JP2023517754A - 抗ｍｕｃ１－ｓｅａ抗体 - Google Patents

Abstract

本発明は、MUC1 SEAドメインに結合する、単離モノクローナル抗体を提供する。本発明はまた、治療および診断方法におけるこれらの抗体の使用に関する。【選択図】なし

Description

本発明は、ヒト細胞の細胞表面上に存在する糖タンパク質であるＭＵＣ１のアルファ鎖およびベータ鎖（ＳＥＡドメインを含む）の接合部に対して特異的な抗体、ならびに癌の検出および治療、ならびに様々な非悪性疾患および障害の検出および治療におけるその方法および使用に関する。

本開示の主題の背景として関連するとみなされる参考文献を以下に挙げる。
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［１０］ Ｄ．Ｂ．Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ，Ｍ．Ｋａｒｍｅｌｙ，Ｒ．Ｚｉｖ，Ｉ．Ｂｅｎｈａｒ，Ｏ．Ｌｅｉｔｎｅｒ，Ｓ．Ｂａｒｏｎ，Ｂ．Ｚ．Ｋａｔｚ，Ｄ．Ｈ．Ｗｒｅｓｃｈｎｅｒ，ＭＵＣ１／Ｘ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｃＤＮＡ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ａｎｔｉ－ＭＵＣ１ ａｌｐｈａ／ｂｅｔａ ｊｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｈａｔ ｔａｒｇｅｔ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｃｅｌｌｓ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，６６（２００６）１１２４７－１１２５３．
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［１２］ Ｄ．Ｂ．Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ，Ｍ．Ｋａｒｍｅｌｙ，Ｅ．Ｐｉｃｈｉｎｕｋ，Ｒ．Ｚｉｖ，Ｉ．Ｂｅｎｈａｒ，Ｎ．Ｆｅｎｇ，Ｎ．Ｉ．Ｓｍｏｒｏｄｉｎｓｋｙ，Ｄ．Ｈ．Ｗｒｅｓｃｈｎｅｒ，Ｔｈｅ ＭＵＣ１ ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ａｓ ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｔａｒｇｅｔ：ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ａｌｐｈａ／ｂｅｔａ ｊｕｎｃｔｉｏｎ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｃｅｌｌ ｋｉｌｌｉｎｇ，Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，１２４（２００９）４６－５４．
［１３］ Ｄ．Ｖ．Ｇｏｌｄ，Ｚ．Ｋａｒａｎｊａｗａｌａ，Ｄ．Ｅ．Ｍｏｄｒａｋ，Ｄ．Ｍ．Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ，Ｒ．Ｈ．Ｈｒｕｂａｎ，ＰＡＭ４－ｒｅａｃｔｉｖｅ ＭＵＣ１ ｉｓ ａ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｅａｒｌｙ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，１３（２００７）７３８０－７３８７．

本明細書における上記参照の了承は、それらが、本開示の主題の特許性に何らかの方法で関連することを意味すると推測されるものではない。

背景
ＭＵＣ１糖タンパク質は、乳癌、前立腺癌、膵臓癌、卵巣癌、肺癌、および結腸癌を含む、様々な高い発生率で高い死亡率のヒト上皮悪性腫瘍、ならびに多発性骨髄腫の悪性形質細胞、および急性骨髄性白血病の骨髄細胞によって過剰発現される。悪性細胞によるその優先的に高い発現のため、また細胞表面上に発現され、従って曝露された分子であるため、ＭＵＣ１は、標的癌療法の標的と疾患進行のマーカーの両方として研究されてきた ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA ［１、２］。

構造的に、ＭＵＣ１分子は、膜貫通糖タンパク質（ＭＵＣ－ＴＭと称される）である。ＭＵＣ－ＴＭは、２０アミノ酸長配列（可変数タンデムリピートであるＶＮＴＲと称される）の２０～１２５リピートを含有する細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達を媒介する短い細胞質側末端からなるヘテロ二量体である（図１Ａを参照）。ＭＵＣ１分子は、１２０アミノ酸の高度に保存されたドメインであるＳＥＡモジュール内で自己タンパク質分解的に切断される。これにより、分子の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含有する膜貫通βサブユニットとの強力な非共有結合性相互作用で結合したタンデムリピートアレイを含有する大きい細胞外αサブユニットがもたらされる。α鎖のβ鎖への結合は、断続的である：α鎖は、断続的な様式でβ鎖に結合する。β鎖は、常に細胞表面上にとどまるが、そのＶＮＴＲを有するα鎖は、断続的にのみ細胞結合したままである。

多数の抗抗ＭＵＣ１抗体が、文献で報告されており、その大部分は、α鎖の高い免疫原性のＶＮＴＲに対するものである。抗ＶＮＴＲ抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＭＵＣ１＋細胞に首尾よく結合することができるが、ＶＮＴＲを含有するＭＵＣ１α鎖のｉｎ ｖｉｖｏでの末梢循環へのシェディングは、抗ＶＮＴＲ抗体がＭＵＣ１発現腫瘍に臨床的に影響を与える能力を著しく損なう。α鎖の腫瘍細胞表面からのシェディングは、抗α鎖抗体のＭＵＣ１標的の数を大幅に減少させるだけでなく、さらに、末梢においてｉｎ ｖｉｖｏで自由に循環するＭＵＣ１α鎖は、抗ＶＮＴＲ抗体または抗グリコシル化ＶＮＴＲ抗体に結合し、中和し、これによってＭＵＣ１発現腫瘍に達する能力さえ制限し得る。

抗体ＰａｎｋｏＭａｂ－Ｇｅｘ、５Ｅ５、ＳＭ３、およびＶＵ－２－Ｇ７などのＶＮＴＲの癌特異的切断Ｏ－グリコフォームを認識する抗体が、正常組織によって発現される標的化ＭＵＣ１の潜在的毒性を克服するための可能な方法として提案されている。しかしながら、α鎖ＶＮＴＲ（図１Ａ）の標的化の制限、主に、細胞表面からのそのシェディングおよび治療で投与される抗ＭＵＣ１抗体に結合するその能力の制限は、依然として残る ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA ［３～７］。

上述の通り、断続的な機序で断続的にのみ腫瘍細胞に結合する、それらの標的の不安定性のため、抗ＭＵＣ１ ＶＮＴＲ抗体は、臨床上有効であると未だ証明されていない ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA ［４、８、９］。注目すべきことに、Ｆｉｅｄｌｅｒらが、抗ＶＮＴＲ癌に特異的なグリコシル化抗体ＰａｎｋｏＭａｂ－Ｇｅｘの臨床試験において１６症例の安定した疾患を報告した ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA ［４］。しかしながら、その研究は、抗ＶＮＴＲ抗体の第Ｉ相治験であり、主な研究目的は、抗腫瘍有効性よりむしろ抗体安全性であり、その結果、観察された安定した疾患の症例は真に解釈することができない。これまで、ＭＵＣ１ ＶＮＴＲに対する抗体も、ＭＵＣ１のα鎖に対する抗体も、ヒトにおける腫瘍に対して有効であることは示されていない。

α鎖およびそのＶＮＴＲとは対照的に、α－サブユニットのβ－サブユニットの細胞外部分との相互作用によって形成されるＭＵＣ１ ＳＥＡドメインは、安定な細胞膜に固定された分子部分である。抗ＭＵＣ１アルファ／ベータ接合部抗体は、ＲｕｂｉｎｓｔｅｉｎらおよびＰｉｃｈｉｎｕｋらにおいて開示されている［１０～１２］。

第一の態様では、本発明は、ＭＵＣ１ ＳＥＡドメインに結合する、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供し、前述の抗体は、以下を含む：
ａ．配列番号２５によって示される重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）１、配列番号２６によって示されるＣＤＲＨ２、配列番号２７によって示されるＣＤＲＨ３、ならびに配列番号２８によって示される軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）１、配列番号２９によって示されるＣＤＲＬ２、および配列番号３０によって示されるＣＤＲＬ３；または
ｂ．配列番号３１によって示される重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）１、配列番号３２によって示されるＣＤＲＨ２、配列番号３３によって示されるＣＤＲＨ３、ならびに配列番号３４によって示される軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）１、配列番号３５によって示されるＣＤＲＬ２、および配列番号３６によって示されるＣＤＲＬ３；または
ｃ．配列番号３７によって示される重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）１、配列番号３８によって示されるＣＤＲＨ２、配列番号３９によって示されるＣＤＲＨ３、ならびに配列番号４０によって示される軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）１、配列番号４１によって示されるＣＤＲＬ２、および配列番号４２によって示されるＣＤＲＬ３；または
ｄ．配列番号４３によって示される重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）１、配列番号４４によって示されるＣＤＲＨ２、配列番号４５によって示されるＣＤＲＨ３、ならびに配列番号４６によって示される軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）１、配列番号４７によって示されるＣＤＲＬ２、および配列番号４８によって示されるＣＤＲＬ３；または
ｅ．配列番号４９によって示される重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）１、配列番号５０によって示されるＣＤＲＨ２、配列番号５１によって示されるＣＤＲＨ３、ならびに配列番号５２によって示される軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）１、配列番号５３によって示されるＣＤＲＬ２、および配列番号５４によって示されるＣＤＲＬ３；または
ｆ．配列番号５５によって示される重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）１、配列番号５６によって示されるＣＤＲＨ２、配列番号５７によって示されるＣＤＲＨ３、ならびに配列番号５８によって示される軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）１、配列番号５９によって示されるＣＤＲＬ２、および配列番号６０によって示されるＣＤＲＬ３。

一部の実施形態では、前述の抗体は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、
ａ．前述の重鎖可変領域は、配列番号１によって示される核酸配列に対して少なくとも７０％同一である核酸配列によってコードされ、前述の軽鎖可変領域は、配列番号２に対して少なくとも７０％同一である核酸配列によってコードされるか；または
ｂ．前述の重鎖可変領域は、配列番号３によって示される核酸配列に対して少なくとも７０％同一である核酸配列によってコードされ、前述の軽鎖可変領域は、配列番号４に対して少なくとも７０％同一である核酸配列によってコードされるか；または
ｃ．前述の重鎖可変領域は、配列番号５によって示される核酸配列に対して少なくとも７０％同一である核酸配列によってコードされ、前述の軽鎖可変領域は、配列番号６に対して少なくとも７０％同一である核酸配列によってコードされるか；または
ｄ．前述の重鎖可変領域は、配列番号７によって示される核酸配列に対して少なくとも７０％同一である核酸配列によってコードされ、前述の軽鎖可変領域は、配列番号８に対して少なくとも７０％同一である核酸配列によってコードされるか；または
ｅ．前述の重鎖可変領域は、配列番号９によって示される核酸配列に対して少なくとも７０％同一である核酸配列によってコードされ、前述の軽鎖可変領域は、配列番号１０に対して少なくとも７０％同一である核酸配列によってコードされるか；または
ｆ．前述の重鎖可変領域は、配列番号１１によって示される核酸配列に対して少なくとも７０％同一である核酸配列によってコードされ、前述の軽鎖可変領域は、配列番号１２に対して少なくとも７０％同一である核酸配列によってコードされる。

一部の実施形態では、前述の抗体は、
ａ．配列番号１３によって示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域もしくはそのバリアント、および配列番号１４によって示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域もしくはそのバリアント；または
ｂ．配列番号１５によって示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域もしくはそのバリアント、および配列番号１６によって示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域もしくはそのバリアント；または
ｃ．配列番号１７によって示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域もしくはそのバリアント、および配列番号１８によって示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域もしくはそのバリアント；または
ｄ．配列番号１９によって示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域もしくはそのバリアント、および配列番号２０によって示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域もしくはそのバリアント；または
ｅ．配列番号２１によって示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域もしくはそのバリアント、および配列番号２２によって示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域もしくはそのバリアント；または
ｆ．配列番号２３によって示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域もしくはそのバリアント、および配列番号２４によって示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域もしくはそのバリアント。

一部の実施形態では、前述の抗体は、完全マウス抗体、完全キメラ抗体、完全ヒト化抗体（例えば、抗体配列の一部は、マウス配列および一部、ヒトに由来する）、または完全ヒト抗体である。

一部の実施形態では、前述のその抗原結合フラグメントは、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、一本鎖Ｆｖ－Ｆｃ（ｓｃＦｖ－Ｆｃ）、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２またはＦ（ａｂ）_２である。

一部の実施形態では、前述の抗体またはその抗原結合フラグメントは、新鮮凍結（ＦＦ）組織由来のホルムアルデヒド固定した切片上、および／またはパラフィン包埋され、ホルムアルデヒド固定された（ＰＥＦＦ）組織上、および／またはＭＵＣ１発現ヒト細胞の蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）解析によって行われる免疫組織化学においてＭＵＣ１ ＳＥＡを同定する。

別の実施形態では、本発明は、本明細書に記載される本発明の抗体または任意のその抗原結合フラグメントをコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子を提供する。

別の実施形態では、本発明は、本発明の単離核酸分子を含む発現ベクターを提供する。

別の実施形態では、本発明は、本発明の発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。

別の実施形態では、本発明は、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメント、および追加の細胞毒性剤または治療剤を含む免疫複合体を提供する。

特定の実施形態では、前述の細胞毒性剤は、アルキル化薬剤、アントラサイクリン、ピリミジン誘導体、ビンカアルカロイド、光線力学薬剤、白金含有化合物、タキサン、トポイソメラーゼ阻害剤、リボソーム不活性化剤、ＤＮＡ損傷を誘発する薬剤、チューブリン阻害剤、抗有糸分裂剤、ラジオアイソトープ、細胞毒性抗体、および細菌毒素からなる群から選択される。

一実施形態では、前述の細胞毒性剤は、シュードモナス外毒素である。

一実施形態では、前述の免疫複合体は、癌を有する対象への投与の際に腫瘍体積を低減する。

別の実施形態では、本発明は、異なる抗原標的に結合する第二の抗体に結合する、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントを含む二重特異性抗体を提供する。

別の実施形態では、本発明は、有効成分として本発明の単離モノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または本発明の免疫複合体、または本発明の二重特異性抗体および薬学的に許容し得る担体、賦形剤、または希釈剤を含む医薬組成物を提供する。

実施形態では、前述の医薬組成物は、疾患または障害、例えば、癌の治療における使用のためのものである。

実施形態では、前述の医薬組成物は、追加の治療剤をさらに含む。

一部の実施形態では、本発明は、それを必要とする対象に、治療上有効量の、本発明の少なくとも一つの単離モノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または免疫複合体、または二重特異性抗体、または医薬組成物を投与することを含む、疾患または障害の治療または改善方法を提供する。

実施形態では、前述の方法は、それを必要とする対象に追加の治療剤を投与することをさらに含む。

一実施形態では、前述の疾患または障害は、癌である。

一実施形態では、前述の癌は、ＭＵＣ１を発現する癌である。

一部の実施形態では、前述の癌は、肺癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、結腸癌、膵臓癌、多発性骨髄腫、および急性骨髄性白血病からなる群から選択される。

列挙された癌のタイプ全てが、その悪性細胞上にＭＵＣ１を発現することが知られている。

一実施形態では、前述の疾患または障害は、自己免疫性または炎症性疾患である。

一部の実施形態では、前述の自己免疫性または炎症性疾患は、関節リウマチ、乾癬性関節炎、全身性エリテマトーデス、アミロイドーシス、および自己免疫性膵炎からなる群から選択されるが、これらに限定されない。

一実施形態では、前述の疾患または障害は、悪性ではないが、異常かつ臨床上有意な成長状態、例えば、嚢胞、例えば、腎嚢胞、甲状腺嚢胞および甲状腺塊、または肝嚢胞である。

一部の実施形態では、本発明は、疾患または障害の治療または改善方法における使用のための、本発明の単離モノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または免疫複合体、または二重特異性抗体、または医薬組成物を提供し、前述の方法は、それを必要とする対象に、治療上有効量の前述の単離モノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメント、前述の免疫複合体、前述の二重特異性抗体、または前述の医薬組成物を投与することを含む。

一実施形態では、前述の方法は、それを必要とする対象に追加の治療剤を投与することをさらに含む。

一実施形態では、前述の疾患または障害は、癌である。

一実施形態では、前述の癌は、ＭＵＣ１を発現する癌である。

一実施形態では、前述の疾患または障害は、自己免疫性または炎症性疾患である。

一実施形態では、前述の疾患または障害は、悪性ではない異常な成長状態、例えば、嚢胞、例えば、腎嚢胞、甲状腺嚢胞および甲状腺塊、または肝嚢胞である。

別の態様では、本発明は、対象における疾患または障害を診断する方法を提供し、前述の疾患または障害は、ＭＵＣ－１発現と関連し、前述の方法は、

ａ．前述の患者から得られた生検を、本発明の少なくとも一つの単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントと接触させること；および

ｂ．前述の単離モノクローナル抗体または任意のその抗原結合フラグメントを検出することを含み、

生検におけるＭＵＣ１ ＳＥＡを過剰発現する細胞の検出が、対象が疾患または障害と診断されることを示す。

一実施形態では、前述の疾患または障害は、癌である。

一実施形態では、前述の疾患または障害は、自己免疫性または炎症性疾患である。

一実施形態では、前述の疾患または障害は、悪性ではなく、臨床上有意な異常な成長状態、例えば、嚢胞、例えば、腎嚢胞、甲状腺嚢胞および甲状腺塊、または肝嚢胞である。

一実施形態では、前述の単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、検出可能に標識される。

別の態様では、本発明は、疾患または障害を画像化する方法を提供し、前述の方法は、
ａ．本発明の少なくとも一つの単離抗ＭＵＣ１ ＳＥＡモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを対象に導入すること、前述の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ラジオアイソトープ、または可視化可能な薬剤（すなわち、例えば、走査によって可視化され得る薬剤）で検出可能に標識される；および
ｂ．前述の検出可能に標識された単離抗ＭＵＣ１ ＳＥＡモノクローナル抗体または任意のその抗原結合フラグメントを可視化することを含み、
前述のアイソトープまたは前述の可視化可能な薬剤で標識された細胞および／または組織の検出は、前述の対象における前述の疾患または障害の存在、および／または局在化および／または程度および／または転移の存在を示す。

