JP2023519967A - 多価免疫グロブリン単一可変ドメインの製造及び精製のための方法 - Google Patents
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Abstract
本開示は、少なくとも３つ又は少なくとも４つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含むポリペプチドの製造のための改善された方法に関する。より詳細には、少なくとも３つ又は少なくとも４つのＩＳＶＤを含むポリペプチドを製造、精製及び単離する改善された方法が提供され、ここで望ましくない生成物に関連するコンホメーション変異体は減少するか又は存在しない。
Description
１ 技術分野
本出願は、免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）の製造及び精製の分野に関する。
本出願は、免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）の製造及び精製の分野に関する。
本出願は、少なくとも３つ又は少なくとも４つのＩＳＶＤを含むポリペプチドの製造のための方法を提供する。より詳細には、少なくとも３つ又は少なくとも４つのＩＳＶＤを含むポリペプチドを製造、精製、及び単離するための改善された方法が提供され、ここで生成物に関連するコンホメーション変異体は、減少するか又は存在しない。本方法に従って製造／精製された少なくとも３つ又は少なくとも４つのＩＳＶＤを含むポリペプチドは、生成物に関連するコンホメーション変異体が減少しているか又は存在しないので、生成物均一性の点で優れている。このことは、例えば、少なくとも３つ又は少なくとも４つのＩＳＶＤを含むポリペプチドの治療応用の状況において有益である。従って、本方法は、少なくとも３つ又は少なくとも４つのＩＳＶＤを含む均一なポリペプチドの製造を提供し、ここで増加した均一性及び／又は効力が得られる。従って、本出願はまた、本発明の方法により得ることができる、少なくとも３つ又は少なくとも４つのＩＳＶＤを含むポリペプチドを含む、治療用途のための改善された組成物を記載する。
２ 背景技術
治療応用のために、免疫グロブリンは、非常に高い生成物品質のものでなくてはならない。これには、とりわけ、構造上の均一性が必要である。さらに、製造費用は、製造プロセスの間に直面する困難により強く影響を受ける。低い収率又は均一性の欠如は、製造プロセスの経済に影響を及ぼし、それ故、その治療の費用全体に影響を及ぼす。例えば、所望のタンパク質の構造変異体を所望のタンパク質から分離する困難性は、複雑で費用の高い精製方針を必要とするだろう。
治療応用のために、免疫グロブリンは、非常に高い生成物品質のものでなくてはならない。これには、とりわけ、構造上の均一性が必要である。さらに、製造費用は、製造プロセスの間に直面する困難により強く影響を受ける。低い収率又は均一性の欠如は、製造プロセスの経済に影響を及ぼし、それ故、その治療の費用全体に影響を及ぼす。例えば、所望のタンパク質の構造変異体を所望のタンパク質から分離する困難性は、複雑で費用の高い精製方針を必要とするだろう。
要件の中でもとりわけ、治療用タンパク質は完全に機能的でなければならない。タンパク質機能は、因子の中でもとりわけ、発酵、精製及び貯蔵の間のタンパク質の化学的及び物理的安定性に依存する。化学的不安定性は、とりわけ、脱アミド、異性化、ラセミ化、加水分解、酸化、ピログルタミン酸形成、カルバミル化、ベータ脱離及び／又はジスルフィド交換により引き起こされ得る。物理的不安定性は、抗体変性、凝集、沈殿、又は吸着により引き起こされ得る。それらの中で、凝集、脱アミド、及び酸化は抗体分解のもっとも一般的な原因であることが知られている（非特許文献１）。
機能的な生成物の適切な収量を得ることの限界は、従来の免疫グロブリン及びそれらのフラグメントについて、広範囲の発現系にわたって報告されており、これらとしては、とりわけ、インビトロ翻訳、大腸菌、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、チャイニーズハムスター卵巣細胞、昆虫細胞におけるバキュロウイルス系及びピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）が挙げられる（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３）。
これらの観察された困難性と対照的に、免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を、大腸菌のような原核生物、ピキア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）のような下等真核生物、又はＣＨＯ細胞のような高等真核生物のような様々な宿主細胞において、十分な速度及びレベルで完全に機能的な形態で容易に発現させることができる。例えば特許文献１において記載されるように、哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）のような高等真核生物におけるＩＳＶＤの生物学的製剤製造は、しばしば低ｐＨ処理による下流精製プロセスにおけるウイルスクリアランス／不活化を必要とする。酵母のような下等真核生物において、ウイルス不活化の問題は存在しない。免疫グロブリン単一可変ドメインは、単一可変ドメインによる抗原結合部位の形成を特徴とし、これは抗原認識のためのさらなるドメインとの相互作用（例えば、ＶＨ／ＶＬ相互作用の形態）を必要としない。免疫グロブリン単一可変ドメインの１つの具体例としてＮＡＮＯＢＯＤＹ（登録商標）ＩＳＶＤの製造は、例えば特許文献２において広範囲にわたって記載されている。
これらの想定される利点にもかかわらず、構造的に均一なＩＳＶＤ生成物を製造する際の問題が報告されている。例えば、特許文献３において、ＩＳＶＤの製造が少なくとも１つのジスルフィド架橋を欠いている生成物関連変異体を伴い得るということが示された。さらに、特許文献４は、少なくとも１つのカルバミル化アミノ酸残基を含む、製造されたＩＳＶＤの構造的変異体の存在を記載する。
Ｃｌｅｌａｎｄら、１９９３、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ １０：３０７－３７７
Ｒｙａｂｏｖａら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５：７９、１９９７
Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓら、ＦＥＥＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３８０：１９４、１９９６
Ｓｈｕｓｔａら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：７７３、１９９８
Ｈｓｕら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．＆ Ｐｕｒｉｆ．７：２８１、１９９６
Ｍｏｈａｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．＆ Ｂｉｏｅｎｇ．９８：６１１、２００７
Ｘｕら、Ｍｅｔａｂｏｌ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒ．７：２６９、２００５
Ｍｅｒｋら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２５：３２８、１９９９
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Ｄｅｍａｒｅｓｔ ａｎｄ Ｇｌａｓｅｒ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｄｅｖｅｌ．１１（５）：６７５－８７、２００８
Ｈｏｎｅｇｇｅｒ、Ｈａｎｄｂ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１８１：４７－６８、２００８
Ｗａｎｇら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．９６（１）：１－２６、２００７
しかし、少なくとも３つ又は少なくとも４つのＩＳＶＤを含む構造的に均一な機能的ＩＳＶＤ生成物を得るためのさらなる特定の問題は報告されていない。
３ 要旨
生成物に関連するコンホメーション変異体は、少なくとも３つ又は少なくとも４つのＩＳＶＤを含む多価ポリペプチド生成物の製造プロセスの間に観察された。この生成物に関連するコンホメーション変異体は、宿主において、特に酵母のような下等真核生物宿主である宿主において、少なくとも３つ又は少なくとも４つのＩＳＶＤを含む多価ポリペプチド生成物の製造の際に観察された。少なくとも３つ又は少なくとも４つのＩＳＶＤを含む多価ポリペプチド生成物のコンホメーション変異体が、宿主における、特に酵母のような下等真核生物宿主である宿主におけるポリペプチドの発現から生じることがわかった。本発明者らは、本明細書において提供されるような、分析用ＳＥ－ＨＰＬＣ及び／又は分析用ＩＥＸ－ＨＰＬＣのような特定の分析用クロマトグラフィー技術により生成物に関連するコンホメーション変異体を同定することができた。この技術は、少なくとも３つ又は少なくとも４つのＩＳＶＤを含む多価ポリペプチドを製造、精製、及び単離する方法に関し、生成物に関連するコンホメーション変異体の減少又はそれが存在しないことを特徴とする。
生成物に関連するコンホメーション変異体は、少なくとも３つ又は少なくとも４つのＩＳＶＤを含む多価ポリペプチド生成物の製造プロセスの間に観察された。この生成物に関連するコンホメーション変異体は、宿主において、特に酵母のような下等真核生物宿主である宿主において、少なくとも３つ又は少なくとも４つのＩＳＶＤを含む多価ポリペプチド生成物の製造の際に観察された。少なくとも３つ又は少なくとも４つのＩＳＶＤを含む多価ポリペプチド生成物のコンホメーション変異体が、宿主における、特に酵母のような下等真核生物宿主である宿主におけるポリペプチドの発現から生じることがわかった。本発明者らは、本明細書において提供されるような、分析用ＳＥ－ＨＰＬＣ及び／又は分析用ＩＥＸ－ＨＰＬＣのような特定の分析用クロマトグラフィー技術により生成物に関連するコンホメーション変異体を同定することができた。この技術は、少なくとも３つ又は少なくとも４つのＩＳＶＤを含む多価ポリペプチドを製造、精製、及び単離する方法に関し、生成物に関連するコンホメーション変異体の減少又はそれが存在しないことを特徴とする。
本出願は、少なくとも３つもしくは少なくとも４つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含むか又はそれらからなるポリペプチドを、該ポリペプチド及びそのコンホメーション変異体を含む組成物から単離又は精製する方法を提供し、ここで該方法は：
ａ） コンホメーション変異体を該（所望の）ポリペプチドに変換する条件を適用すること；
ｂ） コンホメーション変異体を除去すること；又は
ｃ） （ａ）及び（ｂ）の組み合わせ
を含む。
ａ） コンホメーション変異体を該（所望の）ポリペプチドに変換する条件を適用すること；
ｂ） コンホメーション変異体を除去すること；又は
ｃ） （ａ）及び（ｂ）の組み合わせ
を含む。
本出願により提供される方法により単離／精製しようとするポリペプチドは、宿主における発現により得ることができる。本出願において提供される方法により単離／精製しようとするポリペプチドは、ＣＨＯ細胞ではない宿主における発現により得ることができる。本出願により提供される方法により単離／精製しようとするポリペプチドは、酵母のような下等真核生物宿主における発現により得ることができる。コンホメーション変異体は、宿主、特に酵母のような下等真核生物宿主である宿主におけるポリペプチドの発現から生じる。限定することなく、酵母は、ピキア（コマガタエラ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ））、ハンゼヌラ、サッカロミセス、クリベロミセス、カンジダ、トルロプシス、トルラスポラ、分裂酵母、シテロミセス（Ｃｉｔｅｒｏｍｙｃｅｓ）、パキソレン（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）、デバロミセス（Ｄｅｂａｒｏｍｙｃｅｓ）、メトスクニコウィア（Ｍｅｔｓｃｈｕｎｉｋｏｗｉａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、ロイコスポリジウム（Ｌｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、ボトリオアスクス（Ｂｏｔｒｙｏａｓｃｕｓ）、スポリジオボルス（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ）、エンドミコプシス（Ｅｎｄｏｍｙｃｏｐｓｉｓ）であり得る。一態様において、本出願において提供される方法により単離／精製しようとするポリペプチドは、ピキア、特にピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）における発現により得ることができる。
一実施形態において、組成物中のコンホメーション変異体のパーセンテージ（％）は、５％又はそれ以下まで低下する。別の実施形態において、組成物中のコンホメーション変異体のパーセンテージ（％）は、コンホメーション変異体４％又はそれ以下、３％又はそれ以下、２％又はそれ以下、１％又はそれ以下、例えば０．５％、０．１％又は０％にまでも減少する。
本明細書において記載される方法により変換及び／又は除去しようとするコンホメーション変異体は、より緻密な形態を特徴とする。本明細書において記載される方法により変換又は除去しようとするコンホメーション変異体はまた。減少した流体力学的体積を特徴とする。コンホメーション変異体の緻密な形態は、減少した流体力学的体積に起因し得る。コンホメーション変異体はまた、変化した表面電荷及び／又は表面疎水性を特徴とし得る。従って、コンホメーション変異体は、減少した流体力学的体積、変化した表面電荷、及び／又は変化した表面疎水性を特徴とし得る。いずれの仮説にも拘束されることなく、本明細書において記載される方法により変換及び／又は除去しようとするコンホメーション変異体は、ポリペプチド中に存在するＩＳＶＤビルディングブロック間の弱い分子内相互作用を特徴とするかもしれず、これが（所望の）ポリペプチドと比較して、コンホメーション変異体の減少した流体力学的体積、変化した表面電荷、及び／又は変化した表面疎水性を生じているかもしれない。
上記の生物物理学的パラメーターの差異に起因して、本明細書において提供される方法により変換及び／又は除去しようとするコンホメーション変異体は、分析用ＳＥ－ＨＰＬＣ及び／又は分析用ＩＥＸ－ＨＰＬＣのようなクロマトグラフィー技術により識別可能である。従って、一実施形態において、本明細書において提供される方法により変換及び／又は除去しようとするコンホメーション変異体は、上記ポリペプチドと比較してＳＥ－ＨＰＬＣにおける増加した保持時間を特徴とする。別の実施形態において、コンホメーション変異体は、上記ポリペプチドと比較してＩＥＸ－ＨＰＬＣにおける変化した保持時間を特徴とする。さらに別の実施形態において、コンホメーション変異体は、上記ポリペプチドと比較して、ＳＥ－ＨＰＬＣにおける増加した保持時間及びＩＥＸ－ＨＰＬＣにおける変化した保持時間を特徴とする。
一態様において、コンホメーション変異体は、適切な条件を適用することにより上記ポリペプチドに変換され、ここでコンホメーション変異体を該ポリペプチドに変換する条件は：
ｉ） 単離及び／もしくは精製方法の工程において低ｐＨ処理を適用すること；
ｉｉ） 単離及び／もしくは精製方法の工程においてカオトロピック剤を適用すること；
ｉｉｉ） 単離及び／もしくは精製方法の工程において熱ストレスを加えること；又は
ｉｖ） ｉ）～ｉｉｉ）のいずれかの組み合わせ
から選択される。
ｉ） 単離及び／もしくは精製方法の工程において低ｐＨ処理を適用すること；
ｉｉ） 単離及び／もしくは精製方法の工程においてカオトロピック剤を適用すること；
ｉｉｉ） 単離及び／もしくは精製方法の工程において熱ストレスを加えること；又は
ｉｖ） ｉ）～ｉｉｉ）のいずれかの組み合わせ
から選択される。
コンホメーション変異体を上記ポリペプチドに変換するための低ｐＨ処理は、コンホメーション変異体を含む組成物のｐＨを約ｐＨ３．２もしくはそれ以下、又は約ｐＨ３．０もしくはそれ以下に低下させることを含む。一態様において、ｐＨを、約ｐＨ３．２と約ｐＨ２．１との間、約３．０と約ｐＨ２．１との間、約ｐＨ２．９と約ｐＨ２．１との間、約ｐＨ２．７と約ｐＨ２．１との間、又は約ｐＨ２．６と約ｐＨ２．３との間に低下させる。ｐＨ処理は、コンホメーション変異体を上記ポリペプチドに変換するために十分な量の時間の間適用される。本出願において提供される教示を考慮して、当業者は、コンホメーション変異体の上記ポリペプチドへの変換が経時的に増加することがわかる。しかし、実用的な有用なレベルまでのコンホメーション変異体の上記ポリペプチドへの変換は、少なくとも０．５時間、例えば少なくとも約１時間の低ｐＨ処理の後に既に達成される。従って、一態様において、低ｐＨ処理は、少なくとも約０．５時間、少なくとも約１時間、少なくとも約２時間、又は少なくとも約４時間適用される。特定の態様において、ｐＨを、約ｐＨ３．２と約ｐＨ２．１との間に、例えば約ｐＨ３．２、３．０、２．９、２．７、２．５、２．３、又は２．１に低下させる。別の特定の態様において、ｐＨを、約ｐＨ３．０と約ｐＨ２．１との間、例えば約ｐＨ３．０、２．９、２．７、２．５、２．３、又は２．１に低下させる。別の特定の態様において、ｐＨを、約ｐＨ２．９と約ｐＨ２．１との間、例えば約ｐＨ、２．９ ２．７、２．５、２．３、又は２．１に低下させる。別の特定の態様において、ｐＨを、約ｐＨ２．５と約ｐＨ２．１との間、例えばｐＨ２．５、ｐＨ２．３、又はｐＨ２．１に低下させる。別の特定の態様において、ｐＨを、約ｐＨ３．２又はそれ以下に少なくとも０．５時間、例えば少なくとも１時間低下させる。例えば、ｐＨを、約ｐＨ３．２と約２．１との間に少なくとも約０．５時間、例えば少なくとも約１．０時間低下させる。さらに別の態様において、ｐＨを、約ｐＨ３．０又はそれ以下に少なくとも０．５時間、例えば少なくとも１時間低下させる。例えば、ｐＨを、約ｐＨ３．０と約２．１との間に少なくとも約０．５時間、例えば少なくとも１．０時間低下させる。さらに別の態様において、ｐＨを、約ｐＨ２．９又はそれ以下に少なくとも０．５時間、例えば少なくとも１時間低下させる。例えば、ｐＨを、約ｐＨ２．９と約２．１との間に少なくとも約０．５時間、例えば少なくとも１．０時間低下させる。さらに別の態様において、ｐＨを、約ｐＨ２．７又はそれ以下に少なくとも０．５時間、例えば少なくとも１時間低下させる。例えば、ｐＨを、約ｐＨ２．７と約２．１との間に少なくとも約０．５時間、例えば少なくとも約１．０時間低下させる。別の態様において、低ｐＨ処理は、低ｐＨ処理において使用されるｐＨを少なくとも１ｐＨ単位増加させることにより終了される。一実施形態において、単離／精製しようとするポリペプチドは、ピキア、特にピキア・パストリスにおける発現により得ることができる。
別の特定の態様において、ｐＨを、約ｐＨ２．５又はそれ以下に少なくとも約１時間、又は少なくとも約２時間低下させる。別の特定の態様において、ｐＨを、約ｐＨ２．３又はそれ以下に少なくとも約１時間低下させる。別の態様において、低ｐＨ処理は、低ｐＨ処理において使用されるｐＨを少なくとも１ｐＨ単位増加させることにより終了される。一実施形態において、単離／精製しようとするポリペプチドは、ピキア、特にピキア・パストリスにおける発現から得ることができる。
コンホメーション変異体を上記ポリペプチドに変換するために使用される低ｐＨ処理は、クロマトグラフィー技術に基づく精製工程の前又は後に適用され得る。クロマトグラフィー技術に基づく精製工程の前には、精製しようとするポリペプチドを含む組成物をクロマトグラフィー技術の固定相にアプライする前に、低ｐＨ処理が適用されることを意味する。クロマトグラフィー技術に基づく精製工程の後には、精製しようとするポリペプチドをクロマトグラフィー技術の固定相から溶出した後に、低ｐＨ処理が適用されることを意味する。クロマトグラフィー技術の固定相は、樹脂又はメンブレンを含むクロマトグラフィーカラムのような使用されるクロマトグラフィー材料である。従って、低ｐＨ処理は、使用されるクロマトグラフィー技術の固定相からポリペプチドを溶出した後に適用され得る。低ｐＨ処理は、クロマトグラフィー技術に基づく精製工程により得られた溶出液に適用され得る。この実施形態において、上記ポリペプチドはクロマトグラフィー技術の固定相／クロマトグラフィー材料に結合していないか又は溶出されていない（すなわち、まだ接触している）。溶出後に、次いで得られた溶出液を、本明細書に記載されるように、コンホメーション変異体を上記ポリペプチドに変換するために十分な量の時間の間低ｐＨ処理に調整する。従って、一実施形態において、低ｐＨ処理は、クロマトグラフィー技術に基づく精製工程の固定相からのポリペプチドの溶出後に、すなわち溶出液に対して適用される。一実施形態において、単離／精製しようとするポリペプチドは、ピキア、特にピキア・パストリスにおける発現により得ることができる。
コンホメーション変異体を上記ポリペプチドに変換するための低ｐＨ処理はまた、クロマトグラフィー技術に基づく精製工程の間に適用してもよい。精製工程の間は、低ｐＨ処理が、精製しようとするポリペプチドを含む組成物をクロマトグラフィー技術の固定相にアプライしながら（すなわち、精製しようとするポリペプチドを含む組成物を、クロマトグラフィー技術の固定相／クロマトグラフィー材料と接触させる）適用されることを意味する。精製工程の間に、精製しようとするポリペプチドを含む組成物は、固定相／クロマトグラフィー材料と接触していてもよく（例えば、サイズ排除クロマトグラフィー）、又は固定相／クロマトグラフィー材料に（可逆的に）結合されてもよい（例えば、アフィニティークロマトグラフィーにおけるように）。一態様において、溶出緩衝液は、ｐＨ２．５に等しいか又はそれ以下のｐＨを有する。溶出液の実際のｐＨは、低ｐＨ溶出緩衝液の初期ｐＨより常に高いことが一般的に知られている。例えば、ｐＨ３．０の溶出緩衝液を用いた溶出は、ｐＨ３．８の溶出液ｐＨを生じ得る。理由は、使用されるクロマトグラフィー技術の固定相に存在し、そしてより高いｐＨを有する残留液（例えば、固定相の貯蔵、平衡化もしくは回収のために使用される緩衝液、又は固定相へのポリペプチドの結合のために使用される緩衝液）が、クロマトグラフィー技術に基づく精製工程の間に低ｐＨ処理において使用される低ｐＨ緩衝液と混合するということかもしれない。従って、あるいは、溶出緩衝液は、上記ポリペプチドを含有する得られた溶出液がｐＨ２．９に等しいか又はそれ以下のｐＨを有するようなｐＨを有する。これらの態様において、得られた溶出液は、場合によりｐＨ３．２に等しいか又はそれ以下のｐＨ、例えばｐＨ２．７に少なくとも約０．５時間、例えば少なくとも１時間調整される。一実施形態において、単離／精製しようとするポリペプチドは、ピキア、特にピキア・パストリスにおける発現により得ることができる。
本出願において提供される教示を考慮して、当業者は、コンホメーション変異体の上記ポリペプチドへの変換が経時的に増加することがわかる。しかし、実用的な有用なレベルまでのコンホメーション変異体の上記ポリペプチドへの変換は、少なくとも０．５時間、例えば少なくとも約１時間の低ｐＨ処理後に既に達成される。一態様において、溶出液のｐＨを、約ｐＨ３．２又はそれ以下に少なくとも０．５時間、例えば少なくとも１時間低下させる。例えば、ｐＨを、約ｐＨ３．２と約ｐＨ２．１との間に少なくとも約０．５時間、例えば少なくとも約１．０時間低下させる。別の態様において、溶出液のｐＨを、約ｐＨ３．０又はそれ以下に少なくとも０．５時間、例えば少なくとも１時間低下させる。例えば、ｐＨを、約ｐＨ３．０と約ｐＨ２．１との間に少なくとも約０．５時間、例えば少なくとも約１．０時間低下させる。さらに別の態様において、得られた溶出液のｐＨを、約ｐＨ２．９又はそれ以下に少なくとも０．５時間、例えば少なくとも１時間低下させる。例えば、ｐＨを、約ｐＨ２．９と約ｐＨ２．１との間に少なくとも約０．５時間、例えば少なくとも１．０時間低下させる。さらに別の態様において、得られた溶出液のｐＨを、約ｐＨ２．７又はそれ以下に少なくとも０．５時間、例えば少なくとも１時間低下させる。例えば、ｐＨを、約ｐＨ２．７と約ｐＨ２．１との間に少なくとも約０．５時間、例えば少なくとも約１．０時間低下させる。あるいは、上記ポリペプチドを含有する得られた溶出液のｐＨを、ｐＨ２．５に等しいか又はそれ以下のｐＨに低下させる。例えば、ｐＨを、ｐＨ２．７又はそれ以下に少なくとも０．５時間、例えば、少なくとも１時間低下させる。一実施形態において、単離／精製しようとするポリペプチドは、ピキア、特にピキア・パストリスにおける発現により得ることができる。
別の態様において、低ｐＨ処理は、低ｐＨ処理において使用されるｐＨを少なくとも１ｐＨ単位増加させることにより終了する。
別の態様において、コンホメーション変異体を上記ポリペプチドに変換するための低ｐＨ処理は、プロテインＡベースのアフィニティークロマトグラフィーに基づく精製工程の間に適用される。一実施形態において、単離／精製しようとするポリペプチドは、ピキア、特にピキア・パストリスにおける発現により得ることができる。特定の態様において、クロマトグラフィー技術はプロテインＡベースのアフィニティークロマトグラフィーであり、ここで溶出緩衝液は約ｐＨ２．２のｐＨを有し、そしてここで得られた溶出液のｐＨは、約ｐＨ２．５のｐＨに少なくとも約１．５時間調整される。
一態様において、低ｐＨ処理は、ｐＨを約ｐＨ５．５又はそれ以上に増加させることにより終了する。さらに、一態様において、低ｐＨ処理は、クロマトグラフィー技術に基づく精製工程の後に適用される。さらに、一態様において、低ｐＨ処理は室温で適用される。
別の態様において、コンホメーション変異体を上記ポリペプチドに変換するためにカオトロピック剤が使用される。一態様において、カオトロピック剤は、塩化グアニジニウム（ＧｕＨＣｌ）である。一態様において、ＧｕＨＣｌは、少なくとも約１Ｍ、例えば約１Ｍと約２Ｍとの間の最終濃度である。一態様において、ＧｕＨＣｌは、少なくとも約２Ｍの最終濃度である。カオトロピック剤処理は、コンホメーション変異体を上記ポリペプチドに変換するために十分な量の時間適用される。一態様において、ＧｕＨＣｌは、少なくとも０．５時間、又は少なくとも１時間適用される。カオトロピック剤処理は、ＩＳＶＤポリペプチド生成物を、カオトロピック剤を含まない新しい緩衝液系に移すことにより終了される。一態様において、カオトロピック剤処理は、クロマトグラフィー技術に基づく精製工程の後に適用される。一態様において、カオトロピック剤は室温で適用される。一実施形態において、単離／精製しようとするポリペプチドは、ピキア、特にピキア・パストリスにおける発現により得ることができる。
コンホメーション変異体を上記ポリペプチドに変換するために加えられる熱ストレスは、約４０℃～約６０℃の間、約４５℃～約６０℃の間、又は約５０℃～約６０℃の間でコンホメーション変異体を含む組成物をインキュベートすることを含む。熱ストレスは、コンホメーション変異体を上記ポリペプチドに変換するために十分な量の時間加えられる。一態様において、熱ストレスは少なくとも約１時間加えられる。熱ストレスは、温度を室温まで低下させることにより終了される。一態様において、熱ストレスは、クロマトグラフィー技術に基づく精製工程の後に加えられる。一実施形態において、単離／精製しようとするポリペプチドは、ピキア、特にピキア・パストリスにおける発現により得ることができる。
別の態様において、コンホメーション変異体は、上記条件の組み合わせを使用してポリペプチドに変換される。
別の態様において、コンホメーション変異体は、少なくとも３つ又は少なくとも４つのＩＳＶＤを含む多価ポリペプチドを含む組成物から、１つ又はそれ以上のクロマトグラフィー技術により除去される。一態様において、クロマトグラフィー技術は、流体力学的体積、表面電荷又は表面疎水性に基づくクロマトグラフィー技術である。一態様において、クロマトグラフィー技術は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）、カチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）、ミックスモードクロマトグラフィー（ＭＭＣ）、及び／又は疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）である、一実施形態において、単離／精製しようとするポリペプチドは、ピキア、特にピキア・パストリスにおける発現により得ることができる。
さらなる態様において、コンホメーション変異体は、少なくとも３つ又は少なくとも４つのＩＳＶＤを含む多価ポリペプチドを含む組成物を、樹脂１ｍｌあたりタンパク質少なくとも２０ｍｇ、樹脂１ｍｌあたりタンパク質少なくとも３０ｍｇ、又は樹脂１ｍｌあたりタンパク質少なくとも４５ｍｇの負荷率を使用してクロマトグラフィーカラムにアプライすることにより除去される。この態様の一実施形態において、クロマトグラフィーカラムはプロテインＡカラムである。一実施形態において、単離／精製しようとするポリペプチドは、ピキア、特にピキア・パストリスにおける発現により得ることができる。
別の態様において、コンホメーション変異体を上記ポリペプチドに変換する条件の１つ又はそれ以上が単独で、又はコンホメーション変異体を除去する１つもしくはそれ以上の技術と組み合わせて適用される。
少なくとも３つ又は少なくとも４つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含むポリペプチドを製造する方法もまた提供され、ここで該方法は：
ａ）
ｉ） 単離及び／もしくは精製方法の工程において低ｐＨ処理を適用すること；
ｉｉ） 単離及び／もしくは精製方法の工程においてカオトロピック剤を適用すること；
ｉｉｉ） 単離及び／もしくは精製方法の工程において熱ストレスを加えること；もしくは
ｉｖ） ｉ）～ｉｉｉ）のいずれかの組み合わせ、
によりコンホメーション変異体を上記ポリペプチドに変換すること
［ここで条件は本明細書においてさらに記載されるとおりである］；
ｂ） 本明細書においてさらに記載されるようにコンホメーション変異体を除去すること；又は
ｃ） ａ）及びｂ）の組み合わせ
を含む。
ａ）
ｉ） 単離及び／もしくは精製方法の工程において低ｐＨ処理を適用すること；
ｉｉ） 単離及び／もしくは精製方法の工程においてカオトロピック剤を適用すること；
ｉｉｉ） 単離及び／もしくは精製方法の工程において熱ストレスを加えること；もしくは
ｉｖ） ｉ）～ｉｉｉ）のいずれかの組み合わせ、
によりコンホメーション変異体を上記ポリペプチドに変換すること
［ここで条件は本明細書においてさらに記載されるとおりである］；
ｂ） 本明細書においてさらに記載されるようにコンホメーション変異体を除去すること；又は
ｃ） ａ）及びｂ）の組み合わせ
を含む。
特に、以下の実施形態が提供される：
実施形態１． 少なくとも３つ又は少なくとも４つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含むか又はそれらからなるポリペプチドを、該ポリペプチド及びそのコンホメーション変異体を含む組成物から単離又は精製する方法であって、該方法は：
ａ） コンホメーション変異体を該ポリペプチドに変換する条件を適用すること；
ｂ） コンホメーション変異体を除去すること；又は
ｃ） （ａ）及び（ｂ）の組み合わせ
を含み、
場合により、ここで単離又は精製しようとするポリペプチドは、ＣＨＯ細胞ではない宿主における発現により得ることができる、上記方法。
実施形態１． 少なくとも３つ又は少なくとも４つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含むか又はそれらからなるポリペプチドを、該ポリペプチド及びそのコンホメーション変異体を含む組成物から単離又は精製する方法であって、該方法は：
ａ） コンホメーション変異体を該ポリペプチドに変換する条件を適用すること；
ｂ） コンホメーション変異体を除去すること；又は
ｃ） （ａ）及び（ｂ）の組み合わせ
を含み、
場合により、ここで単離又は精製しようとするポリペプチドは、ＣＨＯ細胞ではない宿主における発現により得ることができる、上記方法。
実施形態２． コンホメーション変異体は、下等真核生物宿主のような、ＣＨＯ細胞ではない宿主における上記ポリペプチドの発現から生じる、実施形態１に記載の方法。
実施形態３：単離又は精製しようとするポリペプチドは、下等真核生物宿主である宿主における発現により得ることができる、実施形態１に記載の方法。
実施形態４：下等真核生物宿主は、ピキア、ハンゼヌラ、サッカロミセス、クリベロミセス、カンジダ、トルロプシス、トルラスポラ、分裂酵母、シテロミセス、パキソレン、デバロミセス、メトスクニコウィア、ロドスポリジウム、ロイコスポリジウム、ボトリオアスクス、スポリジオボルス、エンドミコプシスのような酵母である、実施形態２又は実施形態３に記載の方法。
実施形態５：酵母はピキア・パストリスのようなピキアである、実施形態４に記載の方法。
実施形態６． コンホメーション変異体は、上記ポリペプチドと比較してより緻密な形態を特徴とする、．実施形態１～５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態７． コンホメーション変異体は、上記ポリペプチドと比較して減少した流体力学的体積を有する、実施形態１～６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態８． コンホメーション変異体は、上記ポリペプチドと比較して、ＳＥ－ＨＰＬＣにおける増加した保持時間を特徴とする、実施形態１～７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態９． コンホメーション変異体は、上記ポリペプチドと比較して、ＩＥＸ－ＨＰＬＣにおける変化した保持時間を特徴とする、実施形態１～８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１０． コンホメーション変異体は、上記ポリペプチドと比較して、ＩＥＸ－ＨＰＬＣにおける減少した保持時間を特徴とする、実施形態９に記載の方法。
実施形態１１． コンホメーション変異体は、上記ポリペプチドと比較して、ＩＥＸ－ＨＰＬＣにおける増加した保持時間を特徴とする、実施形態９に記載の方法。
実施形態１２． ポリペプチドは、少なくとも３つのＩＳＶＤを含むか又はそれらからなる、実施形態１～１１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１３． ポリペプチドは、少なくとも４つのＩＳＶＤを含むか又はそれらからなる、実施形態１～１２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１４． ポリペプチドは、３つのＩＳＶＤ、４つのＩＳＶＤ、又は５つのＩＳＶＤを含むか又はそれらからなる、実施形態１～１１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１５． コンホメーション変異体を上記ポリペプチドに変換する条件は：
ｉ） 単離及び／もしくは精製方法の工程において低ｐＨ処理を適用すること、［場合により、ここで低ｐＨ処理は、組成物のｐＨを約ｐＨ３．２もしくはそれ以下、又は約ｐＨ３．０もしくはそれ以下に低下させることを含む］；
ｉｉ） 単離及び／もしくは精製方法の工程においてカオトロピック剤を適用すること、［場合により、ここでカオトロピック剤は塩化グアニジニウム（ＧｕＨＣｌ）である］；
ｉｉｉ） 単離及び／もしくは精製方法の工程において熱ストレスを加えること、［場合により、コンホメーション変異体を４０℃～約６０℃でインキュベートすることを含む］；又は
ｉｖ） ｉ）～ｉｉｉ）のいずれかの組み合わせ
から選択され、
ここで、条件はいずれも、コンホメーション変異体をポリペプチドに変換するために十分な量の時間適用される、実施形態１～１４のいずれか１つに記載の方法。
ｉ） 単離及び／もしくは精製方法の工程において低ｐＨ処理を適用すること、［場合により、ここで低ｐＨ処理は、組成物のｐＨを約ｐＨ３．２もしくはそれ以下、又は約ｐＨ３．０もしくはそれ以下に低下させることを含む］；
ｉｉ） 単離及び／もしくは精製方法の工程においてカオトロピック剤を適用すること、［場合により、ここでカオトロピック剤は塩化グアニジニウム（ＧｕＨＣｌ）である］；
ｉｉｉ） 単離及び／もしくは精製方法の工程において熱ストレスを加えること、［場合により、コンホメーション変異体を４０℃～約６０℃でインキュベートすることを含む］；又は
ｉｖ） ｉ）～ｉｉｉ）のいずれかの組み合わせ
から選択され、
ここで、条件はいずれも、コンホメーション変異体をポリペプチドに変換するために十分な量の時間適用される、実施形態１～１４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１６：ポリペプチドは、少なくとも４つのＩＳＶＤを含むか又はそれらからなり、そして低ｐＨ処理は、組成物のｐＨを約ｐＨ３．０又はそれ以下に低下させることを含む、実施形態１５に記載の方法。
実施形態１７． ｐＨを、約ｐＨ３．２と約ｐＨ２．１との間、約ｐＨ３．０と約ｐＨ２．１との間、約ｐＨ２．９と約ｐＨ２．１との間、約ｐＨ２．７と約ｐＨ２．１との間、又は約ｐＨ２．６と約ｐＨ２．３との間に低下させる、実施形態１５又は実施形態１６に記載の方法。
実施形態１８． ｐＨを、約ｐＨ３．０、約ｐＨ２．９、約ｐＨ２．８、約ｐＨ２．７、約ｐＨ２．６、約ｐＨ２．５、約ｐＨ２．４、約ｐＨ２．３、約ｐＨ２．２、又は約ｐＨ２．１に低下させる、実施形態１７に記載の方法。
実施形態１９． 低ｐＨ処理は、少なくとも約０．５時間、少なくとも約１時間、少なくとも約２時間、又は少なくとも約４時間適用される、実施形態１５～１８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２０． ｐＨを約ｐＨ２．５又はそれ以下に低下させる、実施形態１５～１９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２１． ｐＨを、約ｐＨ３．０と約ｐＨ２．１との間に少なくとも０．５時間、少なくとも１時間、場合により少なくとも２時間低下させる、実施形態１５～１９のいずか１つに記載の方法。
実施形態２２． ｐＨを約ｐＨ２．７と約ｐＨ２．１との間に低下させる、実施形態２１に記載の方法。
実施形態２３． ｐＨを、約ｐＨ２．７と約ｐＨ２．１との間に少なくとも１時間、場合により少なくとも２時間低下させる、実施形態１５～１９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２４． ｐＨを、約ｐＨ２．６と約ｐＨ２．３との間に少なくとも１時間、場合により少なくとも２時間低下させる、実施形態２３に記載の方法。
実施形態２５． 多価ポリペプチドは５つのＩＳＶＤを含むか又はそれらからなる、実施形態１５～２４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態２６． ｐＨを約ｐＨ２．６又はそれ以下に低下させる、実施形態２５に記載の方法。
実施形態２７． 低ｐＨ処理は１～２時間の間適用される、実施形態２５又は２６に記載の方法。
実施形態２８． ポリペプチドは配列番号１からなる、実施形態２７に記載の方法。
実施形態２９． 多価ポリペプチドは、４つのＩＳＶＤを含むか又はそれらからなる、実施形態１５～２４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３０． ｐＨを、約ｐＨ２．９又はそれ以下、例えば約ｐＨ２．５に低下させる、実施形態２９に記載の方法。
実施形態３１． 低ｐＨ処理は１～２時間の間適用される、実施形態２９又は３０に記載の方法。
実施形態３２． ポリペプチドは配列番号２からなる、実施形態３１に記載の方法。
実施形態３３． ポリペプチドは、配列番号７０又は配列番号７１からなる、実施形態３１に記載の方法。
実施形態３４． 多価ポリペプチドは、３つのＩＳＶＤを含むか又はそれらからなる、実施形態１５～２４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３５． ｐＨを、約ｐＨ３．０又はそれ以下、例えば約ｐＨ２．５に低下させる、実施形態３４に記載の方法。
実施形態３６． 低ｐＨ処理は、２～４時間の間適用される、実施形態３４又は３５に記載の方法。
実施形態３７． ポリペプチドは配列番号６９からなる、実施形態３６に記載の方法。
実施形態３８． 低ｐＨ処理は、ｐＨを少なくとも１ｐＨ単位増加させるか、少なくとも２ｐＨ単位増加させるか、又は約ｐＨ５．５もしくはそれ以上に増加させることにより終了される、実施形態１５～３７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態３９． 低ｐＨ処理は、クロマトグラフィー技術に基づく精製工程の前又は後に適用される、実施形態１５～３８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４０． 低ｐＨ処理は、クロマトグラフィー技術の固定相に組成物をアプライする前に適用される、実施形態３９に記載の方法。
実施形態４１． 低ｐＨ処理は、クロマトグラフィー技術の固定相から組成物を溶出した後に適用される、実施形態３９に記載の方法。
実施形態４２． 低ｐＨ処理は、クロマトグラフィー技術に基づく精製工程の間に適用され、ここで精製しようとするポリペプチドを含む組成物は、クロマトグラフィー技術の固定相と接触している、実施形態１５～３８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４３． クロマトグラフィー技術はプロテインＡベースのアフィニティークロマトグラフィーである、実施形態３９～４２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４４． クロマトグラフィー技術はプロテインＡベースのアフィニティークロマトグラフィーであり、そしてここで溶出緩衝液はｐＨ２．５に等しいか又はそれ以下のｐＨを有する、実施形態４３に記載の方法。
実施形態４５． クロマトグラフィー技術はプロテインＡベースのアフィニティークロマトグラフィーであり、そしてここで溶出緩衝液は、上記ポリペプチドを含有する得られる溶出液がｐＨ２．９に等しいか又はそれ以下のｐＨを有するようなｐＨを有する、実施形態４３に記載の方法。
実施形態４６． 上記ポリペプチドを含有する溶出液のｐＨは、ｐＨ３．２に等しいかもしくはそれ以下のｐＨ、例えばｐＨ３．０に等しいかもしくはそれ以下のｐＨ、又はｐＨ２．７に等しいかもしくはそれ以下のｐＨに、場合により少なくとも約１時間調整される、実施形態４３～４５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４７． 上記ポリペプチドを含有する溶出液のｐＨは、ｐＨ２．５に等しいか又はそれ以下のｐＨに、場合により少なくとも約１時間調整される、実施形態４３～４５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４８． クロマトグラフィー技術はプロテインＡベースのアフィニティークロマトグラフィーであり、ここで溶出緩衝液は約ｐＨ２．２のｐＨを有し、そしてここで上記ポリペプチドを含有する溶出液のｐＨは、約ｐＨ２．５のｐＨに少なくとも約１．５時間調整される、実施形態４２に記載の方法。
実施形態４９． 低ｐＨ処理後の溶出液のｐＨを、少なくとも１ｐＨ単位増加させるか、少なくとも２ｐＨ単位増加させるか、又は約ｐＨ５．５もしくはそれ以上のｐＨに増加させる、実施形態４２～４８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５０． 低ｐＨ処理は室温で適用される、実施形態１５～４９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５１． 低ｐＨ処理の後に：
