JP2023518996A - オルガネラ特異的タンパク質送達のための分子 - Google Patents

オルガネラ特異的タンパク質送達のための分子 Download PDF

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Abstract

本開示は、非核オルガネラ関連障害、例えば遺伝性障害、例えばフリードライヒ運動失調症を処置するのに有用な融合タンパク質を提供する。この融合タンパク質は、非核オルガネラに送達する対象とするタンパク質、オルガネラ移行配列(OTS)、細胞透過性ペプチド(CPP)、及び標的促進配列(TES)を含む融合タンパク質であって、CPPが、非核オルガネラへの対象とするタンパク質の送達に干渉することができ、TESが、CPPによる前記干渉を防止する融合タンパク質でありうる。この融合タンパク質は、非核オルガネラに送達する対象とするタンパク質、CPP、及びTESを含むものでありうる。本開示は、当該融合タンパク質をそれを必要とする対象に投与することによって、非核オルガネラ関連障害を処置する方法も提供する。【選択図】図１

Description

関連出願
本願は、2020年3月26日出願の米国特許仮出願第63/000,138号の優先権を請求する。この開示の全内容を参照により本明細書に組み込む。
カチオン性細胞透過性ペプチド(CPP)は、治療用タンパク質を細胞内に送達する有望な手段として出現している。しかし、CPPを治療用タンパク質に付加することには、治療用タンパク質の適切な細胞内局在又は機能にCPPが干渉する可能性があるという1つの潜在的欠点がある。例えば、ある種の細胞透過性ペプチド、例えば、HIV-TATは、治療用タンパク質の送達を核に向けることが示されているが、核は、対象とする治療用タンパク質の望ましい細胞内目的地ではない可能性がある。
哺乳動物細胞のミトコンドリアへの治療用タンパク質の送達が、例えばTAT-FXN融合タンパク質を用いて試みられている。TAT-FXN融合タンパク質は、TAT及びフラタキシン(FXN)を含有している。FXNは、遺伝的状態であるフリードライヒ運動失調症(FRDA)と関連するミトコンドリアタンパク質である。FRDA患者は、神経系への進行性の損傷を患っており、この損傷の結果、筋力低下が起こり、最終的には、運動制御が減失する。FRDAは、FRDA遺伝子の転写抑制によって引き起こされ、その結果、FRDA患者では、hFXNタンパク質が無いか、微量になっている。
オルガネラ特異的な治療用タンパク質送達の文脈にあるものを含めた、治療用タンパク質の適切な細胞内局在又は機能を維持しながら、治療用タンパク質を細胞内に送達するための有効な技術の改良は、医学における需要が大きい領域であり続けている。
本開示は、効率的に、例えば以前に達成されたものより高いレベルで、細胞に送達できる融合タンパク質を提供する。本開示は、対象とする治療用タンパク質を細胞に効率的に送達し、かつ対象とする治療用タンパク質の適切な細胞内局在及び/又は機能を達成及び維持することができる融合タンパク質をさらに提供する。例えば、本開示は、非核オルガネラに効率的に送達できる融合タンパク質を提供する。本開示によって提供される例示的融合タンパク質は、細胞に送達する対象とするタンパク質に加えて、細胞透過性ペプチド(CPP)及び/又は標的促進配列(TES)を含む。本開示の融合タンパク質において、CPPは、対象とするタンパク質の、そのタンパク質の適切な細胞内局在への送達及び/又はその機能に干渉することができ、TESは、CPPによるこの干渉を防止する。本開示によって提供される別の例示的融合タンパク質は、非核オルガネラに送達する対象とするタンパク質に加えて、オルガネラ移行配列(OTS)、細胞透過性ペプチド(CPP)、及び/又は標的促進配列(TES)を含む。本開示の前記融合タンパク質において、CPPは、対象とするタンパク質の非核オルガネラへの送達に干渉することができ、TESは、CPPによるこの干渉を防止する。
本開示はまた、対象とするタンパク質及びCPPも含む融合タンパク質に特定のアミノ酸配列(すなわち、TES)を含めることによって、細胞への、対象とするタンパク質の有効な送達が促進され、例えば、融合タンパク質で処置された細胞内で、対象とするタンパク質のレベルの増大がもたらされ、かつ対象とするタンパク質の適切な細胞内局在及び/又は機能が可能であったという驚くべき発見に少なくとも部分的に基づいている。詳細には、本発明者らは、対象とするタンパク質、CPP、及びTESを含む融合タンパク質で処置された細胞が、対象とするタンパク質及びCPPを含むがTESが無い融合タンパク質で処置された細胞より有意に多い量の対象とするタンパク質を含有することを発見した。したがって、本発明者らは、驚くべきことに、CPP及び対象とするタンパク質を含む融合タンパク質にTESを導入することによって、融合タンパク質と接触した細胞における対象とするタンパク質の量を有意に増加させることができることを発見した。本発明者らは、驚くべきことに、対象とするタンパク質、CPP、及びTESを含む融合タンパク質が、細胞機構によって正しくプロセシングされ、適切な細胞局在を実現し、例えば、非核オルガネラへと標的指向化され、細胞に送達された場合に、対象とするタンパク質の望ましい活性を有することも発見した。
本開示によって提供される一部の例示的融合タンパク質において、TESは、内因性の細胞内プロテアーゼによって切断可能なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、このTESは、CPPのすぐそばに隣接して位置し、このCPPは、融合タンパク質のN末端に位置している。TESは、融合タンパク質が細胞質に進入する際に、細胞内ヌクレアーゼによって切断される。特定の理論に拘束されることを望むものではないが、TESの切断によって、融合タンパク質からのCPPの除去が促進され、対象とするタンパク質が原形質膜を横断し、細胞の外に拡散するのをCPPが促進するのが妨げられると考えられる。これにより、対象とするタンパク質の細胞内蓄積が可能となる。本開示はさらに、対象とするタンパク質、CPP、及びOTSも含む融合タンパク質に特定のアミノ酸配列(すなわち、TES)を含めることにより、非核オルガネラ、例えばミトコンドリアへの、対象とするタンパク質の有効な送達が促進されるという驚くべき発見に少なくとも部分的に基づいている。詳細には、本発明者らは、対象とするタンパク質及びCPPとオルガネラ移行配列(OTS)、例えばミトコンドリア移行配列(MTS)を含むがTESを含まない融合タンパク質は、CPPが対象とするタンパク質のミトコンドリア送達に干渉するため、細胞内に進入した際にミトコンドリアではなく細胞核に局在することを発見した。本発明者らはさらに、対象とするタンパク質、CPP、及びOTS、例えばMTSも含む融合タンパク質に、TESなどの特定のアミノ酸配列を含めることによって、融合タンパク質が細胞内に進入する際に、ミトコンドリアへの対象とするタンパク質の送達が促進されることを発見した。
本開示によって提供される例示的融合タンパク質において、TESは、内因性の細胞内プロテアーゼによって切断可能なアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、このTESは、CPPの直ちに隣に位置し、このCPPは、融合タンパク質のN末端に位置している。TESは、融合タンパク質が細胞質に進入する際に、細胞内ヌクレアーゼによって切断される。TESの切断によって、融合タンパク質からのCPPの除去が促進され、ミトコンドリアへの融合タンパク質の送達をCPPが干渉するのが防止される。本開示の他の例示的融合タンパク質において、TESは、核外移行シグナルペプチド(NES)を含み、これが、核への融合タンパク質のCPP促進送達を防止し、代わりに、非核オルガネラ、例えばミトコンドリアへの融合タンパク質の送達を促進する。
本開示の他の例示的融合タンパク質において、TESは、核外移行シグナルペプチド(NES)を含み、これが、核における対象とするタンパク質の蓄積を防止する。
一部の態様では、本開示は、細胞に送達する対象とするタンパク質、細胞透過性ペプチド(CPP)、及び標的促進配列(TES)を含む融合タンパク質を提供する。
一部の実施形態では、CPPが融合タンパク質のN末端に位置し、TESがCPPのC末端に融合している。一部の実施形態では、融合タンパク質は、N末端から開始して、CPP、TES、及び対象とするタンパク質を含むか、又はこれらからなる。
一部の実施形態では、CPPが融合タンパク質のC末端に位置し、TESがCPPのN末端に融合している。
一部の実施形態では、融合タンパク質は、C末端から開始して、対象とするタンパク質、TES、及びCPPを含むか、又はこれらからなる。
一部の実施形態では、対象とするタンパク質はOTSを欠く。
他の実施形態では、融合タンパク質は、対象とするタンパク質にとって外因性のオルガネラ移行配列（オルガネラ標的化配列）(OTS)をさらに含む。
一部の実施形態では、対象とするタンパク質はOTSを含む。
一部の実施形態では、OTSは、対象とするタンパク質にとって異種である。一部の実施形態では、OTSは、対象とするタンパク質にとって内因性である。
一部の実施形態では、対象とするタンパク質は、フラタキシン(FXN)、タファジン、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ(PDH)、SLIRP、LRPPC、PARK2タンパク質、PARK6タンパク質、PARK7タンパク質、VI型ホスホリパーゼA2、及びそのバリアント又は誘導体からなる群から選択される。一部の実施形態では、対象とするタンパク質はフラタキシン(FXN)、PARK2タンパク質(PARKIN)、又はそのバリアント若しくは誘導体を含む。
一部の実施形態では、CPPは、細胞透過性ペプチドデータベースCPPsite2.0に記載されているCPPの群から選択されるペプチドを含む。一部の実施形態では、CPPは、HIV-TAT、ガラニン、マストパラン、トランスポータン、ペネトラチン、ポリアルギニン、VP22、及びそのバリアント又は誘導体からなる群から選択されるペプチドを含む。一部の実施形態では、CPPはHIV-TAT又はそのバリアント若しくは誘導体を含む。
一部の実施形態では、TESは核外移行シグナルペプチドである。一部の実施形態では、核外移行シグナルペプチドは、配列番号36～43のいずれか1つに少なくとも85%の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、核外移行シグナルペプチドは、NES1、NES2、NES3、NES4、NES5、NES6、NES7、NES8、及びそのバリアント又は誘導体からなる群から選択されるペプチドを含む。一部の実施形態では、核外移行シグナルペプチドは、NES1及びNES2、又はそのバリアント若しくは誘導体からなる群から選択されるペプチドを含む。
一部の実施形態では、TESはプロテアーゼ感受性ペプチドである。一部の実施形態では、プロテアーゼ感受性ペプチドはユビキチン様修飾因子を含む。一部の実施形態では、プロテアーゼ感受性ペプチドは、配列番号18～31のいずれか1つに少なくとも85%の配列同一性を有する配列を含む。
一部の実施形態では、プロテアーゼ感受性ペプチドは、ユビキチン、カスパーゼ切断ドメイン、カルパイン切断ドメイン、SUMO1、SUMO2、SUMO3、SUMO4、ISG15、Atg8、Atg12、NEDD8、及びそのバリアント又は誘導体からなる群から選択されるペプチドを含む。
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号55～61、69～71、及び81のいずれかに少なくとも85%、90%、又は95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の態様では、本開示は、非核オルガネラに送達する対象とするタンパク質、オルガネラ移行配列（organella targeting sequence）(OTS)、細胞透過性ペプチド(CPP)、及び標的促進配列(TES)を含む融合タンパク質であって、CPPが、非核オルガネラへの、対象とするタンパク質の送達に干渉することができ、TESがCPPによる前記干渉を防止する融合タンパク質を提供する。
一部の実施形態では、CPPが融合タンパク質のN末端に位置し、TESがCPPのC末端に融合している。
一部の実施形態では、融合タンパク質は、N末端から開始して、CPP、TES、OTS、及び対象とするタンパク質を含むか、又はこれらからなる。
一部の実施形態では、CPPが融合タンパク質のC末端に位置し、TESがCPPのN末端に融合している。一部の実施形態では、非核オルガネラは、ミトコンドリア、サイトゾル、リソソーム、小胞体(ER)、ペルオキシソーム、及びゴルジ装置からなる群から選択される。一部の実施形態では、その天然存在の形態にある対象とするタンパク質は、ミトコンドリア、サイトゾル、リソソーム、小胞体(ER)、ペルオキシソーム、又はゴルジ装置に局在している。
一部の実施形態では、対象とするタンパク質は、フラタキシン(FXN)、タファジン、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ(PDH)、SLIRP、LRPPC、PARK2タンパク質、PARK6タンパク質、PARK7タンパク質、VI型ホスホリパーゼA2、及びバリアント又はその誘導体からなる群から選択される。一部の実施形態では、対象とするタンパク質はフラタキシン(FXN)又はそのバリアント若しくは誘導体である。一部の実施形態では、対象とするタンパク質はピルビン酸デヒドロゲナーゼ(PDH)又はそのバリアント若しくは誘導体である。
一部の実施形態では、CPPは、細胞透過性ペプチドデータベースCPPsite2.0に記載されているCPPの群から選択されるペプチドを含む。一部の実施形態では、CPPは、HIV-TAT、ガラニン、マストパラン、トランスポータン、ペネトラチン、ポリアルギニン、VP22、及びそのバリアント又は誘導体からなる群から選択されるペプチドを含む。一部の実施形態では、CPPはHIV-TAT又はそのバリアント若しくは誘導体を含む。
一部の実施形態では、TESは核外移行シグナルペプチドである。一部の実施形態では、核外移行シグナルペプチドは、配列番号36～43のいずれか1つに少なくとも85%の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、核外移行シグナルペプチドは、NES1、NES2、NES3、NES4、NES5、NES6、NES7、NES8、及びそのバリアント又は誘導体からなる群から選択されるペプチドを含む。一部の実施形態では、核外移行シグナルペプチドは、NES1、NES2、及びそのバリアント若しくは誘導体からなる群から選択されるペプチドを含む。
一部の実施形態では、TESはプロテアーゼ感受性ペプチドである。一部の実施形態では、プロテアーゼ感受性ペプチドはユビキチン様修飾因子を含む。一部の実施形態では、プロテアーゼ感受性ペプチドは、配列番号18～31のいずれか1つに少なくとも85%の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、プロテアーゼ感受性ペプチドは、ユビキチン、カスパーゼ切断ドメイン、カルパイン切断ドメイン、SUMO1、SUMO2、SUMO3、SUMO4、ISG15、Atg8、Atg12、NEDD8、及びそのバリアント又は誘導体からなる群から選択されるペプチドを含む。
一部の実施形態では、本開示の融合タンパク質は分泌シグナル(SS)をさらに含む。
一部の実施形態では、本開示の融合タンパク質は細胞外タンパク質分解部位(EPS)をさらに含む。
一部の実施形態では、融合タンパク質は、対象とするタンパク質を非核オルガネラに送達する。一部の実施形態では、融合タンパク質は、対象とするタンパク質をミトコンドリアに送達する。
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号55～61、69～71、及び81のいずれかに少なくとも85%、90%、又は95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の態様では、本開示は、本開示の融合タンパク質をコードする核酸も提供する。
一部の態様では、本開示は、本開示の核酸を含む、細胞に融合タンパク質を導入するための発現ベクターも提供する。一部の実施形態では、発現ベクターは、レトロウイルスベクター、DNAベクター、プラスミド、RNAベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルス随伴ベクター、レンチウイルスベクター、ファージミド、バキュロウイルス、及びこれらの組合せからなる群から選択される。
一部の態様では、本開示は、本開示の融合タンパク質及び前記融合タンパク質に連結した部分を含む非核オルガネラへのタンパク質の細胞内送達のためのコンジュゲート（結合体）であって、前記部分が放射性標識、蛍光標識、小分子、及びポリマー分子からなる群から選択される、コンジュゲート（conjugate）を提供する。一部の実施形態では、ポリマー分子はポリエチレングリコール(PEG)である。
一部の態様では、本開示は、本開示の融合タンパク質を含む細胞、本開示の核酸、本開示の発現ベクター、本開示のコンジュゲート、又はこれらの組合せを提供する。
一部の実施形態では、細胞は幹細胞又はiPS細胞である。一部の実施形態では、細胞は、筋前駆細胞、ニューロン前駆細胞、骨髄幹細胞、細菌細胞株、又は酵母細胞株からなる群から選択される。
一部の態様では、本開示は、本開示の融合タンパク質、本開示のコンジュゲート、又はこれらの組合せと、薬学的に許容できる希釈剤、担体、添加剤、又は賦形剤とを含む医薬組成物も提供する。
一部の態様では、本開示は、対象とするタンパク質を細胞に送達する方法であって、本開示の融合タンパク質、本開示の核酸、本開示のベクター、又は本開示のコンジュゲートと細胞を接触させることを含む方法を提供する。
一部の態様では、本開示は、細胞内の非核オルガネラに、対象とするタンパク質を細胞内送達する方法であって、前記細胞を本開示の融合タンパク質、本開示の核酸、本開示のいずれか1つのベクター、又は本開示のコンジュゲートと接触させることを含む方法も提供する。一部の実施形態では、非核オルガネラはミトコンドリアである。
一部の態様では、本開示は、非核オルガネラ関連障害を処置するための治療用化合物であって、本開示の融合タンパク質、本開示の核酸、本開示のベクター、又は本開示のコンジュゲートを含む化合物も提供する。一部の実施形態では、非核オルガネラ関連障害は、フリードライヒ運動失調症(FDRA)、バース症候群、パーキンソン病、ウイルソン病、リー症候群、線維症、及びPLA2G6関連神経変性症(PLAN)からなる群から選択される。一部の実施形態では、非核オルガネラ関連障害はFDRAである。一部の実施形態では、非核オルガネラ関連障害はパーキンソン病である。
一部の態様では、本開示は、非核オルガネラ関連障害を処置する方法であって、非核オルガネラ関連障害が処置されるように、本開示の融合タンパク質、本開示の核酸、本開示のベクター、本開示のコンジュゲート、又は本開示の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む方法も提供する。
一部の実施形態では、非核オルガネラ関連障害はフリードライヒ運動失調症(FDRA)、バース症候群、パーキンソン病、ウイルソン病、リー症候群、及び線維症からなる群から選択される。一部の実施形態では、非核オルガネラ関連障害はFDRAである。一部の実施形態では、非核オルガネラ関連障害はパーキンソン病である。
一部の実施形態では、対象はヒトである。
一部の態様では、本開示は、細胞に送達される、対象とするタンパク質の量を増加させる方法であって、融合タンパク質に標的促進配列(TES)を導入することによって、対象とするタンパク質及び細胞透過性ペプチド(CPP)を含む融合タンパク質の配列を改変し、それによって改変融合タンパク質を生成するステップと、細胞を改変融合タンパク質と接触させるステップとを含み、それによって、TESが無い融合タンパク質により細胞に送達される対象とするタンパク質の量と比較して、細胞に送達される対象とするタンパク質の量を増加させる、方法も提供する。
一部の実施形態では、改変融合タンパク質において、CPPが融合タンパク質のN末端に位置し、TESがCPPのC末端に融合している。
一部の実施形態では、改変融合タンパク質は、N末端から開始して、CPP、TES、及び対象とするタンパク質を含む。
一部の実施形態では、改変融合タンパク質は、N末端から開始して、CPP、TES、OTS、及び対象とするタンパク質を含む。
一部の実施形態では、改変融合タンパク質において、CPPが融合タンパク質のC末端に位置し、TESがCPPのN末端に融合している。一部の実施形態では、TESが無い融合タンパク質によりオルガネラに送達される対象とするタンパク質の量と比較して、OTSによって標的とされるオルガネラに送達される、対象とするタンパク質の量が増加している。
一部の実施形態では、対象とするタンパク質は、フラタキシン(FXN)、タファジン、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ(PDH)、SLIRP、LRPPC、PARK2タンパク質、PARK6タンパク質、PARK7タンパク質、及びVI型ホスホリパーゼA2、又はそのバリアント若しくは誘導体からなる群から選択される。一部の実施形態では、対象とするタンパク質は、フラタキシン(FXN)又はそのバリアント若しくは誘導体である。一部の実施形態では、対象とするタンパク質はPARK2タンパク質又はそのバリアント若しくは誘導体である。
一部の実施形態では、CPPは、細胞透過性ペプチドデータベースCPPsite2.0に記載されているCPPの群から選択されるペプチドを含む。一部の実施形態では、CPPは、HIV-TAT、ガラニン、マストパラン、トランスポータン、ペネトラチン、ポリアルギニン、VP22、及びそのバリアント又は誘導体からなる群から選択されるペプチドを含む。一部の実施形態では、CPPはHIV-TAT又はそのバリアント若しくは誘導体を含む。
一部の実施形態では、TESは核外移行シグナルペプチドである。一部の実施形態では、核外移行シグナルペプチドは、配列番号36～43のいずれか1つに少なくとも85%の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、核外移行シグナルペプチドは、NES1、NES2、NES3、NES4、NES5、NES6、NES7、NES8、及びそのバリアント又は誘導体からなる群から選択されるペプチドを含む。一部の実施形態では、核外移行シグナルペプチドは、NES1、NES2、及びそのバリアント又は誘導体からなる群から選択されるペプチドを含む。
一部の実施形態では、TESはプロテアーゼ感受性ペプチドである。一部の実施形態では、プロテアーゼ感受性ペプチドはユビキチン様修飾因子を含む。一部の実施形態では、プロテアーゼ感受性ペプチドは、配列番号18～31のいずれか1つに少なくとも85%の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、プロテアーゼ感受性ペプチドは、ユビキチン、カスパーゼ切断ドメイン、カルパイン切断ドメイン、SUMO1、SUMO2、SUMO3、SUMO4、ISG15、Atg8、Atg12、NEDD8、及びそのバリアント又は誘導体からなる群から選択されるペプチドを含む。
一部の実施形態では、改変融合タンパク質は、配列番号55～61、69～71、及び81のいずれかに少なくとも85%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一態様では、本開示は、非核オルガネラに送達する対象とするタンパク質、オルガネラ移行配列(OTS)、細胞透過性ペプチド(CPP)、及び標的促進配列(TES)を含む融合タンパク質であって、CPPが、非核オルガネラへの、対象とするタンパク質の送達に干渉することができ、TESがCPPによる前記干渉を防止する融合タンパク質を提供する。
一部の実施形態では、CPPが融合タンパク質のN末端に位置し、TESがCPPのC末端に融合している。一部の実施形態では、本開示は、N末端から開始して、CPP、TES、OTS、及び対象とするタンパク質を含む融合タンパク質を提供する。
一部の実施形態では、CPPが融合タンパク質のC末端に位置し、TESがCPPのN末端に融合している。
一部の実施形態では、非核オルガネラは、ミトコンドリア、サイトゾル、リソソーム、小胞体(ER)、ペルオキシソーム、及びゴルジ装置からなる群から選択される。
一部の実施形態では、その天然存在の形態にある対象とするタンパク質は、ミトコンドリア、サイトゾル、リソソーム、小胞体(ER)、ペルオキシソーム、又はゴルジ装置に局在している。
一部の実施形態では、対象とするタンパク質は、フラタキシン(FXN)、タファジン、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ(PDH)、LRPPC、PARK2タンパク質、PARK6タンパク質、PARK7タンパク質、VI型A2ホスホリパーゼ、転写因子、及びそのバリアント若しくは誘導体からなる群から選択される。一実施形態では、対象とするタンパク質は、フラタキシン(FXN)又はそのバリアント若しくは誘導体である。一実施形態では、対象とするタンパク質はピルビン酸デヒドロゲナーゼ(PDH)又はそのバリアント若しくは誘導体である。
一部の実施形態では、CPPは、細胞透過性ペプチドデータベースCPPsite2.0に記載されているCPPの群から選択されるペプチドを含む。さらに他の実施形態では、CPPは、HIV-TAT、ガラニン、マストパラン、トランスポータン、ペネトラチン、ポリアルギニン、VP22、及びそのバリアント又は誘導体からなる群から選択されるペプチドを含む。一部の実施形態では、CPPはHIV-TAT又はそのバリアント若しくは誘導体を含む。
一部の実施形態では、TESは核外移行シグナルペプチドである。さらに他の実施形態では、核外移行シグナルペプチドは、配列番号36～43のいずれか1つに少なくとも85%の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、核外移行シグナルペプチドは、NES1、NES2、NES3、NES4、NES5、NES6、NES7、NES8、及びそのバリアント又は誘導体からなる群から選択されるペプチドを含む。一部の実施形態では、核外移行シグナルペプチドは、NES1、NES2、及びそのバリアント若しくは誘導体からなる群から選択されるペプチドを含む。
一部の実施形態では、TESはプロテアーゼ感受性ペプチドである。一部の実施形態では、プロテアーゼ感受性ペプチドはユビキチン様修飾因子を含む。一部の実施形態では、ユビキチン様修飾因子は、配列番号18～31のいずれか1つに少なくとも85%の配列同一性を有する配列を含む。
一部の実施形態では、プロテアーゼ感受性ペプチドは、ユビキチン、カスパーゼ切断ドメイン、カルパイン切断ドメイン、SUMO1、SUMO2、SUMO3、SUMO4、ISG15、Atg8、Atg12、NEDD8、及びそのバリアント又は誘導体からなる群から選択されるペプチドを含む。
一部の実施形態では、本開示によって提供される融合タンパク質は分泌シグナル(SS)を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は細胞外タンパク質分解部位(EPS)を含む。
一部の実施形態では、融合タンパク質は、対象とするタンパク質を非核オルガネラに送達する。特定の実施形態では、融合タンパク質は、対象とするタンパク質をミトコンドリアに送達する。
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号55～61のいずれかに少なくとも85%の配列同一性を有する配列を含む。
別の態様では、本開示は、本開示の融合タンパク質をコードする核酸を提供する。
関連する一態様では、本開示は、細胞に融合タンパク質を導入するための、本開示の核酸を含む発現ベクターを提供する。
一部の実施形態では、発現ベクターは、レトロウイルスベクター、DNAベクター、プラスミド、RNAベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルス随伴ベクター、レンチウイルスベクター、ファージミド、バキュロウイルス、及びこれらの組合せからなる群から選択される。
別の態様では、本開示は、非核オルガネラへのタンパク質の細胞内送達のためのタンパク質コンジュゲートであって、本開示の融合タンパク質及び融合タンパク質に連結した部分を含み、部分が、放射性標識、蛍光標識、小分子、及びポリマー分子からなる群から選択される、タンパク質コンジュゲートを提供する。一実施形態では、ポリマー分子はポリエチレングリコール(PEG)である。
別の態様では、本開示は、本開示の融合タンパク質、核酸、発現ベクター、若しくはコンジュゲート、又はこれらの組合せを含む細胞を提供する。細胞は、形質転換細胞、例えば、本開示の融合タンパク質、核酸、発現ベクター、若しくはコンジュゲート、又はこれらの組合せで形質転換された細胞であってもよい。一部の態様では、細胞は幹細胞又はiPS細胞である。一部の態様では、細胞は、筋前駆細胞、ニューロン前駆細胞、骨髄幹細胞、細菌細胞、又は酵母細胞からなる群から選択することができる。
別の態様では、本開示は、本開示の融合タンパク質若しくはタンパク質コンジュゲート、又はこれらの組合せと、薬学的に許容できる希釈剤、担体、添加剤、又は賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。
別の態様では、本開示は、細胞内の非核オルガネラに、対象とするタンパク質を細胞内送達する方法であって、細胞を本開示の融合タンパク質、核酸、ベクター、又はタンパク質コンジュゲートと接触させることを含む方法を提供する。一態様では、非核オルガネラはミトコンドリアである。
別の態様では、本開示は、非核オルガネラ関連障害を処置するための治療用化合物であって、本開示の融合タンパク質、核酸、ベクター、又はタンパク質コンジュゲートを含む治療用化合物を提供する。一部の実施形態では、非核オルガネラ関連障害は、フリードライヒ運動失調症(FDRA)、バース症候群、パーキンソン病、ウイルソン病、リー症候群、線維症、及びPLA2G6関連神経変性症(PLAN)からなる群から選択される。一実施形態では、PLANは、乳児神経軸索ジストロフィー(INAD)、非定型神経軸索ジストロフィー(ANAD)、成人発症ジストニアパーキンソニズム(DP)及び常染色体劣性若年性パーキンソニズム(AREP)を含めたパーキンソン症候群からなる群から選択される障害を含む。一態様では、非核オルガネラ関連障害はFDRAである。
関連する一態様では、本開示は、非核オルガネラ関連障害を処置する方法であって、非核オルガネラ関連障害が処置されるように、本開示の融合タンパク質、核酸、ベクター、タンパク質コンジュゲート、又は医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、非核オルガネラ関連障害はフリードライヒ運動失調症(FDRA)、バース症候群、パーキンソン病、ウイルソン病、リー症候群、及び線維症からなる群から選択される。特定の一実施形態では、非核オルガネラ関連障害はFDRAである。
一部の実施形態では、対象はヒトである。
この概要は、以下の発明を実施するための形態でさらに記載する選択された概念を簡易的な形態で導入するために提供している。この概要は、特許請求する主題の重要な特徴又は必須の特徴を特定するものでも、特許請求する主題の範囲を限定するのに使用するものでもない。
本開示の実施形態の非限定な例を、この段落の後に列挙されている本明細書に添付されている図を参照しながら下に記載する。複数の図に記載の同一な特徴は、一般に、それらが記載されているすべての図で同じ標識で標識されている。図における本開示の実施形態の所与の特徴を表すアイコンを標識する標識は、所与の特徴を参照するのに使用されているものでありうる。図に示されている特徴の寸法は、提示が好都合かつ明確になるように選ばれており、必ずしも一定の尺度で示されているわけではない。