一実施形態では、前述の疾患または障害は、癌である。

一実施形態では、前述の疾患または障害は、自己免疫性または炎症性疾患である。

一実施形態では、前述の疾患または障害は、悪性ではない異常な成長状態、例えば、嚢胞、例えば、腎嚢胞、甲状腺嚢胞および甲状腺塊、または肝嚢胞である。

本明細書に開示される主題をより良く理解するために、およびどのようにそれが実際に実施され得るかを示すために、実施形態は、添付の図面を参照して、非限定的な例示のみの目的で説明される。

図１Ａ～１Ｃは、ＭＵＣ１－ＴＭ、ＭＵＣ１－Ｘアイソフォーム、および組み換えＭＵＣ１－Ｘ分子の略図である。（１Ａ）Ｎ（Ｎ）からＣ末端（Ｃ）へと進むと、ＭＵＣ１－ＴＭは、Ｎ末端シグナルペプチド、続いて３０アミノ酸長のセグメント（Ｎ３０）からなり、可変数タンデムリピートアレイ（ＶＮＴＲ）にＮ末端およびＣ末端で隣接する配列に繋がる。これに、ＭＵＣ１－Ｘアイソフォーム（１Ｂ）とＭＵＣ１ Ｘの可溶性細胞外ドメインであるＭＵＣ１－Ｘｅｘ（１Ｃ）の両方に共通する領域が続く。β－サブユニット細胞外ドメインは、膜貫通（ＴＭ）ドメインおよび細胞質（ＣＴ）ドメインのＮ末端に直ぐの５８個のアミノ酸からなる。ＳＥＡモジュールは、α－サブユニットとβ－サブユニットの両方によって関与する、１２０個のアミノ酸を含む。組み換え可溶性ＭＵＣ１－Ｘｅｘタンパク質（１Ｃ）は、シグナルペプチド、Ｎ末端の３０アミノ酸配列、およびＳＥＡモジュール領域を含む。 図１Ｄ～１Ｋは、抗ＭＵＣ１ ＳＥＡ 抗体ＤＭＢ５Ｆ３のフローサイトメトリー解析を示すグラフである。ＭＵＣ１－ＴＭ（１Ｄ）で安定的にトランスフェクトされたＤＡ３細胞またはトランスフェクトされていないＤＡ３細胞（１Ｅ）を、抗ＭＵＣ１ ＳＥＡ ｍＡｂ ＤＭＢ５Ｆ３と反応させ、続いてＦＩＴＣ－コンジュゲート（矢印によって印を付けたトレース）と反応させた。ＭＵＣ１＋ヒト膵臓癌細胞株Ｃｏｌｏ３５７（１Ｆ）ならびにＭＵＣ１＋乳癌細胞Ｔ４７ＤおよびＺＲ７５（１Ｈ、１Ｊ）を、ＤＭＢ５Ｆ３と反応させた（矢印で印を付けたトレーシング）。四つのパネル全てにおいて、矢印で示を付けていないトレーシングは、二次抗体のみに結合した細胞を表し、矢印で示を付けたトレーシングは、ＤＭＢ５Ｆ３と二次抗体の両方と反応した細胞を表す。ＭＵＣ１＋細胞への抗ＭＵＣ１ ＳＥＡ結合は、可溶性ＭＵＣ１－Ｘｅｘタンパク質の存在によって完全に競合した（ＭＵＣ１－Ｘｅｘ介在性抑制結合を、１Ｇ、１Ｉ、および１Ｋの塗りつぶしていない矢印によって示す）。 図１Ａ～１Ｃは、ＭＵＣ１－ＴＭ、ＭＵＣ１－Ｘアイソフォーム、および組み換えＭＵＣ１－Ｘ分子の略図である。（１Ａ）Ｎ（Ｎ）からＣ末端（Ｃ）へと進むと、ＭＵＣ１－ＴＭは、Ｎ末端シグナルペプチド、続いて３０アミノ酸長のセグメント（Ｎ３０）からなり、可変数タンデムリピートアレイ（ＶＮＴＲ）にＮ末端およびＣ末端で隣接する配列に繋がる。これに、ＭＵＣ１－Ｘアイソフォーム（１Ｂ）とＭＵＣ１ Ｘの可溶性細胞外ドメインであるＭＵＣ１－Ｘｅｘ（１Ｃ）の両方に共通する領域が続く。β－サブユニット細胞外ドメインは、膜貫通（ＴＭ）ドメインおよび細胞質（ＣＴ）ドメインのＮ末端に直ぐの５８個のアミノ酸からなる。ＳＥＡモジュールは、α－サブユニットとβ－サブユニットの両方によって関与する、１２０個のアミノ酸を含む。組み換え可溶性ＭＵＣ１－Ｘｅｘタンパク質（１Ｃ）は、シグナルペプチド、Ｎ末端の３０アミノ酸配列、およびＳＥＡモジュール領域を含む。 図１Ｄ～１Ｋは、抗ＭＵＣ１ ＳＥＡ 抗体ＤＭＢ５Ｆ３のフローサイトメトリー解析を示すグラフである。ＭＵＣ１－ＴＭ（１Ｄ）で安定的にトランスフェクトされたＤＡ３細胞またはトランスフェクトされていないＤＡ３細胞（１Ｅ）を、抗ＭＵＣ１ ＳＥＡ ｍＡｂ ＤＭＢ５Ｆ３と反応させ、続いてＦＩＴＣ－コンジュゲート（矢印によって印を付けたトレース）と反応させた。ＭＵＣ１＋ヒト膵臓癌細胞株Ｃｏｌｏ３５７（１Ｆ）ならびにＭＵＣ１＋乳癌細胞Ｔ４７ＤおよびＺＲ７５（１Ｈ、１Ｊ）を、ＤＭＢ５Ｆ３と反応させた（矢印で印を付けたトレーシング）。四つのパネル全てにおいて、矢印で示を付けていないトレーシングは、二次抗体のみに結合した細胞を表し、矢印で示を付けたトレーシングは、ＤＭＢ５Ｆ３と二次抗体の両方と反応した細胞を表す。ＭＵＣ１＋細胞への抗ＭＵＣ１ ＳＥＡ結合は、可溶性ＭＵＣ１－Ｘｅｘタンパク質の存在によって完全に競合した（ＭＵＣ１－Ｘｅｘ介在性抑制結合を、１Ｇ、１Ｉ、および１Ｋの塗りつぶしていない矢印によって示す）。 図１Ａ～１Ｃは、ＭＵＣ１－ＴＭ、ＭＵＣ１－Ｘアイソフォーム、および組み換えＭＵＣ１－Ｘ分子の略図である。（１Ａ）Ｎ（Ｎ）からＣ末端（Ｃ）へと進むと、ＭＵＣ１－ＴＭは、Ｎ末端シグナルペプチド、続いて３０アミノ酸長のセグメント（Ｎ３０）からなり、可変数タンデムリピートアレイ（ＶＮＴＲ）にＮ末端およびＣ末端で隣接する配列に繋がる。これに、ＭＵＣ１－Ｘアイソフォーム（１Ｂ）とＭＵＣ１ Ｘの可溶性細胞外ドメインであるＭＵＣ１－Ｘｅｘ（１Ｃ）の両方に共通する領域が続く。β－サブユニット細胞外ドメインは、膜貫通（ＴＭ）ドメインおよび細胞質（ＣＴ）ドメインのＮ末端に直ぐの５８個のアミノ酸からなる。ＳＥＡモジュールは、α－サブユニットとβ－サブユニットの両方によって関与する、１２０個のアミノ酸を含む。組み換え可溶性ＭＵＣ１－Ｘｅｘタンパク質（１Ｃ）は、シグナルペプチド、Ｎ末端の３０アミノ酸配列、およびＳＥＡモジュール領域を含む。 図１Ｄ～１Ｋは、抗ＭＵＣ１ ＳＥＡ 抗体ＤＭＢ５Ｆ３のフローサイトメトリー解析を示すグラフである。ＭＵＣ１－ＴＭ（１Ｄ）で安定的にトランスフェクトされたＤＡ３細胞またはトランスフェクトされていないＤＡ３細胞（１Ｅ）を、抗ＭＵＣ１ ＳＥＡ ｍＡｂ ＤＭＢ５Ｆ３と反応させ、続いてＦＩＴＣ－コンジュゲート（矢印によって印を付けたトレース）と反応させた。ＭＵＣ１＋ヒト膵臓癌細胞株Ｃｏｌｏ３５７（１Ｆ）ならびにＭＵＣ１＋乳癌細胞Ｔ４７ＤおよびＺＲ７５（１Ｈ、１Ｊ）を、ＤＭＢ５Ｆ３と反応させた（矢印で印を付けたトレーシング）。四つのパネル全てにおいて、矢印で示を付けていないトレーシングは、二次抗体のみに結合した細胞を表し、矢印で示を付けたトレーシングは、ＤＭＢ５Ｆ３と二次抗体の両方と反応した細胞を表す。ＭＵＣ１＋細胞への抗ＭＵＣ１ ＳＥＡ結合は、可溶性ＭＵＣ１－Ｘｅｘタンパク質の存在によって完全に競合した（ＭＵＣ１－Ｘｅｘ介在性抑制結合を、１Ｇ、１Ｉ、および１Ｋの塗りつぶしていない矢印によって示す）。 図２は、抗ＭＵＣ１ ＳＥＡα－β接合部モノクローナル抗体の可変領域のアミノ酸配列を示す。全ての配列について、以下の一般構造：リーダー配列－ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４を提示する。 図２は、抗ＭＵＣ１ ＳＥＡα－β接合部モノクローナル抗体の可変領域のアミノ酸配列を示す。全ての配列について、以下の一般構造：リーダー配列－ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４を提示する。 図３Ａ～３Ｎは、抗ＭＵＣ１ ＳＥＡ α－β接合部抗体ＤＭＢ５Ｆ３によって描写されるＭＵＣ１発現の構造を示す。図３Ａ～３Ｄ：正常（３Ａおよび３Ｂ）ならびに悪性膵組織（３Ｃおよび３Ｄ）のパラフィン包埋マイクロアレイを、ＤＭＢ５Ｆ３で染色した。ＤＭＢ５Ｆ３は、ほぼ環状的パターン（３Ｃおよび３Ｄ）で悪性細胞を強く染色したが、正常な膵腺房細胞において、弱い頂端の陽性しか見られなかった（３Ａ（ｉ）、黒色の矢印）。ＭＵＣ１－Ｘｅｘタンパク質のＤＭＢ５Ｆ３と一緒の添加は、染色を競合的に抑制し（３Ｂ）、これは、ＤＭＢ５Ｆ３結合の特異性を示している。 図３Ｅ～３Ｈ：４人の患者由来のパラフィン包埋した正常乳房組織（３Ｅおよび３Ｆ）ならびに悪性浸潤性乳管癌（３Ｇおよび３Ｈ）を、ＤＭＢ５Ｆ３抗体で染色した。 図３Ｉ～３Ｎは、ＤＭＢ５Ｆ３で染色された、それぞれが隣接する非悪性組織からなる、６人の患者の乳癌生検標本。各標本において、ＤＭＢ５Ｆ３は、ほぼ環状的パターン（濃い染色）で浸潤性癌上皮細胞を強く染色した。対照的に、隣接する正常な腺上皮細胞は、弱い頂端の陽性のみを示した（黒色の矢印）。 図３Ａ～３Ｎは、抗ＭＵＣ１ ＳＥＡ α－β接合部抗体ＤＭＢ５Ｆ３によって描写されるＭＵＣ１発現の構造を示す。図３Ａ～３Ｄ：正常（３Ａおよび３Ｂ）ならびに悪性膵組織（３Ｃおよび３Ｄ）のパラフィン包埋マイクロアレイを、ＤＭＢ５Ｆ３で染色した。ＤＭＢ５Ｆ３は、ほぼ環状的パターン（３Ｃおよび３Ｄ）で悪性細胞を強く染色したが、正常な膵腺房細胞において、弱い頂端の陽性しか見られなかった（３Ａ（ｉ）、黒色の矢印）。ＭＵＣ１－Ｘｅｘタンパク質のＤＭＢ５Ｆ３と一緒の添加は、染色を競合的に抑制し（３Ｂ）、これは、ＤＭＢ５Ｆ３結合の特異性を示している。 図３Ｅ～３Ｈ：４人の患者由来のパラフィン包埋した正常乳房組織（３Ｅおよび３Ｆ）ならびに悪性浸潤性乳管癌（３Ｇおよび３Ｈ）を、ＤＭＢ５Ｆ３抗体で染色した。 図３Ｉ～３Ｎは、ＤＭＢ５Ｆ３で染色された、それぞれが隣接する非悪性組織からなる、６人の患者の乳癌生検標本。各標本において、ＤＭＢ５Ｆ３は、ほぼ環状的パターン（濃い染色）で浸潤性癌上皮細胞を強く染色した。対照的に、隣接する正常な腺上皮細胞は、弱い頂端の陽性のみを示した（黒色の矢印）。 図３Ａ～３Ｎは、抗ＭＵＣ１ ＳＥＡ α－β接合部抗体ＤＭＢ５Ｆ３によって描写されるＭＵＣ１発現の構造を示す。図３Ａ～３Ｄ：正常（３Ａおよび３Ｂ）ならびに悪性膵組織（３Ｃおよび３Ｄ）のパラフィン包埋マイクロアレイを、ＤＭＢ５Ｆ３で染色した。ＤＭＢ５Ｆ３は、ほぼ環状的パターン（３Ｃおよび３Ｄ）で悪性細胞を強く染色したが、正常な膵腺房細胞において、弱い頂端の陽性しか見られなかった（３Ａ（ｉ）、黒色の矢印）。ＭＵＣ１－Ｘｅｘタンパク質のＤＭＢ５Ｆ３と一緒の添加は、染色を競合的に抑制し（３Ｂ）、これは、ＤＭＢ５Ｆ３結合の特異性を示している。 図３Ｅ～３Ｈ：４人の患者由来のパラフィン包埋した正常乳房組織（３Ｅおよび３Ｆ）ならびに悪性浸潤性乳管癌（３Ｇおよび３Ｈ）を、ＤＭＢ５Ｆ３抗体で染色した。 図３Ｉ～３Ｎは、ＤＭＢ５Ｆ３で染色された、それぞれが隣接する非悪性組織からなる、６人の患者の乳癌生検標本。各標本において、ＤＭＢ５Ｆ３は、ほぼ環状的パターン（濃い染色）で浸潤性癌上皮細胞を強く染色した。対照的に、隣接する正常な腺上皮細胞は、弱い頂端の陽性のみを示した（黒色の矢印）。 図４Ａ～４Ｏは、抗ＭＵＣ１ ＳＥＡ α－β接合部抗体を用いた組織マイクロアレイのＩＨＣ染色を示す：図４Ａ～４Ｌ：抗ＭＵＣ１ ＳＥＡα－β接合部抗体を用いた肺、前立腺、結腸、および乳癌のＩＨＣ。肺、前立腺、結腸、および乳癌のパラフィン包埋マイクロアレイを、抗体ＤＭＢ５Ｆ３で染色し、代表的な切片を、それぞれ、図４Ａ、４Ｄ、４Ｇおよび４Ｊに示す。より高い倍率を、図４Ｂ、４Ｅ、４Ｈおよび４Ｋに示し、図４Ａ、４Ｄ、４Ｇおよび４Ｊならびに４Ｂ、４Ｅ、４Ｈおよび４Ｋにおける三角形は、拡大された領域を定める役割を果たす。抗体ＤＭＢ５Ｆ３を用いた染色は、１００μｇ／ｍＬの競合する可溶性ＭＵＣ１－Ｘｅｘタンパク質の存在下で再び無効になり、これは、抗体ＤＭＢ５Ｆ３の特異性を立証している（示していない）。非特異的マウス免疫グロブリンを用いた対照染色を、図４Ｃ、４Ｆ、４Ｉおよび４Ｌに示す。抗体ＤＭＢ５Ｆ３は、ほぼ環状的なパターンで悪性細胞を強く染色した。図４Ａ、４Ｄ、４Ｇおよび４Ｊの底部の線（線のいずれかの端に矢印あり）および図４Ｂ、４Ｅ、４Ｈおよび図４Ｋの底部の線（線のいずれかの端に塗りつぶした円あり）は、それぞれ、２００ミクロンおよび１００ミクロンを示す。濃い染色されている沈殿物は、ＭＵＣ１タンパク質を示す（図４Ａ、４Ｂ、４Ｄ、４Ｅ、４Ｇ、４Ｈ、４Ｊ、および４Ｋを図４Ｃ、４Ｆ、４Ｉおよび４Ｌと比較する）。図４Ａ、４Ｄ、４Ｇおよび４Ｊにおける組織は、それぞれ、病理グレード２肺腺癌、病理グレード５前立腺癌、病理グレード３結腸腺癌、および浸潤性乳管癌に由来する。図４Ｍ～４Ｏは、抗ＭＵＣ１ ＳＥＡ α－β接合部抗体を用いた、正常および悪性膵組織の確証となるＩＨＣ染色。膵臓癌におけるＭＵＣ１の高発現および改変した分子構造を確証するために、追加の膵悪性腫瘍を、抗ＭＵＣ１ ＳＥＡを用いて染色し、正常組織と比較した。正常（図４Ｍ）ならびに悪性膵組織（図４Ｎおよび４Ｏ）のパラフィン包埋マイクロアレイを、抗体ＤＭＢ５Ｆ３を用いて染色した。