JP2023517543A - 創傷治癒および組織再生に有用な血液製剤 - Google Patents

Abstract

本発明は、血小板およびリンパ球に富む血漿からなる血液製剤、創傷治癒および身体組織再生のためのその使用、それを含有する医薬組成物および化粧品組成物、ならびにその調製方法を提供する。

Description

本発明は、血小板およびリンパ球に富む血漿を含有する血液製剤、創傷治癒および体組織再生のためのその使用、それを含有する医薬組成物、ならびにその調製方法に関する。

皮膚創傷治癒は、組織の完全性および機能の回復をもたらす可溶性メディエーター、血液細胞および細胞外マトリックスによって果たされる高度に組織化された動的プロセスである。プロセスを完了するために必要とされる以下の３つの段階がある：血液細胞の血管外遊出、インターロイキン走化性およびＲＯＳ産生によって特徴付けられる炎症段階；表皮および真皮区画の創傷閉鎖および再結合を可能にする、血管新生、肉芽組織形成、線維芽細胞およびケラチノサイト増殖によって記述される増殖段階；創傷収縮および細胞外マトリックス再編成が組織修復を完了する、組織リモデリング。正常な創傷治癒プロセスの中断は、非治癒慢性創傷、糖尿病による足潰瘍および脊髄損傷に起因する圧迫潰瘍などのいくつかの疾患の典型的な合併症の発症につながり得る。これらの慢性創傷は我々の社会において高い罹患率の問題であり、そこでは、それらはそれらが不十分にしか回復せず、頻繁に再発するので、医療システムにとって大きなコストをもたらす。創傷ケアの重要な構成要素である清拭工程に加えて、これらの損傷を治療するための異なるアプローチ、例えば、成長因子の適用または刺激、異なるタイプの創傷ドレッシング材、および皮膚代替物などの薬理学的戦略が提案されている。単純なドレッシング材の適用が十分でない場合、抗菌作用を創傷閉鎖促進と組み合わせる、代替アプローチがある。広範な創傷については、起源（同種異系、異種、および自家）、組成物（真皮、表皮、または両方の成分）、またはタイミング（持続性または一時的な代替物）によって分類することができる、様々な皮膚代替物が利用可能である。理想的な皮膚代替物は費用効果が高く、広く利用可能であり、適用が容易である一方で、皮膚の機能を果たす。提案される別のアプローチは、他の治療と組み合わせて、血管新生、浮腫および創傷サイズの減少に対する効果を有する局所陰圧療法である。全ての場合（自己皮膚代替物の使用を除く）において、病変部位に外部薬剤を導入する問題は、すでに不安定な微小環境においてさらなる炎症応答を誘導し得る。文献において、ＰＲＰ（多血小板血漿）は、整形外科的外傷において成功裏に使用される再生治療であることが報告されている（Ｓａｎｃｈｅｚ， Ａｎｉｔｕａ ｅｔ ａｌ． ２００７， Ａｒｏｒａ， Ｒａｍａｎａｙａｋｅ ｅｔ ａｌ． ２００９， Ｓａｎｃｈｅｚ， Ａｎｉｔｕａ ｅｔ ａｌ． ２００９）。血小板誘導体の使用は、止血プロセスにおいて血小板によって通常放出される濃縮成長因子を送達する方法を表す。（Ａｎｉｔｕａ， Ａｎｄｉａ ｅｔ ａｌ． ２００４）この血小板の濃度および適用は異なる臨床研究において報告されているように、創傷治癒を促進するより多量の生物活性因子を提供するが（Ｃｒｏｖｅｔｔｉ， Ｍａｒｔｉｎｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ． ２００４， Ｓａｌｄａｌａｍａｃｃｈｉａ， Ｌａｐｉｃｅ ｅｔ ａｌ． ２００４）、方法論的アプローチは、常に標準化され、再現可能であるとは限らない。潰瘍の治療におけるさらなる改善は、塩化カルシウムを添加するＰＲＰの活性化によって表され；この操作が三次元創傷に適用可能な「ゲル様」テクスチャーであるフィブリン塊の形成を可能にする（Ａｎｉｔｕａ， Ａｇｕｉｒｒｅ ｅｔ ａｌ． ２００８， Ｒａｉｎｙｓ， Ｃｅｐａｓ ｅｔ ａｌ． ２０１９）。細胞外リモデリングと共に、創傷治癒の障害は、新血管形成の欠如にも依存する；内皮前駆細胞（ＥＰＣ）が末梢血中の循環細胞として最初に発見された、骨髄ニッチ内の血管芽細胞に由来する単能性成体幹細胞である。これらの細胞は、ＣＤ３１、ＣＤ１４４またはＣＤ１４６などの異なる内皮表面マーカーと組み合わせて、血液学的起源を同定するためのＣＤ４５などの異なるマーカーの発現によって単離されている。

さらに、内皮電位を発現するＴリンパ球は、Ｔａｎｇとして記載されており（Ｍｉａｏ， Ｑｉｕ ｅｔ ａｌ． ２０１６， Ｍａｎｅｔｔｉ， Ｐｒａｔｅｓｉ ｅｔ ａｌ． ２０１７）、血管新生Ｔ細胞は一般に、ＣＤ３、ＣＤ３１およびＣＤ１８４の共発現によって同定される。インビトロ実験は、Ｔａｎｇ細胞が血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、インターロイキン（ＩＬ）－８、ＩＬ－１７およびマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）－９（Ｈｕｒ， Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ． ２００７）などの高レベルの血管新生促進因子の分泌を介して早期ＥＰＣを刺激することによって、血管新生および内皮修復を促進し得ることを示した。

ＥＰ３４０３６５９は、レゲナブの名称において、チキソトロピックゲルを含むチューブ中で全血を遠心分離することによって調製されたトロンビン血清を含有する創傷加熱剤組成物の調製方法を開示している。組織治癒剤組成物は、血小板、白血球、フィブリノーゲン、自己トロンビン血清を含有する。

ＥＰ３１１１９７４はポリエステル系チキソトロピックゲルを含有する分離チューブ中で全血を遠心分離する工程、濃縮血小板血漿を全血漿から分離する工程、および血小板濃縮物を細胞抽出物と混合する工程を含む、細胞組成物の調製方法を開示し、ここで、遠心分離は、血小板含有血漿、リンパ球、および単球と、赤血球を含有するペレットとの間に障壁を形成するのに十分な時間長さで約１５００ｇ～２０００ｇの力で行われる。このようにして得られた単離細胞組成物は創傷または組織治癒のために、および組織再生のために、特に皮膚、軟骨、筋肉、腱、脂肪組織、角膜、末梢神経、脊椎または骨再生のために使用される。