プロテアーゼ切断部位を有する標的促進配列(TES)を含む、本開示の特定の融合タンパク質を示す概略図である。 本開示の融合タンパク質中にある様々なドメインの構成を示す概略図である。 TAT-GG-hFXN融合タンパク質(5μM)による処置及び抗hFXN抗体(左パネル)又はミトコンドリア特異的な抗TOMM20抗体(中央パネル)を標識する免疫蛍光の後における、ラットL6筋芽細胞の1セットの写真である。右パネルは、抗hFXN標識及び抗TOMM20標識のマージを示す。 免疫蛍光標識の後における、hFXN(上パネル)又はTAT-GG-hFXN融合タンパク質(下パネル)をコードするプラスミドで形質移入されたラットL6筋芽細胞の1セットの写真である。筋原細胞は、抗hFXN抗体(左パネル)又は抗TOMM20抗体(中央パネル)で標識された。右パネルは、2種の標識のマージを示す。 hFXNを含む、本開示の例示的融合タンパク質の設計を示す概略図である。パネルAは、TAT-GGがhFXN1-210のアミノ末端に融合したもの(TAT-GG-hFXN融合タンパク質)を示す。パネルBは、TAT-GGがタンパク分解に感受性のアミノ酸配列に融合し、その後にhFXN1-210が続いているものを示す。パネルCは、本開示の一実施形態による、TAT-GGがhFXN1-210に融合し、その後に核外移行シグナル(NES)が続いているものを示す。 hFXN(図4A)、TAT-GG-hFXN融合タンパク質(図4B)、TAT-GG-SUMO1-hFXN(図4C)、TAT-GG-LLVY-hFXN(図4D)、TAT-GG-hFXN-NES1(図4E)、TAT-GG-hFXN-NES2(図4F)をコードするプラスミドで形質移入され、免疫蛍光標識されたラットL6筋芽細胞の写真である。免疫蛍光標識化には、hFXNに対する抗体(左パネル)及びTOMM20に対する抗体(中央パネル)でL6筋芽細胞を染色した。右パネルは、2種の標識のマージを示す。 TAT-GG-ユビキチン-hFXN(図4G)、TAT-GG-DEVD-hFXN(図4H)、及びTAT-GG-EPLFAERK-hFXN(図4I)をコードするプラスミドで形質移入され、免疫蛍光標識されたラットL6筋芽細胞の写真である。免疫蛍光標識化には、hFXNに対する抗体(左パネル)及びTOMM20に対する抗体(中央パネル)でL6筋芽細胞を染色した。右パネルは、2種の標識のマージを示す。 hFXNバリアントである、hFXN(レーン1)、TAT-GG-hFXN融合タンパク質(レーン2)、TAT-GG-SUMO1-hFXN(レーン3)、TAT-GG-ユビキチン-hFXN(レーン4)、TAT-GG-EPLFAERK-hFXN(レーン5)、TAT-GG-LLVY-hFXN(レーン6)、TAT-GG-hFXN-NES1(レーン7)、TAT-GG-hFXN-NES2(レーン8)、及びモック(レーン9)で形質移入したラットL6筋芽細胞から得た細胞溶解物のウエスタンブロット分析の写真である。ブロットは、抗hFXN抗体で標識し、β-アクチンを対照として用いた。 実施例5で、その細胞形質導入能について試験した本開示のhFXN融合タンパク質の構造の概略図である。 0.25μM、0.5μM、及び1μMのTAT-GG-hFXN、TAT-GG-EPLFAERK-hFXN、TAT-GG-ユビキチン-hFXN、及び陰性対照である媒体で処置されたシュワン細胞の一連の写真である。写真中、緑色は、ミトコンドリアマーカーであるTOMM20シグナルに対応し、赤色は、hFXNシグナルに対応し、青色は、核マーカーであるHoechst 33342色素シグナルに対応している。 TAT-GG-ユビキチン-hFXNで処置された細胞の高倍率画像である。この画像は、hFXN染色の詳細及びミトコンドリアへのその局在を示している。 様々な濃度のTAT-GG-hFXN、TAT-GG-EPLFAERK-hFXN、及びTAT-GG-ユビキチン-hFXNで処置した細胞における、hFXN染色シグナルの平均値と核染色シグナルの平均値の比率を示す棒グラフである。 形質導入実験に使用したTAT-GG-hFXN、TAT-GG-EPLFAERK-hFXN、TAT-GG-ユビキチン-hFXNの試料をローディングしたSDS-PAGEゲルからの転写を行い、総タンパク質を染色した後のニトロセルロースメンブレンの写真である。写真は、融合タンパク質の分解が無いこと、及び同量の各融合タンパク質が形質導入実験に使用されたことを実証している。 1μMのhFXN融合タンパク質TAT-GG-hFXN、TAT-GG-EPLFAERK-hFXN、及びTAT-GG-ユビキチン-hFXNで処置し、ミトコンドリア染色、核染色、及び抗FXN染色を行ったシュワン細胞及びH9C2細胞の一連の代表写真である。白い矢は、ミトコンドリアへのhFXNの代表的局在を示す。 抗FXN染色シグナルの平均値と抗ミトコンドリア染色シグナルの平均値の比率を、TAT-GG-hFXN、TAT-GG-EPLFAERK-hFXN、及びTAT-GG-ユビキチン-hFXNで処置したシュワン細胞内のhFXN融合タンパク質濃度の関数として示すグラフである。 抗FXN染色シグナルの平均値と抗ミトコンドリア染色シグナルの平均値の比率を、TAT-GG-hFXN、TAT-GG-EPLFAERK-hFXN、及びTAT-GG-ユビキチン-hFXNで処置したH9C2細胞内のhFXN融合タンパク質濃度の関数として示すグラフである。 抗FXN染色シグナルの平均値と抗ミトコンドリア染色シグナルの平均値の比率を、TAT-GG-hFXN、TAT-GG-EPLFAERK-hFXN、TAT-GG-ユビキチン-hFXN、及びTAT-GG-hFXN-NES1で処置したシュワン細胞内のhFXN融合タンパク質濃度の関数として示すグラフである。 様々なhFXN融合タンパク質で形質移入された細胞から単離され、抗FXN抗体を使用して分析された総タンパク質試料のウエスタンブロットの写真である。 本開示のhFXN融合タンパク質で処置したLRPPRC KD細胞及びScr-5細胞の試料を含有する培養プレートの写真である。 試験された最も高い濃度の各hFXN融合タンパク質又は媒体で処置されたLRPPRC KD及びScr-5対照細胞の一連の写真である。 hFXN融合タンパク質で処置したLRPPRC KD細胞の培地中にあるCYR61の量を示すグラフである。 hFXN融合タンパク質で処置したLRPPRC KD細胞の培地中にある乳酸の量を示すグラフである。 本開示のPARKIN融合タンパク質の構造の概略図である。 様々な濃度のHis6-SUMO-TAT-GG-PARKIN、TAT-GG-EPLFAERK-PARKIN、及びTAT-GG-ユビキチン-PARKINで処置された細胞における、PARKIN染色とミトコンドリアの染色の比率を、PARKIN融合タンパク質濃度の関数として示すグラフである。 CCCP非存在下又は10μMのCCCPの存在下に0μM又は0.5μMのTAT-GG-EPLFAERK-PARKINで処置されたL6ラット筋芽細胞の一連の写真である。
本開示の一態様は、細胞に送達する対象とするタンパク質を含む融合タンパク質を提供することに関する。一部の実施形態では、融合タンパク質は、特定のオルガネラ、例えば非核オルガネラ、例えばミトコンドリアに送達する対象とするタンパク質を含む。融合タンパク質は、少なくとも1種の細胞透過性ペプチド(CPP)、少なくとも1種の標的促進配列(TES)、及び場合によって少なくとも1種のオルガネラ移行シグナルの(OTS)も含む。
本開示の特定の態様では、CPPは、オルガネラ、例えば非核オルガネラへの対象とするタンパク質の送達に干渉することができる。例えば、本開示に含まれる特定の実験データによって実証されるように、CPP、例えばHIV-TATは、ミトコンドリアへの対象とするタンパク質、例えばFXNの送達に干渉することができる。具体的には、HIV-TATは、ミトコンドリアではなく核へのFXNの送達を促進する。したがって、本開示の融合タンパク質は、適切な細胞性(例えば非核)オルガネラへの対象とするタンパク質の送達をCPPが干渉するのを防止又は減弱するTESを含む。
例えば、一部の実施形態では、CPPが融合タンパク質のN末端に位置してもよく、TESがCPPのC末端に融合していてもよい。或いは、CPPが融合タンパク質のC末端に位置してもよく、TESがCPPのN末端に融合していてもよい。TESは、細胞に進入した際に、TESにおける融合タンパク質の切断を促進し、それによって、CPPを融合タンパク質の残部から除去し、それが融合タンパク質を核に向けるのを防止する、細胞内プロテアーゼの認識配列を含んでいてもよい。
或いは、TESは、核外移行シグナル、例えば、CPPに媒介されて融合タンパク質が核に送達された後に、融合タンパク質の核から外への移行を促進するシグナルを含んでいてもよい。
本開示の別の態様は、細胞に送達する対象とするタンパク質を含む融合タンパク質を提供することにも関する。融合タンパク質は、少なくとも1種の細胞透過性ペプチド(CPP)、少なくとも1種の標的促進配列(TES)、及び対象とするタンパク質を含む。
本開示の一部の実施形態では、CPPは、細胞への対象とするタンパク質の送達に干渉することができる。例えば、本開示に含まれる特定の実験データによって実証されるように、対象とするタンパク質、CPP、及びTESを含む融合タンパク質で処置した細胞は、対象とするタンパク質及びCPPを含むがTESを含まない融合タンパク質で処置した細胞より有意に多い量の対象とするタンパク質を含有した。したがって、予想外なことに、CPP及び対象とするタンパク質を含む融合タンパク質にTESを導入することによって、細胞に送達される対象とするタンパク質の量を有意に増加させることができることが発見された。
特定の理論に拘束されることを望むものではないが、細胞内の内因性プロテアーゼによるTESの切断によって、融合タンパク質からのCPPの除去が促進され、対象とするタンパク質が原形質膜を横断し、細胞の外に拡散するのをCPPが促進するのが防止されると考えられる。これにより、対象とするタンパク質の細胞内蓄積が可能となる。融合タンパク質からのCPPの除去によって、また、CPPが対象とするタンパク質の適切な細胞内局在に干渉するのが防止される。したがって、本開示の融合タンパク質は、対象とするタンパク質が細胞に送達されるのをCPPが干渉するのを防止又は減弱するTESを含む。一部の実施形態では、本開示の融合タンパク質は、細胞への対象とするタンパク質の適切な細胞内局在をCPPが干渉するのを防止又は減弱するTESを含む。
一部の実施形態では、CPPが融合タンパク質のN末端に位置してもよく、TESがCPPのC末端に融合していてもよい。或いは、CPPが融合タンパク質のC末端に位置してもよく、TESがCPPのN末端に融合していてもよい。TESは、細胞に進入した際に、TESにおける融合タンパク質の切断を促進し、それによって、CPPを融合タンパク質の残部から除去し、それが融合タンパク質を細胞の外に向けるのを防止する細胞内プロテアーゼの認識配列を含んでいてもよい。
或いは、TESは、核外移行シグナルペプチド(NES)を含んでいてもよい。特定の理論に拘束されることを望むものではないが、CPPは、核内への融合タンパク質の輸送を促進し、NESは、融合タンパク質中に存在する場合、核内における融合タンパク質の蓄積を防止すると考えられる。核内に融合タンパク質が蓄積するのを防止することによって、NESは、核外、例えばミトコンドリアにおける、融合タンパク質に含まれている対象とするタンパク質の適切な細胞内局在を促進する。
一部の実施形態では、内因性のプロテアーゼによるTESの切断を介したCPPの除去が、対象とするタンパク質の適切な細胞内局在を促進する。一部の場合、対象とするタンパク質、例えばNFカッパb、アンドロゲン受容体、エストロゲン受容体、又はアコニターゼは、典型的には、複数の細胞コンパートメント、例えば核及びミトコンドリアに局在しうる。内因性プロテアーゼによるTESの切断を介したCPPの除去は、内因性の刺激に反応して、対象とするタンパク質の適切な細胞内局在をCPPが干渉をするのを防止する。
対象とするタンパク質
本開示が提供する融合タンパク質は、細胞に送達する対象とするタンパク質を含む。一部の実施形態では、本開示が提供する融合タンパク質は、細胞内の特定のオルガネラ、例えば非核オルガネラに送達する対象とするタンパク質を含む。本開示の融合タンパク質に含まれる対象とするタンパク質は、非核オルガネラに関連するものであってもよく、例えば、対象とするタンパク質は、細胞内の非核オルガネラ特異的タンパク質であってもよい。例えば、対象とするタンパク質は、非核オルガネラに局在するもの、及び/又は非核オルガネラで遂行される細胞内機能を遂行できるか促進するものでありうる。例示的な非核オルガネラには、サイトゾル、ミトコンドリア、リソソーム、小胞体、ゴルジ装置、及びペルオキシソームが含まれる。一部の実施形態では、本開示の融合タンパク質に含まれる対象とするタンパク質は、代わりに、核に関連するもの、一部の実施形態では、核及び1つ以上非核オルガネラに関連するものであってもよく、例えば、対象とするタンパク質は、核及び他の非核オルガネラ(例えばサイトゾル、ミトコンドリア、リソソーム、小胞体、ゴルジ装置、及びペルオキシソーム)の両方に局在する細胞内タンパク質であってもよい。
対象とするタンパク質は、対象の病的状態に関連するものであり得る。そのような病的状態は、例えば、対象における対象とするタンパク質の欠乏から生じ得る、例えば対象とするタンパク質が、対象とするタンパク質の天然の活性が低減又は消失するように突然変異している可能性のある場合、又は対象とするタンパク質が全く無い場合に生じうる。
本開示の一部の態様では、対象とするタンパク質はミトコンドリアに関連するものであり得る。ミトコンドリアに関連する例示的な対象とするタンパク質には、例えば、フラタキシン(FXN)、タファジン、ピルビン酸デヒドロゲナーゼベータ2(PDHB)、ロイシンリッチPPRモチーフ含有タンパク質(LRPPRCタンパク質)、SLIRP、パーキンRBR E3ユビキチンタンパク質リガーゼ(PARK2タンパク質又はPARKIN)、PTEN誘導キナーゼ1(PINK1又はPARK6タンパク質)、タンパク質デグリカーゼDJ-1(PARK7タンパク質)、及びVI型A2ホスホリパーゼが含まれうる。
一部の実施形態では、対象とするタンパク質はOTSを含む。一部の実施形態では、OTSは、対象とするタンパク質にとって内因性である。一部の実施形態では、OTSは、対象とするタンパク質に対して外因性である。
一部の実施形態では、対象とするタンパク質はOTSを欠く。一部の実施形態では、対象とするタンパク質は、その天然の形態でOTSを欠く、すなわち、それは、天然ではOTSを含有していない。一部の実施形態では、OTSを欠く対象とするタンパク質は、内因性OTSが除去された、タンパク質の成熟型である。
特定の一実施形態では、ミトコンドリアに関連する対象とするタンパク質は、病的状態であるフリードライヒ運動失調症(FRDA)に関連するフラタキシン(FXN)例えばヒトFXNであってもよい。FRDAは、FXNをコードする遺伝子内の突然変異によって引き起こされる遺伝的な進行性神経変性障害である。FXNは、必須かつ系統的に保存されたタンパク質であり、身体中の細胞に見出されるが、心臓、脊椎、肝臓、膵臓、及び骨格筋で最も高レベルである。FXNは、核にコードされており、細胞質で発現し、ミトコンドリア内に輸入し、そこで成熟型にプロセシングされる。ヒトでは、210アミノ酸の完全長hFXN(hFXN1-210、23.1kDa)が、アミノ末端に典型的なミトコンドリア移行配列(MTS)を含有しており、それが、ミトコンドリアのマトリックス内に輸入した際に、ミトコンドリアのマトリックスプロセシングペプチダーゼ(MPP)による2ステップ切断でプロセシングされる。この結果生じるタンパク質は、130アミノ酸、14.2kDaの成熟hFXNタンパク質(hFXN81-210)である。完全長hFXN及び成熟hFXNの配列を下の表1に示す。
Figure 2023518996000002
したがって、一部の態様では、本開示が提供する融合タンパク質は、完全長、すなわち、オルガネラ移行配列(OTS)としてMTSを含むhFXN(hFXN1-210)を含みうる。一部の態様では、融合タンパク質は、完全長hFXNの配列、例えば表1に記載の配列番号1に少なくとも85%、例えば、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含みうる。
一部の態様では、本開示が提供する融合タンパク質は、成熟hFXN(hFXN81-210)を含みうる。一部の態様では、融合タンパク質は、成熟hFXNの配列、例えば表1に記載の配列番号2に少なくとも85%、例えば、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含みうる。
他の態様では、本開示の融合タンパク質に含めることのできる例示的な対象とするタンパク質には、タファジン、ピルビン酸デヒドロゲナーゼベータ2(PDHB)、ロイシンリッチPPRモチーフ含有タンパク質(LRPPRCタンパク質)、SLIRP、パーキンRBR E3ユビキチンタンパク質リガーゼ(PARK2タンパク質又はPARKIN)、PTEN誘導キナーゼ1(PINK1又はPARK6タンパク質)、タンパク質デグリカーゼDJ-1(PARK7タンパク質)、及びVI型A2ホスホリパーゼが含まれる。
以下の表2は、例示的な対象とするタンパク質、対応するヒト配列、及び前記対象とするタンパク質を含む本開示の融合タンパク質で処置することができる関連する病的状態を列挙している。
Figure 2023518996000003
Figure 2023518996000004
Figure 2023518996000005
Figure 2023518996000006
Figure 2023518996000007
一部の実施形態では、本開示の融合タンパク質に含まれる対象とするタンパク質は、表2で列挙した配列のうち任意のもの、例えば配列番号3～9又は72～80のいずれか1つを含むか、又はそれからなるものであり得る。一部の実施形態では、本開示の融合タンパク質に含まれる対象とするタンパク質は、表2で列挙したアミノ酸配列のいずれか1つ、例えば配列番号3～9又は72～80のいずれかに少なくとも85%、例えば、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるものであり得る。
一部の実施形態では、本開示の融合タンパク質に含まれる対象とするタンパク質は、表2に列挙されている配列のうち任意のもの、例えば、配列番号3～9又は72～80のいずれか1つを含むか、又はそれからなり、内因性OTSを欠く、すなわち、内因性OTSが除去されている。特定のタンパク質のOTSは、当業者により容易に認識されるであろう。
本開示の一部の態様では、対象とするタンパク質は、リソソームに関連するものであり得る。本開示の一部の態様では、対象とするタンパク質は、小胞体(ER)に関連するものであり得る。本開示の一部の態様では、対象とするタンパク質は、ゴルジ装置に関連するものであり得る。
一部の実施形態では、対象とするタンパク質は、核に局在するタンパク質であってもよい。一部の実施形態では、対象とするタンパク質は、核及び他の1つ以上の細胞オルガネラに局在するタンパク質であってもよい。当業者ならば、CPP及びそのような対象とするタンパク質を含む融合タンパク質にTESを導入することによって、対象とするタンパク質の局在へのCPPによる干渉が除去されるであろうこと、例えば核への異常な局在が防止又は低減され、それによって、天然の調節経路を可能にして、内因性のシグナルに応答してタンパク質の適切な細胞局在を指示し、それによって適切な細胞内位置に再局在する傾向を改善するであろうことを理解する。そのようなタンパク質には、例えばNFKベータ、STAT3、アンドロゲン受容体、エストロゲン受容体、及びp53を含めることができる。
一部の実施形態では、本開示が提供する融合タンパク質は、本明細書に記載の対象とするタンパク質、又は対象とするタンパク質の機能的な類似体、誘導体、若しくは断片を含むものであり得る。「誘導体」という用語は、本明細書で使用される場合、本開示で具体的に定義しているポリペプチド、例えば配列番号3～9又は72～80とは、元のポリペプチドの活性を改変しないアミノ酸の挿入、欠失、置換、及び改変によって相違しているアミノ酸配列(ポリペプチド)を包含する。本明細書で使用される「挿入」、「欠失」、又は「置換」という用語は、ポリペプチドの1～50アミノ酸残基、例えば1～5アミノ酸残基、1～10アミノ酸残基、5～15アミノ酸残基、10～20アミノ酸残基、25～40アミノ酸残基、又は30～50アミノ酸残基の任意の付加、欠失、又は置き換えをそれぞれ包含すると理解される。より詳細には、挿入、欠失、又は置換は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10アミノ酸残基のいずれか1つのものであり得る。挿入、欠失、又は置換は、改変ペプチドのいかなる位置にあっても、そのN末端又はC末端のいずれかにあってもよいことに留意するべきである。一実施形態では、対象とするタンパク質はFXN、例えばヒトFXNの誘導体である。一実施形態では、対象とするタンパク質はタファジンの誘導体である。一実施形態では、対象とするタンパク質はPDHBの誘導体である。一実施形態では、対象とするタンパク質はLRPPRCの誘導体である。一実施形態では、対象とするタンパク質はSLIRPの誘導体である。一実施形態では、対象とするタンパク質はPARK2タンパク質の誘導体である。一実施形態では、対象とするタンパク質はPINK1(又はPARK6タンパク質)の誘導体である。一実施形態では、対象とするタンパク質はPARK7の誘導体である。一実施形態では、対象とするタンパク質はVI型ホスホリパーゼA2(例えばバリアント1、2、3、4、5、6、7、8、又は9)の誘導体である。
一部の実施形態では、本開示の文脈内における対象とするタンパク質のアミノ酸配列は、上述の病的状態の任意のものと関連する天然存在のタンパク質のアミノ酸配列と異なっていてもよい。一部の実施形態では、病的状態の任意のものと関連する天然存在のタンパク質のアミノ酸配列と比較して、対象とするタンパク質のアミノ酸配列は、保存的アミノ酸置換、すなわち、構造的に類似したアミノ酸による置換を含むものであり得る。例えば、構造的に類似したアミノ酸には、(イソロイシン(I)とロイシン(L)とバリン(V))、(フェニルアラニン(F)とチロシン(Y))、(リジン(K)とアルギニン(R))、(グルタミン(Q)とアスパラギン(N))、(アスパラギン酸(D)とグルタミン酸(E))、及び(グリシン(G)とアラニン(A))が含まれる。
「誘導体」という用語は、本明細書で使用される場合、元のポリペプチドの相同体、バリアント、及び類似体、並びに元のポリペプチドの共有結合的修飾を包含する。本開示で提供する融合タンパク質に含まれるタンパク質又はペプチドのいずれか1つの誘導体、バリアント、及び類似体は、その天然型と同じ生物活性を有することになる。特定の一実施形態では、対象とするタンパク質はFXN、例えばヒトFXNの相同体、バリアント又は類似体である。
一部の実施形態では、本開示の融合タンパク質に含めることができる対象とするタンパク質は、対象に天然に存在するものであり得る。対象は、哺乳動物、例えばマウス、ラット、サル、又はヒトであってもよい。
オルガネラ移行配列(OTS)
一部の実施形態では、本開示の融合タンパク質はオルガネラ移行配列(OTS)も含むものであり得る。「オルガネラ移行配列」又は「OTS」という用語は、本明細書で使用される場合、特定の非核オルガネラへの対象とするタンパク質の送達を促進する任意のアミノ酸配列、例えばタンパク質、ペプチド、又はコンセンサスドメインを指す。例えば、OTSは、ミトコンドリアへの対象とするタンパク質の送達を促進するミトコンドリア移行配列(MTS)であってもよい。MTSは、両親媒性ヘリックスを形成する疎水性アミノ酸と正荷電アミノ酸の交互のパターンを含む約10～70アミノ酸のペプチドであってもよい。
OTSは、また、小胞体(ER)移行配列であってもよい。ER移行配列（ER標的化配列）は、親水性領域、疎水性ドメイン、及びER特異的なシグナルペプチダーゼの切断部位を含有するC末端領域を含む約16～30アミノ酸のペプチドであってもよい。
OTSは、また、ゴルジ及び小胞体(ER)に局在する天然存在のタンパク質に存在しうるHEATモチーフを含むものであり得る。HEATは、短いループによって連結された2本のアルファへリックスで構成されるタンパク質タンデムリピート構造モチーフである。HEATリピートは、いくつかの細胞質タンパク質に見出される一種のソレノイドタンパク質ドメインであるアルファソレノイドを形成することができる。
OTSは、また、対象とするタンパク質のN末端又はC末端に位置しうるペルオキシソーム移行シグナル(PTS)であってもよい。N末端のペルオキシソーム移行シグナルは、Arg-Leu-X-X-X-X-X-His/Gln-Leuというコンセンサス配列を有しうる。配列中、Xは任意のアミノ酸でありうる。C末端ペルオキシソーム移行シグナルは、短い、Ser-Lys-Leuを含むものであってもよいが、他のバリエーション、例えば、PTS2及びmPTS(膜PTS)も存在している。mPTSは、タンパク質ループ(すなわち、膜貫通部の間)中の塩基性アミノ酸(アルギニン及びリジン)のクラスターからなるものでありうる。
OTSは、また、リソソーム移行モチーフ、例えばTyr-X-XOを含む配列であってもよい。配列中、Xは、任意のアミノ酸でありえ、Oは、嵩高い疎水性アミノ酸又はジロイシンモチーフ(Leu-Leu)でありうる。
本開示の融合タンパク質では、OTSは天然配列であってもよい、すなわち、OTSは、同様に融合タンパク質中に存在する対象とするタンパク質中に天然に見出されるものであっても、天然に共在するものであり得る。例えば、OTS及び対象とするタンパク質は、同一の天然存在のポリペプチド配列中の部分であってもよい。一具体例では、本開示の融合タンパク質は、完全長hFXN(配列番号1)に相当する同一の天然存在のポリペプチド配列の両部分である成熟hFXN及びMTS配列MWTLGRRAVAGLLASPSPAQAQTLTRVPRPAELAPLCGRRGLRTDIDATCTPRRASSNQRGLNQIWNVKKQSVYLMNLRK(配列番号10)を含むものであり得る。細胞内で合成された後、天然存在のポリペプチド配列である配列番号1がミトコンドリアマトリックスに輸入された際に、このポリペプチド配列はミトコンドリアマトリックスプロセシングペプチダーゼ(MPP)による2ステップ切断でプロセシングされる。その結果、MTSを含まない成熟hFXN(配列番号2)が生成される。
他の実施形態では、本開示の融合タンパク質に含まれるOTSは異種配列であってもよい、すなわち、同様に融合タンパク質に含まれる対象とするタンパク質と天然に共在しない。異種配列であるOTSは、融合タンパク質に含まれる対象とするタンパク質と異なるタンパク質に由来するものであり得る。例えば、本開示の融合タンパク質は、対象とするタンパク質としてFXN、例えば成熟hFXNを含み、全内容が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第8,912,147号に記載のクエン酸シンターゼ又はリポアミド脱水素酵素(LAD)に由来するMTSを含むものであり得る。異種OTSは、別のタンパク質から切断によって生成されるか、組換技術によって得られる断片であっても、化学的に合成され、対象とするタンパク質にさらに融合されるものであり得る。
一部の実施形態では、OTSは、天然タンパク質又は異種タンパク質の天然存在のOTSドメインに少なくとも85%、例えば、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものであり得る。
一部の実施形態では、本開示の融合タンパク質は、MTS、例えばMWTLGRRAVAGLLASPSPAQAQTLTRVPRPAELAPLCGRRGLRTDIDATCTPRRASSNQRGLNQIWNVKKQSVYLMNLRK(配列番号10)を含む。他の例では、本開示の融合タンパク質は、配列番号10に少なくとも85%、例えば、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、上に定義した、配列番号10の機能的な類似体、誘導体、又は断片を含むものであり得る。
一部の実施形態では、OTSは、対象とするタンパク質と天然に共在するものであってもよく、例えば、その天然存在の形態にある対象とするタンパク質は、その配列の一部としてOTSを含むものであり得る。そのような対象とするタンパク質の一例が完全長hFXN(配列番号1)であり、これは、その配列の部分として、MTS(配列番号10)及び成熟hFXN(配列番号2)を含む。OTSをその配列の一部として含む対象とするタンパク質が本開示の融合タンパク質に含まれている場合、融合タンパク質は、対象とするタンパク質の一部として存在しているOTSの他に、別のOTSを含まない。
他の実施形態では、対象とするタンパク質と天然に共在するOTSは、対象とするタンパク質と天然に共在しないOTSで置換されていてもよい。例えば、完全長hFXNの一部であり、hFXN(配列番号10)と天然に共在するMTSが、異なるOTS、例えば、米国特許第8,912,147号に記載のクエン酸シンターゼ又はリポアミド脱水素酵素(LAD)に由来するMTSで置換されていてもよい。したがって、本開示の融合タンパク質は、成熟hFXN(配列番号2)及び配列番号10とは異なるMTS、例えばLAD由来のMTSを含むものであり得る。
一部の実施形態では、OTSは、本開示の融合タンパク質に存在しない。例えば、本開示の融合タンパク質は、対象とするタンパク質、CPP、例えばHIV-TAT、及びTESを含み、OTSを欠くものであり得る。一部の実施形態では、本開示の融合タンパク質は、対象とするタンパク質、CPP、例えばHIV-TAT、及びTESからなる。
細胞透過性ペプチド(CPP)
本開示が提供する融合タンパク質は、細胞透過性ペプチド(CPP)も含む。細胞透過性ペプチド(CPP)は、様々な分子カーゴ、例えばタンパク質の細胞摂取を促進することができる典型的には長さ5アミノ酸から30アミノ酸の間の短いペプチド配列である。CPPは、ポリカチオン、すなわち、正荷電アミノ酸、例えばリジン又はアルギニンを高い相対的存在量で含有するアミノ酸組成を有するものであり得る。CCPは、また、両親媒性、すなわち、極性/荷電アミノ酸と非極性、疎水性アミノ酸の交互のパターンを含有する配列を有するものであり得る。CPPは、また、疎水性、すなわち、正味の電荷が小さい無極性残基のみを含有するか、細胞内取り込みに決定的に重要である疎水性アミノ酸基を有するものであり得る。
本開示の文脈で有用なCPPは、当業者に知られている任意のCPPでありうる。例えば、本開示の融合タンパク質に含まれるCPPは、全内容が参照により本明細書に組み込まれている細胞透過性ペプチドデータベースCPPsite2.0に列挙されている任意のCPPでありうる。例えば、本開示の文脈で有用なCPPは、HIV-TAT(本明細書において「TAT」と称されることもある)、ガラニン、マストパラン、トランスポータン、ペネトラチン、ポリアルギニン、又はVP22からなる群から選択されるものであり得る。特定の一実施形態では、CPPはHIV-TATである。下の表4に、例示的CPPのアミノ酸配列を列挙する。
[表４]
Figure 2023518996000008
一部の例では、本開示の融合タンパク質は、表4に列挙したアミノ酸配列のいずれか1つ、すなわち、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、又は配列番号83に少なくとも85%、例えば、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものであり得る。一部の例では、本開示の融合タンパク質は、表4に列挙したアミノ酸配列のいずれか1つ、すなわち、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、又は配列番号83の対象とするタンパク質の機能的な類似体、誘導体、又は断片を含むものであり得る。
