異的結合を阻害可能な隠蔽性部分（ＭＭ）を含む活性化可能抗体が生産されている。生物学的標的への結合特異性に関しては、そのような活性化可能抗体は、特定のプロテアーゼ、特に局在的疾病環境（例えば、腫瘍微小環境）において上方制御されるプロテアーゼへの曝露による活性化後にのみ、抗体様の挙動を示す。
製造プロセスにおいて宿主細胞中に存在するプロテアーゼおよびプロテアーゼ基質の相対的不安定性に起因して、活性化可能抗体を含む組成物は、ＭＭの欠如した切断異型体を大きな割合で含むことが多く、そのため容易に健常細胞上の標的に非特異結合し、潜在的にモノクローナル抗体に関連する用量依存性毒性および副作用の原因となることを、本発明者らは明らかにしている。治療剤に切断異型体が存在すれば、体循環において、切断異型体が正常組織で捕捉されるため、標的組織（例えば、癌性組織）に到達できる無損傷活性化可能抗体の用量は低下することがあり得る。また本発明者らは、活性化可能抗体を含む特定の組成物は、切断異型体の存在に加えて、凝集に起因する高分子量分子種を高い割合で含むことを観察しているが、これは有効性を低下させ、免疫原性を増加させることがある。特に、本発明者らは、切断異型体が、開裂切断ということを除けば、元々の活性化可能抗体にサイズが類似しており、またアミノ酸配列も同一であることを明らかにした。切断異型体と無損傷活性化可能抗体の間のサイズならびに構造特性および物理化学的特性の類似性のために、元々の無損傷活性化可能抗体から切断異型体を分離して、高純度の組成物を高収率で（例えば、無損傷の非凝集活性化可能抗体を高い％で）取得することは困難である。後述のように、本発明者らは、切断異型体を選択的に除去して、活性化可能抗体組成物を精製する方法を発見した；該方法では、無損傷活性化可能抗体を高レベルで含むが、切断異型体が低いレベルあるいは検出されないレベルの組成物が得られる。
定義
本明細書において、用語「活性化可能抗体」、「プロテアーゼによって活性化される抗体」、および「無損傷活性化可能抗体」は同義語であり、組換え技術で生産される「隠蔽された」結合化合物を指すが、これは、生物学的標的への結合特異性に関して、特定のプロテアーゼへの曝露による活性化後にのみ、抗体様の挙動を示すように設計されたものである。構造的には、活性化可能抗体は：
（１）非隠蔽状態のときには、生物学的標的に特異的に結合する抗原結合ドメイン（ＡＢ）；
および
（２）隠蔽性部分（ＭＭ）および開裂可能部分（ＣＭ）を含む、またはそれらから成るＡＢに、（ペプチド結合を介して）結合させたプロドメイン、
を含む。
本明細書において、用語「アミノ酸陰イオン」は、アミノ酸の陰イオン形態を指す。該陰イオン部分は、例えば、脱プロトン化αカルボキシルまたはＲ基カルボキシルなど（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸のＲ基カルボキシル部分など）であってもよい。
本明細書において、用語「アミノ酸陽イオン」は、アミノ酸の陽イオン形態を指す。該陽イオン部分は、例えば、プロトンを付加したαアミンまたはＲ基アミン（例えば、アルギニン（すなわち、グアニジノ部分）、トリプトファン、アスパラギン、グルタミン、リジン、ヒスチジンなどのＲ基アミン部分）などであってもよい。
本明細書において、用語「アミノ酸塩」は、アミノ酸の塩を指す。アミノ酸塩の例としては、例えば、アルギニン塩酸塩、リジン塩酸塩などが挙げられる。
本明細書において、用語「抗原結合ドメイン」および「ＡＢ」は、同義語であり、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）をコードする１種類以上のポリペプチドによって形成される、生物学的標的に特異的結合親和性を有する結合ドメインを指す。
本明細書中の用語「生物学的標的」は、ある哺乳動物種にとって天然の蛋白質を指す。
本明細書中の用語「プロドメイン」は、最小限で、隠蔽性部分（ＭＭ）および開裂可能部分（ＣＭ）をコードするアミノ酸配列を有するペプチドを指す。該プロドメインは、例えば、スペーサー、１種類以上のリンカー（例えば、ＭＭとＣＭとの間、および／またはＭＭとＶＬとの間、および／またはＭＭとＶＨとの間、および／またはＣＭとＶＬとの間、および／またはＣＭとＶＨとの間などに配置される）などの他の配列要素を含むものであってもよい。
本明細書中の用語「隠蔽性部分」および「ＭＭ」は、同義語であり、ＡＢの近位に配置される場合に、ＡＢの生物学的標的に対する結合を干渉するペプチドを指す。
本明細書中の用語「開裂可能部分」および「ＣＭ」は、同義語であり、少なくとも１種類のプロテアーゼに関する基質を含むペプチドを指す。
本明細書中の用語「切断不純物」および「切断異型体」は、同義語であり、無損傷活性化可能抗体がプロテアーゼ媒介性開裂を起こした結果としての分子を指す。切断不純物は、対応する活性化可能抗体のＡＢを含むが、ＭＭの一部または全体を欠く（および、したがって、プロドメインの全体または一部を欠き、例えば、少なくとも１つのＣＭの全体または一部を欠き、対応するＭＭの全体を欠く）。用語「切断不純物」および「切断異型体」は、「単一アーム切断」分子種および「完全切断」分子種の両方を含むものであってもよい。
本明細書中の用語「特異的結合親和性」は、ＡＢの特異的生物学的標的への選択的結合を指す。
本明細書中の用語「単一アーム切断不純物」または「単一アーム切断分子種」は、同義語であり、対応する無損傷活性化可能抗体の一方のプロドメインのみにおいて、一部または全体が欠失している切断不純物を指す。用語「単一アーム切断」は、活性化可能抗体の異型体に関連して用いられるが、ここで該無損傷活性化可能抗体は、２種類以上の抗原結合ドメイン（ＡＢ）および２種類以上のプロドメインを含む。
本明細書中の用語「完全切断不純物」または「完全切断分子種」は、同義語であり、対応する無損傷活性化可能抗体の各プロドメインの一部または全体が欠失している切断不純物を指す。
本明細書中の用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「蛋白質」は、同義語であり、天然または非天然のアミノ酸残基またはアミノ酸類似体を含むポリマーまたはオリゴマーを指す。
本明細書中の用語「パーセント切断不純物」、「切断不純物％」、「切断プロドメインをコードするポリペプチドのパーセント」および「切断したプロドメインをコードするポリペプチド％」は、同義語であり、切断プロドメインおよび無損傷プロドメインをコードするポリペプチドの総量に対する百分率で表される、組成物に存在する切断プロドメインをコードするポリペプチドの相対量を指すが、これらの量は、還元ＳＤＳキャピラリーゲル電気泳動（「還元ＳＤＳ－ｃＧＥ」）によって決定される。還元ＳＤＳ－ｃＧＥアッセイの具体例を実施例１に示す。切断不純物のパーセントは、切断プロドメインをコードするポリペプチドおよび無損傷プロドメインをコードするポリペプチドに基づく相対的％ピーク面積によって、以下のように算出される：
Figure 2023521384000002
 全ての検出分子種に対応する総ピーク面積は、全ＳＤＳ－ｃＧＥクロマトグラフにおける、全ピーク面積の総計を指す。
本明細書中の用語「％無損傷活性化可能抗体」、「無損傷活性化可能抗体％」、「無損傷のプロドメインをコードするポリペプチドのパーセント」、および「無損傷のプロドメインをコードするポリペプチド％」は、同義語であり、切断プロドメインおよび無損傷プロドメインをコードするポリペプチドの総量に対する百分率で表される、組成物に存在する無損傷のプロドメインをコードするポリペプチドの相対量を指すが、これらの量は、還元ＳＤＳ－ｃＧＥ（例えば、実施例１に示される還元ＳＤＳ－ｃＧＥアッセイなど）によって決定される。無損傷活性化可能抗体％は、切断プロドメインをコードするポリペプチドおよび無損傷プロドメインをコードするポリペプチドに基づく相対％ピーク面積によって、以下のように算出される：
Figure 2023521384000003
用語「プロドメインをコードするポリペプチド」は、プロドメインをコードするアミノ酸配列を含む活性化可能抗体のポリペプチドを指す。プロドメインをコードするポリペプチドは、プロドメインに加えて、活性化可能抗体の他の要素をコードするアミノ酸配列を含むものであってもよい。例えば、抗体軽鎖をコードするポリペプチド内にプロドメインの残基を含むものであれば、そのプロドメインをコードするポリペプチドは、少なくとも１つのＶＬをもコードする。同様に、他の実施態様においては、抗体重鎖をコードするポリペプチド内にプロドメインの残基を含むものであれば、そのプロドメインをコードするポリペプチドは、少なくとも１つのＶＨをもコードする。同様に、ｓｃＦｖ鎖をコードするポリペプチド内にプロドメインの残基を含むものであれば、そのプロドメインをコードするポリペプチドは、少なくとも１つのＶＬおよびＶＨをさらにコードする。
本明細書中の用語「切断プロドメインをコードするポリペプチド」は、プロドメインの切断後に得られる、切断型プロドメインをコードするポリペプチドを指す。
本明細書中の用語「無損傷のプロドメインをコードするポリペプチド」は、切断されておらず、無損傷のプロドメインを含むプロドメインをコードするポリペプチドを指す。
本明細書中の用語「実質的に除去された」は、検出可能な切断不純物を含まない、あるいは水性原材料に存在する切断不純物のレベルに比較して切断不純物の相対レベルが少なくとも２０％低下している、溶出液組成物を指すが、ここで％減少は以下の式にしたがって算出される：
Figure 2023521384000004
 ここで「％切断不純物」は、上記で定義されるものと同一である。
本明細書において、切断異型体および切断不純物に関連して用いられる用語「実質的に含まない」は、検出可能な切断不純物を含まない、あるいは含まれる切断不純物について、ＳＤＳ－ｃＧＥで判定した場合の％切断不純物が５％未満（例えば、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、あるいはゼロと５％との間のいずれかの数値または範囲）である組成物を指す。
本明細書中の用語「結合した対応する切断不純物」および「結合した切断不純物」は、同義語として用いられ、クロマトグラフィーカラムに保持される切断不純物を指す。
本明細書中の用語「スペーサー」は、プロドメインの遊離末端に挿入されるアミノ酸残基またはペプチドを指す。いくつかの局面においては、スペーサー（または「ヘッダー」）は、グルタミン（Ｑ）残基を含んでいてもよい。いくつかの局面においては、スペーサー中の残基は、Ｎ末端アミノ酸の開裂を防ぐためにアミノペプチダーゼおよび／またはエクソペプチダーゼの作用を最小化する。
本明細書中の用語「リンカー」は、活性化可能抗体のＭＭ、ＣＭ、および／またはＡＢの要素間のさらなる物理的分離を提供するように機能するアミノ酸残基またはペプチドを指す。
本明細書中の用語「高分子量分子種」および「ＨＭＷＳ」は、同義語であり、サイズ除外高速液体クロマトグラフィー（実施例１に記載のアッセイなどのＳＥ－ＨＰＬＣ）によって決定した場合に、無損傷の単量体活性化可能抗体よりも大きな有効分子量を有する組成物不純物（例えば、凝集体）を指す。
用語「有効分子量」は、実施例１に記載のアッセイなどのＳＥ－ＨＰＬＣアッセイによって決定される分子量を指す。
本明細書中の用語「一定組成の」は、溶出工程の時間経過において実質的に一定組成または固定的組成を有する溶離液の使用を指す。
本明細書中の用語「疎水性相互作用クロマトグラフィー固定相」または「ＨＩＣ固定相」は、同義語として用いられ、もっぱら疎水性相互作用を介して化合物に相互作用するように設計したリガンドを有する型の固定相を指す。
本明細書中の用語「マルチモーダルクロマトグラフィーの固定相」または「ＭＭＣ固定相」は、同義語として用いられ、疎水性相互作用ならびに１種類以上の疎水性相互作用ではない別の種類の相互作用（例えば、静電（荷電リガンド置換基を介して）、水素結合、硫黄原子親和性など）を介して化合物と相互作用するリガンドを有する型の固定相を指す。
本明細書中の用語「宿主細胞蛋白質」および「ＨＣＰ」は、同義語として用いられ、無損傷活性化可能抗体を発現させる宿主細胞にとって天然である蛋白質を指す。
本明細書中の用語「総蛋白質収率」は、水性原材料中の総蛋白質に基づき、ＵＶ分光アッセイの波長２８０ｎｍにおける吸光度で測定した、クロマトグラフィー溶出液に回収した総蛋白質の百分率を指す。
本明細書中の用語「介在的ユニット操作」は、細胞培養処理工程と疎水性クロマトグラフィー処理工程との間の処理工程を指す。
用語「バルク中間体産物組成物」は、介在的ユニット操作による産物の組成物を指す。
本明細書中の用語「生物学的回収組成物」は、目的の活性化可能抗体を含む組成物を生産する細胞培養工程に由来する組成物を指す。
ユニット操作間の関係についての言及に関連して用いられる、本明細書中の用語「段階的」は、時間および順番に関する順序に関し、バッチで、準連続的に、または連続的に、のいずれかで、最初に、次いで第２番目として、などのように実施される２つ以上のユニット操作を指す。
本明細書中の用語「共役反応試薬」は、反応性リンカーに共有結合している共役（結合）部分を含む共役（結合）部分の反応の種類を指す。
２種類のアミノ酸配列に関連して用いられる場合の、本明細書中の用語「実質的に対応する」は、最適に整列化させた場合に、少なくとも約９０％である同一性レベルを指す。
規定したパラメータ（すなわち、その配列対にとって可能な最も高い類似性スコアに帰着するように規定したアミノ酸置換マトリックス、ギャップ導入ペナルティ（開始時ギャップペナルティともよばれる）、およびギャップ延長ペナルティ）を用いて整列化した場合に、２種類のポリペプチド配列は「最適に整列化」される。ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス（ＨｅｎｉｋｏｆｆとＨｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９（２２）：１０９１５－１０９１９）は、ポリペプチド配列整列アルゴリズム（ＢＬＡＳＴＰなど）において、既定のスコアリング置換マトリックスとして用いられることが多い。整列化配列の一方に単一アミノ酸ギャップを導入する場合にはギャップ導入ペナルティを与え；ギャップにおける各残基位置にはギャップ延長ペナルティを与える。他で特段に言及しない限り、本明細書中で用いる整列パラメータは、ＢＬＯＳＳＵＭ６２スコアマトリックス、ギャップ導入ペナルティ-１、およびギャップ延長ペナルティ-１である。整列スコアは、整列の初めと終わり（例えば、整列窓）の各配列のアミノ酸位置で規定され、また可能な最も高い類似性スコアに帰着するように、任意選択的に一方または両方の配列への単一ギャップまたは複数のギャップの挿入によっても規定される。
本明細書で言及する数値範囲はいずれもすべてその範囲が、範囲を規定する数値限界をも包含することが意図される。
本発明の処理法および組成物
本発明は、実質的に切断不純物を含まない無損傷のプロテアーゼ活性化可能抗体の精製組成物の生産およびそのような組成物を生産する処理法に関する。精製組成物を調製する処理は、他の不純物の除去にも効果的である。構造的には、活性化可能抗体は：（１）非隠蔽状態の場合に生物学的標的に特異的に結合する抗原結合ドメイン（ＡＢ）；および（２）隠蔽性部分（ＭＭ）および開裂可能部分（ＣＭ）を含むＡＢに共役（結合）したプロドメインを含む。ＣＭの開裂によってＡＢに近い位置からＭＭが解放されるように、ＭＭおよびＡＢの成分に対してＣＭを配置する。したがって、開裂によって典型的には、生物学的標的に特異的結合可能な活性化抗体の生成が起こる。該活性化可能抗体は、多くの場合、２つの同一なＡＢ、２つの同一なＣＭ、および２つの同一なＭＭを含むホモ二量体である。そのような場合には、活性化可能抗体の切断異型体は、２つのＣＭの一方のみが切断され、その結果、切断異型体は、１つの完全なＣＭおよび１つの完全なＭＭを含むが、もう一つのＣＭはその一部分が欠失し、またもう一つのＭＭはその全体が消失している単一アーム切断異型体であってもよい。
罹患組織において活性状態にあることが一般的であるプロテアーゼについての基質を、ＣＭ内に導入することにより、活性化可能抗体が罹患組織で選択的に活性化するように設計してもよい。したがって、活性化可能抗体は、モノクローナル抗体が疾患部位を超えて広範囲に分布する生物学的標的に結合する場合に起こり得る標的媒介毒性を軽減する可能性を有している。Ｄｅｓｎｏｙｅｒｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（２０１３年１０月１６日）５（２０７）：２０７ｒａ１４４を参照のこと。活性化可能抗体については、多くの公開物に記載があり、そのような公開物としては以下が挙げられる：例えば、ＷＯ２００９／０２５８４６、ＷＯ２０１０／０９６８３８、ＷＯ２０１０／０８１１７３、ＷＯ２０１３／１６３６３１、ＷＯ２０１３／１９２５４６、ＷＯ２０１３／１９２５５０、ＷＯ２０１４／０２６１３６、ＷＯ２０１４／０５２４６２、ＷＯ２０１４／１０７５９９、ＷＯ２０１４／１９７６１２、ＷＯ２０１５／０１３６７１、ＷＯ２０１５／０４８３２９、ＷＯ２０１５／０６６２７９、ＷＯ２０１５／１１６９３３、ＷＯ２０１６／０１４９７４、ＷＯ２０１６／１１８６２９、ＷＯ２０１６／１４９２０１、ＷＯ２０１６／１７９２８５、ＷＯ２０１６／１７９２５７、ＷＯ２０１６／１７９３３５、ＷＯ２０１７／０１１５８０；ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０５９７４０；米国特許仮出願第６２／４６９，４２９号、第６２／５７２，４６７号、第６２／６１３，３５８号；およびＷＯ２０１２／０２５５２５、ＷＯ２０１７／０２５６９８、ＷＯ２０１６／０４６７７８、ＷＯ２０１６／１７９００３、ＷＯ２０１６／１８２０６４、ＷＯ２０１７／１５６１７８、ＷＯ２０１７／１４３０９４、ＷＯ２０１７／１６２５８７、ＷＯ２０１３／１２８１９４；これらの参考文献はいずれも、その全体が参照として本明細書に組み入れられる。本発明の処理法および組成物に用いる好適な活性化可能抗体の例示的なさらなる例を、より詳細に後述する。
大変望ましい産物ではあるが、活性化可能抗体の精製組成物の製造は、その活性化可能な性質のために、より難易度が高い。活性化可能抗体の生物学的回収物の分析によって、切断不純物、すなわち活性化可能抗体に関連する固有な化合物の存在が明らかになった。組成物または医薬品中に多量の切断不純物、すなわちその生物学的標的に自由に結合し得る「活性化した」活性化可能抗体を含むことは望ましくない；その理由は、それがオフ標的毒性および効力低下の潜在的効果を有するからである。生産物の安全性プロファイルに影響を与える可能性があるため、薬剤産物中に切断異型体が存在することは望ましくない。
分子サイズ、構造、アミノ酸組成物などの特性に関して所望の生産物と切断不純物との間には相対的に小さな差しかなく、またそれらのアミノ酸配列が各構造の大部分にわたって１００％同一であり得るので、無損傷活性化可能抗体組成物から切断不純物を除去することは難問である。構造的には、無損傷活性化可能抗体と対応する切断不純物との間の差異は、切断不純物では、少なくとも１つのプロドメインの一部分または全体が欠如していることである。いくつかの実施態様においては、隠蔽性部分は比較的短いペプチド配列であり、例えば５０アミノ酸未満、４０アミノ酸未満、３０、２０、１５、１４、１３、１２、１１、または１０アミノ酸の長さである；切断分子種と無損傷活性化可能抗体は、隠蔽性部分のアミノ酸の数がほぼ異なっている。主たる切断異型体は単一アーム切断異型体であり、そのため無損傷活性化可能抗体と切断異型体の間の全体的な差は、単一プロドメインの一部分を欠失していること、例えば、ＭＭおよびＣＭの一部を欠いていることのみにおいて、切断異型体は無損傷活性化可能抗体と異なるということを、発明者らはさらに発見した。したがって、無損傷活性化可能抗体およびその切断異型体のサイズおよび物理化学的特性は似ており、このことがこれら分子の分離を困難にしている。
２つの軽鎖（それぞれが、プロドメインをコードする）および２つの重鎖を有する活性化可能抗体を含む生物学的回収組成物の特徴付けにおいて、図１Ａ～Ｃの３種類の異なる活性化可能抗体組成物についての質量スペクトルから分かるように、切断不純物の全部またはほぼ全てが、単一アーム切断不純物である（すなわち、完全切断不純物ではない）ということが明らかになった。したがって、活性化可能抗体が２つ以上のプロドメインをコードするポリペプチドを有している場合には、主たる切断分子種である単一アーム切断不純物が対応する無損傷活性化可能抗体に構造的に高度に類似するということのために、無損傷活性化可能抗体と切断不純物の分離は悪くなる。いくつかの局面においては、切断不純物の分子量は、無損傷活性化可能抗体の分子量の約９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％である。いくつかの局面においては、切断したプロドメインをコードするポリペプチドの分子量は、無損傷のプロドメインをコードするポリペプチドの分子量の約９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％である。いくつかの局面においては、切断不純物は、無損傷活性化可能抗体のアミノ酸配列に対して約９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％同一である。
いくつかの局面において、切断異型体は、プロドメインの１アミノ酸残基、２アミノ酸残基、３アミノ酸残基、４アミノ酸残基またはそれ以上の数のアミノ酸残基を含むものであってもよい。いくつかの局面において、切断異型体は、ＣＭの１アミノ酸残基、２アミノ酸残基、３アミノ酸残基、４アミノ酸残基またはそれ以上の数のアミノ酸残基を含むものであってもよい。いくつかの局面において、切断異型体は、リンカーの１アミノ酸残基、２アミノ酸残基、３アミノ酸残基、４アミノ酸残基またはそれ以上の数のアミノ酸残基を含むものであってもよい。いくつかの局面において、切断異型体は、リンカーおよびＣＭの１アミノ酸残基、２アミノ酸残基、３アミノ酸残基、４アミノ酸残基またはそれ以上の数のアミノ酸残基を含むものであってもよい。
上記のような困難にも関わらず、対応する切断不純物から無損傷活性化可能抗体を比較的高収率で分離することに非常に有効な処理法が見出されている。無損傷活性化可能抗体の精製組成物を生産する処理法は、以下の工程を含む：
（ａ）クロマトグラフィーカラムに、水、無損傷活性化可能抗体、切断不純物、および第１の塩を含む水性原材料を載せる工程であって、
ここで該クロマトグラフィーカラムが、支持マトリックスおよびそこに結合したリガンドを含む固定相を含み；
ここで該リガンドが、疎水性置換基を含み；
ここで該無損傷活性化可能抗体が、
（ｉ）第１の生物学的標的に対して特異的結合親和性を有する少なくとも第１の抗原結合ドメイン（ＡＢ）、
および
（ｉｉ）第１のプロドメイン、
を含み；
ここで該少なくとも第１のＡＢが、第１の抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および第１の抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含み；
ここで該第１のプロドメインが、第１の隠蔽部分（ＭＭ）および第１の開裂可能部分（ＣＭ）を含み；
ここで該第１のＡＢが該第１のプロドメインに共役（結合）している、
水性原材料を載せる工程；
および
（ｂ）無損傷活性化可能抗体を含む精製組成物を含む溶出液を取得する目的で、水および第２の塩を含む溶離液を用いてクロマトグラフィーカラムを溶出する工程であって、
ここで該溶出液において切断不純物が実質的に除去されている、
クロマトグラフィーカラムを溶出する工程。
本明細書では、工程（ａ）および（ｂ）を合わせて「疎水性クロマトグラフィー処理」と称する。したがって、溶出液および精製組成物はいずれも、切断不純物が実質的に除去されている。無損傷活性化可能抗体および対応する切断不純物の異なる分離ピークが、クロマトグラフィーカラムの溶出産物に認められる。無損傷と切断不純物と間の構造類似性にも関わらず、これらの化合物は、少なくとも部分的には疎水性相互作用に基づくクロマトグラフィーカラムで容易に分離可能であった。得られた無損傷活性化可能抗体を豊富に含む溶出液では、対応する切断不純物が実質的に除去されていた。この処理法は、高い総蛋白質収率で無損傷活性化可能抗体の高純度組成物を調製するための、容易に拡張可能な、高度に生産的な処理法である。
対応する切断不純物の前に位置し、またその他の不純物（例えば、高分子量分子種（「ＨＭＷＳ」）および宿主細胞蛋白質（ＨＣＰ）など）の前に位置する異なるピークに、無損傷活性化可能抗体が溶出することが分かった。この現象は、実施例に示すように、異なるアミノ酸配列および異なる生物学的標的に特異性を有する無損傷活性化可能抗体ならびにそれに対応する切断不純物を含む、多様な水性原材料組成物に観察されるものであった。得られる解像度およびピークプロファイルを考慮し、いくつかの実施態様においては、溶出工程（ｂ）を一定組成条件下で実施する。
多くの実施態様において、工程（ｂ）実施後では、該処理法は、クロマトグラフィーカラムを洗浄剤で洗浄することを含むカラム洗浄工程をさらに含む。これらの実施態様においては、本発明の該処理は、多くの場合、カラム洗浄工程の前に、対応する結合した切断不純物および／または、水性原材料中にその他の不純物（例えば、ＨＭＷＳ、ＨＣＰなど）が存在する場合には、それらの不純物をクロマトグラフィーカラムから第２の溶離液で溶出する工程を含まない。無損傷活性化可能抗体を溶出後のカラムには、不純物が実質的に保持されるので、不純物を個別に溶出することなしに、洗浄工程を実施することが望ましいこともあり、これは、本発明の処理法の高度に生産的な性質をさらに高めるものである。好適な洗浄剤は、当該技術分野で公知の様々なものを含み、例えば、酸水溶液、塩基水溶液、有機溶媒、混合有機溶媒（例えば、２種類以上の異なる有機溶媒を含む）、１種類以上の有機溶媒の水性混合物、上記のうちのいずれかの混合物などが挙げられる。洗浄剤の例としては、水酸化ナトリウム水溶液、エタノール、イソプロパノール、エチレングリコール、グアニジン塩酸塩溶液、酸性ペプシン溶液、ラウロイルサルコシン酸ナトリウム溶液など、ならびに２種類以上の任意の組み合わせが挙げられる。
本発明の処理法に用いられる固定相に関しては、様々な公知の支持マトリックス材料のうちのいずれを用いてもよい。好適な支持マトリックス材料の例としては、親水性ポリマー（例えば、炭水化物（例えば、アガロース（例えば、セファロースという商標のもの（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｃａｐｔｏ（商標）ＩｍｐＲｅｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）など）、架橋されたセルロース（例えば、Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ（商標）ＨＩＣ媒体（Ａｍｓｂｉｏ）など）など））；ポリメタクリル酸樹脂（例えば、Ｍａｃｒｏ－Ｐｒｅｐ（登録商標）ＨＩＣ樹脂（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｉｎｃ．）など）；ポリスチレン樹脂（例えば、Ｂｉｏ－Ｂｅａｄｓ（商標）ＳＭ－２樹脂（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｉｎｃ．）など）；シリカ、合成共重合体、ならびに当該技術分野で公知の他の任意のクロマトグラフィー支持マトリックス材料が挙げられる。支持マトリックスは、様々な形態のいずれであってもよく、例えば、微粒子形態、ビーズ形態、膜形態などが挙げられる。
疎水性置換基を有する公知の様々なリガンド分子種を、本発明の処理法に用いてもよい。疎水性置換基の例としては、例えば、直鎖アルキル置換基（例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、ｎ－ブチル、ｎ－ペンチル、ｎ－ヘキシル、ｎ－ヘプチル、ｎ－オクチルなどを含む）、分岐アルキル置換基（例えば、ｉ－プロピル、ｔ－ブチルなど）、アリール置換基（例えば、フェニル、アルキル置換したフェニルなど）など、ならびに２種類以上の疎水性置換基の任意の組み合わせが挙げられる。いくつかの実施態様においては、該疎水性置換基は、Ｃ４～Ｃ１０アルキル置換基（すなわち、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、またはＣ１０置換基）および／またはフェニル置換基を含む。Ｃ４～Ｃ１０アルキル置換基は、多くの場合、ブチル置換基（すなわち、Ｃ４）またはオクチル置換基（すなわち、Ｃ８）から成る群から選択される。該疎水性置換基は、例えば、Ｏ－エーテル、Ｓ－エーテルなどの様々な結合の任意のものを介して、支持マトリックスに共役（結合）させてもよい。本発明の実施に用いる好適なリガンド（－Ｏ－リンカーを含む）の例としては、－Ｏ－Ｐｈ、－Ｓ－（ＣＨ２）３－ＣＨ３（－Ｓ－ブチル）、－Ｏ－（ＣＨ２）３－ＣＨ３（Ｏ－ブチル）、－Ｏ－（ＣＨ２）７－ＣＨ３（Ｏ－オクチル）、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨＯＨ－ＣＨ２－ＯＨ、－Ｏ－ＣＨ－（ＣＨ３）２などが挙げられる。特定の実施態様においては、詳細が後述されるように、該リガンドが、疎水性以外の相互作用（例えば、静電、水素結合、硫黄原子親和性など）によって、分離を容易にする付加的置換基をさらに含むものであってもよい。