染色は、正常な膵腺房細胞において弱い頂端の陽性を確かにし（図４Ｍ）、悪性細胞を、ほぼ環状的パターンで一貫して染色した（図４Ｎおよび４Ｏ）。 図４Ａ～４Ｏは、抗ＭＵＣ１ ＳＥＡ α－β接合部抗体を用いた組織マイクロアレイのＩＨＣ染色を示す：図４Ａ～４Ｌ：抗ＭＵＣ１ ＳＥＡα－β接合部抗体を用いた肺、前立腺、結腸、および乳癌のＩＨＣ。肺、前立腺、結腸、および乳癌のパラフィン包埋マイクロアレイを、抗体ＤＭＢ５Ｆ３で染色し、代表的な切片を、それぞれ、図４Ａ、４Ｄ、４Ｇおよび４Ｊに示す。より高い倍率を、図４Ｂ、４Ｅ、４Ｈおよび４Ｋに示し、図４Ａ、４Ｄ、４Ｇおよび４Ｊならびに４Ｂ、４Ｅ、４Ｈおよび４Ｋにおける三角形は、拡大された領域を定める役割を果たす。抗体ＤＭＢ５Ｆ３を用いた染色は、１００μｇ／ｍＬの競合する可溶性ＭＵＣ１－Ｘｅｘタンパク質の存在下で再び無効になり、これは、抗体ＤＭＢ５Ｆ３の特異性を立証している（示していない）。非特異的マウス免疫グロブリンを用いた対照染色を、図４Ｃ、４Ｆ、４Ｉおよび４Ｌに示す。抗体ＤＭＢ５Ｆ３は、ほぼ環状的なパターンで悪性細胞を強く染色した。図４Ａ、４Ｄ、４Ｇおよび４Ｊの底部の線（線のいずれかの端に矢印あり）および図４Ｂ、４Ｅ、４Ｈおよび図４Ｋの底部の線（線のいずれかの端に塗りつぶした円あり）は、それぞれ、２００ミクロンおよび１００ミクロンを示す。濃い染色されている沈殿物は、ＭＵＣ１タンパク質を示す（図４Ａ、４Ｂ、４Ｄ、４Ｅ、４Ｇ、４Ｈ、４Ｊ、および４Ｋを図４Ｃ、４Ｆ、４Ｉおよび４Ｌと比較する）。図４Ａ、４Ｄ、４Ｇおよび４Ｊにおける組織は、それぞれ、病理グレード２肺腺癌、病理グレード５前立腺癌、病理グレード３結腸腺癌、および浸潤性乳管癌に由来する。図４Ｍ～４Ｏは、抗ＭＵＣ１ ＳＥＡ α－β接合部抗体を用いた、正常および悪性膵組織の確証となるＩＨＣ染色。膵臓癌におけるＭＵＣ１の高発現および改変した分子構造を確証するために、追加の膵悪性腫瘍を、抗ＭＵＣ１ ＳＥＡを用いて染色し、正常組織と比較した。正常（図４Ｍ）ならびに悪性膵組織（図４Ｎおよび４Ｏ）のパラフィン包埋マイクロアレイを、抗体ＤＭＢ５Ｆ３を用いて染色した。染色は、正常な膵腺房細胞において弱い頂端の陽性を確かにし（図４Ｍ）、悪性細胞を、ほぼ環状的パターンで一貫して染色した（図４Ｎおよび４Ｏ）。 図４Ａ～４Ｏは、抗ＭＵＣ１ ＳＥＡ α－β接合部抗体を用いた組織マイクロアレイのＩＨＣ染色を示す：図４Ａ～４Ｌ：抗ＭＵＣ１ ＳＥＡα－β接合部抗体を用いた肺、前立腺、結腸、および乳癌のＩＨＣ。肺、前立腺、結腸、および乳癌のパラフィン包埋マイクロアレイを、抗体ＤＭＢ５Ｆ３で染色し、代表的な切片を、それぞれ、図４Ａ、４Ｄ、４Ｇおよび４Ｊに示す。より高い倍率を、図４Ｂ、４Ｅ、４Ｈおよび４Ｋに示し、図４Ａ、４Ｄ、４Ｇおよび４Ｊならびに４Ｂ、４Ｅ、４Ｈおよび４Ｋにおける三角形は、拡大された領域を定める役割を果たす。抗体ＤＭＢ５Ｆ３を用いた染色は、１００μｇ／ｍＬの競合する可溶性ＭＵＣ１－Ｘｅｘタンパク質の存在下で再び無効になり、これは、抗体ＤＭＢ５Ｆ３の特異性を立証している（示していない）。非特異的マウス免疫グロブリンを用いた対照染色を、図４Ｃ、４Ｆ、４Ｉおよび４Ｌに示す。抗体ＤＭＢ５Ｆ３は、ほぼ環状的なパターンで悪性細胞を強く染色した。図４Ａ、４Ｄ、４Ｇおよび４Ｊの底部の線（線のいずれかの端に矢印あり）および図４Ｂ、４Ｅ、４Ｈおよび図４Ｋの底部の線（線のいずれかの端に塗りつぶした円あり）は、それぞれ、２００ミクロンおよび１００ミクロンを示す。濃い染色されている沈殿物は、ＭＵＣ１タンパク質を示す（図４Ａ、４Ｂ、４Ｄ、４Ｅ、４Ｇ、４Ｈ、４Ｊ、および４Ｋを図４Ｃ、４Ｆ、４Ｉおよび４Ｌと比較する）。図４Ａ、４Ｄ、４Ｇおよび４Ｊにおける組織は、それぞれ、病理グレード２肺腺癌、病理グレード５前立腺癌、病理グレード３結腸腺癌、および浸潤性乳管癌に由来する。図４Ｍ～４Ｏは、抗ＭＵＣ１ ＳＥＡ α－β接合部抗体を用いた、正常および悪性膵組織の確証となるＩＨＣ染色。膵臓癌におけるＭＵＣ１の高発現および改変した分子構造を確証するために、追加の膵悪性腫瘍を、抗ＭＵＣ１ ＳＥＡを用いて染色し、正常組織と比較した。正常（図４Ｍ）ならびに悪性膵組織（図４Ｎおよび４Ｏ）のパラフィン包埋マイクロアレイを、抗体ＤＭＢ５Ｆ３を用いて染色した。染色は、正常な膵腺房細胞において弱い頂端の陽性を確かにし（図４Ｍ）、悪性細胞を、ほぼ環状的パターンで一貫して染色した（図４Ｎおよび４Ｏ）。 図５Ａ～５Ｄは、ｃｈＤＭＢ５Ｆ３、アービタックス、およびハーセプチンの比較細胞破壊的活性を示すグラフであり、三つの各々を、タンパク質ＺＺによってシュードモナス外毒素ＰＥ３８に連結させた。三つの得られたＺＺ－ＰＥ３８免疫毒素を、ヒト腫瘍細胞株Ｔ４７Ｄ、ＫＢ、Ａ４３１およびＮ８７（それぞれ、図５Ａ～５Ｄ）と反応させた。免疫毒素ｃｈＤＭＢ５Ｆ３：ＺＺ－ＰＥ３８（楕円形のトレーシング）、アービタックス：ＺＺ－ＰＥ３８（菱形のトレーシング）、およびハーセプチン：ＺＺ－ＰＥ３８（長方形のトレーシング）を、様々な抗体濃度で細胞と反応させた（ｘ軸）。細胞生存率を、アルカリホスファターゼアッセイによって評価した（ｙ軸）。ＺＺ－ＰＥ３８毒素（５ｎＭ）のみを添加した対照ウェルにおいて、総（１００％）生存率を決定した。 図５Ａ～５Ｄは、ｃｈＤＭＢ５Ｆ３、アービタックス、およびハーセプチンの比較細胞破壊的活性を示すグラフであり、三つの各々を、タンパク質ＺＺによってシュードモナス外毒素ＰＥ３８に連結させた。三つの得られたＺＺ－ＰＥ３８免疫毒素を、ヒト腫瘍細胞株Ｔ４７Ｄ、ＫＢ、Ａ４３１およびＮ８７（それぞれ、図５Ａ～５Ｄ）と反応させた。免疫毒素ｃｈＤＭＢ５Ｆ３：ＺＺ－ＰＥ３８（楕円形のトレーシング）、アービタックス：ＺＺ－ＰＥ３８（菱形のトレーシング）、およびハーセプチン：ＺＺ－ＰＥ３８（長方形のトレーシング）を、様々な抗体濃度で細胞と反応させた（ｘ軸）。細胞生存率を、アルカリホスファターゼアッセイによって評価した（ｙ軸）。ＺＺ－ＰＥ３８毒素（５ｎＭ）のみを添加した対照ウェルにおいて、総（１００％）生存率を決定した。 図６Ａ～６Ｄは、ヌードマウスに異種移植したヒト膵腫瘍におけるｃｈＤＭＢ５Ｆ３：ＺＺ－ＰＥ３８のｉｎ ｖｉｖｏ細胞毒性を示す。図６Ａ：ヌードマウスに、ＭＵＣ１^＋膵腫瘍Ｃｏｌｏ３５７を接種した（０日目）。次いで、異種移植したマウスを三つの群に分けた：１、６、９、１４、２２および２９日目に、群Ａは、ｃｈＤＭＢ５Ｆ３：ＺＺ－ＰＥ３８を受け取り、群Ｂは、非特異的なアイソタイプ一致のＩｇＧ－ＺＺ：ＰＥ３８（１回の注入当たり５μｇ）を受け取り、一方、群Ｃは、ヘペス緩衝液のみを受け取り、全ての投与は、ｉｖであった（時間点を矢印によって示す）。三つの群：ｃｈＤＭＢ５Ｆ３：ＺＺ－ＰＥ３８免疫毒素を受け取ったマウス、非特異的アイソタイプ一致のｈＩｇＧ－ＺＺ：ＰＥ３８を受け取ったマウス、およびヘペス緩衝液を受け取ったマウスにおいて、注射期間中、３８日目まで、腫瘍体積を毎週測定した。腫瘍体積ｍｍ^３を、ｙ軸上に表示し、写真画像は、ヘペス対照マウス（図６Ｂ）およびｃｈＤＭＢ５Ｆ３：ＺＺ－ＰＥ３８免疫毒素を受け取ったマウス（図６Ｃ）における腫瘍を示す。図６Ｄ：抗ＭＵＣ ＳＥＡ ＤＭＢ５Ｆ３－ＺＺ－Ｐ３８免疫毒素の血清半減期を定量するために、一回用量５マイクログラムをマウスに投与し、血清レベルを、連続希釈Ｅｌｉｓａによって測定した。７日目（７ｄ）と比較して、１４日目（１４ｄ）および２８日目（２８ｄ）のｃｈＤＭＢ５Ｆ３の血清レベルを、それぞれ、２倍および４倍減少した。 図６Ａ～６Ｄは、ヌードマウスに異種移植したヒト膵腫瘍におけるｃｈＤＭＢ５Ｆ３：ＺＺ－ＰＥ３８のｉｎ ｖｉｖｏ細胞毒性を示す。図６Ａ：ヌードマウスに、ＭＵＣ１^＋膵腫瘍Ｃｏｌｏ３５７を接種した（０日目）。次いで、異種移植したマウスを三つの群に分けた：１、６、９、１４、２２および２９日目に、群Ａは、ｃｈＤＭＢ５Ｆ３：ＺＺ－ＰＥ３８を受け取り、群Ｂは、非特異的なアイソタイプ一致のＩｇＧ－ＺＺ：ＰＥ３８（１回の注入当たり５μｇ）を受け取り、一方、群Ｃは、ヘペス緩衝液のみを受け取り、全ての投与は、ｉｖであった（時間点を矢印によって示す）。三つの群：ｃｈＤＭＢ５Ｆ３：ＺＺ－ＰＥ３８免疫毒素を受け取ったマウス、非特異的アイソタイプ一致のｈＩｇＧ－ＺＺ：ＰＥ３８を受け取ったマウス、およびヘペス緩衝液を受け取ったマウスにおいて、注射期間中、３８日目まで、腫瘍体積を毎週測定した。腫瘍体積ｍｍ^３を、ｙ軸上に表示し、写真画像は、ヘペス対照マウス（図６Ｂ）およびｃｈＤＭＢ５Ｆ３：ＺＺ－ＰＥ３８免疫毒素を受け取ったマウス（図６Ｃ）における腫瘍を示す。図６Ｄ：抗ＭＵＣ ＳＥＡ ＤＭＢ５Ｆ３－ＺＺ－Ｐ３８免疫毒素の血清半減期を定量するために、一回用量５マイクログラムをマウスに投与し、血清レベルを、連続希釈Ｅｌｉｓａによって測定した。７日目（７ｄ）と比較して、１４日目（１４ｄ）および２８日目（２８ｄ）のｃｈＤＭＢ５Ｆ３の血清レベルを、それぞれ、２倍および４倍減少した。 図７Ａ～７Ｄは、ｉｎ ｖｉｖｏでのｃｈＤＭＢ５Ｆ３：ＺＺ－ＰＥ３８免疫毒素の細胞毒性を示し、これは、ＳＣＩＤマウスにおけるＭＵＣ１＋膵臓癌異種移植片の切除を示している。図７Ａ：０日目に、ＳＣＩＤマウスにヒトＣｏｌｏ３５７膵臓癌細胞を皮下接種し、三つの群：ｃｈＤＭＢ５Ｆ３：ＺＺ－ＰＥ３８免疫毒素５μｇを受け取った群［１］、非特異的な一致のアイソタイプヒトＩｇ：ＺＺ－ＰＥ３８コンジュゲート５μｇを受け取った群［２］、およびヘペス緩衝液を受け取った群［３］に分けた。三つの群の全ての異種移植したマウスに、１、４、８、１１、１６、２４、３１および３８日目に注射した。腫瘍体積を、細胞接種の４９日後まで比較した。ヒストグラムは、各群の平均腫瘍体積を表し、各アスタリスクは、個々のマウスの値を表す。左のｙ軸は、群１および２の腫瘍体積（ｍｍ^３）を表し、右のｙ軸は、ヘペス対照群のより大きな腫瘍体積を含むように５００ｍｍ^３に拡大した、群３の腫瘍体積（ヘペス緩衝液群）を表す。５００ｍｍ^３点を超える値を有する群３の２点は、７０５ｍｍ^３および１００８ｍｍ^３の腫瘍体積を表す。図７Ｂ～７Ｄは、４９日間の腫瘍測定期間の終了時の、各群の代表的なマウスをそれらの腫瘍体積と共に示す。図７Ｂ：ｃｈＤＭＢ５Ｆ３：ＺＺ－ＰＥ３８免疫毒素を受け取ったマウス、図７Ｃ：非特異的なヒトＩｇ：ＺＺ－ＰＥ３８コンジュゲートを受け取ったマウス、および図７Ｄ：ヘペス緩衝液のみを受け取ったマウス。 図７Ａ～７Ｄは、ｉｎ ｖｉｖｏでのｃｈＤＭＢ５Ｆ３：ＺＺ－ＰＥ３８免疫毒素の細胞毒性を示し、これは、ＳＣＩＤマウスにおけるＭＵＣ１＋膵臓癌異種移植片の切除を示している。図７Ａ：０日目に、ＳＣＩＤマウスにヒトＣｏｌｏ３５７膵臓癌細胞を皮下接種し、三つの群：ｃｈＤＭＢ５Ｆ３：ＺＺ－ＰＥ３８免疫毒素５μｇを受け取った群［１］、非特異的な一致のアイソタイプヒトＩｇ：ＺＺ－ＰＥ３８コンジュゲート５μｇを受け取った群［２］、およびヘペス緩衝液を受け取った群［３］に分けた。三つの群の全ての異種移植したマウスに、１、４、８、１１、１６、２４、３１および３８日目に注射した。腫瘍体積を、細胞接種の４９日後まで比較した。ヒストグラムは、各群の平均腫瘍体積を表し、各アスタリスクは、個々のマウスの値を表す。左のｙ軸は、群１および２の腫瘍体積（ｍｍ^３）を表し、右のｙ軸は、ヘペス対照群のより大きな腫瘍体積を含むように５００ｍｍ^３に拡大した、群３の腫瘍体積（ヘペス緩衝液群）を表す。５００ｍｍ^３点を超える値を有する群３の２点は、７０５ｍｍ^３および１００８ｍｍ^３の腫瘍体積を表す。図７Ｂ～７Ｄは、４９日間の腫瘍測定期間の終了時の、各群の代表的なマウスをそれらの腫瘍体積と共に示す。図７Ｂ：ｃｈＤＭＢ５Ｆ３：ＺＺ－ＰＥ３８免疫毒素を受け取ったマウス、図７Ｃ：非特異的なヒトＩｇ：ＺＺ－ＰＥ３８コンジュゲートを受け取ったマウス、および図７Ｄ：ヘペス緩衝液のみを受け取ったマウス。

本発明は、ｉｎ ｖｉｖｏで強い抗癌活性を有する、ＭＵＣ１ ＳＥＡα－β接合部（ＳＥＡドメインと呼ばれる）に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の配列を提供する。

本発明は、ＤＭＢ５Ｆ３、ＤＭＢ７Ｆ３、ＤＭＢ４Ｂ４、ＤＭＢ１０Ｆ１０、ＤＭＢ４Ｆ４、ＤＭＢ１０Ｂ７、ＤＭＢ１３Ｄ１１およびＤＭＣ２０９と本明細書において称される、ＭＵＣ１ ＳＥＡドメインに対する抗体の配列を提供する。

