JP2023518821A - コロナウイルスのワクチンと使用方法 - Google Patents

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Abstract

特にＣｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ科のウイルス感染症の予防及び／または治療のための組成物及び方法。【選択図】図１

Description

相互参照
本出願は、それぞれが参照によってその全体が本明細書に組み込まれる２０２０年３月２０日に提出された米国仮出願番号６２／９９２，６６６、２０２０年５月１８日に提出された米国仮出願番号６３／０２６，５５９、２０２０年７月３１日に提出された米国仮出願番号６３／０５９，５８２、２０２０年１０月１日に提出された米国仮出願番号６３／０８６，５１９、及び２０２０年１２月８日に出願された米国仮出願番号６３／１２２，９０４に対する優先権を主張する。
新規のコロナウイルスによって引き起こされる新たに出現した急性呼吸器ウイルス感染症は重大な公衆衛生上の懸念である。重要なことは、感染症の急激な増加、特に、例えば、２０１５年のＭＥＲＳ－ＣｏＶまたは２０１９ ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２の感染症の発生時にはワクチンまたは特異的な抗ウイルス剤が存在しないことである。２０１９年１２月に発生した２０１９ ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２感染症の流行では、最初に報告された症例から２ヵ月足らずで２０００人を超える命が奪われた。したがって、そのようなウイルス感染によって引き起こされる疾患と闘うには、新規で容易に拡張できる治療法が必要である。
コロナウイルスは、人獣共通感染源から時折出現してヒト集団に感染するプラス一本鎖ＲＮＡウイルスである。ヒトの感染症のほとんどは軽度の呼吸器症状を引き起こすが、過去１０年間の最近のコロナウイルス感染症のいくつかは重度の罹患率と死亡率をもたらしている。これらには、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）、及び現在進行中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のパンデミックが含まれる。これらのウイルスによる感染症は急性呼吸困難を引き起こすことができ、高い死亡率をもたらす。ＳＡＲＳ－ＣｏＶは２００２年に中国南部で発生し、その世界的な広がりにより８０９６の症例と７７４の死者を出した。ＭＥＲＳ－ＣｏＶの最初の症例は２０１２年にサウジアラビアで出現し、それ以来、合計２４９４の症例と８５８関連死が報告されている。２０１９年１２月末に及び２０２０年３月８日までに中国の武漢で出現した２０１９ ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２は世界中で４２６２の死者を含む１１８，０９６の症例がもたらした。２０１９ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２の急速な蔓延により世界保健機関は国際的な懸念の世界的なパンデミックを宣言した。
３つのコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、及び最近出現したＳＡＲＳ ＣｏＶ－２はすべてベータＣｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ属に属する。ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２は、少なくとも４つの構造タンパク質（スパイク［Ｓ］、エンベロープ［Ｅ］、膜［Ｍ］、及びヌクレオカプシド［Ｎ］）と少なくとも１５の非構造（ＮＳＰ１～１５）タンパク質とをコードする３０キロベースのゲノムサイズを有する。構造タンパク質は、スパイクタンパク質（Ｓ）、膜タンパク質（Ｍ）、エンベロープタンパク質（Ｅ）、及びヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ）である。Ｓタンパク質は標的細胞へのウイルスの侵入を促進し、侵入はＳＡＲＳ－ＣｏＶとＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の双方の細胞受容体ＡＣＥ２へのスパイクタンパク質の結合に依存する。双方のウイルスは、ＳＡＲ－ＣｏＶに対する防御免疫応答に関する以前の研究を活用して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のワクチン開発を支援するのに役立ち得るゲノム全体で７６％のアミノ酸同一性を共有する。
これらの感染症の高い罹患率と死亡率を前提として、そのような感染症に対する免疫応答を調査するさまざまな報告がある。自然免疫応答と適応免疫応答の双方が重要であることが示されている。ＳＡＲＳ－ＣｏＶに感染したマウスでの研究では、ＳＡＲＳの重症度はウイルス特異的な免疫応答を発達させる能力と相関することが示された。別の研究では、Ｉ型インターフェロンと炎症性単球マクロファージ応答の調節不全が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ感染マウスの致死性肺炎につながることが実証された。ＳＡＲＳ－ＣｏＶの場合、液性免疫応答と細胞性免疫応答の双方についての保護的役割が実証されている。Ｓタンパク質及びＮタンパク質に対して生成された抗体応答は、マウスにてＳＡＲＳ－ＣｏＶ感染から保護することが示されており、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ感染患者で検出されている。しかしながら、Ｓタンパク質に対して検出されたこれらの抗体応答は短命であり、回復から６年後では検出されず、ＣＤ４及びＣＤ８の応答がこのウイルスの制御に関与し得ることを示唆している。
ＣＤ４＋とＣＤ８＋Ｔ細胞応答の双方がＳＡＲＳ－ＣｏＶ感染患者で検出されている。ウイルス特異的メモリーＣＤ８Ｔ細胞は、回復した患者では感染から１１年後まで持続し、加齢マウスの致死的なＳＡＲＳ－ＣｏＶ感染に対する保護を提供することが実証された。加えて、マウスにおける研究は、ウイルス特異的エフェクターＣＤ４＋とＣＤ８＋Ｔ細胞の養子移入が、迅速なウイルスのクリアランスと臨床疾患の改善をもたらすことを示している。これらの研究は、疾患の重症度を制御し、同様にＳＡＲ－ＣｏＶ感染に対する防御免疫を提供することにおけるＴ細胞応答の重要な役割を指摘している。ＳＡＲＳ－ＣｏＶとＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２との間の高度なゲノム相同性を考えると、同様の免疫メカニズムがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する保護を提供する上で重要な役割を担い得ると推論された。
本発明の分野は、免疫療法ペプチド、該ペプチドをコードする核酸、ペプチド結合剤、及び、例えば、ウイルス性疾患の免疫療法におけるそれらの使用に関する。一態様では、本発明は、ウイルス感染を治療するために単独で、または他の抗ウイルス剤もしくは免疫調節剤と併用して有用な、ウイルス感染細胞で発現されるウイルスエピトープを提供する。本発明はコロナウイルス感染症の免疫療法に有用である。
本明細書で提供されているのは、（ｉ）以下（ａ）ＯＲＦ１ａｂ由来のエピトープ配列を含む配列、（ｂ）膜糖タンパク質（Ｍ）由来のエピトープ配列を含む配列、及び（ｃ）ヌクレオカプシドリンタンパク質（Ｎ）由来のエピトープ配列を含む配列のうちの少なくとも２つを含むポリペプチド；（ｉｉ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、該ポリペプチドが、以下（ａ）ＯＲＦ１ａｂ由来のエピトープ配列を含む配列、（ｂ）膜糖タンパク質（Ｍ）由来のエピトープ配列を含む配列、及び（ｃ）ヌクレオカプシドリンタンパク質（Ｎ）由来のエピトープ配列を含む配列のうちの少なくとも２つを含む、ポリヌクレオチド；（ｉｉｉ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）もしくは該ＴＣＲを含むＴ細胞であって、該ＴＣＲが対応するＨＬＡクラスＩもしくはクラスＩＩ分子と複合体を形成して該ポリペプチドのエピトープ配列に結合する、ＴＣＲもしくはＴ細胞；（ｉｖ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）を含む抗原提示細胞；または（ｖ）抗体もしくは該抗体を含むＢ細胞であって、該抗体が該ポリペプチドのエピトープ配列に結合する、抗体もしくはＢ細胞と、薬学的に許容される賦形剤とを含む組成物である。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、（ａ）ＯＲＦ１ａｂ由来のエピトープ配列を含む配列、（ｂ）膜糖タンパク質（Ｍ）由来のエピトープ配列を含む配列、及び（ｃ）ヌクレオカプシドリンタンパク質（Ｎ）由来のエピトープ配列を含む配列を含む。いくつかの実施形態では、ＯＲＦ１ａｂ由来のエピトープ配列を含む配列は、ヌクレオカプシドリンタンパク質（Ｎ）由来のエピトープ配列を含む配列のＣ末端にある。いくつかの実施形態では、ＯＲＦ１ａｂ由来のエピトープ配列を含む配列は、膜糖タンパク質（Ｍ）由来のエピトープ配列を含む配列のＮ末端にある。いくつかの実施形態では、ヌクレオカプシドリンタンパク質（Ｎ）由来のエピトープ配列を含む配列は、膜糖タンパク質（Ｍ）由来のエピトープ配列を含む配列のＮ末端にある。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、以下（ａ）ＯＲＦ１ａｂ由来のエピトープ配列を含む配列、（ｂ）膜糖タンパク質（Ｍ）由来のエピトープ配列を含む配列、及び（ｃ）ヌクレオカプシドリンタンパク質（Ｎ）由来のエピトープ配列を含む配列の少なくとも２つを含む。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、（ａ）ＯＲＦ１ａｂ由来の２、３、４、５、６、７、８、９または１０のエピトープ配列、（ｂ）膜糖タンパク質（Ｍ）由来のエピトープ配列を含む配列、及び（ｃ）ヌクレオカプシドリンタンパク質（Ｎ）由来のエピトープ配列を含む配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＯＲＦ１ａｂ由来のエピトープ配列は非構造タンパク質由来のエピトープ配列である。いくつかの実施形態では、非構造タンパク質はＮＳＰ１、ＮＳＰ２、ＮＳＰ３、ＮＳＰ４及びそれらの組み合わせから成る群から選択される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ＮＳＰ１由来のエピトープ配列を含む配列、ＮＳＰ２由来のエピトープ配列を含む配列、ＮＳＰ３由来のエピトープ配列を含む配列、及びＮＳＰ４由来のエピトープ配列を含む配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＯＲＦ１ａｂ由来のエピトープ配列はＹＬＦＤＥＳＧＥＦＫＬ、ＹＬＦＤＥＳＧＥＦ、ＦＧＤＤＴＶＩＥＶ、ＱＬＭＣＱＰＩＬＬ、ＴＴＤＰＳＦＬＧＲＹ、ＰＴＤＮＹＩＴＴＹ、ＰＳＦＬＧＲＹ、ＡＥＡＥＬＡＫＮＶ、ＫＴＩＱＰＲＶＥＫ及びそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される。
いくつかの実施形態では、ヌクレオカプシド糖タンパク質（Ｎ）由来のエピトープ配列はＬＬＬＤＲＬＮＱＬである。いくつかの実施形態では、膜リンタンパク質（Ｍ）由来のエピトープ配列はＶＡＴＳＲＴＬＳＹである。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ＬＬＬＤＲＬＮＱＬであるヌクレオカプシド糖タンパク質（Ｎ）由来のエピトープ配列、及びＶＡＴＳＲＴＬＳＹである膜リンタンパク質（Ｍ）由来のエピトープ配列を含む。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、（ａ）ＯＲＦ１ａｂ由来の以下のエピトープ配列：ＹＬＦＤＥＳＧＥＦＫＬ、ＹＬＦＤＥＳＧＥＦ、ＦＧＤＤＴＶＩＥＶ、ＱＬＭＣＱＰＩＬＬ、ＴＴＤＰＳＦＬＧＲＹ、ＰＴＤＮＹＩＴＴＹ、ＰＳＦＬＧＲＹ、ＡＥＡＥＬＡＫＮＶ、ＫＴＩＱＰＲＶＥＫのそれぞれと、（ｂ）ＬＬＬＤＲＬＮＱＬであるヌクレオカプシド糖タンパク質（Ｎ）由来のエピトープ配列と、（ｃ）ＶＡＴＳＲＴＬＳＹである膜リンタンパク質（Ｍ）由来のエピトープ配列とを含む。
いくつかの実施形態では、ＯＲＦ１ａｂ由来のエピトープ配列を含む配列は、以下の配列またはその断片：ＭＶＴＮＮＴＦＴＬＫＶＰＨＶＧＥＩＰＶＡＹＲＫＶＬＬＫＴＩＱＰＲＶＥＫＹＬＦＤＥＳＧＥＦＫＬＳＥＶＧＰＥＨＳＬＡＥＹＹＩＦＦＡＳＦＹＹ；ＭＶＴＮＮＴＦＴＬＫＶＰＨＶＧＥＩＰＶＡＹＲＫＶＬＬＫＴＩＱＰＲＶＥＫＹＬＦＤＥＳＧＥＦＫＬＳＥＶＧＰＥＨＳＬＡＥＹ；ＡＰＫＥＩＩＦＬＥＧＥＴＬＦＧＤＤＴＶＩＥＶＡＩＩＬＡＳＦＳＡＳＴ；ＡＰＫＥＩＩＦＬＥＧＥＴＬＦＧＤＤＴＶＩＥＶ；
ＨＴＴＤＰＳＦＬＧＲＹＭＳＡＬＦＡＤＤＬＮＱＬＴＧＹＨＴＤＦＳＳＥＩＩＧＹＱＬＭＣＱＰＩＬＬＡＥＡＥＬＡＫＮＶＳＬＩＬＧＴＶＳＷＮＬ；
ＴＴＤＰＳＦＬＧＲＹＭＳＡＬＦＡＤＤＬＮＱＬＴＧＹＨＴＤＦＳＳＥＩＩＧＹＱＬＭＣＱＰＩＬＬＡＥＡＥＬＡＫＮＶＳＬＩＬＧＴＶＳＷＮＬ；ＬＬＳＡＧＩＦＧＡＩＴＤＶＦＹＫＥＮＳＹＫＶＰＴＤＮＹＩＴＴＹ；及びそれらの組み合わせから成る群から選択される。
いくつかの実施形態では、膜糖タンパク質（Ｍ）由来のエピトープ配列を含む配列は、以下の配列またはその断片：ＡＤＳＮＧＴＩＴＶＥＥＬＫＫＬＬＥＱＷＮＬＶＩｇＦＬＦＬＴＷＩＣＬＬＱＦＡＹＡＮＲＮＲＦＬＹＩＩＫＬＩＦＬＷＬＬＷＰＶＴＬＡＣＦＶＬＡＡＶＹＲＩＮＷＩＴＧＧＩＡＩＡＭＡＣＬＶＧＬＭＷＬＳＹＦＩＡＳＦＲＬＦＡＲＴＲＳＭＷＳＦＮＰＥＴＮＩＬＬＮＶＰＬＨＧＴＩＬＴＲＰＬＬＥＳＥＬＶＩｇＡＶＩＬＲＧＨＬＲＩＡＧＨＨＬＧＲＣＤＩＫＤＬＰＫＥＩＴＶＡＴＳＲＴＬＳＹＹＫＬＧＡＳＱＲＶＡＧＤＳＧＦＡＡＹＳＲＹＲＩｇＮＹＫＬＮＴＤＨＳＳＳＳＤＮＩＡＬＬＶＱ；
ＦＡＹＡＮＲＮＲＦＬＹＩＩＫＬＩＦＬＷＬＬＷＰＶＴＬＡＣＦＶＬＡＡＶＹＲＩＮＷＩＴＧＧＩＡＩＡＭＡＣＬＶＧＬＭＷＬＳＹＦＩＡＳＦＲＬＦ；ＬＧＲＣＤＩＫＤＬＰＫＥＩＴＶＡＴＳＲＴＬＳＹＹＫＬＧＡＳＱＲＶＡ；ＫＬＬＥＱＷＮＬＶＩｇＦ；
ＮＲＮＲＦＬＹＩＩＫＬＩＦＬＷＬＬＷＰＶＴＬＡＣＦＶＬＡＡＶＹ；ＳＥＬＶＩｇＡＶＩＬＲＧＨＬＲＩＡＧＨＨＬＧＲ；
ＶＡＴＳＲＴＬＳＹＹＫＬＧＡＳＱＲＶ；ＧＬＭＷＬＳＹＦ；及びそれらの組み合わせから成る群から選択される。
いくつかの実施形態では、ヌクレオカプシドリンタンパク質（Ｎ）由来のエピトープ配列を含む配列は、以下の配列またはその断片：ＫＤＬＳＰＲＷＹＦＹＹＬＧＴＧＰＥＡＧＬＰＹＧＡＮＫＤＧＩＩＷＶＡＴＥＧＡＬＮＴＰＫＤＨＩｇＴＲＮＰＡＮＮＡＡＩＶＬＱＬＰＱＧＴＴＬＰＫＧＦＹＡＥＧＳＲＧＧＳＱＡＳＳＲＳＳＳＲＳＲＮＳＳＲＮＳＴＰＧＳＳＲＧＴＳＰＡＲＭＡＧＮＧＧＤＡＡＬＡＬＬＬＬＤＲＬＮＱＬＥＳＫＭＳＧＫＧＱＱＱＱＧＱＴＶＴＫＫＳＡＡＥＡＳＫＫＰＲＱＫＲＴＡＴＫＡＹＮＶＴＱＡＦＧＲＲＧＰＥＱＴＱＧＮＦＧＤＱＥＬＩＲＱＧＴＤＹＫＨＷＰＱＩＡＱＦＡＰＳＡＳＡＦＦＧＭＳＲＩｇＭＥＶＴＰＳＧＴＷＬＴＹＴＧＡＩＫＬＤＤＫＤＰＮＦＫＤＱＶＩＬＬＮＫＨＩＤＡＹＫＴＦＰＰＴＥＰＫＫＤＫＫＫＫＡＤＥＴＱＡＬＰＱＲＱＫＫＱＱＴＶＴＬＬＰＡＡＤＬＤＤＦＳＫＱＬＱＱＳＭＳＳＡＤＳＴＱＡ；ＲＭＡＧＮＧＧＤＡＡＬＡＬＬＬＬＤＲＬＮＱＬＥＳＫＭＳＧＫＧＱＱＱ；
ＹＫＨＷＰＱＩＡＱＦＡＰＳＡＳＡＦＦＧＭＳＲＩｇＭＥＶＴＰＳＧＴＷＬＴＹＴＧＡＩＫＬＤＤＫＤＰＮＦＫＤＱＶＩＬＬＮＫＨＩＤＡＹＫＴＦＰ；
ＳＰＡＲＭＡＧＮＧＧＤＡＡＬＡＬＬＬＬＤＲＬＮＱＬＥＳＫＭＳＧＫＧＱＱＱＱＧＱＴＶＴＫＫＳＡＡＥＡＳＫＫＰＲＱＫＲＴＡＴＫＡＹＮＶＴＱＡＦＧＲＲＧＰＥＱＴＱＧＮＦＧＤＱＥＬＩＲＱＧＴＤＹＫＨＷＰＱＩＡＱＦＡＰＳＡＳＡＦＦＧＭＳＲＩｇＭＥＶＴＰＳＧＴＷＬＴＹＴＧＡＩＫＬＤＤＫＤＰＮＦＫＤＱＶＩＬＬＮＫＨＩＤＡＹＫＴＦＰＰＴＥＰＫＫＤＫ及びその組み合わせから成る群から選択される。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは１以上のリンカー配列を含む。いくつかの実施形態では、１以上のリンカー配列はＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧ、ＧＧＳＬＧＧＧＧＳＧから成る群から選択される。いくつかの実施形態では、１以上のリンカー配列は切断配列を含む。いくつかの実施形態では、１以上の切断配列はＦＲＡＣ、ＫＲＣＦ、ＫＫＲＹ、ＡＲＭＡ、ＲＲＳＧ、ＭＲＡＣ、ＫＭＣＧ、ＡＲＣＡ、ＫＫＱＧ、ＹＲＳＹ、ＳＦＭＮ、ＦＫＡＡ、ＫＲＮＧ、ＹＮＳＦ、ＫＫＮＧ、ＲＲＲＧ、ＫＲＹＳ及びＡＲＹＡから成る群から選択される。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは膜貫通ドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、膜貫通配列は、ＯＲＦ１ａｂ由来のエピトープ配列を含む配列、膜糖タンパク質（Ｍ）由来のエピトープ配列を含む配列、及びヌクレオカプシドリンタンパク質（Ｎ）由来のエピトープ配列を含む配列に対してＣ末端にある。いくつかの実施形態では、膜貫通配列は、ＥＱＹＩＫＷＰＷＹＩＷＬＧＦＩＡＧＬＩＡＩＶＭＶＴＩＭＬＣＣＭＴＳＣＣＳＣＬＫＧＣＣＳＣＧＳＣＣＫＦＤＥＤＤＳＥＰＶＬＫＧＶＫＬＨＹＴである。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドはＳＥＣ配列を含む。いくつかの実施形態では、ＳＥＣ配列は、ＯＲＦ１ａｂ由来のエピトープ配列を含む配列、膜糖タンパク質（Ｍ）由来のエピトープ配列を含む配列、及びヌクレオカプシドリンタンパク質（Ｎ）由来のエピトープ配列を含む配列に対してＮ末端にある。いくつかの実施形態では、ＳＥＣ配列はＭＦＶＦＬＶＬＬＰＬＶＳＳＱＣＶＮＬＴである。
いくつかの実施形態では、組成物はポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ヒトにおける発現のためにコドン最適化配列を含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはｄＥａｒＩ－ｈＡｇ配列を含む。いくつかの実施形態では、ｄＥａｒＩ－ｈＡｇ配列は、ＡＴＴＣＴＴＣＴＧＧＴＣＣＣＣＡＣＡＧＡＣＴＣＡＧＡＧＡＧＡＡＣＣＣであり、任意で各ＴはＵである。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはコザック配列を含む。いくつかの実施形態では、コザック配列はＧＣＣＡＣＣである。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはＦ要素配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｆ要素配列は分割のアミノ末端エンハンサー（ＡＥＳ）の３ＵＴＲである。いくつかの実施形態では、Ｆ要素配列は、ＣＴＧＧＴＡＣＴＧＣＡＴＧＣＡＣＧＣＡＡＴＧＣＴＡＧＣＴＧＣＣＣＣＴＴＴＣＣＣＧＴＣＣＴＧＧＧＴＡＣＣＣＣＧＡＧＴＣＴＣＣＣＣＣＧＡＣＣＴＣＧＧＧＴＣＣＣＡＧＧＴＡＴＧＣＴＣＣＣＡＣＣＴＣＣＡＣＣＴＧＣＣＣＣＡＣＴＣＡＣＣＡＣＣＴＣＴＧＣＴＡＧＴＴＣＣＡＧＡＣＡＣＣＴＣＣであり、任意で各ＴはＵである。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはＩ要素配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｉ要素配列はミトコンドリアにコードされた１２Ｓ ｒＲＮＡ（ｍｔＲＮＲ１）の３’ＵＴＲである。いくつかの実施形態では、Ｉ要素配列はＣＡＡＧＣＡＣＧＣＡＧＣＡＡＴＧＣＡＧＣＴＣＡＡＡＣＧＣＴＴＡＧＣＣＴＡＧＣＣＡＣＡＣＣＣＣＣＡＣＧＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＧＴＧＡＴＴＡＡＣＣＴＴＴＡＧＣＡＡＴＡＡＡＣＧＡＡＡＧＴＴＴＡＡＣＴＡＡＧＣＴＡＴＡＣＴＡＡＣＣＣＣＡＧＧＧＴＴＧＧＴＣＡＡＴＴＴＣＧＴＧＣＣＡＧＣＣＡＣＡＣＣであり、任意で各ＴはＵである。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはポリＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリＡ配列はＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＡＴＡＴＧＡＣＴＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡであり、任意で各ＴはＵである。
いくつかの実施形態では、ＯＲＦ１ａｂ、膜糖タンパク質、及びヌクレオカプシドリンタンパク質由来のエピトープ配列のそれぞれは、２０１９ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来である。
いくつかの実施形態では、１以上のエピトープまたは各エピトープがＴ細胞応答を誘発する。
いくつかの実施形態では、ＨＬＡ分子によって提示されるものとして、１以上のエピトープまたは各エピトープが質量分析によって観察された。
いくつかの実施形態では、組成物は、（ｉ）ＲＳ Ｃ１ｐ１ｆｕｌｌ、ＲＳ Ｃ２ｐ１ｆｕｌｌ、ＲＳ Ｃ３ｐ１ｆｕｌｌ、ＲＳ Ｃ４ｐ１ｆｕｌｌ、ＲＳ Ｃ５ｐ１、ＲＳ Ｃ５ｐ２、ＲＳ Ｃ５ｐ２ｆｕｌｌ、ＲＳ Ｃ６ｐ１、ＲＳ Ｃ６ｐ２、ＲＳ Ｃ６ｐ２ｆｕｌｌ、ＲＳ Ｃ７ｐ１、ＲＳ Ｃ７ｐ２、ＲＳ Ｃ７ｐ２ｆｕｌｌ、ＲＳ Ｃ８ｐ１、ＲＳ Ｃ８ｐ２、及びＲＳ Ｃ８ｐ２ｆｕｌｌから成る群から選択される配列に対する少なくとも７０％、８０％、９０％もしくは１００％の配列同一性を持つポリペプチド；（ｉｉ）ＲＳ Ｃ１ｐ１ｆｕｌｌ、ＲＳ Ｃ２ｐ１ｆｕｌｌ、ＲＳ Ｃ３ｐ１ｆｕｌｌ、ＲＳ Ｃ４ｐ１ｆｕｌｌ、ＲＳ Ｃ５ｐ１、ＲＳ Ｃ５ｐ２、ＲＳ Ｃ５ｐ２ｆｕｌｌ、ＲＳ Ｃ６ｐ１、ＲＳ Ｃ６ｐ２、ＲＳ Ｃ６ｐ２ｆｕｌｌ、ＲＳ Ｃ７ｐ１、ＲＳ Ｃ７ｐ２、ＲＳ Ｃ７ｐ２ｆｕｌｌ、ＲＳ Ｃ８ｐ１、ＲＳ Ｃ８ｐ２、及びＲＳ Ｃ８ｐ２ｆｕｌｌから成る群から選択される配列に対する少なくとも７０％、８０％、９０％もしくは１００％の配列同一性を持つポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または（ｉｉｉ）配列番号：ＲＳ Ｃ１ｎ１、ＲＳ Ｃ２ｎ１、ＲＳ Ｃ３ｎ１、ＲＳ Ｃ４ｎ１、ＲＳ Ｃ５ｎ１、ＲＳ Ｃ６ｎ１、ＲＳ Ｃ７ｎ１、ＲＳ Ｃ８ｎ１、ＲＳ Ｃ５ｎ２、ＲＳ Ｃ６ｎ２、ＲＳ Ｃ７ｎ２、ＲＳ Ｃ８ｎ２、ＲＳ Ｃ５ｎ２ｆｕｌｌ、ＲＳ Ｃ６ｎ２ｆｕｌｌ、ＲＳ Ｃ７ｎ２ｆｕｌｌ、及びＲＳ Ｃ８ｎ２ｆｕｌｌから成る群から選択される配列に対する少なくとも７０％、８０％、９０％もしくは１００％の配列同一性を持つポリヌクレオチドを含む。
本明細書に記載されているのはまた、本明細書に記載されている組成物のいずれかを含む医薬組成物である。
本明細書に記載されているのはまた、（ｉ）表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２Ａｉ、表２Ａｉｉ、表２Ｂ及び／または表１６のエピトープ配列を含むポリペプチド；（ｉｉ）該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；（ｉｉｉ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはＴＣＲを含むＴ細胞であって、該ＴＣＲが対応するＨＬＡクラスＩまたはクラスＩＩ分子と複合体を形成してエピトープ配列に結合する、ＴＣＲまたはＴＣＲを含むＴ細胞；（ｉｖ）（ｉ）または（ｉｉ）を含む抗原提示細胞；あるいは（ｖ）抗体または抗体を含むＢ細胞であって、該抗体が該エピトープ配列に結合する抗体またはＢ細胞と、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物である。
いくつかの実施形態では、エピトープ配列は以下：ＹＬＦＤＥＳＧＥＦＫＬ、ＹＬＦＤＥＳＧＥＦ、ＦＧＤＤＴＶＩＥＶ、ＬＬＬＤＲＬＮＱＬ、ＱＬＭＣＱＰＩＬＬ、ＴＴＤＰＳＦＬＧＲＹ、ＰＴＤＮＹＩＴＴＹ、ＰＳＦＬＧＲＹ、ＡＥＡＥＬＡＫＮＶ、ＶＡＴＳＴＲＴＳＹ及びＫＴＩＱＰＲＶＥＫのうちの１以上またはそれぞれを含む。いくつかの実施形態では、エピトープ配列は、以下：ＳＡＰＰＡＱＹＥＬ、ＡＶＡＳＫＩＬＧＬ、ＥＹＡＤＶＦＨＬＹ、ＤＥＦＴＰＦＤＶＶ、ＶＲＩＱＰＧＱＴＦ、ＳＦＲＬＦＡＲＴＲ、ＫＦＬＰＦＱＱＦ、ＶＶＱＥＧＶＬＴＡ、ＲＬＤＫＶＥＡＥＶ、ＦＧＡＤＰＩＨＳＬ、ＮＹＮＹＬＹＲＬＦ、ＫＹＩＫＷＰＷＹＩ、ＫＷＰＷＹＩＷＬＧＦ、ＬＰＦＮＤＧＶＹＦ、ＱＰＴＥＳＩＶＲＦ、ＩＰＦＡＭＱＭＡＹ、ＹＬＡＭＱＬＬ及びＲＬＱＳＬＱＴＹＶのうちの１以上またはそれぞれを含む。
いくつかの実施形態では、エピトープ配列はｏｒｆ１ａｂタンパク質に由来する。いくつかの実施形態では、エピトープ配列はｏｒｆ１ａタンパク質に由来する。いくつかの実施形態では、エピトープ配列は表面糖タンパク質（Ｓ）またはそのシフトしたリーディングフレームに由来する。いくつかの実施形態では、エピトープ配列はヌクレオカプシドリンタンパク質（Ｎ）に由来する。いくつかの実施形態では、エピトープ配列はＯＲＦ３ａタンパク質に由来する。いくつかの実施形態では、エピトープ配列は膜糖タンパク質（Ｍ）に由来する。いくつかの実施形態では、エピトープ配列はＯＲＦ７ａタンパク質に由来する。いくつかの実施形態では、エピトープ配列はＯＲＦ８タンパク質に由来する。いくつかの実施形態では、エピトープ配列は、エンベロープタンパク質（Ｅ）に由来する。いくつかの実施形態では、エピトープ配列はＯＲＦ６タンパク質に由来する。いくつかの実施形態では、エピトープ配列はＯＲＦ７ｂタンパク質に由来する。いくつかの実施形態では、エピトープ配列はＯＲＦ１０タンパク質に由来する。いくつかの実施形態では、エピトープ配列はＯＲＦ９ｂタンパク質に由来する。
本明細書で提供されているのはまた、表１１の列２、表１２の列２または表１５の列３に示されている配列のいずれか１つの配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％もしくは１００％の配列同一性を持つアミノ酸配列を有するポリペプチド；または表１１の列２、表１２の列２または表１５の列３に示されている配列のいずれか１つの配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％もしくは１００％の配列同一性を持つアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを含む医薬組成物である。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ＲＳ Ｃ１ｐ１ｆｕｌｌ、ＲＳ Ｃ２ｐ１ｆｕｌｌ、ＲＳ Ｃ３ｐ１ｆｕｌｌ、ＲＳ Ｃ４ｐ１ｆｕｌｌ、ＲＳ Ｃ５ｐ１、ＲＳ Ｃ５ｐ２、ＲＳ Ｃ５ｐ２ｆｕｌｌ、ＲＳ Ｃ６ｐ１、ＲＳ Ｃ６ｐ２、ＲＳ Ｃ６ｐ２ｆｕｌｌ、ＲＳ Ｃ７ｐ１、ＲＳ Ｃ７ｐ２、ＲＳ Ｃ７ｐ２ｆｕｌｌ、ＲＳ Ｃ８ｐ１、ＲＳ Ｃ８ｐ２、及びＲＳ Ｃ８ｐ２ｆｕｌｌから成る群から選択される配列に対する少なくとも７０％、８０％、９０％もしくは１００％の配列同一性を持つポリペプチド；またはＲＳ Ｃ１ｐ１ｆｕｌｌ、ＲＳ Ｃ２ｐ１ｆｕｌｌ、ＲＳ Ｃ３ｐ１ｆｕｌｌ、ＲＳ Ｃ４ｐ１ｆｕｌｌ、ＲＳ Ｃ５ｐ１、ＲＳ Ｃ５ｐ２、ＲＳ Ｃ５ｐ２ｆｕｌｌ、ＲＳ Ｃ６ｐ１、ＲＳ Ｃ６ｐ２、ＲＳ Ｃ６ｐ２ｆｕｌｌ、ＲＳ Ｃ７ｐ１、ＲＳ Ｃ７ｐ２、ＲＳ Ｃ７ｐ２ｆｕｌｌ、ＲＳ Ｃ８ｐ１、ＲＳ Ｃ８ｐ２、及びＲＳ Ｃ８ｐ２ｆｕｌｌから成る群から選択される配列に対する少なくとも７０％、８０％、９０％もしくは１００％の配列同一性を持つポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、配列番号：ＲＳ Ｃ１ｎ１、ＲＳ Ｃ２ｎ１、ＲＳ Ｃ３ｎ１、ＲＳ Ｃ４ｎ１、ＲＳ Ｃ５ｎ１、ＲＳ Ｃ６ｎ１、ＲＳ Ｃ７ｎ１、ＲＳ Ｃ８ｎ１、ＲＳ Ｃ５ｎ２、ＲＳ Ｃ６ｎ２、ＲＳ Ｃ７ｎ２、ＲＳ Ｃ８ｎ２、ＲＳ Ｃ５ｎ２ｆｕｌｌ、ＲＳ Ｃ６ｎ２ｆｕｌｌ、ＲＳ Ｃ７ｎ２ｆｕｌｌ及びＲＳ Ｃ８ｎ２ｆｕｌｌから成る群から選択される配列に対する少なくとも７０％、８０％、９０％または１００％の配列同一性を持つポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはｍＲＮＡである。
いくつかの実施形態では、医薬組成物はさらに、１以上の脂質成分を含む。いくつかの実施形態では、１以上の脂質は脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは組換えポリヌクレオチド構築物をカプセル化する。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは合成物質である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは組換えである。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは長さが８～１０００アミノ酸である。
いくつかの実施形態では、エピトープ配列は、１０００ｎＭ以下のＫＤでＨＬＡクラスＩまたはクラスＩＩ分子に結合する、または結合すると予測される。いくつかの実施形態では、エピトープ配列は５００ｎＭ以下のＫＤでＨＬＡクラスＩまたはクラスＩＩ分子に結合する、または結合すると予測される。
いくつかの実施形態では、エピトープ配列は、対象のウイルス感染細胞によって発現されるウイルスタンパク質の配列を含む。
本明細書で提供されているのはまた、本明細書に記載されている医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、ウイルスによる感染症を治療するもしくは予防する方法、またはウイルスによる感染症に関連する呼吸器疾患もしくは状態を治療する方法である。
いくつかの実施形態では、ウイルスはコロナウイルスである。いくつかの実施形態では、ウイルスは２０１９ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２である。いくつかの実施形態では、対象によって発現されるＨＬＡ分子は投与時に未知である。いくつかの実施形態では、対象の免疫系による認識の逃避を回避するウイルスの能力は、本明細書に記載されている医薬組成物の単一のタンパク質由来のエピトープまたは本明細書に記載されている医薬組成物よりも少ないタンパク質由来のエピトープを含有する医薬組成物を投与された対象の免疫系による認識の逃避を回避するウイルスの能力と比べて低い。いくつかの実施形態では、対象は、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２Ａｉまたは表２Ａｉｉ、表２Ｂまたは表１６のいずれか１つのＨＬＡ対立遺伝子によってコードされるＨＬＡ分子を発現し、エピトープ配列はＨＬＡ対立遺伝子が一致するエピトープ配列である。
いくつかの実施形態では、エピトープ配列は以下：ＳＡＰＰＡＱＹＥＬ、ＡＶＡＳＫＩＬＧＬ、ＥＹＡＤＶＦＨＬＹ、ＤＥＦＴＰＦＤＶＶ、ＶＲＩＱＰＧＱＴＦ、ＳＦＲＬＦＡＲＴＲ、ＫＦＬＰＦＱＱＦ、ＶＶＱＥＧＶＬＴＡ、ＲＬＤＫＶＥＡＥＶ及びＦＧＡＤＰＩＨＳＬのうちの１以上またはそれぞれを含む。
本明細書で提供されているのはまた、本明細書に記載されている医薬組成物を対象に投与することを含む、２０１９ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２感染症の治療または予防をそれを必要とする対象にて行う方法である。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、対象における２０１９ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ウイルス感染症のための１以上の治療薬に加えて投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、（ａ）２０１９ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２スパイクタンパク質もしくはその断片のアミノ酸配列を有するポリペプチド；（ｂ）２０１９ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２スパイクタンパク質もしくはその断片をコードする組換えポリヌクレオチド；または（ａ）もしくは（ｂ）を含む２０１９ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２スパイクタンパク質医薬組成物と併用して投与される。いくつかの実施形態では、２０１９ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２スパイクタンパク質またはその断片はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはその断片である。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、２０１９ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２スパイクタンパク質医薬組成物の最初の投与の１～１０週後に投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、２０１９ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２スパイクタンパク質医薬組成物の最初の投与の１～６週後、１～６ヵ月後または１～２年後またはそれ以降に投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、２０１９ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２スパイクタンパク質医薬組成物の投与と同じ日に、または同時に投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、２０１９ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２スパイクタンパク質もしくはその断片のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または２０１９ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２スパイクタンパク質もしくはその断片をコードする組換えポリヌクレオチドとともに共製剤化される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、２０１９ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２スパイクタンパク質医薬組成物の投与の２～１０週前のような、２０１９ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２スパイクタンパク質医薬組成物の投与前に投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は予防的に投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、１、２、３、４、５、６週もしくはそれ以上の週ごとに１回、または１～７日、７～１４日、１４～２１日、２１～２８日、もしくは２８～３５日ごとに１回、または２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、もしくは３５日ごとに１回投与される。
本明細書で提供されているのはまた、２０１９ ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ウイルスによって引き起こされる呼吸器ウイルス感染症を治療するまたは予防するための治療薬を調製するための、本明細書に記載されている組成物の使用である。
本明細書で提供されているのはまた、薬物として使用するための、本明細書に記載されている組成物または本明細書に記載されている医薬組成物である。
本明細書で提供されているのはまた、２０１９ ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ウイルスによって引き起こされる呼吸器ウイルス感染症の治療または予防に使用するための、本明細書に記載されている組成物または本明細書に記載されている医薬組成物である。
本明細書で提供されているのは、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２Ａｉ、表２Ａｉｉまたは表２Ｂに由来するエピトープ配列を含む抗原ペプチドである。本明細書で提供されているのはまた、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２Ａｉ、表２Ａｉｉまたは表２Ｂに由来するエピトープ配列を含む抗原ペプチドをコードするポリヌクレオチドである。抗原ペプチド及び／またはポリヌクレオチドは組換えであってもよい。抗原ペプチド及び／またはポリヌクレオチドは単離されてもよく、または精製されてもよい。抗原ペプチドは合成であってもよく、またはポリヌクレオチドから発現されてもよい。
本明細書で提供されているのはまた、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２Ａｉ、表２Ａｉｉまたは表２Ｂ由来のエピトープ配列を含む抗原ペプチドに結合する抗体または抗体を含むＢ細胞である。
本明細書で提供されているのはまた、表１Ａまたは表１Ｂに係る対応するＭＨＣクラスＩ分子と複合体を形成して表１Ａまたは表１Ｂ由来のエピトープ配列を結合するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）または該ＴＣＲを含むＴ細胞である。例えば、ＴＣＲは、表１Ａの同じ行の列３（セット１）からの対応するＭＨＣクラスＩ分子と複合体を形成して、表１Ａの列２（セット１）由来のエピトープ配列に結合することができる。例えば、ＴＣＲは、表１Ａの同じ行の列５（セット２）からの対応するＭＨＣクラスＩ分子と複合体を形成して、表１Ａの列４（セット２）由来のエピトープ配列に結合することができる。例えば、ＴＣＲは、表１Ａの同じ行の列７（セット３）からの対応するＭＨＣクラスＩ分子と複合体を形成して、表１Ａの列６（セット３）由来のエピトープ配列に結合することができる。例えば、ＴＣＲは、表１Ｂの同じ行の列３（セット１）からの対応するＭＨＣクラスＩ分子と複合体を形成して、表１Ｂの列２（セット１）由来のエピトープ配列に結合することができる。例えば、ＴＣＲは、表１Ｂの同じ行の列５（セット２）からの対応するＭＨＣクラスＩ分子と複合体を形成して、表１Ｂの列４（セット２）由来のエピトープ配列に結合することができる。
本明細書で提供されているのはまた、表２Ａｉまたは表２Ａｉｉに係る対応するＭＨＣクラスＩＩ分子と複合体を形成して表２Ａｉまたは表２Ａｉｉ由来のエピトープ配列に結合するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）または該ＴＣＲを含むＴ細胞である。例えば、ＴＣＲは、表２Ａｉの同じ行の列３（セット１）からの対応するＭＨＣクラスＩＩ分子と複合体を形成して、表２Ａｉの列２（セット１）由来のエピトープ配列に結合することができる。例えば、ＴＣＲは、表２Ａｉの同じ行の列５（セット２）からの対応するＭＨＣクラスＩＩ分子と複合体を形成して、表２Ａｉの列４（セット２）由来のエピトープ配列に結合することができる。同様に、ＴＣＲは、表２Ａｉｉの右列からの対応するＭＨＣクラスＩＩ分子と複合体を形成して、表２Ａｉｉの左列由来のエピトープ配列に結合することができる。
本明細書で提供されているのは、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２Ａｉ、表２Ａｉｉ、または表２Ｂ由来のエピトープ配列を含む抗原ペプチドを対象に投与することを含む、ウイルス感染症の治療または予防をそれを必要とする対象にて行う方法である。本明細書で提供されているのはまた、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２Ａｉ、表２Ａｉｉ、または表２Ｂ由来のエピトープ配列を含む抗原ペプチドをコードするポリヌクレオチドを対象に投与することを含む、ウイルス感染症の治療または予防をそれを必要とする対象にて行う方法である。
本明細書で提供されているのはまた、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２Ａｉ、表２Ａｉｉ、または表２Ｂ由来のエピトープ配列を含む抗原ペプチドに結合する抗体または抗体を含むＢ細胞を対象に投与することを含む、ウイルス感染の治療または予防をそれを必要とする対象にて行う方法である。
本明細書で提供されているのはまた、表１Ａまたは表１Ｂに係る対応するＭＨＣクラスＩ分子と複合体を形成して表１Ａまたは表１Ｂ由来のエピトープ配列を結合するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）または該ＴＣＲを含むＴ細胞を対象に投与することを含む、ウイルス感染症の治療または予防をそれを必要とする対象にて行う方法である。
例えば、方法は、表１Ａの同じ行の列３（セット１）からの対応するＭＨＣクラスＩ分子と複合体を形成して、表１Ａの列２（セット１）由来のエピトープ配列に結合することができるＴＣＲまたはＴＣＲを含むＴ細胞を対象に投与することを含むことができる。例えば、方法は、表１Ａの同じ行の列３（セット１）からの対応するＭＨＣクラスＩ分子と複合体を形成して、表１Ａの列２（セット１）由来のエピトープ配列に結合することができるＴＣＲまたはＴＣＲを含むＴ細胞を、列３（セット１）からの対応するＭＨＣクラスＩ分子を発現している対象に投与することを含むことができる。例えば、方法は、表１Ａの同じ行の列５（セット２）からの対応するＭＨＣクラスＩ分子と複合体を形成して、表１Ａの列４（セット２）由来のエピトープ配列に結合することができるＴＣＲまたはＴＣＲを含むＴ細胞を対象に投与することを含むことができる。例えば、方法は、表１Ａの同じ行の列５（セット２）からの対応するＭＨＣクラスＩ分子と複合体を形成して、表１Ａの列４（セット２）由来のエピトープ配列に結合することができるＴＣＲまたはＴＣＲを含むＴ細胞を、列５（セット２）からの対応するＭＨＣクラスＩ分子を発現している対象に投与することを含むことができる。例えば、方法は、表１Ａの同じ行の列７（セット３）からの対応するＭＨＣクラスＩ分子と複合体を形成して、表１Ａの列６（セット３）由来のエピトープ配列に結合することができるＴＣＲまたはＴＣＲを含むＴ細胞を対象に投与することを含むことができる。例えば、方法は、表１Ａの同じ行の列７（セット３）からの対応するＭＨＣクラスＩ分子と複合体を形成して、表１Ａの列６（セット３）由来のエピトープ配列に結合することができるＴＣＲまたはＴＣＲを含むＴ細胞を、列７（セット３）からの対応するＭＨＣクラスＩ分子を発現している対象に投与することを含むことができる。
例えば、方法は、表１Ｂの同じ行の列３（セット１）からの対応するＭＨＣクラスＩ分子と複合体を形成して、表１Ｂの列２（セット１）由来のエピトープ配列に結合することができるＴＣＲまたはＴＣＲを含むＴ細胞を対象に投与することを含むことができる。例えば、方法は、表１Ｂの同じ行の列３（セット１）からの対応するＭＨＣクラスＩ分子と複合体を形成して、表１Ｂの列２（セット１）由来のエピトープ配列に結合することができるＴＣＲまたはＴＣＲを含むＴ細胞を、列３（セット１）からの対応するＭＨＣクラスＩ分子を発現している対象に投与することを含むことができる。例えば、方法は、表１Ｂの同じ行の列５（セット２）からの対応するＭＨＣクラスＩ分子と複合体を形成して、表１Ｂの列４（セット２）由来のエピトープ配列に結合することができるＴＣＲまたはＴＣＲを含むＴ細胞を対象に投与することを含むことができる。例えば、方法は、表１Ｂの同じ行の列５（セット２）からの対応するＭＨＣクラスＩ分子と複合体を形成して、表１Ｂの列４（セット２）由来のエピトープ配列に結合することができるＴＣＲまたはＴＣＲを含むＴ細胞を、列５（セット２）からの対応するＭＨＣクラスＩ分子を発現している対象に投与することを含むことができる。
例えば、方法は、表２Ａｉの同じ行の列３（セット１）からの対応するＭＨＣクラスＩＩ分子と複合体を形成して、表２Ａｉの列２（セット１）由来のエピトープ配列に結合することができるＴＣＲまたはＴＣＲを含むＴ細胞を対象に投与することを含むことができる。例えば、方法は、表２Ａｉの同じ行の列３（セット１）からの対応するＭＨＣクラスＩＩ分子と複合体を形成して、表２Ａｉの列２（セット１）由来のエピトープ配列に結合することができるＴＣＲまたはＴＣＲを含むＴ細胞を、列３（セット１）からの対応するＭＨＣクラスＩＩ分子を発現している対象に投与することを含むことができる。例えば、方法は、表２Ａｉの同じ行の列５（セット２）からの対応するＭＨＣクラスＩＩ分子と複合体を形成して、表２Ａｉの列４（セット２）由来のエピトープ配列に結合することができるＴＣＲまたはＴＣＲを含むＴ細胞を対象に投与することを含むことができる。例えば、方法は、表２Ａｉの同じ行の列５（セット２）からの対応するＭＨＣクラスＩＩ分子と複合体を形成して、表２Ａｉの列４（セット２）由来のエピトープ配列に結合することができるＴＣＲまたはＴＣＲを含むＴ細胞を、列５（セット２）からの対応するＭＨＣクラスＩＩ分子を発現している対象に投与することを含むことができる。例えば、方法は、表２Ａｉｉの同じ行の右列からの対応するＭＨＣクラスＩＩ分子と複合体を形成して、表２Ａｉｉの左列由来のエピトープ配列に結合することができるＴＣＲまたはＴＣＲを含むＴ細胞を対象に投与することを含むことができる。
一実施形態では、抗原ペプチドはウイルス抗原である。別の実施形態では、抗原ペプチドは変異していない過剰発現抗原である。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原はウイルス遺伝情報に関する公的に開示された情報に由来する。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原はＴ細胞活性化に好適なエピトープを予測するためのウイルスゲノムの分析に由来する。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原は、コンピュータープロセッサーで実施されるＭＨＣ・ペプチド提示予測アルゴリズムにおけるウイルスゲノムの配列の分析に由来する。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原は、ＭＨＣクラスＩ抗原またはＭＨＣクラスＩＩ抗原によるエピトープの結合及び提示の可能性を予測する機械学習ソフトウェアによって訓練されたコンピュータープロセッサーで実施されるＭＨＣ・ペプチド提示予測アルゴリズムにおけるウイルス配列の分析に由来する。いくつかの実施形態では、ＭＨＣ・ペプチド提示予測因子はｎｅｏｎｍｈｃ２である。
いくつかの実施形態では、ＭＨＣ・ペプチド提示予測アルゴリズムまたはＭＨＣ・ペプチド提示予測因子は、ＮｅｔＭＨＣｐａｎまたはＮｅｔＭＨＣＩＩｐａｎであり、加えて、比較のためにＭＨＣ・ペプチド提示予測因子ＮｅｔＭＨＣｐａｎまたはＮｅｔＭＨＣＩＩｐａｎでさらに分析される。いくつかの実施形態では、当業者はＭＨＣ・ペプチド提示予測のために隠れマルコフモデルのアプローチを使用してもよい。いくつかの実施形態では、ペプチド予測モデルＭＡＲＩＡが利用されてもよい。いくつかの実施形態では、使用されるＭＨＣ・ペプチド提示予測アルゴリズムまたはＭＨＣ・ペプチド提示予測因子はＮｅｔＭＨＣｐａｎまたはＮｅｔＭＨＣＩＩｐａｎではない。いくつかの実施形態では、ウイルス配列は、ＭＨＣ・ペプチド提示予測因子がそれぞれクラスＩ及びクラスＩＩの結合予測を指すｎｅｏｎｍｈｃ１またはｎｅｏｎｍｈｃ２である、コンピュータープロセッサーにて実施されるＭＨＣ・ペプチド提示予測アルゴリズムで分析される。いくつかの実施形態では、ＭＨＣ・ペプチド提示予測因子モデルはＲＥＣＯＮであり、それは発現、プロセシング及び結合能力に基づいて高品質のＭＨＣ・ペプチド提示予測を提供する。
一態様では、本明細書で提供されているのは、１以上のウイルスペプチド抗原を含む組成物を対象に投与することを含む、コロナウイルスによって引き起こされる対象のウイルス性疾患を治療する方法であり、その際、ウイルスペプチド抗原は、対象のＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩのペプチドに結合すると予測され、対象にて抗ウイルス応答が開始されるように抗原提示細胞によって対象のＴ細胞に提示されると予測される。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原は、コンピュータープロセッサーで実施されるＭＨＣ・ペプチド提示予測アルゴリズムにおけるウイルスゲノムの配列の分析に由来する。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原は、ＭＨＣクラスＩ抗原またはＭＨＣクラスＩＩ抗原によるエピトープの結合及び提示の可能性を予測する、機械学習ソフトウェアによって訓練されたコンピュータープロセッサーで実施されるＭＨＣ・ペプチド提示予測アルゴリズムにおけるウイルス配列の分析に由来する。いくつかの実施形態では、ＭＨＣ・ペプチド提示予測因子はｎｅｏｎｍｈｃ２である。いくつかの実施形態では、方法はさらに、機械学習ソフトウェアによって訓練されたコンピュータープロセッサーで実施されるアルゴリズムを含む、ＭＨＣ・ペプチド提示予測モデルにてウイルスゲノムに由来する核酸配列を分析することを含み、その際、ＭＨＣ・ペプチド提示予測モデルは、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩの抗原によるウイルスゲノムによってコードされるエピトープの結合及び提示の可能性を予測する。いくつかの実施形態では、方法はさらに、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩのレパートリーの同定のために、対象由来の生体試料を分析することを含み、その際、分析は、ゲノムもしくは全エクソームの配列決定によって分析すること、またはＨＬＡ遺伝子によってコードされるタンパク質の分析によって分析することを含む。いくつかの実施形態では、方法はさらに、対象のＨＬＡ遺伝子によってコードされるＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩのペプチドに対して高い親和性を有する、ＭＨＣ・ペプチド提示予測モデルによって予測されるエピトープを一致させることと、ＭＨＣ・ペプチド提示予測モデルによって順位付けされる高い親和性で対象のＨＬＡ遺伝子によってコードされるＭＨＣペプチドに結合すると予測される１以上のペプチドを選択することとを含む。いくつかの実施形態では、選択される１以上のペプチドは、対象のＨＬＡ遺伝子によってコードされるＭＨＣペプチドを少なくとも１０００ｎＭの親和性で結合すると予測されている。いくつかの実施形態では、選択される１以上のペプチドは、対象のＨＬＡ遺伝子によってコードされるＭＨＣクラスＩペプチドを少なくとも５００ｎＭの親和性で結合すると予測されている。いくつかの実施形態では、選択される１以上のペプチドは、対象のＨＬＡ遺伝子によってコードされるＭＨＣクラスＩＩペプチドを少なくとも１０００ｎＭの親和性で結合すると予測されている。
いくつかの実施形態では、ＭＨＣ・ペプチド提示予測モデルは、ペプチドをＴ細胞受容体に提示するＨＬＡ対立遺伝子に結合する特定のエピトープまたは抗原ペプチドの可能性が高いものから順に順位の順序を提供するようにプログラムされる。いくつかの実施形態では、ＨＬＡによって結合して提示される可能性が最も高いエピトープ配列が治療薬を調製するために選択される。いくつかの実施形態では、ＨＬＡの選択は対象にて発現されるＨＬＡによって制約されてもよい。いくつかの実施形態では、ＨＬＡの選択は、集団における対立遺伝子の保有率（例えば、さらに高い保有率）に基づいてもよい。いくつかの実施形態では、エピトープは、ペプチド（エピトープ）がＨＬＡ対立遺伝子、例えば目的のＨＬＡ対立遺伝子によって結合して提示される可能性がさらに高いことに基づいて、治療薬を調製するために選択されてもよい。いくつかの実施形態では、この％順位値は、参照ペプチドの固定セット（クラスＩ及びクラスＩＩの参照ペプチドの異なるセット）と比べてクエリペプチドが特定の対立遺伝子についてスコア化する百分位数を評価することによって決定されてもよい。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ対立遺伝子に結合する可能性が最も高いエピトープの上位１０％が選択されてもよい。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ対立遺伝子に結合する可能性が最も高いエピトープの上位２％が選択されてもよい。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ対立遺伝子に結合する可能性が最も高いエピトープの上位５％が選択されてもよい。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ対立遺伝子に結合する可能性が最も高いエピトープの上位８％が選択されてもよい。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ対立遺伝子に結合する可能性が最も高いエピトープの上位１％が選択されてもよい。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ対立遺伝子に結合する可能性が最も高いエピトープの上位０．５％が選択されてもよい。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ対立遺伝子に結合する可能性が最も高いエピトープの上位０．１％が選択されてもよい。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ対立遺伝子に結合する可能性が最も高いエピトープの上位０．０１％が選択されてもよい。いくつかの実施形態では、カットオフの選択は、予測モデルによって決定されるようなＨＬＡ対立遺伝子に結合する可能性が高いと予測されるエピトープの利用可能性及び数に依存してもよい。
いくつかの実施形態では、対象はウイルスに感染してもよい。いくつかの実施形態では、対象はウイルスによる感染症のリスクがあってもよい。いくつかの実施形態では、ウイルスはコロナウイルスである。いくつかの実施形態では、コロナウイルスはＳＡＲＳウイルス、ＭＥＲＳコロナウイルス、または２０１９ ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ウイルスから選択される。いくつかの実施形態では、１以上のウイルスペプチド抗原は、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２Ａｉ、表２Ａｉｉ、表２Ｂ、表９、表１０、表１１、表１２、表１４Ａ、表１４Ｂ、表１５または表１６における配列の少なくとも８の連続アミノ酸を含むペプチドを含む。いくつかの実施形態では、１以上のウイルスペプチド抗原は、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２Ａｉ、表２Ａｉｉ、表２Ｂ、表９、表１０、表１１、表１２、表１４Ａ、表１４Ｂ、表１５または表１６における配列の少なくとも７の連続アミノ酸を含むペプチドを含む。いくつかの実施形態では、１以上のウイルスペプチド抗原は、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２Ａｉ、表２Ａｉｉ、表２Ｂ、表９、表１０、表１１、表１２、表１４Ａ、表１４Ｂ、表１５または表１６における配列の少なくとも６の連続アミノ酸を含むペプチドを含む。
一実施形態では、抗原ペプチドは長さ約５～約５０の間のアミノ酸である。別の実施形態では、抗原ペプチドは長さ約１５～約３５の間のアミノ酸である。別の実施形態では、抗原ペプチドは長さ約１５以下のアミノ酸である。別の実施形態では、抗原ペプチドは長さ約８～約１１の間のアミノ酸である。別の実施形態では、抗原ペプチドは長さ９または１０のアミノ酸である。一実施形態では、抗原ペプチドは、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩを結合する。別の実施形態では、抗原ペプチドは約５００ｎＭ未満の結合親和性でＭＨＣクラスＩを結合する。
別の実施形態では、抗原ペプチドは長さ約３０以下のアミノ酸である。別の実施形態では、抗原ペプチドは長さ約６～約２５の間のアミノ酸である。別の実施形態では、抗原ペプチドは長さ約１５～約２４の間のアミノ酸である。別の実施形態では、抗原ペプチドは長さ約９～約１５の間のアミノ酸である。一実施形態では、抗原ペプチドはＭＨＣクラスＩＩを結合する。別の実施形態では、抗原ペプチドは約１０００ｎＭ未満の結合親和性でＭＨＣクラスＩＩを結合する。
一実施形態では、抗原ペプチドはさらに、隣接アミノ酸を含む。別の実施形態では、隣接アミノ酸は天然の隣接アミノ酸ではない。一実施形態では、抗原ペプチドは少なくとも第２の抗原ペプチドに連結される。別の実施形態では、ペプチドは、ポリグリシンリンカーまたはポリセリンリンカーを使用して連結される。別の実施形態では、第２の抗原ペプチドは約１０００ｎＭ未満の結合親和性でＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩを結合する。別の実施形態では、第２の抗原ペプチドは約５００ｎＭ未満の結合親和性でＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩを結合する。別の実施形態では、双方のエピトープがヒト白血球抗原（ＨＬＡ）－Ａ、－Ｂ、－Ｃ、－ＤＰ、－ＤＱ、または－ＤＲに結合する。別の実施形態では、抗原ペプチドはクラスＩ ＨＬＡを結合し、第２の抗原ペプチドはクラスＩＩ ＨＬＡを結合する。別の実施形態では、抗原ペプチドはクラスＩＩ ＨＬＡを結合し、第２の抗原ペプチドはクラスＩ ＨＬＡを結合する。
一実施形態では、抗原ペプチドはさらに、生体内半減期、細胞標的指向化、抗原の取り込み、抗原のプロセシング、ＭＨＣ親和性、ＭＨＣ安定性、または抗原提示を増やす修飾を含む。別の実施形態では、修飾は、担体タンパク質への結合、リガンドへの結合、抗体への結合、ＰＥＧ化、ポリシアル化ＨＥＳ化、組換えＰＥＧ模倣体、Ｆｃ融合、アルブミン融合、ナノ粒子結合、ナノ粒子カプセル化、コレステロール融合、鉄融合、アシル化、アミド化、グリコシル化、側鎖酸化、リン酸化、ビオチン化、界面活性物質の付加、アミノ酸模倣体の付加、または非天然アミノ酸、例えば、合成アミノ酸もしくはｆ－ｍｏｃアミノ酸、Ｄ－アミノ酸 Ｎ－メチルアミノ酸の付加である。一実施形態では、標的とされる細胞は抗原提示細胞である。別の実施形態では、抗原提示細胞は樹状細胞である。別の実施形態では、樹状細胞は、ＤＥＣ２０５、ＸＣＲ１、ＣＤ１９７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１２３、ＣＤ２０９、ＣＤ２７３、ＣＤ２８３、ＣＤ２８９、ＣＤ１８４、ＣＤ８５ｈ、ＣＤ８５ｊ、ＣＤ８５ｋ、ＣＤ８５ｄ、ＣＤ８５ｇ、ＣＤ８５ａ、ＣＤ１４１、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ８３、ＴＳＬＰ受容体、またはＣＤ１ａマーカーを使用して標的とされる。別の実施形態では、樹状細胞はＣＤ１４１、ＤＥＣ２０５、またはＸＣＲ１マーカーを使用して標的とされる。
一実施形態では、本明細書で提供されているのは本明細書に記載されている抗原ペプチドを含む生体内送達システムである。別の実施形態では、送達システムには細胞透過性ペプチド、ナノ粒子カプセル化、ウイルス様粒子、またはリポソームが含まれる。別の実施形態では、細胞透過性ペプチドはＴＡＴペプチド、単純ヘルペスウイルスＶＰ２２、トランスポータン、またはＡｎｔｐである。
一実施形態では、本明細書で提供されているのは本明細書に記載されている抗原ペプチドを含む細胞である。別の実施形態では、細胞は抗原提示細胞である。別の実施形態では、細胞は樹状細胞である。
一実施形態では、本明細書で提供されているのは本明細書に記載されている抗原ペプチドを含む組成物である。別の実施形態では、組成物は、表１Ａのエピトープを含む抗原ペプチドの少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、または少なくとも３０を含む。別の実施形態では、組成物は、表１Ｂのエピトープを含む抗原ペプチドの少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、または少なくとも３０を含む。別の実施形態では、組成物は、表２Ｂのエピトープを含む抗原ペプチドの少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、または少なくとも３０を含む。別の実施形態では、組成物は２～２０の間の抗原ペプチドを含む。別の実施形態では、組成物はさらに、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、または少なくとも３０の追加の抗原ペプチドを含む。別の実施形態では、組成物は約４～約２０の間の追加の抗原ペプチドを含む。別の実施形態では、追加の抗原ペプチドはコロナウイルスに特異的である。
一実施形態では、本明細書で提供されているのは本明細書に記載されている抗原ペプチドをコードするポリヌクレオチドである。別の実施形態では、ポリヌクレオチドはＲＮＡであり、任意で自己増幅ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはＤＮＡである。別の実施形態では、ＲＮＡは、安定性を高め、細胞標的指向化を高め、翻訳効率、アジュバント性、細胞質への接近性を高める、及び／または細胞傷害性を減らすように修飾される。別の実施形態では、修飾は、担体タンパク質への結合、リガンドへの結合、抗体への結合、コドン最適化、ＧＣ含有量の増加、修飾ヌクレオシドの組み込み、５’－キャップまたはキャップ類似体の組み込み、及び／またはポリＡ配列、例えば、マスクされていないポリＡ配列、または隣接するＡ配列の２つのセグメントがリンカーによって連結されている破壊されたポリＡ配列の組み込みである。
一実施形態では、本明細書で提供されているのは本明細書に記載されているポリヌクレオチドを含む細胞である。
一実施形態では、本明細書で提供されているのは本明細書に記載されているポリヌクレオチドを含むベクターである。別の実施形態では、ポリヌクレオチドはプロモーターに操作可能に連結されている。別の実施形態では、ベクターは、自己増幅ＲＮＡレプリコン、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、ウイルス、またはビリオンである。別の実施形態では、ベクターは、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、またはそれらのシュードタイプである
一実施形態では、本明細書で提供されているのは本明細書に記載されているポリヌクレオチドを含む生体内送達システムである。別の実施形態では、送達システムには、球状核酸、ウイルス、ウイルス様粒子、プラスミド、細菌プラスミド、またはナノ粒子が含まれる。
一実施形態では、本明細書で提供されているのは本明細書に記載されているベクターまたは送達システムを含む細胞である。別の実施形態では、細胞は抗原提示細胞である。別の実施形態では、細胞は樹状細胞である。別の実施形態では、細胞は未成熟樹状細胞である。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されているのは本明細書に記載されている少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む組成物である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されているのは、１以上の２０１９ ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ワクチン（例えば、ｍＲＮＡ系ワクチン、ＤＮＡ系ワクチン、ＡＡＶ系ワクチン、タンパク質系ワクチン）と併用して本明細書に記載されている１以上の抗原ペプチドを含む組成物である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されているのは、１以上の２０１９ ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ワクチン（例えば、ｍＲＮＡ系ワクチン、ＤＮＡ系ワクチン、ＡＡＶ系ワクチン、タンパク質系ワクチン）と併用して本明細書に記載されている少なくとも１つの抗原ペプチドをコードする１以上のポリヌクレオチドを含む組成物である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されているのは本明細書に記載されている１を超える抗原ペプチドをコードする単一のポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されているのは、（ｉ）本明細書に記載されている少なくとも１つの抗原ペプチドと、（ｉｉ）２０１９ ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２タンパク質（例えば、Ｓタンパク質）及び／またはその免疫原性断片（例えば、Ｓタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ））とをコードする単一のポリヌクレオチドである。別の実施形態では、組成物は、ポリヌクレオチドのうち少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、で少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、または少なくとも３０を含む。別の実施形態では、組成物は約２～約２０の間のポリヌクレオチドを含む。別の実施形態では、組成物はさらに、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、または少なくとも３０の、追加の抗原ペプチドをコードする追加の抗原性ポリヌクレオチドを含む。別の実施形態では、組成物は約４～約２０の間の追加の抗原性ポリヌクレオチドを含む。別の実施形態では、ポリヌクレオチド及び追加の抗原性ポリヌクレオチドは連結される。別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ポリグリシンリンカーまたはポリセリンリンカーをコードする核酸を使用して連結される。
