JP2023516016A - 誤って折り畳まれたタンパク質の眼疾患を治療するための組成物及び方法 - Google Patents

Abstract

それを必要とする対象における、誤って折り畳まれた眼タンパク質に関連付けられるか、又はそれによって引き起こされる遺伝性眼障害を治療する方法は、誤って折り畳まれた眼タンパク質のクリアランスを促進する化合物を対象に投与することを含む。【選択図】図１Ａ

Description

関連出願
この出願は、２０２０年２月２６日出願の米国仮出願第６２／９８１,８１９号の優先権を主張するものであり、その主題は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

政府の資金提供
この発明は、米国立衛生研究所によって付与された助成金Ｐ３０ ＥＹ０８０９８の下で政府支援により行われた。米国政府は、本発明に対して一定の権利を有する。

背景
タンパク質のミスフォールディング及び折り畳まれていないタンパク質の応答は、世界中の百万人以上に影響を及ぼす進行性網膜変性の網膜色素変性症（ＲＰ）などの遺伝性網膜疾患の一因であることが見出されている。ＲＰの疾患進行は広く変化するが、数十年間継続し得る。杆体視細胞の漸減により、夜盲症が生じ、その後、視野が減少し、最終的に視野狭窄になる。多くのＲＰ患者の中心視力は、法的失明が生じたときに錐体視細胞の二次喪失が生じるまで、何年も継続し得る。ＲＨＯ遺伝子中の１６０超の変異がＲＰと関連付けられており、これらの変異の約１／３はロドプシンのミスフォールディングを引き起こし、杆体視細胞に対して毒性であるドミナントネガティブ効果をもたらすと考えられている。ＲＨＯ Ｐ２３Ｈ変異のみは、北米における全常染色体優性（ａｄ）ＲＰ症例の約１０～１２％を占めるので、この変異はａｄＲＰのモデルとして最も一般的に研究されている。他のタンパク質のミスフォールディング疾患のように、現在、ＲＰについては有効な治療は利用可能でない。

弱い光の受容体ロドプシンは、杆体視細胞の外側セグメントに存在する最も豊富なタンパク質であり、夜間に高い視覚感度を支持する。ロドプシンのホメオスタシスは、杆体外節（ＯＳ）形態及び杆体視細胞機能を維持するために必須である。杆体ＯＳの高い存在量及び１０％の毎日のリニューアル速度により、杆体ＯＳの長さを一定に保つために、ロドプシン生合成は極めて高いレベルに維持される。そのため、ＲＨＯ遺伝子変異の１つの対立遺伝子でさえ、ロドプシンタンパク質のホメオスタシスを実質的に妨害し、ＲＰでの杆体細胞死をもたらし得る。Ｐ２３Ｈ変異は、ロドプシンの網膜結合部位の頂部に着座した反平行β－プラグ足場の構造的安定性に影響を及ぼし、このβ－プラグ足場は、水性環境から疎水性リガンド結合ポケットを切除するために必須である。変異ロドプシンタンパク質は、培養細胞中の小胞体（ＥＲ）内に蓄積する。ＥＲ結合タンパク質分解経路は、Ｒｈｏ^{Ｐ２３Ｈ／＋}ノックインマウス網膜において活性化され、９０％超の変異ロドプシンタンパク質が分解を受けることは、タンパク質品質管理システムがロドプシンのホメオスタシスを維持することが困難であるという概念を支持する。それにもかかわらず、Ｒｈｏ^{Ｐ２３Ｈ／＋}マウス網膜の杆体におけるこのロバストなタンパク質分解システムは、ロドプシンの分解の一定の高い負荷によって長期的に圧倒される。

初期又は中期のａｄＲＰにおいて誤って折り畳まれたロドプシンによって引き起こされる杆体死を防止するために、実験的取り組みは、ロドプシンの折り畳みの支持又はＥＲ結合タンパク質分解システムの促進に焦点を当ててきた。例えば、薬理学的又は化学的シャペロンは、ロドプシンの折りたたみ並びにビタミンＡ誘導体及び類似体の４－フェニル酪酸及びクルクミンを含むその細胞輸送を改善することが報告された。高用量のビタミンＡ補充は、ＲＰ患者の中で、ある程度のレベルの視覚的保護を示した。しかし、これらの患者の遺伝情報の欠如のために、ビタミンＡの効力がロドプシンの薬理学的シャペロンとして１１－シス－レチナールのレチナール供給の増加によるものであるかどうかは明らかではない。

誤って折り畳まれたロドプシンを減少させることは、杆体視細胞を救助するための有効な戦略として示されている。長期の網膜保護は、ロドプシンｍＲＮＡの変異対立遺伝子を特異的に切断する小リボザイムの遺伝子送達によって処置されたＰ２３Ｈトランスジェニックラットで示されている。プロテアソームの調節サブユニットのトランスジェニック過剰発現による誤って折り畳まれたロドプシン分解を増強することも、ロドプシンＰ２３Ｈノックインマウスにおいて網膜保護を示した。これらの研究から、誤って折り畳まれたロドプシンがＲＨＯ関連ａｄＲＰにおける杆体視細胞を保存するのに十分であることが示唆される。しかし、誤って折り畳まれたロドプシンを除去し、インビボで網膜保護を示すのに有効な薬理学的ツールは利用可能でない。

本明細書に記載の実施形態は、それを必要とする対象において、誤って折り畳まれた眼タンパク質に関連付けられるか、又は誤って折り畳まれた眼タンパク質によって引き起こされる遺伝性眼障害を治療する化合物及び方法に関する。誤って折り畳まれたオプシンタンパク質などの誤って折り畳まれた眼タンパク質を減少させることは、誤って折り畳まれた眼タンパク質に関連付けられるか、又はそれによって引き起こされる遺伝性眼疾患を有する対象において杆体視細胞を保存又は救助するための有効な戦略であり得ることが見出された。小分子ハイスループットスクリーニングアッセイを使用して、対応する野生型タンパク質に影響を与えることなく、誤って折り畳まれた変異眼タンパク質を選択的に減少させる化合物を特定した。これらの化合物は、誤って折り畳まれた眼タンパク質のクリアランスを促進するか、又は分解を加速させ、視覚機能を保存し、遺伝性眼疾患に関連する光受容体死を防止することが見出された。

したがって、いくつかの実施形態では、それを必要とする対象において誤って折り畳まれた眼タンパク質のクリアランスを促進し、かつ／又は誤って折り畳まれた眼タンパク質に関連付けられるか、又はそれによって引き起こされる遺伝性眼障害を治療する方法は、

から選択される治療有効量の化合物、それらの医薬として許容し得る塩、互変異性体、若しくは溶媒和物、又はそれらの組み合わせを対象に投与することを含む。

他の実施形態では、該化合物は、

から、それらの医薬として許容し得る塩、互変異性体、若しくは溶媒和物、又はそれらの組み合わせから選択することができる。

いくつかの実施形態では、対象は、誤って折り畳まれた眼タンパク質に関連付けられるか、若しくはそれによって引き起こされる遺伝性眼障害になりやすいか、又はそれを有する。例えば、対象は、誤って折り畳まれたオプシンタンパク質に関連付けられるか、若しくはそれによって引き起こされる非症候性常染色体優性網膜色素変性症などの、誤って折り畳まれた眼タンパク質に関連付けられるか、若しくはそれによって引き起こされる非症候性網膜障害にかかりやすいか、又はそれを有し得る。

いくつかの実施形態では、誤って折り畳まれた眼タンパク質は、誤って折り畳まれたオプシンである。誤って折り畳まれたオプシンタンパク質は、そのアミノ酸配列に変異を含み得る。例えば、誤って折り畳まれた変異オプシンタンパク質は、誤って折り畳まれた変異ロドプシンであり得、変異は、Ｐ２３Ｈ、Ｃ１１０Ｙ、Ｄ１９０Ｎ、Ｔ１７Ｍ、Ｐ３４７Ｓ、又はＰ２６７Ｌのうちの少なくとも１つである。

いくつかの実施形態では、該化合物は、局所投与、全身投与、硝子体内注射、及び眼内送達のうちの少なくとも１つによって投与することができる。都合のよいことに、該化合物は、網膜変性の発達又は進行を停止させるために、非症候性常染色体優性網膜色素変性症の初期段階又は中間段階などの、眼障害の初期段階又は中間段階に対象に投与される。

いくつかの実施形態では、対象に投与される化合物の治療有効量は、誤って折り畳まれた眼タンパク質の分解を加速させ、眼タンパク質ホメオスタシスを改善し、視覚機能を改善若しくは保存し、光受容細胞死を阻害し、かつ／又は網膜構造を改善若しくは保存するのに有効な量である。

いくつかの実施形態では、視覚機能における改善又は保存には、明所視網膜電図（ＥＲＧ）応答の改善又は保存が含まれる。他の実施形態では、網膜構造における改善又は保存は、外核層（ＯＮＬ）の厚さの改善又は保存である。