いくつかの実施態様においては、該固定相は、疎水性相互作用のみで分離を容易にする疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）固定相である。ＨＩＣ固定相リガンドは、例えば、本明細書中に上記した疎水性置換基のいずれかを含むものであってもよい。特定の実施態様においては、該リガンドとして、フェニル、ブチル、オクチル、およびイソプロピルから成る群から選択される置換基が挙げられる。ＨＩＣ固定相は、市販されており容易に入手可能である。特定の実施態様においては、該固定相は、－Ｏ－フェニル、－Ｓ－（ＣＨ２）３－ＣＨ３（すなわち、－Ｓ－ブチル）、－Ｏ－（ＣＨ２）３－ＣＨ３（すなわち、Ｏ－ブチル）、－Ｏ－（ＣＨ２）７－ＣＨ３（すなわち、Ｏ－オクチル）、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨＯＨ－ＣＨ２－ＯＨ、－Ｏ－ＣＨ－（ＣＨ３）２など、ならびに２種類以上の異なるリガンドの任意の組み合わせから成る群から選択されるリガンドを含む。
その他の実施態様においては、該固定相はマルチモーダルクロマトグラフィー（ＭＭＣ）固定相である。これらの実施態様においては、該リガンドは、１種類上の疎水性置換基、および疎水性以外の相互作用（例えば、静電、水素結合、硫黄原子親和性など）に基づく、分離を容易にする少なくとも１種類のさらなる置換基を含む。本発明の実施に用いる好適なＭＭＣ固定相の例としては、例えば、疎水性置換基、ならびにスルフィド置換基、カルボキシル置換基、およびアミン置換基から成る群から選択される１種類以上の置換基を有するリガンドが挙げられる。カルボキシル置換基および／またはアミン置換基は、用いる処理条件下で荷電していることも多い。本発明の実施に用いる好適なＭＭＣ固定相としては、Ｎ－ベンジルメチルエタノールアミン、Ｎ－ベンジルメチルエタノールアミン、Ｎ－ベンゾイル－ホモシステイン、Ｎ－ベンゾイル－ホモシステイン、オクチルアミンなどから成る群から選択されるリガンドを有するものが挙げられる。
固定化リガンド中に疎水性置換基が存在することが、切断不純物からの無損傷活性化可能抗体の分離促進に実質的影響を与えるようであった。切断不純物からの無損傷活性化可能抗体の分離は、実施例３（ＨＩＣ固定相を用いて）、実施例４（ＨＩＣ固定相を用いて）、および実施例５（ＭＭＣ固定相を用いて）に示されるように、疎水性クロマトグラフィー処理を用いて良好に達成された。
対照的に、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いた場合には、実施例２に説明されるように、切断不純物から無損傷活性化可能抗体を分離することは達成されなかった。同様に、陰イオンクロマトグラフィーを用いた場合にも、実施例３～５に説明されるように、やはり切断不純物から無損傷活性化可能抗体を分離することに有効ではなかった。
疎水性クロマトグラフィー処理は、水、無損傷活性化可能抗体、切断不純物、および第１の塩を含む水性原材料を、クロマトグラフィーカラムに載せることによって開始する。いくつかの実施態様においては、該水性原材料が付加的成分を含むこともあり、そのような成分としては、例えば、細胞培養処理工程の１種類以上の産物（例えば、宿主細胞蛋白質、ＤＮＡなど）、上流精製ユニット操作における１種類以上の残存化合物（例えば、プロテインＡ、プロテインＧなど）、ＨＭＷＳ（例えば、水性原材料中に存在する単量体活性化可能抗体分子種の凝集体など）、低分子量分子種（ＬＭＷＳ）などを含む付加的な不純物が挙げられる。
水性原材料において第１の塩として利用する好適な塩は、カラムの固定相に無損傷活性化可能抗体および切断不純物が結合するのを促進する塩であれば、いずれの塩であってもよい。好適な第１の塩および水性原材料の第１の塩濃度、ならびに第２の塩および溶離液の第２の塩濃度は、塩濃度勾配を用いて一連の試験を実施し、無損傷活性化可能抗体の固定相への結合に有効である塩および塩濃度を判定し、他方で、不純物を固定相から洗い流すか、あるいは固定相に結合したままにしておき、所望の無損傷活性化可能抗体の固定相からの選択的溶出に有効な第２の塩および塩濃度を判定することにより、容易に決定することが可能である。いくつかの実施態様においては、第１の塩と第２の塩は同一の塩である。その他の実施態様においては、第１の塩と第２の塩は異なる塩である。第１および／または第２の塩は、それぞれ独立に塩分子種の混合物を含むものであってもよい。
第１の塩および第２の塩の例としては、それぞれ独立に以下から成る群から選択される陰イオンが挙げられる：ＰＯ４ ３－、ＳＯ４ ２－、ＯＨ－、ＨＰＯ４ ２－、ＣＨ３ＣＯＯ－（酢酸イオン）、クエン酸イオン、Ｆ－、Ｃｌ－、Ｂｒ－、Ｈ２ＰＯ４ －、Ｉ－、ＮＯ３ －、ＣｌＯ４ －、ＳＣＮ－、アミノ酸陰イオンなど。いくつかの実施態様において、第１の塩および第２の塩は、それぞれ独立に以下から成る群から選択される陽イオンであってもよい：Ｎ（ＣＨ３）４ ＋、ＮＨ４ ＋、Ｃｓ＋、Ｒｂ＋、Ｋ＋、Ｎａ＋、Ｈ＋、Ｃａ＋、Ｍｇ２＋、Ａｌ３＋、アミノ酸陽イオンなど。第１の塩は、疎水性クロマトグラフィー処理工程の直前に、無損傷活性化可能抗体および対応する切断不純物を含む水性組成物に導入してもよく、疎水性クロマトグラフィー処理工程の上流の処理工程（例えば、本明細書中に後述するような介在的ユニット操作における）に関連して導入してもよい。後者の場合には、付加的な第１の塩を、任意選択的に該組成物に添加してもよく、および／またはカラムへの所望の試料添加条件に合わせて該組成物を希釈してもよい。
クロマトグラフィーカラムがＨＩＣ固定相を含む場合には、第１の塩は典型的にはコスモトロピックな挙動（塩析）を示す。そのような塩は、例えば、イオンのホフマイスター系列から容易に識別することができる。例えば、Ｔａｄｅｏら、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ（２００９）９７：２５９５および Ｈｙｄｅら、Ｏｒｇ．Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．（２０１７）２１：１３５５を参照のこと；これらの参考文献はいずれも参照としてその全体が本明細書に組み入れられる。いくつかの実施態様においては、第１の塩および第２の塩はそれぞれ独立に、カオトロピックであるよりも、より強力にコスモトロピックである陰イオンおよび／または陽イオンを含む。これらの実施態様のうちの一部においては、第１の塩および第２の塩はそれぞれ独立に、以下から成る群から選択される陰イオンを含む：ＰＯ４ ３－、ＳＯ４ ２－、ＯＨ－、ＨＰＯ４ ２－、Ｆ－、ＣＨ３ＣＯＯ－（酢酸イオン）、クエン酸イオン、アミノ酸陰イオン、およびＣｌ－。その他の実施態様においては、第１の塩および第２の塩はそれぞれ独立に、ＰＯ４ ３－、ＳＯ４ ２－およびＨＰＯ４ ２－から成る群から選択される陰イオンを含む。
これらの実施態様のうちの一部では、第１の塩および第２の塩はそれぞれ独立に、以下から成る群から選択される陽イオンを含む：Ｎ（ＣＨ３）４ ＋、ＮＨ４ ＋、Ｃｓ＋、Ｒｂ＋、Ｋ＋、Ｎａ＋、Ｈ＋、Ｃａ＋、Ｍｇ２＋、Ａｌ３＋、およびアミノ酸陽イオン。いくつかの実施態様においては、第１の塩および第２の塩はそれぞれ独立に、ＮＨ４ ＋、Ｋ＋、Ｎａ＋、Ｌｉ＋、およびＭｇ２＋から成る群から選択される陽イオンを含む。特定の実施態様においては、第１の塩および第２の塩はそれぞれ独立に、ＮＨ４ ＋、Ｋ＋、およびＮａ＋から成る群から選択される陽イオンを含む。いくつかの実施態様においては、第１の塩および第２の塩はそれぞれ独立に、ＮＨ４ ＋、Ｋ＋、およびＮａ＋から成る群から選択される陽イオンを含み、ＰＯ４ ３－、ＳＯ４ ２－、ＯＨ－、ＨＰＯ４ ２－、ＣＨ３ＣＯＯ－（酢酸イオン）、クエン酸イオン、Ｆ－、Ｃｌ－、Ｂｒ－、Ｈ２ＰＯ４ －、Ｉ－、ＮＯ３ －、ＣｌＯ４ －、およびＳＣＮ－から成る群から選択される陰イオンを含む。
いくつかの実施態様においては、第１の塩および第２の塩はそれぞれ独立に、（ＮＨ４）２ＳＯ４、Ｎａ２ＳＯ４、Ｎａ３ＰＯ４、Ｋ３ＰＯ４、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、およびＣＨ３ＣＯＯＮＨ４から成る群から選択される。特定の実施態様においては、第１の塩および第２の塩はそれぞれ独立に、（ＮＨ４）２ＳＯ４、Ｎａ２ＳＯ４、Ｎａ３ＰＯ４、およびＫ３ＰＯ４から成る群から選択される。その他の実施態様においては、第１の塩および第２の塩はそれぞれ独立に、（ＮＨ４）２ＳＯ４およびＮａ２ＳＯ４から成る群から選択される。特定の実施態様においては、第１の塩および第２の塩のうちの少なくとも１つは、（ＮＨ４）２ＳＯ４を含む。これらの実施態様のうちの一部においては、第１の塩および第２の塩の両方が、（ＮＨ４）２ＳＯ４を含む。その他の実施態様においては、第１の塩および第２の塩のうちの少なくとも１つが、Ｎａ２ＳＯ４を含む。これらの実施態様のうちの一部では、第１の塩および第２の塩の両方が、Ｎａ２ＳＯ４を含む。
クロマトグラフィーカラムがＨＩＣ固定相を含む場合には、溶離液は一般的に水性原材料よりも極性が低い。いくつかの実施態様においては、第１の塩濃度（すなわち、水性原材料における）は第２の塩濃度（すなわち、溶離液における）よりも高い。例えば、第１の塩濃度は、第２の塩濃度よりも約１．５倍、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、または約１０倍高いものであってもよい。例えば、第１の塩は約１．５Ｍの硫酸アンモニウムを含んでいてもよく、第２の塩は約０．２５Ｍの硫酸アンモニウムを含んでいてもよい（第１の塩は第２の塩よりも約６倍高い濃度）。第１の塩とは異なる第２の塩を用いることが所望の場合には、第２の塩は、第１の塩と比較して典型的にはコスモトロピックな強度が低い。コスモトロピックな強度がより高い、またはより低い陽イオンおよび陰イオンは、イオン強度のホフマイスター系列にしたがって容易に識別できる。例えば、Ｔａｄｅｏら、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ（２００９）９７：２５９５、およびＨｙｄｅら、Ｏｒｇ．Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．（２０１７）２１：１３５５を参照のこと；これらの参考文献はいずれも参照としてその全体が本明細書に組み入れられる。いくつかの実施態様においては、溶離液は、水混和性有機溶媒（例えば、アルコール、ジオール、ポリオールなど）をさらに含む。
クロマトグラフィーカラムがＭＭＣ固定相を含む場合には、第１の塩は、典型的にはカオトロピックな挙動（塩溶）を示す。ＨＩＣ固定相に関連して用いられる塩については、ＭＭＣを基盤とする処理のおける利用に好適な塩は、イオンのホフマイスター系列から容易に識別することができる。いくつかの実施態様においては、第１および第２の塩はそれぞれ独立に、をコスモトロピックであるよりもより強力にカオトロピックである陰イオンおよび／または陽イオン含む。例えば、Ｔａｄｅｏら、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ（２００９）９７：２５９５およびＨｙｄｅら、Ｏｒｇ．Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．（２０１７）２１：１３５５を参照のこと；これらの参考文献はいずれも参照としてその全体が本明細書に組み入れられる。これらの実施態様のうちの一部においては、第１の塩および第２の塩はそれぞれ独立に、Ｃｌ－、Ｂｒ－、Ｈ２ＰＯ４ －、Ｉ－、ＮＯ３ －、ＣｌＯ４ －、アミノ酸陰イオン、およびＳＣＮ－から成る群から選択される陰イオンを含む。これらの実施態様のうちの一部においては、第１の塩および第２の塩はそれぞれ独立に、Ｃｌ－、Ｂｒ－、Ｈ２ＰＯ４ －、Ｉ－、ＮＯ３ －、アミノ酸陰イオン、およびＣｌＯ４ －、およびＳＣＮ－から成る群から選択される陰イオンを含む。
特定の実施態様においては、第１の塩および第２の塩はそれぞれ独立に、Ｎ（ＣＨ３）４ ＋、ＮＨ４ ＋、Ｂａ＋、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｃｓ＋、Ｒｂ＋、Ｋ＋、Ｎａ＋、およびアミノ酸陽イオンから成る群から選択される陽イオンを含む。いくつかの実施態様においては、該陽イオンは、Ｎ（ＣＨ３）４ ＋、ＮＨ４ ＋、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｋ＋、Ｎａ＋、およびアミノ酸陽イオンから成る群から選択される。アミノ酸陽イオンを用いる場合には、該イオンは、アルギニン陽イオン（例えば、正に荷電したグアニジノ部分を有する）であることが多い。
第１の塩の例としては、例えば、塩化アルギニンまたはアルギニン塩酸塩、ＮａＣｌなどが挙げられる。クロマトグラフィーカラムがＭＭＣ固定相を含む場合には、第１の塩および第２の塩は同一の塩であることが多い。これらの実施態様においては、溶離液は典型的には、水性原材料のおける塩の濃度よりも高い濃度の塩を含む。例えば、溶離液（第２の塩）の塩濃度は、原材料（第１の塩）の塩濃度よりも約１．５倍、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、または約１０倍高いものであってもよい。第１の塩および第２の塩が異なる場合には、第２の塩は、第１の塩と比較してカオトロピック強度が高いものを選択することが多い。カオトロピック強度がより高い、またはより低い陽イオンおよび陰イオンは、イオン強度のホフマイスター系列にしたがって容易に識別することができる。例えば、Ｔａｄｅｏら、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ（２００９）９７：２５９５およびＨｙｄｅら、Ｏｒｇ．Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．（２０１７）２１：１３５５を参照のこと；これらの参考文献はいずれも参照としてその全体が本明細書に組み入れられる。第１の塩および第２の塩が異なる特定の実施態様においては、溶離液は第１の塩および第２の塩の両方を含む。いくつかの局面においては、第１の塩は唯一の塩として約３０ｍＭの塩化ナトリウムを含むものであってもよく、第２の塩は約３０ｍＭの塩化ナトリウムおよび約９０ｍＭのアルギニン塩酸塩を含むものであってもよい。
水性原材料および溶離液はまた、それぞれ独立に１種類以上の緩衝剤を含んでいてもよい。好適な緩衝剤は、１種類以上の塩（例えば、好適な第１の塩として本明細書で上記に列挙されているものの任意の塩など）；酸（例えば、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、（３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸）（ＭＯＰＳ）、（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）、塩化水素など）；および／または塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなど）を含む。
特定の実施態様においては、切断不純物は単一アーム切断不純物から成る。無損傷活性化可能抗体が複数のＡＢおよびそれに対応して複数のプロドメインを含むいくつかの実施態様においては、該切断不純物は、切断不純物分子種の混合物を含むものであってもよい。これらの実施態様のうちの一部においては、単一アーム切断不純物の混合物は、切断不純物分子種および完全切断不純物を含む。無損傷活性化可能抗体が複数のＡＢおよびそれに対応して複数のプロドメインを含むさらに他の実施態様においては、該切断不純物は、本質的に単一アーム切断不純物から成る。これらの実施態様のうちの一部においては、該切断分子種は単一アーム切断不純物から成る。単一アーム切断不純物および完全切断不純物は、質量分析によって容易に判定することができる。
いくつかの実施態様においては、水性原材料は、ｐＨが約５．０～約８．０、または約５．０～約７．５、または約５．０～約７．０、または約５．５～約６．５、または約５．７～６．３、または約５．８～６．２、または約５．６～約６．０の範囲のｐＨを含む。試料添加工程および溶出工程を実施する温度は、同一であっても、異なっていてもよい。いくつかの実施態様においては、１０℃～約３０℃の範囲、または１５℃～約３０℃の範囲、または１５℃～約２９℃の範囲、または１５℃～約２８℃の範囲、または１５℃～約２７℃の範囲、または１５℃～約２６℃の範囲、または１５℃～約２５℃の範囲、または１６℃～約２５℃の範囲、または１７℃～約２５の範囲℃、または約１８℃～約２５℃の範囲の温度で、試料添加工程および溶出工程をそれぞれ独立に実施する。典型的には、試料添加工程および溶出工程を、同一温度範囲の温度で実施する。試料添加工程および溶出工程の両方で、標的温度がほぼ同一であることも多い。いくつかの実施態様においては、試料添加工程を実施する温度とは異なる温度で、溶出工程を実施することが望ましい場合もある。特定の実施態様においては、本明細書における上記の範囲の端点よりも高いまたは低い温度で該処理工程を実施することが望ましい場合もある。例えば、ＨＩＣ固定相を用いる場合には、試料添加工程に、より高温を用いることによってカラムとの疎水性相互作用が増強されることがあり、また溶出工程により低温を用いることにより、カラムとの疎水性相互作用が弱まり、カラムからの成分放出が促進されることがある。
ｐＨ、第１の塩濃度、および温度が、水性原材料とほぼ同一になるように、クロマトグラフィーカラムを事前調整してもよい。これは、クロマトグラフィーカラムにおいて標的条件に到達するまで、水性原材料と同一のｐＨ、同一の第１の塩濃度、および／または同一の温度の緩衝液を充分な量（例えば、１カラム容積またはそれ以上）、クロマトグラフィーカラムに流すことにより達成することができる。
試料添加工程後には、溶出工程前にカラムから非結合成分を除去する目的で、洗浄緩衝液でカラムを洗浄してもよい。いくつかの実施態様においては、洗浄緩衝液は、水性原材料中の第１の塩とほぼ同一の塩濃度、または水性原材料中の第１の塩の濃度よりも高い濃度の塩を含み、また洗浄緩衝液のｐＨは、多くの場合に、水性原材料のｐＨとほぼ同一である。
無損傷活性化可能抗体および不純物を含む水性原材料は、本明細書中に記載の処理法を用いて、高い総蛋白質収率で精製できることが、明らかになっている。いくつかの実施態様においては、波長２８０ｎｍの吸光度で決定した場合の溶出液の総蛋白質収率は、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、または少なくとも約７１％、または少なくとも約７２％、または少なくとも約７３％、または少なくとも約７４％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約７６％、または少なくとも約７７％、または少なくとも約７８％、または少なくとも約７９％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８１％、または少なくとも約８２％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８４％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約８６％、または少なくとも約８７％、または少なくとも約８８％、または少なくとも約８９％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％である。総蛋白質を決定する吸光度アッセイの例を、本明細書で後述する実施例１に記載した。
疎水性クロマトグラフィー処理は、処理流（すなわち、疎水性処理への水性原材料の流れおよび疎水性処理からの溶離液の流れを、合わせてそのように称する）から切断不純物を除去することにおいて、非常に有効である。いくつかの実施態様において、溶出液中の切断不純物の相対量と比較したときの、水性原材料における切断不純物相対量の低下レベルは、還元ＳＤＳキャピラリーゲル電気泳動（ＳＤＳ－ｃＧＥ）で測定した場合には、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、または少なくとも約８倍、または少なくとも約９倍、または少なくとも１０倍、または少なくとも約１５倍、または少なくとも約２０倍である。いくつかの実施態様においては、溶出液中に切断不純物が検出されない。本明細書中の用語「切断不純物の相対量」は、上記で定義される「％切断不純物」である。
不純物（切断不純物、ＨＣＰ、ＨＷＭＳなど）に関連して用いられる、本明細書中の表現「低下レベル」または「低下させること」（およびその文法上の変形）は、水性原材料中の不純物量を溶出液中の不純物量と比較することにより判定したときの不純物量の低下の程度を意味している。不純物の低下レベルは、比（または低下倍数と同義）または％低で表すことができる。
溶出液中に切断不純物が存在する場合には、切断不純物レベルの低下倍数は、以下の式によって決定される：
Figure 2023521384000005
Figure 2023521384000006
上記の式において、切断不純物の定量は、切断されるポリペプチド、すなわち、プロドメインをコードするポリペプチドに関して行う。プロドメインをコードするポリペプチドは、抗体軽鎖、抗体重鎖、ｓｃＦｖなどであってもよいが、それらがプロドメインをコードするか否かに依存する。例えば、プロドメインが抗体軽鎖に連結されている場合には、切断不純物の相対量（すなわち、％切断不純物）は、溶出液中の軽鎖切断不純物の％ピーク面積を、以下の合計で割ることにより算出される；その合計とは、
（ａ）溶出液中の軽鎖切断不純物の％ピーク面積；
および
（ｂ）溶出液中の無損傷軽鎖の％ピーク面積、
である。切断したプロドメインをコードするポリペプチドおよび無損傷プロドメインをコードするポリペプチドのピーク面積は、還元ＳＤＳ－ｃＧＥアッセイ（実施例１に記載のアッセイなど）によって容易に決定される。
したがって、これらの実施態様において、溶出液の％切断不純物に対する水性原材料の％切断不純物の比は、還元ＳＤＳキャピラリーゲル電気泳動（ＳＤＳ－ｃＧＥ）アッセイ（実施例１に記載のアッセイなど）によって測定した場合には、それぞれに対応して、少なくとも約２、または少なくとも約３、または少なくとも約４、または少なくとも約５、または少なくとも約６、または少なくとも約７、または少なくとも約８、または少なくとも約９、または少なくとも約１０、または少なくとも約１５、または少なくとも約２０である。
いくつかの実施態様においては、溶出液中の切断不純物の相対量と比較した水性原材料中の切断不純物の相対量は、還元ＳＤＳ－ｃＧＥ（実施例１に記載のアッセイなど）によって決定した場合に、少なくとも約５０％、または少なくとも約５５％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約７６％、または少なくとも約７７％、または少なくとも約７８％、または少なくとも約７９％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８１％、または少なくとも約８２％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８４％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約８６％、または少なくとも約８７％、または少なくとも約８８％、または少なくとも約８９％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の低下レベルに対応する。切断不純物のパーセント（％）低下は、以下の式によって決定される：
Figure 2023521384000007
 ここで水性原材料および溶出液のそれぞれの％切断不純物は、上記で定義されたものである。
いくつかの実施態様において、溶出液は、水性原材料中に存在する切断不純物の相対量の約５０％未満、または約４５％未満、または約４０％未満、または約３５％未満、または約３０％未満、または約２５％未満、または約２４％未満、または約２３％未満、または約２２％未満、または約２１％未満、または約２０％未満、または約１９％未満、または約１８％未満、または約１７％未満、または約１６％未満、または約１５％未満、または約１４％未満、または約１３％未満、または約１２％未満、または約１１％未満、または約１０％未満を含む。溶出液中の切断不純物の相対量は、水性原材料中の切断不純物に対するパーセントとして、以下のように決定される：
Figure 2023521384000008
 ここで水性原材料および溶出液のそれぞれの％切断不純物は、上記で定義されたものである。
いくつかの実施態様において、溶出液は、還元ＳＤＳ－ｃＧＥによって測定した場合に、水性原材料中の切断不純物量の約１５％未満、または約１４％未満、または約１３％未満、または約１２％未満、または約１１％未満、または約１０％未満、または約１０％未満、または約９％未満、または約８％未満、または約７％未満、または約６％未満の相対量を含む。いくつかの実施態様において、溶出液は、還元ＳＤＳ－ｃＧＥによって測定した場合に、水性原材料中に存在する切断不純物量の約２％～１５％、または約３％～約１５％、または約４％～約１５％、または約５％～約１５％、または約２％～約１０％、または約３％～約１０％の範囲の相対量を含む。
したがって、疎水性処理は、比較的低レベルの切断不純物を有する溶出液（および対応する無損傷活性化可能抗体の精製組成物）を取得する上で有効である。特定の実施態様においては、溶出液（および対応する無損傷活性化可能抗体の精製組成物）は、還元ＳＤＳ－ｃＧＥで判定した場合には、約０．１％～約１５％の切断不純物、または約０．１％～約１０％の切断不純物、または約０．１％～約１０％の切断不純物、または約０．１％～約５％の切断不純物、または約０．１％～約４％の切断不純物、または約０．１％～約３％の切断不純物、または約０．１％～約２％の切断不純物、または約０．１％～約１％の切断不純物の範囲の切断不純物相対量を含む。切断不純物％は、上記の定義のように算出される。切断不純物％は、分離処理が完了した後、即座に、溶出液から分注した試料について測定してもよく、またＳＤＳ－ｃＧＥで直ぐに分析するか、あるいはＳＤＳ－ｃＧＥで分析まで凍結してもよい。
いくつかの実施態様において、溶出液（および対応する無損傷活性化可能抗体の精製組成物）は、還元ＳＤＳ－ｃＧＥによって測定した場合に、約５％未満、または約４％未満、または約３％未満、または約２％未満、または約１％未満、または約０．９％未満、または約０．８％未満、または約０．７％未満、または約０．６％未満、または約０．５％未満の切断不純物を含む。その他の実施態様において、溶出液は、還元ＳＤＳ－ｃＧＥによって測定した場合に、約２％未満、または約１％未満、または約０．９％未満、または約０．８％未満、または約０．７％未満、または約０．６％未満、または約０．５％未満の切断不純物を含む。特定の実施態様において、溶出液（および対応する無損傷活性化可能抗体の精製組成物）は、検出可能な切断不純物を含まない。
いくつかの実施態様において、水性原材料は、宿主細胞蛋白質（ＨＣＰ）、高分子量分子種（ＨＭＷＳ）、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される１種類以上の不純物をさらに含む。本発明の処理法は、同様にこれらの不純物の量を実質的に低下させることにおいても有効である。ＨＣＰおよびＨＭＷＳはいずれも、溶出工程の切断不純物と共に、大部分がカラムに保持されるようである。
特定の実施態様においては、さらなる不純物はＨＣＰである。これらの実施態様において、該処理法は、処理流からＨＣＰを除去するのに非常に有効である。いくつかの実施態様において、疎水性クロマトグラフィー処理によって達成される低下レベルは、対応するＨＣＰ ＥＬＩＳＡアッセイで評価する場合には、１００万分の１（ｐｐｍ）単位で、少なくとも約３倍、または少なくとも約４倍、または少なくとも約５倍、または少なくとも約６倍、または少なくとも約７倍、または少なくとも約８倍、または少なくとも約９倍、または少なくとも約１０倍である。ＨＣＰの低下倍数は、対応するＨＣＰ ＥＬＩＳＡアッセイで評価した場合には、水性原材料中のＨＣＰの量を溶出液中のＨＣＰの量で割ることによってｐｐｍ単位で決定される；
すなわち：
Figure 2023521384000009
 にしたがって決定される。
ＨＣＰの量は、複数の異なる宿主細胞（例えば、哺乳動物、酵母、細菌、およびトランスジェニック宿主生物種を含む）に関する市販の宿主細胞蛋白質ＥＬＩＳＡキットを用いて容易に判定することができる。本明細書中の用語「対応するＨＣＰ ＥＬＩＳＡアッセイ」は、活性化可能抗体生産に用いる宿主細胞に関連する蛋白質に対する抗体を用いる宿主細胞蛋白質ＥＬＩＳＡアッセイを指す。これに対応して、いくつかの実施態様においては、溶出液中のＨＣＰの量に対する水性原材料中のＨＣＰの量の比は、対応するＨＣＰ ＥＬＩＳＡアッセイで評価した場合には、１００万分の１（ｐｐｍ）単位で、少なくとも約４、または少なくとも約５、または少なくとも約６、または少なくとも約７、または少なくとも約８、または少なくとも約９、または少なくとも約１０である。