一実施形態では、本明細書で提供されているのは本明細書に記載されている少なくとも１つの抗原ペプチドを結合することができるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）である。別の実施形態では、ＴＣＲはＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩとの関連で抗原ペプチドを結合することができる。
一実施形態では、本明細書で提供されているのは、（ｉ）Ｔ細胞活性化分子と；（ｉｉ）膜貫通領域と；（ｉｉｉ）本明細書に記載されている抗原ペプチドに結合することができる抗原認識部分とを含むキメラ抗原受容体である。別の実施形態では、ＣＤ３ゼータはＴ細胞活性化分子である。別の実施形態では、キメラ抗原受容体はさらに、少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメインを含む。別の実施形態では、シグナル伝達ドメインはＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＩＴＡＭ、またはＦｃイプシロンＲＩ－ガンマである。別の実施形態では、抗原認識部分はＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩとの関連で抗原ペプチドを結合することができる。別の実施形態では、キメラ抗原受容体は、ＣＤ３－ゼータ、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ－４、ＩＣＯＳ、ＢＴＬＡ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ４ＯＬ、Ｔｉｍ－３、Ａ２ａＲ、またはＰＤ－１の膜貫通領域を含む。
一実施形態では、本明細書で提供されているのは本明細書に記載されているＴ細胞受容体またはキメラ抗原受容体を含むＴ細胞である。一実施形態では、Ｔ細胞はヘルパーＴ細胞または細胞傷害性Ｔ細胞である。
一実施形態では、本明細書で提供されているのは本明細書に記載されているＴ細胞受容体をコードするポリヌクレオチドに操作可能に連結されたプロモーターを含む核酸である。別の実施形態では、ＴＣＲは主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはクラスＩＩとの関連で少なくとも１つの抗原ペプチドに結合することができる。一実施形態では、核酸は、本明細書に記載されているキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドに操作可能に連結されたプロモーターを含む。別の実施形態では、抗原認識部分は主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはクラスＩＩとの関連で少なくとも１つの抗原ペプチドを結合することができる。
一実施形態では、本明細書で提供されているのは、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２Ａｉ、表２Ａｉｉ、表２Ｂ、表９、表１０、表１１、表１２、表１４Ａ、表１４Ｂ、表１５または表１６のエピトープを含むペプチドを結合することができる抗体である。一実施形態では、本明細書で提供されているのは表１Ｂのエピトープを含むペプチドを結合することができる抗体である。一実施形態では、本明細書で提供されているのは表２Ａｉまたは表２Ａｉｉのエピトープを含むペプチドを結合することができる抗体である。
一実施形態では、本明細書で提供されているのは本明細書に記載されている核酸で形質移入または形質導入された改変細胞である。一実施形態では、改変細胞は、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、ＮＫ－Ｔ細胞、ＴＣＲ発現細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、またはＮＫ細胞である。
一実施形態では、本明細書で提供されているのは本明細書に記載されているＴ細胞受容体またはキメラ抗原受容体を含む組成物である。別の実施形態では、組成物は、本明細書に記載されているＴ細胞受容体またはキメラ抗原受容体を含有する患者の自己Ｔ細胞を含む。別の実施形態では、組成物はさらに、免疫チェックポイント阻害剤を含む。別の実施形態では、組成物はさらに、少なくとも２つの免疫チェックポイント阻害剤を含む。別の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤のそれぞれは、ＣＴＬＡ－４、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＰＤ１、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、２Ｂ４、ＣＤ１６０、ＣＧＥＮ－１５０４９、ＣＬＩＫ１、ＣＨＫ２、Ａ２ａＲ、及びＢ－７ファミリーリガンド、またはそれらの組み合わせから成る群から選択されるチェックポイントタンパク質を阻害する。別の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤のそれぞれは、ＣＴＬＡ－４、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＰＤ１、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、２Ｂ４、ＣＤ１６０、ＣＧＥＮ－１５０４９、ＣＨＫ１、ＣＨＫ２、Ａ２ａＲ、及びＢ－７ファミリーリガンド、またはそれらの組み合わせから成る群から選択されるチェックポイントタンパク質のリガンドと相互作用する。
一実施形態では、組成物はさらに、免疫調節剤またはアジュバントを含む。別の実施形態では、免疫調節剤は、共刺激リガンド、ＴＮＦリガンド、Ｉｇスーパーファミリーリガンド、ＣＤ２８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＣＯＳ、ＣＤ４ＯＬ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＤＲ３、ＣＤ６９、または４－１ＢＢである。別の実施形態では、免疫調節剤は少なくとも１つの感染細胞抽出物である。別の実施形態では、感染細胞は組成物を必要とする対象にとって自己由来である。別の実施形態では、感染細胞は溶解を受けている、または紫外線に曝露されている。別の実施形態では、組成物はさらにアジュバントを含む。別の実施形態では、アジュバントは、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、ポリ－ＩＣＬＣ、ＳＴＩＮＧアゴニスト、１０１８ＩＳＳ、アルミニウム塩、Ａｍｐｌｉｖａｘ、ＡＳ１５、ＢＣＧ、ＣＰ－８７０，８９３、ＣｐＧ７９０９、ＣｙａＡ、ｄＳＬＩＭ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＣ３０、ＩＣ３１、Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ、ＩｍｕＦａｃｔ ＩＭＰ３２１、ＩＳ貼付剤、ＩＳＳ、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ、ＪｕｖＩｍｍｕｎｅ、ＬｉｐｏＶａｃ、ＭＦ５９、モノホスホリル脂質Ａ、モンタニドＩＭＳ１３１２ＶＧ、モンタニドＩＳＡ２０６ＶＧ、モンタニドＩＳＡ５０Ｖ２、モンタニドＩＳＡ５１ＶＧ、ＯＫ－４３２、ＯＭ－１７４、ＯＭ－１９７－ＭＰ－ＥＣ、ＩＳＡ－ＴＬＲ２アゴニスト、ＯＮＴＡＫ、ＰｅｐＴｅｌ（登録商標）、ベクターシステム、ＰＬＧ微粒子、レシキモド、ＳＲＬ１７２、ビロソーム及びその他のウイルス様粒子、ＹＦ－１７Ｄ、ＶＥＧＦトラップ、Ｒ８４８、ベータグルカン、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、Ｐａｍ３ＣＳＫ４、アクリルポリマーまたはメタクリルポリマー、無水マレイン酸のコポリマー、及びＱＳ２１スティミュロンから成る群から選択される。別の実施形態では、アジュバントは対象に投与されると液性免疫を誘導する。別の実施形態では、アジュバントは対象に投与されるとヘルパーＴ細胞１型を誘導する。
一実施形態では、本明細書で提供されているのは、細胞を本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、送達システム、ベクター、組成物、抗体または細胞と接触させることを含む、ウイルスに感染する可能性がある対象に、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２Ａｉ、表２Ａｉｉまたは表２Ｂにて定義されたエピトープ由来の少なくとも８つの連続するアミノ酸を含む１以上のペプチドを含むワクチン組成物を投与することによって、ウイルスによる感染症を抑制する方法である。
一実施形態では、本明細書で提供されているのは、対象に本明細書に記載されているペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、組成物、抗体、または細胞を投与することを含む、抗ウイルス応答の増強または延長をそれを必要とする対象にて行うことによって、ウイルス感染、特にコロナウイルス感染症、例えば、２０１９ ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２感染を治療する方法である。
一実施形態では、対象はヒトである。別の実施形態では、対象はウイルス感染を有する。一実施形態では、対象は、急性呼吸器ウイルス、例えば、ＳＡＲＳ様ウイルスまたはＭＥＲＳもしくはＭＥＲＳ様ウイルス、またはさらに具体的には、２０１９ ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２株のコロナウイルスのような呼吸器ウイルスに感染している。いくつかの実施形態では、対象は２０１９ ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２コロナウイルスに感染している。いくつかの実施形態では、対象は２０１９ ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２コロナウイルスに検出可能に感染している。いくつかの実施形態では、対象は無症状である。いくつかの実施形態では、対象は症状を示す。いくつかの実施形態では、対象は、２０１９ ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ウイルスまたは関連するウイルスに感染したことがあるとは検出されていないが、対象は感染者の近くにいる、感染地域にいるか、そうでなければ感染の危険にさらされている。
該方法の一実施形態では、ペプチドが投与される。別の実施形態では、投与は全身性である。該方法の別の実施形態では、ポリヌクレオチド、任意でＲＮＡが投与される。一実施形態では、ポリヌクレオチドは非経口投与される。一実施形態では、ポリヌクレオチドは静脈内投与される。別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、皮内に、または筋肉内に、または皮下に投与される。一実施形態では、ポリヌクレオチドは筋肉内に投与される。該方法の一実施形態では、細胞が投与される。別の実施形態では、細胞はＴ細胞または樹状細胞である。別の実施形態では、ペプチドまたはポリヌクレオチドは、抗原提示細胞を標的とする部分を含む。
一実施形態では、ペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、組成物、または細胞は、別の抗ウイルス療法のような別の療法と同時に投与する前に投与される。別の実施形態では、ペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、組成物、または細胞は別の抗ウイルス療法の前または後に投与される。別の実施形態では、別の抗ウイルス療法の施行は、抗原ペプチド療法、ポリヌクレオチド療法、ベクター療法、組成物療法、または細胞療法の全体を通して継続される。
該方法の一実施形態では、追加の薬剤が投与される。別の実施形態では、薬剤は、化学療法剤、免疫調節薬、免疫代謝調節薬、標的療法、放射線、抗血管新生薬、または免疫抑制を軽減する薬剤である。別の実施形態では、本明細書に記載されている医薬組成物の投与はＣＤ４＋Ｔ細胞免疫応答を誘発する、または促進する。別の実施形態では、本明細書に記載されている医薬組成物の投与は、ＣＤ４＋Ｔ細胞免疫応答及びＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を誘発する、または促進する。
別の実施形態では、患者は抗原ペプチドまたは核酸ワクチンを受け入れるのに先立って、及び／またはその最中に、化学療法剤、免疫調節薬、免疫代謝調節薬、標的療法、または放射線治療を受けた。別の実施形態では、自己Ｔ細胞は、抗原を含有する少なくとも１回のＴ細胞療法をすでに受けたことがある患者から得られる。別の実施形態では、方法はさらに、養子Ｔ細胞療法を含む。別の実施形態では、養子Ｔ細胞療法は自己Ｔ細胞を含む。別の実施形態では、自己Ｔ細胞はウイルス抗原を標的とする。別の実施形態では、養子Ｔ細胞療法はさらに、同種異系Ｔ細胞を含む。別の実施形態では、同種異系Ｔ細胞はウイルス抗原を標的とする。
一実施形態では、本明細書で提供されているのは、（ｉ）改変細胞を投与する前に、対象から得られた第１の試料にて標的細胞の数または濃度を測定することと、（ｉｉ）改変細胞の投与後に対象から得られた第２の試料にて標的細胞の数または濃度を測定することと、（ｉｉｉ）第１の試料における標的細胞の数または濃度と比べて第２の試料における標的細胞の数または濃度の増加または減少を決定することとを含む、治療の有効性を評価する方法である。別の実施形態では、治療の有効性は、臨床転帰：Ｔ細胞による抗ウイルス活性の増加、増強または延長；治療前の数と比べた抗ウイルス性Ｔ細胞または活性化Ｔ細胞の数の増加；Ｂ細胞活性；ＣＤ４Ｔ細胞活性；またはそれらの組み合わせをモニタリングすることによって判定される。別の実施形態では、治療の有効性は生体マーカーをモニタリングすることによって判定される。別の実施形態では、治療効果は、Ｔ細胞の存在によって、またはＴ細胞炎症を示す遺伝子シグネチャーの存在によって、またはそれらの組み合わせによって予測される。
本明細書で提供されているのは、表１１及び１２の列２に示される配列のいずれか１つのアミノ酸配列を有する１以上のポリペプチド；または、表１１及び１２の列２に示される配列のいずれか１つのアミノ酸配列を有するポリペプチドをそれぞれコードする１以上の組換えポリヌクレオチド構築物を含む医薬組成物である。
いくつかの実施形態では、１以上のポリペプチドは、表１１及び１２の列２に示される配列のいずれか１つのアミノ酸配列を有する少なくとも２、３、４、５、６、７または８の異なるポリペプチドを含み；または、１以上の組換えポリヌクレオチド構築物は、表１１及び１２の列２に示される配列のいずれか１つのアミノ酸配列を有する異なるポリペプチドをそれぞれコードする少なくとも２、３、４、５、６、７または８の組換えポリヌクレオチド構築物を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は少なくとも８の組換えポリヌクレオチドストリングを含む。いくつかの実施形態では、複数のコロナウイルスペプチド抗原をコードする１以上の組換えポリヌクレオチドストリングは、配列番号ＲＳ Ｃ１ｎ、ＲＳ Ｃ２ｎ、ＲＳ Ｃ３ｎ、ＲＳＣ４ｎ、ＲＳ Ｃ５ｎ、ＲＳ Ｃ６ｎ、ＲＳ Ｃ７ｎ、及びＲＳ Ｃ８ｎに示される配列の群から選択される配列、または上記のいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性である配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えポリヌクレオチド構築物はｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、組換えポリヌクレオチド構築物はｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、医薬組成物はさらに、１以上の脂質成分を含む。いくつかの実施形態では、１以上の脂質は脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは組換えポリヌクレオチド構築物をカプセル化する。いくつかの実施形態では、医薬組成物はそれを必要とする対象に投与される。
本明細書で提供されているのは、上記の医薬組成物を対象に投与することを含む、ＣＯＶＩＤの治療をそれを必要とする対象にて行う方法である。いくつかの実施形態では、医薬組成物は１以上のＣＯＶＩＤ治療薬に加えて投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、２０１９ ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはその断片のアミノ酸配列を有する１以上のポリペプチド、または２０１９ ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはその断片をコードする１以上の組換えポリヌクレオチド構築物と併用して投与される。いくつかの実施形態では、２０１９ ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはその断片はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはその断片である。いくつかの実施形態では、医薬組成物は２０１９ ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはその断片の最初の投与の２～１０週後に投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は２０１９ ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはその断片の最初の投与の１～６ヵ月後に投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は２０１９ ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはその断片の投与と同時に投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は２０１９ ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはその断片の最初の投与の２～１０週前に投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはそれをコードするポリヌクレオチドを含むワクチンの最初の投与の２～１０週後に投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはそれをコードするポリヌクレオチドの最初の投与の１～６ヵ月後に投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはそれをコードするポリヌクレオチドの投与と同時に投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は予防的に投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、１週、２週、３週、４週、５週、６週以上ごとに１回投与される。
本明細書で提供されているのはまた、２０１９ ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ウイルスによって引き起こされる呼吸器ウイルス感染症を治療するまたは予防するための治療薬を調製するための、本明細書に記載されている組成物のいずれか１つの使用である。
本発明の態様または実施形態がマーカッシュ群または他の選択肢の群に関して記載されている場合、本発明は全体として列挙された群全体だけでなく、群の各メンバーを個別に、及び主群のすべての可能な下位群、及び１以上の群メンバーが存在しない主群も包含する。本発明はまた、本発明の実施形態における任意の群メンバーのうちの１以上の明白な除外も想定する。
本明細書に記載されているウイルスエピトープに対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答の生成に最も関連するペプチドを特定する方法の例示的な流れ図を示す。 検証データセットにおけるクラスＩペプチド・ＭＨＣ対立遺伝子のペアに適用されるＴ細胞エピトープ予測アルゴリズムを使用して得られた結果の例示的なグラフ、及びこれらのペアの計算されたパーセント順位の報告されたＭＨＣ結合アッセイ結果との比較を示す。ＭＨＣ結合アッセイにおいて２成分「陽性」の結果を示したペプチド・ＭＨＣ対立遺伝子のペアのパーセント順位は、「陰性」の結果を示したペアよりも有意に低かった。さらに詳細な陽性の結果では、さらに強いアッセイの結果（低＜中＜高）は有意に低いパーセント順位と関連していた。 同上。 ヒトＴ細胞誘導アッセイにて２０１９ ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２からエピトープを予測したＨＬＡ－Ａ０２：０１の実験的検証を示す。ＨＬＡ－Ａ０２：０１（実施例８の表４を参照）への高バインダーであると予測された２３のペプチドを合成し、３人のヒトドナーからのＰＢＭＣを使用してＴ細胞誘導にてアッセイした。ｐＭＨＣ多量体技術によって決定されるように、少なくとも１人のドナーがペプチドに対するＴ細胞応答を引き起こせば、エピトープは免疫原性であると見なされた。実施例８の表４からのペプチドを使用したｐＭＨＣ染色の代表的なフローサイトメトリープロットを示す。多量体陽性集団を丸で囲み、多量体陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度は各プロットの右上隅に示す。 図４Ａ：ＭＨＣクラスＩエピトープであると予測された示されたペプチドに対するＨＬＡ対立遺伝子の累積ＵＳＡ集団カバー率（左）、及びＭＨＣクラスＩＩエピトープであると予測される２５ｍｅｒペプチドに対するＨＬＡ対立遺伝子の累積ＵＳＡ集団カバー率（右）の例示的なグラフを示す。 図４Ｂ：個々の２０１９ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質（あるいは２０１９－ＣｏＶ－２タンパク質と呼ばれる）からの少数の予測された多対立遺伝子結合エピトープが広い集団カバー率を達成できることを示す。上のパネルは、Ｍ、Ｎ、及びＳタンパク質のそれぞれに含まれる優先ＨＬＡ－Ｉエピトープの数に対比させたＵＳＡ、ＥＵＲ、及びＡＰＩの集団についての累積ＨＬＡ－Ｉカバー率を示す。上のパネルに対応するペプチド配列を表６に示す。下のパネルは、Ｍ、Ｎ、及びＳタンパク質のそれぞれに含まれる優先ＨＬＡ－ＩＩ２５ｍｅｒの数に対比させた各集団の累積ＨＬＡ－ＩＩカバー率を示す。下のパネルに対応するペプチド配列を表７に示す。 潜在的なワクチン標的を優先するために活用できる相対的な２０１９ ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２タンパク質発現レベルを示す、公開されているプロテオミクスデータセットの分析結果を示す。２０１９ ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２感染（別名２０１９ ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２感染）に対するプロテオミクス応答を調べる３つのデータセットが再分析され、タンパク質長に正規化されたスペクトルカウントによってタンパク質存在量が推定された。図に示されていないアノテーション付きＯＲＦは、これらのプロテオミクス研究では検出されなかった。３つの研究すべてにわたって、ヌクレオカプシドタンパク質は２０１９ ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２感染の間で最も豊富なタンパク質である。 図６Ａ：表９及び１１にも記載されている、第１群として記載されるストリング構築物のグラフ表示を示す。 図６Ｂ：図６Ａの構築物の詳細な拡大図を提供する 図７Ａ：表１０及び１２にも記載されている、第２群として記載されるストリング構築物のグラフ表示を示す。 図７Ｂ：図７Ａの構築物の詳細な拡大図を提供する。 図８Ａｉ：単一エピトープのレベルでのＢＮＴ ｍＲＮＡワクチン誘導Ｔ細胞の特徴付けを示す。含まれるデータは３人の異なる参加者における示されたエピトープに対するエピトープ応答性Ｔ細胞を示す。このワクチンは、脂質ナノ粒子にカプセル化された２０１９ ＳＡＲＳ ＣＯＶ－２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質をコードするｍＲＮＡを含む。 同上。 図８Ａｉｉ：単一エピトープのレベルでのＢＮＴ ｍＲＮＡワクチン誘導Ｔ細胞の特徴付けを示す。含まれるデータは３人の異なる参加者における示されたエピトープに対するエピトープ応答性Ｔ細胞を示す。このワクチンは、脂質ナノ粒子にカプセル化された２０１９ ＳＡＲＳ ＣＯＶ－２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質をコードするｍＲＮＡを含む。 図８Ｂ：細胞表面マーカー、ＣＣＲ７、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ３、ＰＤ－１、ＣＤ３８、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ２８及びＣＤ２７についてフローサイトメトリーによって分析された多量体陽性ＣＤ８＋細胞を示す。 図８Ｃ：スパイクタンパク質Ｓ１及びＳ２を含むポリペプチドワクチンを示し、特定のＭＨＣ分子に結合することができる示されたエピトープ領域を長さに沿って無地の形状によって示し、それが結合する対応するＨＬＡ対立遺伝子を下に示す。 図８Ｄ：異なる用量（示されるように１０、２０及び３０マイクログラム）でのスパイクタンパク質ｍＲＮＡワクチンによる患者のワクチン接種後の経時的なＴ細胞応答を示す。上のパネルはＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用したＩＦＮ－ｇ発現によって示されるＣＤ４＋Ｔ細胞応答を示す。下のパネルはＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用したＩＦＮ－ｇ発現によって示されるＣＤ８＋Ｔ細胞応答を示す。ＣＥＦ及びＣＥＦＴは対照のＣＭＶ、ＥＢＶ、及びインフルエンザのプールである。 同上。 図８Ｅ：スパイクタンパク質ｍＲＮＡワクチン（各１０マイクログラム）を投与された高齢者集団における経時的なＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の応答を示す。 エピトープの順序付けにおいてＭＳに基づくＨＬＡ－Ｉ切断予測因子情報を具体的に使用した、ＯＲＦ－１ａｂエピトープを含むワクチンストリングの設計を示す。この設計は最小限の数のリンカー配列を利用する。 図１０Ａ：動物モデルにおけるストリングワクチン組成物の免疫原性を検証するための実験計画を示す。 図１０Ｂ：動物モデルにおけるストリングワクチン組成物の免疫原性を検証し、ワクチンをスパイクタンパク質ｍＲＮＡワクチン組成物単独、ストリングワクチン組成物単独、または図に示されるような２つのさまざまな組み合わせと比較するための実験計画を示す。一部のセットでは、２つのワクチンの共製剤がマウスに投与され、その際、例示的な共製剤の比は、スパイクタンパク質ｍＲＮＡワクチン：ストリングワクチン（例えば、９：１、３：１または１：１）である。 種々のＳＡＲＳ ＣｏＶ－２分離株におけるスパイクタンパク質にわたる配列の変異型及び突然変異型、ならびにワクチンエピトープ配列のそれぞれのマッピングを示す。 種々のＳＡＲＳ ＣｏＶ－２分離株におけるヌクレオカプシドタンパク質にわたる配列の変異型及び突然変異型、ならびにワクチンエピトープ配列のそれぞれのマッピングを示す。 種々のＳＡＲＳ ＣｏＶ－２分離株における膜タンパク質にわたる配列の変異型及び突然変異型、ならびにワクチンエピトープ配列のそれぞれのマッピングを示す。 種々のＳＡＲＳ ＣｏＶ－２分離株におけるＮＳＰ１タンパク質にわたる配列の変異型及び突然変異型、ならびにワクチンエピトープ配列のそれぞれのマッピングを示す。 種々のＳＡＲＳ ＣｏＶ－２分離株におけるＮＳＰ２タンパク質にわたる配列の変異型及び突然変異型、ならびにワクチンエピトープ配列のそれぞれのマッピングを示す。 種々のＳＡＲＳ ＣｏＶ－２分離株におけるＮＳＰ３タンパク質にわたる配列の変異型及び突然変異型、ならびにワクチンエピトープ配列のそれぞれのマッピングを示す。 種々のＳＡＲＳ ＣｏＶ－２分離株におけるＮＳＰ４タンパク質にわたる配列の変異型及び突然変異型、ならびにワクチンエピトープ配列のそれぞれのマッピングを示す。
本明細書に記載されているのは、ウイルスエピトープに基づく新規の治療薬及びワクチンである。したがって、本明細書に記載されている本発明は、例えば、ウイルス抗原に対する免疫応答を刺激するために、ウイルス感染を治療するまたは予防するのに使用するための免疫原性組成物またはワクチンを作り出すために使用することができるペプチド、該ペプチドをコードするポリヌクレオチド、及びペプチド結合剤を提供する。
定義
本発明の理解を促進するために、多数の用語及び語句を下記に定義する。
「ウイルス抗原」はウイルスによってコードされる抗原を指す。それらには、ＣＯＶＩＤ１９ のようなコロナウイルスの抗原が含まれるが、これに限定されない。
本開示の全体を通して、「結合データ」の結果は「ＩＣ５０」で表すことができる。ＩＣ５０は、標識参照ペプチドの結合の５０％阻害が観察される結合アッセイにおける試験ペプチドの濃度である。アッセイが実行される条件（すなわち、ＨＬＡタンパク質及び標識参照ペプチドの濃度を制限する）を考えると、これらの値はＫＤ値に近似する。結合を決定するためのアッセイは当該技術分野で周知であり、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９４／２０１２７及びＷＯ９４／０３２０５、ならびに例えば、Ｓｉｄｎｅｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１８．３．１（１９９８）；Ｓｉｄｎｅｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：２４７（１９９５）；及びＳｅｔｔｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：８１３（１９９４）のような他の刊行物にて詳細に記載されている。あるいは、参照標準ペプチドによる結合と比べて結合を表すことができる。例えば、参照標準ペプチドのＩＣ５０に対するそのＩＣ５０に基づくことができる。結合は、生細胞（例えば、Ｃｅｐｐｅｌｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３９：３９２（１９８９）；Ｃｈｒｉｓｔｎｉｃｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６７（１９９１）；Ｂｕｓｃｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：４４３（１９９０）；Ｈｉｌｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：１８９（１９９１）；ｄｅｌ Ｇｕｅｒｃｉｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：６８５（１９９５））、界面活性剤溶解物を使用する無細胞系（例えば、Ｃｅｒｕｎｄｏｌｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：２０６９（１９９１））、不動化した精製ＭＨＣ（例えば、Ｈｉｌｌ，ｅｔ ａｌ．Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２，２８９０（１９９４）；Ｍａｒｓｈａｌｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：４９４６（１９９４））、ＥＬＩＳＡ系（例えば、Ｒｅａｙ，ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１１：２８２９（１９９２））、表面プラスモン共鳴（例えば、Ｋｈｉｌｋｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１５４２５（１９９３））；高流量可溶性相アッセイ（Ｈａｍｍｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：２３５３（１９９４））、及びクラスＩのＭＨＣの安定化または会合の測定（例えば、Ｌｊｕｎｇｇｒｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４６：４７６（１９９０）；Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，６２：５６３（１９９０）；Ｔｏｗｎｓｅｎｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，６２：２８５（１９９０）；Ｐａｒｋｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：１８９６（１９９２））を使用するものを含む他のアッセイ系を使用して決定することもできる。
エピトープを議論するのに使用される「導出される」という用語は「調製される」の同義語である。導出エピトープは、天然源に由来することができ、または当該技術分野の標準プロトコールに従って合成することができる。合成エピトープは、天然に存在するＬアミノ酸残基のＤ異性体のような人工アミノ酸残基「アミノ酸模倣体」またはシクロヘキシルアラニンのような非天然アミノ酸残基を含むことができる。導出エピトープまたは調製エピトープは天然のエピトープの類似体であることができる。
「希釈剤」には、無菌の液体、例えば、水、及び石油性、動物性、植物性または合成の起源のものを含む油、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油等が挙げられる。水は医薬組成物の希釈剤でもある。生理食塩水溶液ならびにデキストロース及びグリセロールの水溶液も、例えば、注射溶液での希釈剤として採用することができる。
「エピトープ」は、例えば、免疫グロブリン、Ｔ細胞受容体、ＨＬＡ分子、またはキメラ抗原受容体によって認識される部位を一緒に形成する、一次、二次及び三次のペプチド構造、ならびに電荷のような分子の集合的特徴である。あるいは、エピトープは、特定の免疫グロブリンによる認識またはＴ細胞の関連での認識に関与するアミノ酸残基のセットであることができ、それらの残基はＴ細胞受容体タンパク質、キメラ抗原受容体及び／または主要組織適合複合体（ＭＨＣ）受容体による認識に必要である。エピトープは天然源からの単離によって調製することができ、または当該技術分野の標準プロトコールに従って合成することができる。合成エピトープは、天然に存在するＬアミノ酸残基のＤ異性体のような人工アミノ酸残基、「アミノ酸模倣体」またはシクロヘキシルアラニンのような非天然アミノ酸残基を含むことができる。本開示の全体を通して、エピトープは場合によっては、ペプチドまたはペプチドエピトープと呼ばれてもよい。
本明細書に記載されているエピトープまたは類似体、及び追加のアミノ酸（複数可）を含むタンパク質またはペプチドは依然として本発明の範囲内にあることを理解すべきである。特定の実施形態では、ペプチドは抗原の断片を含む。
特定の実施形態では、本発明のペプチドの長さに制限がある。長さが限定される実施形態は、本明細書に記載されているエピトープを含むタンパク質またはペプチドが、天然配列と１００％の同一性を有する領域（すなわち、連続した一連のアミノ酸残基）を含む場合に生じる。例えば天然の分子全体についてエピトープの定義を解釈するのを回避するために、天然のペプチド配列と１００％の同一性を有するいずれの領域にも長さに制限がある。したがって、本明細書に記載されているエピトープ及び天然のペプチド配列と１００％の同一性を持つ領域を含むペプチドについて、天然の配列と１００％の同一性を持つ領域は一般に、６００以下のアミノ酸残基、５００以下のアミノ酸残基、４００以下のアミノ酸残基、２５０以下のアミノ酸残基、１００以下のアミノ酸残基、８５以下のアミノ酸残基、７５以下のアミノ酸残基、６５以下のアミノ酸残基、及び５０以下のアミノ酸残基の長さを有する。特定の実施形態では、本明細書に記載されている「エピトープ」は、５アミノ酸残基までの任意の増分、例えば、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１のアミノ酸残基にて天然のペプチド配列に対して１００％の同一性を有する５１未満のアミノ酸残基を持つ領域を有するペプチドによって構成される。
「ヒト白血球抗原」または「ＨＬＡ」は、ヒトクラスＩまたはクラスＩＩの主要組織適合複合体（ＭＩＴＣ）タンパク質である（例えば、Ｓｔｉｔｅｓ，ｅｔ ａｌ．，ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，８ＴＨ ＥＤ．，Ｌａｎｇｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｌｏｓ Ａｌｔｏｓ，Ｃａｌｉｆ．（１９９４）を参照のこと）。
本明細書で使用されるとき「ＨＬＡスーパータイプまたはＨＬＡファミリー」は共有のペプチド結合特異性に基づいて分類されたＨＬＡ分子のセットを説明する。特定のアミノ酸モチーフを持つペプチドに対して幾分類似した結合親和性を共有するＨＬＡクラスＩ分子は、そのようなＨＬＡスーパータイプに分類される。ＨＬＡスーパーファミリー、ＨＬＡスーパータイプファミリー、ＨＬＡファミリー、及びＨＬＡ ｘｘ様分子（「ｘｘ」は特定のＨＬＡ型を示す）という用語は同義語である。
２以上のペプチド配列または抗原断片の文脈にて「同一の」または「同一性パーセント」いう用語は、配列比較アルゴリズムを使用して、または手動整列及び目視検査によって測定されるように、比較ウィンドウにわたって最大の一致について比較し、及び整列させたときに同一である、または同一である特定の割合のアミノ酸残基を有する２以上の配列または部分配列を指す。
「免疫原性」ペプチドまたは「免疫原性」エピトープまたは「ペプチドエピトープ」は、ペプチドがＨＬＡ分子を結合し、細胞介在性の応答または液性の応答、例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、ヘルパーＴリンパ球（ＨＴＬ）及び／またはＢリンパ球の応答を誘導するように対立遺伝子特異的なモチーフを含むペプチドである。したがって、本明細書に記載されている免疫原性ペプチドは、適切なＨＬＡ分子に結合し、その後ペプチドに対するＣＴＬ（細胞傷害性）応答またはＨＴＬ（及び液性）応答を誘導することができる。
本明細書で使用されるとき、「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」は、免疫グロブリン抗原結合ドメイン（例えば、免疫グロブリン可変ドメイン）及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）定常ドメインを含む抗原結合タンパク質を指す。本明細書で使用されるとき、ＴＣＲポリペプチドの「定常ドメイン」は、膜近位ＴＣＲ定常ドメインを含み、ＴＣＲ膜貫通ドメイン及び／またはＴＣＲ細胞質尾部も含んでもよい。例えば、いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＴＣＲ－ベータ定常ドメインに連結された免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含む第１のポリペプチドと、ＴＣＲα定常ドメインに連結された免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（例えば、ｌｃまたは２＼．，可変ドメイン）を含む第２のポリペプチドとを含む二量体である。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＴＣＲ－α定常ドメインに連結された免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含む第１のポリペプチドと、ＴＣＲβ定常ドメインに連結された免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む第２のポリペプチドとを含む二量体である。
「単離された」または「生物学的に純粋な」という語句は、それが本来の状態で見いだされるような材料に通常付随する成分を実質的または本質的に含まない材料を指す。したがって、本明細書に記載されているペプチドは、その原位置環境でペプチドに通常関連する物質の一部またはすべてを含有しない。「単離された」エピトープはエピトープが由来する抗原の全配列を含まないエピトープを指す。通常、「単離された」エピトープには、天然配列の全長にわたって１００％の同一性を有する配列をもたらす追加のアミノ酸残基が結合していない。天然配列はエピトープが由来するウイルス抗原のような配列であることができる。したがって、「単離された」という用語は、材料がその元の環境（例えば、それが天然に存在するならば自然環境）から取り出されていることを意味する。例えば、生きている動物に存在する天然に存在するポリヌクレオチドまたはペプチドは単離されていないが、天然系に共存する物質の一部または全部から分離された同じポリヌクレオチドまたはペプチドは単離されている。そのようなポリヌクレオチドはベクターの一部であってもよく、及び／またはそのようなポリヌクレオチドまたはペプチドは組成物の一部であってもよく、そのようなベクターまたは組成物がその自然環境の一部ではないという点で依然として「単離」されている。ＲＮＡ分子は、本明細書に記載されているＤＮＡ分子の生体内または試験管内でのＲＮＡ転写物を含み、合成で作り出されたそのような分子をさらに含む。
「主要組織適合複合体」または「ＭＨＣ」は、生理的免疫応答に関与する細胞相互作用の制御において役割を担う遺伝子のクラスターである。ヒトでは、ＭＨＣ複合体はヒト白血球抗原（ＨＬＡ）複合体としても知られている。ＭＨＣ複合体及びＨＬＡ複合体の詳細な説明についてはＰａｕｌ，ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，３．ｓｕｐ．ＲＤ ＥＤ．，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）を参照のこと。
「天然」または「野生型」の配列は自然界に見られる配列を指す。そのような配列は本質的にさらに長い配列を含むことができる。
「Ｔ細胞エピトープ」は、ペプチド提示ＭＨＣ分子またはＭＨＣ複合体の形態でクラスＩまたはＩＩのＭＨＣ分子によって結合され得る、次いでこの形態でそれぞれ、細胞傷害性Ｔリンパ球またはＴヘルパー細胞によって認識され、且つ結合され得るペプチド配列を意味すると理解されるべきである。
「受容体」は、リガンドを結合することができる生体分子または分子系列を意味すると理解されるべきである。受容体は細胞、細胞形成または生物において情報を伝達するのに役立ち得る。受容体は、例えば、各受容体単位がタンパク質分子から成ってもよい少なくとも１つの受容体単位を含む。受容体はリガンドの構造を補完する構造を有し、結合パートナーとしてリガンドを複合体化してもよい。情報は、特に、細胞表面でのリガンドの複合体形成に続く受容体の立体構造の変化によって伝達される。いくつかの実施形態では、受容体は、リガンド、特に好適な長さのペプチドまたはペプチド断片との受容体／リガンドの複合体を形成することができるＭＨＣクラスＩ及びＩＩのタンパク質を特に意味すると理解されるべきである。
「リガンド」は、受容体の構造と相補性の構造を有し、この受容体との複合体を形成することができる分子を意味すると理解されるべきである。いくつかの実施形態では、リガンドは、そのアミノ酸配列にて好適な長さ及び好適な結合モチーフを有するペプチドまたはペプチド断片を意味すると理解されるべきなので、ペプチドまたはペプチド断片はＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩのタンパク質と複合体を形成することができる。
いくつかの実施形態では、「受容体／リガンド複合体」はまた、ペプチドまたはペプチド断片を提示するクラスＩまたはクラスＩＩのＭＨＣ分子が含む「受容体／ペプチド複合体」または「受容体／ペプチド断片複合体」を意味すると理解されるべきである。
「主要組織適合複合体（ＭＨＣ）のタンパク質または分子」、「ＭＨＣ分子」、「ＭＨＣタンパク質」または「ＨＬＡタンパク質」は、タンパク質抗原のタンパク質分解切断から生じ、潜在的なリンパ球エピトープ（例えば、Ｔ細胞エピトープ及びＢ細胞エピトープ）を表すペプチドを結合し、それらを細胞表面に輸送し、そこで特定の細胞、特に細胞傷害性Ｔリンパ球、Ｔヘルパー細胞、またはＢ細胞にそれらを提示することができるタンパク質を意味すると理解されるべきである。ゲノムにおける主要組織適合複合体は、細胞表面に発現されるその遺伝子産物が内在性抗原及び／または外来性抗原を結合し、提示するのに、したがって免疫学的プロセスを調節するのに重要である遺伝子領域を含む。主要組織適合複合体は、異なるタンパク質をコードする２つの遺伝子群、すなわちＭＨＣクラスＩの分子とＭＨＣクラスＩＩの分子に分類される。２つのＭＨＣクラスの細胞生物学及び発現パターンはこれらの異なる役割に適応している。
「ペプチド」及び「ペプチドエピトープ」という用語は、本明細書において「オリゴペプチド」と相互交換可能に使用され、通常、隣接するアミノ酸残基のα－アミノ基とカルボキシル基との間のペプチド結合によって互いに接続される一連の残基を示す。
「合成ペプチド」は、非天然源から得られる、例えば、人工であるペプチドを指す。そのようなペプチドは、化学合成または組換えＤＮＡ技術のような方法を使用して作り出すことができる。「合成ペプチド」には「融合タンパク質」が含まれる。
「ＰａｎＤＲ結合」ペプチド、「ＰａｎＤＲ結合エピトープ」は、１を超えるＨＬＡクラスＩＩＤＲ分子を結合する分子ファミリーのメンバーである。
「薬学的に許容される」とは一般に、非毒性、不活性、及び／または生理学的に適合する組成物または組成物の成分を指す。
「医薬賦形剤」または「賦形剤」は、例えば、アジュバント、担体、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、等張化剤、湿潤剤、保存剤等のような物質を含む。「医薬賦形剤」は薬学的に許容される賦形剤である。「モチーフ」という用語は、定義された長さ、例えば、長さが約１５未満アミノ酸残基、または長さが約１３未満アミノ酸残基のペプチド、例えば、クラスＩのＨＬＡモチーフについて約８～約１３（例えば、８、９、１０、１１、１２、または１３）のアミノ酸残基、及び特定のＨＬＡ分子によって認識される、クラスＩＩのＨＬＡモチーフについて約６～約２５（例えば、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５）のアミノ酸残基のアミノ酸配列における残基のパターンを指す。モチーフは通常、所与のヒトＨＬＡ対立遺伝子によってコードされるＨＬＡタンパク質ごとに異なる。これらのモチーフは一次及び二次のアンカー残基のパターンで異なる。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩモチーフは、長さが９、１０、または１１アミノ酸残基のペプチドを識別する。
「スーパーモチーフ」は、２以上のＨＬＡ対立遺伝子によってコードされるＨＬＡ分子によって共有されるペプチド結合特異性である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているスーパーモチーフ保有ペプチドは、２以上のＨＬＡ抗原によって（本明細書で定義されるように）高親和性または中程度の親和性で認識される。
本明細書で使用されるとき、「天然に存在する」という用語は、ある物体を自然界に見いだすことができるという事実を指す。例えば、生物（ウイルスを含む）に存在し、自然界の供給源に由来することができ、且つ研究室にてヒトによって意図的に修飾されていないペプチドまたは核酸は天然に存在する。
本発明によれば、「ワクチン」という用語は、投与時に免疫応答、例えば、病原体、またはウイルスに感染した細胞のような疾患細胞を認識して攻撃する細胞性免疫応答または液性免疫応答を誘導する医薬製剤（医薬組成物）または医薬製品に関する。ワクチンは疾患の予防または治療のために使用されてもよい。
「防御免疫応答」または「治療的免疫応答」とは、何らかの方法で、疾患の症状、副作用または進行を防止する、または少なくとも部分的に阻止する、病原性抗原（例えば、ウイルス抗原）に由来する抗原に対するＣＴＬ応答及び／またはＨＴＬ応答を指す。免疫応答はヘルパーＴ細胞の刺激によって促進されている抗体応答も含むことができる。
「抗原プロセシング」または「プロセシング」は、ポリペプチドまたは抗原の、当該ポリペプチドまたは抗原の断片であるプロセシング産物への分解（例えば、ポリペプチドのペプチドへの分解）と、細胞、例えば、抗原提示細胞による特定のＴ細胞への提示のための、これらの断片の１以上のＭＨＣ分子との会合（例えば、結合を介して）とを指す。
「抗原提示細胞」（ＡＰＣ）は、細胞表面でＭＨＣ分子と会合してタンパク質抗原のペプチド断片を提示する細胞である。一部のＡＰＣは抗原特異的Ｔ細胞を活性化してもよい。プロフェッショナル抗原提示細胞は、食作用または受容体が介在するエンドサイトーシスのいずれかによって抗原を内部移行させ、次いでクラスＩＩのＭＨＣ分子に結合した抗原の断片を膜上に表示するのに非常に効率的である。Ｔ細胞は抗原提示細胞の膜上で抗原・クラスＩＩ ＭＨＣ分子の複合体を認識し、相互作用する。次いで、追加の共刺激シグナルが抗原提示細胞によって生成され、Ｔ細胞の活性化につながる。共刺激分子の発現はプロフェッショナル抗原提示細胞の決定的な特徴である。
プロフェッショナル抗原提示細胞の主な種類は樹状細胞であり、最も幅広い抗原提示範囲を有し、おそらく最も重要な抗原提示細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、及び特定の活性化上皮細胞である。
樹状細胞（ＤＣ）は、末梢組織で捕捉された抗原をＭＨＣクラスＩＩ及びＩの抗原提示経路の双方を介してＴ細胞に提示する白血球集団である。樹状細胞が免疫応答の強力な誘導因子であり、これらの細胞の活性化が抗ウイルス免疫の誘導にとって重要なステップであることは周知である。
樹状細胞は従来、「未成熟」細胞と「成熟」細胞に分類され、よく特徴付けられた２つの表現型を簡単に区別するのに使用することができる。しかしながら、この命名法は分化のすべての可能な中間段階を除外すると解釈されるべきではない。
未成熟樹状細胞は、抗原の取り込みとプロセシングの能力が高い抗原提示細胞として特徴付けられ、それはＦｅｙ受容体及びマンノース受容体の高発現と相関する。成熟した表現型は通常、これらのマーカーの発現は低いが、クラスＩ及びクラスＩＩのＭＨＣ、接着分子（例えば、ＣＤ５４及びＣＤ１１）及び共刺激分子（例えば、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６及び４－１ＢＢ）のようなＴ細胞活性化に関与する細胞表面分子の発現は高いことを特徴とする。
「残基」という用語は、アミド結合またはアミド結合模倣体によってペプチドまたはタンパク質に組み込まれたアミノ酸残基またはアミノ酸模倣体残基、あるいはアミノ酸またはアミノ酸模倣体をコードする核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を指す。
ペプチドまたはタンパク質を記載するのに使用される命名法は、アミノ基が各アミノ酸残基の左側（アミノ末端またはＮ末端）に、カルボキシル基が右側（カルボキシ末端またはＣ末端）に提示される従来の慣行に従う。アミノ酸残基の位置がペプチドエピトープで言及される場合、それらはアミノからカルボキシル方向に番号付けされ、１位はエピトープ、またはそれが一部であり得るペプチドもしくはタンパク質のアミノ末端に位置する残基である。
本発明の選択された具体的な実施形態を表す式において、アミノ末端基及びカルボキシル末端基は、特に示されていないが、別段の指定がない限り、生理的ｐＨ値で想定される形態である。アミノ酸の構造式では、各残基は一般に、標準的な３文字または１文字の記号で表される。アミノ酸残基のＬ型は大文字の１文字または３文字記号の最初の文字の大文字で表され、アミノ酸残基のＤ型は小文字の１文字または小文字の３文字記号で表される。しかしながら、３文字記号またはフルネームが大文字なしで使用されている場合は、それらはＬアミノ酸残基を指すことができる。グリシンには不斉炭素原子がなく、単に「Ｇｌｙ」または「Ｇ」と呼ばれる。本明細書に示されているペプチドのアミノ酸配列は一般に、標準的な１文字記号を使用して指定される。（Ａ、アラニン；Ｃ、システイン；Ｄ、アスパラギン酸；Ｅ、グルタミン酸；Ｆ、フェニルアラニン；Ｇ、グリシン；Ｈ、ヒスチジン；Ｉ、イソロイシン；Ｋ、リジン；Ｌ、ロイシン；Ｍ、メチオニン；Ｎ、アスパラギン；Ｐ、プロリン；Ｑ、グルタミン；Ｒ、アルギニン；Ｓ、セリン；Ｔ、スレオニン；Ｖ、バリン；Ｗ、トリプトファン；及びＹ、チロシン）。
「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は本明細書にて相互交換可能に使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、ＤＮＡ及びＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチドもしくは塩基、及び／またはそれらの類似体、またはＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼによってポリマーに組み込むことができる任意の基質であることができる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド及び核酸は試験管内で転写されたｍＲＮＡであることができる。いくつかの実施形態では、投与されるポリヌクレオチドはｍＲＮＡである。
２以上の核酸またはポリペプチドの文脈における「同一の」または「同一性」パーセントという用語は、配列同一性の一部として保存的アミノ酸置換を考慮せずに、最大の一致のために比較し、及び整列（必要に応じてギャップを導入）させると同じである、または同じであるヌクレオチドまたはアミノ酸残基の特定の割合を有する２以上の配列または部分配列を指す。同一性パーセントは、配列比較のソフトウェアまたはアルゴリズムを使用して、または目視検査によって測定することができる。アミノ酸配列またはヌクレオチド配列の配列比較を得るのに使用することができる種々のアルゴリズム及びソフトウェアは、当該技術分野で周知である。これらには、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、Ｍｅｇａｌｉｇｎ、ＢｅｓｔＦｉｔ、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ、及びそれらの変種が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている２つの核酸またはポリペプチドは、実質的に同一であり、配列比較アルゴリズムを使用して、または目視検査によって測定されたときに最大の一致のために比較し、整列させた場合、それらは少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、いくつかの実施形態では、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の同一性を有することを意味する。いくつかの実施形態では、同一性は、長さが少なくとも約１０、少なくとも約２０、少なくとも約４０～６０の残基、少なくとも約６０～８０の残基、またはその間の任意の整数値２である配列の領域にわたって存在する。いくつかの実施形態では、同一性は、少なくとも約８０～１００残基のような６０～８０残基よりも長い領域にわたって存在し、いくつかの実施形態では、配列は、ヌクレオチド配列のコード領域のような比較される配列の完全長にわたって実質的に同一である。
「保存的アミノ酸置換」とは、１つアミノ酸残基が類似の側鎖を有するもう１つのアミノ酸残基に置換されているものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基ファミリーは、当該技術分野において定義されおり、それらには、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。例えば、チロシンに対するフェニルアラニンの置換は保存的置換である。ペプチド機能を排除しないヌクレオチド及びアミノ酸の保存的置換を同定する方法は当該技術分野で周知である。
本明細書で使用されるとき「ベクター」という用語は、宿主細胞にて目的の１以上の遺伝子（複数可）または配列（複数可）を送達することができ、通常発現することができる構築物を意味する。ベクターの例には、ウイルスベクター、裸のＤＮＡまたはＲＮＡの発現ベクター、プラスミド、コスミド、またはファージベクター、カチオン性縮合剤に関連するＤＮＡまたはＲＮＡの発現ベクター、及びリポソームにカプセル化されたＤＮＡまたはＲＮＡの発現ベクターが挙げられるが、これらに限定されない。
「単離されている」ポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物は、自然界では見いだされない形態であるポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物である。単離されたポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物には、もはやそれらが自然界で見いだされる形態ではない程度まで精製されたものが挙げられる。いくつかの実施形態では、実質的に純粋であるポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物。一実施形態では、「ポリヌクレオチド」は、ＰＣＲまたは定量的ＰＣＲの反応で増幅されたポリヌクレオチドを含むＰＣＲまたは定量的ＰＣＲの反応を包含する。
本明細書で使用されるとき「実質的に純粋」という用語は、少なくとも５０％純粋（すなわち、汚染物質を含まない）、少なくとも９０％純粋、少なくとも９５％純粋、少なくとも９８％純粋、または少なくとも９９％である物質を指す。
「対象」という用語は、特定の治療のレシピエントとなる、ヒト、ヒト以外の霊長類、イヌ、ネコ、げっ歯類等を含むが、これらに限定されない任意の動物（例えば、哺乳類）を指す。通常、「対象」及び「患者」という用語は、ヒト対象を参照して本明細書では相互交換可能に使用される。
「有効量」または「治療有効量」または「治療効果」という用語は、対象または哺乳類の疾患または障害を「治療する」のに有効な治療薬の量を指す。薬物の治療有効量は治療効果を有し、したがって疾患または障害の発症を防ぐことができ；疾患または障害の発症を遅らせることができ；疾患または障害の進行を遅らせることができ；疾患または障害に関連する症状の１以上をある程度緩和することができ；罹患率及び死亡率を減らすことができ；生活の質を改善することができ；またはそのような効果の組み合わせであることができる。
「治療すること」または「治療」または「治療する」または「緩和すること」または「緩和する」という用語は、１）診断された病的状態または障害の症状を治癒させる、減速する、軽減する、及び／またはその進行を止める治療措置、及び２）標的とされた病的状態または障害の発症を予防するまたは遅らせる予防的または防止的な措置の双方を指す。したがって、治療が必要なものには、障害を既に持つもの；障害を有する傾向があるもの；及び障害を予防する必要があるものが挙げられる。
本開示及び実施形態で使用されるとき、単数形態「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は文脈が明瞭に指示しない限り、複数形態を含む。
「治療薬」という用語は、ウイルス感染、例えば、コロナウイルス感染症のような疾患または状態を治療するまたは予防するのに使用される組成物を指す。例えば、治療薬はワクチンであってもよい。治療薬は、例えば、小分子薬のような薬物であってもよい。疾患または感染症を予防するために、または疾患に関連する１以上の症状を軽減するもしくは改善するために、治療薬がそれを必要とする対象に投与されてもよい。治療薬はまた、疾患の少なくとも症状を治療するために考慮されてもよい。
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等のような用語は、米国特許法でそれに起因する意味を有することができ；例えば、それらは「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」等を意味することができ；「から本質的に成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」及び「から本質的に成る（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」のような用語は、米国特許法でそれらに帰せられる意味を有し、例えば、それらは明示的に列挙されていない要素を許可するが、先行技術に見られる要素、または発明の基本的な、もしくは新規の特徴に影響を与える要素を排除することが理解される。本明細書の内容は約束事を意図したものではない。
本明細書にて「Ａ及び／またはＢ」のような語句で使用されるような「及び／または」という用語はＡ及びＢの双方；ＡまたはＢ；Ａ（単独）；及びＢ（単独）を含むように意図される。同様に、「Ａ、Ｂ、及び／またはＣ」のような語句で使用されるような「及び／または」という用語は、以下の実施形態のそれぞれ：Ａ、Ｂ、及びＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡとＣ；ＡとＢ；ＢとＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；及びＣ（単独）を包含するように意図される。
例えば、ウイルスに言及する場合の「２０１９ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２」という用語には、２０１９ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ウイルス及びその任意の突然変異型または変異型が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、配列決定法を使用してウイルス特異的エピトープを特定してもよい。本発明に従って任意の好適な配列決定方法、例えば、次世代配列決定（ＮＧＳ）技術を使用することができる。第３世代配列決定法は、将来的にＮＧＳ技術に取って代わり、方法の配列決定ステップを高速化してもよい。明確化目的のために：本発明の文脈における「次世代配列決定」または「ＮＧＳ」という用語は、サンガー化学として知られる「従来の」配列決定方法とは対照的に、ゲノム全体を小さな断片に分割することによってゲノム全体に沿って並行して核酸テンプレートを無作為に読み取る、すべての新規ハイスループット配列決定技術を意味する。そのようなＮＧＳ技術（超並列配列決定技術としても知られる）は、全ゲノム、エクソーム、トランスクリプトーム（ゲノムのすべての転写配列）またはメチローム（ゲノムのすべてのメチル化配列）の核酸配列情報を非常に短時間で、例えば１～２週以内、例えば１～７日以内または２４時間未満以内に送達し、原則として、単一細胞配列決定アプローチを可能にすることができる。市販されている、または文献に記載されている複数のＮＧＳプラットフォーム、例えば、ＷＯ２０１２／１５９６４３に詳細に記載されているものを本発明の文脈で使用することができる。
特定の実施形態では、本明細書に記載されているウイルスエピトープペプチド分子は、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１１０、約１２０またはそれ以上のアミノ酸残基、及びそこから導出可能な任意の範囲を含むことができるが、これらに限定されない。具体的な実施形態では、ウイルスエピトープペプチド分子は１００以下のアミノ酸である。
いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩについて本明細書に記載されているウイルスエピトープペプチドは、長さが１３以下の残基であり、通常、約８～約１１残基、特に９または１０残基から成る。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩについて本明細書に記載されているウイルスエピトープペプチドは長さが９～２４残基である。
さらに長いウイルスタンパク質のエピトープペプチドはいくつかの方法で設計することができる。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ結合ペプチドが予測されるまたは既知である場合、さらに長いウイルスタンパク質のエピトープペプチドは、（１）対応する各ペプチドのＮ末端及びＣ末端に向かって２～５アミノ酸の伸長がある個々の結合ペプチド；または（２）結合ペプチドの一部または全部とそれぞれの拡張配列との連結から成ってもよい。いくつかの実施形態では、さらに長いペプチドの使用は、患者細胞による内在性プロセシングを可能にすると推定され、さらに効果的な抗原提示及びＴ細胞応答の誘導につながることができる。いくつかの実施形態では、２以上のペプチドを使用することができ、ペプチドは重複し、長いウイルスエピトープペプチド上に並べられる。
