JP2023517992A - ゲノム配列変異を有する細胞死滅誘導用組成物及び該組成物を用いた細胞死滅誘導方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、ゲノム配列変異を有する細胞（ｃｅｌｌｓ ｈａｖｉｎｇ ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）内のゲノム配列変異を有する細胞特異的変異領域配列のうち、正常細胞には存在しない固有の配列を含む複数個の核酸配列を特異的に認識する複数個の切断因子又はこれをコードするポリヌクレオチド、及び核酸切断酵素又はこれをコードするポリヌクレオチドを含む一つ以上の伝達手段、前記伝達手段を含む組成物及び前記伝達手段又は組成物を用いたゲノム配列変異を有する細胞の死滅誘導方法に関する。【選択図】 図１

Description

本発明は、ゲノム配列変異を有する細胞（ｃｅｌｌｓ ｈａｖｉｎｇ ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）内の細胞特異的変異領域配列のうち、正常細胞には存在しない固有の配列を含む複数個の核酸配列を特異的に認識する複数個の切断因子又はこれをコードするポリヌクレオチド、及び核酸切断酵素又はこれをコードするポリヌクレオチドを含む一つ以上の伝達手段、該伝達手段を含む組成物及び前記伝達手段又は組成物を用いたゲノム配列変異を有する細胞の死滅誘導方法に関する。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓは、ＲＮＡガイドを通じた遺伝子校正道具であって、バクテリア誘導エンドヌクレアーゼＣａｓ９（又は突然変異ニッカーゼ）及びガイドＲＮＡを使用し、ガイドＲＮＡとゲノムＤＮＡとの間の配列をマッチングさせ、ゲノム内の特定位置に二重（又は単一）鎖切断を導入することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介遺伝子ノックアウトは、ＲＮＡ干渉媒介遺伝子ノックダウン（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ）よりさらに効率的であると予想され、遺伝子機能を研究するための有用な実験道具を提供している。
哺乳動物細胞においてＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムが作動し得るという各研究が報告されており、微生物の適応免疫から始まった遺伝子編集技術は、Ｃａｓ９（ＣＲＩＳＰＲ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ９：ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ＤＮＡ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｅｎｚｙｍｅ）及びガイドＲＮＡ（ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ、ｇＲＮＡ）を含む。ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ）及びｔｒａｃｒＲＮＡ（ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｃｒＲＮＡ）を含み、Ｃａｓ９に結合し、ターゲット配列に対する塩基対合を通じて目的とするゲノム配列に案内し、二重鎖切断（Ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋ、ＤＳＢ）が生成される。
生命体は、生きていく過程で様々な形態の細胞分裂をし、このような細胞分裂は、多様な方式で修理（ｒｅｐａｉｒ）する過程を経てゲノム配列を可能な限り同一に維持させているが、状況によってゲノム配列に変異が発生している。このようにゲノム配列に変異が発生した各細胞は、生命体の生存を脅かしたり、良くない影響を及ぼすようになる。このようなゲノム配列変異のうち、最も深刻に台頭しているものが癌である。
癌は、変異の蓄積によって発生し、これは、生殖細胞を通じて遺伝されたり、細胞週期の間に体細胞内で獲得される。このような腫瘍遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、ＤＮＡ復旧遺伝子の変化により、細胞が成長及び調節メカニズムから逸脱し、癌を発生させることもある。
一方、ゲノム配列変異を有する細胞によって由来する代表的な疾患である癌を治療するために、多様な抗癌剤が持続的に開発されている。抗癌剤は、１９７０年代から始まった１世代化学抗癌剤、２０００年代から台頭した２世代標的抗癌剤、及び２０１０年代から適用された３世代免疫抗癌剤として開発されてきた（Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ．５（１）：６５－７２．）。
１世代化学抗癌剤は、パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）などのような抗癌化合物であって、正常細胞に比べて分裂速度の速い癌細胞を攻撃する。ただし、癌細胞のみならず、正常細胞も攻撃することによって患者の免疫体系を破壊し、強い毒性によって脱毛、嘔吐、食欲低下、疲労感、深刻な体力低下などの各種副作用が発生するという問題があった（Ｃｒｉｔｉｃａｌ ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ ｏｎｃｏｌｏｇｙ／ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ８９（１）：４３－６１．及びＣｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌｕｍｅ ２０，Ｉｓｓｕｅ ５，２３ Ｍａｙ ２０１３，Ｐａｇｅｓ ６４８－６５９）。
これを解決するために、特定の変異による腫瘍細胞のみを識別して攻撃する標的抗癌剤、例えば、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）又はイマチニブ（ｉｍａｔｉｎｉｂ）などが癌治療剤として台頭した。これらは、脱毛、嘔吐などの副作用が少なく、治療剤反応率が高いことが確認されるが、癌を誘発する特定の変異を有する患者にのみ使用可能であるので、多様な癌治療が不可能であり、標的抗癌治療剤に対する耐性が発生するという問題があった（Ａｄｖ Ｐｈａｒｍ Ｂｕｌｌ．２０１７ Ｓｅｐ；７（３）：３３９－３４８．）。
近年、腫瘍自体を攻撃する他の抗癌剤と異なり、イピリムマブ（Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）又はチサゲンレクロイセル（Ｔｉｓａｇｅｎｌｅｃｌｅｕｃａｌ）などのように、免疫細胞活性化を通じて腫瘍細胞を攻撃して除去する免疫抗癌剤が注目されている（Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ．２０１９ Ｆｅｂ；２１（２）：２２４－２３３）。このような免疫抗癌剤は、副作用が少なく、治療反応を示す患者において薬効が長期間維持され得る。ただし、これは、反応率が約２０％～３０％程度であるので特定の患者にのみ効果があり、免疫関門抑制剤の耐性問題が台頭しており、免疫細胞治療剤などでは、サイトカイン分泌シンドローム及び神経毒性の副作用などが発生し得ることが知られている（Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．２０１８ Ｎｏｖ ２８；１７（１２）：８５４－８５５）。
このように多数の抗癌剤が治療に使用されているにもかかわらず、目的とする抗癌効果が十分に達成できないか、抗癌剤の適用時に伴われる副作用があるので、依然として新しい癌治療技術の開発及び適用が必要な実情にある。
新しい癌治療技術の一つとして、癌では、正常細胞で発見されない新しいＤＮＡ配列が挿入されたり（Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ：ＩＮ）、正常細胞のＤＮＡの一部が欠失する（Ｄｅｌｅｔｉｏｎ：Ｄｅｌ）現象が多数観察されるが、このような癌細胞ＤＮＡに表れる特異的挿入又は欠失ＤＮＡ（ＩＮＤＥＬ）は、正常細胞に存在しないＤＮＡ配列であるので、これらを正常細胞と癌細胞の差別的攻撃ターゲットとして設定すると癌を治療することができる。
ＤＮＡ二重鎖切断は、細胞水準で最も深刻な損傷の一つであって、損傷したＤＮＡは、非相同末端連結（ｎｏｎ－ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｅｎｄ ｊｏｉｎｉｎｇ）、相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）によって復旧されるが、復旧されていないＤＮＡは、遺伝情報の損傷又は再配列を起こし、細胞死（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）が誘導され得る。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを人間の癌治療に適用できることが報告されている（Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１６ Ｍａｒ １５；７（１１）：１２３０５－１７）。しかし、これは、癌の誘発と相関性のある変異に基づいて、ゲノムのうち一つ以上を修正又は切除することにより、癌に対する強力な治療を提供する可能性を高めることができることを提示するものに過ぎない。
これと関連して、米国特許公開第２０１７／０１１４４１３号には、癌特異的配列変異をターゲットとするガイドＲＮＡを適用したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが提案されている。癌特異的配列変異は、単一ターゲットの癌特異的ＤＮＡのＣＮＶ（ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を対象とし得ることが記載されている。これは、特定の基準以上のＣＮＶを示す癌をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを適用することによって治療できる技術であって、治療可能な癌の種類が極めて制限的である。
韓国登録特許第２０２３５７７号には、癌細胞に特異的に存在する遺伝子複製数変異（ＣＮＶ）が少なくとも７である遺伝子に相補的に結合するポリヌクレオチド、及びＣａｓ９とエキソヌクレアーゼであるＲｅｃＪとが結合された融合タンパク質を用いた腫瘍細胞殺害用組成物が記載されている。本発明によると、Ｃａｓ９以外に、エキソヌクレアーゼであるＥｘｏＩを使用し、複数のガイドＲＮＡの数を最小化することによって目的とする癌治療効果を示すことができる。しかし、ＲｅｃＪをエキソヌクレアーゼとして使用する場合、目的とする程度に投与されるガイドＲＮＡの数を減少又は最小化できなかった。
このような技術的背景の下で、本出願の発明者等は、ゲノム配列変異を有する細胞で複数の変異領域を特異的に認識する複数個の切断因子を用いて、複数の変異領域にＤＳＢ（ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋ）を誘導することによって、ゲノム配列変異を有する細胞が死滅し得ることを確認し、本発明を完成するに至った。
本発明の目的は、核酸切断酵素又はこれをコードするポリヌクレオチド、及びゲノム配列変異を有する細胞内の複数の変異領域のそれぞれを特異的に認識する複数個の切断因子又はこれをコードするポリヌクレオチドを含むゲノム配列変異を有する細胞死滅誘導用組成物を提供することにある。
本発明の目的は、核酸切断酵素をコードするポリヌクレオチド、及びゲノム配列変異を有する細胞内の複数の変異領域のそれぞれを特異的に認識する複数個の切断因子又はこれをコードするポリヌクレオチドを含むゲノム配列変異を有する細胞死滅誘導用ベクターを提供することにある。
本発明の目的は、核酸切断酵素及びゲノム配列変異を有する細胞内の複数の変異領域のそれぞれを特異的に認識する複数個の切断因子又はこれをコードするポリヌクレオチドを含むゲノム配列変異を有する細胞死滅誘導用リボ核酸タンパク質（Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ、ＲＮＰ）複合体を提供することにある。
本発明の目的は、核酸切断酵素又はこれをコードするポリヌクレオチド、及びゲノム配列変異を有する細胞内の複数の変異領域のそれぞれを特異的に認識する複数個の切断因子又はこれをコードするポリヌクレオチドを含むゲノム配列変異を有する細胞死滅誘導用キャリアを提供することにある。
本発明の目的は、核酸切断酵素又はこれをコードするポリヌクレオチド、及びゲノム配列変異を有する細胞内の複数の変異領域のそれぞれを特異的に認識する複数個の切断因子又はこれをコードするポリヌクレオチドを含むゲノム配列変異を有する細胞死滅誘導用エクソソームを提供することにある。
本発明の目的は、前記ベクターを含むゲノム配列変異を有する細胞死滅誘導用組成物を提供することにある。
本発明の目的は、前記リボ核酸タンパク質（Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ、ＲＮＰ）複合体を含むゲノム配列変異を有する細胞死滅誘導用組成物を提供することにある。
本発明の目的は、前記キャリアを含むゲノム配列変異を有する細胞死滅誘導用組成物を提供することにある。
本発明の目的は、前記エクソソームを含むゲノム配列変異を有する細胞死滅誘導用組成物を提供することにある。
本発明の目的は、前記エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼＩが融合された核酸切断酵素又はこれをコードするポリヌクレオチド、及びゲノム配列変異を有する細胞内の複数の変異領域のそれぞれを特異的に認識する複数個の切断因子又はこれをコードするポリヌクレオチドを含むゲノム配列変異を有する細胞死滅誘導用組成物を提供することにある。
本発明の目的は、前記エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼＩが融合された核酸切断酵素をコードするポリヌクレオチド、及びゲノム配列変異を有する細胞内の複数の変異領域のそれぞれを特異的に認識する複数個の切断因子又はこれをコードするポリヌクレオチドを含むゲノム配列変異を有する細胞死滅誘導用ベクターを提供することにある。
本発明の目的は、前記エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼＩが融合された核酸切断酵素、及びゲノム配列変異を有する細胞内の複数の変異領域のそれぞれを特異的に認識する複数個の切断因子又はこれをコードするポリヌクレオチドを含むゲノム配列変異を有する細胞死滅誘導用リボ核酸タンパク質（Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ、ＲＮＰ）複合体を提供することにある。
本発明の目的は、前記エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼＩが融合された核酸切断酵素又はこれをコードするポリヌクレオチド、及びゲノム配列変異を有する細胞内の複数の変異領域のそれぞれを特異的に認識する複数個の切断因子又はこれをコードするポリヌクレオチドを含むゲノム配列変異を有する細胞死滅誘導用キャリアを提供することにある。
本発明の目的は、前記エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼＩが融合された核酸切断酵素又はこれをコードするポリヌクレオチド、及びゲノム配列変異を有する細胞内の複数の変異領域のそれぞれを特異的に認識する複数個の切断因子又はこれをコードするポリヌクレオチドを含むゲノム配列変異を有する細胞死滅誘導用エクソソームを提供することにある。
本発明の目的は、前記ベクターを含むゲノム配列変異を有する細胞死滅誘導用組成物を提供することにある。
本発明の目的は、前記リボ核酸タンパク質（Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ、ＲＮＰ）複合体を含むゲノム配列変異を有する細胞死滅誘導用組成物を提供することにある。
本発明の目的は、前記キャリアを含むゲノム配列変異を有する細胞死滅誘導用組成物を提供することにある。
本発明の目的は、前記エクソソームを含むゲノム配列変異を有する細胞死滅誘導用組成物を提供することにある。
本発明の目的は、前記ゲノム配列変異を有する細胞死滅誘導用組成物、ベクター、リボ核酸タンパク質複合体、キャリア又はエクソソームを提供する段階を含むゲノム配列変異を有する細胞死滅誘導方法を提供することにある。
前記目的を達成するために、本発明は、（ｉ）核酸切断酵素又はこれをコードするポリヌクレオチド；及び（ｉｉ）ゲノム配列変異（ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を有する細胞において、前記ゲノム配列変異を有する４個以上の細胞特異的変異領域をそれぞれ認識する切断因子又はこれをコードするポリヌクレオチドを含むゲノム配列変異を有する細胞の死滅誘導用組成物を提供する。
本発明は、（ｉ）核酸切断酵素又はこれをコードするポリヌクレオチド；及び（ｉｉ）ゲノム配列変異（ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を有する細胞において、前記ゲノム配列変異を有する４個以上の細胞特異的変異領域をそれぞれ認識する切断因子又はこれをコードするポリヌクレオチドを個体に処理するゲノム配列変異を有する細胞死滅誘導方法に関する。
また、本発明は、（ｉ）核酸切断酵素をコードするポリヌクレオチド；及び（ｉｉ）ゲノム配列変異（ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を有する細胞において、前記ゲノム配列変異を有する４個以上の細胞特異的変異領域をそれぞれ認識する切断因子又はこれをコードするポリヌクレオチドを含むゲノム配列変異を有する細胞死滅誘導用ベクターを提供する。
また、本発明は、（ｉ）核酸切断酵素；及び（ｉｉ）ゲノム配列変異（ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を有する細胞において、前記ゲノム配列変異を有する４個以上の細胞特異的変異領域をそれぞれ認識する切断因子又はこれをコードするポリヌクレオチドを含む、ゲノム配列変異を有する細胞死滅誘導用リボ核酸タンパク質複合体を提供する。
また、本発明は、（ｉ）核酸切断酵素又はこれをコードするポリヌクレオチド；（ｉｉ）ゲノム配列変異（ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を有する細胞において、前記ゲノム配列変異を有する４個以上の細胞特異的変異領域をそれぞれ認識する切断因子又はこれをコードするポリヌクレオチドを含む、ゲノム配列変異を有する細胞死滅誘導用キャリアを提供する。
また、本発明は、（ｉ）核酸切断酵素又はこれをコードするポリヌクレオチド；（ｉｉ）ゲノム配列変異（ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を有する細胞において、前記ゲノム配列変異を有する４個以上の細胞特異的変異領域をそれぞれ認識する切断因子又はこれをコードするポリヌクレオチドを含む、ゲノム配列変異を有する細胞死滅誘導用エクソソームを提供する。
また、本発明は、（ｉ）核酸切断酵素をコードするポリヌクレオチド；及び（ｉｉ）ゲノム配列変異（ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を有する細胞において、前記ゲノム配列変異を有する４個以上の細胞特異的変異領域をそれぞれ認識する切断因子又はこれをコードするポリヌクレオチドを含み、前記（ｉ）及び（ｉｉ）が同一又は異なるベクターに含まれる、ゲノム配列変異を有する細胞死滅誘導用組成物を提供する。
また、本発明は、（ｉ）核酸切断酵素又はこれをコードするポリヌクレオチド；及び（ｉｉ）ゲノム配列変異（ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を有する細胞において、前記ゲノム配列変異を有する４個以上の細胞特異的変異領域をそれぞれ認識する切断因子又はこれをコードするポリヌクレオチドを含み、前記（ｉｉ）がベクターに含まれる、ゲノム配列変異を有する細胞死滅誘導用組成物を提供する。
また、本発明は、（ｉ）核酸切断酵素；及び（ｉｉ）ゲノム配列変異（ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を有する細胞において、前記ゲノム配列変異を有する４個以上の細胞特異的変異領域をそれぞれ認識する切断因子又はこれをコードするポリヌクレオチドを含有し、前記（ｉ）及び（ｉｉ）がリボ核酸タンパク質複合体を形成する、ゲノム配列変異を有する細胞死滅誘導用組成物を提供する。
また、本発明は、（ｉ）核酸切断酵素又はこれをコードするポリヌクレオチド；（ｉｉ）ゲノム配列変異（ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を有する細胞において、前記ゲノム配列変異を有する４個以上の細胞特異的変異領域をそれぞれ認識する切断因子又はこれをコードするポリヌクレオチドを含有し、前記（ｉ）及び（ｉｉ）がキャリアに含まれる、ゲノム配列変異を有する細胞死滅誘導用組成物を提供する。
また、本発明は、（ｉ）核酸切断酵素又はこれをコードするポリヌクレオチド；（ｉｉ）ゲノム配列変異（ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を有する細胞において、前記ゲノム配列変異を有する４個以上の細胞特異的変異領域をそれぞれ認識する切断因子又はこれをコードするポリヌクレオチドを含む、エクソソームを含むゲノム配列変異を有する細胞死滅誘導用組成物を提供する。
また、本発明は、（ｉ）核酸切断酵素又はこれをコードするポリヌクレオチド；（ｉｉ）ゲノム配列変異（ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を有する細胞において、前記ゲノム配列変異を有する４個以上の細胞特異的変異領域をそれぞれ認識する切断因子又はこれをコードするポリヌクレオチドを含む、患者に合わせたオーダーメード型疾病治療用組成物を提供する。
また、本発明は、（ｉ）エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼＩが融合された核酸切断酵素又はこれをコードするポリヌクレオチド；及び（ｉｉ）ゲノム配列変異（ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を有する細胞において、前記ゲノム配列変異を有する２個以上の細胞特異的変異領域をそれぞれ認識する切断因子又はこれをコードするポリヌクレオチドを含むゲノム配列変異を有する細胞死滅誘導用組成物を提供する。また、本発明は、（ｉ）エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼＩが融合された核酸切断酵素又はこれをコードするポリヌクレオチド；及び（ｉｉ）ゲノム配列変異（ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を有する細胞において、前記ゲノム配列変異を有する２個以上の細胞特異的変異領域をそれぞれ認識する切断因子又はこれをコードするポリヌクレオチドを個体に処理する段階を含むゲノム配列変異を有する細胞死滅誘導方法を提供する。
また、本発明は、（ｉ）エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼＩが融合された核酸切断酵素をコードするポリヌクレオチド；及び（ｉｉ）ゲノム配列変異（ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を有する細胞において、前記ゲノム配列変異を有する２個以上の細胞特異的変異領域をそれぞれ認識する切断因子又はこれをコードするポリヌクレオチドを含むゲノム配列変異を有する細胞死滅誘導用ベクターを提供する。
また、本発明は、（ｉ）エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼＩが融合された核酸切断酵素；及び（ｉｉ）ゲノム配列変異（ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を有する細胞において、前記ゲノム配列変異を有する２個以上の細胞特異的変異領域をそれぞれ認識する切断因子又はこれをコードするポリヌクレオチドを含む、ゲノム配列変異を有する細胞死滅誘導用リボ核酸タンパク質複合体を提供する。
また、本発明は、（ｉ）エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼＩが融合された核酸切断酵素又はこれをコードするポリヌクレオチド；（ｉｉ）ゲノム配列変異（ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を有する細胞において、前記ゲノム配列変異を有する２個以上の細胞特異的変異領域をそれぞれ認識する切断因子又はこれをコードするポリヌクレオチドを含む、ゲノム配列変異を有する細胞死滅誘導用キャリアを提供する。
また、本発明は、（ｉ）エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼＩが融合された核酸切断酵素又はこれをコードするポリヌクレオチド；（ｉｉ）ゲノム配列変異（ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を有する細胞において、前記ゲノム配列変異を有する２個以上の細胞特異的変異領域をそれぞれ認識する切断因子又はこれをコードするポリヌクレオチドを含む、ゲノム配列変異を有する細胞死滅誘導用エクソソームを提供する。
また、本発明は、（ｉ）エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼＩが融合された核酸切断酵素をコードするポリヌクレオチド；及び（ｉｉ）ゲノム配列変異（ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を有する細胞において、前記ゲノム配列変異を有する２個以上の細胞特異的変異領域をそれぞれ認識する切断因子又はこれをコードするポリヌクレオチドを含み、前記（ｉ）及び（ｉｉ）が同一又は異なるベクターに含まれる、ゲノム配列変異を有する細胞死滅誘導用組成物を提供する。
また、本発明は、（ｉ）エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼＩが融合された核酸切断酵素又はこれをコードするポリヌクレオチド；及び（ｉｉ）ゲノム配列変異（ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を有する細胞において、前記ゲノム配列変異を有する２個以上の細胞特異的変異領域をそれぞれ認識する切断因子又はこれをコードするポリヌクレオチドを含み、前記（ｉｉ）がベクターに含まれる、ゲノム配列変異を有する細胞死滅誘導用組成物を提供する。
また、本発明は、（ｉ）エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼＩが融合された核酸切断酵素；及び（ｉｉ）ゲノム配列変異（ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を有する細胞において、前記ゲノム配列変異を有する２個以上の細胞特異的変異領域をそれぞれ認識する切断因子又はこれをコードするポリヌクレオチドを含有し、前記（ｉ）及び（ｉｉ）がリボ核酸タンパク質複合体を形成する、ゲノム配列変異を有する細胞死滅誘導用組成物を提供する。
また、本発明は、（ｉ）エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼＩが融合された核酸切断酵素又はこれをコードするポリヌクレオチド；（ｉｉ）ゲノム配列変異（ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を有する細胞において、前記ゲノム配列変異を有する２個以上の細胞特異的変異領域をそれぞれ認識する切断因子又はこれをコードするポリヌクレオチドを含有し、前記（ｉ）及び（ｉｉ）がキャリアに含まれる、ゲノム配列変異を有する細胞死滅誘導用組成物を提供する。
また、本発明は、（ｉ）エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼＩが融合された核酸切断酵素又はこれをコードするポリヌクレオチド；（ｉｉ）ゲノム配列変異（ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を有する細胞において、前記ゲノム配列変異を有する２個以上の細胞特異的変異領域をそれぞれ認識する切断因子又はこれをコードするポリヌクレオチドを含有し、前記（ｉ）及び（ｉｉ）がエクソソームに含まれる、ゲノム配列変異を有する細胞死滅誘導用組成物を提供する。
また、本発明は、（ｉ）エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼＩが融合された核酸切断酵素又はこれをコードするポリヌクレオチド；及び（ｉｉ）ゲノム配列変異（ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を有する細胞において、前記ゲノム配列変異を有する２個以上の細胞特異的変異領域をそれぞれ認識する切断因子又はこれをコードするポリヌクレオチドを含む患者に合わせたオーダーメード型疾病治療用組成物を提供する。
ＣＩＮＤＥＬＡが癌細胞で選択的な細胞死滅を誘導することを示す結果である。（Ａ）ＣＩＮＤＥＬＡ（癌特異的ＩＮＤＥＬｓ攻撃者）模式図である。（Ｂ）同時多発的な複数のＤＮＡ ＤＳＢ（制限酵素ＡｓｉＳＩで生成される）は、骨肉腫細胞（Ｕ２ＯＳ）で細胞死滅を誘導する。（Ｃ）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９に起因したＤＳＢは細胞死滅を誘導する。１から１０４以上の多くのサイトを対象とするｓｇＲＮＡをテストし、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の生存率を測定する。（Ｄ）ＳｐＣａｓ９ ＲＮＰ複合体によるＣＩＮＤＥＬＡによって誘導された癌細胞を死滅する。スケールバーは３００μｍである。Ｐ－値は、対応のない両側ｔ検定（ｕｎｐａｉｒｅｄ ｔｗｏ－ｓｉｄｅｄ ｔ－ｔｅｓｔ）を使用して計算する。
ＲＮＰ複合体によって伝達されるＣＩＮＤＥＬＡ ｇＲＮＡによって誘導された同時多発的なＤＮＡ ＤＳＢによる細胞死滅の段階的な増加を示す結果である。ＨＣＴ１１６に対する細胞特異的なＩｎＤｅｌｓをターゲットとする１８個のｇＲＮＡをＡＴＴＯ標識された追跡ＲＮＡで処理する。ＡＴＴＯ信号（赤色）を感知し、ＲＮＰ複合体が成功的に伝達されたことを確認する。誘導されたＤＮＡ ＤＳＢの効果を確認するために、特定の領域で生きている細胞を定量化する。６個（Ａ－Ｃ）１２個、（Ｄ－Ｆ）１８個、（Ｇ）ｇＲＮＡ及び追跡ＲＮＡをＳｐＣａｓ９と共にＨＣＴ１１６細胞に伝達する。（Ｈ）ＳｐＣａｓ９のみをＨＣＴ１１６細胞に伝達する。（Ｉ）細胞の生存度は、それぞれの表示されたＣＩＮＤＥＬＡ処理で定量化する。
ＡＡＶ由来のＣＲＩＳＰＲ／ＳａＣａｓ９を含むＣＩＮＤＥＬＡに対する結果である。（Ａ）ＳａＣａｓ９及びｓｇＲＮＡ発現プラスミドの形質感染を伴うＣＩＮＤＥＬＡはＵ２ＯＳ細胞を死滅する。３０個の非特異的ｓｇＲＮＡを発現する細胞（ＨＣＴ１１６特異的ＩｎＤｅｌｓをターゲットとするｓｇＲＮＡ）に比べて、Ｕ２ＯＳ ＩｎＤｅｌｓに特異的なＣＩＮＤＥＬＡ ｓｇＲＮＡ発現細胞は、増加した死滅を示した。（Ｂ）ＳａＣａｓ９及びＣＩＮＤＥＬＡ ｓｇＲＮＡプラスミドの形質感染後、相対的な細胞生存率をモニターした。有意性は、対応のない両側ｔ検定（ｕｎｐａｉｒｅｄ ｔｗｏ－ｓｉｄｅｄ ｔ－ｔｅｓｔ）を使用して評価された。（Ｃ）ｓｇＲＮＡ及びＳａＣａｓ９発現ＡＡＶをＵ２ＯＳに形質導入し、７２時間後に細胞生存率を観察した。対照群として、同一のＡＡＶをＲＰＥ１細胞に適用し、ＳａＣａｓ９のみを発現するＡＡＶをＵ２ＯＳ細胞に形質導入した。スケールバーは３００μｍである。（Ｄ）アポトーシスは、ＡＡＶ形質導入後に時間依存的に増加する。細胞株特異的ターゲッティングは有意に増加する（ｐ値は、対応のない両側ｔ検定（ｕｎｐａｉｒｅｄ ｔｗｏ－ｓｉｄｅｄ ｔ－ｔｅｓｔ）を使用して計算する）。
プラスミドで伝達されたＣＩＮＤＥＬＡ ｓｇＲＮＡによって誘導された同時多発的なＤＮＡ ＤＳＢによる細胞死滅の段階的な増加を示す結果である。（Ａ）Ｕ２ＯＳ及びＲＰＥ１細胞にＳａＣａｓ９のみを含有したり（ｓｇＲＮＡなし）、又はＵ２ＯＳ細胞に特異的な配列をターゲットとする３０個のｓｇＲＮＡを含むＳａＣａｓ９のうち一つを発現するＡＡＶを形質導入する。（Ｂ）（Ａ）で観察された細胞生存度を定量化する。各ウェルの７０％ＥｔＯＨのうち染色された１％のブロモフェノールブルーを３０％のアセテートから抽出し、ＯＤ５９５を測定する。（Ｃ）ＳａＣａｓ９のみ（ｓｇＲＮＡなし）又はＵ２ＯＳ細胞に特異的な配列をターゲットとする３０個のｓｇＲＮＡを含むＳａＣａｓ９のうち一つを発現するＡＡＶで形質導入されたＵ２ＯＳ細胞において、染色質結合タンパク質を表示された抗体で免疫ブロットする。（Ｄ）Ｕ２ＯＳ及びＲＰＥ１細胞イメージは、ＳａＣａｓ９のみを発現したり、５個のｓｇＲＮＡ（グループＡとＢ）、１０個のｓｇＲＮＡ、２０個のｓｇＲＮＡ又は３０個のｓｇＲＮＡを含むＳａＣａｓ９を発現するＡＡＶ形質導入３日後にキャプチャーする。（Ｅ）（Ｄ）で観察されたアポトーシス細胞死滅を定量化する。
マウス異種移植モデルでのＣＩＮＤＥＬＡ効果を示した結果である。Ｕ２ＯＳ骨肉腫細胞株でマウス異種移植モデルを確立し、ＡＡＶを使用してＳａＣａｓ９とと共に３０ＣＩＮＤＥＬＡ ｓｇＲＮＡを伝達した。（Ａ）腫瘍の増殖は、ＳａＣａｓ９のみを発現するＡＡＶで形質導入された異種移植モデル腫瘍と比較して、Ｕ２ＯＳ特異的ＣＩＮＤＥＬＡ ｓｇＲＮＡ及びＳａＣａｓ９を発現するＡＡＶで形質導入された腫瘍において有意に遅延される。相対的な腫瘍体積の差は、対応のない両側ｔ検定（ｕｎｐａｉｒｅｄ ｔｗｏ－ｓｉｄｅｄ ｔ－ｔｅｓｔ）を使用して分析する。（Ｂ）ＳａＣａｓ９のみで処理された腫瘍と比較して、ＣＩＮＤＥＬＡ ｓｇＲＮＡ及びＳａＣａｓ９で処理された異種移植モデル腫瘍サンプルにおいて細胞死滅が増加する。ＡＡＶ注射６日後に異種移植モデル組織を採取し、ＴＵＮＥＬ分析で細胞死滅を測定する（スケールバー：１００μｍの上端パネル；２０μｍの下端パネル）。（Ｃ）ＣＩＮＤＥＬＡによって誘導されたアポトーシス細胞死滅は、FＡＣＳ分析を通じてアネキシン（Ａｎｎｅｘｉｎ）Ｖ発現を測定することによって確認する（ｐ－値は、対応のない両側ｔ検定（ｕｎｐａｉｒｅｄ ｔｗｏ－ｓｉｄｅｄ ｔ－ｔｅｓｔ）を使用して計算する）。
Ｕ２ＯＳ由来の異種異種移植モデル組織のＣＩＮＤＥＬＡ効果を示した図である。（Ａ）ＣＩＮＤＥＬＡ腫瘍へのＳａＣａｓ９の発現は、抗－ＨＡ（ＳａＣａｓ９にタグ付けされる）抗体を用いた免疫染色によって検出する。（Ｂ）マウスの体重は、一定のＡＡＶ注射の間に測定された。Ｎｏ ｓｇＲＮＡ（ＳａＣａｓ９のみを含む）及びＣＩＮＤＥＬＡ ｓｇＲＮＡ（Ｕ２ＯＳ特異的）は、ＳａＣａｓ９のみ、及びＵ２ＯＳ細胞に特定的な配列をターゲットとする３０個のｓｇＲＮＡを含むＳａＣａｓ９のうち一つを発現するＡＡＶを注入したことを示す。
患者由来の腫瘍細胞とＰＤＸ（患者由来の異種移植）モデルのＣＩＮＤＥＬＡ効果を示した図である。（Ａ）膠芽腫患者（ＧＢＬ－６７）由来の腫瘍細胞をＡＡＶ形質導入を使用して２６個のＣＩＮＤＥＬＡ ｓｇＲＮＡ及びＳａＣａｓ９で処理する。神経幹細胞株（ＮＳＣ－１０）と比較して、ＣＩＮＤＥＬＡ処理は、ＧＢＬ－６７細胞を特異的に死滅する。スケールバーは３００μｍである。（Ｂ）肺癌ＰＤＸモデルは、ＣＩＮＤＥＬＡ ｓｇＲＮＡｓとＳａＣａｓ９で処理する。注目すべきことは、腫瘍の成長が、ＳａＣａｓ９のみを含む対照群と比較してＣＩＮＤＥＬＡ ｓｇＲＮＡ及びＳａＣａｓ９治療で有意に遅延される（有意性は、対応のない両側ｔ検定（ｔｗｏ－ｓｉｄｅｄ ｕｎｐａｉｒｅｄ ｔ－ｔｅｓｔ）を使用して評価する）。
ＣＩＮＤＥＬＡ治療によって肺癌ＰＤＸの増殖が抑制されることを示す図である。（Ａ）ＳａＣａｓ９のみ又はＰＤＸ－０７３癌に特異的な配列をターゲットとする２９個のｓｇＲＮＡを含むＳａＣａｓ９のうち一つを発現するＡＡＶを３日間隔で５回、２週間注射した。腫瘍を有するマウス（上端パネル）とマウスから抽出された腫瘍（下端パネル）の写真である。（Ｂ）ＳａＣａｓ９のみ又はＰＤＸ－３１８癌に特異的な配列をターゲットとする２２個のｓｇＲＮＡを含むＳａＣａｓ９のうち一つを発現するＡＡＶを３日間隔で５回、２週間注射した。腫瘍を有するマウス（上端パネル）とマウスから抽出された腫瘍（下端パネル）の写真である。（Ｃ）マウスの体重は、一定のＡＡＶ注射の間に測定された。
Ｕ２ＯＳ細胞株で３０個のＤＮＡ配列をターゲットとして、細胞死滅を誘導できるかどうかを確認した結果を示した図である。
Ｕ２ＯＳ細胞株で１０個のＤＮＡ配列をターゲットとして、細胞死滅を誘導できるかどうかを確認した結果を示した図である。
Ｕ２ＯＳ細胞株で５個のＤＮＡ配列をターゲットとして、細胞死滅を誘導できるかどうかを確認した結果を示した図である。
Ｕ２ＯＳ細胞株で図１１と異なる５個のＤＮＡ配列をターゲットとして、細胞死滅を誘導できるかどうかを確認した結果を示した図である。
Ｕ２ＯＳ細胞株で３個のＤＮＡ配列をターゲットとして、細胞死滅を誘導できるかどうかを確認した結果を示した図である。
Ｅｘｏ－ｓａＣａｓ９及びこれを用いてＤＳＢを誘導するメカニズムに対する模式図である。
染色体（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）３をターゲットとする５個のガイドＲＮＡを形質感染し、ＨＣＴ１１６細胞死滅効果を実験した結果を示した図である。ｓａＣａｓ９を単独で使用する場合は、５個のガイドＲＮＡで細胞死滅が微々たるものであったが、Ｅｘｏ－ｓａＣａｓ９を使用する場合は、５個のガイドＲＮＡで十分に細胞死滅を起こすことを確認した。
Ｕ２ＯＳ細胞株でＥｘｏ－ｓａＣａｓ９を使用し、５個のガイドＲＮＡで十分に細胞死滅を起こし得ることを確認した結果を示した図である。
ＤＮＡ損傷マーカー（ｄａｍａｇｅ ｍａｒｋｅｒ）であるｇ－Ｈ２ＡＸを通じて、Ｅｘｏ－Ｃａｓ９が細胞死滅をさらにうまく誘導する理由が、ｓａＣａｓ９によるＤＮＡ ＤＳＢ誘導後に復旧（ｒｅｐａｉｒ）を阻害するためであることを確認した結果を示した図である。
Ｅｘｏ－Ｃａｓ９を用いたとき、ＤＲ－ＧＦＰアッセイ（ａｓｓａｙ）を通じてＨＲ（Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）される程度を確認した結果を示した図である。その結果、Ｅｘｏ－Ｃａｓ９を用いたとき、ＨＲが著しく低下することを確認した。Ｅｘｏ－Ｃａｓ９がＨＲを阻害することを証明した結果である。
他の方式で定義されない限り、本明細書で使用された全ての技術的及び科学的用語は、本発明の属する技術分野で熟練した専門家によって通常的に理解されるのと同一の意味を有する。一般に、本明細書で使用された命名法は、本技術分野でよく知られており、通常的に使用される。
本発明は、一観点において、核酸切断酵素又はこれをコードするポリヌクレオチド；及びゲノム配列変異（ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を有する細胞において、前記ゲノム配列変異を有する４個以上の細胞特異的変異領域をそれぞれ認識する切断因子又はこれをコードするポリヌクレオチドを含むゲノム配列変異を有する細胞死滅誘導用組成物に関する。
１．ゲノム配列変異を有する細胞
正常な体細胞の複製時にも、ＤＮＡ重合酵素（ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）は、１０７ペアのヌクレオチドを合成する間に、約１個のエラーが発生する。ＤＮＡ回復メカニズムによってこのようなエラーの９９％は校正され、全体的に１０９個のヌクレオチドを複製するときに１個のエラーを犯す。このような突然変異は蓄積され、ゲノムの不安定性（ｇｅｎｏｍｅ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ）を引き起こす。