特定の実施態様において、ＨＣＰのパーセント（％）低下については、対応するＨＣＰ ＥＬＩＳＡアッセイによってｐｐｍ単位で評価した場合に、低下レベルが、少なくとも約５０％、または少なくとも約５５％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約７６％、または少なくとも約７７％、または少なくとも約７８％、または少なくとも約７９％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８１％、または少なくとも約８２％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８４％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約８６％、または少なくとも約８７％、または少なくとも約８８％、または少なくとも約８９％、または少なくとも約９０％である。ＨＣＰのパーセント（％）低下は、以下の式によって決定される：
Figure 2023521384000010
これに対応して、いくつかの実施態様においては、溶出液は、水性原材料に存在するＨＣＰの約５０％未満、または約４５％未満、または約４０％未満、または約３５％未満、または約２５％未満、または約２４％未満、または約２３％未満、または約２２％未満、または約２１％未満、または約２０％未満、または約１９％未満、または約１８％未満、または約１７％未満、または約１６％未満、または約１５％未満、または約１４％未満、または約１３％未満、または約１２％未満、または約１１％未満、または約１０％未満を含む。溶出液におけるＨＣＰの相対量は、水性原材料中のＨＣＰのパーセントとして、以下の式で決定される：
Figure 2023521384000011
いくつかの実施態様においては、溶出液（および対応する無損傷活性化可能抗体の精製組成物）は、対応するＨＣＰ ＥＬＩＳＡアッセイで評価した場合に、約１５０ｐｐｍ未満、または約１４０ｐｐｍ未満、または約１３０ｐｐｍ未満、または約１２０ｐｐｍ未満、または約１１０ｐｐｍ未満、または約１００ｐｐｍ未満、または約９０ｐｐｍ未満、または約８０ｐｐｍ未満、または約７０ｐｐｍ未満、または約６０ｐｐｍ未満、または約５０ｐｐｍ未満、または約４５ｐｐｍ未満、または約４０ｐｐｍ未満、または約３５ｐｐｍ未満、または約３０ｐｐｍ未満、または約２５ｐｐｍ未満、または約２０ｐｐｍ未満、または約１５ｐｐｍ未満、または約１０ｐｐｍ未満のＨＣＰを含む。特定の実施態様においては、溶出液（および対応する無損傷活性化可能抗体の精製組成物）は、検出可能なＨＣＰを含まない。
その他の実施態様においては、溶出液（および精製した活性化可能抗体の対応する組成物）は、約０．５ｐｐｍのＨＣＰ～約１５０ｐｐｍのＨＣＰ、または約０．５ｐｐｍのＨＣＰ～約１４０ｐｐｍのＨＣＰ、または０．５ｐｐｍのＨＣＰ～約１３０ｐｐｍのＨＣＰ、または約０．５ｐｐｍのＨＣＰ～約１２０ｐｐｍ、または約０．５ｐｐｍのＨＣＰ～約１１０ｐｐｍ、または約０．５ｐｐｍのＨＣＰ～約１００ｐｐｍのＨＣＰ、または約０．５ｐｐｍのＨＣＰ～約９０ｐｐｍのＨＣＰ、または約０．５ｐｐｍのＨＣＰ～約９０ｐｐｍのＨＣＰ、または約０．５ｐｐｍのＨＣＰ～約８０ｐｐｍのＨＣＰ、または約０．５ｐｐｍのＨＣＰ～約７０ｐｐｍのＨＣＰ、または約０．５ｐｐｍのＨＣＰ～約６０ｐｐｍのＨＣＰ、または約０．５ｐｐｍ～約５０ｐｐｍのＨＣＰ、または約０．５ｐｐｍのＨＣＰ～約４５ｐｐｍのＨＣＰ、または約０．５ｐｐｍのＨＣＰ～約４０ｐｐｍのＨＣＰ、または約０．５ｐｐｍのＨＣＰ～約４０ｐｐｍのＨＣＰ、または約０．５ｐｐｍのＨＣＰ～約３５ｐｐｍのＨＣＰ、または約０．５ｐｐｍのＨＣＰ～約３０ｐｐｍのＨＣＰ、または約１ｐｐｍのＨＣＰ～約２５ｐｐｍのＨＣＰ、または約１ｐｐｍのＨＣＰ～約２０ｐｐｍのＨＣＰ、または約０．５ｐｐｍのＨＣＰ～約１５ｐｐｍのＨＣＰ、または約０．５ｐｐｍのＨＣＰ～約１０ｐｐｍのＨＣＰの範囲のＨＣＰの量を含む。
特定の実施態様においては、溶出液（および精製した活性化可能抗体の対応する組成物）は、約１ｐｐｍのＨＣＰ～約１５０ｐｐｍのＨＣＰ、または約１ｐｐｍのＨＣＰ～約１４０ｐｐｍのＨＣＰ、または１ｐｐｍのＨＣＰ～約１３０ｐｐｍのＨＣＰ、または約１ｐｐｍのＨＣＰ～約１２０ｐｐｍ、または約１ｐｐｍのＨＣＰ～約１１０ｐｐｍ、または約１ｐｐｍのＨＣＰ～約１００ｐｐｍのＨＣＰ、または約１ｐｐｍのＨＣＰ～約９０ｐｐｍのＨＣＰ、または約１ｐｐｍのＨＣＰ～約９０ｐｐｍのＨＣＰ、または約１ｐｐｍのＨＣＰ～約８０ｐｐｍのＨＣＰ、または約１ｐｐｍのＨＣＰ～約７０ｐｐｍのＨＣＰ、または約１ｐｐｍのＨＣＰ～約６０ｐｐｍのＨＣＰ、または約１ｐｐｍ～約５０ｐｐｍのＨＣＰ、または約１ｐｐｍのＨＣＰ～約４５ｐｐｍのＨＣＰ、または約１ｐｐｍのＨＣＰ～約４０ｐｐｍのＨＣＰ、または約１ｐｐｍのＨＣＰ～約４０ｐｐｍのＨＣＰ、または約１ｐｐｍのＨＣＰ～約３５ｐｐｍのＨＣＰ、または約１ｐｐｍのＨＣＰ～約３０ｐｐｍのＨＣＰ、または約１ｐｐｍのＨＣＰ～約２５ｐｐｍのＨＣＰ、または約１ｐｐｍのＨＣＰ～約２０ｐｐｍのＨＣＰ、または約１ｐｐｍのＨＣＰ～約１５ｐｐｍのＨＣＰ、または約１ｐｐｍのＨＣＰ～約１０ｐｐｍのＨＣＰの範囲のＨＣＰの量を含む。
その他の実施態様においては、さらなる不純物は、ＨＭＷＳのみまたはＨＣＰとの組み合わせである。ＨＭＷＳは、サイズ排除（ＳＥ）－ＨＰＬＣによって検出および定量できる。ＳＥ－ＨＰＬＣアッセイの例は、実施例１に記載されている。クロマトグラムにおいて、高分子量分子種（ＨＭＷＳ）は、主ピークの左側に検出される。これらの実施態様においては、疎水性クロマトグラフィー処理は、処理流からＨＭＷＳを除去することに関して非常に有効である。いくつかの実施態様においては、疎水性クロマトグラフィー処理によって達成されるＨＭＷＳの量の低下レベルは、少なくとも約２倍、または少なくとも約３倍、または少なくとも約４倍、または少なくとも約５倍であるが、ここでＨＭＷＳは、サイズ排除（ＳＥ）－ＨＰＬＣによって定量される。ＳＥ－ＨＰＬＣアッセイの例は、実施例１に記載されている。ＨＭＷＳの低下倍数、およびそれに対応して、溶出液中のＨＭＷＳの量に対する水性原材料中のＨＭＷＳの量の比は、いずれも以下の式によって決定される：
Figure 2023521384000012
ここで（％ピーク面積ＨＭＷＳ）水性原材料は、ＳＥ－ＨＰＬＣアッセイによって測定される、全てのピーク面積の総計（すなわち、全ピーク面積）で割った、水性原材料中のＨＭＷＳに対応する全ピークの合計であり；
（％ピーク面積ＨＭＷＳ）溶出液は、ＳＥ－ＨＰＬＣによって測定される、全てのピーク面積の総計（全ピーク面積）で割った、溶出液中のＨＭＷＳに対応する全ピークの合計である。
したがって、これらの実施態様において、溶出液中のＨＭＷＳの量に対する水性原材料中のＨＭＷＳの量の比は、それに対応して、少なくとも約２、または少なくとも約３、または少なくとも約４、または少なくとも約５であり、ここでＨＭＷＳの量はＳＥ－ＨＰＬＣによって決定される。
いくつかの実施態様においては、疎水性クロマトグラフィー処理によって達成されるＨＭＷＳの低下レベルは、ＨＭＷＳのパーセント（％）低下としてＳＥ－ＨＰＬＣによって決定した場合には、少なくとも約５０％、または少なくとも約５５％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約７６％、または少なくとも約７７％、または少なくとも約７８％、または少なくとも約７９％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８１％、または少なくとも約８２％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８４％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約８６％、または少なくとも約８７％、または少なくとも約８８％、または少なくとも約８９％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％である。ＨＭＷＳのパーセント低下は、以下の式にしたがって決定される：
Figure 2023521384000013
 ここで水性原材料および溶出液の％ピーク面積ＨＭＷＳは、本明細書において上記で定義されている。
いくつかの実施態様においては、溶出液中のＨＭＷＳの相対量を、ＳＥ－ＨＰＬＣで判定し、水性原材料中に存在するＨＭＷＳのパーセントで表せば、水性原材料に存在するＨＭＷＳの約５０％未満、または約４５％未満、または約４０％未満、または約３５％未満、または約２５％未満、または約３０％未満、または約２５％未満、または約２０％未満、または約１５％未満、または約１５％未満である。溶出液中のＨＭＷＳの相対量を、水性原材料中に存在するＨＭＷＳのパーセントとして、以下のように算出する：
Figure 2023521384000014
 ここで水性原材料および溶出液の％ピーク面積ＨＭＷＳは、本明細書において上記で定義されている。
いくつかの実施態様においては、溶出液（および対応する無損傷活性化可能抗体の精製組成物）は、ＳＥ－ＨＰＬＣによって判定した場合に、約５％未満、または約４％未満、または約３％未満、または約２％未満、または約１％未満のＨＭＷＳを含むが、ここで％ＨＭＷＳは（％ピーク面積ＨＭＷＳ）溶出液に対応し、上記のように決定した。
その他の実施態様においては、溶出液（および対応する無損傷活性化可能抗体の精製組成物）は、約３％未満、または約２％未満、または約１％未満のＨＭＷＳを含む。いくつかの実施態様において、溶出液は、約２％未満、または約１％未満のＨＭＷＳを含む。
いくつかの実施態様においては、溶出液（および対応する無損傷活性化可能抗体の精製組成物）は、ＳＥ－ＨＰＬＣによって判定した場合に、約０．１％、０．２％、または０．３％のＨＭＷＳ～約５％のＨＭＷＳ、または約０．２％のＨＭＷＳ～約４％のＨＭＷＳ、または約０．２％のＨＭＷＳ～約３％のＨＭＷＳ、または約０．２％のＨＭＷＳ～約２％のＨＭＷＳ、または約０．２％のＨＭＷＳ～約１％のＨＭＷＳの範囲のＨＭＷＳの量を含むが、ここで％は全ピーク面積に基づいて決定する。特定の実施態様においては、溶出液（および対応する無損傷活性化可能抗体の精製組成物）は、検出可能なＨＭＷＳを含まない。
本明細書中に記載の処理のいくつかの実施態様においては、水性原材料は、還元ＳＤＳ－ｃＧＥによって測定した場合に、約０．５％超の切断不純物、または約０．６％超、または約０．７％超、または約０．８％超、または約０．９％超、または約１％超、または約１．５％超、または約２％超、または約２．５％超、または約３％超、または約３．５％超、または約４％超、または約４．５％超、または約５％超、または約５．５％超、または約６％超、または約６．５％超、または約７％超、または約７．５％超、または約８％超、または約８．５％超、または約９％超、または約９．５％超、または約１０％超、または約１０．５％超、または約１１％超、または約１１．５％超、または約１２％超、または約１２．５％超、または約１３％超、または約１３．５％超の切断不純物を含む。パーセント切断不純物は、本明細書において上記で定義されている。
本発明の処理法は、無損傷活性化可能抗体の高純度組成物である溶出液を生成するものである。得られた溶出液（および対応する無損傷活性化可能抗体の精製組成物）は、還元ＳＤＳ－ｃＧＥによって測定した場合に、少なくとも約９０％の無損傷活性化可能抗体、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９８．５％、または少なくとも約９９％の無損傷活性化可能抗体を含むことが多い。ＳＤＳ－ｃＧＥアッセイの例は、実施例１に記載されている。パーセント無損傷不純物は、本明細書において上記のように算出される（すなわち、（％無損傷活性化可能抗体）溶出液）。
一局面において、本開示は、組成物を生産する処理法を含むが、該組成物は：
（Ａ）ＭＭ、ＣＭ、およびＡＢを含む無損傷活性化可能抗体を９５％超含み；
および
（Ｂ）その切断異型体を０．０５～５％含み；
該処理法が、
水、（Ａ）、（Ｂ）、および第１の塩を含む水性原材料を、クロマトグラフィーカラムに載せる工程であって、
ここで該クロマトグラフィーカラムが、支持マトリックスおよびそれに結合した疎水性リガンドを含む固定相を含む、
クロマトグラフィーカラムに載せる工程、
および
該組成物を取得するために、水および第２の塩を含む溶離液で、該クロマトグラフィーカラムを溶出する工程、
を含む。一局面において、該処理は、処理流において切断異型体の量を７５～９０％低下させることを含む。一局面において、該処理は、処理流においてＨＣＰの量を７５～９０％低下させることを含む。一局面において、該処理は、処理流においてＨＭＷＳの量を７５～９０％低下させることを含む。一局面において、該処理は、処理流において、切断異型体、ＨＣＰ、およびＨＭＷＳの量を７０～９５％低下させることを含む。
活性化可能抗体の生産は、典型的には、工学的に改変した細胞を培養して、所望の無損傷活性化可能抗体を発現させることによる生物学的生産である。例えば、該細胞は哺乳動物宿主細胞であってもよい。いくつかの局面においては、該細胞は、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）またはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞であってもよい。これらの処理において、活性化可能抗体を細胞培養から細胞培養上清、細胞溶解物、またはその他の活性化可能抗体を含む細胞培養物由来の組成物として回収する。例えば、遠心分離、濾過、またはその他の固体／液体分離処理を用いて、上清または溶解物から細胞および細胞の残骸を分離することによって、生物学的回収組成物を取得する。
疎水性クロマトグラフィー処理は、細胞培養工程の下流に置かれることが多く、任意選択的に、生物学的回収組成物、および利用可能な場合には任意のバルク中間体産物組成物に存在する可能性のある、非免疫グロブリン蛋白質、宿主細胞蛋白質、およびその他の不純物の少なくとも一部を除去する１種類以上の介在的ユニット操作を用いる。
各細胞培養工程、該１種類以上の介在的ユニット操作、および疎水性クロマトグラフィー処理は、バッチ式プロセスとして実施してもよく、あるいは任意選択的に、上記のユニット操作のうちの任意の２種類以上を連続的または準連続的処理として、任意選択的に統合されたシステムにおいて実施してもよい。いくつかの実施態様においては、該細胞培養工程は供給回分操作として実施される。いくつかの実施態様においては、該細胞培養工程は連続培養または灌流操作で実施される。
いくつかの実施態様においては、生物学的回収組成物および／または１種類以上のバルク中間体産物組成物は、次のユニット操作の原料投入前までの期間に段階分けされる。バルク中間体産物組成物は、次回に引き続き行うユニット操作の原料として好適な状態に調整する目的で、任意選択的に１種類以上の調整剤を添加することによって調整を行ってもよい。調整剤の例としては、例えば、緩衝液（すなわち、１種類以上の緩衝剤）、塩（例えば、第１の塩）、塩基、酸などが挙げられる。
したがって、本発明の実施に用いる水性原材料は、生物学的回収組成物またはバルク中間体産物組成物を含むものであってもよい。いくつかの実施態様においては、工程（ａ）の前の処理は：
（ａ０）無損傷活性化可能抗体、活性化可能抗体および対応する切断不純物を含む生物学的回収組成物を１種類以上の介在的ユニット操作に供する工程であって、
該ユニット操作は、遠心分離工程、濾過工程、親和性クロマトグラフィー工程、ウイルス不活性化工程、サイズ排除クロマトグラフィー工程、ウイルス濾過工程、および１種類以上のバルク中間体産物組成物を生産するためのイオン交換（ＩＥＸ）クロマトグラフィー工程から成る群から選択され、
ここで該水性原材料が少なくとも１つのバルク中間体産物組成物を含む、
介在的ユニット操作に供する工程を含む。いくつかの実施態様においては、該処理は、少なくとも２種類以上の介在的ユニット操作の組み合わせを含む。
いくつかの実施態様においては、生物学的回収組成物を、少なくとも２種類以上の段階的介在的ユニット操作、または特定の実施態様においては少なくとも３種類以上の段階的介在的ユニット操作に供するが、該ユニット操作は、遠心分離工程、濾過工程、親和性クロマトグラフィー工程、ウイルス不活性化工程、サイズ排除クロマトグラフィー工程、ウイルス濾過工程、およびイオン交換クロマトグラフィー工程から成る群から選択される。いくつかの実施態様においては、生物学的回収組成物を、親和性クロマトグラフィー工程、また多くの場合、付加的にウイルス不活性化工程、および任意選択的にイオン交換クロマトグラフィー工程に供する。例えば、プロテインＡ（すなわち、「プロテインＡクロマトグラフィー」工程）、プロテインＧ（すなわち、「プロテインＧクロマトグラフィー」工程）などの固定化リガンドを用いることによって、免疫グロブリン（Ｉｇ）を含む成分を生物学的回収組成物中の他の成分から分離するために、親和性クロマトグラフィーを用いてもよい。特定の実施態様においては、工程（ａ０）の１種類以上の介在的ユニット操作は、親和性クロマトグラフィー工程およびイオン交換クロマトグラフィー工程を含む。いくつかの実施態様においては、工程（ａ０）の１種類以上の介在的ユニット操作は、親和性クロマトグラフィー工程、ウイルス不活性化工程、濾過工程（例えば、タンジェント流濾過工程、限外濾過工程、透析濾過工程など）、およびイオン交換クロマトグラフィー工程を含む。特定の実施態様においては、該イオン交換クロマトグラフィー工程は、陰イオン交換クロマトグラフィー工程である。いくつかの局面においては、本開示の方法は、本開示に記載の操作のいずれかの１操作または組み合わせを除外する方法を含む。例えば、本開示の方法は、陰イオン交換工程を除外してもよい。他の例を挙げれば、本開示の方法は、陽イオン交換工程を除外してもよい。他の例を挙げれば、本開示の方法は、サイズ排除クロマトグラフィー工程を除外してもよい。
該処理が１種類以上の介在的ユニット操作を用いる場合には、疎水性クロマトグラフィー処理の直ぐ上流の介在的ユニット操作によって生産されるバルク中間体産物組成物は、本明細書においては「前処理調製物」とよばれる。いくつかの実施態様においては、該前処理調製物を水性原材料として直接的に用いてもよい。特定の実施態様においては、例えば、第１の塩、１種類以上の緩衝剤（例えば、塩、酸、および／または塩基など）などの１種類以上の成分を添加することによって、該前処理調製物の調整を行ってもよい。
切断不純物に対して相対的に無損傷活性化可能抗体が濃縮された溶出液（および対応する無損傷活性化可能抗体の精製組成物）を、下流の産物組成物を生成する目的で、任意選択的に１種類以上の下流ユニット操作に供してもよい。例えば、下流ユニット操作は、例えば、（さらなる）精製処理、化学合成処理、希釈処理、溶媒交換工程、製剤化処理、凍結乾燥処理、またはそれらのうちの２種類以上の任意の組み合わせを含む。例えば、一実施態様においては、該処理は、溶出液を以下から成る群から選択される１種類以上の下流ユニット操作に供することをさらに含む：
遠心分離工程、濾過工程（例えば、タンジェント流濾過、限外濾過、透析濾過など）、親和性クロマトグラフィー工程、ウイルス不活性化工程、サイズ排除クロマトグラフィー工程、ウイルス濾過工程、イオン交換クロマトグラフィー工程、およびそれらのうちの２種類以上の任意の組み合わせ。溶出液および下流産物組成物は多くの場合に、検出可能量の切断不純物、および／またはＨＣＰ、および／またはＨＭＷＳを全く含まないか、あるいはそれらをごく少量含む。溶出液および下流産物組成物は、実質的に切断不純物を含まないこともある。
いくつかの実施態様においては、本発明の処理法によって作成した、精製した無損傷活性化可能抗体組成物（例えば、溶出液または下流の産物組成物）を、化学共役反応に供するが、これは、溶出液または下流の産物組成物を、結合活性化可能抗体を生成するのに充分な条件の下で共役反応試薬に接触させることによって行う。共役部分の役割は、活性化可能抗体に付加的性質を付与することであるが、このような付加的性質としては、以下が挙げられる：
例えば、半減期の延長（例えば、共役部分が半減期延長剤の場合には、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ部分）など）；
細胞毒性（共役部分が毒素の一部または全体である場合には、例えば、ドラスチンまたはその誘導体（例えば、オーリスタチンＥ、ＡＦＰ、ＭＭＡＦ、ＭＭＡＥ、ＭＭＡＤ、ＤＭＡＦ、ＤＭＡＥなど、およびその誘導体）、メイタンシノイドまたはその誘導体、ＤＭ１、ＤＭ４、デュオマイシン（ｄｕｏｍｙｃｉｎ）またはその誘導体、カリケアマイシンまたはその誘導体、ピロロベンゾジアゼピンまたはその誘導体または二量体、重金属（例えば、バリウム、金、白金など）、シュードモナス毒素Ａ変異体（例えば、ＰＥ３８、ＺＺ－ＰＥ３８など）、ＺＪ－１０１、ＯＳＷ－１、Ｏ６－ベンジルグアニンの４－ニトロベンジルオキシカルボニル誘導体、トポイソメラーゼ阻害剤、ヘミアステリン（ｈｅｍｉａｓｔｅｒｌｉｎ）、セファロタキシン、ホモハリングトニン、ピロロベンゾジアゼピン二量体、ピロロベンゾジアゼピン、官能基化ピロロベンゾジアゼピン、官能基化ピロロベンゾジアゼピン二量体、カリケアマイシン、ポドフィロトキシン、タキサン、ビンカ・アルカロイドなど、ならびに様々な他の公知の細胞傷害性薬剤など）；
抗ウイルス活性（例えば、ここで該共役部分は以下のそれぞれの一部または全体：アシクロビル、ビダラビン（Ｖｉｒａ）Ａ、シンメトレル、ツルボスタチン、フェンスタチン、ヒドロキシフェンスタチン、スポンジスタチン（Ｓｐｏｎｇｉｓｔａｔｉｎ）５、スポンジスタチン（Ｓｐｏｎｇｉｓｔａｔｉｎ）７、ハリスタチン１、ハリスタチン２、ハリスタチン３、修飾ブリオスタチン、ハロコムスタチン（ｈａｌｏｃｏｍｓｔａｔｉｎ）、ピロロベンズイミダゾール、シブロスタチン（ｃｉｂｒｏｓｔａｔｉｎ）６、ドキサリホルム（ｄｏｘａｌｉｆｏｒｍ）、アントラサイクリン類似体、セマドチン類似体（例えば、ＣｅｍＣＨ２－ＳＨ）など）；
抗真菌活性（例えば、ここで該共役部分はナイスタチンなどの一部あるいは全体）；
抗新生物活性（例えば、ここで該共役部分は以下のそれぞれの一部または全体：アドリアマイシン、セルビジン（ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ）、ブレオマイシン、アルケラン、ベルバン、オンコビン、フルオロウラシル、メトトレキサート、チオテパ、ビサントレン（ｂｉｓａｎｔｒｅｎｅ）、ノバントロン、チオグアニン、プロカルバジン、シタラビンなど）；
抗細菌活性（例えば、ここで該共役部分は以下のそれぞれの一部または全体：アミノグリコシド、ストレプトマイシン、ネオマイシン、カナマイシン、アミカシン、ゲンタマイシン、トブラマイシン、ストレプトマイシンＢ、スペクチノマイシン、アンピシリン、スルファニルアミド、ポリミキシン、クロラムフェニコールなど）；
抗マイコプラズマ活性（例えば、ここで該共役部分は以下のそれぞれの一部または全体：タイロシン（ｔｙｌｏｓｉｎｅ）、スペクチノマイシンなど）；
ならびに様々な他の望ましい付加的特性のうちのいずれか。
そのような所望の特性および機能を付与する共役部分は、当該技術分野で公知の方法および反応性リンカーを用いて、活性化可能抗体に容易に共役（結合）させることができる。いくつかの実施態様においては、精製活性化可能抗体組成物から、本明細書中に記載のように調製した共役活性化可能抗体の組成物もまた、実質的に切断不純物および／またはＨＣＰおよび／またはＨＭＷＳを含まない。切断不純物、ＨＣＰ、およびＨＭＷＳについては、これら共役させた活性化可能抗体組成物は、多くの場合、本明細書中に記載の溶出液および精製した無損傷活性化可能抗体組成物と同一の純度であり、同一の不純物プロファイルを有している。
さらなる実施態様において、本発明は、本発明の処理法によって生産することのできる精製した無損傷活性化可能抗体組成物を提供する。いくつかの実施態様においては、該精製した無損傷活性化可能抗体組成物は、以下を含む：
還元ＳＤＳ－ｃＧＥによって測定した場合に、少なくとも約９０％の無損傷活性化可能抗体、
ここで％無損傷活性化可能抗体は、本明細書において上記で定義される；
還元ＳＤＳ－ｃＧＥによって測定した場合に、約１５％未満の切断不純物、
ここで％切断不純物は、本明細書において上記で定義される；
ＳＥ－ＨＰＬＣで測定した場合に、約５％未満のＨＭＷＳ、
ここで％ＨＭＷＳは、本明細書において上記で定義される；
および
対応するＨＣＰ ＥＬＩＳＡアッセイで測定した場合に、約１５０ｐｐｍ未満のＨＣＰ。これらの実施態様のうちの一部においては、精製した無損傷活性化可能抗体組成物は、少なくとも約９１％の無損傷活性化可能抗体、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の無損傷活性化可能抗体を含む。
これら精製した無損傷活性化可能抗体組成物の一部においては、ＳＤＳ－ｃＧＥによって測定した場合に、該組成物が、約１４％未満の切断不純物、または約１３％未満、または約１２％未満、または約１１％未満、または約１０％未満、または約９％未満、または約８％未満、または約７％未満、または約６％未満の切断不純物を含む。特定の実施態様においては、精製した無損傷活性化可能抗体組成物は、還元ＳＤＳ－ｃＧＥアッセイによって測定した場合に、約５％未満の切断不純物、または約４％未満、または約３％未満、または約２％未満、または約１％未満、または約０．９％未満、または約０．８％未満、または約０．７％未満、または約０．６％未満、または約０．５％未満の切断不純物を含む。その他の実施態様においては、精製した無損傷活性化可能抗体組成物は、ＳＤＳ－ｃＧＥによって測定した場合に、約２％未満の切断不純物、または約１％未満、または約０．８％未満、または約０．８％未満、または約０．７％未満、または約０．６％未満、または約０．５％未満の切断不純物を含む。ＳＤＳ－ｃＧＥアッセイの例を実施例１に記載する。特定の実施態様においては、精製した無損傷活性化可能抗体組成物は、還元ＳＤＳ－ｃＧＥによって測定した場合に、検出可能な切断不純物を含まない。
特定の実施態様においては、精製した無損傷活性化可能抗体組成物は、還元ＳＤＳ－ｃＧＥで判定した場合に、約０．１％～約１５％の切断不純物、または約０．１％～約１０％の切断不純物、または約０．１％～約１０％の切断不純物、または約０．１％～約５％の切断不純物、または約０．１％～約４％の切断不純物、または約０．１％～約３％の切断不純物、または約０．１％～約２％の切断不純物、または約０．１％～約１％の切断不純物の範囲の相対量の切断不純物を含む。特定の実施態様においては、精製した無損傷活性化可能抗体組成物は、還元ＳＤＳ－ｃＧＥで判定した場合に、検出可能な切断不純物を含まない。
いくつかの実施態様においては、精製した無損傷活性化可能抗体組成物は、対応するＨＣＰ ＥＬＩＳＡによって測定した場合に、約１４０ｐｐｍ未満のＨＣＰ、または約１３０ｐｐｍ未満のＨＣＰ、または約１２０ｐｐｍ未満のＨＣＰ、または約１１０ｐｐｍ未満のＨＣＰ、または約１００ｐｐｍ未満のＨＣＰ、または約９０ｐｐｍ未満のＨＣＰ、または約８０ｐｐｍ未満のＨＣＰ、または約７０ｐｐｍ未満のＨＣＰ、または約６０ｐｐｍ未満のＨＣＰ、または約５０ｐｐｍ未満のＨＣＰ、または約４５ｐｐｍ未満のＨＣＰ、または約４０ｐｐｍ未満のＨＣＰ、または約３５ｐｐｍ未満のＨＣＰ、または約３０ｐｐｍ未満のＨＣＰ、または約２５ｐｐｍ未満のＨＣＰ、または約２０ｐｐｍ未満のＨＣＰ、または約１５ｐｐｍ未満のＨＣＰ、または約１０ｐｐｍ未満のＨＣＰを含む。これらの実施態様のうちの一部では、精製した活性化可能抗体組成物は、対応するＨＣＰ ＥＬＩＳＡによって測定した場合に、約５０ｐｐｍ未満、または約４５ｐｐｍ未満、または約４０ｐｐｍ未満、または約３５ｐｐｍ未満、または約３０ｐｐｍ未満、または約２５ｐｐｍ未満、または約２０ｐｐｍ未満、または約１５ｐｐｍ未満、または約１０ｐｐｍ未満のＨＣＰを含む。特定の実施態様においては、精製した無損傷活性化可能抗体組成物は、対応する宿主細胞ＥＬＩＳＡによって測定した場合に、検出可能なＨＣＰを含まない。
その他の実施態様においては、精製した無損傷活性化可能抗体組成物は、約０．５ｐｐｍのＨＣＰ～約１５０ｐｐｍのＨＣＰ、または約０．５ｐｐｍのＨＣＰ～約１４０ｐｐｍのＨＣＰ、または０．５ｐｐｍのＨＣＰ～約１３０ｐｐｍのＨＣＰ、または約０．５ｐｐｍのＨＣＰ～約１２０ｐｐｍ、または約０．５ｐｐｍのＨＣＰ～約１１０ｐｐｍ、または約０．５ｐｐｍのＨＣＰ～約１００ｐｐｍのＨＣＰ、または約０．５ｐｐｍのＨＣＰ～約９０ｐｐｍのＨＣＰ、または約０．５ｐｐｍのＨＣＰ～約９０ｐｐｍのＨＣＰ、または約０．５ｐｐｍのＨＣＰ～約８０ｐｐｍのＨＣＰ、または約０．５ｐｐｍのＨＣＰ～約７０ｐｐｍのＨＣＰ、または約０．５ｐｐｍのＨＣＰ～約６０ｐｐｍのＨＣＰ、または約０．５ｐｐｍ～約５０ｐｐｍのＨＣＰ、または約０．５ｐｐｍのＨＣＰ～約４５ｐｐｍのＨＣＰ、または約０．５ｐｐｍのＨＣＰ～約４０ｐｐｍのＨＣＰ、または約０．５ｐｐｍのＨＣＰ～約４０ｐｐｍのＨＣＰ、または約０．５ｐｐｍのＨＣＰ～約３５ｐｐｍのＨＣＰ、または約０．５ｐｐｍのＨＣＰ～約３０ｐｐｍのＨＣＰ、または約１ｐｐｍのＨＣＰ～約２５ｐｐｍのＨＣＰ、または約１ｐｐｍのＨＣＰ～約２０ｐｐｍのＨＣＰ、または約０．５ｐｐｍのＨＣＰ～約１５ｐｐｍのＨＣＰ、または約０．５ｐｐｍのＨＣＰ～約１０ｐｐｍのＨＣＰの範囲の量のＨＣＰを含む。
特定の実施態様においては、精製した無損傷活性化可能抗体組成物は、約１ｐｐｍのＨＣＰ～約１５０ｐｐｍのＨＣＰ、または約１ｐｐｍのＨＣＰ～約１４０ｐｐｍのＨＣＰ、または１ｐｐｍのＨＣＰ～約１３０ｐｐｍのＨＣＰ、または約１ｐｐｍのＨＣＰ～約１２０ｐｐｍ、または約１ｐｐｍのＨＣＰ～約１１０ｐｐｍ、または約１ｐｐｍのＨＣＰ～約１００ｐｐｍのＨＣＰ、または約１ｐｐｍのＨＣＰ～約９０ｐｐｍのＨＣＰ、または約１ｐｐｍのＨＣＰ～約９０ｐｐｍのＨＣＰ、または約１ｐｐｍのＨＣＰ～約８０ｐｐｍのＨＣＰ、または約１ｐｐｍのＨＣＰ～約７０ｐｐｍのＨＣＰ、または約１ｐｐｍのＨＣＰ～約６０ｐｐｍのＨＣＰ、または約１ｐｐｍ～約５０ｐｐｍのＨＣＰ、または約１ｐｐｍのＨＣＰ～約４５ｐｐｍのＨＣＰ、または約１ｐｐｍのＨＣＰ～約４０ｐｐｍのＨＣＰ、または約１ｐｐｍのＨＣＰ～約４０ｐｐｍのＨＣＰ、または約１ｐｐｍのＨＣＰ～約３５ｐｐｍのＨＣＰ、または約１ｐｐｍのＨＣＰ～約３０ｐｐｍのＨＣＰ、または約１ｐｐｍのＨＣＰ～約２５ｐｐｍのＨＣＰ、または約１ｐｐｍのＨＣＰ～約２０ｐｐｍのＨＣＰ、または約１ｐｐｍのＨＣＰ～約１５ｐｐｍのＨＣＰ、または約１ｐｐｍのＨＣＰ～約１０ｐｐｍのＨＣＰの範囲の量のＨＣＰを含む。