ＥＰ３３９５３８３およびＥＰ２０７３８６２は、創傷治癒剤組成物および全血の遠心分離に基づいてそれらを調製するための方法を開示している。一実施形態では全血がチキソトロピックゲルを備えたセパレーターチューブ中で遠心分離され、遠心分離工程は約１５００ｇ～最大１７００ｇの力で、約３分～最大約１５分、好ましくは１５００ｇで約８分間、行われる。

ＥＰ３４０３６５９ ＥＰ３１１１９７４ ＥＰ３３９５３８３ ＥＰ２０７３８６２

細胞成分に関して最適化され、それによって創傷治癒プロセスを改善し、容易に調製することができ、無菌状態での複雑な作業手順を必要とせずにすぐに使用できる、病変組織、特に皮膚組織の再生に適した組成物が必要とされている。

これらの目的は、損傷した身体組織の再生に特に効果的であることが証明された、血小板およびリンパ球に富む血漿（本明細書ではＡｎｇｉｏ^ＰＲＰとも呼ばれる）からなる、本発明による血液製剤によって達成される。血液製剤は、皮膚培養物についてインビトロで、および皮膚病変の動物モデルにおいてインビボで研究され、顕著な組織再生および創傷治癒特性を示した。

血液製剤をその細胞構成について分析し、それは、血小板に加えて、白血球ＣＤ４５^＋、ＣＤ３１^＋およびＣＤ３４^－ならびに赤血球を特異的かつ再現可能な量で含むことが見出された。

Ａｎｇｉｏ^ＰＲＰの特性を示す図である。（Ａ）Ａｎｇｉｏ^ＰＲＰ中に存在する血小板および細胞の百分率として表される生成物構成；（Ｂ）元の全血と比較したＡｎｇｉｏ^ＰＲＰの血小板豊富の解析（不対ｔ検定、＊＊ｐ＜０．０１）；（Ｃ）分離前後の白血球濃縮の比較；（Ｄ）Ａｎｇｉｏ^ＰＲＰ細胞亜集団のグラフ表示：全血白血球処方物と比較した顆粒球、単球およびリンパ球のパーセンテージ；（Ｅ）全Ａｎｇｉｏ^ＰＲＰおよび細胞区画；（Ｆ）ＣＤ４５＋／ＣＤ３１＋／ＣＤ３４－の８５．００％～９７．７３％のサイトメトリー解析；（Ｇ）リンパ球、（Ｈ）単球および（Ｉ）顆粒球の異なる細胞亜集団のさらなるサイトメトリー特徴付け。 Ａｎｇｉｏ^ＰＲＰの特性を示す図である。（Ａ）Ａｎｇｉｏ^ＰＲＰ中に存在する血小板および細胞の百分率として表される生成物構成；（Ｂ）元の全血と比較したＡｎｇｉｏ^ＰＲＰの血小板豊富の解析（不対ｔ検定、＊＊ｐ＜０．０１）；（Ｃ）分離前後の白血球濃縮の比較；（Ｄ）Ａｎｇｉｏ^ＰＲＰ細胞亜集団のグラフ表示：全血白血球処方物と比較した顆粒球、単球およびリンパ球のパーセンテージ；（Ｅ）全Ａｎｇｉｏ^ＰＲＰおよび細胞区画；（Ｆ）ＣＤ４５＋／ＣＤ３１＋／ＣＤ３４－の８５．００％～９７．７３％のサイトメトリー解析；（Ｇ）リンパ球、（Ｈ）単球および（Ｉ）顆粒球の異なる細胞亜集団のさらなるサイトメトリー特徴付け。 器官型培養物のインビトロおよび動物モデルのインビボでのＡｎｇｉｏ^ＰＲＰバリデーションを示す図である。（Ａ）Ａｎｇｉｏ^ＰＲＰ、単一成分（Ａｎｇｉｏ^{ｃｅｌｌｓ}およびＰＲＰ）または陰性対照としてのＰＢＳで処置した皮膚組織のインビトロモデルにおける創傷閉鎖領域の割合。（Ｂ）Ａｎｇｉｏ^ＰＲＰ、ヒアロマトリクスまたはＰＢＳで処置したマウス皮膚損傷モデルにおけるインビボでの創傷閉鎖の評価。創傷閉鎖率は様々な時点：４、７、１０、１４および２１日間の処置（＊＊＊＊ ｐ＜０．０００１分散二元配置解析（ＡＮＯＶＡ）ボンフェローニ修正）で測定された面積と最初の病巣の面積との間の比率として定量化した。（Ｃ）Ａｎｇｉｏ^ＰＲＰおよびハイアロマトリックスで処置した皮膚の機械的特性を、ＰＢＳおよび健康な皮膚と比較して決定するために、背側皮膚解析から得られた応力－歪曲線のグラフ表示（不対ｔ検定、＊ｐ＜０．０５）。健康な皮膚と比較した、Ａｎｇｉｏ^ＰＲＰおよびハイアロマトリックスまたはＰＢＳで処置した組織のアルシアンブルー組織学的染色に基づく、高密度（Ｄ）および低密度（Ｅ）エラスチン存在の定量化（不対ｔ検定、＊ｐ＜０．０５； ＊＊ ｐ＜０．０１； ＊＊＊＊ ｐ＜０．０００１）。（Ｆ）免疫蛍光染色に基づくコラーゲンＶＩ面積定量（不対ｔ検定、＊ｐ＜０．０５）。Ａｎｇｉｏ^ＰＲＰ、ハイアロマトリックスまたはＰＢＳで処理した後の皮膚組織における（Ｇ）血管新生ＣＤ３１および（Ｈ）炎症性ＣＤ２０６陽性細胞の定量（不対ｔ検定、＊ｐ＜０．０５、＊＊ ｐ＜０．０１、＊＊＊ ｐ＜０．００１）。 器官型培養物のインビトロおよび動物モデルのインビボでのＡｎｇｉｏ^ＰＲＰバリデーションを示す図である。（Ａ）Ａｎｇｉｏ^ＰＲＰ、単一成分（Ａｎｇｉｏ^{ｃｅｌｌｓ}およびＰＲＰ）または陰性対照としてのＰＢＳで処置した皮膚組織のインビトロモデルにおける創傷閉鎖領域の割合。（Ｂ）Ａｎｇｉｏ^ＰＲＰ、ヒアロマトリクスまたはＰＢＳで処置したマウス皮膚損傷モデルにおけるインビボでの創傷閉鎖の評価。創傷閉鎖率は様々な時点：４、７、１０、１４および２１日間の処置（＊＊＊＊ ｐ＜０．０００１分散二元配置解析（ＡＮＯＶＡ）ボンフェローニ修正）で測定された面積と最初の病巣の面積との間の比率として定量化した。（Ｃ）Ａｎｇｉｏ^ＰＲＰおよびハイアロマトリックスで処置した皮膚の機械的特性を、ＰＢＳおよび健康な皮膚と比較して決定するために、背側皮膚解析から得られた応力－歪曲線のグラフ表示（不対ｔ検定、＊ｐ＜０．０５）。健康な皮膚と比較した、Ａｎｇｉｏ^ＰＲＰおよびハイアロマトリックスまたはＰＢＳで処置した組織のアルシアンブルー組織学的染色に基づく、（Ｄ）高密度エラスチン領域の定量化および（Ｅ）低密度エラスチン領域の定量化（不対ｔ検定、＊ｐ＜０．０５； ＊＊ ｐ＜０．０１； ＊＊＊＊ ｐ＜０．０００１）。（Ｆ）免疫蛍光染色に基づくコラーゲンＶＩ領域定量（不対ｔ検定、＊ｐ＜０．０５）。Ａｎｇｉｏ^ＰＲＰ、ハイアロマトリックスまたはＰＢＳで処理した後の皮膚組織における（Ｇ）血管新生ＣＤ３１および（Ｈ）炎症性ＣＤ２０６陽性細胞の定量（不対ｔ検定、＊ｐ＜０．０５、＊＊ ｐ＜０．０１、＊＊＊ ｐ＜０．００１）。 血液細胞製剤を分離するために使用される遠心分離チューブを示す図である。