このようなゲノムの不安定性（ｇｅｎｏｍｅ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ）は、細胞外的環境要因によって加速され得るが、Ｘ－線、紫外線又は放射線への露出、活性酸素種（ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ、ＲＯＳ）などである。
ゲノムの不安定性の結果、ゲノムが損傷した細胞、すなわち、「ゲノム配列変異を有する細胞」が発生し、変異された遺伝情報が後代の娘細胞に遺伝されて増殖するようになる。
すなわち、前記「ゲノム配列変異を有する細胞」は、突然変異の蓄積によってゲノムの塩基配列に変化が発生した細胞である。このようなゲノムの塩基配列の変化は、細胞の活性及び機能が正常細胞と異なり、その結果、生物体又は生物の器官が生きたり作動するのに問題、すなわち、疾患を引き起こす。
例えば、「ゲノム配列変異を有する細胞」による疾患発病状態の細胞であって、具体的には、老化細胞（ｓｅｎｅｓｃｅｎｔ ｃｅｌｌ）、良性腫瘍（ｂｅｎｉｇｎ ｔｕｍｏｒ）、悪性腫瘍（ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｔｕｍｏｒ）、すなわち、癌細胞などであり、これに限定されない。
このようなゲノム配列変異を有する細胞特異的変異領域は、正常細胞で発見されないＤＮＡ配列の挿入（Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ：Ｉｎ）、又は正常細胞のＤＮＡの一部の欠失（Ｄｅｌｅｔｉｏｎ：Ｄｅｌ）を通じて生成されるが、通常、このような変異配列を「インデル（ＩｎＤｅｌ）」と言う。ゲノム配列変異の形態としては、「インデル（ＩｎＤｅｌ）」以外に、特定の配列が他の配列に代替（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）される場合もある。
いわゆる点突然変異（ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ）は、ＤＮＡとＲＮＡの塩基配列で一つの塩基対が変わって（代替、ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）発生する突然変異である場合である。本発明において、「インデル（ＩｎＤｅｌ）」は、正常細胞のＤＮＡの配列に対して挿入又は欠失した配列はもちろん、代替された配列又は挿入、欠失及び代替の組み合わせの過程で正常細胞に存在しない塩基配列を意味する。
このような遺伝的変異細胞のＤＮＡに表れる特異的な「インデル」配列は、正常細胞に存在しない塩基配列であるので、これらを正常細胞と疾患を引き起こす細胞との差別的攻撃ターゲットとして設定することができる。
本発明において、ＩｎＤｅｌ配列は、疾患を発生させる遺伝子と関連した配列のみを意味しない。また、特定のタンパク質を暗号化する遺伝情報を有している配列はもちろん、いわゆるジャンク（ｊｕｎｋ）ＤＮＡ配列も本発明のＩｎＤｅｌになり得る。すなわち、本発明で主なターゲットとするＩｎＤｅｌは、１）正常細胞には存在しない配列であって、２）疾患発病状態の細胞に共通的に存在する塩基配列である。
前記ゲノム配列変異を有する細胞は、遺伝子変形又は損傷によって細胞の活性が正常細胞と異なるようになった細胞を意味し、例えば、遺伝子変形又は損傷による疾患発病状態の細胞を意味し得る。
前記ゲノム配列変異を有する細胞によって、例えば、癌、老化、免疫疾患、心血管疾患などの疾患が誘発され得る。
癌（ｃａｎｃｅｒ）と細胞老化（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ）は、ゲノムの不安定性（ｇｅｎｏｍｉｃ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ）によって発生する代表的な疾患又は現象である。細胞老化の場合、老化された細胞が身体組織及び臓器などに蓄積され、これは、慢性炎症反応が生じる環境はもちろん、周辺組織及び細胞も容易に損傷させる。結局、生体組織の再生能力が低下し、痴呆、糖尿病、退行性関節炎などの退行性疾患も誘発される。本発明は、「ゲノム配列変異を有する細胞」を選択的に死滅させる方法を提供する。よって、「ゲノム配列変異を有する細胞」から由来する各疾患を効果的に治療することができる。
癌細胞は、突然変異の蓄積によって発生するが、このような過程でＤＮＡに多くのＩｎＤｅｌが作られ、このような遺伝的変異によって、次の二つの遺伝的特徴を備えると癌細胞になる。（１）正常な規制を無視して増殖し、（２）他の細胞のために正常に準備された領域に侵入し、その位置を占める。一つ目の特徴はあるが、二つ目の特徴がない細胞は、過度な増殖はするが、一塊のみとして残っている腫瘍を形成する。この場合の腫瘍を良性（ｂｅｎｉｇｎ）と言い、このような腫瘍は、外科的な手術によって除去され得る。しかし、一つの腫瘍が周辺組織に侵入する能力があると、悪性（ｍａｌｉｇｎａｎｔ）と呼ばれる癌になる。浸透能力がある悪性腫瘍細胞は、１次腫瘍から分離されて血流やリンパ管に入り込み、身体の他の部位に転移（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）されることによって２次腫瘍を形成することができる。
前記癌は、例えば、黒色腫、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神経膠腫、肝臓癌、甲状腺腫瘍、胃癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、肺癌、大腸癌、膠芽腫、子宮内膜癌、腎臓癌、結腸癌、膵臓癌、食道癌腫、頭頸部癌、中皮腫、肉腫、骨肉腫、胆管癌又は表皮癌などであり得るが、これに制限されるのではない。
全ての癌細胞には、正常細胞で発見されない新しいＤＮＡ配列が挿入されたり（Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ：ＩＮ）、正常細胞のＤＮＡの一部が欠失する（Ｄｅｌｅｔｉｏｎ：Ｄｅｌ）現象が多数観察され、各癌細胞ごとに特異的に挿入／欠失したＤＮＡ配列が存在し得る。
細胞は、ＤＮＡ二重鎖が切断されると、これを復旧しようとするＤＮＡ復旧メカニズムを有する。しかし、このような復旧メカニズムは、ＤＮＡ二重鎖切断の数が少ない場合に効果的に復旧するが、その数が多くなると死滅するようになる。バクテリアの場合は、一つのＤＮＡ二重鎖切断でバクテリアが死滅し得るが、動物細胞の場合は、それより多くのＤＳＢが必要であると知られている。
本発明によると、上記の事実に基づいて、ゲノム配列変異を有する細胞、例えば、癌細胞のＩｎＤｅｌを見出し、これを認識できる切断因子を製作し、核酸切断酵素を用いてゲノム配列変異を有する細胞、例えば、癌細胞などを特異的に死滅させるように誘導することができる。
老化の場合は、老化された細胞でＤＮＡ損傷が蓄積されており、ＤＮＡ復旧活性が減少しているが、老化された細胞でＤＮＡ損傷が多くなり得る。このような損傷を治療するために復旧が活発に行わなければならないが、老化された細胞及び組織において、特に二重鎖切断復旧が減少しており、ＤＮＡ変異が多く観察される。
細胞老化（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ）の場合、ＤＮＡ損傷などによるゲノムの不安定性が主な老化経路である。ＤＮＡ損傷が発生すると、重要な遺伝子が壊れたり、転写調節過程などが変化し、特定の生化学的経路に関与するタンパク質の生産及び機能に問題が発生し、細胞の正常な機能が破壊され得る。このような細胞が除去されずに蓄積されると、単一細胞の壊れで終了しなく、個体全体の恒常性を脅かすこともある。
正常細胞で発見されない新しいＤＮＡ配列が挿入されたり（Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ：ＩＮ）、正常細胞のＤＮＡの一部が欠失する（Ｄｅｌｅｔｉｏｎ：Ｄｅｌ）現象が多数観察され、各老化細胞ごとに特異的に挿入／欠失したＤＮＡ配列が存在し得る。
本発明によると、上記の事実に基づいて、ゲノム配列変異を有する細胞、例えば、老化細胞のＩｎＤｅｌを見出し、これを認識できる切断因子を製作し、核酸切断酵素を用いてゲノム配列変異を有する細胞、例えば、老化細胞などを特異的に死滅させるように誘導することができる。
老化細胞（ｓｅｎｅｓｃｅｎｔ ｃｅｌｌｓ）を選択的に除去することによって、老化と関連した特性を緩和することができる。細胞老化の標識子としての役割をするｐ１６プロモーターに細胞死滅遺伝子を発現させることによって老化された細胞を選択的に死滅させたとき、その組織の機能を検討すると、老化と関連して表れる特性の緩和が起こることを確認した。マウスを用いたモデルから早期に老化された細胞を除去することによって、代表的な老化表現型である白内障及び筋肉消失が発生しておらず、運動能力にもさらに優れることを研究結果として得た（Ｂａｋｅｒ，Ｄ．Ｊ．，Ｔ，（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ ４７９：２３２－２３６）。
免疫疾患の場合、哺乳類のリンパ球細胞にはＢ－細胞受容体、Ｔ－細胞受容体が存在するが、これらは、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換え（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）過程を通じてＶ（ｖａｒｉａｂｌｅ）、Ｄ（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ）、Ｊ（ｊｏｉｎｉｎｇ）遺伝子が混合されながら、これを通じて多様な種類の抗原を認識することができる。この過程で二重鎖切断が起こるが、これを調節する各タンパク質が欠けるとき、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換え過程が確実に作動できなくなり、その結果、免疫欠乏、神経欠陥などの多くの疾病が表れるようになる。
正常細胞で発見されない新しいＤＮＡ配列が挿入されたり（Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ：ＩＮ）、正常細胞のＤＮＡの一部が欠失する（Ｄｅｌｅｔｉｏｎ：Ｄｅｌ）現象が多数観察され、各免疫疾患発病細胞ごとに特異的に挿入／欠失したＤＮＡ配列が存在し得る。
本発明によると、上記の事実に基づいて、ゲノム配列変異を有する細胞、例えば、免疫疾患発病細胞のＩｎＤｅｌを見出し、これを認識できる切断因子を製作し、核酸切断酵素を用いてゲノム配列変異を有する細胞、例えば、免疫疾患発病細胞などを特異的に死滅させるように誘導することができる。
心血管疾患と関連して、例えば、心不全症は、心臓のポンプ機能が弱くなったときに発生する疾患であって、現在まで心不全患者において心不全、糖尿病及びインスリン抵抗性の間の連関関係があることが知られている。また、心不全症では、心臓組織及び内臓脂肪でＤＮＡ損傷が蓄積されると知られているが、これは、脂肪組織の炎症反応及びインスリン抵抗性によって起こるものであると知られている。実際にマウスに高カロリーの食物を与えたとき、多くの脂肪酸が脂肪組織に流入しながらＲＯＳの過量生成をもたらし、その結果、ＤＮＡ損傷が蓄積されたり、又はｐ５３が脂肪組織の炎症反応及びインスリン抵抗性に関与することが明らかになった。このような過度な脂肪の分解は、神経系で酸化的ストレスを誘導し、これは、ＤＮＡ損傷及び脂肪組織のｐ５３依存的な炎症反応を誘導する。その他にも、アテローム性動脈硬化症（ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）の初期、病期進行でＤＮＡ損傷が蓄積されることが報告された。併せて、ＤＮＡ損傷は、プラーク（ｐｌａｑｕｅ）のレベルを増加させ、このプラークのレベル増加が動脈硬化につながるという報告もある。これにより、動脈硬化でもＤＮＡ損傷が重要な役割をすることができる。
「ゲノム配列変異を有する細胞」から由来する各疾患のほとんどは、ＤＮＡ復旧（ｒｅｐａｉｒ）やＤＮＡ損傷応答（ｄａｍａｇｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）の欠乏によってもたらされる。代表的な疾患としては、エカルディ・グティエール症候群（Ａｉｃａｒｄｉ－Ｇｏｕｔｉｅｒｅｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）（脳の萎縮症と筋肉の異常）、筋肉萎縮性側索硬化症（Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ４；ＡＬＳ４、神経細胞の退化）、マイヤー・ゴーリン症候群（Ｍｅｉｅｒ－Ｇｏｒｌｉｎ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）（小脳症、膝骨の異常）、ゼッケル症候群（Ｓｅｃｋｅｌ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）（血球の数が減少する疾病）、シムケ免疫性骨形成不全（Ｓｃｈｉｍｋｅ ｉｍｍｕｎｅ－ｏｓｓｅｏｕｓ ｄｙｓｐｌａｓｉａ）（低身長、小脳症、腎臓異常、免疫欠乏、背中が反る疾患）、毛細血管拡張性運動失調症（Ａｔａｘｉａ ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ；毛細管拡張性症、免疫体系異常、白血病）、ナイミーヘン切断症候群（免疫体系異常、リンパ種発生）、ブルーム症候群（皮膚発疹による血管拡張、皮膚色素異常、免疫系異常、肺疾患）、ウェルナー症候群（速い老化）、ロスムンド・トムソン症候群（皮膚異常、赤色斑、血管拡張、白内障）、ファンコニ貧血症（貧血、血小板の減少、白血病の増加）、色素性乾皮症（太陽光敏感性、皮膚癌、色素症）、コケイン症候群（小字症、小人症、太陽光敏感性）、リンチ症候群（大腸癌）、家族性大腸腺腫症（大腸癌、直腸癌の増加）などがある。このような疾病の各患者は、多くのゲノム配列変異を有する細胞を作るようになり、これを通じて各器官で多様な疾患がもたらされる。
正常細胞で発見されない新しいＤＮＡ配列が挿入されたり（Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ：ＩＮ）、正常細胞のＤＮＡの一部が欠失する（Ｄｅｌｅｔｉｏｎ：Ｄｅｌ）現象が多数観察され、心血管疾患発病細胞ごとに特異的に挿入／欠失したＤＮＡ配列が存在し得る。
本発明によると、上記の事実に基づいて、ゲノム配列変異を有する細胞、例えば、心血管疾患発病細胞のＩｎＤｅｌを見出し、これを認識できる切断因子を製作し、核酸切断酵素を用いてゲノム配列変異を有する細胞、例えば、心血管疾患発病細胞などを特異的に死滅させるように誘導することができる。
遺伝的変異細胞に特異的に存在するＩｎＤｅｌは、正常細胞及びゲノム配列（Ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を分析し、互いに異なるＩｎＤｅｌを見出すことができる。塩基配列の分析では、全ゲノム配列（Ｗｈｏｌｅ Ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｎｅｃｅ）を比較することができ、場合によっては、特定の染色体のみを選択し、塩基配列を分析・比較することができる。
場合によって、ＩｎＤｅｌの選別時、癌細胞はＷＧＳしなく、知られているＷＧＳを使用する場合、正常細胞には存在しないＩｎＤｅｌのみを検証することができる。今後、患者の癌細胞で多くのＩｎＤＥＬを発見するとき、共通的に表れるＩｎＤＥＬが存在し得る。この場合、共通的に表れるＩｎＤＥＬのみをＰＣＲなどによって癌細胞で観察し、ターゲット組成物に含ませる戦略が含まれ得る。また、ＷＧＳをし、ＩｎＤｅｌを検出することが現在最も効果的な方法であるが、サブトラクティブハイブリダイゼーション（ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）（正常細胞のＤＮＡと癌細胞のＤＮＡを変性（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）させ、再びハイブリダイゼーション（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）を行うことによって、互いに結合しない部位をＩｎＤｅｌとして見出す方式）も可能である。よって、ＷＧＳを含むＩｎＤｅｌを見出すことができる多様な方法を用いて、遺伝子変形細胞の特異的ＩｎＤｅｌを発見する方式を用いることができる。
２．変異領域
一つの実施例において、前記ゲノム配列変異を有する細胞特異的変異領域は、細胞死滅を誘導するのに十分なターゲットに該当する互いに異なる４個以上であり得る。前記ゲノム配列変異を有する細胞特異的変異領域は、例えば、互いに異なる３０個以下であり得る。前記ゲノム配列変異を有する細胞特異的変異領域は、例えば、互いに異なるそれぞれの４個～３０個であり得る。
前記ゲノム配列変異を有する細胞特異的変異領域は、具体的には、互いに異なるそれぞれの４個～３０個、具体的には、５個～３０個、５個～２９個、５個～２８個、５個～２７個、５個～２６個、５個～２５個、５個～２４個、５個～２３個、５個～２２個、５個～２１個、５個～２０個、５個～１９個、５個～１８個、５個～１７個、５個～１６個、５個～１５個、５個～１４個、５個～１３個、５個～１２個、５個～１１個、５個～１０個、６個～３０個、６個～２９個、６個～２８個、６個～２７個、６個～２６個、６個～２５個、６個～２４個、６個～２３個、６個～２２個、６個～２１個、６個～２０個、６個～１９個、６個～１８個、６個～１７個、６個～１６個、６個～１５個、６個～１４個、６個～１３個、６個～１２個、６個～１１個、６個～１０個、７個～３０個、７個～２９個、７個～２８個、７個～２７個、７個～２６個、７個～２５個、７個～２４個、７個～２３個、７個～２２個、７個～２１個、７個～２０個、７個～１９個、７個～１８個、７個～１７個、７個～１６個、７個～１５個、７個～１４個、７個～１３個、７個～１２個、７個～１１個、７個～１０個、８個～３０個、８個～２９個、８個～２８個、８個～２７個、８個～２６個、８個～２５個、８個～２４個、８個～２３個、８個～２２個、８個～２１個、８個～２０個、８個～１９個、８個～１８個、８個～１７個、８個～１６個、８個～１５個、８個～１４個、８個～１３個、８個～１２個、８個～１１個、８個～１０個、９個～３０個、９個～２９個、９個～２８個、９個～２７個、９個～２６個、９個～２５個、９個～２４個、９個～２３個、９個～２２個、９個～２１個、９個～２０個、９個～１９個、９個～１８個、９個～１７個、９個～１６個、９個～１５個、９個～１４個、９個～１３個、９個～１２個、９個～１１個、９個～１０個、１０個～３０個、１０個～２９個、１０個～２８個、１０個～２７個、１０個～２６個、１０個～２５個、１０個～２４個、１０個～２３個、１０個～２２個、１０個～２１個、１０個～２０個、１０個～１９個、１０個～１８個、１０個～１７個、１０個～１６個、１０個～１５個、１０個～１４個、１０個～１３個、１０個～１２個、１０個～１１個、１１個～３０個、１１個～２９個、１１個～２８個、１１個～２７個、１１個～２６個、１１個～２５個、１１個～２４個、１１個～２３個、１１個～２２個、１１個～２１個、１１個～２０個、１１個～１９個、１１個～１８個、１１個～１７個、１１個～１６個、１１個～１５個、１１個～１４個、１１個～１３個、１１個～１２個、１２個～３０個、１２個～２９個、１２個～２８個、１２個～２７個、１２個～２６個、１２個～２５個、１２個～２４個、１２個～２３個、１２個～２２個、１２個～２１個、１２個～２０個、１２個～１９個、１２個～１８個、１２個～１７個、１２個～１６個、１２個～１５個、１２個～１４個、１２個～１３個、１３個～３０個、１３個～２９個、１３個～２８個、１３個～２７個、１３個～２６個、１３個～２５個、１３個～２４個、１３個～２３個、１３個～２２個、１３個～２１個、１３個～２０個、１３個～１９個、１３個～１８個、１３個～１７個、１３個～１６個、１３個～１５個、１３個～１４個、１４個～３０個、１４個～２９個、１４個～２８個、１４個～２７個、１４個～２６個、１４個～２５個、１４個～２４個、１４個～２３個、１４個～２２個、１４個～２１個、１４個～２０個、１４個～１９個、１４個～１８個、１４個～１７個、１４個～１６個、１４個～１５個、１５個～３０個、１５個～２９個、１５個～２８個、１５個～２７個、１５個～２６個、１５個～２５個、１５個～２４個、１５個～２３個、１５個～２２個、１５個～２１個、１５個～２０個、１５個～１９個、１５個～１８個、１５個～１７個、１５個～１６個であり得る。
前記ゲノム配列変異を有する細胞特異的変異領域は、具体的には、互いに異なるそれぞれの４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個又は３０個（数字の間の範囲も含む）であり得る。
変異が存在する位置の含まれたゲノムは、細胞で二倍体（ｄｉｐｌｏｉｄ）及び／又は三倍体（ｔｒｉｐｌｏｉｄ）であり得るので、互いに異なるそれぞれの４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個又は３０個（数字の間の範囲も含む）、又は、４ペア、５ペア、６ペア、７ペア、８ペア、９ペア、１０ペア、１１ペア、１２ペア、１３ペア、１４ペア、１５ペア、１６ペア、１７ペア、１８ペア、１９ペア、２０ペア、２１ペア、２２ペア、２３ペア 、２４ペア、２５ペア、２６ペア、２７ペア、２８ペア、２９ペア又は３０ペアの変異領域を考慮して、互いに異なる４個～６０個、例えば、互いに異なる６０個、５９個、５８個、５７個、４個～５６個、５５個、５４個、５３個、５２個、５１個、５０個、４９個、４８個、４７個、４６個、４５個、４４個、４３個、４２個、４１個、４０個、３９個、３８個、３７個、３６個、３５個、３４個、３３個、３２個、３１個、３０個、２９個、２８個、２７個、２６個、２５個、２４個、２３個、２２個、２１個、２０個、１９個、１８個、１７個、１６個、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個又は４個（数字の間の範囲も含む）の二重鎖切断（Ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ｂｒｅａｋ、ＤＳＢ）を誘導し、細胞を死滅させることができる。
前記ゲノム配列変異を有する細胞特異的変異領域は、核酸配列であって、例えば、コーディング又はノンコーディング核酸であり得る。前記ゲノム配列変異を有する細胞特異的変異領域の核酸は、コーディング核酸であってもよく、ゲノム（ｇｅｎｏｍｅ）から転写されてタンパク質に翻訳されてもよい。前記ゲノム配列変異を有する細胞特異的変異領域の核酸は、ノンコーディング核酸であってもよく、ゲノムから転写されてタンパク質に翻訳されない。
本発明に係るゲノム配列変異を有する細胞内の変異は、正常細胞で発見されない場合がある。このような変異は、ゲノム配列変異を有する細胞と正常細胞をＷＧＳ（ｗｈｏｌｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）し、ゲノム配列変異を有する細胞特異的変異領域の配列、例えば、配列の挿入、欠失、及び置換で構成された群から選ばれた一つ以上であり得る。
ゲノム配列変異を有する細胞特異的配列のマッピングは、ＷＧＳ（ｗｈｏｌｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、又はサブトラクションハイブリダイゼーション（ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）及びシーケンシングの方法を通じて行われてもよく、このとき、導出されたＩｎＤｅｌの場合、癌で発見された挿入の場合は直ぐガイドＲＮＡを製作し、欠失の場合は、切断地点（ｂｒｅａｋ ｐｏｉｎｔ）をマッピングした後、切断地点を含むガイドＲＮＡを製作して使用することができる。
ＷＧＳ（全ゲノムシーケンシング）は、次世代シーケンシング（ｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）によって１０Ｘ、２０Ｘ、４０Ｘ形式で多くの倍数でゲノムを読む方法を意味する。「次世代シーケンシング」は、チップ（Ｃｈｉｐ）基盤、及びＰＣＲ基盤のペアエンド（ｐａｉｒｅｄ ｅｎｄ）形式で全ゲノムを断片化し、前記断片に対して化学的な反応（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）に基づいて超高速でシーケンシングを行う技術を意味する。
サブトラクションハイブリダイゼーションは、多くの組織又は細胞の間に発現の差がある遺伝子のクローニングに用いられる方法である。試験する細胞のＤＮＡ試料特異的遺伝子が検出され得る。試験する細胞のＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに変性させた後、アニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）を行う。アニーリング条件を調節することによって、試験する細胞特異的ＤＮＡ配列を二本鎖ＤＮＡとして分離することができる。
ゲノム配列変異を有する細胞特異的変異領域の核酸配列は、例えば、該当の配列をターゲットとして、核酸切断酵素によって核酸配列内のＤＮＡのＤＳＢが起こる遺伝子部位を意味するものであって、核酸配列内の核酸切断酵素が特異的に認識する配列、例えば、核酸切断酵素がＣａｓ９である場合、Ｃａｓ９タンパク質が認識するＰＡＭ配列の５’末端及び／又は３’末端に隣接して位置する約１７ｂｐ乃至２３ｂｐ長さの核酸配列を意味し得る。
ゲノム配列変異を有する細胞特異的変異領域の配列を特異的に認識するガイドＲＮＡは、ＰＡＭ配列が位置するＤＮＡ鎖の相補鎖のヌクレオチド配列と９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％の配列相補性を有するヌクレオチド配列を意味するものであって、前記相補鎖のヌクレオチド配列と結合可能である。
ゲノム配列変異を有する細胞特異的変異領域の配列は、該当の配列部位の二つのＤＮＡ鎖のうちＰＡＭ配列が位置する鎖の核酸配列で表示される。このとき、実際にガイドＲＮＡが結合するＤＮＡ鎖は、ＰＡＭ配列が位置する鎖の相補鎖であるので、前記ガイドＲＮＡに含まれた標的化配列は、ＲＮＡの特性上、ＴをＵに変更することを除いては、ＩｎＤｅｌを含む核酸配列と同一の核酸配列を有するようになる。
前記Ｃａｓ９タンパク質がストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のものである場合、前記ＰＡＭ配列は、５’－ＮＧＧ－３’（Ｎは、Ａ、Ｔ、Ｇ、又はＣである）で、ゲノム配列変異を有する細胞固有の変異配列を含む核酸配列は、配列内の５’－ＮＧＧ－３’配列の５’末端及び／又は３’末端に隣接して位置する遺伝子部位であって、例えば、最大長さが約５０ｂｐ又は約４０ｂｐである遺伝子部位であり得る。
前記Ｃａｓ９タンパク質がストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のものである場合、前記ＰＡＭ配列は、５’－ＮＮＡＧＡＡＷ－３’（Ｎは、Ａ、Ｔ、Ｇ、又はＣである）で、ゲノム配列変異を有する細胞固有の変異配列は、配列内の５’－ＮＮＡＧＡＡＷ－３’配列の５’末端及び／又は３’末端に隣接して位置する遺伝子部位であって、例えば、最大長さが約５０ｂｐ又は約４０ｂｐである遺伝子部位であり得る。
前記Ｃａｓ９タンパク質がスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来のものである場合、前記ＰＡＭ配列は、５’－ＮＮＧＲＲＴ－３’（Ｎは、Ａ、Ｔ、Ｇ、又はＣで、Ｒは、Ａ又はＧ）で、ゲノム配列変異を有する細胞固有の変異配列は、配列内の５’－ＮＮＧＲＲＴ－３’配列の５’末端及び／又は３’末端に隣接して位置する遺伝子部位であって、例えば、最大長さが約５０ｂｐ又は約４０ｂｐである遺伝子部位であり得る。
前記Ｃａｓ９タンパク質がカンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）由来のものである場合、前記ＰＡＭ配列は、５’－ＮＮＮＮＲＹＡＣ－３’（Ｎは、Ａ、Ｔ、Ｇ、又はＣで、Ｒは、Ａ又はＧで、Ｙは、Ｃ又はＴである）で、ゲノム配列変異を有する細胞固有の変異配列は、配列内の５’－ＮＮＮＮＲＹＡＣ－３’配列の５’末端及び／又は３’末端に隣接して位置する遺伝子部位であって、例えば、最大長さが約５０ｂｐ又は約４０ｂｐである遺伝子部位であり得る。
３．切断因子
本発明において、切断因子とは、正常細胞と比較して、ゲノム配列変異を有する細胞で変異された部分、すなわち、ゲノム配列変異を有する細胞特異的変異領域の核酸配列を認識して切断できるように誘導する塩基配列を意味する。
ゲノム配列変異を有する細胞特異的変異領域を特異的に認識するガイドＲＮＡは、ＰＡＭ配列が位置するＤＮＡ鎖の相補鎖のヌクレオチド配列と９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％の配列相補性を有するヌクレオチド配列を意味するものであって、前記相補鎖のヌクレオチド配列と結合可能である。
ゲノム配列変異を有する細胞のＩｎＤｅｌを含む核酸配列を特異的に認識する切断因子は、例えば、ガイドＲＮＡであり得る。前記ガイドＲＮＡは、例えば、ｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ）、ｔｒａｃｒＲＮＡ（ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｃｒＲＮＡ）、及び単一ガイドＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ；ｓｇＲＮＡ）からなる群から選ばれた１種以上であってもよく、具体的には、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとが互いに結合された二重鎖ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体、又はｃｒＲＮＡ又はその一部とｔｒａｃｒＲＮＡ又はその一部とがオリゴヌクレオチドリンカーで連結された単一鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であり得る。
本発明の具体的な実施例において、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとが互いに結合された二重鎖ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡを切断因子として使用することができる。ｃｒＲＮＡが標的部位と結合されたことを認識し、エンドヌクレアーゼ機能が活性化され得る。場合によって、切断因子として単一鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を使用することができる。
本発明において、前記切断因子は、複数個であって、複数個のそれぞれの切断因子の配列が異なるので、互いに異なる配列を含むことができる。
本発明において、前記切断因子は、正常細胞の塩基配列と比較して、細胞の死滅を誘導できる十分な複数個の数でなければならなく、互いに異なる配列を有する５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、１１個以上、１２個以上、１３個以上、１４個以上、１５個以上、１６個以上、１７個以上、１８個以上、１９個以上、２０個以上、２１個以上、２２個以上、２３個以上、２４個以上、２５個以上、２６個以上、２７個以上、２８個以上、２９個以上、又は３０個以上であり得る。前記切断因子は、互いに異なる配列を有する３０個以下、２９個以下、２８個以下、２７個以下、２６個以下、２５個以下、２４個以下、２３個以下、２２個以下、２１個以下、２０個以下、１９個以下、１８個以下、１７個以下、１６個以下、１５個以下、１４個以下、１３個以下、１２個以下、１１個以下、１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、又は２個以下であり得る。
本発明において、前記切断因子は、正常細胞の塩基配列と比較して、細胞の死滅を誘導できる十分な複数個の数でなければならなく、互いに異なる配列を有する４個～６０個、例えば、互いに異なる配列を有する４個～５９個、４個～５８個、４個～５７個、４個～５６個、４個～５５個、４個～５４個、４個～５３個、４個～５２個、４個～５１個、４個～５０個、４個～４９個、４個～４８個、４個～４７個、４個～４６個、４個～４５個、４個～４４個、４個～４３個、４個～４２個、４個～４１個、４個～４０個、４個～３９個、４個～３８個、４個～３７個、４個～３６個、４個～３５個、４個～３４個、４個～３３個、４個～３２個、４個～３１個、４個～３０個、４個～２９個、４個～２８個、４個～２７個、４個～２６個、４個～２５個、４個～２４個、４個～２３個、４個～２２個、４個～２１個、４個～２０個、４個～１９個、４個～１８個、４個～１７個、４個～１６個、４個～１５個、４個～１４個、４個～１３個、４個～１２個、４個～１１個、又は４個～１０個であり得る。
本発明において、前記切断因子は、正常細胞の塩基配列と比較して、細胞の死滅を誘導できる十分な複数個の数でなければならなく、互いに異なる配列を有する、例えば、４個～３０個、４個～２９個、４個～２８個、４個～２７個、４個～２６個、４個～２５個、４個～２４個、４個～２３個、４個～２２個、４個～２１個、４個～２０個、４個～１９個、４個～１８個、４個～１７個、４個～１６個、４個～１５個、４個～１４個、４個～１３個、４個～１２個、４個～１１個、４個～１０個、５個～３０個、５個～２９個、５個～２８個、５個～２７個、５個～２６個、５個～２５個、５個～２４個、５個～２３個、５個～２２個、５個～２１個、５個～２０個、５個～１９個、５個～１８個、５個～１７個、５個～１６個、５個～１５個、５個～１４個、５個～１３個、５個～１２個、５個～１１個、５個～１０個、６個～３０個、６個～２９個、６個～２８個、６個～２７個、６個～２６個、６個～２５個、６個～２４個、６個～２３個、６個～２２個、６個～２１個、６個～２０個、６個～１９個、６個～１８個、６個～１７個、６個～１６個、６個～１５個、６個～１４個、６個～１３個、６個～１２個、６個～１１個、６個～１０個、７個～３０個、７個～２９個、７個～２８個、７個～２７個、７個～２６個、７個～２５個、７個～２４個、７個～２３個、７個～２２個、７個～２１個、７個～２０個、７個～１９個、７個～１８個、７個～１７個、７個～１６個、７個～１５個、７個～１４個、７個～１３個、７個～１２個、７個～１１個、７個～１０個、８個～３０個、８個～２９個、８個～２８個、８個～２７個、８個～２６個、８個～２５個、８個～２４個、８個～２３個、８個～２２個、８個～２１個、８個～２０個、８個～１９個、８個～１８個、８個～１７個、８個～１６個、８個～１５個、８個～１４個、８個～１３個、８個～１２個、８個～１１個、８個～１０個、９個～３０個、９個～２９個、９個～２８個、９個～２７個、９個～２６個、９個～２５個、９個～２４個、９個～２３個、９個～２２個、９個～２１個、９個～２０個、９個～１９個、９個～１８個、９個～１７個、９個～１６個、９個～１５個、９個～１４個、９個～１３個、９個～１２個、９個～１１個、９個～１０個、１０個～３０個、１０個～２９個、１０個～２８個、１０個～２７個、１０個～２６個、１０個～２５個、１０個～２４個、１０個～２３個、１０個～２２個、１０個～２１個、１０個～２０個、１０個～１９個、１０個～１８個、１０個～１７個、１０個～１６個、１０個～１５個、１０個～１４個、１０個～１３個、１０個～１２個、１０個～１１個、１１個～３０個、１１個～２９個、１１個～２８個、１１個～２７個、１１個～２６個、１１個～２５個、１１個～２４個、１１個～２３個、１１個～２２個、１１個～２１個、１１個～２０個、１１個～１９個、１１個～１８個、１１個～１７個、１１個～１６個、１１個～１５個、１１個～１４個、１１個～１３個、１１個～１２個、１２個～３０個、１２個～２９個、１２個～２８個、１２個～２７個、１２個～２６個、１２個～２５個、１２個～２４個、１２個～２３個、１２個～２２個、１２個～２１個、１２個～２０個、１２個～１９個、１２個～１８個、１２個～１７個、１２個～１６個、１２個～１５個、１２個～１４個、１２個～１３個、１３個～３０個、１３個～２９個、１３個～２８個、１３個～２７個、１３個～２６個、１３個～２５個、１３個～２４個、１３個～２３個、１３個～２２個、１３個～２１個、１３個～２０個、１３個～１９個、１３個～１８個、１３個～１７個、１３個～１６個、１３個～１５個、１３個～１４個、１４個～３０個、１４個～２９個、１４個～２８個、１４個～２７個、１４個～２６個、１４個～２５個、１４個～２４個、１４個～２３個、１４個～２２個、１４個～２１個、１４個～２０個、１４個～１９個、１４個～１８個、１４個～１７個、１４個～１６個、１４個～１５個、１５個～３０個、１５個～２９個、１５個～２８個、１５個～２７個、１５個～２６個、１５個～２５個、１５個～２４個、１５個～２３個、１５個～２２個、１５個～２１個、１５個～２０個、１５個～１９個、１５個～１８個、１５個～１７個、１５個～１６個であり得る。
本発明において、前記切断因子は、例えば、互いに異なる配列を有する６個～６０個、例えば、互いに異なる配列を有する６個～５９個、６個～５８個、６個～５７個、６個～５６個、６個～５５個、６個～５４個、６個～５３個、６個～５２個、６個～５１個、６個～５０個、６個～４９個、６個～４８個、６個～４７個、６個～４６個、６個～４５個、６個～４４個、６個～４３個、６個～４２個、６個～４１個、６個～４０個、６個～３９個、６個～３８個、６個～３７個、６個～３６個、６個～３５個、６個～３４個、６個～３３個、６個～３２個、６個～３１個、６個～３０個、６個～２９個、６個～２８個、６個～２７個、６個～２６個、６個～２５個、６個～２４個、６個～２３個、６個～２２個、６個～２１個、６個～２０個、６個～１９個、６個～１８個、６個～１７個、６個～１６個、６個～１５個、６個～１４個、６個～１３個、６個～１２個、６個～１１個、又は６個～１０個であり得る。
本発明において、前記切断因子は、例えば、互いに異なる配列を有する８個～６０個、例えば、互いに異なる配列を有する８個～５９個、８個～５８個、８個～５７個、８個～５６個、８個～５５個、８個～５４個、８個～５３個、８個～５２個、８個～５１個、８個～５０個、８個～４９個、８個～４８個、８個～４７個、８個～４６個、８個～４５個、８個～４４個、８個～４３個、８個～４２個、８個～４１個、８個～４０個、８個～３９個、８個～３８個、８個～３７個、８個～３６個、８個～３５個、８個～３４個、８個～３３個、８個～３２個、８個～３１個、８個～３０個、８個～２９個、８個～２８個、８個～２７個、８個～２６個、８個～２５個、８個～２４個、８個～２３個、８個～２２個、８個～２１個、８個～２０個、８個～１９個、８個～１８個、８個～１７個、８個～１６個、８個～１５個、８個～１４個、８個～１３個、８個～１２個、８個～１１個、又は８個～１０個であり得る。
本発明において、前記切断因子は、例えば、互いに異なる配列を有する１０個～６０個、例えば、互いに異なる配列を有する１０個～５９個、１０個～５８個、１０個～５７個、１０個～５６個、１０個～５５個、１０個～５４個、１０個～５３個、１０個～５２個、１０個～５１個、１０個～５０個、１０個～４９個、１０個～４８個、１０個～４７個、１０個～４６個、１０個～４５個、１０個～４４個、１０個～４３個、１０個～４２個、１０個～４１個、１０個～４０個、１０個～３９個、１０個～３８個、１０個～３７個、１０個～３６個、１０個～３５個、１０個～３４個、１０個～３３個、１０個～３２個、１０個～３１個、１０個～３０個、１０個～２９個、１０個～２８個、１０個～２７個、１０個～２６個、１０個～２５個、１０個～２４個、１０個～２３個、１０個～２２個、１０個～２１個、１０個～２０個、１０個～１９個、１０個～１８個、１０個～１７個、１０個～１６個、１０個～１５個、１０個～１４個、１０個～１３個、又は１０個～１２個であり得る。