図１（Ａ－Ｈ）は、誤って折り畳まれたＰ２３Ｈロドプシンを選択的に減少させる小分子のハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）を示す模式的な画像、プロット、及びチャートを示している。Ａ．ＨＴＳ及びカウンタースクリーニングのための細胞ベースのルシフェラーゼレポーターアッセイの図。マウスＰ２３Ｈ又は野生型（ＷＴ）ロドプシンを、ウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）と融合し、Ｈｅｋ２９３細胞で構成的に発現させ、それぞれＨｅｋ２９３（ＲＨＯ^Ｐ２３Ｈ－Ｒｌｕｃ）又はＨｅｋ２９３（ＲＨＯ^ＷＴ－Ｒｌｕｃ）と命名した。ＨＴＳの場合、Ｈｅｋ２９３（ＲＨＯ^Ｐ２３Ｈ－Ｒｌｕｃ）細胞を、ルシフェラーゼ活性についてアッセイする前に各化合物と共に２４時間インキュベートし、平均－２ＳＤよりも低い活性スコアを示したヒットを選択した。カウンタースクリーニングについては、Ｈｅｋ２９３（ＲＨＯ^ＷＴ－Ｒｌｕｃ）細胞中でルシフェラーゼレポーターアッセイを繰り返すことによりヒットを試験し、Ｈｅｋ２９３（ＲＨＯ^ＷＴ－Ｒｌｕｃ）細胞に対してＨｅｋ２９３（ＲＨＯ^Ｐ２３Ｈ－Ｒｌｕｃ）において好ましいクリアランス活性を示したものを選択した。Ｂ．スクリーニングした化合物ライブラリーを示すパイチャート。各ライブラリー中の化合物の数を括弧内に示す。ＵＣ、シンシナティ大学多様性セット（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｅｔ）；ＬＯＰＡＣ、薬理学的に活性のある化合物のライブラリー；ＦＤＡ、米国食品医薬品局承認薬；ＭＩＰＥ，ＮＣＡＴＳメカニズム照会プラットＥ。Ｃ．それぞれ黒い四角及びマゼンタの円として示されているＨｅｋ２９３（ＲＨＯ^Ｐ２３Ｈ－Ｒｌｕｃ）及びＨｅｋ２９３（ＲＨＯ^ＷＴ－Ｒｌｕｃ）細胞におけるヒット化合物ＣＬ－００９の例示的な用量応答プロット。発光を、０．１％ ＤＭＳＯ及び１ｍＭのエバンスブルーで処理した細胞の平均発光により、それぞれ０及び約１００％対照として正規化した。データポイント及びエラーバーは、平均値とＳＤである。Ｎ＝３。用量応答曲線を、ヒル関数を使用してＯｒｉｇｉｎソフトウェアによって適合させた。Ｄ．２５、５０、７５及び１００％でロードした未処理ＮＩＨ３Ｔ３（Ｒｈｏ^ＷＴ／ＧＦＰ）及びＮＩＨ３Ｔ３（ＲＨＯ^Ｐ２３Ｈ／ＧＦＰ）細胞の細胞溶解物のロドプシンドットブロット。Ｅ．Ｄのロドプシンドットブロット強度をＩｍａｇｅｊによって測定し、ロードした細胞溶解物の量の関数としてプロットした。Ｎ＝３。Ｆ．各々０．１％ ＤＭＳＯ又は１０μＭのＣＬ－００１～ＣＬ－００９で２４時間処理したＮＩＨ３Ｔ３（ＲＨＯ^Ｐ２３Ｈ／ＧＦＰ）及びＮＩＨ３Ｔ３（Ｒｈｏ^ＷＴ／ＧＦＰ）細胞（底部）のロドプシンドットブロット。Ｄの１００％ローディング対照と同じ量で細胞をロードした。Ｇ．Ｆのロドプシンドットブロット強度を、それぞれボックスチャートとしてプロットした。Ｇのボックスの中線及び上／下線は、平均値とＳＤである。Ｎ＝３。各反復におけるＰ２３Ｈ及びＷＴのロドプシンレベルを、それぞれ黒い四角及びマゼンタの円として示す。Ｈ．ＣＬ－００１～ＣＬ－００９の化学構造。括弧内に示しているＥＣ_５０は、８～１０用量の各ヒット化合物に応答したＰ２３Ｈロドプシンの免疫染色を定量するハイコンテントイメージ分析から得た。 図２（Ａ－Ｊ）は、インビトロでＰ２３Ｈロドプシンを選択的に減少させる９個のヒットを検証したハイコンテントイメージングアッセイを示す画像及びプロットを示す。ヒットの確認のために、本発明者らは、それぞれＮＩＨ３Ｔ３（ＲＨＯ^Ｐ２３Ｈ／ＧＦＰ）又はＮＩＨ３Ｔ３（ＲＨＯ^ＷＴ／ＧＦＰ）と命名した、ＧＦＰとＰ２３Ｈ又はＧＦＰとＷＴのロドプシンを安定的に共発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞を使用した。Ａ．０．１％ ＤＭＳＯ又は１０μＭのＣＬ－００１～ＣＬ－００９で２４時間処理した細胞のハイコンテントイメージ。ロドプシンの免疫染色は、ＣＬ－００１～ＣＬ－００９がＰ２３Ｈロドプシンレベルを選択的に低下させるが、ＷＴロドプシンレベルを低下させないことを示した。スケールバー、５０μｍ。Ｂ～Ｊ．イメージベース分析による９個のヒット化合物の用量応答曲線。各々ＤＭＳＯ又は８～１０用量のＣＬ－００１～ＣＬ－００９で２４時間処理したＮＩＨ３Ｔ３（ＲＨＯ^Ｐ２３Ｈ／ＧＦＰ）及びＮＩＨ３Ｔ３（ＲＨＯ^ＷＴ／ＧＦＰ）細胞のハイコンテントイメージから測定したロドプシンの相対免疫染色強度。細胞当たりのロドプシンの免疫染色強度は、それぞれＤＭＳＯ処理細胞を０％として、二次抗体のみで染色した細胞を約１００％として正規化した。データ及びエラーバーは、平均値とＳＤである。Ｎ＝３。用量応答曲線を、修正したヒル関数によって適合させた。各グラフの挿入図には、ＮＩＨ３Ｔ３（ＲＨＯ^Ｐ２３Ｈ／ＧＦＰ）中の各ヒット化合物の化学構造及びＥＣ_５０が示されている。 図３（Ａ～Ｄ）は、変異を引き起こす他のａｄＲＰのロドプシン転写、分解、及びクリアランスに対する活性化合物の効果を示すプロット、図及び画像を示す。Ａ．１０μＭの各ヒット化合物で処理したＮＩＨ３Ｔ３（ＲＨＯ^Ｐ２３Ｈ／ＧＦＰ）及びＮＩＨ３Ｔ３（ＲＨＯ^ＷＴ／ＧＦＰ）細胞におけるＲＨＯ転写物の、ＤＭＳＯ対照と比較した倍数変化。ＲＨＯ転写産物のＱ－ＰＣＲ結果を最初にβアクチンにより正規化し、次いでＤＭＳＯ対照により正規化した。中間ライン及びエラーバーは、データポイントとして示される３つの生物学的複製物の平均値とＳＤである。ＲＨＯ^Ｐ２３Ｈ及びＲＨＯ^ＷＴ。Ｂ．非放射性パルスチェイスアッセイの図。簡単に説明すると、細胞を、Ｍｅｔを含まないアジドホモアラニン（ＡＨＡ）富化培地中で４時間パルス化する前に、Ｍｅｔを含まない培地で１時間飢餓させ、合成された新生タンパク質をＡＨＡで標識した。次いで、細胞を２ｍＭのＭｅｔを含む培地中で０～２４時間チェイスし、チェイス期間中に合成されたタンパク質はもはやＡＨＡで標識されなくなった。次に、「クリック」反応を介して、細胞溶解物中のＡＨＡ組み込みタンパク質をビオチン（ＢＴＮ）と結合させた。全ロドプシンを、１Ｄ４抗ロドプシン抗体により免疫沈降（ＩＰ）し、最後に、ＢＴＮ標識ロドプシンを、ＨＲＰ－ストレプトアビジン（ＳＡ）でドットブロット（ＩＢ）した。Ｃ．１Ｄ４抗ロドプシン抗体（ＲＨＯ）でＩＰし、チェイス時間の２４時間の時点にＳＡでＩＢしたＮＩＨ３Ｔ３（ＲＨＯ^Ｐ２３Ｈ／ＧＦＰ）細胞溶解物からの新生Ｐ２３Ｈロドプシンの割合。細胞を、チェイス時間の０時間に、それぞれ１０μＭのＣＬ－００１～ＣＬ－００９、又はＤＭＳＯで処理した。各ドットのＩＢ強度を、同じ膜中のＤＭＳＯ対照によって正規化した（図１０）。各ボックス内の３本の線は、各グループ内のデータの７５、５０及び２５％の値を表し、各グループの平均を塗りつぶした菱形として示し、エラーバーはＳＤであった。Ｎ＝３。対応のない両側スチューデントｔ検定による^＊、ｐ＜０．０５、^＊＊、ｐ＜０．０１）、及び^＊＊＊、ｐ＜０．００１。Ｄ．１０μＭのＣＬ－００１、ＣＬ－００２、ＣＬ－００５（１１μＭ）、ＣＬ－００７、及びＣＬ－００９での処理の下で、常染色体優性網膜色素変性を引き起こすマウスロドプシンのＷＴ又は６つの変異体（Ｔ４Ｒ、Ｐ２３Ｈ、Ｐ５３Ｒ、Ｃ１１０Ｙ、Ｄ１９０Ｎ、Ｐ２６７Ｌ）を安定に発現するＵ２ＯＳ細胞中のロドプシンの免疫染色像。スケールバー、１００μｍ。 図４（Ａ－Ｇ）は、インビトロでのリソソーム活性を介するメトトレキサート（ＭＴＸ／ＣＬ－００９）媒介Ｐ２３Ｈロドプシン分解を示すプロット及び画像を示す。Ａ．１０μＭのＭＴＸ、１００ｎＭのバフィロマイシンＡ１（ＢａｆＡ１）又は５μＭのＭＧ－１３２で２４時間同時処理した（＋）又はしていない（－）ＮＩＨ３Ｔ３（ＲＨＯ^Ｐ２３Ｈ／ＧＦＰ）及びＮＩＨ３Ｔ３（ＲＨＯ^ＷＴ／ＧＦＰ）細胞中のロドプシンのイムノブロット。βアクチンはローディング対照であった。Ｂ．Ａのイムノブロットを繰り返し、ＩｍａｇｅＪによる相対的ＲＨＯレベルの割合として定量した。中線及びエラーバーは、平均値とＳＤである。^＊対応のない両側スチューデントｔ検定によるｐ＜０．０５。ＲＨＯ^Ｐ２３Ｈ、黒四角；及びＲＨＯ^ＷＴ、マゼンタ色の円。Ｃ．ＤＭＳＯ、１０μＭのＭＴＸ、１０μＭのＭＴＸ＋１００ｎＭのＢａｆＡ１、又は１０μＭのＭＴＸ＋５μＭのＭＧ－１３２で処理したＮＩＨ３Ｔ３（ＲＨＯ^Ｐ２３Ｈ／ＧＦＰ）（上部）及びＮＩＨ３Ｔ３（ＲＨＯ^ＷＴ／ＧＦＰ）（底部）細胞中のロドプシン免疫染色のハイコンテントイメージ。スケールバー、５０μｍ。Ｄ．ＭＴＸ濃度のみ又は１００ｎＭのＢａｆＡ１又は５μＭのＭＧ－１３２での同時処理の関数としてプロットしたＮＩＨ３Ｔ３（ＲＨＯ^Ｐ２３Ｈ／ＧＦＰ）細胞のハイコンテントイメージから測定したＰ２３Ｈロドプシンの相対免疫染色強度（ＩＮＴ）。それぞれＤＭＳＯ処理細胞を０％、二次抗体のみで染色した細胞を約１００％として正規化した細胞当たりのＰ２３Ｈロドプシンの免疫染色強度。データポイント及びエラーバーは、平均値とＳＤである。Ｎ＝３。Ｅ～Ｇ．ＮＩＨ３Ｔ３（ＲＨＯ^Ｐ２３Ｈ／ＧＦＰ）及びＮＩＨ３Ｔ３（ＲＨＯ^ＷＴ／ＧＦＰ）細胞におけるキモトリプシン様プロテアソーム活性に対するＭＴＸの効果。Ｅ．Ｂで発明者らが使用した細胞数を示す細胞数の関数としてのプロテアソーム活性の発光読み出し情報は、アッセイの感度範囲内にある。Ｆ．それぞれ１００％及び０％対照としての０．１％のＤＭＳＯ又は５μＭのＭＧ－１３２で処理したＮＩＨ３Ｔ３（グレー）、ＮＩＨ３Ｔ３（ＲＨＯ^ＷＴ／ＧＦＰ）（マゼンタ）及びＮＩＨ３Ｔ３（ＲＨＯ^Ｐ２３Ｈ／ＧＦＰ）（暗灰色）細胞の発光読み出し情報。８つの生物学的複製物（菱形として示されている）からの平均値とＳＤを、中央のバー及びエラーバーとして示す。挿入図中のＺ’＝１－３×（ＳＤ_{１００％対照}＋ＳＤ_０％対照）／（平均値_{１００％対照}－平均値_０％対照)は、アッセイが堅牢であることを実証する。Ｇ．１０用量のＭＴＸに応答した細胞の正規化したキモトリプシン様プロテアソーム活性。キモトリプシン様プロテアソーム活性を、それぞれ１００％及び０％対照によって正規化した。データポイント及びエラーバーは、３つの生物学的複製物の平均値とＳＤである。 図５（Ａ－Ｃ）は、Ｒｈｏ^Ｐ２３Ｈ／^＋マウスの網膜においてＭＴＸによって増加したオートファジーフラックスを示すイムノブロット及びプロットを示す。Ａ．ＰＮＤ１５での２５ｐｍｏｌ／眼のＭＴＸ又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の硝子体内注射（ＩＶＩ）後４８時間の時点でのＲｈｏ^{Ｐ２３Ｈ／＋}マウスからの網膜溶解物３０μｇ中のＳＱＳＴＭ１／ｐ６２及びＬＣ３のイムノブロット。βアクチンはローディング対照であった。破線のボックスは、ローディングされたときに試料が混合され得るレーン６及び７を除いた、Ｂ及びＣにおける強度分析のために選択した試料である。Ｂ及びＣ．それぞれＡにおけるイムノブロッティング画像から測定したβアクチンに対するＳＱＳＴＭ１／ｐ６２及びβアクチンに対するＬＣ３－ＩＩのバンド強度の比。左、ＰＢＳで処置した網膜；右、眼あたり２５ｐｍｏｌのＭＴＸで処置した網膜。中線及びエラーバーは、平均値とＳＤである。Ｎ＝５。^＊対応のない両側スチューデントｔ検定によって計算したＭＴＸ処置群とＰＢＳ群との間ｐ＜０．０５。 図６（Ａ－Ｒ）は、Ｒｈｏ^{Ｐ２３Ｈ／＋}マウスにおけるＭＴＸの１回の硝子体内注射（ＩＶＩ）で増加した網膜電図（ＥＲＧ）応答及び網膜ロドプシンレベルを示すプロット及び画像を示す。マウスの眼を処置しないか又はＰＮＤ１５にＰＢＳ、２５若しくは１００ｐｍｏｌのＭＴＸを硝子体内注射し、ＥＲＧ応答をＰＮＤ３２に記録した。マウスを安楽死させ、免疫組織化学（ＩＨＣ）のためにＰＮＤ３３に眼を除核した。年齢が一致したＲｈｏ^＋／＋マウスを正常対照として使用した。Ａ．１０ｃｄ・ｓ／ｍ^２で光のフラッシュにより刺激した暗順応ＥＲＧ記録。Ｂ及びＣ．それぞれフラッシュ強度の関数（半対数フォーマット）としてプロットした処置マウスの８つのフラッシュ暗順応ａ波及びｂ波の振幅。Ｄ．フラッシュ強度の関数（半対数フォーマット）としてプロットした６つのフラッシュ明順応ｂ波の振幅。黒四角形、赤色円、青色三角形、及びマゼンタの逆三角形は、それぞれ未処置のＲｈｏ^{Ｐ２３Ｈ／＋}マウス、ＰＢＳ、２５及び１００ｐｍｏｌのＭＴＸで処置したＲｈｏ^{Ｐ２３Ｈ／＋}マウスからのものである。データポイント及びエラーバーは、それぞれ平均値とＳＥＭである。Ｎ＝５。^＊２元配置ＡＮＯＶＡにより計算した２５ｐｍｏｌのＭＴＸ処置群とＰＢＳ処置群との間ｐ１＜０．０５。要因１、処置；及び要因２、フラッシュ強度。スケールバー、５０μｍ。Ｑ．ロドプシン免疫蛍光Ｅ－Ｐのスパイダーグラム。それぞれ上から下に、未処置のＲｈｏ^＋／＋網膜、並びに未処置の、ＰＢＳ処置した、又は２５ｐｍｏｌのＭＴＸ処置したＲｈｏ^{Ｐ２３Ｈ／＋}マウス網膜のＩＨＣ画像。ＲＨＯ及び核（ヘキスト３３３４２）をそれぞれ赤及び青で染色した。Ｅ、Ｈ、Ｋ及びＮは、低倍率の網膜ＩＨＣ画像である。スケールバー、５００μｍ。Ｆ、Ｉ、Ｌ及びＯは、網膜下側のＥ、Ｈ、Ｋ及びＮに示したボックス内にマークした部位で撮影した高倍率網膜像であり、Ｇ、Ｊ、Ｍ及びＰは、網膜上側の画像で、それぞれの光学神経ヘッド（ＯＮＨ）から０．６、１及び１．４ｍｍで撮影した高倍率画像からのＩｍａｇｅＪによって測定したＯＳにおける強度である。緑の正方形、年齢が一致したＲｈｏ^＋／＋マウス網膜。Ｒ．０．６、１及び１．４ｍｍの距離で撮影した網膜断面画像の２００μｍ長当たりの外核層（ＯＮＬ）核数のスパイダーグラム。データポイント及びエラーバーは、それぞれ平均値とＳＥＭである。Ｎ＝３。^＊、対応のない両側スチューデントｔ検定による２５ｐｍｏｌのＭＴＸ群とＰＢＳ群の間ｐ＜０．０５。 図７（Ａ－Ｏ）は、Ｒｈｏ^{Ｐ２３Ｈ／＋}マウス網膜の、ＭＴＸの複数回のＩＶＩで改善したＥＲＧ応答、ロドプシンレベル及び光受容細胞数の保存を示すプロット及び画像を示す。未処置のままか、又はＰＮＤ１５から開始してＰＢＳ、処置当たり２５ｐｍｏｌのＭＴＸ及び１００ｐｍｏｌのＭＴＸを週４回のＩＶＩでＲｈｏ^{Ｐ２３Ｈ／＋}マウスの眼に投与し、ＰＮＤ４４にＥＲＧをとった。ＩＨＣのためにＰＮＤ４６に眼を除核した。Ａ．１０ｃｄ・ｓ／ｍ^２で光のフラッシュにより刺激した暗順応ＥＲＧ応答。Ｂ及びＣ．それぞれフラッシュ強度の関数（半対数フォーマット）としてプロットした処置マウスの８つのフラッシュ暗順応ａ波及びｂ波の振幅。Ｄ．フラッシュ強度の関数（半対数フォーマット）としてプロットした６つのフラッシュ明順応ｂ波の振幅。黒四角形、赤色円、青色三角形、及びマゼンタの逆三角形は、それぞれ未処置のＲｈｏ^{Ｐ２３Ｈ／＋}マウス、ＰＢＳ、２５及び１００ｐｍｏｌのＭＴＸで処置したＲＨＯ^{Ｐ２３Ｈ／＋}マウスからのものである。データポイント及びエラーバーは、それぞれ平均値とＳＥＭである。Ｎ＝５。^＊２元配置ＡＮＯＶＡにより計算した２５ｐｍｏｌのＭＴＸ処置群とＰＢＳ処置群との間ｐ１＜０．０５。要因１、処置；及び要因２、フラッシュ強度。Ｅ～Ｍ．それぞれ上から下に、未処置の、ＰＢＳ処置した、又は２５ｐｍｏｌのＭＴＸ処置したＲｈｏ^{Ｐ２３Ｈ／＋}マウス網膜のＩＨＣ画像。ＲＨＯ及び核（ヘキスト３３３４２）をそれぞれ赤及び青で染色した。Ｅ、Ｈ、及びＫは、低倍率の網膜画像である。スケールバー、５００μｍ。それぞれ、Ｆ、Ｉ、及びＬは、下側のＥ、Ｈ、及びＫに示したボックスとしてマークした部位で撮影した高倍率網膜像であり、Ｇ、Ｊ、及びＭは上側の画像である。スケールバー、５０μｍ。Ｎ．ＯＮＨから０．６、１及び１．４ｍｍで撮影した高倍率免疫蛍光画像からのＩｍａｇｅＪによって測定したＯＳにおけるロドプシン免疫蛍光強度のスパイダーグラムである。Ｏ．ＯＮＨから０．６、１及び１．４ｍｍで撮影した網膜断面画像の２００μｍ長当たりのＯＮＬ核数のスパイダーグラム。データポイント及びエラーバーは、それぞれ平均値とＳＥＭである。Ｎ＝３。^＊、対応のない両側スチューデントｔ検定による２５ｐｍｏｌのＭＴＸ群とＰＢＳ群の間ｐ＜０．０５。 図８（Ａ－Ｅ）は、ＨＴＳ及び確認アッセイに使用される安定細胞内のロドプシン発現を確認したイムノブロットを示す。Ａ．当量のＰ２３Ｈ又はＷＴロドプシン－Ｒｌｕｃ融合タンパク質を発現したＨｅｋ２９３（ＲＨＯ^Ｐ２３Ｈ－Ｒｌｕｃ）及びＨｅｋ２９３（ＲＨＯ^ＷＴ－Ｒｌｕｃ）細胞を示すロドプシンのイムノブロット。βアクチンをローディング対照として使用した。Ｂ～Ｅ．各々Ｃ末端でビーナス（Ｖｅｎｕｓ）蛍光タンパク質と融合されているＷＴ、Ｔ４Ｒ、Ｐ２３Ｈ、Ｐ５３Ｒ、Ｃ１１０Ｙ及びＰ２６７Ｌマウスロドプシンを発現するＵ２ＯＳ安定細胞単一クローン中のロドプシンのイムノブロット。ヒット化合物（図３に示されている）の処理の下でハイコンテントイメージング分析のために選択したクローンを赤色ボックスによりマークした。ＷＴと変異体ＲＨＯとの間の分子量の差は、小胞体に蓄積されるＲＨＯ変異体の未熟なグリコシル化によるものである。 図９（Ａ－Ｈ）は、１０又は２０μＭのＣＬ－００１～ＣＬ－００９を含む異なる化合物で各々処理したＮＩＨ３Ｔ３（Ｒｈｏ^Ｐ２３Ｈ／ＧＦＰ）（Ａ、Ｃ、Ｅ及びＧ）並びにＮＩＨ３Ｔ３（Ｒｈｏ^ＷＴ／ＧＦＰ）細胞（Ｂ、Ｄ、Ｆ及びＨ）のロドプシンドットブロットを示す。ＣＬ－００２、ＣＬ－００３、ＣＬ－００４、ＣＬ－００５及びＣＬ－００９で処理した細胞からの３つの生物学的反復。Ｇ～Ｈ．ＣＬ－００１、ＣＬ－００６、ＣＬ－００７及びＣＬ－００８で処理した細胞からのドットブロットの４つの生物学的反復が底部の４つのスキャンに示されている。図１Ｄ＆Ｆに示されるドットブロットは、これらの元のスキャンからクロッピングした。これらの反復におけるロドプシンドットブロット強度を測定し、図１Ｅ及びＧに示す曲線及びボックスチャートにプロットした。 図１０（Ａ－Ｆ）は、非放射性パルスチェイスアッセイを用いてＮＩＨ３Ｔ３（ＲＨＯ^Ｐ２３Ｈ／ＧＦＰ）細胞におけるロドプシン分解に対する９つのヒットの効果を示すイムノブロット及びプロットを示す。Ａ．ＮＩＨ３Ｔ３（ＲＨＯ^ＷＴ／ＧＦＰ）細胞からのＲＨＯ免疫沈降（ＩＰ）の異なる工程におけるＲＨＯのドットブロットは、ロドプシンプルダウンの高い収率を示唆する。全細胞溶解物の５％、フロースルーの５％、最後の洗浄スルー、第１及び第２の溶出からのドットブロットを、それぞれ左から右へＴ、ＦＴ、Ｗ、Ｅ１及びＥ２としてマークした。Ｂ．ＡＨＡによるパルス後０、４及び２４時間の時点でのＷＴ及びＰ２３Ｈロドプシンのチェイス、抗ロドプシン抗体（ＲＨＯ）によるＩＰ及びストレプトアビジン（ＳＡ）によるイムノブロット（ＩＢ）。Ｍｅｔは、ブランク対照としてＭｅｔと常にインキュベートした細胞溶解物。Ｃ．ＩｍａｇｅＪによりＢから定量したチェイス時間の関数としての減衰した新生ロドプシンの割合。灰色の四角形、Ｐ２３Ｈロドプシン；マゼンタ色の円、ＷＴロドプシン。Ｄ．ＮＩＨ３Ｔ３（ＲＨＯ^Ｐ２３Ｈ／ＧＦＰ）細胞を、チェイス時間の０時間にそれぞれ１０μＭのＣＬ－００１～ＣＬ－００９、又はＤＭＳＯで処理した。チェイス時間２４時間にＲＨＯでＩＰし、ＳＡでＩＢした細胞溶解物からの新生Ｐ２３Ｈロドプシン。Ｅ．ＲＨＯでＩＰし、ＲＨＯでＩＢした細胞溶解物の同じバッチからの全Ｐ２３Ｈロドプシンから、各ヒット化合物の活性が実際に、全Ｐ２３Ｈロドプシンタンパク質レベルを低下させたことが確認される。Ｄにおけるドットブロット強度を定量し、図３Ｃに示す。Ｆ．Ｅのドットブロットスキャンから定量し、ＤＭＳＯ対照により正規化したドット強度。四角形及びエラーバーは、６つの生物学的複製物の平均値とＳＤであり、ボックスは、７５、５０及び２５％のデータ値を示す。 図１１（Ａ－Ｅ）は、ＣＬ－００１（Ａ）、ＣＬ－００２（Ｂ）、ＣＬ－００５（Ｃ）、ＣＬ－００７（Ｄ）、及びＣＬ－００９（Ｅ）での処理の下で、ロドプシンのＷＴ又は常染色体優性網膜色素変性を引き起こす６つの変異体を安定に発現するＵ２ＯＳ細胞のハイコンテント免疫染色像から測定したロドプシン免疫蛍光強度を示すプロット及びイムノブロットを示す。正規化したロドプシンの強度を、半対数フォーマットでの７用量の各化合物の関数としてプロットした。用量応答曲線は、修正したヒル関数を使用して、Ｏｒｉｇｉｎソフトウェアによって適合させた。データポイント及びエラーバーは、３つの生物学的複製物からの平均値とＳＤであった。異なるロドプシン変異体に対する各化合物のＥＣ_５０の範囲を各グラフの底部に示した。ＷＴ、Ｔ４Ｒ、Ｐ２３Ｈ、Ｐ５３Ｒ、Ｃ１１０Ｙ、Ｄ１９０Ｎ、及びＰ２６７Ｌのロドプシンを発現する細胞からのデータは、それぞれ黒色の四角形、赤色の円、緑色の三角形、青色の逆三角形、シアンの菱形、マゼンタの左向き三角形及びオリーブ色の右向き三角形としてマークされている。 図１２（Ａ－Ｌ）は、ロドプシン分解のＭＴＸ効果に対するプロテアソーム又はリソソーム活性を阻害する効果を示すイムノブロットを示す。左（Ａ、Ｂ、Ｃ）及び右（Ｇ、Ｈ及びＩ）は、それぞれＤＭＳＯ、１０μＭのメトトレキサート（ＭＴＸ）、３５．５μＭのシクロヘキシミド（ＣＨＸ）、３５．５μＭのＣＨＸと１０μＭのＭＴＸ、１００ｎＭのバフィロマイシンＡ１（ＢａｆＡ１）、１００ｎｍのＢａｆＡ１と１０μＭのＭＴＸ、５μＭのＭＧ－１３２，５μＭのＭＧ－１３２と１０μＭのＭＴＸ、１００ｎＭのＢａｆＡ１と５μＭのＭＧ－１３２で処理したＮＩＨ３Ｔ３（ＲＨＯ^Ｐ２３Ｈ／ＧＦＰ）及びＮＩＨ３Ｔ３（ＲＨＯ^ＷＴ／ＧＦＰ）細胞の溶解物からのロドプシンのイムノブロットである。Ｄ、Ｅ及びＦは、１００ｎＭのＢａｆＡ１と同時処理した、又は１００ｎＭのＢａｆＡ１と同時処理しないで、０、３、１０、３０μＭのＭＴＸで処理したＮＩＨ３Ｔ３（ＲＨＯ^Ｐ２３Ｈ／ＧＦＰ）細胞からのものである。Ｊ、Ｋ及びＬは、１００ｎＭのＢａｆＡ１と同時処理した、又は１００ｎＭのＢａｆＡ１と同時処理しないで、０、３、１０、３０μＭのＭＴＸで処理したＮＩＨ３Ｔ３（ＲＨＯ^Ｐ２３Ｈ／ＧＦＰ）細胞からのものである。図４Ａは、ここのＡ及びＢのイムノブロットスキャンからクロッピングし、図４Ｂに示した定量化は、ここのＡ～Ｌに示した３つの生物学的反復から計算した。 図１３（Ａ－Ｆ）は、Ｒｈｏ^{Ｐ２３Ｈ／＋}ノックインマウスにおけるＭＴＸ処置で改善した網膜機能及びロドプシンのホメオスタシスを示すプロットを示す。ＭＴＸの単回ＩＶＩは、インビボでａ波に対するｂ波の比に影響を及ぼさなかった。マウスにおけるＲｈｏ^{Ｐ２３Ｈ／＋}ノックインマウスに、ＰＮＤ１５にＰＢＳ、２５又は１００ｐｍｏｌのＭＴＸを硝子体内注入し、ＥＲＧをＰＮＤ３２に記録し、図６Ａ～Ｄに示す。Ａ及びＢは、それぞれ半対数フォーマットのフラッシュ強度の関数としてプロットした暗順応及び明順応のａ波に対するｂ波の比である。データ及びエラーバーは、それぞれ平均値とＳＥＭである。Ｎ＝５。２元配置ＡＮＯＶＡによるＰ_１＞０．０５は、ＰＢＳ対照と比較して、２５も１００ｐｍｏｌのＭＴＸ処置も暗順応又は明順応のａ波に対するｂ波の比に影響を与えないことを示唆している。Ｃ～Ｆ．Ｒｈｏ^{Ｐ２３Ｈ／＋}マウスにおけるロドプシンレベルに対するＭＴＸの効果。Ｃ＆Ｄは、単回ＩＶＩで処置したマウスからの網膜ＩＨＣ蛍光強度の定量であり、Ｅ＆Ｆは、週４回のＩＶＩで処置したマウスからのものである。Ｃ＆Ｅ、光学神経ヘッド（ＯＮＨ）から０．６、１及び１．４ｍｍで撮影した高倍率免疫蛍光画像からのＩｍａｇｅＪによって測定した網膜における全ロドプシン免疫蛍光強度（ＩＮＴＳＴ）のスパイダーグラム。Ｄ＆Ｆ、ＯＮＨから０．６、１及び１．４ｍｍで撮影した高倍率画像からのＯＮＬ中のロドプシン免疫蛍光強度のスパイダーグラム。データポイント及びエラーバーは、それぞれ平均値とＳＥＭである。Ｎ＝３。^＊、対応のない両側スチューデントｔ検定による２５ｐｍｏｌのＭＴＸ群とＰＢＳ群の間ｐ＜０．０５。 図１４は、１つの硝子体内注射（ＩＶＩ）で処置したＲｈｏ^＋／＋及びＲｈｏ^{Ｐ２３Ｈ／＋}マウス網膜の免疫組織化学（ＩＨＣ）画像を示す。Ｒｈｏ^{Ｐ２３Ｈ／＋}マウスの眼を、未処置のままか、ＰＮＤ１５にＩＶＩを介してＰＢＳ、２５ｐｍｏｌのＭＴＸで処置し、ＰＮＤ３３に除核した。未処置のＲｈｏ^＋／＋眼を正常対照として使用した。遺伝子型及び処置を左側に垂直にラベルした。Ｎ＝３。ＲＨＯ及び核（ヘキスト３３３４２）をそれぞれ赤及び青で染色した。画像を、それぞれ網膜下側と上側の視神経頭部（ＯＮＨ）から０．６、１及び１．４ｍｍで撮影した。スケールバー、５０μｍ。 図１５は、週４回のＩＶＩで処置したＲｈｏ^{Ｐ２３Ｈ／＋}マウス網膜のＩＨＣ画像を示す。Ｒｈｏ^{Ｐ２３Ｈ／＋}マウスの眼を、未処置のままか、ＰＮＤ１５から始めて、週４回のＰＢＳ又は２５ｐｍｏｌのＭＴＸのＩＶＩにより処置した。ＰＮＤ４６にＩＨＣのために眼の除核をした。遺伝子型及び処置条件を左側に垂直にラベルした。Ｎ＝３。ＲＨＯ及び核（ヘキスト３３３４２）をそれぞれ赤及び青で染色した。画像を、それぞれ網膜下側と上側の視神経頭部（ＯＮＨ）から０．６、１及び１．４ｍｍで撮影した。スケールバー、５０μｍ。

詳細な説明
便宜上、本明細書、実施例、及び添付の特許請求の範囲で用いる特定の用語をここにまとめる。特に定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術用語及び科学用語は、この出願が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。

冠詞「１つ（ａ）」及び「１つ（ａｎ）」は、冠詞の文法目的で１つ又は２以上の（すなわち、少なくとも１つ）を指すために本明細書で使用する。例として、「要素」は、１つの要素又は２以上の要素を意味する。

用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」「有する（ｈａｖｅ）」、及び「有する（ｈａｖｉｎｇ）」は、包括的なオープンな意味で使用され、追加要素が含まれ得ることを意味する。本明細書で使用する用語「など」、「例えば」は、限定するものではなく、単なる例示目的のためのものである。「含む」及び「含むが、これらに限定されない」は、互換的に使用される。

本明細書で使用する用語「又は」は、文脈が特に明確に示さない限り、「及び／又は」を意味すると理解されるべきである。

本明細書で使用する用語「約」又は「おおよそ」は、基準の含量、レベル、値、数、頻度、割合、寸法、大きさ、量、重量又は長さに対して１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％又は１％程度変化する含量、レベル、値、数、頻度、割合、寸法、大きさ、量、重量又は長さを指す。一実施形態では、用語「約」又は「おおよそ」は、基準の含量、レベル、値、数、頻度、割合、寸法、大きさ、量、重量又は長さについて、含量、レベル、値、数、頻度、割合、寸法、大きさ、量、重量又は長さ±１５％、±１０％、±９％、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、±２％、又は±１％の範囲を指す。

本願の化合物のいくつかの構造は、不斉（キラル）炭素又は硫黄原子を含むことに留意されたい。したがって、そのような不斉から生じる異性体は、特に示さない限り、本明細書に含まれることが理解されるべきである。そのような異性体は、古典的な分離技術及び立体化学的に制御された合成によって実質的に純粋な形態で取得できる。本出願の化合物は、立体異性体形態で存在してよく、そのため、個々の立体異性体として、又は混合物として生成できる。