ａ） 適切な量の１Ｍ酢酸ナトリウム ｐＨ５．５を組成物／溶出液に加えて、約５０ｍＭ酢酸ナトリウムの最終濃度を得る工程；
ｂ） 組成物／溶出液のｐＨをｐＨ５．５に調整する工程；及び
ｃ） 水を使用して、組成物／溶出液の導電率を約６ｍＳ／ｃｍ又はそれ以下に調整する工程
が続く、実施形態１５～５０のいずれか１つに記載の方法。
ａ） 適切な量の１Ｍ酢酸ナトリウム ｐＨ５．５を組成物／溶出液に加えて、約５０ｍＭ酢酸ナトリウムの最終濃度を得る工程；
ｂ） 組成物／溶出液のｐＨをｐＨ５．５に調整する工程；及び
ｃ） 水を使用して、組成物／溶出液の導電率を約６ｍＳ／ｃｍ又はそれ以下に調整する工程
が続く、実施形態１５～５０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５２． ｂ）におけるｐＨはＮａＯＨを用いて調整される、実施形態５１に記載の方法。
実施形態５３． ポリペプチドは５つのＩＳＶＤを含むか又はそれらからなる、実施形態５１又は５２に記載の方法。
実施形態５４． ポリペプチドは４つのＩＳＶＤを含むか又はそれらからなる、実施形態５１又は５２に記載の方法。
実施形態５５． ポリペプチドは配列番号２からなる、実施形態５４に記載の方法。
実施形態５６． ＧｕＨＣｌは、少なくとも約１Ｍ、又は少なくとも約２Ｍの最終濃度で適用される、実施形態１５～５５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５７． ＧｕＨＣｌは、少なくとも０．５時間、又は少なくとも１時間適用される、実施形態１５～５６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５８． ＧｕＨＣｌは、少なくとも約１Ｍの最終濃度で少なくとも０．５時間適用される、実施形態５６又は５７に記載の方法。
実施形態５９． ＧｕＨＣｌは、少なくとも約１Ｍの最終濃度で０．５時間～１時間適用される、実施形態５８に記載の方法。
実施形態６０． ＧｕＨＣｌは、約２Ｍの最終濃度で少なくとも０．５時間適用される、実施形態５６又は５７に記載の方法、
実施形態６１． ＧｕＨＣｌは、少なくとも約２Ｍの最終濃度で０．５時間～１時間適用される、実施形態６０に記載の方法。
実施形態６１． ＧｕＨＣｌは、少なくとも約２Ｍの最終濃度で０．５時間～１時間適用される、実施形態６０に記載の方法。
実施形態６２． ポリペプチドは、少なくとも４つのＩＳＶＤを含むか又はそれらからなる、実施形態５６～６１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６３． ポリペプチドは配列番号１からなる、実施形態６１に記載の方法。
実施形態６４． ポリペプチドは配列番号２からなる、実施形態６１に記載の方法。
実施形態６５． カオトロピック剤処理は室温で適用される、実施形態１５又は５６～６４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６６． カオトロピック剤処理は、クロマトグラフィー技術に基づく精製工程の前又は後に適用される、実施形態１５又は５６～６５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６６． カオトロピック剤処理は、クロマトグラフィー技術に基づく精製工程の前又は後に適用される、実施形態１５又は５６～６５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６７． 上記ポリペプチドは、クロマトグラフィー技術の固定相から溶出され、そしてカオトロピック剤処理は、得られた溶出液に適用される、実施形態６６に記載の方法。
実施形態６８． 熱ストレスは、少なくとも約１時間、又は約１～４時間加えられる、実施形態１５～６７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６９． 熱ストレスは、約４０℃～約６０℃、約４５℃～約６０℃、又は約５０℃～約６０℃で加えられる、実施形態６８に記載の方法。
実施形態７０． 熱ストレスは、約４０℃～約５５℃、約４５℃～５５℃、又は約４８℃～約５２℃で加えられる、実施形態６８に記載の方法。
実施形態７１． 熱ストレスは約５０℃で加えられる、実施形態６８に記載の方法。
実施形態７２． 熱ストレスは約５０℃で１時間加えられる、実施形態７１に記載の方法。
実施形態７３． ポリペプチドは少なくとも４つのＩＳＶＤを含むか又はそれらからなる、実施形態７２に記載の方法。
実施形態７４． ポリペプチドは配列番号１からなる、実施形態７２に記載の方法。
実施形態７５． ポリペプチドは配列番号２からなる、実施形態７２に記載の方法。
実施形態７６． 熱ストレスは、クロマトグラフィー技術に基づく精製工程の前又は後に加えられる、実施形態１５、又は６８～７５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態７７． 熱ストレス処理は、クロマトグラフィー技術の固定相に組成物をアプライする前に、又はクロマトグラフィー技術の固定相から組成物を溶出した後に適用される、実施形態７６に記載の方法。
実施形態７８． コンホメーション変異体は、１つ又はそれ以上のクロマトグラフィー技術により除去される、実施形態１～１４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態７９． コンホメーション変異体は、１つ又はそれ以上のクロマトグラフィー技術により除去される前に、ＳＥ－ＨＰＬＣ及びＩＥＸ－ＨＰＬＣのような分析用クロマトグラフィー技術により同定されている、実施形態７８に記載の方法。
実施形態８０． クロマトグラフィー技術は、流体力学的体積、表面電荷又は表面疎水性に基づくクロマトグラフィー技術である、実施形態７８又は７９に記載の方法。
実施形態８１． クロマトグラフィー技術は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）、ミックスモードクロマトグラフィー（ＭＭＣ）、及び疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）から選択される、実施形態８０に記載の方法。
実施形態８２． イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）は、カチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）である、実施形態８１に記載の方法。
実施形態８３． ＨＩＣはＨＩＣカラム樹脂に基づく、実施形態８１に記載の方法。
実施形態８４． ＨＩＣ樹脂は、Ｃａｐｔｏ Ｐｈｅｎｙｌ ＩｍｐＲｅｓ、Ｃａｐｔｏ Ｂｕｔｙｌ ＩｍｐＲｅｓ、Ｐｈｅｎｙｌ ＨＰ、及びＣａｐｔｏ Ｂｕｔｙｌから選択される、実施形態８３に記載の方法。
実施形態８５． ＨＩＣはＨＩＣメンブレンに基づく、実施形態８１に記載の方法。
実施形態８６． 組成物は、樹脂１ｍｌあたりタンパク質少なくとも２０ｍｇ、樹脂１ｍｌあたりタンパク質少なくとも３０ｍｇ、樹脂１ｍｌあたりタンパク質少なくとも４５ｍｇの負荷率を使用してクロマトグラフィーカラムにアプライされ、場合により、ここでクロマトグラフィーカラムはプロテインＡカラムである、実施形態１～８５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態８７． 組成物は、樹脂１ｍｌあたりタンパク質少なくとも４５ｍｇの負荷率を使用してプロテインＡカラムにアプライされる、実施形態８６に記載の方法。
実施形態８８． ポリペプチドは配列番号２からなる、実施形態８７に記載の方法。
実施形態８９． コンホメーション変異体を上記ポリペプチドに変換する条件の１つ又はそれ以上は、単独で、又はコンホメーション変異体を除去する１つもしくはそれ以上の技術と組み合わせて適用される、実施形態１～８８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態９０． 少なくとも３つもしくは少なくとも４つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含むか又はそれらからなるポリペプチドを単離又は精製する方法であって、該方法は、以下：
ｉ） 低ｐＨ処理を、単離又は精製方法の工程において該ポリペプチドを含む組成物に適用すること、［場合により、ここで低ｐＨ処理は、組成物のｐＨを約ｐＨ３．２もしくはそれ以下、又はｐＨ３．０もしくはそれ以下に低下させることを含む］；
ｉｉ） 単離又は精製方法の工程において該ポリペプチドを含む組成物にカオトロピック剤を適用すること、［場合により、ここでカオトロピック剤はＧｕＨＣｌである］；
ｉｉｉ） 単離又は精製方法の工程において該ポリペプチドを含む組成物に熱ストレスを加えること、［場合により、コンホメーション変異体を４０℃～約６０℃でインキュベートすることを含む］；
ｉｖ） 少なくとも２０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも３０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも４５ｍｇ／ｍｌの負荷率を使用してクロマトグラフィーカラムに該ポリペプチドを含む組成物をアプライすること、［場合により、クロマトグラフィーカラムはプロテインＡカラムである］；又は
ｖ） ｉ）～ｉｖ）のいずれかの組み合わせ
の１つ又はそれ以上を含み、
場合により、ここで単離又は精製しようとするポリペプチドは、ＣＨＯ細胞ではない宿主における発現により得ることができる、上記方法。
ｉ） 低ｐＨ処理を、単離又は精製方法の工程において該ポリペプチドを含む組成物に適用すること、［場合により、ここで低ｐＨ処理は、組成物のｐＨを約ｐＨ３．２もしくはそれ以下、又はｐＨ３．０もしくはそれ以下に低下させることを含む］；
ｉｉ） 単離又は精製方法の工程において該ポリペプチドを含む組成物にカオトロピック剤を適用すること、［場合により、ここでカオトロピック剤はＧｕＨＣｌである］；
ｉｉｉ） 単離又は精製方法の工程において該ポリペプチドを含む組成物に熱ストレスを加えること、［場合により、コンホメーション変異体を４０℃～約６０℃でインキュベートすることを含む］；
ｉｖ） 少なくとも２０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも３０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも４５ｍｇ／ｍｌの負荷率を使用してクロマトグラフィーカラムに該ポリペプチドを含む組成物をアプライすること、［場合により、クロマトグラフィーカラムはプロテインＡカラムである］；又は
ｖ） ｉ）～ｉｖ）のいずれかの組み合わせ
の１つ又はそれ以上を含み、
場合により、ここで単離又は精製しようとするポリペプチドは、ＣＨＯ細胞ではない宿主における発現により得ることができる、上記方法。
実施形態９１：コンホメーション変異体は、下等真核生物宿主のような、ＣＨＯ細胞ではない宿主における上記ポリペプチドの発現から生じる、実施形態９０に記載の方法。
実施形態９２． 単離又は精製しようとするポリペプチドは、下等真核生物宿主である宿主における発現により得ることができる、実施形態９０に記載の方法。
実施形態９３． 下等真核生物宿主は、ピキア、ハンゼヌラ、サッカロミセス、クリベロミセス、カンジダ、トルロプシス、トルラスポラ、分裂酵母、シテロミセス、パキソレン、デバロミセス、メトスクニコウィア、ロドスポリジウム、ロイコスポリジウム、ボトリオアスクス、スポリジオボルス、エンドミコプシスのような酵母である、実施形態９１又は実施形態９２に記載の方法。
実施形態９４． 酵母は、ピキア、例えばピキア・パストリスである、実施形態９３に記載の方法。
実施形態９５． ｐＨを、約ｐＨ３．２と約ｐＨ２．１との間、約ｐＨ３．０と約ｐＨ２．１との間、約ｐＨ２．９と約ｐＨ２．１との間、約ｐＨ２．７と約ｐＨ２．１との間、又は約ｐＨ２．６と約ｐＨ２．３との間に低下させる、実施形態９０～９４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態９６． ｐＨを、約ｐＨ３．０、約ｐＨ２．９、約ｐＨ２．８、約ｐＨ２．７、約ｐＨ２．６、約ｐＨ２．５、約ｐＨ２．４、約ｐＨ２．３、約ｐＨ２．２、又は約ｐＨ２．１に低下させる、実施形態９５に記載の方法。
実施形態９７． 低ｐＨ処理は、少なくとも約０．５時間、少なくとも約１時間、少なくとも約２時間、又は少なくとも約４時間適用される、実施形態９０～９６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態９８． ｐＨを約ｐＨ２．５又はそれ以下に低下させる、実施形態９０～９７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態９９． ｐＨを、約ｐＨ３．０と約ｐＨ２．１との間に少なくとも０．５時間、少なくとも１時間又は少なくとも２時間低下させる、実施形態９０～９７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１００． ｐＨを約ｐＨ２．７と約ｐＨ２．１との間に低下させる、実施形態９９に記載の方法。
実施形態１０１． ｐＨを、約ｐＨ２．７と約ｐＨ２．１との間に少なくとも１時間、場合により少なくとも２時間低下させる、実施形態９０～９７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１０２． ｐＨを、約ｐＨ２．６と約ｐＨ２．３との間に少なくとも１時間、場合により少なくとも２時間低下させる、実施形態１０１に記載の方法。
実施形態１０３． 多価ポリペプチドは、３つのＩＳＶＤ、４つのＩＳＶＤ、又は５つのＩＳＶＤを含むか又はそれらからなる、実施形態９０～１０２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１０４． ポリペプチドは、少なくとも４つのＩＳＶＤを含むか又はそれらからなる、実施形態９０～１０３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１０５． ポリペプチドは５つのＩＳＶＤを含むか又はそれらからなる、実施形態９０～１０４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１０６． ｐＨを約ｐＨ２．６又はそれ以下に低下させる、実施形態１０５に記載の方法。
実施形態１０７． 低ｐＨ処理は１～２時間適用される、実施形態１０３～１０６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１０８． ポリペプチドは配列番号１からなる、実施形態１０７に記載の方法。
実施形態１０９． 多価ポリペプチドは４つのＩＳＶＤを含むか又はそれらからなる、実施形態９０～１０４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１１０． ｐＨを約ｐＨ２．９又はそれ以下、例えば約ｐＨ２．５に低下させる、実施形態１０９に記載の方法。
実施形態１１１． 低ｐＨ処理は１～２時間適用される、実施形態１０９又は１１０に記載の方法。
実施形態１１２． ポリペプチドは配列番号２からなる、実施形態１１１に記載の方法。
実施形態１１３． ポリペプチドは配列番号７０又は配列番号７１からなる、実施形態１１１に記載の方法。
実施形態１１４． 多価ポリペプチドは、３つのＩＳＶＤを含むか又はそれらからなる、実施形態９０～１０３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１１５． ｐＨを、約ｐＨ３．０又はそれ以下、例えば約ｐＨ２．５に低下させる、実施形態１１４に記載の方法。
実施形態１１６． 低ｐＨ処理は２～４時間適用される、実施形態１１４又は１１５に記載の方法。
実施形態１１７． ポリペプチドは配列番号６９からなる、実施形態１１６に記載の方法。
実施形態１１８． 低ｐＨ処理は、ｐＨを少なくとも１ｐＨ単位増加させるか、少なくとも２ｐＨ単位増加させるか、又は約ｐＨ５．５もしくはそれ以上に増加させることにより終了される、実施形態９０～１１７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１１９． 低ｐＨ処理は、クロマトグラフィー技術に基づく精製工程の前又は後に適用される、実施形態９０～１１８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１２０． 低ｐＨ処理は、クロマトグラフィー技術の固定相に組成物をアプライする前に適用される、実施形態１１９に記載の方法。
実施形態１２１． 低ｐＨ処理は、クロマトグラフィー技術の固定相から組成物を溶出した後に適用される、実施形態１１９に記載の方法。
実施形態１２２． 低ｐＨ処理は、クロマトグラフィー技術に基づく精製工程の間に適用され、ここで精製しようとするポリペプチドを含む組成物は、クロマトグラフィー技術の固定相と接触している、実施形態９０～１１８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１２３． クロマトグラフィー技術はプロテインＡベースのアフィニティークロマトグラフィーである、実施形態１１９～１２２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１２４． クロマトグラフィー技術はプロテインＡベースのアフィニティークロマトグラフィーであり、そしてここで溶出緩衝液は、ｐＨ２．５に等しいか又はそれ以下のｐＨを有する、実施形態１２３に記載の方法。
実施形態１２５． クロマトグラフィー技術はプロテインＡベースのアフィニティークロマトグラフィーであり、そしてここで溶出緩衝液は、上記ポリペプチドを含有する得られた溶出液がｐＨ２．９に等しいか又はそれ以下のｐＨを有するようなｐＨを有する、実施形態１２３に記載の方法。
実施形態１２６． 上記ポリペプチドを含有する溶出液のｐＨは、３．０に等しいか又はそれ以下のｐＨに、場合により少なくとも１時間、例えばｐＨ２．７に等しいか又はそれ以下のｐＨに、場合により少なくとも０．５時間又は約１時間調整される、実施形態１２３～１２５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１２７． 上記ポリペプチドを含有する溶出液のｐＨは、ｐＨ２．５に等しいか又はそれ以下のｐＨに、場合により少なくとも約０．５時間又は１時間調整される、実施形態１２３～１２５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１２８． クロマトグラフィー技術はプロテインＡベースのアフィニティークロマトグラフィーであり、ここで溶出緩衝液は約ｐＨ２．２のｐＨを有し、そしてここで上記ポリペプチドを含有する溶出液のｐＨは、約ｐＨ２．５のｐＨに少なくとも約１．５時間調整される、実施形態１２２に記載の方法。
実施形態１２９． 低ｐＨ処理後の溶出液のｐＨを、少なくとも１ｐＨ単位増加させるか、少なくとも２ｐＨ単位増加させるか、又は約ｐＨ５．５もしくはそれ以上のｐＨに増加させる、実施形態１１９～１２８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１３０． 低ｐＨ処理は室温で適用される、実施形態９０～１２９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１３１． 低ｐＨ処理の後に：
ａ） 適切な量の１Ｍ酢酸ナトリウム ｐＨ５．５を組成物／溶出液に加えて、約５０ｍＭ酢酸ナトリウムの最終濃度を得る工程；
ｂ） 組成物／溶出液のｐＨをｐＨ５．５に調整する工程；及び
ｃ） 水を使用して組成物／溶出液の電導度を約６ｍＳ／ｃｍ又はそれ以下に調整する工程
の工程が続く、実施形態９０～１３０のいずれか１つに記載の方法。
ａ） 適切な量の１Ｍ酢酸ナトリウム ｐＨ５．５を組成物／溶出液に加えて、約５０ｍＭ酢酸ナトリウムの最終濃度を得る工程；
ｂ） 組成物／溶出液のｐＨをｐＨ５．５に調整する工程；及び
ｃ） 水を使用して組成物／溶出液の電導度を約６ｍＳ／ｃｍ又はそれ以下に調整する工程
の工程が続く、実施形態９０～１３０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１３２． ｂ）におけるｐＨはＮａＯＨを用いて調整される、実施形態１３１に記載の方法。
実施形態１３３． ポリペプチドは５つのＩＳＶＤを含むか又はそれらからなる、実施形態１３１又は１３２に記載の方法。
実施形態１３４． ポリペプチドは４つのＩＳＶＤを含むか又はそれらからなる、実施形態１３１又は１３２に記載の方法。
実施形態１３５． ポリペプチドは配列番号２からなる、実施形態１３４に記載の方法。
実施形態１３６． ＧｕＨＣｌは、少なくとも約１Ｍ、又は少なくとも約２Ｍの最終濃度で適用される、実施形態９０～１３５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１３７． ＧｕＨＣｌは少なくとも０．５時間、又は少なくとも１時間適用される、実施形態９０又は１３６に記載の方法。
実施形態１３８． ＧｕＨＣｌは、少なくとも約１Ｍの最終濃度で少なくとも０．５時間適用される、実施形態１３６又は１３７に記載の方法。
実施形態１３９． ＧｕＨＣｌは、少なくとも約１Ｍの最終濃度で０．５時間～１時間適用される、実施形態１３８に記載の方法。
実施形態１４０． ＧｕＨＣｌは、約２Ｍの最終濃度で少なくとも０．５時間適用される、実施形態１３６又は１３７に記載の方法。
実施形態１４１． ＧｕＨＣｌは、少なくとも約２Ｍの最終濃度で０．５時間～１時間適用される、実施形態１４０に記載の方法。
実施形態１４２． ポリペプチドは、少なくとも４つのＩＳＶＤを含むか又はそれらからなる、実施形態９０又は１３６～１４１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１４３． ポリペプチドは配列番号１からなる、実施形態１４２に記載の方法。
実施形態１４４． ポリペプチドは配列番号２からなる、実施形態１４２に記載の方法。
実施形態１４５． カオトロピック剤処理は室温で適用される、実施形態９０又は１３６～１４４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１４６． カオトロピック剤処理は、クロマトグラフィー技術に基づく精製工程の前又は後に適用される、実施形態９０又は１３６～１４５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１４７． 上記ポリペプチドは、クロマトグラフィー技術の固定相から溶出され、そしてカオトロピック剤処理は、得られた溶出液に適用される、実施形態１４６に記載の方法。
実施形態１４８． 熱ストレスは、少なくとも約１時間、又は約１～４時間加えられる、実施形態９０～１４７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１４９． 熱ストレスは、約４０℃～約６０℃、約４５℃～約６０℃、又は約５０℃～約６０℃で加えられる、実施形態１４８に記載の方法。
実施形態１５０． 熱ストレスは、約４０℃～約５５℃、約４５℃～５５℃、又は約４８℃～約５２℃で加えられる、実施形態１４８に記載の方法。
実施形態１５１． 熱ストレスは約５０℃で加えられる、実施形態１４８に記載の方法。
実施形態１５２． 熱ストレスは約５０℃で１時間加えられる、実施形態１５１に記載の方法。
実施形態１５３． ポリペプチドは少なくとも４つのＩＳＶＤを含むか又はそれらからなる、実施形態１４８～１５２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１５４． ポリペプチドは配列番号１からなる、実施形態１５２に記載の方法。
実施形態１５５． ポリペプチドは配列番号２からなる、実施形態１５２に記載の方法。
実施形態１５６． 熱ストレスは、クロマトグラフィー技術に基づく精製工程の前又は後に適用される、実施形態９０又は１４８～１５５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１５７． 熱ストレス処理は、クロマトグラフィー技術の固定相に組成物をアプライする前に、又はクロマトグラフィー技術の固定相から組成物を溶出した後に適用される、実施形態１５６に記載の方法。
実施形態１５８． 実施形態１～１５４のいずれか１つに記載の方法に記載のポリペプチドを精製及び／又は単離することを含む、少なくとも３つ又は少なくとも４つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含むポリペプチドを製造する方法。
実施形態１５９． 以下の工程：
ａ） 場合により、宿主又は宿主細胞を、該宿主又は宿主細胞が増殖するような条件下で培養する工程；
ｂ） 宿主又は宿主細胞を、該宿主又は宿主細胞が上記ポリペプチドを発現し、かつ／又は産生するような条件下で維持する工程；並びに
ｃ） 実施形態１～１５４のいずれか１つに記載の単離又は精製方法の１つ又はそれ上を含む、分泌されたポリペプチドを培地から単離及び／又は精製する工程
を少なくとも含み、場合により、ここで宿主はＣＨＯ細胞ではない、実施形態１５８に記載の方法。
ａ） 場合により、宿主又は宿主細胞を、該宿主又は宿主細胞が増殖するような条件下で培養する工程；
ｂ） 宿主又は宿主細胞を、該宿主又は宿主細胞が上記ポリペプチドを発現し、かつ／又は産生するような条件下で維持する工程；並びに
ｃ） 実施形態１～１５４のいずれか１つに記載の単離又は精製方法の１つ又はそれ上を含む、分泌されたポリペプチドを培地から単離及び／又は精製する工程
を少なくとも含み、場合により、ここで宿主はＣＨＯ細胞ではない、実施形態１５８に記載の方法。
実施形態１６０． 宿主は下等真核生物宿主である、実施形態１５８又は１５９に記載の方法。
実施形態１６１． 下等真核生物宿主は、ピキア、ハンゼヌラ、サッカロミセス、クリベロミセス、カンジダ、トルロプシス、トルラスポラ、分裂酵母、シテロミセス、パキソレン、デバロミセス、メトスクニコウィア、ロドスポリジウム、ロイコスポリジウム、ボトリオアスクス、スポリジオボルス、エンドミコプシスのような酵母である、実施形態１６０に記載の方法。
実施形態１６２． 酵母は、ピキア・パストリスのようなピキアである、実施形態１６１に記載の方法。
実施形態１６３． 少なくとも３つ又は少なくとも４つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含むか又はそれらからなるポリペプチドを、該ポリペプチド及びそのコンホメーション変異体を含む組成物から単離又は精製するための方法であって、該方法は：
（１） ＳＥ－ＨＰＬＣ及びＩＥＸ－ＨＰＬＣのような分析用クロマトグラフィー技術によりコンホメーション変異体を同定すること；
（２） コンホメーション変異体の特異的除去を可能にするようにクロマトグラフィー条件を調整すること；並びに
（３） １つ又はそれ以上のクロマトグラフィー技術により、該ポリペプチド及びそのコンホメーション変異体を含む組成物からコンホメーション変異体を除去すること
を含み、場合により、ここで単離又は精製しようとするポリペプチドは、ＣＨＯ細胞ではない宿主における発現により得ることができる、上記方法。
（１） ＳＥ－ＨＰＬＣ及びＩＥＸ－ＨＰＬＣのような分析用クロマトグラフィー技術によりコンホメーション変異体を同定すること；
（２） コンホメーション変異体の特異的除去を可能にするようにクロマトグラフィー条件を調整すること；並びに
（３） １つ又はそれ以上のクロマトグラフィー技術により、該ポリペプチド及びそのコンホメーション変異体を含む組成物からコンホメーション変異体を除去すること
を含み、場合により、ここで単離又は精製しようとするポリペプチドは、ＣＨＯ細胞ではない宿主における発現により得ることができる、上記方法。
実施形態１６４． 少なくとも３つ又は少なくとも４つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含むか又はそれらからなるポリペプチドを、該ポリペプチド及びそのコンホメーション変異体を含む組成物から単離又は精製することを可能にするために１つ又はそれ以上のクロマトグラフィー技術を最適化するための方法であって：
（１） ＳＥ－ＨＰＬＣ及びＩＥＸ－ＨＰＬＣのような分析用クロマトグラフィー技術によりコンホメーション変異体を同定すること；
（２） コンホメーション変異体の特異的除去を可能にするようにクロマトグラフィー条件を最適化すること
を含み、
場合により、ここで単離又は精製しようとするポリペプチドは、ＣＨＯ細胞ではない宿主における発現により得ることができる、上記方法。
（１） ＳＥ－ＨＰＬＣ及びＩＥＸ－ＨＰＬＣのような分析用クロマトグラフィー技術によりコンホメーション変異体を同定すること；
（２） コンホメーション変異体の特異的除去を可能にするようにクロマトグラフィー条件を最適化すること
を含み、
場合により、ここで単離又は精製しようとするポリペプチドは、ＣＨＯ細胞ではない宿主における発現により得ることができる、上記方法。
実施形態１６５． コンホメーション変異体は、下等真核生物宿主のような、ＣＨＯ細胞ではない宿主におけるポリペプチドの発現から生じる、実施形態１６３又は１６４に記載の方法。
実施形態１６６：単離又は精製しようとするポリペプチドは、下等真核生物宿主である宿主における発現により得ることができる、実施形態１６３又は１６４に記載の方法。
実施形態１６７：下等真核生物宿主は、ピキア、ハンゼヌラ、サッカロミセス、クリベロミセス、カンジダ、トルロプシス、トルラスポラ、分裂酵母、シテロミセス、パキソレン、デバロミセス、メトスクニコウィア、ロドスポリジウム、ロイコスポリジウム、ボトリオアスクス、スポリジオボルス、エンドミコプシスのような酵母である、実施形態１６５又は実施形態１６６に記載の方法。
実施形態１６８：酵母はピキア・パストリスのようなピキアである、実施形態１６７に記載の方法。
実施形態１６９． コンホメーション変異体は、上記ポリペプチドと比較してより緻密な形態を特徴とする、実施形態１６３～１６８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１７０． コンホメーション変異体は、上記ポリペプチドと比較して減少した流体力学的体積を有する、実施形態１６３～１６９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１７１． コンホメーション変異体は、上記ポリペプチドと比較して、ＳＥ－ＨＰＬＣにおける増加した保持時間を特徴とする、実施形態１６３～１７０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１７２． コンホメーション変異体は、上記ポリペプチドと比較して、ＩＥＸ－ＨＰＬＣにおける変化した保持時間を特徴とする、実施形態１６３～１７１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１７３． コンホメーション変異体は、上記ポリペプチドと比較して、ＩＥＸ－ＨＰＬＣにおける減少した保持時間を特徴とする、実施形態１７２に記載の方法。
実施形態１７４． コンホメーション変異体は、上記ポリペプチドと比較して、ＩＥＸ－ＨＰＬＣにおける増加した保持時間を特徴とする、実施形態１７２に記載の方法。
実施形態１７５． ポリペプチドは、少なくとも３つのＩＳＶＤを含むか又はそれらからなる、実施形態１６３～１７４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１７６． ポリペプチドは、少なくとも４つのＩＳＶＤを含むか又はそれらからなる、実施形態１６３～１７５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１７７． ポリペプチドは、３つのＩＳＶＤ、４つのＩＳＶＤ、又は５つのＩＳＶＤを含むか又はそれらからなる、実施形態１６３～１７６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１７８． クロマトグラフィー技術は、流体力学的体積、表面電荷又は表面疎水性に基づくクロマトグラフィー技術である、実施形態１６３～１７７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１７９． クロマトグラフィー技術は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）、ミックスモードクロマトグラフィー（ＭＭＣ）、及び疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）のいずれかから選択される、実施形態１７８に記載の方法。
実施形態１８０． イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）はカチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）である、実施形態１７９に記載の方法。
実施形態１８１． ＨＩＣはＨＩＣカラム樹脂に基づく、実施形態１７９に記載の方法。
実施形態１８２． ＨＩＣ樹脂は、Ｃａｐｔｏ Ｐｈｅｎｙｌ ＩｍｐＲｅｓ、Ｃａｐｔｏ Ｂｕｔｙｌ ＩｍｐＲｅｓ、Ｐｈｅｎｙｌ ＨＰ、及びＣａｐｔｏ Ｂｕｔｙｌのいずれかから選択される、実施形態１８１に記載の方法。
実施形態１８３． ＨＩＣはＨＩＣメンブレンに基づく、実施形態１７９に記載の方法。
４ 図面の説明
５ 詳細な説明
本開示は、少なくとも３つ又は少なくとも４つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含むか又はそれらからなるポリペプチドのコンホメーション変異体の驚くべき所見を記載する。上記ポリペプチドのコンホメーション変異体は、宿主における該ポリペプチドの産生の間に観察された。特に、コンホメーション変異体は、本明細書に記載されるような下等真核生物宿主のような宿主における少なくとも３つ又は少なくとも４つのＩＳＶＤを含むか又はそれらからなるポリペプチドの産生の際に観察された。少なくとも３つ又は少なくとも４つのＩＳＶＤを含む多価ポリペプチド生成物のコンホメーション変異体は、宿主、特に酵母のような下等真核生物宿主である宿主における該ポリペプチドの発現から生じることがわかった。該ポリペプチド及びそのコンホメーション変異体の分子量は同じであるが、コンホメーション変異体は、電荷／表面特徴の変化を示し、異なる物理化学的挙動、例えば分析用サイズ排除クロマトグラフィー及び／又は分析用イオン交換クロマトグラフィーでの異なる保持時間をもたらす。従って、少なくとも３つ又は少なくとも４つのＩＳＶＤを含むか又はそれらからなるポリペプチドのコンホメーション変異体を、分析用サイズ排除クロマトグラフィーでの該ポリペプチドを含有するメインピークのショルダーポストピークもしくは分離したポストピーク（ＳＥ－ＨＰＬＣポストピーク１）として、かつ／又は分析用イオン交換クロマトグラフィーにおける該ポリペプチドを含有するメインピークのポストピークショルダーもしくは分離したポストピーク（ＩＥＸ－ＨＰＬＣポストピーク１）として観察することができた。このような異なる物理化学的挙動は、スクランブルジスルフィド架橋に起因するものではなかった。
本開示は、少なくとも３つ又は少なくとも４つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含むか又はそれらからなるポリペプチドのコンホメーション変異体の驚くべき所見を記載する。上記ポリペプチドのコンホメーション変異体は、宿主における該ポリペプチドの産生の間に観察された。特に、コンホメーション変異体は、本明細書に記載されるような下等真核生物宿主のような宿主における少なくとも３つ又は少なくとも４つのＩＳＶＤを含むか又はそれらからなるポリペプチドの産生の際に観察された。少なくとも３つ又は少なくとも４つのＩＳＶＤを含む多価ポリペプチド生成物のコンホメーション変異体は、宿主、特に酵母のような下等真核生物宿主である宿主における該ポリペプチドの発現から生じることがわかった。該ポリペプチド及びそのコンホメーション変異体の分子量は同じであるが、コンホメーション変異体は、電荷／表面特徴の変化を示し、異なる物理化学的挙動、例えば分析用サイズ排除クロマトグラフィー及び／又は分析用イオン交換クロマトグラフィーでの異なる保持時間をもたらす。従って、少なくとも３つ又は少なくとも４つのＩＳＶＤを含むか又はそれらからなるポリペプチドのコンホメーション変異体を、分析用サイズ排除クロマトグラフィーでの該ポリペプチドを含有するメインピークのショルダーポストピークもしくは分離したポストピーク（ＳＥ－ＨＰＬＣポストピーク１）として、かつ／又は分析用イオン交換クロマトグラフィーにおける該ポリペプチドを含有するメインピークのポストピークショルダーもしくは分離したポストピーク（ＩＥＸ－ＨＰＬＣポストピーク１）として観察することができた。このような異なる物理化学的挙動は、スクランブルジスルフィド架橋に起因するものではなかった。
これらの観察に基づいて、少なくとも３つ又は少なくとも４つのＩＳＶＤを含むか又はそれらからなるポリペプチドは、分子内相互作用をもたらす特定の構造的可動性を可能にし、その結果該ポリペプチドは、該ポリペプチドのＩＳＶＤビルディングブロックの配置と比較して、より緻密な形態を生じるＩＳＶＤビルディングブロックの立体構造配置を有するコンホメーション変異体として存在し得るという仮説を立てた（図５２を参照のこと）。ＩＳＶＤそれ自体は非常に安定な分子であるが、ポリペプチドの価数が少なくとも３又は少なくとも４つのＩＳＶＤまで増加すると（すなわち、ＩＳＶＤビルディングブロックの数が３、４又はそれ以降まで増加する）、該ポリペプチドはより分子内相互作用しやすくなり得るということが、驚くべきことに観察された。仮説に拘束されないが、少なくとも３つ又は少なくとも４つのＩＳＶＤを含むか又はそれらからなるポリペプチドは、上記ポリペプチド内の少なくとも２つのＩＳＶＤ間の分子内相互作用を可能にし、緻密な形態を有する該ポリペプチドのコンホメーション変異体を形成することができると結論付けられた。緻密な形態は、上記ポリペプチドと比較して減少した流体力学的体積を特徴とする。さらに、緻密な形態は、変化した表面電荷及び／又は変化した表面疎水性／疎水性露出を特徴とし得るということがわかった。従って、少なくとも３つ又は少なくとも４つのＩＳＶＤを含むか又はそれらからなるポリペプチド及びそのコンホメーション変異体を、分析用クロマトグラフィー技術に基づいて識別することができる。特に、少なくとも３つ又は少なくとも４つのＩＳＶＤを含むか又はそれらからなるポリペプチド及びそのコンホメーション変異体は、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ－ＨＰＬＣ）、及び／又はイオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＩＥＸ－ＨＰＬＣ）のような分析用クロマトグラフィー技術により、流体力学的体積及び／又は表面電荷のシフトに基づいて識別され得る。
本出願において明らかにされた処理条件を使用して、コンホメーション変異体を（所望の）ポリペプチドに変換することができるということがさらに示された。さらに、上記ポリペプチドとそのコンホメーション変異体との間の観察された生化学的／生物物理学的差異に基づいて、コンホメーション変異体は、該ポリペプチド及びそのコンホメーション変異体を含む組成物から、本明細書に記載されるように、流体力学的体積、表面電荷及び／又は表面疎水性に基づく公知の分取用クロマトグラフィー技術を使用して除去され得るということがわかった。
５．１ 定義
別の指示又は定義がなければ、使用されるすべての用語は、当業者には明らかな、当該分野におけるそれらの通常の意味を有する。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら１９８９年（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、第１～３巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、Ａｕｓｕｂｅｌら１９８７年（Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、Ｌｅｗｉｎ １９８５年（Ｇｅｎｅｓ ＩＩ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．）、Ｏｌｄら１９８１年（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ：Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、第２版、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、ＣＡ）、Ｒｏｉｔｔら２００１年（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、６ｔｈ Ｅｄ．、Ｍｏｓｂｙ／Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ）、Ｒｏｉｔｔら２００１年（Ｒｏｉｔｔ’ｓ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第１０版．、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、ＵＫ）、及びＪａｎｅｗａｙら２００５年（Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ、第６版．、Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ／Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）のような標準的な手引書、さらには本明細書において引用される一般的な背景が参照される。
別の指示又は定義がなければ、使用されるすべての用語は、当業者には明らかな、当該分野におけるそれらの通常の意味を有する。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら１９８９年（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、第１～３巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、Ａｕｓｕｂｅｌら１９８７年（Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、Ｌｅｗｉｎ １９８５年（Ｇｅｎｅｓ ＩＩ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．）、Ｏｌｄら１９８１年（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ：Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、第２版、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、ＣＡ）、Ｒｏｉｔｔら２００１年（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、６ｔｈ Ｅｄ．、Ｍｏｓｂｙ／Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ）、Ｒｏｉｔｔら２００１年（Ｒｏｉｔｔ’ｓ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第１０版．、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、ＵＫ）、及びＪａｎｅｗａｙら２００５年（Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ、第６版．、Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ／Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）のような標準的な手引書、さらには本明細書において引用される一般的な背景が参照される。