一実施形態では、本開示の融合タンパク質に含まれるCPPがHIV-TAT、例えば配列番号11である。別の特定の例では、本開示の融合タンパク質に含まれるCPPがHIV-TAT(N末端メチオニンを有する)、例えば配列番号83である。別の例では、本開示の融合タンパク質は完全長FXN、例えば配列番号1を含み、CPPとしてHIV-TATを含む。さらに別の例では、本開示の融合タンパク質は、対象とするタンパク質として成熟FXN、例えば配列番号2を含み、CPPとしてHIV-TATを含む。
一部の実施形態において、特定の理論に拘束されることを望むものではないが、本開示の融合タンパク質に含まれるCPPは、同様に融合タンパク質に含まれる対象とするタンパク質の、オルガネラ、例えば非核オルガネラへの送達に干渉することができるものであってもよいと考えられる。例えば、本開示の実施例1に示されるように、TAT-GG-hFXN融合タンパク質は、ミトコンドリア内ではなく、主としてサイトゾル及び核に局在する。
標的促進配列(TES)
本開示の融合タンパク質は、標的促進配列(TES)も含む。「標的促進配列」(TES)という用語は、本明細書で使用される場合、CPPを含む融合タンパク質が存在する場合に、適切な細胞内位置への対象とするタンパク質の送達へのCPPによる干渉を防止又は減弱するアミノ酸配列を指す。例えば、一部の実施形態では、TESは、本明細書で使用される場合、意図されたオルガネラへの対象とするタンパク質の送達への、CPPによって引き起こされる干渉を除去又は減弱させることによって、意図されたオルガネラ(例えば非核オルガネラ、例えばミトコンドリア)への対象とするタンパク質の有効な送達を促進するアミノ酸配列を指す。例示的TESには、本明細書において「プロテアーゼで切断可能なドメイン」、「プロテアーゼ感受性ドメイン」、「プロテアーゼ感受性タンパク質」、又は「プロテアーゼ感受性ペプチド」とも称されるプロテアーゼ感受性配列を含めることができる。例示的TESには、核外移行シグナルペプチドも含めることができる。
プロテアーゼ感受性ペプチドは、「プロテアーゼ切断部位」とも称されることがある。プロテアーゼ感受性ペプチド又はプロテアーゼ切断部位は、特定の細胞内サイトゾルプロテアーゼによって認識され、切断されるアミノ酸配列内の特定のアミノ酸モチーフを指す。
上述の通り、一部の実施形態では、本開示の融合タンパク質において、CPPは、融合タンパク質に含まれる対象とするタンパク質の、非核オルガネラへの送達に干渉することができるものであり得る。プロテアーゼ切断部位を含むTESは、融合タンパク質からのCPPの除去を促進し、それによってCPPによる干渉を防止する。例えば、図1、パネルAに示されるように、本開示のいくつかの例示的融合タンパク質では、CPPが融合タンパク質のN末端に位置してもよく、TESがCPPのC末端側に融合していてもよい。融合タンパク質が内因性プロテアーゼに曝露される場合、内因性プロテアーゼがプロテアーゼ切断部位でTESを切断し、それにより、融合タンパク質のN末端からのCPPの除去を促進し得る。同様に、図1、パネルBに示されるように、本開示の他の例示的融合タンパク質では、CPPが融合タンパク質のC末端に位置してもよく、TESがCPPのN末端側に融合していてもよい。融合タンパク質が内因性プロテアーゼに曝露されるときに、内因性プロテアーゼがプロテアーゼ切断部位でTESを切断し、それによって、融合タンパク質のC末端からCPPを除去する可能性がある。
TESに含まれてもよいプロテアーゼ感受性ペプチドかタンパク質の非限定的な例には、ユビキチン様修飾因子、例えばユビキチン、カスパーゼ切断ドメイン、カルパイン切断ドメイン、SUMO1、SUMO2、SUMO3、SUMO4、ISG15、Atg8、Atg12、及びNEDD8が含まれる。
ユビキチンは真核生物で高度に保存されており、ヒトオーソログの配列は、MQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLHLVLRLRGG(配列番号18)である。
例示的カスパーゼ切断ドメインは、DEVD(配列番号19)を含み得る。
カルパイン切断ドメインの非限定例は、EPLFAERK(配列番号20)又はLLVY(配列番号21)である。
他の例示的プロテアーゼ切断部位は、それぞれの全内容が参照により本明細書に組み込まれているWaugh, Protein Expr. Purif. 2011, 80(2):283-293に記載されている任意の切断部位を含みうる。
特異的なプロテアーゼ切断部位を有する例示的プロテアーゼとしては、ユビキチナーゼ、カスパーゼ、カルパイン、エンテロキナーゼ(軽鎖)、エンテロペプチダーゼ、PreScissionプロテアーゼ、ヒトライノウイルスプロテアーゼ(HRV 3C)、TEV(タバコエッチウイルス)プロテアーゼ、TVMV(タバコ脈斑ウイルス)プロテアーゼ、第Xa因子プロテアーゼ、トロンビン、及び当業者に知られている他のプロテアーゼが挙げられる。下の表5は、プロテアーゼ切断部位のアミノ酸配列のいくつかの例及びそれらのそれぞれのプロテアーゼを含む。
[表５]
Figure 2023518996000009
SUMO(低分子ユビキチン様修飾因子)タンパク質は、細胞内の他のタンパク質に共有結合により連結されたり、それらのタンパク質から分離されたりして、それらの機能を改変する小さなタンパク質(長さが約100アミノ酸、分子量が約12kDa)のファミリーである。正確な長さ及び分子量は、SUMOファミリーメンバー間で異なり、そのタンパク質が由来する生物に依存する。SUMOタンパク質の例は、下の表6に列挙されているアミノ酸配列を有するSUMO1、SUMO2、SUMO3、及びSUMO4である。
[表６]
Figure 2023518996000010
一部の実施形態では、本開示の融合タンパク質に含まれるTESは、プロテアーゼ感受性ペプチド又はタンパク質を含むものであり得る。一部の例では、TESは、本明細書に記載の配列、例えば、表5に列挙した配列番号のいずれか1つ(配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、又は配列番号84)を含むもの、又は表5に列挙した配列番号のいずれか1つ(配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、又は配列番号84)と少なくとも85%、例えば少なくとも90%又は少なくとも95%の配列同一性を有する配列であり得る。一部の例では、本開示の融合タンパク質は、表5に列挙した配列番号のいずれか1つ(配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、又は配列番号84)の対象とするタンパク質の機能的な類似体、誘導体、又は断片を含むものであり得る。
他の実施形態では、本開示の融合タンパク質に含まれるTESはユビキチン様修飾因子を含むものであり得る。一部の例では、TESは、本明細書に記載の配列、例えば表6で列挙した配列番号のいずれか1つ(配列番号32、配列番号33、配列番号34、又は配列番号35)を含むもの、又は表6に列挙した配列番号のいずれか1つ(配列番号32、配列番号33、配列番号34、又は配列番号35)と少なくとも85%、例えば少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、若しくは少なくとも99%の配列同一性を有する配列であり得る。一部の例では、本開示の融合タンパク質は、表6に列挙した配列番号のいずれか1つ(配列番号32、配列番号33、配列番号34、又は配列番号35)の対象とするタンパク質の機能的な類似体、誘導体、又は断片を含むものであり得る。
配列番号22～31のいずれか、又は配列番号32～35のいずれかに少なくとも85%の配列同一性を有するアミノ酸配列は、次のデータベース:GenBank、Protein Data Bank(PDB)、SwissProt、Protein Information Resource(PIR)、又はProtein Research Foundation(PRF)のうちの1つ以上で見出され得る。
一部の例では、本開示の融合タンパク質に含まれるTESは核外移行シグナル(NES)を含むものであり得る。NESは、タンパク質中に存在している場合、細胞核から細胞質に移行するようにタンパク質を標的指向化する。タンパク質の核外移行は、核輸送を介して、核孔複合体を通って行われる。したがって、本開示の文脈において、融合タンパク質中に存在しているCPPが、対象とするタンパク質の、核への送達を促進するときに、TESは、対象とするタンパク質の、細胞質への核外移行を促進することにより、CPPによる前記作用を打ち消す。このようにして、TESは、対象とするタンパク質が、対象とする非核オルガネラ、すなわちミトコンドリアに送達されるであろう可能性を増加させる。
一部の例では、NESは、必ずしも直列でなくてもよい4個の疎水性残基を含むペプチドでありうる。例えば、NESは、アミノ酸配列LXXXLXXLXLを含み、配列中、「L」が疎水性残基(しばしばロイシン)であり、「X」がロイシン以外の任意のアミノ酸であるペプチドであってもよい。特定の理論に拘束されることを望むものではないが、決定的に重要な残基は、通常、タンパク質中で隣接している2次構造の同一面にあり、それによって、それらがエキスポーチンと相互作用できるようになっているので、NESの疎水性残基の間隔は、NESを含有する既知な構造について検査することによって説明することができると考えられる。
核外移行シグナルのデータベースであり、全内容が参照により本明細書に組み込まれているNESbaseバージョン1.0に列挙されているNESを含めた、当業者によって知られている任意のNESが、本開示に包含されている。表7は、特定の例示的なNES及びそれらの対応配列を列挙している。
[表７]
Figure 2023518996000011
本開示の一部の実施形態では、TESは、本明細書に記載の配列、例えば表7に列挙した配列番号のいずれか1つ(配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、又は配列番号43)を含むもの、又は表7に列挙した配列番号のいずれか1つ(配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、若しくは配列番号43)と少なくとも85%、例えば少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%の配列同一性を有する配列であってもよい。一部の例では、本開示の融合タンパク質は、表7に列挙した配列番号のいずれか1つ(配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、又は配列番号43)の対象とするタンパク質の機能的な類似体、誘導体、又は断片を含むものであり得る。
配列番号36～43のいずれかに少なくとも85%の配列同一性を有するアミノ酸配列は、次のデータベース:GenBank、Protein Data Bank(PDB)、SwissProt、Protein Information Resource(PIR)、又はProtein Research Foundation(PRF)のうちの1つ以上で見出される可能性がある。
融合タンパク質
本開示の一実施形態では、本明細書で提供する融合タンパク質は、非核オルガネラに送達する対象とするタンパク質、オルガネラ移行配列(OTS)、細胞透過性ペプチド(CPP)、及び標的促進配列(TES)を含む融合タンパク質であって、CPPが、非核オルガネラへの対象とするタンパク質の送達に干渉することができ、TESが、CPPによる前記干渉を防止する融合タンパク質であってもよい。一部の例では、対象とするタンパク質、OTS、CPP、及びTESが互いに直接的に融合して、直接的に単一ポリペプチド鎖を形成していてもよい。他の例では、対象とするタンパク質、OTS、CPP、及びTESは、互いにスペーサーを介して融合して、単一ポリペプチド鎖を形成していてもよい。
特定の一実施形態では、対象とするタンパク質はFXN、例えば配列番号2である。特定の一実施形態では、OTSはMTS、例えば配列番号10である。特定の一実施形態では、CPPはHIV-TAT、例えば配列番号11である。特定の一実施形態では、TESはプロテアーゼ感受性ペプチド又はタンパク質、例えばSUMO1(例えば配列番号32)、ユビキチン(例えば配列番号18)、カスパーゼ切断部位、例えばDEVD(配列番号19)、又はカルパイン切断部位、例えばEPLFAERK(配列番号20)若しくはLLVY(配列番号21)であってもよい。特定の一実施形態では、TESはNES、例えばNES1(配列番号36)又はNES2(配列番号37)であってもよい。
本開示の一実施形態では、本明細書に提供する融合タンパク質は、細胞に送達する対象とするタンパク質、細胞透過性ペプチド(CPP)、及び標的促進配列(TES)を含むものであり得る。一部の実施形態では、CPPは、細胞及び/又は細胞オルガネラへの対象とするタンパク質の送達に干渉することができ、TESは、CPPによる前記干渉を防止する。一部の例では、対象とするタンパク質、CPP、及びTESが互いに直接的に融合して、直接的に単一ポリペプチド鎖を形成してもよい。他の例では、対象とするタンパク質、CPP、及びTESが互いにスペーサーを介して融合して、単一ポリペプチド鎖を形成してもよい。
特定の一実施形態では、対象とするタンパク質はPARKIN、例えば配列番号7である。特定の一実施形態では、CPPはHIV-TAT、例えば配列番号11である。特定の一実施形態では、TESはプロテアーゼ感受性ペプチド又はタンパク質、例えばSUMO1、(例えば配列番号32)、ユビキチン(例えば配列番号18)、カスパーゼ切断部位、例えばDEVD(配列番号19)、又はカルパイン切断部位例えばEPLFAERK(配列番号20)若しくはLLVY(配列番号21)であってもよい。特定の一実施形態では、TESはNES、例えばNES1(配列番号36)又はNES2(配列番号37)であってもよい。
本開示によって提供される融合タンパク質では、対象とするタンパク質、OTS(存在している場合)、CPP、及びTESの、相互に対する並びにN末端及びC末端に対する位置は様々でありうる。対象とするタンパク質、OTS、CPP、及びTESの様々な相対的配置を含む例示的融合タンパク質を図2に示す。例えば、図2、パネルAに示されるように、例示的融合タンパク質は、N末端から開始して、CPPを含み、TESがそれに続き、OTSがそれに続き、C末端で対象とするタンパク質がそれに続くものであり得る。図2、パネルBに示す別の例では、融合タンパク質は、N末端から開始して、CPPを含み、TESがそれに続き、対象とするタンパク質がそれに続き、C末端でOTSがそれに続くものであり得る。図2、パネルCに示す別の例では、例示的融合タンパク質が、N末端から開始して、OTSを含み、対象とするタンパク質がそれに続き、TESがそれに続き、C末端でCPPがそれに続くものであり得る。図2、パネルDに示す別の例では、融合タンパク質は、N末端から開始して、対象とするタンパク質を含み、OTSがそれに続き、TESがそれに続き、C末端でCPPがそれに続くものであり得る。図2、パネルEに示す別の例では、融合タンパク質は、N末端から開始して、CPPを含み、OTSがそれに続き、対象とするタンパク質がそれに続き、TESがそれに続くものであり得る。図2、パネルFに示すさらに別の例では、融合タンパク質は、N末端で開始して、TESを含み、OTSがそれに続き、対象とするタンパク質がそれに続き、CPPがそれに続くものであり得る。図2、パネルGに示すさらに別の例では、融合タンパク質は、N末端で開始して、CPPを含み、TESがそれに続き、対象とするタンパク質がそれに続くものであり得る。図2、パネルHに示すさらに別の例では、融合タンパク質は、N末端で開始して、対象とするタンパク質を含み、TESがそれに続き、CPPがそれに続くものであり得る。
一部の例では、本開示の融合タンパク質において、様々なドメイン(すなわち、対象とするタンパク質、CPP、存在する場合はOTS、及びTES)が互いに直接的に融合して、単一ポリペプチド鎖を形成していてもよい。本明細書で使用される場合、「直接的に」という用語は、互いに直接的に融合している第1のドメインのC末端アミノ酸と第2のドメインのN末端アミノ酸の間に干渉する（介在する）アミノ酸が無いことを意味する。すなわち、第1のドメインの末端(N又はC末端)の(最初又は最後)のアミノ酸が、第2のドメインの末端(N又はC末端)の(最初又は最後)のアミノ酸に融合して、単一ポリペプチドを形成していてもよい。換言すれば、この実施形態では、第1のドメインのC末端の最後のアミノ酸が、第2のドメインのN末端の最初のアミノ酸に共有結合で直接的に連結するか、又は第1のドメインのN末端の最初のアミノ酸が、第2のドメインのC末端の最後のアミノ酸に共有結合で直接的に連結して、単一ポリペプチドを形成している。
他の例では、本開示の融合タンパク質において、様々なドメイン(すなわち、対象とするタンパク質、CPP、存在する場合にはOTS、及びTES)は、スペーサーを介して一緒に融合して、単一ポリペプチド鎖を形成していてもよい。本明細書で使用される場合、「スペーサー」という用語は、「リンカー」という用語と互換的に使用することができ、2つのドメインを結びつけて単一ポリペプチド鎖を形成する少なくとも1個のアミノ酸の配列を指す。融合タンパク質に含まれている場合、スペーサーは、立体障害を防止しうる。一部の例では、スペーサー又はリンカーの長さが2アミノ酸から31アミノ酸まで、例えば2アミノ酸から10アミノ酸まで、5アミノ酸から15アミノ酸まで、10アミノ酸から25アミノ酸まで、又は12アミノ酸から31アミノ酸まで変動しうる。当業者ならば、リンカー又はスペーサーが融合タンパク質のコンフォメーションにいかなる制約も、融合タンパク質のドメイン相互の相互作用も強いないような、それぞれの特定の融合タンパク質用に適切なリンカー又はスペーサーの長さを決定することができるであろう。リンカー又はスペーサーは、タンパク質内でドメインを分離するか、二量体を形成のための役割を果たしている前に記載した内因性かつ天然存在のリンカー又はスペーサーであってもよい。或いは、リンカー又はスペーサーは、融合タンパク質の生成のための組換技術で有用な人工的に設計されたリンカー又はスペーサーであってもよい。本開示の文脈の中で有用なリンカー又はスペーサーの例を下の表8に示す。
[表８]
Figure 2023518996000012
一部の実施形態では、本開示の融合タンパク質はGG(Gly-Gly)リンカーを含んでいてもよい。例えば、本開示の融合タンパク質は、CPPドメインをTESドメイン、例えばプロテアーゼ切断部位に接続するGGリンカーを含んでいてもよい。別の例では、本開示の融合タンパク質は、CPPドメインをOTSドメイン、例えばMTSに接続するGGリンカーを含んでいてもよい。特定の一実施形態では、TAT-CPPはGGリンカーを介してMTS-FXNに接続される。
本開示の例示的融合タンパク質及びそれらの対応配列を下の表9に列挙する。
[表９]
Figure 2023518996000013
Figure 2023518996000014
Figure 2023518996000015
一部の実施形態では、本開示が提供する融合タンパク質は、表9に列挙したいずれか1つの配列、すなわち、配列番号55～61、69～71又は81(配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号69、配列番号70、配列番号71、又は配列番号81)のいずれかを含むか、又はそれからなる。一部の実施形態では、本開示が提供する融合タンパク質は、表9に記載したいずれか1つの配列、例えば、配列番号55～61、69～71又は81(配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号69、配列番号70、配列番号71、又は配列番号81)のいずれかに少なくとも85%、例えば、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。一部の実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表9に列挙したいずれか1つの配列、すなわち、配列番号55～61(配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号69、配列番号70、配列番号71、又は配列番号81)のいずれかの機能的な類似体、誘導体、又は断片を含むか、又はそれからなるものであり得る。
一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号55に記載のアミノ酸配列を有するTAT-GG-SUMO1-hFXNを含むか、又はそれからなる。一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号81に記載のアミノ酸配列を有するTAT-SS_SUMO-hFXNを含むか、又はそれからなる。一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号56に記載のアミノ酸配列を有するTAT-GG-ユビキチン-hFXNを含むか、又はそれからなる。一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号57に記載のアミノ酸配列を有するTAT-GG-DEVD-hFXNを含むか、又はそれからなる。一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号58に記載のアミノ酸配列を有するTAT-GG-EPLFAERK-hFXNを含むか、又はそれからなる。一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号59に記載のアミノ酸配列を有するTAT-GG-LLVY-hFXNを含むか、又はそれからなる。一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号60に記載のアミノ酸配列を有するTAT-GG-hFXN-NES1を含むか、又はそれからなる。一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号61に記載のアミノ酸配列を有するTAT-GG-hFXN-NES2を含むか、又はそれからなる。一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号69に記載のアミノ酸配列を有するTAT-GG-ユビキチン-PARKINを含むか、又はそれからなる。一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号70に記載のアミノ酸配列を有するTAT-GG-EPLFAERK-PARKINを含むか、又はそれからなる。一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号71に記載のアミノ酸配列を有するTAT-PARKIN-NES1を含むか、又はそれからなる。
一部の実施形態では、本開示が提供する融合タンパク質は、1) 対象とするタンパク質である完全長hFXN(配列番号1)に少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列、2)本明細書に記載の任意のCPP、及び3)本明細書に記載の任意のTESを含む。
一部の実施形態では、本開示が提供する融合タンパク質は1) 対象とするタンパク質である完全長hFXN(配列番号1)に少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列、2)TAT-HIV(配列番号11又は配列番号83)に少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%を有するアミノ酸配列、及び3)本明細書に記載の任意のTESを含む。
例えば、本開示の融合タンパク質は、1) 対象とするタンパク質である完全長hFXN(配列番号1)に少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列、2)TAT-HIV(配列番号11又は配列番号83)に少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%を有するアミノ酸配列、3)ユビキチン(配列番号18)に少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%を有するアミノ酸配列を含むものであり得る。
例えば、本開示の融合タンパク質は、1) 対象とするタンパク質である完全長hFXN(配列番号1)に少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列、2)TAT-HIV(配列番号11)に少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%を有するアミノ酸配列、及び3)配列番号20のカルパイン切断ドメインに少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%又は少なくとも99%を有するアミノ酸配列を含むものであり得る。
例えば、本開示の融合タンパク質は、1) 対象とするタンパク質である完全長hFXN(配列番号1)に少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列、2)TAT-HIV(配列番号11又は配列番号83)に少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%を有するアミノ酸配列、及び3)配列番号19、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、又は配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、及び配列番号35のいずれか1つに少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%を有するアミノ酸配列を含むものであり得る。
一部の実施形態では、本開示が提供する融合タンパク質は1) 対象とするタンパク質であるPARKIN(配列番号7)に少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列、2)本明細書に記載の任意のCPP、及び3)本明細書に記載の任意のTESを含む。
一部の実施形態では、本開示が提供する融合タンパク質は1) 対象とするタンパク質であるPARKIN(本明細書において「PARK2タンパク質」とも称する、配列番号7)に少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列、2)TAT-HIV(配列番号11)に少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%を有するアミノ酸配列、及び3)本明細書に記載の任意のTESを含む。
例えば、本開示の融合タンパク質は、1) 対象とするタンパク質であるPARKIN(配列番号7)に少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列、2)TAT-HIV(配列番号11又は配列番号83)に少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%を有するアミノ酸配列、及び3)ユビキチン(配列番号18)に少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%を有するアミノ酸配列を含むものであり得る。
例えば、本開示の融合タンパク質は、1) 対象とするタンパク質であるPARKIN(配列番号7)に少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列、2)TAT-HIV(配列番号11又は配列番号83)に少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%を有するアミノ酸配列、及び3)配列番号20のカルパイン切断ドメインに少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%を有するアミノ酸配列を含むものであり得る。
例えば、本開示の融合タンパク質は、1) 対象とするタンパク質であるPARKIN(配列番号7)に少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列、2)TAT-HIV(配列番号11又は配列番号83)に少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%を有するアミノ酸配列、及び3)配列番号19、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、又は配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34及び配列番号35のいずれか1つに少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%又は少なくとも99%を有するアミノ酸配列を含むものであり得る。
一部の実施形態では、本開示が提供する融合タンパク質の1つ以上は、真核生物細胞、例えば哺乳動物細胞、例えばヒト細胞に特徴的な翻訳後修飾も含むものであり得る。一部の実施形態では、融合タンパク質は、1つ以上(例えば2、3、4、5、6、7、8、9、10、又は11以上)の翻訳後修飾、例えばグリコシル化、リン酸化、アセチル化、又はこれらの組合せを含むものであり得る。一部の実施形態では、グリコシル化は、アルギニン、アスパラギン、システイン、ヒドロキシリジン、セリン、スレオニン、チロシン、又はトリプトファンへのグリコシル基の付加を含み得る。グリコシル化は、例えばO結合型グリコシル化又はN結合型グリコシル化を含みうる。本開示の融合タンパク質のグリコシル化のレベルは、SDS-PAGEゲル及びウエスタンブロットを使用し、過ヨウ素酸シッフ(PAS)法の変法を使用してインビトロで評価してもよい。グリコシル化を含む可能性のある融合タンパク質の細胞局在は、当技術分野で知られているレクチン蛍光コンジュゲートを用いることによって達成することが可能である。本開示の融合タンパク質中に存在しうるリン酸化は、リン酸化特異的抗体を使用してウエスタンブロットによって評価してもよい。
本開示の融合タンパク質中に存在しうる翻訳後修飾は、疎水基への結合(例えば、ミリストイル化、パルミトイル化、イソプレニル化、プレニル化、又はGPI化)、補因子への結合(例えば、リポイル化、フラビン部分(例えば、FMN又はFAD)、ヘムC結合、ホスホパンテテイニル化、又はレチニリデンシッフ塩基形成)、ジフタミド形成、エタノールアミンホスホグリセロール結合、ハイプシン形成、アシル化(例えばO-アシル化、N-アシル化、又はS-アシル化)、ホルミル化、アセチル化、アルキル化(例えばメチル化又はエチル化)アミド化、ブチリル化、ガンマ-カルボキシル化、マロニル化、ヒドロキシル化、ヨウ素化、ヌクレオチド添加、例えばADPリボシル化、酸化、リン酸エステル(O結合型)又はホスホラミデート(N結合型)形成(例えばリン酸化又はアデニリル化)、プロピオニル化、ピログルタミン酸形成、S-グルタチオン化、S-ニトロシル化、スクシニル化、硫酸化、ISG化、SUMO化、ユビキチン化、NEDD化、又はアミノ酸の化学修飾(例えばシトルリン化、脱アミド、エリミニル化(eliminylation)、又はカルバミル化)、ジスルフィド架橋の形成、ラセミ化(例えばプロリン、セリン、アラニン、又はメチオニンのラセミ化)も含み得る。
核酸
本開示は、上述の融合タンパク質又はその任意のバリアントをコードする核酸も提供する。
本明細書で使用される場合、「核酸」という用語は、「ポリヌクレオチド」という用語と互換的であり、一般に、無修飾のRNA若しくはDNA、又は修飾RNA若しくはDNA、又は任意のこれらの組合せでありうる任意のポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドを指す。「核酸」という用語には、非限定的に、一本鎖核酸及び二本鎖核酸が含まれる。