用語「誘導体」は、共通のコア構造を有し、本明細書に記載の様々な基で置換される化合物を指す。

用語「バイオアイソスター」は、原子又は原子のグループを、別の広く類似する原子又は原子のグループと交換することから生じる化合物を指す。バイオアイソスター置換の目的は、親化合物に類似した生物学的性質を有する新しい化合物を作製することである。バイオアイソスター置換は、物理化学又は位相幾何学に基づき得る。カルボン酸のバイオアイソスターの例には、アシルスルホンイミド、テトラゾール、スルホン酸塩、及びホスホン酸塩が含まれる。例えば、Ｐａｔａｎｉ及びＬａＶｏｉｅ，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９６，３１４７－３１７６（１９９６）を参照されたい。

語句「非経口投与」及び「非経口的に投与される」は、当技術分野で認められた用語であり、注射などの経腸及び局所投与以外の投与様式を含み、静脈内、筋肉内、胸膜内、血管内、心内膜、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、クモ膜下、脊髄内及び胸骨内の注射並びに注入を含むが、これらに限定されない。

用語「治療する」は、当技術分野で認められており、対象における疾患、障害又は病態を抑制すること、例えば、その進行を遅らせること、及び疾患、障害又は病態を緩和すること、例えば、疾患、障害及び／又は病態の退行を引き起こすことを含む。疾患又は病態を治療することは、基礎をなす病態生理に影響を与えなくとも、特定の疾患又は病態の少なくとも１つの症状を寛解させることを含む。

用語「予防する」は、当技術分野で認められており、疾患、障害及び／又は病態になりやすいが、まだそれを有すると診断されていない対象において疾患、障害又は病態が生じるのを止めることを含む。疾患に関連する病態を予防することは、疾患が診断された後であるが病態が診断される前に病態が生じるのを止めることを含む。

用語「医薬組成物」は、対象への投与に適する形態で開示される化合物を含む製剤を指す。好ましい実施形態では、該医薬組成物は、バルク又は単位剤形にある。単位剤形は、例えば、カプセル、ＩＶバッグ、錠剤、エアロゾル吸引器上の単一ポンプ、又はバイアルを含む様々な形態のいずれかである。組成物の単位用量中の有効成分（例えば、開示される化合物又はその塩の製剤）の量は、有効量であり、関与する特定の治療に従って変化する。患者の年齢及び病態に依存して投薬量を日常的に変更する必要が時々あることは、当業者なら理解するであろう。投薬量は投与経路にも依存する。経口、肺、直腸、非経口、経皮、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内、吸入などを含む様々な経路が企図される。本明細書に記載の化合物の局所投与又は経皮投与のための剤形には、粉末、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、液剤、パッチ、噴霧化合物、及び吸入剤が含まれる。好ましい実施形態では、活性化合物は、医薬として許容し得る担体と、必要とされる任意の保存剤、緩衝剤又は噴霧剤と無菌条件下で混合される。

用語「フラッシュ用量」は、剤形を迅速に分散させる化合物製剤を指す。

用語「即時放出」は、比較的短期間での、一般的には最長で約６０分での、剤形からの化合物の放出として定義される。用語「改良放出」は、遅延放出、持続放出、及びパルス放出を含むと定義される。用語「パルス放出」は、剤形からの薬物の一連の放出として定義される。用語「徐放」又は「持続放出」は、長期間にわたる剤形からの化合物の連続放出として定義される。

語句「医薬として許容し得る」は、当技術分野で認められている。特定の実施形態では、この用語は、健康な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、又は他の問題若しくは合併症を起こすことなく、ヒト及び動物の組織と接触させて使用するのに適し、妥当な利益／リスク比に見合う、組成物、ポリマー及び他の物質並びに／又は剤形を含む。

語句「医薬として許容し得る担体」は、当技術分野で認められており、例えば、１つの臓器若しくは身体の部分から、別の臓器若しくは身体の部分に任意の対象組成物を運搬又は輸送するのに関与する液体若しくは固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶剤又は封入材料などの、医薬として許容し得る物質、組成物又はビヒクルを含む。各担体は、対象組成物の他の成分と適合し、患者に有害ではないという意味で「許容でき」なければならない。特定の実施形態では、医薬として許容し得る担体は発熱性ではない。医薬として許容し得る担体として役立ち得る物質のいくつかの例には、医薬製剤に使用される（１）ラクトース、グルコース及びスクロースなどの糖類；（２）コーンスターチ及びジャガイモデンプンなどのデンプン類；（３）カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース及び酢酸セルロースなどのセルロース及びその誘導体；（４）粉末トラガカント；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）タルク；（８）ココアバター及び坐剤ワックスなどの賦形剤；（９）ピーナッツ油、綿実油、ヒマワリ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油及び大豆油などの油類；（１０）プロピレングリコールなどのグリコール類；（１１）グリセリン、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコールなどのポリオール類；（１２）オレイン酸エチル及びラウリン酸エチルなどのエステル類；（１３）寒天；（１４）水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；（１５）アルギン酸；（１６）発熱物質を含まない水；（１７）等張食塩水；（１８）リンゲル液；（１９）エチルアルコール；（２０）リン酸緩衝液；並びに（２１）他の非毒性適合性物質が含まれる。

本出願の化合物は、さらに塩を形成することができる。これらの形態の全ても本明細書で企図される。

化合物の「医薬として許容し得る塩」は、医薬として許容され、親化合物の所望の薬理学的活性を有する塩を意味する。例えば、塩は酸付加塩であり得る。酸付加塩の一実施形態は塩酸塩である。医薬として許容し得る塩は、従来の化学的方法により塩基性又は酸性の部分を含む親化合物から合成することができる。一般に、そのような塩は、これらの化合物の遊離酸形態又は塩基形態と、化学量論量の適切な塩基又は酸とを、水若しくは有機溶媒若しくは２つの混合物中で反応させることによって調製することができ、一般に、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、又はアセトニトリルのような非水性媒体が好ましい。塩のリストは、レミントンの薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、第１８版（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）に見出される。

本明細書に記載の化合物は、エステル、例えば、医薬として許容し得るエステルとして調製することもできる。例えば、化合物中のカルボン酸官能基は、その対応するエステル、例えば、メチル、エチル、又は他のエステルに変換することができる。また、化合物中のアルコール基は、対応するエステル、例えば、アセテート、プロピオネート、又は他のエステルに変換することができる。

本明細書に記載の化合物は、プロドラッグ、例えば、医薬として許容し得るプロドラッグとして調製することもできる。用語「プロドラッグ（ｐｒｏ－ｄｒｕｇ）」及び「プロドラッグ（ｐｒｏｄｒｕｇ）」は、本明細書では同義的に使用され、活性のある親薬物をインビボで放出する任意の化合物を指す。プロドラッグは、薬剤の多くの望ましい品質（例えば、溶解性、バイオアベイラビリティ、製造など）を高めると知られているので、化合物をプロドラッグ形態で送達することができる。そのため、本明細書に記載の化合物は、特許請求される化合物のプロドラッグ、それを送達する方法及びそれを含む組成物を含むと意図される。「プロドラッグ」は、そのようなプロドラッグが対象に投与されるときに、活性のある親薬物をインビボで放出する任意の共有結合担体を含むと意図される。プロドラッグは、修飾物が日常的な操作又はインビボのいずれかで親化合物へと切断されるように、化合物中に存在する官能基を修飾することによって調製される。プロドラッグには、ヒドロキシ基、アミノ基、スルフヒドリル基、カルボキシ基、又はカルボニル基がインビボで開裂して、それぞれ遊離ヒドロキシル基、遊離アミノ基、遊離スルフヒドリル基、遊離カルボキシ基又は遊離カルボニル基を形成する任意の基に結合される化合物が含まれる。

プロドラッグの例には、エステル（例えば、アセテート、ジアルキルアミノアセテート、ホルメート、ホスフェート、スルフェート、及びベンゾエート誘導体）並びにヒドロキシ官能基のカルバメート（例えば、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノカルボニル）、カルボキシル官能基のエステル基（例えば、エチルエステル、モルホリノエタノールエステル）、Ｎ－アシル誘導体（例えば、Ｎ－アセチル）Ｎ－マンニッヒ塩基、シッフ塩基及びアミノ官能基のエナミノン、式Ｉの化合物中のケトン及びアルデヒド官能基のオキシム、アセタール、ケタール及びエノールエステルなどが含まれるが、これらに限定されず、Ｂｕｎｄｅｇａａｒｄ，Ｈ．「プロドラッグの設計（Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｐｒｏｄｒｕｇｓ） ｐ１－９２，Ｅｌｅｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ－Ｏｘｆｏｒｄ（１９８５）を参照されたい。

さらに、本明細書に記載の化合物の塩は、水和若しくは非水和（無水）形態のいずれかで、又は他の溶媒分子との溶媒和物として存在し得る。水和物の非限定的な例には、一水和物、二水和物などが含まれる。溶媒和物の非限定的な例としては、エタノール溶媒和物、アセトン溶媒和物などが含まれる。

用語「溶媒和物」は、化学量論的又は非化学量論的な量の溶媒のいずれかを含む溶媒付加形態を意味する。いくつかの化合物は、結晶性固体状態にある固定モル比の溶媒分子を捕捉する傾向を有するため、溶媒和物を形成する。溶媒が水である場合、形成される溶媒和物は水和物であり、溶媒がアルコールである時は、形成される溶媒和物はアルコラートである。水和物は、水がＨ_２Ｏとしてその分子状態を保持する物質の１つとの１以上の水分子の組み合わせによって形成され、そのような組み合わせは１以上の水和物を形成できる。

本明細書に記載の化合物、塩及びプロドラッグは、エノール及びイミン形態を含むいくつかの互変異性形態、ケト及びエナミン形態並びに幾何異性体並びにそれらの混合物で存在し得る。互変異性体は、溶液中で互変異性セットの混合物として存在する。固体形態では、通常１種類の互変異性体が優勢である。１種類の互変異性体が記載され得るが、本出願は、本発明の化合物の全ての互変異性体を含む。互変異性体は、平衡状態で存在し１種類の異性体形態から別の形態に容易に変換される２種以上の構造異性体のうちの１つである。この反応は、隣接する共役二重結合の交代を伴う水素原子の幾何学的な移動をもたらす。互変異性化が可能である溶液中では、互変異性体の化学平衡に達する。互変異性体の正確な比は、温度、溶媒、及びｐＨを含むいくつかの要因に依存する。互変異性化による相互変換可能な互変異性体の概念は、互変異性と呼ばれる。

用語「類似体」は、別の化合物と構造的に類似しているが、組成がわずかに異なる（１つの原子と異なる要素の原子との置換において又は特定の官能基の存在、又は１つの官能基と別の官能基との置換においてのように）化学化合物を指す。そのため、類似体は、基準化合物と機能及び外観が類似しているか又は同等であるが、構造又は起源が異なる化合物である。

本方法によって治療される「患者」、「対象」、又は「宿主」は、哺乳動物、魚、鳥、爬虫類、若しくは両生類などの、ヒト又は非ヒト動物のいずれかを意味し得る。そのため、本明細書に開示される方法の対象は、ヒト、非ヒト霊長類、馬、豚、ウサギ、犬、羊、山羊、牛、猫、モルモット又は齧歯類であり得る。この用語は、特定の年齢又は性別を示すものではない。そのため、雄又は雌に関係なく、成人及び新生児対象、並びに胎児が含まれることが意図される。一態様において、対象は哺乳動物である。患者は、疾患又は障害に罹患した対象を指す。

用語「予防的」又は「治療的」処置は、当技術分野で認められており、本組成物の１以上を宿主に投与することを含む。望ましくない病態の臨床徴候の前に投与される場合、処置は予防的であり、すなわち、それは望ましくない病態の発症に対して宿主を保護するが、望ましくない病態の徴候の後に投与される場合、処置は治療的である（すなわち、既存の望ましくない病態又はその副作用を軽減、寛解、又は安定化することが意図される）。

「減少する」又は「増加する」は、それぞれ少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％、又は１００％の負又は正の変化を意味する。

用語「治療剤」、「薬物」、「医薬品」及び「生理活性物質」は、当技術分野で認められており、疾患若しくは病態を治療するために患者又は対象において局所的又は全身的に作用する生物学的、生理学的、又は薬理学的活性のある物質である分子及び他の薬剤を含む。この用語は、限定されないが、その医薬として許容し得る塩及びプロドラッグを含む。そのような薬剤は、酸性、塩基性、又は塩であり得、それらは中性分子、極性分子、又は水素結合可能な分子錯体であり得、それらは、患者又は対象に投与される場合、生物学的に活性化されるエーテル、エステル、及びアミドなどの形態のプロドラッグであり得る。

語句「治療有効量」又は「医薬として有効な量」は、当技術分野で認められている用語である。特定の実施形態では、この用語は、何らかの医療処置に適用可能な合理的利益／リスク比でいくつかの所望の効果をもたらす、治療剤の量を指す。特定の実施形態では、この用語は、特定の治療レジメンの標的を除去、低減若しくは維持するのに必要な又は十分なその量を指す。有効量は、治療される疾患若しくは病態、投与される特定の標的化構築物、対象の大きさ又は疾患若しくは病態の重篤度などの要因に応じて変化し得る。当業者は、過度の実験を必要とせずに特定の化合物の有効量を経験的に決定し得る。特定の実施形態では、インビボ使用のための治療有効量の治療剤は、ポリマーの化学的かつ物理的特性に部分的に依存する、ポリマーマトリックスからの薬剤の放出速度；薬剤のアイデンティティ；投与様式及び投与方法；並びに薬剤に加えてポリマーマトリックスに組み込まれる任意の他の材料を含む、多数の要因に依存する可能性がある。

本明細書全体を通して、組成物が、特定の成分を有する、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、又は含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）と記載される場合、組成物はまた、列挙される成分から本質的になる、又は列挙される成分からなることが企図される。同様に、方法又はプロセスが、特定のプロセス工程を有する、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、又は含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）と記載される場合、このプロセスはまた、列挙されるプロセス工程から本質的になる、又は列挙されるプロセス工程からなる。さらに、工程の順番又は特定の行動を実行するための順番は、本明細書に記載の組成物及び方法が操作可能の状態である限り重要ではないと理解されるべきである。さらに、２以上の工程又は行動を同時に行うことができる。

用語「小分子」は、当技術分野で認められている用語である。特定の実施形態では、この用語は、約２０００ａｍｕ未満、又は約１０００ａｍｕ未満、さらに約５００ａｍｕ未満の分子量を有する分子を指す。

用語「野生型」又は「野生型立体構造」は、タンパク質機能が野生型タンパク質機能に対して改変されるように、タンパク質の立体構造又は形状に影響するアミノ酸配列中に存在する変異を含まないタンパク質の３次元構造又は形状を指す。オプシンについては、野生型立体構造は、Ｐ２３Ｈ（Ｐ２３Ｈオプシン）と命名された変異などの、ミスフォールディングを引き起こす変異を含まない立体構造である（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ０００５３９及びＮＰ０００５３０参照）（プロリンがＮ末端から始まる残基２３でヒスチジンに置換されていることを意味する）。「野生型立体構造」のオプシンは、レチノイド結合、視覚サイクル機能、及び光受容体膜への挿入を含むが、これらに限定されないオプシンの生物学的機能が可能である。

「誤って折り畳まれたオプシンタンパク質」とは、誤って折り畳まれたタンパク質が、野生型タンパク質に関連付けられる１以上の生物学的活性を欠いているように野生型タンパク質の立体構造と三次構造が異なるタンパク質を意味する。

「Ｐ２３Ｈロドプシン」は、Ｐ２３Ｈロドプシンの任意の核酸又はタンパク質を意味する。

特に示さない限り、本明細書で使用する全ての割合及び比率は、重量基準である。

本明細書に記載の実施形態は、それを必要とする対象において、誤って折り畳まれた眼タンパク質に関連付けられるか、又はそれによって引き起こされる遺伝性眼障害を治療する化合物及び方法に関する。誤って折り畳まれたオプシンタンパク質などの、誤って折り畳まれた眼タンパク質を減少させることは、誤って折り畳まれた眼タンパク質に関連付けられるか、又はそれによって引き起こされる遺伝性の眼障害を有する対象において杆体視細胞を保存又は救助するための有効な戦略であり得ることが見出された。小分子ハイスループットスクリーニングアッセイを使用して、対応する野生型タンパク質に影響を与えることなく、誤って折り畳まれた変異眼タンパク質を選択的に減少させる化合物を特定した。これらの化合物は、誤って折り畳まれた眼タンパク質のクリアランスを促進するか、又は分解を加速させ、視覚機能を保存し、かつ遺伝性眼障害に関連する光受容体死を防止することが見出された。

いくつかの実施形態では、それを必要とする対象における誤って折り畳まれた眼タンパク質に関連付けられるか、又はそれによって引き起こされる遺伝性眼障害を治療する方法は、それを必要とする対象における誤って折り畳まれた眼タンパク質のクリアランスを促進する治療有効量の化合物を該対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、細胞中の対応する野生型眼タンパク質ではなく、誤って折り畳まれた変異眼タンパク質（例えば、誤って折り畳まれた変異オプシン又はロドプシン）の分解を促進した化合物が選択され得る。本明細書に記載のハイスループットスクリーニングアッセイを用いて、細胞中の対応する野生型眼タンパク質ではなく、誤って折り畳まれた変異眼タンパク質（例えば、誤って折り畳まれた変異オプシン又はロドプシン）の分解を促進したと特定された化合物、それらの医薬として許容し得る塩、互変異性体、若しくは溶媒和物、又はそれらの組み合わせは、

から選択される。

いくつかの実施形態では、遺伝性眼障害は、誤って折り畳まれた眼タンパク質に関連付けられるか、又はそれによって引き起こされる非症候性網膜障害である。例えば、非症候性網膜障害は、誤って折り畳まれた眼タンパク質に関連付けられるか、又はそれによって引き起こされる非症候性常染色体優性網膜色素変性症（ａｄＲＰ）であり得る。

他の実施形態では、該化合物、それらの医薬として許容し得る塩、互変異性体、若しくは溶媒和物、又はそれらの組み合わせは、

から選択され得る。

都合の良いことに、該化合物は、

又は、その医薬として許容し得る塩、互変異性体、若しくは溶媒和物であり得る。この式を有する化合物は、メトトレキサートとも呼ばれる。メトトレキサートは、Ｎ－［４－［（２，４－ジアミノ－６－プテリジニル）メチル]メチルアミノ]ベンゾイル］－Ｌ－グルタミン酸としても知られている非天然の化学物質である。

特定の実施形態では、本明細書に記載の化合物は、対象における網膜色素変性症（ＲＰ）又は常染色体優性網膜色素変性症（ＡｄＲＰ）の治療、予防、改善、又はその進行を遅延させる方法で使用することができる。本方法は、本明細書に記載の化合物を対象に投与することによって、対象における網膜色素変性症（ＲＰ）又は常染色体優性網膜色素変性症（ＡｄＲＰ）の治療、予防、改善、又はその進行を遅延させることを含むことができる。

他の実施形態では、本明細書に記載の化合物は、Ｐ２３Ｈロドプシン変異対立遺伝子を有するか、又は常染色体優性網膜色素変性症（ＡｄＲＰ）などの網膜色素変性症（ＲＰ）を有する対象における視覚機能、視野、光受容細胞機能、ＥＲＧ応答、若しくは視力を改善又は保存する方法で使用することができる。本方法は、本明細書に記載の化合物を対象に投与することを含むことができる。特定の実施形態では、Ｐ２３Ｈロドプシン変異対立遺伝子を有するか、又は常染色体優性網膜色素変性症（ＡｄＲＰ）などの網膜色素変性症（ＲＰ）を有する対象における光受容細胞喪失及び／又は網膜外核層（ＯＮＬ）の劣化を阻害、防止、又はその進行を遅延させる方法は、本明細書に記載の化合物を該対象に投与することを含む。

いくつかの実施形態では、誤って折り畳まれた眼タンパク質は、誤って折り畳まれたオプシンである。本方法は、インビトロ又はインビボで実施することができ、オプシンタンパク質は、緩衝液などの培地中に存在するか、又は細胞内に含まれていてもよい。このような細胞は、一般に、ヒト細胞などの哺乳動物細胞であり、選択した生化学的又は生理学的特性を有する組換え細胞又は細胞株の一部であってもよい。一実施形態では、細胞は、網膜細胞などの眼細胞である。細胞は、脊椎動物又は哺乳動物（例えば、ヒト）の光受容細胞（例えば、杆体細胞、錐体細胞）であり得る。一実施形態では、杆体細胞は、ヒトの眼などの哺乳動物の眼に存在する。

具体的な実施形態では、誤って折り畳まれたオプシンタンパク質は、そのアミノ酸配列に変異を含むことができる。例えば、誤って折り畳まれた変異オプシンタンパク質は、誤って折り畳まれた変異ロドプシンであり得、変異は、Ｐ２３Ｈ、Ｃ１１０Ｙ、Ｄ１９０Ｎ、Ｔ１７Ｍ、Ｐ３４７Ｓ、又はＰ２６７Ｌのうちの少なくとも１つである。

本明細書に記載の他の実施形態は、哺乳動物の眼における光受容体機能の喪失を改善する方法であって、変異オプシンタンパク質のクリアランスを促進する本明細書に記載の治療有効量の化合物を、１１－シス－レチナールに対する親和性が低下した変異オプシンタンパク質に苦しむ哺乳動物に投与することによって、前記哺乳動物の眼における光受容体機能の喪失を改善する方法に関する。一実施形態では、接触は、本明細書に記載の化合物を、光受容体機能の低下に苦しむ哺乳動物に投与することによって生じる。

いくつかの実施形態では、このような光受容体機能の喪失は、部分的な喪失又は完全な喪失であり得、部分的な喪失は、１％の喪失～９９％の喪失の間の任意の程度であり得る。加えて、このような喪失は、変異がＰ２３Ｈ変異であるような、オプシンのミスフォールディングを引き起こす変異の存在によるものであり得る。

別の実施形態では、オプシン結合剤を投与して、誤って折り畳まれたオプシンタンパク質の誤った局在化に関連する眼の病態を改善することができる。一実施形態では、誤って局在化したオプシンタンパク質を有する対象に本明細書に記載の化合物を投与すると、誤って局在化したオプシンタンパク質のクリアランスが促進される。したがって、本明細書に記載の方法及び化合物は、誤って折り畳まれたオプシンタンパク質と関連付けられるオプシンの誤った局在化に関連する眼の病態を予防又は治療するのに有用である。