したがって、第１の実施形態では、本発明が身体組織の再生、創傷治癒、または血管新生を刺激する方法に使用するための、血小板およびリンパ球に富む血漿からなる単離された血液製剤を対象とし、前記製剤は：
１１０ｘ１０^６／ｍｌ～３３０ｘ１０^６／ｍｌ、好ましくは１５０ｘ１０^６／ｍｌ～３３０ｘ１０^６／ｍｌの濃度の血小板；
０．１×１０^６／ｍｌ～２．０×１０^６／ｍｌ、好ましくは０．１×１０^６／ｍｌ～０．７×１０^６／ｍｌの濃度の白血球ＣＤ４５^＋、ＣＤ３１^＋およびＣＤ３４^－；
０～０．０３ｘ１０^９／ｍｌ、好ましくは０．０１ｘ１０^９／ｍｌ未満の濃度の赤血球；
を含む。

白血球画分を、その細胞成分についてさらに分析し、それは、白血球ＣＤ４５^＋、ＣＤ３１^＋およびＣＤ３４^－の総数に対する以下の％量で、リンパ球、単球および顆粒球を含むことが見出された：
４６．２０％～８０．６０％、好ましくは６１．６０％～７３．７０％のリンパ球；
７．７０％～４０．００％、好ましくは１５．９０％～２３．１０％の単球；
３．３０％～３２．９０％、好ましくは５．９０％～１６．７０％の顆粒球。

本発明の好ましい、独立した実施形態において：
リンパ球は、Ｔ細胞、血管新生Ｔリンパ球（Ｔａｎｇ）、Ｂ細胞およびＮＫ細胞を含み；
単球はＣＤ１４^＋、ＣＤ１６^＋またはＣＤ１６^―であり；
顆粒球はＣＤ１５^＋／１６^＋である。

好ましい実施形態では、製剤がフローサイトメトリー分析によって決定されるように、２５％～７５％パーセンタイルで表される以下の白血球集団を含む。

別の実施形態によれば、本発明は、リンパ－血小板に富む血漿血液製剤を調製するための方法であって、以下の工程を含む方法を提供する：
・２～７ｍｌ、好ましくは２～４ｍｌの全血を、２９３～６６０ｇに対応する１２００～１８００ｒｐｍ（ラウンド／分）、好ましくは４５８ｇに対応する１５００ｒｐｍで、室温で５～１０分間、好ましくは５分間、遠心分離チューブ中で遠心分離することにより、上相および下相の分離が得られ、上相は血小板およびリンパ球に富む血漿を含み、下相は赤血球を含み；
・血小板およびリンパ球に富む血漿を含む上相を採取する。

好ましくは、遠心分離チューブ（図３）が５ｍｌの内容積を有し、チューブを上部容積および下部容積に分離する隔壁または膜（２）を備え、それによって、血小板およびリンパ球に富む血漿相が上部容積に収集される一方、赤血球が下部容積に蓄積する収集される。下部容積は、チューブの下端に配置されたリングナット（４）によって、下部チューブチャンバを上下に移動するピストン（３）により操作できる。これにより、遠心分離後の血小板およびリンパ球に富む血漿相を含む約３ｍｌの上部チューブ容積を画定でき、赤血球を含む１～２ｍｌで変動し得る下部容積は、リングナット－ピストンシステムによりによって調節することができる。

さらにより好ましくは、隔壁または膜が１５～２００ミクロンの多孔度を有し、１．５～２．５ｍｍの直径の中心孔を備えた疎水性ディスクバリアまたは膜からなる。ディスクバリアまたは膜に使用される適切な材料としてはポリエチレンが挙げられるが、これらに限定されない。

さらなる態様では、本発明は、上記の特徴を有する血小板およびリンパ球に富む血漿からなる、本明細書に開示される方法によって得ることができる血液製剤を対象とする。この製剤は血管新生の可能性を示し、皮膚病変に対する血管新生促進効果を促進し、インビボでより効率的な創傷治癒を誘導する。

したがって、本発明による血液製剤は、病変した身体組織の再生および創傷治癒の促進のために好都合に使用される。特定の実施形態では、本明細書で定義される血液製剤が化粧用途および治療用途に使用され：
－化粧品用途としては抗老化、瘢痕修復、しわ、座瘡、脱毛症および熱傷治療が挙げられ、
－治療用途としては創傷治癒、骨および軟骨損傷などの整形外科または腫瘍学的起源の病変の治療、手術後の病変または創傷；皮膚潰瘍、褥瘡、褥瘡、静脈性下肢潰瘍、動脈性潰瘍、糖尿病性足潰瘍、角膜および角膜潰瘍の瘢痕などの角膜病変；歯周組織損傷または骨膜病変の治療が挙げられる。

本発明の血液製剤は、同種または自己の治療方法において使用することができる。好ましい実施形態では血液製剤が自己適用のために使用され、すなわち、それはリンパ－血小板に富む血漿が単離される全血の同じドナーに投与される。

本明細書に開示される方法によって得られる血液製剤はすぐに使用可能であり、すなわち、それは、その取得の直後に、それを必要とする対象に適用または投与され得る。あるいは凍結し、必要に応じて解凍して使用することができ、または例えば、適切なビヒクル、担体、賦形剤、保存剤、緩衝剤、安定剤の添加によって実施することができる。例えば、血液製剤は、その収集に使用されるシリンジ内に塩化カルシウム溶液（２．５～１０％ｗ／ｖ）を直接添加することによって、ゲル形態で使用することができる。