いくつかの実施態様においては、精製した無損傷活性化可能抗体組成物は、ＳＥ－ＨＰＬＣによって判定した場合に、約４％未満、または約３％未満、または約２％未満、または約１％未満のＨＭＷＳを含むが、ここで％ＨＭＷＳは本明細書において上記で定義される。
特定の実施態様においては、精製した無損傷活性化可能抗体組成物は、ＳＥ－ＨＰＬＣによって判定した場合に、約０．２％のＨＭＷＳ～約５％のＨＭＷＳ、または約０．２％のＨＭＷＳ～約４％のＨＭＷＳ、または約０．２％のＨＭＷＳ～約３％のＨＭＷＳ、または約０．２％のＨＭＷＳ～約２％のＨＭＷＳ、または約０．２％のＨＭＷＳ～約１％のＨＭＷＳの範囲の量のＨＭＷＳを含む。いくつかの実施態様においては、精製した無損傷活性化可能抗体組成物は、検出可能なＨＭＷＳを含まない。
いくつかの局面においては、精製した無損傷活性化可能抗体組成物は、ＳＤＳ－ｃＧＥによって測定した場合に、９０％超の無損傷活性化可能抗体および０．０５～５％の切断異型体を含む。いくつかの局面においては、該組成物は、９０％超の無損傷活性化可能抗体および０．０５～５％の切断異型体（ＳＤＳ－ｃＧＥによって判定した場合）、１５０ｐｐｍ未満の宿主細胞蛋白質（ＨＣＰ）（宿主細胞ＥＬＩＳＡによって判定した場合）、および５％未満の高分子量分子種（ＨＭＷＳ）（ＳＥ－ＨＰＬＣによって判定した場合）を含む。いくつかの局面においては、該組成物は、９６％超の無損傷活性化可能抗体、０．０５～４％の切断異型体、１５０ｐｐｍ未満の宿主細胞蛋白質（ＨＣＰ）および５％未満のＨＭＷＳを含む。いくつかの局面においては、該組成物は、９７％超の無損傷活性化可能抗体、０．０５～３％の切断異型体、１５０ｐｐｍ未満の宿主細胞蛋白質（ＨＣＰ）および５％未満のＨＭＷＳを含む。いくつかの局面においては、該組成物は、９８％超の無損傷活性化可能抗体、０．０５～２％の切断異型体、１５０ｐｐｍ未満の宿主細胞蛋白質（ＨＣＰ）および５％未満のＨＭＷＳを含む。いくつかの局面においては、該組成物は、９５％超の無損傷活性化可能抗体、０．０５～５％の切断異型体、１００ｐｐｍ未満の宿主細胞蛋白質（ＨＣＰ）および３％未満のＨＭＷＳを含む。いくつかの局面においては、該組成物は、９５％超の無損傷活性化可能抗体、０．０５～３％の切断異型体、１００ｐｐｍ未満の宿主細胞蛋白質（ＨＣＰ）および３％未満のＨＭＷＳを含む。いくつかの局面においては、該組成物は、９５％超の無損傷活性化可能抗体、０．０５～２％の切断異型体、１００ｐｐｍ未満の宿主細胞蛋白質（ＨＣＰ）および３％未満のＨＭＷＳを含む。いくつかの局面においては、該組成物は、９５％超の無損傷活性化可能抗体、０．０５～５％の切断異型体、１００ｐｐｍ未満の宿主細胞蛋白質（ＨＣＰ）および２％未満のＨＭＷＳを含む。いくつかの局面においては、該組成物は、９５％超の無損傷活性化可能抗体、０．０５～５％の切断異型体、１００ｐｐｍ未満の宿主細胞蛋白質（ＨＣＰ）および１．５％未満のＨＭＷＳを含む。いくつかの局面においては、該組成物は、９５％超の無損傷活性化可能抗体、０．０５～３％の切断異型体、１００ｐｐｍ未満の宿主細胞蛋白質（ＨＣＰ）および１．５％未満のＨＭＷＳを含む。いくつかの局面においては、該組成物は、９５％超の無損傷活性化可能抗体、０．０５～２％の切断異型体、１００ｐｐｍ未満の宿主細胞蛋白質（ＨＣＰ）および１．５％未満のＨＭＷＳを含む。いくつかの局面においては、該組成物は、９５％超の無損傷活性化可能抗体、０．０５～５％の切断異型体、２５ｐｐｍ未満の宿主細胞蛋白質（ＨＣＰ）および１．５％未満のＨＭＷＳを含む。いくつかの局面においては、該組成物は、９５％超の無損傷活性化可能抗体、０．０５～３％の切断異型体、２５ｐｐｍ未満の宿主細胞蛋白質（ＨＣＰ）および１．５％未満のＨＭＷＳを含む。いくつかの局面においては、該組成物は、９５％超の無損傷活性化可能抗体、０．０５～２％の切断異型体、２５ｐｐｍ未満の宿主細胞蛋白質（ＨＣＰ）および１．５％未満のＨＭＷＳを含む。いくつかの局面においては、該組成物は、９５％超の無損傷活性化可能抗体、０．０５～２％の切断異型体、１０ｐｐｍ未満の宿主細胞蛋白質（ＨＣＰ）および１．５％未満のＨＭＷＳを含む。いくつかの局面においては、該組成物は、９５％超の無損傷活性化可能抗体、０．０５～５％の切断異型体、２５ｐｐｍ未満の宿主細胞蛋白質（ＨＣＰ）および１．０％未満のＨＭＷＳを含む。いくつかの局面においては、該組成物は、９５％超の無損傷活性化可能抗体、０．０５～３％の切断異型体、２５ｐｐｍ未満の宿主細胞蛋白質（ＨＣＰ）および１．０％未満のＨＭＷＳを含む。いくつかの局面においては、該組成物は、９５％超の無損傷活性化可能抗体、０．０５～２％の切断異型体、２５ｐｐｍ未満の宿主細胞蛋白質（ＨＣＰ）および１．０％未満のＨＭＷＳを含む。いくつかの局面においては、該組成物は、９５％超の無損傷活性化可能抗体、０．０５～２％の切断異型体、１０ｐｐｍ未満の宿主細胞蛋白質（ＨＣＰ）および１．０％未満のＨＭＷＳを含む。いくつかの局面においては、切断異型体は単一アーム切断分子種である。
本発明はまた、本発明の無損傷活性化可能抗体の精製組成物および１種類以上の薬学的に許容され得る成分を含む医薬品組成物を提供する。いくつかの実施態様においては、該薬学的に許容され得る成分は、薬学的に許容され得る賦形剤である。そのような組成物は、本発明の処理法で生産される精製組成物（例えば、本発明の無損傷活性化可能抗体の精製組成物、またはそれに由来するさらなる組成物など）に薬学的に許容され得る賦形剤を添加することによって調製を行ってもよい。本発明の組成物に用いる好適な薬学的に許容され得る賦形剤は、当該技術分野において公知であり、そのような賦形剤としては、例えば、滅菌水、界面活性剤（例えば、非イオン性界面活性剤、陽イオン界面活性剤、および／または陰イオン界面活性剤）、緩衝剤（酸、塩基、および／または塩）、アルコール、ジオール、ポリオール、糖（例えば、単糖、二糖、および／または多糖）、親水性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール、可溶化剤（例えば、シクロデキストリンなど）などが挙げられる。該組成物は、液体形態であってもよく、あるいは固体形態、例えば、微粒子形態であってもよい。例えば、固体形態は、凍結乾燥医薬品組成物を形成させるために対応する液体組成物を凍結乾燥することによって、調製を行ってもよい。
該医薬品組成物が液体形態の場合には、典型的には水をさらに含む（例えば、滅菌水）。いくつかの実施態様においては、該組成物は、界面活性剤、緩衝剤、糖、およびそれらの２種類以上の任意の組み合わせから成る群から選択される１種類以上の成分、および水をさらに含む。該医薬品組成物が固体（例えば、凍結乾燥した）形態の場合には、典型的には、糖および緩衝剤から成る群から選択される１種類以上の成分を含む。いくつかの実施態様においては、該組成物は、糖を含む。
本発明の処理法および組成物は、様々な活性化可能抗体のうちのいずれかを用いてもよい。後述する実施例に例示されるように、該処理法は、切断不純物、ならびにＨＣＰおよびＨＭＷＳを大幅に低下させ、無損傷活性化可能抗体の精製組成物を生産することが可能であることが示される。これらの活性化可能抗体を含む水性原材料を本発明の処理法を用いて精製するそれぞれの例においては、無損傷活性化可能抗体が濃縮され、切断不純物、ＨＭＷＳを含む不純物が実質的に含まれていない溶出液が最初に溶出した。この知見は、様々な活性化可能抗体のアミノ酸配列を通じて一貫するものであった。したがって、活性化可能抗体の特定のアミノ酸配列（例えば、ＭＭ、ＣＭ、ＡＢ）に関係なく、様々な粗成活性化可能抗体組成物に対して、本発明の処理法が利用可能であると考えられる。したがって、本発明の処理法を用いて精製してもよい組成物は、当該技術分野で公知の多くの生物学的標的（隠蔽されていない場合）のうちのいずれか１種類に特異的に結合することの可能なＡＢ成分を有する活性化可能抗体を含むのであってもよい（例えば、所望の生物学的標的に結合することが知られている抗体に由来するＶＬおよびＶＨ ＣＤＲアミノ酸配列を組み込むことによって取得されるもの、あるいは、当該技術分野で公知の様々な抗体創薬スクリーニングプラットフォームのいずれかを用いて同定されるもの）。
生物学的標的の例としては、細胞表面受容体および分泌性結合蛋白質（例えば、成長因子など）、可溶性酵素、構造蛋白質（例えば、コラーゲン、フィブロネクチンなど）などが挙げられる。好適な生物学的標的としては、例えば、以下が挙げられる：
１－０２－ＬＦＡ－３、α４－インテグリン、α－Ｖ－インテグリン、α４β１－インテグリン、ＡＧＲ２、抗ルイスＹ、アペリンＪ受容体、ＡＰＲＩＬ、Ｂ７－Ｈ４、ＢＡＦＦ、ＢＴＬＡ、Ｃ５補体、Ｃ－２４２、ＣＡ９、ＣＡ１９－９（ルイスａ）、炭酸脱水酵素９、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ６、ＣＤ９、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４７、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ６４、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８６、ＣＤ９５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２５、ＣＤ１３２（ＩＬ－２ＲＧ）、ＣＤ１３３、ＣＤ１３７、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１６６、ＣＤ１７２Ａ、ＣＤ２４８、ＣＤＨ６、ＣＥＡＣＡＭ５（ＣＥＡ）、ＣＥＡＣＡＭ６（ＮＣＡ－９０）、ＣＬＡＵＤＩＮ－３、ＣＬＡＵＤＩＮ－４、ｃＭｅｔ、コラーゲン、クリプト（Ｃｒｉｐｔｏ）、ＣＳＦＲ、ＣＳＦＲ－１、ＣＴＬＡ－４、ＣＴＧＦ、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ４、ＣＹＲ６１、ＤＬ４４、ＤＬＫ１、ＤＬＬ４、ＤＰＰ－４、ＤＳＧ１、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖｉｉｉ、エンドセリンＢ受容体（ＥＴＢＲ）、ＥＮＰＰ３、ＥｐＣＡＭ、ＥＰＨＡ２、ＥＲＢＢ３、ＲＳＶのＦ蛋白質、ＦＡＰ、ＦＧＦ－２、ＦＧＦ－８、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、葉酸受容体、ＧＡＬ３ＳＴ１、Ｇ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦＲ、ＧＤ２、ＧＩＴＲ、ＧＬＵＴ１、ＧＬＵＴ４、ＧＭ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦＲ、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体、ＧＰ１３０、ＧＰＩＩＢ／ＩＩＩＡ、ＧＰＮＭＢ、ＧＲＰ７８、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＨＶＥＭ、ヒアルロニダーゼ、ＩＣＯＳ、ＩＦＮα、ＩＦＮβＨＧＦ、ｈＧＨ、ヒアルロニダーゼ、ＩＣＯＳ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩｇＥ、ＩｇＥ受容体（ＦｃｅＲＩ）、ＩＧＦ、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ１Ｒ、ＩＬ２、ＩＬ１１、ＩＬ１２ｐ４０、ＩＬ－１２Ｒ、ＩＬ－１２Ｒβ１、ＩＬ１３、ＩＬ１３Ｒ、ＩＬ１５、ＩＬ１７、ＩＬ１８、ＩＬ２１、ＩＬ２３、ＩＬ２３Ｒ、ＩＬ２７／ＩＬ２７Ｒ（ｗｓｘ１）、ＩＬ２９、ＩＬ－３１Ｒ、ＩＬ３１／ＩＬ３１Ｒ、ＩＬ－２Ｒ、ＩＬ４、ＩＬ４－Ｒ、ＩＬ６、ＩＬ－６Ｒ、インスリン受容体、Ｊａｇｇｅｄリガンド、Ｊａｇｇｅｄ１、Ｊａｇｇｅｄ２、ＬＡＧ－３、ＬＩＦ－Ｒ、ルイスＸ、ＬＩＧＨＴ、ＬＲＰ４、ＬＲＲＣ２６、ＭＣＳＰ、メソテリン、ＭＲＰ４、ＭＵＣ１、ムチン-１６（ＭＵＣ１６、ＣＡ－１２５）、Ｎａ／Ｋ ＡＴＰアーゼ、好中球エラスターゼ、ＮＧＦ、ニカストリン、Ｎｏｔｃｈ受容体、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、Ｎｏｔｃｈ４、ＮＯＶ、ＯＳＭ－Ｒ、ＯＸ－４０、ＰＡＲ２、ＰＤＧＦ－ＡＡ、ＰＤＧＦ－ＢＢ、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ホスファチジルセリン、Ｐ１ＧＦ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＡＡＧ１２、ＲＡＧＥ、ＳＬＣ４４Ａ４、スフィンゴシン１リン酸、ＳＴＥＡＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＴＡＧ－７２、ＴＡＰＡ１、ＴＧＦβ、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ－３、ＴＬＲ２、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＭＥＭ３１、ＴＮＦα、ＴＮＦＲ、ＴＮＦＲＳ１２Ａ、ＴＲＡＩＬ－Ｒ１、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、トランスフェリン、トランスフェリン受容体、ＴＲＫ－Ａ、ＴＲＫ－Ｂ、ｕＰＡＲ、ＶＡＰ１、ＶＣＡＭ－１、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ＶＩＳＴＡ、ＷＩＳＰ－１、ＷＩＳＰ－２、ＷＩＳＰ－３など。
ＡＢは、ＶＬおよびＶＨから形成され（したがって、活性化可能抗体は、ＶＬおよびＶＨを含む）、ＶＬとＶＨは、直接的または間接的に、例えば、共有結合または非共有結合を介して互いに連結されている。いくつかの実施態様においては、ＶＬとＶＨは、１つ以上のジスルフィド結合（例えば、１つ以上のＣｙｓ－Ｃｙｓジスルフィド架橋を介して）、ペプチドリンカー、合成リンカー、天然のリンカーなどを介して互いに連結されている。構造的には、それぞれのＡＢは、独立に様々な形態のうちのいずれか１種類であってもよく、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、単一特異性Ｆａｂ２、二重特異性Ｆａｂ２、三重特異性Ｆａｂ３、ｓｃＦｖ、二重特異性抗体、三重特異性抗体、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、低分子化抗体、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（例えば、ＢｉＴＥ（商標））、二重親和性再標的化抗体（ＤＡＲＴ抗体）などであってもよい。好適な二重特異性の形態は、当該技術分野において公知の多くの二重特異性抗体形態のいずれか１種類を含むが、そのような二重特異性抗体形態としては、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎら「二重特異性抗体（Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」、Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ（２０１５）２０（７）：８３８－８４７に記載のものが挙げられる；この参考文献は参照としてその全体が本明細書に組み入れられる。
いくつかの実施態様においては、活性化可能抗体は、一組の第１のＶＬ ＣＤＲ（すなわち、第１のＶＬ ＣＤＲ１、第１のＶＬ ＣＤＲ２、および第１のＶＬ ＣＤＲ３）を有する第１のＶＬならびに一組の第１のＶＨ ＣＤＲ（すなわち、第１のＶＨ ＣＤＲ１、第１のＶＨ ＣＤＲ２、および第１のＶＨ ＣＤＲ３）を有する第１のＶＨを含み、ここでＶＬとＶＨは共に対応するＡＢを形成する。いくつかの実施態様においては、活性化可能抗体はまた第２のＡＢおよび第２のプロドメインを有し、ここで該第２のＡＢは第２の生物学的標的に対して特異的結合親和性を有し、ここで該第２のＡＢは第２のＶＬ、第２のＶＨを含み、およびここで該第２のプロドメインは第２のＭＭおよび第２のＣＭを含み、ここで該第２のＡＢは第２のプロドメインに共役（結合）している。これらの実施態様においては、該第２のＶＬは、一組の第２のＶＬ ＣＤＲ（すなわち、第２のＶＬ ＣＤＲ１、第２のＶＬ ＣＤＲ２、および第２のＶＬ ＣＤＲ３）を含み、また第２のＶＨは一組の、第２のＶＨ ＣＤＲ（すなわち、第２のＶＨ ＣＤＲ１、第２のＶＨ ＣＤＲ２、および第２のＶＨ ＣＤＲ３）を含み、ここで該ＶＬおよびＶＨは共に対応する第２のＡＢを形成する。付加的ＡＢ（第３のＶＬおよび第３のＶＨのアミノ酸配列に由来するものなど）を有する活性化可能抗体の精製組成物を、本発明の処理法を用いて調製してもよく、ここで各付加的ＡＢは対応するＭＭおよびＣＭであってその付加的ＡＢ結合しているＭＭおよびＣＭを有している。あるＡＢに対応するＶＬおよびＶＨの各組は、単一ポリペプチド（例えば、ｓｃＦｖなど）、または２種類のポリペプチド（抗体軽鎖および抗体重鎖など）によってコードされるものであってもよい。様々な生物学的標的に対して結合特異性を有するＶＬおよびＶＨのＣＤＲ配列が、当該技術分野において公知であり、本発明の処理法および組成物に用いる活性化可能抗体にそのようなＣＤＲ配列を組み込むことができる。
活性化可能抗体が第２のＶＬおよび第２のＶＨを含むいくつかの実施態様においては、第１のＶＬにおける一組のＣＤＲの各ＣＤＲアミノ酸配列が、第２のＶＬにおける一組のＣＤＲの対応するＣＤＲアミノ酸配列と同一である。特定の実施態様においては、第の１ＶＨにおける一組のＣＤＲの各ＣＤＲアミノ酸配列が、第２のＶＨにおける一組のＣＤＲの対応するＣＤＲアミノ酸配列と同一である。これらの実施態様においては、該第１のＡＢおよび該第２のＡＢ（すなわち、隠蔽されていない場合）は、典型的には、同一生物学的標的分子種に対して結合特異性を有している。
いくつかの実施態様においては、第１のＶＬにおける一組のＣＤＲのうちの少なくとも１つのＣＤＲのアミノ酸配列が、第２のＶＬにおける一組のＣＤＲのうちの対応するＣＤＲのアミノ酸配列と同一ではなく、および／または第１のＶＨにおける一組のＣＤＲのうちの少なくとも１つのＣＤＲのアミノ酸配列が、第２のＶＨにおける一組のＣＤＲのうちの対応するＣＤＲのアミノ酸配列と同一ではない。これらの実施態様においては、該第１の生物学的標的および該第２の生物学的標的は、同一であってもよく、あるいは異なっていてもよい。例えば、該第１ＡＢおよび該第２ＡＢが、異なるエピトープに結合してもよく、あるいは同一の生物学標的の重複するエピトープに結合してもよい。これらの実施態様のうちの一部においては、該第１の生物学的標的および該第２の生物学的標的は、同一ではない（すなわち、該活性化可能抗体は、二重特異性活性化可能抗体などの「多重特異性」活性化可能抗体）。これらの実施態様においては、多くの場合、第１および第２の生物学的標的のうちの少なくとも１つが、細胞表面受容体または例えば、癌、細胞増殖、または炎症性プロセスに関連するリガンドである。二重特異性の実施態様のうちの一部においては、該第１の生物学的標的は、分化クラスター３（ＣＤ３）Ｔ細胞共受容体である。通常、第１および第２の生物学的標的のうちの他方の少なくとも１つは、細胞からの発現またはその細胞の存在が疾病状態に関連している細胞外膜結合蛋白質である。
いくつかの実施態様においては、活性化可能抗体のＶＬおよびＶＨドメインは、抗体軽鎖内および抗体重鎖内にあり、それぞれの鎖には、少なくとも１種類の付加的成分と共に、それらが一緒に組み込まれた状態になっている。例えば、軽鎖および重鎖の少なくとも１つが、プロドメインをコードするアミノ酸配列を含む場合には、該軽鎖は、ＶＬおよび付加的成分をコードするアミノ酸配列を含むものであってもよく、ここで該付加的成分は、プロドメイン、リンカー、軽鎖定常ドメイン（λまたはκ）、およびそれらのうちの２種類以上の任意の組み合わせから成る群から選択される少なくとも１種類の付加的成分である；また、該重鎖は、ＶＨおよび付加的成分をコードするアミノ酸配列を含んでいてもよく、ここで該付加的成分は、プロドメイン、リンカー、１種類以上の重鎖定常ドメイン（すなわち、ＣＨ１、ＣＨ２、および／またはＣＨ３ドメイン）および／またはヒンジ領域、それらのうちの２種類以上の任意の組み合わせから成る群から選択される少なくとも１種類の付加的成分である。いくつかの実施態様においては、該重鎖は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、およびＩｇＭから成る群から選択されるヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）クラスに実質的に対応するＦｃ領域をコードするアミノ酸配列を含む。
多くの場合に、該Ｆｃドメインは天然のヒトＦｃドメインを含む。いくつかの実施態様においては、該Ｆｃドメインは、天然のヒトＦｃドメインとは異なるアミノ酸配列を有する工学的に改変したヒトＦｃドメインである。工学的に改変したＦｃドメインは、対応する天然のＦｃドメインと比べて異なるエフェクター機能を示すことも多い。そのような機能としては、例えば、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）の増強、抗体依存性細胞貪食作用（ＡＤＣＰ）の増強、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の促進、エフェクター機能の低下、半減期の延長、ＦｃγＲＩＩｂ結合の増強、ＦｃγＲＩＩａ結合の増強などが挙げられる。
工学的に改変したヒトＦｃドメインのさらなる例については、当業者には公知である。Ｆｃの機能低下をもたらす少なくとも１つのアミノ酸の変異を有するＩｇ重鎖定常領域アミノ酸の例としては、重鎖定常領域のアミノ酸２２８、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３９、２５２、２５４、２５６、２６５、２７０、２９７、３１８、３２０、３２２、３２７、３２９、３３０、および３３１における変異が挙げられるが、これらのみに限定されるものではない。変異アミノ酸の組み合わせの例もまた当該技術分野において公知であり、アミノ酸２３４、２３５、および３３１における変異の組み合わせ（Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ、およびＰ３３１Ｓなど）またはアミノ酸３１８、３２０、および３２２における変異の組み合わせ（Ｅ３１８Ａ、Ｋ３２０Ａ、およびＫ３２２Ａなど）が挙げられるが、これらのみに限定されるものではない。
工学的に改変したＦｃドメインのさらなる例としては、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｖ３０５Ｉ／Ｐ３９６ ＩｇＧ１； Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ ＩｇＧ１；Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌ ＩｇＧ１； Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ；一方の重鎖において、Ｌ２３４Ｙ／Ｌ２３５Ｑ／Ｇ２３６Ｗ／Ｓ２３９Ｍ／Ｈ２６８Ｄ／Ｄ２７０Ｅ／Ｓ２９８Ａ ＩｇＧ１、および他方の重鎖において、Ｄ２７０Ｅ／Ｋ３２６Ｄ、Ａ３３０Ｍ／Ｋ３３４Ｅ ＩｇＧ； Ｇ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ ＩｇＧ１； Ｋ３２６Ｗ／Ｅ３３３Ｓ ＩｇＧ１； Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ ＩｇＧ１； Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ ＩｇＧ１； Ｎ２９７ＡまたはＮ２９７ＱまたはＮ２９７Ｇ ＩｇＧ１； Ｌ２３５Ｅ ＩｇＧ１； Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ ＩｇＧ１； Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ ＩｇＧ４； Ｈ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ ＩｇＧ２； Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ ＩｇＧ２； Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ ＩｇＧ１； Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ ＩｇＧ１； Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ ＩｇＧ１； Ｎ３２５Ｓ／Ｌ３２８Ｆ ＩｇＧ１などが挙げられる。いくつかの実施態様においては、工学的に改変したＦｃドメインは、Ｎ２９７Ａ ＩｇＧ１、Ｎ２９７Ｑ ＩｇＧ１、およびＳ２２８Ｐ ＩｇＧ４から成る群から選択される１種類以上の置換を含む。アミノ酸残基の番号付けは、ＥＵナンバリングシステムに基づく。
本発明の実施に用いられる活性化可能抗体は、構造的に多様な構成であり得る。活性化可能抗体についての構造様式の例を下に示す。下の構造式ではＭＭおよびＣＭが異なる成分として表されているが、本明細書に開示される全ての例示的な実施態様（構造式を含む）においては、ＭＭおよびＣＭのアミノ酸配列は重複し得る（例えば、ＣＭがＭＭ内に完全に、あるいは部分的に含まれるなど）ことが意図されることを、留意されたい。
活性化可能抗体内において、直接的に、あるいは１つ以上のリンカーを介して間接的に、ＭＭとＡＢの間にＣＭを配置してもよい。多くの場合、活性化可能抗体成分、ＭＭ、ＣＭ、およびＡＢのそれぞれを、下の構造式から成る群から選択される構造で配置する：
Ｎ末端からＣ末端への方向、
（ＭＭ）－（ＣＭ）－（ＡＢ）；
または
（ＡＢ）－（ＣＭ）－（ＭＭ）
ここでＭＭ、ＣＭ、およびＡＢは既に定義されており、
またここで各「－」は、それぞれ独立に直接的結合または間接的結合（すなわち、本明細書中に後述するようなリンカーを介する）を表す。
多くの実施態様においては、該活性化可能抗体は、ＭＭ－ＣＭの境界部に、ＣＭ－ＡＢの境界部に、またはその両方のうちの１つ以上に、柔軟性を与える１つ以上のリンカーを含んでいてもよい。例えば、特定の実施態様においては、該活性化可能抗体は、下の構造式から成る群から選択される構造で配置されるＭＭ、ＣＭ、およびＡＢ成分を含んでいてもよい：
Ｎ末端からＣ末端への方向、またはＣ末端からＮ末端への方向のいずれか：
（ＭＭ）－Ｌ１－（ＣＭ）－（ＡＢ）；
（ＭＭ）－（ＣＭ）－Ｌ２－（ＡＢ）；
または
（ＭＭ）－Ｌ１－（ＣＭ）－Ｌ２－（ＡＢ）
ここでＭＭ、ＣＭ、およびＡＢは本明細書中上記で定義されている；
ここで各リンカー、Ｌ１およびＬ２は、同一であっても、異なっていてもよく、それぞれが独立に任意選択的に存在してもよく、または非存在であってもよい。
いくつかの実施態様において、軽鎖および重鎖のうちの一方のみがプロドメインをコードする場合には、該無損傷活性化可能抗体は、第１のＡＢを含むが、ここで該第１のＶＬは第１の軽鎖によってコードされ、ここで該第１のＶＨは第１の重鎖によってコードされ、およびここで該第１の軽鎖は、プロドメイン、リンカー、軽鎖定常ドメイン、およびそれらのうちの２種類以上の任意の組み合わせから成る群から選択される１種類以上の成分をさらにコードし、およびここで該第１の重鎖は、プロドメイン、リンカー、１種類以上の重鎖定常ドメイン、ヒンジ領域、およびそれらのうちの２種類以上の任意の組み合わせから成る群から選択される１種類以上の成分をさらにコードする。
特定の実施態様においては、該無損傷活性化可能抗体は、詳細について後述されるように、Ｆｃドメインをさらに含む。これらの実施態様のうちの一部においては、該活性化可能抗体は、第１のＡＢ（第１のＶＬおよび第１のＶＨを含む）および第２のＡＢ（第２のＶＬおよび第２のＶＨを含む）を含む。特定の一実施態様においては、第１のＶＬと第２のＶＨがリンカーを介して互いに連結されており、また第２のＶＬと第１のＶＨがリンカーを介して互いに連結されている。さらなる特定の一実施態様においては、該活性化可能抗体は、第１のＶＬ、第１のリンカー、および第１のＶＨを含む第１の一本鎖抗体、ならびに第２のＶＬ、第２のリンカー、および第２のＶＨを含む第２の一本鎖抗体を含むが、ここで該第１の一本鎖抗体および第２の一本鎖抗体は第３のリンカーを介して互いに連結されている。
本発明の組成物および処理法に用いる活性化可能抗体は、プロテアーゼの基質として機能するアミノ酸配列を有する様々なＣＭのうちのいずれかを含むものであってもよい。米国特許第７，６６６，８１７号、米国特許第８，５６３，２６９号、ＰＣＴ出願ＷＯ２０１４／０２６１３６、およびＢｏｕｌｗａｒｅら、「急速加水分解動態を示すプロテアーゼのペプチド基質の進化的最適化（Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ ｔｈａｔ ｅｘｈｉｂｉｔ ｒａｐｉｄ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｋｉｎｅｔｉｃｓ）」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．１０６．３（２０１０）：３３９－４６に記載のものを含む様々な公知の技術のいずれかを用いて、好適な基質アミノ酸配列を同定してもよい；これらの参考文献は、参照としてその全体が本明細書に組み入れられる。