本発明において、前記切断因子は、例えば、互いに異なる配列を有する１２個～６０個、例えば、互いに異なる配列を有する１２個～５９個、１２個～５８個、１２個～５７個、１２個～５６個、１２個～５５個、１２個～５４個、１２個～５３個、１２個～５２個、１２個～５１個、１２個～５０個、１２個～４９個、１２個～４８個、１２個～４７個、１２個～４６個、１２個～４５個、１２個～４４個、１２個～４３個、１２個～４２個、１２個～４１個、１２個～４０個、１２個～３９個、１２個～３８個、１２個～３７個、１２個～３６個、１２個～３５個、１２個～３４個、１２個～３３個、１２個～３２個、１２個～３１個、１２個～３０個、１２個～２９個、１２個～２８個、１２個～２７個、１２個～２６個、１２個～２５個、１２個～２４個、１２個～２３個、１２個～２２個、１２個～２１個、１２個～２０個、１２個～１９個、１２個～１８個、１２個～１７個、１２個～１６個、１２個～１５個、１２個～１４個、又は１２個～１３個であり得る。
本発明において、前記切断因子は、例えば、互いに異なる配列を有する互いに異なる配列を有する１４個～６０個、例えば、互いに異なる配列を有する１４個～５９個、１４個～５８個、１４個～５７個、１４個～５６個、１４個～５５個、１４個～５４個、１４個～５３個、１４個～５２個、１４個～５１個、１４個～５０個、１４個～４９個、１４個～４８個、１４個～４７個、１４個～４６個、１４個～４５個、１４個～４４個、１４個～４３個、１４個～４２個、１４個～４１個、１４個～４０個、１４個～３９個、１４個～３８個、１４個～３７個、１４個～３６個、１４個～３５個、１４個～３４個、１４個～３３個、１４個～３２個、１４個～３１個、１４個～３０個、１４個～２９個、１４個～２８個、１４個～２７個、１４個～２６個、１４個～２５個、１４個～２４個、１４個～２３個、１４個～２２個、１４個～２１個、１４個～２０個、１４個～１９個、１４個～１８個、１４個～１７個、１４個～１６個、又は１４個～１５個であり得る。
本発明において、前記切断因子は、例えば、互いに異なる配列を有する１６個～６０個、例えば、互いに異なる配列を有する１６個～５９個、１６個～５８個、１６個～５７個、１６個～５６個、１６個～５５個、１６個～５４個、１６個～５３個、１６個～５２個、１６個～５１個、１６個～５０個、１６個～４９個、１６個～４８個、１６個～４７個、１６個～４６個、１６個～４５個、１６個～４４個、１６個～４３個、１６個～４２個、１６個～４１個、１６個～４０個、１６個～３９個、１６個～３８個、１６個～３７個、１６個～３６個、１６個～３５個、１６個～３４個、１６個～３３個、１６個～３２個、１６個～３１個、１６個～３０個、１６個～２９個、１６個～２８個、１６個～２７個、１６個～２６個、１６個～２５個、１６個～２４個、１６個～２３個、１６個～２２個、１６個～２１個、１６個～２０個、１６個～１９個、１６個～１８個、又は１６個～１７個であり得る。
本発明において、前記切断因子は、例えば、互いに異なる配列を有する１８個～６０個、例えば、互いに異なる配列を有する１８個～５９個、１８個～５８個、１８個～５７個、１８個～５６個、１８個～５５個、１８個～５４個、１８個～５３個、１８個～５２個、１８個～５１個、１８個～５０個、１８個～４９個、１８個～４８個、１８個～４７個、１８個～４６個、１８個～４５個、１８個～４４個、１８個～４３個、１８個～４２個、１８個～４１個、１８個～４０個、１８個～３９個、１８個～３８個、１８個～３７個、１８個～３６個、１８個～３５個、１８個～３４個、１８個～３３個、１８個～３２個、１８個～３１個、１８個～３０個、１８個～２９個、１８個～２８個、１８個～２７個、１８個～２６個、１８個～２５個、１８個～２４個、１８個～２３個、１８個～２２個、１８個～２１個、１８個～２０個、又は１８個～１９個であり得る。
本発明において、前記切断因子は、例えば、互いに異なる配列を有する２０個～６０個、例えば、互いに異なる配列を有する２０個～５９個、２０個～５８個、２０個～５７個、２０個～５６個、２０個～５５個、２０個～５４個、２０個～５３個、２０個～５２個、２０個～５１個、２０個～５０個、２０個～４９個、２０個～４８個、２０個～４７個、２０個～４６個、２０個～４５個、２０個～４４個、２０個～４３個、２０個～４２個、２０個～４１個、２０個～４０個、２０個～３９個、２０個～３８個、２０個～３７個、２０個～３６個、２０個～３５個、２０個～３４個、２０個～３３個、２０個～３２個、２０個～３１個、２０個～３０個、２０個～２９個、２０個～２８個、２０個～２７個、２０個～２６個、２０個～２５個、２０個～２４個、２０個～２３個、２０個～２２個、又は２０個～２１個であり得る。
本発明において、前記切断因子は、例えば、互いに異なる配列を有する２２個～６０個、例えば、互いに異なる配列を有する２２個～５９個、２２個～５８個、２２個～５７個、２２個～５６個、２２個～５５個、２２個～５４個、２２個～５３個、２２個～５２個、２２個～５１個、２２個～５０個、２２個～４９個、２２個～４８個、２２個～４７個、２２個～４６個、２２個～４５個、２２個～４４個、２２個～４３個、２２個～４２個、２２個～４１個、２２個～４０個、２２個～３９個、２２個～３８個、２２個～３７個、２２個～３６個、２２個～３５個、２２個～３４個、２２個～３３個、２２個～３２個、２２個～３１個、２２個～３０個、２２個～２９個、２２個～２８個、２２個～２７個、２２個～２６個、２２個～２５個、２２個～２４個、又は２２個～２３個であり得る。
本発明において、前記切断因子は、例えば、互いに異なる配列を有する２４個～６０個、例えば、互いに異なる配列を有する２４個～５９個、２４個～５８個、２４個～５７個、２４個～５６個、２４個～５５個、２４個～５４個、２４個～５３個、２４個～５２個、２４個～５１個、２４個～５０個、２４個～４９個、２４個～４８個、２４個～４７個、２４個～４６個、２４個～４５個、２４個～４４個、２４個～４３個、２４個～４２個、２４個～４１個、２４個～４０個、２４個～３９個、２４個～３８個、２４個～３７個、２４個～３６個、２４個～３５個、２４個～３４個、２４個～３３個、２４個～３２個、２４個～３１個、２４個～３０個、２４個～２９個、２４個～２８個、２４個～２７個、２４個～２６個、又は２４個～２５個であり得る。
本発明において、前記切断因子は、例えば、互いに異なる配列を有する２６個～６０個、例えば、互いに異なる配列を有する２６個～５９個、２６個～５８個、２６個～５７個、２６個～５６個、２６個～５５個、２６個～５４個、２６個～５３個、２６個～５２個、２６個～５１個、２６個～５０個、２６個～４９個、２６個～４８個、２６個～４７個、２６個～４６個、２６個～４５個、２６個～４４個、２６個～４３個、２６個～４２個、２６個～４１個、２６個～４０個、２６個～３９個、２６個～３８個、２６個～３７個、２６個～３６個、２６個～３５個、２６個～３４個、２６個～３３個、２６個～３２個、２６個～３１個、２６個～３０個、２６個～２９個、２６個～２８個、又は２６個～２７個であり得る。
本発明において、前記切断因子は、例えば、互いに異なる配列を有する２８個～６０個、例えば、互いに異なる配列を有する２８個～５９個、２８個～５８個、２８個～５７個、２８個～５６個、２８個～５５個、２８個～５４個、２８個～５３個、２８個～５２個、２８個～５１個、２８個～５０個、２８個～４９個、２８個～４８個、２８個～４７個、２８個～４６個、２８個～４５個、２８個～４４個、２８個～４３個、２８個～４２個、２８個～４１個、２８個～４０個、２８個～３９個、２８個～３８個、２８個～３７個、２８個～３６個、２８個～３５個、２８個～３４個、２８個～３３個、２８個～３２個、２８個～３１個、２８個～３０個、又は２８個～２９個であり得る。
本発明において、前記切断因子は、例えば、互いに異なる配列を有する３０個～６０個、例えば、互いに異なる配列を有する３０個～５９個、３０個～５８個、３０個～５７個、３０個～５６個、３０個～５５個、３０個～５４個、３０個～５３個、３０個～５２個、３０個～５１個、３０個～５０個、３０個～４９個、３０個～４８個、３０個～４７個、３０個～４６個、３０個～４５個、３０個～４４個、３０個～４３個、３０個～４２個、３０個～４１個、３０個～４０個、３０個～３９個、３０個～３８個、３０個～３７個、３０個～３６個、３０個～３５個、３０個～３４個、３０個～３３個、３０個～３２個、又は３０個～３１個であり得る。
本発明において、前記切断因子は、例えば、互いに異なる配列を有する６０個、５９個、５８個、５７個、５６個、５５個、５４個、５３個、５２個、５１個、５０個、４９個、４８個、４７個、４６個、４５個、４４個、４３個、４２個、４１個、４０個、３９個、３８個、３７個、３６個、３５個、３４個、３３個、３２個、３１個、３０個、２９個、２８個、２７個、２６個、２５個、２４個、２３個、２２個、２１個、２０個、１９個、１８個、１７個、１６個、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、又は４個を含むことができる（数字の間の範囲も含む）。
前記切断因子は、例えば、５個～３０個であり得る。前記切断因子は、例えば、互いに異なる配列を有する３０個、２９個、２８個、２７個、２６個、２５個、２４個、２３個、２２個、２１個、２０個、１９個、１８個、１７個、１６個、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個又は５個を含むことができる。前記切断因子は、正常細胞の塩基配列と比較して、細胞の死滅を誘導できる十分な数字でなければならなく、互いに異なる配列を有する４個～３０個であり得る。前記切断因子は、例えば、互いに異なる配列を有する３０個、２９個、２８個、２７個、２６個、２５個、２４個、２３個、２２個、２１個、２０個、１９個、１８個、１７個、１６個、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個又は４個を含むことができる。
切断因子がターゲットとする染色体が二倍体（ｄｉｐｌｏｉｄ）及び／又は三倍体（ｔｒｉｐｌｏｉｄ）であるかどうかによって、各切断因子がターゲットとする配列を２個及び／又は３個含むことができる。よって、切断因子によって誘導される二重鎖切断（ＤＳＢ）は、細胞の死滅を誘導できる切断因子の数の２倍及び／又は３倍であり得る。例えば、互いに異なる配列を有する５個の切断因子を含む場合、細胞死滅のために１０個乃至１５個の二重鎖切断（ＤＳＢ）が必要である。
前記ガイドＲＮＡは、次のような段階を通じて製作することができる：ゲノム配列変異を有する細胞と一般細胞のＷＧＳ結果データを比較して、ゲノム配列変異を有する細胞固有の変異配列を見出す。これに基づいて、ガイドＲＮＡ製作条件に充足したゲノム配列変異を有する細胞固有の変異配列特異的なガイドＲＮＡを設計する。その後、ゲノム配列変異を有する細胞固有の変異サイトの長さを考慮して任意的順位を付与し、全ての染色体（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）に均一にガイドＲＮＡが設計できるようにし、最終のガイドＲＮＡ組み合わせを完成する。
ガイドＲＮＡの製作条件は次の通りである。（ａ）ＰＡＭサイトを除いたガイドＲＮＡの塩基配列の長さは２０塩基（ｂａｓｅ ｐａｉｒ）である。（ｂ）ガイドＲＮＡに存在するグアニン（ｇｕａｎｉｎｅ）とシトシン（ｃｙｔｏｓｉｎｅ）との和の比率が４０％から６０％である。（ｃ）ゲノム配列変異を有する細胞固有の変異配列がＰＡＭサイト付近の直ぐ前の領域に存在する。（ｄ）最大単一重合体（ｈｏｍｏｐｏｌｙｍｅｒ）の長さが４塩基（ｂａｓｅ ｐａｉｒ）以下である。（ｅ）正常細胞のＷＧＳ結果データに一つの不一致（ｍｉｓｍａｔｃｈ）を許容するマッピングをしたとき、マッピング結果があってはならない。
細胞株特異的なＩｎＤｅｌをＷＧＳを通じて全ゲノム解読して確認した後、該当の領域を強く結合するＰＡＭサイト領域に含ませるようにガイドＲＮＡを設計する。設計されたガイドＲＮＡは、正常を代表するヒトの標準ゲノムで確認し、非特異的反応がないことを確認する。その後、ＩｎＤｅｌサイトの長さを考慮して任意的順位を付与し、これに基づいて全ての染色体（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）に均一にガイドＲＮＡが設計できるようにし、最終のガイドＲＮＡ組み合わせを完成する。ガイドＲＮＡの数は、ゲノム配列変異を有する細胞の種類及びＤＳＢを起こす実験方法によって調整可能である。
４．核酸切断酵素
このようなＤＮＡ二重鎖切断の手段である核酸切断酵素は、制限酵素（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ）、ＺＮＦＮ（ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ）、ＴＡＬＥＮ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖａｔｏｒ－ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ）又はＣａｓタンパク質であり得るが、これに制限されるのではない。前記Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１２ｊ、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃａｓ１４、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、ＣｓＭＴ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３又はＣｓｆ４のエンドヌクレアーゼであり得るが、これに制限されるのではない。
前記Ｃａｓタンパク質は、コリネバクター（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ）、ステレラ（Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ）、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、フィリファクター（Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ）、ユーバクテリウム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、フラビイボラ（Ｆｌａｖｉｉｖｏｌａ）、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アゾスピリルム（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、グルコナセトバクター（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ロセブリア（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ）、パルビバクラム（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、ニトラティフラクター（Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）及びカンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）からなる群から選ばれるＣａｓタンパク質のオーソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）を含む微生物属から由来し、これらから単純分離されたもの又は組み換えられたものであり得る。
５．伝達手段
ゲノム配列変異を有する細胞特異的変異領域配列のうち、正常細胞には存在しない固有の配列を含む核酸配列を特異的に認識する複数個の切断因子又はこれをコードするポリヌクレオチド、及び核酸切断酵素又はこれをコードするポリヌクレオチドを含む一つ以上の伝達手段を含むことができる。
前記伝達手段と関連して、複数個の切断因子又はこれをコードするポリヌクレオチド、及び核酸切断酵素又はこれをコードするポリヌクレオチドは、同一又は異なる伝達手段に位置し得る。
遺伝的変異細胞を選択的に死滅させるときに発生する代表的な副作用は、オフターゲット（ＯＦＦ－Ｔａｒｇｅｔ）効果である。これは、正常細胞のＤＮＡ配列を遺伝的変異細胞のＩｎＤｅｌと誤って認識して切断する場合に発生し得る。このようなエラーを減少させるためには、ＩｎＤｅｌの配列を長くすることが好ましい。ＣＡＳ９の場合、通常、１７個～２１個の配列の長さのガイドＲＮＡを搭載することができる。
このようなオフターゲット効果と共に、細胞内の多量の形質導入による副作用、すなわち、毒性効果を低下させるために、その細胞死滅誘導用組成物の投与量を最小化する必要がある。最近、遺伝子治療の発展により、遺伝子を細胞に導入する多くの方法が開発された。そして、遺伝子を導入する多くの方法のうちウイルスベクター（ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ）を使用する方法の導入においては、人体に有害でないように導入する遺伝子を伝達（ｄｅｌｉｖｅｒｙ）するための毒性の有無も活発に研究された。このような研究は、細胞に導入される酵素の数を減少させる方法でも達成され得る。これは、誘導用組成物がＲＮＰ複合体である場合は、ＲＮＰ複合体の投与量を最小化しなければならないか、誘導用組成物がベクターを活用して形質転換させるものであれば、ベクターの投与量が最小化されることを意味する。
ｉ）１つ目の場合、ＲＮＰ複合体の切断酵素が多数個の切断因子を発現できると、投入されるＲＮＰ複合体の個数を減少させることができる。特に、ＣＡＳ１２、ＣＡＳΦの場合は、複数個のガイドＲＮＡを一つのラインに挿入することができ、複数個の切断因子を一つのＲＮＰ複合体に含ませることができる。
ｉｉ）２つ目の場合は、ベクターに複数個の切断因子を発現させるガイドＲＮＡを含ませれるとよい。
上記のような方法を活用する場合、細胞死滅誘導用組成物の投与量を減少させ、毒性効果を減少できるという効果が獲得される。これと共に、このような発明の場合、それぞれの細胞に導入される各切断因子が同一であるので、細胞死滅作用の統一性（ｕｎｉｆｏｒｍｉｔｙ）を高めることができるが、以下では、これについて説明する。
切断因子ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆの合計５個が細胞死滅に必要であれば、それぞれの切断因子に対応する切断酵素（Ａ）が細胞に全部投与されたり、形質転換されなければならない。一つの細胞に５個の切断酵素が投入されたとしても、全ての切断因子が投入されないので、細胞死滅に帰結しない場合がある。この場合、細胞死滅を確実に発生させるためには、細胞に導入される切断酵素の平均的個数が５個以上である必要がある。ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆを切断因子として認識する切断酵素を活用する場合、その酵素の一つのみが細胞に投入されたとしても、細胞死滅は行われ得る。これと同様に、５個の他の種のベクターを活用することなく、５個の切断因子を発現する一つのベクターのみが細胞に投入されたとしても、その細胞は十分に死滅させることができる。よって、本発明を通じて細胞内に投入されて発現される切断酵素の量を減少させ、毒性を効果的に減少させ、細胞死滅効果の正確度又は統一性（ｕｎｉｆｏｒｍｉｔｙ）を大幅に向上させることができる。これを可能にするＣＡＳ１２、ＣＡＳΦの使用は、効果を高めるものであると考えられる（Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０２０）３６９：３３３）。
また、ウイルス伝達（ｖｉｒａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）の他に、ナノ粒子（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）を用いてＲＮＰ複合体を伝達する方法で細胞死滅を誘導することができる。ナノ粒子を用いる場合は、ナノ粒子の外側に癌細胞に特異的に結合するペプチドを結合し、正常細胞にもたらされ得る副作用を最小化することができる。ペプチドとしては、癌細胞を特異的にターゲットとするＲＰＡＲＰＡＲペプチドなどを含んで使用することができる（Ｓｕｇａｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ（２００９）１６：５１０－５２０）。
前記伝達手段は、例えば、ウイルス伝達手段であり得る。ウイルス伝達手段は、ウイルスベクターを含むことができる。ウイルスベクターは、例えば、ＡＡＶ（Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ）、ＡｄＶ（Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ）、ＬＶ（Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ）又はＲＶ（Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ）を含み得るが、これに制限されない。
前記伝達手段は、例えば、非ウイルス伝達手段であり得る。非ウイルス伝達手段は、例えば、ウイルスレプリコンを含むエピソーマルベクターを含むことができる。非ウイルス伝達手段は、ｍＲＮＡ形態の伝達、ＲＮＰ（Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ）又はキャリアによる伝達を含むことができる。ｍＲＮＡ形態の伝達として、合成修飾（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｍｏｄｉｆｉｅｄ）ｍＲＮＡ又はｓｒＲＮＡ （ｓｅｌｆ－ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ ＲＮＡ）を含むことができる。キャリアとして、ナノ粒子、細胞透過ペプチド（ＣＰＰ）又は重合体を含むことができる。
本発明で使用可能な伝達手段は、例えば、ベクターを含むことができる。「ベクター」は、連結された他の核酸を輸送できる核酸分子を称する。例えば、単一鎖、二重鎖又は部分的二重鎖である核酸分子；一つ以上の自由末端、非自由末端（例えば、環形）を含む核酸分子；ＤＮＡ、ＲＮＡ又はこれらの二つを全て含む核酸分子；及び当業界に公知となっている他の多様なポリヌクレオチド；を含む。
例えば、前記ベクターは、「プラスミド」であって、環形の二重鎖ＤＮＡループを称するものであって、これに、例えば、標準分子クローニング技法によって追加的なＤＮＡセグメントが挿入され得る。
本発明で使用可能なウイルス伝達手段は、例えば、ウイルスベクターを含むことができる。前記ウイルスベクターは、例えば、ＡＡＶ（Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ）、ＡｄＶ（Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ）、ＬＶ（Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ）又はＲＶ（Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ）を含むことができる（Ａｃｔａ Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｐｏｌ．２００５，５２（２）：２８５－２９１．及びＢｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．２０２０ Ｊｕｎ，１０（６）：８３９.）。
ウイルスベクターの場合、ウイルス－誘導されたＤＮＡ又はＲＮＡ配列は、ウイルス（例えば、レトロウイルス、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、複製欠損アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）では、ウイルス内にパッケージングするためのベクターに存在する。ウイルスベクターは、宿主細胞内への形質感染のためのウイルスによって運搬されたポリヌクレオチドを含む。
場合によって、ベクターは、導入される宿主細胞で自律複製することができる（例えば、バクテリア複製Ｏｒｉを有するバクテリアベクター及びエピソーマル哺乳類ベクター）。その他のベクター（例えば、ノンエピソーマル哺乳動物ベクター）は、宿主細胞内への導入時、宿主細胞のゲノムに統合され、これによって宿主ゲノムと共に複製される。
特定のベクターは、これらが作動可能に連結された遺伝子の発現を指示することができる。このようなベクターは、本願で「発現ベクター」と称される。組換えＤＮＡ技術で有用な一般的な発現ベクターは、度々プラスミド形態である。
組換え発現ベクターは、宿主細胞で核酸の発現に適した形態で核酸を含むことができ、これは、組換え発現ベクターが発現のために使用されるように、すなわち、発現される核酸配列に作動可能に連結されるように宿主細胞を基盤にして選択され得る一つ以上の調節要素を含むことを意味する。
組換え発現ベクター内で、「作動可能に連結された」は、関心ヌクレオチド配列がヌクレオチド配列の発現を許容する方式で（例えば、試験管内転写／翻訳システムで又はベクターが宿主細胞内に導入される場合は宿主細胞で）調節要素に連結されることを意味する。
「調節要素」は、プロモーター、エンハンサー、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、及びその他の発現調整要素（例えば、転写終決信号、例えば、ポリアデニル化信号及びポリ－Ｕ配列）を含むことができる。調節要素は、多くの類型の宿主細胞でヌクレオチド配列の誘導、又は常に発現を指示する要素及び特定の宿主細胞でのみヌクレオチド配列の発現を指示する要素（例えば、組織－特異的調節配列）を含む。組織－特異的プロモーターは、要望される関心組織、例えば、筋肉、ニューロン、骨、皮膚、血液、特定の器官（例えば、肝、膵臓）、又は特定の細胞類型（例えば、リンパ球）で主に発現を指示することができる。また、調節要素は、組織又は細胞－類型特異的であったり、組織又は細胞－類型特異的でない細胞－周期依存性又は発達段階－依存的方式などの一時的－依存的方式で発現を指示することができる。
場合によって、ベクターは、一つ以上のｐｏｌ IIIプロモーター、一つ以上のｐｏｌ IIプロモーター、一つ以上のｐｏｌ Ｉプロモーター、又はこれらの組み合わせを含む。ｐｏｌ IIIプロモーターの例は、非制限的にＵ６及びＨ１プロモーターを含む。ｐｏｌ IIプロモーターの例は、非制限的に、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意にＲＳＶエンハンサーを有する）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（選択的にＣＭＶエンハンサーを有する）（例えば、Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ（１９８５）Ｃｅｌｌ ４１：５２１－５３０）、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター、β－アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター及びＥＦ１αプロモーターを含む。
「調節要素」には、エンハンサー、例えば、ＷＰＲＥ；ＣＭＶエンハンサー；ＨＴＬＶ－ＩのＬＴＲでのＲ－Ｕ５’セグメント；ＳＶ４０エンハンサー；及びウサギβ－グロビンのエクソン２とエクソン３との間のイントロン配列などが含まれ得る。発現ベクターのデザインは、形質転換される宿主細胞の選択、要望される発現水準などの因子に左右され得ることが当業者によって認識され得る。ベクターは、宿主細胞内に導入され、本願に記載したような核酸によってエンコードされる融合タンパク質又はペプチドを含む転写物、タンパク質又はペプチドを生成することができる（例えば、クラスター化された規則的間隔の短い回文の反復部（ＣＲＩＳＰＲ）転写物、タンパク質、酵素、その突然変異体、その融合タンパク質など）。有益なベクターは、レンチウイルス及びアデノ随伴ウイルスを含み、このようなベクターの類型は、特定の類型の細胞を標的化するために選択され得る。
「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」及び「オリゴヌクレオチド」は相互交換的に使用される。任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド、又はこれらの類似体を含むことができる。ポリヌクレオチドは、任意の３次元構造を有することができ、公知又は非公知の任意の機能を行うことができる。ポリヌクレオチドは、一つ以上の修飾したヌクレオチド、例えば、メチル化されたヌクレオチド及びヌクレオチド類似体を含むことができる。ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーのアセンブリー前又は後に可能である。
ベクターは、原核細胞又は真核細胞で本発明に係る核酸切断酵素（例えば、核酸転写物、タンパク質又は酵素）及び切断因子の発現のために設計され得る。例えば、核酸切断酵素及び切断因子転写物は、大腸菌などのバクテリア細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクター使用）、酵母細胞、又は哺乳類細胞で発現され得る。場合によって、組換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列及びＴ７重合酵素を使用して試験管内で転写されて翻訳され得る。
ベクターは、原核生物で導入されて増殖され得る。一部の具現例において、原核生物は、真核細胞内に導入されるベクターの複製体を増幅させるために、又は真核細胞に導入されるベクターの生成で中間ベクターとして使用され得る（例えば、ウイルスベクターパッケージングシステムの一部としてプラスミドを増幅させる）。原核生物は、ベクターの複製物を増幅させ、一つ以上の核酸を発現させ、例えば、宿主細胞又は宿主有機体に伝達するための一つ以上のタンパク質の供給源を提供するために使用され得る。原核生物でのタンパク質の発現は、恒常性又は誘導性プロモーターを含む、ベクターを有する大腸菌で行われ得る。
前記ベクターは、それぞれ電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、リポフェクション、ウイルスベクター、ナノ粒子のみならず、ＰＴＤ（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ）融合タンパク質方法などを通じて生体内又は細胞内に伝達され得る。
Ａ．ウイルスベクター
ＡＡＶは、細胞及び動物モデルを対象にしてｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子の編集に使用され得る。ＩＴＲ（逆方向末端反復配列）を追加することができる。ＩＴＲは、ＡＡＶゲノム及び／又は目的とする導入遺伝子に位置し、複製起点として作用し得る。Ｒｅｐ及び／又はｃａｐタンパク質が転写され、ターゲット細胞に伝達するためのＡＡＶゲノムをカプセル化できるようにカプシドを形成する。このようなカプシド上の表面収受容体がＡＡＶセロタイプ（ｓｅｒｏｔｙｐｅ）を決定する。
ＡｄＶは、二重ＤＮＡ鎖を遺伝物質とし、細胞及び動物モデルを対象にしてｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子の編集に使用され得る。ＬＶは、ランダム統合（ｒａｎｄｏｍ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）及び挿入突然変異（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎａｌ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）によってがん遺伝子（ｏｎｃｏｇｅｎｅ）に統合される場合、腫瘍発生可能性が高いので、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｅｘ ｖｉｖｏでのみ使用可能である（Ｐｏｐｅｓｃｕ Ｎ．Ｃ．，Ｚｉｍｏｎｊｉｃ Ｄ．，ＤｉＰａｏｌｏ Ｊ．Ａ．Ｖｉｒａｌ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ，ｆｒａｇｉｌｅ ｓｉｔｅｓ，ａｎｄ ｐｒｏｔｏ－ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｎｅｏｐｌａｓｉａ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１９９０，８４：３８３－３８６．）。ＲＶを用いて、遺伝子伝達を通じた疾病治療を臨床的に試みたことが報告された（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．２００８，１１８：３１３２－３１４２．）。
（１）ＡＡＶ
ＡＡＶは、ｓｓＤＮＡを遺伝物質として含み、約～４．７ｋｂのパッケージング容量を有する。ＡＡＶは、細胞及び動物モデルを対象にしてｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子の編集時に最も多く使用されている（Ｖｉｒｕｓｅｓ ２０１９，１１，２８，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２００８，８，１４７－１６１）。
ＡＡＶのゲノムは、線形の単一鎖ＤＮＡであって、長さは約４．７ｋｂである。ＡＡＶゲノムの両末端には、ＩＴＲｓ（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔｓ）と呼ばれるヘアピン（ｈａｉｒｐｉｎ）構造が存在する。ＩＴＲは、ＡＡＶゲノムの複製とＡＡＶ粒子のパッケージングに関与する。
ＡＡＶ基盤のベクターは、ターゲット細胞での形質感染及びゲノムを核に位置させるためのウイルス機能は維持し、ＡＡＶの複製及び子孫生成能は欠けた状態である。ＡＡＶは、ヒトには免疫原性がないものと知られており、ＡＡＶベクターは、他のウイルス伝達システムに比べて免疫原性が低い。
ＡＡＶゲノムは、ほとんどがエピソームに残留し、癌を生成しないミトコンドリアＤＮＡ及びＡＡＶＳ１染色体１９に一部が統合され得る。非分裂細胞（Ｎｏｎ－ｄｉｖｉｄｉｎｇ ｃｅｌｌｓ）で、長期間安定的に導入遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）を発現可能である。
特定の組織において、ＣＲＩＳＰＲ編集に適した多様なセロタイプが存在する。ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、又はＡＡＶ９のセロタイプを含むことができる。
Figure 2023517992000002
ＡＡＶは、パッケージング容量（Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｃａｐａｃｉｔｙ）が～４．７Ｋｂ程度であるので、導入遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）コーディング遺伝子のパッケージングに困難がある。サイズが大きな核酸切断酵素を使用する場合、遺伝子の治療で最も広く使用される伝達システムであるＡＡＶのパッケージング限界を考慮して、適用可能な方法を探そうとする試みがある。
本発明に係る組成物の効率的伝達のために、二重（ｄｕａｌ）又はそれ以上のＡＡＶシステムを適用することができる。二重又はそれ以上のＡＡＶシステムを製作するための方法は、例えば、断片化ベクター（ｆｒａｇｍｅｎｔｅｄ ｖｅｃｔｏｒ）、重複ベクター（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒ）、トランススプライシングベクター（ｔｒａｎｓ－ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒ）又はハイブリッドベクター（ｈｙｂｒｉｄ ｖｅｃｔｏｒ）の製作を含むことができる（Ｖｉｒｕｓｅｓ ２０１９，１１，２８）。
断片化ベクター（Ｆｒａｇｍｅｎｔｅｄ ｖｅｃｔｏｒ）は、特定の地点で導入遺伝子を切り取った（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）後、各断片を別途のＡＡＶにパッケージングする方法で製作することができ、重畳する導入遺伝子のＨＲ（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）を通じて完全な導入遺伝子を生産することができる。重複ベクター（Ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒ）は、指定された重複を含む導入遺伝子を通じてＨＲを誘導する方法で製作することができ、導入遺伝子の末端にＩＴＲ（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含ませ、二重ＡＡＶが細胞に形質感染されるとＩＴＲが集合され、ＨＲが発生し得る。トランススプライシングベクター（ｔｒａｎｓ－ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒ）は、重複を含まないが、スプライスドナー（ｓｐｌｉｃｅ ｄｏｎｏｒ）／スプライス受容部位（ｓｐｌｉｃｅ ａｃｃｅｐｔｏｒ ｓｉｔｅ）によって分離された導入遺伝子の断片を含んで製作することができ、ゲノムのスプライシングメカニズムによって導入遺伝子の断片を連結させることができる。ハイブリッドベクター（ｈｙｂｒｉｄ ｖｅｃｔｏｒ）は、重複部位及びスプライスドナー（ｓｐｌｉｃｅ ｄｏｎｏｒ）／スプライス受容部位（ｓｐｌｉｃｅ ａｃｃｅｐｔｏｒ ｓｉｔｅ）を含み、重複及びトランススプライシング（ｔｒａｎｓ－ｓｐｌｉｃｉｎｇ）機能を組み合わせて製作することができ、目的とする導入遺伝子産物は、二重ベクター（ｄｕａｌ ｖｅｃｔｏｒ）での共同感染、スプライスドナー（ｓｐｌｉｃｅ ｄｏｎｏｒ）／スプライス受容部位（ｓｐｌｉｃｅ ａｃｃｅｐｔｏｒ ｓｉｔｅ）によるスプライシング及び重複部位によるＨＲを通じて製造することができる。
ＡＡＶシステムに効率的に適用するために核酸切断酵素を使用する場合、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが適用され得る。前記Ｃａｓは、例えば、スプリット（ｓｐｌｉｔ）ＳｐＣａｓ９、ＳａＣａｓ９、ＣｊＣａｓ９、Ｃａｓ１２ａ又はＣａｓ１２ｊなどであり得る。
スプリット（Ｓｐｌｉｔ）Ｃａｓ９は、１，３６８アミノ酸、４．１０ｋｂｐのストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）を対象とする。２個のＡＡＶベクターに、２個に分離されたスプリットＳｐＣａｓ９のそれぞれをパッケージングすることができる。ただし、元のＳｐＣａｓ９に比べて活性が低くなり得るという短所があり、ｉｎ ｖｉｖｏでの２個のＡＡＶベクターによる伝達効率が単一のＡＡＶベクターに比べて低くなり得る。
ＳａＣａｓ９は、１，０５３アミノ酸、３．１６ｋｂｐのスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来のＣａｓ９（ＳａＣａｓ９）であって、ＳａＣａｓ９をｓｇＲＮＡと共に単一のＡＡＶにパッケージングすることができる。ただし、２個以上のｓｇＲＮＡと共にパッケージングするには空間が不足し得る。ＳａＣａｓ９によって認知されるＰＡＭ（ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ－ａｄｊａｃｅｎｔ ｍｏｔｉｆ）配列５’－ＮＮＧＲＲＴ－３’は、ＳｐＣａｓ９のＰＡＭ配列である５’－ＮＧＧ－３’に比べて低い頻度で存在し、ターゲットサイトの設定に制限があり得る。
ＣｊＣａｓ９は、９８４アミノ酸、２．９５ｋｂｐのカンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）由来のＣａｓ９であって、５’－ＮＮＮＮＡＣＡＣ－３’をＰＡＭとして認知することができる。