本開示は、本明細書に記載の融合タンパク質又はそのバリアントを提供する。本開示が提供するバリアントは、アミノ酸配列及び核酸配列の両方に適用される保存的に置換されたバリアントを含み得る。核酸配列に関しては、保存的に改変されたバリアントは、同じか、又は本質的に同じアミノ酸配列をコードする核酸を指す。具体的には、縮重コドン置換は、1個以上の選択された(又はすべての)コドンの第3位が混合塩基及び/又はデオキシイノシン残基で置換されている配列を生成することによって実現することができる。遺伝暗号の縮重のため、多数の機能的に同一な核酸が任意の所与のタンパク質をコードする。例えば、GCA、GCC、GCG、及びGCUというコドンがすべて、アミノ酸であるアラニンをコードしている。したがって、コドンによってアラニンが指定されているあらゆる位置で、コードされたポリペプチドを変えずに、コドンを、記載されている対応するコドンのうち任意のものに変えることができる。そのような核酸バリエーションは、サイレントバリエーションであり、これは、保存的な改変バリエーションの一種である。ポリペプチドをコードする本明細書に記載のあらゆる核酸配列は、核酸のあらゆる可能なサイレントバリエーションをも記載する。当業者であれば、核酸における各コドン(通常はメチオニンの唯一のコドンであるAUG及び通常はトリプトファンの唯一のコドンであるTGGを除く)を改変して、機能的に同一なポリペプチドをコードすることができることを認識するであろう。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレントバリエーションが、記載されている各配列に潜在している。
アミノ酸配列の保存的置換に関しては、当業者であれば、コードされた配列中の単一アミノ酸又は小さな割合のアミノ酸を改変、付加、又は除去する核酸、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質配列への個々の置換、欠失、又は付加が、あるアミノ酸から化学的に類似のアミノ酸への置換を改変がもたらす場合、保存的な改変バリアントであることを認識し得る。機能的に類似しているアミノ酸を示す保存的置換表が当技術分野でよく知られている。そのような保存的な改変バリアントは、本開示の多型バリアント、種間相同体、及び対立遺伝子への追加であり、それらを除外するものではない。
以下の群はそれぞれ、互いに保存的置換であるアミノ酸を含有する。
1)アラニン(A)、グリシン(G)、
2)セリン(S)、スレオニン(T)、
3)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)、
4)アスパラギン(N)、グルタミン(Q)、
5)システイン(C)、メチオニン(M)、
6)アルギニン(R)、リジン(K)、ヒスチジン(H)、
7)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、バリン(V)、
8)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)。
下の表10に、本開示の融合タンパク質をコードする特定の例示的核酸を列挙する。
［表１０］
Figure 2023518996000016
Figure 2023518996000017
Figure 2023518996000018
Figure 2023518996000019
Figure 2023518996000020
一部の実施形態では、本開示の融合タンパク質をコードする核酸配列は、表10に列挙したいずれか1つの配列、すなわち、配列番号62～68(配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号86、配列番号87、又は配列番号88)のいずれかを含む。一部の実施形態では、本開示が提供する融合タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号62～68(配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号86、配列番号87、又は配列番号88)のいずれかに、少なくとも85%、例えば、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を有する配列を含む。
一実施形態では、融合タンパク質TAT-GG-SUMO1-hFXNをコードする核酸配列は配列番号62に記載の配列を有する。一実施形態では、融合タンパク質TAT-GG-ユビキチン-hFXNをコードする核酸配列は配列番号63に記載の配列を有する。一実施形態では、融合タンパク質TAT-GG-DEVD-hFXNをコードする核酸配列は配列番号64に記載の配列を有する。一実施形態では、融合タンパク質TAT-GG-EPLFAERK-hFXNをコードする核酸配列は配列番号65に記載の配列を有する。一実施形態では、融合タンパク質TAT-GG-LLVY-hFXNをコードする核酸配列は配列番号66に記載の配列を有する。一実施形態では、融合タンパク質TAT-GG-hFXN-NES1をコードする核酸配列は配列番号67に記載の配列を有する。一実施形態では、融合タンパク質TAT-GG-hFXN-NES2をコードする核酸配列は配列番号68に記載の配列を有する。一実施形態では、融合タンパク質TAT-GG-ユビキチン-PARKINをコードする核酸配列は配列番号86に記載の配列を有する。一実施形態では、融合タンパク質TAT-GG-EPLFAERK-PARKINをコードする核酸配列は配列番号87に記載の配列を有する。一実施形態では、融合タンパク質TAT-GG-PARKIN-NES1をコードする核酸配列は配列番号88に記載の配列を有する。
本開示は、本明細書に定義した融合タンパク質を細胞、例えば哺乳動物細胞、細菌細胞、又は真菌細胞で生成するための発現ベクターも提供する。本開示の発現ベクターは、本開示の融合タンパク質をコードする核酸、例えば配列番号62～68のいずれか1つを含むものであり得る。例として、発現ベクターは、レトロウイルスベクター、DNAベクター、プラスミド、RNAベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルス随伴ベクター、レンチウイルスベクター、ファージミド、バキュロウイルス、又は任意のこれらの組合せであってもよい。
ベクター
ベクターは、DNA断片又は核酸配列の宿主ゲノムへの組み込みを可能にするもの、又は組み込まれていない遺伝エレメントの発現を可能にし得る。ベクターは、典型的には、所望の核酸配列を含有し、適した宿主細胞内で認識され、所望のスペーサーの翻訳をもたらす遺伝子制御エレメントに作用可能に連結している自己複製するDNA又はRNAコンストラクトである。一般に、遺伝子制御エレメントは、原核細胞のプロモーターシステム又は真核細胞プロモーター発現制御システムを含みうる。そのようなシステムは、典型的には、RNA発現のレベルを上げるための転写プロモーター及び転写エンハンサーを含む。ベクターは、通常、ベクターが宿主細胞とは独立に複製するのを可能にする複製開始点を含有する。したがって、制御及び調節エレメントという用語は、プロモーター、ターミネータ、及び他の発現制御エレメントを含む。そのような調節エレメントは、当技術分野で記載されており、当業者に知られている。例えば、それに作用可能に連結された場合にDNA配列の発現を制御する広範な発現制御配列のうちの任意のものをこれらのベクターで使用して、本明細書に記載の任意の所望の融合タンパク質をコードするDNA配列を発現することができる。
ベクターは、適切な制限部位、ベクター含有細胞を選択するための抗生物質耐性又は他のマーカーをさらに含みうる。プラスミドが最もよく使用されているベクター形態であるが、当技術分野で知られているか、知られるようになる同等の機能を果たす他の形態のベクターも、ここでの使用に適している。
ベクターは、コンストラクトとも、組換え体核酸とも称されることがある。本明細書で言及される場合、「組換え体DNA」、「組換え体核酸配列」、又は「組換え体遺伝子」という用語は、本明細書に記載の融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム(ORF)を含む核酸を指す。本明細書に記載の融合タンパク質をコードするORFを含むコンストラクトは、本明細書に記載の核酸配列に作用可能に連結した追加のエレメント、例えば、プロモーター、調節及び制御エレメント、翻訳、発現、及び他のシグナルを、場合により、さらに含んでいてもよい。本明細書で使用する「作用可能に連結した」という用語は、導入遺伝子の転写が可能となるように結合していることを意味するものとする。本明細書で使用する「コードする」という用語は、適切な発現系で対象核酸が転写され、所望のポリペプチド又は対象とするタンパク質に翻訳されることが可能であること、例えば、対象核酸が、適したベクター(例えば発現ベクター)中で適切な制御配列、例えばプロモーター及びエンハンサーエレメントに連結されている場合及びベクターが適切なシステム又は細胞内に導入されている場合を意味するものとする。
一部の実施形態によれば、本開示の融合タンパク質をコードする組換え体DNAはベクター、例えば細胞内への組み込みが可能なレンチウイルスベクタープラスミド中にクローニングされていてもよい。一部の実施形態によれば、1つ以上の融合タンパク質をコードする組換え体DNAは、選択可能な形質、例えば抗生物質耐性遺伝子をコードするプラスミドDNAコンストラクト中にクローニングされていてもよい。一部の実施形態によれば、融合タンパク質をコードする組換え体DNAは、細胞で融合タンパク質を安定的に発現するように適合されたプラスミドコンストラクト中にクローニングされていてもよい。
コンジュゲート
本開示は、対象とするタンパク質を非核オルガネラに細胞内送達するためのコンジュゲートも提供する。本開示のコンジュゲートは、本開示で定義した融合タンパク質及び標識、例えば、放射性標識、蛍光標識、発色団標識、酵素標識、ペプチド標識、若しくはタンパク質標識、小分子、又は重合体(例えばポリエチレングリコール、PEG)の少なくとも1つを含むものであり得る。
細胞
本開示は、本明細書に記載の融合タンパク質、核酸、ベクター、コンジュゲート、又は任意のこれらの組合せのいずれか1つを含む細胞も提供する。一部の態様では、細胞は幹細胞又はiPS細胞であってもよい。他の態様では、細胞は、筋前駆細胞、ニューロン前駆細胞、骨髄幹細胞、細菌細胞、又は酵母細胞からなる群から選択されるものであり得る。例として、細胞は、筋又は筋前駆細胞、線維芽細胞、表皮細胞、心臓細胞、幹細胞、胚幹細胞、多能性細胞、ニューロン、骨髄幹細胞のいずれか1つであってもよく、酵母細胞株又は細菌細胞株も含まれる。
特定の実施形態では、融合タンパク質、核酸、ベクター、コンジュゲート、又は任意のこれらの組合せを含む細胞は、長期造血幹細胞、短期造血幹細胞、多能性前駆細胞、系譜限定前駆細胞(lineage restricted progenitor cell)、リンパ球前駆細胞、骨髄球系前駆細胞、骨髄球性共通前駆細胞、赤血球前駆細胞、巨核球-赤芽球前駆細胞、網膜細胞、光受容体細胞、杆体細胞、錐体細胞、網膜色素上皮細胞、線維柱帯網細胞、内耳有毛細胞、外有毛細胞、内有毛細胞、肺上皮細胞、気管支上皮細胞、肺胞上皮細胞、肺上皮前駆細胞、横紋筋細胞、心筋細胞、筋サテライト細胞、ニューロン、ニューロン幹細胞、間葉系幹細胞、人工多能性幹(iPS)細胞、胚性幹細胞、線維芽細胞、単球由来マクロファージ又は樹状細胞、巨核球、好中球、好酸球、好塩基球、マスト細胞、細胞、B細胞、例えば前駆B細胞、プレB細胞、プロB細胞、メモリーB細胞、プラズマB細胞、胃腸上皮細胞、胆管上皮細胞、膵管上皮細胞、腸幹細胞、肝細胞、肝星細胞、クッパー細胞、骨芽細胞、破骨細胞、脂肪細胞、前脂肪細胞、膵島細胞(例えばベータ細胞、アルファ細胞、デルタ細胞)、膵外分泌細胞、シュワン細胞、及びオリゴデンドロサイトからなる群から選択されるものでもよい。
一部の実施形態では、融合タンパク質を含む細胞は分裂細胞である。他の実施形態では、融合タンパク質を含む細胞は非分裂細胞である。
一部の実施形態では、本開示の融合タンパク質を含む細胞は、対象、例えば融合タンパク質が、例えば病的状態、例えば遺伝性障害を処置するために投与される対象の中にあってもよい。一部の例では、病的状態は非核オルガネラ関連障害であってもよい。特定の一例では、病的状態はフリードライヒ運動失調症である。
特定の一例では、フリードライヒ運動失調症を処置するために、本開示の融合タンパク質、例えば配列番号55～61のいずれかを対象に投与してもよい。他の例では、ミトコンドリア障害、例えば、ミトコンドリアミオパチー、糖尿病、及び聴覚消失、レーベル遺伝性視神経症、ニューロパチー、網膜色素変性、眼瞼下垂(NARP)、筋神経胃腸脳症(myoneurogenic gastrointestinal encephalopathy)、ミオクローヌスてんかん、アルツハイマー病、筋ジストロフィー、ルー-ゲーリック病、及びがんを処置するために、本開示の融合タンパク質を対象に投与してもよい。さらに他の例では、リソソーム障害、例えばスフィンゴリピドーシス疾患の群の脂質蓄積症(例えば、ニーマン-ピック病、ファブリー病、クラッベ病、ゴーシェ病、テイ-サックス病、又は異染性白質ジストロフィー)、ハンター症候群、I細胞病、マルチプルスルファターゼ欠損症、ムコリピドーシスII型及びIIIA型、ガラクトシアリドーシス、GM2-AP欠損症、SAP欠損症、及びサラ病を処置するために、本開示の融合タンパク質を対象に投与してもよい。さらに他の例では、パーキンソン病を処置するために、本開示が提供する融合タンパク質、例えば配列番号69～71のいずれかを対象に投与してもよい。
他の実施形態では、本開示の融合タンパク質を含む細胞は、融合タンパク質を発現するように操作された細胞であってもよい。一部の例では、そのように操作された細胞は対象から得たもの、例えば単離されたものであり得る。本開示の融合タンパク質を発現するように細胞を操作する方法は当業者に知られており、本明細書において下記「細胞内送達のための方法」という表題のセクションに記載する方法を含む。
医薬組成物
本開示は、上記の融合タンパク質又はコンジュゲート並びに薬学的に許容できる希釈剤、担体、添加剤、及び/又は賦形剤を含む医薬組成物も提供する。
医薬組成物の調製については、例えば、それぞれの全内容が参照により本明細書に組み込まれているHoover, John E.(編集) Remington's Pharmaceutical Sciences、Mack Publishing Co.、米国ペンシルベニア州Easton、第18版(1990)、並びにLiberman, H. A.及びLachman, L. (編集) Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker、米国ニューヨーク州New York(1989)に論じられている。
医薬組成物は、例えば、細胞を医薬組成物と接触させることによって、インビトロで細胞に送達してもよい。或いは、インビボで送達するために、本開示で提供する医薬組成物を、望ましい従来の無毒な薬学的に許容される担体、補助剤、及び媒体を含有する投与単位製剤にて、経口的に、非経口的に、吸入スプレーによって、直腸性に、皮内に、経皮的に、又は局所的に投与してもよい。局所投与は、経皮投与、例えば経皮パッチ又はイオン泳動装置の使用も伴う。本明細書で使用される、非経口的という用語には、皮下、静脈内、筋肉内、胸骨内注射又は注入技法が含まれる。
注射用医薬組成物、例えば無菌注射用水性又は油性懸濁剤は、適した分散剤又は湿潤剤及び懸濁化剤を使用して、当技術分野で知られている技法によって製剤することができる。無菌注射用医薬組成物は、無毒な非経口投与に許容できる希釈剤又は溶媒、例えば1,3-ブタンジオールによる無菌注射用溶液又は懸濁液であってもよい。用いてもよい許容できる媒体及び溶媒としては、水、リンゲル液、及び等張食塩水が挙げられる。加えて、無菌の不揮発性油が溶媒又は懸濁化培地として慣習的に用いられている。この目的には、合成モノグリセリド又はジグリセリドを含めた任意の無刺激不揮発性油を用いることができる。加えて、脂肪酸、例えばオレイン酸が注射剤の調製に有用である。ジメチルアセトアミド、イオン性界面活性剤及び非イオン性界面活性剤を含めた界面活性物質、並びにポリエチレングリコールを使用することができる。溶媒及び湿潤剤、例えば上で論じたものの混合物も有用である。
非経口投与用の医薬組成物は、水性又は非水性の等張無菌注射用溶液又は懸濁液の形態にはあってもよい。これらの溶液及び懸濁液は、経口投与用製剤中での使用について言及した1種以上の担体又は希釈剤を有する無菌の粉末又は顆粒から調製してもよい。融合タンパク質又は組成物を水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノール、コーン油、綿実油、ピーナッツ油、ゴマ油、ベンジルアルコール、塩化ナトリウム、及び/又は様々なバッファーに溶解させることができる。投与の他の補助剤及び方法は、製薬技術分野で広くよく知られている。
経口投与用の液体剤形としては、当技術分野でよく使用されている不活性な希釈剤、例えば水を含有する、薬学的に許容できる乳剤、液剤、懸濁剤、シロップ、及びエリキシル剤を挙げることができる。そのような医薬組成物は、補助剤、例えば湿潤剤、乳化及び懸濁化剤、並びに甘味剤、矯味矯臭剤、及び芳香剤も含んでいてもよい。
経口投与用の固形剤形としては、カプセル剤、錠剤、丸剤、散剤、及び顆粒を挙げることができる。そのような固体剤形では、融合タンパク質を、ラクトース、スクロース、ショ糖粉末、アルカン酸のセルロースエステル、セルロースアルキルエステル、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、酸化マグネシウム、リン酸及び硫酸のナトリウム塩及びカルシウム塩、ゼラチン、アカシアゴム、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、及び/又はポリビニルアルコールと混合し、その後好都合な投与用打錠又はカプセル封入してもよい。そのようなカプセル剤又は錠剤は、ヒドロキシプロピルメチルセルロース中に活性化合物を分散させたもので提供することができるような、放出制御製剤を含有してもよい。カプセル剤、錠剤、及び丸剤の場合、剤形は、緩衝剤、例えばクエン酸ナトリウム、マグネシウム、又は炭酸カルシウム若しくは炭酸水素カルシウムも含んでいてもよい。錠剤及び丸剤を腸溶コーティングでさらに調製してもよい。
本明細書で論じた融合タンパク質の直腸投与用の坐剤は、常温では固体であるが直腸温では液体でありそれゆえ直腸で融解し薬物を放出するであろう適した非刺激性賦形剤、例えばココアバター、合成モノグリセリド、ジグリセリド、若しくはトリグリセリド、脂肪酸、又はポリエチレングリコールと、活性薬剤を混合することによって調製することができる。
本開示の融合タンパク質は、様々な方法で、例えば、経口的、経腸的、粘膜、経皮的、又は非経口的に投与することができる。非経口投与、特に、当業者に利用可能であるポンプを用いた持続注入か間欠注入を含めた静脈内、筋肉内、皮下、皮内、関節内、くも膜下腔内、及び腹腔内注入又は注射によるものが好ましい。或いは、融合タンパク質は、マイクロカプセル、例えばリポソームベースのものに封入した製剤によって投与してもよい。
細胞内送達のための方法
一部の実施形態では、本開示は、対象とするタンパク質の、細胞内の非核オルガネラへの細胞内送達のための方法も提供する。この方法は、本明細書中、上に記載の融合タンパク質、核酸、ベクター、又はコンジュゲートと細胞を接触させることを含む。一例では、非核オルガネラはミトコンドリアである。一例では、対象とするタンパク質はFXN、例えばヒトFXNである。
細胞を本開示の融合タンパク質と接触させることは、本開示のための融合タンパク質、核酸、ベクター、コンジュゲート、医薬組成物、又は任意のこれらの組合せを対象、例えばヒトに投与する文脈で起こりうる。対象は、病的状態、例えば遺伝性障害、例えば非核オルガネラ関連障害を有していてもよい。特定の一例では、病的状態はフリードライヒ運動失調症である。
一部の実施形態では、対象とするタンパク質の、非核オルガネラへの細胞内送達のための方法は、本開示の融合タンパク質をコードする核酸又は本開示の核酸を含むベクターと細胞を接触させることによって、細胞、例えば単離された細胞を接触させることを含むものでありうる。一部の態様では、細胞は幹細胞又はiPS細胞である。他の態様では、細胞を、筋前駆細胞、ニューロン前駆細胞、骨髄幹細胞、細菌細胞、又は酵母細胞からなる群から選択することができる。一部の態様では、細胞は、本開示の融合タンパク質をコードする核酸を有する筋前駆細胞、ニューロン前駆細胞、骨髄幹細胞、細菌細胞株、又は酵母細胞株であってもよい。この方法は、本開示の核酸又はベクターの送達を細胞内に促進するための追加ステップ、例えば、エレクトロポレーション、化学的若しくは重合体形質移入、ウイルス性形質導入、機械的膜破壊、又は当業者に知られている他の方法をさらに含んでもよい。
一部の実施形態では、本開示は、細胞に送達される対象とするタンパク質の量を増加させる方法も提供する。本開示、例えば実施例6に含まれる特定の実験データによって実証されるように、対象とするタンパク質、CPP、及びTESを含む融合タンパク質で処置した細胞は、対象とするタンパク質及びCPPを含むがTESを含まない融合タンパク質で処置した細胞より有意に多い量の対象とするタンパク質を含有した。したがって、実験データは、細胞内の対象とするタンパク質の送達及び/又は蓄積をTESが促進することを示している。したがって、CPP及び対象とするタンパク質を含む融合タンパク質にTESを導入することは、細胞内の対象とするタンパク質の量を有意に増加させる。
特定の理論に拘束されることを望むものではないが、細胞内の内因性プロテアーゼによるTESの切断によって融合タンパク質からのCPPの排除が促進され、対象とするタンパク質が原形質膜を横断し、細胞の外に拡散するのをCPPが促進するのが防止されると考えられる。これにより、対象とするタンパク質の細胞内蓄積が可能となり、細胞に送達される対象とするタンパク質の量の増加がもたらされる。
一部の実施形態では、細胞は対象中、例えばヒトの中にあってもよい。したがって、細胞に送達される対象とするタンパク質の量を増加させる方法は、治療、例えば非核オルガネラ関連障害を処置するための治療の一部として対象に送達する融合タンパク質の用量の低減を可能にしうる。
一部の実施形態では、対象とするタンパク質はFXNであってもよい。したがって、一部の実施形態では、融合タンパク質は、CPP(例えば配列番号11又は配列番号83)、TES、及びFXN(例えば配列番号1又は配列番号2)を含むものであってもよく、対象がFXN欠乏に関連する障害、例えばフリードライヒ運動失調症を有していてもよい。他の実施形態では、融合タンパク質は、CPP(例えば配列番号11又は配列番号83)、TES、及びFXN(例えば配列番号1又は配列番号2)を含むものであってもよく、対象がFXN欠乏に関連しない障害、例えばリー症候群フランス-カナダ型を有していてもよい。
一部の実施形態では、対象とするタンパク質はPARKINであってもよい。したがって、一部の実施形態では、融合タンパク質は、CPP(例えば配列番号11又は配列番号83)、TES、及びPARKIN(例えば配列番号7)を含むものであってもよく、対象は、PARKINをコードするPARK2遺伝子の突然変異に関連するパーキンソン病を有していてもよい。他の実施形態では、融合タンパク質は、CPP(例えば配列番号11又は配列番号83)、TES、及びPARKIN(例えば配列番号7)を含むものであってもよく、対象は、PARKINをコードするPARK2遺伝子の突然変異に関連しないパーキンソン病、例えばPINK1(PARK6)遺伝子の突然変異に関連するパーキンソン病を有していてもよい。
一部の態様では、本開示が提供する細胞に送達される対象とするタンパク質の量を増加させる方法は、融合タンパク質に標的促進配列(TES)を導入することによって、対象とするタンパク質及び細胞透過性ペプチド(CPP)を含む融合タンパク質の配列を改変し、それによって改変融合タンパク質を生成するステップ、及び細胞を改変融合タンパク質と接触させ、それによって細胞に送達される対象とするタンパク質の量を増加させるステップを含む。
CPPは、改変融合タンパク質のN末端に位置してもよく、TESは、CPPのC末端に融合していてもよい。例えば、改変融合タンパク質は、N末端から開始して、CPP、TES、及び対象とするタンパク質を含むものであり得る。別の例では、改変融合タンパク質は、N末端から開始して、CPP、TES、OTS、及び対象とするタンパク質を含むものであり得る。
CPPは、また、改変融合タンパク質のC末端に位置していてもよく、TESは、CPPのN末端に融合していてもよい。例えば、改変融合タンパク質は、N末端から開始して、対象とするタンパク質、TES、及びCPPを含むものであり得る。別の例では、改変融合タンパク質は、N末端から開始して、対象とするタンパク質、OTS、TES、及びCPPを含むものであり得る。さらに別の例では、改変融合タンパク質は、N末端から開始して、OTS、対象とするタンパク質、TES、及びCPPを含むものであり得る。
一部の実施形態では、対象とするタンパク質は、本明細書に記載の任意の対象とするタンパク質、例えば本明細書中、表2に列挙されている任意の対象とするタンパク質でありうる。例えば、対象とするタンパク質は、フラタキシン(FXN)、タファジン、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ(PDH)、SLIRP、LRPPC、PARK2タンパク質、PARK6タンパク質、PARK7タンパク質、及びそのバリアント又は誘導体からなる群から選択されるものであり得る。一例では、対象とするタンパク質は、フラタキシン(FXN)又はそのバリアント若しくは誘導体である。別の例では、対象とするタンパク質はPARK2タンパク質(PARKIN)又はそのバリアント若しくは誘導体である。
一部の実施形態では、CPPは、本明細書に記載の任意CPP、例えば本明細書中、表4に列挙した任意のCPPでありうる。例えば、CPPは、細胞透過性ペプチドデータベースCPPsite2.0に列挙されているCPPの群から選択されるペプチドを含むものであり得る。例えば、CPPは、HIV-TAT、ガラニン、マストパラン、トランスポータン、ペネトラチン、ポリアルギニン、VP22、及びそのバリアント又は誘導体からなる群から選択されるペプチドを含むものであり得る。一実施形態では、CPPはHIV-TAT又はそのバリアント若しくは誘導体を含むものであり得る。
一部の実施形態では、改変融合タンパク質に含まれるTESは、本明細書に記載の任意のTESでありうる。例えば、TESは、核外移行シグナルペプチド、例えば配列番号36～43のいずれか1つに少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%の配列同一性を有する配列を含むものであり得る。一部の例では、核外移行シグナルペプチドは、NES1、NES2、NES3、NES4、NES5、NES6、NES7、NES8及びそのバリアント又は誘導体からなる群から選択されるペプチドを含むものであり得る。一例では、核外移行シグナルペプチドはNES1又はそのバリアント若しくは誘導体を含むものであり得る。別の例では、核外移行シグナルペプチドはNES又はそのバリアント若しくは誘導体を含むものであり得る。
改変融合タンパク質に含まれるTESは、また、プロテアーゼ感受性ペプチドであってもよい。例えば、TESは、ユビキチン様修飾因子を含むものであってもよく、例えば配列番号18～31のいずれか1つに少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%の配列同一性を有する配列を含むものであり得る。
他の例では、TESは、ユビキチン、カスパーゼ切断ドメイン、カルパイン切断ドメイン、SUMO1、SUMO2、SUMO3、SUMO4、ISG15、Atg8、Atg12、NEDD8、及びそのバリアント又は誘導体からなる群から選択されるプロテアーゼ感受性ペプチドを含むものであり得る。
一部の例では、改変融合タンパク質は、配列番号55～61及び69～71のいずれかに少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものであり得る。
処置の方法
それを必要とする対象で非核オルガネラ関連障害を処置するための治療用化合物が本明細書で提供される。一部の実施形態において、治療用化合物は、本開示の融合タンパク質、核酸、ベクター、又はコンジュゲートを含むものであり得る。一部の実施形態では、非核オルガネラ関連障害の非限定例としては、ミトコンドリア障害及びリソソーム障害が挙げられ得る。一部の実施形態では、非核オルガネラ関連障害は遺伝性障害である。
本開示では、非核オルガネラ関連障害を処置する方法であって、本明細書に記載の融合タンパク質、核酸、ベクター、コンジュゲート、細胞、又は医薬組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む方法も提供する。一部の実施形態では、非核オルガネラ関連障害はミトコンドリア障害である。特定の一例では、ミトコンドリア障害はフリードライヒ運動失調症である。
一部の例では、非核オルガネラ関連障害はリソソーム障害、すなわちリソソームの機能障害に関連する障害であってもよい。
一部の実施形態では、非核オルガネラ関連障害は、フリードライヒ運動失調症(FRDA)、バース症候群、パーキンソン病、リー症候群、例えば、リー症候群フランス-カナダ型、及びピルビン酸デヒドロゲナーゼ欠損症からなる群から選択されるものであり得る。
本明細書に開示する障害のいずれか1つ以上を患っているか、発症する危険がある可能性のある対象は、症状の提示及び/又はその疾患又は障害の素因を対象に与えるマーカー(例えば遺伝子突然変異)の同定を含めた多因子に基づいて、処置するために選択することができる。
本明細書で使用される場合、「対象」という用語には、ヒト又は非ヒトの動物、好ましくは脊椎動物、より好ましくは哺乳動物が含まれる。対象としては、トランスジェニック生物も挙げられ得る。最も好ましくは、対象がヒト、例えば非核オルガネラ関連障害、例えばフリードライヒ運動失調症又はパーキンソン病を患っているか、発症する素因があるヒトである。
本明細書で使用される場合、「非核オルガネラ関連障害を処置する」という用語は、非核オルガネラ関連障害、例えばフリードライヒ運動失調症又はパーキンソン病に関連する1つ以上の症状を軽減する、軽快させる、又は解消することを含む。「非核オルガネラ関連障害を処置する」という用語は、非核オルガネラ関連障害に関連する症状又は指標を軽快させる又は改善すること、非核オルガネラ関連障害の少なくとも1つの症状の進行又は悪化を停止することのうち1つ以上を部分的又は実質的に達成することも含む。「非核オルガネラ関連障害を処置する」という用語は、非核オルガネラ関連障害の発症を防止するか、その少なくとも1つの症状の出現を遅延させること、又は非核オルガネラ関連障害の少なくとも1つの症状の発症を、処置無しで発症するであろう同じ症状よりも低い重症度のものにすることも含む。
フリードライヒ運動失調症(FRDA)を処置する方法
一実施形態では、本開示は、フリードライヒ運動失調症(FRDA)を処置する方法であって、本開示の融合タンパク質をそれを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。例えば、本開示は、FRDAを処置する方法であって、1) 対象とするタンパク質である完全長hFXN(配列番号1)に少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列、2)本明細書に記載の任意のCPP、及び3)本明細書に記載の任意のTESを含む融合タンパク質をそれを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。