以下の実施例に示されるように、肺癌、前立腺癌、乳癌、結腸癌、および膵臓癌を含む、一連の悪性腫瘍由来の細胞のＤＭＢ５Ｆ３と称されるｍＡｂを用いた免疫組織化学染色は、正常細胞対悪性細胞におけるＭＵＣ１発現の間の定量的および定性的な相違を明らかにした：ＤＭＢ５Ｆ３は、ほぼ環状的パターンで悪性細胞を強く染色したが、正常な膵臓組織および乳房組織におけるＭＵＣ１は、管／腺房細胞における弱い尖端パターンの陽性のみを示した。ＺＺ－ＰＥ３８に連結されたキメラ（マウス－ヒト）ＤＭＢ５Ｆ３（ＺＺは、シュードモナス外毒素ＰＥ３８に融合されたＩｇＧ結合タンパク質である）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＭＵＣ１＋悪性細胞の活発な細胞毒性を誘発した。抗ＭＵＣ１ ＤＭＢ５Ｆ３：ＺＺ－ＰＥ３８タンパク質－外毒素構築物による細胞死滅の強度は、標的細胞によって発現されるＭＵＣ１のレベルと相関し、これは、ＭＵＣ１発現の閾値が、細胞死滅に必要であることを示唆している。腫瘍殺傷に対する抗体ＤＭＢ５Ｆ３の効果をｉｎ ｖｉｖｏで示すために、ＭＵＣ１＋Ｃｏｌｏ３５７ヒト膵臓癌細胞を、ヌードマウスおよびＳＣＩＤマウスに異種移植し、次いでｃｈＤＭＢ５Ｆ３：ＺＺ－ＰＥ３８免疫複合体で治療した。両方の移植モデル（ヌードおよびＳＣＩＤマウス）において、ｃｈＤＭＢ５Ｆ３：ＺＺ－ＰＥ３８は、同時対照と比較して、ＳＣＩＤマウスにおいて腫瘍体積の最大９０％を抑制する、有意なｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性を示した。

したがって、本発明は、ＭＵＣ１を発現する悪性腫瘍の治療において使用するための抗体を提供する。

従って、第一のその態様では、本発明は、ＭＵＣ１ ＳＥＡドメインに結合する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。

「ＭＵＣ１ ＳＥＡドメイン」（本明細書において「ＭＵＣ１ ＳＥＡモジュール」とも称される）という用語は、ＭＵＣ１ α－サブユニットの、ＭＵＣ１ β－サブユニットの細胞外部分との相互作用によって形成される１２０アミノ酸の高度に保存されたドメインを指す。従って、これは、ＭＵＣ１ α－β接合部に位置し、安定した細胞膜に固定した部分であり、決して細胞表面からシェディングされない（図１Ａ、１Ｂおよび図１Ｃ、楕円によって示される領域を参照）。

当該技術分野で公知のＳＥＡドメインは、ヒトＭＵＣ１タンパク質のアミノ酸２６４と３８４との間に位置する領域として定義される（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ － Ａ０Ａ０８７Ｘ２Ａ４（Ａ０Ａ０８７Ｘ２Ａ４＿ＨＵＭＡＮ）。

ＭＵＣ１膜貫通糖タンパク質（ＭＵＣ－ＴＭ）は、２０アミノ酸長の配列の２０～１２５リピート（可変数タンデムリピートであるＶＮＴＲと称される）を含有する細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達を仲介する短い細胞質側末端からなるヘテロ二量体である。ＭＵＣ１は、ＳＥＡモジュール内で自己タンパク質分解的に切断される。これにより、分子の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含有する膜貫通βサブユニットとの強力な非共有結合性相互作用で結合したタンデムリピートアレイを含有する大きい細胞外αサブユニットがもたらされる。

具体的には、本発明は、ＭＵＣ１ ＳＥＡドメインに結合する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供し、前述の抗体は、以下を含む：
ａ．配列番号２５によって示される重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）１、配列番号２６によって示されるＣＤＲＨ２、配列番号２７によって示されるＣＤＲＨ３、ならびに配列番号２８によって示される軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）１、配列番号２９によって示されるＣＤＲＬ２、および配列番号３０によって示されるＣＤＲＬ３；または
ｂ．配列番号３１によって示される重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）１、配列番号３２によって示されるＣＤＲＨ２、配列番号３３によって示されるＣＤＲＨ３、ならびに配列番号３４によって示される軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）１、配列番号３５によって示されるＣＤＲＬ２、および配列番号３６によって示されるＣＤＲＬ３；または
ｃ．配列番号３７によって示される重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）１、配列番号３８によって示されるＣＤＲＨ２、配列番号３９によって示されるＣＤＲＨ３、ならびに配列番号４０によって示される軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）１、配列番号４１によって示されるＣＤＲＬ２、および配列番号４２によって示されるＣＤＲＬ３；または
ｄ．配列番号４３によって示される重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）１、配列番号４４によって示されるＣＤＲＨ２、配列番号４５によって示されるＣＤＲＨ３、ならびに配列番号４６によって示される軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）１、配列番号４７によって示されるＣＤＲＬ２、および配列番号４８によって示されるＣＤＲＬ３；または
ｅ．配列番号４９によって示される重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）１、配列番号５０によって示されるＣＤＲＨ２、配列番号５１によって示されるＣＤＲＨ３、ならびに配列番号５２によって示される軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）１、配列番号５３によって示されるＣＤＲＬ２、および配列番号５４によって示されるＣＤＲＬ３；または
ｆ．配列番号５５によって示される重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）１、配列番号５６によって示されるＣＤＲＨ２、配列番号５７によって示されるＣＤＲＨ３、ならびに配列番号５８によって示される軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）１、配列番号５９によって示されるＣＤＲＬ２、および配列番号６０によって示されるＣＤＲＬ３。

上で示された通り、本発明は、ＭＵＣ１ ＳＥＡドメインに結合する単離モノクローナル抗体を提供する。「抗体」という用語は、抗原、本事例では、ＭＵＣ１ ＳＥＡドメインに特異的に結合し、認識する免疫グロブリン遺伝子によってコードされるポリペプチドを指す。

本明細書において定義される「モノクローナル抗体」、「複数のモノクローナル抗体」、または「ｍＡｂ」は、同種の抗体の集団を指し、すなわち、集団を含む個々の抗体は、可能性のある天然に存在する稀な変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、単一の抗原部位（エピトープ）に対して向けられる。

モノクローナル抗体は、当該技術分野で公知の任意の方法によって調製され、精製されてもよい。例えば、モノクローナル抗体は、免疫された動物（例えば、ウサギ、ラット、マウス、またはサル）の脾臓またはリンパ節から採取されたＢ細胞から調製されてもよい。

モノクローナル抗体の精製は、当該技術分野で公知の任意の方法、例えば、アフィニティクロマトグラフィー、すなわち、特異的なエピトープ（または抗原）がコンジュゲートされている親和性カラムを使用することによって実施され得る。あるいは、抗体の精製は、タンパク質Ａおよびタンパク質Ｇカラムクロマトグラフィーの使用に基づいてもよい。

典型的な抗体構造単位は、当該技術分野で公知の四量体を含む。各四量体は、二つの同一の対のポリペプチド鎖からなり、各対は、一つの「軽鎖」および一つの「重鎖」を有する。各鎖のＮ末端は、主に抗原（エピトープ）認識に関与する約１００～１１０以上のアミノ酸の可変領域を定義する。

従って、「重鎖可変領域」（Ｖ_Ｈ）および「軽鎖可変領域」（Ｖ_Ｌ）という用語は、それぞれ、これらの重鎖および軽鎖を指す。より具体的には、可変領域は、高頻度可変領域およびフレームワーク（ＦＲ）領域に細分される。高頻度可変領域は、その位置の最も一般的なアミノ酸と比べて、特定の位置の異なるアミノ酸の高い比率を有する。より安定したアミノ酸配列を有する四つのＦＲ領域は、高頻度可変領域を分離する。高頻度可変領域は、抗原の表面の一部に直接接触する。このため、高頻度可変領域は、本明細書において「相補性決定領域」、または「ＣＤＲ」と言及され、ＣＤＲは、抗体の重鎖（「重鎖相補性決定領域」）および抗体の軽鎖（「軽鎖相補性決定領域」）の両方に位置する。

Ｎ末端からＣ末端まで、軽鎖と重鎖の両方が、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含む。ＣＤＲは、抗原のエピトープへの結合に主に関与する。各鎖のＣＤＲは、典型的には、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と称され、Ｎ末端から順次番号付けされ、ＣＤＲが位置する鎖によっても典型的には同定される。

従って、相補性決定領域ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３は、抗体の重鎖のＮ末端から始まる三つの相補性決定領域を指し（重鎖相補性決定領域として本明細書において言及される）、相補性決定領域ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３は、抗体の軽鎖のＮ末端から始まる三つの相補性決定領域を指す（軽鎖相補性決定領域として本明細書において言及される）。

本発明は、本発明の単離抗ＭＵＣ１ ＳＥＡドメインモノクローナル抗体の抗原結合フラグメントを包含する。

本明細書で使用される場合、「抗原結合フラグメント」という用語は、ＭＵＣ１ ＳＥＡドメインへの結合の抗体の特異性を保持する、全長抗体のフラグメントに関する。抗原結合フラグメントは、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、一本鎖Ｆｖ－Ｆｃ（ｓｃＦｖ－Ｆｃ）、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２およびＦ（ａｂ）_２を包含するが、これらに限定されない。

かかるフラグメントは、当該技術分野で公知の任意の方法、例えば、パパイン（Ｆａｂフラグメントを産生するため）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントを産生するため）などの酵素を使用した、タンパク分解性切断によって産生され得る。

従って、一部の実施形態では、本発明による抗体は、一本鎖Ｆｖ－Ｆｃ（ｓｃＦｖ－Ｆｃ）分子、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆｖ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、およびＦ（ａｂ）_２からなる群から選択される抗体フラグメントである。

特定の実施形態では、本発明の単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＭＵＣ１ ＳＥＡドメインに結合する。

以下の実施例５で示されるように、抗体ＤＭＢ５Ｆ３および細胞毒性部分を含む免疫複合体の投与は、マウスでのｉｎ ｖｉｖｏ癌モデルにおける腫瘍体積を有意に低減した。従って、特定の実施形態では、本発明の単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、対象における腫瘍体積を低減するのに有効である。

本発明の文脈における腫瘍体積を「低減する」という用語は、本発明の単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントが、当該技術分野で公知の任意の手段によって測定される腫瘍のサイズを、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントの不存在下での腫瘍サイズと比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または約１００％減少することを意味する。特定の実施形態では、「低減する」という用語は、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の低減を指すことを意味する。

一部の実施形態では、単離抗ＭＵＣ１ ＳＥＡドメインモノクローナル抗体は、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体である。

本明細書において使用される場合、「キメラ抗体」という用語は、一つの種（例えば、マウス抗体の可変ドメイン）および異なる種（例えば、ヒト）の定常ドメイン由来の抗原結合可変ドメインを有する抗体を指す。

本明細書において使用される場合、「ヒト化抗体」という用語は、そのアミノ酸配列が改変されて、ヒトにおいて天然に産生される抗体バリアントとの類似性を増加させる、非ヒト種（例えば、マウス）の構造に基づく抗体を指す。

本明細書において使用される場合、「ヒト抗体」という用語は、ヒトによって産生される、および／または当該技術分野で公知のヒト抗体を作製するための技術のいずれかを使用して作製される、抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体を指す。この定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を具体的に排除する。

キメラ抗体、ヒト化抗体、およびヒト抗体の調製方法は、当該技術分野で周知である。

大量の抗体（キメラ、ヒト化、またはヒトのいずれか）を調製するために、抗体の重鎖と軽鎖の両方を含有するＩｇ発現ベクターを用いて細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）をトランスフェクトすることによって、抗体を発現する安定な細胞株を調製することができる。次いで、抗体は、例えば、バイオリアクターシステムで製造されてもよい。抗体は、十分に確立されたモノクローナル抗体精製方法を使用して、臨床グレードまで精製されてもよい。次いで、高レベルの抗ＭＵＣ１ ＳＥＡドメイン抗体を産生するクローンは、当該技術分野で公知の任意の方法、例えば、ＭＵＣ１ ＳＥＡドメイン特異的ＥＬＩＳＡアッセイによって試験される、上清中の抗体レベルに基づいて選択され、拡大され得る。特定のクローン用に開発されたマスターセルバンクは、全ての臨床グレードのバッチの出発材料として機能し得る。

一部の実施形態では、本発明は、抗ＭＵＣ１ ＳＥＡドメイン単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供し、前述の抗体またはその抗原結合フラグメントは、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、前述の重鎖可変領域は、配列番号１によって示される核酸配列と少なくとも７０％、または７５％、または８０％、または８５％、または９０％以上同一である核酸配列によってコードされ、前述の軽鎖可変領域は、配列番号２によって示される核酸配列と少なくとも７０％、または７５％、または８０％、または８５％、または９０％以上同一である核酸配列によってコードされる。

他の実施形態では、本発明は、抗ＭＵＣ１ ＳＥＡドメイン単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供し、前述の抗体またはその抗原結合フラグメントは、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、前述の重鎖可変領域は、配列番号３によって示される核酸配列と少なくとも７０％、または７５％、または８０％、または８５％、または９０％以上同一である核酸配列によってコードされ、前述の軽鎖可変領域は、配列番号４によって示される核酸配列と少なくとも７０％、または７５％、または８０％、または８５％、または９０％以上同一である核酸配列によってコードされる。

一部のさらなる実施形態では、本発明は、抗ＭＵＣ１ ＳＥＡドメイン単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供し、前述の抗体またはその抗原結合フラグメントは、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、前述の重鎖可変領域は、配列番号５によって示される核酸配列と少なくとも７０％、または７５％、または８０％、または８５％、または９０％以上同一である核酸配列によってコードされ、前述の軽鎖可変領域は、配列番号６によって示される核酸配列と少なくとも７０％、または７５％、または８０％、または８５％、または９０％以上同一である核酸配列によってコードされる。

一部の実施形態では、本発明は、抗ＭＵＣ１－ＳＥＡドメイン単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供し、前述の抗体またはその抗原結合フラグメントは、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、前述の重鎖可変領域は、配列番号７によって示される核酸配列と少なくとも７０％、または７５％、または８０％、または８５％、または９０％以上同一である核酸配列によってコードされ、前述の軽鎖可変領域は、配列番号８によって示される核酸配列と少なくとも７０％、または７５％、または８０％、または８５％、または９０％以上同一である核酸配列によってコードされる。

一部の実施形態では、本発明は、抗ＭＵＣ１ ＳＥＡドメイン単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供し、前述の抗体またはその抗原結合フラグメントは、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、前述の重鎖可変領域は、配列番号９によって示される核酸配列と少なくとも７０％、または７５％、または８０％、または８５％、または９０％以上同一である核酸配列によってコードされ、前述の軽鎖可変領域は、配列番号１０によって示される核酸配列と少なくとも７０％、または７５％、または８０％、または８５％、または９０％以上同一である核酸配列によってコードされる。

一部の実施形態では、本発明は、抗ＭＵＣ１ ＳＥＡドメイン単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供し、前述の抗体またはその抗原結合フラグメントは、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、前述の重鎖可変領域は、配列番号１１によって示される核酸配列と少なくとも７０％、または７５％、または８０％、または８５％、または９０％以上同一である核酸配列によってコードされ、前述の軽鎖可変領域は、配列番号１２によって示される核酸配列と少なくとも７０％、または７５％、または８０％、または８５％、または９０％以上同一である核酸配列によってコードされる。

一部の実施形態では、本発明は、抗ＭＵＣ１ ＳＥＡドメイン単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供し、前述の抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１３によって示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域またはそのバリアントおよび配列番号１４によって示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、またはそのバリアントを含む。

他の実施形態では、本発明は、抗ＭＵＣ１ ＳＥＡドメイン単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供し、前述の抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１５によって示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域またはそのバリアントおよび配列番号１６によって示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、またはそのバリアントを含む。

一部のさらなる実施形態では、本発明は、抗ＭＵＣ１ ＳＥＡドメイン単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供し、前述の抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１７によって示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域またはそのバリアントおよび配列番号１８によって示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、またはそのバリアントを含む。

一部の実施形態では、本発明は、抗ＭＵＣ１ ＳＥＡドメイン単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供し、前述の抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１９によって示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域またはそのバリアントおよび配列番号２０によって示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、またはそのバリアントを含む。

特定の実施形態では、本発明は、抗ＭＵＣ１ ＳＥＡドメイン単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供し、前述の抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号２１によって示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域またはそのバリアントおよび配列番号２２によって示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、またはそのバリアントを含む。

一部の実施形態では、本発明は、抗ＭＵＣ１ ＳＥＡドメイン単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供し、前述の抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号２３によって示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域またはそのバリアントおよび配列番号２４によって示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、またはそのバリアントを含む。

他の実施形態では、本発明による単離抗体は、抗ＭＵＣ１ ＳＥＡドメイン単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであり、配列番号２５～３０によって示される六つのＣＤＲ配列、ならびに配列番号１３と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１４と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

他の実施形態では、本発明による単離抗体は、抗ＭＵＣ１ ＳＥＡドメイン単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであり、配列番号３１～３６によって示される六つのＣＤＲ配列、ならびに配列番号１５と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１６と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

さらなる実施形態では、本発明による単離抗体は、抗ＭＵＣ１ ＳＥＡドメイン単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであり、配列番号３７～４２によって示される六つのＣＤＲ配列、ならびに配列番号１７と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１８と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