Ｃａｓ１２ａ（タイプ－Ｖ Ｃｐｆ１）は、ラクノスピラセ・バクテリウム（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＮＤ２００６（ＬｂＣｐｆ１）由来と、アシダミノコッカス（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）ｓｐ．ＢＶ３Ｌ６（ＡｓＣｐｆ１）由来とに区分され得る。Ｃａｓ１２ａは、３．９ｋｂ Ｔヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）－リッチ（ｒｉｃｈ）ＰＡＭサイト（５’－ＴＴＴＶ）、ｃｒＲＮＡ成熟（ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）の自触作用（ｓｅｌｆ－Ｃａｔａｌｙｓｉｓ）、段違い（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ）ｄｓＤＮＡ切断（ｃｕｔ）を含み、ＮＨＥＪ（ｎｏｎ－ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｅｎｄ ｊｏｉｎｉｎｇ）を通じて遺伝子が挿入され得る。Ｃａｓ１２ａ（タイプ－Ｖ Ｃｐｆ１）は、哺乳動物細胞において、ＳｐＣａｓ９に比べて高い標的特異性（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）を有するものと知られている。
場合によって、ベクター間のトランスフェクションの比率差及び発現率差を最小化するために、核酸切断酵素をコードする核酸と、切断因子である複数個のガイドＲＮＡを一つのベクターにクローニングし、生体内又は細胞内にトランスフェクションすることができる。このとき、核酸切断酵素としてＣｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）を含むことができる。この場合、単一のプロモーターを使用してｃｒＲＮＡの発現を誘導することができる。
Ｃａｓ１２ａによる癌特異的挿入－欠失標的化細胞死滅（Ｃａｎｃｅｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩＮｓｅｒｔｉｏｎ－ＤＥＬｅｔｉｏｎ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ：ＣＩＮＤＥＬＡ）を誘導することができる。これを通じて、癌細胞を殺す程度にベクターの数を最小化することができる。Ｃａｓ１２ａは、癌特異的な挿入と欠失を標的とし、ＤＮＡ二重鎖切断を生成し、これを通じて細胞死滅を誘導するのに使用することができる。
Ｃａｓ１２ａは、単一のガイドＲＮＡによってガイドされるプログラム可能なＤＮＡエンドヌクレアーゼである。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９の場合、各ｓｇＲＮＡは、一般的に個別ベクター又は各ｓｇＲＮＡ自身のプロモーターを必要とするマルチカセットベクターで発現される。対照的に、Ｃａｓ１２ａを通じた多重ゲノム編集は、Ｃａｓ１２ａ自体によって個別ｃｒＲＮＡを処理し、一つのトランスクリプトとしてガイドＲＮＡを発現させることができる。
例えば、ｐＣＥ０４８－ＳｉＴ－Ｃａｓ１２ａベクターを使用して、一つのベクターとして多くのガイドＲＮＡを誘導することができる。ベクターの数を最小化し、癌細胞を除去し、癌特異的挿入－欠失標的化細胞死滅の効率性を改善することができる。
Ｃａｓ１２ｊは、単一（ｓｉｎｇｌｅ）～７０Ｋｄａ ＣａｓΦであって、Ｃａｓ９／Ｃａｓ１２ａに比べて分子量が半分である。Ｃａｓ１２ｊは、５’ＴＢＮ ３’ＰＡＭを認識（Ｂは、Ｇ、Ｔ又はＣ）し、ｔｒａｃｒＲＮＡなしで、ｃｒＲＮＡ相補的ＤＮＡを切断可能である。このような特徴に基づいて、コンパクトシステム（ｃｏｍｐａｃｔ ｓｙｓｔｅｍ）を提供することができる。
国際公開特許ＷＯ２０１６／１７６１９１には、遺伝疾患治療のためのデュアルベクターシステムが記載されている。ベクターシステムは、ＡＡＶベクターであって、Ｃａｓ９遺伝子を含むＡＡＶベクター及び一つ以上のｓｇＲＮＡを含むＡＡＶベクターを含むことができる。このとき、前記Ｃａｓ９遺伝子を含むＡＡＶベクターと、一つ以上のｓｇＲＮＡを含むＡＡＶベクターとの含有比率と関連して、ｓｇＲＮＡを含むＡＡＶベクターが、Ｃａｓ９遺伝子を含むＡＡＶベクターを超えることができる。例えば、一つ以上のｓｇＲＮＡを含むＡＡＶベクターに対するＣａｓ９遺伝子を含むＡＡＶベクターの比率は、約１：３乃至約１：１００、具体的には、約１：１０であり得る。ドナーテンプレートに対する核酸切断酵素（例えば、Ｃａｓ９或いはＣｐｆ）の比率は、核酸切断酵素がＡＡＶベクター以外の供給源によって付加的に或いは代替的に供給される場合にも維持され得ると記載されており、本発明にも適用され得る。
ＡＡＶの適用と関連して、米国登録特許第１０５７７６３０号には、ガイドＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲエンザイムをコードする一つ以上のポリヌクレオチドを含むＡＡＶ粒子を通じて、哺乳動物の肝細胞のうち目的とするゲノム遺伝子座でのターゲット配列を編集し、哺乳動物を変形する方法が記載されている。ＡＡＶ粒子をターゲット細胞に伝達する方法を含み、ｉｎ ｖｉｖｏターゲット配列を編集することによって哺乳動物を変換できることが記載されている。ＡＡＶのパッケージングサイズを考慮して、ガイドＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲエンザイムを一度に搭載できるように、ＣＲＩＳＰＲエンザイムがＳａＣａｓ９であると記載されている。これは、本発明に係る組成物及びその伝達にも適用可能であり、参照として導入され得る。
（２）ＡｄＶ
ＡｄＶは、ｄｓＤＮＡを遺伝物質として含み、約～３５ｋｂｐのパッケージング容量を有する。ＡｄＶも、細胞及び動物モデルを対象にして遺伝子の編集に使用できることが検証された。ＡｄＶ基盤のベクターは、ターゲット細胞での形質感染及びゲノムを核に位置させるためのウイルス機能は維持し、ＡｄＶの複製及び子孫生成能は欠けた状態である（Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｉｓｅａｓｅｓ Ｖｏｌｕｍｅ ４，Ｉｓｓｕｅ ２，Ｊｕｎｅ ２０１７，Ｐａｇｅｓ ４３－６３）。
ＡｄＶは、分裂細胞（ｄｉｖｉｄｉｎｇ ｃｅｌｌ）及び非分裂細胞（ｎｏｎ－ｄｉｖｉｄｉｎｇ ｃｅｌｌ）の全てに形質感染が可能である。細胞ゲノムに統合されずに染色体の外部に存在するので、本発明に係る組成物と共に、細胞にベクターを伝達するときに目的とするターゲットサイト以外の所望でない変異が発生するオフターゲット効果を減少させることができる。
形質導入効率を高め、副作用を最小化するために、ＡｄＶを遺伝子伝達ベクターとして使用するための最適化が試みられた。
１世代ＡｄＶの場合は、ウイルス遺伝子（Ｖｉｒａｌ ｇｅｎｅ）Ｅ１を除去することによって、複製欠損ベクターに製作された。ただし、ウイルスカプシド（Ｖｉｒａｌ ｃａｐｓｉｄ）及び／又はウイルス遺伝子の発現により、依然として急性又は慢性免疫反応が発生し得る。
２世代ＡｄＶの場合は、ウイルス遺伝子（Ｖｉｒａｌ ｇｅｎｅ）Ｅ２及びＥ４を除去し、慢性免疫反応を調節しようとした。Ｅ２及びＥ４の除去により、パッケージング容量を～８ｋｂに増加させることができる。
３世代ＡｄＶの場合は、ウイルス遺伝子を全部除去し、ＩＴＲ及びカプシド形成（ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｉｏｎ）（ψ）と関連した遺伝子のみを含ませることができる。パッケージング容量を～３５ｋｂに増加させ、単一ベクターに核酸切断酵素及び複数の切断因子を全部含ませて伝達可能である。また、慢性免疫反応を誘導しない場合がある。
３世代ＡｄｖであるＨＣＡｄＶ（ｈｉｇｈ－ｃａｐａｃｉｔｙ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ）を用いてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を伝達できることが報告された（Ｎａｔｕｒｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ｖｏｌｕｍｅ ７，Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ：１７１１３（２０１７））。ＡＡＶと異なり、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの全ての構成が単一のベクターに含まれ得る。持続的又は誘導性Ｃａｓ９が発現可能であり、複数のｇＲＮＡを含むことができる。ＨＰＶ １８（ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ １８）がん遺伝子（ｏｎｃｏｇｅｎｅ）Ｅ６、ＤＭＤ（ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｇｅｎｅ ｃａｕｓｉｎｇ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）及びＣＣＲ５（ＨＩＶ ｃｏ－ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｃ－Ｃ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｐｅ ５）ターゲットＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９－ＨＣＡｄＶを製作し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９－ＨＣＡｄＶ発現ユニットがターゲットに伝達され、目的とするターゲット位置にＤＮＡ ＤＳＢが誘導され得る。これは、本発明に係る組成物及びその伝達にも適用可能であり、参照として導入され得る。
（３）ＬＶ
ＬＶは、レトロウイルス（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）ｓｓＲＮＡを遺伝物質として含み、約～８ｋｂのパッケージング容量を有する。ＬＶを通じて、外部遺伝子を希釈なしで分裂細胞（ｄｉｖｉｄｉｎｇ ｃｅｌｌｓ）に形質感染させることができる（Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｐｐ ３７９－３９１）。
ＬＶのインテグラーゼ（ｉｎｔｅｇｒａｓｅ）活性を除去し、ウイルスゲノムが統合されないようにし、これに影響を受けないと共に、転写（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）及びプレインテグレーション複合体（ｐｒｅ－ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ）を核（ｎｕｃｌｅｕｓ）の付近に運ぶ能力は維持させようとする試みがあった（ＩＤＬＶ（Ｉｎｔｅｇｒａｓｅ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ）、Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．２０１７；２０：２９８０－２９９１）。また、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム伝達と関連して、ｔｗｏ－レンチウイルス（ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９伝達を通じて、機能的（Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９配列の宿主ゲノムに統合した後、Ｃａｓ９－ターゲッティングｓｇＲＮＡを共同発現させ、Ｃａｓ９ ＯＲＦ（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）を不活性化させようとする試みがあった（Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１７；８：１５３３４）。これは、本発明に係る組成物及びその伝達にも適用可能であり、参照として導入され得る。
ＬＶは、分裂細胞（ｄｉｖｉｄｉｎｇ ｃｅｌｌ）及び非分裂細胞（ｎｏｎ－ｄｉｖｉｄｉｎｇ ｃｅｌｌ）の全てに形質感染可能である。トランスファーベクター（Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒ）、パッケージングベクター（Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒ）及びエンベロープベクター（Ｅｎｖｅｌｏｐｅ Ｖｅｃｔｏｒ）を含み、３個のベクターを共導入（ｃｏ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させ、ウイルス粒子の生成後で定量－精製し、目的とする遺伝子がうまく伝達された細胞を選別することができる。
前記トランスファーベクター（ｔｒａｎｓｆｅｒ ｖｅｃｔｏｒ）は、Ｔａｔ（遺伝子発現のための転写誘導タンパク質）結合サイト（ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ）である５’ＬＴＲ及び３’ＬＴＲ、パッケージング信号（ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｓｉｇｎａｌ）（ψ）及び導入遺伝子を含むことができる。前記パッケージングベクター（ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒ）は、複製性が除去されたパッケージング信号（Δψ）が欠失し、カプシド（ｃａｐｓｉｄ）、逆転写酵素（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）、プロテアーゼ（ｐｒｏｔｅａｓｅ）、インテグラーゼなどのような酵素が発現されるｇａｇ及び／又はｐｏｌなどのウイルス構造遺伝子を含むことができる。転写を誘導するＴａｔ及び／又はｍＲＮＡを輸送するためのＲｅｖなどのウイルス調節遺伝子（ｔａｔ及び／又はｒｅｖ）を含むことができる。前記エンベロープベクター（ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｖｅｃｔｏｒ）は、ウイルスエンベロープ（ｅｎｖｅｌｏｐｅ）発現遺伝子であるウイルス（ｖｉｒａｌ）ｅｎｖを含むことができる。
（４）ＲＶ
遺伝情報を有するＲＮＡが逆転写酵素によって二重鎖のＤＮＡに転換されたプロウイルス（ｐｒｏｖｉｒｕｓ）ＤＮＡを通じて複製が開始される。約～８ｋｂの外部遺伝子の導入が可能である。ＬＴＲを含む治療遺伝子が導入されたプラスミドをウイルス粒子化細胞株に導入し、ウイルス粒子を製造することができる。細胞株は、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖタンパク質を供給する（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ ２００４，２：９）。
トランスファーベクター（Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒ）、パッケージングベクター（Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒ）及びエンベロープベクター（Ｅｎｖｅｌｏｐｅ Ｖｅｃｔｏｒ）を含み、３個のベクターを共導入（ｃｏ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させ、ウイルス粒子の生成後に定量－精製し、目的とする遺伝子がうまく伝達された細胞を選別することができる。
前記トランスファーベクター（ｔｒａｎｓｆｅｒ ｖｅｃｔｏｒ）は、Ｔａｔ（遺伝子発現のための転写誘導タンパク質）結合サイト（ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ）である５’ＬＴＲ、３’ＬＴＲ、及び導入遺伝子を含むことができる。５’ＬＴＲ及び３’ＬＴＲを通じて、ウイルスの複製、宿主への挿入、ウイルス遺伝子の発現を誘導する。前記パッケージングベクター（ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒ）は、複製性が除去されたパッケージング信号（ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｓｉｇｎａｌ）（Δψ）が欠失し、カプシド、逆転写酵素（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）、プロテアーゼ、インテグラーゼなどのような酵素が発現されるｇａｇ及び／又はｐｏｌなどのウイルス構造遺伝子を含むことができる。前記エンベロープベクター（ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｖｅｃｔｏｒ）は、ウイルスエンベロープ発現遺伝子であるウイルス（ｖｉｒａｌ）ｅｎｖを含むことができる。
（５）その他
以外にも、例えば、ＷＯ２０１７／２２３３３０に記載したように、単一鎖ＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ：ｓｓＲＮＡ）ウイルスのゲノムを用いてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓを伝達することができる。ＬＶ及びＡＡＶは、ｅｘ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ形態で細胞変形に使用されてきたが、ウイルスＤＮＡ基盤の複製は、宿主ゲノムに好ましくない遺伝毒性又は発癌の危険を伴っており、従来と異なる形態のｓｓＲＮＡウイルスベクターを提示する。線形で単一鎖のマイナス極性を有する非感染性ＲＮＡ鎖を含むモノネガティブウイルス（Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ）が例示され得る。極性順次転写（ｐｏｌａｒ ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）を通じて５～１０の他のｍＲＮＡを生産し、完全なアンチゲノム（ａｎｔｉｇｅｎｏｍｅ）を合成することによって複製される。例えば、モノネガティブウイルスは、ボルナウイルス科（ｂｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）、フィロウイルス科（ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、 ニヤミウイルス科（ｎｙａｍｉｖｉｒｉｄａｅ）、パラミクソウイルス科（ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、又はラブドウイルス科（ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）を含むことができる。ボルナウイルス科（ｂｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）にボルナウイルス（ｂｏｒｎａｖｉｒｕｓ）が含まれる。フィロウイルス科（ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）にクウェバウイルス（ｃｕｅｖａｖｉｒｕｓ）、エボラウイルス（ｅｂｏｌａｖｉｒｕｓ）、マールブルグウイルス（ｍａｒｂｕｒｇｖｉｒｕｓ）が含まれる。ニヤミウイルス科（ｎｙａｍｉｖｉｒｉｄａｅ）にニャウイルス（ｎｙａｖｉｒｕｓ）が含まれる。パラミクソウイルス科（ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）にアクアパラミクソウイルス（ａｑｕａｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）、アブラウイルス（ａｖｕｌａｖｉｒｕｓ）、フェラウイルス（ｆｅｒａｖｉｒｕｓ）、ヘニパウイルス（ｈｅｎｉｐａｒｖｉｒｕｓ）、モルビリウイルス（ｍｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ）、レスピロウイルス（ｒｅｓｐｉｒｏｖｉｒｕｓ）、ルブラウイルス（ｒｕｂｕｌａｖｉｒｕｓ）、肺炎ウイルス（ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ）、メタニューモウイルス（ｍｅｔａｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ）及びセンダイウイルス（ｓｅｎｄａｉ ｖｉｒｕｓ）が含まれる。ラブドウイルス科（ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）にアレムンドラウイルス（ａｌｅｍｎｄｒａｖｉｒｕｓ）、バイアウイルス（ｂａｉａｖｉｒｕｓ）、クリオウイルス（ｃｕｒｉｏｖｉｒｕｓ）、サイトラブドウイルス（ｃｙｔｏｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ）、ジコルハウイルス（ｄｉｃｈｏｒｈａｖｉｒｕｓ）、エフェメロウイルス（ｅｐｈｅｍｅｒｏｖｉｒｕｓ）、ハパウイルス（ｈａｐａｖｉｒｕｓ）、レダンテウイルス（ｌｅｄａｎｔｅｖｉｒｕｓ）、リッサウイルス（ｌｙｓｓａｖｉｒｕｓ）、ノヴィラブドウイルス（ｎｏｖｉｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ）、ヌクレオラブドウイルス（ｎｕｃｌｅａｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ）、ペラブドウイルス（ｐｅｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ）、ソーグラウイルス（ｓａｗｇｒａｖｉｒｕｓ）、シグマウイルス（ｓｉｇｍａｖｉｒｕｓ）、スプリビウイルス（ｓｐｒｉｖｉｖｉｒｕｓ）、チブロウイルス（ｔｉｂｒｏｖｉｒｕｓ）、ツパウイルス（ｔｕｐａｖｉｒｕｓ）、及びベシクロウイルス（ｖｅｓｉｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）が含まれる。特に、ＷＯ２０１７／２２３３３０では、センダイウイルス（ｓｅｎｄａｉ ｖｉｒｕｓ）を通じてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ伝達システムを構築した。このとき、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのｇＲＮＡに自己切断リボザイム（ｓｅｌｆ－ｃｌｅａｖｉｎｇ ｒｉｂｏｚｙｍｅ）を適用し、宿主細胞への導入時、ｇＲＮＡの効果的切断／遊離を可能にする。これを通じて、ＲＮＡ形質感染効率が増大したことが確認された。これは、本発明に係る組成物及びその伝達にも適用可能であり、参照として導入され得る。
治療学的効果を達成するためのベクター用量は、ベクターゲノムの用量／体重ｋｇ（ｖｇ／ｋｇ）で提供され得るが、（ａ）投与経路、（ｂ）治療学的効果を達成するのに要求される治療遺伝子の発現水準、（ｃ）ベクターに対する任意の宿主免疫反応、（ｄ）発現されたタンパク質の安定度などの要件によって変動し得る。
Ｂ．非ウイルス伝達手段
非ウイルス伝達手段は例えば、シミアンウイルス（Ｓｉｍｉａｎ ｖｉｒｕｓ）４０（ＳＶ４０）ｏｒｉ、ＢＰＶ（ｂｏｖｉｎｅ ｐａｐｉｌｌｏｍａ ｖｉｒｕｓ）ｏｒｉ又はＥＢＶ（Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ ｎｕｃｌｅａｒ ａｎｔｉｇｅｎ）ｏｒｉを含むエピソーマルベクター、ｍＲＮＡ形態で伝達される方法、ＲＮＰ（Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ）形態で伝達されたり、又はナノ粒子、ＣＰＰ、ポリマーなどのキャリアを介して伝達され得る（Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｖｏｌｕｍｅ １５，ｐａｇｅｓ５４１－５５５（２０１４））。
（１）エピソーマルベクター
ウイルスプラスミド複製（Ｖｉｒａｌ ｐｌａｓｍｉｄ ｒｅｐｌｉｃｏｎ）を含むエピソーマルベクターを製作し、本発明に係る組成物を伝達することができる。使用可能なウイルスプラスミド複製（Ｖｉｒａｌ ｐｌａｓｍｉｄ ｒｅｐｌｉｃｏｎ）は、例えば、シミアンウイルス（Ｓｉｍｉａｎ ｖｉｒｕｓ）４０（ＳＶ４０）、ＢＰＶ（ｂｏｖｉｎｅ ｐａｐｉｌｌｏｍａ ｖｉｒｕｓ）又はＥＢＶ（Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ ｎｕｃｌｅａｒ ａｎｔｉｇｅｎ）の複製起点（Ｏｒｉ）を含むことができる。前記複製起点（Ｏｒｉ）を含むプラスミドベクターを構築することができる。前記プラスミドベクターとして、エシェリヒアコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来のプラスミド、アクチノマイセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）由来のプラスミド、バチルス・サブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のプラスミド又は酵母由来のプラスミドを使用することができる。前記エシェリヒアコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来のプラスミドとして、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９又はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔなどを含むことができる。前記アクチノマイセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）由来のプラスミドとして、例えば、ｐＩＪ４８６などを含むことができる。前記バチルス・サブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のプラスミドとして、ｐＵＢ１１０、ｐＳＨ１９などを含むことができる。前記酵母由来のプラスミドとして、ＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、Ｙｃｐ５０などを含むことができる。
例えば、商業的に入手可能なｐＣＭＶ６－ＸＬ３（ＯｒｉＧｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）、ＥＧＦＰ－Ｃ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐＧＢＴ－９（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐｃＤＮＡＩ（ＦＵＮＡＫＯＳＨＩ）、ｐｃＤＭ８（ＦＵＮＡＫＯＳＨＩ）、ｐＡＧＥ１０７（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３，１９９０）、ｐＣＤＭ８（Ｎａｔｕｒｅ，３２９，８４０，１９８７）、ｐｃＤＮＡＩ／ＡｍＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＡＧＥ１０３（Ｊ．Ｂｌｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７，１９８７）、ｐＡＧＥ２１０などをプラスミドとして使用することができる。
このようなウイルスプラスミド複製（Ｖｉｒａｌ ｐｌａｓｍｉｄ ｒｅｐｌｉｃｏｎ）を含むベクターは、宿主細胞の染色体に統合されない。ベクターは、場合によって、ウイルスｏｒｉを活性化させる産物であるウイルス初期遺伝子（ｖｉｒａｌ ｅａｒｌｙ ｇｅｎｅ）を含むことができる。これを通じて、エピソームは、形質感染された宿主細胞株でうまく調節されて位置し得る。
エピソーマルベクターは、目的とする挿入遺伝子が、細胞ＤＮＡ統合時に発生する各制御因子によって妨害されたり影響を受けないという利点を有する。挿入された異種遺伝子が細胞固有の重要な領域を再配列させたり妨害しない。核において複数の複製として維持され、ウイルストランス活性因子が提供されるだけで目的とする遺伝子の増幅を誘導することができる。安定的な形質感染過程を通じて形質感染効率が高く、真核細胞のみならず、原核細胞でも複製可能なプラスミド構造であるので、一つの細胞システムから他の細胞システムへの転換が容易である。
例えば、ＳＶ４０は、宿主細胞の制御メカニズムとカップリングされずに独立的な複製パターンを示すので、ウイルスゲノムのそれぞれが細胞サイクル中に数回複製可能であり、ＳＶ４０ Ｏｒｉは、複製の数が１００～１０００と非常に高い。よって、細胞分裂の間に高い効率の複製及び核での持続的維持効果を示すことができる。オンコプロテイン（Ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）であるＴ－抗原（ａｎｔｉｇｅｎ）が存在し、人間への適用に制限があり、ＳＶ４０ Ｏｒｉは、Ｔ－抗原が除去された形態で使用されたり、宿主細胞でｔｒａｎｓで発現され得る。
ＢＰＶ Ｏｒｉは、ウイルスによってコーディングされたＥ１タンパク質に対する結合サイトを有し、Ｅ１は、Ｅ２の助けによってヘリカーゼ（ｈｅｌｉｃａｓｅ）で組み合わされ、細胞内遺伝子の核局在化（ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）を助ける。ＢＰＶ Ｏｒｉの複製の数は５０～１５０である。Ｅ２タンパク質が染色体に結合可能であり、遺伝子運搬効果（ｐｉｇｇｙ ｂａｃｋ）を示すので、遺伝子の核内に位置することを持続させ、安定性を維持することができる。
ＥＢＮＡ Ｏｒｉは、宿主細胞内への導入後、ＤＮＡ複製潜在期にＥＢＶゲノムがＦＲ（ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｒｅｐｅａｔｓ）及びＤＳ（ｄｙａｄ ｓｙｍｍｅｔｒｙ）を含むｏｒｉＰと、ＦＲ及びＤＳのそれぞれと結合可能なＥＢＮＡ１（ＥＢＶ ｎｕｃｌｅａｒ ａｎｔｉｇｅｎ １）を通じて複製の数５～２０のプラスミドに複製され得る。ＤＳと結合したＥＢＮＡ１がＤＮＡの複製に必要な宿主細胞メカニズムを集め、ＦＲが結合したＥＢＮＡ１は、遺伝子運搬効果（ｐｉｇｇｙ ｂａｃｋ）を通じて遺伝子の核内に位置することを持続させ、安定性を維持することができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２００８，８，１４７－１６１，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６７，５６６５±５６７８（２０００））。これは、本発明に係る組成物及びその伝達にも適用可能であり、参照として導入され得る。
場合によって、国際公開特許ＷＯ２０１８／０７５２３５のように、アルファウイルスレプリコンＲＮＡを含むことができる。アルファウイルスは、スパイクタンパク質を含有する外被によって取り囲まれたヌクレオカプシドに封入された量の極性の単一鎖ＲＮＡゲノムを有する。例えば、シンドビスウイルス（ＳＩＮ）、セムリキフォレストウイルス（ＳＦＶ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）、及び東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥＶ）を含むことができる。
変形した５’－ＵＴＲを含み、ウイルス構造タンパク質をエンコードする核酸配列の少なくとも一部がない変形したレプリコンＲＮＡを含むことができる。前記変形した５’－ＵＴＲは、一つ以上のヌクレオチド置換を含むことができる。これを通じて、ウイルス構造タンパク質をエンコードする核酸配列を含まない場合がある。このような核酸分子は、宿主ゲノムに統合し、エピソームに複製されたり、一時的に発現可能である。これは、本発明に係る組成物及びその伝達にも適用可能であり、参照として導入され得る。
（２）ｍＲＮＡ形態での伝達
ｍＲＮＡ形態で伝達する場合、ＤＮＡを用いたベクター形態で伝達する場合に比べて、ｍＲＮＡへの転写過程が不必要となり、遺伝子編集の開始が速くなり得る。一時的なタンパク質発現（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）可能性が高い。ＤＮＡに比べて不安定である場合があり、ＲＮＡｓｅによって分解可能性が高い方である。
本発明に係る組成物の核酸切断酵素及び／又は切断因子のそれぞれをｍＲＮＡ形態で伝達することができる。核酸切断酵素及び／又は切断因子のｍＲＮＡを化学修飾（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）したり、合成自己－複製ＲＮＡ（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｓｅｌｆ－ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ ＲＮＡ）形態で伝達することができる。
国際公開特許ＷＯ２０１１／０７１９３１には、単一鎖ｍＲＮＡ分子形態で細胞内に伝達するための変形方法が記載されている。修飾ヌクレオシドが含まれ得る。例えば、修飾ヌクレオシドとして、ｍ５Ｃ（５－メチルシチジン）、ｍ５Ｕ（５－メチルウリジン）、ｍ６Ａ（Ｎ６－メチルアデノシン）、ｓ２Ｕ（２－チオウリジン）、ψ（シュードウリジン）、Ｕｍ（２’－Ｏ－メチルウリジン）、ｍｌＡ（ｌ－メチルアデノシン）、ｍ２Ａ（２－メチルアデノシン）、Ａｍ（２’－Ｏ－メチルアデノシン）、ｍｓ２ｍＧＡ（２－メチルチオ－Ｎ６－メチルアデノシン）、ｉＧＡ（～イソペンテニルアデノシン）、ｍｓｚｉ６Ａ（２－メチルチオ－Ｎ６イソペンテニルアデノシン）、ｉｏ６Ａ（Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン）、ｍｓ２ｉｏ６Ａ（２－メチルチオ－Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン）、ｇ６Ａ（Ｎ６－グリシニルカルバモイルアデノシン）、ｔ６Ａ（Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン）、ｍｓ２ｔ６Ａ（２－メチルチオ－Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン）、ｍ６ｔ６Ａ（Ｎ６－メチル－Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン）、ｈｎ６Ａ（Ｎ６ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン）、ｍｓ２ｈｎ６Ａ（２－メチルチオ－Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン）、Ａｒ（ｐ）（２’－Ｏ－リボシルアデノシン（ホスフェート））、Ｉ（イノシン）、ｍ１Ｉ（ｌ－メチルイノシン）、ｍｌＩｍ（１，２’－Ｏ－ジメチルイノシン）、ｍ３Ｃ（３－メチルシチジン）、Ｃｍ（２’－Ｏ－メチルシチジン）、Ｓ２Ｃ（２チオシチジン）、ａｃ４Ｃ（Ｎ４－アセチルシチジン）、ｆ５Ｃ（５－ホルミルシチジン）、ｍ５Ｃｍ（５，２’－Ｏ－ジメチルシチジン）、ａｃ４Ｃｍ（Ｎ４－アセチル－２’－Ｏ－メチルシチジン）、ｋ２Ｃ（リシジン）、ｍ１Ｇ（ｌ－メチルグアノシン）、ｍ２Ｇ（Ｎ２－メチルグアノシン）、ｍ７Ｇ（７－メチルグアノシン）、Ｇｍ（２’－Ｏ－メチルグアノシン）、ｍ２ ２Ｇ（Ｎ２，Ｎ２－ジメチルグアノシン）、ｍ２Ｇｍ（Ｎ２，２’－Ｏ－ジメチルグアノシン）、ｍ２ ２Ｇｍ（Ｎ２，Ｎ２，２’－Ｏ－トリメチルグアノシン）、Ｇｒ（ｐ）（２’－Ｏ－リボシルグアノシン（ホスフェート））、ｙＷ（ワイブトシン）、ｏ２ｙＷ（ペルオキシワイブトシン）、ＯＨｙＷ（ヒドロキシワイブトシン）、ＯＨｙＷ＊（未完成変形（ｕｎｄｅｒｍｏｄｉｆｉｅｄ）ヒドロキシワイブトシン）、ｉｍＧ（ワイオシン）、ｍｉｍＧ（メチルワイオシン）、Ｑ（クエオシン）、ｏＱ（エポキシクエオシン）、ｇａｌＱ（ガラクトシル－クエオシン）、ｍａｎＱ（マンノシルクエオシン）、ｐｒｅＱ０（７－シアノ－７－デアザグアノシン）、ｐｒｅＱｌ（７－アミノメチル－７－デアザグアノシン）、Ｇ＋（アルカエオシン（ａｒｃｈａｅｏｓｉｎｅ））、Ｄ（ジヒドロウリジン）、ｍ５Ｕｍ（５，２’－Ｏ－ジメチルウリジン）、Ｓ４Ｕ（４－チオウリジン）、ｍ５ｓ２Ｕ（５－メチル－２－チオウリジン）、ｓ２Ｕｍ（２－チオ－２’－Ｏ－メチルウリジン）、ａｃｐ３Ｕ（３－（３－アミノ３－カルボキシプロピル）ウリジン）、ｈｏ５Ｕ（５－ヒドロキシウリジン）、ｍｏ５Ｕ（５－メトキシウリジン）、ｃｍｏ５Ｕ（ウリジン５－オキシ酢酸）、ｍｃｍｏ５Ｕ（ウリジン５－オキシ酢酸メチルエステル）、ｃｈｍ５Ｕ（５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン））、ｍｃｈｍ５Ｕ（５（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジンメチルエステル）、ｍｃｍ５Ｕ（５－メトキシカルボニルメチルウリジン）、ｍｃｍ５Ｕｍ（５－メトキシカルボニルメチル－２’－Ｏ－メチルウリジン）、ｍｃｍ５ｓ２Ｕ（５－メトキシカルボニルメチル－２－チオウリジン）、ｎｍ５ｓ２Ｕ（５－アミノメチル－２－チオウリジン）、ｍｎｍ５Ｕ（５－メチルアミノメチルウリジン）、ｍｎｍ５ｓ２Ｕ（５－メチルアミノメチル－２－チオウリジン）、ｍｎｍｓｅ２Ｕ（５－メチルアミノメチル－２－セレノウリジン）、ｎｃｍ５Ｕ（５－カルバモイルメチルウリジン）、ｎｃｍ５Ｕｍ（５－カルバモイルメチル－２’－Ｏ－メチルウリジン）、ｃｍｎｍ５Ｕ（５－カルボキシメチルアミノメチルウリジン）、ｃｍｎｍ５Ｕｍ（５－カルボキシメチルアミノメチル－２’－メチルウリジン）、ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ（５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン）、ｍ６ ２Ａ（Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデノシン）、Ｉｍ（２’－Ｏ－メチルイノシン）、ｍ４Ｃ（Ｎ４－メチルシチジン）、ｍ４Ｃｍ（Ｎ４，２’－Ｏ－ジメチルシチジン）、ｈｍ５Ｃ（５－ヒドロキシメチルシチジン）、ｍ３Ｕ（３－メチルウリジン）、ｃｍ５Ｕ（５－カルボキシメチルウリジン）、ｍ６Ａｍ（Ｎ６，２’－Ｏ－ジメチルアデノシン）、ｍ６ ２Ａｍ（Ｎ６，Ｎ６，２’－Ｏ－トリメチルアデノシン）、ｍ２，７Ｇ（Ｎ２，７－ジメチルグアノシン）、ｍ２，２，７Ｇ（Ｎ２，Ｎ２，７－トリメチルグアノシン）、ｍ３Ｕｍ（３，２’－Ｏ－ジメチルウリジン）、ｍ５Ｄ（５－メチルジヒドロウリジン）、ｆ５Ｃｍ（５－ホルミル－２’－Ｏ－メチルシチジン）、ｍｌＧｍ（１，２’－Ｏ－ジメチルグアノシン）、ｍ１Ａｍ（１，２’－Ｏ－ジメチルアデノシン）、τｍ５Ｕ（５－タウリノメチルウリジン）、τｍ５ｓ２Ｕ（５－タウリノメチル－２－チオウリジン））、ｉｍＧ－１４（４－ジメチルワイオシン）、ｉｍＧ２（イソワイオシン）、又はａｃ６Ａ（Ｎ６－アセチルアデノシン）を記載しており、これは、本発明の組成物及びその伝達に適用することができる。
合成自己－複製ＲＮＡ（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｓｅｌｆ－ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ ＲＮＡ）形態で伝達され得る（Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．２０１３ Ａｕｇ １，１３（２）：１０）。非感染性のためにパッケージングされる可能性がなく、自己複製可能な ＶＥＥ（Ｖｅｎｅｚｕｅｌａｎ Ｅｑｕｉｎｅ Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）ウイルスのＲＮＡレプリコン（ｒｅｐｌｉｃｏｎ）を含むことができる。ＲＮＡレプリコンをコードするｎｓＰ１乃至ｎｓＰ４を含むことができる。場合によって、ｍＲＮＡに５’－Ｃａｐ及びポリ（ｐｏｌｙ）（Ａ）テール（ｔａｉｌ）を付加することができる。