当業者には明らかなように、別の指示がなければ、詳細には具体的に記載されていないすべての方法、工程、技術及び操作は、それ自体公知のやり方で行うことができ、かつ行われた。この場合もやはり、例えば、標準的な手引書及び本明細書において言及される一般的な背景技術、並びにそこに引用されるさらなる参考文献；さらには、例えば以下の総説：Ｐｒｅｓｔａ ２００６年（Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ． Ｒｅｖ． ５８：６４０）、Ｌｅｖｉｎ及びＷｅｉｓｓ ２００６年（Ｍｏｌ． Ｂｉｏｓｙｓｔ． ２：４９）、Ｉｒｖｉｎｇら２００１年（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８：３１）、Ｓｃｈｍｉｔｚら２０００年（Ｐｌａｃｅｎｔａ ２１ Ｓｕｐｐｌ． Ａ：Ｓ１０６）、Ｇｏｎｚａｌｅｓら２００５年（Ｔｕｍｏｕｒ Ｂｉｏｌ． ２６：３１）が参照され、これらは 親和性成熟のようなタンパク質操作、並びに免疫グロブリンのようなタンパク質の特異性及び他の所望の特性を改善するための他の技術についての技術を記載する。
本明細書において提供されるパラメーター又はパラメーター範囲の文脈において使用される用語「約」は、以下の意味を有するものとする。別の指示がなければ、用語「約」が特定の値又は範囲に適用される場合、その値又は範囲は、それを測定するために使用される方法と同程度正確であると解釈される。許容誤差が出願において特定されていない場合、数値の最後の小数位は、その精度を示す。他の許容誤差が示されていない場合、最大許容誤差は、最後の小数位に四捨五入変換を適用することにより確認され、例えば約ｐＨ２．７のｐＨ値については、許容誤差は２．６５～２．７４である。しかし、以下のパラメーターについては、特定の許容誤差が適用されるものとする：小数位の無い℃で特定される温度は、±１℃の許容誤差を有するものとし（例えば、約５０℃の温度値は５０℃±１℃を意味する）；時間で示される時間は、小数位にかかわらず０．１時間の許容誤差を有する（例えば、約１．０時間の時間値は１．０時間±０．１時間を意味し；約０．５時間の時間値は０．５時間±０．１時間を意味する）。
本出願において、用語「約」とともに示される任意のパラメーターはまた、用語「約」を伴わずに開示されることも企図される。換言すれば、用語「約」を使用してパラメーター値に言及する実施形態はまた、そのパラメーターそれ自体の数値に関する実施形態も記載する。例えば、「約ｐＨ２．７」のｐＨを特定する実施形態はまた、「ｐＨ２．７」のｐＨそれ自体を特定する実施形態も開示する；「約ｐＨ２．７と約ｐＨ２．１」との間のｐＨ範囲を特定する実施形態はまた、「ｐＨ２．７とｐＨ２．１との間」などのｐＨ範囲を特定する実施形態も記載する。
５．２ 免疫グロブリン単一可変ドメイン
用語「免疫グロブリン単一可変ドメイン」（ＩＳＶＤ）は、「単一可変ドメイン」と交換可能に使用され、抗原結合部位が単一免疫グロブリンドメイン上に存在し、かつ単一免疫グロブリンドメインにより形成される免疫グロブリン分子を定義する。これは、免疫グロブリン単一可変ドメインを「従来の」免疫グロブリン（例えば、モノクローナル分子）又はそれらのフラグメント（例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｉ－ｓｃＦｖ）と区別し、ここで２つの免疫グロブリンドメイン、特に２つの可変ドメインは、相互作用して抗原結合部位を形成する。典型的には、従来の免疫グロブリンにおいて、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）は総合作用して抗原結合部位を形成する。この場合、ＶＨ及びＶＬの両方の相補性決定領域（ＣＤＲ）は抗原結合部位に寄与し、すなわち合計で６つのＣＤＲが抗原結合部位形成に関与する。
用語「免疫グロブリン単一可変ドメイン」（ＩＳＶＤ）は、「単一可変ドメイン」と交換可能に使用され、抗原結合部位が単一免疫グロブリンドメイン上に存在し、かつ単一免疫グロブリンドメインにより形成される免疫グロブリン分子を定義する。これは、免疫グロブリン単一可変ドメインを「従来の」免疫グロブリン（例えば、モノクローナル分子）又はそれらのフラグメント（例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｉ－ｓｃＦｖ）と区別し、ここで２つの免疫グロブリンドメイン、特に２つの可変ドメインは、相互作用して抗原結合部位を形成する。典型的には、従来の免疫グロブリンにおいて、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）は総合作用して抗原結合部位を形成する。この場合、ＶＨ及びＶＬの両方の相補性決定領域（ＣＤＲ）は抗原結合部位に寄与し、すなわち合計で６つのＣＤＲが抗原結合部位形成に関与する。
上記の定義を考慮して、これらの場合、抗原の個々のエピトープへの結合は通常は１つの（単一）免疫グロブリンドメインにより発生せず、一対の（会合した）免疫グロブリンドメイン、例えば軽鎖及び重鎖可変ドメインにより、すなわち、免疫グロブリンドメインのＶＨ－ＶＬ対により発生して、それらがそれぞれの抗原のエピトープに一緒に結合するので、従来の４鎖抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ又はＩｇＥ分子；当該分野で公知）の抗原結合ドメイン、又はこのような４鎖抗体から誘導されたＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、例えばジスルフィド連結ＦｖもしくはｓｃＦｖフラグメント、又は二特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）（全て当該分野で公知）の抗原結合ドメインは、通常は免疫グロブリン単一可変ドメインとはみなされない。
対照的に、免疫グロブリン単一可変ドメインは、さらなる免疫グロブリン可変ドメインと対合することなく抗原のエピトープに特異的に結合することができる。免疫グロブリン単一可変ドメインの結合部位は、単一のＶＨ、単一のＶＨＨ又は単一のＶＬドメインにより形成される。
従って、単一可変ドメインは、それが単一抗原結合単位を形成することができるかぎり；軽鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶＬ－配列）もしくはその適切なフラグメント；又は重鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶＨ－配列又はＶＨＨ配列）もしくはその適切なフラグメントであり得る（すなわち、単一可変ドメインから本質的になる機能的抗原結合単位、その結果、単一抗原結合ドメインは、機能的抗原結合単位を形成するために別の可変ドメインと相互作用する必要がない）。
免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）は、例えば、ラクダ化（ｃａｍｅｌｉｚｅｄ）ＶＨ又はヒト化ＶＨＨを含む、ＶＨ、ＶＨＨのような重鎖ＩＳＶＤであり得る。一実施形態において、これはＶＨＨであり、ラクダ化ＶＨ又はヒト化ＶＨＨを含む。重鎖ＩＳＶＤは、従来の４鎖抗体又は重鎖抗体から誘導され得る。
例えば、免疫グロブリン単一可変ドメインは、単一ドメイン抗体（又は単一ドメイン抗体としての使用に適したアミノ酸配列）、「ｄＡｂ」又はｄＡｂ（又はｄＡｂとしての使用に適したアミノ酸配列）又はＮＡＮＯＢＯＤＹ（登録商標）ＩＳＶＤ（本明細書において定義されるとおり、限定されないがＶＨＨが挙げられる）；他の単一可変ドメイン、又はそのいずれか１つの任意の適切なフラグメントであり得る。
特に、免疫グロブリン単一可変ドメインは、ＮＡＮＯＢＯＤＹ（登録商標）ＩＳＶＤ（例えば、ヒト化ＶＨＨ又はラクダ化ＶＨを含むＶＨＨ）又はその適切なフラグメントであり得る［注：ＮＡＮＯＢＯＤＹ（登録商標）は、Ａｂｌｙｎｘ Ｎ．Ｖ．の登録商標である］。
ＶＨＨ、ＶＨＨ抗体フラグメント、及びＶＨＨ抗体としても知られる「ＶＨＨドメイン」は、もともとは「重鎖抗体」（すなわち、「軽鎖を欠いている抗体」；Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎら Ｎａｔｕｒｅ ３６３：４４６－４４８、１９９３）の抗原結合免疫グロブリン可変ドメインとして記載されていた。用語「ＶＨＨドメイン」は、これらの可変ドメインを、従来の４鎖抗体に存在する重鎖可変ドメイン（本明細書では「ＶＨドメイン」と呼ばれる）、及び従来の４鎖抗体に存在する軽鎖可変ドメイン（本明細書では「ＶＬドメイン」と呼ばれる）と区別するために選択された。ＶＨＨのさらなる説明のために、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓによる総説記事が参照される（Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７４：２７７－３０２、２００１）。
典型的には、免疫グロブリンの生成は、実験動物の免疫化、免疫グロブリン産生細胞を融合してハイブリドーマを生成すること、及び所望の特異性についてのスクリーニングを含む。あるいは、免疫グロブリンは、天然又は合成のライブラリー、例えばファージディスプレイによるライブラリーのスクリーニングにより生成され得る。
ＶＨＨのような免疫グロブリン配列の生成は、様々な刊行物において広範囲に記載されており、その中にはＷＯ９４／０４６７８、Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎら １９９３年及びＭｕｙｌｄｅｒｍａｎｓら２００１年（Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７４：２７７－３０２、２００１）がある。これらの方法において、ラクダ類は、標的抗原に対する免疫応答を誘導するためにその標的抗原で免疫される。この免疫化から得られたＶＨＨのレパートリーは、標的抗原に結合するＶＨＨについてさらにスクリーニングされる。
これらの例において、抗体の生成は、免疫化及び／又はスクリーニングのために精製された抗原を必要とする。抗原は、天然供給源から、又は組み換え産生の過程で精製され得る。
免疫グロブリン配列のための免疫化及び／又はスクリーニングは、このような抗原のペプチドフラグメントを使用して行われ得る。
マウス、ラット、ウサギ、ロバ、ヒト及びラクダ免疫グロブリン配列を含む様々な起源の免疫グロブリン配列を、本明細書において記載される方法で製造、精製及び／又は単離することができる。また、完全ヒト、ヒト化又はキメラ配列が、本明細書において記載される方法で製造、精製及び／又は単離され得る。例えば、ラクダ免疫グロブリン配列及びヒト化ラクダ免疫グロブリン配列、又はラクダ化ドメイン抗体、例えばＷａｒｄらにより記載されるラクダ化ｄＡｂ（例えば、ＷＯ ９４／０４６７８及びＲｉｅｃｈｍａｎｎ、Ｆｅｂｓ Ｌｅｔｔ．、３３９：２８５－２９０、１９９４及びＰｒｏｔ．Ｅｎｇ．、９：５３１－５３７、１９９６を参照のこと）が、本明細書において記載される方法で製造、精製及び／又は単離され得る。さらに、ＩＳＶＤは、少なくとも３つ又は少なくとも４つのＩＳＶＤを含むか又はそれらからなるように融合されて、多価及び／又は多選択性構築物を形成する（１つ又はそれ以上のＶＨＨドメインを含有する多価多選択性ポリペプチド及びそれらの製造については、Ｃｏｎｒａｔｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、Ｖｏｌ．２７６、１０．７３４６－７３５０、２００１、さらには例えばＷＯ９６／３４１０３及びＷＯ９９／２３２２１も参照される）。ＩＳＶＤ配列は、タグ又は他の機能的部分、例えば毒素、標識、放射性化学物質などを含み得る。
「ヒト化ＶＨＨ」は、天然に存在するＶＨＨドメインのアミノ酸配列に対応するが、「ヒト化」されている、すなわち、ヒト由来の従来の４鎖抗体由来のＶＨドメインにおける対応する位置に存在するアミノ酸残基の１つ又はそれ以上で、上記天然に存在するＶＨＨ配列（及び特にフレームワーク配列）のアミノ酸配列における１つ又はそれ以上のアミノ酸残基を置き換えることによる（例えば、上に示される）、アミノ酸配列を含む。これは、当業者には明らかであるそれ自体公知の方法で、例えば本明細書におけるさらなる記載及び従来技術（例えば、ＷＯ２００８／０２００７９）に基づいて行われ得る。この場合もやはり、このようなヒト化ＶＨＨを、それ自体公知の任意の適切な方法で得ることができ、従って出発物質として天然に存在するＶＨＨドメインを含むポリペプチドを使用して得られたポリペプチドに厳密に限定されることはないということに留意すべきである。
「ラクダ化ＶＨ」は、天然に存在するＶＨドメインのアミノ酸配列に対応するが、「ラクダ化」されている、すなわち、従来の４鎖抗体由来の天然に存在するＶＨドメインのアミノ酸配列における１つ又はそれ以上のアミノ酸残基を、（ラクダ）重鎖抗体のＶＨＨドメインにおける対応する位置に存在するアミノ酸残基の１つ又はそれ以上で置き換えることによる、アミノ酸配列を含む。これは、当業者には明らかであるそれ自体公知の方法で、例えば本明細書におけるさらなる記載及び従来技術（例えば、Ｄａｖｉｅｓ及びＲｉｅｃｈｍａｎｎ（１９９４年及び１９９６年）、前出）に基づいて行われ得る。このような「ラクダ化（ｃａｍｅｌｉｚｉｎｇ）」置換は、ＶＨ－ＶＬ境界部を形成しかつ／もしくはＶＨ－ＶＬ境界部に存在するアミノ酸残基において、かつ／又は本明細書において定義されるようにいわゆるラクダ科（Ｃａｍｅｌｉｄａｅ）特徴（ｈａｌｌｍａｒｋ）残基において挿入される（例えば、ＷＯ９４／０４６７８並びにＤａｖｉｅｓ及びＲｉｅｃｈｍａｎｎ（１９９４年及び１９９６年）、前出を参照のこと）。一実施形態において、ラクダ化ＶＨを生成又は設計するための出発物質又は出発点として使用されるＶＨ配列は、哺乳動物由来のＶＨ配列、例えばヒトのＶＨ配列、例えばＶＨ３配列である。しかし、このようなラクダ化ＶＨは、それ自体公知の任意の適切な方法で得ることができ、従って出発物質として天然に存在するＶＨドメインを含むポリペプチドを使用して得られたポリペプチドに厳密に限定されることはないということに留意すべきである。
１つ又はそれ以上のＩＳＶＤ配列を互いにかつ／又は他のアミノ酸配列に（例えばジスルフィド架橋を介して）連結して、本発明の方法においても有用であるペプチド構築物（例えば、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ｓｃＦｖ構築物、「二特異性抗体」及び他の多選択性構築物）を生じ得るということに留意すべきである。例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ及びＨｕｄｓｏｎによる総説、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５ Ｓｅｐ；２３（９）：１１２６－３６）が参照される）。一般に、ポリペプチドが対象への投与を意図される場合（例えば、予防目的、治療目的及び／又は診断目的）、上記対象において天然には存在しない免疫グロブリン配列を含む。
免疫グロブリン単一可変ドメイン配列の構造は、４つのフレームワーク領域（「ＦＲ」）から構成されるとみなされ得、これらは、当該分野及び本明細書においてそれぞれ「フレームワーク領域１」（「ＦＲ１」）；「フレームワーク領域２」（「ＦＲ２」）；「フレームワーク領域３」（「ＦＲ３」）；及び「フレームワーク領域４」（「ＦＲ４」）と呼ばれ；これらのフレームワーク領域は、３つの相補性決定領域（「ＣＤＲ」）により割り込まれ、これらは当該分野及び本明細書いおいてそれぞれ「相補性決定領域１」（「ＣＤＲ１」）；「相補性決定領域２」（「ＣＤＲ２」）；及び「相補性決定領域３」（「ＣＤＲ３」）と呼ばれる。
ＷＯ０８／０２００７９（参照により本明細書に加入される）の５８頁及び５９頁の段落ｑ）にさらに記載されるように、免疫グロブリン単一可変ドメインのアミノ酸残基は、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ及びＭｕｙｌｄｅｒｍａｎｓの記事、２０００年（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４０（１－２）：１８５－１９５；例えばこの刊行物の図２を参照のこと）においてラクダ由来のＶＨＨドメインに適用されたように、Ｋａｂａｔらにより示されたＶＨドメインについての一般的ナンバリングに従ってナンバリングされ得る（「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、ＵＳ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１）。－ＶＨドメイン及びＶＨＨドメインについて当該分野で周知のように－ＣＤＲの各々におけるアミノ酸残基の総数は変化し得、そしてＫａｂａｔナンバリングにより示されたアミノ酸残基の総数に対応しないかもしれない（すなわち、Ｋａｂａｔナンバリングに従う１つ又はそれ以上の位置は、実際の配列において専有されていないかもしれず、又は実際の配列は、Ｋａｂａｔナンバリングにより可能な数よりも多いアミノ酸残基含有するかもしれない）ということに留意すべきである。これは、一般的には、Ｋａｂａｔに従うナンバリングが、実際の配列におけるアミノ酸残基の実際のナンバリングに対応してもしなくてもよいということを意味する。ＶＨドメイン及びＶＨＨドメインにおけるアミノ酸残基の総数は、通常は１１０～１２０の範囲、しばしば１１２と１１５との間だろう。しかし、より小さい配列及びより長い配列も本明細書において記載される目的に適しているかもしれないということに留意すべきである。
ＣＤＲ配列は、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ及びＤｕｅｂｅｌ（編 ２０１０年、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、ｖｏｌ ２、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｂｅｒｌｉｎ、Ｍａｒｔｉｎ、第３章、３３－５１頁）に記載されるようにＡｂＭナンバリングに従って決定され得る。この方法に従って、ＦＲ１は位置１～２５のアミノ酸残基を含み、ＣＤＲ１は位置２６～３５のアミノ酸残基を含み、ＦＲ２は位置３６～４９のアミノ酸を含み、ＣＤＲ２は位置５０～５８のアミノ酸残基を含み、ＦＲ３は位置５９～９４のアミノ酸残基を含み、ＣＤＲ３は位置９５～１０２のアミノ酸残基を含み、そしてＦＲ４は位置１０３～１１３のアミノ酸残基を含む。
ＣＤＲ領域の決定はまた、様々な方法に従って行われ得る。Ｋａｂａｔに従うＣＤＲ決定において、免疫グロブリン単一可変ドメインのＦＲ１は位置１～３０のアミノ酸残基を含み、免疫グロブリン単一可変ドメインのＣＤＲ１は位置３１～３５のアミノ酸残基を含み、免疫グロブリン単一可変ドメインのＦＲ２は位置３６～４９のアミノ酸残基を含み、免疫グロブリン単一可変ドメインのＣＤＲ２は位置５０～６５のアミノ酸残基を含み、免疫グロブリン単一可変ドメインのＦＲ３は位置６６～９４のアミノ酸残基を含み、免疫グロブリン単一可変ドメインのＣＤＲ３は位置９５～１０２のアミノ酸残基を含み、そして免疫グロブリン単一可変ドメインのＦＲ４は位置１０３～１１３のアミノ酸残基を含む。
このような免疫グロブリン配列において、フレームワーク配列は任意の適切なフレームワーク配列であり得、そして適切なフレームワーク配列の例は、例えば本明細書において言及される標準的な手引書及びさらなる開示及び先行技術に基づいて、当業者には明らかだろう。
フレームワーク配列は、免疫グロブリンフレームワーク配列又は免疫グロブリンフレームワーク配列から（例えばヒト化又はラクダ化により）誘導されたフレームワーク配列（の適切な組み合わせ）である。例えば、フレームワーク配列は、軽鎖可変ドメイン（例えば、ＶＬ－配列）由来及び／又は重鎖可変ドメイン（例えば、ＶＨ－配列又はＶＨＨ配列）由来のフレームワーク配列であり得る。１つの特定の態様において、フレームワーク配列は、ＶＨＨ－配列由来のフレームワーク配列（ここで上記フレームワーク配列は場合により部分的又は完全にヒト化されている）であるか、又はラクダ化されている（本明細書において定義されるとおり）従来のＶＨ配列のいずれかである。
特に、本明細書において記載される方法において使用されるＩＳＶＤ配列に存在するフレームワーク配列は、（本明細書において定義される）特徴残基の１つ又はそれ以上を含有し得、その結果、ＩＳＶＤ配列は、ヒト化ＶＨＨ又はラクダ化ＶＨを含むＶＨＨのようなＮＡＮＯＢＯＤＹ（登録商標）ＩＳＶＤである。このようなフレームワーク配列（の適切な組み合わせ）の非限定的な例は、本明細書におけるさらなる開示から明らかとなるだろう。
この場合もやはり、免疫グロブリン配列について本明細書に一般的に記載されるように、１つ又はそれ以上のフレームワーク配列が適切に隣接し、かつ／又はそれらを介して連結している、１つ又はそれ以上のＣＤＲ配列を含有するフラグメントのような前述のいずれかの適切なフラグメント（又はフラグメントの組み合わせ）（例えば、これらのＣＤＲと同じ順序で、そしてフレームワーク配列は、そのフラグメントが由来するフルサイズの免疫グロブリン配列中に存在し得る）を使用することも可能である。
しかし、本発明の方法において使用される多価ＩＳＶＤポリペプチド中に含まれるＩＳＶＤは、ＩＳＶＤ配列の（又はそれを発現するために使用されるヌクレオチド配列の）起源に関しても、ＩＳＶＤ配列又はヌクレオチド配列が生成される（生成された）か又は得られる（得られた）方法に関しても限定されないということに留意すべきである。従って、ＩＳＶＤ配列は、（適切な種由来の）天然に存在する配列であっても、合成又は半合成の配列であってもよい。特定の、しかし非限定的な態様において、ＩＳＶＤ配列は、（任意の適切な種由来の）天然に存在する配列又は合成もしくは半合成の配列であり、これらとしては、限定されないが、「ヒト化」（本明細書において定義されるとおり）免疫グロブリン配列（例えば、部分的又は完全にヒト化されたマウス又はウサギ免疫グロブリン配列、及び特に部分的又は完全にヒト化されたＶＨＨ配列）、「ラクダ化」（本明細書において定義されるとおり）免疫グロブリン配列（及び特にラクダ化ＶＨ配列）、さらには親和性成熟（例えば、合成、無作為又は天然に存在する免疫グロブリン配列から開始する）、ＣＤＲグラフティング、化粧張り（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）、異なる免疫グロブリン配列に由来するフラグメントの組み合わせ、オーバーラッププライマーを使用したＰＣＲアセンブリ、及び当業者に周知の免疫グロブリン配列を操作するための類似した技術のような技術により得られたＩＳＶＤ；又は前述のいずれかの任意の適切な組み合わせが挙げられる。
同様に、ヌクレオチド配列は、天然に存在するヌクレオチド配列でも合成又は半合成の配列でもよく、そして例えば、適切な天然に存在するテンプレート（例えば、細胞から単離されたＤＮＡ又はＲＮＡ）からＰＣＲにより単離される配列、ライブラリー（及び特に発現ライブラリー）から単離されたヌクレオチド配列、天然に存在するヌクレオチド配列に（それ自体公知の任意の適切な技術、例えばミスマッチＰＣＲを使用して）変異を導入することにより製造されたヌクレオチド配列、オーバーラッププライマーを使用してＰＣＲにより製造されたヌクレオチド配列、又はそれ自体公知のＤＮＡ合成のための技術を使用して製造されたヌクレオチド配列であり得る。
上記のように、ＩＳＶＤは、ＮＡＮＯＢＯＤＹ（登録商標）ＩＳＶＤ又はその適切なフラグメントであり得る。ＮＡＮＯＢＯＤＹ（登録商標）ＩＳＶＤの一般的な説明については、以下のさらなる記載に加えて、本明細書において引用される従来技術が参照される。しかし、この点において、この記載及び先行技術は、いわゆる「ＶＨ３クラス」のＮＡＮＯＢＯＤＹ（登録商標）ＩＳＶＤ（すなわち、ＤＰ－４７、ＤＰ－５１又はＤＰ－２９のようなＶＨ３クラスのヒト生殖系列配列に高度の配列相同性を有するＩＳＶＤＳ）を主に記載することに留意すべきである。しかし、その最も広い意味で、本明細書において記載される方法において使用されるＩＳＶＤポリペプチドは、一般的にいずれの型のＮＡＮＯＢＯＤＹ（登録商標）ＩＳＶＤも使用することができ、そして例えば、ＷＯ２００７／１１８６７０に記載されるように、いわゆる「ＶＨ４クラス」に属するＮＡＮＯＢＯＤＹ（登録商標）ＩＳＶＤ（すなわち、ＤＰ－７８のようなＶＨ４クラスのヒト生殖系列配列に対して高度の配列相同性を有するＩＳＶＤ）も使用できるということに留意すべきである。
一般に、ＮＡＮＯＢＯＤＹ（登録商標）ＩＳＶＤ（特に、（部分的に）ヒト化されたＶＨＨ配列及びラクダ化されたＶＨ配列を含むＶＨＨ配列）は、フレームワーク配列の１つ又はそれ以上（この場合もやはり本明細書においてさらに記載される）における１つ又はそれ以上の「特徴残基」（本明細書において記載される）の存在を特徴とし得る。従って、一般的に、ＮＡＮＯＢＯＤＹ（登録商標）ＩＳＶＤは、（一般的な）構造
ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４
を有する免疫グロブリン配列として定義され得、
ここでＦＲ１～ＦＲ４はそれぞれフレームワーク領域１～４を指し、そしてここでＣＤＲ１～ＣＤＲ３はそれぞれ相補性決定領域１～３を指し、そしてここで特徴残基の１つ又はそれ以上は、本明細書においてさらに定義されるとおりである。
ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４
を有する免疫グロブリン配列として定義され得、
ここでＦＲ１～ＦＲ４はそれぞれフレームワーク領域１～４を指し、そしてここでＣＤＲ１～ＣＤＲ３はそれぞれ相補性決定領域１～３を指し、そしてここで特徴残基の１つ又はそれ以上は、本明細書においてさらに定義されるとおりである。
特に、Ｎａｎｏｂｏｄｙは、（一般的）構造
ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４
を有する免疫グロブリン配列であり得、ここでＦＲ１～ＦＲ４はそれぞれフレームワーク領域１～４を指し、そしてここでＣＤＲ１～ＣＤＲ３はそれぞれ相補性決定領域１～３を指し、そしてここでフレームワーク配列は本明細書においてさらに定義されるとおりである。
ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４
を有する免疫グロブリン配列であり得、ここでＦＲ１～ＦＲ４はそれぞれフレームワーク領域１～４を指し、そしてここでＣＤＲ１～ＣＤＲ３はそれぞれ相補性決定領域１～３を指し、そしてここでフレームワーク配列は本明細書においてさらに定義されるとおりである。
より特に、ＮＡＮＯＢＯＤＹ（登録商標）ＩＳＶＤは、（一般的）構造
ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４
を有する免疫グロブリン配列であり得、ここでＦＲ１～ＦＲ４はそれぞれフレームワーク領域１～４を指し、そしてここでＣＤＲ１～ＣＤＲ３はそれぞれ相補性決定領域１～３を指し、そしてここで：
Ｋａｂａｔナンバリングに従う位置１１、３７、４４、４５、４７、８３、８４、１０３、１０４及び１０８のアミノ酸残基の１つ又はそれ以上が、以下の表Ａにおいて言及される特徴残基から選択される。
ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４
を有する免疫グロブリン配列であり得、ここでＦＲ１～ＦＲ４はそれぞれフレームワーク領域１～４を指し、そしてここでＣＤＲ１～ＣＤＲ３はそれぞれ相補性決定領域１～３を指し、そしてここで：
Ｋａｂａｔナンバリングに従う位置１１、３７、４４、４５、４７、８３、８４、１０３、１０４及び１０８のアミノ酸残基の１つ又はそれ以上が、以下の表Ａにおいて言及される特徴残基から選択される。
５．３ 多価ＩＳＶＤポリペプチド及びそのコンホメーション変異体
少なくとも３つ又は少なくとも４つのＩＳＶＤを含むか又はそれらからなる多価ＩＳＶＤポリペプチドの精製又は単離のための方法が提供される。本明細書において記載される方法により単離／精製しようとする多価ＩＳＶＤポリペプチドは、宿主における発現により得ることができる。特に、多価ＩＳＶＤポリペプチドは、ＣＨＯ細胞ではない宿主における発現により得ることができる。多価ＩＳＶＤポリペプチドは、本明細書において記載されるような下等真核生物宿主、例えばピキア・パストリスにおける発現により得ることができる。少なくとも３つ又は少なくとも４つのＩＳＶＤを含むか又はそれらからなる多価ＩＳＶＤポリペプチドの製造、精製、及び単離のための方法が提供される。該方法により単離／精製／製造しようとする多価ＩＳＶＤポリペプチドは、本明細書において記載されるような宿主、例えば下等真核生物宿主において産生され得る。一態様において、該方法により単離／精製／製造しようとする多価ＩＳＶＤポリペプチドは、ピキア、例えばピキア・パストリスのような本明細書において記載される酵母宿主において産生され得る。
少なくとも３つ又は少なくとも４つのＩＳＶＤを含むか又はそれらからなる多価ＩＳＶＤポリペプチドの精製又は単離のための方法が提供される。本明細書において記載される方法により単離／精製しようとする多価ＩＳＶＤポリペプチドは、宿主における発現により得ることができる。特に、多価ＩＳＶＤポリペプチドは、ＣＨＯ細胞ではない宿主における発現により得ることができる。多価ＩＳＶＤポリペプチドは、本明細書において記載されるような下等真核生物宿主、例えばピキア・パストリスにおける発現により得ることができる。少なくとも３つ又は少なくとも４つのＩＳＶＤを含むか又はそれらからなる多価ＩＳＶＤポリペプチドの製造、精製、及び単離のための方法が提供される。該方法により単離／精製／製造しようとする多価ＩＳＶＤポリペプチドは、本明細書において記載されるような宿主、例えば下等真核生物宿主において産生され得る。一態様において、該方法により単離／精製／製造しようとする多価ＩＳＶＤポリペプチドは、ピキア、例えばピキア・パストリスのような本明細書において記載される酵母宿主において産生され得る。
一般に、用語「多価」は、ポリペプチド中の複数のＩＳＶＤ（結合単位）の存在を示す。一実施形態において、ポリペプチドは、少なくとも「三価」、すなわち、少なくとも３つのＩＳＶＤを含むか又はそれらからなる。別の実施形態において、ポリペプチドは少なくとも「四価」であり、すなわち、少なくとも４つのＩＳＶＤを含むか又はそれらかななる。従って、本明細書において記載される方法において製造、精製及び／又は単離されるポリペプチドは、「三価」、「四価」、「五価」、「六価」、「七価」、「八価」、「九価」などであり得、すなわち、該ポリペプチドは、それぞれ３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つなどのＩＳＶＤを含むか又はそれらからなる。一実施形態において、多価ＩＳＶＤポリペプチドは三価である。別の実施形態において、多価ＩＳＶＤポリペプチドは四価である。さらに別の実施形態において、多価ＩＳＶＤポリペプチドは五価である。
少なくとも３つ又は少なくとも４つのＩＳＶＤを含むか又はそれらからなる多価ＩＳＶＤ構築物は多選択性であり得る。用語「多選択性」は、複数の異なる標的分子に結合することを指す。従って、多価ＩＳＶＤ構築物は、「二重特異性」、「三重特異性」、「四重特異性」などであり得、すなわち、それぞれ２つ、３つ、４つなどの異なる標的分子に結合することができる。
例えば、ポリペプチドは二重特異性－三価であり得、例えば３つのＩＳＶＤを含むか又はそれらからなるポリペプチドであり、ここで２つのＩＳＶＤがヒトＴＮＦαに結合し、かつ１つのＩＳＶＤがヒト血清アルブミンに結合する（例えば、化合物Ｃ、配列番号６９）。別の例では、ポリペプチドは三重特異性－四価であり得、例えば、４つのＩＳＶＤを含むかもしくはそれらからなるポリペプチドであり、ここで１つのＩＳＶＤはヒトＴＮＦαに結合し、２つのＩＳＶＤはヒトＩＬ２３ｐ１９に結合し、かつ１つのＩＳＶＤはヒト血清アルブミンに結合し（例えば、化合物Ｂ、配列番号２）；又は、例えば４つのＩＳＶＤを含むかもしくはそれらからなるポリペプチドであり、ここで１つのＩＳＶＤはヒトＴＮＦαに結合し、２つのＩＳＶＤはヒトＩＬ６に結合し、かつ１つのＩＳＶＤはヒト血清アルブミンに結合する（例えば、化合物Ｄ、配列番号７０；又は化合物Ｅ、配列番号７１）。さらに別の例において、ポリペプチドは三重特異性－五価であり得、例えば、５つのＩＳＶＤを含むか又はそれらからなるポリペプチドであり、ここで２つのＩＳＶＤはヒトＴＮＦαに結合し、２つのＩＳＶＤはヒトＯＸ４０Ｌに結合し、かつ１つのＩＳＶＤはヒト血清アルブミンに結合する（例えば、化合物Ａ；配列番号１）。
本明細書において記載される方法により製造／精製／単離しようとする少なくとも３つ又は少なくとも４つのＩＳＶＤからなるポリペプチドを、１つ又はそれ以上の適切なリンカー、例えばペプチドリンカーにより連結することができる。２つ又はそれ上の（ポリ）ペプチドを接続するためのリンカーの使用は、当該分野で周知である。例となるペプチドリンカーを表Ｂに示す。１つの頻繁に使用されるペプチドリンカーのクラスは、「Ｇｌｙ－Ｓｅｒ」又は「ＧＳ」リンカーとして知られる。これらは、グリシン（Ｇ）及びセリン（Ｓ）残基から本質的になるリンカーであり、そして通常は、ＧＧＧＧＳ（配列番号４）モチーフのようなペプチドモチーフの１つ又はそれ以上の反復を含む（例えば、式（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）ｎを有し、式中ｎは１、２、３、４、５、６、７又はそれ以上であり得る）。このようなＧＳリンカーのいくつかの頻繁に使用される例は、９ＧＳリンカー（ＧＧＧＧＳＧＧＧＳ、配列番号７）、１５ＧＳリンカー（ｎ＝３）及び３５ＧＳリンカー（ｎ＝７）である。例えばＣｈｅｎら、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．２０１３年１０月１５日；６５（１０）：１３５７-１３６９；及びＫｌｅｉｎら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．（２０１４） ２７（１０）：３２５－３３０が参照される。一実施形態において、上記ポリペプチドは、９ＧＳリンカーを使用して該ポリペプチドの構成要素を互いに連結する。一実施形態において、少なくとも３つ又は少なくとも４つのＩＳＶＤは、線状（すなわち、非分枝）配列で、場合により１つ又はそれ以上のペプチドリンカーを介して互いに接続される。
本発明の方法により製造／精製／単離しようとする少なくとも３つ又は少なくとも４つのＩＳＶＤからなるポリペプチドは、他の基、残基、部分又は結合単位も含んでいてもよい。これらの他の基、残基、部分又は結合単位は、該１つ又はそれ以上の他の基、残基、部分又は結合単位を含まない対応するポリペプチドと比較して増加した半減期を該ポリペプチドに与え得る。例えば、結合単位は、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミンのようなヒト血清タンパク質に結合するＩＳＶＤであり得る（例えば、ＷＯ２０１２／１７５４００、ＷＯ２０１５／１７３３２５、ＷＯ２０１７／０８０８５０、ＷＯ２０１７／０８５１７２、ＷＯ２０１８／１０４４４４、ＷＯ２０１８／１３４２３４、ＷＯ２０１８／１３４２３５を参照のこと）。さらに、本発明の方法により製造／精製／単離しようとする少なくとも３つ又は少なくとも４つのＩＳＶＤからなるポリペプチドはまた、任意の精製プロセスに必要な他の適切な基、残基、部分又は結合単位（例えば、Ｈｉｓタグのようなタグ）を含んでいてもよい。
本発明の方法により製造／精製／単離しようとする少なくとも３つ又は少なくとも４つのＩＳＶＤを含むか又はそれらからなるポリペプチドはまた、例えば、ＩＳＶＤではないが他の機能をもたらす１つ又はそれ以上のさらなるアミノ酸配列（全て場合により１つ又はそれ以上の適切なリンカーを介して連結される）を含むタンパク質又はポリペプチドの一部を形成してもよい。例えば、かつ限定することなく、少なくとも３つ又は少なくとも４つのＩＳＶＤは、このようなタンパク質又はポリペプチドにおいて結合単位として使用され得、これらは場合により、ＩＳＶＤではないが結合単位（すなわち、１つ又はそれ以上の他の標的に対して）として、かつ／又は機能的単位として役立ち得る１つ又はそれ以上のさらなるアミノ酸配列を場合により含有してもよい。
製造、精製、及び／又は単離しようとする少なくとも３つ又は少なくとも４つのＩＳＶＤを含むか又はそれらからなる多価ＩＳＶＤポリペプチドは、本明細書において記載される製造／精製／単離方法の所望の生成物である。これに関して用語「少なくとも３つ又は少なくとも４つのＩＳＶＤを含むか又はそれらからなる（多価ＩＳＶＤ）ポリペプチド」は、本出願内において、「上記ポリペプチド」、「所望のポリペプチド（生成物）」、「ＩＳＶＤポリペプチド」、「所望のＩＳＶＤポリペプチド」、「（多価）ＩＳＶＤポリペプチド（生成物）」、又は「（多価）ＩＳＶＤ構築物」と交換可能に使用される。所望のポリペプチド生成物は、「生成物」、「インタクトな生成物」、又は「インタクトな（ＩＳＶＤ）形態」とも呼ばれる。インタクトな形態は、ＳＥ－ＨＰＬＣ及びＩＥＸ－ＨＰＬＣのような分析用クロマトグラフィー技術におけるメインピークとして現れる。
少なくとも３つ又は少なくとも４つのＩＳＶＤを含むか又はそれらからなる多価ＩＳＶＤポリペプチドの「コンホメーション変異体」は望ましくなく、そして本出願に記載される方法により、所望のＩＳＶＤポリペプチドに変換されるべきであり、かつ／又はインタクトな生成物及びコンホメーション変異体を含む組成物から除去されるべきである。コンホメーション変異体は、インタクトな生成物と比較してより緻密な形態を特徴とする。従って、用語「コンホメーション変異体」は、本出願内で「変異体」、「緻密な変異体」、「緻密なコンホメーション変異体」又は「緻密な形態」と交換可能に使用される。
緻密な変異体は、所望のポリペプチド生成物と比較して減少した流体力学的体積を特徴とする。一般に、流体力学的体積は、膨張した又は膨潤した分子コイルが吸収された溶媒と一緒に占める見かけの体積である。換言すれば、流体力学的体積は、それが溶液状態である場合に特定のポリマー分子がどれだけの空間を占めるかである（溶液中の高分子の有効水和体積）。高分子の流体力学的体積は、その溶液中での挙動から、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）におけるその保持時間から推定することができ、従って高分子のサイズに基づく力学的特性である。タンパク質／ポリペプチドの流体力学的体積を測定することにより、ＳＥＣはタンパク質三次構造（又は高分子相互作用を保存する適切な天然条件が使用される場合は四次構造さえも）を分析することができ、折りたたまれたバージョンと折りたたまれていないバージョン、又は同じタンパク質／ポリペプチドの折りたたまれたドメインと折りたたまれていないドメインさえも区別することを可能にする（しかし分子量ではない）。例えば、典型的なタンパク質ドメインの見かけの流体力学的半径は、折りたたまれた形態及び折りたたまれていない形態についてそれぞれ１４Å及び３６Åであり得る。折りたたまれた形態はそのより小さいサイズに起因してかなりより遅く溶出するので、ＳＥＣはこれらの２つの形態の分離を可能にする。
緻密な変異体は、所望のポリペプチド生成物と比較して、変化した表面電荷及び／又は変化した疎水性露出（表面疎水性）を特徴とする。
仮説により拘束されないが － 変異体の緻密なコンホメーションは、上記ポリペプチドの少なくとも３つ又は少なくとも４つのＩＳＶＤビルディングブロックのうちの少なくとも２つの間の分子内相互作用に起因する（所望のポリペプチド生成物と比較して）。それ故、コンホメーション変異体は、互いに相互作用して所望のポリペプチド生成物と比較して減少した流体力学的体積を生じる少なくとも２つのＩＳＶＤにより特徴づけられ得る。従ってさらに、緻密な変異体は、互いに相互作用して所望のポリペプチド生成物と比較して変化した表面電荷及び／又は変化した表面疎水性を生じる少なくとも２つのＩＳＶＤにより特徴づけられ得る。
従って、コンホメーション変異体を、流体力学的体積のシフトにより所望のポリペプチド生成物と区別することができる。さらに、コンホメーション変異体を、表面電荷及び／又は表面疎水性のシフトにより所望のポリペプチド生成物と区別することができる。コンホメーション変異体及び所望のポリペプチド生成物は、それらの分子量において差異がない。従って、コンホメーション変異体及び所望のポリペプチド生成物は、それらの分子量により区別することができない。さらに、コンホメーション変異体及び所望のポリペプチド生成物は、それらのジスルフィド架橋において差異がない。従って、コンホメーション変異体及び所望のポリペプチド生成物は、スクランブルジスルフィド架橋により区別できない。
上に記載したような変化に起因して、コンホメーション変異体及び所望のポリペプチド生成物を、分析用及び／又は分取用クロマトグラフィー技術において観察される、所望のポリペプチド生成物と比較してコンホメーション変異体の変化した保持時間により区別することができる。例えば、コンホメーション変異体はを、ＳＥ－ＨＰＬＣ及び／又はＩＥＸ－ＨＰＬＣのような１つ又はそれ以上の分析用クロマトグラフィー技術により所望のポリペプチド生成物と区別することができる。特に、コンホメーション変異体を、流体力学的体積のシフトにより所望のポリペプチド生成物と区別することができ、ここで上記のシフトは、分析用ＳＥ－ＨＰＬＣにおける増加した保持時間により示される。さらに、コンホメーション変異体を、表面電荷のシフトにより所望のポリペプチド生成物と区別することができ、ここで上記のシフトは、分析用ＩＥＸ－ＨＰＬＣにおける変化した保持時間により示される。インタクトな生成物と比較してコンホメーション変異体の増加した保持時間は、ポストピークショルダーとして分析用ＳＥ－ＨＰＬＣにおいて、又はこのＳＥ－ＨＰＬＣのクロマトグラムにおいて分離されたポストピークとして同定可能である。インタクトな生成物と比較してコンホメーション変異体の表面電荷の変化は、それぞれ分析用ＩＥＸ－ＨＰＬＣにおいてプレピークショルダーもしくは分離したプレピークとして、又はこのＩＥＸ－ＨＰＬＣのクロマトグラムにおいてポストピークショルダーもしくは分離したポストピークとして同定可能である。当業者に明らかなように、インタクトな生成物と比較してコンホメーション変異体の保持時間が減少するか又は増加するかは、インタクトな生成物と比較してコンホメーション変異体の表面電荷の質及び量の両方に依存し、さらにはＩＥＸ－ＨＰＬＣにおいて使用される条件（例えば、樹脂、緩衝液、ｐＨ、塩濃度／イオン強度など）にも依存する。従って、一実施形態において、コンホメーション変異体は、ＩＥＸ－ＨＰＬＣにおける増加した保持時間を特徴とする。別の実施形態において、コンホメーション変異体は、ＩＥＸ－ＨＰＬＣにおける減少した保持時間を特徴とする。従って、コンホメーション変異体は、インタクトな生成物と比較してＳＥ－ＨＰＬＣにおける増加した保持時間を特徴とする。コンホメーション変異体はまた、インタクトな生成物と比較してＩＥＸ－ＨＰＬＣにおける変化した（減少した又は増加した）保持時間を特徴とする。
上記の変化に起因して、コンホメーション変異体を、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）、例えば、カチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）、ミックスモードクロマトグラフィー（ＭＭＣ）、及び／又は疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）のような１つ又はそれ以上の分取用クロマトグラフィー技術により、インタクトな生成物と区別することもできる。特に、コンホメーション変異体を、上記の分取用クロマトグラフィー技術から得られた異なるフラクションにおけるその存在により、（所望の）ポリペプチドと区別することができる（上記分取用クロマトグラフィー技術において観察される、所望のポリペプチド生成物と比較してコンホメーション変異体の変化した保持時間に起因して）。例えば、コンホメーション変異体は、トップフラクションとして溶出する所望のポリペプチド生成物と比較して、分取用ＩＥＸ（例えば、ＣＥＸ）、分取用ＭＭＣ（例えば、ヒドロキシアパタイト樹脂に基づく）、及び／又はＨＩＣ（例えば、ＨＩＣカラム樹脂又はＨＩＣメンブレンに基づく）におけるサイドフラクションにおけるその存在により特徴づけられ得る。当業者には明らかなように、コンホメーション変異体がプレサイドフラクションとして溶出するか又はポストサイドフラクションとして溶出するか、すなわち、コンホメーション変異体がそれぞれ減少した保持時間又は増加した保持時間のどちらで溶出するかは、所望のポリペプチド生成物と比較したコンホメーション変異体の表面電荷及び／又は表面疎水性の差異の質及び量の両方に依存し、さらに使用されるそれぞれの分取用クロマトグラフィー技術において使用される条件（例えば、樹脂、緩衝液、ｐＨ、塩濃度／イオン強度など）にも依存する。