したがって、さらなる態様において、本発明は適切な担体または賦形剤と一緒に、上記で定義された血液製剤を含有する医薬組成物または化粧品組成物を提供する。

本発明は以下の図面および実施例によってさらに説明されるが、これらに限定されない。

－リンパ－血小板に富む血漿（Ａｎｇｉｏ^ＰＲＰ）の調製
本発明に係るリンパ－血小板に富む血漿の分取に用いる遠心チューブ（以下、「Ａｎｇｉｏ^ＰＲＰ装置」）は、基本的に（図３）から構成される：
１．無菌の外部目盛り付き５ｍｌポリプロピレンチューブで作られた本体；
２．ゴム栓（ＢＤ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ Ｈａｅｍｏｇａｒｄ状）（１）；
３．ＨＤＰＥ、多孔性（孔径＜２００ミクロン）、疎水性、直径１３ｍｍ、厚さ１．５ｍｍの円板障壁、中心の直径２ｍｍの孔からなる２つの部分（上部容積５６％、下部容積４４％）でチューブを分離する隔壁（２）；
４．内側ピストン（３）を備えたリングナット（４）からなる底部。

前もってクエン酸ナトリウムチューブに採取された末梢血のサンプルは、チューブ内のゴム製の蓋を通して注入され、内部バリアは血液サンプルを上部容積内に保持する。

その後、装置は５分間１５００ｒｐｍ（４５８－４６０ｇ）で遠心される。ブレーキ減速なし。
内膜は、血小板（ＰＲＰ）および目的の細胞集団（上部）で富化された血漿の、老廃物（赤血球、下部）からの分離を促進する。
リングナットは、上部チャンバ（膜の上方）内のＰＲＰ相全体を調整することを可能にする。
上部血漿および細胞は、シリンジで引き抜かれ、液体形態で使用する準備ができている。

＜Ａｎｇｉｏ^ＰＲＰ生成物回収＞
３つの症例が起こりうる：

（１）血漿相は完全に膜の上にある。
２．５ｍｌのシリンジに５０ｍｍと２１Ｇの針を使用する。針をラバーストッパに刺し、Ａｎｇｉｏ^ＰＲＰ生成物を抜き取る。膜から３～５ｍｍの位置に針を置き、生成物を吸い出し、血漿相に細胞と血小板を再懸濁する。それぞれのＮｏｖｙＳｅｐ装置から平均容量１ｍｌのＡｎｇｉｏ^ＰＲＰを回収する。
Ａｎｇｉｏ^ＰＲＰ生成物の量は、性別、年齢、ヘマトクリット値、水分補給量などのパラメータによって異なる

（２）血漿相は、部分的に膜の上下に位置する。
ＮｏｖｙＳｅｐスクリュー（リングナット）を反時計回りに回して、血漿相が膜の上に完全にくるまで膜下の容積を減らす。そして、上記（１）のようにＡｎｇｉｏ^ＰＲＰ生成物を回収する。

（３）血漿相は、膜の上に位置する赤血球によって目に見えて汚染される。
生成物を廃棄する。

生／死染色（Ｌ３２２４、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国カリフォルニア州）を、１、２、３、４および７日間後にＡｎｇｉｏ^ＰＲＰに対してインビトロで実施し、細胞生存を評価した。生存率は数日間減少するが、インビトロで７日後、８２．２６±８．５０％の細胞が生存している。内生性の評価のために、８ｘ１０^４ ＨＵＶＥＣ（ＡＴＣＣ－ＬＧＣ，米国バージニア州）を３Ｄ Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に配置し、Ａｎｇｉｏ^ＰＲＰまたはＰＲＰまたはＡｎｇｉｏ^{ｃｅｌｌｓ}を１５０μｌ加え、２４時間後の細胞の細分化をＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ）により定量化した。Ａｎｇｉｏ^ＰＲＰは他の条件よりも長い細分化を誘導した（対照条件と比較して３２７．７５±９．７２×１０^３対２９３．０５±８．３５×１０^３μｍ、ｔ検定＊ｐ＜０．０５）。

－ＦＡＣＳ分析
末梢血（ＰＢ）はミラノ（イタリア、ミラノ）のポリクリニコ病院の研究におけるヒト被験者の使用に関する委員会のガイドラインに従って、インフォームドコンセント後の健常ボランティアから、ミラノのポリクリニコ病院の輸血医学・血液学部門の血液バンクから入手した。クエン酸ナトリウムチューブに採取した２．５ｍｌの末梢血をＮｏｖｙＳｅｐ装置に充填し、相分離を誘導するために室温で１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。血小板に富む血漿相および細胞を、赤血球と血漿との間の界面で回収した。分離前の血液およびＡｎｇｉｏ^ＰＲＰを、血液コールター計数器（ＤｘＨ ５００、ベックマンコールター）によって分析した。分離前に採取した血液および細胞相を、以下に示すモノクローナル抗体で直接標識した。細胞を、Ｓｙｔｏ^ＴＭ １６、抗ＣＤ４５ Ｖ５００、抗ＣＤ３ Ｖ４５０、抗ＣＤ５６ ＰＥ－ＣＹ７、抗ＣＤ１４ ＡＰＣ－Ｈ７、抗ＣＤ１６ ＰＥ、抗ＣＤ１９ ＡＰＣ－Ｒ７００または抗ＣＤ３１ ＰＥ、抗ＣＤ１８４ ＡＰＣ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ－Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，米国カリフォルニア州サンディエゴ）と共にインキュベートした。対照はアイソタイプマッチマウス免疫グロブリンであった。４℃で２０分間の各インキュベーション後、１％熱不活化ＦＣＳおよび０．１％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ １Ｘ中で細胞を洗浄した。サイトメトリー分析は、ＦＡＣＳｕｉｔｅ^ＴＭソフトウエア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ－Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いてＬＹＲＩＣフローサイトメーターで行った。各解析は、各ゲートについて少なくとも１～２×１０の^４事象を含んだ。分析から細胞破片を除去するために光散乱ゲートを設定した。陽性細胞のパーセンテージは、特定のフルオロフォアにコンジュゲートされたアイソタイプ対照に反応するパーセンテージについて補正後に評価した。Ｓｙｔｏ^ＴＭ１６の陽性ゲート上で、様々な細胞亜集団の割合を計算した。

－Ａｎｇｉｏ^ＰＲＰのインビトロ評価
末梢血の分離をＮｏｖｙＳｅｐ装置を用いて行い、Ａｎｇｉｏ^ＰＲＰを分析して血小板組成物の特徴を調べた。図１Ａに報告されるように、Ａｎｇｉｏ^ＰＲＰは主に血小板（８５．１９±７．０３％）から構成され、白血球（ＷＢＣ）の存在は０．８５±０．５３％である。血小板濃度は全血中に存在する元の数に比べＡｎｇｉｏ^ＰＲＰで増加する（１０８．５±６．６２ｘ１０^３血小板／μｌに代えて１４６．８±１１．３５ｘ１０^３、図１Ｂ）。特に、細胞成分をコールターカウンターによってさらに特徴付け、分離手順の前に元の末梢血組成物と比較した。Ａｎｇｉｏ^ＰＲＰでは、全血と比較して、リンパ球成分が富化され（Ａｎｇｉｏ^ＰＲＰについて６７．１５±９．２５％および全血について２９．９８±６．５２％）、一方、顆粒球集団は著しく減少し（Ａｎｇｉｏ^ＰＲＰについて１２．３２±７．６７％および全血について６２．３６±７．３８％）、単球は部分的に増加した（Ａｎｇｉｏ^ＰＲＰについて２０．１３±６．３０％および全血について７．６９±１．５６％、図１Ｄ）。