様々な実施形態では、本発明による単離抗体は、抗ＭＵＣ１ ＳＥＡドメイン単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであり、配列番号４３～４８によって示される六つのＣＤＲ配列、ならびに配列番号１９と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号２０と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

他の実施形態では、本発明による単離抗体は、抗ＭＵＣ１ ＳＥＡドメイン単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであり、配列番号４９～５４によって示される六つのＣＤＲ配列、ならびに配列番号２１と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号２２と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

さらなる実施形態では、本発明による単離抗体は、抗ＭＵＣ１ ＳＥＡドメイン単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであり、配列番号５５～６０によって示される六つのＣＤＲ配列、ならびに配列番号２３と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号２４と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

別の実施形態では、本発明は、以下を含む抗体と競合する、単離モノクローナル抗体を提供する：
（ａ）配列番号２５を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号２６を含む重鎖ＣＤＲ２、および配列番号２７を含む重鎖ＣＤＲ３；ならびに
配列番号２８を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２９を含む軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号３０を含む軽鎖ＣＤＲ３；または
（ｂ）配列番号３１を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号３２を含む重鎖ＣＤＲ２、および配列番号３３を含む重鎖ＣＤＲ３；ならびに
配列番号３４を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３５を含む軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号３６を含む軽鎖ＣＤＲ３；または
（ｃ）配列番号３７を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号３８を含む重鎖ＣＤＲ２、および配列番号３９を含む重鎖ＣＤＲ３；ならびに
配列番号４０を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号４１を含む軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号４２を含む軽鎖ＣＤＲ３；または
（ｄ）配列番号４３を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号４４を含む重鎖ＣＤＲ２、および配列番号４５を含む重鎖ＣＤＲ３；ならびに
配列番号４６を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号４７を含む軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号４８を含む軽鎖ＣＤＲ３；または
（ｅ）配列番号４９を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号５０を含む重鎖ＣＤＲ２、および配列番号５１を含む重鎖ＣＤＲ３；ならびに
配列番号５２を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５３を含む軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号５４を含む軽鎖ＣＤＲ３；または
（ｆ）配列番号５５を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号５６を含む重鎖ＣＤＲ２、および配列番号５７を含む重鎖ＣＤＲ３；ならびに
配列番号５８を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５９を含む軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号６０を含む軽鎖ＣＤＲ３。

本明細書においてＤＭＢ５Ｆ３、ＤＭＢ７Ｆ３、ＤＭＢ４Ｂ４、ＤＭＢ４Ｆ４、ＤＭＢ１０Ｂ７、およびＤＭＣ２０９と称される抗体の重鎖および軽鎖をコードする核酸配列は、以下の表１に詳述される。さらに、本明細書において記載される抗体の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列は、以下の表２に詳述される。さらに、上記の抗体のＣＤＲの配列は、以下の表３に示される。

ＤＭＢ４Ｂ４およびＤＭＢ１０Ｆ１０は、同一のアミノ酸配列を有する。

ＤＭＢ４Ｆ４は、ｍＩｇ－ガンマ１である。ＤＭＢ１０Ｂ７およびＤＭＢ１３Ｄ１１は、ｍＩｇＡである。しかし、全三つの抗体：ＤＭＢ４Ｆ４、ＤＭＢ１０Ｂ７およびＤＭＢ１３Ｄ１１の可変領域は、同一である。

ＣＤＲ配列は、重鎖および軽鎖アミノ酸配列内でハイライト表示され、表３に列挙される。

抗体のゲノム誘導は、以下の表に示される。

本発明はまた、重鎖可変領域のバリアントおよび軽鎖可変領域のバリアントを包含する。バリアントは、本明細書に記載される抗体の活性を変更しない重鎖および軽鎖の相補性決定領域、またはフレームワーク領域における変異を含んでもよい。

「バリアント」という用語は、本明細書に具体的に特定される配列とは異なるアミノ酸またはヌクレオチドの配列を意味し、そこでは一つまたは複数のアミノ酸残基またはヌクレオチドが欠失、置換、または付加される。

本明細書で使用される場合、「付加される」という用語は、本明細書に記載される配列へのアミノ酸残基の任意の付加を意味することは、理解されるべきである。

バリアントは、様々なアミノ酸置換を包含する。アミノ酸「置換」は、あるアミノ酸を、類似または異なる構造および／または化学特性を有する別のアミノ酸で置換した結果である。アミノ酸置換は、含まれる残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、および／または両親媒性の性質の類似性に基づいてなされてもよい。

典型的には、バリアントは、保存的アミノ酸置換を包含する。機能的に類似するアミノ酸を提供する保存的置換の表は、当該技術分野で周知である。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンを含み、極性の中性アミノ酸は、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンを含み、正に荷電した（塩基性）アミノ酸は、アルギニン、リジン、およびヒスチジンを含み、負に荷電した（酸性）アミノ酸は、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含む。

以下の八つの群の各々は、互いに保存的置換である他の典型的なアミノ酸を含有する：
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；および
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）。

保存的核酸置換は、上で定義される保存的アミノ酸置換をもたらす核酸置換である。

本発明によるバリアントはまた、非極性から極性へのアミノ酸置換を包含し、その逆も同様である。

本明細書で使用される場合、「アミノ酸」または「アミノ酸残基」という用語は、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を指す。

バリアント配列は、そのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列の、本明細書に記載されるアミノ酸配列またはヌクレオチド配列（例えば、本明細書に記載される抗体の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列）との同一性の割合によって特徴付けられ得るアミノ酸配列または核酸配列を指す。

一部の実施形態では、本明細書に定義されるバリアント配列は、重鎖および軽鎖可変領域をコードする核酸配列を指し、各々が、本明細書に記載される重鎖および軽鎖可変領域の配列と比較したとき、少なくとも７０％または７５％の配列同一性、およそ８０％または８５％の配列同一性、およそ９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する、ヌクレオチドの配列を有する。

一部の他の実施形態では、本明細書に定義されるバリアント配列は、重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を指し、各々が、本明細書に記載される重鎖および軽鎖可変領域の配列と比較したとき、少なくとも７０％または７５％の配列同一性、およそ８０％または８５％の配列同一性、およそ９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する、アミノ酸配列の配列を有する。

「抗体の活性」という用語は、ＭＵＣ１ ＳＥＡドメインに結合する抗体の能力、好ましくは、単独でまたは細胞毒性部分との免疫複合体の一部としての細胞毒性を仲介する能力を意味する。抗体の活性は、例えば、以下の実施例に記載されるように、当該技術分野で周知の方法を使用して、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで測定することができる。

本発明の抗体のその標的タンパク質への結合は、例えば、ＥＬＩＳＡ、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）、ウェスタンブロットまたは免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）を使用して測定されてもよい。

抗体の生物活性は、例えば、以下の実施例に詳述されるように、ｉｎ ｖｉｖｏ癌モデルにおいて測定することができる。

別の一つのその態様では、本発明は、本発明による抗体またはその抗原結合フラグメントをコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子を提供する。

本明細書において定義される「核酸」または「核酸分子」という用語は、一本鎖または二本鎖のいずれかであってもよいヌクレオチドのポリマーを指し、これは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）などのポリヌクレオチドであり、必要に応じて、リボ核酸（ＲＮＡ）である。用語はまた、均等物として、ヌクレオチド類似体から作製されたＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかの類似体、および記載されている実施形態に該当する場合、一本鎖（センスまたはアンチセンスなど）および二本鎖ポリヌクレオチドを含むと理解されるべきである。本明細書で使用されるＤＮＡという用語は、ｃＤＮＡ、すなわち、逆転写酵素（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）の作用によってＲＮＡ鋳型から産生される相補的またはコピーＤＮＡも包含する。

本発明はさらに、本明細書において定義される単離核酸分子を含む発現ベクターを提供する。

本明細書で使用される場合、ときに、「発現ビヒクル」または「発現構築物」と称される「発現ベクター」は、プラスミドなどのベクター、ウイルス、バクテリオファージ、統合可能なＤＮＡフラグメント、および他のビヒクルを包含し、これにより、ＤＮＡフラグメントの宿主のゲノムへの統合が可能となる。発現ベクターは、典型的には、所望の遺伝子またはそのフラグメント、および適当な宿主細胞において認識され、所望の遺伝子の発現に影響を与える、作動可能に連結された遺伝子制御エレメントを含有する自己複製ＤＮＡまたはＲＮＡ構築物である。これらの制御エレメントは、適当な宿主内での発現に影響し得る。本発明による発現ベクターは、細菌、酵母、または哺乳類の宿主細胞において発現する能力があるが、わずかである。

さらに別の一つのその態様では、本発明は、本発明による単離核酸分子または本発明による発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。

本明細書において使用される場合、「宿主細胞」という用語は、本発明による単離核酸分子の導入または本発明による発現ベクターによる導入に対して感受性がある細胞を指す。好ましくは、前述の細胞は、哺乳類細胞、例えば、ＣＨＯ細胞またはＮＳ０細胞である。本発明による単離核酸分子または発現ベクターの宿主細胞へのトランスフェクションは、当該技術分野で公知の任意の方法によって行われてもよい。

なお別の一つのその態様では、本発明は、本発明による抗体またはその抗原結合フラグメントおよび以下で本明細書において定義される追加の細胞毒性剤または治療剤を含む免疫複合体を提供する。

「免疫複合体（ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）」、「免疫複合体（ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｌｅｘ）」という用語は、本明細書において互換的に使用され、追加の薬剤にコンジュゲート（連結または結合）されている本発明による抗体またはその抗原結合フラグメントを指す。免疫複合体は、当業者に公知の任意の方法によって、例えば、本発明による抗体に追加の薬剤を架橋することによって、または組み換えＤＮＡ方法によって調製され得る。

特定の実施形態では、免疫複合体は、免疫毒素であり、これによって、本発明による抗体またはその抗原結合フラグメントは、細胞毒性剤にコンジュゲートされる。本明細書で使用される場合、「細胞毒性剤」という用語は、接触の際に、細胞に細胞毒性効果を発揮する任意の薬剤を指す。こうした細胞毒性剤は、当業者に周知である。本発明の免疫複合体において使用され得る細胞毒性剤の例は、アルキル化薬剤、アントラサイクリン、ピリミジン誘導体、ビンカアルカロイド、光線力学薬剤、白金含有化合物、タキサン、トポイソメラーゼ阻害剤、リボソーム不活性化剤（例えば、ゲロニン）、ＤＮＡ損傷を誘発する薬剤（例えば、カリチアマイシン）、チューブリン阻害剤（例えば、エムタンシン）、抗有糸分裂剤（例えば、モノメチルオーリスタチン）、または細菌毒素を含むが、これらに限定されない。細胞毒性剤はまた、ラジオアイソトープまたは細胞毒性抗体であってもよい。一実施形態では、毒素剤は、シュードモナス外毒素、例えば、ＺＺ－ＰＥ３８（シュードモナス外毒素に融合したＺＺ ＩｇＧ結合タンパク質）である。

本発明はまた、二つの別個の標的またはエピトープに結合することができる二重特異性抗体も包含し、前述の二重特異性抗体は、本発明による抗体またはその抗原結合フラグメントならびに追加の抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。

従って、特定の実施形態では、本発明は、ＭＵＣ１ ＳＥＡドメインに結合する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを含む免疫複合体を提供し、前述の抗体は、

配列番号２５によって示される重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）１、配列番号２６によって示されるＣＤＲＨ２、配列番号２７によって示されるＣＤＲＨ３、ならびに配列番号２８によって示される軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）１、配列番号２９によって示されるＣＤＲＬ２、および配列番号３０によって示されるＣＤＲＬ３を含み、細胞毒性剤は、シュードモナス外毒素であり、前述の免疫複合体は、癌を有する対象への投与の際に腫瘍体積を低減する。

本発明の抗ＭＵＣ１ ＳＥＡドメイン抗体は、少なくとも一つの追加の治療剤と組み合わせて投与されてもよい。

本明細書で使用される場合、「追加の治療剤」という用語は、疾患または障害、例えば、癌を治療するために使用され得る任意の薬剤を指す。

特定の実施形態では、追加の治療剤は、追加の抗体である。本明細書において定義される場合、「追加の抗体」という用語は、本発明の抗体（すなわち、本発明の少なくとも二つの抗体の組み合せ使用）ならびに本発明による抗体ではない抗体を指し、疾患または障害、例えば、癌を治療するために本発明の抗体と組み合わせて使用され得る。このような他の抗体は、抗ＣＤ２２ 抗体、抗ＣＤ３０抗体、抗ＨＥＲ２受容体抗体、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）抗体、および抗チェックポイント阻害剤を含むが、これらに限定されない。

追加の治療剤はまた、化学療法剤、または抗炎症剤であってもよい。

本発明は、有効成分として、少なくとも一つの本発明の単離抗ＭＵＣ１ ＳＥＡ抗体、もしくはその抗原結合フラグメントまたは本明細書において定義される免疫複合体および薬学的に許容し得る担体、賦形剤、または希釈剤を含む医薬組成物をさらに提供する。

特定の実施形態では、前述の医薬組成物は、ＭＵＣ１の過剰発現と関連する疾患または障害の治療に使用するためのものである。

用語「ＭＵＣ１の過剰発現と関連する疾患または障害」は、その最も広い意味で本明細書において使用され、ＭＵＣ１の異常な発現によって特徴付けられる任意の疾患を指す。特定の実施形態では、ＭＵＣ１の過剰発現と関連する疾患または障害は、癌である。例は、肺癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、結腸癌、小腸癌、膵臓癌、胃癌、肝臓癌、多発性骨髄腫、または急性骨髄性白血病を含むが、これらに限定されない。

他の実施形態では、ＭＵＣ１の過剰発現と関連する疾患または障害は、自己免疫疾患または炎症性疾患である。自己免疫疾患または炎症性疾患の例としては、関節リウマチ、乾癬性関節炎、全身性エリテマトーデス、アミロイドーシス、および自己免疫性膵炎が挙げられる。

他の実施形態では、前述の疾患または障害は、悪性ではない異常な成長状態、例えば、嚢胞、例えば、臨床上有意な腎嚢胞、大きな非機能性甲状腺嚢胞および甲状腺塊、肝嚢胞などである。

本発明の「医薬組成物」は、概して、本明細書において定義される抗体または任意のその抗原結合フラグメント、ならびに緩衝剤、組成物のモル浸透圧濃度を調節する薬剤、ならびに必要に応じて、当該技術分野で公知の一つまたは複数の薬学的に許容し得る担体、賦形剤および／または希釈剤を含む。

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容し得る担体、賦形剤または希釈剤」という用語は、当該技術分野で公知の任意の溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤などを含む。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、その適当な混合物、および植物油を含有する溶媒または分散媒体であり得る。各担体は、他の成分と互換性があり、対象に有害ではないという意味で、薬学的および生理学的に許容可能なものであるべきである。任意の従来の媒体または薬剤が、有効成分と互換性がないため、治療組成物におけるその使用が企図される。

他の実施形態では、本発明による医薬組成物は、追加の治療剤をさらに含む。追加の治療剤の非限定的な例としては、抗ＭＵＣ１抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＣＤ３０抗体、抗ＨＥＲ２受容体抗体、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＴＡＡ抗体およびチェックポイント阻害剤が挙げられる。

本発明はまた、それを必要とする対象に、治療上有効量の本発明の単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント、あるいは本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントを含む免疫複合体あるいは本発明の単離モノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは免疫複合体を含む医薬組成物を投与することを含む、ＭＵＣ１の過剰発現と関連する疾患または障害（例えば、癌）の治療または改善方法を提供する。

「対象」または「患者」という用語は、互換的に使用され、哺乳類（例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ウマ、ウシ、またはヒト）などの、本発明から利益を得ることができる対象を指す。一つの特定の実施形態では、患者はヒトである。ＭＭＵＣ１の過剰発現と関連する疾患または障害の診断は、当該技術分野で公知の方法により、当業者によって行われてもよい。

本発明の文脈において、特に、「それを必要とする対象」という用語は、哺乳類、特に、本明細書において定義されるＭＵＣ１の過剰発現と関連する疾患または障害に罹患しているヒト対象を指す。

本明細書で使用される場合、「治療する」、「治療すること」、「治療」またはその形式は、疾患または状態の有害作用を低減すること、予防すること、治癒すること、逆転させること、改善すること、減衰させること、軽減すること、最小にすること、抑制することもしくは不完全にすること、または本明細書において定義される、ＭＵＣ１の過剰発現と関連する疾患または障害（例えば、癌）の一つまたは複数の臨床的徴候の開始を遅延させることを意味することは、理解されるべきである。一部の実施形態では、本発明による方法は、それを必要とする対象に、本明細書において定義される追加の治療剤を投与することをさらに含む。

本発明による投与は、以下の経路：経口投与、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、くも膜下腔内注射、または皮下注射、直腸内投与、鼻腔内投与、眼投与、または局所投与のいずれかによって行われてもよい。

特定の実施形態では、本発明による投与は、静脈内で行われる。

本明細書において定義される抗体または抗体フラグメント、それを含む任意の医薬組成物またはそれを含む任意のコンジュゲートは、対象に、１回用量または複数回用量で投与されてもよい。

本明細書において定義される目的のための、本発明による単離モノクローナル抗体もしくは任意のその抗原結合フラグメント、または本発明による医薬組成物の「治療上有効量」を、健康状態を治癒する、停止させる、または少なくとも緩和するかもしくは改善するために、当該技術分野で公知である考察によって決定される。本発明の方法で使用される任意の調製物について、投薬量または治療上有効量は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養アッセイから、または適当な動物モデルに基づいて最初に推定することができる。

一部の実施形態では、本発明による治療上有効量は、１０μｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇの範囲にある。

他の実施形態では、本発明による治療上有効量は、０．１ｍｇ／ｋｇ～４０ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ、または５ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇの範囲内である。