米国登録特許第１０３７０６４６号に記載したように、５’ ｔｏ ３’：（ＶＥＥ ＲＮＡ ｒｅｐｌｉｃａｓｅｓ）－（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）－（ＧＯＩ）－（ＩＲＥＳ ｏｒ ｏｐｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）－（ｏｐｔｉｏｎａｌ ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ ｍａｒｋｅｒ）－（ＶＥＥ ３’ＵＴＲ ａｎｄ ｐｏｌｙＡ ｔａｉｌ）－（ｏｐｔｉｏｎａｌ ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ ｍａｒｋｅｒ）－ｐｒｏｍｏｔｅｒの配列を有する構造物を製作し、アルファウイルスの自己複製骨格を含む自己複製ＲＮＡレプリコンを含み、合成自己－複製ＲＮＡ（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｓｅｌｆ－ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ ＲＮＡ）を製作することができ、これは、本発明の組成物及びその伝達に適用することができる。
細胞にｍＲＮＡを伝達する方法、又は生体内でｍＲＮＡを人間、動物などの有機体の細胞に伝達する方法を含み、試験管内又は生体内でｍＲＮＡ分子を細胞に伝達できる方法を考慮することができる。例えば、脂質（例えば、リポソーム、マイセルなど）を含んだり、ナノ粒子又はナノチューブを含んだり、陽イオン性化合物（例えば、ポリエチレンイミン又はＰＥＩ）を含んだり、陽イオン性化合物（例えば、ポリエチレンイミン又はＰＥＩ）を含み、ｍＲＮＡ分子を細胞に伝達することができる。場合によって、ｍＲＮＡを細胞に伝達するために、遺伝子銃又はバイオリステック（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）粒子伝達システムなどのバリスティクス方法（ｂｏｌｉｓｔｉｃｓ ｍｅｔｈｏｄ）を使用することができる。
ただし、核酸切断酵素をｍＲＮＡ形態で伝達するとき、ＲＮＡ形態である切断因子と同一のベクターに存在すると、本発明に係る細胞死滅誘導のために、核酸切断酵素がタンパク質形態で存在しなければならないので、伝達された核酸切断酵素ｍＲＮＡは、タンパク質に翻訳される一方で、翻訳中の切断因子では分解が開始され得る。
このような問題を解決するために、切断因子の伝達を遅延させたり、切断因子の化学修飾（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を誘導したり、又はウイルスベクターに切断因子又はこれをコードするポリヌクレオチドを含ませる方法を考慮することができる。
核酸切断酵素ｍＲＮＡを伝達した後、６時間内に切断因子又はこれをコードするポリヌクレオチドを伝達することができる（Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２０１７，２７（３）：４４０－４４３．）。このような伝達方法を通じて、編集効率（ｅｄｉｔｉｎｇ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）が向上し得る。切断因子又はこれをコードするポリヌクレオチドの化学修飾（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を通じて、切断因子又はこれをコードするポリヌクレオチドを伝達した後の安定性を向上させることができる（Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１７ Ｄｅｃ，３５（１２）：１１７９－１１８７．）。場合によって、核酸切断酵素コーディングｍＲＮＡ形態で伝達し、切断因子又はこれをコードするポリヌクレオチドは、ベクターにクローニングして伝達することができ、分解されやすい切断因子を安定的に伝達することができる。
切断因子の化学修飾（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）と関連して、合成修飾（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｍｏｄｉｆｉｅｄ）ＲＮＡ形態で伝達され得る（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｉｎｔ．２０１９ Ｊｕｎ １９，２０１９：７６４１７６７．）。Ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）過程において、ｍＲＮＡ末端にｃａｐ構造及び／又はポリＡテールを付加することができる。場合によって、シュード（Ｐｓｅｕｄｏ）－ＵＴＰ（ｐｓｅｕｄｏｕｒｉｄｉｎｅ）又は５ｍＣＴＰ（５－ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｉｄｉｎｅ）などの修飾ヌクレオシド（ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ）が付加され得る。ｍＲＮＡ及び翻訳されたタンパク質の安定性が増大し得る。合成修飾ＲＮＡを細胞質に伝達すると、直ぐタンパク質に翻訳され得る。ただし、ｍＲＮＡ形態で多数のデイリー（ｄａｉｌｙ）ｍＲＮＡトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）をする場合、 自然免疫応答（ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｎｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）が誘導される可能性が高く、これによって、細胞ストレス（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｔｒｅｓｓ）及び激しい細胞毒性（ｓｅｖｅｒｅ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）が誘導され得る。
（３）ＲＮＰ
ベクターを通じて細胞死滅を誘導するためには、次の過程を経なければならない：本発明に係る核酸切断酵素及び切断因子を含む組成物をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドを細胞に形質感染し、プラスミドが細胞内の核に移動し、転写が開始された後、核酸切断酵素に対するｍＲＮＡが核の外部に移動してタンパク質に翻訳される。切断因子ＲＮＡは、プラスミドで転写されて核外に移動する。核酸切断酵素と切断因子ＲＮＡとが結合し、ＲＮＰ（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ）を形成した後、核に再び運送される。
しかし、予備形成された（ｐｒｅ－ｆｏｒｍｅｄ）ＲＮＰは細胞に導入され、ターゲットゲノムＤＮＡ編集を開始することができる。このようなＲＮＰ形態の伝達によると、ベクター伝達に比べてオフターゲット効果を減少させることができ、細胞の核に核酸切断酵素及び切断因子ＲＮＡを直接伝達可能であるという長所がある（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ｖｏｌｕｍｅ ８，Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ：１４３５５（２０１８））。
ＲＮＰ（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ）形成のために、核酸切断酵素及び切断因子のそれぞれを合成及び精製してＲＮＰ形態で製作することができる。場合によって、ＣＬ７タグ付けされた核酸切断酵素及び切断因子ＲＮＡをプラスミドを通じて直接発現した後、自己集合（ｓｅｌｆ－ａｓｓｅｍｂｌｙ）形態で組み立てられたＲＮＰを精製して製作することができる（Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２０１７ Ｏｃｔ ２，１２０：３１．１０．１－３１．１０．１９）。
国際公開特許ＷＯ２０１９／０８９８８４では、細胞内のＴＧＦＢＲ２遺伝子発現を変形する方法として、ｇＲＮＡ及びＲＮＡ－ガイドヌクレアーゼ（ｇｕｉｄｅｄ ｎｕｃｌｅａｓｅ）コーディングポリヌクレオチドを含むベクター以外に、ｇＲＮＡ及びＲＮＡ－ガイドヌクレアーゼ（ｇｕｉｄｅｄ ｎｕｃｌｅａｓｅ）を含むゲノム編集システム（ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）を提案している。ＷＯ２０１９／０８９８８４によると、ｇＲＮＡ及びＲＮＡ－ガイドヌクレアーゼ（ｇｕｉｄｅｄ ｎｕｃｌｅａｓｅ）は、ＲＮＰ（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ）複合体を含むことができ、２個以上の異なるＲＮＰ（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ）複合体を含むことができ、異なるターゲットドメインを有するｇＲＮＡを含むことが可能である。
場合によって、韓国登録特許第２１０７７３５号のように、一つ以上の内在的遺伝子変形（欠損又は導入）のためにガイドＲＮＡ及びＣａｓタンパク質をインビトロで混合し、先に組み立てられたＣａｓタンパク質－ガイドＲＮＡ ＲＮＰ（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ）を使用することができる。ＫＲ２１０７７３５では、植物原形質体（ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ）で一つ以上の植物の内在的遺伝子を欠損又は導入させるために、先に組み立てられたＣａｓタンパク質－ガイドＲＮＡ ＲＮＰを適用したが、本発明のように、人間を対象とする疾病治療の場合にも同一に適用することができる。
具体的には、Ｃａｓ９プロテイン（ｐｒｏｔｅｉｎ）及びｇＲＮＡを含む複合体形成条件でＣａｓ９プロテイン及びｇＲＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏで組み立て、Ｃａｓ９プロテイン及びｇＲＮＡを含む複合体をターゲットＤＮＡと接触させることを含むターゲットＤＮＡ変形方法が記載されている米国登録特許第９６３７７３９号のように、本発明でも、核酸切断酵素及び切断因子をｉｎ ｖｉｔｒｏで組み立て、核酸切断酵素及び切断因子を含むＲＮＰ（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ）複合体を処理し、細胞死滅を誘導することができる。
Ｃａｓ９プロテイン及びｇＲＮＡを含む複合体をターゲットＤＮＡと接触させることを含むターゲットＤＮＡ標的及び結合方法が記載されている米国登録特許第１０６２６４１９号のように、本発明でも、核酸切断酵素及び切断因子の複合体を形成し、複合体がターゲットＤＮＡに結合されるようにし、ターゲットＤＮＡをターゲットとすることができる。
（４）キャリアを介した伝達
核酸切断酵素をコードするｍＲＮＡ及び／又は切断因子ＲＮＡのそれぞれが個別的に又はＲＮＰ（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ）形態で製作され、キャリア伝達システムを介して伝達され得る。前記キャリアは、例えば、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）、ナノ粒子、ＺＩＦ（ｚｅｏｌｉｔｉｃ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ ｆｒａｍｅｗｏｒｋｓ）、ＲＮＡアプタマー－ストレプトアビジン（ａｐｔａｍｅｒ－ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）、又は重合体を含むことができる（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２０１８ Ｊｕｌｙ，１７１：２０７－２１８．）。
ＣＰＰは、多様な分子カーゴ（ナノ大きさの粒子から小さい化学分子及びＤＮＡの大きい断片まで）の細胞吸収を容易にする短いペプチドである。カーゴは、核酸切断酵素又はこれをコードするポリヌクレオチド及び／又は切断因子又はこれをコードするポリヌクレオチドを含むことができる。細胞透過性ペプチド及び核酸切断酵素又はこれをコードするポリヌクレオチド及び／又は切断因子又はこれをコードするポリヌクレオチドを含む複合体を製造することができる。具体的には、細胞透過性ペプチドが接合された核酸切断酵素又はこれをコードするポリヌクレオチド及び細胞透過性ペプチドが複合体化された切断因子又はこれをコードするポリヌクレオチドを含むことができる。細胞透過性ペプチド及び核酸切断酵素又はこれをコードするポリヌクレオチド及び／又は切断因子又はこれをコードするポリヌクレオチドは、共有結合を通じた化学的結合又は非－共有相互作用を通じて組み立てられ得る。核酸切断酵素又はこれをコードするポリヌクレオチドは、チオエステル結合を通じてＣＰＰにコンジュゲートされる一方で、切断因子又はこれをコードするポリヌクレオチドはＣＰＰと複合体化され、縮合された正に荷電した粒子を形成する。胚芽幹細胞、皮膚線維芽細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨｅＬａ細胞、及び胚芽癌腫細胞を含むヒト細胞の同時及び順次治療がプラスミド形質感染に比べて減少した標的外突然変異で効率的な遺伝子破壊を誘導した（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２０１４，２４：１０２０－１０２７．）。
米国登録特許第１０５８４３２２号でも、ガイドポリヌクレオチド（ｇｕｉｄｅ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）及びＣａｓエンドヌクレアーゼ（ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）以外に、ＣＰＰ（ｃｅｌｌ－ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ）を含み、ターゲット位置を変形し、本発明に適用することができる。前記ガイドポリヌクレオチド、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ及びＣＰＰが共有結合（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ）又は非共有結合（ｎｏｎ－ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ）方式で連結され、ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ－ＣＰＰ複合体が形成され得る。これを通じて、前記複合体が微生物細胞（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｃｅｌｌ）の細胞膜又は細胞壁を通過し、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、微生物細胞のゲノムのうちターゲット位置で二重鎖切断（ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋ）を誘導することができる。
ナノ粒子と関連して、本発明に係る組成物は、高分子ナノ粒子、金属ナノ粒子、金属／無機ナノ粒子又は脂質ナノ粒子を介して伝達され得る。
前記高分子ナノ粒子は、例えば、ローリングサークル増幅によって合成されたＤＮＡナノクルー（ｎａｎｏｃｌｅｗ）、糸状ＤＮＡナノ粒子であり得る。ＤＮＡナノクルー（ｎａｎｏｃｌｅｗ）、糸状ＤＮＡナノ粒子にＣａｓ９／ｓｇＲＮＡをローディングし、エンドソーム脱出能を向上させるためにＰＥＩをコーティングした。このような複合体が細胞膜に結合して内在化された後、エンドソーム脱出を通じて核に移動し、Ｃａｓ９タンパク質と単一のガイドＲＮＡが同時に伝達される（Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ．２０１５ Ｏｃｔ ５；５４（４１）１２０２９－１２０３３）。これは、本発明に係る組成物の伝達に適用可能であり、参照として導入される。
他の例示として、陽イオン性及び陰イオン性アクリレートモノマーを通じて、Ｃａｓ９タンパク質と単一のガイドＲＮＡのＲＮＰは、静電気的相互作用（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ）によってコーティングされ得る。イミダゾール（Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）を含むモノマー、ＧＳＨ－分解性架橋剤（ｄｅｇｒａｄａｂｌｅ ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒ）、アクリレート（ａｃｒｙｌａｔｅ）ｍＰＥＧ、及びアクリレートＰＥＧ共役リガンド（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｌｉｇａｎｄｓ）を連結してＲＮＰの表面に付着させることができる。ｉｎ ｓｉｔｕフリーラジカル重合（ｆｒｅｅ－ｒａｄｉｃａｌ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）を通じてＲＮＰの周囲にグルタチオン（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）（ＧＳＨ）－切断型（ｃｌｅａｖａｂｌｅ）ナノカプセルが形成できるようにし、ナノカプセルをＧＳＨ－切断可能リンカー（ｃｌｅａｖａｂｌｅ ｌｉｎｋｅｒ）であるＮ，Ｎ’－ビス（アクリロイル）シスタミンと架橋（ｃｒｏｓｓｌｉｎｋ）して細胞質で分解できるようにし、細胞質でＲＮＰが分解できるようにする（Ｎａｔｕｒｅ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｖｏｌｕｍｅ １４，ｐａｇｅｓ９７４－９８０（２０１９））。これは、本発明に係る組成物の伝達に適用することができ、参照として導入される。
前記金属ナノ粒子と関連して、ＤＮＡに金粒子を連結させ、陽イオン性エンドソーム破壊的ポリマー（ｅｎｄｏｓｏｍａｌ ｄｉｓｒｕｐｔｉｖｅ ｐｏｌｙｍｅｒ）と複合体を形成し、Ｃａｓ９リボ核タンパク質（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ）及びドナー（ｄｏｎｏｒ）ＤＮＡを細胞に伝達することができる（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｖｏｌｕｍｅ １，ｐａｇｅｓ８８９－９０１（２０１７））。前記陽イオン性エンドソーム破壊的ポリマー（ｅｎｄｏｓｏｍａｌ ｄｉｓｒｕｐｔｉｖｅ ｐｏｌｙｍｅｒ）は、例えば、ポリエチレンイミン、ポリ（アルギニン）、ポリ（リシン）、ポリ（ヒスチジン）、ポリ－［２－｛（２－アミノエチル）アミノ｝－エチル－アスパルトアミド］（ｐＡｓｐ（ＤＥＴ））、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）とポリ（アルギニン）のブロックｃｏ－ポリマー、ＰＥＧとポリ（リシン）のブロックｃｏ－ポリマー、又はＰＥＧとポリ｛Ｎ－［Ｎ－（２－アミノエチル）－２－アミノエチル］アスパルトアミド｝（ＰＥＧ－ｐＡｓｐ（ＤＥＴ））のブロックｃｏ－ポリマーであり得る。
更に他の例において、磁性ナノ粒子と組換えバキュロウイルスベクター（ｂａｃｕｌｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ）が複合体を形成できるようにし、磁場（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｆｉｅｌｄ）を通じて局所的に活性化させ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介遺伝子の編集を発生させることができる（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｖｏｌｕｍｅ ３，ｐａｇｅｓ１２６－１３６（２０１９））。これは、本発明に係る組成物の伝達に適用することができ、参照として導入される。
更に他の例において、光に不安定な光解離性（ｐｈｏｔｏｌａｂｉｌｅ）半導体高分子ナノトランスデューサー（ｎａｎｏｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ）（ｐＳＰＮ）を、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プラスミドを細胞に伝達する遺伝子ベクターとして用いて、遺伝子の編集を遠隔で活性化するための光調節剤として使用可能である。ｐＳＰＮは、１Ｏ２で切断可能なリンカーを介してポリエチレンイミンブラッシュ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ ｂｒｕｓｈ）でグラフトされた単一の酸素（１Ｏ２）生成バックボーンを含むことができる。近赤外線（ＮＩＲ）光の照射により、ｐＳＰＮで遺伝子ベクターの切断を自発的に誘導し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プラスミドが放出されるようにし、遺伝子の編集を開始する（Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ ２０１９ Ｄｅｃ ９；５８（５０）１８１９７－１８２０１）。これは、本発明に係る組成物の伝達に適用することができ、参照として導入される。
金属／無機ナノ粒子と関連して、例えば、ＺＩＦ－８（ｚｅｏｌｉｔｉｃ ｉｍｉｄａｚｏｌａｔｅ ｆｒａｍｅｗｏｒｋ－８）を通じてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９をカプセル化することができ、効率的エンドソーム脱出を通じて目的とするターゲット遺伝子の発現を変更させることができる（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｖｏｌｕｍｅ２，Ｉｓｓｕｅ４ Ａｐｒｉｌ ２０１９）。これは、本発明に係る組成物の伝達に適用することができ、参照として導入される。
更に他の例において、アルギニン変形した金粒子を使用することができる。アルギニン変形した金粒子を核酸切断酵素又はこれをコードするポリヌクレオチド及び／又は切断因子又はこれをコードするポリヌクレオチドと共に組み立てることができる。これを通じて、ターゲット細胞の膜と融合し、細胞質に移動するようになる（ＡＣＳ Ｎａｎｏ．２０１７，１１：２４５２－２４５８）。これは、本発明の組成物及びその伝達に適用することができる。
ＺＩＦ（ｚｅｏｌｉｔｉｃ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ ｆｒａｍｅｗｏｒｋｓ）を通じて負に荷電したＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰを、正に荷電したナノスケール（ｎａｎｏｓｃａｌｅ）ＺＩＦでカプセル化することができる。このようなＺＩＦにより、ＲＮＰのエンドソーム脱出能（ｅｎｄｏｓｏｍａｌ ｅｓｃａｐｅ）が向上し得る（Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．２０１８，１４０：１４３－１４６）。これは、本発明の組成物及びその伝達に適用することができる。
ＲＮＡアプタマー－ストレプトアビジン、例えば、Ｓ１ｍｐｌｅｘ（ｍｏｄｕｌａｒ ＲＮＡ ａｐｔａｍｅｒ－ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ｓｔｒａｔｅｇｙ）を使用することができる。例えば、ｓｇＲＮＡｓの３’末端にストレプトアビジンと非共有相互結合する６０ヌクレオチドＳ１ｍアプタマーを付加することができる。その後、ストレプトアビジン及びＣａｓ９タンパク質と複合体を形成し、これをＳ１ｍｐｌｅｘｅｓとして細胞内に伝達することができる。場合によって、ストレプトアビジンに高い親和度を示すビオチンが結合したビオチン化（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ）ｓｓＯＤＮｓ（ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を核酸ドナーテンプレート（ｄｏｎｏｒ ｔｅｍｐｌａｔｅ）に結合させることができる。このような構造の複合体を通じて、精巧に核酸を変形できることを確認した。標準ｓｇＲＮＡ ＲＮＰに比べて増加した遺伝子校正効率を示すことができる（Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１７，８：１７１１．）。これは、本発明の組成物及びその伝達に適用することができる。
陰イオンを帯びる（ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ ｃｈａｒｇｅｄ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９をなすＤＮＡ或いは核酸は、陽イオンを帯びる（Ｃａｔｉｏｎｉｃ）物質と結合してナノ粒子を形成することができ、これは、細胞に受容体依存性エンドサイトーシス（ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）或いは食作用（ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）などを通じて浸透し得る。例えば、米国登録特許第１０６８２４１０号には、陽性を帯びるＣａｓ９タンパク質と強い陰イオンを帯びるガイドＲＮＡとが互いに結合し、陰イオンを帯びるＣａｓ９タンパク質－ＲＮＡと超荷電したタンパク質（ｓｕｐｅｒｃｈａｒｇｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）（例えば、正に荷電した超荷電タンパク質）、陽イオン性重合体又は陽イオン性脂質を使用して核酸切断酵素を細胞に伝達する技術が記載されており、これを本発明に適用することができる。超荷電タンパク質、陽イオン性重合体又は陽イオン性脂質を核酸切断酵素と接触させて細胞に導入することができる。標的細胞への伝達のために、Ｃａｓ９タンパク質は陰イオン性電荷を提供し、超荷電蛍光タンパク質として超荷電したＧＦＰ、例えば、＋３６ＧＦＰ又は－３０ＧＦＰと結合される。超荷電タンパク質によってエンドソームを有利に崩壊させ、エンドソーム脱出能が増加し得る。これは、本発明の組成物及びその伝達に適用することができる。
陽イオン性重合体の場合、Ｃａｓ９：ｇＲＮＡ複合体が陽イオン性重合体に結合され得る。陽イオン性重合体として、ポリアリルアミン（ＰＡＨ）；ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）；ポリ（Ｌ－リシン）（ＰＬＬ）；ポリ（Ｌ－アルギニン）（ＰＬＡ）；ポリビニルアミン単一－又は共重合体；ポリ（ビニルベンジル－トリ－Ｃ１－Ｃ４－アルキルアンモニウム塩）；脂肪族又は芳香脂肪族ジハロゲン化物及び脂肪族Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラ－Ｃ１－Ｃ４－アルキル－アルキレンジアミンの重合体；ポリ（ビニルピリジン）又はポリ（ビニルピリジニウム塩）；ポリ（Ｎ，Ｎ－ジアリル－Ｎ，Ｎ－ジ－Ｃ１－Ｃ４－アルキル－アンモニウムハロゲン化物）；４次化されたジ－Ｃ１－Ｃ４－アルキル－アミノエチルアクリレート又はメタクリレートの単一－又は共重合体；ポリクアド（ＰＯＬＹＱＵＡＤ）ＴＭ；ポリアミノアミドなどが含まれ得る。
陽イオン性脂質は、陽イオン性リポソーム製剤を含むことができる。リポソームの脂質二重層は、カプセル化された核酸を分解から保護し、核酸に結合できる抗体による特異的中和を防止することができる。エンドソーム成熟の間、エンドソームメンブレインとリポソームとが融合され、陽イオン性脂質－核酸切断酵素の効率的なエンドソーム脱出が可能である。Ｃａｓ９：ｇＲＮＡ複合体が陽イオン性脂質によってカプセル化され得る。陽イオン性脂質として、ポリエチレンイミン、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）星状デンドリマー、リポフェクチン（ＤＯＴＭＡとＤＯＰＥとの組み合わせ）、リポフェクターゼ、リポフェクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）(商標登録)（例えば、リポフェクタミン(商標登録)２０００、リポフェクタミン(商標登録)３０００、リポフェクタミン(商標登録)ＲＮＡｉＭＡＸ、リポフェクタミン(商標登録)ＬＴＸ）、セイント－レッド（ＳＡＩＮＴ－ＲＥＤ）（Ｓｙｎｖｏｌｕｘ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社、オランダのＧｒｏｎｉｎｇｅｎ所在）、ＤＯＰＥ、サイトフェクチン（Ｇｉｌｅａｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、カリフォルニアのフォスターシティ所在）、及びユーフェクチン（ＪＢＬ社、カリフォルニアのサンルイスオビスポ所在）が含まれ得る。代表的な陽イオン性リポソームは、Ｎ－［１－（２，３－ジオレオイルオキシ）－プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ－［１－（２，３－ジオレオイルオキシ）－プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムメチルスルフェート（ＤＯＴＡＰ）、３β－［Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）、２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、１，２－ジミリスチルオキシプロピル－３－ジメチル－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド；又はジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）から製造され得る。
高分子の場合、例えば、フレキシブル樹枝状高分子（ｆｌｅｘｉｂｌｅ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｐｏｌｙｍｅｒ）とＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓシステムを細胞内に伝達することができる（Ｃｈｅｍ Ｓｃｉ．２０１７，８：２９２３－２９３０．）。また、例えば、ポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ）及びポリサッカライド（ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）で製造されたハイブリッドポリマーマイクロキャリアを介してＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓシステムを細胞内に伝達することができる（Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１８，１４：９７－１０８．）。さらに、例えば、ＧＯ－ＰＥＧ－ＰＥＩ（ｇｒａｐｈｅｎｅ ｏｘｉｄｅ－ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）－ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ）ナノキャリアを介してＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓシステムを細胞内に伝達することができる（Ｎａｎｏｓｃａｌｅ．２０１８，１０：１０６３－１０７１）。
米国公開特許第２０１９／００９９３８１号には、Ｃａｓ９ポリペプチド及びガイドＲＮＡを含むＲＮＰ複合体をコアとして含み、生分解性架橋重合体（ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒ）をシェル（ｓｈｅｌｌ）として含むナノ粒子が記載されている。生分解性架橋重合体は、イミダゾリルアクリロイルモノマー、 ビスアクリロイルジスルフィド、任意的ＰＥＧアクリロイルモノマー（ｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ ＰＥＧ ａｃｒｙｌｏｙｌ ｍｏｎｏｍｅｒｓ）、カチオンアクリロイルモノマー（Ｃａｔｉｏｎｉｃ ａｃｒｙｌｏｙｌ ｍｏｎｏｍｅｒｓ）、アニオンアクリロイルモノマー（ａｎｉｏｎｉｃ ａｃｒｙｌｏｙｌ ｍｏｎｏｍｅｒｓ）、カチオン及びアニオンアクリロイルモノマー、又は非イオン性アクリロイルモノマー（ｎｏｎ－ｉｏｎｉｃ ａｃｒｙｌｏｙｌ ｍｏｎｏｍｅｒｓ）の重合体を含むことができる。このとき、生分解性架橋重合体とＲＮＰの質量比は、０．４乃至３．５の比率で調整され得る。このようなナノ粒子は、本発明に係る組成物を伝達するために適用することができ、本発明に参照として導入される。
脂質ナノ粒子と関連して、キャリアとしてリポソームを用いてＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓシステムを伝達することができる。リポソームは、内部水性区画を取り囲む単一又は多重ラメラ脂質二重層及び相対的に不透過性である外側親脂性リン脂質二重層で構成された球体小嚢構造である。リポソーム剤形は、主に天然リン脂質及び脂質、例えば、１，２－ジステアロリル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、スフィンゴミエリン、ホスファチジルコリン又はモノシアロガングリオシドなどを含むことができる。場合によって、血漿内の不安定性を解消するために、脂質膜にコレステロール又は１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を追加することができる。コレステロールの添加は、カプセル化された生活性化合物の血漿内への迅速な放出を減少させたり、又は１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）は安定性を増加させる（Ｓｅｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｎｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ２８ Ｎｕｍｂｅｒ ２ Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１０，ｐｐ．１７２－１７７）。
米国登録特許第１０３６３２１７号によると、Ｃａｓ９及びガイドＲＮＡ伝達にレシチン、コレステロール及び金属キレート脂質（ｍｅｔａｌ ｃｈｅｌａｔｉｎｇ ｌｉｐｉｄ）を含むナノリポソーム伝達体を使用できることが記載されている。金属キレート脂質として、例えば、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－［（Ｎ－５－アミノ－１－カルボキシペンチル）イミノ二酢酸）スクシニル］（ニッケル塩）（“ＤＯＧＳ－ＮＴＡ－Ｎｉ”）；１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－ジエチレントリアミン－ペンタ酢酸（ガドリニウム塩）（“ＤＭＰＥ－ＤＴＰＡ－Ｇｄ”）；又は１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－ジエチレントリアミン－ペンタ酢酸（銅塩）（“ＤＭＰＥ－ＤＴＰＡ－Ｃｕ”）などが含まれ得る。Ｃａｓ９及びガイドＲＮＡは、カチオン性ポリマー（Ｃａｔｉｏｎｉｃ ｐｏｌｙｍｅｒ）、例えば、ポリ－Ｌ－リシン、ポリアミドアミン、ポリ［２－（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ）エチルメタクリレート］、キトサン、ポリ－Ｌ－オルニチン、シクロデキストリン、ヒストン、コラーゲン、デキストラン、又はＰＥＩ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ）を含んで複合体を形成し、ナノリポソーム伝達体は、ハイブリッドＣＲＩＳＰＲ複合体をカプセル化して伝達することができる。
場合によって、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓシステムは、核酸－脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）のようなリポソームに投与され得る。ＳＮＡＬＰ剤形は、脂質３－Ｎ－［（ｗメトキシポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル］－１，２－ジミリスチルオキシ－プロピル アミン（ＰＥＧ－Ｃ－ＤＭＡ）、１，２－ジリノレイオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）及びコレステロールを２：４０：１０：４８のモル百分率比で含有することができる（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．４４１，４ Ｍａｙ ２００６）。また、ＳＮＡＬＰは、合成コレステロール、ジパルミトイルホスファチジルコリン、３－Ｎ－［（ｗ－メトキシポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル］－１，２－ジミレスチルオキシプロピルアミン、及び陽イオン性１，２－ジリノレイオキシ－３－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパンを含むことができる（Ｇｅｉｓｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ ２０１０，３７５：１８９６－９０５）。さらに、ＳＮＡＬＰは、陽イオン性脂質、ＤＳＰＣ、コレステロール及びＰＥＧ－脂質を、例えば、それぞれ４０：１０：４０：１０のモル比で、例えば、エタノール中に溶解させることによって製造され得る（Ｓｅｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｎｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ２８ Ｎｕｍｂｅｒ ２ Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１０，ｐｐ．１７２－１７７）。
米国登録特許第１０６２６３９３号には、脂質ナノ粒子を用いて核酸を伝達するための薬学的組成物が記載されている。ｇＲＮＡを含む第１核酸－脂質ナノ粒子及びＣａｓ９タンパク質コーディングｍＲＮＡを含む第２核酸－脂質ナノ粒子を含む。このうち、第１核酸－脂質ナノ粒子は、陽イオン性脂質及び非陽イオン性脂質を含む。このような脂質ナノ粒子を適用し、生体内のＣａｓ９タンパク質コーディングｍＲＮＡ及びｇＲＮＡを効果的に伝達し、標的特異的変異を誘発することができる。前記陽イオン性脂質は、１，２－ジリノレイオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２－ジ－γ－リノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン （γ－ＤＬｅｎＤＭＡ；Ｃｏｍｐｏｕｎｄ（１５））、３－（（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イルオキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロパン－１－アミン（ＤＬｉｎ－ＭＰ－ＤＭＡ；Ｃｏｍｐｏｕｎｄ（８））、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート）（Ｃｏｍｐｏｕｎｄ（７））、（６Ｚ，１６Ｚ）－１２－（（Ｚ）－ｄｅｃ－４－エニル）ドコサ－６，１６－ジエン－１１－イル５－（ジメチルアミノ）ペンタノエート（Ｃｏｍｐｏｕｎｄ（１３））などを含む。前記非陽イオン性脂質は、リン脂質又はコレステロールを含む。このような脂質ナノ粒子は、本発明に適用され得る。