任意に、本明細書に記載の化合物は、別の治療剤と共に投与することができる。例えば、本明細書に記載の化合物は、合成レチノイドと組み合わせて使用することができ（例えば、米国特許公開第２００４－０２４２７０４号に開示されている）、任意に別の活性化合物（例えば、本明細書で説明される）と組み合わせて使用することができる。さらに別の実施形態では、本明細書に記載の化合物は、変異Ｐ２３Ｈオプシンタンパク質のクリアランスを促進することができる任意の他の薬剤と組み合わせて投与することができる。

本明細書に記載の方法で使用される化合物は、例えば、眼、非経口、皮下、静脈内、関節内、髄腔内、筋肉内、腹腔内、及び皮内注射などの局所的及び全身的送達方法を含むか、又は硝子体内注射、眼内注射又は眼周囲注射による標準的送達方法を用いて対象に投与することができる。特定の対象に使用される特定の手法及び投与量は、例えば、対象の一般的な健康、体重及び年齢を含むいくつかの要因に依存する。これらなどの要因に基づいて、医療従事者は治療への適切な手法を選択することができる。

本明細書で使用する用語「治療する」又は「治療」は、症状の重篤度及び／又は頻度の低下、症状及び／又は根本原因の除去、症状の発生及び／又はそれらの根本原因の予防、並びに疾患の改善（ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ）又は改善（ｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎ）を指す。このような治療は、必ずしも完全に疾患を改善する必要はない。例えば、本明細書に記載の化合物の投与による網膜変性を有する対象の治療は、疾患の抑制又は疾患の退行を引き起こすことを包含することができる。さらに、このような治療は、当業者に公知の網膜変性のための他の伝統的な治療と組み合わせて使用することができる。

本明細書に記載の方法による治療は、眼障害の状態に依存して、対象において変更、停止、又は再び開始することができる。治療は、当業者が適切であると決定した間隔で実施することができる。例えば、投与は、１日に１回、２回、３回、又は４回実施することができる。いくつかの実施形態では、網膜変性の誘発が生じた後に、該化合物を投与することができる。

治療方法は、治療有効量の本明細書に記載の化合物を対象に投与することを含むことができる。例えば、本明細書に記載の方法に使用するための医薬組成物は、対象の体重１ｋｇ当たり０．０１～１，０００ｍｇ／ｋｇの範囲、より好ましくは患者の体重１ｋｇ当たり約１０～１００ｍｇの範囲で投与量中に治療有効量の化合物又はその塩を有することができる。

上記（及びその他）の投与様式で使用するための医薬化合物の製剤は、当技術分野において公知であり、例えば、レミントンの薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）（第１８版）、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ（編），１９９０，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ,Ｐａ．に記載されている（例えば、Ｍ．Ｊ．Ｒａｔｈｂｏｎｅ（編），経口粘膜薬物送達（Ｏｒａｌ Ｍｕｃｏｓａｌ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、Ｄｒｕｇｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｓｅｒｉｅｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．,１９９６；Ｍ．Ｊ．Ｒａｔｈｂｏｎｅら（編），改変放出薬物送達技術（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ－Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）, Ｄｒｕｇｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｓｅｒｉｅｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，２００３；Ｇｈｏｓｈら（編），口腔への薬物送達（Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｏ ｔｈｅ Ｏｒａｌ Ｃａｖｉｔｙ）, Ｄｒｕｇｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｓｅｒｉｅｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，２００５；及びＭａｔｈｉｏｗｉｔｚら（編），生体接着薬物送達システム（Ｂｉｏａｄｈｅｓｉｖｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ），Ｄｒｕｇｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｓｅｒｉｅｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９９９も参照されたい）。本発明の化合物は、医薬として許容し得る非毒性賦形剤及び担体を含む医薬組成物に製剤化することができる。賦形剤は、有効成分又は複数の有効成分以外に医薬製剤中に存在する全ての成分である。適切な賦形剤及び担体は、安全で効果的であると考えられ、望ましくない生物学的副作用、又は他の薬物との望ましくない相互作用を引き起こさずに個体に投与され得る物質で構成することができる。適切な賦形剤及び担体は、薬剤のバイオアベイラビリティ及び性能に影響を及ぼさない物質で構成されるものである。本明細書で一般的に使用されるように、「賦形剤」には、界面活性剤、乳化剤、乳化安定剤、皮膚軟化剤、緩衝剤、溶媒、染料、香味剤、結合剤、充填剤、滑剤、及び防腐剤が含まれるが、これらに限定されない。適切な賦形剤には、「医薬賦形剤のハンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ）」、第４版、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ，２００３などの当技術分野で一般に知られているものが含まれる。

医薬組成物は、対象への投与に悪影響を与えない限り、必要に応じて、血漿タンパク質、プロテアーゼ、及び他の生物学的物質を含む、１以上の追加のタンパク質を任意にさらに含んでよい。適切なタンパク質又は生体物質は、公知の、当業者に利用できる精製方法のいずれかによってヒト又は哺乳動物の血漿から；標準的な組換えＤＮＡ技術に従って導入されたヒト又は哺乳動物の血漿タンパク質を発現する遺伝子を含む上清、抽出物、又は組換え組織培養物の溶解物、ウイルス、酵母、細菌などから；又は流体（例えば、血液、ミルク、リンパ、尿など）若しくは標準的なトランスジェニック技術に従って導入されたヒト血漿タンパク質を発現する遺伝子を含むトランスジェニック動物から取得され得る。

医薬組成物は、約５．０～約８．０の範囲などの生理学的ｐＨを反映する所定のレベルで製剤のｐＨを維持するための１以上のｐＨ緩衝化合物を含むことができる。水性液体製剤に使用されるｐＨ緩衝化合物は、ヒスチジンなどのアミノ酸若しくはアミノ酸の混合物又はヒスチジンとグリシンなどのアミノ酸の混合物であり得る。あるいは、ｐＨ緩衝化合物は、好ましくは、約５．０～約８．０の範囲などの所定のレベルで製剤のｐＨを維持するが、カルシウムイオンをキレートしない薬剤である。このようなｐＨ緩衝化合物の例示的な例には、イミダゾール及び酢酸イオンが含まれるが、これらに限定されない。ｐＨ緩衝化合物は、製剤のｐＨを所定のレベルで維持するのに適する任意の量で存在し得る。

医薬組成物はまた、１以上の浸透圧調節剤、すなわち、製剤の浸透性（例えば、張力性、浸透圧（ｏｓｍｏｌａｌｉｔｙ）、及び／又は浸透圧（ｏｓｍｏｔｉｃ ｐｒｅｓｓｕｒｅ））を、レシピエント個体の血流及び血液細胞に許容し得るレベルに調節する化合物を含むことができる。浸透圧調節剤は、カルシウムイオンをキレートしない薬剤であり得る。浸透圧調節剤は、製剤の浸透性を調節する当業者に知られているか又は利用可能である任意の化合物であり得る。当業者は、本発明の製剤に使用するための所定の浸透圧調節剤の適性を経験的に決定し得る。適切な種類の浸透圧調節剤の代表的な例には、塩化ナトリウム及び酢酸ナトリウムなどの塩類；スクロース、デキストロース、及びマンニトールなどの糖類；グリシンなどのアミノ酸類；並びにこれらの薬剤及び／又はこれらの種類の薬剤の１以上の混合物が含まれるが、これらに限定されない。浸透圧調節剤（複数可）は、製剤の浸透性を調節するのに十分な任意の濃度で存在し得る。

本明細書に記載の化合物を含む組成物は、カルシウムイオン、マグネシウムイオン及び／又はマンガンイオンなどの多価金属イオンを含むことができる。組成物を安定化させ、レシピエント個体に悪影響を及ぼさない任意の多価金属イオンが使用され得る。当業者は、これらの２つの基準に基づいて、経験的に適切な金属イオンを決定することができ、そのような金属イオンの適切な供給源は公知であり、無機塩及び有機塩を含む。

他の送達系は、時間放出、遅延放出又は持続放出送達システムを含むことができる。そのようなシステムは、組成物の繰り返し投与を避けることができ、対象及び医師の利便性を高めることができる。多くの種類の放出送達システムが利用可能であり、当業者に公知である。それらには、ポリラクチドなどのポリマー塩基系（米国特許第３，７７３，９１９号；欧州特許５８，４８１）、ポリ（ラクチド－グリコリド）、コポリオキサレートポリカプロラクトン、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリ－Ｄ－（－）－３－ヒドロキシ酪酸（欧州特許１３３，９８８）などのポリヒドロキシ酪酸、Ｌ－グルタミン酸とガンマ－エチル－Ｌ－グルタメートのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎ，Ｋ Ｒ．ら，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２：５４７－５５６）、ポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート）又はエチレンビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒ，ｆｔら，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：２６７－２７７；Ｌａｎｇｅｒ，Ｂ．Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８－１０５）、及びポリ無水物が含まれる。

徐放組成物の他の例には、成形品、例えば、フィルム、又はマイクロカプセルの形態の半透過性ポリマーマトリックスが含まれる。送達システムには、コレステロール、コレステロールエステル及び脂肪酸などのステロール類又はモノ－、ジ－及びトリ－グリセリドなどの中性脂肪を含む脂質類；生物学的に誘導される生体再吸収性ヒドロゲルなどのヒドロゲル放出システム（すなわち、キチンヒドロゲル又はキトサンヒドロゲル）；シラスティック系；ペプチドベース系；ワックスコーティング；慣用の結合剤及び賦形剤を用いた圧縮錠剤；部分的に微細化したインプラントなどである非ポリマー系も含まれる。具体的な例には、（ａ）薬剤が、１３．５．米国特許第４，４５２，７７５号、同第４，６６７，０１４号、同第４，７４８，０３４号及び同第５，２３９，６６０号に記載のものなどのマトリックス内の形態に含まれている浸食系、並びに（ｂ）有効成分が、米国特許第３，８３２，２５３号及び同第３，８５４，４８０号に記載のものなどのポリマーから制御された速度で浸透する拡散システムが含まれるが、これらに限定されない。

本明細書に記載の化合物を含む組成物は、網膜色素変性症などの眼疾患又は病態の治療に特に適している。

１つの手法では、該組成物は、眼の硝子体への直接注入に適する眼装置を通して投与することができる。該組成物は、例えば、米国特許第５，６７２，６５９号及び第５，５９５，７６０号に記載のものなどの徐放性組成物中に提供されてもよい。このような装置は、有害な局所的及び全身的副作用の危険性なく、眼を治療するための様々な組成物の持続制御放出を提供することが見出されている。眼への送達方法の目的は、インプラントの持続時間を延長するために、眼内デバイス又はインプラントに含まれる薬物の量を最大にしながら、その大きさを最小にすることである。例えば、米国特許第５，３７８，４７５号、同第６，３７５，９７２号、及び同第６，７５６，０５８号及び米国特許公開第２００５００９６２９０号及び同第２００５０１２６９４４８号を参照されたい。このようなインプラントは、生分解性及び／又は生体適合性インプラントであり得るか、又は非生分解性インプラントであり得る。

生分解性眼インプラントは、例えば、米国特許公開第２００５００４８０９９号に記載されている。インプラントは、活性剤に対して透過性又は不透過性であり得、前部又は後部チャンバーなどの眼のチャンバー内に挿入されるか、又は強膜、経脈絡膜腔、若しくは硝子体の外側の無血管領域内に移植され得る。あるいは、本発明の組成物のデポーとして作用するコンタクトレンズが、薬物送達のために使用され得る。

いくつかの実施形態では、インプラントは、治療の所望の部位、例えば、眼内空間及び眼の斑への薬物の経強膜拡散を可能にするために、強膜上などの無血管領域上に配置され得る。さらに、経強膜拡散の部位は、好ましくは、斑に近接している。本発明の組成物の送達のためのインプラントの例には、全てが参照により本明細書に組み込まれる米国特許第３，４１６，５３０号、同第３，８２８，７７７号、同第４，０１４，３３５号、同第４，３００，５５７号、同第４，３２７，７２５号、同第４，８５３，２２４号、同第４，９４６，４５０号、同第４，９９７，６５２号、同第５，１４７，６４７号、同第１６４，１８８号、同第５，１７８，６３５号、同第５，３００，１１４号、同第５，３２２，６９１号、同第５，４０３，９０１号、同第５，４４３，５０５号、同第５，４６６，４６６号、同第５，４７６，５１１号、同第５，５１６，５２２号、同第５，６３２，９８４号、同第５，６７９，６６６号、同第５，７１０，１６５号、同第５，７２５，４９３号、同第５，７４３，２７４号、同第５，７６６，２４２号、同第５，７６６，６１９号、同第５，７７０，５９２号、同第５，７７３，０１９号、同第５，８２４，０７２号、同第５，８２４，０７３号、同第５，８３０，１７３号、同第５，８３６，９３５号、同第５，８６９，０７９号、同第５，９０２，５９８号、同第５，９０４，１４４号、同第５，９１６，５８４号、同第６，００１，３８６号、同第６，０７４,６６１号、同第６，１１０，４８５号、同第６，１２６，６８７号、同第６，１４６．３６６号、同第６，２５１，０９０号、及び同第６，２９９，８９５号、並びにＷＯ０１／３０３２３及びＷＯ０１／２８４７４に記載の装置を含むが、これらに限定されない。

眼送達のための他の手法には、本明細書に記載の化合物を網膜色素上皮細胞及び／又はＢｒｕｃｈ膜に標的化するリポソームの使用が含まれる。例えば、該化合物は、上記の方法でリポソームと複合化され、この化合物／リポソーム複合体は、該化合物を所望の眼組織又は細胞に向かわせるために、網膜色素変性症などの眼障害を有する患者に静脈内注射を用いて注射され得る。網膜色素上皮細胞又はＢｒｕｃｈ膜の近傍にリポソーム複合体を直接注入することはまた、網膜色素変性症などのいくつかの眼障害形態に複合体の標的化を提供することができる。具体的な実施形態では、該化合物は、眼内持続送達（ＶＩＴＲＡＳＥＲＴ又はＥＮＶＩＳＩＯＮ）を介して投与される。具体的な実施形態では、該化合物は、後部サブテノン注射によって送達される。別の具体的な実施形態では、本発明の組成物を含むマイクロエマルジョン粒子は、Ｂｒｕｃｈ膜、網膜色素上皮細胞、又はその両方から脂質をとるために眼組織に送達される。

本明細書に記載の化合物を含む組成物は、局所的に送達され得る。局所送達のために、該組成物は、眼送達のために承認される任意の医薬として許容し得る賦形剤に提供される。好ましくは、該組成物は、点眼形態で眼の表面に送達される。いくつかの用途では、該組成物の送達は、角膜を通して眼の内部への化合物の拡散に依存する。

一実施例では、本明細書に記載の化合物は、対象の眼に投与することができる眼科用製剤中に提供することができる。眼科用製剤は、医薬として許容し得る溶液、懸濁液又は軟膏中に化合物を含むことができる。濃度のいくつかの変化は、使用される特定の化合物、治療される対象の状態などに依存して必然的に起こり、治療に責任のある人が、個々の対象について最も適する濃度を決定する。眼科用製剤は、所望であれば、追加の成分、例えば、防腐剤、緩衝剤、張度剤、浸透圧剤、酸化防止剤、安定剤、非イオン性湿潤剤又は清澄剤、及び増粘剤を含む滅菌水溶液の形態であり得る。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法で使用される組成物は、メトトレキサートを含むことができる。メトトレキサートを含む組成物は、繰り返される注射用に製剤化することができる。

いくつかの実施形態では、メトトレキサートは持続放出用に製剤化される。多くのメトトレキサートの徐放性製剤は、当技術分野で公知であり、脂質封入製剤などの生分解性インプラント、例えば、Ｂｏｎｅｔｔｉら，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ３３：３０３－３０６（１９９４）に記載の「デポー／メトトレキサート（Ｄｅｐｏ／Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）及びＣｈａｔｅｌｕｔら，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．１９９４ Ｍａｒｃｈ；８３（３）：４２９－３２；例えば、ＷＯ２０１１１４３４８４に記載のメトトレキサート（ＭＴＸ）の多小胞リポソーム（ＭＶＬ）製剤；例えば、Ｖｉｊａｙａｒａｇａｖａｎら，Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ ３（１）：３９－４４（２０１１）に記載のナノ又はマイクロ粒子、例えば、α－ラクトアルブミン微粒子又はＴａｈｅｒｉら，Ｊ Ｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２０１１（ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１５５／２０１１／７６８２０１）に記載のコンジュゲートメトトレキサートーヒト血清アルブミンのナノ粒子；ポリイオン複合体（ＰＩＣ）ミセル；ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）及びポリアクリル酸（ＰＡＡ）誘導体などの生体接着性ポリマー、並びにヒアルロン酸（ＨＡ）、例えば、可溶性ヒドロキシプロピルセルロースの眼用のインサートであるＬａｃｒｉｓｅｒｔ（Ａｔｏｎ Ｐｈａｒｍａ）を含むが、これに限定されない。

あるいは、又は加えて、徐放は、例えば、Ｐａｌａｋｕｒｔｈｉら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｅｙｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３５（１２）：１１０５－１１１５（２０１０）に記載の、若しくはＲｅｔｉｓｅｒｔ（Ｂａｕｓｃｈ ＆ Ｌｏｍｂ）、Ｏｚｕｒｄｅｘ（Ａｌｌｅｒｇａｎ）と類似の硝子体内インプラントなどの徐放性デバイス；又は例えば、Ｉｌｕｖｉｅｎ（Ａｌｉｍｅｒａ）若しくはＶｉｔｒａｓｅｒｔ（Ｂａｕｓｃｈ ＆ Ｌｏｍｂ）インプラントと類似の非生分解性インプラント；Ｉ－ｖａｔｉｏｎプラットフォーム（ＳｕｒＭｏｄｉｃｓ Ｉｎｃ．）を使用して達成され得る。Ｌｅｅら，Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．２７（１０）：２０４３－５３（２０１０）；Ｈａｇｈｊｏｕら，Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ Ｖｉｓ Ｒｅｓ．６（４）：３１７－３２９（２０１１）；Ｋｉｍら，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．４５（８）：２７２２－２７３１（２００４）；並びにＶｅｌｅｚ及びＷｈｉｔｃｕｐ，Ｂｒ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ ８３：１２２５－１２２９（１９９９）も参照されたい。

上記の本明細書に記載の化合物を含む組成物は、治療有効量又は有効量で投与することができる。用語「治療有効量」は、例えば、網膜変性関連疾患又は障害（例えば、網膜色素変性症）を有する対象の治療に有効な量（用量）を指す。治療有効量は、様式又は投与、治療される特定の状態及び所望の結果に依存する。それはまた、対象の病態のステージ、年齢及び身体状態、同時治療の性質、もしあれば、医療従事者に周知の同様の要因に依存し得る。治療用途では、医学的に望ましい結果を達成するのに十分な量である。

網膜色素変性症に罹患している対象に関して、有効量は、細胞中の誤って折り畳まれたオプシンタンパク質のクリアランスを促進するのに十分である。誤って折り畳まれたタンパク質に関連する疾患又は障害を有する対象に関して、有効量は、網膜色素変性症などの病理に関連付けられる症状を安定化、緩慢、又は低下させるのに十分な量である。

いくつかの実施形態では、対象に投与される治療有効量の化合物は、誤って折り畳まれた眼タンパク質の分解を加速させ、眼タンパク質ホメオスタシスを改善し、視覚機能を改善若しくは保存し、光受容細胞死を阻害し、かつ／又は網膜構造を改善若しくは保存するのに有効な量である。

いくつかの実施形態では、視覚機能における改善又は保存には、明順応網膜電図（ＥＲＧ）応答の改善又は保存が含まれる。他の実施形態では、網膜構造における改善又は保存は、外核層（ＯＮＬ）の厚さの改善又は保存である。

一般に、本発明の化合物の用量は、１日当たり約０．０１ｍｇ／ｋｇ～１日当たり約１０００ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．０１、０．０５、０．１、０．２５、０．５、１．０、５、１０、１５、２０、２５）である。約５０～約２０００ｍｇ／ｋｇの範囲の用量（例えば、５０、１００、２００、２５０、５００、７５０、１０００、１２５０、１５００、１７５０、２０００）が適していることが予想される。より低い用量は、静脈内投与などの特定の投与形態から生じる。対象における応答が適用される初期用量で不十分である場合には、より高い用量（又は異なる、より局所的な送達経路によって効果的により高い用量）が、患者の慣用が許容する程度まで使用され得る。本明細書に記載の化合物を含む組成物の適切な全身レベルを達成するために、１日当たり複数回の用量が企図される。

当業者は、動物モデルと比較してヒトの投与量を修正することが当技術分野で日常的であることを認識しているので、ヒトの投与量は、マウスで使用される化合物の量から推定することによって、最初に決定することができる。特定の実施形態では、投与量は、約１０～１０００ｍｇ（例えば、約２０ｍｇ～１，０００ｍｇ、３０ｍｇ～１，０００ｍｇ、４０ｍｇ～１，０００ｍｇ、５０ｍｇ～１，０００ｍｇ、６０ｍｇ～１，０００ｍｇ、７０ｍｇ～１，０００ｍｇ、８０ｍｇ～１，０００ｍｇ、９０ｍｇ～１，０００ｍｇ、約１０～９００ｍｇ、１０～８００ｍｇ、１０～７００ｍｇ、１０～６００ｍｇ、１０～５００ｍｇ、１００～１０００ｍｇ、１００～９００ｍｇ、１００～８００ｍｇ、１００～７００ｍｇ、１００～６００ｍｇ、１００～５００ｍｇ、１００～４００ｍｇ、１００～３００ｍｇ、２００～１０００ｍｇ、２００～９００ｍｇ、２００～８００ｍｇ、２００～７００ｍｇ、２００～６００ｍｇ、２００～５００ｍｇ、２００～４００ｍｇ、３００～１０００ｍｇ、３００～９００ｍｇ、３００～８００ｍｇ、３００～７００ｍｇ、３００～６００ｍｇ、３００～５００ｍｇ、４００ｍｇ～１，０００ｍｇ、５００ｍｇ～１，０００ｍｇ、１００ｍｇ～９００ｍｇ、２００ｍｇ～８００ｍｇ、３００ｍｇ～７００ｍｇ、４００ｍｇ～７００ｍｇ、及び５００ｍｇ～６００ｍｇ）の範囲の量で変化し得ることが想定される。いくつかの実施形態では、該化合物は、約１０ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、１５０ｍｇ、２００ｍｇ、２５０ｍｇ、３００ｍｇ、３５０ｍｇ、４００ｍｇ、４５０ｍｇ、５００ｍｇ、５５０ｍｇ、６００ｍｇ、６５０ｍｇ、７００ｍｇ、７５０ｍｇ、８００ｍｇ以上の量で存在する。いくつかの実施形態では、１５－ＰＧＤＨ阻害剤は、約１０００ｍｇ、９５０ｍｇ、９００ｍｇ、８５０ｍｇ、８００ｍｇ、７５０ｍｇ、７００ｍｇ、６５０ｍｇ、６００ｍｇ、５５０ｍｇ、５００ｍｇ、４５０ｍｇ、４００ｍｇ、３５０ｍｇ、３００ｍｇ、２５０ｍｇ、２００ｍｇ、１５０ｍｇ、又は１００ｍｇ以下の量で存在する。