いくつかの実施形態では、ウイルスエピトープペプチド及びポリペプチドは、ＨＬＡタンパク質（例えば、ＨＬＡクラスＩまたはＨＬＡクラスＩＩ）を結合する。具体的な実施形態では、ウイルスエピトープペプチドまたはポリペプチドは、少なくとも５０００ｎＭ未満、少なくとも５００ｎＭ未満、少なくとも１００ｎＭ未満、少なくとも５０ｎＭ未満、またはそれ以下のＩＣ５０を有する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているウイルスタンパク質のエピトープペプチドは、溶液であることができ、凍結乾燥することができ、または結晶形態であることができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているウイルスタンパク質のエピトープペプチドは、組換えＤＮＡ技術もしくは化学合成によって合成で調製することができ、または天然ウイルスのような天然源に由来することができる。エピトープは、個別に合成することができ、または直接もしくは間接的にペプチドにて連結することができる。本明細書に記載されているウイルスエピトープペプチドは、他の天然に存在する宿主細胞タンパク質及びその断片を実質的に含まないが、いくつかの実施形態では、ペプチドを合成で結合して、天然の断片または粒子に結合させることができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているウイルスタンパク質のエピトープペプチドは多種多様な方法で調製することができる。いくつかの実施形態では、ペプチドは従来の技術に従って、溶液中または固体支持体上で合成することができる。さまざまな自動合成装置が市販されており、既知のプロトコールに従って使用することができる。（例えば、Ｓｔｅｗａｒｔ ＆ Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２Ｄ．ＥＤ．，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，１９８４を参照のこと）。さらに、個々のペプチドは、化学ライゲーションを使用して連結して、依然として本発明の範囲内にあるさらに大きなペプチドを作り出すことができる。
あるいは、ペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現ベクターに挿入し、適切な宿主細胞にて形質転換または形質移入し、発現に好適な条件下で培養する組換えＤＮＡ技術を採用することができる。これらの手順は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ，Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）に一般的に記載されているように、当該技術分野で一般に知られている。したがって、本明細書に記載されている１以上のエピトープを含む、またはそれから成る組換えペプチドを使用して、適切なＴ細胞エピトープを提示することができる。
一態様では、本明細書に記載されている本発明はまた、１つ、少なくとも２つ、または２を超えるウイルスエピトープペプチドを含む組成物も提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている組成物は少なくとも２つの別個のペプチドを含有する。いくつかの実施形態では、少なくとも２つの別個のペプチドは同じポリペプチドに由来する。異なるポリペプチドとは、ペプチドが長さ、アミノ酸配列、またはその双方で異なることを意味する。ペプチドは、ウイルス特異的エピトープを含有することが知られている、または含有することがわかっている任意のポリペプチドに由来する。
ウイルスエピトープのポリヌクレオチド
本明細書に記載されている各ペプチドをコードするポリヌクレオチドも本発明の一部である。当業者によって理解されるように、遺伝子コードの冗長性のために種々の核酸が同じペプチドをコードすることになる。これらの核酸のそれぞれは本発明の範囲内に入る。本発明のこの実施形態は、ＤＮＡ及びＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡを含み、特定の実施形態では、ＤＮＡとＲＮＡの組み合わせを含む。一実施形態では、ｍＲＮＡは自己増幅ｍＲＮＡである。（Ｂｒｉｔｏ，ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｇｅｎｅｔ．２０１５；８９：１７９－２３３）。本明細書に記載されているペプチドをコードする任意のポリヌクレオチドは本発明の範囲内に入ることを理解すべきである。
「ＲＮＡ」という用語は「ｍＲＮＡ」を含み、いくつかの実施形態では「ｍＲＮＡ」に関連する。「ｍＲＮＡ」という用語は「メッセンジャーＲＮＡ」を意味し、ＤＮＡ鋳型を使用することによって生成され、ペプチドまたはポリペプチドをコードする「転写物」に関する。通常、ｍＲＮＡは５’－ＵＴＲ、タンパク質コード領域、及び３’－ＵＴＲを含む。ｍＲＮＡは細胞内及び試験管内では限定された半減期しか持たない。一実施形態では、ｍＲＮＡは自己増幅ｍＲＮＡである。本発明の文脈にて、ｍＲＮＡはＤＮＡ鋳型から試験管内転写によって生成されてもよい。試験管内転写の方法論は当業者に知られている。例えば、市販の種々の試験管内転写キットがある。
ＲＮＡの安定性及び翻訳効率は必要に応じて変更されてもよい。例えば、ＲＮＡは安定化されてもよく、その翻訳はＲＮＡの安定化効果を有する及び／またはＲＮＡの翻訳効率を高める１以上の修飾によって向上してもよい。そのような修飾は、例えば、参照によって本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＥＰ２００６／００９４４８に記載されている。本発明に従って使用されるＲＮＡの発現を増やすために、ＧＣ含量を増やしてｍＲＮＡの安定性を高め、コドン最適化を実行して、細胞における翻訳を増強するように、発現されるペプチドまたはタンパク質の配列を変更することなく、コード領域内、すなわち、発現されるペプチドまたはタンパク質をコードする配列内でそれを修飾してもよい。
本発明で使用されるＲＮＡの文脈における「修飾」という用語は、当該ＲＮＡには天然に存在しないＲＮＡの任意の修飾を含む。本発明の一実施形態では、本発明に従って使用されるＲＮＡはキャップされていない５’－三リン酸を有さない。そのようなキャップされていない５’－三リン酸の除去はＲＮＡをホスファターゼで処理することによって達成することができる。本発明に係るＲＮＡは、その安定性を高め、及び／または細胞傷害性を低下させるために修飾されたリボヌクレオチドを有してもよい。例えば、一実施形態では、本発明に従って使用されるＲＮＡにて、シチジンは５－メチルシチジンによって置換されてもよく；５－メチルシチジンはシチジンを部分的または完全に、例えば完全に置換する。代わりに、またはさらに、一実施形態では、本発明に従って使用されるＲＮＡにて、ウリジンはシュードウリジンまたは１－メチルシュードウリジンによって置換されてもよく；シュードウリジンまたは１－メチルシュードウリジンはウリジンを部分的または完全に、例えば完全に置換する。
一実施形態では、「修飾」という用語はＲＮＡに５’キャップまたは５’キャップ類似体を提供することに関する。「５’－キャップ」という用語は、ｍＲＮＡ分子の５’末端に見られるキャップ構造を指し、一般に、独特な５’－５’三リン酸結合を介してｍＲＮＡに結合したグアノシンヌクレオチドから成る。一実施形態では、このグアノシンは７位でメチル化される。「従来の５’－キャップ」という用語は、天然に存在するＲＮＡ５’－キャップを指し、７－メチルグアノシンキャップ（ｍＧ）を指す。本発明の文脈では、「５’キャップ」という用語は、ＲＮＡキャップ構造に類似し、生体内及び／または細胞にてそれに連結されればＲＮＡを安定化する能力を持つように、及び／またはＲＮＡの翻訳を増強するように修飾される５’キャップ類似体を含む。
特定の実施形態では、ウイルスエピトープをコードするｍＲＮＡはそれを必要とする対象に投与される。一実施形態では、本発明は、修飾ヌクレオシドを含むＲＮＡ、オリゴリボヌクレオチド、及びポリリボヌクレオチドの分子、それらを含む遺伝子治療ベクター、遺伝子治療法、ならびにそれらを含む遺伝子転写サイレンシング法を提供する。一実施形態では、投与されるｍＲＮＡは少なくとも１つの修飾ヌクレオシドを含む。
本明細書に記載されているペプチドをコードするポリヌクレオチドは、化学技術、例えば、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：３１８５（１９８１）のホスホトリエステル法によって合成することができる。類似体を含む、またはそれから成るペプチドをコードするポリヌクレオチドは、天然のエピトープをコードする核酸塩基を適切且つ所望の核酸塩基（複数可）に置換することによって簡単に作成することができる。
本明細書に記載されているウイルスエピトープペプチドを作り出し、且つ投与するのに好適な多数のベクター及び宿主系が当業者に知られており、市販されている。以下のベクターは例として提供されている。細菌：ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ－９（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＢＳ、ｐＤ１０、ファージスクリプト、ｐｓｉＸ１７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ、ｐｂｓｋｓ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３－３、ｐＫＫ２３３－３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）；ｐＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。真核生物：ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）；ｐ７５．６（Ｖａｌｅｎｔｉｓ）；ｐＣＥＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；ｐＣＥＩ（Ｅｐｉｍｍｕｎｅ）。しかしながら、宿主内で複製可能で生存可能である限り、他の任意のプラスミドまたはベクターも使用することができる。
適切な宿主の代表的な例としては、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ属及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の範囲内での種々の種のような細菌細胞；酵母のような真菌細胞；Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ及びＳｆ９のような昆虫細胞；Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｃｅｌｌ，２３：１７５（１９８１）によって記載されたサル腎臓線維芽細胞のＣＯＳ－７株、及び適合性ベクターを発現することができる他の細胞株、例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ及びＢＨＫの細胞株またはＢｏｗｅｓ黒色腫のような動物細胞；植物細胞等を言及することができる。適切な宿主の選択は本明細書の教示から当業者の目的の範囲内にあると見なされる。
したがって、本開示はまた、本明細書に記載されているウイルスエピトープペプチドの産生及び投与に有用なベクター及び発現ベクター、ならびにそのようなベクターを含む宿主細胞も対象とする。
宿主細胞は、例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターであることができるベクターで遺伝子操作（形質導入または形質転換または形質移入）される。ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、ファージ等の形態であり得る。操作された宿主細胞は、プロモーターを活性化し、形質転換体を選択し、またはポリヌクレオチドを増幅するために適宜改変された従来の栄養培地中で培養することができる。温度、ｐＨ等のような培養条件は、発現のために選択された宿主細胞でこれまでに使用されているものであり、当業者には明らかとなる。
本明細書に記載されているウイルスエピトープペプチドの発現については、コード配列は操作可能に連結された開始コドン及び停止コドン、プロモーター及びターミネーターの領域、ならびにいくつかの実施形態では複製システムを提供されて、所望の細胞宿主における発現のための発現ベクターを提供することになる。例えば、細菌宿主と適合するプロモーター配列は、所望のコード配列の挿入のために好都合な制限部位を含有するプラスミドにて提供される。得られた発現ベクターは好適な細菌宿主に形質転換される。
一般に、組換え発現ベクターは、宿主細胞の形質転換を可能にする複製開始点及び選択可能なマーカー、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのアンピシリン耐性遺伝子及びＳ．ｃｅｒｅｖｏｓｉａｅのＴＲＰ１遺伝子、ならびに下流の構造配列の転写を指示するための高度に発現された遺伝子に由来するプロモーターを含むことになる。そのようなプロモーターは、とりわけ、３－ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、酸ホスファターゼ、または熱ショックタンパク質のような解糖系酵素をコードするオペロンに由来することができる。異種構造配列は、適切な段階で、翻訳の開始配列及び終結配列、及びいくつかの実施形態では、翻訳されたタンパク質の細胞周辺腔または細胞外媒体への分泌を導くことができるリーダー配列によって組み立てられる。任意で、異種配列は、所望の特徴、例えば、発現された組換え産物の安定化または単純化された精製を付与するＮ末端識別ペプチドを含む融合タンパク質をコードすることができる。
好適なベクター及び制御配列を用いて、酵母、昆虫または哺乳類の細胞宿主も使用することができる。哺乳類の発現系の例には、Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｃｅｌｌ，２３：１７５（１９８１）によって記載されたサル腎臓線維芽細胞のＣＯＳ－７株、及び適合するベクターを発現できる他の細胞株、例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、及びＢＨＫの細胞株が挙げられる。哺乳類発現ベクターは、複製開始点、好適なプロモーター及びエンハンサー、さらに任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー及びアクセプター部位、転写終結配列、ならびに５’フランキング非転写配列を含むことになる。そのようなプロモーターはまた、例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ－ＩＥプロモーター）または単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ ＴＫプロモーター）のようなウイルス源に由来することができる。ＳＶ４０スプライスに由来する核酸配列及びポリアデニル化部位を使用して、転写されない遺伝要素を提供することができる。
本明細書に記載されているウイルスエピトープペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ユビキチン化シグナル配列、及び／または小胞体（ＥＲ）シグナル配列のような標的指向化配列も含んで、得られたペプチドの小胞体への移動を容易にすることができる。
本明細書に記載されているポリヌクレオチドは、ヒト細胞（例えば、樹状細胞を含む免疫細胞）にて投与され、及び発現させることができる。ヒトのコドン使用表を使用して各アミノ酸のコドンの選択を導くことができる。そのようなポリヌクレオチドは、エピトープ間に及び／または上記のもののような類似体間にスペーサーアミノ酸残基を含み、またはエピトープ及び／または類似体（及び／またはＣＴＬ、ＨＴＬ、及びＢ細胞エピトープ）に隣接する天然に存在する隣接配列を含むことができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているウイルスエピトープペプチドはまた、ウイルスベクターまたは細菌ベクターによって投与され／発現され得る。発現ベクターの例には、ワクシニアまたは鶏痘のような弱毒化ウイルス宿主が含まれる。このアプローチの例として、ワクシニアウイルスをベクターとして使用して、本明細書に記載されているウイルスエピトープペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現させる。免疫化プロトコールで有用なワクシニアベクター及び方法は、例えば、米国特許第４，７２２，８４８号に記載されている。別のベクターはＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ Ｇｕｅｒｉｎ）である。ＢＣＧベクターはＳｔｏｖｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５１：４５６－４６０（１９９１）によって説明されている。本明細書に記載されているウイルスエピトープポリペプチドの治療上の投与または免疫化に有用な多種多様な他のベクター、例えば、アデノウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉベクター、解毒炭疽毒素ベクター、センダイウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、カナリア痘ベクター、及び鶏痘ベクター等は、本明細書の記載から当業者には明らかとなる。いくつかの実施形態では、ベクターは改変Ｖａｃｃｉｎｉａ Ａｎｋａｒａ（ＶＡ）（例えば、Ｂａｖａｒｉａｎ Ｎｏｒｄｉｃ（ＭＶＡ－ＢＮ））である。
当業者に周知の標準的な調節配列をベクターに含めて、ヒト標的細胞における発現を確実にすることができる。いくつかのベクター要素：ポリヌクレオチドのための下流のクローニング部位を持つプロモーター、例えば、ミニ遺伝子の挿入；効率的な転写終結のためのポリアデニル化シグナル；Ｅ．ｃｏｌｉの複製開始点；及びＥ．ｃｏｌｉの選択マーカー（例えば、アンピシリン耐性またはカナマイシン耐性）が望ましい。この目的のために多数のプロモーター、例えばヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）プロモーターを使用することができる。例えば、他の好適なプロモーター配列については、米国特許第５，５８０，８５９号及び同第５，５８９，４６６号を参照のこと。いくつかの実施形態では、プロモーターはＣＭＶ－ＩＥプロモーターである。
本明細書に記載されているポリヌクレオチドは、転写領域に１以上の合成イントロンまたは天然に存在するイントロンを含むことができる。ポリヌクレオチド発現を増加させるために、ｍＲＮＡ安定化配列及び哺乳類細胞における複製のための配列を含めることも考慮することができる。
加えて、本明細書に記載されているポリヌクレオチドは免疫刺激配列（ＩＳＳまたはＣｐＧ）を含むことができる。これらの配列は、免疫原性を高めるために、ポリヌクレオチドのコード配列の外側でベクターに含めることができる。
ウイルスエピトープ
コロナウイルスは、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ科及びＮｉｄｏｖｉｒａｌｅｓ目に属するエンベロープ付きプラス鎖ＲＮＡウイルスである。コロナウイルスは世界中の人々に頻繁に感染している。多数のコロナウイルスがあり、そのほとんどはブタ、ラクダ、コウモリ、ネコを含む家屋周囲の動物の間を循環している。これまでにヒトで同定された７つのコロナウイルスのうち、コロナウイルス２２９Ｅ、ＮＬ６３は第１群抗原性ウイルスに分類され、ＯＣ４３及びＨＫＵ１は第２群抗原性ウイルスに分類された。それらは通常、ヒトの上気道に感染し、急性呼吸器症候群を引き起こし、致命的になる場合がある。コロナウイルスは元来人獣共通感染症であり得る。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、及び２０１９ ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２は、ヒトへの感染力及び感染能を有し、１００年以内の短期間で世界中に大きな公衆衛生上の懸念をもたらした。コロナウイルス間の遺伝的多様性の拡大と、その結果としての人類で病気を引き起こす能力は主として、中間宿主として機能する家屋周辺動物に感染し、組換え事象及び突然変異事象を助長することを介して達成される。ビリオンを宿主細胞膜に付着させるスパイク糖タンパク質（Ｓ糖タンパク質）は宿主の範囲制限において支配的な役割を担うと仮定される。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ及び２０１９ ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２は受容体としてアンギオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）を利用して２型肺細胞及び繊毛気管支上皮細胞に感染する一方で、ＭＥＲＳ－ＣｏＶは膜貫通糖タンパク質であるジペプチジルペプチダーゼ４（ＤＰＰ４）を利用して２型肺細胞及び無毛気管支上皮細胞に感染する。
コロナウイルスは先ず、呼吸器の上皮細胞及び腸細胞で複製する。ヒト気道上皮細胞は、２０１９ ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ウイルスの高い増殖速度を促進する。コロナウイルスに感染したヒトは、インフルエンザのような症状を呈することができ、肺炎を発症する場合がある。この疾患に関連する症状には、咳、発熱、呼吸困難、筋肉痛、疲労が挙げられる。一部のヒト患者はこの疾患の軽度の臨床症状を呈する。しかしながら、ヒト集団における疾患の発現は無症候性から致命的なものまで広範囲にわたる場合がある。場合によっては、ヒトコロナウイルスは２～４日の潜伏期間を有し；２０１９ ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２は３～６日、ＳＡＲＳ－ＣｏＶは４～６日と推定される。ＳＡＲＳコロナウイルスは２００３年に特定され、動物の保有宿主に由来した可能性があり、２００２年に中国南部の広東省で最初にヒトに感染した。患者は呼吸困難と下痢を呈した。ＭＥＲＳ－ＣｏＶは２０１２年にサウジアラビアで確認された。ヒトコブラクダがＭＥＲＳ－ＣｏＶの主要な宿主であった可能性がある。ＭＥＲＳの典型的な症状には、発熱、咳、息切れ、肺炎、下痢を含む胃腸症状が挙げられる。２０１９ ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２はＳＡＲＳ ＣｏＶ－２または単にＣｏＶ－２とも呼ばれる。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶのヒトからヒトへの感染は、２００３年の世界的な流行中に、カナダのトロント、中国の香港特別行政区、台北、シンガポール、及びベトナムのハノイで症例の早期移入があった後に発生し；その後、少なくとも４回の再発が報告されている。ＭＥＲＳは、２０１２年の大流行の間に少なくともアルジェリア、オーストリア、バーレーン、中国、エジプト、フランス、ドイツ、ギリシャ、イラン・イスラム共和国、イタリア、ヨルダン、クウェート、レバノン、マレーシア、オランダ、オマーン、フィリピン、カタール、韓国、サウジアラビア王国、タイ、チュニジア、トルコ、アラブ首長国連邦、英国、米国、イエメンを含む国々に広がったと報告されている。２０１９ ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２は、中国の武漢で最初に確認され、２０１９年１２月から２０２０年初頭にかけて世界中に広がった。
２０１９年３月２０日時点で、これらのウイルスに対して承認されたワクチンはなかった。ウイルスに対する新規の治療法が必要である。本開示は、対象自身の免疫細胞を使用してウイルスに対する免疫応答を活性化する免疫療法を開発するための方法及び組成物を含む。
一態様では、この方法は以下の１以上を含む：
・潜在的なウイルスエピトープに関する情報を取得するためのウイルスゲノム配列を分析すること。
・対象のＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩの発現プロファイルを分析すること。
・コンピュータープロセッサーで実施されるＭＨＣ・ペプチド提示予測アルゴリズムにてウイルス配列を分析すること（その際、コンピュータープロセッサーで実施されるＭＨＣ・ペプチド提示予測アルゴリズムは、特定のＭＨＣ分子に結合すると予測されるペプチドの選択の出力を提供するためにペプチド及びペプチドＭＨＣ相互作用に関連する多数の特徴を組み込む機械学習トレーニングモジュールによって訓練されている。いくつかの実施形態では、ＭＨＣ・ペプチド提示予測因子はｎｅｏｎｍｈｃ２である。いくつかの実施形態では、比較のために、ＭＨＣ・ペプチド提示予測因子ＮｅｔＭＨＣｐａｎまたはＮｅｔＭＨＣｐａｎ ＩＩを使用するさらなる分析が行われる。いくつかの実施形態では、ＭＨＣ・ペプチド提示予測因子はＮｅｔＭＨＣｐａｎである。いくつかの実施形態では、ＭＨＣ・ペプチド提示予測因子はＮｅｔＭＨＣｐａｎＩＩである）。
・どのウイルスエピトープが対象に存在するＭＨＣに結合することができるかを特定すること。
・結合親和性に従って対象のＭＨＣ分子に結合するウイルスペプチドを機械学習することによって支援される順位付け（その際、順位が高いほど、高い結合親和性及び提示効率を推論する）。
・対象の１以上のＭＨＣ分子に対して高い結合親和性を有する順位付けされたペプチドから、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つ以上のウイルスペプチドを選択し、組成物を調製すること（一緒に選択されるウイルスペプチドは、１以上のクラスＩのＭＨＣ、またはクラスＩＩのＭＨＣ、またはクラスＩとクラスＩＩのＭＨＣの混合物に結合してもよく、ＭＨＣのそれぞれは対象によって発現される）。
本明細書で提供されているのは、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２Ａｉ、表２Ａｉｉ、表２Ｂ、表９、表１０、表１１、表１２、表１４Ａ、表１４Ｂ、表１５または表１６からのエピトープ配列を含む抗原ペプチドである。本明細書で提供されているのはまた、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２Ａｉ、表２Ａｉｉ、表２Ｂ、表９、表１０、表１１、表１２、表１４Ａ、表１４Ｂ、表１５または表１６からのエピトープ配列を含む抗原ペプチドをコードするポリヌクレオチドである。抗原ペプチド及び／またはポリヌクレオチドは組換えであってもよい。抗原ペプチド及び／またはポリヌクレオチドは単離されてもよく、または精製されてもよい。抗原ペプチドは、合成であってもよく、またはポリヌクレオチドから発現されてもよい。
本明細書で提供されているのはまた、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２Ａｉ、表２Ａｉｉ、表２Ｂ、表９、表１０、表１１、表１２、表１４Ａ、表１４Ｂ、表１５または表１６からのエピトープ配列を含む抗原ペプチドに結合する抗体または抗体を含むＢ細胞である。
本明細書で提供されているのはまた、表１Ａまたは表１Ｂに係る対応するＭＨＣクラスＩ分子と複合体を形成して表１Ａまたは表１Ｂ由来のエピトープ配列を結合するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）またはＴＣＲを含むＴ細胞である。例えば、ＴＣＲは、表１Ａの同じ行の列３（セット１）由来の対応するＭＨＣクラスＩ分子と複合体を形成して、表１Ａの列２（セット１）由来のエピトープ配列に結合することができる。例えば、ＴＣＲは、表１Ａの同じ行の列５（セット２）からの対応するＭＨＣクラスＩ分子と複合体を形成して、表１Ａの列４（セット２）由来のエピトープ配列に結合することができる。例えば、ＴＣＲは、表１Ａの同じ行の列７（セット３）からの対応するＭＨＣクラスＩ分子と複合体を形成して、表１Ａの列６（セット３）由来のエピトープ配列に結合することができる。例えば、ＴＣＲは、表１Ｂの同じ行の列３（セット１）からの対応するＭＨＣクラスＩ分子と複合体を形成して、表１Ｂの列２（セット１）由来のエピトープ配列に結合することができる。例えば、ＴＣＲは、表１Ｂの同じ行の列５（セット２）からの対応するＭＨＣクラスＩ分子と複合体を形成して、表１Ｂの列４（セット２）由来のエピトープ配列に結合することができる。
本明細書で提供されているのはまた、表２Ａｉに係る対応するＭＨＣクラスＩＩ分子と複合体を形成して表２Ａｉ由来のエピトープ配列に結合するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）またはＴＣＲを含むＴ細胞である。例えば、ＴＣＲは、表２Ａｉの同じ行の列３（セット１）からの対応するＭＨＣクラスＩＩ分子と複合体を形成して、表２Ａｉの列２（セット１）由来のエピトープ配列に結合することができる。例えば、ＴＣＲは、表２Ａｉの同じ行の列５（セット２）からの対応するＭＨＣクラスＩＩ分子と複合体を形成して、表２Ａｉの列４（セット２）由来のエピトープ配列に結合することができる。本明細書で提供されているのはまた、表２Ａｉｉに係る対応するＭＨＣクラスＩＩ分子と複合体を形成して表２Ａｉｉ由来のエピトープ配列に結合するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）またはＴＣＲを含むＴ細胞である。例えば、ＴＣＲは、表２Ａｉｉの同じ行の列３（セット１）からの対応するＭＨＣクラスＩＩ分子と複合体を形成して、表２Ａｉｉの列２（セット１）由来のエピトープ配列に結合することができる。
本明細書で提供されているのは、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２Ａｉ、表２Ａｉｉ、表２Ｂ、表９、表１０、表１１、表１２、表１４Ａ、表１４Ｂ、表１５または表１６からのエピトープ配列を含む抗原ペプチドを対象に投与することを含む、ウイルス感染症の治療または予防をそれを必要とする対象にて行う方法である。本明細書で提供されているのはまた、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２Ａｉ、表２Ａｉｉ、表２Ｂ、表９、表１０、表１１、表１２、表１４Ａ、表１４Ｂ、表１５または表１６からのエピトープ配列を含む抗原ペプチドをコードするポリヌクレオチドを対象に投与することを含む、ウイルス感染症の治療または予防をそれを必要とする対象にて行う方法である。
本明細書で提供されているのはまた、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２Ａｉ、表２Ａｉｉ、表２Ｂ、表９、表１０、表１１、表１２、表１４Ａ、表１４Ｂ、表１５または表１６からのエピトープ配列を含む抗原ペプチドに結合する抗体または抗体を含むＢ細胞を対象に投与することを含む、ウイルス感染症の治療または予防をそれを必要とする対象にて行う方法である。
本明細書で提供されているのはまた、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２Ａｉ、表２Ａｉｉ、表２Ｂ、表９、表１０、表１１、表１２、表１４Ａ、表１４Ｂ、表１５または表１６に係る対応するＭＨＣクラスＩ分子と複合体を形成して表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２Ａｉ、表２Ａｉｉ、表２Ｂ、表９、表１０、表１１、表１２、表１４Ａ、表１４Ｂ、表１５または表１６由来のエピトープ配列を結合するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）またはＴＣＲを含むＴ細胞を対象に投与することを含む、ウイルス感染症の治療または予防をそれを必要とする対象にて行う方法である。
例えば、方法は、表１Ａの同じ行の列３（セット１）からの対応するＭＨＣクラスＩ分子と複合体を形成して、表１Ａの列２（セット１）由来のエピトープ配列に結合することができるＴＣＲまたはＴＣＲを含むＴ細胞を対象に投与することを含むことができる。例えば、方法は、表１Ａの同じ行の列３（セット１）からの対応するＭＨＣクラスＩ分子と複合体を形成して、表１Ａの列２（セット１）由来のエピトープ配列に結合することができるＴＣＲまたはＴＣＲを含むＴ細胞を、列３（セット１）からの対応するＭＨＣクラスＩ分子を発現している対象に投与することを含むことができる。例えば、方法は、表１Ａの同じ行の列５（セット２）からの対応するＭＨＣクラスＩ分子と複合体を形成して、表１Ａの列４（セット２）由来のエピトープ配列に結合することができるＴＣＲまたはＴＣＲを含むＴ細胞を対象に投与することを含むことができる。例えば、方法は、表１Ａの同じ行の列５（セット２）からの対応するＭＨＣクラスＩ分子と複合体を形成して、表１Ａの列４（セット２）由来のエピトープ配列に結合することができるＴＣＲまたはＴＣＲを含むＴ細胞を、列５（セット２）からの対応するＭＨＣクラスＩ分子を発現している対象に投与することを含むことができる。例えば、方法は、表１Ａの同じ行の列７（セット３）からの対応するＭＨＣクラスＩ分子と複合体を形成して、表１Ａの列６（セット３）由来のエピトープ配列に結合することができるＴＣＲまたはＴＣＲを含むＴ細胞を対象に投与することを含むことができる。例えば、方法は、表１Ａの同じ行の列７（セット３）からの対応するＭＨＣクラスＩ分子と複合体を形成して、表１Ａの列６（セット３）由来のエピトープ配列に結合することができるＴＣＲまたはＴＣＲを含むＴ細胞を、列７（セット３）からの対応するＭＨＣクラスＩ分子を発現している対象に投与することを含むことができる。
例えば、方法は、表１Ｂの同じ行の列３（セット１）からの対応するＭＨＣクラスＩ分子と複合体を形成して、表１Ｂの列２（セット１）由来のエピトープ配列に結合することができるＴＣＲまたはＴＣＲを含むＴ細胞を対象に投与することを含むことができる。例えば、方法は、表１Ｂの同じ行の列３（セット１）からの対応するＭＨＣクラスＩ分子と複合体を形成して、表１Ｂの列２（セット１）由来のエピトープ配列に結合することができるＴＣＲまたはＴＣＲを含むＴ細胞を、列３（セット１）からの対応するＭＨＣクラスＩ分子を発現している対象に投与することを含むことができる。例えば、方法は、表１Ｂの同じ行の列５（セット２）からの対応するＭＨＣクラスＩ分子と複合体を形成して、表１Ｂの列４（セット２）由来のエピトープ配列に結合することができるＴＣＲまたはＴＣＲを含むＴ細胞を対象に投与することを含むことができる。例えば、方法は、表１Ｂの同じ行の列５（セット２）からの対応するＭＨＣクラスＩ分子と複合体を形成して、表１Ｂの列４（セット２）由来のエピトープ配列に結合することができるＴＣＲまたはＴＣＲを含むＴ細胞を、列５（セット２）からの対応するＭＨＣクラスＩ分子を発現している対象に投与することを含むことができる。
例えば、方法は、表２Ａｉの同じ行の列３（セット１）からの対応するＭＨＣクラスＩＩ分子と複合体を形成して、表２Ａｉの列２（セット１）由来のエピトープ配列に結合することができるＴＣＲまたはＴＣＲを含むＴ細胞を対象に投与することを含むことができる。例えば、方法は、表１２Ａｉの同じ行の列３（セット１）からの対応するＭＨＣクラスＩＩ分子と複合体を形成して、表２Ａｉの列２（セット１）由来のエピトープ配列に結合することができるＴＣＲまたはＴＣＲを含むＴ細胞を、列３（セット１）からの対応するＭＨＣクラスＩＩ分子を発現している対象に投与することを含むことができる。例えば、方法は、表２Ａｉの同じ行の列５（セット２）からの対応するＭＨＣクラスＩＩ分子と複合体を形成して、表２Ａｉの列４（セット２）由来のエピトープ配列に結合することができるＴＣＲまたはＴＣＲを含むＴ細胞を対象に投与することを含むことができる。例えば、方法は、表２Ａｉの同じ行の列５（セット２）からの対応するＭＨＣクラスＩＩ分子と複合体を形成して、表２Ａｉの列４（セット２）由来のエピトープ配列に結合することができるＴＣＲまたはＴＣＲを含むＴ細胞を、列５（セット２）からの対応するＭＨＣクラスＩＩ分子を発現している対象に投与することを含むことができる。同様に、方法は、表２Ａｉｉの同じ行の右側の各列からの対応するＭＨＣクラスＩＩ分子と複合体を形成して、表２Ａｉｉの左側の列由来のエピトープ配列に結合することができるＴＣＲまたはＴＣＲを含むＴ細胞を対象に投与することを含むことができる。表２Ａｉまたは表２Ａｉｉの任意の１行のペプチドの右隣の列に対応する対立遺伝子によってコードされるタンパク質は、ペプチドに結合し、ＡＰＣによってＴ細胞に提示されるＭＨＣタンパク質である。各行のＨＬＡ対立遺伝子（複数可）のすぐ左の列に列挙されているペプチドはその行のＨＬＡと一致する。









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ウイルスゲノムは、単一のポリヌクレオチドストレッチにまたがる複数のリーディングフレームによってコードされる複数の遺伝子を含む。例えば、ヌクレオカプシドタンパク質は２０１９ ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ウイルスで豊富に発現するタンパク質である。短いタンパク質ＯＲＦ９ｂは、ヌクレオカプシド領域の配列にまたがる別のリーディングフレームによってコードされる。これらの高発現タンパク質はＴ細胞免疫の潜在的な標的の数を増やす。表１Ｃ及び表２Ｂは、Ｏｒｆ９ｂから予測されるＭＨＣ－Ｉ結合エピトープ及びＭＨＣ－ＩＩ結合エピトープをそれぞれ示す。
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選択されたペプチドは、合成で製造され、医薬組成物に調製されてもよく、ウイルスエピトープペプチド抗原が生体内でＴ細胞を刺激する免疫療法ワクチンとして対象に投与されてもよい。さらに、または代わりに、Ｔ細胞は対象由来であってもよく、選択されたウイルスエピトープペプチド抗原によって試験管内で刺激されてもよい。Ｔ細胞の十分な活性化の後、活性化されたＴ細胞が免疫療法として対象に投与される。さらに、または代わりに、抗原提示細胞（ＡＰＣ）は対象由来であってもよく、試験管内でウイルスエピトープ抗原を含むペプチドとＡＰＣを接触させる。ウイルスエピトープ抗原を含むペプチドは２０～１００以上のアミノ酸を含むさらに長いペプチドであってもよい。さらに長いペプチドは、コンカテマーとして提示される複数のエピトープペプチドを含んでもよい。さらに長いペプチドはＡＰＣに取り込まれ、抗原提示のために効率的に処理される。ウイルス抗原活性化及びウイルス抗原提示ＡＰＣは、ＡＰＣが生体内でＴリンパ球を活性化するために個別化免疫療法として対象に投与されてもよい。さらに、または代わりに、抗原提示細胞（ＡＰＣ）は対象由来であってもよく、試験管内でウイルスエピトープ抗原を含むペプチドとＡＰＣを接触させ；その後、活性化されたＡＰＣを対象由来のＴ細胞とインキュベートして試験管内でＴ細胞を活性化する。このように試験管内で活性化された対象のＴ細胞は個別化免疫療法として対象に投与されてもよい。
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されている本発明はまた、ウイルスエピトープ：ＨＬＡのペアが結合親和性と提示予測値（ＰＰＶ）に基づいて順位付けされる情報ライブラリとして生成されるウイルスエピトープペプチドとＨＬＡのペアの大きな選択を提供する。
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されている本発明はまた、コロナウイルス感染症を治療するための既製の免疫療法試薬または製品として棚上げして後で使用するために、上記のステップで説明したように分析され、及び選択されている、且つ合成で製造されているエピトープを含むウイルス抗原ペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、エピトープを含む製造されたペプチドは、好適な賦形剤を含む好適な溶液にて可溶化され、凍結されてもよい。いくつかの実施形態では、製造されたペプチドを凍結乾燥して保存してもよい。いくつかの実施形態では、エピトープを含む製造されたペプチドは乾燥粉末形態で保存されてもよい。入ってくる対象のＨＬＡレパートリーを決定する際、対象がコロナウイルスに対する治療用ワクチンを必要としている場合、対象のＨＬＡに結合することができる１以上のウイルス抗原ペプチドを棚にある製品から回収し、医薬組成物に混合し、それを必要とする対象に投与する。
いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムを分析して１以上のＢ細胞エピトープを同定してもよい。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムの分析によって同定されたエピトープは、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、仔ヒツジを含むが、これらに限定されない哺乳類宿主のような好適な宿主にて抗体を産生するために使用することができる。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムの分析によって同定されたエピトープは、組換え技術によって抗体を産生するために使用することができる。
特定の実施形態では、本発明は、ウイルスエピトープペプチド：ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）複合体に高い親和性で結合することができる結合タンパク質（例えば、抗体またはその抗原結合断片）、またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、タンパク質の細胞外ドメインに由来するウイルスエピトープペプチドに高い親和性で結合することができるＣＡＲを提供する。特定の実施形態では、本明細書に記載されているような抗原特異的結合タンパク質またはＴＣＲまたはＣＡＲは、結合タンパク質がその特異的結合機能を保持する、または実質的に保持するという条件で、１以上のアミノ酸の置換、挿入、または欠失を有する変異型ポリペプチド種を含む。
特定の実施形態では、ウイルスエピトープ特異的結合タンパク質、ＴＣＲまたはＣＡＲは、（ａ）ＣＤ８と無関係にまたはＣＤ８の非存在下での細胞表面上の抗原：ＨＬＡ複合体に特異的に結合することができる。特定の実施形態では、ウイルスエピトープ特異的結合タンパク質は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、キメラ抗原受容体、またはＴＣＲの抗原結合断片であり、そのいずれもキメラ、ヒト化、またはヒトであることができる。さらなる実施形態では、ＴＣＲの抗原結合断片は単鎖ＴＣＲ（ｓｃＴＣＲ）を含む。
特定の実施形態では、上記実施形態のいずれか１つに係るウイルスエピトープ特異的結合タンパク質または高親和性組換えＴＣＲと、薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤とを含む組成物が提供される。
例として、組換え生産された可溶性ＴＣＲを単離する、及び精製するのに有用な方法は、組換え可溶性ＴＣＲを培養培地に分泌する好適な宿主細胞／ベクター系から上清を得ることと、その後、例えば市販のフィルターまたは濃縮器を使用して培地を濃縮することとを含むことができる。濃縮または濾過の後、いくつかの実施形態では、濃縮物または濾液は、例えば、単一の好適な精製マトリックスまたはアフィニティーマトリックスもしくはイオン交換樹脂のような一連の好適なマトリックスに適用することによって精製することができる。代わりに、またはさらに、いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドをさらに精製するために１以上の逆相ＨＰＬＣ工程が採用されてもよい。そのような精製法は、免疫原をその自然環境から単離する場合にも採用することができる。本明細書に記載されている単離された／組換えの可溶性ＴＣＲの１以上の大規模生産のための方法には、適切な培養条件を維持するようにモニタリングされ、及び制御されるバッチ細胞培養が含まれる。可溶性ＴＣＲの精製は、本明細書に記載され、当該技術分野で知られている方法に従って行われてもよい。
一態様では、ウイルスタンパク質は表３に列挙されたタンパク質のような新規コロナウイルス、株２０１９ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２（ＮＣＢＩ参照配列ＮＣ＿０４５５１２．２で入手可能）由来のタンパク質であってもよい。
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免疫原性組成物及びワクチン組成物
一実施形態では、本明細書で提供されているのは、ウイルスエピトープ特異的応答（例えば、液性または細胞介在性の免疫応答）を引き起こすことができる免疫原性組成物、例えば、ワクチン組成物である。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、本明細書で同定されたウイルス特異的なウイルスエピトープに対応する、本明細書に記載されているウイルスエピトープ治療薬（例えば、ペプチド、ポリヌクレオチド、ＴＣＲ、ＣＡＲ、ＴＣＲまたはＣＡＲを含有する細胞、ポリペプチドを含有する樹状細胞、ポリヌクレオチドを含有する樹状細胞、抗体等）を含む。
当業者は、例えば、試験管内でのＴ細胞の生成、ならびにそれらの効率及び全体的な存在、特定のペプチドに対する特定のＴ細胞の増殖、親和性及び増多、ならびにＴ細胞の機能性を調べることによって、例えば、Ｔ細胞によるＩＦＮ－γ産生または細胞殺傷を分析することによってウイルスエピトープ治療薬を選択することができることになる。次に、最も効率的なペプチドを免疫原性組成物として組み合わせることができる。
本発明の一実施形態では、異なるウイルスエピトープペプチド及び／またはポリペプチドは、１つの免疫原性組成物が異なるＭＨＣクラスＩ分子のような異なるＭＨＣ分子と会合することができるウイルスエピトープペプチド及び／またはポリペプチドを含むように選択される。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、最も頻繁に発生するＭＨＣクラスＩ分子と会合することができるウイルスエピトープペプチド及び／またはポリペプチドを含む。したがって、本明細書に記載されている免疫原性組成物は、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つのＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子と会合することができるさまざまなペプチドを含む。
一実施形態では、本明細書に記載されている免疫原性組成物は、特異的な細胞傷害性Ｔ細胞応答、特異的なヘルパーＴ細胞応答、またはＢ細胞応答を引き起こすことができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている免疫原性組成物はアジュバント及び／または担体をさらに含むことができる。有用なアジュバント及び担体の例を本明細書で以下に示す。組成物におけるポリペプチド及び／またはポリヌクレオチドは、例えば、Ｔ細胞またはＢ細胞にペプチドを提示することができる樹状細胞（ＤＣ）のようなタンパク質または抗原提示細胞のような担体と会合することができる。さらなる実施形態では、ＤＣ結合ペプチドを担体として使用して、ウイルスエピトープペプチド及びウイルスエピトープペプチドをコードするポリヌクレオチドを樹状細胞に向かわせる（Ｓｉｏｕｄ，ｅｔ ａｌ．ＦＡＳＥＢ Ｊ，２７：３２７２－３２８３（２０１３））。
実施形態では、ウイルスエピトープポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、そのようなポリペプチドまたはポリヌクレオチドを含有する抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）として提供され得る。他の実施形態では、そのような抗原提示細胞は患者に使用するためにＴ細胞を刺激するのに使用される。
いくつかの実施形態では、抗原提示細胞は樹状細胞である。関連する実施形態では、樹状細胞は、非変異タンパク質エピトープのペプチドまたは核酸でパルスされている自己樹状細胞である。ウイルスエピトープペプチドは、適切なＴ細胞応答を引き起こす任意の好適なペプチドであることができる。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞はＣＴＬである。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞はＨＴＬである。
したがって、本発明の一実施形態は、本明細書に記載されている１以上のウイルスエピトープのポリペプチドまたはポリヌクレオチドでパルスされるまたは負荷される少なくとも１つの抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）を含有する免疫原性組成物である。実施形態では、そのようなＡＰＣは自己由来（例えば、自己樹状細胞）である。あるいは、患者からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）にウイルスエピトープのペプチドまたはポリヌクレオチドを生体外で負荷することができる。関連する実施形態では、そのようなＡＰＣまたはＰＢＭＣを患者に注射して戻す。
ポリヌクレオチドは、樹状細胞を形質導入することができるのでウイルスエピトープペプチドの提示及び免疫の誘導をもたらすことができる任意の好適なポリヌクレオチドであることができる。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、受動負荷によって細胞に取り込まれる裸のＤＮＡであることができる。別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、送達ビヒクル、例えば、リポソーム、ウイルス様粒子、プラスミド、または発現ベクターの一部である。別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ベクターを含まない送達システム、例えば、高性能エレクトロポレーション及び高速細胞変形によって送達される。実施形態では、そのような抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、樹状細胞）または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）はＴ細胞（例えば、自己Ｔ細胞）を刺激するのに使用される。関連する実施形態では、Ｔ細胞はＣＴＬである。他の関連する実施形態では、Ｔ細胞はＨＴＬである。次いで、そのようなＴ細胞が患者に注射される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬが患者に注射される。いくつかの実施形態では、ＨＴＬが患者に注射される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬ及びＨＴＬの双方が患者に注射される。いずれかの治療薬の投与は、同時にまたは連続的に、任意の順序で行うことができる。
治療的処置のための本明細書に記載されている医薬組成物（例えば、免疫原性組成物）は、非経口、局所、経鼻、経口または局所の投与を対象とする。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている医薬組成物は非経口で、例えば、静脈内に、皮下に、皮内に、または筋肉内に投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているのは、ウイルスエピトープペプチドの溶液を含む非経口投与のための組成物であり、免疫原性組成物は許容される担体、例えば水性担体に溶解される、または懸濁される。例えば、水、緩衝水、０．９％生理食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸等、種々の水性担体を使用することができる。これらの組成物は、従来の周知の滅菌技法によって滅菌することができ、または無菌濾過することができる。得られた水溶液は、そのままで使用するために包装され、または凍結乾燥されることができ、凍結乾燥製剤は投与の前に無菌溶液と混ぜ合わせる。組成物は、生理的条件に近づけるために必要とされるような薬学的に許容される補助物質、例えば、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、浸透圧調整剤、湿潤剤等、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミン等を含有することができる。
医薬製剤における本明細書に記載されているウイルスエピトープのペプチド及びポリヌクレオチドの濃度は、広く変化することができ、すなわち、約０．１重量％未満から、通常約２重量％または少なくとも約２重量％で多くても２０重量％～５０重量％以上までであり、選択される特定の投与様式に従って流体の体積、粘度等によって選択されることになる。
本明細書に記載されているウイルスエピトープのペプチド及びポリヌクレオチドは、ペプチドをリンパ組織のような特定の細胞組織に向かわせるリポソームを介して投与することもできる。リポソームは、ペプチドの半減期を延長するのにも有用である。リポソームには、エマルション、泡状物質、ミセル、不溶性単層、液晶、リン脂質分散液、ラメラ層等が含まれる。これらの調製物では、送達されるペプチドは、リポソームの一部として、単独で、または例えばリンパ系細胞の間で一般的な受容体に結合する分子、例えば、ＤＥＣ２０５抗原に結合するモノクローナル抗体と、または他の治療用組成物もしくは免疫原性組成物と併せて組み込まれる。したがって、本明細書に記載されている所望のペプチドまたはポリヌクレオチドで満たされたリポソームは、リンパ系細胞の部位に向けることができ、そこで次にリポソームは選択された治療用／免疫原性のポリペプチド／ポリヌクレオチド組成物を送達する。リポソームは、標準的な小胞形成脂質から形成することができ、それは一般に、中性及び負に荷電したリン脂質及びステロール、例えばコレステロールを含む。脂質の選択は一般に、例えば、リポソームのサイズ、酸不安定性、及び血流中のリポソームの安定性を考慮することによって導かれる。種々の方法は、例えば、Ｓｚｏｋａ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９；４６７（１９８０），米国特許第４，２３５，８７１号、同第４，５０１，７２８号、同第４，５０１，７２８号、同第４，８３７，０２８号、及び同第５，０１９，３６９号に記載されているようにリポソームを調製するのに利用可能である。
免疫細胞を標的とするために、ウイルスエピトープのポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、所望の免疫系細胞の細胞表面決定基のためにリポソームに組み込まれる。ペプチドを含有するリポソーム懸濁液は、とりわけ、投与方法、送達されるポリペプチドまたはポリヌクレオチド、及び治療される疾患の段階に従って変化する用量で、静脈内、局部、局所等に投与することができる。
いくつかの実施形態では、ウイルスエピトープのポリペプチド及びポリヌクレオチドは樹状細胞を標的とする。一実施形態では、ウイルスエピトープのポリペプチド及びポリヌクレオチドは、マーカーＤＥＣ２０５、ＸＣＲ１、ＣＤ１９７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１２３、ＣＤ２０９、ＣＤ２７３、ＣＤ２８３、ＣＤ２８９、ＣＤ１８４、ＣＤ８５ｈ、ＣＤ８５ｊ、ＣＤ８５ｋ、ＣＤ８５ｄ、ＣＤ８５ｇ、ＣＤ８５ａ、ＴＳＬＰ受容体、またはＣＤ１ａを使用して樹状細胞を標的とする。
固体組成物については、例えば、医薬品等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウム等を含む、従来のまたはナノ粒子の非毒性固体担体を使用することができる。経口投与については、薬学的に許容される非毒性組成物は、前述の担体のような通常使用される賦形剤のいずれかと、一般に１０～９５％の有効成分、すなわち、２５％～７５％の濃度での本明細書に記載されている１以上のウイルスエピトープのポリペプチドまたはポリヌクレオチドとを組み込むことによって形成される。
エアロゾル投与については、ウイルスエピトープのポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、界面活性剤及び噴射剤とともに微細に分割された形態で供給することができる。そのような薬剤の代表は、脂肪族多価アルコールまたはその環状無水物との、カプロン酸、オクタン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、オレステリック（ｏｌｅｓｔｅｒｉｃ）酸及びオレイン酸のような６～２２の炭素原子を含有する脂肪酸のエステルまたは部分エステルである。混合グリセリドまたは天然グリセリドのような混合エステルを採用することができる。界面活性剤は組成物の０．１～２０重量％または０．２５～５重量％を構成することができる。組成物の残りは噴射剤であることができる。例えば、鼻腔内送達のためのレシチンと同様に、所望に応じて担体を含めることもできる。
本明細書に記載されているウイルスエピトープポリヌクレオチドを送達するための追加の方法も、当該技術分野で知られている。例えば、核酸は「裸のＤＮＡ」として直接送達することができる。このアプローチは、例えば、Ｗｏｌｆｆ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７：１４６５－１４６８（１９９０）、ならびに米国特許第５，５８０，８５９号及び同第５，５８９，４６６号に記載されている。核酸はまた、例えば、米国特許第５，２０４，２５３号に記載されているように弾道送達を使用して投与することもできる。ＤＮＡのみで構成された粒子を投与することができる。あるいは、ＤＮＡは金粒子のような粒子に付着させることができる。
治療または免疫化の目的で、ウイルスエピトープペプチドをコードするｍＲＮＡ、またはペプチド結合剤も患者に投与することができる。いくつかの実施形態では、ウイルスエピトープペプチドをコードするｍＲＮＡ、またはペプチド結合剤は合成脂質ナノ粒子製剤の一部であってもよい。一実施形態では、ｍＲＮＡは自己増幅ＲＮＡである。さらなる実施形態では、自己増幅ＲＮＡのようなｍＲＮＡは合成脂質ナノ粒子製剤の一部である（Ｇｅａｌｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１０９：１４６０４－１４６０９（２０１２））。
核酸は、カチオン性脂質のようなカチオン性化合物と複合体を形成して送達することもできる。いくつかの実施形態では、核酸は、脂質ナノ粒子（例えば、カチオン性脂質、非カチオン性脂質（例えば、リン脂質及び／またはステロール）及び／またはＰＥＧ－脂質を含む）にカプセル化することができる。脂質が介在する遺伝子送達法は、例えば、ＷＯ９６／１８３７２、ＷＯ９３／２４６４０；Ｍａｎｎｉｎｏ ＆ Ｇｏｕｌｄ－Ｆｏｇｅｒｉｔｅ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６（７）：６８２－６９１（１９８８）；米国特許第５，２７９，８３３号；ＷＯ９１／０６３０９；及びＦｅｌｇｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：７４１３－７４１４（１９８７）に記載されている。
本明細書に記載されているウイルスエピトープのペプチド及びポリペプチドは、ワクシニアまたは鶏痘のような弱毒化ウイルスによっても発現され得る。このアプローチは、ワクシニアウイルスをベクターとして使用して、本明細書に記載されているペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現させることを含む。急性または慢性の感染宿主または非感染宿主に導入されると、組換えワクシニアウイルスは免疫原性ペプチドを発現し、それによって宿主ＣＴＬ応答を誘発する。免疫化プロトコールに有用なワクシニアベクター及び方法は、例えば、米国特許第４，７２２，８４８号に記載されている。別のベクターはＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ Ｇｕｅｒｉｎ）である。ＢＣＧベクターはＳｔｏｖｅｒ，ｅｔ ａｌ．，（Ｎａｔｕｒｅ，３５１：４５６－４６０（１９９１））によって説明されている。本明細書に記載されているペプチドの治療上の投与または免疫化に有用な多種多様な他のベクターは、本明細書の記載から当業者には明らかとなる。
アジュバントは、免疫原性組成物へのその混合が治療薬に対する免疫応答を増大させる、または別の方法で改変する任意の物質である。担体は、ウイルスエピトープのポリペプチドまたはポリヌクレオチドが会合することができる、例えば、ポリペプチドまたは多糖のような足場構造である。任意で、アジュバントは、本明細書に記載されているポリペプチドまたはポリヌクレオチドに共有結合または非共有結合で結合される。
抗原に対する免疫応答を高めるアジュバントの能力は通常、免疫が介在する反応の有意な増大、または疾患症状の軽減によって明らかになる。例えば、液性免疫の増大は、抗原に対して産生された抗体の力価の有意な上昇によって明らかになる場合があり、Ｔ細胞活性の増加は、細胞増殖、または細胞の細胞傷害性またはサイトカイン分泌の増加で明らかになる場合がある。アジュバントはまた、例えば、主に液性応答またはＴヘルパー２応答を主に細胞性応答またはＴヘルパー１応答に変化させることによって、免疫応答を変えることもできる。
好適なアジュバントは、当該技術分野で知られており（ＷＯ２０１５／０９５８１１を参照）、それらには、ポリ（Ｉ：Ｃ）、ポリ－Ｉ及びポリＣ、ＳＴＩＮＧアゴニスト、１０１８ＩＳＳ、アルミニウム塩、Ａｍｐｌｉｖａｘ、ＡＳ１５、ＢＣＧ、ＣＰ－８７０，８９３、ＣｐＧ７９０９、ＣｙａＡ、ｄＳＬＩＭ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＣ３０、ＩＣ３１、Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ、ＩｍｕＦａｃｔ ＩＭＰ３２１、ＩＳ Ｐａｔｃｈ、ＩＳＳ、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ、ＪｕｖＩｍｍｕｎｅ、ＬｉｐｏＶａｃ、ＭＦ５９、モノホスホリル脂質Ａ、モンタニドＩＭＳ１３１２、モンタニドＩＳＡ２０６、モンタニドＩＳＡ５０Ｖ、モンタニドＩＳＡ－５１、ＯＫ－４３２、ＯＭ－１７４、ＯＭ－１９７－ＭＰ－ＥＣ、ＯＮＴＡＫ、ＰｅｐＴｅｌ（登録商標）、ベクターシステム、ＰＬＧ微粒子、レシキモド、ＳＲＬ１７２、ビロソーム及びその他のウイルス様粒子、ＹＦ－１７Ｄ、ＶＥＧＦトラップ、Ｒ８４８、ベータグルカン、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、Ｐａｍ３ＣＳＫ４、サポニンに由来するＡｑｕｉｌａのＱＳ２１スティミュロン（Ａｑｕｉｌａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、ＭＡ、ＵＳＡ）、マイコバクテリア抽出物及び合成細菌細胞壁模倣体、ならびにＲｉｂｉのＤｅｔｏｘ．ＱｕｉｌまたはＳｕｐｅｒｆｏｓのような他の独自のアジュバントが挙げられるが、これらに限定されない。アジュバントには、不完全なフロイントのアジュバントまたはＧＭ－ＣＳＦも含まれる。樹状細胞に特異的ないくつかの免疫学的アジュバント（例えば、ＭＦ５９）及びそれらの調製は、以前に記載されている（Ｄｕｐｕｉｓ，Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８；１８６（１）：１８－２７；Ａｌｌｉｓｏｎ，Ａ．Ｃ．；Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ Ｓｔａｎｄ．１９９８；９２：３－１１）（Ｍｏｓｃａ，ｅｔ ａｌ．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，２００７；１２：４０５０－４０６０）（Ｇａｍｖｒｅｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ＆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００４；８２：５０６－５１６）。また、サイトカインも使用することができる。いくつかのサイトカインは、樹状細胞のリンパ組織への移動に影響を与えること（例えば、ＴＮＦ－アルファ）、樹状細胞のＴリンパ球に対する効率的な抗原提示細胞への成熟を加速すること（例えば、ＧＭ－ＣＳＦ、ＰＧＥ１、ＰＧＥ２、ＩＬ－１、ＩＬ－１ｂ、ＩＬ－４、ＩＬ－６、及びＣＤ４ＯＬ）（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第５，８４９，５８９号）及び免疫アジュバントとして作用すること（例えば、ＩＬ－１２）（Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ ＤＩ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．Ｅｍｐｈａｓｉｓ Ｔｕｍｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６（６）：４１４－４１８）に直接関連付けられている。
ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、ワクチン設定でアジュバントの効果を高めることも報告されている。理論によって束縛されるものではないが、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、主にＴＬＲ９を介して自然免疫（非適応）免疫系を活性化することによって作用する。ＣｐＧが誘発するＴＬＲ９の活性化は、ペプチド抗原またはタンパク質抗原、生ウイルスまたは死滅ウイルス、樹状細胞ワクチン、自己細胞ワクチン、及び予防ワクチンと治療ワクチンの双方における多糖コンジュゲートを含む、多種多様な抗原に対する抗原特異的な液性及び細胞性の応答を増強する。重要なことに、それは樹状細胞の成熟と分化を増進し、ＣＤ４Ｔ細胞の助けがなくても、ＴＨ１細胞の活性化と強力な細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の生成を増進する。ＴＬＲ９刺激によって誘導されるＴＨ１バイアスは、通常はＴＨ２バイアスを促進するミョウバンまたは不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）のようなワクチンアジュバントの存在下でも維持される。ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、他のアジュバントと製剤化されるまたは同時投与される場合、または抗原が比較的弱い場合に強力な応答を誘導するために特に必要である微粒子、ナノ粒子、脂質エマルションまたは同様の製剤のような製剤にて、一層さらに大きなアジュバント活性を示す。それらは免疫応答も促進し、一部の実験ではＣｐＧを含まない完全用量ワクチンに匹敵する抗体応答で抗原用量を減らすことが可能だった（Ａｒｔｈｕｒ Ｍ．Ｋｒｉｅｇ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，５，Ｊｕｎｅ，２００６，４７１４８４）。米国特許第６，４０６，７０５Ｂ１号は、抗原特異的免疫応答を誘導するためのＣｐＧオリゴヌクレオチド、非核酸アジュバント及び抗原の併用を記載している。市販のＣｐＧ ＴＬＲ９アンタゴニストは、Ｍｏｌｏｇｅｎ（Ｂｅｒｌｉｎ，ＧＥＲＭＡＮＹ）によるｄＳＬＩＭ（二重ステムループ免疫調節因子）であり、本明細書に記載されている医薬組成物の成分である。ＲＮＡ結合ＴＬＲ７、ＴＬＲ８及び／またはＴＬＲ９のような他のＴＬＲ結合分子も使用することができる。
有用なアジュバントの他の例には、治療上及び／またはアジュバントとして作用することができる化学的に修飾されたＣｐＧ（例えば、ＣｐＲ、Ｉｄｅｒａ）、ポリ（Ｉ：Ｃ）（例えば、ポリｉ：Ｃｌ２Ｕ），非ＣｐＧ細菌ＤＮＡまたはＲＮＡ、ＴＬＲ８のｓｓＲＮＡ４０、ならびにシクロホスファミド、スニチニブ、ベバシズマブ、セレブレックス、ＮＣＸ－４０１６、シルデナフィル、タダラフィル、バルデナフィル、ソラフィニブ、ＸＬ－９９９、ＣＰ－５４７６３２、パゾパニブ、ＺＤ２１７１、ＡＺＤ２１７１、イピリムマブ、トレメリムマブ、及びＳＣ５８１７５のような免疫活性がある小分子及び抗体が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の文脈にて有用なアジュバント及び添加剤の量及び濃度は、過度の実験を行うことなく、当業者によって容易に決定され得る。追加のアジュバントには、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ、サルグラモスチム）のようなコロニー刺激因子が挙げられる。
いくつかの実施形態では、本発明に係る免疫原性組成物は１を超える異なるアジュバントを含むことができる。さらに、本発明は、上記のいずれか、またはそれらの組み合わせを含む任意のアジュバント物質を含む治療用組成物を包含する。ウイルスエピトープ治療薬が免疫応答（例えば、液性または細胞性の免疫応答）を誘発する、または促進することができることも企図される。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、ウイルスエピトープ治療薬（例えば、ペプチド、ポリヌクレオチド、ＴＣＲ、ＣＡＲ、ＴＣＲまたはＣＡＲを含む細胞、ポリペプチドを含有する樹状細胞、ポリヌクレオチドを含有する樹状細胞、抗体等）を含み、アジュバントは別に任意の適切な順序で投与することができる。
担体はアジュバントとは無関係に存在することができる。担体の機能は、例えば、それらの活性もしくは免疫原性を高め、安定性を付与し、生物活性を高め、または血清半減期を増やすために特定の突然変異型の分子量を増やすことであることができる。さらに、担体はペプチドをＴ細胞に提示するのを助けることができる。担体は、当業者に知られている任意の好適な担体、例えばタンパク質または抗原提示細胞であることができる。担体タンパク質は、スカシガイヘモシアニン、例えば、トランスフェリン、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、サイログロブリンもしくはオボアルブミンのような血清タンパク質、免疫グロブリン、またはインスリンもしくはパルミチン酸のようなホルモンであってもよいが、これらに限定されない。一実施形態では、担体はヒトフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインを含む（Ｋｏｉｄｅ，ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０１２；５０３：１３５－５６）。ヒトの免疫のために、担体はヒトに許容され、安全な生理学的に許容される担体でなければならない。しかしながら、破傷風トキソイド及び／またはジフテリアトキソイドは本発明の一実施形態では好適な担体である。あるいは、担体はデキストラン、例えば、セファロースであることができる。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ポリペプチドを担体に結合させて免疫原性を高める代わりに、多重連結ペプチドとして合成することができる。そのような分子は、複数の抗原ペプチド（ＭＡＰＳ）としても知られている。
一態様では、本明細書で提示されている方法は、１以上のコロナウイルス抗原ペプチドまたは特徴的な１以上のコロナウイルス抗原ペプチドをコードする核酸を単離すること、及び／または特徴付けすることを含み、その際、コロナウイルス抗原ペプチドは、対象にて発現される１以上のＨＬＡコードするＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩの分子に結合すると予測され、対象はコロナウイルスワクチンのようなコロナウイルス免疫療法が必要とする。いくつかの実施形態では、方法は、（ａ）機械学習するＨＬＡペプチド提示予測モデルを使用して複数の候補ペプチド配列のアミノ酸情報を処理して、複数の提示予測を生成すること（その際、複数の候補ペプチド配列の各候補ペプチド配列がコロナウイルスのゲノムまたはエクソームによってコードされ、複数の提示予測は、複数の候補ウイルスペプチド配列のそれぞれについてのＨＬＡ提示予測を含み、各ＨＬＡ提示予測は対象の細胞のクラスＩＩ ＨＬＡ対立遺伝子によってコードされる１以上のタンパク質が、複数の候補ウイルスペプチド配列のうちの所与の候補ウイルスペプチド配列を提示することができる可能性を示し、機械学習するＨＬＡペプチド提示予測モデルは、訓練細胞で発現されるＨＬＡタンパク質によって提示される、質量分析で同定された訓練ペプチドの配列の配列情報を含む訓練データを使用して訓練される）、及び（ｂ）複数の提示予測に少なくとも基づいて、対象の細胞のクラスＩＩ ＨＬＡ対立遺伝子によってコードされる１以上のタンパク質のうちの少なくとも１つによって提示されるような複数のペプチド配列のうちでウイルスペプチド配列を同定すること（その際、機械学習するＨＬＡペプチド提示予測モデルは、提示ＰＰＶ決定法に従って少なくとも０．０７の陽性適中率（ＰＰＶ）を有する）を含む。
本明細書で提供されているのは、（ａ）機械学習するＨＬＡペプチド結合予測モデルを使用してコロナウイルスのゲノムまたはエクソームによってコードされる複数のペプチド配列のアミノ酸情報を処理し、複数の結合予測を生成すること（その際、複数の結合予測は、複数の候補ペプチド配列のそれぞれについてのＨＬＡ結合予測を含み、各結合予測は、対象の細胞のクラスＩＩ ＨＬＡ対立遺伝子によってコードされる１以上のタンパク質が複数の候補ペプチド配列のうちの所与の候補ペプチド配列に結合する可能性を示し、機械学習するＨＬＡペプチド結合予測モデルは、ＨＬＡクラスＩＩタンパク質またはＨＬＡクラスＩＩタンパク質類似体に結合することが同定されたペプチドの配列の配列情報を含む訓練データを使用して訓練される）、及び（ｂ）複数の結合予測に少なくとも基づいて、対象の細胞のクラスＩＩ ＨＬＡ対立遺伝子によってコードされた１以上のタンパク質のうちの少なくとも１つへの結合の閾値結合予測確率値よりも高い確率を有する複数のペプチド配列のうち１つのペプチド配列を同定すること（その際、機械学習するＨＬＡペプチド結合予測モデルは、結合ＰＰＶ決定法に従って少なくとも０．１の陽性的中率（ＰＰＶ）を有する）を含む方法である。
いくつかの実施形態では、機械学習するＨＬＡペプチド提示予測モデルは、訓練細胞にて発現されるＨＬＡタンパク質によって提示される、質量分析によって同定された訓練ペプチドの配列の配列情報を含む訓練データを使用して訓練される。
いくつかの実施形態では、方法は提示予測に基づいて、対象の細胞のクラスＩＩ ＨＬＡ対立遺伝子によってコードされる１以上のタンパク質のうちの少なくとも１つによって提示されると同定された少なくとも２つのペプチドを順位付けすることを含む。
いくつかの実施形態では、方法は順位付けされた２以上のペプチドのうちの１以上のペプチドを選択することを含む。
いくつかの実施形態では、方法は、対象の細胞のクラスＩＩ ＨＬＡ対立遺伝子によってコードされる１以上のタンパク質のうちの少なくとも１つによって提示されると同定された複数のペプチドのうちの１以上のペプチドを選択することを含む。
いくつかの実施形態では、方法は、提示予測に基づいて順位付けされた２以上のペプチドのうちの１以上のペプチドを選択することを含む。
いくつかの実施形態では、機械学習するＨＬＡペプチド提示予測モデルは、複数の試験ペプチド配列のアミノ酸情報を処理して複数の試験提示予測を生成する場合、少なくとも０．０７の陽性適中率（ＰＰＶ）を有し、各試験提示予測は、対象の細胞のクラスＩＩ ＨＬＡ対立遺伝子によってコードされる１以上のタンパク質が、複数の試験ペプチド配列のうちの所与の試験ペプチド配列を提示することができる可能性を示し、複数の試験ペプチド配列は、（ｉ）細胞にて発現されるＨＬＡタンパク質によって提示される、質量分析によって同定された少なくとも１つの的中ペプチド配列と、（ｉｉ）生物のゲノムによってコードされるタンパク質内に含有される少なくとも４９９のデコイペプチド配列とを含む少なくとも５００の試験ペプチド配列を含み、生物と対象は同じ種であり、複数の試験ペプチド配列は少なくとも１つの的中ペプチド配列の少なくとも４９９のデコイペプチド配列に対する１：４９９の比を含み、且つ、機械学習するＨＬＡペプチド提示予測モデルによって複数の試験ペプチド配列の上位割合が細胞にて発現されるＨＬＡタンパク質により提示されると予測される。
いくつかの実施形態では、機械学習するＨＬＡペプチド提示予測モデルは、複数の試験ペプチド配列のアミノ酸情報を処理して複数の試験結合予測を生成する場合、少なくとも０．１の陽性適中率（ＰＰＶ）を有し、各試験結合予測は、対象の細胞のクラスＩＩ ＨＬＡ対立遺伝子によってコードされる１以上のタンパク質が、複数の試験ペプチド配列のうちの所与の試験ペプチド配列に結合する可能性を示し、複数の試験ペプチド配列は、（ｉ）細胞にて発現されるＨＬＡタンパク質によって提示される、質量分析によって同定された少なくとも１つの的中ペプチド配列と、（ｉｉ）細胞にて発現されるＨＬＡタンパク質、例えば、細胞にて発現される単一のＨＬＡタンパク質（例えば、単一対立遺伝子細胞）によって提示される、質量分析によって同定された少なくとも１つのペプチド配列を含むタンパク質内に含有される少なくとも１９のデコイペプチド配列とを含む少なくとも２０の試験ペプチド配列を含み、複数の試験ペプチド配列は少なくとも１つの的中ペプチド配列の少なくとも１９のデコイペプチド配列に対する１：１９の比を含み、且つ、機械学習するＨＬＡペプチド提示予測モデルによって複数の試験ペプチド配列の上位割合が細胞にて発現されるＨＬＡタンパク質に結合すると予測される。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの的中ペプチド配列とデコイペプチド配列との間にアミノ酸配列の重複は存在しない。
ＣＴＬペプチドとＨＴＬペプチドの組み合わせ
免疫刺激活性を有する、本明細書に記載されているウイルスエピトープのポリペプチド及びポリヌクレオチド、またはその類似体を含む免疫原性組成物またはワクチン組成物を改変して、血清半減期の改善のような所望の属性を提供する、または免疫原性を増強することができる。
例えば、ＣＴＬ活性を誘導するウイルスエピトープペプチドの能力は、Ｔヘルパー細胞応答を誘導することができる少なくとも１つのエピトープを含有する配列にペプチドを連結することによって増強することができる。一実施形態では、ＣＴＬエピトープ／ＨＴＬエピトープのコンジュゲートはスペーサー分子によって連結される。スペーサーは通常、生理学的条件下で実質的に荷電されていない、アミノ酸またはアミノ酸模倣体のような比較的小さな中性分子で構成される。スペーサーは通常、例えば、Ａｌａ、Ｇｌｙ、または非極性アミノ酸もしくは中性極性アミノ酸の他の中性スペーサーから選択される。任意で存在するスペーサーは、同じ残基で構成される必要はないので、ヘテロオリゴマーまたはホモオリゴマーであることができることが理解されることになる。存在する場合、スペーサーは通常、少なくとも１または２の残基、さらに通常３～６残基となる。あるいは、ＣＴＬペプチドはスペーサーなしでＴヘルパーペプチドに連結することができる。
ＣＴＬペプチドエピトープはＴヘルパーペプチドエピトープに直接連結することができるが、ＣＴＬエピトープ／ＨＴＬエピトープのコンジュゲートはスペーサー分子によって連結することができる。スペーサーは通常、生理学的条件下で実質的に荷電されていない、アミノ酸またはアミノ酸模倣体のような比較的小さな中性分子で構成される。スペーサーは通常、例えば、Ａｌａ、Ｇｌｙ、または非極性アミノ酸もしくは中性極性アミノ酸の他の中性スペーサーから選択される。任意で存在するスペーサーは、同じ残基から構成される必要はないので、ヘテロオリゴマーまたはホモオリゴマーであることができることが理解されることになる。存在する場合、スペーサーは通常、少なくとも１または２の残基、さらに通常３～６残基となる。ＣＴＬペプチドエピトープはＣＴＬペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかで、直接またはスペーサーを介してＴヘルパーペプチドエピトープに連結することができる。免疫原性ペプチドまたはＴヘルパーペプチドのいずれかのアミノ末端をアシル化することができる。
ＨＴＬペプチドエピトープを修飾してその生物学的特性を変更することもできる。例えば、ＨＴＬエピトープを含むペプチドは、Ｄ－アミノ酸を含有してプロテアーゼに対する耐性を高めるので血清半減期を延長することができる。また、エピトープペプチドは、脂質、タンパク質、もしくは糖のような他の分子、または他の合成化合物に結合して、それらの生物活性を高めることができる。例えば、Ｔヘルパーペプチドは、アミノ末端またはカルボキシル末端のいずれかで１以上のパルミチン酸鎖に結合することができる。
特定の実施形態では、Ｔヘルパーペプチドは、集団の大部分に存在するＴヘルパー細胞によって認識されるペプチドである。これは、ＨＬＡクラスＩＩ分子の多く、ほとんど、またはすべてに結合するアミノ酸配列を選択することによって達成することができる。これらは、「緩やかなＨＬＡ拘束」または「無差別な」Ｔヘルパー配列として知られる。無差別であるアミノ酸配列の例には、８３０～８４３位の破傷風トキソイド（ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥ）、３７８～３９８位のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのＣＳタンパク質（ＤＩＥＫＫＩＡＫＭＥＫＡＳＳＶＦＮＶＶＮＳ）、及び１１６位のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓの１８ｋＤタンパク質（ＧＡＶＤＳＩＬＧＧＶＡＴＹＧＡＡ）のような抗原由来の配列が挙げられる。他の例には、ＤＲ１－４－７スーパーモチーフ、またはＤＲ３モチーフのいずれかを持つペプチドが挙げられる。
あるいは、自然界には見いだされないアミノ酸配列を使用して、緩やかにＨＬＡ拘束された様式でＴヘルパーリンパ球を刺激することができる合成ペプチドを調製することが可能である（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９５／０７７０７を参照のこと）。汎ＤＲ結合エピトープと呼ばれるこれらの合成化合物（例えば、ＰＡＤＲＥ，Ｅｐｉｍｍｕｎｅ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）はほとんどのＨＬＡ－ＤＲ（ヒトＨＬＡクラスＩＩ）分子を結合するように設計されている。例えば、式：ａＫＸＶＷＡＮＴＬＫＡＡａ（式中、「Ｘ」はシクロヘキシルアラニン、フェニルアラニン、またはチロシンのいずれかであり、ａはＤ－アラニンまたはＬ－アラニンのいずれかである）を有する汎ＤＲ結合エピトープペプチドは、ほとんどのＨＬＡ－ＤＲ対立遺伝子に結合し、ＨＬＡ型に関係なく、ほとんどの個人由来のＴヘルパーリンパ球の応答を刺激することが見いだされている。汎ＤＲ結合エピトープの代替物は、「Ｌ」天然アミノ酸すべてを含み、エピトープをコードする核酸の形態で提供され得る。
いくつかの実施形態では、その少なくとも１つの成分が細胞傷害性Ｔリンパ球を刺激する医薬組成物（例えば、免疫原性組成物）にてウイルスエピトープ治療薬（例えば、ペプチド、ポリヌクレオチド、ＴＣＲ、ＣＡＲ、ＴＣＲまたはＣＡＲを含有する細胞、ポリペプチドを含有する樹状細胞、ポリヌクレオチドを含有する樹状細胞、抗体等）を含むことが望ましい場合がある。脂質は、ウイルス抗原に対して生体内でＣＴＬを刺激することができる薬剤として同定されている。例えば、パルミチン酸残基は、リジン残基のｃ－及びａ－アミノ基に結合され、次いで、例えば、Ｇｌｙ、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－、Ｓｅｒ、Ｓｅｒ－Ｓｅｒ等のような１以上の連結残基を介して免疫原性ウイルスエピトープペプチドに連結され得る。脂質化ペプチドは、その後、ミセルまたは粒子で直接、リポソームに組み込まれて、またはアジュバントにて乳化されて投与することができる。一実施形態では、特に有効な免疫原性構築物は、免疫原性ペプチドのアミノ末端に結合、例えば、Ｓｅｒ－Ｓｅｒを介して連結されているＬｙｓのｃ－及びａ－アミノ基に連結されたパルミチン酸を含む。
ＣＴＬ応答の脂質刺激の別の例として、トリパルミトイル－Ｓ－グリセリルシステイニルセリル－セリン（Ｐ３ＣＳＳ）のようなＥ．ｃｏｌｉリポタンパク質を使用して、適切なペプチドに共有結合した場合にウイルス特異的ＣＴＬを刺激することができる。（例えば、Ｄｅｒｅｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４２：５６１，１９８９を参照のこと）。本明細書に記載されているウイルスエピトープペプチドは、例えば、Ｐ３ＣＳＳに結合することができ、リポペプチドを個体に投与して、標的抗原に対するＣＴＬ応答を特異的に刺激することができる。さらに、中和抗体の誘導はＰ３ＣＳＳ結合エピトープでも刺激することができるので、そのような２つの組成物を組み合わせて、感染に対する液性及び細胞性の応答の双方をさらに効果的に誘発することができる。
本明細書で述べたように、担体支持体またはさらに大きなペプチドに結合させるために、ペプチドまたはオリゴペプチド等の物理的または化学的な特性を改変するために追加のアミノ酸をウイルスエピトープペプチドの末端に付加して、ペプチドを互いに連結しやすくすることができる。チロシン、システイン、リジン、グルタミン酸またはアスパラギン酸のようなアミノ酸を、ペプチドまたはオリゴペプチドのＣ末端またはＮ末端に導入することができる。しかしながら、Ｔ細胞エピトープのカルボキシル末端での修飾は、場合によっては、ペプチドの結合特性を変更する可能性があることに注意すべきである。加えて、ペプチドまたはオリゴペプチドの配列は、例えば、アルカノイル（Ｃ１～Ｃ２０）またはチオグリコリルアセチル化、末端カルボキシルアミド化、例えばアンモニア、メチルアミン等による末端ＮＨ２のアシル化によって修飾されることにより、天然の配列とは異なることができる。場合によっては、これらの修飾は、支持体または他の分子に連結するための部位を提供することができる。
本明細書に記載されている免疫原性組成物の実施形態は、患者の血液由来のＰＢＭＣまたはそこからのＤＣへのエピトープ保有ウイルスエピトープのポリペプチドまたはポリヌクレオチドのカクテルの生体外投与を含む。ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１ｂ、及びＴＮＦａを含む、樹状細胞（ＤＣ）の採取を容易にする医薬品を使用することができる。ペプチドまたはペプチドをコードするポリヌクレオチドでＤＣをパルスした後、患者に再注入する前に、ＤＣを洗浄して結合していないペプチドを取り除く。この実施形態では、ワクチン組成物または免疫原性組成物は、その表面にＨＬＡ分子と複合体を形成したパルスされたペプチドエピトープを提示するペプチドでパルスしたＤＣを含む。次いで、組成物を患者に投与する。他の実施形態では、そのようなパルスされたＤＣはＴ細胞療法での使用に好適なＴ細胞を刺激するのに使用される。
マルチエピトープ免疫原性組成物
複数のエピトープの同時送達を可能にする多数の異なるアプローチが利用可能である。本明細書に記載されているウイルスエピトープペプチドをコードする核酸は、本発明の特に有用な実施形態である。一実施形態では、その核酸はＲＮＡである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている１または複数のエピトープを含むウイルスエピトープペプチドをコードするミニ遺伝子構築物を使用して、本明細書に記載されているウイルスエピトープペプチドをコードする核酸を投与してもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている１または複数のエピトープを含むウイルスエピトープペプチドをコードするＲＮＡ構築物（例えば、ｍＲＮＡ構築物）が投与される。
マルチエピトープミニ遺伝子の例示的な使用はＡｎ，Ｌ．ａｎｄ Ｗｈｉｔｔｏｎ，Ｊ．Ｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：２２９２，１９９７；Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｓ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：８２２，１９９６；Ｗｈｉｔｔｏｎ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：３４８，１９９３；Ｈａｎｋｅ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ，１６：４２６，１９９８に記載されている。例えば、スーパーモチーフ及び／またはモチーフを持つ抗原ペプチド、普遍的なヘルパーＴ細胞エピトープ（または複数のウイルス抗原ＨＴＬエピトープ）、及び小胞体移行シグナル配列をコードするマルチエピトープＤＮＡプラスミドを操作することができる。
マルチエピトープミニ遺伝子の免疫原性をトランスジェニックマウスで調べて、調べたエピトープに対して誘導される免疫応答の大きさを評価することができる。さらに、生体内でＤＮＡにコードされるエピトープの免疫原性は、ＤＮＡプラスミドで形質移入された標的細胞に対して特異的なＣＴＬ株の試験管内応答と相関することができる。したがって、これらの実験は、ミニ遺伝子が、１）細胞が介在する応答及び／または液性の応答を生じさせること、及び２）誘導された免疫細胞がコードされたエピトープを発現する細胞を認識したことの双方に役立つことを示すことができる。
例えば、ヒト細胞における発現のために選択されたウイルスエピトープ（ミニ遺伝子）をコードするＤＮＡ配列を作り出すには、エピトープのアミノ酸配列を逆翻訳することができる。ヒトのコドン使用表を使用して各アミノ酸についてコドン選択を導くことができる。これらのウイルスエピトープをコードするＤＮＡ配列は直接隣接することができるので、翻訳されると連続したポリペプチド配列が作り出される。発現及び／または免疫原性を最適化するには、追加の要素をミニ遺伝子設計に組み込むことができる。逆翻訳され、ミニ遺伝子配列に含めることができるアミノ酸配列の例には、ＨＬＡクラスＩエピトープ、ＨＬＡクラスＩＩエピトープ、ユビキチン化シグナル配列、及び／または小胞体標的指向化シグナルが挙げられる。加えて、ＣＴＬ及びＨＴＬのエピトープのＨＬＡ提示は、ＣＴＬまたはＨＴＬエピトープに隣接する合成の（例えば、ポリアラニン）または天然に存在する隣接配列を含めることによって改善することができ；エピトープ（複数可）を含むこれらのさらに大きなペプチドは本発明の範囲内にある。
ミニ遺伝子配列は、ミニ遺伝子のプラス鎖及びマイナス鎖をコードするオリゴヌクレオチドを組み立てることによってＤＮＡに変換することができる。重複するオリゴヌクレオチド（長さ３０～１００塩基）は、周知の技術を使用して適切な条件下で合成する、リン酸化する、精製する及びアニーリングすることができる。オリゴヌクレオチドの末端は、例えば、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使用して結合することができる。次いで、エピトープポリペプチドをコードするこの合成ミニ遺伝子を所望の発現ベクターにクローニングすることができる。
当業者に周知の標準的な調節配列をベクターに含めて、標的細胞における発現を確実にすることができる。例えば、ミニ遺伝子挿入のために下流にクローニング部位を持つプロモーター；効率的な転写終結のためのポリアデニル化シグナル；Ｅ．ｃｏｌｉの複製開始点；及びＥ．ｃｏｌｉの選択可能なマーカー（例えば、アンピシリン耐性またはカナマイシン耐性）。この目的のために多数のプロモーター、例えばヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）プロモーターを使用することができる。例えば、他の好適なプロモーター配列については、米国特許第５，５８０，８５９号及び同第５，５８９，４６６号を参照のこと。
追加のベクターの修飾を使用して、ミニ遺伝子の発現と免疫原性を最適化することができる。場合によっては、効率的な遺伝子発現のためにイントロンが利用され、１以上の合成のまたは天然に存在するイントロンがミニ遺伝子の転写領域に組み込まれてもよい。ミニ遺伝子の発現を増やすために、ｍＲＮＡ安定化配列及び哺乳類細胞における複製のための配列を含めることも考慮することができる。
いったん発現ベクターが選択されると、ミニ遺伝子をプロモーターの下流のポリリンカー領域にクローニングすることができる。このプラスミドを適切なＥ．ｃｏｌｉ株に形質転換し、標準的な技術を使用してＤＮＡを調製する。ミニ遺伝子の配向性及びＤＮＡ配列、ならびにベクターに含まれる他のすべての要素は、制限マッピングとＤＮＡ配列分析を使用して確認することができる。正しいプラスミドを持つ細菌細胞は、万能細胞バンク及び機能細胞バンクとして保存することができる。
加えて、免疫調節配列がＤＮＡワクチンの免疫原性にて役割を担うと思われる。これらの配列は、免疫原性を増強することが望まれる場合、ミニ遺伝子コード配列の外側でベクターに含めることができる。一実施形態では、配列は免疫刺激性である。別の実施形態では、配列はＩＳＳまたはＣｐＧである。
いくつかの実施形態では、ミニ遺伝子コード化エピトープ及び第２のタンパク質（免疫原性を増強または低下させるために含まれる）の双方の産生を可能にするバイシストロン性発現ベクターを使用することができる。同時発現される場合、免疫応答を有益に増強してもよいタンパク質またはポリペプチドの例には、サイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＧＭ－ＣＳＦ）、サイトカイン誘導分子（例えば、ＬｅＩＦ）、共刺激分子、またはＨＴＬ応答のための、汎ＤＲ結合タンパク質が挙げられる。ヘルパー（ＨＴＬ）エピトープは細胞内標的指向化シグナルに連結され、発現したＣＴＬエピトープとは別に発現させることができ；これによって、ＨＴＬエピトープをＣＴＬエピトープとは異なる細胞の区画に向けることができる。必要に応じて、これは、ＨＬＡクラスＩＩの経路へのＨＴＬエピトープのさらに効率的な侵入を促進し、それによってＨＴＬ誘導が改善される。ＨＴＬまたはＣＴＬの誘導とは対照的に、免疫抑制分子（例えばＴＧＦ－（３））の同時発現による免疫応答の特異的な低下は特定の疾患に有益であることができる。
治療量のプラスミドＤＮＡは、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉでの発酵とそれに続く精製によって作り出すことができる。機能細胞バンクからの一定分量を使用して増殖培地に播種し、周知の技術に従って振とうフラスコまたは生物反応器で飽和するまで増殖させる。プラスミドＤＮＡは、ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．（Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）によって供給される固相アニオン交換樹脂のような標準的な生物分離技術を使用して精製することができる。必要に応じて、スーパーコイル化ＤＮＡは、ゲル電気泳動法またはその他の方法を使用して開環状及び線形の形態に由来することができる。
精製されたプラスミドＤＮＡは種々の製剤を使用して注射用に調製することができる。これらの中で最も簡単なのは、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）にて凍結乾燥ＤＮＡを再構成することである。「裸のＤＮＡ」として知られるこのアプローチは、現在、臨床試験で筋肉内（ＩＭ）投与に使用されている。ミニ遺伝子ＤＮＡワクチンの免疫療法効果を最大化するために、精製されたプラスミドＤＮＡを製剤化する別の方法を使用することができる。種々の方法が説明されており、新しい技術を利用可能することができる。カチオン性脂質も製剤にて使用することができる（例えば、ＷＯ９３／２４６４０；Ｍａｎｎｉｎｏ ＆ Ｇｏｕｌｄ－Ｆｏｇｅｒｉｔｅ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，６（７）：６８２（１９８８）；米国特許第５，２７９，８３３号；ＷＯ９１／０６３０９；及びＦｅｌｇｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：７４１３（１９８７）によって記載されているものを参照のこと）。加えて、糖脂質、融合性リポソーム、ペプチド、及び総称して保護的、相互作用的、非凝縮性の化合物（ＰＩＮＣ）と呼ばれる化合物も精製されたプラスミドＤＮＡと複合体を形成して、安定性、筋肉内分散、または特定の臓器もしくは細胞型への輸送のような変数に影響を与えてもよい。
別の実施形態では、核酸は高速細胞変形の使用によって細胞に導入される。高速変形中、細胞膜に一時的な破壊が起こるので核酸が細胞に入るのを可能にするように細胞は圧迫される。あるいは、タンパク質は発現ベクターから、例えば、細菌発現ベクターにて生成することができ、その後、そのタンパク質を細胞に送達することができる。
標的細胞感作は、ミニ遺伝子にコードされたＣＴＬエピトープの発現及びＨＬＡクラスＩ提示の機能アッセイとして使用することができる。例えば、プラスミドＤＮＡは、標準的なＣＴＬクロム放出アッセイの標的として好適である哺乳類細胞株に導入される。使用される形質移入法は最終的な製剤に依存することになる。エレクトロポレーションを「裸の」ＤＮＡに使用することができるのに対して、カチオン性脂質は直接の試験管内形質移入を可能にする。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するプラスミドを同時形質移入し、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用して形質移入された細胞の濃縮を可能にする。次に、これらの細胞をクロム－５１（５１－Ｃｒ）で標識し、エピトープ特異的ＣＴＬ株の標的細胞として使用し；５１Ｃｒ放出によって検出される細胞溶解はミニ遺伝子にコードされたＣＴＬエピトープの産生及びＨＬＡ提示の双方を示す。ＨＴＬエピトープの発現は、ＨＴＬ活性を評価するためのアッセイを使用して類似の方法で評価することができる。
生体内免疫原性はミニ遺伝子ＤＮＡ製剤の機能検査についての第２のアプローチである。適切なヒトＨＬＡタンパク質を発現しているトランスジェニックマウスをＤＮＡ産物で免疫する。投与量及び投与経路は製剤に依存する（例えば、ＰＢＳ中のＤＮＡについてはＩＭ、脂質複合化ＤＮＡについては腹腔内（ＩＰ））。例示的なプロトコールは、免疫後２１日であり、脾細胞を採取し、調べられる各エピトープをコードするペプチドの存在下で１週間再刺激する。その後、ＣＴＬエフェクター細胞については、標準的な技術を使用してペプチド負荷された５１Ｃｒ標識標的細胞の細胞溶解についてアッセイを実施する。ミニ遺伝子にコードされたエピトープに対応するペプチドエピトープを負荷したＨＬＡによって感作された標的細胞の溶解は、ＣＴＬの生体内誘導に対するＤＮＡワクチン機能を実証する。ＨＴＬエピトープの免疫原性はトランスジェニックマウスにて同様の方法で評価される。
あるいは、核酸は、例えば、米国特許第５，２０４，２５３号に記載されているように弾道送達を使用して投与することができる。この技術を使用して、ＤＮＡのみで構成された粒子を投与する。さらに代わりの実施形態では、ＤＮＡを金粒子のような粒子に付着させることができる。
細胞
一態様では、本発明はまた、免疫応答細胞を活性化するウイルスエピトープ認識受容体（例えば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ））を発現する細胞、及び免疫応答の増強を必要とする疾患の治療にそのような細胞を使用する方法を提供する。
そのような細胞には、本明細書に記載されているウイルスエピトープペプチドの１つを結合する抗原認識受容体（例えば、ＴＣＲまたはＣＡＲ）を発現する遺伝子操作された免疫応答細胞（例えば、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）細胞、ヘルパーＴリンパ球（ＨＴＬ）細胞）が含まれ、且つ、したがって、抗原特異的免疫応答の増大が望まれる新生物及び他の病状の治療に使用する方法。Ｔ細胞の活性化には抗原を標的とするＴＣＲまたはＣＡＲが介在する。
本発明は、免疫応答細胞を活性化する抗原認識受容体（例えば、ＴＣＲ、ＣＡＲ）とキメラ共刺激受容体（ＣＣＲ）との組み合わせを発現する細胞、及びそのような細胞を、増強された免疫応答が必要である疾患の治療に使用する方法を提供する。一実施形態では、ウイルス抗原特異的なＴ細胞、ＮＫ細胞、ＣＴＬ細胞、または他の免疫応答細胞が、新生物の治療または予防のための１以上の共刺激リガンドの選択的濃縮のためのシャトルとして使用される。そのような細胞は、特定のウイルス感染の治療または予防のために、それを必要とするヒト対象に投与される。
一実施形態では、本発明の方法で使用することができるウイルス抗原特異的ヒトリンパ球には、限定しないで、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子操作された末梢ドナーリンパ球（Ｓａｄｅｌａｉｎ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．２００３ Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ３：３５－４５）、ａ及びｐヘテロ二量体を含む完全長ウイルス抗原認識Ｔ細胞受容体複合体を発現するように遺伝子操作された末梢ドナーリンパ球（Ｍｏｒｇａｎ，Ｒ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．２００６ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１４：１２６－１２９）、及び人工的抗原提示細胞（ＡＡＰＣ）またはパルス樹状細胞を採用する選択的に試験管内で増殖させた抗原特異的末梢血白血球（Ｄｕｐｏｎｔ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．２００５ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６５：５４１７－５４２７；Ｐａｐａｎｉｃｏｌａｏｕ，Ｇ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．２００３ Ｂｌｏｏｄ １０２：２４９８－２５０５）が挙げられる。Ｔ細胞は、自家、同種異系であってもよく、または試験管内では操作された前駆細胞もしくは幹細胞に由来してもよい。
共刺激リガンド
一実施形態では、本発明の細胞には、免疫細胞の完全な活性化に重要な非抗原特異的シグナルである少なくとも１つの共刺激リガンドが提供される。共刺激リガンドには限定しないで、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）リガンド、サイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５またはＩＬ２１）リガンド、及び免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーリガンドが挙げられる。腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）は全身性炎症に関与するサイトカインであり、急性期反応を刺激する。その主な役割は免疫細胞の調節にある。腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）リガンドは多くの共通の特徴を共有している。リガンドの大部分は、短い細胞質セグメントと比較的長い細胞外領域とを含有するＩＩ型膜貫通タンパク質として合成される。ＴＮＦリガンドには限定しないで、神経成長因子（ＮＧＦ）、ＣＤ４ＯＬ（ＣＤ４ＯＬ）／ＣＤ１５４、ＣＤ１３７Ｌ／４－１ＢＢＬ、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦａ）、ＣＤ１３４Ｌ／ＯＸ４ＯＬ／ＣＤ２５２、ＣＤ２７Ｌ／ＣＤ７０、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）、ＣＤ３ＯＬ／ＣＤ１５３、腫瘍壊死因子ｆ３（ＴＮＦ（３）／リンホトキシン－アルファ（ＬＴａ）、リンホトキシン－ベータ（ｕｒ（３）、ＣＤ２５７／Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）／Ｂｌｙｓ／ＴＨＡＮＫ／Ｔａ１１－１、グルココルチコイド誘導ＴＮＦ受容体リガンド（ＧＩＴＲＬ）、及びＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）、ＬＩＧＨＴ（ＴＮＦＳＦ１４）が挙げられる。免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーは、細胞の認識、結合、または接着プロセスに関与する細胞表面タンパク質及び可溶性タンパク質の大きな群である。これらのタンパク質は免疫グロブリンと構造的特徴を共有しており、免疫グロブリンドメイン（折り畳み）を持つ。免疫グロブリンスーパーファミリーのリガンドには限定しないで、双方がＣＤ２８のリガンドであるＣＤ８０及びＣＤ８６が含まれる。
本発明の遺伝子操作された免疫応答細胞を含む組成物は、新生物の治療のために対象に全身性にまたは直接、提供することができる。一実施形態では、本発明の細胞は目的の臓器に直接注入される。あるいは、遺伝子操作された免疫応答細胞を含む組成物は、例えば、循環系への投与によって目的の臓器に間接的に提供される。試験管内または生体内でのＴ細胞、ＮＫ細胞、またはＣＴＬ細胞の産生を増加させるために、細胞の投与前、投与中、または投与後に増殖剤及び分化剤を提供することができる。
改変された細胞は、生理学的に許容される任意のビヒクル中で、通常は血管内に投与することができるが、細胞が再生及び分化のための適切な部位（例えば、胸腺）を見つけることができる場合、骨または他の好都合な部位に導入することもできる。改変された細胞は自家または同種異系であることができる。本発明の遺伝子操作された免疫応答細胞は、精製された細胞集団を含むことができる。当業者は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）のような種々の周知の方法を使用して、集団中の遺伝子操作された免疫応答細胞の割合を容易に決定することができる。投与量は、当業者によって容易に調整することができる（例えば、純度の低下は投与量の増加を必要とする場合がある）。細胞は、注射、カテーテル等によって導入することができる。所望であれば、インターロイキン類、例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－６、及びＩＬ－１１、ならびに他のインターロイキン類、コロニー刺激因子、例えば、Ｇ－、Ｍ－及びＧＭ－ＣＳＦ、インターフェロン、例えばインターフェロンガンマ、及びエリスロポエチンを含むが、これらに限定されない因子を含めることもできる。
本発明の組成物には、遺伝子操作された免疫応答細胞またはそれらの前駆細胞と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物が含まれる。投与は自己または異種であることができる。例えば、免疫応答細胞または前駆細胞は１人の対象から得ることができ、同じ対象または異なる適合する対象に投与することができる。本発明の末梢血由来の免疫応答細胞またはそれらの子孫（例えば、生体内、生体外、または試験管内由来）は、カテーテル投与、全身性注射、局所注射、静脈内注射、または非経口投与を含む局所注射を介して投与することができる。本発明の治療用組成物（例えば、遺伝子操作された免疫応答細胞を含有する医薬組成物）を投与する場合、それは一般に注射可能な単位剤形（溶液、懸濁液、エマルション）で製剤化される。
使用方法及び医薬組成物
本明細書に記載されているウイルスエピトープ治療薬（例えば、ペプチド、ポリヌクレオチド、ＴＣＲ、ＣＡＲ、ＴＣＲまたはＣＡＲを含有する細胞、ポリペプチドを含有する樹状細胞、ポリヌクレオチドを含有する樹状細胞、抗体等）は、例えば、ウイルス感染症の治療または予防のような治療的処置方法を含むが、これらに限定されない種々の適用にて有用である。いくつかの実施形態では、治療的処置方法は免疫療法を含む。特定の実施形態では、ウイルスエピトープペプチドは、免疫応答を活性化する、促進する、増大させる、及び／または増強することに、または既存の免疫応答を新しい標的に向け直すことに有用である。使用方法は、試験管内、生体外または生体内の方法であることができる。
いくつかの態様では、本発明は、本明細書に記載されているウイルスエピトープ治療薬を使用して対象における免疫応答を活性化する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載されているウイルスエピトープ治療薬を使用して対象にて免疫応答を促進する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載されているウイルスエピトープペプチドを使用して対象にて免疫応答を増大させる方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、ウイルスエピトープペプチドを使用して免疫応答を増強する方法を提供する。いくつかの実施形態では、免疫応答を活性化する、促進する、増大させる、及び／または増強することは細胞性免疫の増加を含む。いくつかの実施形態では、免疫応答を活性化する、促進する、増大させる、及び／または増強することはＴ細胞の活性または液性免疫の増大を含む。いくつかの実施形態では、免疫応答を活性化する、促進する、増大させる、及び／または増強することはＣＴＬまたはＨＴＬの活性の増大を含む。いくつかの実施形態では、免疫応答を活性化する、促進する、増大させる、及び／または増強することはＮＫ細胞活性の増大を含む。いくつかの実施形態では、免疫応答を活性化する、促進する、増大させる、及び／または増強することはＴ細胞活性を増大させること及びＮＫ細胞活性を増大させることを含む。いくつかの実施形態では、免疫応答を活性化する、促進する、増大させる、及び／または増強することはＣＴＬ活性を増大させること及びＮＫ細胞活性を増大させることを含む。いくつかの実施形態では、免疫応答を活性化する、促進する、増大させる、及び／または増強することは、Ｔｒｅｇの抑制活性を阻害するまたは低下させることを含む。いくつかの実施形態では、免疫応答は抗原刺激の結果である。
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載されているウイルスエピトープ治療薬を使用して免疫応答を活性化する、促進する、増大させる、及び／または増強する方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、ウイルスエピトープのポリペプチドまたはポリヌクレオチドを細胞に送達する、治療有効量のウイルスエピトープ治療薬を、それを必要とする対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、それを必要とする対象に細胞が内部移行させる治療有効量のウイルスエピトープを投与することを含み、ウイルスエピトープペプチドは細胞によって処理される。いくつかの実施形態では、方法は、それを必要とする対象に、細胞が内部移行させる治療有効量のウイルスエピトープポリペプチドを投与することを含み、抗原ペプチドは細胞の表面に提示される。いくつかの実施形態では、方法は、それを必要とする対象に、細胞が内部移行させ、細胞によって処理される治療有効量のウイルスエピトープポリペプチドを投与することを含み、抗原ペプチドは細胞の表面に提示される。
いくつかの実施形態では、方法は、それを必要とする対象に、少なくとも１つの抗原ペプチドを含む外因性ポリペプチドを細胞に送達する本明細書に記載されている治療有効量のウイルスエピトープのポリペプチドまたはポリヌクレオチドを投与することを含み、抗原ペプチドは細胞の表面上に提示される。いくつかの実施形態では、抗原ペプチドは、ＭＨＣクラスＩ分子と複合体を形成して細胞の表面に提示される。いくつかの実施形態では、抗原ペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩ分子と複合体を形成して細胞の表面に提示される。
いくつかの実施形態では、方法は、少なくとも１つの抗原ペプチドを含む外因性ポリペプチドを細胞に送達する、本明細書に記載されているウイルスエピトープのポリペプチドまたはポリヌクレオチドと細胞を接触させることを含み、抗原ペプチドは細胞の表面に提示される。いくつかの実施形態では、抗原ペプチドはＭＨＣクラスＩ分子と複合体を形成して細胞の表面に提示される。いくつかの実施形態では、抗原ペプチドはＭＨＣクラスＩＩ分子と複合体を形成して細胞の表面に提示される。
いくつかの実施形態では、方法は、それを必要とする対象に、少なくとも１つの抗原ペプチドを含む外因性ポリペプチドを細胞に送達する本明細書に記載されている治療有効量のウイルスエピトープのポリペプチドまたはポリヌクレオチドを投与することを含み、その際、抗原ペプチドが細胞の表面に提示され、細胞に対する免疫応答が誘導される。いくつかの実施形態では、細胞に対する免疫応答が増大する。いくつかの実施形態では、ウイルスエピトープのポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、少なくとも１つの抗原ペプチドを含む外因性ポリペプチドを細胞に送達し、その際、抗原ペプチドは細胞の表面に提示される。
いくつかの実施形態では、方法は、それを必要とする対象に、少なくとも１つの抗原ペプチドを含む外因性ポリペプチドを細胞に送達する本明細書に記載されている治療有効量のウイルスエピトープのポリペプチドまたはポリヌクレオチドを投与することを含み、その際、抗原ペプチドが細胞の表面に提示され、細胞に向けられたＴ細胞殺傷が誘導される。いくつかの実施形態では、細胞に向けられたＴ細胞殺傷が増強される。いくつかの実施形態では、細胞に向けられたＴ細胞殺傷が増大する。
いくつかの実施形態では、対象にて免疫応答を増大させる方法は、治療有効量の本明細書に記載されているウイルスエピトープ治療薬を対象に投与することを含み、その際、薬剤は本明細書に記載されているウイルスエピトープを特異的に結合する抗体である。いくつかの実施形態では、対象にて免疫応答を増大させる方法は、治療有効量の抗体を対象に投与することを含む。
本発明は、ウイルスに対する免疫応答を誘導するまたは促進するまたは増強する方法を提供する。いくつかの実施形態では、ウイルスに対する免疫応答を誘導するまたは促進するまたは増強する方法は、治療有効量の本明細書に記載されているウイルスエピトープ治療薬を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、免疫応答はウイルスに対するものである。好ましい実施形態では、既存の免疫応答はコロナウイルスに対するものである。好ましい実施形態では、既存の免疫応答はＣＯＶＩＤ１９に対するものである。いくつかの実施形態では、ウイルスは、麻疹ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ；水痘ウイルス）、インフルエンザウイルス、おたふくかぜウイルス、ポリオウイルス、風疹ウイルス、ロタウイルス、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、及びサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）から成る群から選択される。いくつかの実施形態では、ウイルスは水痘帯状疱疹ウイルスである。いくつかの実施形態では、ウイルスはサイトメガロウイルスである。いくつかの実施形態では、ウイルスは麻疹ウイルスである。いくつかの実施形態では、免疫応答は自然なウイルス感染後に獲得されたものである。いくつかの実施形態では、免疫応答はウイルスに対するワクチンの接種後に獲得されたものである。いくつかの実施形態では、免疫応答は細胞が介在する応答である。いくつかの実施形態では、既存の免疫応答は、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）またはＨＴＬを含む。
いくつかの実施形態では、対象にてウイルスに対する免疫応答を誘導するまたは促進するまたは増強する方法は、（ｉ）ウイルスエピトープを特異的に結合する抗体と、（ｉｉ）本明細書に記載されている少なくとも１つのウイルスエピトープペプチドとを含む融合タンパク質を投与することを含み、その際、（ａ）融合タンパク質はウイルス抗原に結合した後、細胞が内部移行させ；（ｂ）ウイルスエピトープペプチドは処理され、ＭＨＣクラスＩ分子に関連して細胞の表面に提示され；（ｃ）ウイルスエピトープペプチド／ＭＨＣクラスＩ複合体は細胞傷害性Ｔ細胞によって認識される。いくつかの実施形態では、細胞傷害性Ｔ細胞はメモリーＴ細胞である。いくつかの実施形態では、メモリーＴ細胞はウイルスエピトープペプチドによるワクチン接種の結果である。
本発明はウイルスの免疫原性を高める方法を提供する。いくつかの実施形態では、ウイルスの免疫原性を高める方法は、ウイルスに感染した細胞を本明細書に記載されている有効量のウイルスエピトープ治療薬と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、ウイルスの免疫原性を高める方法は、本明細書に記載されている治療有効量のウイルスエピトープ治療薬を対象に投与することを含む。特定の実施形態では、対象はヒトである。
いくつかの実施形態では、方法は、治療有効量の本明細書に記載されているウイルスエピトープ治療薬を対象に投与することによって、それを必要とする対象にてがんを治療するまたは予防することを含むことができる。いくつかの実施形態では、がんはリンパ腫または白血病のような液体癌である。いくつかの実施形態では、がんは固形腫瘍である。特定の実施形態では、腫瘍は、結腸直腸腫瘍、膵臓腫瘍、肺腫瘍、卵巣腫瘍、肝臓腫瘍、乳房腫瘍、腎臓腫瘍、前立腺腫瘍、神経内分泌腫瘍、消化管腫瘍、黒色腫、頚部腫瘍、膀胱腫瘍、膠芽腫、及び頭頚部腫瘍から成る群から選択される腫瘍である。特定の実施形態では、腫瘍は結腸直腸腫瘍である。特定の実施形態では、腫瘍は卵巣腫瘍である。いくつかの実施形態では、腫瘍は乳房腫瘍である。いくつかの実施形態では、腫瘍は肺腫瘍である。特定の実施形態では、腫瘍は膵臓腫瘍である。特定の実施形態では、腫瘍は黒色腫腫瘍である。いくつかの実施形態では、がんは固形腫瘍である。
本発明はさらに、本明細書に記載されている治療有効量のウイルスエピトープ治療薬を対象に投与することを含む、対象にてウイルス感染を治療する、または予防する方法を提供する。
いくつかの実施形態では、ウイルス感染を治療する、または予防する方法は、既存の免疫応答を新しい標的に向け直すことを含み、方法は、治療有効量のウイルスエピトープ治療薬を対象に投与することを含み、その際、既存の免疫応答はウイルスエピトープペプチドによって細胞またはウイルスに感染した細胞に送達される抗原ペプチドに対するものである。
本発明はさらに、本明細書に記載されている治療有効量のウイルスエピトープ治療薬を対象（例えば、治療を必要とする対象）に投与することを含む、ウイルス感染を治療する、または予防する方法を提供する。特定の実施形態では、対象はヒトである。特定の実施形態では、対象はコロナウイルス感染症を有する、またはコロナウイルス感染症のリスクがある。
特定の実施形態では、本明細書に記載されているウイルスエピトープ治療薬を投与することに加えて、方法または治療はさらに、少なくとも１つの追加の治療剤を投与することを含む。追加の治療剤は、薬剤の投与に先立って、それと同時に及び／またはそれに続いて投与することができる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの追加の治療剤は１、２、３、またはそれ以上の追加の治療剤を含む。
いくつかの実施形態では、ウイルスエピトープ治療薬は、アドレノメジュリン（ＡＭ）、アンジオポエチン（Ａｎｇ）、ＢＭＰ、ＢＤＮＦ、ＥＧＦ、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＦＧＦ、ＧＤＮＦ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＧＤＦ９、ＨＧＦ、ＨＤＧＦ、ＩＧＦ、遊走刺激因子、ミオスタチン（ＧＤＦ－８）、ＮＧＦ、ニューロトロフィン、ＰＤＧＦ、トロンボポエチン、ＴＧＦ－α、ＴＧＦ ＴＮＦ－α、ＶＥＧＦ、Ｐ１ＧＦ、ガンマ－ＩＦＮ、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－１８から成る群から選択される生体分子と併用して投与することができる。
特定の実施形態では、治療は、本明細書に記載されているウイルスエピトープ治療薬を追加の治療法と組み合わせて投与することを含む。特定の実施形態では、追加の治療法は、別のウイルス、例えば、インフルエンザに対する治療法である。ウイルスの例示的な治療法には、オセルタミビル、リン酸オセルタミビル（ジェネリック版として、または商品名タミフル（登録商標）として入手可能）、ザナミビル（商品名リレンザ（登録商標））、ペラミビル（商品名ラピバブ（登録商標））、バロキサビルマルボキシル（商品名ゾフルーザ（登録商標））、アマンタジン、モロキシジン、リマンタジン、ウミフェノビル（商品名アルビドール（登録商標））、及びザナミビル（商品名リレンザ（登録商標））が挙げられるが、これらに限定されない。
薬剤による治療は、追加の治療法の施行前、施行と同時に、または施行後に行うことができる。そのような追加の治療法の投薬スケジュールは、熟練した医師によって決定され得る。
併用投与は、単一の医薬製剤での、もしくは別個の製剤を使用しての同時投与、またはいずれかの順序での、しかし、一般に全ての活性剤がそれらの生物活性を同時に発揮するような時間内での連続投与を含むことができる。
本明細書に記載されているウイルスエピトープ治療薬と少なくとも１つの追加の治療剤との併用は、任意の順序でまたは同時に施行することができることが理解されることになる。いくつかの実施形態では、薬剤は、第２の治療剤による治療を以前に受けたことがある患者に投与される。特定の他の実施形態では、ウイルスエピトープ治療薬及び第２の治療剤は、実質的に同時にまたは同時に投与されることになる。例えば、対象は、第２の治療剤（例えば、化学療法）による一連の治療を受けている間に薬剤を与えられ得る。特定の実施形態では、ウイルスエピトープ治療薬は、第２の治療剤による治療から１年以内に投与されることになる。２つ（またはそれ以上）の薬剤または治療を、数時間または数分以内に（すなわち、実質的に同時に）対象に投与することができることがさらに理解されることになる。
疾患の治療については、本明細書に記載されているウイルスエピトープ治療薬の適切な投与量は、すべて主治医の裁量にて治療される疾患の種類、疾患の重症度及び経過、疾患の応答性、薬剤が予防目的で投与されるか治療目的で投与されるか、以前の治療、患者の病歴等に左右される。ウイルスエピトープ治療薬は、１回投与することができ、または数日から数ヵ月続く一連の治療にわたって、または治癒が達成されるまで、もしくは疾患状態の減退が達成されるまで投与することができる。最適な投薬スケジュールは、患者の体内での薬物蓄積の測定値から計算することができ、個々の薬剤の相対的効力に応じて異なることになる。投与する医師は、最適な投与量、投与方法論、及び反復率を決定することができる。
いくつかの実施形態では、ウイルスエピトープ治療薬は、最初にさらに高い「負荷」用量、その後１以上のさらに低い用量で投与されることができる。いくつかの実施形態では、投与頻度も変更することができる。いくつかの実施形態では、投薬計画は、初回用量を投与し、続いて、週に１回、２週に１回、３週に１回、または毎月１回、追加の用量（または「維持」用量）を投与することを含むことができる。例えば、投薬計画は、初期負荷用量を投与し、続いて、例えば、初回用量の半分の毎週の維持用量を投与することを含むことができる。または、投薬計画は、初期負荷用量を投与し、続いて、例えば、初回用量の半分の維持用量を隔週で投与することを含むことができる。または、投薬計画は、３週にわたって３回の初回用量を投与し、続いて、例えば、隔週で同量の維持用量を投与することを含むことができる。
当業者に知られているように、任意の治療剤の投与は副作用及び／または毒性を引き起こす場合がある。場合によっては、副作用及び／または毒性は非常に深刻であるため、治療有効用量で特定の薬剤を投与することができない。場合によっては、治療を中止する必要があり、他の薬剤を試すことができる。しかしながら、同じ治療クラスの多くの薬剤が同様の副作用及び／または毒性を示すことは、患者が治療を中止する必要がある、または可能であれば治療剤に関連する不快な副作用に苦しむ必要があることを意味する。
いくつかの実施形態では、投薬スケジュールは特定の投与回数または「サイクル」に限定することができる。いくつかの実施形態では、薬剤は３、４、５、６、７、８、またはそれ以上のサイクルにわたって投与される。例えば、薬剤を２週毎に６サイクル投与する、薬剤を３週毎に６サイクル投与する、薬剤を２週毎に４サイクル投与する、薬剤を３週毎に４サイクル投与する等である。投薬スケジュールは当業者が決定し、その後変更することができる。
本発明は、薬剤、化学療法剤等の投与に関連する副作用及び／または毒性を軽減することができる１以上の薬剤を投与するための間欠的投薬戦略を使用することを含む、本明細書に記載されているウイルスエピトープ治療薬を対象に投与する方法を提供する。いくつかの実施形態では、ヒト対象にてウイルス感染症を治療する、または予防する方法は、治療有効用量の抗ウイルス剤のような別の治療剤と併用して対象に治療有効用量のウイルスエピトープ治療薬を対象に投与することを含み、その際、薬剤の一方または双方は間欠的投薬戦略に従って投与される。いくつかの実施形態では、ヒト対象にてウイルス感染症を治療する、または予防する方法は、治療有効用量の第２のウイルスエピトープ治療薬と併用して治療有効用量のウイルスエピトープ治療薬を対象に投与することを含み、その際、薬剤の一方または双方は間欠的投薬戦略に従って投与される。いくつかの実施形態では、間欠的投薬戦略は、ウイルスエピトープ治療薬の初回用量を対象に投与することと、薬剤のその後の用量をほぼ２週に１回投与することとを含む。いくつかの実施形態では、間欠的投薬戦略は、ウイルスエピトープ治療薬の初回用量を対象に投与することと、薬剤のその後の用量をほぼ３週に１回投与することとを含む。いくつかの実施形態では、間欠的投薬戦略は、ウイルスエピトープ治療薬の初回用量を対象に投与することと、薬剤のその後の用量をほぼ４週に１回投与することとを含む。いくつかの実施形態では、薬剤は間欠的投薬戦略を使用して投与され、追加の治療剤は毎週投与される。
本発明は、本明細書に記載されているウイルスエピトープ治療薬を含む組成物を提供する。本発明はまた、本明細書に記載されているウイルスエピトープ治療薬と薬学的に許容されるビヒクルとを含む医薬組成物も提供する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は免疫療法で使用される。いくつかの実施形態では、組成物はウイルス複製の阻害に使用される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、対象（例えば、ヒト患者）にてウイルス複製を阻害するのに使用される。
製剤は、本発明の抗原治療薬を薬学的に許容されるビヒクル（例えば、担体または賦形剤）と組み合わせることによって、貯蔵及び使用のために調製される。当業者は一般に、製剤または医薬組成物の不活性成分である薬学的に許容される担体、賦形剤、及び／または安定剤を検討する。例示的な製剤はＷＯ２０１５／０９５８１１に列挙されている。
好適な薬学的に許容されるビヒクルには、非毒性緩衝液、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸；塩化ナトリウムのような塩；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；保存剤、例えば、オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール、アルキルパラベン、例えば、メチルもしくはプロピルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３－ペンタノール、及びｍ－クレゾール；低分子量（約１０アミノ酸残基未満）のポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジン；単糖類、二糖類、グルコース、マンノース、またはデキストリンのような炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖類、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース、またはソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体、例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体；及び非イオン性界面活性、例えば、ＴＷＥＥＮまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられるが、これらに限定されない。（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２２ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１２，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ．）。一実施形態では、ビヒクルは５％デキストロース水溶液である。
本明細書に記載されている医薬組成物は、局所治療または全身治療のいずれかのためにかなり多数の方法で投与することができる。投与は、表皮または経皮の貼付剤、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、点滴剤、坐剤、スプレー、液体及び粉末による局所的投与、ネブライザー、気管内、及び鼻腔内投与を含む、粉末またはエアロゾルの吸入または吹送による肺内投与；経口投与；あるいは静脈内投与、動脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、筋肉内投与（例えば、注射または注入）、または頭蓋内投与（例えば、髄腔内投与または脳室内投与）を含む非経口投与であることができる。
治療製剤は単位剤形であることができる。そのような製剤には、錠剤、丸薬、カプセル剤、粉末、顆粒、水性もしくは非水性の媒体における溶液もしくは懸濁液、または坐薬が挙げられる。
本明細書に記載されているウイルスエピトープペプチドはマイクロカプセルに封入することもできる。そのようなマイクロカプセルは、例えば、コアセルベーション技術によって、または界面重合によって、例えば、コロイド薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子、及びナノカプセル）またはＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２２ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１２，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎに記載されているようなマクロエマルションにおけるそれぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン－マイクロカプセル及びポリ－（メチルメタクリレート（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ））マイクロカプセルによって調製される。
特定の実施形態では、医薬製剤はリポソームと複合体を形成した、本明細書に記載されているウイルスエピトープ治療薬を含む。リポソームを作り出す方法は当業者に知られている。例えば、一部のリポソームはホスファチジルコリン、コレステロール、及びＰＥＧ誘導ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＰＥ）を含む脂質組成物による逆相蒸発法によって生成することができる。リポソームは、所定の細孔サイズのフィルターを通して押し出されて、所望の直径を持つリポソームが得ることができる。