一部の実施形態では、FRDAを処置する方法は、1) 対象とするタンパク質である完全長hFXN(配列番号1)に少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列、2)TAT-HIV(配列番号11)に少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%を有するアミノ酸配列、及び3)本明細書に記載の任意のTESを含む融合タンパク質をそれを必要とする対象に投与することを含む。
一部の実施形態では、FRDAを処置する方法は、1) 対象とするタンパク質である完全長hFXN(配列番号1)に少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列、2)TAT-HIV(配列番号11)に少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%を有するアミノ酸配列、及び3)ユビキチン(配列番号18)に少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%を有するアミノ酸配列を含む融合タンパク質をそれを必要とする対象に投与することを含む。
一部の実施形態では、FRDAを処置する方法は、1) 対象とするタンパク質である完全長hFXN(配列番号1)に少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列、2)TAT-HIV(配列番号11)に少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%を有するアミノ酸配列、及び3)配列番号20のカルパイン切断ドメインに少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%を有するアミノ酸配列を含む融合タンパク質をそれを必要とする対象に投与することを含む。
一部の実施形態では、FRDAを処置する方法は、1) 対象とするタンパク質である完全長hFXN(配列番号1)に少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列、2)TAT-HIV(配列番号11)に少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%を有するアミノ酸配列、及び3)配列番号19、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、又は配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、及び配列番号35のいずれか1つに少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%を有するアミノ酸配列を含む融合タンパク質をそれを必要とする対象に投与することを含む。
一部の実施形態では、FRDAを処置する方法は、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60、配列番号61、及び配列番号81からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる融合タンパク質をそれを必要とする対象に投与することを含む。
一実施形態では、FRDAを処置する方法は、配列番号56に少なくとも約85%、約90%、約95%、又は約99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる融合タンパク質をそれを必要とする対象に投与することを含む。
一実施形態では、FRDAを処置する方法は、配列番号57に少なくとも約85%、約90%、約95%、又は約99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる融合タンパク質をそれを必要とする対象に投与することを含む。
一実施形態では、FRDAを処置する方法は、配列番号58に少なくとも約85%、約90%、約95%、又は約99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる融合タンパク質をそれを必要とする対象に投与することを含む。
一実施形態では、FRDAを処置する方法は、配列番号59に少なくとも約85%、約90%、約95%、又は約99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる融合タンパク質をそれを必要とする対象に投与することを含む。
一実施形態では、FRDAを処置する方法は、配列番号60に少なくとも約85%、約90%、約95%、又は約99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる融合タンパク質をそれを必要とする対象に投与することを含む。
一実施形態では、FRDAを処置する方法は、配列番号61に少なくとも約85%、約90%、約95%、又は約99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる融合タンパク質をそれを必要とする対象に投与することを含む。
一実施形態では、FRDAを処置する方法は、配列番号81に少なくとも約85%、約90%、約95%、又は約99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる融合タンパク質をそれを必要とする対象に投与することを含む。
本明細書で使用される「FRDA」という用語は、フラタキシン欠乏に関連する任意の疾患、障害、又は状態を包含する。本明細書で使用される場「FRDAと関連する疾患、障害、又は状態」という用語は、FRDAに続発する及び/又は引き起こされる、すなわち、対象で存在する場合、それはFRDAと併発し、FRDAの非存在下では対象で存在していない疾患、障害、又は状態を包含する。FRDAと関連する疾患、障害、又は状態の非限定例には、FRDAと関連する肺炎、FRDAと関連する肥大型心筋症、及びFRDAと関連する糖尿病が含まれる。FRDAと関連する疾患、障害、又は状態の他の非限定例には、限定されるものではないが、
(1)限定されるものではないが、固有感覚欠如、反射消失、歩行能喪失、眼で凝視し続ける能力の喪失のうちの1つ以上を含めた神経障害、
(2)嚥下障害及び/又は進行性嚥下能力喪失、進行性難聴、
(3)FXN不足から生じる網膜変性による進行性視力喪失、
(4)進行性失語症、
(5)限定されるものではないが、トリグリセリド上昇、高密度リポタンパク質(HDL)コレステロール低下、及び低密度リポタンパク質(LDL)コレステロール上昇を含めたメタボリックシンドローム、
(6)矯正に手術を必要とする脊柱側弯症、及び/又はこれらの組合せ
を特徴とするFRDAと関連する疾患、障害、又は状態が含まれる。
一部の実施形態では、対象への本開示の融合タンパク質の投与は、例えばFRDAと関連する疾患、障害、又は状態を含めたFRDAを処置しうる。本明細書で使用される「FRDAを処置すること」は、例えばFRDAと関連する疾患、障害、又は状態を含めたFRDAの軽快、改善、又は重症度の低減の実現を包含する。例えば、「FRDAを処置すること」は、FRDAに関連する少なくとも1つの症状又は指標を軽快させるか、改善するか、又はその低減を実現することを包含する。本明細書で使用される「FRDAを処置すること」は、対象で、例えばFRDAと関連する疾患、障害、若しくは状態を含めたFRDAの進行を遅延させること、例えばFRDAに関連する少なくとも1つの症状若しくは指標の出現を遅延させること、又はFRDAに関連する少なくとも1つの症状又は指標の重症度の増大を防止することも包含する。
一部の実施形態では、「FRDAを処置すること」という用語は、例えばFRDAと関連する疾患、障害、又は状態を含めたFRDAを有する対象、例えばヒトの生存(例えば生存期間)の延長を達成することも包含する。例えば、FRDAの処置は、例えばFRDAと関連する疾患、障害、又は状態を含めたFRDAを有する対象、例えばヒトの期待余命の延長をもたらしうる。一部の実施形態では、本開示の文脈におけるFRDAの処置は、処置されていない類似の疾患を有する1以上の対照個体の平均期待余命と比較して、約10%超、約20%超、約30%超、約40%超、約50%超、約60%超、約70%超、約80%超、約90%超、約100%超、約110%超、約120%超、約130%超、約140%超、約150%超、約160%超、約170%超、約180%超、約190%超、又は約200%超の対象の期待余命の延長をもたらしうる。
一部の実施形態では、本開示の文脈における例えばFRDAと関連する疾患、障害、又は状態を含めたFRDAの処置が、対象の期待余命を、処置されていない類似の疾患を有する1以上の対照個体の平均期待余命と比較して約6ヶ月超、約8ヶ月超、約10ヶ月超、約12ヶ月超、約2年超、約4年超、約6年超、約8年超、又は約10年超延長しうる。一部の実施形態では、本開示の文脈における、例えばFRDAと関連する疾患、障害、又は状態を含めたFRDAの処置が、例えばFRDAと関連する疾患、障害、又は状態を含めたFRDAを有する対象、例えばヒトの長期生存をもたらしうる。本明細書で使用される「長期生存」という用語は、約40年間、45年間、50年間、55年間、60年間、又はそれを超える期間より長い生存期間又は期待余命を指す。
例えばFRDAと関連する疾患、障害、又は状態を含めたFRDAを評価するため、FRDAの重症度を決定するため、及び/又は対象への本開示の融合タンパク質の投与の影響を決定するために、当業者に知られている臨床アセスメントを使用してもよい。FRDAの重症度のアセスメントを含めた、FRDAの臨床アセスメントの方法の例は、例えば、それぞれの全内容が参照により本明細書に組み込まれている、Paapら、"Standardized Assessment of Hereditary Ataxia Patients in Clinical Studies", Mov Disord Clin Pract. 2016, 3(3):230-240、及びPatelら、"Progression of Friedreich ataxia: quantitative characterization over 5 years", Ann Clin Transl Neurol 2016, 3(9):684-694に記載されている。
時間測定25フィート歩行(Timed 25-Foot Walk、T25-FW)は、25フィートの歩行を完遂するのに必要な時間を測定する、移動性及び下肢機能の定量的なパフォーマンス試験である。一部の実施形態では、対象への本開示の融合タンパク質の投与は、例えば25フィートの歩行を完遂するのに必要な時間によって測定されるFRDAの重症度の低減をもたらしうる。例えば、本開示の融合タンパク質の対象に対する投与は、本開示の融合タンパク質の投与の前に対象で測定した25フィートの歩行を完遂するのに必要な時間と比較して、又はベースライン値と比較して、25フィートの歩行を完遂するのに必要な時間の低減、例えば25フィートの歩行を完遂するのに必要な時間の少なくとも約5%、少なくとも約10%と、少なくとも約25%、又は少なくとも約50%の低減をもたらしうる。ベースライン値は、本開示の融合タンパク質の投与の前に測定した25フィートの歩行を完遂するのに必要な時間であってもよい。
他の実施形態では、対象への本開示の融合タンパク質の投与は、例えば25フィートの歩行を完遂するのに必要な時間によって測定される対象におけるFRDAの進行を遅延させうる。例えば、対象への本開示の融合タンパク質の投与によって、25フィートの歩行を完遂するのに必要な時間が、ベースライン値、すなわち、本開示の融合タンパク質の投与の前に対象で測定された25フィートの歩行を完遂するのに必要な時間と比較して、実質的に同様になるか、又は25フィートの歩行を完遂するのに必要な時間の増加が実質的にない(例えば25フィートの歩行を完遂するのに必要な時間の増大が20%未満、10%未満、又は5%未満)ようになる可能性がある。
改変フリードライヒ運動失調症評定尺度(mFARS)は、例えばそれぞれの全内容が参照により本明細書に組み込まれているBurkら、"Monitoring progression in Friedreich ataxia (FRDA): the use of clinical scales", J of Neurochemistry 2013, 126(suppl. 1):118-124、及びRummeyら、"Psychometric properties of the Friedreich's Ataxia Rating Scale", Neurol Genet 2019, 5:e371に記載されているFRDAの重症度を評価するための検査法ベースの評価尺度である。
一部の実施形態では、mFARSスコアが、以下のサブスコアの少なくとも1つを含むものであり得る。a)機能的障害度評価尺度に基づくスコア(FARS-FDS、0～6段階、アセスメントは通常、神経内科医が行う)、b)日常生活動作尺度に基づくスコア(FARS-ADL、0～36段階、アセスメントは患者又は介護者が行う)、及びc)神経学的な評価尺度に基づくスコア(FARS-neuro、0～125段階、アセスメントは神経内科医が行う)。一部の例では、FARS_ADLスコアが、ADL(例えば、発話、食品の切断、更衣動作、及び個人衛生)を完遂する対象の能力を評価する、0～36点の範囲のスコアを有するFARS評価尺度である。回答者は、対象であっても、対象と家族の組合せでも、試験を完遂することができない対象については、家族の構成員、配偶者、又は介護者でもよい。
一部の実施形態では、神経学的な評価尺度に基づくスコアは、対象の直接的な参加を伴い、FRDAによって影響を受ける特定の領域、例えば延髄、上肢、下肢、及び立位安定性を標的にする神経学的な評価尺度の改変スコアリング(mFARS-neuro、0～99段階)を含み得る。mFARS-neuroは、FARS質問票の神経学的な評価尺度から、サブスケールD(末梢神経系)及びサブスケールA(延髄)の最初の2つの質問を除いたものである。
一部の実施形態では、mFARSスコアが、完全なFARS質問票に由来する2つのサブスコア、すなわち、上述のmFARS-neuro及び上述のFARS_ADLに基づくものであり得る。
一部の実施形態では、対象への本開示の融合タンパク質の投与は、例えばmFARSスコア又は本明細書に記載のmFARSサブスコアの少なくとも1つで測定されるFRDAの重症度の低減をもたらしうる。例えば、対象への本開示の融合タンパク質の投与によって、ベースライン値、すなわち、本開示の融合タンパク質の投与の前に対象で測定したmFARSスコア又は少なくとも1つのmFARSサブスコアとの比較における、mFARSスコア又は少なくとも1つのmFARSサブスコアの低減が起こりうる。
他の実施形態では、対象への本開示の融合タンパク質の投与は、例えば本明細書に開示のmFARSスコア又は少なくとも1つのmFARSサブスコアによって測定される対象におけるFRDAの進行を遅延させうる。例えば、対象への本開示の融合タンパク質の投与によって、mFARSスコア又は少なくとも1つのmFARSサブスコアが、ベースライン値、すなわち、本開示の融合タンパク質の投与の前に対象で測定したmFARSスコア又は少なくとも1つのmFARSサブスコアと比較して、又はベースライン値と比較して、実質的に同様になるか、mFARSスコア又は少なくとも1つのmFARSサブスコアの増大が実質的になくなる可能性がある。
FRDAを有する対象の指の器用さを測定するために、ナインホールペグテスト(9HPT)を用いることができる。この試験において、対象は、できるだけ迅速に容器からペグをひとつずつ取り、ボード上の9つの穴にそれらを入れるように要求される。その後、対象は、穴からペグをひとつずつ取り除き、それらを容器の中に戻さなければならない。スコアは、試験の活動を完遂するのにかかる、秒で記録される時間に基づく。
一部の実施形態では、対象への本開示の融合タンパク質の投与は、例えば9HPTスコアで測定されるFRDAの重症度の低減をもたらしうる。例えば、対象への本開示の融合タンパク質の投与は、ベースライン値、すなわち本開示の融合タンパク質の投与の前に対象で測定された9HPTスコアと比較して、試験の活動を完遂する時間で表現される9HPTスコアの低減(例えば試験の活動を完遂する時間で表現される9HPTスコアの少なくとも約5%、10%、25%、又は50%の低減)をもたらしうる。
他の実施形態では、対象への本開示の融合タンパク質の投与は、例えば9HPTスコアで測定される対象におけるFRDAの進行を遅延させうる。例えば、対象への本開示の融合タンパク質の投与によって、ベースライン値、すなわち本開示の融合タンパク質の投与の前に対象で測定された9HPTスコアとの比較における、試験の活動を完遂する時間で表現される9HPTスコアが実質的に同様になるか、9HPTスコアの実質的増加がなくなる可能性がある。
一部の実施形態では、対象への本開示の融合タンパク質の投与は、ベースラインレベル、すなわち本開示の融合タンパク質を投与する前の対象の少なくとも1種の組織又は生体液中のhFXNレベルと比較した、対象の少なくとも1種の組織又は生体液中のhFXNレベルの増大をもたらす。一部の実施形態では、対象への本開示の融合タンパク質の投与によって起こる対象の少なくとも1種の組織又は生体液中のhFXNレベルの増大が、治療効果を有するのに十分、すなわち対象におけるFRDAを処置するのに十分である。
一部の実施形態では、FRDAを有する対象への本開示の融合タンパク質の投与は、FRDAを有しない対象(例えば正常な健康対象)の少なくとも1種の組織又は生体液中のhFXNレベルより低いが、依然として治療効果を有するのに十分、すなわち対象におけるFRDAを処置するのに十分である対象の少なくとも1種の組織又は生体液中のhFXNレベルをもたらしうる。例えば、FRDAを有する対象への本開示の融合タンパク質の投与の後に、対象の少なくとも1種の組織又は生体液中のhFXNレベルは、FRDAを有しない対象(例えば正常な健康対象)の少なくとも1種の組織又は生体液中のhFXNレベルの約10%から約50%、約20%から約60%、又は約30%から約80%でありうるが、そのhFXNのレベルは依然として治療効果を有するのに十分、すなわち対象におけるFRDAを処置するのに十分である。
一部の実施形態では、FRDAを有する対象への本開示の融合タンパク質の投与は、本開示の融合タンパク質を投与する前の対象の少なくとも1種の組織又は生体液のhFXNレベルと比較して、又はベースラインレベルと比較して、対象の少なくとも1種の組織又は生体液中のhFXNレベルの少なくとも約5%、約10%、約25%、約50%、約100%、約150%、約200%、約300%、約400%、約500%、又は約600%の増大をもたらしうる。
一部の実施形態では、FRDAを有する対象への本開示の融合タンパク質の投与は、本開示の融合タンパク質を投与する前の対象の少なくとも1種の組織又は生体液のhFXNレベルと比較して、又はベースラインレベルと比較して、対象の少なくとも1種の組織又は生体液中のhFXNレベルの約5%から約30%、約10%から約50%、約25%から約100%、約50%から約150%、約100%から約300%、約50%から約250%、約150%から約500%、又は約200%から約700%の増大をもたらしうる。一部の実施形態では、対象への本開示の融合タンパク質の投与は、本開示の融合タンパク質を投与する前の対象の少なくとも1種の組織又は生体液のhFXNレベルと比較して、又はベースラインレベルと比較して、対象の少なくとも1種の組織又は生体液中のhFXNレベルの少なくとも約2倍、約3倍、約4倍、約5倍の増大をもたらしうる。一部の実施形態では、対象への本開示のTAT-FXN融合ポリペプチド及び/又は本開示のTAT-FXN融合ポリペプチドを含む医薬組成物の投与は、本開示の融合タンパク質を投与する前の対象の少なくとも1種の組織又は生体液のhFXNレベルと比較して、又はベースラインレベルと比較して、対象の少なくとも1種の組織又は生体液中のhFXNレベルの約2倍と約5倍の間又は約2倍と約10倍の間の増大をもたらしうる。
一部の実施形態では、hFXNレベルを測定及び/又は増大することができる対象の組織は、生検することができる任意の組織でありうる。一部の実施形態では、組織は、気管支肺胞組織(例えば気管支肺胞ブラッシングによってサンプリングすることができる)、粘膜(例えば鼻腔粘膜、例えば鼻ブラッシングによってサンプリングすることができる)、毛包、皮膚組織、又は頬側組織を含みうる。一部の実施形態では、組織は皮膚組織又は頬側組織を含む。
一部の実施形態では、hFXNレベルが測定及び/又は増大することができる対象の生体液は、血液若しくは血液成分(例えば血清、血漿、血小板、又は任意の他の血液成分)、尿、又は唾液でありうる。
FRDAと関連する肺炎
FRDAと診断された対象は、進行性の運動失調を引き起こす後根神経節の神経変性症を患う。これは、典型的には、歩行する能力、自立的に摂食する能力、話す能力、及び嚥下する能力の進行性の喪失、並びに誤嚥をもたらす。誤嚥イベントは、肺炎、頻繁な入院、及び最終的に診断日から10～15年の期間にわたる死亡をもたらす可能性がある。
したがって、本開示の融合タンパク質の投与は、FRDAと診断されたFXN欠損対象において、誤嚥を防止し、それによって誤嚥に続く肺炎を防止するタンパク質補充療法として有効でありうる。したがって、本開示は、対象のFRDAと関連する肺炎を処置する方法であって、本開示の融合タンパク質をそれを必要とする対象に投与し、それによって対象のFRDAと関連する肺炎を処置することを含む方法を提供する。
FRDAと関連する肥大型心筋症
肥大型心筋症は、心臓の筋肉が厚くなり、それにより心臓が循環系を通して血液をポンピングするのが困難になっている状態である。この状態は、心臓細胞のミトコンドリアにおけるFXNの欠乏により引き起こされる可能性がある。FRDAと診断された対象では、進行性の肥大型心筋症が、約50%の場合に、心不全及び死亡へと進行する。本開示の融合タンパク質によるタンパク質補充療法は、肥大型心筋症の基礎となるFXN欠乏を補充することができる。
本開示の融合タンパク質の投与は、したがって、FRDA及び肥大型心筋症の両方と診断されたFXN欠乏の対象におけるタンパク質補充療法として有効でありうる。したがって、本開示は、対象におけるFRDAと関連する肥大型心筋症を処置する方法であって、本開示の融合タンパク質をそれを必要とする対象に投与し、それによって対象におけるFRDAと関連する肥大型心筋症を処置することを含む方法を提供する。
糖尿病
糖尿病のホールマークは、グルコースの血中濃度を適切に調節できないことであり、これは血糖値上昇をもたらす。FRDAと診断された対象では、多くの場合、膵臓におけるFXN欠乏ミトコンドリアの結果として糖尿病が現れる。本開示の融合タンパク質によるタンパク質補充療法は、糖尿病の基礎となるFXN欠乏を補充することができる。
本開示の融合タンパク質の投与は、したがって、糖尿病と診断されたFXN欠乏の対象におけるタンパク質補充療法として有効でありうる。したがって、本開示は、対象におけるFRDAと関連する糖尿病を処置する方法であって、本開示の融合タンパク質をそれを必要とする対象に投与し、それによって対象におけるFRDAと関連する糖尿病を処置することを含む方法を提供する。
他のFRDA関連の疾患/障害
FRDAと診断された対象は、しばしばFXN欠乏に関連する他の障害を経験する。そのようなFRDAと関連する障害としては、固有感覚欠如、反射消失、歩行能喪失、眼で凝視し続ける能力の喪失を非限定的に含めた神経障害;嚥下障害及び/又は進行性の嚥下能力喪失;進行性難聴;FXNの不足から生じる網膜変性による進行性の視力喪失;進行性の失語症;トリグリセリド上昇、高密度リポタンパク質(HDL)コレステロール低下、及び低密度リポタンパク質(LDL)コレステロール上昇を非限定的に含むメタボリックシンドローム;矯正のための手術を必要とする脊柱側弯症;及び/又はこれらの組合せを非限定的に挙げることができる。本開示の融合タンパク質によるタンパク質補充療法は、これらのFRDAと関連する疾患/障害の基礎となるFXN欠乏を補充することができる。
本開示の融合タンパク質の投与は、したがって、FRDAと診断され、固有感覚欠如、反射消失、歩行能喪失、眼で凝視し続ける能力の喪失を非限定的に含めた神経障害;嚥下障害及び/又は進行性の嚥下能力喪失;進行性難聴;FXNの不足から生じる網膜変性による進行性の視力喪失;進行性の失語症;トリグリセリド上昇、HDLコレステロール低下、及びLDLコレステロール上昇を非限定的に含めたメタボリックシンドローム;矯正のための手術を必要とする脊柱側弯症;及び/又はこれらの組合せを経験しているFXN欠失の対象におけるタンパク質補充療法として有効でありうる。
したがって、本開示は、FRDAと関連する疾患、障害、又は状態を処置する方法であって、本開示の融合タンパク質をそれを必要とする対象に投与することを含み、FRDAと関連する疾患、障害、又は状態が、固有感覚欠如、反射消失、歩行能喪失、眼で凝視し続ける能力の喪失を非限定的に含めた神経障害;嚥下障害及び/又は進行性の嚥下能力喪失;進行性難聴;FXNの不足から生じる網膜変性による進行性の視力喪失;進行性の失語症;トリグリセリド上昇、HDLコレステロール低下、及びLDLコレステロール上昇を非限定的に含めたメタボリックシンドローム;並びに矯正のための手術を必要とする脊柱側弯症から選択される、方法を提供する。
特定の実施形態では、本開示の融合タンパク質、医薬組成物、又は治療用化合物、例えばFXNを含む融合タンパク質によるそれを必要とする対象の処置は対象におけるFXNの細胞レベルを増加させる。一部の実施形態では、本開示の方法はFXNの細胞レベルを、処置の前の対象のFXNのレベルと比較して、少なくとも約10%、例えば約20%、約25%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、又は約95%超増加させる。別の実施形態では、本開示の方法は、FXNの細胞レベルを少なくとも約2倍、少なくとも約3倍、少なくとも約4倍、少なくとも約5倍、少なくとも約6倍、少なくとも約7倍、少なくとも約8倍、少なくとも約9倍、又は少なくとも約10倍増加させる。一部の実施形態では、増加は、本開示の融合タンパク質の投与の前と後の対象におけるFXNの細胞レベルを比較することによって測定される。
本開示の融合タンパク質、医薬組成物、及び/又は治療用化合物の投与前、投与中、及び投与後に、対象におけるFXNの細胞レベルを生体試料、例えば血液、血清、血漿、尿、腹水、脳脊髄液、糞便、腸粘膜擦過検体、組織から採取した試料、及び/又は胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸、直腸、及び肛門管のうちの1つ以上の内容物から採取した試料で測定することができる。一部の実施形態では、当該方法は、本明細書に開示した融合タンパク質を投与して、対象におけるFXNの細胞レベルを増加させることを含むものであり得る。一部の実施形態では、当該方法は、本明細書に開示された融合タンパク質を投与して、FXNの細胞レベルを、処置の前の対象におけるFXNの細胞レベルの約1%、2%、5%、10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、又は95%を超える分、増加させることを含むものであり得る。FXNの細胞レベルは、当技術分野で知られている方法で測定することができる。例えば、FXNの細胞レベルは、試料、例えば皮膚生検(パンチ生検)、口腔スワブ、血小板を採取し、ELISA、ハイブリッドLBA-LC-MS/MS、又は他の質量分析関連の方法を用いて、FXNについてそれらを分析することによって測定することができる。
リー症候群フランス-カナダ型(LSFC)を処置する方法
本開示は、リー症候群フランス-カナダ型(LSFC)を処置する方法であって、対象のLSFCが処置されるように、本開示の融合タンパク質をそれを必要とする対象に投与することを含む方法も提供する。驚くべきことに、細胞増殖培地の酸性化によって証明されるLRPPRC欠失細胞におけるミトコンドリア障害が、本開示のhFXN融合タンパク質による細胞の処置で低減することが発見された。驚くべきことに、LRPPRC欠失細胞によって細胞増殖培地内に分泌されるCYR61タンパク質の量が、本開示のhFXN融合タンパク質による細胞の処置で低減することも発見された。さらに、驚くべきことに、TESを含む本開示のhFXN融合タンパク質が、培地酸性化及びLRPPRC欠失細胞からのCYR61の分泌の低減に、TESを含まないhFXN融合タンパク質より有効であることも発見された。
上に記載した発見は、LRPPRCの欠失に関連する特定の分子変化及び細胞変化が、本開示のhFXN融合タンパク質を投与することによって緩和及び/又は反転される可能性があることを示す。上に記載した発見は、LRPPRCの欠失と関連するLSFCが、本開示のhFXN融合タンパク質を投与することによって処置されうることも示す。さらに、上に記載した発見は、TESを含む本開示のhFXN融合タンパク質が、LSFCを有する対象におけるLSFC及び/又は乳酸アシドーシスを処置するのに、TESを含まないhFXN融合タンパク質より有効であることを示す。
一部の実施形態では、本開示は、それを必要とする対象におけるLSFCを処置する方法であって、1) 対象とするタンパク質である完全長hFXN(配列番号1)に少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列、2)本明細書に記載の任意のCPP、及び3)本明細書に記載の任意のTESを含む融合タンパク質を対象に投与することを含む方法を提供する。
一部の実施形態では、LSFCを処置する方法は、1) 対象とするタンパク質である完全長hFXN(配列番号1)に少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列、2)TAT-HIV(配列番号11)に少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%を有するアミノ酸配列、及び3)本明細書に記載の任意のTESを含む融合タンパク質をそれを必要とする対象に投与することを含む。
一部の実施形態では、LSFCを処置する方法は、1) 対象とするタンパク質である完全長hFXN(配列番号1)に少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列、2)TAT-HIV(配列番号11)に少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%を有するアミノ酸配列、及び3)ユビキチン(配列番号18)に少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%を有するアミノ酸配列を含む融合タンパク質をそれを必要とする対象に投与することを含む。
一部の実施形態では、LSFCを処置する方法は、1) 対象とするタンパク質である完全長hFXN(配列番号1)に少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列、2)TAT-HIV(配列番号11)に少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%を有するアミノ酸配列、及び3)配列番号20のカルパイン切断ドメインに少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%を有するアミノ酸配列を含む融合タンパク質をそれを必要とする対象に投与することを含む。
一部の実施形態では、LSFCを処置する方法は、1) 対象とするタンパク質である完全長hFXN(配列番号1)に少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列、2)TAT-HIV(配列番号11)に少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%を有するアミノ酸配列、及び3)配列番号19、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、又は配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、及び配列番号35のいずれか1つに少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%を有するアミノ酸配列を含む融合タンパク質をそれを必要とする対象に投与することを含む。