具体的な典型的な用量は、医師の裁量により、１日用量として、または３日に１回、もしくは週に１回投与される０．２５ｍｇ／ｋｇ、または０．７５ｍｇ／ｋｇ、または２．５ｍｇ／ｋｇ、または５ｍｇ／ｋｇ、または１０ｍｇ／ｋｇを含むが、これらに限定されない。一実施形態では、用量は、静脈内投与される。

本発明は、本明細書において定義されるＭＵＣ１の過剰発現と関連する疾患または障害（例えば、癌）の治療または改善方法において使用するための、本発明による単離抗ＭＵＣ１ ＳＥＡ抗体もしくは任意のその抗原結合フラグメント、または本発明による免疫複合体、または本発明による医薬組成物をさらに提供する。

なおさらに、本発明は、本明細書において定義されるＭＵＣ１の過剰発現と関連する疾患または障害（例えば、癌）の治療または改善のための医薬の調製における、本発明の単離モノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメント、免疫複合体、または医薬組成物の使用を提供する。

「精製された」または「単離された」という用語は、その天然の環境から単離、または分離されているアミノ酸もしくは核酸配列、ペプチド、ポリペプチド、または抗体などの分子を指すことは理解される。従って、「単離抗体」は、精製された抗体である。本明細書で使用される場合、「精製された」または「精製すること」という用語はまた、試料からの汚染物質の除去を意味する。

別の態様では、本発明は、対象から得られた生検における疾患または障害（例えば、癌）を診断する方法を提供し、前述の方法は、
ａ．前述の生検を、本発明の少なくとも一つの単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントと接触させること；および
ｂ．前述の単離モノクローナル抗体または任意のその抗原結合フラグメントを検出することを含み、
生検におけるＭＵＣ１ ＳＥＡを過剰発現する細胞の検出は、前述の疾患または障害（例えば、癌）の指標として機能する。

ＭＭＵＣ１－ＳＥＡ発現を検出する本発明の単離抗体の能力の評価は、当該技術分野で公知の任意の方法、例えば、免疫組織化学またはフローサイトメトリーによって行われてもよい。免疫組織化学は、新鮮凍結（ＦＦ）組織由来のホルムアルデヒド固定切片ならびにパラフィン包埋およびホルムアルデヒド固定（ＰＥＦＦ）組織で行われてもよい。例えば、以下の実施例２に示されるように、抗体ＤＭＢ５Ｆ３は、ＦＦ切片とＰＥＦＦ切片の両方に存在するＭＵＣ１を発現する細胞を染色した。抗体はまた、フローサイトメトリーを使用してＭＵＣ１を発現する細胞を認識する能力も有していた。様々な実施形態では、本発明による単離抗体は、当該技術分野で公知の任意の方法に従って標識されてもよい。他の実施形態では、検出は、二次抗体を使用して前述の抗体を同定することに基づいてもよい。

「生検」という用語は、その最も広い意味で本明細書において使用され、ＭＵＣ１ ＳＥＡを過剰発現する細胞が検出され得る、本明細書において定義される対象から採取された任意の生検を指す。生検は、哺乳類（ヒトを含む）から採取され、細胞を含む体液試料と組織試料の両方を包含し得る。一部の実施形態では、体液試料は、血液、血漿、血清、リンパ液または尿である。一部の実施形態では、生検は、癌細胞を含有することが疑われる組織試料である。

別の態様では、本発明は、疾患または障害を画像化する方法を提供し、前述の方法は、
ａ．本発明の少なくとも一つの単離抗ＭＵＣ１ ＳＥＡモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを対象に導入すること、前述の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ラジオアイソトープ、または可視化可能な薬剤（すなわち、例えば、走査によって可視化され得る薬剤）で検出可能に標識される；および
ｂ．前述の検出可能に標識された単離抗ＭＵＣ１ ＳＥＡモノクローナル抗体または任意のその抗原結合フラグメントを可視化することを含み、
前述のアイソトープまたは前述の可視化可能な薬剤で標識された細胞および／または組織の検出は、前述の対象における前述の疾患または障害の存在、および／または局在化および／または程度および／または転移の存在を示す。

本明細書で使用される場合、「約」という用語は、整数値および必要に応じて、連続範囲を構成する、非整数値も含む逸脱範囲に対して参照される値より最大１％、より具体的には、５％、より具体的には１０％、より具体的には１５％、ある場合では、２０％以上または以下はずれたてもよい値を示す。開示および記載される通り、本発明が、方法の工程および組成物は、多少変化し得るため、本明細書に開示される特定の実施例、方法の工程、および組成物に限定されないことは理解されるべきである。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲およびその均等物によって制限されるため、本明細書において使用され技術用語は、特定の実施形態を記載する目的でのみ使用され、制限することを意図されないことも理解されるべきである。

本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数の参照物を含むことに留意されたい。

本明細書および実施例および添付の特許請求の範囲全体を通して、文脈が別段要求しない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語、ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含むこと」などの変形は、指定される整数もしくは工程または整数もしくは工程の群を含むが、任意の他の整数もしくは工程または整数もしくは工程の群を除外しないことは理解される。

材料および方法
試薬および抗体
別段指定しない限り、全ての試薬および化学物質を、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から得た。細胞カウンター染色または免疫組織化学開発に使用した二次抗体を、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）から得た。

マウスの免疫およびハイブリドーマの生成
マウスを、２１日間隔で５回の連続する皮内ＤＮＡ免疫でまず免疫した。免疫ＤＮＡは、ＭＵＣ１－ＴＭタンパク質をコードするｐＣＬ－ＭＵＣ１－ＴＭ発現ベクタープラスミドからなっていた。次いで、ＭＵＣ１－Ｘタンパク質（組み換え細菌ＭＵＣ１－Ｘｅｘ）の細胞外ドメインを、フロイント不完全アジュバントと共に使用して、マウスをブーストした。これらの免疫に使用した細菌で合成させた組み換えＭＵＣ１－Ｘｅｘタンパク質は、自発的に自己切断し、互いに強く、なおかつ非共有結合的に相互作用して、非常に安定なヘテロ二量体切断ＭＵＣ１－Ｘｅｘタンパク質を形成する、ＭＵＣ１－Ｘ ａおよびｂサブユニットを生成する。ハイブリドーマを、非分泌性ミエローマ細胞の免疫脾臓細胞との融合により調製し、ＥＬＩＳＡアッセイによってスクリーニングした。

抗ＭＵＣ１ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体のＭＵＣ１－Ｘタンパク質の細胞外ドメインへの結合を決定するためのＥＬＩＳＡ
Ｅｌｉｓａイムノアッセイプレート（ＣｏＳｔａｒ）を、組み換えＭＵＣ１タンパク質でコーティングし、続いてブロッキングした。次いで、初期ハイブリドーマの使用済み培養培地を、ウェルに加えた。インキュベーション後、試料を除去し、ウェルをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄した。結合した抗体の検出を、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート抗マウス抗体を用いて行った。

抗ＭＵＣ１モノクローナル抗体の選別のための二段階スクリーニング
ハイブリドーマの一次スクリーニングを、上のＥＬＩＳＡアッセイに記載した通り、ＭＵＣ１－Ｘ（ＭＵＣ１－Ｘｅｘ）の細胞外ドメインへの抗体結合を評価することによって行った。ＭＭＵＣ１－Ｘｅｘだけでなく、完全な細胞表面ＭＵＣ１－ＴＭタンパク質も認識する抗体を分泌するハイブリドーマを選別するために、第一のスクリーンで陽性のシグナルを示すそれらのハイブリドーマを、第二段階のスクリーンに供した。これは、ヒトＭＵＣ１－ＴＭ（商標）を発現するマウス細胞トランスフェクタント（ＤＡ３－ＴＭ細胞と称す）、および並行して、ヒトＭＵＣ１を発現しない同じ親細胞（ＤＡ３－ＰＡＲ細胞と称す）を使用したフローサイトメトリー解析からなっていた。本手順により、ＭＵＣ１－ＸとＭＵＣ１－ＴＭの両方に共通するＭＵＣ１部分に結合するだけでなく、哺乳類細胞が発現する細胞表面ヒトＭＵＣ１－ＴＭ分子を認識する抗体の選別が確かになった。

細胞株および細胞培養
ＤＡ３－ＰＡＲ親マウス乳腺細胞（ヒトＭＵＣ１を発現しない）、ｃＤＮＡ（全長ヒトＭＵＣ１－ＴＭをコードする）を安定的にトランスフェクトしたＤＡ３－ＴＭマウス乳腺細胞、細胞株Ｔ４７ＤおよびＺＲ７５（ヒト乳癌）、細胞株ＫＢ（ヒト類表皮癌）、Ｃｏｌｏ３５７（ヒト膵臓癌）、Ｎ８７（ヒト胃癌腫）、ならびにＣＨＯ－Ｋ１（チャイニーズハムスター卵巣細胞）を全て、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ、およびＤＭＥＭ：Ｆ１２（１：１）培養培地において成長させた［１２］。

動物
７週齢の胸腺欠損（ヌード）マウスおよびＳＣＩＤマウス（（Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を、イスラエル保健省の規制および基準に従い、実験動物ケア認定のためのテルアビブ大学（ＴＡＵ）施設内倫理委員会が承認した施設において屠殺まで維持した。

フローサイトメトリー解析
トリプシン処理後、ＭＵＣ１を発現する腫瘍細胞を洗浄し、ＤＭＢ５Ｆ３（０．５μｇ／ｍｌ）と、ＭＵＣ１－Ｘｅｘ競合物（１００μｇ／ｍｌ）あり、またはなしで、４℃で１時間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄後、フルオレセイン標識ヤギ抗マウスＩｇＧを、４℃で４５分間加えた。結合ＩｇＧを、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）上でフローサイトメトリーによって検出した。

免疫組織化学（ＩＨＣ）染色
正常および悪性の膵臓組織および乳房組織のマイクロアレイを、ＵＳ Ｂｉｏｍａｘ（Ｄｅｒｗｏｏｄ、ＭＤ）から購入した。自動免疫染色を、製造業者の指示に従い、Ｄａｋｏ Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ Ｌｉｎｋ ４８（Ｄａｋｏ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を使用して得た。抗原回収を、室温で３０分間、クエン酸緩衝液を用いて行った。内因性ペルオキシダーゼ活性を、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ Ｆｌｅｘペルオキシダーゼ阻害試薬（Ｄａｋｏ）を３０分間添加することによって遮断し、続いて、ＤＭＢ５Ｆ３（５μｇ／ｍｌ）で２時間インキュベーションした。ペルオキシダーゼおよび二次抗体と結合したポリマーデキストランを１５分間（ＥｎＶｉｓｉｏｎ－Ｆｌｅｘ／ＨＲＰ、Ｄａｋｏ）およびジアミノベンジジンを１０分間（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）添加することによって、免疫組織化学反応を検出した。これに続いて、ヘマトキシリンで１０分間対比染色した。

抗ＭＵＣ１－ＳＥＡモジュールモノクローナル抗体の配列決定
試薬についての技術マニュアル（Ａｍｂｉｏｎ Ｉｎｃ．、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）に従って、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬ｌを用いて一連のＤＭＢハイブリドーマからＲＮＡを単離した。ＲＮＡ配列を以下の通り決定した：ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（商標）第１鎖ｃＤＮＡ合成キット（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）の技術マニュアルに従って、ユニバーサルまたはアイソタイプ特異的アンチセンスプライマーを用いた全ＲＮＡの逆転写によってｃＤＮＡを生成した。ＶＨおよびＶＬ抗体フラグメントの増幅を、ｃＤＮＡ末端の迅速増幅を含む標準操作手順（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、ＮＪ、ＵＳＡ）に従って行い、続いて、標準的なクローニングベクターに分離クローニングした。正しいサイズのインサートを有するクローンを、コロニーＰＣＲにより配列決定し、このようなインサートを有する少なくとも五つのコロニーを、各フラグメントについて配列決定し、異なるクローンのアラインメントにより共通配列を導いた。

チャイニーズハムスター卵巣細胞における哺乳類の発現のためのキメラｃｈＤＭＢ５Ｆ３の構築
ヒトキメラＤＭＢ５Ｆ３（ｃｈＤＭＢ５Ｆ３）を、マウスＤＭＢ５Ｆ３から生成した。哺乳類ベクターｐＭＡＺ－ＩｇＨおよびｐＭＡＺ－ＩｇＬを、それぞれ、ヒトγ１重鎖およびヒトκ軽鎖に融合したＤＭＢ５Ｆ３のＶＨおよびＶＬ領域をコードするｃＤＮＡの発現のための骨格として使用した ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA ［Ｍａｚｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，３２１（２００７）４１－５９； Ｍａｚｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ，２５７（２００７）１２４－１３５］。生成したｐＭＡＺ ＩｇＨ－ｃｈＤＭＢ５Ｆ３ベクターおよびｐＭＡＺ ＩｇＬ－ｃｈＤＭＢ５Ｆ３ベクターをトランスフェクションに使用し、得られたキメラ抗体ｃｈＤＭＢ５Ｆ３を、ＣＨＯ細胞で発現させた。安定的にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞は、ｃｈＤＭＢ５Ｆ３を分泌し、これをタンパク質Ａアフィニティクロマトグラフィーにより精製した。

ｃｈＤＭＢ５Ｆ３：ＺＺ－ＰＥ３８免疫複合体の調製
ｃｈＤＭＢ５Ｆ３：ＺＺ－ＰＥ３８免疫複合体の生成を、Ｐｉｃｈｉｎｕｋらに記載される通り、行った［１１］。簡潔に述べると、ｃｈＤＭＢ５Ｆ３を、２０ｍＭヘペス緩衝液中の精製組み換えＺＺ－ＰＥ３８タンパク質と、２倍のモル濃度を超えるＺＺ－ＰＥ３８と混合し、４℃で２時間インキュベートした。過剰なＺＺ－ＰＥ３８および非コンジュゲートｃｈＤＭＢ５Ｆ３抗体を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ
２００サイズ分類カラムを通して除去した。

Ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞生存率アッセイ
Ｔ４７Ｄ、ＫＢ、Ａ４３１およびＮ８７癌細胞（２０，０００細胞／ウェル）を、９６ウェル細胞培養プレートに播種し、５％ＣＯ_２中、３７℃で増殖させた。播種後、ｃｈＤＭＢ５Ｆ３：ＺＺ－ＰＥ３８免疫複合体を、１００ｎｇ／ｍｌの濃度で細胞に直接適用した。陰性対照は、ＺＺ－ＰＥ３８毒素単独、ｃｈＤＭＢ５Ｆ３抗体にコンジュゲートさせていないＺＺ－ＰＥ３８、またはＺＺ－ＰＥ３８毒素を欠く、ｃｈＤＭＢ５Ｆ３モノクローナル抗体単独と反応させた標的細胞からなっていた。細胞生存率を、アルカリホスファターゼ活性／ウェルによって評価した。結果を、２～３回の実験の平均として計算し、３回行った。

ｃｈＤＭＢ５Ｆ３：ＺＺ－ＰＥ３８免疫複合体のＭＵＣ１－Ｘｅｘタンパク質への結合の決定のためのＥＬＩＳＡ
マウス血清中のｃｈＤＭＢ５Ｆ３レベルを定量するために、ＥＬＩＳＡイムノアッセイプレートを、組み換えＭＵＣ１－Ｘｅｘタンパク質でコーティングした（概略構造を示す図１Ｃを参照のこと）、続いて、ブロッキングした。ｃｈＤＭＢ５Ｆ３：ＺＺ－ＰＥ３８免疫複合体５μｇの単回投与の１、７、１５および２８日後に、マウス血清を、倍希釈でＥＬＩＳＡウェルに適用し、結合した抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗ヒトＦｃ抗体を用いて検出した。結果を、２～３回の実験の平均として計算し、３回行った。

Ｉｎ ｖｉｖｏ細胞毒性アッセイ
二つの定量的に測定可能なヒト腫瘍異種移植片モデル、一つが、７週齢のメス胸腺欠損ヌードマウスおよび一つが、７週齢のＳＣＩＤマウスを、ＭＵＣ１^＋ヒト膵癌細胞株であるＣｏｌｏ３５７を使用することによって確立した。少量（１００μｌ）のヘペス緩衝液中に懸濁した合計３×１０^６個のＣｏｌｏ３５７細胞を、マウスの右脇腹に皮下注射した。ヌードマウス試験とＳＣＩＤマウス試験の両方において、マウスを、三つの群（５マウス／群）：ｃｈＤＭＢ５Ｆ３：ＺＺ－ＰＥ３８（０．２５ｍｇ／ｋｇ）５μｇを受け取った群１、非特異的ヒトＩｇ：ＺＺ－ＰＥ３８（０．２５ｍｇ／ｋｇ）５μｇを受け取った群２および均等な体積のヘペス緩衝液のみを受け取った群３に分けた。胸腺欠損ヌードマウス（７週齢のメスのマウス）において、三つの実験群における抗ＭＵＣ１免疫毒素、非特異的免疫毒素またはヘペスの投与を、Ｃｏｌｏ３５７細胞の注射の２４時間後に開始した。注射プロトコールは、各実験群において、１、６、９、１５、２２および２９日目に、計６回の静脈内（ｉｖ）投与からなっていた（ｘ軸に沿った黒色の矢印、図６を参照）。ＳＣＩＤマウス（７週齢のメスのマウス）において、ｃｈＤＭＢ５Ｆ３：ＺＺ－ＰＥ３８、非特異的なヒトＩｇ：ＺＺ－ＰＥ３８、およびヘペスの投与を、三つの群それぞれにおいて、膵腫瘍細胞の注射の２４時間後に同様に開始した。投与の全体的なプロトコールは、３群それぞれにおいて、１、４、８、１１、１６、２４、３１および３８日目での８回のＩＶ注射からなっていた。腫瘍増殖を、デジタルキャリパーを用いて実験群の各々において連続的に評価した。腫瘍体積を、ＴｏｍａｙｋｏおよびＲｅｙｎｏｌｄｓ（Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，２４（１９８９）１４８－１５４）に記載される、式０．５×Ｌ×Ｗ^２（式中、Ｌは腫瘍長であり、Ｗは腫瘍幅である）に従って計算した。全ての動物実験を、ＴＡＵの治験審査委員会が承認した。