従って、ＳＥ－ＨＰＬＣ及び／又はＩＥＸ－ＨＰＬＣのような本明細書において提供される特定の分析用クロマトグラフィー技術によるコンホメーション変異体の同定後に、当業者は、コンホメーション変異体を除去するために分取用クロマトグラフィー技術を調整／最適化することができる。
さらなる態様において、コンホメーション変異体を、効力の変化により所望のポリペプチド生成物と区別することができ、ここでコンホメーション変異体は、所望のポリペプチド生成物と比較して減少した効力（本明細書において定義されるとおり）を有する。
さらに、コンホメーション変異体を、本明細書に記載されるような処理方法において所望のポリペプチド生成物に変換されるその能力により所望のポリペプチド生成物と区別することができる。より詳細には、コンホメーション変異体は：
ｉ） 単離及び／もしくは精製方法の１つもしくはそれ以上の工程において低ｐＨ処理を適用すること；
ｉｉ） 単離及び／もしくは精製方法の１つもしくはそれ以上の工程においてカオトロピック剤を適用すること；
ｉｉｉ） 単離及び／もしくは精製方法の１つもしくはそれ以上の工程において熱ストレスを加えること；又は
ｉｖ） ｉ）～ｉｉｉ）のいずれかの組み合わせ
を行った際に所望のポリペプチド生成物に変換されるその能力により特徴づけられ、ここで変換は、ＳＥ－ＨＰＬＣ及び／又はＩＥＸ－ＨＰＬＣのような１つ又はそれ以上の分析用クロマトグラフィー技術により実証される。特に、変換は、分析用ＳＥ－ＨＰＬＣのクロマトグラムにおけるポストピークショルダー又は分離されたポストピークの減少又は消失（さえも）により実証される。さらに、又は代替としては、変換は、分析用ＩＥＸ－ＨＰＬＣのクロマトグラムにおけるプレピークショルダーもしくは分離したプレピーク、又はポストピークショルダーもしくは分離したポストピークの減少又は消失（さえも）により実証される。
ｉ） 単離及び／もしくは精製方法の１つもしくはそれ以上の工程において低ｐＨ処理を適用すること；
ｉｉ） 単離及び／もしくは精製方法の１つもしくはそれ以上の工程においてカオトロピック剤を適用すること；
ｉｉｉ） 単離及び／もしくは精製方法の１つもしくはそれ以上の工程において熱ストレスを加えること；又は
ｉｖ） ｉ）～ｉｉｉ）のいずれかの組み合わせ
を行った際に所望のポリペプチド生成物に変換されるその能力により特徴づけられ、ここで変換は、ＳＥ－ＨＰＬＣ及び／又はＩＥＸ－ＨＰＬＣのような１つ又はそれ以上の分析用クロマトグラフィー技術により実証される。特に、変換は、分析用ＳＥ－ＨＰＬＣのクロマトグラムにおけるポストピークショルダー又は分離されたポストピークの減少又は消失（さえも）により実証される。さらに、又は代替としては、変換は、分析用ＩＥＸ－ＨＰＬＣのクロマトグラムにおけるプレピークショルダーもしくは分離したプレピーク、又はポストピークショルダーもしくは分離したポストピークの減少又は消失（さえも）により実証される。
さらに、又は代替としては、変換は、所望のポリペプチド生成物の効力と比較した効力の部分的な回復又は完全な回復により実証される。
５．４ 製造／精製／単離方法
上記の多価ＩＳＶＤポリペプチド生成物を単離又は精製するための方法が提供され、ここで単離又は精製しようとする多価ＩＳＶＤポリペプチドは、宿主における発現により得ることができる。一実施形態において、宿主はＣＨＯ細胞ではない。一実施形態において、宿主は本明細書において示されるような下等真核生物宿主である（セクション５．３ 「多価ＩＳＶＤポリペプチド及びそのコンホメーション変異体」）。本明細書において使用される用語「精製する」、「精製」、又は「精製すること」は、所望の多価ＩＳＶＤポリペプチド生成物及びコンホメーション変異体を含む組成物が、不純要素（その中にはコンホメーション変異体もある）の無いことを意味する。本明細書において使用される用語「単離する」、「単離」、又は「単離すること」は、所望の多価ポリペプチド生成物が、不純要素に加えて所望の多価ＩＳＶＤポリペプチド生成物及びそのコンホメーション変異体の両方を含む組成物から離されるか又は分離されることを意味する。
上記の多価ＩＳＶＤポリペプチド生成物を単離又は精製するための方法が提供され、ここで単離又は精製しようとする多価ＩＳＶＤポリペプチドは、宿主における発現により得ることができる。一実施形態において、宿主はＣＨＯ細胞ではない。一実施形態において、宿主は本明細書において示されるような下等真核生物宿主である（セクション５．３ 「多価ＩＳＶＤポリペプチド及びそのコンホメーション変異体」）。本明細書において使用される用語「精製する」、「精製」、又は「精製すること」は、所望の多価ＩＳＶＤポリペプチド生成物及びコンホメーション変異体を含む組成物が、不純要素（その中にはコンホメーション変異体もある）の無いことを意味する。本明細書において使用される用語「単離する」、「単離」、又は「単離すること」は、所望の多価ポリペプチド生成物が、不純要素に加えて所望の多価ＩＳＶＤポリペプチド生成物及びそのコンホメーション変異体の両方を含む組成物から離されるか又は分離されることを意味する。
さらに、多価ＩＳＶＤポリペプチド生成物を宿主において製造するための方法が提供される。一実施形態において、宿主はＣＨＯ細胞ではない。一実施形態において、宿主は本明細書に示されるような下等真核生物宿主である。該方法は、上記ポリペプチドをコードする核酸を用いて宿主細胞又は宿主生物を形質変換／トランスフェクトすること、該宿主において上記ポリペプチドを発現させることを含み、その後に１つ又はそれ以上の単離工程及び／又は精製工程が続く。詳細には、多価ＩＳＶＤポリペプチド生成物を製造する方法は：
ａ） 適切な宿主細胞もしくは宿主生物において又は別の適切な発現系において、上記ポリペプチドをコードする核酸配列を発現させること；続いて：
ｂ） 所望のポリペプチドを単離及び／又は精製すること
を含み得る。
ａ） 適切な宿主細胞もしくは宿主生物において又は別の適切な発現系において、上記ポリペプチドをコードする核酸配列を発現させること；続いて：
ｂ） 所望のポリペプチドを単離及び／又は精製すること
を含み得る。
下等真核生物宿主細胞のような宿主により産生された多価ＩＳＶＤポリペプチドの重要なフラクションにおいて、生成物に関連するコンホメーション変異体の存在が観察される。このコンホメーション変異体の存在は、最終多価ＩＳＶＤポリペプチド生成物の品質及び均一性に影響を及ぼすかもしれない。しかし、生成物の高い品質及び均一性は、例えば、これらの多価ＩＳＶＤポリペプチド生成物の治療上の使用に必須である。
本出願は、改善された品質を有する（すなわち、コンホメーション変異体の減少したレベルを有するか又はそれが存在しないこと）多価ＩＳＶＤポリペプチド生成物を含む組成物の製造／精製／単離のための方法を記載する。品質は、特定の条件（１）コンホメーション変異体が所望のポリペプチド生成物に変換される、かつ／又は（２）コンホメーション変異体が多価ＩＳＶＤポリペプチドの単離もしくは精製工程の間に除去される、を適用することにより改善される。従って、生成物に関連するコンホメーション変異体をＩＳＶＤを含有する所望のポリペプチド生成物へと変換する方法が本明細書において提供される。生成物に関連するコンホメーション変異体を、（所望の）ポリペプチド生成物及びそのコンホメーション変異体を含む組成物から除去する方法もまた提供される。生成物に関連するコンホメーション変異体を（所望の）ＩＳＶＤポリペプチド生成物へ変換し、そして生成物に関連するコンホメーション変異体を、（所望の）ＩＳＶＤポリペプチド生成物及びそのコンホメーション変異体を含む組成物から除去する方法が提供される。
５．４．１ 少なくとも３つ又は少なくとも４つのＩＳＶＤを含むか又はそれらからなるポリペプチドの製造
本発明者らは、宿主におけるそのポリペプチドの産生の際に、少なくとも３つ又は少なくとも４つのＩＳＶＤを含むか又はそれらからなるポリペプチドのコンホメーション変異体を同定した。コンホメーション変異体は、宿主、特に本明細書に示されるような下等真核生物宿主である宿主における産生の際に観察された。
本発明者らは、宿主におけるそのポリペプチドの産生の際に、少なくとも３つ又は少なくとも４つのＩＳＶＤを含むか又はそれらからなるポリペプチドのコンホメーション変異体を同定した。コンホメーション変異体は、宿主、特に本明細書に示されるような下等真核生物宿主である宿主における産生の際に観察された。
当業者は、宿主細胞において免疫グロブリン単一可変ドメインを製造する一般的な方法が十分にわかる。
一般的な実施形態において、少なくとも３つ又は少なくとも４つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含むポリペプチドを製造する方法は、以下のセクション５．４．３「コンホメーション変異体の所望のポリペプチド生成物への変換」及び５．４．４「コンホメーション変異体の除去」にさらに詳述されるように、コンホメーション変異体の所望のＩＳＶＤポリペプチド生成物への変換並びに／又は所望のＩＳＶＤポリペプチド生成物及びそのコンホメーション変異体を含む組成物からのコンホメーション変異体の除去を生じる１つ又はそれ以上の精製／単離工程を含む。
より詳細には、少なくとも３つ又は少なくとも４つのＩＳＶＤを含むポリペプチドを製造するための方法は、以下の工程：
ａ） 場合により、宿主又は宿主細胞が増殖するような条件下で宿主又は宿主細胞を培養する工程；
ｂ） 宿主又は宿主細胞が上記ポリペプチドを発現し、かつ／又は産生するような条件下で宿主又は宿主細胞を維持する工程；並びに
ｃ） 分泌されたポリペプチドを培地から単離及び／又は精製する工程、［ここで、該単離及び／又は精製する工程は、コンホメーション変異体の所望のＩＳＶＤポリペプチド生成物への変換、及び／又は所望のＩＳＶＤポリペプチド生成物及びそのコンホメーション変異体を含む組成物からのコンホメーション変異体の除去を生じる１つ又はそれ以上の精製／単離工程を含む］、
を少なくとも含む。
ａ） 場合により、宿主又は宿主細胞が増殖するような条件下で宿主又は宿主細胞を培養する工程；
ｂ） 宿主又は宿主細胞が上記ポリペプチドを発現し、かつ／又は産生するような条件下で宿主又は宿主細胞を維持する工程；並びに
ｃ） 分泌されたポリペプチドを培地から単離及び／又は精製する工程、［ここで、該単離及び／又は精製する工程は、コンホメーション変異体の所望のＩＳＶＤポリペプチド生成物への変換、及び／又は所望のＩＳＶＤポリペプチド生成物及びそのコンホメーション変異体を含む組成物からのコンホメーション変異体の除去を生じる１つ又はそれ以上の精製／単離工程を含む］、
を少なくとも含む。
本明細書において記載される方法により単離／精製しようとするＩＳＶＤポリペプチドは宿主において産生され得る。宿主は、ＣＨＯ細胞ではない宿主であり得る。特に、宿主は、酵母生物のような下等真核生物宿主であり得る。単離／精製しようとするポリペプチドの産生に適した酵母生物は、ピキア（コマガタエラ）、ハンゼヌラ、サッカロミセス、クリベロミセス、カンジダ、トルロプシス、トルラスポラ、分裂酵母、シテロミセス、パキソレン、デバロミセス、メトスクニコウィア、ロドスポリジウム、ロイコスポリジウム、ボトリオアスクス、スポリジオボルス、エンドミコプシスである。特定の実施形態において、精製／単離しようとするポリペプチドは、ピキア、特にピキア・パストリスにおいて産生される。
ピキア・パストリスのような下等真核生物宿主におけるＩＳＶＤの製造は、Ｆｒｅｎｋｅｎら２０００年（Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７８：１１－２１）、ＷＯ９４／２５５９１、ＷＯ２０１０／１２５１８７、ＷＯ２０１２／０５６０００、ＷＯ２０１２／１５２８２３及びＷＯ２０１７／１３７５７９に記載されている。これらの出願の内容は、適切な培地及び条件を含めて一般的な培養技術及び方法に関連して明示的に参照される。当業者はまた、よく知られた一般的な知識に基づいて宿主細胞におけるドメインの発現のための適切な遺伝子構築物を構築することもできる。
用語「宿主生物」及び「宿主細胞」は、本明細書において「宿主」として一緒に言及される。本明細書に記載される製造方法において、任意の宿主（生物）又は宿主細胞を使用してもよいが、ただし、それらはＩＳＶＤ含有ポリペプチドの産生に適したものである。特に、ポリペプチドの一部が生成物に関連するコンホメーション変異体の形態で産生される宿主（例えば、下等真核生物宿主）が記載される。
適切な宿主の具体例は、コリネ型細菌又は腸内細菌科のような原核生物を含む。昆虫細胞、特にトリオプルシアニ（Ｔｒｉｏｐｌｕｓｉａｎｉ）又はヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）由来細胞のようなバキュロウイルス媒介組み換え発現に適した昆虫細胞、限定されないが、ＢＴＩ－ＴＮ－５Ｂ１－４ Ｈｉｇｈ ＦｉｖｅＴＭ昆虫細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＳＦ９又はＳｆ２１細胞が挙げられる；ＣＨＯ細胞のような哺乳動物細胞、及び酵母を含む下等真核生物宿主、例えば、ピキア（コマガタエラ）、ハンゼヌラ、サッカロミセス、クリベロミセス、カンジダ、トルロプシス、トルラスポラ、分裂酵母、シテロミセス、パキソレン、デバロミセス、メトスクニコウィア、ロドスポリジウム、ロイコスポリジウム、ボトリオアスクス、スポリジオボルス、エンドミコプシスも含まれる。一実施形態において、例えばピキア・パストリスのような酵母が宿主として使用される。
製造方法において使用される宿主は、ＩＳＶＤ含有ポリペプチドを産生することができる。典型的には、これは１つ又はそれ以上のＩＳＶＤ含有ポリペプチドをコードする１つ又はそれ以上の核酸配列を含むように遺伝的に改変される。遺伝子改変の非限定的な例は、例えば、プラスミドもしくはベクターを用いた形質変換、又はウイルスベクターを用いた形質導入を含む。融合技術により遺伝子改変され得る宿主もある。遺伝子改変は、別々の核酸分子を宿主中に導入すること、例えばプラスミド又はベクター、さらには例えば、宿主の染色体への組み込みによる、例えば相同組み換えによる、宿主の遺伝子材料の直接的な改変を含む。両方の組み合わせがしばしば起こり、例えば、宿主は、相同組み換えの際に宿主染色体中に（少なくとも部分的に）組み込まれるプラスミドを用いて形質変換される。当業者には、宿主がＩＳＶＤ含有ポリペプチドを産生することを可能にするために適した遺伝子改変の方法が分かる。
核酸の発現及びポリペプチドの産生のための具体的な条件及び遺伝子構築物は、当該分野で記載されており、例えば、ＷＯ ９４／２５５９１、Ｇａｓｓｅｒら Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９４：５３５、２００６；Ｇａｓｓｅｒら Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７３：６４９９、２００７；又はＤａｍａｓｃｅｎｏら Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７４：３８１、２００７に記載される一般的な培養方法、プラスミド、プロモーター及びリーダー配列。
５．４．２ 少なくとも３つ又は少なくとも４つのＩＳＶＤを含むか又はそれらからなるポリペプチドの精製
当業者は、ＩＳＶＤポリペプチド（例えば、ＶＨ及びＶＨＨ）を精製するための一般的方法を十分知っている。
当業者は、ＩＳＶＤポリペプチド（例えば、ＶＨ及びＶＨＨ）を精製するための一般的方法を十分知っている。
例えば、ＩＳＶＤの精製は、ＷＯ ２０１０／１２５１８７及びＷＯ ２０１２／０５６０００に記載される。
ポリペプチドの産生／発現後に、宿主は慣用の手段により培地から除去され得る。例えば、宿主は、遠心分離又はろ過により除去され得る。培地からの宿主の除去により得られた溶液はまた、培養上清又は清澄化された培養上清とも呼ばれる。
多価ＩＳＶＤ生成物は、標準的な方法により培養上清から精製され得る。標準的な方法としては、限定されないが、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）、アフィニティークロマトグラフィー（ＡＣ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、ミックスモードクロマトグラフィー（ＭＭＣ）を含むクロマトグラフィー方法が挙げられる。これらの方法は、単独で、又は他の精製方法、例えば沈殿と組み合わせて行われ得る。当業者は、よく知られた一般的な知識にもとづいて、ＩＳＶＤ及びＩＳＶＤ含有ポリペプチドのための精製方法の適切な組み合わせを考案することができる。具体的な例については、本明細書において引用される技術が参照される。
以下に詳細に記載されるように（セクション５．４．３ 「コンホメーション変異体の所望のポリペプチド生成物への変換」及び５．４．４「コンホメーション変異体の除去」）、コンホメーション変異体を変換又は除去する条件のいずれか又はそれらの組み合わせが、これらの精製方法の任意の工程の前、任意の工程の時点でもしくは間に、又は任意の工程の後に適用され得るということが想定される。
任意の又は全てのクロマトグラフィー工程を任意の機械的手段により行うことができる。クロマトグラフィーは、例えば、カラムで行われ得る。カラムは、圧力をかけて又はかけないで、上から下へ又は下から上へ流され得る。カラムにおける流体の流れの方向は、クロマトグラフィープロセスの間に逆にされ得る。クロマトグラフィーはまた、バッチプロセスで行われてもよく、ここで固形媒体は、重力、遠心分離、又はろ過を含む任意の適切な手段によりサンプルをロード、洗浄及び溶出するために使用される液体から分離される。
クロマトグラフィーはまた、サンプル中のいくつかの分子を他の分子より強く吸収又は保持するフィルターとサンプルを接触させることにより行われ得る。以下の記載において、様々な実施形態は、カラムにおいて行われるクロマトグラフィーの文脈で大部分記載される。しかし、カラムの使用は、使用され得るいくつかのクロマトグラフィー様式のうちの単なる一つにすぎず、そして当業者は教示を他の様式、例えばバッチプロセス又はフィルターを使用する様式にも容易に応用し得るので、カラムを使用した説明は、適用をカラムクロマトグラフィーに限定しないということが理解される。
適切な支持体は、特許請求される方法を実施するために必要な特徴を有する任意の現在利用可能な材料又は後に開発される材料であってよく、そして任意の合成、有機、又は天然のポリマーに基づくものであり得る。例えば、一般的に使用される支持体の物質としては、セルロース、ポリスチレン、アガロース、セファロース、ポリアクリルアミド ポリメタクリレート、デキストラン及びデンプンのような有機材料、並びに炭、シリカ（ガラスビーズ又は砂）及びセラミック材料のような無機材料が挙げられる。適切な固体支持体は、例えば、Ｚａｂｏｒｓｋｙ 「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ」 ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、１９７３、２８－４６頁表ＩＶに開示される。
一般的な方法条件、溶液及び／又は緩衝液、さらには様々なクロマトグラフィープロセスにおける使用のためのそれらの濃度範囲は、標準的なクロマトグラフィーに関する手引書（例えば、Ｇｕｅｎｔｅｒ Ｊａｇｓｃｈｉｅｓ、Ｅｖａ Ｌｉｎｄｓｋｏｇ（編）Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、Ｄｅｓｉｇｎ、ａｎｄ Ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ、第１版２０１７年、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）に基づいて、クロマトグラフィーの当業者により決定され得る。
ＩＳＶＤポリペプチド精製プロセスの第一の工程は、しばしば「捕獲工程」と呼ばれる。捕獲工程の目的は、プロセスに関連する不純物の第一の減少を有すること（例えば、限定されないが、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、色及びＤＮＡ）及び高い回収を維持しながらＩＳＶＤポリペプチド生成物を捕獲することである。一実施形態において、捕獲工程は、結合及び溶出モードにおけるプロテインＡクロマトグラフィーでの最初の精製を指す。
精製プロセスの第二の工程は、しばしば「ポリッシング工程」と呼ばれ、純度改善を目的とする。例えば、ＩＳＶＤポリペプチド精製プロセスの第二の精製工程として、結合及び溶出モードでのイオン交換クロマトグラフィー工程が、生成物関連変異体（例えば、限定されないが、高分子量（ＨＭＷ）種、低分子量（ＬＭＷ）種、及び他の荷電した変異体）、さらには捕獲工程後もなお存在しているいくつかのプロセス関連不純物（例えば、限定されないが、ＨＣＰ、残留プロテインＡ、ＤＮＡ）を除去／減少させるために使用され得る。
１つの例となる実施形態において、多価ＩＳＶＤポリペプチドは、プロテインＡ及びでのアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーの組み合わせにより培養上清から精製され得る。任意の「精製工程」の参照は、限定されないが、これらの特定の方法を含む。
プロテインＡベースのクロマトグラフィー
一実施形態において、ＩＳＶＤポリペプチド含有調製物は、プロテインＡクロマトグラフィーにより精製され得る。ブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）は、Ｎ末端から順にＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ及びＣと名付けられた５つのほとんど相同なドメインから構成される４２ｋＤａのタンパク質である（Ｓｊｏｄｈａｌ Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７８：４７１－４９０（１９７７）；Ｕｈｌｅｎら Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：１６９５－１７０２（１９８４））。これらのドメインは約５８残基を含有し、それぞれアミノ酸配列同一性約６５％～９０％を共有する。プロテインＡと抗体との間の結合研究は、ＳｐＡの全てのドメイン（Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｂ及びＣ）がＩｇＧにそのＦｃ領域を介して結合するが、ドメインＤ及びＥは有意なＦａｂ結合を示すということを示した（Ｌｊｕｎｇｂｅｒｇら Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０（１４）：１２７９－１２８５（１９９３）；Ｒｏｂｅｎら Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：６４３７－６４４５（１９９５）；Ｓｔａｒｏｖａｓｎｉｋら Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｉ．８：１４２３－１４３１ （１９９９）。Ｂドメインの機能的アナログでありかつエネルギー最小化バージョンであるＺドメイン（ＮｉｌｓｓｏｎらＰｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１：１０７－１１３ （１９８７））は、抗体可変ドメイン領域に対して無視できる結合しか有していないことが示された（Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎら Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．６（４）：４４１－４４８ （１９９３）；Ｌｊｕｎｇｂｅｒｇら （１９９３）前出；Ｓｔａｒｏｖａｓｎｉｋら （１９９９）前出）。
一実施形態において、ＩＳＶＤポリペプチド含有調製物は、プロテインＡクロマトグラフィーにより精製され得る。ブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）は、Ｎ末端から順にＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ及びＣと名付けられた５つのほとんど相同なドメインから構成される４２ｋＤａのタンパク質である（Ｓｊｏｄｈａｌ Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７８：４７１－４９０（１９７７）；Ｕｈｌｅｎら Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：１６９５－１７０２（１９８４））。これらのドメインは約５８残基を含有し、それぞれアミノ酸配列同一性約６５％～９０％を共有する。プロテインＡと抗体との間の結合研究は、ＳｐＡの全てのドメイン（Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｂ及びＣ）がＩｇＧにそのＦｃ領域を介して結合するが、ドメインＤ及びＥは有意なＦａｂ結合を示すということを示した（Ｌｊｕｎｇｂｅｒｇら Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０（１４）：１２７９－１２８５（１９９３）；Ｒｏｂｅｎら Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：６４３７－６４４５（１９９５）；Ｓｔａｒｏｖａｓｎｉｋら Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｉ．８：１４２３－１４３１ （１９９９）。Ｂドメインの機能的アナログでありかつエネルギー最小化バージョンであるＺドメイン（ＮｉｌｓｓｏｎらＰｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１：１０７－１１３ （１９８７））は、抗体可変ドメイン領域に対して無視できる結合しか有していないことが示された（Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎら Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．６（４）：４４１－４４８ （１９９３）；Ｌｊｕｎｇｂｅｒｇら （１９９３）前出；Ｓｔａｒｏｖａｓｎｉｋら （１９９９）前出）。
最近まで、市販のプロテインＡ固定相は、それらの固定リガンドとしてＳｐＡ（黄色ブドウ球菌から単離されるか又は組み換え発現された）を採用していた。非タンパク質性リガンドを使用すると典型的にクロマトグラフィーの他のモードを用いて行われるので、これらのカラムを使用すると、カラム再生及び衛生のためにアルカリ条件を使用することが不可能であった（ＧｈｏｓｅらＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｙｏｌ．９２ （６）：６６５－７３ （２００５））。より強いアルカリ条件に耐えるように新しい樹脂（ＭａｂＳＥＬＥＣＴＴＭ ＳｕＲｅ）が開発された（Ｇｈｏｓｅら（２００５年）前出）。タンパク質工学技術を使用して、多数のアスパラギン残基がプロテインＡのＺドメインにおいて置き換えられ、そして新シリガンドが４つの同じように改変されたＺドメインの四量体として生成された（Ｇｈｏｓｅら（２００５）前出）。
したがって、精製方法は、市販のプロテインＡカラムを使用して製造者の仕様書に従って行われ得る。例えば、ＭａｂＳＥＬＥＣＴＴＭカラム又はＭａｂＳＥＬＥＣＴＴＭ ＳｕＲｅカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を使用することができる。ＭａｂＳＥＬＥＣＴＴＭは、その固定リガンドとして組み換えＳｐＡを含有する市販の樹脂である。限定されないが、コントロールされた多孔質ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ）に共有結合でカップリングされたプロテインＡからなるＰＲＯＳＥＰ－ＡＴＭ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｕ．Ｋ．）を含むプロテインＡカラムの他の市販の供給源を有用に使用することができる。他の有用なプロテインＡ配合物としては、プロテインＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＡＳＴ ＦＬＯＷＴＭ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、ＡｍｓｐｈｅｒｅＴＭ Ａ３ （ＪＳＲ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、及びＴＯＹＯＰＥＡＲＬＴＭ ６５０ＭプロテインＡ（ＴｏｓｏＨａａｓ Ｃｏ．、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）が挙げられる。
プロテインＡベースのクロマトグラフィーによるタンパク質精製は、固定されたプロテインＡリガンドを含有するカラム（典型的には、プロテインＡを又はその機能的誘導体からなる吸着剤が固定されたメタクリレートコポリマーの改変した支持体又はアガロースビーズを充填したカラム）で行われ得る。カラムは、典型的には緩衝液で平衡化され、そしてタンパク質の混合物（標的タンパク質、及び混入タンパク質）を含有するサンプルを、カラム上にロードする。化合物がカラムを通過するにつれて、標的タンパク質はカラム内の吸着剤（プロテインＡ又はその誘導体）に結合し、一方でいくつかの未結合の不純物及び混入物は流出する。次いで、結合したタンパク質はカラムから溶出される。このプロセスにおいて、標的タンパク質がカラムに結合される間、不純物混入物は流出する。標的タンパク質はその後溶出液から回収される。
一般的な実施形態において、少なくとも３つ又は少なくとも４つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含むポリペプチドを精製／単離する方法が提供され、ここで、セクション５．４．３「コンホメーション変異体の所望のポリペプチド生成物への変換」及びセクション５．４．４「コンホメーション変異体の除去」にさらに詳述されるように、該方法は、コンホメーション変異体の所望のＩＳＶＤポリペプチド生成物への変換並びに／又は所望のＩＳＶＤポリペプチド生成物及びそのコンホメーション変異体を含む組成物からのコンホメーション変異体の除去を生じる１つ又はそれ以上の精製／単離工程を含む。
５．４．３ コンホメーション変異体の所望のポリペプチド生成物への変換
一態様において、ポリペプチド生成物及びそのコンホメーション変異体を含む組成物は、コンホメーション変異体を所望のポリペプチド生成物に変換する条件を適用することにより精製される。
一態様において、ポリペプチド生成物及びそのコンホメーション変異体を含む組成物は、コンホメーション変異体を所望のポリペプチド生成物に変換する条件を適用することにより精製される。
この態様において、コンホメーション変異体を所望のポリペプチド生成物に変換する条件は、ａ）低ｐＨ処理を適用すること、ｂ）カオトロピック剤を適用すること、ｃ）熱ストレスを加えること、及びｄ） ａ）～ｃ）のいずれかの処理の組み合わせを適用することから選択され得る。例えば、一態様において、コンホメーション変異体は、低ｐＨ処理及びカオトロピック剤を適用することにより、所望のポリペプチド生成物に変換される。別の実施形態において、コンホメーション変異体は、低ｐＨ処理及び熱処理を適用することにより所望のポリペプチド生成物に変換される。さらなる実施形態において、コンホメーション変異体は、熱ストレス及びカオトロピック剤を適用することにより所望のポリペプチド生成物に変換される。さらに別の実施形態において、コンホメーション変異体は、低ｐＨ処理、カオトロピック剤、及び熱ストレスを適用することにより所望のポリペプチドに変換される。
コンホメーション変異体を所望のポリペプチド生成物に変換する条件は、（限定することなく）多価ＩＳＶＤポリペプチドを含む培養上清に（捕獲工程の前に）、捕獲工程の間に、捕獲工程の前であるがポリッシング工程の前に、ポリッシング工程の間に、又はポリッシング工程の後に適用され得る。コンホメーション変異体を所望のポリペプチド生成物に変換する条件は、多価ＩＳＶＤポリペプチドの部分的又は高度に精製された調製物に対して適用され得る。コンホメーション変異体を所望のポリペプチド生成物に変換する条件はまた、カラム上に、清澄化された上清に、又はＩＳＶＤ含有ポリペプチドの部分的もしくは高度に精製された調製物に適用され得る。コンホメーション変異体を所望のポリペプチド生成物に変換する条件はまた、ろ過工程の前もしくは後、又は精製におけるいずれかの他の工程のような、別の工程の間に適用され得る。
以下において、コンホメーション変異体を所望のポリペプチド生成物に変換する条件は、より詳細に考察される。これらの条件の適用はまた、多価ＩＳＶＤポリペプチドの「処理」とも呼ばれる。
低ｐＨ処理
コンホメーション変異体は、低ｐＨ処理により所望のポリペプチドに変換され得る。
コンホメーション変異体は、低ｐＨ処理により所望のポリペプチドに変換され得る。
低ｐＨ処理は、多価ＩＳＶＤポリペプチドの精製／単離方法の間いつでも適用され得る。一実施形態において、低ｐＨ処理は、クロマトグラフィー技術に基づく精製工程の前に適用される。別の実施形態において、低ｐＨ処理は、クロマトグラフィー技術、例えばプロテインＡベースのアフィニティークロマトグラフィー（ＡＣ）に基づく精製工程の間に適用される。例えば、低ｐＨ処理は、プロテインＡベースのアフィニティークロマトグラフィーのＩＳＶＤポリペプチド捕獲工程の間に適用され得る。別の実施形態において、低ｐＨ処理は、クロマトグラフィー技術に基づく精製工程の後に適用される。例えば、低ｐＨ処理は、プロテインＡベースのアフィニティークロマトグラフィーのＩＳＶＤポリペプチド捕獲工程の後に（かつＩＳＶＤポリペプチドポリッシング工程の前に）適用され得る。代替において、低ｐＨ処理は、ＩＳＶＤポリペプチドポリッシング工程の後に適用され得る。
低ｐＨ処理は、所望のポリペプチド生成物及びそのコンホメーション変異体を含む組成物のｐＨを約ｐＨ３．２又はそれ以下に、コンホメーション変異体がインタクトなＩＳＶＤポリペプチド生成物に変換されるように十分な量の時間低下させることを含む。
低ｐＨ処理は、所望のポリペプチド生成物及びそのコンホメーション変異体を含む組成物のｐＨを約ｐＨ３．０又はそれ以下に、コンホメーション変異体がインタクトなＩＳＶＤポリペプチド生成物に変換されるように十分な量の時間低下させることを含む。
従って、低ｐＨ処理は、インタクトなポリペプチド生成物及びそのコンホメーション変異体を含む組成物（例えば、（プロテインＡ）捕獲工程の後の捕獲溶出液）のｐＨを、約ｐＨ３．２又はそれ以下、約ｐＨ３．１又はそれ以下、約ｐＨ３．０又はそれ以下、約ｐＨ２．９又はそれ以下、約ｐＨ２．８又はそれ以下、約ｐＨ２．７又はそれ以下、約ｐＨ２．６又はそれ以下、約ｐＨ２．５又はそれ以下、約ｐＨ２．４又はそれ以下、約ｐＨ２．３又はそれ以下、約ｐＨ２．２又はそれ以下、約ｐＨ２．１又はそれ以下にも低下させることを含む。詳細には、組成物のｐＨを、約ｐＨ２．９、約ｐＨ２．８、約ｐＨ２．７、約ｐＨ２．６、約ｐＨ２．５、約ｐＨ２．４、約ｐＨ２．３、約ｐＨ２．２、又は約２．１に低下させ得る。一実施形態において、ｐＨを、約ｐＨ３．２と約ｐＨ２．１との間、約ｐＨ３．０と約ｐＨ２．１との間、約ｐＨ２．９と約ｐＨ２．１との間、約ｐＨ２．７と約ｐＨ２．１との間に低下させる。別の実施形態において、ｐＨを、約ｐＨ２．６と約ｐＨ２．３との間に低下させる。別の実施形態において、ｐＨを約ｐＨ２．５と約ｐＨ２．１との間に低下させる。
低ｐＨ処理において、ｐＨを任意の慣用の手段により低下させ得る。例えば、所望のポリペプチド生成物及びそのコンホメーション変異体を含む組成物のｐＨを、ＨＣｌ（例えば、０．１Ｍ～３Ｍ、例えば０．１Ｍ、１Ｍ、３Ｍ、又は２．７Ｍのストック濃度で）を使用して、又はグリシン（例えば、０．１Ｍのストック濃度で）を使用して低下させ得る。当業者は、他の適切な手段を容易に選択することができる。
一実施形態において、低ｐＨ処理は、クロマトグラフィー技術、例えば、プロテインＡベースのアフィニティークロマトグラフィーに基づく精製工程の間に適用される。プロテインＡベースのアフィニティークロマトグラフィーに使用される溶出緩衝液は、約ｐＨ２．５に等しいか又はそれ以下のｐＨを有し得る。あるいは、プロテインＡベースのアフィニティークロマトグラフィーに使用される溶出緩衝液は、ポリペプチドを含有する得られる溶出液が、約ｐＨ３．２に等しいか又はそれ以下、例えば約ｐＨ２．９未満のｐＨを有するようなｐＨを有する。上に示されるような溶出緩衝液を使用したプロテインＡカラムからのポリペプチドの溶出後に、該ポリペプチドを含有する得られた溶出液のｐＨを、（場合により）ｐＨ２．５に等しいか又はそれ以下のｐＨにさらに低下させ得る。別の実施形態において、得られた溶出液のｐＨは、約ｐＨ３．２に等しいか又はそれ以下に、少なくとも約０．５時間、例えば１時間又は２時間調整され得る。別の実施形態において、得られた溶出液のｐＨは、約ｐＨ２．９に等しいか又はそれ以下のｐＨに、少なくとも約０．５時間、例えば１時間又は２時間調整され得る。さらに別の実施形態において、得られた溶出液のｐＨは、約ｐＨ２．７又はそれ以下のｐＨに少なくとも約１時間調整され得る。別の実施形態において、クロマトグラフィー技術はプロテインＡベースのアフィニティークロマトグラフィーであり、ここで溶出緩衝液は約ｐＨ２．２のｐＨを有し、そしてここで得られた溶出液のｐＨは、約ｐＨ２．５のｐＨに少なくとも約１．５時間調整される。
本発明の技術はまた、少なくとも３つ又は少なくとも４つのＩＳＶＤを含むか又はそれらからなるポリペプチドのコンホメーション変異体を、ＳＥ－ＨＰＬＣ及びＩＥＸ－ＨＰＬＣのような分析用クロマトグラフィー方法により同定する方法を提供する。本発明の技術はさらに、コンホメーション変異体を低ｐＨ処理によりインタクトな生成物に変換する概念を提供する。それ故、本明細書において提供される概念に基づいて、当業者は、本明細書に記載される低ｐＨ処理を、少なくとも３つ又は少なくとも４つのＩＳＶＤを含むか又はそれらからなる任意のポリペプチドに対して最適な酸性ｐＨ、さらにはインキュベーション時間の点で調整することができる。
低ｐＨ処理は、上記ポリペプチドを含む組成物のｐＨを増加させることにより終了され得る。低ｐＨ処理は、低ｐＨ処理された組成物のｐＨを少なくとも１ｐＨ単位増加させることにより終了され得る。例えば、低ｐＨ処理が約ｐＨ２．７で行われる場合、ｐＨを少なくとも約ｐＨ３．７に増加させることにより処理を終了させることができる。低ｐＨ処理は、低ｐＨ処理された組成物のｐＨを少なくとも２ｐＨ単位増加させることにより終了され得る。例えば、低ｐＨ処理が約ｐＨ２．７で行われる場合、ｐＨを少なくとも約ｐＨ４．７に増加させることにより処理を終了させることができる。従って、ｐＨを、約ｐＨ３．５又はそれ以上に、約ｐＨ４．０又はそれ以上に、約ｐＨ４．５又はそれ以上に、約ｐＨ５．０又はそれ以上に、約ｐＨ５．５又はそれ以上に、約ｐＨ６．０又はそれ以上に、約ｐＨ６．５又はそれ以上に、約ｐＨ７．０又はそれ以上に、約ｐＨ７．５又はそれ以上に、約ｐＨ８．０又はそれ以上などに増加させることにより低ｐＨ処理を終了することができる。しかし、ｐＨを高く増加しすぎること（例えば、約ｐＨ９又はそれ以上まで）は、ポリペプチド生成物の（重大な）分解を生じるかもしれない。それ故、低ｐＨ処理は、ｐＨを、約ｐＨ４と約ｐＨ８との間に、又は約ｐＨ５と約ｐＨ７．５との間に増加させることにより終了される。当業者には明らかなように、ｐＨ増加は、可能なその後の精製、製剤化又は貯蔵工程に必要なｐＨに適合され得る。本出願において、低ｐＨ処理の終了は、「ｐＨ中和」と交換可能に使用される。
低ｐＨ処理を終了するために、ｐＨを任意の慣用の手段により増加させ得る。限定することなく、例えば、組成物のｐＨを、ＮａＯＨ（例えば、０．１Ｍ又は１Ｍのストック濃度で）を使用して、又は酢酸ナトリウム（例えば、１Ｍのストック濃度で）を使用して増加させることができる。当業者は他の適切な手段を容易に選択することができる。
本明細書に記載される方法に基づいて、当業者は、コンホメーション変異体を所望のポリペプチド生成物に変換するために必要な時間を決定することができる。例えば、低ｐＨ処理は、十分な量の時間、コンホメーション変異体が本明細書において記載されるクロマトグラフィー技術により本質的にもはや検出されなくなるまで適用される。例えば、低ｐＨ処理は、十分な時間の間、ポストピークショルダーも分離されたポストピークも（コンホメーション変異体を示す）、分析用ＳＥ－ＨＰＬＣを使用した低ｐＨ処理後の組成物のクロマトグラムにおいて本質的に観察されなくなるまで適用される。さらに、又は代替としては、低ｐＨ処理は、十分な量の時間、プレ／ポストピークショルダーも分離されたプレ／ポストも（コンホメーション変異体を示す）、分析用ＩＥＸ－ＨＰＬＣを使用した低ｐＨ処理後の組成物のクロマトグラムにおいて本質的に観察されなくなるまで適用される。これに関して、低ｐＨ処理は、少なくとも約０．５時間、少なくとも約１時間、少なくとも約１．５時間、少なくとも約２時間、少なくとも約２．５時間、少なくとも約３時間、少なくとも約３．５時間、少なくとも約４時間、少なくとも約６時間、少なくとも約８時間、少なくとも約１２時間、少なくとも約２４時間適用され得る。例えば、低ｐＨ処理は、約０．５時間、約１時間、約１．５時間、約２時間、約２．５時間、約３時間、約３．５時間、約４時間、約６時間、約８時間、約１２時間、約２４時間適用され得る。特定の実施形態において、低ｐＨ処理は、少なくとも約１時間、又は少なくとも約２時間、又は少なくとも約４時間適用され得る。
一実施形態において、ｐＨを、約ｐＨ３．２と約２．１との間に少なくとも０．５時間、約ｐＨ２．９と約２．１との間に少なくとも０．５時間、約ｐＨ２．７と約２．１との間に少なくとも０．５時間、例えば約ｐＨ２．９に、約ｐＨ２．７に、約ｐＨ２．５に、又は約ｐＨ２．３に０．５時間低下させる。別の実施形態において、ｐＨを、約ｐＨ３．２と約２．１との間に少なくとも１時間、約ｐＨ２．９と約２．１との間に少なくとも１時間、約ｐＨ２．７と約２．１との間に少なくとも１時間、例えば約ｐＨ２．９に、約ｐＨ２．７に、約ｐＨ２．５に、又は約ｐＨ２．３に１時間低下させる。さらに別の実施形態において、ｐＨを、約ｐＨ３．２と約２．１との間に少なくとも２時間、約ｐＨ２．９と約２．１との間に少なくとも２時間、約ｐＨ２．７と約２．１との間に少なくとも２時間、例えば、約ｐＨ２．９に、約ｐＨ２．７に、約ｐＨ２．５に、又は約ｐＨ２．３に２時間低下させる。さらに別の実施形態において、ｐＨを、約ｐＨ３．２と約２．１との間に少なくとも４時間、約ｐＨ２．９と約２．１との間に少なくとも４時間、約ｐＨ２．７と約２．１との間に少なくとも４時間、例えば、約ｐＨ２．９に、約ｐＨ２．７に、約ｐＨ２．５に、又は約ｐＨ２．３に４時間低下させる。別の実施形態において、ｐＨを、約ｐＨ２．６と約ｐＨ２．３との間に少なくとも１時間、又は少なくとも２時間、例えば約ｐＨ２．６に１又は２時間低下させる。別の実施形態において、ｐＨを、約ｐＨ２．５と約ｐＨ２．１との間に少なくとも１時間、又は少なくとも２時間、例えば約ｐＨ２．４又はｐＨ２．５に２時間低下させる。