一部の実施形態では、LSFCを処置する方法は、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60、配列番号61、及び配列番号83からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる融合タンパク質をそれを必要とする対象に投与することを含む。
一実施形態では、LSFCを処置する方法は、配列番号56に少なくとも約85%、約90%、約95%、又は約99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる融合タンパク質をそれを必要とする対象に投与することを含む。
一実施形態では、LSFCを処置する方法は、配列番号57に少なくとも約85%、約90%、約95%、又は約99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む融合タンパク質をそれを必要とする対象に投与することを含む。
一実施形態では、LSFCを処置する方法は、配列番号58に少なくとも約85%、約90%、約95%、又は約99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる融合タンパク質をそれを必要とする対象に投与することを含む。
一実施形態では、LSFCを処置する方法は、配列番号59に少なくとも約85%、約90%、約95%、又は約99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる融合タンパク質をそれを必要とする対象に投与することを含む。
一実施形態では、LSFCを処置する方法は、配列番号60に少なくとも約85%、約90%、約95%、又は約99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる融合タンパク質をそれを必要とする対象に投与することを含む。
一実施形態では、LSFCを処置する方法は、配列番号61に少なくとも約85%、約90%、約95%、又は約99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる融合タンパク質をそれを必要とする対象に投与することを含む。
一実施形態では、LSFCを処置する方法は、配列番号83に少なくとも約85%、約90%、約95%、又は約99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる融合タンパク質をそれを必要とする対象に投与することを含む。
一部の実施形態では、本開示は、LSFCを有する対象における乳酸アシドーシスを処置する方法であって、対象の乳酸アシドーシスが処置されるように、本開示の融合タンパク質をそれを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。例えば、本開示は、LSFCを有する対象における乳酸アシドーシスを処置する方法であって、1) 対象とするタンパク質である完全長hFXN(配列番号1)に少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列、2)本明細書に記載の任意のCPP、及び3)本明細書に記載の任意のTESを含む融合タンパク質を対象に投与することを含む方法を提供する。
一部の実施形態では、LSFCを有する対象における乳酸アシドーシスを処置する方法は、1) 対象とするタンパク質である完全長hFXN(配列番号1)に少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列、2)TAT-HIV(配列番号11)に少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%を有するアミノ酸配列、及び3)本明細書に記載の任意のTESを含む融合タンパク質を対象に投与することを含む。
一部の実施形態では、LSFCを有する対象における乳酸アシドーシスを処置する方法は、1) 対象とするタンパク質である完全長hFXN(配列番号1)に少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列、2)TAT-HIV(配列番号11)に少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%を有するアミノ酸配列、及び3)ユビキチン(配列番号18)に少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%を有するアミノ酸配列を含む融合タンパク質を対象に投与することを含む。
一部の実施形態では、LSFCを有する対象における乳酸アシドーシスを処置する方法は、1) 対象とするタンパク質である完全長hFXN(配列番号1)に少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列、2)TAT-HIV(配列番号11)に少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%を有するアミノ酸配列、及び3)配列番号20のカルパイン切断ドメインに少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%を有するアミノ酸配列を含む融合タンパク質を対象に投与することを含む。
一部の実施形態では、LSFCを有する対象における乳酸アシドーシスを処置する方法は、1) 対象とするタンパク質である完全長hFXN(配列番号1)に少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列、2)TAT-HIV(配列番号11)に少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%を有するアミノ酸配列、及び3)配列番号19、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、又は配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、及び配列番号35のいずれか1つに少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%を有するアミノ酸配列を含む融合タンパク質を対象に投与することを含む。
一部の実施形態では、LSFCを有する対象における乳酸アシドーシスを処置する方法は、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60、配列番号61、及び配列番号83からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる融合タンパク質を対象に投与することを含む。
一実施形態では、LSFCを有する対象における乳酸アシドーシスを処置する方法は、配列番号56に少なくとも約85%、約90%、約95%、又は約99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる融合タンパク質を対象に投与することを含む。
一実施形態では、LSFCを有する対象における乳酸アシドーシスを処置する方法は、配列番号57に少なくとも約85%、約90%、約95%、又は約99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる融合タンパク質を対象に投与することを含む。
一実施形態では、LSFCを有する対象における乳酸アシドーシスを処置する方法は、配列番号58に少なくとも約85%、約90%、約95%、又は約99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる融合タンパク質を対象に投与することを含む。
一実施形態では、LSFCを有する対象における乳酸アシドーシスを処置する方法は、配列番号59に少なくとも約85%、約90%、約95%、又は約99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる融合タンパク質を対象に投与することを含む。
一実施形態では、LSFCを有する対象における乳酸アシドーシスを処置する方法は、配列番号60に少なくとも約85%、約90%、約95%、又は約99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる融合タンパク質を対象に投与することを含む。
一実施形態では、LSFCを有する対象における乳酸アシドーシスを処置する方法は、配列番号61に少なくとも約85%、約90%、約95%、又は約99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる融合タンパク質を対象に投与することを含む。
一実施形態では、LSFCを有する対象における乳酸アシドーシスを処置する方法は、配列番号83に少なくとも約85%、約90%、約95%、又は約99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる融合タンパク質を対象に投与することを含む。
本明細書で使用する「LSFCを処置する」という用語は、LSFCの軽快、改善、又は重症度の低減の実現、例えば対象におけるLSFCと関連する少なくとも1つの症状又は指標の軽快、改善、又は低減の実現を包含する。本明細書で使用する「LSFCを処置する」は、LSFCの進行を遅延させること、例えばLSFCと関連する少なくとも1つの症状若しくは指標の出現を遅延させること、又は対象におけるLSFCと関連する少なくとも1つの症状若しくは指標の重症度の増大を防止することも包含する。一部の実施形態では、LSFCと関連する少なくとも1つの症状又は指標は、発育遅延、運動失調、筋緊張低下、脳障害、昏睡、異常呼吸パターン、てんかん発作、脳卒中様のエピソード、及び乳酸アシドーシスからなる群から選択されるものであり得る。
パーキンソン病を処置する方法
一実施形態では、本開示は、パーキンソン病(PD)を処置する方法であって、本開示の融合タンパク質をそれを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。例えば、本開示は、パーキンソン病を処置する方法であって、本開示の融合タンパク質をそれを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。例えば、本開示は、パーキンソン病を処置する方法であって、1) 対象とするタンパク質であるPINK1(配列番号8)に少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列、2)本明細書に記載の任意のCPP、及び3)本明細書に記載の任意のTESを含む融合タンパク質をそれを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。
一部の実施形態では、パーキンソン病を処置する方法は、1) 対象とするタンパク質であるPINK1(配列番号8)に少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列、2)TAT-HIV(配列番号11)に少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%を有するアミノ酸配列、及び3)本明細書に記載の任意のTES、例えばユビキチン(配列番号18)又はカルパイン切断ドメイン(配列番号20)を含む融合タンパク質をそれを必要とする対象に投与することを含む。
一部の実施形態では、パーキンソン病を処置する方法は、1) 対象とするタンパク質であるPINK1(配列番号8)に少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列、2)TAT-HIV(配列番号11)に少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%を有するアミノ酸配列、及び3)ユビキチン(配列番号18)に少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%を有するアミノ酸配列を含む融合タンパク質をそれを必要とする対象に投与することを含む。
一実施形態では、本開示は、パーキンソン病を処置する方法であって、1) 対象とするタンパク質であるPARKIN(配列番号7)に少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列、2)本明細書に記載の任意のCPP、及び3)本明細書に記載の任意のTESを含む融合タンパク質をそれを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。
一部の実施形態では、パーキンソン病を処置する方法は、1) 対象とするタンパク質であるPARKIN(配列番号7)に少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列、2)TAT-HIV(配列番号11)に少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%を有するアミノ酸配列、及び3)本明細書に記載の任意のTESを含む融合タンパク質をそれを必要とする対象に投与することを含む。
一部の実施形態では、パーキンソン病を処置する方法は、1) 対象とするタンパク質であるPARKIN(配列番号7)に少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列、2)TAT-HIV(配列番号11)に少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%を有するアミノ酸配列、及び3)ユビキチン(配列番号18)に少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%を有するアミノ酸配列を含む融合タンパク質をそれを必要とする対象に投与することを含む。
一部の実施形態では、パーキンソン病を処置する方法は、1) 対象とするタンパク質であるPARKIN(配列番号7)に少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列、2)TAT-HIV(配列番号11)に少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%を有するアミノ酸配列、及び3)配列番号20のカルパイン切断ドメインに少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%を有するアミノ酸配列を含む融合タンパク質をそれを必要とする対象に投与することを含む。
一部の実施形態では、パーキンソン病を処置する方法は、1) 対象とするタンパク質であるPARKIN(配列番号1)に少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列、2)TAT-HIV(配列番号11)に少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%を有するアミノ酸配列、及び3)配列番号19、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、又は配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、及び配列番号35のいずれか1つに少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%を有するアミノ酸配列を含む融合タンパク質をそれを必要とする対象に投与することを含む。
一部の実施形態では、パーキンソン病を処置する方法は、配列番号69、配列番号70、及び配列番号71からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる融合タンパク質をそれを必要とする対象に投与することを含む。
一実施形態では、パーキンソン病を処置する方法は、配列番号69に少なくとも約85%、約90%、約95%、又は約99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる融合タンパク質をそれを必要とする対象に投与することを含む。
一実施形態では、パーキンソン病を処置する方法は、配列番号70に少なくとも約85%、約90%、約95%、又は約99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる融合タンパク質をそれを必要とする対象に投与することを含む。
一実施形態では、パーキンソン病を処置する方法は、配列番号71に少なくとも約85%、約90%、約95%、又は約99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる融合タンパク質をそれを必要とする対象に投与することを含む。
本明細書で使用される場合、「パーキンソン病」という用語は、孤発性型のパーキンソン病及び家族性型のパーキンソン病の両方を包含する。家族性型のパーキンソン病は、パーキンソン病の症例の約5～10%の原因となっており、約20遺伝子における突然変異がパーキンソン病に関連づけられている。一部の実施形態では、家族性型のパーキンソン病は、PARK2(PRKN)、PINK1(PRKN6)、PARK7、SNCA、及びLRRK2からなる群から選択される1つ以上の遺伝子内の突然変異と関連するものでありうる。一実施形態では、家族性型のパーキンソン病はPARK2(PRKN)の突然変異と関連するものでありうる。別の実施形態では、家族性型のパーキンソン病はPINK1(PRKN6)の突然変異に関連するものでありうる。一実施形態では、パーキンソン病は孤発性型のパーキンソン病ではない。
一実施形態では、本開示は、PARK2遺伝子の突然変異に関連するパーキンソン病を処置する方法であって、PARKIN(配列番号7)を含む本開示の融合タンパク質、例えば配列番号69、配列番号70、又は配列番号71のいずれか1つに少なくとも約85%、約90%、約95%、又は約99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む融合タンパク質をそれを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。
一実施形態では、本開示は、PINK1(PRKN6)遺伝子の突然変異に関連するパーキンソン病を処置する方法であって、PARKIN(配列番号7)を含む本開示の融合タンパク質、例えば配列番号69、配列番号70、又は配列番号71のいずれか1つに少なくとも約85%、約90%、約95%、又は約99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む融合タンパク質をそれを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。
一部の実施形態では、パーキンソン病は、下記から選択される少なくとも1つの症状を特徴とする。
a)振戦又はふるえ、通常は手足、しばしば手又は指で始まるもの。パーキンソン病と関連する振戦としては、親指と人差し指を前後にこする、丸薬丸め振戦として知られているもの及びリラックスしているとき(静止時)の手の振戦が挙げられ得る。
b)緩徐な動き(動作緩慢)、
c)筋強剛、
d)姿勢平衡障害、
e)自動運動の喪失
加えて、「非運動症状」又は「ドーパミン非反応性」の徴候又は症状もパーキンソン病を有する対象でよくみられ、それには以下のものが含まれうる。
f)認知障害、
g)気分障害、例えばうつ病及び不安、
h)個体がその夢を行動に起こすレム睡眠障害を含めた睡眠障害、
i)起立性低血圧、
j)便秘、
k)発話及び嚥下障害、
l)原因不明の疼痛、流涎、及び嗅覚消失。
本明細書で使用する「パーキンソン病を処置する」という用語は、上に記載したパーキンソン病の1つ以上の徴候又は症状の軽減、緩和、又は軽快、パーキンソン病の程度の低減、パーキンソン病の安定(すなわち悪化しないこと)の維持、病状の軽快又は緩和を包含する。パーキンソン病の処置は、上に記載したPDの主症状又は非運動症状の軽減、緩和、又は軽快のうちの1つ以上、例えば、振戦、動作緩慢、筋強剛の軽減、緩和、又は軽快、発話及び嚥下障害の軽減などを含むものであり得る。一実施形態では、処置が、パーキンソン病の進行を阻害すること及び遅くすることも含みうる。
処置は、治癒的である必要はない。処置成績を定量的に決定する必要はない。しかし、特定の実施形態では、例えば統一パーキンソン病評価尺度(UPDRS)又はMDS-UPDRSとして知られる改訂UPDRSを使用してパーキンソン病の経時的経過を追跡することによって、処置成績を定量化することができる。UPDRSは、パーキンソン病の臨床評価に最もよく使用されているスコアリングシステムである。UPDRSは、対象に対する問診及び臨床所見で評価される42項目を含んでいる。UPDRSスケールでは、合計199点が可能であり、199が最も悪い障害を表し、0が無障害を表す。UPDRSは、下記のセクションからなる。
パートI:精神機能、行動、及び気分の評価、
パートII:発話、嚥下、書字、更衣、衛生、転倒、流涎、寝返り、歩行、及び食品の切断を含めた日常生活動作(ADL)の自己評価、
パートIII:臨床医が採点する検査による運動評価、
パートIV:治療の合併症、
パートV:Hoehn及びYahrによるパーキンソン病の重症度分類、並びに
パートVI:Schwab及びEnglandのADLスケール。
これらは問診及び臨床所見によって評価される。いくつかのセクションでは、複数のグレードを各四肢に割り当てることが必要である。改訂UPDRSは、様々なサブスケールの再編成を含むが、元のUPDRSの4スケール構造を保持している。各スケールのタイトルは次の通りである。(1)日常生活の非運動経験(13項目)、(2)日常生活の運動経験(13項目)、(3)運動検査(18項目)、及び(4)運動合併症(6項目)。各サブスケールは、0～4の評点を有し、0=正常、1=軽微、2=軽度、3=中等度、4=重度である。
UPDRS又はMDS-UPDRSを用いて、人のパーキンソン病の進行を追跡するか、治療、例えば本開示の融合タンパク質を投与することを含む治療の利益を測定することができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載の方法によって本開示の融合タンパク質を対象に投与することによって、対象におけるパーキンソン病の進行の阻害又は減速がもたらされる。具体的には、一部の実施形態において、本開示の融合タンパク質を対象に投与することによって、一定の期間にわたって、例えば1週間、2週間、3週間、1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月、6ヶ月、9ヶ月、1年、2年、3年、又は5年にわたって、対象のUPDRSスコアの上昇が実質的になくなる。一部の実施形態では、本開示の融合タンパク質を対象に投与することによって、一定の期間にわたって、例えば1週間、2週間、3週間、1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月、6ヶ月、9ヶ月、1年、2年、3年、又は5年にわたって、対象におけるUPDRSスコアの低減がもたらされる。
バース症候群及び家族性孤立性拡張型心筋症を処置する方法
一実施形態では、本開示は、バース症候群及び家族性孤立性拡張型心筋症を処置する方法であって、本開示の融合タンパク質をそれを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。例えば、本開示は、バース症候群及び家族性孤立性拡張型心筋症を処置する方法であって、1) 対象とするタンパク質であるタファジン(配列番号3)に少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列、2)本明細書に記載の任意のCPP、及び3)本明細書に記載の任意のTESを含む融合タンパク質をそれを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。
一部の実施形態では、バース症候群及び家族性孤立性拡張型心筋症を処置する方法は、1) 対象とするタンパク質であるタファジン(配列番号3)に少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列、2)TAT-HIV(配列番号11)に少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%を有するアミノ酸配列、及び3)本明細書に記載の任意のTES、例えばユビキチン(配列番号18)又はカルパイン切断ドメイン(配列番号20)を含む融合タンパク質をそれを必要とする対象に投与することを含む。
ピルビン酸デヒドロゲナーゼE1-ベータ欠損症を処置する方法
一実施形態では、本開示は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼE1-ベータ欠損症を処置する方法であって、本開示の融合タンパク質をそれを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。例えば、本開示は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼE1-ベータ欠損症を処置する方法であって、1) 対象とするタンパク質であるPDHB(配列番号4)に少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列、2)本明細書に記載の任意のCPP、及び3)本明細書に記載の任意のTESを含む融合タンパク質をそれを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。
一部の実施形態では、ピルビン酸デヒドロゲナーゼE1-ベータ欠損症を処置する方法は、1) 対象とするタンパク質であるPDHB(配列番号4)に少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列、2)TAT-HIV(配列番号11)に少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%を有するアミノ酸配列、及び3)本明細書に記載の任意のTES、例えばユビキチン(配列番号18)又はカルパイン切断ドメイン(配列番号20)を含む融合タンパク質をそれを必要とする対象に投与することを含む。
リー症候群フランス-カナダ型を処置する方法
一実施形態では、本開示は、リー症候群フランス-カナダ型を処置する方法であって、本開示の融合タンパク質をそれを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。例えば、本開示は、リー症候群フランス-カナダ型を処置する方法であって、1) 対象とするタンパク質であるLRPPRC(配列番号5)又はSLIRP(配列番号6)に少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列、2)本明細書に記載の任意のCPP、及び3)本明細書に記載の任意のTESを含む融合タンパク質をそれを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。
一部の実施形態では、リー症候群フランス-カナダ型を処置する方法は、1) 対象とするタンパク質であるLRPPRC(配列番号5)又はSLIRP(配列番号6)に少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列、2)TAT-HIV(配列番号11)に少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%を有するアミノ酸配列、及び3)本明細書に記載の任意のTES、例えばユビキチン(配列番号18)又はカルパイン切断ドメイン(配列番号20)を含む融合タンパク質をそれを必要とする対象に投与することを含む。
PLA2G6関連神経変性症(PLAN)を処置する方法
一実施形態では、本開示は、PLA2G6関連神経変性症(PLAN)を処置する方法を提供する。一部の実施形態では、「PLA2G6関連神経変性症(PLAN)」という用語が、次の障害、すなわち乳児神経軸索ジストロフィー(INAD)、非定型神経軸索ジストロフィー(ANAD)、成人発症ジストニアパーキンソニズム(DP)及び常染色体劣性若年性パーキンソニズム(AREP)を含めたパーキンソン症候群のうちの1つ以上を含むものであり得る。
一部の実施形態では、PLANを処置する方法は、1) 対象とするタンパク質である表2に記載したVI型ホスホリパーゼA2の任意のバリアント1～9(配列番号72～80)に少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列、2)本明細書に記載の任意のCPP、及び3)本明細書に記載の任意のTESを含む融合タンパク質をそれを必要とする対象に投与することを含む。
一部の実施形態では、PLANを処置する方法は、1) 対象とするタンパク質である表2に記載したVI型ホスホリパーゼA2の任意のバリアント1～9(配列番号72～80)に少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列、2)TAT-HIV(配列番号11)に少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも99%を有するアミノ酸配列、及び3)本明細書に記載の任意のTES、例えばユビキチン(配列番号18)又はカルパイン切断ドメイン(配列番号20)を含む融合タンパク質をそれを必要とする対象に投与することを含む。特段の記載が無いか、文脈から明らかでない限り、本明細書で使用される場合、「約」という用語は、当技術分野において通常の許容差の範囲内にある、例えば平均2標準偏差以内にあることと理解される。約は、記載の値の10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、又は0.01%以内にあると理解される。別段に文脈から明らかでない限り、本明細書に示すすべての数値が、約という用語によって修飾されうる。
本明細書で使用する「投与する」、「投与すること」、又は「投与」という用語には、本開示の融合タンパク質、医薬組成物、又は治療用化合物の送達のいかなる方法も含まれる。特定の実施形態では、本開示の融合タンパク質、医薬組成物、又は治療用化合物を非経口的に、例えば静脈内、筋肉内、又は皮下に投与することができる。特定の一実施形態では、本開示の融合タンパク質、医薬組成物、又は治療用化合物を皮下投与することができる。融合タンパク質、医薬組成物、又は治療用化合物を投与することは、協調して働く何人かの人によって実施されうる。薬剤を投与することには、例えば、投与される薬剤を対象に処方すること、及び/又は自己送達、例えば経口送達、皮下送達、中心ラインを通した静脈内送達など、又は訓練された専門家による送達、例えば静脈内送達、筋肉内送達などによって特定の薬剤を摂取するように直接的に若しくは別のものを介して指示を与えることが含まれる。
[実施例]
[実施例1]
hFXNとTAT-GG-hFXN融合タンパク質の細胞内局在の比較
免疫蛍光染色による、TAT-GG-hFXN融合タンパク質で処置した後のラットL6筋芽細胞におけるhFXNの細胞内局在の決定
ヒトフラタキシンタンパク質(hFXN1-210)は、核にコードされており、配列番号1(表1)に示すアミノ酸配列を有する210アミノ酸の前駆体タンパク質として合成される。その発現の後、完全長hFXN1-210は、N末端の80aaミトコンドリア移行配列(MTS)によってミトコンドリアに向けられ、そこで、能動的に輸入され、タンパク質分解によるプロセシングを受けて、14.2kDaの予測分子量及び配列番号2(表1)に示す配列を有する、このタンパク質の130aaの成熟型、すなわち活性断片(hFXN81-210)を産生する。FXNの成熟型は、最終的に、ミトコンドリアのマトリックス内に存在する。