いくつかの実施態様において、ＣＭはプロテアーゼの基質を含むが、該プロテアーゼは病的状態または罹患組織において活性であり、例えば、上方制御されるか、あるいは非制御状態であり、活性化可能抗体が該プロテアーゼに対して曝露された場合に、該プロテアーゼが活性化可能抗体のＣＭを切断する。病的状態の例としては、例えば、癌（例えば、この場合には、罹患組織は腫瘍組織である）および炎症状態または自己免疫状態（例えば、この場合には、罹患組織が炎症組織である）が挙げられる。いくつかの実施態様において、該ＣＭは細胞外プロテアーゼの基質を含む。図３Ａおよび３Ｂに示されるように、ＣＭを切断するプロテアーゼが健常組織に比較して過剰発現する罹患組織の微小環境において、本開示の無損傷活性化可能抗体のＣＭが切断されてもよい。したがって、本開示の精製した活性化可能抗体組成物は、療用量よりも低い量の該組成物を罹患組織に送達する可能性を最小化し、それに加えて、切断抗体、したがって活性抗体が対象の健常組織に送達されることを回避しながら、標的治療用量の無損傷活性化可能抗体を関連罹患組織へ送達することを可能にする。
米国特許第７，６６６，８１７号、米国特許第８，５６３，２６９号、Ｂｏｕｌｗａｒｅら、「急速加水分解動態を示すプロテアーゼのペプチド基質の進化的最適化（Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ ｔｈａｔ ｅｘｈｉｂｉｔ ｒａｐｉｄ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｋｉｎｅｔｉｃｓ）」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．１０６．３（２０１０）：３３９－４６に記載のものを含む様々な公知の技術のいずれかを用いることにより、好適な基質を容易に識別し得る；これらの参考文献は、参照としてその全体が本明細書に組み入れられる。基質の例としては、以下のプロテアーゼのうちの任意の１種類以上に対する基質が挙げられる：
ＡＤＡＭ、ＡＤＡＭ様、またはＡＤＡＭＴＳ（例えば、ＡＤＡＭ８、ＡＤＡＭ９、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＡＭ１５、ＡＤＡＭ１７／ＴＡＣＥ、ＡＤＡＭＤＥＣ１、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＤＡＭＴＳ５など）；アスパラギン酸プロテアーゼ（例えば、ＢＡＣＥ、レニンなど）；アスパラギン酸カテプシン（例えば、カテプシンＤ、カテプシンＥなど）；カスパーゼ（例えば、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０、カスパーゼ１４など）；システインプロテイナーゼ（例えば、クルジパイン（Ｃｒｕｚｉｐａｉｎ）、レグマイン、オトバイン－２など）；カリクレイン関連ペプチダーゼ（ＫＬＫ）（例えば、ＫＬＫ４、ＫＬＫ５、ＫＬＫ６、ＫＬＫ７、ＫＬＫ８、ＫＬＫ１０、ＫＬＫ１１、ＫＬＫ１３、ＫＬＫ１４など）；金属プロテアーゼ（例えば、メプリン、ネプリライシン（Ｎｅｐｒｉｌｙｓｉｎ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、骨形成蛋白質１（ＢＭＰ－１）など）；マトリックス金属プロテアーゼ（ＭＭＰ）（例えば、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ７、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１０、ＭＭＰ１１、ＭＭＰ１２、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１４、ＭＭＰ１５、ＭＭＰ１６、ＭＭＰ１７、ＭＭＰ１９、ＭＭＰ２０、ＭＭＰ２３、ＭＭＰ２４、ＭＭＰ２６、ＭＭＰ２７など）；セリンプロテアーゼ（例えば、活性化蛋白質Ｃ、カテプシンＡ、カテプシンＧ、キマーゼ、凝固因子プロテアーゼ（例えば、ＦＶＩＩａ、ＦＩＸａ、ＦＸａ、ＦＸＩａ、ＦＸＩＩａなど））；エラスターゼ、グランザイムＢ、グアニジノベンゾアターゼ、ＨｔｒＡ１、ヒト好中球エラスターゼ、ラクトフェリン、マラプシン（Ｍａｒａｐｓｉｎ）、ＮＳ３／４Ａ、ＰＡＣＥ４、プラスミン、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、組織プラスミノゲン活性化因子（ｔＰＡ）、トロンビン、トリプターゼ、ウロキナーゼ（ｕＰＡ）、ＩＩ型膜貫通セリンプロテアーゼ（ＴＴＳＰ）（例えば、ＤＥＳＣ１、ＤＰＰ－４、ＦＡＰ、ヘプシン、マトリプターゼ－２、ＭＴ－ＳＰ１／マトリプターゼ、ＴＭＰＲＳＳ２、ＴＭＰＲＳＳ３、ＴＭＰＲＳＳ４など）など。特異的活性化可能抗体ＣＭについては、例えば、ＷＯ２０１０／０８１１７３、ＷＯ２０１５／０４８３２９、ＷＯ２０１５／１１６９３３、およびＷＯ２０１６／１１８６２９に記載がある；これらの参考文献はそれぞれ、その全体が参照として本明細書に組み入れられる。
いくつかの実施態様においては、無損傷活性化可能抗体中に存在する少なくとも１つ以上のＣＭ（例えば、（存在する場合には）第１および第２のＣＭの一方または両方）は、少なくとも１つのＭＭＰの基質を含む。これらの実施態様のうちの一部において、ＭＭＰは、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１４、ＭＭＰ１、ＭＭＰ３、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１７、ＭＭＰ１１、およびＭＭＰ１９から成る群から選択される。特定の一実施態様においては、無損傷活性化可能抗体中に存在する少なくとも１つ以上のＣＭ（例えば、（存在する場合には）第１および第２のＣＭの一方または両方）は、ＭＭＰ１４の基質を含む。特定の実施態様においては、該ＣＭは、以下から成る群から選択される少なくとも１種類のプロテアーゼの基質である：
マトリックス金属プロテアーゼ（ＭＭＰ）、トロンビン、好中球エラスターゼ、システインプロテアーゼ、レグマイン、およびセリンプロテアーゼ（マトリプターゼ（ＭＴ－ＳＰ１）、およびウロキナーゼ（ｕＰＡ）など）。理論に基づかなくとも、これらのプロテアーゼは、癌、炎症、または自己免疫の少なくとも１つにおいて、上方制御されるか、あるいは非制御状態であると考えられる。
いくつかの実施態様においては、無損傷活性化可能抗体中に存在する少なくとも１つ以上のＣＭ（例えば、（存在する場合には）第１および第２のＣＭの一方または両方）は、少なくとも２種類の異なるプロテアーゼ（すなわち、少なくとも第１のプロテアーゼおよび少なくとも第２のプロテアーゼ）の基質を含むアミノ酸配列を含む。これらの実施態様においては、該開裂部位は、該少なくとも２種類の異なるプロテアーゼに関して同一であっても、異なっていてもよい。好適な第１および第２のプロテアーゼは、本明細書において上記のものを含む。これらの実施態様のうちの一部では、該第１のプロテアーゼは、ＭＭＰ、トロンビン、好中球エラスターゼ、システインプロテアーゼ、ｕＰＡ、レグマインおよびマトリプターゼから成る群から選択され、該第２のプロテアーゼは、上記のもののうちのいずれかから成る群から選択される。いくつかの実施態様においては、該第１のプロテアーゼはマトリックス金属プロテアーゼ（ＭＭＰ）であり、該第２のプロテアーゼはセリンプロテアーゼ（ＳＰ）である。
該ＣＭは、少なくとも２種類以上の異なるプロテアーゼの２種類以上の公知の基質を含むように設計してもよい。ここで該２種類以上の基質は、一繋がりに互いに直接的または直接的に共有結合で連結されるが、ここで該ＣＭは該ＡＢに共役（結合）している。例えば、ＣＭは直接的または間接的に共有結合で第２の基質に連結される第１の基質を含んでいてもよく、ここで該第１の基質は第１のプロテアーゼの基質であり、また、該第２の基質は第２のプロテアーゼの基質であり、ここで第１および第２のプロテアーゼは異なるプロテアーゼであり、ここで該ＣＭは該ＡＢに共役（結合）している。いくつかの実施態様においては、該第１の基質および該第２の基質はそれぞれ、約２５アミノ酸残基以下の長さ、約２４アミノ酸残基以下、または約２３アミノ酸残基以下、または約２２アミノ酸残基以下、または約２１アミノ酸残基以下、または約２０アミノ酸残基以下、または約１９アミノ酸残基以下、または約１８アミノ酸残基以下、または約１７アミノ酸残基以下、または約１５アミノ酸残基以下の長さのペプチドである。
いくつかの実施態様においては、該無損傷活性化可能抗体は、以下から成る群から選択されるプロテアーゼの少なくとも１種類の基質を含む：ＭＭＰ、トロンビン、好中球エラスターゼ、システインプロテアーゼ、ｕＰＡ、レグマイン、およびマトリプターゼ。いくつかの実施態様においては、該活性化可能抗体は、２つのプロドメインを含み、したがって第１のＣＭおよび第２のＣＭを含む。これらの実施態様のうちの一部においては、第１のＣＭおよび第２のＣＭは、同一プロテアーゼの基質を含む。これらの実施態様のうちの一部においては、該第１のＣＭは該第１の基質を含み、該第２のＣＭは第２の基質を含むが、ここで該第１の基質および該第２の基質は、２種類の異なるプロテアーゼの基質である。
特定の実施態様においては、活性化可能抗体中の少なくとも１つのＣＭ（例えば、第２のプロドメインが活性化可能抗体中に存在する場合には、第１のＣＭおよび第２のＣＭの少なくとも１つ）は、配列番号：１～６７から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様においては、活性化可能抗体に存在する各ＣＭ（例えば、第２のプロドメインが活性化可能抗体中に存在する場合には、第１のＣＭおよび第２のＣＭの両方）は独立に、配列番号：１～６７から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む。これらの実施態様のうちの一部においては、活性化可能抗体に存在する各ＣＭは、同一アミノ酸配列を含む（例えば、第２のプロドメインが活性化可能抗体中に存在する場合には、第１ＣＭおよび第２のＣＭは、同一アミノ酸配列を含む）。
本発明の組成物および処理法に用いる活性化可能抗体のＭＭ成分は、様々な長さのうちのいずれであってもよい。いくつかの実施態様においては、活性化可能抗体に存在する各ＭＭ（例えば、第１のＭＭ；第１のＭＭおよび第２のＭＭなど）はそれぞれ、約３０アミノ酸残基以下の長さ、または約２９アミノ酸残基以下の長さ、または約２８アミノ酸残基以下の長さ、または約２７アミノ酸残基以下の長さ、または約２６アミノ酸残基以下の長さ、または約２５アミノ酸残基以下の長さ、または約２４アミノ酸残基以下の長さ、または約２３アミノ酸残基以下の長さ、または約２２アミノ酸残基以下の長さ、または約２１アミノ酸残基以下の長さ、または約２０アミノ酸残基のペプチドである。存在する各ＭＭは、対応するＡＢがそのそれぞれの生物学的標的に特異的に結合する能力を低下させる。
該ＭＭは、該活性化可能抗体の生物学的標的に対する結合を様々な様式で阻害することができる。例えば、該ＭＭは該ＡＢに結合することができ、それによって該活性化可能抗体の生物学的標的への結合を阻害する。該ＭＭは、該活性化可能抗体の生物学的標的への結合を、アロステリックまたは立体的に阻害することができる。いくつかの実施態様においては、該ＭＭは該ＡＢに特異的に結合する。米国特許出願第２００９／００６２１４２号および第２０１２／０２４４１５４号、およびＰＣＴ特許出願ＷＯ２０１４／０２６１３６に記載のものを含む様々な公知の技術のいずれかを用いて、好適なＭＭを同定してもよい；これらの参考文献は、参照としてその全体が本明細書に組み入れられる。
多くの場合、生物学的標的に対する活性化可能抗体の解離定数（Ｋｄ）は、生物学的標的に対する対応するＡＢ（該ＭＭが存在しない場合）のＫｄよりも大きい。
いくつかの実施態様においては、該ＭＭは、生物学的標的に対する該ＡＢの結合を、少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％、および１００％低下させ、または少なくとも約２時間、または少なくとも約４時間、または少なくとも約６時間、または少なくとも約８時間、または少なくとも約１２時間、または少なくとも約２４時間、または少なくとも約２８時間、または少なくとも約３０時間、または少なくとも約３６時間、または少なくとも約４８時間、または少なくとも約６０時間、または少なくとも約７２時間、または少なくとも約８４時間、または少なくとも約９６時間、または少なくとも約５日、または少なくとも約１０日、または少なくとも約１５日、または少なくとも約３０日、または少なくとも約４５日、または少なくとも約６０日、または少なくとも約９０日、または少なくとも約１２０日、または少なくとも約１５０日、または少なくとも約１８０日、または少なくとも約１か月、または少なくとも約２か月、または少なくとも約３か月、または少なくとも約４か月、または少なくとも約５か月、または少なくとも約６か月、または少なくとも約７か月、または少なくとも約８か月、または少なくとも約９か月、または少なくとも約１０か月、または少なくとも約１１か月、または少なくとも約１２か月以上にわたって、低下させる。ＭＭの例としては、例えば、ＷＯ２００９／０２５８４６、ＷＯ２０１０／０９６８３８、ＷＯ２０１０／０８１１７３、ＷＯ２０１３／１６３６３１、ＷＯ２０１３／１９２５４６、ＷＯ２０１３／１９２５５０、ＷＯ２０１４／０２６１３６、ＷＯ２０１４／０５２４６２、ＷＯ２０１４／１０７５９９、ＷＯ２０１４／１９７６１２、ＷＯ２０１５／０１３６７１、ＷＯ２０１５／０４８３２９、ＷＯ２０１５／０６６２７９、ＷＯ２０１５／１１６９３３、ＷＯ２０１６／０１４９７４、ＷＯ２０１６／１１８６２９、ＷＯ２０１６／１４９２０１、ＷＯ２０１６／１７９２８５、ＷＯ２０１６／１７９２５７、ＷＯ２０１６／１７９３３５、ＷＯ２０１７／０１１５８０、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０５９７４０、および米国特許仮出願第６２／４６９，４２９号、第６２／５７２，４６７号に記載のものが挙げられる；これらの参考文献はそれぞれ、その全体が参照として本明細書に組み入れられる。
本発明の実施に用いる活性化可能抗体は、１種類以上の付加的な構造要素（例えば、１種類以上のリンカー、あるいは構造上の利点を付与する他のアミノ酸残基またはペプチド（Ｎ末端スペーサーアミノ酸残基またはアミノ酸配列など）など）を含む。
本発明の組成物および処理法における活性化可能抗体に利用する好適なリンカーは、様々な長さのうちのいずれであってもよい。好適なリンカーとしては、約１～約２０アミノ酸残基、または約１～約１９アミノ酸残基、または約１～約１８アミノ酸残基、または約１～約１７アミノ酸残基、または約１～約１６アミノ酸残基、または約１～約１５アミノ酸残基、または約２～約１５アミノ酸残基、または約３～約１５アミノ酸残基、または約３～約１４アミノ酸残基、または約３～約１３アミノ酸残基、または約３～約１２アミノ酸残基の範囲の長さを有するリンカーが挙げられる。いくつかの実施態様においては、該活性化可能抗体は、１種類以上のリンカーを含み、それぞれのリンカーは独立に、１アミノ酸残基、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０アミノ酸残基を含む。
典型的には、該リンカーは、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、およびＴｈｒから成る群から選択される１アミノ酸残基以上を含む柔軟なリンカーであり、また多くの場合、該リンカーは、ＧｌｙおよびＳｅｒから成る群から選択される１アミノ酸残基以上を含む柔軟なリンカーである。柔軟なリンカーの例としては、グリシンホモポリマー（Ｇ）ｎ（ここでｎは、少なくとも１である整数または約１～約３０の範囲の整数、または約１～約２５の範囲の整数、または約１～約２０の範囲の整数、または約１～約１５の範囲の整数、または約１～約１０の範囲の整数）；グリシン－セリン共重合体（例えば、（ＧＳ）ｎ（ここでｎは、少なくとも１である整数または約１～約３０の範囲の整数、または約１～約２５の範囲の整数、または約１～約２０の範囲の整数、または約１～約１５の範囲の整数、または約１～約１０の範囲の整数）、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号：６８）（ここでｎは、少なくとも１である整数または約１～約３０の範囲の整数、または約１～約２５の範囲の整数、または約１～約２０の範囲の整数、または約１～約１５の範囲の整数、または約１～約１０の範囲の整数）；（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号：６９）（ここでｎは、少なくとも１である整数または約１～約３０の範囲の整数、または約１～約２５の範囲の整数、または約１～約２０の範囲の整数、または約１～約１５の範囲の整数、または約１～約１０の範囲の整数）など）；グリシン残基およびセリン残基を含む、あるいはそれらから成るリンカー（例えば、ＧＧＳＧ（配列番号：７０）、ＧＧＳＧＧ（配列番号：７１）、ＧＳＧＳＧ（配列番号：７２）、ＧＳＧＧＧ（配列番号：７３）、ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧ（配列番号：７４）、ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号：７５）、ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号：７６）、ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧ（配列番号：７７）、ＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＳ（配列番号：７８）、ＧＧＧＳ（配列番号：７９）、ＧＳＳＧ（配列番号：８０）、ＧＧＧＳＳＧＧＳＧＧＳＧＧ（配列番号：８１）、ＧＧＧＳＧ（配列番号：８２）、ＧＧＧＳＧＧ（配列番号：１５２）、ＧＳＧＧＧＳ（配列番号：１５３）、ＧＳＧＧＳＧ（配列番号：１５４）、ＧＧＳなど）；グリシン残基、セリン残基、およびトレオニン残基を含む、あるいはそれらから成るリンカー（例えば、ＧＳＳＧＴ（配列番号：８３）など）；グリシン－アラニン共重合体；アラニン－セリン共重合体；ならびに当該技術分野において公知の他の柔軟リンカーが挙げられる。
いくつかの実施態様においては、本発明の実施に用いる活性化可能抗体は、例えば、該ＭＭのアミノ末端に位置するスペーサーをも含む。いくつかの実施態様においては、該スペーサーは、該活性化可能抗体の各ＭＭに直接的連結される（例えば、Ｎ末端からＣ末端方向で、スペーサー－ＭＭ－ＣＭ－ＡＢの構造配置で）；ここで各「－」は、それぞれ独立に直接的結合または間接的結合（すなわち、本明細書中に後述するようなリンカーを介する）を表す。スペーサーのアミノ酸配列の例としては、以下の例示的アミノ酸配列のうちのいずれかを含む、またはそれから成るものを挙げることができる：
ＱＧＱＳＧＳ（配列番号：８４）；ＧＱＳＧＳ（配列番号：８５）；ＱＳＧＳ（配列番号：８６）；ＳＧＳ；ＧＳ；Ｓ；ＱＧＱＳＧＱＧ（配列番号：８７）；ＧＱＳＧＱＧ（配列番号：８８）；ＱＳＧＱＧ（配列番号：８９）；ＳＧＱＧ（配列番号：９０）；ＧＱＧ；ＱＧ；Ｇ；ＱＧＱＳＧＱ（配列番号：９１）；ＧＱＳＧＱ（配列番号：９２）；ＱＳＧＱ（配列番号：９３）；ＱＧＱＳＧ（配列番号：９４）；ＱＧＱＳ（配列番号：９５）；ＳＧＱ；ＧＱ；およびＱ。
上記のように、精製活性化可能抗体組成物は、様々な活性化可能抗体のいずれかのものとして調製を行ってもよい。活性化可能抗体の例としては、複数の生物学的標的のいずれかに対する結合特異性を与える一組のＶＬおよびＶＨのＣＤＲを含むものであってもよい。特定のＣＤＲの例としては、例えば、ヒトＣＤ１６６に対して結合特異性を有するＡＢを共に形成するＶＬおよびＶＨのＣＤＲが挙げられ、ここでそのＶＬは、配列番号：９６のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号：９７のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号：９８のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含み、ＶＨは、配列番号：９９のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１、配列番号：１００のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、および配列番号：１０１のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３を含む。これらの活性化可能抗体においては、該ＭＭは、配列番号：１０２～１１９から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むものであってもよい。これらのＣＤＲを含む特定の活性化可能抗ＣＤ１６６抗体は、同一である第１の軽鎖および第２の軽鎖、および同一である第１の重鎖および第２の重鎖を含み、ここで第１および第２の軽鎖のそれぞれは、同一である第１および第２のＶＬアミノ酸配列、同一の第１および第２のＭＭ、および同一の第１および第２のＣＭを含み、ここで第１および第２の軽鎖は、配列番号：１２０のアミノ酸配列を含み、およびここで第１および第２の重鎖のそれぞれは、配列番号：１２１および配列番号：１２２から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む。
別の一組のＣＤＲの例としては、ヒトＰＤ１に対して結合特異性を有するＡＢを共に形成するＶＬおよびＶＨのＣＤＲが挙げられるが、ここで該ＶＬは、配列番号：１２３または配列番号：１２９のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号：１２４のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号：１２５のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含み、および該ＶＨは、配列番号：１２６のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１、配列番号：１２７のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、および配列番号：１２８のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３を含む。これらの活性化可能抗体においては、該ＭＭは、配列番号：１３０～２８０から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むものであってもよい。これらのＣＤＲを含む特定の活性化可能抗ＰＤ１抗体は、同一である第１の軽鎖および第２の軽鎖、および同一である第１の重鎖および第２の重鎖を含み、ここで第１および第２の軽鎖のそれぞれは、同一である第１および第２のＶＬアミノ酸配列、同一の第１および第２のＭＭ、および同一の第１および第２のＣＭを含み、ここで第１および第２の軽鎖は、配列番号：２８１のアミノ酸配列を含み、およびここで第１および第２の重鎖のそれぞれは、同一の第１および第２のＶＨアミノ酸配列、ならびに同一の第１および第２の重鎖定常ドメインを含み、ここで第１および第２の重鎖のそれぞれは、配列番号：２８２から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む。
別の一組のＣＤＲの例としては、ヒトＰＤＬ１に対して結合特異性を有するＡＢを共に形成するＶＬおよびＶＨのＣＤＲが挙げられるが、ここで該ＶＬは、配列番号：２８３のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号：２８４のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２、および配列番号：２８５のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含み、および該ＶＨは、配列番号：２８６のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１、配列番号：２８７のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、および配列番号：２８８のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３を含む。これらの活性化可能抗体においては、該ＭＭは、配列番号：２８９～３１３から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むものであってもよい。これらのＣＤＲを含む特定の活性化可能抗ＰＤＬ１抗体は、同一である第１の軽鎖および第２の軽鎖、および同一である第１の重鎖および第２の重鎖を含み、ここで第１および第２の軽鎖のそれぞれは、同一の第１および第２のＶＬアミノ酸配列、同一の第１および第２のＭＭ、同一の第１および第２のＣＭ、および同一の第１および第２の軽鎖定常ドメインを含み、ここで第１および第２の軽鎖のそれぞれは、配列番号：３１４のアミノ酸配列を含み、ここで第１および第２の重鎖のそれぞれは、同一の第１および第２のＶＨアミノ酸配列ならびに同一の第１および第２の重鎖定常ドメインを含み、ここで第１および第２の重鎖のそれぞれは、配列番号：３１５のアミノ酸配列を含む。
別の局面においては、本開示は、組成物生産処理中に活性化可能抗体集団およびその切断異型体集団を含む試料組成物をゲルキャピラリー電気泳動法に供することにより、活性化可能抗体およびその切断異型体の相対量を判定またはモニターする方法を含む。ゲルキャピラリー電気泳動法は、還元ＳＤＳ－ｃＧＥまたは非還元ＳＤＳ－ｃＧＥであってもよい。一局面においては、該方法は、還元ＳＤＳ－ｃＧＥ法用いて、無損傷のプロドメインをコードするポリペプチドの集団を、その切断異型体の集団から分離すること、および無損傷のプロドメインをコードするポリペプチドに対応するピーク面積およびその切断プロドメインをコードするポリペプチドに対応するピーク面積を測定することによって活性化可能抗体集団およびその切断異型体集団の相対量を定量することを含む。別の局面においては、該方法は、非還元ＳＤＳ－ｃＧＥ法を用いて活性化可能抗体の集団をその切断異型体の集団から分離すること、および無損傷活性化可能抗体に対応するピーク面積およびその切断異型体に対応するピーク面積を測定することによって活性化可能抗体集団およびその切断異型体集団の相対量を定量することを含む。
いくつかの局面においては、本明細書中に記載のゲルキャピラリー電気泳動法は、サイズ排除クロマトグラフィー（例えば、ＳＥ－ＨＰＬＣ）、陰イオン交換クロマトグラフィー、または陽イオン交換クロマトグラフィーなどの他のクロマトグラフィー法では観察されない切断異型体の存在を識別することができる。
したがって、いくつかの局面においては、本明細書中に記載の定量的ゲルキャピラリー電気泳動法は、活性化可能抗体の産物および処理についての質の評価（例えば、医薬品生産処理における品質管理のモニタリング）に利用してもよい。いくつかの局面においては、該方法は、活性化可能抗体を含む精製組成物が、医薬品組成物調製への利用に好適であるか否かを判定するために用いてもよい。いくつかの局面においては、本開示は、活性化可能抗体を含む医薬品組成物を調製する方法を含むが、該方法は、以下の工程を含む：
（ａ）無損傷活性化可能抗体およびその切断異型体を含む精製組成物を提供する工程；
（ｂ）試料を還元または非還元ＳＤＳ－ｃＧＥに供することによって、無損傷活性化可能抗体分子種をその切断異型体から分離する工程；
（ｃ）無損傷活性化可能抗体または無損傷プロドメインを含むポリペプチドに対応するピーク面積およびその切断抗体または切断プロドメインを含むポリペプチドに対応するピーク面積を測定することにより、活性化可能抗体の集団およびその切断異型体の集団の相対量を定量する工程；
および
（ｄ）試料中の切断異型体の相対量が閾値未満である場合に、医薬品組成物の調製に用いる精製組成物を選択する工程。いくつかの局面において、該閾値は切断異型体が３％である。いくつかの局面においては、該閾値は、２．５％、２％、１．９％、１．８％、１．７％、１．６％、１．５％、１．４％、１．３％、１．２％、１．１％、１．０％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、または０．２％である。
いくつかの局面においては、本開示は、組成物の生産処理中に活性化可能抗体およびその切断異型体の相対％を判定またはモニターする方法を提供するが、ここで該方法は以下の工程を含む：
（ａ）活性化可能抗体の集団およびその切断異型体の集団を含む試料組成物をゲルキャピラリー電気泳動に供する工程；
（ｂ）ゲルキャピラリー電気泳動において活性化可能抗体の集団をその切断異型体の集団から分離する工程；
および