低ｐＨ処理は、広範囲の温度で適用され得るが、ただし、その温度は、ＩＳＶＤポリペプチドの不可逆的変性も分解も生じない。例としては、限定されないが、約４℃と約３０℃との間の温度である。従って、低ｐＨ処理は、約３０°、２９℃、２８℃、２７℃、２６℃、２５℃、２４℃、２３℃、２２℃、２１℃、２０℃、１９℃、１８℃、１７℃、１６℃、１５℃、１４℃、１３℃、１２℃、１１℃、１０℃、９℃、８℃、７℃、６℃、５℃、４℃で適用され得る。当業者は、低ｐＨ処理に適した温度を容易に選択することができる。一実施形態において、低ｐＨ処理は、約１５℃と約３０℃との間の温度で適用される。別の実施形態において、低ｐＨ処理は、約４℃と約１２℃との間の温度で適用される。別の実施形態において、低ｐＨ処理は、室温（ＲＴ）で、すなわち、約２０℃と２５℃との間で適用される。
カオトロピック剤処理
コンホメーション変異体はまた、カオトロピック剤を適用することにより所望のポリペプチド生成物に変換され得る。
コンホメーション変異体はまた、カオトロピック剤を適用することにより所望のポリペプチド生成物に変換され得る。
カオトロピック剤は、一般的に、水素結合、ファンデルワールス力及び疎水性相互作用のような非共有結合力により媒介される分子間及び分子内相互作用を妨げて、それによりその系のエントロピーを増大させる。生体分子に関して、カオトロピック剤は、タンパク質及び核酸（例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡ）のような高分子の構造を破壊し、そして変性させることができる。カオトロピック剤は当業者に周知であり、そして（限定されないが）ｎ－ブタノール、エタノール、塩化グアニジニウム（ＧｕＨＣｌ）、過塩素酸リチウム、酢酸リチウム、塩化マグネシウム、フェノール、２－プロパノール、ドデシル硫酸ナトリウム、チオ尿素、及び尿素を含む。一実施形態において、コンホメーション変異体は、ＧｕＨＣｌ又は尿素であるカオトロピック剤を適用することにより所望のポリペプチド生成物に変換される。特定の実施形態において、コンホメーション変異体は、ＧｕＨＣｌであるカオトロピック剤を適用することにより所望のポリペプチド生成物に変換される。
カオトロピック剤は、多価ＩＳＶＤポリペプチドの精製／単離方法の間にいつでも適用され得る。一実施形態において、カオトロピック剤は、クロマトグラフィー技術に基づく精製工程の前に（例えば、ＩＳＶＤポリペプチド捕獲工程の前に、又はＩＳＶＤポリペプチドポリッシング工程の前に）適用される。別の実施形態において、カオトロピック剤は、クロマトグラフィー技術に基づく精製工程の後に（例えば、ＩＳＶＤポリペプチド捕獲工程の後に、又はＩＳＶＤポリペプチドポリッシング工程の後に）適用される。別の実施形態において、カオトロピック剤は、クロマトグラフィー技術に基づく精製工程の後すぐに適用され、ここでクロマトグラフィー技術は、プロテインＡベースのアフィニティークロマトグラフィーである（例えば、ＩＳＶＤポリペプチド捕獲工程に使用される）。従って、一実施形態において、カオトロピック剤は、プロテインＡベースのＩＳＶＤポリペプチド捕獲工程のすぐ後に、かつポリッシング工程の前に適用される。別の実施形態において、カオトロピック剤は、ＩＳＶＤポリペプチドポリッシング工程の後すぐに適用される。
当業者は、カオトロピック剤が、コンホメーション変異体の所望のポリペプチド生成物への変換を可能にするがその不可逆的変性も分解も生じない濃度で適用されなければならないということを十分に知っている。本明細書に記載される方法に基づいて、当業者は、コンホメーション変異体を所望のポリペプチド生成物に変換するためにカオトロピック剤のどの濃度が適切か決定することができる。コンホメーション変異体が、本明細書において記載されるクロマトグラフィー技術によりもはや検出可能でない場合に、適切な濃度が適用されている。例えば、分析用ＳＥ－ＨＰＬＣを使用して、カオトロピック剤処理後の組成物のクロマトグラムにおいてポストピークショルダーも分離されたポストピーク（コンホメーション変異体を示す）も本質的に観察されない場合に、適切な濃度が適用されている。さらに、又は代替としては、分析用ＩＥＸ－ＨＰＬＣを使用して、カオトロピック剤処理後の組成物のクロマトグラムにおいて、プレ／ポストピークショルダーも分離されたプレ／ポストピーク（コンホメーション変異体を示す）も本質的に観察されない場合に、適切な濃度が適用されている。カオトロピック剤によるＩＳＶＤポリペプチド生成物の不可逆的変性又は分解は、それぞれのＳＥ－ＨＰＬＣ又はＩＥＸ－ＨＰＬＣクロマトグラムが高分子量種（ＨＭＷ種）（ＳＥ－ＨＰＬＣにおけるプレピーク）の形成並びに／又はＩＥＸ－ＨＰＬＣ及び／もしくはＳＥ－ＨＰＬＣにおける総面積の減少（生成物の損失）もしくはメインピークの減少を示さない場合、除外され得る。
一態様において、カオトロピック剤は、約０．５モル濃度（Ｍ）と約３Ｍとの間、約０．５Ｍと約２．５Ｍとの間、約１Ｍと約２．５Ｍとの間、約１Ｍと約２Ｍとの間、例えば、約１Ｍ、約２Ｍ、約２．５Ｍ又は約３Ｍの最終濃度のＧｕＨＣｌである。別の態様において、カオトロピック剤は、少なくとも約１Ｍ、又は少なくとも約２Ｍの最終濃度のＧｕＨＣｌである。
本明細書に記載される方法に基づいて、当業者は、コンホメーション変異体を所望のポリペプチド生成物に変換するために必要な時間を決定することができる。例えば、カオトロピック剤処理は、コンホメーション変異体が本明細書に記載されるクロマトグラフィー技術によりもはや本質的に検出可能でなくなるまで、十分な量の時間適用される。例えば、カオトロピック剤処理は、分析用ＳＥ－ＨＰＬＣを使用して、カオトロピック剤処理後の組成物のクロマトグラムにおいて、ポストピークショルダーも分離されたポストピーク（コンホメーション変異体を示す）も本質的に観察されなくなるまで、十分な量の時間適用される。さらに、又は代替としては、カオトロピック剤処理は、分析用ＩＥＸ－ＨＰＬＣを使用して、カオトロピック剤処理後の組成物のクロマトグラムにおいて、プレ／ポストピークショルダーも分離したプレ／ポストピーク（コンホメーション変異体を示す）も本質的に観察されなくなるまで、十分な量の時間適用される。当業者は、カオトロピック剤が、コンホメーション変異体の所望のポリペプチド生成物への変換を可能にするがその不可逆的変性も分解も生じない時間の間適用されなければならないということを十分に知っている。カオトロピック剤によるＩＳＶＤポリペプチド生成物の不可逆的変性又は分解は、それぞれのＳＥ－ＨＰＬＣ又はＩＥＸ－ＨＰＬＣクロマトグラムが高分子量種（ＨＭＷ種）（ＳＥ－ＨＰＬＣにおけるプレピーク）の形成並びに／又はＩＥＸ－ＨＰＬＣ及び／もしくはＳＥ－ＨＰＬＣにおける総面積の減少（生成物の損失）もしくはメインピークの減少を示さない場合、除外され得る。これに関して、カオトロピック剤処理は、少なくとも約０．５時間、少なくとも約１時間、少なくとも約１．５時間、少なくとも約２時間、少なくとも約２．５時間、少なくとも約３時間、少なくとも約３．５時間、少なくとも約４時間、少なくとも約６時間、少なくとも約８時間、少なくとも約１２時間適用され得る。例えば、カオトロピック剤は、約０．５時間、約１時間、約１．５時間、約２時間、約２．５時間、約３時間、約３．５時間、約４時間、約６時間、約８時間、約１２時間適用され得る。一実施形態において、カオトロピック剤は、少なくとも約０．５時間、又は少なくとも約１時間適用され得る。
この態様において、ＧｕＨＣｌは、少なくとも約０．５時間、又は少なくとも約１時間適用される。一実施形態において、カオトロピック剤は、約１Ｍと約２Ｍとの間の最終濃度で約０．５時間のＧｕＨＣｌである。別の実施形態において、カオトロピック剤は、約１Ｍと約２Ｍとの間の最終濃度で約１時間のＧｕＨＣｌである。
本発明の技術は、少なくとも３つ又は少なくとも４つのＩＳＶＤを含むか又はそれらからなるポリペプチドのコンホメーション変異体を、ＳＥ－ＨＰＬＣ及びＩＥＸ－ＨＰＬＣのような分析用クロマトグラフィー方法により同定する方法を提供する。本発明の技術は、カオトロピック剤を用いた処理により、コンホメーション変異体をインタクトな生成物に変換する概念をさらに提供する。それ故、本明細書において提供される概念に基づいて、当業者は、本明細書に記載されるカオトロピック剤処理をカオトロピック剤濃度に加えてインキュベーション時間の点でも、少なくとも３つ又は少なくとも４つのＩＳＶＤを含むか又はそれらからなる任意のポリペプチドに対して調整することができる。
カオトロピック剤処理は、ＩＳＶＤポリペプチド生成物を新しい緩衝液系（カオトロピック剤を含まない）に移すことにより終了され得る。この移行は、慣用の手段、例えば、透析、透析ろ過又はクロマトグラフィー方法（例えば、サイズ排除又は緩衝液交換クロマトグラフィー）により達成され得る。例えば、ＩＳＶＤポリペプチド生成物は、透析によりＰＢＳ中に移され得る。ＩＳＶＤポリペプチド生成物はまた、生理食塩水中に移されてもよい。当業者は、他の適切な緩衝液系を容易に選択することができる。緩衝液の選択は、可能性のあるその後の精製、製剤化又は貯蔵工程に必要な緩衝液条件に依存し得る。
カオトロピック剤処理は、広範囲の温度で適用され得るが、ただし、温度はＩＳＶＤポリペプチドの不可逆的変性も分解も生じない。例としては、限定されないが、約４℃と約３０℃との間の温度が挙げられる。従って、カオトロピック剤処理は、約３０°、２９℃、２８℃、２７℃、２６℃、２５℃、２４℃、２３℃、２２℃、２１℃、２０℃、１９℃、１８℃、１７℃、１６℃、１５℃、１４℃、１３℃、１２℃、１１℃、１０℃、９℃、８℃、７℃、６℃、５℃、４℃で適用され得る。当業者は、カオトロピック剤処理に適した温度を容易に選択することができる。一実施形態において、カオトロピック剤処理は、約１５℃と約３０℃との間の温度で適用される。別の実施形態において、カオトロピック剤処理は、約４℃と約１２℃との間の温度で適用される。別の実施形態において、カオトロピック剤処理は、室温で、すなわち約２０℃と２５℃との間で適用される。
熱処理
コンホメーション変異体はまた、熱ストレスを加えることにより所望のポリペプチド生成物に変換され得る。用語「熱処理」及び「熱ストレス」は本明細書において交換可能に使用される。
コンホメーション変異体はまた、熱ストレスを加えることにより所望のポリペプチド生成物に変換され得る。用語「熱処理」及び「熱ストレス」は本明細書において交換可能に使用される。
熱ストレスは、多価ＩＳＶＤポリペプチドの精製／単離方法の間にいつでも適用され得る。一実施形態において、熱ストレスは、クロマトグラフィー技術に基づく精製工程の前に適用される。別の実施形態において、熱ストレスは、クロマトグラフィー技術に基づく精製工程の後に適用される。例えば、熱ストレスは、プロテインＡベースのアフィニティークロマトグラフィーのＩＳＶＤポリペプチド捕獲工程の後（かつＩＳＶＤポリペプチドポリッシング工程の前）に適用され得る。代替としては、熱ストレスは任意のＩＳＶＤポリペプチドポリッシング工程の後に適用され得る。
熱ストレスは、コンホメーション変異体の所望のポリペプチド生成物への変換を可能にするが、その不可逆的な変性も分解も生じない４０℃と６０℃との間の適切な温度で適用される。本明細書に記載される方法に基づいて、当業者は、コンホメーション変異体を所望のポリペプチド生成物に変換するためにどの温度が適切であるかを決定することができる。コンホメーション変異体が、本明細書に記載されるクロマトグラフィー技術によりもはや本質的に検出可能でなくなる場合、適切な温度が適用されている。例えば、分析用ＳＥ－ＨＰＬＣを使用して、熱ストレス後の組成物のクロマトグラムにおいてポストピークショルダーも分離されたポストピーク（コンホメーション変異体を示す）も本質的に観察されない場合、適切な温度が適用されている。さらに、又は代替として、分析用ＩＥＸ－ＨＰＬＣを使用して、熱ストレス後の組成物のクロマトグラムにおいてプレ／ポストピークショルダーも分離されたプレ／ポストピーク（コンホメーション変異体を示す）も本質的に観察されない場合に、適切な温度が適用されている。ＩＳＶＤポリペプチド生成物の熱ストレスによる不可逆的変性又は分解は、それぞれのＳＥ－ＨＰＬＣ又はＩＥＸ－ＨＰＬＣクロマトグラムが、高分子量種（ＨＭＷ種）（ＳＥ－ＨＰＬＣにおけるプレピーク）並びに／又はＩＥＸ－ＨＰＬＣ及びＳＥ－ＨＰＬＣにおける総面積の減少（生成物の損失）もしくはメインピークの減少を示さない場合、除外され得る。従って、コンホメーション変異体を所望のポリペプチド生成物に変換するために加えられる熱ストレスは、組成物を約４０℃～約６０℃、約４５℃～約６０℃、又は約５０℃～約６０℃でインキュベートすることを含む。熱ストレスはまた、組成物を約４０℃～約５５℃、約４５℃～５５℃、又は約４８℃～約５２℃、例えば約５０℃でインキュベートすることも含み得る。
本明細書に記載される方法に基づいて、当業者は、コンホメーション変異体を所望のポリペプチド生成物に変換するために必要な時間を決定することができる。熱ストレスは、本明細書に記載されるクロマトグラフィー技術によりコンホメーションがもはや本質的に検出できなくなるまで、十分な量の時間適用される。例えば、熱ストレスは、分析用ＳＥ－ＨＰＬＣを使用して、熱ストレス後の組成物のクロマトグラムにおいて、ポストピークショルダーも分離されたポストピーク（コンホメーション変異体を示す）も本質的に観察されなくなるまで、十分な量の時間加えられる。さらに、又は代替として、熱ストレスは、分析用ＩＥＸ－ＨＰＬＣを使用して、熱ストレス後の組成物のクロマトグラムにおいてプレ／ポストピークショルダーも分離されたプレ／ポストピーク（コンホメーション変異体を示す）も本質的に観察されなくなるまで、十分な量の時間適用される。当業者は、コンホメーション変異体の所望のポリペプチド生成物への変換を可能にするが、その不可逆な変性又は分解を生じない時間、熱ストレスを加えなければならないことが十分に分かる。熱ストレスによるＩＳＶＤポリペプチド生成物の不可逆的変性又は分解は、それぞれのＳＥ－ＨＰＬＣ又はＩＥＸ－ＨＰＬＣクロマトグラムが、高分子量種（ＨＭＷ種）（ＳＥ－ＨＰＬＣにおけるプレピーク）の形成又はＩＥＸ－ＨＰＬＣ及びＳＥ－ＨＰＬＣにおける総面積の減少（生成物の損失）もしくはメインピークの減少を示さない場合に除外され得る。これに関して、熱ストレスは、４時間より長く適用されないものとする。従って、熱ストレスは、少なくとも約０．５時間、少なくとも約１時間、少なくとも約１．５時間、少なくとも約２時間、少なくとも約２．５時間、少なくとも約３時間、少なくとも約３．５時間、約４時間加えられ得るが、４時間より長くは加えられない。特に、熱ストレスは、約０．５時間、約１時間、約１．５時間、約２時間、約２．５時間、約３時間、約３．５時間、約４時間加えられ得る。一実施形態において、熱ストレスは、少なくとも約０．５時間、又は少なくとも約１時間、例えば、５０℃で約１時間加えられる。別の実施形態において、熱ストレスは約４時間、例えば５０℃で約４時間加えられる。
本発明の技術は、少なくとも３つ又は少なくとも４つのＩＳＶＤを含むか又はそれらからなるポリペプチドのコンホメーション変異体を、ＳＥ－ＨＰＬＣ及びＩＥＸ－ＨＰＬＣのような分析用クロマトグラフィー方法により同定する方法を提供する。本発明の技術は、熱処理によりコンホメーション変異体をインタクトな生成物に変換する概念をさらに提供する。それ故、本明細書において提供される概念に基づいて、当業者は、最適な熱ストレス温度に加えてインキュベーション時間の両方の点で、少なくとも３つ又は少なくとも４つのＩＳＶＤを含むか又はそれらからなる任意のポリペプチドに対して熱処理を調整することができる。
熱ストレスは、ＩＳＶＤポリペプチド生成物を含む組成物を、約３０℃未満の温度、すなわち、約４℃と約３０℃との間の任意の温度に調整することにより終了され得る。従って、熱処理は、約３０°、２９℃、２８℃、２７℃、２６℃、２５℃、２４℃、２３℃、２２℃、２１℃、２０℃、１９℃、１８℃、１７℃、１６℃、１５℃、１４℃、１３℃、１２℃、１１℃、１０℃、９℃、８℃、７℃、６℃、５℃、４℃に組成物の温度を調整することにより終了される。一実施形態において、熱処理は、組成物の温度を約１５℃と約３０℃との間に調整することにより終了される。別の実施形態において、熱処理は、組成物の温度を約４℃と約１２℃との間に調整することにより終了される。別の実施形態において、熱処理は、組成物の温度を室温に、すなわち、約２０℃と約２５℃との間に調整することにより終了される。温度調整（熱処理の終了のため）は、可能性のあるその後の精製、製剤化又は貯蔵工程に必要な温度に適合され得る。
コンホメーション変異体を所望のポリペプチド生成物に変換する条件に関する一般的態様
コンホメーション変異体を所望のポリペプチド生成物に変換する上に記載される処理条件は、タンパク質精製／製剤化に適した広範囲の緩衝液、特に抗体精製／製剤化に適した任意の公知の緩衝液を使用して適用され得る。例としては、限定されないが、ＰＢＳ、リン酸緩衝液、酢酸塩、ヒスチジン緩衝液、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、グリシン緩衝液が挙げられる。ＩＳＶＤポリペプチドはまた、生理食塩水中に存在し得る。当業者は、他の適切な緩衝液系を容易に選択することができる。
コンホメーション変異体を所望のポリペプチド生成物に変換する上に記載される処理条件は、タンパク質精製／製剤化に適した広範囲の緩衝液、特に抗体精製／製剤化に適した任意の公知の緩衝液を使用して適用され得る。例としては、限定されないが、ＰＢＳ、リン酸緩衝液、酢酸塩、ヒスチジン緩衝液、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、グリシン緩衝液が挙げられる。ＩＳＶＤポリペプチドはまた、生理食塩水中に存在し得る。当業者は、他の適切な緩衝液系を容易に選択することができる。
コンホメーション変異体を所望のポリペプチド生成物に変換する上に記載される条件のいずれか、又はそれらの任意の組み合わせは、以下にさらに記載されるようなコンホメーション変異体を除去する任意の方法と組み合わせられ得る。
本明細書において提供される低ｐＨ処理、カオトロピック剤を用いた処理及び熱処理の概念に基づいて、当業者は、少なくとも３つ又は少なくとも４つのＩＳＶＤを含むか又はそれらからなる任意のポリペプチドに対して最適なｐＨ、カオトロピック剤濃度、及び／又は熱ストレス温度、さらにはインキュベーション時間の点において本明細書に記載される処理条件を調整することができる。
５．４．４ コンホメーション変異体の除去又は減少
除去又は減少は、生成物に関連するコンホメーション変異体が、所望のＩＳＶＤポリペプチド生成物及び生成物に関連するコンホメーション変異体の両方を含む組成物から、物理的に分離されることを意味する。正確な意味は文脈から明らかだろう。先行技術において、当業者は、本明細書において提供されるような下等真核生物宿主において産生された場合の、少なくとも３つ又は少なくとも４つのＩＳＶＤを含むか又はそれらからなるポリペプチドのコンホメーション変異体の存在について知識を有していなかった。本出願により提供されるこの知識に基づいてのみ、当業者は、所望のＩＳＶＤポリペプチド生成物及び生成物に関連するコンホメーション変異体を含む組成物中に存在するコンホメーション変異体を除去するか又は減少させるために使用されるアッセイ条件を調整／最適化することができる。従って、本明細書において提供される特定の方法（以下のセクション「分析方法」を参照のこと）による少なくとも３つ又は少なくとも４つのＩＳＶＤを含むか又はそれらからなるポリペプチドのコンホメーション変異体の同定は、当業者が、コンホメーション変異体を特異的に除去できるように従来技術の精製方法を具体的に調整／最適化することを可能にするための要件である。
除去又は減少は、生成物に関連するコンホメーション変異体が、所望のＩＳＶＤポリペプチド生成物及び生成物に関連するコンホメーション変異体の両方を含む組成物から、物理的に分離されることを意味する。正確な意味は文脈から明らかだろう。先行技術において、当業者は、本明細書において提供されるような下等真核生物宿主において産生された場合の、少なくとも３つ又は少なくとも４つのＩＳＶＤを含むか又はそれらからなるポリペプチドのコンホメーション変異体の存在について知識を有していなかった。本出願により提供されるこの知識に基づいてのみ、当業者は、所望のＩＳＶＤポリペプチド生成物及び生成物に関連するコンホメーション変異体を含む組成物中に存在するコンホメーション変異体を除去するか又は減少させるために使用されるアッセイ条件を調整／最適化することができる。従って、本明細書において提供される特定の方法（以下のセクション「分析方法」を参照のこと）による少なくとも３つ又は少なくとも４つのＩＳＶＤを含むか又はそれらからなるポリペプチドのコンホメーション変異体の同定は、当業者が、コンホメーション変異体を特異的に除去できるように従来技術の精製方法を具体的に調整／最適化することを可能にするための要件である。
所望のポリペプチド生成物は、所望のポリペプチド及びそのコンホメーション変異体を含む組成物からコンホメーション変異体を除去する条件を適用することにより単離／精製される。この態様において、コンホメーション変異体は、１つ又はそれ以上の分取用クロマトグラフィー技術により除去される。クロマトグラフィー技術は、流体力学的体積、表面電荷及び／又は疎水性露出／表面疎水性に基づく分取用クロマトグラフィー技術であり得る。一実施形態において、分取用クロマトグラフィー技術は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）、例えば、カチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）、ミックスモードクロマトグラフィー（ＭＭＣ）、及び疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）から選択される。
一実施形態によれば、コンホメーション変異体は、流体力学的体積に基づく分取用クロマトグラフィー分離により除去される。従って、コンホメーション変異体は、分取用サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用して除去される。ＳＥＣにおいて、クロマトグラフィーカラムは、（限定しないが）デキストランポリマー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）、アガロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）、又はポリアクリルアミド（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ又はＢｉｏＧｅｌ Ｐ）から構成される微細な多孔性ビーズで充填される。これらのビーズの孔径は、高分子の寸法を見積もるために使用される。限定しないが、ＳＥＣ樹脂の例としては、Ｓｅｐｈａｄｅｘベースの製品（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｍｅｒｃｋ）、バイオゲルベースの製品（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅベースの製品（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、及びＳｕｐｅｒｄｅｘベースの製品（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）が挙げられる。
別の実施形態において、コンホメーション変異体は、表面電荷に基づく分取用クロマトグラフィー分離により除去される。従って、コンホメーション変異体は、分取用イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）（例えば、カチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ））を使用して除去される。限定しないが、ＩＥＸ樹脂の例としては、Ｐｏｒｏｓ ５０ＨＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ）、Ｐｏｒｏｓ ５０ＨＱ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ）、ＳＯＵＲＣＥ ３０Ｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ＳＯＵＲＣＥ １５Ｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｃａｐｔｏ Ｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｃａｐｔｏ ＳＰ Ｉｍｐｒｅｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｃａｐｔｏ Ｓ ＩｍｐＡｃｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｃａｐｔｏ Ｑ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｐｏｒｏｓ ＸＳ（Ｔｈｅｒｍｏ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＴＭ）、ＡＧ（登録商標）５０Ｗ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）、ＡＧ（登録商標）ＭＰ－５０（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）、Ｎｕｖｉａ ＨＲ－Ｓ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）、ＵＮＯｓｐｈｅｒｅＴＭ Ｓ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）、及びＵＮＯｓｐｈｅｒｅ Ｒａｐｉｄ Ｓ （Ｂｉｏ－Ｒａｄ）が挙げられる。
別の実施形態において、コンホメーション変異体は、表面疎水性／疎水性露出に基づいて分取クロマトグラフィー分離により除去される。従って、コンホメーション変異体は、分取用疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を使用して除去される。一実施形態において、ＨＩＣはＨＩＣカラム樹脂に基づく。限定することなく、ＨＩＣ樹脂は、Ｃａｐｔｏ Ｐｈｅｎｙｌ ＩｍｐＲｅｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｃａｐｔｏ Ｂｕｔｙｌ ＩｍｐＲｅｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｐｈｅｎｙｌ ＨＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｃａｐｔｏ Ｂｕｔｙｌ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｃａｐｔｏ Ｏｃｔｙｌ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＰＰＧ－６００（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ｐｈｅｎｙｌ－６００（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ｐｈｅｎｙｌ－６５０（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ｂｕｔｙｌ－６００（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ｂｕｔｙｌ－６５０（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＴＳＫｇｅｌ Ｐｈｅｎｙｌ ５－ＰＷ（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）から選択され得る。別の実施形態において、ＨＩＣはＨＩＣメンブレンに基づく。限定することなく、ＨＩＣメンブレンは、Ａｄｓｏｒｂｅｒ Ｑ （ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ａｄｓｏｒｂｅｒ Ｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ａｄｓｏｒｂｅｒ Ｐｈｅｎ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｍｕｓｔａｎｇ Ｑシステム（Ｐａｌｌ）、ＮａｔｒｉＦｌｏ ＨＤ－Ｑメンブレンクロマトグラフィー（Ｎａｔｒｉｘ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ ＳＴＩＣ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ Ｑ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）、又はＳａｒｔｏｂｉｎｄ Ｐｈｅｎｙｌ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）であり得る。
さらに別の実施形態において、コンホメーション変異体は、流体力学的体積、表面電荷、及び／又は表面疎水性／疎水性露出に基づいて分取用クロマトグラフィー分離により除去される。従って、コンホメーション変異体は、ミックスモードクロマトグラフィー（ＭＭＣ）を使用して除去される。ＭＭＣは、固定相と分析物との間の相互作用の１つより多くの形態を、それらの分離を達成するために利用するクロマトグラフィー方法を指す。従って、ＭＭＣ樹脂は、いくつかの異なる種類の相互作用：イオン交換、親和性、サイズ排除、及び疎水性が本質的に可能であるリガンドを用いて官能化された媒体に基づく。様々なヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー樹脂が市販されており、そして任意の利用可能な形態の材料が使用され得る。ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーに適した条件の詳細な記載は、ＷＯ ２００５／０４４８５６及びＷＯ ２０１２／０２４４００（これらの内容はその全体として本明細書に参照により加入される）において示される。
一実施形態において、ヒドロキシアパタイトは結晶形態である。ヒドロキシアパタイトは、凝集して粒子を形成し得、そして高温で焼結されて安定な多孔性セラミック塊になり得る。ヒドロキシアパタイトの粒径は、広く変動し得るが、典型的な粒径は、直径１μｍから１０００μｍの範囲に及び得、そして１０μｍ～１００μｍであり得る。一実施形態において、粒径２０μｍである。別の実施形態において、粒径は４０μｍである。さらに別の実施形態において、粒径は８０μｍである。
多数のクロマトグラフィー支持体が、セラミックヒドロキシアパタイトカラムの製造において使用され得、最も広く使用されるものは、Ｉ型及びＩＩ型ヒドロキシアパタイトである。Ｉ型は高いタンパク質結合能を有し、そして酸性タンパク質に対してより良好な能力を有する。しかしＩＩ型はより低いタンパク質結合能を有するが、核酸及び特定のタンパク質のより良好な分解能を有する。ＩＩ型物質はまた、アルブミンに対して非常に低い親和性を有し、そして多くの免疫グロブリンの種及びクラスの精製に特に適している。特定のヒドロキシアパタイト型の選択は、当業者により決定され得る。
限定することなく、ヒドロキシアパタイト樹脂は、ＣＨＴセラミックヒドロキシアパタイト、Ｉ型（２０、４０又は８０μｍ）（ＢｉｏＲａｄ）、ＣＨＴセラミックヒドロキシアパタイトＩＩ型（２０、４０又は８０μｍ）（ＢｉｏＲａｄ）、ＭＰＣＴＭセラミックヒドロキシフルオロアパタイトＩ型（４０μｍ）、Ｃａ＋＋Ｐｕｒｅ－ＨＡ（Ｔｏｓｏｈ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）である。
さらに、又は代替として、コンホメーション変異体は、上述の分取用ＳＥＣ、ＩＥＸ、ＨＩＣ、又はＭＭＣの任意の連続した組み合わせを使用して除去され得る。
本開示を考慮して、当業者は、多価ＩＳＶＤポリペプチドのコンホメーション変異体を同定し、次いで除去する（又は少なくとも減少させる）ために適したクロマトグラフィー条件を見出すことができる。本明細書に記載されるコンホメーション変異体を同定したら、当業者は、選択されたクロマトグラフィー方法のパラメーター及び条件（グラジエント、緩衝液、濃度）を適合させ、そしてその後にピークの適切なフラクションを取ることができるだろう。例えば、それらに限定されないが、本明細書中の実施例において使用されるクロマトグラフィー条件は、少なくとも３つ又は少なくとも４つのＩＳＶＤを含む多価ＩＳＶＤポリペプチドのコンホメーション変異体の除去（又は少なくとも減少）のために使用され得る。実施例において使用されるクロマトグラフィー条件は、少なくとも３つ又は少なくとも４つのＩＳＶＤを含む特定の多価ＩＳＶＤポリペプチドのコンホメーション変異体を除去する（又は少なくとも減少させる）ために適切なクロマトグラフィー条件の開発のための参照点として少なくとも役立ち得る。
詳細には、本出願の教示に基づいて、多価ＩＳＶＤポリペプチド及びそのコンホメーション変異体の両方を含む組成物からのコンホメーション変異体の除去又は減少は：
ｉ） 分取用クロマトグラフィー技術を適用すること；
ｉｉ） 工程（ｉ）から得られたフラクションを、多価ＩＳＶＤポリペプチドの存在について分析する工程；
ｉｉｉ） 多価ＩＳＶＤポリペプチドのみを含むがコンホメーション変異体は含まない工程（ｉｉ）のフラクションを選択する工程
を含む。
ｉ） 分取用クロマトグラフィー技術を適用すること；
ｉｉ） 工程（ｉ）から得られたフラクションを、多価ＩＳＶＤポリペプチドの存在について分析する工程；
ｉｉｉ） 多価ＩＳＶＤポリペプチドのみを含むがコンホメーション変異体は含まない工程（ｉｉ）のフラクションを選択する工程
を含む。
工程ｉ）及びｉｉ）は、抗体精製の分野、特にＩＳＶＤ精製の分野における当業者に公知の手段により行われ得る。該方法は、本明細書において提供されるコンホメーション変異体の同定及びコンホメーション変異体の除去／減少の両方について詳細に適合／最適化され得る。適切な例となる分析用及び分取用クロマトグラフィー技術は、本明細書に記載される。これらの一般的な技術は、コンホメーション変異体の除去／減少を可能にするために詳細に適合／最適化されなければならない。
工程ｉｉ）及びｉｉｉ）は、以下のセクション５．４．５に記載される特定の分析用クロマトグラフィー技術により達成され得る。例えば、（分析用）ＳＥ－ＨＰＬＣにおいて検出可能なポストピークショルダー及び／又は分離したポストピークが無い場合に、クロマトグラフィーフラクションは多価ＩＳＶＤポリペプチドのみを含むがコンホメーション変異体を含まない。コンホメーション変異体の存在はまた、分析用ＩＥＸ－ＨＰＬＣにおいて検出可能な、プレピークショルダー及び／もしくは分離したプレピークが存在しない場合、又はポストピークショルダー及び／もしくは分離したポストピークが存在しない場合も除外され得る。
従来技術において、当業者は、本明細書において提供されるような下等真核生物宿主において産生された場合の、少なくとも３つ又は少なくとも４つのＩＳＶＤを含むか又はそれらからなるポリペプチドのコンホメーション変異体の存在について知識を有していなかった。本出願により提供されるこの知識に基づいてのみ、当業者は、コンホメーション変異体の具体的な除去／減少が達成され得るように上記の工程ｉ）～ｉｉｉ）を調整／最適化することができる。
コンホメーション変異体を含有するフラクションは、廃棄されてもよく、又はコンホメーション変異体を所望のポリペプチド生成物に変換するために本明細書に記載される変換方法（セクション５．４．３「コンホメーション変異体の所望のポリペプチド生成物への変換」）に従って処理されてもよい。変換の成功は、例えば以下のセクション５．４．５に記載される分析用クロマトグラフィー技術により、本明細書に記載されるように評価され得る。
工程ｉｉｉ）の後に得られた多価ＩＳＶＤポリペプチドのみを含むフラクションは、場合により、当該分野で公知の精製又はろ過工程にかけられてもよい。
（分析用）ＳＥ－ＨＰＬＣにおいて検出可能なポストピークショルダー及び／又は分離されたポストピークが本質的に存在しない場合、フラクションは、「多価ＩＳＶＤポリペプチドのみを含む（がコンホメーション変異体は含まない）」とみなされる。あるいは、分析用ＩＥＸ－ＨＰＬＣにおいて検出可能な、プレピークショルダー及び／もしくは分離したプレピークが本質的に存在しない場合、又はポストピークショルダー及び／もしくは分離したポストピークが本質的に存在しない場合、フラクションは、多価ＩＳＶＤポリペプチドのみを含む（がコンホメーション変異体は含まない）」とみなされる。「プレピークショルダー及び／もしくは分離されたプレピークが本質的に無い」又は「ポストピークショルダー及び／もしくは分離されたポストピークが本質的に無い」は、それぞれＳＥ－ＨＰＬＣ又はＩＥＸ－ＨＰＬＣクロマトグラムにおいて、メインピーク及びプレピーク／ポストピーク（ショルダー）の曲線下総面積に対する、プレピーク／ポストピーク（ショルダー）についての曲線下面積（ＡＵＣ）の比が、５％より低い、例えば、４．５％もしくはそれ以下、４％もしくはそれ以下、３％もしくはそれ以下、２％もしくはそれ以下、又は１％もしくはそれ以下であることを意味する。一実施形態において、それぞれＳＥ－ＨＰＬＣ又はＩＥＸ－ＨＰＬＣクロマトグラムにおいて検出可能なプレピーク／ポストピーク（ショルダー）は存在しない。
別の態様において、コンホメーション変異体は、多価ＩＳＶＤポリペプチド及びコンホメーション変異体を含む組成物を、樹脂１ｍｌあたりタンパク質少なくとも２０ｍｇの負荷率を使用してクロマトグラフィーカラムにアプライすることにより除去されるか又は減少する。この態様の一実施形態において、負荷率は、樹脂１ｍｌあたりタンパク質少なくとも３０ｍｇ、又は樹脂１ｍｌあたりタンパク質少なくとも４５ｍｇである。一実施形態において、クロマトグラフィーカラムはプロテインＡカラムである。従って、コンホメーション変異体は、多価ＩＳＶＤポリペプチド及びコンホメーション変異体を含む組成物を、樹脂１ｍｌあたりタンパク質少なくとも２０ｍｇの負荷率を使用してプロテインＡカラムにアプライすることにより除去されるか又は減少する。別の実施形態において、コンホメーション変異体は、多価ＩＳＶＤポリペプチド及びコンホメーション変異体を含む組成物を、樹脂１ｍｌあたりタンパク質少なくとも４５ｍｇの負荷率を使用してプロテインＡカラムにアプライすることにより除去されるか又は減少する。
ＩＳＶＤポリペプチド及びそのコンホメーション変異体を含む組成物からコンホメーション変異体を除去する（又は減少させる）ために使用されるクロマトグラフィー技術は、多価ＩＳＶＤポリペプチドを含む培養上清に対して適用され得る。例えば、捕獲工程を除去又は減少のために使用することができる。コンホメーション変異体を除去する（又は減少させる）ために使用されるクロマトグラフィー技術はまた、多価ＩＳＶＤポリペプチドの部分的又は高度に精製された調製物にも適用され得る。例えば、コンホメーション変異体を除去する（又は減少させる）ために使用されるクロマトグラフィー技術は、捕獲工程の後であるが、最初のポリッシング工程の前もしくは最初のポリッシング工程時に、又は１つもしくはそれ以上のさらなるポリッシング工程時に、又はポリッシング工程の後に適用され得る。
５．４．５ 分析方法
コンホメーション変異体を観察するために使用される分析方法
少なくとも３つ又は少なくとも４つのＩＳＶＤを含むか又はそれらからなるポリペプチドのコンホメーション変異体は、本明細書において提供される特定の分析用クロマトグラフィー技術により同定され得る。分析用ＳＥ－ＨＰＬＣ及びＩＥＸ－ＨＰＬＣのような分析用クロマトグラフィー方法は、当業者に公知である。しかし、コンホメーション変異体を同定する問題に対してこれらの方法を適合／最適化する必要がある。従って、このような分析用クロマトグラフィー技術の適合／最適化のための要件は、少なくとも３つ又は少なくとも４つのＩＳＶＤを含むか又はそれらからなるポリペプチドを下等真核生物において製造すると、本明細書に記載されるようなコンホメーション変異体が（部分的に）生じ得るという知識である。
コンホメーション変異体を観察するために使用される分析方法
少なくとも３つ又は少なくとも４つのＩＳＶＤを含むか又はそれらからなるポリペプチドのコンホメーション変異体は、本明細書において提供される特定の分析用クロマトグラフィー技術により同定され得る。分析用ＳＥ－ＨＰＬＣ及びＩＥＸ－ＨＰＬＣのような分析用クロマトグラフィー方法は、当業者に公知である。しかし、コンホメーション変異体を同定する問題に対してこれらの方法を適合／最適化する必要がある。従って、このような分析用クロマトグラフィー技術の適合／最適化のための要件は、少なくとも３つ又は少なくとも４つのＩＳＶＤを含むか又はそれらからなるポリペプチドを下等真核生物において製造すると、本明細書に記載されるようなコンホメーション変異体が（部分的に）生じ得るという知識である。
本明細書において提供されるように、減少した流体力学的体積に基づいて、コンホメーション変異体を所望のポリペプチド生成物と区別することができる。従って、コンホメーション変異体の存在を分析用ＳＥ－ＨＰＬＣにより検出することができる。適切な条件を使用して、コンホメーション変異体の存在は、ポストピークショルダー又は分離したポストピークによりＳＥ－ＨＰＬＣクロマトグラムにおいて実証される。それ故、コンホメーション変異体の同定のために適合／最適化されたＳＥ－ＨＰＬＣを使用して、本明細書に記載されるようにコンホメーション変異体を所望のポリペプチド生成物に変換する条件を確認することができる。さらに、コンホメーション変異体の同定のために適合／最適化されたＳＥ－ＨＰＬＣを使用して、所望のポリペプチド生成物及びそのコンホメーション変異体を含む組成物からのコンホメーション変異体の除去又は減少を確認することができる。
本明細書においてさらに提供されるように、コンホメーション変異体を、変化した表面電荷及び／又は表面疎水性に基づいて所望のポリペプチド生成物と区別することができる。従って、適切な条件を使用して、コンホメーション変異体の存在を（具体的に開発された）分析用ＩＥＸ－ＨＰＬＣにより検出することができる。表面電荷及び／又は表面疎水性の変化の質に依存して、コンホメーション変異体の存在は、プレ／ポストピークショルダー又は分離したプレ／ポストピークによりＩＥＸ－ＨＰＬＣクロマトグラムにおいて示され得る。それ故、コンホメーション変異体の同定のために適合／最適化されたＩＥＸ－ＨＰＬＣを使用して、コンホメーション変異体を所望のポリペプチド生成物に変換する条件を確認することができる。さらに、コンホメーション変異体の同定のために適合／最適化されたＩＥＸ－ＨＰＬＣを使用して、所望のポリペプチド生成物及びそのコンホメーション変異体を含む組成物からのコンホメーション変異体の除去及び減少を確認することができる。
本開示に基づいて、当業者は、多価ＩＳＶＤポリペプチドのコンホメーション変異体を同定するために適したクロマトグラフィー条件を見つけることができるだろう。例えば、これらに限定されないが、本明細書における実施例において使用されるクロマトグラフィー条件は、少なくとも３つ又は少なくとも４つのＩＳＶＤを含む多価ＩＳＶＤポリペプチドのコンホメーション変異体の検出のために使用され得る。本明細書における実施例において使用されるクロマトグラフィー条件は、少なくとも３つ又は少なくとも４つのＩＳＶＤを含む特定の多価ＩＳＶＤポリペプチドについてコンホメーション変異体を検出するために適したクロマトグラフィー条件の開発のための参照点として少なくとも役立ち得る。基本的な例となる条件を表Ｃに示す。
コンホメーション変異体の特徴づけのために使用されるさらなる分析方法
以下の分析技術は当業者に公知である。例えば、これらに限定されないが、適切な条件は表Ｃに示される。
以下の分析技術は当業者に公知である。例えば、これらに限定されないが、適切な条件は表Ｃに示される。
ＩＳＶＤポリペプチドの効力を観測するために使用される分析方法
コンホメーション変異体は、効力の変化によっても所望のポリペプチド生成物と区別され得、ここでコンホメーション変異体は、所望のポリペプチド生成物と比較して減少した効力を有する。さらに、コンホメーション変異体の所望のポリペプチド生成物への（成功した）変換は、それぞれの所望のポリペプチド生成物の効力と比べて、又はコンホメーション変異体を濃縮も枯渇もしていない参照ＩＳＶＤポリペプチドと比べて、効力の部分的又は完全な回復により実証され得る。