－エクスビボ前臨床実験：器官型皮膚培養
ヒト真皮および表皮多層モデル（ＭａｔＴｅｋ'ｓ ＥｐｉＤｅｒｍＦＴ Ｆｕｌｌ Ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ ＥＦＴ－４００）をインビトロモデルとして用い、ＮｏｖｙＳｅｐ装置の組織再生能力を評価した。組織モデル（角質層および表皮）上の皮膚生検を、ＥｐｉＤｅｒｍ－ＦＴの製造業者のプロトコールに記載されるように、５ｍｍパンチによって得た。次の４種類の培養条件下で試験した：１）Ａｎｇｉｏ^ＰＲＰを用いた器官型皮膚培養、２）Ａｎｇｉｏ^{ｃｅｌｌｓ}、３）ＰＲＰ、４）ＰＢＳ １Ｘ（陰性対照として）。培養２４時間後、２日後、４日後、５日後、６日後および７日後のヒト皮膚組織を分析し、創傷閉鎖および上皮再生を評価するために、免疫組織化学的および免疫蛍光分析を行った。ヘマトキシリンおよびエオシン染色を、創傷治癒をより良く特徴付けるために行い、画像定量化およびプロセスを、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ）を用いて行った。
図２Ａに報告されているように、Ａｎｇｉｏ^ＰＲＰで処置された病巣は６日後に完全な治癒を示したが、ＰＲＰでの処置は同じ結果に達するのにもう１日かかった。Ａｎｇｉｏ^{ｃｅｌｌｓ}とＰＢＳの使用は１週間で完全治癒に成功しなかった。

－インビボ創傷治癒実験
５ヶ月齢のＳｃｉｄマウス（ｎ＝１０）は、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｉｎｃ．（イタリア国カルコ）から入手した；この研究における動物の使用が国立保健省によって認可された（プロトコル番号５１／２０１８－ＰＲ）。動物をアベルチンで麻酔し、５ｍｍの全層切除を２回行い、これは、マウスの正中線の両側に１つずつ、海綿体を背側に作製した。シリコーンスプリントを、接着剤の助けを借りて創傷の周りに配置し、次いで、スプリントを、中断された縫合糸で固定した。各マウスはそれ自体の対照として作用し、一方の創傷は処置を受け、他方のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ １Ｘ）を受けた。汚染を防ぐために透明な閉塞包帯を適用した。創傷を、２～３日ごとに写真を撮ることによってチェックし、面積を、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ）を使用してミリメートル基準に対して定量化し、創傷閉鎖に対応する、損傷の０、４、７、１０、１５、および２１日後に測定された創傷面積のパーセンテージとして表した；マウスを、完全深部麻酔下で頸椎脱臼によって犠牲にし、背部皮膚病変を除去した；生検を、組織学的または分子生物学的分析のためにそれぞれ２つの群に分けた。１群をイソペンタンに入れ、プロテオミクス分析のために－８０℃で凍結した。他の群は４％パラホルムアルデヒドのＰＢＳ溶液中、４℃で一晩インキュベートし、ＰＢＳ １Ｘ溶液中、３０％スクロースにさらに２４時間移した後、４℃でインキュベートし、Ｏ．Ｃ．Ｔ化合物中に包埋し、－８０℃で凍結した。厚さ１２μｍの連続切片を切断し、免疫蛍光法および組織学的分析によって検査した。

Ａｎｇｉｏ^ＰＲＰ処置（ｎ＝５）、ヒアロマトリクス処置（ｎ＝５）およびＰＢＳ処置（ｎ＝１０）についてそれぞれ皮膚創閉鎖時期を比較した。さらに、異なる条件で全閉鎖に達するのに必要な時間を評価した。２１日目のＡｎｇｉｏ^ＰＲＰによる処置は損傷の完全な閉鎖を誘発し、代わりに、ヒアロマトリクスで処置された皮膚は、損傷後２１日目に７５～８０％の創傷閉鎖を示した。さらに、ＰＢＳで処理した試料は、同じ時点で創傷閉鎖の９０％を示した。Ａｎｇｉｏ^ＰＲＰ処置では６．５／７日後に６０％の閉創の達成が観察されたのに対し、ヒアロマトリクス処置では１５日であった（ｐ＜０．０００１、ボンフェローニ補正による二元配置分散解析（ＡＮＯＶＡ））。ＰＢＳによる対照処理は、ほぼ１０日で閉鎖の６０％に達する。２１日後において優位な差異が、Ａｎｇｉｏ^ＰＲＰとヒアロマトリクスの間（ｐ＜０．０００１、ボンフェローニ補正による二元分散分析（ＡＮＯＶＡ））およびＡｎｇｉｏ^ＰＲＰとＰＢＳの間（ｐ＜０．０００１、ボンフェローニ補正による二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ））でも認められた（図２Ｂ）。

－表皮分化
１２μｍ皮膚組織切片の連続切片を切断し、ヘマエトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）、アルシアンブルーおよびピクロシリウスレッド染色を用いて、形態学的評価のための製造業者の指示に従って染色した。画像をＬＭＤ６０００Ｂ（ライカ、ドイツ）で捕捉した。

免疫蛍光分析のために、組織切片を、マウスモノクローナル抗体抗－シトケラチン１０（１：１００、アブカム）、ウサギ抗－インボルクリン（１：１００、アブカム）、マウスモノクローナル抗体抗－シトケラチン１４（１：１００、アブカム）、ウサギ抗－ロリクリン（１：１００、アブカム）、ＣＤ２０６（１：４００、アブカム）と共にインキュベートし、細胞核を、ＤＡＰＩを用いて室温で５分間染色した。スライドを、蛍光顕微鏡ＬＥＩＣＡ ＤＭＩ８（ライカ、ドイツ）を用いて分析した。