他の実施形態では、化合物の治療有効投与量は、例えば、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重～５００ｍｇ／ｋｇ体重、例えば、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重～４００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重～３００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重～２００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重～９０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重～８０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重～７０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重～６０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重～５０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重～４０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重～３０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重～２５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重～２０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重～１５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重～１０ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。

さらに他の実施形態では、治療有効投与量は、例えば、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重～０．１ｍｇ／ｋｇ体重、例えば、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重～０．０９ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重～０．０８ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重～０．０７ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重～０．０６ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重～０．０５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重～０．０４ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重～０．０３ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重～０．０２ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重～０．０１９ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重～０．０１８ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重～０．０１７ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重～０．０１６ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重～０．０１５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重～０．０１４ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重～０．０１３ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重～０．０１２ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重～０．０１１ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重～０．０１ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重～０．００９ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重～０．００８ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重～０．００７ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重～０．００６ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重～０．００５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重～０．００４ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重～０．００３ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重～０．００２ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。いくつかの実施形態では、治療有効用量は、０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重、０．０００２ｍｇ／ｋｇ体重、０．０００３ｍｇ／ｋｇ体重、０．０００４ｍｇ／ｋｇ重量、０．０００５ｍｇ／ｋｇ重量、０．０００６ｍｇ／ｋｇ重量、０．０００７ｍｇ／ｋｇ重量、０．０００８ｍｇ／ｋｇ重量、０．０００９ｍｇ／ｋｇ重量、０．００１ｍｇ／ｋｇ重量、０．００２ｍｇ／ｋｇ重量、０.００３ｍｇ／ｋｇ体重、０．００４ｍｇ／ｋｇ体重、０．００５ｍｇ／ｋｇ体重、０．００６ｍｇ／ｋｇ体重、０．００７ｍｇ／ｋｇ体重、０．００８ｍｇ／ｋｇ体重、０．００９ｍｇ／ｋｇ体重、０．０１ｍｇ／ｋｇ体重、０.０２ｍｇ／ｋｇ体重、０．０３ｍｇ／ｋｇ体重、０．０４ｍｇ／ｋｇ体重、０．０５ｍｇ／ｋｇ体重、０．０６ｍｇ／ｋｇ体重、０．０７ｍｇ／ｋｇ体重、０．０８ｍｇ／ｋｇ体重、０．０９ｍｇ／ｋｇ体重、又は０．１ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。特定の個体の有効用量は、個体の必要性に応じて経時的に変化（例えば、増加又は減少）させることができる。

いくつかの実施形態では、治療有効投与量は、１０μｇ／ｋｇ／日、５０μｇ／ｋｇ／日、１００μｇ／ｋｇ／日、２５０μｇ／ｋｇ／日、５００μｇ／ｋｇ／日、１０００μｇ／ｋｇ／日又はそれ以上の投与量であり得る。様々な実施形態では、１５－ＰＧＤＨ阻害剤又はその医薬塩の量は、０．０１μｇ／ｋｇ～１０μｇ／ｋｇ、０．１μｇ／ｋｇ～５μｇ／ｋｇ、０．１μｇ／ｋｇ～１０００μｇ／ｋｇ、０．１μｇ／ｋｇ～９００μｇ／ｋｇ、０．１μｇ／ｋｇ～９００μｇ／ｋｇ、０．１μｇ／ｋｇ～８００μｇ／ｋｇ、０．１μｇ／ｋｇ～７００μｇ／ｋｇ、０．１μｇ／ｋｇ～６００μｇ／ｋｇ、０．１μｇ／ｋｇ～５００μｇ／ｋｇ、又は０．１μｇ／ｋｇ～４００μｇ／ｋｇの投与量を患者に提供するのに十分である。

一態様では、有効量の化合物を含む医薬組成物は、少なくとも２回投与される。別の態様では、医薬組成物は少なくとも５回投与される。さらに別の態様では、医薬組成物は少なくとも１０回投与される。当業者は、治療されている特定の疾患又は障害に基づいて組成物を投与する頻度、又は対象が従来の治療にどのように応答したかを判断することができる。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の化合物は、非症候性常染色体優性網膜色素変性症の初期段階又は中間段階で対象に投与することができる。網膜色素変性疾患の過程は、３段階、すなわち初期段階、中間段階、及び最終段階に都合よく分割することができる。

初期段階では、夜間の失明が主症状である。それは、人生の最初の年から存在し得るか、又は２０年間又はそれ以降に出現し得る。この段階では、薄暗い光に周辺視野欠陥が存在する可能性がある。しかし、これらの欠陥は存在しないか、又は日中は最小であるため、患者は正常な生活習慣を有し、疾患は安定であると思われ得る。特に家族の病歴がない場合（症例の約半分）、この段階で診断を確立することは困難である。視力は正常であるか、又は亜正常である。骨片状色素沈着物が存在しないか、又は稀であるので、眼底検査は正常であるように思われ得る。さらに、網膜細動脈の減衰は適度であり、視神経円板は正常である。網膜電図（ＥＲＧ）は重要な試験である。ほとんどの場合、それは、暗順応条件において優勢であるｂ波の振幅が減少していることを示す。しかし、ＥＲＧは、網膜が部分的に影響を受けた場合にのみ、最大ＥＲＧ振幅が減少するにもかかわらず、正常であるように思われ得る。

中間段階では、臨床像が完成する。夜間の失明は明らかであり、夜間の運転が困難であり、夕方及び暗い階段で歩行することが困難である。患者は、常同的な状況を通して日中の光の状態で周辺視野内の喪失を認識するようになる。運転中には、歩行者又は側方から近づく車に気づかず、握手の際に手を握れず、頻繁に様々な物体にぶつかる。その結果、患者は、不慣れな場所での夜間の運転及び循環を回避することによって自分自身を適合させる。淡い色（特に青色及び黄色の色相）に対する色弱が存在する場合が多い。加えて、患者は、特に、拡散光（白色の曇った天候）の下では明順応性になる。このことは、不十分な光と明るすぎる光との間の狭い窓で、読むことが困難になる。読むことができないのは、黄斑の関与（黄斑浮腫又は軽度の中心窩黄斑の萎縮）及び皮質下後方の白内障のせいで、部分的に視力が低下するためである。眼底検査によって、網膜の萎縮と共に、中央周辺部に骨片状色素沈着物の存在が明らかになっている。網膜血管の狭窄は明らかであり、視神経円板は適度に薄い。これとは対照的に、軽度の黄斑の関与は頻繁であるが、極端な周囲及び黄斑領域は比較的不十分に見える。ＥＲＧは、通常、暗順応条件（杆体）では記録不可能であり、錐体応答（３０Ｈ_Ｚフリッカー、明るい光）は顕著に低下している。

最終段階では、患者は、周囲の視力喪失（古典的なトンネル視覚）の結果として自律的に移動することができず、固定点の周りの残りの視野の程度は少ない。読むことは困難であり、拡大眼鏡が必要である。羞明は強烈である。眼底検査によって、黄斑領域に到達する広範囲の色素沈着物が明らかになっている。血管は薄く、視神経円板は蝋様蒼白を有する。蛍光眼底造影は、周囲及び中心窩黄斑領域にも網脈絡膜萎縮を検出する。ＥＲＧは記録不可能である。

一実施形態では、対象が網膜色素変性症の症状（視覚障害、夜間の失明、光感度、トンネル視覚、及び周辺視覚の喪失から視覚の全喪失など）を有すると診断されると、開示される化合物が投与される。別の実施形態では、対象が網膜色素変性症を発症するリスクがある（リスク要因は、家族の病歴を含むか、又はロドプシン変異についての試験結果が陽性であり得る）と特定される場合があると、開示される化合物が投与される。さらに別の実施形態では、対象が網膜色素変性症を有すると診断され得ると、開示される化合物が投与される。別の実施形態では、病因として、対象の光受容細胞中のロドプシン変異（例えば、Ｐ２３Ｈ杆体オプシン変異）が関与する網膜変性の他の形態の症状を有すると対象が診断されると、該化合物が投与される。別の実施形態では、対象の光受容細胞中のロドプシン変異が病因である網膜変性の他の形態を発症する危険性であると対象が特定されると、開示される化合物が投与される。いくつかの実施形態では、化合物を予防的に投与される。いくつかの実施形態では、網膜損傷が明らかになる前に、対象は疾患を有すると診断されている。いくつかの実施形態では、ヒト対象は、彼又は彼女が網膜生成治療又は予防を必要としていることを知り得る。

いくつかの実施形態では、対象は、網膜変性の程度を監視され得る。対象は、眼の検査、散瞳検査、眼底検査、視力検査、及び／又は生検などの様々な方法で監視され得る。監視は、様々な時間で行うことができる。例えば、対象は、化合物が投与された後に監視され得る。監視は、例えば、化合物の最初の投与後１日、１週間、２週間、１ヶ月、２ヶ月、６ヶ月、１年、２年、５年、又は任意の他の時点で起こり得る。対象は、繰り返し監視され得る。いくつかの実施形態では、化合物の用量は、監視に応答して変更され得る。

網膜変性を患っている対象を治療するための別の方法は、本明細書に記載の治療有効量の化合物を、ロドプシンのシャペロン及び／又は抗網膜変性剤若しくは療法として作用する治療有効量の追加の化合物と共に投与することである。抗網膜変性剤又は療法の例には、ビタミンＡ、ＤＨＡ、及びルテインなどのサプリメント、並びに光学プロステーシス装置、遺伝子治療メカニズム及び網膜シート移植が含まれるが、これらに限定されない。

当業者なら、網膜色素変性症を治療するために本発明の化合物のいずれかを使用するための最良の治療レジメンを直接決定できることを認識する。これは実験の問題ではなく、むしろ医療技術において日常的に実施される最適化の１つである。ヌードマウスにおけるインビボ研究が、投与量及び送達の投与計画の最適化を開始する開始点を提供する場合が多い。注射の頻度は、最初に、いくつかのマウスの研究において行われているように、週に１回である。しかし、この頻度は、最初の臨床試験の前に得られた結果及び特定の患者の必要性に応じて、１日から２週毎に、２週毎から毎月に最適に調節され得る。

実施例
この実施例では、本発明者らは、破壊される最初の細胞事象であり、杆体のストレス及び死を引き起こすＲＨＯ関連ａｄＰＲの予防的治療のために、小分子による変異ロドプシンを発現する杆体細胞におけるロドプシンのホメオスタシスを標的とする。本発明者らは、リソソーム活性を介してＰ２３Ｈロドプシン分解を選択的に加速させる細胞ベースのアッセイを用いるハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）による承認された薬物メトトレキサート（ＭＴＸ）を特定した。重要なことに、ＭＴＸは、Ｒｈｏ^{Ｐ２３Ｈ／＋}ノックインマウスにおいて単回硝子体内注射（ＩＶＩ）によってロドプシンのホメオスタシスを改善し、視覚機能を高めた。さらに、週に複数回ＭＴＸをＩＶＩすると、ビヒクル対照と比較して、Ｒｈｏ^{Ｐ２３Ｈ／＋}ノックインマウスの上網膜上の光受容細胞の数がより多くなった。誤って折り畳まれたロドプシンのクリアランスを誘導する際のＭＴＸの活性は、タンパク質のミスフォールディングによって引き起こされる遺伝性網膜変性症の治療における可能性を示唆する。

材料及び方法
安定細胞株
前述したようにルシフェラーゼレポーターアッセイのためのウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）と各々融合したＷＴ及びＰ２３Ｈ変異マウスロドプシンを安定的に発現する２つのＨｅｋ２９３安定細胞株のＨｅｋ２９３（Ｒｈｏ^ＷＴ－Ｒｌｕｃ）及びＨｅｋ２９３（ＲＨＯ^Ｐ２３Ｈ－Ｒｌｕｃ）細胞を作製した。簡単に説明すると、Ｈｅｋ２９３細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）を、Ｒｌｕｃ ８（オーガスタ大学、Ａｕｇｕｓｔａ，ＧＡ ＵＳＡのＮａｖｉｎｅ Ｌａｍｂｅｒｔ博士からの贈与）と融合したマウスＷＴ又はＰ２３ＨロドプシンのｃＤＮＡを含むｐｃＤＮＡ３．１ Ｚｅｏでトランスフェクトし、トランスフェクト細胞を、１０％ウシ胎児血(ＦＢＳ，Ｇｉｂｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ ＵＳＡ)を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ，Ｇｅｎｅｓｅｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｅｌ Ｃａｊｏｎ，ＣＡ ＵＳＡ）中で４８時間インキュベートし、陽性クローン選択のために、４００μｇ／ｍＬのゼオシン（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ ＵＳＡ）を添加した。１週間のゼオシン選択から生き残った細胞のコロニーを収集し、ＷＴ及びＰ２３Ｈロドプシンの発現を、ルシフェラーゼアッセイ及びロドプシンのイムノブロッティングにより確認し、モノマーの陽性バンドは約７０ｋＤであった（図８）。ＷＴとＰ２３Ｈのロドプシンタンパク質間の分子量の差は、ＷＴ及びＰ２３Ｈロドプシンタンパク質を発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞においても見られるグリコシル化の違いによるものである。

２つのＮＩＨ３Ｔ３安定細胞株のＮＩＨ３Ｔ３（ＲＨＯ^ＷＴ／ＧＦＰ）及びＮＩＨ３Ｔ３（ＲＨＯ^Ｐ２３Ｈ／ＧＦＰ）を、それぞれウイルス形質導入（２４、３３）を介してＮＩＨ３Ｔ３細胞にｐＭｉＬＲＯ ２３及びｐＭｉＬＲＯ ＤＮＡコンストラクトを組み込むことによって作製したＫｒｚｙｓｚｔｏｆ Ｐａｌｃｚｅｗｓｋｉ博士の研究室と分け合った。陽性クローン選択のために、ＧＦＰをロドプシンと共発現させた。ＷＴ及びＰ２３Ｈロドプシンタンパク質の発現をイムノブロット及び免疫染色によって確認した。

ビーナス蛍光タンパク質と融合したＷＴのマウスロドプシン及び６つ変異マウスロドプシン（Ｔ４Ｒ、Ｐ２３Ｈ、Ｐ５３Ｒ、Ｃ１１０Ｙ、Ｄ１９０Ｎ、Ｐ２６７Ｌ）を別々に発現する７種のＵ２ＯＳ安定細胞株を作製した。簡単に説明すると、Ｕ２ＯＳ細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）を、ビーナスマウスと融合したＷＴ又はＴ４Ｒ、Ｐ２３Ｈ、Ｐ５３Ｒ、Ｃ１１０Ｙ、Ｄ１９０Ｎ、Ｐ２６７ＬロドプシンのｃＤＮＡを含むｐｃＤＮＡ３．１ Ｚｅｏでトランスフェクトし、トランスフェクト細胞を、１０％ ＦＢＳを有するＤＭＥＭ中で４８時間インキュベートし、陽性クローン選択のために、４００μｇ／ｍＬのゼオシを添加した。１週間のゼオシン選択から生き残った細胞のコロニーを収集し、ＷＴ及び６つの変異ロドシンの発現を、ビーナスの蛍光及びロドプシンのイムノブロッティングにより確認した。

細胞の培養及び培地
細胞を、１０％ＦＢＳ及び５μｇ／ｍＬのプラスモシン（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ ＵＳＡ）を有するＤＭＥＭを含む完全培地中で、３７℃、５％ＣＯ_２及び＞９５％の湿度で培養し、ＡＴＣＣ動物細胞培養ガイド（ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ）で指示されるように継代培養した。

化学薬品及び試薬
ＶｉｖｉＲｅｎをＰｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）から購入し、６０ｍＭのストックアリコートとしてジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、琥珀色のチューブ内で、－８０℃で保存した。ＵＣ １０ｋダイバーシティセットは、３８４ウェルフォーマットで、化合物当たり１０ｍＭでシンシナティ大学創薬センター（ＵＣＤＤＣ，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ ＵＳＡ）によって提供され、スペクトラムコレクション（ＭｉｃｒｏＳｏｕｒｃｅ，Ｇａｙｌｏｒｄｓｖｉｌｌｅ，ＣＴ ＵＳＡ）及びＬｉｆｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ５０Ｋダイバーシティセット（Ｌｉｆｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ＵＳＡ，Ｗｏｏｄｂｒｉｄｇｅ，ＣＴ ＵＳＡ）を、３８４ウェルフォーマットで、化合物当たり１０ｍＭでＫｒｚｙｓｚｔｏｆ Ｐａｌｃｚｅｗｓｋｉ博士によって提供され、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）承認薬、薬理学的に活性のある化合物のライブラリー（ＬＯＰＡＣ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ ＵＳＡ）及びメカニズム照会プラットＥ（ＭＩＰＥ）コレクションは、１５３６ウェルフォーマットで各化合物について７又は１１用量シリーズでＮＣＡＴＳによって提供された。これらの化合物ライブラリー中の全ての化合物をＤＭＳＯに溶解し、－８０℃で保存し、接着箔フィルムでシールした。ヒット化合物を粉末中の化合物ストックから厳選するか、又は３連の用量応答試験並びに確認及びカウンタースクリーニングのために化学ベンダーから注文した。ＣＬ－００１（Ｐｕｂｃｈｅｍ ＣＩＤ：１１７１５７６７）、ＣＬ－００６（ＣＩＤ：１１３３８０３３）、ＣＬ－００７（ＣＩＤ：５３３０７９０）、及びＣＬ－００８（ＣＩＤ：１６７４７６８３）をＳｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ ＵＳＡ）から購入し；ＣＬ－００２（ＣＩＤ：６２２４４２２）、ＣＬ－００３（ＣＩＤ：４４３８４２４）、及びＣＬ－００４（ＣＩＤ：６６２４０３０）をＬｉｆｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから注文し、ＣＬ－００５（ＣＩＤ：１００９１６８１）はＵＣＤＤＣによって提供され、ＣＬ－００９／ＭＴＸ（ＣＩＤ：１２６９４１）は、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ ＵＳＡ）から購入した。ＤＭＳＯ及びＬ－メチオニンは、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ ＵＳＡ）社製であった。抗ロドプシン抗体１Ｄ４及びＢ６３０は、Ｋｒｚｙｓｚｔｏｆ Ｐａｌｃｚｅｗｓｋｉ博士の研究室と共有した。抗微小管関連タンパク質軽鎖３（ＬＣ３）抗体は、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（４１０８Ｓ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ ＵＳＡ）から購入した。抗セクエストソーム１（ＳＱＳＴＭ１／ｐ６２）抗体を、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（ＮＢＰ１－４２８２１，Ｃｅｎｔｅｎｎｉａｌ，ＣＯ ＵＳＡ）から購入した。Ｃｙ３コンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（Ａ１０５２１）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（３２２３０）、ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ウサギＩｇＧ（３２２６０）、ＨＲＰ－ストレプトアビジン（ＳＡ）（４３４３２３）、Ｌ－アジドホモアラニン（ＡＨＡ，Ｃ１０１０２）、ビオチン（ＢＴＮ）－ｓＤＩＢＯ（Ｃ２００２３）、及びダイナビーズ（商標）プロテインＧ（１０００４Ｄ）、ＢＣＡタンパク質アッセイ（２３２２５）、パラホルムアルデヒド（２８９０８）、ヘキスト３３３４２（Ｈ３５７０）、及びスーパーシグナル（商標）Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ ＰＬＵＳ化学発光基質（３４５８０）は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ ＵＳＡ）から取得した。

ＨＴＳ及びカウンタースクリーニングの手順
ＨＴＳは、シンシナティ大学（ＵＣ）、ケース・ウェスタン・リザーブ大学、及び国立トランスレーショナルサイエンス推進センター(ＮＣＡＴＳ)を含む３つの施設で実施され、合計６種の化合物コレクションを試験した。これらの化合物コレクションには、１）ＵＣ １０ｋダイバーシティセット（１０，０１１化合物）、２）Ｌｉｆｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ５０Ｋコレクション（５０，５６０）、３）スペクトルコレクション（２，４００化合物）、４）ＬＯＰＡＣコレクション（１，２８０化合物）、５）ＦＤＡコレクション（２，８１６化合物）及び６）ＮＣＡＴＳ ＭＩＰＥコレクション（１，９１２化合物）が含まれる。ＨＴＳアッセイ及び確認アッセイの手順は、品質管理パラメータ（信号対ノイズ比及びＺ’因子）にもかかわらず、異なる施設での設備に適合させるためにわずかに異なり（表４）、これらのアッセイが堅牢であることを実証する（表１）。化合物コレクション１）、２）及び３）については、最初に、１回の単一用量（９．９３～１６．１３μＭ）でＰ２３Ｈロドプシンルシフェラーゼレポーターアッセイを用いて、３８４ウェルフォーマットで各化合物を試験し、平均－２ＳＤでカットオフよりも低い活性スコアを有する２０７２個の化合物を特定した。活性スコアは、０％対照としてＤＭＳＯ処理細胞及び約１００％対照として１ｍＭのエバンスブルー処理細胞を用いて正規化した。これらのヒット化合物から、本発明者らは、ルシフェラーゼ阻害活性を有すると報告されたものを除外し、ヒットの確認のために残りを厳選した。３連でルシフェラーゼレポーターアッセイにより再びＨｅｋ２９３（ＲＨＯ^Ｐ２３Ｈ－Ｒｌｕｃ）細胞中１０μＭで各ヒットを試験し、次いで、約５０％より低い活性スコアを有する確認されたヒットを、組換えＲｌｕｃ活性アッセイによるＲｌｕｃ活性に対する効果、及びＨｅｋ２９３（ＲＨＯ^ＷＴ－Ｒｌｕｃ）細胞における３連で１０μＭでのルシフェラーゼレポーターアッセイによるＷＴロドプシンレベルに対する効果についてそれぞれカウンタースクリーニングをした。本発明者らは、Ｒｌｕｃ活性又はＷＴロドプシン－Ｒｌｕｃレポーター活性（約５０％より高い活性スコア）に顕著に影響しない５２個の化合物を特定した。次に、本発明者らは、Ｈｅｋ２９３（ＲＨＯ^Ｐ２３Ｈ－Ｒｌｕｃ）細胞とＨｅｋ２９３（ＲＨＯ^ＷＴ－Ｒｌｕｃ）細胞の両方においてこれらの確認されたヒットの用量応答を試験し、用量依存的にＷＴロドプシンよりＰ２３Ｈのクリアランスを選択的に優先した化合物を特定した（表４）。化合物コレクション４）～６）については、本発明者らは、１５３６ウェルフォーマットでＨｅｋ２９３（ＲＨＯ^Ｐ２３Ｈ－Ｒｌｕｃ）細胞におけるルシフェラーゼレポーターアッセイを用いて、７又は１１用量で各化合物を直接試験し、約５０％より小さい効力を有し、ＥＣ_５０＜２０μＭである１２８個の化合物を特定した。次に、本発明者らは、これらの１２８個の化合物を厳選し、Ｈｅｋ２９３（ＲＨＯ^Ｐ２３Ｈ－Ｒｌｕｃ）とＨｅｋ２９３（Ｒｈｏ^ＷＴ－Ｒｌｕｃ）細胞の両方において３連で、７又は１１用量でルシフェラーゼレポーターアッセイによりそれらを試験し、ＷＴロドプシンよりＰ２３Ｈのクリアランスに対してより高い効力を示した３４個の化合物を選択した。