場合によって、標的核酸の発現を調節するために、ガイドＲＮＡの３’又は５’にＭＳ２バクテリオファージコートタンパク質などのＲＮＡ結合ドメインターゲット（ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ｔａｒｇｅｔ）を含むアプタマーを連結することができ、米国登録特許第１０６４０７８９号を参照することができる。細胞でＲＮＡ結合ドメインターゲットに結合するＲＮＡ結合ドメイン（ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）を含む転写活性化因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）又はリプレッサー（ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ）を発現させることができる。細胞内でガイドＲＮＡに転写活性化因子又はリプレッサーが連結され、転写活性化因子又はリプレッサーを通じてターゲット核酸の発現が調節されることによって、校正効率を増大させることができる。
（５）エクソソームを介した伝達
「エクソソーム」は、細胞－由来した小さい（２０ｎｍ～３００ｎｍの直径、さらに好ましくは４０ｎｍ～２００ｎｍの直径）小胞であって、内部空間を取り囲む膜を含み、直接的な原形質膜バディング又は後期エンドソームと原形質膜との融合によって前記細胞から生成される小胞を称する。一般に、エクソソームの生産は、生産細胞の破壊をもたらさない。エクソソームは、脂質又は脂肪酸及びポリペプチドを含み、選択的にペイロード（例えば、治療剤）、レシーバー（例えば、標的化モイエティ）、ポリヌクレオチド（例えば、核酸、ＲＮＡ、又はＤＮＡ）、糖（例えば、単糖、多糖類、又はグリカン）又は他の分子を含む。エクソソームは、生産細胞から誘導され、その大きさ、密度、生化学的パラメーター、又はこれらの組み合わせに基づいて生産細胞から単離され得る。
このようなエクソソームは、細胞外小胞又は小器官を９乃至１４のｐＨを有する水溶液で処理して開放させることによって膜を収得し、小胞内又は小器官の内容物を除去した後、膜を再び組み立て（ｒｅ－ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ）、膜小胞形態を形成することによって収得することができる。
前記エクソソームに伝達対象物を混合し、再び組み立てることによって膜小胞を形成することができる。伝達対象物は、ゲノム編集システムであり得る。ゲノム編集システムは、非制限的には、メガヌクレアーゼ（ｍｅｇａｎｕｃｌｅａｓｅ）システム、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ；ＺＦＮ）システム、転写活性因子様エフェクターヌクレアーゼ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ－ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ；ＴＡＬＥＮ）システム、及びクラスター化された規則的間隔の短い回文の反復（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ；ＣＲＩＳＰＲ）システムを含む。ＣＲＩＳＰＲシステムは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムであり得る。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムは、Ｃａｓ９タンパク質をエンコードするヌクレオチド配列、標的配列と混成化されたＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）をエンコードするヌクレオチド配列、及びトランス－活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をエンコードするヌクレオチド配列を含む。ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは、一つのガイドＲＮＡに融合され得る。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの成分は、同一のベクター又は異なるベクターに位置し得る。さらに、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムは、核局在化信号（ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ；ＮＬＳ）を含むことができる。このようなエクソソームは、本発明に係る組成物の伝達に適用可能であり、参照として導入され得る。
官能基化されたエクソソームを介してＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを伝達することができる（Ｂｉｏｍａｔｅｒ Ｓｃｉ．２０２０ Ｍａｙ １９；８（１０）：２９６６－２９７６．）。ＧＦＰ及びＧＦＰナノボディー（ｎａｎｏｂｏｄｙ）をエクソソーム膜タンパク質であるＣＤ６３と結合させ、Ｃａｓ９タンパク質をエクソソームに融合させることができる。これを通じて、受容細胞（Ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ ｃｅｌｌ）でターゲット遺伝子を効率的に編集できることが確認された。このようなエクソソームを介して本発明に係る組成物を伝達することができ、参照として導入される。
国際公開特許第ＷＯ２０２０／１０１７４０及び米国公開特許第ＵＳ２０２０／０１５５７０３号のように、治療用膜小胞は、その表面分子を通じて受容細胞と相互作用する能力によって細胞外小胞、例えば、エクソソームを模倣する。治療用膜小胞は、細胞外小胞又は小器官から由来した膜から形成される。例えば、前記膜は、そのような細胞外小胞又は小器官の開放によって細胞外小胞又は小器官から由来し得る。したがって、結果的に空いている治療用膜小胞は、有害な内因性分子、例えば、ＤＮＡ又は核膜成分、又は任意の所望でないＲＮＡ種、酵素又は他のタンパク質のみならず、感染性成分、例えば、ウイルス、ウイルスゲノム物質及び／又はプリオンを含むウイルス成分又は類似する感染性要素を含み、天然細胞外小胞又は小器官が含有する有害な内容物がない場合がある。
治療用膜小胞は、治療伝達対象物でローディングされ得る。ローディングされた伝達対象物を含む治療用膜小胞は、その表面分子を介して受容細胞と相互作用し、前記受容細胞にその伝達対象物を伝達する能力を有するという点で自然発生細胞外小胞を模倣する。
治療用膜小胞は、例えば、標的化効能、伝達を改善させ、受容細胞／器官／対象への治療伝達対象物を増加させることによって、現在の細胞外小胞治療剤が有する多くの問題を解決することができる。治療用膜小胞は、その表面分子を介して受容細胞と相互作用し／したり、受容細胞に治療伝達対象物を伝達する能力でエクソソーム又は任意の他の細胞外小胞を模倣することによってエクソソーム又は任意の他の細胞外小胞を模倣すると言える。併せて、治療用膜小胞は、可能な否定的な副作用を有する所望でない細胞外小胞のみならず、これらが自然に含有し得る任意の有害な内容物への可能な汚染を軽減できるという点でエクソソーム及び他の自然発生細胞外小胞と異なる。
ヨーロッパ公開特許第３７０６７９６号及びヨーロッパ登録特許第３４６３４６５号のように、エクソソームポリペプチドを介して本発明に係る組成物を伝達することができ、参照として導入される。
「エクソソームポリペプチド」は、ポリペプチド作製物の小胞体構造物、例えば、エクソソームへの輸送、トラフィッキング又はシャットリングを可能にする任意のポリペプチド（前記言及したように、典型的に少なくとも一つのＰｏＩ及び少なくとも一つのポリペプチド基盤の放出システムを含むが、標的化ペプチド／ポリペプチドも含み得る）を含む。
例えば、ＣＤ９、ＣＤ５３、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ５４、ＣＤ５０、ＦＬＯＴ１、ＦＬＯＴ２、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ７１、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ２３５ａ、ＡＬＩＸ、シンテニン－１、シンテニン－２、Ｌａｍｐ２ｂ、ＴＳＰＡＮ８、ＴＳＰＡＮ１４、ＣＤ３７、ＣＤ８２、ＣＤ１５１、ＣＤ２３１、ＣＤ１０２、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＯＴＣＨ３、ＮＯＴＣＨ４、ＤＬＬ１、ＤＬＬ４、ＪＡＧ１、ＪＡＧ２、ＣＤ４９ｄ／ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＢ５、ＩＴＧＢ６、ＩＴＧＢ７、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８／ＩＴＧＢ２、ＣＤ４１、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ５１、ＣＤ６１、ＣＤ１０４、Ｆｃ受容体、インターロイキン受容体、免疫グロブリン、ＭＨＣ－Ｉ又はＭＨＣ－ＩＩ成分、ＣＤ２、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ１３、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ３０、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＣＤ１１０、ＣＤ１１１、ＣＤ１１５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２５、ＣＤ１３５、ＣＤ１８４、ＣＤ２００、ＣＤ２７９、ＣＤ２７３、ＣＤ２７４、ＣＤ３６２、ＣＯＬ６Ａ１、ＡＧＲＮ、ＥＧＦＲ、ＧＡＰＤＨ、ＧＬＵＲ２、ＧＬＵＲ３、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＳＰＧ２、Ｌ１ＣＡＭ、ＬＡＭＢ１、ＬＡＭＣ１、ＬＦＡ－１、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、Ｍａｃ－１アルファ、Ｍａｃ－１ベータ、ＭＦＧＥ８、ＳＬＩＴ２、ＳＴＸ３、ＴＣＲＡ、ＴＣＲＢ、ＴＣＲＤ、ＴＣＲＧ、ＶＴＩ１Ａ又はＶＴＩ１Ｂであり得る。
前記エクソソームは、核酸を含み、単一鎖ＲＮＡ又はＤＮＡ、二重鎖ＲＮＡ又はＤＮＡ、化学的に合成及び／又は化学的に修飾したオリゴヌクレオチドを含むことができる。
前記エクソソームは、目的とするポリペプチド（ＰｏＩ）を含み、ここで、前記目的とするポリペプチドは、エクソソームポリペプチドに放出可能に付着している。目的とするポリペプチドのエクソソームポリペプチドへの付着は放出可能であり、目的とする治療学的ポリペプチドのＥＶへの効率的で且つ妨害されないローディング及び内因性に誘発された放出を可能にする。目的とするポリペプチドとエクソソームポリペプチドとの間の放出可能な付着は、ＥＶの内部で及び／又は後続的に標的細胞又は標的組織の内部で目的とするポリペプチドの内因性に活性化され得る放出を可能にし、ローディング及び治療学的活性を最適化できる放出システムによって媒介される特性である。前記放出システムは、外部刺激に対する必要なしで活性化又は誘発され得る多様な放出可能なポリペプチド相互作用システム（すなわち、前記放出システムは、典型的に細胞又はＥＶ内、又は必須的に任意の生物学的システム内で内因性活性によって誘発される）、例えば、シス－切断ポリペプチド－基盤の放出システム（例えば、インテインを基準にして）、核局所化信号（ＮＬＳ）－ＮＬＳ結合タンパク質（ＮＬＳＢＰ）基盤の放出システム又は他のタンパク質ドメインを基準にする放出システムを含むグループから選ばれ得るポリペプチド基盤のシステムを含むことができる。単量体性光－誘導された切断－基盤の放出システムを使用することができ、ここで、非常に短い光ブーストのみを使用して単量体性タンパク質ドメインの内因性タンパク質溶解切断を開始し、目的とするポリペプチドを放出することができる。
韓国登録特許第１９００４６５号によると、光特異的結合タンパク質を用いてＣａｓ９タンパク質を含むエクソソームが記載されている。光特異的結合タンパク質を使用し、一時的に目的タンパク質をマーカータンパク質と結合させ、目的タンパク質が内部に含まれるようにエクソソームを製造する技術が記載されている。例えば、光特異的結合タンパク質であるＣＩＢＮとＣＲＹ２を利用できるが、具体的には、前記ＣＩＢＮは、前記マーカータンパク質の一つであるＣＤ９と融合された形態に発現されるようにし、前記ＣＲＹ２は、目的タンパク質と融合された形態で発現されるように、これらの融合タンパク質をコードする遺伝子をエクソソーム生産細胞に導入した。前記エクソソーム生産細胞で発現されたＣＩＢＮ－ＣＤ９融合タンパク質は、ＣＤ９によってエクソソームに含まれるが、このとき、前記細胞に青色光ＬＥＤ照明を照射すると、前記エクソソーム生産細胞で発現された目的タンパク質－ＣＲＹ２融合タンパク質のＣＲＹ２ドメインが、ＣＤ９に融合されたＣＩＢＮドメインに結合されるので、目的タンパク質－ＣＲＹ２－ＣＩＢＮ－ＣＤ９形態の可逆的に誘導された融合タンパク質が形成され、このような融合タンパク質は、ＣＤ９によってエクソソームの内部に含まれる。このように、目的タンパク質が内部に含まれたエクソソームが生産された後、前記青色光ＬＥＤ照明をこれ以上照射しないと、ＣＩＢＮ－ＣＲＹ２結合が解除され、目的タンパク質がエクソソームの細胞膜に結合されない状態でエクソソームの内部に含まれるようになるので、結果的に、目的タンパク質を含むエクソソームを製造することができる。
光特異的タンパク質として、ＣＲＹ（ｃｈｒｙｐｔｏｃｈｒｏｍｅ）以外にも、ＣＩＢ（ｃｒｙｐｔｏｃｈｒｏｍｅ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｂａｓｉｃ－ｈｅｌｉｘ－ｌｏｏｐ－ｈｅｌｉｘ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＣＩＢＮ（Ｎ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ＣＩＢ）、ＰｈｙＢ（ｐｈｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｂ）、ＰＩＦ（ｐｈｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）、ＦＫＦ１（Ｆｌａｖｉｎｂｉｎｄｉｎｇ、Ｋｅｌｃｈ ｒｅｐｅａｔ、Ｆ－ｂｏｘ １）、ＧＩＧＡＮＴＥＡ又はＰＨＲ（ｐｈｙｔｏｌｙａｓｅ ｈｏｍｏｌｇｏｕｓ ｒｅｇｉｏｎ）などが使用され得る。
エクソソーム膜に付着している状態であって、エクソソーム膜から分離されないので、エクソソームが標的細胞の細胞膜に融合される場合にのみ、前記目的タンパク質が標的細胞に伝達され得る。このように標的細胞に融合された後にも、エクソソーム膜に融合されたエクソソームに結合された形態で存在するので、前記目的タンパク質は、標的細胞内で彼の効果を示す確率が非常に低いという限界を有していた。しかし、目的タンパク質がエクソソームの内部に膜と結合されない状態で捕集されている場合、エクソソームが標的細胞によってエンドサイトーシス（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）されて細胞質に入ったとき、エクソソーム膜に付着しているわけではないので、エクソソームが分解される場合、目的タンパク質が標的細胞の細胞質に伝達され得る。また、標的細胞の細胞質内で自由に移動可能であるので、目的タンパク質は、標的細胞質で生理活性を十分に示すことができる。
ＣＲＹ２及びｍＣｈｅｒｒｙの融合タンパク質とＣＩＢ及びＣＤ９の融合タンパク質を、エクソソームを多く作り出す不滅細胞株であるＨＥＫ２９３Ｔ細胞内で発現した結果、細胞質に均一に分布されていたｍＣｈｅｒｒｙタンパク質は、青色光を照射したとき、細胞膜、エンドソーム類似構造などの膜にあることが観察された。ＦＫＦ１及びｍＣｈｅｒｒｙの融合タンパク質とＧＩＧＡＮＴＥＡ及びＣＤ９の融合タンパク質をＨＥＫ２９３Ｔ細胞で発現させたときにも、類似する結果を観察できた。また、ＣＲＹ２及びｍＣｈｅｒｒｙの融合タンパク質とＣＩＢＮ及びＣＤ９の融合タンパク質をＨＥＫ２９３Ｔに発現させ、青色光の強さを調節した結果、２０μＷ乃至５０μＷの光を照射したとき、エクソソーム内に捕集されたｍＣｈｅｒｒｙタンパク質が最も高い水準を示すことを確認した。また、前記細胞で生産分離されたエクソソームを異種細胞であるＨＴ１０８０細胞に約２５０μｇ／ｍｌの濃度で処理した結果、ＨＴ１０８０細胞に対して特別な細胞毒性を示しておらず、前記ＨＴ１０８０細胞の細胞質にｍＣｈｅｒｒｙタンパク質が伝達されることを確認した。このような結果により、本発明に係る組成物の伝達時にエクソソームを適用することができ、参照として導入され得る。
６．伝達方法
Ａ．伝達対象
本発明に係る組成物は、ゲノム配列変異を有する細胞内のゲノム配列変異を有する細胞特異的変異領域配列のうち、正常細胞には存在しない固有の配列を含む複数個の核酸配列を特異的に認識する複数個の切断因子又はこれをコードするポリヌクレオチド、及び核酸切断酵素又はこれをコードするポリヌクレオチドを含み、それぞれを伝達するために単一又は伝達手段を同一又は異なる構成で組み合わせて使用することができる。
国際公開特許ＷＯ２０１５／１９１６９３によると、ｇＲＮＡは第１伝達手段に含まれ、核酸編集システムは第２伝達手段に含まれる伝達システムが記載されている。それぞれの伝達システムは、同時にウイルス伝達手段であったり、一つはウイルス伝達手段で、他の一つは非－ウイルス伝達手段であったり、同時に非－ウイルス伝達手段であり得ることが記載されている。これは、本発明に係る組成物を伝達するために適用することができ、本発明に参照として導入される。
前記複数個の切断因子をコードするポリヌクレオチド配列及び／又は核酸切断酵素をコードするポリヌクレオチド配列は、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列、又はその組み合わせ（ＲＮＡ－ＤＮＡ組み合わせ配列）であり得る。
本発明に係る組成物において切断因子又はこれをコードするポリヌクレオチドは、切断因子のＲＮＡ配列又はＤＮＡ配列を含むことができる。本発明に係る組成物において核酸切断酵素又はこれをコードするポリヌクレオチドは、核酸切断酵素タンパク質、核酸切断酵素タンパク質をコードするＲＮＡ配列又はＤＮＡ配列を含むことができる。
Ｂ．ベクターによる伝達
本発明に係る組成物を伝達するための方法として、切断因子のＤＮＡ配列及び核酸切断酵素タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むことができる。切断因子のＤＮＡ配列及び核酸切断酵素タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、ベクターなどの伝達手段を介して提供され得る。
一観点において、本発明は、（ｉ）核酸切断酵素をコードするポリヌクレオチド；及び（ｉｉ）ゲノム配列変異（ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を有する細胞において、前記ゲノム配列変異を有する４個以上の細胞特異的変異領域をそれぞれ認識する切断因子又はこれをコードするポリヌクレオチドを含むゲノム配列変異を有する細胞死滅誘導用ベクターに関する。
一観点において、本発明は、（ｉ）核酸切断酵素をコードするポリヌクレオチド；及び（ｉｉ）ゲノム配列変異（ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を有する細胞において、前記ゲノム配列変異を有する４個以上の細胞特異的変異領域をそれぞれ認識する切断因子又はこれをコードするポリヌクレオチドを含み、前記（ｉ）及び（ｉｉ）が同一又は異なるベクターに含まれる、ゲノム配列変異を有する細胞死滅誘導用組成物に関する。
一つの実施例において、（ｉ）核酸切断酵素をコードするポリヌクレオチド；及び（ｉｉ）ゲノム配列変異（ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を有する細胞において、前記ゲノム配列変異を有する４個以上の細胞特異的変異領域をそれぞれ認識する切断因子又はこれをコードするポリヌクレオチドのそれぞれは、同一又は異なるベクターに含まれ得る。
（１）個別ベクターを用いた伝達
ベクターは、原核細胞又は真核細胞において複数個の切断因子及び核酸切断酵素の核酸転写物、タンパク質又は酵素の発現のために設計され得る。切断因子のＤＮＡ配列及び核酸切断酵素タンパク質をコードするＤＮＡ配列のそれぞれは、別個の異なるベクター上に位置させて伝達することができる。
本発明に係るウイルスベクターとして、例えば、ＡＡＶ（Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ）、ＡｄＶ（Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ）、ＬＶ（Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ）又はＲＶ（Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ）、その他のウイルスベクター、例えば、シミアンウイルス（Ｓｉｍｉａｎ ｖｉｒｕｓ）４０（ＳＶ４０）ｏｒｉ、ＢＰＶ（ｂｏｖｉｎｅ ｐａｐｉｌｌｏｍａ ｖｉｒｕｓ）ｏｒｉ又はＥＢＶ（Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ ｎｕｃｌｅａｒ ａｎｔｉｇｅｎ）ｏｒｉを含むエピソーマルベクターを使用して伝達することができる。
（２）単一のベクターを用いた伝達
切断因子のＤＮＡ配列及び核酸切断酵素タンパク質をコードするＤＮＡ配列を同一のベクター上に位置させ、一つのベクターを介して同時に伝達することができる。
本発明に係るウイルスベクターとして、例えば、ＡＡＶ（Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ）、ＡｄＶ（Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ）、ＬＶ（Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ）又はＲＶ（Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ）、その他のウイルスベクター、例えば、シミアンウイルス（Ｓｉｍｉａｎ ｖｉｒｕｓ）４０（ＳＶ４０）ｏｒｉ、ＢＰＶ（ｂｏｖｉｎｅ ｐａｐｉｌｌｏｍａ ｖｉｒｕｓ）ｏｒｉ又はＥＢＶ（Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ ｎｕｃｌｅａｒ ａｎｔｉｇｅｎ）ｏｒｉを含むエピソーマルベクターを使用して伝達することができる。
複数個の切断因子を含んで多重遺伝子を編集することは、ｃｒＲＮＡ－プロセッシングメカニズム（ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）と連関している（Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｖｏｌｕｍｅ １１，Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ：１２８１（２０２０），Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｖｏｌｕｍｅ ３５，ｐａｇｅｓ３１－３４（２０１７））。
核酸切断酵素の種類と関連して、Ｃａｓ１２ａ／Ｃａｓ１３ａは、ｔｒａｃｒＲＮＡなしでｃｒＲＮＡを加工することができる。自体のヌクレアーゼ特性を保有し、ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡ（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｒＲＮＡ）加工に必要な反復配列（ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）であるＤＲ（ｄｉｒｅｃｔ ｒｅｐｅａｔ）を除去することができる。
Ｃａｓ６は、最後のエフェクター複合体（ｆｉｎａｌ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｏｍｐｌｅｘ）を形成するために付属タンパク質（ａｃｃｅｓｓｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ）が必要であり、Ｃａｓ６によって加工されたｃｒＲＮＡは、カスケード（ｃａｓｃａｄｅ）と呼ばれるＣａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８で構成されたターゲット認知モジュールに導入され、このようなカスケード複合体は、外部遺伝子のＰＡＭを認知することによってＤＮＡを編集する。
Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃは、ｔｒａｃｒＲＮＡ（ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｃｒＲＮＡ）及びＲＮａｓｅ IIIを通じてｐｒｅ－ｃｒＲＮＡ（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｒＲＮＡ）加工をする。
複合遺伝子の校正において、例えば、Ｃａｓ９が適用される場合、Ｃａｓ９のｇＲＮＡはｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体を含み、ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡが融合されてｓｇＲＮＡを形成するので、複合遺伝子の校正のためにそれぞれのｃｒＲＮＡの間にｐｒｅ－ｃｒＲＮＡ（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｒＲＮＡ）加工に必要な反復配列である直接反復（ｄｉｒｅｃｔ ｒｅｐｅａｔ）を挿入し、ｔｒａｃｒＲＮＡを別途に発現させ、ＲＮａｓｅ IIIがｔｒａｃｒＲＮＡによって作動し、直接反復を除去しながら複数の遺伝子を編集することができる。
場合によって、それぞれのＲＮＡの間にリボザイムなどの自己切断配列（ｓｅｌｆ－ｃｌｅａｖｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を結合させたり、ＲＮＡのうち２８－ｎｔステムループ配列（ｓｔｅｍ－ｌｏｏｐ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を認知し、２０番目のヌクレオチドを切断する酵素であるＣｓｙ４認知部位を結合させたり、又は内因性ＲＮａｓｅ Ｐ／ＲＮａｓｅ Ｚによって加工可能なｔＲＮＡを挿入することによって、ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡ（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｒＲＮＡ）がｃｒＲＮＡに加工できるようにする。
複数のｇＲＮＡのそれぞれの間にリボザイムなどの自己切断配列を結合させることができる。Ｐｏｌ II及びＰｏｌ IIIプロモーターを適用し、Ｐｏｌ II及びＰｏｌ IIIプロモーターによって媒介される転写を通じてｐｒｅ－ｃｒＲＮＡを加工することができる。
また、ＲＮＡのうち２８－ｎｔステムループ配列を認知し、２０番目のヌクレオチドを切断する酵素であるＣｓｙ４認知部位を結合させることができる。Ｃｓｙ４認知配列を含むｇＲＮＡとＣｓｙ４を共同発現させると、多重ｇＲＮＡが発現され、単一のプロモーターを通じて加工され得る。
さらに、内因性ＲＮａｓｅ Ｐ／ＲＮａｓｅ Ｚによって加工可能なｔＲＮＡを挿入し、ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡを加工することができる。ＲＮａｓｅ Ｐ／ＲＮａｓｅ Ｚは、ｐｒｅ－ｔＲＮＡの５’末端及び３’末端を切断し、多重ｇＲＮＡがｔＲＮＡ－ｇＲＮＡから加工され得る。
Ｃ．ベクター及びｍＲＮＡ、キャリア又はエクソソーム組み合わせ
本発明に係る組成物を伝達するための方法として、切断因子のＤＮＡ配列及び核酸切断酵素タンパク質又は核酸切断酵素タンパク質をコードするＲＮＡ配列を含むことができる。
本発明は、（ｉ）核酸切断酵素又はこれをコードするポリヌクレオチド；及び（ｉｉ）ゲノム配列変異（ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を有する細胞において、前記ゲノム配列変異を有する４個以上の細胞特異的変異領域をそれぞれ認識する切断因子又はこれをコードするポリヌクレオチドを含み、前記（ｉｉ）がベクターに含まれる、ゲノム配列変異を有する細胞死滅誘導用組成物に関する。
前記切断因子のＤＮＡ配列は、ベクターを介して伝達することができる。本明細書に記載された任意のベクターを適用して伝達することができ、例えば、ＡＡＶ（Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ）、ＡｄＶ（Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ）、ＬＶ（Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ）又はＲＶ（Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ）、その他のウイルスベクター、例えば、シミアンウイルス（Ｓｉｍｉａｎ ｖｉｒｕｓ）４０（ＳＶ４０）ｏｒｉ、ＢＰＶ（ｂｏｖｉｎｅ ｐａｐｉｌｌｏｍａ ｖｉｒｕｓ）ｏｒｉ又はＥＢＶ（Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ ｎｕｃｌｅａｒ ａｎｔｉｇｅｎ）ｏｒｉを含むエピソーマルベクターを使用して伝達することができる。
核酸切断酵素タンパク質をコードするＲＮＡ配列をｍＲＮＡ形態で伝達することができる。ｍＲＮＡ形態の伝達として、合成修飾（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｍｏｄｉｆｉｅｄ）ｍＲＮＡ又はｓｒＲＮＡ（ｓｅｌｆ－ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ ＲＮＡ）を含むことができる。
核酸切断酵素タンパク質又は核酸切断酵素タンパク質をコードするＲＮＡ配列は、修飾ヌクレオシドを含んだり、合成自己－複製ＲＮＡ（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｓｅｌｆ－ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ ＲＮＡ）を含んだり、本明細書に記載されたキャリア又はエクソソームを介して伝達することができる。例えば、ナノ粒子、ｃｐｐ、ポリマーなどのキャリア又はエクソソームを介して伝達することができる。
Ｄ．ｍＲＮＡ又はキャリアによる伝達
本発明に係る組成物を伝達するための方法として、切断因子のＲＮＡ配列及び核酸切断酵素タンパク質又は核酸切断酵素タンパク質をコードするＲＮＡ配列を含むことができる。切断因子のｍＲＮＡ形態で伝達することができる。核酸切断酵素は、タンパク質形態又は核酸切断酵素タンパク質をコードするｍＲＮＡ形態で伝達することができる。
本発明は、（ｉ）核酸切断酵素又はこれをコードするポリヌクレオチド；（ｉｉ）ゲノム配列変異（ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を有する細胞において、前記ゲノム配列変異を有する４個以上の細胞特異的変異領域をそれぞれ認識する切断因子又はこれをコードするポリヌクレオチドを含有するゲノム配列変異を有する細胞死滅誘導用キャリアに関する。
本発明は、（ｉ）核酸切断酵素又はこれをコードするポリヌクレオチド；（ｉｉ）ゲノム配列変異（ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を有する細胞において、前記ゲノム配列変異を有する４個以上の細胞特異的変異領域をそれぞれ認識する切断因子又はこれをコードするポリヌクレオチドを含有し、前記（ｉ）及び（ｉｉ）がキャリアに含まれるゲノム配列変異を有する細胞死滅誘導用組成物に関する。
本発明は、（ｉ）核酸切断酵素又はこれをコードするポリヌクレオチド；（ｉｉ）ゲノム配列変異（ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を有する細胞において、前記ゲノム配列変異を有する４個以上の細胞特異的変異領域をそれぞれ認識する切断因子又はこれをコードするポリヌクレオチドを含む、ゲノム配列変異を有する細胞死滅誘導用エクソソームに関する。
本発明は、（ｉ）核酸切断酵素又はこれをコードするポリヌクレオチド；（ｉｉ）ゲノム配列変異（ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を有する細胞において、前記ゲノム配列変異を有する４個以上の細胞特異的変異領域をそれぞれ認識する切断因子又はこれをコードするポリヌクレオチドを含有し、前記（ｉ）及び（ｉｉ）がエクソソームに含まれる、ゲノム配列変異を有する細胞死滅誘導用組成物に関する。
ｍＲＮＡ形態の伝達として、合成修飾（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｍｏｄｉｆｉｅｄ）ｍＲＮＡ又はｓｒＲＮＡ（ｓｅlｆ－ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ ＲＮＡ）を含むことができる。
切断因子のｍＲＮＡ、核酸切断酵素タンパク質又は核酸切断酵素タンパク質をコードするｍＲＮＡ配列を核酸切断酵素タンパク質形態で伝達したり、核酸切断酵素タンパク質をコードするｍＲＮＡ形態で伝達したり、又は本明細書に記載されたキャリア又はエクソソーム、例えば、ナノ粒子、ｃｐｐ、ポリマーなどのキャリア又はエクソソームを介して伝達することができる。
Ｅ．ＲＮＰによる伝達
切断因子のｍＲＮＡ、核酸切断酵素タンパク質は、ＲＮＰ形態でｉｎ ｖｉｔｒｏで複合体を形成するようにして伝達することができる。
本発明は、（ｉ）核酸切断酵素；及び（ｉｉ）ゲノム配列変異（ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を有する細胞において、前記ゲノム配列変異を有する４個以上の細胞特異的変異領域をそれぞれ認識する切断因子又はこれをコードするポリヌクレオチドを含む、ゲノム配列変異を有する細胞死滅誘導用リボ核酸タンパク質（Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ、ＲＮＰ）複合体に関する。
本発明は、（ｉ）核酸切断酵素；及び（ｉｉ）ゲノム配列変異（ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を有する細胞において、前記ゲノム配列変異を有する４個以上の細胞特異的変異領域をそれぞれ認識する切断因子又はこれをコードするポリヌクレオチドを含有し、前記（ｉ）及び（ｉｉ）がリボ核酸タンパク質（Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ、ＲＮＰ）複合体を形成する、ゲノム配列変異を有する細胞死滅誘導用組成物に関する。
場合によって、ＲＮＰを本明細書に記載されたキャリア又はエクソソーム、例えば、ナノ粒子、ｃｐｐ、ポリマーなどのキャリア又はエクソソームを介して伝達することができる。
７．エキソヌクレアーゼ
本発明の具体的な実施例において、エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼＩが融合された核酸切断酵素を使用する場合、細胞死滅誘導に必要な切断因子の数を減少できることを確認した。
他の観点において、本発明は、エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼＩが融合された核酸切断酵素又はこれをコードするポリヌクレオチド；及びゲノム配列変異（ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を有する細胞において、前記ゲノム配列変異を有する２個以上の細胞特異的変異領域をそれぞれ認識する切断因子又はこれをコードするポリヌクレオチドを含むゲノム配列変異を有する細胞死滅誘導用組成物に関する。
前記エキソヌクレアーゼは、５’－３’のヌクレオチド切断能を有することができる。本発明によると、Ｃａｓ９の場合、５個のｇＲＮＡで細胞死滅が起こらなかったが、Ｅｘｏ－Ｃａｓ９を使用すると、５個のｇＲＮＡでも十分に細胞死滅を起こすことを確認した。これは、理論に拘らないが、Ｃａｓ９によるＤＮＡ二重鎖切断（ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋ）以後に復旧を阻害するためであると判断される。
前記エキソヌクレアーゼＩは、微生物、酵素、昆虫、マウス又はヒト由来であり得る。具体的には、前記エキソヌクレアーゼＩは、配列番号３１の配列を含むことができる。
Figure 2023517992000003
エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼＩが融合された核酸切断酵素を使用する場合、前記ゲノム配列変異を有する細胞特異的変異領域は、細胞死滅を誘導するのに十分なターゲットに該当する互いに異なる２個以上であり得る。前記ゲノム配列変異を有する細胞特異的変異領域は、例えば、互いに異なる２０個以下であり得る。前記ゲノム配列変異を有する細胞特異的変異領域は、例えば、互いに異なるそれぞれの２個～２０個であり得る。
前記ゲノム配列変異を有する細胞特異的変異領域は、具体的には、互いに異なるそれぞれの２個～２０個、２個～１９個、２個～１８個、２個～１７個、２個～１６個、２個～１５個、２個～１４個、２個～１３個、２個～１２個、２個～１１個、２個～１０個、２個～９個、２個～８個、２個～７個、２個～６個、２個～５個、２個～４個、又は２個～３個であり得る。
前記ゲノム配列変異を有する細胞特異的変異領域は、具体的には、互いに異なるそれぞれの２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、又は２０個（数字の間の範囲も含む）であり得る。
変異が存在する位置が含まれたゲノムは、細胞で二倍体（ｄｉｐｌｏｉｄ）及び／又は三倍体（ｔｒｉｐｌｏｉｄ）であり得るので、互いに異なるそれぞれの２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、又は２０個（数字の間の範囲も含む）、又は２ペア、３ペア、４ペア、５ペア、６ペア、７ペア、８ペア、９ペア、１０ペア、１１ペア、１２ペア、１３ペア、１４ペア、１５ペア、１６ペア、１７ペア、１８ペア、１９ペア、又は２０ペアの変異領域を考慮して、互いに異なる２個～４０個、例えば、互いに異なる４０個、３９個、３８個、３７個、３６個、３５個、３４個、３３個、３２個、３１個、３０個、２９個、２８個、２７個、２６個、２５個、２４個、２３個、２２個、２１個、２０個、１９個、１８個、１７個、１６個、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個又は２個（数字の間の範囲も含む）の二重鎖切断（Ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ｂｒｅａｋ、ＤＳＢ）を誘導することによって細胞を死滅させることができる。
前記ゲノム配列変異を有する細胞特異的変異領域は、核酸配列であって、例えば、コーディング又は非コーディング核酸であり得る。前記ゲノム配列変異を有する細胞特異的変異領域の核酸は、コーディング核酸であってもよく、ゲノムから転写されてタンパク質に翻訳されてもよい。前記ゲノム配列変異を有する細胞特異的変異領域の核酸は、非コーディング核酸であってもよく、ゲノムから転写されてタンパク質に翻訳されない。