（ｃ）無損傷プロドメインを含むポリペプチドに対応するピーク面積およびその切断プロドメインを含むポリペプチドに対応するピーク面積を測定することによって、活性化可能抗体の集団およびその切断異型体の集団の相対量を定量する工程。
いくつかの局面においては、該試料組成物は、活性化可能抗体を発現する細胞の細胞回収組成物である。いくつかの局面においては、該試料組成物は、蛋白質親和性クロマトグラフィーに供されている。いくつかの局面においては、該試料組成物は、イオン交換クロマトグラフィーに供されている。いくつかの局面においては、該試料組成物は、陰イオン交換クロマトグラフィーに供されている。いくつかの局面においては、該試料組成物は、陽イオン交換クロマトグラフィーに供されている。いくつかの局面においては、該試料組成物は、疎水性相互作用クロマトグラフィーに供されている。いくつかの局面においては、該試料組成物は、マルチモーダルクロマトグラフィーに供されている。いくつかの局面においては、細胞回収、蛋白質親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、およびマルチモーダルクロマトグラフィーのうちの２種類以上のそれぞれの後に活性化可能抗体の集団およびその切断異型体の集団の相対％を定量することによって、該相対％をモニターする。いくつかの局面においては、工程（ａ）は、試料組成物中の活性化可能抗体およびその切断異型体を還元剤に接触させることを含む。いくつかの局面においては、該還元剤は、ジチオエリトリトール（ＤＴＥ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、βメルカプトエタノール、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの局面においては、工程（ａ）は、試料組成物中の活性化可能抗体およびその切断異型体を、変性剤に接触させることを含む。いくつかの局面においては、該変性剤は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）である。いくつかの局面においては、該方法は、ＳＤＳ蛋白質分子量標準を用いたゲルキャピラリー電気泳動法を実施し、分子量標準較正曲線を作成することをさらに含む。いくつかの局面においては、工程（ｃ）は、ゲルキャピラリー電気泳動法に供した活性化可能抗体およびその切断異型体のそれぞれに対応するピークを含む電気泳動図を取得することを含む。いくつかの局面においては、該方法は、切断したプロドメインをコードするポリペプチドのピーク面積および無損傷のプロドメインをコードするポリペプチドのピーク面積を取得するために、活性化可能抗体およびその切断異型体のそれぞれに対応する各ピークについてピーク積分を実施することをさらに含む。
下記の実施例は本発明の実施についてさらに実例を示すものであるが、本発明の範囲を多少なりとも限定するものとみなすべきではない。
実施例
実施例１：分析法
Ａ：総蛋白質濃度
水性原材料および精製産物の総蛋白質濃度は、ＵＶ分光法によって決定した。分離工程後、直ぐに各溶出液の試料を取り、本明細書中に記載のアッセイ（例えば、総蛋白質、ＳＤＳ－ｃＧＥ、ＳＥ－ＨＰＬＣ、およびＨＣＰ ＥＬＩＳＡアッセイ）に使用するまで凍結した。試料を超純水で段階的希釈して、ＵＶ分光光度計（分光光度計Ｃａｒｙ６０ＵＶ－Ｖｉｓ、Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ，Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．）を用いて波長２８０ｎｍの蛋白質吸光度を測定した。蛋白質濃度は、ランバート・ベールの法則にしたがい、アミノ酸配列に基づいて算出したモル吸光係数を用いて波長２８０ｎｍで決定した。例えば、Ｐａｃｅら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９５）４：２４１１を参照のこと。
総蛋白質収率を次式にしたがい算出した：
Figure 2023521384000015
Ｂ：還元ドデシル硫酸ナトリウムゲルキャピラリー電気泳動（ＳＤＳ－ｃＧＥ）を用いた、活性化可能抗体の定量
活性化可能抗体組成物の純度（％無損傷活性化可能抗体）は、ドデシル硫酸ナトリウムキャピラリーゲル電気泳動法（ＳＤＳ－ｃＧＥ）およびＵＶフォトダイオードアレイ（ＰＤＡ）検出法（ＰＡ８００ Ｐｌｕｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｂｒｅａ、ＣＡ）を用いて決定した。活性化可能抗体を含む試料は、０．５Ｍの１，４－ジチオエリトリトール（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号：Ｄ８２５５－５Ｇ）を用いて還元し、次いで、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の存在下で加熱変性させた。変性後に、電気泳動分離の篩分け選択性を提供するＳＤＳポリマー・マトリックスを含むキャピラリーで、試料をサイズに基づいて分離した。
ＳＣＩＥＸのＩｇＧ純度および不均一性に関するアッセイキットのＳＤＳ蛋白質サイズ標準、緩衝液、およびキット構成物を含む試薬を用いて製造元の指示にしたがい、製造元の指示マニュアルに記載される方法で、ＩｇＧ純度および不均一性に関するアッセイを実施した。
製造元の指示にしたがい、分子量標準較正曲線を作成した。ポリペプチドのピークを識別する目的で、ピーク積分を実施して電気泳動図を調べた。切断したプロドメインをコードするポリペプチドに対応するピークは、無損傷のプロドメインをコードするポリペプチドの予想ピークより前に出現する。
％無損傷活性化可能抗体（すなわち、％無損傷活性化可能抗体または「純度」）および％切断不純物は、次式にしたがい決定する：
Figure 2023521384000016
Ｃ：サイズ除外高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ－ＨＰＬＣ）によるＨＭＷＳの定量
本明細書に記載の組成物中のＨＭＷＳを定量する目的で、サイズ除外高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ－ＨＰＬＣ）を用いた。
超純水中に２００ｍＭ Ｋ２ＰＯ４および１５０ｍＭ ＫＣｌを含む移動相を調製した（ｐＨ６．８±０．１）。オートサンプラー（Ｄｉｏｎｅｘ Ｕ３０００ ＨＰＬＣ、Ｕｌｔｉｍａｔｅ（商標）ＷＰＳ－３０００ＴＢＲＳ温度自動調節生体適合性オートサンプラー、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（カラム：分析カラム（ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷｘｌ、カタログ番号：０８５４１、Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＬＬＣ））、ガードカラム（ＴＳＫｇｅｌ Ｇｕａｒｄ ＳＷｘｌ、６ｍｍｘ４０ｍｍ、カタログ番号：０８５４３、Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＬＬＣ）、およびフリット前カラム（０．５μｍ前カラムフリット、Ｕｐｃｈｕｒｃｈ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号：Ａ－３１８）を備えるＨＰＬＣシステムで、分析を実施した。試料分析前に、０．５ｍＬ／分の流速で、移動相によりカラムを平衡化した。分析試料は、必要に応じて、脱イオン化高グレード水で１ｍｇ／ｍＬの標的濃度に希釈した。参照物質は、対応する単量体活性化可能抗体（すなわち、非凝集の活性化抗体）とした。参照物質は、必要に応じて、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１ｍｇ／ｍＬの標的濃度に希釈した。
試料分析は以下の条件で実施した：ＵＶ検出、波長２２０ｎｍ（４ｎｍバンド幅）および２８０ｎｍ（４ｎｍバンド幅）；周囲カラムオーブン温度；オートサンプラー内で５±３℃の試料温度；流速、０．５ｍＬ／分；および実施時間、３０分／試料。参照物質の注入前、試料の各シリーズの開始時に、製剤緩衝液対照の注入を行った。２０μｇの参照物質を注入した後、４０μｇの被検試料を注入した。被検試料各シリーズの注入の各シリーズ後に、２０μｇの参照物質を注入した。
被検試料のクロマトグラムの積分は、Ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎ ７ ＣＤＳのＳｍａｒｔ Ｃｏｂｒａ Ｗｉｚａｒｄ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて行った。低分子量分子種（ＬＭＷＳ）は、主ピーク（参照物質）の右側に検出される。高分子量分子種（ＨＭＷＳ）に対応するピークは、主ピークの左側に検出される。相対ピーク面積％は、クロマトグラムの全ピークについてのピーク面積合計（全ピーク面積）に基づいて算出した。観察される各ＨＭＷＳピークのピーク面積を合計し、その合計を全ピーク面積で割って１００倍し、ＨＭＷＳに対応する％ピーク面積（すなわち、％ＨＭＷＳ）を算出した。
Ｄ：宿主細胞蛋白質（ＨＣＰ）
ＨＣＰの定量（ｐｐｍ単位（ｎｇ／ｍｌ産物））は、市販のＨＣＰ ＥＬＩＳＡキット（ＣＨＯ ＨＣＰ ＥＬＩＳＡキット、（Ｆ５５０）、Ｃｙｇｎｕｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．）を用い製造元の指示にしたがって実施した。
実施例２（比較実施例）：陽イオン交換クロマトグラフィー
無損傷の活性化可能抗ＣＤ１６６抗体および対応する切断不純物を含む水性原材料を精製する方法として、陽イオン交換クロマトグラフィーを評価した。水性原材料の％切断不純物は、７．５％超であった。水性原材料は、９８％超の単量体を含むものであった。活性化可能抗ＣＤ１６６抗体は、２本の軽鎖および２本の重鎖を有している。各軽鎖は、ＭＭ、ＣＭ、ＶＬ、および定常領域をコードし、配列番号：１２０のアミノ酸配列を有している。各重鎖は、ＶＨおよび定常領域をコードし、配列番号：１２１のアミノ酸配列を有している。重鎖および軽鎖の各対のＶＬおよびＶＨは共に、隠蔽されていない場合にはヒトＣＤ１６６を結合可能なＦａｂを形成する。水性原材料の負荷総蛋白質量は、実施例１Ａに記載するように、波長２８０ｎｍの吸光度によって決定した場合に、１０ｍｇ／ｍｌであった。水性原材料は、平衡化緩衝液で１：１０希釈することにより、ｐＨ５．０に調整し、陽イオン交換樹脂（Ｃａｐｔｏ Ｓ ＩｍｐＡｃｔ、ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）に載せた（負荷した）。カラムは、第１の緩衝液（２５ｍＭ ＮａＯＡｃ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５．０（８０カラム容積勾配））を第２の緩衝液（２５ｍＭ ＮａＯＡｃ、２５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５．０）に混合することによるＮａＣｌ勾配（ｐＨ５）で溶出した。１ｍＬの画分を分取した。１ｍｌ画分を採取し還元ＳＤＳ－ｃＧＥで分析したクロマトグラムにおいて、単一ピークが観察された。図５は、得られたクロマトグラムを表している（線「Ａ」は、２８０ｎｍの吸光度を表す）。この結果は、無損傷活性化可能抗体および切断不純物の両方が存在するが、（ピーク）分離には至らなかったことを示している。このように、無損傷活性化可能抗体の切断異型体からの有効分離は、陽イオン交換クロマトグラフィーでは得られなかった。
実施例３：活性化可能抗体の精製組成物の調製
実施例２に記載の活性化可能抗ＣＤ１６６抗体と同一の抗体を含む水性原材料を、本発明の疎水性クロマトグラフィー処理法を用いて処理した。
無損傷活性化可能抗体および切断不純物を含むバイオリアクター回収上清を、プロテインＡ親和性クロマトグラフィー工程に供し、次いでウイルス不活性化工程、および陰イオン交換クロマトグラフィー（陰イオンＩＥＸ）工程に供した。これらの処理では、無損傷活性化可能抗体の切断異型体からの有効分離は得られなかった。図４Ａは、プロテインＡ親和性クロマトグラフィー工程における溶出液試料のＳＤＳ－ｃＧＥ分析の結果を示している。切断異型体を含む大きなピークが観察される（ピーク１、「切断ＬＣ」）。図４Ｂは、陰イオンＩＥＸ工程における溶出液試料のＳＤＳ－ｃＧＥ分析の結果を示している。切断異型体を含む大きなピークが観察され（ピーク１、「切断ＬＣ」）、その前に実施したプロテインＡクロマトグラフィー工程の溶出液と比較して、切断異型体のピーク面積は減少してはいない。疎水性相互作用クロマトグラフィー固定相を充填したクロマトグラフィーカラム（すなわち、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）カラム）を利用した疎水性クロマトグラフィー処理をさらに実施するために、陰イオンＩＥＸ工程の産物の採取を行った。
樹脂（すなわち、固定相）としてＣａｐｔｏ（商標）フェニルＩｍｐＲｅｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて結合－溶出モードでＨＩＣカラムを実施した。この樹脂は、フェニル基を含むリガンドを有するアガロース樹脂である。陰イオンＩＥＸ工程で採取した産物を、２０ｍＭの２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）および１．５Ｍ硫酸アンモニウム（ＮＨ４）２ＳＯ４を含む緩衝液（ｐＨ６）で調整することにより、水性原材料を作成した。この水性原材料を分注して、「分注試料１」および「分注試料２」とし、疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムによる処理を２サイクル行い、それぞれ「サイクル１」および「サイクル２」とした。カラムおよび緩衝液を含むクロマトグラフィー機器を、２２℃±１℃に維持した温度キャビネットに設置した。
２サイクルにおいて、２つの分注物をカラムに載せた。添加密度は、サイクル１では最大で２０ｍｇ／ｍＬ（樹脂）、サイクル２では、最大で１６ｍｇ／ｍＬ（樹脂）に設定した。カラムは、２０ｍＭのＭＥＳおよび０．２６Ｍ硫酸アンモニウムを含む緩衝液（ｐＨ６．０）で溶出した。ピーク分離基準（光路長２ｍｍのＵＶセル）は、５０ｍＡＵ上昇調および６００ｍＡＵ下降調に設定した。溶出液を採取し、カラムを１ＭのＮａＯＨ溶液で洗浄した。総蛋白質濃度は、実施例１に記載するようにＵＶ吸光度によって決定した；また、総蛋白質収率は水性原材料および溶出液における容積および蛋白質濃度に基づいて算出した。疎水性クロマトグラフィー処理工程の総蛋白質収率を下の表１に示す。
Figure 2023521384000017
無損傷活性化可能抗体および切断不純物の相対量は、実施例１に記載するように、還元ＳＤＳ－ｃＧＥアッセイによって決定した。％無損傷活性化可能抗体および％切断不純物は、プロドメインをコードするポリペプチドである軽鎖に基づいて算出した。
疎水性クロマトグラフィー処理工程の処理能に関する測定量のまとめを下の表２に示す。
Figure 2023521384000018
陰イオンＩＥＸ工程（疎水性クロマトグラフィー工程の直ぐ上流）では、中間体組成物の切断不純物量の低下に測定可能な効果は与えなかった。図４Ａおよび４Ｂを参照のこと。対照的に、疎水性クロマトグラフィー処理工程（ＨＩＣカラムを用いた）は、切断不純物除去に大きな効果をもたらした。図４Ｃを参照のこと；この図は、疎水性クロマトグラフィー工程の溶出液試料のＳＤＳ－ｃＧＥ分析の結果を示している。図４Ｃには切断異型体に対応するピークが全く観察されない。水性原材料の切断分子種の量と比較した、溶出液の切断分子種の量は、疎水性クロマトグラフィー処理が、処理流における切断不純物量を約８倍から９．６倍減少させるのに有効であることを示した。両方のサイクルにおいて、各溶出液中の切断不純物の残存レベルは、水性原材料中の存在量よりも実質的に低かった。両方のサイクルの溶出液において、還元ＳＤＳ－ｃＧＥによって測定した場合の、溶出液中の残留切断不純物レベルは切断不純物１％未満で、純度レベル（％無損傷活性化可能抗体）は高かった。
水性原材料および溶出液組成物中の宿主細胞蛋白質レベルについては、実施例１に記載のＨＣＰ ＥＬＩＳＡ分析法を用いて特徴付けを行った。その結果を下の表３に示す。ＨＣＰの量をｐｐｍ単位で表す（すなわち、ｎｇ／ｍＬ単位のＨＣＰ（対応するＨＣＰ ＥＬＩＳＡによる測定値）を、ｍｇ／ｍＬ単位の産物濃度（実施例１Ａに記載の波長２８０における吸光度測定値）で割り算したもの）。
Figure 2023521384000019
ＨＩＣ固定相を用いた疎水性クロマトグラフィー処理工程は、処理流のＨＣＰレベルを約７倍以上低下させる効果があった。溶出液中のＨＣＰの残存レベルは、原材料レベルの約１５％未満であった。
原材料および溶出液のＨＭＷＳのレベルについても、実施例１に記載のＳＥ－ＨＰＬＣアッセイを用いて評価した。その結果を下の表４に示す。
Figure 2023521384000020
この結果は、この処理が処理流から８５％以上のＨＭＷＳを除去することに有効であったことを示している。得られた溶出液組成物は、水性原材料中に存在するＨＭＷＳと比較して約１５％未満（サイクル１）および約１０％未満（サイクル２）しか含んでいなかった。
溶出液（精製）組成物中の無損傷活性化可能抗体、切断不純物、ＨＣＰ、およびＨＭＷＳの相対量に関するまとめを、下の表５に示す。
Figure 2023521384000021
切断不純物と無損傷活性化可能抗体との間のピーク分離が達成されて、非常に類似した分子量およびアミノ酸配列を有するこれらの分子種が良好に分離された。この結果は、切断不純物、ＨＣＰ、およびＨＭＷＳの残留レベルが低く、無損傷活性化可能抗体が高純度の組成物を調製する上で、疎水性クロマトグラフィー処理工程が非常に有効であることを示している。
実施例４：活性化可能抗ＰＤ１抗体の精製組成物の調製
２回のバイオリアクター実施（５０Ｌスケール（「実施１」）および１，０００Ｌスケール（「実施２」））により調製された、活性化可能抗ＰＤ１抗体を含む培養産物は、切断不純物などの様々な不純物を除去する目的で精製を行った。活性化可能抗ＰＤ１抗体は２本の軽鎖を有し、それぞれが、ＭＭ、ＣＭ、ＶＬ、および定常領域をコードし、またそれぞれが配列番号：２８１のアミノ酸配列を有している；また、活性化可能抗ＰＤ１抗体は２本の重鎖を有し、それぞれがＶＨおよび定常領域をコードし、またそれぞれが配列番号：２８２のアミノ酸配列を有している。ＶＬおよびＶＨは両者が一緒になって、非隠蔽時には、標的ヒトＰＤ１に結合可能なＦａｂを形成する。
各バイオリアクター実施の下流精製工程は類似したものであった。活性化可能抗ＰＤ１抗体産物を含むバイオリアクター回収上清を、プロテインＡを基盤とする親和性クロマトグラフィー工程に供し、次いでウイルス不活性化工程、および陰イオン交換クロマトグラフィー（陰イオンＩＥＸ）工程に供した。これらの処理では、無損傷活性化可能抗体は、切断異型体から有効に分離されなかった。ＨＩＣカラムでさらに処理を行うために、産物を採取した。２０ｍＭのＭＥＳおよび１．８Ｍ硫酸アンモニウム（ｐＨ６．０）を用いて、陰イオンＩＥＸ工程の産物の伝導度を、実施１では１２７．０±１３ｍＳ／ｃｍに、実施２では１２６ｍＳ／ｃｍ±１３に調整した。産物を、ＨＩＣカラムの充填容量に合致する量に分注した。次いで、結合／溶出（Ｂ／Ｅ）モード、２２±１℃の温度で稼動するＨＩＣカラム（Ｃａｐｔｏ（商標）フェニルＩｍｐＲｅｓ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に、各分注物（水性原材料）を載せた。２０ｍＭのＭＥＳおよび０．４Ｍの硫酸アンモニウムの水溶液（ｐＨ６．０）でカラム溶出を行った。溶出液を採取してから、カラムを０．０１ＭのＮａＯＨ溶液で洗浄した。
総蛋白質濃度は、実施例１に記載のようにＵＶ吸光度によって決定した；また、総蛋白質収率を、水性原材料および溶出液の容積および蛋白質濃度に基づいて算出した。ＨＩＣカラムに添加した各分注物の総蛋白質収率を下の表６に示す。
Figure 2023521384000022
この結果は、両実施とも、総蛋白質収率が比較的高いことを示している。
無損傷活性化可能抗体および切断不純物の相対量は、実施例１に記載のような還元ＳＤＳ－ｃＧＥアッセイによって決定した。％無損傷活性化可能抗体および％切断不純物の算出は、プロドメインをコードするポリペプチドである軽鎖に基づいて行った。
実施１および実施２の疎水性クロマトグラフィー処理工程に関する処理能測定量のまとめをそれぞれ、下の表７Ａおよび表７Ｂに示す。
Figure 2023521384000023
Figure 2023521384000024
実施例３に記載の処理スキームのように、疎水性クロマトグラフィー工程の上流の陰イオンＩＥＸ工程では、中間体組成物の切断不純物量の低下に関して、検出可能な効果は全く得られなかった。対照的に、疎水性クロマトグラフィー処理工程は、処理流において、切断不純物の量を低下させることに非常に有効であった。実施例１に記載のＨＣＰ ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、ＨＣＰの存在に関する中間体組成物の分析も行った。その結果を表８Ａ（実施１）および表８Ｂ（実施２）に示す。
Figure 2023521384000025
Figure 2023521384000026
この結果は、疎水性クロマトグラフィー処理工程が、処理流において少なくとも４倍、ＨＣＰの量を減少させることに有効であることを示している。
水性原材料および溶出液の試料におけるＨＭＷＳのレベルについても、実施例１に記載のＳＥ－ＨＰＬＣアッセイを用いて評価を行った。ＨＭＷＳ定量の結果を、表９Ａ（実施１）および表９Ｂ（実施２）に示す。
Figure 2023521384000027
Figure 2023521384000028
この結果は、疎水性クロマトグラフィー処理が、処理流におけるＨＭＷＳのレベルを低下させることに非常に有効であることを示している。
本発明の疎水性クロマトグラフィー処理によって調製した精製組成物における無損傷活性化可能抗体、切断不純物、ＨＣＰ、およびＨＭＷＳの相対量についてのまとめを、下の表１０Ａ（実施１）および表１０Ｂ（実施２）に示す。
Figure 2023521384000029
Figure 2023521384000030
本発明の疎水性クロマトグラフィー処理を、本例ではＨＩＣカラムを用いて行っているが、この処理によって、切断分子種、ＨＣＰ、およびＨＭＷＳを処理流から良好に除去し、それによって無損傷活性化可能抗体の高純度組成物が生成することを、この結果は示している。
実施例５
活性化可能抗ＰＤＬ１抗体の精製組成物の調製
活性化可能抗ＰＤＬ１抗体を含む培養産物は、様々な不純物を除去するため、本発明の疎水性クロマトグラフィー処理を用いて処理した。活性化可能抗ＰＤＬ１抗体は、２本の軽鎖を有し、それぞれがＭＭ、ＣＭ、ＶＬ、および定常領域をコードし、またそれぞれが配列番号：３１４のアミノ酸配列を有する；または活性化可能抗ＰＤＬ１抗体は、２本の重鎖を有し、それぞれがＶＨおよび定常領域をコードし、およびそれぞれが配列番号：３１５のアミノ酸配列を有している。ＶＬおよびＶＨの両者が一緒になって、非隠蔽時に、標的ヒトＰＤＬ１に結合可能なＦａｂを形成する。
無損傷活性化可能抗体および切断不純物を含むバイオリアクター回収上清を、プロテインＡ親和性クロマトグラフィー工程に供し、次いでウイルス不活性化工程、および陰イオンＩＥＸ工程に供した。これらの処理では、切断異型体から無損傷活性化可能抗体が有効に分離されることはなかった。マルチモーダルクロマトグラフィーの固定相を充填したクロマトグラフィーカラム（すなわち、マルチモーダルクロマトグラフィー（ＭＭＣ）カラム）を利用した疎水性クロマトグラフィー処理をさらに実施するために、陰イオンＩＥＸ工程の産物を採取した。
樹脂（すなわち、Ｎ－ベンゾイル－ホモシステインリガンドの固定相）としてＣａｐｔｏ（商標）ＭＭＣ ＩｍｐＲｅｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて結合－溶出モード、温度２２±４℃でＭＭＣカラムを実施した。
中間体産物組成物（ｐＨ５．９）を２５ｍＭのＭＥＳ、３０ｍＭのＮａＣｌで調整した後、２つの分注物（水性原材料）を取り分け、２サイクルの処理を行った。添加密度は、各実施で３０ｍｇ／ｍｌ樹脂であった。カラムを洗浄した後、２５ｍＭのＭＥＳ、３０ｍＭのＮａＣｌ、９０ｍＭアルギニンＨＣｌ（ｐＨ５．９）で溶出を行った。溶出液を採取し、カラムを１ＭのＮａＯＨ溶液で洗浄した。
総蛋白質濃度は、実施例１に記載のようにＵＶ吸光度によって決定した；また、総蛋白質収率を、水性原材料および溶出液の容積および蛋白質濃度に基づいて算出した。疎水性クロマトグラフィー処理工程の総蛋白質収率を下の表１１に示す。
Figure 2023521384000031
この処理によって比較的高い総蛋白質収率が得られることを、この結果は示している。
無損傷活性化可能抗体および切断不純物の相対量は、実施例１に記載のような還元ＳＤＳ－ｃＧＥアッセイによって決定した。その結果のまとめを表１２に示す。
Figure 2023521384000032
疎水性クロマトグラフィー処理を、本例ではＭＭＣカラムを用いて行っているが、この処理が、処理流から８５％超の切断不純物を効果的に除去し、この不純物を８倍超減少させたことを、この結果は示している。無損傷活性化可能抗体は、両方の溶出液試料で９８％超の高レベル（純度）であった。これとは対照的に、陰イオンＩＥＸ工程は、処理流の切断不純物レベルを低下させることに有効ではなかった。
ＭＭＣ原材料および溶出液組成物中のＨＣＰの存在に関しても分析を行った。その結果を表１３に示す。
Figure 2023521384000033
ＭＭＣクロマトグラフィーカラムを用いる疎水性クロマトグラフィー工程が、ＭＭＣ原材料組成物中のＨＣＰの量を、分注１については６倍超（８４％超）および分注２については１１倍超（９０％超）減少させ、有効であることを、この結果は示している。溶出液中のＨＣＰ残存量は、分注１および分注２では、それぞれ、原材料レベルに比較して１６％未満および約９％であった。
原材料および溶出液の試料中のＨＭＷＳの量についても、実施例１に記載のＳＥ－ＨＰＬＣアッセイを用いて評価を行った。ＨＭＷＳ定量の結果を下の表１４に示す
Figure 2023521384000034
疎水性クロマトグラフィー処理工程を、本例ではＭＭＣカラムを用いて行っているが、この処理が、処理流からＨＭＷＳの実質的画分を非常に有効に除去することを、この結果は示している。
本発明の疎水性クロマトグラフィー処理によって生成する精製組成物中の無損傷活性化可能抗体、切断不純物、ＨＣＰ、およびＨＭＷＳの相対量のまとめを、下の表１５に示す。
Figure 2023521384000035
疎水性クロマトグラフィー処理工程は、切断不純物、ＨＣＰ、およびＨＭＷＳが存在するのであれば、それらの残留レベルが低い組成物であって、相対的に無損傷活性化可能抗体が純粋である組成物を調製するのに非常に有効であることを、この結果は示している。
実施例６：高レベルの切断不純物を含む水性原材料からの活性化可能抗ＰＤＬ１抗体精製組成物の調製
Ａ：水性原材料：３．１％切断不純物
実施例５に記載の抗ＰＤＬ１抗体を含む水性原材料を、ＭＭＣカラムに載せた。水性原材料の組成物は、３．１％の切断不純物および９８％超の単量体形態の活性化可能抗体（すなわち、２％未満のＨＭＷＳ）を含むものであった。
樹脂（すなわち、Ｎ－ベンゾイル－ホモシステインリガンドの固定相）としてＣａｐｔｏ（商標）ＭＭＣ ＩｍｐＲｅｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、結合－溶出モード、温度２２±４℃で用いて、ＭＭＣカラムを実施した。２５ｍＭのＭＥＳ、３０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ６）で水性原材料を調整した。カラムを２５ｍＭのＭＥＳ、３０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭアルギニンＨＣｌ（ｐＨ６）で洗浄した後、２５ｍＭのＭＥＳ、３０ｍＭのＮａＣｌ、９０ｍＭのアルギニンＨＣｌ（ｐＨ６）で溶出を行った。溶出液を採取して、カラムを１ＭのＮａＯＨ溶液で洗浄した。
総蛋白質濃度は、実施例１に記載のようにＵＶ吸光度によって決定した；また、総蛋白質収率を、水性原材料および溶出液の容積および蛋白質濃度に基づいて算出した。得られた溶出液中の切断不純物のレベルは７．５倍超低下しており、水性原材料中の切断不純物と比較して約１３％未満が溶出液中に残存していた。単量体活性化可能抗体の残存量は９８％超であった。総蛋白質収率は６５％超であった。
Ｂ：水性原材料：１３．５％切断不純物
実施例５に記載の抗ＰＤＬ１抗体を含む水性原材料を、ＭＭＣカラム（Ｃａｐｔｏ（商標）ＩｍｐＲｅｓ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を充填）に載せて、パートＡに記載のように処理した。水性原材料の組成物は、１３．５％の切断不純物および９６．８％の単量体形態の活性化可能抗体（すなわち、３％超のＨＭＷＳ）を含んでいた。得られた溶出液中の切断不純物のレベルは、７倍超、低下していた（水性原材料中の切断不純物の１４％未満）；また、単量体活性化可能抗体の量は９８％超（すなわち、２％未満のＨＭＷＳ）であった。総蛋白質収率は６５％超であった。
これらの実験の結果は、相対的に切断不純物量の多い水性原材料を精製する目的で、疎水性クロマトグラフィー処理を用い得ることを示唆している。疎水性クロマトグラフィー処理によって、切断不純物が実質的に除去された組成物が得られる。