配列番号1:
Figure 2023518996000021
配列番号2:
Figure 2023518996000022
TAT-GG-hFXN融合タンパク質は、フリードライヒ運動失調症(FRDA)の処置のためのタンパク質補充療法で使用するために開発された。TAT-GG-hFXN融合タンパク質は、細胞及び動物におけるFRDAに関連する疾患表現型をレスキューすることが示されている。TAT-GG-hFXN融合タンパク質は、細胞内にある場合、ミトコンドリアに局在すると考えられる。
TAT-GG-hFXN融合タンパク質で処置した後のラットL6筋芽細胞におけるhFXNの細胞内局在を、免疫蛍光顕微鏡検査法で評価した(図3)。簡潔には、ラットL6筋芽細胞を、無血清培地中のTAT-GG-hFXN融合タンパク質(5μM)で2時間にわたって処置した。2時間後に、TAT-GG-hFXN融合タンパク質を含有する無血清培地を完全培地で置き換え、細胞をインキュベートした。図3に示す通り、hFXNは、小さな点状の細胞内小胞及び核の中で強く検出された(図3、「hFXN」及び「マージ」パネル参照)。観察されたhFXN含有細胞内小胞は、ミトコンドリア膜マーカーTOMM20との有意なオーバーラップを示さなかった(図3の「マージ」パネルに示されている)。これらの小胞は、TAT-GG-hFXN融合タンパク質が細胞に摂取された後における、エンドソーム/リソソームシステムを介したその輸送を表している可能性があるが、この仮説を立証するには、さらなる研究が必要である。あわせて、これらのデータは、hFXNが細胞内で検出できること、及びTAT-GG-hFXN融合タンパク質で処置された後に、hFXNが核で強く検出されることを実証している。記載されている条件下でTAT-GG-hFXN融合タンパク質で処置された後に、低レベルのhFXNがミトコンドリア内に存在している可能性があるが、ミトコンドリアのhFXNは、実際的に、免疫蛍光染色によってラットL6筋芽細胞で検出することは不可能である。
hFXN又はTAT-GG-hFXN融合タンパク質で形質移入した後のラットL6筋芽細胞間におけるhFXNの細胞内局在の比較
上述の条件下で、hFXNは、TAT-GG-hFXN融合タンパク質で処置した後、ほとんどがラットL6筋芽細胞の核内に検出された(図3)。完全長hFXNに付加されたN末端TAT-GG配列は、治療用タンパク質が細胞内に取り込まれた後に、それを核内に向けることができる可能性がある。hFXNに対するTAT-GGのこの影響をさらに慎重に評価するために、ラットL6筋芽細胞内のhFXNと比較した、細胞内で発現されたTAT-GG-hFXN融合タンパク質の細胞内局在を検出し、免疫蛍光顕微鏡検査法で比較した。形質移入分野の当業者に知られている脂質ベースの形質移入試薬、例えばL6細胞Avalanche(商標)システム(EZ Biosystems販売)を用いて、TAT-GG-hFXN融合タンパク質又はhFXN1-210をコードする遺伝子コンストラクトを含有する発現プラスミドで、ラットL6筋芽細胞を形質移入した。24時間後に、4%パラホルムアルデヒドを使用して形質移入細胞を固定し、hFXNに対する抗体又はミトコンドリア膜マーカーTOMM20を使用して染色し、Hoechst 33342核染色も行った。予測通り、hFXN1-210コンストラクトで形質移入されたラットL6筋芽細胞は、ミトコンドリア膜マーカーTOMM20との明らかな共局在によって証明されたように、ミトコンドリアhFXNの存在について陽性であった(図4、上パネル、「マージ」)。対照的に、TAT-GG-hFXN融合タンパク質で形質移入されたラットL6筋芽細胞は、hFXNについて陽性に、細胞のサイトゾル全体で染色され、核内で強く染色された(図4、下パネル、「マージ」)。TAT-GG-hFXN融合タンパク質で形質移入された細胞のうちのごくわずかな割合の細胞では、hFXNがミトコンドリアでも検出された(図4、下パネル、「マージ」におけるごくわずかな共局在染色)。まとめると、これらのデータは、TAT-GG-hFXN融合タンパク質の細胞内局在がhFXNの天然の細胞内局在と異なっており、主としてミトコンドリア(hFXN)からサイトゾルに、そして強度に核に行く(TAT-GG-hFXN融合タンパク質)ことを実証している。
[実施例2]
ミトコンドリアへのhFXNの送達を強化するための新規なTAT-GG-hFXNコンストラクトの設計
記載した実施例1で示された蛍光共局在結果である図3及び図4は、細胞内のTAT-GG-hFXN融合タンパク質分子の大多数がミトコンドリアに特異的に局在しておらず、これが、この分子のアミノ末端に付加されているTAT-GG配列の存在による可能性があることを示している。この障害を克服するために、いくつかの新規なフラタキシン融合タンパク質を設計し、それらのミトコンドリア送達収率について試験した。ミトコンドリアで作用する治療用融合タンパク質のミトコンドリア送達の収率を改善すると、ミトコンドリア病、例えばFRDAのより良い処置も提供することになる。この目標を達成するために、新規な融合タンパク質を設計した。これらのタンパク質の概略図を図5パネルa～cに示す。
一群のタンパク質を、プロテアーゼで切断可能なドメインを含むように設計し、「プロテアーゼで活性化可能な」細胞透過性hFXN融合タンパク質をコードするコンストラクトのライブラリーを作製した。これらのコンストラクトは、細胞透過性ペプチド(CPP)、例えばHIV-TAT(YGRKKRRQRRR;配列番号11)ペプチドをコードする配列が、内因性の細胞内プロテアーゼで切断することができるアミノ酸配列に融合したものを含み、そのすぐ後に、対象とするタンパク質、この場合には完全長前駆体hFXNが続いている。ジペプチドGGは、CPPとタンパク質分解性切断ドメインの間のリンカーとして使用された。サイトゾル内で融合タンパク質からTAT-GGが切断されると、TATを含まないhFXNタンパク質が生じることになり、その後、それが内因性MTSによってミトコンドリアに輸入され得る。例として、使用される切断可能な細胞内プロテアーゼ感受性タンパク質は、SUMO-1(SUMOプロテアーゼで切断される)及びユビキチン(ユビキチナーゼで切断される)であり、タンパク質分解感受性ペプチドは、DEVD(カスパーゼ切断部位、配列番号19)、EPLFAERK(配列番号20)及びLLVY(カルパイン切断部位、配列番号21)であった。
代替群のタンパク質を、核外移行シグナル(NES)を含むように、そして対象とするタンパク質が細胞核に蓄積するのが回避されるように設計した。すなわち、NESに連結された、対象とするタンパク質に連結されたCPPを含むようにコンストラクトを設計した。例として、TAT-GG-hFXN融合コンストラクトのカルボキシル末端を核外移行シグナル(NES)、例えばPKIα(NES1)及びMAPKK(NES2)由来のNESドメインに直接的に融合させた。
これらの融合タンパク質の概略図を図5、パネルa～cに示し、融合タンパク質コンストラクトの概要を表11に示す。
[表１１]
Figure 2023518996000023
[実施例3]
hFXN融合タンパク質の細胞内発現-ミトコンドリア輸送のための予備スクリーニング
様々なhFXNバリアント、すなわち、hFXN、TAT-GG-hFXN(TAT-hFXN融合タンパク質)、TAT-GG-SUMO1-hFXN、TAT-GG-ユビキチン-hFXN、TAT-GG-DEVD-hFXN、TAT-GG-EPLFAERK-hFXN、TAT-GG-LLVY-hFXN、TAT-GG-hFXN-NES1、及びTAT-GG-hFXN-NES2をコードする遺伝子コンストラクトを発現ベクターにクローニングした。例として、プラスミドベクターpcDNA3.1(+)(Genscript(登録商標)、米国ニュージャージー州Piscataway)を使用した。タンパク質をコードする配列はすべて、哺乳動物(ヒト)発現用に最適化されたコドンであった。バリアントのアミノ酸配列及びそれらそれぞれをコードしている核酸配列は、本開示の他の場所にある表9及び10に示されている。
形質移入分野の当業者に知られている脂質ベースの形質移入試薬を用いて、例えばL6細胞Avalanche(商標)システム(EZ Biosystems製)を用いて、これらの発現プラスミドでラットL6筋芽細胞を形質移入した。hFXN細胞内局在を、実施例1に記載のように行った免疫蛍光顕微鏡検査法で検出した。形質移入細胞を24時間培養し、その後、4%のパラホルムアルデヒドを使用して細胞を固定し、hFXNに対する抗体及びミトコンドリア膜マーカーTOMM20を使用して染色した。加えて、細胞の核を、Hoechst33342核染色を使用して染色した。
免疫標識の結果を図6、パネルa～iに示し、表12にまとめた。
[表１２]
Figure 2023518996000024
実施例1で実証されるように、ラットL6筋芽細胞で発現した場合、hFXNはミトコンドリアに局在したが、TAT-GG-hFXN融合タンパク質は、主として、サイトゾル及び核で検出された。TAT-GG-SUMO1-hFXN及びTAT-GG-ユビキチン-hFXNで形質移入された細胞では、hFXNがミトコンドリアで検出された。TAT-GG-DEVD-hFXNで形質移入された細胞では、hFXNがサイトゾル及び核で検出され、有意なミトコンドリア局在は観察されなかった。TAT-GG-EPLFAERK-hFXN及びTAT-GG-LLVY-hFXNで形質移入された細胞では、hFXNがミトコンドリア並びにサイトゾル及び核内で検出された。まとめると、これらのデータは、細胞内SUMOプロテアーゼ、デユビキチナーゼ、及び細胞内カルパインが、それらのそれぞれの切断部位で融合タンパク質を切断し、ミトコンドリアに局在するhFXNバリアントを産生することができることを実証している。TAT-GG-hFXN融合タンパク質と同様に、TAT-GG-DEVD-hFXNはミトコンドリアに検出されなかった。これは、DEVD(配列番号19)のカスパーゼ媒介切断が現行条件下で非効率的であったことを示唆している。
TAT-GG-hFXN-NES1及びTAT-GG-hFXN-NES2で形質移入された細胞では、hFXNがミトコンドリア並びにサイトゾル及び核内で検出された。あわせて、これらのデータは、hFXN融合タンパク質の核外移行が、hFXNのミトコンドリア輸入の改善をもたらすことを実証している。
[実施例4]
ウエスタンブロット分析によるhFXN成熟のアセスメント
天然の状態では、完全長hFXN1-210が、N末端ミトコンドリア移行配列(MTS)によってミトコンドリアに向けられ、そこで、それが輸入され、このタンパク質の成熟型であるhFXN81-210断片を産生する2ステップでのタンパク質分解プロセシングを受ける。新規なhFXNバリアントのタンパク質分解プロセシングによるhFXN成熟の程度を評価するために、hFXN、TAT-GG-hFXN融合タンパク質、TAT-GG-SUMO1-hFXN、TAT-GG-ユビキチン-hFXN、TAT-GG-EPLFAERK-hFXN、TAT-GG-LLVY-hFXN、TAT-GG-hFXN-NES1、及びTAT-GG-hFXN-NES2をコードする遺伝子を含有するそれぞれの発現プラスミドで形質移入されたラットL6筋芽細胞で生成されたhFXNバリアントでウエスタンブロット分析を行った。形質移入の72時間後に細胞を採取し、プロテアーゼ阻害剤及びEDTAを補足した氷冷の放射性免疫沈降アッセイ(RIPA)バッファー中で溶解させた。細胞溶解物を、SDS-PAGE(ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動)によって分離し、ニトロセルロースメンブレンに転写し、hFXNに対する市販の抗体(AbCamから購入)並びにローディング対照であるβ-アクチンに対する抗体を使用したウエスタンブロットで分析した。
結果を図7に示す。完全に成熟したhFXN(レーン1、15kDaマーカーの下のバンド、約14.2kDa)が、hFXNコンストラクトで形質移入された細胞から得られた溶解物で検出された。成熟したhFXN(約14.2kDa)に対応するバンドは、TAT-GG-hFXN融合タンパク質(レーン2)及びTAT-GG-SUMO1-hFXN(レーン3)をコードするプラスミドで形質移入された細胞から得られた溶解物でも検出された。成熟したhFXNは、TAT-GG-ユビキチン-hFXN(レーン4)、TAT-GG-EPLFAERK-hFXN(レーン5)、及びTAT-GG-hFXN-NES1(レーン7、このレーンでは、NES1の付加が分子量を約1kDa増加させるので、hFXN-NES1がSDS-PAGEで、より遅く移動した)で形質移入された細胞から得られた溶解物で、より多くの量で検出された。成熟したhFXNに対応するバンドは、TAT-GG-LLVY-hFXN(レーン6)及びTAT-GG-hFXN-NES2(レーン8)でも検出された。これらの結果は、新規のコンストラクトであるTAT-GG-ユビキチン-hFXN、TAT-GG-EPLFAERK-hFXN、及びTAT-GG-hFXN-NES1が、細胞内でタンパク質分解プロセシングを受け、TAT-GG-hFXN融合タンパク質より多い量の成熟したhFXNを産生することを示す。
[実施例5]
hFXN融合タンパク質を用いたシュワン細胞の形質導入
この実験の目標は、様々なhFXN融合タンパク質が細胞を形質導入する能力を決定及び比較することであった。
この実験は、実施例1に記載したTAT-GG-hFXN融合タンパク質及び新規なTAT-FXN融合タンパク質、すなわちTAT-GG-ユビキチン-hFXN(配列番号56)及びTAT-GG-EPLFAERK-hFXN(配列番号58)を用いた。TAT-GG-EPLFAERK-hFXN(配列番号58)では、EPLFAERK(配列番号20)がカルパイン1の感受性配列である。実験で使用された融合タンパク質の概要構造を図8に示す。
実験は、シュワン細胞が比較的速く成長し、形質導入しやすいので、シュワン細胞を用いた。また、これらの細胞におけるhFXNの内因性レベルは、検出限界より低く、したがって、TAT-GG-hFXN融合タンパク質によって生成されるシグナルには干渉しないと予測される。
シュワン細胞を、1ウェルあたり8,000細胞の播種密度で、96ウェルプレート(Corning 3904)にプレーティングし、37℃で終夜インキュベートした。1日目に、DMEM、1%熱失活FBS、及び20mMグリセロールを含有する形質導入培地中にそれぞれ1.25μM、1μM、及び0.5μMのTAT-GG-hFXN融合タンパク質を含有する溶液を調製した。1ウェルあたり150μLのPBSで細胞を洗浄し、その後、TAT-GG-hFXN溶液又は陰性対照用の形質導入培地のみをウェルあたり60μL添加した。細胞を37℃で2時間インキュベートし、その後、DMEM、10%FBS、1%抗生物質:抗真菌物質(Gemini Bio-Products 400-101)を含有する完全培地をウェルあたり60μL添加し、細胞を37℃で終夜インキュベートした。
同じ処置を2日目に繰り返した。3日目に、各ウェルの細胞を150μLのPBSで洗浄し、その後50μLのTrypLE(Gibco(商標)12604021)を各ウェルに添加し、37℃で5分間インキュベートすることによって細胞をトリプシン処理した。この後、50μLの完全培地を各ウェルに添加することによって、トリプシン処理反応を止めた。細胞を再懸濁し、1ウェルあたり40μLの完全DMEMを含有するフィブロネクチンでコーティングされたガラス底のプレート(Corning 4584)に移した。細胞を37℃で終夜沈着させた。
4日目に、細胞をPBSで洗浄し、その後、各ウェルに50μLの新たに調製された4%パラホルムアルデヒド溶液を添加し、細胞を室温で10分間インキュベートした。続いて、1ウェルあたり150μLのPBSで細胞を二度洗浄し、その後、1ウェルあたり50μLのブロッキングバッファー(0.3%Triton-X100、5%正常ヤギ血清を含むPBS)を添加した。細胞を室温で1時間インキュベートし、その後ブロッキングバッファーを除去し、ブロッキングバッファーで希釈した50μLの一次抗体(abcam製の抗フラタキシン抗体ab110328及びabcam製の抗TOMM20抗体ab78547)を各ウェルに添加した。抗フラタキシン抗体は、1:600希釈し、TOMM20抗体は1:300希釈した。細胞を4℃で終夜インキュベートした。
5日目に、1ウェルあたり120μLのPBSで細胞を二度洗浄し、ブロッキングバッファーで希釈した二次抗体(抗マウスIgG AlexaFluor594であるabcam製のab150116、及び抗ラビットigG Alexafluor488であるabcam製のab150077)50μLを各ウェルに添加した。各抗体は1:1000希釈した。細胞を室温で1時間インキュベートし、1ウェルあたり150μLのPBSで洗浄し、1ウェルあたり50μLの300nM Hoescht 33342染色液を添加することによって染色し、室温で3分間インキュベートした。続いて、細胞をPBSで洗浄した。
Lionheart顕微鏡を使用して細胞を画像化した。ヒトFXNは、マウス抗hFXNモノクローナル一次抗体に結合するAlexa-594標識のヤギ抗マウスIgG二次抗体を使用して検出した。ミトコンドリア膜は、抗TOMM20ポリクローナル一次抗体に結合するAlexa-488標識のヤギ抗ラビットIgG二次抗体を使用して検出した。
実験の結果を図9に示す。詳細には、図9、パネルAは、0.25μM、0.5μM、及び1μMのTAT-GG-hFXN、TAT-GG-EPLFAERK-hFXN、TAT-GG-ユビキチン-hFXN、及び陰性対照である媒体で処置されたシュワン細胞の一連の写真である。写真中、緑色は、ミトコンドリアマーカーであるTOMM20シグナルに対応し、赤色は、hFXNシグナルに対応し青色は、核マーカーであるHoechst33342色素シグナルに対応している。この画像化の条件下では、内因性フラタキシンレベルはシュワン細胞で検出できない。図9、パネルAで実証されるように、媒体で形質導入された細胞は、核染色及びミトコンドリア染色のみを示し、hFXNの染色は示さなかった。TAT-GG-hFXNで形質導入された細胞は、ある程度のhFXN染色を示した。対照的に、TAT-GG-EPLFAERK-hFXN及びTAT-GG-ユビキチン-hFXNで形質導入された細胞は、より高いレベルのhFXN染色を対応する濃度で示した。
図9、パネルBは、TAT-GG-ユビキチン-hFXN融合タンパク質で処置した細胞の高倍率画像である。この画像は、hFXN染色及びミトコンドリアへのその局在の詳細を示す。この画像は、新規なhFXN融合タンパク質で処置された細胞で、hFXNがミトコンドリアに局在することを示している。
Alexa594関連のシグナルを検出するのに使用されるテキサスレッドチャネルの平均強度を決定することによって、図9に示す写真のhFXNシグナルの量を定量化した。核シグナルの量は、Hoechst 33342色素に関連するシグナルを検出するのに使用されるDAPIチャネルの平均強度を決定することによって定量化した。
図9、パネルCは、様々な濃度のTAT-GG-hFXN、TAT-GG-EPLFAERK-hFXN、及びTAT-GG-ユビキチン-hFXNで処置した細胞のhFXN染色シグナルの平均値と核染色シグナルの平均値の比率を示す棒グラフである。図9、パネルCに示されている結果は、本開示の新規な融合タンパク質、すなわち、TAT-GG-EPLFAERK-hFXN及びTAT-GG-ユビキチン-hFXNで処置された細胞で検出されたhFXNの量が、研究されたすべての濃度で、TAT-GG-hFXNで処置された細胞で検出されるhFXNの量より2桁超多いことを示している。
顕微鏡実験におけるhFXNの定量化の精度をさらに確実にするために、細胞形質導入実験で使用した精製された組換え体hFXN融合タンパク質をSDS-PAGEゲルで分離し、ニトロセルロースメンブレンに転写した。メンブレンを総タンパク質染色で染色し、可視化した。
図9、パネルDは、形質導入実験に使用されたTAT-GG-hFXN、TAT-GG-EPLFAERK-hFXN、及びTAT-GG-ユビキチン-hFXNの試料をローディングしたSDS-PAGEゲルからの転写及び総タンパク質の染色が起こった後のニトロセルロースメンブレンの写真である。図9、パネルDに示す結果は、形質移入に使用された試料で、同様な量のTAT-GG-hFXN、TAT-GG-EPLFAERK-hFXN、及びTAT-GG-ユビキチン-hFXNが見出されていることを実証している。これらの結果は、融合タンパク質分解が無いことを実証しており、同量の各融合タンパク質が形質導入実験に使用されたことを確認する。これらの結果は、図9、パネルA及びBにおける顕微鏡実験でみられた定量化の結果が、細胞に添加されたhFXN融合タンパク質の量の相違によるものではないことも実証している。
図9、パネルA～Dに示す結果は、CPP及びTESを含む本開示の新規な融合タンパク質で細胞を形質導入した後の細胞で検出された、対象とするタンパク質、例えばhFXNの量が、CPPを含むが、TESは含まない融合タンパク質で細胞を形質導入した後の細胞で検出された、対象とするタンパク質、例えばhFXNの量より有意に多いことを実証している。結果は、TESがCPPと、対象とするタンパク質の間に位置するように、CPPを含む融合タンパク質にTESを導入することによって、細胞内の対象とするタンパク質の量が有意に増加しうることを示している。
[実施例6]
hFXN融合タンパク質を用いたシュワン細胞及びH9C2細胞の形質導入
この実験の目標は、様々なhFXN融合タンパク質で細胞を形質導入した後における、ミトコンドリアに局在するhFXNの能力を決定し、比較することであった。
この実験では、シュワン細胞及びH9C2筋芽細胞並びに実施例5で使用し、図8に示したのと同じhFXN融合タンパク質、すなわちTAT-GG-hFXN、TAT-GG-EPLFAERK-hFXN、及びTAT-GG-ユビキチン-hFXNを用いた。この実験では、実施例5に記載したのと同じ手順を用いて、0.00625μM、0.125μM、0.25μM、0.5μMの融合タンパク質濃度のhFXN融合タンパク質で細胞を処置した。細胞は、その後、抗FXN染色、核染色、及びミトコンドリア染色を使用して染色し、実施例5で記載の顕微鏡法を使用して分析した。
図10、パネルAは、1μMのhFXN融合タンパク質で処置され、ミトコンドリア染色、核染色、及び抗FXN染色で染色されたシュワン細胞及びH9C2細胞の一連の代表写真である。白い矢は、ミトコンドリアへの高レベルのhFXNの代表的な局在を示す。図10、パネルAに示す結果は、1μMのTAT-GG-EPLFAERK-hFXN及びTAT-GG-ユビキチン-hFXNで処置した細胞におけるhFXNの量が、TAT-GG-hFXNで処置した細胞におけるhFXNの量より多いことを示している。結果は、1μMのTAT-GG-EPLFAERK-hFXN及びTAT-GG-ユビキチン-hFXNで処置した細胞では、hFXNがミトコンドリアに局在する(白い矢を参照)が、1μMのTAT-GG-hFXNで処置した細胞では、観察されたhFXNのミトコンドリア局在がそれより少ないことも示している。
各試料について抗FXN染色シグナルの平均値及び抗ミトコンドリア染色シグナルの平均値を決定し、抗FXN染色シグナルの平均値と抗ミトコンドリア染色シグナルの平均値(TOMM20)の比率を計算した。図10、パネルBは、抗FXN染色シグナルの平均値と抗ミトコンドリア染色シグナルの平均値の比率を、シュワン細胞内のhFXN融合タンパク質濃度の関数として示すグラフである。図10、パネルCは、抗FXN染色シグナルの平均値と抗ミトコンドリア染色シグナルの平均値の比率を、H9C2細胞内のhFXN融合タンパク質濃度の関数として示すグラフである。図10、パネルB、及びCに示す結果は、GG-EPLFAERK-hFXN及びTAT-GG-ユビキチン-hFXNで処置したシュワン細胞及びH9C2細胞では、TAT-GG-hFXNで処置したシュワン細胞及びH9C2細胞と比較して、より多くの量のhFXNがミトコンドリアに局在することを実証している。さらに、GG-EPLFAERK-hFXN及びTAT-GG-ユビキチン-hFXNで処置した細胞におけるミトコンドリア局在の量は、用量依存的である。
別の細胞形質移入実験を、シュワン細胞、並びにTAT-GG-hFXN、TAT-GG-EPLFAERK-hFXN、TAT-GG-ユビキチン-hFXN、及びTAT-GG-hFXN NES1(配列番号60、図8に示す)を含めたhFXN融合タンパク質を使用して行った。実験に使用した実験プロトコールは上述のものと同じであった。図10、パネルDは、抗FXN染色シグナルの平均値と抗ミトコンドリア染色シグナルの平均値の比率を、シュワン細胞内のhFXN融合タンパク質濃度の関数として示すグラフである。図10、パネルDに示す結果は、TAT-GG-EPLFAERK-hFXN、TAT-GG-ユビキチン-hFXN、及びTAT-GG-hFXN-NES1で処置したシュワン細胞では、TAT-GG-hFXNで処置したシュワン細胞及びH9C2細胞と比較して、より多くの量のhFXNがミトコンドリアに局在することを実証している。結果は、融合タンパク質濃度0.5μMで、TAT-GG-hFXN-NES1で処置した後にミトコンドリアに局在するhFXNの量が、TAT-GG-EPLFAERK-hFXN、TAT-GG-ユビキチン-hFXNで処置した後にミトコンドリアに局在するhFXNの量より有意に多いことも実証している。さらに、新規なhFXN融合タンパク質で処置した細胞における、ミトコンドリアの局在の量は用量依存的である。
図10、パネルA～Dに示す結果は、本開示の新規な融合タンパク質、すなわち、TAT-GG-EPLFAERK-hFXN、TAT-GG-ユビキチン-hFXN、及びTAT-GG-hFXN-NES1で処置した細胞では、TAT-GG-hFXNで処置した細胞と比較して、より多くの量のhFXNが検出されることを示している。結果は、本開示の新規なhFXN融合タンパク質で処置した細胞におけるhFXNがミトコンドリアに局在することも示している。
[実施例7]
新規なhFXN融合タンパク質の細胞内プロセシングの確認
この実験の目標は、本開示の新規なhFXN融合タンパク質が、細胞機構によって正しくプロセシングされて、成熟したFXNタンパク質を産生することを確認することであった。この実験では、L6ラット筋芽細胞、並びに実施例5で使用し、図8に示したのと同じhFXN融合タンパク質、すなわち、TAT-GG-hFXN、TAT-GG-EPLFAERK-hFXN、及びTAT-GG-ユビキチン-hFXNを用いた。この実験では、以下の2種の追加のhFXN融合タンパク質、すなわちTAT-GG-hFXN-NES1(配列番号60)及びTAT-GG-SUMO-hFXN(配列番号81)も用いた。TAT-GG-SUMO-hFXN(配列番号81)のアミノ酸配列を下に示す。
Figure 2023518996000025
この実験用に、L6細胞を、hFXN融合タンパク質をコードするDNAベクターで形質移入し、細胞を24時間インキュベートした。細胞を収集し、処理して、総タンパク質を単離し、次いで、それをSDS-PAGEゲルで分離した。SDS-PAGE分離の後に、抗FXN抗体及び対照用の抗βアクチン抗体を用いたウエスタンブロッティングを使用して、ゲル中のフラタキシンを分析した。
図11は、様々なhFXN融合タンパク質で形質移入された細胞から単離され、抗FXN抗体を使用して分析された総タンパク質試料のウエスタンブロットの写真である。レーン1は、TATが融合していないhFXN対照をコードするコンストラクトで形質移入された細胞の試料を含有している。この試料では、約15kDaのバンドが、内因性のミトコンドリアα及びβ-MPPプロテアーゼによるMTS配列の二重切断の後に生じる成熟してプロセシングされたhFXNに対応する。
レーン2は、TAT-GG-hFXN融合タンパク質をコードするコンストラクトで形質移入された細胞の試料に対応している。この試料では、少量のhFXNが、プロセシングされて成熟したフラタキシンとして現れるが、hFXNの大部分は、約25kDaのプロセシングされていない完全長融合タンパク質として存在している。
レーン3、4、及び5は、それぞれTAT-SUMO-hFXN、TAT-GG-ユビキチン-hFXN、及びTAT-GG-EPLFAERK-hFXNをコードするコンストラクトで形質移入された細胞の試料に対応している。同じ実験条件下で、これらの試料は、レーン1及び2の試料より多くの量の成熟したhFXNを含有している。不完全なhFXNプロセシング及び様々なSUMO切断に対応する中間切断産物もレーン3～5に存在する(レーン3)。
レーン6は、TAT-GG-hFXN-NESをコードするコンストラクトで形質移入された細胞の試料を含有している。この試料は、レーン1及び2の試料より多くの量の成熟したhFXNも含有している。レーン6には、不完全なhFXNプロセシングに対応する中間切断産物も存在している。NESはプロセシングによって切断されず、MTS切断の後に融合タンパク質の一部を残すので、成熟したhFXN及び中間切断産物の分子量が、他の試料における成熟したhFXN及び中間切断産物の分子量より大きいことに留意されたい。
図11に示す結果は、本開示の新規なhFXN融合タンパク質、すなわちTAT-SUMO-hFXN、TAT-GG-ユビキチン-hFXN、TAT-GG-EPLFAERK-hFXN、及びTAT-GG-hFXN-NESが細胞内でプロセシングされて、成熟したhFXNを産生することを実証している。結果は、成熟したhFXNを産生する新規なhFXN融合タンパク質のプロセシングは、TAT-GG-hFXN融合タンパク質のプロセシングより効率的であることも実証している。TAT-GG-hFXNのプロセシングと比較して、より効率的な新規なhFXN融合タンパク質のプロセシングは、図4及び6に示す通り、核に局在する新規なhFXN融合タンパク質の量が、TAT-GG-hFXN融合タンパク質と比較して少ないという事実によって少なくとも部分的に説明することができる。
[実施例8]
hFXN融合タンパク質の機能的特性分析
この実験の目標は、新規なhFXN融合タンパク質の機能を特徴付けることであった。本出願人は、LRPPRCを欠失した細胞が、高レベルの細胞培地酸性化及び培地へのSYR61タンパク質の分泌を示すことを以前に示した。本出願人は、LRPPRC欠失細胞の処置が細胞培地酸性化及びSYR61タンパク質の分泌量の両方の低減を引き起こすことも以前に示した(例えばWO2021/011929を参照。この開示の全内容を参照により本明細書に組み込む)。したがって、細胞培地酸性化及びSYR61タンパク質の分泌量は、細胞内のFXN活性の尺度として使用することができる。
本実験は、以前に、例えばWO2021/011929に記載されている細胞株HEK293LRPPRC KD(クローン21C)を用いる。簡潔には、この細胞株は、LRPPRC shRNAでHEK293細胞を形質移入して、LRPPRCの遺伝子サイレンシングを起こすことによって作製されたLRPPRCノックダウン細胞株である。スクランブル配列(Scr-5)で形質移入した対照細胞株もこの実験で使用した。この実験では、実施例5で使用し、図8に示すものと同じhFXN融合タンパク質、すなわち、TAT-GG-hFXN、TAT-GG-EPLFAERK-hFXN、及びTAT-GG-ユビキチン-hFXNも用いた。
この実験用に、LRPPRC KD細胞及びScr-5細胞を、完全DMEM(DMEM、10%FBS、及び1%抗生物質:抗真菌物質)中、1ウェルあたり50,000細胞の播種密度で24ウェルプレートにプレーティングした。1日目に、細胞を媒体、TAT-GG-hFXN、TAT-GG-EPLFAERK-hFXN、又はTAT-GG-ユビキチン-hFXNで、37℃で3時間処置した。融合タンパク質濃度2.5μM、5μM、及び10μMで、TAT-GG-hFXN融合タンパク質による細胞の処置を行った。融合タンパク質濃度0.25μM、0.5μM、及び1μMで、TAT-GG-EPLFAERK-hFXN及びTAT-GG-ユビキチン-hFXNによる細胞の処置を行った。3時間後に、完全培地を各ウェルに添加し、細胞を37℃で終夜インキュベートした。
同じ処置を2日目に繰り返し、細胞を37℃で終夜インキュベートした。3日目に、細胞を完全培地でさらに48時間インキュベートした。