特定の実施形態では、本明細書に記載されているウイルスエピトープペプチドを含む持続放出製剤を製造することができる。持続放出製剤の好適な例には、薬剤を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、これらのマトリックスは、成形物品（例えば、フィルムまたはマイクロカプセル）の形態である。持続放出マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル、例えば、ポリ（２－ヒドロキシエチル－メタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール）、ポリラクチド、Ｌ－グルタミン酸及び７エチル－Ｌ－グルタミン酸のコポリマー、非分解性エチレン－酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴＴＭ（乳酸－グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドから構成される注射可能なミクロスフェア）のような分解性乳酸－グリコール酸コポリマー、酢酸イソ酪酸スクロース、及びポリ－Ｄ－（－）－３－ヒドロキシ酪酸が挙げられる。
ストリング構築物の設計及びワクチン組成物
一態様では、本明細書で提供されているのは、２０１９ ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ウイルスに対する免疫応答を増強する、誘導する、促進する、強化するまたは改善するための組成物及び方法である。一実施形態では、本明細書に記載されている組成物及び方法は、２０１９ ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ウイルスに対する免疫記憶を増強する、誘導する、促進する、強化するまたは改善するように設計されている。一実施形態では、本明細書に記載されている組成物及び方法は、２０１９ ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ウイルスのスパイクタンパク質に向けられたワクチンのような一次ワクチンに対する免疫的追加免疫として作用するように設計されている。一実施形態では、組成物は１以上のＳＡＲＳ ＣＯＶ－２エピトープをコードする１以上のポリヌクレオチド構築物（本明細書では「ストリング」と呼ばれる）を含む。本明細書では、コード鎖及び非コード鎖の双方が企図される。いくつかの実施形態では、ストリングはタンデムになって複数のＳＡＲＳ ＣＯＶ－２エピトープをコードするポリヌクレオチド鎖を指す。いくつかの実施形態では、約２～約１００、約２～約１０００、または約２～約１０，０００のエピトープが１つのストリングにコードされる。いくつかの実施形態では、約２～５０００のＳＡＲＳ ＣＯＶ－２エピトープが１つのポリヌクレオチドストリングにコードされる。いくつかの実施形態では、約２～４０００のＳＡＲＳ ＣＯＶ－２エピトープが１つのポリヌクレオチドストリングにコードされる。いくつかの実施形態では、約２～３０００のＳＡＲＳ ＣＯＶ－２エピトープが１つのポリヌクレオチドストリングにコードされる。いくつかの実施形態では、約２～２０００のＳＡＲＳ ＣＯＶ－２エピトープが１つのポリヌクレオチドストリングにコードされる。いくつかの実施形態では、約２～１０００のＳＡＲＳ ＣＯＶ－２エピトープが１つのポリヌクレオチドストリングにコードされる。いくつかの実施形態では、約１０～５００のＳＡＲＳ ＣＯＶ－２エピトープが１つのポリヌクレオチドストリングにコードされる。いくつかの実施形態では、約１０～２００のＳＡＲＳ ＣＯＶ－２エピトープが１つのポリヌクレオチドストリングにコードされる。いくつかの実施形態では、約２０～１００のＳＡＲＳ ＣＯＶ－２エピトープが１つのポリヌクレオチドストリングにコードされる。
いくつかの実施形態では、ストリング構築物によってコードされるＳＡＲＳ ＣＯＶ－２エピトープは、免疫応答を誘発するためにＨＬＡによってコードされるタンパク質によってＴ細胞に提示される可能性が高いとＨＬＡ結合及び提示予測ソフトウェアによって予測されるエピトープを含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡによってコードされるタンパク質により提示される可能性が高いと予測されるストリング構築物によってコードされるＳＡＲＳ ＣＯＶ－２エピトープは、表１～１２、１４Ａ、１４Ｂ及び１５に記載されているタンパク質またはペプチドのいずれか１つから選択される。いくつかの実施形態では、ストリング構築物によってコードされるＳＡＲＳ ＣｏＶ－２エピトープは、ＨＬＡによってコードされるタンパク質によって提示される可能性が高いと予測されるエピトープを含み、該エピトープは、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２Ａｉ、表２Ａｉｉ、表２Ｂ、表９、表１０、表１１、表１２、表１４Ａ、表１４Ｂ及び／または表１５に記載されているタンパク質のいずれか１つから選択される。いくつかの実施形態では、ストリング構築物におけるエピトープはヌクレオカプシドエピトープを含む。
いくつかの実施形態では、ストリング構築物におけるエピトープはスパイク（Ｓ）エピトープを含む。いくつかの実施形態では、ストリング構築物におけるエピトープは膜タンパク質エピトープを含む。いくつかの実施形態では、ストリング構築物におけるエピトープはＮＳＰ１、ＮＳＰ２、ＮＳＰ３、またはＮＳＰ４のエピトープを含む。いくつかの実施形態では、ストリング構築物はウイルスにおける２、３、４、またはそれ以上のタンパク質に由来する多数のエピトープを含む。いくつかの実施形態では、ストリング構築物は表９～１２及び１５に記載されている特徴を含む。いくつかの実施形態では、ストリング構築物は、配列番号ＲＳ Ｃ１ｎ、ＲＳ Ｃ２ｎ、ＲＳ Ｃ３ｎ、ＲＳ Ｃ４ｎ、配列番号ＲＳ Ｃ５ｎ、ＲＳ Ｃ６ｎ、ＲＳ Ｃ７ｎ、ＲＳ Ｃ８ｎで示される配列、または配列番号ＲＳ Ｃ１ｎ、ＲＳ Ｃ２ｎ、ＲＳ Ｃ３ｎ、ＲＳ Ｃ４ｎ、配列番号ＲＳ Ｃ５ｎ、ＲＳ Ｃ６ｎ、ＲＳ Ｃ７ｎ、ＲＳ Ｃ８ｎに示される配列のいずれか１つと少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ストリング構築物は、リンカーのような追加の配列、及びペプチド自己切断配列、例えば、Ｔ２Ａ配列またはＰ２Ａ配列をコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、ストリング構築物は２以上の重複するエピトープ配列を含む。いくつかの実施形態では、ストリング構築物は、配列番号ＲＳ Ｃ１ｎ、ＲＳ Ｃ２ｎ、ＲＳ Ｃ３ｎ、ＲＳ Ｃ４ｎ、配列番号ＲＳ Ｃ５ｎ、ＲＳ Ｃ６ｎ、ＲＳ Ｃ７ｎ、ＲＳ Ｃ８ｎの配列のいずれか１つに対して８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％配列同一性である配列を含む。
いくつかの実施形態では、エピトープは、例えば、対象のＨＬＡ対立遺伝子レパートリーによる認識を最大化することによってストリングの免疫原性を最大化するようにストリング上に配置される。いくつかの実施形態では、同じストリングが、異なるＨＬＡ対立遺伝子に結合できる、または結合すると予測されるエピトープをコードする。例えば、配列表、例えば、少なくとも表９、１０、１１、１２、１４Ａ及び１４Ｂ、及び１５にて十分に例示されているように、ストリングは：（ａ）第１のＨＬＡ対立遺伝子によってコードされる第１のＭＨＣペプチドに結合する、または結合すると予測される第１のエピトープ；（ｂ）第２のＨＬＡ対立遺伝子によってコードされる第２のＭＨＣペプチドに結合する、または結合すると予測される第２のエピトープ；（ｃ）第３のＨＬＡ対立遺伝子によってコードされる第３のＭＨＣペプチドに結合する、または結合すると予測される第３のエピトープを含むエピトープ（複数可）をコードし、且つ、例えば、ＲＳ－Ｃ１またはＲＳ－Ｃ２等のストリング配列におけるようにさらなるそのようなエピトープを加えることができ、その際、第１、第２及び第３のエピトープは、同じウイルスタンパク質または異なるウイルスタンパク質に由来するエピトープである。このようにして、単一のストリングによってコードされるエピトープ分布は異なるＭＨＣに基づくＴ細胞への提示に当たるように最大化され、それによって、所与の集団にてさらに広い範囲の患者から抗ウイルス応答を生成する確率及び各患者の応答の堅牢性を最大化する。いくつかの実施形態では、エピトープは、ＲＥＣＯＮ予測アルゴリズムのような信頼できる予測アルゴリズムまたはシステムによるＨＬＡへの結合に関する高スコア予測に基づいて選択される。いくつかの実施形態では、本開示は、非エピトープ配列またはエピトープに隣接する配列の有無にかかわらず、ストリングによってコードされるエピトープの配置にて、非常に信頼性が高く効率的な予測アルゴリズムに基づいてエピトープを選択することによって、特に成功したストリングを提供できるという見通しを提供し、これは、ストリングの免疫原性が生体外細胞培養モデルまたは動物モデルで、具体的には、エピトープ特異的Ｔ細胞応答の知見を伴うストリング構築物またはストリング構築物によってコードされるポリペプチドによるワクチン接種後のＴ細胞誘導を示すことで検証されるようなものである。いくつかの実施形態では、検証は、ヒト患者での使用に由来してもよく、ワクチン接種後の患者から得られたＴ細胞がエピトープ特異的で効率的且つ持続的なＴ細胞応答を示すという知見によるものでもよい。一実施形態では、ワクチンとしてのストリングの効率はその設計によって影響され、その設計は、とりわけ、設計の思慮深い実行に使用されるバイオインフォマティクス情報の強度、ＭＨＣ提示予測モデルの信頼性、ストリングワクチンが細胞内で発現されるときのエピトープ処理の効率に部分的に依存する。
いくつかの実施形態では、ストリング構築物におけるエピトープコード配列には、さらに高い免疫原性、ＭＨＣへのペプチド提示のためのさらに良好な切断性、さらに良好な発現、及び／または対象における細胞での改善された翻訳のために選択された１以上の配列が隣接する。隣接配列は特定の切断可能な配列を持つリンカーを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ストリング構築物におけるエピトープコード配列には分泌タンパク質配列が隣接する。いくつかの実施形態では、ストリング配列は、ＭＦＶＦＬＶＬＬＰＬＶＳＳＱＣＶＮＬＴのような分泌配列、またはそれに対して１、２、３、４、もしくは多くても５のアミノ酸の差異を有する少なくとも配列を含んでもよい、またはそうでなければそれに連結されてもよいエピトープをコードする。いくつかの実施形態では、ストリング配列は、配列ＭＦＶＦＬＶＬＬＰＬＶＳＳＱＣＶＮＬＴ、またはそれに対して１、２、３、４、もしくは多くても５のアミノ酸の差異を有する配列によってＮ末端で連結されてもよいエピトープをコードする。連結された配列は特定の切断可能な配列を持つリンカーを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ストリング構築物は膜貫通ドメイン（ＴＭ）に連結される。いくつかの実施形態では、ストリング配列は、ＴＭドメイン配列ＥＱＹＩＫＷＰＷＹＩＷＬＧＦＩＡＧＬＩＡＩＶＭＶＴＩＭＬＣＣＭＴＳＣＣＳＣＬＫＧＣＣＳＣＧＳＣＣＫＦＤＥＤＤＳＥＰＶＬＫＧＶＫＬＨＹＴ、またはそれに対して１、２、３、４、もしくは多くても５のアミノ酸の差異を有する配列によってＣ末端配列で連結されてもよいエピトープをコードする。いくつかの実施形態では、１以上のリンカー配列は切断配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、リンカーは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上のアミノ酸の長さを有してもよい。いくつかの実施形態では、約３０以下、２５、２０、１５、１０、またはそれ以下のアミノ酸のリンカーが使用される。一般に、任意のアミノ酸がリンカー配列として存在してもよい。いくつかの実施形態では、リンカーまたは切断配列はリジン（Ｋ）を含有する。いくつかの実施形態では、リンカーまたは切断配列はアルギニン（Ｒ）を含有する。いくつかの実施形態では、リンカーまたは切断配列はメチオニン（Ｍ）を含有する。いくつかの実施形態では、リンカーまたは切断配列はチロシン（Ｙ）を含有する。いくつかの実施形態では、リンカーは、切断予測因子に基づいてアミノ酸を含むように設計されて、高度に切断可能な配列のペプチド配列を生成し、Ｔ細胞ワクチン設定において免疫原性Ｔ細胞エピトープを送達する新規の且つ効果的な方法である。いくつかの実施形態では、ストリング構築物にコードされたエピトープ分布及びそれらの並置は、エピトープのアミノ酸配列及び／または隣接残基または連結残基が寄与する切断配列を促進するように設計され、それによって最小限のリンカー配列を使用する。いくつかの例示的な切断配列は、ＦＲＡＣ、ＫＲＣＦ、ＫＫＲＹ、ＡＲＭＡ、ＲＲＳＧ、ＭＲＡＣ、ＫＭＣＧ、ＡＲＣＡ、ＫＫＱＧ、ＹＲＳＹ、ＳＦＭＮ、ＦＫＡＡ、ＫＲＮＧ、ＹＮＳＦ、ＫＫＮＧ、ＲＲＲＧ、ＫＲＹＳ、及びＡＲＹＡのうちの１以上であってもよい。とりわけ、本明細書に含まれるＭＳデータは、結合について高度に予測されるエピトープが結局はＴ細胞に提示され、且つ免疫原性であることを実証している。
いくつかの実施形態では、ストリング構築物はｍＲＮＡであってもよい。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、それぞれが複数のＳＡＲＳ ＣｏＶ－２エピトープをコードする配列を含む、１以上のｍＲＮＡストリング構築物を含んでもよい。いくつかの実施形態では、１以上のｍＲＮＡは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２スパイクタンパク質に由来する複数のエピトープを含んでもよく、その際、複数のエピトープのそれぞれは、ＨＬＡ結合及び提示予測アルゴリズムによって、ＨＬＡによりコードされるタンパク質によって免疫応答を誘発するためにＴ細胞に提示される可能性が高いと予測される。いくつかの実施形態では、１以上のｍＲＮＡは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ヌクレオカプシドタンパク質由来の複数のエピトープを含んでもよく、その際、複数のエピトープのそれぞれはＨＬＡ結合及び提示予測アルゴリズムによって、ＨＬＡによりコードされるタンパク質によって免疫応答を誘発するためにＴ細胞に提示される可能性が高いと予測される。いくつかの実施形態では、１以上のｍＲＮＡは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２スパイク、またはヌクレオカプシドタンパク質、または膜タンパク質または他のタンパク質に由来する複数のエピトープを含んでもよく、その際、複数のエピトープのそれぞれはＨＬＡ結合及び提示予測アルゴリズムによって、ＨＬＡによりコードされるタンパク質によって免疫応答を誘発するためにＴ細胞に提示される可能性が高いと予測される。いくつかの実施形態では、複数のエピトープは単一の２０１９ ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２タンパク質由来のエピトープを含んでもよい。いくつかの実施形態では、複数のエピトープは複数の２０１９ ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２タンパク質由来のエピトープを含んでもよい。いくつかの実施形態では、複数のエピトープは２０１９ ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドタンパク質由来のエピトープを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ＵＴＲはポリＡ配列を含んでもよい。ポリＡ配列は５０～２００の間のヌクレオチド長であってもよい。いくつかの実施形態では、２０１９ ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ウイルスエピトープはシグナルペプチド配列、例えば、ＳＰ１配列が隣接して、エピトープの処理及び提示を増強してもよい。いくつかの実施形態では、２０１９ ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ウイルスエピトープはＭＩＴＤ配列が隣接してエピトープの処理及び提示を増強する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはｄＥａｒＩ－ｈＡｇ配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリＡテールは、約５０以上、約６０以上、約７０以上、約８０以上、約９０以上、約１００以上、約１２０、または約１５０または約２００のような特定の数のアデノシンを含む。いくつかの実施形態では、ストリング構築物のポリＡテールは２００以下のＡ残基を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ストリング構築物のポリＡテールは約２００のＡ残基を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ストリング構築物のポリＡテールは１８０以下のＡ残基を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ストリング構築物のポリＡテールは約１８０のＡ残基を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ポリＡテールは１５０以下の残基を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ストリング構築物のポリＡテールは約１５０のＡ残基を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ポリＡテールは１２０以下の残基を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ストリング構築物のポリＡテールは約１２０のＡ残基を含んでもよい。
いくつかの実施形態では、複数のエピトープをコードするストリング構築物のヌクレオチド配列はコドン最適化されてもよい。コドン最適化配列の例は、真核生物、例えばヒトでの発現に最適化された配列（すなわち、ヒトでの発現に最適化されている）、または別の真核生物、動物もしくは哺乳類での発現に最適化された配列であってもよい。ヒト以外の宿主種に対するコドン最適化、または特定の臓器に対するコドン最適化が知られている。いくつかの実施形態では、タンパク質をコードするコード配列はヒト細胞のような真核細胞における発現のために最適化されたコドンであってもよい。コドン最適化とは、天然の配列の少なくとも１つのコドン（例えば、約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０もしくはそれ以上、またはこれらの数を超える数のコドン）を目的の宿主細胞の遺伝子にてさらに頻繁にまたは最も頻繁に使用される一方で天然のアミノ酸配列を維持するコドンによって置換することにより、その宿主細胞における発現を増強するために核酸配列を修飾するプロセスを指す。種々の種が、特定のアミノ酸の特定のコドンに対して特定の偏りを示す。コドンバイアス（生物間のコドン使用頻度の差異）はメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳効率と相関することが多く、それは、とりわけ、翻訳されるコドンの特性と特定のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存すると考えられている。細胞における選択されたｔＲＮＡの優位性は一般に、ペプチド合成で最も頻繁に使用されるコドンを反映したものであってよい。したがって、コドン最適化に基づいて、所与の生物における最適な遺伝子発現のために遺伝子を調整してもよい。コドン使用頻度表は、例えば、ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒｊｐ／ｃｏｄｏｎ／で入手可能な「Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅ」で容易に入手可能であり、これらの表は多数の方法で適応させてもよい。Ｇｅｎｅ Ｆｏｒｇｅ（Ａｐｔａｇｅｎ；Ｊａｃｏｂｕｓ，ＰＡ）のような特定の宿主細胞での発現のために特定の配列をコドン最適化するコンピューターアルゴリズムも利用できる。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡの安定性及び翻訳効率は、ＲＮＡの安定性及び／または翻訳効率に寄与するために確立された１以上の要素を組み込んでもよく；例示的なそのような要素は、例えば、参照によって本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＥＰ２００６／００９４４８に記載されている。本発明に従って使用されるＲＮＡの発現を増やすために、ＧＣ含量を増やしてｍＲＮＡの安定性を高め、コドン最適化を実行するので細胞における翻訳を増強できるように、発現されているペプチドまたはタンパク質の配列を変えることなく、コード領域内にて、すなわち、発現されているペプチドまたはタンパク質をコードする配列内にてＲＮＡが修飾されてもよい。
いくつかの実施形態では、ストリング構築物はＦ要素を含んでもよい。いくつかの実施形態では、Ｆ要素配列は分割のアミノ末端エンハンサー（ＡＥＳ）の３ＵＴＲである。
いくつかの実施形態では、上記のようなストリングｍＲＮＡ構築物は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５またはそれ以上のエピトープを含んでもよい。いくつかの実施形態では、医薬組成物は２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以上のストリングを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は６のストリングを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は７のストリングを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は８のストリングを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は９のストリングを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は１０のストリングを含む。
いくつかの実施形態では、ストリング構築物はポリヌクレオチドであってもよく、ポリヌクレオチドはＤＮＡである。
いくつかの実施形態では、上記の１以上のストリングｍＲＮＡ構築物を含む医薬組成物は脂質ナノ粒子にてカプセル化されてもよい。脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、直径１００～２５０ｎｍであってもよい。いくつかの実施形態では、複数の脂質ナノ粒子は、２００ｎｍ未満、１５０ｎｍ未満、１００ｎｍ未満、８０ｎｍ未満、７５ｎｍ未満、またはそれ以下の平均粒度を有してもよい。いくつかの実施形態では、複数の脂質ナノ粒子は、少なくとも３０ｎｍ、少なくとも５０ｎｍ、少なくとも６０ｎｍ、少なくとも７０ｎｍ、少なくとも８０ｎｍ、少なくとも９０ｎｍ、少なくとも１００ｎｍ、少なくとも１２５ｎｍ、少なくとも１５０ｎｍ、またはそれ以上の平均粒度を有してもよい。上述の範囲の組み合わせも可能である。いくつかの実施形態では、複数の脂質ナノ粒子は３０ｎｍ～２００ｎｍ、または３０ｎｍ～１００ｎｍ、または５０ｎｍ～８０ｎｍ、または５０ｎｍ～８０ｎｍ未満の平均粒度を有してもよい。いくつかの実施形態では、ＬＮＰはカチオン性脂質を含んでもよい。ＬＮＰは非カチオン性脂質を含んでもよい。ＬＮＰはＰＥＧ修飾脂質を含んでもよい。ＬＮＰはステロールまたはステロイド脂質を含んでもよい。いくつかの実施形態では、上記のような１以上のストリングｍＲＮＡ構築物を含む医薬組成物は、いくつかの実施形態では、例えば、タンパク質ベース、ＲＮＡベース、ＤＮＡベース、ウイルスベクターベースのワクチンであることができ、前に、後で、または同時に投与されてもよい別の２０１９ ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ワクチンとともに投与されてもよい。いくつかの実施形態では、上記のような１以上のストリングｍＲＮＡ構築物を含む医薬組成物は、対象が本明細書に記載されている医薬組成物と別の２０１９ ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ワクチン（例えば、Ｓタンパク質またはその免疫原性断片のようなＳＡＲＳ ＣｏＶ－２タンパク質に対する抗体の産生を誘導するワクチン）の組み合わせを受け取るようにそれを必要とする対象に投与されてもよい。例えば、いくつかの実施形態では、上記のような１以上のストリングｍＲＮＡ構築物を含む医薬組成物は、別の２０１９ ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ワクチン（例えば、Ｓタンパク質またはその免疫原性断片のような２０１９ ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２タンパク質に対する抗体の産生を誘導するワクチン）を受けているまたは受けたことがある対象に投与されてもよい。
いくつかの実施形態では、上記のような１以上のストリングｍＲＮＡ構築物を含む医薬組成物は、ＳＡＲＳ ＣＯＶ－２スパイクタンパク質に対するワクチンと同時投与されてもよい。いくつかの実施形態では、ワクチンは、例えば、以下の仕様のいずれかを有してもよい２０１９ ＳＡＲＳ ＣＯＶ－２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質、またはそれをコードする核酸配列を含む：
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質をコードする例示的な構築物
構造：ｍ２７，３’－ＯＧｐｐｐ（ｍ１２’－Ｏ）ＡｐＧ）－ｈＡｇ－Ｋｏｚａｋ－Ｓ１Ｓ２－ＰＰ－ＦＩ－Ａ３０Ｌ７０
コードされた抗原：ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２のウイルススパイクタンパク質（Ｓ１Ｓ２タンパク質）（Ｓ１Ｓ２全長タンパク質、配列変異型）
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質をコードする例示的なヌクレオチド配列
ヌクレオチド配列は太字で示されている個々の配列要素とともに示されている。加えて、翻訳されたタンパク質の配列は、コードヌクレオチド配列の下にイタリック体で示されている。（＊＝終止コドン）。
Figure 2023518821000302
Figure 2023518821000303
Figure 2023518821000304
Figure 2023518821000305
Figure 2023518821000306
Figure 2023518821000307
 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質をコードする例示的な構築物
構造：ｍ２７，３’－ＯＧｐｐｐ（ｍ１２’－Ｏ）ＡｐＧ）－ｈＡｇ－Ｋｏｚａｋ－Ｓ１Ｓ２－ＰＰ－ＦＩ－Ａ３０Ｌ７０
コードされた抗原：ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２のウイルススパイクタンパク質（Ｓ１Ｓ２タンパク質）（Ｓ１Ｓ２全長タンパク質、配列変異型）
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質をコードする例示的なヌクレオチド配列
ヌクレオチド配列は、太字で示されている個々の配列要素とともに示されている。さらに、翻訳されたタンパク質の配列はコードヌクレオチド配列の下にイタリック体で示されている。（＊＝終止コドン）。





























Figure 2023518821000308










Figure 2023518821000309
Figure 2023518821000310
Figure 2023518821000311
Figure 2023518821000312
いくつかの実施形態では、ストリング構築物によってコードされるポリペプチドをコードする１以上のポリヌクレオチドを含む医薬組成物は、ウイルス性疾患、例えば、ＣＯＶＩＤを治療するための別のワクチンとともに同時投与されてもよい。いくつかの実施形態では、ストリング構築物を含む医薬組成物は、例えば、ＳＡＲＳ ＣＯＶ－２タンパク質、例えば、ｏｒｆ１ａｂポリタンパク質、ｏｒｆ１ａポリタンパク質、表面糖タンパク質（Ｓ）、ヌクレオカプシドリンタンパク質（Ｎ）、ＯＲＦ３ａタンパク質、膜糖タンパク質（Ｍ）、ＯＲＦ７ａタンパク質、ＯＲＦ８タンパク質、エンベロープタンパク質（Ｅ）、ＯＲＦ６タンパク質、ＯＲＦ７ｂタンパク質またはＯＲＦ１０タンパク質に結合することができる中和抗体のような抗体と同時投与されてもよい。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ＳＡＲＳスパイクタンパク質に向けられた抗体と同時投与されてもよい。いくつかの実施形態では、ストリング構築物によってコードされるポリペプチドをコードする１以上のポリヌクレオチドを含む医薬組成物は、上記の別のワクチンを含む治療計画の前に、後で、または同時に投与されてもよい。
いくつかの態様では、特にＳＡＲＳ ＣＯＶ－２のヌクレオカプシドタンパク質エピトープを含むストリング構築物によってコードされるポリペプチドは、ウイルスに対する免疫原性及び免疫記憶を増強するように設計される。試験における現在のワクチンのいくつかは、免疫原性応答を付与する可能性が高いが、Ｔ細胞応答を誘発するまたは促進すると考えられていないウイルススパイクタンパク質に向けられたワクチンを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているストリング構築物またはストリング構築物によってコードされるポリペプチドを含むワクチンは、Ｔ細胞応答を誘発する、または促進することができ、及び／または持続的な免疫記憶を誘発する、または促進することができる。いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２に対するワクチンは、例えば、初回刺激後の追加免疫のような投与計画の一部として、本明細書に記載されている１以上のストリングワクチン組成物を伴ってもよい。いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２に対するワクチンは、ｍＲＮＡベース、ウイルスベクターベース（例えば、複製及び／または非複製）、ＤＮＡベース、タンパク質ベース（例、タンパク質サブユニット及び／またはウイルス様粒子）、及び／または不活化／弱毒化ウイルスベースであってもよい。いくつかの実施形態では、そのようなワクチンはスパイクタンパク質またはその免疫原性断片に向けられる。いくつかの実施形態では、そのようなＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ワクチンはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するｍＲＮＡベースのワクチンであってもよく、またはそれを含んでもよく、例えば、いくつかの実施形態ではＳＡＲＳ ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の感染前の安定化された形態をコードするＭｏｄｅｒｎａによって開発されたｍＲＮＡベースのワクチン（ｍＲＮＡ－１２７３）であってもよく、またはそれを含んでもよい。いくつかの実施形態では、そのようなＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ワクチンは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するウイルスベクターベースのワクチンであってもよく、またはそれを含んでもよく、例えば、いくつかの実施形態では、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａによって開発された、アデノウイルスの弱体化型であるウイルス（例えば、ＣｈＡｄＯｘ１）から作られる、ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２スパイクタンパク質をコードするアデノウイルスワクチンベクターベースのワクチン（ＡＺＤ１２２２）であってもよく、またはそれを含んでもよい。
ストリング構築物またはストリング構築物によってコードされるポリペプチドを含む医薬組成物
一態様では、ストリングワクチンを含む医薬組成物は、患者に単独で、または他の薬物もしくはワクチンと併用して投与されてもよい。
いくつかの実施形態では、ストリングワクチンを含む医薬組成物は、ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ウイルス感染のための別のワクチンまたは薬物の初回投与の前に、同時に、または後で投与されてもよい。
いくつかの実施形態では、ストリングワクチンを含む医薬組成物はＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ウイルス感染症のための別のワクチンまたは薬物の投与の７日、２週、３週、４週、５週、６週、７週、８週、９週、１０週、１１週、１２週、１４週、１６週、１８週、または２０週以上前に投与されてもよい。ストリングワクチンを含む医薬組成物は、予防的に、または予防ワクチンとして、例えば毎年のインフルエンザシーズンの開始時にインフルエンザワクチンと同様に投与されてもよい。
いくつかの実施形態では、ストリングワクチンを含む医薬組成物は２０１９ ＳＡＲＳ ＣｏＶ２ウイルス感染症のためのワクチンまたは薬物の投与の７日、２週、３週、４週、５週、６週、７週、８週、９週、１０週、１１週、１２週、１４週、１６週、１８週、または２０週以上後に投与されてもよい。いくつかの実施形態では、ストリングワクチンを含む医薬組成物は、別の２０１９ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ワクチン療法の３ヵ月後に投与されてもよい。いくつかの実施形態では、ストリングワクチンを含む医薬組成物は、別の２０１９ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ワクチン療法の６ヵ月後に投与されてもよい。いくつかの実施形態では、ストリングワクチンを含む医薬組成物は、別の２０１９ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ワクチン療法の８ヵ月後に投与されてもよい。いくつかの実施形態では、ストリングワクチンを含む医薬組成物は、別の２０１９ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ワクチン療法の９ヵ月後に投与されてもよい。いくつかの実施形態では、ストリングワクチンを含む医薬組成物は、別のＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ワクチン療法の１０ヵ月後に投与されてもよい。いくつかの実施形態では、ストリングワクチンを含む医薬組成物は、別の２０１９ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ワクチン療法の１２ヵ月後に投与されてもよい。
いくつかの実施形態では、ストリングワクチンを含む医薬組成物は、２日、７日、２週、３週、４週、５週、６週、７週、８週、９週、１０週、１２週ごとにまたはそれ以上ごとに１回投与されてもよい。いくつかの実施形態では、ストリングワクチン（例えば、本明細書に記載されているようなもの）を含む医薬組成物は２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日ごとにまたはそれ以上ごとに１回投与されてもよい。いくつかの実施形態では、ストリングワクチン（例えば、本明細書に記載されているようなもの）を含む医薬組成物は３ヵ月、４ヵ月、５ヵ月、６ヵ月、７ヵ月、８ヵ月、９ヵ月、１０ヵ月、１１ヵ月、１２ヵ月ごとにまたはそれ以上ごとに１回投与されてもよい。いくつかの実施形態では、対象は、ストリングワクチン（例えば、本明細書に記載されているようなもの）を含む医薬組成物の少なくとも２回の用量を投与されてもよく、ストリングワクチンを含む医薬組成物の少なくとも２回の用量は２０日間の間隔で投与されてもよい。いくつかの実施形態では、そのような２回の用量は２１日の間隔で投与されてもよい。いくつかの実施形態では、そのような２回の用量は２２日の間隔で投与されてもよい。いくつかの実施形態では、そのような２回の用量は２３日の間隔で投与されてもよい。いくつかの実施形態では、そのような２回の用量は２４日の間隔で投与されてもよい。いくつかの実施形態では、そのような２回の用量は２５日の間隔で投与されてもよい。いくつかの実施形態では、そのような２回の用量は２６日の間隔で投与されてもよい。いくつかの実施形態では、そのような２回の用量は２７日の間隔で投与されてもよい。いくつかの実施形態では、そのような２回の用量は２８日の間隔で投与されてもよい。いくつかの実施形態では、ストリングワクチンを含む医薬組成物は、さらに頻繁な投薬を含む初回刺激用量の初期段階の後、６ヵ月ごとに１回、または８ヵ月ごとに１回または１２ヵ月ごとに１回、追加免疫（または維持）として投与されてもよい。いくつかの実施形態では、初回刺激用量は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の用量を含んでもよい。
いくつかの実施形態では、ストリングワクチン組成物は１人当たり１回の投与につき１～１０００マイクログラムの間の用量で使用されてもよい。いくつかの実施形態では、ストリングワクチン組成物は１人当たり１回の投与につき１～６００マイクログラムの用量で投与されてもよい。いくつかの実施形態では、ストリングワクチン組成物は１人当たり１回の投与につき１～５００マイクログラムの用量で投与されてもよい。いくつかの実施形態では、ストリングワクチン組成物は１人当たり１回の投与につき１～４００マイクログラムの用量で投与されてもよい。いくつかの実施形態では、ストリングワクチン組成物は１人当たり１回の投与につき１～３００マイクログラムの用量で投与されてもよい。いくつかの実施形態では、ストリングワクチン組成物は１人当たり１回の投与につき１～２００マイクログラムの用量で投与されてもよい。いくつかの実施形態では、ストリングワクチン組成物は１人当たり１回の投与につき１０～３００マイクログラムの用量で投与されてもよい。いくつかの実施形態では、ストリングワクチン組成物は１人当たり１回の投与につき１０～２００マイクログラムの用量で投与されてもよい。いくつかの実施形態では、ストリングワクチン組成物は１人当たり１回の投与につき１０～１００マイクログラムの用量で投与されてもよい。いくつかの実施形態では、ストリングワクチン組成物は１人当たり１回の投与につき１０マイクログラムの用量で投与されてもよい。いくつかの実施形態では、ストリングワクチン組成物は１人当たり１回の投与につき２０マイクログラムの用量で投与されてもよい。いくつかの実施形態では、ストリングワクチン組成物は１人当たり１回の投与につき３０マイクログラムの用量で投与されてもよい。いくつかの実施形態では、ストリングワクチン組成物は１人当たり１回の投与につき４０マイクログラムの用量で投与されてもよい。いくつかの実施形態では、ストリングワクチン組成物は１人当たり１回の投与につき５０マイクログラムの用量で投与されてもよい。いくつかの実施形態では、ストリングワクチン組成物は１人当たり１回の投与につき６０マイクログラムの用量で投与されてもよい。いくつかの実施形態では、ストリングワクチン組成物は１人当たり１回の投与につき７０マイクログラムの用量で投与されてもよい。いくつかの実施形態では、ストリングワクチン組成物は１人当たり１回の投与につき８０マイクログラムの用量で投与されてもよい。いくつかの実施形態では、ストリングワクチン組成物は１人当たり１回の投与につき９０マイクログラムの用量で投与されてもよい。いくつかの実施形態では、ストリングワクチン組成物は１人当たり１回の投与につき１００マイクログラムの用量で投与されてもよい。いくつかの実施形態では、ストリングワクチン組成物は１人当たり１回の投与につき１２０マイクログラムの用量で投与されてもよい。いくつかの実施形態では、ストリングワクチン組成物は１人当たり１回の投与につき１５０マイクログラムの用量で投与されてもよい。
いくつかの実施形態では、ストリングワクチン組成物（例えば、本明細書に記載されているような）がＢＮＴ ＲＮＡワクチン組成物、例えば、いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子にカプセル化されてもよいウイルススパイクタンパク質（例えば、ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質またはその免疫原性断片（例えば、ＲＢＤ））をコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）を含む組成物との併用で投与される場合、そのようなＢＮＴ ＲＮＡワクチン組成物は、０．１マイクログラム～１００マイクログラム、１～６０マイクログラム、３～５０マイクログラム、３～３０マイクログラム、または１０～３０マイクログラムの範囲での用量で投与されてもよい。いくつかの実施形態では、そのようなＢＮＴ ＲＮＡワクチン組成物は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０マイクログラムまたはそれ以上の用量で投与されてもよい。いくつかの実施形態では、ＢＮＴ ＲＮＡワクチンは、ｍ２７，３’－ＯＧｐｐｐ（ｍ１２’－Ｏ）ＡｐＧ）－ｈＡｇ－Ｋｏｚａｋ－Ｓ１Ｓ２－ＰＰ－ＦＩ－Ａ３０Ｌ７０として表される構造を有することができる、ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質をコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）構築物を含む。
いくつかの実施形態では、ストリングワクチン組成物（例えば、本明細書に記載されているような）と併用で投与されるＢＮＴ ＲＮＡワクチン組成物（例えば、本明細書に記載されているような）は初回用量、例えば、初回刺激用量、及び経過観察用量、例えば、追加免疫用量を含んでもよい。いくつかの実施形態では、初回刺激用量及び追加免疫用量は２０日の間隔で投与される。いくつかの実施形態では、そのようなＢＮＴ ＲＮＡワクチン組成物の用量は２１日の間隔で投与されてもよい。いくつかの実施形態では、そのようなＢＮＴ ＲＮＡワクチン組成物の用量は２２日の間隔で投与されてもよい。いくつかの実施形態では、そのようなＢＮＴ ＲＮＡワクチン組成物の用量は２３日の間隔で投与されてもよい。いくつかの実施形態では、そのようなＢＮＴ ＲＮＡワクチン組成物は２４日の間隔で投与されてもよい。いくつかの実施形態では、そのようなＢＮＴ ＲＮＡワクチン組成物の用量は２５日の間隔で投与されてもよい。いくつかの実施形態では、そのようなＢＮＴ ＲＮＡワクチン組成物の用量は２６日の間隔で投与されてもよい。いくつかの実施形態では、そのようなＢＮＴ ＲＮＡワクチン組成物の用量は２７日の間隔で投与されてもよい。いくつかの実施形態では、そのようなＢＮＴ ＲＮＡワクチン組成物の用量は２８日の間隔で投与されてもよい。いくつかの実施形態では、そのようなＢＮＴ ＲＮＡワクチン組成物は、２８日より長い間隔で、例えば、１ヵ月、２ヵ月、３ヵ月、４ヵ月、５ヵ月、６ヵ月、７ヵ月、８ヵ月、９ヵ月、１０ヵ月、１１ヵ月、１２ヵ月ごとに、またはそれ以上ごとに投与されてもよい。
いくつかの実施形態では、ストリングワクチン組成物（例えば、本明細書に記載されているような）と併用して投与されるＢＮＴ ＲＮＡワクチン組成物（例えば、本明細書に記載されているような）は、ウイルススパイクタンパク質（例えば、ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質またはその免疫原性断片（例えば、ＲＢＤ））をコードする修飾ＲＮＡを含んでもよく、その際、１以上のウリジンヌクレオチド残基が修飾ウリジンヌクレオチド（例えば、１－メチルシュードウリジン）で置換されている。いくつかの実施形態では、構造のＵヌクレオチドの少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％または少なくとも７０％、または少なくとも８０％または少なくとも９０％が修飾ウリジンヌクレオチド（例えば、１－メチルシュードウリジン）によって置換される。いくつかの実施形態では、構造のＵヌクレオチドの１００％が修飾ウリジンヌクレオチド（例えば、１－メチルシュードウリジン）によって置換される
いくつかの実施形態では、スパイクタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むワクチンは、ストリング構築物を含むＲＮＡワクチンと同時投与されてもよい。いくつかの実施形態では、スパイクタンパク質ワクチンをコードするヌクレオチド配列を含むワクチンが初回用量として投与され、その後、経過観察用量、維持用量、第２の用量、第３の用量としての、または１回以上の追加免疫用量としての、２以上のウイルスタンパク質由来の２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上のエピトープをコードする配列を含むストリング構築物を含むＲＮＡワクチンが投与される。いくつかの実施形態では、スパイクタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むワクチンが初回用量として投与され、その後、経過観察用量、維持用量、第２の用量、第３の用量、または１回以上の追加免疫用量としての、２以上のウイルスタンパク質由来の２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上のエピトープをコードする配列を含むストリング構築物を含むＲＮＡワクチンが投与される。いくつかの実施形態では、２以上のウイルスタンパク質由来の２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上のエピトープをコードする配列を含むストリング構築物を含むＲＮＡワクチンが初回用量として対象に投与され、その後、経過観察用量、維持用量、第２の用量、第３の用量、または１回以上の追加免疫用量としてのスパイクタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むワクチンが投与される。
いくつかの実施形態では、ストリング構築物を含む医薬組成物は共製剤ワクチンを含んでもよい。いくつかの実施形態では、共製剤ワクチン組成物は、第１の濃度での第１のストリングワクチン、第２の濃度での第２のストリングワクチン、及び第３の濃度での第３のストリングワクチン等を含んでもよい。いくつかの実施形態では、第１ストリングワクチンはスパイクタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むワクチンを含んでもよい。
いくつかの実施形態では、共製剤組成物は、スパイクタンパク質またはその断片をコードするヌクレオチドワクチンを含む第１のポリヌクレオチド組成物を含んでもよい。いくつかの実施形態では、共製剤は上記のような構造ｍ２７，３’－ＯＧｐｐｐ（ｍ１２’－Ｏ）ＡｐＧ）－ｈＡｇ－Ｋｏｚａｋ－Ｓ１Ｓ２－ＰＰ－ＦＩ－Ａ３０Ｌ７０を有する第１のヌクレオチド配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、共製剤はＲＳ Ｃ５、ＲＳ Ｃ６、ＲＳ Ｃ７、及びＲＳ Ｃ８、またはそれらの組み合わせを含む第２の組成物を含んでもよい。いくつかの実施形態では、共製剤はＲＳ Ｃ１、ＲＳ Ｃ２、ＲＳ Ｃ３、及びＲＳ Ｃ４、またはそれらの組み合わせを含む第２の組成物を含んでもよい。いくつかの実施形態では、構造ｍ２７，３’－ＯＧｐｐｐ（ｍ１２’－Ｏ）ＡｐＧ）－ｈＡｇ－Ｋｏｚａｋ－Ｓ１Ｓ２－ＰＰ－ＦＩ－Ａ３０Ｌ７０を有する第１のヌクレオチド配列と、ＲＳ Ｃ１、ＲＳ Ｃ２、ＲＳ Ｃ３、ＲＳ Ｃ４、ＲＳ Ｃ５、ＲＳ Ｃ６、ＲＳ Ｃ７、またはＲＳ Ｃ８を有する第２のヌクレオチド配列は、２０：１、１９：１、１８：１、１７：１、１６：１、１５：１、１４：１、１３：１、１２：１、１１：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１また１：１の比で存在してもよい。いくつかの実施形態では、共製剤はＲＳ Ｃ１、ＲＳ Ｃ２、ＲＳ Ｃ３、及びＲＳ Ｃ４、またはそれらの組み合わせを含む第２の組成物を含んでもよい。いくつかの実施形態では、構造ｍ２７，３’－ＯＧｐｐｐ（ｍ１２’－Ｏ）ＡｐＧ）－ｈＡｇ－Ｋｏｚａｋ－Ｓ１Ｓ２－ＰＰ－ＦＩ－Ａ３０Ｌ７０を有する第１のヌクレオチド配列と、ＲＳ Ｃ１、ＲＳ Ｃ２、ＲＳ Ｃ３、ＲＳ Ｃ４、ＲＳ Ｃ５、ＲＳ Ｃ６、ＲＳ Ｃ７、またはＲＳ Ｃ８を有する第２のヌクレオチド配列は１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、１：１８、１：１９また１：２０の比で存在してもよい。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているポリヌクレオチド（例えば、ウイルススパイクタンパク質をコードするポリヌクレオチド及び／またはペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、本明細書に記載されているエピトープ配列を含む）を脂質ナノ粒子にてカプセル化することができる。いくつかの実施形態では、そのような脂質ナノ粒子は１以上のカチオン性脂質またはイオン化可能な脂質を含んでもよい。いくつかの実施形態では、そのような脂質ナノ粒子は任意で、中性脂質（例えば、リン脂質及び／またはコレステロールのようなステロール）、及び／またはＰＥＧ化脂質のようなポリマー結合脂質を含んでもよい。
いくつかの実施形態では、対象の特異的Ｔ細胞を含む医薬組成物は、生体外で生成されてもよく、その際、対象の特異的Ｔ細胞集団は、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２Ａｉ、表２Ａｉｉ、表２Ｂ、表９、表１０、表１１、表１２、表１４Ａ、表１４Ｂ、表１５もしくは表１６におけるエピトープのうちの少なくとも１つに、またはウイルス抗原に対応する本明細書で開示されている任意の抗原に応答性であってもよい。一実施形態では、対象由来のＰＢＭＣを（例えば、白血球除去試料から）単離し、表（表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２Ａｉ、表２Ａｉｉ、表２Ｂ、表９、表１０、表１１、表１２、表１４Ａ、表１４Ｂ、表１５もしくは表１６）のいずれか１つに開示されている１以上のエピトープの存在下でインキュベートしてもよい。いくつかの実施形態では、抗原は対象に存在するＭＨＣペプチドに基づいて選択されてもよいので、抗原ペプチドは表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２Ａｉ、表２Ａｉｉ、表２Ｂ、表９、表１０、表１１、表１２、表１４Ａ、表１４Ｂ、表１５または表１６に開示されているペプチド：ＭＨＣのペアに基づいてＭＨＣと組み合わせて高い親和性及び提示予測スコアを有する。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、（ｉ）ＮＹＮＹＬＹＲＬＦ；ＫＷＰＷＹＩＷＬＧＦ；ＱＹＩＫＷＰＷＹＩ；ＬＰＦＮＤＧＶＹＦ；ＱＰＴＥＳＩＶＲＦ；ＩＰＦＡＭＱＭＡＹ；ＹＬＱＰＲＴＦＬＬ；及び／またはＲＬＱＳＬＱＴＹＶから選択されるエピトープ配列を含むペプチド；（ｉｉ）ペプチドをコードするポリヌクレオチド；（ｉｉｉ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはＴＣＲを含むＴ細胞であって、ＴＣＲが対応するＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子と複合体を形成しているエピトープ配列に結合する、ＴＣＲまたはＴＣＲを含むＴ細胞；（ｉｖ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）を含む抗原提示細胞；または（ｖ）エピトープ配列に結合する抗体または該抗体を含むＢ細胞を含む。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞を含む医薬組成物は生体外で生成されてもよく、その際、Ｔ細胞は、ＮＹＮＹＬＹＲＬＦを含むまたはそれから成るエピトープ配列に応答性であってもよく、いくつかの実施形態では、対象はＨＬＡ－Ａ＊２４０２によってコードされるＭＨＣタンパク質を発現する。いくつかの実施形態では、対象の特異的Ｔ細胞を含む医薬組成物は生体外で生成されてもよく、その際、Ｔ細胞はＫＹＩＫＷＰＷＹＩを含むまたはそれから成るエピトープ配列に応答性であってもよく、いくつかの実施形態では、対象はＨＬＡ－Ａ＊２４０２によってコードされるＭＨＣタンパク質を発現する。いくつかの実施形態では、対象の特異的Ｔ細胞を含む医薬組成物は生体外で生成されてもよく、その際、Ｔ細胞はＫＷＰＷＹＩＷＬＧＦを含むまたはそれから成るエピトープ配列に応答性であってもよく、いくつかの実施形態では、対象はＨＬＡ－Ａ＊２４０２によってコードされるＭＨＣタンパク質を発現する。いくつかの実施形態では、対象の特異的Ｔ細胞を含む医薬組成物は生体外で生成されてもよく、その際、Ｔ細胞はＱＹＩＫＷＰＷＹＩを含むまたはそれから成るエピトープ配列に応答性であってもよく、いくつかの実施形態では、対象はＨＬＡ－Ａ＊２４０２によってコードされるＭＨＣタンパク質を発現する。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞を含む医薬組成物は生体外で生成されてもよく、その際、Ｔ細胞はＬＰＦＮＤＧＶＹＦを含むまたはそれから成るエピトープ配列に応答性であってもよく、いくつかの実施形態では、対象はＨＬＡ－Ｂ＊３５０１によってコードされるＭＨＣタンパク質を発現する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞を含む医薬組成物は生体外で生成されてもよく、その際、Ｔ細胞はＱＰＴＥＳＩＶＲＦを含むまたはそれから成るエピトープ配列に応答性であってもよく、いくつかの実施形態では、対象はＨＬＡ－Ｂ＊３５０１によってコードされるＭＨＣタンパク質を発現する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞を含む医薬組成物は生体外で生成されてもよく、その際、Ｔ細胞はＩＰＦＡＭＱＭＡＹを含むまたはそれから成るエピトープ配列に応答性であってもよく、いくつかの実施形態では、対象はＨＬＡ－Ｂ＊３５０１によってコードされるＭＨＣタンパク質を発現する。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞を含む医薬組成物は生体外で生成されてもよく、その際、Ｔ細胞はＹＬＱＰＲＴＦＬＬを含むまたはそれから成るエピトープ配列に応答性であってもよく、いくつかの実施形態では、対象はＨＬＡ－Ａ＊０２０１によってコードされるＭＨＣタンパク質を発現する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞を含む医薬組成物は生体外で生成されてもよく、その際、Ｔ細胞はＲＬＱＳＬＱＴＹＶを含むまたはそれから成るエピトープ配列に応答性であってもよく、いくつかの実施形態では、対象はＨＬＡ－Ａ＊０２０１によってコードされるＭＨＣタンパク質を発現する。
いくつかの実施形態では、ストリングワクチンは対象への注射によって全身性に水溶液中で送達されるように製剤化されてもよい。ストリングワクチンはｍＲＮＡのようなＲＮＡのような１以上のポリヌクレオチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは１以上の脂質と会合してもよい。いくつかの実施形態では、ストリングワクチンは１以上のストリング、１以上のスパイクｍＲＮＡワクチンを含むように共製剤化されてもよく、１以上のストリングは他のウイルスタンパク質、ＯＲＦ１ａｂ、ヌクレオカプシド、膜タンパク質またはそれらの組み合わせの１以上をカバーするエピトープ配列を含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、筋肉内、皮下、静脈内、眼内のような全身注射用に製剤化される。
いくつかの実施形態では、ストリングｍＲＮＡを、抗原提示細胞及びＴ細胞を含む細胞集団に接触させる。いくつかの実施形態では、ストリングｍＲＮＡはＡＰＣのような細胞にてエレクトロポレーションされる。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は本出願内の別の場所に記載されるように生成され、１以上のストリングを発現するＡＰＣによって抗原刺激される。
いくつかの実施形態では、スパイクｍＲＮＡワクチンもしくはストリングワクチンまたは他の治療薬と併用したストリングワクチンを含む任意のワクチン組成物は、疾患の傾向と転帰と関連する年齢、健康状態、性別、病歴、民族性等に応じて、選択された患者群に投与されてもよい。いくつかの実施形態では、患者集団は、疾患の傾向と転帰に関連して年齢、健康状態、性別、病歴、民族性等に基づいて高リスクとして分類されてもよい。患者集団が高リスクと分類されている場合にのみ、ストリングワクチンを含む、または第２の治療薬と併用してストリングワクチンを含む治療薬を患者集団に投与してもよい。逆に、患者集団が低リスクとして分類されている場合にのみ、ストリングワクチンを含む、または第２の治療薬と併用してストリングワクチンを含む治療薬を患者集団に投与してもよい。いくつかの実施形態では、ワクチン組成物は、単独でまたは組み合わせて１９～５５歳の患者に対するものであってもよい。いくつかの実施形態では、ワクチン組成物は、単独でまたは組み合わせて１２～６５歳の患者に対するものであってもよい。いくつかの実施形態では、ワクチン組成物は、単独でまたは組み合わせて１２～３５歳の患者に対するものであってもよい。いくつかの実施形態では、ワクチン組成物は、単独でまたは組み合わせて１９～３５歳の患者に対するものであってもよい。いくつかの実施形態では、ワクチン組成物は、単独でまたは組み合わせて３５～５５歳の患者に対するものであってもよい。いくつかの実施形態では、ワクチン組成物は、単独でまたは組み合わせて４０～６５歳の患者に対するものであってもよい。いくつかの実施形態では、ワクチン組成物は、単独でまたは組み合わせて６５～８５歳の患者に対するものであってもよい。いくつかの実施形態では、ワクチン組成物は、単独でまたは組み合わせて１２歳以下の患者に対するものであってもよい。いくつかの実施形態では、ワクチン組成物は、単独でまたは組み合わせて１０歳以下の患者に対するものであってもよい。いくつかの実施形態では、ワクチン組成物は、単独でまたは組み合わせて思春期集団（例えば、約１２歳～約１７歳の個人）に対するものであってもよい。いくつかの実施形態では、ワクチン組成物は、単独でまたは組み合わせて小児集団に対するものであってもよい。種々の実施形態では、小児集団は、１８歳未満、例えば、５歳～１８歳未満、１２歳～１８歳未満、１６歳～１８歳未満、１２歳～１６歳未満、または５歳～１２歳未満の対象を含む、またはそれらから成る。種々の実施形態では、小児集団は、５歳未満、例えば、２歳～５歳未満、１２ヵ月～２４ヵ月未満、７ヵ月～１２ヵ月未満、または６ヵ月未満の対象を含む、またはそれらから成る。
いくつかの実施形態では、ストリングワクチンを含む、または第２の治療薬と併用してストリングワクチンを含む治療薬は、慢性疾患、例えば、がん、糖尿病、腎臓病またはＣＦＴＲのような１以上の併存疾患を有する患者に投与されてもよい。いくつかの実施形態では、ストリングワクチンを含む、または第２の治療薬と併用してストリングワクチンを含む治療薬は、慢性疾患のような１以上の併存疾患を有する患者に投与されなくてもよい。いくつかの実施形態では、ストリングワクチンを含む、または第２の治療薬と併用してストリングワクチンを含む治療薬は、その職業及び／または環境暴露（例えば、大量輸送機関、囚人、食料品店の従業員、長期介護施設の居住者、肉屋またはその他の食肉加工労働者、医療従事者、及び／または緊急対応者のような最初の対応者を含むが、これらに限定されない）がＳＡＲＳ ＣｏＶ－２に感染するリスクを劇的に高め得る対象に投与されてもよい。いくつかの実施形態では、ストリングワクチンを含む、または第２の治療薬と併用してストリングワクチンを含む治療薬は、医療従事者及び／または最初の対応者、例えば、緊急対応者に投与されてもよい。いくつかの実施形態では、ストリングワクチンを含む、または第２の治療薬と併用してストリングワクチンを含む治療薬は、喫煙歴または電子タバコ使用歴のある（例えば、慢性の喫煙歴または電子タバコ使用歴を含めて、６ヵ月以内、１２ヵ月以内、またはそれ以上以内）者に投与されてもよい。いくつかの実施形態では、ストリングワクチンを含む、または第２の治療薬と併用してストリングワクチンを含む治療薬は、ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２感染に対してさらに感受性であると判定されている特定の民族群に投与されてもよい。いくつかの実施形態では、ストリングワクチンを含む、または第２の治療薬と併用してストリングワクチンを含む治療薬は、ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２感染に対してさらに感受性であると判定されてもよい血液型の特定の集団に投与されてもよい。いくつかの実施形態では、ストリングワクチンを含む、または第２の治療薬と併用してストリングワクチンを含む治療薬は、免疫無防備状態の対象（例えば、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ；特定の免疫抑制剤を服用しているがん患者及び移植患者；免疫抑制療法を必要とすると予想される自己免疫疾患またはその他の生理学的状態（例えば、３ヵ月以内、６ヵ月以内、またはそれ以上以内）；及び免疫系に影響を与える遺伝性疾患（例えば、先天性無ガンマグロブリン血症、先天性ＩｇＡ欠乏症）がある者）に投与されてもよい。いくつかの実施形態では、ストリングワクチンを含む、または第２の治療薬と併用してストリングワクチンを含む治療薬は感染症がある者に投与されてもよい。例えば、いくつかの実施形態では、ストリングワクチンを含む、または第２の治療薬と併用してストリングワクチンを含む治療薬は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）及び／または肝炎ウイルス（例えば、ＨＢＶ、ＨＣＶ）に感染した者に投与されてもよい。いくつかの実施形態では、ストリングワクチンを含む、または第２の治療薬と併用してストリングワクチンを含む治療薬は、基礎疾患を有する者に投与されてもよい。そのような基礎疾患の例には、高血圧、心血管疾患、糖尿病、慢性呼吸器疾患、例えば慢性肺疾患、喘息等、がん、及び他の慢性疾患、例えばループス、関節リウマチ、慢性肝疾患、慢性腎疾患（例えば、いくつかの実施形態では、６０ｍＬ／分／１．７３ｍ２未満の糸球体濾過率（ＧＦＲ）を特徴とするステージ３またはさらに深刻なステージ）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ストリングワクチンを含む、または第２の治療薬と併用してストリングワクチンを含む治療薬は、例えば、特に約３０ｋｇ／ｍ２を超える肥満度指数（ＢＭＩ）を有する対象を含む過体重または肥満の対象に投与されてもよい。いくつかの実施形態では、ストリングワクチンを含む、または第２の治療薬と併用してストリングワクチンを含む治療薬は、例えば、血清学または鼻腔スワブに基づいてＣＯＶＩＤ－１９の以前の診断、または現在もしくは以前のＳＡＲＳ ＣｏＶ－２感染の証拠を有する対象に投与されてもよい。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているストリングワクチンは、他のＳＡＲＳウイルスに対する、または２０１９ ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ２と類似性を有する種々のウイルス株に対する耐性、交差防御を付与してもよく、且つ免疫原性を生成してもよい。
キット
本明細書に記載されているウイルスエピトープ治療薬は投与の説明書とともにキットの形態で提供することができる。通常、キットは、容器内にて単位剤形での所望の抗原治療薬と、投与のための指示書とを含む。サイトカイン、リンホカイン、チェックポイント阻害剤、抗体のような追加の治療薬もキットに含めることができる。同様に望ましい場合がある他のキット構成要素には、例えば、滅菌注射器、追加免疫投与量、及び他の所望の賦形剤が含まれる。
本発明は特定の実施例によってさらに詳細に記載される。以下の実施例は、例証目的で提示されるにすぎず、決して本発明を限定するようには意図するものではない。当業者は、本発明に係る代わりの実施形態を得るように変更または修正され得る、種々の重要ではないパラメーターを容易に認識することになる。本明細書に列挙される特許、特許出願、及び刊行物はすべて、参照によってそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
実施形態
１．本開示の一実施形態は、
（ｉ）以下（ａ）ＯＲＦ１ａｂ由来のエピトープ配列を含む配列、（ｂ）膜糖タンパク質（Ｍ）由来のエピトープ配列を含む配列、及び（ｃ）ヌクレオカプシドリンタンパク質（Ｎ）由来のエピトープ配列を含む配列のうちの少なくとも２つを含むポリペプチド；
（ｉｉ）前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）または前記ＴＣＲを含むＴ細胞であって、前記ＴＣＲが対応するＨＬＡクラスＩまたはクラスＩＩ分子と複合体を形成して前記ポリペプチドのエピトープ配列に結合する、前記ＴＣＲまたは前記ＴＣＲを含むＴ細胞；
（ｉｖ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）を含む抗原提示細胞；または
（ｖ）抗体または前記抗体を含むＢ細胞であって、前記抗体が前記ポリペプチドのエピトープ配列に結合する、前記抗体または前記抗体を含むＢ細胞と
薬学的に許容される賦形剤とを含む組成物である。
２．一実施形態では、前記組成物は、（ａ）ＯＲＦ１ａｂ由来のエピトープ配列を含む配列と、（ｂ）膜糖タンパク質（Ｍ）由来のエピトープ配列を含む配列と、（ｃ）ヌクレオカプシドリンタンパク質（Ｎ）由来のエピトープ配列とを含む。