コンホメーション変異体は、効力の変化によっても所望のポリペプチド生成物と区別され得、ここでコンホメーション変異体は、所望のポリペプチド生成物と比較して減少した効力を有する。さらに、コンホメーション変異体の所望のポリペプチド生成物への（成功した）変換は、それぞれの所望のポリペプチド生成物の効力と比べて、又はコンホメーション変異体を濃縮も枯渇もしていない参照ＩＳＶＤポリペプチドと比べて、効力の部分的又は完全な回復により実証され得る。
これに関して効力は、ポリペプチド中に存在する少なくとも３つ又は少なくとも４つのＩＳＶＤの１つ又はそれ以上により特定の効果を生じるために必要なポリペプチドの結合能（特定の標的に対して）、機能的活性、及び／又は量を指す。効力は、インビトロアッセイ（例えば、競合リガンド結合アッセイ又は細胞ベースのアッセイ）又はインビボで（例えば、動物モデルにおいて）測定され得る。これらに限定することなく、効力は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子のＴＮＦα誘導発現の阻害、ルシフェラーゼレポーター遺伝子のＩＬ－２３誘導発現の阻害、ルシフェラーゼレポーター遺伝子のＯＸ４０Ｌ誘導発現の阻害、又はヒト血清アルブミンへの結合能を指し得る。所望のポリペプチド生成物とそのコンホメーション変異体との間の効力差異を決定するための適切な例となるアッセイは、（限定することなく）：
ＴＮＦ－アルファ結合部分の効力試験のための細胞ベースのレポーターアッセイ
である。
ＴＮＦ－アルファ結合部分の効力試験のための細胞ベースのレポーターアッセイ
である。
Ｇｌｏ ｒｅｓｐｏｎｓｅＴＭ ＨＥＫ２９３＿ＮＦｋＢ－ＮＬｕｃＰ細胞は、ＮＦκＢ依存性プロモーターの制御下でＮａｎｏルシフェラーゼをコードするレポーター構築物で安定にトランスフェクトされたＴＮＦ受容体発現細胞である。可溶性ヒトＴＮＦαとのこれらの細胞のインキュベーションは、ＮＦκＢ媒介Ｎａｎｏ－ルシフェラーゼ発現をもたらす。
アッセイは、一般的に以下のように行われ得る。Ｇｌｏ ｒｅｓｐｏｎｓｅＴＭ ＨＥＫ２９３＿ＮＦｋＢ－ＮＬｕｃＰ細胞は、適切な組織培養プレートにおいて適切な細胞数で通常の増殖培地に播種されるべきである。試験しようとするＩＳＶＤ構築物の希釈系列を、適切で十分な量のヒトＴＮＦαに加え、そして細胞とともに十分な時間（例えば、約５時間）３７℃及び５％ＣＯ２でインキュベートする。このインキュベーションの間、ルシフェラーゼレポーター遺伝子のＴＮＦ誘導発現は、ＩＳＶＤ構築物により阻害される。インキュベーション後に、プレートを冷却した（例えば、１０分間）後、Ｎａｎｏ－Ｇｌｏルシフェラーゼ基質を加えてルシフェラーゼ活性を定量する。基質を加えた５分後に、例えば、Ｔｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｆ－ｐｌｅｘプレートリーダーで発光を測定することができる。相対発光量（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｌｉｇｈｔ ｕｎｉｔｓ）（ＲＬＵ）として表される発光は、ルシフェラーゼの濃度に直接比例する。
ＩＬ－２３結合部分の効力試験のための細胞ベースのレポーターアッセイ
Ｇｌｏ ｒｅｓｐｏｎｓｅＴＭ ＨＥＫ２９３＿ｈｕｍａｎ ＩＬ－２３Ｒ／ＩＬ－１２Ｒｂ１－Ｌｕｃ２Ｐは、ｓｉｓ誘導エレメント（ＳＩＥ）応答性プロモーターの制御下でルシフェラーゼ遺伝子を含有するレポーター構築物で安定にトランスフェクトされた細胞である。さらに、これらの細胞は、ヒトＩＬ－２３受容体の両方のサブユニット、すなわち、ＩＬ－１２Ｒｂ１及びＩＬ－２３Ｒを構成的に過剰発現する。ヒトＩＬ－２３を用いたこれらの細胞の刺激は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現を誘導する。
Ｇｌｏ ｒｅｓｐｏｎｓｅＴＭ ＨＥＫ２９３＿ｈｕｍａｎ ＩＬ－２３Ｒ／ＩＬ－１２Ｒｂ１－Ｌｕｃ２Ｐは、ｓｉｓ誘導エレメント（ＳＩＥ）応答性プロモーターの制御下でルシフェラーゼ遺伝子を含有するレポーター構築物で安定にトランスフェクトされた細胞である。さらに、これらの細胞は、ヒトＩＬ－２３受容体の両方のサブユニット、すなわち、ＩＬ－１２Ｒｂ１及びＩＬ－２３Ｒを構成的に過剰発現する。ヒトＩＬ－２３を用いたこれらの細胞の刺激は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現を誘導する。
アッセイは一般的には以下のように行われ得る。Ｇｌｏ ｒｅｓｐｏｎｓｅＴＭ ＨＥＫ２９３＿ｈｕｍａｎ ＩＬ－２３Ｒ／ＩＬ－１２Ｒｂ１－Ｌｕｃ２Ｐ細胞は、適切な組織培養プレートにおいて適切な細胞数で通常の増殖培地中に播種されるべきである。試験しようとするＩＳＶＤ構築物の希釈系列を細胞に加え、続いて適切な量の組み換えｈＩＬ－２３（例えば、３ｐＭ）を加える。細胞は十分な時間（例えば、約６時間）３７℃でインキュベートされるべきである。インキュベーション工程の後、プレートの冷却期間（例えば、１０分間）が必要であり、その後、ルシフェラーゼ基質５’－フルオロルシフェリン（Ｂｉｏ－ＧｌｏＴＭルシフェラーゼアッセイシステム）を加えてルシフェラーゼ活性を定量する。基質を加えた５分後に、発光を、例えばＴｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｆ－ｐｌｅｘプレートリーダーで測定することができる。発光（相対発光量ＲＬＵで表される）は、ルシフェラーゼ濃度に直接比例する。
ＯＸ４０Ｌ結合部分の効力試験のための細胞ベースのレポーターアッセイ
ＯＸ４０Ｌの阻害に対する効力を、細胞ベースのレポーターアッセイを使用して評価することができる。例えば、Ｇｌｏ ＲｅｓｐｏｎｓｅＴＭ ＮＦｋＢ－ｌｕｃ２／ＯＸ４０ Ｊｕｒｋａｔ浮遊細胞は、適切な組織培養プレートにおいて適切な細胞数で通常増殖培地中に播種されるべきである。ＩＳＶＤ構築物の希釈系列を細胞に加え、続いて固定濃度の７００ｐＭ ＯＸ４０Ｌを加える。次いでプレートを十分な時間（例えば、３時間）３７℃及び５％ＣＯ２でインキュベーターにおいてインキュベートしてＯＸ４０Ｌ／ＯＸ４０シグナル伝達によるＮＦ－ｋＢプロモーターの活性化を可能にするべきであり、これが今度はルシフェラーゼ遺伝子の転写を生じる。インキュベーション工程後に、プレートの冷却期間（例えば、１０分間）が必要であり、その後ルシフェラーゼ基質５’－フルオロルシフェリン（Ｂｉｏ－ＧｌｏＴＭルシフェラーゼアッセイシステム）を加えてルシフェラーゼ活性を定量する。基質を加えた５分後に、例えば、Ｔｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｆ２００プレートリーダーで発光を測定することができる。発光（相対発光量、ＲＬＵとして表される）は、ルシフェラーゼの濃度に直接比例する。
ＯＸ４０Ｌの阻害に対する効力を、細胞ベースのレポーターアッセイを使用して評価することができる。例えば、Ｇｌｏ ＲｅｓｐｏｎｓｅＴＭ ＮＦｋＢ－ｌｕｃ２／ＯＸ４０ Ｊｕｒｋａｔ浮遊細胞は、適切な組織培養プレートにおいて適切な細胞数で通常増殖培地中に播種されるべきである。ＩＳＶＤ構築物の希釈系列を細胞に加え、続いて固定濃度の７００ｐＭ ＯＸ４０Ｌを加える。次いでプレートを十分な時間（例えば、３時間）３７℃及び５％ＣＯ２でインキュベーターにおいてインキュベートしてＯＸ４０Ｌ／ＯＸ４０シグナル伝達によるＮＦ－ｋＢプロモーターの活性化を可能にするべきであり、これが今度はルシフェラーゼ遺伝子の転写を生じる。インキュベーション工程後に、プレートの冷却期間（例えば、１０分間）が必要であり、その後ルシフェラーゼ基質５’－フルオロルシフェリン（Ｂｉｏ－ＧｌｏＴＭルシフェラーゼアッセイシステム）を加えてルシフェラーゼ活性を定量する。基質を加えた５分後に、例えば、Ｔｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｆ２００プレートリーダーで発光を測定することができる。発光（相対発光量、ＲＬＵとして表される）は、ルシフェラーゼの濃度に直接比例する。
アルブミン結合部分の効力試験のためのＥＬＩＳＡベースのアルブミン結合アッセイ
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に対する結合効力を、直接結合ＥＬＩＳＡにより測定することができる。例えば、９６ウェルマイクロタイタープレートを、炭酸水素塩緩衝液中ｐＨ９．６で適切な量のＨＳＡで終夜コーティングし得る。プレート上の非特異的結合部位を、約３０分間室温（ＲＴ）でＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋ Ｔ２０を使用してブロックし得る。ＩＳＶＤ構築物の段階希釈をＰＢＳ ＋ １０％ Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ Ｔ２０中で調製し、そしてＨＳＡ被覆プレートに移し、これに約７５分間ＲＴにて６００ｒｐｍで震盪しながらのインキュベーション工程が続く。例えば、１μｇ／ｍＬのマウス抗ＩＳＶＤ構築物抗体を９０分間ＲＴにて６００ｒｐｍで震盪しながら使用し、続いて５０分間０．２μｇ／ｍＬ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ポリクローナルウサギ抗マウス抗体とともにＲＴにて６００ｒｐｍで震盪しながらインキュベーションを行い、結合したＩＳＶＤ構築物を検出することができる。１／３希釈３，５，３’５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）１液タイプ（ｏｎｅ）を加えることにより、結合したＨＲＰ標識ポリクローナル抗体を測定することができる。１Ｍ ＨＣｌを加えてＨＲＰと基質との間に生じた発色反応を停止させる。光学密度を、波長４５０ｎｍ及び参照波長６２０ｎｍで、例えばプレート－分光光度計を使用して測定し得る。このＯＤは、被覆ＨＳＡに結合したＩＳＶＤ構築物の量に直接比例する。
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に対する結合効力を、直接結合ＥＬＩＳＡにより測定することができる。例えば、９６ウェルマイクロタイタープレートを、炭酸水素塩緩衝液中ｐＨ９．６で適切な量のＨＳＡで終夜コーティングし得る。プレート上の非特異的結合部位を、約３０分間室温（ＲＴ）でＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋ Ｔ２０を使用してブロックし得る。ＩＳＶＤ構築物の段階希釈をＰＢＳ ＋ １０％ Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ Ｔ２０中で調製し、そしてＨＳＡ被覆プレートに移し、これに約７５分間ＲＴにて６００ｒｐｍで震盪しながらのインキュベーション工程が続く。例えば、１μｇ／ｍＬのマウス抗ＩＳＶＤ構築物抗体を９０分間ＲＴにて６００ｒｐｍで震盪しながら使用し、続いて５０分間０．２μｇ／ｍＬ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ポリクローナルウサギ抗マウス抗体とともにＲＴにて６００ｒｐｍで震盪しながらインキュベーションを行い、結合したＩＳＶＤ構築物を検出することができる。１／３希釈３，５，３’５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）１液タイプ（ｏｎｅ）を加えることにより、結合したＨＲＰ標識ポリクローナル抗体を測定することができる。１Ｍ ＨＣｌを加えてＨＲＰと基質との間に生じた発色反応を停止させる。光学密度を、波長４５０ｎｍ及び参照波長６２０ｎｍで、例えばプレート－分光光度計を使用して測定し得る。このＯＤは、被覆ＨＳＡに結合したＩＳＶＤ構築物の量に直接比例する。
５．５ 製造及び／又は単離もしくは精製方法により得ることができる多価ＩＳＶＤポリペプチド生成物
本出願はまた、本明細書に記載される方法により得ることができる多価ＩＳＶＤポリペプチド生成物を含む改善された組成物を記載する。これは、生成物に関連するコンホメーション変異体の減少したレベル、又は完全に存在しないことにより特徴づけられる。例えば、本明細書に記載される方法により得ることができるＩＳＶＤポリペプチドは、生成物に関連するコンホメーション変異体を５％未満、例えば０～４．９％、０～４％、０～３％、０～２％又は０～１％含む。別の実施形態において、本明細書に記載される方法により得ることができるＩＳＶＤポリペプチドは、生成物に関連するコンホメーション変異体を１％未満、０．５％未満、０．０１％含む。一実施形態において、本明細書に記載される方法により得ることができる多価ＩＳＶＤポリペプチド生成物は、生成物に関連するコンホメーション変異体を含まない。例えば、本明細書に記載される方法により得ることができるＩＳＶＤポリペプチドを含む組成物は、生成物に関連するコンホメーション変異体を５％未満、例えば０～４．９％、０～４％、０～３％、０～２％又は０～１％含む。別の実施形態において、本明細書に記載される方法により得ることができるＩＳＶＤポリペプチドを含む組成物は、生成物に関連するコンホメーション変異体を１％未満、０．５％未満、０．０１％未満含む。一実施形態において、本明細書に記載される方法により得ることができる多価ＩＳＶＤポリペプチド生成物を含む組成物は、生成物に関連するコンホメーション変異体を含まない。当業者は、例えば本明細書に記載されるようなＳＥ－ＨＰＬＣ及びＩＥＸ－ＨＰＬＣにより、総ポリペプチドの％として生成物に関連するコンホメーション変異体の比率を容易に決定することができる（すなわち、プレピーク又はポストピーク（ショルダー）のＡＵＣ／メインピーク及びプレーピーク又はポストピーク（ショルダー）の両方の総ＡＵＣ を決定することにより）。
本出願はまた、本明細書に記載される方法により得ることができる多価ＩＳＶＤポリペプチド生成物を含む改善された組成物を記載する。これは、生成物に関連するコンホメーション変異体の減少したレベル、又は完全に存在しないことにより特徴づけられる。例えば、本明細書に記載される方法により得ることができるＩＳＶＤポリペプチドは、生成物に関連するコンホメーション変異体を５％未満、例えば０～４．９％、０～４％、０～３％、０～２％又は０～１％含む。別の実施形態において、本明細書に記載される方法により得ることができるＩＳＶＤポリペプチドは、生成物に関連するコンホメーション変異体を１％未満、０．５％未満、０．０１％含む。一実施形態において、本明細書に記載される方法により得ることができる多価ＩＳＶＤポリペプチド生成物は、生成物に関連するコンホメーション変異体を含まない。例えば、本明細書に記載される方法により得ることができるＩＳＶＤポリペプチドを含む組成物は、生成物に関連するコンホメーション変異体を５％未満、例えば０～４．９％、０～４％、０～３％、０～２％又は０～１％含む。別の実施形態において、本明細書に記載される方法により得ることができるＩＳＶＤポリペプチドを含む組成物は、生成物に関連するコンホメーション変異体を１％未満、０．５％未満、０．０１％未満含む。一実施形態において、本明細書に記載される方法により得ることができる多価ＩＳＶＤポリペプチド生成物を含む組成物は、生成物に関連するコンホメーション変異体を含まない。当業者は、例えば本明細書に記載されるようなＳＥ－ＨＰＬＣ及びＩＥＸ－ＨＰＬＣにより、総ポリペプチドの％として生成物に関連するコンホメーション変異体の比率を容易に決定することができる（すなわち、プレピーク又はポストピーク（ショルダー）のＡＵＣ／メインピーク及びプレーピーク又はポストピーク（ショルダー）の両方の総ＡＵＣ を決定することにより）。
換言すると、本明細書に記載される方法により得ることができる多価ＩＳＶＤポリペプチド生成物は、従来技術の調製物と比較して、改善された構造的均一性を特徴とする。特に、従来技術の調製物は、５％又はそれ以上の比率の生成物に関連するコンホメーション変異体、例えば５～１５％、５～２０％、５～２５％又はそれ以上の比率の生成物に関連するコンホメーション変異体を含み得る。
改善された構造的均一性を考慮して、本方法により得ることができる多価ＩＳＶＤポリペプチド生成物は、従来技術の調製物と比較して有利である。例えば、本発明の方法により得ることができる多価ＩＳＶＤポリペプチド生成物は、治療への応用に有利である。治療上の抗体の使用に関連して、構造的均一性は、臨床上かつ規制に関して最も重要なものである。
従って、本出願はまた、本明細書に記載される方法により得ることができる多価ＩＳＶＤポリペプチド生成物を含む医薬製剤及び他の組成物を記載する。本明細書に記載される方法により得ることができる多価ＩＳＶＤポリペプチド生成物は、治療においても使用され得る（すなわち、医療用途）。
当業者は、よく知られた一般的知識に基づいて、本明細書に記載される方法により得ることができる多価ＩＳＶＤポリペプチド生成物の薬学的に適した製剤を容易に製剤化することができる。さらに、本明細書に引用される、多価ＩＳＶＤポリペプチドを具体的に扱う参考文献は、明示的に参照される。限定することなく、適用の標準的な経路のための製剤を製造することができ、これらとしては、経鼻、経口、静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、腟内、直腸適用、局所適用又は吸入による適用のための製剤が挙げられる。
当業者はまた、本明細書に記載される方法により得ることができる治療有効量の多価ＩＳＶＤポリペプチドの使用を特徴とする処置の適切な方法を容易に考案することもできる。
６ 実施例
以下の実施例は、製造及び精製プロセスの間の多価ＩＳＶＤ構築物のコンホメーション変異体の存在の同定を記載する。このようなコンホメーション変異体が特徴的な生化学的／生物物理学的挙動を示し、クロマトグラフィー方法によるそれらの分離を可能にするということが示された。また、生化学的／生物物理学的特性の差異とは別に、コンホメーション変異体は、それらのそれぞれの標的に対して１つ又はそれ以上のＩＳＶＤビルディングブロックの効力の差異を示すということがわかった。最終的に、このような望ましくないコンホメーション変異体を、ＩＳＶＤ構築物の精製プロセスの間に、適切な処理条件によりインタクトなＩＳＶＤポリペプチドに変換することができ、かつ／又はインタクトな形態に加えて望ましくないコンホメーション変異体の両方を含有する組成物から特異的に減少／除去することができるということを示すことができた。
以下の実施例は、製造及び精製プロセスの間の多価ＩＳＶＤ構築物のコンホメーション変異体の存在の同定を記載する。このようなコンホメーション変異体が特徴的な生化学的／生物物理学的挙動を示し、クロマトグラフィー方法によるそれらの分離を可能にするということが示された。また、生化学的／生物物理学的特性の差異とは別に、コンホメーション変異体は、それらのそれぞれの標的に対して１つ又はそれ以上のＩＳＶＤビルディングブロックの効力の差異を示すということがわかった。最終的に、このような望ましくないコンホメーション変異体を、ＩＳＶＤ構築物の精製プロセスの間に、適切な処理条件によりインタクトなＩＳＶＤポリペプチドに変換することができ、かつ／又はインタクトな形態に加えて望ましくないコンホメーション変異体の両方を含有する組成物から特異的に減少／除去することができるということを示すことができた。
６．１ 実施例１：化合物Ａのコンホメーション変異体の同定
コンホメーション変異体を、多価ＩＳＶＤ構築物の捕獲プロセスの工程の間に同定することができた
多価ＩＳＶＤ構築物のコンホメーション変異体を、多価ＩＳＶＤ構築物の精製の最初の工程（すなわち、捕獲工程段階）の間に同定した。捕獲工程段階は、清澄化された上清から最大のＩＳＶＤ生成物を回収するために行われた。
コンホメーション変異体を、多価ＩＳＶＤ構築物の捕獲プロセスの工程の間に同定することができた
多価ＩＳＶＤ構築物のコンホメーション変異体を、多価ＩＳＶＤ構築物の精製の最初の工程（すなわち、捕獲工程段階）の間に同定した。捕獲工程段階は、清澄化された上清から最大のＩＳＶＤ生成物を回収するために行われた。
化合物Ａ（配列番号１）の捕獲精製プロセスの間に、分析用サイズ排除プロフィール（ＳＥ－ＨＰＬＣ；表Ｃに示される条件）が、クロマトグラフィープロセスの間に使用される樹脂及び溶出緩衝液によって異なるということが観察された。
化合物Ａ（配列番号１）は、３つの異なる標的に結合する重鎖ラマ抗体の可変ドメインが最適化された３つの異なる配列を含む多価ＩＳＶＤ構築物である。ＩＳＶＤビルディングブロックは、以下のフォーマットでＧ／Ｓリンカーとヘッド－トゥー－テイル融合され（Ｎ末端からＣの末端）：ＯＸ４０Ｌ結合ＩＳＶＤ － ９ＧＳリンカー- ＯＸ４０Ｌ結合ＩＳＶＤ - ９ＧＳリンカー - ＴＮＦα結合ＩＳＶＤ - ９ＧＳリンカー - ヒト血清アルブミン結合ＩＳＶＤ － ９ＧＳリンカー - ＴＮＦα結合ＩＳＶＤ、そして以下の配列を有する：
図１は、プロテインＡ又は非プロテインＡ捕獲樹脂でのクロマトグラフィー精製後の溶出液についてのＳＥ－ＨＰＬＣプロフィールを表す。溶出液のＳＥ－ＨＰＬＣプロフィールは、非プロテインＡと比較して捕獲樹脂としてプロテインＡを使用した場合、あまり顕著ではないポストピークショルダー（図１においてポストピーク１と示される）を示した。ポストピークショルダー（ポストピーク１）の存在は、クロマトグラフィー精製の間に使用される条件／樹脂に依存すると結論付けられた。非プロテインＡ樹脂と対照的に、プロテインＡ樹脂での溶出は低ｐＨである。これらの観察に基づいて、ＳＥ－ＨＰＬＣプロフィールに対する溶出緩衝液ｐＨの影響を調べた。従って、異なる酸性ｐＨを有する緩衝液Ａ～Ｄ（表２に記載される）を、プロテインＡ捕獲樹脂からの化合物Ａの溶出について比較した。
図２は、プロテインＡ捕獲並びに異なる溶出緩衝液Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤを使用した溶出後（中和なし）の溶出液についてのＳＥ－ＨＰＬＣプロフィールを表す。ポストピーク１は、Ｂ、Ｃ及びＤと比較して溶出緩衝液Ａにおいてあまり顕著ではなかった。図３において、溶出緩衝液Ａ（図３（１））及び溶出緩衝液Ｂ（図３（２））を用いた溶出直後の捕獲溶出液及び１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．０を使用して少なくともｐＨ６．７に中和された捕獲溶出液のＳＥ－ＨＰＬＣプロフィールを示す。図２並びに図３（１）及び図３（２）において見られるように、ＳＥ－ＨＰＬＣプロフィールにおけるポストピークショルダー（ポストピーク１と示される）は、ｐＨ３．６～４．７（緩衝液Ｂ～Ｄ）での溶出液と比較してｐＨ２．９（緩衝液Ａ）での溶出液についてより低かった。しかし、ポストピーク１は、溶出液をすぐに中和した場合減少しなかった（図３（１）における溶出液と中和した溶出液との比較）。従って、「ｐＨ維持」は、ポストピーク１に対する効果を有し得る。溶出緩衝液Ｂについては、ポストピーク１は、得られた溶出液のその後の中和とは独立して溶出後に観察された（図３（２））。
これらの観察に基づいて、ＳＥ－ＨＰＬＣにおけるポストピーク１の検出可能性に対するｐＨの影響があると結論付けられた。さらに、ポストピーク１はＩＳＶＤ構築物のコンホメーション変異体を表し得ると推測された。わずかに増加した保持時間は、メインピークにより表されるＩＳＶＤ構築物のインタクトな形態と比較して、より緻密なコンホメーションを示し得る。
多価ＩＳＶＤ構築物のポリッシング工程段階の間にコンホメーション変異体を同定することができた
多価ＩＳＶＤ構築物のコンホメーション変異体を、ポリッシング工程段階の間にも同定することができた。ポリッシング工程段階は、多価ＩＳＶＤ含有組成物の純度を改善するために捕獲工程の後に行われた。
多価ＩＳＶＤ構築物のコンホメーション変異体を、ポリッシング工程段階の間にも同定することができた。ポリッシング工程段階は、多価ＩＳＶＤ含有組成物の純度を改善するために捕獲工程の後に行われた。
ＩＳＶＤ構築物のポリッシング工程のために、カチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）を行った。従って、２５ｍＭクエン酸塩ｐＨ６．０中０から３５０ｍＭ ＮａＣｌへの線形塩グラジエントを、２０カラム体積（ＣＶ）かけて室温でポリッシングＣＥＸ樹脂で適用した。クロマトグラフィープロフィールを図４に示す。
線形グラジエントの間に溶出したトップフラクション（図４においてフラクション２Ａ１と呼ばれる）に加えてサイド（フロント）フラクション（図４においてフラクション１Ｃ２と呼ばれる）を、ＳＥ－ＨＰＬＣにおいてさらに分析し、そしてロード材料と比較した（図５）。ロード材料についてＳＥ－ＨＰＬＣで観察されたポストピーク１は、ＣＥＸ樹脂でのこのグラジエントのトップフラクションには存在していなかった。対照的に、ＳＥ－ＨＰＬＣでの有意なポストピーク１（約６０％）が、サイト（フロント）フラクションについて観察された。
従って、ＩＳＶＤ構築物のコンホメーション変異体を、ポリッシング工程の間にも同定することができた。ＣＥＸポリッシング工程の異なる溶出液フラクションは、異なる比率のインタクトな形態（メインピーク）及びコンホメーション変異体（ポストピーク１）を含有することがＳＥ－ＨＰＬＣにおいて示された（図５）。ＣＥＸポリッシング工程のトップフラクションはコンホメーション変異体が激減していることがわかったが、一方でサイドフラクションは、むしろ濃縮されていた。
２０ＣＶかけて２５ｍＭクエン酸塩ｐＨ６．０中０から３５０ｍＭ ＮａＣｌへのグラジエントを用いてポリッシング手順について試験された、Ｃａｐｔｏ ＳＰ Ｉｍｐｒｅｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及びＣａｐｔｏ Ｓ ＩｍｐＡｃｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のような様々なカチオン交換樹脂について、並びに例えば、２０ＣＶかけて２５ｍＭクエン酸塩ｐＨ６．０中０から４００ｍＭのグラジエントを用いて（データは示していない）、及び２５ｍＭヒスチジンｐＨ６．０及び２０ＣＶかけて０から４００ｍＭのグラジエントを使用して（データは示していない）、ポリッシング手順について試験された他のＣＥＸ樹脂について、これらの結果は同様であった。
これらの観察結果は、ＳＥ－ＨＰＬＣで観察されるポストピーク１が、ＩＳＶＤ構築物のコンホメーション変異体を表し得るという結論をさらに強調した。ＳＥ－ＨＰＬＣにおけるわずかに増加した保持時間はより緻密な形態（すなわち、減少した流体力学的体積）を示すが、分取用ＣＥＸにおいて観察された保持時間のわずかな差異は、インタクトなＩＳＶＤ生成物と比較して変化した表面電荷を示す。従って、分取用ＳＥＣ又はＣＥＸのような適切なクロマトグラフィー技術を使用してコンホメーション変異体及びインタクトなＩＳＶＤ生成物を分離する可能性がある。
６．２ 実施例２：化合物Ａのコンホメーション変異体の検証及び特徴づけ
実施例１において、化合物Ａは、分析用ＳＥ－ＨＰＬＣの間にメインピーク及びポストピーク１（ポストピークショルダー）として溶出することが示された。わずかに長い保持時間に起因して、ポストピーク１は、多価ＩＳＶＤ構築物のより緻密な形態を指し得ると結論付けられた。さらに、ｐＨ２．５の溶出緩衝液を使用したプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーは、減少したポストピーク１／メインピーク比を生じ得る。しかし、ポストピーク１／メインピーク比は、捕獲溶出液をすぐに中和した場合に変化しないままであった。従って、コンホメーション変異体はインタクトなＩＳＶＤ生成物に変換可能であり、従って分子サイズは異ならないと結論付けられた。
実施例１において、化合物Ａは、分析用ＳＥ－ＨＰＬＣの間にメインピーク及びポストピーク１（ポストピークショルダー）として溶出することが示された。わずかに長い保持時間に起因して、ポストピーク１は、多価ＩＳＶＤ構築物のより緻密な形態を指し得ると結論付けられた。さらに、ｐＨ２．５の溶出緩衝液を使用したプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーは、減少したポストピーク１／メインピーク比を生じ得る。しかし、ポストピーク１／メインピーク比は、捕獲溶出液をすぐに中和した場合に変化しないままであった。従って、コンホメーション変異体はインタクトなＩＳＶＤ生成物に変換可能であり、従って分子サイズは異ならないと結論付けられた。
コンホメーション変異体の性質をさらに特徴づけ、そして質量変異体の存在を排除するために、実施例１のＣＥＸポリッシングのコンホメーション変異体を枯渇したトップフラクション及びコンホメーション変異体を濃縮したフラクションを、分析用イオン交換-高速液体クロマトグラフィー（ＩＥＸ－ＨＰＬＣ；表Ｃに示される条件、プロトコルＩ）、キャピラリー等電点電気泳動（ＣＥ－ＩＥＦ）及び逆相超高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＵＨＰＬＣ）による分析にかけた。
分析用ＩＥＸ－ＨＰＬＣにおける挙動
分析用ＳＥ－ＨＰＬＣと同様に、ＩＥＸ－ＨＰＬＣクロマトグラムは、コンホメーション変異体濃縮サイドフラクションについて有意なポストピーク１（約４６％）を示し、これはコンホメーション変異体枯渇トップフラクションには存在しないものであった（図６）。
分析用ＳＥ－ＨＰＬＣと同様に、ＩＥＸ－ＨＰＬＣクロマトグラムは、コンホメーション変異体濃縮サイドフラクションについて有意なポストピーク１（約４６％）を示し、これはコンホメーション変異体枯渇トップフラクションには存在しないものであった（図６）。
ＣＥ－ＩＥＦ／ＲＰ－ＵＨＰＬＣにおける挙動
ＣＥ－ＩＥＦ分析試験において、分取用ＣＥＸ（データは示していない）において得られたサイド（「濃縮」）フラクションとトップ（「枯渇」）フラクションとの間で差異はほどんど観察されなかった。同様に、ＲＰ－ＵＨＰＬＣ（データは示していない）において両方のフラクションに差異は観察されなかった。
ＣＥ－ＩＥＦ分析試験において、分取用ＣＥＸ（データは示していない）において得られたサイド（「濃縮」）フラクションとトップ（「枯渇」）フラクションとの間で差異はほどんど観察されなかった。同様に、ＲＰ－ＵＨＰＬＣ（データは示していない）において両方のフラクションに差異は観察されなかった。
ＣＥ－ＩＥＦと対照的に、ＩＥＸ－ＨＰＬＣは、コンホメーション変異体濃縮サイドＣＥＸフラクションとコンホメーション変異体枯渇トップＣＥＸフラクションとの間で異なるクロマトグラフィープロフィールを示した。２つの電荷ベースの方法ＣＥ－ＩＥＦとＩＥＸ－ＨＰＬＣとの間の主要な差異は、ＣＥ－ＩＥＦが変性条件（３Ｍ尿素）の存在下で実行されることである。ＣＥ－ＩＥＦにおいて差異がない事は、インタクトなＩＳＶＤ生成物とコンホメーション変異体との間に全体の電荷差異をもたらす化学的改変が無いということを示す。しかし、ＩＥＸ－ＨＰＬＣにおける差異は、インタクトなＩＳＶＤ生成物と比較して、コンホメーション変異体のわずかに変化した表面電荷を示唆する。換言すると、コンホメーション変化に起因して表面電荷のみが変化したが、分子の総電荷は変化しなかった。これらの知見はまた、コンホメーション変異体が変性条件により除去され得るという仮説を示唆した。
ＲＰ－ＵＨＰＬＣにおける両方のＣＥＸフラクションの類似した挙動により、緻密なコンホメーション変異体が、ＩＳＶＤ構築物のインタクトな形態と比較してスクランブルジスルフィド架橋に起因するということは除外された。
インタクトなＩＳＶＤ構築物及びそのコンホメーション変異体の効力差異
コンホメーション変異体が任意の程度まで標的結合におけるその効力が異なっているか否かをさらに調べるために、以下のアッセイを、上記の分取用ＣＥＸから得られたコンホメーション変異体濃縮サイドフラクション及びコンホメーション変異体枯渇トップフラクションに対して行った。
コンホメーション変異体が任意の程度まで標的結合におけるその効力が異なっているか否かをさらに調べるために、以下のアッセイを、上記の分取用ＣＥＸから得られたコンホメーション変異体濃縮サイドフラクション及びコンホメーション変異体枯渇トップフラクションに対して行った。
それらのそれぞれの標的に対するＩＳＶＤの効力を、以下のアッセイを使用して決定した（上の５．４．５項に記載されるとおり）：
－ ＴＮＦ－アルファ結合部分の効力試験のための細胞ベースのレポーターアッセイ；
－ ＯＸ４０Ｌ結合部分の効力試験のための細胞ベースのレポーターアッセイ；
－ アルブミン結合部分の効力試験のためのＥＬＩＳＡベースのアルブミン結合アッセイ。
－ ＴＮＦ－アルファ結合部分の効力試験のための細胞ベースのレポーターアッセイ；
－ ＯＸ４０Ｌ結合部分の効力試験のための細胞ベースのレポーターアッセイ；
－ アルブミン結合部分の効力試験のためのＥＬＩＳＡベースのアルブミン結合アッセイ。
サイド（「濃縮」）及びトップ（「枯渇」）フラクションの効力についての結果を表３に示す。
効力の有意な低下が、ＴＮＦα効力アッセイにおいて枯渇フラクションと比較してコンホメーション変異体濃縮フラクションについて観察された。従って、化合物Ａのコンホメーション変化は、ＴＮＦαの結合効力に影響を与える。
６．３ 実施例３：化合物Ａのコンホメーションに影響を与える条件の決定
実施例１及び実施例２からの知見に基づいて、多価ＩＳＶＤ構築物のコンホメーションに影響を及ぼし得る特定の実験条件の影響を評価するために、追加の実験を設定した。試験した条件は、穏やかな変性、ストレス又はカオトロピック剤の存在であった。試験した条件を表４にまとめる。
実施例１及び実施例２からの知見に基づいて、多価ＩＳＶＤ構築物のコンホメーションに影響を及ぼし得る特定の実験条件の影響を評価するために、追加の実験を設定した。試験した条件は、穏やかな変性、ストレス又はカオトロピック剤の存在であった。試験した条件を表４にまとめる。
低ｐＨ処理
低ｐＨ処理のために、分取用ＣＥＸ（上に記載される）からの緻密な変異体を濃縮した材料及び枯渇した材料を、ｐＨ２．５、ｐＨ３．０もしくはｐＨ３．５を有する最終濃度１００ｍＭグリシンに達するように、又は配合緩衝液ｐＨ６．５（対照）を用いて処理した。サンプルを４時間それぞれのｐＨでインキュベートし、ついでそのまま分析するか、又は０．１Ｍ ＮａＯＨで中和し、ついで分析した。緻密な変異体を濃縮した材料及び枯渇した材料に対するｐＨ２．５での処理の影響を、ＳＥ－ＨＰＬＣ及びＩＥＸ－ＨＰＬＣ（表Ｃに示される条件；ＩＥＸ－ＨＰＬＣプロトコルＩ）により分析し、そして図７（１）及び（２）（ＳＥ－ＨＰＬＣ）並びに図８（ＩＥＸ－ＨＰＬＣ；緻密変異体濃縮フクラクションのみ）に示した。
低ｐＨ処理のために、分取用ＣＥＸ（上に記載される）からの緻密な変異体を濃縮した材料及び枯渇した材料を、ｐＨ２．５、ｐＨ３．０もしくはｐＨ３．５を有する最終濃度１００ｍＭグリシンに達するように、又は配合緩衝液ｐＨ６．５（対照）を用いて処理した。サンプルを４時間それぞれのｐＨでインキュベートし、ついでそのまま分析するか、又は０．１Ｍ ＮａＯＨで中和し、ついで分析した。緻密な変異体を濃縮した材料及び枯渇した材料に対するｐＨ２．５での処理の影響を、ＳＥ－ＨＰＬＣ及びＩＥＸ－ＨＰＬＣ（表Ｃに示される条件；ＩＥＸ－ＨＰＬＣプロトコルＩ）により分析し、そして図７（１）及び（２）（ＳＥ－ＨＰＬＣ）並びに図８（ＩＥＸ－ＨＰＬＣ；緻密変異体濃縮フクラクションのみ）に示した。
ｐＨ２．５でインキュベートされたコンホメーション変異体濃縮材料について、ＳＥ－ＨＰＬＣ及びＩＥＸ－ＨＰＬＣポストピーク１は有意に減少した。両方の分析においてこの減少はメインピークの増加を伴っていたので、これはコンホメーション変異体がインタクトな形態に変換されたことを実証した。さらに、溶出液がｐＨ２．５で４時間インキュベートされた場合（データは示していない）、この変換は中和後も維持された。対照サンプルについてもコンホメーション変異体枯渇材料についても変化は観察されなかった（図７（２）；ＩＥＸ－ＨＰＬＣについてデータは示していない）。ｐＨ３．０及び３．５でインキュベートされた材料については、ＳＥ－ＨＰＬＣ及びＩＥＸ－ＨＰＬＣポストピークのわずかな減少のみが観察され、ｐＨが、コンホメーション変異体のインタクトな形態への変換を可能にするほど十分低くなかったことを示唆した（データは示していない）。
次いで、インタクトな形態に変換された緻密な変異体の安定性を、ｐＨ２．５での低ｐＨ処理とその後の中和の後に検証した。インタクトな形態に変換されたこの緻密な変異体の２５℃で２週間までの貯蔵の後に、ＳＥ－ＨＰＬＣプロフィールには変化が無く、緻密変異体濃縮材料のｐＨ処理の際のインタクトな形態への変換が維持されたことを実証した（緻密変異体枯渇材料と同様）。同じ結果が５℃で２週間の貯蔵についても得られた（データは示していない）。
カオトロピック剤を用いた処理
カオトロピック剤の影響を評価するために、コンホメーション変異体を濃縮した材料及び枯渇した材料を、１Ｍ、２Ｍ、又は３Ｍの塩化グアニジニウム（ＧｕＨＣｌ）を用いて又は用いずに０．５時間インキュベートし、そしてＳＥ－ＨＰＬＣ（表Ｃに示される条件；ＳＥ－ＨＰＬＣ）及びＩＥＸ－ＨＰＬＣ（表Ｃにに示される条件；ＩＥＸ－ＨＰＬＣプロトコルＩＩ）により分析した。２Ｍ及び３Ｍ ＧｕＨＣｌ変性剤を用いた処理のコンホメーション変異体濃縮材料に対する影響の結果を図９（ＳＥ－ＨＰＬＣ）及び図１０（ＩＥＸ－ＨＰＬＣ）に示す。
カオトロピック剤の影響を評価するために、コンホメーション変異体を濃縮した材料及び枯渇した材料を、１Ｍ、２Ｍ、又は３Ｍの塩化グアニジニウム（ＧｕＨＣｌ）を用いて又は用いずに０．５時間インキュベートし、そしてＳＥ－ＨＰＬＣ（表Ｃに示される条件；ＳＥ－ＨＰＬＣ）及びＩＥＸ－ＨＰＬＣ（表Ｃにに示される条件；ＩＥＸ－ＨＰＬＣプロトコルＩＩ）により分析した。２Ｍ及び３Ｍ ＧｕＨＣｌ変性剤を用いた処理のコンホメーション変異体濃縮材料に対する影響の結果を図９（ＳＥ－ＨＰＬＣ）及び図１０（ＩＥＸ－ＨＰＬＣ）に示す。
ＧｕＨＣｌとともにインキュベートされた緻密変異体濃縮材料について、ＳＥ－ＨＰＬＣ及びＩＥＸ－ＨＰＬＣのポストピーク１は、ＧｕＨＣｌ濃度２Ｍを適用した場合に有意に減少した。さらに、ポストピーク１の減少は、両方の分析についてメインピークの増加を伴っており、コンホメーション変異体がインタクトな形態に変換されたことを実証した。コンホメーション変異体枯渇対照サンプルについては変化は観察されなかった（データは示していない）。
３Ｍ ＧｕＨＣｌの濃度は、試験された化合物Ａについては高すぎて、高分子量（ＨＭＷ）種の形成（ＳＥ－ＨＰＬＣにおけるプレピーク）により実証されるように生成物の分解をもたらした。
１Ｍ ＧｕＨＣｌの適用の際のＩＥＸ－ＨＰＬＣ及びＳＥ－ＨＰＬＣ分析におけるポストピーク面積のわずかな減少のみがあった。化合物Ａについては、この条件は、コンホメーション変異体をインタクトな形態に完全に変換するためには不十分な変性のようであった（データは示していない）。
熱ストレス処理
熱処理については、コンホメーション変異体濃縮材料及び枯渇材料を１又は４時間５０℃又は６０℃でインキュベートし、その後室温（ＲＴ）に再平衡化させた。５０℃で１時間の熱ストレスの影響の結果を図１１（ＳＥ－ＨＰＬＣ）及び図１２（ＩＥＸ－ＨＰＬＣ）に示す。
熱処理については、コンホメーション変異体濃縮材料及び枯渇材料を１又は４時間５０℃又は６０℃でインキュベートし、その後室温（ＲＴ）に再平衡化させた。５０℃で１時間の熱ストレスの影響の結果を図１１（ＳＥ－ＨＰＬＣ）及び図１２（ＩＥＸ－ＨＰＬＣ）に示す。
コンホメーション変異体濃縮材料については、ＳＥ－ＨＰＬＣ及びＩＥＸ－ＨＰＬＣのポストピークは、材料が５０℃で１時間及び４時間のインキュベーションで加熱された場合に有意に減少した（４時間インキュベーションについてのデータは示していない）。この減少は両方の分析についてメインピークの増加を伴っていたので、これはコンホメーション変異体がインタクトな形態に変換されたことを実証した。コンホメーション変異体枯渇サンプルについては変化は観察されなかった（データは示していない）。
６０℃でのインキュベーションは化合物Ａには高すぎるようであり、ＳＥ－ＨＰＬＣ及びＩＥＸ－ＨＰＬＣにおける総面積が減少し（生成物の損失）（データは示していない）、生成物の分解をもたらした。
ｐＨ又はＧｕＨＣｌ処理の際の効力回復
ｐＨ２．５処理４時間又は２Ｍ ＧｕＨＣｌ処理０．５時間の後のコンホメーション変異体の濃縮フラクション及び枯渇フラクション中に存在する化合物ＡのＴＮＦαに対する効力（実施例２に記載されるとおり）を、未処理のサンプルと比較して決定した。結果を表５に示す。
ｐＨ２．５処理４時間又は２Ｍ ＧｕＨＣｌ処理０．５時間の後のコンホメーション変異体の濃縮フラクション及び枯渇フラクション中に存在する化合物ＡのＴＮＦαに対する効力（実施例２に記載されるとおり）を、未処理のサンプルと比較して決定した。結果を表５に示す。
コンホメーション変異体枯渇フラクションと比較して、未処理のコンホメーション変異体濃縮フラクションについての効力低下が確認された。コンホメーション変異体濃縮フラクションの低ｐＨ処理は、コンホメーション変異体枯渇フラクションについて観察されたレベルまでのＴＮＦα効力の回復を生じた。ＧｕＨＣｌ処理サンプルについては、効力はより低かったが、処理後の濃縮及び枯渇フラクションに匹敵するものであった。
要旨
これらの実験全体で、特定の穏やかな変性条件下で、又は静電相互作用（ｐＨ）を変更した場合に、インタクトな形態に変換され得るコンホメーション変異体の存在が確認された。コンホメーション変異体のインタクトなＩＳＶＤ生成物への変換は、変性条件又はｐＨ調整の除去の後も維持されるということも示された。さらに、変換後の効力は回復し、そして２５℃又は５℃で２週間維持された（データは示していない）。
これらの実験全体で、特定の穏やかな変性条件下で、又は静電相互作用（ｐＨ）を変更した場合に、インタクトな形態に変換され得るコンホメーション変異体の存在が確認された。コンホメーション変異体のインタクトなＩＳＶＤ生成物への変換は、変性条件又はｐＨ調整の除去の後も維持されるということも示された。さらに、変換後の効力は回復し、そして２５℃又は５℃で２週間維持された（データは示していない）。
６．４ 実施例４：プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによる化合物Ａのコンホメーション変異体の分離
プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーの間の代替溶出緩衝液の使用又は化合物Ａのコンホメーション変異体の除去
コンホメーション変異体の特徴づけの間に得られた結果に基づいて（実施例１及び２）、化合物の捕獲の間に代替の溶出緩衝液条件を試験した。
プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーの間の代替溶出緩衝液の使用又は化合物Ａのコンホメーション変異体の除去
コンホメーション変異体の特徴づけの間に得られた結果に基づいて（実施例１及び２）、化合物の捕獲の間に代替の溶出緩衝液条件を試験した。
溶出条件及び結果を表６、図１３（ＳＥ－ＨＰＬＣ）及び図１４（ＩＥＸ－ＨＰＬＣ）に示す（表Ｃに示される条件、ＳＥ－ＨＰＬＣ及びＩＥＸ－ＨＰＬＣプロトコルＩ）。
少なくとも７．０のｐＨへの溶出液のｐＨ調整を、０．１Ｍ ＮａＯＨを使用して行った。
０．１Ｍグリシン中ｐＨ２．２での溶出緩衝液を使用して行ったランについて、溶出液材料の一部を０．１Ｍ ＮａＯＨを使用してすぐにｐＨ７．１に調整し、溶出液材料の別の部分については、ｐＨをｐＨ２．５に調整し、１．５時間インキュベートし、次いでｐＨを０．１Ｍ ＮａＯＨを用いてｐＨ７．０に再調整した。
ＳＥ－ＨＰＬＣにおいて、ポストピーク１がＧｕＨＣｌを含む溶出緩衝液について有意に減少するということが分かった。しかし、ＧｕＨＣｌの存在は、ｐＨ２．２の緩衝液を使用した溶出と比較して、溶出液中のＨＭＷ種（ＳＥ－ＨＰＬＣにおけるプレピーク）の形成により示されるように、生成物の分解をもたらした。ｐＨ２．２での溶出について、ＳＥ－ＨＰＬＣポストピーク１は、非中和溶出液、又はｐＨ２．５に調整され、そして中和前に１．５時間インキュベートされた溶出液と比較して、溶出液がすぐに中和された場合により高かった（図１３）。これは、溶出液がすぐに中和された溶出液と比較して、ｐＨ２．５に調整され、そして中和前にインキュベートされた溶出液についてポストピークショルダーが消失したＩＥＸ－ＨＰＬＣにおいて裏付けられた（図１４）。