48時間後に、培地を収集した。ヒトCyr61/CCN1 Quantikine ELISAキット(R&D Systems、カタログ番号DCYR10)を使用したCYR61 Elisaによって、CYR61レベルの分析を行った。乳酸gloキット(#J5021、Promega Corporation)を使用し、製造業者のプロトコールに従って、培地中の乳酸レベルを決定した。
図12、パネルAは、本開示のhFXN融合タンパク質で処置したLRPPRC KD細胞及びScr-5細胞の試料を含有する培養プレートの写真を示す。細胞培養培地の酸性化は、桃色(酸性化が弱い)から黄色(酸性化が強い)に、培養培地中のフェノールレッドの色が変化するのに反映されている。図12、パネルAは、写真に示す細胞培養プレート内の試料の概略図も示す。
図12、パネルAにおける結果は、LRPPRC KD細胞が細胞培地酸性化を誘導すること(プレートの行4列1～3のウェル内の黄色い培地で実証される)及び試験されたhFXN融合タンパク質による処置の後に、培地酸性化の程度が用量依存的に低減すること(プレートの列3行1～3のウェル内の橙色の培地、列2行1～3のウェル内の桃色の培地、及び列1行1～3のウェル内の暗色よりの桃色又は赤色の培地によって実証される)を実証している。結果は、TAT-GG-hFXNが濃度10μMで培地酸性化を防止することができ、他方で、TAT-GG-EPLFAERK-hFXN及びTAT-GG-ユビキチン-hFXNが、それぞれ、1μMという、TAT-GG-hFXNより著しく低い濃度で培地酸性化を防止することができることも実証している。
図12、パネルBは、試験された最も高い濃度の各hFXN融合タンパク質又は媒体で処置されたLRPPRC KD及びScr-5対照細胞の一連の写真である。図12、パネルBの結果は、細胞培養培地の酸性化が細胞死によるものでなかったことを実証している。
図12、パネルCは、hFXN融合タンパク質で処置したLRPPRC KD細胞の培地における、CYR61の量を示すグラフである。図12、パネルCの結果は、hFXN融合タンパク質で処置した後のLRPPRC KD細胞によるCYR61分泌の濃度依存的な阻害を実証している。結果は、CYR61分泌に対する阻害効果が、TAT-GG-hFXNと比較して、有意に低いTAT-GG-EPLFAERK-hFXN及びTAT-GG-ユビキチン-hFXNの濃度でみられることも実証している。この効果は、TAT-GG-EPLFAERK-hFXN及びTAT-GG-ユビキチン-hFXNのCYR61阻害のIC50値が、図12、パネルCの表に示すTAT-GG-hFXNのIC50値と比較して、より低いことにも反映されている。
図12、パネルDは、hFXN融合タンパク質で処置したLRPPRC KD細胞の培地中の乳酸の量を示すグラフである。図12、パネルDの結果は、hFXN融合タンパク質で処置した後のLRPPRC KD細胞による乳酸産生の濃度依存的な阻害を実証している。結果は、乳酸産生の阻害効果が、TAT-GG-hFXNと比較して、有意に低いTAT-GG-EPLFAERK-hFXN及びTAT-GG-ユビキチン-hFXNの濃度でみられることも実証している。この効果は、TAT-GG-EPLFAERK-hFXN及びTAT-GG-ユビキチン-hFXNの乳酸産生の阻害のIC50値が、図12、パネルDの表に示すTAT-GG-hFXNのIC50値と比較して、より低いことにも反映されている。
図12、パネルA～Dに示す結果は、乳酸産生及びCYR61分泌の阻害で測定される活性がTAT-GG-hFXNより高いことによって、TAT-GG-EPLFAERK-hFXN及びTAT-GG-ユビキチン-hFXNが特徴付けられることを実証している。結果は、融合タンパク質にTESを導入すると融合タンパク質の機能が強化されることを示している。
[実施例9]
新規なPARKIN融合コンストラクトの設計及び合成
この実験の目標は、ヒトPARKINタンパク質(配列番号7)を含む本開示に記載の新規な融合タンパク質を合成することであった。
PARKIN融合タンパク質の設計は、実施例2に記載したhFXN融合コンストラクトの設計と同様であった。いくつかのPARKIN融合タンパク質は、細胞透過性ペプチド(CPP)、例えばHIV-TAT(YGRKKRRQRRR;配列番号11)ペプチドをコードする配列が、TES、例えば内因性の細胞内プロテアーゼで切断されることができるアミノ酸配列に融合し、そのすぐ後に、対象とするタンパク質であるPARKINが続いているものを含んでいた。ジペプチドGGは、CPPとタンパク質分解性切断ドメインの間のリンカーとして使用された。サイトゾルで融合タンパク質からTAT-GGが切断されると、TATを含まないPARKINタンパク質が生じることになる。PARKIN融合タンパク質で使用されたタンパク質分解性切断ドメインは、ユビキチン(配列番号18)及びEPLFAERK(配列番号45)であった。
代替のPARKIN融合タンパク質は、核外移行シグナル(NES)を含み、細胞核におけるPARKINの蓄積が回避されるように設計された。このコンストラクトは、NESに連結された対象とするタンパク質であるPARKINに連結されたCPPを含むように設計された。
PARKIN融合タンパク質の概略図を図13に示し、融合タンパク質コンストラクトの概要を表13に示す。
[表１３]
Figure 2023518996000026
対照として使用されたHis6-SUMO-TAT-GG-PARKIN(配列番号82)のアミノ酸配列を下に示す。
Figure 2023518996000027
対照融合タンパク質であるHis6-SUMO-TAT-GG-PARKINでは、His6-SUMO部分が精製の容易さのためのみに存在していることに留意されたい。His6タグ(配列番号85)を使用した精製の後に、SUMO配列のプロテアーゼ媒介切断でHis6タグ(配列番号85)を除去する。したがって、配列番号82の対照融合タンパク質は、TES配列を含有していない。
[実施例10]
PARKIN融合タンパク質の形質導入能力
この実験の目標は、細胞を形質導入して、ミトコンドリアに局在するPARKIN融合タンパク質の能力を決定することであった。
この実験では、L6ラット筋芽細胞を用いた。これは、これらの細胞の内因性PARKINレベルが低く、したがって、TAT-GG-hFXN融合タンパク質によって生成されたシグナルに干渉しないためである。この実験は、実施例9に記載したPARKIN融合タンパク質も用いた。
この実験用に、完全DMEM培地(DMEM、10%FBS、及び1%抗生物質:抗真菌物質)中、1ウェルあたり8,000細胞の播種密度で96ウェルプレート(corning 3904)にL6細胞をプレーティングし、37℃で終夜インキュベートした。1日目に、0.0625μM、0.125μM、0.25μM、0.5μM、及び1μMの各PARKIN融合タンパク質で、37℃で2時間、細胞を処置した。2時間後に、ウェル毎に同じ量の完全培地を添加し、37℃で終夜インキュベートした。同じ処置を2日目に繰り返した。
3日目に、細胞をPBSで洗浄し、トリプシン処理し、完全細胞培養培地中に再懸濁し、フィブロネクチンでコーティングされたガラス底プレートに移し、37℃で終夜沈着させた。4日目に、細胞をPBSで洗浄し、新たに調製した4%パラホルムアルデヒド溶液で、室温で10分間処置した。10分間後に、細胞をPBSで二度洗浄し、その後、ウェルあたり50μLのブロッキングバッファー(0.3%Triton-X 100、5%正常なヤギ血清を含むPBS)を添加し、室温で1時間インキュベートした。1時間後に、ブロッキングバッファーを吸引し、ブロッキングバッファーで希釈した一次抗体(抗パーキン抗体12235-1-AP(1:100)及び抗TOMM20抗体EMD Millipore MABT166(1:500)を、ウェルあたり添加し、4℃で終夜インキュベートした。
5日目に、細胞をPBSで二度洗浄し、ブロッキングバッファーで希釈した二次抗体(抗マウスIgG AlexaFluor594であるab150116 abcam(1:1000)、抗ラビットIgG Alexafluor488であるab150077 abcam(1:1000))50μLを各ウェルに添加した。細胞を室温で1時間インキュベートし、その後それらをPBSで穏やかに洗浄し、50μLの300nMのHoescht33342染色液と混合し、室温で3分間静置した。その後、細胞をPBSで二度洗浄し、画像化した。ミトコンドリアと共局在するPARKINタンパク質の比率をOperetta(Perkin Elmer製のハイコンテントイメージャー)のHarmonyソフトウェアを使用して評価し、ミトコンドリアに局在するPARKINの、タンパク質濃度(μM)に対する比率の関数としてプロットした。具体的には、AlexaFluor488染色(PARKINに対応する)の量とAlexaFluor594染色(ミトコンドリアに対応する)の量の比率を計算し、グラフ上にプロットして、様々なPARKIN融合タンパク質の形質導入効率を比較した。
実験の結果を図14に示す。具体的には、PARKIN染色とミトコンドリアの染色の比率を、様々な濃度のHis6-SUMO-TAT-GG-PARKIN、TAT-GG-EPLFAERK-PARKIN、及びTAT-GG-ユビキチン-PARKINで処置した細胞のPARKIN融合タンパク質濃度の関数として示す図14はグラフである。図14に示す結果は、PARKIN融合タンパク質による細胞の形質導入が用量依存的に起こることを実証しており、比率が高いほど、ミトコンドリア局在が高度であることを示している。結果は、TESを含有するPARKIN融合タンパク質、すなわちTAT-GG-EPLFAERK-PARKIN及びTAT-GG-ユビキチン-PARKINが、1μMの濃度で、TESの無い対照PARKIN融合タンパク質であるHis6-SUMO-TAT-GG-PARKINより多くのミトコンドリア局在を有することを示している。この実験の結果は、TESを含有するPARKIN融合タンパク質が、細胞内に形質導入され、対照のHis6-SUMO-TAT-PARKIN融合タンパク質より多い量で、正しくミトコンドリアに局在することを示している。
[実施例11]
PARKIN融合タンパク質の活性
この実験の目標は、新規なPARKIN融合タンパク質で処置した細胞でPARKINの活性を試験することであった。具体的には、実験の目標は、新規なPARKIN融合タンパク質で細胞を処置した後に、ミトコンドリア脱共役剤カルボニルシアニドm-クロロフェニルヒドラゾン(CCCP)の存在下で、PARKINがミトコンドリアに局在して、マイトファジーを誘導するかどうかを決定することであった。
この実験用に、10μMのCCCPの存在下及び非存在下で、L6ラット筋芽細胞を0μM、0.5μM、及び1μMのHis6-SUMO-TAT-GG-PARKIN、TAT-GG-EPLFAERK-PARKIN、又はTAT-GG-ユビキチン-PARKINで処置した。その後、免疫染色及び顕微鏡法を、本質的には実施例10に記載した通りに行った。
TAT-GG-EPLFAERK-PARKINの実験の結果を図15に示す。具体的には、図15は、10μMのCCCPの非存在下又は存在下で、0μM又は0.5μMのTAT-GG-EPLFAERK-PARKINで処置したL6ラット筋芽細胞の一連の写真である。図15に示す結果は、対照L6ラット筋芽細胞がCCCPの非存在下又は存在下でいかなる形態学的な相違も示さないことを実証している。また、図15は、PARKIN融合タンパク質による処置の非存在下で、内因性のPARKINがL6細胞で検出不可能なままであることを示している。図15に示す結果は、TAT-GG-EPLFAERK-PARKINで処置したL6ラット筋芽細胞では、CCCPの存在下でミトコンドリアへのPARKINの局在が観察されることも示している。この観察は、ミトコンドリア膜脱分極の際における、ミトコンドリアへのPARKINのミトコンドリア再局在を伴う、マイトファジーにおける内因性PARKINの既知な役割と整合している。

Claims (91)

  1. 細胞に送達する対象とするタンパク質、
    細胞透過性ペプチド(CPP)、及び
    標的促進配列(TES)
    を含む融合タンパク質。
  2. CPPが融合タンパク質のN末端に位置し、TESがCPPのC末端に融合している、請求項1に記載の融合タンパク質。
  3. N末端から開始して、
    CPP、
    TES、及び
    対象とするタンパク質
    を含むか、又はこれらからなる請求項1又は2に記載の融合タンパク質。
  4. CPPが融合タンパク質のC末端に位置し、TESがCPPのN末端に融合している、請求項1に記載の融合タンパク質。
  5. C末端から開始して、
    対象とするタンパク質、
    TES、及び
    CPP
    を含むか、又はこれらからなる請求項1又は4に記載の融合タンパク質。
  6. 対象とするタンパク質がOTSを欠く、請求項1～5のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  7. 融合タンパク質が、対象とするタンパク質にとって外因性のオルガネラ移行配列(OTS)をさらに含む、請求項6に記載の融合タンパク質。
  8. 対象とするタンパク質がOTSを含む、請求項1～5のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  9. OTSが、対象とするタンパク質と異種である、請求項8に記載の融合タンパク質。
  10. OTSが、対象とするタンパク質にとって内因性である、請求項8に記載の融合タンパク質。
  11. 対象とするタンパク質が、フラタキシン(FXN)、タファジン、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ(PDH)、SLIRP、LRPPC、PARK2タンパク質、PARK6タンパク質、PARK7タンパク質、VI型ホスホリパーゼA2、及びそのバリアント又は誘導体からなる群から選択される、請求項1～5のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  12. 対象とするタンパク質が、フラタキシン(FXN)、PARK2タンパク質、又はそのバリアント若しくは誘導体を含む、請求項11の融合タンパク質。
  13. CPPが、細胞透過性ペプチドデータベースCPPsite2.0に記載されているCPPの群から選択されるペプチドを含む、請求項1～12のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  14. CPPが、HIV-TAT、ガラニン、マストパラン、トランスポータン、ペネトラチン、ポリアルギニン、VP22、及びそのバリアント又は誘導体からなる群から選択されるペプチドを含む、請求項1～13のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  15. CPPがHIV-TAT又はそのバリアント若しくは誘導体を含む、請求項14に記載の融合タンパク質。
  16. TESが核外移行シグナルペプチドである、請求項1～15のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  17. 核外移行シグナルペプチドが、配列番号36～43のいずれか1つに少なくとも85%の配列同一性を有する配列を含む、請求項16に記載の融合タンパク質。
  18. 核外移行シグナルペプチドが、NES1、NES2、NES3、NES4、NES5、NES6、NES7、NES8、及びそのバリアント又は誘導体からなる群から選択されるペプチドを含む、請求項17に記載の融合タンパク質。
  19. 核外移行シグナルペプチドが、NES1及びNES2、又はそのバリアント若しくは誘導体からなる群から選択されるペプチドを含む、請求項18に記載の融合タンパク質。
  20. TESがプロテアーゼ感受性ペプチドである、請求項1～19のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  21. プロテアーゼ感受性ペプチドがユビキチン様修飾因子を含む、請求項20に記載の融合タンパク質。
  22. プロテアーゼ感受性ペプチドが、配列番号18～31のいずれか1つに少なくとも85%の配列同一性を有する配列を含む、請求項20に記載の融合タンパク質。
  23. プロテアーゼ感受性ペプチドが、ユビキチン、カスパーゼ切断ドメイン、カルパイン切断ドメイン、SUMO1、SUMO2、SUMO3、SUMO4、ISG15、Atg8、Atg12、NEDD8、及びそのバリアント又は誘導体からなる群から選択されるペプチドを含む、請求項20に記載の融合タンパク質。
  24. 融合タンパク質が、配列番号55～61、69～71、及び81のいずれかに少なくとも85%、90%、又は95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の融合タンパク質。
  25. 非核オルガネラに送達する対象とするタンパク質、
    オルガネラ移行配列(OTS)、
    細胞透過性ペプチド(CPP)、及び
    標的促進配列(TES)
    を含み、CPPが、非核オルガネラへの対象とするタンパク質の送達に干渉することができ、
    TESがCPPによる前記干渉を防止する、
    融合タンパク質。
  26. CPPが融合タンパク質のN末端に位置し、TESがCPPのC末端に融合している、請求項25に記載の融合タンパク質。
  27. N末端から開始して、
    CPP、
    TES、
    OTS、及び
    対象とするタンパク質
    を含む、請求項25又は26に記載の融合タンパク質
  28. CPPが融合タンパク質のC末端に位置し、TESがCPPのN末端に融合している、請求項25に記載の融合タンパク質。
  29. 非核オルガネラが、ミトコンドリア、サイトゾル、リソソーム、小胞体(ER)、ペルオキシソーム、及びゴルジ装置からなる群から選択される、請求項25～28のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  30. 対象とするタンパク質が、その天然存在の形態では、ミトコンドリア、サイトゾル、リソソーム、小胞体(ER)、ペルオキシソーム、又はゴルジ装置に局在している、請求項25又は26に記載の融合タンパク質。
  31. 対象とするタンパク質が、フラタキシン(FXN)、タファジン、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ(PDH)、SLIRP、LRPPC、PARK2タンパク質、PARK6タンパク質、PARK7タンパク質、VI型ホスホリパーゼA2、及びそのバリアント又は誘導体からなる群から選択される、請求項25～30のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  32. 対象とするタンパク質が、フラタキシン(FXN)又はそのバリアント若しくは誘導体である、請求項31に記載の融合タンパク質。
  33. 対象とするタンパク質がピルビン酸デヒドロゲナーゼ(PDH)又はそのバリアント若しくは誘導体である、請求項31に記載の融合タンパク質。
  34. CPPが、細胞透過性ペプチドデータベースCPPsite2.0に記載されているCPPの群から選択されるペプチドを含む、請求項25～33のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  35. CPPが、HIV-TAT、ガラニン、マストパラン、トランスポータン、ペネトラチン、ポリアルギニン、VP22、及びそのバリアント又は誘導体からなる群から選択されるペプチドを含む、請求項25～34のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  36. CPPがHIV-TAT又はそのバリアント若しくは誘導体を含む、請求項35に記載の融合タンパク質。
  37. TESが核外移行シグナルペプチドである、請求項25～36のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  38. 核外移行シグナルペプチドが、配列番号36～43のいずれか1つに少なくとも85%の配列同一性を有する配列を含む、請求項37に記載の融合タンパク質。
  39. 核外移行シグナルペプチドが、NES1、NES2、NES3、NES4、NES5、NES6、NES7、NES8、及びそのバリアント又は誘導体からなる群から選択されるペプチドを含む、請求項38に記載の融合タンパク質。
  40. 核外移行シグナルペプチドが、NES1、NES2、及びそのバリアント若しくは誘導体からなる群から選択されるペプチドを含む、請求項39に記載の融合タンパク質。
  41. TESがプロテアーゼ感受性ペプチドである、請求項25～36のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  42. プロテアーゼ感受性ペプチドがユビキチン様修飾因子を含む、請求項41に記載の融合タンパク質。
  43. プロテアーゼ感受性ペプチドが、配列番号18～31のいずれか1つに少なくとも85%の配列同一性を有する配列を含む、請求項41に記載の融合タンパク質。
  44. プロテアーゼ感受性ペプチドが、ユビキチン、カスパーゼ切断ドメイン、カルパイン切断ドメイン、SUMO1、SUMO2、SUMO3、SUMO4、ISG15、Atg8、Atg12、NEDD8、及びそのバリアント又は誘導体からなる群から選択されるペプチドを含む、請求項41に記載の融合タンパク質。
  45. 分泌シグナル(SS)をさらに含む、請求項25～44のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  46. 細胞外タンパク質分解部位(EPS)をさらに含む、請求項25～45のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  47. 融合タンパク質が、対象とするタンパク質を非核オルガネラに送達する、請求項25～46のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  48. 融合タンパク質が、対象とするタンパク質をミトコンドリアに送達する、請求項25～47のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  49. 融合タンパク質が、配列番号55～61、69～71、及び81のいずれかに少なくとも85%、90%、又は95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項25に記載の融合タンパク質。
  50. 請求項1～49のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
  51. 請求項50に記載の核酸を含む、細胞に融合タンパク質を導入するための発現ベクター。
  52. 発現ベクターが、レトロウイルスベクター、DNAベクター、プラスミド、RNAベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルス随伴ベクター、レンチウイルスベクター、ファージミド、バキュロウイルス、及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項51に記載の発現ベクター。
  53. 非核オルガネラへのタンパク質の細胞内送達のためのコンジュゲートであって、請求項1～49のいずれか一項に記載の融合タンパク質及び前記融合タンパク質に連結した部分を含み、前記部分が、放射性標識、蛍光標識、小分子、及びポリマー分子からなる群から選択される、コンジュゲート。
  54. ポリマー分子がポリエチレングリコール(PEG)である、請求項53に記載のコンジュゲート。
  55. 請求項1～49のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項50の核酸、請求項51～52のいずれか一項に記載の発現ベクター、請求項53～54のいずれか一項に記載のコンジュゲート、又はこれらの組合せを含む細胞。
  56. 幹細胞又はiPS細胞である、請求項55に記載の細胞。
  57. 筋前駆細胞、ニューロン前駆細胞、骨髄幹細胞、細菌細胞株、又は酵母細胞株からなる群から選択される、請求項55に記載の細胞。
  58. 請求項1～49のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項53～54のいずれか一項に記載のコンジュゲート、又はこれらの組合せ、及び薬学的に許容できる希釈剤、担体、添加剤、又は賦形剤を含む医薬組成物。
  59. 対象とするタンパク質を細胞に送達する方法であって、前記細胞を請求項1～49のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項50に記載の核酸、請求項51～52のいずれか一項に記載のベクター、又は請求項53～54のいずれか一項に記載のコンジュゲートと接触させることを含む方法。
  60. 細胞内の非核オルガネラに、対象とするタンパク質を細胞内送達する方法であって、前記細胞を請求項1～49のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項50に記載の核酸、請求項51～52のいずれか一項に記載のベクター、又は請求項53～54のいずれか一項に記載のコンジュゲートと接触させることを含む方法。
  61. 前記非核オルガネラがミトコンドリアである、請求項59に記載の方法。
  62. 非核オルガネラ関連障害を処置するための治療用化合物であって、請求項1～49のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項50に記載の核酸、請求項51～52のいずれか一項に記載のベクター、又は請求項53～54のいずれか一項に記載のコンジュゲートを含む化合物。
  63. 非核オルガネラ関連障害が、フリードライヒ運動失調症(FDRA)、バース症候群、パーキンソン病、ウイルソン病、リー症候群、線維症、及びPLA2G6関連神経変性症(PLAN)からなる群から選択される、請求項62に記載の治療用化合物。
  64. 非核オルガネラ関連障害がFDRAである、請求項63に記載の治療用化合物。
  65. 非核オルガネラ関連障害がパーキンソン病である、請求項63に記載の治療用化合物。
  66. 非核オルガネラ関連障害を処置する方法であって、前記非核オルガネラ関連障害が処置されるように、請求項1～49のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項50に記載の核酸、請求項51～52のいずれか一項に記載のベクター、請求項53～54のいずれか一項に記載のコンジュゲート、又は請求項58に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む方法。
  67. 非核オルガネラ関連障害が、フリードライヒ運動失調症(FDRA)、バース症候群、パーキンソン病、ウイルソン病、リー症候群、及び線維症からなる群から選択される、請求項66に記載の方法。
  68. 非核オルガネラ関連障害がFDRAである、請求項67に記載の方法。
  69. 非核オルガネラ関連障害がパーキンソン病である、請求項67に記載の方法。
  70. 前記対象がヒトである、請求項66～69のいずれか一項の方法。
  71. 細胞に送達される、対象とするタンパク質の量を増加させる方法であって、
    融合タンパク質に標的促進配列(TES)を導入することによって、対象とするタンパク質及び細胞透過性ペプチド(CPP)を含む融合タンパク質の配列を改変し、それによって、改変融合タンパク質を生成するステップ、及び
    細胞を改変融合タンパク質と接触させるステップ
    を含み、それによって、TESが無い融合タンパク質により細胞に送達される対象とするタンパク質の量と比較して、細胞に送達される対象とするタンパク質の量を増加させる、方法。
  72. 改変融合タンパク質中で、CPPが融合タンパク質のN末端に位置し、TESがCPPのC末端に融合している、請求項71に記載の方法。
  73. 改変融合タンパク質が、N末端から開始して、
    CPP、
    TES、及び
    対象とするタンパク質
    を含む、請求項71又は72に記載の方法。
  74. 改変融合タンパク質が、N末端から開始して、
    CPP、
    TES、
    OTS、及び
    対象とするタンパク質
    を含む、請求項71又は72に記載の方法。
  75. 改変融合タンパク質中で、CPPが融合タンパク質のC末端に位置し、TESがCPPのN末端に融合している、請求項71に記載の方法。
  76. TESが無い融合タンパク質によりオルガネラに送達される対象とするタンパク質の量と比較して、OTSにより標的にされるオルガネラに送達される対象とするタンパク質の量が増加している、請求項74に記載の方法。
  77. 対象とするタンパク質が、フラタキシン(FXN)、タファジン、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ(PDH)、SLIRP、LRPPC、PARK2タンパク質、PARK6タンパク質、PARK7タンパク質、及びVI型ホスホリパーゼA2、又はそのバリアント若しくは誘導体からなる群から選択される、請求項71～76のいずれか一項の方法。
  78. 対象とするタンパク質がフラタキシン(FXN)又はそのバリアント若しくは誘導体である、請求項77に記載の方法。
  79. 対象とするタンパク質がPARK2タンパク質又はそのバリアント若しくは誘導体である、請求項77に記載の方法。
  80. CPPが、細胞透過性ペプチドデータベースCPPsite2.0に記載されているCPPの群から選択されるペプチドを含む、請求項71～79のいずれか一項に記載の方法。
  81. CPPが、HIV-TAT、ガラニン、マストパラン、トランスポータン、ペネトラチン、ポリアルギニン、VP22、及びそのバリアント又は誘導体からなる群から選択されるペプチドを含む、請求項71～79のいずれか一項に記載の方法。
  82. CPPがHIV-TAT又はそのバリアント若しくは誘導体を含む、請求項81に記載の方法。
  83. TESが核外移行シグナルペプチドである、請求項71～82のいずれか一項の方法。
  84. 核外移行シグナルペプチドが、配列番号36～43のいずれか1つに少なくとも85%の配列同一性を有する配列を含む、請求項83に記載の方法。
  85. 核外移行シグナルペプチドが、NES1、NES2、NES3、NES4、NES5、NES6、NES7、NES8、及びそのバリアント又は誘導体からなる群から選択されるペプチドを含む、請求項84に記載の方法。
  86. 核外移行シグナルペプチドが、NES1、NES2、及びそのバリアント又は誘導体からなる群から選択されるペプチドを含む、請求項85に記載の方法。
  87. TESがプロテアーゼ感受性ペプチドである、請求項71～82のいずれか一項に記載の方法。
  88. プロテアーゼ感受性ペプチドがユビキチン様修飾因子を含む、請求項87に記載の方法。
  89. プロテアーゼ感受性ペプチドが、配列番号18～31のいずれか1つに少なくとも85%の配列同一性を有する配列を含む、請求項87に記載の方法。
  90. プロテアーゼ感受性ペプチドが、ユビキチン、カスパーゼ切断ドメイン、カルパイン切断ドメイン、SUMO1、SUMO2、SUMO3、SUMO4、ISG15、Atg8、Atg12、NEDD8、及びそのバリアント又は誘導体からなる群から選択されるペプチドを含む、請求項87に記載の方法。
  91. 改変融合タンパク質が、配列番号55～61、69～71、及び81のいずれかに少なくとも85%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項71に記載の方法。
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