３．ＯＲＦ１ａｂ由来のエピトープ配列を含む前記配列が、ヌクレオカプシドリンタンパク質（Ｎ）由来のエピトープ配列を含む前記配列のＣ末端にある、前記実施形態に記載の組成物。
４．ＯＲＦ１ａｂ由来のエピトープ配列を含む前記配列が、膜糖タンパク質（Ｍ）由来のエピトープ配列を含む前記配列のＮ末端にある、前記実施形態に記載の組成物。
５．ヌクレオカプシドリンタンパク質（Ｎ）由来のエピトープ配列を含む前記配列が、膜糖タンパク質（Ｍ）由来のエピトープ配列を含む前記配列のＮ末端にある、前記実施形態に記載の組成物。
６．前記組成物が、（ａ）ＯＲＦ１ａｂ由来の２、３、４、５、６、７、８、９または１０以上のエピトープ配列と、（ｂ）膜糖タンパク質（Ｍ）由来のエピトープ配列を含む配列と、（ｃ）ヌクレオカプシドリンタンパク質（Ｎ）由来のエピトープ配列を含む配列とを含む、前記実施形態に記載の組成物。
７．ＯＲＦ１ａｂ由来の前記エピトープ配列が非構造タンパク質由来のエピトープ配列である、前記実施形態に記載の組成物。
８．前記非構造タンパク質が、ＮＳＰ１、ＮＳＰ２、ＮＳＰ３、ＮＳＰ４及びそれらの組み合わせから成る群から選択される、前記実施形態に記載の組成物。
９．前記ポリペプチドが、ＮＳＰ１由来のエピトープ配列を含む配列と、ＮＳＰ２由来のエピトープ配列を含む配列と、ＮＳＰ３由来のエピトープ配列を含む配列と、ＮＳＰ４由来のエピトープ配列を含む配列とを含む、前記実施形態に記載の組成物。
１０．ＯＲＦ１ａｂ由来の前記エピトープ配列が、ＹＬＦＤＥＳＧＥＦＫＬ、ＹＬＦＤＥＳＧＥＦ、ＦＧＤＤＴＶＩＥＶ、ＱＬＭＣＱＰＩＬＬ、ＴＴＤＰＳＦＬＧＲＹ、ＰＴＤＮＹＩＴＴＹ、ＰＳＦＬＧＲＹ、ＡＥＡＥＬＡＫＮＶ、ＫＴＩＱＰＲＶＥＫ及びそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される、前記実施形態に記載の組成物。
１１．ヌクレオカプシド糖タンパク質（Ｎ）由来の前記エピトープ配列がＬＬＬＤＲＬＮＱＬである、前記実施形態に記載の組成物。
１２．膜リンタンパク質（Ｍ）由来の前記エピトープ配列がＶＡＴＳＲＴＬＳＹである、前記実施形態に記載の組成物。
１３．前記ポリペプチドが、ＬＬＬＤＲＬＮＱＬであるヌクレオカプシド糖タンパク質（Ｎ）由来のエピトープ配列と、ＶＡＴＳＲＴＬＳＹである膜リンタンパク質（Ｍ）由来のエピトープ配列とを含む、前記実施形態に記載の組成物。
１４．前記ポリペプチドが（ａ）ＯＲＦ１ａｂ由来の以下のエピトープ配列：ＹＬＦＤＥＳＧＥＦＫＬ、ＹＬＦＤＥＳＧＥＦ、ＦＧＤＤＴＶＩＥＶ、ＱＬＭＣＱＰＩＬＬ、ＴＴＤＰＳＦＬＧＲＹ、ＰＴＤＮＹＩＴＴＹ、ＰＳＦＬＧＲＹ、ＡＥＡＥＬＡＫＮＶ、ＫＴＩＱＰＲＶＥＫのそれぞれと、（ｂ）ＬＬＬＤＲＬＮＱＬであるヌクレオカプシド糖タンパク質（Ｎ）由来のエピトープ配列と、（ｃ）ＶＡＴＳＲＴＬＳＹである膜リンタンパク質（Ｍ）由来のエピトープ配列とを含む、前記実施形態に記載の組成物。
１５．ＯＲＦ１ａｂ由来のエピトープ配列を含む前記配列が、以下の配列またはその断片：ＭＶＴＮＮＴＦＴＬＫＶＰＨＶＧＥＩＰＶＡＹＲＫＶＬＬＫＴＩＱＰＲＶＥＫＹＬＦＤＥＳＧＥＦＫＬＳＥＶＧＰＥＨＳＬＡＥＹＹＩＦＦＡＳＦＹＹ；
ＭＶＴＮＮＴＦＴＬＫＶＰＨＶＧＥＩＰＶＡＹＲＫＶＬＬＫＴＩＱＰＲＶＥＫＹＬＦＤＥＳＧＥＦＫＬＳＥＶＧＰＥＨＳＬＡＥＹ；
ＡＰＫＥＩＩＦＬＥＧＥＴＬＦＧＤＤＴＶＩＥＶＡＩＩＬＡＳＦＳＡＳＴ；
ＡＰＫＥＩＩＦＬＥＧＥＴＬＦＧＤＤＴＶＩＥＶ；
ＨＴＴＤＰＳＦＬＧＲＹＭＳＡＬＦＡＤＤＬＮＱＬＴＧＹＨＴＤＦＳＳＥＩＩＧＹＱＬＭＣＱＰＩＬＬＡＥＡＥＬＡＫＮＶＳＬＩＬＧＴＶＳＷＮＬ；
ＴＴＤＰＳＦＬＧＲＹＭＳＡＬＦＡＤＤＬＮＱＬＴＧＹＨＴＤＦＳＳＥＩＩＧＹＱＬＭＣＱＰＩＬＬＡＥＡＥＬＡＫＮＶＳＬＩＬＧＴＶＳＷＮＬ；
ＬＬＳＡＧＩＦＧＡＩＴＤＶＦＹＫＥＮＳＹＫＶＰＴＤＮＹＩＴＴＹ；及びそれらの組み合わせから成る群から選択される、前記実施形態に記載の組成物。
１６．膜糖タンパク質（Ｍ）由来のエピトープ配列を含む前記配列が、以下の配列またはその断片：ＡＤＳＮＧＴＩＴＶＥＥＬＫＫＬＬＥＱＷＮＬＶＩＧＦＬＦＬＴＷＩＣＬＬＱＦＡＹＡＮＲＮＲＦＬＹＩＩＫＬＩＦＬＷＬＬＷＰＶＴＬＡＣＦＶＬＡＡＶＹＲＩＮＷＩＴＧＧＩＡＩＡＭＡＣＬＶＧＬＭＷＬＳＹＦＩＡＳＦＲＬＦＡＲＴＲＳＭＷＳＦＮＰＥＴＮＩＬＬＮＶＰＬＨＧＴＩＬＴＲＰＬＬＥＳＥＬＶＩＧＡＶＩＬＲＧＨＬＲＩＡＧＨＨＬＧＲＣＤＩＫＤＬＰＫＥＩＴＶＡＴＳＲＴＬＳＹＹＫＬＧＡＳＱＲＶＡＧＤＳＧＦＡＡＹＳＲＹＲＩＧＮＹＫＬＮＴＤＨＳＳＳＳＤＮＩＡＬＬＶＱ；
ＦＡＹＡＮＲＮＲＦＬＹＩＩＫＬＩＦＬＷＬＬＷＰＶＴＬＡＣＦＶＬＡＡＶＹＲＩＮＷＩＴＧＧＩＡＩＡＭＡＣＬＶＧＬＭＷＬＳＹＦＩＡＳＦＲＬＦ；
ＬＧＲＣＤＩＫＤＬＰＫＥＩＴＶＡＴＳＲＴＬＳＹＹＫＬＧＡＳＱＲＶＡ；
ＫＬＬＥＱＷＮＬＶＩＧＦ；
ＮＲＮＲＦＬＹＩＩＫＬＩＦＬＷＬＬＷＰＶＴＬＡＣＦＶＬＡＡＶＹ；
ＳＥＬＶＩＧＡＶＩＬＲＧＨＬＲＩＡＧＨＨＬＧＲ；
ＶＡＴＳＲＴＬＳＹＹＫＬＧＡＳＱＲＶ；
ＧＬＭＷＬＳＹＦ；及びそれらの組み合わせから成る群から選択される、前記実施形態に記載の組成物。
１７．ヌクレオカプシドリンタンパク質（Ｎ）由来のエピトープ配列を含む前記配列が、以下の配列またはその断片：
ＫＤＬＳＰＲＷＹＦＹＹＬＧＴＧＰＥＡＧＬＰＹＧＡＮＫＤＧＩＩＷＶＡＴＥＧＡＬＮＴＰＫＤＨＩＧＴＲＮＰＡＮＮＡＡＩＶＬＱＬＰＱＧＴＴＬＰＫＧＦＹＡＥＧＳＲＧＧＳＱＡＳＳＲＳＳＳＲＳＲＮＳＳＲＮＳＴＰＧＳＳＲＧＴＳＰＡＲＭＡＧＮＧＧＤＡＡＬＡＬＬＬＬＤＲＬＮＱＬＥＳＫＭＳＧＫＧＱＱＱＱＧＱＴＶＴＫＫＳＡＡＥＡＳＫＫＰＲＱＫＲＴＡＴＫＡＹＮＶＴＱＡＦＧＲＲＧＰＥＱＴＱＧＮＦＧＤＱＥＬＩＲＱＧＴＤＹＫＨＷＰＱＩＡＱＦＡＰＳＡＳＡＦＦＧＭＳＲＩＧＭＥＶＴＰＳＧＴＷＬＴＹＴＧＡＩＫＬＤＤＫＤＰＮＦＫＤＱＶＩＬＬＮＫＨＩＤＡＹＫＴＦＰＰＴＥＰＫＫＤＫＫＫＫＡＤＥＴＱＡＬＰＱＲＱＫＫＱＱＴＶＴＬＬＰＡＡＤＬＤＤＦＳＫＱＬＱＱＳＭＳＳＡＤＳＴＱＡ；
ＲＭＡＧＮＧＧＤＡＡＬＡＬＬＬＬＤＲＬＮＱＬＥＳＫＭＳＧＫＧＱＱＱ；
ＹＫＨＷＰＱＩＡＱＦＡＰＳＡＳＡＦＦＧＭＳＲＩＧＭＥＶＴＰＳＧＴＷＬＴＹＴＧＡＩＫＬＤＤＫＤＰＮＦＫＤＱＶＩＬＬＮＫＨＩＤＡＹＫＴＦＰ；
ＳＰＡＲＭＡＧＮＧＧＤＡＡＬＡＬＬＬＬＤＲＬＮＱＬＥＳＫＭＳＧＫＧＱＱＱＱＧＱＴＶＴＫＫＳＡＡＥＡＳＫＫＰＲＱＫＲＴＡＴＫＡＹＮＶＴＱＡＦＧＲＲＧＰＥＱＴＱＧＮＦＧＤＱＥＬＩＲＱＧＴＤＹＫＨＷＰＱＩＡＱＦＡＰＳＡＳＡＦＦＧＭＳＲＩＧＭＥＶＴＰＳＧＴＷＬＴＹＴＧＡＩＫＬＤＤＫＤＰＮＦＫＤＱＶＩＬＬＮＫＨＩＤＡＹＫＴＦＰＰＴＥＰＫＫＤＫ及びその組み合わせから成る群から選択される、前記実施形態に記載の組成物。
１８．前記ポリペプチドがさらにシグナルペプチド配列を含む、前記実施形態に記載の組成物。
１９．前記シグナルペプチド配列がＭＲＶＭＡＰＲＴＬＩＬＬＬＳＧＡＬＡＬＴＥＴＷＡＧＳである、前記実施形態に記載の組成物。
２０．前記ポリペプチドがさらにＭＩＴＤ配列を含む、実施形態１に記載の組成物。
２１．前記ＭＩＴＤ配列がＩＶＧＩＶＡＧＬＡＶＬＡＶＶＶＩＧＡＶＶＡＴＶＭＣＲＲＫＳＳＧＧＫＧＧＳＹＳＱＡＡＳＳＤＳＡＱＧＳＤＶＳＬＴＡである、前記実施形態に記載の組成物。
２２．前記ポリペプチドが１以上のリンカー配列を含む、実施形態１に記載の組成物。
２３．前記１以上のリンカー配列が、ＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧ、ＧＧＳＬＧＧＧＧＳＧから成る群から選択される、前記実施形態に記載の組成物。
２４．前記１以上のリンカー配列が切断配列を含む、実施形態２２に記載の組成物。
２５．前記１以上の切断配列がＦＲＡＣ、ＫＲＣＦ、ＫＫＲＹ、ＡＲＭＡ、ＲＲＳＧ、ＭＲＡＣ、ＫＭＣＧ、ＡＲＣＡ、ＫＫＱＧ、ＹＲＳＹ、ＳＦＭＮ、ＦＫＡＡ、ＫＲＮＧ、ＹＮＳＦ、ＫＫＮＧ、ＲＲＲＧ、ＫＲＹＳ及びＡＲＹＡから成る群から選択される、前記実施形態に記載の組成物。
２６．前記ポリペプチドが膜貫通ドメイン配列を含む、実施形態１に記載の組成物。
２７．前記膜貫通配列が、ＯＲＦ１ａｂ由来のエピトープ配列を含む前記配列、膜糖タンパク質（Ｍ）由来のエピトープ配列を含む前記配列、及びヌクレオカプシドリンタンパク質（Ｎ）由来のエピトープ配列を含む前記配列に対してＣ末端にある、実施形態２６に記載の組成物。
２８．前記膜貫通配列がＥＱＹＩＫＷＰＷＹＩＷＬＧＦＩＡＧＬＩＡＩＶＭＶＴＩＭＬＣＣＭＴＳＣＣＳＣＬＫＧＣＣＳＣＧＳＣＣＫＦＤＥＤＤＳＥＰＶＬＫＧＶＫＬＨＹＴである、実施形態２６に記載の組成物。
２９．前記ポリペプチドがＳＥＣ配列を含む、実施形態１に記載の組成物。
３０．前記ＳＥＣ配列が、ＯＲＦ１ａｂ由来のエピトープ配列を含む前記配列、膜糖タンパク質（Ｍ）由来のエピトープ配列を含む前記配列、及びヌクレオカプシドリンタンパク質（Ｎ）由来のエピトープ配列を含む前記配列に対してＮ末端にある、実施形態２９に記載の組成物。
３１．前記ＳＥＣ配列がＭＦＶＦＬＶＬＬＰＬＶＳＳＱＣＶＮＬＴである、実施形態２９に記載の組成物。
３２．前記組成物が前記ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドを含む、実施形態１に記載の組成物。
３３．前記ポリヌクレオチドがｍＲＮＡである、実施形態３２に記載の組成物。
３４．前記ポリヌクレオチドが、ヒトにおける発現のためにコドン最適化された配列を含む、実施形態３２に記載の組成物。
３５．前記ポリヌクレオチドがｄＥａｒＩ－ｈＡｇ配列を含む、実施形態３２に記載の組成物。
３６．前記ｄＥａｒＩ－ｈＡｇ配列がＡＴＴＣＴＴＣＴＧＧＴＣＣＣＣＡＣＡＧＡＣＴＣＡＧＡＧＡＧＡＡＣＣＣであり、任意で各ＴがＵである、実施形態３５に記載の組成物。
３７．前記ポリヌクレオチドがコザック配列を含む、実施形態３２に記載の組成物。
３８．コザック配列がＧＣＣＡＣＣである、実施形態３７に記載の組成物。
３９．前記ポリヌクレオチドがＦ要素配列を含む、実施形態３２に記載の組成物。
４０．前記Ｆ要素配列が、分割のアミノ末端エンハンサー（ＡＥＳ）の３ＵＴＲである、実施形態３９に記載の組成物。
４１．前記Ｆ要素配列が、ＣＴＧＧＴＡＣＴＧＣＡＴＧＣＡＣＧＣＡＡＴＧＣＴＡＧＣＴＧＣＣＣＣＴＴＴＣＣＣＧＴＣＣＴＧＧＧＴＡＣＣＣＣＧＡＧＴＣＴＣＣＣＣＣＧＡＣＣＴＣＧＧＧＴＣＣＣＡＧＧＴＡＴＧＣＴＣＣＣＡＣＣＴＣＣＡＣＣＴＧＣＣＣＣＡＣＴＣＡＣＣＡＣＣＴＣＴＧＣＴＡＧＴＴＣＣＡＧＡＣＡＣＣＴＣＣであり、任意で各ＴはＵである、実施形態３９に記載の組成物。
４２．前記ポリヌクレオチドがＩ要素配列を含む、実施形態３２に記載の組成物。
４３．前記Ｉ要素配列が、ミトコンドリアにコードされた１２Ｓ ｒＲＮＡ（ｍｔＲＮＲ１）の３’ＵＴＲである、実施形態４２に記載の組成物。
４４．前記Ｉ要素配列がＣＡＡＧＣＡＣＧＣＡＧＣＡＡＴＧＣＡＧＣＴＣＡＡＡＣＧＣＴＴＡＧＣＣＴＡＧＣＣＡＣＡＣＣＣＣＣＡＣＧＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＧＴＧＡＴＴＡＡＣＣＴＴＴＡＧＣＡＡＴＡＡＡＣＧＡＡＡＧＴＴＴＡＡＣＴＡＡＧＣＴＡＴＡＣＴＡＡＣＣＣＣＡＧＧＧＴＴＧＧＴＣＡＡＴＴＴＣＧＴＧＣＣＡＧＣＣＡＣＡＣＣであり、任意で各ＴはＵである、実施形態４２に記載の組成物。
４５．前記ポリヌクレオチドがポリＡ配列を含む、実施形態３２に記載の組成物。
４６．前記ポリＡ配列がＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＡＴＡＴＧＡＣＴＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡであり、任意で各ＴはＵである、実施形態４５に記載の組成物。
４７．前記ＯＲＦ１ａｂ、前記膜糖タンパク質、及び前記ヌクレオカプシドリンタンパク質に由来する前記エピトープ配列のそれぞれが２０１９ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来である、実施形態１に記載の組成物。
４８．１以上のエピトープまたは各エピトープがＴ細胞応答を誘発する、実施形態１に記載の組成物。
４９．１以上のエピトープまたは各エピトープが、ＨＬＡ分子によって提示されるものとして質量分析によって観察されている、実施形態１に記載の組成物。
５０．前記ポリペプチドが、ＲＳ Ｃ１ｎ、ＲＳ Ｃ２ｎ、ＲＳ Ｃ３ｎ、ＲＳＣ４ｎ、ＲＳ Ｃ５ｎ、ＲＳ Ｃ６ｎ、ＲＳ Ｃ７ｎ、及びＲＳ Ｃ８ｎから成る群から選択される配列を含む、実施形態１に記載の組成物。
５１．前記実施形態のいずれかの１つに記載の組成物を含む医薬組成物。
５２．医薬組成物であって、
（ｉ）表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２Ａｉ、表２Ａｉｉ、表２Ｂ及び／または表１６のエピトープ配列を含むポリペプチド；
（ｉｉ）前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）または前記ＴＣＲを含むＴ細胞であって、前記ＴＣＲが対応するＨＬＡクラスＩまたはクラスＩＩ分子と複合体を形成して前記エピトープ配列に結合する前記ＴＣＲまたは前記ＴＣＲを含むＴ細胞；
（ｉｖ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）を含む抗原提示細胞；または
（ｖ）抗体または前記抗体を含むＢ細胞であって、前記抗体が前記エピトープ配列に結合する前記抗体または前記抗体を含むＢ細胞と
薬学的に許容される賦形剤とを含む、前記医薬組成物。
５３．前記エピトープ配列が、以下：ＹＬＦＤＥＳＧＥＦＫＬ、ＹＬＦＤＥＳＧＥＦ、ＦＧＤＤＴＶＩＥＶ、ＬＬＬＤＲＬＮＱＬ、ＱＬＭＣＱＰＩＬＬ、ＴＴＤＰＳＦＬＧＲＹ、ＰＴＤＮＹＩＴＴＹ、ＰＳＦＬＧＲＹ、ＡＥＡＥＬＡＫＮＶ、ＶＡＴＳＴＲＴＳＹ及びＫＴＩＱＰＲＶＥＫのうちの１以上またはそれぞれを含む、実施形態５２に記載の医薬組成物。
５４．前記エピトープ配列が、以下：ＳＡＰＰＡＱＹＥＬ、ＡＶＡＳＫＩＬＧＬ、ＥＹＡＤＶＦＨＬＹ、ＤＥＦＴＰＦＤＶＶ、ＶＲＩＱＰＧＱＴＦ、ＳＦＲＬＦＡＲＴＲ、ＫＦＬＰＦＱＱＦ、ＶＶＱＥＧＶＬＴＡ、ＲＬＤＫＶＥＡＥＶ、ＦＧＡＤＰＩＨＳＬ、ＮＹＮＹＬＹＲＬＦ、ＫＹＩＫＷＰＷＹＩ、ＫＷＰＷＹＩＷＬＧＦ、ＬＰＦＮＤＧＶＹＦ、ＱＰＴＥＳＩＶＲＦ、ＩＰＦＡＭＱＭＡＹ、ＹＬＡＭＱＬＬ及びＲＬＱＳＬＱＴＹＶのうちの１以上またはそれぞれを含む、実施形態５２に記載の医薬組成物。
５５．前記エピトープ配列がｏｒｆ１ａｂタンパク質に由来する、実施形態５２に記載の医薬組成物。
５６．前記エピトープ配列がｏｒｆ１ａタンパク質に由来する、実施形態５２に記載の医薬組成物。
５７．前記エピトープ配列が表面糖タンパク質（Ｓ）またはそのシフトしたリーディングフレームに由来する、実施形態５２に記載の医薬組成物。
５８．前記エピトープ配列がヌクレオカプシドリンタンパク質（Ｎ）に由来する、実施形態５２に記載の医薬組成物。
５９．前記エピトープ配列がＯＲＦ３ａタンパク質に由来する、実施形態５２に記載の医薬組成物。
６０．前記エピトープ配列が膜糖タンパク質（Ｍ）に由来する、実施形態５２に記載の医薬組成物。
６１．前記エピトープ配列がＯＲＦ７ａタンパク質に由来する、実施形態５２に記載の医薬組成物。
６２．前記エピトープ配列がＯＲＦ８タンパク質に由来する、実施形態５２に記載の医薬組成物。
６３．前記エピトープ配列がエンベロープタンパク質（Ｅ）に由来する、実施形態５２に記載の医薬組成物。
６４．前記エピトープ配列がＯＲＦ６タンパク質に由来する、実施形態５２に記載の医薬組成物。
６５．前記エピトープ配列がＯＲＦ７ｂタンパク質に由来する、実施形態５２に記載の医薬組成物。
６６．前記エピトープ配列がＯＲＦ１０タンパク質に由来する、実施形態５２に記載の医薬組成物。
６７．前記エピトープ配列がＯＲＦ９ｂタンパク質に由来する、実施形態５２に記載の医薬組成物。
６８．表１１及び１２の列２ならびに表１５の列３に示される配列のいずれか１つのアミノ酸配列を有する１以上のポリペプチド；または、表１１及び１２の列２ならびに表１５の列３に示される配列のいずれか１つのアミノ酸配列を有するポリペプチドをそれぞれコードする１以上の組換えポリヌクレオチド構築物を含む、医薬組成物。
６９．前記１以上のポリペプチドが表１１及び１２の列２に示される配列のいずれか１つのアミノ酸配列ならびに表１５の列３に示される配列のいずれか１つのアミノ酸配列を有する少なくとも２、３、４、５、６、７または８の異なるポリペプチドを含み；または、前記１以上の組換えポリヌクレオチド構築物が、表１１及び１２の列２ならびに表１５の列３に示される配列のいずれか１つのアミノ酸配列を有する異なるポリペプチドをそれぞれコードする少なくとも２、３、４、５、６、７または８の組換えポリヌクレオチド構築物を含む、実施形態６８に記載の医薬組成物。
７０．前記１以上の組換えポリヌクレオチド構築物が、配列番号：ＲＳ Ｃ１ｎ、ＲＳ Ｃ２ｎ、ＲＳ Ｃ３ｎ、ＲＳＣ４ｎ、ＲＳ Ｃ５ｎ、ＲＳ Ｃ６ｎ、ＲＳ Ｃ７ｎ、及びＲＳ Ｃ８ｎから成る群から選択される配列に対する少なくとも７０％、８０％、９０％または１００％の配列同一性を持つ配列を含む、実施形態６８に記載の医薬組成物。
７１．前記組換えポリヌクレオチド構築物がｍＲＮＡである、実施形態６８に記載の医薬組成物。
７２．１以上の脂質成分をさらに含む、実施形態５１、５２または６８のいずれか１つに記載の医薬組成物。
７３．前記１以上の脂質が脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含む、実施形態７２に記載の医薬組成物。
７４．前記ＬＮＰが前記組換えポリヌクレオチド構築物をカプセル化する、実施形態７３に記載の医薬組成物。
７５．前記ポリペプチドが合成である、実施形態５１、５２または６８のいずれか１つに記載の医薬組成物。
７６．前記ポリペプチドが組換えである、実施形態５１、５２または６８のいずれか１つに記載の医薬組成物。
７７．前記ポリペプチドが長さ８～１０００のアミノ酸である、実施形態５１、５２または６８のいずれか１つに記載の医薬組成物。
７８．前記エピトープ配列が、１０００ｎＭ以下のＫＤでＨＬＡクラスＩまたはクラスＩＩ分子に結合する、または結合すると予測される、実施形態５１、５２または６８のいずれか１つに記載の医薬組成物。
７９．前記エピトープ配列が、５００ｎＭ以下のＫＤでＨＬＡクラスＩまたはクラスＩＩ分子に結合する、または結合すると予測される、実施形態５１、５２または６８のいずれか１つに記載の医薬組成物。
８０．前記エピトープ配列が、対象のウイルス感染細胞によって発現されるウイルスタンパク質の配列を含む、実施形態５１、５２、または６８のいずれか１つに記載の医薬組成物。
８１．前記ウイルスが２０１９ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２である、実施形態８０に記載の医薬組成物。
８２．実施形態５１、５２または６８のいずれか１つに記載の医薬組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む、ウイルスによる感染症を治療もしくは予防する方法、またはウイルスによる感染症に関連する呼吸器の疾患もしくは状態を治療する方法。
８３．前記ウイルスがコロナウイルスである、実施形態８２に記載の方法。
８４．前記ウイルスが２０１９ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２である、実施形態８２に記載に記載の方法。
８５．前記対象によって発現されるＨＬＡ分子が投与時に未知である、実施形態８２に記載の方法。
８６．前記対象の免疫系による認識の回避を避けるウイルスまたはその突然変異版の能力が、実施形態５１、５２または６８のいずれか１つに記載の医薬組成物における単一のタンパク質由来のエピトープまたは前記医薬組成物よりも少ないタンパク質由来のエピトープを含有する医薬組成物を投与された対象の免疫系による認識の回避を避けるウイルスまたはその突然変異版の能力と比べて低い、実施形態８２に記載の方法。
８７．前記対象が、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２Ａｉまたは表２Ａｉｉ、表２Ｂまたは表１６のいずれか１つのＨＬＡ対立遺伝子によってコードされるＨＬＡ分子を発現し、前記エピトープ配列はＨＬＡ対立遺伝子が一致するエピトープ配列である、実施形態８２に記載の方法。
８８．前記エピトープ配列が以下：ＳＡＰＰＡＱＹＥＬ、ＡＶＡＳＫＩＬＧＬ、ＥＹＡＤＶＦＨＬＹ、ＤＥＦＴＰＦＤＶＶ、ＶＲＩＱＰＧＱＴＦ、ＳＦＲＬＦＡＲＴＲ、ＫＦＬＰＦＱＱＦ、ＶＶＱＥＧＶＬＴＡ、ＲＬＤＫＶＥＡＥＶ及びＦＧＡＤＰＩＨＳＬのうちの１以上またはそれぞれを含む、実施形態８２に記載の方法。
８９．２０１９ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２感染症の治療または予防をそれを必要とする対象にて行う方法であって、実施形態５１、５２または６８のいずれか１つの医薬組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法。
９０．前記医薬組成物が、前記対象にて２０１９ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ウイルス感染症のための１以上の治療薬に加えて投与される、実施形態に記載８９の方法。
９１．前記医薬組成物が、（ａ）２０１９ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２スパイクタンパク質もしくはその断片のアミノ酸配列を有するポリペプチド；（ｂ）２０１９ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２スパイクタンパク質もしくはその断片をコードする組換えポリヌクレオチド；または（ａ）もしくは（ｂ）を含む２０１９ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２スパイクタンパク質医薬組成物と併用して投与される、実施形態８９に記載の方法。
９２．前記２０１９ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２スパイクタンパク質またはその断片がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはその断片である、実施形態８９に記載の方法。
９３．前記医薬組成物が、前記２０１９ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２スパイクタンパク質医薬組成物の最初の投与の１～１０週後に投与される、実施形態８９に記載の方法。
９４．前記医薬組成物が、前記２０１９ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２スパイクタンパク質医薬組成物の最初の投与の１～６週後、１～６ヵ月後または１～２年後またはそれ以降に投与される、実施形態８９に記載の方法。
９５．前記医薬組成物が、前記２０１９ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２スパイクタンパク質医薬組成物の投与と同じ日に、または同時に投与される、実施形態８９に記載の方法。
９６．前記医薬組成物が、２０１９ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２スパイクタンパク質もしくはその断片のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または２０１９ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２スパイクタンパク質もしくはその断片をコードする組換えポリヌクレオチドとともに共製剤化される、実施形態９５に記載の方法。
９７．前記医薬組成物が、前記２０１９ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２スパイクタンパク質医薬組成物の投与の２～１０週前のような、前記２０１９ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２スパイクタンパク質医薬組成物の投与前に投与される、実施形態８９に記載の方法。
９８．前記医薬組成物が予防的に投与される、実施形態８９に記載の方法。
９９．前記医薬組成物が、１、２、３、４、５、６週もしくはそれ以上の週ごとに１回、または１～７日、７～１４日、１４～２１日、２１～２８日、もしくは２８～３５日ごとに１回、または２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、もしくは３５日ごとに１回投与される、実施形態８９に記載の方法。
１００．２０１９ ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ウイルスによって引き起こされる呼吸器ウイルス感染症を治療するまたは予防するために治療薬を調製するための、実施形態１～５０のいずれか１つに記載の組成物の使用。
１０１．実施形態１に記載の医薬組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む、ウイルス感染症を治療するもしくは予防する方法、または前記ウイルス感染症に関連する呼吸器の疾患もしくは状態を治療する方法。
１０２．前記ウイルスがコロナウイルスである、実施形態１０１に記載の方法。
１０３．前記ウイルスが２０１９ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２である、実施形態１０１に記載の方法。
１０４．前記対象が、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２Ａｉ、表２Ａｉｉまたは表２Ｂまたは表１６のいずれか１つのＨＬＡ対立遺伝子によってコードされるＭＨＣ分子を発現し、前記エピトープ配列はＨＬＡ対立遺伝子が一致するエピトープ配列である、実施形態１０１に記載の方法。
１０５．前記エピトープ配列が以下：ＳＡＰＰＡＱＹＥＬ、ＡＶＡＳＫＩＬＧＬ、ＥＹＡＤＶＦＨＬＹ、ＤＥＦＴＰＦＤＶＶ、ＶＲＩＱＰＧＱＴＦ、ＳＦＲＬＦＡＲＴＲ、ＫＦＬＰＦＱＱＦ、ＶＶＱＥＧＶＬＴＡ、ＲＬＤＫＶＥＡＥＶ及びＦＧＡＤＰＩＨＳＬのうちの１以上またはそれぞれを含む、実施形態１０１に記載の方法。
実施例１：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するＴ細胞応答を誘導するためのワクチン標的の配列に基づく予測
コロナウイルスは、人獣共通感染源から時折出現してヒト集団に感染するプラスセンス一本鎖ＲＮＡウイルスである。ほとんどのコロナウイルス感染症は軽度の呼吸器症状を引き起こす。しかしながら、いくつかの最近のコロナウイルス感染症は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）、及び現在の世界的なパンデミック、ＣＯＶＩＤ－１９に関与する２０１９ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含めて、深刻な罹患率と死亡率を生じている。これら３つのウイルスはＢｅｔａｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ属に属する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶは２００２年に中国南部で確認され、その世界的な広がりにより８，０９６の症例と７７４人の死者を出した。ＭＥＲＳ－ＣｏＶの最初の症例は２０１２年にサウジアラビアで発生し、それ以来、合計２，４９４の症例と８５８人の関連死が報告されている。これら他のコロナウイルス感染症のさらに限定的な範囲とは対照的に、２０１９年１２月末に中国の武漢で出現したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は２０２０年５月９日現在、世界で２７９，０４３人の死者を含む４，０７７，３５５の症例をもたらした。ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２の急速な蔓延により世界保健機関は世界的なパンデミックを宣言した。したがって、この非常に感染性の高い病原体の拡散を減らすためにＳＡＲＳ ＣｏＶ－２に対する効果的なワクチンと抗ウイルス治療が緊急に必要である。
ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２のゲノムは長さが３０キロベースに及び、４つの構造タンパク質を含む１３のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードする。これらの構造タンパク質は、スパイクタンパク質（Ｓ）、膜タンパク質（Ｍ）、エンベロープタンパク質（Ｅ）、及びヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ）である。加えて、ウイルスの転写と複製に関与するすべてのタンパク質を説明する２０を超える非構造タンパク質がある。ウイルスのコードされたタンパク質はすべて、強力なＴ細胞免疫を誘導するワクチンを開発するための潜在的な候補である。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶとＳＡＲＳ ＣｏＶ－２はゲノム全体で７６％のアミノ酸同一性を共有する。この高度な配列類似性により、ＳＡＲＳ－ＣｏＶに対する防御免疫応答に関する以前の研究を活用してＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のワクチン開発を支援することができる。液性免疫応答と細胞性免疫応答の双方が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶに対する宿主の応答において重要であることが示されている。Ｓタンパク質及びＮタンパク質に対して生成された抗体応答は、マウスにてＳＡＲＳ－ＣｏＶ感染から保護することが示されており、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ感染患者で検出されている。しかしながら、Ｓタンパク質に対して検出された抗体応答は回復６年後の患者では検出できなかった。加えて、ウイルス感染のさらに深刻な臨床症例ではさらに高い力価の抗体が見いだされており、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ ＣｏＶ－２の感染を制御するには強力な抗体応答だけでは不十分な場合があることが示唆されている。
Ｂ細胞免疫とともに、Ｔ細胞応答は免疫応答によるＳＡＲＳ－ＣｏＶの制御に重要であると思われ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の制御に重要である可能性が最も高い。マウスでは、研究により、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ特異的なメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の養子移入が加齢マウスの致死的なＳＡＲＳ－ＣｏＶ感染に対する保護を提供し、エフェクターＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の免疫不全マウスまたは若齢マウスへの養子移入がウイルスのクリアランスを促進し、且つ臨床成績を改善したことが示されている。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋のＴ細胞応答の双方ともＳＡＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染患者で検出されている。さらに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ特異的なメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＳＡＲＳから回復した患者にて感染後最大１１年間持続することが見いだされている。これらのウイルス特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞は細胞傷害性であることができ、ウイルスに感染した細胞を殺傷して疾患の重症度を軽減することができる。エフェクター機能に加えて、ＣＤ４＋Ｔ細胞はＴ依存性Ｂ細胞を活性化することによってウイルス特異的な抗体の産生を促進することができる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶからの豊富なデータ、ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２と ＳＡＲＳ－ＣｏＶの間の相同性、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２からの新たなデータを考えると、Ｔ細胞免疫はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する保護を提供する上で重要な役割を担っている可能性がある。
ここでは、本発明者らは、質量分析（ＭＳ）に基づくＨＬＡ－Ｉ及びＨＬＡ－ＩＩエピトープ結合予測ツールを利用して、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋のＴ細胞によって認識されるＳＡＲＳ ＣｏＶ－２のエピトープを特定した。ＭＳを介して生成された高品質の単一対立遺伝子ＨＬＡ免疫ペプチドームのデータでこれらの結合予測因子を訓練した。ＭＨＣペプチドリガンドームの同定にＭＳを使用すると、生体内で自然に処理され、提示されたＭＨＣ結合ペプチドの大規模で比較的偏りのない集団が得られる。化学合成とアッセイ対象のペプチド及びリガンドの先験的な知識とに依存する従来の結合アッセイとは異なり、ＭＳは、細胞内での内在性のプロセシング及び提示の経路の対象になる天然のペプチド・ＭＨＣ複合体を使用する。さらに、操作された単一対立遺伝子細胞株を使用することで、インシリコデコンボリューション技術への依存が回避され、標的を絞った方法で対立遺伝子のカバー率を拡大することができる。
このアプローチにより、本発明らは７４のＨＬＡ－Ｉ及び８３のＨＬＡ－ＩＩの対立遺伝子について結合予測因子を生成した。データ収集のために選択された対立遺伝子は集団のカバー率を最大化するために優先順位を付けた。このＭＳデータにより、ＨＬＡ－Ｉ及びＨＬＡ－ＩＩの双方について主要な親和性ベースの予測因子よりも優れた、対立遺伝子固有のニューラルネットワークベースの結合予測因子を訓練することができた。さらに、本発明者らは、Ａｂｅｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１９にて、病原体とアレルゲンの多様な収集物に対する免疫応答のデータセットでこのアプローチを検証することによって、この改善された結合予測が免疫原性予測の改善につながることを実証した。ここでは、本発明者らは、ウイルス病原体リソース（ＶｉＰＲ）のデータベースからのＴ細胞の反応性またはＭＨＣ結合についてアッセイされたＣｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ科のペプチドを利用して、結合予測因子を具体的に検証した。ＶｉＰＲデータベースは、内部で精選されたデータ、研究者の提出物、及び種々の外部情報源からのデータに由来するウイルス病原体データを統合する。本発明者らのアプローチは、同様の目的を有したが、さらに小さな検証データセットとさらに少ない対象対立遺伝子に依存して、バイオインフォマティクスで予測されたＳＡＲＳ ＣｏＶ－２エピトープのセットをはるかに限られたものにした最近の研究と比べて、予測の幅とその妥当性の双方で大幅な改善を提供した。
本発明者らは、本発明者らのＭＳベースのＨＬＡ－Ｉ及びＨＬＡ－ＩＩ結合予測因子を使用して、米国、ヨーロッパ、アジアの人口の大部分をカバーする幅広いＨＬＡ－Ｉ及びＨＬＡ－ＩＩ対立遺伝子のセットに対して、ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ゲノム全体のペプチド配列の結合能を予測した。本発明者らはさらに、これらのエピトープのサブセットがドナーＰＢＭＣを用いたＴ細胞誘導アッセイにて特定のＣＤ８＋Ｔ細胞応答を生じることができることを確認している。さらに、本発明者らが、一般に公開されているプロテオミクスデータを解析し、ウイルス感染細胞における複数のＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ タンパク質の相対発現量が大きく異なることを明らかにし、細胞性免疫を誘導するワクチン設計にて考慮すべき別のパラメーターを示している。複数のＨＬＡ－Ｉ及びＨＬＡ－ＩＩ対立遺伝子に結合する可能性が高く、感染したヒト細胞で高い発現を示すと予測されるエピトープは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するＴ細胞応答を誘発する有望なワクチン候補である。
方法
ＶｉＰＲからのＣｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ科のＴ細胞エピトープの分析
ヒト宿主のＣｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ科についての実験的に決定されたエピトープをＶｉＰＲデータベースから読み出した（ｖｉｐｒｂｒｃ．ｏｒｇ／；２０２０年３月５日にアクセス）。検証データセットを構築するために、Ｔ細胞アッセイとＭＨＣ結合アッセイの陽性と陰性の双方を得た。この分析には、少なくとも４桁の解像度で識別され、本発明者らの予測因子によってサポートされている対立遺伝子に関連するアッセイのみが含まれた。
陽性の判定が優先された。すなわち、所与のペプチド・対立遺伝子のペアが特定のアッセイ型によって複数回アッセイされ、いずれか１つのアッセイで陽性であると判定された場合、ペプチド・対立遺伝子のペアは陽性として分類された。具体的には、以下の順：陽性・高＞陽性・中＞陽性・低＞陽性＞陰性で優先順位をつけた（例えば、３回アッセイして陽性・高、陽性、及び陰性の結果が得られたペプチド・対立遺伝子の対合は陽性・高の結果を割り当てた）。注目すべきは、陰性のアッセイ結果を優先する、または複数の結果の場合に無作為に選択するような代わりのアプローチでは、非常に類似した結果が得られたことである（データは示さず）。
ＶｉＰＲ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ科Ｔ細胞エピトープの結合予測
ＶｉＰＲ検証データセットにおけるペプチド・ＨＬＡ－Ｉ対立遺伝子のペアは、単一対立遺伝子のＭＳデータで訓練されたニューラルネットワークである本発明者らのＨＬＡ－Ｉ結合予測因子を使用してスコア化した。同様に、ＶｉＰＲ検証データセットにおけるペプチド・ＨＬＡ－ＩＩ対立遺伝子のペアは、本発明者らのＨＬＡ－ＩＩ結合予測因子を使用してスコア化されたが、これは、最近発表された畳み込みニューラルネットワークに基づくモデルで、これも単一対立遺伝子ＭＳデータで訓練された。本発明者らは、所与のアッセイペプチド内に含有される１２～２０ｍｅｒすべてをＨＬＡ－ＩＩ結合予測因子でスコア化し、アッセイペプチドの代表的な結合スコアとして最大スコアを採用した。ＶｉＰＲデータセットの大部分を占める試験管内のＭＨＣ結合アッセイは、陽性の結合結果にために内在性のプロセシング及び提示を必要としない。ＭＳを介して観察され、自然に処理され提示されたリガンドで訓練される本発明者らの結合予測因子は、これらの内在性のプロセシング規則も暗黙のうちに学習しているので、本発明者らは、この区別を説明するためにアッセイされたペプチド（完全長のアッセイペプチド自体ではなく）内の潜在的なリガンドすべてをスコア化する。
２０１９ ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２の配列の回収
２０１９ ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２のＧｅｎＢａｎｋ参照配列（アクセッション：ＮＣ＿０４５５１２．２）がこの試験に使用された。１２のアノテーション付きオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ１ａ、ＯＲＦ１ｂ、Ｓ、ＯＲＦ３ａ、Ｅ、Ｍ、ＯＲＦ６、ＯＲＦ７ａ、ＯＲＦ７ｂ、ＯＲＦ８、Ｎ、及びＯＲＦ１０）はすべて潜在的なエピトープの供給源と見なされた。加えて、最近公開されたプロテオミクスデータセットでの発現レベルが高いために、ＵｎｉＰｒｏｔ（Ｐ０ＤＴＤ２）によってアノテーションが付けられたＯＲＦ９ｂもエピトープ予測に使用された。
ＨＬＡ－Ｉエピトープの同定及び集団カバー率による優先順位付け
候補のＨＬＡ－Ｉエピトープを特定するために、２１のＨＬＡ－Ａ対立遺伝子、３５のＨＬＡ－Ｂ対立遺伝子、及び１８のＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子を含む７４の対立遺伝子について本発明者らのＨＬＡ－Ｉ結合予測因子によって、２０１９ ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２由来の考えられる８～１２ｍｅｒペプチド配列すべてを徹底的にスコア化した。ペプチド・対立遺伝子のペアには、同じそれぞれの対立遺伝子についてその結合スコアを１，０００，０００の参照ペプチド（モデル訓練に使用されていないヒトプロテオームの区分から選択）の結合スコアと比較することによってパーセント順位を割り当てた。これらの参照ペプチドのスコアのうち上位１％のスコアを得たペプチド・対立遺伝子にペアを強力な潜在的なバインダーと見なした。
ワクチンは理想的には集団の大部分に利益をもたらすはずであるので、各ペプチドが結合すると予想される対立遺伝子すべて（すなわち、上位１％にスコア化されたペプチドについての対立遺伝子すべて）を考えると、これらの上位に順位付けしているペプチドは次いで予想される集団のカバー率に基づいて優先された。各ペプチドの集団カバー率の推定値は次のように計算された。
カバー率＝１－Π遺伝子座（１－Σ遺伝子座対立遺伝子 ｆ対立遺伝子、平均）２
式中、ｆ対立遺伝子、平均は、米国、ヨーロッパ、及びアジアの太平洋諸島民（ＡＰＩ）集団全体の（重み付けされていない）平均対立遺伝子頻度であり、３つのＨＬＡ－Ｉ遺伝子座：ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及びＨＬＡ－Ｃにわたって取得される累積積である。累積積自体は、集団内の個人が含有される対立遺伝子のいずれか１つも発現しない可能性を表す；したがって、補集合は少なくとも１つが存在する確率を説明する。
米国集団の対立遺伝子頻度は、いくつかの亜集団の次の加重平均：０．６２３＊ＥＵＲ＋０．１３３＊ＡＦＡ＋０．０６８＊ＡＰＩ＋０．１７６＊ＨＩＳとして計算され、その際、ＥＵＲ＝ヨーロッパ人、ＡＦＡ＝アフリカ系アメリカ人、ＡＰＩ＝アジア太平洋諸島系住民、ＨＩＳ＝ヒスパニック系集団である。ＡＦＡ、ＨＩＳ、またはＡＰＩの集団頻度が利用できなかった対立遺伝子については、米国集団対立遺伝子頻度の値がＥＵＲに一致するように設定された。欠落しているＡＰＩ対立遺伝子頻度の値は本発明者らの分析のために保守的に０と推定された。
次に、本発明者らは、カバー率によってＨＬＡ－Ｉエピトープの順位付けされた２種類のリストを作成した。１つ目は、すべてのＳＡＲＳ ＣｏＶ－２エピトープをその絶対的なカバー率によって順位付けするので、対立遺伝子の同様の収集物を結合すると予測されるペプチドが同様に順位付けされる。このアプローチは、各ペプチドについて予想されるカバー率によって選別された予測されたクラスＩエピトープの全リストを、すべての結合予測が正しいという寛大な前提で提供する。
「ばらばらな」リストと呼ばれる第２の種類のリストは、最大のカバー率を持つペプチドが最初に選択され、次に残りのエピトープのカバー率が更新されて、既に選択されている（表６）任意の対立遺伝子由来の寄与を無効にする繰り返す方法で構築される。タンパク質レベルの優先順位付けを提供するために、２０１９ ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ゲノム全体にわたる代わりにＭ、Ｎ、及びＳタンパク質（最も高度に発現された構造タンパク質）について個別にばらばらなリストが生成された。このアプローチは、最小数の選択で累積母集団のカバー率を最大化するように設計されているペプチドの倹約リストを作成し、図４Ａ（左）と図４Ｂ（上部パネル）を作成するために使用した。
ＨＬＡ－ＩＩエピトープの特定及び集団カバー率による優先順位付け
ＨＬＡ－ＩＩエピトープを特定するために、本発明者らは、本発明者らのＭＳベースのＨＬＡ－ＩＩ結合予測因子を使用して、ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２プロテオームにおける１２～２０ｍｅｒ配列すべてをスコア化し、各１２～２０ｍｅｒ内の結合の可能性及び結合コアと思われる部分の双方を予測した。スコア化は４６のＨＬＡ－ＤＲ対立遺伝子、１７のＨＬＡ－ＤＰ対立遺伝子、及び２０のＨＬＡ－ＤＱ対立遺伝子から成る、サポートされているＨＬＡ－ＩＩ対立遺伝子すべてにわたって実行された。
ペプチド・対立遺伝子のペアには、それらの結合スコアを１００，０００の参照ペプチドのスコア（前述のように、訓練から提供されたヒトプロテオームの区分から試料採取された）と比較することによってパーセント順位を割り当てた。上位１％のスコアを持つペアを結合する可能性が高いと見なした。さらに本発明者らは、１２～２０ｍｅｒの「エピトープ」を配列内の予測される結合コアであると定義する。したがって、所与の対立遺伝子について同じ予測される結合コアを持つ重複する１２～２０ｍｅｒは単一のエピトープを構成する。表５はこれらのエピトープの数を示す。
さらに本発明者らは、世界の人口全体で広く有効であるワクチンを設計したいという願望を考えて、ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２にて予測されるＨＬＡ－ＩＩを結合する２５ｍｅｒを集団カバー率によって優先順位付けした。これを行うために、本発明者らは各２５ｍｅｒをバインダーである可能性が高いすべての部分配列と関連付け、対応するＨＬＡ－ＩＩ対立遺伝子の集団カバー率を計算した。対立遺伝子の収集物を考えて、本発明者らは前のセクションで説明したようにカバー率を計算し、唯一の差異は累積積が次の４つのＨＬＡ－ＩＩ遺伝子座：ＨＬＡ－ＤＲＢ１、ＨＬＡ－ＤＲＢ３／４／５、ＨＬＡ－ＤＰ、及びＨＬＡ－ＤＱにわたって取られることである。ＨＬＡ－ＩＩ対立遺伝子の頻度は、Ａｌｌｅｌｅ Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ Ｎｅｔ Ｄａｔａｂａｓｅから取得した。
ＨＬＡ－Ｉと同様に、予測される結合配列の２種類の選別されたリストを生成した。第１の種類は、構成部分配列が結合すると予想されるＨＬＡ－ＩＩ対立遺伝子によって提供される絶対カバー率によって予測されるすべてのＳＡＲＳ ＣｏＶ－２の２５ｍｅｒを順位付けする。第２の種類の順位付けはＭ、Ｎ、及びＳタンパク質の予測されるバインダーに対して、ばらばらのカバー率を使用して再び個別に実行され、ペプチドの倹約リストで累積集団カバー率を最大化した（表７）。これは図４Ａ（右）、及び図４Ｂ（下部パネル）を生成するために使用された。
予測エピトープのヒトプロテオームとの比較
ヒトゲノムのｈｇ１９アノテーションとそのタンパク質コード転写物（６３，６９１エントリ）とともにＵＣＳＣゲノムブラウザー遺伝子を使用してヒトプロテオーム由来の同じ長さのすべての部分配列に対して、ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２由来の８～１２ｍｅｒ配列（予測されるＨＬＡ－Ｉエピトープに対応する）、９ｍｅｒ配列（予測されるＨＬＡ－ＩＩ結合コアに対応する）、及び２５ｍｅｒ配列（複数の対立遺伝子を結合した予測されるＨＬＡ－ＩＩ配列に対応する）を比較した。正確な一致を特定し、ばらばらなカバー率順位付け分析から除外して不注意に自己免疫応答を誘発し得るペプチドを優先することを回避した。予測されたＨＬＡ－ＩＩ結合コアまたは２５ｍｅｒ配列について正確な一致は見つからなかった。
ペプチド・ＭＨＣ陽性Ｔ細胞応答のＴ細胞誘導及び評価
ＨＬＡ－Ａ０２：０１陽性ヒトドナー由来のヒトＰＢＭＣを、アフェレーシス材料（ＡｌｌＣｅｌｌｓ，ＵＳＡ）からＦｉｃｏｌｌ分離を使用して分離した。ＨＬＡ－Ａ０２：０１への強力なバインダーであると予測される２３のＳＡＲＳ ＣｏＶ－２エピトープをプールあたり最大６つのペプチドで同様の結合能力によってプールした。選択されたペプチドは、Ｓ、Ｎ、Ｍ、Ｅ、及びＯＲＦ１ａｂのタンパク質全体からＨＬＡ－Ａ０２：０１を結合すると予測された上位順位のペプチドを表し、Ｇｒｉｆｏｎｎｉ ｅｔ ａｌ．によっても優先順位付けされた配列を回避する。２３のペプチド配列のうち５つはＳＡＲＳ－ＣｏＶにも見られ、以前にアッセイされ、ＶｉＰＲ にてＨＬＡ－Ａ０２：０１のバインダーとして確認された。ＰＢＭＣをペプチドプールとともにインキュベートし、ＩＬ－７及びＩＬ－１５（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の存在下で成熟させ、培養してＴ細胞の増殖を促進した。次いで、細胞を回収し、ペプチド・ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度を、ｐＭＨＣ多量体の組み合わせコーディングを使用してアッセイした。ｐＭＨＣ多量体は本出願人によって別の場所に記載されているように調製した。簡単に言えば、ＵＶ切断可能ペプチドを負荷したビオチン化ＨＬＡ－Ａ０２：０１単量体をＵＶ光下でＳＡＲＳ ＣｏＶ－２予測ペプチドと交換した。ストレプトアビジン標識蛍光色素分子ＰＥ、ＡＰＣ、ＢＶ４２１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）、ＢＶ６５０、及びＢＵＶ３９５（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ）をＵＶ交換単量体に添加して、蛍光標識した多量体試薬を作り出した。次に、回収した細胞を６３３または６３５ｎｍ励起用のＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｎｅａｒ－ＩＲ死細胞染色キット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＵＳＡ）、抗ＣＤ４ＦＩＴＣ、抗ＣＤ１４ＦＩＴＣ、抗ＣＤ１６ＦＩＴＣ、及び抗ＣＤ１９ＦＩＴＣ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ）及び抗－ＣＤ８ＡＦ７００（ＢｉｏｌｅｇｅｎｄＩｎｃ．，ＵＳＡ）によって染色した。関連するｐＭＨＣ多量体の双方の蛍光色素についての生ＣＤ８＋Ｔ細胞染色のみが陽性であると見なされた。ＦＡＣＳ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ１８Ｘ２０サイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で試料を分析し、ＦｌｏｗＪｏ（ＴｒｅｅＳｔａｒ）を使用してデータを分析した。アッセイで使用したそれぞれのペプチドを表４に示す。
Figure 2023518821000313
公開されているＳＡＲＳ ＣｏＶ－２プロテオミクスデータセットの分析
２０１９ ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２プロテオミクスデータセットはＰＲＩＤＥリポジトリ（Ｂｏｊｋｏｖａ，ｅｔ ａｌ．：ＰＸＤ０１７７１０；Ｂｅｚｓｔａｒｏｓｔｉ，ｅｔ ａｌ．：ＰＸＤ０１８７６０；Ｄａｖｉｄｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．：ＰＸＤ０１８２４１）からダウンロードされた。これらの試験では、Ｃａｃｏ－２ヒト結腸直腸腺癌細胞（Ｂｏｊｋｏｖａ）またはＶｅｒｏ Ｅ６アフリカミドリザル腎臓上皮細胞（Ｂｅｚｓｔａｒｏｓｔｉ及びＤａｖｉｄｓｏｎ）のいずれかに２０１９ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を感染させた。データ依存取得（ＤＤＡ）で取得したタンデム質量スペクトル（ＭＳ／ＭＳ）は、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｍｉｌｌ ＭＳ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓソフトウェアパッケージｖ７．０プレリリース（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して解釈した。システインカルバミドメチル化を固定修飾として選択した。メチオニンの酸化、アスパラギンの脱アミド化、タンパク質のＮ末端のアセチル化、ペプチドのＮ末端のグルタミンからピログルタミン酸への変換、及びペプチドのＮ末端のシステインのピロカルバミドメチル化を可変修飾として選択した。等圧質量タグを採用したＢｏｊｋｏｖａデータセットについては、ＴＭＴ１１を固定修飾としてペプチドＮ末端とリジンに付加し、１３Ｃ６－１５Ｎ２－ＴＭＴ１１－リジン及び１３Ｃ６－１５Ｎ４－アルギニンを可変修飾として追加した。データセットはすべて、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓプロテオーム（Ｂｏｊｋｏｖａ、ＵＣＳＣ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｒｏｗｓｅｒ ｈｇ１９アノテーション、６３６９１エントリー）またはＣｈｌｏｒｏｃｅｂｕｓ ｓａｂａｅｕｓプロテオーム（Ｂｅｚｓｔａｒｏｓｔｉ及びＤａｖｉｄｓｏｎ，ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ，９２２９エントリー）のいずれかを含有するデータベースに連結した２０１９ ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２プロテオーム（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ、２０２０年４月２８日、１４エントリー）に対して検索した。前駆体及び断片の質量許容差は、各原稿に記載されているように設定し、または指定されていない場合は２０ｐｐｍに設定した。データベースの検索結果は、ペプチド・スペクトル一致（ＰＳＭ）のリストとして送出し、標的デコイに基づく誤検出率（ＦＤＲ）推定値は１％だった。各試験からの個々の分数は単一のリストにまとめた。スペクトルカウントを実行するために、単一の２０１９ ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２タンパク質に割り当てられたＰＳＭを計数し、ＯＲＦ１ａとＯＲＦ１ａｂを単一のタンパク質群として扱った。宿主とＳＡＲＳ ＣｏＶ－２タンパク質の双方に一致するペプチドは破棄した。スペクトルカウントを各タンパク質の長さ対して正規化し、各データセット内の最大値は１００％に設定した。
結果
ＶｉＰＲを使用したウイルスエピトープについてのバイオインフォマティクス予測因子の検証
本発明者らは先ず、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ科のゲノムからエピトープを特定する本発明者らの予測因子の能力を検証しようとした。ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２は最近出現したばかりであるので、ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ペプチドのＭＨＣ結合及び免疫原性エピトープに関する特定のデータは現在のところ限られている。しかしながら、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ科の他のウイルス、特にＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶは十分的に研究されている。後者は、２０１９ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と有意な配列相同性を有する。したがって、本発明者らは、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ科全体から以前に調べられたエピトープを活用して、ウイルスペプチドの予測を検証しようとしたが、新規の２０１９ ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ウイルスのタンパク質配列と正確に一致するペプチド配列に特に関心があった。そのために、本発明者らはウイルス病原体エピトープについてのＨＬＡ－Ｉ及びＨＬＡ－ＩＩの対立遺伝子の双方に対するＴ細胞免疫原性及びＭＨＣ・ペプチド結合アッセイの結果を列挙するＶｉＰＲデータベースを使用した。本発明者らは、本発明者らの検証データセットとしてＶｉＰＲからのヒト宿主によるＣｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ科ウイルスのすべてのアッセイを使用した。関連する４桁のＨＬＡ対立遺伝子を有さないアッセイ、または本発明者らのモデルがサポートしていない対立遺伝子に関連するアッセイは省略した。
ＨＬＡ－Ｉについては、検証データセット内に、合計４，４４５の独特なペプチド・ＨＬＡ対立遺伝子のペアがあり、それらは以下の変動：１）細胞性ＭＨＣまたは精製ＭＨＣ；２）直接アッセイまたは競合アッセイ；及び３）蛍光または放射活性による測定を使用してＭＨＣ結合についてアッセイされた。２つの追加のペプチド・ＭＨＣ対立遺伝子のペアはＸ線結晶構造解析によって確認された。データが収集された研究に応じて、ペプチド・ＭＨＣ対立遺伝子のペアはＶｉＰＲにて結合について単純に「陰性」及び「陽性」として定義され、または陽性のさらに細かいスケール（低、中、及び高）で定義された。本発明者らは、複数の測定値を持つペプチド・ＭＨＣ対立遺伝子のペアを複製全体で検出された最も高いＭＨＣ結合に割り当てた（方法を参照のこと）。
次に、本発明者らは、本発明者らのＨＬＡ－Ｉ結合予測因子を検証データセットにおけるペプチド・ＭＨＣ対立遺伝子のペアに適用し、これらのペアの計算されたＨＬＡ－Ｉのパーセント順位を報告されたＭＨＣ結合アッセイ結果と比較した。低いパーセント順位値は結合の可能性が高いことに対応する（例えば、無作為ペプチドの参照セットにて上位１％のスコアを持つパーセント順位１％のペプチド）。ＭＨＣ結合アッセイにて２成分「陽性」の結果を有したペプチド・ＭＨＣ対立遺伝子のペアのパーセント順位は「陰性」の結果を示したペアよりも有意に低かった。その上、さらに詳細な陽性結果では、さらに強いアッセイ結果（低＜中級＜高）はますます低いパーセント順位と関連していた（図２、左上）。加えて、Ｘ線結晶構造解析によって確認された２つのペプチド・ＭＨＣ対立遺伝子は０．０７％及び０．３０％ｒと低いパーセント順位スコアで非常に可能性の高いバインダーとして予測された。本発明者らのＨＬＡ－Ｉ結合予測因子は、当初、がんにおけるネオアンチゲン予測をサポートする目的で構築されたが、この分析はそれがコロナウイルスのプロテオームに好適に適用できることを示している。本発明者らはＰｒｅｃｉｓｉｏｎ－Ｒｅｃａｌｌ分析を行うことによって本発明者らの予測因子を評価し、陽性のバインダーの正確な呼び出しと検出される真のバインダーの割合との間でのトレードオフを実証した（図２、左下）。
エピトープに対するＴ細胞の免疫原性のさらに厳密な測定であるＴ細胞反応性のアッセイ（例えば、インターフェロン－ガンマＥＬＩＳｐｏｔ、四量体）はＭＨＣ結合アッセイと比べて有意に少ない数で実施された。ＨＬＡ－Ｉについては、本発明者らが予測を有したペプチド・ＭＨＣ対立遺伝子のペア（サポートされた対立遺伝子）と、Ｔ細胞アッセイが報告されたペアとの重複はわずか３２ペアから成り、そのうち２３ペアが陽性結果を有した。本発明者らは、陽性群と陰性群にわたってパーセント順位の差異を検出しなかったが、試料サイズは非常に小さい（データは示さず）。加えて、ＨＬＡ－Ｉエピトープについては、検証データセットが、結合アッセイにて陽性の結果を有するペプチド・ＭＨＣ対立遺伝子ペアについてＴ細胞アッセイ結果のみを含有したということは、陽性のＴ細胞アッセイの結果の高い比率でも反映されるように、検査用に選択されたエピトープの非常に偏ったプールを示唆している。実際、完全に無作為に選択されたペプチドで予想されるものと比べて陽性のＭＨＣ結合アッセイの割合が高いことは、予測または以前のデータに基づいて結合すると予想されるペプチドが検査のために優先順位付けされた（または陰性の結果は過少報告された）ことも意味する。アッセイされたペプチドのこの根底にある偏りは、この検証データセットで結合予測因子の性能を評価する際に留意することが重要である。検査用に無作為なペプチドが選択されていれば、陽性と陰性のスコアの一層さらに劇的な差が予想される。
ＣＤ８＋Ｔ細胞についての標的の特定に加えて、本発明者らは最近、ＨＬＡ－ＩＩバインダーを予測する能力を実証し、２０１９ ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ワクチンに利用されてもよいＣＤ４＋Ｔ細胞応答を標的とすることが可能になった。これらのＣＤ４＋応答はＴ細胞免疫を増強し、液性免疫を増強する可能性があり得る。
ＨＬＡ－Ｉ分析と同様の方法で、本発明者らは、本発明者らのＨＬＡ－ＩＩ結合予測因子を使用してＶｉＰＲにてサポートされているＨＬＡ－ＩＩ対立遺伝子を持つすべてのＣｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ科のペプチド・ＭＨＣ対立遺伝子のペアすべてをスコア化した。ＨＬＡ－ＩＩについてのＶｉＰＲ検証データセットではＭＨＣ結合アッセイによってアッセイされた２５９の独特なペプチド・ＭＨＣ対立遺伝子のペアがあった。以前と同様に、本発明者らはそれらのパーセント順位を報告された「最良の」（複数測定の場合）ＭＨＣ結合アッセイ結果と比較した。この比較は、ＨＬＡ－ＩＩについての検証データセットに陰性の結果が１つしかなかったので、独立した群としての「陰性の」ペアでは実行できなかった。陰性の数が少ないのは、陰性のアッセイ結果が過小報告されていることに起因する場合があり、またはアッセイ対象のペプチドが偏って選択されていることに起因する場合がある。したがって、本発明者らは、「陰性」群と「陽性－低」群を１つの群に統合し、それらのパーセント順位を「陽性－中間」群または「陽性－高」群と比較した（図２、右上）。この分析によって、ＨＬＡ－Ｉ予測で観察されたものと同様の傾向が明らかになり、強力な予測因子に期待されるように、さらに強いＭＨＣ結合アッセイの結果は、ＨＬＡ－ＩＩバインダーの低い予測パーセント順位と関連することが示された。また、本発明者らはＰｒｅｃｉｓｉｏｎ－Ｒｅｃａｌｌ分析を実行することによって本発明者らのＨＬＡ－ＩＩ結合予測因子も評価した（図２、右下）。Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ－Ｒｅｃａｌｌ曲線下面積（ＡＵＣ）は無作為な推測よりも本発明者らの予測因子にわずかな利点しかないことを示し、それはＨＬＡ－ＩＩ結合アッセイの結果が陽性であるペプチドへの大きな偏りによって説明される。ＨＬＡ－Ｉ Ｔ細胞アッセイと同様に、本発明者らの検証データセットに記録されたＨＬＡ－ＩＩ Ｔ細胞アッセイが少なすぎて、陽性と陰性を調べるペプチド・ＨＬＡ ＩＩ対立遺伝子のペア間のパーセント順位の差異を判定できなかった。一緒に、これらの知見はさらに、結合アッセイで陽性の結果を持つペプチド・ＭＨＣ対立遺伝子のペアが、ＨＬＡ－Ｉ及びＨＬＡ－ＩＩのＭＨＣ結合予測因子の双方によって一貫して低いパーセント順位（さらに良好なスコア）を有するので、本発明者らのエピトープ予測因子の有効性を裏付けている。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２についてのエピトープ予測
本発明者らは本発明者らのＭＳベースのＨＬＡ結合予測能力を利用してＳＡＲＳ ＣｏＶ－２のＴ細胞応答の生成に最も関連するペプチドを特定した。本発明者らは先ず、ＨＬＡ－Ｉペプチド結合の分析を行い、１３のＳＡＲＳ ＣｏＶ－２のＯＲＦからの長さ８～１２のアミノ酸の各ペプチドが本発明者らのデータベースにおける任意のＨＬＡ－Ｉ対立遺伝子に結合する可能性を計算した。次に本発明者らは、その結合スコアを一連の参照ペプチドのものと比較することによって各ペプチド・ＭＨＣ対立遺伝子のペアのパーセント順位を計算し；推定バインダーはパーセント順位が１％以下である所与の対立遺伝子に結合すると予測される配列として特定された（図１）。
この測定基準によって、本発明者らは少なくとも１つのＨＬＡ－Ｉ対立遺伝子を結合すると予測された合計１１，８９７の独特なＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ペプチドを検出した。これらのペプチドのうち１６はヒトプロテオームの部分配列と重複し、自己免疫の可能性を考慮して印を付けた。
結合したペプチドの長さをおよそ８～１２アミノ酸に制約する閉鎖結合溝を有するＨＬＡ－Ｉとは異なって、ＨＬＡ－ＩＩを結合するペプチドは、ＨＬＡ－ＩＩの結合溝が両端で開放しているのでさらに広い長さの分布（最大３０またはそれ以上のアミノ酸）を有する。ペプチドは、ＨＬＡ－ＩＩの結合溝を占める９アミノ酸の部分配列（結合コアと呼ばれる）と結合し、任意の隣接配列は分子の端に突き出る。本発明者らは、隣接領域が異なるが、単一のエピトープとして共通の結合コアを共有するペプチドの群を検討している。ＨＬＡ－ＩＩの予測因子を使用して、本発明者らは少なくとも１つのＨＬＡ－ＩＩ対立遺伝子を１％以下のパーセント順位スコアで結合すると予測される３，３７２の独特な結合コアを特定した（表５）。予測されたペプチド・ＭＨＣ対立遺伝子のペアの大部分は、主にこれらのＯＲＦの長さによって駆動されるＯＲＦ１ａ及びＯＲＦ１ａｂに由来する。加えて、ＯＲＦ１ａ及びＯＲＦ１ａｂは非常に類似した配列を有し、双方のＯＲＦについて１８，０００を超える同一の結合ペプチド・ＨＬＡ－Ｉ対立遺伝子がペア予測されている。したがって、本発明者らは冗長な予測を除外することを選択し、独特なペアのみを報告した（表５における＊を参照のこと）。同様に、ＯＲＦ１ａ由来のＨＬＡ－ＩＩ予測エピトープはすべてＯＲＦ１ａｂについて報告されたものによってカバーされていた。
ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２予測ペプチド・ＨＬＡペアの有効性を調べるために、本発明者らは、ＶｉＰＲデータベースのＣｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ部分でＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ペプチド配列と正確に一致するペプチド配列を探した（図２Ｄ）。ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２由来の合計３７４のＨＬＡ－Ｉペプチド・ＭＨＣ対立遺伝子のペアは双方とも本発明者らの予測因子によって１％未満のパーセント順位を有し、ＨＬＡ－Ｉ ＭＨＣ結合検証データセットで見つかった。驚くべきことに、これらのＨＬＡ－Ｉペプチド・ＭＨＣ対立遺伝子ペアのうち、３３３（８９％）は陽性のアッセイ結果を有した。比較として、本発明者らは、ＭＨＣ結合の可能性が低い（５０％以上のパーセント順位）と予測されたエピトープと検証データセットとの重複についても調べた。３７のペプチド・ＭＨＣ対立遺伝子ペアがこれらのセット間で重複しており、そのうち３６（９７．２％）は予測どおり陰性のアッセイ結果を有した。さらに、本発明者らは、本発明者らの高度に予測された２０１９ ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ペプチド・ＨＬＡ－Ｉ対立遺伝子のペア（１％未満のパーセント順位）が報告されたＴ細胞アッセイの結果によって検証されるかどうかを判定しようとした。検証データセットにてＴ細胞反応性について調べられたペプチド・ＭＨＣ対立遺伝子のペアの数が大幅に少ないにもかかわらず、アッセイされた１０のペアも本発明者らのＨＬＡ－Ｉ結合予測因子によって高度に予測された。これら１０のうち９（９０％）の予測されたペアはＴ細胞アッセイに対して陽性の結果を有した。検証データセットでは、スコア化の低いペア（パーセント順位が５０％以上）は報告されなかった。これらの知見はＳＡＲＳ ＣｏＶ－２エピトープについてのペプチド・ＨＬＡ－Ｉ対立遺伝子ペアについての本発明者らの予測の妥当性を実証している。特に、本発明者らのアルゴリズムはＴ細胞反応性データで訓練されておらず、ペプチド・ＭＨＣ結合を目的としている一方で、Ｔ細胞反応性アッセイの結果が報告されたＶｉＰＲのいくつかの例では、本発明者らは本発明者らの高スコア化ペプチド・ＭＨＣ対立遺伝子ペアが非常に多くの場合に実際に免疫原性であることを示すことができた。
ＨＬＡ－ＩＩペプチド・ＭＨＣ対立遺伝子のペアについては、単一のＨＬＡ－ＩＩペプチド・ＭＨＣ対立遺伝子のペアのみが双方とも１％未満のパーセント順位を有し、検証データセットで報告された；この単一のペア（エンベロープタンパク質由来）は「陽性－高」のアッセイ結果を有した。


Figure 2023518821000314
ＨＬＡ－Ａ０２：０１－予測された２０１９ ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２エピトープの免疫原性
使用されるＭＳベースの結合予測アルゴリズムは、特定のＨＬＡ対立遺伝子によって提示されるエピトープの可能性を予測するが、ＭＨＣ分子によって提示されるエピトープを認識するＴ細胞受容体の能力を直接予測するわけではない。自己抗原由来のペプチドと交差反応し得るＴ細胞を除去する中枢性寛容のプロセスに起因して、強力なＭＨＣバインダーであるエピトープすべてがＴ細胞応答を誘発するわけではない。したがって、Ｔ細胞アッセイにて高親和性ＭＨＣ結合ペプチドをさらに検証する必要がある（図１）。高度に予測されたＭＨＣ結合ペプチドのサブセットの免疫原性に対処するために、本発明者らは以下のＳＡＲＳ ＣｏＶ－２タンパク質のぞれぞれ：Ｓ、Ｍ、Ｎ、Ｅ、及びＯＲＦ１ａｂから２３の高度に予測されたＨＬＡ－Ａ０２：０１結合エピトープを合成した。これらの高度に予測されたＳＡＲＳ ＣｏＶ－２エピトープのうち、５つの配列はＶｉＰＲにてＨＬＡ－Ａ０２：０１に関連してＭＨＣ結合またはＴ細胞反応性について陽性だった。これらのペプチドのプールを３人のヒトドナー由来のＰＢＭＣとともに培養し、３人のドナーのうち少なくとも１人にてＨＬＡ－Ａ０２：０１についてｐＭＨＣ多量体への結合によって検出されるようなＴ細胞応答を、予測されたエピトープが誘発する場合、それらは免疫原性であると見なされた。
図３に示すように、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、２３の高度に予測されたエピトープのうちの１１について少なくとも１人のドナーで検証された（表７及び図３）。ＶｉＰＲで免疫原性または強力なバインダーとして以前に報告された５つのエピトープのうち、３つはＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発することが確認され、本発明者らの結合予測因子が免疫原性であるエピトープを特定できることが確認された。加えて、本発明者らは、ドナーＰＢＭＣの特定のＣＤ８＋Ｔ細胞によって認識される、ＶｉＰＲで以前に報告されていない８つの新規エピトープを特定することができた。応答は一般に堅牢で、本発明者らのアッセイで陽性の１１のエピトープのうち９が、少なくとも２人のドナーにて特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞応答によって認識され（表７）、激励されることに、アッセイされた２０１９ ＳＡＲＳ ＣＯＶ－２由来のＯＲＦはすべてＴ細胞応答をもたらす少なくとも１つのペプチドを有した（表７）。まとめると、これらのデータは、ＭＨＣ－Ｉ結合予測因子から強力なバインダーであると予測された多くの新規２０１９ ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２のエピトープが免疫原性であることが判明したことを示している。
複数のＨＬＡ－Ｉ及びＨＬＡ－ＩＩ対立遺伝子に結合すると予測されるペプチドの集団カバー率
検証データセットと本明細書で提供されている高度に予測されたペプチド・ＭＨＣ対立遺伝子ペアとの間の一致は、ＨＬＡ結合予測因子が２０１９ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＯＲＦから予測されたＭＨＣ結合ペプチドのリストを大幅に拡張することを示している。次に、これらの集団にてＭＨＣ対立遺伝子が広く行き渡っていることに基づいて、米国、ヨーロッパ（ＥＵ）、及びアジア太平洋諸島民（ＡＰＩ）の集団に幅広いカバー率を提供すると予測されたＭ、Ｎ、及びＳタンパク質由来のペプチドが優先された。ペプチドのサブセットが、ＨＬＡ－ＩまたはＨＬＡ－ＩＩの対立遺伝子のいずれかの広範なセットに結合すると予測されることが見いだされた。各タンパク質について、少数のペプチド配列が、米国、ヨーロッパ、及びアジアの太平洋諸島の集団について飽和させるカバー率を提供することが判定され、それぞれ、＞９９％の集団カバー率がＨＬＡ－Ｉについて選択された８～１２ｍｅｒエピトープで達成され、且つ＞９５％の集団カバー率がＨＬＡ－ＩＩについて選択された２５ｍｅｒ配列で達成された（図４Ｂ）。所与のペプチドが上位１％のスコアであるペプチド・ＭＨＣ対立遺伝子ペアすべてが実際に免疫原性であるという寛大な仮定が完全に支持されるわけではなくても、この知見は、広範なＴ細胞免疫を誘導するための倹約的で広く効果的なワクチンの設計を促進してもよい。
表６は、３つのＳＡＲＳ ＣｏＶ－２タンパク質：累積対立遺伝子カバー率が最も広いスパイク、ヌクレオカプシド、及び膜タンパク質のそれぞれに由来する上位のＨＬＡ－Ｉ予測バインダーを示す。この表は、ペプチド配列、その順位、それが由来する２０１９ ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２タンパク質、ペプチドが結合すると予測される対立遺伝子、ならびにこの順位までのすべてのペプチドについての米国、ヨーロッパ（ＥＵＲ）、及びアジア太平洋諸島民（ＡＰＩ）の集団のための累積ＨＬＡ－Ｉカバー率を提供している。
表７は、３つの２０１９ ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２タンパク質：スパイク、ヌクレオカプシド、及び膜タンパク質のそれぞれに由来する上位のＨＬＡ－ＩＩ予測バインダーを示している。各２５ｍｅｒについて、表は順位、ペプチド配列、それが由来する２０１９ ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２タンパク質、この順位までのすべての２５ｍｅｒによってカバーされる累積対立遺伝子、ならびに関連する米国、ヨーロッパ（ＥＵＲ）、及びアジア太平洋諸島民（ＡＰＩ）の集団カバー率を提供している。これら２５ｍｅｒのいずれか、またはそれらの結合部分配列が、ヒトプロテオーム内の部分配列として見られるわけではないことに留意のこと。
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Figure 2023518821000332
プロテオミクスデータを活用して相対的なウイルスタンパク質存在量を推測すること
ペプチド・ＭＨＣ結合に加えて、潜在的なＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ワクチンの設計におけるもう１つの重要な検討事項は、感染宿主細胞におけるウイルスタンパク質発現の程度である。ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２タンパク質の相対的存在量を決定するために、本発明者らはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染宿主細胞のトリプシン消化物で偏りのないＬＣ－ＭＳ／ＭＳを取得した３つの公表されているプロテオミクスデータセットを分析した。ウイルスタンパク質の相対的存在量は、ペプチド・スペクトルの一致を数え、合計がタンパク質間で比較される半定量的アプローチであるスペクトルカウントによって推定した（表８）。表８は、公開されたＳＡＲＳ ＣｏＶ－２プロテオミクスデータセットからのスペクトルカウントを示す。ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２タンパク質由来のペプチドに割り当てられたＭＳ／ＭＳスペクトルをデータセット全体で集計し、タンパク質の長さで割り、各データセット内で正規化して図５を作成した。この分析は、ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２タンパク質の発現レベルの範囲が有意に広いことを実証した。具体的には、ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２感染後の３つのデータセットすべてにわたってＮタンパク質が最も豊富なウイルスタンパク質であることが確認された（図５）。この知見は、ＣＯＶＩＤ－１９患者のうがい液試料でＮ由来ペプチドが検出されたという報告によって裏付けられている。さらに、Ｎタンパク質はＳＡＲＳ－ＣｏＶウイルスに感染した患者を診断するための生体マーカーとして使用されている。一方、ゲノム情報のみに基づくと、ＯＲＦ１０はワクチン開発の潜在的な標的と見なされてもよい。しかしながら、ＯＲＦ１０が実際にＳＡＲＳ ＣｏＶ－２感染細胞で発現されているというプロテオミクス及びトランスクリプトームの証拠はほとんどない。これらの知見は、ワクチン設計戦略において、ＨＬＡ 結合予測とこれらのエピトープの免疫原性に加えて、ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２タンパク質発現レベルを考慮することの価値を強調している。

Figure 2023518821000333
考察
この試験では、使用されたＨＬＡ－Ｉ及びＨＬＡ－ＩＩ結合予測アルゴリズムの有用性と妥当性が、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅのウイルスファミリー、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して実証された。予測の強度は２倍である；第１に、本発明者らはＨＬＡ－Ｉ及びＨＬＡ－ＩＩバインダーの双方についてＭＳに基づいた検証済み予測因子を有し、それは、ウイルスに対するＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞双方の免疫を長期的に誘導するために活用されてもよい。具体的には、単一対立遺伝子ＭＳデータの大規模なセットでも訓練されている本発明者らのＨＬＡ－ＩＩ予測因子は、以前に公開されたツールよりも大幅に優れていることが示されており、細胞性免疫及び液性免疫の双方に寄与し得る高品質のＣＤ４＋エピトープを特定するのにここで使用されている。第２に、サポートされているＨＬＡ－Ｉ及びＨＬＡ－ＩＩ対立遺伝子の本発明者らの膨大なデータベースは、多くのペプチド・ＭＨＣ対立遺伝子ペアを特定するだけでなく、米国、ヨーロッパ、アジアの太平洋諸島の集団全体によって提示され得る多数の潜在的ＨＬＡ対合とともにペプチドの狭いリストも生成する能力を本発明者らに提供している。これらのアルゴリズムをＶｉＰＲで以前にアッセイしたペプチド・ＭＨＣ対立遺伝子ペアに適用することによって、本発明者らは本発明者らの結合予測とＨＬＡ－Ｉ及びＨＬＡ－ＩＩエピトープの双方の結合アッセイの結果との間の優れた一致を実証することができた。本発明者らは、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ科内の相同性を活用して、その検証が利用可能である上位のＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ペプチド・ＭＨＣ対立遺伝子ペアのうち非常に高位の部分（約９０％）が予測されたＭＨＣ対立遺伝子を結合することが実際に確認されることを実証した。また本発明者らは、本発明者らの結合予測因子が、免疫原性であり、且つドナーＰＢＭＣにおける複数のＳＡＲＳ ＣｏＶ－２タンパク質に対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答をもたらすことができるエピトープを特定することができることも確認した。この最初の実験ではわずか３人のドナーからのＰＢＭＣが使用されたので、実験的に確認されたエピトープ（すべての高度に予測され、調べられたエピトープ）のかなりの部分が全体的な免疫原性を過小評価しているにすぎない可能性が高い。本発明者らはＨＬＡ－ＩＩ予測エピトープの免疫原性を評価するためのＴ細胞アッセイを実行しなかったが、特に細胞性及び液性の抗ウイルス応答の双方におけるＣＤ４＋Ｔ細胞の重要性を考えると、そのような分析は有益であることになる。したがって、本発明者らは、Ｂ細胞エピトープとＴ細胞エピトープの組み合わせがＳＡＲＳ ＣｏＶ－２からの長期にわたる免疫を提供し得、または防御が部分的な場合に疾患の重症度を軽減し得ることを提案する．
したがって、本発明者らは、ＭＳに基づくＨＬＡ結合予測因子を使用して、ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２のＯＲＦからＴ細胞エピトープを予測することは、ウイルスに対する高品質のＴ細胞ワクチン標的の大幅に拡張された新規セットを提供すると結論付けた。これは、この研究をＧｒｉｆｏｎｉらによる最近の出版物と比較した場合に特に当てはまった。本発明者らは、本発明者らがワクチン候補の優先順位をさらに良好に設定できる、さらに多くのＨＬＡ対立遺伝子にわたって１０倍高度に予測されたエピトープを提供する。加えて、本発明者らは、ＶｉＰＲにおけるＣｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ科由来の他のウイルスから以前に報告されたエピトープのさらに大きなセットによるバイオインフォマティクス検証だけでなく、実験的に検証された新規の２０１９ ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２のＴ細胞エピトープも提供する。
タンパク質発現、集団の大部分にカバー率を提供すると予測されるエピトープ、及び保存された２０１９ ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２エピトープによって標的配列の選択をさらに導くことができる。第１に、予測されたエピトープに対する治療薬の設計は、それらのエピトープを含有するタンパク質が、効率的な抗原のプロセシングと提示が行われるのに十分な高いレベルで発現される場合にのみ有効である。したがって、治療標的を選択する際にタンパク質発現を考慮することが重要である。第２に、複数の対立遺伝子を結合すると予測されるエピトープの優先順位付けは、ワクチンに少数のエピトープを含めながら、集団のかなりの割合にカバー率を提供してもよい。最後に、集団全体でのウイルスの拡散と増殖の最中に、ゲノム修飾が獲得され、２０１９ ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２集団の間で配列の多様性が生成される。この多様性は免疫圧の回避を可能にする場合があり、したがって２０１９ ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２集団全体で保存されているエピトープを優先することが重要である。
エピトープの選択を高度に発現されたタンパク質、複数の高頻度ＨＬＡ対立遺伝子を結合すると予測されるエピトープ、及び保存されたウイルスエピトープに限定することは可能性があるエピトープの数を制約する一方で、本発明者らが提供する幅広いリストは多くの高品質で高発現のエピトープを特定する可能性を高める。ここで特徴付けられたエピトープは、免疫原性を確認するためのさらなる取り組みとともに、２０１９ ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ タンパク質発現に関する洞察と組み合わせて、強力な細胞性免疫を誘導するワクチン候補であってもよいエピトープの前臨床検証を提供することができる。
結論
要約すると、この試験は、２０１９ ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ゲノム全体にまたがり、ＨＬＡ－Ｉ及びＨＬＡ－ＩＩ対立遺伝子の幅広いセットを結合するＣＤ４＋及びＣＤ８＋のＴ細胞エピトープ双方の最も広範なセットを提供する。このエピトープリストをタンパク質の発現レベル、集団カバー率、及びウイルス配列保存と組み合わせることは、集団の大部分で免疫原性を示す可能性が高いワクチンエピトープ候補の短いリストの生成につながることになる。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋のＴ細胞エピトープの本発明者らの予測リストは、Ｂ細胞エピトープを補完し、科学界が強力な２０１９ ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ワクチンエピトープを生成し、長期的なＴ細胞免疫を生成するための資源として役立つことになる。
実施例２：ＨＬＡクラスＩ及びクラスＩＩの結合アッセイ
ＨＬＡ分子へのペプチド結合の以下の例は、ＨＬＡクラスＩ及びクラスＩＩのペプチドの結合親和性の定量化を実証する。結合アッセイは、モチーフを持つペプチドまたはモチーフを持たないペプチドのいずれかで実行することができる。２０１９ ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２感染細胞株を準備した。開示されたプロトコール（Ｓｉｄｎｅｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１８．３．１（１９９８）；Ｓｉｄｎｅｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：２４７（１９９５）；Ｓｅｔｔｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：８１３（１９９４））に従って細胞溶解物を調製し、ＨＬＡ分子を精製する。ＨＬＡ分子はアフィニティークロマトグラフィーによって溶解物から精製される。溶解物を、適切な抗体に結合したセファロースＣＬ－４Ｂビーズのカラムに通す。次いで、抗ＨＬＡカラムを１％ＮＰ－４０、ＰＢＳにおける１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣＬ、ｐＨ８．０で洗浄し、ＰＢＳは０．４％ｎ－オクチルグルコシドを含有し、ＨＬＡ分子を０．４％ｎ－オクチルグルコシドを含有する０．１５ＭのＮａＣｌにおける５０ｍＭのジエチルアミン、ｐＨ１１．５で溶出する。２．０ＭのＴｒｉｓ、ｐＨ６．８の１／２５容量を溶出液に加えてｐＨを下げる。次いで、溶出液をＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ３０濃縮器（Ａｍｉｃｏｎ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）での遠心分離によって濃縮する。タンパク質含量はＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）によって評価し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって確認する。
クラスＩ及びクラスＩＩのＭＨＣへのペプチドの結合を測定するのに利用されるプロトコールの詳細な説明が公開されている（Ｓｅｔｔｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：８１３，１９９４；Ｓｉｄｎｅｙ，ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｓｅｃｔｉｏｎ，１８．３，１９９８）。簡単に説明すると、精製されたＭＨＣ分子（５～５００ｎＭ）をプロテアーゼ阻害剤カクテルの存在下で０．０５％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０（ＮＰ４０）（またはＨ－２ＩＡアッセイ用の２０％ｗ／ｖジギトニン）を含有するＰＢＳにて種々の非標識ペプチド阻害剤及び１～１０ｎＭの１２５Ｉ放射性標識したプローブペプチドとともに４８時間インキュベートする。ｐＨ４．５で実行されたＤＲＢ１＊０３０１、ならびにｐＨ５．０で実行されたＤＲＢ１＊１６０１（ＤＲ２ｗ２１１３１）及びＤＲＢ４＊０１０１（ＤＲｗ５３）を除いて、アッセイはすべてｐＨ７．０である。
インキュベートに続いて、７．８ｍｍ×１５ｃｍのＴＳＫ２００カラム（ＴｏｓｏＨａａｓ １６２１５，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＰＡ）でのゲル濾過によってＭＨＣ・ペプチド複合体を遊離ペプチドから分離する。ＤＲＢ１＊１５０１（ＤＲ２ｗ２（３１）アッセイに使用される放射性標識したペプチドの大きなサイズはこれらの条件下では非結合ピークからの結合ピークの分離をさらに困難にするので、ＤＲＢ１＊１５０１（ＤＲ２ｗ２（３１）アッセイはすべて、０．６ｍＬ／分で溶出される７．８ｍｍ×３０ｃｍのＴＳＫ２０００カラムを使用して実施した。ＴＳＫカラムからの溶出液をＢｅｃｋｍａｎ１７０放射性同位体検出器に通し、Ｈｅｗｌｅｔｔ－Ｐａｃｋａｒｄ３３９６Ａ統合装置を使用して放射活性をプロットし、及び統合し、結合したペプチドの割合を決定する。
放射性標識ペプチドはクロラミン－Ｔ法を使用してヨウ素化される。通常、予備実験では、固定量の放射性標識ペプチドの存在下で各ＭＨＣ調製物を力価測定して、総放射活性の１０～２０％を結合するのに必要なＨＬＡ分子の濃度を決定する。その後のすべての阻害及び直接結合アッセイはこれらのＨＬＡ濃度を使用して実行される。
これらの条件下で［標識］＜［ＨＬＡ］及びＩＣ５０＞［ＨＬＡ］なので、測定されたＩＣ５０値は真のＫＤ値の合理的な近似値である。ペプチド阻害剤は通常、１２０μｇ／ｍｌ～１．２ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度で調べられ、２～４回の完全に独立した実験で調べられる。異なる実験で得られたデータの比較を可能にするために、阻害に関する陽性対照のＩＣ５０を各試験ペプチド（通常、放射性標識プローブペプチドの非標識版）のＩＣ５０で割ることにより、各ペプチドについて相対結合数値を計算する。データベースの目的及び実験間の比較のために、相対的な結合値を集める。これらの値は、続いて、阻害について陽性対照のＩＣ５ｏｎＭを目的のペプチドの相対的結合で割ることによってＩＣ５０ｎＭ値に戻すことができる。このデータ編集方法は、異なる日、または精製ＭＨＣの異なるロットで調べられているペプチドを比較するのに最も正確で一貫性があることが証明されている。
ＨＬＡ－ＤＲ精製（ＬＢ３．１）に使用される抗体はａ鎖特異的であるので、１３１分子は１３３（及び／または１３４及び（３５）分子から分離されない。結合アッセイの１３１特異性は、ＤＲＢ１＊０１０１（ＤＲ１）、ＤＲＢ１＊０８０２（ＤＲ８ｗ２）、及びＤＲＢ１＊０８０３（ＤＲ８ｗ３）の場合に明白であり、その際、１３３は発現されない。ＤＲＢ１＊０３０１（ＤＲ３）及びＤＲＢ３＊０１０１（ＤＲ５２ａ）、ＤＲＢ１＊０４０１（ＤＲ４ｗ４）、ＤＲＢ１＊０４０４（ＤＲ４ｗ１４）、ＤＲＢ１＊０４０５（ＤＲ４ｗ１５）、ＤＲＢ１＊１１０１（ＤＲ５）、ＤＲＢ１＊１２０１（ＤＲ５ｗ１２）、ＤＲＢ１＊１３０２（ＤＲ６ｗ１９）及びＤＲＢ１＊０７０１（ＤＲ７）についてもそれは実証されている。ＤＲＢ１＊１５０１（ＤＲ２ｗ２（３１）、ＤＲＢ５＊０１０１（ＤＲ２ｗ２（３２）、ＤＲＢ１＊１６０１（ＤＲ２ｗ２１１３１）、ＤＲＢ５＊０２０１（ＤＲ５１Ｄｗ２１）、及びＤＲＢ４＊０１０１（ＤＲｗ５３）アッセイについての１３鎖特異性の問題は線維芽細胞の使用によって回避される。ＤＲＰ分子特異性に関するアッセイの開発及び検証は以前に記載されている（例えば、Ｓｏｕｔｈｗｏｏｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：３３６３－３３７３，１９９８を参照のこと）。
生細胞／フローサイトメトリーに基づくアッセイも使用することができる。これは、ＴＡＰ欠損ハイブリドーマ細胞株Ｔ２（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ－１９９２），Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．）を利用した十分に確立されたアッセイである。この細胞株におけるＴＡＰ欠損はＥＲでのＭＨＣＩの非効率的な負荷と空のＭＨＣＩの過剰につながる。Ｓａｌｔｅｒ ａｎｄ Ｃｒｅｓｓｗｅｌｌ，ＥＭＢＯ Ｊ．５：９４３４９（１９８６）；Ｓａｌｔｅｒ，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，２１：２３５－４６（１９８５）。空のＭＨＣＩは非常に不安定であるため、短命である。Ｔ２細胞を低温で培養すると、空のＭＨＣＩが細胞表面に一時的に現れ、そこでそれらはＭＨＣＩ結合ペプチドの外からの添加によって安定化することができる。この結合アッセイを実施するために、無血清ＡＩＭ－Ｖ培地のみ、または漸増濃度（０．１～１００μＭ）のペプチドを含有する培地中にて２６℃で一晩、１０７個のＴ２細胞の一定分量を培養することによってペプチド受容性ＭＨＣＩを誘導した。次に、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、続いて蛍光タグ付きのＨＬＡ－Ａ０２：０１に特異的なモノクローナル抗体、ＢＢ７．２とともにインキュベートして細胞表面の発現を定量した。試料はＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ装置（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）でデータ取得し、付属のＣｅｌｌｑｕｅｓｔソフトウェアを使用して平均蛍光強度（ＭＦＩ）を決定した。
実施例３：免疫原性の確認
免疫原性を確認するための例示的な方法では、試験管内教育（ＩＶＥ）アッセイを使用して、各試験ペプチドがＣＤ８＋Ｔ細胞を増殖させる能力を調べる。成熟したプロフェッショナルＡＰＣは以下の方法でこれらのアッセイ用に調製される。健康なヒトドナーからの８０～９０×１０６個のＰＢＭＣを２％ヒトＡＢ血清を含有する２０ｍｌのＲＰＭＩ培地に入れ、３７℃で２時間インキュベートして、単球によるプラスチックへの付着を可能にする。非接着細胞を取り除き、接着細胞をＲＰＭＩ、２％ヒトＡＢ血清、８００ＩＵ／ｍｌのＧＭ－ＣＳＦ及び５００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－４にて培養する。６日後、最終濃度１０ｎｇ／ｍｌとなるようにＴＮＦ－アルファを添加する。７日目に、樹状細胞（ＤＣ）は１２．５ｍｇ／ｍｌのポリＩ：Ｃまたは０．３μｇ／ｍｌのＣＤ４ＯＬの添加によって成熟する。成熟樹状細胞（ｍＤＣ）を８日目に回収し、洗浄し、直接使用する、または将来の使用のために凍結保存する。
ＣＤ８＋Ｔ細胞のＩＶＥのために、２×１０５個のｍＤＣの一定分量を１００マイクロモルの最終濃度での各ペプチドによってパルスし、３７℃で４時間インキュベートし、次いで照射する（２５００ラド）。２％ヒトＡＢ血清を含有するＲＰＭＩにてペプチドでパルスしたｍＤＣを２回洗浄する。２×１０５個のｍＤＣ及び２×１０６個の自己ＣＤ８＋細胞を２％ヒトＡＢ、２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７及び１００ｐｇ／ｍｌのＩＬ－１２を含有する２ｍｌのＲＰＭＩにて２４ウェルプレートのウェルごと入れ、１２日間インキュベートする。次いで、ＣＤ８＋Ｔ細胞をペプチドでパルスし、照射したｍＤＣで再刺激する。２～３日後、２０ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２及び２０ｎｇ／ＩＬ７を添加する。増殖しているＣＤ８＋Ｔ細胞を８～１０日ごとに再刺激し、ＩＬ－２及びＩＬ－７を含有する培地で維持する。機能アッセイ及び／または四量体染色の組み合わせを使用して、培養物をペプチド特異的Ｔ細胞についてモニタリングする。修飾ペプチド及び親ペプチドとの並列ＩＶＥＳにより、ペプチドがペプチド特異的Ｔ細胞を増殖させる相対的効率の比較が可能になった。
ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞の定量的及び機能的な評価
四量体染色
ＭＨＣ四量体は現地で購入され、または製造され、ＩＶＥアッセイにてペプチド特異的Ｔ細胞増殖を測定するのに使用される。評価のために、製造元の指示に従って、１％ＦＣＳ及び０．１％アジ化ナトリウム含有するＰＢＳ（ＦＡＣＳ緩衝液）にて１×１０５個の細胞に四量体を加える。細胞を暗所にて室温で２０分間インキュベートする。次に、ＣＤ８のようなＴ細胞マーカーに特異的な抗体を、製造元が提案する最終濃度まで添加し、細胞を４℃の暗所で２０分間インキュベートする。細胞を冷ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、１％ホルムアルデヒドを含有する緩衝液に再浮遊させる。細胞はＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）機器でデータ取得し、Ｃｅｌｌｑｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して分析する。四量体陽性細胞の分析については、前方散乱光と側方散乱光のプロットからリンパ球のゲートを利用する。データはＣＤ８＋／四量体＋であった細胞の割合として報告される。
ペプチド抗原に対するＣＤ４＋Ｔ細胞の応答は生体外誘導プロトコールを使用して調べることができる。この実施例では、ＣＤ４＋Ｔ細胞の応答は、抗原特異的な方法でのＩＦＮγ及び／またはＴＮＦαの産生をモニタリングすることによって特定された。
抗原提示の評価：予測された抗原のサブセットについては、示されたＨＬＡ対立遺伝子に対するウイルスエピトープの親和性、及びＨＬＡ対立遺伝子によるネオエピトープの安定性を決定した。クラスＩのＭＨＣに対するペプチドの結合親和性を測定するために利用されるプロトコールの例示的な詳細な説明が公開されている（Ｓｅｔｔｅ，ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１（１１）：８１３－２２，１９９４）。簡単に言えば、ＭＨＣＩ複合体を調製し、放射性標識した参照ペプチドに結合させた。ペプチドをこれらの複合体と種々の濃度で２日間インキュベートし、ＭＨＣＩに結合した残りの放射性標識ペプチドの量を、サイズ排除ゲル濾過を使用して測定した。参照放射性標識ペプチドを置換するのに必要な試験ペプチドの濃度が低いほど、ＭＨＣＩに対する試験ペプチドの親和性が強いことを示す。ＭＨＣＩに対して＜５０ｎＭの親和性を持つペプチドは一般的に強力なバインダーと考えられている一方で、＜１５０ｎＭの親和性があるものは中間バインダーと見なされ、＜５００ｎＭのものは弱いバインダーと見なされる（Ｆｒｉｔｓｃｈ，ｅｔ ａｌ，２０１４）。
ペプチドのクラスＩのＭＨＣへの結合安定性を測定するために利用されるプロトコールの例示的な詳細な説明が公開されている（Ｈａｒｎｄａｈｌ，ｅｔ ａｌ．ＪＩｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．３７４：５－１２，２０１１）。簡単に言えば、ビオチン化ＭＨＣ－Ｉの重鎖及び軽鎖をコードする合成遺伝子をＥ．ｃｏｌｉで発現させ、標準的な方法を使用して封入体から精製する。軽鎖（β２ｍ）をヨウ素（１２５Ｉ）で放射性標識し、精製したＭＨＣ－Ｉ重鎖及び目的のペプチドと１８℃で混ぜ合わせてｐＭＨＣ－Ｉ複合体の形成を開始する。これらの反応は、ストレプトアビジンでコーティングされたマイクロプレートで行われ、ビオチン化ＭＨＣ－Ｉ重鎖を表面に結合させ、放射性標識軽鎖を測定して複合体形成をモニタリングできるようにする。高濃度の非標識軽鎖を添加し、３７℃でインキュベートすることによって解離を開始する。安定性は、シンチレーションカウントによって測定されるように、複合体の半分が解離するのにかかる時間の長さとして定義される。ペプチドとのＭＨＣ－ＩＩの結合親和性は、ＭＨＣＩ・ペプチドの結合親和性の測定と同じ一般手順に従って測定される。所与のペプチドへの結合についてＭＨＣＩＩ対立遺伝子を予測するのに利用される予測アルゴリズムは、本明細書に記載されている。また、結合の予測にはＮｅｔＭＨＣＩＩｐａｎが利用されてもよい。
抗原がさらに大きなポリペプチドの状況から処理及び提示されてもよいかどうかを評価するために、目的の遺伝子を発現している細胞から単離されたＨＬＡ（クラスＩまたはクラスＩＩ）分子から溶出されたペプチドをタンデム質量分析法（ＭＳ／ＭＳ）で分析した。
ＥＬＩＳＰＯＴ
ペプチド特異的なＴ細胞は、単一細胞基準でＴ細胞からのＩＦＮガンマの放出を測定するＥＬＩＳＰＯＴアッセイ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して機能的に数えられる。標的細胞（Ｔ２またはＨＬＡ－Ａ０２０１形質移入したＣ１Ｒ）を１０ｕＭペプチドで３７℃にて１時間パルスし、３回洗浄した。１×１０５個のペプチドをパルスした標的を、ＩＶＥ培養から採取したさまざまな濃度のＴ細胞（５×１０２～２×１０３）とともにＥＬＩＳＰＯＴプレートのウェルにて共培養する。プレートは製造元のプロトコールに従って発色させ、付属のソフトウェアを使用してＥＬＩＳＰＯＴリーダー（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｔｄ．）で分析する。ＩＦＮガンマ産生Ｔ細胞の数に対応するスポットは、プレートに入れたＴ細胞の数あたりのスポットの絶対数として報告される。修飾ペプチドで増殖したＴ細胞は、修飾ペプチドでパルスされた標的を認識する能力だけでなく、親ペプチドでパルスされた標的を認識する能力についても調べられる。
ＣＤ１０７染色
ＣＤ１０７ａ及びｂは、同族ペプチドによる活性化の後、ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞表面に発現される。Ｔ細胞の溶解顆粒は分子ＣＤ１０７ａ及びｂを含むリソソーム関連膜糖タンパク質（「ＬＡＭＰ」）を含有する脂質二重層を有する。細胞傷害性Ｔ細胞がＴ細胞受容体を介して活性化されると、これらの溶解顆粒の膜が動員され、Ｔ細胞の細胞膜と融合する。顆粒の内容物が放出され、これが標的細胞の死につながる。顆粒膜が細胞膜と融合すると、ＣＤ１０７ａ及びｂが細胞表面に露出されるので、脱顆粒のマーカーとなる。ＣＤ１０７ａ及びｂ染色によって測定される脱顆粒は単一細胞基準で報告されるので、このアッセイはペプチド特異的なＴ細胞を機能的に数えるのに使用される。アッセイを行うために、ＨＬＡ－Ａ０２０１を形質移入したＣ１Ｒ細胞にペプチドを最終濃度２０μＭになるように添加し、細胞を３７℃で１時間インキュベートし、３回洗浄した。ペプチドをパルスしたＣ１Ｒ細胞１×１０５個を試験管に等分し、ＣＤ１０７ａ及びｂに特異的な抗体を製造元（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）が提案する最終濃度まで加える。アッセイの経過中にＣＤ１０７分子が一時的に表面に現れるのでそれらを「捕捉」するためにＴ細胞の添加前に抗体を添加する。次に、培養物からの１×１０５個のＴ細胞を添加し、試料を３７℃で４時間インキュベートした。Ｔ細胞をさらに、ＣＤ８のような追加の細胞表面分子について染色し、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ機器（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）でデータ取得を行う。付属のＣｅｌｌｑｕｅｓｔソフトウェアを使用してデータを分析し、結果をＣＤ８＋ＣＤ１０７ａ及びｂ＋細胞の割合として報告した。
ＣＴＬ溶解
細胞傷害活性はクロム放出アッセイを使用して測定される。標的Ｔ２細胞をＮａ５１Ｃｒで３７℃にて１時間標識し、洗浄した後、５×１０３の標的Ｔ２細胞をＩＶＥ培養物からの種々の数のＴ細胞に添加した。クロムの放出は３７℃で４時間のインキュベートの後に回収された上清で測定される。特異的溶解の割合は次のように計算される：
実験の放出－自然の放出／総放出－自然の放出×１００
実施例４：予防または治療の用途のためのペプチド組成物
本発明の免疫原性組成物またはワクチン組成物はウイルス複製を阻害するために使用される。例えば、複数のＣＴＬ及びＨＴＬのエピトープを含有するポリエピトープ組成物（またはそれを含む核酸）はウイルス感染を有する個体に投与される。組成物は、複数のエピトープを包含する単一の脂質付加ポリペプチドとして提供される。組成物はミョウバンで構成される水性担体中で投与される。初回免疫のためのペプチドの用量は７０ｋｇの患者に対して約１～約５０，０００ｌｉｇ、一般に１００～５，０００ｐｓである。最初の投与に続いて、４週でブースター投与を行い、続いてＰＢＭＣ試料にてエピトープ特異的なＣＴＬ集団の存在を決定する技術によって患者における免疫応答の大きさを評価する。必要に応じて、さらなる追加免疫用量を投与する。組成物は、ウイルスの複製を阻害するのに安全で、且つ効果的であることが見いだされている。
あるいは、ポリエピトープ組成物は、当該技術分野で知られており、本明細書に開示されている方法に従って、核酸、例えばＲＮＡとして投与することができる。
ＴＣＲまたはＣＡＲのようなウイルスエピトープ結合剤は、当該技術分野で知られており、本明細書に開示されている方法論に従って投与することができる。結合剤は、結合剤をコードするポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、例えばＲＮＡとして、または結合剤を発現する細胞を投与することによる細胞療法として投与することができる。
ウイルスエピトープのペプチド、ポリヌクレオチド、結合剤、またはこれらの分子を発現する細胞は、当該技術分野で知られている複数の方法論を介して同じ患者に送達することができ、さらに他の療法（例えば、抗ウイルス療法）と併用することができる。
実施例５：樹状細胞を使用する組成物の投与
本発明のエピトープを含むワクチンは樹状細胞を使用して投与されてもよい。この実施例では、ペプチドをパルスした樹状細胞を患者に投与して、生体内でＣＴＬ応答を刺激することができる。この方法では、樹状細胞を単離し、増殖させ、本発明のペプチドＣＴＬ及びＨＴＬのエピトープを含むワクチンでパルスする。樹状細胞は生体内でＣＴＬ及びＨＴＬの応答を誘発するために患者に注入して戻される。次いで、誘導されたＣＴＬ及びＨＴＬは、ワクチンにおけるエピトープが由来するタンパク質を持つ特定の標的細胞を破壊する（ＣＴＬ）または破壊を促進する（ＨＴＬ）。
あるいは、特定のウイルス抗原に対する生体外でのＣＴＬ応答またはＨＴＬ応答は、樹状細胞のような抗原提示細胞の供給源及び適切な免疫原性ペプチドと一緒に患者の、または遺伝的に適合するＣＴＬまたはＨＴＬの前駆細胞を組織培養でインキュベートすることによって誘導することができる。
前駆細胞が活性化され、エフェクター細胞に増殖する適切なインキュベート時間（通常は約７～２８日）の後、細胞は患者に注入して戻され、それらの特定の標的細胞、すなわちウイルスエピトープを表示する細胞を破壊する（ＣＴＬ）またはその破壊を促進することになる（ＨＴＬ）。
実施例６：免疫原性を持つ突然変異配列の特定
各エピトープについて、ウイルスエピトープの完全長アミノ酸配列を導出した。任意の構成要素の９ｍｅｒまたは１０ｍｅｒのタンパク質配列を、利用可能なアルゴリズムを使用して６つの共通するＨＬＡ対立遺伝子（ＨＬＡ－Ａ０１：０１、ＨＬＡ－Ａ０２：０１、ＨＬＡ－Ａ０３：０１、ＨＬＡ－Ａ２４：０２、ＨＬＡ－Ｂ０７：０２、及びＨＬＡ－Ｂ０８：０１）に対する結合能についてスコア化した。１０００ｎＭよりも優れたスコアの任意のペプチドを指名した。
各エピトープについて、ウイルスエピトープの完全長アミノ酸配列を導出した。生殖細胞系列のタンパク質配列に見いだされない任意の構成要素の９ｍｅｒまたは１０ｍｅｒに目印をつけ、利用可能なアルゴリズムを使用して６つの共通するＨＬＡ対立遺伝子（ＨＬＡ－Ａ０１：０１、ＨＬＡ－Ａ０２：０１、ＨＬＡ－Ａ０３：０１、ＨＬＡ－Ａ２４：０２、ＨＬＡ－Ｂ０７：０２、及びＨＬＡ－Ｂ０８：０１）に対する結合能をスコア化した。
実施例７：ＳＡＲＳ ＣＯＶ－２（２０１９ ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ２）のペプチドストリングの設計
本明細書で提供されているのは、治療適用のための複数の２０１９ ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２のヌクレオカプシドエピトープの特別な構築物「ストリング」である。これらのストリングは、それぞれが本出願の前の実施例で個別に開示されており、上記のようなＭＨＣ結合アルゴリズムによって予測される、２０１９ ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ヌクレオカプシドの特定のエピトープを含有するように設計されている。これらのストリングは、ＣＯＶＩＤ１９の治療における治療用途向けに設計されており、脂質ナノ粒子にカプセル化されたｍＲＮＡのような核酸ストリング構築物として投与することができる。
ストリングは５’ＵＴＲと３’ＵＴＲを含むように設計されている。エピトープは、それぞれの核酸配列によってコードされるペプチドリンカーによって相互接続されている。一部のリンカーは特定の切断部位を有する。表１１及び表１２は、アミノ酸の完全な配列及びそれらをコードするヌクレオチド配列を示す。ヌクレオチド配列は、ヒトでの効率的な翻訳のためにさらにコドン最適化されている。表９及び１０は構築物マップを提供し、それぞれ表１１及び１２の各ストリングに対応するセグメント及び配列を詳述する。図６Ａ及び６Ｂは、第１群、ＲＳ Ｃ１～Ｃ４の配列のストリングの設計を図式的に例示する。図６Ｂは図６Ａのさらに詳細な配置を示す。図７Ａ及び７Ｂは、第２群、ＲＳ Ｃ５～Ｃ８の配列のストリングの設計を図式的に例示する。図７Ｂは図７Ａのさらに詳細な配置を示す。場合によっては、ストリングがＲＳ Ｃ１ｎ、ＲＳ－Ｃ２ｎ等としても特定される。
「ＲＳ＿Ｃ１ ＧＳＳリンカー」という名称のストリング（略してＲＳ Ｃ１）は、１２６６アミノ酸のアミノ酸長を有するＯＲＦをコードし、ＯＲＦをコードするヌクレオチド配列は３７９８ヌクレオチド長である。ストリング全体は４１０７ヌクレオチド長であり、１３６９アミノ酸長のペプチドストリングをコードする。表１１はアミノ酸及び核酸の配列を例示する（コドン最適化されていない）。「ＲＳ Ｃ１ ＧＳＳリンカー」と名付けられたストリングのコドン最適化配列の例は次のとおりである。
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「ＲＳ Ｃ２ ＧＳＳリンカー逆位」という名称のストリング（略してＲＳ Ｃ２）は１２６６アミノ酸のアミノ酸長を有するＯＲＦをコードし、ＯＲＦをコードするヌクレオチド配列は３７９８ヌクレオチド長である。ストリング全体は４１０７ヌクレオチド長であり、１３６９アミノ酸長のペプチドストリングをコードする。表１１は、アミノ酸配列及びそれをコードする核酸配列（コドン最適化されていない）を例示する。「ＲＳ Ｃ２ ＧＳＳリンカー逆位」と名付けられたストリングのコドン最適化配列の例は次のとおりである。
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「ＲＳ＿Ｃ３ ２Ａリンカー」という名称のストリング（略してＲＳ Ｃ３）は１３２６アミノ酸のアミノ酸長を有するＯＲＦをコードし、ＯＲＦをコードするヌクレオチド配列は３９７８ヌクレオチド長である。ストリング全体は４２８７ヌクレオチド長であり、１４２９アミノ酸長のペプチドストリングをコードする。表１１は、アミノ酸配列及びそれをコードする核酸配列（コドン最適化されていない）を例示する。「ＲＳ＿Ｃ３ ２Ａリンカー」と名付けられたストリングのコドン最適化配列の例は次のとおりである。
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「リンカーとしてのＲＳ Ｃ４ ＯＲＦ１ａｂ」という名称のストリング（略してＲＳ Ｃ４）は１２３４アミノ酸のアミノ酸長を有するＯＲＦをコードし、ＯＲＦをコードするヌクレオチド配列は３７０２ヌクレオチド長である。ストリング全体は４０１１ヌクレオチド長であり、１３３７アミノ酸長のペプチドストリングをコードする。表１１は、アミノ酸配列及びそれをコードする核酸配列（コドン最適化されていない）を例示する。「リンカーとしてのＲＳ Ｃ４ ＯＲＦ１ａｂ」と名付けられたストリングのコドン最適化配列の例は次のとおりである。
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「ＲＳ Ｃ５ ２３００」という名称のストリング（略してＲＳ Ｃ５）は７５６アミノ酸のアミノ酸長を有するＯＲＦをコードし、ＯＲＦをコードするヌクレオチド配列は２２６８ヌクレオチド長である。ストリング全体は２５７７ヌクレオチド長であり、８５９アミノ酸長のペプチドストリングをコードする。表１２はアミノ酸配列及びそれをコードする核酸配列（コドン最適化されていない）を例示する。「ＲＳ Ｃ５ ２３００」という名称のストリングのコドン最適化配列の例は次のとおりである。
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「ＲＳ Ｃ６ １２００」という名称のストリング（略してＲＳ Ｃ６）は４０４アミノ酸のアミノ酸長を有するＯＲＦをコードし、ＯＲＦをコードするヌクレオチド配列は１２１２ヌクレオチド長である。ストリング全体は１５２１ヌクレオチド長であり、５０７アミノ酸長のペプチドストリングをコードする。表１２はアミノ酸配列及びそれをコードする核酸配列（コドン最適化されていない）を例示する。「ＲＳ Ｃ６ １２００」という名称のストリングのコドン最適化配列の例は次のとおりである。
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「ＲＳ Ｃ７ １５００＿Ｍ＿チャンク」という名称のストリング（略してＲＳ Ｃ７）は４９２アミノ酸のアミノ酸長を有するＯＲＦをコードし、ＯＲＦをコードするヌクレオチド配列は１４７６ヌクレオチド長である。ストリング全体は１７８５ヌクレオチド長であり、５９５アミノ酸長のペプチドストリングをコードする。表１２はアミノ酸配列及びそれをコードする核酸配列（コドン最適化されていない）を例示する。「ＲＳ Ｃ７ １５００＿Ｍ＿チャンク」という名称のストリングのコドン最適化配列の例は次のとおりである。
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「ＲＳ Ｃ８ １５００＿Ｍ＿エピトープ」という名称のストリング（略してＲＳ Ｃ８）は４８５アミノ酸のアミノ酸長を有するＯＲＦをコードし、ＯＲＦをコードするヌクレオチド配列は１４５５ヌクレオチド長である。ストリング全体は１７６４ヌクレオチド長であり、５８８アミノ酸長のペプチドストリングをコードする。表１２はアミノ酸配列及びそれをコードする核酸配列（コドン最適化されていない）を例示する。「ＲＳ Ｃ８ １５００＿Ｍ＿エピトープ」という名称のストリングのコドン最適化配列の例は次のとおりである。
ＡＴＧＡＧＧＧＴＧＡＴＧＧＣＣＣＣＣＡＧＧＡＣＣＣＴＣＡＴＡＴＴＧＴＴＧＴＴＧＡＧＣＧＧＧＧＣＣＣＴＴＧＣＡＣＴＣＡＣＴＧＡＡＡＣＴＴＧＧＧＣＴＧＧＧＡＧＴＧＧＧＧＧＴＡＧＴＧＧＴＧＧＧＧＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＣＧＧＧＴＣＡＣＣＧＧＣＴＣＧＡＡＴＧＧＣＡＧＧＴＡＡＣＧＧＣＧＧＧＧＡＴＧＣＣＧＣＡＴＴＧＧＣＧＣＴＣＴＴＧＣＴＧＣＴＣＧＡＣＡＧＧＴＴＧＡＡＣＣＡＧＴＴＧＧＡＡＴＣＣＡＡＧＡＴＧＡＧＴＧＧＡＡＡＡＧＧＴＣＡＧＣＡＡＣＡＡＣＡＧＧＧＧＣＡＧＡＣＣＧＴＡＡＣＧＡＡＧＡＡＧＡＧＣＧＣＴＧＣＣＧＡＧＧＣＣＴＣＣＡＡＧＡＡＧＣＣＴＣＧＣＣＡＧＡＡＡＣＧＡＡＣＧＧＣＣＡＣＧＡＡＧＧＣＴＴＡＴＡＡＣＧＴＧＡＣＣＣＡＧＧＣＡＴＴＣＧＧＴＡＧＡＡＧＡＧＧＴＣＣＴＧＡＡＣＡＧＡＣＡＣＡＡＧＧＡＡＡＣＴＴＴＧＧＣＧＡＣＣＡＧＧＡＡＣＴＣＡＴＣＡＧＧＣＡＡＧＧＧＡＣＧＧＡＣＴＡＣＡＡＧＣＡＴＴＧＧＣＣＧＣＡＡＡＴＡＧＣＧＣＡＧＴＴＣＧＣＧＣＣＣＡＧＣＧＣＣＡＧＣＧＣＣＴＴＣＴＴＴＧＧＡＡＴＧＴＣＡＡＧＡＡＴＴＧＧＡＡＴＧＧＡＡＧＴＴＡＣＧＣＣＧＡＧＴＧＧＧＡＣＴＴＧＧＣＴＴＡＣＴＴＡＴＡＣＧＧＧＣＧＣＴＡＴＴＡＡＧＣＴＣＧＡＣＧＡＣＡＡＧＧＡＣＣＣＣＡＡＴＴＴＣＡＡＧＧＡＣＣＡＡＧＴＧＡＴＡＴＴＧＣＴＣＡＡＴＡＡＧＣＡＣＡＴＣＧＡＣＧＣＣＴＡＣＡＡＧＡＣＴＴＴＣＣＣＴＣＣＣＡＣＡＧＡＧＣＣＣＡＡＡＡＡＧＧＡＴＡＡＧＴＴＣＣＧＡＧＣＣＴＧＣＡＴＧＧＴＡＡＣＧＡＡＣＡＡＴＡＣＴＴＴＴＡＣＡＣＴＴＡＡＧＧＴＧＣＣＣＣＡＴＧＴＡＧＧＡＧＡＧＡＴＡＣＣＴＧＴＧＧＣＴＴＡＴＣＧＡＡＡＡＧＴＧＣＴＧＣＴＴＡＡＧＡＣＴＡＴＴＣＡＡＣＣＴＣＧＣＧＴＣＧＡＡＡＡＡＴＡＣＣＴＣＴＴＴＧＡＣＧＡＧＡＧＴＧＧＴＧＡＧＴＴＴＡＡＧＣＴＧＴＣＡＧＡＡＧＴＡＧＧＡＣＣＣＧＡＧＣＡＴＴＣＡＴＴＧＧＣＧＧＡＧＴＡＴＴＡＣＡＴＡＴＴＣＴＴＣＧＣＣＡＧＴＴＴＴＴＡＴＴＡＴＡＡＡＡＧＧＴＧＣＴＴＣＣＡＣＡＣＧＡＣＴＧＡＣＣＣＧＴＣＴＴＴＴＣＴＴＧＧＴＡＧＧＴＡＣＡＴＧＡＧＴＧＣＧＣＴＧＴＴＴＧＣＡＧＡＣＧＡＴＣＴＧＡＡＴＣＡＧＣＴＣＡＣＣＧＧＴＴＡＴＣＡＣＡＣＧＧＡＴＴＴＴＡＧＴＴＣＡＧＡＡＡＴＣＡＴＡＧＧＣＴＡＣＣＡＧＴＴＧＡＴＧＴＧＣＣＡＡＣＣＡＡＴＴＣＴＴＣＴＣＧＣＣＧＡＧＧＣＧＧＡＡＣＴＴＧＣＴＡＡＡＡＡＴＧＴＴＡＧＴＴＴＧＡＴＴＴＴＧＧＧＣＡＣＣＧＴＡＡＧＣＴＧＧＡＡＣＣＴＴＡＡＡＡＡＡＣＧＡＴＡＣＣＴＴＣＴＣＴＣＴＧＣＣＧＧＣＡＴＡＴＴＴＧＧＴＧＣＴＡＴＴＡＣＴＧＡＣＧＴＧＴＴＣＴＡＴＡＡＡＧＡＧＡＡＴＴＣＡＴＡＴＡＡＡＧＴＴＣＣＡＡＣＴＧＡＣＡＡＣＴＡＴＡＴＣＡＣＣＡＣＣＴＡＴＧＣＴＡＧＧＡＴＧＧＣＧＧＣＡＣＣＧＡＡＧＧＡＡＡＴＡＡＴＣＴＴＴＣＴＧＧＡＧＧＧＧＧＡＡＡＣＴＣＴＧＴＴＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＡＣＣＧＴＡＡＴＴＧＡＧＧＴＴＧＣＣＡＴＡＡＴＡＣＴＧＧＣＡＴＣＡＴＴＣＴＣＡＧＣＣＡＧＣＡＣＴＡＧＡＡＧＡＣＧＣＧＧＧＡＡＧＣＴＴＴＴＧＧＡＡＣＡＧＴＧＧＡＡＴＴＴＧＧＴＴＡＴＴＧＧＡＴＴＣＡＡＣＣＧＡＡＡＣＡＧＧＴＴＴＴＴＧＴＡＴＡＴＡＡＴＴＡＡＧＣＴＣＡＴＡＴＴＴＣＴＴＴＧＧＴＴＧＴＴＧＴＧＧＣＣＣＧＴＴＡＣＣＣＴＴＧＣＡＴＧＣＴＴＣＧＴＴＣＴＴＧＣＣＧＣＣＧＴＣＴＡＣＡＧＴＧＡＧＣＴＣＧＴＡＡＴＴＧＧＧＧＣＧＧＴＴＡＴＴＣＴＧＣＧＡＧＧＡＣＡＴＣＴＣＣＧＡＡＴＣＧＣＴＧＧＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＧＧＡＣＧＣＡＣＡＧＴＣＧＣＴＡＣＡＡＧＴＡＧＧＡＣＧＣＴＴＴＣＡＴＡＣＴＡＴＡＡＡＴＴＧＧＧＡＧＣＣＡＧＴＣＡＡＣＧＡＧＴＴＡＡＡＣＧＧＴＡＣＴＣＡＧＧＧＴＴＧＡＴＧＴＧＧＴＴＧＡＧＣＴＡＴＴＴＣＧＣＡＡＧＧＴＡＣＧＣＣＧＧＡＧＧＡＴＣＣＣＴＧＧＧＡＧＧＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＧＧＴＡＴＡＧＴＣＧＧＴＡＴＣＧＴＧＧＣＡＧＧＣＣＴＴＧＣＧＧＴＧＣＴＣＧＣＧＧＴＴＧＴＡＧＴＣＡＴＡＧＧＣＧＣＡＧＴＧＧＴＴＧＣＴＡＣＡＧＴＣＡＴＧＴＧＴＣＧＣＣＧＣＡＡＡＴＣＣＡＧＴＧＧＡＧＧＴＡＡＧＧＧＧＧＧＴＡＧＣＴＡＴＴＣＣＣＡＧＧＣＣＧＣＴＴＣＡＴＣＴＧＡＣＴＣＡＧＣＡＣＡＡＧＧＡＴＣＡＧＡＣＧＴＣＴＣＴＣＴＧＡＣＴＧＣＡＴＡＡＴＡＡ （配列番号：ＲＳ Ｃ８ｎ）
配置された配列はＤＮＡ配列であり、当業者に周知であるように、ＲＮＡ（またはｍＲＮＡ）配列を解釈するのに相互交換可能に使用することができる。
実施例８：設計されたＳＡＲＳ ＣｏＶ－２（２０１９ ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ２）のヌクレオカプシドペプチドストリングについての医薬組成物
実施例８に例示されるように設計されたストリングは、配列番号ＲＳ Ｃ１ｎ、もしくは配列番号ＲＳ Ｃ２ｎ、もしくは配列番号ＲＳ Ｃ３ｎ、もしくは配列番号ＲＳ Ｃ４ｎ、もしくは配列番号ＲＳ Ｃ５ｎ、もしくは配列番号ＲＳ Ｃ６ｎ、もしくは配列番号ＲＳ Ｃ７ｎ、もしくは配列番号ＲＳ Ｃ８ｎ、またはそれらの任意の組み合わせで示される配列を有する、あるいは表１１及び１２の配列設定ＲＳＣ１～ＲＳＣ８の各行の列２に開示されているアミノ酸配列を有する表１１及び１２に記載されている対応するアミノ酸をコードする配列を有する脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）でカプセル化されたｍＲＮＡの医薬組成物に調製される。ＬＮＰは少なくともカチオン性脂質、非カチオン性脂質及び／またはＰＥＧ修飾脂質を含む。ＬＮＰでカプセル化されたｍＲＮＡ製剤は凍結乾燥され、（－）２０℃未満の温度で保存され、好ましくは長期保存のために液体窒素下で凍結される。ＬＮＰ－ｍＲＮＡ組成物を使用のために解凍し、水溶液で再構成することができる。
設計されたストリングのＬＮＰ－ｍＲＮＡ組成物は、単独で投与される、または２０１９ ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２感染のためのＢＮＴスパイクワクチンと同時投与される。
実施例９：ストリング構築物を生成する方法
本明細書に記載されているのは、バイオインフォマティクス及び分子生物学の技術の統合によってストリング構築物を生成するための例示的な方法である。ストリングは、２０１９ ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２タンパク質由来のエピトープを含むように設計されている。これらのエピトープは、コンピューターに基づくプログラムでのＨＬＡ結合及び予測アルゴリズムの順位、ならびに実験データからのサポートに基づいて選択される。タンパク質のセグメントを選択する際に、集団のカバー率を最大化するために集団のＨＬＡ頻度に基づいて予測される集団のカバー率を考慮に入れた。
簡単に言えば、構築物は、ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２タンパク質のヌクレオカプシド、膜、ＯＲＦ３ａ、ＯＲＦ９ｂ、及びＯＲＦ１ａｂを含む、種々のウイルスタンパク質の５’－３’の上位で予測された且つ免疫原性のエピトープ及び領域を組み込むように設計されている。
ＲＮＡストリングは、２０１９ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のさまざまなオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）からの配列を連結することによって設計された。ＯＲＦ由来の配列はＯＲＦ全体；ＯＲＦの区分（９９～９５４ｂｐの長さの範囲－予測された及び観察されたエピトープ密度に基づいて優先順位付けされる）；または、ＭＨＣクラスＩの切断性を最適化するために組み立てられたＣＤ８＋エピトープを構成するもしくは含有する領域であってもよい。この最後のアプローチは、すべてのストリング変異型についてのＯＲＦ１ａｂに採用され；これは１つのストリング変異型（ＲＳ Ｃ８）について膜ＯＲＦでも行われた。ＭＨＣクラスＩの切断性は、ＭＨＣクラスＩの質量分析データで訓練されたニューラルネットワーク予測因子を使用してスコア化され、それは、切断されるべきである候補ペプチド配列とその背景（両側で３０ＡＡ）を入力として必要とする。４つのＡＡ長の切断可能なリンカー（アミノ酸のすべての潜在的な組み合わせを調べ、本発明者らの予測因子によって最高のスコア化を取得することによって選択された）は、他の方法では効率的な切断が不可能な場合にエピトープ間に、及び組み立てられたエピトープの各領域の側面に、所与のストリング変異型の隣接する配列を考慮して追加された。エピトープの順序付けは、できるだけ少ない切断可能リンカーを追加しながら、最も効率的な切断を可能にする構成を選択することによって決定された。２つのストリング変異型は、推定上非免疫原性のＧＳＳリンカーを使用して異なるＯＲＦから配列を分離した。一方のストリング変異型は２Ａ自己切断ペプチド配列をリンカーとして使用して異なるＯＲＦから配列を分離した。残りの変異型は、設計されたＭＨＣクラスＩ切断可能領域を「リンカー」として使用した。ストリング内のＯＲＦの順序付けは、プロテオミクスの存在量と免疫原性のデータによって決定された。ストリング変異型の１つは、ストリングに沿った距離の関数として翻訳効率を評価するために、対照としてＯＲＦの順序を逆にした。
実施例１０：ｍＲＮＡワクチンのエピトープ特異性
この実施例では、ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２に向けられたＢＮＴ ｍＲＮＡワクチンを投与した際のＴ細胞特異性を生体内で実証する例示的な試験を説明している。試験参加者は、１日目にＢＮＴ１６２ｂ２による初回刺激免疫を受け、２２±２日目に追加免疫を受けた。血清は１日目（初回刺激前）、８±１日目（初回刺激後）、２２±２日目（追加免疫前）、２９±３日目、４３±４日目、５０±４日目、及び８５±７日目（追加免疫後）に得た。ＰＢＭＣは１日目（初回刺激前）及び２９±３日目（追加免疫後）に得られた。
この試験では、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答は３人のＢＮＴ ｍＲＮＡワクチン接種参加者におけるエピトープレベルで特徴付けた。３人のワクチン接種参加者（用量コホート１０μｇ、ｎ＝１；３０μｇ、ｎ＝２）の１日目（初回刺激前）及び２９日目（追加免疫後７日）に得られたＰＢＭＣを個々のｐＭＨＣクラスＩ多量体カクテルで染色し、Ｔ細胞エピトープ特異性（図８Ａｉ及び８Ａｉｉ）及び表現型（図８Ｂ；参加者３の例；ＹＬＱＰＲＴＦＬＬ）についてフローサイトメトリーによって分析した。図８Ａｉ～８Ｃでは、ドットプロットの上のペプチド配列はｐＭＨＣクラスＩ多量体のエピトープ特異性を示し、ドットプロットの上の数字はＳタンパク質内のエピトープに対応するアミノ酸を示す。図８Ｃは、Ｓタンパク質内の同定されたＭＨＣクラスＩ拘束エピトープの局在化を示す。ワクチン接種前及びワクチン接種後のＰＢＭＣを、個別化されたペプチド／ＭＨＣ多量体のフローサイトメトリー分析用の染色カクテルで染色した。２３（ＨＬＡ－Ｂ＊０７０２が４、ＨＬＡ－Ａ＊２４０２が１９）、１４（ＨＬＡ－Ｂ＊３５０１）及び２３（ＨＬＡ－Ｂ＊４４０１が７，ＨＬＡ－Ａ＊０２０１が１６）の多様なペプチド／ＭＨＣ対立遺伝子ペアを参加者１、２、及び３にそれぞれ使用したので、ポリエピトープＴ細胞応答を包括的に捕捉するのではなく、潜在的な反応性の選択されたセットを調べた。参加者ごとに、複数のエピトープに対するデノボ誘導したＣＤ８＋Ｔ細胞の反応性が特定され、Ｓの完全長にわたって広がった最大合計８までの異なるエピトープ／ＭＨＣペアを加えた（図８Ａｉ～８Ａｉｉ、８Ｃ）。エピトープ特異的なＴ細胞応答の大きさは、末梢ＣＤ８＋Ｔ細胞の０．０１～３．０９％の範囲であり、ＨＬＡ－Ａ＊０２０１ＹＬＱＰＲＴＦＬＬ（ＣＤ８＋の３．０９％多量体＋）、ＨＬＡ－Ａ＊２４０２ＱＹＩＫＷＰＷＹＩ（ＣＤ８＋の１．２７％多量体＋）及びＨＬＡ－Ｂ＊３５０１ＱＰＴＥＳＩＶＲＦ（ＣＤ８＋の０．１７％多量体＋）について最も顕著な増殖が観察された。ＥＬＩＳｐｏｔ及びＩＣＳによって決定されたこれらの個人における完全Ｓに対するバルクＩＦＮγ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞応答との比較は、ｐＭＨＣ技術が細胞性免疫応答の真の程度を評価するのにさらに有用であり得ることを示した。特定されたｐＭＨＣ多量体＋Ｓ抗原を経験したＣＤ８＋Ｔ細胞特異性の表現型解析は、ＣＣＲ７及びＣＤ４５ＲＡの低発現と共刺激分子ＣＤ２８及びＣＤ２７の高発現を特徴とする初期分化したエフェクターメモリー表現型を明らかにした。ＣＤ８＋Ｔ細胞はまた、ＣＤ３８、ＨＬＡ－ＤＲ、及びＰＤ－１のような同族活性化に関連するマーカーも発現した（図８Ｂ）。ここに提示されたデータは、ＣＯＶＩＤ－１９ワクチン誘導のＴ細胞によって認識されるエピトープの最初の実証である。
ワクチン投与後の活性化Ｔ細胞の検出の経時変化をヒト対象にて追跡した。図８Ｄに示される試験では、スパイクタンパク質をコードする１０、２０または３０マイクログラムのｍＲＮＡワクチンを対象に投与した。活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞を２００日までの時間間隔で単離し、細胞からのＩＦＮガンマの放出をＥＬＩＳＰＯＴで検出した。対象は、用量依存性のＩＦＮｇ放出によって決定された活性化されたＣＤ４＋とＣＤ８＋のＴ細胞双方のさらに長い持続性を示した。図はまた、例えば、左のグラフの上のパネルにおける２００日目での１０マイクログラム群の８人のうちの７人のように、対象が曝露されたほとんどのエピトープに細胞が応答したことも示している。高齢者コホートにおける同じ試験はまた、２００日間の経過にわたって、ワクチン接種されたエピトープ応答性の活性化Ｔ細胞がさらに長く持続することも示した（図８Ｅ）。ちなみに、無関係なウイルスプールエピトープの対照（ＣＥＦＴまたはＣＥＦ）はＣＤ４＋Ｔ細胞に対してさらに低い応答を示した。それぞれのエピトープ、一致するＨＬＡ、及び対象における応答を以下に列挙する。
Figure 2023518821000334
実施例１１．ペプチド／ＭＨＣ多量体の染色
多量体分析用のＭＨＣクラスＩエピトープを選択するために、質量分析に基づく結合及び提示予測因子（例えば、Ａｂｅｌｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，４６，３１５－３２６（２０１７）；及びＰｏｒａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｍｅｄ．１２，７０（２０２０）に記載されているような）を、ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２のＧｅｎＢａｎｋ参照配列（アクセッション：ＮＣ＿０４５５１２．２，ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／ＮＣ＿０４５５１２）に由来し、ヨーロッパの集団における＞５％の頻度での１８のＭＨＣクラスＩ対立遺伝子と対合するスパイク糖タンパク質の８～１２のアミノ酸長のペプチド配列に適用した。結合のパーセント順位（≦１％）及び提示スコア（≧１０～２．２）に閾値を設定することによって上位の予測エピトープを特定し、＞９０％純度のペプチドの合成を検討した。ｅａｓＹｍｅｒ技術（ｅａｓＹｍｅｒ（登録商標）キット、ＩｍｍｕｎｅＡｗａｒｅ Ａｐｓ）を使用してｐＭＨＣ複合体を再び折り畳み、製造元の指示書に従ってビーズに基づくフローサイトメトリーアッセイにて複合体形成を検証した。５つの異なる蛍光標識の２色の組み合わせを利用してＴ細胞の抗原特異性を分析するのに組み合わせ標識を使用して、試料あたり最大１０の異なるＴ細胞集団の検出を可能にした。四量体化のために、ストレプトアビジン（ＳＡ）－蛍光色素コンジュゲート：ＳＡ ＢＶ４２１、ＳＡ ＢＶ７１１、ＳＡ ＰＥ、ＳＡ ＰＥ－Ｃｙ７、ＳＡ ＡＰＣ（すべてＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を加えた。３人のＢＮＴ１６２ｂ２ワクチンを接種した参加者については、個別化されたｐＭＨＣ多量体染色カクテルは最大１０のｐＭＨＣ複合体を含有し、各ｐＭＨＣ複合体は特有の２色の組み合わせでコード化されていた。ＰＢＭＣ（２ｘ１０６）をＢｒｉｌｌｉａｎｔ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ Ｐｌｕｓ（ＳＢ Ｐｌｕｓ ［ＢＤ Ｈｏｒｉｚｏｎ（商標）］）中で最終濃度４ｎＭの各ｐＭＨＣ多量体カクテルによって室温にて２０分間生体外で染色した。表面染色及び生存率染色は、ＢＳＢ Ｐｌｕｓを添加したフロー緩衝液（２％ＦＢＳ［Ｂｉｏｃｈｒｏｍ］、２ｍＭのＥＤＴＡ［Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ］を伴うＤＰＢＳ［Ｇｉｂｃｏ］）にて４℃で３０分間行った（ＣＤ３ ＢＵＶ３９５，１：５０；ＣＤ４５ＲＡ ＢＵＶ５６３，１：２００；ＣＤ２７ ＢＵＶ７３７，１：２００；ＣＤ８ ＢＶ４８０，１：２００；ＣＤ２７９ ＢＶ６５０，１：２０；ＣＤ１９７ ＢＶ７８６，１：１５；ＣＤ４ ＢＢ５１５，１：５０；ＣＤ２８ ＢＢ７００，１：１００；ＣＤ３８ ＰＥ－ＣＦ５９４，１：６００；ＨＬＡ－ＤＲ ＡＰＣ－Ｒ７００，１：１５０；すべてＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；ＤＵＭＰチャネル：ＣＤ１４ ＡＰＣ－ｅＦｌｕｏｒ７８０，１：１００；ＣＤ１６ ＡＰＣ－ｅＦｌｕｏｒ７８０，１：１００；ＣＤ１９ ＡＰＣ－ｅＦｌｕｏｒ７８０，１：１００；固定化生存率色素ｅＦｌｕｏｒ７８０，１：１，６６７；すべてＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。細胞を１×Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｆｉｘａｔｉｖｅ（ＢＤ）にて４℃で１５分間固定し、ＦＡＣＳｙｍｐｈｏｎｙ（商標）Ａ３フローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でデータ取得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアバージョン１０．６．２（ＦｌｏｗＪｏ ＬＬＣ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析した。ＣＤ８＋Ｔ細胞の反応性は、２つのｐＭＨＣ多量体カラーのみで標識されたクラスター化された集団が観察された場合、陽性と見なされた。