統計
ｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍成長の統計解析を、単純な一対の片側ｔ検定に従い、行った。０．０５未満のｐ値を、統計的に有意であるとみなした。

結果
実施例１：細胞結合したＭＵＣ１α－β接合部に結合するＤＭＢ ｍＡｂの生成および配列決定ならびにＤＭＢ５Ｆ３ ｍＡｂの特徴決定
抗ＭＵＣ１モノクローナルＩｇＧを、高い力価のポリクローナル抗ＭＵＣ１－Ｘｅｘ抗体を有する、接種したマウスから単離した脾臓細胞を用いて作成した。免疫に使用したＭＵＣ１－Ｘｅｘ組み換えタンパク質、ならびに膜貫通ＭＵＣ１－ＴＭおよびＭＵＣ１－Ｘｅｘタンパク質とのその関係を、図１に示す（１Ｃを１Ｂおよび１Ａと比較する）。こうして、計７種のＤＭＢ ｍＡｂを生成した。

全ての抗ＭＵＣ１ ＳＥＡα－β接合部モノクローナル抗体の可変領域のヌクレオチド配列を、材料および方法に上記した通り決定し、ｍＡｂの推定アミノ酸配列を、図２に示す。得られたｍＡｂの配列決定は、それらが、４つの群にクラスター化したことを示し、［Ｉ］ＤＭＢ５Ｆ３^［Ｉ］、［ＩＩ］ＤＭＢ７Ｆ３^［ＩＩ］、［ＩＩＩ］ＤＭＢ４Ｂ４^{［ＩＩＩ－ａ］}およびＤＭＢ１０Ｆ１０^{［ＩＩＩ－ｂ］}および［ＩＶ］ＤＭＢ４Ｆ４^{［ＩＶ－ａ］}、ＤＭＢ１０Ｂ７^{［ＩＶ－ｂ］}およびＤＭＢ１３Ｄ１１^{［ＩＶ－ｃ］}と命名した（完全ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列については図２ならびに表１および２を参照のこと）。各群内の配列決定により、ＤＭＢ５Ｆ３^［Ｉ］およびＤＭＢ７Ｆ３^［ＩＩ］について固有のｍＡｂ配列、または群［ＩＩＩ］および［ＩＶ］について同一のＶ_Ｈ配列およびＶ_Ｌ配列を有するｍＡｂのいずれかが明らかになった。

全ての抗体の可変ドメインは、プライムブーストによって生成した抗体から予想する通り、親和性成熟の典型である。群［ＩＶ］ｍＡｂ ＤＭＢ１０Ｂ７^{［ＩＶ－ｂ］}およびＤＭＢ１３Ｄ１１^{［ＩＶ－ｃ］}を除く全てのｍＡｂｓは、Ｉｇ－ガンマ１であった。群［ＩＶ］は、同一のＶ_Ｈ配列およびＶ_Ｌ配列を有する三つのｍＡｂを含有しており、一つ（ＤＭＢ４Ｆ４^{［ＩＶ－ａ］}）は、Ｉｇ－ガンマ１サブタイプであり、残りの二つ（ＤＭＢ１０Ｂ７^{［ＩＶ－ｂ］}およびＤＭＢ１３Ｄ１１^{［ＩＶ－ｃ］}）は、ＩｇＡであった。

全ての七つの抗ＭＵＣ１ α－β接合部ｍＡｂが、フローサイトメトリーによって評価した通り、膜貫通ＭＵＣ１－ＴＭタンパク質を発現する細胞に強力に結合した（図１Ｄ～１Ｋ）。四つのｍＡｂ群の各々由来の代表的なｍＡｂも、新鮮凍結（ＦＦ）組織由来ならびに包埋およびホルムアルデヒド固定（ＰＥＦＦ）組織由来のホルムアルデヒド固定切片上で行った免疫組織化学によってＭＵＣ１－ＴＭ発現を検出するそれらの能力について評価した。抗体ＤＭＢ５Ｆ３^［Ｉ］は、ＦＦとＰＥＦＦ切片の両方に存在するＭＵＣ１を発現する細胞を染色し（以下を参照）、一方、ＤＭＢ７Ｆ３^［ＩＩ］および群［ＩＶ］由来のｍＡｂは、対照的にＦＦ切片のみで染色し、フローサイトメトリーによって評価した通り、ＭＵＣ１を発現する細胞に良好に結合しながら群［ＩＩＩ］ｍＡｂは、ＦＦとＰＥＦＦ切片の両方と非反応性であった（データは示していない）。

ＶＨドメインは、９個の体細胞変異を有するマウス生殖系列Ｖ遺伝子ＩＧＨＶ３－１^＊０２に由来する。これは、ＮＣＢＩ ＢｌａｓｔＰ検索において最高スコアの同一配列と１０５／１２２（８６％）同一である。ＶＬドメイン（Ｖ－カッパ）は、３つの体細胞変異を有するマウス生殖系列Ｖ遺伝子ＩＧＫＶ５－４８^＊０１に由来する。これは、ＮＣＢＩ ＢｌａｓｔＰ検索において最高スコアの同一配列と１０１／１０７（９４％）同一である。

フローサイトメトリー解析は、ＤＭＢ５Ｆ３が、完全長ＭＵＣ１（ＤＡ３－ＴＭ）で安定的にトランスフェクトしたＤＡ３細胞に強く結合するが（図１Ｄ）、一方、ＭＵＣ１を発現しない、トランスフェクトしていないＤＡ３－ＰＡＲ細胞は、一貫して陰性であった（図１Ｅ）であることを示した。ＭＵＣ１－陽性ヒト膵臓癌細胞株であるＣｏｌｏ３５７、ならびにＭＵＣ１陽性乳癌細胞株Ｔ４７ＤおよびＺＲ７５は、ＤＭＢ５Ｆ３との強い反応性を示した（図１Ｄ、１Ｆ、１Ｈおよび１Ｊ）。競合する可溶性組み換えＭＵＣ１－Ｘｅｘタンパク質（組み換えＭＵＣ１－Ｘｅｘの構造については図１Ｃを参照）の添加は、全てのＤＭＢ５Ｆ３細胞結合を消失させ（図１Ｇ、１Ｉおよび１Ｋ）、抗体特異性を確認した。

実施例２：ＤＭＢ５Ｆ３を用いたヒト膵臓および乳房組織切片のＩＨＣ染色
モノクローナルＤＭＢ５Ｆ３が悪性組織および正常組織に結合する程度を決定するために、乳癌、膵臓癌、肺癌、前立腺癌、および結腸癌を含む、組織マイクロアレイにおける様々な悪性腫瘍を免疫組織化学染色した（典型的な結果を図３および図４に示す）。悪性腫瘍におけるＭＵＣ１過剰発現を示す過去の報告にもかかわらず、ＭＵＣ１発現について広範な分析を行う根拠は、本明細書に記述した抗ＭＵＣ１ ｍＡｂが、ＭＵＣ１ ＳＥＡモジュールを認識し、組み換えＭＵＣ１－Ｘｅｘタンパク質を用いた免疫によって生成された（図１Ｃを参照）が、ＭＵＣ１－ＴＭタンパク質を用いた免疫によって生成された（図１Ａを参照）という重要な事実にある。これまでのＭＵＣ１発現の分析を、α鎖ＶＮＴＲ部分内のエピトープを認識する抗体を用いてほぼ独占的にった。したがって、抗ＭＵＣ１－ＳＥＡドメイン抗体の細胞認識パターンを初めて解析することは興味深いものであった。これらの分析に使用した組織マイクロアレイは、以下を含んでいた（括弧内のＢｉｏｍａｘマイクロアレイ指定）：各々対応する正常組織由来の２種の切片（ＴＰ４８１）に加えて、隣接する非腫瘍組織を有する６つの膵腫瘍（ＰＡ２４１）；４０種の異なる膵腫瘍および８種の正常な膵組織（ＰＡ４８３）；乳房形質細胞性乳腺炎、腺疾患および線維腺腫の各々３種の試料ならびに３６種の浸潤性乳管癌、加えて２種の浸潤性小葉癌（ＢＲ９６３ａ）、ならびに結腸癌、乳癌、前立腺癌、肺癌および結腸癌の各々の１０症例。ＤＭＢ５Ｆ３を用いて免疫組織化学的に染色した正常組織および悪性組織の代表的な複合アレイを図３に示す。４６種の膵腫瘍（マイクロアレイＰＡ２４１およびＰＡ４８３中）のうち、４４種が、ＤＭＢ５Ｆ３との強い反応性を示し、腫瘍細胞は、ほぼ環状的パターンで染色された（例えば、図３Ｃおよび３Ｄを参照）。対照的に、正常な膵組織ＤＭＢ５Ｆ３反応性は、膵管上皮細胞の管腔表面に限定された（図３Ａ）。

ＢＲ９６３ａマイクロアレイで分析した乳房組織試料のうち、正常な乳房組織、形質細胞乳腺炎、腺疾患および線維腺腫を含む非悪性組織において、染色は最小限であるか、または全く見られなかった。対照的に、３６種の浸潤性乳管癌のうち２１種は、非常に高いＤＭＢ５Ｆ３反応性を示し、４種は、低レベルの発現を示し、１１種の試料は、わずかに発現を示すか、発現を示さなかった。調べた膵組織は、腺房（図３Ｄ）と管腺癌（図３Ｃならびに図４Ｎおよび４Ｏ）の両方を含み、マイクロアレイ内の悪性乳房組織は、浸潤性管癌からなっていた（図３Ｇおよび３Ｈ）。膵臓癌（図３Ｃおよび３Ｄならびに図４Ｎおよび４Ｏ）、乳癌（図３Ｇおよび３Ｈ、ならびに図３Ｉ～３Ｎ、患者１～６）、ならびに肺癌、前立腺癌および結腸癌（図４Ａ、４Ｄおよび４Ｇ、それぞれ、より高い倍率で図４Ｂ、４Ｅおよび４Ｈ）由来の悪性細胞は、ＤＭＢ５Ｆ３と強く反応し、ほぼ環状的な細胞染色を有していた。対照的に、正常な膵腺房細胞は、以前の記載［１３］と一致し、弱い頂端陽性のみを示した（図３Ａ（ｉ）の黒色の矢印によって示す；より高い倍率を、図３Ｂ、および図４Ｍに示す）。正常な乳管上皮細胞（図３Ｅおよび３Ｆ）ならびに悪性腫瘍に隣接する非悪性上皮細胞によって形成される正常な腺様構造は、マイクロアレイ上で、弱い頂端陽性を示した（図３Ｉ～３Ｎは、６人の患者由来の生検切片を示し、正常な腺様構造を、黒色の矢印で示す）。これは、ＤＭＢ５Ｆ３抗ＭＵＣ１－ＳＥＡ抗体で強く染色した同じ切片の悪性細胞と著しい対照をなした（図３Ｉ～３Ｎ）。悪性および非悪性物質は、同じマイクロアレイ試料にあり、したがって、同時かつ均一に染色されたため、取り扱いおよび染色における単なる技術的相違が、排除し得る所見を説明することができる。さらに、可溶性ＭＵＣ１－Ｘｅｘが、ＤＭＢ５Ｆ３による細胞染色と競合したという事実は、ＤＭＢ５Ｆ３の抗ＭＵＣ１特異性を確かにした（それぞれ、図３Ａおよび３Ｂを比較する）。

これらの知見を他の腫瘍タイプに拡張するために、肺癌、前立腺癌、および結腸癌を、ＤＭＢ５Ｆ３で免疫組織化学的に調べた（図４Ａ、４Ｄおよび４Ｇ）。結果は、乳癌および膵臓癌において観察したものと同様のＭＵＣ１分布パターンを示した（図３）。細胞レベルでのＭＵＣ１発現の密度の増加に加えて、ＭＵＣ１構造の違いも観察し、抗ＭＵＣ１－ＳＥＡ ＤＭＢ５Ｆ３は、ほぼ環状的パターンで悪性細胞に結合した。ここでも、ＤＭＢ５Ｆ３を用いた染色は、競合する可溶性ＭＵＣ１－Ｘｅｘタンパク質の存在下で無効になり、ＤＭＢ５Ｆ３の特異性を示し（データは示していない）、非免疫マウス免疫グロブリンでは、染色を観察しなかった（図４Ａ、４Ｄ、４Ｇおよび４Ｊを４Ｃ、４Ｆ、４Ｉおよび４Ｌと比較する）。マイクロアレイで調べたほぼ５０種の肺癌、前立腺癌、結腸癌、乳癌、および膵腺癌組織の大半が、同様のＩＨＣ染色パターンを示し、少数が、より少ない量のＭＵＣ１を発現し、若干が、無視できるほどのＭＵＣ１発現を有していた。この不均一性は、一般的な腫瘍表現型、具体的には、ＭＵＣ１の不均一性と一致する。高い死亡率のＭＵＣ１を発現する悪性腫瘍である膵臓癌を、ｉｎ ｖｉｖｏ研究のため選択したので（以下を参照）、追加の一連の患者由来の膵腫瘍組織を調べて、ＭＵＣ１発現の腫瘍関連構造の変化を確認した（図４Ｎおよび４Ｏ中の代表的な染色を参照）。これらの分析は、腺癌細胞の細胞表面全体にわたって、環状的ＤＭＢ５Ｆ３免疫反応性の増加を明らかにするが、以下の二点の注意が関連する：（ａ）免疫組織学的分析は、半定量的であり、（ｂ）一部の事例では、ＭＵＣ１は、細胞内で強く発現し、表面発現の比較は困難である。これら二点の但し書きにもかかわらず、腺癌に由来する癌細胞は、ＤＭＢ５Ｆ３との高い細胞表面免疫反応性を明らかに示す。

実施例３：ｃｈＤＭＢ５Ｆ３：ＺＺ－ＰＥ３８免疫複合体のＩｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性
細胞株（図１Ｄ～１Ｋ）と組織生検のマイクロアレイ（図３および図４）の両方で、細胞表面ＭＵＣ１を発現する癌細胞とのＤＭＢ５Ｆ３の反応性を示した後、細胞毒性部分を悪性細胞に輸送する抗体の能力を調べた。ＺＺ－ＰＥ３８融合タンパク質は、シュードモナス外毒素ＰＥ３８およびタンパク質Ａ由来のＩｇＧ結合ＺＺドメインからなる。ＺＺドメインは、ヒトＦｃに強く結合し、マウスＩｇＧ１ Ｆｃへのわずかな結合を示すため、材料および方法に記載した通り、マウスＩｇＧ１－ＦｃをヒトＦｃに置換し、次いで、ＺＺ－ＰＥ３８をキメラ（ｃｈ）ＤＭ５Ｆ３に付加して、免疫毒素複合体を形成する、キメラＤＭＢ５Ｆ３抗体を生成した。

ＺＺ－ＰＥ３８毒素単独は、細胞に結合または内部移行することができないため、ＤＭＢ５Ｆ３－ＺＺ－Ｐ３８－免疫複合体によって誘発した全ての腫瘍細胞毒性は、抗ＭＵＣ１ ＤＭＢ５Ｆ３免疫複合体による細胞結合および内部移行のみによるものである［Ｍａｚｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，３２１（２００７）４１－５９； Ｍａｚｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ，２５７（２００７）１２４－１３５］。細胞株Ｔ４７Ｄ、ＫＢ、Ａ４３１、およびＮ８７を、３００ｎｇ／ｍｌの濃のｃｈＤＭＢ５Ｆ３、アービタックスおよびハーセプチンを用いて細胞学的に分析した。ＭＵＣ１^＋Ｔ４７Ｄ細胞（乳癌）およびＫＢ細胞（類表皮腫瘍）は、細胞成長のｃｈＤＭＢ５Ｆ３：ＺＺ－ＰＥ３８免疫複合体介在性阻害に感受性があることを見出し、２００ｐＭと同等の抗体濃度で腫瘍細胞毒性を観察した（図５Ａおよび５Ｂ）。対照的に、低いが、依然として明確に検出可能なレベルのＥＧＦＲ１を発現するＴ４７Ｄ乳癌細胞は、アービタックス（登録商標）：ＺＺ－ＰＥ３８（図５Ａ、菱形のトレーシング）に感受性がなく、ハーセプチン（登録商標）：ＺＺ－ＰＥ３８に部分的にのみ感受性であった（図５Ａ、長方形のトレーシング）。低いが、依然として明らかに検出可能なレベルのｅｒｂＢ２－ＥＧＦＲ２を発現したＫＢ細胞は、ハーセプチン（登録商標）：ＺＺ－ＰＥ３８に感受性がなかった（図５Ｂ、長方形のトレーシング）。Ｎ８７などの著しく低いレベルのＭＵＣ１を発現する細胞は、Ｔ４７Ｄ細胞およびＫＢ細胞に見られる高いＭＵＣ１発現および高い細胞毒性とは対照的に、およそ４０％の細胞毒性を示した（図５Ｄを、図５Ａおよび５Ｂと比較する）。調べた全ての細胞株の中で最も低いＭＵＣ１発現物質であるＡ４３１は、ＭＵＣ１発現を示さず、低いレベルのＭＵＣ１を発現するはるかに小さな亜集団のみを有する、細胞の主要集団を含有していた。この低いレベルのＭＵＣ１発現と一致して、ｃｈＤＭＢ５Ｆ３：ＺＺ－ＰＥ３８免疫複合体は、Ａ４３１の非常に限定的な細胞毒性をもたらした。これらの結果は、閾値レベルの細胞表面のＭＵＣ１発現および密度が、細胞毒性を惹起するために必要な要件であることを示す。同様の現象を、これらの細胞による低いが、依然として検出可能なレベルのｅｒｂＢ２－ＥＧＦＲ２発現にもかかわらず、ＫＢ細胞に適用したとき、ハーセプチン－免疫毒素－複合体を用いないで不存在で検察し（図５Ｂ）、低いが、依然として検出可能なレベルのＥＧＦＲ１も発現するＴ４７Ｄ細胞に適用したとき、アービタックス－免疫毒素－複合体を用いないで観察した（図５Ａ）。