配列表を下の表１６に示す。
Figure 2023521384000036
Figure 2023521384000037


Figure 2023521384000038


Figure 2023521384000039


Figure 2023521384000040


Figure 2023521384000041


Figure 2023521384000042


Figure 2023521384000043


Figure 2023521384000044


Figure 2023521384000045
本発明の局面
以下は本明細書中に記載の発明の非限定的局面である：
局面１：無損傷活性化可能抗体精製組成物を生産する処理法であって、ここで該処理法が：
（ａ）水、無損傷活性化可能抗体、切断不純物、および第１の塩を含む水性原材料をクロマトグラフィーカラムに載せる工程であって、
ここで該クロマトグラフィーカラムが、支持マトリックスおよびそこに結合したリガンドを含む固定相を含み、
ここで該リガンドが、疎水性置換基を含み、
かつ
ここで該無損傷活性化可能抗体が、
（ｉ）第１の生物学的標的に対して特異的な結合親和性を有する少なくとも第１の抗原結合ドメイン（ＡＢ）、
および
（ｉｉ）第１のプロドメイン、
を含み、
ここで該少なくとも第１のＡＢが、第１の抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および第１の抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含み、
ここで該第１のプロドメインが、第１の隠蔽部分（ＭＭ）および第１の開裂可能部分（ＣＭ）を含み、
かつ
ここで該第１のＡＢが、該第１のプロドメインに共役（結合）している、
水性原材料をクロマトグラフィーカラムに載せる工程；
および
（ｂ）無損傷活性化可能抗体を含む精製組成物を含む溶出液を生成するために、水および第２の塩を含む溶離液でクロマトグラフィーカラムを溶出する工程であって、
ここで該溶出液から切断不純物が実質的に除去される、
クロマトグラフィーカラムを溶出する工程、
を含む処理法。
局面２：局面１の処理法であって、ここで該溶出工程（ｂ）を、一定組成の条件下で実施する、処理法。
局面３：局面１～２のいずれかの処理法であって、ここで工程（ｂ）の後に、該処理法が、クロマトグラフィーカラムを洗浄剤で洗浄することを含むカラム洗浄工程をさらに含み、ここで該処理法が、該洗浄工程の前に、結合した切断不純物を溶出する工程を含まない、処理法。
局面４：局面１～３のいずれかの処理法であって、ここで該第１の塩および第２の塩がそれぞれ独立に：
ＰＯ４ ３－、ＳＯ４ ２－、ＯＨ－、ＨＰＯ４ ２－、ＣＨ３ＣＯＯ－、クエン酸イオン、アミノ酸陰イオン、Ｆ－、Ｃｌ－、Ｂｒ－、Ｈ２ＰＯ４ －、Ｉ－、ＮＯ３ －、ＣｌＯ４ －、およびＳＣＮ－から成る群から選択される陰イオンを含む、処理法。
局面５：局面１～４のいずれかの処理法であって、ここで該第１および第２の塩がそれぞれ独立に：
Ｎ（ＣＨ３）４ ＋、ＮＨ４ ＋、Ｃｓ＋、Ｒｂ＋、Ｋ＋、Ｎａ＋、Ｈ＋、Ｃａ＋、Ｍｇ２＋、Ａｌ３＋、およびアミノ酸陽イオンから成る群から選択される陽イオンを含む、処理法。
局面６：局面１～５のいずれかの処理法であって、ここで該リガンドが、直鎖アルキル置換基、分岐アルキル置換基、およびアリール置換基から成る群から選択される１つ以上の疎水性置換基を含む、処理法。
局面７：局面１～６のいずれかの処理法であって、ここで該リガンドがＣ４～Ｃ１０アルキル置換基を含む、処理法。
局面８：局面１～７のいずれかの処理法であって、ここで該リガンドが分岐アルキル置換基を含む、処理法。
局面９：局面１～８のいずれかの処理法であって、ここで該リガンドがアリール置換基を含む、処理法。
局面１０：局面９の処理法であって、ここで該アリール置換基がフェニルである、処理法。
局面１１：局面１～１０のいずれかの処理法であって、ここで該固定相が疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）固定相である、処理法。
局面１２：局面１１の処理法であって、ここで該第１の塩および第２の塩がそれぞれ独立に、ＰＯ４ ３－、ＳＯ４ ２－、ＯＨ－、ＨＰＯ４ ２－、Ｆ－、ＣＨ３ＣＯＯ－、クエン酸イオン、アミノ酸陰イオン、およびＣｌ－から成る群から選択される陰イオンを含む、処理法。
局面１３：局面１１～１２のいずれかの処理法であって、ここで該第１の塩および第２の塩がそれぞれ独立に、ＰＯ４ ３－、ＳＯ４ ２－、およびＨＰＯ４ ２－から成る群から選択される陰イオンを含む、処理法。
局面１４：局面１１～１３のいずれかの処理法であって、ここで該第１および第２の塩がそれぞれ独立に、Ｎ（ＣＨ３）４ ＋、ＮＨ４ ＋、Ｃｓ＋、Ｒｂ＋、Ｋ＋、Ｎａ＋、Ｈ＋、Ｃａ＋、Ｍｇ２＋、Ａｌ３＋、およびアミノ酸陽イオンから成る群から選択される陽イオンを含む、処理法。
局面１５：局面１１～１４のいずれかの処理法であって、ここで該第１および第２の塩がそれぞれ独立に、ＮＨ４ ＋、Ｋ＋、Ｎａ＋、Ｌｉ＋、およびＭｇ２＋から成る群から選択される陽イオンを含む、処理法。
局面１６：局面１１～１５のいずれかの処理法であって、ここで該第１および第２の塩がそれぞれ独立に、ＮＨ４ ＋、Ｋ＋、およびＮａ＋から成る群から選択される陽イオンを含む、処理法。
局面１７：局面１１～１６のいずれかの処理法であって、ここで該第１および第２の塩がそれぞれ独立に、ＮＨ４ ＋、Ｋ＋、およびＮａ＋から成る群から選択される陽イオンを含み、かつＰＯ４ ３－、ＳＯ４ ２－、ＯＨ－、ＨＰＯ４ ２－、ＣＨ３ＣＯＯ－、クエン酸イオン、Ｆ－、Ｃｌ－、Ｂｒ－、Ｈ２ＰＯ４ －、Ｉ－、ＮＯ３ －、ＣｌＯ４ －、およびＳＣＮ－から成る群から選択される陰イオンを含む、処理法。
局面１８：局面１１～１７のいずれかの処理法であって、ここで該第１および第２の塩がそれぞれ独立に、（ＮＨ４）２ＳＯ４、Ｎａ２ＳＯ４、Ｎａ３ＰＯ４、Ｋ３ＰＯ４、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、およびＣＨ３ＣＯＯＮＨ４から成る群から選択される、処理法。
局面１９：局面１１～１８のいずれかの処理法であって、ここで該第１および第２の塩がそれぞれ独立に、（ＮＨ４）２ＳＯ４、Ｎａ２ＳＯ４、Ｎａ３ＰＯ４、およびＫ３ＰＯ４から成る群から選択される、処理法。
局面２０：局面１１～１９のいずれかの処理法であって、ここで該第１および第２の塩がそれぞれ独立に、（ＮＨ４）２ＳＯ４およびＮａ２ＳＯ４から成る群から選択される、処理法。
局面２１：局面１１～２０のいずれかの処理法であって、ここで該第１の塩および該第２の塩が同一の塩である、処理法。
局面２２：局面１１～２０のいずれかの処理法であって、ここで該第１の塩および該第２の塩が異なる塩である、処理法。
局面２３：局面１１～２２のいずれかの処理法であって、ここで該水性原材料および溶離液が、それぞれ、第１の塩濃度および第２の塩濃度を含み、ここで該第１の塩濃度が該第２の塩濃度よりも高濃度である、処理法。
局面２４：局面１～１０のいずれかの処理法であって、ここで該固定相がマルチモーダルクロマトグラフィー（ＭＭＣ）固定相であり、それによって該リガンドが疎水性以外の相互作用に基づいて分離を容易にする少なくとも１種類のさらなる置換基をさらに含む、処理法。
局面２５：局面２４の処理法であって、ここで該少なくとも１種類のさらなる置換基が、静電、水素結合、および硫黄原子親和性から成る群から選択される相互作用に基づいて分離を容易にする、処理法。
局面２６：局面２４～２５のいずれかの処理法であって、ここで該少なくとも１種類のさらなる置換基が、スルフィド置換基、カルボキシル置換基、およびアミン置換基から成る群から選択される、処理法。
局面２７：局面２４～２６のいずれかの処理法であって、ここで該少なくとも１種類のさらなる置換基が、カルボキシル置換基を含む、処理法。
局面２８：局面２４～２７のいずれかの処理法であって、ここで該少なくとも１種類のさらなる置換基が、アミン置換基を含む、処理法。
局面２９：局面２４～２８のいずれかの処理法であって、ここで該少なくとも１種類のさらなる置換基が、スルフィド置換基を含む、処理法。
局面３０：局面２４～２９のいずれかの処理法であって、ここで該第１の塩および該第２の塩がそれぞれ独立に、Ｃｌ－、Ｂｒ－、Ｈ２ＰＯ４ －、Ｉ－、ＮＯ３ －、アミノ酸陰イオン、ＣｌＯ４ －、およびＳＣＮ－から成る群から選択される陰イオンを含む、処理法。
局面３１：局面２４～３０のいずれかの処理法であって、ここで該第１および第２の塩がそれぞれ独立に、Ｎ（ＣＨ３）４ ＋、ＮＨ４ ＋、Ｂａ＋、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｃｓ＋、Ｒｂ＋、Ｋ＋、Ｎａ＋、およびアミノ酸陽イオンから成る群から選択される陽イオンを含む、処理法。
局面３２：局面２４～３１のいずれかの処理法であって、ここで第１および第２の塩の少なくとも１つがアミノ酸陽イオンである、処理法。
局面３３：局面３２の処理法であって、ここで該アミノ酸陽イオンがアルギニン陽イオンである、処理法。
局面３４：局面２４～３３のいずれかの処理法であって、ここで該第１の塩および該第２の塩が同一である、処理法。
局面３５：局面２４～３３のいずれかの処理法であって、ここで該第１の塩および該第２の塩が異なる、処理法。
局面３６：局面２４～３１のいずれかの処理法であって、ここで該第１の塩がＮａ＋陽イオンを含み、かつ該第２の塩は、Ｎａ＋陽イオンおよびアルギニン陽イオンの両方を含む、処理法。
局面３７：局面２４～３６のいずれかの処理法であって、ここで該水性原材料および溶出液が、それぞれ、第１の塩濃度および第２の塩濃度を含み、ここで該第２の塩濃度が第１の塩濃度よりも高濃度である、処理法。
局面３８：局面３７の処理法であって、ここで該第２の塩濃度が第１の塩濃度よりも少なくとも２倍高濃度である、処理法。
局面３９：局面３７の処理法であって、ここで該第２の塩濃度が該第１の塩濃度よりも少なくとも３倍高濃度である、処理法。
局面４０：局面３６または３７の処理法であって、ここで該第２の塩におけるＮａ＋陽イオンの濃度が該第１の塩におけるＮａ＋陽イオンの濃度と同一であり、ここで該第２の塩が、該第１の塩には存在しないアルギニン陽イオンをさらに含む、処理法。
局面４１：局面１１～２０のいずれかの処理法であって、ここで該第１および第２の塩が同一であり、（ＮＨ４）２ＳＯ４およびＮａ２ＳＯ４から成る群から選択される、処理法。
局面４２：局面２３～４１のいずれかの処理法であって、ここで該第１の塩濃度が、該第２の塩濃度よりも少なくとも２倍高濃度である、処理法。
局面４３：局面２３～４１のいずれかの処理法であって、ここで該第１の塩濃度が、該第２の塩濃度よりも少なくとも３倍高濃度である、処理法。
局面４４：局面１～４３のいずれかの処理法であって、ここで該水性原材料が、約５．０～約８．０、または約５．０～約７．５、または約５．０～約７．０、または約５．５～約６．５の範囲のｐＨを含む、処理法。
局面４５：局面１～４４のいずれかの処理法であって、ここで該水性原材料のｐＨが、該溶離液のｐＨよりも高い、処理法。
局面４６：局面１～４４のいずれかの処理法であって、ここで該水性原材料のｐＨが、該溶離液のｐＨよりも低い、処理法。
局面４７：局面１～４４のいずれかの処理法であって、ここで該水性原材料のｐＨが、ほぼ該溶離液のｐＨと同一である、処理法。
局面４８：局面４７の処理法であって、該水性原材料のｐＨおよび該溶離液のｐＨが約５．５～約６．５である、処理法。
局面４９：局面４７の処理法であって、ここで該水性原材料のｐＨおよび該溶離液のｐＨが約５．８～約６．２である、処理法。
局面５０：局面１１の処理法であって、ここで該第１および第２の塩が、（ＮＨ４）２ＳＯ４およびＮａ２ＳＯ４から成る群から個別的に選択され、ここで該水性原材料のｐＨおよび該溶離液のｐＨが約５．５～約６．５である、処理法。
局面５１：局面５０の処理法であって、ここで該第１の塩濃度が約１．０～２．０Ｍであり、およびここで該第２の塩濃度が約０．２～約０．６Ｍである、処理法。
局面５２：局面５０の処理法であって、ここで該第１の塩濃度が、該第２の塩濃度よりも少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、または少なくとも５倍高濃度である、処理法。
局面５３：局面２４の処理法であって、ここで該第１の塩がＮａＣｌであり、該第２の塩がＮａＣｌおよびアルギニンＨＣｌであり、ここで該水性原材料のｐＨおよび該溶離液のｐＨが約５．５～約６．５である、処理法。
局面５４：局面５３の処理法であって、ここで該第１の塩濃度が約３０ｍＭ ＮａＣｌであり、該第２の塩濃度が約３０ｍＭ ＮａＣｌおよび約９０ｍＭアルギニンＨＣｌである、処理法。
局面５５：局面５３の処理法であって、ここで該第２の塩濃度が、該第１の塩濃度よりも少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、または少なくとも５倍高濃度である、処理法。
局面５６：局面１～５５のいずれかの処理法であって、ここで工程（ａ）および（ｂ）を、約３℃～約４０℃の範囲の温度、または約１０℃～約３０℃の範囲の温度、または約１５℃～約３０℃の範囲の温度、または約２２℃＋／－４℃の範囲の温度で実施する、処理法。
局面５７：局面５６の処理法であって、ここで工程（ａ）および（ｂ）を約２２℃＋／－４℃の温度で実施する、処理法。
局面５８：局面１～５７のいずれかの処理法であって、ここで２８０ｎｍの波長の吸光度で判定した場合に、該処理法によって、少なくとも約７０％、または少なくとも約７１％、または少なくとも約７２％、または少なくとも約７３％、または少なくとも約７４％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約７６％、または少なくとも約７７％、または少なくとも約７８％、または少なくとも約７９％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８１％、または少なくとも約８２％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８４％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約８６％、または少なくとも約８７％、または少なくとも約８８％、または少なくとも約８９％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％の総蛋白質収率が得られる、処理法。
局面５９：局面１～５８のいずれかの処理法であって、ここで該溶出液中の切断不純物の量に対する該水性原材料中の切断不純物の量の比が、還元ＳＤＳ－ｃＧＥで判定した場合には、％切断不純物として、少なくとも約２、または少なくとも約３、または少なくとも約４、または少なくとも約５、または少なくとも約６、または少なくとも約７、または少なくとも約８、または少なくとも約９、または少なくとも約１０、または少なくとも約１５、または少なくとも約２０である、処理法。
局面６０：局面１～５９のいずれかの処理法であって、ここで該溶出液が、還元ＳＤＳ－ｃＧＥで判定した場合には、該水性原材料に存在する切断不純物に対する相対量で、約１５％未満、または約１４％未満、または約１３％未満、または約１２％未満、または約１１％未満、または約１０％未満、または約１０％未満、または約９％未満、または約８％未満、または約７％未満、または約６％未満を含む、処理法。
局面６１：局面６０の処理法であって、ここで該溶出液が、還元ＳＤＳ－ｃＧＥで判定した場合に、約５％未満、または約４％未満、または約３％未満、または約２％未満、または約１％未満、または約０．９％未満、または約０．８％未満、または約０．７％未満、または約０．６％未満、または約０．５％未満の切断不純物を含む、処理法。
局面６２：局面６１の処理法であって、ここで該溶出液が、還元ＳＤＳ－ｃＧＥで判定した場合に、約２％未満、または約１％未満、または約０．９％未満、または約０．８％未満、または約０．７％未満、または約０．６％未満、または約０．５％未満の切断不純物を含む、処理法。
局面６３：局面１～６２のいずれかの処理法であって、ここで該溶出液が、還元ＳＤＳ－ｃＧＥで判定した場合に、約０．１％～約１５％の切断不純物、または約０．１％～約１０％の切断不純物、または約０．１％～約１０％の切断不純物、または約０．１％～約５％の切断不純物、または約０．１％～約４％の切断不純物、または約０．１％～約３％の切断不純物、または約０．１％～約２％の切断不純物、または約０．１％～約１％の切断不純物の範囲にある切断不純物の相対量を含む、処理法。
局面６４：局面１～６２のいずれかの処理法であって、ここで該溶出液が、還元ＳＤＳ－ｃＧＥで判定した場合に、検出可能な切断不純物を含まない、処理法。
局面６５：局面１～６４のいずれかの処理法であって、ここで該水性原材料および該溶出液がそれぞれ独立に、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、またはＨＥＰＥＳから成る群から選択される緩衝液を含む、処理法。
局面６６：局面５９～６４のいずれかの処理法であって、ここで該第１のＡＢが抗体軽鎖および抗体重鎖を含み、ここで第１のプロドメインが、ペプチド結合を介して該第１のＡＢの抗体軽鎖に共役（結合）しており、ここで該切断不純物の相対量が、還元ＳＤＳ－ｃＧＥで判定した場合に、軽鎖切断異型体および無損傷活性化可能抗体軽鎖に基づいて判定される、処理法。
局面６７：局面１～６４のいずれかの処理法であって、ここで該第１のプロドメインが、ペプチド結合を介して該第１のＡＢに共役（結合）している、処理法。
局面６８：局面１～６７のいずれかの処理法であって、ここで該水性原材料が、宿主細胞蛋白質（ＨＣＰ）および高分子量分子種（ＨＭＷＳ）から成る群から選択される不純物をさらに含む、処理法。
局面６９：局面６８の処理法であって、ここで該水性原材料がＨＣＰをさらに含む、処理法。
局面７０：局面６９の処理法であって、ここで該溶出液中のＨＣＰの量に対する該水性原材料中のＨＣＰの量の比が、対応するＨＣＰ ＥＬＩＳＡアッセイによって判定した場合に、ｐｐｍ単位で、少なくとも約２、または少なくとも約３、または少なくとも約４、または少なくとも約５、または少なくとも約６、または少なくとも約７、または少なくとも約８、または少なくとも約９、または少なくとも約１０である、処理法。
局面７１：局面６９～７０のいずれかの処理法であって、ここで該溶出液が、対応するＨＣＰ ＥＬＩＳＡアッセイによって判定した場合に、約約１５０ｐｐｍ未満、または約１４０ｐｐｍ未満、または約１３０ｐｐｍ未満、または約１２０ｐｐｍ未満、または約１１０ｐｐｍ未満、または約１００ｐｐｍ未満、または約９０ｐｐｍ未満、または約８０ｐｐｍ未満、または約７０ｐｐｍ未満、または約６０ｐｐｍ未満、または約５０ｐｐｍ未満、または約４５ｐｐｍ未満、または約４０ｐｐｍ未満、または約３５ｐｐｍ未満、または約３０ｐｐｍ未満、または約２５ｐｐｍ未満、または約２０ｐｐｍ未満、または約１５ｐｐｍ未満、または約１０ｐｐｍ未満のＨＣＰ、または約５ｐｐｍ未満のＨＣＰ未満、または約１ｐｐｍ未満のＨＣＰを含む、処理法。
局面７２：局面６９～７０のいずれかの処理法であって、ここで該溶出液が、約０．５ｐｐｍのＨＣＰ～約１５０ｐｐｍのＨＣＰ、または約０．５ｐｐｍのＨＣＰ～約１４０ｐｐｍのＨＣＰ、または０．５ｐｐｍのＨＣＰ～約１３０ｐｐｍのＨＣＰ、または約０．５ｐｐｍのＨＣＰ～約１２０ｐｐｍ、または約０．５ｐｐｍのＨＣＰ～約１１０ｐｐｍ、または約０．５ｐｐｍのＨＣＰ～約１００ｐｐｍのＨＣＰ、または約０．５ｐｐｍのＨＣＰ～約９０ｐｐｍのＨＣＰ、または約０．５ｐｐｍのＨＣＰ～約９０ｐｐｍのＨＣＰ、または約０．５ｐｐｍのＨＣＰ～約８０ｐｐｍのＨＣＰ、または約０．５ｐｐｍのＨＣＰ～約７０ｐｐｍのＨＣＰ、または約０．５ｐｐｍのＨＣＰ～約６０ｐｐｍのＨＣＰ、または約０．５ｐｐｍ～約５０ｐｐｍのＨＣＰ、または約０．５ｐｐｍのＨＣＰ～約４５ｐｐｍのＨＣＰ、または約０．５ｐｐｍのＨＣＰ～約４０ｐｐｍのＨＣＰ、または約０．５ｐｐｍのＨＣＰ～約４０ｐｐｍのＨＣＰ、または約０．５ｐｐｍのＨＣＰ～約３５ｐｐｍのＨＣＰ、または約０．５ｐｐｍのＨＣＰ～約３０ｐｐｍのＨＣＰ、または約１ｐｐｍのＨＣＰ～約２５ｐｐｍのＨＣＰ、または約１ｐｐｍのＨＣＰ～約２０ｐｐｍのＨＣＰ、または約０．５ｐｐｍのＨＣＰ～約１５ｐｐｍのＨＣＰ、または約０．５ｐｐｍのＨＣＰ～約１０ｐｐｍのＨＣＰの範囲のＨＣＰの量を含む、処理法。
局面７３：局面６９～７０のいずれかの処理法であって、ここで該溶出液が、対応するＨＣＰ ＥＬＩＳＡアッセイで測定した場合に、検出可能ＨＣＰを含まない、処理法。
局面７４：局面１～７３のいずれかの処理法であって、ここで該水性原材料がＨＭＷＳをさらに含む、処理法。
局面７５：局面７４の処理法であって、ここで該溶出液中のＨＭＷＳの量に対する該水性原材料中のＨＭＷＳの量の比が、サイズ排除（ＳＥ）－ＨＰＬＣで測定した場合に、％ピーク面積に基づいて、少なくとも約２、または少なくとも約３、または少なくとも約４、または少なくとも約５である、処理法。
局面７６：局面７４～７５のいずれかの処理法であって、ここで該溶出液が、ＳＥ－ＨＰＬＣによって測定した場合に、約５％未満のＨＭＷＳ、または約４％未満のＨＭＷＳ、または約３％未満のＨＭＷＳ、または約２％未満のＨＭＷＳ、または約１％未満のＨＭＷＳを含む、処理法。
局面７７：局面７４～７５のいずれかの処理法であって、ここで該溶出液が、ＳＥ－ＨＰＬＣによって測定した場合に、約０．２％のＨＭＷＳ～約５％のＨＭＷＳ、または約０．２％のＨＭＷＳ～約４％のＨＭＷＳ、または約０．２％のＨＭＷＳ～約３％のＨＭＷＳ、または約０．２％のＨＭＷＳ～約２％のＨＭＷＳ、または約０．２％のＨＭＷＳ～約１％のＨＭＷＳの範囲のＨＭＷＳの量を含む、処理法。
局面７８：局面７４～７５のいずれかの処理法であって、ここで該溶出液が、ＳＥ－ＨＰＬＣによって測定した場合に、検出可能なＨＭＷＳを含まない、処理法。
局面７９：局面１～７８のいずれかの処理法であって、ここで該溶出液が、還元ＳＤＳ－ｃＧＥで判定した場合に、少なくとも約９０％の無損傷活性化可能抗体、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％の無損傷活性化可能抗体を含む、処理法。
局面８０：局面７９の処理法であって、ここで該第１のＡＢが、抗体軽鎖および抗体重鎖を含み、およびここで第１のプロドメインがペプチド結合を介して該第１のＡＢの抗体軽鎖に共役（結合）しており、およびここで％無損傷活性化可能抗体が、還元ＳＤＳ－ｃＧＥで判定した場合に、無損傷活性化可能抗体の軽鎖および軽鎖切断異型体に基づいて、決定される、処理法。
局面８１：局面１～８０のいずれかの処理法であって、ここで工程（ａ）の前に、該処理法が：
（ａ０）１種類以上のバルク中間体産物組成物を生産する目的で、該無損傷活性化可能抗体および該切断不純物を含む生物学的回収組成物を、遠心分離工程、濾過工程、親和性クロマトグラフィー工程、ウイルス不活性化工程、サイズ排除クロマトグラフィー工程、ウイルス濾過工程、イオン交換クロマトグラフィー工程、およびそれらのうちの２種類以上の任意の組み合わせから成る群から選択される１種類以上の介在的ユニット操作に供する工程であって、ここで該水性原材料が少なくとも１種類のバルク中間体産物組成物を含む、介在的ユニット操作に供する工程、
をさらに含む、処理法。
局面８２：局面１～８１のいずれかの処理法であって、ここで下流の産物組成物を生成する目的で、該溶出液を１種類以上の下流ユニット操作に供する、処理法。
局面８３：局面８２の処理法であって、ここで該１種類以上の下流ユニット操作が、さらなる精製工程、化学合成処理、希釈プロセス、溶媒交換工程、製剤化工程、凍結乾燥プロセス、およびそれらのうちの２種類以上の任意の組み合わせから成る群から選択される、処理法。
局面８４：局面８２または８３の処理法であって、ここで該１種類以上の下流ユニット操作が、遠心分離工程、濾過工程、親和性クロマトグラフィー工程、ウイルス不活性化工程、サイズ排除クロマトグラフィー工程、ウイルス濾過工程、イオン交換クロマトグラフィー工程、およびそれらのうちの２種類以上の任意の組み合わせから成る群から選択されるさらなる精製処理を含む、処理法。
局面８５：局面８２～８４のいずれかの処理法であって、ここで該１種類以上の下流ユニット操作が、凍結乾燥処理を含む、処理法。
局面８６：局面８２～８５のいずれかの処理法であって、ここで該１種類以上の下流ユニット操作が化学合成処理である、処理法。
局面８７：局面８６の処理法であって、ここで該化学合成処理が化学共役反応である、処理法。
局面８８：局面１～８７のいずれかの処理法であって、ここで該水性原材料が、還元ＳＤＳ－ｃＧＥで判定した場合に、約０．５％超の切断不純物、または約０．６％超、または約０．７％超、または約０．８％超、または約０．９％超、または約１％超、または約１．５％超、または約２％超、または約２．５％超、または約３％超、または約３．５％超、または約４％超、または約４．５％超の切断不純物を含む、処理法。
局面８９：局面１～８８のいずれかの処理法であって、ここで該無損傷活性化可能抗体が第２のＡＢおよび第２のプロドメインを含み、およびここで該切断不純物が、質量分析で判定した場合に単一アーム切断不純物を含む、処理法。
局面９０：局面８９の処理法であって、ここで該第２のＡＢが該第１のＡＢと同一であり、およびここで該第２のプロドメインが該第１のプロドメインと同一である、処理法。
局面９１：局面８９または９０の処理法であって、ここで該切断不純物が、質量分析で判定した場合に、本質的に単一アーム切断不純物から成る、処理法。
局面９２：局面８９または９０の処理法であって、ここで質量分析により判定した場合に、該切断不純物が単一アーム切断不純物から成る、処理法。
局面９３：局面１～９２のいずれかの処理法によって生産される、精製した無損傷活性化可能抗体組成物。
局面９４：局面８２～８７のいずれかの下流の産物組成物を含む精製産物組成物。
局面９５：局面１～９２のいずれかの処理法であって、ここで該溶出液が、還元ＳＤＳ－ｃＧＥで判定した場合に少なくとも約９０％の無損傷活性化可能抗体、還元ＳＤＳ－ｃＧＥで判定した場合に約１５％未満の切断不純物、ＳＥ－ＨＰＬＣで判定した場合に約５％未満のＨＭＷＳ、および対応するＨＣＰ ＥＬＩＳＡで判定した場合に約１５０ｐｐｍ未満のＨＣＰを含む、処理法。
局面９６：局面９５の処理法であって、ここで該溶出液が、還元ＳＤＳ－ｃＧＥで判定した場合に約５％未満の切断不純物を含む、処理法。
局面９７：局面９６の処理法であって、ここで該溶出液が、還元ＳＤＳ－ｃＧＥで判定した場合に約３％未満の切断不純物を含む、処理法。
局面９８：局面１～９７のいずれかの処理法によって生産される溶出液を含む精製した無損傷活性化可能抗体組成物。
局面９９：還元ＳＤＳ－ｃＧＥで判定した場合に少なくとも約９０％の無損傷活性化可能抗体、還元ＳＤＳ－ｃＧＥで判定した場合に約１５％未満の切断不純物、ＳＥ－ＨＰＬＣで判定した場合に約５％未満のＨＭＷＳ、対応するＨＣＰ ＥＬＩＳＡで判定した場合に約１５０ｐｐｍ未満のＨＣＰを含む精製した無損傷活性化可能抗体組成物。
局面１００：局面９８または９９の精製した無損傷活性化可能抗体組成物であって、ここで該組成物が、還元ＳＤＳ－ｃＧＥで判定した場合に、約１４％未満の切断不純物、または約１３％未満の切断不純物、または約１２％未満の切断不純物、または約１２％未満の切断不純物、または約１１％未満の切断不純物、または約１０％未満の切断不純物、または約９％未満の切断不純物、または約８％未満の切断不純物、または約７％未満の切断不純物、または約６％未満の切断不純物を含む、精製した無損傷活性化可能抗体組成物。
局面１０１：局面９８～１００のいずれかの精製した無損傷活性化可能抗体組成物であって、ここで該組成物が、還元ＳＤＳ－ｃＧＥで判定した場合に、約５％未満の切断不純物、または約４％未満の切断不純物、または約３％未満の切断不純物、または約２％未満の切断不純物を含む、精製した無損傷活性化可能抗体組成物。
局面１０２：局面９８～１０１のいずれかの精製した無損傷活性化可能抗体組成物であって、ここで該組成物が、還元ＳＤＳ－ｃＧＥで判定した場合に、約１％未満の切断不純物、または約０．９％未満の切断不純物、または約０．８％未満の切断不純物、または約０．７％未満の切断不純物、または約０．６％未満の切断不純物、または約０．５％未満の切断不純物を含む、精製した無損傷活性化可能抗体組成物。
局面１０３：局面９８または９９の精製した無損傷活性化可能抗体組成物であって、ここで該組成物が、還元ＳＤＳ－ｃＧＥで判定した場合に、約０．１％～約１５％の切断不純物、または約０．１％～約１０％の切断不純物、または約０．１％～約１０％の切断不純物、または約０．１％～約５％の切断不純物、または約０．１％～約４％の切断不純物、または約０．１％～約３％の切断不純物、または約０．１％～約２％の切断不純物、または約０．１％～約１％の切断不純物の範囲の相対量の切断不純物を含む、精製した無損傷活性化可能抗体組成物。
局面１０４：局面９８または９９の精製した無損傷活性化可能抗体組成物であって、ここで該組成物が、還元ＳＤＳ－ｃＧＥで判定した場合に、検出可能切断不純物を含まない、無損傷活性化可能抗体組成物。