実施例１２．Ｔ細胞の生産
本明細書で提供されているのは、ウイルスエピトープに特異的な抗原ペプチドに対して刺激され、応答性であるＴ細胞が対象に投与されるＴ細胞療法である。該療法は、ウイルスＴ細胞エピトープを発現するＡＰＣでＴ細胞を抗原刺激し、活性化されたＴ細胞を増殖させて記憶表現型を示すこれらの細胞の集団を含むウイルスエピトープ特異的なＣＤ８＋及びＣＤ４＋を得ることによって、生体外でウイルスエピトープ特異的Ｔ細胞を生成することを含むことができる（例えば、参照によってその全体が組み込まれるＷＯ２０１９０９４６４２を参照のこと）。標的ウイルス抗原応答性Ｔ細胞は生体外で生成され、免疫原性は試験管内の抗原特異的Ｔ細胞アッセイを使用して検証される。質量分析は、目的の抗原を発現する細胞が関連するＨＬＡ分子でペプチドを処理し、及び提示することができることを検証するのに使用することができる。さらに、ペプチドを提示する細胞を殺傷するこれらのＴ細胞の能力は細胞傷害性アッセイを使用して確認される。
生体外での標的腫瘍細胞抗原応答性Ｔ細胞の生成
材料：
ＡＩＭ Ｖ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ヒトＦＬＴ３Ｌ、前臨床ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ＃１４１５－０５０ストック５０ｎｇ／μＬ；ＴＮＦ－α、前臨床ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ＃１４０６－０５０ストック１０ｎｇ／μＬ；ＩＬ－１β、前臨床ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ＃１４１１－０５０ストック１０ｎｇ／μＬ；Ｃｚｅｃｈ ｒｅｐｕｂｌｉｃ Ｓｔｏｃｋ由来のＰＧＥ１またはＡｌｐｒｏｓｔａｄｉｌ－Ｃａｙｍａｎ０．５μｇ／μＬ；Ｒ１０培地－ＲＰＭＩ１６４０グルタマックス＋１０％ヒト血清＋１％ＰｅｎＳｔｒｅｐ；２０／８０培地－１８％ＡＩＭ Ｖ＋７２％ＲＰＭＩ１６４０グルタマックス＋１０％ヒト血清＋１％ＰｅｎＳｔｒｅｐ；ＩＬ７ストック５ｎｇ／μＬ；ＩＬ１５ストック５ｎｇ／μＬ。
手順
工程１：２ｍＬのＡＩＭ Ｖ培地にてＦＬＴ３Ｌを含む２４ウェルプレートの各ウェルに５００万個のＰＢＭＣ（または目的の細胞）を播種する。
工程２：ＡＩＭＶにおけるペプチドの負荷及び成熟
１．目的のペプチドプール（ペプチドなしの条件を除く）をそれぞれのウェルでＰＢＭＣ（または目的の細胞）と混合する。
２．１時間インキュベートする。
３．インキュベートの後、成熟カクテル（ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＰＧＥ１、及びＩＬ－７を含む）を各ウェルに混合する。
工程３．１０体積％の最終濃度で各ウェルにヒト血清を加えて混合する。
工程４．培地を、ＩＬ７＋ＩＬ１５を添加した新鮮なＲＰＭＩ＋１０％ＨＳ培地に交換する。
工程５．インキュベートの期間中１～６日ごとにＩＬ７＋ＩＬ１５を添加した新鮮な２０／８０培地と当該培地を交換する。
工程６：２ｍＬのＡＩＭ Ｖ培地にてＦＬＴ３Ｌを含む新しい６ウェルプレートの各ウェルに５００万個のＰＢＭＣ（または目的の細胞）を播種する。
工程７．再刺激のためのペプチドの負荷及び成熟－（新しいプレート）
１．目的のペプチドプール（ペプチドなしの条件を除く）をそれぞれのウェルにてＰＢＭＣ（または目的の細胞）と混合する。
２．１時間インキュベートする。
３．インキュベートの後、成熟カクテルを各ウェルに混合する。
工程８：再刺激：
１．最初の刺激ＦＬＴ３Ｌ培養物をカウントし、５００万個の培養細胞を新しい再刺激プレートに加える。
２．培養液量を５ｍＬ（ＡＩＭ Ｖ）にし、５００μＬのヒト血清（１０体積％）を加える。
工程９．培地の３ｍｌを取り除き、ＩＬ７＋ＩＬ１５を添加したＲＰＭＩ＋１０％ＨＳ培地の６ｍｌを加える。
工程１０．培地の７５％をＩＬ７＋ＩＬ１５を添加した新鮮な２０／８０培地と交換する。
工程１１．必要に応じて再刺激を繰り返す。
抗原特異的誘導の分析
ＭＨＣ四量体は、当業者に知られている方法に従って現場で購入または製造され、免疫原性アッセイにてペプチド特異的Ｔ細胞増殖を測定するのに使用される。評価のために、製造元の指示書に従って、１％ＦＣＳ及び０．１％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ（ＦＡＣＳ緩衝液）にて１×１０５個の細胞に四量体を加える。細胞を暗所にて室温で２０分間インキュベートする。次に、ＣＤ８のようなＴ細胞マーカーに特異的な抗体を製造元が提案する最終濃度まで添加し、細胞を４℃の暗所にて２０分間インキュベートする。細胞を冷ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、１％ホルムアルデヒドを含有する緩衝液に再浮遊させる。細胞はＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）機器でデータ取得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して分析する。四量体陽性細胞の分析については、前方散乱光と側方散乱光のプロットからリンパ球のゲートを利用する。データはＣＤ８＋／四量体＋であった細胞の割合として報告される。
ウイルス抗原提示の評価
ＨＬＡ対立遺伝子に対するウイルスエピトープの親和性及びＨＬＡ対立遺伝子によるウイルスエピトープの安定性を決定することができる。クラスＩのＭＨＣに対するペプチドの結合親和性を測定するために利用されるプロトコールの例示的な詳細な説明が公開されている（Ｓｅｔｔｅ，ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１（１１）：８１３－２２，１９９４）。簡単に言えば、ＭＨＣＩ複合体を調製し、放射性標識参照ペプチドに結合させた。ペプチドをこれらの複合体と種々の濃度で２日間インキュベートし、ＭＨＣＩに結合した残りの放射性標識ペプチドの量を、サイズ排除ゲル濾過を使用して測定した。参照放射性標識ペプチドを置換するのに必要な試験ペプチドの濃度が低いほど、ＭＨＣＩに対する試験ペプチドの親和性が強いことを示す。ＭＨＣＩに対して＜５０ｎＭの親和性を持つペプチドは一般的に強力なバインダーと考えられている一方で、＜１５０ｎＭの親和性があるものは中間バインダーと見なされ、＜５００ｎＭのものは弱いバインダーと見なされる（Ｆｒｉｔｓｃｈ，ｅｔ ａｌ，２０１４）。
ペプチドのクラスＩのＭＨＣへの結合安定性を測定するために利用されるプロトコールの例示的な詳細な説明が公開されている（Ｈａｒｎｄａｈｌ，ｅｔ ａｌ．ＪＩｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．３７４：５－１２，２０１１）。簡単に言えば、ビオチン化ＭＨＣ－Ｉの重鎖及び軽鎖をコードする合成遺伝子をＥ．ｃｏｌｉで発現させ、標準的な方法を使用して封入体から精製する。軽鎖（β２ｍ）をヨウ素（１２５Ｉ）で放射性標識し、精製したＭＨＣ－Ｉ重鎖及び目的のペプチドと１８℃で混ぜ合わせてｐＭＨＣ－Ｉ複合体の形成を開始する。これらの反応は、ストレプトアビジンでコーティングされたマイクロプレートで行われ、ビオチン化ＭＨＣ－Ｉ重鎖を表面に結合させ、放射性標識軽鎖を測定して複合体形成をモニタリングできるようにする。高濃度の非標識軽鎖を添加し、３７℃でインキュベートすることによって解離を開始する。安定性は、シンチレーションカウントによって測定されるように、複合体の半分が解離するのにかかる時間の長さとして定義される。
抗原がさらに大きなポリペプチドの状況から処理及び提示されてもよいかどうかを評価するために、目的の遺伝子を発現している細胞から単離されたＨＬＡ分子から溶出されたペプチドをタンデム質量分析法（ＭＳ／ＭＳ）で分析した。
ウイルス抗原の提示の分析については、ウイルスに感染している細胞株、またはウイルス抗原を発現するようにレンチウイルスで形質導入された細胞株が利用される。ＨＬＡ分子は、細胞株の自然な発現に基づいて分離される、または目的のＨＬＡを発現するように細胞株がレンチウイルスで形質導入される、もしくは一時的に形質移入される。２９３Ｔ細胞は、ウイルスポリペプチドの種々の領域をコードするレンチウイルスベクターで形質導入される。ウイルスポリペプチドによってコードされるペプチドを発現する５０００万個を超える細胞を培養し、酸洗浄を使用してＨＬＡ・ペプチド複合体からペプチドを溶出した。次いで、溶出されたペプチドは並行反応モニタリング（ＰＲＭ）を伴う標的化ＭＳ／ＭＳによって分析される。
ＨＬＡクラスＩの結合と安定性
親和性測定に使用されるペプチドのサブセットはまた、記載されているアッセイを使用した安定性測定にも使用される。５０ｎＭ未満のものはその分野では強力なバインダーと見なすことができ、５０～１５０ｎＭのものは中間のバインダーと見なすことができ、１５０～５００ｎＭのものは弱いバインダーと見なすことができ、５００ｎＭを超えるものは非常に弱いバインダーと見なすことができる。
免疫原性アッセイは各試験ペプチドのＴ細胞を増殖させる能力を調べるのに使用される。成熟したプロフェッショナルＡＰＣは次の方法でこれらのアッセイ用に調製される。単球は、ビーズに基づくキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して、健康なヒトドナーのＰＢＭＣから濃縮される。濃縮した細胞をＧＭ－ＣＳＦ及びＩＬ－４に播種して未成熟ＤＣを誘導する。５日後、サイトカイン成熟カクテル（ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１β、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＴＮＦα、ＰＧＥ１β）を添加する前に、未成熟ＤＣを各ペプチドとともに３７℃で１時間インキュベートする。細胞を３７℃でインキュベートしてＤＣを成熟させる。
試験管内での抗原特異的Ｔ細胞の細胞傷害能の評価
細胞傷害性活性は、フローサイトメトリーによって標的細胞内の切断されたカスパーゼ３を検出することで測定することができる。標的がん細胞は、適切なＭＨＣ－Ｉ対立遺伝子とともにウイルスペプチドを発現するように操作される。模擬形質導入標的細胞（すなわち、ウイルスペプチドを発現していない）を陰性対照として使用する。細胞は、エフェクター細胞として使用される刺激されたＰＢＭＣと区別するためにＣＦＳＥで標識される。標的細胞とエフェクター細胞を回収する前に６時間共培養する。細胞内染色を行ってＣＦＳＥ陽性の標的細胞におけるカスパーゼ３の切断型を検出する。特異的溶解の割合は次のように計算される：カスパーゼ３の実験的切断／カスパーゼ３の自然な切断（突然変異型ペプチド発現の非存在下で測定）×１００。
いくつかの例では、細胞傷害活性は、ウイルス抗原特異的Ｔ細胞の集団を伴う誘導されたＴ細胞を対応するＨＬＡを発現する標的細胞とともに共培養することと、標的細胞におけるアポトーシスマーカーである、アネキシンＶを特異的に測定することと併せて標的細胞の相対的増殖を決定することとによって評価される。ウイルスペプチドを発現するように標的細胞を操作する、またはウイルスペプチドを外から負荷する。模擬形質導入標的細胞（すなわち、ウイルスペプチドを発現していない）、ウイルスペプチドを負荷した標的細胞、またはペプチドを負荷していない標的細胞を陰性対照として使用する。ＧＦＰを安定して発現するように細胞を形質導入し、標的細胞の増殖を追跡できるようにする。ＩｎｃｕＣｙｔｅ Ｓ３装置によってＧＦＰシグナルまたはアネキシン－Ｖシグナルを経時的に測定する。エフェクター細胞に由来するアネキシンＶのシグナルはサイズ排除によって濾別される。標的細胞の増殖と死は、経時的なＧＦＰとアネキシンＶの面積（ｍｍ２）としてそれぞれ表される。
標的抗原活性化Ｔ細胞の濃縮
ウイルス抗原応答性Ｔ細胞はさらに濃縮されてもよい。この実施例では、抗原応答性Ｔ細胞を濃縮するための複数の方法が検討されている。ウイルス抗原特異的Ｔ細胞の最初の刺激の後、これらの細胞のさらなる増殖の前に濃縮手順を使用することができる。例として、刺激した培養物を最初の刺激に使用したのと同じウイルスペプチドで１３日目にパルスすると、Ｍａｇｎｅｔｉｃ－Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ（ＭＡＣＳ；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して、４－１ＢＢを上方調節している細胞が濃縮される。次いで、これらの細胞は、例えば、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８マイクロビーズと低用量のＩＬ－２を使用して、さらに増殖させることができる。
選択したペプチドの免疫原性アッセイ
ＤＣの成熟後、ＰＢＭＣ（Ｔ細胞についてバルクまたは濃縮）を増殖サイトカインとともに成熟樹状細胞に添加する。機能アッセイ及び／または四量体染色の組み合わせを使用して、培養物をウイルスペプチド特異的Ｔ細胞についてモニタリングする。ウイルスペプチドによる並行免疫原性アッセイによって、ペプチドがペプチド特異的Ｔ細胞を増殖させる相対的効率の比較が可能になった。いくつかの実施形態では、ペプチドがＴ細胞培養物にて免疫応答を誘発することは、Ｔ細胞培養物にてＦＡＳリガンド、グランザイム、パーフォリン、ＩＦＮ、ＴＮＦ、またはそれらの組み合わせの発現を検出することを含む。
免疫原性は四量体アッセイによって測定することができる。ＭＨＣ四量体は現地で購入または製造され、免疫原性アッセイでペプチド特異的Ｔ細胞増殖を測定するのに使用される。評価のために、製造元の指示書に従って、１％ＦＣＳ及び０．１％アジ化ナトリウム（ＦＡＣＳ緩衝液）を含有するＰＢＳにて１×１０∧５個の細胞に四量体を加える。細胞を暗所にて室温で２０分間インキュベートする。次に、ＣＤ８のようなＴ細胞マーカーに特異的な抗体を製造元が提案する最終濃度まで添加し、細胞を摂氏４度の暗所にて２０分間インキュベートする。細胞を冷ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、１％ホルムアルデヒドを含有する緩衝液に再浮遊させる。細胞はＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）機器でデータ取得し、Ｃｅｌｌｑｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して分析する。四量体陽性細胞の分析については、前方散乱光と側方散乱光のプロットからリンパ球のゲートを利用する。データはＣＤ８＋／四量体＋であった細胞の割合として報告される。
免疫原性は細胞内サイトカイン染色によって測定することができる。ウイルス抗原特異的なＴ細胞集団を特定するための十分に確立された四量体染色がない場合、十分に確立されたフローサイトメトリーアッセイを使用したサイトカイン産生の評価を使用して抗原特異性を推定することができる。簡単に言えば、Ｔ細胞を目的のウイルスペプチドで刺激し、対照と比較する。刺激後、ＣＤ４＋Ｔ細胞によるサイトカインの産生（例えば、ＩＦＮγ及びＴＮＦα）を細胞内染色によって評価する。これらのサイトカイン、特にＩＦＮγは刺激された細胞を特定するのに使用される。
いくつかの実施形態では、免疫原性は、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを使用してＴ細胞によって発現されるタンパク質またはペプチドを測定することによって測定される。ペプチド特異的なＴ細胞は、単一細胞基準でＴ細胞からのＩＦＮγの放出を測定するＥＬＩＳｐｏｔアッセイ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して機能的に数えられる。標的細胞を１０μＭのウイルスペプチドで３７℃にて１時間パルスし、３回洗浄する。１×１０∧５個のペプチドをパルスした標的を、免疫原性培養から採取したさまざまな濃度のＴ細胞（５×１０∧２～２×１０∧３）とともにＥＬＩＳＰＯＴプレートのウェルで共培養する。プレートは、製造元のプロトコールに従って発色させ、付属のソフトウェアを使用してＥＬＩＳＰＯＴリーダー（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｔｄ．）で分析する。ＩＦＮガンマ産生Ｔ細胞の数に対応するスポットはプレートに入れたＴ細胞の数あたりのスポットの絶対数として報告される。修飾ペプチドで増殖したＴ細胞は、修飾ペプチドでパルスされた標的を認識する能力だけでなく、親ペプチドでパルスされた標的を認識する能力についても調べられる。
ＣＤ１０７ａ及びＣＤ１０７ｂは、ウイルスペプチドによる活性化の後、ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞表面に発現される。Ｔ細胞の溶解顆粒は分子ＣＤ１０７ａ及びｂを含むリソソーム関連膜糖タンパク質（「ＬＡＭＰ」）を含有する脂質二重層を有する。細胞傷害性Ｔ細胞がＴ細胞受容体を介して活性化されると、これらの溶解顆粒の膜が動員され、Ｔ細胞の細胞膜と融合する。顆粒の内容物が放出され、これが標的細胞の死につながる。顆粒膜が細胞膜と融合すると、ＣＤ１０７ａ及びｂが細胞表面に露出されるので、脱顆粒のマーカーとなる。ＣＤ１０７ａ及びｂ染色によって測定されるような脱顆粒は単一細胞基準で報告されるので、該アッセイはウイルスペプチド特異的なＴ細胞を機能的に数えるのに使用される。アッセイを行うために、ＨＬＡを形質移入した細胞にペプチドを最終濃度２０μＭになるように添加し、細胞を３７℃で１時間インキュベートし、３回洗浄する。ペプチドをパルスした細胞１×１０∧５個を試験管に等分し、ＣＤ１０７ａ及びｂに特異的な抗体を製造元（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）が提案する最終濃度まで加える。アッセイの経過中にＣＤ１０７分子が一時的に表面に現れるのでそれらを「捕捉」するためにＴ細胞の添加前に抗体を添加する。次に、免疫原性培養物からの１×１０∧５個のＴ細胞を添加し、試料を３７℃で４時間インキュベートした。Ｔ細胞をさらに、ＣＤ８のような追加の細胞表面分子について染色し、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ機器（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）でデータ取得を行う。付属のＣｅｌｌｑｕｅｓｔソフトウェアを使用してデータを分析し、結果をＣＤ８＋ＣＤ１０７ａ及びｂ＋細胞の割合として報告する。
細胞傷害活性はクロム放出アッセイを使用して測定される。標的Ｔ２細胞をＮａ５１Ｃｒで３７℃にて１時間標識し、洗浄した後、５×１０∧３個の標的細胞を免疫原性培養物からの種々の数のＴ細胞に添加する。クロムの放出は３７℃で４時間のインキュベートの後に回収された上清で測定される。特異的溶解の割合は次のように計算される：実験の放出－自然の放出／総放出－自然の放出×１００
免疫原性アッセイを実施して、各ペプチドがウイルス抗原特異的増殖によってＴ細胞応答を誘発できるかどうかを評価する。陽性の結果はペプチドがＴ細胞応答を誘導できることを示す。いくつかのウイルスペプチドは、記載されているように、多量体の読み出しでＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発する能力について調べられる。各陽性の結果は、任意の調製物の偏りを避けるために第２の多量体の調製物で測定された。例示的なアッセイでは、ウイルスエピトープを負荷した単球由来の樹状細胞とともにＴ細胞を１０日間共培養した。多量体を使用してウイルスエピトープに対するウイルス抗原特異性についてＣＤ８＋Ｔ細胞を分析した（初期：ＢＶ４２１及びＰＥ；検証：ＡＰＣ及びＢＵＶ３９６）。
抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、十分に確立されたＨＬＡクラスＩ多量体技術を使用して容易に評価される一方で、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答は、ＨＬＡクラスＩＩ多量体技術が十分に確立されていないので、評価するために別のアッセイが必要である。ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を評価するために、Ｔ細胞を目的のウイルスペプチドで再刺激する。刺激後、ＣＤ４＋Ｔ細胞によるサイトカインの産生（例えば、ＩＦＮγ及びＴＮＦα）を細胞内染色によって評価する。これらのサイトカイン、特にＩＦＮγは、刺激された細胞を特定するのに使用される。
細胞の増殖及び調製
ＡＰＣを調製するために、以下の方法が採用される。（ａ）患者の末梢血から自己免疫細胞を得る；培養における単球及び樹状細胞を濃縮する；ウイルスペプチドと成熟ＤＣを負荷する。
Ｔ細胞の誘導（プロトコール１）
最初の誘導：（ａ）アフェレーシスバッグから自己Ｔ細胞を取得すること；（ｂ）ＣＤ２５＋細胞とＣＤ１４＋細胞を枯渇させること、またはＣＤ２５＋細胞のみを枯渇させること；（ｃ）ペプチドを負荷した成熟ＤＣ細胞を洗浄し、Ｔ細胞培養培地に再浮遊させること；（ｄ）Ｔ細胞を成熟ＤＣとともにインキュベートすること。２回目の誘導：（ａ）Ｔ細胞を洗浄し、Ｔ細胞培地に再浮遊させ、任意で細胞培養物から少量の一定分量を評価して細胞増殖、比較増殖、及びＴ細胞亜型の誘導、及び抗原特異性を決定し、細胞集団の損失をモニタリングすること；（ｂ）Ｔ細胞を成熟ＤＣとともにインキュベートすること。
３回目の誘導：（ａ）Ｔ細胞を洗浄し、Ｔ細胞培地に再浮遊させ、任意で細胞培養物から少量の一定分量を評価してＴ細胞亜型の細胞増殖、比較増殖、及びＴ細胞亜型の誘導、及びウイルス抗原特異性を決定し、細胞集団の損失をモニタリングすること；（ｂ）Ｔ細胞を成熟ＤＣとともにインキュベートすること。
ペプチド活性化Ｔ細胞を採取し、Ｔ細胞を凍結保存するには、以下の方法を採用することができる。（ａ）原薬（ＤＳ）の望ましい特性を構成する最適な細胞数及び細胞型の割合にある活性化Ｔ細胞を含む最終製剤を洗浄し、再浮遊させること。リリース基準試験には、とりわけ、無菌性、エンドトキシン、細胞表現型、ＴＮＣ数、生存率、細胞濃度、効力；（ｂ）原薬を好適な密閉輸液バッグに充填すること；（ｃ）使用時までの保存が含まれる。
ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ウイルス抗原特異的なＴ細胞の機能的特徴付けの方法。
Ｔ細胞生産プロセスは、養子細胞療法で使用するためのウイルス抗原反応性Ｔ細胞産物を生成する、生体外Ｔ細胞刺激の複数回のラウンドを介してウイルス抗原に対するメモリー及びデノボＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞応答を高めるために開発された。刺激されたＴ細胞産物の詳細な特徴付けを使用して、これらのプロセスが利用する多数の潜在的な変数を調べることができる。Ｔ細胞の機能性及び／または特異性を調べるために、ウイルス抗原特異的Ｔ細胞応答を同時に検出し、その大きさと機能を特徴付けるアッセイが開発された。このアッセイは次の工程を採用する。先ず、Ｔ細胞・ＡＰＣの共培養を使用してウイルス抗原特異的Ｔ細胞の反応性を引き出した。任意で、蛍光細胞バーコード付けを使用する試料の多重化が採用される。ウイルス抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞を特定し、Ｔ細胞の機能性を調べるには、ペプチド・ＭＨＣ多量体の染色及び細胞内の多重パラメーター及び／または細胞表面細胞マーカーの染色を、ＦＡＣＳ解析を使用して同時に調べた。この合理化されたアッセイの結果は、健康なドナーから誘導されるＴ細胞応答を検討するためのその応用を実証した。ペプチドに対して誘導されるウイルス抗原特異的なＴ細胞応答はドナーにて特定される。誘導されたＴ細胞応答の大きさ、特異性、及び機能性も比較される。簡単に言えば、さまざまな濃度のさまざまな蛍光色素によって、さまざまなＴ細胞試料をバーコード化する（例えば、実施例１９を参照のこと）。各試料は、さまざまな濃度の蛍光色素またはさまざまな濃度の複数の色素の組み合わせを受け取る。試料をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に再浮遊させ、ＤＭＳＯに溶解した（通常、１：５０希釈）蛍光色素分子を５μＭの最大最終濃度まで添加する。３７℃で５分間標識した後、余分な蛍光色素を、タンパク質含有培地（例えば、１０％のプールされたヒトＡＢ型血清を含有するＲＰＭＩ培地）を添加することによって消光する。独自にバーコード化されたＴ細胞培養物に、上記のようなウイルス抗原ペプチドでパルスした自己ＡＰＣを負荷する。
差別的に標識した試料を、１つのＦＡＣＳチューブまたはウェルにて混ぜ合わせ、得られる体積が１００μＬを超える場合は再びペレット化する。混ぜ合わせたバーコード化試料（通常、１００μＬ）を、蛍光色素結合ペプチド・ＭＨＣ多量体を含む表面マーカー抗体で染色する。固定及び透過処理の後、ＴＮＦ－α及びＩＦＮ－γを標的とする抗体で試料をさらに細胞内染色する。
次に、混ぜ合わせたバーコード化Ｔ細胞試料の細胞マーカープロファイルとＭＨＣ四量体染色をフローサイトメーターでのフローサイトメトリーによって同時に分析する。Ｔ細胞試料の細胞マーカープロファイルとＭＨＣ四量体染色を別々に分析する他の方法とは異なり、この実施例に記載されているＴ細胞試料の細胞マーカープロファイルとＭＨＣ四量体染色の同時分析は、双方ともウイルス抗原特異的であり、細胞マーカー染色が増加しているＴ細胞の割合に関する情報を提供する。Ｔ細胞試料の細胞マーカープロファイルとＭＨＣ四量体染色を分析する他の方法は、ウイルス抗原特異的である試料のＴ細胞の割合を別々に決定し、細胞マーカー染色が増加したＴ細胞の割合を別々に決定し、これらの頻度の相関関係のみを認める。
この実施例に記載されているＴ細胞試料の細胞マーカープロファイルとＭＨＣ四量体染色の同時分析は、ウイルス抗原特異的なＴ細胞の頻度と細胞マーカー染色が増加したＴ細胞の頻度の相関関係に依存せず；むしろそれは、ウイルス抗原特異的であり、且つ細胞マーカー染色が増加しているＴ細胞の頻度を提供する。この実施例に記載されているＴ細胞試料の細胞マーカープロファイルとＭＨＣ四量体染色の同時分析は、ウイルス抗原特異的であり、且つ細胞マーカー染色が増加している細胞を単一細胞レベルで決定することを可能にする。
所与の誘導プロセスの成功を評価するために、多重化された多重パラメーターのフローサイトメトリーパネル分析がその後に続くリコール応答アッセイを使用してもよい。誘導培養から採取した試料を、独自の２色蛍光細胞バーコードで標識する。標識された細胞を、ウイルス抗原が負荷されたＤＣまたは負荷されていないＤＣ上で一晩インキュベートし、ウイルス抗原特異的細胞にて機能的応答を刺激する。翌日、抗体と多量体の染色の前に、独自に標識した細胞を混ぜ合わせる。Ｔ細胞培養のための例示的な材料を以下に提供する：
材料：ＡＩＭ Ｖ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ヒトＦＬＴ３Ｌ；前臨床ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ＃１４１５－０５０ストック５０ｎｇ／μＬ ＴＮＦα；前臨床ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ＃１４０６－０５０ストック１０ｎｇ／μＬ；ＩＬ－１β，前臨床ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ＃１４１１－０５０ストック１０ｎｇ／μＬ；Ｃｚｅｃｈ ｒｅｐｕｂｌｉｃ Ｓｔｏｃｋ由来のＰＧＥ１またはＡｌｐｒｏｓｔａｄｉｌ－Ｃａｙｍａｎ０．５μｇ／μＬ；Ｒ１０培地－ＲＰＭＩ１６４０グルタマックス＋１０％ヒト血清＋１％ＰｅｎＳｔｒｅｐ；２０／８０培地－１８％ＡＩＭ Ｖ＋７２％ＲＰＭＩ １６４０ グルタマックス＋１０％ヒト血清＋１％ＰｅｎＳｔｒｅｐ；ＩＬ７ストック５ｎｇ／μＬ；ＩＬ１５ストック５ｎｇ／μＬ；ＤＣ培地（Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ）；ＣＤ１４マイクロビーズ，ヒト，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ＃１３０－０５０－２０１，サイトカイン及び／または増殖因子，Ｔ細胞培地（ＡＩＭ Ｖ＋ＲＰＭＩ１６４０グルタマックス＋血清＋ＰｅｎＳｔｒｅｐ），ペプチドウイルスペプチドあたりペプチドストック－１ｍＭ）。
実施例１３．Ｏｒｆ１ａｂ最小エピトープのリンカーを設計すること
この実施例は、ＭＳベースのＨＬＡ－Ｉ切断予測因子を使用して、Ｏｒｆ１ａｂエピトープまたは最小エピトープ含有ストレッチの順序付けを最適化し、効率的なエピトープ切断を維持しながらリンカーをできる限り追加しないようにストリングを設計したことを示す（図９）。同じ１８のＯｒｆ１ａｂ配列は２つの配列が除かれているＲＳ－Ｃ６を除いて、各ストリング変異型に含まれる。しかしながら、配列のセットと設計された切断リンカーの順序付けは隣接状況に基づいて異なる。ストリングＲＳ Ｃ８は、最小のＯｒｆ１ａｂの最小エピトープ配列が互いに近接して配置されるように特別に設計され、エピトープの両側にあるＭＳベースの切断予測因子を利用し、最小のリンカー配列を必要とする。

Figure 2023518821000335
実施例１４．動物モデルにおける免疫原性試験
この実施例は、免疫原性に基づいてストリングを選択する方法を実証しており、１以上のドメインが開発に採用されてもよい。ｍＲＮＡストリングワクチンを調べるモデル試験は図１０Ａに記載されている；または、ウイルス分泌ドメイン（ＳＥＣドメイン）もしくは細胞質尾部ＴＭドメインを標的とするワクチンによって提供される免疫原性を比較することは免疫原性応答について検証される。例示的なアッセイでは、６～８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス及びＨＬＡ－Ａ２トランスジェニックマウスの各セットに４種のｍＲＮＡストリング構築物（５マイクログラム／マウス）のうち１つの筋肉内注射を実施し、注射後７、１４、２１及び２８日目に血液試料を採取する。１４日目及び２８日目に動物を安楽死させ、臓器を採取する。
図１０Ｂに例示されるようなさらに精巧な試験設計では、異なるワクチン戦略が比較されている：単一ワクチン：（ａ）スパイクｍＲＮＡワクチン単独、または（ｂ）ストリングワクチン単独及び組み合わせ、（ｃ）先ずスパイクワクチン、続いてストリングワクチン；（ｄ）先ずストリングワクチン、その後スパイクワクチン；（ｅ）第１の比率（例えば、９：１）でのスパイクワクチンとストリングワクチンの共製剤；（ｆ）第２の比率（例えば、３：１）でのスパイクワクチンとストリングワクチンの共製剤；（ｇ）第３の比率（例えば、１：１）でのスパイクワクチンとストリングワクチンの共製剤。試験の１つでは、各セットのマウスの約半分が１４日目に屠殺され、残りは２８日目に屠殺された。サイトカイン及びケモカインの生成について試料を分析し、１４日目及び２１日目に採取した試料でＥＬＩＳＰＯＴを実行し、フローサイトメトリーによって抗ウイルスサイトカイン応答、表面マーカーの発現、系列マーカーについてＴ細胞サブセットを調べる。Ｔ細胞の抗原特異的応答性も試験管内で測定する。組織試料も、脾臓、排出リンパ節及び血液におけるスパイク抗体、Ｔ細胞応答、及びＴ細胞サブセットの存在について調べられる。
実施例１５．独立した試験からの検証とＲＥＣＯＮ予測の相関
この試験で最初に報告され、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２Ａｉ、表２Ａｉｉ、表２Ｂ、表９、表１０、表１１、表１２、表１４Ａ、表１４Ｂ、表１５または表１６のエピトープ配列で提供されたエピトープ予測と強く相関し、それを検証しているＴ細胞免疫原性試験及び質量分析試験に由来する大量のデータが現在世界中で利用可能である。世界中で実施された試験におけるそのような検証及び強い相関関係は予測アルゴリズムの信頼性に高い信頼をもたらす。表１４Ａ及び表１４ＢはエピトープのＭＳ観察検証を例示する。
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上記のデータは、８８１のクラスＩの固有エピトープ配列を含む１１８０のクラスＩエピトープを対象とする１９の試験を示す。７５６（８６％）もの多数がＲＥＣＯＮ予測と正確に一致する。８７２（９８％）の配列はＲＥＣＯＮ予測にてスーパーストリングまたはサブストリングのいずれかを有する。これらの試験は、ＲＥＣＯＮによるエピトープ予測と実際のＴ細胞免疫原性が観察されたデータとの高度な相関関係を示している。
実施例１６．ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２の配列変異性
この実施例では、ストリングワクチンが提供できる保護の観点からＳＡＲＳ ＣｏＶ－２の配列変異性が示されている。図１１～１７はＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ゲノムに沿った変異型または変異したアミノ酸位置の検出／特定を示す。これは次に、変異型に対するストリングワクチンの感受性を評価するのに使用された。図はストリングによってカバーされるエピトープによってカバーされる領域を強調する。少なくともこれらの図に示されるように、また文書の他の場所で提供されているストリング配列に関する情報と組み合わせると、複数の異なるウイルスタンパク質由来の複数のエピトープが各ストリングに含まれる。すなわち、１つのエピトープが突然変異型配列をカバーするならば、他のエピトープはウイルス株に対する免疫応答を提供するように少なくとも温存される。この設計は、ワクチンによってさらに広くさらに強力な免疫原性応答が引き起こされ得るだけでなく、ウイルスのさまざまな変異型及び突然変異型がストリングワクチンによってカバーされることに留意することも重要であるということを保証する。図１１～１７での分析で実証されているように、当然、構築物の設計は、ウイルス回避変異型を避ける良好なメカニズムを提供することになる。これは、ストリングワクチンが変異型に依存しない防御免疫を付与することができる支援を提供する。
実施例１７．ＨＬＡペプチド提示予測アルゴリズムを使用した予測
機械学習するＨＬＡペプチド提示予測アルゴリズムＲＥＣＯＮの更新された実行では、高いスコア（すなわち、エピトープペプチドが実際にＨＬＡ対立遺伝子によって提示される可能性が高いことを表すスコア）で予測された新しいエピトープが予測された。これらのエピトープ・ＨＬＡペアは以下で表１６にて列挙する。各ペアについては、左列（列１または３）のエピトープのペプチド配列は、同じ行のすぐ右（それぞれ列２または列４）のＨＬＡによって提示されると予測される。




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Claims (98)

  1. 組成物であって、
    （ｉ）以下（ａ）ＯＲＦ１ａｂ由来のエピトープ配列を含む配列と、（ｂ）膜糖タンパク質（Ｍ）由来のエピトープ配列を含む配列と、（ｃ）ヌクレオカプシドリンタンパク質（Ｎ）由来のエピトープ配列を含む配列とのうちの少なくとも２つを含むポリペプチド；
    （ｉｉ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、前記ポリペプチドが以下（ａ）ＯＲＦ１ａｂ由来のエピトープ配列を含む配列と、（ｂ）膜糖タンパク質（Ｍ）由来のエピトープ配列を含む配列と、（ｃ）ヌクレオカプシドリンタンパク質（Ｎ）由来のエピトープ配列を含む配列とのうちの少なくとも２つを含む、前記ポリヌクレオチド；
    （ｉｉｉ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）または前記ＴＣＲを含むＴ細胞であって、前記ＴＣＲが対応するＨＬＡクラスＩまたはクラスＩＩ分子と複合体を形成して前記ポリペプチドのエピトープ配列に結合する、前記ＴＣＲまたは前記ＴＣＲを含むＴ細胞；
    （ｉｖ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）を含む抗原提示細胞；または
    （ｖ）抗体または前記抗体を含むＢ細胞であって、前記抗体が前記ポリペプチドのエピトープ配列に結合する、前記抗体または前記抗体を含むＢ細胞と、
    薬学的に許容される賦形剤とを含む、前記組成物。
  2. 前記ポリペプチドが（ａ）ＯＲＦ１ａｂ由来のエピトープ配列を含む配列と、（ｂ）膜糖タンパク質（Ｍ）由来のエピトープ配列を含む配列と、（ｃ）ヌクレオカプシドリンタンパク質（Ｎ）由来のエピトープ配列を含む配列とを含む、請求項１に記載の組成物。
  3. ＯＲＦ１ａｂ由来のエピトープ配列を含む前記配列が、ヌクレオカプシドリンタンパク質（Ｎ）由来のエピトープ配列を含む前記配列のＣ末端にある、請求項１に記載の組成物。
  4. ＯＲＦ１ａｂ由来のエピトープ配列を含む前記配列が、膜糖タンパク質（Ｍ）由来のエピトープ配列を含む前記配列のＮ末端にある、請求項１に記載の組成物。
  5. ヌクレオカプシドリンタンパク質（Ｎ）由来のエピトープ配列を含む前記配列が、膜糖タンパク質（Ｍ）由来のエピトープ配列を含む前記配列のＮ末端にある、請求項１に記載の組成物。
  6. 前記ポリペプチドが、（ａ）ＯＲＦ１ａｂ由来の２、３、４、５、６、７、８、９または１０以上のエピトープ配列と、（ｂ）膜糖タンパク質（Ｍ）由来のエピトープ配列を含む配列と、（ｃ）ヌクレオカプシドリンタンパク質（Ｎ）由来のエピトープ配列を含む配列とを含む、請求項１に記載の組成物。
  7. ＯＲＦ１ａｂ由来の前記エピトープ配列が非構造タンパク質（ＮＳＰ）由来のエピトープ配列である、請求項１に記載の組成物。
  8. 前記非構造タンパク質（ＮＳＰ）がＮＳＰ１、ＮＳＰ２、ＮＳＰ３、ＮＳＰ４及びそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項７に記載の組成物。
  9. 前記ポリペプチドが、ＮＳＰ１由来のエピトープ配列を含む配列と、ＮＳＰ２由来のエピトープ配列を含む配列と、ＮＳＰ３由来のエピトープ配列を含む配列と、ＮＳＰ４由来のエピトープ配列を含む配列とを含む、請求項１に記載の組成物。
  10. ＯＲＦ１ａｂ由来の前記エピトープ配列が、ＹＬＦＤＥＳＧＥＦＫＬ、ＹＬＦＤＥＳＧＥＦ、ＦＧＤＤＴＶＩＥＶ、ＱＬＭＣＱＰＩＬＬ、ＴＴＤＰＳＦＬＧＲＹ、ＰＴＤＮＹＩＴＴＹ、ＰＳＦＬＧＲＹ、ＡＥＡＥＬＡＫＮＶ、ＫＴＩＱＰＲＶＥＫ及びそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される、請求項１に記載の組成物。
  11. ヌクレオカプシド糖タンパク質（Ｎ）由来の前記エピトープ配列がＬＬＬＤＲＬＮＱＬである、請求項１に記載の組成物。
  12. 膜リンタンパク質（Ｍ）由来の前記エピトープ配列がＶＡＴＳＲＴＬＳＹである、請求項１に記載の組成物。
  13. 前記ポリペプチドが、ＬＬＬＤＲＬＮＱＬであるヌクレオカプシド糖タンパク質（Ｎ）由来のエピトープ配列と、ＶＡＴＳＲＴＬＳＹである膜リンタンパク質（Ｍ）由来のエピトープ配列とを含む、請求項１に記載の組成物。
  14. 前記ポリペプチドが（ａ）ＯＲＦ１ａｂ由来の以下のエピトープ配列：ＹＬＦＤＥＳＧＥＦＫＬ、ＹＬＦＤＥＳＧＥＦ、ＦＧＤＤＴＶＩＥＶ、ＱＬＭＣＱＰＩＬＬ、ＴＴＤＰＳＦＬＧＲＹ、ＰＴＤＮＹＩＴＴＹ、ＰＳＦＬＧＲＹ、ＡＥＡＥＬＡＫＮＶ、ＫＴＩＱＰＲＶＥＫのそれぞれと、（ｂ）ＬＬＬＤＲＬＮＱＬであるヌクレオカプシド糖タンパク質（Ｎ）由来のエピトープ配列と、（ｃ）ＶＡＴＳＲＴＬＳＹである膜リンタンパク質（Ｍ）由来のエピトープ配列とを含む、請求項１に記載の組成物。
  15. ＯＲＦ１ａｂ由来のエピトープ配列を含む前記配列が、以下の配列またはその断片：ＭＶＴＮＮＴＦＴＬＫＶＰＨＶＧＥＩＰＶＡＹＲＫＶＬＬＫＴＩＱＰＲＶＥＫＹＬＦＤＥＳＧＥＦＫＬＳＥＶＧＰＥＨＳＬＡＥＹＹＩＦＦＡＳＦＹＹ；
    ＭＶＴＮＮＴＦＴＬＫＶＰＨＶＧＥＩＰＶＡＹＲＫＶＬＬＫＴＩＱＰＲＶＥＫＹＬＦＤＥＳＧＥＦＫＬＳＥＶＧＰＥＨＳＬＡＥＹ；
    ＡＰＫＥＩＩＦＬＥＧＥＴＬＦＧＤＤＴＶＩＥＶＡＩＩＬＡＳＦＳＡＳＴ；
    ＡＰＫＥＩＩＦＬＥＧＥＴＬＦＧＤＤＴＶＩＥＶ；
    ＨＴＴＤＰＳＦＬＧＲＹＭＳＡＬＦＡＤＤＬＮＱＬＴＧＹＨＴＤＦＳＳＥＩＩＧＹＱＬＭＣＱＰＩＬＬＡＥＡＥＬＡＫＮＶＳＬＩＬＧＴＶＳＷＮＬ；
    ＴＴＤＰＳＦＬＧＲＹＭＳＡＬＦＡＤＤＬＮＱＬＴＧＹＨＴＤＦＳＳＥＩＩＧＹＱＬＭＣＱＰＩＬＬＡＥＡＥＬＡＫＮＶＳＬＩＬＧＴＶＳＷＮＬ；
    ＬＬＳＡＧＩＦＧＡＩＴＤＶＦＹＫＥＮＳＹＫＶＰＴＤＮＹＩＴＴＹ；及びそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項１に記載の組成物。
  16. 膜糖タンパク質（Ｍ）由来のエピトープ配列を含む前記配列が、以下の配列またはその断片：ＡＤＳＮＧＴＩＴＶＥＥＬＫＫＬＬＥＱＷＮＬＶＩＧＦＬＦＬＴＷＩＣＬＬＱＦＡＹＡＮＲＮＲＦＬＹＩＩＫＬＩＦＬＷＬＬＷＰＶＴＬＡＣＦＶＬＡＡＶＹＲＩＮＷＩＴＧＧＩＡＩＡＭＡＣＬＶＧＬＭＷＬＳＹＦＩＡＳＦＲＬＦＡＲＴＲＳＭＷＳＦＮＰＥＴＮＩＬＬＮＶＰＬＨＧＴＩＬＴＲＰＬＬＥＳＥＬＶＩＧＡＶＩＬＲＧＨＬＲＩＡＧＨＨＬＧＲＣＤＩＫＤＬＰＫＥＩＴＶＡＴＳＲＴＬＳＹＹＫＬＧＡＳＱＲＶＡＧＤＳＧＦＡＡＹＳＲＹＲＩＧＮＹＫＬＮＴＤＨＳＳＳＳＤＮＩＡＬＬＶＱ；
    ＦＡＹＡＮＲＮＲＦＬＹＩＩＫＬＩＦＬＷＬＬＷＰＶＴＬＡＣＦＶＬＡＡＶＹＲＩＮＷＩＴＧＧＩＡＩＡＭＡＣＬＶＧＬＭＷＬＳＹＦＩＡＳＦＲＬＦ；
    ＬＧＲＣＤＩＫＤＬＰＫＥＩＴＶＡＴＳＲＴＬＳＹＹＫＬＧＡＳＱＲＶＡ；
    ＫＬＬＥＱＷＮＬＶＩＧＦ；
    ＮＲＮＲＦＬＹＩＩＫＬＩＦＬＷＬＬＷＰＶＴＬＡＣＦＶＬＡＡＶＹ；
    ＳＥＬＶＩＧＡＶＩＬＲＧＨＬＲＩＡＧＨＨＬＧＲ；
    ＶＡＴＳＲＴＬＳＹＹＫＬＧＡＳＱＲＶ；
    ＧＬＭＷＬＳＹＦ；及びそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項１に記載の組成物。
  17. ヌクレオカプシドリンタンパク質（Ｎ）由来のエピトープ配列を含む前記配列が、以下の配列またはその断片：
    ＫＤＬＳＰＲＷＹＦＹＹＬＧＴＧＰＥＡＧＬＰＹＧＡＮＫＤＧＩＩＷＶＡＴＥＧＡＬＮＴＰＫＤＨＩｇＴＲＮＰＡＮＮＡＡＩＶＬＱＬＰＱＧＴＴＬＰＫＧＦＹＡＥＧＳＲＧＧＳＱＡＳＳＲＳＳＳＲＳＲＮＳＳＲＮＳＴＰＧＳＳＲＧＴＳＰＡＲＭＡＧＮＧＧＤＡＡＬＡＬＬＬＬＤＲＬＮＱＬＥＳＫＭＳＧＫＧＱＱＱＱＧＱＴＶＴＫＫＳＡＡＥＡＳＫＫＰＲＱＫＲＴＡＴＫＡＹＮＶＴＱＡＦＧＲＲＧＰＥＱＴＱＧＮＦＧＤＱＥＬＩＲＱＧＴＤＹＫＨＷＰＱＩＡＱＦＡＰＳＡＳＡＦＦＧＭＳＲＩＧＭＥＶＴＰＳＧＴＷＬＴＹＴＧＡＩＫＬＤＤＫＤＰＮＦＫＤＱＶＩＬＬＮＫＨＩＤＡＹＫＴＦＰＰＴＥＰＫＫＤＫＫＫＫＡＤＥＴＱＡＬＰＱＲＱＫＫＱＱＴＶＴＬＬＰＡＡＤＬＤＤＦＳＫＱＬＱＱＳＭＳＳＡＤＳＴＱＡ；
    ＲＭＡＧＮＧＧＤＡＡＬＡＬＬＬＬＤＲＬＮＱＬＥＳＫＭＳＧＫＧＱＱＱ；
    ＹＫＨＷＰＱＩＡＱＦＡＰＳＡＳＡＦＦＧＭＳＲＩＧＭＥＶＴＰＳＧＴＷＬＴＹＴＧＡＩＫＬＤＤＫＤＰＮＦＫＤＱＶＩＬＬＮＫＨＩＤＡＹＫＴＦＰ；
    ＳＰＡＲＭＡＧＮＧＧＤＡＡＬＡＬＬＬＬＤＲＬＮＱＬＥＳＫＭＳＧＫＧＱＱＱＱＧＱＴＶＴＫＫＳＡＡＥＡＳＫＫＰＲＱＫＲＴＡＴＫＡＹＮＶＴＱＡＦＧＲＲＧＰＥＱＴＱＧＮＦＧＤＱＥＬＩＲＱＧＴＤＹＫＨＷＰＱＩＡＱＦＡＰＳＡＳＡＦＦＧＭＳＲＩＧＭＥＶＴＰＳＧＴＷＬＴＹＴＧＡＩＫＬＤＤＫＤＰＮＦＫＤＱＶＩＬＬＮＫＨＩＤＡＹＫＴＦＰＰＴＥＰＫＫＤＫ及びその組み合わせから成る群から選択される、請求項１に記載の組成物。
  18. 前記ポリペプチドが１以上のリンカー配列を含む、請求項１に記載の組成物。
  19. 前記１以上のリンカー配列が、ＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧ、ＧＧＳＬＧＧＧＧＳＧから成る群から選択される、請求項１８に記載の組成物。
  20. 前記１以上のリンカー配列が切断配列を含む、請求項１８に記載の組成物。
  21. 前記１以上の切断配列がＦＲＡＣ、ＫＲＣＦ、ＫＫＲＹ、ＡＲＭＡ、ＲＲＳＧ、ＭＲＡＣ、ＫＭＣＧ、ＡＲＣＡ、ＫＫＱＧ、ＹＲＳＹ、ＳＦＭＮ、ＦＫＡＡ、ＫＲＮＧ、ＹＮＳＦ、ＫＫＮＧ、ＲＲＲＧ、ＫＲＹＳ及びＡＲＹＡから成る群から選択される、請求項２０に記載の組成物。
  22. 前記ポリペプチドが膜貫通ドメイン配列を含む、請求項１に記載の組成物。
  23. 前記膜貫通ドメイン配列が、ＯＲＦ１ａｂ由来のエピトープ配列を含む前記配列、膜糖タンパク質（Ｍ）由来のエピトープ配列を含む前記配列、及びヌクレオカプシドリンタンパク質（Ｎ）由来のエピトープ配列を含む前記配列に対してＣ末端にある、請求項２２に記載の組成物。
  24. 前記膜貫通ドメイン配列がＥＱＹＩＫＷＰＷＹＩＷＬＧＦＩＡＧＬＩＡＩＶＭＶＴＩＭＬＣＣＭＴＳＣＣＳＣＬＫＧＣＣＳＣＧＳＣＣＫＦＤＥＤＤＳＥＰＶＬＫＧＶＫＬＨＹＴである、請求項２２に記載の組成物。
  25. 前記ポリペプチドがＳＥＣ配列を含む、請求項１に記載の組成物。
  26. 前記ＳＥＣ配列が、ＯＲＦ１ａｂ由来のエピトープ配列を含む前記配列、膜糖タンパク質（Ｍ）由来のエピトープ配列を含む前記配列、及びヌクレオカプシドリンタンパク質（Ｎ）由来のエピトープ配列を含む前記配列に対してＮ末端にある、請求項２５に記載の組成物。
  27. 前記ＳＥＣ配列がＭＦＶＦＬＶＬＬＰＬＶＳＳＱＣＶＮＬＴである、請求項２５に記載の組成物。
  28. 前記組成物が前記ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載の組成物。
  29. 前記ポリヌクレオチドがｍＲＮＡである、請求項２８に記載の組成物。
  30. 前記ポリヌクレオチドが、ヒトにおける発現のためにコドン最適化配列を含む、請求項２８に記載の組成物。
  31. 前記ポリヌクレオチドがｄＥａｒＩ－ｈＡｇ配列を含む、請求項２８に記載の組成物。
  32. 前記ｄＥａｒＩ－ｈＡｇ配列がＡＴＴＣＴＴＣＴＧＧＴＣＣＣＣＡＣＡＧＡＣＴＣＡＧＡＧＡＧＡＡＣＣＣであり、任意で各ＴがＵである、請求項３１に記載の組成物。
  33. 前記ポリヌクレオチドがコザック配列を含む、請求項２８に記載の組成物。
  34. 前記コザック配列がＧＣＣＡＣＣである、請求項３３に記載の組成物。
  35. 前記ポリヌクレオチドがＦ要素配列を含む、請求項２８に記載の組成物。
  36. 前記Ｆ要素配列が、分割のアミノ末端エンハンサー（ＡＥＳ）の３ＵＴＲである、請求項３５に記載の組成物。
  37. 前記Ｆ要素配列が、ＣＴＧＧＴＡＣＴＧＣＡＴＧＣＡＣＧＣＡＡＴＧＣＴＡＧＣＴＧＣＣＣＣＴＴＴＣＣＣＧＴＣＣＴＧＧＧＴＡＣＣＣＣＧＡＧＴＣＴＣＣＣＣＣＧＡＣＣＴＣＧＧＧＴＣＣＣＡＧＧＴＡＴＧＣＴＣＣＣＡＣＣＴＣＣＡＣＣＴＧＣＣＣＣＡＣＴＣＡＣＣＡＣＣＴＣＴＧＣＴＡＧＴＴＣＣＡＧＡＣＡＣＣＴＣＣであり、任意で各ＴはＵである、請求項３５に記載の組成物。
  38. 前記ポリヌクレオチドがＩ要素配列を含む、請求項２８に記載の組成物。
  39. 前記Ｉ要素配列が、ミトコンドリアにコードされた１２Ｓ ｒＲＮＡ（ｍｔＲＮＲ１）の３’ＵＴＲである、請求項３８に記載の組成物。
  40. 前記Ｉ要素配列がＣＡＡＧＣＡＣＧＣＡＧＣＡＡＴＧＣＡＧＣＴＣＡＡＡＣＧＣＴＴＡＧＣＣＴＡＧＣＣＡＣＡＣＣＣＣＣＡＣＧＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＧＴＧＡＴＴＡＡＣＣＴＴＴＡＧＣＡＡＴＡＡＡＣＧＡＡＡＧＴＴＴＡＡＣＴＡＡＧＣＴＡＴＡＣＴＡＡＣＣＣＣＡＧＧＧＴＴＧＧＴＣＡＡＴＴＴＣＧＴＧＣＣＡＧＣＣＡＣＡＣＣであり、任意で各ＴはＵである、請求項３８記載の組成物。
  41. 前記ポリヌクレオチドがポリＡ配列を含む、請求項２８に記載の組成物。
  42. 前記ポリＡ配列がＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＡＴＡＴＧＡＣＴＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡであり、任意で各ＴはＵである、請求項４１に記載の組成物。
  43. 前記ＯＲＦ１ａｂ、前記膜糖タンパク質、及び前記ヌクレオカプシドリンタンパク質に由来する前記エピトープ配列のそれぞれが２０１９ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来である、請求項１に記載の組成物。
  44. １以上のエピトープまたは各エピトープがＴ細胞応答を誘発する、請求項１に記載の組成物。
  45. １以上のエピトープまたは各エピトープがＨＬＡ分子によって提示されるものとして質量分析によって観察されている、請求項１に記載の組成物。
  46. 前記組成物が、（ｉ）ＲＳ Ｃ１ｐ１ｆｕｌｌ、ＲＳ Ｃ２ｐ１ｆｕｌｌ、ＲＳ Ｃ３ｐ１ｆｕｌｌ、ＲＳ Ｃ４ｐ１ｆｕｌｌ、ＲＳ Ｃ５ｐ１、ＲＳ Ｃ５ｐ２、ＲＳ Ｃ５ｐ２ｆｕｌｌ、ＲＳ Ｃ６ｐ１、ＲＳ Ｃ６ｐ２、ＲＳ Ｃ６ｐ２ｆｕｌｌ、ＲＳ Ｃ７ｐ１、ＲＳ Ｃ７ｐ２、ＲＳ Ｃ７ｐ２ｆｕｌｌ、ＲＳ Ｃ８ｐ１、ＲＳ Ｃ８ｐ２、及びＲＳ Ｃ８ｐ２ｆｕｌｌから成る群から選択される配列に対する少なくとも７０％、８０％、９０％もしくは１００％の配列同一性を持つポリペプチド；（ｉｉ）ＲＳ Ｃ１ｐ１ｆｕｌｌ、ＲＳ Ｃ２ｐ１ｆｕｌｌ、ＲＳ Ｃ３ｐ１ｆｕｌｌ、ＲＳ Ｃ４ｐ１ｆｕｌｌ、ＲＳ Ｃ５ｐ１、ＲＳ Ｃ５ｐ２、ＲＳ Ｃ５ｐ２ｆｕｌｌ、ＲＳ Ｃ６ｐ１、ＲＳ Ｃ６ｐ２、ＲＳ Ｃ６ｐ２ｆｕｌｌ、ＲＳ Ｃ７ｐ１、ＲＳ Ｃ７ｐ２、ＲＳ Ｃ７ｐ２ｆｕｌｌ、ＲＳ Ｃ８ｐ１、ＲＳ Ｃ８ｐ２、及びＲＳ Ｃ８ｐ２ｆｕｌｌから成る群から選択される配列に対する少なくとも７０％、８０％、９０％もしくは１００％の配列同一性を持つポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または（ｉｉｉ）配列番号：ＲＳ Ｃ１ｎ１、ＲＳ Ｃ２ｎ１、ＲＳ Ｃ３ｎ１、ＲＳ Ｃ４ｎ１、ＲＳ Ｃ５ｎ１、ＲＳ Ｃ６ｎ１、ＲＳ Ｃ７ｎ１、ＲＳ Ｃ８ｎ１、ＲＳ Ｃ５ｎ２、ＲＳ Ｃ６ｎ２、ＲＳ Ｃ７ｎ２、ＲＳ Ｃ８ｎ２、ＲＳ Ｃ５ｎ２ｆｕｌｌ、ＲＳ Ｃ６ｎ２ｆｕｌｌ、ＲＳ Ｃ７ｎ２ｆｕｌｌ、及びＲＳ Ｃ８ｎ２ｆｕｌｌから成る群から選択される配列に対する少なくとも７０％、８０％、９０％もしくは１００％の配列同一性を持つポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載の組成物。
  47. 請求項１～４６のいずれか１項に記載の組成物を含む医薬組成物。
  48. 医薬組成物であって、
    （ｉ）表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２Ａｉ、表２Ａｉｉ、表２Ｂ及び／または表１６のエピトープ配列を含むポリペプチド；
    （ｉｉ）表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２Ａｉ、表２Ａｉｉ、表２Ｂ及び／または表１６のエピトープ配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
    （ｉｉｉ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）または前記ＴＣＲを含むＴ細胞であって、前記ＴＣＲが対応するＨＬＡクラスＩまたはクラスＩＩ分子と複合体を形成して前記エピトープ配列に結合する、前記ＴＣＲまたは前記ＴＣＲを含むＴ細胞；
    （ｉｖ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）を含む抗原提示細胞；または
    （ｖ）抗体または前記抗体を含むＢ細胞であって、前記抗体が前記エピトープ配列に結合する、前記抗体または前記抗体を含むＢ細胞と、
    薬学的に許容される賦形剤とを含む、前記医薬組成物。
  49. 前記エピトープ配列が、以下：ＹＬＦＤＥＳＧＥＦＫＬ、ＹＬＦＤＥＳＧＥＦ、ＦＧＤＤＴＶＩＥＶ、ＬＬＬＤＲＬＮＱＬ、ＱＬＭＣＱＰＩＬＬ、ＴＴＤＰＳＦＬＧＲＹ、ＰＴＤＮＹＩＴＴＹ、ＰＳＦＬＧＲＹ、ＡＥＡＥＬＡＫＮＶ、ＶＡＴＳＲＴＬＳＹ及びＫＴＩＱＰＲＶＥＫの１以上またはそれぞれを含む、請求項４８に記載の医薬組成物。
  50. 前記エピトープ配列が、以下：ＳＡＰＰＡＱＹＥＬ、ＡＶＡＳＫＩＬＧＬ、ＥＹＡＤＶＦＨＬＹ、ＤＥＦＴＰＦＤＶＶ、ＶＲＩＱＰＧＱＴＦ、ＳＦＲＬＦＡＲＴＲ、ＫＦＬＰＦＱＱＦ、ＶＶＱＥＧＶＬＴＡ、ＲＬＤＫＶＥＡＥＶ、ＦＧＡＤＰＩＨＳＬ、ＮＹＮＹＬＹＲＬＦ、ＫＹＩＫＷＰＷＹＩ、ＫＷＰＷＹＩＷＬＧＦ、ＬＰＦＮＤＧＶＹＦ、ＱＰＴＥＳＩＶＲＦ、ＩＰＦＡＭＱＭＡＹ、ＹＬＱＰＲＴＦＬＬ及びＲＬＱＳＬＱＴＹＶのうちの１以上またはそれぞれを含む、請求項４８に記載の医薬組成物。
  51. 前記エピトープ配列がｏｒｆ１ａｂタンパク質に由来する、請求項４８に記載の医薬組成物。
  52. 前記エピトープ配列がｏｒｆ１ａタンパク質に由来する、請求項４８に記載の医薬組成物。
  53. 前記エピトープ配列が表面糖タンパク質（Ｓ）またはそのシフトしたリーディングフレームに由来する、請求項４８に記載の医薬組成物。
  54. 前記エピトープ配列がヌクレオカプシドリンタンパク質（Ｎ）に由来する、請求項４８に記載の医薬組成物。
  55. 前記エピトープ配列がＯＲＦ３ａタンパク質に由来する、請求項４８に記載の医薬組成物。
  56. 前記エピトープ配列が膜糖タンパク質（Ｍ）に由来する、請求項４８に記載の医薬組成物。
  57. 前記エピトープ配列がＯＲＦ７ａタンパク質に由来する、請求項４８に記載の医薬組成物。
  58. 前記エピトープ配列がＯＲＦ８タンパク質に由来する、請求項４８に記載の医薬組成物。
  59. 前記エピトープ配列がエンベロープタンパク質（Ｅ）に由来する、請求項４８に記載の医薬組成物。
  60. 前記エピトープ配列がＯＲＦ６タンパク質に由来する、請求項４８に記載の医薬組成物。
  61. 前記エピトープ配列がＯＲＦ７ｂタンパク質に由来する、請求項４８に記載の医薬組成物。
  62. 前記エピトープ配列がＯＲＦ１０タンパク質に由来する、請求項４８に記載の医薬組成物。
  63. 前記エピトープ配列がＯＲＦ９ｂタンパク質に由来する、請求項４８に記載の医薬組成物。
  64. 医薬組成物であって、表１１の列２、表１２の列２もしくは表１５の列３に示されている配列のいずれか１つの配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％もしくは１００％の配列同一性を持つアミノ酸配列を有するポリペプチド；または表１１の列２、表１２の列２もしくは表１５の列３に示されている配列のいずれか１つの配列に対して少なくとも７０％、８０％、９０％もしくは１００％の配列同一性を持つアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを含む、前記医薬組成物。
  65. 前記医薬組成物が、ＲＳ Ｃ１ｐ１ｆｕｌｌ、ＲＳ Ｃ２ｐ１ｆｕｌｌ、ＲＳ Ｃ３ｐ１ｆｕｌｌ、ＲＳ Ｃ４ｐ１ｆｕｌｌ、ＲＳ Ｃ５ｐ１、ＲＳ Ｃ５ｐ２、ＲＳ Ｃ５ｐ２ｆｕｌｌ、ＲＳ Ｃ６ｐ１、ＲＳ Ｃ６ｐ２、ＲＳ Ｃ６ｐ２ｆｕｌｌ、ＲＳ Ｃ７ｐ１、ＲＳ Ｃ７ｐ２、ＲＳ Ｃ７ｐ２ｆｕｌｌ、ＲＳ Ｃ８ｐ１、ＲＳ Ｃ８ｐ２、及びＲＳ Ｃ８ｐ２ｆｕｌｌから成る群から選択される配列に対する少なくとも７０％、８０％、９０％もしくは１００％の配列同一性を持つポリペプチド；またはＲＳ Ｃ１ｐ１ｆｕｌｌ、ＲＳ Ｃ２ｐ１ｆｕｌｌ、ＲＳ Ｃ３ｐ１ｆｕｌｌ、ＲＳ Ｃ４ｐ１ｆｕｌｌ、ＲＳ Ｃ５ｐ１、ＲＳ Ｃ５ｐ２、ＲＳ Ｃ５ｐ２ｆｕｌｌ、ＲＳ Ｃ６ｐ１、ＲＳ Ｃ６ｐ２、ＲＳ Ｃ６ｐ２ｆｕｌｌ、ＲＳ Ｃ７ｐ１、ＲＳ Ｃ７ｐ２、ＲＳ Ｃ７ｐ２ｆｕｌｌ、ＲＳ Ｃ８ｐ１、ＲＳ Ｃ８ｐ２、及びＲＳ Ｃ８ｐ２ｆｕｌｌから成る群から選択される配列に対する少なくとも７０％、８０％、９０％もしくは１００％の配列同一性を持つポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項６４に記載の医薬組成物。
  66. 前記医薬組成物が、配列番号：ＲＳ Ｃ１ｎ１、ＲＳ Ｃ２ｎ１、ＲＳ Ｃ３ｎ１、ＲＳ Ｃ４ｎ１、ＲＳ Ｃ５ｎ１、ＲＳ Ｃ６ｎ１、ＲＳ Ｃ７ｎ１、ＲＳ Ｃ８ｎ１、ＲＳ Ｃ５ｎ２、ＲＳ Ｃ６ｎ２、ＲＳ Ｃ７ｎ２、ＲＳ Ｃ８ｎ２、ＲＳ Ｃ５ｎ２ｆｕｌｌ、ＲＳ Ｃ６ｎ２ｆｕｌｌ、ＲＳ Ｃ７ｎ２ｆｕｌｌ及びＲＳ Ｃ８ｎ２ｆｕｌｌから成る群から選択される配列に対する少なくとも７０％、８０％、９０％または１００％の配列同一性を持つポリヌクレオチドを含む、請求６４に記載の医薬組成物。
  67. 前記ポリヌクレオチドがｍＲＮＡである、請求項４７、４８または６４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  68. １以上の脂質成分をさらに含む、請求項４７、４８または６４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  69. 前記１以上の脂質が脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含む、請求項６８に記載の医薬組成物。
  70. 前記ＬＮＰが前記組換えポリヌクレオチド構築物をカプセル化する、請求項６９に記載の医薬組成物。
  71. 前記ポリペプチドが合成である、請求項４７、４８または６４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  72. 前記ポリペプチドが組換えである、請求項４７、４８または６４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  73. 前記ポリペプチドが長さ８～１０００のアミノ酸である、請求項４７、４８または６４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  74. 前記エピトープ配列が、１０００ｎＭ以下のＫＤでＨＬＡクラスＩまたはクラスＩＩ分子に結合する、または結合すると予測される、請求項４７、４８または６４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  75. 前記エピトープ配列が、５００ｎＭ以下のＫＤでＨＬＡクラスＩまたはクラスＩＩ分子に結合する、または結合すると予測される、請求項４７、４８または６４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  76. 前記エピトープ配列が、対象のウイルス感染細胞によって発現されるウイルスタンパク質の配列を含む、請求項４７、４８または６４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  77. 前記ウイルスが２０１９ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２である、請求項７６に記載の医薬組成物。
  78. ウイルスによる感染症を治療もしくは予防する方法、またはウイルスによる感染症に関連する呼吸器の疾患もしくは状態を治療する方法であって、それを必要とする対象に請求項４７、４８または６４のいずれか１項に記載の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
  79. 前記ウイルスがコロナウイルスである、請求項７８に記載の方法。
  80. 前記ウイルスが２０１９ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２である、請求項７８に記載の方法。
  81. 前記対象によって発現されるＨＬＡ分子が投与時に未知である、実施形態７８の方法。
  82. 前記対象の免疫系による認識の回避を避けるウイルスの能力が、請求項４７、４８または６４のいずれか１項に記載の医薬組成物における単一のタンパク質由来のエピトープまたは前記医薬組成物よりも少ないタンパク質由来のエピトープを含有する医薬組成物を投与された対象の免疫系による認識の回避を避けるウイルスの能力と比べて低い、、請求項７８に記載の方法。
  83. 前記対象が、表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２Ａｉまたは表２Ａｉｉ、表２Ｂまたは表１６のいずれか１つのＨＬＡ対立遺伝子によってコードされるＨＬＡ分子を発現し、前記エピトープ配列はＨＬＡ対立遺伝子が一致するエピトープ配列である、請求項７８に記載の方法。
  84. 前記エピトープ配列が以下：ＳＡＰＰＡＱＹＥＬ、ＡＶＡＳＫＩＬＧＬ、ＥＹＡＤＶＦＨＬＹ、ＤＥＦＴＰＦＤＶＶ、ＶＲＩＱＰＧＱＴＦ、ＳＦＲＬＦＡＲＴＲ、ＫＦＬＰＦＱＱＦ、ＶＶＱＥＧＶＬＴＡ、ＲＬＤＫＶＥＡＥＶ及びＦＧＡＤＰＩＨＳＬのうちの１以上またはそれぞれを含む、請求項７８に記載の方法。
  85. ２０１９ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２の感染症の治療または予防をそれを必要とする対象において行う方法であって、請求項４７、４８または６４のいずれか１項に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法。
  86. 前記医薬組成物が、前記対象にて前記２０１９ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ウイルス感染のための１以上の治療薬に加えて投与される、請求項８５に記載の方法。
  87. 前記医薬組成物が、（ａ）２０１９ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２スパイクタンパク質もしくはその断片のアミノ酸配列を有するポリペプチド；（ｂ）２０１９ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２スパイクタンパク質もしくはその断片をコードする組換えポリヌクレオチド；または（ａ）もしくは（ｂ）を含む２０１９ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２スパイクタンパク質医薬組成物と併用して投与される、請求項８５に記載の方法。
  88. 前記２０１９ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２スパイクタンパク質またはその断片がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質またはその断片である、請求項８５に記載の方法。
  89. 前記医薬組成物が、前記２０１９ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２スパイクタンパク質医薬組成物の最初の投与の１～１０週間後に投与される、請求項８５に記載の方法。
  90. 前記医薬組成物が、前記２０１９ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２スパイクタンパク質医薬組成物の最初の投与の１～６週後、１～６ヵ月後または１～２年後またはそれ以降に投与される、請求項８５に記載の方法。
  91. 前記医薬組成物が、前記２０１９ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２スパイクタンパク質医薬組成物の投与と同じ日に、または同時に投与される、請求項８５に記載の方法。
  92. 前記医薬組成物が、２０１９ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２スパイクタンパク質もしくはその断片のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または２０１９ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２スパイクタンパク質もしくはその断片をコードする組換えポリヌクレオチドとともに共製剤化される、請求項９１に記載の方法。
  93. 前記医薬組成物が、前記２０１９ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２スパイクタンパク質医薬組成物の投与の２～１０週前のような、前記２０１９ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２スパイクタンパク質医薬組成物の投与前に投与される、請求項８５に記載の方法。
  94. 前記組成物が予防的に投与される、請求項８５に記載の方法。
  95. 前記医薬組成物が、１、２、３、４、５、６週ごとにもしくはそれ以上の週ごとに１回、または１～７日、７～１４日、１４～２１日、２１～２８日、もしくは２８～３５日ごとに１回、または２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、もしくは３５日ごとに１回投与される、請求項８５に記載の方法。
  96. ２０１９ ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ウイルスによって引き起こされる呼吸器ウイルス感染症を治療または予防するために治療薬を調製するための、請求項１～４６のいずれか１項に記載の組成物の使用。
  97. 薬物として使用するための、請求項１～４６のいずれか１項に記載の組成物、または請求項４７、４８及び６４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  98. ２０１９ ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ウイルスによって引き起こされる呼吸器ウイルス感染症の治療または予防に使用するための、請求項１～４６のいずれか１項に記載の組成物、または請求項４７、４８及び６４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
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