表１－ルシフェラーゼレポーターアッセイを用いた各化合物コレクションのＨＴＳの品質管理パラメータ

Ｒｌｕｃレポーターアッセイ
Ｒｌｕｃレポーターアッセイについては以前に説明されている。ＨＴＳを、ＵＣ １０Ｋダイバーシティセット、スペクトルコレクション及びＬｉｆｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ５０Ｋダイバーシティセットには３８４ウェルフォーマットで、ＦＤＡ、ＬＯＰＡＣ、及びＭＩＰＥコレクションには１５３６ウェルフォーマットで行った。一例として３８４ウェルフォーマットを使用して、３×１０^５／ｍＬのＨｅｋ（ＲＨＯ^Ｐ２３Ｈ－Ｒｌｕｃ）細胞を、８チャンネルＭｕｌｔｉｆｌｏ液体ディスペンサー（Ｂｉｏｔｅｃｋ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ ＵＳＡ）により３８４ウェル白色壁透明底プレート（アッセイプレート）のウェル当たり４０μＬ播種した。アッセイプレートを３００×ｇで３０秒間遠心分離し、３７℃で、５％ＣＯ_２で一晩培養した。翌日、化合物を、３８４ウェル化合物プレートから培養細胞を含む３８４ウェルアッセイプレートに、ＪＡＮＵＳ ＭＤＴ自動ワークステーション（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ ＵＳＡ）によって操作される５０ｎＬの３８４ピンツールによって移した。５０μＬ／ウェルの化合物溶液を含む化合物プレートを、カラム３～２２中のＤＭＳＯに溶解した。対照を、それぞれ５０μＬのＤＭＥＭ、ＤＭＳＯ、ＤＭＳＯ、及びエバンスブルー（ＤＭＳＯ中６０６ｍＭ）を含む対照プレート中のカラム１、２、２３、及び２４にローディングした。化合物プレートからアッセイプレートに５０ｎＬのピンツールを用いて対照を移した。再使用する前に、ピンツールを、１００ｍＬのＤＭＳＯ、洗浄水、及び１００ｍＬのエタノールを含む洗浄ウェルに順次浸漬することによって十分に洗浄し、３０秒間空気乾燥した。処理したアッセイプレートを３００×ｇで３０秒間遠心分離し、３７℃、５％ＣＯ_２で２４時間インキュベートした。３日目に、５μＬ／ウェルの２％のｎ－ドデシル－β－Ｄ－マルトピラノシド（ＤＤＭ）をアッセイプレートに添加し、続いて５秒間振盪を行った。アッセイプレートを室温で５分間インキュベートし、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈した５０μＭのＶｉｖｉＲＥＮ溶液５μＬ／ウェルを添加し、続いて５秒間振盪した。アッセイプレートを、室温で、薄暗い光の中で１時間インキュベートした。各ウェルの発光を、０．１秒の積分時間でＥｎｓｐｉｒｅプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）によって読み取った。ＨＴＳアッセイの１５３６ウェルフォーマットについては、細胞を白色壁透明底の１５３６ウェルプレートのウェル当たり５μＬの３０００個の細胞／ウェルで播種し；化合物を２３ｎＬの１５３６ピンツールを用いて移し、０．５μＬ／ウェルのＤＤＭ及び１μＬ／ウェルの３０μＭのＶｉｖｉＲＥＮ溶液をアッセイプレートに順次添加したことの違いを除いて、手順は３８４ウェルアッセイと同じである。カウンタースクリーニングアッセイのために、Ｈｅｋ２９３（Ｒｈｏ^ＷＴ－Ｒｌｕｃ）細胞を用いてＨＴＳアッセイとしてアッセイを繰り返した。活性スコア（％）＝（ＲＬＵ_化合物－ＲＬＵ_ＤＭＳＯ）／（ＲＬＵ_ＤＭＳＯ－ＲＬＵ_{エバンスブルー}）×１００。ＲＬＵ、相対発光単位。

組換えＲｌｕｃ活性アッセイ
組換えＲｌｕｃ（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ，Ｐｅａｃｈｔｒｅｅ Ｃｏｒｎｅｒｓ，ＧＡ ＵＳＡ）をＰＢＳに溶解し、０．３μｇ／ｍＬに希釈した。各化合物を、化合物作業溶液としてのＰＢＳで１０×最終濃度に希釈した。３８４ウェルプレートで、希釈したＲｌｕｃ１６μＬ／ウェルを化合物作業溶液４μＬ／ウェルと混合した。ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ＸＬマイクロプレートリーダーを用いて、各ウェル内の発光を、５μＭのセレンテラジンｈ基質（Ｎａｎｏｌｉｇｈｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ, Ｐｉｎｅｔｏｐ,ＡＺ ＵＳＡ）をウェル当たり２０μＬ注入した後に２．５秒読み取った。各化合物を１０μＭの最終濃度で試験し、３回繰り返した。ルシフェラーゼ活性を、ＤＭＳＯ及び１ｍＭのエバンスブルーによってそれぞれ０％及び約１００％の対照として正規化した。

ドットブロット
ＮＩＨ_３Ｔ_３（ＲＨＯ^Ｐ２３Ｈ／ＧＦＰ）又はＮＩＨ３Ｔ３（ＲＨＯ^ＷＴ／ＧＦＰ）細胞を、９６ウェルプレート中の１００μＬ／ウェルの完全培地に２．５×１０^４細胞／ウェルで播種し、３７℃、５％ＣＯ_２で４時間培養した。次いで、細胞を、２×最終濃度の試験化合物を含む１００μＬ／ウェルの完全培地で処理した。３７℃、５％ＣＯ_２でさらに２４時間インキュベーションした後、培地を吸引し、細胞をＰＢＳで１回洗浄した。放射線免疫沈降アッセイ（ＲＩＰＡ）緩衝液及び完全プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を含む細胞溶解緩衝液を、２００μＬ／ウェルで細胞に添加した後、６秒間超音波処理した。ＲＨＯ^ＷＴの細胞タンパク質レベルはＲＨＯ^Ｐ２３Ｈよりも高かったので、１ウェルのＮＩＨ３Ｔ３（ＲＨＯ^ＷＴ／ＧＦＰ）細胞試料の５％及び１ウェルのＮＩＨ３Ｔ３（ＲＨＯ^Ｐ２３Ｈ／ＧＦＰ）細胞試料の９０％をニトロセルロース膜にロードし、空気乾燥させた。オプシンタンパク質を０．１μｇ／ｍＬのＨＲＰコンジュゲート１Ｄ４抗ロドプシン抗体で免疫染色した。バンドのデンシトメトリーを、ＩｍａｇｅＪソフトウェアによって測定し、ＤＭＳＯ処理対照に正規化した。

ウェスタンブロット
細胞を５×１０^５細胞／ウェルの密度で６ウェルプレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ_２で１７時間培養した。対応する濃度の化合物を含む新鮮な培地で培地交換した。２４時間処理した後、細胞を収集し、氷上で１２秒超音波処理しながら、０．１％ＳＤＳ及び完全プロテアーゼ阻害剤カクテルを含む１５０μＬのＰＢＳに溶解した。氷上での２４秒間の超音波処理を行いながら、０．１％ＳＤＳと完全プロテアーゼ阻害剤カクテルを含むＰＢＳの３００μＬ／網膜に網膜試料を溶解した。タンパク質濃度を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光計を用いてＯＤ_{２８０ｎｍ}の測定により決定した。ロドプシンをイムノブロットするために、ＮＩＨ３Ｔ３（ＲＨＯ^Ｐ２３Ｈ／ＧＦＰ）細胞については１ウェル当たり１００μｇの全タンパク質、又はＮＩＨ３Ｔ３（ＲＨＯ^ＷＴ／ＧＦＰ）細胞については２０μｇの全タンパク質を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上にロードした。他のタンパク質を検出するために、１ウェル当たり５０μｇの全タンパク質をロードした。１０％及び１６％のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルでの電気泳動により分離した後、タンパク質を、湿潤膜電気転写カセットを用いてニトロセルロース膜に移し、続いて０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ中５％ウシ血清アルブミンで１時間ブロッキングした。膜を４℃で一次抗体と一晩インキュベートした後、室温で１時間、適切な二次抗体とインキュベートした。ブロットをＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（商標）Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ ＰＬＵＳ化学発光基質を用いて可視化し、ＢｉｏＲａｄゲルイメージャによりスキャンした。

ハイコンテントイメージング
哺乳動物細胞におけるＰ２３Ｈロドプシンクリアランスに対する活性化合物の効果を評価するために、先に記載したように、ＮＩＨ３Ｔ３（ＲＨＯ^ＷＴ／ＧＦＰ）及びＮＩＨ３Ｔ３（ＲＨＯ^Ｐ２３Ｈ／ＧＦＰ）細胞を用いてイメージベースアッセイを行った。簡単に説明すると、細胞を、３８４ウェルプレートにウェル当たり５０００個の細胞を播種し、細胞がプレートの底部に付着するまで、３７℃、５％ＣＯ_２で４時間インキュベートした。付着した細胞を２４時間化合物で処理した。アッセイ培地を吸引し、細胞を室温で２０分間、ウェル当たり２０μＬの４％パラホルムアルデヒドで固定した。細胞膜を０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳで透過処理し、次いで、１５μＬ／ウェルで、５０μｇ／ｍＬの１Ｄ４抗ロドプシン抗体と室温で１時間インキュベートした。５０μＬ／ウェルのＰＢＳＴで３回洗浄した後、細胞を１５μＬ／ウェルのＣｙ３コンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ抗体と室温で１時間インキュベートした。５０μＬ／ウェルのＰＢＳＴで３回洗浄した後、細胞を、２μｇ／ｍＬのヘキスト３３３４２を含むＰＢＳ５０μＬ／ウェル中でインキュベートし、核を染色した。最後に、免疫染色した細胞を、ＩｍａｇｅＥｘｐｒｅｓｓハイコンテントイメージングシステム（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ）により画像化した。ロドプシンの免疫蛍光を、ウェル当たり６００～１０００個の無傷細胞を含む５つのフィールドから取得したウェル当たり、細胞当たりのＣｙ３チャネルの全蛍光の平均を用いて、ＭｅｔａＸｐｒｅｓｓソフトウェアによって測定した。０％としてのＤＭＳＯ処理細胞及び約１００％としての二次抗体のみで免疫染色した細胞にロドプシンの蛍光強度を正規化した後に、各化合物についての用量応答曲線をプロットし、Ｏｒｉｇｉｎソフトウェアを用いて改変ヒル関数によりフィッティングした。ヒット確認のためのハイコンテントイメージング実験をＣＷＲＵ創薬研究所で実施し、ＢａｆＡ１及びＭＧ－１３２によるＭＴＸ同時処理のためのハイコンテントイメージング分析をピッツバーグ大学創薬研究所で行った。そのため、実験的変動による小さな差異が、ＣＬ－００９／ＭＴＸ活性について見られた。

ｑＰＣＲ
ＮＩＨ３Ｔ３（ＲＨＯ^ＷＴ／ＧＦＰ）及びＮＩＨ３Ｔ３（ＲＨＯ^Ｐ２３Ｈ／ＧＦＰ）細胞を、２４ウェルプレートに、２．５×１０^５個の細胞／ウェルの密度で播種し、３７℃、５％ＣＯ_２で一晩培養した。次いで、細胞を、化合物を含む培地で２４時間インキュベートした。培地を吸引した後、細胞を収集し、３００μＬ／ウェルのＴＲＩｚｏｌ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，１５５９６０２６，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ ＵＳＡ）に５分間溶解した。試料を６０μＬのクロロホルムと３０秒間激しく混合し、次いで、１２，０００×ｇで１５分間、４℃で遠心分離した。ＲＮＡを含む上部水性相を取り出し、激しく振盪することにより１５０μＬのイソプロパノールと混合した。１０分間鎮静後、試料を１２，０００×ｇで、１０分間４℃で遠心分離した。ペレットを３００μＬの７５％エタノールで洗浄し、４℃で５分間、７，５００×ｇで遠心分離した。ＲＮＡペレットを１５分間空気乾燥させ、３０μＬのヌクレアーゼを含まない水（ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＢＰ２４８４－１００，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ ＵＳＡ）に溶解した。ＲＮＡの収率及び純度をＮａｎｏＤｒｏｐ分光計により評価した。ｃＤＮＡを、Ｈｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ ＲＮＡ－ｔｏ－ｃＤＮＡキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，４３８７４０６，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ ＵＳＡ）を用いて１μｇのＲＮＡから作製した。ｃＤＮＡ鋳型及びプライマーと共に、ＰｏｗｅｒＵｐ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎマスターミックス（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ａ２５７４１，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ ＵＳＡ）を用いてｑＰＣＲ増幅を行い、反応を、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ３サーモサイクラー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ, Ｗａｌｔｈａｍ, ＭＡ ＵＳＡ）によって制御した。プライマー配列は以下の通りである：ＲＨＯ、フォワード５’－ＣＣＣＴＴＣＴＣＣＡＡＣＧＴＣＡＣＡＧＧ－３’（配列番号１）、リバース５’－ＴＧＡＧＧＡＡＧＴＴＧＡＴＧＧＧＧＡＡＧＣ－３’（配列番号２）；βアクチン、フォワード５’－ＡＣＣＴＴＣＴＡＣＡＡＴＧＡＧＣＴＧＣＧ－３’（配列番号３）、リバース５’－ＣＴＧＧＡＴＧＧＣＴＡＣＧＴＡＣＡＴＧＧ－３’（配列番号４）。

パルスチェイスアッセイ
ロドプシンの分解を定量するために、非放射性パルスチェイスアッセイに「クリック」反応を使用した。簡単に説明すると、ＮＩＨ３Ｔ３（ＲＨＯ^Ｐ２３Ｈ／ＧＦＰ）又はＮＩＨ３Ｔ３（Ｒｈｏ^ＷＴ／ＧＦＰ）細胞を、２４ウェルプレート中の１０％ＦＢＳを含む完全培地中３×１０^５細胞／ウェルで培養した。一晩培養した後、培地を吸引し、細胞を１ｍＬ／ウェルのＰＢＳで１回穏やかに洗浄した。細胞をＬ－メチオニンを含まないＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，２１０１３－０２４，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ ＵＳＡ）で１時間インキュベートし、細胞内メチオニンを排出した。次いで、細胞を最終濃度５０μＭでＬ－ＡＨＡで４時間パルスした。一方、５０μＭのＬ－メチオニンで処理した細胞を陰性対照として使用した。標識後、細胞を、様々なチェイス時間中、活性化合物の存在下又は非存在下で、２ｍＭのＬ－メチオニンを有する完全なＤＭＥＭ培地と置換した。次いで、０．１％ＳＤＳ、１％ＤＤＭ及び完全プロテアーゼ阻害剤カクテルを含むＰＢＳで細胞を溶解した。全タンパク質濃度をＢＣＡアッセイにより測定した。２００μｇの全タンパク質を含む細胞溶解物を、５μＭのＢＴＮ－ｓＤＩＢＯと混合し、３７℃で１時間「クリック」反応させた。１Ｄ４の抗ロドプシン抗体と結合したＤｙｎａｂｅａｄｓ（商標）プロテインＧと試料を室温で１５分間インキュベートし、続いて０．０２％のＴｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳで３回洗浄した。ｐＨ２．８の５０ｍＭのグリシンでタンパク質を室温で１０分間溶出し、次いで、ニトロセルロース膜上にロードした。空気乾燥後、膜を５％ミルクでブロッキングし、０．２５μｇ／ｍＬのＨＲＰコンジュゲートＳＡでイムノブロットした。

プロテアソーム活性アッセイ
ＮＩＨ３Ｔ３（ＲＨＯ^Ｐ２３Ｈ／ＧＦＰ）、ＮＩＨ３Ｔ３（ＲＨＯ^ＷＴ／ＧＦＰ）及びＮＩＨ３Ｔ３細胞を、２０μＬの完全培地中２５００細胞／ウェルの白色壁透明底３８４ウェルプレートに播種した。３時間のインキュベーションの後、ＭＴＸを含む完全培地５μＬ／ウェルを細胞に添加して、細胞を最終濃度０．０１９５～１０μＭで２４時間処理した。０．１％のＤＭＳＯを含む完全培地で処理した細胞を１００％対照として使用し、５μＭのＭＧ－１３２で８時間処理した細胞を０％対照として使用した。終点プロテアソーム活性測定のために、各ウェルに、Ｓｕｃ－ＬＬＶＹ－Ｇｌｏ（商標）基質（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｇ８６６０，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ ＵＳＡ）を含むプロテアソーム－Ｇｌｏ（商標）試薬２５μＬを加えた。３８４ウェルプレートを２分間振盪し、溶液を混合し、続いて室温で２４分間インキュベートした。各ウェルの発光を、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｉ３Ｘマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）によって検出した。キモトリプシン様プロテアソーム活性を、それぞれ１００％及び０％対照によって正規化した。

動物
Ｋｒｚｙｓｚｔｏｆ Ｐａｌｃｚｅｗｓｋｉ博士の実験室によって作製されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｒｈｏ^＋／＋）マウス及びＲｈｏ^{Ｐ２３Ｈ／Ｐ２３Ｈ}マウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ストック番号０１７６２８）から購入した。Ｒｈｏ^{Ｐ２３Ｈ／Ｐ２３Ｈ}マウスを野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスと交配させ、Ｐ２３Ｈヘテロ接合体マウスを作製した。全ての系統の遺伝子型決定は、それぞれフォワード及びリバースプライマー：１）ＧＧＴＡＧＣＡＣＴＧＴＴＧＧＧＣＡＴＣＴ（配列番号５）;及び２）ＧＡＣＣＣＣＡＣＡＧＡＧＡＣＡＡＧＣＴＣ（配列番号６）を用いて指示通り行った。５７３及び３９９ｂｐのＰＣＲ産物は、それぞれＰ２３Ｈノックアウト変異体及びＲＨＯ遺伝子のＷＴ対立遺伝子を示した。マウスを育種し、ピッツバーグ大学動物施設で、標準的な１２時間明るい／１２時間暗い条件下に収容した。全ての動物実験は、動物愛護法及び規則のためのガイドに従って、ピッツバーグ大学施設内動物管理使用委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認された。

硝子体内注射（ＩＶＩ）
インビボで網膜に対する化合物の効果を決定するために、本発明者らは化合物を硝子体空間に直接投与した。簡単に説明すると、マウスを１％トロピカミド点眼液（Ａｋｏｒｎ，Ｌａｋｅ Ｆｏｒｅｓｔ，ＩＬ ＵＳＡ）で処置して、瞳孔を広げ、次いで、８０ｍｇ／ｋｇ体重（ｂｗ）のケタミン（Ｈｅｎｒｙ Ｓｃｈｅｉｎ，Ｄｕｂｌｉｎ，ＯＨ ＵＳＡ）及び７ｍｇ／ｋｇ ｂｗのキシラジン（Ｂｉｍｅｄａ，Ｌｅ Ｓｕｅｕｒ，ＭＮ ＵＳＡ）の腹腔内注射で麻酔した。注射前の局所麻酔薬として、０．５％の塩酸テトラカイン（ＴＣＩ、東京、日本）１滴をマウスの眼に適用した。注射の間に、眼用の０．３％ヒプロメロースゲル（Ａｌｃｏｎ，Ｆｏｒｔ Ｗｏｒｔｈ，ＴＸ ＵＳＡ）によって眼を潤滑化した。体温を維持するために加熱パッドを使用した。マウスを位置付けて、眼の強膜を露出させた。３０ゲージの針（Ｍｅｄｌｉｎｅ，Ｎｏｒｔｈｆｉｅｌｄ，ＩＬ ＵＳＡ）を用いて、４５°の角度で角膜の後方の強膜を通して穴をあけた。３３ゲージの鈍端針（Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｒｅｎｏ，ＮＶ ＵＳＡ）を使用して穴に挿入し、合計０．５μＬの滅菌ＰＢＳ又はＰＢＳ中のＭＴＸをゆっくりと後部チャンバーに注入し、針をその場に約３０秒間保持し、針をゆっくりと取り除いた。少量のトリ抗生物質軟膏（Ｍｅｄｌｉｎｅ，Ｎｏｒｔｈｆｉｅｌｄ，ＩＬ ＵＳＡ）を注射部位にアプライして、感染を防止した。生後日（ＰＮＤ）１５に、各Ｒｈｏ^{Ｐ２３Ｈ／＋}マウスの一方の眼に２５又は１００ｐｍｏｌのＭＴＸを単回ＩＶＩ投与し、ＰＢＳをビヒクル対照として他方の眼に注射した。本発明者らはまた、ＰＮＤ１５、２２、２９及び３６に、Ｒｈｏ^{Ｐ２３Ｈ／＋}マウスの第２のグループにＭＴＸ又はＰＢＳのＩＶＩを週４回行った。