両方の分析について、ポストピーク（コンホメーション変異体）の減少は、メインピーク（インタクトな形態）の増加を伴っていた。これらの結果全体で、緻密な変異体のインタクトな形態への変換が示唆された。
化合物Ａのコンホメーション変異体の変換のための、プロテインＡのアフィニティークロマトグラフィー後の低ｐＨインキュベーションの使用
上で得られた結果に基づいて、コンホメーション変異体を変換する手段としての低ｐＨ処理を、化合物Ａについて調べた。
上で得られた結果に基づいて、コンホメーション変異体を変換する手段としての低ｐＨ処理を、化合物Ａについて調べた。
低ｐＨ処理及びインキュベーションの長さの影響を、ｐＨ２．１、ｐＨ２．３、ｐＨ２．５及びｐＨ２．７、並びに０、１、２、４、６及び２４時間のインキュベーションで調べた。捕獲溶出液のｐＨを、０．１Ｍ ＨＣｌを用いて適切なｐＨ（２．１、２．３、２．５又は２．７）に低下させ、そしてすぐに０．１Ｍ ＮａＯＨを用いてｐＨ６．０に調整するか（Ｔ０）、又は低ｐＨで１時間もしくは２時間もしくは４時間もしくは６時間もしくは２４時間インキュベートし、次いでｐＨ６．０に０．１Ｍ ＮａＯＨを用いて調整した（Ｔ１ｈ、Ｔ２ｈ、Ｔ４ｈ、Ｔ６ｈ、又はＴ２４ｈ）。様々な低ｐＨ処理サンプルの生成物品質を、０．１Ｍ ＮａＯＨを用いてすぐにｐＨ６．０に調整された捕獲溶出液（対照；Ｔ０）と比較し、そしてＩＥＸ－ＨＰＬＣ、ＳＥ－ＨＰＬＣ、ＲＰ－ＵＨＰＬＣ及びキャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）（表Ｃ及びに示されるＩＥＸ－ＨＰＬＣ条件、プロトコルＩ）により分析した。ＳＥ－ＨＰＬＣ結果を図１５（１）及び（２）（Ｔ０について）並びに図１５（３）及び（４）（Ｔ１ｈについて）に示す。
Ｔ０で、ＳＥ－ＨＰＬＣにおいて観察されたポストピークは、対照と比較してｐＨ２．１及びｐＨ２．７で低かった。これは、このｐＨ範囲で、化合物Ａのコンホメーション変異体の変換が瞬時に起きていることを示す。しかし、ＳＥ－ＨＰＬＣにおいて観察されたポストピーク１は、Ｔ０で既にｐＨ２．１、２．３、及び２．５についてより低く、コンホメーション変異体の変換がｐＨ２．５に等しいか又はそれより低いｐＨで瞬時に起こることを意味する。これはＩＥＸ－ＨＰＬＣにおいて確認され（データは示していない）、ポストピークはＴ０でｐＨ２．７と比較してｐＨ２．３及び２．５についてより低くかった。
１時間インキュベーション以降は、ＳＥ－ＨＰＬＣにおけるポストピークショルダーは全てのｐＨ処理について同様であった。
従って、上のデータは、化合物Ａのコンホメーション変異体のインタクトな形態への変換が、ｐＨ２．１～２．７の範囲に及ぶｐＨで少なくとも１時間の全ての処理について有効であることを示した。
ＲＰ－ＵＨＰＬＣ及びＣＧＥでは変化が観察されず（データは示していない）、緻密な変異体が分子量（ＬＭＷではない）、化学組成、又はジスルフィド架橋（スクランブルＳ－Ｓ）の点で異なっていないということを示す。
化合物Ａのコンホメーション変異体の変換のための低ｐＨインキュベーションは、ｐＨ調整ストック溶液の濃度に依存しない
ｐＨ調整溶液の濃度の影響を調べるために、２組のｐＨ調整溶液を試験した：ｐＨを２．６に低下させるために０．１Ｍ ＨＣｌ、及びｐＨを６．０に調整するために０．１Ｍ ＮａＯＨを用いる第１の組、並びにｐＨを２．６に低下させるために２．７Ｍ ＨＣｌ（１０％ ＨＣｌに等しい）、及びｐＨを６．０に調整するために１Ｍ ＮａＯＨを用いる第２の組。サンプルを１時間ｐＨ２．６でインキュベートした後、ｐＨ６．０に調整した。ＳＥ－ＨＰＬＣ結果を図１６Ａに示す。
ｐＨ調整溶液の濃度の影響を調べるために、２組のｐＨ調整溶液を試験した：ｐＨを２．６に低下させるために０．１Ｍ ＨＣｌ、及びｐＨを６．０に調整するために０．１Ｍ ＮａＯＨを用いる第１の組、並びにｐＨを２．６に低下させるために２．７Ｍ ＨＣｌ（１０％ ＨＣｌに等しい）、及びｐＨを６．０に調整するために１Ｍ ＮａＯＨを用いる第２の組。サンプルを１時間ｐＨ２．６でインキュベートした後、ｐＨ６．０に調整した。ＳＥ－ＨＰＬＣ結果を図１６Ａに示す。
２組のｐＨ調整溶液の使用は同等の結果をもたらし、ＳＥ－ＨＰＬＣポストピークの減少はメインピークの増加を伴い、コンホメーション変異体のインタクトな形態への変換に関連付けられた。
次いで、中間拡張性を評価するために、低ｐＨインキュベーション工程を、中間スケールランのための過程に導入した。０．１Ｍ ＨＣｌを使用してｐＨをｐＨ２．６に低下させ、次いで１時間後に０．１Ｍ ＮａＯＨを加えることによりｐＨ６．０に調整した。
ＳＥ－ＨＰＬＣ（表Ｃ及びに示される条件）結果は、捕獲溶出液（低ｐＨ処理前）と比較して、捕獲ろ液（低ｐＨインキュベーション）についてメインピークの増加を伴うポストピーク１の減少を示し、コンホメーション変異体のインタクトな形態への変換を裏付けた（データは示していない）。
化合物Ａのコンホメーション変異体に対する他の低ｐＨ処理の影響
ピキア・パストリスにおける化合物Ａの発現、及びタンジェンシャルフローろ過を用いた清澄化の後、Ａｍｓｐｈｅｒｅ Ａ３樹脂を使用した捕獲クロマトグラフィーを使用して、化合物Ａを他の不純物から単離した。
ピキア・パストリスにおける化合物Ａの発現、及びタンジェンシャルフローろ過を用いた清澄化の後、Ａｍｓｐｈｅｒｅ Ａ３樹脂を使用した捕獲クロマトグラフィーを使用して、化合物Ａを他の不純物から単離した。
カラムを最初にＰＢＳ緩衝液ｐＨ７．５で平衡化し、そして目的の化合物を含有する清澄化した無細胞収穫材料をロードした。化合物ＡはＡｍｓｐｈｅｒｅ Ａ３樹脂に結合し、そして不純物はカラムをフロースルーした。その後、ロードした樹脂を平衡化工程と同じＰＢＳ緩衝液で洗浄し、続いてｔｒｉｓ緩衝液で洗浄した。ｔｒｉｓ緩衝液は１００ｍＭ ｔｒｉｓ及び１Ｍ ＮａＣｌをｐＨ８．５で含有していた。樹脂をさらに第２の１００ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ５．５で洗浄した。化合物Ａを、低ｐＨグリシン緩衝液を用いてカラムから溶出した。低ｐＨグリシン溶出緩衝液は、１００ｍＭグリシンをｐＨ３．０で含有していた。最後に、樹脂を１００ｍＭ ＮａＯＨを用いて浄化した後、平衡化と同じＰＢＳ緩衝液中で貯蔵した。全ての緩衝液を１８３ｃｍ／時で流した。
最初の実験において、化合物Ａの捕獲溶出液材料のｐＨを、１Ｍ ＨＣｌを用いてｐＨ２．６、ｐＨ２．８、ｐＨ２．９、及びｐＨ３．０に低下させた。低ｐＨで１時間及び２時間のインキュベーション後に、０．２Ｍ ＮａＯＨを用いてサンプルをｐＨ６．０に調整した。Ｔ０サンプル、又は対照サンプルは、溶出直後に凍結した捕獲クロマトグラフィーであった。このサンプルはｐＨ４．３を有していた。
第２の実験において、クロマトグラフィーカラムから溶出した生成物のｐＨは、２つの捕獲クロマトグラフィーランにおいて４．１及び３．７であった。捕獲溶出液のｐＨを、１Ｍ ＨＣｌを用いてｐＨ３．２又はｐＨ３．６に低下させた。低ｐＨで２時間及び４時間のインキュベーション後に、サンプルを０．２Ｍ ＮａＯＨを用いてｐＨ６．０に調整した。１Ｍ ＨＣｌを用いて化合物Ａを目標低ｐＨ（すなわちｐＨ３．２又は３．６）に低下させることによりＴ０を生成し、そしてすぐ０．２Ｍ ＮａＯＨを用いてｐＨ６．０に調整した（Ｔ０）。
生成物品質に対するｐＨの影響を、ＩＥＸ－ＨＰＬＣにより時間の関数で分析した。表６－１及び６－２並びに図１６Ｂ及びＣを参照のこと。
ＩＥＸ－ＨＰＬＣ結果は、サンプル中のコンホメーション変異体の存在に対する低ｐＨ処理の経時的なポジティブな影響を示す。第１の組の実験（ｐＨ２．６、ｐＨ２．８、ｐＨ２．９及びｐＨ３．０）において、対照サンプル中のコンホメーション変異体のレベルは３．５％であった。第２の組の実験（ｐＨ３．２及び３．６）において、コンホメーション変異体のレベルは３．１％であった。
低ｐＨでの２時間のインキュベーション後に、コンホメーション変異体のレベルは、試験した全てのｐＨにおいて減少した。コンホメーション変異体に対する低ｐＨ処理のポジティブな効果は、ｐＨが低くなるにつれ増加した。最良の減少はｐＨ３．０とｐＨ２．６との間で観察された。
６．５ 実施例５：化合物Ａの低ｐＨ処理のスケールアップ（１０Ｌ及び１００Ｌ）
前の実施例に基づいて、化合物Ａの低ｐＨインキュベーションについて選択された条件は、目標ｐＨ２．６、室温で≧６０かつ≦１２０分であった。捕獲溶出液のｐＨを０．１Ｍ ＨＣｌを使用して低下させ、次いで≧６０かつ≦１２０分後に０．１Ｍ ＮａＯＨを加えることによりｐＨ６．０に調整した。発酵プロセスを１０Ｌ及び１００Ｌのスケールにスケールアップした。低ｐＨ処理前の捕獲溶出液（「捕獲溶出液」と呼ぶ）及び上記の低ｐＨ処理とその後の６．０へのｐＨ調整、そしてろ過の後の捕獲溶出液（捕獲ろ液と呼ぶ）の生成物品質を、ＳＥ－ＨＰＬＣ、ＣＧＥ及びＩＥＸ－ＨＰＬＣ（表Ｃに示される条件、ＩＥＸ－ＨＰＬＣプロトコルＩ）のような分析方法により決定した。全ての出発物質を処理するために、３サイクルの捕獲工程を各スケールについて行った。異なるスケールについての結果を表７に示す。
前の実施例に基づいて、化合物Ａの低ｐＨインキュベーションについて選択された条件は、目標ｐＨ２．６、室温で≧６０かつ≦１２０分であった。捕獲溶出液のｐＨを０．１Ｍ ＨＣｌを使用して低下させ、次いで≧６０かつ≦１２０分後に０．１Ｍ ＮａＯＨを加えることによりｐＨ６．０に調整した。発酵プロセスを１０Ｌ及び１００Ｌのスケールにスケールアップした。低ｐＨ処理前の捕獲溶出液（「捕獲溶出液」と呼ぶ）及び上記の低ｐＨ処理とその後の６．０へのｐＨ調整、そしてろ過の後の捕獲溶出液（捕獲ろ液と呼ぶ）の生成物品質を、ＳＥ－ＨＰＬＣ、ＣＧＥ及びＩＥＸ－ＨＰＬＣ（表Ｃに示される条件、ＩＥＸ－ＨＰＬＣプロトコルＩ）のような分析方法により決定した。全ての出発物質を処理するために、３サイクルの捕獲工程を各スケールについて行った。異なるスケールについての結果を表７に示す。
発酵及び精製のスケールとは無関係に、低ｐＨ処理及びろ過工程は、ＣＧＥ分析でのメインピーク％に関して生成物純度に対して影響を有していなかった。これらの結果は方法の変動の範囲内であった。しかし、驚くべきことに、ＳＥ－ＨＰＬＣによる％ＨＭＷ種の減少（図１７（１）（１０Ｌ）及び図１７（２）（１００Ｌ）を参照のこと）が、捕獲ろ液及び捕獲溶出液を比較した場合、発酵（それぞれ１０Ｌ及び１００Ｌ）及び精製スケールアップ（それぞれ７ｃｍ及び２０ｃｍカラム直径）の両方において観察された；この減少は、低ｐＨ処理及び／又はろ過工程の結果である。さらに、以前に小スケールで観察されたように、メインピーク％純度の有意な増加に加えてポストピーク（コンホメーション変異体）％の減少が、捕獲ろ液を捕獲溶出液と比較した場合に、低ｐＨ処理後のＩＥＸ－ＨＰＬＣにおいて観察された（表７並びに図１８（１０Ｌ）及び１９（１００Ｌ））。さらに、ポストピーク１（ショルダー）の減少は、捕獲ろ液のプロフィールについてメインピークの増加を伴っていた。これはＩＥＸデータと相関しており、化合物Ａのコンホメーション変異体のインタクトな形態への変換を裏付ける。
全体として、これらの結果は、低ｐＨ処理が拡張可能なプロセスであり、そして化合物Ａのコンホメーション変異体をインタクトな形態に変換するために有効であるということを示した。
６．６ 実施例６：他のクロマトグラフィー技術による化合物Ａのコンホメーション変異体の分離
化合物Ａのコンホメーション変異体の除去のためのミックスモードクロマトグラフィー（ＭＭＣ）の使用
上記の実施例において、化合物Ａのコンホメーション変異体を、ＩＥＸベースのクロマトグラフィー方法を使用して確実に分離できるということを実証することができた。より低い効力のコンホメーション変異体を、コンホメーション変異体及びインタクトな形態の混合物から除去することも他のクロマトグラフィー方法により達成することができるか否かを決定するために、ＣＨＴセラミックヒドロキシアパタイトＩＩ型（４０μｍ）樹脂（ＢｉｏＲａｄ）を使用したミックスモードクロマトグラフィー（ＭＭＣ）を行った。クロマトグラフィー条件を表８にまとめる。
化合物Ａのコンホメーション変異体の除去のためのミックスモードクロマトグラフィー（ＭＭＣ）の使用
上記の実施例において、化合物Ａのコンホメーション変異体を、ＩＥＸベースのクロマトグラフィー方法を使用して確実に分離できるということを実証することができた。より低い効力のコンホメーション変異体を、コンホメーション変異体及びインタクトな形態の混合物から除去することも他のクロマトグラフィー方法により達成することができるか否かを決定するために、ＣＨＴセラミックヒドロキシアパタイトＩＩ型（４０μｍ）樹脂（ＢｉｏＲａｄ）を使用したミックスモードクロマトグラフィー（ＭＭＣ）を行った。クロマトグラフィー条件を表８にまとめる。
ヒドロキシアパタイト樹脂でのクロマトグラフィープロフィールを図２０に示す。ＣＥＸと同様に、サイド（フロント）フラクション（Ｆ８）及びトップフラクション（Ｆ１１）を単離し、そしてさらなるＳＥ－ＨＰＬＣ及びＩＥＸ－ＨＰＬＣ分析に使用した。両方の分析の結果を図２１（１）／（２）（ＳＥ－ＨＰＬＣ）及び図２２（１）／（２）（ＩＥＸ－ＨＰＬＣ）に示す。ＳＥ－ＨＰＬＣ及びＩＥＸ－ＨＰＬＣ（表Ｃに示される条件；ＩＥＸ－ＨＰＬＣプロトコルＩ）で有意なポストピーク１がフラクションＦ８（メイン／トップピークの前のピークから採られたフラクション）について観察され、このフラクションがコンホメーション変異体を多く含むということを示した。フラクションＦ１１については、ＳＥ－ＨＰＬＣ及びＩＥＸ－ＨＰＬＣポストピーク１がロード材料と比較して有意に減少していたので、このフラクションＦ１１はコンホメーション変異体が枯渇していた。
結論として、ヒドロキシアパタイト樹脂での結果は、カチオン交換樹脂で得られた結果と類似していた。従って、ヒドロキシアパタイト樹脂は、化合物Ａのコンホメーション変異体及びインタクトな形態の混合物からより低い効力のコンホメーション変異体を除去するために適していることが示された。
化合物Ａをのコンホメーション変異体の除去のための疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）の使用
化合物Ａのインタクトな形態からの緻密なコンホメーション変異体の分離は、様々なクロマトグラフィー技術及び樹脂の種類について観察されたので、別のクロマトグラフィー方法である疎水性クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を試験した。最初に、ＨＩＣ ＴＳＫ Ｐｈｅｎｙｌゲル５ ＰＷ（３０）（Ｔｏｓｏｈ）樹脂を使用したグラジエントを、表９に示される条件を使用して実行した。
化合物Ａのインタクトな形態からの緻密なコンホメーション変異体の分離は、様々なクロマトグラフィー技術及び樹脂の種類について観察されたので、別のクロマトグラフィー方法である疎水性クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を試験した。最初に、ＨＩＣ ＴＳＫ Ｐｈｅｎｙｌゲル５ ＰＷ（３０）（Ｔｏｓｏｈ）樹脂を使用したグラジエントを、表９に示される条件を使用して実行した。
対応するＨＩＣクロマトグラムを図２３に示す。ＣＥＸ及びＭＭＣクロマトグラムに見られるように、試験されたグラジエントは、２つの分離したピーク（第１（メイン）ピーク、続いて第２（サイド）ピークも）を含むＨＩＣプロフィールを生じた。各ピークの１つの代表的なフラクションをさらに分析した。メインピーク（Ｆ２６；トップフラクション）及びサイドピーク（Ｆ４１；サイドフラクション）の選択されたフラクションからのＳＥ－ＨＰＬＣデータ（表Ｃに示される条件）を図２４（１）／（２）に示す。対応するＳＥ－ＨＰＬＣプロフィールにより、ＳＥ－ＨＰＬＣでポストピーク１が見られないので、トップフラクションはより早く溶出するインタクトな形態のみからなるということが分かった。対照的に、ＳＥ－ＨＰＬＣデータは、サイドフラクションの主要な化学種がほとんど完全に、より遅く溶出するコンホメーション変異体である（ほとんど１００％ポストピーク１）ということを示した。
従って、ＨＩＣでのグラジエントを使用して、所望のインタクトな形態からのコンホメーション変異体の良好な分離を達成することができた。従って、このＨＩＣ樹脂は、化合物Ａのコンホメーション変異体及びインタクトな形態の両方の混合物のコンホメーション変異体の除去に適していることが示された。
最初に試験したＨＩＣ樹脂（ＴＳＫ Ｐｈｅｎｙｌゲル５ ＰＷ（３０）樹脂）は高分解能樹脂であったので、大規模処理により適している他のＨＩＣ樹脂を試験した：Ｃａｐｔｏ ｐｈｅｎｙｌ Ｈｉｇｈ Ｓｕｂ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｃａｐｔｏ ｐｈｅｎｙｌ ＩｍｐＲｅｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｃａｐｔｏ ｂｕｔｙｌ ＩｍｐＲｅｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｐｈｅｎｙｌ ＨＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及びＣａｐｔｏ Ｂｕｔｙｌ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）。硫酸アンモニウム及び塩化ナトリウムを使用したグラジエントを試験した。使用した条件を以下の表１０に記載する。硫酸アンモニウムグラジエントとともに使用した樹脂Ｃａｐｔｏ Ｂｕｔｙｌ Ｉｍｐｒｅｓについてのトップフラクション及びロードのＳＥ－ＨＰＬＣプロフィールを図２５に示す。
ＳＥ－ＨＰＬＣにおけるポストピークは、Ｃａｐｔｏ Ｐｈｅｎｙｌ Ｈｉｇｈ ｓｕｂを除いて、塩化ナトリウム及び硫酸アンモニウムを使用したグラジエントの両方について、試験した全ての樹脂について有意に減少した。塩化ナトリウム又は硫酸アンモニウムグラジエントのいずれかを用いてＨＩＣ樹脂に適したプロセスを使用することにより、コンホメーション変異体を除去することができるということが結果として確認された。
樹脂Ｃａｐｔｏ Ｂｕｔｙｌ Ｉｍｐｒｅｓ及び硫酸アンのニウムグラジエントのＨＩＣクロマトグラムを図２６に示す。クロマトグラムに見られるように、試験されたグラジエントは、２つの分離したピーク、第１（メイン）ピーク及びそれに続くより小さな第２（サイド）ピークを生じた。メインピークのいくつかのフラクション（Ｆ１５及びＦ２０）及び第２（サイド）ピークの１つのフラクション（Ｆ２９）を、ＳＥ－ＨＰＬＣによりさらに分析した。得られたクロマトグラム（図２７）は、フラクションＦ２９が、より遅く溶出するコンホメーション変異体のみ（ほとんど１００％ ＳＥ－ＨＰＬＣポストピーク１；ロードピークと比較したピークシフトを参照のこと）を含有することを示した。対照的に、メインピークのフラクション１５及び２０は、ＳＥ－ＨＰＬＣポストピーク１の存在を示さず、これらのフラクションが、より遅く溶出する望ましくないコンホメーション変異体を枯渇していることを実証した。
従って、Ｃａｐｔｏ Ｂｕｔｙｌ Ｉｍｐｒｅｓ樹脂を使用して、疎水性相互作用でグラジエントを使用する化合物Ａのコンホメーション変異体の良好な分離が達成された。従って、この樹脂は、化合物Ａのコンホメーション変異体及びインタクトな形態の両方の混合物からコンホメーション変異体を除去するために使用可能であることが示された。
化合物Ａのコンホメーション変異体の除去のためのメンブレンベースのＨＩＣの使用
コンホメーション変異体及びインタクトな形態の分離を、カラムにおいてＨＩＣ樹脂を使用して十分に達成することができたので、フロースルー中に所望のインタクトな形態を含むフロースルーモードの工程を開発した。従って、ＨＩＣメンブレンＳａｒｔｏｂｉｎｄ Ｐｈｅｎｙｌ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を使用したさらなるＨＩＣ設定を実行した。Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ ｐｈｅｎｙｌメンブレン（フィルタープレート）でのスクリーニングの条件を表１１に記載する。
コンホメーション変異体及びインタクトな形態の分離を、カラムにおいてＨＩＣ樹脂を使用して十分に達成することができたので、フロースルー中に所望のインタクトな形態を含むフロースルーモードの工程を開発した。従って、ＨＩＣメンブレンＳａｒｔｏｂｉｎｄ Ｐｈｅｎｙｌ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を使用したさらなるＨＩＣ設定を実行した。Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ ｐｈｅｎｙｌメンブレン（フィルタープレート）でのスクリーニングの条件を表１１に記載する。
代表的な条件（条件Ｃ２）のＳＥ－ＨＰＬＣプロフィールを図２８に示す。ＳＥ－ＨＰＬＣポストピーク１は、コンホメーション変異体を含有する参照サンプルと比較して有意に減少した。参照は、低ｐＨ処理を受けていないがそのままｐＨ７．４に中和された捕獲溶出液（プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーから）を使用した。参照はＨＩＣにかけなかった。それ故、コンホメーション変異体は参照サンプルから除去もされず変換もしていなかった。
さらに、３ｍＬ Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ ｐｈｅｎｙｌメンブレンを使用して最適化を行った。条件を表１２に記載する。硫酸アンモニウム及び塩化ナトリウムを、様々な濃度で使用して、フロースルーでのインタクトな形態の回収を最適化した。
最適な条件についてのＨＩＣクロマトグラムを図２９に示す。ロード、フラクションプール２、及びストリッピングフラクションからのＳＥ－ＨＰＬＣデータを図３０に示す。ＳＥ－ＨＰＬＣポストピーク１は、プール２についてメンブレンのフロースルーから有意に減少した。ストリッピングはＳＥ－ＨＰＬＣポストピークショルダー、すなわち望ましくないコンホメーション変異体が多く含まれていた。従って、コンホメーション変異体は、ＨＩＣ ｐｈｅｎｙｌメンブレンを使用してフロースルーモードで化合物Ａの望ましいインタクトな形態から除去された。回収は硫酸アンモニウムを使用して７４％（プール２）、そして塩化ナトリウムを使用して６３％（プール２）であった。
６．７ 実施例７：化合物Ｂの緻密な変異体の同定及び初期特徴づけ
緻密な変異体が他の多価ＩＳＶＤ構築物についても出現することを確認するために、さらなる調査を化合物Ｂについて行った。
緻密な変異体が他の多価ＩＳＶＤ構築物についても出現することを確認するために、さらなる調査を化合物Ｂについて行った。
化合物Ｂ（配列番号２）は、３つの異なる標的に結合する重鎖ラマ抗体の４つの異なる配列の最適化された可変ドメインを含む多価ＩＳＶＤ構築物である。ＩＳＶＤ結合ブロックは、以下の形式でヘッド－トゥ－テイル（Ｎ末端からＣ末端）でＧ／Ｓリンカーを用いて融合され：ＴＮＦα結合ＩＳＶＤ － ９ＧＳリンカー - ＩＬ２３ｐ１９結合ＩＳＶＤ - ９ＧＳリンカー - ヒト血清アルブミン結合ＩＳＶＤ － ９ＧＳリンカー - ＩＬ２３ｐ１９結合ＩＳＶＤ、そして以下の配列を有する：
化合物Ｂタンパク質の品質を、技術の中でもとりわけ、分析用ＩＥＸ－ＨＰＬＣ（表Ｃに示される条件、ＩＥＸ－ＨＰＬＣプロトコルＩＩ）により評価した。
精製された化合物Ｂタンパク質について、いくつかの異なるサイドピークがＩＥＸ－ＨＰＬＣプロフィールにおいて観察された（図３１）。質量分析計（ＭＳ）と共同した２Ｄ－ＬＣ多元ハートカット分析（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｈｅａｒｔ ｃｕｔｔｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ）を行い、変異体を同定した。２Ｄ－ＬＣ－ＭＳにより、ＩＥＸ－ＨＰＬＣ（１Ｄ）プロフィールにおいて観察された全てのピークのトップフラクションを別々に集め、そして脱塩工程（２Ｄ）の後に、Ｑ－ＴＯＦ質量分析計で分析し、ＩＥＸピークにより表されたタンパク質の分子量を決定した。２Ｄ－ＬＣ－ＭＳ分析は、ポストピーク１が生成物（メインピーク）と同じ分子量を有することを示し、ポストピーク１は、生成物と比較して変化した表面電荷分布を有し、そのため潜在的に緻密な形態を有する（データは示していない）「インタクトな質量変異体」であると結論づけられた。
さらに、化合物Ｂのポリッシング工程段階の間、いくつかのＣＥＸ（カチオン交換クロマトグラフィー）樹脂は、ＣＥＸで化合物Ａのについて以前に観察されたもの（例えば、実施例１及び２を参照のこと）に類似したクロマトグラフィープロフィール（すなわち、プレピーク「ショルダー」を有するメインピーク）を示した。従って、化合物Ｂのポリッシング工程段階の間に生成された材料を、その後ＩＥＸ－ＨＰＬＣにより分析した。ＣＥＸ樹脂を使用したグラジエントは、ポリッシングプロセスの間に行われており、ラン条件を表１４に示し、クロマトグラムを図３２に示す。
フラクション２Ｃ４及びフラクション２Ｃ７～２Ｃ１１のプール（図３２）をＩＥＸ－ＨＰＬＣ分析及びＳＥ－ＨＰＬＣ分析（表Ｃに示される条件）に出した。結果をそれぞれ図３３及び図３４に示す。
ＩＥＸ－ＨＰＬＣ分析（図３３）において、フラクション２Ｃ４はＩＥＸ－ＨＰＬＣポストピーク１を３３．６％含んでいたが、この変異体はフラクション２Ｃ７～２Ｃ１１のプール中に＜１．０％しか存在していなかった。ＳＥ－ＨＰＬＣ結果は、化合物Ａについて観察されたものと同様のクロマトグラフィープロフィールを示し、フラクション２Ｃ４は、フラクション２Ｃ７～２Ｃ１１と比較してポストピークショルダーを示した。総合すると、これらの結果は、ＩＥＸ－ＨＰＬＣポストピーク１が、化合物Ａについて観察されたように潜在的に効力に影響を有し得る「緻密な」変異体であり得るということを示唆した。従って、フラクション２Ｃ４及びフラクション２Ｃ７～２Ｃ１１のプールを効力分析に出した。
ＴＮＦα、ＩＬ－２３及びＨＳＡに対する化合物Ｂの効力を、５．４．５項に記載されるように決定した：
－ ＴＮＦ－アルファ結合部分の効力試験のための細胞ベースのレポーターアッセイ；
－ ＩＬ－２３結合部分の効力試験のための細胞ベースのレポーターアッセイ；
－ アルブミン結合部分の効力試験のためのＥＬＩＳＡベースのアルブミン結合アッセイ。
－ ＴＮＦ－アルファ結合部分の効力試験のための細胞ベースのレポーターアッセイ；
－ ＩＬ－２３結合部分の効力試験のための細胞ベースのレポーターアッセイ；
－ アルブミン結合部分の効力試験のためのＥＬＩＳＡベースのアルブミン結合アッセイ。
効力分析の結果を表１５に示す。
３３．６％ ＩＥＸ－ＨＰＬＣポストピーク１を含有する濃縮フラクション２Ｃ４について、プールフラクション２Ｃ７～２Ｃ１１と比較して、少なくともＴＮＦαに対する効力について有意な低下が観察された。化合物Ｂの流体力学的体積及び電荷に影響を与えることに加えて、コンホメーション変化は、少なくともＴＮＦαへの結合にも影響を及ぼすと結論付けられた。
従って、緻密な変異体を除去／変換する手段を調べた。
６．８ 実施例８：化合物Ｂのコンホメーションに影響を及ぼす条件の決定
化合物Ｂの低ｐＨ処理
化合物Ａについて得られた観察結果に基づいて、化合物Ｂの捕獲溶出液材料に対する低ｐＨインキュベーションを試験した。捕獲溶出液のｐＨを、１Ｍ ＨＣｌを用いてｐＨ２．１、ｐＨ２．３又はｐＨ２．５に低下させた。低ｐＨで１時間のインキュベーションの後、サンプルを１Ｍ酢酸ナトリウムを用いてｐＨ５．５に調整した。様々な低ｐＨで処理されたサンプルの生成物品質を、１Ｍ酢酸ナトリウムを用いてすぐにｐＨ５．５に調整された捕獲溶出液（対照）と比較し、そしてＩＥＸ－ＨＰＬＣ（表１６及び図３５）及びＳＥ－ＨＰＬＣ（図３６）で分析した（実施例７及び表Ｃにも示される条件；ＩＥＸ－ＨＰＬＣプロトコルＩＩ）。
化合物Ｂの低ｐＨ処理
化合物Ａについて得られた観察結果に基づいて、化合物Ｂの捕獲溶出液材料に対する低ｐＨインキュベーションを試験した。捕獲溶出液のｐＨを、１Ｍ ＨＣｌを用いてｐＨ２．１、ｐＨ２．３又はｐＨ２．５に低下させた。低ｐＨで１時間のインキュベーションの後、サンプルを１Ｍ酢酸ナトリウムを用いてｐＨ５．５に調整した。様々な低ｐＨで処理されたサンプルの生成物品質を、１Ｍ酢酸ナトリウムを用いてすぐにｐＨ５．５に調整された捕獲溶出液（対照）と比較し、そしてＩＥＸ－ＨＰＬＣ（表１６及び図３５）及びＳＥ－ＨＰＬＣ（図３６）で分析した（実施例７及び表Ｃにも示される条件；ＩＥＸ－ＨＰＬＣプロトコルＩＩ）。
ＩＥＸ－ＨＰＬＣ分析の結果は、低ｐＨ処理が生成物の増加（％メインピーク純度）だけでなく緻密変異体の減少（％ＩＥＸ－ＨＰＬＣポストピーク１）ももたらすことを示す。さらに、そして化合物Ａと同様に、ＳＥ－ＨＰＬＣにおいて観察されたメインピークは、低ｐＨ処理後に「鋭く」なり、すぐにｐＨ５．５に調整された捕獲溶出液中の変異体の存在を示唆した。これらの結果を総合すると、生成物（ＩＥＸ－ＨＰＬＣ及び／又はＳＥ－ＨＰＬＣでのメインピーク）、従って、化合物Ａについて観察された活性生成物に変換することができる緻密変異体の存在が実証された。
化合物Ａについて得られた観察結果に基づいて、そしてＩＥＸ－ＨＰＬＣポストピーク１が変換され得るか否かを評価するために、カオトロピック剤、熱又は低ｐＨに基づく条件を化合物Ｂをに対して試験した。次いでサンプルをＲＰ－ＵＨＰＬＣ、ＳＥ－ＨＰＬＣ及びＩＥＸ－ＨＰＬＣにより分析した。ＩＥＸ－ＨＰＬＣポストピーク１に関する変化を有する結果のみをここに示す。
低ｐＨ処理
低ｐＨ処理のために、化合物Ｂを、１００ｍＭ最終グリシンｐＨ２．５、ｐＨ３．０もしくはｐＨ３．５、又は製剤化緩衝液ｐＨ６．５（対照）で処理した。４時間室温でのインキュベーション後に、サンプルを分析するか又は０．１Ｍ ＮａＯＨで中和した後分析した。非中和サンプルのＩＥＸ－ＨＰＬＣ及びＳＥ－ＨＰＬＣの結果をそれぞれ図３７及び３８に示す；全ての結果を表１７にまとめる。
低ｐＨ処理のために、化合物Ｂを、１００ｍＭ最終グリシンｐＨ２．５、ｐＨ３．０もしくはｐＨ３．５、又は製剤化緩衝液ｐＨ６．５（対照）で処理した。４時間室温でのインキュベーション後に、サンプルを分析するか又は０．１Ｍ ＮａＯＨで中和した後分析した。非中和サンプルのＩＥＸ－ＨＰＬＣ及びＳＥ－ＨＰＬＣの結果をそれぞれ図３７及び３８に示す；全ての結果を表１７にまとめる。
サンプルを１００ｍＭグリシン最終ｐＨ２．５で処理し、そして中和するか又は中和せずに４時間室温でインキュベートした場合、化合物ＢのＩＥＸ－ＨＰＬＣメインピーク％は増加したが、ＩＥＸ－ＨＰＬＣポストピークの％は対照と比較して減少し（表１７及び図３７）、ＩＥＸ－ＨＰＬＣポストピーク１がコンホメーション変異体であることを示唆した。ＩＥＸ－ＨＰＬＣポストピーク１はメインピーク、従って活性生成物に変換され得る。さらに、サンプルを１００ｍＭグリシン最終ｐＨ３．５で処理し、そして中和するか又は中和せずに４時間室温でインキュベートした場合、対照と比較してＩＥＸ－ＨＰＬＣ結果において有意な変化は観察されず、そしてＩＥＸ－ＨＰＬＣポストピーク１についての限定された減少はｐＨ３．０処理の後観察することができなかった。ＳＥ－ＨＰＬＣ結果に関して（表１７及び図３８）、ＨＭＷ種の増加は観察されず、ＩＥＸ－ＨＰＬＣポストピーク１がＨＭＷ種（例えば、可溶性凝集体）に変換されなかったことを示す。さらに、ＳＥ－ＨＰＬＣ結果により、ｐＨ２．５処理がメインピークの形状に影響を及ぼすことが分かった。メインピークはｐＨ２．５処理後に「鋭く」なり、これはＩＥＸ－ＨＰＬＣ結果及び化合物Ａで生じた結果と相関していた。
カオトロピック剤を用いた処理
カオトロピック剤を用いた処理のために、化合物Ｂを、３Ｍ最終グアニジン塩酸塩、２Ｍ最終グアニジン塩酸塩、１Ｍ最終グアニジン塩酸塩、又はＭｉｌｌｉ Ｑ（対照）のいずれかで処理し、その後０．５時間室温でインキュベートした。ＩＥＸ－ＨＰＬＣの結果を図３９に示す。
カオトロピック剤を用いた処理のために、化合物Ｂを、３Ｍ最終グアニジン塩酸塩、２Ｍ最終グアニジン塩酸塩、１Ｍ最終グアニジン塩酸塩、又はＭｉｌｌｉ Ｑ（対照）のいずれかで処理し、その後０．５時間室温でインキュベートした。ＩＥＸ－ＨＰＬＣの結果を図３９に示す。
サンプル中のＧｕＨＣｌの存在はＩＥＸ－ＨＰＬＣ法の条件と干渉し、対照と比較して処理されたサンプルのＵＶシグナルの減少を生じた。統合されたデータは低いシグナル信頼性の欠如によるものであるが（従って示されていない）、クロマトグラムのオーバーレイは、ＧｕＨＣｌの添加が緻密な変異体のピーク（ＩＥＸ－ＨＰＬＣポストピーク１）を減少し得ることを示す。これらの結果は化合物Ａについて得られた結果と一致する。
熱ストレス処理
熱処理のために、化合物Ｂを１時間５０℃で、４時間５０℃で、１時間６０℃で、４時間６０℃で（その後室温まで再平衡化）、４時間室温でインキュベートするか、又はインキュベートしなかった（対照）。ＩＥＸ－ＨＰＬＣ及びＳＥ－ＨＰＬＣの結果をそれぞれ図４０及び４１に示す（１時間５０℃について）に示し、そして表１８にまとめる。
熱処理のために、化合物Ｂを１時間５０℃で、４時間５０℃で、１時間６０℃で、４時間６０℃で（その後室温まで再平衡化）、４時間室温でインキュベートするか、又はインキュベートしなかった（対照）。ＩＥＸ－ＨＰＬＣ及びＳＥ－ＨＰＬＣの結果をそれぞれ図４０及び４１に示す（１時間５０℃について）に示し、そして表１８にまとめる。
１時間５０℃、４時間５０℃、１時間６０℃、又は４時間６０℃で熱処理した場合、化合物ＢのＩＥＸ－ＨＰＬＣメインピーク％は増加したが、ＩＥＸ－ＨＰＬＣピストピーク１の％は対照と比較して減少し、ＩＥＸ－ＨＰＬＣポストピーク１がコンホメーション変異体であることを示唆した（表１８及び図４０）。ＩＥＸ－ＨＰＬＣポストピーク１は、潜在的にメインピークに変換され得、従って活性生成物である。さらに、４時間室温でインキュベートした場合、対照と比較して有意な変化は観察されなかった。これらのサンプルをＳＥ－ＨＰＬＣにより分析した場合、ＨＭＷ種の増加は観察されず、ＩＥＸ－ＨＰＬＣポストピーク１はＨＭＷ種（例えば、可溶性凝集体）に変換されなかったことを示した。さらに、ＳＥ－ＨＰＬＣ結果（表１８及び図４１）により、熱処理がメインピークの形状に影響を及ぼすことが分かった。メインピークは熱処理されると「鋭く」なり、これはＩＥＸ－ＨＰＬＣ結果及び化合物Ａで生じた結果と相関する。
要旨
総合すると、これらの結果は、ＩＥＸ－ＨＰＬＣポストピーク１が、ｐＨ２．５での低ｐＨ処理、ＧｕＨＣｌ処理及び／又は熱処理により、ＩＥＸ－ＨＰＬＣ及びＳＥ－ＨＰＬＣにおけるメインピークのより効力の高いインタクトな形態（本明細書において「インタクトな生成物」と呼ばれる）に変換することができる、化合物Ｂのコンホメーション変異体（本明細書ではより低い効力の「緻密な変異体」と呼ばれる）であることを裏付けた。
総合すると、これらの結果は、ＩＥＸ－ＨＰＬＣポストピーク１が、ｐＨ２．５での低ｐＨ処理、ＧｕＨＣｌ処理及び／又は熱処理により、ＩＥＸ－ＨＰＬＣ及びＳＥ－ＨＰＬＣにおけるメインピークのより効力の高いインタクトな形態（本明細書において「インタクトな生成物」と呼ばれる）に変換することができる、化合物Ｂのコンホメーション変異体（本明細書ではより低い効力の「緻密な変異体」と呼ばれる）であることを裏付けた。
６．９ 実施例９：化合物Ｂについての低ｐＨ処理の最適化
上記の実施例８において記載される化合物Ａ及び化合物Ｂの処理の結果に基づいて、緻密な変異体を変換する手段としての低ｐＨ処理を、化合物Ｂについて最適化した。
上記の実施例８において記載される化合物Ａ及び化合物Ｂの処理の結果に基づいて、緻密な変異体を変換する手段としての低ｐＨ処理を、化合物Ｂについて最適化した。
ピキア・パストリスにおける化合物Ｂの発現及び収穫の後、Ａｍｓｐｈｅｒｅ Ａ３樹脂を使用した捕獲クロマトグラフィーを使用して、他の不純物から化合物Ｂを単離した。
カラムを最初にＰＢＳ緩衝液ｐＨ７．５を用いて平衡化し、そして目的の化合物を含有する清澄化した無細胞収穫材料をロードした。化合物ＢはＡｍｓｐｈｅｒｅ Ａ３樹脂に結合し、そして不純物はカラムをフロースルーした。続いて、ロードされた樹脂を平衡化工程と同じＰＢＳ緩衝液で洗浄し、続いてｔｒｉｓ緩衝液で洗浄した。ｔｒｉｓ緩衝液は、１００ｍＭ ｔｒｉｓ、及び１Ｍ ＮａＣｌをｐＨ８．５で含有していた。樹脂をさらに第２の１００ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ５．５で洗浄した。化合物Ｂは、低ｐＨグリシン緩衝液を用いてカラムから溶出された。低ｐＨグリシン溶出緩衝液は、１００ｍＭグリシンをｐＨ３で含有していた。最後に、樹脂を１００ｍＭ ＮａＯＨで浄化した後、平衡化と同じＰＢＳ緩衝液で貯蔵した。全ての緩衝液は１８３ｃｍ／時で流された。
捕獲クロマトグラフィー後に、クロマトグラフィーカラムから溶出する生成物のｐＨはｐＨ３．８であった。次いで、低ｐＨインキュベーション工程を化合物Ｂに適用した。
低ｐＨインキュベーション時間
（１）初期実験：最初に、ｐＨ２．３及びｐＨ２．５での低ｐＨ処理の影響（実施例１を参照のこと）を、その後の実験で確認し、そして低ｐＨでのインキュベーションの長さをさらに評価した。捕獲溶出液のｐＨを、１Ｍ ＨＣｌを用いてｐＨ２．３又はｐＨ２．５に低下させ、そしてすぐに１Ｍ酢酸ナトリウムを用いてｐＨ５．５に調整するか（Ｔ０）、１時間低ｐＨでインキュベートし、次いで１Ｍ酢酸ナトリウム用いて調整するか（Ｔ１）、２時間低ｐＨでインキュベートし、次いで１Ｍ酢酸ナトリウムを用いて調整するか（Ｔ２）、又は４時間低ｐＨでインキュベートし、次いで１Ｍ酢酸ナトリウムを用いて調整した（Ｔ４）。様々な低ｐＨ処理サンプルの生成物品質を、すぐに１Ｍ酢酸ナトリウムを用いてｐＨ５．５に調整された捕獲溶出液（対照）と比較し、そしてＩＥＸ－ＨＰＬＣ、ＳＥ－ＨＰＬＣ及びＣＧＥ（表Ｃに示される条件；ＩＥＸ－ＨＰＬＣプロトコルＩＩ）により分析した。ＳＥ－ＨＰＬＣの結果を図４２Ａ及び４２Ｂに示し、そして表１９にまとめた。
（１）初期実験：最初に、ｐＨ２．３及びｐＨ２．５での低ｐＨ処理の影響（実施例１を参照のこと）を、その後の実験で確認し、そして低ｐＨでのインキュベーションの長さをさらに評価した。捕獲溶出液のｐＨを、１Ｍ ＨＣｌを用いてｐＨ２．３又はｐＨ２．５に低下させ、そしてすぐに１Ｍ酢酸ナトリウムを用いてｐＨ５．５に調整するか（Ｔ０）、１時間低ｐＨでインキュベートし、次いで１Ｍ酢酸ナトリウム用いて調整するか（Ｔ１）、２時間低ｐＨでインキュベートし、次いで１Ｍ酢酸ナトリウムを用いて調整するか（Ｔ２）、又は４時間低ｐＨでインキュベートし、次いで１Ｍ酢酸ナトリウムを用いて調整した（Ｔ４）。様々な低ｐＨ処理サンプルの生成物品質を、すぐに１Ｍ酢酸ナトリウムを用いてｐＨ５．５に調整された捕獲溶出液（対照）と比較し、そしてＩＥＸ－ＨＰＬＣ、ＳＥ－ＨＰＬＣ及びＣＧＥ（表Ｃに示される条件；ＩＥＸ－ＨＰＬＣプロトコルＩＩ）により分析した。ＳＥ－ＨＰＬＣの結果を図４２Ａ及び４２Ｂに示し、そして表１９にまとめた。
ＩＥＸ－ＨＰＬＣの結果（表１９）に関して、対照、ｐＨ２．３ Ｔ０及びｐＨ２．５ Ｔ０の間に差異は観察されなかった。メインピーク純度％の有意な増加に加えてＩＥＸ－ＨＰＬＣポストピーク１（緻密変異体）の％の減少が、低ｐＨでの１時間インキュベーション、２時間インキュベーション及び４時間インキュベーションについて観察された。さらに、 ＩＥＸ－ＨＰＬＣポストピーク１の減少は、最も長いインキュベーション時間で最も有効であった。ＳＥ－ＨＰＬＣ結果（表１９、図４２Ａ及び４２Ｂ）に関して、捕獲溶出液のｐＨをｐＨ２．３又はｐＨ２．５に低下させることにより、ＨＭＷ種（プレピーク）がわずかに増加したが、以前に観察されたように主にメインピークが細くなった。ＣＧＥプロフィール（表１９）は、メインピーク純度について異なるサンプル間で有意な差異を示さず、緻密な変異体はインタクトな生成物と異なる分子量を有していないという初期２Ｄ－ＬＣ結果（実施例７）を裏付けた。総合すると、これらの結果は、ＩＥＸ－ＨＰＬＣポストピーク１は緻密な変異体であり、低ｐＨ２．３及びｐＨ２．５処理を１時間、２時間及び４時間行うことによりＩＥＸ－ＨＰＬＣ及びＳＥ－ＨＰＬＣにおけるメインピークに変換することができるということを裏付けた。
（２）さらなる実験：次いで、初期実験の低ｐＨ処理を拡大した。化合物Ｂの捕獲材料のｐＨを、１Ｍ ＨＣｌを用いてｐＨ２．７、ｐＨ２．９、ｐＨ３．１、ｐＨ３．３、ｐＨ３．５、及びｐＨ３．９に低下させた。低ｐＨで２時間及び４時間のインキュベーション後に、サンプルを１Ｍ酢酸ナトリウムでｐＨ５．５に調整した。
化合物Ｂの捕獲溶出液のｐＨを、１Ｍ ＨＣｌを用いて目標低ｐＨ（すなわち、上に示したようにｐＨ２．７～３．９）に低下させ、そしてすぐに１Ｍ酢酸ナトリウムを用いてｐＨ５．５に調整することによりＴ０を生成した（Ｔ０）。
時間の関数での低ｐＨ処理の生成物品質に対する影響をＩＥＸ－ＨＰＬＣにより分析した。表２０及び図４３Ａ及びＢを参照のこと。
ＩＥＸ－ＨＰＬＣ結果は、サンプル中のコンホメーション変異体の存在に対して低ｐＨ処理のポジティブな影響を示す。Ｔ０サンプル中のコンホメーション変異体のレベルは、試験した全てのサンプルにおいて同様であった。実験の初期の組、すなわちｐＨ２．３及び２．５において、このレベルは約４．５％であった。さらなる実験において、Ｔ０（ｐＨ２．７、２．９、３．１、３．３、３．５及びｐＨ３．７）における対照サンプル中のコンホメーション変異体のレベルは約３％であった。
低ｐＨでの２時間のインキュベーションの後に、コンホメーション変異体のレベルは試験した全てのｐＨにおいて減少した。コンホメーション変異体に対する低ｐＨのポジティブな効果は、より低いｐＨで、すなわちｐＨ３．０未満で増加した。
低ｐＨでの４時間のインキュベーションの後に、コンホメーション変異体のレベルは、試験した全てのｐＨについてさらに減少した。最良の減少はｐＨ２．３で、ｐＨ２．９まで観察された。
この実施例において得られた全ての結果は、コンホメーション変異体に対する低ｐＨ、特にｐＨ３又はそれ以下のポジティブな影響を示す。
さらなる低ｐＨ処理
次いで、低ｐＨ処理の動作範囲の広さを調べるために、ｐＨ２．４及びｐＨ２．６での２時間の低ｐＨインキュベーションを調べた。捕獲溶出液のｐＨを、１Ｍ ＨＣｌを用いてｐＨ２．４又はｐＨ２．６に低下させ、そしてサンプルを室温で２時間インキュベートした。次いで１Ｍ酢酸ナトリウムを用いてサンプルをｐＨ５．５に調整した。様々な低ｐＨ処理されたサンプルの生成物品質を、１Ｍ酢酸ナトリウムを用いてすぐにｐＨ５．５に調整された捕獲溶出液（対照）を比較し、そしてＩＥＸ－ＨＰＬＣ、ＳＥ－ＨＰＬＣ及びＧＥにより分析した。結果を図４４に示し、そして表２１にまとめる。
次いで、低ｐＨ処理の動作範囲の広さを調べるために、ｐＨ２．４及びｐＨ２．６での２時間の低ｐＨインキュベーションを調べた。捕獲溶出液のｐＨを、１Ｍ ＨＣｌを用いてｐＨ２．４又はｐＨ２．６に低下させ、そしてサンプルを室温で２時間インキュベートした。次いで１Ｍ酢酸ナトリウムを用いてサンプルをｐＨ５．５に調整した。様々な低ｐＨ処理されたサンプルの生成物品質を、１Ｍ酢酸ナトリウムを用いてすぐにｐＨ５．５に調整された捕獲溶出液（対照）を比較し、そしてＩＥＸ－ＨＰＬＣ、ＳＥ－ＨＰＬＣ及びＧＥにより分析した。結果を図４４に示し、そして表２１にまとめる。
－ＨＰＬＣ結果（表２１）は、ｐＨ２．４及びｐＨ２．６での２時間インキュベーション後に、メインピーク純度％の有意な増加に加えてＩＥＸ－ＨＰＬＣポストピーク１（緻密変異体）％の減少も示す。ＳＥ－ＨＰＬＣ結果（表２１及び図４４）は、捕獲溶出液のｐＨのｐＨ２．４又はｐＨ２．６への低下がＨＭＷ種のわずかな増加をもたらしたが、以前に観察されたようにメインピークが細くなった。ＣＧＥプロフィール（表２１）は、対照と低ｐＨ処理サンプルとの間で有意な差異を示さず、緻密な変異体がインタクトな生成物と異なる分子量を有していないという初期の２Ｄ－ＬＣ結果（実施例７）を裏付けた。総合すると、これらの結果は、ＩＥＸ－ＨＰＬＣポストピーク１が、ｐＨ２．４及び２．６で２時間の処理によりＩＥＸ－ＨＰＬＣにおけるメインピークのインタクトな形態に変換することができるコンホメーション変異体であるということを裏付けた。
低ｐＨ調整手順