本発明に係るゲノム配列変異を有する細胞内変異は、正常細胞で発見されない場合がある。このような変異は、ゲノム配列変異を有する細胞と正常細胞をＷＧＳ（ｗｈｏｌｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）し、ゲノム配列変異を有する細胞特異的変異領域の配列、例えば、配列の挿入、欠失、置換で構成された群から選ばれた一つ以上であり得る。
ゲノム配列変異を有する細胞特異的配列のマッピングは、ＷＧＳ（ｗｈｏｌｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、又はサブトラクションハイブリダイゼーション及びシーケンシングの方法を通じて行うことができ、このときに導出されたＩｎＤｅｌにおいて、癌で発見された挿入の場合は直ぐガイドＲＮＡを製作し、欠失の場合は、切断地点（ｂｒｅａｋ ｐｏｉｎｔ）をマッピングした後、切断地点を含むガイドＲＮＡを製作して使用することができる。
ＷＧＳ（全ゲノムシーケンシング）は、次世代シーケンシング（ｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）によって１０Ｘ、２０Ｘ、４０Ｘ形式で多くの倍数でゲノムを読む方法を意味する。「次世代シーケンシング」は、チップ基盤、及びＰＣＲ基盤のペアドエンド形式で全ゲノムを断片化し、前記断片を化学的な反応（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）に基づいて超高速でシーケンシングする技術を意味する。
サブトラクションハイブリダイゼーションは、多くの組織又は細胞の間に発現の差を有する遺伝子のクローニングに用いられる方法である。試験する細胞のＤＮＡ試料特異的遺伝子が検出され得る。試験する細胞のＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに変性させた後、アニーリングを行う。アニーリング条件を調節することによって、試験する細胞特異的ＤＮＡ配列を二本鎖ＤＮＡに分離することができる。
本発明において、前記切断因子は、複数個であって、複数個のそれぞれの切断因子の配列が異なっており、互いに異なる配列を含むことができる。
前記切断因子は、正常細胞の塩基配列と比較して、細胞の死滅を誘導できる十分な複数個の数でなければならなく、互いに異なる配列を有する２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、１１個以上、１２個以上、１３個以上、１４個以上、１５個以上、１６個以上、１７個以上、１８個以上、１９個以上、２０個以上であり得る。前記切断因子は、互いに異なる配列を有する２０個以下、１９個以下、１８個以下、１７個以下、１６個以下、１５個以下、１４個以下、１３個以下、１２個以下、１１個以下、１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、又は２個以下であり得る。
前記切断因子の数が多くなるほど、細胞死滅がさらにうまく行われるが、１０個程度になると、十分な変異細胞死滅効果を示す。よって、切断因子の数は、２個から１０個まで、好ましくは２個から８個まで、より好ましくは３個から５個まで選択することができる。
前記切断因子は、互いに異なる配列を有する４個～２０個、４個～１９個、４個～１８個、４個～１７個、４個～１６個、４個～１５個、４個～１４個、４個～１３個、４個～１２個、４個～１１個、又は４個～１０個であり得る。
本発明において、前記切断因子は、例えば、互いに異なる配列を有する６個～２０個、６個～１９個、６個～１８個、６個～１７個、６個～１６個、６個～１５個、６個～１４個、６個～１３個、６個～１２個、６個～１１個、又は６個～１０個であり得る。
本発明において、前記切断因子は、例えば、互いに異なる配列を有する８個～２０個、８個～１９個、８個～１８個、８個～１７個、８個～１６個、８個～１５個、８個～１４個、８個～１３個、８個～１２個、８個～１１個、又は８個～１０個であり得る。
本発明において、前記切断因子は、例えば、互いに異なる配列を有する１０個～２０個、１０個～１９個、１０個～１８個、１０個～１７個、１０個～１６個、１０個～１５個、１０個～１４個、１０個～１３個、又は１０個～１２個であり得る。
本発明において、前記切断因子は、例えば、互いに異なる配列を有する１２個～２０個、１２個～１９個、１２個～１８個、１２個～１７個、１２個～１６個、１２個～１５個、１２個～１４個、又は１２個～１３個であり得る。
本発明において、前記切断因子は、例えば、互いに異なる配列を有する１４個～２０個、１４個～１９個、１４個～１８個、１４個～１７個、１４個～１６個、又は１４個～１５個であり得る。
本発明において、前記切断因子は、例えば、互いに異なる配列を有する１６個～２０個、１６個～１９個、１６個～１８個、又は１６個～１７個であり得る。
本発明において、前記切断因子は、例えば、互いに異なる配列を有する１８個～２０個、又は１８個～１９個であり得る。
本発明において、前記切断因子は、例えば、互いに異なる配列を有する２０個、１９個、１８個、１７個、１６個、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、又は４個を含むことができる（数字の間の範囲も含む）。前記切断因子は、例えば、互いに異なる配列を有する２０個、１９個、１８個、１７個、１６個、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個又は２個を含むことができる（数字の間の範囲も含む）。
前記切断因子は、正常細胞の塩基配列と比較して、細胞の死滅を誘導できる十分な数でなければならなく、互いに異なる配列を有する２個～２０個であり得る。例えば、２個～２０個、２個～１９個、２個～１８個、２個～１７個、２個～１６個、２個～１５個、２個～１４個、２個～１３個、２個～１２個、２個～１１個、２個～１０個、２個～９個、２個～８個、２個～７個、２個～６個、２個～５個、２個～４個、又は２個～３個であり得る。
切断因子がターゲットとする染色体が二倍体（ｄｉｐｌｏｉｄ）及び／又は三倍体（ｔｒｉｐｌｏｉｄ）であるかどうかによって、各切断因子がターゲットとする配列を２個及び／又は３個含むことができる。よって、切断因子によって誘導される二重鎖切断（ＤＳＢ）は、細胞の死滅を誘導できる切断因子の数の２倍及び／又は３倍であり得る。例えば、互いに異なる配列を有する２個の切断因子を含む場合、細胞死滅のために４個乃至６個の二重鎖切断（ＤＳＢ）が必要である。
場合によって、ＤＮＡ二重鎖切断を通じて細胞死滅効率を高めるために、ＤＮＡ二重鎖の復旧を阻害するように、例えば、カフェイン（Ｃａｆｆｅｉｎｅ）、ウォルトマンニン（Ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ）、ＣＰ－４６６７２２、ＫＵ－５５９３３、ＫＵ－６００１９、及びＫＵ－５５９４０３で構成された群から選ばれた一つ以上のＡＴＭ（Ａｔａｘｉａ ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ ｍｕｔａｔｅｄ）阻害剤、シザンドリン（Ｓｃｈｉｓａｎｄｒｉｎ）Ｂ、ＮＵ６０２７、ＮＶＰ－ＢＥＺ２３５、ＶＥ－８２１、ＶＥ－８２２（ＶＸ－９７０）、ＡＺ２０、及びＡＺＤ６７３８で構成された群から選ばれた一つ以上のＡＴＲ（Ａｔａｘｉａ ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ ａｎｄ Ｒａｄ－３ ｍｕｔａｔｅｄ）阻害剤、又はＤＮＡ－ＰＫｃｓ（ＤＮＡ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｓｕｂｕｎｉｔ）のＤＮＡ二重鎖の復旧阻害剤をさらに含むことができる。
Ａ．伝達対象
本発明に係る組成物は、ゲノム配列変異を有する細胞内細胞特異的変異領域の配列のうち、正常細胞には存在しない固有の配列を含む２個以上の細胞特異的変異領域を特異的に認識する複数個の切断因子又はこれをコードするポリヌクレオチド、及びエンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼＩが融合された核酸切断酵素又はこれをコードするポリヌクレオチドを含み、それぞれを伝達するために単一又は伝達手段を同一又は異なる構成で組み合わせて使用することができる。
前記複数個の切断因子をコードするポリヌクレオチド配列及び／又は核酸切断酵素をコードするポリヌクレオチド配列は、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列、又はその組み合わせ（ＲＮＡ－ＤＮＡ組み合わせ配列）であり得る。
本発明に係る組成物において、切断因子又はこれをコードするポリヌクレオチドは、切断因子のＲＮＡ配列又はＤＮＡ配列を含むことができる。本発明に係る組成物において、エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼＩが融合された核酸切断酵素をコードするポリヌクレオチドは、タンパク質、タンパク質をコードするＲＮＡ配列又はＤＮＡ配列を含むことができる。
Ｂ．ベクターによる伝達
本発明に係る組成物を伝達するための方法として、切断因子のＤＮＡ配列及びエンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼＩが融合された核酸切断酵素をコードするＤＮＡ配列を含むことができる。切断因子のＤＮＡ配列及びエンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼＩが融合された核酸切断酵素をコードするＤＮＡ配列は、ベクターなどの伝達手段を介して提供され得る。
一観点において、本発明は、（ｉ）エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼＩが融合された核酸切断酵素をコードするポリヌクレオチド；及び（ｉｉ）ゲノム配列変異（ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を有する細胞において、前記ゲノム配列変異を有する２個以上の細胞特異的変異領域をそれぞれ認識する切断因子をコードするポリヌクレオチドを含むゲノム配列変異を有する細胞死滅誘導用ベクターに関する。
一観点において、本発明は、（ｉ）エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼＩが融合された核酸切断酵素をコードするポリヌクレオチド；及び（ｉｉ）ゲノム配列変異（ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を有する細胞において、前記ゲノム配列変異を有する２個以上の細胞特異的変異領域をそれぞれ認識する切断因子をコードするポリヌクレオチドを含み、前記（ｉ）及び（ｉｉ）が同一又は異なるベクターに含まれる、ゲノム配列変異を有する細胞死滅誘導用組成物に関する。
一つの実施例において、（ｉ）エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼＩが融合された核酸切断酵素又はこれをコードするポリヌクレオチド；及び（ｉｉ）ゲノム配列変異を有する２個以上の細胞特異的変異領域を認識する一つ以上の切断因子のそれぞれは、同一又は異なるベクターに含まれ得る。
（１）個別ベクターを用いた伝達
ベクターは、原核細胞又は真核細胞において複数個の切断因子及び核酸切断酵素の核酸転写物、タンパク質又は酵素の発現のために設計され得る。切断因子のＤＮＡ配列及び核酸切断酵素タンパク質をコードするＤＮＡ配列のそれぞれを別個の異なるベクター上に位置させて伝達することができる。
本発明に係るウイルスベクターとして、例えば、ＡＡＶ（Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ）、ＡｄＶ（Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ）、ＬＶ（Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ）又はＲＶ（Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ）、その他のウイルスベクター、例えば、シミアンウイルス（Ｓｉｍｉａｎ ｖｉｒｕｓ）４０（ＳＶ４０）ｏｒｉ、ＢＰＶ（ｂｏｖｉｎｅ ｐａｐｉｌｌｏｍａ ｖｉｒｕｓ）ｏｒｉ又はＥＢＶ（Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ ｎｕｃｌｅａｒ ａｎｔｉｇｅｎ）ｏｒｉを含むエピソーマルベクターを使用して伝達することができる。
（２）単一のベクターを用いた伝達
切断因子のＤＮＡ配列及びエンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼＩが融合された核酸切断酵素をコードするＤＮＡ配列を同一のベクター上に位置させ、一つのベクターを介して同時に伝達することができる。
本発明に係るウイルスベクターとして、例えば、ＡＡＶ（Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ）、ＡｄＶ（Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ）、ＬＶ（Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ）又はＲＶ（Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ）、その他のウイルスベクター、例えば、シミアンウイルス（Ｓｉｍｉａｎ ｖｉｒｕｓ）４０（ＳＶ４０）ｏｒｉ、ＢＰＶ（ｂｏｖｉｎｅ ｐａｐｉｌｌｏｍａ ｖｉｒｕｓ）ｏｒｉ又はＥＢＶ（Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ ｎｕｃｌｅａｒ ａｎｔｉｇｅｎ）ｏｒｉを含むエピソーマルベクターを使用して伝達することができる。
複数個の切断因子を含んで多重遺伝子を編集することは、ｃｒＲＮＡ－プロセッシングメカニズムと連関している（Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｖｏｌｕｍｅ １１，Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ：１２８１（２０２０），Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｖｏｌｕｍｅ ３５，ｐａｇｅｓ３１－３４（２０１７））。
核酸切断酵素の種類と関連して、Ｃａｓ１２ａ／Ｃａｓ１３ａは、ｔｒａｃｒＲＮＡなしでｃｒＲＮＡを加工することができる。自体のヌクレアーゼ特性を保有し、ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡ（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｒＲＮＡ）加工に必要な反復配列であるＤＲ（ｄｉｒｅｃｔ ｒｅｐｅａｔ）を除去することができる。
Ｃａｓ６は、最後のエフェクター複合体（ｆｉｎａｌ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｏｍｐｌｅｘ）を形成するために付属タンパク質（ａｃｃｅｓｓｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ）が必要であり、Ｃａｓ６によって加工されたｃｒＲＮＡは、カスケードと呼ばれるＣａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８で構成されたターゲット認知モジュールに導入され、このようなカスケード複合体は、外部遺伝子のＰＡＭを認知することによってＤＮＡを編集する。
Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃは、ｔｒａｃｒＲＮＡ（ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｃｒＲＮＡ）及びＲＮａｓｅ IIIを通じてｐｒｅ－ｃｒＲＮＡ（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｒＲＮＡ）加工をする。
複合遺伝子の校正で、例えば、Ｃａｓ９が適用される場合、Ｃａｓ９のｇＲＮＡはｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体を含み、ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡが融合されてｓｇＲＮＡを形成するので、複合遺伝子の校正のためにそれぞれのｃｒＲＮＡの間にｐｒｅ－ｃｒＲＮＡ（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｒＲＮＡ）加工に必要な反復配列である直接反復を挿入し、ｔｒａｃｒＲＮＡを別途に発現させ、ＲＮａｓｅ IIIがｔｒａｃｒＲＮＡによって作動し、直接反復を除去しながら複数の遺伝子を編集することができる。
場合によって、それぞれのＲＮＡの間にリボザイムなどの自己切断配列を結合させたり、ＲＮＡのうち２８－ｎｔステムループ配列を認知し、２０番目のヌクレオチドを切断する酵素であるＣｓｙ４認知部位を結合させたり、又は内因性ＲＮａｓｅ Ｐ／ＲＮａｓｅ Ｚによって加工可能なｔＲＮＡを挿入することによって、ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡ（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｒＲＮＡ）がｃｒＲＮＡに加工できるようにする。
複数のｇＲＮＡのそれぞれの間にリボザイムなどの自己切断配列を結合させることができる。Ｐｏｌ II及びＰｏｌ IIIプロモーターを適用し、Ｐｏｌ II及びＰｏｌ IIIプロモーターによって媒介される転写を通じてｐｒｅ－ｃｒＲＮＡを加工することができる。
また、ＲＮＡのうち２８－ｎｔステムループ配列を認知し、２０番目のヌクレオチドを切断する酵素であるＣｓｙ４認知部位を結合させることができる。Ｃｓｙ４認知配列を含むｇＲＮＡとＣｓｙ４を共同発現させると、多重ｇＲＮＡが発現され、単一のプロモーターを通じて加工され得る。
さらに、内因性ＲＮａｓｅ Ｐ／ＲＮａｓｅ Ｚによって加工可能なｔＲＮＡを挿入し、ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡを加工することができる。ＲＮａｓｅ Ｐ／ＲＮａｓｅ Ｚは、ｐｒｅ－ｔＲＮＡの５’末端及び３’末端を切断し、多重ｇＲＮＡがｔＲＮＡ－ｇＲＮＡから加工され得る。
Ｃ．ベクター及びｍＲＮＡ、キャリア又はエクソソーム組み合わせ
本発明に係る組成物を伝達するための方法として、切断因子のＤＮＡ配列及びエンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼＩが融合された核酸切断酵素又は核酸切断酵素をコードするＲＮＡ配列を含むことができる。
本発明は、（ｉ）エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼＩが融合された核酸切断酵素又はこれをコードするポリヌクレオチド；及び（ｉｉ）ゲノム配列変異（ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を有する細胞において、前記ゲノム配列変異を有する２個以上の細胞特異的変異領域をそれぞれ認識する切断因子をコードするポリヌクレオチドを含み、前記（ｉｉ）がベクターに含まれる、ゲノム配列変異を有する細胞死滅誘導用組成物に関する。
前記切断因子のＤＮＡ配列は、ベクターを介して伝達することができる。本明細書に記載された任意のベクターを適用して伝達することができ、例えば、ＡＡＶ（Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ）、ＡｄＶ（Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ）、ＬＶ（Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ）又はＲＶ（Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ）、その他のウイルスベクター、例えば、シミアンウイルス（Ｓｉｍｉａｎ ｖｉｒｕｓ）４０（ＳＶ４０）ｏｒｉ、ＢＰＶ（ｂｏｖｉｎｅ ｐａｐｉｌｌｏｍａ ｖｉｒｕｓ）ｏｒｉ又はＥＢＶ（Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ ｎｕｃｌｅａｒ ａｎｔｉｇｅｎ）ｏｒｉを含むエピソーマルベクターを使用して伝達することができる。
エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼＩが融合された核酸切断酵素をコードするＲＮＡ配列をｍＲＮＡ形態で伝達することができる。ｍＲＮＡ形態の伝達として、合成修飾（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｍｏｄｉｆｉｅｄ）ｍＲＮＡ又はｓｒＲＮＡ（ｓｅｌｆ－ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ ＲＮＡ）を含むことができる。
エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼＩが融合された核酸切断酵素又は核酸切断酵素をコードするＲＮＡ配列は、修飾ヌクレオシドを含んだり、合成自己－複製ＲＮＡ（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｓｅｌｆ－ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ ＲＮＡ）を含んだり、本明細書に記載されたキャリア又はエクソソームを介して伝達され得る。例えば、ナノ粒子、ｃｐｐ、ポリマーなどのキャリア又はエクソソームを介して伝達することができる。
Ｄ．ｍＲＮＡ又はキャリアによる伝達
本発明に係る組成物を伝達するための方法として、切断因子のＲＮＡ配列及びエンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼＩが融合された核酸切断酵素又は核酸切断酵素をコードするＲＮＡ配列を含むことができる。切断因子のｍＲＮＡ形態で伝達することができる。エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼＩが融合された核酸切断酵素は、タンパク質形態又は核酸切断酵素タンパク質をコードするｍＲＮＡ形態で伝達することができる。
本発明は、（ｉ）エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼＩが融合された核酸切断酵素又はこれをコードするポリヌクレオチド；（ｉｉ）ゲノム配列変異（ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を有する細胞において、前記ゲノム配列変異を有する２個以上の細胞特異的変異領域をそれぞれ認識する切断因子をコードするポリヌクレオチドを含む、ゲノム配列変異を有する細胞死滅誘導用キャリアに関する。
本発明は、（ｉ）エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼＩが融合された核酸切断酵素をコードするポリヌクレオチド；（ｉｉ）ゲノム配列変異（ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を有する細胞において、前記ゲノム配列変異を有する２個以上の細胞特異的変異領域をそれぞれ認識する切断因子をコードするポリヌクレオチドを含有し、前記（ｉ）及び（ｉｉ）がキャリアに含まれるゲノム配列変異を有する細胞死滅誘導用組成物に関する。
本発明は、（ｉ）エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼＩが融合された核酸切断酵素をコードするポリヌクレオチド；（ｉｉ）ゲノム配列変異（ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を有する細胞において、前記ゲノム配列変異を有する２個以上の細胞特異的変異領域をそれぞれ認識する切断因子をコードするポリヌクレオチドを含む、ゲノム配列変異を有する細胞死滅誘導用エクソソームに関する。
本発明は、（ｉ）エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼＩが融合された核酸切断酵素をコードするポリヌクレオチド；（ｉｉ）ゲノム配列変異（ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を有する細胞において、前記ゲノム配列変異を有する２個以上の細胞特異的変異領域をそれぞれ認識する切断因子又はこれをコードするポリヌクレオチドを含有し、前記（ｉ）及び（ｉｉ）がエクソソームに含まれる、ゲノム配列変異を有する細胞死滅誘導用組成物に関する。
ｍＲＮＡ形態の伝達として、合成修飾（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｍｏｄｉｆｉｅｄ）ｍＲＮＡ又はｓｒＲＮＡ（ｓｅｌｆ－ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ ＲＮＡ）を含むことができる。
切断因子のｍＲＮＡ、核酸切断酵素タンパク質又は核酸切断酵素タンパク質をコードするｍＲＮＡ配列を核酸切断酵素タンパク質形態で伝達したり、核酸切断酵素タンパク質をコードするｍＲＮＡ形態で伝達したり、又は本明細書に記載されたキャリア又はエクソソーム、例えば、ナノ粒子、ｃｐｐ、ポリマーなどのキャリア又はエクソソームを介して伝達することができる。
Ｅ．ＲＮＰによる伝達
切断因子のｍＲＮＡ、核酸切断酵素タンパク質は、ＲＮＰ形態でｉｎ ｖｉｔｒｏで複合体を形成するようにして伝達することができる。
本発明は、（ｉ）エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼＩが融合された核酸切断酵素；及び（ｉｉ）ゲノム配列変異（ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を有する細胞において、前記ゲノム配列変異を有する２個以上の細胞特異的変異領域をそれぞれ認識する切断因子をコードするポリヌクレオチドを含む、ゲノム配列変異を有する細胞死滅誘導用リボ核酸タンパク質（Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ、ＲＮＰ）複合体に関する。
本発明は、（ｉ）エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼＩが融合された核酸切断酵素；及び（ｉｉ）ゲノム配列変異を有する細胞内の変異のうち２個～１０個の変異領域を特異的に認識する一つ以上の切断因子をコードするポリヌクレオチドを含有し、前記（ｉ）及び（ｉｉ）がリボ核酸タンパク質（Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ、ＲＮＰ）複合体を形成する、ゲノム配列変異を有する細胞死滅誘導用組成物に関する。
場合によって、ＲＮＰを本明細書に記載されたキャリア又はエクソソーム、例えば、ナノ粒子、ｃｐｐ、ポリマーなどのキャリア又はエクソソームを介して伝達することができる。
本発明を通じて患者に合わせたオーダーメード型治療医薬品を製造することができる。患者に合わせたオーダーメード型は、患者固有の特性又は患者の疾病特性を十分に反映し、効果的に疾病を治療できることを意味する。患者に合わせたオーダーメード型疾病治療用組成物は、治療剤の選別及び治療方法の選択などに有用に使用することができる。
これによって、本発明は、（ｉ）核酸切断酵素又はこれをコードするポリヌクレオチド；（ｉｉ）ゲノム配列変異（ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を有する細胞において、前記ゲノム配列変異を有する４個以上の細胞特異的変異領域をそれぞれ認識する切断因子又はこれをコードするポリヌクレオチドを含む、患者に合わせたオーダーメード型疾病治療用組成物に関する。本発明は、（ｉ）核酸切断酵素又はこれをコードするポリヌクレオチド；（ｉｉ）ゲノム配列変異（ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を有する細胞において、前記ゲノム配列変異を有する４個以上の細胞特異的変異領域をそれぞれ認識する切断因子又はこれをコードするポリヌクレオチドを患者に処理する患者に合わせたオーダーメード型疾病治療方法に関する。
本発明は、正常細胞と異なる複数個のゲノム変異配列を選択する１段階；及び核酸切断酵素又はこれをコードするポリヌクレオチド、及びゲノム配列変異を有する細胞内の複数の変異領域のそれぞれを特異的に認識する複数個の切断因子又はこれをコードするポリヌクレオチドを含むゲノム配列変異を有する細胞死滅誘導用組成物を処理する段階；を含む患者に合わせたオーダーメード型疾病治療方法に関する。
本発明は、（ｉ）エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼＩが融合された核酸切断酵素又はこれをコードするポリヌクレオチド；及び（ｉｉ）ゲノム配列変異（ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を有する細胞において、前記ゲノム配列変異を有する２個以上の細胞特異的変異領域をそれぞれ認識する切断因子をコードするポリヌクレオチドを含む患者に合わせたオーダーメード型疾病治療用組成物に関する。本発明は、（ｉ）エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼＩが融合された核酸切断酵素又はこれをコードするポリヌクレオチド；及び（ｉｉ）ゲノム配列変異（ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を有する細胞において、前記ゲノム配列変異を有する２個以上の細胞特異的変異領域をそれぞれ認識する切断因子をコードするポリヌクレオチドを患者に処理する患者に合わせたオーダーメード型疾病治療方法に関する。
本発明は、正常細胞と異なる複数個のゲノム変異配列を選択する１段階；及びエンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼＩが融合された核酸切断酵素又はこれをコードするポリヌクレオチド、及びゲノム配列変異を有する細胞内の複数の変異領域のそれぞれを特異的に認識する複数個の切断因子又はこれをコードするポリヌクレオチドを含むゲノム配列変異を有する細胞死滅誘導用組成物を処理する段階；を含む患者に合わせたオーダーメード型疾病治療方法に関する。
本発明の組成物、方法及び用途は、これを必要とする対象体に十分な量又は有効量で投与され得る。「有効量」又は「十分な量」は、単一又は多重用量で単独で又は一つ以上の他の治療用組成物、プロトコル、又は治療療法と組み合わされて任意の期間の間に対象体に有益を与えたり、対象体に予想又は要望される結果を提供する量を示す。製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、病的状態、投与時間、投与経路、排出速度、及び反応感応性などの各要因によって多様に処方され得る。
実施例
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、本発明を例示するためのものに過ぎなく、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されるものと解釈されないことは、当業界で通常の知識を有する者にとって自明であろう。
実施例１．同時多発的ＤＮＡ ＤＳＢが細胞死滅を誘導する。
ＩｎＤｅｌｓをターゲットとする場合、多量の癌細胞特異的ＤＮＡ ＤＳＢが生成され、癌細胞を選択的に死滅できると仮定した（図１Ａ）。ＥＲ－ＡｓｉＳＩ Ｕ２ＯＳ細胞を使用し、酵素的に誘導されたＤＳＢが増殖する癌細胞を死滅させるのに十分であるかどうかをテストした。
ＥＲ－ＡｓｉＳＩ（１７）を備えたＵ２ＯＳ細胞は、Ｔａｎｙａ Ｐａｕｌｌ博士（テキサス大学オースティン校、米国）によって寄贈された。ＥＲ－ＡｓｉＳＩ Ｕ２ＯＳ細胞は、１０％の牛胎児血清を含むＤＭＥＭ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で培養した。次は、１×１０５細胞を６ウェルプレートに播種し、４－ヒドロキシタモキシフェン（４－ＯＨＴ）（Ｃａｔ＃．Ｈ７９０４；Ｍｅｒｃｋ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を添加し、最終処理濃度を３００ｎＭにした。４－ＯＨＴ処理４時間後に培地を再生し、細胞を追加的に６日間インキュベートした。細胞の生存率は、製造社のプロトコル（Ｇ９２４１；Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）によってメチレンブルー染色によるコロニー形成分析（Ｃａｔ＃ Ｍ９１４０；Ｍｅｒｃｋ）又はＣｅｌｌｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏ分析を通じて確認した。
ＥＲ－ＡｓｉＳＩ Ｕ２ＯＳ細胞は、タモキシフェン（４ＯＨＴ）の存在下で核に移動するＡｓｉＳＩ制限酵素を発現する（図１Ｂ）。ヒトゲノム（ＧＲＣｈ３８）の現在のバージョンには、１，２２５のＡｓｉＳＩ認識サイトが含まれている。したがって、このような細胞類型では、約１００～１，０００のＤＳＢが発生する可能性があると予測した。４ＯＨＴ処理後、ＡｓｉＳＩが核に移動した場合、４ＯＨＴを処理したＵ２ＯＳ細胞と比較してほぼ全てのＥＲ－ＡｓｉＳＩ Ｕ２ＯＳ細胞が死滅した（図１Ｂ）。このようなデータは、酵素によって生成された多数のＤＳＢが増殖中の癌細胞を殺すことができることを示す。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９によって誘導されたＤＮＡ ＤＳＢが癌細胞も殺すことができるかどうかをテストした。
ヒトゲノムの多様なｌｏｃｉをターゲットとするｓｇＲＮＡを構築するためにｓｇＲＮＡを設計し、ヒトＧＲＣｈ３８参照ゲノムに対してＣａｓ－ＯＦＦｉｎｄｅｒを使用してターゲットの数を検証した。各ｓｇＲＮＡ配列は、ｐＭＪ１７９プラスミド（Ｃａｔ＃ ８５９９６；Ａｄｄｇｅｎｅ，Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）で変形したマウスＵ６プロモーターを含むｓｇＲＮＡ発現ベクターにクローニングされた。形質感染１日前に１．５×１０４個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに播種した。次は、２００ｎｇのＳｐＣａｓ９（Ｃａｔ＃ ４３９４５；Ａｄｄｇｅｎｅ）及びｓｇＲＮＡ発現プラスミドをリポフェクタミン３０００（Ｃａｔ＃ Ｌ３００００１５；Ｔｈｅｒｍｏ Fｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎtｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用して細胞に形質感染した。形質感染３日後、製造社の指示に従ってＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ発光細胞生存率アッセイ（Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ）（Ｃａｔ＃ Ｇ７５７０；Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して細胞生存率を測定した。マイクロプレートリーダー（ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ）とＧｅｎ５ソフトウェア（ＢｉｏＴｅｋ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ，ＵＳＡ）を使用して発光度を測定した。
ヒトゲノムに反復的に存在する公知のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ターゲット配列を選択した（図１Ｃ及び図２）。ｓｇＲＮＡの数が１０以上に増加し、異数体ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のゲノムに２０ ＤＳＢが生成されると、細胞が死滅しはじめることが観察された。癌細胞株においてＣＩＮＤＥＬＡ細胞死滅をテストするための出発点として、３０個のｇＲＮＡを選択した。
Figure 2023517992000004
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９によって生成された特定のＩｎＤｅｌｓのＤＳＢが選択的に癌細胞を死滅するかどうかをテストするために、骨肉腫と結腸癌からそれぞれ由来したＵ２ＯＳとＨＣＴ１１６細胞の全ゲノム塩基配列（ｗｈｏｌｅ－ｇｅｎｏｍｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）を決定した。比較のために、テロメラーゼ発現によって不滅化された非腫瘍細胞株であるＲＰＥ１の全ゲノムもシーケンシングした。各細胞株で識別されたＩｎＤｅｌｓに対して、ＩｎＤｅｌｓをターゲットとするｓｇＲＮＡを設計した。
製造社の指示に従って、１５０ｂｐペアの末端リード（１５０－ｂｐ ｐａｉｒｅｄ－ｅｎｄ ｒｅａｄ）を含む３０×範囲をターゲットとするＩｌｌｕｍｉｎａＮｏｖａＳｅｑ ６０００を使用して細胞株及びゼノグラフト組織の全ゲノムシーケンシング（ｗｈｏｌｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を行った（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）。アダプター配列をｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ（ｖｅｒｓｉｏｎ ０．３９）（３１）で加工した後、ＢＭＡ－ＭＥＭ（ｖｅｒｓｉｏｎ ０．７．１７－ｒ１１８８）を使用し、ヒトゲノム（ＧＲＣｈ３８）に対するリードをマッピングした。ヒト（ＧＲｃｈ３８）ゲノムとマウス（ｍｍ１０）ゲノムに対するデータベースにリードをマッピングした。その後、フィルタリングされたリードは、ゼノグラフトサンプルに対して追加的に分析するためにヒトゲノムに優先的にマッピングされた。ｓａｍｔｏｏｌｓ（ｖｅｒｓｉｏｎ １．１０）を用いて重複した一致を除去した後、生殖細胞系列の変形を確認するためのデフォルトセッティングでｓｔｒｅｌｋａ２（ｖｅｒｓｉｏｎ ２．９．１０）を使用した。
癌細胞株特異的ＩｎＤｅｌｓに対するｓｇＲＮＡを設計するために、まず、３ｂｐｓ～８ｂｐｓのＩｎＤｅｌｓをフィルタリングし、ＳｐＣａｓ９及びＳａＣａｓ９のうち一つに対して該当のＩｎＤｅｌｓを使用してｓｇＲＮＡを設計した。ｇｎｏｍＡＤデータベース（ｖｅｒｓｉｏｎ ２．１．１）及び以前にテストした他の癌細胞のうち一つにおいて不均一性（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）、対立遺伝子の深さ（ａｌｌｅｌｅ ｄｅｐｔｈ）及びＩｎＤｅｌ可用性（ＩｎＤｅｌ ａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ）を考慮して、ｓｇＲＮＡの優先順位を選定した。ｅｘｏｎｅｒａｔｅ（ｖｅｒｓｉｏｎ ２．４．０）を使用し、２個の不一致を許容値としてオフターゲットの可能性を確認し、全ての最終候補対象を視覚的に検査した。分析で使用される全てのコードは、Ｇｉｔｈｕｂ（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｔａｅｊｏｏｎ／ＣＲＩＳＰＲ－ｔｏｏｌｂｏｘ）で利用可能である。
Figure 2023517992000005