網膜電図（ＥＲＧ）
ＥＲＧは、先に記載したように、Ｃｅｌｅｒｉｓシステム（Ｄｉａｇｎｏｓｙｓ，Ｌｏｗｅｌｌ，ＭＡ， ＵＳＡ）を用いて実施した。各試験の前に、マウスを暗闇に一晩おいた。１％トロピカミド点眼液（Ａｋｏｒｎ，Ｌａｋｅ Ｆｏｒｅｓｔ，ＩＬ ＵＳＡ）で瞳孔を広げた。８０ｍｇ／ｋｇ ｂｗのケタミン及び７ｍｇ／ｋｇ ｂｗのキシラジンの腹腔内注射でマウスに麻酔した。眼用の０．３％ヒプロメロースゲル（Ａｌｃｏｎ，Ｆｏｒｔ Ｗｏｒｔｈ，ＴＸ ＵＳＡ）によって眼を潤滑化した。体温を３７℃で維持するために加熱パッドを用いた。０．０１ｃｄ・ｓ／ｍ^２～３０ｃｄ・ｓ／ｍ^２の１０回のフラッシュに対する暗さに適合させた眼の暗順応ＥＲＧ応答を記録し、１０～３０秒のスイープ間隔でフラッシュ強度あたり３回のスイープから平均化した。５分の１０ｃｄ／ｍ^２照明ヘの曝露後、１０ｃｄ／ｍ^２のバックグラウンド光に加えて、０．０１ｃｄ・ｓ／ｍ^２～３０ｃｄ・ｓ／ｍ^２のフラッシュに応答して光に適合させた眼から明順応ＥＲＧ応答を記録した。ＭＴＸ処置群及びビヒクル（ＰＢＳ）群における応答振幅間の統計的有意性を決定するために、２元配置ＡＮＯＶＡによってＰ値を計算した。要因１、治療条件；及び要因２は、フラッシュ強度。

組織収集及び免疫組織化学（ＩＨＣ）
マウスを安楽死させ、各目の上側を焼灼ペンによって作製される燃焼マークで標識した。１対の湾曲した先端鉗子によって眼の除核を行い、新たに調製した４％パラホルムアルデヒドで２時間固定した。固定した眼を、ＰＢＳ中５、１０、２０及び４０％のスクロース溶液で各々、室温で３０分間連続的に脱水した。最後に、４℃で一晩、１：１の体積比で、ＰＢＳ及びＯ．Ｃ．Ｔ化合物（ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ ＵＳＡ）中４０％スクロースの混合物中で眼をインキュベートした後、それらを同じ混合溶液中に配向特異的に包埋し、液体窒素浴イソブテン中で凍結させた。１２ミクロンの網膜断面を、－１６℃でミクロトームによって作製し、視神経頭を含むものをＳｕｐｅｒＦｒｏｓｔガラススライド（ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ ＵＳＡ）上にアプライした。次いで、これらのスライドをＩＨＣに使用した。ＰＢＳＴ中で１５分間再水和及び透過処理をした後、網膜切片を５％ヤギ血清中で３０分間インキュベートし、次いで、マウス１Ｄ４抗ロドプシン抗体（２０μｇ／ｍＬ）を含むＰＢＳと加湿チャンバー内で、室温で２時間インキュベートした。網膜切片をＰＢＳＴで４回洗浄し、Ｃｙ３コンジュゲートヤギ抗マウス抗体（５μｇ／ｍＬ）と室温で１時間インキュベートした。ヘキスト３３３４２（１：１００００希釈）をアプライし、５分間核を染色した。切片をＰｒｏｌｏｎｇＧｏｌｄマウンティング溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ ＵＳＡ）でマウントした。次いで、免疫蛍光画像を、低倍率画像については蛍光顕微鏡及び高倍率画像については共焦点顕微鏡により撮影した。全６つの高倍率画像を、光学神経ヘッド（ＯＮＨ）から０．６、１．０及び１．４ｍｍ近接して、網膜凍結切片当たり油を用いて、６０×対物レンズを用いて取得した。マジックワンドを用いて対応する層を選択し、選択した領域内の蛍光強度を測定することにより、ＯＳ中のロドプシンの免疫蛍光強度及び外核層（ＯＮＬ）を、ＩｍａｇｅＪを用いて測定した。ＯＮＬにおける核の数を、網膜に沿って２００μｍに及ぶ各高倍率画像においてＯＮＬ中のヘキスト３３３４３陽性物体を計数することによって計算した。

統計的分析
ＨＴＳ及びハイコンテントイメージングアッセイを、０％と約１００％の対照の１６の反復を含む各アッセイプレートを用いて実施し、Ｚ’をプレートごとに計算し、各プレートの結果が対照により適切に計算された堅牢な活性スコアであることを示す、ＨＴＳについてはＺ’＞０．５及びハイコンテントイメージングアッセイについてはＺ’＞０を確実にした。Ｚ’=１－３×（ＳＤ_０％対照＋ＳＤ_{約１００％対照}）／（平均_０％対照－平均_{約１００％対照}）。

ＥＲＧ応答は２つの要因の化合物処理（要因１）とフラッシュ強度（要因２）の影響を受け得るので、ＥＲＧ記録を二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）により分析した。ｐ_１及びｐ_２は、化合物処理及びフラッシュ強度がそれぞれＥＲＧ応答に顕著に影響するかどうかを決定する一方で、ｐ_１－２は、２つの要因が互いに相互作用するかどうかを決定した。他のアッセイを、対応のない両側スチューデントのｔ検定によって分析した。有意性についての基準は、有意ではないがｐ＞０．０５；^＊ｐ＜００．５）、^＊＊ｐ＜００．１）、^＊＊＊ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。試料サイズを、関数：１）

及び２）

（式中、
σはＳＤであり、φは標準的な正規分布関数であり、αは０．０５に設定したタイプＩエラー又はＰ値であり、τは行われる比較の数であり、βはタイプＩＩエラーであり、１－βは０．９０に設定したパワーである）
を用いるパワー解析に基づいて選択した（３９）。雄と雌の両方を、動物研究の各試料群にランダムに含めた。

結果
ＨＴＳはＰ２３Ｈロドプシンを選択的に減少させる４６個の化合物を特定した
誤って折り畳まれたＰ２３Ｈロドプシン変異タンパク質を明らかにする小分子を特定するために、本発明者らは、Ｐ２３Ｈロドプシンと融合したレポーターとして明るいＲｌｕｃを安定に発現するＨｅｋ２９３細胞株（Ｈｅｋ２９３（ＲＨＯ^Ｐ２３Ｈ－Ｒｌｕｃ）、図１Ａ及び図８）を用いて、細胞ベースのＨＴＳアッセイを開発した。光受容細胞株は培養には利用できないので、本発明者らは、ＨＴＳに最も一般的に使用されているＨｅｋ２９３細胞のうちの１つを選択した。このルシフェラーゼレポーターアッセイを用いて、２４時間の化合物処理に応答するＰ２３Ｈロドプシンを定量するために、本発明者らは、合計６つの化合物コレクション中に６８，９７９個の小分子のＨＴＳを実施した（図１Ｂ、表４）。１つの用量（９．９６～１６．１３μＭ）で試験した平均－２ＳＤ（表１）におけるカットオフよりも低い活性スコアを有する２０７２個の化合物を３つの化合物コレクションから特定し、７～１１用量で試験したＥＣ_５０＜２０μＭである１２８個のヒットを他の３つの化合物コレクションから特定した。ヒット選択プロセスにおいて、本発明者らは、組換えＲｌｕｃ活性を阻害する化合物を除外し、１０μＭの化合物濃度で野生型（ＷＴ）ロドプシンを発現するＨｅｋ２９３（ＲＨＯ^ＷＴ－Ｒｌｕｃ）細胞上で発光を減少させない化合物のみを選択するためにカウンタースクリーニングを実施し、これらの選択した化合物が変異ロドプシンのクリアランスを選択的に好むことを示唆している。次いで、本発明者らは、ルシフェラーゼレポーターアッセイにより、Ｈｅｋ２９３（ＲＨＯ^Ｐ２３Ｈ－Ｒｌｕｃ）及びＨｅｋ２９３（ＲＨＯ^ＷＴ－Ｒｌｕｃ）細胞におけるこれらの化合物の用量応答効果を試験し、Ｐ２３Ｈロドプシンを選択的に減少させるこれらの化合物の効力及び有効性を測定した（図１Ｃ）。一緒、変異ロドプシン選択性を有する４６個の化合物を、この６８，９７９個の化合物のＨＴＳから確認した。

ヒットバリデーションは９個のヒットを確認した
細胞株又はＲｌｕｃ融合に関連する偽陽性を排除し、ＷＴロドプシンを上回るＰ２３Ｈのクリアランスに対する４６個のヒットの選択的活性を確認するために、本発明者らは、それぞれＰ２３Ｈロドプシン（ＮＩＨ３Ｔ３（ＲＨＯ^Ｐ２３Ｈ／ＧＦＰ））及びＷＴロドプシン（ＮＩＨ３Ｔ３（ＲＨＯ^ＷＴ／ＧＦＰ））を安定的に発現する２つのＮＩＨ３Ｔ３細胞株においてこれらの化合物を試験した。ＨＴＳに使用したＨｅｋ２９３由来の異なる細胞株を用いて、細胞型特異的でない活性を有する化合物を選択した。本発明者らはまた、ＷＴロドプシンと比較してＰ２３Ｈの選択的低下を示した各化合物１０μＭで処理したＮＩＨ３Ｔ３（ＲＨＯ^Ｐ２３Ｈ／ＧＦＰ）及びＮＩＨ３Ｔ３（ＲＨＯ^ＷＴ／ＧＦＰ）細胞からの細胞溶解物のドットブロットを用いてロドプシンレベルを決定した（図１Ｄ～Ｇ及び図９）。本発明者らは、これらの化合物で２４時間処理した後に、これらの細胞中のＰ２３Ｈ及びＷＴロドプシンを定量するために、ロドプシン免疫蛍光のハイコンテントイメージング分析を使用した（図１Ｈ及び２）。結果として、本発明者らは、哺乳動物細胞中で誤って折り畳まれたＰ２３Ｈロドプシンを選択的に除去する９個の化合物を検証した（図１Ｈ及び表２）。

表２－Ｐ２３Ｈロドプシンを選択的に除去する確認済み化合物の薬理学的活性

９つの変異体ロドプシン選択的ヒットのケモインフォマティクス
９つのヒットの中で、２つの化合物（ＣＬ－００２及びＣＬ－００４）のみが、以前に知られた薬理学的活性を有していない。それらのうちの４つ（ＣＬ－００１、ＣＬ－００６、ＣＬ－００７、及びＣＬ－００８）は、汎サイクリン依存性キナーゼ阻害剤であった（図１Ｈ）。ＣＬ－００３は、１（ＮＯＤ１）、ＮＯＤ２、ハンチンチン、腫瘍壊死要因α、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３などを含むヌクレオチド結合オリゴマー化ドメインを含む異なるタンパク質を標的とする多数のアッセイにおいて活性が証明されており、多くの標的と非選択的に相互作用する汎アッセイ干渉化合物であり得る。ＣＬ－００５は、プロリルヒドロキシラーゼの阻害剤、及び熱ショック誘導因子１αの安定化剤であり、低酸素応答の誘導において活性が示唆されている。ＣＬ－００９、ＭＴＸは、癌及び関節リウマチの治療のための承認薬である。しかし、これらの化合物がＰ２３Ｈロドプシンクリアランスを媒介する分子の作用メカニズムは、さらなる調査を必要とする。

ロドプシン転写及び生分解に対する９つの確認済み化合物の効果
本発明者らは、Ｐ２３Ｈロドプシンの選択的クリアランスの効果が、ロドプシンの生合成の低下又は分解の増強のいずれかによるものであるかを決定するために、２４時間、各ヒット化合物で処理した、又は処理していないＮＩＨ３Ｔ３（ＲＨＯ^Ｐ２３Ｈ／ＧＦＰ）及びＮＩＨ３Ｔ３（ＲＨＯ^ＷＴ／ＧＦＰ）細胞でｑＰＣＲ及び非放射性パルスチェイスアッセイを行った。ｑＰＣＲは、ＷＴとＰ２３Ｈロドプシン転写物の両方が、ＤＭＳＯ対照と比較してＣＬ－００１、ＣＬ－００２、ＣＬ－００３、ＣＬ－００４、ＣＬ－００６、ＣＬ－００７及びＣＬ－００８により非選択的に低下したことを示した（図３Ａ）。驚くべきことに、ＣＬ－００５は、ＤＭＳＯ対照と比較してＮＩＨ３Ｔ３（ＲＨＯ^Ｐ２３Ｈ／ＧＦＰ）とＮＩＨ３Ｔ３（ＲＨＯ^ＷＴ／ＧＦＰ）細胞の両方においてロドプシン転写物を２倍増加させる一方で、ＣＬ－００９／ＭＴＸは、ＷＴとＰ２３Ｈロドプシンの両方の転写に影響を及ぼさなかった。

非放射性パルスチェイスアッセイにおいて、本発明者らは、ＮＩＨ３Ｔ３（ＲＨＯ^ＷＴ／ＧＦＰ）及びＮＩＨ３Ｔ３（ＲＨＯ^Ｐ２３Ｈ／ＧＦＰ）細胞の培地中でメチオニン（Ｍｅｔ）をＡＨＡに、Ｍｅｔの類似体を側鎖中のアジド基に置換し、その後、培地にＭｅｔを添加し、２４時間チェイスすることにより、一時的に新生タンパク質を４時間標識した。「クリック」反応を介してＡＨＡ組み込みタンパク質にＢＴＮを付着させ、細胞溶解物を１Ｄ４抗ロドプシン抗体で免疫沈降させ、ＳＡでドットブロットすることにより、残りのＡＨＡ標識ロドプシンを測定した（図３Ｂ）。本発明者らは、ＢＴＮ－ＡＨＡ標識Ｐ２３Ｈロドプシンが、ＤＭＳＯ対照と比較して、１０μＭのＣＬ－００１、ＣＬ－００２、ＣＬ－００５、ＣＬ－００７及びＣＬ－００９（ＭＴＸ）での処理による２４時間のチェイスで顕著に低下したことを見出した（図３Ｃ及び図１０）。全Ｐ２３Ｈロドプシンのプルダウンレベルが試験した全９個のヒットによって減少し、以前に検証された活性が確認された（図１０Ｆ）。この結果は、これら５つの化合物（ＣＬ－００１、ＣＬ－００２、ＣＬ－００５、ＣＬ－００７及びＣＬ－００９／ＭＴＸ）のみが、誤って折り畳まれたロドプシンの分解を加速させたことを示唆する。一緒に、ロドプシンドットブロット、ｑＰＣＲ及びパルスチェイスアッセイの結果は、（表３）ヒット化合物が、１）ロドプシン転写のみ低下させる（ＣＬ－００３、ＣＬ－００４、ＣＬ－００６、及びＣＬ－００８）、２）分解のみ増加させる（ＣＬ－００５及びＣＬ－００９）、又は３）転写の減少とＰ２３Ｈロドプシンの分解の増加の両方（ＣＬ－００１、ＣＬ－００２、及びＣＬ－００７）によってＰ２３Ｈロドプシンを低下させることを示した。安定細胞におけるロドプシンの転写は、ロドプシンプロモーターではなく、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターによって促進されるため、グループ１）化合物は、インビボでＰ２３Ｈロドプシンレベルに影響を与えない可能性があるので、この研究のさらなる調査に含めなかった。５個の化合物（ＣＬ－００１、ＣＬ－００２、ＣＬ－００５、ＣＬ－００７、及びＣＬ－００９）のみが、さらなる研究のために残った。

表３－ロドプシンの転写及び分解に対する９つの確認済み化合物の効果

表４－各化合物ライブラリーに対して行ったＨＴＳ及び確認アッセイのワークフロー

他の誤って折り畳まれたロドプシン変異体のクリアランスに対する５個の化合物の活性
これらの５個の確認済み化合物がインビトロで他のＲＰを引き起こすロドプシン変異体のクリアランスに影響を及ぼすかどうかを決定するために、本発明者らは、これらの化合物で処理した場合に、Ｕ２ＯＳ細胞で安定に発現し、ａｄＲＰを引き起こす６つのロドプシン変異体（Ｔ４Ｒ、Ｐ２３Ｈ、Ｐ５３Ｒ、Ｃ１１０Ｙ、Ｄ１９０Ｎ及びＰ２３７Ｌ、図８）のタンパク質レベルを測定した。これらのクラスＩＩ変異体は、ロドプシンのミスフォールディングを引き起こすと以前に報告された（ｗｗｗ．ｈｇｍｄ．ｃｆ．ａｃ．ｕｋ）。本明細書で使用するＵ２ＯＳ細胞は、ロドプシン輸送をレスキューする際の小分子シャペロンの効果を定量するために以前に使用した。ロドプシンのレベルを定量するために、免疫蛍光及びハイコンテントイメージングを用いて、本発明者らは、５つの化合物のいずれもロドプシン変異体の細胞局在化に影響を及ぼさなかったが、これらのロドプシン変異体の免疫蛍光強度は、ＣＬ－００１、ＣＬ－００２、ＣＬ－００５、及びＣＬ－００７（図３Ｄ及び図１１）によって低下したことを見出した。ＣＬ－００９（ＭＴＸ）処理単独では、Ｐ２３Ｈ、Ｃ１１０Ｙ、Ｄ１９０Ｎ及びＰ２６７Ｌ変異体を発現する細胞において用量依存的低下を示したが、Ｔ４Ｒ及びＰ５３Ｒ変異体では示さなかった。ＮＩＨ３Ｔ３（図２Ａ）及びＵ２ＯＳ細胞（図３Ｄ）におけるＰ２３Ｈロドプシンクリアランスに対するこれらの化合物のわずかに異なる薬理学的活性は、２つの安定な細胞株におけるＰ２３Ｈロドプシンの細胞型及び発現レベルの差によるものである。次いで、本発明者らは、ＣＬ－００９（ＭＴＸ）が、転写に影響を及ぼすことなく変異ロドプシン分解を加速させる唯一の化合物であるので、その作用メカニズム及びインビボでの効力研究のためにＣＬ－００９（ＭＴＸ）に焦点を合わせた。

プロテアソーム経路ではなく、リソソーム経路を介するＭＴＸ媒介Ｐ２３Ｈロドプシンクリアランス
ロドプシンは、プロテアソームとリソソームの経路の両方を介して分解される。どのタンパク質分解経路がＭＴＸ媒介性Ｐ２３Ｈロドプシンクリアランスに関与しているかを決定するために、本発明者らは、ＭＴＸに加えて、リソソームの酸性化及び活性を防止するＡＴＰａｓｅ阻害剤のバフィロマイシンＡ１（ＢａｆＡ１）、又はプロテアソーム阻害剤であるＭＧ－１３２のいずれかを用いて、ＮＩＨ３Ｔ３（ＲＨＯ^Ｐ２３Ｈ／ＧＦＰ）及びＮＩＨ３Ｔ３（ＲＨＯ^ＷＴ／ＧＦＰ）細胞を処理し、イムノブロットによってこれらの細胞中のＰ２３Ｈ又はＷＴロドプシンレベルを定量した。本発明者らは、ＭＧ－１３２処理ではなく、ＢａｆＡ１処理のみがＭＴＸ誘導性Ｐ２３Ｈロドプシンクリアランスを廃止したことを見出し、プロテアソーム経路よりむしろリソソーム経路がＭＴＸ媒介性Ｐ２３Ｈロドプシンクリアランスに関与することを示唆した（図４Ａ＆Ｂ及び図１２）。ＢａｆＡ１及びＭＴＸの同時処理はＷＴロドプシンの蓄積ももたらす一方で、ＭＧ－１３２＋ＭＴＸはもたらさなかったことから（図４Ａ＆Ｂ）、ＷＴとＰ２３Ｈロドプシンの両方が、これらのＮＩＨ３Ｔ３安定細胞中のリソソーム経路を介して主に分解されることが示唆された。

本発明者らは、これらの処理を繰り返し、免疫蛍光及びハイコンテントイメージングによりロドプシンレベルを定量した（図４Ｃ＆Ｄ）。本発明者らは、細胞当たりのＰ２３Ｈロドプシン免疫染色の平均強度が、ＭＴＸ用量依存的に低下し、ＭＧ－１３２の添加によって影響されないが、ＢａｆＡ１との同時処理によって完全に消失したことを見出した。この結果は、ＭＴＸがリソソーム経路を介してＰ２３Ｈロドプシンの分解を選択的に改善した上記のイムノブロットデータを確認した。

発明者らは、さらに、ＭＴＸ処理が、ＮＩＨ３Ｔ３（ＲＨＯ^Ｐ２３Ｈ／ＧＦＰ）及びＮＩＨ３Ｔ３（ＲＨＯ^ＷＴ／ＧＦＰ）細胞におけるキモトリプシン様プロテアソーム活性に影響を及ぼさないことを見出し（図４Ｅ～Ｇ）、ＭＴＸがプロテアソーム経路に影響を及ぼさないという結論を確認した。

ＭＴＸはインビボでオートファジーフラックスを増加させた
オートファジーは、リソソーム活性を介してタンパク質凝集体のクリアランスを調節することが知られているので、ＭＴＸ処置が、ＲＰの一般的に使用されている動物モデルであるＲｈｏ^{Ｐ２３Ｈ／＋}ノックインマウスにおいてオートファジーに影響を及ぼすかどうかを調べた。ＰＮＤ１５に、ＩＶＩによる２５ｐｍｏｌのＭＴＸを一方の眼に、ビヒクル対照として等容量のＰＢＳを他方の眼に投与した。オートファジーフラックスがＭＴＸによって影響を受けたかどうかを決定するために、治療の４８時間後に網膜中のＬＣ３及びＳＱＳＴＭ１／ｐ６２をイムノブロットした（図５）。ＬＣ３－ＩＩは、オートファゴソームに組み込まれるＬＣ３の脂質化形態であり、ＳＱＳＴＭ１／ｐ６２はオートファジーフラックスの既知のカーゴである。ＰＢＳ対照と比較して、ＭＴＸ処置は、ＳＱＳＴＭ１／ｐ６２レベルの減少（図５Ｂ）及びＬＣ３－ＩＩの増加（図５Ｃ）をもたらし、ＭＴＸがインビボでオートファジーフラックスを増加させたことが示唆された。