実施例４：ヌードマウスにおけるｃｈＤＭＢ５Ｆ３の薬物動態
ｃｈＤＭＢ５Ｆ３のｉｎ ｖｉｖｏ安定性を、ｉｖ投与の１、７、１４および２８日後の血清レベルを評価することによって評価した。結果は、７日目と比較して、１４日目および２８日目の抗体ｃｈＤＭＢ５Ｆ３の血清レベルは、それぞれ、２倍および４倍減少したこと（図６Ｄ）を示し、これは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで生成したキメラＩｇＧおよび臨床使用における抗体のマウスにおける従前に報告された半減期と一致した。毒素コンジュゲートについては、シュードモナス外毒素の半減期を、ＩｇＧへの結合によって延長することを示した。

実施例５：異種移植したヒト腫瘍におけるｃｈＤＭＢ５Ｆ３：ＺＺ－ＰＥ３８免疫複合体のＩｎ ｖｉｖｏ細胞毒性
ＭＭＵＣ１^＋ヒト膵Ｃｏｌｏ３５７細胞を異種移植したヌードマウスへのｃｈＤＭＢ５Ｆ３：ＺＺＰＥ３８免疫複合体の投与は、２１日目、２８日目および３５日目に、ヘペス緩衝液または非特異的なアイソタイプ一致ＩｇＧ－ＺＺ：ＰＥ３８を受け取った対照群と比較して腫瘍体積の減少を伴う顕著な細胞破壊効果をもたらした（図６Ａ）。ｃｈＤＭＢ５Ｆ３：ＺＺＰＥ３８免疫複合体投与の完了の際、治療した群の腫瘍体積は、予想した通り、対照群におけるものと平行して漸進的に増加し、４０日目（動物を屠殺したとき）まで、三つの群全てにおける腫瘍体積は、２００～４００ｍｍ^３の範囲に達した（図６Ａ）。これにより、投与したｃｈＤＭＢ５Ｆ３：ＺＺＰＥ３８の腫瘍抑制効果を再び確認した。

異種移植したヌードマウスにおけるｃｈＤＭＢ５Ｆ３：ＺＺＰＥ３８免疫複合体の細胞毒性有効性をおそらく制限する因子は、内因性の循環抗体であり、これは、ＺＺリンカーと相互作用することによって、ｃｈＤＭＢ５Ｆ３からのＺＺ－ＰＥ３８毒素を少なくとも部分的に置換し得る。ＺＺは、マウスＩｇＧ１に結合しないが、マウスＩｇＧ２に結合することができる。置換による免疫毒素の有効性の制限は、抗体ｃｈＤＭＢ５Ｆ３の腫瘍細胞表面ＭＵＣ１への結合の欠如を反映しないが、ＺＺ－ＰＥ３８のｃｈＤＭＢ５Ｆ３抗体へのＺＺ介在性結合の減少による毒素消失から生じる。この複雑な因子を回避するために、次いで、検出可能な内因性抗体を欠くＳＣＩＤマウスにおけるほぼ同一の研究を行った。ヌードマウスプロトコールと同様に、移植したＳＣＩＤマウスを、三つの群に分け、一つは、ｃｈＤＭＢ５Ｆ３：ＺＺＰＥ３８免疫複合体を受け取っており、一つは、一致アイソタイプＩｇＧ－ＺＺ：ＰＥ３８を受け取っており、一つは、ヘペス緩衝液単独を受け取っており、各々を、膵腫瘍の注射の２４時間後に開始した。材料および方法のセクションに記載した通り、プロトコールは、１、４、８、１１、１６、２４、３１、および３８日目の各群における連続投与からなっていた。ｃｈＤＭＢ５Ｆ３：ＺＺ－ＰＥ３８免疫複合体は、ｃｈＤＭＢ５Ｆ３：ＺＺ－ＰＥ３８で治療したＳＣＩＤマウスにおいて顕著な抗腫瘍効果を示した：異種移植したＣｏｌｏ３５７ヒト腫瘍の体積は、対照群におけるものと比較して９０％も低減した（図７）。治療後の腫瘍体積（ｍｍ^３）の実際の値は、以下の通りである： ｃｈＤＭＢ５Ｆ３－免疫毒素を用いて治療したマウスである群１：２、１４、１６、２５および３６ｍｍ^３；非特異的なアイソタイプ－一致ＩｇＧ－ＺＺ：ＰＥ３８で治療したマウスの群２：１８０、２２５、２５８および２７０ｍｍ^３（この群における一つのマウスの腫瘍の欠如を含めない）；ならびにヘペス緩衝液単独で治療したマウスの群３：１８０、２４５、３０４、７０５および１００８ｍｍ３。ｃｈＤＭＢ５Ｆ３：ＺＺ－ＰＥ３８投与の３１および３８日目まで延長したスケジュールにより、４９日目までも抗腫瘍効果を確かにした。

実施例６：ＤＭＣ２０９の配列決定
総ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、カタログ番号７４０３４）の技術マニュアルに従い、ハイブリドーマ細胞から単離した。次いで、ＳＭＡＲＴＳｃｒｉｂｅ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＴａＫａＲａ、カタログ番号６３９５３６）の技術マニュアルに従い、アイソタイプ特異的アンチセンスプライマーまたはユニバーサルプライマーのいずれかを使用して、総ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。ＧｅｎＳｃｒｉｐｔのｃＤＮＡ末端（ＲＡＣＥ）の迅速増幅の標準的操作手法（ＳＯＰ）に従い、重鎖および軽鎖の抗体フラグメントを増幅した。増幅した抗体フラグメントを、標準的なクローニングベクターに別々にクローニングした。コロニーＰＣＲを行い、正しいサイズのインサートを有するコロニーをスクリーニングした。コンセンサス配列を、表１に提供する（重鎖可変領域について、配列番号１１および軽鎖可変領域について、配列番号１２）。

Claims (35)

1. ＭＵＣ１ ＳＥＡドメインに結合する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記抗体が、
   ａ．配列番号２５によって示される重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）１、配列番号２６によって示されるＣＤＲＨ２、配列番号２７によって示されるＣＤＲＨ３、ならびに配列番号２８によって示される軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）１、配列番号２９によって示されるＣＤＲＬ２、および配列番号３０によって示されるＣＤＲＬ３；または
   ｂ．配列番号３１によって示される重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）１、配列番号３２によって示されるＣＤＲＨ２、配列番号３３によって示されるＣＤＲＨ３、ならびに配列番号３４によって示される軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）１、配列番号３５によって示されるＣＤＲＬ２、および配列番号３６によって示されるＣＤＲＬ３；または
   ｃ．配列番号３７によって示される重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）１、配列番号３８によって示されるＣＤＲＨ２、配列番号３９によって示されるＣＤＲＨ３、ならびに配列番号４０によって示される軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）１、配列番号４１によって示されるＣＤＲＬ２、および配列番号４２によって示されるＣＤＲＬ３；または
   ｄ．配列番号４３によって示される重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）１、配列番号４４によって示されるＣＤＲＨ２、配列番号４５によって示されるＣＤＲＨ３、ならびに配列番号４６によって示される軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）１、配列番号４７によって示されるＣＤＲＬ２、および配列番号４８によって示されるＣＤＲＬ３；または
   ｅ．配列番号４９によって示される重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）１、配列番号５０によって示されるＣＤＲＨ２、配列番号５１によって示されるＣＤＲＨ３、ならびに配列番号５２によって示される軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）１、配列番号５３によって示されるＣＤＲＬ２、および配列番号５４によって示されるＣＤＲＬ３；または
   ｆ．配列番号５５によって示される重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）１、配列番号５６によって示されるＣＤＲＨ２、配列番号５７によって示されるＣＤＲＨ３、ならびに配列番号５８によって示される軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）１、配列番号５９によって示されるＣＤＲＬ２、および配列番号６０によって示されるＣＤＲＬ３を含む、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
2. 前記抗体が、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、
   ａ．前記重鎖可変領域は、配列番号１によって示される核酸配列に対して少なくとも７０％同一である核酸配列によってコードされ、前記軽鎖可変領域は、配列番号２に対して少なくとも７０％同一である核酸配列によってコードされるか；または
   ｂ．前記重鎖可変領域は、配列番号３によって示される核酸配列に対して少なくとも７０％同一である核酸配列によってコードされ、前記軽鎖可変領域は、配列番号４に対して少なくとも７０％同一である核酸配列によってコードされるか；または
   ｃ．前記重鎖可変領域は、配列番号５によって示される核酸配列に対して少なくとも７０％同一である核酸配列によってコードされ、前記軽鎖可変領域は、配列番号６に対して少なくとも７０％同一である核酸配列によってコードされるか；または
   ｄ．前記重鎖可変領域は、配列番号７によって示される核酸配列に対して少なくとも７０％同一である核酸配列によってコードされ、前記軽鎖可変領域は、配列番号８に対して少なくとも７０％同一である核酸配列によってコードされるか；または
   ｅ．前記重鎖可変領域は、配列番号９によって示される核酸配列に対して少なくとも７０％同一である核酸配列によってコードされ、前記軽鎖可変領域は、配列番号１０に対して少なくとも７０％同一である核酸配列によってコードされるか；または
   ｆ．前記重鎖可変領域は、配列番号１１によって示される核酸配列に対して少なくとも７０％同一である核酸配列によってコードされ、前記軽鎖可変領域は、配列番号１２に対して少なくとも７０％同一である核酸配列によってコードされる、請求項１に記載の単離モノクローナル抗体。
3. 前記抗体が、
   ａ．配列番号１３によって示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域もしくはそのバリアント、および配列番号１４によって示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域もしくはそのバリアント；または
   ｂ．配列番号１５によって示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域もしくはそのバリアント、および配列番号１６によって示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域もしくはそのバリアント；または
   ｃ．配列番号１７によって示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域もしくはそのバリアント、および配列番号１８によって示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域もしくはそのバリアント；または
   ｄ．配列番号１９によって示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域もしくはそのバリアント、および配列番号２０によって示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域もしくはそのバリアント；または
   ｅ．配列番号２１によって示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域もしくはそのバリアント、および配列番号２２によって示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域もしくはそのバリアント；または
   ｆ．配列番号２３によって示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域もしくはそのバリアント、および配列番号２４によって示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域もしくはそのバリアントを含む、請求項１または請求項２に記載の単離モノクローナル抗体。
4. 前記抗体が、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体である、請求項１～３のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
5. 前記その抗原結合フラグメントが、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、一本鎖Ｆｖ－Ｆｃ（ｓｃＦｖ－Ｆｃ）、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２またはＦ（ａｂ）_２である、請求項１～４のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
6. 前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、新鮮凍結（ＦＦ）組織由来のホルムアルデヒド固定した切片上、および／またはパラフィン包埋され、ホルムアルデヒド固定された（ＰＥＦＦ）組織上、および／またはＭＵＣ１発現ヒト細胞の蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）解析によって行われる免疫組織化学においてＭＵＣ１ ＳＥＡを同定する、請求項１～５のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
7. 請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体または任意のその抗原結合フラグメントをコードするヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子。
8. 請求項７に記載の単離核酸分子を含む、発現ベクター。
9. 請求項８に記載の発現ベクターでトランスフェクトされた、宿主細胞。
10. 請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントおよび追加の細胞毒性剤または治療剤を含む、免疫複合体。
11. 前記細胞毒性剤が、アルキル化薬剤、アントラサイクリン、ピリミジン誘導体、ビンカアルカロイド、光線力学薬剤、白金含有化合物、タキサン、トポイソメラーゼ阻害剤、リボソーム不活性化剤、ＤＮＡ損傷を誘発する薬剤、チューブリン阻害剤、抗有糸分裂剤、ラジオアイソトープ、細胞毒性抗体、および細菌毒素からなる群から選択される、請求項１０に記載の免疫複合体。
12. 前記細胞毒性剤が、シュードモナス外毒素である、請求項１０に記載の免疫複合体。
13. 前記免疫複合体が、癌を有する対象への投与の際に、腫瘍体積を低減する、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の免疫複合体。
14. 請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントおよび異なる抗原標的に結合する第二の抗体を含む、二重特異性抗体。
15. 有効成分として、請求項１～６のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント、または請求項１０～１３のいずれか一項に記載の免疫複合体、請求項１４に記載の二重特異性抗体および薬学的に許容し得る担体、賦形剤、または希釈剤を含む、医薬組成物。
16. 前記医薬組成物が、追加の治療剤をさらに含む、請求項１５に記載の医薬組成物。
17. それを必要とする対象に、治療上有効量の少なくとも一つの、請求項１～６のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または請求項１０～１３のいずれか一項に記載の免疫複合体、請求項１４に記載の二重特異性抗体、または請求項１５もしくは１６に記載の医薬組成物を投与することを含む、疾患または障害の治療または改善方法。
18. 前記疾患または障害が癌である、請求項１７に記載の方法。
19. 前記癌が、ＭＵＣ１を発現する癌である、請求項１８に記載の方法。
20. 前記癌が、肺癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、結腸癌、膵臓癌、多発性骨髄腫、および急性骨髄性白血病からなる群から選択される、請求項１８に記載の癌。
21. 前記疾患または障害が、自己免疫性疾患または炎症性疾患である、請求項１７に記載の方法。
22. 前記自己免疫性または炎症性疾患が、関節リウマチ、乾癬性関節炎、全身性エリテマトーデス、アミロイドーシス、および自己免疫性膵炎からなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
23. 前記疾患または障害が、悪性ではなく、臨床上有意な異常な成長状態、例えば、嚢胞、例えば、腎嚢胞、甲状腺嚢胞および甲状腺塊、または肝嚢胞である、請求項１７に記載の方法。
24. 前記方法が、それを必要とする対象に追加の治療剤を投与することをさらに含む、請求項１７～２３のいずれか一項に記載の方法。
25. それを必要とする対象に、治療上有効量の前記単離モノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメント、前記免疫複合体または前記医薬組成物を投与することを含む、疾患または障害の治療または改善方法における使用のための、請求項１～６のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメント、請求項１０～１３のいずれか一項に記載の免疫複合体、請求項１４に記載の二重特異性抗体、または請求項１５もしくは１６に記載の医薬組成物。
26. 前記疾患または障害が癌である、請求項２５に記載の使用のための単離モノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または免疫複合体、または二重特異性抗体、または医薬組成物。
27. 前記疾患もしくは障害が、自己免疫性疾患もしくは炎症性疾患であるか、または前記疾患もしくは障害が、悪性ではない異常な成長状態、例えば、嚢胞、例えば、腎嚢胞、甲状腺嚢胞および甲状腺塊、または肝嚢胞である、請求項２５に記載の使用のための単離モノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または免疫複合体、または二重特異性抗体、または医薬組成物。
28. 前記方法が、それを必要とする対象に追加の治療剤を投与することをさらに含む、請求項２５～２７のいずれか一項に記載の使用のための単離モノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または免疫複合体、または二重特異性抗体または医薬組成物。
29. 対象における疾患または障害を診断する方法であって、前記疾患または障害が、ＭＵＣ－１発現と関連し、前記方法が、
    ａ．前記患者から得られた生検を少なくとも一つの、請求項１～６のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントと接触させること；および
    ｂ．前記単離モノクローナル抗体または任意のその抗原結合フラグメントを検出することを含み、
    前記生検におけるＭＵＣ１ ＳＥＡを過剰発現する細胞の検出は、前記対象が、前記疾患または障害と診断されることを示す、方法。
30. 前記疾患または障害が癌である、請求項２９に記載の方法。
31. 前記疾患もしくは障害が、自己免疫性疾患もしくは炎症性疾患であるか、または前記疾患もしくは障害が、悪性ではない異常な成長状態、例えば、嚢胞、例えば、腎嚢胞、甲状腺嚢胞および甲状腺塊、または肝嚢胞である、請求項２９に記載の方法。
32. 前記単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントが、検出可能に標識される、請求項２９～３１のいずれか一項に記載の方法。
33. 疾患または障害を画像化する方法であって、
    ａ．少なくとも一つの、請求項１～６のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを対象に導入することであって、前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、ラジオアイソトープまたは可視化可能な薬剤で検出可能に標識される、導入すること；および
    ｂ．前記検出可能に標識された単離モノクローナル抗体または任意のその抗原結合フラグメントを可視化することを含み、
    前記アイソトープまたは可視化可能な薬剤で標識された細胞および／または組織の検出は、前記対象における前記疾患または障害の存在および／または局在化および／または程度および／または転移の存在を示す、方法。
34. 前記疾患または障害が癌である、請求項３３に記載の方法。
35. 前記疾患もしくは障害が、自己免疫性疾患もしくは炎症性疾患であるか、または前記疾患もしくは障害が、悪性ではない異常な成長状態、例えば、嚢胞、例えば、腎嚢胞、甲状腺嚢胞および甲状腺塊、または肝嚢胞である、請求項３３に記載の方法。

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