２１日間のヘマトキシリン・エオジン染色の結果、Ａｎｇｉｏ^ＰＲＰで処理した皮膚は、ヒアロマトリクス（市販品）で処理した皮膚と比較して、線維芽細胞およびケラチノサイトの増殖および創傷部位への移動によって誘発される完全な創傷治癒を示した。また、種々の表皮層に対する特異的マーカーを用いて表皮分化を評価した。２１日間で、Ａｎｇｉｏ^ＰＲＰで処置された皮膚は、特異的マーカサイトケラチン５についての陽性かつ均一なシグナルによって示されるように、基底層の完全かつ均一な再生を示した。一方、ヒアロマトリクスおよびＰＢＳで処理した試料は、不完全で不連続な再生を示した。顆粒層に関して、Ａｎｇｉｏ^ＰＲＰでの処理はサイトケラチン１０染色によって実証されるように、完全な再生を誘導し、健康な皮膚試料と同等であった。一方、ヒアロマトリクスおよびＰＢＳで処置した皮膚病変は顆粒層の後期再生を示し、サイトケラチン１０の不均一な発現を示した。角質層に関して、最も外側の層を可視化するためにロリクリンについて免疫蛍光染色を行った；我々はＡｎｇｉｏ^ＰＲＰで処理した試料においてのみ完全な再上皮化を観察したが、一方、ヒアロマトリクスおよびＰＢＳで処理した皮膚においては２１日目に不完全な上皮を観察した。

－皮膚弾性特性
犠牲にした後、機械的試験のための皮膚を、クランプされた端部を覆うゴム片を有する金属スクリュークランプに入れた。クランプをＢｏｓｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｆｏｒｃｅ ３１００機器に入れた。０．１５Ｎの初期トラクションを適用する。ＭＰａで測定したトラクションは、破壊点まで毎秒０．２％増加した。力（Ｎ）および変位（ｍｍ）をｘｙプロッターで測定し、これらの点を続いて応力（σ＝断面積当たりの力）および歪み（ε＝長さ／初期長さの変化）として記録し、Ｅｘｃｅｌ（Ａｓｈｌｅｙ Ｗ．Ｓｅｉｆｅｒｔ ｅｔ．Ａｌ；２０１２）で再プロットした。

皮膚の弱さを評価するために、Ａｎｇｉｏ^ＰＲＰ、ＰＢＳ、ヒアロマトリクス（陰性対照として）および健康な皮膚（陽性対照として）で処置した皮膚の機械的特性を比較する。背側皮膚から応力‐歪曲線を導き、平均引張強度を決定した。Ａｎｇｉｏ^ＰＲＰで処置した皮膚は、ヒアロマトリクスまたはＰＢＳで処置した皮膚（３ＭＰａ±０．７、０．３ＭＰａ±０．３および１．８ＭＰａ±０．７０）と比較して、牽引に対してより高い耐性を示した（図２Ｃ）。さらに、ＬＰＥＰで処置した皮膚は、健康な皮膚と同等の傾向を示した（３ＭＰａ±０．７および３．１±０．７）。Ａｎｇｉｏ^ＰＲＰで処理された皮膚において観察されるより高い弾性率は、単位面積当たりの線維性分子の数の増加によるものであり得る。エラスチンは皮膚弾性線維の主成分であり、皮膚再生に有益であるため、ＶＩ型コラーゲンの免疫蛍光染色を行った。Ａｎｇｉｏ^ＰＲＰで処置された皮膚は図２Ｆに定量化され報告されているように、ヒアルロマトリクスで処置された皮膚と比較して、コラーゲンＶＩ発現に関して有意差を示した（不対ｔ検定、＊ｐ＜０．０５）。

表皮の特徴付けに加えて、真皮組成の分析を行った。アルシアンブルー染色を用いて、真皮領域におけるコラーゲン線維の存在を確認した。この染色の強さのおかげで、皮膚試料中の高密度弾性線維と低密度弾性線維とを区別し、様々な処理においてこれらの２つの密度タイプによって占められる表面を定量することができた；図２Ｄおよび２Ｅに報告されるように、Ａｎｇｉｏ^ＰＲＰで処理された試料は、ヒアロマトリクスおよびＰＢＳ処理と比べ、健康な皮膚とより類似した皮膚組成を示し、高密度エラスチンが高く、低密度エラスチンが少ない（不対ｔ検定、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。

－プロテオミクスおよび生化学分析
皮膚サンプルをプロテオミクス分析用に抽出し、４℃で１７，０００ｘｇで１０分間遠心分離し、４℃で１ｈで２００，０００ｘｇで超遠心分離を施した。０．１Ｍ重炭酸アンモニウム（ｐＨ７．９）に再懸濁したペレットを、以前に報告された手順（Ｂａｒｉ，Ｐｅｒｔｅｇｈｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．２０１８）に従って、各試料からの５０±０．５μｇのタンパク質を用いてトリプシン処理した。１マイクロリットルのトリプシン消化混合物を、Ｑ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，米国）に連結したｃＨｉＰＬＣ－ｎａｎｏｆｌｅｘシステム（Ｅｋｓｉｇｅｎｔ，ＡＢ ＳＣＩＥＸ，米国）を備えたナノクロマトグラフィーにより、５～４５％の溶離剤Ｂ（溶離剤Ａ、水中０．１％ギ酸；溶離剤Ｂ、アセトニトリル中０．１％ギ酸）の６５分勾配を介して、３００ｎＬ／分の流速で分析した。完全質量スペクトルは、７００００ＦＷＨＭ分解能で４００～１６００ｍ／ｚの範囲にわたるポジティブイオンモードで記録され、続いて１０のＭＳ／ＭＳスペクトルで１７，５００ＦＷＨＭの分解能では、最も豊富なイオンに依存する様式でデータを生成した。生成されたデータはすべて、ＳＥＱＵＥＳＴ検索エンジンおよびヒトタンパク質データベース（７０７２６エントリー、ＵＮＩＰＲＯＴウェブサイト、ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｇｏｖから２０１７年１月にダウンロード）に基づいて、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ ２．１プラットフォーム（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて検索した。得られたタンパク質リストをアラインメントし、正規化し（Ｓｅｒｅｎｉ，Ｃａｓｔｉｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．２０１８）、次いで線形判別解析手段（ＬＤＡ）により処理した（Ｈｉｌａｒｉｏ ａｎｄ Ｋａｌｏｕｓｉｓ ２００８）。各被験体を特定の群に割り当てるために、抽出されたマーカータンパク質に従ってα値パラメータを計算した（Ｂｒａｍｂｉｌｌａ，Ｌａｖａｔｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．２０１２）。