局面１０５：局面９８～１０４のいずれかの精製した無損傷活性化可能抗体組成物であって、ここで該組成物が、対応するＨＣＰ ＥＬＩＳＡアッセイで判定した場合に、約１４０ｐｐｍ未満のＨＣＰ、または約１３０ｐｐｍ未満のＨＣＰ、または約１２０ｐｐｍ未満のＨＣＰ、または約１１０ｐｐｍ未満のＨＣＰ、または約１００ｐｐｍ未満のＨＣＰ、または約９０ｐｐｍ未満のＨＣＰ、または約８０ｐｐｍ未満のＨＣＰ、または約７０ｐｐｍ未満のＨＣＰ、または約６０ｐｐｍ未満のＨＣＰ、または約５０ｐｐｍ未満のＨＣＰ、または約４５ｐｐｍ未満のＨＣＰ、または約４０ｐｐｍ未満のＨＣＰ、または約３５ｐｐｍ未満のＨＣＰ、または約３０ｐｐｍ未満のＨＣＰ、または約２５ｐｐｍ未満のＨＣＰ、または約２０ｐｐｍ未満のＨＣＰ、または約１５ｐｐｍ未満のＨＣＰ、または約１０ｐｐｍ未満のＨＣＰを含む、精製した無損傷活性化可能抗体組成物。
局面１０６：局面９８～１０５のいずれかの精製した無損傷活性化可能抗体組成物であって、ここで該組成物が、約１ｐｐｍのＨＣＰ～約１５０ｐｐｍのＨＣＰ、または約１ｐｐｍのＨＣＰ～約１４０ｐｐｍのＨＣＰ、または１ｐｐｍのＨＣＰ～約１３０ｐｐｍのＨＣＰ、または約１ｐｐｍのＨＣＰ～約１２０ｐｐｍ、または約１ｐｐｍのＨＣＰ～約１１０ｐｐｍ、または約１ｐｐｍのＨＣＰ～約１００ｐｐｍのＨＣＰ、または約１ｐｐｍのＨＣＰ～約９０ｐｐｍのＨＣＰ、または約１ｐｐｍのＨＣＰ～約９０ｐｐｍのＨＣＰ、または約１ｐｐｍのＨＣＰ～約８０ｐｐｍのＨＣＰ、または約１ｐｐｍのＨＣＰ～約７０ｐｐｍのＨＣＰ、または約１ｐｐｍのＨＣＰ～約６０ｐｐｍのＨＣＰ、または約１ｐｐｍ～約５０ｐｐｍのＨＣＰ、または約１ｐｐｍのＨＣＰ～約４５ｐｐｍのＨＣＰ、または約１ｐｐｍのＨＣＰ～約４０ｐｐｍのＨＣＰ、または約１ｐｐｍのＨＣＰ～約４０ｐｐｍのＨＣＰ、または約１ｐｐｍのＨＣＰ～約３５ｐｐｍのＨＣＰ、または約１ｐｐｍのＨＣＰ～約３０ｐｐｍのＨＣＰ、または約１ｐｐｍのＨＣＰ～約２５ｐｐｍのＨＣＰ、または約１ｐｐｍのＨＣＰ～約２０ｐｐｍのＨＣＰ、または約１ｐｐｍのＨＣＰ～約１５ｐｐｍのＨＣＰ、または約１ｐｐｍのＨＣＰ～約１０ｐｐｍのＨＣＰの範囲のＨＣＰの量を含む、精製した無損傷活性化可能抗体組成物。
局面１０７：局面９８～１０６のいずれかの精製した無損傷活性化可能抗体組成物であって、ここで該組成物が、ＳＥ－ＨＰＬＣで判定した場合に、約４％未満のＨＭＷＳ、または約３％未満のＨＭＷＳ、または約２％未満のＨＭＷＳ、または約１％未満のＨＭＷＳを含む、精製した無損傷活性化可能抗体組成物。
局面１０８：局面９８または９９の精製した無損傷活性化可能抗体組成物であって、ここで該組成物が、ＳＥ－ＨＰＬＣで判定した場合に、約０．２％のＨＭＷＳ～約５％のＨＭＷＳ、または約０．２％のＨＭＷＳ～約４％のＨＭＷＳ、または約０．２％のＨＭＷＳ～約３％のＨＭＷＳ、または約０．２％のＨＭＷＳ～約２％のＨＭＷＳ、または約０．２％のＨＭＷＳ～約１％のＨＭＷＳの範囲のＨＭＷＳの量を含む、精製した無損傷活性化可能抗体組成物。
局面１０９：局面９８～１０８のいずれかの精製した無損傷活性化可能抗体組成物であって、ここで該組成物が、還元ＳＤＳ－ｃＧＥで判定した場合に、少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％の無損傷活性化可能抗体を含む、精製した無損傷活性化可能抗体組成物。
局面１１０：局面９８～１０９のいずれかの精製した無損傷活性化可能抗体組成物であって、ここで該組成物が凍結乾燥物である、精製した無損傷活性化可能抗体組成物。
局面１１１：局面９８～１１０のいずれかの組成物および薬学的に許容され得る賦形剤を含む薬学的に許容可能な組成物。
局面１１２：局面１～９２、または局面９５～９７のいずれかの処理法、局面９３、または９８～１１０のいずれかの精製した無損傷活性化可能抗体組成物、局面９４の精製産物組成物、または局面１１１の薬学的に許容され得る組成物であって、ここで該無損傷活性化可能抗体中の第１のＣＭが、健常組織と比較して罹患組織において過剰発現するプロテアーゼの基質を含む、処理法、精製した無損傷活性化可能抗体組成物、精製産物組成物、または薬学的に許容され得る組成物。
局面１１３：局面１～９２、局面９５～９７、または局面１１２のいずれかの処理法、局面９３、または９８～１１０のいずれかの精製した無損傷活性化可能抗体組成物、局面９４または１１２のいずれかの精製産物組成物、または局面１１０または１１１のいずれかの薬学的に許容され得る組成物であって、
ここで該無損傷活性化可能抗体が：
（ｉｉｉ）第２の生物学的標的に特異的な結合親和性を有する第２のＡＢ；
および
（ｉｖ）第２のプロドメイン、
をさらに含み、
ここで該第２のＡＢが、第２のＶＬおよび第２のＶＨを含み、
ここで該第２のプロドメインが、第２のＭＭおよび第２のＣＭを含み、
ここで該第２のＡＢが該第２のプロドメインに共役（結合）している、
処理法、精製した無損傷活性化可能抗体組成物、精製産物組成物、または薬学的に許容され得る組成物。
局面１１４：局面１１３の処理法、精製した無損傷活性化可能抗体組成物、精製産物組成物、または薬学的に許容され得る組成物であって、ここで該第２のＣＭが、健常組織と比較して罹患組織において過剰発現するプロテアーゼの基質を含む、処理法、精製した無損傷活性化可能抗体組成物、精製産物組成物、または薬学的に許容され得る組成物。
局面１１５：局面１１３～１１４のいずれかの処理法、精製した無損傷活性化可能抗体組成物、精製産物組成物、または薬学的に許容され得る組成物であって、ここで該第１のＣＭおよび該第２のＣＭが、同一アミノ酸配列を含む、処理法、精製した無損傷活性化可能抗体組成物、精製産物組成物、または薬学的に許容され得る組成物。
局面１１６：局面１１３～１１５のいずれかの処理法、精製した無損傷活性化可能抗体組成物、精製産物組成物、または薬学的に許容され得る組成物であって、ここで該第１のＣＭおよび該第２のＣＭが、異なるアミノ酸配列を含む、処理法、精製した無損傷活性化可能抗体組成物、精製産物組成物、または薬学的に許容され得る組成物。
局面１１７：局面１１３～１１６のいずれかの処理法、精製した無損傷活性化可能抗体組成物、精製産物組成物、または薬学的に許容され得る組成物であって、ここで該第１の生物学的標的および該第２の生物学的標的が異なる、処理法、精製した無損傷活性化可能抗体組成物、精製産物組成物、または薬学的に許容され得る組成物。
局面１１８：局面１１３～１１７のいずれかの処理法、精製した無損傷活性化可能抗体組成物、精製産物組成物、または薬学的に許容され得る組成物であって、ここで該第１の生物学的標的および該第２の生物学的標的の少なくとも１つがＴ細胞共受容体である、処理法、精製した無損傷活性化可能抗体組成物、精製産物組成物、または薬学的に許容され得る組成物。
局面１１９：局面１１８の処理法、精製した無損傷活性化可能抗体組成物、精製産物組成物、または薬学的に許容され得る組成物であって、ここで該Ｔ細胞共受容体が分化クラスター３（ＣＤ３）Ｔ細胞共受容体である、処理法、精製した無損傷活性化可能抗体組成物、精製産物組成物、または薬学的に許容され得る組成物。
局面１２０：局面１１３～１１５のいずれかの処理法、精製した無損傷活性化可能抗体組成物、精製産物組成物、または薬学的に許容され得る組成物であって、ここで該第２のＡＢが該第１のＡＢと同一であり、またここで該第２のプロドメインが該第１のプロドメインと同一である、処理法、精製した無損傷活性化可能抗体組成物、精製産物組成物、または薬学的に許容され得る組成物。
局面１２１：局面１２０の処理法、精製した無損傷活性化可能抗体組成物、精製産物組成物、または薬学的に許容され得る組成物であって、ここで該第１の生物学的標的および該第２の生物学的標的がＣＤ１６６である、処理法、精製した無損傷活性化可能抗体組成物、精製産物組成物、または薬学的に許容され得る組成物。
局面１２２：局面１２０の処理法、精製した無損傷活性化可能抗体組成物、精製産物組成物、または薬学的に許容され得る組成物であって、ここで該第１の生物学的標的および該第２の生物学的標的がＰＤ－１である、処理法、精製した無損傷活性化可能抗体組成物、精製産物組成物、または薬学的に許容され得る組成物。
局面１２３：局面１２０の処理法、精製した無損傷活性化可能抗体組成物、精製産物組成物、または薬学的に許容され得る組成物であって、ここで該第１の生物学的標的および該第２の生物学的標的がＰＤＬ－１である、処理法、精製した無損傷活性化可能抗体組成物、精製産物組成物、または薬学的に許容され得る組成物。
上記の発明は明確さと理解を目的としてある程度詳細に記載されているが、発明の真の範囲から逸脱することなく形態や細部について様々な変更を加え得ることは、本開示を理解する当業者にとっては明白であろう。本明細書に記載の材料、実施例、および実施態様は例示目的のみであって、限定することを意図するものではなく、またその観点から、当業者に様々な変更または変形を示唆するものであり、それらもまた付属の特許請求の範囲の趣旨および範囲内に含まれるものであることが、理解される。

Claims (64)

  1. 無損傷活性化可能抗体およびその切断異型体を含む組成物であって、ここで該組成物が、ＳＤＳ－ｃＧＥで評価した場合に少なくとも９５％の無損傷活性化可能抗体および０．０５～５％のその切断異型体を含み、ここで無損傷活性化可能抗体％およびその切断異型体％が全体で１００％である、組成物。
  2. 請求項１の組成物であって、ここで該切断異型体が、抗原結合ドメイン（ＡＢ）および少なくとも開裂可能部分（ＣＭ）の一部を含む、組成物。
  3. 請求項１または２の組成物であって、該組成物が、対応するＨＣＰ ＥＬＩＳＡによって評価した場合に１５０ｐｐｍ未満の宿主細胞蛋白質（ＨＣＰ）をさらに含み、および／またはＳＥ－ＨＰＬＣで評価した場合に０．１～５％の高分子量分子種（ＨＭＷＳ）をさらに含む、組成物。
  4. 請求項１の組成物であって、該組成物が、対応するＨＣＰ ＥＬＩＳＡで評価した場合に約０．５ｐｐｍ～１００ｐｐｍの宿主細胞蛋白質（ＨＣＰ）およびＳＥ－ＨＰＬＣで評価した場合に０．１～３％のＨＭＷＳをさらに含む、組成物。
  5. 請求項１の組成物であって、該組成物が、ＳＤＳ－ｃＧＥによって評価した場合に少なくとも９７％の無損傷活性化可能抗体、０．０５～３％のその切断異型体、対応するＨＣＰ ＥＬＩＳＡで評価した場合に約０．５ｐｐｍ～１００ｐｐｍの宿主細胞蛋白質（ＨＣＰ）、およびＳＥ－ＨＰＬＣよって評価した場合に０．１～３％のＨＭＷＳを含み、ここで該無損傷活性化可能抗体％およびその切断異型体％が全体で１００％である、組成物。
  6. 請求項１の組成物であって、該組成物が、ＳＤＳ－ｃＧＥで評価した場合に、少なくとも９７％の無損傷活性化可能抗体、０．０５～３％のその切断異型体、およびＳＥ－ＨＰＬＣで評価した場合に０．１～３％のＨＭＷＳを含み、ここで無損傷活性化可能抗体％およびその切断異型体％が全体で１００％である、組成物。
  7. 無損傷活性化可能抗体およびその切断異型体、ならびにＣｌ－、Ｂｒ－、Ｈ２ＰＯ４ －、Ｉ－、ＮＯ３ －、ＣｌＯ４ －、およびＳＣＮ－から選択される陰イオンおよびＮ（ＣＨ３）４ ＋、ＮＨ４ ＋、Ｂａ＋、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｃｓ＋、Ｒｂ＋、Ｋ＋、Ｎａ＋から選択される陽イオン、または該陰イオンおよび該陽イオンの組み合わせを含む、水性組成物。
  8. 請求項１～７のいずれか１項または組み合わせの組成物であって、該組成物が２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、（ＮＨ４）２ＳＯ４、Ｎａ２ＳＯ４、Ｎａ３ＰＯ４、Ｋ３ＰＯ４、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、およびＣＨ３ＣＯＯＮＨ４、またはそれらの組み合わせを含む、組成物。
  9. 請求項１～９のいずれか１項または組み合わせの組成物であって、該組成物が１０ｍＭ～１００ｍＭの陰イオン、陽イオン、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、（ＮＨ４）２ＳＯ４、Ｎａ２ＳＯ４、Ｎａ３ＰＯ４、Ｋ３ＰＯ４、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、およびＣＨ３ＣＯＯＮＨ４、またはそれらの組み合わせを含む、組成物。
  10. 請求項１～７のいずれか１項または組み合わせの組成物であって、該組成物がアルギニン、トリプトファン、アスパラギン、グルタミン、リジン、ヒスチジン、セリン、プロリン、またはその塩を含む、組成物。
  11. 請求項１０の組成物であって、該組成物が１０ｍＭ～１５０ｍＭのアルギニン、トリプトファン、アスパラギン、グルタミン、リジン、ヒスチジン、セリン、プロリン、またはその塩を含む、組成物。
  12. 請求項１～１１のいずれか１項または組み合わせの組成物であって、ここで該組成物が、約５．０～約８．０、または約５．０～約７．５、または約５．０～約７．０、または約５．５～約６．５のｐＨを有する水性組成物である、組成物。
  13. 請求項１～１２のいずれか１項または組み合わせの組成物であって、ここで該組成物が、１１０～１５０ｍＳ／ｃｍ、１１５～１４５ｍＳ／ｃｍ、１２０～１４０ｍＳ／ｃｍ、１２５～１３５ｍＳ／ｃｍまたは約１３０ｍＳ／ｃｍの伝導度を有する水性組成物である、組成物。
  14. 請求項１～７のいずれか１項または組み合わせの組成物であって、ここで該組成物が緩衝剤を含まない、組成物。
  15. 請求項１～７のいずれか１項または組み合わせの組成物であって、ここで該組成物のｐＨが該組成物中に存在する緩衝剤の緩衝能外である、組成物。
  16. 請求項１～１３のいずれか１項または組み合わせの組成物であって、ここで該組成物が、６．０～９．０のｐＫａ有する緩衝剤を含む、組成物。
  17. 請求項１～１６のいずれか１項または組み合わせの組成物を含む容器、バイアル、注射筒、または注入デバイス。
  18. ＨＩＣまたはＭＭＣクロマトグラフィーカラムの水性原材料であって、該水性原材料が水、無損傷活性化可能抗体、ＳＤＳ－ｃＧＥで判定した場合に無損傷活性化可能抗体の切断異型体を少なくとも２％、対応するＨＣＰ ＥＬＩＳＡで判定した場合に少なくとも１０ｐｐｍのＨＣＰ、およびＳＥ－ＨＰＬＣで判定した場合に少なくとも１％のＨＭＷＳを含む、水性原材料。
  19. 請求項１８のＨＩＣまたはＭＭＣクロマトグラフィーカラムの水性原材料であって、該水性原材料が、ＳＤＳ－ｃＧＥで判定した場合に少なくとも９０％の無損傷活性化可能抗体、ＳＤＳ－ｃＧＥで判定した場合に無損傷活性化可能抗体の切断異型体を少なくとも２％～１５％、ＥＬＩＳＡで判定した場合に少なくとも１０ｐｐｍのＨＣＰ、およびＳＥ－ＨＰＬＣで判定した場合に１％～６％のＨＭＷＳを含む、水性原材料。
  20. 請求項１８または請求項１９の水性原材料のＨＩＣ溶出液であって、該ＨＩＣ溶出液が、ＳＤＳ－ｃＧＥで判定した場合に少なくとも９５％の無損傷活性化可能抗体、ＳＤＳ－ｃＧＥで判定した場合に２％未満の無損傷活性化可能抗体の切断異型体、ＥＬＩＳＡで判定した場合に５ｐｐｍ未満のＨＣＰ、およびＳＥ－ＨＰＬＣで判定した場合に１％未満のＨＭＷＳを含み、ここで無損傷活性化可能抗体％および切断異型体％が全体で１００％である、ＨＩＣ溶出液。
  21. 請求項２０のＨＩＣ溶出液であって、該ＨＩＣ溶出液が、ＳＤＳ－ｃＧＥで判定した場合に少なくとも９７％の無損傷活性化可能抗体、ＳＤＳ－ｃＧＥで判定した場合に１％未満の無損傷活性化可能抗体の切断異型体、ＥＬＩＳＡで判定した場合に２ｐｐｍ未満のＨＣＰ、およびＳＥ－ＨＰＬＣで判定した場合に０．５％未満ＨＭＷＳを含み、ここで無損傷活性化可能抗体％および切断異型体％が全体で１００％である、ＨＩＣ溶出液。
  22. 請求項１８または請求項１９の水性原材料のＭＭＣ溶出液であって、該ＭＭＣ溶出液が、ＳＤＳ－ｃＧＥで判定した場合に少なくとも９７％の無損傷活性化可能抗体、ＳＤＳ－ｃＧＥで判定した場合に１％未満の無損傷活性化可能抗体の切断異型体、ＥＬＩＳＡで判定した場合に６ｐｐｍ未満のＨＣＰ、およびＳＥ－ＨＰＬＣで判定した場合に１％未満のＨＭＷＳを含み、ここで無損傷活性化可能抗体％および切断異型体％が全体で１００％である、ＭＭＣ溶出液。
  23. 請求項２２のＭＭＣ溶出液であって、該ＭＭＣ溶出液が、ＳＤＳ－ｃＧＥで判定した場合に少なくとも９８％の無損傷活性化可能抗体、ＳＤＳ－ｃＧＥで判定した場合に０．５％未満の無損傷活性化可能抗体の切断異型体、ＥＬＩＳＡで判定した場合に５ｐｐｍ未満のＨＣＰ、およびＳＥ－ＨＰＬＣで判定した場合に０．５％未満のＨＭＷＳを含み、ここで無損傷活性化可能抗体％および切断異型体％が全体で１００％である、ＭＭＣ溶出液。
  24. 請求項２０または２１のＨＩＣ溶出液あるいは請求項２２または請求項２３のＭＭＣ溶出液であって、請求項１８または請求項１９の水性原材料中に存在する無損傷活性化可能抗体の少なくとも７５％の収率で、無損傷活性化可能抗体を含むＨＩＣ溶出液またはＭＭＣ溶出液。
  25. 請求項２０または２１のＨＩＣ溶出液あるいは請求項２２または請求項２３のＭＭＣ溶出液であって、ここで該溶出液中の切断異型体の相対量と比較した該水性原材料中の切断異型体の相対量の減少のレベルが、２倍と２０倍との間である、ＨＩＣ溶出液またはＭＭＣ溶出液。
  26. 請求項２０または２１のＨＩＣ溶出液あるいは請求項２２または請求項２３のＭＭＣ溶出液であって、ここで該溶出液中の切断異型体の相対量と比較した該水性原材料中の切断異型体の相対量の減少のレベルが、２倍と１０倍との間である、ＨＩＣ溶出液またはＭＭＣ溶出液。
  27. 請求項２０または２１のＨＩＣ溶出液あるいは請求項２２または請求項２３のＭＭＣ溶出液であって、ここで該溶出液中の切断異型体の相対量と比較した該水性原材料中の切断異型体の相対量の減少のレベルが、５倍と１０倍との間である、ＨＩＣ溶出液またはＭＭＣ溶出液。
  28. 組成物を生産する処理法であって、該組成物が：
    （Ａ）ＭＭ、ＣＭ、およびＡＢを含む無損傷活性化可能抗体を９５％超含み；
    および
    （Ｂ）その切断異型体を、ＳＤＳ－ｃＧＥで判定した場合に０．０５～５％含み、
    ここで該処理法が：
    （ｉ）水、（Ａ）、（Ｂ）、および第１の塩を含む水性原材料を、クロマトグラフィーカラムに載せる工程であって、
    ここで該クロマトグラフィーカラムが、支持マトリックスおよびそれに結合した疎水性リガンドを含む固定相を含む、
    クロマトグラフィーカラムに載せる工程；
    および
    （ｉｉ）該組成物を取得するために、水および第２の塩を含む溶離液で、該クロマトグラフィーカラムを溶出する工程、
    を含む、処理法。
  29. 請求項２８の処理法であって、該処理法が、該水性原材料中の切断異型体に対する相対量として、７５～９０％減少させることを含む、処理法。
  30. 請求項２８の処理法であって、該処理法が、該水性原材料中のＨＣＰの量と比較して、ＨＣＰの量を７５～９０％減少させることを含む、処理法。
  31. 請求項２８の処理法であって、該処理法が、該水性原材料中のＨＭＷＳの量と比較して、ＨＭＷＳの量を７５～９０％減少させることを含む、処理法。
  32. 請求項２８の処理法であって、該処理法が、該水性原材料中の存在量と比較して、活性異型体、ＨＣＰ、およびＨＭＷＳの量を７０～９５％減少させることを含む、処理法。
  33. 請求項２８の処理法であって、ここで該組成物が、ＳＤＳ－ｃＧＥで判定した場合に少なくとも９５％の無損傷活性化可能抗体および０．１～５％の切断異型体を含み、ここで無損傷活性化可能抗体％および切断異型体％が全体で１００％である、処理法。
  34. 請求項２８～３３のいずれか１項または組み合わせの処理法であって、ここで該切断異型体の配列が、無損傷活性化可能抗体の配列と少なくとも９５％同一である、処理法。
  35. 請求項２８～３４のいずれか１項または組み合わせの処理法であって、ここで該切断異型体の分子量が、無損傷活性化可能抗体の分子量の８５～９８％である、処理法。
  36. 請求項２８～３３のいずれか１項または組み合わせの処理法であって、ここで該切断異型体が、ＭＭを欠如し、またＣＭの一部を欠如することにおいてのみ、該無損傷活性化可能抗体と異なる、処理法。
  37. 請求項２８～３６のいずれか１項または組み合わせの処理法であって、ここで該活性化可能抗体が、同一の２つのＡＢ、同一の２つのＣＭ、および同一の２つのＭＭを含むホモ二量体であり、ここで該切断異型体が単一アーム切断異型体である、処理法。
  38. ＳＤＳ－ｃＧＥで判定した場合に無損傷活性化可能抗体および５％未満のその切断異型体、ＳＥ－ＨＰＬＣで判定した場合に５％未満のＨＭＷＳ、および対応するＨＣＰ ＥＬＩＳＡで判定した場合に１００ｐｐｍ未満のＨＣＰ、またはそれらの組み合わせを含む組成物を生産する方法であって、該方法が：
    （ｉ）水、該無損傷活性化可能抗体、その切断異型体、ＨＭＷＳ、ＨＣＰ、および第１の塩を含む水性原材料をクロマトグラフィーカラムに載せる工程であって、
    ここで該クロマトグラフィーカラムが、支持マトリックスおよびそれに結合した疎水性リガンドを含む固定相を含む、
    クロマトグラフィーカラムに載せる工程；
    および
    （ｉｉ）該組成物を取得する目的で、水および第２の塩を含む溶離液で、該クロマトグラフィーカラムを溶出する工程、
    を含む、方法。
  39. 無損傷活性化可能抗体をその切断異型体から分離する方法であって、ここで該切断異型体のアミノ酸配列が、該無損傷活性化可能抗体のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であり、
    該方法が：
    （ｉ）水、該無損傷活性化可能抗体、その切断異型体、および第１の塩を含む水性原材料をクロマトグラフィーカラムに載せる工程であって、
    ここで該クロマトグラフィーカラムが、支持マトリックスおよびそれに結合した疎水性リガンドを含む固定相を含む、
    クロマトグラフィーカラムに載せる工程；
    および
    （ｉｉ）組成物を取得する目的で、水および第２の塩を含む溶離液で該クロマトグラフィーカラムを溶出する工程、
    を含み、
    ここで該水性原材料中の該切断異型体の相対量が少なくとも９０％減少する、
    方法。
  40. 請求項１～１６のいずれか１項または組み合わせの組成物または請求項２８～３９のいずれか１項または組み合わせの処理または方法によって生産される組成物、および薬学的に許容され得る担体を含む医薬品組成物。
  41. 医薬品組成物を調製する方法であって、該方法が、請求項１～１６のいずれか１項または組み合わせの組成物または請求項２８～３９のいずれか１項または組み合わせの処理または方法によって生産される組成物を、薬学的に許容され得る担体と組み合わせることを含む、方法。
  42. 癌、炎症性疾患、自己免疫疾患、またはそれらの組み合わせに罹患した対象を治療する方法であって、該方法が、請求項４０の医薬品組成物を該対象に投与することを含む、方法。
  43. 癌、炎症性疾患、自己免疫疾患、またはそれらの組み合わせに罹患した対象を治療する方法であって、該方法が、毒性用量よりも低い用量の活性化可能抗体の切断異型体、および特定用量の無損傷活性化可能抗体を含む組成物を投与することを含み、ここでＳＤＳ－ｃＧＥで判定した場合に無損傷活性化可能抗体の相対量が少なくとも９５％であり、かつその切断異型体の相対量が５％未満である、方法。
  44. 生物学的回収組成物または蛋白質親和性クロマトグラフィー溶出液において、７５～８５％収率の無損傷活性化可能抗体を取得しながら、ＳＤＳ－ｃＧＥで判定した場合に無損傷活性化可能抗体の切断異型体の量を７倍～１０倍減少させ、ＥＬＩＳＡで判定した場合にＨＣＰの量を８倍～１０倍減少させ、およびＳＥ－ＨＰＬＣで判定した場合にＨＭＷＳの量を７倍～１３倍減少させる処理法であって、該処理法が：
    （ａ）生物学的回収組成物または蛋白質親和性クロマトグラフィー溶出液をクロマトグラフィーカラムに載せる工程、
    ここで該クロマトグラフィーカラムが、支持マトリックスおよびそれに結合した疎水性置換基を含むリガンドを含む固定相を含み、
    および
    第１の塩および水を該クロマトグラフィーカラムに載せる工程；
    および
    （ｂ）溶出液を得る目的で、水および第２の塩を含む溶離液で該クロマトグラフィーカラムを溶出する工程、
    を含む、
    処理法。
  45. 請求項４４の処理法であって、ここで該溶出液が、ＳＤＳ－ｃＧＥで判定した場合に少なくとも９５％の無損傷活性化可能抗体、ＳＤＳ－ｃＧＥで判定した場合に２％未満の無損傷活性化可能抗体の切断異型体、ＥＬＩＳＡで判定した場合に５ｐｐｍ未満のＨＣＰ、およびＳＥ－ＨＰＬＣで判定した場合に１％未満のＨＭＷＳを含み、ここで無損傷活性化可能抗体％および切断異型体％が全体で１００％である、処理法。
  46. 請求項４４の処理法であって、ここで該溶出液が、ＳＤＳ－ｃＧＥで判定した場合に少なくとも９７％の無損傷活性化可能抗体、ＳＤＳ－ｃＧＥで判定した場合に１％未満の無損傷活性化可能抗体の切断異型体、ＥＬＩＳＡで判定した場合に２ｐｐｍ未満のＨＣＰ、およびＳＥ－ＨＰＬＣで判定した場合に０．５％未満のＨＭＷＳを含み、ここで無損傷活性化可能抗体％および切断異型体％が全体で１００％である、処理法。
  47. 請求項４４の処理法であって、ここで該溶出液が、
    ＳＤＳ－ｃＧＥで判定した場合に少なくとも９７％の無損傷活性化可能抗体、ＳＤＳ－ｃＧＥで判定した場合に１％未満の無損傷活性化可能抗体の切断異型体、ＥＬＩＳＡで判定した場合に６ｐｐｍ未満のＨＣＰ、およびＳＥ－ＨＰＬＣで判定した場合に１％未満のＨＭＷＳを含み、ここで無損傷活性化可能抗体％および切断異型体％が全体で１００％である、処理法。
  48. 請求項４４の処理法であって、ここで該溶出液が、
    ＳＤＳ－ｃＧＥで判定した場合に少なくとも９８％の無損傷活性化可能抗体、ＳＤＳ－ｃＧＥで判定した場合に０．５％未満の無損傷活性化可能抗体の切断異型体、ＥＬＩＳＡで判定した場合に５ｐｐｍ未満のＨＣＰ、およびＳＥ－ＨＰＬＣで判定した場合に０．５％未満のＨＭＷＳを含み、ここで無損傷活性化可能抗体％および切断異型体％が全体で１００％である、処理法。
  49. 請求項４４～４８のいずれか１項または組み合わせの処理法であって、ここで該切断異型体の配列が、無損傷活性化可能抗体の配列と少なくとも９５％同一である、処理法。
  50. 組成物生産処理中に活性化可能抗体およびその切断異型体の相対％を判定またはモニターする方法であって、該方法が：
    （ａ）活性化可能抗体の集団およびその切断異型体の集団を含む試料組成物をゲルキャピラリー電気泳動に供する工程；
    （ｂ）ゲルキャピラリー電気泳動で活性化可能抗体の集団をその切断異型体の集団から分離する工程；
    および
    （ｃ）無損傷のプロドメインを含むポリペプチドに対応するピーク面積およびその切断プロドメインを含むポリペプチドに対応するピーク面積を測定することによって、活性化可能抗体の集団およびその切断異型体の集団の相対量を定量する工程、
    を含む、方法。
  51. 請求項５０の方法であって、ここで該試料組成物が活性化可能抗体を発現する細胞の細胞回収組成物である、方法。
  52. 請求項５０～５１のいずれか１項の方法であって、ここで該試料組成物が蛋白質親和性クロマトグラフィーに供されている、方法。
  53. 請求項５０～５２のいずれか１項の方法であって、ここで該試料組成物がイオン交換クロマトグラフィーに供されている、方法。
  54. 請求項５０～５３のいずれか１項の方法であって、ここで該試料組成物が陰イオン交換クロマトグラフィーに供されている、方法。
  55. 請求項５０～５４のいずれか１項の方法であって、ここで該試料組成物が疎水性相互作用クロマトグラフィーに供されている、方法。
  56. 請求項５０～５５のいずれか１項の方法であって、ここで該試料組成物がマルチモーダルクロマトグラフィーに供されている、方法。
  57. 請求項５０の方法であって、ここで細胞回収、蛋白質親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、およびマルチモーダルクロマトグラフィーのうちの２種類以上のそれぞれを実施した後の、活性化可能抗体の集団およびその切断異型体の集団の相対％を定量することによって、該相対％がモニターされる、方法。
  58. 請求項５０の方法であって、ここで工程（ａ）が該試料組成物中の該活性化可能抗体およびその切断異型体を還元剤に接触させることを含む、方法。
  59. 請求項５８の方法であって、ここで該還元剤が、ジチオエリトリトール（ＤＴＥ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、βメルカプトエタノール、またはそれらの組み合わせである、方法。
  60. 請求項５０または請求項５８の方法であって、ここで工程（ａ）が、が該試料組成物中の該活性化可能抗体およびその切断異型体を変性剤に接触させることを含む、方法。
  61. 請求項６０の方法であって、ここで該変性剤がドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）である、方法。
  62. 請求項６１の方法であって、ＳＤＳ蛋白質分子量標準を用いたゲルキャピラリー電気泳動法を実施し分子量標準較正曲線を作成することをさらに含む、方法。
  63. 請求項５０～６２のいずれか１項の方法であって、ここで工程（ｃ）が、ゲルキャピラリー電気泳動法に供した該活性化可能抗体およびその切断異型体のそれぞれに対応するピークを含む電気泳動図を取得することを含む、方法。
  64. 請求項６３の方法であって、切断したプロドメインをコードするポリペプチドのピーク面積および無損傷のプロドメインをコードするポリペプチドのピーク面積を取得する目的で、該活性化可能抗体およびその切断異型体のそれぞれに対応する各ピークをピーク積分することをさらに含む、方法。
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