最後に、方法の次の精製工程に及ぼす影響を検討するためにｐＨを適合させる手順を調べた。実際に、低ｐＨ処理の後に１Ｍ酢酸ナトリウムを用いてｐＨをｐＨ５．５に達するまで増加させることにより、サンプルの導電率は有意に上昇した。次いでサンプルを、次のクロマトグラフィー工程に適した導電率（≦６．０ｍＳ／ｃｍ）まで水で高度に希釈しなければならなかった。これはロード体積及び結果として工程所要時間有意に増大させた。
最後に、方法の次の精製工程に及ぼす影響を検討するためにｐＨを適合させる手順を調べた。実際に、低ｐＨ処理の後に１Ｍ酢酸ナトリウムを用いてｐＨをｐＨ５．５に達するまで増加させることにより、サンプルの導電率は有意に上昇した。次いでサンプルを、次のクロマトグラフィー工程に適した導電率（≦６．０ｍＳ／ｃｍ）まで水で高度に希釈しなければならなかった。これはロード体積及び結果として工程所要時間有意に増大させた。
低ｐＨ処理後のｐＨ調整のための異なるアプローチを、２つの独立して実験で行った（表２２）。実験１において、捕獲溶出液を、１Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ９を用いてすぐにｐＨ５．５及び導電率≦６．０ｍＳ／ｃｍに調整するか（対照１）、又は捕獲溶出液を最初に１Ｍ ＨＣｌを用いてｐＨ２．４に２時間調整し、次いで１Ｍ酢酸ナトリウムでｐＨ５．５に調整し、そしてＭｉｌｌｉＱ水で一定導電率（≦６．０ｍＳ／ｃｍ）に達するまで希釈した。
実験２において、捕獲溶出液を、すぐに１Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ９を用いてｐＨ５．５及び電導度≦６．０ｍＳ／ｃｍに調整するか（対照２）、又は捕獲溶出液を最初に１Ｍ ＨＣｌを用いてｐＨ２．６に２時間調整し、次いで（ｉ）所定の体積の１Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５．５を加えて約５０ｍＭ酢酸ナトリウムに到達させること、（ｉｉ）０．１Ｍ ＮａＯＨを用いてｐＨ５．５に調整すること、及び（ｉｉｉ）必要な場合、水を用いて導電率≦６．０ｍＳ／ｃｍに調整することにより、ｐＨ５．５及び電導度≦６．０ｍＳ／ｃｍに調整した。
低ｐＨ処理後にｐＨをｐＨ５．５に増加させるためにアプローチ（表２１及び表２２）とは独立して、ＩＥＸ－ＨＰＬＣ ポストピーク１の％の同様の減少がＩＥＸ－ＨＰＬＣにおいて観察された。驚くべきことに、以前の化合物Ｂの結果と比較して、新しいｐＨ調整アプローチ（１Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５．５及び０．１Ｍ ＮａＯＨの混合）を用いてＳＥ－ＨＰＬＣにおいてＨＭＷ種の増加はなかった（表２２及び図４５）。さらに、ＳＥ－ＨＰＬＣメインピークが細くなったことは、ｐＨ２．６での低ｐＨ処理そして新しいｐＨ調整アプローチの後でもなお観察された（図４５）。最後に、希釈倍率（ｐＨ５．５に調整された溶出液の体積／捕獲溶出液の体積）は、新しいｐＨ調整アプローチでは有意に低く（表２２）、従って次の精製工程で処理されるべき体積を減少させることにより工程所要時間全体を改善した。
６．１０ 実施例１０：低ｐＨ処理の化合物Ｂに対する影響
初期特徴づけは、ＩＥＸ－ＨＰＬＣポストピーク１（すなわち、緻密な変異体）を濃縮したフラクションについて効力の低下を示し、そして低ｐＨ処理は化合物Ｂの緻密な変異体をより活性なインタクトな生成物へと変換するので、化合物Ｂのコンホメーション変異体に対する低ｐＨ処理の影響を、効力が回復するかどうかを評価するために以下において調べた。表２３に示されるラン条件を用いてＣＥＸ樹脂を使用したグラジエントを実行した。クロマトグラムを図４６に示す。
初期特徴づけは、ＩＥＸ－ＨＰＬＣポストピーク１（すなわち、緻密な変異体）を濃縮したフラクションについて効力の低下を示し、そして低ｐＨ処理は化合物Ｂの緻密な変異体をより活性なインタクトな生成物へと変換するので、化合物Ｂのコンホメーション変異体に対する低ｐＨ処理の影響を、効力が回復するかどうかを評価するために以下において調べた。表２３に示されるラン条件を用いてＣＥＸ樹脂を使用したグラジエントを実行した。クロマトグラムを図４６に示す。
ＣＥＸクロマトグラムは、緻密な変異体を含有する予測されたメインピークショルダーを示した。フラクション１０～１４（図４６）のプールを、低ｐＨ処理をせず、又はｐＨ２．５での低ｐＨ処理の後にＩＥＸ－ＨＰＬＣ分析（表Ｃ条件に示される条件；ＩＥＸ－ＨＰＬＣプロトコルＩＩ）に出した。ＩＥＸ－ＨＰＬＣ結果の要旨を表２４に示す。
ＩＥＸ－ＨＰＬＣポストピーク１が１９．５％から８．０％に減少したことにより証明されるように、低ｐＨ処理は、ＩＥＸ－ＨＰＬＣポストピーク１の緻密変異体をメインピークのインタクトな生成物に変換した。低ｐＨ処理されたサンプルを効力分析に出し、そして以前に得られた結果と比較した（表２５）。低ｐＨ処理は、緻密な変異体を活性な生成物に変換することにより、効力を、特にＴＮＦαに対して回復した。従って、低ｐＨ処理は化合物Ｂの緻密変異体を活性なインタクト生成物へと変換する手段である。
６．１１ 実施例１１：化合物Ｂのより低い効力の緻密変異体の除去のためのＨＩＣの使用
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）により化合物Ａの緻密変異体を除去／濃縮することに成功したので、ＨＩＣを、化合物Ｂの緻密変異体の除去についても試験した。Ｃａｐｔｏ Ｂｕｔｙｌ ＩｍｐＲｅｓ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用したグラジエントを、表２６に示されるラン条件を用いて実行した。クロマトグラムを図４７に示す。ＨＩＣロード（適切なローディング条件で交換されたポリッシング溶出液緩衝液）及び溶出フラクション１４／１９／２０／２４／２８を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分析した（図４８）。フラクション１４及びフラクション１８～２６をＩＥＸ－ＨＰＬＣにより分析した（表２７）。
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）により化合物Ａの緻密変異体を除去／濃縮することに成功したので、ＨＩＣを、化合物Ｂの緻密変異体の除去についても試験した。Ｃａｐｔｏ Ｂｕｔｙｌ ＩｍｐＲｅｓ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用したグラジエントを、表２６に示されるラン条件を用いて実行した。クロマトグラムを図４７に示す。ＨＩＣロード（適切なローディング条件で交換されたポリッシング溶出液緩衝液）及び溶出フラクション１４／１９／２０／２４／２８を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分析した（図４８）。フラクション１４及びフラクション１８～２６をＩＥＸ－ＨＰＬＣにより分析した（表２７）。
クロマトグラフィーＨＩＣプロフィール（図４７）で観察されるように、このグラジエントは２つの分離したピークを生じた。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析（図４８）は、様々なフラクションのメインバンドが、緻密な変異体について予測されたように、同様の分子量を有していた。興味深いことに、ＩＥＸ－ＨＰＬＣ分析（表２７）は、ＨＩＣプロフィールの第１のピーク（フラクション１４）のみが活性生成物及び活性のより低い緻密な変異体を含有することを明らかにし、それぞれ「インタクトな生成物」４７．９％及び「緻密な変異体」５２．１％であった。さらに、ＩＥＸ－ＨＰＬＣ分析（表２７）は、ＨＩＣプロフィールの第２のピーク（フラクション１９～２６）中に緻密な変異体は存在していないということを示した。従って、化合物Ｂのコンホメーション変異体を、疎水性相互作用クロマトグラフィーにより完全に除去し、かつ／又は濃縮することができた。
６．１２ 実施例１２：捕獲カラムでの負荷率を増加させることによる、より低い効力の緻密変異体の除去／減少。
化合物Ｂについて捕獲工程を最適化するために、負荷率（生成物ｍｇ／樹脂ｍｌ）、ロード流量（ｃｍ／時）、溶出緩衝液のｐＨ、ロードｐＨ及び精製プロセスの洗浄液のような様々なパラメーター（すなわち、因子）を、ＪＭＰ （ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）ソフトウェアからの決定的スクリーニング計画（Ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｄｅｓｉｇｎ）（ＤＳＤ）を使用した実験設計（ＤＯＥ）アプローチを使用して評価した。これらの因子の応答に対する影響を評価するために、様々な出力（すなわち、応答）を測定した。応答としては、限定されないが、捕獲工程の間にＩＥＸ－ＨＰＬＣポストピーク１を減少させる／除去することが可能か否かを評価するためにＩＥＸ－ＨＰＬＣ分析が挙げられる。ＤＯＥ結果を、ＤＳＤアプローチに従ってＪＭＰソフトウェアにより分析した。興味深いことに、試験した様々な因子のうち、負荷率のみがＩＥＸ－ＨＰＬＣポストピーク１に対して影響を有していた（図４９）。驚くべきことに、緻密な変異体のＩＥＸ－ＨＰＬＣポストピーク１を、負荷率を増加させることにより有意に除去／減少させることができた（表２８）。従って、ＩＳＶＤ生成物を用いた捕獲カラムでの負荷率の増加は、望ましくないより低い効力の緻密変異体を減少させる／除去する手段として使用され得る。
６．１３ 実施例１３：化合物Ｂの低ｐＨ処理のスケールアップ（１０Ｌ及び１００Ｌ）
上の実施例に基づいて、化合物Ｂの低ｐＨインキュベーションのために選択された条件は、２．５の目標ｐＨ、室温で２時間であった。捕獲溶出液のｐＨを１Ｍ ＨＣｌを用いて低下させ、次いで２時間後に、（ｉ）約５０ｍＭ酢酸ナトリウムに達するように所定の体積の１Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５．５を加えること、（ｉｉ）０．１Ｍ ＮａＯＨを用いてｐＨ５．５に調整すること、及び（ｉｉｉ）必要な場合、水を用いて導電率≦６．０ｍＳ／ｃｍに調整することにより、ｐＨ５．５及び導電率≦６．０ｍＳ／ｃｍに調整した。次いで、化合物Ｂの製造プロセスを、さらなる精製のために１０Ｌ及び１００Ｌの発酵スケールにスケールアップした。分析方法ＳＥ－ＨＰＬＣ、ＩＥＸ－ＨＰＬＣ、ＣＧＥを使用して、低ｐＨ処理前の捕獲溶出液（すなわち、捕獲溶出液）及び低ｐＨ処理後に上記のように５．５にｐＨ調整し、そしてろ過した捕獲溶出液（すなわち、捕獲ろ液）の生成物品質を分析した。２サイクルの捕獲工程を各スケールについて実行した。様々なスケールの結果を表２９に示す。
上の実施例に基づいて、化合物Ｂの低ｐＨインキュベーションのために選択された条件は、２．５の目標ｐＨ、室温で２時間であった。捕獲溶出液のｐＨを１Ｍ ＨＣｌを用いて低下させ、次いで２時間後に、（ｉ）約５０ｍＭ酢酸ナトリウムに達するように所定の体積の１Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５．５を加えること、（ｉｉ）０．１Ｍ ＮａＯＨを用いてｐＨ５．５に調整すること、及び（ｉｉｉ）必要な場合、水を用いて導電率≦６．０ｍＳ／ｃｍに調整することにより、ｐＨ５．５及び導電率≦６．０ｍＳ／ｃｍに調整した。次いで、化合物Ｂの製造プロセスを、さらなる精製のために１０Ｌ及び１００Ｌの発酵スケールにスケールアップした。分析方法ＳＥ－ＨＰＬＣ、ＩＥＸ－ＨＰＬＣ、ＣＧＥを使用して、低ｐＨ処理前の捕獲溶出液（すなわち、捕獲溶出液）及び低ｐＨ処理後に上記のように５．５にｐＨ調整し、そしてろ過した捕獲溶出液（すなわち、捕獲ろ液）の生成物品質を分析した。２サイクルの捕獲工程を各スケールについて実行した。様々なスケールの結果を表２９に示す。
最初に、発酵及び精製スケールとは関係なく、低ｐＨ処理及びろ過工程は、ＣＧＥ分析及びＣＧＥプロフィールでのメインピーク％に関して生成物品質に影響を有しておらず、それらの結果は方法変動性の範囲内であった（表２９）。驚くべきことに、ＨＭＷ種％の減少が捕獲ろ液及び捕獲溶出液を比較した場合に両方のスケールにおいて観察され、従って低ｐＨ処理及び／又はろ過工程に起因し得る（表２９）。さらに、ＳＥ－ＨＰＬＣ結果（図５０及び図５１）は、低ｐＨ処理がメインピークの形状を影響を及ぼすことを裏付けた。メインピークは低ｐＨ処理後に（例えば、捕獲ろ液中）「鋭く」なり、これはＩＥＸ－ＨＰＬＣ結果及び化合物Ａ及びについて得られた結果と相関していた。最後に、より小さいスケールで以前に観察されたように、メインピーク純度％の有意な増加に加えてＩＥＸ－ＨＰＬＣポストピーク１（緻密な変異体）％の減少も、捕獲ろ液を捕獲溶出液と比較した場合に低ｐＨ処理後にＩＥＸ－ＨＰＬＣで観察された（表２９）。
総合すると、これらの結果は、低ｐＨ処理が拡張可能なプロセスであり、かつ多価ＩＳＶＤ生成物構築物のより低い効力の望ましくない緻密変異体の、効力のあるインタクトな生成物への変換において有効であるということを示した
６．１４ 実施例１４：化合物Ｃの緻密変異体の同定及び初期特徴づけ
緻密変異体が他の多価ＩＳＶＤ構築物についても出現することを確認するために、化合物Ｃについてさらなる調査を行った。
緻密変異体が他の多価ＩＳＶＤ構築物についても出現することを確認するために、化合物Ｃについてさらなる調査を行った。
化合物Ｃ（配列番号６９）は、２つの異なる標的に結合する重鎖ラマ抗体の３つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含む多価ＩＳＶＤ構築物である。ＩＳＶＤビルディングブロックは、ヘッド－トゥ－テールで（Ｎ末端からＣ末端へ）Ｇ／Ｓリンカーを用いて以下の形式で融合されており：ＴＮＦα結合ＩＳＶＤ － ９ＧＳリンカー－ ヒト血清アルブミン結合ＩＳＶＤ － ９ＧＳリンカー － ＴＮＦα結合ＩＳＶＤ、そして以下の配列を有する：
ピキア・パストリスにおける化合物Ｃの発現及びタンジェンシャルフローろ過による化合物の収穫後に、Ａｍｓｐｈｅｒｅ Ａ３樹脂を使用した捕獲クロマトグラフィーを使用して、他の不純物から化合物Ｃを単離した。
カラムを最初にＰＢＳ緩衝液ｐＨ７．３を用いて平衡化し、そして化合物Ｃを含有する清澄化した無細胞収穫材料をロードした。化合物ＣはＡｍｓｐｈｅｒｅ Ａ３樹脂に結合し、そして不純物はカラムをフロースルーした。続いて、ロードされた樹脂を平衡化工程と同じＰＢＳ緩衝液を用いて洗浄した。化合物Ｃを低ｐＨグリシン緩衝液を用いてカラムから溶出させた。低ｐＨグリシン溶出緩衝液は、１００ｍＭグリシンｐＨ３．０を含有していた。最後に、樹脂を１００ｍＭ ＮａＯＨで浄化した後、平衡化と同じＰＢＳ緩衝液中で貯蔵した。全ての緩衝液は１８３ｃｍ／時で流された。
捕獲クロマトグラフィー後に、クロマトグラフィーカラムから溶出する生成物のｐＨはｐＨ３．５であった。その後、化合物Ｃを低ｐＨインキュベートした。捕獲溶出液のｐＨを１Ｍ ＨＣｌを用いてｐＨ２．５又はｐＨ３．０に低下させた。低ｐＨで２時間及び４時間のインキュベーション後に、サンプルを１Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ６．０を用いてｐＨ５．５に調整した。１Ｍ ＨＣｌを用いて化合物Ｃを目標低ｐＨ（すなわちｐＨ２．５又は３．０）に低下させ、そしてすぐ１Ｍ酢酸ナトリウムを用いてｐＨ５．５に調整することによりＴ０を生成した（Ｔ０）。
化合物Ｃタンパク質の品質をＳＥ－ＨＰＬＣにより評価した。化合物Ｃについても、明確なポストピークがＳＥ－ＨＰＬＣにおいて観察された（図５３Ａ及びＢ）。
生成物品質に対するｐＨの影響を、ＳＥ－ＨＰＬＣにより時間の関数で分析した（表３１及び図５４を参照のこと）。
ＳＥ－ＨＰＬＣ結果は、サンプル中のコンホメーション変異体の存在に対する低ｐＨ処理のポジティブな影響を示す。Ｔ０サンプル中のコンホメーション変異体のレベルは、試験した２つのサンプルにおいて同様であり、すなわち、ｐＨ２．５サンプルについて緻密変異体６．７％及びｐＨ３．０サンプルについてコンホメーション変異体６．８％であった。これら２つの値は、初期サンプル、すなわち低ｐＨで処理されていない捕獲溶出液と同様であり、この場合、コンホメーション変異体のレベルは６．９％であった。低ｐＨでのインキュベーションの２時間後に、コンホメーション変異体の減少が試験した全てのｐＨについて観察された。この減少は、さらに低ｐＨでのインキュベーション４時間までの間継続した。
この実施例において得られた全ての結果は、コンホメーション変異体のパーセンテージに対する低ｐＨのポジティブな影響を示す。
６．１５ 実施例１５：ＣＨＯ細胞におけるＩＳＶＤ産生の際の緻密変異体の不在
化合物Ｃ（配列番号６９）のＣＨＯ細胞における発現の後、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｘｔｒａ樹脂を使用した捕獲クロマトグラフィーを使用して、他の不純物から化合物Ｃを単離した。
化合物Ｃ（配列番号６９）のＣＨＯ細胞における発現の後、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｘｔｒａ樹脂を使用した捕獲クロマトグラフィーを使用して、他の不純物から化合物Ｃを単離した。
カラムを最初にＴｒｉｓ緩衝液を用いて平衡化し、そして目的の化合物を含有する清澄化無細胞収穫材料をロードした。平衡化緩衝液は、ｐＨ７．５で５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含有していた。化合物ＣはＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｘｔｒａ樹脂に結合し、そして不純物はカラムをフロースルーする。続いて、ロードされた樹脂を平衡化工程と同じＴｒｉｓ緩衝液で洗浄し、続いてＴｒｉｓ洗浄緩衝液で２回めの洗浄を行った。洗浄緩衝液はｐＨ７．５で１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ ＮａＣｌを含有していた。化合物Ｃを、低ｐＨグリシン緩衝液を用いてカラムから溶出した。低ｐＨグリシン溶出緩衝液は、ｐＨ３．０で５０ｍＭグリシンを含有していた。最後に、樹脂を１００ｍＭグリシン緩衝液ｐＨ２．５で再生し、そして５０ｍＭ ＮａＯＨ、１Ｍ ＮａＣｌで浄化した後、Ｅｔ－ＯＨ中で貯蔵した。全ての緩衝液を１９１ｃｍ／時で流した。
捕獲クロマトグラフィー後に、クロマトグラフィーカラムから溶出する生成物のｐＨは３．４であった。その後、化合物Ｃを低ｐＨインキュベートした。捕獲溶出液のｐＨを、１Ｍ ＨＣｌを用いてｐＨ２．５又はｐＨ３．０に低下させた。低ｐＨでの２時間のインキュベーション後に、サンプルを１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．０を用いてｐＨ５．５に低下させた。すぐにｐＨ５．５に調整された捕獲溶出液はこの実験における対照サンプルであった。
化合物Ｃタンパク質の品質をＳＥ－ＨＰＬＣにより評価した。化合物ＣがＣＨＯ細胞において産生された場合、ＳＥ－ＨＰＬＣにおいてポストピークは観察されなかった（図５５）。
ＳＥ－ＨＰＬＣ結果は、サンプル中にコンホメーション変異体が存在していないことを示した。
６．１６ 実施例１６：化合物Ｄのコンホメーション変異体の同定及び初期特徴づけ
化合物Ｄ（配列番号７０）は、３つの異なる標的に結合する重鎖ラマ抗体の４つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含む多価ＩＳＶＤ構築物である。ＩＳＶＤビルディングブロックは、ヘッド－トゥ－テールで（Ｎ末端からＣ末端に）Ｇ／Ｓリンカーを用いて以下の形式で融合され：ＴＮＦα結合ＩＳＶＤ － ９ＧＳリンカー － ＩＬ－６結合ＩＳＶＤ － ９ＧＳリンカー － ヒト血清アルブミン結合ＩＳＶＤ － ９ＧＳリンカー - ＩＬ－６結合ＩＳＶＤ、そして以下の配列を有する：
化合物Ｄ（配列番号７０）は、３つの異なる標的に結合する重鎖ラマ抗体の４つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含む多価ＩＳＶＤ構築物である。ＩＳＶＤビルディングブロックは、ヘッド－トゥ－テールで（Ｎ末端からＣ末端に）Ｇ／Ｓリンカーを用いて以下の形式で融合され：ＴＮＦα結合ＩＳＶＤ － ９ＧＳリンカー － ＩＬ－６結合ＩＳＶＤ － ９ＧＳリンカー － ヒト血清アルブミン結合ＩＳＶＤ － ９ＧＳリンカー - ＩＬ－６結合ＩＳＶＤ、そして以下の配列を有する：
ピキアにおける化合物Ｄの発現及び収穫後に、Ａｍｓｐｈｅｒｅ Ａ３樹脂を使用する捕獲クロマトグラフィーを使用して他の不純物から化合物Ｄを単離した。
カラムを最初にＰＢＳ緩衝液ｐＨ７．５を用いて平衡化し、そして目的の化合物を含有する清澄化無細胞収穫材料をロードした。化合物ＤはＡｍｓｐｈｅｒｅ Ａ３樹脂に結合し、そして不純物はカラムをフロースルーする。続いて、ロードされた樹脂を平衡化工程と同じＰＢＳ緩衝液で洗浄した。化合物Ｄを、低ｐＨグリシン緩衝液を用いてカラムから溶出した。低ｐＨグリシン溶出緩衝液は、ｐＨ３．０で１００ｍＭグリシンを含有していた。最後に、樹脂を１００ｍＭ ＮａＯＨで浄化した後、平衡化と同じＰＢＳ緩衝液中で貯蔵した。全ての緩衝液を２３３ｃｍ／時で流した。
化合物Ｄを低ｐＨインキュベートした。捕獲溶出液のｐＨを、１Ｍ ＨＣｌを用いてｐＨ２．５、ｐＨ２．７、ｐＨ２．９、ｐＨ３．１、ｐＨ３．２、ｐＨ３．４及びｐＨ３．６に低下させた。低ｐＨでの２時間及び４時間のインキュベーション後に、サンプルを、０．１Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５．６を用いてｐＨ５．５に調整した。１Ｍ ＨＣｌを用いて化合物Ｄを目標低ｐＨ（すなわち、ｐＨ２．３、ｐＨ２．７、ｐＨ２．９、ｐＨ３．１、ｐＨ３．２、ｐＨ３．４及びｐＨ３．６）に低下させ、そしてすぐに１Ｍ酢酸ナトリウムを用いてｐＨ５．５に調整することによりＴ０を生成した（Ｔ０）。
時間の関数での生成物の品質に対するｐＨの影響をＳＥ－ＨＰＬＣにより分析した（表３３及び図５６）。
ＳＥ－ＨＰＬＣ結果は、サンプル中のコンホメーション変異体の存在に対する低ｐＨ処理のポジティブな影響を示す。Ｔ０サンプル中のコンホメーション変異体のレベルは、試験した全てのサンプルにおいて同様であった。Ｔ０、ｐＨ２．９、３．１、３．２、３．４及びｐＨ３．６での対照サンプル中のコンホメーション変異体のレベルは約８．７％であった。より低いｐＨ、すなわち、ｐＨ２．５、ｐＨ２．７では、開始時の量は、ｐＨのポジティブな影響のためにより低かった（ｐＨ７．６及びｐＨ８．２）。
低ｐＨでの２時間のインキュベーション後に、コンホメーション変異体のレベルは低下した。コンホメーション変異体に対する低ｐＨのポジティブな効果は、より低いｐＨで増加した。
低ｐＨでの４時間のインキュベーションの後、コンホメーション変異体のレベルはさらに低下した。最も良好な減少はｐＨ２．３で、ｐＨ３．１まで得られた。
この実施例において得られた全ての結果は、コンホメーション変異体に対する低ｐＨの経時的なポジティブな影響を示す。
６．１７ 実施例１７：化合物Ｅのコンホメーション変異体の同定及び初期特徴づけ
化合物Ｅ（配列番号７１）は、３つの異なる標的に結合する重鎖ラマ抗体の４つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含む多価ＩＳＶＤ構築物である。ＩＳＶＤビルディングブロックは、ヘッド－トゥ－テールで（Ｎ末端からＣ末端へ）Ｇ／Ｓリンカーを用いて以下の形式で融合されており：ＴＮＦα結合ＩＳＶＤ － ９ＧＳリンカー － ＩＬ－６結合ＩＳＶＤ － ９ＧＳリンカー － ヒト血清アルブミン結合ＩＳＶＤ － ９ＧＳリンカー － ＩＬ－６結合ＩＳＶＤ、そして以下の配列を有する：
化合物Ｅ（配列番号７１）は、３つの異なる標的に結合する重鎖ラマ抗体の４つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含む多価ＩＳＶＤ構築物である。ＩＳＶＤビルディングブロックは、ヘッド－トゥ－テールで（Ｎ末端からＣ末端へ）Ｇ／Ｓリンカーを用いて以下の形式で融合されており：ＴＮＦα結合ＩＳＶＤ － ９ＧＳリンカー － ＩＬ－６結合ＩＳＶＤ － ９ＧＳリンカー － ヒト血清アルブミン結合ＩＳＶＤ － ９ＧＳリンカー － ＩＬ－６結合ＩＳＶＤ、そして以下の配列を有する：
ピキアにおける化合物Ｅの発現及び収穫の後に、Ａｍｓｐｈｅｒｅ Ａ３樹脂を使用した捕獲クロマトグラフィーを使用して、他の不純物から化合物Ｅを単離した。
カラムを最初にＰＢＳ緩衝液ｐＨ７．５で平衡化し、そして目的の化合物を含有する清澄化した無細胞収穫材料をロードした。化合物ＥはＡｍｓｐｈｅｒｅ Ａ３樹脂に結合し、そして不純物はカラムをフロースルーした。続いて、ロードされた樹脂を、平衡化工程と同じＰＢＳ緩衝液で洗浄した。化合物Ｅを低ｐＨグリシン緩衝液を用いてカラムから溶出した。低ｐＨグリシン溶出緩衝液は１００ｍＭグリシンをｐＨ３．０で含有していた。最後に、樹脂を１００ｍＭ ＮａＯＨで浄化した後、平衡化と同じＰＢＳ緩衝液中で貯蔵した。全ての緩衝液を２３３ｃｍ／時で流した。
化合物Ｅを低ｐＨインキュベートした。捕獲溶出液のｐＨを、１Ｍ ＨＣｌを用いてｐＨ２．５、ｐＨ２．７、ｐＨ２．９、ｐＨ３．１、ｐＨ３．２、ｐＨ３．４及びｐＨ３．６に低下させた。低ｐＨで２時間のインキュベーション後に、サンプルを、０．１Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５．６を用いてｐＨ５．５に調整した。化合物Ｅを１Ｍ ＨＣｌを用いて目標低ｐＨ（すなわち、ｐＨ２．５、ｐＨ２．７、ｐＨ２．９、ｐＨ３．１、ｐＨ３．２、ｐＨ３．４及びｐＨ３．６）に低下させ、そしてすぐに１Ｍ酢酸ナトリウムを用いてｐＨ５．５に調整することによりＴ０を生成した（Ｔ０）。
時間の関数での生成物品質に対するｐＨの影響をＳＥ－ＨＰＬＣにより分析した（表３５及び図５７）。
ＳＥ－ＨＰＬＣの結果は、サンプル中のコンホメーション変異体の存在に対する低ｐＨ処理のポジティブな影響を示す。Ｔ０サンプル中のコンホメーション変異体のレベルは、試験した全てのサンプルにおいて同様であった。Ｔ０、ｐＨ２．９、３．１、３．２、３．４及びｐＨ３．６での対照サンプル中のコンホメーション変異体のレベルは約７．５％（又はそれ以上）であった。より低いｐＨ、すなわち、ｐＨ２．５、ｐＨ２．７では、ｐＨのポジティブな影響に起因して開始量はより低かった（ｐＨ７．２）。
低ｐＨで２時間のインキュベーション後に、コンホメーション変異体のレベルは低下した。コンホメーション変異体に対する低ｐＨのポジティブな効果は、より低いｐＨで増加した。この実施例において得られた全ての結果は、コンホメーション変異体に対する低ｐＨの経時的なポジティブな影響を示す。最も良好な減少はｐＨ２．５でｐＨ２．９まで得られた
Claims (69)
- 少なくとも３つ又は少なくとも４つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含むか又はそれらからなるポリペプチドを、該ポリペプチド及びそのコンホメーション変異体を含む組成物から単離又は精製する方法であって、該方法は：
ａ） コンホメーション変異体を該ポリペプチドに変換する条件を適用すること；
ｂ） コンホメーション変異体を除去すること；又は
ｃ） （ａ）及び（ｂ）の組み合わせ
を含む、上記方法。 - 単離又は精製しようとするポリペプチドは、宿主における発現により得ることができる、請求項１に記載の方法。
- 単離又は精製しようとするポリペプチドは、ＣＨＯ細胞ではない宿主における発現により得ることができる、請求項２に記載の方法。
- 単離又は精製しようとするポリペプチドは、下等真核生物宿主である宿主における発現により得ることができる、請求項２又は３に記載の方法。
- 下等真核生物宿主は、ピキア、ハンゼヌラ、サッカロミセス、クリベロミセス、カンジダ、トルロプシス、トルラスポラ、分裂酵母、シテロミセス、パキソレン、デバロミセス、メトスクニコウィア、ロドスポリジウム、ロイコスポリジウム、ボトリオアスクス、スポリジオボルス、エンドミコプシスのような酵母を含む、請求項４に記載の方法。
- 酵母はピキア・パストリスのようなピキアである、請求項５に記載の方法。
- ポリペプチドは、少なくとも４つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含むか又はそれらからなる、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
- コンホメーション変異体は、上記ポリペプチドと比較して、より緻密な形態を特徴とする、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
- コンホメーション変異体は、上記ポリペプチドと比較して減少した流体力学的体積を有する、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
- コンホメーション変異体は、上記ポリペプチドと比較して、ＳＥ－ＨＰＬＣにおける増加した保持時間を特徴とする、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
- コンホメーション変異体は、上記ポリペプチドと比較して、ＩＥＸ－ＨＰＬＣにおける変化した保持時間を特徴とする、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
- コンホメーション変異体を上記ポリペプチドに変換する条件は：
ｉ） 単離もしくは精製方法の工程において低ｐＨ処理を適用すること、［場合により、ここで低ｐＨ処理は、組成物のｐＨを約ｐＨ３．２もしくはそれ以下に、又は約ｐＨ３．０もしくはそれ以下に低下させることを含む］；
ｉｉ） 単離もしくは精製方法の工程においてカオトロピック剤を適用すること、［場合により、ここでカオトロピック剤は、塩化グアニジニウム（ＧｕＨＣｌ）である］；
ｉｉｉ） 単離もしくは精製方法の工程において熱ストレスを加えること、［場合により、コンホメーション変異体を約４０℃～約６０℃でインキュベートすることを含む］；又は
ｉｖ） ｉ）～ｉｉｉ）のいずれかの組み合わせ
から選択される、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。 - ポリペプチドは、少なくとも４つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含むか又はそれらからなり、そしてここで低ｐＨ処理は、組成物のｐＨを約ｐＨ３．０又はそれ以下に低下させることを含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
- ｐＨを、約ｐＨ３．２と約２．１との間に、約ｐＨ３．０と約２．１との間に、約ｐＨ２．９と約ｐＨ２．１との間に、約ｐＨ２．７と約ｐＨ２．１との間に、又は約ｐＨ２．６と約ｐＨ２．３との間に低下させる、請求項１２又は１３に記載の方法。
- 低ｐＨ処理は、少なくとも約０．５時間、少なくとも約１時間、少なくとも約２時間、又は少なくとも約４時間適用される、請求項１２～１４のいずれか１項に記載の方法。
- ｐＨを、約ｐＨ３．２と約ｐＨ２．１との間に、少なくとも約０．５時間、例えば少なくとも約１．０時間低下させる、請求項１２～１５のいずれか１項に記載の方法。
- ｐＨを、約ｐＨ３．０と約ｐＨ２．１との間に少なくとも約０．５時間、例えば少なくとも約１．０時間低下させる、請求項１２～１６のいずれか１項に記載の方法。
- ｐＨを、約ｐＨ２．９と約ｐＨ２．１との間に少なくとも約０．５時間、例えば少なくとも約１．０時間低下させる、請求項１２～１７のいずれか１項に記載の方法。
- ｐＨを、約ｐＨ２．７と約ｐＨ２．１との間に少なくとも約０．５時間、例えば少なくとも約１．０時間低下させる、請求項１２～１８のいずれか１項に記載の方法。
- 低ｐＨ処理は、クロマトグラフィー技術に基づく精製工程の前に、クロマトグラフィー技術に基づく精製工程の間に、又はクロマトグラフィー技術に基づく精製工程の後に適用される、請求項１２～１９のいずれか１項に記載の方法。
- 低ｐＨ処理は、クロマトグラフィー技術の固定相に組成物をアプライする前に、又はクロマトグラフィー技術の固定相から組成物を溶出した後に適用される、請求項２０に記載の方法。
- カオトロピック剤は、少なくとも約１Ｍ又は少なくとも約２Ｍの最終濃度の塩化グアニジニウム（ＧｕＨＣｌ）である、請求項１２～２１のいずれか１項に記載の方法。
- ＧｕＨＣｌは、少なくとも０．５時間、又は少なくとも１時間適用される、請求項１２～２２のいずれか１項に記載の方法。
- 熱ストレスは少なくとも約１時間加えられる、請求項１２～２３のいずれか１項に記載の方法。
- コンホメーション変異体は、１つ又はそれ以上のクロマトグラフィー技術により除去され、場合により、ここでコンホメーション変異体は、１つ又はそれ以上のクロマトグラフィー技術により除去される前に、ＳＥ－ＨＰＬＣ及びＩＥＸ－ＨＰＬＣのような分析用クロマトグラフィー技術により同定されている、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
- クロマトグラフィー技術は、流体力学的体積、表面電荷又は表面疎水性に基づくクロマトグラフィー技術である、請求項２５に記載の方法。
- クロマトグラフィー技術は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）、例えば、カチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）、ミックスモードクロマトグラフィー（ＭＭＣ）、及び疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）のいずれかから選択される、請求項２６に記載の方法。
- ＨＩＣはＨＩＣカラム樹脂に基づく、請求項２７に記載の方法。
- ＨＩＣはＨＩＣメンブレンに基づく、請求項２７に記載の方法。
- ポリペプチドの単離又は精製は、組成物をクロマトグラフィーカラムにアプライすることを含み、ここで組成物は、樹脂１ｍｌあたりタンパク質少なくとも２０ｍｇ、樹脂１ｍｌあたりタンパク質少なくとも３０ｍｇ、樹脂１ｍｌあたりタンパク質少なくとも４５ｍｇの負荷率を使用してカラムにアプライされ、場合により、ここでクロマトグラフィーカラムはプロテインＡカラムである、請求項１～２９のいずれか１項に記載の方法。
- コンホメーション変異体を上記ポリペプチドに変換する１つ又はそれ以上の条件は、単独で、又はコンホメーション変異体を除去する１つもしくはそれ以上の技術と組み合わせて適用される、請求項１～３０のいずれか１項に記載の方法。
- 少なくとも３つ又は少なくとも４つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含むか又はそれらからなるポリペプチドを単離又は精製する方法であって、該方法は、以下：
ｉ） 単離もしくは精製方法の工程において、該ポリペプチドを含む組成物に低ｐＨ処理を適用すること、［場合により、ここで低ｐＨ処理は、組成物のｐＨを約ｐＨ３．２もしくはそれ以下に、又は約ｐＨ３．０もしくはそれ以下に低下させることを含む］；
ｉｉ） 単離もしくは精製方法の工程において、該ポリペプチドを含む組成物にカオトロピック剤を適用すること、［場合により、ここでカオトロピック剤はＧｕＨＣｌである］；
ｉｉｉ） 単離もしくは精製方法の工程において、該ポリペプチドを含む組成物に熱ストレスを加えること、［場合により、該組成物を約４０℃～約６０℃でインキュベートすることを含む］；
ｉｖ） 該ポリペプチドを含む組成物を、少なくとも２０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも３０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも４５ｍｇ／ｍｌの負荷率を使用してクロマトグラフィーカラムにアプライすること、［場合により、ここでクロマトグラフィーカラムはプロテインＡカラムである］；又は
ｖ） ｉ）～ｉｖ）のいずれかの組み合わせ
の１つ又はそれ以上を含む、上記方法。 - 単離又は精製しようとするポリペプチドは、宿主における発現により得ることができる、請求項３２に記載の方法。
- 単離又は精製しようとするポリペプチドは、ＣＨＯ細胞ではない宿主における発現により得ることができる、請求項３３に記載の方法。
- 単離又は精製しようとするポリペプチドは、下等真核生物宿主である宿主における発現により得ることができる、請求項３３又は３４に記載の方法。
- 下等真核生物宿主は、ピキア、ハンゼヌラ、サッカロミセス、クリベロミセス、カンジダ、トルロプシス、トルラスポラ、分裂酵母、シテロミセス、パキソレン、デバロミセス、メトスクニコウィア、ロドスポリジウム、ロイコスポリジウム、ボトリオアスクス、スポリジオボルス、エンドミコプシスのような酵母を含む、請求項３５に記載の方法。
- 酵母はピキア・パストリスのようなピキアである、請求項３６に記載の方法。
- ポリペプチドは、少なくとも４つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含むか又はそれらからなり、場合により、ここで低ｐＨ処理は、組成物のｐＨを約ｐＨ３．０又はそれ以下に低下させることを含む、請求項３２～３７のいずれか１項に記載の方法。
- ｐＨを、約ｐＨ３．２と約ｐＨ２．１との間に、約ｐＨ３．０と約ｐＨ２．１との間に、約ｐＨ２．９と約ｐＨ２．１との間に、約ｐＨ２．７と約ｐＨ２．１との間に、又は約ｐＨ２．６と約ｐＨ２．３との間に低下させる、請求項３２～３８のいずれか１項に記載の方法。
- 低ｐＨ処理は、少なくとも約０．５時間、少なくとも約１時間、少なくとも約２時間、又は少なくとも約４時間適用される、請求項３２～３９のいずれか１項に記載の方法。
- ｐＨを、約ｐＨ３．２と約ｐＨ２．１との間に少なくとも約０．５時間、例えば少なくとも約１．０時間低下させる、請求項３９又は４０に記載の方法。
- ｐＨを、約ｐＨ３．０と約ｐＨ２．１との間に少なくとも約０．５時間、例えば少なくとも約１．０時間低下させる、請求項３９～４１のいずれか１項に記載の方法。
- ｐＨを、約ｐＨ２．９と約ｐＨ２．１との間に少なくとも約０．５時間、例えば少なくとも約１．０時間低下させる、請求項３９～４２のいずれか１項に記載の方法。
- ｐＨを、約ｐＨ２．７と約ｐＨ２．１との間に少なくとも約０．５時間、例えば少なくとも約１．０時間低下させる、請求項３９～４３のいずれか１項に記載の方法。
- 低ｐＨ処理は、クロマトグラフィー技術に基づく精製工程の前に、クロマトグラフィー技術に基づく精製工程の間に、又はクロマトグラフィー技術に基づく精製工程の後に適用される、請求項３２～４４のいずれか１項に記載の方法。
- 低ｐＨ処理は、組成物をクロマトグラフィー技術の固定相にアプライする前に、又は組成物をクロマトグラフィー技術の固定相から溶出した後に適用される、請求項４５に記載の方法。
- カオトロピック剤は、少なくとも約１Ｍ、又は少なくとも約２Ｍの最終濃度のＧｕＨＣｌである、請求項３２～４６のいずれか１項に記載の方法。
- ＧｕＨＣｌは、少なくとも０．５時間、又は少なくとも１時間適用される、請求項３２～４７のいずれか１項に記載の方法。
- 熱ストレスは、少なくとも約１時間加えられる、請求項３２～４８のいずれか１項に記載の方法。
- 請求項１～４９のいずれか１項に記載の方法に従って精製又は単離することを含む、少なくとも３つ又は少なくとも４つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含むポリペプチドを製造する方法。
- 以下の工程：
ａ） 場合により、宿主又は宿主細胞を、該宿主又は宿主細胞が増殖するような条件下で培養する工程；
ｂ） 宿主又は宿主細胞を、該宿主又は宿主細胞が上記ポリペプチドを発現し、かつ／又は産生するような条件下で維持する工程；並びに
ｃ） 請求項１～４９のいずれか１項に記載の単離又は精製方法の１つ又はそれ上を含む、分泌されたポリペプチドを培地から単離及び／又は精製する工程
を少なくとも含む、請求項５０に記載の方法。 - 宿主はＣＨＯ細胞ではない、請求項５０又は５１に記載の方法。
- 宿主は下等真核生物宿主である、請求項５０～５２のいずれか１項に記載の方法。
- 下等真核生物宿主は、ピキア、ハンゼヌラ、サッカロミセス、クリベロミセス、カンジダ、トルロプシス、トルラスポラ、分裂酵母、シテロミセス、パキソレン、デバロミセス、メトスクニコウィア、ロドスポリジウム、ロイコスポリジウム、ボトリオアスクス、スポリジオボルス、エンドミコプシスのような酵母を含む、請求項５３に記載の方法。
- 酵母はピキア・パストリスのようなピキアである、請求項５４に記載の方法。
- 少なくとも３つ又は少なくとも４つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含むか又はそれらからなるポリペプチドを、該ポリペプチド及びそのコンホメーション変異体を含む組成物から単離又は精製するための方法であって、該方法は：
（１） ＳＥ－ＨＰＬＣ及びＩＥＸ－ＨＰＬＣのような分析用クロマトグラフィー技術によりコンホメーション変異体を同定すること；
（２） コンホメーション変異体の特異的除去を可能にするようにクロマトグラフィー条件を調整すること；並びに
（３） １つ又はそれ以上のクロマトグラフィー技術により、該ポリペプチド及びそのコンホメーション変異体を含む組成物からコンホメーション変異体を除去すること
を含む、上記方法。 - 少なくとも３つ又は少なくとも４つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含むか又はそれらからなるポリペプチドを、該ポリペプチド及びそのコンホメーション変異体を含む組成物から１つ又はそれ以上のクロマトグラフィー技術により単離又は精製することを可能にするために１つ又はそれ以上のクロマトグラフィー技術を最適化するための方法であって：
（１） ＳＥ－ＨＰＬＣ及びＩＥＸ－ＨＰＬＣのような分析用クロマトグラフィー技術によりコンホメーション変異体を同定すること；
（２） コンホメーション変異体の特異的除去を可能にするようにクロマトグラフィー条件を最適化すること
を含む、上記方法。 - 単離又は精製しようとするポリペプチドは、宿主における発現により得ることができる、請求項５６又は５７に記載の方法。
- 単離又は精製しようとするポリペプチドは、ＣＨＯ細胞ではない宿主における発現により得ることができる、請求項５８に記載の方法。
- 単離又は精製しようとするポリペプチドは、下等真核生物宿主である宿主における発現により得ることができる、請求項５８又は５９に記載の方法。
- 下等真核生物宿主は、ピキア、ハンゼヌラ、サッカロミセス、クリベロミセス、カンジダ、トルロプシス、トルラスポラ、分裂酵母、シテロミセス、パキソレン、デバロミセス、メトスクニコウィア、ロドスポリジウム、ロイコスポリジウム、ボトリオアスクス、スポリジオボルス、エンドミコプシスのような酵母を含む、請求項６０に記載の方法。
- 酵母はピキア・パストリスのようなピキアである、請求項６１に記載の方法。
- コンホメーション変異体は、請求項８～１１におけるように特徴づけられる、請求項５６～６２のいずれか１項に記載の方法。
- クロマトグラフィー技術は、流体力学的体積、表面電荷又は表面疎水性に基づくクロマトグラフィー技術である、請求項５６～６３のいずれか１項に記載の方法。
- クロマトグラフィー技術は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）、ミックスモードクロマトグラフィー（ＭＭＣ）、及び疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）のいずれかから選択される、請求項６４に記載の方法。
- イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）はカチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）である、請求項６５に記載の方法。
- ＨＩＣはＨＩＣカラム樹脂に基づく、請求項６５に記載の方法。
- ＨＩＣ樹脂は、Ｃａｐｔｏ Ｐｈｅｎｙｌ ＩｍｐＲｅｓ、Ｃａｐｔｏ Ｂｕｔｙｌ ＩｍｐＲｅｓ、Ｐｈｅｎｙｌ ＨＰ、及びＣａｐｔｏ Ｂｕｔｙｌのいずれかから選択される、請求項６７に記載の方法。
- ＨＩＣはＨＩＣメンブレンに基づく、請求項６５に記載の方法。
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