異なる創傷処置のタンパク質プロファイルを理解するために、本発明者らはｎＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を実施した；単一のＰＢＳ処置を、相対群（ＮｏｖｙＳｅｐまたはヒアロマトリクス）の内部対照として使用し、一方、健康な皮膚を分析して、同じ動物の皮膚の正常対照プロファイル（内部対照）を同定するために分析した。同定されたタンパク質の総数は１５１４であり、高い技術的および群再現性を有した。ヒアロマトリクス創傷組織からのプロテオミクスプロファイルは、同じ動物からの対照皮膚試料のプロファイルと比較して著しく異なる。試料の主成分解析は、対照試料がＡｎｇｉｏ^ＰＲＰ処置創傷から収集された試料から類似のクラスターを形成することを示す。実際、ヒアロマトリクスで処理された試料はそれらの内部対照と一致を示し、一方、単一のＡｎｇｉｏ^ＰＲＰ試料はそれらの単一の相対的内部対照と相関し、このことは、処理の全身作用を示唆する。健康な皮膚試料はヒアルロマトリクス群よりもＡｎｇｉｏ^ＰＲＰとクラスター化し、より相関する。ボンフェローニ補正後、１７９個のタンパク質が少なくとも２群間で差次的に発現されたが、アップレギュレートおよびダウンレギュレートされたタンパク質は同じ比較または同じ評価条件において類似していた。単一処理およびその特異的対照を分析すると、半数の差次的タンパク質が、ヒアルロマトリクス処理よりもＡｎｇｉｏ^ＰＲＰ処理において変化している。処置された条件が健康な皮膚と比較される場合、同じ挙動が報告される。このことは、Ａｎｇｉｏ^ＰＲＰがヒアロマトリクスよりも健康な皮膚に近い傾向があることを示唆している。次いで、プロテオーム回復指数（ＰＲｉ）（Ｒｏｆｆｉａ，Ｄｅ Ｐａｌｍａ ｅｔ ａｌ．２０１８，Ｓｅｒｅｎｉ，Ｃａｓｔｉｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．２０１８）を適用して、アルゴリズムでホメオスタシス回復に関与するタンパク質を同定するために、健常および疾患プロファイルを生成および比較し、３つの異なる条件を比較した。創傷組織に存在しない、Ａｎｇｉｏ^ＰＲＰ処理後の６種のタンパク質、および未処理の病巣に存在し、Ａｎｇｉｏ^ＰＲＰ試料には存在しない１２種のタンパク質を同定した（ＰＢＳ試料を陰性対照として使用した）。９７個のタンパク質の濃度はＡｎｇｉｏ^ＰＲＰ処理後に回収されるが（損傷組織において５７個がアップレギュレートされ、４０個がダウンレギュレートされる）、一方、２３個のみが、ヒアロマトリクス処理後に検出された（Ａｎｇｉｏ^ＰＲＰ群と共通が１４個）。正規化されたデータのクラスター化は、同じマクロ群におけるヒアロマトリクスおよび相対対照、ならびに健康な皮膚およびＡｎｇｉｏ^ＰＲＰの単一試料を、それらの相対陰性対照と相関させて、結果を確認した。差次的に発現されたタンパク質を、Ｃｙｔｏｓｃａｐｅプラットフォームを用いて分析し、代謝を評価した。ネットワーク分析は、創傷誘導および２つの相対的処置の両方について、異なる代謝クラスターの変動を強調した。特に、セルピン、防御反応に関与するタンパク質、細胞骨格構成、補体および凝固カスケード、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）およびリボソームに対するクラスターは、ヒアロマトリクス処理およびその対照条件において過剰発現され、一方、Ａｎｇｉｏ^ＰＲＰおよび相対対照においては健常試料と同様に正規化される。逆に、ケラチンと脂質代謝に関与するタンパク質のクラスターは、ヒアロマトリクスよりもＡｎｇｉｏ^ＰＲＰ条件でより多く発現する。これら８つの標的群の中で、我々は、２つの処置後に異なる方法で発現され、健康な組織と比較される１７の創傷関連タンパク質：カベオリン－１、ＥＧＦＲ、フィブロネクチン、デコリン、プレクチン、セルピンＢ２、ジソイドドメイン受容体－２、プロトロンビン、ヘムオキシゲナーゼ１、フィブリノーゲンα－、β－、およびγ－鎖、テナシン、プラスチン－２、α－トロポミオシン、サイトケラチン－６ＡおよびアネキシンＡ１に注目した。これらのタンパク質の発現は、ヒアロマトリクスおよびＡｎｇｉｏ^ＰＲＰ処理に対して逆の傾向を示す：例えば、カベオリン１およびデコリンはＡｎｇｉｏ^ＰＲＰ処理後にアップレギュレートされるが、ヒアロマトリクス試料においてダウンレギュレートされる。逆に、フィブリノーゲン、セルピンＢ２、およびプロトロンビンなどの凝固に関与する因子は、Ａｎｇｉｏ^ＰＲＰ処置後よりヒアロマトリクス処置後の方がより発現される。

－ネットワークおよび統計分析
差次的およびＬＤＡ法によって選択されたタンパク質の一覧から出発して、対応するヒトタンパク質－タンパク質相互作用（ＰＰＩ）ネットワークを抽出し、Ｃｙｔｏｓｃａｐｅプラグイン、ＳＴＲＩＮＧ ８データベース（Ｐａｗｌｏｗｓｋｉ、Ｍｕｓｚｅｗｓｋａら、２０１０年）の手段によって、既知の相互作用を、いくつかのデータベース、例えば、Ｐｒｏｌｉｎｋ、ＤＩＰ、ＫＥＧＧおよびＢＩＮＤから検索した。さらに、ＰＰＩをＣｙｔｏｓｃａｐｅ ３．５（Ｓｈａｎｎｏｎ，Ｍａｒｋｉｅｌ ｅｔ ａｌ．２００３）を用いて検査し、＞０．１５スコアを有する実験的に検証された相互作用のみが保持された。最後に、Ｂｉｎｇｏ ２．４４（Ｍａｅｒｅ，Ｈｅｙｍａｎｓ ｅｔ ａｌ．２００５）を使用して、機能的に組織化されたＧＯ用語に基づくモジュールを強調した。

ペプチド配列および関連タンパク質の同定のための基準は、酵素としてのトリプシン；ペプチドあたり３つの失われた切断が許容される；前駆体イオンについて１０ｐｐｍおよびフラグメントイオンについて±０．６Ｄａの質量許容差が適用された。Ｐｅｒｃｏｌａｔｏｒノードはｑ値に基づく０．０１（厳密）のペプチドスペクトルマッチ（ＰＳＭ）レベルでの最終的な偽発見率（ＦＤＲ）を与えるために、標的－デコイ戦略と共に使用され、０．０５の最大ΔＣＮを考慮し（Ｋａｌｌ，Ｃａｎｔｅｒｂｕｒｙ ｅｔ ａｌ．２００７）、６アミノ酸の最小ペプチド長、およびランク１が考慮され、タンパク質グループ化および厳密な節約原理が適用された。

カテゴリー変数の差は、χ二乗検定を用いて評価した。Ｋｒｕｓｋａｌ Ｗａｌｌｉｓ検定を定量的変数の比較に適用した。Ｒ（３．５．２）統計解析ソフトウェアを用いて解析を行い、ｐ値＜０．０５を統計的に有意であるとみなした。