癌特異的ＩｎＤｅｌｓをターゲットとするガイドＲＮＡとトレーサー（ｔｒａｃｅｒ） ＲＮＡ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ，ＵＳＡ）を使用した。ＲＮＰ（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ）複合体は、２０μｇのガイドＲＮＡとトレーサーＲＮＡを同一のモル濃度で混合した混合物とＳｐＣａｓ９ １５μｇとを組み合わせて形成された。製造社のプロトコルによって、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭＣＲＩＳＰＲＭＡＸＴＭＣａｓ９ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｃａｔ＃ ＣＭＡＸ００００１、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してＲＮＰを伝達した。
このようなｓｇＲＮＡが細胞特異的ＤＮＡ ＤＳＢを誘導できるかどうかを調査するために、３０個のＣＲＩＳＰＲ－ＳｐＣａｓ９ＲＮＰ複合体をＵ２ＯＳ細胞に形質感染した。Ｕ２ＯＳ特異的ＩｎＤｅｌをターゲットとするＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＰ複合体を含むＵ２ＯＳ細胞の細胞死滅は、形質感染７２時間後に観察された。ＨＣＴ１１６特異的なＩｎＤｅｌをターゲットとするＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＰ複合体が形質感染されたＵ２ＯＳ細胞では、細胞死滅が観察されなかった（図１Ｄ）。ＲＮＰ伝達のために、ｇＲＮＡの数を３０から１８、１２又は６に減少させると、用量依存的に細胞死滅が観察された（図２）。
Figure 2023517992000006
Figure 2023517992000007
実施例２．ＡＡＶ－ＳａＣａｓ９を含み、ＣＩＮＤＥＬＡ処理時に癌特異的細胞死滅が誘導される。
ＣＭＶプロモーターの下でＣＲＩＳＰＲ／ＳａＣａｓ９発現のためのＡＡＶプラスミドＡｄｄｇｅｎｅ（＃６１５９１）を製作し、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に形質感染した後、３日目にＡＡＶウイルス粒子を回収して濃縮した（Ａｄｄｇｅｎｅ，ＡＡＶ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ＨＥＫ２９３Ｔ Ｃｅｌｌｓ）。ＡＡＶ血清型２をウイルスパッケージングに使用し、２．８１×１０１０ウイルス粒子を使用してＣＩＮＤＥＬＡに対する標的細胞に形質導入した。
ＡＡＶ伝達に使用されたＳａＣａｓ９に３ｘＨＡをタグ付けし、単クローン抗－ＨＡ抗体（Ｃａｔ＃ Ｈ３６６３；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で検出した。ＤＮＡ損傷がある細胞は、γＨ２ＡＸを感知する抗－リン酸化－ヒストンＨ２Ａ.Ｘ抗体（Ｃａｔ＃ ０５－６３６；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して分析した。アポトーシス細胞死滅は、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ Ａｌｅｘａ ＦｌｕｏｒＴＭ ４８８コンジュゲート（Ｃａｔ＃．Ａ１３２０１；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及びＦｌｏｗ－Ｊｏソフトウェア（ｖｅｒｓｉｏｎ １０）を備えたＢＤ ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ機器を使用して製造社の指針に従って定量化した。
生体内の腫瘍環境にＲＮＰ複合体を伝達することは容易でないので、ＣＩＮＤＥＬＡ治療にＡＡＶ（Ａｄｅｎo－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ）基盤のＳａＣａｓ９を使用できるかどうかをテストした。プラスミド形質感染を通じて、ＳａＣａｓ９タンパク質を発現し、一つはＵ２ＯＳ ＩｎＤｅｌｓをターゲットとし、他の一つはＨＣＴ１１６ ＩｎＤｅｌｓをターゲットとする二つの互いに異なるＣＩＮＤＥＬＡ ｓｇＲＮＡセットを含むプラスミドを形質感染させ、Ｕ２ＯＳＣＩＮＤＥＬＡの効果を観察した。ＲＮＰ複合体伝達と同様に、Ｕ２ＯＳ細胞は、Ｕ２ＯＳ ＩｎＤｅｌをターゲットとするｓｇＲＮＡとＳａＣａｓ９が共同発現した場合にのみ死滅した（図３Ａ）。ＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＰ形質感染後のアネキシン（ａｎｎｅｘｉｎ）Ｖ信号の増加は、アポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）によって細胞が死滅したことを示した（図３Ｂ）。ｉｎ ｖｉｖｏ ＣＩＮＤＥＬＡテストのために、癌特異的なＩｎＤｅｌｓをターゲットとするｓｇＲＮＡとＳａＣａｓ９を共同発現するＡＡＶを製作した。互いに異なるｓｇＲＮＡとＳａＣａｓ９を共同発現する３０個のＡＡＶをＵ２ＯＳ細胞及びＲＰＥ１細胞に形質導入した。ＡＡＶの形質導入は、ＳａＣａｓ９発現に対するウェスタンブロットによって確認された。
Figure 2023517992000008
Ｕ２ＯＳ特異的ＩｎＤｅｌをターゲットとするＡＡＶによる選択的Ｕ２Ｏ２細胞死滅は、形質導入してから２日後に開始された（図３Ｃ；図４Ａ及び図４Ｂ）。対照的に、ＲＰＥ１細胞には影響を与えなかった。強力なγＨ２ＡＸ信号は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９の標的となったＵ２ＯＳ細胞でのみ観察され、標的細胞株で選択的なＤＳＢが確認された（図４Ｃ）。形質感染を通じた接近と同様に、ＣＩＮＤＥＬＡで形質導入されたＡＡＶも時間依存的に細胞死滅を起こした（図４Ｄ）。
Figure 2023517992000009
各細胞に必要なＣＩＮＤＥＬＡターゲットの最小数を確認するために、ＡＡＶで伝達されるｓｇＲＮＡの数を体系的に減少させた。ＣＩＮＤＥＬＡによって誘導されたＵ２ＯＳ細胞死滅には、ＳａＣａｓ９タンパク質発現と共に５個以上のｓｇＲＮＡが必要であった（図４Ｄ）。Ｕ２ＯＳ細胞は、一部の染色体で二倍体（ｄｉｐｌｏｉｄ）又は三倍体（ｔｒｉｐｌｏｉｄ）であるので、Ｕ２ＯＳゲノムは、各ガイドＲＮＡがターゲットとする２個以上のＤＮＡ配列を運搬し、細胞死滅に１０個乃至１５個のＤＳＢが必要である。一貫的にターゲットとするｓｇＲＮＡの数の増加により、ＣＩＮＤＥＬＡ誘導細胞死滅率が増加することが観察された（図４Ｅ）。１個又は３個のＡＡＶがＵ２ＯＳ細胞に形質導入される場合、明白な細胞死滅が発生しなかった。
実施例３．ＣＩＮＤＥＬＡ処理時にｉｎ ｖｉｖｏ異種移植モデル腫瘍成長が抑制される。
ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスは、標準条件で飼育された。全ての動物実験は、ＵＮＩＳＴの動物管理使用委員会（ＩＡＣＵＣ－１９－０５）で承認されたプロトコルを使用して実施された。６週齢のマウスに対して２×１０６の癌細胞を一つの側面に皮下注射した。腫瘍の大きさが約１ｃｍに到逹したとき、ＡＡＶ粒子を３日間隔で４回注射した。最初にＡＡＶ注射してから２週後、腫瘍を採取して分析した。Ｐｒｏｍｅｇａ ＤｅａｄＥｎｄＴＭ Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ＴＵＮＥＬ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃａｔ＃ Ｇ７３６０，Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してＴＵＮＥＬ分析を行った。ＰＤＸ実験は、ヒト肺扁平上皮癌のＰＤＸモデル：前臨床および共臨床応用における因子の考察（ＰＤＸ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｌｕｎｇ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ ｃｏ－ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）．Ｊ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ １８，３０７（２０２０）通じて知られている方法を使用してＤＮＡｌｉｎｋ，Ｉｎｃ．で実施された。
ＣＩＮＤＥＬＡがｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍成長を抑制できるかどうかをテストした。Ｕ２ＯＳ細胞異種移植モデルＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスで製作し、腫瘍の大きさが約１ｃｍに到逹するまでモニターした。次に、Ｕ２ＯＳ特異的ＣＩＮＤＥＬＡ ｓｇＲＮＡ及びＳａＣａｓ９を発現するＡＡＶ又はＳａＣａｓ９のみを発現するＡＡＶを３日間隔で２週間マウスに５回注射した。図５Ａに示したように、Ｕ２ＯＳ特異的ＣＩＮＤＥＬＡ ｓｇＲＮＡ及びＳａＣａｓ９発現ＡＡＶの注射によって腫瘍増殖が選択的に抑制されることを観察した。ＳａＣａｓ９のＨＡタグは、ＳａＣａｓ９のみを注射したマウス及びｓｇＲＮＡを含むＳａＣａｓ９腫瘍切片で検出された（図６Ａ）。ＡＡＶ治療期間の間、マウスは、有意な症状を示しておらず、ＡＡＶによって伝達されたＣＩＮＤＥＬＡが正常な組織及び細胞に影響を及ぼさなかったことを示唆した（図６Ｂ）。ＣＩＮＤＥＬＡ処理によって誘導された特異的細胞死滅経路を確認するために残った腫瘍を採取し、γＨ２ＡＸ又はＴＵＮＥＬ染色をした。予想どおり、ＣＩＮＤＥＬＡがターゲットとした腫瘍は、対照群の腫瘍と比較したとき、アポトーシス細胞死滅（図５Ｃ）以外に、γＨ２ＡＸ及びＴＵＮＥＬ信号の相当な誘導を示した（図５Ａ及び図５Ｂ）。
実施例４．ＣＩＮＤＥＬＡ処理時に患者由来の１次腫瘍及びＰＤＸを選別的に死滅させる。
ＣＩＮＤＥＬＡ治療が実際に腫瘍サンプルに適用できるかどうかを証明するために、韓国の膠芽腫患者由来の腫瘍細胞株ＧＢＬ－６７を使用した。全ゲノム配列データを基盤にして、ＧＢＬ－６７ ＩｎＤｅｌｓを特異的にターゲットとする２６個のＳａＣａｓ９ ＣＩＮＤＥＬＡガイドＲＮＡを設計した。同一の個体の正常細胞を入手できなかったので、ターゲットとするＩｎＤｅｌｓのないＮＳＣ－１０神経幹細胞を対照群として使用した。ｓｇＲＮＡ及びＳａＣａｓ９を発現するそれぞれのＡＡＶが生成されると同時に、原発性膠芽腫ＧＢＬ－６７及びＮＳＣ－１０細胞に形質導入された。ＣＩＮＤＥＬＡ処理によって約５０個の細胞特異的ＤＳＢが誘導され、膠芽腫細胞を十分に死滅できることを確認した（図７Ａ）。対照的に、ＮＳＣ－１０細胞は、同一に形質導入された後、成長が弱化されなかった。
Figure 2023517992000010
最後に、癌治療に対する予測前臨床モデルである患者由来の異種移植モデル（ＰＤＸ：ｐａｔｉｅｎｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ）でＣＩＮＤＥＬＡの有効性をテストした。確立された肺癌ＰＤＸで組織をシーケンシングした後、約３０個のＣＩＮＤＥＬＡターゲットを特定した（ＳＰＸ４－０７３に対して２９個のｇＲＮＡ、ＳＰＸ４－３１８に対して２２個のｇＲＮＡ）。ターゲットｓｇＲＮＡと共にＳａＣａｓ９を発現するＡＡＶを３日間隔で５回注射した後、異種移植モデルの腫瘍の大きさを２週間モニターした。ＰＤＸ腫瘍成長は、ｓｇＲＮＡ及びＳａＣａｓ９を発現するＡＡＶによって阻害された。対照的に、ＳａＣａｓ９のみが発現されたＡＡＶは腫瘍成長を抑制しなかった（図７Ｂ；図８Ａ及び図８Ｂ）。マウスＡＡＶ治療期間の間、有意な症状を示さなかった（図８Ｃ）。
Figure 2023517992000011
Figure 2023517992000012
実施例５．ＡＡＶ形質導入を通じて染色体５番のターゲットの選別的細胞死滅を誘導する。
５－１．３０ ＣＩＮＤＥＬＡ ｗｉｔｈ ｓａＣａｓ９
骨肉腫細胞を選択的にターゲットとし得る３０個の配列をＷＧＳ（ｗｈｏｌｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を通じて確認した後、ＡＡＶ－ｓａＣＡＳ９ベクター（ｐＸ６０１－ＡＡＶ－ＣＭＶ：：ＮＬＳ－ＳａＣａｓ９－ＮＬＳ－３ｘＨＡ）にそれぞれの配列を入れた後、ＨＥＣ２９３Ｔ細胞を用いて５個の配列を一つのグループとして合計６個のＡＡＶ粒子グループ（ｐａｒｔｉｃｌｅ ｇｒｏｕｐ）を製作した。製作されたＡＡＶ粒子（ｐａｒｔｉｃｌｅ）をｑＰＣＲを用いて定量した後、正常細胞であるＲＰＥ１細胞及び骨肉腫細胞であるＵ２ＯＳ細胞に形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）した。９６時間後、骨肉腫細胞でのみ選択的に細胞死滅が行われることを確認した。
Figure 2023517992000013
Ｕ２ＯＳ細胞に３０個のＤＮＡ配列をターゲットとし、骨肉腫細胞を選択的に死滅できることを確認した（図９）。
５－２．１０ ＣＩＮＤＥＬＡ ｗｉｔｈ ｓａＣａｓ９
骨肉腫細胞をターゲットとし得る３０個の配列のうち染色体（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）５番をターゲットとし得る１０個の配列を用いて、１－１．と同一の方法で（５個の配列を一つのグループとし、２個のＡＡＶ粒子グループを製作する）細胞死滅を誘導できるかどうかを確認した。
Figure 2023517992000014
Ｕ２ＯＳ細胞に１０個のＤＮＡ配列をターゲットとし、骨肉腫細胞を選択的に死滅できることを確認した。３０個の配列をターゲットとしたときと同様に、細胞死滅を誘導できることを確認した（図１０）。
５－３．５ ＣＩＮＤＥＬＡ ｗｉｔｈ ｓａＣａｓ９
染色体（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）５番をターゲットとし得る１０個の配列のうち１個のグループ（５個のＤＮＡ配列をターゲット：グループ５Ａ）のみで細胞死滅を誘導できるかどうかを確認した。
Ｕ２ＯＳ細胞に５個のＤＮＡ配列をターゲットとし、骨肉腫細胞を選択的に死滅できることを確認した。３０個或いは１０個の配列をターゲットとした場合と比較したとき、生きている細胞の比率が少し増加するが、ほとんどの細胞が死滅することを確認した（図１１）。
５－４．５ ＣＩＮＤＥＬＡ ｗｉｔｈ ｓａＣａｓ９
１－３と異なる染色体（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）５番をターゲットとし得る１個のグループ（グループ５Ｂ）で細胞死滅が誘導されるかどうかを確認した。
Ｕ２ＯＳ細胞に実施例１－３と異なる配列である５個のＤＮＡ配列をターゲットとし、骨肉腫細胞を選択的に死滅できることを確認した。３０個或いは１０個の配列をターゲットとした場合と比較したとき、生きている細胞の比率が少し増加するが、ほとんどの細胞が死滅することを確認した（図１２）。
５－５．３ ＣＩＮＤＥＬＡ ｗｉｔｈ ｓａＣａｓ９
染色体（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）５番をターゲットとし得る１０個の配列のうち３個の配列を任意に選択し、１個のＡＡＶ粒子グループ（ｐａｒｔｉｃｌｅ ｇｒｏｕｐ）を製作した後、細胞死滅が誘導されるかどうかを確認した。
Figure 2023517992000015
Ｕ２ＯＳ細胞に３個のＤＮＡ配列をターゲットとし、骨肉腫細胞の選択的な死滅を試みたが、細胞死滅が行われないことを確認した（図１３）。
実施例６．染色体３番のターゲットの選別的な細胞死滅を誘導する。
６－１．染色体（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）３番のためのＨＣＴ１１６ ｇＲＮＡ（５）ターゲッティング
ｓａＣａｓ９タンパク質にＥ．ｃｏｌｉエキソヌクレアーゼ（ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ）を結合したＥｘｏ－ｓａＣａｓ９組換えタンパク質を生成した。形質感染１２時間前に、ＨＣＴ１１６細胞を（６×１０５／６ウェルプレート）準備する。染色体（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）３をターゲットとする５個のｇＲＮＡとｓａＣａｓ９或いはＥｘｏ－Ｃａｓ９をリポフェクタミン３０００を用いて形質感染した後、４８時間が経過したとき、顕微鏡を用いて細胞死滅を観察する。
染色体（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）３をターゲットとする５個のｇＲＮＡを形質感染して実験した。ｓａＣａｓ９を単独で使用した場合、５個のｇＲＮＡで細胞死滅が起こらなかったが、Ｅｘｏ－ｓａＣａｓ９を使用すると、５個のｇＲＮＡでも十分に細胞死滅を起こすことを確認した（図１５）。
６－２．染色体（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）１番のためのＵ２ＯＳ ｇＲＮＡ（５）ターゲッティング
形質感染１２時間前に、Ｕ２ＯＳ細胞を（３×１０５／６ウェルプレート）準備する。Ｕ２ＯＳ染色体（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）１をターゲットとする５個のｇＲＮＡとｓａＣａｓ９或いはＥｘｏ－Ｃａｓ９をリポフェクタミン３０００を用いて形質感染した後、４８時間が経過したとき、顕微鏡を用いて細胞死滅を観察する。
染色体（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）１をターゲットとする５個のｇＲＮＡを形質感染して実験した。ｓａＣａｓ９を単独で使用した場合、５個のｇＲＮＡで細胞死滅が起こらなかったが、Ｅｘｏ－ｓａＣａｓ９を使用すると、５個のｇＲＮＡでも十分に細胞死滅を起こすことを確認した（図１６）。
６－３．復旧阻害有無の確認
２－１と２－２と同様に形質感染された各細胞を、４８時間後にＰＢＳを用いて収穫する。５０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上澄み液（ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）を捨てた後、ペレット（ｐｅｌｌｅｔ）にバッファーＡ（細胞膜、核膜除去用バッファー）２００μｌを処理する。５０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上澄み液を除去する。ペレットを５０μｌのＲＩＰＡバッファーに再懸濁（ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）させた後、１分間５０ａｍｐで超音波処理（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）を行う。１３，２００ｒｐｍで２５分間遠心分離した後、上澄み液を定量し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルで分離させ、ｇ－Ｈ２ＡＸアンチボディーを使用してウェスタンブロッティング（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）を行う。
図１４によるＥｘｏ－Ｃａｓ９を使用する場合、ＤＮＡ損傷マーカー（ｄａｍａｇｅ ｍａｒｋｅｒ）であるｇ－Ｈ２ＡＸ発現が高いことを確認した（図１７）。Ｅｘｏ－Ｃａｓ９を使用する場合、細胞死滅をさらにうまく誘導することは、ｓａＣａｓ９によるＤＮＡ二重鎖切断（ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋ）以後に復旧を阻害するためであると判断される。
６－４．ＤＲ－ＧＦＰアッセイ
ＤＲ－ＧＦＰが発現されるＵ２ＯＳ細胞をｓａＣａｓ９或いはｅｘｏ－ｓａＣａｓ９とＤＲ－ＧＦＰ特異的ｇＲＮＡと共に、リポフェクタミン３０００で形質感染させ、７２時間後に収穫する。収穫した細胞でのＧＦＰ発現量をＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）を用いて測定する。
ＨＲ（Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）される程度をＤＲ－ＧＦＰアッセイを通じて確認した結果、Ｅｘｏ－Ｃａｓ９を用いたときにＨＲが著しく低下することを確認した。Ｅｘｏ－Ｃａｓ９がＨＲを阻害できることを証明した（図１８）。
以上では、本発明の内容の特定部分を詳細に記述したが、当業界で通常の知識を有する者にとって、このような具体的な記述は好ましい実施様態に過ぎなく、これによって本発明の範囲が制限されないことは明白であろう。よって、本発明の実質的な範囲は、添付の特許請求の範囲及びそれらの等価物によって定義されると言えるだろう。

Claims (43)

  1. （ｉ）核酸切断酵素又はこれをコードするポリヌクレオチド；及び
    （ｉｉ）ゲノム配列変異（ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を有する細胞において、前記ゲノム配列変異を有する４個以上の細胞特異的変異領域をそれぞれ認識する切断因子又はこれをコードするポリヌクレオチド；を含む、ゲノム配列変異を有する細胞の死滅誘導用組成物。
  2. 前記ゲノム配列変異を有する細胞は、癌細胞、老化細胞、免疫疾患誘発細胞又は心血管疾患誘発細胞である、請求項１に記載の組成物。
  3. （ｉ）核酸切断酵素をコードするポリヌクレオチド；及び
    （ｉｉ）ゲノム配列変異（ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を有する細胞において、前記ゲノム配列変異を有する４個以上の細胞特異的変異領域をそれぞれ認識する切断因子又はこれをコードするポリヌクレオチド；を含む、ゲノム配列変異を有する細胞の死滅誘導用ベクター。
  4. 前記（ｉ）及び（ｉｉ）が同一又は異なるベクターに含まれる、請求項３に記載のベクター。
  5. 前記ベクターは、ＡＡＶ（Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ）、ＡｄＶ（Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ）、ＬＶ（Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ）、及びＲＶ（Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ）からなる群から選ばれるウイルスベクター；又はウイルスレプリコンを含むエピソーマルベクター；を含む、請求項３に記載のベクター。
  6. 前記エピソーマルベクターは、シミアンウイルス（Ｓｉｍｉａｎ ｖｉｒｕｓ）４０（ＳＶ４０）、ＢＰＶ（ｂｏｖｉｎｅ ｐａｐｉｌｌｏｍａ ｖｉｒｕｓ）又はＥＢＶ（Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ ｎｕｃｌｅａｒ ａｎｔｉｇｅｎ）の複製起点（Ｏｒｉ）を含む、請求項５に記載のベクター。
  7. （ｉ）核酸切断酵素；及び
    （ｉｉ）ゲノム配列変異（ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を有する細胞において、前記ゲノム配列変異を有する４個以上の細胞特異的変異領域をそれぞれ認識する切断因子をコードするポリヌクレオチド；を含む、ゲノム配列変異を有する細胞死滅誘導用リボ核酸タンパク質（Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ、ＲＮＰ）複合体。
  8. （ｉ）核酸切断酵素又はこれをコードするポリヌクレオチド；及び
    （ｉｉ）ゲノム配列変異（ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を有する細胞において、前記ゲノム配列変異を有する４個以上の細胞特異的変異領域をそれぞれ認識する切断因子をコードするポリヌクレオチド；を含む、ゲノム配列変異を有する細胞死滅誘導用キャリア。
  9. （ｉ）核酸切断酵素又はこれをコードするポリヌクレオチド；及び
    （ｉｉ）ゲノム配列変異（ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を有する細胞において、前記ゲノム配列変異を有する４個以上の細胞特異的変異領域をそれぞれ認識する切断因子をコードするポリヌクレオチド；を含む、ゲノム配列変異を有する細胞死滅誘導用エクソソーム。
  10. （ｉ）核酸切断酵素をコードするポリヌクレオチド；及び
    （ｉｉ）ゲノム配列変異（ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を有する細胞において、前記ゲノム配列変異を有する４個以上の細胞特異的変異領域をそれぞれ認識する切断因子をコードするポリヌクレオチド；を含み、
    前記（ｉ）及び（ｉｉ）が同一又は異なるベクターに含まれる、ゲノム配列変異を有する細胞死滅誘導用組成物。
  11. （ｉ）核酸切断酵素又はこれをコードするポリヌクレオチド；及び
    （ｉｉ）ゲノム配列変異（ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を有する細胞において、前記ゲノム配列変異を有する４個以上の細胞特異的変異領域をそれぞれ認識する切断因子をコードするポリヌクレオチド；を含み、
    前記（ｉｉ）がベクターに含まれる、ゲノム配列変異を有する細胞死滅誘導用組成物。
  12. （ｉ）の核酸切断酵素をコードするポリヌクレオチドは、核酸切断酵素をコードするＲＮＡであって、選択的に修飾ヌクレオシドを含んだり、又は合成自己－複製ＲＮＡ（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｓｅｌｆ－ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ ＲＮＡ）を含んだり；又は
    （ｉ）の核酸切断酵素又はこれをコードするポリヌクレオチドがキャリア又はエクソソームに含まれることを特徴とする、請求項１１に記載の組成物。
  13. （ｉ）核酸切断酵素；及び
    （ｉｉ）ゲノム配列変異（ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を有する細胞において、前記ゲノム配列変異を有する４個以上の細胞特異的変異領域をそれぞれ認識する切断因子をコードするポリヌクレオチド；を含有し、
    前記（ｉ）及び（ｉｉ）がリボ核酸タンパク質（Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ、ＲＮＰ）複合体を形成する、ゲノム配列変異を有する細胞死滅誘導用組成物。
  14. （ｉ）核酸切断酵素又はこれをコードするポリヌクレオチド；及び
    （ｉｉ）ゲノム配列変異（ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を有する細胞において、前記ゲノム配列変異を有する４個以上の細胞特異的変異領域をそれぞれ認識する切断因子をコードするポリヌクレオチド；を含有し、
    前記（ｉ）及び（ｉｉ）がキャリアに含まれる、ゲノム配列変異を有する細胞死滅誘導用組成物。
  15. 前記キャリアは、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）、ナノ粒子、ＺＩＦ（ｚｅｏｌｉｔｉｃ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ ｆｒａｍｅｗｏｒｋｓ）、ＲＮＡアプタマー－ストレプトアビジン（ａｐｔａｍｅｒ－ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）又は重合体を含む、請求項１４に記載の組成物。
  16. （ｉ）核酸切断酵素又はこれをコードするポリヌクレオチド；及び
    （ｉｉ）ゲノム配列変異（ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を有する細胞において、前記ゲノム配列変異を有する４個以上の細胞特異的変異領域をそれぞれ認識する切断因子をコードするポリヌクレオチド；を含有し、
    前記（ｉ）及び（ｉｉ）がエクソソームに含まれる、ゲノム配列変異を有する細胞死滅誘導用組成物。
  17. 互いに異なる配列を有する４個以上の切断因子を含む、請求項９～１６のいずれか１項に記載の組成物。
  18. 前記ゲノム配列変異を有する細胞内の４個～３０個の変異領域を特異的に認識する切断因子を含む、請求項９～１６のいずれか１項に記載の組成物。
  19. 互いに異なる配列を有する４個～３０個の切断因子を含む、請求項９～１６のいずれか１項に記載の組成物。
  20. ゲノム配列変異を有する細胞固有の挿入及び／又は欠失を含む４個～６０個の核酸配列部位に二重鎖切断（Ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ｂｒｅａｋ、ＤＳＢ）を誘導し、細胞を死滅させることを特徴とする、請求項９～１６のいずれか１項に記載の組成物。
  21. 前記核酸切断酵素は、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１２ｊ、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃａｓ１４、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、ＣｓＭＴ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３又はＣｓｆ４である、請求項９～１６のいずれか１項に記載の組成物。
  22. （ｉ）核酸切断酵素又はこれをコードするポリヌクレオチド；及び
    （ｉｉ）ゲノム配列変異（ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を有する細胞において、前記ゲノム配列変異を有する４個以上の細胞特異的変異領域をそれぞれ認識する切断因子をコードするポリヌクレオチド；を含む、患者に合わせたオーダーメード型疾病治療用組成物。
  23. （ｉ）エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼＩが融合された核酸切断酵素又はこれをコードするポリヌクレオチド；及び
    （ｉｉ）ゲノム配列変異（ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を有する細胞において、前記ゲノム配列変異を有する２個以上の細胞特異的変異領域をそれぞれ認識する切断因子又はこれをコードするポリヌクレオチド；を含むゲノム配列変異を有する細胞死滅誘導用組成物。
  24. （ｉ）エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼＩが融合された核酸切断酵素をコードするポリヌクレオチド；及び
    （ｉｉ）ゲノム配列変異（ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を有する細胞において、前記ゲノム配列変異を有する２個以上の細胞特異的変異領域をそれぞれ認識する切断因子をコードするポリヌクレオチド；を含むゲノム配列変異を有する細胞死滅誘導用ベクター。
  25. 前記（ｉ）及び（ｉｉ）が同一又は異なるベクターに含まれる、請求項２４に記載のベクター。
  26. ＡＡＶ（Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ）、ＡｄＶ（Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ）、ＬＶ（Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ）、及びＲＶ（Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ）からなる群から選ばれるウイルスベクター；又はウイルスレプリコン；を含む、請求項２５に記載のエピソーマルベクターを含むベクター。
  27. 前記エピソーマルベクターは、シミアンウイルス（Ｓｉｍｉａｎ ｖｉｒｕｓ）４０（ＳＶ４０）、ＢＰＶ（ｂｏｖｉｎｅ ｐａｐｉｌｌｏｍａ ｖｉｒｕｓ）又はＥＢＶ（Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ ｎｕｃｌｅａｒ ａｎｔｉｇｅｎ）の複製起点（Ｏｒｉ）を含む、請求項２６に記載のベクター。
  28. （ｉ）エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼＩが融合された核酸切断酵素；及び
    （ｉｉ）ゲノム配列変異（ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を有する細胞において、前記ゲノム配列変異を有する２個以上の細胞特異的変異領域をそれぞれ認識する切断因子をコードするポリヌクレオチド；を含む、ゲノム配列変異を有する細胞死滅誘導用リボ核酸タンパク質（Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ、ＲＮＰ）複合体。
  29. （ｉ）エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼIが融合された核酸切断酵素又はこれをコードするポリヌクレオチド；及び
    （ｉｉ）ゲノム配列変異（ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を有する細胞において、前記ゲノム配列変異を有する２個以上の細胞特異的変異領域をそれぞれ認識する切断因子をコードするポリヌクレオチド；を含む、ゲノム配列変異を有する細胞死滅誘導用キャリア。
  30. （ｉ）エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼIが融合された核酸切断酵素又はこれをコードするポリヌクレオチド；及び
    （ｉｉ）ゲノム配列変異（ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を有する細胞において、前記ゲノム配列変異を有する２個以上の細胞特異的変異領域をそれぞれ認識する切断因子をコードするポリヌクレオチド；を含む、ゲノム配列変異を有する細胞死滅誘導用エクソソーム。
  31. （ｉ）エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼIが融合された核酸切断酵素をコードするポリヌクレオチド；及び
    （ｉｉ）ゲノム配列変異（ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を有する細胞において、前記ゲノム配列変異を有する２個以上の細胞特異的変異領域をそれぞれ認識する切断因子をコードするポリヌクレオチド；を含み、
    前記（ｉ）及び（ｉｉ）が同一又は異なるベクターに含まれる、ゲノム配列変異を有する細胞死滅誘導用組成物。
  32. （ｉ）エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼIが融合された核酸切断酵素又はこれをコードするポリヌクレオチド；及び
    （ｉｉ）ゲノム配列変異（ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を有する細胞において、前記ゲノム配列変異を有する２個以上の細胞特異的変異領域をそれぞれ認識する切断因子をコードするポリヌクレオチド；を含み、
    前記（ｉｉ）がベクターに含まれる、ゲノム配列変異を有する細胞死滅誘導用組成物。
  33. （ｉ）の核酸切断酵素をコードするポリヌクレオチドは、核酸切断酵素をコードするＲＮＡであって、選択的に修飾ヌクレオシドを含んだり、又は合成自己－複製ＲＮＡ（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｓｅｌｆ－ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ ＲＮＡ）を含んだり；又は
    （ｉ）の核酸切断酵素又はこれをコードするポリヌクレオチドがキャリア又はエクソソームに含まれることを特徴とする、請求項３２に記載の組成物。
  34. （ｉ）エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼＩが融合された核酸切断酵素；及び
    （ｉｉ）ゲノム配列変異（ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を有する細胞において、前記ゲノム配列変異を有する２個以上の細胞特異的変異領域をそれぞれ認識する切断因子をコードするポリヌクレオチド；を含有し、
    前記（ｉ）及び（ｉｉ）がリボ核酸タンパク質（Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ、ＲＮＰ）複合体を形成する、ゲノム配列変異を有する細胞死滅誘導用組成物。
  35. （ｉ）エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼＩが融合された核酸切断酵素又はこれをコードするポリヌクレオチド；及び
    （ｉｉ）ゲノム配列変異（ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を有する細胞において、前記ゲノム配列変異を有する２個以上の細胞特異的変異領域をそれぞれ認識する切断因子をコードするポリヌクレオチド；を含有し、
    前記（ｉ）及び（ｉｉ）がキャリアに含まれる、ゲノム配列変異を有する細胞死滅誘導用組成物。
  36. 前記キャリアは、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）、ナノ粒子、ＺＩＦ（ｚｅｏｌｉｔｉｃ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ ｆｒａｍｅｗｏｒｋｓ）、ＲＮＡアプタマー－ストレプトアビジン（ａｐｔａｍｅｒ－ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）又は重合体を含む、請求項３５に記載の組成物。
  37. （ｉ）エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼＩが融合された核酸切断酵素又はこれをコードするポリヌクレオチド；及び
    （ｉｉ）ゲノム配列変異（ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を有する細胞において、前記ゲノム配列変異を有する２個以上の細胞特異的変異領域をそれぞれ認識する切断因子をコードするポリヌクレオチド；を含有し、
    前記（ｉ）及び（ｉｉ）がエクソソームに含まれる、ゲノム配列変異を有する細胞死滅誘導用組成物。
  38. 前記ゲノム配列変異を有する細胞内の２個～１０個の変異領域を特異的に認識する切断因子を含む、請求項２８～３７のいずれか１項に記載の組成物。
  39. 互いに異なる配列を有する２個以上の切断因子を含む、請求項３８に記載の組成物。
  40. 互いに異なる配列を有する２個～１０個の切断因子を含む、請求項３８に記載の組成物。
  41. 前記エキソヌクレアーゼＩは、微生物、酵素、昆虫、マウス又はヒト由来であることを特徴とする、請求項２８～３７のいずれか１項に記載の組成物。
  42. 前記エキソヌクレアーゼＩは配列番号３１の配列を含む、請求項４１に記載の組成物。
  43. （ｉ）エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼＩが融合された核酸切断酵素又はこれをコードするポリヌクレオチド；及び
    （ｉｉ）ゲノム配列変異（ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を有する細胞において、前記ゲノム配列変異を有する２個以上の細胞特異的変異領域をそれぞれ認識する切断因子又はこれをコードするポリヌクレオチド；を含む患者に合わせたオーダーメード型疾病治療用組成物。
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