ＭＴＸの１回のＩＶＩは、Ｒｈｏ ^{Ｐ２３Ｈ／＋} マウスにおいてＥＲＧ応答及び網膜ロドプシンレベルを増加させた
Ｒｈｏ^{Ｐ２３Ｈ／＋}マウスの光受容体は、ＰＮＤ１５から１ヶ月齢までの急速な変性期間を受け、その後、より遅い速度で死亡する。本発明者らは、Ｒｈｏ^{Ｐ２３Ｈ／＋}マウスにおける網膜変性の速い段階に、網膜の機能及び構造に対するＭＴＸ処置の効果を試験した。ＰＮＤ１５に、これらのマウスの一方の眼に２５又は１００ｐｍｏｌのＭＴＸを、他方の眼にビヒクル対照としての等量のＰＢＳをＩＶＩ投与し、ＰＮＤ３２にこれらのマウスの暗順応及び明順応全視野ＥＲＧを記録した。これらの２つの用量を、マウスの眼球の体積、及びインビトロでのＭＴＸの有効濃度に基づいて推定した。１０ｃｄ・ｓ／ｍ^２での代表的な暗順応ＥＲＧ応答は、２５ｐｍｏｌのＭＴＸで処置したＲｈｏ^{Ｐ２３Ｈ／＋}マウスの眼のａ波及びｂ波がＰＢＳ及び未処置群よりも高いことを示した（図６Ａ）。マルチフラッシュ暗順応ＥＲＧ測定により、２５ｐｍｏｌのＭＴＸで処置したＲｈｏ^{Ｐ２３Ｈ／＋}の眼のａ波とｂ波の両方はＰＢＳ又は未処置眼よりも顕著に高いが、１００ｐｍｏｌのＭＴＸで処置した眼は効果を示さなかったことが確認された（図６Ｂ＆Ｃ）。２５ｐｍｏｌのＭＴＸで処置したＲｈｏ^{Ｐ２３Ｈ／＋}眼はまた、ＰＢＳで処置した又は未処置の目よりも高い明順応ＥＲＧ応答を示した（図６Ｄ）が、１００ｐｍｏｌのＭＴＸはいずれの効果も示さなかった。暗順応及び明順応のａ波に対するｂ波の振幅の比は、ＭＴＸ処置によって影響されず、２５ｐｍｏｌのＭＴＸによるｂ波の機能的増加は主に光受容体機能の増加によるものであるが、独立して増加した双極細胞応答ではないことが示唆された（図１３Ａ～Ｂ）。ＰＢＳ処置群は、非処置群に対する暗順応又は明順応応答に差がなく、単回ＩＶＩが安全であり、視覚機能に影響を及ぼさないことが示唆された。

網膜構造及びロドプシンのホメオスタシスを調べるために、本発明者らは、これらの処置マウス（ＰＮＤ３３に安楽死させた）からの網膜凍結切片を、ＯＳを標識する抗ロドプシン抗体及び核染色のためのヘキスト３３３４２で免疫染色した。以前に報告されているように、ＰＮＤ３３に未処置Ｒｈｏ^{Ｐ２３Ｈ／＋}網膜は、Ｒｈｏ^＋／＋網膜と比較して、顕著により短いＯＳ層を示し、ＯＮＬにおけるロドプシンレベルが低下し、核数が約半分になり、ロドプシンのホメオスタシスが破壊され、網膜変性が１ヶ月齢でＲｈｏ^{Ｐ２３Ｈ／＋}マウスに生じたことを支持した（図６Ｅ～Ｊ＆Ｑ－Ｒ及び図１３Ｃ～Ｄ＆１４）。２５ｐｍｏｌのＭＴＸ処置Ｒｈｏ^{Ｐ２３Ｈ／＋}網膜は、下側ではなく上側のＰＢＳ対照と比較して、全ロドプシンレベルとＯＳ中のロドプシンにおいて有意な増加を示した。（図６Ｋ～Ｑ、及び図１３Ｃ～Ｄ＆１４）。ＭＴＸの処置により、Ｒｈｏ^{Ｐ２３Ｈ／＋}網膜のいずれの側にもＯＮＬ核数の変化は見られず（図６Ｒ）、２５ｐｍｏｌのＭＴＸの１回のＩＶＩは、網膜変性の速い期間からＲｈｏ^{Ｐ２３Ｈ／＋}マウスを保護するのに十分ではない可能性が示唆される。ＰＢＳで処置した網膜は、未処置のＲｈｏ^{Ｐ２３Ｈ／＋}網膜と比較して、全ロドプシンのレベル又は局在化にも、ＯＮＬ核数にも差を示さず、１回のＩＶＩ自体が安全で、網膜の形態を変化させないことが確認された（図６Ｈ～Ｍ＆Ｑ～Ｒ及び図１３Ｃ～Ｄ）。ＥＲＧとＩＨＣの結果を組み合わせると、杆体視細胞の数の増加のせいではない網膜の上側の機能的ロドプシンレベルの増加によって、Ｒｈｏ^{Ｐ２３Ｈ／＋}眼における２５ｐｍｏｌのＭＴＸの単回ＩＶＩがＥＲＧ応答を改善したと結論付けられる。

ＭＴＸの複数回ＩＶＩは、Ｒｈｏ ^{Ｐ２３Ｈ／＋} マウスにおいてＥＲＧ応答及びロドプシンレベル並びに光受容細胞数を増加させた
次いで、本発明者らは、ロドプシンホメオスタシスを回復させ、Ｒｈｏ^{Ｐ２３Ｈ／＋}マウスにおいて光受容体を保存する際に、ＭＴＸの複数回投与が効力を改善したかどうかを調べた（図７）。そのため、本発明者らは、ＰＮＤ１５から始めるＲｈｏ^{Ｐ２３Ｈ／＋}マウスの眼にＭＴＸの週４回のＩＶＩを行った後、ＰＮＤ４４にＥＲＧを記録し、ＩＨＣのためにＰＮＤ４６に動物を安楽死させた。ＭＴＸで処置した眼のマルチフラッシュ暗順応及び明順応ｂ波は、ＰＢＳ対照群（図７Ａ～Ｄ）と比較して顕著に増加した。１００ｐｍｏｌのＭＴＸで処置したＲｈｏ^{Ｐ２３Ｈ／＋}眼の明順応ｂ波も、２５ｐｍｏｌのＭＴＸ群ほど高くないにしても、より高いフラッシュ強度でＰＢＳ群よりも高かった（図７Ｄ）。ＥＲＧ記録は、ＭＴＸの複数回ＩＶＩがビヒクル対照と比較して視覚機能を改善したことを示した。しかし、ビヒクルの毎週のＩＶＩは、未処置対照と比較して、暗順応応答と明順応応答の両方の低下を示し（図７Ａ～Ｄ）、毎週のＩＶＩがＲｈｏ^{Ｐ２３Ｈ／＋}マウスの視覚的機能を損なうことを示唆した。

２５ｐｍｏｌのＭＴＸの４回のＩＶＩで処置したＲｈｏ^{Ｐ２３Ｈ／＋}網膜のＩＨＣは、ＰＢＳ群と比較して、下側ではないが、上側においてＯＳ中のロドプシンの顕著により高いレベル、ＯＮＬ中のロドプシンのより低いレベル、及びＯＮＬ中のより高い核数を示した（図７Ｅ～Ｏ及び図１３Ｅ～Ｆ＆１５Ｄ）。結果から、２５ｐｍｏｌのＭＴＸの４回のＩＶＩが、変異体とＷＴロドプシンを区別することができなくとも、網膜の上側においてＯＳ中の折り畳まれたロドプシンを増加させ、ＯＮＬ中の誤って局在化したロドプシンを減少させたことが示唆された。２５ｐｍｏｌのＭＴＸの１回の注射と比較して、ＭＴＸの週４回のＩＶＩは網膜保護により高い効力を示し、ＰＢＳ群と比較して上側でより多くのＯＮＬ核数を保存したが、１回のＭＴＸ注射では保存されなかった。しかし、ＰＢＳの週４回のＩＶＩは、未処置対照と比較して、Ｒｈｏ^{Ｐ２３Ｈ／＋}網膜のＯＮＬ中の総ロドプシンレベルの低下及びより低い核数を示し、ＥＲＧ応答にも見られる週に複数回のＩＶＩによる副作用が確認された（図７Ｅ～Ｊ及びＮ～Ｏ）。ＶＩ間隔の将来の最適化又は処置経路の変更が、長期間のＭＴＸ処置に必要である。

異なる段階でのＲＰの治療戦略は、介入時に生存している光受容体の数に依存して異なる。後期ＲＰの視覚を回復するために、ほとんどの光受容体が無くなった網膜において視覚的応答を再構築するための幹細胞療法、光遺伝学、及び網膜プロステーシスの開発を含む様々な技術に対して多くの努力がなされてきた。網膜構造がまだ大部分が維持されている場合に、遺伝的変異により失われる機能性遺伝子の局所送達により、主に常染色体劣性失明を治療するための遺伝子治療が実質的にブレークスルーとなった。あるいは、毛様体神経栄養因子及び錐体杆体由来神経栄養因子などのアデノ随伴ウイルスによる神経栄養因子の遺伝子送達は、ＲＰの動物モデルにおいて杆体及び錐体の死を遅らせる保護効果をそれぞれ示した。遺伝子治療の補完において、網膜の構造及び機能を保存することができ、視覚がＲＰの初期又は中間段階で維持できるように、本発明者らは、それらが死ぬ前に杆体内の早期事象を標的とする薬理学的介入を探している。具体的には、本発明者らは、杆体死が遺伝子の機能不全のせいではなく、むしろＲＨＯなどの変異遺伝子のドミナントネガティブ効果のせいであるａｄＲＰを標的としている。そのため、この研究の目的は、誤って折り畳まれたロドプシンによって引き起こされるａｄＲＰの初期及び中間段階を標的とする予防療法を開発することである。重要なことに、本発明者らは、ＲＰの動物モデルにおいて網膜変性の早い時期から誤って折り畳まれたロドプシンの分解を上方制御し、視覚機能を改善し、網膜構造を保存するＦＤＡ認可薬のＭＴＸの新規活性を発見した。潜在的に、ＭＴＸによって上方制御されたこの誤って折り畳まれたタンパク質分解経路は、ロドプシン単独のクリアランスに制限されない可能性があり、ミオシリン関連の原発性開放隅角緑内障などの他の誤って折り畳まれたタンパク質関連失明に適用できる。

Ｇタンパク質共役受容体のタンパク質ホメオスタシスを調節する分子経路はよく理解されていない。新規小分子化合物と薬理学的に活性のある小分子化合物の両方をスクリーニングすることにより、本発明者らは、化学遺伝学を探求し、ロドプシンのホメオスタシスを調節する最も関連する分子経路を見出すことができた。本明細書で、本発明者らは、６８，９７９個の小分子のＨＴＳキャンペーンで、誤って折り畳まれたロドプシンの分解を高める５個の化合物を特定した：ＣＬ－００１及びＣＬ－００７は汎サイクリン依存性キナーゼ阻害剤であり；ＣＬ－００５はＨＩＦ１αの安定剤であり；ＣＬ－００９（ＭＴＸ）は葉酸代謝の阻害剤であり；かつＣＬ－００２のみは薬理学的活性が報告されていない未知の化学物質である。この研究は、作用メカニズム及びインビボ効果についてＭＴＸにのみ焦点を合わせたが、誤って折り畳まれたロドプシンの分解を媒介することにおけるＣＫＤ又は他のキナーゼの潜在的な役割、及びＭＩＦ１αの調節要因を探索することは、エキサイティングな将来を導き、膜タンパク質の分解のよりよい理解につながり得る。

ＭＴＸは水溶性であり、網膜ブドウ膜炎などの炎症性眼疾患のためのオフタグ治療として硝子体内投与されている。そのため、Ｐ２３Ｈロドプシンの選択的クリアランスにおけるＭＴＸの新規活性と、Ｒｈｏ^{Ｐ２３Ｈ／＋}マウスにおけるその網膜保護効果があるために、治療可能性を有するこの薬物は、ＲＨＯ関連ａｄＲＰ治療にも利用できる。

ＭＴＸは、Ｐ２３Ｈロドプシンの選択的クリアランスにおいて明らかなインビトロ活性を示した。そのため、ＭＴＸの単回又は複数回のＩＶＩの後に、Ｒｈｏ^{Ｐ２３Ｈ／＋}マウス網膜の上側のロドプシンレベルの増加を観察することは反直感的である。ロドプシン免疫染色のほとんどは、ＭＴＸ処置したＲｈｏ^{Ｐ２３Ｈ／＋}マウス網膜のＯＳ上であり（図６及び７）、ＭＴＸによるロドプシンの増加は、適切に折り畳まれ、標的部位に輸送されることを示唆している。本明細書で試験したノックインマウスのヘテロ接合性の背景と、抗ロドプシン抗体がＷＴロドプシンとＰ２３Ｈロドプシンを区別することができないことを考慮すると、ＯＳにおける折り畳まれたロドプシンレベルの増加におけるＭＴＸの活性は、インビボでＰ２３Ｈロドプシンの選択的クリアランスのためであり得る。実際に、本発明者らは、Ｒｈｏ^{Ｐ２３Ｈ／＋}マウスにおけるＭＴＸのＩＶＩ後に、増大したオートファジーフラックスを観察し、ＭＴＸが、オートファジーの誘導を介して、誤って折り畳まれたロドプシン分解を増強し得ることが示唆される。この推論を試験するために、本発明者らは、ＰＮＤ１５に２５ｐｍｏｌのＭＴＸのＩＶＩによるＲｈｏ^{Ｐ２３Ｈ／Ｐ２３Ｈ}マウスにおいてＰ２３Ｈロドプシンレベルに対するＭＴＸ処置の効果を決定し、続いて処置後２４、４８及び７２時間の時点で網膜イムノブロットを行った。しかし、Ｒｈｏ^{Ｐ２３Ｈ／Ｐ２３Ｈ}マウスにおけるＰ２３Ｈロドプシンのタンパク質レベルが低いこと（Ｒｈｏ^＋／＋網膜と比較して約１／２００のロドプシン）、及び個々の動物間での変動が高いため、ＰＢＳ対照と比較して、ＭＴＸの処置によりＰ２３Ｈロドプシンの一貫して統計的に有意な差異は見られなかった（図示せず）。

網膜変性における空間的差異は、ＲＰ動物モデル及びＲＰ患者において知られているが、ＲＰにおいて網膜の下側が上側よりも速く変性する理由は明らかではない。興味深いことに、本発明者らは、上側でのみＲｈｏ^{Ｐ２３Ｈ／＋}網膜へのＭＴＸ処置の反復的非対称効力を観察した。薬物処置への応答のこの空間的差異は、ＲＰの齧歯類モデルに対する神経栄養因子のＩＶＩにも見られている。上側と下側の網膜の間の差次的遺伝子発現又は光暴露は、ＭＴＸ処置の空間感度に寄与し得る。

ＭＴＸが１００ｐｍｏｌより２５ｐｍｏｌでより良好な網膜保護を示した理由は、さらなる調査を必要とする。１つの可能性のある説明としては、誤って折り畳まれたロドプシンを除去することによってその保護効果と共に反作用し得るＭＴＸのより高い用量での細胞傷害性であり得る。１．７６μモルのＭＴＸ（ウサギの硝子体腔が約１．５ｍＬであることを考慮して、硝子体中約１ｍＭの最終濃度）の硝子体内注射によりウサギにおいて網膜損傷が観察された。マウスの硝子体容積は約５．３μＬであるため、１００ｐｍｏｌのＭＴＸは１８．９μＭの初期硝子体濃度をもたらす一方で、２５ｐｍｏｌのＭＴＸ投与は約４．７μＭの硝子体濃度であった（ＭＴＸのＥＣ_５０はインビトロでは約３．３μＭである）。１００ｐｍｏｌのＭＴＸによって引き起こされる明らかな網膜変性は見られなかったが、この結果は、本発明者らの将来の研究に、ＭＴＸの完全な毒性研究が必要であることを示す。ＲＮＡ－ｓｅｑによるトランスクリプトーム分析も、ＭＴＸによって変更した分子経路を理解するのに重要な将来の方向性である。

本発明者らの結果は、未処置対照と比較して、Ｒｈｏ^{Ｐ２３Ｈ／＋}マウスにおける週４回の滅菌ＰＢＳのＩＶＩが網膜変性を加速させたことを実証しているので、複数回のＩＶＩには注意を払わなければならない。しかし、４回用量のＭＴＸで処置した網膜は、ＰＢＳ対照と比較して増加した光受容体数を示したが、ＭＴＸの１回の注射はこの効果を有さず、１回の注射はＲＰにおける長期の網膜保護に十分ではないことが示唆された。ＩＶＩによる副作用を回避するためのＭＴＸでの長期処置に、最適化したＩＶＩ間隔又は徐放製剤の開発が将来必要になる。

本発明の上記の説明から、当業者は、改良、変更及び修正を認識するであろう。当業者の範囲内のそのような改良、変更及び修正は、添付の特許請求の範囲に包含されることが意図される。本明細書で引用される全ての参考文献、刊行物、及び特許は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

Claims (25)

1. それを必要とする対象において誤って折り畳まれた眼タンパク質のクリアランスを促進する方法であって、
   

   

   から選択される治療有効量の化合物、それらの医薬として許容し得る塩、互変異性体、若しくは溶媒和物、又はそれらの組み合わせを前記対象に投与することを含む方法。
2. 前記化合物が、
   

   

   それらの医薬として許容し得る塩、互変異性体、若しくは溶媒和物、又はそれらの組み合わせから選択される、請求項１に記載の方法。
3. 前記対象が、誤って折り畳まれた眼タンパク質に関連付けられるか、若しくはそれによって引き起こされる遺伝性眼障害になりやすいか、又はそれを有する、請求項１又は２のいずれかに記載の方法。
4. 前記対象が、誤って折り畳まれた眼タンパク質に関連付けられるか、若しくはそれによって引き起こされる非症候性網膜障害にかかりやすいか、又はそれを有する、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
5. 前記対象が、誤って折り畳まれた眼タンパク質に関連付けられるか、又はそれによって引き起こされる非症候性常染色体優性網膜色素変性症を有する、請求項１～４のいずれかに記載の方法。
6. 前記化合物が、非症候性常染色体優性網膜色素変性症の初期段階又は中間段階で前記対象に投与される、請求項５に記載の方法。
7. 前記誤って折り畳まれた眼タンパク質が、誤って折り畳まれたオプシンである、請求項１～６のいずれかに記載の方法。
8. 前記誤って折り畳まれた眼タンパク質が、そのアミノ酸配列に変異を含む誤って折り畳まれたオプシンタンパク質である、請求項１～６のいずれかに記載の方法。
9. 前記変異が、Ｐ２３Ｈ、Ｃ１１０Ｙ、Ｄ１９０Ｎ、Ｔ１７Ｍ、Ｐ３４７Ｓ、又はＰ２６７Ｌのうちの少なくとも１つである、請求項８に記載の方法。
10. 前記治療有効量は、誤って折り畳まれた眼タンパク質の分解を加速させ、眼タンパク質ホメオスタシスを改善し、視覚機能を改善若しくは保存し、光受容細胞死を阻害し、かつ／又は網膜構造を改善若しくは保存するのに有効な量である、請求項１～９のいずれかに記載の方法。
11. 前記視覚機能における改善又は保存には、明順応網膜電図（ＥＲＧ）応答の改善又は保存が含まれる、請求項１０に記載の方法。
12. 前記網膜構造における改善又は保存は、外核層（ＯＮＬ）の厚さの改善又は保存である、請求項１０に記載の方法。
13. 前記化合物が、局所投与、全身投与、硝子体内注射、及び眼内送達のうちの少なくとも１つによって投与される、請求項１～１２のいずれかに記載の方法。
14. それを必要とする対象において誤って折り畳まれた眼タンパク質に関連付けられるか、又はそれによって引き起こされる遺伝性眼障害を治療する方法であって、
    

    

    から選択される治療有効量の化合物、それらの医薬として許容し得る塩、互変異性体、若しくは溶媒和物、又はそれらの組み合わせを前記対象に投与することを含む方法。
15. 前記化合物が、
    

    

    それらの医薬として許容し得る塩、互変異性体、若しくは溶媒和物、又はそれらの組み合わせから選択される、請求項１４に記載の方法。
16. 前記対象が、誤って折り畳まれた眼タンパク質に関連付けられるか、若しくはそれによって引き起こされる非症候性網膜障害になりやすいか、又はそれを有する、請求項１４又は１５のいずれかに記載の方法。
17. 前記対象が、誤って折り畳まれた眼タンパク質に関連付けられるか、又はそれによって引き起こされる非症候性常染色体優性網膜色素変性症を有する、請求項１４～１６のいずれかに記載の方法。
18. 前記化合物が、非症候性常染色体優性網膜色素変性症の初期段階又は中間段階に前記対象に投与される、請求項１７に記載の方法。
19. 前記誤って折り畳まれた眼タンパク質が、誤って折り畳まれたオプシンである、請求項１４～１８のいずれかに記載の方法。
20. 前記誤って折り畳まれた眼タンパク質が、そのアミノ酸配列に変異を含む誤って折り畳まれたオプシンタンパク質である、請求項１４～１９のいずれかに記載の方法。
21. 前記変異が、Ｐ２３Ｈ、Ｃ１１０Ｙ、Ｄ１９０Ｎ、Ｔ１７Ｍ、Ｐ３４７Ｓ、又はＰ２６７Ｌのうちの少なくとも１つである、請求項２０に記載の方法。
22. 前記治療有効量が、誤って折り畳まれた眼タンパク質の分解を加速させ、眼タンパク質ホメオスタシスを改善し、視覚機能を改善若しくは保存し、光受容細胞死を阻害し、かつ／又は網膜構造を改善若しくは保存するのに有効な量である、請求項１４～２０のいずれかに記載の方法。
23. 前記視覚機能における改善又は保存には、明順応網膜電図（ＥＲＧ）応答の改善又は保存が含まれる、請求項２２に記載の方法。
24. 前記網膜構造における改善又は保存は、外核層（ＯＮＬ）の厚さの改善又は保存である、請求項２２に記載の方法。
25. 前記化合物が、局所投与、全身投与、硝子体内注射、及び眼内送達のうちの少なくとも１つによって投与される、請求項１４～２４のいずれかに記載の方法。

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