ＳｐＣはｔ検定によっても評価され（Ｚｈａｎｇ， ＶｅｒＢｅｒｋｍｏｅｓ ｅｔ ａｌ． ２００６）、ＬＤＡおよびＭＡＰｒｏＭＡの両方によって選択されたタンパク質は階層的クラスタリング（Ｚｈａｏ ａｎｄ Ｋａｒｙｐｉｓ ２００５）によって、Ｗａｒｄの方法およびユークリッド距離メトリックを適用して評価された。ＬＤＡを用いたすべての層別化群の共通共分散行列およびマハラノビス距離（Ｊａｉｎ ＡＫ １９９９）を用い、ＪＭＰ ５．１ソフトウェアにより階層的クラスタリングを行った。層別小児群を識別するタンパク質を選択するために、最大Ｆ比（≧５）と最小ｐ値（≦０．０５）を持つタンパク質を考察した。スペクトルカウント（ＳｐＣ、ＰＳＭとも呼ばれる）と同定されたタンパク質の相対存在量との間の直接相関に基づいて、ＭＡＰｒｏＭａ（多次元アルゴリズムタンパク質マップ）ソフトウェア（Ｍａｕｒｉ， Ｒｉｃｃｉｏ ｅｔ ａｌ．２０１４）のＤＡｖｅ（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ａｖｅｒａｇｅ）およびＤＣＩ（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｉｎｄｅｘ）インデックスを使用して、分析された各子供群に対応する平均（ａＳｐＣ）を処理した。課せられた閾値はＤＡｖｅ＞｜０．２｜およびＤＣＩ＞｜１００｜であった。

Claims (16)

1. 血小板およびリンパ球に富む血漿からなる単離された血液製剤であって：
   １１０ｘ１０^６／ｍｌ～３３０ｘ１０^６／ｍｌ、好ましくは１５０ｘ１０^６／ｍｌ～３３０ｘ１０^６／ｍｌの濃度の血小板；
   ０．１×１０^６／ｍｌ～２．０×１０^６／ｍｌ、好ましくは０．１×１０^６／ｍｌ～０．７×１０^６／ｍｌの濃度の白血球ＣＤ４５^＋、ＣＤ３１^＋およびＣＤ３４^－；
   ０～０．０３ｘ１０^９／ｍｌ、好ましくは０．０１ｘ１０^９／ｍｌ未満の濃度の赤血球；
   を含み、創傷治癒、皮膚組織の再生、または血管新生を刺激する方法に使用される、単離された血液製剤。
2. 白血球ＣＤ４５^＋、ＣＤ３１^＋およびＣＤ３４^－が、リンパ球、単球および顆粒球を含む、請求項１に記載の単離された血液製剤。
3. リンパ球が、全白血球ＣＤ４５^＋、ＣＤ３１^＋およびＣＤ３４^－に対して４６．２％～８０．６％、好ましくは６１．６％～７３．７％である、請求項２に記載の単離された血液製剤。
4. リンパ球が、Ｔ細胞、血管新生Ｔリンパ球（Ｔａｎｇ）、Ｂ細胞、ＮＫ細胞およびＥＰＣ細胞を含む、請求項２または３に記載の単離された血液製剤。
5. Ｔ細胞、血管新生Ｔリンパ球（Ｔａｎｇ）、Ｂ細胞、ＮＫ細胞およびＥＰＣ細胞が、フローサイトメトリー分析により測定して、以下の２５％～７５％パーセンタイルを有する、請求項４に記載の単離された血液製剤。
   Ｔ細胞 ５１．５４～６６．１１
   Ｂ細胞 ６．６５～１０．６６
   ＮＫ細胞 ４．９２～１０．８９
   Ｔａｎｇ（ＣＤ３＋／１８４＋／３１＋） １９．２０～２７．３２
   ＣＤ３１＋／１４６＋／９０＋（ＥＰＣ） ０．１９５～０．５６５
6. 単球がＣＤ１４^＋およびＣＤ１６^＋またはＣＤ１６^－であり、全白血球ＣＤ４５^＋、ＣＤ３１^＋およびＣＤ３４^－に対して７．７％～４０．０％、好ましくは１５．９％～２３．１％である、請求項２に記載の単離された血液製剤。
7. 前記単球がフローサイトメトリー分析により測定して、以下の２５％～７５％パーセンタイルである、請求項６に記載の単離された血液製剤。
   単球 ６．４４～１３．０２
8. 顆粒球がＣＤ１５^＋／１６^＋であり、全白血球ＣＤ４５^＋、ＣＤ３１^＋およびＣＤ３４^－に対し３．３％～３２．９％、好ましくは５．９％～１６．７％である、請求項２に記載の単離された血液製剤。
9. 顆粒球がフローサイトメトリー分析により測定して、以下の２５％～７５％パーセンタイルである、請求項８に記載の単離された血液製剤。
   顆粒球 ２．８７～１０．８７
10. （ｉ）２～７ｍｌの全血を遠心分離チューブに入れ、２９３～６６０ｇで、好ましくは４５８ｇで、室温で５～１０分間遠心分離することにより、分離された上相および下相を得、ここで上相は血小板およびリンパ球に富む血漿を含み、下相は赤血球を含む工程；
    （ｉｉ）血小板とリンパ球に富む血漿を含む上相を採取する工程；
    を含む、請求項１～８のいずれか1項に記載の血液製剤を調製する方法。
11. 前記遠心分離チューブが、ゴム栓（１）と、請求項１０の記載に対応する上相および下相を画定する、前記チューブの上部容積および下部容積を分離する膜（２）と、前記チューブの下部容積を上下させる内側ピストン（３）を操作するための底面に配置されたリングナット（４）とを備える、請求項１０に記載の方法。
12. 前記膜が１５～２００ミクロンの多孔度を有し、１．５～２．５ｍｍの直径の中心孔を備える疎水性ディスクバリアまたは膜からなる、請求項１１に記載の方法。
13. 請求項１０～１２のいずれか一項に記載の方法によって得られる血液製剤。
14. 骨および軟骨損傷、術後の病変または創傷；皮膚潰瘍、褥瘡痛、床ずれ、静脈性下肢潰瘍、動脈性潰瘍、糖尿病性足潰瘍、角膜および角膜潰瘍の瘢痕化などの角膜病変；歯周組織損傷または骨膜病変などの整形外科または腫瘍学的起源の病変の治療に使用するための、請求項１～９または１３のいずれか一項に記載の血液製剤。
15. 抗老化、瘢痕修復、しわ、座瘡、脱毛症および熱傷の美容的処置のための、請求項１～９または１３のいずれか一項に記載の血小板およびリンパ球に富む血漿からなる単離された血液製剤の使用。
16. 請求項１～９または１３のいずれか一項に記載の単離された血液製剤を含有する、医薬組成物または化粧品組成物。

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